1991R2568 — DA — 04.08.2016 — 029.001

Denne tekst tjener udelukkende som dokumentationsværktøj og har ingen retsvirkning. EU's institutioner påtager sig intet ansvar for dens indhold. De autentiske udgaver af de relevante retsakter, inklusive deres betragtninger, er offentliggjort i den Europæiske Unions Tidende og kan findes i EUR-Lex. Disse officielle tekster er tilgængelige direkte via linkene i dette dokument

Ændret ved:





Berigtiget ved:









▼B

KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91

af 11. juli 1991

om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte metoder







▼M20

Artikel 1

1. Som jomfruolie efter punkt 1, litra a) og b), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis respektive kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 1 og 2 i bilag I til nærværende forordning.

2. Som bomolie efter punkt 1, litra c), i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 3 i bilag I til nærværende forordning.

3. Som raffineret olivenolie efter punkt 2 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 4 i bilag I til nærværende forordning.

4. Som olivenolie bestående af raffineret olivenolie og jomfruolier efter punkt 3 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 5 i bilag I til nærværende forordning.

5. Som rå olie af olivenpresserester efter punkt 4 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 6 i bilag I til nærværende forordning.

6. Som raffineret olie af olivenpresserester efter punkt 5 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 7 i bilag I til nærværende forordning.

7. Som olie af olivenpresserester efter punkt 6 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 8 i bilag I til nærværende forordning.

▼M26

Artikel 2

1. Bestemmelsen af kendetegnene for de i bilag I fastsatte olier sker ved hjælp af følgende analysemetoder:

a) til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre, metoden i bilag II

b) til bestemmelse af peroxidtallet, metoden i bilag III

c) til bestemmelse af voksindhold, metoden i bilag IV

d) til bestemmelse af sammensætningen og indholdet af steroler og triterpenalkoholer ved gaskromatografi på kapillarsøjle, metoden i bilag V

e) til bestemmelse af det procentvise indhold af 2-glycerylmonopalmitat, metoden i bilag VII

f) til den spektrofotometriske undersøgelse, metoden i bilag IX

▼M28

g) til bestemmelse af fedtsyrernes sammensætning, metoden i bilag X

▼M26

h) til bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsningsmidler, metoden i bilag XI

i) til bedømmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn, metoden i bilag XII

j) til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener, metoden i bilag XVII

k) til bestemmelse af indholdet af ECN42-holdige triglycerider, metoden i bilag XVIII

▼M28

l) til bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer og triterpenalkoholer, metoden i bilag XIX

▼M26

m) til bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere, metoden i bilag XX.

▼M28 —————

▼M26

2. Den kontrol, som de nationale myndigheder eller deres repræsentanter foretager af de organoleptiske kendetegn for jomfruolie, gennemføres af paneler af smagere, som medlemsstaterne har godkendt.

De organoleptiske kendetegn for en i første afsnit omhandlet olivenolie anses for at stemme overens med den anmeldte type olivenolie, hvis et af den pågældende medlemsstat godkendt panel bekræfter klassifikationen i den henseende.

Hvis panelet ikke bekræfter den anmeldte kategori med hensyn til de organoleptiske kendetegn, lader de nationale myndigheder eller deres repræsentanter på den berørte parts anmodning straks foretage to kontrolanalyser, som udføres af andre godkendte paneler, og hvoraf mindst den ene udføres af et panel, der er godkendt af den pågældende producentmedlemsstat. De pågældende kendetegn anses for at stemme overens med dem, der er anmeldt, hvis de to kontrolanalyser bekræfter den anmeldte klassifikation. I modsat fald pålægges kontrolanalyseudgifterne den berørte part, uden at dette foregriber anvendelsen af sanktioner.

3. Hvad angår de nationale myndigheders eller deres repræsentanters kontrol af oliens kendetegn som omhandlet i stk. 1 udtages der prøver efter de internationale standarder EN ISO 661 og EN ISO 5555 for forberedelse af prøver til forsøg og prøveudtagning. Uanset punkt 6.8 i standard EN ISO 5555 udtages prøverne i henhold til bilag Ia til denne forordning for partier af den nævnte olie i umiddelbare emballager. I tilfælde af bulkolier, hvor prøveudtagningen ikke kan foretages i henhold til EN ISO 5555, gennemføres prøveudtagningen i overensstemmelse med de retningslinjer, der udstedes af medlemsstatens kompetente myndighed.

Med forbehold af bestemmelserne i standard EN ISO 5555 og kapitel 6 i standard EN ISO 661 beskyttes de udtagne prøver straks mod lys og stræk varme og sendes til laboratoriet til analyse senest den femte arbejdsdag efter udtagningsdage, i modsat fald skal prøverne opbevares på en sådan måde, at de ikke bliver ødelagt eller beskadiget under transporten eller opbevaringen, før de sendes til laboratoriet.

4. Med hensyn til kontrollen i stk. 3 foretages analyserne i bilag II, III, IX, XII og XX samt eventuelle kontrolanalyser, der er fastsat ved national lov, inden datoen for mindste holdbarhed, når der er tale om emballerede produkter. Ved prøveudtagning af bulkolier foretages analyserne senest den sjette måned efter den måned, hvor prøven er udtaget.

Der gælder ingen frister for de øvrige analyser, som er fastsat ved nærværende forordning.

Svarer analyseresultaterne ikke til kendetegnene for den anmeldte kategori olivenolie eller olie af olivenpresserester, underrettes den pågældende herom senest en måned inden udløbet af fristen i første afsnit, undtagen hvis prøveudtagningen fandt sted mindre end to måneder inden datoen for mindste holdbarhed.

5. Til bestemmelse af olivenoliernes kendetegn efter metoderne omhandlet i stk. 1, første afsnit, sammenlignes analyseresultaterne direkte med de i denne forordning fastsatte grænseværdier.

▼M25

Artikel 2a

1. I denne artikel forstås ved »afsat olivenolie« den samlede mængde af en medlemsstats olivenolie og olie af olivenpresserester, der forbruges i medlemsstaten eller eksporteres fra medlemsstaten.

2. Medlemsstaterne sørger for, at der med passende hyppighed udføres overensstemmelseskontrol, der er selektiv, dvs. bygger på en risikoanalyse, for dermed at sikre, at den afsatte olivenolie svarer til den anmeldte kategori.

3. Kriterierne for vurderingen af risikoen kan omfatte:

a) oliens kategori, produktionstidsrummet, prisen på olien i forhold til andre vegetabilske olier, blandings- og emballeringsaktiviteter, lageranlæg og opbevaringsforhold, oprindelsesland, bestemmelsesland, transportmåde samt partiets størrelse

b) hvilket led i afsætningskæden de erhvervsdrivende tilhører, hvilke oliekategorier de afsætter og hvor meget, målt i mængde og/eller værdi, samt hvilken virksomhed de udøver, fx presning, lagring, raffinering, blanding, emballering eller detailsalg

c) oplysninger om forhold, der er konstateret under tidligere kontroller, herunder antal og type af konstaterede mangler, den afsatte olies normale kvalitet og det anvendte tekniske udstyrs ydeevne

d) hvor pålidelige de erhvervsdrivendes kvalitetssikringssystemer eller egenkontrolsystemer til kontrol af, om handelsnormerne overholdes, er

e) det sted, hvor kontrollen finder sted, især hvis det er det sted, hvor varen først føres ind i EU eller sidst føres ud af EU, eller det sted, hvor olien produceres, emballeres, læsses eller sælges til den endelige forbruger

f) øvrige oplysninger, der kan tyde på manglende overensstemmelse.

4. Medlemsstaterne fastlægger på forhånd:

a) kriterierne for vurdering af risikoen for, at partier ikke er i overensstemmelse med normerne

b) minimumsantallet af erhvervsdrivende eller partier og/eller mængder, der underkastes overensstemmelseskontrol, på grundlag af en risikoanalyse for hver risikokategori.

Der udføres mindst én overensstemmelseskontrol pr. 1 000 ton olivenolie, der afsættes i medlemsstaten pr. år.

5. Medlemsstaterne kontrollerer overensstemmelsen ved

a) at analyserne i bilag I udføres i vilkårlig rækkefølge, eller

b) at analyserne udføres i den rækkefølge, der er angivet i beslutningsskemaet i bilag Ib, indtil en af beslutningerne i skemaet træffes.

▼M19 —————

▼M25

Artikel 3

Konstateres det, at en olie ikke svarer til beskrivelsen af dens kategori, anvender medlemsstaten sanktioner, der er effektive, står i rimeligt forhold til overtrædelsen og har afskrækkende virkning, og hvis størrelse afhænger af den konstaterede uregelmæssigheds omfang, uden at dette i øvrigt udelukker eventuelle andre sanktioner.

Hvis der ved kontrollen afsløres væsentlige uregelmæssigheder, øger medlemsstaterne kontrolfrekvensen ud fra sådanne kriterier som afsætningsled, oliekategori, oprindelse mv.

▼M5

Artikel 4

▼M19

1. Med henblik på de nationale myndigheders eller deres repræsentants vurdering og kontrol af de organoleptiske kendetegn kan medlemsstaterne godkende paneler af smagere.

Godkendelsesbetingelserne fastlægges af medlemsstaterne, således at bl.a.

— betingelserne i bilag XII, punkt 4, opfyldes

— det sikres, at panelets leder optrænes af en virksomhed og på betingelser, som er anerkendt af medlemsstaten i den henseende

— godkendelsens gyldighed gøres afhængig af de resultater, der opnås ved en årlig kontrolordning, som medlemsstaten har oprettet.

Hver medlemsstat meddeler Kommissionen listen over godkendte paneler og de foranstaltninger, der er truffet i henhold til dette stykke.

▼M5

2. Hvis en medlemsstat har vanskeligheder med at oprette et panel på sit område, kan den gøre brug af et godkendt panel i en anden medlemsstat.

3. Hver medlemsstat opstiller en liste over de paneler af smagsdommere, der er oprettet af erhvervs- eller brancheorganisationer på de i stk. 1 fastsatte betingelser, og de kontrollerer, at disse betingelser overholdes.

▼M19 —————

▼B

Artikel 6

1. Olieindholdet i presserester og andre restprodukter fra udvinding af olivenolie (KN-kode 2306 90 11 og 2306 90 19 ) bestemmes efter metoden i bilag XV.

2. Det i stk. 1 omhandlede olieindhold udtrykkes i vægtprocent af tørstoffet.

▼M20

Artikel 7

EF-bestemmelserne om forekomst af forurenende stoffer finder anvendelse.

Hvad indholdet af halogenerede opløsningsmidler angår, gælder følgende grænseværdier for alle kategorier af olivenolie:

— Maksimalt indhold af hvert påvist halogeneret opløsningsmiddel: 0,1 mg/kg

— Maksimalt samlet indhold af påviste halogenerede opløsningsmidler: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artikel 7a

Fysiske eller juridiske personer eller sammenslutninger af sådanne personer, som ligger inde med olivenolie og olie af olivenpresserester, lige fra den udvindes på oliefabrikken, til den er tappet på flasker, uanset til hvilke erhvervsmæssige eller kommercielle formål, skal føre ind- og udgangsbøger for hver kategori af sådanne olier.

Medlemsstaterne sikrer, at forpligtelserne i stk. 1 opfyldes.

▼M25

Artikel 8

1. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen, hvilke foranstaltninger de træffer til anvendelse af denne forordning. De underretter Kommissionen om eventuelle senere ændringer heraf.

2. Medlemsstaterne sender hvert år senest den 31. maj Kommissionen en rapport om anvendelsen af denne forordning i det foregående kalenderår. Rapporten skal mindst indeholde resultaterne af de overensstemmelseskontroller, der er udført på olivenolie ifølge skemaerne i bilag XXI.

3. De meddelelser, der er nævnt i denne forordning, sendes i overensstemmelse med Kommissionens forordning (EF) nr. 792/2009 ( 1 )

▼B

Artikel 9

Forordning (EØF) nr. 1058/77 ophæves.

Artikel 10

1. Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.

Metoden i bilag XII anvendes dog fra den ►M1 1. november 1992 ◄ , undtagen i forbindelse med interventionsforanstaltninger.

▼M5

Metoden anvendes ikke for jomfruolie, der er aftappet før den 1. november 1992.

▼B

2. Denne forordning anvendes ikke for olivenolie og olie af olivenpresserester, der aftappes inden datoen for denne forordnings ikrafttræden, og som bringes i handelen inden den 31. oktober 1992.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.









