1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS SYVENDE DIREKTIV
af 1. marts 1976
om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer
(76/372/EØF)
(EFT L 102 af 15.4.1976, s. 8)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1 Kommissionens direktiv 81/680/EØF af 30. juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2 Kommissionens direktiv 92/95/EØF af 9. november 1992 L 327 54 13.11.1992
►M3 Kommissionens direktiv 94/14/EF af 29. marts 1994 L 94 30 13.4.1994
▼B
KOMMISSIONENS SYVENDE DIREKTIV
af 1. marts 1976
om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle
kontrol med foderstoffer
(76/372/EØF)
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europæiske økono-
miske Fællesskab,
under henvisning til Rådets direktiv af 20. juli 1970 om indførelse af
fællesskabsprøveudtagningsmåder og -analysemetoder for så vidt angår
den officielle kontrol med foderstoffer (1), senest ændret ved tiltrædel-
sesakten (2), særlig artikel 2, og
ud fra følgende betragtninger:Ved ovennævnte direktiv er det fastsat, at den officielle kontrol med
foderstoffer til konstatering af, om de betingelser, der er fastsat pågrundlag af administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser omfoderstoffernes beskaffenhed og sammensætning, er opfyldt, skal fore-
tages efter fællesskabsprøveudtagningsmåder og -analysemetoder;
der er allerede ved Kommissionens direktiver 71/250/EØF af 15. juni
1971 (
3), 71/393/EØF af 18. november 1971 (4), 72/199/EØF af 27. april
1972 (5), 73/46/EØF af 5. december 1972 (6), 74/203/EØF af 25. marts
1974 (7) og 75/84/EØF af 20. december 1974 (8) fastsat en række fælles-
skabsanalysemetoder; i betragtning af den hastighed, hvormed arbejdet
siden da er skredet frem, bør der fastsættes en syvende serie af
metoder;
de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med
udtalelse fra Den stående Foderstofkomité —
UDSTEDT FØLGENDE DIREKTIV:
Artikel 1
Medlemsstaterne foreskriver, at analyserne i forbindelse med den offi-
cielle kontrol af foderstoffer for så vidt angår deres indhold afAflatoxin B
1skal foretages efter de metoder, der er beskrevet ibi laget
til dette direktiv.
Artikel 2
Medlemsstaterne sætter senest den 1. oktober 1976 de nødvendige
administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser i kraft for at efter-komme bestemmelserne i dette direktiv. De underretter omgåendeKommissionen herom.
Artikel 3
Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 2
(1) EFT nr. L 170 af 3. 8. 1970, s. 2.
(2) EFT nr. L 73 af 27. 3. 1972, s. 14.
(3) EFT nr. L 155 af 12. 7. 1971, s. 13.
(4) EFT nr. L 279 af 20. 12. 1971, s. 7.
(5) EFT nr. L 123 af 29. 5. 1972, s. 6.
(6) EFT nr. L 83 af 30. 3. 1973, s. 21.
(7) EFT nr. L 108 af 22. 4. 1974, s. 7.
(8) EFT nr. L 32 af 5. 2. 1975, s. 26.▼M1
▼B
▼B
BILAG
BESTEMMELSE AF AFLATOXIN B1
A. FREMGANGSMÅDE VED ENDIMENSIONAL TYNDTLAGSKROMA-
TOGRAFI
1. Formål og anvendelsesområde
Metoden gør det muligt at bestemme indholdet af aflatoksin B1i
råvarer og ublandede foderstoffer. Denne metode kan ikke
anvendes ved tilstedeværelse af citruskvas. Den mindste mængde,
der kan bestemmes, er 0,01 mg/kg (10 ppb).
Ved tilstedeværelse af interfererende stoffer, som generer bestem-
melserne, må analysen gentages efter metode B
(højtryksvæskekromatografi).
2. Princip
Prøven ekstraheres med chloroform. Ekstrakten filtreres og en
alikvot del af ekstrakten renses ved søjlekromatografi på kiselgel.
Eluatet inddampes, og inddampningsresten opløses i en bestemt
mængde chloroform eller i en blanding af benzen og acetonitril.
En alikvot del af denne opløsning tyndtlagskromatograferes.
Mængden af aflatoxin B1bestemmes under UV bestråling af
kromatogrammet, enten visuelt eller ved fluorodensitometri, ved
sammenligning med kendte mængder af aflatoxin B1standard.
Identiteten af det ekstraherede aflatoxin B1ifoderstoffet skal
bekræftes ved hjælp af de anførte fremgangsmåder.
3. Reagenser
NB.: Alle reagenserne skal være af »analyse« kvalitet, medmindre
andet er angivet.
3.1. Acetone.
3.2. Chloroform, stabiliseret med 0,5 til 1,0 % 96 % ethanol (v/v).
3.3. n-Hexan.
3.4. Methanol.
3.5. Vandfri diethylether, peroxidfrit.
3.6. Blanding af benzen og acetonitril: 98/2 (v/v).
3.7. Blanding af chloroform (3.2) og methanol (3.4): 97/3 (v/v).
3.8. Kiselgel til søjlekromatografi kornstørrelse: 0,05 til 0,20 mm.3.9. Hygroskopisk bomuld, forinden affedtet med chloroform, eller
glasuld.
3.10. Natriumsulfat, vandfrit, granuleret.
3.11. Inaktiv luftart, f.eks. kvælstof.
3.12. 1 N saltsyre.
3.13. 50 % (v/v) svovlsyre.
3.14. Diatoméjord (Hyflosupercel), vasket i syre.3.15. Kiselgel G-HR eller tilsvarende til tyndtlagskromatografi.
3.16. Standardopløsning af ca. 0,1 µg aflatoxin B
1pr. ml. ichloroform
(3.2) eller i benzen acetonitril-blandingen (3.6), tilberedt og
kontrolleret som angivet under punkt 7.
