1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS SYVENDE DIREKTIV
af 1. marts 1976
om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer
(76/372/EØF)
(EFT L 102 af 15.4.1976, s. 8)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EØF af 30. juli 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
KOMMISSIONENS SYVENDE DIREKTIV
af 1. marts 1976
om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle
kontrol med foderstoffer
(76/372/EØF)
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europæiske økono-
miske Fællesskab,
under henvisning til Rådets direktiv af 20. juli 1970 om indførelse af
fællesskabsprøveudtagningsmåder og -analysemetoder for så vidt angår
den officielle kontrol med foderstoffer(1), senest ændret ved tiltrædel-
sesakten(2), særlig artikel 2, og
ud fra følgende betragtninger:Ved ovennævnte direktiv er det fastsat, at den officielle kontrol med
foderstoffer til konstatering af, om de betingelser, der er fastsat pågrundlag af administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser omfoderstoffernes beskaffenhed og sammensætning, er opfyldt, skal fore-
tages efter fællesskabsprøveudtagningsmåder og -analysemetoder;
der er allerede ved Kommissionens direktiver 71/250/EØF af 15. juni
1971(
3), 71/393/EØF af 18. november 1971(4), 72/199/EØF af 27. april
1972(5), 73/46/EØF af 5. december 1972(6), 74/203/EØF af 25. marts
1974(7) og 75/84/EØF af 20. december 1974(8) fastsat en række fælles-
skabsanalysemetoder; i betragtning af den hastighed, hvormed arbejdet
siden da er skredet frem, bør der fastsættes en syvende serie af
metoder;
de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med
udtalelse fra Den stående Foderstofkomité —
UDSTEDT FØLGENDE DIREKTIV:
Artikel 1
Medlemsstaterne foreskriver, at analyserne i forbindelse med den offi-
cielle kontrol af foderstoffer for så vidt angår deres indhold afAflatoxin B
1skal foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilaget
til dette direktiv.
Artikel 2
Medlemsstaterne sætter senest den 1. oktober 1976 de nødvendige
administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser i kraft for at efter-komme bestemmelserne i dette direktiv. De underretter omgåendeKommissionen herom.
Artikel 3
Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) EFT nr. L 170 af 3. 8. 1970, s. 2.
(2) EFT nr. L 73 af 27. 3. 1972, s. 14.
(3) EFT nr. L 155 af 12. 7. 1971, s. 13.
(4) EFT nr. L 279 af 20. 12. 1971, s. 7.
(5) EFT nr. L 123 af 29. 5. 1972, s. 6.
(6) EFT nr. L 83 af 30. 3. 1973, s. 21.
(7) EFT nr. L 108 af 22. 4. 1974, s. 7.
(8) EFT nr. L 32 af 5. 2. 1975, s. 26.▼M1
▼B
▼B
BILAG
BESTEMMELSE AF AFLATOXIN B1
A. FREMGANGSMÅDE VED ENDIMENSIONAL TYNDTLAGSKROMA-
TOGRAFI
1. Formål og anvendelsesområde
Metoden gør det muligt at bestemme indholdet af aflatoxin B1i
følgende foderstoffer: jordnødkage/skrå, kokoskage/skrå, hørfrø-
kage/skrå, sojakage/skrå, sesamkage, babassukage og
majskimkage, korn og kornprodukter, formalede ærter, kartoffel-
pulp og -stivelse, tapiokamel og tørret sukkerroeaffald. Den
mindste mængde der kan bestemmes, er 0,01 mg/kg (10 ppm).
Ved tilstedeværelse af interfererende stoffer, som forstyrrer bestem-
melserne, må analysen udføres efter fremgangsmåden under B (ved
todimensional yndtlagskromatografi).
2. Princip
Prøven ekstraheres med chloroform. Ekstrakten filtreres og en
alikvot del af ekstrakten renses ved søjlekromatografi på kiselgel.
Eluatet inddampes, og inddampningsresten opløses i en bestemt
mængde chloroform eller i en blanding af benzen og acetonitril.
En alikvot del af denne opløsning tyndtlagskromatograferes.
Mængden af aflatoxin B1bestemmes under UV bestråling af
kromatogrammet, enten visuelt eller ved fluorodensitometri, ved
sammenligning med kendte mængder af aflatoxin B1standard.