BILAG

Resumé







Bilag I: Kendetegn for olivenolie Bilag Ia: Udtagning af prøver af partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester leveret i umiddelbare emballager Bilag Ib: Beslutningsskema til kontrol af, om en olivenolieprøve svarer til den anmeldte kategori Bilag II: Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, kold metode Bilag III: Bestemmelse af peroxidtallet Bilag IV: Bestemmelse af voksindhold ved gaskromatografering med kapillarkolonne Bilag V: Bestemmelse af sammensætning og indhold af steroler og triterpendialkoholer ved gaskromatografi på kapillarkolonne Bilag VII: ►M21 Bestemmelse af indholdet af 2-glycerylmonopalmitat i procent ◄ ▼M20 ————— ▼B Bilag IX: Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys ▼M28 Bilag X: Bestemmelse af fedtsyremethylestere ved gaskromatografi ▼B Bilag XI: Bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsningsmidler i olivenolie Bilag XII: Det internationale olivenråds metode til organoleptisk vurdering af jomfruolier ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Bilag XV: Olieindhold i presserester af oliven Bilag XVI: Bestemmelse af iodtal Bilag XVII: Metode til bestemmelse af stigmastadiener i vegetabilske olier Bilag XVIII: Bestemmelse af forskellen mellem det faktiske og det teoretiske indhold af ECN 42-triacylglyceroler Bilag XIX: ►M28 Bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer og triterpenalkoholer ved gaskromatografi på kapillarkolonne ◄ ▼M23 Bilag XX: Metode til bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere ved gaskromatografi på kapillarkolonne ▼M28 ————— ▼M25 Bilag XXI: Resultaterne af overensstemmelseskontroller, der er udført på olivenolie, jf. artikel 8, stk. 2

▼M27









BILAG I

KENDETEGN FOR OLIVENOLIE







Kategori Fedtsyreethylestere (FAEE) mg/kg (*) Syreindhold (%) (*) Peroxidtal mEq O2/kg (*) Voks mg/kg (**) 2-glycerylmonopalmitat (%) Stigmastadiener mg/kg (1) Forskel mellem ECN42 (HPLC) og ECN42 (teoretisk beregnet) K232 (*) K268 eller K270 (*) Delta-K (*) Organoleptisk vurdering Median for mangler (Md) (*) Organoleptisk vurdering Median for egenskaben frugtagtig (Mf) (*) 1. Ekstra jomfruolie FAEE ≤ 40 (2013-2014 produktionsår) (2) FAEE ≤ 35 (2014-2016 produktionsår) FAEE ≤ 30 (efter 2016 produktionsår) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 hvis palmitinsyre i alt > 14 % 2. Jomfruolie — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9, hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % 3. Bomolie — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9 hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1, hvis palmitinsyre i alt > 14 % 4. Raffineret olivenolie — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1, hvis palmitinsyre i alt > 14 % 5. Olivenolie bestående af raffinerede olivenolier og jomfruolier — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 hvis palmitinsyre i alt ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0, hvis palmitinsyre i alt > 14 % 6. Rå olie af olivenpresserester — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Raffineret olie af olivenpresserester — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olie af olivenpresserester — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42+C44+C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Summen af isomerer, der eventuelt kan adskilles på kapillarsøjle. (2) Denne grænse gælder for olivenolier, der produceres fra den 1. marts 2014. (3) Olier med et voksindhold på mellem 300 mg/kg og 350 mg/kg betragtes som bomolie, hvis det samlede indhold af alifatiske alkoholer er på 350 mg/kg eller derunder, eller hvis indholdet af erytrodiol og uvaol er på 3,5 % eller derunder. (4) Eller hvis medianen for mangler er lig med eller derunder, og medianen for lugt og smag er 0. (5) Olier med et voksindhold på mellem 300 mg/kg og 350 mg/kg betragtes som rå olie af olivenpresserester, hvis det samlede indhold af alifatiske alkoholer er på over 350 mg/kg, og hvis indholdet af erytrodiol og uvaol er over 3,5 %.







Kategori Fedtsyresammensætning (1) Summen af isomerer af transoliesyre (%) Summen af translinolsyre og isomerer af translinolensyre (%) Sterolsammensætning Steroler i alt (mg/kg) Erythrodiol og uvaol (%) (**) Myristin (%) Linolen (%) Arachin (%) Eicosan (%) Behen (%) Lignocerin (%) Kolesterol (%) Brassicasterol (%) Campesterol (2) (%) Stigmasterol (%) App beta-sitosterol (%) (3) (%) (**) Delta-7-stigmastenol (2) (%) 1. Ekstra jomfruolie ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Jomfruolie ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Bomolie ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Raffineret olivenolie ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olivenolie bestående af raffinerede olivenolier og jomfruolier ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Rå olie af olivenpresserester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Raffineret olie af olivenpresserester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olie af olivenpresserester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Indhold af andre fedtsyrer (%): palmitinsyre: 7,50-20,00, palmitolsyre: 0,30-3,50, heptadecansyre: ≤ 0,30, heptadecensyre: ≤ 0,30, stearinsyre: 0,50-5,00, oliesyre: 55,00-83,00, linolsyre: 3,50-21,00. (2) Se tillægget til dette bilag. (3) App β-sitosterol: Delta-5,23-stigmastadienol + chlerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol. (4) Olier med et voksindhold på mellem 300 mg/kg og 350 mg/kg betragtes som bomolie, hvis det samlede indhold af alifatiske alkoholer er på 350 mg/kg eller derunder, eller hvis indholdet af erytrodiol og uvaol er på 3,5 % eller derunder. (5) Olier med et voksindhold på mellem 300 mg/kg og 350 mg/kg betragtes som rå olie af olivenpresserester, hvis det samlede indhold af alifatiske alkoholer er på over 350 mg/kg, og hvis indholdet af erytrodiol og uvaol er på over 3,5 %.

Noter:

a) Analyseresultaterne skal anføres med lige så mange decimaler som dem, der er angivet for hvert kendetegn. Sidste ciffer skal forhøjes med en enhed, hvis det følgende ciffer er større end 4.

b) Hvis de fastsatte grænseværdier overskrides for blot ét kendetegn, klassificeres olien i en anden kategori eller erklæres for ikke at opfylde renhedskravene i henhold til denne forordning.

c) Hvis et kvalitetskendetegn er mærket med en asterisk (*), betyder det følgende: — for bomolie, at de pågældende grænseværdier ikke alle skal være opfyldt samtidig — for jomfruolie, at olien skal klassificeres i en anden kategori, hvis blot én af disse grænseværdier ikke er opfyldt, men at den fortsat skal klassificeres i en af kategorierne for jomfruolie.

d) Hvis et kvalitetskendetegn er mærket med to asterisker (**), betyder det for alle de pågældende olier af olivenpresserester, at alle grænseværdier ikke behøver være opfyldt samtidig.









Tillæg

BESLUTNINGSSKEMA

Campesterol-beslutningsskema for jomfruolie og ekstra jomfruolie:

De øvrige parametre skal overholde de grænseværdier, der er fastsat i denne forordning.

Delta-7-stigmastenol-beslutningsskema for:

— Ekstra jomfruolie og jomfruolie —

De øvrige parametre skal overholde de grænseværdier, der er fastsat i denne forordning.

— Olie af olivenpresserester (rå og raffineret) —

▼M26









BILAG Ia

UDTAGNING AF PRØVER AF PARTIER AF OLIVENOLIE ELLER OLIE AF OLIVENPRESSERESTER LEVERET I UMIDDELBARE EMBALLAGER

Denne prøveudtagningsmetode anvendes for partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester aftappet i umiddelbare emballager. Der anvendes forskellige prøveudtagningsmetoder afhængigt af, om den umiddelbare emballage er større eller mindre end 5 liter.

Ved "parti" forstås de salgsenheder, der produceres, fremstilles og aftappes under sådanne forhold, at olien i alle disse salgsenheder anses for homogen med hensyn til alle analysekendetegn. Et parti skal identificeres i overensstemmelse med Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2011/91/EU ( 2 ).

Ved "delprøve" forstås den mængde olie, der er indeholdt i en umiddelbar emballage, og som udtages et vilkårligt sted i partiet.

1. BASISPRØVENS INDHOLD

1.1. Umiddelbar emballage på højst 5 liter

Ved "basisprøve" for umiddelbare emballager på højst 5 liter forstås det antal delprøver, der udtages fra et parti og i overensstemmelse med tabel 1.







Tabel 1 Minimumsstørrelse for basisprøve omfatter følgende Hvis de umiddelbare emballager indeholder tages basisprøven af olien i a) 1 liter eller derover a) 1 umiddelbar emballage b) under 1 liter b) det mindste antal emballager, hvis samlede indhold overstiger 1,0 liter

Det antal emballager, der er anført i tabel 1, som udgør en basisprøve, kan efter behov forøges af medlemsstaterne (hvis organoleptisk vurdering f.eks. foretages af et andet laboratorium end det, der udførte de kemiske analyser, modanalysen osv.).

1.2. Umiddelbar emballage på mere end 5 liter

Ved "basisprøve" for umiddelbare emballager på mere end 5 liter forstås en repræsentativ del af de samlede delprøver, der fås ved en reduktionsproces og i overensstemmelse med tabel 2. Basisprøven sammensættes af forskellige eksempler.

Ved "eksempel" på en basisprøve forstås hver af de emballager, der udgør basisprøven.







Tabel 2 Mindste antal delprøver, der skal udtages Antal emballager i partiet Mindste antal delprøver, der skal udtages Op til 10 1 Fra … 11 til 150 2 Fra … 151 til 500 3 Fra … 501 til 1 500 4 Fra … 1 501 til 2 500 5 > 2 500 pr. 1 000 emballager 1 ekstra delprøve

For at begrænse prøvetagningen i forbindelse med umiddelbare emballager homogeniseres indholdet af delprøver med henblik på fremstilling af basisprøven. Portionerne af de forskellige delprøver hældes i en fælles beholder og homogeniseres ved omrøring, således at basisprøven er bedst muligt beskyttet mod luft.

Indholdet af basisprøven hældes i en serie af emballager, der kan indeholde mindst 1,0 liter, og som hver udgør et eksempel på basisprøven.

Antallet af basisprøver kan efter behov forøges af medlemsstaterne (hvis organoleptisk vurdering f.eks. foretages af et andet laboratorium end det, der udførte de kemiske analyser, modanalysen osv.).

Hver emballage skal fyldes på en sådan måde, at luftlaget øverst er så lille som muligt, og skal derefter lukkes og forsegles effektivt med henblik på at beskytte produktet mod manipulation.

Disse eksempler forsynes med etiket for at sikre korrekt identifikation.

2. ANALYSER OG RESULTATER

2.1. Hver basisprøve opdeles i laboratorieprøver, jf. punkt 2.5 i standard EN ISO 5555, og analyseres i overensstemmelse med den rækkefølge, der fremgår af beslutningsskemaet i bilag Ib, eller i en anden vilkårlig rækkefølge.

2.2. Hvis alle analyseresultaterne svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for at opfylde kravene. Hvis et analyseresultat ikke svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for ikke at opfylde kravene.

3. KONTROL AF PARTIETS KATEGORI

3.1. Med henblik på at kontrollere partiets kategori kan den kompetente myndighed forøge det antal basisprøver, der udtages på forskellige steder i partiet, i overensstemmelse med følgende tabel:



Tabel 3 Antal basisprøver fastsat på grundlag af partiets størrelse Partiets størrelse (liter) Antal basisprøver Under 7 500 2 Fra 7 500 til 25 000 3 Fra 25 000 til 75 000 4 Fra 75 000 til 125 000 5 125 000 eller derover 6 + 1 for hver yderligere 50 000 liter Hver delprøve, der udgør en basisprøve, skal udtages fra et kontinuerligt sted i partiet. Placeringen af hver basisprøve skal registreres, og den skal identificeres utvetydigt. Hver basisprøve fremstilles ved hjælp af procedurerne i punkt 1.1 og 1.2. Hver basisprøve analyseres derefter som beskrevet i artikel 2, stk. 1.

3.2. Hvis et af resultaterne af de analyser, der er beskrevet i artikel 2, stk. 1, af mindst én basisprøve ikke svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for ikke at opfylde kravene.









BILAG Ib

BESLUTNINGSSKEMA TIL KONTROL AF, OM EN OLIVENOLIEPRØVE SVARER TIL DEN ANMELDTE KATEGORI

Tabel 1

Tabel 2

Tabel 3









Tillæg 1







Overensstemmelse mellem bilagene til denne forordning og de i beslutningsskemaet nævnte analyser — Syreindhold Bilag II Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, kold metode — Peroxidtal Bilag III Bestemmelse af peroxidtal — UV-spektrometri Bilag IX Spektrofotometrisk analyse — Organoleptisk vurdering Bilag XII Organoleptisk vurdering af jomfruolie — Ethylestere Bilag XX Metode til bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere ved gaskromatografi på kapillarkolonne — Stigmasta-3,5-dien Bilag XVII Metode til bestemmelse af stigmastadiener i vegetabilske olier ▼M28 — Transisomerer i fedtsyrer Bilag X Bestemmelse af fedtsyremethylestere ved gaskromatografi — Fedtsyreindhold Bilag X Bestemmelse af fedtsyremethylestere ved gaskromatografi ▼M26 — ΔECN42 Bilag XVIII Bestemmelse af sammensætning af triglycerider i ECN42 (forskel mellem HPLC-data og teoretisk indhold) — Sammen-sætning af steroler og steroler i alt — Erytrodiol og uvaol Bilag V Bestemmelse af sammensætning og indhold af steroler og triterpendialkoholer ved gaskromatografi på kapillarkolonne — Voks Bilag IV Bestemmelse af voksindhold ved gaskromatografering med kapillarkolonne ▼M28 — Alifatiske alkoholer og triterpenalkoholer Bilag XIX Bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer og triterpenalkoholer ved gaskromatografi på kapillarkolonne ▼M26 — Mættede fedtsyrer i 2-stillingen Bilag VII Bestemmelse af indholdet af 2-glycerylmonopalmitat i procent

▼M29









BILAG II

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FRIE FEDTSYRER, KOLD METODE

1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE

Metoden er en procedure til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer i olivenolier og olier af olivenpresserester. Indholdet af frie fedtsyrer udtrykkes ved syreindhold beregnet som procentdelen af oliesyre.

2. PRINCIP

En analyseprøve opløses i en blanding af opløsningsmidler, hvorefter de tilstedeværende frie fedtsyrer bestemmes ved hjælp af en opløsning af kaliumhydroxid eller natriumhydroxid.

