1991R2568 — DA — 01.01.2008 — 021.001

Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor

Ændret ved:





Berigtiget ved:









▼B

KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91

af 11. juli 1991

om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte metoder







KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR — under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europæiske Økonomiske Fællesskab, under henvisning til Rådets forordning nr. 136/66/EØF af 22. september 1966 om oprettelse af en fælles markedsordning for fedtstoffer ( 1 ), senest ændret ved forordning (EØF) nr. 3577/90 ( 2 ), særlig artikel 35a, og ud fra følgende betragtninger: ud fra følgende betragtninger: I bilaget til forordning nr. 136/66/EØF er der fastsat betegnelser for og definitioner på olivenolie og olie af olivenpresserester, der afsættes i de enkelte medlemsstater, i samhandelen mellem medlemsstaterne og i samhandelen mellem medlemsstaterne og tredjelande; for at kunne skelne mellem de forskellige typer olie er det nødvendigt at definere de fysisk-kemiske kendetegn for hver type samt de organoleptiske kendetegn for jomfruolie, således at produkternes renhed og kvalitet sikres uden at dette berører andre eksisterende bestemmelser på området; kendetegnene for de forskellige typer olie bør fastlægges ensartet for hele Fællesskabet; med henblik herpå bør der fastlægges EF-metoder for kemisk analyse og orgenoleptisk vurdering; i en overgangsperiode bør medlemsstaterne dog kunne anvende andre metoder, idet det dog skal fastsættes, at det er resultatet af den fælles metode, der gælder i tilfælde af uoverensstemmelse; definitionen af de fysisk-kemiske kendetegn for olivenolie og analysemetoder indebærer, at de supplerende bestemmelser til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur skal tilpasses; som led i metoden til bedømmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn skal der oprettes paneler af udvalgte og øvede smagsdommere; der bør afsættes den fornødne tid til etablering af en sådan struktur; i betragtning af de vanskeligheder, som visse medlemsstater vil få med at oprette panelerne, bør det tillades disse medlemsstater at benytte de i andre medlemsstater eksisterende paneler; for at ordningen med importafgift på olivenpresserester kan fungere efter hensigten bør der fastlægges en fælles metode til bestemmelse af olieindholdet i disse produkter; for ikke at påføre handelen skade, bør det fastsættes, at det i en begrænset periode er tilladt at afsætte olie aftappet før denne forordnings ikrafttræden; Kommissionens forordning (EØF) nr. 1058/77 ( 3 ), senest ændret ved forordning (EØF) nr. 1858/88 ( 4 ), bør ophæves; Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer har ikke afgivet udtalelse inden for den af formanden fastsatte frist — UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:







▼M20

Artikel 1

1. Som jomfruolie efter punkt 1, litra a) og b), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis respektive kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 1 og 2 i bilag I til nærværende forordning.

2. Som bomolie efter punkt 1, litra c), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 3 i bilag I til nærværende forordning.

3. Som raffineret olivenolie efter punkt 2 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 4 i bilag I til nærværende forordning.

4. Som olivenolie bestående af raffineret olivenolie og jomfruolier efter punkt 3 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 5 i bilag I til nærværende forordning.

5. Som rå olie af olivenpresserester efter punkt 4 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 6 i bilag I til nærværende forordning.

6. Som raffineret olie af olivenpresserester efter punkt 5 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 7 i bilag I til nærværende forordning.

7. Som olie af olivenpresserester efter punkt 6 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 8 i bilag I til nærværende forordning.

▼B

Artikel 2

1. Bestemmelsen af kendetegnene for de i bilag I fastsatte olier sker ved hjælp af følgende analysemetoder:

— til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre, metoden i bilag II

— til bestemmelse af peroxidtallet, metoden i bilag III

▼M19

— til bestemmelse af indholdet af voks: metoden i bilag IV

▼B

— til bestemmelse af indholdet af steroler, metoden i bilag V

— til bestemmelse af indholdet af erytrodiol og uvaol, metoden i bilag VI

▼M21

— til bestemmelse af det procentvise indhold af 2-glycerylmonopalmitat, metoden i bilag VII

▼M20 —————

▼B

— til den spektrofotometriske undersøgelse, metoden i bilag IX

— til bestemmelse af fedtsyrernes sammensætning, metoden i bilag X A og X B

— til bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsningsmidler, metoden i bilag XI

— til bestemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn, metoden i bilag XII, anvendt som omhandlet i stk. 2

▼M20 —————

▼M11

— til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener, metoden i bilag XVII.

▼M13

— til bestemmelse af indholdet af ECN42-holdige triglycerider, metoden i bilag XVIII.

▼M19

— til bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer: metoden i bilag XIX.

▼M19

2. Den kontrol, som de nationale myndigheder eller deres repræsentanter foretager af de organoleptiske kendetegn for jomfruolie, gennemføres af paneler af smagere, som medlemsstaterne har godkendt.

De organoleptiske kendetegn for en i første afsnit omhandlet olivenolie anses for at stemme overens med den anmeldte type olivenolie, hvis et af den pågældende medlemsstat godkendt panel bekræfter klassifikationen i den henseende.

Hvis det godkendte panel ikke bekræfter anmeldelsen med hensyn til de organoleptiske kendetegn for den anmeldte type olivenolie, lader de nationale myndigheder eller deres repræsentanter på den berørte parts anmodning foretage to kontrolanalyser, som udføres af andre godkendte paneler, og hvoraf mindst den ene udføres af et panel, der er godkendt af den pågældende producentmedlemsstat. De pågældende kendetegn anses for at stemme overens med dem, der er anmeldt, hvis de to kontrolanalyser bekræfter den anmeldte klassifikation. I modsat fald pålægges kontrolanalyseudgifterne den berørte part, uden at dette foregriber anvendelsen af sanktioner.

▼M17

3. Hvad angår de nationale myndigheders eller deres repræsentanters kontrol af oliens kendetegn som omhandlet i stk. 1 udtages der prøver efter de internationale standarder EN ISO 661 og EN ISO 5555 for forberedelse af prøver til forsøg og prøveudtagning. Uanset punkt 6.8 i standard EN ISO 5555 udtages prøverne i henhold til bilag Ia til denne forordning for partier af den nævnte olie i umiddelbare emballager på 100 liter eller derunder.

▼M19

Med forbehold af bestemmelserne i standard EN ISO 5555 og kapitel 6 i standard ISO 661 beskyttes prøverne hurtigst muligt mod lys og stærk varme og sendes til laboratoriet til analyse senest:

— den tiende arbejdsdag efter udtagningsdagen i månederne oktober-maj, og

— den femte arbejdsdag efter udtagningsdagen i månederne juni-september.

▼M17

4. ►M20 Med hensyn til kontrollen i stk. 3 foretages analyserne i bilag II, III, IX, X og XII samt eventuelle kontrolanalyser, der er fastsat ved national lov, inden datoen for mindste holdbarhed. Udtages prøverne mere end fire måneder før sidste holdbarhedsdato, foretages analyserne senest fire måneder efter prøveudtagningen. Der gælder ingen frister for de øvrige analyser, som er fastsat ved forordningen. ◄

Svarer analyseresultaterne ikke til kendetegnene for den anmeldte kategori olivenolie eller olie af olivenpresserester, underrettes den pågældende herom senest en måned inden udløbet af fristen i første afsnit, undtagen hvis prøveudtagningen fandt sted mindre end en måned inden datoen for mindste holdbarhed.

▼M19

5. Til bestemmelse af olivenoliernes kendetegn efter metoderne omhandlet i stk. 1 sammenlignes analyseresultaterne direkte med de i denne forordning fastsatte grænseværdier.

▼M20

Artikel 2a

De nationale myndigheders eller deres repræsentanters kontrol af, om en prøve af olivenolie og olie af olivenpresserester svarer til den anmeldte kategori, kan enten foregå ved:

a) at analyserne i bilag I udføres i vilkårlig rækkefølge, eller

b) at analyserne udføres i den rækkefølge, der er angivet i beslutningsskemaet i bilag Ib, indtil en af beslutningerne i samme skema træffes.

▼M19 —————

▼M5

Artikel ►M19 3 ◄

Konstateres det, at en olies organoleptiske kendetegn er forskellige fra dem, der følger af dens benævnelse, anvender medlemsstaten administrative bøder, hvis størrelse afhænger af den konstaterede uregelmæssigheds omfang, uden at dette i øvrigt udelukker eventuelle andre sanktioner.

Ved vurderingen af uregelmæssigheden tages der hensyn til den naturlige udvikling i kendetegnene for en olie, der er opbevaret under normale vilkår.

I begyndelsen af hvert halvår underretter medlemsstaterne om antallet og arten af konstaterede uregelmæssigheder og de sanktioner, der er anvendt i det foregående halvår.

▼M5

Artikel 4

▼M19

1. Med henblik på de nationale myndigheders eller deres repræsentants vurdering og kontrol af de organoleptiske kendetegn kan medlemsstaterne godkende paneler af smagere.

Godkendelsesbetingelserne fastlægges af medlemsstaterne, således at bl.a.

— betingelserne i bilag XII, punkt 4, opfyldes

— det sikres, at panelets leder optrænes af en virksomhed og på betingelser, som er anerkendt af medlemsstaten i den henseende

— godkendelsens gyldighed gøres afhængig af de resultater, der opnås ved en årlig kontrolordning, som medlemsstaten har oprettet.

Hver medlemsstat meddeler Kommissionen listen over godkendte paneler og de foranstaltninger, der er truffet i henhold til dette stykke.

▼M5

2. Hvis en medlemsstat har vanskeligheder med at oprette et panel på sit område, kan den gøre brug af et godkendt panel i en anden medlemsstat.

3. Hver medlemsstat opstiller en liste over de paneler af smagsdommere, der er oprettet af erhvervs- eller brancheorganisationer på de i stk. 1 fastsatte betingelser, og de kontrollerer, at disse betingelser overholdes.

▼M19 —————

▼B

Artikel 6

1. Olieindholdet i presserester og andre restprodukter fra udvinding af olivenolie (KN-kode 2306 90 11 og 2306 90 19) bestemmes efter metoden i bilag XV.

2. Det i stk. 1 omhandlede olieindhold udtrykkes i vægtprocent af tørstoffet.

▼M20

Artikel 7

EF-bestemmelserne om forekomst af forurenende stoffer finder anvendelse.

Hvad indholdet af halogenerede opløsningsmidler angår, gælder følgende grænseværdier for alle kategorier af olivenolie:

— Maksimalt indhold af hvert påvist halogeneret opløsningsmiddel: 0,1 mg/kg

— Maksimalt samlet indhold af påviste halogenerede opløsningsmidler: 0,2 mg/kg.

▼B

Artikel 8

1. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen, hvilke foranstaltninger de træffer til anvendelse af denne forordning.

2. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen i begyndelsen af hvert halvår en oversigt over analyseresultaterne i forbindelse med de bestemmelser, der er foretaget i løbet af det foregående halvår.

Resultaterne gennemgås af Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer efter proceduren i artikel 39 i forordning nr. 136/66/EØF.

Artikel 9

Forordning (EØF) nr. 1058/77 ophæves.

Artikel 10

1. Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.

Metoden i bilag XII anvendes dog fra den ►M1 1. november 1992 ◄ , undtagen i forbindelse med interventionsforanstaltninger.

▼M5

Metoden anvendes ikke for jomfruolie, der er aftappet før den 1. november 1992.

▼B

2. Denne forordning anvendes ikke for olivenolie og olie af olivenpresserester, der aftappes inden datoen for denne forordnings ikrafttræden, og som bringes i handelen inden den 31. oktober 1992.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.









