1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS TREDJE DIREKTIV
af 27. april 1972
om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer
(72/199/EØF)
(EFT L 123 af 29.5.1972, s. 6)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EØFaf 30. juli 1981 L246 32 29.8.1981
►M2Kommissionens direktiv 84/4/EØFaf 20. december 1983 L15 28 18.1.1984
►M3Kommissionens direktiv 93/28/EØFaf 4. juni 1993 L179 8 22.7.1993
►M4Kommissionens direktiv 98/54/EFaf 16. juli 1998 L208 49 24.7.1998
►M5Kommissionens direktiv 1999/79/EFaf 27. juli 1999 L209 23 7.8.1999
Berigtiget ved:
►C1Berigtigelse, EFT L 320 af 27.11.1980, s. 43 (72/199/EØF)
▼B
KOMMISSIONENS TREDJE DIREKTIV
af 27. april 1972
om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af
foderstoffer
(72/199/EØF)
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europæiske økono-
miske Fællesskab,
under henvisning til Rådets direktiv af 20. juli 1970 om indførelse af
fællesskabsregler for prøveudtagning og fælleskabsanalysemetoder tilden officielle kontrol af foderstoffer(
1), særlig artikel 2, og
ud fra følgende betragtninger:Ovennævnte direktiv bestemmer, at officielle kontrolforanstaltninger
vedrørende foderstoffer med henblik på at konstatere, om de i henholdtil administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser foreskrevne betin-
gelser med hensyn til foderstoffers beskaffenhed og sammensætning er
opfyldt, foretages under anvendelse af fællesskabsregler for prøveud-tagning og fællesskabsanalysemetoder;
ved Kommissionens direktiver nr. 71/250/EØFaf 15. juni 1971(
2)o g
nr. 71/393/EØFaf 18. november 1971(3) er allerede en række analyse-
metoder fastlagt; det arbejde, der i mellemtiden er udført, er nu så vidt
fremskredet, at en 3. serie analysemetoder bør fastlægges;
de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med
udtalelse fra Den stående Komité for foderstoffer —
Artikel 1
Medlemsstaterne foreskriver, at analyser i forbindelse med officiel
kontrol af foderstoffer med hensyn til disses indhold af stivelse, råpro-tein, pepsin- og saltsyreopløseligt råprotein og fri og total gossypol
samt med hensyn til pepsinaktiviteten udføres efter de i bilag I til dette
direktiv beskrevne metoder.
Artikel 2
Medlemsstaterne foreskriver, at analyser i forbindelse med officiel
kontrol af foderstoffer ►M4 ◄samt med hensyn til
foderstoffernes indhold af ►M4 ◄tytosin og virginia-
mycin udføres efter de i bilag II til dette direktiv beskrevne metoder.
Artikel 3
Senest 1. juli 1973 bringer medlemsstaterne de nødvendige administra-
tivt eller ved lov fastsatte bestemmelser i anvendelse for at efterkommedette direktivs bestemmelser. De underretter straks Kommissionenherom.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 2
(1) EFT nr. L 170 af 3.8.1970, s. 2.
(2) EFT nr. L 155 af 12.7.1971, s. 13.
(3) EFT nr. L 279 af 20.12.1971, s. 7.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Artikel 4
Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 3
▼B
BILAG I
1.BESTEMMELSE AF STIVELSE
POLARIMETRISK METODE
1.Formål og anvendelsesområde
Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af stivelse og nedbryd-
ningsprodukter heraf med høj molekylvægt i foderstoffer til kontrol af, om
bestemmelserne i direktiv 86/174/EØFog direktiv 96/25/EFer overholdt.
2.Princip
Metoden er baseret på en dobbelt bestemmelse. Ved den første bestemmelse
behandles prøven i varm tilstand med fortyndet saltsyre. Efter klaring og
filtrering måles opløsningens optiske drejning polarimetrisk.
Ved den anden bestemmelse ekstraheres prøven med 40 % ethanol. Efter
behandling af filtratet med saltsyre klares og filtreres, og den optiske drejning
måles under samme betingelser som ved den første bestemmelse.
Forskellen mellem de to målinger, multipliceret med en kendt faktor, giver
prøvens stivelsesindhold.
3.Reagenser
3.1. 25 % (w/w) saltsyre, mf. 1,126.3.2. 1,128 % (w/v) saltsyre.
Koncentrationen skal kontrolleres, ved titrering med 0,1 N natriumhy-
droxydopløsning under tilstedeværelse af 0,1 % (w/v) metylrødt i 94 %
(v/v) ethanol. 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 N.
3.3. Carrez-opløsning I: 21,9 g zinkacetat ZN CH
3COO ðÞ2:2H2Oo g3g
iseddike opløses i vand, og der fyldes op med vand til 100 ml.
3.4. Carrez-opløsning II: 10,6 g kaliumhexacyanoferrat K 4FeC NðÞ6/C2/C3
:3H2O
opløses i vand, og der fyldes op med vand til 100 ml.
3.5. 40 % (v/v) ethanol, mf. 0,948 ved 20 ºC.
4.Apparatur
4.1. 250 ml Erlenmeyerkolbe med standardslibhals og tilbageløbssvaler.
4.2. Polarimeter eller saccharimeter.
5.Procedure
5.1.Tilberedning af prøven
Prøven formales så fint, at den passerer en sigte med runde huller fuld-
stændigt (huldiameter 0,5 mm).
5.2.Bestemmelse af den totale optiske drejning (P eller S) (se bemærkning
7.1)
2,5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 100 ml
målekolbe, og der tilsættes 25 ml saltsyre (3.2). Kolben rystes, indtil
prøvematerialet er jævnt fordelt, og der tilsættes yderligere 25 ml salt-
syre (3.2). Derefter nedsænkes kolben i et kogende vandbad. I de første
3 minutter rystes kolben kraftigt og med regelmæssige mellemrum for at
forhindre klumpdannelse. Vandmængden i vandbadet skal være tilstræk-
kelig til fortsat at holde vandet i kog, når kolben nedsænkes. Under
omrystningen må kolben ikke tages op af vandbadet. Efter nøjagtig 15
minutter tages kolben op af vandbadet, hvorefter der tilsættes 30 ml
koldt vand og straks afkøles til 20 ºC.
Der tilsættes 5 ml Carrez-opløsning I (3.3) og omrystes 1 minut. Derpå
tilsættes 5 ml Carrez-opløsning II (3.4), og der omrystes atter 1 minut.
Der fyldes op med vand til mærket, omrystes og filtreres: Hvis filtratet
ikke er fuldstændig klart, hvilket sjældent forekommer, skal bestem-
melsen gentages med en større mængde Carrez-opløsning I og II, fx
10 ml.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 4
▼M5
▼M5
Opløsningens optiske drejning måles i et 200 mm rør med et polarimeter
eller et saccharimeter.
5.3.Bestemmelse af den optiske drejning (P' eller S') for de i 40 % ethanol
opløselige stoffer.
