1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS BESLUTNING
af 15. juli 1994
om dyresundhedsmæssige betingelser og udstedelse af sundhedscertifikat for indførsel af tyresæd
fra tredjelande
(94/577/EF)
(EFT L 221 af 26.8.1994, s. 26)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1Kommissionens beslutning 1999/495/EF af 1. juli 1999 L 192 56 24.7.1999
►M2Kommissionens beslutning 2004/52/EF af 9. januar 2004 L 10 67 16.1.2004
▼B
KOMMISSIONENS BESLUTNING
af 15. juli 1994
om dyresundhedsmæssige betingelser og udstedelse af sundhedscer-
tifikat for indførsel af tyresæd fra tredjelande
(94/577/EF)
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fælles-
skab,
under hevisning til Rådets direktiv 88/407/EØF af 14. juni 1988 om
fastsættelse af de veterinærpolitimæssige krav i forbindelse medhandelen inden for Fællesskabet med tyresæd og indførsel heraf (
1),
senest ændret ved direktiv 93/60/EØF (2), særlig artikel 10 og 11, og
ud fra følgende betragtninger:
Listen over tredjelande, hvorfra medlemsstaterne tillader indførsel af
tyresæd, i det følgende benævnt »tredjelandslisten«, blev fastsat vedKommissionens beslutning 90/14/EØF (
3), ændret ved beslutning 91/
276/EØF (4);
sygdomssituationen i Israel resulterede i, at der blev indført forbud mod
indførsler fra dette land ved Kommissionens beslutning 91/277/EØF (5);
ved Kommissionens beslutning 91/479/EØF (6), 91/549/EØF (7), 92/
123/EØF (8), 92/124/EØF(9), 92/125/EØF (10), 92/126/EØF (11), 92/127/
EØF (12), 92/128/EØF (13), 92/386/EØF (14), 92/387/EØF (15)og 92/445/
EØF (16) blev der fastsat dyresundhedsmæssige betingelser og bestem-
melser om udstedelse af sundhedscertifikat for indførsel af tyresæd frahenholdsvis USA, Canada, Polen, Finland, New Zealand, Østrig,Schweiz, Sverige, Ungarn, Norge og Tjekkoslovakiet;
direktiv 93/60/EØF, som skal være gennemført i medlemsstaterne
inden den 1. juli 1994, ændrer direktiv 88/407/EØF, hvilket gør detnødvendigt at ændre tredjelandsbeslutninger; for at forenkle og klargøreEU-forskrifterne inden for dette område bør beslutninger samles i énenkelt beslutning, og de beslutninger, der er gældende for hvert enkelt
land, ophæves;
i betragtning af bestemmelserne i aftalen om Det Europæiske Økono-
miske Samarbejdsområde er det ikke nødvendigt at opretholdesundhedscertifikatet ved indførsel af tyresæd fra Finland, Norge,
Sverige og Østrig;
ifølge udtalelse fra Den Videnskabelige Veterinærkomité er en yderli-
gere prøve for epizootiskhæmorragisksygdom påk rævet;
det er kun i Canada, at forudgående rutineprøver for denne sygdrom
kan udføres med seks måneders mellemrum; der bør derfor fastlægges
en overgangsperiode for anvendelsen af denne beslutning med hensyn
til Canada for at give de canadiske veterinærmyndigheder tilstrækkeligtid til at indføre den nye prøve i deres rutineprogram;1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 2
(1) EFT nr. L 194 af 22. 7. 1988, s. 10.
(2) EFT nr. L 186 af 28. 7. 1993, s. 28.
(3) EFT nr. L 8 af 11. 1. 1990, s. 71.
(4) EFT nr. L 135 af 30. 5. 1991, s. 58.
(5) EFT nr. L 135 af 30. 5. 1991, s. 60.
(6) EFT nr. L 258 af 16. 9. 1991, s. 1.
(7) EFT nr. L 298 af 29. 10. 1991, s. 6.
(8) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 1.
(9) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 10.
(10) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 19.
(11) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 28.
(12) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 37.
(13) EFT nr. L 48 af 22. 2. 1992, s. 46.
(14) EFT nr. L 204 af 21. 7. 1992, s. 13.
(15) EFT nr. L 204 af 21. 7. 1992, s. 22.
(16) EFT nr. L 247 af 27. 8. 1992, s. 1.
