1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91
af 11. juli 1991
om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte
metoder
(EFT L 248 af 5.9.1991, s. 1)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1Kommissionens forordning (EØF) nr. 3682/91 af 17. december 1991 L 349 36 18.12.1991
►M2Kommissionens forordning (EØF) nr. 1429/92 af 26. maj 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Kommissionens forordning (EØF) nr. 1683/92 af 29. juni 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Kommissionens forordning (EØF) nr. 1996/92 af 15. juli 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Kommissionens forordning (EØF) nr. 3288/92 af 12. november 1992 L 327 28 13.11.1992
►M6Kommissionens forordning (EØF) nr. 183/93 af 29. januar 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 ændret ved Kommissionens forordning (EØF) nr. 826/93 af 6. april
1993L 87 6 7.4.1993
►M8Kommissionens forordning (EØF) nr. 620/93 af 17. marts 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Kommissionens forordning (EF) nr. 177/94 af 28. januar 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Kommissionens forordning (EF) nr. 2632/94 af 28. oktober 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11kommissionens forordning (EF) nr. 656/95 af 28. marts 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Kommissionens forordning (EF) nr. 2527/95 af 27. oktober 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13Kommissionens forordning (EF) nr. 2472/97 af 11. december 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14Kommissionens forordning (EF) nr. 282/98 af 3. februar 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15Kommissionens forordning (EF) nr. 2248/98 af 19. oktober 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16Kommissionens forordning (EF) nr. 379/1999 af 19. februar 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17Kommissionens forordning (EF) nr. 455/2001 af 6. marts 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18Kommissionens forordning (EF) nr. 2042/2001 af 18. oktober 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19Kommissionens forordning (EF) nr. 796/2002 af 6. maj 2002 L 128 8 15.5.2002
Berigtiget ved:
►C1Berigtigelse, EFT L 176 af 20.7.1993, s. 26 (183/93)
▼B
KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91
af 11. juli 1991
om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i
den forbindelse anvendte metoder
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det EuropæiskeØkonomiske Fællesskab,
under henvisning til Rådets forordning nr. 136/66/EØF af 22.
september 1966 om oprettelse af en fælles markedsordning for fedt-
stoffer(
1), senest ændret ved forordning (EØF) nr. 3577/90(2), særlig
artikel 35a, og
ud fra følgende betragtninger:
I bilaget til forordning nr. 136/66/EØF er der fastsat betegnelser for og
definitioner på olivenolie og olie af olivenpresserester, der afsættes i deenkelte medlemsstater, i samhandelen mellem medlemsstaterne og isamhandelen mellem medlemsstaterne og tredjelande;
for at kunne skelne mellem de forskellige typer olie er det nødvendigt
at definere de fysisk-kemiske kendetegn for hver type samt de organo-leptiske kendetegn for jomfruolie, således at produkternes renhed ogkvalitet sikres uden at dette berører andre eksisterende bestemmelserpå området;
kendetegnene for de forskellige typer olie bør fastlægges ensartet for
hele Fællesskabet; med henblik herpå bør der fastlægges EF-metoderfor kemisk analyse og orgenoleptisk vurdering; i en overgangsperiodebør medlemsstaterne dog kunne anvende andre metoder, idet det dogskal fastsættes, at det er resultatet af den fælles metode, der gælder i
tilfælde af uoverensstemmelse;
definitionen af de fysisk-kemiske kendetegn for olivenolie og analyse-
metoder indebærer, at de supplerende bestemmelser til kapitel 15 i DenKombinerede Nomenklatur skal tilpasses;
som led i metoden til bedømmelse af jomfruolies organoleptiske kende-
tegn skal der oprettes paneler af udvalgte og øvede smagsdommere; derbør afsættes den fornødne tid til etablering af en sådan struktur; ibetragtning af de vanskeligheder, som visse medlemsstater vil få med
at oprette panelerne, bør det tillades disse medlemsstater at benytte de
i andre medlemsstater eksisterende paneler;
for at ordningen med importafgift på olivenpresserester kan fungere
efter hensigten bør der fastlægges en fælles metode til bestemmelse af
olieindholdet i disse produkter;
for ikke at påføre handelen skade, bør det fastsættes, at det i en
begrænset periode er tilladt at afsætte olie aftappet før denne forord-ningsikrafttræden;
Kommissionens forordning (EØF) nr. 1058/77(
3), senest ændret ved
forordning (EØF) nr. 1858/88(4), bør ophæves;
Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer har ikke afgivet udtalelse inden
for den af formanden fastsatte frist —
UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:
Artikel 1
1. Som jomfruolie (KN-kode 1509 10 90) efter punkt 1, litra a), b)
og c), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtesolie, hvis1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 2
(1) EFT nr. 172 af 30. 9. 1966, s. 3025/66.
(2) EFT nr. L 353 af 17. 12. 1990, s. 23.
(3) EFT nr. L 128 af 24. 5. 1977, s. 6.
(4) EFT nr. L 166 af 1. 7. 1988, s. 10.
▼B
respektive kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt
1, 2 og 3 i bilag I til nærværende forordning.
2. Som bomolie (KN-kode 1509 10 10) efter punkt 1, litra d), i bi-
laget til forordning nr. 136/66/EØF betragtesolie, hviskendetegn er ioverensstemmelse med kendetegnene i punkt 4 i bilag I til nærværendeforordning.
3. Som raffineret olivenolie (KN-kode 1509 90 00) efter punkt 2 i
bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtesolie, hviskendetegn er
i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 5 i bilag I til næværendeforordning.
4. Som olivenolie (KN-kode 1509 90 00) efter punkt 3 i bilaget til
forordning nr. 136/66/EØF betragtesolie, hviskendetegn er i overens -
stemmelse med kendetegnene i punkt 6 i bilag I til næværendeforordning.
5. Som rå olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 10) efter
punkt 4 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtesolie, hvis
kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 7 i bilag I
til nærværende forordning.
6. Som raffineret olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 90)
efter punkt 5 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtesolie,hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 8 i
bilag I til nærværende forordning.
7. Som olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 90) efter punkt
6 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtesolie, hviskendetegner i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 9 i bilag I til nærvæ-rende forordning.
8. For produktionsårene fra ►
M181998/99 til 2002/03 ◄
betragtesendvidere s om jomfruolivenolie efter punkt 1, litra a), b), c)
eller d), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF dog olie, uaftappet eller
i detailemballage med et nettoindhold på mindst 100 kg, der helt haroprindelse i Marokko, og hvis karakteristika er i overensstemmelsemed karakteristikaene i henholdsvis punkt 1, 2, 3 og 4 i bilag I tilnærværende forordning, og hvis indhold af linolensyre uanset stk. 1
og 2 højst er 1 %.
Artikel 2
1. Bestemmelsen af kendetegnene for de i bilag I fastsatte olier sker
ved hjælp af følgende analysemetoder:
— til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre,
metoden i bilag II
— til bestemmelse af peroxidtallet, metoden i bilag III
— til bestemmelse af indholdet af voks: metoden i bilag IV
— til bestemmelse af indholdet af steroler, metoden i bilag V
— til bestemmelse af indholdet af erytrodiol og uvaol, metoden i bilag
VI
— til bestemmelse af indholdet af mættede fedtsyrer i 2-stillingen i
triglycerider, metoden i bilag VII
— til bestemmelse af indholdet af trilinolcin, metoden i bilag VIII— til den spektrofotometriske undersøgelse, metoden i bilag IX
— til bestemmelse af fedtsyrernes sammensætning, metoden i bilag X
Ao gXB
— til bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsnings-
midler, metoden i bilag XI
— til bestemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn, metoden i
bilag XII, anvendt som omhandlet i stk. 2
— til bevisfor raffinering, metoden i bilag XIII1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 3
▼M15
▼B
▼M19
▼B
▼M11
— til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener, metoden i bilag
XVII
— til bestemmelse af indholdet af ECN42-holdige triglycerider,
metoden i bilag XVIII
— til bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer: metoden i bilag
XIX.
2. Den kontrol, som de nationale myndigheder eller deres repræsen-
tanter foretager af de organoleptiske kendetegn for jomfruolie,gennemføres af paneler af smagere, som medlemsstaterne har
godkendt.
De organoleptiske kendetegn for en i første afsnit omhandlet olivenolie
anses for at stemme overens med den anmeldte type olivenolie, hvis etaf den pågældende medlemsstat godkendt panel bekræfter klassifikati-onen i den henseende.
Hvis det godkendte panel ikke bekræfter anmeldelsen med hensyn til
de organoleptiske kendetegn for den anmeldte type olivenolie, lader
de nationale myndigheder eller deresrepræs entanter på den berørte
parts anmodning foretage to kontrolanalyser, som udføres af andregodkendte paneler, og hvoraf mindst den ene udføres af et panel, derer godkendt af den pågældende producentmedlemsstat. De pågældendekendetegn anses for at stemme overens med dem, der er anmeldt, hvisde to kontrolanalyser bekræfter den anmeldte klassifikation. I modsat
fald pålæggeskontrolanalys eudgifterne den berørte part, uden at dette
foregriber anvendelsen af sanktioner.
3. Hvad angår de nationale myndighederseller deresrepræs entanters
kontrol af oliens kendetegn som omhandlet i stk. 1 udtages der prøver
efter de internationale standarder EN ISO 661 og EN ISO 5555 for
forberedelse af prøver til forsøg og prøveudtagning. Uanset punkt 6.8i standard EN ISO 5555 udtages prøverne i henhold til bilag Ia tildenne forordning for partier af den nævnte olie i umiddelbare embal-lager på 100 liter eller derunder.
Med forbehold af bestemmelserne i standard EN ISO 5555 og kapitel 6
i standard ISO 661 beskyttes prøverne hurtigst muligt mod lys og stærkvarme og sendes til laboratoriet til analyse senest:
— den tiende arbejdsdag efter udtagningsdagen i månederne oktober-
maj, og
— den femte arbejdsdag efter udtagningsdagen i månederne juni-
september.
4. Med hensyn til kontrollen i stk. 3 foretages analyserne efter bilag
II, III, IX og XII samt eventuelle kontrolanalyser som fastsat ved nati-onal lov inden datoen for mindste holdbarhed. Udtages prøverne mere
end fire måneder forud for sidste holdbarhedsdato, foretages analyserne
senest fire måneder efter prøveudtagningen. Der gælder ingen fristerfor de øvrige analyser, som er fastsat ved forordningen.
Svarer analyseresultaterne ikke til kendetegnene for den anmeldte kate-
gori olivenolie eller olie af olivenpresserester, underrettes denpågældende herom senest en måned inden udløbet af fristen i første
afsnit, undtagen hvis prøveudtagningen fandt sted mindre end en
måned inden datoen for mindste holdbarhed.
5. Til bestemmelse af olivenoliernes kendetegn efter metoderne
omhandlet i stk. 1 sammenlignes analyseresultaterne direkte med de idenne forordning fastsatte grænseværdier.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 4
▼M13
▼M19
▼M17
▼M19
▼M17
▼M19
▼M19
Artikel►M193◄
Konstateres det, at en olies organoleptiske kendetegn er forskellige fra
dem, der følger af dens benævnelse, anvender medlemsstaten admini-
strative bøder, hvis størrelse afhænger af den konstateredeuregelmæssigheds omfang, uden at dette i øvrigt udelukker eventuelleandre sanktioner.
Ved vurderingen af uregelmæssigheden tages der hensyn til den natur-
lige udvikling i kendetegnene for en olie, der er opbevaret under
normale vilkår.
I begyndelsen af hvert halvår underretter medlemsstaterne om antallet
og arten af konstaterede uregelmæssigheder og de sanktioner, der eranvendt i det foregående halvår.
Artikel 4
1. Med henblik på de nationale myndighederseller deresrepræs en-
tantsvurdering og kontrol af de organoleptis ke kendetegn kanmedlemsstaterne godkende paneler af smagere.
Godkendelsesbetingelserne fastlægges af medlemsstaterne, således at
bl.a.
— betingelserne i bilag XII, punkt 4, opfyldes
— det sikres, at panelets leder optrænes af en virksomhed og på betin-
gelser, som er anerkendt af medlemsstaten i den henseende
— godkendelsens gyldighed gøres afhængig af de resultater, der opnås
ved en årlig kontrolordning, som medlemsstaten har oprettet.
Hver medlemsstat meddeler Kommissionen listen over godkendte
paneler og de foranstaltninger, der er truffet i henhold til dette stykke.
2. Hvis en medlemsstat har vanskeligheder med at oprette et panel
på sit område, kan den gøre brug af et godkendt panel i en andenmedlemsstat.
3. Hver medlemsstat opstiller en liste over de paneler af smagsdom-
mere, der er oprettet af erhvervs- eller brancheorganisationer på de i
stk. 1 fastsatte betingelser, og de kontrollerer, at disse betingelser over-
holdes.
Artikel 6
1. Olieindholdet i presserester og andre restprodukter fra udvinding
af olivenolie (KN-kode 2306 90 11 og 2306 90 19) bestemmes efter
metoden i bilag XV.
2. Det i stk. 1 omhandlede olieindhold udtrykkes i vægtprocent af
tørstoffet.
Artikel 7
EF-bestemmelserne vedrørende forekomsten af andre uønskede stoffer
end dem, der er omhandlet i bilag XI, finder anvendelse.
Artikel 8
1. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen, hvilke foranstaltninger
de træffer til anvendelse af denne forordning.
2. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen i begyndelsen af hvert
halvår en oversigt over analyseresultaterne i forbindelse med debestemmelser, der er foretaget i løbet af det foregående halvår.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 5
▼M5
▼M19
▼M5
▼M19
▼B
▼B
Resultaterne gennemgås af Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer efter
proceduren i artikel 39 i forordning nr. 136/66/EØF.
Artikel 9
Forordning (EØF) nr. 1058/77 ophæves.
Artikel 10
1. Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggø-
relsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende .
Metoden i bilag XII anvendesdog fra den ►M11. november
1992◄, undtagen i forbindelse med interventionsforanstaltninger.
Metoden anvendesikke for jomfruolie, der er aftappet før den 1.
november 1992.
2. Denne forordning anvendesikke for olivenolie og olie af oliven-
presserester, der aftappes inden datoen for denne forordningsikrafttræden, og som bringes i handelen inden den 31. oktober 1992.
Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart
i hver medlemsstat.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 6
▼M5
▼B
▼B
BILAG
Resumé
Bilag I: Karakteristika ved olivenolie …
Bilag Ia: Prøveudtagning for partier af olivenolie eller olie af olivenpres-
serester i umiddelbare emballager på højst 100 liter ...
Bilag II: Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer …
Bilag III: Bestemmelse af peroxidtallet …
Bilag IV: ►M6Bestemmelse af voksindhold ved gaskramatografering
med kapillarkolonne ◄…
Bilag V: Bestemmelse af sammensætningen og indholdet af steroler ved
gaskromatografi på kapillarsøjle …
Bilag VI: Bestemmelse af erythrodiol og uvaol …
Bilag VII: Bestemmelse af fedtsyrer i 2-positionen i triglycerider fra olier
og fedtstoffer …
Bilag VIII: Bestemmelse af indholdet af trilinolein …Bilag IX: Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys …
Bilag XA: Gaskromatografering af fedtsyremethylestere …
Bilag XB: Fremstilling af fedtsyremethylestere …Bilag XI: Bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsnings-
midler i olivenolie …
Bilag XII: Organoleptisk vurdering af jomfruolie …Bilag XIII: ►
M6Neutralisation og blegning af olivenolie i laboratoriet ◄
…
Bilag XV: Olieindhold i presserester af oliven …
Bilag XVI: Bestemmelse af iodtal …
Bilag XVII: Metode til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener i vege-
tabilske olier …
Bilag XVIII: Bestemmelse af indholdet af ECN42-holdige triglycerider ...Bilag XIX: Metode til bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer ...1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 7
▼M17
▼B
▼M19
▼B
▼M11
▼M13
▼M19
BILAG I
KARAKTERISTIK AF OLIVENOLIER
TypeSurhedsgrad
(%) (*)Peroyxidtal
(mEq 02/
kg) (*)Halogene-
rede opløs-
ningsmidler
(mg/
kg) (*) (1)Voks
(mg/kg) (**)Mættede
syrer i 2-
stillingen i
triglyceridet
(%)Stigmasta-
dien
(mg/kg) (2)Forskel
mellem
ECN42
HPLC og
ECN42,
teoretiskberegnetK
232(*) K270(*)K270efter
aluminium-
oxid (3)Delta-K (*)Organolep-
tisk vurde-
ring Median
for mangler
(Mm) (*)Organolep-
tisk vurde-
ring
Median for
lugt og
smag
(Mls) (*)
1. Jomfruolie, ekstra ≤1,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,20 ≤0,10 ≤0,01 Mm = 0 Mls> 0
2. Jomfruolie ≤2,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Mm ≤2,5 Mls> 0
3. Jomfruolie, almindelig ≤3,3 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Mm-
≤6,0 (4)—
4. Bomolie > 3,3 > 20 > 0,20 ≤300 (5)≤1,3 ≤0,50 ≤0,3 ≤3,70 > 0,25 ≤0,11 — Mm > 6 —
5. Olivenolie, raffineret ≤0,5 ≤5 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,40 ≤1,20 — ≤0,16 — —
6. Olivenolie ≤1,5 ≤15 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,30 ≤1,00 — ≤0,13 — —
7. Rå olivenolie af pres-
serester> 0,5 (**) — — >350 (6)≤1,8 — ≤0 , 6 ——————
8. Raffineret olivenolie
af presserester≤0,5 ≤5 ≤0,20 > 350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,50 ≤2,50 — ≤0,25 — —
9. Olivenolie af pressere-
ster≤1,5 ≤15 ≤0,20 > 350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,30 ≤2,00 — ≤0,20 — —
(1) Størst tilladt samlet indhold af halogenerede forbindelser påvist med elektronindfangningsdetektor.
For de enkelte påviste forbindelser er den øvre grænse 0,10 mg/kg.
(2) Summen af isomerer, der (eventuelt) kan adskilles på kapitallarkolonne.
(3) Ved kontrol af, om der er raffineret olie til stede, gentages bestemmelsen af K270efter behandling med aliminimumoxid, hvisK270er over grænsen for den pågældende type.
(4) Hvis medianen for smag og lugt er 0, må medianen for mangler højst være 2,5.
(5) Olie med et voksindhold mellem 300 og 350 mg/kg betragtes som bomolie, hvis det samlede indhold af alifatisk alkohol er 350 mg/kg eller derunder, elle r hvisindholdet af erytrodiol og uvaol er 3,5 % eller derunder.
(6) Olie med et voksindhold mellem 300 og 350 mg/kg betragtes som rå olivenolie af presserester, hvis det samlede indhold af alifatisk alkohol er større e nd 350 mg/kg, og hvisindholdet af erytrodiol og uvaol er s tørre end 3,5 %.▼M191991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 8
TypeSyreindhold
Sum af
isomerer
af trans-
oliesyre
(%)Sum af
isomerer
af trans-
linol og
transli-
nolen
(%)Chole-
sterol
(%)Brassica-
sterol
(%)Campe-
sterol
(%)Stigma-
sterol
(%)Betasito-
sterol
(%) (1)Delta-7-
stigma-
stenol
(%)Steroler i
alt
(mg/kg)Erythro-
diol og
uvaol
(%) (**)Myristin
(%)Linolen
(%)Arachin
(%)Eicosen
(%)Behen
(%)Ligno-
cerin
(%)
1. Jomfruolie, ekstra ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Jomfruolie ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Jomfruolie,
almindelig≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
4. Bomolie ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (2)
5. Olivenolie, raffi-
neret≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Olivenolie ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
7. Rå olivenolie af
presserester≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5 (3)
8. Raffineret oliven-
olie af presserester≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
9. Olivenolie af
presserester≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Summen af delta-5,23-stigmastadienol + chlerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol.
(2) Olie med et voksindhold mellem 300 og 350 mg/kg betragtes som bomolie, hvis det samlede indhold af alifatisk alkohol er 350 mg/kg eller derunder, elle r hvisindholdet af erytrodiol og uvaol er 3,5 % eller derunder.
(3) Olie med et voksindhold mellem 300 og 350 mg/kg betragtes som rå olivenolie af presserester, hvis det samlede indhold af alifatisk alkohol er større e nd 350 mg/kg, og hvisindholdet af erytrodiol og uvaol er s tørre end 3,5 %
Bemærkninger:
a) Analyseresultaterne skal anføres med samme antal decimaler som de tilsvarende værdier i tabellen.
Det sidste tal oprundes med en enhed, hvis det følgende tal overstiger 4.
b) Hvis blot én parameter ikke opfylder kravene til type, klassificeres olien som en anden type, eller olien erklæres for ikke at opfylde renhedskrave ne.
c) De kvalitetsparametre, der er mærket med en asterisk (*), indebærer følgende:
— Bomolie behøver ikke at opfylde kravene for alle disse parametre samtidig (undtagen K232).
— De øvrige jomfruolier skifter type, hvis en eller flere af disse parametre ikke er opfyldt, men forbliver en jomfruolie.
d) De kvalitetsparametre, der er mærket med to asterisker (**), indebærer, at alle de pågældende olivenolier af presserester ikke behøver at opfylde kravene for parametrene samtidig.▼M191991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 9
▼M17
BILAG Ia
Prøveudtagning for partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester i
umiddelbare emballager på højst 100 liter
Denne prøveudtagningsmetode anvendes for partier af olivenolie eller olie af
olivenpresserester på højst 125 000 liter, aftappet i umiddelbare emballager på
højst 100 liter.
Hvisdet pågældende parti er på over 125 000 liter, opdelesdet i nogenlunde
lige store delpartier på 125 000 liter eller derunder. Metoden anvendes da for
det enkelte delparti.
1. Basisprøvens indhold
Den enkelte basisprøve udgøres af:
a) hvisde umiddelbare emballager indeholder 6 l eller derover: olien i en
umiddelbar emballage, fordelt i mindst seks beholdere på 1 l, heraf:
— en beholder til analyserne efter bilag II, III, IX og XII
— en anden beholder til de øvrige analyser, og
— de resterende beholdere til eventuelle kontrolanalyser
b) hvisde umiddelbare emballager indeholder 2-6 l: olien i fire umiddelbare
emballager, heraf:
— en umiddelbar emballage til analyserne efter bilag II, III, IX og XII
— en tredjedel af en anden emballage til de øvrige analyser, og— den resterende olie til eventuelle kontrolanalyser
c) hvisde umiddelbare emballager indeholder 0,75-2 l: olien i s eksumiddel-
bare emballager, heraf:
— en umiddelbar emballage til analyserne efter bilag II, III, IX og XII
— en anden emballage til de øvrige analyser, og
— den resterende olie til eventuelle kontrolanalyser
d) hvisde umiddelbare emballager indeholder under 0,75 l: olien i det
mindste antal emballager, hvis samlede indhold overstiger 4,5 l, og som
fordeles således:
— olien i det mindste antal emballager, hvis samlede indhold overstiger
0,75 l, er forbeholdt analyserne efter bilag II, III, IX og XII
— en tilsvarende mængde er forbeholdt de øvrige analyser, og
— den resterende olie gemmes til eventuelle kontrolanalyser.
2. Antal basisprøver
Det mindste antal basisprøver, der skal udtages, fastsættes på grundlag af
partiets størrelse som vist i nedenstående tabel:
Parti (i liter) på under Mindste antal basisprøver
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Til basisprøven udvælges umiddelbare emballager, som står ved siden af
hinanden i partiet.
I tvivlstilfælde kan medlemsstaterne forøge det antal basisprøver, der skal
udtages.
3. Analyser og resultater
Olien skal så vidt muligt bevares i de originale beholdere, indtil den analy-
seres.
a) Den enkelte basisprøve opdeles i laboratorieprøver, jf. punkt 2.5 i stan-
dard EN ISO 5555, med henblik på at blive underkastet følgende
analyser:
— bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, jf. artikel 2, stk. 1, første
led1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 10
▼M17
— bestemmelse af peroxidtallet, jf. artikel 2, stk. 1, andet led
— spektrofotometrisk undersøgelse, jf. artikel 2, stk. 1, ottende led
— fedtsyrernes sammensætning, jf. artikel 2, stk. 1, niende led.
b) Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra a), for mindst en af basisprøverne fra
samme parti ikke svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori,
anses hele det pågældende parti for ikke at opfylde kravene.
Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra a), for hver af basisprøverne fra
samme parti er homogene under hensyntagen til repeterbarheden af de
pågældende metoder og svarer til kendetegnene for den anmeldte olieka-
tegori, underkastes en af basisprøverne fra dette parti de øvrige analyser.
c) Hvis et af analyseresultaterne, jf. litra b), andet afsnit, ikke svarer til
kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende
parti for ikke at opfylde kravene.
Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra b), andet afsnit, svarer til kendeteg-
nene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for at
opfylde kravene.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 11
▼B
BILAG II
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FRIE FEDTSYRER
1. FORMÅL
Bestemmelse af frie fedtsyrer i olivenolie. Indholdet af frie fedtsyrer
udtrykkes ved det vedtægtsmæssigt beregnede syreindhold.
1.1.Princip
En analyseprøve opløses i en blanding af opløsningsmidler, hvorefter de
tilstedeværende frie fedtsyrer bestemmes ved hjælp af en opløsning af
kaliumhydroxid i ethanol.
1.2.Reagenser
Samtlige reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet, og der
anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.
1.2.1. Dietyhlether/ethanol, 95 % (v/v), blandet i forholdet 1:1 efter rumfang.
Note:Dietylether er meget let antændelig og kan danne eksplosive pero-
xider. Under anvendelsen skal der træffes særlige forholdsregler.
Nøjagtigt på anvendelsestidspunktet neutraliseres med en opløsning af
kaliumhydroxid (1.2.2) ved tilstedeværelse af 0,3 ml phenolphtalein-
opløsning (1.2.3) pr. 100 ml blanding.
Note:Hvisdet ikke er muligt at anvende diethylether, kan en blanding af
opløsningsmidler bestående af ethanol og toluen anvendes. Om
nødvendigt kan ethanolen erstattes af 2-propanol.
1.2.2. Indstillet opløsning af kaliumhydroxid i ethanol, c(KOH) ca. 0,1 mol/l
eller om nødvendigt c(KOH) ca. 0,5 mol/l.
