1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS FORORDNING(EØF) nr. 3942/92
af 22. december 1992
om fastlæggelse af en referencemetode til bestemmelse af sitosterol og stigmasterol i butteroil
(EFT L 399 af 31.12.1992, s. 29)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1Kommissionens forordning (EØF) nr. 2539/93 af 15. september 1993 L 233 1 16.9.1993
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 2
▼B
KOMMISSIONENS FORORDNING(EØF) nr. 3942/92
af 22. december 1992
omfastlæggelseafenreferencemetodetilbestemmelseafsitosterol
og stigmasterol i butteroil
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europæiske Økono-miske Fællesskab,
under henvisning til Rådets forordning (EØF) nr. 804/68 af 27. juni
1968 om den fælles markedsordning for mælk og mejeriprodukter(
1),
senest ændret ved forordning (EØF) nr. 2071/92 (2), særlig artikel 6, og
ud fra følgende betragtninger:Butteroil skal kunne spores og kontrolleres i henhold til Kommissionens
forordning (EØF) nr. 3143/85 (
3), senest ændret ved forordning (EØF)
nr. 1264/92 (4), særlig artikel 5 og 6;
butteroil kan spores og skal kontrolleres i henhold til Kommissionens
forordning (EØF) nr. 570/88 (5), senest ændret ved forordning (EØF) nr.
124/92 (6), særlig artikel 3 og 6;
butteroil skal kunne spores og kontrolleres i henhold til Kommissionens
forordning (EØF) nr. 429/90 (7), senest ændret ved forordning (EØF) nr.
1264/92, særlig artikel 10 og 11;
bestemmelserne om sporing af butteroil må overholdes nøje med
henblik på at forhindre uautoriseret anvendelse af smør, hvortil der erydet støtte;
sporing spiller en vigtig rolle i disse støtteordninger, og der må derfor
på EF-plan udarbejdes referencemetoder til påvisning af sporestoffer,der anvendes som led i dise ordninger;
dermed vil det kunne sikres, at man ikke i forbindelse med disse
ordninger forskelsbehandler visse parter eller forvrider konkurrencevil-kårene, som det kan være tilfældet nu som følge af forskelle i medlems-staternes analysemetoder;
det er vanskeligt at udarbejde sådanne referencemetoder for samtlige
sporestoffer samtidigt; det vil være et skridt på vejen, hvis der fastsættesen referencemetode til bestemmelse af stigmasterol og sitosterol i butte-roil;
foranstaltningerne i denne forordning er i overensstemmelse med udta-
lelse fra Forvaltningskomitéen for Mælk og Mejeriprodukter —
UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:
Artikel 1
▼M1
Referenceanalysemetoden til bestemmelse af indholdet af stigmasterol ibutteroil i henhold til artikel 6 i forordning (EØF) nr. 3143/85, artikel 6i forordning (EØF) nr. 570/88 eller artikel 11 i forordning (EØF) nr.429/90 og indholdet af β-sitosterol i butteroil i henhold til artikel 6 i
forordning (EØF) nr. 570/88 er fastsat i bilaget.
(1) EFT nr. L 148 af 28. 6. 1968, s. 13.
(2) EFT nr. L 215 af 30. 7. 1992, s. 64.
(3) EFT nr. L 298 af 12. 11. 1985, s. 9.
(4) EFT nr. L 135 af 19. 5. 1992, s. 5.
(5) EFT nr. L 55 af 1. 3. 1988, s. 31.
(6) EFT nr. L 14 af 21. 1. 1992, s. 28.
(7) EFT nr. L 45 af 21. 2. 1990, s. 8.
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 3
▼B
Butteroil er sporet korrekt, hvis resultaterne er i overensstemmelse medbestemmelserne i punk t 8 i bilaget til denne forordning.
Artikel 2
Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i
De Europæiske Fællesskabers Tidende .
Den anvendes fra den 1. februar 1993.
Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart
i hver medlemsstat.
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 4
▼B
BILAG
BESTEMMELSE AF SITOSTEROL OGSTIG MASTEROL I BUTTE-
ROIL VED GASKROMATOGRAF I KAPILLARKOLONNE
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden består i en procedure til kvantitativ bestemmelse af sitosterol
og stigmasterol i butteroil. Ved sitosterol forstås summen af β-sitosterol
og 22-dihydro- β-sitosterol, eftersom andre sitosteroler anses for at være
uden betydning. Dette gælder for prøver, som er udtaget i henhold tilforordning (EØF) nr. 3143/85, 570/88 og 429/90.