3. REAGENSER

Samtlige reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet, og der anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.

3.1. Dietyhlether/ethanol, 95 % (v/v), blandet i forholdet 1:1 efter rumfang. Nøjagtigt på anvendelsestidspunktet neutraliseres med en opløsning af kaliumhydroxid (3.2) ved tilstedeværelse af 0,3 ml phenolphtaleinopløsning (3.3) pr. 100 ml blanding. Note 1: Dietylether er meget let antændelig og kan danne eksplosive peroxider. Under anvendelsen skal der derfor træffes særlige forholdsregler. Note 2: Hvis det ikke er muligt at anvende diethylether, kan en blanding af opløsningsmidler bestående af ethanol og toluen anvendes. Om nødvendigt kan ethanolen erstattes af 2-propanol.

3.2. Indstillet opløsning af kaliumhydroxid eller natriumhydroxid i ethanol eller vand, c(KOH) ca. 0,1 mol/l eller om nødvendigt c(KOH) [eller c(NaOH)] ca. 0,5 mol/l. Disse opløsninger kan købes i handelen. Den nøjagtige koncentration af kaliumhydroxidopløsningen (eller natriumhydroxidopløsningen) i ethanol eller vand skal være kendt og kontrolleres før brug. Der anvendes en opløsning, der er fremstillet mindst fem dage før brugen og dekanteret over i en flaske af brunt glas, lukket med en gummiprop. Opløsningen skal være farveløs eller strågul. Hvis der observeres faseadskillelse ved anvendelse af kaliumhydroxidopløsningen (eller natriumhydroxidopløsningen) i vand, erstattes den vandige opløsning af en ethanolopløsning. Note 3: En stabil farveløs opløsning af kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) kan fremstilles på følgende måde: 1 000 ml ethanol med 8 g kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) og 0,5 g aluminiumspåner bringes i kog og holdes kogende i 1 time med tilbageløb. Derefter destilleres omgående, og den krævede mængde kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) opløses i destillatet. Man lader opløsningen henstå i flere dage og dekanterer derefter den øverste klare væske fra bundfaldet af kaliumcarbonat (natriumcarbonat). Opløsningen kan også fremstilles uden destillation på følgende måde: til 1 000 ml ethanol (eller vand) tilsættes 4 ml aluminiumbutylat, hvorefter man lader blandingen henstå i nogle dage. Derefter dekanteres den ovenstående væske fra, og heri opløses den krævede mængde kaliumhydroxid (natriumcarbonat) opløses heri. Denne opløsning er klar til brug.

3.3. Phenolphtaleinopløsning, 10 g/l i 95-96 % (v/v) ethanol, eller alkaliblåt 6B eller thymolphthaleinopløsning, 20 g/l i 95-96 % (v/v) ethanol. Ved stærkt farvede olier skal alkaliblåt eller thymolphthalein anvendes.

4. APPARATUR

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:

4.1 Analysevægt.

4.2. 250 ml Erlenmeyer-kolbe.

4.3. 10 ml burette, klasse A, med 0,05 ml inddelinger, eller tilsvarende automatburette.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Forberedelse af analyseprøve

Hvis analyseprøven er uklar, skal den filtreres.

5.2. Analyseprøve

Ud fra det antagne syreindhold udtages en prøve efter angivelserne i følgende tabel:







Forventet syreindhold (oliesyreindhold g/100g) Prøvens masse (g) Prøven afvejes med en nøjagtighed i g på 0-2 10 0,02 > 2-7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Prøven afvejes i Erlenmeyer-kolben (4.2).

5.3. Bestemmelse

Prøven (5.2) opløses i 50-100 ml af den på forhånd neutraliserede blanding af diethylether/ethanol (3.1).

Under omrøring titreres med kaliumhydroxidopløsning (eller natriumhydroxidopløsning), 0,1 mol/l (3.2) (se note 4), indtil indikatoren slår om (farveindikatorens farve skal holde sig i mindst 10 sek.).

Note 4: Hvis den nødvendige mængde 0,1 mol/l kaliumhydroxidopløsning (eller natriumhydroxidopløsning) overstiger 10 ml, anvendes i stedet en opløsning på 0,5 mol/l, eller prøvens masse tilpasses til det forventede indhold af frie syrer og den foreslåede tabel.

Note 5: Bliver opløsningen uklar under titreringen, tilsættes så meget opløsningsmiddelblanding (3.1), at opløsningen bliver klar.

Der udføres endnu en bestemmelse, hvis det første resultat ligger over den fastlagte grænseværdi for den pågældende oliekategori.

6. ANGIVELSE AF RESULTATER

Syreindholdet i % oliesyre, udtrykt som vægtprocent =

hvor:

V = rumfanget i ml af den anvendte titrerede kaliumhydroxidopløsning (eller natriumhydroxidopløsning)

c = den nøjagtige koncentration i mol/l af den anvendte titrerede kaliumhydroxidopløsning (eller natriumhydroxidopløsning)

M = 282 g/mol, molvægten i g/mol af oliesyren

m = massen af analyseprøven i gram.

Oliesyreindhold angives som følger:

a) to decimaler for værdier fra 0 og til og med 1

b) én decimal for værdier fra 1 og til og med 100.

▼B









BILAG III

BESTEMMELSE AF PEROXIDTALLET

1. OMRÅDE

Denne standard beskriver en metode til bestemmelse af peroxidtallet for olier og fedtstoffer.

2. ANVENDELSESOMRÅDE

Denne standard finder anvendelse for animalske og vegetabilske olier og fedtstoffer.

3. DEFINITION

Peroxidtallet angiver den mængde stoffer i prøven, udtrykt som milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, som oxiderer kaliumiodid under de beskrevne forsøgsbetingelser.

4. PRINCIP

Analyseprøven, opløst i en blanding af eddikesyre og chloroform, behandles med en opløsning af kaliumiodid. Det frigjorte iod titreres med en indstillet natriumthiosulfatopløsning.

5. APPARATUR

Alt udstyr skal være fri for reducerende og oxiderende stoffer.

Note:

Sliboverflader må ikke indfedtes.

5.1. 3 ml glasske.

5.2. Kolber med slib og prop, på ca. 250 ml, som på forhånd tørres og fyldes med ren, tør inert gas (nitrogen eller — helst — carbondioxid).

5.3. 25 eller 50 ml burette med 0,1 ml inddeling.

6. REAGENSER

6.1. Analyseren chloroform, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør inert gas.

6.2. Analyseren iseddike, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør inert gas.

6.3. Mættet vandig opløsning af kaliumiodid, fremstillet umiddelbart før brug og fri for iod og iodater.

6.4. Natriumthiosulfat, 0,01 eller 0,002 N nøjagtigt indstillet vandig opløsning, indstillet umiddelbart før brug.

6.5. Stivelsesopløsning, 10 g/l vandig opslæmning, fremstillet umiddelbart før brug ud fra naturlig opløselig stivelse.

7. PRØVE

Prøven udtages og opbevares beskyttet mod lys, holdes nedkølet og opbevares i fuldstændigt fyldte glasbeholdere, der er hermetisk tillukket med slibpropper af glas eller korkpropper.

8. FREMGANGSMÅDE

Analysen udføres i diffust dagslys eller i kunstigt lys. I en glasske (5.1) eller i mangel heraf en kolbe (5.2) afvejes med en nøjagtighed på 0,001 g en prøvemængde i overensstemmelse med følgende tabel, svarende til det forventede peroxidtal:







Forventet perioxidtal (meq O2/kg) Analyseprøvens vægt (i g) 0 — 12 5,0 — 2,0 12 — 20 2,0 — 1,2 20 — 30 1,2 — 0,8 30 — 50 0,8 — 0,5 50 — 90 0,5 — 0,3

Proppen tages af en kolbe (5.2), og analyseprøven i glasskeen overføres til kolben. Der tilsættes 10 ml chloroform (6.1), og analyseprøven opløses hurtigt ved omrystning. Derefter tilsættes 15 ml eddikesyre (6.2), efterfulgt af 1 ml kaliumiodidopløsning (6.3). Så sættes proppen hurtigt i, og der omrystes i 1 min., hvorefter man lader kolben henstå i nøjagtigt 5 min. i mørke ved en temperatur på 15 — 25° C.

Der tilsættes ca. 75 ml destilleret vand, og det frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatopløsning (6.4) (0,002 N opløsning for forventede værdier under 12, og 0,01 N opløsning for forventede værdier over 12) under kraftig omrystning og med anvendelse af stivelsesopløsning (6.4) som indikator.

Der udføres to bestemmelser på samme analyseprøve.

Samtidig udføres en blindprøve. Hvis resultatet af blindprøven overstiger 0,05 ml 0,01 N natriumthiosulfatopløsning (6.4), udskiftes de urene reagenser.

9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Perioxidtallet (P.V.), udtrykt i milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, er givet ved formlen:

hvor:

V = antal ml forbrugt indstillet natriumthiosulfatopløsning (6.4) ved analysen, korrigeret for resultatet af blindprøven

T = den nøjagtige normalitet af den anvendte natriumthiosulfatopløsning (6.4),

m = analyseprøvens vægt i g.

Som resultat angives det aritmetiske gennemsnit af de to udførte bestemmelser.

▼M21









BILAG IV

BESTEMMELSE AF VOKSINDHOLD VED GASKROMATOGRAFERING MED KAPILLARKOLONNE

1. GENSTAND

Metoden er en procedure til bestemmelse af voksindholdet i olivenolie. Vokserne adskilles efter antallet af kulstofatomer. Metoden er navnlig velegnet, når der skal skelnes mellem olivenolie, der er udvundet ved presning, og olivenolie, der er udvundet ved ekstraktion (af presserester).

2. PRINCIP

Der tilsættes en egnet intern standard til olien, hvorefter adskillelsen finder sted ved kromatografering på en kolonne med hydratiseret silicagel. Den fraktion, der først elueres under prøvebetingelserne (og som har lavere polaritet end triglyceriderne), opsamles og analyseres direkte ved gaskromatografi med kapillarkolonne.

3. APPARATUR

3.1. 25 ml erlenmeyerkolbe

3.2. kromatografikolonne af glas, indvendig diameter 15,0 mm, længde 30-40 cm, med hane

3.3. gaskromatograf til brug med kapillarkolonne og med et system til direkte indsprøjtning i kolonnen, bestående af følgende: 3.3.1. termostatstyret kolonneovn med temperaturprogrammering 3.3.2. kold injektor til direkte indsprøjtning i kolonnen 3.3.3. en flammeioniseringsdetektor og en konverter-forstærker 3.3.4. skriver/integrator, der passer til konverter-forstærkeren (3.3.3), med responstid højst 1 sekund og variabel papirhastighed. (Der kan også benyttes computersystemer, hvor gaskromatografidataene opsamles på en PC.) 3.3.5. kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, længde 8-12 m og indvendig diameter 0,25-0,32 mm, coatet indvendigt med stationær fase i en ensartet lagtykkelse på 0,10-0,30 μm (egnet stationær fase af den kommercielle type SE52 eller SE54)

3.4. mikroinjektionssprøjte på 10 μl med hærdet kanyle til direkte indsprøjtning i kolonnen

3.5. elektrisk vibrator

3.6. rotationsfordamper

3.7. muffelovn

3.8. analysevægt med en nøjagtighed på ± 0,1 mg

3.9. sædvanligt glasudstyr.

4. REAGENSER

4.1. silicagel med kornstørrelse 60-200 μm Silicagelen anbringes i ovnen ved 500 °C i mindst fire timer. Efter afkøling tilsættes der 2 % vand beregnet på silicagelmængden. Pulveret rystes omhyggeligt, til det er ensartet. Opbevares i mørke i mindst tolv timer inden brug.

4.2. n-hexan til kromatografi

4.3. ethylether til kromatografering

4.4. n-heptan til kromatografi

4.5. kalibreringsopløsning af 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern standard) (Der kan også bruges palmitylpalmitat eller myristylstearat.) 4.5.1. Sudan 1 (1-phenylazo-2-naphthol)

4.6. bæregas: hydrogen eller helium, ren, til gaskromatografi

4.7. hjælpegasser: — hydrogen, ren, til gaskromatografi — luft, ren, til gaskromatografi.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Fremstilling af kromatografikolonnen

15 g silicagel (4.1) opslæmmes i n-hexan (4.2) og hældes i kolonnen (3.2). Når kolonnematerialet har sat sig ved henstand, pakkes det yderligere ved hjælp af en el-vibrator (3.5) for at opnå større homogenitet. Der elueres med 30 ml n-hexan for at fjerne eventuelle urenheder. På vægten (3.8) afvejes der nøjagtig 500 mg af prøven i en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1), og der tilsættes en mængde intern standard (4.5) svarende til det formodede voksindhold. F.eks. tilsættes der 0,1 mg laurylarachidat til presset olivenolie og 0,25-0,5 mg til olie af presserester. Den tilberedte prøve overføres til kromatografikolonnen ved hjælp af to portioner n-hexan (4.2) a 2 ml.

Der aftappes opløsningsmiddel, indtil væskeoverfladen står 1 mm over kolonnematerialet, og ved eluering med yderligere 70 ml n-hexan fjernes det naturlige indhold af n-alkaner. Kromatograferingen startes dernæst ved, at 180 ml af n-hexan/ethylether-blandingen i forholdet 99:1 opsamles med en hastighed på ca. 15 dråber pr. 10 sekunder. Prøveelueringen foretages ved en rumtemperatur på 22 ± 4 °C.

