1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91
af 11. juli 1991
om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte
metoder
(EFT L 248 af 5.9.1991, s. 1)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1 Kommissionens forordning (EØF) nr. 3682/91 af 17. december 1991 L 349 36 18.12.1991
►M2 Kommissionens forordning (EØF) nr. 1429/92 af 26. maj 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3 Kommissionens forordning (EØF) nr. 1683/92 af 29. juni 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4 Kommissionens forordning (EØF) nr. 1996/92 af 15. juli 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5 Kommissionens forordning (EØF) nr. 3288/92 af 12. november 1992 L 327 28 13.11.1992
►M6 Kommissionens forordning (EØF) nr. 183/93 af 29. januar 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 ændret ved Kommissionens forordning (EØF) nr. 826/93 af 6. april
1993L 87 6 7.4.1993
►M8 Kommissionens forordning (EØF) nr. 620/93 af 17. marts 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9 Kommissionens forordning (EF) nr. 177/94 af 28. januar 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10 Kommissionens forordning (EF) nr. 2632/94 af 28. oktober 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11 kommissionens forordning (EF) nr. 656/95 af 28. marts 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12 Kommissionens forordning (EF) nr. 2527/95 af 27. oktober 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13 Kommissionens forordning (EF) nr. 2472/97 af 11. december 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14 Kommissionens forordning (EF) nr. 282/98 af 3. februar 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15 Kommissionens forordning (EF) nr. 2248/98 af 19. oktober 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16 Kommissionens forordning (EF) nr. 379/1999 af 19. februar 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17 Kommissionens forordning (EF) nr. 455/2001 af 6. marts 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18 Kommissionens forordning (EF) nr. 2042/2001 af 18. oktober 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19 Kommissionens forordning (EF) nr. 796/2002 af 6. maj 2002 L 128 8 15.5.2002
►M20 Kommissionens forordning (EF) nr. 1989/2003 af 6. november 2003 L 295 57 13.11.2003
Berigtiget ved:
►C1 Berigtigelse, EFT L 176 af 20.7.1993, s. 26 (183/93)
▼B
KOMMISSIONENS FORORDNING (EØF) Nr. 2568/91
af 11. juli 1991
om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i
den forbindelse anvendte metoder
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det EuropæiskeØkonomiske Fællesskab,
under henvisning til Rådets forordning nr. 136/66/EØF af 22.
september 1966 om oprettelse af en fælles markedsordning for fedt-stoffer (
1), senest ændret ved forordning (EØF) nr. 3577/90 (2), særlig
artikel 35a, og
ud fra følgende betragtninger:I bilaget til forordning nr. 136/66/EØF er der fastsat betegnelser for og
definitioner på olivenolie og olie af olivenpresserester, der afsættes i deenkelte medlemsstater, isamhandelen mellem medlemsstaterne og i
samhandelen mellem medlemsstaterne og tredjelande;
for at kunne skelne mellem de forskellige typer olie er det nødvendigt
at definere de fysisk-kemiske kendetegn for hver type samt de organo-
leptiske kendetegn for jomfruolie, således at produkternes renhed ogkvalitet sikres uden at dette berører andre eksisterende bestemmelserpå området;
kendetegnene for de forskellige typer olie bør fastlægges ensartet for
hele Fællesskabet; med henblik herpå bør der fastlægges EF-metoderfor kemisk analyse og orgenoleptisk vurdering; i en overgangsperiodebør medlemsstaterne dog kunne anvende andre metoder, idet det dog
skal fastsættes, at det er resultatet af den fælles metode, der gælder i
tilfælde af uoverensstemmelse;
definitionen af de fysisk-kemiske kendetegn for olivenolie og analyse-
metoder indebærer, at de supplerende bestemmelser til kapitel 15 i DenKombinerede Nomenklatur skal tilpasses;
som led i metoden til bedømmelse af jomfruolies organoleptiske kende-
tegn skal der oprettes paneler af udvalgte og øvede smagsdommere; derbør afsættes den fornødne tid til etablering af en sådan struktur; ibetragtning af de vanskeligheder, som visse medlemsstater vil få medat oprette panelerne, bør det tillades disse medlemsstater at benytte de
iandre medlemsstater eksi sterende paneler;
for at ordningen med importafgift på olivenpresserester kan fungere
efter hensigten bør der fastlægges en fælles metode til bestemmelse af
olieindholdet i disse produkter;
for ikke at påføre handelen skade, bør det fastsættes, at det i en
begrænset periode er tilladt at afsætte olie aftappet før denne forord-nings ikrafttræden;
Kommissionens forordning (EØF) nr. 1058/77 (
3), senest ændret ved
forordning (EØF) nr. 1858/88 (4), bør ophæves;
Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer har ikke afgivet udtalelse inden
for den af formanden fastsatte frist —1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 2
(1) EFT nr. 172 af 30. 9. 1966, s. 3025/66.
(2) EFT nr. L 353 af 17. 12. 1990, s. 23.
(3) EFT nr. L 128 af 24. 5. 1977, s. 6.
(4) EFT nr. L 166 af 1. 7. 1988, s. 10.
▼B
UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:
Artikel 1
1. Som jomfruolie efter punkt 1, litra a) og b), i bilaget til forord-
ning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis respektive kendetegn er ioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt 1 og 2 ibi lag I ti l nærvæ-rende forordning.
2. Som bomolie efter punkt 1, litra c), i bilaget til forordning nr.
136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse medkendetegnene i punkt 3 i bilag I til nærværende forordning.
3. Som raffineret olivenolie efter punkt 2 i bilaget til forordning nr.
136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med
kendetegnene i punkt 4 i bilag I til nærværende forordning.
4. Som olivenolie bestående af raffineret olivenolie og jomfruolier
efter punkt 3 i bilaget til forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie,hvi s kendetegn er ioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt 5 i
bilag I til nærværende forordning.
5. Som rå olie af olivenpresserester efter punkt 4 i bilaget til forord-
ning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er ioverensstemmelse med kendetegnene ipunkt 6 ibi lag I ti l nærværendeforordning.
6. Som raffineret olie af olivenpresserester efter punkt 5 i bilaget til
forordning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i overens-stemmelse med kendetegnene ipunkt 7 ibi lag I ti l nærværendeforordning.
7. Som olie af olivenpresserester efter punkt 6 i bilaget til forord-
ning nr. 136/66/EØF betragtes olie, hvis kendetegn er i
overensstemmelse med kendetegnene ipunkt 8 ibi lag I ti l nærværendeforordning.
Artikel 2
1. Bestemmelsen af kendetegnene for de i bilag I fastsatte olier sker
ved hjælp af følgende analysemetoder:
— til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre,
metoden ibi lag II
— til bestemmelse af peroxidtallet, metoden i bilag III
— til bestemmelse af indholdet af voks: metoden i bilag IV
— til bestemmelse af indholdet af steroler, metoden i bilag V
— til bestemmelse af indholdet af erytrodiol og uvaol, metoden i bilag
VI
— til bestemmelse af indholdet af mættede fedtsyrer i 2-stillingen i
triglycerider, metoden i bilag VII
— til den spektrofotometriske undersøgelse, metoden i bilag IX
— til bestemmelse af fedtsyrernes sammensætning, metoden i bilag X
Ao gXB
— til bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløsnings-
midler, metoden i bilag XI
— til bestemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn, metoden i
bilag XII, anvendt som omhandlet i stk. 21991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 3
▼M20
▼B
▼M19
▼B
▼M20
▼B
▼M20
▼M11
— til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener, metoden i bilag
XVII
— til bestemmelse af indholdet af ECN42-holdige triglycerider,
metoden ibi lag XVIII
— til bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer: metoden i bilag
XIX.
2. Den kontrol, som de nationale myndigheder eller deres repræsen-
tanter foretager af de organoleptiske kendetegn for jomfruolie,
gennemføres af paneler af smagere, som medlemsstaterne hargodkendt.
De organoleptiske kendetegn for en i første afsnit omhandlet olivenolie
anses for at stemme overens med den anmeldte type olivenolie, hvis et
af den pågældende medlemsstat godkendt panel bekræfter klassifikati-
onen iden henseende.
Hvis det godkendte panel ikke bekræfter anmeldelsen med hensyn til
de organoleptiske kendetegn for den anmeldte type olivenolie, lader
de nationale myndigheder eller deres repræsentanter på den berørte
parts anmodning foretage to kontrolanalyser, som udføres af andregodkendte paneler, og hvoraf mindst den ene udføres af et panel, derer godkendt af den pågældende producentmedlemsstat. De pågældendekendetegn anses for at stemme overens med dem, der er anmeldt, hvisde to kontrolanalyser bekræfter den anmeldte klassifikation. I modsat
fald pålægges kontrolanalyseudgifterne den berørte part, uden at dette
foregriber anvendelsen af sanktioner.
3. Hvad angår de nationale myndigheders eller deres repræsentanters
kontrol af oliens kendetegn som omhandlet i stk. 1 udtages der prøverefter de internationale standarder EN ISO 661 og EN ISO 5555 forforberedelse af prøver til forsøg og prøveudtagning. Uanset punkt 6.8i standard EN ISO 5555 udtages prøverne i henhold til bilag Ia til
denne forordning for partier af den nævnte olie i umiddelbare embal-
lager på 100 liter eller derunder.
Med forbehold af bestemmelserne istandard EN ISO 5555 og kapi tel 6
i standard ISO 661 beskyttes prøverne hurtigst muligt mod lys og stærkvarme og sendes til laboratoriet til analyse senest:
— den tiende arbejdsdag efter udtagningsdagen i månederne oktober-
maj, og
— den femte arbejdsdag efter udtagningsdagen i månederne juni-
september.
4.►
M20 Med hensyn til kontrollen i stk. 3 foretages analyserne i
bilag II, III, IX, X og XII samt eventuelle kontrolanalyser, der er fastsatved national lov, inden datoen for mindste holdbarhed. Udtages
prøverne mere end fire måneder før sidste holdbarhedsdato, foretages
analyserne senest fire måneder efter prøveudtagningen. Der gælderingen frister for de øvrige analyser, som er fastsat vedforordningen. ◄
Svarer analyseresultaterne ikke til kendetegnene for den anmeldte kate-
gori olivenolie eller olie af olivenpresserester, underrettes denpågældende herom senest en måned inden udløbet af fristen i førsteafsnit, undtagen hvis prøveudtagningen fandt sted mindre end enmåned inden datoen for mindste holdbarhed.
5. Til bestemmelse af olivenoliernes kendetegn efter metoderne
omhandlet i stk. 1 sammenlignes analyseresultaterne direkte med de idenne forordning fastsatte grænseværdier.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 4
▼M13
▼M19
▼M17
▼M19
▼M17
▼M19
▼M20
Artikel 2a
De nationale myndigheders eller deres repræsentanters kontrol af, om
en prøve af olivenolie og olie af olivenpresserester svarer til den
anmeldte kategori, kan enten foregå ved:
a) at analyserne i bilag I udføres i vilkårlig rækkefølge, eller
b) at analyserne udføres iden rækkefølge, der er angi vet ibeslutni ngs-
skemaet i bilag Ib, indtil en af beslutningerne i samme skema
træffes.
Artikel►M193◄
Konstateres det, at en olies organoleptiske kendetegn er forskellige fra
dem, der følger af dens benævnelse, anvender medlemsstaten admini-strative bøder, hvis størrelse afhænger af den konstateredeuregelmæssigheds omfang, uden at dette i øvrigt udelukker eventuelleandre sanktioner.
Ved vurderingen af uregelmæssigheden tages der hensyn til den natur-
lige udvikling i kendetegnene for en olie, der er opbevaret under
normale vilkår.
I begyndelsen af hvert halvår underretter medlemsstaterne om antallet
og arten af konstaterede uregelmæssigheder og de sanktioner, der eranvendt idet foregående halvår.
Artikel 4
1. Med henblik på de nationale myndigheders eller deres repræsen-
tants vurdering og kontrol af de organoleptiske kendetegn kanmedlemsstaterne godkende paneler af smagere.
Godkendelsesbetingelserne fastlægges af medlemsstaterne, således at
bl.a.
— betingelserne i bilag XII, punkt 4, opfyldes
— det sikres, at panelets leder optrænes af en virksomhed og på betin-
gelser, som er anerkendt af medlemsstaten iden henseende
— godkendelsens gyldighed gøres afhængig af de resultater, der opnås
ved en årlig kontrolordning, som medlemsstaten har oprettet.
Hver medlemsstat meddeler Kommissionen listen over godkendte
paneler og de foranstaltninger, der er truffet i henhold til dette stykke.
2. Hvis en medlemsstat har vanskeligheder med at oprette et panel
på sit område, kan den gøre brug af et godkendt panel i en andenmedlemsstat.
3. Hver medlemsstat opstiller en liste over de paneler af smagsdom-
mere, der er oprettet af erhvervs- eller brancheorganisationer på de i
stk. 1 fastsatte betingelser, og de kontrollerer, at disse betingelser over-
holdes.
Artikel 6
1. Olieindholdet i presserester og andre restprodukter fra udvinding
af olivenolie (KN-kode 2306 90 11 og 2306 90 19) bestemmes eftermetoden ibi lag XV.
2. Det i stk. 1 omhandlede olieindhold udtrykkes i vægtprocent af
tørstoffet.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 5
▼M19
▼M5
▼M19
▼M5
▼M19
▼B
▼M20
Artikel 7
EF-bestemmelserne om forekomst af forurenende stoffer finder anven-
delse.
Hvad indholdet af halogenerede opløsningsmidler angår, gælder
følgende grænseværdier for alle kategorier af olivenolie:
— Maksimalt indhold af hvert påvist halogeneret opløsningsmiddel:
0,1 mg/kg
— Maksimalt samlet indhold af påviste halogenerede opløsnings-
midler: 0,2 mg/kg.
Artikel 8
1. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen, hvilke foranstaltninger
de træffer til anvendelse af denne forordning.
2. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen i begyndelsen af hvert
halvår en oversigt over analyseresultaterne i forbindelse med de
bestemmelser, der er foretaget iløbet af det foregående halvår.
Resultaterne gennemgås af Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer efter
proceduren iarti kel 39 iforordni ng nr. 136/66/EØF.
Artikel 9
Forordning (EØF) nr. 1058/77 ophæves.
Artikel 10
1. Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggø-
relsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende .
Metoden ibi lag XII anvendes dog fra den ►M11. november
1992◄, undtagen i forbindelse med interventionsforanstaltninger.
Metoden anvendes ikke for jomfruolie, der er aftappet før den 1.
november 1992.
2. Denne forordning anvendes ikke for olivenolie og olie af oliven-
presserester, der aftappes inden datoen for denne forordningsikrafttræden, og som bringes i handelen inden den 31. oktober 1992.
Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart
ihver medlemsstat.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 6
▼B
▼M5
▼B
▼B
BILAG
Resumé
Bilag I: Karakteristika ved olivenolie
Bilag Ia: Prøveudtagning for partier af olivenolie eller olie af oliven-
presserester i umiddelbare emballager på højst 100 liter
Bilag Ib: BeslutningsskemaBilag II: Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer
Bilag III: Bestemmelse af peroxidtallet
Bilag IV: ►
M6Bestemmelse af voksindhold ved gaskramatografering
med kapillarkolonne ◄
Bilag V: Bestemmelse af sammensætningen og indholdet af steroler
ved gaskromatografipå kapi llarsøjle
Bilag VI: Bestemmelse af erythrodiol og uvaol
Bilag VII: Bestemmelse af fedtsyrer i 2-positionen i triglycerider fra
olier og fedtstoffer
Bilag IX: Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys
Bilag XA: Gaskromatografering af fedtsyremethylestere
Bilag XB: Fremstilling af fedtsyremethylestere
Bilag XI: Bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede opløs-
ningsmidler i olivenolie
Bilag XII: Organoleptisk vurdering af jomfruolie
Bilag XV: Olieindhold i presserester af olivenBilag XVI: Bestemmelse af iodtal
Bilag XVII: Metode til bestemmelse af indholdet af stigmastadiener i
vegetabilske olier
Bilag XVIII: Bestemmelse af indholdet af ECN42-holdige triglycerider
Bilag XIX: Metode til bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 7
▼M17
▼M20
▼B
▼M20
▼B
▼M20
▼M19
▼B
▼M11
▼M13
▼M19
BILAG I
KENDETEGN FOR OLIVENOLIE
KategoriSurhedsgrad
(%)
(*)Peroxidtal
mEq 02/kg
(*)Voks mg/kg
(**)Mættede syrer
i 2-position i
triglyceridet
(%)Stigmastadien
mg/kg (1)Forskel
mellem HPLC
og ECN42,
teoretisk
beregnetK232(*) K270(*) Delta-K (*)Organoleptisk
vurdering
Median for
mangler (Md)
(*)Organoleptisk
vurdering
Median for
lugt og smag
(Mf) (*)
1. Ekstra jomfruolie ≤0,8 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,22 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Jomfruolie ≤2,0 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Bomolie > 2,0 — ≤300 (3) ≤1,5 ≤0,50 ≤0,3 — — — Md > 2,5 (2)—
4. Raffineret olivenolie ≤0,3 ≤5 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤1,10 ≤0,16 — —
5. Olivenolie bestående af
raffinerede olivenolier og
jomfruolier ≤1,0 ≤15 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤0,90 ≤0,15 — —
6. Rå olie af olivenpressere-
ster — — > 350 (4) ≤2,2 — ≤0,6 — — — — —
7. Raffineret olie af oliven-
presserester ≤0,3 ≤5 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤2,00 ≤0,20 — —
8. Olie af olivenpresserester ≤1,0 ≤15 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤1,70 ≤0,18 — —
(1) Summen af isomerer, der eventuelt kan adskilles på kapillarsøjle.
(2) Eller hvis medianen for mangler er 2,5 eller derunder, og medianen for lugt og smag er 0.
(3) Olier med et voksindhold på mellem 300 mg/kg og 350 mg/kg betragtes som bomolie, hvis det samlede indhold af alifatisk alkohol er på 350 mg/kg eller der under, eller hvis indholdet af erytrodiol og uvaol er på 3,5 % eller
derunder.
(4) Olier med et voksindhold på mellem 300 mg/kg og 350 mg/kg betragtes som rå olie af olivenpresserester, hvis det samlede indhold af alifatisk alkohol e r på over 350 mg/kg, og hvis indholdet af erytrodiol og uvaol er på over
3,5 %.▼M201991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 8
KategoriFedtsyreindhold (1)
Summen
af
isomerer
af trans-
oliesyrer
(%)Summen
af
isomerer
af transli-
nolsyre
og trans-
linolen-
syre
(%)Sterolsammensætning
Steroler i
alt
(mg/kg)Erytrodio
og uvaol
(%) (**)Myristin
(%)Linolen
(%)Arachin
(%)Eicosan
(%)Behen
(%)Ligno-
cerin
(%)Kole-
sterol
(%)Brassica-
sterol
(%)Campe-
sterol
(%)Stigma-
sterol
(%)Betasito-
sterol
(%) (2)Delta-7-
stigma-
stenol
(%)
1. Ekstra jomfru-
olie ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Jomfruolie ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Bomolie ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (3)
4. Raffineret
olivenolie ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
5. Olivenolie
bestående af
raffinerede olive-
nolier og
jomfruolier ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Rå olie af
olivenpressere-
ster ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5 (4)
7. Raffineret olie af
olivenpressere-
ster ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
8. Olie af oliven-
presserester ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Indhold af andre fedtsyrer (%): palmitinsyre: 7,5-20,0; palmitolsyre: 0,3-3,5; heptadecansyre: ≤; heptadecensyre: ≤0,3; stearinsyre: 0,5-5,0; oliesyre: 55,0-83,0; linolsyre: 3,5-21,0
(2) Summen af: delta-5-23-stigmastadienol + klerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5-24-stigmastadienol.
(3) Olier med et voksindhold på mellem 300 mg/kg og 350 mg/kg betragtes som bomolie, hvis det samlede indhold af alifatisk alkohol er på 350 mg/kg eller der under, eller hvis indholdet af erytrodiol og uvaol er på 3,5 % eller
derunder.
(4) Olie med et voksindhold på mellem 300 mg/kg og 350 mg/kg betragtes som rå olie af olivenpresserester, hvis det samlede indhold af alifatisk alkohol er på over 350 mg/kg, og hvis indholdet af erytrodiol og uvaol er på over
3,5 %.
Bemærkninger:
a) Analyseresultaterne skal anføres med lige så mange decimaler som dem, der er angivet for hvert kendetegn. Sidste ciffer skal forhøjes med en enhed, hvis det følgende ciffer er større end 4.
b) Hvis de fastsatte grænseværdier overskrides for blot ét kendetegn, klassificeres olien i en anden kategori eller erklæres for ikke at opfylde renh edskravene.
c) Hvis et kvalitetskendetegn er mærket med en asterisk (*), betyder det:
— for bomolie, at de pågældende grænseværdier ikke alle skal være opfyldt samtidig
— for jomfruolie, at olien skal klassificeres i en anden kategori, hvis blot én af disse grænseværdier ikke er opfyldt, men at den fortsat skal klassifi ceres i en af kategorierne for jomfruolie.
d) Hvis et kvalitetskendetegn er mærket med to asterisker (**), betyder det, at for alle de pågældende olier af olivenpresserester behøver alle græns eværdier ikke være opfyldt samtidig.▼M201991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 9
▼M20
BILAG Ia
Udtagning af prøver af partier af olivenolie eller olie af olivenpresserester
leveret i umiddelbare emballager på højst 100 liter
Denne prøveudtagningsmetode anvendes for partier af olivenolie eller olie af
olivenpresserester på højst 125 000 liter, aftappet i umiddelbare emballager på
højst 100 liter.
