1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS FORORDNING(EF) Nr. 86/94
af 19. januar 1994
om fastlæggelse af en referencemetode til bestemmelse af sitosterol og stigmasterol i smør
(EFT L 17 af 20.1.1994, s. 7)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1 Kommissionens forordning (EF) nr. 175/1999 af 26. januar 1999 L 20 22 27.1.1999
1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 2
▼B
KOMMISSIONENS FORORDNING(EF) Nr. 86/94
af 19. januar 1994
omfastlæggelseafenreferencemetodetilbestemmelseafsitosterol
og stigmasterol i smør
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fælles-skab,
under henvisning til Rådets forordning (EØF) nr. 804/68 af 27. juni
1968 om den fælles markedsordning for mælk og mejeriprodukter (
1),
senest ændret ved forordning (EØF) nr. 2071/92 (2), særlig artikel 6, stk.
7, og
ud fra følgende betragtninger:Smør kan tilsættes røbestoffer, og dette skal kontrolleres i henhold til
artikel 3 o g 6 i Kommissionens forordning (EØF) nr. 570/88 (
3), senest
ændret ved forordning (EF) nr. 3049/93 (4);
bestemmelserne om tilsætning af røbestoffer af smør må overholdes
nøje med henblik på at forhindre autoriseret anvendelse af smør, hvortilder er ydet støtte;
tilsætning af røbestoffer spiller en vigtig rolle i denne ordning, og der
må derfor på EF-plan udarbejdes referencemetoder til påvisning af allerøbestoffer, der anvendes som led i denne ordning;
dermed vil der kunne sikres lige behandling af alle, der anvender denne
ordning, og undgås ulige konkurrencevilkår, som forskelle i medlems-staternes analysemetoder for øjeblikket kan resultere i;
der er fastsat en referencemetode til bestemmelse af stigmasterol og
sitosterol i butteroil ved Kommissionens forordning (EØF) nr. 3942/92 (
5); denne metode kan anvendes i lidt ændret form til bestemmelse af
sterolrøbestoffer i smør;
de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse
med udtalelse fra Forvaltningskomitéen for Mælk og Mejeriprodukter—
UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:
Artikel 1
Referenceanalysemetoden i bilaget anvendes, når indholdet af stigma-
sterol eller β-sitosterol i smør skal bestemmes i henhold til artikel 6 i
►M1forordning (EF) nr. 2571/97 ◄.
Tilsætning af røbestoffer til smør er korrekt, hvis resultaterne er i
overensstemmelse med bestemmelserne i punkt 8 i bilaget til denneforordning.
Artikel 2
Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i
De Europæiske Fællesskabers Tidende .
Den anvendes fra den 1. april 1994.
Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart
i hver medlemsstat.
(1) EFT nr. L 148 af 28. 6. 1968, s. 13.
(2) EFT nr. L 215 af 30. 7. 1992, s. 64.
(3) EFT nr. L 55 af 1. 3. 1988, s. 31.
(4) EFT nr. L 273 af 5. 11. 1993, s. 7.
(5) EFT nr. L 399 af 31. 12. 1992, s. 29.
1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 3
▼B
BILAG
BESTEMMELSEAFSITOSTEROLOGSTIGMASTEROLISMØRVED
GASKROMATOGRAFI I KAPILLARKOLONNE
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden består i en procedure til kvantitativ bestemmelse af sitosterol
og stigmasterol i smør. Ved sitosterol forstås summen af β-sitosterol og
22-dihydro- β-sitosterol, eftersom andre sisteroler anses for at være uden
betydning. Dette gælder for prøver, som er udtaget i henhold til forord-ning (EØF) nr. 570/88.
2. PRINCIP
Smørret forsæbes med kaliumhydroxid i en ethanolopløsning og uforsæ-
belige bestanddele ekstraheres med diethylether.
Sterolerne omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved gaskro-
matografi i en kapillarkolonne med betulin som intern standard.
3. APPARATUR
3.1. En 150 ml kolbe til forsæbning med tilbagesvaler med glasslib.3.2. 500 ml skilletragte.3.3. 250 ml kolber.3.4. Trykudligningstragte, 250 ml eller tilsvarende, til opsamling af
fordampet diethylether.
3.5. Glaskolonne, 350 mm × 20 mm, med sintret glasskive.3.6. Vandbad eller varmekappe.3.7. Prøveglas, 2 ml.3.8. Gaskromatograf (med splitningssystem), som egner sig til brug med
kapillarkolonne, bestående af:
3.8.1. en kolonneovn, som kan opretholde den ønskede temperatur inden for ±
1°C
3.8.2. injektionsblok med temperaturindstilling
3.8.3. flammeioniseringsdetektor og konverter/forstærker3.8.4. skriver med integrator, som kan anvendes sammen med konverteren/
forstærkeren (3.8.3).
