1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS FJERDE DIREKTIV
af 5. december 1972
om fastsættelse af fælles analysemetoder til officiel kontrol af dyrefoder
(73/46/EØF)
(EFT L 83 af 30.3.1973, s. 21)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EØF af 30. juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Kommissionens direktiv 92/89/EØF af 3. november 1992 L 344 35 26.11.1992
▼B
KOMMISSIONENS FJERDE DIREKTIV
af 5. december 1972
om fastsættelse af fælles analysemetoder til officiel kontrol af dyre-
foder
(73/46/EØF)
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR
i henhold til traktaten om oprettelse af Det europæiske økonomiske
Fællesskab;
i henhold til Rådetsdirektiv af den 20. juli 1970 vedrørende
indførelsen af fælles metoder til udtagelse af prøver og til analyse tilofficiel kontrol af dyrefoder(
1), ændret ved direktivet nr. 72/275/EEC
af den 20. juli 1972(2), og i særdeleshed dens paragraf 2;
idet den anser, at ovennævnte direktiv forudsætter, at den officielle
kontrol af dyrefoder—for at sikre sig, at de fastsatte betingelser i
henhold til de juridiske, reglementære eller administrative forskriftervedrørende dyrefoderets kvalitet og sammensætning den officiellekontrol af dyrefoder — for at sikre sig, at de fastsatte betingelser ihenhold til de juridiske, bliver overholdt — udføres ved hjælp af fælles
metoder til udtagelse af prøver og til analyse;
idet den anser, at Kommissionens direktiver nr. 71/250/EEC, nr. 71/
393/EEC og nr. 72/199/EEC af den 15. juni 1971(
3), den 18. november
1971(4) og den 27. april 1972(5), allerede har fastsat en hel del fælles
analysemetoder; at man, med henblik på den hastighed, arbejdet sidener skredet frem med, bør vedtage en fjerde række metoder;
idet den anser, at de forholdsregler, der er fastlagt i det foreliggende
direktiv, er i overensstemmelse med en udtalelse fra Forvaltningsko-miteen for dyrefoder,
UDSTEDT FØLGENDE DIREKTIV:
Artikel 1
Medlemslandene foreskriver, at analyserne til officiel kontrol af dyre-
foder, hvad angår de animalske og vegetabilske fedtstoffer og oliers
fugtighedsindhold, såvel som foderets indhold af magnesium og råcellulose, udføres efter de metoder, der beskrives i bilag I til det fore-liggende direktiv.
Artikel 2
Medlemslandene foreskriver, at analyserne til officiel kontrol af dyre-
foder, hvad angår detsindhold af retinol (A-vitamin), thiamin
(aneurin, B1-vitamin), ascorbinsyre og dehydroascorbinsyre (C-
vitamin), udføresefter de metoder, der bes krivesi bilag II til det fore-liggende direktiv.
Artikel 3
Medlemslandene gennemfører senest den 1. januar 1974 de fornødne
juridiske, reglementære eller administrative bestemmelser for at over-1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1) EFT nr. L 170 af 3. 8. 1970, s. 2.
(2) EFT nr. L 171 af 29. 7. 1972, s. 39.
(3) EFT nr. L 155 af 12. 7. 1971, s. 13.
(4) EFT nr. L 279 af 20. 12. 1971, s. 7.
(5) EFT nr. L 123 af 29. 5. 1972, s. 6.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
holde det foreliggende direktivs bestemmelser. De underretter
omgående Kommissionen derom.
Artikel 4
Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 3
▼B
BILAG I
1.FUGTIGHEDSINDHOLDET I DE ANIMALSKE OG VEGETABILSKE
FEDTSTOFFER OG OLIER
1.Formål og anvendelsesområde
Denne metode gør det muligt at bestemme de animalske og vegetabilske
fedtstoffer og oliers fugtighedsindhold (vand og andre flygtige stoffer).
2.Princip
Prøven udtørres ved 103 ºC indtil omfanget ikke mere formindskes.
Omfangstabet bestemmes ved afvejning.
3.Redskaber
3.1. Fladbundet beholder af korrosionsfast materiale, diameter: 8 til 9 cm,
højde: ca. 3 cm.
3.2. Kviksølvtermometer med forstærket kugle og udvidelsesrum i den
øverste ende, inddelt i grader fra ca. 80 ºC til mindst 110 ºC, længde:
ca. 10 cm.
3.3. Elektrisk kogeplade.
3.4. Tørreapparat, der indeholder et effektivt udtørrende produkt.
3.5. Analysevægt.
4.Fremgangsmåde
Afvej, med 1 mg'snøjagtighed, ca. 20 g af den homogenis erede prøve i den
tørre og afvejede beholder (3.1), hvori termometeret (3.2) er anbragt. Opvarm
den på kogepladen (3.3) ved stadig omrøring med termometeret, så den når
en temperatur på 90 ºC i løbet af ca. 7 minutter.
Dæmp varmen efter den hyppighed, med hvilken boblerne stiger op fra
beholderensbund. Temperaturen må ikke overs tige 105 ºC. Bliv ved med at
røre og skrabe bunden indtil der ikke er flere bobler.
For at være sikker på, at fugtigheden er fuldkommen forsvundet, gentag
opvarmningen til 103 ºC (oere) ± 2 º flere gange, med afkøling til 93 ºC
mellem de på hinanden følgende opvarminger. Lad derefter beholderen køle
af i tørreapparatet (3.4) indtil stuetemperatur og afvej. Gentag denne opera-
tion indtil vægttabet mellem to afvejninger ikke overstiger 2 mg.
NBHvisprøvensvolumen forhøjesefter gentagne opvarmninger, s kyldesdet
iltning af fedtstoffet. I så tilfælde udregnes resultatet af den afvejning,
der er blevet foretaget umiddelbart inden denne forhøjelse af volumen.
5.Udregning af resultaterne
Prøvensfugtigheds indhold i procent opnåsved formlen:
M1/C0M2 ðÞ /C1100
Mo
i hvilken:
Mo= prøvens masse, i gram,
M1= beholder og indholds masse, i gram, inden opvarmningen,
M2= beholder og indholds masse, i gram, efter opvarmingen.