Den nøjagtige koncentration af kaliumhydroxid-opløsningen i ethanol
skal være kendt og verificeres umiddelbart før brug. Der anvendes en
opløsning, der er fremstillet mindst fem dage før brugen, og dekanteret
over i en flaske af brunt glas, lukket med en gummiprop. Opløsningen
skal være farveløs eller strågul.
Note:En ufarvet stabil opløsning af kaliumhydroxid kan fremstilles på
følgende måde: 1 000 ml ethanol med 8 g kaliumhydroxid og
0,5 g aluminiumspåner bringes i kog og holdes kogende i 1 time
med tilbageløb. Derefter destilleres omgående, og den krævede
mængde kaliumhydroxid opløses i destillatet. Man lader opløs-
ningen henstå i flere dage og dekanterer derefter den øverste klare
væske fra bundfaldet af kaliumcarbonat.
Opløsingen kan også fremstilles uden destillation på følgende
måde: til 1 000 ml ethanol tilsættes 4 ml aluminiumbutylat, hvor-
efter man lader blandingen henstå i nogle dage. Derefter
dekanteres den klare væske fra, og heri opløses den krævede
mængde kaliumhydroxid. Denne opløsning er klar til brug.
1.2.3. Phenolphtalein, opløsning med 10 g/l i 95—96 % (v/v) ethanol, eller
alkaliblåt (i tilfælde af stærkt farvede fedtstoffer), opløsning med 20 g/l
i 95—96 % (v/v) ethanol.
1.3.Apparatur
Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:
1.3.1. Analysevægt.1.3.2. 250 ml Erlenmeyer-kolbe.1.3.3. 10 ml burette med 0,05 ml inddelinger.
1.4.Fremgangsmåde
1.4.1. Forberedelse af analyseprøve
Analyseprøven forberedes i overensstemmelse med NF T 60—200. (På
prøven som den er, hvis det samlede indhold af vand og urenheder ikke
overstiger 1 %, ellers på en filtreret prøve). Bestemmelsen foretages på
den filtrerede prøve. Hvisdet s amlede indhold af vand og urenheder er
under 1 %, foretages bestemmelsen på den ubehandlede prøve.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 12
▼B
1.4.2. Prøveudtagning
Ud fra det antagne syreindhold udtages en prøve efter angivelserne i
følgende tabel:
Antaget syreindhold
vægtprocentPrøvens masse
igPrøven afvejesmed en
nøjagtighed
igp å
< 1 20 0,05
1— 4 10 0,02
4—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Prøven afvejesi Erlenmeyer-kolben (1.3.2).
1.4.3. Bestemmelse
Prøven (1.4.2) opløses i 50 — 150 ml af den på forhånd neutraliserede
blanding af diethylether/ethanol (1.2.1).
Under omrøring titreresmed kaliumhydroxidopløs ning, 0,1 mol/l (1.2.2)
(se note 2), indtil indikatoren slår om (den rosa farve af phenolphtalein
skal holde sig i mindst 10 sek.).
Note 1: Den indstillede opløsning af kaliumhydroxid i ethanol (1.2.2) kan
erstattes af en vandig opløsning af kaliumhydroxid eller natrium-
hydroxid, når den tilførte vandmængde ikke medfører
faseadskillelse.
Note 2: Hvisden nødvendige mængde 0,1 mol/l kaliumhydroxidopløs -
ning overstiger 10 ml, anvendes i stedet en opløsning på
0,5 mol/l.
Note 3: Bliver opløsningen uklar under titreringen, tilsættes så meget
opløsningsmiddelblanding (1.2.1), at opløsningen bliver klar.
1.5.Angivelse af syreindholdet i % oliesyre
Syreindholdet, udtrykt som vægtprocent =
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
hvor:
V = rumfanget i ml af den forbrugte kaliumhydroxidopløsning
c = den nøjagtige koncentration i mol/l af den anvendte kaliumhydro-
xidopløsning
M = den molvægt i g/mol af syren, der er valgt til angivelse af resul-
tatet (Moliesyre= 282 g/mol)
m = analyseprøvens vægt i gram.
Som resultat anvendes det aritmetiske gennemsnit ►M6af to
bestemmelser ◄.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 13
▼B
BILAG III
BESTEMMELSE AF PEROXIDTALLET
1. OMRÅDE
Denne standard beskriver en metode til bestemmelse af peroxidtallet for
olier og fedtstoffer.
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder anvendelse for animalske og vegetabilske olier og
fedtstoffer.
3. DEFINITION
Peroxidtallet angiver den mængde stoffer i prøven, udtrykt som milliækvi-
valenter aktivt oxygen pr. kg, som oxiderer kaliumiodid under de beskrevne
forsøgsbetingelser.
4. PRINCIP
Analyseprøven, opløst i en blanding af eddikesyre og chloroform,
behandlesmed en opløs ning af kaliumiodid. Det frigjorte iod titreresmed
en indstillet natriumthiosulfatopløsning.
5. APPARATUR
Alt udstyr skal være fri for reducerende og oxiderende stoffer.
Note:Sliboverflader må ikke indfedtes.
5.1. 3 ml glasske.
5.2. Kolber med slib og prop, på ca. 250 ml, som på forhånd tørres og fyldes
med ren, tør inert gas(nitrogen eller — hels t — carbondioxid).
5.3. 25 eller 50 ml burette med 0,1 ml inddeling.
6. REAGENSER
6.1. Analyseren chloroform, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør
inert gas.
6.2. Analyseren iseddike, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør
inert gas.
6.3. Mættet vandig opløsning af kaliumiodid, fremstillet umiddelbart før brug
og fri for iod og iodater.
6.4. Natriumthiosulfat, 0,01 eller 0,002 N nøjagtigt indstillet vandig opløsning,
indstillet umiddelbart før brug.
6.5. Stivelsesopløsning, 10 g/l vandig opslæmning, fremstillet umiddelbart før
brug ud fra naturlig opløselig stivelse.
7. PRØVE
Prøven udtages og opbevares beskyttet mod lys, holdes nedkølet og opbe-
vares i fuldstændigt fyldte glasbeholdere, der er hermetisk tillukket med
slibpropper af glas eller korkpropper.
8. FREMGANGSMÅDE
Analysen udføres i diffust dagslys eller i kunstigt lys. I en glasske (5.1)
eller i mangel heraf en kolbe (5.2) afvejesmed en nøjagtighed på 0,001 g
en prøvemængde i overensstemmelse med følgende tabel, svarende til det
forventede peroxidtal:1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 14
▼B
Forventet perioxidtal
(meq O2/kg)Analyseprøvens vægt
(i g)
0 — 12 5,0 — 2,0
12 — 20 2,0 — 1,220 — 30 1,2 — 0,830 — 50 0,8 — 0,5
50 — 90 0,5 — 0,3
Proppen tages af en kolbe (5.2), og analyseprøven i glasskeen overføres til
kolben. Der tilsættes 10 ml chloroform (6.1), og analyseprøven opløses
hurtigt ved omrystning. Derefter tilsættes 15 ml eddikesyre (6.2), efterfulgt
af 1 ml kaliumiodidopløsning (6.3). Så sættes proppen hurtigt i, og der
omrystes i 1 min., hvorefter man lader kolben henstå i nøjagtigt 5 min. i
mørke ved en temperatur på 15 — 25º C.
Der tilsættes ca. 75 ml destilleret vand, og det frigjorte iod titreres med
natriumthiosulfatopløsning (6.4) (0,002 N opløsning for forventede værdier
under 12, og 0,01 N opløsning for forventede værdier over 12) under
kraftig omrystning og med anvendelse af stivelsesopløsning (6.4) som indi-
kator.
Der udføres to bestemmelser på samme analyseprøve.
Samtidig udføres en blindprøve. Hvis resultatet af blindprøven overstiger
0,05 ml 0,01 N natriumthiosulfatopløsning (6.4), udskiftes de urene
reagenser.
9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Perioxidtallet (P.V.), udtrykt i milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, er
givet ved formlen:
P:V:¼
V/C2T/C21000
m
hvor:
V = antal ml forbrugt indstillet natriumthiosulfatopløsning (6.4) ved
analysen, korrigeret for resultatet af blindprøven
T = den nøjagtige normalitet af den anvendte natriumthiosulfatopløsning
(6.4),
m = analyseprøvens vægt i g.
Som resultat angives det aritmetiske gennemsnit af de to udførte bestem-
melser.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 15
▼M6
BILAG IV
BESTEMMELSE AF VOKSINDHOLD VED GASKROMATOGRAFE-
RING MED KAPILLARKOLONNE
1. FORMÅL
Metoden består af en procedure til bestemmelse af voksindholdet i visse
fedtstoffer og olier efter prøvebetingelserne.
Den er navnlig velegnet, når der skal skelnes mellem olivenolie, der er
udvundet ved presning, og olivenolie, der er udvundet ved ekstraktion.
2. PRINCIP
Der tilsættes en egnet intern standard til fedtstoffet eller olien, hvorefter
adskillelsen finder sted ved hjælp af kromatografering på en hydreret
kiselgelkolonne. Den fraktion, der først elueres under prøvebetingel-
serne, og som har lavere polaritet end triglyceriderne opsamles, og der
analyseres derefter direkte ved hjælp af gaskromtografering med kapil-
larkolonne.
3. APPARATUR
3.1. 25 ml Erlenmeyerkolbe.3.2. Glaskolonne til kromatografering, 15 mm indvendig diameter og højde
30-40 cm.
3.3. Gaskromatograf, der kan fungere med en kapillarkolonne, der er
udstyret med et system til direkte indsprøjtning i kolonnen, og som
består af følgende:
3.3.1. Ovn med termostat til kolonnerne, der kan holde den valgte temperatur
inden for ± 1 ºC.
3.3.2. Kold injektor til direkte indsprøjtning i kolonnen.3.3.3. Flammeioniseringsdetektor og konverter/forstærker.
3.3.4. Skriver/integrator, der kan fungere med konverter/-forstærkeren (3.3.3),
responstid under 1 sekund, med variabel papirhastighed.
3.3.5. Kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, ►
C110-15 m lang ◄,
0,25-0,32 mm indvendig diameter, coated med SE-52 eller SE-54 eller
tilsvarende i en ensartet lagtykkelse på 0,10-0,30 µm.
3.4. Mikrosprøjte på 10 µl med hærdet nål til direkte indsprøjtning i
kolonnen.
4. REAGENSER
4.1. Kiselgel, 70-230 mesh, artikel 7754 Merck.
Gelen anbringesi ovnen ved 500 ºC i fire timer. Hens tillestil afkøling,
hvorefter der tilsættes 2 % vand. Der rystes omhyggeligt for at homo-
genisere opslæmning. Opbevares i mørke i mindst tolv timer inden
brug.
4.2. n-hexan til kromatografering.4.3. Ethylether til kromatografering.
4.4. n-heptan til kromatografering.
4.5. Standardopløsning af 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern stan-
dard).
4.6. Bæregas: hydrogen, ren, til gaskromatografering.4.7. Hjælpegasser:
— hydrogen, ren, til gaskromatografering
— luft, ren, til gaskromatografering.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 16
▼M6
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Adskillelse af voksfraktionen
5.1.1. Fremstilling af kromatografikolonnen.
15 g kiselgel tilsat 2 % vand opslæmmes i vandfri n-hexan og
indsprøjtes i kolonnen.
Hensættes til bundfældning. Fuldstændig bundfældning foretages ved
hjælp af en el-vibrator for at opnå større homogenitet. 30 ml n-hexan
filtreresfor at fjerne eventuelle urenheder.
5.1.2. Kolonnekromatografi
Der afvejesnøjagtig 500 mg af prøven i en 25 ml kolbe og tils ættesen
passende mængde intern standard afhængig af det skønnede voksind-
hold, f.eks. tilsættes 0,1 mg laurylarachidat til presset olivenolie og
0,25-0,5 mg til ekstraheret olivenolie.
Den tilberedte prøve overførestil kromatografikolonnen, der er frem-
stillet efter 5.1.1, ved hjælp af to 2 ml portioner n-hexan.
Der aftappes opløsningsmiddel, indtil væskeoverfladen står 1 mm over
kolonnematerialet. Derefter startes elueringen. 140 ml af n-hexan/ethy-
letherblandingen opsamles i forholdet 99:1 med en hastighed på ca. 15
dråber pr. 10 sekunder (2,1 ml/minut).
Den derved fremkomne fraktion tørresi en rotations fordamper, indtil
opløsningsmidlet næsten helt er forsvundet. De sidste 2 eller 3 ml
opløsningsmiddel fjernes ved hjælp af en svar nitrogenstrøm, og
derefter tilsættes 10 ml n-heptan.
5.2. Gaskromatografisk analyse5.2.1. Indledende procedure: konditionering af kolonnen5.2.1.1. Kolonnen påmonteresgas kromatografen, idet den ene ende forbindes
med injektionssystemet og den anden ende med detektoren.
Gaskromatografien kontrolleres (detektors og skrivers ydeevne osv.).
5.2.1.2. Hviskolonnen benyttesfor førs te gang, kan det anbefalesat konditio-
nere den. En let strøm gas ledes gennem kolonnen, hvorefter
gaskromatografiapparaturet sættes i gng. Der opvarmes gradvis til
mindst 20 ºC over driftstemperaturen (anmærkning). Denne temperatur
holdes i mindst to timer, hvorefter apparaturet reguleres efter arbejdsbe-
tingelserne (gasstrømmen reguleres, der tændes for flammen, der
tilsluttes til den elektroniske skriver, kolonneovnens temperatur regu-
leres, detektoren reguleres osv.). Signalet registreres med en følsomhed
på mindst det dobbelte af den, der kræves for at foretage analysen.
Basislinjen bør være lineær uden nogen form for toppe og må ikke
udvise nogen forstyrrelser.
En negativ retlinjet forstyrrelse tyder på, at kolonnen ikke er korrekt
forbundet. En positiv forstyrrelse er tegn på, at kolonnen ikke er blevet
ordentligt konditioneret.
Anmærkning: Konditioneringstemperaturen skal altid holdes mindst 20
ºC under den maksimumstemperatur, der er angivet for
den anvendte eluent.
5.2.2. Valg af arbejdsbetingelser
5.2.2.1. Arbejdsbetingelserne er normalt som følger:
— kolonnetemperatur: 80 ºC til at begynde med stigende med 30 ºC/
minut til 120 ºC med derpå følgende programmering til en stigning
på 5 ºC/minut op til 340 ºC
— detektortempertur: 350 ºC— bæregassens lineære hastighed: hydrogen, 20-35 cm/sekund— instrumentfølsomhed: 4-16 gange minimumsdæmpningsindstillingen— skriverens følsomhed: 1-2 mV fra skalaens nederste ende— papirhastighed: 30 cm/time— indsprøjtet mængde: 0,5-1 µl opløsningsmiddel.
Disse betingelser kan ændres, så de passer til kolonnens og gaskromato-
grafiapparaturetskarakteris tika (for at opnå kromatogrammer, der
opfylder følgende betingelser: retentionstiden for C
32intern standard
skal være 25 ± 2 minutter, og voksernes mest repræsentative top skal
ligge mellem 60 og 100 % fra skalaens nederste ende).1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 17
▼M6
5.2.2.2. Parametrene for toppenes integration bestemmes på en sådan måde, at
der opnåsen korrekt evaluering af toppenesarealer.
5.2.3. Analyseprocedure
5.2.3.1. 1 µl af opløsningsmidlet opsuges med 10 µl mikrosprøjten. Stemplet
trækkes tilbage, indtil nålen er tom. Nålen indføres i injektionssystemet,og der indsrøjtes hurtigt efter 1-2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder
trækkesnålen fors igtigt ud.
5.2.3.2. Registreringen fortsætter, indtil alle vokserne er helt eluerede.
Basislinjen skal altid opfylde de fastsatte betingelser (5.2.1.2).
5.2.4. Identifikation af toppene
Toppene identificeres ud fra retentionstiderne, idet de sammenlignes
med blandinger af vokser med kendte retentionstider analyseret under
samme betingelser.
Figur 1 viser et vokskromatogram af jomfruolivenolie.
5.2.5. Kvantitativ analyse5.2.5.1. Toppenes arealer svarende til den interne standard og de alifatiske
estere fra C
40til C46bestemmes ved hjælp af integratoren.
5.2.5.2. Voksindholdet i hver af esterne bestemmes i mg/kg fedtstof efter
formlen:
ester (mg/kg) =Ax·ms·►M91 000◄
As·m
hvor:
Ax= er arealet svarende til toppen for hver enkelt ester
As= er arealet svarende til laurylarachidattoppen
ms= er massen af det tilsatte laurylarachidat i milligram
m = er massen af den prøve, der er udtaget til analyse, i gram.
6. FORMULERING AF RESULTATERNE
De forskellige voksindhold og summen af disse indhold angives i mg/
kg fedtstof.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 18
▼M6
APPENDIKS
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
1-3µl methan (propan) indsprøjtes i gaskromatografiapparaturet, efter at det er
tilpasset de normale arbejdsbetingelser. Den tid, som det tager gassen af
strømme gennem kolonnen, fra det øjeblik den indsprøjtes, til toppen viser sig,
måles(tM).
Den lineære hastighed i cm/sek. udtrykkes ved formlen L/tM, hvor L er kolon-
nenslængde i cm og tM tiden målt i s ekunder.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 19
▼M61991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 20
▼B
BILAG V
BESTEMMELSE AF SAMMENSÆTNINGEN OG INDHOLDET AF
STEROLER VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARSØJLE
1. OMRÅDE
Metoden beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af indholdet af
de enkelte steroler og det samlede sterolindhold i fedtstoffer.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffer, med α-cholestanol tilsat som en intern standard, forsæbes
med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de bestanddele, der ikke
kan forsæbes, ekstraheres derefter med diethylether.
Sterolfraktionen adskilles fra ekstrakten af stoffer, som ikke kan
forsæbes, ved kromatografi på en basisk kiselgelplade. De steroler,
som genvindes fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og
analyseres ved hjælp af gaskromatografi på kapillarsøjle.
3. APPARATUR
3.1. 250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glas-
slib.
3.2. 500 ml skilletragte.3.3. 250 ml kolber.3.4. Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm
glasplader.
3.5. Ultraviolet lampe med en bølgelængde på 366 eller 254 nm.3.6. 100 µl og 500 µl mikrosprøjter.3.7. En cylindrisk filtertragt med et G3 porøst septum (porøsitet 15—40 µm),
med en diameter på ca. 2 cm og en dybde på ca. 5 cm, med en befæ-
stelsesdel, der er egnet til filtrering under vakuum, og en samlingsdel
med et 12/21 udvendig konisk glasslib.
3.8. En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendig konisk glasslib,
som filtertragten (3.7) kan monteres på.
3.9. Et 10 ml prøverør med konisk bund og tætsluttende prop.3.10. En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsøjle, forsynet
med et spaltningssystem, der består af:
3.10.1. Et termostatkammer til søjler, som kan opretholde den ønskede tempe-
ratur med en nøjagtighed på ± 1º C.
3.10.2. En inddampningsenhed med temperaturindstilling, med et fordamp-
ningselement af silanglas.
3.10.3. En flammeioniserings-detektor og en omformer-forstærker.3.10.4. En integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-
forstærkeren (3.10.3), og som har en svartid på ikke over ét sekund og
variabel papirhastighed.
3.11. En kapillarsøjle af glas eller kvartsglas, med en længde på 20—30 m,
en indre diameter på 0,25—0,32 mm, helt overtrukket med SE-52 eller
SE-54 væske eller tilsvarende i en ensartet tykkelse på mellem 0,10 og
0,30 µm.
3.12. En 10 µl gaskromatografi-mikrosprøjte med hærdet kanyle.
4. REAGENSER
4.1. Kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanolopløsning. 130 g kaliumhydroxid
(minimum titer 85 %) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling,
og der fyldesop med ethanol til 1 liter. Opløs ningen opbevaresi veltil-
proppede, mørke glasflasker.
4.2. Diethylether, analyseren.4.3. Vandfrit natriumsulfat, analyserent.4.4. Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescensindikator,
tykkelse 0,25 mm (kan fås brugsfærdige i handelen).1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 21
▼B
4.5. Kaliumhydroxid, 0,2 N, i ethanolopløsning. 13 g kaliumhydroxid
opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter.
4.6. Benzen, til kromatografi (5.2.2).4.7. Acetone, til kromatografi (5.2.2).4.8. Hexan, til kromatografi (5.2.2).4.9. Diethylether, til kromatografi (5.2.2).
4.10. Chloroform, analyseren.
4.11. Referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phyto-
steroler, ►
M62%◄opløsning i chloroform.
4.12. 2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk
ved tilsætning af nogle få dråber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidopløs-
ning.
4.13. Vandfri pyridin til kromatografi.
4.14. Hexamethyldisilazan.4.15. Trimethylchlorsilan.4.16. Referenceopløsninger af sterol-trimethylsilylethere (TMSE). Friskfrem-
stillet ud fra rene steroler eller blandinger af steroler udvundet af
sterolholdige olier.
4.17. α-cholestanol, 0,2 % opløsning (m/v) i chloroform (intern standard).
4.18. Bæregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren.4.19. Hjælpegasser:
— Hydrogen, gaskromatografiren
— Luft, gaskromatografiren.
5. FREMGANGSMÅDE5.1.Forberedelse af de ikke-forsæbelige stoffer
5.1.1. Et rumfang 0,2 % α-cholestanolopløsning i chloroform (4.17), der inde-
holder en mængde α-cholestanol svarende til ca. 10 % af
sterolindholdet i den del af prøven, der er taget ud til bestemmelsen,indføres i 250 ml kolben ved hjælp af 500 µl mikrosprøjten. F.eks.
sættes til 5 g af prøven 500 µl 0,2 % α-cholestanolopløsning, hvis
undersøgelsen gælder olivenolie, og 1 500 µl, hvis det gælder
►
M6 ◄olie fra olivenpresserester.
Prøven inddampestil tørhed i en nitrogens trøm, hvorefter 5 g af den
tørrede, filtrerede prøve afvejesnøjagtigt og overførestil den s amme
kolbe.
►M6 ◄Olier►M6 ◄, der indeholder
betydelige mængder cholesterol, kan vise en top, der har den samme
retentionstid som α-cholestanol. Hvis det forekommer, må sterolfrakti-
onen analyseres to gange med og uden intern standard ►M6eller der
anvendes betulinol i stedet for cholestanol ◄.
5.1.2. 50 ml 2 N kaliumhydroxid i ethanolopløsning tilsættes, refluxsvaleren
påsættes, og væsken opvarmes til svag kogning på vandbad under
vedvarende, kraftig omrøring, indtil forsæbningen sker (opløsningen
bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter, derefter
tilsættes 50 ml destilleret vand fra den øverste del af svaleren, svaleren
tagesaf, og kolben afkølestil ca. 30º C.
5.1.3. Kolbensindhold overføreskvantitativt til en 500 ml s killetragt, idet der
skylles flere gange med destilleret vand, ialt ca. 50 ml. Ca. 80 ml
diethylether tilsættes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og får
lov til at henstå (note 1).
Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt.
Yderligere to ekstraktioner foretages på den vandige fase på samme
måde, idet der bruges60—70 ml diethylether hver gang.
Note 1: Eventuel emulsion kan ødelægges ved tilsætning af små
mængder ethyl- eller methylalkohol ved hjælp af en spray.
5.1.4. Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destil-
leret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral
reaktion.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 22
▼B
Når vaskevandet er fjernet, tørres ekstrakterne med vandfrit natrium-
sulfat og filtreres på vandfrit natriumsulfat ned i en på forhånd vejet
250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder diethylether.
5.1.5. Etheren destilleres ned til nogle få ml og bringes derefter til tørhed
under et let undertryk eller i en nitrogenstrøm, tørres fuldstændigt i en
ovn ved 100º C i ca. 15 minutter, og vejes så efter afkøling i en ekssik-
kator.
5.2.Separation af sterolfraktionen
5.2.1. Forberedelse af de basiske plader. Kiselgelpladerne (4.4) nedsænkes
fuldstændig i 0,2 N opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol (4.5) i 10
sekunder. Derefter får de lov at tørre i et stinkskab i 2 timer og sættes
til sidst i en ovn ved 100º C i 1 time.
Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssik-
kator, til de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal
anvendesinden 15 dage).
Note 2: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere sterolfrakti-
onen, er det ikke, nødvendigt at behandle de ikke-forsæbelige
stoffer med aluminiumoxid. På denne måde holdes alle sure
forbindelser (fede syrer og andre) tilbage på basislinien, og
sterolbåndet er klar adskilt fra de alifatiske og triterpene alko-
holersbånd.
5.2.2. En 95:5 (v/v) benzen/acetoneblanding anbringesi kromatografika-
mmeret til en højde på ca. 1 cm. Som et alternativ kan en 65:35 (v/v)
hexan/diethyletherblanding bruges. Kammeret lukkes med det dertil
passende dæksel og efterlades således i ca. en halv time, så at der
opnåsligevægt mellem væs ke og damp. Strimler af filtrerpapir, der
dypper ned i eluenten, kan anbringespå kammeretsindre overflader.
Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet
og regelmæssig eluering af komponenterne.
Note 3: Kromatografiblandingen bør udskiftes for hver test for at opnå
fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser.
5.2.3. Man tilbereder en ca. 5 % opløsning af de ikke-forsæbelige stoffer
(5.1.5) i chloroform. Med 100 µl mikrosprøjten afsætter man på en
kromatografiplade (5.2.1) med 0,3 ml, ca. 2 cm fra den ene ende, en
streg, som er så tynd og ensartet som muligt. På linie med stregen
placeres 2—3 µl af sterol-referenceopløsningen (4.11) i den ene ende
af pladen, så sterolbåndet kan identificeres efter eluering.
5.2.4. Pladen anbringes i kromatografikammeret, som er forberedt som
angivet i 5.2.2. Den omgivende temperatur bør holdesmellem 15 og
20º C. Kammeret lukkes straks med dækslet, og det får lov til at eluere,
indtil opløsningsmidlets forkant når ca. 1 cm fra pladens øverste kant.
Derpå fjernespladen fra kromatografikammeret, og man lader opløs -
ningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen
stå en kort tid i et stinkskab.