Identiteten af det ekstraherede aflatoxin B1i foderstoffet skal
bekræftesved hjælp af de anførte fremgangs måder.
3. Reagenser
NB.:Alle reagenserne skal være af »analyse« kvalitet, medmindre
andet er angivet.
3.1. Acetone.
3.2. Chloroform, stabiliseret med 0,5 til 1,0 % 96 % ethanol (v/v).3.3. n-Hexan.3.4. Methanol.3.5. Vandfri diethylether, peroxidfrit.
3.6. Blanding af benzen og acetonitril: 98/2 (v/v).
3.7. Blanding af chloroform (3.2) og methanol (3.4): 97/3 (v/v).3.8. Kiselgel til søjlekromatografi kornstørrelse: 0,05 til 0,20 mm.3.9. Hygroskopisk bomuld, forinden affedtet med chloroform, eller
glasuld.
3.10. Natriumsulfat, vandfrit, granuleret.3.11. Inaktiv luftart, f.eks. kvælstof.3.12. 1 N saltsyre.
3.13. 50 % (v/v) svovlsyre.
3.14. Diatoméjord (Hyflosupercel), vasket i syre.3.15. Kiselgel G-HR eller tilsvarende til tyndtlagskromatografi.3.16. Standardopløsning af ca. 0,1 µg aflatoxin B
1pr. ml. i chloroform
(3.2) eller i benzen acetonitril-blandingen (3.6), tilberedt og
kontrolleret som angivet under punkt 7.
3.17. Kvalitativ standardopløsning af ca. 0,1 µg aflatoxin B1og B2pr. ml
i chloroform (3.2) eller i benzen/acetonitril-blandingen (3.6). Disse
koncentrationer er kun vejledende. De skal afpasses, så der opnås
den samme fluorescensintensitet for begge aflatoxinerne.
3.18. Udviklingsvæsker:3.18.1. Chloroform (3.2)/acetone (3.1): 9/1 (v/v), umættet kar;1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 3
▼B
3.18.2. Diethylether (3.5)/methanol (3.4)/vand: 96/3/1 (v/v), umættet kar,
3.18.3. Diethylether (3.5)/methanol (3.4)/vand: 94/4,5/1,5 (v/v), mættet kar;
3.18.4. Chloroform (3.2)/methanol (3.4): 94/6 (v/v), mættet kar;
3.18.5. Chloroform (3.2)/methanol (3.4): 97/3 (v/v), mættet kar.
4. Apparatur
4.1. Kværn.
4.2. Rysteapparat eller magnetomrører.
4.3. Foldefiltre, Schleicher og Schüll nr. 588 eller tilsvarende, diameter:
24 cm.
4.4. Kromatografisøjle af glas (indvendig diameter: 22 mm, længde:
300 mm), med teflonhane og 250 ml beholder.
4.5. Rotationsfordamper med 500 ml rundbundet kolbe.
4.6. 500 ml koniske kolber med slib og glasprop.
4.7. Tyndtlagskromatografiudstyr.
4.8. Glasplader til tyndtlagskromatografi, 200 × 200 mm, behandlet som
beskrevet nedenfor (de angivne mængder er passende til at dække
fem plader): 30 g G-HR kiselgel (3.15) hældes i en konisk kolbe;
der tilsættes 60 ml destilleret vand, sættes prop i og rystes i etminut. Suspensionen stryges ud på pladerne, så der fremkommer
et ensartet lag på 0,25 mm's tykkelse. Pladerne tørres i luften og
opbevares dernæst i en ekssikkator, forsynet med kiselgel. Pladerne
aktiveres på anvendelsestidspunktet ved anbringelse i et varmeskab
ved 110 ºC i en time. Fabriksfremstillede færdigplader er egnede i
det omfang de giver lignende resultater som de plader, der er
behandlet på den ovenfor beskrevne måde.
4.9. Lang-bølget UV-lampe (360 nm). Fluorecensintensiteten skal gøre
det muligt helt klart at skelne en plet på 1,0 ng aflatoxin B
1på en
plade til tyndtlagskromatografi i en afstand af 10 cm fra lampen.
4.10. 10 ml måleglasmed polyethylenpropper.
4.11. UV-spektrofotometer.
4.12. Fluorodensitometer (eventuelt).
5. Fremgangsmåde
5.1. Tilberedning af prøven (se bemærkninger,afsnit C,punkt 1).
Prøven findeles således, at den kan passere igennem en sigte med
en maskevidde på 1 mm (som anbefalet af ISO E 565).