Resultater på under 0,05 % opføres som »mindre end 0,05 %«.
Gentagelse
Forskellen mellem resultaterne af to parallele forsøg med den samme prøve
må ikke overstige 0,05 % i absolut værdi.
2.MAGNESIUMINDHOLD
— ved spektrophotometri af atomabsorberingen —
1.Formål og anvendelsesområde
Denne metode gør det muligt at bestemme magnesiumindholdet i dyrefoder.
Den er i særdeleshed god til at bestemme et magnesiumindhold på under 5 %.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 4
▼B
2.Princip
Prøven brændes til aske og opløses i fortyndet saltsyre. Hvis den ikke inde-
holder nogen organiske stoffer, opløses den direkte i den fortyndede saltsyre.
Opløsningen fortyndes, og magnesiumindholdet bestemmes ved spektropho-
tometri af atomabsorberingen ved 285,2 nm, ved sammenligning med
standardopløsninger.
3.Reagenser
3.1. Saltsyre p.a., opløsning: 1,16.
3.2. Saltsyre p.a., opløsning: 1,19.
3.3. Magnesium, i bånd- eller trådform, eller magnesiumsulfat MgSO4·
7H2O p.a., vakuumtørret ved stuetemperatur.
3.4. Opløsning af strontiumsalt (klorid eller nitrat) med 2,5 % (p/v) stron-
tium (= 76,08 g SrCl2·6H2O p.a./1 eller 60,38 g Sr (NO3)2p.a./1).
3.5. Standardmagnesiumopløsning: afvej, med 1 mg's nøjagtighed, 1 g
magnesium (3.3), der først omhyggeligt er befriet for sin oxydhinde,
eller en tilsvarende mængde magnesiumsulfat (3.3), anbring det i en
kolbe med et rumindhold på 1 000 ml, hæld 80 ml saltsyre (3.1) i, lad
det opløse sig og hæld vand i indtil 1 000 ml. 1 ml af denne opløsning
indeholder 1 000 mg magnesium.
4.Redskaber
4.1. Forbrændingsdigel af platin, kvarts eller porcelæn.
4.2. Elektrisk muffelovn med termostat.
4.3. Atomabsorberingsspektrophotometer.
5.Fremgangsmåde
5.1.Opløsning
5.1.1.Foder, der består udelukkende af mineralske stoffer
Afvej, med 1 mg'snøjagtighed, 5 g af prøven og anbring dem i
en kolbe med et rumindhold på 500 ml sammen med 250 til
300 ml vand. Hæld 40 ml saltsyre (3.1) i, bring væsken til koge-
punktet og lad den småkoge i 30 min. Lad den afkøles, hæld vand
på til kolben er fuld, bland omhyggeligt og filtrér gennem et tørt,
foldet filter ned i en tør beholder. Smid de første 30 ml af filtratetvæk.
I tilfælde af, at der forefindeskis eljord, behandles5 g af prøven
med en tilstrækkelig mængde (15 til 30 ml) saltsyre (3.2) og
udtørres over vandbad. Fortsæt som angivet i 5.1.2, fra og med
den tredje fase.
5.1.2.Foder, der for størstedelen består af mineralske stoffer
Afvej, med 1 mg'snøjagtighed, 5 g af prøven i en forbrændin-
gsdigel og brænd dem ved 550 º i en muffelovn, indtil de bliver
til aske uden den mindste kulpartikel. For at fjerne kiseljorden,
blandes asken med en tilstrækkelig mængde (15 til 30 ml) salt-
syre (3.2) og udtørres over vandbad. Udtør den derefter i en
time i tørreovn ved 105 º. Opbland resten med 10 ml saltsyre
(3.1) og hæld den ved hjælp af varmt vand over i en kolbe med
et rumindhold på 500 ml. Bringestil kogepunktet, lad afkøle og
fyld kolben op med vand. Bland omhyggeligt og filtrér gennem et
tørt, foldet filter ned i en tør beholder. Smid de første 30 ml af
filtratet væk.
5.1.3.Foder, der for størstedelen består af organiske stoffer
Afvej, med 1 mg'snøjagtighed, 5 g af prøven i en forbrændin-
gsdigel og brænd dem ved 550º i en muffelovn, indtil de bliver
til aske uden den mindste kulpartikel. Opbland asken med 5 mlsaltsyre (3.2), udtør over vandbad og udtør den derefter i en
time i tørreovn ved 105 º for at gøre kiseljorden uopløselig. Bland
resten med 5 ml saltsyre (3.1) og hæld den ved hjælp af varmt
vand over i en kolbe med et rumfang på 250 ml, bring til koge-
punktet, lad afkølesog fyld kolben op med vand. Bland
omhyggeligt og filtrér gennem et tørt foldet filter ned i en tør
beholder. Smid de første 30 ml af filtratet væk.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 5
▼B
5.2.Opmåling af atomsabsorberingen
Tilbered, ved fortynding med vand af standardopløsningen (3.5), mindst
5 referenceopløsninger med stigende koncentration, valgt med henblik
på spektrophotometerets optimumsmålezone. Bland 10 ml strontiumsal-
topløsning (3.4) i hver af opløsningerne og fyld op med vand indtil
100 ml.
Fortynd med vand en aliquot del af det i 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3 opnåede
filtrat, så man opnår en magnesiumkoncentration, der ligger inden for
referenceopløsningers koncentrationsgrænser. Denne opløsnings saltsyre-koncentration må ikke overstige 0,4 N. Ibland 10 ml
strontiumsaltopløsning (3.4) og fyld derefter vand på indtil 100 ml.
Opmål absorberingen hos den opløsning, hvis magnesiumindhold skal
bestemmes, og hos referenceopløsningerne ved en bølgelængde på
285,2 nm.
6.Udregning af resultaterne
Udregn prøvens magnesiumindhold ved sammenligning med referenceoplø-
sningerne. Resultatet udtrykkes i procentdele af prøven.
GentagelseForskellen mellem resultaterne af to parallele forsøg med den samme prøve
må ikke overstige 5 % i relativ værdi.