2. PRINCIP
Butteroil’en forsæbes med kaliumhydroxid i en ethanolopløsning og
uforsæbelige bestanddele ekstraheres med diethylether.
Sterolerne omdannes til trimethyisilylethere og analyseres ved gaskro-
matografi i en kapillarkolonne med betulin som intern standard.
3. APPARATUR
3.1. En 150 ml kolbe til forsæbning med tilbagesvaler med glasslib.3.2. 500 ml skilletragte.3.3. 250 ml kolber.3.4. Trykudligningstragte, 250 ml eller tilsvarende, til opsamling af
fordampet diethylether.
3.5. Glaskolonne, 350 mm × 20 mm, med sintret glasskive.3.6. Vandbad eller varmekappe.3.7. Prøveglas, 2 ml.3.8. Gaskromatograf (med splitningssystem), som egner sig til brug med
kapillarkolonne, bestående af:
3.8.1. en kolonneovn, som kan opretholde den ønskede temperatur inden for
±1°C
3.8.2. injektionsblok med temperaturindstilling3.8.3. flammeioniseringsdetektor og konverter/forstærker3.8.4. skriver med integrator, som kan anvendes sammen med konverteren/
forstærkeren (3.8.3).
3.9. Kapillarkolonne i kvartsglas, coated med BP1 eller tilsvarende i en
ensartet lagtykkelse på 0,25 µm; kolonnen skal kunne adskille trimethyl-
silylderivater af lanosterol og sitosterol — en BP1-kolonne på 12 m med0,2 mm indre diameter er velegnet.
3.10. Mikrosprøjte på 1 µm med hærdet nål.
4. REAGENSER
Alle reagenser skal være analytisk rene. Vand skal være destilleret eller
af mindst tilsvarende renhedsgrad.
4.1. Ethanol, mindst 95 %.4.2. Kaliumhydroxid, 60 %: 600 g kaliumhydroxid (minimum 85 %) opløses
i vand og fortyndes til 1 liter med vand.
4.3. Betulin, mindst 99 %.4.3.1. Intern standardopløsning. Betulin i diethylether (4.4).4.3.1.1. Betulinopløsningen til bestemmelse af sitosterol skal være af en koncen-
tration på 1,0 mg/ml.
4.3.1.2. Betulinopløsningen til bestemmelse af stigmasterol skal være af en
koncentration på 0,4 mg/ml.
4.4. Analytisk ren diethylether (fri for peroxider og rester).4.5. Natriumsulfat, vandfrit, granuleret og tørret ved 102 °C i to timer.
4.6. Silyleringsreagens, f. eks. TRI-SIL (kan fås fra Pierce Chemical Co,
katalognummer 49001) eller tilsvarende. (ADVARSEL: TRI-SIL erbrændbart, ætsende, giftigt og muligvis kræftfremkaldende. Laboratorie-
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 5
▼B
personalet skal have kendskab til sikkerhedsbestemmelserne for
TRI-SIL og handle derefter).
4.7. Lanosterol.4.8. Sitosterol af en kendt renhedsgrad på ikke under 90 % (P).
Note 1:Renhedsgraden af standardmaterialer, som anvendes til kalibre-
ring, fastsættes efter standardiseringsprincippet. Det forudsættes, atsamtlige steroler, som findes i prøven, kommer til udtryk på kromato-grammet, at toppenes samlede areal repræsenterer 100 % af sterolind-holdet og at sterolerne fremkalder samme detektorrespons. Systemetslinearitet skal kontrolleres for de aktuelle koncentrationsområder.
4.8.1. Sitosterolstandardopløsning — der fremstilles en opløsning af sitosterol
(4.8) i diethylether (4.4), indeholdende ca. 0,5 mg/ml (med en nøjag-tighed på 0,001 mg/ml) (W
1).
4.9. Stigmasterol af en kendt renhedsgrad på ikke under 90 % (P).4.9.1. Stigmasterolstandardopløsning — der fremstilles en opløsning af stig-
masterol (4.9) i diethylether (4.4), indeholdende ca. 0,2 mg/ml (med ennøjagtighed på 0,001 mg/ml (W
1).
