1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS BESLUTNING
af 15. juli 1994
om dyresundhedsmæssige betingelser og udstedelse af sundhedscertifikat for indførsel af tyresæd
fra tredjelande
(94/577/EF)
(EFT L 221 af 26.8.1994, s. 26)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1Kommissionens beslutning 1999/495/EF af 1. juli 1999 L192 56 24.7.1999
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 2
▼B
KOMMISSIONENS BESLUTNING
af 15. juli 1994
omdyresundhedsmæssigebetingelserogudstedelseafsundhedscer-
tifikat for indførsel af tyresæd fra tredjelande
(94/577/EF)
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
underhenvisningtiltraktatenomoprettelseafDetEuropæiskeFælles-
skab,
under hevisning til Rådets direktiv 88/407/EØF af 14. juni 1988 om
fastsættelse af de veterinærpolitimæssige krav i forbindelse medhandelen inden for Fællesskabet med tyresæd og indførsel heraf(
1),
senest ændret ved direktiv 93/60/EØF(2), særlig artikel 10 og 11, og
ud fra følgende betragtninger:Listen over tredjelande, hvorfra medlemsstaterne tillader indførsel af
tyresæd, i det følgende benævnt »tredjelandslisten«, blev fastsat vedKommissionens beslutning 90/14/EØF(
3), ændret ved beslutning 91/
276/EØF(4);
sygdomssituationeniIsraelresulteredei,atderblevindførtforbudmod
indførslerfradettelandvedKommissionensbeslutning91/277/EØF(5);
ved Kommissionens beslutning 91/479/EØF(6), 91/549/EØF(7), 92/
123/EØF(8), 92/124/EØF(9), 92/125/EØF(10), 92/126/EØF(11), 92/
127/EØF(12), 92/128/EØF(13), 92/386/EØF(14), 92/387/EØF(15)og 92/
445/EØF(16) blev der fastsat dyresundhedsmæssige betingelser og
bestemmelser om udstedelse af sundhedscertifikat for indførsel aftyresæd fra henholdsvis USA, Canada, Polen, Finland, New Zealand,Østrig, Schweiz, Sverige, Ungarn, Norge og Tjekkoslovakiet;
direktiv93/60/EØF,somskalværegennemførtimedlemsstaterneinden
den1.juli1994,ændrerdirektiv88/407/EØF,hvilketgørdetnødven-digt at ændre tredjelandsbeslutninger; for at forenkle og klargøre EU-forskrifterneindenfordetteområdebørbeslutningersamlesiénenkeltbeslutning, og de beslutninger, der er gældende for hvert enkelt land,ophæves;
i betragtning af bestemmelserne i aftalen om Det Europæiske Økono-
miske Samarbejdsområde er det ikke nødvendigt at opretholde sund-hedscertifikatetvedindførselaftyresædfraFinland,Norge,SverigeogØstrig;
ifølge udtalelse fra Den Videnskabelige Veterinærkomité er en yderli-
gere prøve for epizootisk hæmorragisk sygdom påkrævet;
deterkuniCanada,atforudgåenderutineprøverfordennesygdromkan
udføres med seks måneders mellemrum; der bør derfor fastlægges enovergangsperiode for anvendelsen af denne beslutning med hensyn til
(1) EFT nr. L 194 af 22. 7. 1988, s. 10.
(2) EFT nr. L 186 af 28. 7. 1993, s. 28.
(3)E F Tn r .L8a f1 1 .1 . 1990, s. 71.
(4) EFT nr. L 135 af 30. 5. 1991, s. 58.
(5) EFT nr. L 135 af 30. 5. 1991, s. 60.
(6) EFT nr. L 258 af 16. 9. 1991, s. 1.
(7) EFT nr. L 298 af 29. 10. 1991, s. 6.
(8) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 1.
(9) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 10.
(10) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 19.
(11) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 28.
(12) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 37.
(13) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 46.
(14) EFT nr. L 204 af 21. 7. 1992, s. 13.
(15) EFT nr. L 204 af 21. 7. 1992, s. 22.
(16) EFT nr. L 247 af 27. 8. 1992, s. 1.