Hvis leverancen er på over 125 000 liter, opdeles den i partier på 125 000 liter
eller derunder. Hvis leverancen er på under 125 000 liter, udgør den ét parti.
Metoden anvendes da for hvert parti.
Ud fra partiets størrelse fastsættes det mindste antal basisprøver, der skal
udtages, jf. tabellen ipunkt 1.
Basisprøvens størrelse bestemmes ud fra de umiddelbare emballagers indhold, jf.
tabellen ipunkt 2.1.
Leverancer, basisprøver og laboratorieprøver svarer til definitionerne i EN ISO
5555.
Ved »parti« forstås de salgsenheder, der produceres, fremstilles og aftappes
under sådanne forhold, at olien i alle disse salgsenheder anses for homogen
med hensyn til alle analysekendetegn.
1. ANTAL BASISPRØVER
Det mindste antal basisprøver, der skal udtages, fastsættes på grundlag af
partiets størrelse som vist i nedenstående tabel:
Parti (liter) på under Mindste antal basisprøver
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Til basisprøven udvælges umiddelbare emballager, som står ved siden af
hinanden i partiet.
I tvivlstilfælde kan medlemsstaterne forøge det antal basisprøver, der skal
udtages.
2. BASISPRØVENS INDHOLD
2.1En basisprøve omfatter følgende:
Hvis de umiddelbare emballager inde-
holder:tages basisprøven af olien i:
a) 5 liter eller derover a) 3 umiddelbare emballager
b) 3 liter eller derover, men under
5 literb) 3 umiddelbare emballager
c) 2 liter eller derover, men under 3
literc) 3 umiddelbare emballager
d) 1 liter eller derover, men under
2 literd) 6 umiddelbare emballager
e) 0,75 liter eller derover, men
under 1 litere) 6 umiddelbare emballager
f) under 0,75 liter f) 3 gange olien i det mindste antal
emballager, hvis samlede indhold
overstiger 1,5 liter1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 10
▼M20
2.2Basisprøverne skal opbevares i de umiddelbare emballager indtil det
tidspunkt, hvor analyserne foretages. Olien i basisprøverne opdeles
derpå i givet fald i tre laboratorieprøver med henblik på at foretage:
a) analyserne ibi lag II, III, IX og X
b) analysen ibi lag XII
c) de øvrige analyser.
2.3Emballager, der udgør en basisprøve, opdeles efter de kontrolproce-
durer, der er fastsat i de nationale lovgivninger.
3. ANALYSER OG RESULTATER
a) Hver basisprøve som omhandlet i punkt 1 opdeles i laboratorieprøver, jf.
punkt 2.5 i standard EN ISO 5555, med henblik på at blive underkastet
følgende analyser:
— bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, jf. artikel 2, stk. 1, første
led
— bestemmelse af peroxidtallet, jf. artikel 2, stk. 1, andet led
— spektrofotometrisk undersøgelse, jf. artikel 2, stk. 1, ottende led— fedtsyrernes sammensætning, jf. artikel 2, stk. 1, niende led.
b) Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra a), for mindst en af basisprøverne
fra samme parti ikke svarer til kendetegnene for den anmeldte oliekate-gori, anses hele det pågældende parti for ikke at opfylde kravene.
Hvis analyseresultaterne, jf. litra a), for hver af basisprøverne fra samme
parti ikke alle er homogene under hensyntagen til repeterbarheden af de
pågældende metoder, anses hele partiet for at være uhomogent, og hver
basisprøve skal underkastes de øvrige foreskrevne analyser. I modsat
fald skal kun en af basisprøverne fra dette parti underkastes de fore-
skrevne analyser.
c) Hvis et af analyseresultaterne, jf. litra b), andet afsnit, ikke svarer til
kendetegnene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende
partifor i kke at opfylde kravene.
Hvis alle analyseresultaterne, jf. litra b), andet afsnit, svarer til kendeteg-
nene for den anmeldte oliekategori, anses hele det pågældende parti for
at opfylde kravene.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 11
▼M20
BILAG Ib
BESLUTNINGSSKEMA TIL KONTROL AF, OM EN OLIVENOLIE-
PRØVE SVARER TIL DEN ANMELDTE KATEGORI
Analyse af, om en olivenolie eller olie af olivenpresserester svarer til den
anmeldte kategori, kan foretages:
a) enten ved i vilkårlig rækkefølge at udføre de analyser, der er fastsat til
kontrol af, at de ibi lag I fastsatte kendetegn er overholdt
b) eller ved iden ibeslutni ngsskemaet fastsatte rækkefølge at udføre de deri
fastsatte analyser, indtil man når frem til en af de i skemaet nævnte beslut-
ninger.
De analyser vedrørende forurenende stoffer, der er nødvendige for at fastslå, om
et produkt overholder EF's normer, udføres særskilt.
Beslutningsskemaet skal anvendes for alle kategorier af olivenolie og olie af
olivenpresserester. Det består af tabeller med numrene 1 til 11, der skal
anvendes som foreskrevet og iden ioversi gtstabellen angi vne rækkefølge
afhængigt af, hvilken kategori olie der er anmeldt.
Oversigtstabellen og tabel 1 til 11 læses som følger:
— En dobbelt linje (=) angiver den vej, der skal følges i tilfælde af overens-
stemmelse (positivt svar) med betingelserne i den foregående rubrik; en
stiplet linje (…) angiver omvendt, hvilken vej der skal følges i tilfælde af
manglende overensstemmelse.
— Overskrifterne i rubrikkerne i tabel 1 til 11 vedrører de i denne forordning
fastsatte analyser på grundlag af de sammenligninger, der er nævnt i tillæg
1 til dette bilag.
— Referencebogstaverne i cirklerne for negativ beslutning i tabel 1 til 11 svarer
til de vejledende oplysninger, der er nævnt i tillæg 2 til dette bilag. De inde-
bærer ikke i sig selv nogen forpligtelse til at fortsætte analyserne eller
sikkerhed for de nævnte formodninger.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 12
▼M20
Oversigtstabel1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 13

▼M20
Tabel 11991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 14

▼M20
Tabel 21991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 15

▼M20
Tabel 31991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 16

▼M20
Tabel 41991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 17

▼M20
Tabel 51991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 18

▼M20
Tabel 61991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 19

▼M20
Tabel 71991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 20

▼M20
Tabel 81991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 21

▼M20
Tabel 91991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 22

▼M20
Tabel 101991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 23

▼M20
Tabel 111991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 24

▼M20
Tillæg 1
Overensstemmelse mellem bilagene til denne forordning og de i beslutningsskemaet nævnte
analyser
— Syreindhold Bilag II Bestemmelse af indhold af frie fedt-
syrer
— Peroxidtal Bilag III Bestemmelse af peroxidtal
— Spektrofotometrived ultravi olet
lysBilag IX Spektrofotometrisk analyse
— Organoleptisk vurdering Bilag XII Organoleptisk vurdering af jomfru-
olie
— Stigmasta-3,5-dien Bilag XVII Metode til bestemmelse af indhold af
stigmastadiener i vegetabilske olier
— Transisomerer i fedtsyrer Bilag X a og Gaskromatografianalyse af fedtsyre-
methylestere
Bilag X b Forberedelse af fedtsyremethylestere
— Sammensætning af fedtsyrer Bilag X a og Gaskromatografianalyse af fedtsyre-
methylestere
Bilag X b Forberedelse af fedtsyremethylestere
—∆ECN42 Bilag XVIII Bestemmelse af sammensætning af
triglycerider i ECN42 (forskel
mellem faktisk og teoretisk sammen-
sætning)
— Sammensætning af steroler og
steroler ialtBilag V Bestemmelse af sammensætning og
indhold af steroler ved gaskromato-
grafipå kapi llarsøjle
— Erytrodiol og uvaol Bilag VI Bestemmelse af indhold af erytrodiol
og uvaol
— Voks Bilag IV Bestemmelse af voksindhold ved
gaskromatografipå kapi llarsøjle
— Alifatiske alkoholer Bilag XIX Bestemmelse af indhold af alifatiske
alkoholer ved gaskromatografipå
kapillarsøjle
— Mættede fedtsyrer i 2-position Bilag VII Bestemmelse af indhold af mættede
fedtsyrer i 2-position af triglycerider1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 25
▼M20
Tillæg 2
Tabel 1
a) Se jomfruolie eller bomolie ( tabel 2 : kvalitetskriterier eller tabel 4 : kvalitets-
og renhedskriterier)
b) Se bomolie ( tabel 4 : kvalitets- og renhedskriterier)
Tabel 2
a) Se bomolie ( tabel 4 : kvalitets- og renhedskriterier)
b) Se jomfruolie ekstra ( tabel 1 : kvalitetskriterier)
Tabel 3
a) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)
b) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester
Tabel 4
a) Se jomfruolie ekstra og jomfruolie ( tabel 1 og 2 : kvalitetskriterier)
b) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)
c) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester
d) Tilstedeværelse af forestrede olier
Tabel 7
a) Tilstedeværelse af olivenolie af presserester
b) Tilstedeværelse af forestrede olier
Tabel 8
a) Tilstedeværelse af raffineret olie (oliven- eller anden olie)
b) Se bomolie ( tabel 4 : kvalitets- og renhedskriterier)
c) Tilstedeværelse af forestrede olier
Tabel 11
a) Tilstedeværelse af forestrede olier1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 26
▼B
BILAG II
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FRIE FEDTSYRER
1. FORMÅL
Bestemmelse af frie fedtsyrer i olivenolie. Indholdet af frie fedtsyrer
udtrykkes ved det vedtægtsmæssigt beregnede syreindhold.
1.1.Princip
En analyseprøve opløses i en blanding af opløsningsmidler, hvorefter de
tilstedeværende frie fedtsyrer bestemmes ved hjælp af en opløsning af
kaliumhydroxid i ethanol.
1.2.Reagenser
Samtlige reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet, og der
anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.
1.2.1. Dietyhlether/ethanol, 95 % (v/v), blandet i forholdet 1:1 efter rumfang.
Note: Dietylether er meget let antændelig og kan danne eksplosive pero-
xider. Under anvendelsen skal der træffes særlige forholdsregler.
Nøjagtigt på anvendelsestidspunktet neutraliseres med en opløsning af
kaliumhydroxid (1.2.2) ved tilstedeværelse af 0,3 ml phenolphtalein-
opløsning (1.2.3) pr. 100 ml blanding.
Note: Hvis det ikke er muligt at anvende diethylether, kan en blanding af
opløsningsmidler bestående af ethanol og toluen anvendes. Om
nødvendigt kan ethanolen erstattes af 2-propanol.
1.2.2. Indstillet opløsning af kaliumhydroxid i ethanol, c(KOH) ca. 0,1 mol/l
eller om nødvendigt c(KOH) ca. 0,5 mol/l.
Den nøjagtige koncentration af kaliumhydroxid-opløsningen i ethanol
skal være kendt og verificeres umiddelbart før brug. Der anvendes en
opløsning, der er fremstillet mindst fem dage før brugen, og dekanteret
over i en flaske af brunt glas, lukket med en gummiprop. Opløsningen
skal være farveløs eller strågul.
Note: En ufarvet stabil opløsning af kaliumhydroxid kan fremstilles på
følgende måde: 1 000 ml ethanol med 8 g kaliumhydroxid og
0,5 g aluminiumspåner bringes i kog og holdes kogende i 1 time
med tilbageløb. Derefter destilleres omgående, og den krævede
mængde kaliumhydroxid opløses i destillatet. Man lader opløs-
ningen henstå i flere dage og dekanterer derefter den øverste klare
væske fra bundfaldet af kaliumcarbonat.
Opløsingen kan også fremstilles uden destillation på følgende
måde: til 1 000 ml ethanol tilsættes 4 ml aluminiumbutylat, hvor-
efter man lader blandingen henstå i nogle dage. Derefter
dekanteres den klare væske fra, og heriopløses den krævede
mængde kaliumhydroxid. Denne opløsning er klar til brug.
1.2.3. Phenolphtalein, opløsning med 10 g/l i 95—96 % (v/v) ethanol, eller
alkaliblåt (i tilfælde af stærkt farvede fedtstoffer), opløsning med 20 g/l
i95—96 % (v/v) ethanol.
1.3.Apparatur
Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:
1.3.1. Analysevægt.1.3.2. 250 ml Erlenmeyer-kolbe.1.3.3. 10 ml burette med 0,05 ml inddelinger.
1.4.Fremgangsmåde
1.4.1. Forberedelse af analyseprøve
Analyseprøven forberedes ioverensstemmelse med NF T 60—200. (På
prøven som den er, hvis det samlede indhold af vand og urenheder ikke
overstiger 1 %, ellers på en filtreret prøve). Bestemmelsen foretages på
den filtrerede prøve. Hvis det samlede indhold af vand og urenheder er
under 1 %, foretages bestemmelsen på den ubehandlede prøve.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 27
▼B
1.4.2. Prøveudtagning
Ud fra det antagne syreindhold udtages en prøve efter angivelserne i
følgende tabel:
Antaget syreindhold
vægtprocentPrøvens masse
igPrøven afvejes med en
nøjagtighed
igp å
< 1 20 0,05
1— 4 10 0,02
4—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Prøven afvejes iErlenmeyer-kolben (1.3.2).
1.4.3. Bestemmelse
Prøven (1.4.2) opløses i50 — 150 ml af den på forhånd neutrali serede
blanding af diethylether/ethanol (1.2.1).
Under omrøring titreres med kaliumhydroxidopløsning, 0,1 mol/l (1.2.2)
(se note 2), indtil indikatoren slår om (den rosa farve af phenolphtalein
skal holde sig i mindst 10 sek.).
Note 1: Den indstillede opløsning af kaliumhydroxid i ethanol (1.2.2) kan
erstattes af en vandig opløsning af kaliumhydroxid eller natrium-
hydroxid, når den tilførte vandmængde ikke medfører
faseadskillelse.
Note 2: Hvis den nødvendige mængde 0,1 mol/l kaliumhydroxidopløs-
ning overstiger 10 ml, anvendes i stedet en opløsning på
0,5 mol/l.
Note 3: Bliver opløsningen uklar under titreringen, tilsættes så meget
opløsningsmiddelblanding (1.2.1), at opløsningen bliver klar.
1.5.Angivelse af syreindholdet i % oliesyre
Syreindholdet, udtrykt som vægtprocent =
V/C2c/C2M
1 000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
hvor:
V = rumfanget i ml af den forbrugte kaliumhydroxidopløsning
c = den nøjagtige koncentration i mol/l af den anvendte kaliumhydro-
xidopløsning
M = den molvægt i g/mol af syren, der er valgt til angivelse af resul-
tatet (Moliesyre= 282 g/mol)
m = analyseprøvens vægt igram.
Som resultat anvendes det aritmetiske gennemsnit ►M6af to
bestemmelser ◄.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 28
▼B
BILAG III
BESTEMMELSE AF PEROXIDTALLET
1. OMRÅDE
Denne standard beskriver en metode til bestemmelse af peroxidtallet for
olier og fedtstoffer.
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder anvendelse for animalske og vegetabilske olier og
fedtstoffer.
3. DEFINITION
Peroxidtallet angiver den mængde stoffer i prøven, udtrykt som milliækvi-
valenter aktivt oxygen pr. kg, som oxiderer kaliumiodid under de beskrevne
forsøgsbetingelser.
4. PRINCIP
Analyseprøven, opløst i en blanding af eddikesyre og chloroform,
behandles med en opløsning af kaliumiodid. Det frigjorte iod titreres med
en indstillet natriumthiosulfatopløsning.
5. APPARATUR
Alt udstyr skal være frifor reducerende og oxi derende stoffer.
Note: Sliboverflader må ikke indfedtes.
5.1. 3 ml glasske.
5.2. Kolber med slib og prop, på ca. 250 ml, som på forhånd tørres og fyldes
med ren, tør inert gas (nitrogen eller — helst — carbondioxid).
5.3. 25 eller 50 ml burette med 0,1 ml inddeling.
6. REAGENSER
6.1. Analyseren chloroform, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør
inert gas.
6.2. Analyseren iseddike, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, tør
inert gas.
6.3. Mættet vandig opløsning af kaliumiodid, fremstillet umiddelbart før brug
og fri for iod og iodater.
6.4. Natriumthiosulfat, 0,01 eller 0,002 N nøjagtigt indstillet vandig opløsning,
indstillet umiddelbart før brug.
6.5. Stivelsesopløsning, 10 g/l vandig opslæmning, fremstillet umiddelbart før
brug ud fra naturlig opløselig stivelse.
7. PRØVE
Prøven udtages og opbevares beskyttet mod lys, holdes nedkølet og opbe-
vares i fuldstændigt fyldte glasbeholdere, der er hermetisk tillukket med
slibpropper af glas eller korkpropper.
8. FREMGANGSMÅDE
Analysen udføres idi ffust dagslys eller ikunsti gt lys. I en glasske (5.1)
eller imangel heraf en kolbe (5.2) afvejes med en nøjagti ghed på 0,001 g
en prøvemængde ioverensstemmelse med følgende tabel, svarende ti l det
forventede peroxidtal:1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 29
▼B
Forventet perioxidtal
(meq O2/kg)Analyseprøvens vægt
(ig)
0 — 12 5,0 — 2,0
12 — 20 2,0 — 1,2
20 — 30 1,2 — 0,8
30 — 50 0,8 — 0,5
50 — 90 0,5 — 0,3
Proppen tages af en kolbe (5.2), og analyseprøven iglasskeen overføres ti l
kolben. Der tilsættes 10 ml chloroform (6.1), og analyseprøven opløses
hurtigt ved omrystning. Derefter tilsættes 15 ml eddikesyre (6.2), efterfulgt
af 1 ml kaliumiodidopløsning (6.3). Så sættes proppen hurtigt i, og der
omrystes i 1 min., hvorefter man lader kolben henstå i nøjagtigt 5 min. i
mørke ved en temperatur på 15 — 25º C.
Der tilsættes ca. 75 ml destilleret vand, og det frigjorte iod titreres med
natriumthiosulfatopløsning (6.4) (0,002 N opløsning for forventede værdier
under 12, og 0,01 N opløsning for forventede værdier over 12) under
kraftig omrystning og med anvendelse af stivelsesopløsning (6.4) som indi-
kator.
Der udføres to bestemmelser på samme analyseprøve.Samtidig udføres en blindprøve. Hvis resultatet af blindprøven overstiger
0,05 ml 0,01 N natriumthiosulfatopløsning (6.4), udskiftes de urene
reagenser.
9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Perioxidtallet (P.V.), udtrykt i milliækvivalenter aktivt oxygen pr. kg, er
givet ved formlen:
P:V:¼
V/C2T/C21 000
m
hvor:
V = antal ml forbrugt indstillet natriumthiosulfatopløsning (6.4) ved
analysen, korrigeret for resultatet af blindprøven
T = den nøjagtige normalitet af den anvendte natriumthiosulfatopløsning
(6.4),
m = analyseprøvens vægt ig.
Som resultat angives det aritmetiske gennemsnit af de to udførte bestem-
melser.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 30
▼M6
BILAG IV
BESTEMMELSE AF VOKSINDHOLD VED GASKROMATOGRAFE-
RING MED KAPILLARKOLONNE
1. FORMÅL
Metoden består af en procedure til bestemmelse af voksindholdet i visse
fedtstoffer og olier efter prøvebetingelserne.
Den er navnlig velegnet, når der skal skelnes mellem olivenolie, der er
udvundet ved presning, og olivenolie, der er udvundet ved ekstraktion.
2. PRINCIP
Der tilsættes en egnet intern standard til fedtstoffet eller olien, hvorefter
adskillelsen finder sted ved hjælp af kromatografering på en hydreret
kiselgelkolonne. Den fraktion, der først elueres under prøvebetingel-
serne, og som har lavere polaritet end triglyceriderne opsamles, og der
analyseres derefter direkte ved hjælp af gaskromtografering med kapil-
larkolonne.
3. APPARATUR
3.1. 25 ml Erlenmeyerkolbe.3.2. Glaskolonne til kromatografering, 15 mm indvendig diameter og højde
30-40 cm.
3.3. Gaskromatograf, der kan fungere med en kapillarkolonne, der er
udstyret med et system til direkte indsprøjtning i kolonnen, og som
består af følgende:
3.3.1. Ovn med termostat til kolonnerne, der kan holde den valgte temperatur
inden for ± 1 ºC.
3.3.2. Kold injektor til direkte indsprøjtning i kolonnen.3.3.3. Flammeioniseringsdetektor og konverter/forstærker.
3.3.4. Skriver/integrator, der kan fungere med konverter/-forstærkeren (3.3.3),
responstid under 1 sekund, med variabel papirhastighed.
3.3.5. Kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, ►
C110-15 m lang ◄,
0,25-0,32 mm indvendig diameter, coated med SE-52 eller SE-54 eller
tilsvarende i en ensartet lagtykkelse på 0,10-0,30 µm.
3.4. Mikrosprøjte på 10 µl med hærdet nål til direkte indsprøjtning i
kolonnen.
4. REAGENSER
4.1. Kiselgel, 70-230 mesh, artikel 7754 Merck.
Gelen anbringes i ovnen ved 500 ºC i fire timer. Henstilles til afkøling,
hvorefter der tilsættes 2 % vand. Der rystes omhyggeligt for at homo-
genisere opslæmning. Opbevares i mørke i mindst tolv timer inden
brug.
4.2. n-hexan til kromatografering.4.3. Ethylether til kromatografering.
4.4. n-heptan til kromatografering.
4.5. Standardopløsning af 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern stan-
dard).