5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 100 ml målekolbe, og
der tilsættes ca. 80 ml ethanol (3.5) (se bemærkning 7.2). Kolben
henstilles en time ved rumtemperatur. I dette tidsrum rystes kolben kraf-
tigt seks gange, så prøvematerialet blandes godt med ethanolen. Der
fyldes op med ethanol (3.5) til mærket, omrystes og filtreres. 50 ml af
filtratet (= 2,5 g af prøven) afpipetteres i en 250 ml Erlenmeyerkolbe, og
der tilsættes 2,1 ml saltsyre (3.1). Kolben rystes kraftigt, sluttes til en
tilbageløbssvaler og nedsænkes i et bad med kogende vand. Efter
nøjagtig 15 minutter tages Erlenmeyerkolben op af vandbadet, og
indholdet skylles over i en 100 ml målekolbe med en lille mængde koldt
vand og afkøles til 20 ºC. Derpå klares med Carrezopløsning I (3.3) og
II (3.4), fyldes op med vand til mærket, omrystes og filtreres, og den
optiske drejning måles som beskrevet under 5.2, andet og tredje afsnit.
6.Beregning af resultaterne
Indholdet af stivelse (%) beregnes som følger:
6.1.Polarimetriske målinger
Stivelsesindhold ð%Þ¼2000 P - P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = total optisk drejning i cirkelgrader
P′= optisk drejning i cirkelgrader af de i ethanolen opløselige
stoffer
α½/C13820º
D= den rene stivelses specifikke drejning. Til denne faktor
anvendes følgende generelt accepterede værdier:
+ 185,9º: risstivelse
+ 185,4º: kartoffelstivelse
+ 184,6º: majsstivelse
+ 182,7º: hvedestivelse
+ 181,5º bygstivelse
+ 181,3º havrestivelse
+ 184,0º andre typer stivelse og stivelsesblandinger i foder-
blandinger
6.2.Saccharimetriske målinger
Stivelsesindhold ð%Þ¼2000
α½/C13820º
Dx2N x 0 ;665 ðÞ xS - S0ðÞ
100-26;6Nx S-S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = total optisk drejning i saccharimetergrader
S′= optisk drejning i saccharimetergrader af de i 40 % ethanol
opløselige stoffer
N = vægt af saccharose i g i 100 ml vand ved en vejlængde på
200 mm giver en optisk drejning på 100 saccharimetergrader.
Denne vægt varierer alt efter saccharimetertype:
16,29 g for franske saccharimetre
26,00 g for tyske saccharimetre20,00 g for blandede saccharimetre.
α½/C138
20º
D= den rene stivelses specifikke drejningsevne (se 6.1)
6.3.Repeterbarhed
Forskellen mellem resultaterne af to parallelbestemmelser af samme
prøve må ved indhold på under 40 % stivelse ikke være mere end
0,4 % absolut og ved indhold på 40 % og derover ikke mere end 1,1 %
relativt.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 5
▼M5
7.Bemærkninger
7.1. Hvis prøven indeholder mere end 6 % karbonater, beregnet som kalci-
umkarbonat, skal de destrueres med den nøjagtige mængde fortyndet
svovlsyre inden bestemmelsen af den totale optiske drejning.
7.2. For produkter med højt laktoseindhold, fx mælkeserum i pulverform
eller skummetmælkspulver, anvendes efter tilsætning af 80 ml ethanol
(3.5) følgende fremgangsmåde: Kolben tilsluttes en tilbageløbssvaler og
nedsænkes i et vandbad på 50 ºC i 30 minutter. Efter afkøling fortsættes
som beskrevet under 5.3.
7.3. Ved tilstedeværelse i foderstoffer i større mængde kan følgende foder-
midler interferere ved bestemmelse af stivelsesindholdet efter den
polarimetriske metode, som derved kan give forkerte resultater:
— (sukker)roeprodukter, såsom (sukker)roesnitter, (sukker)roemelasse,
(sukker)roesnitter, ekstraherede, tilsat melasse, (sukker)roevinase,
(roe)sukker
— citruskvas
— hørfrø, hørfrøkage, hørfrøskrå
— rapsfrø, rapskage, rapsskrå, rapsskaller— solsikkefrø, solsikkeskrå, solsikkeskrå, delvis afskallet— kokoskage, kokosskrå
— kartoffelkvas
— tørret gær— produkter med stort inulinindhold (fx snitter og skrå af jordskokker)— grever.
2.INDHOLD AF RÅPROTEIN
1.Formål og anvendelsesmetode
Ved denne metode kan råproteinindholdet i foderstoffer bestemmes ud fra
nitrogenindholdet bestemt efter Kjeldahlmetoden.
2.Princip
Prøven destrueres med svovlsyre i tilstedeværelse af en katalysator. Syreo-
pløsningen gøres alkalisk med en natriumhydroxidopløsning. Ammoniakken
destilleres og opsamles i en kendt mængde svovlsyre, og den overskydende
mængde svovlsyre titreres med en standardopløsning af natriumhydroxid.
3.Reagenser
3.1 Kaliumsulfat3.2 Katalysator: kobber(II)oxid, CuO, eller kobber(II)sulfat-pentahydrat,
CuSO
4·5H2O
3.3 Granuleret zink3.4 Svovlsyre, ρ
20= 1,84 g/ml
3.5 Svovlsyre, c(½H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6 Svovlsyre, c(½H2SO4) = 0,1 mol/l
3.7 Metylrød inikator: 300 mg metylrødt opløses i 100 ml ethanol, σ= 95-
96 % (v/v)
3.8 Natriumhydroxidopløsning (teknisk kvalitet kan bruges), β=4 0g /
100 ml (m/v: 40 %)
3.9 Natriumhydroxidopløsning, c = 0,25 mol/l3.10 Natriumhydroxidopløsning, c = 0,1 mol/l3.11 Granuleret pimpsten, vasket i saltsyre og udglødet3.12 Acetanilid (smp. = 114 ºC, N = 10,36 %)3.13 Saccharose (nitrogenfri)
4.Apparatur
Apparatur, der er velegnet til destruktion, destillation og titrering efter Kjel-
dahlmetoden.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 6
▼M3
▼M3
5.Fremgangsmåde
5.1Destruktion
1 g af prøven afvejes til det nærmeste 0,001 g og overføres til destruk-
tionskolben. 15 g kaliumsulfat (3.1), en passende mængde katalysator
(3.2) (0,3 - 0,4 g kobber(II)oxid eller 0,9 - 1,2 g kobber(II)sulfat-penta-
hydrat), 25 ml svovslyre (3.4) og nogle få granulater pimpsten (3.11)
tilsættes og blandes. Kolben opvarmes i destruktionskolben først forsig-
tigt og omrystes om nødvendigt af og til, indtil prøven er forkullet og
skummet forsvundet. Derefter opvarmes kraftigere, indtil væsken koger
jævnt. Opvarmningen er tilstrækkelig, hvis den kogende syre fortætter
sig på kolbens væg. Det må forhindres, at siderne bliver overophedet,
og at organiske partikler klæber til dem. Når opløsningen bliver klar og
lysegrøn, fortsættes kogningen i yderligere to timer. Derefter henstilles
kolben til afkøling.
5.2Destillation
Tilsæt forsigtigt tilstrækkeligt vand til, at sulfaterne opløses fuldstændigt.
Kolben henstår til køling, hvorefter der tilsættes nogle få granulater zink
(3.3).
I destillationsapparatets forlagskolbe anbringes en nøjagtigt afmålt
mængde på 25 ml svovlsyre (3.5 eller 3.6) afhængigt af det formodede
nitrogenindhold. Et par dråber metylrød indikator tilsættes (3.7).