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 3
▼B
Canadaforatgivedecanadiskeveterinærmyndighedertilstrækkeligtid
til at indføre den nye prøve i deres rutineprogram;
da der i den senere tid er opnået bedre kendskab til bluetongues
epidemi, kan der nu også gives tilladelse til indførsel af tyresæd fraAustralien;
den dyresundhedsmæssige situation i de på tredjelandslisten opførte
landesynesatværegodogkontrolleretafvelstruktureredeogvelorga-niserede veterinærmyndigheder hvad angår sygdomme, der kan over-føres via sæd;
tredjelandenes veterinærmyndigheder har forpligtet sig til inden for 24
timerviatelexellertelefaxatunderretteKommissionenogmedlemssta-terneombekræftelseafenhverforekomstafenafdepåOIE’slisteAopførte sygdomme eller om enhver ændring i vaccinationspolitikken iforbindelsemeddissesygdommeog—indenforenrimeligfrist—omforekomst af de på OIE’s liste B opførte sygdomme og om enhverpåtænktændringafimportreglerneforhusdyrellersædellerembryonerfra husdyr;
veterinærmyndighederne i de på tredjelandslisten opførte lande har
forpligtet sig til at føre officielt tilsyn med udstedelsen af de i dennebeslutning omhandlede certifikater samt til at sikre, at alle relevantecertifikater, fravigelser og resultater af laboratorieundersøgelser, somudstedelsen af certifikater måtte være baseret på, forbliver officieltregistreret i mindst tolv måneder efter afsendelsen af den sæd, devedrører;
veterinærmyndighederne i de på tredjelandslisten opførte lande har
forpligtetsigtilofficieltatgodkendetyrestationertiludførselafsædtilFællesskabet somfastsat i artikel 9 i direktiv 88/407/EØF;
de dyresundhedsmæssige betingelser og udstedelsen af sundhedscerti-
fikatmåtillpassesdendyresundhedsmæssigesituationidetpågældendetredjeland;
de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse
med udtalelse fra Den Stående Veterinærkomité —
VEDTAGET FØLGENDE BESLUTNING:
Artikel 1
Medlemsstaternetilladerindførselaftyresæd,deropfylderbetingelserne
i certifikaterne i bilag A, B, C og D, første del, dog kun fra detredjelande,dereranførtihenholdsvisbilagA,B,CogD,andendel.
Medlemsstaterne tillader dog indførsel fra Canada af tyresæd, der er
opsamlet og behandlet i henhold til beslutning 91/549/EØF, indtil den31. december 1994.
Artikel 2
Beslutning 91/479/EØF, 92/123/EØF, 92/124/EØF, 92/125/EØF, 92/
126/EØF, 92/127/EØF, 92/128/EØF, 92/386/EØF, 92/387/EØF og 92/445/EØF ophæves.
Kommissionens beslutning 91/549/EØF ophæves fra den 1. januar
1995.
Artikel 3
Bestemmelserneiartikel1,stk.1,vedrørendeCanadaanvendesfraden
1. januar 1995.
Artikel 4
Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 4
▼B
BILAG A
FØRSTE DEL
SUNDHEDSCERTIFIKAT
for indførsel af tyresæd

1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 5
▼B

1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 6
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii)erbehandlet,oplagretogtransporteretunderforhold,deropfylderbetingelserneidirektiv88/407/EØF.
Udfærdigeti....................................................,
(sted)den ..............................................................
(dato)
/SS74Stempel(2)Underskrift(2): ......................................................................
Navnmedblokbogstaver: .........................................................
Officieltitel: .. .......................................................................
►(2)◄
(2) Underskrift og stempel i en farve, der afviger fra påtrykkets farve.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 7
▼B
ANDEN DEL
Listeoverlande,somhartilladelsetilatanvendedetsundhedscertifikat,der
er vist i bilag A, første del
DEN TJEKKISKE REPUBLIKUNGARNNEW ZEALANDPOLENRUMÆNIENSCHWEIZDEN SLOVAKISKE REPUBLIK
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 8
▼B
BILAG B
FØRSTE DEL
SUNDHEDSCERTIFIKAT
for indførsel af tyresæd fra USA

1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 9
▼B

1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 10
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii)erbehandlet,oplagretogtransporteretunderforhold,deropfylderbetingelserneidirektiv88/407/EØ F
iv) eropsamletfratyre,somvedtolejlighedermedhøjsttolvmånedersmellemrumharværetunderkaste t
følgende undersøgelser før og efter opsamlingen med negativt resultat på et godkendt laboratoriu m
(vedundersøgelsenefteropsamlingenskalblodprøvenværetagetsenest21dageefteropsamlingena f
den til udførsel bestemte sæd):
— en kompetitiv Elisa for bluetongue efter metoden i bilag E
— enagargelimmunodiffusionsprøveeftermetodenibilagEogenvirusneutralisationsprøveforall e
serotyper af epizootisk hæmorragisk sygdom (EDH), der vides at forekomme i udførselslandet.