5.2.5. Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluorosceinopløsningen.
Når pladen observeres under ultraviolet lys, kan sterolbåndet identifi-
ceresved, at det bringespå linie med den plet, der er opnået fra
referenceopløsningen. Båndets grænser langs fluoroscenses kanter
markeresmed en s ort blyant.
5.2.6. Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede område.
Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten
(3.7). 10 ml varm chloroform tilsættes, man blander omhyggeligt med
metalspatelen og filtrerer under vakuum; filtratet opsamles i den
koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten.
Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether
(ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er
forbundet med filtertragten. Filtratet inddampestil et rumfang af
4—5 ml, den tilbageværende opløsning overføres til det på forhånd
vejede 10 ml prøverør (3.9), det inddampestil tørhed med let opvarm-
ning i en blød strøm af nitrogen, der fyldes atter op med nogle få dråber
acetone, der inddampesigen til tørhed, røret placeresi en ovn ved 105º
C i ca. 10 minutter, derefter lader man det svale af i en ekssikkator og
vejer det.
Den rest, der findes i prøverøret, består af sterolfraktionen.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 23
▼B
5.3.Forberedelse af trimethylsilyletherne
5.3.1. Til prøverøret, der indeholder sterolfraktionen, sættes silyleringsrea-
genset, der består af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-
disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 4), i forholdet 50 µl for hvert milli-
gram sterol, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 5).
Note 4: Brugsfærdige opløsninger kan fås i handelen. Man kan også få
andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-
acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med
et lige så stort rumfang vandfrit pyridin.
5.3.2. Prøverøret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i
vejret på det), indtil sterolerne er fuldstændig opløst. Man lader det stå
i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det så i nogle
få minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse.
Note 5: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver
ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller
fremkommer en lyserød farve, er det et tegn på tilstedeværelsen
af fugt eller svækkelse af reagensen. Hvis det forekommer, må
prøven gentages.
5.4.Gaskromatografisk analyse
5.4.1. Forberedende operationer, pakning af søjlen
5.4.1.1. Søjlen monteres i gaskromatografen, idet indløbsenden forbindes med
fordamperen, der står i forbindelse med spaltningssystemet, og udløb-
senden forbindes med detektoren.
Man foretager en generel kontrol af gaskromatografen (lækager fra
gaskredsløbene, detektorens effektivitet, spaltningssystemets og regi-
streringssystemets effektivitet osv.)
5.4.1.2. Hvis søjlen skal bruges for første gang, anbefales det, at den underka-
stes en konditionering. Man lader en svag gasstrøm passere gennem
søjlen og tænder så for gaskromatografienheden, derefter begynder
man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20º C over driftstem-
peraturen (note 6). Denne temperatur opretholdesi minds t 2 timer,
derefter sættes hele enheden i driftstilstand (justering af gasstrømme
og spaltning, antændelse af flammen, forbindelse til den elektroniske
skriver, justering af søjlekammeret, detektorens og injektorens tempe-
ratur osv.), og derefter optegens signalet med en følsomhed, der er
mindst to gange større end den, man agter at anvende til analysen.
Basisliniens forløb skal være lige, uden toppe af nogen art, og den må
ikke glide.
Negativ glidning af en lige linie tyder på lækage fra søjlens forbin-
delser, positiv glidning tyder på utilstrækkelig konditionering af søjlen.
Note 6: Konditioneringstemperaturen skal altid være mindst 20º C
lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den
anvendte stationære fase.
5.4.2. Valg af driftsbetingelser5.4.2.1. De anbefalede driftsbetingelser er som følger:
— søjletemperatur: 260º C ± 5º C
— fordampertemperatur: 280º C
— detektortemperatur: 290º C— bæregassens lineære hastighed: helium 20—35 cm/s, hydrogen
30—50 cm/s
— spaltningsforhold: fra 1:50 til 1:100
— instrumentets følsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale dæmpning
— registreringsfølsomhed: 1—2 mV fuld skala
— papirhastighed: 30—60 cm/time
— mængde stof injiceret: 0,5—1µl TMSE-opløsning.
Disse betingelser kan varieres i lyset af søjlens og gaskromatografens
egenskaber, så man opnår kromatogrammer, der opfylder følgende krav:
— retentionstiden for β-sitosterol bør være 20 ± 5 minutter
— campesteroltoppen bør være: for olivenolie (gennemsnitsindhold
3 %) 15 ± 5 % af hel skala; for soyaolie (gennemsnitsindhold
20 %) 80 ± 10 % af hel skala
— alle tilstedeværende steroler skal adskilles. Desuden skal toppene
også være fuldstændig opløst, dvs. hver tops spor skal gå tilbage til
basislinien, før sporet går op til den næste top. Ufuldstændig opløs-1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 24
▼B
ning kan dog tolereres, såfremt toppen ved TRR (relativ retenti-
onstid) 1,02 kan bestemmes kvantitativt ved brug af den vinkelrette
linie.
5.4.3. Analytisk fremgangsmåde
5.4.3.1. Med 10 µl mikrosprøjten optages 1 µl hexan, derefter trækkes først
0,5 µl luft og derefter 0,5—1 µl af prøveopløsningen op. Stemplet
trækkes højere op, så kanylen tømmes. Kanylen trykkes gennem injek-
tionsenhedens membran, og efter 1—2 sekunder injiceres hurtigt,
derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder.
5.4.3.2. Optegnelsen fortsættes, indtil de tilstedeværende sterolers TMSE er
fuldstændig elueret.
Basislinien skal til stadighed opfylde kravene (5.4.1.2).
5.4.4. Identifikation af toppene
De enkelte toppe identificeres på basis af retentionstiderne og ved
sammenligning med blandinger af sterol-TMSE, der er analyseret under
de samme betingelser.
Sterolerne elueres i følgende rækkefølge: cholesterol, brassicasterol, 24-
methylencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, ∆-7-
campesterol, ∆-5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol,
∆-5-avenasterol, ∆-5,24-stigmastadienol, ∆-7-stigmastenol, ∆-7-avena-
sterol.
Retentionstiderne for β-sitosterol for SE 52 og SE 54 søjler er vist i
tabel 1.
Figur 1 og 2 illustrerer typiske kromatogrammer for nogle olier.
5.4.5. Kvantitativ vurdering
5.4.5.1. Arealerne for α-cholestanol- og steroltoppene beregnes ved hjælp af den
integrerende tæller. Der ses bort fra toppene for eventuelle forbindelser,
der ikke er blandt dem, der er opregnet i tabel 1.
5.4.5.2. Koncentrationen af hver enkelt sterol beregnes i mg/100 g fedtstof som
følger:
sterol x =Ax·ms· 100
As·m
hvor:
Ax= toparealet for sterol x ►M6 ◄
As= arealet af α-cholestanoltoppen ►M6 ◄
ms= massen af tilsat α-cholestanol i milligram
m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.
6. RAPPORTERING AF RESULTATERNE
6.1. De individuelle sterolkoncentrationer angives som mg/100 g fedtstof og
deres sum som »total sterolmængde«.
6.2. Den procentvise andel af de individuelle steroler beregnes på grundlag
af forholdet mellem arealet af den tilsvarende top og summen af area-
lerne af sterolernes toppe.
% sterol x =Ax× 100
ΣA
hvor:
Ax= arealet af top x
ΣA = summen af arealerne af alle toppe.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 25
▼B
APPENDIX
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1—3 µl
methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere
gennem søjlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen frem-
kommer (tM).
Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde i cm,
og tMer den målte tid i sekunder.
Tabel 1
Relative retentionstider for steroler
T-
opIdentifikationRelativ retentionstid
SE 54
søjleSE 52
søjle
1 cholesterol ∆-5-cholesten-3- β-ol 0,67 0,63
2 cholestanol 5- α-cholestan-3- β-ol 0,68 0,64
3 brassicasterol [24S]-24-methyl- ∆-5,22-cholestadien-3- β-
ol0,73 0,71
4 24-methylen-cholesterol 24-methylen- ∆-5,24-cholestadien-3- β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-methyl- ∆-5-cholesten-3- β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-methyl-cholestan-3- β-ol 0,85 0,82
7 stigmasterol [24S]-24-ethyl- ∆-5,22-cholestadien-3- β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-campesterol [24R]-24-methyl- ∆-7-cholesten-3- β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl- ∆-5,23-cholestadien-3- β-
ol0,95 0,95
10 chlerosterol [24S]-24-ethyl- ∆-5,25-cholastadien-3- β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-ethyl- ∆-5-cholestan-3- β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-ethyl-cholestan-3- β-ol 1,02 1,02
13 ∆-5-avenasterol [24Z]-24-ethyliden- ∆-5-cholesten-3- β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl- ∆-5,24-cholestadien-3- β-
ol1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenol [24R,S]-24-ethyl- ∆-7,24-cholestadien-3- β-
ol1,12 1,12
16 ∆-7-avenasterol [24Z]-24-ethyliden- ∆-7-cholesten-3- β-ol 1,16 1,161991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 26
▼B
Figur 1
Gaskromatogram af sterolfraktionen af en uraffineret olivenolie
1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 27
▼B
Figur 2
Gaskromatogram af sterolfraktionen af en raffineret olivenolie
1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 28
▼B
BILAG VI
BESTEMMELSE AF ERYTHRODIOL OG UVAOL
INDLEDNING
Erythrodiol (almindeligvis forstået som totalindholdet af diolerne erythro-
diol og uvaol) er en uforsæbelig bestanddel, som er karakteristisk for
visse arter af fedtstoffer. Den findes i betydeligt højere koncentration i
ekstraheret olivenolie end i de andre olier, som den findes i (presset
olivenolie, vindruekerneolie), hvorfor bestemmelsen heraf kan anvendes
til at konstatere tilstedeværelsen af ekstraheret olivenolie.
1. FORMÅL
At beskrive fremgangsmåden til bestemmelse af erythrodiol i fedtstoffer.
2. PRINCIP
Fedtstoffer forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de ufor-
sæbelige bestanddele ekstraheres derefter med diethylether og renses på
en kolonne af aluminiumoxid.
De uforsæbelige bestanddele fraktioneres ved tyndtlagskromatografi på
kiselgel, hvorved båndet med sterolfraktionen adskilles fra båndet med
erythrodiolfraktionen.
Sterolfraktionen og erythrodiolfraktionen fra pladen omdannestil trime-
thylsilylethere, hvorefter blandingen analyseres ved gaskromatografi.
Resultatet angives i procent erythrodiol i forhold til det samlede indhold
af erythrodiol pluss teroler.
3. APPARATUR
3.1. Det apparatur, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolind-
holdet).
4. REAGENSER
4.1. De reagenser, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolind-
holdet).
4.2. Referenceopløsning af erythrodiol, 0,5 % opløsning i chloroform.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1.Femstilling af de uforsæbelige stoffer
Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.1.2 i bilag V.
5.2.Separation af erythrodiol og steroler
5.2.1. Se afsnit 5.2.1 i bilag V.5.2.2. Se afsnit 5.2.2 i bilag V.
5.2.3. Der fremstilles en 5 % opløsning i chloroform af de uforsæbelige stoffer.
Med en mikrosprøjte på 100 µl anbringes på en kromatografiplade ca.
1,5 cm fra den nederste kant 0,3 ml af denne opløsning i en streg, der
er så tynd og ensartet som muligt. På den ene ende af pladen anbringes
som reference nogle mikroliter af opløsningen af cholesterol og erythro-
diol.
5.2.4. Pladen anbringesi kromatografikarret, der er klargjort s om angivet i 5.2.2
i bilag V. Den omgivende temperatur holdespå ca. 20º C. Karret lukkes
straks, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra
pladensøvers te kant. Derpå fjernespladen fra kromatografikarret, og
man lader opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft.
5.2.5. Pladen sprøjtes ensartet med en alkoholopløsning af 2,7-dichlorfluore-
scein. Når pladen observeres under ultraviolet lys, fremstår sterol- og
erythrodiolbåndene ud for pletterne fra referenceopløsningen, og de
afmærkesmed et punkt lidt uden for det fluores cerende båndskanter.
5.2.6. Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det
afskrabede materiale fra pladen overføres til en kolbe på 50 ml. Der1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 29
▼B
tilsættes 15 ml varm chloroform, omrystes omhyggeligt og filtreres på
glasfilter, idet siliagelen overføres til selve filteret. Der vaskes tre gange
med 10 ml portioner varm chloroform, idet filtratet opsamles i en rund-
bundet kolbe på 100 ml. Filtratet inddampestil et rumfang på 4—5 ml og
overføres til et tareret spidsbundet centrifugeglas på 10 ml, og der
inddampes til tørhed under let opvarmning i en svag strøm af nitrogen,
hvorefter der vejes.
5.3.Forberedelse af trimethylsilyletherne (TMSE)
Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.3 i bilag V.
5.4.Gaskromatografi
Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.4 i bilag V.
Arbejdsbetingelserne for gaskromatograferingen skal vælges således, at
de udover at opfylde kravene for analyse af sterolerne også fører til sepa-
ration af TMSE af erythrodiol og uvaol.
Efter injektion af prøven lader man skriveren køre indtil alle tilstedevæ-
rende steroler, erythrodiol og uvaol er elueret. Derefter identificeres
toppene (erythrodiol og uvaol har i forhold til β-sitosterol en relativ
retentionstid på henholdsvis ca. 1,45 og 1,55), og arealerne beregnes
som angivet for sterolerne.
6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Erythrodiol % =A1+A2
A1+A2+ΣAsteroler× 100
hvor:
A1= toparealet for erythrodiol ►M6 ◄
A2= toparealet for uvaol ►M6 ◄
ΣAsteroler= summen af arealerne for de tilstedeværende steroler
►M6 ◄
Resultatet angives med én decimal.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 30
▼B
BILAG VII
BESTEMMELSE AF FEDTSYRER I 2-POSITIONEN I TRIGLY-
CERIDER FRA OLIER OG FEDTSTOFFER
1. OMFANG
I denne standard beskrives en metode til bestemmelse af sammensæt-
ningen af den del af fedtsyrerne i en olie eller et fedtstof, som er
forestret til glycerolens 2-position.
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder som følge af pankreas-lipases særlige virkning
anvendelse på olie og fedtstoffer med et smeltepunkt på under 45º C.
Den kan ikke uden videre anvendespå olier og fedts toffer, der indeholder
betydelige mængder fedtsyrer med 12 eller færre kulstofatomer (kokos- og
palmekerneolie, smørfedt), stærkt umættede fedtsyrer (med mere end fire
dobbeltbindinger), med 20 eller flere kulstofatomer (fiskeolie og marine
olier) eller fedtsyrer indeholdende andre oxygenerede grupper end syre-
gruppen.
3. PRINCIP
Eventuel neutralisering af sure olier og fedtstoffer i opløsning. Rensning
på kolonne af aluminiumoxid. Delvishydrolys e af triglycerider ved hjælp
af pankreas-lipase inden for et bestemt tidsrum. Separation af de dannede
monoglycerider ved tyndtlagskromatografi og methanolyse af disse mono-
glycerider. Analyse af methylesterne ved gas/væskekromatografi.
4. APPARATUR
4.1. 100 ml rundbundet kolbe.4.2. 25 ml rundbundet kolbe med slib.4.3. 1 m lang svaler, som passer til kolben 4.2.4.4. 250 ml Erlenmeyer-kolbe.4.5. 50 ml bægerglas.4.6. 500 ml skilletragt.4.7. Kromatografisøjle af glas, 13 mm indvendig diameter og 400 mm lang,
forsynet med glasfilter og hane.
4.8. 10 ml centrifugeglasmed s libprop.4.9. 5 ml burette med 0,05 ml inddelinger.4.10. 1 ml injektionssprøjte med tynd kanyle.4.11. Mikrosprøjte, som kan levere dråber på 3—4 µl.4.12. Udstrygningsapparat til tyndtlagskromatografi.4.13. Glasplader til tyndtlagskromatografi, 20 × 20 cm.4.14. Elueringskar til tyndtlagskromatografi med slebet glaslåg egnet til
20 × 20 cm plader.
4.15. Spray til tyndtlagskromatografi.4.16. Ovn indstillet til 103 ± 2º C.4.17. Termostat, som mellem 30 og 45º C kan reguleres med en nøjagtighed på
0,5º C.
4.18. Rotationsfordamper.4.19. Elektrisk rysteapparat, som muliggør en kraftig omrystning af centrifuge-
glasset.
4.20. UV-lampe til undersøgelse af tyndtlagsplader.
Til kontrol af lipaseaktiviteten:
4.21. pH-meter.4.22. Spiralomrører.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 31
▼B
4.23. 5 ml burette.
4.24. Stopur.
For eventuel fremstilling af lipase:
4.25. Laboratorieomrører, egnet til dispergering og blanding af heterogene
materialer.
5. REAGENSER
5.1. n-hexan, eller i mangel heraf petroleumsether (kogepunkt 30—50º C),
kromatografikvalitet.
5.2. 2-propanol eller ethanol 95 % (v/v), analyseren kvalitet.5.3. 2-propanol eller ethanol, 1:1 vandig opløsning.5.4. Diethylether, peroxidfri.
5.5. Acetone.
5.6. Myresyre, mindst 98 % (m/m).5.7. Elueringsopløsning: blanding af n-hexan (5.1), diethylether (5.4) og myre-
syre (5.6) i forholdet 70/30/1 (v/v/v).
5.8. Aktiveret aluminiumoxid til kromatografi, neutral, Brockmann I.5.9. Silicapulver med bindemiddel, af egnet kvalitet til tyndtlagskromatografi.5.10. Pankreas-lipase af egnet kvalitet (note 1, note 2).5.11. Natriumhydroxid, vandig opløsning med 120 g/l.5.12. Saltsyre, 6 N vandig opløsning.
5.13. Calciumchlorid (CaCl
2), vandig opløsning med 220 g/l.
5.14. Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig opløsning med 1 g/l.5.15. Bufferopløsning: pH af en 1 M vandig opløsning af trishydroxymethyla-
minomethan bringes op på 8 ved tilsætning af saltsyre (5.12)
(kontrolleresmed potentiometer).
5.16. Phenolphthalein, opløsning med 10 g/l i 95 % (v/v) ethanol.5.17. 2,7-dichlorfluorescein, opløsning med 2 g/l i 95 % (v/v) ethanol, gjort
svagt alkalisk ved tilsætning af 1 dråbe 1 N natriumhydroxidopløsning
pr. 100 ml.
Til kontrol af lipase-aktiviteten:
5.18. Neutraliseret olie.5.19. Natriumhydroxid, 0,1 N vandig opløsning.5.20. Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig opløsning med 200 g/l.5.21. Gummi arabicum, vandig opløsning med 100 g/l.
6. PRØVEFORBEREDELSE
Hvis prøvens syreindhold er under 3 %, bestemt efter bilag II, renses den
direkte på aluminiumoxid som beskrevet under 6.2.
Er syreindholdet i prøven over 3 %, bestemt efter bilag II, neutraliseres
der med alkali ved tilstedeværelse af et opløsningsmiddel som beskrevet
under 6.1, efterfulgt af passage over aluminiumoxid som beskrevet under
6.2.
6.1.Neutralisering med alkali ved tilstedeværelse af opløsningsmiddel.
Der anbringesca. 10 g af den rå olie i en s killetragt (4.6), hvorefter der
tilsættes 100 ml hexan (5.1), 50 ml 2-propanol (5.2), nogle få dråber
phenolphthaleinopløsning (5.16) og en mængde natriumhydroxidopløsning
(5.11) svarende til den frie syremængde i olien, plus 0,3 % i overskud.
Der omrystes kraftigt i 1 min., tilsættes 50 ml destilleret vand og omrystes
igen, hvorefter man lader opløsningen stå og bundfælde.
Efter separation fjernes sæbelaget på bunden, ligesom eventuelle
mellemlag (slim, uopløseligt stof) fjernes. Hexanopløsningen af den
neutraliserede olie vaskes i flere omgange med 2-propanolopløsning (5.3)1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 32
▼B
i portioner på 25—30 ml, indtil phenolphthaleinets lyserøde farve forsv-
inder.
Det meste af hexanen fjernes ved destillation under vakuum i rotationsfor-
damperen (4.18), hvorefter olien tørresved 30—40º C under vakuum ved
hjælp af en strøm af ren nitrogen, indtil hexanen er fjernet fuldstændigt.
6.2.Rensning på aluminiumoxid
15 g aktiveret aluminiumoxid (5.8) opslæmmes i 50 ml hexan (5.1), og
suspensionen hældes i kromatografisøjlen (4.7) under omrøring. Man lader
aluminumoxidet bundfælde sig og lader opløsningsmidlets niveau falde til
1—2 mm over adsorbenten. Derefter hældes forsigt en opløsning af 5 g
olie i 25 ml hexan (5.1) på søjlen, og hele eluatet opsamles i en rund-
bundet kolbe (4.1).
7. FREMSTILLING AF KROMATOGRAFIPLADER
Glaspladerne (4.13) renses grundigt med ethanol, petroleumsether og
acetone, så alle spor af fedtstof fjernes.
I en Erlenmeyer-kolbe (4.4) anbringes30 g s ilicapulver (5.9), og der
tilsættes 60 ml destilleret vand. Derefter tilproppes kolben og rystes kraf-
tigt i 1 min., hvorefter opslæmningen omgående overføres til
udstrygningsapparatet (4.12), og de rene plader belægges med et 0,25 mm
tykt lag.
Pladerne lufttørresi 15 min. og derefter i 1 time i ovnen (4.16) ved
103 ± 2º C. Pladerne afkøles til stuetemperatur i ekssikkator før brug.
Færdigfremstillede plader fås i handelen.
8. FREMGANGSMÅDE
8.1.Hydrolyse med pankreas-lipase
I centrifugeglasset (4.8) afvejes ca. 0,1 g af den forberedte prøve. Hvis
prøven består af flydende olie, gås direkte frem som beskrevet nedenfor.
Består den af fast fedt, opløses den i 0,2 ml hexan, om nødvendigt under
forsigtig opvarmning.
Der tilsættes 20 mg lipase (5.10) og 2 ml bufferopløsning (5.15). Der
omrystes forsigtigt men omhyggeligt og tilsættes 0,5 ml natriumcholato-
pløsning (5.14) og 0,2 ml calciumchloridopløsning (5.13). Glasset lukkes
med slibprop, rystes forsigtigt (undgå at fugte proppen) og anbringes
derefter omgående i termostaten (4.17), som holdes på en temperatur på
40 ± 0,5º C, og rystes i hånden i nøjagtigt 1 min.
Glasset fjernes fra termostaten og omrystes kraftigt ved hjælp af rysteap-
paratet (4.19) i nøjagtigt 2 min.
Derefter køles omgående i rindende vand. Så tilsættes 1 ml saltsyre (5.12)
og 1 ml diethylether (5.4). Glasset tilproppes, og der blandes grundigt ved
hjælp af det elektriske rysteapparat. Derefter lader man glasset henstå og
fjerner det organiske lag ved hjælp af sprøjten (4.10), om nødvendigt efter
centrifugering.
8.2.Separation af monoglyceriderne ved tyndtlagskromatografi
Ekstraktet anbringes på kromotografipladen med mikrosprøjten (4.11) ca.
1,5 cm fra den nederste kant i en tynd ensartet linje så smal som mulig.
Pladen anbringesi det godt mættede eluerings kar (4.14), og der elueres
med elueringsvæsken (5.7) ved ca. 20º C op til ca. 1 cm fra pladens
øverste kant.
Pladen lufttørresved karretstemperatur og s prøjtesmed 2,7-dichlorfluore-
sceinopløsning (5.17). Monoglyceridbåndet identificeres (Rf ca. 0,035)
under ultraviolet lys(4.20).
8.3.Analyse af monoglyceriderne ved gas/væskekromatografi
Det under 8.2 fremkomne bånd fjernesved hjælp af en s patel (undgå at
fjerne restbestanddele på basislinjen) og overføres til methyleringskolben
(4.2).
Det afskrabede silica behandles nøjagtigt som beskrevet i bilag X B, så
monoglyceriderne omdannes til methylestere, hvorefter esterne undersøges
ved gaskromatografi som beskrevet i bilag X A.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 33
▼B
9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Sammensætningen af fedtsyrer i 2-positionen beregnes med én decimals
nøjagtighed (note 3).
10. NOTER
Note 1: Test for lipaseaktivitet
I en passende mixer tilberedes en olieemulsion ved omrøring af
en blanding af 165 ml gummi arabicum-opløsning (5.21), 15 g
knust is og 20 ml neutraliseret olie (5.18).
10 ml af denne emulsion hældes i et bærgerglas (4.5), efterfulgt
af 0,3 ml natriumcholatopløsning (5.20) og 20 ml destilleret vand.
Bægerglasset sættes i en termostat, der er indstillet til 37 ± 0,5º C
(note 4), og elektroderne til et pH-meter (4.21) og en omrører
(4.22) nedsænkes i bægerglasset.
Med en burette (4.23) tilsættes dråbevis natriumhydroxidopløs-
ning (5.19), indtil der er opnået et pH på 8,5.
Der tilsættes en tilstrækkelig mængde vandig suspension af lipase
(se nedenfor). Så snart pH-meteret viser en pH-værdi på 8,3,
startes stopuret (4.24), og der tilsættes dråbevis natriumhydroxi-
dopløsning (5.19) med en sådan hastighed, at pH holdes fast på
8,3. Den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning aflæses
hvert minut.
De aflæste værdier afsættes i et diagram med tiden som abscisse
og den mængde alkaliopløsning, der kræves til fastholdelse af en
konstant pH-værdi, som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje.
Den ovenfor omtalte lipasesuspension er en 1 ‰ (m/m) suspen-
sion i vand. Til hver test bør der anvendes tilstrækkeligt af
denne suspension til, at der forbruges ca. 1 ml natriumhydroxido-
pløsning på 4 — 5 min. Almindeligvis er der brug for 1 — 5 mg
pulver.
Lipaseenheden er defineret som den mængde enzym, der frigør
10 µ-ækvivalenter syre pr. minut. Aktiviteten A af det anvendte
pulver, målt i lipaseenheder pr. mg, beregnes efter formlen:
A¼V/C210
m
hvor:
V = antal ml natriumhydroxidopløsning (5.19) forbrugt pr.
minut, beregnet ud fra diagrammet
m = lipasetestportionens masse i mg.