BILAG

Resumé







Bilag I: Karakteristika ved olivenolie Bilag Ia: Prøveudtagning for partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester i umiddelbare emballager på højst 100 liter Bilag Ib: Beslutningsskema Bilag II: ►M21 Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, kold metode ◄ Bilag III: Bestemmelse af peroxidtallet Bilag IV: ►M6 Bestemmelse af voksindhold ved gaskramatografering med kapillarkolonne ◄ Bilag V: Bestemmelse af sammensætningen og indholdet af steroler ved gaskromatografi på kapillarsøjle Bilag VI: Bestemmelse af erythrodiol og uvaol Bilag VII: ►M21 Bestemmelse af indholdet af 2-glycerylmonopalmitat i procent ◄ Bilag VIII: Bestemmelse af indholdet af trilinolein Bilag IX: Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys Bilag XA: Gaskromatografering af fedtsyremethylestere Bilag XB: Fremstilling af fedtsyremethylestere Bilag XI: Bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsningsmidler i olivenolie Bilag XII: Organoleptisk vurdering af jomfruolie Bilag XIII: ►M6 Neutralisation og blegning af olivenolie i laboratoriet ◄ Bilag XIV: Supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur Bilag XV: Olieindhold i presserester af oliven Bilag XVI: Bestemmelse af iodtal Bilag XVII: Metode til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener i vegetabilske olier Bilag XVIII: Bestemmelse af indholdet af ECN42-holdige triglycerider Bilag XIX: Metode til bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer

▼M21









BILAG I







KENDETEGN FOR OLIVENOLIE Kategori Surhedsgrad (%) (*) Peroxidtal mEq O2/kg (*) Voks mg/kg (**) 2-glycerylmonopalmitat (%) Stigmastadien mg/kg (1) Forskel mellem HPLC og ECN42, teoretisk beregnet K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Organoleptisk vurdering Median for mangler (Md) (*) Organoleptisk vurdering Median for lugt og smag (Mf) (*) 1. Ekstra jomfruolie ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % ≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Jomfruolie ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % ≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 2,5 Mf > 0 3. Bomolie > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % ≤ 1,1, hvis palmitinsyre i alt > 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 2,5 (2) — 4. Raffineret olivenolie ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % ≤ 1,1, hvis palmitinsyre i alt > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Olivenolie bestående af raffinerede olivenolier og jomfruolier ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % ≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Rå olie af olivenpresserester — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Raffineret olie af olivenpresserester ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olie af olivenpresserester ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Kategori Fedtsyreindhold (1) Summen af isomerer af transoliesyrer (%) Summen af isomerer af translinolsyre og translinolensyre (%) Sterolsammensætning Steroler i alt (mg/kg) Erythrodiol og uvaol (%) (**) Myristin (%) Linolen (%) Arachin (%) Eicosan (%) Behen (%) Lignocerin (%) Kolesterol (%) Brassicasterol (%) Campesterol (%) Stigmasterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7-stigmastenol (%) 1. Ekstra jomfruolie ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Jomfruolie ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Bomolie ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Raffineret olivenolie ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olivenolie, blandet ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Rå olie af olivenpresserester ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Raffineret olie af olivenpresserester ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olie af olivenpresserester ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









BILAG Ia

Udtagning af prøver af partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester leveret i umiddelbare emballager på højst 100 liter

Denne prøveudtagningsmetode anvendes for partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester på højst 125 000 liter, aftappet i umiddelbare emballager på højst 100 liter.

Hvis leverancen er på over 125 000 liter, opdeles den i partier på 125 000 liter eller derunder. Hvis leverancen er på under 125 000 liter, udgør den ét parti. Metoden anvendes da for hvert parti.

Ud fra partiets størrelse fastsættes det mindste antal basisprøver, der skal udtages, jf. tabellen i punkt 1.

Basisprøvens størrelse bestemmes ud fra de umiddelbare emballagers indhold, jf. tabellen i punkt 2.1.

Leverancer, basisprøver og laboratorieprøver svarer til definitionerne i EN ISO 5555.

Ved »parti« forstås de salgsenheder, der produceres, fremstilles og aftappes under sådanne forhold, at olien i alle disse salgsenheder anses for homogen med hensyn til alle analysekendetegn.

1. ANTAL BASISPRØVER

Det mindste antal basisprøver, der skal udtages, fastsættes på grundlag af partiets størrelse som vist i nedenstående tabel:







Parti (liter) på under Mindste antal basisprøver 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Til basisprøven udvælges umiddelbare emballager, som står ved siden af hinanden i partiet.

I tvivlstilfælde kan medlemsstaterne forøge det antal basisprøver, der skal udtages.

2. BASISPRØVENS INDHOLD

2.1 En basisprøve omfatter følgende:







Hvis de umiddelbare emballager indeholder: tages basisprøven af olien i: a) 5 liter eller derover a) 3 umiddelbare emballager b) 3 liter eller derover, men under 5 liter b) 3 umiddelbare emballager c) 2 liter eller derover, men under 3 liter c) 3 umiddelbare emballager d) 1 liter eller derover, men under 2 liter d) 6 umiddelbare emballager e) 0,75 liter eller derover, men under 1 liter e) 6 umiddelbare emballager f) under 0,75 liter f) 3 gange olien i det mindste antal emballager, hvis samlede indhold overstiger 1,5 liter

2.2 Basisprøverne skal opbevares i de umiddelbare emballager indtil det tidspunkt, hvor analyserne foretages. Olien i basisprøverne opdeles derpå i givet fald i tre laboratorieprøver med henblik på at foretage:

a) analyserne i bilag II, III, IX og X

b) analysen i bilag XII

c) de øvrige analyser.

2.3 Emballager, der udgør en basisprøve, opdeles efter de kontrolprocedurer, der er fastsat i de nationale lovgivninger.

3. ANALYSER OG RESULTATER

a) Hver basisprøve som omhandlet i punkt 1 opdeles i laboratorieprøver, jf. punkt 2.5 i standard EN ISO 5555, med henblik på at blive underkastet følgende analyser: — bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, jf. artikel 2, stk. 1, første led — bestemmelse af peroxidtallet, jf. artikel 2, stk. 1, andet led — spektrofotometrisk undersøgelse, jf. artikel 2, stk. 1, ottende led — fedtsyrernes sammensætning, jf. artikel 2, stk. 1, niende led.

b) Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra a), for mindst en af basisprøverne fra samme parti ikke svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for ikke at opfylde kravene. Hvis analyseresultaterne, jf. litra a), for hver af basisprøverne fra samme parti ikke alle er homogene under hensyntagen til repeterbarheden af de pågældende metoder, anses hele partiet for at være uhomogent, og hver basisprøve skal underkastes de øvrige foreskrevne analyser. I modsat fald skal kun en af basisprøverne fra dette parti underkastes de foreskrevne analyser.

c) Hvis et af analyseresultaterne, jf. litra b), andet afsnit, ikke svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for ikke at opfylde kravene. Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra b), andet afsnit, svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for at opfylde kravene.

▼M20









BILAG Ib

BESLUTNINGSSKEMA TIL KONTROL AF, OM EN OLIVENOLIEPRØVE SVARER TIL DEN ANMELDTE KATEGORI

Analyse af, om en olivenolie eller olie af olivenpresserester svarer til den anmeldte kategori, kan foretages:

a) enten ved i vilkårlig rækkefølge at udføre de analyser, der er fastsat til kontrol af, at de i bilag I fastsatte kendetegn er overholdt

b) eller ved i den i beslutningsskemaet fastsatte rækkefølge at udføre de deri fastsatte analyser, indtil man når frem til en af de i skemaet nævnte beslutninger.

De analyser vedrørende forurenende stoffer, der er nødvendige for at fastslå, om et produkt overholder EF's normer, udføres særskilt.

Beslutningsskemaet skal anvendes for alle kategorier af olivenolie og olie af olivenpresserester. Det består af tabeller med numrene 1 til 11, der skal anvendes som foreskrevet og i den i oversigtstabellen angivne rækkefølge afhængigt af, hvilken kategori olie der er anmeldt.

Oversigtstabellen og tabel 1 til 11 læses som følger:

— En dobbelt linje (=) angiver den vej, der skal følges i tilfælde af overensstemmelse (positivt svar) med betingelserne i den foregående rubrik; en stiplet linje (…) angiver omvendt, hvilken vej der skal følges i tilfælde af manglende overensstemmelse.

— Overskrifterne i rubrikkerne i tabel 1 til 11 vedrører de i denne forordning fastsatte analyser på grundlag af de sammenligninger, der er nævnt i tillæg 1 til dette bilag.

— Referencebogstaverne i cirklerne for negativ beslutning i tabel 1 til 11 svarer til de vejledende oplysninger, der er nævnt i tillæg 2 til dette bilag. De indebærer ikke i sig selv nogen forpligtelse til at fortsætte analyserne eller sikkerhed for de nævnte formodninger.

Oversigtstabel

Tabel 1

Tabel 2

Tabel 3

Tabel 4

Tabel 5

Tabel 6

Tabel 7

Tabel 8

Tabel 9

Tabel 10

Tabel 11









Tillæg 1

Overensstemmelse mellem bilagene til denne forordning og de i beslutningsskemaet nævnte analyser







▼M21 — Syreindhold Bilag II Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, kold metode ▼M20 — Peroxidtal Bilag III Bestemmelse af peroxidtal — Spektrofotometri ved ultraviolet lys Bilag IX Spektrofotometrisk analyse — Organoleptisk vurdering Bilag XII Organoleptisk vurdering af jomfruolie — Stigmasta-3,5-dien Bilag XVII Metode til bestemmelse af indhold af stigmastadiener i vegetabilske olier — Transisomerer i fedtsyrer Bilag X a og Gaskromatografianalyse af fedtsyremethylestere Bilag X b Forberedelse af fedtsyremethylestere — Sammensætning af fedtsyrer Bilag X a og Gaskromatografianalyse af fedtsyremethylestere Bilag X b Forberedelse af fedtsyremethylestere — ΔECN42 Bilag XVIII Bestemmelse af sammensætning af triglycerider i ECN42 (forskel mellem faktisk og teoretisk sammensætning) — Sammensætning af steroler og steroler i alt Bilag V Bestemmelse af sammensætning og indhold af steroler ved gaskromatografi på kapillarsøjle — Erytrodiol og uvaol Bilag VI Bestemmelse af indhold af erytrodiol og uvaol — Voks Bilag IV Bestemmelse af voksindhold ved gaskromatografi på kapillarsøjle — Alifatiske alkoholer Bilag XIX Bestemmelse af indhold af alifatiske alkoholer ved gaskromatografi på kapillarsøjle ▼M21 — Mættede fedtsyrer i 2-stillingen Bilag VII Bestemmelse af indholdet af 2-glycerylmonopalmitat i procent ▼M20









Tillæg 2

Tabel 1

a) Se jomfruolie eller bomolie (tabel 2: kvalitetskriterier eller tabel 4: kvalitets- og renhedskriterier)

b) Se bomolie (tabel 4: kvalitets- og renhedskriterier)

Tabel 2

a) Se bomolie (tabel 4: kvalitets- og renhedskriterier)

b) Se jomfruolie ekstra (tabel 1: kvalitetskriterier)

Tabel 3

a) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)

b) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester

Tabel 4

a) Se jomfruolie ekstra og jomfruolie (tabel 1 og 2: kvalitetskriterier)

b) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)

c) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester

d) Tilstedeværelse af forestrede olier

Tabel 7

a) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester

b) Tilstedeværelse af forestrede olier

Tabel 8

a) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)

b) Se bomolie (tabel 4: kvalitets- og renhedskriterier)

c) Tilstedeværelse af forestrede olier

Tabel 11

a) Tilstedeværelse af forestrede olier

▼B









BILAG II

▼M21

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FRIE FEDTSYRER, KOLD METODE

▼B

1. FORMÅL

Bestemmelse af frie fedtsyrer i olivenolie. Indholdet af frie fedtsyrer udtrykkes ved det vedtægtsmæssigt beregnede syreindhold.

1.1. Princip

En analyseprøve opløses i en blanding af opløsningsmidler, hvorefter de tilstedeværende frie fedtsyrer bestemmes ved hjælp af en opløsning af kaliumhydroxid i ethanol.

1.2. Reagenser

Samtlige reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet, og der anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.

1.2.1. Dietyhlether/ethanol, 95 % (v/v), blandet i forholdet 1:1 efter rumfang. Note: Dietylether er meget let antændelig og kan danne eksplosive peroxider. Under anvendelsen skal der træffes særlige forholdsregler. Nøjagtigt på anvendelsestidspunktet neutraliseres med en opløsning af kaliumhydroxid (1.2.2) ved tilstedeværelse af 0,3 ml phenolphtalein-opløsning (1.2.3) pr. 100 ml blanding. Note: Hvis det ikke er muligt at anvende diethylether, kan en blanding af opløsningsmidler bestående af ethanol og toluen anvendes. Om nødvendigt kan ethanolen erstattes af 2-propanol.

1.2.2. Indstillet opløsning af kaliumhydroxid i ethanol, c(KOH) ca. 0,1 mol/l eller om nødvendigt c(KOH) ca. 0,5 mol/l. Den nøjagtige koncentration af kaliumhydroxid-opløsningen i ethanol skal være kendt og verificeres umiddelbart før brug. Der anvendes en opløsning, der er fremstillet mindst fem dage før brugen, og dekanteret over i en flaske af brunt glas, lukket med en gummiprop. Opløsningen skal være farveløs eller strågul. Note: En ufarvet stabil opløsning af kaliumhydroxid kan fremstilles på følgende måde: 1 000 ml ethanol med 8 g kaliumhydroxid og 0,5 g aluminiumspåner bringes i kog og holdes kogende i 1 time med tilbageløb. Derefter destilleres omgående, og den krævede mængde kaliumhydroxid opløses i destillatet. Man lader opløsningen henstå i flere dage og dekanterer derefter den øverste klare væske fra bundfaldet af kaliumcarbonat. Opløsingen kan også fremstilles uden destillation på følgende måde: til 1 000 ml ethanol tilsættes 4 ml aluminiumbutylat, hvorefter man lader blandingen henstå i nogle dage. Derefter dekanteres den klare væske fra, og heri opløses den krævede mængde kaliumhydroxid. Denne opløsning er klar til brug.

1.2.3. Phenolphtalein, opløsning med 10 g/l i 95—96 % (v/v) ethanol, eller alkaliblåt (i tilfælde af stærkt farvede fedtstoffer), opløsning med 20 g/l i 95—96 % (v/v) ethanol.

1.3. Apparatur

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:

1.3.1. Analysevægt.

1.3.2. 250 ml Erlenmeyer-kolbe.

1.3.3. 10 ml burette med 0,05 ml inddelinger.