3.BESTEMMELSE AF TRÆSTOFINDHOLD
1.Formål og anvendelsesområde
Denne metode gør det muligt at bestemme fedtfri organiske stoffer i foder-
stoffer, som er uopløselige i fortyndede syre- og baseopløsninger, og som
normalt betegnes som træstof.
2.Princip
Prøven, der om nødvendigt er affedtet, behandlesi kogende opløs ninger af
først svovlsyre og derefter kaliumhydroxid i bestemte koncentrationer. Bund-
faldet adskilles ved filtrering i en glasfilterdigel, hvorefter det vaskes, tørres,
vejes og foraskes ved 475 - 500 ºC. Vægttabet ved foraskningen svarer til
træstofindholdet i prøven.
3.Reagenser
3.1. Svovlsyre, c = 0,13 mol/l.3.2. Skumdæmpende middel (f.eks. n-octanol).3.3. Filtreringshjælpemiddel (Celite 545 el. lign.) opvarmet til 500 ºC i fire
timer.
3.4. Acetone.3.5. Petroleumsether (40 - 60 ºC).3.6. Saltsyre, c = 0,5 mol/l.3.7. Kaliumhydroxidopløsning, c = 0,23 mol/l.
4.Apparatur
4.1. Varmeenhed til kogning med svovlsyre eller kaliumhydroxid med holder
til filterdiglen (4.2.) og afgangsrør med hane til afløb samt vakuum-
pumpe, eventuelt med trykluft. Enheden forvarmesfør daglig brug med
kogende vand i fem minutter.
4.2. Glasfilterdigel med filterplade af sintret glas, porestørrelse 40 - 90 µm.
Inden den første gang tages i anvendelse, opvarmes den i nogle få
minutter til 500 ºC og afkøles(8.6.).
4.3. Kogecylinder på ca. 270 ml med tilbagesvaler.
4.4. Tørreovn med termostat.4.5. Muffelovn med termostat.4.6. Ekstraktionsapparat med holder til filterdiglen (4.2.) og afgangsrør med
hane til væskeafløb samt vakuumpumpe.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 6
▼M2
▼M2
4.7. Forbindelsesringe til samling af varmeenhed (4.1.), filterdigel (4.2.) og
kogecylinder (4.3.) og til samling af ekstraktionsapparat (4.6.) og filter-
digel.
5.Fremgangsmåde
I glasfilterdiglen afvejes med 1 mg's nøjagtighed ca. 1 g af den forberedte
prøve (se 8.1, 8.2 og 8.3) og tilsat 1 g filtreringshjælpemiddel (3.3.).
Varmeenheden (4.1.) og filterdiglen (4.2.) samles. Kogecylinderen (4.3.)
forbindes til diglen. 150 ml svovlsyre (3.1.), der er opvarmet til kogepunktet,
overførestil kogecylinderen, og om nødvendigt tils ættesder et par dråber
skumdæmpende middel (3.2.). Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af
5 ± 2 min. og kogeslivligt i præcis30 min.
Afgangshanen (4.1.) åbnes, og svovlsyren filtreres under vakuum gennem
filterdiglen. Bundfaldet på filterdiglen vaskes under vakuum tre gange med
30 ml kogende vand. Filtret med bundfald suges tørt efter hver vask.
Afgangshanen lukkes, og 150 ml kogende kaliumhydroxid 0,23 mol/l (3.7.)
overførestil kogecylinderen. Et par dråber s kumdæmpende middel (3.2.)
tilsættes. Væsken bringes i kog i løbet af 5 ± 2 min. og koges livligt i præcis
30 min. Bundfaldet filtreres og vaskes på samme måde som efter behandling
med svovlsyre.
Efter den sidste vask suges bundfaldet tørt, og diglen med indhold forbindes
til ekstraktionsapparatet (4.6.). Bundfaldet vaskes tre gange med 25 ml
acetone (3.4.) hver gang og suges tørt efter hver vask.
Filterdiglen med indhold tørresi tørreovnen med 130 ºC indtil kons tant vægt.
Efter hver tørring afkøles diglen i en ekssikkator og vejes straks. Herefter
anbringesden i muffelovnen, og indholdet foras kesved 475 - 500 ºC i
mindst 30 min. Dette gentages indtil konstant vægt. Efter hver foraskning
afkøles diglen først i ovnen og derefter i ekssikkatoren, inden den vejes.
Der foretagesen blindprøve uden prøve. Vægttabet ved foras kningen må ikke
overstige 4 mg.
6.Beregning af resultater
Træstofindholdet som procent af prøven udtrykkes ved formlen:
b/C0c ðÞ /C2 100
a
hvor
a = gram afvejet prøve
b = vægttabet ved foraskning af bundfaldet fra prøven efter tørring ved
130 ºC
c = vægttabet ved foraskning af bundfaldet af blindprøven efter tørring ved
130 ºC.
7.Repeterbarhed
Forskellen mellem to parallelle bestemmelser foretaget på samme prøve må
ikke være over:
— 0,3 i absolut værdi for træstofindhold på under 10 %
— 3 % i forhold til det højere resultat for træstofindhold på 10 % eller
derover.
8.Bemærkninger
8.1. Foderstoffer, der indeholder over 10 % råfedt, skal affedtes med petro-
leumsether (3.5.) inden analysen. Filterdiglen (4.2.) med den vejede
prøve forbindes med ekstraktionsapparatet (4.6.) og vaskes under
vakuum tre gange med 30 ml petroleumsether (3.5.) hver gang. Prøven
suges tør, og diglen med indhold forbindes til varmeenheden (4.1.).
Derefter fortsættes som beskrevet i punkt 5.
8.2. Foderstoffer, der indeholder fedt, som ikke direkte kan ekstraheres med
petroleumsether, skal affedtes som angivet i 8.1 og efter kogning med
syre affedtes endnu en gang.