4.6. Bæregas: hydrogen, ren, til gaskromatografering.4.7. Hjælpegasser:
— hydrogen, ren, til gaskromatografering
— luft, ren, til gaskromatografering.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 31
▼M6
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Adskillelse af voksfraktionen
5.1.1. Fremstilling af kromatografikolonnen.
15 g kiselgel tilsat 2 % vand opslæmmes i vandfri n-hexan og
indsprøjtes i kolonnen.
Hensættes til bundfældning. Fuldstændig bundfældning foretages ved
hjælp af en el-vibrator for at opnå større homogenitet. 30 ml n-hexan
filtreres for at fjerne eventuelle urenheder.
5.1.2. Kolonnekromatografi
Der afvejes nøjagtig 500 mg af prøven i en 25 ml kolbe og tilsættes en
passende mængde intern standard afhængig af det skønnede voksind-
hold, f.eks. tilsættes 0,1 mg laurylarachidat til presset olivenolie og
0,25-0,5 mg til ekstraheret olivenolie.
Den tilberedte prøve overføres til kromatografikolonnen, der er frem-
stillet efter 5.1.1, ved hjælp af to 2 ml portioner n-hexan.
Der aftappes opløsningsmiddel, indtil væskeoverfladen står 1 mm over
kolonnematerialet. Derefter startes elueringen. 140 ml af n-hexan/ethy-
letherblandingen opsamles i forholdet 99:1 med en hastighed på ca. 15
dråber pr. 10 sekunder (2,1 ml/minut).
Den derved fremkomne fraktion tørres i en rotationsfordamper, indtil
opløsningsmidlet næsten helt er forsvundet. De sidste 2 eller 3 ml
opløsningsmiddel fjernes ved hjælp af en svar nitrogenstrøm, og
derefter tilsættes 10 ml n-heptan.
5.2. Gaskromatografisk analyse5.2.1. Indledende procedure: konditionering af kolonnen5.2.1.1. Kolonnen påmonteres gaskromatografen, idet den ene ende forbindes
med injektionssystemet og den anden ende med detektoren.
Gaskromatografien kontrolleres (detektors og skrivers ydeevne osv.).
5.2.1.2. Hvis kolonnen benyttes for første gang, kan det anbefales at konditio-
nere den. En let strøm gas ledes gennem kolonnen, hvorefter
gaskromatografiapparaturet sættes i gng. Der opvarmes gradvis til
mindst 20 ºC over driftstemperaturen (anmærkning). Denne temperatur
holdes i mindst to timer, hvorefter apparaturet reguleres efter arbejdsbe-
tingelserne (gasstrømmen reguleres, der tændes for flammen, der
tilsluttes til den elektroniske skriver, kolonneovnens temperatur regu-
leres, detektoren reguleres osv.). Signalet registreres med en følsomhed
på mindst det dobbelte af den, der kræves for at foretage analysen.
Basislinjen bør være lineær uden nogen form for toppe og må ikke
udvise nogen forstyrrelser.
En negativ retlinjet forstyrrelse tyder på, at kolonnen ikke er korrekt
forbundet. En positiv forstyrrelse er tegn på, at kolonnen ikke er blevet
ordentligt konditioneret.
Anmærkning: Konditioneringstemperaturen skal altid holdes mindst 20
ºC under den maksimumstemperatur, der er angivet for
den anvendte eluent.
5.2.2. Valg af arbejdsbetingelser
5.2.2.1. Arbejdsbetingelserne er normalt som følger:
— kolonnetemperatur: 80 ºC til at begynde med stigende med 30 ºC/
minut til 120 ºC med derpå følgende programmering til en stigning
på 5 ºC/minut op til 340 ºC
— detektortempertur: 350 ºC— bæregassens lineære hastighed: hydrogen, 20-35 cm/sekund— instrumentfølsomhed: 4-16 gange minimumsdæmpningsindstillingen— skriverens følsomhed: 1-2 mV fra skalaens nederste ende— papirhastighed: 30 cm/time— indsprøjtet mængde: 0,5-1 µl opløsningsmiddel.
Disse betingelser kan ændres, så de passer til kolonnens og gaskromato-
grafiapparaturets karakteristika (for at opnå kromatogrammer, der
opfylder følgende betingelser: retentionstiden for C
32intern standard
skal være 25 ± 2 minutter, og voksernes mest repræsentative top skal
ligge mellem 60 og 100 % fra skalaens nederste ende).1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 32
▼M6
5.2.2.2. Parametrene for toppenes integration bestemmes på en sådan måde, at
der opnås en korrekt evaluering af toppenes arealer.
5.2.3. Analyseprocedure
5.2.3.1. 1 µl af opløsningsmidlet opsuges med 10 µl mikrosprøjten. Stemplet
trækkes tilbage, indtil nålen er tom. Nålen indføres i injektionssystemet,og der indsrøjtes hurtigt efter 1-2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder
trækkes nålen forsigtigt ud.
5.2.3.2. Registreringen fortsætter, indtil alle vokserne er helt eluerede.
Basislinjen skal altid opfylde de fastsatte betingelser (5.2.1.2).
5.2.4. Identifikation af toppene
Toppene identificeres ud fra retentionstiderne, idet de sammenlignes
med blandinger af vokser med kendte retentionstider analyseret under
samme betingelser.
Figur 1 viser et vokskromatogram af jomfruolivenolie.
5.2.5. Kvantitativ analyse5.2.5.1. Toppenes arealer svarende til den interne standard og de alifatiske
estere fra C
40til C46bestemmes ved hjælp af integratoren.
5.2.5.2. Voksindholdet i hver af esterne bestemmes i mg/kg fedtstof efter
formlen:
ester (mg/kg) =Ax·ms·►M91 000◄
As·m
hvor:
Ax= er arealet svarende til toppen for hver enkelt ester
As= er arealet svarende til laurylarachidattoppen
ms= er massen af det tilsatte laurylarachidat i milligram
m = er massen af den prøve, der er udtaget til analyse, i gram.
6. FORMULERING AF RESULTATERNE
De forskellige voksindhold og summen af disse indhold angives i mg/
kg fedtstof.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 33
▼M6
APPENDIKS
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
1-3µl methan (propan) indsprøjtes i gaskromatografiapparaturet, efter at det er
tilpasset de normale arbejdsbetingelser. Den tid, som det tager gassen af
strømme gennem kolonnen, fra det øjeblik den indsprøjtes, til toppen viser sig,
måles (tM).
Den lineære hastighed i cm/sek. udtrykkes ved formlen L/tM, hvor L er kolon-
nens længde icm og tM ti den målt isekunder.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 34
▼M61991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 35
▼B
BILAG V
BESTEMMELSE AF SAMMENSÆTNINGEN OG INDHOLDET AF
STEROLER VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARSØJLE
1. OMRÅDE
Metoden beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af indholdet af
de enkelte steroler og det samlede sterolindhold i fedtstoffer.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffer, med α-cholestanol tilsat som en intern standard, forsæbes
med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de bestanddele, der ikke
kan forsæbes, ekstraheres derefter med diethylether.
Sterolfraktionen adskilles fra ekstrakten af stoffer, som ikke kan
forsæbes, ved kromatografi på en basisk kiselgelplade. De steroler,
som genvindes fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og
analyseres ved hjælp af gaskromatografipå kapi llarsøjle.
3. APPARATUR
3.1. 250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glas-
slib.
3.2. 500 ml skilletragte.3.3. 250 ml kolber.3.4. Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm
glasplader.
3.5. Ultraviolet lampe med en bølgelængde på 366 eller 254 nm.3.6. 100 µl og 500 µl mikrosprøjter.3.7. En cylindrisk filtertragt med et G3 porøst septum (porøsitet 15—40 µm),
med en diameter på ca. 2 cm og en dybde på ca. 5 cm, med en befæ-
stelsesdel, der er egnet til filtrering under vakuum, og en samlingsdel
med et 12/21 udvendig konisk glasslib.
3.8. En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendig konisk glasslib,
som filtertragten (3.7) kan monteres på.
3.9. Et 10 ml prøverør med konisk bund og tætsluttende prop.3.10. En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsøjle, forsynet
med et spaltningssystem, der består af:
3.10.1. Et termostatkammer til søjler, som kan opretholde den ønskede tempe-
ratur med en nøjagtighed på ± 1º C.
3.10.2. En inddampningsenhed med temperaturindstilling, med et fordamp-
ningselement af silanglas.
3.10.3. En flammeioniserings-detektor og en omformer-forstærker.3.10.4. En integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-
forstærkeren (3.10.3), og som har en svartid på ikke over ét sekund og
variabel papirhastighed.
3.11. En kapillarsøjle af glas eller kvartsglas, med en længde på 20—30 m,
en indre diameter på 0,25—0,32 mm, helt overtrukket med SE-52 eller
SE-54 væske eller tilsvarende i en ensartet tykkelse på mellem 0,10 og
0,30 µm.
3.12. En 10 µl gaskromatografi-mikrosprøjte med hærdet kanyle.
4. REAGENSER
4.1. Kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanolopløsning. 130 g kaliumhydroxid
(minimum titer 85 %) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling,
og der fyldes op med ethanol til 1 liter. Opløsningen opbevares i veltil-
proppede, mørke glasflasker.
4.2. Diethylether, analyseren.4.3. Vandfrit natriumsulfat, analyserent.4.4. Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescensindikator,
tykkelse 0,25 mm (kan fås brugsfærdige i handelen).1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 36
▼B
4.5. Kaliumhydroxid, 0,2 N, i ethanolopløsning. 13 g kaliumhydroxid
opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter.
4.6. Benzen, til kromatografi (5.2.2).4.7. Acetone, til kromatografi (5.2.2).4.8. Hexan, til kromatografi (5.2.2).4.9. Diethylether, til kromatografi (5.2.2).
4.10. Chloroform, analyseren.
4.11. Referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phyto-
steroler, ►
M62%◄opløsning i chloroform.
4.12. 2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk
ved tilsætning af nogle få dråber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidopløs-
ning.
4.13. Vandfri pyridin til kromatografi.
4.14. Hexamethyldisilazan.4.15. Trimethylchlorsilan.4.16. Referenceopløsninger af sterol-trimethylsilylethere (TMSE). Friskfrem-
stillet ud fra rene steroler eller blandinger af steroler udvundet af
sterolholdige olier.
4.17. α-cholestanol, 0,2 % opløsning (m/v) i chloroform (intern standard).
4.18. Bæregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren.4.19. Hjælpegasser:
— Hydrogen, gaskromatografiren
— Luft, gaskromatografiren.
5. FREMGANGSMÅDE5.1.Forberedelse af de ikke-forsæbelige stoffer
5.1.1. Et rumfang 0,2 % α-cholestanolopløsning i chloroform (4.17), der inde-
holder en mængde α-cholestanol svarende til ca. 10 % af
sterolindholdet i den del af prøven, der er taget ud til bestemmelsen,indføres i 250 ml kolben ved hjælp af 500 µl mikrosprøjten. F.eks.
sættes til 5 g af prøven 500 µl 0,2 % α-cholestanolopløsning, hvis
undersøgelsen gælder olivenolie, og 1 500 µl, hvis det gælder
►
M6 ◄olie fra olivenpresserester.
Prøven inddampes til tørhed i en nitrogenstrøm, hvorefter 5 g af den
tørrede, filtrerede prøve afvejes nøjagtigt og overføres til den samme
kolbe.
►M6 ◄Olier►M6 ◄, der indeholder
betydelige mængder cholesterol, kan vise en top, der har den samme
retentionstid som α-cholestanol. Hvis det forekommer, må sterolfrakti-
onen analyseres to gange med og uden intern standard ►M6eller der
anvendes betulinol i stedet for cholestanol ◄.
5.1.2. 50 ml 2 N kaliumhydroxid i ethanolopløsning tilsættes, refluxsvaleren
påsættes, og væsken opvarmes til svag kogning på vandbad under
vedvarende, kraftig omrøring, indtil forsæbningen sker (opløsningen
bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter, derefter
tilsættes 50 ml destilleret vand fra den øverste del af svaleren, svaleren
tages af, og kolben afkøles til ca. 30º C.
5.1.3. Kolbens indhold overføres kvantitativt til en 500 ml skilletragt, idet der
skylles flere gange med destilleret vand, ialt ca. 50 ml. Ca. 80 ml
diethylether tilsættes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og får
lov til at henstå (note 1).
Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt.
Yderligere to ekstraktioner foretages på den vandige fase på samme
måde, idet der bruges 60—70 ml diethylether hver gang.
Note 1: Eventuel emulsion kan ødelægges ved tilsætning af små
mængder ethyl- eller methylalkohol ved hjælp af en spray.
5.1.4. Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destil-
leret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral
reaktion.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 37
▼B
Når vaskevandet er fjernet, tørres ekstrakterne med vandfrit natrium-
sulfat og filtreres på vandfrit natriumsulfat ned i en på forhånd vejet
250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder diethylether.
5.1.5. Etheren destilleres ned til nogle få ml og bringes derefter til tørhed
under et let undertryk eller i en nitrogenstrøm, tørres fuldstændigt i en
ovn ved 100º C i ca. 15 minutter, og vejes så efter afkøling i en ekssik-
kator.
5.2.Separation af sterolfraktionen
5.2.1. Forberedelse af de basiske plader. Kiselgelpladerne (4.4) nedsænkes
fuldstændig i 0,2 N opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol (4.5) i 10
sekunder. Derefter får de lov at tørre i et stinkskab i 2 timer og sættes
til sidst i en ovn ved 100º C i 1 time.
Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssik-
kator, til de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal
anvendes inden 15 dage).
Note 2: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere sterolfrakti-
onen, er det ikke, nødvendigt at behandle de ikke-forsæbelige
stoffer med aluminiumoxid. På denne måde holdes alle sure
forbindelser (fede syrer og andre) tilbage på basislinien, og
sterolbåndet er klar adskilt fra de alifatiske og triterpene alko-
holers bånd.
5.2.2. En 95:5 (v/v) benzen/acetoneblanding anbringes i kromatografika-
mmeret til en højde på ca. 1 cm. Som et alternativ kan en 65:35 (v/v)
hexan/diethyletherblanding bruges. Kammeret lukkes med det dertil
passende dæksel og efterlades således ica. en halv ti me, så at der
opnås ligevægt mellem væske og damp. Strimler af filtrerpapir, der
dypper ned i eluenten, kan anbringes på kammerets indre overflader.
Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet
og regelmæssig eluering af komponenterne.
Note 3: Kromatografiblandingen bør udskiftes for hver test for at opnå
fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser.
5.2.3. Man tilbereder en ca. 5 % opløsning af de ikke-forsæbelige stoffer
(5.1.5) ichloroform. Med 100 µl mi krosprøjten afsætter man på en
kromatografiplade (5.2.1) med 0,3 ml, ca. 2 cm fra den ene ende, en
streg, som er så tynd og ensartet som muligt. På linie med stregen
placeres 2—3 µl af sterol-referenceopløsningen (4.11) i den ene ende
af pladen, så sterolbåndet kan identificeres efter eluering.
5.2.4. Pladen anbringes i kromatografikammeret, som er forberedt som
angivet i 5.2.2. Den omgivende temperatur bør holdes mellem 15 og
20º C. Kammeret lukkes straks med dækslet, og det får lov til at eluere,
indtil opløsningsmidlets forkant når ca. 1 cm fra pladens øverste kant.
Derpå fjernes pladen fra kromatografikammeret, og man lader opløs-
ningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen
stå en kort tid i et stinkskab.
5.2.5. Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluorosceinopløsningen.
Når pladen observeres under ultraviolet lys, kan sterolbåndet identifi-
ceres ved, at det bringes på linie med den plet, der er opnået fra
referenceopløsningen. Båndets grænser langs fluoroscenses kanter
markeres med en sort blyant.
5.2.6. Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede område.
Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten
(3.7). 10 ml varm chloroform tilsættes, man blander omhyggeligt med
metalspatelen og filtrerer under vakuum; filtratet opsamles i den
koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten.
Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether
(ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er
forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af
4—5 ml, den tilbageværende opløsning overføres til det på forhånd
vejede 10 ml prøverør (3.9), det inddampes til tørhed med let opvarm-
ning i en blød strøm af nitrogen, der fyldes atter op med nogle få dråber
acetone, der inddampes igen til tørhed, røret placeres i en ovn ved 105º
C ica. 10 mi nutter, derefter lader man det svale af ien ekssi kkator og
vejer det.
Den rest, der findes i prøverøret, består af sterolfraktionen.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 38
▼B
5.3.Forberedelse af trimethylsilyletherne
5.3.1. Til prøverøret, der indeholder sterolfraktionen, sættes silyleringsrea-
genset, der består af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-
disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 4), i forholdet 50 µl for hvert milli-
gram sterol, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 5).
Note 4: Brugsfærdige opløsninger kan fås i handelen. Man kan også få
andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-
acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med
et lige så stort rumfang vandfrit pyridin.
5.3.2. Prøverøret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i
vejret på det), indtil sterolerne er fuldstændig opløst. Man lader det stå
i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det så i nogle
få minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse.
Note 5: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver
ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller
fremkommer en lyserød farve, er det et tegn på tilstedeværelsen
af fugt eller svækkelse af reagensen. Hvis det forekommer, må
prøven gentages.
5.4.Gaskromatografisk analyse
5.4.1. Forberedende operationer, pakning af søjlen
5.4.1.1. Søjlen monteres i gaskromatografen, idet indløbsenden forbindes med
fordamperen, der står i forbindelse med spaltningssystemet, og udløb-
senden forbindes med detektoren.
Man foretager en generel kontrol af gaskromatografen (lækager fra
gaskredsløbene, detektorens effektivitet, spaltningssystemets og regi-
streringssystemets effektivitet osv.)
5.4.1.2. Hvis søjlen skal bruges for første gang, anbefales det, at den underka-
stes en konditionering. Man lader en svag gasstrøm passere gennem
søjlen og tænder så for gaskromatografienheden, derefter begynder
man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20º C over driftstem-
peraturen (note 6). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer,
derefter sættes hele enheden i driftstilstand (justering af gasstrømme
og spaltning, antændelse af flammen, forbindelse til den elektroniske
skriver, justering af søjlekammeret, detektorens og injektorens tempe-
ratur osv.), og derefter optegens signalet med en følsomhed, der er
mindst to gange større end den, man agter at anvende til analysen.
Basisliniens forløb skal være lige, uden toppe af nogen art, og den må
ikke glide.
Negativ glidning af en lige linie tyder på lækage fra søjlens forbin-
delser, positiv glidning tyder på utilstrækkelig konditionering af søjlen.
Note 6: Konditioneringstemperaturen skal altid være mindst 20º C
lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den
anvendte stationære fase.
5.4.2. Valg af driftsbetingelser5.4.2.1. De anbefalede driftsbetingelser er som følger:
— søjletemperatur: 260º C ± 5º C
— fordampertemperatur: 280º C
— detektortemperatur: 290º C— bæregassens lineære hastighed: helium 20—35 cm/s, hydrogen
30—50 cm/s
— spaltningsforhold: fra 1:50 til 1:100
— instrumentets følsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale dæmpning
— registreringsfølsomhed: 1—2 mV fuld skala
— papirhastighed: 30—60 cm/time
— mængde stof injiceret: 0,5—1µl TMSE-opløsning.
Disse betingelser kan varieres i lyset af søjlens og gaskromatografens
egenskaber, så man opnår kromatogrammer, der opfylder følgende krav:
— retentionstiden for β-sitosterol bør være 20 ± 5 minutter
— campesteroltoppen bør være: for olivenolie (gennemsnitsindhold
3 %) 15 ± 5 % af hel skala; for soyaolie (gennemsnitsindhold
20 %) 80 ± 10 % af hel skala
— alle tilstedeværende steroler skal adskilles. Desuden skal toppene
også være fuldstændig opløst, dvs. hver tops spor skal gå tilbage til
basislinien, før sporet går op til den næste top. Ufuldstændig opløs-1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 39
▼B
ning kan dog tolereres, såfremt toppen ved TRR (relativ retenti-
onstid) 1,02 kan bestemmes kvantitativt ved brug af den vinkelrette
linie.
5.4.3. Analytisk fremgangsmåde
5.4.3.1. Med 10 µl mikrosprøjten optages 1 µl hexan, derefter trækkes først
0,5 µl luft og derefter 0,5—1 µl af prøveopløsningen op. Stemplet
trækkes højere op, så kanylen tømmes. Kanylen trykkes gennem injek-
tionsenhedens membran, og efter 1—2 sekunder injiceres hurtigt,
derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder.
5.4.3.2. Optegnelsen fortsættes, indtil de tilstedeværende sterolers TMSE er
fuldstændig elueret.
Basislinien skal til stadighed opfylde kravene (5.4.1.2).
5.4.4. Identifikation af toppene
De enkelte toppe identificeres på basis af retentionstiderne og ved
sammenligning med blandinger af sterol-TMSE, der er analyseret under
de samme betingelser.
Sterolerne elueres ifølgende rækkefølge: cholesterol, brassi casterol, 24-
methylencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, ∆-7-
campesterol, ∆-5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol,
∆-5-avenasterol, ∆-5,24-stigmastadienol, ∆-7-stigmastenol, ∆-7-avena-
sterol.
Retentionstiderne for β-sitosterol for SE 52 og SE 54 søjler er vist i
tabel 1.
Figur 1 og 2 illustrerer typiske kromatogrammer for nogle olier.
5.4.5. Kvantitativ vurdering
5.4.5.1. Arealerne for α-cholestanol- og steroltoppene beregnes ved hjælp af den
integrerende tæller. Der ses bort fra toppene for eventuelle forbindelser,
der ikke er blandt dem, der er opregnet i tabel 1.