1.4. Fremgangsmåde

1.4.1. Forberedelse af analyseprøve Analyseprøven forberedes i overensstemmelse med NF T 60—200. (På prøven som den er, hvis det samlede indhold af vand og urenheder ikke overstiger 1 %, ellers på en filtreret prøve). Bestemmelsen foretages på den filtrerede prøve. Hvis det samlede indhold af vand og urenheder er under 1 %, foretages bestemmelsen på den ubehandlede prøve.

1.4.2. Prøveudtagning Ud fra det antagne syreindhold udtages en prøve efter angivelserne i følgende tabel:



Antaget syreindhold vægtprocent Prøvens masse i g Prøven afvejes med en nøjagtighed i g på < 1 20 0,05 1— 4 10 0,02 4—15 2,5 0,01 15—75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Prøven afvejes i Erlenmeyer-kolben (1.3.2).

1.4.3. Bestemmelse Prøven (1.4.2) opløses i 50 — 150 ml af den på forhånd neutraliserede blanding af diethylether/ethanol (1.2.1). Under omrøring titreres med kaliumhydroxidopløsning, 0,1 mol/l (1.2.2) (se note 2), indtil indikatoren slår om (den rosa farve af phenolphtalein skal holde sig i mindst 10 sek.). Note 1: Den indstillede opløsning af kaliumhydroxid i ethanol (1.2.2) kan erstattes af en vandig opløsning af kaliumhydroxid eller natriumhydroxid, når den tilførte vandmængde ikke medfører faseadskillelse. Note 2: Hvis den nødvendige mængde 0,1 mol/l kaliumhydroxidopløsning overstiger 10 ml, anvendes i stedet en opløsning på 0,5 mol/l. Note 3: Bliver opløsningen uklar under titreringen, tilsættes så meget opløsningsmiddelblanding (1.2.1), at opløsningen bliver klar.

1.5. Angivelse af syreindholdet i % oliesyre

hvor:

V = rumfanget i ml af den forbrugte kaliumhydroxidopløsning

c = den nøjagtige koncentration i mol/l af den anvendte kaliumhydroxidopløsning

M = den molvægt i g/mol af syren, der er valgt til angivelse af resultatet (Moliesyre = 282 g/mol)

m = analyseprøvens vægt i gram.

Som resultat anvendes det aritmetiske gennemsnit ►M6 af to bestemmelser ◄ .









BILAG III

BESTEMMELSE AF PEROXIDTALLET

1. OMRÅDE

Denne standard beskriver en metode til bestemmelse af peroxidtallet for olier og fedtstoffer.

2. ANVENDELSESOMRÅDE

Denne standard finder anvendelse for animalske og vegetabilske olier og fedtstoffer.

3. DEFINITION

Peroxidtallet angiver den mængde stoffer i prøven, udtrykt som milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, som oxiderer kaliumiodid under de beskrevne forsøgsbetingelser.

4. PRINCIP

Analyseprøven, opløst i en blanding af eddikesyre og chloroform, behandles med en opløsning af kaliumiodid. Det frigjorte iod titreres med en indstillet natriumthiosulfatopløsning.

5. APPARATUR

Alt udstyr skal være fri for reducerende og oxiderende stoffer.

Note:

Sliboverflader må ikke indfedtes.

5.1. 3 ml glasske.

5.2. Kolber med slib og prop, på ca. 250 ml, som på forhånd tørres og fyldes med ren, tør inert gas (nitrogen eller — helst — carbondioxid).

5.3. 25 eller 50 ml burette med 0,1 ml inddeling.

6. REAGENSER

6.1. Analyseren chloroform, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør inert gas.

6.2. Analyseren iseddike, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør inert gas.

6.3. Mættet vandig opløsning af kaliumiodid, fremstillet umiddelbart før brug og fri for iod og iodater.

6.4. Natriumthiosulfat, 0,01 eller 0,002 N nøjagtigt indstillet vandig opløsning, indstillet umiddelbart før brug.

6.5. Stivelsesopløsning, 10 g/l vandig opslæmning, fremstillet umiddelbart før brug ud fra naturlig opløselig stivelse.

7. PRØVE

Prøven udtages og opbevares beskyttet mod lys, holdes nedkølet og opbevares i fuldstændigt fyldte glasbeholdere, der er hermetisk tillukket med slibpropper af glas eller korkpropper.

8. FREMGANGSMÅDE

Analysen udføres i diffust dagslys eller i kunstigt lys. I en glasske (5.1) eller i mangel heraf en kolbe (5.2) afvejes med en nøjagtighed på 0,001 g en prøvemængde i overensstemmelse med følgende tabel, svarende til det forventede peroxidtal:







Forventet perioxidtal (meq O2/kg) Analyseprøvens vægt (i g) 0 — 12 5,0 — 2,0 12 — 20 2,0 — 1,2 20 — 30 1,2 — 0,8 30 — 50 0,8 — 0,5 50 — 90 0,5 — 0,3

Proppen tages af en kolbe (5.2), og analyseprøven i glasskeen overføres til kolben. Der tilsættes 10 ml chloroform (6.1), og analyseprøven opløses hurtigt ved omrystning. Derefter tilsættes 15 ml eddikesyre (6.2), efterfulgt af 1 ml kaliumiodidopløsning (6.3). Så sættes proppen hurtigt i, og der omrystes i 1 min., hvorefter man lader kolben henstå i nøjagtigt 5 min. i mørke ved en temperatur på 15 — 25° C.

Der tilsættes ca. 75 ml destilleret vand, og det frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatopløsning (6.4) (0,002 N opløsning for forventede værdier under 12, og 0,01 N opløsning for forventede værdier over 12) under kraftig omrystning og med anvendelse af stivelsesopløsning (6.4) som indikator.

Der udføres to bestemmelser på samme analyseprøve.

Samtidig udføres en blindprøve. Hvis resultatet af blindprøven overstiger 0,05 ml 0,01 N natriumthiosulfatopløsning (6.4), udskiftes de urene reagenser.

9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Perioxidtallet (P.V.), udtrykt i milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, er givet ved formlen:

hvor:

V = antal ml forbrugt indstillet natriumthiosulfatopløsning (6.4) ved analysen, korrigeret for resultatet af blindprøven

T = den nøjagtige normalitet af den anvendte natriumthiosulfatopløsning (6.4),

m = analyseprøvens vægt i g.

Som resultat angives det aritmetiske gennemsnit af de to udførte bestemmelser.

▼M21









BILAG IV

BESTEMMELSE AF VOKSINDHOLD VED GASKROMATOGRAFERING MED KAPILLARKOLONNE

1. GENSTAND

Metoden er en procedure til bestemmelse af voksindholdet i olivenolie. Vokserne adskilles efter antallet af kulstofatomer. Metoden er navnlig velegnet, når der skal skelnes mellem olivenolie, der er udvundet ved presning, og olivenolie, der er udvundet ved ekstraktion (af presserester).

2. PRINCIP

Der tilsættes en egnet intern standard til olien, hvorefter adskillelsen finder sted ved kromatografering på en kolonne med hydratiseret silicagel. Den fraktion, der først elueres under prøvebetingelserne (og som har lavere polaritet end triglyceriderne), opsamles og analyseres direkte ved gaskromatografi med kapillarkolonne.

3. APPARATUR

3.1. 25 ml erlenmeyerkolbe

3.2. kromatografikolonne af glas, indvendig diameter 15,0 mm, længde 30-40 cm, med hane

3.3. gaskromatograf til brug med kapillarkolonne og med et system til direkte indsprøjtning i kolonnen, bestående af følgende: 3.3.1. termostatstyret kolonneovn med temperaturprogrammering 3.3.2. kold injektor til direkte indsprøjtning i kolonnen 3.3.3. en flammeioniseringsdetektor og en konverter-forstærker 3.3.4. skriver/integrator, der passer til konverter-forstærkeren (3.3.3), med responstid højst 1 sekund og variabel papirhastighed. (Der kan også benyttes computersystemer, hvor gaskromatografidataene opsamles på en PC.) 3.3.5. kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, længde 8-12 m og indvendig diameter 0,25-0,32 mm, coatet indvendigt med stationær fase i en ensartet lagtykkelse på 0,10-0,30 μm (egnet stationær fase af den kommercielle type SE52 eller SE54)

3.4. mikroinjektionssprøjte på 10 μl med hærdet kanyle til direkte indsprøjtning i kolonnen

3.5. elektrisk vibrator

3.6. rotationsfordamper

3.7. muffelovn

3.8. analysevægt med en nøjagtighed på ± 0,1 mg

3.9. sædvanligt glasudstyr.

4. REAGENSER

4.1. silicagel med kornstørrelse 60-200 μm Silicagelen anbringes i ovnen ved 500 °C i mindst fire timer. Efter afkøling tilsættes der 2 % vand beregnet på silicagelmængden. Pulveret rystes omhyggeligt, til det er ensartet. Opbevares i mørke i mindst tolv timer inden brug.

4.2. n-hexan til kromatografi

4.3. ethylether til kromatografering

4.4. n-heptan til kromatografi

4.5. kalibreringsopløsning af 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern standard) (Der kan også bruges palmitylpalmitat eller myristylstearat.) 4.5.1. Sudan 1 (1-phenylazo-2-naphthol)

4.6. bæregas: hydrogen eller helium, ren, til gaskromatografi

4.7. hjælpegasser: — hydrogen, ren, til gaskromatografi — luft, ren, til gaskromatografi.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Fremstilling af kromatografikolonnen

15 g silicagel (4.1) opslæmmes i n-hexan (4.2) og hældes i kolonnen (3.2). Når kolonnematerialet har sat sig ved henstand, pakkes det yderligere ved hjælp af en el-vibrator (3.5) for at opnå større homogenitet. Der elueres med 30 ml n-hexan for at fjerne eventuelle urenheder. På vægten (3.8) afvejes der nøjagtig 500 mg af prøven i en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1), og der tilsættes en mængde intern standard (4.5) svarende til det formodede voksindhold. F.eks. tilsættes der 0,1 mg laurylarachidat til presset olivenolie og 0,25-0,5 mg til olie af presserester. Den tilberedte prøve overføres til kromatografikolonnen ved hjælp af to portioner n-hexan (4.2) a 2 ml.

Der aftappes opløsningsmiddel, indtil væskeoverfladen står 1 mm over kolonnematerialet, og ved eluering med yderligere 70 ml n-hexan fjernes det naturlige indhold af n-alkaner. Kromatograferingen startes dernæst ved, at 180 ml af n-hexan/ethylether-blandingen i forholdet 99:1 opsamles med en hastighed på ca. 15 dråber pr. 10 sekunder. Prøveelueringen foretages ved en rumtemperatur på 22 ± 4 °C.

Bemærkninger:

— n-hexan/ethylether-blandingen (99:1) skal friskfremstilles hver dag.

— Korrekt eluering af vokserne kan kontrolleres visuelt ved, at der til prøveopløsningen tilsættes 100 μl 1 % Sudan 1 i elueringsvæsken. Farvestoffet har en retentionstid mellem vokser og triglycerider, så når farven har nået bunden af kolonnen, bør elueringen standses, eftersom al voks da er elueret.

Den derved fremkomne fraktion inddampes i en rotationsfordamper (3.6), indtil opløsningsmidlet næsten helt er forsvundet. De sidste 2 ml opløsningsmiddel fjernes ved hjælp af en svag nitrogenstrøm, og derefter tilsættes der 2-4 ml n-heptan.

5.2. Gaskromatografisk analyse

5.2.1. Indledende procedure

Kolonnen påmonteres gaskromatografen (3.3), idet den ene ende forbindes med injektionssystemet og den anden ende med detektoren. Gaskromatografen kontrolleres (gasledningerne, detektors og skrivers ydeevne, m.v.).

Hvis kolonnen ikke har været benyttet før, kan det anbefales at konditionere den. En svag gasstrøm ledes gennem kolonnen, hvorefter gaskromatografen sættes i gang. Der opvarmes gradvis til 350 °C over en periode på ca. fire timer. Denne temperatur holdes i mindst to timer, hvorefter apparaturet indstilles til arbejdsbetingelserne (gasstrømmen indstilles, der tændes for flammen, den elektroniske skriver (3.3.4) tilsluttes, kolonneovnens og detektorens temperatur indstilles, osv.). Signalet registreres med en følsomhed på mindst det dobbelte af den, der kræves for at foretage analysen. Basislinjen bør være lineær uden nogen form for toppe og uden nogen forstyrrelser.

Negativ drift tyder på utætheder i kolonneforbindelserne, mens positiv drift er tegn på utilstrækkelig konditionering af kolonnen.

5.2.2. Valg af arbejdsbetingelser

Arbejdsbetingelserne er normalt som følger:

— kolonnetemperatur: —



20 °C/minut 5 °C/minut 20 °C/minut fra 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektortemperatur: 350 °C

— indsprøjtet mængde: 1 μl af opløsningen i (2-4 ml) n-heptan

— bæregas: helium eller hydrogen med den for den valgte gas optimale lineære hastighed (se tillægget)

— instrumentfølsomhed: skal opfylde nedenstående krav:

Disse betingelser kan ændres alt efter kolonnens og gaskromatografens karakteristika, så man opnår adskillelse af alle vokser, en tilfredsstillende opløsning af toppene (se figuren) og en retentionstid for den interne C32-standard på 18 ± 3 minutter. Voksernes mest repræsentative top skal måle mindst 60 % af fuldt udslag.