Efter kogning i syre og efterfølgende vask forbindes diglen med indhold
til ekstraktionsapparatet (4.6.) og vaskes tre gange med 30 ml acetone
efterfulgt af tre gange vask med 30 ml petroleumsether. Filtret suges
tørt, og analysen fortsættes som beskrevet i punkt 5 med behandlingen
med kaliumhydroxid.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 7
▼M2
8.3. Hvis foderstofferne indeholder over 5 % karbonat udtrykt som kalcium-
karbonat, forbindesdiglen (4.2.) med den vejede prøve til varmeenheden
(4.1.). Prøven vaskes tre gange med 30 ml saltsyre (3.6.). Efter hver
tilsætning skal prøven henstå omkring et minut, inden den filtreres. Der
vaskes én gang med 30 ml vand, hvorefter der fortsættes som beskrevet
i punkt 5.
8.4. Hvisder anvendesapparatur i form af et s tativ (flere digler forbundet
med samme varmeenhed), må der aldrig foretages to enkeltbestemmelser
af samme analyseprøve i samme prøverække.
8.5. Hvis det efter kogning viser sig vanskeligt at filtrere syre- og baseoplø-
sningerne, føres der trykluft gennem varmeenhedens afgangsrør,
hvorefter filtreringen fortsættes.
8.6. Udglødningstemperaturen må ikke være over 500 ºC, således at diglerne
af sintret glas kan holde længst muligt. Der må drages omsorg for at
undgå store temperaturudsving under opvarmning og afkøling.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 8
▼B
BILAG II
1.RETINOLINDHOLD (A-VITAMIN)
1.Formål og anvendelsesområde
Denne metode gør det muligt at bestemme retinolindholdet (A-vitamin) i
foder, koncentrater og forblandinger. Den laveste grænse for bestemmelsenaf indholdet ligger på 10 000 UI/kg for de stærkt pigmenterede nærings-
midler og på 4 000 UI/kg for de andre produkter(
1). Produkterne fordelesi
to grupper, alt efter deresformodede retinolindhold:
Gruppe A: indhold på under 200 000 UI/kg
Gruppe B: indhold på mindst 200 000 UI/kg.
2.Princip
Prøven hydrolyseres ved opvarmning ved hjælp af en kaliumhydroxydopløs-
ning i æthylalkohol med et iltskyende middel eller i kvælstofatmosfære.
Blandingen udsættes for ekstrahering ved 1,2 dikloræthan. Ekstraktet
inddampes og udtørres og opblandes med petroleumsæter. Opløsningen
kromatograferespå aluminiumoxyds øjle (for produkterne i gruppe B er
kromatografienkun nødvendig i særlige tilfælde). Retinolindholdet bestemmes
ved spektrophotometri ved 610 nm efter udvikling af et farvet molekylekom-
pleksifølge Carr-Price-reaktionen, for produkterne i gruppe A; ved
spektrophotometri i den ultraviolette lampe ved 325 nm for produkterne i
gruppe B.
3.Reagenser
a)anvendt til analyse af produkterne i gruppe A og B
3.1. Æthylalkohol, 96 % (v/v)3.2. Natriumascorbatopløsning p.a., 10 % (p/v), eller3.3. Renset kvælstof
3.4. Kaliumhydroxydopløsning p.a., 50 % (p/v)
3.5. Kaliumhydroxydopløsning 1 N3.6. Kaliumhydroxydopløsning, 0,5 N3.7. 1,2-dikloræthan p.a.3.8. Petroleumsæter, ren, kogepunkt 30—50º. Rens den om nødvendigt
som følger. Omryst 1 000 ml petroleumsæter med doser på 20 ml
af koncentreret svovlsyre indtil syren forbliver farveløs. Fjern syren
og vask æteren først med 500 ml vand, derpå med to gange 250 ml
af en 10 % opløsning af natriumhydroxyd og tre gange 500 ml
vand. Fjern vandlaget, tør æteren i en time på aktivt kul og vandfrit
natriulsulfat, filtrér og distillér.
3.9. Aluminiumoxyd, standardiseret ved Brockmann-metoden: Forkul i 8
timer ved 750º, lad afkøle i tørreapparat og opbevar i brun glas-
flaske med slebet prop. Inden anvendelsen til kromatografi fugtes
den på følgende måde: anbring 10 g aluminiumoxyd og 0,7 ml
vand i en brun glasflaske, tilprop den hermetisk, opvarm den i
5 min. i vandbad ved stadig omrystning. Lad afkøle ved omryst-
ning. Afprøv det således behandlede aluminiumoxyds aktivitet ved
at analysere ifølge 5.3 og 5.4 en kendt mængde standard-retinol
(3.17).
3.10. Basisk aluminiumoxyd, aktivitetsgrad I.
3.11. Ren diæthylæter. Fjern peroxyderne og alle spor af vand ved
kromatografi over en basisk aluminiumoxydsøjle (3.10) (25 g
aluminiumoxyd til 250 ml diæthylæter).
3.12. Petroleumsæteropløsning (3.8), 4, 8, 12, 16 og 20 % (v/v) diæthy-
læter (3.11).
3.13. Natriumsulfidopløsning, 0,5 molekyle-gram i 70 % glycerin (v/v)
fremstillet af natriumsulfid p.a.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 9
(1) 1 UI = 0,3 µg retinol.
▼B
b)anvendt udelukkende til analyse af produkterne i gruppe A
3.14. Krystalliserende benzol p.a.
3.15. Kloroform p.a. Fjern æthylalkoholen, fosgenen og sporene af vand
ved kromatografi over en basisk aluminiumoxydsøjle (3.10) (50 g
aluminiumoxyd til 200 ml kloroform; de første 50 ml af produktet
bør kromatograferesén gang til).
3.16. Reagensifølge Carr-Price: Omrys t ca. 25 g antimontriklorid p.a.
(opbevaret i tørreapparat) sammen med 100 ml kloroform (3.15)
indtil opløsningen er mættet. En svag antimontrikloridaflejring er
ingen hindring. Ibland 2 ml eddikesur anhydrid p.a. Opbevares i
isskab i en brun glasflaske med slebet prop. Holdbarhed: flere uger.