Destruktionskolben forbindes med destillationsapparatets svaler, og
svalerens nederste del sænkes i væsken i forlagskolben i en dybde på
mindst 1 cm (jf. 8.3). 100 ml natriumhydroxidopløsning (3.8) tilsættes
forsigtigt destruktionskolben, uden at der mistes ammoniak (jf. 8.1.1).
Kolben opvarmes, indtil ammoniakken er destilleret over.
5.3Titrering
Den overskydende svovlsyre i opsamlingskolben titreres med natriumhy-
droxidopløsning (3.9 eller 3.10) afhængigt af koncentrationen af den
anvendte svovlsyre, indtil ækvivalenspunktet er nået.
5.4Blindprøve
For at sikre, at reagenserne er nitrogenfri, foretages der en blindprøve
(destruktion, destillation og titrering) ved brug af 1 g saccharose (3.13)
i stedet for prøven.
6.Beregning af resultaterne
Indholdet af råprotein beregnes efter nedenstående formel:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
hvor
V0= volumen (ml) NaOH (3.9 eller 3.10) avendt i blindprøven
V1= volumen (ml) NaOH (3.9 eller 3.10) anvendt i titreringen af prøven
c = koncentration (mol/l) af natriumhydroxid (3.9 eller 3.10)
m = prøvens masse (g)
7.Kontrol af metoden
7.1Repeterbarhed
Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser foretaget på
samme prøve må ikke overstige:
0,2 % i absolut værdi, for råproteinindhold på under 20 %1,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat), for råproteinindhold på
20 %-40 %
0,4 % i i absolut værdi, for råproteinindhold på over 40 %
7.2Nøjagtighed
Analysen (destruktion, destillation og titrering) foretages på 1,5 - 2,0 g
acetanilid (3.12) i tilstedeværelse af 1 g saccharose (3.13). 1 g acetanilid1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 7
▼M3
kræver 14,80 ml svovlsyre (3.5). Genfindingsprocenten skal være mindst
99 %.
8.Bemærkninger
8.1 Apparaturet kan være manuelt, halvautomatisk eller automatisk. Hvis
apparaturet kræver overførsel mellem destruktions- og destillationstrinet,
skal sådan overførsel kunne ske uden tab. Hvis destillationsapparatets
kolbe ikke har skilletragt, tilsættes natriumhydroxiden, lige inden kolben
forbindes med svaleren, idet væsken hældes langsomt ned langs siden.
8.2 Hvis destruktionsproduktet størkner, gentages bestemmelsen med brug af
en større mængde svovlsyre (3.4) end angivet ovenfor.
8.3 For produkter med lavt nitrogenindhold, kan mængden af svovlsyre (3.6),
der skal bruges i opsamlingskolben, om nødvendigt mindskes til 10 eller
15 ml og fyldes op med vand til 25 ml.
3.BESTEMMELSE AF DET MED PEPSIN OG SALTSYRE OPLØSE-
LIGE RÅPROTEIN
1.Formål og anvendelsesområde
Metoden tillader bestemmelse af det med pepsin og saltsyre opløselige råpro-
tein under definerede betingelser. Metoden gælder for alle foderstoffer.
2.Princip
Prøven behandles 48 timer ved 40º C med en pepsin-saltsyre-opløsning.
Suspensionen filtreres, og kvælstofindholdet i filtratet bestemmes efter den
til bestemmelse af råprotein beskrevne metode.
3.Reagenser
3.1 Saltsyre, mf. 1,125.3.2 0,075 N saltsyre.3.3 Pepsin 2.0 E/mg. Aktiviteten er defineret i 4. del af forskrifterne i dette
bilag og kontrolleres i overensstemmelse dermed.
3.4 Pepsinopløsning ca. 0,02 % (w/v) i saltsyre (3.2), frisk tilberedt. Akti-
vitet 400 E/l.
3.5 Antiskumemulsion (f. eks. silikone).3.6 Samtlige under punkt 3 i metoden til bestemmelse af råproteiner anførte
reagenser.
4.Apparatur
4.1 I termostatstyret vandbad eller varmeskab, indstillet på 40º C ± 1º C.4.2 Apparatur til destruktion og destillation ifølge Kjeldahl.
5.Udførelse
5.1Oplosning af råproteinet (se bemærkning 7.2)
2 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes i en 500 ml
målekolbe. Hertil sættes 450 ml pepsinopløsning (3.4), som først er
opvarmet til 40º C, hvorefter der rystes for at forhindre klumpdannelse.
Suspensionens pH-værdi skal ligge under 1,7. Kolben henstilles i
vandbad eller varmeskab (4.1) i 48 timer. Der rystes efter 8, 24 og 32
timer. Efter 48 timer tilsættes 15 ml saltsyre (3.1), afkøles til 20º C,
fyldes op med vand til mærket og filtreres.
5.2Destruktion
250 ml af filtratet kommes i destruktionsapparaturets kolbe (4.2). Derpå
tilsættes de til destruktionen nødvendige reagenser, som anført i beskri-
velsen af metoden til bestemmelse af råprotein under punkt 5.1, 2.
punktum. Der blandes og opvarmes til kogetemperatur. Såfremt der
dannes kraftigt skum, tilsættes nogle dråber antiskumemulsion (3.5).
Væsken holdes i kraftigt kog, til vandet er næsten fuldstændig fordampet.
De sidste spor af vand elimineres forsigtigt ved lavere varmetilførsel.
Når opløsningen er klar og farveløs (resp. lysegrøn ved anvendelse af1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 8
▼B
▼B
en kobberholdig katalysator), fortsættes kogningen i endnu 1 time; derpå
afkøles der.
5.3Destillation og titrering
Fremgangsmåde som beskrevet i metoden til bestemmelse af råproteiner
under 5.2 og 5.3.
5.4Blindforsøg
Et blindforsøg udføres under anvendelse af samme fremgangsmåde uden
analyseprøve.
6.Beregning af resultaterne
Rumfanget af den i blindforsøget forbrugte svovlsyre trækkes fra analyseprø-
vens forbrug. 1 ml 0.1 N svovlsyre svarer til 1,4 mg kvælstof.
Den fundne kvælstofmængde multipliceres med faktoren 625. Resultatet
udtrykkes i procent af prøven.
Reproducerbarhed
Differencen mellem to parallelbestemmelser må ved én og samme prøve
— ved indhold på mindre end 20 % opløseligt råprotein, ikke være over
0,4 % absolut,
— ved indhold på 20 til 40 % opløseligt råprotein, ikke over 2 % relativt,
— ved indhold på mere end 40 % opløseligt råprotein, ikke over 0,8 %
absolut.
7.Bemærkninger
7.1 De beregnede værdier står ikke i direkte forhold til fordøjeligheden in
vivo.
7.2 Foderstoffer, hvis råfedtindhold er mere end 10 %, skal affedtes ved
ekstraktion med petroleumsæter (kp. 40—60º C).
4.BESTEMMELSE AF PEPSINAKTIVITET
1.Formål og anvendelsesområde
Metoden tjener til kontrol af aktiviteten i den pepsin, der anvendes til
bestemmelse af det med pepsin og saltsyre opløselige råprotein.