3.9. Kapillarkolonne i kvartsglas, coated med BP1 eller tilsvarende i en
ensartet lagtykkelse på 0,25 µm; kolonnen skal kunne adskille trimethyl-silylderivater af lanosterol og sitosterol — en BP1-kolonne på 12 m med0,2 mm indre diameter er velegnet.
3.10. Mikrosprøjte på 1 µm med hærdet nål.
4. REAGENSER
Alle reagenser skal være analytisk rene. Vand skal være destilleret eller
af mindst tilsvarende renhedsgrad.
4.1. Ethanol, mindst 95 %.4.2. Kaliumhydroxid, 60 %: 600 g kaliumhydroxid (minimum 85 %) opløses
i vand og fortyndes til 1 liter med vand.
4.3. Betulin, mindst 99 %.
4.3.1. Intern standardopløsning. Betulin i diethylether (4.4)
4.3.1.1. Betulinopløsningen til bestemmelse af sitosterol skal være af en koncen-
tration på 1,0 mg/ml;
4.3.1.2. Betulinopløsningen til bestemmelse af stigmasterol skal være af en
koncentration på 0,4 mg/ml.
1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 4
▼B
4.4. Analytisk ren diethylether (fri for peroxider og rester).
4.5. Natriumsulfat, vandfrit, granuleret og tørret ved 102 °C i to timer.
4.6. Silyleringsreagens, f. eks. TRI-SIL (kan fås fra Pierce Chemical Co,
katalognummer 49001) eller tilsvarende. (ADVARSEL: TRI-SIL erbrændbart, ætsende, giftigt og muligvis kræftfremkaldende. Laboratorie-personalet skal have kendskab til sikkerhedsbestemmelserne forTRI-SIL og handle derefter).
4.7. Lanosterol.4.8. Sitosterol af en kendt renhedsgrad på ikke under 90 % (P).
Note 1: Renhedsgraden af standardmaterialer, som anvendes til kalibre-
ring, fastsættes efter standardiseringsprincippet. Det forudsættes, atsamtlige steroler, som findes i prøven, kommer til udtryk på kromato-grammet, at toppenes samlede areal repræsenterer 100 % af sterolind-holdet og at sterolerne fremkalder samme detektorrespons. Systemetslinearitet skal kontrolleres for de aktuelle koncentrationsområder.
4.8.1. Sitosterolstandardopløsning — der fremstilles en opløsning af sitosterol
(4.8) i diethylether (4.4), indeholdende ca. 0,5 mg/ml) (med en nøjag-tighed på 0,001 mg/ml) (W
1).
4.9. Stigmasterol af en kendt renhedsgrad på ikke under 90 % (P).4.9.1. Stigmasterolstandardopløsning — der fremstilles en opløsning af stig-
masterol (4.9) i diethylether (4.4), indeholdende ca. 0,2 mg/ml (med ennøjagtighed på 0,001 mg/ml (W
1).
4.10. Opløsning til kontrol af adskillelsesevne. Der fremstilles en opløsning af
0,05 mg lanosterol (4.7) og 0,5 mg sitosterol (4.8) pr. ml diethylether(4.4).
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Fremstilling af standardopløsning til kromatografi. Tilsætning af intern
standardopløsning (4.3.1) til den pågældende sterolstandardopløsningskal ske samtidig med tilsætning til den forsæbede prøve (se 5.2.2).
5.1.1. Standardkromatografiopløsning for sitosterol; der overføres 1 ml sitoste-
rolstandardopløsning (4.8.1) til hvert af to prøveglas (3.7), og diethylet-heren afdampes med nitrogen. Der tilsættes 1 ml intern standardopløs-ning (4.3.1.1), og diethyletheren afdampes med nitrogen.
5.1.2. Standardkromatografiopløsning for stigmasterol; der overføres 1 ml stig-
masterolstandardopløsning (4.9.1) til hvert af to prøveglas (3.7), ogdiethyletheren afdampes med nitrogen. Der tilsættes 1 ml intern stan-dardopløsning (4.3.1.2), og diethyletheren afdampes med nitrogen.
5.2. Tilberedning af uforsæbelige bestanddele.
5.2.1. Smørprøven smeltes ved opvarmning til højst 35 °C. Den blandes
omhyggeligt ved omrøring. Der afveje s 1 g smør (W
2), med 1 mg
nøjagtighed, i en 150 ml kolbe (3.1). Der tilsættes 50 ml ethanol (4.1) og10 ml kaliumhydroxidopløsning (4.2). Tilbagesvaleren påsættes, ogkolben opvarmes til ca. 75 °C i 30 minutter. Svaleren tages af, og
kolben afkøles til rumtemperatur.
