1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91
af 11. juli 1991
om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte
metoder
(EFT L 248 af 5.9.1991, s. 1)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1 Kommissionens forordning (EØF) nr. 3682/91 af 17. december 1991 L 349 36 18.12.1991
►M2 Kommissionens forordning (EØF) nr. 1429/92 af 26. maj 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3 Kommissionens forordning (EØF) nr. 1683/92 af 29. juni 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4 Kommissionens forordning (EØF) nr. 1996/92 af 15. juli 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5 Kommissionens forordning (EØF) nr. 3288/92 af 12. november 1992 L 327 28 13.11.1992
►M6 Kommissionens forordning (EØF) nr. 183/93 af 29. januar 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 ændret ved Kommissionens forordning (EØF) nr. 826/93 af 6. april
1993L 87 6 7.4.1993
►M8 Kommissionens forordning (EØF) nr. 620/93 af 17. marts 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9 Kommissionens forordning (EF) nr. 177/94 af 28. januar 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10 Kommissionens forordning (EF) nr. 2632/94 af 28. oktober 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11 kommissionens forordning (EF) nr. 656/95 af 28. marts 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12 Kommissionens forordning (EF) nr. 2527/95 af 27. oktober 1995 L 258 49 28.10.1995
Berigtiget ved:
►C1 Berigtigelse, EFT L 176 af 20.7.1993, s. 26 (183/93)
▼B
KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91
af 11. juli 1991
om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i
den forbindelse anvendte metoder
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det EuropæiskeØkonomiske Fællesskab,
under henvisning til Rådets forordning nr. 136/66/EØF af 22.
september 1966 om oprettelse af en fælles markedsordning for fedt-
stoffer (
1), senest ændret ved forordning (EØF) nr. 3577/90 (2), særlig
artikel 35a, og
ud fra følgende betragtninger:
I bilaget til forordning nr. 136/66/EØF er der fastsat betegnelser for og
definitioner på olivenolie og olie af olivenpresserester, der afsættes i deenkelte medlemsstater, isamhandelen mellem medlemsstaterne og isamhandelen mellem medlemsstaterne og tredjelande;
for at kunne skelne mellem de forskellige typer olie er det nødvendigt
at definere de fysisk-kemiske kendetegn for hver type samt de organo-leptiske kendetegn for jomfruolie, således at produkternes renhed ogkvalitet sikres uden at dette berører andre eksisterende bestemmelserpå området;
kendetegnene for de forskellige typer olie bør fastlægges ensartet for
hele Fællesskabet; med henblik herpå bør der fastlægges EF-metoderfor kemisk analyse og orgenoleptisk vurdering; i en overgangsperiodebør medlemsstaterne dog kunne anvende andre metoder, idet det dogskal fastsættes, at det er resultatet af den fælles metode, der gælder i
tilfælde af uoverensstemmelse;
definitionen af de fysisk-kemiske kendetegn for olivenolie og analyse-
metoder indebærer, at de supplerende bestemmelser til kapitel 15 i DenKombinerede Nomenklatur skal tilpasses;
som led i metoden til bedømmelse af jomfruolies organoleptiske kende-
tegn skal der oprettes paneler af udvalgte og øvede smagsdommere; derbør afsættes den fornødne tid til etablering af en sådan struktur; ibetragtning af de vanskeligheder, som visse medlemsstater vil få med
at oprette panelerne, bør det tillades disse medlemsstater at benytte de
iandre medlemsstater eksi sterende paneler;
for at ordningen med importafgift på olivenpresserester kan fungere
efter hensigten bør der fastlægges en fælles metode til bestemmelse af
olieindholdet i disse produkter;
for ikke at påføre handelen skade, bør det fastsættes, at det i en
begrænset periode er tilladt at afsætte olie aftappet før denne forord-nings ikrafttræden;
Kommissionens forordning (EØF) nr. 1058/77 (
3), senest ændret ved
forordning (EØF) nr. 1858/88 (4), bør ophæves;
Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer har ikke afgivet udtalelse inden
for den af formanden fastsatte frist —
UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:
Artikel 1
1. Som jomfruolie (KN-kode 1509 10 90) efter punkt 1, litra a), b)
og c), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 2
(1) EFT nr. 172 af 30. 9. 1966, s. 3025/66.
(2) EFT nr. L 353 af 17. 12. 1990, s. 23.
(3) EFT nr. L 128 af 24. 5. 1977, s. 6.
(4) EFT nr. L 166 af 1. 7. 1988, s. 10.
▼B
respekti ve kendetegn er ioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt
1, 2 og 3 i bilag I til nærværende forordning.
2. Som bomolie (KN-kode 1509 10 10) efter punkt 1, litra d), i bi-
laget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er ioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt 4 ibi lag I ti l nærværendeforordning.
3. Som raffineret olivenolie (KN-kode 1509 90 00) efter punkt 2 i
bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn erioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt 5 ibi lag I ti l næværendeforordning.
4. Som olivenolie (KN-kode 1509 90 00) efter punkt 3 i bilaget til
forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overens-stemmelse med kendetegnene ipunkt 6 ibi lag I ti l næværendeforordning.
5. Som rå olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 10) efter
punkt 4 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hviskendetegn er ioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt 7 ibi lag Itil nærværende forordning.
6. Som raffineret olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 90)
efter punkt 5 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie,hvi s kendetegn er ioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt 8 ibilag I til nærværende forordning.
7. Som olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 90) efter punkt
6 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegner ioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt 9 ibi lag I ti l nærvæ-
rende forordning.
Artikel 2
1. Bestemmelsen af kendetegnene for de i bilag I fastsatte olier sker
ved hjælp af følgende analysemetoder:
— til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre,
metoden ibi lag II
— til bestemmelse af peroxidtallet, metoden i bilag III— til bestemmlese af indholdet af alfatiske alkoholer, metoden i bilag
IV
— til bestemmelse af indholdet af steroler, metoden i bilag V
— til bestemmelse af indholdet af erytrodiol og uvaol, metoden i bilag
VI
— til bestemmelse af indholdet af mættede fedtsyrer i 2-stillingen i
triglycerider, metoden i bilag VII
— til bestemmelse af indholdet af trilinolcin, metoden i bilag VIII
— til den spektrofotometriske undersøgelse, metoden i bilag IX— til bestemmelse af fedtsyrernes sammensætning, metoden i bilag X
Ao gXB
— til bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsnings-
midler, metoden i bilag XI
— til bestemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn, metoden i
bilag XII, anvendt som omhandlet i stk. 2
— til bevis for raffinering, metoden i bilag XIII
— til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener, metoden i bilag
XVII.
2.►
M3Analytikeren, der er ekspert i sensorisk analyse, eller som
bistås af eksperter ◄— bedømmer de organoleptiske kendetegn efter
proceduren beskrevet i det i bilag XII omhandlede smageskema. Hvisde gennem analysen fremkomne kendetegn afviger fra dem, derfremgår af produktets betegnelse, undersøges prøven af et smagspanelsom omhandlet ibi lag XII.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 3
▼M11
▼B
▼B
Den nye analyse foretages af panelet ioverensstemmelse med nævnte
bestemmelser.
Når det gælder bedømmelsen af de organoleptiske kendetegn i forbin-
delse med foranstaltningerne under interventionsordningen, foretagesden af smagspanelet i henhold til bilag XII.
Artikel 3
Indførelsen af de i artikel 2 fastsatte analysemetoder udelukker ikke, at
medlemsstaterne indtil ►
M6den 28. februar 1993 ◄kan anvende
andre afprøvede og videnskabeligt anerkendte metoder, hvis den friebevægelse af produkter, som ifølge EF-metoderne opfylder degældende bestemmelser, ikke hindres herved. Medlemsstaterne
meddeler Kommissionen disse andre metoder, inden de anvender dem.
Hvis en af de andre metoder giver et andet resultat end det, der følger
af EF-metoden, fastholdes resultatet fra EF-metoden.
Artikel 3a
I tilfælde af uenighed om de organoleptiske kendetegn for en olie, der
er bragt i handelen, kan parterne henvende sig til et af dem selv
udvalgt, godkendt panel af smagsdommere.
Artikel 3b
Konstateres det, at en olies organoleptiske kendetegn er forskellige fra
dem, der følger af dens benævnelse, anvender medlemsstaten admini-
strative bøder, hvis størrelse afhænger af den konstateredeuregelmæssigheds omfang, uden at dette i øvrigt udelukker eventuelleandre sanktioner.
Ved vurderingen af uregelmæssigheden tages der hensyn til den natur-
lige udvikling i kendetegnene for en olie, der er opbevaret undernormale vilkår.
I begyndelsen af hvert halvår underretter medlemsstaterne om antallet
og arten af konstaterede uregelmæssigheder og de sanktioner, der er
anvendt idet foregående halvår.
Artikel 4
1. Med henblik på bedømmelsen af de organoleptiske kendetegn
opretter medlemsstaterne paneler af smagsdommere, der forestår den
offentlige kontrol med kendetegnene, og som skal opfylde følgendebetingelser:
— panelerne skal bestå af smagsdommere, der er udvalgt og uddannet
efter de regler, der er fastsat efter metoden ibi lag XII.
— de skal råde over de anlæg og redskaber, der er nødvendige for den
organoleptiske bedømmelse efter reglerne i nævnte metode
— de skal anvende den specielle ordliste for sensorisk analyse af
olivenolie, det profilskema og det bedømmelsesskema, der er fastsatinævnte metode
— de skal forpligte sig til at gennemføre de organoleptiske bedøm-
melser, der er fastsat på fællesskabsplan eller internationalt, vedperiodisk kontrol og møder om harmonisering af fornemmelseskri-terierne
— panelerne skal forpligte sig til hvert år at meddele Kommissionen
alle oplysninger om ændringer af panelets sammensætning og
antallet af bedømmelser, de har foretaget ideres egenskab afgodkendte paneler.
Medlemsstaterne godkender paneler, der opfylder ovennævnte betin-
gelser, og som er oprettet på deres område. De udpeger blandt
panelerne det eller de paneler, der skal foretage kontrolanalyser.
Paneler, som medlemsstaterne har oprettet inden den 1. november 1992
ifølge de regler, som er fastsat ved metoden i bilag XII, betragtes somgodkendte paneler efter denne artikel.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 4
▼M5
▼M5
Medlemsstaterne meddeler hinanden og Kommissionen listen over
godkendte paneler.
2. Hvis en medlemsstat har vanskeligheder med at oprette et panel
på sit område, kan den gøre brug af et godkendt panel i en anden
medlemsstat.
3. Hver medlemsstat opstiller en liste over de paneler af smagsdom-
mere, der er oprettet af erhvervs- eller brancheorganisationer på de istk. 1 fastsatte betingelser, og de kontrollerer, at disse betingelser over-holdes.
Artikel 5
Supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 til kapitel 15 i Den Kombine-
rede Nomenklatur i bilag I til Rådets forordning (EØF) nr. 2658/87 (
1),
affattes som angivet i bilag XIV til nærværende forordning.
Artikel 6
1. Olieindholdet i presserester og andre restprodukter fra udvinding
af olivenolie (KN-kode 2306 90 11 og 2306 90 19) bestemmes eftermetoden ibi lag XV.
2. Det i stk. 1 omhandlede olieindhold udtrykkes i vægtprocent af
tørstoffet.
Artikel 7
EF-bestemmelserne vedrørende forekomsten af andre uønskede stoffer
end dem, der er omhandlet i bilag XI, finder anvendelse.
Artikel 8
1. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen, hvilke foranstaltninger
de træffer til anvendelse af denne forordning.
2. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen i begyndelsen af hvert
halvår en oversigt over analyseresultaterne i forbindelse med de
bestemmelser, der er foretaget iløbet af det foregående halvår.
Resultaterne gennemgås af Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer efter
proceduren iarti kel 39 iforordni ng nr. 136/66/EØF.
Artikel 9
Forordning (EØF) nr. 1058/77 ophæves.
Artikel 10
1. Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggø-
relsen iDe Europæiske Fællesskabers Tidende .
Metoden ibi lag XII anvendes dog fra den ►
M11. november
1992◄, undtagen i forbindelse med interventionsforanstaltninger.
Metoden anvendes ikke for jomfruolie, der er aftappet før den 1.
november 1992.
2. Denne forordning anvendes ikke for olivenolie og olie af oliven-
presserester, der aftappes inden datoen for denne forordningsikrafttræden, og som bringes i handelen inden den 31. oktober 1992.
Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart
ihver medlemsstat.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 5
(1) EFT nr. L 256 af 7. 9. 1987, s. 1.▼M6
▼B
▼M5
▼B
▼B
BILAG
Resumé
Bilag I: Karakteristika ved olivenolie …
Bilag II: Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer …
Bilag III: Bestemmelse af peroxidtallet …Bilag IV: ►
M6Bestemmelse af voksindhold ved gaskramatografering
med kapillarkolonne ◄…
Bilag V: Bestemmelse af sammensætningen og indholdet af steroler ved
gaskromatografipå kapi llarsøjle …
Bilag VI: Bestemmelse af erythrodiol og uvaol …Bilag VII: Bestemmelse af fedtsyrer i 2-positionen i triglycerider fra olier
og fedtstoffer …
Bilag VIII: Bestemmelse af indholdet af trilinolein …Bilag IX: Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys …
Bilag XA: Gaskromatografering af fedtsyremethylestere …
Bilag XB: Fremstilling af fedtsyremethylestere …Bilag XI: Bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsnings-
midler i olivenolie …
Bilag XII: Organoleptisk vurdering af jomfruolie …
Bilag XIII: ►
M6Neutralisation og blegning af olivenolie i laboratoriet ◄
…
Bilag XIV: Supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 til kapitel 15 i Den
Kombinerede Nomenklatur
Bilag XV: Olieindhold i presserester af oliven …
Bilag XVI: Bestemmelse af iodtal …
Bilag XVII: Metode til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener i vegeta-
bilske olier …1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 6
▼M11
BILAG I
KARAKTERISTIKA VED OLIVENOLIE
TypeSurheds-
grad
%Peroxidtal
meq O2/kgHalogene-
rede
opløs-
nings-
midler
mg/kg (1)Vokser
mg/kgMættede
fedtsyrer i
2-stil-
lingen i
triglycerid
%Stigmasta-
diener (2)Erytrodiol
+ uvaol
%Trilinolein
%Kolesterol
%Brassica-
sterol
%Campe-
sterol
%Stigma-
sterol
%Betasito-
sterol (3)
%Delta-7-
stigma-
stenol
%Steroler i
alt
mg/kg
1. Jomfruolie ekstra M 1,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
2. Jomfruolie M 2,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 10003. Jomfruolie almin-
delig M 3,3 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
4. Bomolie m 3,3 m 20 m 0,20 M 350 M 1,3 M 0,50 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 10005. Olivenolie raffi-
neret M 0,5 M 5 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
6. Olivenolie M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 10007. Rå olivenolie af
presserester m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,7 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2500
8. Raffineret oliven-
olie af pressere-
ster M 0,5 M 5 M 0,20 — M 2,0 m 12 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1800
9. Olivenolie af
presserester M 1,5 M 15 M 0,20 >350 M 2,0 >4,5 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1600
M = maksimum, m = minimum
(1) Total maksimalgrænseværdi for forbindelser detekteret ved elektronindfangningsdetektor.
For de enkelte påviste bestanddele er den maksimale grænseværdi 0,10 mg/kg
(2) Summen af isomerer, der eventuelt kan adskilles på kapillarkolonne.
(3) Delta-5,23-stigmastadienol + klerosterol + sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadieno l.
NB:En olie deklasseres, hvis blot en enkelt egenskab ligger uden for de fastsatte grænser.▼M111991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 7
TypeFedtsyresammensætning
Summen af
transoliesy-
reisomererSummen af
translinolsy-
reog transli-
nolsyreiso-
merer
%K232K270K270med
aluminium-
oxydDelta-KPanelbe-
dømmelse Myristin
%Linolen
%Arachin
%Eicosan
%Behen
%Lignocerin
%
1. Jomfruolie ekstra M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,50 M 0,20 M 0,10 M 0,01 m 6,5
2. Jomfruolie M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 5,5
3. Olivenolie, almin-
delig M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 3,5
4. Bomolie M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,10 M 0,10 M 3,70 M 0,25 M 0,11 — < 3,55. Olivenolie, raffineret M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —6. Olivenolie M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —
7. Rå olivenolie af
presserester M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,20 M 0,10 —————
8. Raffineret olivenolie
af presserester M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Olivenolie af presse-
rester M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —
M = maksimum; m = minimum.
NB:
En olie deklasseres, hvis blot en enkelt egenskab ligger uden for de fastsatte grænser.
Med henblik på at fastslå renheden bestemmes K270efter behandling med aluminiumoxyd, når K270overstiger grænsen for den pågældende kategori.▼M111991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 8
▼B
BILAG II
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FRIE FEDTSYRER
1. FORMÅL
Bestemmelse af frie fedtsyrer i olivenolie. Indholdet af frie fedtsyrer
udtrykkes ved det vedtægtsmæssigt beregnede syreindhold.
1.1.Princip
En analyseprøve opløses i en blanding af opløsningsmidler, hvorefter de
tilstedeværende frie fedtsyrer bestemmes ved hjælp af en opløsning af
kaliumhydroxid i ethanol.
1.2.Reagenser
Samtlige reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet, og der
anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.
1.2.1. Dietyhlether/ethanol, 95 % (v/v), blandet i forholdet 1:1 efter rumfang.
Note: Dietylether er meget let antændelig og kan danne eksplosive pero-
xider. Under anvendelsen skal der træffes særlige forholdsregler.
Nøjagtigt på anvendelsestidspunktet neutraliseres med en opløsning af
kaliumhydroxid (1.2.2) ved tilstedeværelse af 0,3 ml phenolphtalein-
opløsning (1.2.3) pr. 100 ml blanding.
Note: Hvis det ikke er muligt at anvende diethylether, kan en blanding af
opløsningsmidler bestående af ethanol og toluen anvendes. Om
nødvendigt kan ethanolen erstattes af 2-propanol.
1.2.2. Indstillet opløsning af kaliumhydroxid i ethanol, c(KOH) ca. 0,1 mol/l
eller om nødvendigt c(KOH) ca. 0,5 mol/l.
Den nøjagtige koncentration af kaliumhydroxid-opløsningen i ethanol
skal være kendt og verificeres umiddelbart før brug. Der anvendes en
opløsning, der er fremstillet mindst fem dage før brugen, og dekanteret
over i en flaske af brunt glas, lukket med en gummiprop. Opløsningen
skal være farveløs eller strågul.
Note: En ufarvet stabil opløsning af kaliumhydroxid kan fremstilles på
følgende måde: 1 000 ml ethanol med 8 g kaliumhydroxid og
0,5 g aluminiumspåner bringes i kog og holdes kogende i 1 time
med tilbageløb. Derefter destilleres omgående, og den krævede
mængde kaliumhydroxid opløses i destillatet. Man lader opløs-
ningen henstå i flere dage og dekanterer derefter den øverste klare
væske fra bundfaldet af kaliumcarbonat.
Opløsingen kan også fremstilles uden destillation på følgende
måde: til 1 000 ml ethanol tilsættes 4 ml aluminiumbutylat, hvor-
efter man lader blandingen henstå i nogle dage. Derefter
dekanteres den klare væske fra, og heriopløses den krævede
mængde kaliumhydroxid. Denne opløsning er klar til brug.
1.2.3. Phenolphtalein, opløsning med 10 g/l i 95—96 % (v/v) ethanol, eller
alkaliblåt (i tilfælde af stærkt farvede fedtstoffer), opløsning med 20 g/l
i95—96 % (v/v) ethanol.
1.3.Apparatur
Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:
1.3.1. Analysevægt.1.3.2. 250 ml Erlenmeyer-kolbe.1.3.3. 10 ml burette med 0,05 ml inddelinger.
1.4.Fremgangsmåde
1.4.1. Forberedelse af analyseprøve
Analyseprøven forberedes ioverensstemmelse med NF T 60—200. (På
prøven som den er, hvis det samlede indhold af vand og urenheder ikke
overstiger 1 %, ellers på en filtreret prøve). Bestemmelsen foretages på
den filtrerede prøve. Hvis det samlede indhold af vand og urenheder er
under 1 %, foretages bestemmelsen på den ubehandlede prøve.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 9
▼B
1.4.2. Prøveudtagning
Ud fra det antagne syreindhold udtages en prøve efter angivelserne i
følgende tabel:
Antaget syreindhold
vægtprocentPrøvens masse
igPrøven afvejes med en
nøjagtighed
igp å
< 1 20 0,05
1— 4 10 0,02
4—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Prøven afvejes iErlenmeyer-kolben (1.3.2).
1.4.3. Bestemmelse
Prøven (1.4.2) opløses i50 — 150 ml af den på forhånd neutrali serede
blanding af diethylether/ethanol (1.2.1).
Under omrøring titreres med kaliumhydroxidopløsning, 0,1 mol/l (1.2.2)
(se note 2), indtil indikatoren slår om (den rosa farve af phenolphtalein
skal holde sig i mindst 10 sek.).
Note 1: Den indstillede opløsning af kaliumhydroxid i ethanol (1.2.2) kan
erstattes af en vandig opløsning af kaliumhydroxid eller natrium-
hydroxid, når den tilførte vandmængde ikke medfører
faseadskillelse.
Note 2: Hvis den nødvendige mængde 0,1 mol/l kaliumhydroxidopløs-
ning overstiger 10 ml, anvendes i stedet en opløsning på
0,5 mol/l.
Note 3: Bliver opløsningen uklar under titreringen, tilsættes så meget
opløsningsmiddelblanding (1.2.1), at opløsningen bliver klar.
1.5.Angivelse af syreindholdet i % oliesyre
Syreindholdet, udtrykt som vægtprocent =
V/C2c/C2M
1 000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
hvor:
V = rumfanget i ml af den forbrugte kaliumhydroxidopløsning
c = den nøjagtige koncentration i mol/l af den anvendte kaliumhydro-
xidopløsning
M = den molvægt i g/mol af syren, der er valgt til angivelse af resul-
tatet (Moliesyre= 282 g/mol)
m = analyseprøvens vægt igram.
Som resultat anvendes det aritmetiske gennemsnit ►M6af to
bestemmelser ◄.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 10
▼B
BILAG III
BESTEMMELSE AF PEROXIDTALLET
1. OMRÅDE
Denne standard beskriver en metode til bestemmelse af peroxidtallet for
olier og fedtstoffer.
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder anvendelse for animalske og vegetabilske olier og
fedtstoffer.
3. DEFINITION
Peroxidtallet angiver den mængde stoffer i prøven, udtrykt som milliækvi-
valenter aktivt oxygen pr. kg, som oxiderer kaliumiodid under de beskrevne
forsøgsbetingelser.
4. PRINCIP
Analyseprøven, opløst i en blanding af eddikesyre og chloroform,
behandles med en opløsning af kaliumiodid. Det frigjorte iod titreres med
en indstillet natriumthiosulfatopløsning.
5. APPARATUR
Alt udstyr skal være frifor reducerende og oxi derende stoffer.
Note: Sliboverflader må ikke indfedtes.
5.1. 3 ml glasske.
5.2. Kolber med slib og prop, på ca. 250 ml, som på forhånd tørres og fyldes
med ren, tør inert gas (nitrogen eller — helst — carbondioxid).
5.3. 25 eller 50 ml burette med 0,1 ml inddeling.
6. REAGENSER
6.1. Analyseren chloroform, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør
inert gas.
6.2. Analyseren iseddike, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør
inert gas.
6.3. Mættet vandig opløsning af kaliumiodid, fremstillet umiddelbart før brug
og fri for iod og iodater.
6.4. Natriumthiosulfat, 0,01 eller 0,002 N nøjagtigt indstillet vandig opløsning,
indstillet umiddelbart før brug.
6.5. Stivelsesopløsning, 10 g/l vandig opslæmning, fremstillet umiddelbart før
brug ud fra naturlig opløselig stivelse.
7. PRØVE
Prøven udtages og opbevares beskyttet mod lys, holdes nedkølet og opbe-
vares i fuldstændigt fyldte glasbeholdere, der er hermetisk tillukket med
slibpropper af glas eller korkpropper.
8. FREMGANGSMÅDE
Analysen udføres idi ffust dagslys eller ikunsti gt lys. I en glasske (5.1)
eller imangel heraf en kolbe (5.2) afvejes med en nøjagti ghed på 0,001 g
en prøvemængde ioverensstemmelse med følgende tabel, svarende ti l det
forventede peroxidtal:1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 11
▼B
Forventet perioxidtal
(meq O2/kg)Analyseprøvens vægt
(ig)
0 — 12 5,0 — 2,0
12 — 20 2,0 — 1,220 — 30 1,2 — 0,830 — 50 0,8 — 0,5
50 — 90 0,5 — 0,3
Proppen tages af en kolbe (5.2), og analyseprøven iglasskeen overføres ti l
kolben. Der tilsættes 10 ml chloroform (6.1), og analyseprøven opløses
hurtigt ved omrystning. Derefter tilsættes 15 ml eddikesyre (6.2), efterfulgt
af 1 ml kaliumiodidopløsning (6.3). Så sættes proppen hurtigt i, og der
omrystes i 1 min., hvorefter man lader kolben henstå i nøjagtigt 5 min. i
mørke ved en temperatur på 15 — 25º C.
Der tilsættes ca. 75 ml destilleret vand, og det frigjorte iod titreres med
natriumthiosulfatopløsning (6.4) (0,002 N opløsning for forventede værdier
under 12, og 0,01 N opløsning for forventede værdier over 12) under
kraftig omrystning og med anvendelse af stivelsesopløsning (6.4) som indi-
kator.
Der udføres to bestemmelser på samme analyseprøve.
Samtidig udføres en blindprøve. Hvis resultatet af blindprøven overstiger
0,05 ml 0,01 N natriumthiosulfatopløsning (6.4), udskiftes de urene
reagenser.
9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Perioxidtallet (P.V.), udtrykt i milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, er
givet ved formlen:
P:V:¼
V/C2T/C21 000
m
hvor:
V = antal ml forbrugt indstillet natriumthiosulfatopløsning (6.4) ved
analysen, korrigeret for resultatet af blindprøven
T = den nøjagtige normalitet af den anvendte natriumthiosulfatopløsning
(6.4),
m = analyseprøvens vægt ig.
Som resultat angives det aritmetiske gennemsnit af de to udførte bestem-
melser.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 12
▼M6
BILAG IV
BESTEMMELSE AF VOKSINDHOLD VED GASKROMATOGRAFE-
RING MED KAPILLARKOLONNE
1. FORMÅL
Metoden består af en procedure til bestemmelse af voksindholdet i visse
fedtstoffer og olier efter prøvebetingelserne.
Den er navnlig velegnet, når der skal skelnes mellem olivenolie, der er
udvundet ved presning, og olivenolie, der er udvundet ved ekstraktion.
2. PRINCIP
Der tilsættes en egnet intern standard til fedtstoffet eller olien, hvorefter
adskillelsen finder sted ved hjælp af kromatografering på en hydreret
kiselgelkolonne. Den fraktion, der først elueres under prøvebetingel-
serne, og som har lavere polaritet end triglyceriderne opsamles, og der
analyseres derefter direkte ved hjælp af gaskromtografering med kapil-
larkolonne.
3. APPARATUR
3.1. 25 ml Erlenmeyerkolbe.3.2. Glaskolonne til kromatografering, 15 mm indvendig diameter og højde
30-40 cm.
3.3. Gaskromatograf, der kan fungere med en kapillarkolonne, der er
udstyret med et system til direkte indsprøjtning i kolonnen, og som
består af følgende:
3.3.1. Ovn med termostat til kolonnerne, der kan holde den valgte temperatur
inden for ± 1 ºC.