Note 2: Fremstilling af lipase
Lipaser med tilfredstillende lipaseaktivitet kan fås i handelen,
men de kan også fremstilles i laboratoriet på følgende måde: 5 kg
frisk svinepankreas afkøles til 0º C. Alt omgivende fedt og
bindevæv fjernes, og pankreasvævet finddeles i en blender, indtil
der opnåsen flydende pas ta. Denne omrøresmed omrøreren
(4.25) i 4 — 6 timer med 2,5 l vandfri acetone og centrifugeres
derefter. Bundfaldet ekstraheres yderligere tre gange med den
samme mængde acetone, derefter to gange med en blanding af
lige dele acetone og diethylether (v/v) og til sidst to gange med
diethylether.
Efter tørring af bundfaldet i vakuum i 48 timer opnåset s tabilt
pulver, som bør opbevares i køleskab.
Note 3: I alle tilfælde tilrådes det at bestemme sammensætningen af
prøvens samlede indhold af fedtsyrer, eftersom sammenligningen
med sammensætningen af syrer i 2-positionen vil hjælpe med ved
fortolkningen af de fundne data.
Note 4: Hydrolysetemperaturen er fastsat til 37º C, eftersom der anvendes
en flydende olie. Den er dog fastsat til 40º C for analyseprøven,
så der bliver mulighed for at undersøge fedtstoffer med smelte-
punkter på op til 45º C.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 34
▼B
BILAG VIII
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF TRILINOLEIN
1. OMFANG
Bestemmelse af sammensætningen af triglycerider i flydende vegetabilske
olier, udtrykt ved deres ævivalente kulstoftal, ved højtryks væskekromato-
grafi.
I denne standard beskrives en metode til separation og kvantitativ bestem-
melse af triglyceridsammensætningen af vegetabilske olier, udtrykt ved
deresmolekylvægt og grad af umættethed s om funktion af deresækviva-
lente kulstoftal (note 1).
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder anvendelse på alle vegetabilske olier indeholdende
triglycerider af langkædede fedtsyrer. Metoden er specielt anvendelig til
påvisning af små mængder ikke-tørrende (linolsyreholdige) olier i de vege-
tabilske olier, hvor oliesyre er den fremherskende umættede festsyrer,
såsom olivenolie.
3. PRINCIP
Separation af triglycerider efter deresækvivalente kuls toftal ved højt
ydende væskekromatografi (med omvendt fase) og tolkning af kromato-
grammerne.
4. APPARATUR
4.1. Højtydende væskekromatograf med mulighed for termostatisk kontrol af
kolonnetemperaturen.
4.2. Injektionsenhed for portioner på 10 µl.4.3. Detektor: differentialrefraktometer. Følsomheden bør være mindst 10
−4af
fuldt udslag.
4.4. Kolonne: rør af rustfrit stål, længde 250 mm og indvendig diameter 4,5 mm,
fyldt med silicapartikler med en diameter på 5 µm og med 22—23 %
kulstof i form af octadecylsilan (note 2).
4.5. Skriver og/eller integrator.
5. REAGENSER
Reagenserne skal være af analysekvalitet. Elueringsvæskerne skal være
afluftede og kan recirkuleres adskillige gange uden indflydelse på separa-
tionerne.
5.1. Chloroform.
5.2. Acetone.
5.3. Acetonitril.5.4. Elueringsvæske: acetonitril + acetone (i et indbyrdes forhold, som fører til
den ønskede separation; der begyndes med en blanding i forholdet 50:50).
5.5. Opløsningsmiddel for analyseprøven: acetone eller en blanding af acetone/
chloroform i forholdet 1:1.
5.6. Referencetriglycerider: enten anvendesglycerider, s om fåsi handelen
(tripalmitin, triolein osv.), hvis retentionstider afsættes mod det ækvivalente
kulstoftal, eller der anvendes et referencekromatogram af soyaolie (se note
3 og 4 og figur 1 og 2).
6. PRØVEFORBEREDELSE
Der fremstilles en 5 % opløsning af de prøver, der skal analyseres, ved, at
der afvejes0,5 ± 0,001 g af prøven i en 10 ml målekolbe, hvorefter der
fyldes op til 10 ml med opløsningsmiddel for analyseprøven (5.5).
7. FREMGANGSMÅDE
7.1. Kromatografisystemet gøres klar, og der pumpes elueringsvæske (5.4)
igennem med en hastighed af 1,5 ml/min. til rensning af hele systemet.
Der ventes, indtil basislinjen er blevet stabil.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 35
▼B
Derefter indsprøjtes 10 µl af prøven forberedt som under (6).
8. BEREGNING OG ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Der anvendes intern standard, dvs. at summen af toparealerne svarende til
de forskellige triglycerider sættes lig med 100 %. Den procentvise andel af
hvert triglycerid beregnesefter formlen:
% triglycerid =topareal
summen af alle toparealer× 100
idet resultatet angives med én decimal.
Note 1: Elueringsrækkefølgen kan bestemmes ved beregning af de ækviva-
lente kulstoftal, ofte defineret ved udtrykket ECN = CN − 2n, hvor
CN er kulstoftallet, og n er antallet af dobbeltbindinger. Det kan
beregnesmere nøjagtigt, hvisder tageshens yn til dobbelbindin-
gensoprindels e. Hvisno,nlog nlnantallet af dobbeltbindinger i
henholdsvis olie-, linol- og linolensyre, kan det ækvivalente
kulstoftal beregnes efter formlen:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln
hvor koefficienterne do,dlog dlnkan beregnesved hjælp af referen-
cetriglyceriderne. Under de betingelser, der er specificeret ved
denne metode, vil resultatet ligge tæt ved
ECN = CN − [2,60 no] − [2,35 nl] − [2,17 nln]
Note 2: Eksempler: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 eller
lignende.
Note 3: Med adskillige referencetriglycerider er det også muligt at beregne
opløsningsevnen med hensyn til triolein,
α=RT′
RT′olein
ved hjælp af den reducerede retentionstid RT ′=R T−R Topløsnings-
middel
Ud fra en afbildning af log αmod f (antal dobbeltbindinger) kan
retentionsværdierne for alle de triglycerider af fedtsyrer, som
findes i referenctriglyceriderne, bestemmes — se figur 2.
Note 4: Kolonnen skal være så effektiv, at toppene af LLL (trilinolein)
adskilles helt fra toppene af triglyceriderne med næsten samme
retentionstid.
Note 5: For bomolie og rå olie af olivenpresserester er det for at opnå en
tilfredsstillende separation mellem toppen for trilinolein og nabo-
toppene eller interferende stoffer nødvendigt forud at rense olien
efter følgende metode:
200µl olie absorberes uden fortynding på en siliciumkolonne til
fast stof/væske-ekstraktion (af typen SEP PAK silica cartridge-
waterspart. nr. 51900).
Triglyceriderne elueresmed 20 ml vandfrit hexan til HPLC i højs t
20 sekunder.
Det eluerede produkt tørres i en nitrogenstrøm og genopløses i
isopropanol eller acetone (5 ml). Der injiceres 10-20 µl i HPLC.
Det må kontrolleres, at oliens fedtsyreindhold er det samme før
og efter rensningen inden for den fejlmargin, analysemetoden
tillader.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 36
▼M11
▼B
Figur 1
Kromatogram af en prøve af soyaolie
P: palmitinsyre; St: stearinsyre; O: oliesyre; L: linolsyre; Ln: linolensyre.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 37
▼B
Figur 2
Afbildning af log αmod f (antal dobbeltbindinger)
La: laurinsyre; My: myristinsyre; P: palmitinsyre; St: stearinsyre; O: olie-
syre; L: linolsyre; Ln: linolensyre.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 38
▼B
BILAG IX
SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSØGELSE VED ULTRAVIOLET
LYS
INDLEDNING
Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys kan give oplysninger
om et fedtstofs kvalitet, dets konserveringstilstand og om forandringer i
det, frembragt ved teknologiske processer.
Absorptionen ved de bølgelængder, der er specificeret i metoden, skyldes
tilstedeværelsen af konjugerede dien- og triensystemer. Disse absorptioner
er udtrykt som specifikke ekstinktioner E 1 % 1 cm (ekstinktionen for en
1 % opløsning af fedtstoffet i det angivne opløsningsmiddel i et 1 cm tykt
væskelag), sædvanligvis betegnet ved K, (også kaldet ekstinktionskoeffi-
cienten).
1. OMRÅDE
Metoden beskriver fremgangsmåden til udførelse af en spektrofotometrisk
undersøgelse af fedtstoffer ved ultraviolet lys.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffet opløses i det specificerede opløsningsmiddel, og opløsningens
ekstinktion bestemmes så ved de fastsatte bølgelængder i forhold til rent
opløsningsmiddel. De specifikke ekstinktioner beregnes ud fra aflæsnin-
gerne på spektrofotometeret.
3. APPARATUR
3.1. Et spektrofotometer til måling af ekstinktion i ultraviolet lys mellem 220
og 360 nm, med mulighed for aflæsning ved hver hele nanometer.
3.2. Firkantede kvartskuvetter med låg, med en optisk vejlængde på 1 cm. Når
kuvetterne er fyldt med vand eller et andet passende opløsningsmiddel, bør
der ikke være forskelle på mere end 0,01 ekstinktionsenheder mellem dem.
3.3. 25 ml målekolber.
3.4. En kromatografisøjle, hvis øverste del er 270 mm lang med en diameter på
35 mm, og hvisneders te del er 270 ml lang med en diameter på 10 mm.
4. REAGENSER
4.1. Isooctan (2,2,4-trimethylpentan) af spektrofotometrikvalitet med en trans-
mittanspå ikke mindre end 60 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 %
ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller
— cyclohexan af spektrofotometrikvalitet med en transmittans på ikke
mindre end 40 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i
forhold til destilleret vand.
4.2. Basisk aluminiumoxid til søjlekromatografi, tilberedt og kontrolleret som
beskrevet i appendix 1.
4.3. n-hexan til kromatografi.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Prøven skal være fuldstændig homogen og fri for urenheder i suspension.
Olier, som er flydende ved stuetemperatur, filtreres på papir ved en tempe-
ratur på ca. 30º C; faste fedtstoffer homogeniseres og filtreres ved entemperatur på højst 10º C over smeltepunktet.
5.2. Ca. 0,25 g af den således forberedte prøve afvejes nøjagtigt i en 25 ml
målekolbe, der fyldes op til mærket med det angivne opløsningsmiddel,
og opløsningen homogeniseres. Den fremkomne opløsning skal være fuld-
stændig klar. I modsat fald filtreres hurtigt på papir.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 39
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3. En kuvette fyldes med opløsningen, og ekstinktionerne måles ved en
passende bølgelængde mellem 232 og 276 nm med opløsningsmiddel som
reference.
De aflæste ekstinktionsværdier skal ligge inden for området 0,1—0,8. Gør
de ikke det, gentagesmålingerne, idet der benyttesmere koncentrerede
eller mere fortyndede opløsninger.
5.4. Når bestemmelse af en specifik ekstinktion skal ske efter passage over
aluminiumoxid, går man frem på følgende måde: 30 g basisk aluminium-
oxid opslæmmet i hexan hældes på kromatografisøjlen. Efter at
adsorbenten har bundfældet sig, tappes den overskydende hexan af, indtil
overfladen er ca. 1 cm over aluminiumoxidet.
10 g af fedtstoffet, homogeniseret og filtreret som beskrevet (5.1), opløses i
100 ml hexan, og opløsningen hældes på søjlen. Eluatet opsamles, og alt
opløsningsmiddel dampes af under vakuum ved en temperatur under 25º C.
Man går straks videre som beskrevet i (5.2) med dette fedtstof.
6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
6.1. Man opgiver den specifikke ekstinktion (ekstinktionskoefficient) ved de
forskellige bølgelængder, som beregnes efter:
Kλ¼Eλ
c/C2s
hvor:
Kλ= den specifikke ekstinktion ved bølgelængden λ
Eλ= den ekstinktion, der er målt ved bølgelængden λ
c = opløsningens koncentration i g/100 mls= kuvettens tykkels e i cm.
Resultaterne angives med to decimaler.
6.2. Spektrofotometrisk analyse af olivenolie i henhold til den officielle metode,
der er angivet i EF-forordningerne, kræver bestemmelse af den specifikke
ekstinktion i isooctanopløsning ved bølgelængderne 232 og 270 nm samt
bestemmelse af ∆K, som er givet ved:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
hvor Kmer den specifikke ekstinktion ved bølgelængden m, den bølge-
længde på ca. 270 nm der giver maksimal absorption.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 40
▼B
APPENDIX I
Tilberedning af aluminiumoxidet og kontrol af dets aktivitet
A 1.1. Tilberedning af aluminiumoxidet
Aluminiumoxid, som på forhånd er tørret i en ovn ved 380—400º C i 3
timer, anbringesi en beholder, der kan lukkeshermetis k, hvorefter der
tilsættes 5 ml destilleret vand pr. 100 g aluminiumoxid, og beholderen
lukkes øjeblikkeligt. Den rystes flere gange og får så lov til at stå i
mindst 12 timer før brugen.
A 1.2. Kontrol af aluminiumoxidetsaktivitet
En kromatografisøjle med 30 g aluminiumoxid klargøres. Efter frem-
gangsmåden i afsnit (5.4) lader man en blanding, der består af:
— 95 % jomfruolie med en specifik ekstinktion på under 0,18 ved
268 nm
— 5 % jordnødolie, der er behandlet med blegejord ved raffineringen,
og som har en specifik ekstinktion på ikke under 4 ved 268 nm,
passere gennem søjlen.
Hvis blandingen efter passage gennem søjlen har en specifik ekstinktion
på over 0,11 ved 268 nm, er aluminiumoxidet acceptabelt; hvisikke må
hydratiseringsgraden øges.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 41
▼B
APPENDIX II
Kalibrering af spektrofotometeret
A 2. Udstyret skal kontrolleres med regelmæssige mellemrum (mindst hver
sjette måned), både for korrekt bølgelængde og for udslagets nøjag-
tighed.
A 2.1. Bølgelængden kan kontrolleresved hjælp af en kviks ølvlampe eller med
egnede filtre.
A 2.2. Ved kontrol af fotocellensog fotomultiplikatorrøretsres ponsgår man
frem på følgende måde: 0,2 g ren kaliumchromat til spektrofotometri
afvejes og opløses i 0,05 N kaliumhydroxidopløsning i en 1 000 ml
målekolbe, og der fyldesop til mærket. Man overfører præcis25 ml af
denne opløsning til en 500 ml målekolbe og fortynder op til mærket med
den samme kaliumhydroxidopløsning.
Derefter måler man denne opløsnings ekstinktion ved 275 nm med
kaliumhydroxidopløsningen som reference. Den målte ekstinktion med
en 1 cm kuvette skal være 0,200 ± 0,005.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 42
▼B
BILAG X A
GASKROMATOGRAFERING AF FEDTSYREMETHYLESTERE
1. FORMÅL
Denne standard giver generelle retninglinjer for gaskromatografisk
bestemmelse med pakket kolonne eller kapillarkolonne af den kvalita-
tive og kvantitative sammensætning af en blanding af
fedtsyremethylestere fremstillet i henhold til bilag X B.
Metoden gælder ikke for polymeriserede fedtsyrer.
2. REAGENSER2.1.Bæregas
Inaktiv gas(nitrogen, helium, argon, hydrogen etc.) vel tørret og inde-
holdende mindre end 10 mg oxygen/kg.
Note 1: Hydrogen, der kun benyttes som bæregas, når det gælder kapil-
larkolonner, gør det muligt at foretage analysen dobbelt så
hurtigt, men indebærer en risiko. Der forefindes sikkerhedsan-
ordninger.
2.2.Hjælpegasser
2.2.1. Hydrogen (renhedsgrad ≥99,9 %), fri for organiske urenheder.
2.2.2. Luft eller oxygen, fri for organiske urenheder.
2.3.Referencestandard
En methylesterblanding af rene fedtsyrer eller methylesterne af et fedt-
stof, der så vidt muligt har samme sammensætning som det fedtstof, der
skal analyseres.
Iltning af polyumættende fedtsyrer må undgås.
3. APPARATUR
Instruktionerne angår det sædvanlige udstyr til gaskromatografering
med pakket kolonne og/eller kapillarkolonne og flammeionisationsde-
tektor. Alt udstyr, som kan give den i 4.1.2. definerede ydeevne og
opløsning, kan anvendes.
3.1.Gaskromatograf
Gaskromatografen skal omfatte følgende elementer:
3.1.1. Injektionssystem
Der benyttes enten et injektionssystem
a) med pakkede kolonner med det mindst mulige dødvolumen (i dette
tilfælde skal injektionssystemet kunne opvarmes til en temperatur,
som er 20—50º C højere end kolonnens) eller
b) med kapillarkolonner, hvor injektionssystemet skal være specielt
udformet til anvendelse med sådanne kolonner. Injektoren kan være
med eller uden split.
Note 2: Er der ikke tale om fedtsyrer med mindre end 16 kulstofa-
tomer, kan der benyttesinjektor med faldende nål (moving
needle injector).
3.1.2. Ovn
Ovnen skal være i stand til at opvarme kolonnen til en temperatur på
mindst 260º C og holde den valgte temperatur inden for 1º C, når der
er tale om en kapillarkolonne. Det sidste krav er særlig vigtigt, da der
benyttes et rør af sintret kvarts.
Det anbefalesi alle tilfælde at anvende temperaturprogrammeret
opvarmning, navnlig til fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 43
▼B
3.1.3. Pakket kolonne
3.1.3.1. Kolonnen skal være kontrueret af et materiale, som er inaktivt i forhold
til de stoffer, der skal analyseres (dsv. glas eller rustfrit stål), af
følgende dimensioner:
a) Længde: 1—3 m. En relativt kort kolonne anvendesved tils tedevæ-
relse af langkædede fedtsyrer (over C20). Ved analyse af syrer med 4
eller 6 kulstofatomer anbefales det at anvende en kolonne på 2 m.
b) Indre diameter: 2—4 mm.
Note 3: Ved tilstedeværelse af polyumætterde forbindelser med mere
end tre dobbeltbindinger er der risiko for, at de nedbrydes i en
kolonne af rustfrit stål.
Note 4: Der kan anvendes et system med to pakkede kolonner.
3.1.3.2. Fyldmateriale bestående af følgende elementer:
a)Bærer: kiselgur, syrevasket og silanbehandlet, eller andet egnet
inaktivt bæremateriale med et snævert kornstørrelsesinterval (25 µm
i området 125 µm—200 µm), idet middelværdien vælgesefter
kolonnensindre diameter og længde.
b)Stationær fase: polær væske af polyestertype (f.eks. diethylenglycol-
polysuccinat, butandiolpolysuccinat, ethylenglycolpolyadipat mv.),
cyanosiliconer eller enhver anden væske, der giver den krævede
kromatografiske adskillelse (4). Den stationær fase bør udgøre 5 %
(m/m)—20 % (m/m) af fyldmaterialet. En ikke-polær fase kan
anvendes til visse adskillelser.
3.1.3.3. Konditionering af kolonnen
Efter at kolonnen om muligt er adskilt fra detektoren, opvarmes ovnen
gradvistil 185º C, og en s trøm af inaktiv gasledesgennem den netop
fremstillede kolonne med en hastighed på 20—60 ml/min. i mindst 16
timer ved denne temperatur og derpå i 2 timer ved 195º C.
3.1.4. Kapillarkolonne
3.1.4.1. Røret skal være af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer,
der skal analyseres (normalt glas eller sintret kvarts). Den indre
diameter skal være på mellem 0,2 mm og 0,8 mm. Den indvendige
overflade skal undergå en passende behandling (f.eks. forbehandling,
deaktivering), inden den stationære fasebelægning påføres. En længde
på 25 m er tilstrækkelig i de fleste tilfælde.
3.1.4.2. Stationær fase: normalt af typen polyglycol [poly(ethylenglycol)
20 000], polyester (butandiolpolysuccinat) eller polær polysiloxan
(cyanosiliconer). Bundne (tværbundne) kolonner er velegnede.
Note 5: Der er risiko for, at polære polysiloxaner gør det vanskeligt at
identificere og adskille linolensyre og C20syrer.
Belægningerne skal være tynde, dvs. 0,1 µm—0,2 µm.
3.1.4.3. Samling og konditionering af kolonnen
Der træffes de normale forholdsregler ved samlingen af kapillarko-
lonner, dvs. placering af kolonnen i ovnen (bærer), valg og montering
af samlinger (tæthed), anbringelse af kolonnens ender i injektoren og
detektoren (reduktion af dødvolumener). Kolonnen anbringesunder enstrøm af bæregas (f.eks. 0,3 bar (30 kPa) for en kolonne med en længde
på 25 m og en indre diameter på 0,3 mm).
Kolonnen konditioneresved temperaturprogrammering af ovnen ved 3º
C/min. fra den omgivende temperatur til en temperatur på 10º C under
den stationære fases dekomponeringsgrænse. Ovnen holdes på denne
temperatur i 1 time, indtil basislinjen har stabiliseret sig. Den genind-
stilles på 180º C, så der opnås isotermiske betingelser.
Note 6: Korrekt prækonditionerede kolonner fåsi handelen.
3.1.5. Detektoren skal helst kunne opvarmes til en temperatur, som er højere
end ovnens.
3.2.Injektionssprøjte
Injektionssprøjten skal have en maksimumskapacitet på 10 µl med 0,1 µl
inddelinger.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 44
▼B
3.3.Skriver
Hvis den optegnede kurve skal anvendes til at beregne sammensæt-
ningen af den analyserede blanding, skal skriveren være et meget
præcist elektronisk instrument, som er foreneligt med det anvendte
apparatur. Skriveren skal have følgende specifikationer:
a) responstid mindre end 1,5 sek. og helst 1 sek. (responstiden er den
tid, der forløber, fra skriveren modtager et pludseligt signal på
100 %, og indtil den giver et udslag på 90 %)
b) papirbredde: minimum 20 cm
c) papirhastighed: regulerbar fra 0,4—2,5 cm/min.
3.4.Integrator
Anvendelse af elektronisk integrator giver en hurtig og præcis bereg-
ning. Den skal give et lineært udslag med tilstrækkelig følsomhed, og
korrektionen for forstyrrelser på basislinjen skal være tilfredsstillende.
4. FREMGANGSMÅDE
4.1 til 4.3 angår anvendelse af en flammeionisationsdetektor.Alternativt kan anvendesen gas kromatograf med katarometerdetektor
(registrerer ændringer af varmeledningsevne). I så fald ændres arbejds-
betingelserne som angivet i 6.
4.1.Prøvebetingelser
4.1.1. Bestemmelse af de optimale arbejdsbetingelser4.1.1.1. Pakket kolonne
Følgende variabler indgår i valget af arbejdsbetingelser:
a) kolonneslængde og diameter
b) den stationære fases art og mængde
c) kolonnenstemperatur
d) bæregassens hastighed
e) den ønskede opløsning
f) prøvens størrelse valgt på en sådan måde, at detektoren og elektro-
metret i forening giver et lineært udslag
g) analysetiden.
Almindeligvis vil værdierne i tabel 1 og tabel 2 give de ønskede resul-
tater, dvs. for methylstearat mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m
kolonnelængde og en elueringstid på ca. 15 min.
Hvisapparaturet gør det muligt, s kal injektoren have en temperatur på
omkring 200º C og detektoren en temperatur, som er lig med eller
højere end kolonnes.
Forholdet mellem hydrogenstrømmen til flammeionisationsdetektoren
og bæregassens hastighed ligger normalt på 1:2 til 1:1 alt efter kolon-
nens diameter. Oxygenstrømmen er ca. 5—10 gange større end
hydrogenstrømmen.
Tabel 1
Kolonnesindre diameter
mmBæregassens hastighed
ml/min.
2 15—25
3 20—40
4 40—60
Tabel 2
Den stationære fases koncentration
% (m/m)Kolonnenstemperatur
ºC
5 175
10 1801991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 45
▼B
Den stationære fases koncentration
% (m/m)Kolonnenstemperatur
ºC
15 185
20 185
4.1.1.2. Kapillarkolone
Kapillarkolonnensydeevne og permabilitet er ens betydende med, at
adskillelsen mellem bestanddelene og analysetiden stort set afhænger
af bæregassens hastighed i kolonnen. Det vil derfor være nødvendigt
at skabe de bedst mulige driftsbetingelser ved ad følge dette parameter
(eller blot rette sig efter kolonnens tryktab) alt efter, om man ønsker at
opnå bedre adskillelser eller foretage en hurtig analyse.
4.1.2. Bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og
opløsning
(Se figur 1).
Analysen gennemføres med en blanding af methylstearat og methyloleat
i nogenlunde lige store mængder (f.eks. methylestere af kakaosmør).
Kolonnens temperatur og bæregassens hastighed vælges således, at
methylstearattoppens maksimum resistreres ca. 15 min. efter opløs-
ningsmiddeltoppen. Der anvendes en tilstrækkelig mængde af
methylesterblandingen til, at methylstearattoppen svarer til ca. ¾af
fuldt udslag.
Antallet af teoretiske bunde, n (ydeevne), beregnes ud fra formelen:
n¼16/C2dω
ω1/C20/C21
2
og opløsningen, R, ud fra formelen:
R¼2/C2∆
ω1þω2
hvor
dω= retentionsafstanden i mm målt fra kromatogrammets start
til det relative maksimum for methylstearattoppen
ω1ogω2= methylstearat- og methylolealtoppenes bredde i mm målt
mellem basislinjens skæringspunkter med kurvens vende-
tangenter
∆ = afstanden i mm mellem methylstearat- og methylolea-
ttoppenesmaks ima
og opløsningsindekset Ir ud fra formlen
a
b
hvor
a = højden af den mindste top målt i forhold til basislinjen
b = højden af det laveste punkt i området mellem to toppe ved siden
af hinanden målt i forhold til basislinjen.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 46
▼M2
▼B
Figur 1
Kromatogram til bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og opløs-
ning
Betingelserne vælges således, at de for methylstearat giver mindst 2 000teoretiske bunde pr. m kolonnelængde og en opløsning på mindst 1,25.