Bemærkninger:

— n-hexan/ethylether-blandingen (99:1) skal friskfremstilles hver dag.

— Korrekt eluering af vokserne kan kontrolleres visuelt ved, at der til prøveopløsningen tilsættes 100 μl 1 % Sudan 1 i elueringsvæsken. Farvestoffet har en retentionstid mellem vokser og triglycerider, så når farven har nået bunden af kolonnen, bør elueringen standses, eftersom al voks da er elueret.

Den derved fremkomne fraktion inddampes i en rotationsfordamper (3.6), indtil opløsningsmidlet næsten helt er forsvundet. De sidste 2 ml opløsningsmiddel fjernes ved hjælp af en svag nitrogenstrøm, og derefter tilsættes der 2-4 ml n-heptan.

5.2. Gaskromatografisk analyse

5.2.1. Indledende procedure

Kolonnen påmonteres gaskromatografen (3.3), idet den ene ende forbindes med injektionssystemet og den anden ende med detektoren. Gaskromatografen kontrolleres (gasledningerne, detektors og skrivers ydeevne, m.v.).

Hvis kolonnen ikke har været benyttet før, kan det anbefales at konditionere den. En svag gasstrøm ledes gennem kolonnen, hvorefter gaskromatografen sættes i gang. Der opvarmes gradvis til 350 °C over en periode på ca. fire timer. Denne temperatur holdes i mindst to timer, hvorefter apparaturet indstilles til arbejdsbetingelserne (gasstrømmen indstilles, der tændes for flammen, den elektroniske skriver (3.3.4) tilsluttes, kolonneovnens og detektorens temperatur indstilles, osv.). Signalet registreres med en følsomhed på mindst det dobbelte af den, der kræves for at foretage analysen. Basislinjen bør være lineær uden nogen form for toppe og uden nogen forstyrrelser.

Negativ drift tyder på utætheder i kolonneforbindelserne, mens positiv drift er tegn på utilstrækkelig konditionering af kolonnen.

5.2.2. Valg af arbejdsbetingelser

Arbejdsbetingelserne er normalt som følger:

— kolonnetemperatur: —



20 °C/minut 5 °C/minut 20 °C/minut fra 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektortemperatur: 350 °C

— indsprøjtet mængde: 1 μl af opløsningen i (2-4 ml) n-heptan

— bæregas: helium eller hydrogen med den for den valgte gas optimale lineære hastighed (se tillægget)

— instrumentfølsomhed: skal opfylde nedenstående krav:

Disse betingelser kan ændres alt efter kolonnens og gaskromatografens karakteristika, så man opnår adskillelse af alle vokser, en tilfredsstillende opløsning af toppene (se figuren) og en retentionstid for den interne C32-standard på 18 ± 3 minutter. Voksernes mest repræsentative top skal måle mindst 60 % af fuldt udslag.

Parametrene for toppenes integration fastlægges på en sådan måde, at de relevante toppes arealer vurderes korrekt.

Bemærkning:På grund af den høje sluttemperatur, tillades der en positiv drift på op til 10 % af fuldt udslag.

5.3. Udførelse af analysen

Der suges 1 μl af opløsningen op i 10 μl-mikrosprøjten, og stemplet trækkes tilbage, så kanylen er tom. Kanylen stikkes ind i injektionssystemet, og der indsprøjtes hurtigt efter 1-2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder trækkes kanylen forsigtigt ud.

Registreringen fortsættes, indtil alle vokserne er helt elueret.

Basislinjen skal hele tiden opfylde de fastsatte betingelser.

5.4. Identifikation af toppene

Toppene identificeres ud fra retentionstiderne, idet de sammenlignes med blandinger af vokser med kendte retentionstider analyseret under samme betingelser.

Figuren viser et kromatogram af vokser fra jomfruolie.

5.5. Kvantitativ vurdering

Arealerne af toppene for den interne standard og de alifatiske C40-C46-estere bestemmes ved hjælp af integratoren.

Indholdet af hver af voksesterne bestemmes i mg pr. kg fedtstof efter formlen:

hvor:

Ax = arealet af toppen for den enkelte ester i kvadratmillimeter

As = arealet af toppen for den interne standard i kvadratmillimeter

ms = massen af tilsat intern standard i milligram

m = massen af den prøve, der er udtaget til analyse, i gram.

6. ANGIVELSE AF RESULTATER

Summen af de forskellige C40-C46-vokser angives i mg pr. kg fedtstof (ppm).

Bemærkning:De bestanddele, der skal bestemmes kvantitativt, er dem med toppe, der kan identificeres som C40-C46-estere med et lige antal kulstofatomer, jf. kromatogrammet af vokser fra jomfruolie i nedenstående figur. Hvis C46-esteren giver en dobbelt top, tilrådes den identificeret ved analyse af voksfraktionen fra olie af olivenpresserester, hvor C46-toppen let kan identificeres på grund af sin størrelse.

Resultaterne angives med en decimal.

Figur

Kromatogram af vokser fra jomfruolie ( 3 )

Signaturer:

I.S. = laurylarachidat

1. = diterpenestere

2 + 2′ = C40-estere

3 + 3′ = C42-estere

4 + 4′ = C44-estere

5 = C46-estere

6 = sterolestere og triterpenalkoholer.









APPENDIKS

Bestemmelse af gassens lineære hastighed

Der indsprøjtes 1-3 μl methan (eller propan) i gaskromatografen, efter at den er indstillet til normale arbejdsbetingelser. Den tid, som det tager gassen at strømme gennem kolonnen, fra det øjeblik, den indsprøjtes, til toppen viser sig, måles (tM).

Den lineære hastighed i cm/s beregnes ved formlen L/tM, hvor L er kolonnens længde i cm og tM tiden målt i sekunder.

▼M26









BILAG V

BESTEMMELSE AF SAMMENSÆTNING OG INDHOLD AF STEROLER OG TRITERPENDIALKOHOLER VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARKOLONNE

1. OMRÅDE

Denne metode beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af indholdet af de enkelte steroler og det samlede indhold af steroler og triterpendialkoholer i olivenolie og olie af olivenpresserester.

2. PRINCIP

Olie, med α-cholestanol tilsat som en intern standard, forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de bestanddele, der ikke kan forsæbes, ekstraheres derefter med ethylether.

Sterol- og triterpendialkoholfraktionen separeres fra ekstrakten af ikkeforsæbelige stoffer ved tyndtlagskromatografi på en basisk kiselgelplade. De fraktioner, der er indvundet fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og analyseres derefter ved gaskromatografi på kapillarkolonne.

3. APPARATUR

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder især følgende:

3.1. 250 ml-kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib.

3.2. 500 ml-skilletragt.

3.3. 250 ml-kolber.

3.4. Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med glasplader, der måler 20 × 20 cm.

3.5. Ultraviolet lampe med en bølgelængde på 254 eller 366 nm.

3.6. 100 μl- og 500 μl-mikrosprøjter.

3.7. Cylindrisk filtertragt med G3-glasfritte (porøsitet 15-40 μm), med en diameter på ca. 2 cm og en højde på ca. 5 cm, egnet til vakuumfiltrering og med et udvendigt konisk glasslib.

3.8. Konisk vakuumkolbe (50 ml) med et indvendigt glasslib, som filtertragten (punkt 3.7) kan monteres på.

3.9. 10 ml-reagensglas med konisk bund og tætsluttende prop.

3.10. Gaskromatograf, som kan bruges med kapillarkolonne (med splitningssystem), og som består af: 3.10.1. et termostatkammer til kolonner, som kan opretholde den ønskede temperatur med en nøjagtighed på ± 1 °C 3.10.2. en injektionsenhed med temperaturindstilling, et fordampningselement af silanglas og splitningssystem 3.10.3. en flammeioniseringsdetektor (FID) 3.10.4. et dataopsamlingssystem, som kan bruges med FID-detektoren (punkt 3.10.3.), og som kan integreres manuelt.

3.11. En kapillarkolonne af kvartsglas med en længde på 20 til 30 m, en indre diameter på 0,25 til 0,32 mm, helt overtrukket med en blanding af 5 % diphenyl og 95 % dimethylpolysiloxan (SE 52- eller SE 54-væske eller tilsvarende) i en ensartet tykkelse på mellem 0,10 og 0,30 μm.

3.12. 10 μl-mikrosprøjte til gaskromatografi med cementeret nål, der kan bruges til splitinjektion.

3.13. Calciumchlorid-ekssikkator.

4. REAGENSER

4.1. Kaliumhydroxid, minimum titer 85 %.

4.2. Opløsning af kaliumhydroxid i ethanol, ca. 2 N. 130 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling, og der fyldes op med ethanol til 1 liter (punkt 4.10). Opløsningen opbevares i veltilproppede, mørke glasflasker i højst to dage.

4.3. Ethylether (analysekvalitet).

4.4. Opløsning af kaliumhydroxid i ethanol, ca. 0,2 N. 13 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter (punkt 4.10).

4.5. Vandfrit natriumsulfat (analysekvalitet).

4.6. Glasplader (20 x 20 cm) belagt med kiselgel uden fluorescensindikator, tykkelse 0,25 mm (kan fås brugsfærdige i handelen).

4.7. Toluen (kromatografikvalitet).

4.8. Acetone (kromatografikvalitet).

4.9. n-Hexan (kromatografikvalitet).

4.10. Ethylether (kromatografikvalitet).

4.11. Ethanol (analysekvalitet).

4.12. Ethylacetat (analysekvalitet).

4.13. Referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phytosteroler og 5 % erytrodiolopløsning i ethylacetat (punkt 4.11).

4.14. 2,7-dichlorfluorescein, 0,2 %-opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk ved tilsætning af nogle få dråber alkoholisk 2 N-kaliumhydroxidopløsning (punkt 4.2).

4.15. Vandfri pyridin (kromatografikvalitet) (se note 5).

4.16. Hexamethyl-disilazan (analysekvalitet).

4.17. Trimethylchlorsilan (analysekvalitet).

4.18. Prøveopløsninger af sterol-trimethylsilylethere. Friskfremstilles ud fra steroler og erytrodiol udvundet af sterol- og erytrodiolholdige olier.

4.19. αα-cholestanol, renhed over 99 % (renhed skal kontrolleres ved hjælp af GC-analyse).

4.20. α-cholestanol, intern standardopløsning, 0,2 %-opløsning (m/V) i ethylacetat (punkt 4.11).

4.21. Phenolphthaleinopløsning, 10 g/l i ethanol (punkt 4.10).

4.22. Bæregas: hydrogen eller helium, gaskromatografikvalitet.

4.23. Hjælpegasser: hydrogen, helium, nitrogen og luft, gaskromatografikvalitet.

4.24. n-Hexan (punkt 4.9)/ethylether (punkt 4.10) i forholdet 65:35 (V/V).

4.25. Silyleringsreagens bestående af en blanding i forholdet 9:3:1 (V/V/V) af pyridin/hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Fremstilling af ikkeforsæbeligt stof: 5.1.1. Et rumfang α-cholestanol i intern standardopløsning (punkt 4.20), der indeholder en mængde cholestanol svarende til ca. 10 % af prøvens sterolindhold, overføres til 250 ml-kolben (punkt 3.1) ved hjælp af en 500 μl-mikrosprøjte (punkt 3.6). Hvis der er tale om en olivenolieprøve på 5 g, tilsættes der f.eks. 500 μl α-cholestanolopløsning (punkt 4.20), og hvis der er tale om olie fra olivenpresserester, tilsættes der 1 500 μl. Prøven inddampes til tørhed i en svag nitrogenstrøm i varmt vandbad. Efter nedkøling af kolben afvejes 5±0,01 g af den tørrede filtrerede prøve til den samme kolbe. Note 1: Animalske eller vegetabilske olier og fedtstoffer, der indeholder betydelige mængder cholesterol, kan vise en top, der har næsten samme retentionstid som cholestanol. Hvis det forekommer, skal sterolfraktionen analyseres to gange med og uden intern standard. 5.1.2. Tilsæt 50 ml 2 N-opløsning af kaliumhydroxid i ethanol (punkt 4.2) og pimpsten, påsæt refluxsvaleren, og opvarm til svag kogning, indtil forsæbningen sker (opløsningen bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter. Derefter tilsættes 50 ml destilleret vand fra den øverste del af svaleren, svaleren tages af, og kolben afkøles til ca. 30 °C. 5.1.3. Overfør kolbens indhold kvantitativt til en 500 ml-skilletragt (punkt 3.2), idet der skylles flere gange med destilleret vand (50 ml). Tilsæt ca. 80 ml ethylether (punkt 4.10), og ryst kraftigt i ca. 60 sekunder, idet presset regelmæssigt frigives ved at vende skilletragten på hovedet og åbne stophanen. Lad skilletragten henstå, indtil fuldstændig separation af de to faser er opnået (note 2). Aftap derefter så meget af sæbeopløsningen som muligt i en anden skilletragt. Foretag endnu to ekstraktioner på den vandige/alkoholholdige fase på samme måde, idet der bruges 60 til 70 ml ethylether (punkt 4.10). Note 2: Eventuel emulsion kan ødelægges ved tilsætning af små mængder ethanol (punkt 4.11). 5.1.4. De tre etherekstrakter samles i en enkelt skilletragt, der indeholder 50 ml vand. Vask med vand (50 ml), indtil vaskevandet ikke længere bliver lyserødt, når der tilsættes en dråbe af phenolphthaleinopløsningen (punkt 4.21). Når vaskevandet er hældt af, filtreres på vandfrit natriumsulfat (punkt 4.5) ned i en på forhånd vejet 250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder ethylether (punkt 4.10). 5.1.5. Opløsningen inddampes ved destillation i en rotationsfordamper ved 30 °C under vakuum. Tilsæt 5 ml acetone, og fjern det flygtige opløsningsmiddel fuldstændigt i en svag luftstrøm. Tør reststoffet i ovnen ved 103 ± 2 °C i 15 minutter. Afkøl i en ekssikkator, og afvej til nærmeste 0,1 mg.

