02009R0152 — DA — 24.05.2017 — 006.001

Denne tekst tjener udelukkende som dokumentationsværktøj og har ingen retsvirkning. EU's institutioner påtager sig intet ansvar for dens indhold. De autentiske udgaver af de relevante retsakter, inklusive deres betragtninger, er offentliggjort i den Europæiske Unions Tidende og kan findes i EUR-Lex. Disse officielle tekster er tilgængelige direkte via linkene i dette dokument

►B KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR152/2009 af 27. januar 2009 om prøveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder (EØS-relevant tekst) (EUT L 054 af 26.2.2009, s. 1)

Ændret ved:





Berigtiget ved:









▼B

KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR152/2009

af 27. januar 2009

om prøveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder

(EØS-relevant tekst)







▼M3

Artikel 1

Udtagning af prøver som led i den offentlige kontrol af foder, navnlig for så vidt angår bestemmelse af bestanddele, herunder materiale, der indeholder eller består af eller er fremstillet af genetisk modificerede organismer, fodertilsætningsstoffer som defineret i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1831/2003 ( 1 ), uønskede stoffer som defineret i Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2002/32/EF ( 2 ), foretages efter de metoder, der er anført i bilag I.

Den prøveudtagningsmetode, der er anført i bilag I, finder anvendelse på kontrol af foder, for så vidt angår bestemmelse af pesticidrester som defineret i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 396/2005 ( 3 ) og kontrol af overensstemmelse med forordning (EU) nr. 619/2011.

▼B

Artikel 2

Klargøring af prøver til analyse og angivelse af resultater foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag II.

Artikel 3

Analyser som led i den offentlige kontrol af foder foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag III (Analysemetoder til kontrol af sammensætningen af fodermidler og foderblandinger), bilag IV (Analysemetoder til kontrol af indholdet af godkendte tilsætningsstoffer i foder), bilag V (Analysemetoder til kontrol for uønskede stoffer i foder) og bilag VI (Analysemetoder til bestemmelse af animalske bestanddele som led i den offentlige kontrol af foder).

Artikel 4

Næringsværdien af foderblandinger til fjerkræ beregnes som angivet i bilag VII.

Artikel 5

De i bilag VIII beskrevne analysemetoder til kontrol for ulovlig forekomst af fodertilsætningsstoffer, der ikke længere er tilladt, anvendes til verifikationsformål.

Artikel 6

Direktiv 71/250/EØF, 71/393/EØF, 72/199/EØF, 73/46/EØF, 76/371/EØF, 76/372/EØF, 78/633/EØF, 81/715/EØF, 84/425/EØF, 86/174/EØF, 93/70/EØF, 93/117/EF, 98/64/EF, 1999/27/EF, 1999/76/EF, 2000/45/EF, 2002/70/EF og 2003/126/EF ophæves.

Henvisninger til de ophævede direktiver gælder som henvisninger til nærværende forordning og læses efter sammenligningstabellerne i bilag IX.

Artikel 7

Denne forordning træder i kraft på tyvendedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.

Den anvendes fra den 26. august 2009

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

▼M3









BILAG I

PRØVEUDTAGNINGSMETODER

1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE

Prøver, der er bestemt til offentlig kontrol af foder, udtages i overensstemmelse med de nedenfor anførte metoder. De således fremkomne prøver skal betragtes som repræsentative for de portioner, der prøvetages af.

Formålet med repræsentativ prøveudtagning er at udtage en brøkdel af et parti på en sådan måde, at fastlæggelsen af de særlige karakteristika ved denne brøkdel repræsenterer gennemsnitsværdien af partiets karakteristika. Der udtages prøver af partiet ved gentagne gange at udtage enkeltprøver på forskellige steder i partiet. Disse enkeltprøver kombineres ved sammenblanding, så de udgør en samleprøve, hvorfra der klargøres repræsentative slutprøver ved hjælp af repræsentativ prøveneddeling.

Hvis det ved en visuel kontrol viser sig, at en del af det foder, der skal udtages prøver af, er af en anden kvalitet end resten af foderet i samme parti, adskilles de pågældende dele fra resten af foderet og behandles som et særskilt delparti. Hvis det ikke er muligt at opdele foderet i særskilte delpartier, udtages prøver som fra et parti. I sådanne tilfælde nævnes dette i prøveudtagningsrapporten.

Såfremt det konstateres, at foder, der udtages prøver af i overensstemmelse med bestemmelserne i denne forordning, og som ikke opfylder EU's krav, udgør en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU's krav.

2. DEFINITIONER

— Parti (lot eller batch) : En identificerbar mængde foder, hvorom det er fastslået, at det har fælles karakteristika såsom oprindelse, type, emballagetype, pakkevirksomhed, afsender eller mærkning og i tilfælde af en produktionsproces en produktionsenhed fra ét anlæg, hvor der anvendes ensartede produktionsparametre, eller et antal af sådanne enheder, når de er fremstillet fortløbende og oplagres sammen.

— Portion der prøvetages af : Et parti eller en identificerbar del af partiet eller delpartiet.

— Plomberet prøve : En prøve, der er plomberet på en måde, som forhindrer enhver adgang til prøven uden at bryde eller fjerne plomben.

— Enkeltprøve : En mængde, som er udtaget på et enkelt sted i den portion, der prøvetages af.

— Samleprøve : En samling af enkeltprøverne, udtaget fra den portion, der prøvetages af.

— Reduceret prøve : En del af en samleprøve, fremkommet ved repræsentativ reduktion af denne.

— Slutprøve : En del af den reducerede prøve eller af den homogeniserede samleprøve.

— Laboratorieprøve : Prøve bestemt til laboratorieundersøgelse (som modtaget af laboratoriet), der kan være en slutprøve, en reduceret prøve eller en samleprøve.

3. ALMINDELIGE BESTEMMELSER

— Prøveudtagningspersonale: Prøverne skal udtages af personer, som er autoriseret hertil af den kompetente myndighed.

— Prøven plomberes på en måde, som forhindrer enhver adgang til prøven uden at bryde eller fjerne plomben. Plombens etiket skal være klart identificerbar og synlig. Alternativt kan prøven anbringes i en beholder, der kan lukkes på en sådan måde, at den ikke kan åbnes uden at medføre uoprettelig skade på beholderen, så man undgår genanvendelse af beholderen.

— Identifikation af prøven: Prøven skal være mærket på en uudslettelig måde og skal identificeres på en sådan måde, at der er en utvetydig forbindelse til prøveudtagningsrapporten.

— Fra hver enkelt samleprøve udtages mindst to slutprøver: mindst én til offentlig kontrol (håndhævelsesformål) og en til lederen af foderstofvirksomheden (kontraprøve). Endelig kan der udtages én slutprøve til referenceformål. Hvis hele samleprøven homogeniseres, udtages slutprøverne af den homogeniserede samleprøve, medmindre denne fremgangsmåde er i modstrid med medlemsstaternes forskrifter for så vidt angår rettighederne for lederen af en foderstofvirksomhed.

4. APPARATUR

4.1. Det apparatur, der anvendes til prøveudtagning, skal være udført i materialer, der ikke kan forurene de produkter, der skal udtages prøver af. Apparatur, der er bestemt til at blive anvendt flere gange, skal være let at rengøre for at undgå krydsforurening.

4.2. Anbefalet apparatur til udtagning af prøver af foder i fast form. 4.2.1. Manuel prøveudtagning 4.2.1.1. Skovl med flad bund og lodrette sider 4.2.1.2. Prøveudtagningsspyd med lang spalte eller inddelt i kamre. Prøveudtagningsspyddets dimensioner skal være afpasset efter de forhold, hvorunder den del, der udtages prøver af, befinder sig (beholderens dybde, sækkenes dimensioner osv.), og efter størrelsen af de partikler, foderet består af. Hvis prøveudtagningsspyddet har flere åbninger for at sikre, at prøverne udtages på forskellige steder langs spyddet, skal åbningerne være adskilt af kamre eller sekventielt forskudte åbninger. 4.2.2. Mekanisk prøveudtagning Passende mekanisk apparatur kan anvendes til udtagning af prøver af foder i bevægelse. Passende betyder, at der mindst udtages prøver af hele flowets tværsnit. Prøveudtagning af foder i bevægelse (med høj flowhastighed) kan udføres med automatisk prøvetagningsudstyr. 4.2.3. Prøvedeler Til neddeling af prøver på en repræsentativ måde anvendes apparatur, der deler prøverne i tilnærmelsesvis lige store dele, hvis det er muligt og hensigtsmæssigt.

5. KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR ANTAL ENKELTPRØVER

— De kvantitative krav i punkt 5.1 og 5.2, for så vidt angår antallet af enkeltprøver, gælder for portioner, der prøvetages af, med en vægt på op til 500 tons, og hvoraf der kan udtages prøver på en repræsentativ måde. Den anførte fremgangsmåde for prøveudtagning gælder også for mængder, som er større end den foreskrevne maksimale størrelse af portioner, der prøvetages af, hvis der ses bort fra det højeste antal enkeltprøver, som er angivet i nedenstående tabeller, og antallet af enkeltprøver fastlægges ved hjælp af den kvadratrodsformel, der er fastsat i den relevante del af fremgangsmåden (jf. punkt 5.3), og den mindste størrelse af samleprøven øges proportionelt hermed. Dette forhindrer ikke, at et stort parti kan opdeles i mindre delpartier, og at der udtages prøver af hvert delparti i overensstemmelse med fremgangsmåden i punkt 5.1 og 5.2.

— Størrelsen af portionen, der prøvetages af, skal være således, at der kan udtages enkeltprøver af alle dens bestanddele.

— I tilfælde af meget store partier eller delpartier (> 500 tons) og partier, som transporteres eller oplagres på en sådan måde, at der ikke kan udtages prøver i overensstemmelse med den fremgangsmåde, der er fastsat i punkt 5.1 og 5.2, anvendes den i punkt 5.3 fastsatte fremgangsmåde.

— Hvis lederen af foderstofvirksomheden i henhold til lovgivningen har pligt til at overholde bestemmelserne i denne forordning som led i et obligatorisk overvågningssystem, kan lederen af foderstofvirksomheden afvige fra de kvantitative krav, som er fastsat i dette afsnit, for at tage hensyn til operationelle karakteristika, forudsat at lederen af foderstofvirksomheden over for den kompetente myndighed har godtgjort ækvivalensen af fremgangsmåden for prøveudtagning med hensyn til repræsentativitet og efter godkendelse fra den kompetente myndighed.

— I særlige tilfælde, hvis det ikke er muligt at anvende den fastsatte prøveudtagningsmetode for så vidt angår de kvantitative krav på grund af uacceptabel forretningsmæssig beskadigelse af partiet (som følge af emballeringsform, transportmiddel, opbevaringsforhold osv.), kan der anvendes en alternativ prøveudtagningsmetode, under forudsætning af at den er så repræsentativ som muligt og beskrives og dokumenteres fuldt ud.

5.1. Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter, der er homogent fordelt i foderet

5.1.1. Uemballeret foder i fast form







Størrelsen af den portion, der prøvetages af Mindste antal enkeltprøver ≤ 2,5 tons 7 > 2,5 tons Kvadratroden af 20 gange det antal tons, som den portion, der prøvetages af, vejer (1), op til 40 enkeltprøver (*1) Er den fremkomne størrelse ikke et helt tal, afrundes til nærmeste højere hele tal.

5.1.2. Uemballeret foder i flydende form







Størrelsen af den portion, der prøvetages af Mindste antal enkeltprøver ≤ 2,5 tons eller ≤ 2 500 liter 4 (1) > 2,5 tons eller > 2 500 liter 7 (1) (*1) Hvis det ikke er muligt at gøre væsken homogen, øges antallet af enkeltprøver.

5.1.3. Emballeret foder

Foder (i fast og flydende form) kan være emballeret i sække, poser, dåser, tønder mv., der i tabellen er omhandlet som enheder. Af store enheder (≥ 500 kg eller liter) udtages prøver i overensstemmelse med bestemmelserne for uemballeret foder (jf. punkt 5.1.1 og 5.1.2).