5.4.5.2. Koncentrationen af hver enkelt sterol beregnes i mg/100 g fedtstof som
følger:
sterol x =Ax·ms· 100
As·m
hvor:
Ax= toparealet for sterol x ►M6 ◄
As= arealet af α-cholestanoltoppen ►M6 ◄
ms= massen af tilsat α-cholestanol i milligram
m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.
6. RAPPORTERING AF RESULTATERNE
6.1. De individuelle sterolkoncentrationer angives som mg/100 g fedtstof og
deres sum som »total sterolmængde«.
6.2. Den procentvise andel af de individuelle steroler beregnes på grundlag
af forholdet mellem arealet af den tilsvarende top og summen af area-
lerne af sterolernes toppe.
% sterol x =Ax× 100
∑A
hvor:
Ax= arealet af top x
∑A = summen af arealerne af alle toppe.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 40
▼B
APPENDIX
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1—3 µl
methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere
gennem søjlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen frem-
kommer (tM).
Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde icm,
og tMer den målte tid i sekunder.
Tabel 1
Relative retentionstider for steroler
Top IdentifikationRelativ retentionstid
SE 54
søjleSE 52
søjle
1 cholesterol ∆-5-cholesten-3- β-ol 0,67 0,63
2 cholestanol 5- α-cholestan-3- β-ol 0,68 0,64
3 brassicasterol [24S]-24-methyl- ∆-5,22-cholestadien-3- β-
ol0,73 0,71
4 24-methylen-cholesterol 24-methylen- ∆-5,24-cholestadien-3- β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-methyl- ∆-5-cholesten-3- β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-methyl-cholestan-3- β-ol 0,85 0,82
7 stigmasterol [24S]-24-ethyl- ∆-5,22-cholestadien-3- β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-campesterol [24R]-24-methyl- ∆-7-cholesten-3- β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl- ∆-5,23-cholestadien-3-
β-ol0,95 0,95
10 chlerosterol [24S]-24-ethyl- ∆-5,25-cholastadien-3- β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-ethyl- ∆-5-cholestan-3- β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-ethyl-cholestan-3- β-ol 1,02 1,02
13 ∆-5-avenasterol [24Z]-24-ethyliden- ∆-5-cholesten-3- β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl- ∆-5,24-cholestadien-3-
β-ol1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenol [24R,S]-24-ethyl- ∆-7,24-cholestadien-3-
β-ol1,12 1,12
16 ∆-7-avenasterol [24Z]-24-ethyliden- ∆-7-cholesten-3- β-ol 1,16 1,161991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 41
▼B
Figur 1
Gaskromatogram af sterolfraktionen af en uraffineret olivenolie
1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 42
▼B
Figur 2
Gaskromatogram af sterolfraktionen af en raffineret olivenolie
1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 43
▼B
BILAG VI
BESTEMMELSE AF ERYTHRODIOL OG UVAOL
INDLEDNING
Erythrodiol (almindeligvis forstået som totalindholdet af diolerne erythro-
diol og uvaol) er en uforsæbelig bestanddel, som er karakteristisk for
visse arter af fedtstoffer. Den findes i betydeligt højere koncentration i
ekstraheret olivenolie end i de andre olier, som den findes i (presset
olivenolie, vindruekerneolie), hvorfor bestemmelsen heraf kan anvendes
til at konstatere tilstedeværelsen af ekstraheret olivenolie.
1. FORMÅL
At beskrive fremgangsmåden til bestemmelse af erythrodiol i fedtstoffer.
2. PRINCIP
Fedtstoffer forsæbes med kaliumhydroxid i ethanolopløsning, og de ufor-
sæbelige bestanddele ekstraheres derefter med diethylether og renses på
en kolonne af aluminiumoxid.
De uforsæbelige bestanddele fraktioneres ved tyndtlagskromatografi på
kiselgel, hvorved båndet med sterolfraktionen adskilles fra båndet med
erythrodiolfraktionen.
Sterolfraktionen og erythrodiolfraktionen fra pladen omdannes til trime-
thylsilylethere, hvorefter blandingen analyseres ved gaskromatografi.
Resultatet angives i procent erythrodiol i forhold til det samlede indhold
af erythrodiol plus steroler.
3. APPARATUR
3.1. Det apparatur, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolind-
holdet).
4. REAGENSER
4.1. De reagenser, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolind-
holdet).
4.2. Referenceopløsning af erythrodiol, 0,5 % opløsning i chloroform.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1.Femstilling af de uforsæbelige stoffer
Der gås frem som beskrevet iafsni t 5.1.2 ibi lag V.
5.2.Separation af erythrodiol og steroler
5.2.1. Se afsnit 5.2.1 i bilag V.5.2.2. Se afsnit 5.2.2 i bilag V.
5.2.3. Der fremstilles en 5 % opløsning i chloroform af de uforsæbelige stoffer.
Med en mikrosprøjte på 100 µl anbringes på en kromatografiplade ca.
1,5 cm fra den nederste kant 0,3 ml af denne opløsning i en streg, der
er så tynd og ensartet som muligt. På den ene ende af pladen anbringes
som reference nogle mikroliter af opløsningen af cholesterol og erythro-
diol.
5.2.4. Pladen anbringes i kromatografikarret, der er klargjort som angivet i 5.2.2
i bilag V. Den omgivende temperatur holdes på ca. 20º C. Karret lukkes
straks, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra
pladens øverste kant. Derpå fjernes pladen fra kromatografikarret, og
man lader opløsningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft.
5.2.5. Pladen sprøjtes ensartet med en alkoholopløsning af 2,7-dichlorfluore-
scein. Når pladen observeres under ultraviolet lys, fremstår sterol- og
erythrodiolbåndene ud for pletterne fra referenceopløsningen, og de
afmærkes med et punkt lidt uden for det fluorescerende bånds kanter.
5.2.6. Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det
afskrabede materiale fra pladen overføres til en kolbe på 50 ml. Der1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 44
▼B
tilsættes 15 ml varm chloroform, omrystes omhyggeligt og filtreres på
glasfilter, idet siliagelen overføres til selve filteret. Der vaskes tre gange
med 10 ml portioner varm chloroform, idet filtratet opsamles i en rund-
bundet kolbe på 100 ml. Filtratet inddampes til et rumfang på 4—5 ml og
overføres til et tareret spidsbundet centrifugeglas på 10 ml, og der
inddampes til tørhed under let opvarmning i en svag strøm af nitrogen,
hvorefter der vejes.
5.3.Forberedelse af trimethylsilyletherne (TMSE)
Der gås frem som beskrevet iafsni t 5.3 ibi lag V.
5.4.Gaskromatografi
Der gås frem som beskrevet iafsni t 5.4 ibi lag V.
Arbejdsbetingelserne for gaskromatograferingen skal vælges således, at
de udover at opfylde kravene for analyse af sterolerne også fører til sepa-
ration af TMSE af erythrodiol og uvaol.
Efter injektion af prøven lader man skriveren køre indtil alle tilstedevæ-
rende steroler, erythrodiol og uvaol er elueret. Derefter identificeres
toppene (erythrodiol og uvaol har i forhold til β-sitosterol en relativ
retentionstid på henholdsvis ca. 1,45 og 1,55), og arealerne beregnes
som angivet for sterolerne.
6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Erythrodiol % =A1+A2
A1+A2+ΣAsteroler× 100
hvor:
A1= toparealet for erythrodiol ►M6 ◄
A2= toparealet for uvaol ►M6 ◄
ΣAsteroler= summen af arealerne for de tilstedeværende steroler
►M6 ◄
Resultatet angives med én decimal.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 45
▼B
BILAG VII
BESTEMMELSE AF FEDTSYRER I 2-POSITIONEN I TRIGLY-
CERIDER FRA OLIER OG FEDTSTOFFER
1. OMFANG
I denne standard beskrives en metode til bestemmelse af sammensæt-
ningen af den del af fedtsyrerne i en olie eller et fedtstof, som er
forestret til glycerolens 2-position.
2. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne standard finder som følge af pankreas-lipases særlige virkning
anvendelse på olie og fedtstoffer med et smeltepunkt på under 45º C.
Den kan ikke uden videre anvendes på olier og fedtstoffer, der indeholder
betydelige mængder fedtsyrer med 12 eller færre kulstofatomer (kokos- og
palmekerneolie, smørfedt), stærkt umættede fedtsyrer (med mere end fire
dobbeltbindinger), med 20 eller flere kulstofatomer (fiskeolie og marine
olier) eller fedtsyrer indeholdende andre oxygenerede grupper end syre-
gruppen.
3. PRINCIP
Eventuel neutralisering af sure olier og fedtstoffer i opløsning. Rensning
på kolonne af aluminiumoxid. Delvis hydrolyse af triglycerider ved hjælp
af pankreas-lipase inden for et bestemt tidsrum. Separation af de dannede
monoglycerider ved tyndtlagskromatografi og methanolyse af disse mono-
glycerider. Analyse af methylesterne ved gas/væskekromatografi.
4. APPARATUR
4.1. 100 ml rundbundet kolbe.4.2. 25 ml rundbundet kolbe med slib.4.3. 1 m lang svaler, som passer til kolben 4.2.4.4. 250 ml Erlenmeyer-kolbe.4.5. 50 ml bægerglas.4.6. 500 ml skilletragt.4.7. Kromatografisøjle af glas, 13 mm indvendig diameter og 400 mm lang,
forsynet med glasfilter og hane.
4.8. 10 ml centrifugeglas med slibprop.4.9. 5 ml burette med 0,05 ml inddelinger.4.10. 1 ml injektionssprøjte med tynd kanyle.4.11. Mikrosprøjte, som kan levere dråber på 3—4 µl.4.12. Udstrygningsapparat til tyndtlagskromatografi.4.13. Glasplader til tyndtlagskromatografi, 20 × 20 cm.4.14. Elueringskar til tyndtlagskromatografi med slebet glaslåg egnet til
20 × 20 cm plader.
4.15. Spray til tyndtlagskromatografi.4.16. Ovn indstillet til 103 ± 2º C.4.17. Termostat, som mellem 30 og 45º C kan reguleres med en nøjagtighed på
0,5º C.
4.18. Rotationsfordamper.4.19. Elektrisk rysteapparat, som muliggør en kraftig omrystning af centrifuge-
glasset.
4.20. UV-lampe til undersøgelse af tyndtlagsplader.
Til kontrol af lipaseaktiviteten:
4.21. pH-meter.4.22. Spiralomrører.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 46
▼B
4.23. 5 ml burette.
4.24. Stopur.
For eventuel fremstilling af lipase:
4.25. Laboratorieomrører, egnet til dispergering og blanding af heterogene
materialer.
5. REAGENSER
5.1. n-hexan, eller imangel heraf petroleumsether (kogepunkt 30—50º C),
kromatografikvalitet.
5.2. 2-propanol eller ethanol 95 % (v/v), analyseren kvalitet.5.3. 2-propanol eller ethanol, 1:1 vandig opløsning.5.4. Diethylether, peroxidfri.
5.5. Acetone.
5.6. Myresyre, mindst 98 % (m/m).5.7. Elueringsopløsning: blanding af n-hexan (5.1), diethylether (5.4) og myre-
syre (5.6) iforholdet 70/30/1 (v/v/v).
5.8. Aktiveret aluminiumoxid til kromatografi, neutral, Brockmann I.5.9. Silicapulver med bindemiddel, af egnet kvalitet til tyndtlagskromatografi.5.10. Pankreas-lipase af egnet kvalitet (note 1, note 2).5.11. Natriumhydroxid, vandig opløsning med 120 g/l.5.12. Saltsyre, 6 N vandig opløsning.
5.13. Calciumchlorid (CaCl
2), vandig opløsning med 220 g/l.
5.14. Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig opløsning med 1 g/l.5.15. Bufferopløsning: pH af en 1 M vandig opløsning af trishydroxymethyla-
minomethan bringes op på 8 ved tilsætning af saltsyre (5.12)
(kontrolleres med potentiometer).
5.16. Phenolphthalein, opløsning med 10 g/l i 95 % (v/v) ethanol.5.17. 2,7-dichlorfluorescein, opløsning med 2 g/l i 95 % (v/v) ethanol, gjort
svagt alkalisk ved tilsætning af 1 dråbe 1 N natriumhydroxidopløsning
pr. 100 ml.
Til kontrol af lipase-aktiviteten:
5.18. Neutraliseret olie.5.19. Natriumhydroxid, 0,1 N vandig opløsning.5.20. Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig opløsning med 200 g/l.5.21. Gummi arabicum, vandig opløsning med 100 g/l.
6. PRØVEFORBEREDELSE
Hvis prøvens syreindhold er under 3 %, bestemt efter bilag II, renses den
direkte på aluminiumoxid som beskrevet under 6.2.
Er syreindholdet i prøven over 3 %, bestemt efter bilag II, neutraliseres
der med alkali ved tilstedeværelse af et opløsningsmiddel som beskrevet
under 6.1, efterfulgt af passage over aluminiumoxid som beskrevet under
6.2.
6.1.Neutralisering med alkali ved tilstedeværelse af opløsningsmiddel.
Der anbringes ca. 10 g af den rå olie i en skilletragt (4.6), hvorefter der
tilsættes 100 ml hexan (5.1), 50 ml 2-propanol (5.2), nogle få dråber
phenolphthaleinopløsning (5.16) og en mængde natriumhydroxidopløsning
(5.11) svarende til den frie syremængde i olien, plus 0,3 % i overskud.
Der omrystes kraftigt i 1 min., tilsættes 50 ml destilleret vand og omrystes
igen, hvorefter man lader opløsningen stå og bundfælde.
Efter separation fjernes sæbelaget på bunden, ligesom eventuelle
mellemlag (slim, uopløseligt stof) fjernes. Hexanopløsningen af den
neutraliserede olie vaskes i flere omgange med 2-propanolopløsning (5.3)1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 47
▼B
i portioner på 25—30 ml, indtil phenolphthaleinets lyserøde farve forsv-
inder.
Det meste af hexanen fjernes ved destillation under vakuum i rotationsfor-
damperen (4.18), hvorefter olien tørres ved 30—40º C under vakuum ved
hjælp af en strøm af ren nitrogen, indtil hexanen er fjernet fuldstændigt.
6.2.Rensning på aluminiumoxid
15 g aktiveret aluminiumoxid (5.8) opslæmmes i 50 ml hexan (5.1), og
suspensionen hældes i kromatografisøjlen (4.7) under omrøring. Man lader
aluminumoxidet bundfælde sig og lader opløsningsmidlets niveau falde til
1—2 mm over adsorbenten. Derefter hældes forsigt en opløsning af 5 g
oli e i25 ml hexan (5.1) på søjlen, og hele eluatet opsamles ien rund-
bundet kolbe (4.1).
7. FREMSTILLING AF KROMATOGRAFIPLADER
Glaspladerne (4.13) renses grundigt med ethanol, petroleumsether og
acetone, så alle spor af fedtstof fjernes.
I en Erlenmeyer-kolbe (4.4) anbringes 30 g silicapulver (5.9), og der
tilsættes 60 ml destilleret vand. Derefter tilproppes kolben og rystes kraf-
tigt i 1 min., hvorefter opslæmningen omgående overføres til
udstrygningsapparatet (4.12), og de rene plader belægges med et 0,25 mm
tykt lag.
Pladerne lufttørres i15 mi n. og derefter i1 ti me iovnen (4.16) ved
103 ± 2º C. Pladerne afkøles til stuetemperatur i ekssikkator før brug.
Færdigfremstillede plader fås i handelen.
8. FREMGANGSMÅDE
8.1.Hydrolyse med pankreas-lipase
I centrifugeglasset (4.8) afvejes ca. 0,1 g af den forberedte prøve. Hvis
prøven består af flydende olie, gås direkte frem som beskrevet nedenfor.
Består den af fast fedt, opløses den i0,2 ml hexan, om nødvendi gt under
forsigtig opvarmning.
Der tilsættes 20 mg lipase (5.10) og 2 ml bufferopløsning (5.15). Der
omrystes forsigtigt men omhyggeligt og tilsættes 0,5 ml natriumcholato-
pløsning (5.14) og 0,2 ml calciumchloridopløsning (5.13). Glasset lukkes
med slibprop, rystes forsigtigt (undgå at fugte proppen) og anbringes
derefter omgående itermostaten (4.17), som holdes på en temperatur på
40 ± 0,5º C, og rystes ihånden inøjagti gt 1 mi n.
Glasset fjernes fra termostaten og omrystes kraftigt ved hjælp af rysteap-
paratet (4.19) i nøjagtigt 2 min.
Derefter køles omgående i rindende vand. Så tilsættes 1 ml saltsyre (5.12)
og 1 ml diethylether (5.4). Glasset tilproppes, og der blandes grundigt ved
hjælp af det elektriske rysteapparat. Derefter lader man glasset henstå og
fjerner det organiske lag ved hjælp af sprøjten (4.10), om nødvendigt efter
centrifugering.
8.2.Separation af monoglyceriderne ved tyndtlagskromatografi
Ekstraktet anbringes på kromotografipladen med mikrosprøjten (4.11) ca.
1,5 cm fra den nederste kant i en tynd ensartet linje så smal som mulig.
Pladen anbringes i det godt mættede elueringskar (4.14), og der elueres
med elueringsvæsken (5.7) ved ca. 20º C op til ca. 1 cm fra pladens
øverste kant.
Pladen lufttørres ved karrets temperatur og sprøjtes med 2,7-dichlorfluore-
sceinopløsning (5.17). Monoglyceridbåndet identificeres (Rf ca. 0,035)
under ultraviolet lys (4.20).
8.3.Analyse af monoglyceriderne ved gas/væskekromatografi
Det under 8.2 fremkomne bånd fjernes ved hjælp af en spatel (undgå at
fjerne restbestanddele på basislinjen) og overføres til methyleringskolben
(4.2).
Det afskrabede silica behandles nøjagtigt som beskrevet i bilag X B, så
monoglyceriderne omdannes til methylestere, hvorefter esterne undersøges
ved gaskromatografisom beskrevet ibi lag X A.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 48
▼B
9. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
Sammensætningen af fedtsyrer i 2-positionen beregnes med én decimals
nøjagtighed (note 3).
10. NOTER
Note 1: Test for lipaseaktivitet
I en passende mixer tilberedes en olieemulsion ved omrøring af
en blanding af 165 ml gummi arabicum-opløsning (5.21), 15 g
knust is og 20 ml neutraliseret olie (5.18).
10 ml af denne emulsion hældes i et bærgerglas (4.5), efterfulgt
af 0,3 ml natriumcholatopløsning (5.20) og 20 ml destilleret vand.
Bægerglasset sættes i en termostat, der er indstillet til 37 ± 0,5º C
(note 4), og elektroderne til et pH-meter (4.21) og en omrører
(4.22) nedsænkes ibægerglasset.
Med en burette (4.23) tilsættes dråbevis natriumhydroxidopløs-
ning (5.19), indtil der er opnået et pH på 8,5.
Der tilsættes en tilstrækkelig mængde vandig suspension af lipase
(se nedenfor). Så snart pH-meteret viser en pH-værdi på 8,3,
startes stopuret (4.24), og der tilsættes dråbevis natriumhydroxi-
dopløsning (5.19) med en sådan hastighed, at pH holdes fast på
8,3. Den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning aflæses
hvert minut.
De aflæste værdier afsættes i et diagram med tiden som abscisse
og den mængde alkaliopløsning, der kræves til fastholdelse af en
konstant pH-værdi, som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje.
Den ovenfor omtalte lipasesuspension er en 1 ‰ (m/m) suspen-
sion i vand. Til hver test bør der anvendes tilstrækkeligt af
denne suspension til, at der forbruges ca. 1 ml natriumhydroxido-
pløsning på 4 — 5 min. Almindeligvis er der brug for 1 — 5 mg
pulver.
Lipaseenheden er defineret som den mængde enzym, der frigør
10 µ-ækvivalenter syre pr. minut. Aktiviteten A af det anvendte
pulver, målt ili paseenheder pr. mg, beregnes efter formlen:
A¼V/C210
m
hvor:
V = antal ml natriumhydroxidopløsning (5.19) forbrugt pr.
minut, beregnet ud fra diagrammet
m = lipasetestportionens masse i mg.
Note 2: Fremstilling af lipase
Lipaser med tilfredstillende lipaseaktivitet kan fås i handelen,
men de kan også fremstilles i laboratoriet på følgende måde: 5 kg
frisk svinepankreas afkøles til 0º C. Alt omgivende fedt og
bindevæv fjernes, og pankreasvævet finddeles i en blender, indtil
der opnås en flydende pasta. Denne omrøres med omrøreren
(4.25) i 4 — 6 timer med 2,5 l vandfri acetone og centrifugeres
derefter. Bundfaldet ekstraheres yderligere tre gange med den
samme mængde acetone, derefter to gange med en blanding af
lige dele acetone og diethylether (v/v) og til sidst to gange med
diethylether.
Efter tørring af bundfaldet i vakuum i 48 timer opnås et stabilt
pulver, som bør opbevares ikøleskab.
Note 3: I alle tilfælde tilrådes det at bestemme sammensætningen af
prøvens samlede indhold af fedtsyrer, eftersom sammenligningen
med sammensætningen af syrer i 2-positionen vil hjælpe med ved
fortolkningen af de fundne data.
Note 4: Hydrolysetemperaturen er fastsat til 37º C, eftersom der anvendes
en flydende olie. Den er dog fastsat til 40º C for analyseprøven,
så der bliver mulighed for at undersøge fedtstoffer med smelte-
punkter på op til 45º C.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 49
▼M20
▼B
BILAG IX
SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSØGELSE VED ULTRAVIOLET
LYS
INDLEDNING
Spektrofotometrisk undersøgelse ved ultraviolet lys kan give oplysninger
om et fedtstofs kvalitet, dets konserveringstilstand og om forandringer i
det, frembragt ved teknologiske processer.