4.10. Opløsning til kontrol af adskillelsesevne. Der fremstilles en opløsning af
0,05 mg lanosterol (4.7) og 0,5 mg sitosterol (4.8) pr. ml diethylether(4.4).
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Fremstilling af standardopløsninger til kromatografi. Tilsætning af intern
standardopløsning (4.3.1) til den pågældende sterolstandardopløsningskal ske samtidig med tilsætning til den forsæbede prøve (se 5.2.2).
5.1.1. Standardkromatografiopløsning for sitosterol; der overføres 1 ml sitoste-
rolstandardopløsning (4.8.1) til hvert af to prøveglas (3.7), og diethylet-heren afdampes med nitrogen. Der tilsættes 1 ml intern standardopløs-ning (4.3.1.1), og diethyletheren afdampes med nitrogen.
5.1.2. Standardkromatografiopløsning for stigmasterol; der overføres 1 ml stig-
masterolstandardopløsning (4.9.1) til hvert af to prøveglas (3.7), ogdiethyletheren afdampes med nitrogen. Der tilsættes 1 ml intern stan-dardopløsning (4.3.1.2), og diethyletheren afdampes med nitrogen.
5.2. Tilberedning af uforsæbelige bestanddele.5.2.1. Der afvejes 1 g butteroil (W
2), med 1 mg nøjagtighed, i en 150 ml kolbe
(3.1). Der tilsættes 50 ml ethanol (4.1) og 10 ml kaliumhydroxidopløs-ning (4.2). Tilbagesvaleren påsættes, og kolben opvarmes til ca. 75 °Ci
30 minutter. Scaleren tages af, og kolben afkøles til rumtemperatur.
5.2.2. Kolben tilsættes 1,0 ml intern standardopløsning. Hvis indholdet af sito-
sterol skal bestemmes, anvendes opløsningen i (4.3.1.1), hvis det drejersig om stigmasterol, anvendes opløsningen i (4.3.1.2). Efter omhyggeligblanding overføres indholdet kvantitativt til en 500 ml skilletragt (3.2),og kolben skylles med 50 ml vand og 250 ml diethylether (4.4). Skillet-ragten rystes kraftigt i to minutter, hvorefter man lader faserne adskilles.Det nedre vandige lag tappes af, og etherlaget vaskes ved at ryste kolbenmed fire hold vand a 100 ml.
Note 2:For at undgå emulsionsdannelse er det meget vigtigt at være
forsigtig ved de første to vaskninger (kolben vendes ti gange). Vedtredje vask rystes kraftigt i 30 sekunder. En eventuel emulsion kanbrydes ved at tilsætte 5 til 10 ml ethanol. Hvis der tilsættes ethanol, skalder foretages yderligere to grundige vaskninger med vand.
5.2.3. Det klare, sæbefrie etherlag ledes igennem en glaskolonne (3.5), som
indeholder 30 g vandfri natriumsulfat (4.5). Etheren opsamles i en250 ml kolbe (3.3). Der tilsættes en kogesten, og etheren afdampes tilnæsten tørhed i vandbad eller varmekappe, mens overskyende opløs-ningsmiddel omhyggeligt opsamles.
Note 3:Hvis prøveekstrakter inddampes til fuldstændig tørhed ved for
høj temperatur, kan der ske tab af sterol.
5.3. Fremstilling af trimethylsilylethere.5.3.1. Den resterende etheropløsning i kolben hældes i et 2 ml prøveglas (3.7)
med 2 ml diethylether, og etheren afdampes med nitrogen. Kolbenskylles med yderligere to hold diethylether a 2 ml. Indholdet hældeshver gang over i prøveglasset, og etheren efdampes med nitrogen.
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 6
▼B
5.3.2. Prøven silyleres ved tilsætning af 1 ml TRI-SIL (4.6). Prøveglasset
lukkes og rystes grundigt for at opløse prøven. Hvis prøven stadig ikkeer fuldstændigt opløst, opvarmes den til 65-70 °C. Prøven henstår i
mindst em minutter, inden den indsprøjtes i gaskromatografen. Referen-ceopløsningerne silyleres på samme måde som prøverne. Opløsningen tilkontrol af adskillelsesevnen (4.10) silyleres på samme måde.
Note 4: Silylering skal foretages i vandfrit miljø. Ved ufuldstændig
silylering ses en top tæt ved betulintoppen.