Størrelsen af den portion, der prøvetages af Mindste antal enheder, hvoraf (mindst) én enkeltprøve skal udtages (1) 1 til 20 enheder 1 enhed (1) 21 til 150 enheder 3 enheder (2) 151 til 400 enheder 5 enheder (3) > 400 enheder ►C1 ¼ af kvadratroden af antallet af enheder, som udgør den portion, der prøvetages (1), op til 40 enheder ◄ (*1) I tilfælde af at åbningen af en enhed kan påvirke analysen (f.eks. letfordærveligt vådt foder), udgøres en enkeltprøve af den uåbnede enhed. (*2) For enheder, hvis indhold ikke overstiger 1 kg eller 1 liter, udgøres en enkeltprøve af indholdet af én original enhed. (*3) Er den fremkomne størrelse ikke et helt tal, afrundes til nærmeste højere hele tal.

5.1.4. Foderblokke og mineralske sliksten

▼C1

For hver 25 enheder, der prøvetages, udtages mindst én blok eller sliksten, dog højst 4 blokke eller sliksten.

▼M3

For blokke eller sliksten, der ikke vejer over 1 kg stykket, udgøres en enkeltprøve af indholdet af én blok eller én sliksten.

5.1.5. Grovfoder/foderplanter







Størrelsen af den portion, der prøvetages af Mindste antal enkeltprøver (1) ≤ 5 tons 5 > 5 tons Kvadratroden af 5 gange det antal tons, som den portion, der prøvetages af, udgør (2), op til 40 enkeltprøver (*1) Det erkendes, at det i visse situationer (f.eks. ved ensilage) ikke er muligt at udtage de krævede enkeltprøver uden at forårsage uacceptabel beskadigelse af partiet. En alternativ prøveudtagningsmetode kan anvendes i sådanne situationer, og inden ikrafttrædelsen af denne forordning vil der blive udarbejdet en vejledning om prøveudtagning af sådanne partier. (*2) Er den fremkomne størrelse ikke et helt tal, afrundes til nærmeste højere hele tal.

5.2. Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver i forbindelse med kontrol af bestanddele eller stoffer, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i foderet

Disse kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøver skal anvendes i følgende situationer:

— kontrol med forekomst af aflatoksin, meldrøje, andre mykotoksiner og skadelige botaniske urenheder i fodermidler

— kontrol af krydsforurening fra en bestanddel, herunder genmodificeret materiale eller stof, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i fodermidler.

Hvis kontrolmyndigheden har stærk mistanke om, at der forekommer en uhomogen fordeling, og i tilfælde af krydsforurening fra en bestanddel eller et stof i en foderblanding, kan de kvantitative krav i nedenstående tabel anvendes.







Størrelsen af den portion, der prøvetages af Mindste antal enkeltprøver < 80 tons Jf. de kvantitative krav i punkt 5.1. Antal enkeltprøver, som skal udtages, ganges med 2,5. ≥ 80 tons 100

5.3. Kvantitative krav for så vidt angår enkeltprøverne i tilfælde af meget store partier

I tilfælde af store portioner, der prøvetages af (> 500 tons), er antallet af enkeltprøver, der skal udtages = 40 enkeltprøver + kvadratroden af antal tons i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter, der er homogent fordelt i foderet, eller 100 enkeltprøver + kvadratroden af antal tons i forbindelse med kontrol af bestanddele eller stoffer, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i fodermidler.

6. KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR SAMLEPRØVER







Der skal være én samleprøve for hver portion der prøvetages af. Fodertype Minimumsstørrelse af samleprøven (1) (2) 6.1. Uemballeret foder 4 kg 6.2. Emballeret foder: 4 kg (3) 6.3. Flydende eller halvflydende foder: 4 liter 6.4. Foderblokke eller mineralske sliksten: 6.4.1. med en stykvægt på over 1 kg 4 kg 6.4.2. med en stykvægt på højst 1 kg vægten af 4 originale blokke eller sliksten 6.5. Grovfoder/foderplanter 4 kg (4) (*1) Hvis det foder, der udtages prøver af, er af stor værdi, kan der udtages en mindre mængde samleprøve, under forudsætning af at dette beskrives og dokumenteres i prøveudtagningsrapporten. (*2) I henhold til bestemmelserne i Kommissionens forordning (EU) nr. 619/2011 af 24. juni 2011 om prøveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder for så vidt angår forekomst af genetisk modificeret materiale, som er under godkendelse, eller for hvilket godkendelsen er udløbet (EUT L 166 af 25.6.2011, s. 9) skal samleprøven til kontrol af forekomst af genetisk modificeret materiale indeholde mindst 35 000 frø/korn. ►C1 Dette betyder, at for majs skal størrelsen af samleprøven være mindst 10,5 kg og for sojabønner 7 kg. ◄ For andre frø og korn, såsom byg, hirse, havre, ris, rug, hvede og rapsfrø, svarer størrelsen af samleprøven på 4 kg til mere end 35 000 frø/korn. (*3) I tilfælde af emballeret foder er det heller ikke altid muligt at opnå en størrelse på 4 kg for samleprøven afhængigt af størrelsen af de enkelte enheder. (*4) For så vidt angår grovfoder eller foderplanter med lav massefylde (f.eks. hø, halm) skal samleprøven være på mindst 1 kg.

7. KVANTITATIVE KRAV FOR SÅ VIDT ANGÅR SLUTPRØVER

Slutprøver

Der kræves analyse af mindst én slutprøve. Mængden af slutprøven, der skal analyseres, må ikke være mindre end:







Foder i fast form 500 g (1) (2) (3) Flydende eller halvflydende foder 500 ml (1) (*1) I henhold til bestemmelserne i forordning (EU) nr. 619/2011 skal slutprøver til kontrol af forekomst af genetisk modificeret materiale indeholde mindst 10 000 frø/korn. ►C1 Dette betyder, at for majs skal størrelsen af slutprøven være mindst 3 000 g og for sojabønner 2 000 g. ◄ For andre frø og korn, såsom byg, hirse, havre, ris, rug, hvede og rapsfrø, svarer størrelsen af slutprøven på 500 g til mere end 10 000 frø/korn. (*2) Hvis størrelsen af samleprøven er betydeligt mindre end 4 kg eller liter (jf. fodnoterne i afsnit 6), kan der ligeledes udtages en mindre mængde slutprøve, under forudsætning af at dette beskrives og dokumenteres i prøveudtagningsrapporten. (*3) I tilfælde af prøveudtagning af bælgfrugter, korn og nødder til bestemmelse af indholdet af pesticidrester skal minimumsstørrelsen af slutprøven være 1 kg i overensstemmelse med bestemmelserne i Kommissionens direktiv 2002/63/EF (EFT L 187 af 16.7.2002, s. 30).

8. PRØVEUDTAGNINGSMETODE FOR MEGET STORE PARTIER ELLER PARTIER, SOM OPBEVARES ELLER TRANSPORTERES PÅ EN MÅDE, SÅ PRØVEUDTAGNING I HELE PARTIET IKKE ER MULIG

8.1. Generelle principper

Hvis transport eller opbevaring af et parti forhindrer udtagning af enkeltprøver i hele partiet, bør prøveudtagning af sådanne partier foretages, når partiet er i flow.

I tilfælde af store lagerbygninger, der er bestemt til oplagring af foder, bør virksomhederne opfordres til at installere udstyr i lagerbygningerne, som (automatisk) foretager prøveudtagning i hele det oplagrede parti.

Ved anvendelse af de fremgangsmåder for prøveudtagning, som er omhandlet i dette afsnit 8, underrettes lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant om den pågældende fremgangsmåde for prøveudtagning. Hvis lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant anfægter denne fremgangsmåde for prøveudtagning, skal lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repræsentant give den kompetente myndighed mulighed for at udtage prøver af hele det pågældende parti for vedkommendes regning.

8.2. Store partier, som transporteres med skib

8.2.1. Dynamisk prøveudtagning af store partier, som transporteres med skib

Prøveudtagning af store partier i skibe foretages bedst, mens produktet er i flow (dynamisk prøveudtagning).

Prøveudtagningen skal foretages pr. lastrum (enhed, der fysisk kan adskilles). Lastrummene tømmes imidlertid ikke hver for sig, så den oprindelige fysiske adskillelse eksisterer ikke længere efter overførslen til lagerfaciliteter. Prøveudtagning kan derfor foretages enten på baggrund af den oprindelige fysiske adskillelse eller på baggrund af opdelingen efter overførslen til lagerfaciliteterne.

Losningen af et skib kan vare flere dage. Normalt gennemføres prøveudtagningen med regelmæssige mellemrum under hele losningens varighed. Det er dog ikke altid muligt eller hensigtsmæssigt, at en officiel inspektør er til stede med henblik på prøveudtagning i løbet af hele lossearbejdet. Det er derfor tilladt at gennemføre prøveudtagning på en del af hele partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af.

Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

Selv om den officielle prøve udtages automatisk, skal der være en inspektør til stede. Såfremt den automatiske prøveudtagning gennemføres med forudindstillede parametre, som ikke kan ændres under prøveudtagningen, og enkeltprøverne indsamles i en plomberet beholder, som forhindrer eventuelt svig, er inspektørens tilstedeværelse kun nødvendig ved påbegyndelsen af prøveudtagningen, hver gang prøvebeholderen skal udskiftes og ved afslutningen af prøveudtagningen.

8.2.2. Prøveudtagning af partier, som transporteres med skib ved statisk prøveudtagning

Hvis prøveudtagningen udføres på en statisk måde, anvendes den samme fremgangsmåde som den, der gælder for lagerfaciliteter (siloer), som er tilgængelige ovenfra (jf. punkt 8.4.1).

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del (ovenfra) af partiet/lastrummet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

8.3. Prøveudtagning af store partier, der er oplagret i lagerbygninger

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del af partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

8.4. Udtagning af prøver fra lagerfaciliteter (siloer)

8.4.1. Udtagning af prøver fra siloer, som er (let) tilgængelige ovenfra

Prøveudtagningen gennemføres på den tilgængelige del af partiet. Antallet af enkeltprøver bestemmes under hensyntagen til størrelsen af den portion, der prøvetages af. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

8.4.2. Udtagning af prøver fra siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer)

8.4.2.1. Siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer) med en størrelse på > 100 tons

Der kan ikke udtages prøver af foder, der er oplagret i sådanne siloer, på en statisk måde. Hvis der skal udtages prøver af foder i en sådan silo, og det ikke er muligt at flytte partiet, skal der derfor træffes aftale med virksomhedslederen om, at vedkommende meddeler inspektøren, hvornår den pågældende silo vil blive tømt, så der kan udtages prøver, mens foderet er i flow.

8.4.2.2. Siloer, som ikke er tilgængelige ovenfra (lukkede siloer) med størrelse på < 100 tons

Fremgangsmåden for prøveudtagning indebærer overførsel til en beholder af en størrelse på 50-100 kg, hvorfra prøven udtages. Størrelsen af samleprøven skal svare til hele partiet, og antallet af enkeltprøver skal beregnes på baggrund af mængden i den silo, hvorfra der overføres foder til en beholder med henblik på prøveudtagning. Hvis der er udtaget prøver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse, og det konstateres, at denne del af partiet ikke opfylder EU's krav, antages det, at alt foder i det pågældende parti er berørt, medmindre en nærmere gennemgang ikke giver belæg for, at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EU’s krav.

8.5. Udtagning af prøver af uemballeret foder i store lukkede beholdere

Der kan som regel kun udtages prøver af sådanne partier, når beholderne aflæsses. Det er i visse tilfælde ikke muligt at aflæsse beholderne ved indførsel eller kontrol, og prøveudtagningen bør derfor gennemføres, når beholderne aflæsses.

9. FREMGANGSMÅDE VED UDTAGNING, KLARGØRING OG EMBALLERING AF PRØVERNE

9.1. Generelt

Prøverne udtages og klargøres så hurtigt som muligt under hensyntagen til de forholdsregler, som er nødvendige for at undgå, at produktet forandres eller forurenes. Instrumenter og også overflader og beholdere, som er beregnet til at rumme prøverne, skal være rene og tørre.

9.2. Enkeltprøver

Enkeltprøver skal udtages tilfældigt fra hele den portion, der prøvetages af. Deres størrelse skal være tilnærmelsesvis ens.