Absorptionen ved de bølgelængder, der er specificeret i metoden, skyldes
tilstedeværelsen af konjugerede dien- og triensystemer. Disse absorptioner
er udtrykt som specifikke ekstinktioner E 1 % 1 cm (ekstinktionen for en
1 % opløsning af fedtstoffet i det angivne opløsningsmiddel i et 1 cm tykt
væskelag), sædvanligvis betegnet ved K, (også kaldet ekstinktionskoeffi-
cienten).
1. OMRÅDE
Metoden beskriver fremgangsmåden til udførelse af en spektrofotometrisk
undersøgelse af fedtstoffer ved ultraviolet lys.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffet opløses i det specificerede opløsningsmiddel, og opløsningens
ekstinktion bestemmes så ved de fastsatte bølgelængder i forhold til rent
opløsningsmiddel. De specifikke ekstinktioner beregnes ud fra aflæsnin-
gerne på spektrofotometeret.
3. APPARATUR
3.1. Et spektrofotometer til måling af ekstinktion i ultraviolet lys mellem 220
og 360 nm, med mulighed for aflæsning ved hver hele nanometer.
3.2. Firkantede kvartskuvetter med låg, med en optisk vejlængde på 1 cm. Når
kuvetterne er fyldt med vand eller et andet passende opløsningsmiddel, bør
der ikke være forskelle på mere end 0,01 ekstinktionsenheder mellem dem.
3.3. 25 ml målekolber.
3.4. En kromatografisøjle, hvis øverste del er 270 mm lang med en diameter på
35 mm, og hvis nederste del er 270 ml lang med en diameter på 10 mm.
4. REAGENSER
4.1. Isooctan (2,2,4-trimethylpentan) af spektrofotometrikvalitet med en trans-
mittans på ikke mindre end 60 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 %
ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller
— cyclohexan af spektrofotometrikvalitet med en transmittans på ikke
mindre end 40 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i
forhold til destilleret vand.
4.2. Basisk aluminiumoxid til søjlekromatografi, tilberedt og kontrolleret som
beskrevet iappendi x 1.
4.3. n-hexan til kromatografi.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1. Prøven skal være fuldstændig homogen og fri for urenheder i suspension.
Olier, som er flydende ved stuetemperatur, filtreres på papir ved en tempe-
ratur på ca. 30º C; faste fedtstoffer homogeniseres og filtreres ved entemperatur på højst 10º C over smeltepunktet.
5.2. Ca. 0,25 g af den således forberedte prøve afvejes nøjagtigt i en 25 ml
målekolbe, der fyldes op til mærket med det angivne opløsningsmiddel,
og opløsningen homogeniseres. Den fremkomne opløsning skal være fuld-
stændig klar. I modsat fald filtreres hurtigt på papir.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 50
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3. En kuvette fyldes med opløsningen, og ekstinktionerne måles ved en
passende bølgelængde mellem 232 og 276 nm med opløsningsmiddel som
reference.
De aflæste ekstinktionsværdier skal ligge inden for området 0,1—0,8. Gør
de ikke det, gentages målingerne, idet der benyttes mere koncentrerede
eller mere fortyndede opløsninger.
5.4. Når bestemmelse af en specifik ekstinktion skal ske efter passage over
aluminiumoxid, går man frem på følgende måde: 30 g basisk aluminium-
oxid opslæmmet i hexan hældes på kromatografisøjlen. Efter at
adsorbenten har bundfældet sig, tappes den overskydende hexan af, indtil
overfladen er ca. 1 cm over aluminiumoxidet.
10 g af fedtstoffet, homogeniseret og filtreret som beskrevet (5.1), opløses i
100 ml hexan, og opløsningen hældes på søjlen. Eluatet opsamles, og alt
opløsningsmiddel dampes af under vakuum ved en temperatur under 25º C.
Man går straks videre som beskrevet i (5.2) med dette fedtstof.
6. ANGIVELSE AF RESULTATERNE
6.1. Man opgiver den specifikke ekstinktion (ekstinktionskoefficient) ved de
forskellige bølgelængder, som beregnes efter:
Kλ¼Eλ
c/C2s
hvor:
Kλ= den specifikke ekstinktion ved bølgelængden λ
Eλ= den ekstinktion, der er målt ved bølgelængden λ
c = opløsningens koncentration i g/100 ml
s = kuvettens tykkelse icm.
Resultaterne angives med to decimaler.
6.2. Spektrofotometrisk analyse af olivenolie i henhold til den officielle metode,
der er angivet i EF-forordningerne, kræver bestemmelse af den specifikke
ekstinktion i isooctanopløsning ved bølgelængderne 232 og 270 nm samt
bestemmelse af ∆K, som er givet ved:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
hvor Kmer den specifikke ekstinktion ved bølgelængden m, den bølge-
længde på ca. 270 nm der giver maksimal absorption.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 51
▼B
APPENDIX I
Tilberedning af aluminiumoxidet og kontrol af dets aktivitet
A 1.1. Tilberedning af aluminiumoxidet
Aluminiumoxid, som på forhånd er tørret i en ovn ved 380—400º C i 3
timer, anbringes i en beholder, der kan lukkes hermetisk, hvorefter der
tilsættes 5 ml destilleret vand pr. 100 g aluminiumoxid, og beholderen
lukkes øjeblikkeligt. Den rystes flere gange og får så lov til at stå i
mindst 12 timer før brugen.
A 1.2. Kontrol af aluminiumoxidets aktivitet
En kromatografisøjle med 30 g aluminiumoxid klargøres. Efter frem-
gangsmåden i afsnit (5.4) lader man en blanding, der består af:
— 95 % jomfruolie med en specifik ekstinktion på under 0,18 ved
268 nm
— 5 % jordnødolie, der er behandlet med blegejord ved raffineringen,
og som har en specifik ekstinktion på ikke under 4 ved 268 nm,
passere gennem søjlen.
Hvis blandingen efter passage gennem søjlen har en specifik ekstinktion
på over 0,11 ved 268 nm, er aluminiumoxidet acceptabelt; hvis ikke må
hydratiseringsgraden øges.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 52
▼B
APPENDIX II
Kalibrering af spektrofotometeret
A 2. Udstyret skal kontrolleres med regelmæssige mellemrum (mindst hver
sjette måned), både for korrekt bølgelængde og for udslagets nøjag-
tighed.
A 2.1. Bølgelængden kan kontrolleres ved hjælp af en kviksølvlampe eller med
egnede filtre.
A 2.2. Ved kontrol af fotocellens og fotomultiplikatorrørets respons går man
frem på følgende måde: 0,2 g ren kaliumchromat til spektrofotometri
afvejes og opløses i 0,05 N kaliumhydroxidopløsning i en 1 000 ml
målekolbe, og der fyldes op til mærket. Man overfører præcis 25 ml af
denne opløsning til en 500 ml målekolbe og fortynder op til mærket med
den samme kaliumhydroxidopløsning.
Derefter måler man denne opløsnings ekstinktion ved 275 nm med
kaliumhydroxidopløsningen som reference. Den målte ekstinktion med
en 1 cm kuvette skal være 0,200 ± 0,005.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 53
▼B
BILAG X A
GASKROMATOGRAFERING AF FEDTSYREMETHYLESTERE
1. FORMÅL
Denne standard giver generelle retninglinjer for gaskromatografisk
bestemmelse med pakket kolonne eller kapillarkolonne af den kvalita-
tive og kvantitative sammensætning af en blanding af
fedtsyremethylestere fremstillet i henhold til bilag X B.
Metoden gælder ikke for polymeriserede fedtsyrer.
2. REAGENSER2.1.Bæregas
Inaktiv gas (nitrogen, helium, argon, hydrogen etc.) vel tørret og inde-
holdende mindre end 10 mg oxygen/kg.
Note 1: Hydrogen, der kun benyttes som bæregas, når det gælder kapil-
larkolonner, gør det muligt at foretage analysen dobbelt så
hurtigt, men indebærer en risiko. Der forefindes sikkerhedsan-
ordninger.
2.2.Hjælpegasser
2.2.1. Hydrogen (renhedsgrad ≥99,9 %), frifor organi ske urenheder.
2.2.2. Luft eller oxygen, frifor organi ske urenheder.
2.3.Referencestandard
En methylesterblanding af rene fedtsyrer eller methylesterne af et fedt-
stof, der så vidt muligt har samme sammensætning som det fedtstof, der
skal analyseres.
Iltning af polyumættende fedtsyrer må undgås.
3. APPARATUR
Instruktionerne angår det sædvanlige udstyr til gaskromatografering
med pakket kolonne og/eller kapillarkolonne og flammeionisationsde-
tektor. Alt udstyr, som kan give den i 4.1.2. definerede ydeevne og
opløsning, kan anvendes.
3.1.Gaskromatograf
Gaskromatografen skal omfatte følgende elementer:
3.1.1. Injektionssystem
Der benyttes enten et injektionssystem
a) med pakkede kolonner med det mindst mulige dødvolumen (i dette
tilfælde skal injektionssystemet kunne opvarmes til en temperatur,
som er 20—50º C højere end kolonnens) eller
b) med kapillarkolonner, hvor injektionssystemet skal være specielt
udformet til anvendelse med sådanne kolonner. Injektoren kan være
med eller uden split.
Note 2: Er der ikke tale om fedtsyrer med mindre end 16 kulstofa-
tomer, kan der benyttes injektor med faldende nål (moving
needle injector).
3.1.2. Ovn
Ovnen skal være i stand til at opvarme kolonnen til en temperatur på
mindst 260º C og holde den valgte temperatur inden for 1º C, når der
er tale om en kapillarkolonne. Det sidste krav er særlig vigtigt, da der
benyttes et rør af sintret kvarts.
Det anbefales ialle ti lfælde at anvende temperaturprogrammeret
opvarmning, navnlig til fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 54
▼B
3.1.3. Pakket kolonne
3.1.3.1. Kolonnen skal være kontrueret af et materiale, som er inaktivt i forhold
til de stoffer, der skal analyseres (dsv. glas eller rustfrit stål), af
følgende dimensioner:
a) Længde: 1—3 m. En relativt kort kolonne anvendes ved tilstedevæ-
relse af langkædede fedtsyrer (over C20). Ved analyse af syrer med 4
eller 6 kulstofatomer anbefales det at anvende en kolonne på 2 m.
b) Indre diameter: 2—4 mm.
Note 3: Ved tilstedeværelse af polyumætterde forbindelser med mere
end tre dobbeltbindinger er der risiko for, at de nedbrydes i en
kolonne af rustfrit stål.
Note 4: Der kan anvendes et system med to pakkede kolonner.
3.1.3.2. Fyldmateriale bestående af følgende elementer:
a)Bærer: kiselgur, syrevasket og silanbehandlet, eller andet egnet
inaktivt bæremateriale med et snævert kornstørrelsesinterval (25 µm
i området 125 µm—200 µm), idet middelværdien vælges efter
kolonnens indre diameter og længde.
b)Stationær fase: polær væske af polyestertype (f.eks. diethylenglycol-
polysuccinat, butandiolpolysuccinat, ethylenglycolpolyadipat mv.),
cyanosiliconer eller enhver anden væske, der giver den krævede
kromatografiske adskillelse (4). Den stationær fase bør udgøre 5 %
(m/m)—20 % (m/m) af fyldmaterialet. En ikke-polær fase kan
anvendes til visse adskillelser.
3.1.3.3. Konditionering af kolonnen
Efter at kolonnen om muligt er adskilt fra detektoren, opvarmes ovnen
gradvis til 185º C, og en strøm af inaktiv gas ledes gennem den netop
fremstillede kolonne med en hastighed på 20—60 ml/min. i mindst 16
timer ved denne temperatur og derpå i 2 timer ved 195º C.
3.1.4. Kapillarkolonne
3.1.4.1. Røret skal være af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer,
der skal analyseres (normalt glas eller sintret kvarts). Den indre
diameter skal være på mellem 0,2 mm og 0,8 mm. Den indvendige
overflade skal undergå en passende behandling (f.eks. forbehandling,
deaktivering), inden den stationære fasebelægning påføres. En længde
på 25 m er tilstrækkelig i de fleste tilfælde.
3.1.4.2. Stationær fase: normalt af typen polyglycol [poly(ethylenglycol)
20 000], polyester (butandiolpolysuccinat) eller polær polysiloxan
(cyanosiliconer). Bundne (tværbundne) kolonner er velegnede.
Note 5: Der er risiko for, at polære polysiloxaner gør det vanskeligt at
identificere og adskille linolensyre og C20syrer.
Belægningerne skal være tynde, dvs. 0,1 µm—0,2 µm.
3.1.4.3. Samling og konditionering af kolonnen
Der træffes de normale forholdsregler ved samlingen af kapillarko-
lonner, dvs. placering af kolonnen i ovnen (bærer), valg og montering
af samlinger (tæthed), anbringelse af kolonnens ender i injektoren og
detektoren (reduktion af dødvolumener). Kolonnen anbringes under enstrøm af bæregas (f.eks. 0,3 bar (30 kPa) for en kolonne med en længde
på 25 m og en indre diameter på 0,3 mm).
Kolonnen konditioneres ved temperaturprogrammering af ovnen ved 3º
C/min. fra den omgivende temperatur til en temperatur på 10º C under
den stationære fases dekomponeringsgrænse. Ovnen holdes på denne
temperatur i 1 time, indtil basislinjen har stabiliseret sig. Den genind-
stilles på 180º C, så der opnås isotermiske betingelser.
Note 6: Korrekt prækonditionerede kolonner fås i handelen.
3.1.5. Detektoren skal helst kunne opvarmes til en temperatur, som er højere
end ovnens.
3.2.Injektionssprøjte
Injektionssprøjten skal have en maksimumskapacitet på 10 µl med 0,1 µl
inddelinger.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 55
▼B
3.3.Skriver
Hvis den optegnede kurve skal anvendes til at beregne sammensæt-
ningen af den analyserede blanding, skal skriveren være et meget
præcist elektronisk instrument, som er foreneligt med det anvendte
apparatur. Skriveren skal have følgende specifikationer:
a) responstid mindre end 1,5 sek. og helst 1 sek. (responstiden er den
tid, der forløber, fra skriveren modtager et pludseligt signal på
100 %, og indtil den giver et udslag på 90 %)
b) papirbredde: minimum 20 cm
c) papirhastighed: regulerbar fra 0,4—2,5 cm/min.
3.4.Integrator
Anvendelse af elektronisk integrator giver en hurtig og præcis bereg-
ning. Den skal give et lineært udslag med tilstrækkelig følsomhed, og
korrektionen for forstyrrelser på basislinjen skal være tilfredsstillende.
4. FREMGANGSMÅDE
4.1 til 4.3 angår anvendelse af en flammeionisationsdetektor.Alternativt kan anvendes en gaskromatograf med katarometerdetektor
(registrerer ændringer af varmeledningsevne). I så fald ændres arbejds-
betingelserne som angivet i 6.
4.1.Prøvebetingelser
4.1.1. Bestemmelse af de optimale arbejdsbetingelser
4.1.1.1. Pakket kolonne
Følgende variabler indgår i valget af arbejdsbetingelser:
a) kolonnes længde og diameter
b) den stationære fases art og mængde
c) kolonnens temperatur
d) bæregassens hastighed
e) den ønskede opløsning
f) prøvens størrelse valgt på en sådan måde, at detektoren og elektro-
metret i forening giver et lineært udslag
g) analysetiden.
Almindeligvis vil værdierne i tabel 1 og tabel 2 give de ønskede resul-
tater, dvs. for methylstearat mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m
kolonnelængde og en elueringstid på ca. 15 min.
Hvis apparaturet gør det muligt, skal injektoren have en temperatur på
omkring 200º C og detektoren en temperatur, som er lig med eller
højere end kolonnes.
Forholdet mellem hydrogenstrømmen til flammeionisationsdetektoren
og bæregassens hastighed ligger normalt på 1:2 til 1:1 alt efter kolon-
nens diameter. Oxygenstrømmen er ca. 5—10 gange større end
hydrogenstrømmen.
Tabel 1
Kolonnes indre diameter
mmBæregassens hastighed
ml/min.
2 15—25
3 20—40
4 40—601991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 56
▼B
Tabel 2
Den stationære fases koncentration
% (m/m)Kolonnens temperatur
ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Kapillarkolone
Kapillarkolonnens ydeevne og permabilitet er ensbetydende med, at
adskillelsen mellem bestanddelene og analysetiden stort set afhænger
af bæregassens hastighed i kolonnen. Det vil derfor være nødvendigt
at skabe de bedst mulige driftsbetingelser ved ad følge dette parameter
(eller blot rette sig efter kolonnens tryktab) alt efter, om man ønsker at
opnå bedre adskillelser eller foretage en hurtig analyse.
4.1.2. Bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og
opløsning
(Se figur 1).Analysen gennemføres med en blanding af methylstearat og methyloleat
inogenlunde li ge store mængder (f.eks. methylestere af kakaosmør).
Kolonnens temperatur og bæregassens hastighed vælges således, at
methylstearattoppens maksimum resistreres ca. 15 min. efter opløs-
ningsmiddeltoppen. Der anvendes en tilstrækkelig mængde af
methylesterblandingen til, at methylstearattoppen svarer til ca. ¾af
fuldt udslag.
Antallet af teoretiske bunde, n (ydeevne), beregnes ud fra formelen:
n¼16/C2
dω
ω1/C20/C21
2
og opløsningen, R, ud fra formelen:
R¼2/C2∆
ω1þω2
hvor
dω= retentionsafstanden i mm målt fra kromatogrammets start
til det relative maksimum for methylstearattoppen
ω1ogω2= methylstearat- og methylolealtoppenes bredde imm målt
mellem basislinjens skæringspunkter med kurvens vende-
tangenter
∆ = afstanden imm mellem methylstearat- og methylolea-
ttoppenes maksima
og opløsningsindekset Ir ud fra formlen
a
b
hvor
a = højden af den mindste top målt i forhold til basislinjen
b = højden af det laveste punkt iområdet mellem to toppe ved si den
af hinanden målt i forhold til basislinjen.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 57
▼M2
▼B
Figur 1
Kromatogram til bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og opløs-
ning
Betingelserne vælges således, at de for methylstearat giver mindst 2 000teoretiske bunde pr. m kolonnelængde og en opløsning på mindst 1,25.
4.2.Prøve
Med injektionssprøjten (3.2) udtages 0,1—2 µl af methylesteropløs-
ningen, der er fremstillet i henhold til bilag X B, og indsprøjtes i
kolonnen.
Når det gælder ikke opløste estere, fremstilles i heptan til kromatografi
en opløsning på 100 mg/ml, og 0,1—1 µl af denne opløsning
indsprøjtes.
Ved analyse af bestanddele, der kun er til stede som spor, kan prøveud-
tagningen forøges (op til ti gange).
4.3.Analyse
Normalt vil driftsbetingelserne være de samme som dem, der er fastlagt
i(4.1.1).
Det er dog muligt at arbejde med en lavere kolonnetemperatur, når fedt-
syrer med mindre end 12 kulstofatomer skal bestemmes, eller en højere
temperatur, når fedtsyrer med mere end 20 kulstofatomer skal
bestemmes. Det et muligt at anvende temperaturprogrammering i begge
tilfælde. Hvis prøven f.eks. indeholder fedtsyremethylestere med mindre
end 12 kulstofatomer, indsprøjtes prøven ved 100º C (eller 50—60º C,
hvis der er smørsyre til stede), hvorefter temperaturen straks øges med
4—8º C/min, indtil den optimale temperatur nås. I visse tilfælde kan de
to fremgangsmåder kombineres.
Efter den programmerede opvarmning fortsættes elueringen ved
konstant temperatur, indtil alle bestanddelene er elueret. Hvis apparatet
ikke arbejder med programmeret opvarmning, arbejdes der med to faste
temperaturer mellem 100º C og 195º C.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 58
▼B
Om nødvendigt anbefales det at foretage en analyse på to stationære
faser med forskellig polaritet for at sikre sig, at der ikke forekommer
maskerede toppe, hvilket kan være tilfældet ved samtidig tilstedevæ-
relse af C18:3og C20:0eller af C18:3og C18:2konjugeret.
4.4.Udarbejdelse af referencekromatogrammet og referencedia-
grammer
Referencestandardblandingen (2.3) analyseres under de samme driftsbe-
tingelser som for prøvens vedkommende, og retentionstiderne eller
retentionsafstandene for de tilstedeværende fedtsyrer måles. På semilo-
garitmisk papir afbildes logaritmen til retentionstiden eller -afstanden
mod antallet af kulstofatomer for alle grader af umættethed; under
isotermiske betingelser skal de punkter, der repræsenterer ligekædede
syrer med samme umættethedsgrad, ligge på rette linjer, der er nogen-
lunde parallelle.
Det er nødvendigt at undgå betingelser, hvor der fremkommer »maske-
rede toppe«, dvs. hvor opløsningen er utilstrækkelig til at adskille to
bestanddele.
5. ANGIVELSE AF RESULTATER
5.1.Kvalitativ analyse
Prøvens methylestertoppe identificeres ud fra diagrammerne, der er
udarbejdet i 4.4, om nødvendigt ved interpolation.
5.2.Kvantitativ analyse
5.2.1. Bestemmelse af sammensætningen
Bortset fra undtagelsestilfælde anvendes den interne normaliseringsme-
tode, dvs. det forudsættes, at samtlige bestanddele i prøven er
repræsenteret på kromatogrammet, således at toppenes samlede areal
udgør 100 % af bestanddelene (total eluering).
Hvis apparaturet omfatter en integrator, anvendes resultaterne fra denne.
Hvis ikke, bestemmer man arealet af hver enkelt top ved at multiplicere
toppens høje med dens bredde ihalv højde og tager igi vet fald hensyn
til de forsekllige dæmpningsindstillinger under registreringen.