4.2.Prøve
Med injektionssprøjten (3.2) udtages 0,1—2 µl af methylesteropløs-
ningen, der er fremstillet i henhold til bilag X B, og indsprøjtes i
kolonnen.
Når det gælder ikke opløste estere, fremstilles i heptan til kromatografi
en opløsning på 100 mg/ml, og 0,1—1 µl af denne opløsning
indsprøjtes.
Ved analyse af bestanddele, der kun er til stede som spor, kan prøveud-
tagningen forøges(op til ti gange).
4.3.Analyse
Normalt vil driftsbetingelserne være de samme som dem, der er fastlagt
i (4.1.1).
Det er dog muligt at arbejde med en lavere kolonnetemperatur, når fedt-
syrer med mindre end 12 kulstofatomer skal bestemmes, eller en højere
temperatur, når fedtsyrer med mere end 20 kulstofatomer skal
bestemmes. Det et muligt at anvende temperaturprogrammering i begge
tilfælde. Hvis prøven f.eks. indeholder fedtsyremethylestere med mindre
end 12 kulstofatomer, indsprøjtes prøven ved 100º C (eller 50—60º C,
hvis der er smørsyre til stede), hvorefter temperaturen straks øges med
4—8º C/min, indtil den optimale temperatur nås. I visse tilfælde kan de
to fremgangsmåder kombineres.
Efter den programmerede opvarmning fortsættes elueringen ved
konstant temperatur, indtil alle bestanddelene er elueret. Hvis apparatet
ikke arbejder med programmeret opvarmning, arbejdesder med to fas te
temperaturer mellem 100º C og 195º C.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 47
▼B
Om nødvendigt anbefales det at foretage en analyse på to stationære
faser med forskellig polaritet for at sikre sig, at der ikke forekommer
maskerede toppe, hvilket kan være tilfældet ved samtidig tilstedevæ-
relse af C18:3og C20:0eller af C18:3og C18:2konjugeret.
4.4.Udarbejdelse af referencekromatogrammet og referencedia-
grammer
Referencestandardblandingen (2.3) analyseres under de samme driftsbe-
tingelser som for prøvens vedkommende, og retentionstiderne eller
retentionsafstandene for de tilstedeværende fedtsyrer måles. På semilo-
garitmisk papir afbildes logaritmen til retentionstiden eller -afstanden
mod antallet af kulstofatomer for alle grader af umættethed; under
isotermiske betingelser skal de punkter, der repræsenterer ligekædede
syrer med samme umættethedsgrad, ligge på rette linjer, der er nogen-
lunde parallelle.
Det er nødvendigt at undgå betingelser, hvor der fremkommer »maske-
rede toppe«, dvs. hvor opløsningen er utilstrækkelig til at adskille to
bestanddele.
5. ANGIVELSE AF RESULTATER5.1.Kvalitativ analyse
Prøvensmethyles tertoppe identificeresud fra diagrammerne, der er
udarbejdet i 4.4, om nødvendigt ved interpolation.
5.2.Kvantitativ analyse
5.2.1. Bestemmelse af sammensætningen
Bortset fra undtagelsestilfælde anvendes den interne normaliseringsme-
tode, dvs. det forudsættes, at samtlige bestanddele i prøven er
repræsenteret på kromatogrammet, således at toppenes samlede areal
udgør 100 % af bestanddelene (total eluering).
Hvisapparaturet omfatter en integrator, anvendesres ultaterne fra denne.
Hvisikke, bes temmer man arealet af hver enkelt top ved at multipliceretoppenshøje med densbredde i halv højde og tager i givet fald hens yn
til de forsekllige dæmpningsindstillinger under registreringen.
5.2.2. Beregningsmetode5.2.2.1. Generelt
Indholdet af en given bestanddel i, udtrykt i vægtprocent methylestere,
beregnes ved, at man bestemmer den procentdel, som den tilsvarende
top udgør i forhold til summen af arealerne af samtlige toppe, ud fra
følgende formel:
Ai
Σν
ιΑ/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
Σν
ιΑ= summen af arealerne af samtlige toppe.
Resultatet anføres med en decimal.
Note 7: I dette generelle tilfælde betragtesres ultatet af beregningen,
som er baseret på relative arealer, som en vægtprocent. I de
tilfælde, hvor man ikke kan arbejde med denne antagelse,
henvises til 5.2.2.2.
5.2.2.2. Anvendelse af korrektionsfaktorer
I visse tilfælde, f.eks. ved tilstedeværelse af fedtsyrer med mindre end
otte kulstofatomer eller syrer med andre funktionelle grupper, bør der,
når man anvender varmeledningsevnedetektorer, eller når den størst
mulige præcision er specielt påkrævet, anvendes korrektionsfaktorer
for at omsætte bestanddelenes procentvise toparealer til vægtprocent.
Korrektionsfaktorerne bestemmes ved hjælp af et kromatogram af en
referenceblanding af methylestere med kendt sammensætning under
samme betingelser som for prøvens vedkommende.
For denne referenceblanding udtrykkesvægtprocent bes tanddel i ud fra
formlen1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 48
▼B
mi
Σν
ιµ/C2100
hvor
mi= massen af bestanddel i i referenceblandingen
Σν
ιµ= summen af masserne af referenceblandingens forskellige
bestanddele.
Ud fra referenceblandingens(4.4) kromatogram beregnesprocentdelen
(areal/areal) af bestanddel i som følger:
Ai
Σν
ιΑ/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
Σν
ιΑ= summen af arealerne af samtlige toppe.
Korrektionsfaktoren beregnes derpå som:
Ki¼mi/C2Σν
ιΑ
Ai/C2Σν
ιµ
Almindeligvis sættes korrektionsfaktorerne i relation til KC16, så de rela-
tive faktorer bliver:
K0
i¼Ki
KC16
For prøven er mængden af hver bestanddel i, udtrykt i vægtprocent
methylestere,
K0
i/C2Ai
Σν
ιΚ0ι/C2Αι/C0/C1 /C2100
Resultatet anføres med en decimal.
5.2.2.3. Anvendelse af en intern standard
I forbindelse med visse analyser (f.eks. når det ikke er alle fedtsyrerne
der er elueret, som det er tilfældet, når syrer med 4 og 6 kulstofatomer
er til stede sammen med syrer med 16 og 18 kulstofatomer, eller når
det er nødvendigt at bestemme den absolutte mængde af en fedtsyre i
en prøve), er det nødvendigt at anvende en intern standard. Der benyttes
ofte fedtsyrer med 5, 15 eller 17 kulstofatomer. Den eventuelle korrek-
tionsfaktor for den interne standard bestemmes.
Vægtprocent bestanddele i, udtrykt som methylestere, betemmes ud fra
formlen
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
As= arealet af den top, der svarer til den interne standard
K′i= korrektionsfaktoren for bestanddel i (i forhold til KC16)
K′s= korrektionsfaktoren for den interne standard (i forhold til KC16)
m = massen i mg af prøvenm
s= massen i mg af den interne standard.
Resultaterne anføres med en decimal.
6. BESTEMMELSE AF TRANSISOMERER
Det er muligt at bestemme indholdet af transisomerer i fedtsyrer med et
antal kulstofatomer på mellem 10 og 24 ved adskillelse af methylestere
under anvendelse af en kromatograf med kapillarkolonne og særlig
polaritet.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 49
▼M2
▼M2
6.1. Kapillarkolonne af kvartsglas med en intern diameter på 0,25 mm -
0,32 mm og en længde på 50 m, dækket af cyanopropylsilicone i en
lagtykkelse på 0,1 - 0,3 µm (type SP 2340, type SP 2380 C.P. Sil 88,
Silor 10 og lignende).
6.2. Methylesterne fremstilles i overensstemmelse med metode B i bilag X
B. De fedtholdige stoffer med et indhold af frie syrer på over 3 % skal
på forhånd neutraliseres i overensstemmelse med punkt 6.1 i bilag VII.
6.3. De vilkår, hvorunder gaskromatograferingen skal finde sted, er:
— kolonnetemperatur programmeret til 150-230 ºC (f.eks. 165 ºC i 15
minutter, derefter en stigning på 5 ºC i minuttet indtil 200 ºC)
— injektorenstemperatur: 250 ºC, hvisder anvendess plitting, eller
samme begyndelsestemperatur som kolonnen, hvis der anvendes
»on column«
— detektorenstemperatur: 260 ºC— strømningshastighed for bæregassen (helium eller hydrogen): 1,2 ml/
minut.
Den injicerede mængde skal være sådan, at højden af den top, der svar-
er til methylesteren fra arachinsyre ved den anvendte følsomhed skal
være mindst 20 % af fuldt udslag.
6.4. Identifikationen af de enkelte methylestere sker på grundlag af retenti-
onstiderne, der sammenlignes med retentionstiderne for
referenceblandinger (som angivet i punkt 2.3).
Esterne fra transfedtsyrerne elueres før de tilsvarende cis-isomerer. Et
eksempel på kromatogram er anført i figur 2.
Figur 2
Gaskromatogram vedrørende bestemmelse af transisomerer i fedtsyrer med
kapillarkolonne
6.5. Kolonnens effektivitet som bestemt i overensstemmelse med punkt
4.1.2 skal muliggøre separation af visse kritiske par, f.eks. det par, der
består af transoliesyre og oliesyre, trans C18: 1/cis C18: 1, med et
opløsningsindeks på over 2.
6.6. Den procentvise andel af hver enkelt transfedtsyre beregnet på grundlag
af forholdet mellem arealet af den tilhørende top og summen af area-
lerne af alle tilstedeværende toppe.
De procentvise andele af følgende syrer tages i betragtning:
— trans-octadecensyre (T 18: 1), i bilag I til nærværende forordning
anført som isomerer af transoliesyrer
— cis-trans- og trans-cis-octadecadiensyre [(CT/TC) 8: 2], i bilag I til
nærværende forordning anført som isomerer af translinolsyre1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 50
▼M2
— trans-cis-trans-, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis-octadecatri-
ensyre [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], i bilag I til
nærværende forordning anført som isomerer af translinolensyre.
Note 8: På grund af denne metodes ganske særlige karakteristik, skal
resultatet angives med to decimaler.
►M27.◄SÆRLIGE TILFÆLDE — ANVENDELSE AF KATAROME-
TERDETEKTORER (REGISTRERER ÆNDRINGER AF
VARMELEDNINGSEVNE)
En gaskromatograf med detektor, der registrerer ændringer af varmeled-
ningsevne (et katarometer) kan også anvendes til bestemmelse af den
kvalitative og kvantitative sammensætning af en blanding af fedtsyre-
methylestere. I så fald ændres betingelserne i (3) og (4) som vist i
tabel 3.
Til kvantitativ analyse anvendes korrektionsfaktorerne i (5.2.2.2).
Tabel 3
Variabel Værdi/betingelse
Kolonne Længde: 2—4 m
Indre diameter: 4 mm
Bærer Kornstørrelse mellem 160 og
200 µm
Mængde stationær fase 15 % (m/m) — 25 % (m/m)
BæregasHelium eller i mangel heraf
hydrogen med lavest mulige
indhold af oxygen
Hjælpegasser Ingen
Indsprøjtningstemperatur 40—60 ºC højere end kolonnens
temperatur
Kolonnenstemperatur 180—200 ºC
Bæregassens hastighed Normalt mellem 60 og 80 ml/
min.
Indsprøjtet prøvemængde Normalt mellem 0,5 og 2 µl
►M28.◄PRØVERAPPORT
Prøverapporten skal indeholde en beskrivelse af de metoder, der er
anvendt til fremstilling af methylesterne og til gaskromatograferingen,
samt de opnåede resultater. Den skal også indholde alle de enkeltheder,
der ikke er nævnt i denne standard, eller som betragtes om valgfri, samt
en redegørelse for eventuelle forhold, der kan have haft indflydelse på
resultaterne.
Rapporten skal indeholde alle oplysninger, der er nødvendige for en
nøjagtig identifikation af prøven.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 51
▼B
▼M19
BILAG X B
FREMSTILLING AF METHYLESTERE AF FEDTSYRER FRA OLIVEN-
OLIE OG OLIE AF OLIVENPRESSERESTER
De to nedenfor anførte metoder anbefales til fremstilling af methylestere af fedt-
syrer fra olivenolie og olie af olivenpresserester:
metode A: kold omestring med kaliumhydroxid i methanol
metode B: varm methylering med natriummethylat i methanol efterfulgt af
forestring i sur væske.
Valget mellem de to metoder afhænger af, hvilken parameter der skal analy-
seres, og hvilken olietype der er tale om, på følgende måde:
a) bestemmelse af forskellen mellem det faktiske og det teoretiske indhold af
ECN42-triglycerider ( ∆ECN42):
— Metode A anvendestil olieprøver af alle typer efter rens ning af olien på
silicagelkolonne
b) bestemmelse af fedtsyresammensætningen:
— Metode A anvendesdirekte på prøver af følgende olietyper:
— jomfruolier med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %
— raffineret olivenolie
— olivenolie (blanding af jomfruolier og raffineret olivenolie)— raffineret olie af olivenpresserester
— olie af olivenpresserester (blanding af jomfruolier og raffineret olie af
olivenpresserester).
— Metode B anvendesdirekte på prøver af følgende olietyper:
— jomfruolie med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %
— rå olie af olivenpresserester
c) bestemmelse af transfedtsyrer:
— Metode A anvendesdirekte på prøver af følgende olietyper:
— jomfruolier med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %
— raffineret olivenolie— olivenolie (blanding af jomfruolier og raffineret olivenolie)
— raffineret olie af olivenpresserester
— olie af olivenpresserester (blanding af jomfruolier og raffineret olie af
olivenpresserester).
— Metode A anvendes til olieprøver af nedenstående typer efter rensning af
olien på silicagelkolonne:
— jomfruolie med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %
— rå olie af olivenpresserester.
RENSNING AF OLIEPRØVER
Om nødvendigt renses prøverne på silicagelkolonne med en blanding af hexan
og diethylether (87:13, v/v) som elueringsmiddel som beskrevet i IUPAC-
metode 2.507.
En alternativ metode er fastfaseekstraktion ved hjælp af silicagelpatroner. En
silicagelpatron (1 g, 6 ml) anbringes i et tomt elueringsapparat og skylles med
6 ml hexan. Sugningen standses, så udtørring af kolonnen undgås. Derefter
sættes der en opløsning af olien (ca. 0,12 g) i 0,5 ml hexan på kolonnen, og
der åbnes for sugningen, så opløsningen trænger ned i silicagelen; derefter
elueresder med 10 ml hexan/diethylether (87:13, v/v) med vakuum. Eluaterne
samles og blandes og deles i to lige store portioner. Den ene portion inddampes
til tørhed på rotationsfordamper under reduceret tryk og ved stuetemperatur.
Remanensen opløses i 1 ml heptan. Opløsningen er parat til gaskromatografisk
analyse. Den anden portion inddampes, og remanensen opløses i 1 ml acetone til
HPLC-triglyceridanalyse, hvis det er påkrævet.
METODER TIL FREMSTILLING AF FEDTSYREMETHYLESTERE
1.Metode A: Kold omestring med kaliumhydroxid i methanol
1.1.Anvendelse
Denne hurtigmetode kan anvendes på olivenolie og olie af olivenpresse-
rester med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %. De frie fedtsyrer1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 52
▼M19
forestres ikke med kaliumhydroxid. Ethylestere af fedtsyrer omestrer
langsommere end glycerolestere, og muligvis methyleres de kun delvis.
1.2.Princip
Methylestrene dannes ved omestring i en opløsning af kaliumhydroxid i
methanol, hvilket er mellemstadiet inden forsæbning (punkt 5 i metoden
i ISO 5509:2000, punkt 5 i IUPAC-metode 2.301).
1.3.Reagenser
methanol med højst 0,5 % (m/m) vandheptan til kromatografi.kaliumhydroxid, ca. 2 N opløsning i methanol: 11,2 g kaliumhydroxid
opløses i 100 ml methanol.
1.4.Apparatur
reagensglas (rumindhold: 5 ml) med skrueprop med teflonpakningmålepipetter eller automatpipetter på 2 ml og 0,2 ml.
1.5.Fremgangsmåde
I et 5 ml reagensglas med skrueprop afvejes ca. 0,1 g af olieprøven. Der
tilsættes 2 ml heptan og rystes. Efter tilsætning af 0,2 ml 2 N kalium-
hydroxidopløsning i methanol lukkes glasset med proppen med
teflonpakning, og det rystes kraftigt i 30 sekunder. Glasset henstilles,
indtil det øvre lag af opløsningen er blevet klart. Det øvre lag, som
indeholder methylestrene, dekanteres fra. Heptanopløsningen er parat
til injektion i kromatografen. Det tilrådes, at opløsningen opbevares i
køleskab indtil kromatograferingen. Det frarådes at opbevare opløs-
ningen i mere end 12 timer.
2.Metode B: Varm methylering med natriummethylat i methanol efter-
fulgt af forestring i sur væske
2.1.Anvendelse
Denne metode kan anvendes på olivenolie og olie af olivenpresserester
med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %.
2.2.Princip
Neutralisering af frie fedtsyrer og alkalisk methanolyse af glycerider
efterfulgt af forestring af fedtsyrerne i sur væske (punkt 4.2 i IUPAC-
metode 2.301).
2.3.Reagenser
— heptan til kromatografi
— methanol med højst 0,05 % (m/m) vand
— natriummethanolat, 0,2 N opløsning i methanol: 5 g natrium opløses
i 1 000 ml methanol (kan fremstilles ud fra indkøbte opløsninger).
— phenolphtalein, 0,2 % opløsning i methanol
— svovlsyre, 1 N opløsning i methanol: Der tilsættes 3 ml 96 % svovl-
syre til 100 ml methanol
— mættet opløsning af natriumchlorid i vand.
2.4.Apparatur
— 50 ml målekolbe med flad bund og høj snæver hals med slib
— tilbagesvaler: luftkøler (1 m lang) med slib
— kogesten
— glastragt.
2.5.Fremgangsmåde
0,25 g af olieprøven anbringesi en 50 ml målekolbe med s lib. Gennem
tragten tilsættes der 10 ml 0,2 N-natriummethanolatopløsning i
methanol og kogesten. Tilbagesvaleren påsættes, og efter omrystning
bringes opløsningen i kog. Opløsningen skal være klar efter ca. 10
minutter. Reaktionen er praktisk taget afsluttet efter 15 minutter.
Kolben tages af varmen, tilbagesvalingen standses, svaleren fjernes, og1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 53
▼M19
der tilsættes to dråber phenolphthaleinopløsning. Der tilsættes nogle
ml 1 N svovlsyre i methanol, indtil opløsningen bliver farveløs, og der
tilsættes endnu 1 ml i overskud. Svaleren påsættes, og der koges i
endnu ca. 20 minutter. Kolben tagesaf varmen og afkølesunder
rindende vand. Svaleren fjernes, der tilsættes 20 ml mættet natriumch-
lorid, og der omrystes. Der tilsættes 5 ml heptan, kolben tilproppes, og
der rystes kraftigt i 15 sekunder.
Blandingen henstilles, indtil faserne er helt adskilt. Der tilsættes mættet
natriumchloridopløsning, indtil vandfasen når op til kolbehalsens under-
kant. Det øvre lag, der befinder sig i kolbehalsen, indeholder
methylestrene. Opløsningen er parat til injektion i gaskromatografen.
Forsigtig: Methylering ifølge metode B skal udføres i stinkskab.
2.6.Alternativ til methylering ifølge metode B
2.6.1. Metode C
2.6.1.1. Princip
Fedtstoffet, der skal analyseres, behandles med en opløsning af chlor-
brinte i methanol i et forseglet glas ved 100 ºC.
2.6.1.2. Apparatur
— tykvægget glasmed et rumindhold på ca. 5 ml (højde 40-45 mm,
diameter 14-16 mm)
— målepipetter, 1 og 2 ml.
2.6.1.3. Reagenser
2 % opløsning af chlorbrinte i methanol, fremstillet ud fra chlorbrin-
tegasog vandfri methanol (note 1).
Hexan til kromatografi.
Note 1: Der kan benyttesindkøbte opløs ninger af chlorbrinte i
methanol. Det er nemt at fremstille små mængder chlorbrinte i
laboratoriet ved simpel uddrivning fra den i handelen værende
saltsyre (d = 1,18) ved tildrypning af koncentreret svovlsyre.
Da methanol let optager chlorbrintegas, bør der træffes de
sædvanlige forholdsregler ved opløsningen (f.eks. tilføres
gassen ved hjælp af en lille omvendt tragt, der netop rører
metanoloverfladen). Større mængder methanolopløsning af
chlorbrinte kan fremstilles i forvejen; de er holdbare ved opbe-
varing i mørke i kolber med glasprop. Reagenset kan også
fremstilles vedopløsning af acetylchlorid i vandfri metanol.
2.6.1.4. Fremgangsmåde
— I glasset anbringes 0,2 g af fedtstoffet, som forinden er tørret over
natriumsulfat og filtreret, og der tilsættes 2 ml af methanolopløs-
ningen af chlorbrinte. Glasset lukkes.
— Glasset neddyppes ved 100 ºC i 40 minutter.
— Glasset afkøles under rindende vand og åbnes, og der tilsættes 2 ml
destilleret vand og 1 ml hexan.
— Blandingen centrifugeres, og hexanfasen, som er klar til brug, kan
udtages.
2.6.2. Metode D
2.6.2.1. Princip
Fedtstoffet, der skal analyseres, opvarmes med tilbagesvaling med
methanol, hexan og svovlsyre. Methylestrene ekstraheres med petrole-
umsether.
2.6.2.2. Apparatur
— reagensglas på ca. 20 ml med glasslib og med en ca. 1 m lang luft-
svaler.
— 5 ml målepipette
— 50 ml skilletragt
— 10 og 25 ml reagensglas
— 15 ml spidsbundet reagensglas.
2.6.2.3. Reagenser
— methyleringsreagens: vandfri methanol, hexan og koncentreret
svovlsyre (d = 1,84) i forholdet 75:25:1 (v/v/v)
— 40-60 ºC petroleumsether1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 54
▼M19
— vandfrit natriumsulfat.
2.6.2.4. Fremgangsmåde
I glasset på 20 ml anbringes 0,1 g olie, og der tilsættes 5 ml methyle-
ringsreagens.
Svaleren påsættes, og der opvarmes i 30 minutter på kogende vandbad
(note 2).
Blandingen overføreskvantitativt til en 50 ml s killetragt ved hjælp af
10 ml destilleret vand og 10 ml petroleumsether. Der omrystes kraftigt,
og blandingen henstår, indtil faserne er adskilt. Vandfasen fjernes, og
etherlaget vaskes to gange med 20 ml destilleret vand. Skilletragten
tilsættes en lille mængde vandfrit natriumsulfat, der omrystes, blan-
dingen henstår i nogle få minutter, og der filtreres, idet filtratetopsamles i et 15 ml spidsbundet reagensglas.
Opløsningsmidlet afdampes på vandbad med en strøm af nitrogen.
Note 2: For at holde kogningen under kontrol kan man indsætte en
glasstav i reagensglasset og begrænse vandbadets temperatur
til 90 C
3.Nøjagtighed
Det Internationale Olivenolieråd har i forbindelse med sin metode COI/
T.20/dok. nr. 24 offentliggjort en statistisk vurdering af nøjagtigheden
ved metode A og B.
ANVISNINGER FOR GASKROMATOGRAFI AF ESTERE AF FEDTSYRER
FRA OLIVENOLIE OG OLIE AF OLIVENPRESSERESTER
1.Fremgangsmåde
Gaskromatografi af opløsninger af fedtsyreestere i hexan udføres ifølge
ISO 5508 på kapillarkolonne (50 m lang, indre diameter 0,25 eller
0,32 mm) belagt med cyanopropylsilicone som angivet ved bestem-
melse af trans-fedtsyrer (COI/T.20/dok. nr. 17).
Figur 1 viser et typisk kromatogram af olie af olivenpresserester, som
indeholder methyl- og ethylestere af fedtsyrer og transisomerer af
methylestere.
2.Beregninger
2.1. Ved beregning af sammensætningen af fedtsyrer og ∆ECN42 skal
følgende fedtsyrer medregnes:
myristinsyre (C14:0)
palmitinsyre (C16:0) — summen af arealerne af methyl- og ethylester-
toppene
palmitolsyre (C16:1) — summen af arealerne af toppene for ω9-e tω7-
isomererne af methylesteren
heptadecansyre (C17:0)heptadecensyre (C17:1)stearinsyre (C18:0)oliesyre (C18:1) summen af arealerne af toppene for ω9-e tω7-isome-
rerne af methylesteren, ethylesteren og transisomeren af methylesteren
linolsyre (C18:2) — summen af arealerne af toppene for methyl- og
ethylesteren og transisomererne af methylesteren
arachinsyre (C20:0)linolensyre (C18:3) — summen af toppene for methylesteren og transi-
somererne af methylesteren
eicosensyre (C20:1)behensyre (C22:0)lignocerinsyre (C24:0).Squalen medregnesikke ved beregningen af det s amlede areal.
2.2. Til beregning af det procentvise indhold af trans-C18:1 benyttes toppen
for methylesteren af denne fedtsyre. For at få summen (trans-
C18:2 + trans-C18:3) adderes alle toppene for transisomererne af disse
to fedtsyrer. Ved beregning af det samlede areal medregnes alle de
toppe, der er nævnt i punkt 2.1 (jf. COI/T.20/dok. nr. 17).1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 55
▼M19
Procentindholdet af de enkelte fedtsyrer beregnes efter følgende
formel:% X = (areal X × 100)/(samlet areal)
Figur 1: Typisk kromatogram af olie af olivenpresserester, fremkommet vedmetoden med kold methylering. Toppene er for methylestrene, hvor intet andet
er anført.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 56
▼B
BILAG XI
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FLYGTIGE HALOGENE
OPLØSNINGSMIDLER I OLIVENOLIE
1. PRINCIP
Analyse ved gaskromatografi ifølge teknikken med luftrummet over
væsken (head space).
2. APPARATUR
2.1. Gaskromatografiapparat udstyret med en elektronindfangningsdetektor
(ECD).
2.2. Apparatur for luftrummet over væsken (head space).2.3. Gaskromatografisøjle af glas med længde på 2 m og med 2 mm diameter,
stationær fase
10 % OV101 på chromosorb WLADMOS granulometri 80—100 Mesh.