▼B
da der i den senere tid er opnået bedre kendskab til bluetongues
epidemi, kan der nu også gives tilladelse til indførsel af tyresæd fraAustralien;
den dyresundhedsmæssige situation i de på tredjelandslisten opførte
lande synes at være god og kontrolleret af velstrukturerede og velorga-niserede veterinærmyndigheder hvad angår sygdomme, der kanoverføres via sæd;
tredjelandenes veterinærmyndigheder har forpligtet sig til inden for 24
timer via telex eller telefax at underrette Kommissionen og medlems-staterne om bekræftelse af enhver forekomst af en af de på OIE's liste
A opførte sygdomme eller om enhver ændring i vaccinationspolitikken
i forbindelse med disse sygdomme og — inden for en rimelig frist —om forekomst af de på OIE's liste B opførte sygdomme og om enhverpåtænkt ændring af importreglerne for husdyr eller sæd eller embryonerfra husdyr;
veterinærmyndighederne i de på tredjelandslisten opførte lande har
forpligtet sig til at føre officielt tilsyn med udstedelsen af de i denne
beslutning omhandlede certifikater samt til at sikre, at alle relevantecertifikater, fravigelser og resultater af laboratorieundersøgelser, somudstedelsen af certifikater måtte være baseret på, forbliver officieltregistreret i mindst tolv måneder efter afsendelsen af den sæd, devedrører;
veterinærmyndighederne i de på tredjelandslisten opførte lande har
forpligtet sig til officielt at godkende tyrestationer til udførsel af sæd
til Fællesskabet som fastsat i artikel 9 i direktiv 88/407/EØF;
de dyresundhedsmæssige betingelser og udstedelsen af sundhedscerti-
fikat må tillpasses den dyresundhedsmæssige situation i detpågældende tredjeland;
de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse
med udtalelse fra Den Stående Veterinærkomité —
VEDTAGET FØLGENDE BESLUTNING:
Artikel 1
Medlemsstaterne tillader indførsel af tyresæd, der opfylder betingel-
serne i certifikaterne i bilag A, B, C og D, første del, dog kun fra de
tredjelande, der er anført i henholdsvis bilag A, B, C og D, anden del.
Medlemsstaterne tillader dog indførsel fra Canada af tyresæd, der er
opsamlet og behandlet i henhold til beslutning 91/549/EØF, indtil den31. december 1994.
Artikel 2
Beslutning 91/479/EØF, 92/123/EØF, 92/124/EØF, 92/125/EØF, 92/
126/EØF, 92/127/EØF, 92/128/EØF, 92/386/EØF, 92/387/EØF og 92/445/EØF ophæves.
Kommissionens beslutning 91/549/EØF ophæves fra den 1. januar
1995.
Artikel 3
Bestemmelserne i artikel 1, stk. 1, vedrørende Canada anvendes fra den
1. januar 1995.
Artikel 4
Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 3
▼B
BILAG A
FØRSTE DEL
SUNDHEDSCERTIFIKAT
for indførsel af tyresæd
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 4
▼B
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 5
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 6
▼M2
ANDEN DEL
Liste over lande, som må anvende modellen til sundhedscertifikatet i del I i
bilag A
ISO-kode Land Bemærkninger
CH Schweiz
NZ New Zealand
RO RumænienCY Cypern (*)
CZ Tjekkiet (*)
EE Estland (*)
HU Ungarn (*)
LT Litauen (*)
LV Letland (*)
MT Malta (*)
PL Polen (*)
SI Slovenien (*)
SK Slovakiet (*)
(*) Gælder kun, indtil dette tiltrædende land bliver medlem af Fællesskabet.1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 7
▼B
BILAG B
FØRSTE DEL
SUNDHEDSCERTIFIKAT
for indførsel af tyresæd fra USA
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 8
▼B
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 9
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 10
▼B
ANDEN DEL
Liste over lande, som har tilladelse til at anvende det sundhedscertifikat,
der er vist i bilag B, første del
USA1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 11
▼B
BILAG C
FØRSTE DEL
SUNDHEDSCERTIFIKAT
for indførsel af tyresæd
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 12
▼B
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 13
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 14
▼B
ANDEN DEL
Liste over lande, som har tilladelse til at anvende det sundhedscertifikat,
der er vist i bilag C, første del
CANADA Bortset fra regionen Okanagan Valley i British Columbia, der defi-
neres som et område, der afgrænses af en linje trukket fra et punktpå grænsen mellem Canada og USA 120º 15 ′længde, 49º bredde
mod nord til et punkt 119º 35 ′længde, 50º 30 ′bredde mod nordøst
til et punkt 119º længde, 50º 45 ′bredde mod syd til et punkt på
grænsen mellem Canada og USA 118º 15 ′længde, 49º bredde.1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 15
▼B
BILAG D
FØRSTE DEL
SUNDHEDSCERTIFIKAT
for indførsel af tyresæd
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 16
▼B
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 17
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 18
▼B
ANDEN DEL
Liste over tredjelande, som har tilladelse til at anvende det sundhedscerti-
fikat, der er vist i bilag D, første del
AUSTRALIEN1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 19
▼B
BILAG E
Protokol for en blokerende eller kompetitiv enzym-kæde-immunitet-måling
med anvendelse af et gruppespecifikt monoklonalt antistof til påvisning af
antistoffer mod bluetongue-virus
DEN KOMPETITIVE ELISA TIL PÅVISNING AF BLUETONGUE MED
ANVENDELSE AF MONOKLONALT ANTISTOF 3-17-A3
Prøven kan påvise antistoffer mod alle kendte serotyper af bluetongue-virus
(BTV).