5.2.2. Beregningsmetode
5.2.2.1. Generelt
Indholdet af en given bestanddel i, udtrykt i vægtprocent methylestere,
beregnes ved, at man bestemmer den procentdel, som den tilsvarende
top udgør i forhold til summen af arealerne af samtlige toppe, ud fra
følgende formel:
Ai
Σν
ιΑ/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
Σν
ιΑ = summen af arealerne af samtlige toppe.
Resultatet anføres med en decimal.
Note 7: I dette generelle tilfælde betragtes resultatet af beregningen,
som er baseret på relative arealer, som en vægtprocent. I de
tilfælde, hvor man ikke kan arbejde med denne antagelse,
henvises til 5.2.2.2.
5.2.2.2. Anvendelse af korrektionsfaktorer
I visse tilfælde, f.eks. ved tilstedeværelse af fedtsyrer med mindre end
otte kulstofatomer eller syrer med andre funktionelle grupper, bør der,
når man anvender varmeledningsevnedetektorer, eller når den størst
mulige præcision er specielt påkrævet, anvendes korrektionsfaktorer
for at omsætte bestanddelenes procentvise toparealer til vægtprocent.
Korrektionsfaktorerne bestemmes ved hjælp af et kromatogram af en
referenceblanding af methylestere med kendt sammensætning under
samme betingelser som for prøvens vedkommende.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 59
▼B
For denne referenceblanding udtrykkes vægtprocent bestanddel i ud fra
formlen
mi
Σν
ιµ/C2100
hvor
mi= massen af bestanddel iireferenceblandi ngen
Σν
ιµ = summen af masserne af referenceblandingens forskellige
bestanddele.
Ud fra referenceblandingens (4.4) kromatogram beregnes procentdelen
(areal/areal) af bestanddel isom følger:
Ai
Σν
ιΑ/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
Σν
ιΑ = summen af arealerne af samtlige toppe.
Korrektionsfaktoren beregnes derpå som:
Ki¼mi/C2Σν
ιΑ
Ai/C2Σν
ιµ
Almindeligvis sættes korrektionsfaktorerne i relation til KC16, så de rela-
tive faktorer bliver:
K0
i¼Ki
KC16
For prøven er mængden af hver bestanddel i, udtrykt i vægtprocent
methylestere,
K0
i/C2Ai
Σν
ιΚ0ι/C2Αι/C0/C1 /C2100
Resultatet anføres med en decimal.
5.2.2.3. Anvendelse af en intern standard
I forbindelse med visse analyser (f.eks. når det ikke er alle fedtsyrerne
der er elueret, som det er tilfældet, når syrer med 4 og 6 kulstofatomer
er til stede sammen med syrer med 16 og 18 kulstofatomer, eller når
det er nødvendigt at bestemme den absolutte mængde af en fedtsyre i
en prøve), er det nødvendigt at anvende en intern standard. Der benyttes
ofte fedtsyrer med 5, 15 eller 17 kulstofatomer. Den eventuelle korrek-
tionsfaktor for den interne standard bestemmes.
Vægtprocent bestanddele i, udtrykt som methylestere, betemmes ud fra
formlen
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
hvor
Ai= arealet af den top, der svarer til bestanddel i
As= arealet af den top, der svarer til den interne standard
K′i= korrektionsfaktoren for bestanddel i (i forhold til KC16)
K′s= korrektionsfaktoren for den interne standard (i forhold til KC16)
m = massen img af prøvenm
s= massen img af den i nterne standard.
Resultaterne anføres med en decimal.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 60
▼M2
6. BESTEMMELSE AF TRANSISOMERER
Det er muligt at bestemme indholdet af transisomerer i fedtsyrer med et
antal kulstofatomer på mellem 10 og 24 ved adskillelse af methylestere
under anvendelse af en kromatograf med kapillarkolonne og særlig
polaritet.
6.1. Kapillarkolonne af kvartsglas med en intern diameter på 0,25 mm -
0,32 mm og en længde på 50 m, dækket af cyanopropylsilicone i en
lagtykkelse på 0,1 - 0,3 µm (type SP 2340, type SP 2380 C.P. Sil 88,
Silor 10 og lignende).
6.2. Methylesterne fremstilles i overensstemmelse med metode B i bilag X
B. De fedtholdige stoffer med et indhold af frie syrer på over 3 % skal
på forhånd neutrali seres ioverensstemmelse med punkt 6.1 ibi lag VII.
6.3. De vilkår, hvorunder gaskromatograferingen skal finde sted, er:
— kolonnetemperatur programmeret til 150-230 ºC (f.eks. 165 ºC i 15
minutter, derefter en stigning på 5 ºC i minuttet indtil 200 ºC)
— injektorens temperatur: 250 ºC, hvis der anvendes splitting, eller
samme begyndelsestemperatur som kolonnen, hvis der anvendes
»on column«
— detektorens temperatur: 260 ºC— strømningshastighed for bæregassen (helium eller hydrogen): 1,2 ml/
minut.
Den injicerede mængde skal være sådan, at højden af den top, der svar-
er til methylesteren fra arachinsyre ved den anvendte følsomhed skal
være mindst 20 % af fuldt udslag.
6.4. Identifikationen af de enkelte methylestere sker på grundlag af retenti-
onstiderne, der sammenlignes med retentionstiderne for
referenceblandinger (som angivet i punkt 2.3).
Esterne fra transfedtsyrerne elueres før de tilsvarende cis-isomerer. Et
eksempel på kromatogram er anført ifi gur 2.
Figur 2
Gaskromatogram vedrørende bestemmelse af transisomerer i fedtsyrer med
kapillarkolonne
6.5. Kolonnens effektivitet som bestemt i overensstemmelse med punkt
4.1.2 skal muliggøre separation af visse kritiske par, f.eks. det par, der
består af transoliesyre og oliesyre, trans C18: 1/cis C18: 1, med et
opløsningsindeks på over 2.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 61
▼M2
6.6. Den procentvise andel af hver enkelt transfedtsyre beregnet på grundlag
af forholdet mellem arealet af den tilhørende top og summen af area-
lerne af alle tilstedeværende toppe.
De procentvise andele af følgende syrer tages i betragtning:
— trans-octadecensyre (T 18: 1), i bilag I til nærværende forordning
anført som isomerer af transoliesyrer
— cis-trans- og trans-cis-octadecadiensyre [(CT/TC) 8: 2], i bilag I til
nærværende forordning anført som isomerer af translinolsyre
— trans-cis-trans-, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis-octadecatri-
ensyre [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], i bilag I til
nærværende forordning anført som isomerer af translinolensyre.
Note 8: På grund af denne metodes ganske særlige karakteristik, skal
resultatet angives med to decimaler.
►M27.◄SÆRLIGE TILFÆLDE — ANVENDELSE AF KATAROME-
TERDETEKTORER (REGISTRERER ÆNDRINGER AF
VARMELEDNINGSEVNE)
En gaskromatograf med detektor, der registrerer ændringer af varmeled-
ningsevne (et katarometer) kan også anvendes til bestemmelse af den
kvalitative og kvantitative sammensætning af en blanding af fedtsyre-
methylestere. I så fald ændres betingelserne i (3) og (4) som vist i
tabel 3.
Til kvantitativ analyse anvendes korrektionsfaktorerne i (5.2.2.2).
Tabel 3
Variabel Værdi/betingelse
Kolonne Længde: 2—4 m
Indre diameter: 4 mm
Bærer Kornstørrelse mellem 160 og
200 µm
Mængde stationær fase 15 % (m/m) — 25 % (m/m)
Bæregas Helium eller i mangel heraf
hydrogen med lavest mulige
indhold af oxygen
Hjælpegasser Ingen
Indsprøjtningstemperatur 40—60 ºC højere end kolonnens
temperatur
Kolonnens temperatur 180—200 ºC
Bæregassens hastighed Normalt mellem 60 og 80 ml/
min.
Indsprøjtet prøvemængde Normalt mellem 0,5 og 2 µl
►M28.◄PRØVERAPPORT
Prøverapporten skal indeholde en beskrivelse af de metoder, der er
anvendt til fremstilling af methylesterne og til gaskromatograferingen,
samt de opnåede resultater. Den skal også indholde alle de enkeltheder,
der ikke er nævnt i denne standard, eller som betragtes om valgfri, samt
en redegørelse for eventuelle forhold, der kan have haft indflydelse på
resultaterne.
Rapporten skal indeholde alle oplysninger, der er nødvendige for en
nøjagtig identifikation af prøven.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 62
▼B
▼M19
BILAG X B
FREMSTILLING AF METHYLESTERE AF FEDTSYRER FRA OLIVEN-
OLIE OG OLIE AF OLIVENPRESSERESTER
De to nedenfor anførte metoder anbefales til fremstilling af methylestere af fedt-
syrer fra olivenolie og olie af olivenpresserester:
metode A: kold omestring med kaliumhydroxid i methanol
metode B: varm methylering med natriummethylat i methanol efterfulgt af
forestring i sur væske.
Valget mellem de to metoder afhænger af, hvilken parameter der skal analy-
seres, og hvilken olietype der er tale om, på følgende måde:
a) bestemmelse af forskellen mellem det faktiske og det teoretiske indhold af
ECN42-triglycerider ( ∆ECN42):
— Metode A anvendes til olieprøver af alle typer efter rensning af olien på
silicagelkolonne
b) bestemmelse af fedtsyresammensætningen:
— Metode A anvendes direkte på prøver af følgende olietyper:
— jomfruolier med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %
— raffineret olivenolie
— olivenolie (blanding af jomfruolier og raffineret olivenolie)— raffineret olie af olivenpresserester
— olie af olivenpresserester (blanding af jomfruolier og raffineret olie af
olivenpresserester).
— Metode B anvendes direkte på prøver af følgende olietyper:
— jomfruolie med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %
— rå olie af olivenpresserester
c) bestemmelse af transfedtsyrer:
— Metode A anvendes direkte på prøver af følgende olietyper:
— jomfruolier med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %
— raffineret olivenolie— olivenolie (blanding af jomfruolier og raffineret olivenolie)
— raffineret olie af olivenpresserester
— olie af olivenpresserester (blanding af jomfruolier og raffineret olie af
olivenpresserester).
— Metode A anvendes til olieprøver af nedenstående typer efter rensning af
olien på silicagelkolonne:
— jomfruolie med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %
— rå olie af olivenpresserester.
RENSNING AF OLIEPRØVER
Om nødvendigt renses prøverne på silicagelkolonne med en blanding af hexan
og diethylether (87:13, v/v) som elueringsmiddel som beskrevet i IUPAC-
metode 2.507.
En alternativ metode er fastfaseekstraktion ved hjælp af silicagelpatroner. En
silicagelpatron (1 g, 6 ml) anbringes i et tomt elueringsapparat og skylles med
6 ml hexan. Sugningen standses, så udtørring af kolonnen undgås. Derefter
sættes der en opløsning af olien (ca. 0,12 g) i 0,5 ml hexan på kolonnen, og
der åbnes for sugningen, så opløsningen trænger ned i silicagelen; derefter
elueres der med 10 ml hexan/diethylether (87:13, v/v) med vakuum. Eluaterne
samles og blandes og deles i to lige store portioner. Den ene portion inddampes
til tørhed på rotationsfordamper under reduceret tryk og ved stuetemperatur.
Remanensen opløses i 1 ml heptan. Opløsningen er parat til gaskromatografisk
analyse. Den anden portion inddampes, og remanensen opløses i 1 ml acetone til
HPLC-triglyceridanalyse, hvis det er påkrævet.
METODER TIL FREMSTILLING AF FEDTSYREMETHYLESTERE
1.Metode A: Kold omestring med kaliumhydroxid i methanol
1.1.Anvendelse
Denne hurtigmetode kan anvendes på olivenolie og olie af olivenpresse-
rester med et indhold af frie fedtsyrer på under 3,3 %. De frie fedtsyrer1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 63
▼M19
forestres ikke med kaliumhydroxid. Ethylestere af fedtsyrer omestrer
langsommere end glycerolestere, og muligvis methyleres de kun delvis.
1.2.Princip
Methylestrene dannes ved omestring i en opløsning af kaliumhydroxid i
methanol, hvilket er mellemstadiet inden forsæbning (punkt 5 i metoden
iISO 5509:2000, punkt 5 iIUPAC-metode 2.301).
1.3.Reagenser
methanol med højst 0,5 % (m/m) vandheptan til kromatografi.kaliumhydroxid, ca. 2 N opløsning i methanol: 11,2 g kaliumhydroxid
opløses i100 ml methanol.
1.4.Apparatur
reagensglas (rumindhold: 5 ml) med skrueprop med teflonpakningmålepipetter eller automatpipetter på 2 ml og 0,2 ml.
1.5.Fremgangsmåde
I et 5 ml reagensglas med skrueprop afvejes ca. 0,1 g af olieprøven. Der
tilsættes 2 ml heptan og rystes. Efter tilsætning af 0,2 ml 2 N kalium-
hydroxidopløsning i methanol lukkes glasset med proppen med
teflonpakning, og det rystes kraftigt i 30 sekunder. Glasset henstilles,
indtil det øvre lag af opløsningen er blevet klart. Det øvre lag, som
indeholder methylestrene, dekanteres fra. Heptanopløsningen er parat
til injektion i kromatografen. Det tilrådes, at opløsningen opbevares i
køleskab indtil kromatograferingen. Det frarådes at opbevare opløs-
ningen i mere end 12 timer.
2.Metode B: Varm methylering med natriummethylat i methanol efter-
fulgt af forestring i sur væske
2.1.Anvendelse
Denne metode kan anvendes på olivenolie og olie af olivenpresserester
med et indhold af frie fedtsyrer på over 3,3 %.
2.2.Princip
Neutralisering af frie fedtsyrer og alkalisk methanolyse af glycerider
efterfulgt af forestri ng af fedtsyrerne isur væske (punkt 4.2 iIUPAC-
metode 2.301).
2.3.Reagenser
— heptan til kromatografi
— methanol med højst 0,05 % (m/m) vand
— natriummethanolat, 0,2 N opløsning i methanol: 5 g natrium opløses
i 1 000 ml methanol (kan fremstilles ud fra indkøbte opløsninger).
— phenolphtalein, 0,2 % opløsning i methanol
— svovlsyre, 1 N opløsning i methanol: Der tilsættes 3 ml 96 % svovl-
syre til 100 ml methanol
— mættet opløsning af natriumchlorid i vand.
2.4.Apparatur
— 50 ml målekolbe med flad bund og høj snæver hals med slib
— tilbagesvaler: luftkøler (1 m lang) med slib
— kogesten
— glastragt.
2.5.Fremgangsmåde
0,25 g af olieprøven anbringes i en 50 ml målekolbe med slib. Gennem
tragten tilsættes der 10 ml 0,2 N-natriummethanolatopløsning i
methanol og kogesten. Tilbagesvaleren påsættes, og efter omrystning
bringes opløsningen i kog. Opløsningen skal være klar efter ca. 10
minutter. Reaktionen er praktisk taget afsluttet efter 15 minutter.
Kolben tages af varmen, tilbagesvalingen standses, svaleren fjernes, og1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 64
▼M19
der tilsættes to dråber phenolphthaleinopløsning. Der tilsættes nogle
ml 1 N svovlsyre i methanol, indtil opløsningen bliver farveløs, og der
tilsættes endnu 1 ml i overskud. Svaleren påsættes, og der koges i
endnu ca. 20 minutter. Kolben tages af varmen og afkøles under
rindende vand. Svaleren fjernes, der tilsættes 20 ml mættet natriumch-
lorid, og der omrystes. Der tilsættes 5 ml heptan, kolben tilproppes, og
der rystes kraftigt i 15 sekunder.
Blandingen henstilles, indtil faserne er helt adskilt. Der tilsættes mættet
natriumchloridopløsning, indtil vandfasen når op til kolbehalsens under-
kant. Det øvre lag, der befinder sig i kolbehalsen, indeholder
methylestrene. Opløsningen er parat til injektion i gaskromatografen.
Forsigtig: Methylering ifølge metode B skal udføres i stinkskab.
2.6.Alternativ til methylering ifølge metode B
2.6.1. Metode C
2.6.1.1. Princip
Fedtstoffet, der skal analyseres, behandles med en opløsning af chlor-
bri nte imethanol iet forseglet glas ved 100 ºC.
2.6.1.2. Apparatur
— tykvægget glas med et rumindhold på ca. 5 ml (højde 40-45 mm,
diameter 14-16 mm)
— målepipetter, 1 og 2 ml.
2.6.1.3. Reagenser
2 % opløsning af chlorbrinte i methanol, fremstillet ud fra chlorbrin-
tegas og vandfrimethanol (note 1).
Hexan til kromatografi.
Note 1: Der kan benyttes indkøbte opløsninger af chlorbrinte i
methanol. Det er nemt at fremstille små mængder chlorbrinte i
laboratoriet ved simpel uddrivning fra den i handelen værende
saltsyre (d = 1,18) ved tildrypning af koncentreret svovlsyre.
Da methanol let optager chlorbrintegas, bør der træffes de
sædvanlige forholdsregler ved opløsningen (f.eks. tilføres
gassen ved hjælp af en lille omvendt tragt, der netop rører
metanoloverfladen). Større mængder methanolopløsning af
chlorbrinte kan fremstilles i forvejen; de er holdbare ved opbe-
vari ng imørke ikolber med glasprop. Reagenset kan også
fremstilles vedopløsning af acetylchlorid i vandfri metanol.
2.6.1.4. Fremgangsmåde
— I glasset anbringes 0,2 g af fedtstoffet, som forinden er tørret over
natriumsulfat og filtreret, og der tilsættes 2 ml af methanolopløs-
ningen af chlorbrinte. Glasset lukkes.
— Glasset neddyppes ved 100 ºC i40 mi nutter.
— Glasset afkøles under rindende vand og åbnes, og der tilsættes 2 ml
destilleret vand og 1 ml hexan.
— Blandingen centrifugeres, og hexanfasen, som er klar til brug, kan
udtages.
2.6.2. Metode D
2.6.2.1. Princip
Fedtstoffet, der skal analyseres, opvarmes med tilbagesvaling med
methanol, hexan og svovlsyre. Methylestrene ekstraheres med petrole-
umsether.
2.6.2.2. Apparatur
— reagensglas på ca. 20 ml med glasslib og med en ca. 1 m lang luft-
svaler.
— 5 ml målepipette
— 50 ml skilletragt
— 10 og 25 ml reagensglas
— 15 ml spidsbundet reagensglas.
2.6.2.3. Reagenser
— methyleringsreagens: vandfri methanol, hexan og koncentreret
svovlsyre (d = 1,84) iforholdet 75:25:1 (v/v/v)
— 40-60 ºC petroleumsether1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 65
▼M19
— vandfrit natriumsulfat.
2.6.2.4. Fremgangsmåde
I glasset på 20 ml anbringes 0,1 g olie, og der tilsættes 5 ml methyle-
ringsreagens.
Svaleren påsættes, og der opvarmes i30 mi nutter på kogende vandbad
(note 2).
Blandingen overføres kvantitativt til en 50 ml skilletragt ved hjælp af
10 ml destilleret vand og 10 ml petroleumsether. Der omrystes kraftigt,
og blandingen henstår, indtil faserne er adskilt. Vandfasen fjernes, og
etherlaget vaskes to gange med 20 ml destilleret vand. Skilletragten
tilsættes en lille mængde vandfrit natriumsulfat, der omrystes, blan-
dingen henstår i nogle få minutter, og der filtreres, idet filtratetopsamles iet 15 ml spi dsbundet reagensglas.
Opløsningsmidlet afdampes på vandbad med en strøm af nitrogen.
Note 2: For at holde kogningen under kontrol kan man indsætte en
glasstav ireagensglasset og begrænse vandbadets temperatur
til 90 C
3.Nøjagtighed
Det Internationale Olivenolieråd har i forbindelse med sin metode COI/
T.20/dok. nr. 24 offentliggjort en statistisk vurdering af nøjagtigheden
ved metode A og B.
ANVISNINGER FOR GASKROMATOGRAFI AF ESTERE AF FEDTSYRER
FRA OLIVENOLIE OG OLIE AF OLIVENPRESSERESTER
1.Fremgangsmåde
Gaskromatografi af opløsninger af fedtsyreestere i hexan udføres ifølge
ISO 5508 på kapillarkolonne (50 m lang, indre diameter 0,25 eller
0,32 mm) belagt med cyanopropylsilicone som angivet ved bestem-
melse af trans-fedtsyrer (COI/T.20/dok. nr. 17).
Figur 1 viser et typisk kromatogram af olie af olivenpresserester, som
indeholder methyl- og ethylestere af fedtsyrer og transisomerer af
methylestere.
2.Beregninger
2.1. Ved beregning af sammensætningen af fedtsyrer og ∆ECN42 skal
følgende fedtsyrer medregnes:
myristinsyre (C14:0)
palmitinsyre (C16:0) — summen af arealerne af methyl- og ethylester-
toppene
palmitolsyre (C16:1) — summen af arealerne af toppene for ω9-e tω7-
isomererne af methylesteren
heptadecansyre (C17:0)heptadecensyre (C17:1)stearinsyre (C18:0)oliesyre (C18:1) summen af arealerne af toppene for ω9-e tω7-isome-
rerne af methylesteren, ethylesteren og transisomeren af methylesteren
linolsyre (C18:2) — summen af arealerne af toppene for methyl- og
ethylesteren og transisomererne af methylesteren
arachinsyre (C20:0)linolensyre (C18:3) — summen af toppene for methylesteren og transi-
somererne af methylesteren
eicosensyre (C20:1)behensyre (C22:0)lignocerinsyre (C24:0).Squalen medregnes ikke ved beregningen af det samlede areal.