2.4. Transportluftart og hjælpeluftart: nitrogen.
2.5. 10 til 15 ml glaskolber med en foring af teflon og en aluminiumsprop med
en åbning til udtagning med sprøjte.
2.6. Tang til hermetisk lukning.2.7. Sprøjte til luftarter på 0,5 til 2 ml.
3. REAGENSER
Flygtige halogene opløsningsmidler med en renhedsgrad, der egner sig til
gaskromatografi.
Pentan med en renhedsgrad, der egner sig til gaskromatografi.
4. ANALYSEMETODE
4.1. Der afvejesmed nøjagtighed ca. 3 g olie i en glas kolbe (der ikke må
genbruges), og kolben tilproppes indtil den hermetiske lukning. Kolben
anbringes i en termostat ved 70º C i en time. Der udtages med akkuratesse
ved hjælp af sprøjten en mængde på 0,2 til 0,5 ml af luftrummet over
væsken. Det indsprøjtes i gaskromatografisøjleapparatet, der er indstillet
således:
— injektortemperatur: 150º C
— søjletemperatur: 70 til 80º C
— detektortemperatur: 200 til 250º C.
Andre temperaturer kan også anvendes, såfremt resultaterne er ækivalente.
4.2. Referenceopløsninger. Der tilberedes standardopløsninger ved brug af raffi-
neret olivenolie uden spor af opløsningsmidler til variable koncentrationer
af flygtige halogene opløsningsmidler mellem 0,05 og 1 ppm og i forhold
til det formodede indhold af prøven. En eventuel fortynding af flygtige
halogene opløsningsmidler skal ske ved hjælp af pentan.
4.3. Mængdemæssig vurdering. Forholdet fastlægges mellem overfladerne eller
toppene på prøverne og den standardopløsning, der har den nærmeste
formodede koncentration. Hvis den forholdsvise forskel er over 10 %, er
det nødvendigt at gentage analysen ved sammenligning med en ny stan-
dardopløsning, indtil dens koncentration overholder ovennævnte
forholdsvise forskel. Indholdet af flygtige halogene opløsningsmidler
bestemmes på grundlag af et gennemsnit af elementære indsprøjtninger.
4.4. Udtryk for resultaterne. Resultaterne udtrykkes i ppm (mg/kg). Metodens
påvisningsgrænse er 0,01 mg/kg.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 57
▼M19
BILAG XII
ORGANOLEPTISK VURDERING AF JOMFRUOLIER
1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE
Formålet med denne metode er at fastlægge de nødvendige kriterier for
vurdering af de organoleptiske kendetegn for jomfruolier, jf. punkt 1 i bi-
laget til forordning nr. 136/66/EØF, og at beskrive metoden til
klassifikation.
Den beskrevne metode er kun anvendelig til klassifikation af jomfruolier i
forhold til den frugtagtige karakter og manglernes intensitet, der bestemmes
af en gruppe udvalgte og optrænede smagere, der er nedsat som et panel i
overensstemmelse med punkt 4.
2. GENERELT
Hvad den almindelige grundordliste, prøvelokale, generelle metoder og glas
til oliesmagning angår, henvises der til de forskrifter, som er fastsat af Det
Internationale Olivenolieråd.
3. SPECIEL ORDLISTE
3.1.Positive egenskaber
Frugtagtig : en række duftfornemmelser, der afhænger af olivensort og
kendetegn for en olie, som er udvundet af sunde og friske, grønne eller
modne frugter, og som fornemmes direkte eller retronasalt.
Bitter: karakteristisk smag af olie, der er udvundet af grønne oliven eller
oliven, der er lige ved at skifte farve.
Stærk: en prikkende fornemmelse, der er karakteristisk for olier, som er
udvundet i produktionsårets begyndelse især af endnu grønne oliven.
3.2.Negative egenskaber
Muggen : karakteristisk flavour for olie, der er udvundet af oliven, som er
opbevaret i bunker, og som har nået et fremskredet stadium af anaerob
gæring.
Mug-fugt : karakteristisk flavour for olie udvundet af oliven, hvori svampe
og gær har udviklet sig, fordi de har været opbevaret i adskillige dage i
fugtige omgivelser.
Mudret bundfald : karakteristisk flavour for olie, der er udvundet af dekan-
teret bundfald i kar og underjordiske tanke.
Vinagtig-eddikeagtig : karakteristisk flavour for visse olier, som minder om
vin eller eddike. Skyldes hovedsagelig, at der dannes eddikesyre, ethyla-
cetat og ethanol ved gæring af oliven.
Metallisk : flavour, der minder om metal. Karakteristisk for olie, der har
været i langvarig kontakt med metaloverflader under knusning, blanding,
presning eller opbevaring.
Harsk: flavour i olie, der har undergået en oxideringsproces.
Ophedet eller brændt : karakteristisk flavour for olie, forårsaget af over-
dreven og/eller langvarig opvarmning under bearbejdningen, især når
pastaen blandes termisk, hvis det gøres under uegnede betingelser.
Hø-træ: karakteristisk flavour for visse olier, der er udvundet af tørre
oliven.
Grov: en karakteristisk fornemmelse ved visse olier, som giver en tyk,
pastaagtig fornemmelse i munden, når man smager på dem.
Fedtet: flavour i olie, der minder om jordolie, fedt eller mineralsk olie.
Grønsagsvand : flavour, som olien får som følge af langvarig kontakt med
grønsagsvand.
Saltlage : flavour i olie, der er udvundet af oliven, som har været konser-
veret i saltlage.
Esparto : karakteristisk flavour for olie, der er udvundet af oliven, som er
presset i nye måtter af espartogræs. Lugten/smagen kan være forskellig,
alt efter om måtterne er lavet af grønt eller tørret espartogræs.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 58
▼M19
Jordet: flavour i olie, der er udvundet af oliven, som er opsamlet med jord
eller mudder på overfladen, og som ikke er blevet vasket.
Larvebefængt : flavour i olie, der er udvundet af oliven, som har været hårdt
angrebet af larver af olivenfluen (Bactrocera oleae).
Agurk: karakteristisk flavour, der fremkommer, når en olie har været pakket
hermetisk i for lang tid, især i blikbeholdere, og som tilskrives dannelsen af
2,6-nonadienal.
4. PANEL
Panelet udnævnes af medlemsstaten og består af en panelleder og otte til 12
smagere. For produktionsåret 2001/02 kan antallet af smagere dog være
mindre end otte.
Panellederen skal have gennemgået en grundig optræning og være kyndig
ekspert i de forskellige olietyper. Han er ansvarlig for panelet og dets tilret-
telæggelse og funktion, for prøvernes forberedelse, kodning og præsentation
for smagerne samt for indsamling af data og deres statistiske behandling.
Panellederen udvælger smagerne og sørger for deres optræning og kontrol
af deres indsats for at sikre sig, at de opretholder et passende egnethedsni-
veau.
Smagere, der foretager organoleptisk kontrol af olivenolie, skal udvælges
og optrænesi forhold til deresevne til at s kelne mellem prøver, der ligner
hinanden, i overensstemmelse med Det internationale Olivenolieråds
vejledning om udvælgelse, optræning og kontrol af kvalificerede jomfruo-
liesmagere.
Panelerne skal forpligte sig til at deltage i organoleptiske bedømmelser på
nationalt, EF- eller internationalt plan med henblik på periodisk kontrol og
harmonisering af sansningskriterier. De skal i øvrigt hvert år meddele den
pågældende medlemsstat alle data om deres sammensætning og antallet af
bedømmelser, de har udført som godkendt panel.
5. PROCEDURE FOR ORGANOLEPTISK BEDØMMELSE OG KLASSIFI-
KATION
5.1.Smagerens anvendelse af profilskemaet
Det profilskema, som smageren skal benytte, er anført i tillæg A til denne
metode.
Hver smager i panelet skal lugte til og derpå smage på(1) den olieprøve,
der er i smageglasset. Smageren analyserer de olfaktoriske, gustatoriske,
taktile og kinæstetiske indtryk. På profilskemaet noterer han derpå den
intensitet, hvormed han opfatter negative og positive egenskaber.
Hvis smageren opfatter negative egenskaber, som ikke er anført på profil-
skemaet, skal han anføre dem i rubrikken »Andet«, idet han benytter det
eller de udtryk, som beskriver dem med den størst mulige præcision af de
udtryk, som er defineret i punkt 3.2 i denne metode.
5.2.Panellederens anvendelse af data
Panellederen indsamler de profilskemaer, som smagerne har udfyldt; han
kontrollerer de tildelte intensiteter; konstaterer han en anormalitet, anmoder
han smageren om at ændre sit profilskema og om nødvendigt at gentage
forsøget.
Panellederen kan indlæse data i et edb-program efter den metode til stati-
stisk beregning af medianen, der er anført i B. Data for en prøve registreres
på en matrix bestående af ti kolonner, der svarer til de ti sanseegenskaber,
og antal linjer svarende til antal smagere i panelet.
Hvis mindst 50 % af panelet anfører en negativ egenskab i rubrikken andet,
skal panellederen beregne medianen for denne egenskab og den tilsvarende
klassifikation.
Hvis der foretages analyser i forbindelse med kontrol af overholdelse af
normer eller kontrolanalyser, skal panellederen gennemføre en tredobbelt
organoleptisk bedømmelse af olien med mindst en dags mellemrum;
medianen for egenskaberne beregnes ud fra samtlige data på profilske-
maerne for de tre forsøg.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 59
(1) Smageren kan undlade at smage på olien, hvis han konstaterer særligt intense negative
egenskaber, og han noterer denne ekstraordinære omstændighed på profilskemaet.
▼M19
5.3.Klassifikation af olier
Olien klassificeres under nedennævnte betegnelser i forhold til medianen af
mangler og medianen for egenskaben frugtagtig. Ved medianen af mang-
lerne forstås medianen af den negative egenskab, der opfattes med den
stærkeste intensitet. Værdien af den robuste variationskoefficient for denne
negative egenskab skal være mindre end eller lig med 20 %.
a)Jomfruolie, ekstra : Medianen af manglerne er lig med 0, og medianen af
den frugtagtige karakter er større end 0.
b)Jomfruolie : Medianen af manglerne er større end 0 og lig med eller
mindre end 2,5, og medianen af den frugtagtige karakter er større end 0.
c)Jomfruolie, almindelig : Medianen af manglerne er større end 2,5 og lig
med eller mindre end 6,0; eller medianen af manglerne er lig med eller
mindre end 2,5, og medianen af den frugtagtige karakter er lig med 0.
d)Bomolie : Medianen af manglerne er større end 6,0.
Fra den 1. november 2003 erstattes typerne c) og d) dog med følgende
type:
c)Bomolie : Medianen af manglerne er større end 2,5; eller medianen af
manglerne er lig med eller mindre end 2,5, og medianen af den frugtag-
tige karakter er lig med 0.
5.4.Særlige tilfælde
Hvis medianen for en anden positiv egenskab end frugtagtig er større end
5,0, anfører panellederen dette på oliens analyseattest.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 60
▼M19
TILLÆG A
1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 61
▼M19
TILLÆG B
METODE TIL BEREGNING AF MEDIAN OG KONFIDENSINTER-
VALLER
Median
Medianen er det reelle tal, Xm, der er kendetegnet ved, at sandsynligheden (P)
for, at værdierne af fordelingen (X) er mindre end dette tal (Xm), er mindre end
eller lig med 0,5, og at sandsynligheden (P) for, at værdierne af fordelingen (X)
er mindre end eller lig med Xm, samtidigt er større end eller lig med 0,5. Ifølge
en anden definition er medianen den 50. percentil af en fordeling, hvis
elementer er ordnet i stigende rækkefølge. Med andre ord er medianen den
midterste værdi i en ordnet række af et ulige antal elementer eller gennemsnittet
af de to midterste værdier i en ordnet række af et lige antal elementer.
Robust standardafvigelse
Som et pålideligt estimat af variabiliteten omkring medianen benyttes Stuart og
Kendallas estimat over den robuste standardafvigelse. Formlen for den asympto-
tiske standardafvigelse S afhænger af N og IQR. N er antallet af observationer,
og IQR er den interkvartile afstand, dvs. det robuste estimat af variabiliteten af
de pågældende data (den interkvartile afstand dækker nøjagtig 50 % af elemen-
terne i en given sandsynlighedsfordeling). Den interkvartile afstand beregnes
som afstanden mellem den 75. og 25. percentil.
IQR = 75. percentil — 25. percentilPercentilen er værdien Xpc, der er kendetegnet ved, at sandsynligheden (P) for,
at værdierne af fordelingen er mindre end Xpc, er mindre end eller lig med en
given procentdel, og at sandsynligheden (P) for, at værdierne af fordelingen er
mindre end eller lig med Xpc, samtidigt er større end eller lig med den pågæl-
dende procentdel. Procentdelen angiver den pågældende fordelingsfraktion. For
medianensvedkommende er den 50 %.
Percentilen er med andre ord den værdi af fordelingen, der svarer til et bestemt
areal, som tegnes ud fra fordelings- eller tæthedskurven. Den 25. percentil er
f.eks. den værdi af fordelingen, som svarer til et areal på 0,25 eller 25/100.
Robust variationskoefficient i %
Variationskoefficienten er et rent (dvs. dimensionløst) tal, der angiver forholdet
mellem den procentvise variabilitet i den analyserede talrække og medianens
værdi Me. Af denne grund er variationskoefficienten til stor nytte som kontrol
af panelmedlemmernespålidelighed.
95 %-konfidensintervaller
95 %-konfidensintervallerne (IC) (fejl af første orden lig med 0,05 eller 5 %)
repræsenterer det interval, inden for hvilket værdien af medianen ville variere,
hvis det var muligt at gentage forsøget et uendeligt antal gange. I praksis
angiver dette interval variabilitetsintervallet for forsøget ved de herskende betin-1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 62
▼M19
gelser, hvis forsøget kunne gentages flere gange. Intervallet er ligesom variati-
onskoefficienten en hjælp til evaluering af forsøgets pålidelighed.
IC sup. = Me + (c.S)IC inf. = Me — (c.S)Hvor c, hvis konfidensintervallet er på
0,95, er lig med 1,96.
Klassifikationen foretages ved at sammenligne værdierne af medianen med de
referenceintervaller, der er fastlagt i metodens punkt 5.3. Med edb-programmer
er det muligt at vise klassifikationen i en tabel med statistiske data eller som
grafik.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 63
▼B
BILAG XIII
NEUTRALISATION OG BLEGNING AF OLIVENOLIE I LABORATO-
RIET
1. NEUTRALISATION OG BLEGNING AF OLIVENOLIE I LABORA-
TORIET
1.1.Neutralisation af olie
1.1.1. Apparatur
— højt 300 ml bægerglas
— laboratoriecentrifuge med 100 ml reagensglas— 250 ml bægerglas
— 100 ml kolber
— dekantertragt til 1 liter.
1.1.2. Reagenser
— vandig natriumhydroxidopløsning på 12 %
— ethanolopløsning på 1 % af phenolphtalin
— analyseren hexan
— analyseren isopropylalkohol.
1.1.3. Fremgangsmåde
a)Olier af en surhedsgrad, udtrykt i oliesyre, på under 30 %
50 g råolie hældesi et højt 300 ml bægerglasog opvarmestil 65º C i
vandbad. Under langsom bevægelse tilsættes en mængde natriumhydr-
oxid på 12 % svarende til oliens indhold af frie fedtsyrer, med et
overskud på 5 %. Omrøringen fortsættes i fem minutter, idet der
opretholdesen temperatur på 65º C.
Det hele omhældes i 100 ml reagensglas til centrifugering og sæbe-
massen udskilles ved centrifugering. Den dekanterede olie hældes i et
250 ml bægerglas og vaskes med 50—60 ml destilleret kogende vand,
idet det vandholdige lag fjernesved hjælp af en hævert. Vas kningerne
gentages, indtil sporene af sæberester er fuldstændig forsvundet (indtil
phenolphtaleinets rosa farve er forsvundet).
Olien centrifugeres for at fjerne de små restmængder af vand.
b)Olier af en surhedsgrad, udtrykt i oliesyre, på over 30 %
I en dekantertragt til en liter hældes50 g råolie, 200 ml hexan, 100 ml
isopropylalkohol, og en så stor mængde natriumhydroxidopløsning på
12 %, som svarer til oliens indhold af frie fedtsyrer, med et overskud
på 0,3 %. Der omrøreskraftigt i 1 minut. Derefter tils ættes100 ml
destilleret vand; der omrøres på ny, og man lader væsken stå.
Efter lagdelingen lader man det nederste lag, der indeholder sæberne,
løbe af. Mellem de to lag (olieholdigt foroven og vandholdigt
forneden) dannes der ofte et mellemlag, som består af planteslim og
uopløselige stoffer, og som ligeledes skal fjernes.
Derefter vaskes hexanopløsningen af syrefri olie med portioner,
bestående af 50—60 ml af en opløsning af isopropylalkohol og destil-
leret vand i forholdet 1: 1 (v/d), indtil phenolphtaleinetsros a farve
forsvinder. Derpå fjernes hexanet fuldstændigt ved afdestillering i
vakuum (for eksempel ved hjælp af en rotationsfordamper).
1.2.Blegning af den neutraliserede olie
1.2.1. Apparatur
— 250 ml kolbe med tre slebne halse, der gør det muligt at indsætte:
a) et gradinddelt termometer, der kan aflæses op til 90º C
b) et mekanisk røreapparat med 250—300 omdrejninger i minuttet og
udstyret til at fungere i vakuum
c) et forbindelsesstykke til vakuumpumpen
— vakuumpumpe udstyret med manometer og i stand til at give residual-
tryk på 15—30 milibar.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 64
▼M6
▼B
▼B
1.2.2. Fremgangsmåde
I trehalsekolben afvejes ca. 100 g af den neutraliserede olie. Termometret
og røreapparatet indsættes; vakuumpumpen tilsluttes og olien opvarmes
under omrøring indtil 90º C. Denne temperatur holdesunder s tadig omrø-
ring, indtil den olie, der skal analyseres, er fuldstændig befriet for sit
vandindhold (ca. 30 minutter).
Vakuum brydesog der tils ættes2 à 3 g aktiveret jord. Vakuum genop-
rettes, indtil der opnås et residualtryk på 15—30 milibar, og der omrøres
stadig ved en temperatur på 90º C i 30 minutter med ca. 250 omdrej-
ninger i minuttet.
Dernæst filtreres ved varme i et termostatisk reguleret tørreskab (50—60º
C).1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 65
▼M19
▼B
BILAG XV
1. OLIEINDHOLD I PRESSERESTER AF OLIVEN
1.1.Apparatur
— Egnet ekstraktionsapparat, forsynet med en 200—250 ml kolbe.
— Elektrisk opvarmet bad (sandbad, vandbad, osv.) eller varmeplade.
— Analysevægt.
— Ovn, der er indstillet til højst 80º C.
— Elektrisk ovn med temperaturregulering, der kan indstilles til 103º C
± 2º C, og som muliggør luftindblæsning eller vakuum.
— Mekanisk mølle, der er let at rengøre, egnet til olivenoliekager, og som
er i stand til at male uden opvarmning eller mærkbar reduktion af
indholdet af vand, af flygtige stoffer og af stoffer, der kan uddrages
ved hjælp af hexan.
— Ekstraktionshylster og vat eller filterpapir, fri for substanser, der kan
uddragesved hjælp af hexan.
— Ekssikkator.
— Sigte med huller på 1 mm i diameter.
— Pimpsten i små korn, tørret.
1.2.Reagens
Teknisk n-hexan, hvis fordampningsrest ved fuldstændig fordampning er
mindre end 0,002 g/100 ml.
2. FREMGANGSMÅDE
2.1.Tilberedning af prøven
Om nødvendigt males analyseprøven i den mekaniske mølle, der skal være
omhyggeligt rengjort på forhånd, således at prøven kan reduceres til små
partikler, der kan passere sien fuldstændigt.
Ca. en tyvendedel af prøven anvendestil en fulds tændig rengøring af
møllen; denne formalede del bortkastes, og resten males, opsamles og
blandes med omhu, hvorefter analysen straks foretages.
2.2.Prøvemængde
Der afvejesmed 0,01 g nøjagtighed ca. 10 g af analys eprøven til prøve-
mængde, når formalingen er afsluttet.
2.3.Tilberedning af ekstraktionshylstret
Prøvemængden anbringes i hylstret, og dette lukkes med vandsugende vat.
Såfremt der anvendesfilterpapir, indpakkesprøven i dette papir.
2.4.Fortørring
Hvis presseresterne er meget fugtige (indhold af vand og flygtige stoffer på
over 10 %), foretagesder en fortørring, idet det fyldte hyls ter (eller filter-
papir) anbringes en passende tid i ovnen, der højst kan opvarmes til 80º C,
således at indholdet af vand og flygtige stoffer bringes ned under 10 %.
2.5.Tilberedning af kolben
Kolben, der indeholder 1 à 2 pimpstenskorn, og som på forhånd er tørret i
ovnen ved en temperatur på 103º C ± 2º C og derefter afkølet mindst 1
time i ekssikkatoren, vejes med 1 mg nøjagtighed.
2.6.Første ekstraktion
Hylstret (eller filterpapiret), der indeholder prøvemængden, anbringes i
ekstraktionsapparatet. Den nødvendige mængde hexan hældes i kolben.
Kolben tilsluttes ekstraktionsapparatet, og det hele anbringes i det elektrisk
opvarmede bad. Opvarmningen reguleres således, at tilbageløbsmængden
udgør mindst tre dråber i sekundet (moderat, ikke stærk kogning).
Efter fire timers ekstraktion foretages afkøling. Hylstret udtages af ekstrak-
tionsapparatet og anbringes i en luftstrøm for at fjerne størstedelen af det
indeholdte opløsningsmiddel.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 66
▼B
2.7.Anden ekstraktion
Hylstret tømmes i mikromøllen, og der males så fint som muligt.
Anbring mængdemæssigt blandingen påny i hylstret og dette i ekstraktions-
apparatet.
Ekstraktionen begyndes påny, og den fortsættes endnu to timer, idet kolben
med forrige ekstraktion anvendes.
Den opløsning, der opnås i ekstraktionskolben, skal være gennemsigtig.
Såfremt dette ikke er tilfældet, filtreresder på et s tykke filterpapir, idet
den første kolbe og filterpapiret gentagne gange vaskes med hexan. Filtratet
og afvaskningsopløsningen opsamles i en særskilt kolbe, der på forhånd er
tørret og vejet med 1 mg nøjagtighed.
2.8.Eliminering af opløsning og vejning af ekstraktet
Størstedelen af opløsningsmidlet fjernes ved destillation i elektrisk
opvarmet vandbad. De sidste rester af opløsningsmidlet fjernes ved at
opvarme kolben i ovnen ved 103º C ± 2º C i 20 minutter. Fordampningen
fremskyndes enten ved indblæsning af luft eller, bedre, inaktiv gas fra tid
til anden eller ved anvendelse af vakuum.
Kolben afkøles i ekssikkatoren i mindst 1 time, og den vejes med 1 mg
nøjagtighed.
Der opvarmespå ny i 10 min. under s amme forhold, hvorefter kolben
afkøles i ekssikkator og vejes.
Forskellen mellem to vejninger må ikke overstige 10 mg. I modsat fald
opvarmesder på ny i perioder på ti minutter med efterfølgende afkøling
og vejning, indtil forskellen i masse er højst 10 mg. Den sidste vejning af
kolben noteres.
Der foretages to bestemmelser.
3. UDFORMNING AF RESULTATER3.1.Beregning og formler
a) Ekstraktet udtrykt i masseprocent af produktet som leveret er lig med:
S=m
1×100
m0
hvor:
S = masseprocent af produktet som leveret
m0= massen i gram af den udtagne prøvemængde
m1= massen i gram af ekstraktet efter tørring
Som resultat tages det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser,
såfremt ingen gentagelse af bestemmelsen er nødvendig.
Resultatet udtrykkes med en decimal
b) Ekstraktet kan udtrykkes i relation til tørstoffet ved anvendelse af
følgende formel:
S×100
100 − U= ekstrakt i % fedtstof/tørstof
hvor:
S = masseprocent for ekstraktet af produktet som leveret (jf. a))
U = indhold af vand og flygtige stoffer.
3.2.Reproducerbarhed
Forskellen mellem resultaterne af de to samtidigt eller umiddelbart efter
hinanden af samme analytiker foretagne bestemmelser, må ikke overstige
0,2 g ekstrakt ved hexan for 100 g prøve.
I modsat fald gentages analysen på to andre prøvemængder. Hvis forskellen
også denne gang overstiger 0,2 g, tages som resultat det aritmetiske
gennemsnit af de fire bestemmelser.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 67
▼B
BILAG XVI
BESTEMMELSE AF IODTAL
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne internationale standard specificerer en metode til bestemmelse af
iodtallet i animalske og vegetabilske fedtstoffer og olier, i det følgende be-
nævnt fedtstoffer.
2. DEFINITION
Ved anvendelsen af denne internationale standard gælder følgende defini-
tion.
2.1. Iodtal: den mængde iod, der absorberes af prøven under de arbejdsbetin-
gelser, der er specificeret i denne internationale standard.
Iodtallet udtrykkess om g iod pr. 100 g prøve.
3. PRINCIP
En prøve opløses i opløsningsmiddel, og der tilsættes Wijs reagens. Efter
en nærmere fastsat tid tilsættes kaliumiodidopløsning og vand, og det
frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatopløsning.
4. REAGENSER
Alle reagenser skal være anerkendt analysekvalitet.
4.1. Vand, skal opfylde kravene i ISO 3696, grad 3.
4.2. Kaliumiodid — 100 g/l opløsning, der ikke indeholder iodat eller frit iod.4.3. Stivelseopløsning.
5 g opløselig stivelse blandes i 30 ml vand, denne blanding tilsættes
1 000 ml kogende vand efterfulgt af kogning i 3 min. og afkøling.
4.4. Natriumthiosulfat — standardopløsning.
c(Na
2S2O3×5 H2O) = 0,1 mol/l, som er standardiseret højst syv dage inden
brug.
4.5. Opløsningsmiddel — tilberedes ved blanding af lige dele cyclohexan og
eddikesyre.