3.17. Kvalitativ standardopløsning af ca. 0,1 µg aflatoxin B1og B2pr. ml
i chloroform (3.2) eller i benzen/acetonitril-blandingen (3.6). Disse
koncentrationer er kun vejledende. De skal afpasses, så der opnås
den samme fluorescensintensitet for begge aflatoxinerne.
3.18. Udviklingsvæsker:
3.18.1. Chloroform (3.2)/acetone (3.1): 9/1 (v/v), umættet kar;1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 3
▼M2
▼B
▼B
3.18.2. Diethylether (3.5)/methanol (3.4)/vand: 96/3/1 (v/v), umættet kar,
3.18.3. Diethylether (3.5)/methanol (3.4)/vand: 94/4,5/1,5 (v/v), mættet kar;
3.18.4. Chloroform (3.2)/methanol (3.4): 94/6 (v/v), mættet kar;
3.18.5. Chloroform (3.2)/methanol (3.4): 97/3 (v/v), mættet kar.
4. Apparatur
4.1. Kværn.
4.2. Rysteapparat eller magnetomrører.
4.3. Foldefiltre, Schleicher og Schüll nr. 588 eller tilsvarende, diameter:
24 cm.
4.4. Kromatografisøjle af glas (indvendig diameter: 22 mm, længde:
300 mm), med teflonhane og 250 ml beholder.
4.5. Rotationsfordamper med 500 ml rundbundet kolbe.
4.6. 500 ml koniske kolber med slib og glasprop.
4.7. Tyndtlagskromatografiudstyr.
4.8. Glasplader til tyndtlagskromatografi, 200 × 200 mm, behandlet som
beskrevet nedenfor (de angivne mængder er passende til at dække
fem plader): 30 g G-HR kiselgel (3.15) hældes i en konisk kolbe;
der tilsættes 60 ml destilleret vand, sættes prop i og rystes i etminut. Suspensionen stryges ud på pladerne, så der fremkommer
et ensartet lag på 0,25 mm's tykkelse. Pladerne tørres iluften og
opbevares dernæst i en ekssikkator, forsynet med kiselgel. Pladerne
aktiveres på anvendelsestidspunktet ved anbringelse i et varmeskab
ved 110 ºC i en time. Fabriksfremstillede færdigplader er egnede i
det omfang de giver lignende resultater som de plader, der er
behandlet på den ovenfor beskrevne måde.
4.9. Lang-bølget UV-lampe (360 nm). Fluorecensintensiteten skal gøre
det muligt helt klart at skelne en plet på 1,0 ng aflatoxin B
1på en
plade til tyndtlagskromatografi i en afstand af 10 cm fra lampen.
4.10. 10 ml måleglas med polyethylenpropper.
4.11. UV-spektrofotometer.
4.12. Fluorodensitometer (eventuelt).
5. Fremgangsmåde
5.1. Tilberedning af prøven (se bemærkninger, afsnit C, punkt 1).
Prøven findeles således, at den kan passere igennem en sigte med
en maskevidde på 1 mm (som anbefalet af ISO E 565).
5.2. Ekstraktion
50,0 g af den findelte og homogeniserede prøve overføres til en
500 ml konisk kolbe (4.6). 25 g diatoméjord (3.14), 25 ml vand
og 250 ml chloroform (3.2) tilsættes.
Kolben tilproppes og rystes eller omrøres i 30 minutter ved hjælp
af apparaturet (4.2) og indholdet filtreres gennem et foldefilter
(4.3). De første 10 ml af filtratet kasseres, dernæst opsamles 50 ml.
5.3. Oprensning på søjle
Bunden af et kromatografirør (4.4) forsynes med en prop af vat
eller glasuld (3.9), røret fyldes to tredjedele op med chloroform
(3.2), og der tilsættes 5 g natriumsulfat (3.10).
Sørg for, at natriumsulfatlagets øvre overflade er plan, tilsæt
dernæst 10 g kiselgel (3.8) i små portioner. Efter hver tilsætning
røres omhyggeligt for at fjerne luftblærer. Efter henstand i 15
minutter, tilsættes forsigtigt 15 g natriumsulfat (3.10). Lad det
ovenstående chloroform løbe ud således at overfladen står umiddel-
bart over natriumsulfatlaget.
De 50 ml ekstrakt, som blev opsamlet under 5.2, blandes med
100 ml n-Hexan (3.3), og blandingen overføres kvantitativt til
søjlen. Lad væsken synke, indtil væskeniveauet når natriumsulfatla-
gets overflade og fjern den gennemløbne væske. Dernæst tilsættes
100 ml diethylether (3.5), der elueres indtil væskeniveauet atter
når natriumsulfatlagets overflade. Under disse operationer skal
gennemløbshastigheden holdes på 8 til 12 ml i minuttet, og søjlen1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 4
▼B
må ikke løbe tør. Den gennemløbne væske kasseres. Derefter
elueres med 150 ml af chloroform/methanol-blandingen (3.7), og
hele eluatet opsamles.
Eluatet inddampes til næsten tørhed ved gennemblæsning af inaktiv
luft (3.11) og ved en temperatur på under 50 ºC ved hjælp af rota-
tionsfordamperen (4.5). Inddampningsresten overføres kvantitativt
med chloroform (3.2) eller benzen/acetonitril-blandingen til et
10 ml måleglas (4.10). Opløsningen inddampes ved gennemblæs-
ning af inaktiv luft (3.11) og rumfanget justeres til 2,0 ml med
chloroform (3.2) eller benzen/acetonitril-blandingen (3.6).
5.4. Tyndtlagskromatografi
De nedenfor angivne rumfang af standardopløsningen og af
ekstrakten påsættes som pletter på en plade til tyndtlagskromato-
grafi(4.8), 2 cm fra den underste kant med en i ndbyrdes afstand
på 2 cm:
— 10, 15, 20, 30 og 40 µl af aflatoxin B1tandardopløsning (3.16);
— 10 µl af ekstrakten fra punkt 5.3 og, oven i dette , 20 µl af stan-
dardopløsning (3.16);
— 10 og 20 µl af ekstrakten fra punkt 5.3.