5.2. Ekstraktion
50,0 g af den findelte og homogeniserede prøve overføres til en
500 ml konisk kolbe (4.6). 25 g diatoméjord (3.14), 25 ml vand
og 250 ml chloroform (3.2) tilsættes.
Kolben tilproppesog rys teseller omrøresi 30 minutter ved hjælp
af apparaturet (4.2) og indholdet filtreresgennem et foldefilter
(4.3). De første 10 ml af filtratet kasseres, dernæst opsamles 50 ml.
5.3. Oprensning på søjle
Bunden af et kromatografirør (4.4) forsynes med en prop af vat
eller glasuld (3.9), røret fyldes to tredjedele op med chloroform
(3.2), og der tilsættes 5 g natriumsulfat (3.10).
Sørg for, at natriumsulfatlagets øvre overflade er plan, tilsæt
dernæst 10 g kiselgel (3.8) i små portioner. Efter hver tilsætning
røresomhyggeligt for at fjerne luftblærer. Efter hens tand i 15
minutter, tilsættes forsigtigt 15 g natriumsulfat (3.10). Lad det
ovenstående chloroform løbe ud således at overfladen står umiddel-
bart over natriumsulfatlaget.
De 50 ml ekstrakt, som blev opsamlet under 5.2, blandes med
100 ml n-Hexan (3.3), og blandingen overføreskvantitativt til
søjlen. Lad væsken synke, indtil væskeniveauet når natriumsulfatla-
gets overflade og fjern den gennemløbne væske. Dernæst tilsættes
100 ml diethylether (3.5), der elueresindtil væs keniveauet atter
når natriumsulfatlagets overflade. Under disse operationer skal
gennemløbshastigheden holdes på 8 til 12 ml i minuttet, og søjlen1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 4
▼B
må ikke løbe tør. Den gennemløbne væske kasseres. Derefter
elueresmed 150 ml af chloroform/methanol-blandingen (3.7), og
hele eluatet opsamles.
Eluatet inddampes til næsten tørhed ved gennemblæsning af inaktiv
luft (3.11) og ved en temperatur på under 50 ºC ved hjælp af rota-
tionsfordamperen (4.5). Inddampningsresten overføres kvantitativt
med chloroform (3.2) eller benzen/acetonitril-blandingen til et
10 ml måleglas (4.10). Opløsningen inddampes ved gennemblæs-
ning af inaktiv luft (3.11) og rumfanget justeres til 2,0 ml med
chloroform (3.2) eller benzen/acetonitril-blandingen (3.6).
5.4. Tyndtlagskromatografi
De nedenfor angivne rumfang af standardopløsningen og af
ekstrakten påsættes som pletter på en plade til tyndtlagskromato-
grafi (4.8), 2 cm fra den underste kant med en indbyrdes afstand
på 2 cm:
— 10, 15, 20, 30 og 40 µl af aflatoxin B1tandardopløsning (3.16);
— 10 µl af ekstrakten fra punkt 5.3 og, oven i dette , 20 µl af stan-
dardopløsning (3.16);
— 10 og 20 µl af ekstrakten fra punkt 5.3.
Kromatogrammet udviklesi dæmpet belys ning ved hjælp af en af
væskerne (3.18). Valget af udviklingsvæske skal finde sted forinden
ved at anbringe 25 µl af den kvalitative standardopløsning (3.17) på
pladen og ved at sikre sig, at aflatoxinerne B1og B2adskilles fuld-
stændigt under kromatograferingen.
Opløsningsmidlerne afdampes i dæmpet belysning, og der bestråles
med UV-lys, idet pladen anbringes 10 cm fra lampen (4.9). Afla-
toxin B1-pletterne fluorescerer blåt.
5.5. Kvantitative bestemmelser
Bestemmelserne foretages enten visuelt eller ved hjælp af fluoro-
densitometri, som angivet nedenfor.