Enkeltprøvens størrelse skal være på mindst 100 g eller 25 g i tilfælde af grovfoder eller foderplanter med lav massefylde.

I tilfælde af at der i henhold til den fremgangsmåde for prøveudtagning, der er fastsat i afsnit 8, skal udtages færre end 40 enkeltprøver, fastlægges størrelsen af enkeltprøverne på baggrund af den størrelse, der kræves for samleprøver (jf. afsnit 6).

I tilfælde af prøveudtagning af prøver af mindre partier af emballeret foder, hvor der i henhold til de kvantitative krav skal udtages et begrænset antal enkeltprøver, skal en enkeltprøve udgøres af indholdet af én original enhed, hvis indhold ikke overstiger 1 kg eller 1 liter.

I tilfælde af prøveudtagning af emballeret foder, der består af små enheder (f.eks. < 250 g), afhænger antallet af enkeltprøver af enhedernes størrelse.

9.2.1. Uemballeret foder

Hvor det er passende, kan prøveudtagningen foretages, mens partiet er i bevægelse (pålæsning eller aflæsning).

9.2.2. Emballeret foder

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, udtages en del af indholdet af hver enhed ved hjælp af spyd eller skovl. Om nødvendigt skal prøverne udtages, efter at enhederne er tømt hver for sig.

9.2.3. Flydende eller halvflydende foder, som er homogent eller kan gøres homogent

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, homogeniseres indholdet om nødvendigt, og der udtages en mængde fra hver enhed.

Enkeltprøverne kan eventuelt udtages under aftapning af partiet.

9.2.4. Flydende eller halvflydende foder, som ikke kan gøres homogent

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til prøveudtagning er udvalgt, udtages prøver fra forskellige niveauer.

Enkeltprøver kan ligeledes udtages, når partiet aftappes, men de første fraktioner kasseres.

Under alle omstændigheder må den samlede udtagne mængde ikke være mindre end 10 liter.

9.2.5. Foderblokke og mineralske sliksten

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal blokke eller sliksten til prøveudtagning er udvalgt, kan der udtages en del af hver blok eller sliksten. I tilfælde af mistanke om en uhomogen blok eller sliksten, kan hele blokken eller slikstenen udtages som prøve.

For blokke eller sliksten, der ikke vejer over 1 kg stykket, udgøres en enkeltprøve af indholdet af én blok eller én sliksten.

9.3. Klargøring af samleprøver

Enkeltprøverne sammenblandes, så de udgør en enkelt samleprøve.

9.4. Klargøring af slutprøver

Samleprøven blandes omhyggeligt ( 4 ).

— Hver prøve anbringes i en egnet beholder. Alle nødvendige forholdsregler tages for at undgå, at prøven forurenes eller forfalskes, eller at sammensætningen ændres under transport eller opbevaring.

— Ved kontrol af bestanddele eller stoffer, der er homogent fordelt i foderet, kan samleprøven reduceres på en repræsentativ måde til mindst 2,0 kg eller 2,0 liter (reduceret prøve) ( 5 ) helst ved anvendelse af en mekanisk eller en automatisk prøvedeler. Ved kontrol af forekomst af pesticidrester i bælgfrugter, korn og trænødder er minimumsstørrelsen af den reducerede prøve 3 kg. Hvis fodertypen umuliggør anvendelse af en prøvedeler, eller hvis der ikke er en prøvedeler til rådighed, kan prøven reduceres ved firdeling (kvartning). Fra de reducerede prøver klargøres slutprøverne (til kontrol-, kontraprøve- og referenceformål) af tilnærmelsesvis samme størrelse og under overholdelse af de kvantitative krav i afsnit 7. Ved kontrol af bestanddele, herunder genetisk modificeret materiale eller stoffer, der sædvanligvis er uhomogent fordelt i fodermidler, skal samleprøven være: — — fuldstændigt homogeniseret og derefter opdelt i slutprøver eller — reduceret til mindst 2 kg eller 2 liter ( 6 ) ved anvendelse af en mekanisk eller automatisk prøvedeler. Kun i tilfælde, hvor fodertypen forhindrer anvendelse af en prøvedeler, kan prøven om nødvendigt reduceres ved firdeling. Med henblik på kontrol af forekomst af genetisk modificeret materiale i henhold til forordning (EU) nr. 619/2011 skal den reducerede prøve indeholde mindst 35 000 frø/korn for at opnå de slutprøver, der kræves til håndhævelses-, kontraprøve- og referenceformål på mindst 10 000 frø/korn (jf. fodnote (**) i afsnit 6 og fodnote (*) i afsnit 7).

9.5. Emballering af prøver

Beholdere eller pakninger plomberes og forsynes med etiketter på en sådan måde, at de ikke kan åbnes, uden at plomben beskadiges. Hele etiketten skal anbringes inden for plomben.

9.6. Forsendelse af prøver til laboratoriet

Prøven sendes så hurtigt som muligt til det udpegede analyselaboratorium sammen med de for analysen nødvendige oplysninger.

10. REGISTRERING AF PRØVEUDTAGNING

Hver prøve skal registreres, således at portionen, der prøvetages af, og dens størrelse utvetydigt kan identificeres.

Desuden skal enhver afvigelse fra den fremgangsmåde for prøveudtagning, der er fastsat i denne forordning, registreres.

De registrerede oplysninger stilles til rådighed for det officielle kontrollaboratorium samt for lederen af foderstofvirksomheden og/eller det laboratorium, som er udpeget af foderstofvirksomheden.









BILAG II

ALMINDELIGE BESTEMMELSER VEDRØRENDE ANALYSEMETODER FOR FODER

A. KLARGØRING AF PRØVER TIL ANALYSE

1. Formål

De nedenfor beskrevne fremgangsmåder omhandler klargøring til analyse af prøver, der efter udtagning sendes til kontrollaboratorierne i overensstemmelse med bilag I.

Laboratorieprøverne klargøres således, at de i henhold til analysemetoderne afvejede mængder er homogene og repræsentative for slutprøverne.

2. Forholdsregler

Fremgangsmåden for klargøring af prøven afhænger af, hvilke analysemetoder der skal anvendes, og hvilke bestanddele eller stoffer der skal kontrolleres. Det er derfor yderst vigtigt at sikre, at den fremgangsmåde for klargøring af prøven, der følges, passer til den anvendte analysemetode og til de bestanddele eller stoffer, der skal kontrolleres.

Alle nødvendige arbejdsgange udføres, så det så vidt muligt undgås at forurene prøven og ændre dens sammensætning.

Formaling, blanding og sigtning gennemføres så hurtigt som muligt, og således at prøven udsættes mindst muligt for luft og lys. Der anvendes ikke kværne og andre formalingsapparater med væsentlig tilbøjelighed til at frembringe varme i prøven.

Særligt varmefølsomt foder bør formales manuelt. Det sikres tillige, at apparaturet i sig selv ikke forurener.

Kan klargøringen ikke foretages uden væsentlige ændringer af prøvens vandindhold, bestemmes vandindholdet før og efter klargøringen efter den metode, der er fastsat i del A i bilag III.

3. Fremgangsmåde

3.1. Generel fremgangsmåde

Testdelprøven udtages af slutprøven. Neddeling efter keglemetoden og firdeling (kvartning) kan ikke anbefales, da disse metoder giver risiko for uhomogene delprøver.

3.1.1. Foder, der kan formales direkte

— Den sigtede slutprøve blandes og opsamles i en egnet, ren og tør beholder med lufttæt lukning. Slutprøven blandes igen for at sikre fuldstændig homogenisering umiddelbart før afvejning til analyse (testdelprøve).

3.1.2. Foder, der kan formales efter tørring

— Medmindre andet er angivet for analysemetoden, tørres slutprøven, så den får et vandindhold på 8-12 %, i overensstemmelse med den fremgangmåde for fortørring, der er anført i punkt 4.3 om metoden til bestemmelse af vandindhold i del A i bilag III. Der fortsættes som beskrevet i punkt 3.1.1.

3.1.3. Flydende eller halvflydende foder

— Slutprøven opsamles i en ren, tør og egnet beholder med lufttæt lukning. Slutprøven blandes grundigt for at sikre fuldstændig homogenisering umiddelbart før afvejning til analyse (testdelprøve).

3.1.4. Andet foder

— Slutprøver, der ikke kan klargøres i overensstemmelse med en af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder, behandles på anden måde, så der skabes sikkerhed for, at de mængder, der afvejes til analyse (testdelprøve), er homogene og repræsentative for slutprøverne.

3.2. Særlig fremgangsmåde i tilfælde af undersøgelse ved visuel eller ved mikroskopisk kontrol eller i tilfælde, hvor samleprøven er homogeniseret

— I tilfælde af en undersøgelse ved visuel kontrol (uden anvendelse af mikroskop) anvendes hele laboratorieprøven til undersøgelsen.

— I tilfælde af en mikroskopisk undersøgelse kan laboratoriet reducere samleprøven eller reducere den reducerede prøve yderligere. Slutprøver til kontraprøve- og eventuelt referenceformål udtages efter en fremgangsmåde svarende til den fremgangsmåde, der følges for slutprøver til kontrolformål.

— Hvis hele samleprøven er homogeniseret, udtages slutprøverne fra den homogeniserede samleprøve.

4. Opbevaring af prøverne

Prøverne opbevares ved en temperatur, der ikke ændrer deres sammensætning. Prøver, der er bestemt til analyse af vitaminer eller særligt lysfølsomme stoffer, opbevares under sådanne betingelser, at prøven ikke påvirkes negativt af lys.

B. KRAV TIL REAGENSER OG APPARATUR, DER ANVENDES I FORBINDELSE MED ANALYSEMETODERNE

1. Medmindre andet er angivet for analysemetoderne, skal alle reagenser være af analysekvalitet (p.a.). Ved udførelse af en sporstofanalyse kontrolleres reagensernes renhed ved en blindprøve. Resultatet af blindprøven er afgørende for, om der kræves yderligere oprensning af reagenserne.

2. Til alle former for fremstilling af opløsninger, fortynding, skylning eller vaskning, der er angivet i forbindelse med analysemetoderne, uden at opløsnings- eller fortyndingsmidlets art er omtalt, anvendes vand. Som generel regel gælder det, at der anvendes demineraliseret eller destilleret vand. I særlige tilfælde, som angivet i de beskrevne analysemetoder, er det nødvendigt at underkaste vandet særlige oprensningsprocesser.

3. Standardapparatur, der normalt findes på kontrollaboratorier, er ikke omtalt i forbindelse med analysemetoderne; derimod omtales specialinstrumenter og -udstyr samt instrumenter og udstyr, hvis brug der stilles særlige krav til. Instrumenter og apparatur skal være rene, især ved bestemmelse af meget små stofmængder.

C. ANVENDELSE AF ANALYSEMETODERNE OG ANGIVELSE AF RESULTATER

1. Ekstraktionsprocedure

Der er flere metoder, der omfatter en specifik ekstraktionsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre ekstraktionsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte ekstraktionsprocedure bevisligt frembyder en ekstraktionseffektivitet for den analyserede matrix, der svarer til effektiviteten af den i metoden omtalte fremgangsmåde.

2. Oprensningsprocedure

Der er flere metoder, der omfatter en specifik oprensningsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre oprensningsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte oprensningsprocedure bevisligt giver analyseresultater for den analyserede matrix, der svarer til de resultater, som opnås med den i metoden omtalte fremgangsmåde.

3. Antal bestemmelser

I forbindelse med analyse af uønskede stoffer gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. I andre tilfælde er det nødvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af prøver. Gennemsnittet af de to bestemmelser, hvor der tages hensyn til måleusikkerheden, anvendes til at verificere, om kravene er opfyldt.

Ved kontrol af det angivne indhold af et stof eller en ingrediens gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse bekræfter det angivne indhold, dvs. hvis analyseresultatet ligger inden for det acceptable variationsområde for det angivne indhold, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. I andre tilfælde er det nødvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af prøver. Gennemsnittet af de to bestemmelser, hvor der tages hensyn til måleusikkerheden, anvendes til at verificere, om kravene er opfyldt.