2.2. Til beregning af det procentvise indhold af trans-C18:1 benyttes toppen
for methylesteren af denne fedtsyre. For at få summen (trans-
C18:2 + trans-C18:3) adderes alle toppene for transisomererne af disse
to fedtsyrer. Ved beregning af det samlede areal medregnes alle de
toppe, der er nævnt ipunkt 2.1 (jf. COI/T.20/dok. nr. 17).1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 66
▼M19
Procentindholdet af de enkelte fedtsyrer beregnes efter følgende
formel:
% X = (areal X × 100)/(samlet areal)
Figur 1: Typisk kromatogram af olie af olivenpresserester, fremkommet ved
metoden med kold methylering. Toppene er for methylestrene, hvor intet andet
er anført.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 67
▼B
BILAG XI
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FLYGTIGE HALOGENE
OPLØSNINGSMIDLER I OLIVENOLIE
1. PRINCIP
Analyse ved gaskromatografi ifølge teknikken med luftrummet over
væsken (head space).
2. APPARATUR
2.1. Gaskromatografiapparat udstyret med en elektronindfangningsdetektor
(ECD).
2.2. Apparatur for luftrummet over væsken (head space).2.3. Gaskromatografisøjle af glas med længde på 2 m og med 2 mm diameter,
stationær fase
10 % OV101 på chromosorb WLADMOS granulometri80—100 Mesh.
2.4. Transportluftart og hjælpeluftart: nitrogen.
2.5. 10 til 15 ml glaskolber med en foring af teflon og en aluminiumsprop med
en åbning til udtagning med sprøjte.
2.6. Tang til hermetisk lukning.2.7. Sprøjte til luftarter på 0,5 til 2 ml.
3. REAGENSER
Flygtige halogene opløsningsmidler med en renhedsgrad, der egner sig til
gaskromatografi.
Pentan med en renhedsgrad, der egner sig til gaskromatografi.
4. ANALYSEMETODE
4.1. Der afvejes med nøjagtighed ca. 3 g olie i en glaskolbe (der ikke må
genbruges), og kolben tilproppes indtil den hermetiske lukning. Kolben
anbri nges ien termostat ved 70º C ien ti me. Der udtages med akkuratesse
ved hjælp af sprøjten en mængde på 0,2 til 0,5 ml af luftrummet over
væsken. Det indsprøjtes i gaskromatografisøjleapparatet, der er indstillet
således:
— injektortemperatur: 150º C
— søjletemperatur: 70 til 80º C
— detektortemperatur: 200 til 250º C.
Andre temperaturer kan også anvendes, såfremt resultaterne er ækivalente.
4.2. Referenceopløsninger. Der tilberedes standardopløsninger ved brug af raffi-
neret olivenolie uden spor af opløsningsmidler til variable koncentrationer
af flygtige halogene opløsningsmidler mellem 0,05 og 1 ppm og i forhold
til det formodede indhold af prøven. En eventuel fortynding af flygtige
halogene opløsningsmidler skal ske ved hjælp af pentan.
4.3. Mængdemæssig vurdering. Forholdet fastlægges mellem overfladerne eller
toppene på prøverne og den standardopløsning, der har den nærmeste
formodede koncentration. Hvis den forholdsvise forskel er over 10 %, er
det nødvendigt at gentage analysen ved sammenligning med en ny stan-
dardopløsning, indtil dens koncentration overholder ovennævnte
forholdsvise forskel. Indholdet af flygtige halogene opløsningsmidler
bestemmes på grundlag af et gennemsnit af elementære indsprøjtninger.
4.4. Udtryk for resultaterne. Resultaterne udtrykkes ippm (mg/kg). Metodens
påvisningsgrænse er 0,01 mg/kg.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 68
▼M19
BILAG XII
ORGANOLEPTISK VURDERING AF JOMFRUOLIER
1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE
Formålet med denne metode er at fastlægge de nødvendige kriterier for
vurdering af de organoleptiske kendetegn for jomfruolier, jf. punkt 1 i bi-
laget til forordning nr. 136/66/EØF, og at beskrive metoden til
klassifikation.
Den beskrevne metode er kun anvendelig til klassifikation af jomfruolier i
forhold til den frugtagtige karakter og manglernes intensitet, der bestemmes
af en gruppe udvalgte og optrænede smagere, der er nedsat som et panel i
overensstemmelse med punkt 4.
2. GENERELT
Hvad den almindelige grundordliste, prøvelokale, generelle metoder og glas
til oliesmagning angår, henvises der til de forskrifter, som er fastsat af Det
Internationale Olivenolieråd.
3. SPECIEL ORDLISTE
3.1.Positive egenskaber
Frugtagtig : en række duftfornemmelser, der afhænger af olivensort og
kendetegn for en olie, som er udvundet af sunde og friske, grønne eller
modne frugter, og som fornemmes direkte eller retronasalt.
Bitter : karakteristisk smag af olie, der er udvundet af grønne oliven eller
oliven, der er lige ved at skifte farve.
Stærk : en prikkende fornemmelse, der er karakteristisk for olier, som er
udvundet i produktionsårets begyndelse især af endnu grønne oliven.
3.2.Negative egenskaber
Muggen : karakteristisk flavour for olie, der er udvundet af oliven, som er
opbevaret ibunker, og som har nået et fremskredet stadi um af anaerob
gæring.
Mug-fugt : karakteristisk flavour for olie udvundet af oliven, hvori svampe
og gær har udviklet sig, fordi de har været opbevaret i adskillige dage i
fugtige omgivelser.
Mudret bundfald : karakteristisk flavour for olie, der er udvundet af dekan-
teret bundfald ikar og underjordi ske tanke.
Vinagtig-eddikeagtig : karakteristisk flavour for visse olier, som minder om
vin eller eddike. Skyldes hovedsagelig, at der dannes eddikesyre, ethyla-
cetat og ethanol ved gæring af oliven.
Metallisk : flavour, der minder om metal. Karakteristisk for olie, der har
været i langvarig kontakt med metaloverflader under knusning, blanding,
presning eller opbevaring.
Harsk : flavour i olie, der har undergået en oxideringsproces.
Ophedet eller brændt : karakteristisk flavour for olie, forårsaget af over-
dreven og/eller langvarig opvarmning under bearbejdningen, især når
pastaen blandes termisk, hvis det gøres under uegnede betingelser.
Hø-træ : karakteristisk flavour for visse olier, der er udvundet af tørre
oliven.
Grov: en karakteristisk fornemmelse ved visse olier, som giver en tyk,
pastaagtig fornemmelse i munden, når man smager på dem.
Fedtet : flavour i olie, der minder om jordolie, fedt eller mineralsk olie.
Grønsagsvand : flavour, som olien får som følge af langvarig kontakt med
grønsagsvand.
Saltlage : flavour i olie, der er udvundet af oliven, som har været konser-
veret isaltlage.
Esparto : karakteristisk flavour for olie, der er udvundet af oliven, som er
presset inye måtter af espartogræs. Lugten/smagen kan være forskelli g,
alt efter om måtterne er lavet af grønt eller tørret espartogræs.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 69
▼M19
Jordet : flavour i olie, der er udvundet af oliven, som er opsamlet med jord
eller mudder på overfladen, og som ikke er blevet vasket.
Larvebefængt : flavour i olie, der er udvundet af oliven, som har været hårdt
angrebet af larver af olivenfluen (Bactrocera oleae).
Agurk : karakteristisk flavour, der fremkommer, når en olie har været pakket
hermetisk i for lang tid, især i blikbeholdere, og som tilskrives dannelsen af
2,6-nonadienal.
4. PANEL
Panelet udnævnes af medlemsstaten og består af en panelleder og otte til 12
smagere. For produktionsåret 2001/02 kan antallet af smagere dog være
mindre end otte.
Panellederen skal have gennemgået en grundig optræning og være kyndig
ekspert i de forskellige olietyper. Han er ansvarlig for panelet og dets tilret-
telæggelse og funktion, for prøvernes forberedelse, kodning og præsentation
for smagerne samt for indsamling af data og deres statistiske behandling.
Panellederen udvælger smagerne og sørger for deres optræning og kontrol
af deres indsats for at sikre sig, at de opretholder et passende egnethedsni-
veau.
Smagere, der foretager organoleptisk kontrol af olivenolie, skal udvælges
og optrænes i forhold til deres evne til at skelne mellem prøver, der ligner
hinanden, i overensstemmelse med Det internationale Olivenolieråds
vejledning om udvælgelse, optræning og kontrol af kvalificerede jomfruo-
liesmagere.
Panelerne skal forpligte sig til at deltage i organoleptiske bedømmelser på
nationalt, EF- eller internationalt plan med henblik på periodisk kontrol og
harmonisering af sansningskriterier. De skal i øvrigt hvert år meddele den
pågældende medlemsstat alle data om deres sammensætning og antallet af
bedømmelser, de har udført som godkendt panel.
5. PROCEDURE FOR ORGANOLEPTISK BEDØMMELSE OG KLASSIFI-
KATION
5.1.Smagerens anvendelse af profilskemaet
Det profilskema, som smageren skal benytte, er anført i tillæg A til denne
metode.
Hver smager ipanelet skal lugte ti l og derpå smage på (1) den olieprøve,
der er i smageglasset. Smageren analyserer de olfaktoriske, gustatoriske,
taktile og kinæstetiske indtryk. På profilskemaet noterer han derpå den
intensitet, hvormed han opfatter negative og positive egenskaber.
Hvis smageren opfatter negative egenskaber, som ikke er anført på profil-
skemaet, skal han anføre dem i rubrikken »Andet«, idet han benytter det
eller de udtryk, som beskriver dem med den størst mulige præcision af de
udtryk, som er defi neret ipunkt 3.2 idenne metode.
5.2.Panellederens anvendelse af data
Panellederen indsamler de profilskemaer, som smagerne har udfyldt; han
kontrollerer de tildelte intensiteter; konstaterer han en anormalitet, anmoder
han smageren om at ændre sit profilskema og om nødvendigt at gentage
forsøget.
Panellederen kan indlæse data i et edb-program efter den metode til stati-
stisk beregning af medianen, der er anført i B. Data for en prøve registreres
på en matrix bestående af ti kolonner, der svarer til de ti sanseegenskaber,
og antal linjer svarende til antal smagere i panelet.
Hvis mindst 50 % af panelet anfører en negativ egenskab i rubrikken andet,
skal panellederen beregne medianen for denne egenskab og den tilsvarende
klassifikation.
Hvis der foretages analyser i forbindelse med kontrol af overholdelse af
normer eller kontrolanalyser, skal panellederen gennemføre en tredobbelt
organoleptisk bedømmelse af olien med mindst en dags mellemrum;
medianen for egenskaberne beregnes ud fra samtlige data på profilske-
maerne for de tre forsøg.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 70
(1) Smageren kan undlade at smage på olien, hvis han konstaterer særligt intense negative
egenskaber, og han noterer denne ekstraordinære omstændighed på profilskemaet.
▼M19
5.3.Klassifikation af olier
Olien klassificeres under nedennævnte betegnelser i forhold til medianen af
mangler og medianen for egenskaben frugtagtig. Ved medianen af mang-
lerne forstås medianen af den negative egenskab, der opfattes med den
stærkeste intensitet. Værdien af den robuste variationskoefficient for denne
negative egenskab skal være mindre end eller lig med 20 %.
a)Jomfruolie, ekstra : Medianen af manglerne er lig med 0, og medianen af
den frugtagtige karakter er større end 0.
b)Jomfruolie : Medianen af manglerne er større end 0 og lig med eller
mindre end 2,5, og medianen af den frugtagtige karakter er større end 0.
c)Jomfruolie, almindelig : Medianen af manglerne er større end 2,5 og lig
med eller mindre end 6,0; eller medianen af manglerne er lig med eller
mindre end 2,5, og medianen af den frugtagtige karakter er lig med 0.
d)Bomolie : Medianen af manglerne er større end 6,0.
Fra den 1. november 2003 erstattes typerne c) og d) dog med følgende
type:
c)Bomolie : Medianen af manglerne er større end 2,5; eller medianen af
manglerne er lig med eller mindre end 2,5, og medianen af den frugtag-
tige karakter er lig med 0.
5.4.Særlige tilfælde
Hvis medianen for en anden positiv egenskab end frugtagtig er større end
5,0, anfører panellederen dette på oliens analyseattest.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 71
▼M19
TILLÆG A
1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 72
▼M19
TILLÆG B
METODE TIL BEREGNING AF MEDIAN OG KONFIDENSINTERVALLER
Median
Medianen er det reelle tal, Xm, der er kendetegnet ved, at sandsynligheden (P)
for, at værdierne af fordelingen (X) er mindre end dette tal (Xm), er mindre end
eller lig med 0,5, og at sandsynligheden (P) for, at værdierne af fordelingen (X)
er mindre end eller lig med Xm, samtidigt er større end eller lig med 0,5. Ifølge
en anden definition er medianen den 50. percentil af en fordeling, hvis
elementer er ordnet i stigende rækkefølge. Med andre ord er medianen den
midterste værdi i en ordnet række af et ulige antal elementer eller gennemsnittet
af de to midterste værdier i en ordnet række af et lige antal elementer.
Robust standardafvigelse
Som et pålideligt estimat af variabiliteten omkring medianen benyttes Stuart og
Kendallas estimat over den robuste standardafvigelse. Formlen for den asympto-
tiske standardafvigelse S afhænger af N og IQR. N er antallet af observationer,
og IQR er den interkvartile afstand, dvs. det robuste estimat af variabiliteten af
de pågældende data (den interkvartile afstand dækker nøjagtig 50 % af elemen-
terne i en given sandsynlighedsfordeling). Den interkvartile afstand beregnes
som afstanden mellem den 75. og 25. percentil.
IQR = 75. percentil — 25. percentil
Percentilen er værdien Xpc, der er kendetegnet ved, at sandsynligheden (P) for,
at værdierne af fordelingen er mindre end Xpc, er mindre end eller lig med en
given procentdel, og at sandsynligheden (P) for, at værdierne af fordelingen er
mindre end eller lig med Xpc, samtidigt er større end eller lig med den pågæl-
dende procentdel. Procentdelen angiver den pågældende fordelingsfraktion. For
medianens vedkommende er den 50 %.
Percentilen er med andre ord den værdi af fordelingen, der svarer til et bestemtareal, som tegnes ud fra fordelings- eller tæthedskurven. Den 25. percentil er
f.eks. den værdi af fordelingen, som svarer til et areal på 0,25 eller 25/100.
Robust variationskoefficient i %
Variationskoefficienten er et rent (dvs. dimensionløst) tal, der angiver forholdet
mellem den procentvise variabilitet i den analyserede talrække og medianens
værdi Me. Af denne grund er variationskoefficienten til stor nytte som kontrol
af panelmedlemmernes pålidelighed.
95 %-konfidensintervaller
95 %-konfidensintervallerne (IC) (fejl af første orden lig med 0,05 eller 5 %)
repræsenterer det interval, inden for hvilket værdien af medianen ville variere,
hvis det var muligt at gentage forsøget et uendeligt antal gange. I praksis1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 73
▼M19
angiver dette interval variabilitetsintervallet for forsøget ved de herskende betin-
gelser, hvis forsøget kunne gentages flere gange. Intervallet er ligesom
variationskoefficienten en hjælp til evaluering af forsøgets pålidelighed.
IC sup. = Me + (c.S)
IC inf. = Me — (c.S)
Hvor c, hvis konfidensintervallet er på 0,95, er lig med 1,96.
Klassifikationen foretages ved at sammenligne værdierne af medianen med de
referenceintervaller, der er fastlagt i metodens punkt 5.3. Med edb-programmer
er det muligt at vise klassifikationen i en tabel med statistiske data eller som
grafik.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 74
▼M20
▼M19
▼B
BILAG XV
1. OLIEINDHOLD I PRESSERESTER AF OLIVEN
1.1.Apparatur
— Egnet ekstraktionsapparat, forsynet med en 200—250 ml kolbe.
— Elektrisk opvarmet bad (sandbad, vandbad, osv.) eller varmeplade.
— Analysevægt.
— Ovn, der er indstillet til højst 80º C.
— Elektrisk ovn med temperaturregulering, der kan indstilles til 103º C
± 2º C, og som muliggør luftindblæsning eller vakuum.
— Mekanisk mølle, der er let at rengøre, egnet til olivenoliekager, og som
er i stand til at male uden opvarmning eller mærkbar reduktion af
indholdet af vand, af flygtige stoffer og af stoffer, der kan uddrages
ved hjælp af hexan.
— Ekstraktionshylster og vat eller filterpapir, fri for substanser, der kan
uddrages ved hjælp af hexan.
— Ekssikkator.
— Sigte med huller på 1 mm i diameter.
— Pimpsten i små korn, tørret.
1.2.Reagens
Teknisk n-hexan, hvis fordampningsrest ved fuldstændig fordampning er
mindre end 0,002 g/100 ml.
2. FREMGANGSMÅDE
2.1.Tilberedning af prøven
Om nødvendigt males analyseprøven i den mekaniske mølle, der skal være
omhyggeligt rengjort på forhånd, således at prøven kan reduceres til små
partikler, der kan passere sien fuldstændigt.
Ca. en tyvendedel af prøven anvendes til en fuldstændig rengøring af
møllen; denne formalede del bortkastes, og resten males, opsamles og
blandes med omhu, hvorefter analysen straks foretages.
2.2.Prøvemængde
Der afvejes med 0,01 g nøjagtighed ca. 10 g af analyseprøven til prøve-
mængde, når formalingen er afsluttet.
2.3.Tilberedning af ekstraktionshylstret
Prøvemængden anbringes i hylstret, og dette lukkes med vandsugende vat.
Såfremt der anvendes filterpapir, indpakkes prøven i dette papir.
2.4.Fortørring
Hvis presseresterne er meget fugtige (indhold af vand og flygtige stoffer på
over 10 %), foretages der en fortørring, idet det fyldte hylster (eller filter-
papir) anbringes en passende tid i ovnen, der højst kan opvarmes til 80º C,
således at indholdet af vand og flygtige stoffer bringes ned under 10 %.
2.5.Tilberedning af kolben
Kolben, der indeholder 1 à 2 pimpstenskorn, og som på forhånd er tørret i
ovnen ved en temperatur på 103º C ± 2º C og derefter afkølet mindst 1
time i ekssikkatoren, vejes med 1 mg nøjagtighed.
2.6.Første ekstraktion
Hylstret (eller filterpapiret), der indeholder prøvemængden, anbringes i
ekstraktionsapparatet. Den nødvendige mængde hexan hældes i kolben.
Kolben tilsluttes ekstraktionsapparatet, og det hele anbringes i det elektrisk
opvarmede bad. Opvarmningen reguleres således, at tilbageløbsmængden
udgør mindst tre dråber i sekundet (moderat, ikke stærk kogning).
Efter fire timers ekstraktion foretages afkøling. Hylstret udtages af ekstrak-
tionsapparatet og anbringes i en luftstrøm for at fjerne størstedelen af det
indeholdte opløsningsmiddel.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 75
▼B
2.7.Anden ekstraktion
Hylstret tømmes i mikromøllen, og der males så fint som muligt.
Anbring mængdemæssigt blandingen påny i hylstret og dette i ekstraktions-
apparatet.
Ekstraktionen begyndes påny, og den fortsættes endnu to timer, idet kolben
med forrige ekstraktion anvendes.
Den opløsning, der opnås i ekstraktionskolben, skal være gennemsigtig.
Såfremt dette ikke er tilfældet, filtreres der på et stykke filterpapir, idet
den første kolbe og filterpapiret gentagne gange vaskes med hexan. Filtratet
og afvaskningsopløsningen opsamles i en særskilt kolbe, der på forhånd er
tørret og vejet med 1 mg nøjagtighed.
2.8.Eliminering af opløsning og vejning af ekstraktet
Størstedelen af opløsningsmidlet fjernes ved destillation i elektrisk
opvarmet vandbad. De sidste rester af opløsningsmidlet fjernes ved at
opvarme kolben iovnen ved 103º C ± 2º C i20 mi nutter. Fordampni ngen
fremskyndes enten ved indblæsning af luft eller, bedre, inaktiv gas fra tid
til anden eller ved anvendelse af vakuum.
Kolben afkøles i ekssikkatoren i mindst 1 time, og den vejes med 1 mg
nøjagtighed.
Der opvarmes på ny i10 mi n. under samme forhold, hvorefter kolben
afkøles iekssi kkator og vejes.
Forskellen mellem to vejninger må ikke overstige 10 mg. I modsat fald
opvarmes der på ny i perioder på ti minutter med efterfølgende afkøling
og vejning, indtil forskellen i masse er højst 10 mg. Den sidste vejning af
kolben noteres.
Der foretages to bestemmelser.
3. UDFORMNING AF RESULTATER3.1.Beregning og formler
a) Ekstraktet udtrykt imasseprocent af produktet som leveret er li g med:
S=m
1×100
m0hvor:
S = masseprocent af produktet som leveret
m0= massen igram af den udtagne prøvemængde
m1= massen igram af ekstraktet efter tørri ng
Som resultat tages det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser,
såfremt ingen gentagelse af bestemmelsen er nødvendig.
Resultatet udtrykkes med en decimal
b) Ekstraktet kan udtrykkes i relation til tørstoffet ved anvendelse af
følgende formel:
S×100
100 − U= ekstrakt i% fedtstof/tørstof
hvor:S = masseprocent for ekstraktet af produktet som leveret (jf. a))
U = indhold af vand og flygtige stoffer.
3.2.Reproducerbarhed
Forskellen mellem resultaterne af de to samtidigt eller umiddelbart efter
hinanden af samme analytiker foretagne bestemmelser, må ikke overstige
0,2 g ekstrakt ved hexan for 100 g prøve.