5.5.1. Visuel måling
Mængden af aflatoxin B1i ekstrakten bestemmes ved at sammen-
ligne fluorescensintensiteten fra pletterne fra ekstrakten med
intensiteten fra pletterne fra standardopløsningen. Der interpoleres
om nødvendigt. Den fluorescens, som fremkommer ved at anbringe
ekstrakten oven i standardopløsningen, skal være kraftigere end
den, som udsendes fra de 10 µl ekstrakt, og der må kun kunne
opfattes en plet. Hvis fluorescens-intensiteten fra de 10 µl ekstrakt
er kraftigere end den, som de 40 µl standardopløsning giver,
fortyndeseks trakten 10 eller 100 gange med chloroform (3.2) eller
med benzen/acetonitril-blandingen (3.6), inden den igen tyndtlags-
kromatograferes.
5.5.2. Målinger ved hjælp af fluorodensitometri
Fluorescensintensiteten fra aflatoxin B1-pletterne målesmed et fluo-
rodensitometer (4.12), idet der benyttes en excitationsbølgelængde
på 365 nm og en emissionsbølgelængde på 443 nm. Mængden af
aflatoxin B1i de afsatte ekstrakter bestemmes ved at sammenligne
ekstraktpletternes fluorescensintensitet med standardopløsningens.
5.6. Verificering af identiteten af aflatoxin B1
Identiteten af det aflatoxin B1, som findes i ekstrakten, verificeres
ved de nedenfor angivne fremgangsmåder.
5.6.1 Behandling med svovlsyre
Påsprøjt forstøvet svovlsyre (3.13) på kromatogrammet fra punkt
5.4. Under UV-bestråling skal fluorescensen fra aflatoxin B1-plet-
terne efter påsprøjtningen skifte fra blåt til gult.
5.6.2. Todimensionelt kromatografi der omfatter dannelse af
aflatoxin B1-hemiacetal (aflatoxin B2a)
NB:De nedenfor beskrevne arbejdsoperationer skal foretages i
overensstemmelse med skemaet i fig. 3.
5.6.2.1. Anbringelse af opløsningerne
På en plade (4.8) trækkesto rette linier parallelt med to hos lig-
gende sider (i en afstand af 6 cm fra disse sider), med det formål
at afgrænse opløsningsmidlernes bevægelse. Ved hjælp af kapillar-1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
pipetter eller mikrosprøjter anbringes de nedenfor angivne opløs-
ninger på pladen.
—I punkt A: et rumfang renset ekstrakt fra punkt 5.3 indeholdende
ca. 2,5 ng aflatoxin B1;
—I punkterne B og C: 25 µl af standardopløsning (3.16).
5.6.2.2. Kromatografering
Kromatogrammet udviklesi retning I ved hjælp af væs ken (3.18.1)
(1 cm tykt lag i umættet kar), i dæmpet belysning, indtil væske-
fronten når grænselinjen.
Pladen fjernesfra karret og tørresi fem minutter ved s tuetempe-
ratur i dæmpet belysning. Dernæst sprøjtes med forstøvet saltsyre
(3.12) på et 2,5 cm bredt stykke af pladen, som dækker punkterne
A og B (angivet ved det skraverede felt på fig. 3), indtil mørkfarv-
ning, idet resten af pladen beskyttes med en tynd glasplade. Efter
10 minutters indvirkning i mørke, tørres i en luftstrøm ved stuetem-
peratur.
Derefter udvikleskromatogrammet i retning II ved hjælp af væs ken
(3.18.1) (1 cm tykt lag i umættet kar), i dæmpet belysning, indtil
væskefronten når grænselinjen. Pladen fjernes fra karret og tørres
ved stuetemperatur.
5.6.2.3. Fortolkning af kromatogrammet
Kromatogrammet undersøges ved UV lys (4.9), og de nedenfor
angivne iagttagelser kontrolleres:
a) forekomst af en fluorescerende blå plet af aflatoxin B1,so m
hidrører fra den i C anbragte standardopløsning (bevægelse i
retning I);
b) forekomst af en fluorescerende blå plet af aflatoxin B1(som
ikke har reageret med saltsyren) og af en mere intens fluoresce-
rende blå plet af aflatoxin B1-hemiacetal, som hidrører fra den i
B anbragte standardopløsning (bevægelse i retning II);
c) forekomst af pletter, som ligner de under punkt b) beskrevne,
hidrørende fra det i A anbragte ekstrakt. Disse pletters belig-
genhed defineresved B1-aflatoxinetstilbagelagte afs tand fra
punkt A i retning I (samme afstand, som er tilbagelagt af den i
C anbragte standardopløsning) fulgt af den afstand, som er tilba-
gelagt i retning II af B1-aflatoxinet (som ikke har reageret med
saltsyren) og af aflatoxin B1-hemiacetalet (samme afstand som
den, den i B anbragte standardopløsning har tilbagelagt); fluore-
scensintensiteten fra de hemiacetalpletter, som hidrører fra
ekstrakten og fra den i B anbragte standardopløsning, bør
stemme overens.