Parametrene for toppenes integration fastlægges på en sådan måde, at de relevante toppes arealer vurderes korrekt.

Bemærkning: På grund af den høje sluttemperatur, tillades der en positiv drift på op til 10 % af fuldt udslag.

5.3. Udførelse af analysen

Der suges 1 μl af opløsningen op i 10 μl-mikrosprøjten, og stemplet trækkes tilbage, så kanylen er tom. Kanylen stikkes ind i injektionssystemet, og der indsprøjtes hurtigt efter 1-2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder trækkes kanylen forsigtigt ud.

Registreringen fortsættes, indtil alle vokserne er helt elueret.

Basislinjen skal hele tiden opfylde de fastsatte betingelser.

5.4. Identifikation af toppene

Toppene identificeres ud fra retentionstiderne, idet de sammenlignes med blandinger af vokser med kendte retentionstider analyseret under samme betingelser.

Figuren viser et kromatogram af vokser fra jomfruolie.

5.5. Kvantitativ vurdering

Arealerne af toppene for den interne standard og de alifatiske C40-C46-estere bestemmes ved hjælp af integratoren.

Indholdet af hver af voksesterne bestemmes i mg pr. kg fedtstof efter formlen:

hvor:

Ax = arealet af toppen for den enkelte ester i kvadratmillimeter

As = arealet af toppen for den interne standard i kvadratmillimeter

ms = massen af tilsat intern standard i milligram

m = massen af den prøve, der er udtaget til analyse, i gram.

6. ANGIVELSE AF RESULTATER

Summen af de forskellige C40-C46-vokser angives i mg pr. kg fedtstof (ppm).

Bemærkning: De bestanddele, der skal bestemmes kvantitativt, er dem med toppe, der kan identificeres som C40-C46-estere med et lige antal kulstofatomer, jf. kromatogrammet af vokser fra jomfruolie i nedenstående figur. Hvis C46-esteren giver en dobbelt top, tilrådes den identificeret ved analyse af voksfraktionen fra olie af olivenpresserester, hvor C46-toppen let kan identificeres på grund af sin størrelse.

Resultaterne angives med en decimal.

Figur

Kromatogram af vokser fra jomfruolie ( 5 )

Signaturer:

I.S. = laurylarachidat

1. = diterpenestere

2 + 2′ = C40-estere

3 + 3′ = C42-estere

4 + 4′ = C44-estere

5 = C46-estere

6 = sterolestere og triterpenalkoholer.









APPENDIKS

Bestemmelse af gassens lineære hastighed

Der indsprøjtes 1-3 μl methan (eller propan) i gaskromatografen, efter at den er indstillet til normale arbejdsbetingelser. Den tid, som det tager gassen at strømme gennem kolonnen, fra det øjeblik, den indsprøjtes, til toppen viser sig, måles (tM).

Den lineære hastighed i cm/s beregnes ved formlen L/tM, hvor L er kolonnens længde i cm og tM tiden målt i sekunder.

▼B









BILAG V

BESTEMMELSE AF SAMMENSÆTNINGEN OG INDHOLDET AF STEROLER VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARSØJLE

1. OMRÅDE

Metoden beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af indholdet af de enkelte steroler og det samlede sterolindhold i fedtstoffer.

2. METODENS PRINCIP

Fedtstoffer, med α-cholestanol tilsat som en intern standard, forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de bestanddele, der ikke kan forsæbes, ekstraheres derefter med diethylether.

Sterolfraktionen adskilles fra ekstrakten af stoffer, som ikke kan forsæbes, ved kromatografi på en basisk kiselgelplade. De steroler, som genvindes fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved hjælp af gaskromatografi på kapillarsøjle.

3. APPARATUR

3.1. 250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib.

3.2. 500 ml skilletragte.

3.3. 250 ml kolber.

3.4. Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm glasplader.

3.5. Ultraviolet lampe med en bølgelængde på 366 eller 254 nm.

3.6. 100 μl og 500 μl mikrosprøjter.

3.7. En cylindrisk filtertragt med et G3 porøst septum (porøsitet 15—40 μm), med en diameter på ca. 2 cm og en dybde på ca. 5 cm, med en befæstelsesdel, der er egnet til filtrering under vakuum, og en samlingsdel med et 12/21 udvendig konisk glasslib.

3.8. En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendig konisk glasslib, som filtertragten (3.7) kan monteres på.

3.9. Et 10 ml prøverør med konisk bund og tætsluttende prop.

3.10. En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsøjle, forsynet med et spaltningssystem, der består af: 3.10.1. Et termostatkammer til søjler, som kan opretholde den ønskede temperatur med en nøjagtighed på ± 1° C. 3.10.2. En inddampningsenhed med temperaturindstilling, med et fordampningselement af silanglas. 3.10.3. En flammeioniserings-detektor og en omformer-forstærker. 3.10.4. En integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-forstærkeren (3.10.3), og som har en svartid på ikke over ét sekund og variabel papirhastighed.

3.11. En kapillarsøjle af glas eller kvartsglas, med en længde på 20—30 m, en indre diameter på 0,25—0,32 mm, helt overtrukket med SE-52 eller SE-54 væske eller tilsvarende i en ensartet tykkelse på mellem 0,10 og 0,30 μm.

3.12. En 10 μl gaskromatografi-mikrosprøjte med hærdet kanyle.

4. REAGENSER

4.1. Kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanolopløsning. 130 g kaliumhydroxid (minimum titer 85 %) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling, og der fyldes op med ethanol til 1 liter. Opløsningen opbevares i veltilproppede, mørke glasflasker.

4.2. Diethylether, analyseren.

4.3. Vandfrit natriumsulfat, analyserent.

4.4. Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescensindikator, tykkelse 0,25 mm (kan fås brugsfærdige i handelen).

4.5. Kaliumhydroxid, 0,2 N, i ethanolopløsning. 13 g kaliumhydroxid opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter.

4.6. Benzen, til kromatografi (5.2.2).

4.7. Acetone, til kromatografi (5.2.2).

4.8. Hexan, til kromatografi (5.2.2).

4.9. Diethylether, til kromatografi (5.2.2).

4.10. Chloroform, analyseren.

4.11. Referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phytosteroler, ►M6 2 % ◄ opløsning i chloroform.

4.12. 2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk ved tilsætning af nogle få dråber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidopløsning.

4.13. Vandfri pyridin til kromatografi.

4.14. Hexamethyldisilazan.

4.15. Trimethylchlorsilan.

4.16. Referenceopløsninger af sterol-trimethylsilylethere (TMSE). Friskfremstillet ud fra rene steroler eller blandinger af steroler udvundet af sterolholdige olier.

4.17. α-cholestanol, 0,2 % opløsning (m/v) i chloroform (intern standard).

4.18. Bæregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren.

4.19. Hjælpegasser: — Hydrogen, gaskromatografiren — Luft, gaskromatografiren.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Forberedelse af de ikke-forsæbelige stoffer

5.1.1. Et rumfang 0,2 % α-cholestanolopløsning i chloroform (4.17), der indeholder en mængde α-cholestanol svarende til ca. 10 % af sterolindholdet i den del af prøven, der er taget ud til bestemmelsen, indføres i 250 ml kolben ved hjælp af 500 μl mikrosprøjten. F.eks. sættes til 5 g af prøven 500 μl 0,2 % α-cholestanolopløsning, hvis undersøgelsen gælder olivenolie, og 1 500 μl, hvis det gælder ►M6 ————— ◄ olie fra olivenpresserester. Prøven inddampes til tørhed i en nitrogenstrøm, hvorefter 5 g af den tørrede, filtrerede prøve afvejes nøjagtigt og overføres til den samme kolbe. ►M6 ————— ◄ Olier ►M6 ————— ◄ , der indeholder betydelige mængder cholesterol, kan vise en top, der har den samme retentionstid som α-cholestanol. Hvis det forekommer, må sterolfraktionen analyseres to gange med og uden intern standard ►M6 eller der anvendes betulinol i stedet for cholestanol ◄ .

5.1.2. 50 ml 2 N kaliumhydroxid i ethanolopløsning tilsættes, refluxsvaleren påsættes, og væsken opvarmes til svag kogning på vandbad under vedvarende, kraftig omrøring, indtil forsæbningen sker (opløsningen bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter, derefter tilsættes 50 ml destilleret vand fra den øverste del af svaleren, svaleren tages af, og kolben afkøles til ca. 30° C.

5.1.3. Kolbens indhold overføres kvantitativt til en 500 ml skilletragt, idet der skylles flere gange med destilleret vand, ialt ca. 50 ml. Ca. 80 ml diethylether tilsættes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og får lov til at henstå (note 1). Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt. Yderligere to ekstraktioner foretages på den vandige fase på samme måde, idet der bruges 60—70 ml diethylether hver gang. Note 1: Eventuel emulsion kan ødelægges ved tilsætning af små mængder ethyl- eller methylalkohol ved hjælp af en spray.

5.1.4. Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destilleret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral reaktion. Når vaskevandet er fjernet, tørres ekstrakterne med vandfrit natriumsulfat og filtreres på vandfrit natriumsulfat ned i en på forhånd vejet 250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder diethylether.

5.1.5. Etheren destilleres ned til nogle få ml og bringes derefter til tørhed under et let undertryk eller i en nitrogenstrøm, tørres fuldstændigt i en ovn ved 100° C i ca. 15 minutter, og vejes så efter afkøling i en ekssikkator.

5.2. Separation af sterolfraktionen

5.2.1. Forberedelse af de basiske plader. Kiselgelpladerne (4.4) nedsænkes fuldstændig i 0,2 N opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol (4.5) i 10 sekunder. Derefter får de lov at tørre i et stinkskab i 2 timer og sættes til sidst i en ovn ved 100° C i 1 time. Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssikkator, til de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal anvendes inden 15 dage). Note 2: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere sterolfraktionen, er det ikke, nødvendigt at behandle de ikke-forsæbelige stoffer med aluminiumoxid. På denne måde holdes alle sure forbindelser (fede syrer og andre) tilbage på basislinien, og sterolbåndet er klar adskilt fra de alifatiske og triterpene alkoholers bånd.

5.2.2. En 95:5 (v/v) benzen/acetoneblanding anbringes i kromatografikammeret til en højde på ca. 1 cm. Som et alternativ kan en 65:35 (v/v) hexan/diethyletherblanding bruges. Kammeret lukkes med det dertil passende dæksel og efterlades således i ca. en halv time, så at der opnås ligevægt mellem væske og damp. Strimler af filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringes på kammerets indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet og regelmæssig eluering af komponenterne. Note 3: Kromatografiblandingen bør udskiftes for hver test for at opnå fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser.

5.2.3. Man tilbereder en ca. 5 % opløsning af de ikke-forsæbelige stoffer (5.1.5) i chloroform. Med 100 μl mikrosprøjten afsætter man på en kromatografiplade (5.2.1) med 0,3 ml, ca. 2 cm fra den ene ende, en streg, som er så tynd og ensartet som muligt. På linie med stregen placeres 2—3 μl af sterol-referenceopløsningen (4.11) i den ene ende af pladen, så sterolbåndet kan identificeres efter eluering.

5.2.4. Pladen anbringes i kromatografikammeret, som er forberedt som angivet i 5.2.2. Den omgivende temperatur bør holdes mellem 15 og 20° C. Kammeret lukkes straks med dækslet, og det får lov til at eluere, indtil opløsningsmidlets forkant når ca. 1 cm fra pladens øverste kant. Derpå fjernes pladen fra kromatografikammeret, og man lader opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen stå en kort tid i et stinkskab.

5.2.5. Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluorosceinopløsningen. Når pladen observeres under ultraviolet lys, kan sterolbåndet identificeres ved, at det bringes på linie med den plet, der er opnået fra referenceopløsningen. Båndets grænser langs fluoroscenses kanter markeres med en sort blyant.

5.2.6. Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede område. Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten (3.7). 10 ml varm chloroform tilsættes, man blander omhyggeligt med metalspatelen og filtrerer under vakuum; filtratet opsamles i den koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten. Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af 4—5 ml, den tilbageværende opløsning overføres til det på forhånd vejede 10 ml prøverør (3.9), det inddampes til tørhed med let opvarmning i en blød strøm af nitrogen, der fyldes atter op med nogle få dråber acetone, der inddampes igen til tørhed, røret placeres i en ovn ved 105° C i ca. 10 minutter, derefter lader man det svale af i en ekssikkator og vejer det. Den rest, der findes i prøverøret, består af sterolfraktionen.

5.3. Forberedelse af trimethylsilyletherne

5.3.1. Til prøverøret, der indeholder sterolfraktionen, sættes silyleringsreagenset, der består af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 4), i forholdet 50 μl for hvert milligram sterol, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 5). Note 4: Brugsfærdige opløsninger kan fås i handelen. Man kan også få andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med et lige så stort rumfang vandfrit pyridin.