I visse tilfælde er det acceptable variationsområde fastsat i lovgivningen, som f.eks. i Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 767/2009 af 13. juli 2009 om markedsføring og anvendelse af foder, om ændring af Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1831/2003, og om ophævelse af Rådets direktiv 79/373/EØF, Kommissionens direktiv 80/511/EØF, Rådets direktiv 82/471/EØF, 83/228/EØF, 93/74/EØF, 93/113/EF og 96/25/EF og Kommissionens beslutning 2004/217/EF ( 7 ).

4. Afrapportering af anvendt analysemetode

Analyserapporten skal angive den anvendte analysemetode.

5. Afrapportering af analyseresultater

Analyseresultatet angives som anført i analysemetoden med et tilstrækkeligt antal betydende cifre og korrigeres om nødvendigt til samme vandindhold, som slutprøven havde før prøveklargøringen.

6. Måleusikkerhed og genfindingsprocent i forbindelse med analyse af uønskede stoffer

For så vidt angår uønskede stoffer som omhandlet i direktiv 2002/32/EF bør et produkt til foderbrug anses for ikke at overholde det fastsatte maksimumsindhold, hvis analyseresultatet beregnet ved et vandindhold på 12 % vurderes at overstige maksimumsindholdet under hensyntagen til den ekspanderede måleusikkerhed og korrektion for genfinding. Det vurderes, om maksimumsindholdet er overholdt, ved at vurdere analyseresultatet korrigeret for genfinding og fratrukket ekspanderet måleusikkerhed. Dette gælder kun i tilfælde, hvor analysemetoden tillader vurdering af måleusikkerheden og korrektion for genfinding (hvilket f.eks. ikke er tilfældet ved mikroskopering).

Analyseresultatet skal afrapporteres som følger (hvis den anvendte analysemetode tillader vurdering af måleusikkerhed og genfindingsprocent):

a) ved korrektion for genfinding den angivne genfindingsprocent. Ved en genfindingsprocent på 90-110 % er korrektion for genfinding ikke påkrævet

b) som »x +/– U«, hvor x er analyseresultatet og U er den ekspanderede måleusikkerhed, idet der anvendes en dækningsfaktor på 2, hvilket giver et konfidensniveau på ca. 95 %.

Analyseresultatet kan dog, hvis resultatet af analysen er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, hvis der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer, og hvis analysen udelukkende har til formål at kontrollere, at gældende lovgivning er overholdt, indberettes uden korrektion for genfinding, ligesom det i sådanne tilfælde kan undlades at indberette genfindingsprocent og måleusikkerhed.

▼B









BILAG III

ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF SAMMENSÆTNINGEN AF FODERMIDLER OG FODERBLANDINGER

A. BESTEMMELSE AF VANDINDHOLD

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme vandindholdet i foder. For så vidt angår foder indeholdende flygtige stoffer, såsom organiske syrer, skal det bemærkes, at der sammen med vandindholdet også bestemmes betydelige mængder flygtige stoffer.

Metoden er ikke beregnet på analyse af mejeriprodukter, der anvendes som fodermidler, analyse af mineralske stoffer og blandinger, der overvejende består af mineralske stoffer, analyse af animalsk og vegetabilsk fedt eller analyse af olieholdige frø og frugter.

2. Princip

Prøven tørres under nærmere angivne betingelser, som er afhængige af foderets art. Vægttabet bestemmes ved vejning. For fast foder med højt vandindhold er yderligere fortørring nødvendig.

3. Apparatur

3.1. Formalingsapparat udført i et materiale, der ikke er fugtabsorberende, og som er let at gøre rent, muliggør en hurtig og ensartet formaling uden mærkbar varmeudvikling, så vidt muligt forhindrer kontakt med den omgivende luft og opfylder kravene i punkt 4.1.1 og 4.1.2 (f. eks. mikrohammermøller, mikroformalingsapparater med vandkøling, demontable keglemøller, langsomtløbende keglemøller og tandskivemøller)

3.2. Analysevægt med 1 mg aflæsningsnøjagtighed

3.3. Tørre vejekar af korrosionsbestandigt metal eller glas med lufttæt lukning; nyttearealet skal være stort nok til, at prøven kan fordeles med ca. 0,3 g/cm2

3.4. Elektrisk opvarmet, temperaturreguleret tørreskab (± 2 oC), som sikrer hurtig regulering af temperaturen og med god ventilation ( 8 ).

3.5. Elektrisk opvarmet justerbart vakuumtørreskab med oliepumpe, som enten er forsynet med en anordning til tilførsel af tørret varmluft eller med et tørremiddel (f.eks. calciumoxid)

3.6. Ekssikkator med tyk, perforeret plade af metal eller porcelæn indeholdende et virksomt tørringsmiddel.

4. Fremgangsmåde

NB De under dette punkt beskrevne arbejdsgange skal udføres straks efter åbningen af de pakninger, som indeholder prøverne. Analyserne skal foretages mindst to gange.

4.1. Klargøring

4.1.1. Foder, bortset fra det under punkt 4.1.2 og 4.1.3 nævnte

Der udtages mindst 50 g af prøven, som — om nødvendigt — formales eller neddeles på fornøden vis for at undgå varierende fugtighedsgrader (se punkt 6).

4.1.2. Korn og gryn

Der udtages mindst 50 g af prøven. Den formales, så kornstørrelsen ved sigtning med masker på 0,5 mm tillader passage af mindst 50 %, og at der ved sigtning med runde masker på 1 mm bliver højst 10 % tilbage.

4.1.3. Flydende eller grødagtigt foder; foder overvejende bestående af fedt

Der udtages ca. 25 g af prøven, afvejet med 10 mg nøjagtighed, som blandes med en tilsvarende mængde vandfrit sand, afvejet med 10 mg nøjagtighed, indtil der fremkommer en homogen vare.

4.2. Tørring

4.2.1. Foder, bortset fra det under punkt 4.2.2 og 4.2.3 nævnte

Et vejekar med låg (3.3) vejes med 1 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 103 oC opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i 4 timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 103 oC. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30-45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed.

For prøver af foder overvejende bestående af fedt foretages yderligere en tørring på 30 minutter i tørreskabet ved 130 oC. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold.

4.2.2. Korn, mel, gryn og grutning

Et vejekar med låg (3.3) vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 130 oC opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i 2 timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 130 oC. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30–45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed.

4.2.3. Foderblandinger indeholdende mere end 4 % saccharose eller lactose: fodermidler såsom johannesbrødskrå, hydrolyserede kornprodukter, maltspirer, sukkerroesnitter, fiskepressevand og sukker, samt foderblandinger med mere end 25 % mineralske salte inkl. krystalvand

Et vejekar med låg (3.3) vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 80-85 oC opvarmet vakuumtørreskab (3.5). For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet.

Trykket indstilles til 100 torr, og prøven tørres i 4 timer ved dette tryk enten under tilførsel af varm, tør luft eller ved hjælp af et tørringsmiddel (ca. 300 g til 20 prøver). I sidstnævnte tilfælde afbrydes forbindelsen til vakuumpumpen, så snart det foreskrevne tryk er nået. Tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 80–85 oC. Efter tørringstidens udløb bringes tørreskabet forsigtigt op på atmosfærisk tryk. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret straks med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30–45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed. Der tørres i yderligere 30 minutter under vakuum i tørreskabet ved 80–85 oC, og derefter vejes på ny. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold.

4.3. Fortørring

4.3.1. Foder, bortset fra det under punkt 4.3.2 nævnte

Fast foder med højt vandindhold, og hvis formaling er vanskelig, skal fortørres som følger:

50 g af den ikke-formalede prøve (om nødvendigt foretages en grov neddeling af presset eller klumpet foder) afvejes med 10 mg nøjagtighed i en egnet beholder (f. eks. en aluminiumskål på 20 × 12 cm med en kant på 0,5 cm). Der tørres i tørreskab ved 60-70 oC, indtil vandindholdet er reduceret til mellem 8 og 12 %. Beholderen tages ud af tørreskabet og henstilles utildækket til afkøling i laboratoriet i 1 time, hvorefter der vejes med 10 mg nøjagtighed. Alt efter foderets art foretages, som beskrevet i punkt 4.1.1, derefter straks en formaling, og der tørres som beskrevet i punkt 4.2.1 eller 4.2.3.

4.3.2. Korn

Korn med et vandindhold på over 17 % skal fortørres som følger:

50 g af de ikke-formalede korn afvejes med 10 mg nøjagtighed i en egnet beholder (f. eks. en aluminiumskål på 20 × 12 cm med en kant på 0,5 cm) og tørres i tørreskab i 5-7 minutter ved 130 oC, hvorefter prøven tages ud af tørreskabet. Prøven henstilles utildækket til afkøling i laboratoriet i 2 timer, hvorefter der vejes med 10 mg nøjagtighed. Straks efter formales som beskrevet i punkt 4.1.2 og tørres som beskrevet i punkt 4.2.2.

5. Beregning af resultater

Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formler:

5.1. Tørring uden fortørring

hvor:

m = prøvens begyndelsesvægt i gram

m0 = den tørre prøves vægt i gram.

5.2. Tørring med fortørring

hvor:

m = prøvens begyndelsesvægt i gram

m1 = prøvens vægt i gram efter fortørring

m2 = prøvens vægt i gram efter formaling

m0 = den tørre prøves vægt i gram.

5.3. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,2 % vandindhold i absolut værdi.

6. Bemærkning

Hvis det viser sig at være nødvendigt med formaling og der i den forbindelse må påregnes en ændring af materialets vandindhold, skal analyseresultaterne for foderets bestanddele korrigeres i overensstemmelse med originalprøvens vandindhold.

B. BESTEMMELSE AF VANDINDHOLDET I ANIMALSK OG VEGETABILSK FEDT

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme animalske og vegetabilske fedtstoffers og oliers vandindhold (vand og flygtige stoffer).

2. Princip

Prøven tørres ved 103 °C, indtil vægten ikke mere formindskes (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg). Vægttabet bestemmes ved vejning.

3. Apparatur

3.1. Fladbundet beholder af korrosionsbestandigt materiale, diameter: 8-9 cm, højde: ca. 3 cm

3.2. Termometer med forstærket kugle og udvidelsesrum i den øverste ende, inddelt i grader fra ca. 80 °C til mindst 110 °C, længde: ca. 10 cm

3.3. Sandbad eller elektrisk varmeplade

3.4. Ekssikkator indeholdende et effektivt tørremiddel

3.5. Analysevægt.

4. Fremgangsmåde

Ca. 20 g af den homogeniserede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i den tørre, tarerede beholder (3.1), hvori termometret (3.2) er anbragt. Prøven opvarmes på sandbadet eller varmepladen (3.3) under stadig omrøring med termometret, så den når en temperatur på 90 °C i løbet af ca. 7 minutter.

Varmen dæmpes efter den hyppighed, med hvilken boblerne stiger op fra beholderens bund. Temperaturen må ikke overstige 105 °C. Bliv ved med at røre og skrabe bunden, indtil der ikke dannes flere bobler.

For at sikre, at fugtigheden helt er fjernet, gentages opvarmningen til 103 °C ± 2 ° flere gange, med afkøling til 93 °C mellem de på hinanden følgende opvarmninger. Derefter henstilles til afkøling til rumtemperatur i ekssikkatoren (3.4) og vejes. Denne proces gentages, indtil vægttabet mellem to afvejninger ikke overstiger 2 mg.

NB Hvis prøvens vægt øges efter gentagne opvarmninger, er dette tegn på oxidering af fedtstoffet. I så fald beregnes resultatet af den afvejning, der er blevet foretaget, umiddelbart inden vægtforøgelsen begyndte.

5. Beregning af resultater

Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formel:

hvor:

m = prøvens vægt i gram

m1 = beholderens og indholdets vægt i gram inden opvarmning

m2 = beholderens og indholdets vægt i gram efter opvarmning.

Resultater på under 0,05 % opføres som »mindre end 0,05 %«.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,05 % vandindhold i absolut værdi.

C. BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF RÅPROTEIN

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af råprotein i foder på basis af nitrogenindholdet (Kjeldahls metode).

2. Princip

Prøven destrueres med svovlsyre under tilstedeværelse af en katalysator. Syreopløsningen gøres alkalisk med en natriumhydroxidopløsning. Ammoniakken destilleres og opsamles i en nøjagtigt afmålt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre titreres med en standardnatriumhydroxidopløsning.