6. Beregning af resultater
6.1. På grundlag af visuel måling
Aflatoxin B1-indholdet i prøvematerialet i µg/kg (ppb) beregnes
efter formlen:
S/C1Y/C1V
W /C1X
hvor:
Y og X er indholdet udtrykt i µl af henholdsvis standardopløs-
ningen af aflatoxin B1(3.16) og af ekstrakten, som giver en
tilsvarende fluorescensintensitet;
S = koncentrationen i µg af aflatoxin B1pr. ml standardopløs-
ning (3.16);
V = ekstraktens slutvolumen i µl, under hensyntagen til eventu-
elle fortyndinger;
W = prøvens vægt i g svarende til rumfanget af den ekstrakt, som
blev oprenset på søjle.
6.2. På grundlag af fluorodensitometrisk måling
Aflatoxin B1-indholdet i µg pr. kg af prøven (ppb) beregnesefter
formlen:1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
S/C1V
W /C1Y
hvor:
Y = volumen i µl af den på pladen anbragte ekstrakt (10 eller
20 µl);
S = mængden i ng af aflatoxin B1fra den anbragte ekstrakt
(under hensyntagen til volumen Y), udledt af bestemmel-
serne;
V = ekstraktens slutvolumen i µl, under hensyntagen til eventu-
elle fortyndinger;
W = prøvens vægt i g svarende til rumfanget af den ekstrakt, som
blev oprenset på søjle.
7. Tilberedning af og kontrol med standardopløsning (3.16)
7.1. Bestemmelse af aflatoxin B1koncentration
Der tilberedes en standardopløsning af aflatoxin B1i chloroform
(3.2) eller i benzen/acetonitrilblandingen (3.6) med en koncentra-
tion på 8 til 10 µg pr. ml. Absorptions spekret bestemmes mellem
330 og 370 nm ved hjælp af spektrofotometret (4.11).
Lysabsorptionen (A) måles ved 363 nm for chloroformopløsningens
vedkommende; ved 348 nm for benzen/acetonitril-blandingen
vedkommende.
Aflatoxin B1-koncentrationen i µg/ml opløsning beregnes ud fra
nedenstående formler:
312 /C1A/C11000
20600for chloroform-opløsningen
312 /C1A/C11000
19800for opløsningen i benzen/acetonitril-blandingen.
I dæmpet belysning tilberedes passende fortyndinger til en rbejds-
standardopløsning med en aflatoxin B1koncentration på ca 0,1 µg/
ml. Ved opbevaring i køleskab ved 4 ºC er denne opløsning holdbar
i to uger.
7.2. Kontrol af den kromatografiske renhed
På en plade (4.8) anbringes 5 µl af standardopløsningen med 8 —
10 µg aflatoxin B1pr. ml (jf. 7.1). Kromatogrammet udvikless om
beskrevet under punkt 5.4. Fluorescensen må ved UV-lys kun give
anledning til opfattelse af en enkelt plet, og der må ikke opfattes
nogen fluorescens i den oprindeligt afsatte prøves område.
8. Repeterbarhed
Forskellen mellem resultaterne af to sideløbende bestemmelser
udført af den samme person på den samme prøve bør ikke over-
stige:
— 25 % af det højeste resultat for et aflatoxinindhold på mellem
10 og 20 µg/kg,
— 5 µg i absolut værdi for et indhold på mellem 20 og 50 µg/kg,— 10 % af det højeste resultat for et indhold på over 50 µg/kg.
9. Reproducerbarhed
Se bemærkninger, afsnit C, punkt 2,
B. FREMGANGSMÅDE VED TODIMENSIONAL TYNDTLAGSKROMA-
TOGRAFI
1. Formål og anvendelsesområde
Metoden gør det muligt at bestemme indholdet af aflatoxin B
1i
foderstoffer som ikke kan bestemmes under metode A. Den
mindste mængde, der kan bestemmes, er 0,01 mg/kg (10 ppb).