4.6. Wijsreagens— indeholder iodmonochlorid i eddikes yre. Der benyttes
kommercielt Wijsreagens .
5. APPARATUR
Normalt laboratorieudstyr og navnlig følgende:
5.1. Vejeskeer af glas, der passer til prøven og kan anbringes i kolberne (5.2).
5.2. Erlenmeyer-kolber, 500 ml, der er forsynet med slebne glaspropper og er
helt tørre.
6. FORBEREDELSE AF ANALYSEPRØVEN
Den homogeniserede prøve tørres på natriumsulfat og filtreres.
7. FREMGANGSMÅDE
7.1.Prøven
Prøvens størrelse varierer alt efter dens forventede iodtal, jf. tabel 1.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 68
▼B
Tabel 1
Forventet iodtal Prøvens størrelse
under 5 3,00 g
5— 20 1,00 g
21— 50 0,40 g
51—100 0,20 g
101—150 0,13 g
151—200 0,10 g
Prøven afvejes til nærmeste 0,1 mg i en glasske (5.1).
7.2.Bestemmelse
Prøven kommes i en 500 ml kolbe (5.2). Der tilsættes 20 ml opløsnings-
middel (4.5) for at opløse fedtstoffet. Der tilsættes nøjagtig 25 ml Wijs
reagens (4.6), proppen sættes i, indholdet omrystes med en roterende bevæ-
gelse, og kolben anbringes i mørke. Der må ikke benyttes mundpipette til
Wijsreagens et.
På tilsvarende måde forberedes der en blindprøve med opløsningsmidlet og
reagenset, men prøven udelades.
Når det gælder prøver med et iodtal på under 150, skal kolberne henstå i
mørke i 1 time. Når det gælder prøver med et iodtal på over 150, polyme-
riserede produkter eller kraftigt iltede produkter, skal kolberne henstå i 2
timer.
Derefter tilsættes hver af kolberne 20 ml kaliumiodidopløsning (4.2) og
150 ml vand (4.1).
Der titreres med natriumthiosulfat i standardopløsning (4.4), indtil den gule
farve, der skyldes iodet, næsten er forsvundet. Der tilsættes nogle få dråber
stivelsesopløsning (4.3), og titreringen fortsætter, indtil den blå farve lige
akkurat forsvinder efter meget kraftig omrystning.
Note:Potentiometrisk bestemmelse af slutpunktet kan tillades.
7.3.Antal bestemmelser
Der foretages to bestemmelser af samme prøve.
8. ANGIVELSE AF RESULTATER
Iodtallet angivess om
12;69/C2c/C2V1/C0V2 ðÞ
mhvor
c = den numeriske værdi af den eksakte koncentration (mol/l) af den
benyttede natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
V1= den numeriske værdi af den til blindprøven benyttede mængde (ml)
natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
V2= den numeriske værdi af den til bestemmelsen benyttede mæmgde
(ml) natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
m = den numeriske værdi af prøvens størrelse (g) (7.1).
Resultatet betragtes som det artimetiske gennemsnit af de to bestemmelser
under forudsætning af, at repeterbarhedskravet er opfyldt.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 69
▼M11
BILAG XVII
METODE TIL BESTEMMELSE AF STIGMASTADIENER I VEGETA-
BILSKE OLIER
1. FORMÅL
Bestemmelse af stigmastadiener i vegetabilske olier indeholdende lave
koncentrationer af disse kulbrinter, navnlig i jomfruolie og råolie af
olivenpresserester.
2. OMRÅDE
Metoden kan anvendes på alle vegetabilske olier, selv om målinger kun
er pålidelige, hvisindholdet af de pågældende kulbrinter er på mellem
0,01 og 4,0 mg/kg. Metoden er særligt velegnet til at påvise tilstedevæ-
relsen af raffinerede vegetabilske olier (oliven, olivenrester, solsikke,
palme osv.) i jomfruolie, da raffinerede olier indeholder stimastadiener,
og jomfruolie ikke gør det.
3. PRINCIP
Isolation af uforsæbelige stoffer. Separation af den steroide kulbrintefrak-
tion ved søjlekromatografi på silicagel og analyse ved
kapillargaskromatografi.
4. APPARATUR
4.1. 250 ml kolber, der er egnet til brug med tilbagesvaler4.2. Skilletragte, kapacitet 500 ml
4.3. 100 ml rundbundede kolber
4.4. Rotationsfordamper4.5. Kromatografisøjle af glas (1,5-2,0 cm indvendig diameter × 50 cm
længde) med teflonprop og en tot glasuldsfibre eller sintret glasskive i
bunden. Til tilberedning af en silicagelsøjle hældes hexan på kromatogra-
fisøjlen til en dybde på ca. 5 cm, hvorefter der fyldes op med en
opslæmning af silicagel i hexan (15 g i 40 ml) ved hjælp af små mængderhexan. Henstilles til bundfældning, som afsluttes med let sammenryst-
ning. Der tilsættes vandfrit natriumsulfat til en højde på ca. 0,5 cm, og
til slut elueres den overskydende hexan.
4.6. Gaskromatograf med flammeioniseringsdetektor, splitinjektor eller kold
»on column«-injektor og en ovn, der kan programmerestil en nøjagtighed
på ± 1 ºC.
4.7. Kapillarsøjle med sintret silica til gaskromatografi (0,25 eller 0,32 mm
indvendig diameter × 25 m længde) belagt med en 5 % phenylmethylsili-
conefase, 0,25 µm filmtykkelse.
Note 1.
Der kan brugesandre s øjler med lignende eller lavere polaritet.
4.8. Skriver/integrator med mulighed for integration over hver enkelt top.4.9. 5-10 µl mikroinjektionssprøjte til gaskromatografi med cementeret nål.
4.10. Elektrisk varmekappe eller varmeplade.
5. REAGENSER
Alle reagenser bør være af analytisk renhed, medmindre andet er angivet.
Det benyttede vand bør være destilleret vand eller vand af mindst tilsva-
rende renhed.
5.1. Hexan eller blanding af alkaner med kogepunktsinterval på 65-70 ºC
destilleret med rektificeringssøjle.
Note 2.
Opløsningsmidlet skal være destilleret for at fjerne urenheder.
5.2. 96 v/v ethanol.5.3. Vandfrit natriumsulfat.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 70
▼M11
5.4. 10 % alkoholisk kaliumhydroxidopløsning. Der tilsættes 10 ml vand til
50 g natriumoxid og omrøres. Derpå opløses blandingen i ethanol til
500 ml.
Note 3.
Alkoholisk kaliumhydroxid bliver brun ved henstand. Den bør tilberedes
frisk hver dag og opbevares i godt tilproppede, brune glasflasker.
5.5. Silicagel 60 til søjlekromatografi, 70-230 mesh (Merck ref. 7734 el.lign.).
Note 4.
Normalt kan silicagel bruges direkte fra beholderen uden behandling.
Imidlertid kan nogle batcher silica vise lav aktivitet, som giver ringe
kromatografiske separationer. Derfor bør silicagelen behandles således:
Silicagelen deaktiveresved opvarmning i minds t fire timer ved 550 ºC.
Efter opvarmning anbringes silicagelen i en ekssikator, hvor gelen
afkøler, og derefter overføress ilicagelen til en kolbe med prop. Der
tilsættes 2 % vand og omrystes, til der ikke længere kan ses klumper,
og pulveret flyder frit.
Hvisbatcher af s ilicagel giver kromatogrammer med interfererende toppe,
bør silicagelen behandles som beskrevet ovenfor. Som alternativ kan der
benyttes ekstraren silicagel 60 (Merck ref. 7754).
5.6. Stamopløsning (200 ppm) af cholesta-3,5-dien (Sigma, 99 % renhed) i
hexan (10 mg i 50 ml).
5.7. Standardopløsning af cholesta-3,5-dien i hexan ved en koncentration på
20 ppm fremkommet ved fortynding af ovennævnte opløsning.
Note 5.
Hvis opløsninger som nævnt i 5.6 og 5.7 holdes ved under 4 ºC, forringes
de ikke i løbet af i hvert fald de første fire måneder.
5.8. Opløsning af n-nonacosan i hexan i en koncentration på ca. 100 ppm.
5.9. Bæregastil kromatografi: helium eller hydrogen af 99,9990 % renhed.
5.10. Hjælpegasser til flammeioniseringsdetektor: hydrogen af 99,9990 %
renhed og renset luft.
6. FREMGANGSMÅDE6.1.Fremstilling af uforsæbeligt stof:
6.1.1. 20 ± 0,1 g olie afvejes i en 250 ml kolbe (4.1), der tilsættes 1 ml af stan-
dardopløsningen af cholesta-3,5-dien (20 µg) og 75 ml 10 % alkoholisk
kaliumhydroxid, 10 %. Tilbagesvaleren påsættes, og der opvarmes til
svag kogning i 30 minutter. Kolben med prøven fjernes fra varmekilden,
og man lader opløsningen køle lidt (den må ikke afkøles helt, da prøven
så vil stivne). Der tilsættes 100 ml vand, og opløsningen overføres til en
skilletragt (4.2) ved hjælp af 100 ml hexan. Blandingen rystes kraftigt i
30 sekunder, hvorefter man lader den henstå, så lagene kan skilles.
Note 6.
Hvis der dannes en emulsion, som ikke hurtigt forsvinder, tilsættes der
små mængder ethanol.
6.1.2. Den nedre vandige fase overføres til en anden skilletragt, og der ekstra-
heresigen med 100 ml hexan. Man lader igen den nedre fas e løbe af, og
hexanekstrakterne vaskes (samlet i en anden skilletragt) tre gange med
hver gang 100 ml blanding af ethanol-vand (1: 1), indtil der opnåsneutral
pH-værdi.
6.1.3. Hexanopløsningen passeres gennem vandfrit natriumsulfat (50 g), vaskes
med 20 ml hexan og inddampesi en rotations fordamper ved 30 ºC og
lavt tryk, indtil den er tør.
6.2.Separation af den steroide kulbrintefraktion:
6.2.1. Det tilbageværende overføres til fraktioneringssøjlen ved hjælp af to 1 ml-
portioner hexan. Man lader væskeniveauet falde til toppen af natriumsul-
fatet, og den kromatografiske eluering startes med hexan ved en
hastighed på ca. 1 ml/min. De første 25-30 ml af elueringen kasseres, og
den følgende 40 ml fraktion opsamles. Efter opsamlingen overføres denne
fraktion til en 100 ml rundbundet kolbe (4.3).1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 71
▼M11
Note 7.
Den første fraktion indeholder mættede kulbrinter (jf. figur 1a) og den
anden fraktion de steroide kulbrinter. Yderligere eluering giver squalen
og relaterede forbindelser. For at opnå god separation mellem mættede
og steroide kulbrinter kræves der optimering af fraktioneringsmængderne.
Med henblik herpå justeres mængden af den første fraktion således, at når
den anden fraktion analyseres, er de toppe, som repræsenterer de mættede
kulbrinter, lave (jf. figur 1c). Hvis sådanne ikke fremkommer, men stan-
dardtoppensintens itet er lav, reduceresmængden. I hvert fald er en
komplet separation mellem komponenterne i den første og den anden
fraktion unødvendig, da der ikke er nogen overlappende toppe under
gaskromatografianalyse, hvis betingelserne justeres som beskrevet i
6.3.1. Optimering af mængden af den anden fraktion er normalt unød-
vendig, da der er god separation fra de øvrige komponenter.
Tilstedeværelsen af en høj top ved en retentionstid på ca. 1,5 min. mindre
end standard skyldes squalen og angiver dårlig separation.
6.2.2. Den anden fraktion inddampesi en fordamper ved 30 ºC og lavt tryk
indtil tørhed, og restmængden opløses straks i 0,2 ml hexan. Opløsningen
opbevares i køleskab indtil analyse.
Note 8.
Restmængder under 6.1.3 og 6.2.2 bør ikke opbevares tørt ved rumtempe-
ratur. Så snart de er fremkommet, bør opløsningsmidlet tilsættes, og
opløsningerne bør opbevares i køleskab.
6.3.Gaskromatografi
6.3.1. Arbejdsbetingelser for splitinjektion:
— injektortemperatur: 300 ºC
— detektortemperatur: 320 ºC
— skriver/integrator: parametrene for integration bør sættes, så de giver
en korrekt bedømmelse af arealerne. Integration over de enkelte toppe
anbefales
— følsomhed: ca. 16 gange mindste dæmpning— injiceret mængde opløsning: 1 µl
— ovnprogrammeringstemperaturer: initialtemperatur 235 ºC i 6 min. og
derefter stigende med 2 ºC/min. indtil 285 ºC
— injektor med splitforhold 1: 15
— bæregas: helium eller hydrogen ved ca. 120 kPa tryk.
Disse betingelser kan justeres alt efter kromatografens og søjlens evne til
at give kromatogrammer, der imødekommer følgende krav: intern stan-
dardtop inden for ca. 5 min. af den tid, der er angivet i 6.3.2. Den
interne standardtop bør være på mindst 80 % fuldt udslag.
Gaskromatografisystemet skal kontrolleres ved injektion af en blanding af
stamopløsningen af cholestadien (5.6) og n-nonacosanopløsning (5.8).
Cholesta-3,5-dientoppen skal vise sig før n-nonacosanen (jf. figur 1c).
Hvisden ikke fremkommer, kan man vælge mellem to metoder: at bringe
ovntemperaturen ned og/eller benytte mindre polære søjler.
6.3.2. Identifikation af toppe
Den interne standardtop viser sig efter ca. 19 min. og stigmasta-3,5-dien
ved en relativ retentionstid på ca. 1,29 (jf. figur 1b). Sammen med med
stigmasta-3,5-dien forekommer der små mængder af en isomer, som
normalt kun giver en enkelt kromatografisk top. Hvis søjlen er for polær
eller har stor opløsningsevne, kan isomeren imidlertid vise sig som en
lille top før og nær på toppen for stigmasta-3,5-dien (jf. figur 2). For at
sikre, at stigmastadienerne elueres som en top, er det tilrådeligt at erstatte
søjlen med en mindre polære søjle eller med en søjle med større
indvendig diameter.
Note 9.
Der kan fås en stigmastadienreference ved analyse af en raffineret vegeta-
bilsk olie ved at benytte metoden til bestemmelser af steroide kulbrinter.
Stigmastadiener fremkalder en signifikant og let identificerbar top.
6.3.3. Kvantitativ analyse
Indholdet af stimastadiener bestemmes efter formlen:
mg/kg stigmastadiener =As/C2Mc
Ac/C2Mo1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 72
▼M11
hvor: As= areal af stigmastadientop (hvis toppen er opløst i to
isomerer, summen af de to toppes arealer)
Ac= areal af interne standard (cholestadien)
Mc= massen af tilsat standard i mikrogram
Mo= massen af olie i g.
Påvisningsgrænse: Ca. 0,01 mg/kg.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 73
▼M11
Figur 1
Gaskromatogrammer fra olivenolieprøver analyseret på en kapillarsøjle
med sintret silica (0,25 mm indvendig diameter × 25 m), belagt med 5 %
phenylmethylsilicone, 0,25 µm filmtykkelse.
a) Første fraktion (30 ml) fra jomfruolie tilsat standardopløsning.
b) Anden fraktion (40 ml) fra olivenolie indeholdende 0,10 mg/kg stig-
mastadiener.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 74
▼M11
c) Anden fraktion (40 ml) indeholdende en lille smule af den første frak-
tion.
Figur 2
Gaskromatogrammer fra en prøve af raffineret olivenolie analyseret på en
D-5-søjle, der viser stigmasta-3,5-diens isomer.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 75
▼M13
BILAG XVIII
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ECN 42-HOLDIGE TRIGLY-
CERIDER (FORSKEL MELLEM HPLC-DATA OG DET TEORETISKE
INDHOLD)
1.Formål
Bestemmelse af sammensætningen af triglycerider (TAG) i olivenolier
udtrykt på basis af deres ækvivalente kulstofantal, ved hjælp af forskel-
lene mellem de analytiske resultater opnået ved HPLC og det teoretiske
indhold beregnet ud fra fedtsyresammensætningen.
2.Anvendelsesområde
Standarden gælder for olivenolier. Metoden er anvendelig til at påvise
tilstedeværelsen af små mængder frøolie (der har et stort indhold af
linolsyre) i alle kategorier af olivenolie.
3.Princip
Indholdet af ECN 42-holdige triglycerider bestemt ved HPLC-analyse
og det teoretiske indhold af ECN 42-holdige triglycerider (beregnet på
grundlag af GLC-bestemmelse af fedtsyresammensætningen) er inden
for visse grænser i overensstemmelse med hinanden for rene olier. En
større forskel end de værdier, der er fastsat i forordningen for hver
type olie, viser, at olien indeholder frøolier.
4.Metode
Metoden til beregning af det teoretiske indhold af ECN 42-holdige trig-
lycerider og af forskellen mellem denne værdi og data fra HPLC-
analysen består hovedsagelig i samordning af analytiske data, der er
fremkommet ved andre metoder; disse kan opdeles i tre trin: bestem-
melse af fedtsyresammensætningen ved hjælp af gaschromatografi ved
anvendelse af kapillarkolonne, beregning af den teoretiske sammensæt-
ning af ECN 42-holdige triglycerider og HPLC-bestemmelse af ECN
42-holdige triglycerider.
4.1.Apparatur
4.1.1. Rundkolber, 250 og 500 ml.4.1.2. Bægerglas100 ml.4.1.3. Glaschromatografikolonne, indvendig diameter på 21 mm, længde på
450 mm, med hane og normal (indvendig) slib foroven.
4.1.4. Skilletragte, 250 ml, med normal (udvendig) slib forneden, som passer
øverst på kolonnen.
4.1.5. Glasstang, længde på 600 mm.4.1.6. Glastragt, diameter på 80 mm.4.1.7. Målekolber, 50 ml.4.1.8. Målekolber, 20 ml.4.1.9. Rotationsinddamper.4.1.10. HPLC med mulighed for termostatstyring af kolonnetemperaturen.4.1.11. Injektionsenhed à 10 µl.
4.1.12. Detektor: differentialrefraktometer. Følsomheden ved fuldt udslag bør
være mindst 10
-4enheder.
4.1.13. Kolonne: rustfrit stålrør, længde på 250 mm og indvendig diameter på
4,5 mm, fyldt med 5 µm diameter silicapartikler med 22-23 % kulstof i
form af octadecylsilan (note 2).
4.1.14. Skriver og/eller integrator.
4.2.Reagenser
Reagenserne skal være af analysegrad. Elueringsvæskerne bør degasses
og kan recirkuleres adskillige gange uden indflydelse på separationerne.
4.2.1. Petroleumether, 40-60 ºC, chromatografigrad.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 76
▼M13
4.2.2. Ethylether, peroxidfri, frisk destilleret.
4.2.3. Glaschromatografisk elueringsvæske: blanding af petroleumether/ethy-
lether 87/13 (v/v).
4.2.4. Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, med standardiseret vandind-
hold på 5 % (w/w).
4.2.5. Glasuld.4.2.6. Acetone.
4.2.7. Acetonitril.
4.2.8. HPLC-elueringsvæske: acetonitril + acetone (i et indbyrdes forhold, der
giver den ønskede separation; der begyndes med en blanding i forholdet
50:50).
4.2.9. Opløsningsmiddel: acetone.
4.2.10. Referencetriglycerider: enten anvendestriglycerider, s om fåsi handelen
(tripalmitin, triolein osv.), hvis retentionstider plottes mod det ækviva-
lente kulstofantal, eller der anvendes referencechromatogrammer af
sojaolie, en blanding af sojaolie og olivenolie i forholdet 30:70 og ren
olivenolie (se note 3 og 4 og figur 1, 2, 3 og 4).
4.3.Prøveforberedelse
Da interfererende stoffer kan give falsk positive resultater, skal prøven
altid oprenses ifølge IUPAC-metode 2.507, der anvendes til bestem-
melse af polære stoffer i oxyderet olie.
4.3.1. Forberedelse af chromatografikolonne
Kolonnen (4.1.3) fyldes med ca. 30 ml elueringsvæske (4.2.3), derefter
indsættes glasuld (4.2.5) i kolonnen, og ved hjælp af glasstangen (4.1.5)
skubbes glasulden ned i bunden af kolonnen.
I et 100 ml bægerglas opslæmmes 25 g silicagel (4.2.4) i 80 ml elue-
ringsblanding (4.2.3), som derefter overføres til kolonnen ved hjælp af
en glastragt (4.1.6).
For at sikre sig, at al silicagelen er overført til kolonnen, skylles bæger-
glasset med elueringsblandingen, og skyllevæsken hældes ligeledes ned
i kolonnen.
Der åbnes for hanen, så væsken kan løbe ud af kolonnen, indtil den står
ca. 1 cm over silicagelen.
4.3.2. Kolonnechromatografi
2,5 ± 0,1 g olie, der om nødvendigt er filtreret, homogeniseret og tørret
i forvejen, afvejesmed 0,001 g nøjagtighed i en 50 ml målekolbe
(4.1.7). Olien opløses i ca. 20 ml elueringsvæske (4.2.3), som om
nødvendigt opvarmeslidt for at få den i opløs ning. Olien afkølesved
stuetemperatur og volumen justeres med elueringsvæske.
Ved hjælp af en fuldpipette overføres20 ml opløs ning til kolonnen, der
er forberedt i overensstemmelse med 4.3.1, der åbnes for hanen og
væsken eluerer, indtil den er på højde med silicagelen.
Der elueres dernæst med 150 ml elueringsvæske (4.2.3), med en
hastighed på ca. 2 ml/min (det vil tage ca. 60-70 minutter at lade
150 ml løbe gennem kolonnen).
Eluatet opsamles i en 250 ml rundkolbe (4.1.1), der i forvejen er tareret
og nøjagtigt afvejet. Efter at væsken er inddampet (Rotavapor), afvejes
remanensen, som vil blive anvendt ved fremstilling af opløsningen til
HPLC-analyse og ved fremstilling af methylester.
Udbyttet af prøven fra kolonnen skal være mindst 90 % for kategori-
erne ekstra jomfru, jomfru og almindelig raffineret olivenolie, og
mindst 80 % for bomolie og olivenolie af presserester.
4.4.HPLC-analyse
4.4.1. Prøveforberedelse til chromatografianalyse
Der fremstilles en 5 % opløsning af den prøve, der skal analyseres, ved
at der afvejes0,5 ± 0,001 g af prøven i en 10 ml målekolbe, hvorefter
der fyldes op til 10 ml med opløsningsmiddel (4.2.9).1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 77
▼M13
4.4.2. Fremgangsmåde
Chromatografisystemet gøres klar, og der pumpes elueringsvæske
(4.2.8) igennem med en hastighed af 1,5 ml/min. til rensning af hele
systemet. Der ventes, indtil basislinjen er blevet stabil. Derefter
indsprøjtes 10 µl af prøven forberedt som under 4.3.
4.4.3. Beregning og angivelse af resultaterne
Der anvendes intern standard, dvs. at summen af toparealerne svarende
til de forskellige triglycerider sættes lig med 100 %. Den procentvise
andel af hvert triglycerid beregnesefter formlen:
% triglycerid = topareal × 100/summen af alle toparealer
idet resultatet angives med to decimaler.
Note 1: Elueringsrækkefølgen kan bestemmes ved beregning af det
ækvivalente kulstofantal, ofte defineret ved udtrykket ECN = CN −
2n, hvor CN er kulstofantallet, og n er antallet af dobbeltbindinger.
Det kan beregnesmere nøjagtigt, hvisdobbeltbindingensplacering
tagesi betragtning. Hvisno,nlog nlner antallet af dobbeltbindinger i
henholdsvis olie-, linol- og linolensyre, kan det ækvivalente kulstofantal
beregnesefter formlen:
EN = CN − dono−dlnl−dlnnln
hvor koefficienterne do,dlog dlnkan beregnesved hjælp af reference-
triglyceriderne. Under de betingelser, der er specificeret ved denne
metode, vil resultatet ligge tæt ved:
ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln)
Note 2: Eksempler: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377
Note 3: Med flere referencetriglycerider er det også muligt at beregne
opløsningsevnen med hensyn til triolein:
α=R T1/ RT triolein
ved hjælp af den reducerede retentionstid RT1= RT − RT opløsnings-
middel.
Ud fra en afbildning af log αmod f (antal dobbeltbindinger) kan reten-
tionstiderne for alle de triglycerider af fedtsyrer, som findes i
referencetriglyceriderne, bestemmes (se figur 2).
Note 4: Kolonnen skal være så effektiv, at toppene af LLL (trilinolein)
adskilles tydeligt fra toppene af triglyceriderne med næsten samme
retentionstid. Elueringen fortsættes, indtil ECN 52-toppen.
Note 5: Der sikres en præcis måling af alle relevante toparealer for
denne bestemmelse, hvis den anden top svarende til ECN 50 giver
50 % af fuldt udslag på skriveren.
4.5.Beregning af triglyceridernes sammensætning
4.5.1. Bestemmelse af fedtsyresammensætningen
Fedtsyresammensætningen bestemmes ved hjælp af den gaschromato-
grafiske EF-metode, der er omhandlet i bilag X A til forordning (EØF)
nr. 2568/91, ved anvendelse af en kapillarkolonne. Methylesterne frem-
stilles efter metoden i bilag X B i ovennævnte forordning
(natriummethylat i en alkoholopløsning).
4.5.2. Fedtsyrer, der indgår i beregningen
Glyceriderne grupperespå grundlag af deresækvivalente kuls tofantal
(Equivalent Carbon Number − ECN) som anført i tabellen nedenfor.
Der er kun medtaget fedtsyrer med 16 eller 18 kulstofatomer, fordi
kun disse er af betydning for olivenolie.