2.Princip
Hæmoglobin behandles under definerede betingelser med pepsin og fortyndet
saltsyre. Den ikke hydrolyserede andel af proteinerne udfældes med triklored-
dikesyre. Til filtratet sættes natriumhydroxydopløsning og reagens ifølge
Folin-Ciocalteu. Ekstinktionen af denne opløsning måles ved 750 µ og den
til denne ekstinktion svarende mængde tyrosin aflæses af en standardkurve.
Definition: Pepsin-enheden (E) defineres som den enzymmængde, der under
metodens betingelser pr. minut frigiver så mange hydroxyaryl-grupper, at
disses farvning med Folin-Ciocalteureagens giver en ekstinktion, som svarer
til ekstinktionen af 1 µ mol tyrosin under de samme betingelser.
3.Reagenser
3.1 0,2 N saltsyre
3.2 0,06 N saltsyre
3.3 0,025 N saltsyre
3.4 trikloreddikesyreopløsning 5 % (w/v)
3.5 0,5 N natriumhydroxydopløsning3.6 Reagens ifølge Folin-Ciocalteu: 100 g natriumwolframat (Na
2WO4·
2H2O), 25 g natriummolybdat (Na2MoO4·2H2O) og 700 ml vand
kommes i en 2 liters rundbundet kolbe med tilsleben prop. — Der
tilsættes 50 ml fosforsyre (mf. 1,71) og 100 ml koncentreret saltsyre
(mf. 1,19), hvorpå kolben forbindes med en tilbageløbskøler. Der
opvarmes til kogetemperatur og opløsningen holdes svagt i kog 10 timer.
Efter afkøling fjerner man tilbageløbskøleren, tilsætter 175 g litiumsulfat
(Li2SO4·2H2O), 50 ml. vand og 1ml brom. Umiddelbart herefter koger
man 15 minutter for at fjerne den overskydende brom.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 9
▼B
Efter afkøling fyldes opløsningen over i en 1 liter målekolbe, der fyldes
op med vand, rystes og filtreres. Det færdige reagens må ikke antage
grønlig farve. Før brugen fortyndes 1 volumendel reagens med 2 volu-
mendele vand.
3.7 Hæmoglobinopløsning: En til 354 mg kvælstof(1) svarende hæmoglobin-
mængde (ca. 2 g), proteasesubstrat ifølge Anson, afvejes og kommes i en
200 ml kolbe med tilsleben prop. Man tilsætter nogle ml 0,06 N saltsyre
(3.2), forbinder kolben med vakuumpumpen og ryster, indtil hæmoglo-
binet er fuldstændig opløst. Derefter fjerner man vakuum og tilsætter
under omrystning den endnu indtil 100 ml manglende mængde saltsyre
(3.2). Friskfremstilles før brugen.
3.8 Tyrosin-standardopløsning: 181,2 mg tyrosin opløses i saltsyre (3.1) og
der fyldes op med samme syre til 1 liter (stamopløsning). Der udtages
20,0 ml af denne opløsning, som fortyndes med saltsyre (3.1) til 100 ml.
1 ml af denne opløsning indeholder 0,2 µ mol tyrosin
4.Apparatur
4.1 Ultratermostat, indstillet på 25º C ± 0,1º C.
4.2 Spektrofotometer.
4.3 Kronometer, nøjagtighed: 1 sek.
4.4 pH-meter.
5.Udførelse
5.1Fremstilling af opløsningen (se bemærkning 7.1)
150 mg pepsin opløses i 100 ml saltsyre (3.2). Af denne opløsning afpi-
petteres 2 ml i en 50 ml målekolbe, og der fyldes op med saltsyre (3.3)
til mærket. Den med pH-meteret kontrollerede pH-værdi bør ligge på
1,6 ± 0,1. Kolben sættes ind i ultratermostaten (4.1).
5.2Hydrolyse
5,0 ml hæmoglobinopløsning (3.7) pipetteres over i et reagensglas og der
opvarmes i ultratermostaten (4.1) til 25º C. Derpå tilsætter man 1,0 ml af
den ifølge 5,1 fremstillede pepsinopløsning, blander ved hjælp af en i
spidsen fortykket glasstang, som bevæges ca. 10 gange op og ned, og
lader reagensglasset henstå i nøjagtig 10 minutter (regnet fra pepsinoplø-
sningens tilsætning) i vandbad ved 25º C (tid og temperatur skal
overholdes nøje). Efter forløbet af de 10 minutter tilsættes 10,0 ml af
den i forvejen til 25º C opvarmede trikloreddikeopløsning (3.4), der
rystes og filtreres gennem et tørt filter.
5.3Udvikling af farvningen og måling af ekstinktionen
5,0 ml af filtratet afpipetteres i en 50 ml Erlenmeyerkolbe, hvortil der
sættes 10,0 ml natriumhydroxydopløsning (3.5). Derpå tilsættes der
under konstant omrystning 3,0 ml af det fortyndede reagens ifølge
Folin-Ciocalteu (3.6). Efter 5 til 10 minutter bestemmes ekstinktionen
af opløsningen fotometrisk i 1 cm kuvetter ved 750 µ over for vand.
5.4Til hver bestemmelse udføres et blindforsøg som følger:
5,0 ml hæmoglobinopløsning (3.7) afpipetteres i et reagensglas og
opvarmes i ultratermostaten (4.1) til 25º C. Derpå tilsætter man 10,0 ml
af den i forvejen til 25º C opvarmede trikloreddikesyreopløsning (3.4),
blander og tilsætter umiddelbart derefter 1,0 ml af den ifølge 5.1 frem-
stillede pepsinopløsning. Man blander ved hjælp af en glasstang og
lader reagensglasset henstå i nøjagtig 10 minutter ved 25º C i et vandbad
(4.1). Der omrystes og filtreres. Herefter fortsætter man som beskrevet
under 5.3.
5.5Standardkurve
I 50 ml Erlenmeyerkolben kommes 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 5,0 ml tyrosin-
standardopløsning (3.8) (svarende til tyrosinmængderne på 0,2, 0,4, 0,6,
0,8 og 1,0 µ mol). Rækken kompletteres med en tyrosinfri sammenlig-
ningsprøve. De enkelte afmålinger suppleres med saltsyre (3.1) til1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 10
(1) Kvælstofindholdet bestemmes efter Kjeldahls semimikrometode (teoretisk indhold:
17,7 % nitrogren),
▼B
5,0 ml. Endvidere tilsættes der 10,0 ml. natriumhydroxydopløsning (3.5)
og under konstant omrystning 3,0 ml af det fortyndede reagens ifølge
Folin-Ciocalteu (3.6). Ekstinktionen måles som under 5.3, sidste
punktum. Standardkurven tegnes ved at sætte de tilsatte mængder tyrosin
mod ekstinktionen.
6.Beregning af resultaterne
Af standardkurven aflæses den mængde tyrosin i µ mol, som svarer til den
med blindværdien korrigerede ekstinktion af de farvede opløsninger.
Pepsinens aktivitet i µ mol tyrosin pr. mg og pr. minut ved 25º C beregnes
efter følgende formel:
Enheder pr :mg E =mgðÞ ¼0;32 a
p
idet
a = den af standardkurven aflæste tyrosinmængde i µ mol,
p = vægten i mg af den ifølge 5.2 tilsatte pepsinmængde.
7.Bemærkninger
7.1 Den mængde pepsin, som skal opløses, vælges således, at der ved den
fotometriske slutmåling opnås en ekstinktion på 0,35 ± 0,035.