Alternativt destilleres den frigjorte ammoniak i et overskud af borsyreopløsning, hvorefter der titreres med en saltsyre- eller svovlsyreopløsning.

3. Reagenser

3.1. Kaliumsulfat.

3.2. Katalysator: kobber(II)oxid (CuO) eller kobber(II)sulfatpentahydrat (CuSO4 · 5H2O).

3.3. Granuleret zink.

3.4. Svovlsyre, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,25 mol/liter.

3.6. Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,10 mol/liter.

3.7. Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,05 mol/liter.

3.8. Indikator af methylrødt; 300 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9. Natriumhydroxidopløsning (teknisk kvalitet kan bruges), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Natriumhydroxid, standardopløsning, c(NaOH) = 0,25 mol/liter.

3.11. Natriumhydroxid, standardopløsning, c(NaOH) = 0,10 mol/liter.

3.12. Granuleret pimpsten, vasket i saltsyre og udglødet.

3.13. Acetanilid (smeltepunkt = 114 oC, N-indhold = 10,36 %).

3.14. Saccharose (nitrogenfri).

3.15. Borsyre (H3BO3).

3.16. Indikatoropløsning af methylrødt: 100 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol eller methanol.

3.17. Opløsning af bromcresolgrønt: 100 mg bromcresolgrønt opløses i 100 ml ethanol eller methanol.

3.18. Borsyreopløsning (10–40 g/liter, afhængigt af det anvendte apparatur)

Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, skal borsyreopløsningerne tilføres methylrødt- og bromcresolgrøntindikatorer. Fremstilles 1 liter borsyreopløsning, tilsættes der, inden tilpasning af volumen, 7 ml indikatoropløsning af methylrødt (3.16) og 10 ml opløsning af bromcresolgrønt (3.17).

Borsyreopløsningens pH-værdi vil kunne variere fra batch til batch afhængigt af vandet, der bruges. Det vil ofte være nødvendigt at justere med en lille mængde alkali for at opnå en positiv blindprøve.

NB En god justering opnås normalt ved at tilsætte ca. 3–4 ml NaOH (3.11) til 1 liter borsyreopløsning på 10 g/liter. Opløsningen opbevares ved rumtemperatur og beskyttes under opbevaringen mod lys og ammoniakdampe.

3.19. Standardsaltsyreopløsning, c(HCl) = 0,10 mol/liter.

NB Der kan anvendes opløsninger i andre koncentrationer (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 og 3.19), forudsat at der korrigeres herfor i beregningerne. Koncentrationen skal altid angives med fire decimaler.

4. Apparatur

Apparat egnet til destruktion, destillation og titrering efter Kjeldahls metode.

5. Fremgangsmåde

5.1. Destruktion

1 g af prøven afvejes med 0,001 g nøjagtighed og overføres til destruktionskolben. Der tilsættes 15 g kaliumsulfat (3.1), en passende mængde katalysator (3.2) (0,3 –0,4 g kobber(II)oxid eller 0,9 –1,2 g kobber(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svovlsyre (3.4) og eventuelt nogle få korn pimpsten (3.12) og blandes.

Kolben opvarmes, forsigtigt i begyndelsen, og omrystes om nødvendigt af og til forsigtigt, indtil prøven er forkullet og skummet forsvundet. Derefter opvarmes kraftigere, indtil væsken koger jævnt. Opvarmningen er tilstrækkelig, hvis den kogende syre fortætter sig på kolbens væg. Det må forhindres, at siderne bliver overophedet, og at organiske partikler klæber til dem.

Når opløsningen bliver klar og lysegrøn, fortsættes kogningen i yderligere to timer. Derefter henstilles kolben til afkøling.

5.2. Destillation

Der tilsættes forsigtigt tilstrækkeligt vand til, at sulfaterne opløses fuldstændigt. Kolben henstår til afkøling, hvorefter der om nødvendigt tilsættes nogle få zinkkorn (3.3). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2.1 eller 5.2.2.

5.2.1. Destillation i svovlsyre

I destillationsapparatets opsamlingskolbe anbringes en nøjagtigt afmålt mængde på 25 ml svovlsyre (3.5 eller 3.7) afhængigt af det formodede nitrogenindhold. Der tilsættes nogle få dråber indikator af methylrødt (3.8).

Destruktionskolben forbindes med destillationsapparatets svaler, og svalerens nederste del nedsænkes i væsken i opsamlingskolben til en dybde af mindst 1 cm (se bemærkning 8.3). 100 ml natriumhydroxidopløsning (3.9) overføres forsigtigt til destruktionskolben, uden at der mistes ammoniak (se bemærkning 8.1). Kolben opvarmes, indtil ammoniakken er destilleret over.

5.2.2. Destillation i borsyre

Foretages titreringen af destillatets ammoniakindhold manuelt, følges den nedenfor beskrevne fremgangsmåde. Er destillationsenheden fuldt automatiseret, så også titreringen af destillatets ammoniakindhold sker automatisk, følges brugsanvisningen til destillationsenheden.

En opsamlingskolbe med 25-30 ml af borsyreopløsningen (3.18) anbringes under svalerens afløbsåbning, således at tilførselsrøret befinder sig under overfladen i den overskydende borsyreopløsning. Destillationsenheden indstilles til at give 50 ml natriumhydroxidopløsning (3.9). Destillationsenheden betjenes i overensstemmelse med brugsanvisningen, og den ammoniak, der er frigivet ved tilførslen af natriumhydroxidopløsningen, afdampes. Destillatet opsamles i forlaget med borsyre. Destillatmængden (dampdestillationstiden) afhænger af mængden af nitrogen i prøven. Brugsanvisningen følges.

NB I en halvautomatisk destillationsenhed sker tilførslen af overskydende natriumhydroxid samt dampdestillationen automatisk.

5.3. Titrering

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.1 eller 5.3.2.

5.3.1. Svovlsyre

Den overskydende svovlsyre i opsamlingskolben titreres med natriumhydroxidopløsning (3.10 eller 3.11) afhængigt af koncentrationen af den anvendte svovlsyre, indtil ækvivalenspunktet er nået.

5.3.2. Borsyre

Med en burette titreres opsamlingskolbens indhold med standardsaltsyreopløsningen (3.19) eller med standardsvovlsyreopløsningen (3.6), og den anvendte titrantmængde aflæses.

Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, er ækvivalenspunktet nået ved det første tegn på pinkfarvning af indholdet. Buretteaflæsningen anslås med 0,05 ml nøjagtighed. En oplyst magnetisk omrørerplade eller en fotometrisk detektor vil kunne lette visualiseringen af ækvivalenspunktet.

Processen kan gøres automatisk ved anvendelse af en dampdestillationsenhed med automatisk titrering.

Brugsanvisningen til den enkelte destillationsenhed eller destillationsenhed/titrator følges.

NB Anvendes et automatisk titreringssystem, begynder titreringen umiddelbart efter, at destillationen er begyndt, og borsyreopløsningen på 1 % (3.18) anvendes. Gøres der brug af en fuldautomatisk destillationsenhed, kan den automatiske titrering af ammoniakken også foretages med endpointbestemmelse, idet der så anvendes et potentiometrisk pH-system. I dette tilfælde anvendes en automatisk titrator med pH-meter. pH-metret skal være korrekt kalibreret i området pH 4-pH 7 i overensstemmelse med almindelige laboratorie-pH-kalibreringsprocedurer. pH-titreringsækvivalenspunktet nås ved en pH-værdi på 4,6 , som er det sted på titreringskurven, hvor hældningen er stejlest.

5.4. Blindprøve

For at sikre, at reagenserne er nitrogenfrie, foretages der en blindprøve (destruktion, destillation og titrering) ved brug af 1 g saccharose (3.14) i stedet for prøven.

6. Beregning af resultater

Beregningerne foretages som beskrevet i punkt 6.1 eller 6.2.

6.1. Titreringsberegning, jf. 5.3.1

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

Vo = mængde (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) forbrugt i blindprøven

V1 = mængde (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) forbrugt ved titreringen af prøven

c = koncentration (mol/liter) af natriumhydroxid (3.10 eller 3.11)

m = prøvens vægt i gram.

6.2. Titreringsberegning, jf. 5.3.2

6.2.1. Titrering med saltsyre

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

m = testportionens vægt i gram

c = koncentration (mol/liter) af standardsaltsyreopløsningen (3.19)

V0 = mængde (ml) saltsyre anvendt i blindprøven

V1 = mængde (ml) saltsyre anvendt i testportionen.

6.2.2. Titrering med svovlsyre

Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel:

hvor:

m = testportionens vægt i gram

c = koncentration (mol/liter) af standardsvovlsyreopløsningen (3.6)

V0 = mængde (ml) svovlsyre (3.6) anvendt i blindprøven

V1 = mængde (ml) svovlsyre (3.6) anvendt i testportionen.

7. Kontrol af metoden

7.1. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

— 0,2 % i absolut værdi for råproteinindhold på under 20 %

— 1,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for råproteinindhold på 20–40 %

— 0,4 % i absolut værdi for råproteinindhold på over 40 %.

7.2. Nøjagtighed

Analysen (destruktion, destillation og titrering) foretages på 1,5 –2,0 g acetanilid (3.13) under tilstedeværelse af 1 g saccharose (3.14). 1 g acetanilid kræver 14,80 ml svovlsyre (3.5). Genfindingsprocenten skal være mindst 99 %.

8. Bemærkninger

8.1. Apparaturet kan være manuelt, halvautomatisk eller automatisk. Hvis apparaturet kræver overførsel mellem destruktions- og destillationstrinet, skal sådan overførsel kunne ske uden tab. Hvis destillationsapparatets kolbe ikke har skilletragt, tilsættes natriumhydroxiden, lige inden kolben forbindes med svaleren, idet væsken hældes langsomt ned langs siden.

8.2. Hvis destruktionsproduktet størkner, gentages bestemmelsen med brug af en større mængde svovlsyre (3.4) end angivet ovenfor.

8.3. For produkter med lavt nitrogenindhold kan mængden af svovlsyre (3.7), der skal bruges i opsamlingskolben, om nødvendigt mindskes til 10 eller 15 ml og fyldes op med vand til 25 ml.

8.4. Til rutineanalyser kan der anvendes alternative analysemetoder til bestemmelse af råprotein, men Kjeldahls metode som beskrevet her i del C er referencemetoden. Det skal for hver enkelt matrix godtgøres, at de resultater, der opnås med den alternative metode (f.eks. DUMAS), svarer til dem, der opnås med referencemetoden. Eftersom resultaterne, der opnås med en alternativ metode, kan afvige en smule fra de resultater, der opnås med referencemetoden, selv efter ækvivalenskontrol, er det nødvendigt i analyserapporten at angive, hvilken analysemetode der er anvendt til bestemmelse af råprotein.

D. BESTEMMELSE AF URINSTOF

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af urinstof i foder.

2. Princip

Prøven opslæmmes i vand under tilsætning af et klaringsmiddel. Suspensionen filtreres. Filtratets indhold af urinstof bestemmes, efter tilsætning af 4-dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB), ved måling af ekstinktionen ved en bølgelængde på 420 nm.

3. Reagenser

3.1. 4-Dimethylaminobenzaldehydopløsning: 1,6 g 4-DMAB opløses i 100 ml 96 % ethanol, og der tilsættes 10 ml saltsyre (ρ20 = 1,19 g/ml). Dette reagens kan højst holde sig i to uger.

3.2. Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 · 2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.3. Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 · 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml.

3.4. Aktivt kul, der ikke absorberer urinstoffet (skal kontrolleres).

3.5. Urinstof, 0,1 % opløsning (w/v).

4. Apparatur

4.1. Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet

4.2. Reagensglas: 160 × 16 mm, med slibprop

4.3. Spektrofotometer.

5. Fremgangsmåde

5.1. Analyse af prøven

2 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 1 g aktivt kul (3.4) i en 500 ml målekolbe. Der tilsættes 400 ml vand og 5 ml Carrez-reagens I (3.2) og blandes i ca. 30 sekunder, hvorefter der tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (3.3). Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet. Der fyldes op med vand til mærket, omrystes og filtreres.