Kromatogrammet udvikles i dæmpet belysning ved hjælp af en af
væskerne (3.18). Valget af udviklingsvæske skal finde sted forinden
ved at anbringe 25 µl af den kvalitative standardopløsning (3.17) på
pladen og ved at sikre sig, at aflatoxinerne B1og B2adskilles fuld-
stændigt under kromatograferingen.
Opløsningsmidlerne afdampes i dæmpet belysning, og der bestråles
med UV-lys, idet pladen anbringes 10 cm fra lampen (4.9). Afla-
toxin B1-pletterne fluorescerer blåt.
5.5. Kvantitative bestemmelser
Bestemmelserne foretages enten visuelt eller ved hjælp af fluoro-
densitometri, som angivet nedenfor.
5.5.1. Visuel måling
Mængden af aflatoxin B1iekstrakten bestemmes ved at sammen-
ligne fluorescensintensiteten fra pletterne fra ekstrakten med
intensiteten fra pletterne fra standardopløsningen. Der interpoleres
om nødvendigt. Den fluorescens, som fremkommer ved at anbringe
ekstrakten oven i standardopløsningen, skal være kraftigere end
den, som udsendes fra de 10 µl ekstrakt, og der må kun kunne
opfattes en plet. Hvis fluorescens-intensiteten fra de 10 µl ekstrakt
er kraftigere end den, som de 40 µl standardopløsning giver,
fortyndes ekstrakten 10 eller 100 gange med chloroform (3.2) eller
med benzen/acetonitril-blandingen (3.6), inden den igen tyndtlags-
kromatograferes.
5.5.2. Målinger ved hjælp af fluorodensitometri
Fluorescensintensiteten fra aflatoxin B1-pletterne måles med et fluo-
rodensitometer (4.12), idet der benyttes en excitationsbølgelængde
på 365 nm og en emissionsbølgelængde på 443 nm. Mængden af
aflatoxin B1ide afsatte ekstrakter bestemmes ved at sammenli gne
ekstraktpletternes fluorescensintensitet med standardopløsningens.
5.6. Verificering af identiteten af aflatoxin B1
Identiteten af det aflatoxin B1, som findes i ekstrakten, verificeres
ved de nedenfor angivne fremgangsmåder.
5.6.1 Behandling med svovlsyre
Påsprøjt forstøvet svovlsyre (3.13) på kromatogrammet fra punkt
5.4. Under UV-bestråling skal fluorescensen fra aflatoxin B1-plet-
terne efter påsprøjtningen skifte fra blåt til gult.
5.6.2. Todimensionelt kromatografi der omfatter dannelse af
aflatoxin B1-hemiacetal (aflatoxin B2a)
NB: De nedenfor beskrevne arbejdsoperationer skal foretages i
overensstemmelse med skemaet ifi g. 3.
5.6.2.1. Anbringelse af opløsningerne
På en plade (4.8) trækkes to rette linier parallelt med to hoslig-
gende sider (i en afstand af 6 cm fra disse sider), med det formål
at afgrænse opløsningsmidlernes bevægelse. Ved hjælp af kapillar-1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 5
▼B
pipetter eller mikrosprøjter anbringes de nedenfor angivne opløs-
ninger på pladen.
—IpunktA: et rumfang renset ekstrakt fra punkt 5.3 indeholdende
ca. 2,5 ng aflatoxin B1;
—I punkterne B og C: 25 µl af standardopløsning (3.16).
5.6.2.2. Kromatografering
Kromatogrammet udvikles i retning I ved hjælp af væsken (3.18.1)
(1 cm tykt lag i umættet kar), i dæmpet belysning, indtil væske-
fronten når grænselinjen.
Pladen fjernes fra karret og tørres ifem mi nutter ved stuetempe-
ratur idæmpet belysni ng. Dernæst sprøjtes med forstøvet saltsyre
(3.12) på et 2,5 cm bredt stykke af pladen, som dækker punkterne
A og B (angivet ved det skraverede felt på fig. 3), indtil mørkfarv-
ning, idet resten af pladen beskyttes med en tynd glasplade. Efter
10 minutters indvirkning i mørke, tørres i en luftstrøm ved stuetem-
peratur.
Derefter udvikles kromatogrammet i retning II ved hjælp af væsken
(3.18.1) (1 cm tykt lag i umættet kar), i dæmpet belysning, indtil
væskefronten når grænselinjen. Pladen fjernes fra karret og tørres
ved stuetemperatur.
5.6.2.3. Fortolkning af kromatogrammet
Kromatogrammet undersøges ved UV lys (4.9), og de nedenfor
angivne iagttagelser kontrolleres:
a) forekomst af en fluorescerende blå plet af aflatoxin B1, som
hidrører fra den i C anbragte standardopløsning (bevægelse i
retning I);
b) forekomst af en fluorescerende blå plet af aflatoxin B1(som
ikke har reageret med saltsyren) og af en mere intens fluoresce-
rende blå plet af aflatoxin B1-hemiacetal, som hidrører fra den i
B anbragte standardopløsning (bevægelse i retning II);
c) forekomst af pletter, som ligner de under punkt b) beskrevne,
hidrørende fra det i A anbragte ekstrakt. Disse pletters belig-
genhed defineres ved B1-aflatoxinets tilbagelagte afstand fra
punkt A i retning I (samme afstand, som er tilbagelagt af den i
C anbragte standardopløsning) fulgt af den afstand, som er tilba-
gelagt iretni ng II af B1-aflatoxinet (som ikke har reageret med
saltsyren) og af aflatoxin B1-hemiacetalet (samme afstand som
den, den i B anbragte standardopløsning har tilbagelagt); fluore-
scensintensiteten fra de hemiacetalpletter, som hidrører fra
ekstrakten og fra den iB anbragte standardopløsni ng, bør
stemme overens.