Prøveprincippet er, at reaktionen mellem BTV-antigen og et gruppespecifikt
monoklonalt antistof (3-17-A3) afbrydes ved tilsætning af fortyndinger af prøve-
serum. Tilstedeværende antistoffer mod BTV i prøveserummet blokerer
reaktionsevnen hos det monoklonale antistof (Mas) og resulterer i en formind-
skelse af den forventede farveudvikling ved tilsætning af enzymsubstrat.
MATERIALER OG REAGENSER
1. Fladbundede mikrotiterplader.
2. Antigen: tilberedes som beskrevet nedenfor.
3. Blokerende buffer: 5 % (w/v) »Marvel« tørret mælkepulver, 0,1 % (v/v)
Tween-20 (leveres som polyoxyethylensorbitanmonolauratsirup) i phosphat-
bufferet saltopløsning (PBS).
4. Monoklonalt antistof: 3-17-A3 (leveres som hybridom cellekultur superna-
tant), opbevaret ved −20 ºC eller frysetørret, fortyndet i forholdet 1: 50 med
blokerende buffer inden brug, rettet mod det gruppespecifikke polypeptid p7.
5. Konjugat: kanin-antimuseglobulin (adsorberet og elueret), konjugeret med
peberrodsperoxidase og opbevaret i mørke ved 4º C.
6. Substrat og kromogen: 0,2 g ortofenylendiamin (OPD) opløst i en buffer
bestående af 2,553 g citronsyre og 4,574 g dinatriumhydrogenortofosfat tilsat
destilleret vand op til 500 ml, opdelt i 25 ml alikvoter og opbevaret i mørke
ved - 20ºC med tilsætning af 12 µl/ml hydrogenperoxid (30 % w/v) umiddel-
bart inden brug.
OMGÅS MED FORSIGTIGHED — BRUG GUMMIHANDSKER —
MISTANKE OM MUTAGEN.
7. 1 Molar svovlsyre: 26,6 ml syre blandet i 473,4 ml destilleret vand.
HUSK — BLAND ALTID SYRE I VAND, ALDRIG VAND I SYRE
8. Orbitalryster.9. Elisa-pladelæser (prøven kan aflæses visuelt).1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 20
▼B
1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 21
▼B
PRØVEPROTOKOL
Blindprøvekontrol
Række 1 A-H er en blindprøvekontrol bestående af BTV-antigen og konjugat.
Den kan anvendes som blindprøve for Elisa-læseren.
Mas-kontrolRække 2 A-H er den monoklonale antistofkontrol og består af BTV-antigen,
monoklonalt antistof og konjugat. Den udgør en negativ kontrol. Middelværdien
af absorbansaflæsningerne af denne kontrolrække repræsenterer 0 % hæmning.
Positiv kontrol
Række 3 A-H er den positive kontrol. Den består af BTV-antigen, BTV-positive
antiserumfortyndinger, monoklonalt antistof og konjugat. Den tjener som indi-
kator for, at prøven fungerer ordentligt, og der bør opnås samstemmende
hæmningsniveauer fra prøve til prøve.
Prøvesera
I ovenstående prøveformat kan der afprøves 18 sera fortyndet i forholdet 1:2,
1:4, 1:8 og 1:16. Dette vil vise noget om antistoftiteret i prøveserummet. Fortyn-
dingsrækken kan gå længere, således at titrene for serumfortynding når
slutpunktet. Som et alternativ kan sera, når det gælder serologiske undersøgelser
i stor skala, prøves i en enkelt fortynding (1:4) eller to fortyndinger (1:2 og 1:4)
som en hurtig screeningtest.