5.3.2. Prøverøret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i vejret på det), indtil sterolerne er fuldstændig opløst. Man lader det stå i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det så i nogle få minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse. Note 5: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller fremkommer en lyserød farve, er det et tegn på tilstedeværelsen af fugt eller svækkelse af reagensen. Hvis det forekommer, må prøven gentages.

5.4. Gaskromatografisk analyse

5.4.1. Forberedende operationer, pakning af søjlen 5.4.1.1. Søjlen monteres i gaskromatografen, idet indløbsenden forbindes med fordamperen, der står i forbindelse med spaltningssystemet, og udløbsenden forbindes med detektoren. Man foretager en generel kontrol af gaskromatografen (lækager fra gaskredsløbene, detektorens effektivitet, spaltningssystemets og registreringssystemets effektivitet osv.) 5.4.1.2. Hvis søjlen skal bruges for første gang, anbefales det, at den underkastes en konditionering. Man lader en svag gasstrøm passere gennem søjlen og tænder så for gaskromatografienheden, derefter begynder man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20° C over driftstemperaturen (note 6). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer, derefter sættes hele enheden i driftstilstand (justering af gasstrømme og spaltning, antændelse af flammen, forbindelse til den elektroniske skriver, justering af søjlekammeret, detektorens og injektorens temperatur osv.), og derefter optegens signalet med en følsomhed, der er mindst to gange større end den, man agter at anvende til analysen. Basisliniens forløb skal være lige, uden toppe af nogen art, og den må ikke glide. Negativ glidning af en lige linie tyder på lækage fra søjlens forbindelser, positiv glidning tyder på utilstrækkelig konditionering af søjlen. Note 6: Konditioneringstemperaturen skal altid være mindst 20° C lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den anvendte stationære fase.

5.4.2. Valg af driftsbetingelser 5.4.2.1. De anbefalede driftsbetingelser er som følger: — søjletemperatur: 260° C ± 5° C — fordampertemperatur: 280° C — detektortemperatur: 290° C — bæregassens lineære hastighed: helium 20—35 cm/s, hydrogen 30—50 cm/s — spaltningsforhold: fra 1:50 til 1:100 — instrumentets følsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale dæmpning — registreringsfølsomhed: 1—2 mV fuld skala — papirhastighed: 30—60 cm/time — mængde stof injiceret: 0,5—1μl TMSE-opløsning. Disse betingelser kan varieres i lyset af søjlens og gaskromatografens egenskaber, så man opnår kromatogrammer, der opfylder følgende krav: — retentionstiden for β-sitosterol bør være 20 ± 5 minutter — campesteroltoppen bør være: for olivenolie (gennemsnitsindhold 3 %) 15 ± 5 % af hel skala; for soyaolie (gennemsnitsindhold 20 %) 80 ± 10 % af hel skala — alle tilstedeværende steroler skal adskilles. Desuden skal toppene også være fuldstændig opløst, dvs. hver tops spor skal gå tilbage til basislinien, før sporet går op til den næste top. Ufuldstændig opløsning kan dog tolereres, såfremt toppen ved TRR (relativ retentionstid) 1,02 kan bestemmes kvantitativt ved brug af den vinkelrette linie.

5.4.3. Analytisk fremgangsmåde 5.4.3.1. Med 10 μl mikrosprøjten optages 1 μl hexan, derefter trækkes først 0,5 μl luft og derefter 0,5—1 μl af prøveopløsningen op. Stemplet trækkes højere op, så kanylen tømmes. Kanylen trykkes gennem injektionsenhedens membran, og efter 1—2 sekunder injiceres hurtigt, derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder. 5.4.3.2. Optegnelsen fortsættes, indtil de tilstedeværende sterolers TMSE er fuldstændig elueret. Basislinien skal til stadighed opfylde kravene (5.4.1.2).

5.4.4. Identifikation af toppene De enkelte toppe identificeres på basis af retentionstiderne og ved sammenligning med blandinger af sterol-TMSE, der er analyseret under de samme betingelser. Sterolerne elueres i følgende rækkefølge: cholesterol, brassicasterol, 24-methylencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ-7-campesterol, Δ-5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ-5-avenasterol, Δ-5,24-stigmastadienol, Δ-7-stigmastenol, Δ-7-avenasterol. Retentionstiderne for β-sitosterol for SE 52 og SE 54 søjler er vist i tabel 1. Figur 1 og 2 illustrerer typiske kromatogrammer for nogle olier.

5.4.5. Kvantitativ vurdering 5.4.5.1. Arealerne for α-cholestanol- og steroltoppene beregnes ved hjælp af den integrerende tæller. Der ses bort fra toppene for eventuelle forbindelser, der ikke er blandt dem, der er opregnet i tabel 1. 5.4.5.2. Koncentrationen af hver enkelt sterol beregnes i mg/100 g fedtstof som følger: hvor: Ax = toparealet for sterol x ►M6 ————— ◄ As = arealet af α-cholestanoltoppen ►M6 ————— ◄ ms = massen af tilsat α-cholestanol i milligram m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.

6. RAPPORTERING AF RESULTATERNE

6.1. De individuelle sterolkoncentrationer angives som mg/100 g fedtstof og deres sum som »total sterolmængde«.

6.2. Den procentvise andel af de individuelle steroler beregnes på grundlag af forholdet mellem arealet af den tilsvarende top og summen af arealerne af sterolernes toppe. hvor: Ax = arealet af top x A = summen af arealerne af alle toppe.









APPENDIX

Bestemmelse af gassens lineære hastighed

Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1—3 μl methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere gennem søjlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen fremkommer (tM).

Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde i cm, og tM er den målte tid i sekunder.







Tabel 1 Relative retentionstider for steroler Top Identifikation Relativ retentionstid SE 54 søjle SE 52 søjle 1 cholesterol Δ-5-cholesten-3-β-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5-α-cholestan-3-β-ol 0,68 0,64 3 brassicasterol [24S]-24-methyl-Δ-5,22-cholestadien-3-β-ol 0,73 0,71 4 24-methylen-cholesterol 24-methylen-Δ-5,24-cholestadien-3-β-ol 0,82 0,80 5 campesterol [24R]-24-methyl-Δ-5-cholesten-3-β-ol 0,83 0,81 6 campestanol [24R]-24-methyl-cholestan-3-β-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol [24S]-24-ethyl-Δ-5,22-cholestadien-3-β-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-campesterol [24R]-24-methyl-Δ-7-cholesten-3-β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl-Δ-5,23-cholestadien-3-β-ol 0,95 0,95 10 chlerosterol [24S]-24-ethyl-Δ-5,25-cholastadien-3-β-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]-24-ethyl-Δ-5-cholestan-3-β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-ethyl-cholestan-3-β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]-24-ethyliden-Δ-5-cholesten-3-β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl-Δ-5,24-cholestadien-3-β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R,S]-24-ethyl-Δ-7,24-cholestadien-3-β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol [24Z]-24-ethyliden-Δ-7-cholesten-3-β-ol 1,16 1,16

Figur 1

Gaskromatogram af sterolfraktionen af en uraffineret olivenolie

Figur 2

Gaskromatogram af sterolfraktionen af en raffineret olivenolie









BILAG VI

BESTEMMELSE AF ERYTHRODIOL OG UVAOL

INDLEDNING

Erythrodiol (almindeligvis forstået som totalindholdet af diolerne erythrodiol og uvaol) er en uforsæbelig bestanddel, som er karakteristisk for visse arter af fedtstoffer. Den findes i betydeligt højere koncentration i ekstraheret olivenolie end i de andre olier, som den findes i (presset olivenolie, vindruekerneolie), hvorfor bestemmelsen heraf kan anvendes til at konstatere tilstedeværelsen af ekstraheret olivenolie.

1. FORMÅL

At beskrive fremgangsmåden til bestemmelse af erythrodiol i fedtstoffer.

2. PRINCIP

Fedtstoffer forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de uforsæbelige bestanddele ekstraheres derefter med diethylether og renses på en kolonne af aluminiumoxid.

De uforsæbelige bestanddele fraktioneres ved tyndtlagskromatografi på kiselgel, hvorved båndet med sterolfraktionen adskilles fra båndet med erythrodiolfraktionen.

Sterolfraktionen og erythrodiolfraktionen fra pladen omdannes til trimethylsilylethere, hvorefter blandingen analyseres ved gaskromatografi.

Resultatet angives i procent erythrodiol i forhold til det samlede indhold af erythrodiol plus steroler.

3. APPARATUR

3.1. Det apparatur, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolindholdet).

4. REAGENSER

4.1. De reagenser, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolindholdet).

4.2. Referenceopløsning af erythrodiol, 0,5 % opløsning i chloroform.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Femstilling af de uforsæbelige stoffer

Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.1.2 i bilag V.

5.2. Separation af erythrodiol og steroler

5.2.1. Se afsnit 5.2.1 i bilag V.

5.2.2. Se afsnit 5.2.2 i bilag V.

5.2.3. Der fremstilles en 5 % opløsning i chloroform af de uforsæbelige stoffer. Med en mikrosprøjte på 100 μl anbringes på en kromatografiplade ca. 1,5 cm fra den nederste kant 0,3 ml af denne opløsning i en streg, der er så tynd og ensartet som muligt. På den ene ende af pladen anbringes som reference nogle mikroliter af opløsningen af cholesterol og erythrodiol.

5.2.4. Pladen anbringes i kromatografikarret, der er klargjort som angivet i 5.2.2 i bilag V. Den omgivende temperatur holdes på ca. 20° C. Karret lukkes straks, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra pladens øverste kant. Derpå fjernes pladen fra kromatografikarret, og man lader opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft.

5.2.5. Pladen sprøjtes ensartet med en alkoholopløsning af 2,7-dichlorfluorescein. Når pladen observeres under ultraviolet lys, fremstår sterol- og erythrodiolbåndene ud for pletterne fra referenceopløsningen, og de afmærkes med et punkt lidt uden for det fluorescerende bånds kanter.

5.2.6. Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det afskrabede materiale fra pladen overføres til en kolbe på 50 ml. Der tilsættes 15 ml varm chloroform, omrystes omhyggeligt og filtreres på glasfilter, idet siliagelen overføres til selve filteret. Der vaskes tre gange med 10 ml portioner varm chloroform, idet filtratet opsamles i en rundbundet kolbe på 100 ml. Filtratet inddampes til et rumfang på 4—5 ml og overføres til et tareret spidsbundet centrifugeglas på 10 ml, og der inddampes til tørhed under let opvarmning i en svag strøm af nitrogen, hvorefter der vejes.

5.3. Forberedelse af trimethylsilyletherne (TMSE)

Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.3 i bilag V.

5.4. Gaskromatografi

Der gås frem som beskrevet i afsnit 5.4 i bilag V.

Arbejdsbetingelserne for gaskromatograferingen skal vælges således, at de udover at opfylde kravene for analyse af sterolerne også fører til separation af TMSE af erythrodiol og uvaol.

Efter injektion af prøven lader man skriveren køre indtil alle tilstedeværende steroler, erythrodiol og uvaol er elueret. Derefter identificeres toppene (erythrodiol og uvaol har i forhold til β-sitosterol en relativ retentionstid på henholdsvis ca. 1,45 og 1,55), og arealerne beregnes som angivet for sterolerne.

6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE

hvor:

A1 = toparealet for erythrodiol ►M6 ————— ◄

A2 = toparealet for uvaol ►M6 ————— ◄

Asteroler = summen af arealerne for de tilstedeværende steroler ►M6 ————— ◄

Resultatet angives med én decimal.

▼M21









BILAG VII

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF 2-GLYCERYLMONOPALMITAT I PROCENT

1. GENSTAND OG ANVENDELSESOMRÅDE

Metoden er en analyseprocedure for bestemmelse af det procentvise indhold af palmitinsyre i 2-stillingen i triglycerider ved måling af 2-glycerylmonopalmitat.

Metoden kan anvendes på vegetabilske olier, der er flydende ved stuetemperatur (20 °C).

2. PRINCIP

Olieprøven behandles efter forberedelsen med pankreaslipase, som specifikt hydrolyserer triglyceridets 1- og 3-stilling og efterlader 2-monoglycerider. Det procentvise indhold af 2-glycerylmonopalmitat i monoglyceridfraktionen bestemmes efter silylering ved gaskromatografi med kapillarkolonne.

3. APPARATUR OG SÆDVANLIGT UDSTYR

3.1. 25 ml erlenmeyerkolbe

3.2. 100, 250 og 300 ml bægerglas

3.3. kromatografikolonne af glas, indvendig diameter 21-23 mm og længde 400 mm, med sintret glasfilter og hane

3.4. 10, 50, 100 og 200 ml måleglas

3.5. 100 og 250 ml rundbundede kolber

3.6. rotationsfordamper

3.7. 10 ml centrifugeglas med konisk bund og slibprop

3.8. centrifuge til 10 og 100 ml glas

3.9. termostat, der kan holde en temperatur på 40 ± 0,5 °C

3.10. 1 og 2 ml målepipetter

3.11. 1 ml injektionssprøjte

3.12. 100 μl mikroinjektionssprøjte

3.13. 1 000 ml skilletragt

3.14. gaskromatograf til kapillarkolonner med kold »on column«-injektor til direkte indsprøjtning af prøven i kolonnen og med en ovn, der kan fastholde den ønskede temperatur inden for ca. 1 °C.