6. Beregning af resultater
6.1. På grundlag af visuel måling
Aflatoxin B1-indholdet i prøvematerialet i µg/kg (ppb) beregnes
efter formlen:
S/C1Y/C1V
W/C1X
hvor:
Y og X er indholdet udtrykt i µl af henholdsvis standardopløs-
ningen af aflatoxin B1(3.16) og af ekstrakten, som giver en
tilsvarende fluorescensintensitet;
S = koncentrationen i µg af aflatoxin B1pr. ml standardopløs-
ning (3.16);
V = ekstraktens slutvolumen iµl, under hensyntagen ti l eventu-
elle fortyndinger;
W = prøvens vægt ig svarende ti l rumfanget af den ekstrakt, som
blev oprenset på søjle.
6.2. På grundlag af fluorodensitometrisk måling
Aflatoxin B1-indholdet i µg pr. kg af prøven (ppb) beregnes efter
formlen:1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 6
▼B
S/C1V
W/C1Y
hvor:
Y = volumen iµl af den på pladen anbragte ekstrakt (10 eller
20 µl);
S = mængden ing af aflatoxi n B1fra den anbragte ekstrakt
(under hensyntagen til volumen Y), udledt af bestemmel-
serne;
V = ekstraktens slutvolumen iµl, under hensyntagen ti l eventu-
elle fortyndinger;
W = prøvens vægt ig svarende ti l rumfanget af den ekstrakt, som
blev oprenset på søjle.
7. Tilberedning af og kontrol med standardopløsning (3.16)
7.1. Bestemmelse af aflatoxin B1koncentration
Der tilberedes en standardopløsning af aflatoxin B1ichloroform
(3.2) eller i benzen/acetonitrilblandingen (3.6) med en koncentra-
tion på 8 til 10 µg pr. ml. Absorptions spekret bestemmes mellem
330 og 370 nm ved hjælp af spektrofotometret (4.11).
Lysabsorptionen (A) måles ved 363 nm for chloroformopløsningens
vedkommende; ved 348 nm for benzen/acetonitril-blandingen
vedkommende.
Aflatoxin B1-koncentrationen i µg/ml opløsning beregnes ud fra
nedenstående formler:
312/C1A/C11000
20 600for chloroform-opløsningen
312/C1A/C11000
19 800for opløsningen i benzen/acetonitril-blandingen.
I dæmpet belysning tilberedes passende fortyndinger til en rbejds-
standardopløsning med en aflatoxin B1koncentration på ca 0,1 µg/
ml. Ved opbevaring i køleskab ved 4 ºC er denne opløsning holdbar
ito uger.
7.2. Kontrol af den kromatografiske renhed
På en plade (4.8) anbringes 5 µl af standardopløsningen med 8 —
10 µg aflatoxin B1pr. ml (jf. 7.1). Kromatogrammet udvikles som
beskrevet under punkt 5.4. Fluorescensen må ved UV-lys kun give
anledning til opfattelse af en enkelt plet, og der må ikke opfattes
nogen fluorescens i den oprindeligt afsatte prøves område.
8. Repeterbarhed
Forskellen mellem resultaterne af to sideløbende bestemmelser
udført af den samme person på den samme prøve bør ikke over-
stige:
— 25 % af det højeste resultat for et aflatoxinindhold på mellem
10 og 20 µg/kg,
— 5 µg iabsolut værdifor et i ndhold på mellem 20 og 50 µg/kg,— 10 % af det højeste resultat for et indhold på over 50 µg/kg.
9. Reproducerbarhed
Se bemærkninger, afsnit C, punkt 2,
B. BESTEMMELSE AF AFLATOKSIN B
1. HPLC-METODE
1. Formål og anvendelsesområde
I dette forslag beskrives en metode til bestemmelse af aflatoksin B1i foderstoffer (også med indhold af citruskvas). Den mindste
mængde, der kan bestemmes er 0,001 mg/kg (1 ppb).1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 7
▼M2
▼M2
2. Princip
Metoden er baseret på separation ved højtryksvæskekromatografi
(HPLC) med fluoressenspåvisning. Prøven ekstraheres med kloro-
form. Ekstraktet filtreres, og en aliquot del renses over en
Florisilkolonne og derefter over en C18-kolonne. Den endelige sepa-
ration og bestemmelse foretages på en omvendt-fase-C18HPLC-
søjle efterfulgt af post column derivatisering med jod i vand samt
fluoressensmåling.
Bemærk: Mykotoksiner er meget giftige stoffer. Arbejdet skal
udføres i stinkskab. Speciel forsigtighed skal udvises når toksinerne
er i tør form på grund af deres tendens til at spredes elektrostatisk
på arbejdspladsen.
3. Reagenser
3.1. Kloroform, stabiliseret med 0,5-1.0 % (w/w) ethanol. Se bemærk-
ning 10.2.
3.2. Methanol, HPLC-kvalitet til fremstilling af 3.6.3.3. Acetone.3.4. Acetonitril, HPLC-kvalitet.3.5. Elueringsmidler: tilbered et døgn før brug eller fjern luften i opløs-
ningen ved hjælp af ultralyd.
3.5.1. Blanding af acetone (3.3) og vand (98 + 2) (v + v).3.5.2. Blanding af vand og methanol (3.2) (80 + 20) (v + v).3.5.3. Blanding af vand og acetone (3.3) (85 + 15) (v + v).
3.6. Mobile fase til HPLC.
Blanding af vand, methanol (3.2) og acetonitril (3.4) (130 + 70 + 40)
(v + v + v).
NB: Det kan være nødvendigt at ændre blandingsforholdet for
væskerne til den mobile fase afhængig af den benyttede HPLC-
søjle.
3.7. Mættet jodopløsning i vand. Tilsæt 2 g jod til 400 ml vand. Bland i
mindst 90 minutter og filtrer gennem et membranfilter (4.15). Den
mættede opløsning beskyttes mod lys for at undgå fotokemisk
nedbrydning.