5.2. Separation af sterol- og triterpendialkoholfraktionen (erytrodiol + uvaol) 5.2.1. Fremstilling af basiske plader til tyndtlagskromatografi. Kiselgelpladerne (punkt 4.6) nedsænkes ca. 4 cm i 0,2 N-opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol (punkt 4.5) i 10 sekunder. Derefter får de lov at tørre i et stinkskab i to timer og sættes til sidst i en ovn ved 100 °C i en time. Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en ekssikkator med calciumchlorid (punkt 3.13), indtil de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal anvendes inden 15 dage). Note 3: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere sterolfraktionen, er det ikke nødvendigt at behandle den ikkeforsæbelige fraktion med aluminiumoxid. På denne måde holdes alle sure forbindelser (fedtsyrer og andre) tilbage på basislinjen, og sterolbåndet er klart adskilt fra de alifatiske og triterpene alkoholers bånd. 5.2.2. Hæld en hexan/ethyletherblanding (punkt 4.24) (note 4) i kromatografikammeret til en dybde på ca. 1 cm. Sæt låg på kammeret, og lad det henstå således et køligt sted i mindst en halv time, så der opnås ligevægt mellem væske og damp. Strimler af filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringes på kammerets indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet og regelmæssig eluering af komponenterne. Note 4: Kromatografiblandingen udskiftes for hver test for at opnå fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser. Alternativt kan en opløsning på 50:50 (V/V) n-hexan/ethylether anvendes. 5.2.3. Fremstil en ca. 5 %-opløsning af de ikkeforsæbelige stoffer (punkt 5.1.5) i ethylacetat (punkt 4.12). Med 100 μl-mikrosprøjten afsættes 0,3 ml af opløsningen på en smal og ensartet streg nederst (ca. 2 cm) på kromatografipladen (punkt 5.2.1). På linje med stregen afsættes 2 til 3 μl af referenceopløsningen (punkt 4.13), så sterol- og triterpendialkoholbåndet kan identificeres efter eluering. 5.2.4. Anbring pladen i kromatografikammeret, som er forberedt som angivet i 5.2.2. Omgivelsestemperaturen bør holdes mellem 15 og 20 °C (note 5). Kammeret lukkes straks med låget, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra pladens øverste kant. Tag derefter pladen ud af kromatografikammeret, og lad opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen stå en kort tid i et stinkskab. Note 5: Højere temperatur kan forringe separationen. 5.2.5. Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluorosceinopløsningen (punkt 4.14), hvorefter den henstår til tørring. Når pladen observeres under ultraviolet lys, kan sterol- og triterpendialkoholbåndet identificeres ved, at det er på linje med de pletter, der er afsat ved hjælp af referenceopløsningen (punkt 4.13). Båndets grænser langs fluorescenckanterne markeres med en sort blyant (se tyndtlagskromatografipladen i figur 3). 5.2.6. Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det fjernede materiale pulveriseres fint og hældes i filtertragten (punkt 3.7). Tilsæt 10 ml varm ethylacetat, bland det omhyggeligt med metalspatelen, og filtrer under vakuum; filtratet opsamles i den koniske kolbe (punkt 3.8), der er sat på filtertragten. Reststoffet i kolben vaskes tre gange med ethylether (punkt 4.3) (ca. 10 ml hver gang), idet filtratet opsamles i den samme kolbe, der er påsat filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af 4 til 5 ml. Den tilbageværende opløsning overføres til det på forhånd vejede 10 ml-reagensglas (punkt 3.9). Inddamp til tørhed ved let opvarmning i en svag strøm af nitrogen, fyld op med et par dråber acetone (punkt 4.8), og inddamp igen til tørhed. Reststoffet i reagensglasset skal bestå af sterol- og triterpendialkoholfraktionen.

5.3. Fremstilling af trimethylsilylethere 5.3.1. Tilsæt silyleringsreagenset (punkt 4.25) (note 6) i forholdet 50 μl for hvert milligram steroler og triterpendialkoholer til reagensglasset med sterol- og triterpenfraktionen, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 7). Note 6: Opløsninger klar til brug fås i handelen. Man kan også få andre silyleringsreagenser, som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimethylchlorsilan, som skal fortyndes med et lige så stort rumfang vandfri pyridin. Pyridin kan erstattes med samme mængde acetonitril. 5.3.2. Reagensglasset tilproppes og rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i vejret på det), indtil forbindelserne er fuldstændig opløst. Lad henstå i mindst 15 minutter ved omgivelsestemperatur, og centrifuger derefter i et par minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse. Note 7: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller fremkommer en lyserød farve, er det tegn på tilstedeværelsen af fugt eller svækkelse af reagenset. Hvis det forekommer, skal testen gentages (kun hvis hexamethyldisilazan/trimethylchlorsilan anvendes).

5.4. Gaskromatografisk analyse. 5.4.1. Forberedende operationer, konditionering af kolonnen. 5.4.1.1. Kolonnen (punkt 3.11) monteres i gaskromatografen, idet indløbsenden forbindes med splitinjektoren, og udløbsenden forbindes med detektoren. Der foretages en generel kontrol af gaskromatografen (lækager fra gaskredsløbene, detektorens effektivitet, splittersystemets og registreringssystemets effektivitet osv.) 5.4.1.2. Hvis kolonnen skal bruges for første gang, anbefales det, at den underkastes en konditionering. Man lader en svag gasstrøm passere gennem kolonnen og tænder så for gaskromatografienheden. Derefter begynder man gradvis at varme op til en temperatur på mindst 20 °C over driftstemperaturen (note 8). Denne temperatur opretholdes i mindst to timer. Derefter sættes hele enheden i driftstilstand (justering af gasstrømme og splittersystem, antændelse af flammen, forbindelse til computeren, justering af kolonnekammerets, detektorens og injektorens temperatur osv.), og dernæst registreres signalet med en følsomhed, der er mindst to gange større end den, man agter at anvende til analysen. Basislinjens forløb skal være lige uden toppe af nogen art, og den må ikke glide. Negativ glidning af en lige linje tyder på lækage fra kolonnens forbindelser. Positiv glidning tyder på utilstrækkelig konditionering af kolonnen. Note 8: Konditioneringstemperaturen skal altid være mindst 20 °C lavere end den maksimumstemperatur, der er angivet for den anvendte stationære fase. 5.4.2. Valg af driftsbetingelser. 5.4.2.1. Følgende driftsbetingelser anvendes: — kolonnetemperatur: 260 ± 5 °C — injektortemperatur: 280-300 °C — detektortemperatur: 280-300 °C — bæregassens lineære hastighed: helium 20-35 cm/s, hydrogen 30-50 cm/s — splitterforhold: fra 1:50 til 1:100 — instrumentets følsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale dæmpning — registreringsfølsomhed: 1-2 mV fuld skala — indsprøjtet mængde: 0,5-1 μl TMSE-opløsning. Disse betingelser kan ændres afhængigt af kolonnens og gaskromatografens egenskaber, så man opnår kromatogrammer, der opfylder følgende krav: — Retentionstiden for ß-sitosteroltoppen bør være 20 ± 5 minutter. — Campesteroltoppen bør være: for olivenolie (gennemsnitsindhold 3 %) 20 ± 5 % af fuld skala; for sojaolie (gennemsnitsindhold 20 %) 80 ± 10 % af fuld skala. — Alle tilstedeværende steroler skal adskilles. Desuden skal toppene også være fuldstændig opløst, dvs. hver tops spor skal gå tilbage til basislinjen, før sporet går op til den næste top. Ufuldstændig opløsning kan dog tolereres, såfremt toppen ved RRT (relativ retentionstid) 1,02 (Sitostanol) kan bestemmes kvantitativt ved brug af den vinkelrette linje. 5.4.3. Analytisk fremgangsmåde 5.4.3.1. Med 10 μl-mikrosprøjten optages 1 μl hexan, derefter trækkes først 0,5 μl luft og derefter 0,5 til 1 μl af prøveopløsningen op. Stemplet trækkes længere ud, så kanylen tømmes. Kanylen trykkes gennem injektorens membran, og efter 1-2 sekunder injiceres hurtigt; derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder. Der kan også anvendes en automatisk injektor. 5.4.3.2. Registreringen fortsættes, indtil de tilstedeværende triterpendialkoholers TMSE er fuldstændig elueret. Basislinjen skal fortsat opfylde kravene (punkt 5.4.1.2). 5.4.4. Identifikation af toppe De enkelte toppe identificeres ud fra retentionstiderne og ved sammenligning med blandinger af sterol- og triterpendialkohol-TMSE, der er analyseret under de samme betingelser (se tillægget). Sterolerne og triterpendialkoholerne elueres i følgende rækkefølge: cholesterol, brassicasterol, ergosterol, 24-methylen-cholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-stigmastadienol, clerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erytrodiol og uvaol. Retentionstiderne for β-sitosterol for SE 52- og SE 54-kolonner er vist i tabel 1. Figur 1 og 2 viser typiske kromatogrammer for bestemte olier. 5.4.5. Kvantitativ vurdering 5.4.5.1. Arealerne for α-cholestanol- samt sterol- og triterpendialkoholtoppene beregnes ved hjælp af computeren. Der ses bort fra toppene for forbindelser, der ikke er blandt dem, der er opregnet i tabel 1 (ergosterol skal ikke beregnes). Responsfaktoren for α-cholestanol antages at være lig med 1. 5.4.5.2. Koncentrationen af hver enkelt sterol beregnes i mg/kg fedtstof som følger: hvor: Ax = toparealet for sterol x i computerenheder As = toparealet for α-cholestanol i computerenheder ms = massen af tilsat α-cholestanol i milligram m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.

6. RAPPORTERING AF RESULTATERNE

6.1. De individuelle sterolkoncentrationer angives som mg/kg fedtstof og deres sum som "steroler i alt". Sammensætningen af hver af de individuelle steroler samt af erytrodiol og uvaol angives med en decimal. Den samlede sterolsammensætning udtrykkes uden decimaler.

▼M28

6.2. Den procentvise andel af de individuelle steroler beregnes på grundlag af forholdet mellem arealet af den tilsvarende top og summen af sterolernes topareal: hvor: Ax = topareal x ΣA = summen af toparealet for steroler.

▼M26

6.3. Tilsyneladende β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Den procentvise andel af erytrodiol og uvaol beregnes: hvor: ΣA = samlet areal for sterol i computerenheder Er = areal af erytrodiol i computerenheder Uv = areal af uvaol i computerenheder









Tillæg

Bestemmelse af gassens lineære hastighed

Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1 til 3 μl methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere gennem kolonnen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen fremkommer (tM).

Den lineære hastighed i cm/s beregnes ved formlen L/tM, hvor L er kolonnens længde i cm, og tM er den målte tid i sekunder.







Tabel 1 Relative retentionstider for steroler Top Identifikation Relativ retentions-tid SE 54-kolonne SE 52-kolonne 1 Cholesterol Δ-5-cholesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 Cholestanol 5α-cholestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brassicasterol [24S]-24-methyl-Δ-5,22-cholestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterol [24S] 24 methy Δ5-7-22 cholestatrien 3ß-ol 0,78 0,76 4 24-methylen-cholesterol 24-methylen-Δ-5,24-cholestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Campesterol (24R)-24-methyl-Δ-5-cholesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 Campestanol (24R)-24-methyl-cholestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmasterol (24S)-24-ethyl-Δ-5,22-cholestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-campesterol (24R)-24-methyl-Δ-7-cholesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-ethyl-Δ-5,23-choIestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 Clerosterol (24S)-24-ethyl-Δ-5,25-cholestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-ethyl-Δ-5-cholesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-ethyl-cholestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-ethyliden-Δ-cholesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-ethyl-Δ-5,24-cholestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-ethyl-Δ-7-cholesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-ethyliden-Δ-7-cholesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Erytrodiol 5α olean-12en-3ß28 diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-ursen-3ß28 diol 1,52 1,52

Figur 1

Gaskromatogram af sterol- og triterpendialkoholfraktionen af bomolie (tilsat intern standard)

Figur 2

Gaskromatogram af sterol- og triterpendialkoholfraktionen af en raffineret olivenolie (tilsat intern standard)

Figur 3

Tyndtlagskromatografiplade med olie fra olivenpresserester med den zone, der skal skrabes med henblik på bestemmelse af steroler og triterpendialkoholer

1 – Squalen

2 – Triterpen og alifatiske alkoholer

3 – Steroler og triterpendialkoholer

4 – Start og frie fedtsyrer

▼M26 —————

▼M21









BILAG VII

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF 2-GLYCERYLMONOPALMITAT I PROCENT

1. GENSTAND OG ANVENDELSESOMRÅDE

Metoden er en analyseprocedure for bestemmelse af det procentvise indhold af palmitinsyre i 2-stillingen i triglycerider ved måling af 2-glycerylmonopalmitat.