3.17. Standard-retinol, afprøvet ved spektrofotometri.
c)anvendt udelukkende til analyse af produkterne i gruppe B
3.18. Isopropanol til kromatografi.
4.Redskaber
4.1. Vandbad.
4.2. Rotationsapparat til vakuumfordampning, med runde kolber med
forskelligt rumindhold.
4.3. Reagensglas til kromatografi (længde: 300 mm, indvendig diameter: ca.
13 mm).
4.4. Spektrofotometer med 10 mm tykke skåle (af kvarts til opmålinger i den
ultraviolette lampe).
4.5. Ultraviolet lampe, 365 nm.
5.Fremgangsmåde
NB:Alle operationer skal foregå fjernt fra direkte belysning, eventuelt i en
installation af brunt glas.
5.1.Stikprøver
Udtag en stikprøve af den fint opdelte prøve, i forhold til det formodede
A-vitaminindhold, nemlig:
0,1 til 1,0 g af koncentraterne (indhold på over 20 000 UI/g);
3,0 til 5,0 g af forblandingerne (indhold på mellem 400 og 20 000 UI/g;
10 til 20 g af de mineralske blandinger;
30 g af produkterne i gruppe A.Anbring omgående stikprøven i en 500 ml kolbe med slebet prop.
5.2.Hydrolyse og ekstrahering (
1)
Ibland stikprøven i rækkefølge 40 ml æthylalkohol (3.1), 2 ml natriuma-
scorbatopløsning (3.2)(2), 10 ml kaliumhydroxydopløsning (3.4) og 2 ml
natriumsulfidopløsning (3.13).
Opvarm i 30 min. ved 70—80º i køleapparat med omløb og lad derefter
afkølesunder rindende vand. Ibland 50 ml æthylalkohol (3.1) og 100 ml
1,2-dikloræthan (3.7) (opsuget med en pipette). Omryst kraftigt og afklar
den væske, der flyder ovenpå, i en afklaringskolbe. Hæld 150 ml
kaliumhydroxydopløsning (3.5) i kolben, omryst i 10 sekunder og lad
hvile indtil faserne adskilles. Opsaml dikloræthanfasen (den underste
fase) i en afklaringskolbe, ibland 40 ml kaliumhydroxydopløsning
(3.6), omryst i 10 sekunder og lad hvile indtil faserne adskilles. Opsaml
dikloræthanfasen i en afklaringskolbe og vask 6 til 8 gange med doser
på 40 ml vand indtil alkalien er forsvundet (forsøg med phenolphtalein).
Opsaml dikloræthanfasen og fjern de sidste spor af vand ved hjælp af
strimler af filtrérpapir.
Inddamp og udtør en aliquot del af opløsningen i vakuumrum over
vandbad ved 40º. Opløs hurtigt resten i 5 ml petroleumsæter (3.8).1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 10
(1) For diegivningsfoder og produkter, der har tendens til at klumpe sig sammen eller
svulme op, fordobles mængden af reagenser angivet i 5.2, 1. og 2. afsnit.
(2) Iblanding af natriumascorbat er ikke nødvendig når hydrolysen udføres i kvælstofat-
mosfære.
▼B
For produkterne i gruppe A , kromatografér som angivet i 5.3.1.
For produkterne i gruppe B , overfør opløsningen til en kolbe på 50 ml,
fyld op med petroleumsæter (3.8) bland omhyggeligt og mål den optiske
tæthed som angivet i 5.4.2.
5.3.Kromatografi
5.3.1.Produkter i gruppe A
Fyld et reagensglas til kromatografi (4.3) op til 200 mm med
aluminiumoxyd (3.9), der først er mættet med petroleumsæter
(3.8). Hæld den i 5.2 opnåede opløsning i reagensglasset og
ibland omgående 20 ml petroleumsæter (3.8). Kromatografér i
rækkefølgen med doser på 10 ml af petroleumsæteropløsningerne
med 4, 8, 12, 16 og 20 % diæthylæter (3.12) i delvisvakuumrum
eller under tryk, hvorved gennemløbshastigheden er på 2 til 3
dråber i sekundet.
Carotinen kromatograferesførs t(1). Retinolen kromatograferes
som regel af petroleumsæteropløsningen med 20 % diæthylæter
(3.12). Kromatograferingen kontrolleresved ultraviolet lys(kort
bestråling af søjlen med en kviksølvlampe. Retinolens selvly-
sende stribe adskiller sig tydeligt fra de gule xanthofylstriber,
der følger den. Opsaml den del af produktet, der indeholder reti-
nolen i en erlenmeyer.
5.3.2.Produkter i gruppe B
Kromatografien skal kun udføres hvis de i 5.4.2 opnåede
afmålinger af den optiske tæthed ikke er i overensstemmelse
med de i 5.4.2 angivne forskrifter.
Hviskromatografien s kulle være nødvendig, anbringesi kromato-
grafisøjlen en aliquot del af den i 5.2. angivne opløsning i
petroleumsæter, der indeholder ca. 500 UI retinol, og der kroma-
tograferess om angivet i 5.3.1.
5.4.Opmåling af den optiske tæthed
5.4.1.Produkter i gruppe A
Inddamp og udtør i vakuumrum produktet, der indeholder retinol,
som blev opnået i 5.3.1. Opløs resten i 2 ml benzol (3.14). Udtag
0,3 ml af denne opløsning og ibland 3 ml af reagensen ifølge
Carr-Price (3.16). Der udvikler sig en blå indfarvning. Opmål
den optiske tæthed med et spektrofotometer med 610 nm, præcis
30 sekunder efter reaktionens begyndelse. Bestem retinolind-
holdet ved sammenligning med en skala, der er opnået ved
benzolopløsninger med stigende indhold af standard-retinol
behandlet med reagensen ifølge Carr-Price (2 til 16 UI standard-
A-vitamin (3.17) pr. 0,3 ml benzol (3.14) + 3 ml reagensifølge
Carr-Price (3.16)). Skalaen skal kontrolleres regelmæssigt og
med korte mellemrum ved hjælp af standardprøven og en nylig
tilberedt opløsning af reagensen ifølge Carr-Price.