3.8. Syrevasket celite 545 eller tilsvarende materiale.3.9. Florisil-kolonne (Waters SEP-PAK) eller tilsvarende materiale.
3.10. C
18-kolonne (Waters SEP-PAK) eller tilsvarende materiale.
3.11. Inaktiv luft, f.eks. kvælstof, kloroform.3.12. Aflatoksin B
1-standardopløsning, koncentration 10 µg/ml.
Koncentrationen kontrolleres som følger: ovennævnte opløsnings
absorptionsspektrum bestemmes mellem 330 og 370 nm ved hjælp
af spektrofotometret (4.23). Absorbansen (A) måles ved 363 nm.
Koncentrationen af aflatoksin B1beregnes 1 µg pr. ml opløsning
efter formlen:
Koncentration èmg =ml ðÞ ¼312/C2A/C21000
22 300¼13;991/C2A
3.12.1. Aflatoksin B1stamopløsning i kloroform.
Overfør 2,5 ml af aflatoksin B1standardopløsningen (3.12) kvanti-
tativt til en 50 ml målekolbe og fyld op til mærket med kloroform.
Denne stamopløsning (0,5 µg/ml) opbevares køligt 40 ºC) i mørke,
tæt tillukket og omviklet med aluminiumsfolie.
3.13. Aflatoksin B1-kalibreringsopløsninger til HPLC.
NB: Der benyttes syrevaskede glasvarer til fremstillingen af disse
opløsninger (jf. 4 — apparatur).
3.13.1. Kalibreringsopløsning 4 ng/ml.
Målekolben i alufolien med stamopløsningen (3.12.1) henstår til
opvarmning til stuetemperatur (nogle få timer). Overfør 400 µl1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 8
▼M2
stamopløsning til en 50 ml målekolbe og inddamp til tørhed i en
strøm af inaktiv luft (3.11). Opløs resten i ca. 20 ml vand/acetone-
blanding (3.5.3); fyld op til mærket med vand/acetoneblanding
(3.5.3) og bland godt.
3.13.2. Kalibreringsopløsning 3 ng/ml.
Fortynd 7,5 ml af kalibreringsopløsningen 4 ng/ml (3.13.1) til 10 ml
med vand/acetoneblanding (3.5.3) og bland godt.
3.13.3. Kalibreringsopløsning 2 ng/ml.
Fortynd 25 ml af kalibreringsopløsningen 4 ng/ml (3.13.1) til 50 ml
med vand/acetoneblanding (3.5.3) og bland godt. Denne opløsning
benyttes også til gentagen injektion ved HPLC-bestemmelsen og er
idet følgende benævnt referenceopløsni nger.
3.13.4. Kalibreringsopløsning 1 ng/ml.
Fortynd 2,5 ml af kalibreringsopløsningen 4 ng/ml (3.12.1) til 10 ml
med vand/acetoneblanding (3.4.3) og blandt godt.
3.14. Ampul med en blanding af aflatoksin B1,B2,G1iG2koncentrati-
oner på henholdsvis ca. 1, 0,5, 1 en 0,5 µg/ml i 1 ml kloroform.
3.14.1. Testopløsning til HPLC.
Overfør ampullens indhold (3.14) til et reagensglas med slib og
glasprop eller et glas med skruelåg. Overfør 40 µl af denne opløs-
ning til et reagensglas med slib og glasprop (syrevasket) (4.22).
Inddamp kloroformen med inaktiv luft og opløs i 10 ml vand/aceto-
neblanding (3.5.3).
3.15. Reagenser til verificering (6).
3.15.1. Mættet NaCl-opløsning i vand.
3.15.2. Natriumsulfat, vandfri, granuleret.
4. Apparatur
Advarsel: Anvendelse af glasvarer, der ikke er vasket med syre, til
vandige aflatoksinopløsninger kan forårsage tab af aflatoksin. Der
må udvises særlig omhu med nye glasvarer og engangsglasvarer
såsom glas til autosampler og Pasteur-pipetter. Laboratorieglas-
varer, der kommer i kontakt med vandige opløsninger af
aflatoksin, bør derfor henstå i fortyndet syre (f.eks. svovlsyre, c
= 2 mol/l) i flere timer og derefter grundigt skylles med destilleret
vand, så alle spor af syre fjernes (f. eks. tre gange; det kontrolleres
med pH-papir). Denne behandling er i praksis nødvendig for rund-
bundede kolber (4.4), målekolber, målecylindre, flasker eller
reagensglas, der bruges til kalibreringsopløsninger og slutekstrakter
(især glas til autosampler) og Pasteur-pipetter, hvis de bruges til
overførsel af kalibreringsopløsninger eller ekstrakter.
4.1. Kværn.
4.2. Sigte med maskevidde 1,0 mm (ISO R 565).
4.3. Mekanisk rysteapparat.4.4. Vakuumrotationsfordamper med en 150 ml rundbundet kolbe (150-
250 ml).
4.5. Højtryksvæskekromatograf, injektor med loop til injektion af 250 µl.
Se fabrikantes instruktion for delvis eller fuldstændig loopfyldning.
4.6. HPLC-analysesøjle: 3 µm eller 5 µm C
18-søjlemateriale.
4.7. Pulseringsfri pumpe til eftersøjle-jodreagens, f.eks. HPLC-pumpe
eller en pumpe, der er specielt konstrueret til dette formål.
4.8. Dødvolumenfrit T-stykke (Valco), af rustfrit stål (1/16 ″× 0,75 mm).
4.9. Spiralreaktionskolonne af teflon eller rustfrit stål. Dimensioner på
3 000 × 0,5 mm til 5 000 × 0,5 mm er erfaringsvis velegnede i
forbindelse med 5 µm eller 3 µm HPLC-søjler.