7.2 2 E/mg, bestemt efter denne metode, svarer til
3.64 m-Anson E/mg (µ mol tyrosin/mg · min. ved 35,5º C) eller
36400 gængse E/g (µ mol tyrosin/g · 10 min. ved 35,5º C).
5.BESTEMMELSE AF FRI OG TOTALGOSSYPOL
1.Formål og anvendelsesområde
Metoden tillader bestemmelse af fri gossypol, totalgossypol og kemisk nært
beslægtede substanser i frø, mel og kager af bomuldsfrø, samt i foderblan-
dinger, som indeholder produkter af bomuldsfrø. Den laveste grænse for
bestemmeligheden er 20 ppm.
2.Princip
Gossypol ekstraheres under tilstedeværelse af 3-amino-1-propanol enten med
en isopropanol-hexan-blanding til bestemmelse af fri gossypol eller med
dimetylformamid til bestemmelse af totalgossypol og omsættes med anilin
til gossypol-dianiline, hvis ekstinktion måles ved 440 mµ.
3.Reagenser
3.1 Isopropanol-hexan-blanding: 60 volumendele isopropanol p.a. blandes
med 40 volumendele n-hexan.
3.2 Opløsningsmiddel A: I en 1 liter målekolbe fyldes der ca. 500 ml isopro-
panol-hexan-blanding (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanol, 8 ml iseddike og
50 ml vand, og der fyldes op med isopropanol-hexan-blanding (3.1) til
mærket. Dette reagens er holdbart 1 uge.
3.3 Opløsningsmiddel B: I en 100 ml målekolbe afpipetteres 2ml 3-amino-1-
propanol og 10 ml iseddike, hvorefter der afkøles til rumtemperatur og
fyldes op med N,N-dimetylformamid til mærket. Dette reagens er hold-
bart 1 uge.
3.4 Anilin p. a.: Såfremt ekstinktionen i blindforsøget er større end 0,022,
destilleres anilinen over zinkstøv, idet man bortkaster de første og sidste
10 % af destillatet. I køleskab er dette reagens ved opbevaring i vel
tillukket, brunt glas holdbart i et par måneder.
3.5 Gossypol-standardopløsning A: I en 250 ml målekolbe opløses 27,9 mg
gossypol-acetat med opløsningsmiddel A (3.2) og der fyldes op til
mærket med dette, 50 ml af denne opløsning afpipetteres i en 250 ml
målekolbe og der fyldes op med opløsningsmiddel A (3.2) til mærket.
Denne opløsnings gossypolkoncentration er 0,02 mg/ml. Før brugen
henstår denne opløsning 1 time ved rumtemperatur.
3.6 Gossypol-standardopløsning B: I en 50 ml målekolbe opløses 27,9 mg
gossypol-acetat i opløsningsmiddel B (3.3) og der fyldes op til mærket.
Gossypolkoncentrationen i denne opløsning er 0,5 mg/ml.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 11
▼B
Standard-gossypol-opløsningerne er holdbare i 24 timer, såfremt de er
beskyttet mod lyset.
4.Apparatur
4.1 Mekanisk rysteapparat: ca. 35 omdr./min.
4.2 Spektrofotometer.
5.Udførelse
5.1Afvejning
Størrelsen af den afvejede stofmængde retter sig efter det formodede
indhold af gossypol i prøven. Det er fordelagtigt at arbejde med en lille
afvejning og med en relativt stor aliquot del af filtratet for at få en
tilstrækkelig mængde gossypol til en nøjagtig fotometrisk måling. Til
bestemmelsen af fri gossypol i frø, mel og kager af bomuldsfrø bør
afvejningen ikke være på mere end 1 g, medens den ved foderblandinger
kan være på 5 g. En aliquot del af filtratet på 10 ml er i de fleste tilfælde
anvendelig; den skal indeholde 50 til 100 µg gossypol. Til bestemmelsen
af totalgossypol bør afvejningen ligge på fra 0,5 til 5 g, således at der i
den aliquot del af filtratet på 2 ml er et indhold på 40 til 200 µg
gossypol.
Analyser udføres ved en rumtemperatur på ca. 20º C.
5.2Bestemmelse af fri gossypol
Den afvejede stofmængde bringes i en 250 ml kolbe med tilsleben prop,
hvis bund er dækket med glassplinter, 50 ml af opløsningsmidlet A (3.2)
tilsættes med pipette, kolben lukkes og rystes én time i rysteapparat.
Derpå filtreres gennem et tørt filter og giltratet opsamles i en lille kolbe
med tilsleben prop. Under filtreringen tildækkes tragten med et urglas.
Lige store aliquote dele af filtratet, indeholdende 50 til 100 µg gossypol
afpipetteres i to 25 ml målekolber (A og B), eventuelt fortyndes med
opløsningsmiddel A (3.2) til 10 ml. Derpå suppleres kolbens indhold
(A) med isopropanol-hexan-blandingen (3.1) til mærket. Denne opløs-
ning anvendes som sammenligningsopløsning ved målingen af
prøveopløsningen. Derefter afpipetteres 10 ml opløsningsmiddel A (3.2)
i to andre 25 ml målekolber. Indholdet i kolben (C) suppleres med
isopropanol-hexan-blandingen (3.1) til mærket. Denne oplosning
anvendes som sammenligningsopløsning ved målingen af blindprøveo-
pløsningen.
Til hver af målekolberne (D) og (B) sættes 2 ml anilin (3.4). Der
opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand til udvikling af farv-
ningen, afkøles til stuetemperatur, fortyndes med isopropanol-hexan-
blandingen (3.1) til mærket, omrystes, hvorefter det hele henstår 1 time.
Herefter måles i spektrofotometeret ved 440 mµ og i glaskuvetter på 1 cm
tykkelse blindprøvens (B) ekstinktion i forhold til sammenligningsopløs-
ningen (C) og prøveopløsningens (B) ekstinktion i forhold til
sammenligningsopløsningen (A). Ekstinktionen af blindprøveopløsningen
trækkes fra ekstinktionen af prøveopløsningen (= korrigeret ekstinktion).
På basis af den fundne værdi beregnes indholdet af fri gossypol som
beskrevet under 6.
5.3Bestemmelse af totalgossypol
En afvejet stofmængde indeholdende 1 til 5 mg gossypol kommes i en
50 ml målekolbe; derpå tilsættes 10 ml af opløsningsmidlet B (3.3).
Samtidig tilberedes et blindforsøg med 10 ml af opløsningsmidlet B
(3.3) i en anden 50 ml målekolbe. Begge målekolber opvarmes i 30
minutter i et bad med kogende vand, afkøles til stuetemperatur og
fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen (3.1) til mærket. Der omry-
stes, henstilles 10 til 15 minutter, derpå filtreres, og filtratet opsamles i
kolber med tilsleben prop.
2 ml af prøvefiltratet afpipetteres i hver af to 25 ml målekolber og 2 ml
af filtratet fra blindforsøget i hver af to andre 25 ml målekolber. En
kolbe i hver serie fyldes op med isopropanol-hexan-blandingen (3.1) til
25 ml. Disse opløsninger anvendes som sammenligningsopløsninger.