5.4.2.Produkter i gruppe B
Udtag en aliquot del af den i 5.2 opnåede opløsning i petrole-
umsæter, der indeholder ca. 200 UI retinol. Inddamp og udtør i
vakuumrum og opløs resten i 25 ml isopropanol (3.18). Opmål
den optiske tæthed med spektrofotometer ved 325, 310 og
334 nm. Maksimumsabsorberingen ligger på 325 nm. Opløsnin-
gensretinolindhold udregness om følger:
E325· 18,30 = UI retinol/ml
Forholdet mellem de optiske tætheder
E310:E325og E334:E325
skal imidlertid ligge på 6 : 7 = 0,857.Hvis et af disse forhold afviger meget fra denne værdi (<0,830 ou
> 0,880), skal der forinden opmålingen af de optiske tætheder
foretagesen kromatografi efter den i 5.3.2 angivne frem-
gangsmåde.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 11
(1) Carotinindholdet kan bestemmes ved opmåling af den optiske tæthed ved 450 nm;
E1%
1c m¼2600
▼B
Hvisopmålingen af de optis ke tætheder, der foretagesefter
kromatografien viser at de ovennævnte forhold endnu afviger
meget fra værdien 0,857 (< 0,830 eller > 0,880), skal bestem-
melsen af indholdet foretages efter den fremgangsmåde, der er
angivet for produkterne i gruppe A.
6.Udregning af resultaterne
Udregn prøvens retinolindhold med hensyntagen til stikprøvens vægt og til
de fortyndelser, der har fundet sted i løbet af analysen. Resultaterne
udtrykkesi UI retinol pr. kg.
GentagelseForskellen mellem resultaterne af to parallele bestemmelser af den samme
prøve må ikke overstige:
— 20 % i relativ værdi for retinolindhold under 75 000 UI/kg
— 15 000 UI for indhold mellem 75 000 og 150 000 UI/kg
— 10 % i relativ værdi for indhold mellem 150 000 og 250 000 UI/kg— 25 000 UI for indhold mellem 250 000 og 500 000 UI/kg— 5 % i relativ værdi for indhold over 500 000 UI/kg.
2.THIAMININDHOLD (ANEURIN, B
1-VITAMIN)
1.Formål og anvendelsesområde
Denne metode gør det muligt at bestemme thiaminindholdet(aneurin, B1-
vitamin) i foder, koncentrater og forblandinger. Den laveste grænse for
bestemmelse af indholdet ligger på 5 ppm.
2.Princip
Prøven behandles efter opvarmning med fortyndet svovlsyre og hydrolyseres
derefter ved hjælp af enzymer. Den opnåede opløsning udsættes for alkalisk
oxydering. Den thiokrom, der dannes, extraheres ved hjælp af isobutanol og
bestemmes ved fluorimetri.
3.Reagenser
3.1. Standard-thiaminopløsning i forholdet 100 µg/ml: opløs 112,3 mg
meget ren Thiamin-klorhydrat, der først er udtørret i vakuumrum indtil
konstant vægt, i 1 000 ml svovlsyre 0,2 N (3.2). Opbevaret køligt og
mørkt er denne opløsning stabil i en måned.
3.2. Svovlsyre 0,2 N.3.3. Natriummetabisulfit, Na
2S2O5, ren.
3.4. Opløsning på 20 % (p/v) af kaliumferricyanid p.a.3.5. Opløsning på 25 % (p/v) af kaliumhydroxyd p.a.3.6. Oxyderingsblanding: bland 2 ml Kaliumferricyanidopløsning (3.4) med
48 ml kaliumhydroxydopløsning (3.5). Denne blanding kan ikke holde
sig mere end 4 timer.
3.7. Isobutanol p.a.3.8. Natriumacetatopløsning 2,5 N.3.9. Præparat der indeholder flere enzymer, så som protease, fosfatase og
amylase (f.eks. clarase).
3.10. Æthylalkohol på 96 % (v/v).
4.Redskaber
4.1. Vandbad.4.2. Centrifuge (3 500 omdrejninger/min.) med reagensglas på 30 til 50 ml,
forsynet med slebne propper.
4.3. Fluorimeter.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 12
▼B
5.Fremgangsmåde
5.1.Enzymhydrolyse
Anbring i to kolber, A og B, på 250 ml identiske mængder af den fint
opdelte prøve, der indeholder ca. 100 mg thiamin og 125 ml svovlsyre
(3.2). Ibland desuden, kun i kolbe A , 1,0 ml standardopløsning (3.1).
Omryst kraftigt, opvarm kolberne på vandbad i 15 min. ved omrystning
fra tid til anden. Lad temperaturen falde til ca. 45º. Hæld 20 ml natriu-
macetatopløsning (3.8) og 0,5 g enzympræparat (3.9) i begge kolber, lad
hvile i 20 min. ved stuetemperatur. Ibland 20 ml natriumacetatopløsning
(3.8), fyld op med vand, bland omhyggeligt og filtrér. Opsaml filtraterne
A og B efter at have fjernet de første 15 ml. Tilbered følgende opløs-
ninger:
5.1.1.Prøveopløsning T
Anbring 5 ml af filtrat A og ca. 10 mg natriummetabisulfit (3.3) i
et centrifugeringsreagensglas (4.2). Nedsænk glasset i 15 min. i
kogende vandbad og lad det derefter afkølesved s tuetemperatur.
5.1.2.Opløsning A (standard) og B (prøve)
Anbring 5 ml af filtrat A i et centrifugeringsreagensglas (4.2) og
5 ml af filtrat B i et andet glas(4.2).
5.2.Oxydering
Ibland opløsningerne T, A og B 5 ml af oxyderingsblandingen (3.6) og,
et minut senere, 10 ml isobutanol (3.7). Tilprop glassene og omryst kraf-
tigt i 5 sekunder. Lad dem hvile et minut og centrifugér for at adskille
faserne. Udtag fra hvert af glassene 5 ml af isobutanolfasen, der flyder
ovenpå, anbring hver af dem i kolber på 25 ml, fyld op med æthylal-
kohol (3.10) og bland omhyggeligt (= ekstrakt T, A og B).