3.15. kold »on column«-injektor til direkte indsprøjtning af prøven i kolonnen

3.16. flammeioniseringsdetektor og elektrometer

3.17. skriver-integrator, der passer til elektrometeret, med responstid højst 1 sekund og variabel papirhastighed

3.18. kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, længde 8-12 m og indvendig diameter 0,25-0,32 mm, coatet med 5 % methylpolysiloxan eller phenylmethylpolysiloxan i en lagtykkelse på 0,10-0,30 μm, og brugbar op til 370 °C

3.19. 10 μl mikroinjektionssprøjte med hærdet kanyle, længde mindst 7,5 cm, til indsprøjtning direkte i kolonnen.

4. REAGENSER

4.1. silicagel med kornstørrelse 63-200 μm (70/280 mesh), tilberedt således: Silicagelen anbringes i en porcelænsskål, tørres i ovn ved 160 °C i fire timer og afkøles til stuetemperatur i ekssikkator. Der tilsættes 5 % vand til silicagelen på følgende måde: I en erlenmeyerkolbe afvejes 152 g silicagel, og der tilsættes 8 g destilleret vand; kolben tilproppes og rystes forsigtigt, indtil vandet er jævnt fordelt. Henstår i mindst 12 timer inden brugen.

4.2. n-hexan (til kromatografi)

4.3. isopropanol

4.4. isopropanol, vandig opløsning 1:1 (v/v)

4.5. pankreaslipase. Den anvendte lipase skal have en aktivitet på 2,0-10 lipaseenheder pr. mg. (Der er pankreaslipaser i handelen med en aktivitet på 2-10 enheder pr. mg enzym.)

4.6. bufferopløsning af trishydroxymethylaminomethan: 1 M vandig opløsning indstillet til pH 8 (potentiometrisk måling) med koncentreret HCl (1:1, v/v)

4.7. natriumcholat, enzymkvalitet, 0,1 % vandig opløsning (opløsningen skal bruges inden for to uger)

4.8. calciumchlorid, 22 % vandig opløsning

4.9. diethylether til kromatografi

4.10. elueringsvæske: blanding af n-hexan og diethylether, 87:13 (v/v)

4.11. natriumhydroxid, 12 % opløsning (w/w)

4.12. phenolphthalein, 1 % opløsning i ethanol

4.13. bæregas: hydrogen eller helium, til gaskromatografi

4.14. hjælpegasser: hydrogen, mindst 99 % ren, fri for vand og organisk materiale, og luft af samme renhed, til kromatografi

4.15. silyleringsreagens: blanding af pyridin, hexamethyldisilazan og trimethylchlorsilan 9:3:1 (v/v/v). (Der fås brugsklare opløsninger i handelen. Der kan også benyttes andre silyleringsreagenser, f.eks. bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethylchlorsilan, fortyndet med samme volumen vandfri pyridin.)

4.16. Referenceopløsninger: rene monoglycerider eller blandinger af monoglycerider med kendt procentvis sammensætning af omtrent samme størrelse som prøven.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Prøveforberedelse

5.1.1. Olier med under 3 % frie syrer behøver ikke at neutraliseres inden kromatograferingen på silicagelkolonne. Olier med mere end 3 % frie syrer neutraliseres som beskrevet i punkt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Der anbringes 50 g olie og 200 ml n-hexan i skilletragten på 1 000 ml (3.13). Der tilsættes 100 ml isopropanol og en mængde 12 % natriumhydroxidopløsning (4.11), der svarer til oliens indhold af frie syrer forhøjet med 5 %. Der rystes kraftigt i 1 minut. Derefter tilsættes der 100 ml destilleret vand, og efter fornyet omrystning sættes skilletragten til side. Efter separation tappes det nedre lag med sæberne af. Eventuelle mellemlag (slim og uopløselige stoffer) fjernes. Hexanopløsningen af neutraliseret olie vaskes flere gange med portioner af isopropanol/vand-opløsningen (4.4) a 50-60 ml, indtil phenolphthaleinets lyserøde farve er forsvundet. Det meste af hexanen fjernes ved vakuumdestillation (f.eks. rotationsfordamper), og olien overføres til en 100 ml rundbundet kolbe (3.5). Olien inddampes til fuldstændig tørhed under vakuum. Herefter skal oliens syreindhold være mindre end 0,5 %.

5.1.2. I en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1) anbringes 1,0 g olie, som er behandlet som beskrevet ovenfor, og den opløses i 10 ml elueringsvæske (4.10). Opløsningen henstår mindst 15 minutter inden kromatografering på silicagelkolonne. Hvis opløsningen er uklar, centrifugeres den, så kromatografibetingelserne bliver optimale. (Der kan anvendes brugsklare patroner med 500 mg SPE-silicagel.)

5.1.3. Fremstilling af kromatografikolonnen Der hældes ca. 30 ml elueringsvæske (4.10) i kolonnen (3.3), og i bunden af kolonnen placeres der ved hjælp af en glasstav et stykke vat, som luften trykkes ud af. I et bægerglas fremstilles en opslæmning af 25 g silicagel (4.1) i ca. 80 ml elueringsvæske, og opslæmningen hældes på kolonnen gennem en tragt. Når det er kontrolleret, at al silicagelen er kommet ned i kolonnen, skylles der med elueringsvæske (4.10), hanen åbnes, og der tappes væske af, indtil overfladen er ca. 2 mm over silicagelens overkant.

5.1.4. Kolonnekromatografi I en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1) anbringes 1,0 g prøve, som er behandlet som beskrevet i punkt 5.1. Prøven opløses i 10 ml elueringsvæske (4.10). Opløsningen overføres til kromatografikolonnen, der er fremstillet som beskrevet i punkt 5.1.3. Kolonnepakningens overflade må ikke forstyrres. Der åbnes for hanen og aftappes elueringsmiddel, indtil prøveopløsningens overflade er på niveau med silicagelen. Der elueres med 150 ml elueringsvæske. Hastigheden sættes til 2 ml/min (dvs. at de 150 ml løber gennem kolonnen på ca. 60-70 minutter). Eluatet opsamles i en tareret 250 ml rundbundet kolbe. Opløsningsmidlet afdampes under vakuum, og de sidste rester fjernes med en nitrogenstrøm. Kolben vejes, og ekstraktmængden udregnes. (Hvis der benyttes brugsklare SPE-silicagelpatroner, følges denne fremgangsmåde: 1 ml af opløsningen (5.1.2) sættes på patroner, der er forberedt med 3 ml n-hexan. Når opløsningen er løbet igennem, elueres der med 4 ml n-hexan/diethylether 9:1 (v/v). Eluatet opsamles i et 10 ml glas og inddampes med en nitrogenstrøm til fuldstændig tørhed. Remanensen behandles med pankreaslipase (5.2). Det er meget vigtigt, at fedtsyresammensætningen før og efter behandlingen på SPE-patronen kontrolleres.)

5.2. Hydrolyse med pankreaslipase

5.2.1. I centrifugeglasset afvejes 0,1 g olie, som er behandlet som beskrevet i punkt 5.1. Der tilsættes 2 ml bufferopløsning (4.6), 0,5 ml natriumcholatopløsning (4.7) og 0,2 ml calciumchloridopløsning, idet der omrøres omhyggeligt mellem hver tilsætning. Glasset lukkes med slibproppen og anbringes i termostaten ved 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Der tilsættes 20 mg lipase og omrystes omhyggeligt (uden at proppen fugtes), og glasset anbringes i termostaten i nøjagtig 2 minutter, hvorefter det tages op, rystes energisk i nøjagtig 1 minut og hensættes til afkøling.

5.2.3. Der tilsættes 1 ml diethylether, tilproppes og rystes energisk, og centrifugeres, hvorefter etheropløsningen overføres til et rent og tørt glas med en mikroinjektionssprøjte.

5.3. Fremstilling af silanderivater og gaskromatografi

5.3.1. Med en mikroinjektionssprøjte overføres 100 μl af opløsningen (5.2.3) til et 10 ml glas med konisk bund.

5.3.2. Opløsningsmidlet afdampes med en svag nitrogenstrøm, der tilsættes 200 μl silyleringsreagens (4.15), glasset tilproppes, og man lader det stå i 20 minutter.

5.3.3. Efter 20 minutter tilsættes der 1-5 ml n-hexan (alt efter kromatograferingsbetingelserne): Den fremkomne opløsning er klar til gaskromatografering.

5.4. Gaskromatografi

Der anvendes følgende arbejdsbetingelser:

— injektortemperatur (»on column«-injektor) under opløsningsmidlets kogepunkt (68 °C)

— detektortemperatur: 350 °C

— kolonnetemperatur: temperaturprogrammering af ovnen: 60 °C i 1 minut, derefter stigning først med 15 °C pr. minut indtil 180 °C og dernæst med 5 °C pr. minut indtil 340 °C, og endelig 340 °C i 13 minutter

— bæregas: hydrogen eller helium indstillet til en sådan lineær hastighed, at der opnås den i figur 1 viste opløsning. C54-triglyceridet skal have en retentionstid på 40 ± 5 minutter (se figur 2). (Ovenstående arbejdsbetingelser er vejledende. Den enkelte analyseansvarlige må optimere dem for at opnå det ønskede resultat. Højden af toppen for 2-glycerylmonopalmitat skal være mindst 10 % af fuldt udslag på skriveren.)

— indsprøjtet mængde: 0,5-1 μl af opløsningen i (5 ml) n-hexan (5.3.3).

5.4.1. Identifikation af toppene

De enkelte monoglycerider identificeres efter deres retentionstider i prøveanalysen sammenlignet med tiderne fra analyse af standardmonoglyceridblandinger under samme betingelser.

5.4.2. Kvantitativ vurdering

Arealerne af toppene beregnes ved hjælp af integratoren.

6. ANGIVELSE AF RESULTATER

Det procentvise indhold af glycerylmonopalmitat beregnes ud fra forholdet mellem arealet af den pågældende top og summen af arealerne af samtlige monoglyceridtoppe (se figur 2) efter følgende formel:

hvor:

Ax = arealet af den top, der svarer til glycerylmonopalmitat

ΣA = summen af arealerne af samtlige monoglyceridtoppe

Resultatet angives med én decimal.

7. ANALYSERAPPORT

Analyserapporten skal indeholde følgende:

— henvisning til denne metode

— alle oplysninger til fuldstændig identifikation af prøven

— resultatet af analysen

— alle afvigelser fra metoden, uanset om det er besluttet af de berørte parter eller har andre årsager

— nøje identifikation af laboratoriet, dato for udførelse af analysen og de ansvarliges underskrift.

Figur 1

Kromatogram af reaktionsprodukter fra silylering efter lipasebehandling af en raffineret olivenolie med tilsætning af 20 % forestret olie (100 %)

Signaturer: »acides gras libres« = frie fedtsyrer,»huile d'olive raffinée + 20 % huile estérifiée« = raffineret olivenolie + 20 % forestret olie, »1-2 monopalmitoléine« = 1-2 monopalmitolein, »1-2 mono C18 insat.« = umættet 1-2 mono-C18.

Figur 2

Kromatogram af:

A) ægte olivenolie, efter lipasebehandling og silylering; under de pågældende betingelser (kapillarkolonne 8-12 m) elueres voksfraktionen samtidig med eller kort tid efter diglyceridfraktionen. Efter lipasebehandlingen bør triglyceridindholdet ikke være højere end 15 % Signaturer: 1 = Frie fedtsyrer 2 = Monoglycerider 3 = Diglycerider 4 = Triglycerider * = 2-monopalmitat ** = C54-triglycerid

Kromatogram af:

B) forestret olie efter lipasebehandling og silylering; under de pågældende betingelser (kapillarkolonne 8-12 m) elueres voksfraktionen samtidig med eller kort tid efter diglyceridfraktionen. Efter lipasebehandlingen bør triglyceridindholdet ikke være højere end 15 % Signaturer: 1 = Frie fedtsyrer 2 = Monoglycerider 3 = Diglycerider 4 = Triglycerider * = 2-monopalmitat ** = C54-triglycerid

8. NOTER

Lipaser med tilfredsstillende aktivitet kan fås i handelen. De kan også fremstilles i laboratoriet på følgende måde:

5 kg frisk svinepankreas afkøles til 0 °C. Alt omgivende fedt og bindevæv fjernes, og vævet findeles i blender til en flydende pasta. Den omrøres i 4-6 timer med 2,5 l vandfri acetone, hvorefter den centrifugeres. Bundfaldet ekstraheres endnu tre gange med samme mængde vandfri acetone og derefter to gange med en blanding af acetone og diethylether (1:1) (v/v) og to gange med diethylether.

Bundfaldet tørres i 48 timer under vakuum til et stabilt pulver, som har lang holdbarhed ved opbevaring tørt i køleskab.

Der fremstilles en olivenolieemulsion på følgende måde:

I en mixer omrøres i 10 minutter en blanding af 165 ml af en gummi arabicum-opløsning med 100 g/l, 15 g knust is og 20 ml neutraliseret olivenolie.