Metoden kan ikke anvendestil foders toffer, der indeholder citru-
spulp.1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 7
▼B
2. Princip
Prøven ekstraheres med chloroform. Ekstrakten filtreres, en alikvot
del af ekstrakten oprenses ved søjlekromatografi på kiselgel.
Eluatet inddampes, og inddampningsresten opløses i en bestemt
mængde chloroform eller i en blanding af benzen og acetonitril.
En alikvot del af denne opløsning tyndtlagskromatograferes todi-
mensionalt. Mængden af aflatoxin B1bestemmes under UV-
bestråling af kromatogrammet enten visuelt eller ved fluorodensito-
metri, ved sammenligning med kendte mængder aflatoxin B1standard. Identiteten af det ekstraherede aflatoxin B1af foderstoffet
skal verificeres.
3. Reagenser
NB:Alle reagenserne skal være af »analyse« kvalitet, medmindre
andet er angivet.
3.1. Acetone.
3.2. Chloroform, stabiliseret med 0,5 til 1,0 % 96 % (v/v) ethanol.3.3. n-Hexan.
3.4. Methanol.
3.5. Vandfri diethylether, peroxidfrit.3.6. Blanding af benzen og acetonitril: 98/2 (v/v).3.7. Blanding af chloroform (3.2) og methanol (3.4): 97/3 (v/v).
3.8. Kiselgel, til søjlekromatografi, kornstørrelse: 0,05 til 0,20 mm.
3.9. Hygroskopisk bomuld, forinden affedtet med chloroform, eller
glasuld.
3.10. Natriumsulfat, vandfrit, granuleret.3.11. Inaktiv luftart, f.eks. kvælstof.3.12. 1 N saltsyre.
3.13. Diatoméjord (Hyflosupercel), vasket i syre.
3.14. Kiselgel G-HR eller tilsvarende til tyndtlagskromatografi.3.15. Udviklingsvæsker.
3.15.1. Diethylether (3.5)/methanol (3.4)/vand: 94/4,5/1,5 (v/v) mættet kar.
3.15.2. Chloroform (3,2)/acetone (3.1): 9/1 (v/v) umættet kar.3.16. Standardopløsning af ca. 0,1 µg aflatoxin B
1pr. ml i chloroform
(3.2) eller i benzen/acetonitril-blanding (3.6), tilberedt og kontrol-
leret som angivet under punkt 7 i metode A.
4. Apparatur
Se punkt 4 under fremgangsmåde A.
5. Fremgangsmåde
5.1. Tilberedning af prøven
Se punkterne 5.1, 5.2 og 5.3
under fremgangsmåde A./C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C1505.2. Ekstraktion
5.3. Oprensning på søjle
5.4. Todimensionel tyndtlagskromatografi
5.4.1. Anbringelse af opløsningerne (følg skemaet på (fig. 1)
På en plade (4.8) trækkesto rette linjer parallelt med to hos lig-
gende sider (med en afstand på henholdsvis 5 og 6 cm fra disse
sider), med det formål at afgrænse opløsningsmidlernes bevægelse.
Ved hjælp af kapillarpipetter eller mikrosprøjter placeres de
nedenfor angivne opløsninger på pladen:
—i punkt A: 20 µl oprenset ekstrakt fra punkt 5.3,
—i punkt B: 20 µl af standardopløsning (3.16),
—i punkt C: 10 µl af standardopløsning (3.16),
—i punkt D: 20 µl af standardopløsning (3.16),
—i punkt E: 40 µl af standardopløsning (3.16).1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
Tør pletterne ved hjælp af en svag luftstrøm (3.11). De påsatte
pletter skal have en diameter på ca. 5 mm.
5.4.2. Kromatografering (skemaet på fig. 1 følges)
Kromatogrammet udviklesi retning I ved hjælp af væs ken (3.15.1)
(1 cm tykt lag i mættet kar), i dæmpet belysning, indtil væske-
fronten når grænselinien. Pladen fjernes fra karret og tørres i
mindst 15 minutter ved stuetemperatur og i dæmpet belysning.
Dernæst udvikles kromatogrammet i retning II ved hjælp af væsken
(3.15.2) (1 cm tykt lag i umættet kar) i dæmpet belysning indtil
væskefronten når grænselinien. Pladen fjernes fra karret og tørres
ved stuetemperatur og i dæmpet belysning.