Udfærdigeti....................................................,
(sted)den ..............................................................
(dato)
/SS74Stempel(2)Underskrift(2): ......................................................................
Navnmedblokbogstaver: .........................................................
Officieltitel: .. .......................................................................
►(2)◄
(2) Underskrift og stempel i en farve, der afviger fra påtrykkets farve.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 11
▼B
ANDEN DEL
Listeoverlande,somhartilladelsetilatanvendedetsundhedscertifikat,der
er vist i bilag B, første del
USA
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 12
▼B
BILAG C
FØRSTE DEL
SUNDHEDSCERTIFIKAT
for indførsel af tyresæd

1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 13
▼B

1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 14
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii)erbehandlet,oplagretogtransporteretunderforhold,deropfylderbetingelserneidirektiv88/407/EØ F
iv) stammer fra donorer, som enten
— opholdt sig på den godkendte tyrestation den 1. juli 1994
eller
— er indsat på den godkendte tyrestation efter den 1. juli 1994 og er blevet underkastet følgend e
prøverforbluetongueogepizootiskhæmorragisksygdom(EDH)ietgodkendtlaboratoriumrne d
negativtresultatforudforindsættelsenogibeggetilfældehversjettemånederblevetunderkaste t
følgende prøver i et godkendt laboratoriumm ed negativt resultat:
— en kompetitiv Elisa for bluetongue efter metoden i bilag E— enagargelimmunodiffusionsprøveeftermetodenibilagEogenvirusneutralisationsprøveforall
e
serotyper af epizootisk hæmorragisk sygdom (EDH), der vides at forekomme i udførselslandet.
Udfærdigeti....................................................,
(sted)den ..............................................................
(dato)
/SS74Stempel(2)Underskrift(2): ......................................................................
Navnmedblokbogstaver: .........................................................
Officieltitel: .. .......................................................................
►(2)◄
(2) Underskrift og stempel i en farve, der afviger fra påtrykkets farve.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 15
▼B
ANDEN DEL
Listeoverlande,somhartilladelsetilatanvendedetsundhedscertifikat,der
er vist i bilag C, første del
CANADA Bortset fra regionen Okanagan Valley i British Columbia, der defi-
neressometområde,derafgrænsesafenlinjetrukketfraetpunktpågrænsenmellemCanadaogUSA120 °15 /prime1længde,49 °breddemod
nordtiletpunkt119 °35 /prime1længde,50 °30 /prime1breddemodnordøsttilet
punkt119 °længde,50 °45 /prime1breddemodsydtiletpunktpågrænsen
mellem Canada og USA 118 °15 /prime1længde, 49 °bredde.
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 16
▼B
BILAG D
FØRSTE DEL
SUNDHEDSCERTIFIKAT
for indførsel af tyresæd

1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 17
▼B

1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 18
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii)erbehandlet,oplagretogtransporteretunderforhold,deropfylderbetingelserneidirektiv88/407/EØF.iv) erindsamletfratyre,somvedtolejlighedermedhøjsttolvmånedersmellemrumharværetunderkaste
t
følgende undersøgelser før og efter opsamlingen med negativt resultat på et godkendt laboratoriu m
(vedundersøgelsenefteropsamlingenskalblodprøvenværetagetsenest21dageefteropsamlingena f
den til udførsel bestemte sæd):
— en kompetitiv Elisa for bluetongue efter metoden i bilag E
— enagargelimmunodiffusionsprøveeftermetodenibilagEogenvirusneutralisationsprøveforall e
serotyper af epizootisk hæmorragisk sygdom (EDH), der vides at forekomme i udførselslande t
— en serumneutralisationsprøve for Akabanevirus.
Udfærdigeti....................................................,
(sted)den ..............................................................
(dato)
/SS74Stempel(2)Underskrift(2): ......................................................................
Navnmedblokbogstaver: .........................................................
Officieltitel: .. .......................................................................