4.10. Termostatstyret vandbad indstillet på 60 ºC. Temperaturen skal
kunne reguleres med under 0,1 ºC nøjagtighed.
4.11. Fluoressensdetektor med ca. 365 nm excitations bølgelængde og ca.
435 nm emissionsbølgelængde (for filterinstrument: emissionsbøl-
gelængde: > 400 nm). Påvisning af mindst 0,05 ng aflatoksin B1skal være mulig. Undertiden kan et vist modtryk være ønskeligt1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 9
▼M2
(f.eks. restriktor eller spole af teflon eller rustfri stålkolonne
forbundet med detektorens udgang) for at forhindre luftbobler i
gennemløbskuvetten.
4.12. Skriver.
4.13. Integrator (eventuelt).4.14. Foldefilter. Macherey-Nagel 617 ¼, diameter 24 cm eller tilsva-
rende filter.
4.15. Membranfilter med porestørrelse på 0,45 µm, Millipore HAWP
04700 eller lignende.
4.16. 500 ml konisk kolbe med slib og glasprop.
4.17. Glassøjle (indvendig diameter ca. 1,0 cm, længde ca. 30 cm) med
Luer-endestykke.
4.18. Kloroformresistent Luer-hane af nylon (f.eks. Bio-Rad 7328017,
Analytichem A1 6078 eller J.T. Baker 4514 eller lignende).
4.19. Kemisk resistent sprøjte, 10 ml Luer-forbindelse.4.20. Sprøjte til påsætning af 250 µl (se 4.5).
4.21. 100 µl mikrosprøjte (det kontrolleres ved vejning, af nøjagtigheden
er inden for 2 %).
4.22. 10 ml målereagensglas med slib og glasprop.4.23. Spektrofotometer til måling i spektrets UV-område.
4.24. Udstyr til verificering (6).
4.24.1. Syrevasket 100 ml skilletragt med teflonhane.4.24.2. Varmeblok 40-50 ºC.
5. Fremgangsmåde
5.1. Fremstilling af prøven
Prøven formales, så den passerer fuldstændigt gennem sigten (4.2).
5.2. Analyseprøven
50,0 g af den fremstillede prøve afvejes i kolben (4.16).
5.3. Ekstraktion
Tilsæt 25 g Celite (3.8), 250 ml kloroform (3.1) og 25 ml vand til
analyseprøven (5.2). Tilluk og ryst i 30 minutter på et mekanisk
rysteapparat (4.3). Filtrer gennem et foldefilter (4.14) og opsaml
50 ml af filtratet. Med hensyn til prøver, der kræver fortynding,
udtages en aliquot del af filtratet, der fortyndes til 50 ml med
kloroform, så koncentrationen af aflatoksin B
1ikke er større end
4 ng/ml.
5.4. Oprensning
Processen bør foretages uden nævneværdige afbrydelser.Bemærk:
— det laboratorium, hvor analysen foretages, skal være beskyttet
mod dagslys; det kan ske ved:
1) UV-absorberende folie på vinduerne kombineret med
dæmpet belysning (ikke direkte sollys!)
2) gardiner eller persienner i forbindelse med kunstigt belys-
ning (lysstofrør kan benyttes)
— aflatoksinholdige opløsninger skal i videst muligt omfang
beskyttes mod lys (opbevaring i mørke og brug af alufolie).
5.4.1. Florisil SEP-PAK oprensning
5.4.1.1. Forberedelse af kombinationen søjle og kolonne
Der anbringes en hane (4.18) på den korte ende af Florisil-kolonnen
(3.9) (se fig. 1). Vask kolonnen og fjern luften således: 8 ml ud af
10 ml kloroform presses via hanen gennem kolonnen med en
sprøjte (4.19). Den lange ende af kolonnen forbindes med en glas-
søjle (4.17), og de resterende 2 ml kloroform presses gennem
kolonnen op isøjlen. Hanen lukkes og sprøjten fjernes.1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 10
▼M2
5.4.1.2. Oprensning
Det i 5.3 opsamlede filtrat påsættes søjle/kolonnekombinationen
ved hjælp af tyngdekraften. Der skylles med 5 ml kloroform (3.1)
og derefter med 20 ml methanol (3.2). Eluaterne kasseres. Det må
under dette arbejde sikres, at søjle/kolonnekombinationen ikke
løber tør. Eluer aflatoksin B1med 40 ml af acetone/vandblandingen
(3.5.1) og opsaml hele eluatet iden rundbundede (150 ml) kolbe ti l
rotationsfordamperen (4.4). Eluatet koncentreres på rotationsfor-
damperen ved 40-50 ºC, indtil der ikke længere destilleres acetone
(NB: ca. 0,5 ml af væsken er på dette punkt tilbage i kolben.
Forsøg har vist, at videre fordampning ikke er skadelig, og at når
der er 0,5 ml væske tilbage, er der ingen signifikant acetone-
mængde tilbage. Acetonerester kan medføre tab af aflatoksin B1på C18-kolonne.) Der tilsættes 1 ml methanol (3.2), og kolben
skylles, så aflatoksin B1bliver opløst på siderne, hvorefter der
tilsættes 4 ml H2O. Kolonnen aftages og kasseres. Glassøjlen
skylles med vand og gemmes til C18-oprensningsprocessen.
5.4.2. C18-SEP-PAK oprensning
5.4.2.1. Forberedelse af kombinationen søjle og SEP-PAK kolonne
Der anbringes en stophane (4.18) på den korte end af C18-kolonnen
(3.10) (se fig. 1). Skyl kolonnen og fjern luft således: 10 ml
methanol (3.2) presses hurtigt via hanen gennem kolonnen med en
sprøjte (4.19) (luftbobler ipatronen er synli ge som lyse pletter på
en ellers grålig baggrund). Fra sprøjten med 10 ml vand presses
8 ml heraf via hanen op gennem kolonnen (luftindtrængning i
kolonnen skal undgås ved overgangen fra methanol til vand). Den
lange ende af kolonnen forbindes med en glassøjle, og de rester-
ende 2 ml vand presses op isøjlen gennem kolonnen. Hanen
lukkes og sprøjten fjernes.