3.3.2. Kold injektor til direkte indsprøjtning i kolonnen.3.3.3. Flammeioniseringsdetektor og konverter/forstærker.
3.3.4. Skriver/integrator, der kan fungere med konverter/-forstærkeren (3.3.3),
responstid under 1 sekund, med variabel papirhastighed.
3.3.5. Kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, ►
C110-15 m lang ◄,
0,25-0,32 mm indvendig diameter, coated med SE-52 eller SE-54 eller
tilsvarende i en ensartet lagtykkelse på 0,10-0,30 µm.
3.4. Mikrosprøjte på 10 µl med hærdet nål til direkte indsprøjtning i
kolonnen.
4. REAGENSER
4.1. Kiselgel, 70-230 mesh, artikel 7754 Merck.
Gelen anbringes i ovnen ved 500 ºC i fire timer. Henstilles til afkøling,
hvorefter der tilsættes 2 % vand. Der rystes omhyggeligt for at homo-
genisere opslæmning. Opbevares i mørke i mindst tolv timer inden
brug.
4.2. n-hexan til kromatografering.4.3. Ethylether til kromatografering.
4.4. n-heptan til kromatografering.
4.5. Standardopløsning af 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern stan-
dard).
4.6. Bæregas: hydrogen, ren, til gaskromatografering.4.7. Hjælpegasser:
— hydrogen, ren, til gaskromatografering
— luft, ren, til gaskromatografering.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 13
▼M6
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Adskillelse af voksfraktionen
5.1.1. Fremstilling af kromatografikolonnen.
15 g kiselgel tilsat 2 % vand opslæmmes i vandfri n-hexan og
indsprøjtes i kolonnen.
Hensættes til bundfældning. Fuldstændig bundfældning foretages ved
hjælp af en el-vibrator for at opnå større homogenitet. 30 ml n-hexan
filtreres for at fjerne eventuelle urenheder.
5.1.2. Kolonnekromatografi
Der afvejes nøjagtig 500 mg af prøven i en 25 ml kolbe og tilsættes en
passende mængde intern standard afhængig af det skønnede voksind-
hold, f.eks. tilsættes 0,1 mg laurylarachidat til presset olivenolie og
0,25-0,5 mg til ekstraheret olivenolie.
Den tilberedte prøve overføres til kromatografikolonnen, der er frem-
stillet efter 5.1.1, ved hjælp af to 2 ml portioner n-hexan.
Der aftappes opløsningsmiddel, indtil væskeoverfladen står 1 mm over
kolonnematerialet. Derefter startes elueringen. 140 ml af n-hexan/ethy-
letherblandingen opsamles i forholdet 99:1 med en hastighed på ca. 15
dråber pr. 10 sekunder (2,1 ml/minut).
Den derved fremkomne fraktion tørres i en rotationsfordamper, indtil
opløsningsmidlet næsten helt er forsvundet. De sidste 2 eller 3 ml
opløsningsmiddel fjernes ved hjælp af en svar nitrogenstrøm, og
derefter tilsættes 10 ml n-heptan.
5.2. Gaskromatografisk analyse5.2.1. Indledende procedure: konditionering af kolonnen5.2.1.1. Kolonnen påmonteres gaskromatografen, idet den ene ende forbindes
med injektionssystemet og den anden ende med detektoren.
Gaskromatografien kontrolleres (detektors og skrivers ydeevne osv.).
5.2.1.2. Hvis kolonnen benyttes for første gang, kan det anbefales at konditio-
nere den. En let strøm gas ledes gennem kolonnen, hvorefter
gaskromatografiapparaturet sættes i gng. Der opvarmes gradvis til
mindst 20 ºC over driftstemperaturen (anmærkning). Denne temperatur
holdes i mindst to timer, hvorefter apparaturet reguleres efter arbejdsbe-
tingelserne (gasstrømmen reguleres, der tændes for flammen, der
tilsluttes til den elektroniske skriver, kolonneovnens temperatur regu-
leres, detektoren reguleres osv.). Signalet registreres med en følsomhed
på mindst det dobbelte af den, der kræves for at foretage analysen.
Basislinjen bør være lineær uden nogen form for toppe og må ikke
udvise nogen forstyrrelser.
En negativ retlinjet forstyrrelse tyder på, at kolonnen ikke er korrekt
forbundet. En positiv forstyrrelse er tegn på, at kolonnen ikke er blevet
ordentligt konditioneret.
Anmærkning: Konditioneringstemperaturen skal altid holdes mindst 20
ºC under den maksimumstemperatur, der er angivet for
den anvendte eluent.
5.2.2. Valg af arbejdsbetingelser
5.2.2.1. Arbejdsbetingelserne er normalt som følger:
— kolonnetemperatur: 80 ºC til at begynde med stigende med 30 ºC/
minut til 120 ºC med derpå følgende programmering til en stigning
på 5 ºC/minut op til 340 ºC
— detektortempertur: 350 ºC— bæregassens lineære hastighed: hydrogen, 20-35 cm/sekund— instrumentfølsomhed: 4-16 gange minimumsdæmpningsindstillingen— skriverens følsomhed: 1-2 mV fra skalaens nederste ende— papirhastighed: 30 cm/time— indsprøjtet mængde: 0,5-1 µl opløsningsmiddel.
Disse betingelser kan ændres, så de passer til kolonnens og gaskromato-
grafiapparaturets karakteristika (for at opnå kromatogrammer, der
opfylder følgende betingelser: retentionstiden for C
32intern standard
skal være 25 ± 2 minutter, og voksernes mest repræsentative top skal
ligge mellem 60 og 100 % fra skalaens nederste ende).1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 14
▼M6
5.2.2.2. Parametrene for toppenes integration bestemmes på en sådan måde, at
der opnås en korrekt evaluering af toppenes arealer.
5.2.3. Analyseprocedure
5.2.3.1. 1 µl af opløsningsmidlet opsuges med 10 µl mikrosprøjten. Stemplet
trækkes tilbage, indtil nålen er tom. Nålen indføres i injektionssystemet,og der indsrøjtes hurtigt efter 1-2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder
trækkes nålen forsigtigt ud.
5.2.3.2. Registreringen fortsætter, indtil alle vokserne er helt eluerede.
Basislinjen skal altid opfylde de fastsatte betingelser (5.2.1.2).
5.2.4. Identifikation af toppene
Toppene identificeres ud fra retentionstiderne, idet de sammenlignes
med blandinger af vokser med kendte retentionstider analyseret under
samme betingelser.
Figur 1 viser et vokskromatogram af jomfruolivenolie.
5.2.5. Kvantitativ analyse5.2.5.1. Toppenes arealer svarende til den interne standard og de alifatiske
estere fra C
40til C46bestemmes ved hjælp af integratoren.
5.2.5.2. Voksindholdet i hver af esterne bestemmes i mg/kg fedtstof efter
formlen:
ester (mg/kg) =Ax·ms·►M91 000◄
As·m
hvor:
Ax= er arealet svarende til toppen for hver enkelt ester
As= er arealet svarende til laurylarachidattoppen
ms= er massen af det tilsatte laurylarachidat i milligram
m = er massen af den prøve, der er udtaget til analyse, i gram.
6. FORMULERING AF RESULTATERNE
De forskellige voksindhold og summen af disse indhold angives i mg/
kg fedtstof.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 15
▼M6
APPENDIKS
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
1-3µl methan (propan) indsprøjtes i gaskromatografiapparaturet, efter at det er
tilpasset de normale arbejdsbetingelser. Den tid, som det tager gassen af
strømme gennem kolonnen, fra det øjeblik den indsprøjtes, til toppen viser sig,
måles (tM).
Den lineære hastighed i cm/sek. udtrykkes ved formlen L/tM, hvor L er kolon-
nens længde icm og tM ti den målt isekunder.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 16
▼M61991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 17
▼B
BILAG V
BESTEMMELSE AF SAMMENSÆTNINGEN OG INDHOLDET AF
STEROLER VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARSØJLE
1. OMRÅDE
Metoden beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af indholdet af
de enkelte steroler og det samlede sterolindhold i fedtstoffer.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffer, med α-cholestanol tilsat som en intern standard, forsæbes
med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de bestanddele, der ikke
kan forsæbes, ekstraheres derefter med diethylether.
Sterolfraktionen adskilles fra ekstrakten af stoffer, som ikke kan
forsæbes, ved kromatografi på en basisk kiselgelplade. De steroler,
som genvindes fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og
analyseres ved hjælp af gaskromatografipå kapi llarsøjle.
3. APPARATUR
3.1. 250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glas-
slib.
3.2. 500 ml skilletragte.3.3. 250 ml kolber.3.4. Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm
glasplader.
3.5. Ultraviolet lampe med en bølgelængde på 366 eller 254 nm.3.6. 100 µl og 500 µl mikrosprøjter.3.7. En cylindrisk filtertragt med et G3 porøst septum (porøsitet 15—40 µm),
med en diameter på ca. 2 cm og en dybde på ca. 5 cm, med en befæ-
stelsesdel, der er egnet til filtrering under vakuum, og en samlingsdel
med et 12/21 udvendig konisk glasslib.
3.8. En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendig konisk glasslib,
som filtertragten (3.7) kan monteres på.
3.9. Et 10 ml prøverør med konisk bund og tætsluttende prop.3.10. En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsøjle, forsynet
med et spaltningssystem, der består af:
3.10.1. Et termostatkammer til søjler, som kan opretholde den ønskede tempe-
ratur med en nøjagtighed på ± 1º C.
3.10.2. En inddampningsenhed med temperaturindstilling, med et fordamp-
ningselement af silanglas.
3.10.3. En flammeioniserings-detektor og en omformer-forstærker.3.10.4. En integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-
forstærkeren (3.10.3), og som har en svartid på ikke over ét sekund og
variabel papirhastighed.
3.11. En kapillarsøjle af glas eller kvartsglas, med en længde på 20—30 m,
en indre diameter på 0,25—0,32 mm, helt overtrukket med SE-52 eller
SE-54 væske eller tilsvarende i en ensartet tykkelse på mellem 0,10 og
0,30 µm.
3.12. En 10 µl gaskromatografi-mikrosprøjte med hærdet kanyle.
4. REAGENSER
4.1. Kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanolopløsning. 130 g kaliumhydroxid
(minimum titer 85 %) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling,
og der fyldes op med ethanol til 1 liter. Opløsningen opbevares i veltil-
proppede, mørke glasflasker.
4.2. Diethylether, analyseren.4.3. Vandfrit natriumsulfat, analyserent.4.4. Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescensindikator,
tykkelse 0,25 mm (kan fås brugsfærdige i handelen).1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 18
▼B
4.5. Kaliumhydroxid, 0,2 N, i ethanolopløsning. 13 g kaliumhydroxid
opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter.
4.6. Benzen, til kromatografi (5.2.2).4.7. Acetone, til kromatografi (5.2.2).4.8. Hexan, til kromatografi (5.2.2).4.9. Diethylether, til kromatografi (5.2.2).
4.10. Chloroform, analyseren.
4.11. Referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phyto-
steroler, ►
M62%◄opløsning i chloroform.
4.12. 2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk
ved tilsætning af nogle få dråber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidopløs-
ning.
4.13. Vandfri pyridin til kromatografi.
4.14. Hexamethyldisilazan.4.15. Trimethylchlorsilan.4.16. Referenceopløsninger af sterol-trimethylsilylethere (TMSE). Friskfrem-
stillet ud fra rene steroler eller blandinger af steroler udvundet af
sterolholdige olier.
4.17. α-cholestanol, 0,2 % opløsning (m/v) i chloroform (intern standard).
4.18. Bæregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren.4.19. Hjælpegasser:
— Hydrogen, gaskromatografiren
— Luft, gaskromatografiren.
5. FREMGANGSMÅDE5.1.Forberedelse af de ikke-forsæbelige stoffer
5.1.1. Et rumfang 0,2 % α-cholestanolopløsning i chloroform (4.17), der inde-
holder en mængde α-cholestanol svarende til ca. 10 % af
sterolindholdet i den del af prøven, der er taget ud til bestemmelsen,indføres i 250 ml kolben ved hjælp af 500 µl mikrosprøjten. F.eks.
sættes til 5 g af prøven 500 µl 0,2 % α-cholestanolopløsning, hvis
undersøgelsen gælder olivenolie, og 1 500 µl, hvis det gælder
►
M6 ◄olie fra olivenpresserester.
Prøven inddampes til tørhed i en nitrogenstrøm, hvorefter 5 g af den
tørrede, filtrerede prøve afvejes nøjagtigt og overføres til den samme
kolbe.
►M6 ◄Olier►M6 ◄, der indeholder
betydelige mængder cholesterol, kan vise en top, der har den samme
retentionstid som α-cholestanol. Hvis det forekommer, må sterolfrakti-
onen analyseres to gange med og uden intern standard ►M6eller der
anvendes betulinol i stedet for cholestanol ◄.
5.1.2. 50 ml 2 N kaliumhydroxid i ethanolopløsning tilsættes, refluxsvaleren
påsættes, og væsken opvarmes til svag kogning på vandbad under
vedvarende, kraftig omrøring, indtil forsæbningen sker (opløsningen
bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter, derefter
tilsættes 50 ml destilleret vand fra den øverste del af svaleren, svaleren
tages af, og kolben afkøles til ca. 30º C.
5.1.3. Kolbens indhold overføres kvantitativt til en 500 ml skilletragt, idet der
skylles flere gange med destilleret vand, ialt ca. 50 ml. Ca. 80 ml
diethylether tilsættes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og får
lov til at henstå (note 1).
Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt.
Yderligere to ekstraktioner foretages på den vandige fase på samme
måde, idet der bruges 60—70 ml diethylether hver gang.
Note 1: Eventuel emulsion kan ødelægges ved tilsætning af små
mængder ethyl- eller methylalkohol ved hjælp af en spray.
5.1.4. Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destil-
leret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral
reaktion.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 19
▼B
Når vaskevandet er fjernet, tørres ekstrakterne med vandfrit natrium-
sulfat og filtreres på vandfrit natriumsulfat ned i en på forhånd vejet
250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder diethylether.
5.1.5. Etheren destilleres ned til nogle få ml og bringes derefter til tørhed
under et let undertryk eller i en nitrogenstrøm, tørres fuldstændigt i en
ovn ved 100º C i ca. 15 minutter, og vejes så efter afkøling i en ekssik-
kator.
5.2.Separation af sterolfraktionen
5.2.1. Forberedelse af de basiske plader. Kiselgelpladerne (4.4) nedsænkes
fuldstændig i 0,2 N opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol (4.5) i 10
sekunder. Derefter får de lov at tørre i et stinkskab i 2 timer og sættes
til sidst i en ovn ved 100º C i 1 time.
Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssik-
kator, til de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal
anvendes inden 15 dage).
Note 2: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere sterolfrakti-
onen, er det ikke, nødvendigt at behandle de ikke-forsæbelige
stoffer med aluminiumoxid. På denne måde holdes alle sure
forbindelser (fede syrer og andre) tilbage på basislinien, og
sterolbåndet er klar adskilt fra de alifatiske og triterpene alko-
holers bånd.
5.2.2. En 95:5 (v/v) benzen/acetoneblanding anbringes i kromatografika-
mmeret til en højde på ca. 1 cm. Som et alternativ kan en 65:35 (v/v)
hexan/diethyletherblanding bruges. Kammeret lukkes med det dertil
passende dæksel og efterlades således ica. en halv ti me, så at der
opnås ligevægt mellem væske og damp. Strimler af filtrerpapir, der
dypper ned i eluenten, kan anbringes på kammerets indre overflader.
Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet
og regelmæssig eluering af komponenterne.
Note 3: Kromatografiblandingen bør udskiftes for hver test for at opnå
fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser.
5.2.3. Man tilbereder en ca. 5 % opløsning af de ikke-forsæbelige stoffer
(5.1.5) ichloroform. Med 100 µl mi krosprøjten afsætter man på en
kromatografiplade (5.2.1) med 0,3 ml, ca. 2 cm fra den ene ende, en
streg, som er så tynd og ensartet som muligt. På linie med stregen
placeres 2—3 µl af sterol-referenceopløsningen (4.11) i den ene ende
af pladen, så sterolbåndet kan identificeres efter eluering.
5.2.4. Pladen anbringes i kromatografikammeret, som er forberedt som
angivet i 5.2.2. Den omgivende temperatur bør holdes mellem 15 og
20º C. Kammeret lukkes straks med dækslet, og det får lov til at eluere,
indtil opløsningsmidlets forkant når ca. 1 cm fra pladens øverste kant.
Derpå fjernes pladen fra kromatografikammeret, og man lader opløs-
ningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen
stå en kort tid i et stinkskab.
5.2.5. Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluorosceinopløsningen.
Når pladen observeres under ultraviolet lys, kan sterolbåndet identifi-
ceres ved, at det bringes på linie med den plet, der er opnået fra
referenceopløsningen. Båndets grænser langs fluoroscenses kanter
markeres med en sort blyant.
5.2.6. Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede område.
Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten
(3.7). 10 ml varm chloroform tilsættes, man blander omhyggeligt med
metalspatelen og filtrerer under vakuum; filtratet opsamles i den
koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten.
Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether
(ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er
forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af
4—5 ml, den tilbageværende opløsning overføres til det på forhånd
vejede 10 ml prøverør (3.9), det inddampes til tørhed med let opvarm-
ning i en blød strøm af nitrogen, der fyldes atter op med nogle få dråber
acetone, der inddampes igen til tørhed, røret placeres i en ovn ved 105º
C ica. 10 mi nutter, derefter lader man det svale af ien ekssi kkator og
vejer det.
Den rest, der findes i prøverøret, består af sterolfraktionen.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 20
▼B
5.3.Forberedelse af trimethylsilyletherne
5.3.1. Til prøverøret, der indeholder sterolfraktionen, sættes silyleringsrea-
genset, der består af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-
disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 4), i forholdet 50 µl for hvert milli-
gram sterol, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 5).
Note 4: Brugsfærdige opløsninger kan fås i handelen. Man kan også få
andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-
acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med
et lige så stort rumfang vandfrit pyridin.
5.3.2. Prøverøret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i
vejret på det), indtil sterolerne er fuldstændig opløst. Man lader det stå
i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det så i nogle
få minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse.
Note 5: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver
ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller
fremkommer en lyserød farve, er det et tegn på tilstedeværelsen
af fugt eller svækkelse af reagensen. Hvis det forekommer, må
prøven gentages.
5.4.Gaskromatografisk analyse
5.4.1. Forberedende operationer, pakning af søjlen
5.4.1.1. Søjlen monteres i gaskromatografen, idet indløbsenden forbindes med
fordamperen, der står i forbindelse med spaltningssystemet, og udløb-
senden forbindes med detektoren.
Man foretager en generel kontrol af gaskromatografen (lækager fra
gaskredsløbene, detektorens effektivitet, spaltningssystemets og regi-
streringssystemets effektivitet osv.)
5.4.1.2. Hvis søjlen skal bruges for første gang, anbefales det, at den underka-
stes en konditionering. Man lader en svag gasstrøm passere gennem
søjlen og tænder så for gaskromatografienheden, derefter begynder
man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20º C over driftstem-
peraturen (note 6). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer,
derefter sættes hele enheden i driftstilstand (justering af gasstrømme
og spaltning, antændelse af flammen, forbindelse til den elektroniske
skriver, justering af søjlekammeret, detektorens og injektorens tempe-
ratur osv.), og derefter optegens signalet med en følsomhed, der er
mindst to gange større end den, man agter at anvende til analysen.
Basisliniens forløb skal være lige, uden toppe af nogen art, og den må
ikke glide.
Negativ glidning af en lige linie tyder på lækage fra søjlens forbin-
delser, positiv glidning tyder på utilstrækkelig konditionering af søjlen.
Note 6: Konditioneringstemperaturen skal altid være mindst 20º C
lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den
anvendte stationære fase.
5.4.2. Valg af driftsbetingelser5.4.2.1. De anbefalede driftsbetingelser er som følger:
— søjletemperatur: 260º C ± 5º C
— fordampertemperatur: 280º C
— detektortemperatur: 290º C— bæregassens lineære hastighed: helium 20—35 cm/s, hydrogen
30—50 cm/s
— spaltningsforhold: fra 1:50 til 1:100
— instrumentets følsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale dæmpning
— registreringsfølsomhed: 1—2 mV fuld skala
— papirhastighed: 30—60 cm/time
— mængde stof injiceret: 0,5—1µl TMSE-opløsning.
Disse betingelser kan varieres i lyset af søjlens og gaskromatografens
egenskaber, så man opnår kromatogrammer, der opfylder følgende krav:
— retentionstiden for β-sitosterol bør være 20 ± 5 minutter
— campesteroltoppen bør være: for olivenolie (gennemsnitsindhold
3 %) 15 ± 5 % af hel skala; for soyaolie (gennemsnitsindhold
20 %) 80 ± 10 % af hel skala
— alle tilstedeværende steroler skal adskilles. Desuden skal toppene
også være fuldstændig opløst, dvs. hver tops spor skal gå tilbage til
basislinien, før sporet går op til den næste top. Ufuldstændig opløs-1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 21
▼B
ning kan dog tolereres, såfremt toppen ved TRR (relativ retenti-
onstid) 1,02 kan bestemmes kvantitativt ved brug af den vinkelrette
linie.
5.4.3. Analytisk fremgangsmåde
5.4.3.1. Med 10 µl mikrosprøjten optages 1 µl hexan, derefter trækkes først
0,5 µl luft og derefter 0,5—1 µl af prøveopløsningen op. Stemplet
trækkes højere op, så kanylen tømmes. Kanylen trykkes gennem injek-
tionsenhedens membran, og efter 1—2 sekunder injiceres hurtigt,
derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder.
5.4.3.2. Optegnelsen fortsættes, indtil de tilstedeværende sterolers TMSE er
fuldstændig elueret.
Basislinien skal til stadighed opfylde kravene (5.4.1.2).
5.4.4. Identifikation af toppene
De enkelte toppe identificeres på basis af retentionstiderne og ved
sammenligning med blandinger af sterol-TMSE, der er analyseret under
de samme betingelser.
Sterolerne elueres ifølgende rækkefølge: cholesterol, brassi casterol, 24-
methylencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, ∆-7-
campesterol, ∆-5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol,
∆-5-avenasterol, ∆-5,24-stigmastadienol, ∆-7-stigmastenol, ∆-7-avena-
sterol.
Retentionstiderne for β-sitosterol for SE 52 og SE 54 søjler er vist i
tabel 1.
Figur 1 og 2 illustrerer typiske kromatogrammer for nogle olier.
5.4.5. Kvantitativ vurdering
5.4.5.1. Arealerne for α-cholestanol- og steroltoppene beregnes ved hjælp af den
integrerende tæller. Der ses bort fra toppene for eventuelle forbindelser,
der ikke er blandt dem, der er opregnet i tabel 1.
5.4.5.2. Koncentrationen af hver enkelt sterol beregnes i mg/100 g fedtstof som
følger:
sterol x =Ax·ms· 100
As·m
hvor:
Ax= toparealet for sterol x ►M6 ◄
As= arealet af α-cholestanoltoppen ►M6 ◄
ms= massen af tilsat α-cholestanol i milligram
m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.
6. RAPPORTERING AF RESULTATERNE
6.1. De individuelle sterolkoncentrationer angives som mg/100 g fedtstof og
deres sum som »total sterolmængde«.
6.2. Den procentvise andel af de individuelle steroler beregnes på grundlag
af forholdet mellem arealet af den tilsvarende top og summen af area-
lerne af sterolernes toppe.
% sterol x =Ax× 100
ΣA
hvor:
Ax= arealet af top x
ΣA = summen af arealerne af alle toppe.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 22
▼B
APPENDIX
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1—3 µl
methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere
gennem søjlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen frem-
kommer (tM).
Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde icm,
og tMer den målte tid i sekunder.
Tabel 1
Relative retentionstider for steroler
T-
opIdentifikationRelativ retentionstid
SE 54
søjleSE 52
søjle
1 cholesterol ∆-5-cholesten-3- β-ol 0,67 0,63
2 cholestanol 5- α-cholestan-3- β-ol 0,68 0,64
3 brassicasterol [24S]-24-methyl- ∆-5,22-cholestadien-3- β-
ol0,73 0,71
4 24-methylen-cholesterol 24-methylen- ∆-5,24-cholestadien-3- β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-methyl- ∆-5-cholesten-3- β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-methyl-cholestan-3- β-ol 0,85 0,82
7 stigmasterol [24S]-24-ethyl- ∆-5,22-cholestadien-3- β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-campesterol [24R]-24-methyl- ∆-7-cholesten-3- β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl- ∆-5,23-cholestadien-3- β-
ol0,95 0,95
10 chlerosterol [24S]-24-ethyl- ∆-5,25-cholastadien-3- β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-ethyl- ∆-5-cholestan-3- β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-ethyl-cholestan-3- β-ol 1,02 1,02
13 ∆-5-avenasterol [24Z]-24-ethyliden- ∆-5-cholesten-3- β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl- ∆-5,24-cholestadien-3- β-
ol1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenol [24R,S]-24-ethyl- ∆-7,24-cholestadien-3- β-
ol1,12 1,12
16 ∆-7-avenasterol [24Z]-24-ethyliden- ∆-7-cholesten-3- β-ol 1,16 1,161991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 23
▼B
Figur 1
Gaskromatogram af sterolfraktionen af en uraffineret olivenolie
1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 24
▼B
Figur 2
Gaskromatogram af sterolfraktionen af en raffineret olivenolie
1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 25
▼B
BILAG VI
BESTEMMELSE AF ERYTHRODIOL OG UVAOL
INDLEDNING
Erythrodiol (almindeligvis forstået som totalindholdet af diolerne erythro-
diol og uvaol) er en uforsæbelig bestanddel, som er karakteristisk for
visse arter af fedtstoffer. Den findes i betydeligt højere koncentration i
ekstraheret olivenolie end i de andre olier, som den findes i (presset
olivenolie, vindruekerneolie), hvorfor bestemmelsen heraf kan anvendes
til at konstatere tilstedeværelsen af ekstraheret olivenolie.
1. FORMÅL
At beskrive fremgangsmåden til bestemmelse af erythrodiol i fedtstoffer.
2. PRINCIP
Fedtstoffer forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de ufor-
sæbelige bestanddele ekstraheres derefter med diethylether og renses på
en kolonne af aluminiumoxid.
De uforsæbelige bestanddele fraktioneres ved tyndtlagskromatografi på
kiselgel, hvorved båndet med sterolfraktionen adskilles fra båndet med
erythrodiolfraktionen.
Sterolfraktionen og erythrodiolfraktionen fra pladen omdannes til trime-
thylsilylethere, hvorefter blandingen analyseres ved gaskromatografi.
Resultatet angives i procent erythrodiol i forhold til det samlede indhold
af erythrodiol plus steroler.
3. APPARATUR
3.1. Det apparatur, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolind-
holdet).
4. REAGENSER
4.1. De reagenser, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolind-
holdet).
4.2. Referenceopløsning af erythrodiol, 0,5 % opløsning i chloroform.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1.Femstilling af de uforsæbelige stoffer
Der gås frem som beskrevet iafsni t 5.1.2 ibi lag V.
5.2.Separation af erythrodiol og steroler
5.2.1. Se afsnit 5.2.1 i bilag V.5.2.2. Se afsnit 5.2.2 i bilag V.
5.2.3. Der fremstilles en 5 % opløsning i chloroform af de uforsæbelige stoffer.
Med en mikrosprøjte på 100 µl anbringes på en kromatografiplade ca.
1,5 cm fra den nederste kant 0,3 ml af denne opløsning i en streg, der
er så tynd og ensartet som muligt. På den ene ende af pladen anbringes
som reference nogle mikroliter af opløsningen af cholesterol og erythro-
diol.
5.2.4. Pladen anbringes i kromatografikarret, der er klargjort som angivet i 5.2.2
i bilag V. Den omgivende temperatur holdes på ca. 20º C. Karret lukkes
straks, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra
pladens øverste kant. Derpå fjernes pladen fra kromatografikarret, og
man lader opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft.