►(2)◄
(2) Underskrift og stempel i en farve, der afviger fra påtrykkets farve.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 19
▼B
ANDEN DEL
Liste over tredjelande, som har tilladelse til at anvende det sundhedscerti-
fikat, der er vist i bilag D, første del
AUSTRALIEN
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 20
▼B
BILAG E
Protokol for en blokerende eller kompetitiv enzym-kæde-immunitet-måling
med anvendelse af et gruppespecifikt monoklonalt antistof til påvisning af
antistoffer mod bluetongue-virus
DEN KOMPETITIVE ELISA TIL PÅVISNING AF BLUETONGUE MED
ANVENDELSE AF MONOKLONALT ANTISTOF 3-17-A3
Prøven kan påvise antistoffer mod alle kendte serotyper af bluetongue-virus
(BTV).
Prøveprincippet er, at reaktionen mellem BTV-antigen og et gruppespecifikt
monoklonaltantistof(3-17-A3)afbrydesvedtilsætningaffortyndingerafprøve-serum. Tilstedeværende antistoffer mod BTV i prøveserummet blokerer reakti-onsevnenhosdetmonoklonaleantistof(Mas)ogresultererienformindskelseafden forventede farveudvikling ved tilsætning af enzymsubstrat.
MATERIALER OG REAGENSER
1. Fladbundede mikrotiterplader.
2. Antigen: tilberedes sombeskrevet nedenfor.3. Blokerende buffer : 5 % (w/v) »Marvel« tørret mælkepulver, 0,1 % (v/v)
Tween-20 (leveres sompolyoxyethylensorbitanm onolauratsirup) i phosphat-bufferet saltopløsning (PBS).
4. Monoklonalt antistof: 3-17-A3 (leveres somhybridomcellekultur superna-
tant),opbevaretved−20 °Cellerfrysetørret,fortyndetiforholdet1:50med
blokerendebufferindenbrug,rettetmoddetgruppespecifikkepolypeptidp7.
5. Konjugat: kanin-antimuseglobulin (adsorberet og elueret), konjugeret med
peberrodsperoxidase og opbevaret i mørke ved 4 °C.
6. Substrat og kromogen: 0,2 g ortofenylendiamin (OPD) opløst i en buffer
beståendeaf2,553gcitronsyreog4,574gdinatriumhydrogenortofosfattilsatdestilleretvandoptil500ml,opdelti25mlalikvoterogopbevaretimørkeved-20 °Cmedtilsætningaf12 µl/mlhydrogenperoxid(30%w/v)umiddel-
bart inden brug.
OMGÅS MED FORSIGTIGHED — BRUG GUMMIHANDSKER —
MISTANKE OM MUTAGEN.
7. 1 Molar svovlsyre: 26,6 ml syre blandet i 473,4 ml destilleret vand.
HUSK — BLAND ALTID SYRE I VAND, ALDRIG VAND I SYRE
8. Orbitalryster.9. Elisa-pladelæser (prøven kan aflæses visuelt).
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 21
▼B
PRØVEFORMAT
PRØVEPROTOKOL
Blindprøvekontrol
Række 1 A-H er en blindprøvekontrol bestående af BTV-antigen og konjugat.
Den kan anvendes somblindprøve for Elisa-læseren.
Mas-kontrol
Række 2 A-H er den monoklonale antistofkontrol og består af BTV-antigen,
monoklonaltantistofogkonjugat.Denudgørennegativkontrol.Middelværdienaf absorbansaflæsningerne af denne kontrolrække repræsentere r 0 % hæmning.
Positiv kontrol
Række3A-Herdenpositivekontrol.DenbestårafBTV-antigen,BTV-positive
antiserumfortyndinger, monoklonalt antistof og konjugat. Den tjener som indi-kator for, at prøven fungerer ordentligt, og der bør opnås samstemmendehæmningsniveauer fra prøve til prøve.
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 22
▼B
Prøvesera
I ovenstående prøveformat kan der afprøves 18 sera fortyndet i forholdet 1:2,
1:4,1:8og1:16.Dettevilvisenogetomantistoftiteretiprøveserummet.Fortyn-dingsrækken kan gå længere, således at titrene for serumfortynding når slut-punktet. Somet alternativ kan sera, når det gælder serologiske undersøgelser istorskala,prøvesienenkeltfortynding(1:4)ellertofortyndinger(1:2og1:4)somen hurtig screeningtest.