5 ml af de klare og farveløse filtrater udtages med pipette og hældes i reagensglassene med slibprop, hvorefter der tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (3.1) og blandes. Glassene anbringes i vandbad ved 20 oC (+/- 4 oC). Efter 15 minutter måles ekstinktionen i prøveopløsningen i spektrofotometret ved 420 nm ved sammenligning med reagensernes blindprøveopløsning.

5.2. Kalibreringskurve

Der udtages volumener på 1, 2, 4, 5 og 10 ml af urinstofopløsningen (3.5), disse hældes i 100 ml målekolber, og der fyldes op med vand til mærket. Der udtages 5 ml af hver opløsning, hver af dem tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (3.1), der homogeniseres, og ekstinktionen måles, som angivet ovenfor, ved sammenligning med en kontrolopløsning, som indeholder 5 ml 4-DMAB og 5 ml vand uden urinstof. Kalibreringskurven tegnes.

6. Beregning af resultater

Bestem mængden af urinstof i prøven ved benyttelse af kalibreringskurven.

Resultatet angives i procent af prøven.

7. Bemærkninger

7.1. Hvis indholdet af urinstof er større end 3 %, reduceres analyseprøven til 1 gram, eller den oprindelige opløsning fortyndes så meget, at der ikke er mere end 50 mg urinstof i 500 ml.

7.2. Hvis indholdet af urinstof er ringe, forøges prøvens volumen i det omfang, filtratet vedbliver at være klart og farveløst.

7.3. Hvis prøven indeholder simple kvælstofforbindelser, som for eksempel aminosyrer, foretages målingen af ekstinktionen ved 435 nm.

E. BESTEMMELSE AF FLYGTIGE KVÆLSTOFHOLDIGE BASER

I. BESTEMMELSE VED MIKRODIFFUSION

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvælstofholdige baser, udtrykt som ammoniak, i foder.

2. Princip

Prøven ekstraheres med vand, og opløsningen klares og filtreres. De flygtige kvælstofholdige baser udskilles efter tilsætning af kaliumcarbonatopløsning ved mikrodiffusion, opfanges i en borsyreopløsning og titreres med svovlsyre.

3. Reagenser

3.1. Trichloreddikesyre, 20 % opløsning (w/v).

3.2. Indikator: 33 mg bromcresolgrønt og 65 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol 95–96 % (v/v).

3.3. Borsyreopløsning: 10 g borsyre opløses i en 1 liter målekolbe indeholdende 200 ml ethanol 95–96 % (v/v) og 700 ml vand. 10 ml af indikatoren (3.2) tilsættes. Opløsningen blandes og bringes om nødvendigt under tilsætning af natriumhydroxidopløsning til at antage en lyserød farve. 1 ml af denne opløsning kan binde op til 300 μg NH3.

3.4. Mættet kaliumcarbonatopløsning: 100 g kaliumcarbonat opløses i 100 ml kogende vand. Efter afkøling filtreres opløsningen.

3.5. Svovlsyre, 0,01 mol/liter.

4. Apparatur

4.1. Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet

4.2. Conwayskåle (se skitse) af glas eller plastic

4.3. Mikroburetter inddelt i 1/100 ml.

5. Fremgangsmåde

10 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed, kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml målekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet. Der tilsættes 50 ml trichloreddikesyreopløsning (3.1), fyldes op med vand til mærket, omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter.

1 ml borsyreopløsning (3.3) afpipetteres i Conwayskålens midte, hvorefter 1 ml af prøvefiltratet overføres til skålens ring. Skålen tildækkes delvist med det let indfedtede låg. 1 ml af den mættede kaliumcarbonatopløsning (3.4) kommes hurtigt ned i ringen, og skålen lukkes, så den er lufttæt. Skålen drejes forsigtigt i vandret stilling, så de to reagenser blandes. Der inkuberes i mindst 4 timer ved rumtemperatur eller i 1 time ved 40 oC.

De i borsyreopløsningen indeholdte flygtige baser titreres derefter med svovlsyre (3.5) ved anvendelse af en mikroburette (4.3).

På samme måde udføres en blindprøve under udeladelse af analyseprøven.

6. Beregning af resultater

1 ml 0,01 mol/liter svovlsyre svarer til 0,34 mg ammoniak.

Resultatet angives i procent af prøven.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige:

— 10 % i relativ værdi ved indhold på mindre end 1,0 % ammoniak

— 0,1 % i absolut værdi ved indhold på 1,0 % ammoniak og derover.

7. Bemærkning

Har prøven et indhold på mere end 0,6 % ammoniak, fortyndes det oprindelige filtrat.

II. BESTEMMELSE VED DESTILLATION

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvælstofholdige baser, udtrykt som ammoniak, i fiskemel, som praktisk talt ikke indeholder urinstof. Metoden anvendes kun ved indhold på mindre end 0,25 % ammoniak.

2. Princip

Prøven ekstraheres med vand, og opløsningen klares og filtreres. De flygtige kvælstofholdige baser udskilles efter tilsætning af magnesiumoxid ved kogetemperatur og opfanges i en bestemt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre tilbagetitreres med en natriumhydroxidopløsning.

3. Reagenser

3.1. Trichloreddikesyre, 20 % opløsning (w/v)

3.2. Magnesiumoxid

3.3. Skumdæmpende emulsion (f.eks. silikone)

3.4. Svovlsyre, 0,05 mol/liter

3.5. Natriumhydroxidopløsning, 0,1 mol/liter

3.6. Methylrødtopløsning, 0,3 % i 95–96 % (v/v) ethanol.

4. Apparatur

4.1. Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet

4.2. Destillationsapparatur af Kjeldahl-typen.

5. Fremgangsmåde

10 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml målekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet. Der tilsættes 50 ml trichloreddikesyreopløsning (3.1), fyldes op med vand til mærket, omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter.

Afhængigt af det formodede indhold af flygtige kvælstofholdige baser udtages en mængde af det klare filtrat (normalt 100 ml). Det fortyndes til 200 ml, og der tilsættes 2 g magnesiumoxid (3.2) samt nogle få dråber skumdæmpende emulsion (3.3). Opløsningen skal reagere alkalisk over for lakmuspapir; i modsat fald tilsættes yderligere magnesiumoxid (3.2). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2 og 5.3 for analysemetoden til bestemmelse af indholdet af råprotein (del C i dette bilag).

På samme måde udføres en blindprøve under udeladelse af analyseprøven.

6. Beregning af resultater

1 ml 0,05 mol/liter svovlsyre svarer til 1,7 mg ammoniak.

Resultatet angives i procent af prøven.

Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % ammoniak i relativ værdi.

F. BESTEMMELSE AF AMINOSYRER (BORTSET FRA TRYPTOPHAN)

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af frie (syntetiske og naturlige) og totale (peptidbundne og frie) aminosyrer i foder ved brug af en aminosyreanalysator. Metoden kan anvendes til følgende aminosyrer: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, histidin, isoleucin, leucin, phenylalanin, prolin, serin, tyrosin og valin.

Metoden skelner ikke mellem salte af aminosyrer og kan ikke differentiere mellem D- og L-former af aminosyrer. Den er ikke anvendelig til bestemmelse af tryptophan- eller hydroxyanaloger af aminosyrer.

2. Princip

2.1. Frie aminosyrer

Frie aminosyrer ekstraheres med fortyndet saltsyre. Kvælstofholdige makromolekyler, der ekstraheres samtidig, udfældes med sulfosalicylsyre og fjernes ved filtrering. Den filtrerede opløsnings pH-værdi justeres til 2,20 . Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm.

2.2. Totale aminosyrer

Den valgte metode afhænger af de aminosyrer, der skal undersøges. Cyst(e)in og methionin skal oxideres til henholdsvis cysteinsyre og methioninsulfon inden hydrolyse. Tyrosin skal bestemmes i hydrolysater af uoxiderede prøver. Alle de øvrige aminosyrer, der er nævnt i punkt 1, kan bestemmes i enten den oxiderede eller den uoxiderede prøve.

Oxidering sker ved 0 oC med en phenolholdig permyresyre. Overskydende oxideringsreagens destrueres med natriumdisulfit. Den oxiderede eller uoxiderede prøve hydrolyseres med saltsyre (3.20) i 23 timer. Hydrolysatets pH-værdi justeres til 2,20 . Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm (440 nm for prolin).

3. Reagenser

Der skal anvendes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS).

3.1. Hydrogenperoxid, w (w/v) = 30 %.

3.2. Myresyre, w (w/v) = 98–100 %.

3.3. Phenol.

3.4. Natriumdisulfit.

3.5. Natriumhydroxid.

3.6. 5-Sulfosalicylsyre-dihydrat.

3.7. Saltsyre, massefylde: ca. 1,18 g/ml.

3.8. Tri-natriumcitrat-dihydrat.

3.9. 2,2 '-Thiodiethanol (thiodiglycol).

3.10. Natriumchlorid.

3.11. Ninhydrin.

3.12. Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC.

3.13. Norleucin eller anden forbindelse, der er egnet til brug som intern standard.

3.14. Nitrogengas (< 10 ppm oxygen).

3.15. 1-Octanol.

3.16. Aminosyrer

3.16.1. Standardstoffer som anført i punkt 1. Rene forbindelser, der ikke indeholder krystalvand. Tørres under vakuum over P205 eller H2SO4 i 1 uge inden brug.

3.16.2. Cysteinsyre.

3.16.3. Methioninsulfon.

3.17. Natriumhydroxidopløsning, c = 7,5 mol/liter:

300 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op til 1 liter.

3.18. Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/liter:

40 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op til 1 liter.

3.19. Phenolholdig myresyreopløsning:

889 g myresyre (3.2) blandes med 111 g vand, og der tilsættes 4,73 g phenol (3.3).

3.20. Hydrolyseblanding, c = 6 mol HCl/liter indeholdende 1 g phenol/liter:

Der tilsættes 1 g phenol (3.3) til 492 ml HCl (3.7) og fyldes op med vand til 1 liter.

3.21. Ekstraktionsopløsning, c = 0,1 mol HCl/liter indeholdende 2 % thiodiglycol: 8,2 ml HCl (3.7) opløses i ca. 900 ml vand, hvorefter der tilsættes 20 ml thiodiglycol (3.9) og fyldes op med vand til 1 liter (3.7 og 3.9 må ikke blandes direkte).

3.22. 5-Sulfosalicylsyreopløsning, ß = 6 %:

60 g 5-sulfosalicylsyre (3.6) opløses i vand, og der fyldes op med vand til 1 liter.

3.23. Oxideringsreagens (permyresyre-phenol):

0,5 ml hydrogenperoxid (3.1) blandes med 4,5 ml phenolholdig myresyreopløsning (3.19) i et lille bægerglas. Inkuberes ved 20–30 oC i 1 time for at danne permyresyre. Herefter afkøles opløsningen i isbad (15 minutter), inden den tilsættes prøven.

Advarsel: Undgå kontakt med huden, og bær beskyttelsesbeklædning.

3.24. Citratbuffer, c = 0,2 mol Na+/liter, pH 2,20 :

19,61 g natriumcitrat (3.8), 5 ml thiodiglycol (3.9), 1 g phenol (3.3) og 16,50 ml HCl (3.7) opløses i ca. 800 ml vand. pH justeres til 2,20 . Der fyldes op med vand til 1 liter.

3.25. Elueringsbuffere fremstillet ifølge betingelserne for den benyttede analysator (4.9).

3.26. Ninhydrinreagens fremstillet ifølge betingelserne for den benyttede analysator (4.9).

3.27. Standardopløsninger af aminosyrer. Opløsningerne opbevares ved < 5 oC.

3.27.1. Standardstamopløsning af aminosyrer (3.16.1)

c = 2,5 μmol/ml af hver i saltsyre.

Kan fås i handelen.

3.27.2. Standardstamopløsning af cysteinsyre og methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml

0,2115 g cysteinsyre (3.16.2) og 0,2265 g methioninsulfon (3.16.3) opløses i citratbuffer (3.24) i en 1 liter målekolbe, og der fyldes op til mærket med citratbuffer. Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 12 måneder. Denne opløsning benyttes ikke, hvis standardstamopløsningen (3.27.1) indeholder cysteinsyre og methioninsulfon.