5.2.2. Kolben tilsættes 1,0 ml intern standardopløsning. Hvis indholdet af
sitosterol skal bestemmes, anvendes opløsningen i (4.3.1.1), hvis detdrejer sig om stigmasterol, anvendes opløsningen i (4.3.1.2). Efteromhyggelig blanding overføres indholdet kvantitativt til en 500 mlskilletragt (3.2), og kolben skylles med 50 ml vand og 250 ml diethy-lether (4.4). Skilletragten rystes kraftigt i to minutter, hvorefter manlader faserne adskilles. Det nedre vandige lag tappes af, og etherlagetvaskes ved at ryste kolben med fire hold vand à 100 ml.
Note 2: For at undgå emulsionsdannelse er det meget vigtigt at være
forsigtig ved de første to vaskninger (kolben vendes ti gange). Vedtredje vask rystes kraftigt i 30 sekunder. En eventuel emulsion kan
1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 5
▼B
brydes ved at tilsætte 5 til 10 ml ethanol. Hvis der tilsættes ethanol, skal
der foretages yderligere to grundige vaskninger med vand.
5.2.3. Det klare, sæbefrie etherlag ledes igennem en glaskolonne (3.5), som
indeholder 30 g vandfri natriumsulfat (4.5). Etheren opsamles i en 250ml kolbe (3.3). Der tilsættes en kogesten, og etheren afdampes til næstentørhed i vandbad eller varmekappe, mens overskydende opløsnings-middel omhyggeligt opsamles.
Note 3: Hvis prøveekstrakter inddampes til fuldstændig tørhed ved for
høj temperatur, kan der ske tab af sterol.
5.3. Fremstilling af trimethylsilylethere.
5.3.1. Den resterende etheropløsning i kolben hældes i et 2 ml prøveglas (3.7)
med 2 ml diethylether, og etheren afdampes med nitrogen. Kolbenskylles med yderligere to hold diethylethe r à 2 ml. Indholdet hældes
hver gang over i prøveglasset, og etheren afdampes med nitrogen.
5.3.2. Prøven silyleres ved tilsætning af 1 ml TRI-SIL (4.6). Prøveglasset
lukkes og rystes grundigt for at opløse prøven. Hvis prøven stadig ikkeer fuldstændigt opløst, opvarmes den til 65—70 °C. Prøven henstår i
mindst fem minutter, inden den indsprøjtes i gaskromatografen. Referen-ceopløsningerne silyleres på samme måde som prøverne. Opløsningen tilkontrol af adskillelsesevnen (4.10) silyleres på samme måde.
Note 4: Silylering skal foretages i vandfrit miljø. Ved ufuldstændig
silylering ses en top tæt ved betulintoppen.
Ethanol, kan give interferens ved silylering. Dette kan skyldes utilstræk-
kelig vaskning under ekstraktionen. Hvis dette problem forekommer,kan der foretages en femte vaskning med kraftig rystning 30 sekunderunder ekstraktionen.
5.4. Gaskromatografisk analyse.
5.4.1. Kromatografibetingelser.
Gaskromatografen indstilles som angivet i betjeningsvejledningen.
De vejledende kromatografibetingelser er som følger:
— kolonnetemperatur 265 °C
— injektorblokkens temperatur 280 °C
— detektorens temperatur 300 °C
— bæregassens gennemstrømningshastighed 0,6 ml/minut— hydrogentryk 84 kPa— lufttryk 155 kPa— splitningssystemet indstilles til mellem 10: 1 og 50: 1 og optimeres
i henhold til betjeningsvejledningen, hvorefter detektorresponsens line-aritet kontrolleres inden for det aktuelle koncentrationsområde.
Note 5: Det er af særlig vigtighed, at injektionsblokkens belægning
rengøres regelmæssigt.
— indsprøjtet mængde: 1 µl trimethylsilyletheropløsning.
Systemet skal være i ligevægt og grundlinjen stabil, inden analysen
påbegyndes.
Disse betingelser kan fraviges, hvis særlige forhold ved kolonnen og
gaskromatografen gør det nødvendigt for at opnå kromatogrammer, somopfylder følgende krav:
— sitosteroltoppen skal være tydeligt adskilt fra lanosteroltoppen. I
figur 1 ses, hvordan et kromatogram af en silyleret opløsning tilkontrol af adskillelsesevnen (4.10) typisk skal se ud
— den relative retentionstid for følgende steroler skal være ca:
1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 6
▼B
Cholesterol 1,0
Stigmasterol 1,3Sitosterol 1,5Betulin 2,5
— retentionstiden for betulin skal være ca. 24 minutter.