5.2.5. Pladen sprøjtes ensartet med en alkoholopløsning af 2,7-dichlorfluore-
scein. Når pladen observeres under ultraviolet lys, fremstår sterol- og
erythrodiolbåndene ud for pletterne fra referenceopløsningen, og de
afmærkes med et punkt lidt uden for det fluorescerende bånds kanter.
5.2.6. Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det
afskrabede materiale fra pladen overføres til en kolbe på 50 ml. Der1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 26
▼B
tilsættes 15 ml varm chloroform, omrystes omhyggeligt og filtreres på
glasfilter, idet siliagelen overføres til selve filteret. Der vaskes tre gange
med 10 ml portioner varm chloroform, idet filtratet opsamles i en rund-
bundet kolbe på 100 ml. Filtratet inddampes til et rumfang på 4—5 ml og
overføres til et tareret spidsbundet centrifugeglas på 10 ml, og der
inddampes til tørhed under let opvarmning i en svag strøm af nitrogen,
hvorefter der vejes.
5.3.Forberedelse af trimethylsilyletherne (TMSE)
Der gås frem som beskrevet iafsni t 5.3 ibi lag V.
5.4.Gaskromatografi
Der gås frem som beskrevet iafsni t 5.4 ibi lag V.
Arbejdsbetingelserne for gaskromatograferingen skal vælges således, at
de udover at opfylde kravene for analyse af sterolerne også fører til sepa-
ration af TMSE af erythrodiol og uvaol.
Efter injektion af prøven lader man skriveren køre indtil alle tilstedevæ-
rende steroler, erythrodiol og uvaol er elueret. Derefter identificeres
toppene (erythrodiol og uvaol har i forhold til β-sitosterol en relativ
retentionstid på henholdsvis ca. 1,45 og 1,55), og arealerne beregnes
som angivet for sterolerne.
6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Erythrodiol % =A1+A2
A1+A2+ΣAsteroler× 100
hvor:
A1= toparealet for erythrodiol ►M6 ◄
A2= toparealet for uvaol ►M6 ◄
ΣAsteroler= summen af arealerne for de tilstedeværende steroler
►M6 ◄
Resultatet angives med én decimal.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 27
▼B
BILAG VII
BESTEMMELSE AF FEDTSYRER I 2-POSITIONEN I TRIGLY-
CERIDER FRA OLIER OG FEDTSTOFFER
1. OMFANG
I denne standard beskrives en metode til bestemmelse af sammensæt-
ningen af den del af fedtsyrerne i en olie eller et fedtstof, som er
forestret til glycerolens 2-position.
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder som følge af pankreas-lipases særlige virkning
anvendelse på olie og fedtstoffer med et smeltepunkt på under 45º C.
Den kan ikke uden videre anvendes på olier og fedtstoffer, der indeholder
betydelige mængder fedtsyrer med 12 eller færre kulstofatomer (kokos- og
palmekerneolie, smørfedt), stærkt umættede fedtsyrer (med mere end fire
dobbeltbindinger), med 20 eller flere kulstofatomer (fiskeolie og marine
olier) eller fedtsyrer indeholdende andre oxygenerede grupper end syre-
gruppen.
3. PRINCIP
Eventuel neutralisering af sure olier og fedtstoffer i opløsning. Rensning
på kolonne af aluminiumoxid. Delvis hydrolyse af triglycerider ved hjælp
af pankreas-lipase inden for et bestemt tidsrum. Separation af de dannede
monoglycerider ved tyndtlagskromatografi og methanolyse af disse mono-
glycerider. Analyse af methylesterne ved gas/væskekromatografi.
4. APPARATUR
4.1. 100 ml rundbundet kolbe.4.2. 25 ml rundbundet kolbe med slib.4.3. 1 m lang svaler, som passer til kolben 4.2.4.4. 250 ml Erlenmeyer-kolbe.4.5. 50 ml bægerglas.4.6. 500 ml skilletragt.4.7. Kromatografisøjle af glas, 13 mm indvendig diameter og 400 mm lang,
forsynet med glasfilter og hane.
4.8. 10 ml centrifugeglas med slibprop.4.9. 5 ml burette med 0,05 ml inddelinger.4.10. 1 ml injektionssprøjte med tynd kanyle.4.11. Mikrosprøjte, som kan levere dråber på 3—4 µl.4.12. Udstrygningsapparat til tyndtlagskromatografi.4.13. Glasplader til tyndtlagskromatografi, 20 × 20 cm.4.14. Elueringskar til tyndtlagskromatografi med slebet glaslåg egnet til
20 × 20 cm plader.
4.15. Spray til tyndtlagskromatografi.4.16. Ovn indstillet til 103 ± 2º C.4.17. Termostat, som mellem 30 og 45º C kan reguleres med en nøjagtighed på
0,5º C.
4.18. Rotationsfordamper.4.19. Elektrisk rysteapparat, som muliggør en kraftig omrystning af centrifuge-
glasset.
4.20. UV-lampe til undersøgelse af tyndtlagsplader.
Til kontrol af lipaseaktiviteten:
4.21. pH-meter.4.22. Spiralomrører.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 28
▼B
4.23. 5 ml burette.
4.24. Stopur.
For eventuel fremstilling af lipase:
4.25. Laboratorieomrører, egnet til dispergering og blanding af heterogene
materialer.
5. REAGENSER
5.1. n-hexan, eller imangel heraf petroleumsether (kogepunkt 30—50º C),
kromatografikvalitet.
5.2. 2-propanol eller ethanol 95 % (v/v), analyseren kvalitet.5.3. 2-propanol eller ethanol, 1:1 vandig opløsning.5.4. Diethylether, peroxidfri.
5.5. Acetone.
5.6. Myresyre, mindst 98 % (m/m).5.7. Elueringsopløsning: blanding af n-hexan (5.1), diethylether (5.4) og myre-
syre (5.6) iforholdet 70/30/1 (v/v/v).
5.8. Aktiveret aluminiumoxid til kromatografi, neutral, Brockmann I.5.9. Silicapulver med bindemiddel, af egnet kvalitet til tyndtlagskromatografi.5.10. Pankreas-lipase af egnet kvalitet (note 1, note 2).5.11. Natriumhydroxid, vandig opløsning med 120 g/l.5.12. Saltsyre, 6 N vandig opløsning.
5.13. Calciumchlorid (CaCl
2), vandig opløsning med 220 g/l.
5.14. Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig opløsning med 1 g/l.5.15. Bufferopløsning: pH af en 1 M vandig opløsning af trishydroxymethyla-
minomethan bringes op på 8 ved tilsætning af saltsyre (5.12)
(kontrolleres med potentiometer).
5.16. Phenolphthalein, opløsning med 10 g/l i 95 % (v/v) ethanol.5.17. 2,7-dichlorfluorescein, opløsning med 2 g/l i 95 % (v/v) ethanol, gjort
svagt alkalisk ved tilsætning af 1 dråbe 1 N natriumhydroxidopløsning
pr. 100 ml.
Til kontrol af lipase-aktiviteten:
5.18. Neutraliseret olie.5.19. Natriumhydroxid, 0,1 N vandig opløsning.5.20. Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig opløsning med 200 g/l.5.21. Gummi arabicum, vandig opløsning med 100 g/l.
6. PRØVEFORBEREDELSE
Hvis prøvens syreindhold er under 3 %, bestemt efter bilag II, renses den
direkte på aluminiumoxid som beskrevet under 6.2.
Er syreindholdet i prøven over 3 %, bestemt efter bilag II, neutraliseres
der med alkali ved tilstedeværelse af et opløsningsmiddel som beskrevet
under 6.1, efterfulgt af passage over aluminiumoxid som beskrevet under
6.2.
6.1.Neutralisering med alkali ved tilstedeværelse af opløsningsmiddel.
Der anbringes ca. 10 g af den rå olie i en skilletragt (4.6), hvorefter der
tilsættes 100 ml hexan (5.1), 50 ml 2-propanol (5.2), nogle få dråber
phenolphthaleinopløsning (5.16) og en mængde natriumhydroxidopløsning
(5.11) svarende til den frie syremængde i olien, plus 0,3 % i overskud.
Der omrystes kraftigt i 1 min., tilsættes 50 ml destilleret vand og omrystes
igen, hvorefter man lader opløsningen stå og bundfælde.
Efter separation fjernes sæbelaget på bunden, ligesom eventuelle
mellemlag (slim, uopløseligt stof) fjernes. Hexanopløsningen af den
neutraliserede olie vaskes i flere omgange med 2-propanolopløsning (5.3)1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 29
▼B
i portioner på 25—30 ml, indtil phenolphthaleinets lyserøde farve forsv-
inder.
Det meste af hexanen fjernes ved destillation under vakuum i rotationsfor-
damperen (4.18), hvorefter olien tørres ved 30—40º C under vakuum ved
hjælp af en strøm af ren nitrogen, indtil hexanen er fjernet fuldstændigt.
6.2.Rensning på aluminiumoxid
15 g aktiveret aluminiumoxid (5.8) opslæmmes i 50 ml hexan (5.1), og
suspensionen hældes i kromatografisøjlen (4.7) under omrøring. Man lader
aluminumoxidet bundfælde sig og lader opløsningsmidlets niveau falde til
1—2 mm over adsorbenten. Derefter hældes forsigt en opløsning af 5 g
oli e i25 ml hexan (5.1) på søjlen, og hele eluatet opsamles ien rund-
bundet kolbe (4.1).
7. FREMSTILLING AF KROMATOGRAFIPLADER
Glaspladerne (4.13) renses grundigt med ethanol, petroleumsether og
acetone, så alle spor af fedtstof fjernes.
I en Erlenmeyer-kolbe (4.4) anbringes 30 g silicapulver (5.9), og der
tilsættes 60 ml destilleret vand. Derefter tilproppes kolben og rystes kraf-
tigt i 1 min., hvorefter opslæmningen omgående overføres til
udstrygningsapparatet (4.12), og de rene plader belægges med et 0,25 mm
tykt lag.
Pladerne lufttørres i15 mi n. og derefter i1 ti me iovnen (4.16) ved
103 ± 2º C. Pladerne afkøles til stuetemperatur i ekssikkator før brug.
Færdigfremstillede plader fås i handelen.
8. FREMGANGSMÅDE
8.1.Hydrolyse med pankreas-lipase
I centrifugeglasset (4.8) afvejes ca. 0,1 g af den forberedte prøve. Hvis
prøven består af flydende olie, gås direkte frem som beskrevet nedenfor.
Består den af fast fedt, opløses den i0,2 ml hexan, om nødvendi gt under
forsigtig opvarmning.
Der tilsættes 20 mg lipase (5.10) og 2 ml bufferopløsning (5.15). Der
omrystes forsigtigt men omhyggeligt og tilsættes 0,5 ml natriumcholato-
pløsning (5.14) og 0,2 ml calciumchloridopløsning (5.13). Glasset lukkes
med slibprop, rystes forsigtigt (undgå at fugte proppen) og anbringes
derefter omgående itermostaten (4.17), som holdes på en temperatur på
40 ± 0,5º C, og rystes ihånden inøjagti gt 1 mi n.
Glasset fjernes fra termostaten og omrystes kraftigt ved hjælp af rysteap-
paratet (4.19) i nøjagtigt 2 min.
Derefter køles omgående i rindende vand. Så tilsættes 1 ml saltsyre (5.12)
og 1 ml diethylether (5.4). Glasset tilproppes, og der blandes grundigt ved
hjælp af det elektriske rysteapparat. Derefter lader man glasset henstå og
fjerner det organiske lag ved hjælp af sprøjten (4.10), om nødvendigt efter
centrifugering.
8.2.Separation af monoglyceriderne ved tyndtlagskromatografi
Ekstraktet anbringes på kromotografipladen med mikrosprøjten (4.11) ca.
1,5 cm fra den nederste kant i en tynd ensartet linje så smal som mulig.
Pladen anbringes i det godt mættede elueringskar (4.14), og der elueres
med elueringsvæsken (5.7) ved ca. 20º C op til ca. 1 cm fra pladens
øverste kant.
Pladen lufttørres ved karrets temperatur og sprøjtes med 2,7-dichlorfluore-
sceinopløsning (5.17). Monoglyceridbåndet identificeres (Rf ca. 0,035)
under ultraviolet lys (4.20).
8.3.Analyse af monoglyceriderne ved gas/væskekromatografi
Det under 8.2 fremkomne bånd fjernes ved hjælp af en spatel (undgå at
fjerne restbestanddele på basislinjen) og overføres til methyleringskolben
(4.2).
Det afskrabede silica behandles nøjagtigt som beskrevet i bilag X B, så
monoglyceriderne omdannes til methylestere, hvorefter esterne undersøges
ved gaskromatografisom beskrevet ibi lag X A.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 30
▼B
9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Sammensætningen af fedtsyrer i 2-positionen beregnes med én decimals
nøjagtighed (note 3).
10. NOTER
Note 1: Test for lipaseaktivitet
I en passende mixer tilberedes en olieemulsion ved omrøring af
en blanding af 165 ml gummi arabicum-opløsning (5.21), 15 g
knust is og 20 ml neutraliseret olie (5.18).
10 ml af denne emulsion hældes i et bærgerglas (4.5), efterfulgt
af 0,3 ml natriumcholatopløsning (5.20) og 20 ml destilleret vand.
Bægerglasset sættes i en termostat, der er indstillet til 37 ± 0,5º C
(note 4), og elektroderne til et pH-meter (4.21) og en omrører
(4.22) nedsænkes ibægerglasset.
Med en burette (4.23) tilsættes dråbevis natriumhydroxidopløs-
ning (5.19), indtil der er opnået et pH på 8,5.
Der tilsættes en tilstrækkelig mængde vandig suspension af lipase
(se nedenfor). Så snart pH-meteret viser en pH-værdi på 8,3,
startes stopuret (4.24), og der tilsættes dråbevis natriumhydroxi-
dopløsning (5.19) med en sådan hastighed, at pH holdes fast på
8,3. Den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning aflæses
hvert minut.
De aflæste værdier afsættes i et diagram med tiden som abscisse
og den mængde alkaliopløsning, der kræves til fastholdelse af en
konstant pH-værdi, som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje.
Den ovenfor omtalte lipasesuspension er en 1 ‰ (m/m) suspen-
sion i vand. Til hver test bør der anvendes tilstrækkeligt af
denne suspension til, at der forbruges ca. 1 ml natriumhydroxido-
pløsning på 4 — 5 min. Almindeligvis er der brug for 1 — 5 mg
pulver.
Lipaseenheden er defineret som den mængde enzym, der frigør
10 µ-ækvivalenter syre pr. minut. Aktiviteten A af det anvendte
pulver, målt ili paseenheder pr. mg, beregnes efter formlen:
A¼V/C210
m
hvor:
V = antal ml natriumhydroxidopløsning (5.19) forbrugt pr.
minut, beregnet ud fra diagrammet
m = lipasetestportionens masse i mg.
Note 2: Fremstilling af lipase
Lipaser med tilfredstillende lipaseaktivitet kan fås i handelen,
men de kan også fremstilles i laboratoriet på følgende måde: 5 kg
frisk svinepankreas afkøles til 0º C. Alt omgivende fedt og
bindevæv fjernes, og pankreasvævet finddeles i en blender, indtil
der opnås en flydende pasta. Denne omrøres med omrøreren
(4.25) i 4 — 6 timer med 2,5 l vandfri acetone og centrifugeres
derefter. Bundfaldet ekstraheres yderligere tre gange med den
samme mængde acetone, derefter to gange med en blanding af
lige dele acetone og diethylether (v/v) og til sidst to gange med
diethylether.
Efter tørring af bundfaldet i vakuum i 48 timer opnås et stabilt
pulver, som bør opbevares ikøleskab.
Note 3: I alle tilfælde tilrådes det at bestemme sammensætningen af
prøvens samlede indhold af fedtsyrer, eftersom sammenligningen
med sammensætningen af syrer i 2-positionen vil hjælpe med ved
fortolkningen af de fundne data.
Note 4: Hydrolysetemperaturen er fastsat til 37º C, eftersom der anvendes
en flydende olie. Den er dog fastsat til 40º C for analyseprøven,
så der bliver mulighed for at undersøge fedtstoffer med smelte-
punkter på op til 45º C.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 31
▼B
BILAG VIII
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF TRILINOLEIN
1. OMFANG
Bestemmelse af sammensætningen af triglycerider i flydende vegetabilske
olier, udtrykt ved deres ævivalente kulstoftal, ved højtryks væskekromato-
grafi.
I denne standard beskrives en metode til separation og kvantitativ bestem-
melse af triglyceridsammensætningen af vegetabilske olier, udtrykt ved
deres molekylvægt og grad af umættethed som funktion af deres ækviva-
lente kulstoftal (note 1).
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder anvendelse på alle vegetabilske olier indeholdende
triglycerider af langkædede fedtsyrer. Metoden er specielt anvendelig til
påvisning af små mængder ikke-tørrende (linolsyreholdige) olier i de vege-
tabilske olier, hvor oliesyre er den fremherskende umættede festsyrer,
såsom olivenolie.
3. PRINCIP
Separation af triglycerider efter deres ækvivalente kulstoftal ved højt
ydende væskekromatografi(med omvendt fase) og tolkni ng af kromato-
grammerne.
4. APPARATUR
4.1. Højtydende væskekromatograf med mulighed for termostatisk kontrol af
kolonnetemperaturen.
4.2. Injektionsenhed for portioner på 10 µl.4.3. Detektor: differentialrefraktometer. Følsomheden bør være mindst 10
−4af
fuldt udslag.
4.4. Kolonne: rør af rustfrit stål, længde 250 mm og indvendig diameter 4,5 mm,
fyldt med silicapartikler med en diameter på 5 µm og med 22—23 %
kulstof iform af octadecylsi lan (note 2).
4.5. Skriver og/eller integrator.
5. REAGENSER
Reagenserne skal være af analysekvalitet. Elueringsvæskerne skal være
afluftede og kan recirkuleres adskillige gange uden indflydelse på separa-
tionerne.
5.1. Chloroform.
5.2. Acetone.
5.3. Acetonitril.5.4. Elueringsvæske: acetonitril + acetone (i et indbyrdes forhold, som fører til
den ønskede separation; der begyndes med en blanding i forholdet 50:50).
5.5. Opløsningsmiddel for analyseprøven: acetone eller en blanding af acetone/
chloroform iforholdet 1:1.
5.6. Referencetriglycerider: enten anvendes glycerider, som fås i handelen
(tripalmitin, triolein osv.), hvis retentionstider afsættes mod det ækvivalente
kulstoftal, eller der anvendes et referencekromatogram af soyaolie (se note
3 og 4 og figur 1 og 2).
6. PRØVEFORBEREDELSE
Der fremstilles en 5 % opløsning af de prøver, der skal analyseres, ved, at
der afvejes 0,5 ± 0,001 g af prøven ien 10 ml målekolbe, hvorefter der
fyldes op til 10 ml med opløsningsmiddel for analyseprøven (5.5).
7. FREMGANGSMÅDE
7.1. Kromatografisystemet gøres klar, og der pumpes elueringsvæske (5.4)
igennem med en hastighed af 1,5 ml/min. til rensning af hele systemet.
Der ventes, indtil basislinjen er blevet stabil.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 32
▼B
Derefter indsprøjtes 10 µl af prøven forberedt som under (6).
8. BEREGNING OG ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Der anvendes intern standard, dvs. at summen af toparealerne svarende til
de forskellige triglycerider sættes lig med 100 %. Den procentvise andel af
hvert triglycerid beregnes efter formlen:
% triglycerid =topareal
summen af alle toparealer× 100
idet resultatet angives med én decimal.
Note 1: Elueringsrækkefølgen kan bestemmes ved beregning af de ækviva-
lente kulstoftal, ofte defineret ved udtrykket ECN = CN − 2n, hvor
CN er kulstoftallet, og n er antallet af dobbeltbindinger. Det kan
beregnes mere nøjagtigt, hvis der tages hensyn til dobbelbindin-
gens oprindelse. Hvis no,nlog nlnantallet af dobbeltbindinger i
henholdsvis olie-, linol- og linolensyre, kan det ækvivalente
kulstoftal beregnes efter formlen:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln
hvor koefficienterne do,dlog dlnkan beregnes ved hjælp af referen-
cetriglyceriderne. Under de betingelser, der er specificeret ved
denne metode, vil resultatet ligge tæt ved
ECN = CN − [2,60 no] − [2,35 nl] − [2,17 nln]
Note 2: Eksempler: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 eller
lignende.
Note 3: Med adskillige referencetriglycerider er det også muligt at beregne
opløsningsevnen med hensyn til triolein,
α=RT′
RT′olein
ved hjælp af den reducerede retentionstid RT ′=R T−R Topløsnings-
middel
Ud fra en afbildning af log αmod f (antal dobbeltbindinger) kan
retentionsværdierne for alle de triglycerider af fedtsyrer, som
findes i referenctriglyceriderne, bestemmes — se figur 2.
Note 4: Kolonnen skal være så effektiv, at toppene af LLL (trilinolein)
adskilles helt fra toppene af triglyceriderne med næsten samme
retentionstid.
Note 5: For bomolie og rå olie af olivenpresserester er det for at opnå en
tilfredsstillende separation mellem toppen for trilinolein og nabo-
toppene eller interferende stoffer nødvendigt forud at rense olien
efter følgende metode:
200µl olie absorberes uden fortynding på en siliciumkolonne til
fast stof/væske-ekstraktion (af typen SEP PAK silica cartridge-
waters part. nr. 51900).
Triglyceriderne elueres med 20 ml vandfrit hexan til HPLC i højst
20 sekunder.
Det eluerede produkt tørres ien ni trogenstrøm og genopløses i
isopropanol eller acetone (5 ml). Der injiceres 10-20 µl iHPLC.
Det må kontrolleres, at oliens fedtsyreindhold er det samme før
og efter rensningen inden for den fejlmargin, analysemetoden
tillader.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 33
▼M11
▼B
Figur 1
Kromatogram af en prøve af soyaolie
P: palmitinsyre; St: stearinsyre; O: oliesyre; L: linolsyre; Ln: linolensyre.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 34
▼B
Figur 2
Afbildning af log αmod f (antal dobbeltbindinger)
La: laurinsyre; My: myristinsyre; P: palmitinsyre; St: stearinsyre; O: olie-
syre; L: linolsyre; Ln: linolensyre.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 35
▼B
BILAG IX
SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSØGELSE VED ULTRAVIOLET
LYS
INDLEDNING
Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys kan give oplysninger
om et fedtstofs kvalitet, dets konserveringstilstand og om forandringer i
det, frembragt ved teknologiske processer.
Absorptionen ved de bølgelængder, der er specificeret i metoden, skyldes
tilstedeværelsen af konjugerede dien- og triensystemer. Disse absorptioner
er udtrykt som specifikke ekstinktioner E 1 % 1 cm (ekstinktionen for en
1 % opløsning af fedtstoffet i det angivne opløsningsmiddel i et 1 cm tykt
væskelag), sædvanligvis betegnet ved K, (også kaldet ekstinktionskoeffi-
cienten).
1. OMRÅDE
Metoden beskriver fremgangsmåden til udførelse af en spektrofotometrisk
undersøgelse af fedtstoffer ved ultraviolet lys.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffet opløses i det specificerede opløsningsmiddel, og opløsningens
ekstinktion bestemmes så ved de fastsatte bølgelængder i forhold til rent
opløsningsmiddel. De specifikke ekstinktioner beregnes ud fra aflæsnin-
gerne på spektrofotometeret.
3. APPARATUR
3.1. Et spektrofotometer til måling af ekstinktion i ultraviolet lys mellem 220
og 360 nm, med mulighed for aflæsning ved hver hele nanometer.
3.2. Firkantede kvartskuvetter med låg, med en optisk vejlængde på 1 cm. Når
kuvetterne er fyldt med vand eller et andet passende opløsningsmiddel, bør
der ikke være forskelle på mere end 0,01 ekstinktionsenheder mellem dem.
3.3. 25 ml målekolber.
3.4. En kromatografisøjle, hvis øverste del er 270 mm lang med en diameter på
35 mm, og hvis nederste del er 270 ml lang med en diameter på 10 mm.
4. REAGENSER
4.1. Isooctan (2,2,4-trimethylpentan) af spektrofotometrikvalitet med en trans-
mittans på ikke mindre end 60 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 %
ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller
— cyclohexan af spektrofotometrikvalitet med en transmittans på ikke
mindre end 40 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i
forhold til destilleret vand.
4.2. Basisk aluminiumoxid til søjlekromatografi, tilberedt og kontrolleret som
beskrevet iappendi x 1.
4.3. n-hexan til kromatografi.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Prøven skal være fuldstændig homogen og fri for urenheder i suspension.
Olier, som er flydende ved stuetemperatur, filtreres på papir ved en tempe-
ratur på ca. 30º C; faste fedtstoffer homogeniseres og filtreres ved entemperatur på højst 10º C over smeltepunktet.
5.2. Ca. 0,25 g af den således forberedte prøve afvejes nøjagtigt i en 25 ml
målekolbe, der fyldes op til mærket med det angivne opløsningsmiddel,
og opløsningen homogeniseres. Den fremkomne opløsning skal være fuld-
stændig klar. I modsat fald filtreres hurtigt på papir.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 36
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3. En kuvette fyldes med opløsningen, og ekstinktionerne måles ved en
passende bølgelængde mellem 232 og 276 nm med opløsningsmiddel som
reference.
De aflæste ekstinktionsværdier skal ligge inden for området 0,1—0,8. Gør
de ikke det, gentages målingerne, idet der benyttes mere koncentrerede
eller mere fortyndede opløsninger.
5.4. Når bestemmelse af en specifik ekstinktion skal ske efter passage over
aluminiumoxid, går man frem på følgende måde: 30 g basisk aluminium-
oxid opslæmmet i hexan hældes på kromatografisøjlen. Efter at
adsorbenten har bundfældet sig, tappes den overskydende hexan af, indtil
overfladen er ca. 1 cm over aluminiumoxidet.
10 g af fedtstoffet, homogeniseret og filtreret som beskrevet (5.1), opløses i
100 ml hexan, og opløsningen hældes på søjlen. Eluatet opsamles, og alt
opløsningsmiddel dampes af under vakuum ved en temperatur under 25º C.
Man går straks videre som beskrevet i (5.2) med dette fedtstof.
6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
6.1. Man opgiver den specifikke ekstinktion (ekstinktionskoefficient) ved de
forskellige bølgelængder, som beregnes efter:
Kλ¼Eλ
c/C2s
hvor:
Kλ= den specifikke ekstinktion ved bølgelængden λ
Eλ= den ekstinktion, der er målt ved bølgelængden λ
c = opløsningens koncentration i g/100 mls = kuvettens tykkelse icm.
Resultaterne angives med to decimaler.
6.2. Spektrofotometrisk analyse af olivenolie i henhold til den officielle metode,
der er angivet i EF-forordningerne, kræver bestemmelse af den specifikke
ekstinktion i isooctanopløsning ved bølgelængderne 232 og 270 nm samt
bestemmelse af ∆K, som er givet ved:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
hvor Kmer den specifikke ekstinktion ved bølgelængden m, den bølge-
længde på ca. 270 nm der giver maksimal absorption.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 37
▼B
APPENDIX I
Tilberedning af aluminiumoxidet og kontrol af dets aktivitet
A 1.1. Tilberedning af aluminiumoxidet
Aluminiumoxid, som på forhånd er tørret i en ovn ved 380—400º C i 3
timer, anbringes i en beholder, der kan lukkes hermetisk, hvorefter der
tilsættes 5 ml destilleret vand pr. 100 g aluminiumoxid, og beholderen
lukkes øjeblikkeligt. Den rystes flere gange og får så lov til at stå i
mindst 12 timer før brugen.