Metoden kan anvendes på vegetabilske olier, der er flydende ved stuetemperatur (20 °C).

2. PRINCIP

Olieprøven behandles efter forberedelsen med pankreaslipase, som specifikt hydrolyserer triglyceridets 1- og 3-stilling og efterlader 2-monoglycerider. Det procentvise indhold af 2-glycerylmonopalmitat i monoglyceridfraktionen bestemmes efter silylering ved gaskromatografi med kapillarkolonne.

3. APPARATUR OG SÆDVANLIGT UDSTYR

3.1. 25 ml erlenmeyerkolbe

3.2. 100, 250 og 300 ml bægerglas

3.3. kromatografikolonne af glas, indvendig diameter 21-23 mm og længde 400 mm, med sintret glasfilter og hane

3.4. 10, 50, 100 og 200 ml måleglas

3.5. 100 og 250 ml rundbundede kolber

3.6. rotationsfordamper

3.7. 10 ml centrifugeglas med konisk bund og slibprop

3.8. centrifuge til 10 og 100 ml glas

3.9. termostat, der kan holde en temperatur på 40 ± 0,5 °C

3.10. 1 og 2 ml målepipetter

3.11. 1 ml injektionssprøjte

3.12. 100 μl mikroinjektionssprøjte

3.13. 1 000 ml skilletragt

3.14. gaskromatograf til kapillarkolonner med kold »on column«-injektor til direkte indsprøjtning af prøven i kolonnen og med en ovn, der kan fastholde den ønskede temperatur inden for ca. 1 °C.

3.15. kold »on column«-injektor til direkte indsprøjtning af prøven i kolonnen

3.16. flammeioniseringsdetektor og elektrometer

3.17. skriver-integrator, der passer til elektrometeret, med responstid højst 1 sekund og variabel papirhastighed

3.18. kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, længde 8-12 m og indvendig diameter 0,25-0,32 mm, coatet med 5 % methylpolysiloxan eller phenylmethylpolysiloxan i en lagtykkelse på 0,10-0,30 μm, og brugbar op til 370 °C

3.19. 10 μl mikroinjektionssprøjte med hærdet kanyle, længde mindst 7,5 cm, til indsprøjtning direkte i kolonnen.

4. REAGENSER

4.1. silicagel med kornstørrelse 63-200 μm (70/280 mesh), tilberedt således: Silicagelen anbringes i en porcelænsskål, tørres i ovn ved 160 °C i fire timer og afkøles til stuetemperatur i ekssikkator. Der tilsættes 5 % vand til silicagelen på følgende måde: I en erlenmeyerkolbe afvejes 152 g silicagel, og der tilsættes 8 g destilleret vand; kolben tilproppes og rystes forsigtigt, indtil vandet er jævnt fordelt. Henstår i mindst 12 timer inden brugen.

4.2. n-hexan (til kromatografi)

4.3. isopropanol

4.4. isopropanol, vandig opløsning 1:1 (v/v)

4.5. pankreaslipase. Den anvendte lipase skal have en aktivitet på 2,0-10 lipaseenheder pr. mg. (Der er pankreaslipaser i handelen med en aktivitet på 2-10 enheder pr. mg enzym.)

4.6. bufferopløsning af trishydroxymethylaminomethan: 1 M vandig opløsning indstillet til pH 8 (potentiometrisk måling) med koncentreret HCl (1:1, v/v)

4.7. natriumcholat, enzymkvalitet, 0,1 % vandig opløsning (opløsningen skal bruges inden for to uger)

4.8. calciumchlorid, 22 % vandig opløsning

4.9. diethylether til kromatografi

4.10. elueringsvæske: blanding af n-hexan og diethylether, 87:13 (v/v)

4.11. natriumhydroxid, 12 % opløsning (w/w)

4.12. phenolphthalein, 1 % opløsning i ethanol

4.13. bæregas: hydrogen eller helium, til gaskromatografi

4.14. hjælpegasser: hydrogen, mindst 99 % ren, fri for vand og organisk materiale, og luft af samme renhed, til kromatografi

4.15. silyleringsreagens: blanding af pyridin, hexamethyldisilazan og trimethylchlorsilan 9:3:1 (v/v/v). (Der fås brugsklare opløsninger i handelen. Der kan også benyttes andre silyleringsreagenser, f.eks. bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethylchlorsilan, fortyndet med samme volumen vandfri pyridin.)

4.16. Referenceopløsninger: rene monoglycerider eller blandinger af monoglycerider med kendt procentvis sammensætning af omtrent samme størrelse som prøven.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Prøveforberedelse

5.1.1. Olier med under 3 % frie syrer behøver ikke at neutraliseres inden kromatograferingen på silicagelkolonne. Olier med mere end 3 % frie syrer neutraliseres som beskrevet i punkt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Der anbringes 50 g olie og 200 ml n-hexan i skilletragten på 1 000 ml (3.13). Der tilsættes 100 ml isopropanol og en mængde 12 % natriumhydroxidopløsning (4.11), der svarer til oliens indhold af frie syrer forhøjet med 5 %. Der rystes kraftigt i 1 minut. Derefter tilsættes der 100 ml destilleret vand, og efter fornyet omrystning sættes skilletragten til side. Efter separation tappes det nedre lag med sæberne af. Eventuelle mellemlag (slim og uopløselige stoffer) fjernes. Hexanopløsningen af neutraliseret olie vaskes flere gange med portioner af isopropanol/vand-opløsningen (4.4) a 50-60 ml, indtil phenolphthaleinets lyserøde farve er forsvundet. Det meste af hexanen fjernes ved vakuumdestillation (f.eks. rotationsfordamper), og olien overføres til en 100 ml rundbundet kolbe (3.5). Olien inddampes til fuldstændig tørhed under vakuum. Herefter skal oliens syreindhold være mindre end 0,5 %.

5.1.2. I en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1) anbringes 1,0 g olie, som er behandlet som beskrevet ovenfor, og den opløses i 10 ml elueringsvæske (4.10). Opløsningen henstår mindst 15 minutter inden kromatografering på silicagelkolonne. Hvis opløsningen er uklar, centrifugeres den, så kromatografibetingelserne bliver optimale. (Der kan anvendes brugsklare patroner med 500 mg SPE-silicagel.)

5.1.3. Fremstilling af kromatografikolonnen Der hældes ca. 30 ml elueringsvæske (4.10) i kolonnen (3.3), og i bunden af kolonnen placeres der ved hjælp af en glasstav et stykke vat, som luften trykkes ud af. I et bægerglas fremstilles en opslæmning af 25 g silicagel (4.1) i ca. 80 ml elueringsvæske, og opslæmningen hældes på kolonnen gennem en tragt. Når det er kontrolleret, at al silicagelen er kommet ned i kolonnen, skylles der med elueringsvæske (4.10), hanen åbnes, og der tappes væske af, indtil overfladen er ca. 2 mm over silicagelens overkant.

5.1.4. Kolonnekromatografi I en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1) anbringes 1,0 g prøve, som er behandlet som beskrevet i punkt 5.1. Prøven opløses i 10 ml elueringsvæske (4.10). Opløsningen overføres til kromatografikolonnen, der er fremstillet som beskrevet i punkt 5.1.3. Kolonnepakningens overflade må ikke forstyrres. Der åbnes for hanen og aftappes elueringsmiddel, indtil prøveopløsningens overflade er på niveau med silicagelen. Der elueres med 150 ml elueringsvæske. Hastigheden sættes til 2 ml/min (dvs. at de 150 ml løber gennem kolonnen på ca. 60-70 minutter). Eluatet opsamles i en tareret 250 ml rundbundet kolbe. Opløsningsmidlet afdampes under vakuum, og de sidste rester fjernes med en nitrogenstrøm. Kolben vejes, og ekstraktmængden udregnes. (Hvis der benyttes brugsklare SPE-silicagelpatroner, følges denne fremgangsmåde: 1 ml af opløsningen (5.1.2) sættes på patroner, der er forberedt med 3 ml n-hexan. Når opløsningen er løbet igennem, elueres der med 4 ml n-hexan/diethylether 9:1 (v/v). Eluatet opsamles i et 10 ml glas og inddampes med en nitrogenstrøm til fuldstændig tørhed. Remanensen behandles med pankreaslipase (5.2). Det er meget vigtigt, at fedtsyresammensætningen før og efter behandlingen på SPE-patronen kontrolleres.)

5.2. Hydrolyse med pankreaslipase

5.2.1. I centrifugeglasset afvejes 0,1 g olie, som er behandlet som beskrevet i punkt 5.1. Der tilsættes 2 ml bufferopløsning (4.6), 0,5 ml natriumcholatopløsning (4.7) og 0,2 ml calciumchloridopløsning, idet der omrøres omhyggeligt mellem hver tilsætning. Glasset lukkes med slibproppen og anbringes i termostaten ved 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Der tilsættes 20 mg lipase og omrystes omhyggeligt (uden at proppen fugtes), og glasset anbringes i termostaten i nøjagtig 2 minutter, hvorefter det tages op, rystes energisk i nøjagtig 1 minut og hensættes til afkøling.

5.2.3. Der tilsættes 1 ml diethylether, tilproppes og rystes energisk, og centrifugeres, hvorefter etheropløsningen overføres til et rent og tørt glas med en mikroinjektionssprøjte.

5.3. Fremstilling af silanderivater og gaskromatografi

5.3.1. Med en mikroinjektionssprøjte overføres 100 μl af opløsningen (5.2.3) til et 10 ml glas med konisk bund.

5.3.2. Opløsningsmidlet afdampes med en svag nitrogenstrøm, der tilsættes 200 μl silyleringsreagens (4.15), glasset tilproppes, og man lader det stå i 20 minutter.

5.3.3. Efter 20 minutter tilsættes der 1-5 ml n-hexan (alt efter kromatograferingsbetingelserne): Den fremkomne opløsning er klar til gaskromatografering.

5.4. Gaskromatografi

Der anvendes følgende arbejdsbetingelser:

— injektortemperatur (»on column«-injektor) under opløsningsmidlets kogepunkt (68 °C)

— detektortemperatur: 350 °C

— kolonnetemperatur: temperaturprogrammering af ovnen: 60 °C i 1 minut, derefter stigning først med 15 °C pr. minut indtil 180 °C og dernæst med 5 °C pr. minut indtil 340 °C, og endelig 340 °C i 13 minutter

— bæregas: hydrogen eller helium indstillet til en sådan lineær hastighed, at der opnås den i figur 1 viste opløsning. C54-triglyceridet skal have en retentionstid på 40 ± 5 minutter (se figur 2). (Ovenstående arbejdsbetingelser er vejledende. Den enkelte analyseansvarlige må optimere dem for at opnå det ønskede resultat. Højden af toppen for 2-glycerylmonopalmitat skal være mindst 10 % af fuldt udslag på skriveren.)

— indsprøjtet mængde: 0,5-1 μl af opløsningen i (5 ml) n-hexan (5.3.3).

5.4.1. Identifikation af toppene

De enkelte monoglycerider identificeres efter deres retentionstider i prøveanalysen sammenlignet med tiderne fra analyse af standardmonoglyceridblandinger under samme betingelser.

5.4.2. Kvantitativ vurdering

Arealerne af toppene beregnes ved hjælp af integratoren.

6. ANGIVELSE AF RESULTATER

Det procentvise indhold af glycerylmonopalmitat beregnes ud fra forholdet mellem arealet af den pågældende top og summen af arealerne af samtlige monoglyceridtoppe (se figur 2) efter følgende formel:

glycerylmonopalmitat (%):

hvor:

Ax = arealet af den top, der svarer til glycerylmonopalmitat

ΣA = summen af arealerne af samtlige monoglyceridtoppe

Resultatet angives med én decimal.

7. ANALYSERAPPORT

Analyserapporten skal indeholde følgende:

— henvisning til denne metode

— alle oplysninger til fuldstændig identifikation af prøven

— resultatet af analysen

— alle afvigelser fra metoden, uanset om det er besluttet af de berørte parter eller har andre årsager

— nøje identifikation af laboratoriet, dato for udførelse af analysen og de ansvarliges underskrift.

Figur 1

Kromatogram af reaktionsprodukter fra silylering efter lipasebehandling af en raffineret olivenolie med tilsætning af 20 % forestret olie (100 %)

Signaturer: »acides gras libres« = frie fedtsyrer,»huile d'olive raffinée + 20 % huile estérifiée« = raffineret olivenolie + 20 % forestret olie, »1-2 monopalmitoléine« = 1-2 monopalmitolein, »1-2 mono C18 insat.« = umættet 1-2 mono-C18.

Figur 2

Kromatogram af:

A) ægte olivenolie, efter lipasebehandling og silylering; under de pågældende betingelser (kapillarkolonne 8-12 m) elueres voksfraktionen samtidig med eller kort tid efter diglyceridfraktionen. Efter lipasebehandlingen bør triglyceridindholdet ikke være højere end 15 % Signaturer: 1 = Frie fedtsyrer 2 = Monoglycerider 3 = Diglycerider 4 = Triglycerider * = 2-monopalmitat ** = C54-triglycerid

Kromatogram af:

B) forestret olie efter lipasebehandling og silylering; under de pågældende betingelser (kapillarkolonne 8-12 m) elueres voksfraktionen samtidig med eller kort tid efter diglyceridfraktionen. Efter lipasebehandlingen bør triglyceridindholdet ikke være højere end 15 % Signaturer: 1 = Frie fedtsyrer 2 = Monoglycerider 3 = Diglycerider 4 = Triglycerider * = 2-monopalmitat ** = C54-triglycerid

8. NOTER

FREMSTILLING AF LIPASE

Lipaser med tilfredsstillende aktivitet kan fås i handelen. De kan også fremstilles i laboratoriet på følgende måde:

5 kg frisk svinepankreas afkøles til 0 °C. Alt omgivende fedt og bindevæv fjernes, og vævet findeles i blender til en flydende pasta. Den omrøres i 4-6 timer med 2,5 l vandfri acetone, hvorefter den centrifugeres. Bundfaldet ekstraheres endnu tre gange med samme mængde vandfri acetone og derefter to gange med en blanding af acetone og diethylether (1:1) (v/v) og to gange med diethylether.