PROCEDURE
1. BTV-antigen fortyndes til prætitreret fortynding i PBS, der sonikeres et
øjeblik for at sprede akkumuleret virus (hvis der ikke findes nogen sonikator,
pipetteres der kraftigt), og der tilføres 50 µl til alle huller i Elisa-pladen. Der
bankes på pladens sider for at sprede antigenet.
2. Der inkuberes ved 37 ºC i 60 minutter i en orbitalryster. Pladerne vaskes tre
gange ved overskylning og tømning af hullerne med usterilt PBS, og de
trykkes af med klatpapir.
3. Der tilsættes 50 µl blokerende buffer pr. hul. Prøvesera og positivt serum
hældes i de relevante huller, og der fortyndes hen over pladen ved hjælp af
en multikanalpipette. Sera må ikke tilsættes blankprøvekontrollen eller Mas-
kontrollen.
4. Straks efter tilsætningen af prøveseraene fortyndes Mas i blokerende buffer
(for at prætitrere fortyndingen), og der hældes 50 µl i alle pladens huller,
undtagen når det gælder blindprøvekontrollen.
5. Der inkluderes ved 37 ºC i 60 minutter i en sonikator. Der vaskes tre gange
med PBS og trykkes af med klatpapir.
6. Kanin-antimusekoncentrat fortyndes til 1: 5 000 i blokerende buffer, og der
hældes 50 µl i alle pladens huller.
7. Der inkuberes ved 37 ºC i 60 minutter i en sonikator. Der vaskes tre gange
med PBS og trykkes af med klatpapir.
8. OPD optøs, og umiddelbart inden brug tilsættes hver 25 ml POD 12 µl3 0%
hydrogenperoxid. 50 µl hældes i alle pladens huller. Man lader farven
udvikle sig i ca. ti minutter og standser reaktionen med 1 M svovlsyre (50
µl pr. hul). Farven skal udvikle sig i Mas-kontrolhullerne og i de huller, der
ikke indeholder sera med antistof mod BTV.
9. Hullerne undersøges og registreres enten visuelt eller ved hjælp af en spek-
trofotometrisklæser.
ANALYSE AF RESULTATER
Middel-OD-aflæsningen beregnes ud fra Mas-kontrollerne. Dette repræsenterer
hæmningsværdien på 0 %. Absorbansaflæsninger af prøveseraene udtrykkes i
procent hæmningsværdier ved hjælp af følgende formel:
Procent hæmningsværdi ¼100/C0
OD ved tilstedeværelse af prøveserum
OD ved fravær af prøveserum/C2100
Hæmningsværdier på over 40 % ved en serumfortynding på 1: 4 betragtes som
positive. Visuel aflæsning er mulig, da 40 % hæmning er den laveste værdi, der
let kan ses med det blotte øje.1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 22
▼B
TILBEREDNING AF BTV ELISA-ANTIGEN
1. 10 roux sammenflydende BHK-21 celler vaskes tre gange med serumfrit
Eagle's medium, og der inficeres med bluetongue-virus serotype 1 i serum-
frit Eagle's medium.
2. Der inkuberes ved 37 ºC og undersøges daglig for cytopatisk effekt (cpe).
3. Når der kan konstateres cpe i 80 til 90 % af cellelaget i hver roux,
indsamles viruset ved, at eventuelle celler, der stadig sidder på glasset,
rystes af.
4. Der centrifugeres ved 2000 til 3 000 rpm for at sammenpresse cellerne.5. Supernatanten fjernes, og cellerne genopslæmmes i ca. 30 ml PBS, som
indeholder 1 % »Sarkosyl« og 2 ml fenolmetylsulfonylfluorid (lysisbuffer).
Dette kan bevirke, at cellerne danner en gel, og der kan tilsættes mere lysis-
buffer for at reducere denne effekt.
NB:Fenylmetylsulfonylfluorid er skadeligt — behandles med største forsig-
tighed.
6. Cellerne sprænges i 60 sekunder ved hjælp af en ultralydsonde med en
amplitude på 30 micron.
7. Der centrifugeres ved 10000 rpm i ti minutter.8. Supernatanten opbevares ved + 4 ºC, og den resterende cellemasse genop-
slæmmes i 10 til 20 ml lysisbuffer.
9. Der sonikeres og foretages en klaring, idet supernatanten opbevares på hvert
stadium, i alt tre gange.