PROCEDURE
1. BTV-antigen fortyndes til prætitreret fortynding i PBS, der sonikeres et
øjeblikforatspredeakkumuleretvirus(hvisderikkefindesnogensonikator,pipetteresderkraftigt),ogdertilføres50 µltilallehulleriElisa-pladen.Der
bankes på pladens sider for at sprede antigenet.
2. Derinkuberesved37 °Ci60minutterienorbitalryster.Pladernevaskestre
gange ved overskylning og tømning af hullerne med usterilt PBS, og detrykkes af med klatpapir.
3. Der tilsættes 50 µl blokerende buffer pr. hul. Prøvesera og positivt serum
hældesiderelevantehuller,ogderfortyndeshenoverpladenvedhjælpafenmultikanalpipette. Sera må ikke tilsættes blankprøvekontrollen eller Mas-kontrollen.
4. Straks efter tilsætningen af prøveseraene fortyndes Mas i blokerende buffer
(for at prætitrere fortyndingen), og der hældes 50 µl i alle pladens huller,
undtagen når det gælder blindprøvekontrollen.
5. Derinkluderesved37 °Ci60minutteriensonikator.Dervaskestregange
med PBS og trykkes af med klatpapir.
6. Kanin-antimusekoncentrat fortyndes til 1: 5000 i blokerende buffer, og der
hældes 50 µl i alle pladens huller.
7. Derinkuberesved37 °Ci60minutteriensonikator.Dervaskestregange
med PBS og trykkes af med klatpapir.
8. OPDoptøs,ogumiddelbartindenbrugtilsætteshver25mlPOD12 µl30%
hydrogenperoxid.50 µlhældesiallepladenshuller.Manladerfarvenudvikle
sigica.timinutterogstandserreaktionenme d1Msvovlsyre(50 µlpr.hul).
Farven skal udvikle sig i Mas-kontrolhullerne og i de huller, der ikke inde-holder sera med antistof mod BTV.
9. Hullerneundersøgesogregistreresentenvisueltellervedhjælpafenspektro-
fotometrisk læser.
ANALYSE AF RESULTATER
Middel-OD-aflæsningen beregnes ud fra Mas-kontrollerne. Dette repræsenterer
hæmningsværdien på 0 %. Absorbansaflæsninger af prøveseraene udtrykkes iprocent hæmningsværdier ved hjælp af følgende formel:
Procenthæmningsværdi=100−ODvedtilstedeværelseafprøveserumODved
fravær af prøveserum× 100
Hæmningsværdierpåover40%vedenserumfortyndingpå1:4betragtessom
positive.Visuelaflæsningermulig,da40%hæmningerdenlavesteværdi,derlet kan ses med det blotte øje.
TILBEREDNING AF BTV ELISA-ANTIGEN
1. 10 roux sammenflydende BHK-21 celler vaskes tre gange med serumfrit
Eagle’smedium,ogderinficeresmedbluetongue-virusserotyp e1iserum-
frit Eagle’s medium.
2. Der inkuberes ved 37 °C og undersøges daglig for cytopatisk effekt (cpe).
3. Nårderkankonstaterescpei80til90%afcellelagetihverroux,indsamles
viruset ved, at eventuelle celler, der stadig sidder på glasset, rystes af.
4. Der centrifugeres ved 2000 til 3000 rpm for at sammenpresse cellerne.5. Supernatanten fjernes, og cellerne genopslæmmes i ca. 30 ml PBS, som
indeholder1%»Sarkosyl«og2mlfenolmetylsulfonylfluorid(lysisbuffer).Dette kan bevirke, at cellerne danner en gel, og der kan tilsættes merelysisbuffer for at reducere denne effekt.
NB:Fenylmetylsulfonylfluoriderskadeligt—behandlesmedstørsteforsig-
tighed.
6. Cellerne sprænges i 60 sekunder ved hjælp af en ultralydsonde med en
amplitude på 30 micron.
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 23
▼B
7. Der centrifugeres ved 10000 rpmi ti m inutter.
8. Supernatanten opbevares ved + 4 °C, og den resterende cellemasse genop-
slæmmes i 10 til 20 ml lysisbuffer.
9. Dersonikeresogforetagesenklaring,idetsupernatantenopbevarespåhvert
stadium, i alt tre gange.