3.27.3. Standardstamopløsning af den interne standard, f.eks. norleucin, c = 20 μmol/ml

0,6560 g norleucin (3.13) opløses i citratbuffer (3.24) i en målekolbe, og der fyldes op med citratbuffer til 250 ml. Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 6 måneder.

3.27.4. Kalibreringsopløsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater, c = 5 nmol/50 μl cysteinsyre og methioninsulfon og c = 10 nmol/50 μl af de øvrige aminosyrer. 2,2 g natriumchlorid (3.10) opløses i et 100 ml bægerglas med 30 ml citratbuffer (3.24). Der tilsættes 4,00 ml standardstamopløsning af aminosyrer (3.27.1), 4,00 ml standardstamopløsning af cysteinsyre og methioninsulfon (3.27.2) og, hvis benyttet, 0,50 ml standardstamopløsning af intern standard (3.27.3). pH justeres til 2,20 med natriumhydroxid (3.18).

Opløsningen overføres kvantitativt til en 50 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med citratbuffer (3.24) og blandes.

Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 3 måneder.

Se også bemærkning 9.1.

3.27.5. Kalibreringsopløsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater fremstillet under punkt 5.3.3.1 og til brug med ekstrakter (5.2). Kalibreringsopløsningen fremstilles efter punkt 3.27.4, men der tilsættes ikke natriumchlorid.

Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 3 måneder.

4. Apparatur

4.1. 100 eller 250 ml rundbundet kolbe med tilbagesvaler.

4.2. 100 ml borsilikatglasflaske med skruelåg forsynet med gummi/teflonpakning (f.eks. Duran, Schott) til brug i tørreskab.

4.3. Tørreskab med motordreven ventilation og temperaturindstilling med en nøjagtighed på ± 2 oC.

4.4. pH-meter (aflæsning med tre decimaler).

4.5. Membranfilter (0,22 μm).

4.6. Centrifuge.

4.7. Rotationsvakuumfordamper.

4.8. Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører.

4.9. Aminosyreanalysator eller HPLC-udstyr med ionbyttekolonne, anordning til ninhydrin-postkolonne-derivatisering og fotometrisk detektor.

Kolonnen pakkes med sulfoneret polystyrenresin, der kan adskille aminosyrerne fra hinanden og fra andre ninhydrinpositive stoffer. Pumperne til buffer- og ninhydrinopløsningen skal i den tid, der omfatter såvel standardkalibreringskørslen som prøveanalysen, have en flowstabilitet på ±0,5 %.

Nogle aminosyreanalysatorer kan benyttes, hvor hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/liter og indeholder den resterende myresyre fra oxideringstrinnet. Andre analysatorer giver ikke tilfredsstillende adskillelse af visse aminosyrer, hvis hydrolysatet indeholder overskydende myresyre og/eller høje natriumionkoncentrationer. I så fald reduceres syrevolumen ved inddampning til ca. 5 ml efter hydrolysen og inden pH-justeringen. Inddampningen foretages under vakuum ved højst 40 oC.

5. Fremgangsmåde

5.1. Klargøring af prøven

Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 oC eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.12) inden formaling.

5.2. Bestemmelse af frie aminosyrer i foder og forblandinger

En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en konisk kolbe, og der tilsættes 100,0 ml ekstraktionsopløsning (3.21). Blandingen rystes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.8). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et 100 ml bægerglas.

Der tilsættes 5,0 ml sulfosalicylsyreopløsning (3.22) under omrøring, og der omrøres fortsat med magnetomrører i 5 minutter. Supernatanten filtreres eller centrifugeres for at fjerne eventuelt bundfald. 10,0 ml af den klarede opløsning kommes i et 100 ml bægerglas, og pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.18). Opløsningen overføres med citratbuffer (3.24) til en målekolbe af passende størrelse, og der fyldes op til mærket med citratbufferopløsningen (3.24).

Hvis der bruges en intern standard, tilsættes 1,00 ml intern standard (3.27.3) for hver 100 ml slutopløsning, og der fyldes op til mærket med bufferopløsningen (3.24).

Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Hvis ekstraktet ikke kromatograferes samme dag, skal det opbevares ved < 5 oC.

5.3. Bestemmelse af totale aminosyrer

5.3.1. Oxidering

0,1 –1 g af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i:

— en 100 ml rundbundet kolbe (4.1) til åben hydrolyse (5.3.2.3), eller

— en 250 ml rundbundet kolbe (4.1), hvis der kræves en lav natriumkoncentration (5.3.3.1), eller

— en 100 ml flaske med skruelåg (4.2) til lukket hydrolyse (5.3.2.4).

Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg og et vandindhold på højst 100 mg.

Kolben/flasken anbringes i isbad og nedkøles til 0 oC, hvorefter der tilsættes 5 ml oxideringsblanding (3.23) og omrøres ved hjælp af en glasspatel med bøjet spids. Kolben/flasken, der indeholder spatelen, lukkes med lufttæt film. Isbadet med den lukkede beholder anbringes i et køleskab ved 0 oC og henstår i 16 timer. Efter 16 timer tages det ud af køleskabet, og det overskydende oxideringsreagens destrueres ved tilsætning af 0,84 g natriumdisulfit (3.4).

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.1.

5.3.2. Hydrolyse

5.3.2.1. Hydrolyse af oxiderede prøver

Den oxiderede prøve (5.3.1) tilsættes 25 ml hydrolyseblanding (3.20). Alle prøverester, der måtte sidde fast på beholderen og spatelen, skal omhyggeligt vaskes ned.

Alt efter den benyttede hydrolysemetode fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hydrolyse af uoxiderede prøver

0,1 –1 g af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en 100 ml eller 250 ml rundbundet kolbe (4.1) eller en 100 ml flaske med skruelåg (4.2). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes forsigtigt 25 ml hydrolyseblanding (3.20), som blandes med prøven. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.3. Åben hydrolyse

Der tilsættes tre glasperler til blandingen i kolben (klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2). Den opvarmes til kogning og holdes under konstant kogning med tilbagesvaler i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen skylles tilbagesvaleren med 5 ml citratbuffer (3.24). Kolben aftages og afkøles i isbad.

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3.

5.3.2.4. Lukket hydrolyse

Flasken med blandingen klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2 anbringes i et tørreskab (4.3) ved 110 oC. For at forhindre trykopbygning (på grund af udvikling af gasser) og undgå eksplosion lægges skruelåget i den første time løst på flasken. Flasken må ikke lukkes med skruelåget. Efter en times forløb lukkes flasken med skruelåget og henstår i tørreskabet (4.3) i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen tages flasken ud af tørreskabet, skruelåget åbnes forsigtigt, og kolben anbringes i isbad, hvor den henstår til afkøling.

Alt efter metoden for justering af pH-værdien (5.3.3) overføres kolbens indhold kvantitativt med citratbuffer (3.24) til et 250 ml bægerglas eller til en 250 ml rundbundet kolbe.

Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3.

5.3.3. Justering af pH-værdien

Alt efter aminosyreanalysatorens (4.9) natriumtolerance foretages justeringen af pH-værdien som beskrevet i punkt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2.

5.3.3.1. For kromatografisystemer (4.9), der kræver en lav natrium-koncentration:

Det er tilrådeligt at bruge en intern standardstamopløsning (3.27.3), hvis der benyttes aminosyreanalysatorer, der kræver en lav natriumkoncentration (hvor syreindholdet skal reduceres).

I så fald tilsættes 2,00 ml af den interne standardstamopløsning (3.27.3) til hydrolysatet før inddampningen.

Der tilsættes 2 dråber 1-octanol (3.15) til det efter punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat.

Volumen reduceres ved hjælp af rotationsfordamperen (4.7) til 5–10 ml under vakuum ved 40 oC. Hvis volumen ved et uheld reduceres til under 5 ml, kasseres hydrolysatet, og analysen gentages.

pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.18), og der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4.

5.3.3.2. For andre aminosyreanalysatorer (4.9) :

Det efter 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat neutraliseres delvis ved under omrøring at tilsætte 17 ml natriumhydroxidopløsning (3.17), samtidig med at temperaturen holdes under 40 oC.

pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.17 og 3.18) ved rumtemperatur. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4.

5.3.4. Prøveopløsning til kromatografi

Hydrolysatet (5.3.3.1 eller 5.3.3.2) justeret til en pH-værdi på 2,20 overføres med citratbuffer (3.24) kvantitativt til en 200 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med buffer (3.24).

Hvis en intern standard anvendes, og denne ikke allerede er tilsat, tilsættes der 2,00 ml intern standard (3.27.3) og fyldes op til mærket med citratbuffer (3.24). Der blandes omhyggeligt.

Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Hvis prøveopløsningen ikke kromatograferes samme dag, skal den opbevares ved < 5 oC.

5.4. Kromatografi

Inden kromatografi opvarmes ekstraktet (5.2) eller hydrolysatet (5.3.4) til rumtemperatur. Blandingen rystes, og en passende mængde filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter (4.5). Der foretages ionbytningskromatografi af den fremstillede klarede opløsning ved brug af en aminosyreanalysator (4.9).

Indsprøjtningen kan foretages manuelt eller automatisk. Hovedsagen er, at der altid tilsættes samme mængde opløsning ± 0,5 % til kolonnen til analyse af standardopløsninger og prøveopløsninger, undtagen i tilfælde, hvor der bruges en intern standard. Forholdet mellem natrium og aminosyre i standard- og prøveopløsningerne skal være så ens som muligt.

Kalibreringshyppigheden afhænger normalt af stabiliteten af ninhydrinreagenset og det anvendte analysatorsystem. Standard- eller prøveopløsningen fortyndes med citratbuffer (3.24), således at der for standarden fremkommer et topareal på 30–200 % af arealet af toppene for aminosyrerne i prøveopløsningen.

Kromatografien af aminosyrerne vil variere lidt afhængigt af den anvendte type analysator og kolonnematerialet. Systemet skal kunne adskille aminosyrerne fuldstændigt fra hinanden og fra øvrige ninhydrinpositive stoffer. Kromatografisystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons på ændringer i mængderne af aminosyrer, der tilsættes kolonnen.

Hvis der analyseres en ækvimolær opløsning (af de aminosyrer, der skal bestemmes), skal der ved kromatografien opnås nedenstående forhold mellem dal og tophøjde. Den ækvimolære opløsning skal indeholde mindst 30 % af den største mængde af hver aminosyre, der kan måles præcist med aminosyreanalysatoren (4.9).

Ved adskillelsen af threonin og serin må forholdet mellem dal og tophøjde for den laveste af de to sammenhængende aminosyretoppe ikke være større end 2:10. (Hvis der kun bestemmes cyst(e)in, methionin, threonin og lysin, vil utilstrækkelig adskillelse fra nabotoppe indvirke uheldigt på bestemmelsen.) For alle øvrige aminosyrer skal adskillelsen være bedre end 1:10.

Systemet skal sikre, at lysin adskilles fra artefakter fra andre lysinlignende stoffer og ornithin.

6. Beregning af resultater

Arealet af toppene i prøve- og standardopløsningerne måles for hver enkelt aminosyre, og mængden (X) beregnes i gram aminosyre pr. kg prøve:

Ved anvendelse af en intern standard multipliceres med:

A = topareal for hydrolysat eller ekstrakt

B = topareal for standardkalibreringsopløsning

C = topareal for intern standard i hydrolysat eller ekstrakt

D = topareal for intern standard, standardkalibreringsopløsning

M = molarvægt af den aminosyre, der skal bestemmes

c = standardopløsningens koncentration i μmol/ml

m = prøvens vægt i gram (korrigeret til oprindelig vægt hvis tørret eller affedtet)

V = ml totalhydrolysat (5.3.4) eller ml beregnet total fortyndingsvolumen af ekstraktet (6.1).

Såvel cystin som cystein bestemmes som cysteinsyre i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som cystin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) ved anvendelse af M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Methionin bestemmes som methioninsulfon i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som methionin ved anvendelse af M af methionin (149,21 g/mol).

Tilsat fri methionin bestemmes efter ekstraktion som methionin, hvorved der benyttes samme M til beregningen.

6.1. Totale fortyndingsvolumen af ekstrakter (F) til bestemmelse af frie aminosyrer (5.2) beregnes som følger:

V = slutekstraktets volumen.