Bundfaldet tørres i 48 timer under vakuum til et stabilt pulver, som har lang holdbarhed ved opbevaring tørt i køleskab.

TEST FOR LIPASEAKTIVITET

Der fremstilles en olivenolieemulsion på følgende måde:

I en mixer omrøres i 10 minutter en blanding af 165 ml af en gummi arabicum-opløsning med 100 g/l, 15 g knust is og 20 ml neutraliseret olivenolie.

I et 50 ml bægerglas hældes først 10 ml af denne emulsion og derefter 0,3 ml natriumcholatopløsning (0,2 g/ml) og 20 ml destilleret vand.

Bægerglasset anbringes i termostat ved 37 °C, og der nedsænkes en pH-meterelektrode og en propelomrører i bægerglasset.

Fra en burette tilsættes der dråbevis en 0,1 N natriumhydroxidopløsning, indtil pH er 8,3.

Der tilsættes en portion af opslæmningen af lipasepulver i vand (0,1 g lipase pr. ml). Når pH-meteret viser et pH på 8,3, startes stopuret, og der tilsættes dråbevis så meget natriumhydroxidopløsning, at pH holdes på 8,3. Hvert minut noteres den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning.

Målingerne afsættes i et koordinatsystem med tiden som abscisse og det forbrugte antal ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje.

Lipaseaktiviteten, målt i lipaseenheder pr. mg, beregnes efter følgende formel:

hvor:

A er aktiviteten i lipaseenheder pr. mg

V er antallet af ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning pr. minut (beregnet ud fra grafen)

N er natriumhydroxidopløsningens normalitet

m er mængden af tilsat lipase i mg.

Lipaseenheden er defineret som den mængde enzym, der frigør 10 mikroækvivalenter syre pr. minut.

▼M20 —————

▼M28









BILAG IX

SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSØGELSE VED ULTRAVIOLET LYS

INDLEDNING

Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys kan give oplysninger om et fedtstofs kvalitet, dets konserveringstilstand og om forandringer frembragt ved teknologiske processer. Absorptionen ved de bølgelængder, der er specificeret i metoden, skyldes tilstedeværelsen af konjugerede dien- og triensystemer, der er resultatet af oxidationsprocesser og/eller raffineringsprocesser. Disse absorptioner er udtrykt som specifikke ekstinktioner

(ekstinktionen for en 1 % w/v opløsning af fedtstoffet i det angivne opløsningsmiddel i en 10 mm kuvette), sædvanligvis betegnet ved K, (også kaldet ekstinktionskoefficienten).

1. OMRÅDE

I dette bilag beskrives fremgangsmåden for udførelse af en spektrofotometrisk undersøgelse af olivenolie i det ultraviolette område.

2. METODENS PRINCIP

En prøve opløses i det specificerede opløsningsmiddel, og opløsningens absorbans måles ved de fastsatte bølgelængder i forhold til rent opløsningsmiddel.

De specifikke ekstinktioner ved 232 og 268 nm i isooctan eller ved 232 og 270 nm i cyclohexan beregnes for en koncentration på 1 % w/v i en 10 mm kuvette.

3. APPARATUR

3.1. Et spektrofotometer til måling af ultraviolette bølgelængder (220 nm til 360 nm), med mulighed for aflæsning ved hver hele nanometer. Af hensyn til nøjagtigheden og reproducerbarheden anbefales det regelmæssigt at kontrollere spektrofotometerets absorbans- og bølgelængdeskala såvel som spildlys. 3.1.1. Bølgelængdeskala: Denne kan kontrolleres med et referencemateriale i form af et filter af optisk glas indeholdende holmiumoxid eller en opløsning af holmiumoxid (forseglet eller ikke), som har skarpt adskilte absorptionsbånd. Referencematerialet er beregnet til kontrol og kalibrering af bølgelængdeskalaen i spektrofotometre, der arbejder i det synlige og ultraviolette område og har en nominel spektral båndbredde på 5 nm eller derunder. Målingerne foretages med luft som blindprøve i bølgelængdeområdet fra 640 til 240 nm i henhold til de anvisninger, der er vedlagt referencematerialet. Ved hver ændring af spaltebredden korrigeres basislinjen med en tom strålegang. Bølgelængderne for standarden er anført i referencematerialets certifikat. 3.1.2. Absorbansskala: Den kan kontrolleres med kommercielt tilgængelige forseglede referencematerialer bestående af sure kaliumdichromatopløsninger i visse koncentrationer og med certificerede absorbansværdier ved λmax (i form af fire opløsninger af kaliumdichromat i perchlorsyre, som er forseglet i fire UV-kvartskuvetter, dvs. måling af linearitet og fotometrisk nøjagtighed i UV-området). Efter korrektion af basislinjen måles kaliumdichromatopløsningerne mod en blindprøve af den anvendte syre i henhold til de anvisninger, der er vedlagt referencematerialet. Absorbansværdierne er anført i referencematerialets certifikat. Fotocellens og fotomultiplikatorrørets respons kan også kontrolleres på følgende vis: 0,2000 g ren kaliumchromat til spektrofotometri afvejes og opløses i 0,05 N kaliumhydroxidopløsning i en 1 000 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket. Der overføres præcis 25 ml af denne opløsning til en 500 ml målekolbe, som fortyndes op til mærket med den samme kaliumhydroxidopløsning. Derefter måler man denne opløsnings ekstinktion ved 275 nm med kaliumhydroxidopløsningen som reference. Den målte ekstinktion med en 1 cm kuvette skal være 0,200 ± 0,005.

3.2. Firkantede kvartskuvetter med låg, til måling af ultraviolette bølgelængder (220 til 360 nm), med en optisk vejlængde på 10 mm. Når kuvetterne er fyldt med vand eller et andet passende opløsningsmiddel, bør der ikke være forskelle på mere end 0,01 ekstinktionsenheder mellem dem.

3.3. 25 ml målekolbe, klasse A.

3.4. Analysevægt, hvorpå der kan aflæses ned til 0,0001 g.

4. REAGENSER

Under analysen må der kun benyttes reagenser af anerkendt analysekvalitet og destilleret eller demineraliseret vand eller vand af tilsvarende renhedsgrad, medmindre andet er anført.

Opløsningsmiddel: Isooctan (2,2,4-trimethylpentan) til målinger ved 232 nm og 268 nm og cyclohexan til målinger ved 232 nm og 270 nm, med en absorbans på mindre end 0,12 ved 232 nm og mindre end 0,05 ved 270 nm målt i en 10 mm kuvette med destilleret vand som reference.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Prøven skal være fuldstændig homogen og fri for suspenderede urenheder. Er den ikke det, skal den filtreres på papir ved en temperatur på ca. 30 °C.

5.2. Ca. 0,25 g af den således forberedte prøve afvejes nøjagtigt (med 1 mg nøjagtighed) i en 25 ml målekolbe, der fyldes op til mærket med det angivne opløsningsmiddel, og opløsningen homogeniseres. Den fremkomne opløsning skal være fuldstændig klar. Ved opalescens eller uklarhed filtreres hurtigt på papir. BEMÆRK: Generelt er en masse på 0,25-0,30 g tilstrækkeligt til at måle jomfruolivenoliers og ekstra jomfruolivenoliers absorbans ved 268 nm og 270 nm. Til målinger ved 232 nm er der almindeligvis behov for 0,05 g af prøven, så der forberedes normalt to særskilte opløsninger. Til målinger af absorbans i olier af olivenpresserester, raffinerede olivenolier og forfalskede olivenolier, er der almindeligvis behov for en mindre andel af prøven, f.eks. 0,1 g, da disse olier har en højere absorbans.

5.3. Hvis det er nødvendigt, korrigeres basislinjen (220-290 nm) med opløsningsmiddel i begge kvartskuvetter (prøve og reference). Derefter fyldes kvartskuvetten med prøven med prøveopløsningen, og ekstinktionerne måles ved 232, 268 og 270 nm mod det opløsningsmiddel, der anvendes som reference. De aflæste ekstinktionsværdier skal ligge inden for området 0,1-0,8 eller inden for spektrofotometerens liniaritetsinterval, som bør kontrolleres. Gør de ikke det, gentages målingerne, idet der benyttes mere koncentrerede eller mere fortyndede opløsninger.

5.4. Efter måling af absorbansen ved 268 og 270 nm måles absorbansen ved λmax, λmax + 4 og λmax – 4. Disse absorbansværdier anvendes til at bestemme den specifikke ekstinktions variation (ΔΚ). BEMÆRK: λmax anses for at være 268 nm for isooctan, der anvendes som opløsningsmiddel, og 270 nm for cyclohexan.

6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE

6.1. Som måleresultat registreres den specifikke ekstinktion (ekstinktionskoefficient) ved de forskellige bølgelængder, som beregnes efter formlen: hvor: Kλ = den specifikke ekstinktion ved bølgelængden λ Eλ = den ekstinktion, der er målt ved bølgelængden λ c = opløsningens koncentration i g pr. 100 ml s = kvartskuvettens vejlængde i cm angives med to decimaler.

6.2. Den specifikke ekstinktions variation (ΔΚ) Variationen i den absolutte værdi af den specifikke ekstinktion (ΔΚ) er givet ved: hvor Km er den specifikke ekstinktion ved den bølgelængde, henholdsvis 270 nm og 268 nm, der giver maksimal absorption, afhængig af hvilket opløsningsmiddel der anvendes. Resultaterne angives med to decimaler.









BILAG X

BESTEMMELSE AF FEDTSYREMETHYLESTERE VED GASKROMATOGRAFI

1. ANVENDELSESOMRÅDE

Dette bilag indeholder vejledning om bestemmelse ved gaskromatografi af frie og bundne fedtsyrer i vegetabilske fedtstoffer og olier efter deres omdannelse til fedtsyremethylestere (FAME).

De bundne fedtsyrer af triacylglycerolerne (TAG) og, afhængig af esterificeringsmetoden, de frie fedtsyrer, omdannes til fedtsyreethylestere (FAME), som bestemmes ved gaskromatografi på kapillarkolonne.

Den metode, der er beskrevet i dette bilag, gør det muligt at bestemme FAME fra C12 til C24, herunder mættede, cis- og transenkeltumættede og cis- og transflerumættede fedtsyremethylestere.

2. PRINCIP

Gaskromatografi anvendes til den kvantitative analyse af FAME. FAME fremstilles i henhold til del A. Derefter injiceres de i injektoren og inddampes i denne. Adskillelsen af FAME udføres på analytiske kolonner med specifik polaritet og længde. Til detektion af FAME anvendes en flammeionisationsdetektor. Testbetingelserne af angivet i del B.

Ved gaskromatografien af FAME med flammeionisationsdetektor kan hydrogen eller helium anvendes som bæregas (mobil fase). Hydrogen fremskynder adskillelsen og giver mere spidse toppe. Den stationære fase er et mikroskopisk lag af tynd flydende film på en inert fast overflade af kvartsglas.

Når de flygtiggjorte forbindelser, som analyseres, passerer gennem kapillarkolonnen, interagerer de med den stationære fase, som dækker overfladen på kolonnens inderside. Da de forskellige forbindelser interagerer på forskellig vis, eluerer de på forskellige tidspunkter. Dette kaldes forbindelsens retentionstid for et givet sæt analyseparametre. Sammenligningen af retentionstiderne anvendes til at bestemme de forskellige forbindelser.

DEL A

REMSTILLING AF METHYLESTERE AF FEDTSYRER FRA OLIVENOLIE OG OLIE AF OLIVENPRESSERESTER

1. OMFANG

I denne del beskrives fremstillingen af methylestere af fedtsyrer. Den omfatter metoder til fremstilling af methylestere af fedtsyrer fra olivenolie og olie af olivenpresserester.

2. ANVENDELSESOMRÅDE

Fremstillingen af fedtsyremethylestere fra olivenolie og olie af olivenpresserester udføres ved omestring med en methanolopløsning af kaliumhydroxid ved stuetemperatur. Hvorvidt prøven skal renses før omestringen, afhænger fra prøvens indhold af frie fedtsyrer og af, hvilket analytisk parameter, der skal bestemmes. I den forbindelse kan følgende skema anvendes:







Oliekategori Metode Jomfruolivenolie med et syreindhold på ≤ 2,0 % 1. Fedtsyrer 2. Transfedtsyrer 3. ΔECN42 (efter rensning med silicagel SPE) Raffineret olivenolie Olivenolie bestående af raffineret olivenolie og jomfruolie Raffineret olie af olivenpresserester Olie af olivenpresserester Jomfruolivenolie med et syreindhold på > 2,0 % Rå olie af olivenpresserester 1. Fedtsyrer (efter rensning med silicagel SPE) 2. Transfedtsyrer (efter rensning med silicagel SPE) 3. ΔECN42 (efter rensning med silicagel SPE)

3. METODER

3.1. Omestring med en opløsning af kaliumhydroxid i methanol ved stuetemperatur

3.1.1. Princip

Methylestre dannes ved omestring i en opløsning af kaliumhydroxid i methanol, hvilket er mellemstadiet inden forsæbning.