5.3.Opmåling af fluorescensen
Udfør opmålingerne ved den bølgelængde, ved hvilken fluorimeteret
giver et optimalt svar på thiokromens fluorescens. Bestrål ved ca.
365 nm.
Tilpas instrumentet til nulpunktet ved hjælp af ekstraktet T. Opmål
ekstrakt A og B's fluorescensintensitet.
6.Udregning af resultaterne
Thiaminindholdet i mg pr. kg af prøven findesved formlen:
d/C1b
a/C0bðÞ c
i hvilken:
a = ekstrakt A's fluorescensintensitet (standard),
b = ekstrakt B's fluorescensintensitet (prøve),c = stikprøvens vægt i g,d = mængden af thiamin i µg tilføjet stikprøven (standard).
GentagelseForskellen mellem resultaterne af to parallele bestemmelser af den samme
prøve må ikke overstige:
10 % i relativ værdi for indhold under 500 ppm og
5 % i relativ værdi for indhold på mindst 500 ppm.
3.INDHOLD AF ASCORBINSYRE OG DEHYDROASCORBINSYRE (C-
VITAMIN)
1.Formål og anvendelsesområde
Metoden gør det muligt at bestemme indholdet af ascorbinsyre og dehydroa-
scorbinsyre (C-vitamin) i foder, koncentrater og forblandinger. Den laveste
grænse for bestemmelse af indholdet ligger på 5 ppm. Produkterne er opdelt
i to grupper, ifølge deresformodede C-vitaminindhold:
Gruppe A: indhold under 10 g/kg
Gruppe B: indhold på mindst 10 g/kg.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 13
▼B
2.Princip
Prøven, der er opslemmet i en fortyndet metafosforsyreopløsning, udsættes
for ekstrahering ved hjælp af kloroform. Vandfasen behandles med en opløs-
ning af 2,6-diklorophenol-indophenol, for at gøre ascorbinsyren til
dehydroascorbinsyre, og derefter med en opløsning af 2,4-dinitrophenylhy-
drazin. Den hydrazon, der danneseks traheresved hjælp af en blanding af
æthylacetat, iskold eddikesyre og acetone. Opløsningen kromatograferes
over en kiselgelsøjle, produktet inddampes og udtørres og resten opløses i
fortyndet svovlsyre. Opløsningens optiske tæthed måles med fotometer ved
509 nm.
For produkterne i gruppe A udsættes produktet af kromatografien over søjlen
desuden for kromatografi over tyndt lag for at isolere hydrazonen.
3.Reagenser
3.1. Standardopløsning med 0,05 % L-ascorbinsyre: opløs 50 mg L-ascor-
binsyre p.a. i ca. 20 ml metafosforsyreopløsning (3.2) og fyld op til
100 ml med vand. Tilberedesumiddelbart inden brugen.
3.2. Opløsning med 10 % (p/v) metafosforsyre: opløs i vand 200 g metafos-
forsyre p.a., knust i en morter, og fyld op til 2000 ml med vand.
Opbevar ved 4 ºC. Forny efter en ugesforløb.
3.3. Kloroform p.a.3.4. Opløsning med 0,5 % (p/v) 2,6-diklorophenol-indophenol p.a. Tilbe-
redesumiddelbart inden brugen.
3.5. Filtreringshjælpemiddel (S. og S. n
o121 el. lign.).
3.6. Sur opløsning med 2 % (p/v) 2,4-dinitrophenylhydrazin: opløs 2 g 2,4-
dinitrophenylhydrazin i 100 ml fortyndet svovlsyre (25 ml svovlsyre
p.a., d: 1,84, fortyndet til 100 ml med vand). Denne opløsning kan
holde sig en uge, hvis den opbevares køligt.
3.7. Kvælstof eller.3.8. Kultveilte.
3.9. Blanding af æthylacetat p.a./iskold eddikesyre/acetone p.a.: 96/2/2.
3.10. Blanding af diklorometan p.a./iskold eddikesyre: 97/3.3.11. Kiselgel, kornstørrelse: 0,05 til 0,2 mm.3.12. Kiselgel H, ifølge Stahl, til kromatografi over tyndt lag.3.13. Fortyndet svovlsyre: anbring 105 ml vand i en kolbe på 200 ml, fyld
op med svovlsyre p.a., d: 1,84.
3.14. Fortynder til kromatografi over tyndt lag: bland 75 ml diæthylæter p.a.,
25 ml æthylacetat p.a. og 4,0 ml eddikesyre, 96 % (p/v) p.a. Forny
efter 2 til 3 kromatografier.
4.Redskaber
4.1. Vandbad, indstillet med ultrathermostat på 20 ºC.
4.2. Centrifuge (3 500 omdr./min.) med reagensglas på 40 til 50 ml forsynet
med slebne propper.
4.3. Rotationsapparat til vakuuminddampning, med kolber på 250 ml.4.4. Kromatografireagensglas (længde: 100 mm, indvendig diameter: 20 mm)
med presset glasplade (f.eks. Allihn-glas).
4.5. Spektrofotometer eller colorimeter med filtre, udstyret med 10 mm
tykke skåle.
4.6. Instrumenter til kromatografi over tyndt lag, med kiselgelplader (3.12),
Tykkelse af laget: 0,5 til 0,6 mm. (Færdige plader kan bruges). Tør
pladerne i 2½ til 3 timer i tørreovn ved 120—130 ºC. Lad afkøle og
opbevar derefter i tørreapparat mindst 24 timer inden brugen.
4.7. Tørreapparat, indstillet på 120—130º.
5.Fremgangsmåde
5.1.Ekstrahering
Anbring i to kolber, A og B, på 250 ml med slebet prop, ens mængder
af den fint opdelte prøve, der indeholder ca. 200 µg C-vitamin. Ibland,1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 14
▼B
kun i kolbe A , 0,4 ml standardopløsning (3.1) og bland omhyggeligt ved
omrystning (standard).