A 1.2. Kontrol af aluminiumoxidets aktivitet
En kromatografisøjle med 30 g aluminiumoxid klargøres. Efter frem-
gangsmåden i afsnit (5.4) lader man en blanding, der består af:
— 95 % jomfruolie med en specifik ekstinktion på under 0,18 ved
268 nm
— 5 % jordnødolie, der er behandlet med blegejord ved raffineringen,
og som har en specifik ekstinktion på ikke under 4 ved 268 nm,
passere gennem søjlen.
Hvis blandingen efter passage gennem søjlen har en specifik ekstinktion
på over 0,11 ved 268 nm, er aluminiumoxidet acceptabelt; hvis ikke må
hydratiseringsgraden øges.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 38
▼B
APPENDIX II
Kalibrering af spektrofotometeret
A 2. Udstyret skal kontrolleres med regelmæssige mellemrum (mindst hver
sjette måned), både for korrekt bølgelængde og for udslagets nøjag-
tighed.
A 2.1. Bølgelængden kan kontrolleres ved hjælp af en kviksølvlampe eller med
egnede filtre.
A 2.2. Ved kontrol af fotocellens og fotomultiplikatorrørets respons går man
frem på følgende måde: 0,2 g ren kaliumchromat til spektrofotometri
afvejes og opløses i 0,05 N kaliumhydroxidopløsning i en 1 000 ml
målekolbe, og der fyldes op til mærket. Man overfører præcis 25 ml af
denne opløsning til en 500 ml målekolbe og fortynder op til mærket med
den samme kaliumhydroxidopløsning.
Derefter måler man denne opløsnings ekstinktion ved 275 nm med
kaliumhydroxidopløsningen som reference. Den målte ekstinktion med
en 1 cm kuvette skal være 0,200 ± 0,005.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 39
▼B
BILAG X A
GASKROMATOGRAFERING AF FEDTSYREMETHYLESTERE
1. FORMÅL
Denne standard giver generelle retninglinjer for gaskromatografisk
bestemmelse med pakket kolonne eller kapillarkolonne af den kvalita-
tive og kvantitative sammensætning af en blanding af
fedtsyremethylestere fremstillet i henhold til bilag X B.
Metoden gælder ikke for polymeriserede fedtsyrer.
2. REAGENSER2.1.Bæregas
Inaktiv gas (nitrogen, helium, argon, hydrogen etc.) vel tørret og inde-
holdende mindre end 10 mg oxygen/kg.
Note 1: Hydrogen, der kun benyttes som bæregas, når det gælder kapil-
larkolonner, gør det muligt at foretage analysen dobbelt så
hurtigt, men indebærer en risiko. Der forefindes sikkerhedsan-
ordninger.
2.2.Hjælpegasser
2.2.1. Hydrogen (renhedsgrad ≥99,9 %), frifor organi ske urenheder.
2.2.2. Luft eller oxygen, frifor organi ske urenheder.
2.3.Referencestandard
En methylesterblanding af rene fedtsyrer eller methylesterne af et fedt-
stof, der så vidt muligt har samme sammensætning som det fedtstof, der
skal analyseres.
Iltning af polyumættende fedtsyrer må undgås.
3. APPARATUR
Instruktionerne angår det sædvanlige udstyr til gaskromatografering
med pakket kolonne og/eller kapillarkolonne og flammeionisationsde-
tektor. Alt udstyr, som kan give den i 4.1.2. definerede ydeevne og
opløsning, kan anvendes.
3.1.Gaskromatograf
Gaskromatografen skal omfatte følgende elementer:
3.1.1. Injektionssystem
Der benyttes enten et injektionssystem
a) med pakkede kolonner med det mindst mulige dødvolumen (i dette
tilfælde skal injektionssystemet kunne opvarmes til en temperatur,
som er 20—50º C højere end kolonnens) eller
b) med kapillarkolonner, hvor injektionssystemet skal være specielt
udformet til anvendelse med sådanne kolonner. Injektoren kan være
med eller uden split.
Note 2: Er der ikke tale om fedtsyrer med mindre end 16 kulstofa-
tomer, kan der benyttes injektor med faldende nål (moving
needle injector).
3.1.2. Ovn
Ovnen skal være i stand til at opvarme kolonnen til en temperatur på
mindst 260º C og holde den valgte temperatur inden for 1º C, når der
er tale om en kapillarkolonne. Det sidste krav er særlig vigtigt, da der
benyttes et rør af sintret kvarts.
Det anbefales ialle ti lfælde at anvende temperaturprogrammeret
opvarmning, navnlig til fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 40
▼B
3.1.3. Pakket kolonne
3.1.3.1. Kolonnen skal være kontrueret af et materiale, som er inaktivt i forhold
til de stoffer, der skal analyseres (dsv. glas eller rustfrit stål), af
følgende dimensioner:
a) Længde: 1—3 m. En relativt kort kolonne anvendes ved tilstedevæ-
relse af langkædede fedtsyrer (over C20). Ved analyse af syrer med 4
eller 6 kulstofatomer anbefales det at anvende en kolonne på 2 m.
b) Indre diameter: 2—4 mm.
Note 3: Ved tilstedeværelse af polyumætterde forbindelser med mere
end tre dobbeltbindinger er der risiko for, at de nedbrydes i en
kolonne af rustfrit stål.
Note 4: Der kan anvendes et system med to pakkede kolonner.
3.1.3.2. Fyldmateriale bestående af følgende elementer:
a)Bærer: kiselgur, syrevasket og silanbehandlet, eller andet egnet
inaktivt bæremateriale med et snævert kornstørrelsesinterval (25 µm
i området 125 µm—200 µm), idet middelværdien vælges efter
kolonnens indre diameter og længde.
b)Stationær fase: polær væske af polyestertype (f.eks. diethylenglycol-
polysuccinat, butandiolpolysuccinat, ethylenglycolpolyadipat mv.),
cyanosiliconer eller enhver anden væske, der giver den krævede
kromatografiske adskillelse (4). Den stationær fase bør udgøre 5 %
(m/m)—20 % (m/m) af fyldmaterialet. En ikke-polær fase kan
anvendes til visse adskillelser.
3.1.3.3. Konditionering af kolonnen
Efter at kolonnen om muligt er adskilt fra detektoren, opvarmes ovnen
gradvis til 185º C, og en strøm af inaktiv gas ledes gennem den netop
fremstillede kolonne med en hastighed på 20—60 ml/min. i mindst 16
timer ved denne temperatur og derpå i 2 timer ved 195º C.
3.1.4. Kapillarkolonne
3.1.4.1. Røret skal være af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer,
der skal analyseres (normalt glas eller sintret kvarts). Den indre
diameter skal være på mellem 0,2 mm og 0,8 mm. Den indvendige
overflade skal undergå en passende behandling (f.eks. forbehandling,
deaktivering), inden den stationære fasebelægning påføres. En længde
på 25 m er tilstrækkelig i de fleste tilfælde.
3.1.4.2. Stationær fase: normalt af typen polyglycol [poly(ethylenglycol)
20 000], polyester (butandiolpolysuccinat) eller polær polysiloxan
(cyanosiliconer). Bundne (tværbundne) kolonner er velegnede.
Note 5: Der er risiko for, at polære polysiloxaner gør det vanskeligt at
identificere og adskille linolensyre og C20syrer.
Belægningerne skal være tynde, dvs. 0,1 µm—0,2 µm.
3.1.4.3. Samling og konditionering af kolonnen
Der træffes de normale forholdsregler ved samlingen af kapillarko-
lonner, dvs. placering af kolonnen i ovnen (bærer), valg og montering
af samlinger (tæthed), anbringelse af kolonnens ender i injektoren og
detektoren (reduktion af dødvolumener). Kolonnen anbringes under enstrøm af bæregas (f.eks. 0,3 bar (30 kPa) for en kolonne med en længde
på 25 m og en indre diameter på 0,3 mm).
Kolonnen konditioneres ved temperaturprogrammering af ovnen ved 3º
C/min. fra den omgivende temperatur til en temperatur på 10º C under
den stationære fases dekomponeringsgrænse. Ovnen holdes på denne
temperatur i 1 time, indtil basislinjen har stabiliseret sig. Den genind-
stilles på 180º C, så der opnås isotermiske betingelser.
Note 6: Korrekt prækonditionerede kolonner fås i handelen.
3.1.5. Detektoren skal helst kunne opvarmes til en temperatur, som er højere
end ovnens.
3.2.Injektionssprøjte
Injektionssprøjten skal have en maksimumskapacitet på 10 µl med 0,1 µl
inddelinger.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 41
▼B
3.3.Skriver
Hvis den optegnede kurve skal anvendes til at beregne sammensæt-
ningen af den analyserede blanding, skal skriveren være et meget
præcist elektronisk instrument, som er foreneligt med det anvendte
apparatur. Skriveren skal have følgende specifikationer:
a) responstid mindre end 1,5 sek. og helst 1 sek. (responstiden er den
tid, der forløber, fra skriveren modtager et pludseligt signal på
100 %, og indtil den giver et udslag på 90 %)
b) papirbredde: minimum 20 cm
c) papirhastighed: regulerbar fra 0,4—2,5 cm/min.
3.4.Integrator
Anvendelse af elektronisk integrator giver en hurtig og præcis bereg-
ning. Den skal give et lineært udslag med tilstrækkelig følsomhed, og
korrektionen for forstyrrelser på basislinjen skal være tilfredsstillende.
4. FREMGANGSMÅDE
4.1 til 4.3 angår anvendelse af en flammeionisationsdetektor.Alternativt kan anvendes en gaskromatograf med katarometerdetektor
(registrerer ændringer af varmeledningsevne). I så fald ændres arbejds-
betingelserne som angivet i 6.
4.1.Prøvebetingelser
4.1.1. Bestemmelse af de optimale arbejdsbetingelser4.1.1.1. Pakket kolonne
Følgende variabler indgår i valget af arbejdsbetingelser:
a) kolonnes længde og diameter
b) den stationære fases art og mængde
c) kolonnens temperatur
d) bæregassens hastighed
e) den ønskede opløsning
f) prøvens størrelse valgt på en sådan måde, at detektoren og elektro-
metret i forening giver et lineært udslag
g) analysetiden.
Almindeligvis vil værdierne i tabel 1 og tabel 2 give de ønskede resul-
tater, dvs. for methylstearat mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m
kolonnelængde og en elueringstid på ca. 15 min.
Hvis apparaturet gør det muligt, skal injektoren have en temperatur på
omkring 200º C og detektoren en temperatur, som er lig med eller
højere end kolonnes.
Forholdet mellem hydrogenstrømmen til flammeionisationsdetektoren
og bæregassens hastighed ligger normalt på 1:2 til 1:1 alt efter kolon-
nens diameter. Oxygenstrømmen er ca. 5—10 gange større end
hydrogenstrømmen.
Tabel 1
Kolonnes indre diameter
mmBæregassens hastighed
ml/min.
2 15—25
3 20—40
4 40—60
Tabel 2
Den stationære fases koncentration
% (m/m)Kolonnens temperatur
ºC
5 175
10 1801991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 42
▼B
Den stationære fases koncentration
% (m/m)Kolonnens temperatur
ºC
15 185
20 185
4.1.1.2. Kapillarkolone
Kapillarkolonnens ydeevne og permabilitet er ensbetydende med, at
adskillelsen mellem bestanddelene og analysetiden stort set afhænger
af bæregassens hastighed i kolonnen. Det vil derfor være nødvendigt
at skabe de bedst mulige driftsbetingelser ved ad følge dette parameter
(eller blot rette sig efter kolonnens tryktab) alt efter, om man ønsker at
opnå bedre adskillelser eller foretage en hurtig analyse.
4.1.2. Bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og
opløsning
(Se figur 1).
Analysen gennemføres med en blanding af methylstearat og methyloleat
inogenlunde li ge store mængder (f.eks. methylestere af kakaosmør).
Kolonnens temperatur og bæregassens hastighed vælges således, at
methylstearattoppens maksimum resistreres ca. 15 min. efter opløs-
ningsmiddeltoppen. Der anvendes en tilstrækkelig mængde af
methylesterblandingen til, at methylstearattoppen svarer til ca. ¾af
fuldt udslag.
Antallet af teoretiske bunde, n (ydeevne), beregnes ud fra formelen:
n¼16/C2dω
ω1/C20/C21
2
og opløsningen, R, ud fra formelen:
R¼2/C2∆
ω1þω2
hvor
dω= retentionsafstanden i mm målt fra kromatogrammets start
til det relative maksimum for methylstearattoppen
ω1ogω2= methylstearat- og methylolealtoppenes bredde imm målt
mellem basislinjens skæringspunkter med kurvens vende-
tangenter
∆ = afstanden imm mellem methylstearat- og methylolea-
ttoppenes maksima
og opløsningsindekset Ir ud fra formlen
a
b
hvor
a = højden af den mindste top målt i forhold til basislinjen
b = højden af det laveste punkt iområdet mellem to toppe ved si den
af hinanden målt i forhold til basislinjen.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 43
▼M2
▼B
Figur 1
Kromatogramtil bestemmelse afantallet af teoretiske bunde (ydeevne) ogopløs-
ning
Betingelserne vælges således, at de for methylstearat giver mindst 2 000teoretiske bunde pr. m kolonnelængde og en opløsning på mindst 1,25.
4.2.Prøve
Med injektionssprøjten (3.2) udtages 0,1—2 µl af methylesteropløs-
ningen, der er fremstillet i henhold til bilag X B, og indsprøjtes i
kolonnen.
Når det gælder ikke opløste estere, fremstilles i heptan til kromatografi
en opløsning på 100 mg/ml, og 0,1—1 µl af denne opløsning
indsprøjtes.
Ved analyse af bestanddele, der kun er til stede som spor, kan prøveud-
tagningen forøges (op til ti gange).
4.3.Analyse
Normalt vil driftsbetingelserne være de samme som dem, der er fastlagt
i(4.1.1).
Det er dog muligt at arbejde med en lavere kolonnetemperatur, når fedt-
syrer med mindre end 12 kulstofatomer skal bestemmes, eller en højere
temperatur, når fedtsyrer med mere end 20 kulstofatomer skal
bestemmes. Det et muligt at anvende temperaturprogrammering i begge
tilfælde. Hvis prøven f.eks. indeholder fedtsyremethylestere med mindre
end 12 kulstofatomer, indsprøjtes prøven ved 100º C (eller 50—60º C,
hvis der er smørsyre til stede), hvorefter temperaturen straks øges med
4—8º C/min, indtil den optimale temperatur nås. I visse tilfælde kan de
to fremgangsmåder kombineres.
Efter den programmerede opvarmning fortsættes elueringen ved
konstant temperatur, indtil alle bestanddelene er elueret. Hvis apparatet
ikke arbejder med programmeret opvarmning, arbejdes der med to faste
temperaturer mellem 100º C og 195º C.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 44
▼B
Om nødvendigt anbefales det at foretage en analyse på to stationære
faser med forskellig polaritet for at sikre sig, at der ikke forekommer
maskerede toppe, hvilket kan være tilfældet ved samtidig tilstedevæ-
relse af C18:3og C20:0eller af C18:3og C18:2konjugeret.
4.4.Udarbejdelse af referencekromatogrammet og referencedia-
grammer
Referencestandardblandingen (2.3) analyseres under de samme driftsbe-
tingelser som for prøvens vedkommende, og retentionstiderne eller
retentionsafstandene for de tilstedeværende fedtsyrer måles. På semilo-
garitmisk papir afbildes logaritmen til retentionstiden eller -afstanden
mod antallet af kulstofatomer for alle grader af umættethed; under
isotermiske betingelser skal de punkter, der repræsenterer ligekædede
syrer med samme umættethedsgrad, ligge på rette linjer, der er nogen-
lunde parallelle.
Det er nødvendigt at undgå betingelser, hvor der fremkommer »maske-
rede toppe«, dvs. hvor opløsningen er utilstrækkelig til at adskille to
bestanddele.
5. ANGIVELSE AF RESULTATER5.1.Kvalitativ analyse
Prøvens methylestertoppe identificeres ud fra diagrammerne, der er
udarbejdet i 4.4, om nødvendigt ved interpolation.
5.2.Kvantitativ analyse
5.2.1. Bestemmelse af sammensætningen
Bortset fra undtagelsestilfælde anvendes den interne normaliseringsme-
tode, dvs. det forudsættes, at samtlige bestanddele i prøven er
repræsenteret på kromatogrammet, således at toppenes samlede areal
udgør 100 % af bestanddelene (total eluering).
Hvis apparaturet omfatter en integrator, anvendes resultaterne fra denne.
Hvis ikke, bestemmer man arealet af hver enkelt top ved at multipliceretoppens høje med dens bredde ihalv højde og tager igi vet fald hensyn
til de forsekllige dæmpningsindstillinger under registreringen.
5.2.2. Beregningsmetode5.2.2.1. Generelt
Indholdet af en given bestanddel i, udtrykt i vægtprocent methylestere,
beregnes ved, at man bestemmer den procentdel, som den tilsvarende
top udgør i forhold til summen af arealerne af samtlige toppe, ud fra
følgende formel:
Ai
Σν
ιΑ/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
Σν
ιΑ= summen af arealerne af samtlige toppe.
Resultatet anføres med en decimal.
Note 7: I dette generelle tilfælde betragtes resultatet af beregningen,
som er baseret på relative arealer, som en vægtprocent. I de
tilfælde, hvor man ikke kan arbejde med denne antagelse,
henvises til 5.2.2.2.
5.2.2.2. Anvendelse af korrektionsfaktorer
I visse tilfælde, f.eks. ved tilstedeværelse af fedtsyrer med mindre end
otte kulstofatomer eller syrer med andre funktionelle grupper, bør der,
når man anvender varmeledningsevnedetektorer, eller når den størst
mulige præcision er specielt påkrævet, anvendes korrektionsfaktorer
for at omsætte bestanddelenes procentvise toparealer til vægtprocent.
Korrektionsfaktorerne bestemmes ved hjælp af et kromatogram af en
referenceblanding af methylestere med kendt sammensætning under
samme betingelser som for prøvens vedkommende.
For denne referenceblanding udtrykkes vægtprocent bestanddel i ud fra
formlen1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 45
▼B
mi
Σν
ιµ/C2100
hvor
mi= massen af bestanddel iireferenceblandi ngen
Σν
ιµ= summen af masserne af referenceblandingens forskellige
bestanddele.
Ud fra referenceblandingens (4.4) kromatogram beregnes procentdelen
(areal/areal) af bestanddel isom følger:
Ai
Σν
ιΑ/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
Σν
ιΑ= summen af arealerne af samtlige toppe.
Korrektionsfaktoren beregnes derpå som:
Ki¼mi/C2Σν
ιΑ
Ai/C2Σν
ιµ
Almindeligvis sættes korrektionsfaktorerne i relation til KC16, så de rela-
tive faktorer bliver:
K0
i¼Ki
KC16
For prøven er mængden af hver bestanddel i, udtrykt i vægtprocent
methylestere,
K0
i/C2Ai
Σν
ιΚ0ι/C2Αι/C0/C1 /C2100
Resultatet anføres med en decimal.
5.2.2.3. Anvendelse af en intern standard
I forbindelse med visse analyser (f.eks. når det ikke er alle fedtsyrerne
der er elueret, som det er tilfældet, når syrer med 4 og 6 kulstofatomer
er til stede sammen med syrer med 16 og 18 kulstofatomer, eller når
det er nødvendigt at bestemme den absolutte mængde af en fedtsyre i
en prøve), er det nødvendigt at anvende en intern standard. Der benyttes
ofte fedtsyrer med 5, 15 eller 17 kulstofatomer. Den eventuelle korrek-
tionsfaktor for den interne standard bestemmes.
Vægtprocent bestanddele i, udtrykt som methylestere, betemmes ud fra
formlen
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
As= arealet af den top, der svarer til den interne standard
K′i= korrektionsfaktoren for bestanddel i (i forhold til KC16)
K′s= korrektionsfaktoren for den interne standard (i forhold til KC16)
m = massen img af prøvenm
s= massen img af den i nterne standard.
Resultaterne anføres med en decimal.
6. BESTEMMELSE AF TRANSISOMERER
Det er muligt at bestemme indholdet af transisomerer i fedtsyrer med et
antal kulstofatomer på mellem 10 og 24 ved adskillelse af methylestere
under anvendelse af en kromatograf med kapillarkolonne og særlig
polaritet.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 46
▼M2
▼M2
6.1. Kapillarkolonne af kvartsglas med en intern diameter på 0,25 mm -
0,32 mm og en længde på 50 m, dækket af cyanopropylsilicone i en
lagtykkelse på 0,1 - 0,3 µm (type SP 2340, type SP 2380 C.P. Sil 88,
Silor 10 og lignende).
6.2. Methylesterne fremstilles i overensstemmelse med metode B i bilag X
B. De fedtholdige stoffer med et indhold af frie syrer på over 3 % skal
på forhånd neutrali seres ioverensstemmelse med punkt 6.1 ibi lag VII.
6.3. De vilkår, hvorunder gaskromatograferingen skal finde sted, er:
— kolonnetemperatur programmeret til 150-230 ºC (f.eks. 165 ºC i 15
minutter, derefter en stigning på 5 ºC i minuttet indtil 200 ºC)
— injektorens temperatur: 250 ºC, hvis der anvendes splitting, eller
samme begyndelsestemperatur som kolonnen, hvis der anvendes
»on column«
— detektorens temperatur: 260 ºC— strømningshastighed for bæregassen (helium eller hydrogen): 1,2 ml/
minut.
Den injicerede mængde skal være sådan, at højden af den top, der svar-
er til methylesteren fra arachinsyre ved den anvendte følsomhed skal
være mindst 20 % af fuldt udslag.
6.4. Identifikationen af de enkelte methylestere sker på grundlag af retenti-
onstiderne, der sammenlignes med retentionstiderne for
referenceblandinger (som angivet i punkt 2.3).
Esterne fra transfedtsyrerne elueres før de tilsvarende cis-isomerer. Et
eksempel på kromatogram er anført ifi gur 2.
Figur 2
Gaskromatogram vedrørende bestemmelse af transisomerer i fedtsyrer med
kapillarkolonne
6.5. Kolonnens effektivitet som bestemt i overensstemmelse med punkt
4.1.2 skal muliggøre separation af visse kritiske par, f.eks. det par, der
består af transoliesyre og oliesyre, trans C18: 1/cis C18: 1, med et
opløsningsindeks på over 2.
6.6. Den procentvise andel af hver enkelt transfedtsyre beregnet på grundlag
af forholdet mellem arealet af den tilhørende top og summen af area-
lerne af alle tilstedeværende toppe.
De procentvise andele af følgende syrer tages i betragtning:
— trans-octadecensyre (T 18: 1), i bilag I til nærværende forordning
anført som isomerer af transoliesyrer
— cis-trans- og trans-cis-octadecadiensyre [(CT/TC) 8: 2], i bilag I til
nærværende forordning anført som isomerer af translinolsyre1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 47
▼M2
— trans-cis-trans-, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis-octadecatri-
ensyre [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], i bilag I til
nærværende forordning anført som isomerer af translinolensyre.
Note 8: På grund af denne metodes ganske særlige karakteristik, skal
resultatet angives med to decimaler.
►M27.◄SÆRLIGE TILFÆLDE — ANVENDELSE AF KATAROME-
TERDETEKTORER (REGISTRERER ÆNDRINGER AF
VARMELEDNINGSEVNE)
En gaskromatograf med detektor, der registrerer ændringer af varmeled-
ningsevne (et katarometer) kan også anvendes til bestemmelse af den
kvalitative og kvantitative sammensætning af en blanding af fedtsyre-
methylestere. I så fald ændres betingelserne i (3) og (4) som vist i
tabel 3.
Til kvantitativ analyse anvendes korrektionsfaktorerne i (5.2.2.2).
Tabel 3
Variabel Værdi/betingelse
Kolonne Længde: 2—4 m
Indre diameter: 4 mm
Bærer Kornstørrelse mellem 160 og
200 µm
Mængde stationær fase 15 % (m/m) — 25 % (m/m)
Bæregas Helium eller i mangel heraf
hydrogen med lavest mulige
indhold af oxygen
Hjælpegasser Ingen
Indsprøjtningstemperatur 40—60 ºC højere end kolonnens
temperatur
Kolonnens temperatur 180—200 ºC
Bæregassens hastighed Normalt mellem 60 og 80 ml/
min.
Indsprøjtet prøvemængde Normalt mellem 0,5 og 2 µl
►M28.◄PRØVERAPPORT
Prøverapporten skal indeholde en beskrivelse af de metoder, der er
anvendt til fremstilling af methylesterne og til gaskromatograferingen,
samt de opnåede resultater. Den skal også indholde alle de enkeltheder,
der ikke er nævnt i denne standard, eller som betragtes om valgfri, samt
en redegørelse for eventuelle forhold, der kan have haft indflydelse på
resultaterne.
Rapporten skal indeholde alle oplysninger, der er nødvendige for en
nøjagtig identifikation af prøven.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 48
▼B
▼B
BILAG X B
FREMSTILLING AF FEDTSYREMETHYLESTERE I OVERENSSTEM-
MELSE MED BILAG VI, PUNKT I OG II, TIL FORORDNING (EØF)
Nr. 72/77 ELLER I OVERENSSTEMMELSE MED DEN NEDENFOR
BESKREVNE METODE
FORORD
Metodevalget afhænger af det pågældende fedtstofs fedtsyresammensætning
og surhedsgrad og af gaskromatograferingen, der skal foretages.
Nærmere bestemt
— skal der anvendes forseglede glas eller dimethylsulfat til fedtstoffer, der
indeholder fedtsyrer med mindre end 12 kulstofatomer
— skal der anvendes methanolsaltsyre eller dimethylsulfat til fedtstoffer
med en surhedsgrad på over 3 %
— skal der anvendes natriummethylat eller dimethylsulfat til gaskromato-
grafering af transisomerer
— skal der anvendes methanol-hexan-svovlsyre til fremstilling af methyle-
stere af små mængder fedtstoffer, der er adskilt ved hjælp af
tyndtlagskromatografi.
Man kan se bort fra ikke-forsæbelige stoffer, hvis mængde ikke overstiger
3 %. I modsat fald må methylesterne fremstilles af fedtsyrerne.
1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE
Der beskrives fem metoder til fremstilling af methylestere af fedtstoffer:
A: med natriummethylat
B: med natriummethylat i et forseglet glas
C: med methanolsaltsyre iet forseglet glas
D: med dimethylsulfatE: med methanol-hexan-svovlsyre.
Metode A
2. PRINCIP
Fedtstoffet, der analyseres, opvarmes med tilbagesvaling med methanol og
natriummethylat. Methylesterne ekstraheres med ethylether.
3. APPARATUR
3.1. 100 ml slibekolbe med svaler med et natriumhydroxidrør i toppen.
3.2. 50 ml måleglas.
3.3. 5 ml målepipette med 0,1 ml inddeling.
3.4. 250 ml skilletragte.3.5. 200 ml kolbe.
4. REAGENSER
4.1. Vandfrit methanol.
4.2. En opløsning af ca. 1 % natriummethylat i methanol. Den fremstilles ved,
at 0,34 g natrium opløses i 100 ml vandfrit methanol.
4.3. Diethylether.
4.4. 10 % natriumchloridopløsning.
4.5. 40—60º C petroleumsether.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. I 100 ml kolben anbringes 2 g fedtstoffet, som først er blevet tørret over
natriumsulfat og filtreret. Der tilsættes 35 ml methanol, svaleren påsættes,
og blandingen koges med tilbagesvaling nogle få minutter.
5.2. Opvarmningen standses, svaleren fjernes, og der tilsættes hurtigt 3,5 ml
natriummethylatopløsning. Svaleren påsættes igen, og blandingen koges1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 49
▼B
med tilbagesvaling i mindst 3 timer. Methyleringen er komplet, når alt fedt-
stoffet er opløst, og reagensblandingen er helt klar ved stuetemperatur.