Til hver af de to andre målekolber sættes 2 ml anilin (3.4). Derpå
opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand til udvikling af farv-
ningen, afkøles til stuetemperatur, fortyndes med isopropanol-hexan-
blandingen (3.1) til 25 ml, omrystes, hvorefter det hele henstår 1 time.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 12
▼B
Ekstinktionen måles som beskrevet under 5.2 for fri gossypol. På basis af
den fundne værdi beregnes indholdet af totalgossypol som beskrevet
under 6.
6.Beregning af resultaterne
Beregningen af resultaterne kan foretages på basis af den specifikke ekstink-
tion (6.1) eller ved benyttelse af en standardkurve (6.2).
6.1På basis af den specifikke ekstinktion
Den specifikke ekstinktion andrager under de angivne betingelser for fri
gossypol E1%
1c m¼625
totalgossypol E1%
1c m¼600
Indholdet af fri eller totalgossypol i prøven andrager:
E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a¼% gossypol
idet:
E = korrigeret ekstinktion, som bestemt under 5.2,
p = afvejet stofmængde i ga = aliquot del af filtratet i ml.
6.2Ved hjælp af en standardkurve
6.2.1 Fri gossypol
Der forberedes 2 rækker med hver fem 25 ml målekolber. I begge
rækker afpipetteres 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 og 10,0 af gossypol-standard-
opløsningen A (3.5) og rumfanget suppleres til 10 ml med
opløsningsmidlet A (3.2). I hver række stilles en 25 ml målekolbe,
som kun indeholder 10 ml af opløsningsmidlet A (3.2) (blind-
forsøg).
Kolberne i den første række inclusive blindforsøget fyldes op med
isopropanol-hexan-blandingen (3.1) til 25 ml (sammenlignings-
række).
Til hver af kolberne i den anden række, inclusive blindforsøget,
sættes 2 ml anilin (3.4). Derpå opvarmes i 30 minutter i et bad
med kogende vand til udvikling af farvningen, afkøles til rumtem-
peratur, fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen (3.1) til
mærket, rystes, hvorefter det hele henstår 1 time (standardrække).
Under de i 5.2 beskrevne betingelser måles ekstinktionen af stan-
dardrækkeopløsningerne ved sammenligning med de tilsvarende
opløsninger i sammenligningsrækken. Standardkurven fremstilles
grafisk, idet ekstinktionsværdierne og gossypolmængderne (i µg)
indtegnes over for hinanden.
6.2.2 Total gossypol
Der tilberedes seks 50 ml målekolber. I den første afpipetteres
10 ml af opløsningsmidlet B (3.3) og i hver af de øvrige 2,0, 4,0,
6,0, 8,0 og 10,0 ml af gossypolstandardopløsningen B (3.6).
Indholdet i hver af kolberne suppleres med opløsningsmidlet B
(3.3) til 10 ml, opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende
vand, afkøles til rumtemperatur, fortyndes med isopropanol-
hexan-blandingen (3.1) til mærket og rystes.
I to rækker med seks 25 ml målekolber afpipetteres i hver 2,0 ml
af denne opløsning. Kolberne i den første række fyldes op med
isopropanol-hexan-blandingen (3.1) til 25 ml (sammenlignings-
række).
I kolberne i den anden række kommes i hver 2 ml anilin (3.4).
Derpå opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand, afkøles
til rumtemperatur, fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen
(3.1) til mærket, rystes, hvorefter det hele henstår 1 time (standard-
række).1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 13
▼B
Under de i 5.2 beskrevne betingelser måles ekstinktionen af stan-
dardrækkeopløsningerne ved sammenligning med de tilsvarende
opløsninger i sammenligningsrækken. Standardkurven fremstilles
grafisk, idet ekstinktionsværdierne og gossypolmængderne (i µg)
indtegnes over for hinanden.
6.3Reproducerbarhed
Differencen mellem to parallelbestemmelser må ved én og samme prøve
ved indhold på
— mindre end 500 ppm gossypol ikke være over 15 % relativt,
— 500 til 750 ppm gossypol ikke over 75 ppm absolut,— 750 ppm og mere gossypol ikke over 10 % relativt.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 14
▼B
BILAG II
4.BESTEMMELSE AF TYLOSIN
— VED DIFFUSION I AGARNÆRINGSSUBSTRAT —
1.Formål og anvendelsesområde
Metoden tillader bestemmelse af tylosin i foderstoffer, koncentrater og
forblandinger. Den laveste grænse for bestemmeligheden andrager 2 ppm.
2.Princip
Prøven behandles med en til 80º C opvarmet fosfatstødpudeopløsning pH 8
og ekstraheres derefter med metanol. Efter centrifugering fortyndes
ekstrakten, og dens antibiotiske aktivitet bestemmes ved måling af tylosinets
diffusion i et med Sarcina lutea podet agarnæringssubstrat. Diffusionen
påvises ved hjælp af de opstående hæmningszoner med testorganismen.
Diameteren af disse hæmningszoner er direkte proportional med logaritmen
til koncentrationen.
3.Testorganisme: Sarcina lutea ATCC 9341
3.1Opbevaring af stamkulturen
Et agarskråglas af næringssubstratet (4.1) indstilles til pH 7,0, podes med
Sarcina lutea og inkuberes ved ca. 35º C natten over. Derefter opbevares
kulturen i køleskab og podes 1 gang om måneden over i agarskråglas.
3.2Fremstilling af kimsuspensionen
Et agarskråglas (3.1) opslæmmes med 2 til 3 ml steril, friskfremstillet
kogsaltopløsning (4.4). Med denne suspension podes en Roux-kolbe,
som indeholder 250 ml af substratet (4.1) pH 7,0. Efter en inkubationstid
på 24 timer ved 35º C opslæmmes kimene med 25 ml fysiologisk kogsal-
topløsning (4.4) og homogeniseres. Denne suspension fortyndes for at
opnå en transmission ved 650 mµ på ca. 75 %. Denne suspension er
holdbar 1 uge ved opbevaring i køleskab.
Ved hjælp af forsøgsplader med testsubstratet (4.1) findes den podnings-
mængde, som giver de størst mulige men endnu skarpe hæmningszoner
med de forskellige anvendte koncentrationer af tylosin. Udpodningen på
substratet skal ske ved en temperatur på mellem 48 og 50º C.
4.Næringssubstrat og reagenser
4.1Testsubstrat (1)
Glukose 1 g
Pepton, tryptisk fordøjet 10 g
Kødekstrakt 1,5 gGærekstrakt 3 g
Agar, alt efter kvalitet 10—20 g
Destilleret vand ad 1000 ml
Til opbevaring af stamkulturen og fremstilling af kimsuspensionen
indstillede til pH 7,0 til bestemmelsen justeres til pH 8,0.
4.2Fosfatstødpudeopløsning, pH 8
Monokaliumfosfat KH
2PO4p.a. 0,523 g
Dikaliumfosfat K2HPO4p.a. 16,730 g
Destilleret vand ad 1000 ml1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 15
(1) Ethvert næringssubstrat, som er normal handelsvare og har tilsvarende sammensætning,
og som giver samme resultater, kan anvendes.▼M4
▼B
▼B
4.3Fosfatstødpudeopløsning, pH 7
Monokaliumfosfat KH2PO4p.a. 5,5 g
Dikaliumfosfat K2HPO4p.a. 13,6 g
Destilleret vand ad 1000 ml
4.4 Fysiologisk kogsaltopløsning, steril
4.5 Metanol, ren
4.6 Metanol 40 % (v/v)4.7 Blanding af fosfatstødpudeopløsning (4.2) og metanol, ren: 60/40 i vol.
4.8 Standardpræparat: Tylosin med kendt aktivitet.
5.Standardopløsninger
Standardpræparatet (4.8) tørres 3 timer ved 60º C i vakuumtørreskabet ved
5 mm Hg. En afvejet stofmængde på 10 til 50 mg opløses med 5 ml metanol(4.5) i en målekolbe og fortyndes derpå med fostfatstødpudeopløsningen pH
7 (4.3) for at opnå en koncentration af tylosin base på 1000 µg/ml.