I et 50 ml bægerglas hældes først 10 ml af denne emulsion og derefter 0,3 ml natriumcholatopløsning (0,2 g/ml) og 20 ml destilleret vand.

Bægerglasset anbringes i termostat ved 37 °C, og der nedsænkes en pH-meterelektrode og en propelomrører i bægerglasset.

Fra en burette tilsættes der dråbevis en 0,1 N natriumhydroxidopløsning, indtil pH er 8,3.

Der tilsættes en portion af opslæmningen af lipasepulver i vand (0,1 g lipase pr. ml). Når pH-meteret viser et pH på 8,3, startes stopuret, og der tilsættes dråbevis så meget natriumhydroxidopløsning, at pH holdes på 8,3. Hvert minut noteres den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning.

Målingerne afsættes i et koordinatsystem med tiden som abscisse og det forbrugte antal ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje.

Lipaseaktiviteten, målt i lipaseenheder pr. mg, beregnes efter følgende formel:

hvor:

A er aktiviteten i lipaseenheder pr. mg

V er antallet af ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning pr. minut (beregnet ud fra grafen)

N er natriumhydroxidopløsningens normalitet

m er mængden af tilsat lipase i mg.

Lipaseenheden er defineret som den mængde enzym, der frigør 10 mikroækvivalenter syre pr. minut.

▼M20 —————

▼B









BILAG IX

SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSØGELSE VED ULTRAVIOLET LYS

INDLEDNING

Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys kan give oplysninger om et fedtstofs kvalitet, dets konserveringstilstand og om forandringer i det, frembragt ved teknologiske processer.

Absorptionen ved de bølgelængder, der er specificeret i metoden, skyldes tilstedeværelsen af konjugerede dien- og triensystemer. Disse absorptioner er udtrykt som specifikke ekstinktioner E 1 % 1 cm (ekstinktionen for en 1 % opløsning af fedtstoffet i det angivne opløsningsmiddel i et 1 cm tykt væskelag), sædvanligvis betegnet ved K, (også kaldet ekstinktionskoefficienten).

1. OMRÅDE

Metoden beskriver fremgangsmåden til udførelse af en spektrofotometrisk undersøgelse af fedtstoffer ved ultraviolet lys.

2. METODENS PRINCIP

Fedtstoffet opløses i det specificerede opløsningsmiddel, og opløsningens ekstinktion bestemmes så ved de fastsatte bølgelængder i forhold til rent opløsningsmiddel. De specifikke ekstinktioner beregnes ud fra aflæsningerne på spektrofotometeret.

3. APPARATUR

3.1. Et spektrofotometer til måling af ekstinktion i ultraviolet lys mellem 220 og 360 nm, med mulighed for aflæsning ved hver hele nanometer.

3.2. Firkantede kvartskuvetter med låg, med en optisk vejlængde på 1 cm. Når kuvetterne er fyldt med vand eller et andet passende opløsningsmiddel, bør der ikke være forskelle på mere end 0,01 ekstinktionsenheder mellem dem.

3.3. 25 ml målekolber.

▼M6

3.4. En kromatografisøjle, hvis øverste del er 270 mm lang med en diameter på 35 mm, og hvis nederste del er 270 ml lang med en diameter på 10 mm.

▼B

4. REAGENSER

4.1. Isooctan (2,2,4-trimethylpentan) af spektrofotometrikvalitet med en transmittans på ikke mindre end 60 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller — cyclohexan af spektrofotometrikvalitet med en transmittans på ikke mindre end 40 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i forhold til destilleret vand. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Basisk aluminiumoxid til søjlekromatografi, tilberedt og kontrolleret som beskrevet i appendix 1.

4.3. n-hexan til kromatografi.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Prøven skal være fuldstændig homogen og fri for urenheder i suspension. Olier, som er flydende ved stuetemperatur, filtreres på papir ved en temperatur på ca. 30° C; faste fedtstoffer homogeniseres og filtreres ved en temperatur på højst 10° C over smeltepunktet.

5.2. Ca. 0,25 g af den således forberedte prøve afvejes nøjagtigt i en 25 ml målekolbe, der fyldes op til mærket med det angivne opløsningsmiddel, og opløsningen homogeniseres. Den fremkomne opløsning skal være fuldstændig klar. I modsat fald filtreres hurtigt på papir.

5.3. En kuvette fyldes med opløsningen, og ekstinktionerne måles ved en passende bølgelængde mellem 232 og 276 nm med opløsningsmiddel som reference. De aflæste ekstinktionsværdier skal ligge inden for området 0,1—0,8. Gør de ikke det, gentages målingerne, idet der benyttes mere koncentrerede eller mere fortyndede opløsninger.

5.4. Når bestemmelse af en specifik ekstinktion skal ske efter passage over aluminiumoxid, går man frem på følgende måde: 30 g basisk aluminiumoxid opslæmmet i hexan hældes på kromatografisøjlen. Efter at adsorbenten har bundfældet sig, tappes den overskydende hexan af, indtil overfladen er ca. 1 cm over aluminiumoxidet. 10 g af fedtstoffet, homogeniseret og filtreret som beskrevet (5.1), opløses i 100 ml hexan, og opløsningen hældes på søjlen. Eluatet opsamles, og alt opløsningsmiddel dampes af under vakuum ved en temperatur under 25° C. Man går straks videre som beskrevet i (5.2) med dette fedtstof.

6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE

6.1. Man opgiver den specifikke ekstinktion (ekstinktionskoefficient) ved de forskellige bølgelængder, som beregnes efter: hvor: Kλ = den specifikke ekstinktion ved bølgelængden λ Eλ = den ekstinktion, der er målt ved bølgelængden λ c = opløsningens koncentration i g/100 ml s = kuvettens tykkelse i cm. Resultaterne angives med to decimaler.

6.2. Spektrofotometrisk analyse af olivenolie i henhold til den officielle metode, der er angivet i EF-forordningerne, kræver bestemmelse af den specifikke ekstinktion i isooctanopløsning ved bølgelængderne 232 og 270 nm samt bestemmelse af ΔK, som er givet ved: hvor Km er den specifikke ekstinktion ved bølgelængden m, den bølgelængde på ca. 270 nm der giver maksimal absorption.









APPENDIX I

Tilberedning af aluminiumoxidet og kontrol af dets aktivitet

A 1.1. Tilberedning af aluminiumoxidet

Aluminiumoxid, som på forhånd er tørret i en ovn ved 380—400° C i 3 timer, anbringes i en beholder, der kan lukkes hermetisk, hvorefter der tilsættes 5 ml destilleret vand pr. 100 g aluminiumoxid, og beholderen lukkes øjeblikkeligt. Den rystes flere gange og får så lov til at stå i mindst 12 timer før brugen.

A 1.2. Kontrol af aluminiumoxidets aktivitet

En kromatografisøjle med 30 g aluminiumoxid klargøres. Efter fremgangsmåden i afsnit (5.4) lader man en blanding, der består af:

— 95 % jomfruolie med en specifik ekstinktion på under 0,18 ved 268 nm

— 5 % jordnødolie, der er behandlet med blegejord ved raffineringen, og som har en specifik ekstinktion på ikke under 4 ved 268 nm,

passere gennem søjlen.

Hvis blandingen efter passage gennem søjlen har en specifik ekstinktion på over 0,11 ved 268 nm, er aluminiumoxidet acceptabelt; hvis ikke må hydratiseringsgraden øges.









APPENDIX II

Kalibrering af spektrofotometeret

A 2. Udstyret skal kontrolleres med regelmæssige mellemrum (mindst hver sjette måned), både for korrekt bølgelængde og for udslagets nøjagtighed. A 2.1. Bølgelængden kan kontrolleres ved hjælp af en kviksølvlampe eller med egnede filtre. A 2.2. Ved kontrol af fotocellens og fotomultiplikatorrørets respons går man frem på følgende måde: 0,2 g ren kaliumchromat til spektrofotometri afvejes og opløses i 0,05 N kaliumhydroxidopløsning i en 1 000 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket. Man overfører præcis 25 ml af denne opløsning til en 500 ml målekolbe og fortynder op til mærket med den samme kaliumhydroxidopløsning. Derefter måler man denne opløsnings ekstinktion ved 275 nm med kaliumhydroxidopløsningen som reference. Den målte ekstinktion med en 1 cm kuvette skal være 0,200 ± 0,005.









BILAG X A

GASKROMATOGRAFERING AF FEDTSYREMETHYLESTERE

1. FORMÅL

Denne standard giver generelle retninglinjer for gaskromatografisk bestemmelse med pakket kolonne eller kapillarkolonne af den kvalitative og kvantitative sammensætning af en blanding af fedtsyremethylestere fremstillet i henhold til bilag X B.

Metoden gælder ikke for polymeriserede fedtsyrer.

2. REAGENSER

2.1. Bæregas

Inaktiv gas (nitrogen, helium, argon, hydrogen etc.) vel tørret og indeholdende mindre end 10 mg oxygen/kg.

Note 1:

Hydrogen, der kun benyttes som bæregas, når det gælder kapillarkolonner, gør det muligt at foretage analysen dobbelt så hurtigt, men indebærer en risiko. Der forefindes sikkerhedsanordninger.

2.2. Hjælpegasser

2.2.1. Hydrogen (renhedsgrad ≥ 99,9 %), fri for organiske urenheder.

2.2.2. Luft eller oxygen, fri for organiske urenheder.

2.3. Referencestandard

En methylesterblanding af rene fedtsyrer eller methylesterne af et fedtstof, der så vidt muligt har samme sammensætning som det fedtstof, der skal analyseres.

Iltning af polyumættende fedtsyrer må undgås.

3. APPARATUR

Instruktionerne angår det sædvanlige udstyr til gaskromatografering med pakket kolonne og/eller kapillarkolonne og flammeionisationsdetektor. Alt udstyr, som kan give den i 4.1.2. definerede ydeevne og opløsning, kan anvendes.

3.1. Gaskromatograf

Gaskromatografen skal omfatte følgende elementer:

3.1.1. Injektionssystem

Der benyttes enten et injektionssystem

a) med pakkede kolonner med det mindst mulige dødvolumen (i dette tilfælde skal injektionssystemet kunne opvarmes til en temperatur, som er 20—50° C højere end kolonnens) eller

b) med kapillarkolonner, hvor injektionssystemet skal være specielt udformet til anvendelse med sådanne kolonner. Injektoren kan være med eller uden split.

Note 2:

Er der ikke tale om fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer, kan der benyttes injektor med faldende nål (moving needle injector).

3.1.2. Ovn

Ovnen skal være i stand til at opvarme kolonnen til en temperatur på mindst 260° C og holde den valgte temperatur inden for 1° C, når der er tale om en kapillarkolonne. Det sidste krav er særlig vigtigt, da der benyttes et rør af sintret kvarts.

Det anbefales i alle tilfælde at anvende temperaturprogrammeret opvarmning, navnlig til fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer.

3.1.3. Pakket kolonne

3.1.3.1. Kolonnen skal være kontrueret af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (dsv. glas eller rustfrit stål), af følgende dimensioner: a) Længde: 1—3 m. En relativt kort kolonne anvendes ved tilstedeværelse af langkædede fedtsyrer (over C20). Ved analyse af syrer med 4 eller 6 kulstofatomer anbefales det at anvende en kolonne på 2 m. b) Indre diameter: 2—4 mm. Note 3: Ved tilstedeværelse af polyumætterde forbindelser med mere end tre dobbeltbindinger er der risiko for, at de nedbrydes i en kolonne af rustfrit stål. Note 4: Der kan anvendes et system med to pakkede kolonner.

3.1.3.2. Fyldmateriale bestående af følgende elementer: a) Bærer: kiselgur, syrevasket og silanbehandlet, eller andet egnet inaktivt bæremateriale med et snævert kornstørrelsesinterval (25 μm i området 125 μm—200 μm), idet middelværdien vælges efter kolonnens indre diameter og længde. b) Stationær fase: polær væske af polyestertype (f.eks. diethylenglycolpolysuccinat, butandiolpolysuccinat, ethylenglycolpolyadipat mv.), cyanosiliconer eller enhver anden væske, der giver den krævede kromatografiske adskillelse (4). Den stationær fase bør udgøre 5 % (m/m)—20 % (m/m) af fyldmaterialet. En ikke-polær fase kan anvendes til visse adskillelser.

3.1.3.3. Konditionering af kolonnen Efter at kolonnen om muligt er adskilt fra detektoren, opvarmes ovnen gradvis til 185° C, og en strøm af inaktiv gas ledes gennem den netop fremstillede kolonne med en hastighed på 20—60 ml/min. i mindst 16 timer ved denne temperatur og derpå i 2 timer ved 195° C.

3.1.4. Kapillarkolonne

3.1.4.1. Røret skal være af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (normalt glas eller sintret kvarts). Den indre diameter skal være på mellem 0,2 mm og 0,8 mm. Den indvendige overflade skal undergå en passende behandling (f.eks. forbehandling, deaktivering), inden den stationære fasebelægning påføres. En længde på 25 m er tilstrækkelig i de fleste tilfælde.