5.4.3. Fortolkning af kromatogrammet (skemaet på fig. 2 følges)
Kromatogrammet bestråles med UV-lys, idet pladen anbringes
10 cm fra lampen (4.9). Placeringen af de blå fluorescenspletter
fra aflatoxin B1i B, C, D og E, hidrørende fra standardopløsningen,
lokaliseres og der trækkes to imaginære linjer igennem disse pletter
vinkelret på udviklingsretningerne. Skæringspunktet P for disse
rette linjer er det sted, hvor man skulle vente at finde den aflatoxin
B1-plet, som hidrører fra den i A (fig. 1) anbragte ekstrakt. Ikke
desto mindre kan denne plet befinde sig i et punkt Q, beliggende i
skæringspunktet for to imaginære rette linjer, som med hinanden
danner en vinkel på ca. 100 º, og som går gennem pletterne i
henholdsvis B og C. Mængden af aflatoxin B1i ekstrakten fra
prøven bestemmes som givet under punkt 5.5.
5.4.4. Supplerende kromatografi
På en ny plade (4.8) trækkesto rette linjer parallelt med to hos lig-
gende sider, som angivet i skemaet på fig. 1, og i punkt A (se fig.
1) anbringes 20 µl af den under 5.3 fremkomne rensede ekstrakt fra
prøven, og oven i denne anbringes 20 µl af standardopløsning
(3.16). Kromatogrammet udvikless om angivet under 5.4.2 og
bestråles med UV lys (4.9), hvorefter det kontrolleres at
— aflatoxin B1-pletterne fra ekstrakten og fra standardopløsningen
falder sammen,
— fluorescensen fra denne plet er mere intens end fluorescensen
fra den aflatoxin B1-plet, som blev udviklet i punkt Q på den
første plade.
5.5. Kvantitative bestemmelser
Bestemmelserne foretages enten visuelt eller ved hjælp af fluoro-
densitometri, som angivet nedenfor.
5.5.1. Visuel måling
Mængden af aflatoxin B1i ekstrakten bestemmes ved at sammen-
ligne fluorescensintensiteten fra pletten fra ekstrakten med
intensiteten fra pletterne C, D og E fra standardopløsningen. Der
interpoleres om nødvendigt. Hvis fluorescensintensitetenfra de
20 µl ekstrakt er stærkere end intensiteten fra de 40 µl standardop-
løsning, fortyndes ekstrakten 10 eller 100 gange med chloroform
(3.2) eller med benzen/acetonitril-blandingen (3.6), inden den på
ny tyndtlagskromatograferes.
5.5.2. Målinger ved hjælp af fluorodensitometri
Intensiteten af fluorescensen fra aflatoxin B1-pletterne målesved
hjælp af fluorodensitometri (4.12), idet der benyttes en excitations-
bølgelængde på 365 nm og en emissionsbølgelængde på 443 nm.
Mængden af aflatoxin B1i den afsatte ekstrakt bestemmes ved at
sammenligne pletternes fluorescensintensitet med pletterne C, D
og E fra standardopløsningen.
5.6. Bekræftelse af indentiteten af aflatoxin B1
Se metode A under punkt 5.6.
6. Beregning
Se punkt 6 under metode A.
7. Repterbarhed
Se punkt 8 under metode A.1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
8. Reproducerbarhed
Se Bemærkninger, afsnit C, punkt 2.
C. BEMÆRKNINGER VEDRØRENDE FREMGANGSMÅDE A OG B
1.Affedtning
Prøver, der indeholder mere end 5 % fedt bør affedtesmed petroleums bengin
(kogepunkt 40—60º C) efter den under 5.1 angivne tilberedning. I så fald
skal analyseresultaterne sammenholdes med vægten af den ikke-affedtede
prøve.
2.Resultaternes reproducerbarhed
Resultaternes reproducerbarhed, dvs. variationer mellem resultater opnået af
to eller flere laboratorier på den samme prøve, er bestemt til at være:
± 50 % af gennemsnit for gennemsnitsværdier af aflatoxin B1mellem 10 og
20 µg/kg;
± 10 µg/kg af gennemsnit for gennemsnitsværdier større end 20 og op til
50 µg/kg;
± 20 % af gennemsnit for gennemsnitsværdier over 50 µg/kg.1976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
BILAG
Fig. 1
Fig. 21976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
Fig. 31976L0372 — DA — 19.08.1981 — 001.001 — 12