5.3. Reagensblandingen afkøles og hældes i en 250 ml skilletragt, der tilsættes
35—40 ml diethylether, 100 ml vand og 5—6 ml 10 % natriumchlorido-
pløsning. Blandingen omrystes og henstår, til lagene er adskilt. Den
vandige fase overføres til en anden skilletragt og ekstraheres på ny med
25 ml diethylether.
50 ml 40—60º C petroleumsether tilsættes de samlede etherekstrakter.
Vandet skilles da ud og kan fjernes.
Etherfasen skylles tre gange med 10—15 ml vand, tørres over natriumsulfat
og filtreres gennem papir, idet filtratet opsamles i 200 ml kolben.
Opløsningsmidlet destilleres, og processen afsluttes over et vandbad i en
strøm af rent nitrogen.
Metode B
2. PRINCIP
Fedtstoffet, der analyseres, behandles med natriummethylat i en methanolo-
pløsning i et forseglet glas ved 85—90º C.
3. APPARATUR
3.1. Et solidt glas til forsegling med en kapacitet på ca. 5 ml (højde 40—45 mm,
diameter 14—16 mm).
3.2. 1 ml målepipette med 0,1 ml inddeling.
4. REAGENSER
4.1. En opløsning på ca. 1,5 % natriummethylat i methanol. Den fremstilles
ved, at 0,50 g natrium opløses i 100 ml vandfrit methanol.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. I glasset anbringes 2 g af fedtstoffet, som først er blevet tørret over
natriumsulfat og filtreret. Der tilsættes 0,3 g (ca. 0,4 ml) natriummethylo-
pløsning, og glasset varmeforsegles.
5.2. Glasset neddyppes i2 ti mer ved 85—90º C. Det omrystes med mellemrum.
Esterificeringsprocessen er afsluttet, når glassets indhold er klart, efter at
glycerinet og reagensresterne har bundfældet sig.
5.3. Der afkøles til stuetemperatur. Glasset åbnes, når methylesterne skal
bruges. De kræver ikke yderligere behandling, før de indføres i gaskroma-
tografen.
Metode C
2. PRINCIP
Fedtstoffet, der analyseres, behandles med methanolsaltsyre iet forseglet
glas ved 100º C.
3. APPARATUR
3.1. Et solidt glas til forsegling med en kapacitet på ca. 5 ml (højde 40—45 mm,
diameter 14—16 mm).
3.2. 1 og 2 ml kalibrerede pipetter.
4. REAGENSER
4.1. En opløsning af saltsyre i 2 % methanol. Den fremstilles af chlorbrinte og
vandfrit methanol (note 1).
4.2. Hexan til gaskromatografering.
Note 1: Det er nemt at fremstille små mængder chlorbrinte i laboratoriet
ved simpel uddrivning fra handelsopløsningen (d = 1,18) ved
tildrypning af koncentreret svovlsyre (d = 1,84). Den frigjorte
chlorbrinte tørres nemt ved, at man lader den boble gennem
koncentreret svovlsyre. Da saltsyre meget hurtigt absorberes af
methanol, anbefales det at træffe de sædvanlige forholdsregler,
når man opløser den, f.eks. lede chlorbrinten igennem en lille
omvendt tragt, hvis rand lige netop rører væskens overflade. Store1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 50
▼B
mængder methanolsaltsyreopløsning kan fremstilles på forhånd, da
den holder sig fint i flasker, der er forsynet med glasprop og opbe-
vares imørke.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. I glasset anbringes 2 g fedtstoffet, som først er blevet tørret over natrium-
sulfat og filtreret, og 2 ml saltsyremethanolopløsning tilsættes. Glasset
varmeforsegles.
5.2. Glasset neddyppes ved 100º C i40 mi nutter.5.3. Glasset afkøles under rindende vand, åbnes, og 2 ml destilleret vand og 1 ml
hexan tilsættes. Blandingen centrifugeres, og hexanfasen, som er klar til
brug, fjernes.
Metode D
2. PRINCIP
Fedtstoffet, der analyseres, forsæbes med en opløsning af kaliumhydroxid i
methanol og behandles derpå med dimethylsulfat. Når der tilsættes saltsyre,
udskilles de methylestere, der har dannet sig, automatisk. Der opnås meget
rene methylestere ved efterfølgende behandling med aluminiumoxid.
3. APPARATUR
3.1. Et solidt reagensglas med en kapacitet på ca. 20 ml med 10/19 glasslib og
slibklemmer.
3.2. 5-kammersvalere med 10/19 glasslib.3.3. Sintrede glasfiltre, størrelse G 2, 20 mm diameter.
3.4. Spidsbundet reagensglas med en kapacitet på ca. 10 ml.
3.5. 1 ml og 5 ml sprøjter.
4. REAGENSER
4.1. Kaliumhydroxid, 10 % opløsning i methanol til gaskromatografering.4.2. Grøn bromkresolindikator, 0,50 % opløsning i methanol.
4.3. Dimethylsulfat (d = 1,335 ved 15º C).
4.4. Koncentreret saltsyre, d = 1,19, fortyndet iforholdet 1: 1 med methanol ti l
gaskromatografering.
4.5. Brockman aluminiumoxid til adsorbtionskromatografi.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. I 20 ml reagensglasset anbringes ca. 2,2 ml af fedtstoffet, som først er
blevet tørret over natriumsulfat og filtreret. Der tilsættes 5 ml kaliumhydro-
xidopløsning og nogle få kvartskorn for at kontrollere kogningen. Svaleren
påsættes, der opvarmes ved lavt blus i 5 minutter under omrystning.
Forsæbningen er afsluttet, når opløsningen er klar. Til slut afkøles under
rindende vand, og svaleren fjernes.
5.2. Der tilsættes 2 dråber af indikatoren og ved hjælp af en sprøjte langsomt
1 ml dimethylsulfat. Reagensglasset forsegles hermetisk og omrystes i
2—3 minutter, idet reagensglassets bund neddyppes i et kogende vandbad
med hyppige mellemrum. Reaktionen er afsluttet, når indikatoren skifter fra
blåt til gult. Til slut afkøles reagensglasset under rindende vand, der åbnes,
og der tilsættes 5 ml af saltsyre-methanolopløsningen.
5.3. Efter omrystning i nogle få sekunder sættes reagensglasset på skrå, og der
bankes let på det. Dette hjælper med at bringe methylesterne op til over-
fladen i form af en olieagtig masse (note 2).
Methylesterne fjernes med en sprøjte og anbringes i et spidsbundet reagens-
glas, der tilsættes en mængde aluminiumoxid svarende til ca. ¼ af
methylestermængden, omrystes og filtreres på filtrerpapir.
Note 2: Hvis methylesterne ikke udskiller sig spontant, tilsættes reagen-
sglasset 5 ml vand, og der omrystes.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 51
▼B
Metode E
2. PRINCIP
Fedtstoffet, der analyseres, opvarmes med tilbagesvaling med methanol-
hexan-svovlsyre. Methylesterne ekstraheres med petroleumsether.
3. APPARATUR
3.1. Reagensglas med glasslib og med en kapacitet på ca. 20 ml forsynet med
en ca. 1 m lang luftsvaler.
3.2. 5 ml kalibreret pipette.
3.3. 50 ml skilletragt.3.4. 10 ml og 25 ml måleglas.
3.5. 15 ml spidsbundet reagensglas.
4. REAGENSER
4.1. Methyliseringsreagens: vandfri methanol-hexan-koncentreret svovlsyre (d
= 1,84) iforholdet 75: 25:1 (v/v/v).
4.2. 40—60º C petroleumsether.4.3. Vandfrit natriumsulfat.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Stoffet, der er taget fra pladen, anbringes i 20 ml reagensglasset, og der
tilsættes 5 ml methyliseringsreagens.
5.2. Svaleren påsættes, og der opvarmes i30 mi nutter iet kogende vandbad
(note 3).
5.3. Blandingen overføres kvantitativt til en 50 ml skilletragt ved hjælp af 10 ml
destilleret vand og 10 ml petroleumsether. Der omrystes kraftigt, og blan-
dingen henstår, til faserne adskilles, den vandige fase fjernes, og etherlaget
skylles to gange med 20 ml destilleret vand. Skilletragten tilsættes en lille
mængde vandfrit natriumsulfat, der omrystes, blandingen henstår i nogle få
minutter og filtreres, idet filtratet opsamles i et 15 ml spidsbundet reagens-
glas. Opløsningsmidlet afdampes over et vandbad med en strøm af
nitrogen.
Note 3: For at kontrollere kogningen indsætter man en glasstang i reagen-
sglasset og begrænser vandbadets temperatur til 90º C.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 52
▼B
BILAG XI
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FLYGTIGE HALOGENE
OPLØSNINGSMIDLER I OLIVENOLIE
1. PRINCIP
Analyse ved gaskromatografi ifølge teknikken med luftrummet over
væsken (head space).
2. APPARATUR
2.1. Gaskromatografiapparat udstyret med en elektronindfangningsdetektor
(ECD).
2.2. Apparatur for luftrummet over væsken (head space).2.3. Gaskromatografisøjle af glas med længde på 2 m og med 2 mm diameter,
stationær fase
10 % OV101 på chromosorb WLADMOS granulometri80—100 Mesh.
2.4. Transportluftart og hjælpeluftart: nitrogen.
2.5. 10 til 15 ml glaskolber med en foring af teflon og en aluminiumsprop med
en åbning til udtagning med sprøjte.
2.6. Tang til hermetisk lukning.2.7. Sprøjte til luftarter på 0,5 til 2 ml.
3. REAGENSER
Flygtige halogene opløsningsmidler med en renhedsgrad, der egner sig til
gaskromatografi.
Pentan med en renhedsgrad, der egner sig til gaskromatografi.
4. ANALYSEMETODE
4.1. Der afvejes med nøjagtighed ca. 3 g olie i en glaskolbe (der ikke må
genbruges), og kolben tilproppes indtil den hermetiske lukning. Kolben
anbri nges ien termostat ved 70º C ien ti me. Der udtages med akkuratesse
ved hjælp af sprøjten en mængde på 0,2 til 0,5 ml af luftrummet over
væsken. Det indsprøjtes i gaskromatografisøjleapparatet, der er indstillet
således:
— injektortemperatur: 150º C
— søjletemperatur: 70 til 80º C
— detektortemperatur: 200 til 250º C.
Andre temperaturer kan også anvendes, såfremt resultaterne er ækivalente.
4.2. Referenceopløsninger. Der tilberedes standardopløsninger ved brug af raffi-
neret olivenolie uden spor af opløsningsmidler til variable koncentrationer
af flygtige halogene opløsningsmidler mellem 0,05 og 1 ppm og i forhold
til det formodede indhold af prøven. En eventuel fortynding af flygtige
halogene opløsningsmidler skal ske ved hjælp af pentan.
4.3. Mængdemæssig vurdering. Forholdet fastlægges mellem overfladerne eller
toppene på prøverne og den standardopløsning, der har den nærmeste
formodede koncentration. Hvis den forholdsvise forskel er over 10 %, er
det nødvendigt at gentage analysen ved sammenligning med en ny stan-
dardopløsning, indtil dens koncentration overholder ovennævnte
forholdsvise forskel. Indholdet af flygtige halogene opløsningsmidler
bestemmes på grundlag af et gennemsnit af elementære indsprøjtninger.
4.4. Udtryk for resultaterne. Resultaterne udtrykkes ippm (mg/kg). Metodens
påvisningsgrænse er 0,01 mg/kg.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 53
▼B
BILAG XII
ORGANOLEPTISK VURDERING AF JOMFRUOLIE
1. FORMÅL
Formålet med denne metode er at fastlægge de nødvendige kriterier for
vurdering af jomfruolies duft- og smagsegenskaber (»flavour«) og at
udvikle den nødvendige metodologi for vurderingen.
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Den beskrevne metode er kun anvendelig til den organoleptiske vurdering
og klassifikation af jomfruolie, der kan bruges til direkte fortæring. Den
begrænser sig til klassifikation af jomfruolien efter en numerisk skala i
relation til opfattelsen af dens duft- og smagsstimuli efter et skøn udøvet
af en gruppe udvalgte smagere, der arbejder som et panel.
3. ALMINDELIG GRUNDORDLISTE FOR SENSORISK ANALYSE
Der henvises til »Sensorisk analyse: almindelig grundordliste«.
4. SPECIEL ORDLISTE FOR OLIVENOLIE
4.1. Behagelige fornemmelser fremkaldt af jomfruolivenoliers karakteristiske
kvalitetsegenskaber:
Frugtagtig: duft og smag, som minder om både lugten og smagen af
sund, frisk frugt, plukket på dens optimale modenhedstrin.
Moden frugt: duft og smag af olivenolie udvundet af modne frugter; olien
har i almindelighed en lidt flad duft og en sødlig smag.
Umoden frugt: duft og smag af olivenolie udvundet af endnu ikke modne
frugter.
4.2. Mere eller mindre behagelige fornemmelser, alt efter intensiteten, der
ikke skal betragtes som en mangel, men som har indvirkning på den
frugtagtige harmoni:
Æble: duft og smag af olivenolie, der minder om denne frugt.
Sød: behagelig smag, som ikke er direkte sukkeragtig, men som findes i
olier, hvor de bitre, sammensnerpende og skarpe egenskaber ikke er
dominerende.
Græs: karakteristisk duft og smag ved visse olier, der minder om nyslået
græs.
Grønne blade (bitter): duft og smag af olie udvundet af alt for grønne
oliven eller oliven, der er lige ved at skifte farve. Den kan være mere
eller mindre behagelig afhængig af intensiteten.
Skarp: karakteristisk fornemmelse ved visse olier, som, når man smager
på dem, giver en sammensnerpende reaktion i munden.
Stærk: olier, der, når man smager på dem, giver en prikkende fornem-
melse på tungen, hvilket er karakteristisk for olier produceret i
begyndelsen af produktionsåret hovedsagelig af endnu ikke modne oliven.
Den prikkende fornemmelse skyldes phenoliske stoffers indvirkning på
trigeminus-nervens ender, der forgrener sig i hele mundhulen.
Mandel: denne duft og smag kan forekomme ito former: den, der er
typisk for friske mandler, og den, der er særegen for tørrede, sunde
mandler, og som kan forveksles med begyndende harskhed. En distinkt
smag bemærkes som en eftersmag, når olien forbliver i kontakt med
tungen og ganen. Den forbindes med søde olier, der har en flad lugt.
Flad eller glat: duft og smag af olivenolie, hvis organoleptiske karakteri-
stika er meget svage på grund af tabet af dens aromatiske bestanddele.
Hø:karakteristisk duft og smag ved visse olier, minder mere eller mindre
om tørret græs.
4.3. Altid ubehagelige fornemmelser, der, selv om deres intensitet knap er
mærkbar, betragtes som organoleptiske mangler:
Esparto: karakteristisk lugt og smag ved olie udvundet fra oliven, der er
presset inye måtter af espartogræs. Smagen kan være forskelli g, alt efter
om måtterne er lavet af grønt eller tørret espartogræs.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 54
▼M3
▼M3
Jordet: karakteristisk lugt og smag ved olie udvundet af oliven, der er
opsamlet med jord eller mudder på overfladen, og som ikke er blevet
vasket. Kan undertiden være ledsaget af en muggen-fugtig lugt og smag.
Gammel: karakteristisk lugt og smag af olie, der er blevet opbevaret for
længe ilagerbeholdere. Kan også forekomme ioli e, der har været pakket
i overordentlig lang tid.
Larvebefængt: karakteristisk lugt og smag af olie udvundet af oliven, der
har været hårdt angrebet af larver af olivenfluen (Dacus Oleae).
Metallisk: duft og smag, der minder om metal. Karakteristisk for olier,
der under uheldige omstændigheder har været i langvarig kontakt med
fødevarer eller metaloverflader under knusning, blanding, presning eller
opbevaring.
Mug-fugt: karakteristisk lugt og smag af olie udvundet af frugter, hvori
store mængder svampe og gær har udviklet sig, fordi de har været opbe-
varet i adskillige dage i bunker i fugtige omgivelser.
Harsk: karakteristisk lugt og smag, som er fælles for alle olier og fedt-
stoffer, der har undergået en auto-oxideringsproces som følge af
langvarig kontakt med luften. Denne lugt og smag er ubehagelig og kan
ikke korrigeres.
»Atrojado« (muggen): karakteristisk lugt og smag ved olie, der er
udvundet af oliven, der er opbevaret i bunker, og som har nået et frem-
skredet stadium af gæring.
Saltlage: duft og smag af olier ekstraheret fra oliven, der har været
konserveret isaltopløsni nger.
Presserester: karakteristisk lugt og smag, der minder om oliven-pressere-
ster.
Sæbeagtig: lugt og smag, som giver en fornemmelse, der minder om grøn
sæbe.
Grønsagsvand: karakteristisk smag og lugt, som olien får som følge af
dårlig dekantering og langvarig kontakt med grønsagsvand.
Vinagtig — eddikeagtig: karakteristisk duft og smag af visse olier, som
minder om vin eller eddike. Skyldes hovedsagelig dannelsen af eddike-
syre, ethylacetat og ethanol istørre mængder end normalt ioli venoli ens
aroma.
Agurk: duft og smag, der fremkommer, når en olie er pakket hermetisk i
for lang tid, især i blikbeholdere, og som tilskrives dannelsen af 2,6-nona-
dienal.
Ophedet eller brændt: karakteristisk lugt og smag af olier, forårsaget af
overdreven og/eller langvarig opvarmning under bearbejdningen, især
når pastaen blandes termisk, hvis det gøres under uegnede betingelser.
Mudret bundfald: karakteristisk lugt og smag ved olie, der er udvundet af
dekanteret bundfald ikar og underjordi ske tanke.
Pressemåtte: karakteristisk lugt og smag af olie fra oliven, der er blevet
presset isnavsede pressemåtter, hvorider har været forgærede rester.
Fedtet: lugt af olivenolie, der er ekstraheret i et anlæg, hvor rester af
jordolie, fedt eller mineralsk olie ikke er fjernet ordentligt fra maskine-
riet.
Grov: en karakteristisk fornemmelse ved visse olier, som, når man
smager på dem, giver en tyk, pastaagtig fornemmelse i munden.
5. GLAS TIL OLIESMAGNING
Der henvises til »Glas til oliesmagning«.
6. PRØVELOKALE
Der henvises til »Vejledning i indretning af prøvelokale«.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 55
▼B
▼B
7. APPARATUR
Følgende apparatur, som er nødvendigt for at smageren kan udføre sin
opgave rigtigt, skal anbringes i hver bås og skal være inden for nem
rækkevidde:
— glas (standardiserede), som indeholder prøverne, mærket med en
inskription bestående af to tilfældigt valgte tal eller af to tal og
bogstaver. Mærkningen skal foretages med en lugtfri blyant, hvis
skrift ikke kan slettes
— urglas med identiske mærker til at dække glassene med
— klassificeringsskema (se figur 2), med brugsanvisning
— blyant eller pen
— små bakker med æble skåret iski ver— et glas vand ved stuetemperatur.
8. METODOLOGI
Dette afsnit forudsætter de nødvendige forkundskaber til at udføre den
sensoriske analyse af jomfruolie, og det forsøger at standardisere den
adfærd og den metode, som forventes af de smagere, der deltager i
sådanne prøver, og som må være opmærksomme på både de generelle
og de specifikke anbefalinger for smagning af olivenolie.
8.1.De pligter, der påhviler panelets organisator eller tilsynsførende
Organisatoren skal være en tilstrækkelig trænet, kyndig person, som er
ekspert i de typer olie, han vil støde på under sit arbejde. Han er nøglefi-guren i panelet og er ansvarlig for dets organisation og virke. Han skal
sammenkalde smagerne i tilstrækkelig god tid og skal opklare alle tvivls-
spørgsmål, smagerne kan have med hensyn til prøvernes udførelse; men
han skal afstå fra at påvirke deres mening om prøverne.
Organisatoren skal være ansvarlig for at føre en fortegnelse over appara-
turet og for at sikre, at det er tilstrækkelig rengjort, for at tilberede og
kode prøverne og for at præsentere dem for smagerne ioverensstemmelse
med forsøgsplanen, samt for at indsamle de opnåede data og behandle
dem statistisk, så de bedste resultater opnås med den mindste anstren-
gelse.
Den opgave, der påhviler den tilsynsførende, kræver sensorisk færdighed,
omhu ved forberedelsen og tilrettelæggelsen af prøverne, og dygtighed og
tålmodighed ved planlægningen og udførelsen af prøverne. Det er den
tilsynsførendes opgave at stimulere paneldeltagernes moral ved at anspore
deres interesse, nysgerrighed og konkurrenceånd. Han skal sikre, at hans
egen mening ikke er kendt, og han skal forhindre mulige ledertyper i at
hævde deres kriterier over for de øvrige smagere. Han skal også være
ansvarlig for at træne, udvælge og overvåge smagerne for at konstatere,
om de lever op til et passende niveau med hensyn til dygtighed.
8.2.Testbetingelser
8.2.1. Prøvens størrelse
Hvert glas skal indeholde 15 ml olie.
8.2.2. Testtemperatur
De olieprøver, der skal undersøges, skal opbevares i glas ved 28º C ± 2º
C. Denne temperatur er valgt, fordidet er den bedste temperatur ti l at
observere organoleptiske forskelle ved, ved normal temperatur, når olier
bruges som krydderi. En anden faktor, der taler for denne værdi, er, at
ved lavere eller højere temperaturer vil enten de aromatiske komponenter
næppe fordampe, eller der vil dannes flygtige komponenter, der er speci-
elle for ophedede olier.
8.2.3. Tider for smagningens afholdelse
Morgenen er det bedste tidspunkt for smagning af olie. Det er bevist, at
der i dagens løb forekommer optimale perceptionsperioder med hensyn til
lugt og smag.
Forud for måltiderne går der en periode, hvor følsomheden for lugt og
smagsindtryk er forøget, hvorimod følsomheden aftager efter måltidet.
Dette hensyn bør dog ikke føre til overdrivelser, hvor sult kan distrahere
smagerne og dermed nedsætte deres evne til at skelne og især deres krite-
rier for, hvad de foretrækker eller kan acceptere.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 56
▼B
9. SMAGERE
De personer, der skal virke som smagere ved organoleptiske bedøm-
melser af oliven-spiseolie, skal trænes og udvælges i overensstemmelse
med deres evne til at skelne mellem prøver, der ligner hinanden; man
bør erindre, at deres evne til at skelne nøjagtigt vil forbedres ved træning
(se afsnit herom).
Der kræves 8 — 12 smagere til en test; det er dog klogt at holde nogle
ekstra smagere ireserve, så de kan gå i nd iti lfælde af fravær.
9.1.Generelle anbefalinger for kandidater og smagere
Disse anbefalinger gælder kandidaternes og smagernes adfærd under
arbejdet.
Når en smager indkaldes af panelets organisator for at deltage i en orga-
noleptisk test, bør han være i stand til at møde på den forud fastsatte tid,
og han skal overholde følgende regler:
9.1.1. Han skal undlade at ryge i mindst 30 minutter før det tidspunkt, der er
fastsat for smagningen.
9.1.2. Han må ikke bruge nogen parfume, kosmetik eller sæbe, hvis duft ville
kunne holde sig til tidspunktet for smagningen. Han skal bruge en upar-
fumeret eller svagt parfumeret sæbe til at vaske hænderne med, og han
skal derefter skylle og tørre hænderne så ofte, som det er nødvendigt for
at fjerne en eventuel duft.
9.1.3. Han skal faste i mindst en time, før smagningen udføres.
9.1.4. Hvis smageren føler sig fysisk utilpas, og især hvis hans smags- eller
lugtesans er påvirket, eller hvis han er under en psykologisk påvirkning,
der forhindrer ham i at koncentrere sig om sit arbejde, skal han underrette
den tilsynsførende om det, så han eventuelt kan trække sig tilbage fra
testen, eller der kan træffes passende beslutninger, idet man må væreopmærksom på den deviation i middelværdierne for resten af panelet,
der kan opstå.
9.1.5. Når smageren har opfyldt ovenstående krav, skal han tage plads iden
bås, der er tildelt ham, på en så rolig og ordentlig måde som muligt.
9.1.6. Når smageren har taget plads, skal han kontrollere, at han har det rigtige
apparatur, og at det er rigtigt arrangeret, og han skal sikre sig, at inskrip-
tionen på glasset svarer til inskriptionen på urglasset.
9.1.7. Smageren skal omhyggeligt læse de instruktioner, der er givet på klassifi-
ceringsskemaet, og han må ikke begynde at undersøge prøven, før han
føler sig helt sikker på den opgave, han skal udføre. Hvis der opstår
nogen som helst tvivl, skal han diskutere vanskelighederne med den
tilsynsførende i enrum.
9.1.8. Smageren skal tage glasset op, og idet han holder det dækket med
urglasset, skal han holde det lidt skråt; han skal så dreje glasset helt rundt
i denne stilling, så en så stor del af indersiden som muligt bliver fugtet.
Når dette stadium er overstået, skal han fjerne urglasset og lugte til
prøven, idet han tager jævne, langsomme, dybe indåndinger, til han har
dannet sig et indtryk af den olie, der skal vurderes. Lugtefasen må ikke
overstige 30 sek. Hvis han ikke er kommet til nogen konklusion inden for
dette tidsrum, skal han hvile en kort tid, før han prøver igen. Når den
olfaktoriske test er udført, skal smageren bedømme oliens »flavour«,
dvs. det generelle lugte-, smags- og føleindtryk. For at gøre dette skal
han tage et lille nip af olien, ca. 3 ml. Det er meget vigtigt, at olien
fordeles ud over hele mundhulen, fra den forreste del af munden og
tungen langs siderne til den bageste del af tungen og ganen, da det er
velkendt, at opfattelsen af de fire primære smagskvaliteter, sødt, salt,
surt og bittert, varierer i intensitet over de forskellige områder af tungen
og ganen.
Det bør understreges, at det er afgørende, at en tilstrækkelig mængde olie
spredes meget langsomt over den bageste del af tungen og ned mod
halsen, mens smageren koncentrerer sig om den rækkefølge, i hvilken de
bitre og skarpe stimuli fremkommer; hvis dette ikke sker, kan begge disse
stimuli undgå smagerens opmærksomhed ved visse olier, eller den bitre
stimulus kan blive tilsløret af den skarpe stimulus.
At tage korte åndedrag lige efter hinanden, idet luften trækkes ind
gennem munden, sætter smageren i stand til ikke blot at sprede prøven
ud over hele mundhulen, men også at opfatte de flygtige aromatiske
komponenter via den bageste del af næsen.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 57
▼B
Følesansen skal også tages ibetragtni ng, Derfor skal letflydenhed,
klæbrighed og skarphed eller brod noteres ned, når de observeres, og
hvis det kræves til den pågældende test, skal deres intensitet angives
kvantitativt.
9.1.9. Når der foretages organoleptisk vurdering af en jomfruolivenolie, må der
kun vurderes én prøve ad gangen for at undgå den kontrastvirkning, der
kunne opstå, hvis andre prøver skulle smages umiddelbart efter.
Da flere på hinanden følgende smagninger fremkalder træthed eller
nedsat følsomhed, er det vigtigt at bruge et produkt, der kan fjerne
resterne af olie fra den forudgående smagning fra munden.
Det kan anbefales at bruge et lille stykke æble (ca. 15 g), som, efter at
man har tygget det, kan spyttes ud ispytkummen. Derefter skylles
munden med lidt vand ved stuetemperatur. Der skal hengå mindst 15
minutter mellem afslutningen af én smagning og påbegyndelsen af den
næste.