Af denne stamopløsning fremstilles der ved fortynding med blandingen (4.7)
en arbejdsstandardopløsning S
8, som indeholder 2 µg tylosin base/ml.
Herefter fremstilles nedenstående koncentrationer med blandingen (4.7) ved
efter hinanden påfølgende fortyndinger (1 + 1):
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Ekstraktion
Der afvejes ved koncentrater 10 g ved forblandinger og foderblandinger 20 g.
Den afvejede stofmængde opslæmmes med 60 ml fosfatstødpudeopløsning
pH 8 (4.2) opvarmet til 80º C og homogeniseres 2 minutter (køkkenmaskine,
Ultra-Turrax etc.).
Efter henstand i 10 minutter tilsættes 40 ml metanol (4.5) og der homogeni-
seres på ny i 5 minutter. Ekstrakten centrifugeres og en aliquot del fortyndes
med blandingen (4.7) for at opnå en formodet koncentration af tylosin på
2 µg/ml (= U8). Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4,U2og
U1med blandingen (4.7) ved efter hinanden påfølgende fortyndinger (1 + 1).
Ved indhold på under 10 ppm inddampes ekstrakten ved 35º C til tørhed i en
rotationsfordamper og opslæmmes med metanol 40 % (4.6).
7.Testmetode
7.1Podning af næringssubstratet
Kim-suspensionen (3.2) udpodes på det til pH 8,0 justerede testsubstrat
(4.1) ved 48 til 50º C.
7.2Fremstilling af pladerne
Testen sættes an som diffusionstest på plader med hver 4 koncentrations-
trin af standardopløsningen (S8,S4,S2,S1) og ekstraktet (U8,U4,U2,U1).
Hver plade skal ubetinget indeholde alle 4 koncentrationer af standard og
prøve.
Derfor skal pladerne have en sådan størrelse, at der kan udstanses mindst
8 huller i substratlaget. Huldiameteren skal være 10 til 13 mm. Den
podede substratmængde (7.1) skal være beregnet således, at man får et
ensartet lag på ca. 2 mm tykkelse. Testen bør fortrinsvis udføres på
plader, som er fremstillet ved hjælp af en glasplade, hvorpå der lægges
en plandrejet aluminiums- eller kunststofring med 20 mm højde og
200 mm diameter.
I hullerne afpipetteres nøje afmålte mængder af antibiotikaopløsningen,
mellem 0,10 og 0,15 ml alt efter hullernes diameter.
For hver prøve gentages påfyldningen af hver koncentration mindst 4
gange, således at der pr. påsætning for hver prøve kan bedømmes 32
hæmningszoner.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 16
▼B
7.3Inkubation
Der inkuberes natten over ved 35 til 37º C.
8.Bedømmelse
Hæmningszonernes diameter måles fortrinsvis ved projektion. Målingerne
indtegnes på semilogaritmepapir, idet logaritmen til koncentrationen indføres
over for diameteren af hæmningszonerne. Både for standarden og for
ekstrakten trækkes lige linjer. Ved en test med ukompliceret forløb skal de
to lige linjer være parallelle. — Logaritmen til den relative aktivitet udregnes
efter følgende formel:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Faktisk aktivitet = formodet aktivitet × relativ aktivitet.
9.Reproducerbarhed
Differencen mellem to parallelbestemmelser må ved én og samme prøve ikke
være mere end 10 %.
5.BESTEMMELSE AF VIRGINIAMYCIN
— VED DIFFUSION PÅ AGARPLADER —
1.Formål og anvendelsesområde
Metoden anvendes til bestemmelse af virginiamycin i foderstoffer og forblan-
dinger. Undergrænsen for bestemmelsen er 2 mg/kg (2 ppm)(1).
2.Princip
Prøven ekstraheres med en opløsning af Tween 80 i methanol. Ekstraktet
dekanteres eller centrifugeres og fortyndes. Dets antibiotiske styrkebestemmes ved at måle diffusionen af virginiamycin i et agarsubstrat podet
medMicrococcus luteus . Diffusionen viser sig ved dannelsen af zoner, hvori
mikroorganismens vækst er hæmmet. Diameteren af disse zoner anses for at
være direkte proportional med logaritmen til den antibiotiske styrke inden for
de anvendte koncentrationer af antibiotikum.
3.Testorganisme: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC) 8340, NCIB
8553)
3.1.Opbevaring af stamkulturen
Micrococcus luteus podes på skråagar med næringssubstrat (4.1) og
inkuberes i 24 timer ved 30º C. Kulturen opbevares i køleskab ved ca.
4º C. Den ompodes hver anden uge.
3.2.Fremstilling af bakteriesuspension (
a)
Væksten fra et skråagarglas (3.1) opslemmes med 2 til 3 ml natrium-
chloridopløsning (4.3). Denne opslæmning anvendes til podning af
250 ml næringssubstrat (4.1) i en Roux-kolbe, og der inkuberes i 18 til
20 timer ved 30º C. Væksten opslæmmes i 25 ml natriumchloridopløs-
ning (4.3) og fortyndes 10 gange med samme opløsning.
Opslæmningens lystransmission skal være ca. 75 pct., målt ved 650 nm
mod natriumchloridopløsning (4.3) i en 1 cm celle. Opslæmningen kan
opbevares ved ca. 4º C i en uge.
4.Næringssubstrater og reagenser
4.1.Nærings- og testsubstrat (b)
Kødpepton 6,0 g
Trypton 4,0 g
Gærekstrakt 3,0 g1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 17
(1) 1 mg virginiamycinbase svarer til 1000 »UK« enheder.
(a) Andre metoder kan anvendes, forudsat at det er bevist, at de giver tilsvarende bakterie-
suspensioner.
(b) Ethvert næringssubstrat af tilsvarende sammensætning, som er i handelen, og som giver
de samme resultater, kan anvendes.▼M2
▼M2
Køekstrakt 1,5 g
Glucose 1,0 g
Agar 10,0 til 20,0 g
Vand 1000 ml
pH 6,5 (efter sterilisering).
4.2.Phosphatbuffer, pH 6
Kaliumhydrogenphosphat, K2HPO4 2,0 g
Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO48,0 g
Vand til 1000 ml.
4.3. Natriumchloridopløsning, 0,8 %: 8 g natriumchlorid opløses i vand,
fortyndes til 1000 ml og steriliseres.
4.4. Methanol.
4.5. Blanding af phosphatbuffer (4.2) og methanol (4.4): 80/20 (v/v).
4.6. Opløsning af Tween 80 i methanol, 0,5 % (w/v): 5 g Tween 80 opløses i
methanol (4.4) og fortyndes til 1000 ml.