7. Evaluering af metoden

Metoden er blevet afprøvet ved en international ringanalyse i 1990 med anvendelse af fire forskellige typer foder (svinefoderblanding, slagtefjerkræblanding, proteinkoncentrat og en forblanding). Resultaterne af middel- og standardafvigelse efter fjernelse af outliers er vist i tabellerne under dette punkt:







Middelværdi i g/kg Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Slagtefjerkræblanding 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Proteinkoncentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Forblanding 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = antal deltagende laboratorier.

7.1. Repeterbarhed

Repeterbarheden for de undersøgte aminosyrer udtrykt som »standardafvigelse inden for laboratorier« for de ovennævnte prøver er gengivet i nedenstående tabel.







Standardafvigelse inden for laboratorier (Sr) i g/kg Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Slagtefjerkræblanding 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Proteinkoncentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Forblanding 1,30 n= 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = antal deltagende laboratorier.







Variationskoefficient ( %) for standardafvigelsen inden for laboratorier (Sr) Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Slagtefjerkræblanding 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Proteinkoncentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Forblanding 2,2 n= 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = antal deltagende laboratorier.

7.2 Reproducerbarhed

Resultaterne af standardafvigelse mellem laboratorier for ovennævnte undersøgelser er vist i nedenstående skema.







Standardafvigelse mellem laboratorier (SR) i g/kg Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Slagtefjerkræblanding 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Proteinkoncentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Forblanding 2,49 n= 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = antal deltagende laboratorier.







Variationskoefficient ( %) for standardafvigelsen mellem laboratorier (SR) Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Slagtefjerkræblanding 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Proteinkoncentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Forblanding 4,3 n= 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = antal deltagende laboratorier.

8. Anvendelse af referencematerialer

Det undersøges, om metoden er brugt korrekt, ved at foretage gentagne målinger af certificerede referencematerialer, når sådanne forefindes. Det anbefales at kalibrere med certificeret aminosyrekalibreringsopløsning.

9. Bemærkninger

9.1. På grund af forskelle mellem aminosyreanalysatorer skal slutkoncentrationerne af kalibreringsopløsningerne af standardaminosyrerne (se punkt 3.27.4 og 3.27.5) og hydrolysatet (se punkt 5.3.4) betragtes som en retningslinje.

Apparatets lineære responsskala skal kontrolleres for alle aminosyrer.

Standardopløsningen fortyndes med citratbuffer for at opnå toparealer midt på skalaen.

9.2. Hvis der anvendes HPLC-udstyr til at analysere hydrolysaterne, skal kørselsbetingelserne optimeres i henhold til fabrikantens anbefaling.

9.3. Hvis metoden anvendes på foder, der indeholder mere end 1 % chlorid (koncentrat, mineralfoder, fodertilskud), vil der kunne ske en undervurdering af methionin, og der skal foretages en særlig behandling.

G. BESTEMMELSE AF TRYPTOPHAN

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode gør det muligt at bestemme det samlede indhold af tryptophan (totaltryptophan) og frit tryptophan i foder. Der differentieres ikke mellem D- og L-former.

2. Princip

Til bestemmelse af totaltryptophan hydrolyseres prøven i basisk miljø i en mættet bariumhydroxidopløsning og holdes opvarmet til 110 oC i 20 timer. Efter hydrolysen tilsættes der intern standard.

Til bestemmelse af frit tryptophan ekstraheres prøven i svagt sur væske under tilstedeværelse af intern standard.

Tryptophanet og den interne standard i hydrolysatet eller i ekstraktet bestemmes ved HPLC med fluorescensdetektor.

3. Reagenser

3.1. Der benyttes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS/cm).

3.2. Standardstof: tryptophan (renhedsgrad/indhold ≥ 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentoxid.

3.3. Internt standardstof: α-methyltryptophan (renhedsgrad/indhold ≥ 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentoxid.

3.4. Bariumhydroxidoctahydrat (man skal passe på ikke at udsætte Ba(OH)2.8H2O for meget for luft, da der ellers dannes BaCO3, som kan interferere med bestemmelsen) (se bemærkning 9.3).

3.5. Natriumhydroxid.

3.6. Orthophosphorsyre, w (w/w) = 85 %.

3.7. Saltsyre, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8. Methanol, svarende til HPLC-kvalitet.

3.9. Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC.

3.10. Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/liter: 40,0 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op med vand (3.1) til 1 liter.

3.11. Saltsyre, c = 6 mol/liter:

492 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand.

3.12. Saltsyre, c = 1 mol/liter:

82 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand.

3.13. Saltsyre, c = 0,1 mol/liter:

8,2 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand.

3.14. Orthophosphorsyre, c = 0,5 mol/liter:

34 ml orthophosphorsyre (3.6) fortyndes til 1 liter med vand (3.1).

3.15. Koncentreret opløsning af tryptophan (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

I en 500 ml målekolbe opløses 0,2553 g tryptophan (3.2) i saltsyre (3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (3.13). Opløsningen opbevares ved - 18 oC i højst 4 uger.

3.16. Koncentreret opløsning af intern standard, c = 2,5 μmol/ml:

I en 500 ml målekolbe opløses 0,2728 g α-methyltryptophan (3.3) i saltsyre (3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (3.13). Opløsningen opbevares ved - 18 oC i højst 4 uger.

3.17. Standardkalibreringsopløsning af tryptophan og intern standard:

2,00 ml koncentreret opløsning af tryptophan (3.15) og 2,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (α-methyltryptophan) (3.16) fortyndes med vand (3.1) og methanol (3.8) til omtrent samme volumen og omtrent samme methanolkoncentration (10–30 %) som det færdige hydrolysat.

Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen.

Der sørges for beskyttelse mod direkte sollys under fremstillingen.

3.18. Eddikesyre.

3.19. 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol.

3.20. Ethanolamin, w (w/w) > 98 %.

3.21. Opløsning af 1 g 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) i 100 ml methanol (3.8).

3.22. Mobil fase til HPLC: 3,00 g eddikesyre (3.18) + 900 ml vand (3.1) +50,0 ml af opløsningen (3.21) af 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) i methanol (3.8) (1 g pr. 100 ml). pH justeres til 5,00 med ethanolamin (3.20). Der fyldes op med vand (3.1) til 1 000 ml.

4. Apparatur

4.1. HPLC-udstyr med spektrofluorometrisk detektor

4.2. HPLC-kolonne, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm pakkemateriale, eller tilsvarende

4.3. pH-meter

4.4. Polypropylenflaske, 125 ml, med vid hals og skruelåg

4.5. Membranfilter, 0,45 μm

4.6. Autoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1 ) bar

4.7. Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører

4.8. Vortex-blander.

5. Fremgangsmåde

5.1. Klargøring af prøver

Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 oC eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.9) inden formaling.

5.2. Bestemmelse af frit tryptophan (ekstrakt)

En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 1 mg i en konisk kolbe. Der tilsættes 100,0 ml saltsyre (3.13) og 5,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (3.16). Der omrystes eller blandes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.7). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et bægerglas. Der tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (3.14). pH justeres til 3 med natriumhydroxid (3.10). Der tilsættes så meget methanol (3.8), at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (ca. samme volumen som standardkalibreringsopløsningen (3.17)).

Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Standardopløsninger og ekstrakter beskyttes mod direkte sollys. Hvis ekstrakterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 oC i højst 3 dage.

5.3. Bestemmelse af totaltryptophan (hydrolysat)

Med en nøjagtighed på 0,2 mg afvejes 0,1 –1 g af den klargjorte prøve (5.1) i polypropylenflasken (4.4). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes 8,4 g bariumhydroxidoctahydrat (3.4) og 10 ml vand. Der blandes på vortex-blander (4.8) eller magnetomrører (4.7). Den teflonbelagte magnetpind efterlades i blandingen. Flaskens vægge skylles med 4 ml vand. Skruelåget skrues løst på flasken, der sættes ind i autoklaven (4.6) med kogende vand i 30–60 minutter. Autoklaven lukkes, og der autoklaveres ved 110 (± 2) oC i 20 timer.

Temperaturen i autoklaven sænkes til lige under 100 oC, inden den åbnes. For at undgå udkrystallisering af Ba(OH)2 · 8H2O tilsættes der til den varme blanding 30 ml stuevarmt vand. Der omrystes eller omrøres forsigtigt og tilsættes 2,00 ml koncentreret intern standardopløsning (α-methyltryptophan) (3.16). Flasken afkøles i vand/isbad i 15 minutter.

Derefter tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (3.14). Medens flasken stadig står i kølebadet, neutraliseres der med saltsyre (3.11) under omrøring, og pH justeres til 3,0 med saltsyre (3.12). Der tilsættes så meget methanol, at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (f.eks. 100 ml). Der må ikke ske udfældning under methanoltilsætningen.

Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4.

Standardopløsninger og hydrolysater beskyttes mod direkte sollys. Hvis hydrolysaterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 oC i højst 3 dage.

5.4. HPLC-bestemmelse

Nedenstående betingelser for isokratisk eluering er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater (se også bemærkning 9.1 og 9.2).







HPLC-kolonne (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, 3 pakkemateriale, μm eller tilsvarende Kolonnetemperatur: Rumtemperatur Mobil fase (3.22): 3,00 g eddikesyre (3.18) + 900 ml vand (3.1) +50,0 ml af opløsningen (3.21) af 1,1 ,1-trichlor- 2-methyl-2-propanol (3.19) i methanol (3.8) (1 g pr. 100 ml). pH justeres til 5,00 med ethanolamin (3.20). Der fyldes op med vand (3.1) til 1 000 ml Flow: 1 ml/minuttet Total gennemløbstid: ca. 34 minutter Detektionsbølgelængde: excitation: 280 nm, emission: 356 nm Injektionsvolumen: 20 μl.

6. Beregning af resultater

Mængden af tryptophan (X) beregnes i gram pr. 100 g prøve:

A = topareal for intern standard, standardkalibreringsopløsning (3.17)

B = topareal for tryptophan, ekstrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)

V1 = volumen i ml (2 ml) af den mængde koncentreret tryptophanopløsning (3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17)

c = koncentration i μmol/ml (= 2,50 ) af den koncentrerede tryptophanopløsning (3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17)

V2 = volumen i ml af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (3.16), der er tilsat til ekstraktet (5.2) (= 5,00 ml) eller til hydrolysatet (5.3) (= 2,00 ml)

C = topareal for intern standard, ekstrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)

D = topareal for tryptophan, standardkalibreringsopløsning (3.17)

V3 = volumen i ml (= 2,00 ml) af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (3.16), der er tilsat til standardkalibreringsopløsningen (3.17)

m = prøvens vægt i gram (korrigeret til oprindelig vægt, hvis den er tørret og/eller affedtet)

M = tryptophans molarvægt (= 204,23 g/mol).

7. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % i relativ værdi (af det højeste resultat).

8. Resultater af ringanalyse

Der er gennemført en EF-ringanalyse (4. ringanalyse), hvor 3 prøver blev analyseret i op til 12 laboratorier med henblik på certificering af hydrolysemetoden. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:







Prøve 1 Svinefoder Prøve 2 Svinefoder suppleret med L-tryptophan Prøve 3 Foderkoncentrat til svin L 12 12 12 n 50 55 50 Middelværdi [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2

L = antal laboratorier, der har indleveret resultater

n = antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test)

sr = standardafvigelse for repeterbarhed

SR = standardafvigelse for reproducerbarhed

r = repeterbarhed

R = reproducerbarhed

CVr = variationskoefficient for repeterbarhed, %

CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed, %.

Der er også gennemført en EF-ringanalyse (3. ringanalyse), hvor 2 prøver blev analyseret i op til 13 laboratorier med henblik på certificering af metoden til ekstraktion af frit tryptophan. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:







Prøve 4 Blanding af soja og hvede Prøve 5 Blanding af soja og hvede (= prøve 4) med tilsætning af tryptophan (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Middelværdi [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [%] 4,71 5,11

L = antal laboratorier, der har indleveret resultater

n = antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test)

sr = standardafvigelse for repeterbarhed

SR = standardafvigelse for reproducerbarhed

r = repeterbarhed

R = reproducerbarhed

CVr = variationskoefficient for repeterbarhed, %

CVR = variationskoefficient for r