10. Supernatanternesamlesogcentrifugeresved24000rpmi120minutterved
+4 °Cpåen5mlpudebeståendeaf40%saccharose(w/viPBS)vedhjælp
af 30 ml Beckman centrifugeglas og en SW 28 rotor.
11. Supernatanten fjernes, glassene tømmes helt, og massen genopslæmmes i
PBSvedhjælpafsonikering.Antigenetopbevaresialikvoterved−70 °C.
TITRERING AF BTV ELISA-ANTIGEN
BluetongueElisa-antigentitreresvedhjælpafdenindirekteElisa.Tofoldfortyn-
dingerafantigentitreresoverforenkonstantfortynding(1:50)afmonoklonaltantistof 3-17-A3). Protokollen er somfølger:
PROCEDURE
1. BTV antigen fortyndes i PBS over mikrotiterpladen i en todobbelt fortyn-
dingsrække (50 µl/hul) ved hjælp af en multikanalpipette.
2. Der inkuberes en time ved 37 °C i en orbitalryster.
3. Pladerne vaskes tre gange med PBS.4. Dertilsætteshverthulimikrotiterpladen50 µlmonoklonaltantistof3-17-A3
(fortyndet 1: 50).
5. Der inkuberes en time ved 37 °C i en orbitalryster.
6. Pladerne vaskes tre gange med PBS.7. Dertilsætteshverthulimikrotiterpladen50 µlkanin-antimuseglobulinkonju-
geretmedpeberrodsperoxidasefortyndettilenprætitreretoptimalkoncentra-tion.
8. Der inkuberes en time ved 37 °C i en sonikator.
9. Der tilsættes substrat og kromogen som tidligere beskrevet. Reaktionen
standses efter ti minutter ved tilsætning af 1 Molar svovlsyre (50 µl/hul).
I den kompetitive prøve skal det monoklonale antistof være i overskud, og der
vælges derfor en fortynding af antigen, somligger på titreringskurven (ikke påden flade del), hvilket giver ca. 0,8 OD efter ti minutter.
Protokol for en agar-gel-immunodiffusionsprøve til påvisning af antistoffer
mod epizootisk hæmoragisk sygdom
Agar-gel-immunodiffusionsprøven foretages efter følgende protokol:
MATERIALER OG REAGENSER
1. Antigen
Antigen, der bundfældes, tilberedes i et cellekultursystem, der tåler den
hurtige formering af den/de pågældende serotype(r) epizootisk hæmoragisksygdomsvirus.BHKellerVero-celleranbefales.Antigenforekommerisuper-natantvæsken,nårvirusetsvæksterophørt,menkræverenkoncentrationpå50til100gangeforatværeeffektivt.Dettekanopnåsvedhjælpafenhverstandardprocedureforproteinkoncentrering.Virusiantigenetkaninaktiveresved tilsætning af 0,3 % (v/v) beta-propiolakton.
2. Kendt positivt kontrolserum
Ved hjælp af det internationale referenceserumog antigen frem stilles et
nationaltstandardserum,derstandardiseresidetoptimaleforholdsomfordetinternationale referenceserum, frysetørres og anvendes som det kendtekontrolserumi hver enkelt prøve.
3. Prøveserum
PROCEDURE
1. 1%agarosetilberedtiboratellernatriumbarbitolbuffer,pH8,5til9,0hældes
i en petriskål op til mindst 3,0 mm.
2. Derskæresetprøvemønsterpåsyvfugtfrihullerpåhvert5,0mmdiameteri
agaren.Mønstretbestårafetcenterhulogsekshuller,dereranbragtrundtomdet i en cirkel med en radius på 3 mm.
1994D0577 — DA — 05.07.1999 — 001.001 — 24
▼B
3. Centerhullet fyldes med standardantigenet. De ydre huller 2, 4 og 6 fyldes
med kendt positivt serum og hul 1, 3 og 5 fyldes med prøvesera.
4. Systemet inkuberes i indtil 72 timer ved stuetemperatur i et lukket fugtigt
kammer.
FORTOLKNING
Et prøveserumer positivt, hvis det danner en specifik bundfældninglinje m ed
antigenet og danner en ubrudt identitetslinje med kontrolserummet. Et prøve-serumer negativt, hvis det ikke danner en specifik linje m ed antigenet og detikke krummer kontrolserummets linje. Petriskåle bør undersøges mod en mørkbaggrund ved indirekte belysning.