3.1.2. Reagenser

3.1.2.1. Methanol med højst 0,5 % (m/m) vand.

3.1.2.2. Hexan, til kromatografi.

3.1.2.3. Heptan, til kromatografi.

3.1.2.4. Diethylether, analyseren.

3.1.2.5. Acetone, til kromatografi.

3.1.2.6. Elueringsvæske til rensning af olien ved kolonne-/SPE-kromatografi, blanding af hexan/diethylether 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Kaliumhydroxid, ca. 2 M opløsning i methanol: 11,2 g kaliumhydroxid opløses i 100 ml methanol.

3.1.2.8. Silicagelpatroner, 1 g (6 ml), til fastfaseekstraktion.

3.1.3. Apparatur

3.1.3.1. Reagensglas (volumen: 5 ml) med skrueprop med teflonpakning.

3.1.3.2. Målepipetter eller automatpipetter på 2 ml og 0,2 ml.

3.1.4. Rensning af olieprøver

Om nødvendigt renses prøverne ved at føre olien gennem en silicagelpatron til fastfaseekstraktion. En silicagelpatron (3.1.2.8) anbringes i et elueringsapparat til eluering under vakuum og skylles med 6 ml hexan (3.1.2.2). Skylningen foretages uden vakuum. Derefter sættes der en opløsning af olien (ca. 0,12 g) i 0,5 ml hexan (3.1.2.2) på kolonnen. Opløsningen trænger ned i gelen og elueres derefter med 10 ml hexan/diethylether (87:13, v/v) (3.1.2.6). Eluaterne samles og blandes og deles i to lige store portioner. Den ene portion inddampes til tørhed på rotationsfordamper under reduceret tryk og ved stuetemperatur. Remanensen opløses i 1 ml heptan. Opløsningen er parat til gaskromatografisk analyse. Den anden portion inddampes, og remanensen opløses i 1 ml acetone til HPLC-triglyceridanalyse, hvis det er påkrævet.

3.1.5. Fremgangsmåde

I et 5 ml reagensglas med skrueprop (3.1.3.1) afvejes ca. 0,1 g af olieprøven. Der tilsættes 2 ml heptan (3.1.2.2) og rystes. Efter tilsætning af 0,2 ml kaliumhydroxidopløsningen i methanol (3.1.2.7) lukkes glasset med proppen med teflonpakning, og det rystes kraftigt i 30 sekunder. Glasset henstilles, indtil det øvre lag af opløsningen er blevet klart. Det øvre lag, som indeholder methylestrene, dekanteres fra. Heptanopløsningen er parat til injektion i gaskromatografen. Det tilrådes, at opløsningen opbevares i køleskab indtil kromatograferingen. Det frarådes at opbevare opløsningen i mere end 12 timer.

DEL B

ANALYSE AF FEDTSYREMETHYLESTERE VED GASKROMATOGRAFI

1. OMFANG

Denne del giver generelle retningslinjer for gaskromatografisk bestemmelse på kapillarkolonne af den kvalitative og kvantitative sammensætning af en blanding af fedtsyremethylestere fremstillet i henhold til den metode, der er angivet i del A.

Denne del gælder ikke for polymeriserede fedtsyrer.

2. REAGENSER

2.1. Bæregas

Inert gas (helium eller hydrogen) vel tørret og indeholdende mindre end 10 mg oxygen/kg.

Note 1: Hydrogen gør det muligt at foretage analysen dobbelt så hurtigt, men indebærer en risiko. Der forefindes sikkerhedsanordninger.

2.2. Hjælpegasser

2.2.1. Hydrogen (renhedsgrad ≥ 99,9 %), fri for organiske urenheder.

2.2.2. Luft eller oxygen, fri for organiske urenheder.

2.2.3. Nitrogen (renhedsgrad > 99 %).

2.3. Referencestandard

En methylesterblanding af rene fedtsyrer eller methylesterne af et fedtstof, der så vidt muligt har samme sammensætning som det fedtstof, der skal analyseres. Cis- og transisomerer af octadecen-, octadecadien- og octadecatrienmethylestere er nyttige til at bestemme transisomerer i umættede syrer.

Iltning af polyumættende fedtsyrer bør undgås.

3. APPARATUR

Instruktionerne vedrører det sædvanlige udstyr til gaskromatografering med kapillarkolonne og flammeionisationsdetektor.

3.1. Gaskromatograf

Gaskromatografen skal omfatte følgende elementer:

3.1.1. Injektionssystem

Der benyttes et injektionssystem med kapillarkolonner, hvor injektionssystemet bør være specielt udformet til anvendelse med sådanne kolonner. Injektoren kan være med eller uden split.

3.1.2. Ovn

Ovnen skal være i stand til at opvarme kapillarkolonnen til en temperatur på mindst 260 °C og holde den valgte temperatur inden for 0,1 °C. Sidstnævnte er særlig vigtigt, når der anvendes rør af kvartsglas.

Det anbefales i alle tilfælde at anvende temperaturprogrammeret opvarmning, navnlig til fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer.

3.1.3. Kapillarkolonne

3.1.3.1. Røret skal være af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (normalt glas eller sintret kvarts). Den indre diameter skal være på mellem 0,20 mm og 0,32 mm. Den indvendige overflade skal undergå en passende behandling (f.eks. forbehandling, deaktivering), inden den stationære fasebelægning påføres. En længde på 60 m er tilstrækkeligt for fedtsyrer og cis- og transisomerer af fedtsyrer.

3.1.3.2. Stationær fase: polær polysiloxan (cyanopropylsilicone) og bundne (tværbundne) kolonner er velegnede. Note 2: Der er risiko for, at polære polysiloxaner kan gøre det vanskeligt at identificere og adskille linolensyre og C20-syrer. Belægningerne skal være tynde, dvs. 0,1-0,2 μm.

3.1.3.3. Samling og konditionering af kolonnen Der træffes de normale forholdsregler ved samlingen af kapillarkolonner, dvs. placering af kolonnen i ovnen (bærer), valg og montering af samlinger (tæthed), anbringelse af kolonnens ender i injektoren og detektoren (reduktion af dødvolumener). Kolonnen anbringes under en strøm af bæregas (f.eks. 0,3 bar (30 kPa) for en kolonne med en længde på 25 m og en indre diameter på 0,3 mm). Kolonnen konditioneres ved temperaturprogrammering af ovnen ved 3 °C/min. fra den omgivende temperatur til en temperatur på 10 °C under den stationære fases dekomponeringsgrænse. Ovnen holdes på denne temperatur i 1 time, indtil basislinjen har stabiliseret sig. Den genindstilles på 180 °C, så der opnås isotermiske betingelser. Note 3: Korrekt prækonditionerede kolonner fås i handelen.

3.1.4. Flammeioniseringsdetektor og omformer-forstærker

3.2. Injektionssprøjte

Injektionssprøjten skal have en maksimumskapacitet på 10 μl med inddelinger på 0,1 μl.

3.3. Dataopsamlingssystem

Dataopsamlingssystem, som er forbundet online med detektorerne, og som anvendes sammen med et softwareprogram, der egner sig til integration og normalisering af toppe.

4. FREMGANGSMÅDE

4.1 til 4.3 angår anvendelse af en flammeionisationsdetektor.

4.1. Prøvebetingelser

4.1.1. Valg af optimale driftsbetingelser for kapillarkolonne

Grundet kapillarkolonnens ydeevne og permabilitet afhænger adskillelsen mellem bestanddelene og analysetiden stort set af bæregassens hastighed i kolonnen. Derfor vil det være nødvendigt at optimere driftsbetingelserne ved at justere dette parameter (eller, enklere, ved at mindske trykket ved kolonnetoppen) afhængig af, om formålet er at forbedre adskillelsen eller at foretage analysen hurtigere.

Følgende betingelser har vist sig at være velegnede til adskillelse af fedtsyremethylestere (C4 til C26). I tillæg B er der vist eksempler på kromatogrammer:







Injektortemperatur: 250 °C Detektortemperatur: 250 °C Ovntemperatur: 165 °C (8 minutter) til 210 °C ved 2 °C/min Bæregas hydrogen: tryk ved kolonnetop: 179 kPa Samlet gennemstrømning: 154,0 ml/min. Splitforhold 1:100 Injektionsvolumen: 1 μl

4.1.2. Bestemmelse af opløsningen (se tillæg A)

Opløsningen R af de to ved siden af hinanden liggende toppe I og II beregnes ved hjælp af formlen:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) eller R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia)),

Eller

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), (BP (British Pharmacopeia))

hvor:

d r(I) er retentionsafstanden for top I

d r(II) er retentionsafstanden for top II

t r(I) er retentionstiden for top I

t r(II) er retentionstiden for top II

ω(I) er bredden på basen af top I

ω(II) er bredden på basen af top II

ω0,5 er bredden på toppen af den angivne forbindelse, ved midten af toppen

Hvis ω(I) ≈ ω(II), beregnes R efter følgende formel:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

hvor:

σ er standardafvigelsen (se tillæg A, figur 1).

Hvis afstanden dr mellem de to toppe d r(II) - d r(I) er lig med 4σ, er opløsningsfaktoren R = 1.

Hvis to toppe ikke er fuldstændig adskilt, skærer tangenterne til de to toppes inflektionspunkter hinanden i punkt C. For at adskille de to toppe fuldstændigt, skal afstanden mellem de to toppe være lig med:

d r(II) - d r(I) = 6 σ som giver R = 1,5 (se tillæg A, figur 3).

5. ANGIVELSE AF RESULTATER

5.1. Kvalitativ analyse

Prøvens methylestertoppe identificeres ud fra kromatogrammet i tillæg B, figur 1, om nødvendigt ved interpolation eller ved sammenligning af dem med referenceblandingen af methylestere (som beskrevet i 2.3).

5.2. Kvantitativ analyse

5.2.1. Bestemmelse af sammensætningen

Massefraktionen, w i , for hver fedtsyremethylester, udtrykt i vægtprocent af methylestere beregnes som følger:

5.2.2. Beregningsmetode

5.2.2.1. Generelt

Indholdet af en given bestanddel i, udtrykt i vægtprocent methylestere, beregnes ved, at man bestemmer den procentdel, som den tilsvarende tops areal udgør i forhold til summen af arealerne af samtlige toppe, ud fra følgende formel:

wi = (Ai/ΣA) × 100

hvor:

Ai er arealet under toppen af den enkelte fedtsyremethylester i

ΣA er summen af arealerne under toppene af alle de enkelte fedtsyremethylestere.

Resultaterne angives med to decimaler.

Note 4: For fedtstoffer og olier er massefraktionen af fedtsyremethylestere lig med massefraktionen af triacylglycerolerne i gram pr. 100 g. I de tilfælde, hvor man ikke kan arbejde med denne antagelse, henvises til 5.2.2.2.

5.2.2.2. Anvendelse af korrektionsfaktorer

I visse tilfælde, f.eks. ved tilstedeværelse af fedtsyrer med mindre end otte kulstofatomer eller syrer med andre funktionelle grupper, korrigeres arealerne med specifikke korrektionsfaktorer (Fci). Disse faktorer bestemmes for hvert enkelt instrument. Til dette formål anvendes dertil egnede referencematerialer med certificeret fedtsyresammensætning i det tilsvarende interval.

Note 5: Disse korrektionsfaktorer er ikke identiske med de teoretiske korrektionsfaktorer ved brug af flammeionisationsdetektor, som er angivet i tillæg A, da de også omfatter injektionssystemets ydelse m.m. I tilfælde af væsentlige forskelle bør hele systemets ydelse kontrolleres.

For denne referenceblanding udtrykkes vægtprocenten af FAME i ud fra formlen:

wi = (mi /Σ m) × 100

hvor:

m i er massen af FAME i i referenceblandingen

Σm er summen af masserne af referenceblandingens forskellige bestanddele som fedtsyremethylestere.

Ud fra referenceblandingens kromatogram beregnes arealprocenten for FAME i som følger:

wi = (Ai/ΣA) × 100

hvor:

Ai er arealet af FAME i i referenceblandingen

ΣA er summen af alle arealer af alle fedtsyremethylestere i referenceblandingen.

Korrektionsfaktoren Fc er så

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

For prøven er vægtprocenten for hver FAME i:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Resultaterne angives med to decimaler.

Note 6: Den beregnede værdi svarer til vægtprocenten af den enkelte fedtsyre beregnet som triacylglyceroler pr. 100 g fedtstof.

5.2.2.3. Anvendelse af en intern standard

I forbindelse med visse analyser (f.eks. når det ikke er alle fedtsyrerne, der er elueret, som det er tilfældet, når syrer med fire og seks kulstofatomer er til stede sammen med syrer med 16 og 18 kulstofatomer, eller når det er nødvendigt at bestemme den absolutte mængde af en fedtsyre i en prøve), er det nødvendigt at anvende en intern standard. Der benyttes ofte fedtsyrer med 5, 15 eller 17 kulstofatomer. Den eventuelle korrektionsfaktor for den interne standard bestemmes.

Vægtprocenten af bestanddel i, udtrykt som methylestere, bestemmes ud fra formlen:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

hvor:

A i er arealet af FAME i

A IS er arealet af den interne standard

F i er korrektionsfakto