9.2.Bedømmelse af kandidater
Dette stadium skal gennemføres af organisatoren, som personligt skal tale
med kandidaterne for at gøre sig fortrolig med deres personlighed og
miljø. De fysio-psykologiske krav, som skal opfyldes, er ikke særlig
strenge, da teoretisk enhver normal person skulle være i stand til at
deltage. Faktorer som køn, alder, specielle vaner (rygning) osv. er nutil-
dags afløst af andre som f.eks. helbred og personlig interesse samt at
kandidaten har tid til rådighed til arbejdet.
Under samtalen skal organisatoren forklare kandidaten opgavens art og
hvor megen tid det omtrent vil tage. Han skal så samle opløsninger fra
kandidaten, der gør det muligt for ham at vurdere kandidatens interesse
og motivation samt hvor megen tid han reelt har til rådighed. Følgende
spørgeskema kan være til hjælp som reference.
1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 58
▼B
Organisatoren skal bruge disse oplysninger til at sortere kandidaterne, og
han skal afvise dem, der kun viser ringe interesse for denne type arbejde,
ikke har tid til rådighed, eller ikke er i stand til at udtrykke sig klart.
9.3.Bestemmelse af gruppens »gennemsnitlige tærskel« for »karakteri-
stiske egenskaber«
Udvælg omhyggeligt fire olier, der hver anses for repræsentativ for én af
følgende smagsegenskaber: »atrojado« (muggen), vinagtig, harsk og
bitter, og som har så stor og klar en intensitet som muligt.
Tag en del af hver olie og forbered prøver, hvis koncentration varierer
med en faktor 2, så der opstår flere, stadig svagere fortyndinger efter
hinanden, i et passende fortyndingsmiddel, indtil der ikke kan opfattes
nogen forskel mellem det glas, der kun indeholder fortyndingsmidlet, og
de sidste to eller tre fortyndinger. Det sidste par skal være to glas med
fortyndingsmiddel.
Serien kompletteres med glas, der indeholder højere koncentrationer,
indtil et samlet antal af otte glas er nået.
Der skal forberedes tilstrækkelige mængder af de forskellige koncentrati-
oner til, at hver kandidat kan få en komplet serie af hver smagsegenskab.
For at fastlægge kandidaternes »gennemsnitlige tærskel« for hver smags-
egenskab skal de hver have et glas med 15 ml af én af de forberedte
koncentrationer og et glas, der udelukkende indeholder 15 ml af fortyn-
dingsmidlet. Når kandidaten har udført prøven, skal han angive, om
indholdet af de to glas er ens eller forskelligt.
Den samme prøve gentages for de øvrige koncentrationer af den smags-
egenskab, der er under betragtning.
Antallet af korrekte svar, der opnås fra alle smagerne for hver koncentra-
tion, noteres, og dette tal angives som en procentdel af antallet af udførte
prøver.
Derefter dannes et koordinatsystem, hvor der på abscisseaksen afsættes de
afprøvede koncentrationer i stigende rækkefølge, og på ordinataksen
afsættes procentdelen af korrekte svar. Sammenhørende værdier af
koncentration og procent korrekte svar afsættes i dette koordinatsystem.
Figur 1 er et praktisk eksempel på denne fremgangsmåde. Detektions-
tærsklen findes ved at trække en linie fra det punkt på kurven, der
svarer til ordinatværdien 75 %, ned på abscisseaksen.
Denne »tærskelkoncentration«, som kan være forskellig for hver oprin-
delig olie, fordi den afhænger af den tilstedeværende smagsegenskabs
intensitet, bør være meget nær den samme for de forskellige grupper af
kandidater til de forskellige paneler; den er ikke forbundet med nogen
vane eller forkærlighed. Derfor er den et referencepunkt, som er fælles
for enhver normal gruppe af mennesker, og den kan bruges til at homo-
genisere de forskellige paneler udelukkende efter deres følsomhed for
lugt og smag.
På grundlag af den tærskelkoncentration, der er opnået for gruppen, går
man frem på følgende måde:
Man forbereder en serie af stigende og aftagende koncentrationer på en
såden måde, at »tærskelkoncentrationen« indtager plads nr. 10 på denne
skala. Den 11. og 12. koncentration vil naturligvis være mere fortyndede,
hvorfor det vil være vanskeligere at opfatte tilstedeværelsen af den olie,
der har den valgte smagsegenskab.
Idet man tager C10koncentrationen som udgangspunkt, kan de øvrige
prøver tilberedes i henhold til følgende formel:
C10×an, hvor a er en konstant, fortyndingsfaktoren, som er lig med 1,5,
og n er eksponenten, der varierer mellem 9 og − 2.
Eksempel: Viforudsætter, at tærsklen for harsk oli e er 0,32; C10= 0,32,
da a = 1,5, vil serien af prøver have følgende koncentrationer:
Prøve 1 23456789 1 0 1 1 1 2
Koncentration 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Hvis denne procedure gentages for de tre andre smagsegenskaber på
grundlag af deres respektive tærskler, der beregnes som ovenfor angivet,
opnås skalaer med lignende aromatiske intensiteter for hver stimulus for1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 59
▼B
alle laboratorier, selv om manglerne ved de oprindelige olier kan være
mærkbare ved forskellige intensiteter.
9.4.Udvælgelse af smagere ved intensitetsvurderingsmetoden
Ved udvælgelsesproceduren bør der være to-tre gange så mange kandi-
dater, som der kræves til panelet, for at de personer, der har den bedste
følsomhed og evne til at skelne, kan udvælges. Det er altid tilrådeligt at
anvende det samme produkt som det, der senere skal analyseres (derfor
vil olivenolie altid blive anvendt).
Figur 1
Ved valg af metode må man ikke overse, at foruden at være effektiv bør
den anvendte fremgangsmåde være så økonomisk som muligt med hensyn
til mængden af olie, antallet af prøver, der skal sendes, og den tid, der
bruges til udvælgelsen. En udvælgelsesprocedures effektivitet ligger i
valget af de optimale niveauer for følgende tre afhængige variable:
a) omkostninger bestemt af antallet af prøver,
b) det forholdsmæssige antal potentielt egnede kandidater, som ved et
tilfælde bliver udelukket ved udvælgelsen, og
c) det forholdsmæssige antal kandidater, som ved et tilfælde kommer
igennem udvælgelsesprocessen, skønt de ikke er egnede.
Fire punkter af den valgte udvælgelsesprocedure, intensitetsvurderingste-
sten, som er beskrevet i ASTM (American Society for Testing and
Materials), STP (Special Technical Publication) nr. 440, side 53, er blevet
modificeret ved:
1) at nedsætte antallet af prøver iseri en
2) at udvide rækken af stimuli med henblik på at forøge antallet af olfak-
toriske og gustatoriske (lugt- og smags-) noter, som udvælgelsen
baseres på, så de tilpasses til de mest almindelige mangler, man finder
i olivenolie
3) at variere koncentrationsforholdene i serierne
4) at behandle resultaterne statistisk.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 60
▼B
Nødvendigt apparatur
1 500 ml flasker eller glaskolber.
mørke smageglasprøverør med 10, 15, 1 000 og 1 500 ml inddeling.Nødvendige produkter— Merck paraffin (reference 7.160, DAB 8, USP XX) eller fortyn-
dingsmiddel i form af en olie uden lugt eller smag (nyraffineret
olivenolie eller anden lignende olie).
— Olier: »atrojado« (muggen), vinagtig, harsk og bitter.
9.4.1. Fremgangsmåde
Efter at have tilberedt fortyndingerne går man videre til udvælgelsen,
hvor man begynder med 25 kandidater og prøver dem i overensstemmelse
med følgende metodologifor hver sti mulus:
1) Man forbereder serier på 12 prøveglas, mærket med en kode (én serie
pr. kandidat). 15 ml af hver af de forskellige koncentrationer, der er
tilberedt efter formlen C
10×an, hældes ihver si t prøveglas.
2) Når prøveglassene er blevet fyldt, bør de stå dækket med et urglas i
smagelokalet ved en temperatur på 20—22º C i mindst en time, før
prøven påbegyndes, for at bringe deres temperatur på niveau med
den omgivende temperatur.
3) Organisatoren skal så stille de 12 prøveglas i hver serie op i en række,
arrangeret efter aftagende koncentration.
Næste trin er at bede hver kandidat om at udføre prøven på egen hånd
efter følgende instruktion:
9.4.2. Instruktion til kandidater
De 12 smageglas, der står på række foran kandidaten, indeholder fortyn-
dinger af ét af de fire stimuli: »atrojado« (muggen), vinagtig, harsk og
bitter. Den faktor, der gør det muligt at skelne mellem indholdet af glas-
sene, er lugtens intensitet. Det glas med den mest intense lugt står yderst
til venstre, og resten af glassene er placeret i rækkefølge efter aftagende
intensitet fra venstre mod højre. Det sidste smageglas til højre kan have
så svag en lugt, at det måske er umuligt at opfatte den.
Gå frem på følgende måde: Gør Dem fortrolig med lugten af hvert af
glassene iseri en. Begynd fra højre (nr. 12), og prøv på at huske alle
lugtenes intensitet uden at blive overtræt.
Når De føler, at De er blevet vant til koncentrationsskalaen for lugte, går
De ud af lokalet.
I mellemtiden skal organisatoren fjerne ét af glassene i serien og sætte det
på niveau med det sidste på højre side og flytte alle de andre, så plad-
serne til venstre fyldes. De skal så komme tilbage til lokalet og fortsætte
med prøven.
Prøven omfatter følgende:Det smageglas, der er blevet fjernet fra serien, skal sættes tilbage på sin
rigtige plads. For at gøre det skal De lugte til det og sammenligne det
med de andre så ofte, som De ønsker. De skal huske, at hvis det skal
sættes rigtigt på plads, skal det lugte stærkere end prøven umiddelbart til
højre for det og svagere end prøven umiddelbart til venstre. Denne prøve
vil blive gentaget med tre andre glas.
For at lette prøven og indsamlingen af svarene skal der til hver kandidat
udleveres en formular i forbindelse med de instruktioner, der er beskrevet
her.
1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 61
▼B
9.4.3. Optegnelse af resultater
Organisatoren skal optegne data for hver af kandidaterne på følgende
måde:
9.4.4. Statistisk bedømmelsesprocedure
I dette særlige tilfælde skal de smageglas, der skal sættes tilbage på deres
rette plads, være de samme for alle kandidaterne. Ifølge de statistiske
beregninger, der er udført til dette formål, skal de svare til følgende posi-
tioner i rækkefølgen med hensyn til hver smagsegenskab:
»Atrojado«
— muggen
(M)Vinagtig (V) Harsk (H) Bitter (B)
Glas nr. Glas nr. Glas nr. Glas nr.
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
Det nummer, der svarer til glassets position i rækkefølgen, må ikke
varieres, da de statistiske beregninger for denne test er udført med
henblik på sandsynligheden for, at glassene tilfældigt bliver sat tilbage i
deres rigtige positioner.
For i videst muligt omfang at sikre, at oplysninger ikke overgives fra den
ene kandidat til den anden, skal organisatoren sikre sig:
1. At der ikke er nogen mulighed for kontakt mellem kandidaterne. Der
skal bruges forskellige inskriptioner til hver af kandidaterne.
2. At der ikke er nogen måde, hvorpå kandidaterne kan finde ud af,
hvilken position de glas, der er fjernet, havde.
3. Selv om alle kandidaterne skal have forelagt de samme glas som tidli-
gere angivet, skal den rækkefølge, hvori de overrækkes til kandidaten,
variere.
Til hver kandidat skal der så gives en karakter, der afhænger af hans
udførelse af opgaven på følgende måde:
Lad ei
1,ei
2,…ei
12være de 12 glas med de 12 koncentrationer af duft- og
smagsegenskaben »i« (i kan være en hvilken som helst af de fire egen-
skaber »atrojado« — muggen, vinagtig, harsk og bitter), arrangeret efter
aftagende intensitet.
Lad ei
Kvære ét af de udtagne glas og K ′være den position, som kandi-
daten giver det, når han sætter det på plads i serien. Værdierne af K og
K′er derfor hele tal mellem 1 og 12 inklusive, svarende til henholdsvis
det virkelige pladsnummer for det valgte glas og det pladsnummer, som
kandidaten giver det.
Lad T (den maksimale tilladte afvigelse) være en forud fastlagt værdi,
som i vort tilfælde er = 3, så at hvis |K ′−K| > T, bliver kandidaten auto-
matisk vraget (1).
Hvis derimod |K ′−|≤T, er kandidaten teoretisk godkendt og kan gå
videre med prøven, da han eller hun er i stand til at sætte den pågældende
stimulus tilbage til dens rigtige position eller i det mindste meget nær ved
den.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 62
(1) Organisatoren bør presse kandidaten til at gå fornuftigt frem, dvs. uden at miste
følsomhed på grund af udmattelse af lugtesansen.
▼B
I dette tilfælde skal den karakter, der er givet til en kandidat, der har
vurderet en bestemt stimulus (koncentration), for eksempel i »atrojado«
— muggen serien, være lig med kvadratet på differensen mellem glassets
rigtige nummer i rækkefølgen og den position, kandidaten har placeret
det i. Det vil sige PM
h=( K′−K)2.
Da denne operation skal udføres af hver kandidat på fire stimuli (koncen-
trationer) af hver duft- og smagsegenskab, vil den partielle karakter for
egenskaben (f.eks. M) være
ZM=PM
h+PM
j+PM
l+PM
m
Nedenfor er der givet nogle eksempler for at lette foreståelsen af denne
operation.
Eksempel 1:
Lad os antage, at de svar, kandidat A har givet for de fire stimuli, der er
fjernet fra serien for egenskab (i) er som følger:
Korrekt position for
glasset iseri en
(K)Position, som kandi-
daten satte det
tilbage i
(K′)Afvigelse fra den korrekte posi-
tion
(K′−K)
7 7 7−7=0
4 5 4−5=−1
10 6 10 − 6 = 4 (1)
2 4 2−4=−2
(1) Denne kandidat afvises, fordi han har opnået T > 3 i prøven.
Eksempel 2:
Lad os antage, at en kandidat placerer glassene for en bestemt egenskab
således:
Korrekt position for
glasset iseri en
(K)Position, som kandi-
daten satte det
tilbage i
(K′)Afvigelse fra den korrekte posi-
tion
(K′−K)
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10 − 7 = 3
2 3 2−3=−1
Denne kandidat afvises ikke. Han har opnået en karakter på:
Zi=O2+O2+32+ (−1)2=1 0
Kandidatens endelige karakter, der afgør hans godkendelse eller afvisning
som smager, og som afhænger af hans svar på de fire egenskaber, der
undersøges, vil blive som følger:
PM
h+PM
j+PM
l+PM
m=ZM
PV
h+PV
j+PV
l+PV
m=ZV
PH
h+PH
j+PH
l+PH
m=ZH
PB
h+PB
j+PB
l+PB
m=ZB
Endelig Z-værdi:Z=ZM+…+ZB
hvor:
M = »Atrojado« — Muggen
V = Vinagtig
H = Harsk
B = Bitter1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 63
▼B
Det gælder nu om at afgøre, op til hvilken maksimal værdi kandidaten
kan anses for at have et tilstrækkelig højt niveau for opfattelse, hukom-
melse for lugtindtryk og intellektuel organisation. Det er klart, at Z
aldrig kan have en negativ værdi, og at Z = 0 betyder, at kandidaten på
korrekt måde har reorganiseret og kvantificeret alle de 16 intensiteter, han
har fået forelagt (fire for hver egenskab). Z-værdier, der afviger fra 0,
angiver, at kandidaten har genkendt de områder af skalaen, som de valgte
intensiteter er taget fra, men inden for disse områder har han været ude af
stand til at finde den nøjagtige position, fordi hans evne til at skelne
mellem de intensiteter, der er blevet forelagt ham, ikke har været tilfreds-
stillende.
Det er derfor nødvendigt at bestemme en kritisk værdi (Zc), således at
hvis kandidaten ved et tilfælde skulle sætte alle glassene tilbage inden
for de områder, han havde undersøgt iforvejen, har sandsynli gheden for
at få en slutkarakter Z, der er mindre end Zc, en tilstrækkelig ringe værdi
(α),som kan fastsættes på forhånd. Med andre ord, det må sikres, at
sandsynligheden for ved denne procedure at vælge en smager, som ikke
har tilstrækkelig evne til at skelne intensiteten af de stimuli, der bruges til
udvælgelsesprocessen, er mindre end α.
Når værdien for αer fastsat, (i vores tilfælde til 0,05), fås Zcaf sandsyn-
lighedsdistributionen for den variable Z, som igen afhænger af
sandsynlighedsdistributionen for de variable P (K ′).
Ifølge de relevante statistiske beregninger bliver Zc= 34.
Når Z-værdierne for alle kandidater er udregnet, skal alle kandidater, hvis
Z-værdili gger over 34, udelukkes.
Som eksempel vises Z-værdierne for kandidaterne A og B:
Egenskab Kandidat A Kandidat B
»Atrojado« — Muggen (M) ZM=1 0 ZM=1 2
Vinagtig (V) ZV=1 0 ZV=1 1
Harsk (H) ZH=1 0 ZH=1 5
Bitter (B) ZB=4 ZB=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Da de to kandidater har Z-værdier på henholdsvis 34 og 38, vil kandidat
A blive godkendt, medens kandidat B vil blive forkastet. Når alle kandi-dater med en Z-værdi over 34 er blevet elimineret, skal resten
klassificeres i henhold til deres Z-værdier, indtil de 12 bedste kandidater
er blevet udvalgt.
9.5.Træning
Hovedformålene med træningsstadiet er:
a) at gøre smagerne fortrolie med de mange olfaktorisk-gustatorisk-
taktile varianter (dvs. varianter, der kan erkendes med lugte-, smags-
og følesansen), der findes inden for olivenolier
b) at gøre smagerne fortrolige med den særlige sensoriske metodologi
c) at højne den individuelle evne til at genkende, identificere og kvanti-
ficere de sensoriske egenskaber og
d) at forbedre følsomheden og hukommelsen med hensyn til de forskel-
lige smags- og duftegenskaber, så slutresultatet bliver præcise og
ensartede vurderinger.
Træningsstadiet omfatter normalt et antal møder afhængig af de mulig-
heder, der står åbne for panelet og studiet. Efter at have analyseret
olierne individuelt skal smagerne her diskutere de vanskeligheder, de er
stødt på, med organisatoren, og de skal kommentere de givne bedøm-
melser, så kriterier og meninger kan blive ensartede.
Den standard, der er nået ved træning efter et fastsat antal møder,
vurderes ud fra den procentiske forøgelse af nøjagtige svar — hvis der
anvendes diskriminatoriske prøver — eller ved at analysere variansen i
panelets gennemsnitlige individuelle bedømmelser, når der foretages
prøver med brug af en skala.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 64
▼B
Den praktiske nytte af denne træningsperiode har været diskuteret frem
og tilbage, men for tiden anses den for at være meget effektiv og endog
væsentlig, hvis man skal opnå nøjagtige sensoriske data.
9.6.Præstationskontrol
Paneler af gamle og erfarne smagere udfører normalt smagninger på en
regelmæssig og vedvarende basis, hvad der indebærer sensoriske prøver,
som kræver store anstrengelser af dem. Beslutninger af stor teknologisk
og kommerciel betydning afhænger i overordentlig mange tilfælde af
deres skøn. Derfor bør smagernes præstationer kontrolleres efter udvæl-
gelse og træning for at sikre, at deres resultater er præcise.
Efter at panelerne er sammensat og har gennemgået rutineprøverne, vil
det være nødvendigt at kontrollere deres præstationer regelmæssigt med
passende mellemrum.
10. FREMGANGSMÅDE VED ORGANOLEPTISK BEDØMMELSE AF
JOMFRUOLIE
Når ovenstående standarder er opfyldt, de nødvendige faciliteter til
rådighed og panelet udvalgt, skal hver smager lugte til og smage på (1)
den olieprøve, der er i smageglasset. Smageren analyserer de olfaktoriske,
gustatoriske, taktile og kinæstetiske indtryk ved hjælp af det i figur 2
viste skema. På dette ark optegnes de »noter«, der er til stede, og deres
intensitet. Dernæst bedømmes oliens kvalitet.
10.1.Brug af skemaet i figur 2
Nogle af de mest karakteristiske lugt- og smagsegenskaber, som hyppigt
findes i olivenolie, og som beskriver dens »flavour«, er opført i skemaets
venstre side. Hvis smageren finder andre stimuli, der ikke svarer til de
anførte beskrivelser, optegnes de under »andet«, idet der bruges en
beskrivelser, der definerer dem så nøjagtigt som muligt.
De stimuli, der kan opfattes, vurderes i forhold til deres intensitet, som
angives ved et kryds (x) i det tilhørende felt efter følgende kriterier:
1 = knap mærkbar
2 = mindre
3 = middel
4 = stor5 = meget stor
I skemaets højre side er afsat en skala, der går fra 1 til 9 points (9 for
usædvanlig god kvalitet og 1 for den ringeste kvalitet), som smagerne
bruger til at give en enkelt, generel bedømmelse af de karakteristika, der
er fundet ved den olie, der undersøges. Bedømmelsen skal være i over-
ensstemmelse med de gode punkter og de mangler ved olien, som
allerede er anført iskemaets venstre si de.
Bedømmelsesskemaets første spalte (mangler) er delt op ifem rubri kker.
Følgelig skal klassificeringen af olien først og fremmest baseres på det
totale fravær af eller tilstedeværelsen af dårligt lugt og smag og på, hvor
alvorlige og intense sådanne fænomener er. Da skalaen går op til 9
points, bør der også medregnes visse nuancer eller aspekter, der kan
hjælpe til en endelig bestemmelse af den samlede kvalitetsbedømmelse
som beskrevet i anden spalte med overskriften »karakteristika«.
10.2.Endelig bedømmelse
Den person, der fører tilsyn med panelet, skal indsamle de bedømmelser,
der er udført af hver af smagerne. Han skal kontrollere, at de egenskaber
og smagsintensiteter, smageren har opfattet og anført på sit profilark, på
acceptabel vis modsvarer den værdi, olien er anført til i klassifikationsta-
bellen.
Hvis der er en påfaldende forskel, skal den tilsynsførende bede smageren
revidere sit profilark.
Om nødvendigt skal smageren gentage prøven.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 65
(1) Smageren kan afstå fra at smage, hvis vedkommende finder intenst ubehagelige egen-
skaber ved lugten; iså fald noteres dette på bedømmelsesskemaet som en ekscepti onel
hændelse.
▼B
Endelig skal den, der fører tilsyn med panelet, udarbejde en tabel med
hele panelets bedømmelser og beregne gennemsnittet heraf og standardaf-
vigelsen (for gennemsnittet).
Hvis standardafvigelsen er højere end den metodiske fejl, skal prøven
gentages af hele panelet.
Det er kun i tilfælde af analyse i revisionsøjemed, at panelet skal gentage
prøverne for at få tre bedømmelser af olieprøven. Den endelige bedøm-
melse er gennemsnittet af de tre bedømmelser angivet med én decimal.
Hvis gennemsnitsbedømmelsen af bitterhed og/eller skarphed er højere
end 2,5, bør olien mærkes tilsvarende, og det bør optegnes, at den er
bitter eller skarp.
Angivelse af resultaterne: den tilsynsførende bestemmer på grundlag af
gennemsnitskarakteren den kategori, hvori prøven klassificeres, på
grundlag af grænserne i bilag I. Med henblik herpå anvender den tilsyns-
førende:
— iprodukti onsåret 1992/93 en tolerance på + 1,5
— fra produktionsåret 1993/94 en tolerance på + 1
hvis gennemsnitskarakteren er på 5 point eller derover.
For olier, der er genstand for interventionsforanstaltninger, gælder der
dog ingen tolerance.
Den statistiske forskel, for så vidt angår tallene for repeterbarhed og
reproducerbarhed, mellem analyseresultatet og den forskriftsmæssige
grænse er i ndbefattet iden tolerance, som er nævnt ide foregående afsni t.
Hvis der i ovennævnte produktionsår foretages klassificering af olie, uden
at tolerancen anvendes, kan der på den emballage, som umiddelbart
omslutter varen, anføres en oplysning om produktets organoleptiske mini-
mumsbedømmelse, som kan kontrolleres i afsætningsperioden.
I analyserapporten anfører den tilsynsførende blot, hvilken kategori
prøven er klassificeret i. Foretages bedømmelsen af en analytiker i over-
ensstemmelse med artikel 2, stk. 2, første afsnit, følger analytikeren
samme procedure for kategoribedømmelse.
NB: Olieprøverne bør opbevares i køleskab, indtil de analyseres, og igen
anbringes i køleskab, indtil prøven er udført tre gange.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 66
▼M12
▼M9
▼M5
▼B
▼M3
Figur 2
Jomfruolie
SENSORISK ANALYSE: ALMINDELIG GRUNDORDLISTE
1. FORMÅL
Formålet med denne standard er at samle de generelle termer, der bruges
ved sensorisk analyse, og angive deres definitioner.
2. ORDLISTE2.1.Almindelig terminologi
Sensorisk analyse (substantiv):1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 67
▼B
▼B
undersøgelse af et produkts organoleptiske egenskaber ved hjælp af
sanseorganerne.
Opfattelse (substantiv):
sensorisk bevidsthed om ydre genstande eller begivenheder.Organoleptisk (adjektiv) (attribut):
beskriver en egenskab ved et produkt, som kan opfattes med sanseorga-
nerne.
Ekspert (substantiv):
(med hensyn til undersøgelse af organoleptiske egenskaber)
smager, som har specialiseret sig i sensorisk analyse af et specifikt
produkt og har en grundlæggende forståelse for produktets fremstilling
og forbrugernes præference.
Smager (substantiv):
klarsynet, følsom, trænet person, som er udvalgt til at vurdere et nærings-
middels organoleptiske egenskaber med sanseorganerne.
Panel:gruppe af vurderingsmænd, som er specielt udvalgt og trænet, og som
træder sammen for at foretage den sensoriske analyse af produktet under
kontrollerede forhold.
Fornemmelse (substantiv):
subjektivt fænomen, der fremkommer som resultat af stimulering af et
sanseorgan. Dette fænomen kan skelnes subjektivt eller defineres objek-
tivt ved det involverede sanseorgan, afhængig af stimulus' karakter og
intensitet.
Følsomhed (substantiv):
evne til at opfatte en stimulus af ringe intensitet eller små forskelle
mellem stimuli, både kvantitativt og kvalitativt ved hjælp af sanseorga-
nerne.
Smagning (substantiv):
arbejde, der omfatter opfattelse, analyse og bedømmelse af et levneds-
middels organoleptiske egenskaber, især de olfaktoriske, gustatoriske,
taktile og kinæstetiske egenskaber, dvs. egenskaber, der kan opfattes
med lugte-, smags- og følesansen og muskelfølelsen.
Accept (substantiv):
et individs eller en befolknings velvillige modtagelse af et produkt.
Harmoni (substantiv):
egenskab ved et produkt, som giver anledning til en generel behagelig
fornemmelse. Denne fornemmelse fremkaldes af opfattelsen af produktets
komponenter som olfaktoriske, gustatoriske, taktile og kinæstetiske
stimuli, fordi de er til stede i passende koncentrationsforhold.
Acceptabilitet (substantiv):
tilstand hos et produkt, som modtages velvilligt af et individ eller en
befolkning med hensyn til dets organoleptiske egenskaber.
Skelnen (substantiv):
kvalitativ og/eller kvantitativ differentiering mellem to eller flere stimuli.Kompensation (substantiv):
resultat af vekselvirkningen mellem en kombination af stimuli, således at
hver af dem opfattes med mindre intensitet, end hvis den virkede alene.
Aspekt (substantiv):
kombination af organoleptiske egenskaber, der opfattes visuelt: størrelse,
form, farve, turbiditet, renhed, fluiditet, skum og mousseren. Denne term
bør foretrækkes fremfor termen udseende.