3.1.4.2. Stationær fase: normalt af typen polyglycol [poly(ethylenglycol) 20 000], polyester (butandiolpolysuccinat) eller polær polysiloxan (cyanosiliconer). Bundne (tværbundne) kolonner er velegnede. Note 5: Der er risiko for, at polære polysiloxaner gør det vanskeligt at identificere og adskille linolensyre og C20 syrer. Belægningerne skal være tynde, dvs. 0,1 μm—0,2 μm.

3.1.4.3. Samling og konditionering af kolonnen Der træffes de normale forholdsregler ved samlingen af kapillarkolonner, dvs. placering af kolonnen i ovnen (bærer), valg og montering af samlinger (tæthed), anbringelse af kolonnens ender i injektoren og detektoren (reduktion af dødvolumener). Kolonnen anbringes under en strøm af bæregas (f.eks. 0,3 bar (30 kPa) for en kolonne med en længde på 25 m og en indre diameter på 0,3 mm). Kolonnen konditioneres ved temperaturprogrammering af ovnen ved 3° C/min. fra den omgivende temperatur til en temperatur på 10° C under den stationære fases dekomponeringsgrænse. Ovnen holdes på denne temperatur i 1 time, indtil basislinjen har stabiliseret sig. Den genindstilles på 180° C, så der opnås isotermiske betingelser. Note 6: Korrekt prækonditionerede kolonner fås i handelen.

3.1.5. Detektoren skal helst kunne opvarmes til en temperatur, som er højere end ovnens.

3.2. Injektionssprøjte

Injektionssprøjten skal have en maksimumskapacitet på 10 μl med 0,1 μl inddelinger.

3.3. Skriver

Hvis den optegnede kurve skal anvendes til at beregne sammensætningen af den analyserede blanding, skal skriveren være et meget præcist elektronisk instrument, som er foreneligt med det anvendte apparatur. Skriveren skal have følgende specifikationer:

a) responstid mindre end 1,5 sek. og helst 1 sek. (responstiden er den tid, der forløber, fra skriveren modtager et pludseligt signal på 100 %, og indtil den giver et udslag på 90 %)

b) papirbredde: minimum 20 cm

c) papirhastighed: regulerbar fra 0,4—2,5 cm/min.

3.4. Integrator

Anvendelse af elektronisk integrator giver en hurtig og præcis beregning. Den skal give et lineært udslag med tilstrækkelig følsomhed, og korrektionen for forstyrrelser på basislinjen skal være tilfredsstillende.

4. FREMGANGSMÅDE

4.1 til 4.3 angår anvendelse af en flammeionisationsdetektor.

Alternativt kan anvendes en gaskromatograf med katarometerdetektor (registrerer ændringer af varmeledningsevne). I så fald ændres arbejdsbetingelserne som angivet i 6.

4.1. Prøvebetingelser

4.1.1. Bestemmelse af de optimale arbejdsbetingelser

4.1.1.1. Pakket kolonne Følgende variabler indgår i valget af arbejdsbetingelser: a) kolonnes længde og diameter b) den stationære fases art og mængde c) kolonnens temperatur d) bæregassens hastighed e) den ønskede opløsning f) prøvens størrelse valgt på en sådan måde, at detektoren og elektrometret i forening giver et lineært udslag g) analysetiden. Almindeligvis vil værdierne i tabel 1 og tabel 2 give de ønskede resultater, dvs. for methylstearat mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m kolonnelængde og en elueringstid på ca. 15 min. Hvis apparaturet gør det muligt, skal injektoren have en temperatur på omkring 200° C og detektoren en temperatur, som er lig med eller højere end kolonnes. Forholdet mellem hydrogenstrømmen til flammeionisationsdetektoren og bæregassens hastighed ligger normalt på 1:2 til 1:1 alt efter kolonnens diameter. Oxygenstrømmen er ca. 5—10 gange større end hydrogenstrømmen.



Tabel 1 Kolonnes indre diameter mm Bæregassens hastighed ml/min. 2 15—25 3 20—40 4 40—60



Tabel 2 Den stationære fases koncentration % (m/m) Kolonnens temperatur ° C 5 175 10 180 15 185 20 185

4.1.1.2. Kapillarkolone Kapillarkolonnens ydeevne og permabilitet er ensbetydende med, at adskillelsen mellem bestanddelene og analysetiden stort set afhænger af bæregassens hastighed i kolonnen. Det vil derfor være nødvendigt at skabe de bedst mulige driftsbetingelser ved ad følge dette parameter (eller blot rette sig efter kolonnens tryktab) alt efter, om man ønsker at opnå bedre adskillelser eller foretage en hurtig analyse.

4.1.2. Bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og opløsning

(Se figur 1).

Analysen gennemføres med en blanding af methylstearat og methyloleat i nogenlunde lige store mængder (f.eks. methylestere af kakaosmør).

Kolonnens temperatur og bæregassens hastighed vælges således, at methylstearattoppens maksimum resistreres ca. 15 min. efter opløsningsmiddeltoppen. Der anvendes en tilstrækkelig mængde af methylesterblandingen til, at methylstearattoppen svarer til ca. ¾ af fuldt udslag.

Antallet af teoretiske bunde, n (ydeevne), beregnes ud fra formelen:

og opløsningen, R, ud fra formelen:

hvor

dω = retentionsafstanden i mm målt fra kromatogrammets start til det relative maksimum for methylstearattoppen

ω1 og ω2 = methylstearat- og methylolealtoppenes bredde i mm målt mellem basislinjens skæringspunkter med kurvens vendetangenter

Δ = afstanden i mm mellem methylstearat- og methyloleattoppenes maksima.

▼M2

og opløsningsindekset Ir ud fra formlen

hvor

a = højden af den mindste top målt i forhold til basislinjen

b = højden af det laveste punkt i området mellem to toppe ved siden af hinanden målt i forhold til basislinjen.

▼B

Figur 1

Kromatogram til bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og opløsning

Betingelserne vælges således, at de for methylstearat giver mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m kolonnelængde og en opløsning på mindst 1,25.

4.2. Prøve

Med injektionssprøjten (3.2) udtages 0,1—2 μl af methylesteropløsningen, der er fremstillet i henhold til bilag X B, og indsprøjtes i kolonnen.

Når det gælder ikke opløste estere, fremstilles i heptan til kromatografi en opløsning på 100 mg/ml, og 0,1—1 μl af denne opløsning indsprøjtes.

Ved analyse af bestanddele, der kun er til stede som spor, kan prøveudtagningen forøges (op til ti gange).

4.3. Analyse

Normalt vil driftsbetingelserne være de samme som dem, der er fastlagt i (4.1.1).

Det er dog muligt at arbejde med en lavere kolonnetemperatur, når fedtsyrer med mindre end 12 kulstofatomer skal bestemmes, eller en højere temperatur, når fedtsyrer med mere end 20 kulstofatomer skal bestemmes. Det et muligt at anvende temperaturprogrammering i begge tilfælde. Hvis prøven f.eks. indeholder fedtsyremethylestere med mindre end 12 kulstofatomer, indsprøjtes prøven ved 100° C (eller 50—60° C, hvis der er smørsyre til stede), hvorefter temperaturen straks øges med 4—8° C/min, indtil den optimale temperatur nås. I visse tilfælde kan de to fremgangsmåder kombineres.

Efter den programmerede opvarmning fortsættes elueringen ved konstant temperatur, indtil alle bestanddelene er elueret. Hvis apparatet ikke arbejder med programmeret opvarmning, arbejdes der med to faste temperaturer mellem 100° C og 195° C.

Om nødvendigt anbefales det at foretage en analyse på to stationære faser med forskellig polaritet for at sikre sig, at der ikke forekommer maskerede toppe, hvilket kan være tilfældet ved samtidig tilstedeværelse af C18:3 og C20:0 eller af C18:3 og C18:2 konjugeret.

4.4. Udarbejdelse af referencekromatogrammet og referencediagrammer

Referencestandardblandingen (2.3) analyseres under de samme driftsbetingelser som for prøvens vedkommende, og retentionstiderne eller retentionsafstandene for de tilstedeværende fedtsyrer måles. På semilogaritmisk papir afbildes logaritmen til retentionstiden eller -afstanden mod antallet af kulstofatomer for alle grader af umættethed; under isotermiske betingelser skal de punkter, der repræsenterer ligekædede syrer med samme umættethedsgrad, ligge på rette linjer, der er nogenlunde parallelle.

Det er nødvendigt at undgå betingelser, hvor der fremkommer »maskerede toppe«, dvs. hvor opløsningen er utilstrækkelig til at adskille to bestanddele.

5. ANGIVELSE AF RESULTATER

5.1. Kvalitativ analyse

Prøvens methylestertoppe identificeres ud fra diagrammerne, der er udarbejdet i 4.4, om nødvendigt ved interpolation.

5.2. Kvantitativ analyse

5.2.1. Bestemmelse af sammensætningen

Bortset fra undtagelsestilfælde anvendes den interne normaliseringsmetode, dvs. det forudsættes, at samtlige bestanddele i prøven er repræsenteret på kromatogrammet, således at toppenes samlede areal udgør 100 % af bestanddelene (total eluering).

Hvis apparaturet omfatter en integrator, anvendes resultaterne fra denne. Hvis ikke, bestemmer man arealet af hver enkelt top ved at multiplicere toppens høje med dens bredde i halv højde og tager i givet fald hensyn til de forsekllige dæmpningsindstillinger under registreringen.

5.2.2. Beregningsmetode

5.2.2.1. Generelt Indholdet af en given bestanddel i, udtrykt i vægtprocent methylestere, beregnes ved, at man bestemmer den procentdel, som den tilsvarende top udgør i forhold til summen af arealerne af samtlige toppe, ud fra følgende formel: hvor Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i = summen af arealerne af samtlige toppe. Resultatet anføres med en decimal. Note 7: I dette generelle tilfælde betragtes resultatet af beregningen, som er baseret på relative arealer, som en vægtprocent. I de tilfælde, hvor man ikke kan arbejde med denne antagelse, henvises til 5.2.2.2.

5.2.2.2. Anvendelse af korrektionsfaktorer I visse tilfælde, f.eks. ved tilstedeværelse af fedtsyrer med mindre end otte kulstofatomer eller syrer med andre funktionelle grupper, bør der, når man anvender varmeledningsevnedetektorer, eller når den størst mulige præcision er specielt påkrævet, anvendes korrektionsfaktorer for at omsætte bestanddelenes procentvise toparealer til vægtprocent. Korrektionsfaktorerne bestemmes ved hjælp af et kromatogram af en referenceblanding af methylestere med kendt sammensætning under samme betingelser som for prøvens vedkommende. For denne referenceblanding udtrykkes vægtprocent bestanddel i ud fra formlen hvor mi = massen af bestanddel i i referenceblandingen = summen af masserne af referenceblandingens forskellige bestanddele. Ud fra referenceblandingens (4.4) kromatogram beregnes procentdelen (areal/areal) af bestanddel i som følger: hvor Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i = summen af arealerne af samtlige toppe. Korrektionsfaktoren beregnes derpå som: Almindeligvis sættes korrektionsfaktorerne i relation til KC16, så de relative faktorer bliver: For prøven er mængden af hver bestanddel i, udtrykt i vægtprocent methylestere, Resultatet anføres med en decimal.

5.2.2.3. Anvendelse af en intern standard I forbindelse med visse analyser (f.eks. når det ikke er alle fedtsyrerne der er elueret, som det er tilfældet, når syrer med 4 og 6 kulstofatomer er til stede sammen med syrer med 16 og 18 kulstofatomer, eller når det er nødvendigt at bestemme den absolutte mængde af en fedtsyre i en prøve), er det nødvendigt at anvende en intern standard. Der benyttes ofte fedtsyrer med 5, 15 eller 17 kulstofatomer. Den eventuelle korrektionsfaktor for den interne standard bestemmes. Vægtprocent bestanddele i, udtrykt som methylestere, betemmes ud fra formlen hvor Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i As = arealet af den top, der svarer til den interne standard K′i = korrektionsfaktoren for bestanddel i (i forhold til KC16) K′s = korrektionsfaktoren for den interne standard (i forhold til KC16) m = massen i mg af prøven ms = massen i mg af den interne standard. Resultaterne anføres med en decimal.

▼M2

6. BESTEMMELSE AF TRANSISOMERER

Det er muligt at bestemme indholdet af transisomerer i fedtsyrer med et antal kulstofatomer på mellem 10 og 24 ved adskillelse af methylestere under anvendelse af en kromatograf med kapillarkolonne og særlig polaritet.

6.1. Kapillarkolonne af kvartsglas med en intern diameter på 0,25 mm - 0,32 mm og en længde på 50 m, dækket af cyanopropylsilicone i en lagtykkelse på 0,1 - 0,3 μm (type SP 2340, type SP 2380 C.P. Sil 88, Silor 10 og lignende).

▼M21

6.2. Methylestrene fremstilles i overensstemmelse med metode B i bilag X B. Fedtstoffer og olier med et indhold af frie syrer på over 3 % skal på forhånd neutraliseres i overensstemmelse med punkt 5.1.1 i bilag VII.

▼M2

6.3. De vilkår, hvorunder gaskromatograferingen skal finde sted, er: — kolonnetemperatur programmeret til 150-230 °C (f.eks. 165 °C i 15 minutter, derefter en stigning på 5 °C i minuttet indtil 200 °C) — injek