Fedtsyre (AG) ForkortelseMolekylvægt
(MW)ECN
Palmitinsyre P 256,4 16
Palmitolsyre Po 254,4 141991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 78
▼M13
Fedtsyre (AG) ForkortelseMolekylvægt
(MW)ECN
Stearinsyre S 284,5 18
Oliesyre O 282,5 16Linolsyre L 280,4 14Linolensyre Ln 278,4 12
4.5.3. Omregning af areal % til mol for alle fedtsyrer
mol P ¼
areal % P
MW Pmol S ¼areal % S
MW Smol Po ¼areal % Po
MW Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
mol O ¼areal % O
MW Omol L ¼areal % L
MW Lmol Ln ¼areal % Ln
MW Ln
4.5.4. Normalisering af fedtsyrerne til 100 %
mol % P 1 ;2;3 ðÞ ¼mol P /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)mol % S 1 ;2;3 ðÞ ¼
mol S /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼mol Po /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % O 1 ;2;3 ðÞ ¼mol O /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % L 1 ;2;3 ðÞ ¼mol L /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼mol Ln /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Resultaterne giver den procentvise andel af hver fedtsyre i mol % i den
samlede position (1, 2 og 3) for TAG.
Derefter beregnes summen af de mættede fedtsyrer P og S (SFA) og de
umættede fedtsyrer Po, O, L og Ln (UFA):
mol % SFA = mol % P + mol % S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)mol % UFA = 100 − mol % SFA
4.5.5. Beregning af fedtsyresammensætningen i 2- og 1-3-positio-
nerne i TAG
Fedtsyrerne fordeles i tre grupper som følger: to identiske for 1- og 3-
positionerne og én for 2-positionen med forskellige koefficienter for de
mættede (P og S) og umættede syrer (Po, O, L og Ln).
4.5.5.1. Mættede fedtsyrer i 2-positionen [P(2) og S(2)]
mol % P(2) = mol % P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)mol % S(2) = mol % S (1,2,3) * 0,061991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 79
▼M13
4.5.5.2. Umættede fedtsyrer i 2-positionen [Po(2), O(2), L(2) og Ln(2)]:
mol % Po 2 ðÞ ¼mol % Po 1 ;2;3 ðÞ
mol % UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0mol % S 2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)mol % O 2 ðÞ¼
mol % O 1 ;2;3 ðÞ
mol % UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ/C0mol % S 2 ðÞ ½/C138
mol % L 2 ðÞ ¼mol % L 1 ;2;3 ðÞ
mol % UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0mol % S 2 ðÞ ½/C138
mol % Ln 2 ðÞ ¼mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
mol % UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0mol % S 2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3. Fedtsyrer i 1- og 3-positionerne [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3)
og Ln(1,3)]:
mol % P 1 ;3ðÞ ¼mol % P 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % P 2 ðÞ
2þmol % P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)mol % S 1 ;3ðÞ ¼
mol % S 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % S 2 ðÞ
2þmol % S 1 ;2;3 ðÞ
mol % Po 1 ;3ðÞ ¼mol % Po 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % Po 2 ðÞ
2þmol % Po 1 ;2;3 ðÞ
mol % O 1 ;3ðÞ ¼mol % O 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % O 2 ðÞ
2þmol % O 1 ;2;3 ðÞ
mol % L 1 ;3ðÞ ¼mol % L 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % L 2 ðÞ
2þmol % L 1 ;2;3 ðÞ
mol % Ln 1 ;3ðÞ ¼mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0mol % Ln 2 ðÞ
2þmol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Beregning af triglycerider
4.5.6.1. TAG med én fedtsyre (AAA, her LLL, PoPoPo)
mol % AAA ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % A 2 ðÞ/C3mol % A 1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TAG med to fedtsyrer (AAB, her PoPoL, PoLL)
mol % AAA ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % A 2 ðÞ/C3mol % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
mol % ABA ¼
mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % B 2 ðÞ/C3mol % A 1 ;3ðÞ
10000
4.5.6.3. TAG med tre forskellige fedtsyrer (ABC, her OLLn, PLLn, PoOLn,
PPoLn)
mol % ABC ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % B 2 ðÞ/C3mol % C 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) mol % BCA ¼
mol % B 1 ;3ðÞ /C3 mol % C 2 ðÞ/C3mol % A 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
mol % CAB ¼mol % C 1 ;3ðÞ /C3 mol % A 2 ðÞ/C3mol % B 1 ;3ðÞ /C3 2
100001991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 80
▼M13
4.5.6.4. ECN 42-holdige triglycerider
De følgende ECN 42-holdige triglycerider beregnes i overensstemmelse
med ligning 7, 8 og 9 i den rækkefølge, der er bestemt af den forven-
tede eluering i HPLC (normalt kun tre toppe).
LLL
PoLL og den positionelle isomer LPoLOLLn og de positionelle isomerer OLnL og LnOLPoPoL og den positionekke isomer PoLPoPoOLn og de positionelle isomerer OPoLn og OLnPoPLLn og de positionelle isomerer LLnP og LnPLPoPoPoSLnLn og den positionelle isomer LnSLnPPoLn og de positionelle isomerer PLnPo og PoPLn
De ECN 42-holdige triglycerider er givet ved summen af de ni trigly-
cerider, inklusive deres positionelle isomerer. Resultaterne angives med
mindst to decimaler.
5.Evaluering af resultaterne
Den beregnede teoretiske sammensætning og den sammensætning, der
er bestemt ved HPLC-analysen, sammenlignes. Hvis differencen
mellem HPLC-data minus teoretiske data overstiger de værdier, der er
anført i forordningen for den pågældende oliekategori, indeholder
prøven frøolie.
Bemærk: Resultaterne angives med én decimal.
6.Eksempel (Tallene henviser til afsnittene i beskrivelsen af metoden)
4.5.1. Beregning af mol % fedtsyrer på gr undlag af GLC-data
(areal %)
Der fremkommer følgende data for fedtsyresammensætningen ved
GLC:
FA
MWP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
Areal % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Omregning af areal % til mol for alle fedtsyrer
mol P ¼10
256 ;4¼0;03900 mol P Se formel (1)
mol S ¼3
284 ;5¼0;01054 mol S Se formel (1)
mol Po ¼1
254 ;4¼0;00393 mol Po Se formel (1)
mol O ¼75
282 ;5¼0;26549 mol O Se formel (1)
mol L ¼10
280 ;4¼0;03566 mol L Se formel (1)
mol Ln ¼1
278 ;4¼0;003594 mol Ln Se formel (1)
I alt = 0,35822 mol TAG1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 81
▼M13
4.5.4. Normalisering af fedtsyrerne til 100 %
mol % P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 mol P /C3100
0;35822 mol¼10;888 % Se formel (2)
mol % S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 mol S /C3100
0;35822 mol¼2;944 % Se formel (2)
mol % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 mol Po /C3100
0;35822 mol¼1;097 % Se formel (2)
mol % O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 mol O /C3100
0;35822 mol¼74;113 % Se formel (2)
mol % L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 mol L /C3100
0;35822 mol¼9;956 % Se formel (2)
mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 mol Ln /C3100
0;35822 mol¼1;003 % Se formel (2)
mol % i alt = 100,0 %
Sum af mættede og umættede fedtsyrer i 1-, 2-, 3-position i TAG:
mol % SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Se formel (3)
mol % UFA = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Se formel (3)
4.5.5. Beregning af fedtsyresammensætningen i 2- og 1-3-positio-
nerne i TAG
4.5.5.1. Mættede fedtsyrer i 2-positionen [P(2) og S(2)]
mol % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 % Se formel (4) Se formel (4)
mol % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 % Se formel (4) Se formel (4)
4.5.5.2. Umættede fedtsyrer i 1,3-positionen [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og Ln(1,3)]
mol % Po 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 mol % Se formel
(5)
mol % O 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 mol % Se formel
(5)
mol % L 2 ðÞ ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458 mol % Se formel
(5)
mol % Ln 2 ðÞ ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154 mol % Se formel
(5)
4.5.5.3. Fedtstyrer i 1,3-positionerne [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og
Ln(1,3)]
mol % P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 mol % Se formel (6)
mol % S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 mol % Se formel (6)
mol % Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 mol % Se formel (6)
mol % O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 mol % Se formel (6)
mol % L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 mol % Se formel (6)
mol % Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927 mol % Se formel (6)1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 82
▼M13
4.5.6. Beregning af triglycerider
På grundlag af den beregnede fedtsyresammensætning i sn-2- og sn-1,3-
positionerne (se ovenfor):
FA i 1,3-pos. 2-pos.
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %
L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %I alt 100,0 % 100,0 %
beregnesfølgede triglycerider:
LLL
PoPoPoPoLL med 1 positionel isomerSLnLn med 1 positionel isomerPoPoL med 1 positionel isomerPPoLn med 2 positionelle isomererOLLn med 2 positionelle isomererPLLn med 2 positionelle isomererPoOLn med 2 positionelle isomerer
4.5.6.1. TAG med én fedtsyre (LLL, PoPoPo) Se formel (7)
mol % LLL ¼
9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10000= 0,09708 mol LLL
mol % PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10000= 0,00013 mol PoPoPo
4.5.6.2. TAG med to fedtyrer (PoLL, SLnLn, PoPoL) Se formel (8)
mol % PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10000= 0,02141
mol % LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10000= 0,01070
0,03211 mol PoLL
mol % SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00093
mol % LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10000= 0,00002
0,00095 mol SLnLn
mol % PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00236
mol % PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10000= 0,00118
0,00354 mol PoPoL1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 83
▼M13
4.5.6.3. TAG med tre forskellige fedtsyrer (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Se
formel (9)
mol % PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00375
mol % LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10000= 0,00012
mol % PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,00375
0,00762 mol PPoLn
mol % OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,14577
mol % LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10000= 0,14577
mol % LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10000= 0,14577
0,43671 mol OLLn
mol % PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,03400
mol % LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00111
mol % LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,03400
0,06911 mol PLLn
mol % PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10000= 0,01605
mol % LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10000= 0,01605
mol % OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10000= 0,01605
0,04815 mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 mol triacylglyce-
roler1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 84
▼M14
Figur 1: Afbildning af log αmod f (antal dobbeltbindinger)
La: laurinsyre; My: myristinsyre; P: palmitinsyre; St: stearinsyre; O:
oliesyre; L: linolsyre; Ln: linolensyre.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 85
▼M14
Figur 2: Sojaolie
Figur 3: Sojaolie/olivenolie 30/70
1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 86
▼M14
Figur 4: Olivenolie
1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 87
▼M19
BILAG XIX
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ALIFATISKE ALKOHOLER
VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARSØJLE
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden beskriver en fremgangsmåde til at bestemme indholdet af de
enkelte alifatiske alkoholer og det samlede indhold af alifatiske alko-
holer i fedtstoffer.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffer, tilsat 1-eicosanol som intern standard, forsæbes med
kaliumhydroxid i ethanolopløsning, hvorefter de ikke-forsæbelige
stoffer ekstraheres med diethylether. Alkoholfraktionen separeres fra
ekstrakten af ikke-forsæbelige stoffer ved kromatografi på basiske kisel-
gelplader. De alkoholer, der er indvundet fra kiselgelen, omdannes til
trimethylsilylethere og analyseres ved gaskromatografi på kapillarsøjle.
3. APPARATUR
3.1. 250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib3.2. 500 ml skilletragt
3.3. 250 ml kolber
3.4. komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm
glasplader.
3.5. ultraviolet lampe med en bølgelængde på 366 eller 254 nm
3.6. 100 og 500 µl mikrosprøjter
3.7. en cylindrisk filtertragt med G3-glasfritte (porøsitet 15-40 µm), med en
diameter på ca. 2 cm og en højde på ca. 5 cm, egnet til vakuumfiltre-
ring og med et 12/21 udvendigt konisk glasslib
3.8. en 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendigt konisk glasslib,
som filtertragten (punkt 3.7) kan monteres på
3.9. et 10 ml prøverør med konisk bund og tætsluttende prop
3.10. en gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsøjle, har et split-
tersystem og består af:
3.10.1. et termostatkammer til søjler, som kan opretholde den ønskede tempe-
ratur med en nøjagtighed på 1 ºC
3.10.2. en injektionsenhed med temperaturindstilling, med et fordampningsele-
ment af silanglas
3.10.3. en flammeioniseringsdetektor og en omformer-forstærker3.10.4. en integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-
forstærkeren (punkt 3.10.3), og som har en svartid på ikke over ét
sekund og variabel papirhastighed
3.11. en kapillarsøjle af glas eller kvartsglas, med en længde på 20-30 m, en
indre diameter på 0,25-0,32 mm, indvendig belagt med SE-52– eller
SE-54–væskefase eller tilsvarende i en ensartet tykkelse på mellem
0,10 og 0,30 µm
3.12. en 10 µl gaskromatografi-mikrosprøjte med hærdet kanyle.
3.13. præcisionsvægt med en følsomhed på 1 mg (angivelse af 0,1 mg).
4. REAGENSER
4.1. kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanolopløsning: 130 g kaliumhydroxid
(titer: min. 85 %) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling, og
der fyldesop med ethanol til 1 liter. Opløs ningen opbevaresi veltil-
proppede, mørke glasflasker
4.2. diethylether, analyseren
4.3. vandfrit natriumsulfat, analyserent
4.4. glasplader belagt med kiselgel uden fluorescensindikator, tykkelse
0,25 mm (kan fåsbrugs færdige i handelen)1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 88
▼M19
4.5. kaliumhydroxid, ca. 0,2 N, i ethanolopløsning: 13 g kaliumhydroxid
opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter
4.6. benzen, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.7. acetone, til kromatografi (punkt 5.2.2)4.8. hexan, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.9. diethylether, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.10. chloroform, analyseren
4.11. referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phyto-
steroler, 5 %-opløsning i chloroform
4.12. 2,7-dichlorfluorescein, 0,2 %-opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk
ved tilsætning af nogle få dråber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidopløs-
ning
4.13. vandfri pyridin til kromatografi4.14. hexamethyldisilazan
4.15. trimethylchlorsilan
4.16. standardopløsninger af trimethylsilylethere (TMSE) af de alifatiske
alkoholer fra C
20til C28, friskfremstillede ud fra blandinger af rene alko-
holer
4.17. 1-eicosanol, 0,1 % (m/v)–opløsning i chloroform (intern standard)
4.18. bæregas: hydrogen eller helium, ren, til gaskromatografi
4.19. hjælpegas: nitrogen, ren, til gaskromatografi.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1.Fremstilling af de uforsæbelige stoffer
5.1.1. Et rumfang 0,1 %-1-eicosanolopløsning i chloroform (punkt 4.17), der
indeholder en mængde 1-eicosanol (man kan ligeledes anvende 1-
eneicosanol) svarende til ca. 10 % af indholdet af alifatiske alkoholer i
den del af prøven, der er taget ud til bestemmelsen, overføres til 250 ml-
kolben ved hjælp af 500 µl-mikrosprøjten. F.eks. sættes til 5 g af
prøven 250 µl 0,1 %–1-eicosanolopløsning, hvis undersøgelsen gælder
olivenolier eller frøolier, og 1 500 µl, hvisdet gælder olie fra oliven-
presserester.
Prøven inddampestil tørhed i en nitrogens trøm, hvorefter 5 g af den
tørrede, filtrerede prøve afvejesnøjagtigt og overførestil den s amme
kolbe.
5.1.2. 50 ml 2 N–opløsning af kaliumhydroxid i ethanol tilsættes, refluxsva-
leren påsættes, og væsken opvarmes til svag kogning på vandbad
under vedvarende, kraftig omrøring, indtil forsæbningen er sket (opløs-
ningen bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter,
derefter tilsættes 50 ml destilleret vand ovenfra gennem svaleren,
svaleren tages af, og kolben afkøles til ca. 30 ºC.
5.1.3. Kolbensindhold overføreskvantitativt til en 500 ml–s killetragt, idet der
skylles flere gange med destilleret vand, i alt ca. 50 ml. Ca. 80 ml
diethylether tilsættes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og får
lov til at henstå (note 1).
Den nedre vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt.
Yderligere to ekstraktioner foretages på den vandige fase på samme
måde, idet der bruges60-70 ml diethylether hver gang.
Note 1: En eventuel emulsion kan brydes ved tilsætning af en lille
mængde ethyl- eller methylalkohol ved hjælp af en spray.
5.1.4. Etherekstrakterne samles i én skilletragt og vaskes med destilleret vand
(50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver neutral reaktion.
Når vaskevandet er fjernet, tørres ekstrakterne med vandfrit natrium-
sulfat og filtreres over vandfrit natriumsulfat ned i en på forhånd vejet
250 ml-kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder diethylether.
5.1.5. Etheren destilleres ned til nogle få ml og bringes derefter til tørhed
under et let undertryk eller i en nitrogenstrøm, tørres fuldstændigt i en
ovn ved 100 ºC i ca. 15 minutter og vejes efter afkøling i en ekssik-
kator.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 89
▼M19
5.2.Separation af alkoholfraktionen
5.2.1. Forberedelse af de basiske plader: Kiselgelpladerne (punkt 4.4)
nedsænkes fuldstændig i 0,2 N-opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol
(punkt 4.5) i 10 sekunder, tørrer under emhætte i 2 timer og sættes til
sidst i en ovn ved 100 ºC i 1 time.
Pladeren tages ud af ovnen og opbevares i en ekssikkator med calcium-
chlorid, til de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal
anvendesinden 15 dage).
Note 2: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere alkoholfrak-
tionen, er det ikke nødvendigt at behandle de ikke-forsæbelige
stoffer med aluminiuoxid. På denne måde holdes alle sure
forbindelser (fedtsyrer og andre syrer) tilbage på basislinjen,
og båndet med alifatiske alkoholer og terpenalkoholer bliver
klart adskilt fra sterolbåndet.
5.2.2. Der hældes65:35 (v/v)-hexan/ethyletherblanding i kromatografika-
mmeret til en højde på ca. 1 cm(*).
Kammeret lukkes med det dertil passende låg og henstår i ca. en halv
time, så at der opnås ligevægt mellem væske og damp. Strimler af
filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringespå kammerets
indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. en tredjedel
og giver en mere ensartet og regelmæssig eluering af komponenterne.
Note 3: Kromatografiblandingen bør udskiftes for hver test for at opnå
fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser.
5.2.3. Der fremstilles en ca. 5 %-opløsning af de ikke-forsæbelige stoffer
(punkt 5.1.5) i chloroform. Med 100 µl-mikrosprøjten afsættes med
0,3 ml af denne opløsning på en kromatografiplade (punkt 5.2.1), ca.
2 cm fra den ene ende, en streg, som er så tynd og ensartet som muligt.
På linje med stregen placeres 2-3 µl af alkoholreferenceopløsningen
(punkt 4.11) i den ene ende af pladen, så båndet med de alifatiske alko-
holer kan identificeresefter eluering.
5.2.4. Pladen anbringesi kromatografikammeret, der er forberedt s om angivet
i punkt 5.2.2. Temperaturen bør holdesmellem 15 og 20 ºC. Kammeret
lukkes straks med låget, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten
er ca. 1 cm fra pladensøvers te kant.
Derpå fjernespladen fra kromatografikammeret, og man lader opløs -
ningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen
stå en kort tid under emhætte.
5.2.5. Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluroresceinopløsningen.
Båndet med alifatiske alkoholer identificeres ved, at det ligger på linje
med pletten fra referenceopløsningen, hvorefter båndet med alifatiske
alkoholer og båndet umiddelbart derover, som indeholder triterpenalko-
holer, markeresmed en s ort blyant.
Note 4: Anvisningen om at udtage både båndet med alifatiske alkoholer
og båndet med triterpenalkoholer skyldes, at under denne
metodes betingelser er der en betydelig mængde alifatiske
alkoholer i båndet med triterpenalkoholer.
5.2.6. Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det
fjernede materiale pulveriseres fint og placeres i filtertragten (punkt
3.7). Der tilsættes 10 ml varm chloroform, blandes omhygeligt med
metalspatelen og filtreres under vakuum; filtratet opsamles i den
koniske kolbe (punkt 3.8), der er forbundet med filtertagten.
Materialet i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml ad
gangen), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er forbundet med
filtertragten. Filtratet inddampestil et rumfang af 4-5 ml, s om overføres
til det på forhånd vejede 10 ml–prøverør (punkt 3.9), og der inddampes
til tørhed med let opvarmning i en svag strøm af nitrogen. Remanensen
genopløses i nogle få dråber acetone, der inddampes igen til tørhed,
røret placeresi en ovn ved 105 ºC i ca. 10 minutter, og det afs valesi
en ekssikkator og vejes.
Remanensen i prøverøret udgør alkoholfraktionen.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 90
(*) I disse tilfælde i særdeleshed benyttes 95:5 (v/v)–benzen/acetoneblandingen for at
opnå god adskillelse af båndene.
▼M19
5.3.Fremstilling af trimethylsilylethere (TMSE)
5.3.1. Til prøverøret med alkoholfraktionen sættes silyleringsreagenset, der
består af en 9:3:1 (v/v/v)-blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/
trimethylchlorsilan (note 5), i en mængde af 50 µl pr. milligram
alkohol, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 6).
Note 5: Brugsfærdige opløsninger kan fås i handelen. Man kan også få
andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-
trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimethylchlorsilan, som
skal fortyndes med et lige så stort rumfang vandfri pyridin.
Note 6: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver
ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller
fremkommer en lyserød farve, er det tegn på, at der er fugt til
stede, eller at reagenset ikke er i orden. Hvis det forekommer,
må prøven gentages.
5.3.2. Prøverøret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i
vejret på det), indtil alkoholerne er fuldstændig opløst. Efter mindst 15
minutters henstand ved stuetemperatur centrifugeres der i nogle få
minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse.
5.4.Gaskromatografisk analyse
5.4.1. Forberedende operationer, konditionering af søjlen
5.4.1.1. Søjlen monteres i gaskromatografen, idet indløbsenden forbindes med
injektoren, der står i forbindelse med splittersystemet, og udløbsenden
forbindesmed detektoren. Der foretagesen generel kontrol af gas kro-
matografienheden (lækager fra gaskredsløbene, detektorens effektivitet,
splittersystemets og skriversystemets effektivitet osv.).
5.4.1.2. Hvis søljen skal bruges for første gang, anbefales det, at den underka-
stes en konditionering. Man lader en svag gasstrøm passere gennem
søjlen og tænder så for gaskromatografienheden, derefter begynder
man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20 ºC over driftstem-
peraturen (note 7). Denne temperatur opretholdesi minds t 2 timer,
derefter sættes hele systemet i driftstilstand (justering af gasstrømme
og splitter, antændelse a flammen, forbindelse til den elektroniske
skriver, justering af søjlekammeret, detektorens og injektorens tempe-
ratur osv.), og derefter optegnes signalet med en følsomhed, der er
mindst to gange større end den, man agter at anvende til analysen.
Basislinjens forløb skal være lige, uden toppe af nogen art, og den må
ikke drive. Drivning nedad af en lige linje tyder på lækage fra søjlens
forbindelser, drivning opad tyder på utilstrækkelig konditionering af
søjlen.
Note 7: Konditioneringstemperaturen skal altid være mindst 20 ºC
lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den
anvendte stationære fase.
5.4.2. Valg af driftsbetingelser
5.4.2.1. Der anbefales følgende vejledende driftsbetingelser:
— søjletemperatur: først konstant temperatur 180 ºC i 8 minutter,
derefter programmeret stigning med 5 ºC/minut op til 260 ºC og
endelig 15 minutter ved 260 ºC
— fordampertemperatur: 280 ºC— detektortemperatur: 290 ºC— bæregassens lineære hastighed: helium 20-35 cm/s, hydrogen 30-
50 cm/s
— splitterforhold: fra 1:50 til 1:100— instrumentets følsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale dæmpning— registreringsfølsomhed: 1-2 mV fuld skala
— papirhastighed: 30-60 cm/time
— mængde stof injiceret: 0,5-1 µl TMSE-opløsning.
Disse betingelser kan varieres alt efter søjlens og gaskromatografens
egenskaber, så man opnår kromatogrammer, der opfylder følgende krav:
— Retentionstiden for C
26-alkohol skal være 18 ± 5 minutter.
— Toppen for C22-alkohol skal være 80 ± 20 % af fuld skala for
olivenolie og 40 ± 20 % af fuld skala for frøolier.
5.4.2.2. For at kontrollere ovenstående krav foretages gentagne injektioner af
prøveblandinger af alkohol-TMSE, og driftsbetingelserne justeres, så
de bedste resultater opnås.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 91
▼M19
5.4.2.3. Integrationsparametrene for toppene må fastsættes sådan, at de giver
korrekte værdier for de relevante toppe.
5.4.3. Udførelse af analysen
5.4.3.1. Med 10 µl-mikrosprøjten opsuges 1 µl hexan, 0,5 µl luft og derefter
0,5-1 µl af prøveopløsningen. Stemplet trækkes længere ud, så kanylen
tømmes. Kanylen trykkes gennem injektionsenhedens membran, og
efter 1-2 sekunder injiceres hurtigt; derefter fjernes kanylen langsomt
efter ca. 5 sekunder.
5.4.3.2. Skriveren skal køre, indtil alle alkohol-TMSE er fuldstændig elueret.
Basislinjen skal til stadighed opfylde kravene (punkt 5.4.1.2).
5.4.4. Identifikation af toppene
De enkelte toppe identificeres på basis af retentionstiderne og ved
sammenligning med blandinger af alkohol-TMSE, der er analyseret
under de samme betingelser.
Figur 1 viser et kromatogram for alkoholfraktionen af en jomfruolie.
5.4.5. Kvantitativ vurdering
5.4.5.1. Toparealerne for 1-eicosanol og de alifatiske alkoholer C22,C24,C26og
C28beregnesved hjælp af integratoren.
5.4.5.2. Koncentrationen af de enkelte simple alifatiske alkoholer beregnes i mg
pr. 1 000 g fedtstof som følger:
hvor:
Ax= toparealet for alkohol x
As= arealet af 1-eicosanoltoppen
ms= massen af tilsat 1-eicosanol i milligram
m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.
6. ANGIVELSE AF RESULTATER
Koncentrationerne af simple alifatiske alkoholer angives i mg pr.
1 000 g fedtstof og deres sum som »total mængde alifatiske alkoholer«.1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 92
▼M19
TILLÆG
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1-3 µl
methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere
gennem søjlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen frem-
kommer (tM).
Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde i cm,
og tM er den målte tid i sekunder.
Figur 1: Kromatogram af alkoholfraktionen af en jomfruolie
1 = eicosanol
2 = docosanol
3 = tricosanol4 = tetracosanol
5 = pentacosanol
6 = hexacosanol7 = heptacosanol8 = octacosanol1991R2568 — DA — 22.05.2002 — 019.001 — 93