4.7. Standardpræparat: virginiamycin af kendt styrke.
5.Standardopløsninger
En nøjagtigt afvejet mængde standardpræparat (4.7) opløses i methanol (4.4)
og fortyndes med methanol (4.4), således at der fremkommer en stamopløs-
ning indeholdende 1000 µg virginiamycin pr. ml. Opbevaret i tilproppede
flasker ved 4º c vil denne opløsning være holdbar i indtil 5 dage.
Af denne stamopløsning fremstilles ved successiv fortynding med blandingen
(4.5) følgende opløsninger:
S81 µg/ml,
S40,5 µg/ml,
S20,25 µg/ml,
S10,125 µg/ml.
6.Fremstilling af ekstrakt og testopløsninger
6.1.Ekstraktion
6.1.1. Produkter med et virginiamycinindhold på til og med 100 mg/kg
50,0 g af prøven afvejes. Der tilsættes 200 ml af opløsningen
(4.6) og rystes i 30 minutter. Efter bundfældning eller centrifuge-
ring udtages 20 ml af supernatanten, som inddampes til ca. 5 ml i
en rotationsfordamper ved højst 40º C. Remanensen fortyndes
med blandingen (4.5) indtil et forventet virginiamycinindhold på
1 µg/ml (= U8).
6.1.2. Produkter med et virginiamycinindhold på over 100 mg/kg
Der afvejes en mængde af prøven på højst 10,0 g, der indeholder
mellem 1 og 50 mg virginiamycin. Der tilsættes 100 ml af opløs-
ningen (4.6) og rystes i 30 minutter. Efter bundfældning eller
centrifugering fortyndes supernatanten med blandingen (4.5)
indtil et forventet virginiamycinindhold på 1 µg/ml (= U8).
6.2.Testopløsninger
Opløsningerne U4(forventet indhold: 0,5 µg/ml), U2(forventet indhold:
0,25 µg/ml) og U1(forventet indhold: 0,125 µg/ml) fremstilles af opløs-
ning U8ved successiv fortynding (1: 1) med blandingen (4.5).
7.Testmetode
7.1.Podning af testsubstratet
Testsubstratet (4.1) podes med bakteriesuspensionen (3.2) ved ca. 50º C.
På plader med testsubstrat (4.1) bestemmes forud den mængden bakte-
riesuspension, der giver de største og tydeligste hæmningszoner med de
forskellige koncentrationer af virginiamycin.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 18
▼M2
7.2.Forberedelse af pladerne
Diffusionen i agar udføres på plader med de fire koncentrationer af stan-
dardopløsningen (S8,S4,S2,S1) og de fire koncentrationer af
testopløsningen (U8,U4,U2og U1). Disse fire koncentrationer af ekstrakt
og standard skal nødvendigvis alle findes på hver plade. Der bør derfor
vælges plader, der er store nok til at rumme mindst otte huller i agarsub-
stratet med en diameter på 10 til 13 mm og mindst 30 mm mellem
hullernes centrum. Testen kan udføres på plader, der består af en glas-
plade med en aluminium- eller plastring ovenpå, 200 mm i diameter og
20 mm høj.
Pladerne påhældes substrat (4.1), der er podet som angivet i 7.1, så der
opnås et ca. 2 mm tykt lag (60 ml til en plade på 200 mm i diameter).
Pladerne anbringes vandret til størkning, hullerne udstanses, og nøjagtigt
afmålte mængder af test- og standardopløsning anbringes i hullerne
(mellem 0,10 og 0,15 ml pr. hul, afhængig af diameteren), Hver koncen-
tration skal anbringes mindst fire gange, således at hver bestemmelse er
baseret på en aflæsning af 32 hæmningszoner.
7.3.Inkubation
Pladerne inkuberes i 16 til 18 timer ved 30º C ± 2º C.
8.Bedømmelse
Hæmningszonernes diameter måles med 0,1 mm nøjagtighed. Middeldiame-
teren for hver koncentration afsættes på semilogaritmisk papir, således at de
viser logaritmen til koncentrationen i forhold til hæmningszonernes diameter.
Der indtegnes den »bedst tilpassede« rette linje for henholdsvis standardop-
løsningen og ekstratet, f.eks. som vist nedenfor.
Det »bedst tilpassede punkt« for den laveste værdi for standardopløsningen
(SL) bestemmes ved hjælp af formlen:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Det »bedst tilpassede punkt« for den højeste værdi for standardopløsningen
(SH) bestemmes ved hjælp af formlen:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
På tilsvarende måde beregnes det »bedst tilpassede punkt« for den laveste
værdi for ekstratet (UL) og den højeste værdi for ekstratet (UH) ved at
erstatte s1,s2,s4og s8med u1,u2,u4og u8i ovennævnte formler.
De beregnede SL- og SH-værdier indtegnes på samme millimeterpapir og
forbindes til den »bedst tilpassede linje« for standardopløsningen. UL- og
UH-værdierne indtegnes på tilsvarende måde og forbindes til den »bedst
tilpassede linje« for ekstraktet.
Hvis der ikke er stoffer til stede, som forstyrrer analysen, vil linjerne være
parallelle. Til praktiske formål kan linjerne betragtes som værende parallelle,
hvis værdierne (SH-SL) og (UH-UL) ikke afgiver mere end 10 % fra middel-
værdien.
Såfremt linjerne viser sig ikke at være parallelle. kan enten u1og s1eller u8og s8udelades, og SL, SH, UL og UH beregnes ved hjælp af de alternative
formler, for at opnå de alternative »bedst tilpassede linjer«:
(a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6eller5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6eller5s8þ2s4/C0s2
6
og tilsvarende for UL og UH. De samme kriterier for parallelisme skal være
opfyldt. Det noteres i den endelige rapport, at resultatet er beregnet ud fra tre
koncentrationer.
Hvis linjerne kan betragtes som værende parallelle, beregnes logaritmen til
den relative styrke (log A) ved hjælp af én af følgende formler alt efter om
der er anvendt 3 eller 4 koncentrationer til at bestemme parallelismen.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 19
▼M2
For fire koncentrationer
(c) Log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
For tre koncentrationer
(d) Log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
eller
(d′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Prøveekstraktets styrke = den pågældende standards styrke A:
(U8=S8×A )
Hvis den relative styrke ligger uden for området 0,5 til 2,0, gentages
analysen med den fornødne tilpasning af virginiamycinkoncentrationen i
ekstrakterne eller, hvis dette ikke er muligt, i standardopløsningerne. Hvis
den relative styrke ikke kan bringes inden for det krævede interval, må de
resultater, der opnås, betragtes som tilnærmede og dette bør anføres i den
endelige rapport.
Hvis linjerne ikke kan betragtes som værende parallelle, gentages bestem-
melsen. Hvis der stadig ikke opnås parallelisme, må bestemmelsen betragtes
som utilfredsstillende.
Resultatet udtrykkes i milligram virginiamycin pr. kilogram foderstof.
9.Repeterbarhed
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, udført på samme prøve af
samme person, bør ikke overstige:
— 2 mg/kg i absolut værdi for et indhold af virginiamycin på til og med
10 mg/kg;
— 20 % i forhold til den højeste værdi for et indhold på over 10 og til og
med 25 mg/kg;
— 5 mg/kg i absolut værdi for et indhold på over 25 til og med 50 mg/kg;— 10 % i forhold til den højeste værdi for et indhold på over 50 mg/kg.1972L0199 — DA — 27.08.1999 — 005.001 — 20