Ethanol kan give interferens ved silylering. Dette kan skyldes utilstræk-
kelig vaskning under ekstraktionen. Hvis dette problem forekommer,kan der foretages en femte vaskning med kraftig rystning 30 sekunderunder ekstraktionen.
5.4. Gaskromatografisk analyse.5.4.1. Kromatografibetingelser.
Gaskromatografen indstilles som angivet i betjeningsvejledningen.De vejledende kromatografibetingelser er som følger:
— kolonnetemperatur 265 °C
— injektorblokkens temperatur 280 °C
— detektorens temperatur 300 °C
— bæregassens gennemstrømningshastighed 0,6 ml/minut— hydrogentryk 84 KPa— lufttryk 155 kPa— splitningssystemet indstilles til mellem 10:1 og 50:1 og optimeres
i henhold til betjeningsvejledningen, hvorefter detektorresponsenslinearitet kontrolleres inden for det aktuelle koncentrationsområde.
Note 5: Det er af særlig vigtighed, at injektionsblokkens belægning
rengøres regelmæssigt
— indsprøjtet mængde: 1 µl trimethylsilyletheropløsning.
Systemet skal være i ligevægt og grundlinjen stabil, inden analysen
påbegyndes.
Disse betingelser kan fraviges, hvis særlige forhold ved kolonnen og
gaskromatografen gør det nødvendigt for at opnå kromatogrammer, somopfylder følgende krav:
— sitosteroltoppen skal være tydeligt adskilt fra lanosteroltoppen. I
figur ses, hvordan et kromatogram af en silyleret opløsning tilkontrol af adskillelsesevnen (4.10) typisk skal se ud
— den relative retentionstid for følgende steroler skal være ca:
Cholesterol 1,0
Stigmasterol 1,3Sitosterol 1,5Betulin 2,5.
— retentionstiden for betulin skal være ca. 24 minutter.
5.4.2. Analyseprocedure
Der indsprøjtes 1 µl silyleret standardopløsning (stigmasterol eller sito-
sterol), og integratorens kalibreringsparametre indstilles.
Herefter indsprøjtes yderligere 1 µl silyleret standardopløsning for at
bestemme responsfaktorerne for betulin.
Der indsprøjtes 1 µl silyleret prøveopløsning, og toppene aflæses. Hver
kromatografisk serie skal begyndes med og efterfølges af indsprøjtningaf standardopløsninger. Som hovedregel bør der indsprøjtes en standard-opløsning efter en serie på seks prøveopløsninger.
Note 6:Integration af stigmateroltoppen skal også omfatte en evt. hale
som afgrænset af punkt 1, 2 o g 3 i figur 2b.
Integration af sitosteroltoppen skal også omfatte toppen for 22-
dihydro- β-sitosterol (stigmastanol), som eluerer umiddelbart efter sito-
sterol, se figur 3b, når den samlede mængde sitosterol bestemmes.
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 7
▼B
6. BEREGNING AF RESULTATER
6.1. Arealet af steroltoppe og betulintoppe i begge referencekromatogrammer
omkring en serie bestemmes, og R1beregnes således:
R1=gennemsnitligt topareal af sterol i standard
gennemsnitligt topareal af betulin i standard
arealet af steroltoppen (stigmasterol eller sitosterol) og betulintoppen i
prøven bestemmes, og R2beregnes således:
R2=topareal af sterol i prøven
Topareal af betulin i prøven
W1= sterolindhold (i mg) i 1 ml standardopløsning (4.8.1 eller 4.9.1)
W2= prøvens væg t i d (5.2.1)
P = renhedsgrad af sterolstandarden (4.8 eller 4.9)
sterolindhold i prøven (mg/kg) mg/kg =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. METODENS PRÆCISION
7.1. Repeterbarhed.7.1.1. Stigmasterol.
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøve-
materiale foretaget umiddelbart efter hinanden af den samme personmed det samme udstyr må ikke overstige 10,2 mg/kg.
7.1.2. Sitosterol.
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøve-
materiale foretaget umiddelbart efter hinanden af den samme personmed det samme udstyr må ikke være større end 3,6 % af gennemsnittetaf resultaterne.
7.2. Reproducerbarhed.7.2.1. Stigmasterol.
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøve-
materiale, foretaget i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, måikke overstige 25,3 mg/kg.