Ibland 30 ml kloroform (3.3) og 25 ml metafosforsyreopløsning (3.2) på
4 ºC i hver af kolberne. Omryst kort og lad hvile 10 til 15 min. Hæld
25 ml vand i, tilprop kolberne, omryst kraftigt i 10 sekunder og lad hvile
10 til 15 min. i vandbadet (4.1). Centrifugér for at adskille vandfasen fra
kloroformfasen. Udfør operationerne samtidig på vandekstrakterne A
(standard) og B, som angivet herefter.
5.2.Oxydering
Udtag med en pipette 40 ml af vandopløsningen, der svømmer ovenpå
(lettere uklart), og som bleve opnået i 5.1; anbring dem i et reagensglas
med slebet prop, ibland 0,5 til 1 ml af opløsningen af 2,6-diklorophenol-
indophenol (3.4) og bland omhyggeligt. En rød infarvning finder sted,
der skal vedvare mindst 15 min. Ibland derpå ca. 300 mg filtreringshjæl-
pemiddel (3.5), omryst og filtrér gennem et tørt foldet filter. Filtratet
skal ikke nødvendigvis være glasklart.
5.3.Reaktion ved 2,4-dinitrophenylhydrazinen og ekstrahering af hydrazonen
Opsaml med pipetten 10 ml af det i 5.2 opnåede filtrat, anbring dem i et
centrifugeringsreagensglas (4.2), ibland 2 ml 2,4-dinitrophenylhydrazi-
nopløsning (3.6) og bland omhyggeligt. Hæld hurtigt en kvælstofstråle
(3.7) eller kultveiltestråle (3.8) ned i glasset, tilprop det og neddyp det
i ca. 15 timer (en nat) i vandbadet (4.1). Ibland derpå 3 ml vand, 20 ml
af blandingen æthylacetat/iskold eddikesyre/acetone (3.9) og ca. 800 mg
filtréringshjælpemiddel (3.5). Tilprop glasset, omryst kraftigt i 30
sekunder og centrifugér. Anbring 15 ml af fasen, der flyder ovenpå, i
en inddampningskolbe og inddamp ved formindsket tryk i rotationsappa-
ratet (4.3) indtil der opnåsen olieagtig aflejring. Opløsaflejringen i 2 ml
af blandingen æthylacetat/iskold eddikesyre/acetone (3.9) idet der
opvarmestil 50 ºC, lad afkøle, ibland 10 ml af blandingen dikloro-
metan/iskold eddikesyre (3.10) og bland omhyggeligt.
5.4.Kromatografi over søjle
Fyld et kromatografireagensglas (4.4) op til 30 mm med blandingen
diklorometan/iskold eddikesyre (3.10). Opslem (ved kraftig omrystning)
5 g kiselgel (3.11) i 30 ml af blandingen diklorometan/iskold eddikesyre
(3.10); hæld opslemningen op i glasset. Lad synke til bunds og pres
sammen under svagt kvælstoftryk (3.7).
Fyld den i 5.3 opnåede opløsning op i glasset, skyl kolben med en lille
smule af blandingen diklorometan/iskold eddikesyre (3.10) og hæld det
op i glasset, fyld derpå dette op med blandingen (3.10) og fortsæt
afvaskningen af søjlen med den samme blanding (3 til 4 doser på ca.
5 ml) indtil produktet er farveløst. Fjern den del af produktet, der er
farvet gult.
Kromatografér den rødlige zone øverst i søjlen med blandingen æthyla-
cetat/iskold eddikesyre/acetone (3.9), opsaml produktet og inddamp og
udtør det.
5.4.1.For produkterne i gruppe A (indhold af C-vitamin under 10 g/kg) ,
opløs resten i 2,0 ml af blandingen (æthylacetat/iskold eddike-
syre/acetone (3.9) og forsæt omgående med kromatografien over
tyndt lag som angivet i 5.5.
5.4.2.For produkterne i gruppe B (C-vitaminindhold på mindst 10 g/
kg), opløs resten i 4,0 ml fortyndet svovlsyre (3.13), omryst kraf-
tigt for at opløse den olieagtige aflejring fuldkommen og foretag
opmålingen af den optiske tæthed som angivet i 5.6.
5.5.Kromatografi over tyndt lag
Udfør de følgende operationer to gange. Anbring i form af en streg på
kromatografipladen (4.6) 0,5 ml af den i 5.4.1 opnåede opløsning. Frem-
kald i mindst 20 min. ved hjælp af kromatografifortynderen (3.14) i
mættet bad, indtil hydrazonområdet, der farves lyserødt, adskiller sig
tydeligt. Lad tørre i fri luft. Afgræns den lyserøde zone, skrab denne
med en spatel og overfør pulveret til et kromatografireagensglas (4.4).
Kromatografér en gang med 2 ml og to gange med 1,5 ml af blandingen
æthylacetat: iskold eddikesyre/acetone (3.9). Opsaml produktet i en lille
kolbe (den sidste del skal være farveløs). Inddamp og udtør, opløs den
oljeagtige aflejring i 4,0 ml fortyndet svovlsyre (3.13), omryst kraftigt
for at opløse aflejringen fuldkommen og foretag opmålingen af den
optiske tæthed.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 15
▼B
5.6.Opmåling af den optiske tæthed
Mål den optiske tæthed med fotometer ved 509 nm, 20 til 30 min. efter
opløsningen af aflejringen i svovlsyren. Udfør opmålingen ved sammen-
ligning med fortyndet svovlsyre (3.13).
5.7.Forsøg uden forsøgsmateriale
Udfør dette forsøg ved benyttelse af samme fremgangsmåde uden prøve.
6.Udregning af resultaterne
C-vitaminindholdet i g pr. kg af prøven findesved formlen:
c/C0aðÞ /C1 2
b/C0c ðÞ /C1 10 d
i hvilken:
a = den optiske tæthed af den hvide farve,
b = standardopløsningens optiske tæthed,
c = prøveopløsningens optiske tæthed,
d = stikprøvens vægt i g.
Gentagelse
Forskellen mellem resultaterne af to parallele bestemmelser af den samme
prøve må ikke overstige:
10 % i relativ værdi for C-vitaminindhold under 10 g/kg og
5 % i relativ værdi for indhold på mindst 10 g/kg.1973L0046 — DA — 10.11.1992 — 002.001 — 16