5.4.2. Analyseprocedure
Der indsprøjtes 1 µl silyleret standardopløsning (stigmasterol eller sito-
sterol), og integratorens kalibreringsparametre indstilles.
Herefter indsprøjtes yderligere 1 µl silyleret standardopløsning for at
bestemme responsfaktorerne for betulin.
Der indsprøjtes 1 µl silyleret prøveopløsning, og toppene aflæses. Hver
kromatografisk serie skal indledes og afsluttes med indsprøjtning afstandardopløsninger. Som hovedregel kan der indsprøjtes seks prøver ihver serie.
Note 6: Integration af stigmasteroltoppen skal også omfatte en evt. hale
som afgrænset af punkt 1, 2 o g 3 i figur 2b.
Integration af sitosteroltoppen skal også omfatte toppen for 22-
dihydro- β-sitosterol (stigmastanol), som eluerer umiddelbart efter sito-
sterol se figur 3b, når den samlede mængde sitosterol bestemmes.
6. BEREGNING AF RESULTATER
6.1. Arealet af steroltoppe og betulintoppe i begge referencekromatogrammer
omkring en serie bestemmes, og R
1beregnes således:
R1=gennemsnitligt topareal af sterol i standard
gennemsnitligt topareal af betulin i standard
arealet af steroltoppen (stigmasterol eller sitosterol) og betulintoppen i
prøven bestemmes, og R2beregnes således:
R2=topareal af sterol i prøven
topareal af betulin i prøven
W1= sterolindhold (i mg )i1m l standardopløsning (4.8.1 eller 4.9.1)
W2= prøvens væg t i g (5.2.1)
P = renhedsgrad af sterolstandarden (4.8 eller 4.9)
sterolindhold i prøven (mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. METODENS PRÆCISION
7.1. Repeterbarhed.
7.1.1. Stigmasterol.
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøve-
materiale foretaget umiddelbart efter hinanden af den samme personmed det samme udstyr må ikke overstige 19,3 mg/kg.
7.1.2. Sitosterol.
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøve-
materiale foretaget umiddelbart efter hinanden af den samme personmed det samme udstyr må ikke overstige 23,0 mg/kg.
7.2. Reproducerbarhed.
7.2.1. Stigmasterol.
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøve-
materiale, foretaget i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, måikke overstige 31,9 mg/kg.
1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 7
▼B
7.2.2. Sitosterol.
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøve-
materiale, foretaget i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, måikke være større end 8,7 % af gennemsnittet af resultaterne.
7.3. Kilde for bestemmelserne om præcision.
Bestemmelserne om præcision er fastlagt på grundlag af et eksperiment,
som i 1992 blev foretaget med otte laboratorier og seks prøver (blindbe-stemmelse med tre dobbeltprøver) for stigmasterol; seks prøver (blind-bestemmelse med tre dobbeltprøver) for sitosterol.
8. TOLERANCER
▼
M1
8.1. Der udtages tre prøver af produktet med røbestof for at kontrollere, om
iblandingen af røbestof i produktet er korrekt.
▼B
8.2. Stigmasterol.
8.2.1. Der iblandes 150 g mindst 95 % ren stigmasterol pr. ton smør, dvs.
142,5 mg/kg; eller 170 g mindst 85 % ren stigmasterol pr. ton smør, dvs.144,5 mg/kg.
▼
M1
8.2.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at
kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og detlaveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier(under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynligheds-grænse (CrD95)):
— 116,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigma-
sterol)
— 118,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigma-
sterol)
— 81,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigma-
sterol)
— 82,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigma-
sterol).
Røbestofkoncentrationen i den prøve, der giver det laveste resultat,
benyttes sammen med interpolering mellem henholdsvis 116,0 mg/kg og81,0 mg/kg og 118,0 mg/kg og 82,0 mg/kg.
▼
B
8.3. Sitosterol.
8.3.1. Der iblandes 600 g mindst 90 % ren sitosterol pr. ton smør, dvs. 540
mg/kg.
▼M1
8.3.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at
kontrollere mængden og renheden af det iblandede røbestof, og detlaveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier(under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynligheds-grænse (CrD95)):
— 486,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol)
— 358,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 90 % ren sito-
sterol).
Røbestofkoncentrationen i den prøve, der giver det laveste resultat,benyttes sammen med interpolering mellem 486,0 mg/kg og 358,0 mg/kg.
1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 8
▼
M1
1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 9
▼M1

1994R0086 — DA — 03.02.1999 — 001.001 — 10
▼
M1