7.2.2. Sitosterol.
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøve-
materiale, foretaget i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, måikke være større end 8,9 % af gennemsnittet af resultaterne.
7.3. Kilde for bestemmelserne om præcision.
Bestemmelserne om præcision er fastlagt på grundlag af et eksperiment,
som i 1991 blev foretaget med ni laboratorier og seks prøver (blindbe-stemmelse med tre dobbeltprøver) for stigmasterol; seks prøver (blind-bestemmelse med tre dobbeltprøver) for sitosterol.
8. TOLERANCER
8.1. Der udtages tre prøver fra det sporede produkt for at sikre, at resulta-
terne er repræsentative.
8.2. Stigmasterin.8.2.1. Der iblandes 150 g mindst 95 % ren stigmasterol pr. ton butteroil, dvs.
142,5 mg/kg; eller 170 gram mindst 85 % ren stigmasterol pr. ton butte-roil, dvs. 144,5 mg/kg.
8.2.2. Med et konventionelt konfidensinterval på 95 % (CrD
95) må gennem-
snittet af de tre resultater ikke være lavere end 128,3 mg/kg ved iblan-ding af 95 % ren stigmasterol, og 130,3 mg/kg ved iblanding af 85 %ren stigmasterol.
8.2.3. Udover kriterierne i 8.2.2 anvendes det laveste resultat, som opnås ved
analyse af produktet, til at kontrollere, om sporestoffet er jævnt fordelt.Dette gøres ved at sammenholde det med følgende grænseværdier:
— 120,4 mg/kg (95 % af den mindste tilladelige iblanding ved 95 %
ren stigmasterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD
95))
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 8
▼B
— 122,3 mg/kg (95 % af den mindste tilladelige iblanding ved 85 %
ren stigmasterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95))
— 99,0 mg/kg (80 % af den mindste tilladelige iblanding ved 95 % ren
stigmasterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95))
— 100,6 mg/kg (80 % af den mindste tilladelige iblanding ved 85 %
ren stigmasterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95))
Den laveste sporestofkoncentration i prøven sammenholdes med en
interpolering mellem enten 120,4 mg/kg og 99,0 mg/kg eller 122,3 mg/kg og 100,6 mg/kg.
8.3. Sitosterol.8.3.1. Der iblandes 600 g mindst 90 % ren sitosterol pr. ton butteroil, dvs.
540 mg/kg.
8.3.2. Med et konventionelt konfidensinterval på 95 % må gennemsnittet af de
tre resultater ikke være lavere end 513,0 mg/kg.
8.3.3. Udover kriteriet i 8.3.2 anvendes det laveste resultat, som opnås ved
analyse af produktet, til at kontrollere, om sporestoffet er jævnt fordelt.Dette gøres ved at sammenholde det med følgende grænseværdier:
— 484,4 mg/kg (95 % af den mindste tilladelige iblanding ved 90 %
ren sitosterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD
95))
— 403,4 mg/kg (80 % af den mindste tilladelige iblanding ved 90 %
ren sitosterol med konventionelt konfidensinterval (ISO CrD95))
Den laveste sporestofkoncentration i prøven sammenholdes med en
interpolering mellem 484,4 mg/kg og 403,4 mg/kg.
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 9
▼B
Figur 1 Kromatogram af opløsning til kontrol af adskillelsesevne
Det er bedst, hvis toppene er fuldstændig adskilt, dvs. at toppen for
lanosterol går helt ned til basislinjen, før sitosteroltoppen begynder. Envis overlapning kan dog accepteres.

1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 10
▼B
Figur 2a
Stigmasterolstandardopløsning

1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 11
▼B
Figur 2b
Butteroilprøve denatureret med stigmasterol
Bemærk: Integration af stigmasteroltoppen skal også omfatte en eventuel hale
som afgrænset af punkt 1, 2 og 3.
1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 12
▼B
Figur 3a
β-sistosterolstandardopløsning

1992R3942 — DA — 01.02.1993 — 001.001 — 13
▼B
Figur 3b
Butteroilprøve denatureret med β-sitosterol
Bemærk: β-sitosterol indholder ofte et fremmedstof (stigmastanol, som eluerer
umiddelbart efter β-sitosterol. Det samlede indhold af β-sitosterol findes ved at
lægge disse to toppes arealer sammen.