10. Supernatanterne samles og centrifugeres ved 24000 rpm i 120 minutter ved
+ 4 ºC på en 5 ml pude bestående af 40 % saccharose (w/v i PBS) ved
hjælp af 30 ml Beckman centrifugeglas og en SW 28 rotor.
11. Supernatanten fjernes, glassene tømmes helt, og massen genopslæmmes i
PBS ved hjælp af sonikering. Antigenet opbevares i alikvoter ved − 70 ºC.
TITRERING AF BTV ELISA-ANTIGEN
Bluetongue Elisa-antigen titreres ved hjælp af den indirekte Elisa. Tofoldfortyn-
dinger af antigen titreres over for en konstant fortynding (1:50) af monoklonalt
antistof 3-17-A3). Protokollen er som følger:
PROCEDURE
1. BTV antigen fortyndes i PBS over mikrotiterpladen i en todobbelt fortyn-
dingsrække (50 µl/hul) ved hjælp af en multikanalpipette.
2. Der inkuberes en time ved 37 ºC i en orbitalryster.
3. Pladerne vaskes tre gange med PBS.
4. Der tilsættes hvert hul i mikrotiterpladen 50 µl monoklonalt antistof 3-17-A3
(fortyndet 1: 50).
5. Der inkuberes en time ved 37 ºC i en orbitalryster.
6. Pladerne vaskes tre gange med PBS.7. Der tilsættes hvert hul i mikrotiterpladen 50 µl kanin-antimuseglobulin
konjugeret med peberrodsperoxidase fortyndet til en prætitreret optimal
koncentration.
8. Der inkuberes en time ved 37 ºC i en sonikator.
9. Der tilsættes substrat og kromogen som tidligere beskrevet. Reaktionen
standses efter ti minutter ved tilsætning af 1 Molar svovlsyre (50 µl/hul).
I den kompetitive prøve skal det monoklonale antistof være i overskud, og der
vælges derfor en fortynding af antigen, som ligger på titreringskurven (ikke på
den flade del), hvilket giver ca. 0,8 OD efter ti minutter.1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 23
▼B
Protokol for en agar-gel-immunodiffusionsprøve til påvisning af antistoffer
mod epizootisk hæmoragisk sygdom
Agar-gel-immunodiffusionsprøven foretages efter følgende protokol:
MATERIALER OG REAGENSER
1. Antigen
Antigen, der bundfældes, tilberedes i et cellekultursystem, der tåler den
hurtige formering af den/de pågældende serotype(r) epizootiskhæmoragisk
sygdomsvirus. BHK eller Vero-celler anbefales. Antigen forekommer i super-
natantvæsken, når virusets vækst er ophørt, men kræver en koncentration på
50 til 100 gange for at være effektivt. Dette kan opnås ved hjælp af enhver
standardprocedure for proteinkoncentrering. Virus i antigenet kan inaktiveres
ved tilsætning af 0,3 % (v/v) beta-propiolakton.
2. Kendt positivt kontrolserum
Ved hjælp af det internationale referenceserum og antigen fremstilles et nati-
onalt standardserum, der standardiseres i det optimale forhold som for det
internationale referenceserum, frysetørres og anvendes som det kendte
kontrolserum i hver enkelt prøve.
3. Prøveserum
PROCEDURE
1. 1 % agarose tilberedt i borat eller natriumbarbitolbuffer, pH 8,5 til 9,0
hældes i en petriskål op til mindst 3,0 mm.
2. Der skæres et prøvemønster på syv fugtfri huller på hvert 5,0 mm diameter i
agaren. Mønstret består af et centerhul og seks huller, der er anbragt rundt
om det i en cirkel med en radius på 3 mm.
3. Centerhullet fyldes med standardantigenet. De ydre huller 2, 4 og 6 fyldes
med kendt positivt serum og hul 1, 3 og 5 fyldes med prøvesera.
4. Systemet inkuberes i indtil 72 timer ved stuetemperatur i et lukket fugtigt
kammer.
FORTOLKNING
Et prøveserum er positivt, hvis det danner en specifikbundfældninglinje med
antigenet og danner en ubrudt identitetslinje med kontrolserummet. Et prøve-
serum er negativt, hvis det ikke danner en specifik linje med antigenet og det
ikke krummer kontrolserummets linje. Petriskåle bør undersøges mod en mørk
baggrund ved indirekte belysning.1994D0577 — DA — 19.01.2004 — 002.001 — 24