Attribut (substantiv):
en karakteristisk egenskab, som kan opfattes.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 68
▼B
2.2.Fysiologiske termer
Stimulus (substantiv):
fysisk eller kemisk stof/middel, der fremkalder en specifik respons fra de
eksterne eller interne sensoriske receptorer.
Smag (substantiv):
(smagssans)
sans, hvis receptorer er lokaliseret til mundhulen, især på tungen, og som
aktiveres af forskellige forbindelser i opløsning.
Gustatorisk (adjektiv):
beskriver den egenskab ved et produkt, der kan aktivere smagssansen ved
at vække de fornemmelser, der hører til én eller flere af de fire primære
smage: sødt, salt, surt og bittert.
Receptor (substantiv):
specifik struktur i et sanseorgan, som kan vækkes og kan modtage en
stimulus og omdanne den til en nerveudladning.
Bemærk: Receptorer klassificeres efter den type energi, der er forbundet
med den pågældende stimulus (lys, varme, lyd osv.).
Lugten (substantiv):
lugtesansens funktion med at opfatte og skelne mellem de molekyler, der
når den i luftform fra det ydre miljø, direkte eller indirekte gennem
næsen.
Intensitet (substantiv):
størrelsen af den energi ved et attribut, der kan måles efter en kvantitativ
værdiskala over tærskelværdien.
Tilpasning (substantiv):
midlertidig ændring af følsomheden til opfattelse af sensoriske stimuli på
grund af vedvarende, gentagen udsættelse for en given stimulus eller en,
der ligner den.
Hæmning (substantiv):
mangel på reaktion fra et sanseorgan eller en del deraf, til trods for, at det
bliver udsat for påvirkning fra en egnet stimulus, hvis intensitet er over
tærsklen.
Reaktion (substantiv):
handling, hvor de sensoriske celler reagerer på påvirkning fra én eller
flere stimuli med relation til et givet sanseorgan.
Krop (substantiv):
berøringsfornemmelse, der opfattes i mundhulen, og som giver en
fornemmelse af et produkts tæthed, viskositet, konsistens eller
kompakthed.
Vellugt (substantiv):
frisk, behagelig, dejlig duft.
At lugte (verbum):
(aktiv form anvendt på lugt)
beskriver den handling at opfatte en lugt.
Objektiv (adjektiv):
a) beskriver det, der giver en sand fremstilling, som kan verificeres, af
genstanden ved at minimere de menneskelige faktorer (f.eks. præfe-
rence, vane, tilbøjelighed)
b) beskriver den teknik, der enten ved hjælp af sensoriske eller instru-
mentelle metoder minimerer selvinducerede fejl.
Bemærk: Brugen af termen »instrumentel« som synonym kan ikke
tilrådes.
Subjektiv (adjektiv):
beskriver det, der fremkalder en opfattelse, der er påvirket ikke alene af
stimulus, men også af vores måde at tænke og føle på.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 69
▼B
Muskelfølelse (substantiv):
fornemmelser, der fremkommer som resultat af tryk på prøven frembragt
ved bevægelser imundhulen eller med fi ngrene (f.eks. ved at trykke på
ost med fingrene).
Tærskel (substantiv):
Absolut tærskel:den mindste værdi af en sensorisk stimulus, der giver anledning til:
— fremkomsten af en fornemmelse (stimulustærskel eller detektionstær-
skel)
— eller identifikation af fornemmelsen (genkendelsestærskel).
Differenstærskel:
den mindste værdi af en sensorisk stimulus, der giver anledning til en
mærkbar forskel i fornemmelsens intensitet.
Terminaltærskel:
den største værdi af en stimulus, over hvilken en forøgelse af intensiteten
ikke opfattes.
Præferencetærskel:
den mindste kvantitative værdi af en stimulus eller kritiske overtærskel-
værdi af den samme stimulus, ved hvilken en tiltræknings- eller
afvisningsreaktion fremkommer i relation til en neutral stimulus, f.eks.
ved valget mellem en sukkeropløsning og vand.
Bemærk: Der bør skelnes mellem en absolut præferencetærskel og en
differential præferencetærskel.
Under-tærskel (adjektiv):
under den absolutte tærskel.
Over-tærskel (adjektiv):
over den absolutte tærskel.
Sensorisk udmattelse:specifik form for sensorisk tilpasning, hvor der forekommer en nedsæt-
telse af følsomheden.
Kompensation (substantiv):
resultat af en vekselvirkning mellem en kombination af stimuli, således at
hver af dem opfattes med mindre intensitet, end hvis den virkede alene.
Synergisk (adjektiv):
samlet effekt eller påvirkning af givne stoffer, hvor intensiteten af de
organoleptiske attributter, der fremkommer som et resultat af kombinati-
onen, overstiger summen af intensiteterne af attributterne taget hver for
sig.
Kontrastvirkning:
forøgelse af reaktionen på forskelle mellem to stimuli, der optræder
samtidig eller lige efter hinanden. Modsat konvergensvirkning.
Konvergensvirkning:
reduktion af reaktionen på forskelle mellem to stimuli, der optræder
samtidig eller lige efter hinanden. Modsat kontrastvirkning.
2.3.Terminologi i relation til organoleptiske egenskaber
Sur(adjektiv):
a) beskriver den primære smag, der fremkaldes af fortyndede vandige
opløsninger af de fleste sure stoffer (f.eks. citronsyre, mælkesyre,
vinsyre)
b) beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, som frem-
bringer denne smag.
Det tilsvarende substantiv er surhed.
Sur(adjektiv):1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 70
▼B
beskriver den lugt- og smagsfornemmelse, hvor de syrer, der generelt
fremkommer ved gæring, er fremherskende, samt de næringsmidler, der
fremkalder denne fornemmelse.
Nogle faktorer, der bidrager til denne fornemmelse, står i forbindelse med
gæring, for eksempel mælkesyregæring eller eddikesyregæring, i et
næringsmiddel.
Bitter (adjektiv):
a) beskriver den primære smag, der fremkaldes af fortyndede vandige
opløsninger af forskellige stoffer som f.eks, kinin, koffein og visse
alkaloider
b) beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, der frem-
kalder denne smag.
Det tilsvarende substantiv er bitterhed.Salt(adjektiv):
a) karakteristisk fornemmelse, der opfattes med smagssansen, det mest
typiske eksempel herpå fremkaldes af natriumchloridopløsning
b) beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, der frem-
kalder denne smag.
Det tilsvarende substantiv er salthed.Sødt (adjektiv):
a) beskriver den primære smag, der fremkaldes af vandige opløsninger af
forskellige stoffer som f.eks. sakkarose
b) beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, der frem-
kalder denne smag.
Det tilsvarende substantiv er sødme.Astringerende:
a) beskriver den komplekse fornemmelse, der fremkaldes i mundhulen af
en fortyndet vandig opløsning af produkter som f.eks. nogle tanniner
(garvesyre) (for eksempel kakitannin og slåentannin)
b) beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, der frem-
kalder denne fornemmelse.
Det tilsvarende substantiv er astringens.Flavour (substantiv):
»flavour« betyder den kombination af olfaktoriske, gustatoriske, taktile og
kinæstetiske fornemmelser, som gør det muligt for en vurderingsmand at
identificere og etablere et gunstigt eller ugunstigt kriterium på flere
niveauer.
Smag (substantiv):
a) fornemmelse der opfattes, når smagspapillerne stimuleres, af opløse-
lige stoffer
b) egenskab hørende til den specifikke fornemmelse, der fremkaldes af
sådanne stoffer.
Primærsmag (substantiv):
enhver af de karakteristiske smage, som der menes at være fire af: sødt,
salt, surt og bittert.
Lugt (substantiv):
a) kombination af fornemmelser, der opfattes af lugteorganet ved
indsnusning af flygtige stoffer
b) egenskab ved den specifikke fornemmelse, der fremkaldes af ethvert
af de ovennævnte stoffer.
Aroma (substantiv):
a) behagelige fornemmelser, som opfattes indirekte af lugteorgenet, når
man smager på madvarer
b) inden for parfumeriet og i ikke-specialiseret sprog bruges denne term
også om de samme fornemmelser opfattet direkte gennem næsen.
Eftersmag, restsmag (substantiv):1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 71
▼B
kombination af fornemmelser opfattet efter at stimulus er forsvundet fra
mundhulen, og som afviger fra de fornemmelser, der opfattedes før.
Aromatisk (adjektiv):
a) beskriver egenskaben ved rene stoffer eller blandinger, som, når de
smages, fremkalder de fornemmelser, der kaldes aroma
b) beskriver de produkter, som når de undersøges direkte via næsen,
fremkalder fornemmelser af vellugt og friskhed.
Stofvirkning (substantiv):
karakteristika ved et produkts faste eller rheologiske tilstand, som i
kombination kan stimulere de mekaniske receptorer under smagningen,
især de receptorer, der er lokaliseret til mundhulen.
Bemærk: Denne term refererer udelukkende til de objektive egenskaber,
ikke til de fornemmelser, der fremkommer, og som betegnes
ved generelle termer som f.eks. konsistens, trævlethed,
fedtethed osv.
Mundskylning:
handling, hvorved føde, der er til stede i munden, kommer i kontakt med
alle de følsomme områder imunden, så at alle de fornemmelser, den
fremkalder, kan opfattes.
Bemærk: Denne ordliste kan udvides ved at studere ISO standard 5492,
del I til V, og andre publikationer som f.eks. J. L. Magnens
publikation med titlen »Les cahiers techniques du Centre Nati-
onal de Coordination des Études et Recherches sur la Nutrition
et l'Alimentation«.
GLAS TIL OLIESMAGNING
1. FORMÅL
Denne standards formål er at beskrive de karakteristiske egenskaber ved
de glas, der er beregnet til brug ved den organoleptiske analyse af spise-
olier (lugt, smag, flavour).
Desuden beskriver den det varmeaggregat, der er nødvendigt for at nå og
opretholde den rette temperatur til denne analyse.
2. BESKRIVELSE AF GLASSET
Tegningen i figur 1 forsøger at fastlægge de optimale karakteristika for et
stykke apparatur af denne art, som kan specificeres således:
a) maksimal stabilitet for at forhindre, at glasset vipper og olien spildes
b) en basis, der passer til fordybningerne i varmeaggregatet, så bunden af
glasset opvarmes jævnt
c) en form, der er bredest ved basis, så oliens flygtige komponenter let
kan frigøres, men som indsnævres ved glassets munding, så de samme
komponenter let koncentreres; derved sikres det, at de opfattes og
identificeres bedre af næsen
d) glasset er lavet af mørkt glas for at forhindre smageren i at opfatte
oliens farve; derved elimineres eventuelle fordomme, og dannelsen af
forudfattede meninger eller tendenser hindres.
2.1.Dimensioner
Glasset er skitseret i figur 1, og det har følgende dimensioner:total kapacitet 130 ml ± 10 ml
total højde 60 mm ± 1 mm
diameter ved munding 50 mm ± 1 mmdiameter på det videste sted 70 mm ± 1 mm
diameter ved basis 35 mm ± 1 mm
glassets tykkelse på siderne 1,5 mm ± 0,2 mmbasis' tykkelse 5 mm ± 1 mmHvert glas skal være udstyret med et urglas, hvis diameter skal være
10 mm større end glassets munding. Dette urglas skal bruges som låg
for at forebygge tab af aroma og tilgang af støv.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 72
▼B
2.2.Fremstillingskarakteristika
Glasene skal være lavet af modstandsdygtigt glas; det skal være mørkt, så
indholdets farve ikke kan skelnes, og det skal være frit for ridser og
bobler.
Kanten skal være jævn, glat og afrundet.Glasset skal være hærdet, så det kan tåle de temperaturforandringer, det
kommer ud for under prøverne.
2.3.Brugsanvisning
Glassene skal rengøres med uparfumeret sæbe eller opvaskemiddel, og de
skal skylles flere gange, indtil rensemidlet er fuldstændig fjernet. Den
sidste skylning skal være med destilleret vand, hvorefter glassene skal
stå og løbe af og derefter tørres ien tørreovn.
Der må hverken benyttes koncentrerede syrer eller blandinger med krom-
syre.
Glassene skal enten stå i ovnen, indtil de skal bruges, eller de skal opbe-
vares iet skab, hvor de skal være beskyttet mod forureni ng fra eventuel
udefra kommende lugt.
Før brugen skal der lugtes til hvert glas for at sikre, at der ikke er nogen
udefra kommende lugt til stede. Mens prøven forberedes, skal man sørge
for at optegne inskriptionen på hvert glas og hvilken olie, det indeholder.
Organisatoren skal være den eneste, der kender denne relation mellem
inskription og olie.
3. ANORDNING TIL OPVARMNING AF PRØVER
Prøverne skal underkastes organoleptisk undersøgelse ved en fastsat
temperatur, som for olier skal være 28 ± 2º C. Til dette formål skal der
installeres en opvarmningsanordning (se figur 2) inden for smagerens
rækkevidde i hver bås. Den består af en aluminiumblok nedsænket i et
termostatreguleret vandbad, hvor der opretholdes en konstant temperatur.
Denne blok har en række fordybninger, som glassenes bund passer ned i.
Temperaturforskellen mellem opvarmningsanordningen og den olie, der
er ide glas, der er i ndsat ifordybni ngerne ide forskelli ge blokke, må
ikke være større end ± 2º C.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 73
▼B
Figur 1 — Smageglas
Dimensioner (in mm)1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 74
▼B
Figur 2 — Anordning til opvarmning af prøver (dimensioner i mili-
meter)
VEJLEDNING I INDRETNING AF ET PRØVELOKALE
1. INDLEDNING
Prøvelokalet udformes, så det giver det panel, der deltager i de sensoriske
prøver, et egnet, behageligt, standardiseret miljø, der letter arbejdet og
hjælper med til at forbedre resultaternes repeterbarhed og reproducer-
barhed.
2. FORMÅL
Denne standards formål er at specificere de basale betingelser, der skal
opfyldes ved indretningen af et prøvelokale.
3. GENERELLE SPECIFIKATIONER FOR INDRETNINGEN
Lokalerne skal, uanset deres størrelse (se 3.1), opfylde følgende specifika-
tioner:1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 75
▼B
De skal være behagelige og passende oplyst (se 3.2), men i neutral stil.
Til dette formål anbefales en beroligende, klar, lys farve til væggene, så
der skabes en afslappet atmosfære (1).
Lokalerne skal være lette at rengøre, og de skal være adskilt fra eventu-
elle støjkilder, derfor skal de helst være lydisolerede. De skal også holdes
fri for udefra kommende lugte; derfor skal de, hvis det er muligt, udstyres
med effektiv ventilation. Hvis svingningerne i den ydre temperatur gør
det nødvendigt, skal prøvelokalet være udstyret med air conditioning for
at holde temperaturen tæt på 20—22º C.
3.1.Dimensioner
Lokalernes dimensioner afhænger ofte af laboratoriets eller firmaets
muligheder. Generelt bør de være tilstrækkelig rummelige til at mulig-
gøre indretningen af ti båse og et område til tilberedning af prøverne.
Det er dog klart, at jo større et areal, der reserveres til indretning af
prøvelokalet, des bedre, da hjælpeområder så kan indrettes, f.eks. til
rengøring af apparatur, til kulinariske forberedelser og til samlingssted
for åbne paneler.
3.2.Belysning
Den almindelige belysning, hvad enten den kommer fra sollys eller
lamper (f.eks. lysstofrør), skal være ensartet, kontrollerbar og diffus.
3.3.Temperatur- og fugtighedsforhold
Lokalerne skal konstant holdes på en behagelig temperatur og under
behagelige hygrometriske betingelser. Bortset fra helt specielle omstæn-
digheder anbefales en temperatur på 20—22º C og hygrometriske
betingelser på 60—70 % relativ fugtighed.
4. BESKRIVELSE AF BÅSENE4.1.Almindelige karakteristika
Båsene til sensorisk analyse skal være placeret ved siden af hinanden i
lokalerne. De skal være ens, og de skal være adskilt af skillevægge, som
skal være tilstrækkelig høje og brede til at isolere smagerne, når de sidder
ibåsene.
Båsene kan være lavet af et hvilket som helst egnet materiale, som er let
at rengøre og vedligeholde (f.eks. træ, glasovertrukket krydsfiner, lami-
neret træ og lignende). Hvis der benyttes maling, skal den være
fuldstændig lugtfri, når den er tør.
Stolene i båsene skal være behagelige, og de skal kunne indstilles i
højden.
Hver bås skal også have individuel belysning, hvis retning og intensitet
kan indstilles.
Det må stærkt anbefales, at båsene udstyres med en knap, der står i
forbindelse med en udvendig lampe, så smageren kan meddele den tjenst-
gørende udenfor, at han er færdig med prøven, ønsker flere prøver, savner
et stykke apparatur, har bemærket en eller anden uregelmæssighed eller
har behov for oplysninger osv., uden at distrahere de andre smagere.
4.2.Dimensioner
Båsene skal være tilstrækkelig store og komfortable. I almindelighed skal
de have følgende dimensioner:
— bredde:
0,75 m (uden vask)0,85 m (med vask)
— længde:
0,50 m (bord)0,20 m ekstra til skillevæg
— skillevæggenes højde:
mindst 0,60 m fra bord1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 76
(1) Lokalets farveskema og dets belysning kan påvirke resultaterne af den sensoriske
analyse.
▼B
— bordets højde:
0,75 m.
4.3.Indretning
Bordoverfladen skal være let at rengøre.En del af denne overflade skal benyttes til en vask forsynet med rindende
drikkevand. Hvis dette ikke kan lade sig gøre, kan denne plads dog
benyttes til en spyttebakke, spytkumme eller lignende.
Når prøverne skal opbevares ved en konstant temperatur over eller under
stuetemperatur, mens smagningen forgår, er det tilrådeligt at have en
egnet anordning til dette formål (vandbad, varmeplade e.lign.).
Der kan også sættes en hylde op ien højde af ca. 1,10 meter fra gulvet ti l
placering af forskelligt tilbehør (glas, små apparater osv.).
Hvis indretningen af båsene i prøvelokalet gør det muligt, kan det betale
sig at installere en anordning til at lette præsentationen af prøverne. Den
kan være i form af en skydelem (figur 1), en drejelig lodret anordning,
som egner sig til glas eller kopper (høje beholdere) (figur 2), eller en
luge, der åbnes horisontalt, når de beholdere, der indeholder prøverne, er
små (figur 3). Det er simpelt hen et spørgsmål om at sikre, at åbningen er
stor nok til, at bakker og glas med prøver kan passere igennem den.
5. EKSTRA LOKALER
Hvis der er tilstrækkelig plads, er det tilrådeligt at indrette særlige lokaler
til tilberedning af prøver (kulinarisk eller på anden måde), til at arrangere
glas eller apparatur og til diskussioner før eller efter smagningen. Hvis
sådanne lokaler er til rådighed, skal de holdes rene, og lugte, støj eller
samtaler fra disse lokaler må på ingen måde forstyrre smagernes arbejde
iprøvelokalet.
Et eksempel på et prøvelokale med yderligere lokaler ses på figur 4.Bemærk: Her er ideelle forhold beskrevet. Hvis det ikke er muligt at
holde en sådan installation udelukkende til sensorisk analyse,
kan prøverne dog udføres i lokaler, der opfylder de minimums-
krav, der her er beskrevet (belysning, temperatur, støj, lugte),
ved at der opsættes transportable båse, fremstillet af foldeele-
menter, således at de i det mindste isolerer smagerne fra
hinanden.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 77
▼B
BÅSENS INDRETNING
Figur 1
1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 78
▼B
DREJELIG ANORDNING TIL PRÆSENTATION AF PRØVER
Figur 2
1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 79
▼B
LEM TIL PRÆSENTATION AF PRØVER
Figur 3
1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 80
▼B
Figur 4 — eksempel på et prøvelokale
1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 81
▼B
BILAG XIII
NEUTRALISATION OG BLEGNING AF OLIVENOLIE I LABORATO-
RIET
1. NEUTRALISATION OG BLEGNING AF OLIVENOLIE I LABORA-
TORIET
1.1.Neutralisation af olie
1.1.1. Apparatur
— højt 300 ml bægerglas
— laboratoriecentrifuge med 100 ml reagensglas— 250 ml bægerglas
— 100 ml kolber
— dekantertragt til 1 liter.
1.1.2. Reagenser
— vandig natriumhydroxidopløsning på 12 %
— ethanolopløsning på 1 % af phenolphtalin
— analyseren hexan
— analyseren isopropylalkohol.
1.1.3. Fremgangsmåde
a)Olier af en surhedsgrad, udtrykt i oliesyre, på under 30 %
50 g råolie hældes i et højt 300 ml bægerglas og opvarmes til 65º C i
vandbad. Under langsom bevægelse tilsættes en mængde natriumhydr-
oxid på 12 % svarende til oliens indhold af frie fedtsyrer, med et
overskud på 5 %. Omrøringen fortsættes i fem minutter, idet der
opretholdes en temperatur på 65º C.
Det hele omhældes i 100 ml reagensglas til centrifugering og sæbe-
massen udskilles ved centrifugering. Den dekanterede olie hældes i et
250 ml bægerglas og vaskes med 50—60 ml destilleret kogende vand,
idet det vandholdige lag fjernes ved hjælp af en hævert. Vaskningerne
gentages, indtil sporene af sæberester er fuldstændig forsvundet (indtil
phenolphtaleinets rosa farve er forsvundet).
Olien centrifugeres for at fjerne de små restmængder af vand.
b)Olier af en surhedsgrad, udtrykt i oliesyre, på over 30 %
I en dekantertragt til en liter hældes 50 g råolie, 200 ml hexan, 100 ml
isopropylalkohol, og en så stor mængde natriumhydroxidopløsning på
12 %, som svarer til oliens indhold af frie fedtsyrer, med et overskud
på 0,3 %. Der omrøres kraftigt i 1 minut. Derefter tilsættes 100 ml
destilleret vand; der omrøres på ny, og man lader væsken stå.
Efter lagdelingen lader man det nederste lag, der indeholder sæberne,
løbe af. Mellem de to lag (olieholdigt foroven og vandholdigt
forneden) dannes der ofte et mellemlag, som består af planteslim og
uopløselige stoffer, og som ligeledes skal fjernes.
Derefter vaskes hexanopløsningen af syrefri olie med portioner,
bestående af 50—60 ml af en opløsning af isopropylalkohol og destil-
leret vand i forholdet 1: 1 (v/d), indtil phenolphtaleinets rosa farve
forsvinder. Derpå fjernes hexanet fuldstændigt ved afdestillering i
vakuum (for eksempel ved hjælp af en rotationsfordamper).
1.2.Blegning af den neutraliserede olie
1.2.1. Apparatur
— 250 ml kolbe med tre slebne halse, der gør det muligt at indsætte:
a) et gradinddelt termometer, der kan aflæses op til 90º C
b) et mekanisk røreapparat med 250—300 omdrejninger i minuttet og
udstyret til at fungere i vakuum
c) et forbindelsesstykke til vakuumpumpen
— vakuumpumpe udstyret med manometer og i stand til at give residual-
tryk på 15—30 milibar.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 82
▼M6
▼B
▼B
1.2.2. Fremgangsmåde
I trehalsekolben afvejes ca. 100 g af den neutraliserede olie. Termometret
og røreapparatet indsættes; vakuumpumpen tilsluttes og olien opvarmes
under omrøring indtil 90º C. Denne temperatur holdes under stadig omrø-
ring, indtil den olie, der skal analyseres, er fuldstændig befriet for sit
vandindhold (ca. 30 minutter).
Vakuum brydes og der tilsættes 2 à 3 g aktiveret jord. Vakuum genop-
rettes, indtil der opnås et residualtryk på 15—30 milibar, og der omrøres
stadig ved en temperatur på 90º C i 30 minutter med ca. 250 omdrej-
ninger i minuttet.
Dernæst filtreres ved varme i et termostatisk reguleret tørreskab (50—60º
C).1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 83
▼M6
BILAG XIV
SUPPLERENDE BESTEMMELSER NR. 2, 3 OG 4 TIL KAPITEL 15 I
DEN KOMBINEREDE NOMENKLATUR
2. A. Under KN-kode 1509 og 1510 henhører kun olie, som udelukkende er
fremstillet af oliven, hvis analytiske karakteristika med hensyn til fedt-
syre- og sterolindhold er som anført nedenfor.
Tabel I: Fedtsyreindhold i vægtprocent af fedtsyrer
ialtTabel II: Sterolindhold i vægtprocent af steroler i
alt
Myristinsyre M 0,1 Kolesterol M 0,5
Linolensyre M 0,9 Brassicasterol M 0,2
Arachinsyre M 0,7 Campesterol M 4,0
Eicosansyre M 0,5 Stigmasterol (1) < Campesterol
Behensyre M 0,3 β-sitosterol (2) m 93,0
Lignocerinsyre M 0,5 ∆-7-stigmasterol M 0,5
m = minimum
M = maksimum
(1) Betingelsen gælder ikke for bomolie (pos. 1509 10 10) eller for rå olie af olivenpresserester (pos.
1510 00 10).
(2)∆-5, 23-stigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + ∆-5-avenasterol + ∆-5, 24-stigmasta-
dienol.
Kemisk modificeret olivenolie (især reesterificeret olie) og blandinger af
olivenolie med anden olie henhører ikke under KN-kode 1509 og 1510.
Tilstedeværelsen af reesterificeret olivenolie eller anden olie konstateres
efter metoderne i bilag V, VII, X A og X B til forordning (EØF) nr.
2568/91.
B. Under pos. 1509 10 henhører kun olivenolie som defineret i punkt I og II
nedenfor, der udelukkende er fremstillet ved mekaniske eller andre
fysiske processer under betingelser — især varmebetingelser — uden
indflydelse på oliens sammensætning, og som ikke har undergået anden
behandling end vask, bundfældning, centrifugering og filtrering. Olie
fremstillet af oliven ved hjælp af opløsningsmidler henhører under KN-
kode 1510).
I. Som »bomolie« (pos. 1509 10 10) betragtes uanset syreindholdet olie
med følgende karakteristika:
a)►M9et voksindhold ◄på ikke over ►M9350◄mg/kg
b) et indhold af erytrodiol og uvaol på ikke over 4,5 %
c) et indhold af mættede fedtsyrer i triglyceriderne i 2-stillingen på
ikke over 1,3 %
d) summen af transoleinisomerer udgør under 0,10 % og summen af
translinolisomerer + translinolenisomerer udgør under 0,10 %
e) samt et eller flere af følgende karakteristika:
1) et peroxidtal på over 20 mekv aktiv oxygen/kg
2) et indhold af flygtige, halogenerede opløsningsmidler på i alt
0,2 mg/kg eller over 0,1 mg/kg for mindst et af dem
3) en ekstinktionskoefficient K270, der er på over 0,25, og som
efter behandling med aktiveret aluminiumoxid ikke er på over
0,11. Olie med et indhold af frie fedtsyrer, beregnet som olie-
syre, på over 3,3 g/100 g kan nemlig efter behandling med
aktiveret aluminiumoxid efter metoden i bilag IX til forordning
(EØF) nr. 2568/91 have en ekstinktionskoefficient K270på over
0,10. I så fald skal olien efter neutralisation og blegning i labo-
ratoriet efter metoden i bilag XIII til forordning (EØF) nr.
2568/91 have følgende karakteristika:
— en ekstinktionskoefficent K270på ikke over 1,20
— en variation ( ∆K) i ekstinktionskoefficienten i bølgelæng-
deområdet omkring 270 nm på over 0,01, men ikke over
0,16
hvor ∆K= Km− 0,5 (Km−4+Km+4)1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 84
▼M6
Km= er ekstinktionskoefficienten for de i
området omkring 270 nm liggende
bølgelængder, som ligger i absorpti-
onskurvens maksimum
Km−4og Km+4= er ekstinktionskoefficienterne for
bølgelængder, der ligger henholdsvis
4 nm lavere eller højere end ved Km
4) organoleptiske egenskaber, der indbefatter påviselige mangler,
som overstiger grænserne for det acceptable, og en panelbe-
dømmelse, som giver under 3,5 point, jf. bilag XII til
forordning (EØF) nr. 2568/91.