5.4.2.2. Oprensning
Det i 5.4.1.2 opsamlede ekstrakt overføres kvantitativt til søjlen
(4.17) idet kolben skylles to gange med 5 ml vand/methanolblan-
ding (3.5.2) og væsken elueres ved hjælp af tyngdekraften. Det må
under dette arbejde sikres, at søjle/kolonnekombinationen ikke
løber tør. (Hvis der opstår luftbobler i forsnævringen ved kolonnen,
afbrydes elueringen, og der bankes let på toppen af glassøjlen for at
fjerne luftboblerne, hvorefter oprensningen fortsættes.) Der elueres
med 25 ml vand/methanolblanding. Eluaterne kasseres. Aflatoksin
B1elueres med 50 ml vand/acetoneblanding (3.5.3), og hele eluatet
opsamles ien 50 ml målekolbe. Der fyldes op med vand ti l 50 ml
og blandes. Den herved opnåede opløsning benyttes til kromato-
grafi(5.5).
Bemærk: Det er normalt ikke nødvendigt at filtrere det endelige
ekstrakt inden HPLC. Hvis det findes nøvendigt, må der
ikke benyttes cellulosefiltre, da de kan medføre tab af
aflatoksin B1. Teflonfiltre kan bruges.
5.5. Højtryksvæskekromatografi (HPLC)
(Med hensyn til opstilling af udstyret henvises til fig. 2.) Der skal
beregnes tilstrækkelig tid til, at instrumenterne bliver opvarmet og
stabiliseret.
Bem. 1:
Flow-hastighederne for HPLC-væskerne og post column reagenser
er kun vejledende. Det kan være nødvendigt at justere dem alt efter
HPLC-søjlens type og størrelse.
Bem. 2:
Aflatoksins topareal er temperaturafhængig, og der må derfor korri-
geres for afvigelser (se fig. 3). Ved injektion af en bestemt mængde
aflatoksin B1-referenceopløsning (3.12.3) med regelmæssige inter-
valler (f.eks. ved hver tredje injektion) kan topværdierne for
aflatoksin B1mellem disse referenceopløsninger korrigeres ved
hjælp af middelværdien, forudsat at forskellen mellem reaktionernemellem to på hinanden følgende injektioner er meget lille (< 10 %).
Injektionerne skal derfor foretages kontinuerligt. Hvis en afbrydelse
er nødvendig, er det den sidste injektion før stoppet og den første
injektion efter stoppet, der er referenceopløsning (3.13.3). Da kali-
breringskurven er lineær og passerer gennem nulpunktet,
bestemmes aflatoksin B
1-mængden iprøveekstrakterne di rekte ved
reference til de nærmestliggende standardopløsninger.1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 11
▼M2
5.5.1. Indstilling af HPLC-pumpe
HPLC-pumpen (4.5) indstilles, så den giver et flow på 0,5 eller
0,3 ml/min. til henholdsvis en 5 µm eller en 3 µm HPLC-søjle
(4.6); idet den mobile fase (3.6) benyttes.
5.5.2. Indstilling af post column pumpen
Pumpen (4.7) indstilles til at give et flow på 0,2-0,4 ml/min. af den
jodmættede vandopløsning (3.7). Som en grov retningslinje kan der
tilrådes flow på ca. 0,4 eller 0,2 ml/min. i kombinationer med flow
på henholdsvis 0,5 og 0,3 ml/min. af den mobile fase (3.6).
5.5.3. Fluoressensdetektor
Fluoressensdetektoren (4.11) indstilles til excitationsbølgelængden
365 nm og emissionsbølgelængden 435 nm (filterinstrument:
> 400 nm). Attenueringen indstilles således, at 1 ng aflatoksin B1giver ca. 80 % af fuldt udslag på skriveren.
5.5.4. Prøvepåsætter
Der påsættes mængder på 250 µl af alle opløsninger. Følg brugsan-
visningen til injektoren.
5.5.5. Kontrol af den kromatografiske separation
Der påsættes en kromatografisk testopløsning (3.14.1). Dalene skal
være mindre end 5 % af summen af tophøjderne i de nærmestlig-
gende topområder.
5.5.6. Kontrol af apparaturets stabilitet
Inden hver analyserække påsættes referenceopløsningen (3.13.3)
gentagne gange, indtil der er opnået stabile toparealer. ( NB: area-
lerne af aflatoksin B1toppene i på hinanden følgende injektioner
bør ikke afvige indbyrdes med mere end 6 %.) Derefter fortsættes
straks med kontrol af lineariteten.
5.5.7. Kontrol af lineariteten
Der påsættes aflatoksin B1-kalibreringsopløsninger (3.13.1 til
3.13.4). For hver tredje injektion anvendes referenceopløsningen
(3.13.3) til korrektion af ændringer i reaktion ( NB: Arealerne af
toppene af referenceopløsning må højst afvige med 10 % i løbet
af 90 minutter). Der korrigeres for afvigelser efter formlen i punkt
7. Kalibreringskurven bør være lineær og passere gennem
nulpunktet med en afvigelse på højst to gange standardafvigelse
på Y-værdien. De fundne værdier skal afvige med under 3 % fra
de nominelle værdier. Hvis disse krav er opfyldt, fortsættes der
umiddelbart. I modsat fald identificeres og korrigeres fejlkilderne
først.
5.5.8. Injektion af prøveekstrakter
De oprensede prøveekstrakter (5.4.2.2) påsættes. Hver gang der
påsættes to prøveekstrakter, påsættes der referenceopløsning
(3.12.3), dvs.: referenceopløsning, ekstrakt, ekstrakt, referenceo-
pløsning, ekstrakt, ekstrakt, referenceopløsning osv.