II. Som »anden jomfruolie« (pos. 1509 10 90) betragtes olivenolie med
følgende karakteristika:
a) et syreindhold, beregnet som oliesyre, på ikke over 3,3 g/100 g
b) et peroxidtal på ikke over 20 mekv aktiv oxygen/kg
c)►M9et voksindhold ◄på ikke over ►M9250◄mg/kg
d) et indhold af flygtige, halogenerede opløsningsmidler på i alt 0,2
mg/kg og for hvert af dem et indhold på ikke over 0,1 mg/kg
e) en ekstinktionskoefficient K270, der er på ikke over 0,25, og som
efter behandling med aktiveret aluminiumoxid ikke er på over 0,10
f) en variation ( ∆K) i ekstinktionskoefficienten i bølgelængdeområdet
omkring 270 nm på ikke over 0,01
g) organoleptiske egenskaber, der indbefatter påviselige mangler, som
overstiger grænserne for det acceptable, og en panelbedømmelse,
som giver 3,5 point eller derover, jf. bilag XII til forordning
(EØF) nr. 2568/91
h) et indhold af erytrodiol og uvaol på ikke over 4,5 %
i) et indhold af mættede fedtsyrer i triglyceriderne i 2-stillingen på
ikke over 1,3 %
j) summen af transoleinisomerer udgør under 0,03 % og summen af
translinolisomerer + translinolenisomerer udgør under 0,03 %
C. Under pos. 1509 90 00 henføres olivenolie fremstillet af olier henhørende
under pos. 1509 10 10og/eller 1509 10 90, også blandet med jomfruolie,
og som har følgende karakteristika:
a) et syreindhold, beregnet som oliesyre, på ikke over 3,3 g/100 g
b)►M9et voksindhold ◄på ikke over 350 mg/kg
c) en ekstinktionskoefficient K270på ikke over 1,20
d) variationer i ekstinktionskoefficienten ( ∆K) ibølgelængdeområdet
omkring 270 nm på ikke over 0,16
e) et indhold af erytrodiol og uvaol på ikke over 4,5 %
f) et indhold af mættede fedtsyrer i triglyceriderne i 2-stillingen på ikke
over 1,5 %
g) summen af transoleinisomerer udgør under 0,20 % og summen af
translinolisomerer + translinolenisomerer udgør under 0,30 %.
D. Som »rå olie« (pos. 1510 00 10) betragtes olie, bl.a. olie af olivenpresse-
rester, som har følgende karakteristika:
a) et syreindhold, beregnet som oliesyre, på mindst 2 g/100 g
b) et indhold af erytrodiol og uvaol på mindst 12 %
c) et indhold af mættede fedtsyrer i triglyceriderne i 2-stillingen på ikke
over 1,8 %
d) summen af transoleinisomerer udgør under 0,20 % og summen af
translinolisomerer + translinolenisomerer udgør under 0,10 %
E. Under pos. 1510 00 90 henføres såvel olie fremstillet ved behandling af
olier henhørende under pos. 1510 00 10, også blandet med jomfruolie,som olie, der ikke har de i bestemmelse nr. 2 B, 2 C og 2 D omhandlede
karakteristika. Olie henhørende under denne pos. skal have et indhold af
mættede fedtsyrer i triglyceriderne i 2-stillingen på ikke over 2 %, og
summen af på under 0,40 % og summen af translinolisomerer + translino-
lenisomerer på under 0,35 %.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 85
▼M9
▼M6
▼M6
3. Pos. 1522 00 31 og 1522 00 39 omfatter ikke følgende:
a) restprodukter fra behandling af fedtstoffer, som indeholder olie, hvis
jodtal som bestemt efter metoden i bilag XVI til forordning (EØF) nr.
2568/91 er under 70 eller over 100
b) restprodukter fra behandlingen af fedtstoffer, som indeholder olie, hvis
jodtal er mellem 70 og 00, men hvor arealet af den top, der svarer til
retentionstiden for β-sistosterol (1) som bestemt efter bilag V i forordning
(EØF) nr. 2568/91 udgør mindre end 93 % af summen af steroltoppenes
arealer.
4. Til bestemmelse af ovenstående produkters karakteristika anvendes analyse-
metoderne i bilagene til forordning (EØF) nr. 2568/91.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 86
(1)∆-5, 23-stigmastadienol + clerosterol − β-sitosterol + sitostanol + ∆-5-avenasterol +
∆5, 24 -stigmastadienol.
▼B
BILAG XV
1. OLIEINDHOLD I PRESSERESTER AF OLIVEN
1.1.Apparatur
— Egnet ekstraktionsapparat, forsynet med en 200—250 ml kolbe.
— Elektrisk opvarmet bad (sandbad, vandbad, osv.) eller varmeplade.
— Analysevægt.
— Ovn, der er indstillet til højst 80º C.
— Elektrisk ovn med temperaturregulering, der kan indstilles til 103º C
± 2º C, og som muliggør luftindblæsning eller vakuum.
— Mekanisk mølle, der er let at rengøre, egnet til olivenoliekager, og som
er i stand til at male uden opvarmning eller mærkbar reduktion af
indholdet af vand, af flygtige stoffer og af stoffer, der kan uddrages
ved hjælp af hexan.
— Ekstraktionshylster og vat eller filterpapir, fri for substanser, der kan
uddrages ved hjælp af hexan.
— Ekssikkator.
— Sigte med huller på 1 mm i diameter.
— Pimpsten i små korn, tørret.
1.2.Reagens
Teknisk n-hexan, hvis fordampningsrest ved fuldstændig fordampning er
mindre end 0,002 g/100 ml.
2. FREMGANGSMÅDE
2.1.Tilberedning af prøven
Om nødvendigt males analyseprøven i den mekaniske mølle, der skal være
omhyggeligt rengjort på forhånd, således at prøven kan reduceres til små
partikler, der kan passere sien fuldstændigt.
Ca. en tyvendedel af prøven anvendes til en fuldstændig rengøring af
møllen; denne formalede del bortkastes, og resten males, opsamles og
blandes med omhu, hvorefter analysen straks foretages.
2.2.Prøvemængde
Der afvejes med 0,01 g nøjagtighed ca. 10 g af analyseprøven til prøve-
mængde, når formalingen er afsluttet.
2.3.Tilberedning af ekstraktionshylstret
Prøvemængden anbringes i hylstret, og dette lukkes med vandsugende vat.
Såfremt der anvendes filterpapir, indpakkes prøven i dette papir.
2.4.Fortørring
Hvis presseresterne er meget fugtige (indhold af vand og flygtige stoffer på
over 10 %), foretages der en fortørring, idet det fyldte hylster (eller filter-
papir) anbringes en passende tid i ovnen, der højst kan opvarmes til 80º C,
således at indholdet af vand og flygtige stoffer bringes ned under 10 %.
2.5.Tilberedning af kolben
Kolben, der indeholder 1 à 2 pimpstenskorn, og som på forhånd er tørret i
ovnen ved en temperatur på 103º C ± 2º C og derefter afkølet mindst 1
time i ekssikkatoren, vejes med 1 mg nøjagtighed.
2.6.Første ekstraktion
Hylstret (eller filterpapiret), der indeholder prøvemængden, anbringes i
ekstraktionsapparatet. Den nødvendige mængde hexan hældes i kolben.
Kolben tilsluttes ekstraktionsapparatet, og det hele anbringes i det elektrisk
opvarmede bad. Opvarmningen reguleres således, at tilbageløbsmængden
udgør mindst tre dråber i sekundet (moderat, ikke stærk kogning).
Efter fire timers ekstraktion foretages afkøling. Hylstret udtages af ekstrak-
tionsapparatet og anbringes i en luftstrøm for at fjerne størstedelen af det
indeholdte opløsningsmiddel.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 87
▼B
2.7.Anden ekstraktion
Hylstret tømmes i mikromøllen, og der males så fint som muligt.
Anbring mængdemæssigt blandingen påny i hylstret og dette i ekstraktions-
apparatet.
Ekstraktionen begyndes påny, og den fortsættes endnu to timer, idet kolben
med forrige ekstraktion anvendes.
Den opløsning, der opnås i ekstraktionskolben, skal være gennemsigtig.
Såfremt dette ikke er tilfældet, filtreres der på et stykke filterpapir, idet
den første kolbe og filterpapiret gentagne gange vaskes med hexan. Filtratet
og afvaskningsopløsningen opsamles i en særskilt kolbe, der på forhånd er
tørret og vejet med 1 mg nøjagtighed.
2.8.Eliminering af opløsning og vejning af ekstraktet
Størstedelen af opløsningsmidlet fjernes ved destillation i elektrisk
opvarmet vandbad. De sidste rester af opløsningsmidlet fjernes ved at
opvarme kolben iovnen ved 103º C ± 2º C i20 mi nutter. Fordampni ngen
fremskyndes enten ved indblæsning af luft eller, bedre, inaktiv gas fra tid
til anden eller ved anvendelse af vakuum.
Kolben afkøles i ekssikkatoren i mindst 1 time, og den vejes med 1 mg
nøjagtighed.
Der opvarmes på ny i10 mi n. under samme forhold, hvorefter kolben
afkøles iekssi kkator og vejes.
Forskellen mellem to vejninger må ikke overstige 10 mg. I modsat fald
opvarmes der på ny i perioder på ti minutter med efterfølgende afkøling
og vejning, indtil forskellen i masse er højst 10 mg. Den sidste vejning af
kolben noteres.
Der foretages to bestemmelser.
3. UDFORMNING AF RESULTATER3.1.Beregning og formler
a) Ekstraktet udtrykt imasseprocent af produktet som leveret er li g med:
S=m
1×100
m0
hvor:
S = masseprocent af produktet som leveret
m0= massen igram af den udtagne prøvemængde
m1= massen igram af ekstraktet efter tørri ng
Som resultat tages det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser,
såfremt ingen gentagelse af bestemmelsen er nødvendig.
Resultatet udtrykkes med en decimal
b) Ekstraktet kan udtrykkes i relation til tørstoffet ved anvendelse af
følgende formel:
S×100
100 − U= ekstrakt i% fedtstof/tørstof
hvor:
S = masseprocent for ekstraktet af produktet som leveret (jf. a))
U = indhold af vand og flygtige stoffer.
3.2.Reproducerbarhed
Forskellen mellem resultaterne af de to samtidigt eller umiddelbart efter
hinanden af samme analytiker foretagne bestemmelser, må ikke overstige
0,2 g ekstrakt ved hexan for 100 g prøve.
I modsat fald gentages analysen på to andre prøvemængder. Hvis forskellen
også denne gang overstiger 0,2 g, tages som resultat det aritmetiske
gennemsnit af de fire bestemmelser.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 88
▼B
BILAG XVI
BESTEMMELSE AF IODTAL
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne internationale standard specificerer en metode til bestemmelse af
iodtallet i animalske og vegetabilske fedtstoffer og olier, i det følgende be-
nævnt fedtstoffer.
2. DEFINITION
Ved anvendelsen af denne internationale standard gælder følgende defini-
tion.
2.1. Iodtal: den mængde iod, der absorberes af prøven under de arbejdsbetin-
gelser, der er specificeret i denne internationale standard.
Iodtallet udtrykkes som g iod pr. 100 g prøve.
3. PRINCIP
En prøve opløses i opløsningsmiddel, og der tilsættes Wijs reagens. Efter
en nærmere fastsat tid tilsættes kaliumiodidopløsning og vand, og det
frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatopløsning.
4. REAGENSER
Alle reagenser skal være anerkendt analysekvalitet.
4.1. Vand, skal opfylde kravene iISO 3696, grad 3.
4.2. Kaliumiodid — 100 g/l opløsning, der ikke indeholder iodat eller frit iod.4.3. Stivelseopløsning.
5 g opløselig stivelse blandes i 30 ml vand, denne blanding tilsættes
1 000 ml kogende vand efterfulgt af kogning i 3 min. og afkøling.
4.4. Natriumthiosulfat — standardopløsning.
c(Na
2S2O3×5 H2O) = 0,1 mol/l, som er standardiseret højst syv dage inden
brug.
4.5. Opløsningsmiddel — tilberedes ved blanding af lige dele cyclohexan og
eddikesyre.
4.6. Wijs reagens — indeholder iodmonochlorid i eddikesyre. Der benyttes
kommercielt Wijs reagens.
5. APPARATUR
Normalt laboratorieudstyr og navnlig følgende:
5.1. Vejeskeer af glas, der passer til prøven og kan anbringes i kolberne (5.2).
5.2. Erlenmeyer-kolber, 500 ml, der er forsynet med slebne glaspropper og er
helt tørre.
6. FORBEREDELSE AF ANALYSEPRØVEN
Den homogeniserede prøve tørres på natriumsulfat og filtreres.
7. FREMGANGSMÅDE
7.1.Prøven
Prøvens størrelse varierer alt efter dens forventede iodtal, jf. tabel 1.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 89
▼B
Tabel 1
Forventet iodtal Prøvens størrelse
under 5 3,00 g
5— 20 1,00 g
21— 50 0,40 g
51—100 0,20 g
101—150 0,13 g
151—200 0,10 g
Prøven afvejes til nærmeste 0,1 mg i en glasske (5.1).
7.2.Bestemmelse
Prøven kommes i en 500 ml kolbe (5.2). Der tilsættes 20 ml opløsnings-
middel (4.5) for at opløse fedtstoffet. Der tilsættes nøjagtig 25 ml Wijs
reagens (4.6), proppen sættes i, indholdet omrystes med en roterende bevæ-
gelse, og kolben anbringes i mørke. Der må ikke benyttes mundpipette til
Wijs reagenset.
På tilsvarende måde forberedes der en blindprøve med opløsningsmidlet og
reagenset, men prøven udelades.
Når det gælder prøver med et iodtal på under 150, skal kolberne henstå i
mørke i 1 time. Når det gælder prøver med et iodtal på over 150, polyme-
riserede produkter eller kraftigt iltede produkter, skal kolberne henstå i 2
timer.
Derefter tilsættes hver af kolberne 20 ml kaliumiodidopløsning (4.2) og
150 ml vand (4.1).
Der titreres med natriumthiosulfat i standardopløsning (4.4), indtil den gule
farve, der skyldes iodet, næsten er forsvundet. Der tilsættes nogle få dråber
stivelsesopløsning (4.3), og titreringen fortsætter, indtil den blå farve lige
akkurat forsvinder efter meget kraftig omrystning.
Note: Potentiometrisk bestemmelse af slutpunktet kan tillades.
7.3.Antal bestemmelser
Der foretages to bestemmelser af samme prøve.
8. ANGIVELSE AF RESULTATER
Iodtallet angives som
12;69/C2c/C2V1/C0V2 ðÞ
mhvor
c = den numeriske værdi af den eksakte koncentration (mol/l) af den
benyttede natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
V1= den numeriske værdi af den til blindprøven benyttede mængde (ml)
natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
V2= den numeriske værdi af den til bestemmelsen benyttede mæmgde
(ml) natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
m = den numeriske værdi af prøvens størrelse (g) (7.1).
Resultatet betragtes som det artimetiske gennemsnit af de to bestemmelser
under forudsætning af, at repeterbarhedskravet er opfyldt.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 90
▼M11
BILAG XVII
METODE TIL BESTEMMELSE AF STIGMASTADIENER I VEGETA-
BILSKE OLIER
1. FORMÅL
Bestemmelse af stigmastadiener i vegetabilske olier indeholdende lave
koncentrationer af disse kulbrinter, navnlig i jomfruolie og råolie af
olivenpresserester.
2. OMRÅDE
Metoden kan anvendes på alle vegetabilske olier, selv om målinger kun
er pålidelige, hvis indholdet af de pågældende kulbrinter er på mellem
0,01 og 4,0 mg/kg. Metoden er særligt velegnet til at påvise tilstedevæ-
relsen af raffinerede vegetabilske olier (oliven, olivenrester, solsikke,
palme osv.) i jomfruolie, da raffinerede olier indeholder stimastadiener,
og jomfruolie ikke gør det.
3. PRINCIP
Isolation af uforsæbelige stoffer. Separation af den steroide kulbrintefrak-
tion ved søjlekromatografi på silicagel og analyse ved
kapillargaskromatografi.
4. APPARATUR
4.1. 250 ml kolber, der er egnet til brug med tilbagesvaler4.2. Skilletragte, kapacitet 500 ml
4.3. 100 ml rundbundede kolber
4.4. Rotationsfordamper4.5. Kromatografisøjle af glas (1,5-2,0 cm indvendig diameter × 50 cm
længde) med teflonprop og en tot glasuldsfibre eller sintret glasskive i
bunden. Til tilberedning af en silicagelsøjle hældes hexan på kromatogra-
fisøjlen til en dybde på ca. 5 cm, hvorefter der fyldes op med en
opslæmning af silicagel i hexan (15 g i 40 ml) ved hjælp af små mængderhexan. Henstilles til bundfældning, som afsluttes med let sammenryst-
ning. Der tilsættes vandfrit natriumsulfat til en højde på ca. 0,5 cm, og
til slut elueres den overskydende hexan.
4.6. Gaskromatograf med flammeioniseringsdetektor, splitinjektor eller kold
»on column«-injektor og en ovn, der kan programmeres til en nøjagtighed
på ± 1 ºC.
4.7. Kapillarsøjle med sintret silica til gaskromatografi (0,25 eller 0,32 mm
indvendig diameter × 25 m længde) belagt med en 5 % phenylmethylsili-
conefase, 0,25 µm filmtykkelse.
Note 1.
Der kan bruges andre søjler med lignende eller lavere polaritet.
4.8. Skriver/integrator med mulighed for integration over hver enkelt top.4.9. 5-10 µl mikroinjektionssprøjte til gaskromatografi med cementeret nål.
4.10. Elektrisk varmekappe eller varmeplade.
5. REAGENSER
Alle reagenser bør være af analytisk renhed, medmindre andet er angivet.
Det benyttede vand bør være destilleret vand eller vand af mindst tilsva-
rende renhed.
5.1. Hexan eller blanding af alkaner med kogepunktsinterval på 65-70 ºC
destilleret med rektificeringssøjle.
Note 2.
Opløsningsmidlet skal være destilleret for at fjerne urenheder.
5.2. 96 v/v ethanol.5.3. Vandfrit natriumsulfat.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 91
▼M11
5.4. 10 % alkoholisk kaliumhydroxidopløsning. Der tilsættes 10 ml vand til
50 g natriumoxid og omrøres. Derpå opløses blandingen i ethanol til
500 ml.
Note 3.
Alkoholisk kaliumhydroxid bliver brun ved henstand. Den bør tilberedes
frisk hver dag og opbevares i godt tilproppede, brune glasflasker.
5.5. Silicagel 60 til søjlekromatografi, 70-230 mesh (Merck ref. 7734 el.lign.).
Note 4.
Normalt kan silicagel bruges direkte fra beholderen uden behandling.
Imidlertid kan nogle batcher silica vise lav aktivitet, som giver ringe
kromatografiske separationer. Derfor bør silicagelen behandles således:
Silicagelen deaktiveres ved opvarmning i mindst fire timer ved 550 ºC.
Efter opvarmning anbringes silicagelen i en ekssikator, hvor gelen
afkøler, og derefter overføres silicagelen til en kolbe med prop. Der
tilsættes 2 % vand og omrystes, til der ikke længere kan ses klumper,
og pulveret flyder frit.
Hvis batcher af silicagel giver kromatogrammer med interfererende toppe,
bør silicagelen behandles som beskrevet ovenfor. Som alternativ kan der
benyttes ekstraren silicagel 60 (Merck ref. 7754).
5.6. Stamopløsning (200 ppm) af cholesta-3,5-dien (Sigma, 99 % renhed) i
hexan (10 mg i50 ml).
5.7. Standardopløsning af cholesta-3,5-dien i hexan ved en koncentration på
20 ppm fremkommet ved fortynding af ovennævnte opløsning.
Note 5.
Hvis opløsninger som nævnt i 5.6 og 5.7 holdes ved under 4 ºC, forringes
de i kke iløbet af ihvert fald de første fi re måneder.
5.8. Opløsni ng af n-nonacosan ihexan ien koncentrati on på ca. 100 ppm.
5.9. Bæregas til kromatografi: helium eller hydrogen af 99,9990 % renhed.
5.10. Hjælpegasser til flammeioniseringsdetektor: hydrogen af 99,9990 %
renhed og renset luft.
6. FREMGANGSMÅDE6.1.Fremstilling af uforsæbeligt stof:
6.1.1. 20 ± 0,1 g olie afvejes i en 250 ml kolbe (4.1), der tilsættes 1 ml af stan-
dardopløsningen af cholesta-3,5-dien (20 µg) og 75 ml 10 % alkoholisk
kaliumhydroxid, 10 %. Tilbagesvaleren påsættes, og der opvarmes til
svag kogning i 30 minutter. Kolben med prøven fjernes fra varmekilden,
og man lader opløsningen køle lidt (den må ikke afkøles helt, da prøven
så vil stivne). Der tilsættes 100 ml vand, og opløsningen overføres til en
skilletragt (4.2) ved hjælp af 100 ml hexan. Blandingen rystes kraftigt i
30 sekunder, hvorefter man lader den henstå, så lagene kan skilles.
Note 6.
Hvis der dannes en emulsion, som ikke hurtigt forsvinder, tilsættes der
små mængder ethanol.
6.1.2. Den nedre vandige fase overføres til en anden skilletragt, og der ekstra-
heres igen med 100 ml hexan. Man lader igen den nedre fase løbe af, og
hexanekstrakterne vaskes (samlet ien anden ski lletragt) tre gange med
hver gang 100 ml blanding af ethanol-vand (1: 1), indtil der opnås neutral
pH-værdi.
6.1.3. Hexanopløsningen passeres gennem vandfrit natriumsulfat (50 g), vaskes
med 20 ml hexan og inddampes i en rotationsfordamper ved 30 ºC og
lavt tryk, indtil den er tør.
6.2.Separation af den steroide kulbrintefraktion:
6.2.1. Det tilbageværende overføres til fraktioneringssøjlen ved hjælp af to 1 ml-
portioner hexan. Man lader væskeniveauet falde til toppen af natriumsul-
fatet, og den kromatografiske eluering startes med hexan ved en
hastighed på ca. 1 ml/min. De første 25-30 ml af elueringen kasseres, og
den følgende 40 ml fraktion opsamles. Efter opsamlingen overføres denne
fraktion til en 100 ml rundbundet kolbe (4.3).1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 92
▼M11
Note 7.
Den første fraktion indeholder mættede kulbrinter (jf. figur 1a) og den
anden fraktion de steroide kulbrinter. Yderligere eluering giver squalen
og relaterede forbindelser. For at opnå god separation mellem mættede
og steroide kulbrinter kræves der optimering af fraktioneringsmængderne.
Med henblik herpå justeres mængden af den første fraktion således, at når
den anden fraktion analyseres, er de toppe, som repræsenterer de mættede
kulbrinter, lave (jf. figur 1c). Hvis sådanne ikke fremkommer, men stan-
dardtoppens intensitet er lav, reduceres mængden. I hvert fald er en
komplet separation mellem komponenterne i den første og den anden
fraktion unødvendig, da der ikke er nogen overlappende toppe under
gaskromatografianalyse, hvis betingelserne justeres som beskrevet i
6.3.1. Optimering af mængden af den anden fraktion er normalt unød-
vendig, da der er god separation fra de øvrige komponenter.
Tilstedeværelsen af en høj top ved en retentionstid på ca. 1,5 min. mindre
end standard skyldes squalen og angiver dårlig separation.
6.2.2. Den anden fraktion inddampes i en fordamper ved 30 ºC og lavt tryk
indtil tørhed, og restmængden opløses straks i 0,2 ml hexan. Opløsningen
opbevares i køleskab indtil analyse.
Note 8.
Restmængder under 6.1.3 og 6.2.2 bør ikke opbevares tørt ved rumtempe-
ratur. Så snart de er fremkommet, bør opløsningsmidlet tilsættes, og
opløsningerne bør opbevares i køleskab.
6.3.Gaskromatografi
6.3.1. Arbejdsbetingelser for splitinjektion:
— injektortemperatur: 300 ºC
— detektortemperatur: 320 ºC
— skriver/integrator: parametrene for integration bør sættes, så de giver
en korrekt bedømmelse af arealerne. Integration over de enkelte toppe
anbefales
— følsomhed: ca. 16 gange mindste dæmpning— injiceret mængde opløsning: 1 µl
— ovnprogrammeringstemperaturer: initialtemperatur 235 ºC i 6 min. og
derefter stigende med 2 ºC/min. indtil 285 ºC
— injektor med splitforhold 1: 15
— bæregas: helium eller hydrogen ved ca. 120 kPa tryk.
Disse betingelser kan justeres alt efter kromatografens og søjlens evne til
at give kromatogrammer, der imødekommer følgende krav: intern stan-
dardtop inden for ca. 5 min. af den tid, der er angivet i 6.3.2. Den
interne standardtop bør være på mindst 80 % fuldt udslag.
Gaskromatografisystemet skal kontrolleres ved injektion af en blanding af
stamopløsningen af cholestadien (5.6) og n-nonacosanopløsning (5.8).
Cholesta-3,5-dientoppen skal vise sig før n-nonacosanen (jf. figur 1c).
Hvis den ikke fremkommer, kan man vælge mellem to metoder: at bringe
ovntemperaturen ned og/eller benytte mindre polære søjler.
6.3.2. Identifikation af toppe
Den interne standardtop viser sig efter ca. 19 min. og stigmasta-3,5-dien
ved en relativ retentionstid på ca. 1,29 (jf. figur 1b). Sammen med med
stigmasta-3,5-dien forekommer der små mængder af en isomer, som
normalt kun giver en enkelt kromatografisk top. Hvis søjlen er for polær
eller har stor opløsningsevne, kan isomeren imidlertid vise sig som en
lille top før og nær på toppen for stigmasta-3,5-dien (jf. figur 2). For at
sikre, at stigmastadienerne elueres som en top, er det tilrådeligt at erstatte
søjlen med en mindre polære søjle eller med en søjle med større
indvendig diameter.
Note 9.
Der kan fås en stigmastadienreference ved analyse af en raffineret vegeta-
bilsk olie ved at benytte metoden til bestemmelser af steroide kulbrinter.
Stigmastadiener fremkalder en signifikant og let identificerbar top.
6.3.3. Kvantitativ analyse
Indholdet af stimastadiener bestemmes efter formlen:
mg/kg stigmastadiener =As/C2Mc
Ac/C2Mo1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 93
▼M11
hvor: As= areal af stigmastadientop (hvis toppen er opløst i to
isomerer, summen af de to toppes arealer)
Ac= areal af interne standard (cholestadien)
Mc= massen af tilsat standard i mikrogram
Mo= massen af olie i g.
Påvisningsgrænse: Ca. 0,01 mg/kg.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 94
▼M11
Figur 1
Gaskromatogrammer fra olivenolieprøver analyseret på en kapillarsøjle
med sintret silica (0,25 mm indvendig diameter × 25 m), belagt med 5 %
phenylmethylsilicone, 0,25 µm filmtykkelse.
a) Første fraktion (30 ml) fra jomfruolie tilsat standardopløsning.
b) Anden fraktion (40 ml) fra olivenolie indeholdende 0,10 mg/kg stig-
mastadiener.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 95
▼M11
c) Anden fraktion (40 ml) indeholdende en lille smule af den første frak-
tion.
Figur 2
Gaskromatogrammer fra en prøve af raffineret olivenolie analyseret på en
D-5-søjle, der viser stigmasta-3,5-diens isomer.1991R2568 — DA — 31.10.1995 — 013.001 — 96