6. Verificering og identitet
6.1. Behandling af ekstraktet (5.4.2.2)
Der tilsættes 5 ml NaCl-opløsning (3.15.1) til slutekstraktet fra
5.4.2.2. Der ekstraheres tre gange i1 mi nut med 2 ml kloroform
(3.1) med brug af skilletragten (4.24.1). Det opsamlede kloroform-
ekstrakt hældes igennem ca. 1 g natriumsulfat (3.15.2) over i et
10 ml reagensglas. Der kan bruges en lille tragt (diameter 4 cm)
med lidt bomuld i forsnævringen, der dækkes med ca. 1 g natrium-
sulfat (3.14.2).
Natriumsulfatlaget vaskes med nogle få ml kloroform og opsamles
i reagensglasset. Kloroformekstraktet inddampes til tørhed i reagen-sglasset ved brug af varmeblokken (4.24.2) og opløses derefter igen
i1 ml kloroform.
6.2. Fremstilling af derivater og tyndtlagskromatografi
Jf. Rådets direktiv 76/372/EØF, bilaget, metode A, punkt 5.6.2.1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 12
▼M2
7. Beregning af resultater
Prøvens indhold af aflatoksin B1µg/kg beregnes efter nedenstående
formel:
Indhold af B 1ièmg =kg¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc
hvor:
m = mængden af aflatoksin B1ing som B1-top iprøven
beregnet som følger:
m¼P prøveðÞ
Ps t 1ðÞ þ Ps t 2ðÞ/C22rs tðÞ
P(prøve) = toparealet for aflatoksin B1iprøven
P(st1) = toparealet for aflatoksin B1iden forudgående påsæt-
ning af referenceopløsning (3.13.3)
P(st2) = toparealet for aflatoksin B1iden efterfølgende påsæt-
ning af referenceopløsning (3.13.3)
r(st) = den påsatte mængde referenceopløsning B1(3.13.3) i
ng
Vm= mængden af den påsatte prøveekstrakt iml; der tages
høje for eventuel fortynding under 5.3
Vext= den endelige mængde prøveekstrakt i ml
M = prøvens vægt ig
Vf= mængden af filtrat i ml overført til Florisil-kolonnen
(5.4.1.2)
Vc= mængden af kloroform iml, der er anvendt ti l ekstra-
hering af prøven.
Hvis proceduren i denne forskrift følges, kan formlen forkortes til:Indhold af aflatoksin B
1iµg/kg = 20 × m
7.1. Resultaterne kan også beregnes ved måling af tophøjderne.
8. Reperterbarhed
Jf. punkt 10.1 (bemærkninger).
9. Reproducerbarhed
Jf. punkt 10.1.
10. Bemærkninger
10.1. Præcision
En sammenlignende undersøgelse (1) af foderblandinger gennemført
på internationalt plan gav de i tabel 1 anførte resultater for repeter-
barhed og reproducerbarhed. Begrebet reperterbarhed (r), som det
er anvendt her, defineres som det største forhold mellem to aflæs-
ninger af samme prøve udført på samme laboratorium under samme
betingelser, som ikke er signifikant på 95 % sandsynlighedsniveau.
Begrebet reproducerbarhed (R) defineres på tilsvarende måde, når
der er to forskellige laboratorier der sammenlignes, ifølge ISO
3534 - 1977, 2.35 (2) og Kommissionens beslutning 89/610/
EØF (3). I tabel 1 er r og R også angivet som variationskoeffi-
cienter.1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 13
(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977
(3) EFT nr. L L 351 af 2. 12. 1989, s. 39.
▼M2
Tabel 1
Reperterbarhed (r) og reproducerbarhed (R) udtrykt som
forholdstal og de tilsvarende variationskoefficienter
(15 laboratorier).
Niveau r R CVr(*) CVR
(µg/kg) (%) (%)
8 & 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = variationskoefficient.
10.2. Stabilisering af kloroform
Absorptionsevnen af florisilkolonnen kan ændres, hvis der bruges
anden stabilisator end ethanol til kloroform. Dette skal kontrolleres
i henhold til 10.3, hvis den foreskrevne kloroform ikke kan skaffes.
10.3. Nøjagtighed
Det efterprøves, om metoden udføres rigtigt, ved gentagne målinger
på certificeret referencemateriale. Hvis sådant materiale ikke fore-
findes, bør metodens effektivitet afprøves ved genfindingsforsøg
på blindprøver. Middelværdien må ikke afvige fra den sande værdi
med fra under 20 % til over 10 %.1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 14
▼M2
Figur 1: Kombination af søjle og kolonne
Figur 2: Flowdiagram for HPLC-systemet til post column derivati-
sering med jod1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 15
▼M2
Figur 3: Kompensation for ændring for afvigelse i aflatoksin B1-
udslag ved påsætning af referenceopløsning med regelmæssige
intervaller (3.13.3).
C. BEMÆRKNINGER VEDRØRENDE FREMGANGSMÅDE A OG B
1.Affedtning
Prøver, der indeholder mere end 5 % fedt, skal affedtes med let petroleum
(kogepunkt 40 til 60º C) efter den under 5.1 angivne tilberedning.
I så fald skal analyseresultaterne udtrykkes som vægten af den ikke-affedtede
prøve.
2.Reproducerbarhed af resultaterne efter metode A
Resultaternes reproducerbarhed, dvs. variationer mellem resultater opnået af
to eller flere laboratorier på den samme prøve, skønnes at være:
± 50 % af gennemsnittet for gennemsnitværdier af aflatoxin B1mellem 10 og
20 µg/kg
± 10 µg/kg af gennemsnittet for gennemsnitsværdier større end 20 og op til
50 µg/kg
± 20 % af gennemsnittet for gennemsnitsværdier og 50 µg/kg.1976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 16
▼M3
▼B
BILAG
Fig. 1
Fig. 21976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 17
▼B
Fig. 31976L0372 — DA — 03.05.1994 — 003.001 — 18