I modsat fald gentages analysen på to andre prøvemængder. Hvis forskellen
også denne gang overstiger 0,2 g, tages som resultat det aritmetiske
gennemsnit af de fire bestemmelser.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 76
▼B
BILAG XVI
BESTEMMELSE AF IODTAL
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Denne internationale standard specificerer en metode til bestemmelse af
iodtallet i animalske og vegetabilske fedtstoffer og olier, i det følgende be-
nævnt fedtstoffer.
2. DEFINITION
Ved anvendelsen af denne internationale standard gælder følgende defini-
tion.
2.1. Iodtal: den mængde iod, der absorberes af prøven under de arbejdsbetin-
gelser, der er specificeret i denne internationale standard.
Iodtallet udtrykkes som g iod pr. 100 g prøve.
3. PRINCIP
En prøve opløses i opløsningsmiddel, og der tilsættes Wijs reagens. Efter
en nærmere fastsat tid tilsættes kaliumiodidopløsning og vand, og det
frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatopløsning.
4. REAGENSER
Alle reagenser skal være anerkendt analysekvalitet.
4.1. Vand, skal opfylde kravene iISO 3696, grad 3.4.2. Kaliumiodid — 100 g/l opløsning, der ikke indeholder iodat eller frit iod.4.3. Stivelseopløsning.
5 g opløselig stivelse blandes i 30 ml vand, denne blanding tilsættes
1 000 ml kogende vand efterfulgt af kogning i 3 min. og afkøling.
4.4. Natriumthiosulfat — standardopløsning.
c(Na
2S2O3×5 H2O) = 0,1 mol/l, som er standardiseret højst syv dage inden
brug.
4.5. Opløsningsmiddel — tilberedes ved blanding af lige dele cyclohexan og
eddikesyre.
4.6. Wijs reagens — indeholder iodmonochlorid i eddikesyre. Der benyttes
kommercielt Wijs reagens.
5. APPARATUR
Normalt laboratorieudstyr og navnlig følgende:
5.1. Vejeskeer af glas, der passer til prøven og kan anbringes i kolberne (5.2).5.2. Erlenmeyer-kolber, 500 ml, der er forsynet med slebne glaspropper og er
helt tørre.
6. FORBEREDELSE AF ANALYSEPRØVEN
Den homogeniserede prøve tørres på natriumsulfat og filtreres.
7. FREMGANGSMÅDE7.1.Prøven
Prøvens størrelse varierer alt efter dens forventede iodtal, jf. tabel 1.
Tabel 1
Forventet iodtal Prøvens størrelse
under 5 3,00 g
5— 20 1,00 g
21— 50 0,40 g
51—100 0,20 g1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 77
▼B
Forventet iodtal Prøvens størrelse
101—150 0,13 g
151—200 0,10 g
Prøven afvejes til nærmeste 0,1 mg i en glasske (5.1).
7.2.Bestemmelse
Prøven kommes i en 500 ml kolbe (5.2). Der tilsættes 20 ml opløsnings-
middel (4.5) for at opløse fedtstoffet. Der tilsættes nøjagtig 25 ml Wijs
reagens (4.6), proppen sættes i, indholdet omrystes med en roterende bevæ-
gelse, og kolben anbringes i mørke. Der må ikke benyttes mundpipette til
Wijs reagenset.
På tilsvarende måde forberedes der en blindprøve med opløsningsmidlet og
reagenset, men prøven udelades.
Når det gælder prøver med et iodtal på under 150, skal kolberne henstå i
mørke i 1 time. Når det gælder prøver med et iodtal på over 150, polyme-
riserede produkter eller kraftigt iltede produkter, skal kolberne henstå i 2
timer.
Derefter tilsættes hver af kolberne 20 ml kaliumiodidopløsning (4.2) og
150 ml vand (4.1).
Der titreres med natriumthiosulfat i standardopløsning (4.4), indtil den gule
farve, der skyldes iodet, næsten er forsvundet. Der tilsættes nogle få dråber
stivelsesopløsning (4.3), og titreringen fortsætter, indtil den blå farve lige
akkurat forsvinder efter meget kraftig omrystning.
Note: Potentiometrisk bestemmelse af slutpunktet kan tillades.
7.3.Antal bestemmelser
Der foretages to bestemmelser af samme prøve.
8. ANGIVELSE AF RESULTATER
Iodtallet angives som
12;69/C2c/C2V1/C0V2 ðÞ
m
hvor
c = den numeriske værdi af den eksakte koncentration (mol/l) af den
benyttede natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
V1= den numeriske værdi af den til blindprøven benyttede mængde (ml)
natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
V2= den numeriske værdi af den til bestemmelsen benyttede mæmgde
(ml) natriumthiosulfat-standardopløsning (4.4)
m = den numeriske værdi af prøvens størrelse (g) (7.1).
Resultatet betragtes som det artimetiske gennemsnit af de to bestemmelser
under forudsætning af, at repeterbarhedskravet er opfyldt.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 78
▼M11
BILAG XVII
METODE TIL BESTEMMELSE AF STIGMASTADIENER I VEGETA-
BILSKE OLIER
1. FORMÅL
Bestemmelse af stigmastadiener i vegetabilske olier indeholdende lave
koncentrationer af disse kulbrinter, navnlig i jomfruolie og råolie af
olivenpresserester.
2. OMRÅDE
Metoden kan anvendes på alle vegetabilske olier, selv om målinger kun
er pålidelige, hvis indholdet af de pågældende kulbrinter er på mellem
0,01 og 4,0 mg/kg. Metoden er særligt velegnet til at påvise tilstedevæ-
relsen af raffinerede vegetabilske olier (oliven, olivenrester, solsikke,
palme osv.) i jomfruolie, da raffinerede olier indeholder stimastadiener,
og jomfruolie ikke gør det.
3. PRINCIP
Isolation af uforsæbelige stoffer. Separation af den steroide kulbrintefrak-
tion ved søjlekromatografi på silicagel og analyse ved
kapillargaskromatografi.
4. APPARATUR
4.1. 250 ml kolber, der er egnet til brug med tilbagesvaler4.2. Skilletragte, kapacitet 500 ml
4.3. 100 ml rundbundede kolber
4.4. Rotationsfordamper4.5. Kromatografisøjle af glas (1,5-2,0 cm indvendig diameter × 50 cm
længde) med teflonprop og en tot glasuldsfibre eller sintret glasskive i
bunden. Til tilberedning af en silicagelsøjle hældes hexan på kromatogra-
fisøjlen til en dybde på ca. 5 cm, hvorefter der fyldes op med en
opslæmning af silicagel i hexan (15 g i 40 ml) ved hjælp af små mængderhexan. Henstilles til bundfældning, som afsluttes med let sammenryst-
ning. Der tilsættes vandfrit natriumsulfat til en højde på ca. 0,5 cm, og
til slut elueres den overskydende hexan.
4.6. Gaskromatograf med flammeioniseringsdetektor, splitinjektor eller kold
»on column«-injektor og en ovn, der kan programmeres til en nøjagtighed
på ± 1 ºC.
4.7. Kapillarsøjle med sintret silica til gaskromatografi (0,25 eller 0,32 mm
indvendig diameter × 25 m længde) belagt med en 5 % phenylmethylsili-
conefase, 0,25 µm filmtykkelse.
Note 1.
Der kan bruges andre søjler med lignende eller lavere polaritet.
4.8. Skriver/integrator med mulighed for integration over hver enkelt top.4.9. 5-10 µl mikroinjektionssprøjte til gaskromatografi med cementeret nål.
4.10. Elektrisk varmekappe eller varmeplade.
5. REAGENSER
Alle reagenser bør være af analytisk renhed, medmindre andet er angivet.
Det benyttede vand bør være destilleret vand eller vand af mindst tilsva-
rende renhed.
5.1. Hexan eller blanding af alkaner med kogepunktsinterval på 65-70 ºC
destilleret med rektificeringssøjle.
Note 2.
Opløsningsmidlet skal være destilleret for at fjerne urenheder.
5.2. 96 v/v ethanol.5.3. Vandfrit natriumsulfat.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 79
▼M11
5.4. 10 % alkoholisk kaliumhydroxidopløsning. Der tilsættes 10 ml vand til
50 g natriumoxid og omrøres. Derpå opløses blandingen i ethanol til
500 ml.
Note 3.
Alkoholisk kaliumhydroxid bliver brun ved henstand. Den bør tilberedes
frisk hver dag og opbevares i godt tilproppede, brune glasflasker.
5.5. Silicagel 60 til søjlekromatografi, 70-230 mesh (Merck ref. 7734 el.lign.).
Note 4.
Normalt kan silicagel bruges direkte fra beholderen uden behandling.
Imidlertid kan nogle batcher silica vise lav aktivitet, som giver ringe
kromatografiske separationer. Derfor bør silicagelen behandles således:
Silicagelen deaktiveres ved opvarmning i mindst fire timer ved 550 ºC.
Efter opvarmning anbringes silicagelen i en ekssikator, hvor gelen
afkøler, og derefter overføres silicagelen til en kolbe med prop. Der
tilsættes 2 % vand og omrystes, til der ikke længere kan ses klumper,
og pulveret flyder frit.
Hvis batcher af silicagel giver kromatogrammer med interfererende toppe,
bør silicagelen behandles som beskrevet ovenfor. Som alternativ kan der
benyttes ekstraren silicagel 60 (Merck ref. 7754).
5.6. Stamopløsning (200 ppm) af cholesta-3,5-dien (Sigma, 99 % renhed) i
hexan (10 mg i50 ml).
5.7. Standardopløsning af cholesta-3,5-dien i hexan ved en koncentration på
20 ppm fremkommet ved fortynding af ovennævnte opløsning.
Note 5.
Hvis opløsninger som nævnt i 5.6 og 5.7 holdes ved under 4 ºC, forringes
de i kke iløbet af ihvert fald de første fi re måneder.
5.8. Opløsni ng af n-nonacosan ihexan ien koncentrati on på ca. 100 ppm.
5.9. Bæregas til kromatografi: helium eller hydrogen af 99,9990 % renhed.
5.10. Hjælpegasser til flammeioniseringsdetektor: hydrogen af 99,9990 %
renhed og renset luft.
6. FREMGANGSMÅDE6.1.Fremstilling af uforsæbeligt stof:
6.1.1. 20 ± 0,1 g olie afvejes i en 250 ml kolbe (4.1), der tilsættes 1 ml af stan-
dardopløsningen af cholesta-3,5-dien (20 µg) og 75 ml 10 % alkoholisk
kaliumhydroxid, 10 %. Tilbagesvaleren påsættes, og der opvarmes til
svag kogning i 30 minutter. Kolben med prøven fjernes fra varmekilden,
og man lader opløsningen køle lidt (den må ikke afkøles helt, da prøven
så vil stivne). Der tilsættes 100 ml vand, og opløsningen overføres til en
skilletragt (4.2) ved hjælp af 100 ml hexan. Blandingen rystes kraftigt i
30 sekunder, hvorefter man lader den henstå, så lagene kan skilles.
Note 6.
Hvis der dannes en emulsion, som ikke hurtigt forsvinder, tilsættes der
små mængder ethanol.
6.1.2. Den nedre vandige fase overføres til en anden skilletragt, og der ekstra-
heres igen med 100 ml hexan. Man lader igen den nedre fase løbe af, og
hexanekstrakterne vaskes (samlet ien anden ski lletragt) tre gange med
hver gang 100 ml blanding af ethanol-vand (1: 1), indtil der opnås neutral
pH-værdi.
6.1.3. Hexanopløsningen passeres gennem vandfrit natriumsulfat (50 g), vaskes
med 20 ml hexan og inddampes i en rotationsfordamper ved 30 ºC og
lavt tryk, indtil den er tør.
6.2.Separation af den steroide kulbrintefraktion:
6.2.1. Det tilbageværende overføres til fraktioneringssøjlen ved hjælp af to 1 ml-
portioner hexan. Man lader væskeniveauet falde til toppen af natriumsul-
fatet, og den kromatografiske eluering startes med hexan ved en
hastighed på ca. 1 ml/min. De første 25-30 ml af elueringen kasseres, og
den følgende 40 ml fraktion opsamles. Efter opsamlingen overføres denne
fraktion til en 100 ml rundbundet kolbe (4.3).1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 80
▼M11
Note 7.
Den første fraktion indeholder mættede kulbrinter (jf. figur 1a) og den
anden fraktion de steroide kulbrinter. Yderligere eluering giver squalen
og relaterede forbindelser. For at opnå god separation mellem mættede
og steroide kulbrinter kræves der optimering af fraktioneringsmængderne.
Med henblik herpå justeres mængden af den første fraktion således, at når
den anden fraktion analyseres, er de toppe, som repræsenterer de mættede
kulbrinter, lave (jf. figur 1c). Hvis sådanne ikke fremkommer, men stan-
dardtoppens intensitet er lav, reduceres mængden. I hvert fald er en
komplet separation mellem komponenterne i den første og den anden
fraktion unødvendig, da der ikke er nogen overlappende toppe under
gaskromatografianalyse, hvis betingelserne justeres som beskrevet i
6.3.1. Optimering af mængden af den anden fraktion er normalt unød-
vendig, da der er god separation fra de øvrige komponenter.
Tilstedeværelsen af en høj top ved en retentionstid på ca. 1,5 min. mindre
end standard skyldes squalen og angiver dårlig separation.
6.2.2. Den anden fraktion inddampes i en fordamper ved 30 ºC og lavt tryk
indtil tørhed, og restmængden opløses straks i 0,2 ml hexan. Opløsningen
opbevares i køleskab indtil analyse.
Note 8.
Restmængder under 6.1.3 og 6.2.2 bør ikke opbevares tørt ved rumtempe-
ratur. Så snart de er fremkommet, bør opløsningsmidlet tilsættes, og
opløsningerne bør opbevares i køleskab.
6.3.Gaskromatografi
6.3.1. Arbejdsbetingelser for splitinjektion:
— injektortemperatur: 300 ºC
— detektortemperatur: 320 ºC— skriver/integrator: parametrene for integration bør sættes, så de giver
en korrekt bedømmelse af arealerne. Integration over de enkelte toppe
anbefales
— følsomhed: ca. 16 gange mindste dæmpning
— injiceret mængde opløsning: 1 µl
— ovnprogrammeringstemperaturer: initialtemperatur 235 ºC i 6 min. og
derefter stigende med 2 ºC/min. indtil 285 ºC
— injektor med splitforhold 1: 15— bæregas: helium eller hydrogen ved ca. 120 kPa tryk.
Disse betingelser kan justeres alt efter kromatografens og søjlens evne til
at give kromatogrammer, der imødekommer følgende krav: intern stan-
dardtop inden for ca. 5 min. af den tid, der er angivet i 6.3.2. Den
interne standardtop bør være på mindst 80 % fuldt udslag.
Gaskromatografisystemet skal kontrolleres ved injektion af en blanding af
stamopløsningen af cholestadien (5.6) og n-nonacosanopløsning (5.8).
Cholesta-3,5-dientoppen skal vise sig før n-nonacosanen (jf. figur 1c).
Hvis den ikke fremkommer, kan man vælge mellem to metoder: at bringe
ovntemperaturen ned og/eller benytte mindre polære søjler.
6.3.2. Identifikation af toppe
Den interne standardtop viser sig efter ca. 19 min. og stigmasta-3,5-dien
ved en relativ retentionstid på ca. 1,29 (jf. figur 1b). Sammen med med
stigmasta-3,5-dien forekommer der små mængder af en isomer, som
normalt kun giver en enkelt kromatografisk top. Hvis søjlen er for polær
eller har stor opløsningsevne, kan isomeren imidlertid vise sig som en
lille top før og nær på toppen for stigmasta-3,5-dien (jf. figur 2). For at
sikre, at stigmastadienerne elueres som en top, er det tilrådeligt at erstatte
søjlen med en mindre polære søjle eller med en søjle med større
indvendig diameter.
Note 9.
Der kan fås en stigmastadienreference ved analyse af en raffineret vegeta-
bilsk olie ved at benytte metoden til bestemmelser af steroide kulbrinter.
Stigmastadiener fremkalder en signifikant og let identificerbar top.
6.3.3. Kvantitativ analyse
Indholdet af stimastadiener bestemmes efter formlen:
mg/kg stigmastadiener =
As/C2Mc
Ac/C2Mo1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 81
▼M11
hvor: As= areal af stigmastadientop (hvis toppen er opløst i to
isomerer, summen af de to toppes arealer)
Ac= areal af interne standard (cholestadien)
Mc= massen af tilsat standard i mikrogram
Mo= massen af olie i g.
Påvisningsgrænse: Ca. 0,01 mg/kg.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 82
▼M11
Figur 1
Gaskromatogrammer fra olivenolieprøver analyseret på en kapillarsøjle
med sintret silica (0,25 mm indvendig diameter × 25 m), belagt med 5 %
phenylmethylsilicone, 0,25 µm filmtykkelse.
a) Første fraktion (30 ml) fra jomfruolie tilsat standardopløsning.
b) Anden fraktion (40 ml) fra olivenolie indeholdende 0,10 mg/kg stig-
mastadiener.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 83
▼M11
c) Anden fraktion (40 ml) indeholdende en lille smule af den første frak-
tion.
Figur 2
Gaskromatogrammer fra en prøve af raffineret olivenolie analyseret på en
D-5-søjle, der viser stigmasta-3,5-diens isomer.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 84
▼M13
BILAG XVIII
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ECN 42-HOLDIGE TRIGLY-
CERIDER (FORSKEL MELLEM HPLC-DATA OG DET TEORETISKE
INDHOLD)
1.Formål
Bestemmelse af sammensætningen af triglycerider (TAG) i olivenolier
udtrykt på basis af deres ækvivalente kulstofantal, ved hjælp af forskel-
lene mellem de analytiske resultater opnået ved HPLC og det teoretiske
indhold beregnet ud fra fedtsyresammensætningen.
2.Anvendelsesområde
Standarden gælder for olivenolier. Metoden er anvendelig til at påvise
tilstedeværelsen af små mængder frøolie (der har et stort indhold af
linolsyre) i alle kategorier af olivenolie.
3.Princip
Indholdet af ECN 42-holdige triglycerider bestemt ved HPLC-analyse
og det teoretiske indhold af ECN 42-holdige triglycerider (beregnet på
grundlag af GLC-bestemmelse af fedtsyresammensætningen) er inden
for visse grænser i overensstemmelse med hinanden for rene olier. En
større forskel end de værdier, der er fastsat i forordningen for hver
type olie, viser, at olien indeholder frøolier.
4.Metode
Metoden til beregning af det teoretiske indhold af ECN 42-holdige trig-
lycerider og af forskellen mellem denne værdi og data fra HPLC-
analysen består hovedsagelig i samordning af analytiske data, der er
fremkommet ved andre metoder; disse kan opdeles i tre trin: bestem-
melse af fedtsyresammensætningen ved hjælp af gaschromatografi ved
anvendelse af kapillarkolonne, beregning af den teoretiske sammensæt-
ning af ECN 42-holdige triglycerider og HPLC-bestemmelse af ECN
42-holdige triglycerider.
4.1.Apparatur
4.1.1. Rundkolber, 250 og 500 ml.4.1.2. Bægerglas 100 ml.4.1.3. Glaschromatografikolonne, indvendig diameter på 21 mm, længde på
450 mm, med hane og normal (indvendig) slib foroven.
4.1.4. Skilletragte, 250 ml, med normal (udvendig) slib forneden, som passer
øverst på kolonnen.
4.1.5. Glasstang, længde på 600 mm.4.1.6. Glastragt, diameter på 80 mm.4.1.7. Målekolber, 50 ml.4.1.8. Målekolber, 20 ml.4.1.9. Rotationsinddamper.4.1.10. HPLC med mulighed for termostatstyring af kolonnetemperaturen.4.1.11. Injektionsenhed à 10 µl.
4.1.12. Detektor: differentialrefraktometer. Følsomheden ved fuldt udslag bør
være mindst 10
-4enheder.
4.1.13. Kolonne: rustfrit stålrør, længde på 250 mm og indvendig diameter på
4,5 mm, fyldt med 5 µm diameter silicapartikler med 22-23 % kulstof i
form af octadecylsilan (note 2).
4.1.14. Skriver og/eller integrator.
4.2.Reagenser
Reagenserne skal være af analysegrad. Elueringsvæskerne bør degasses
og kan recirkuleres adskillige gange uden indflydelse på separationerne.
4.2.1. Petroleumether, 40-60 ºC, chromatografigrad.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 85
▼M13
4.2.2. Ethylether, peroxidfri, frisk destilleret.
4.2.3. Glaschromatografisk elueringsvæske: blanding af petroleumether/ethy-
lether 87/13 (v/v).
4.2.4. Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, med standardiseret vandind-
hold på 5 % (w/w).
4.2.5. Glasuld.4.2.6. Acetone.
4.2.7. Acetonitril.
4.2.8. HPLC-elueringsvæske: acetonitril + acetone (i et indbyrdes forhold, der
giver den ønskede separation; der begyndes med en blanding i forholdet
50:50).
4.2.9. Opløsningsmiddel: acetone.
4.2.10. Referencetriglycerider: enten anvendes triglycerider, som fås i handelen
(tripalmitin, triolein osv.), hvis retentionstider plottes mod det ækviva-
lente kulstofantal, eller der anvendes referencechromatogrammer af
sojaolie, en blanding af sojaolie og olivenolie i forholdet 30:70 og ren
olivenolie (se note 3 og 4 og figur 1, 2, 3 og 4).
4.3.Prøveforberedelse
Da interfererende stoffer kan give falsk positive resultater, skal prøven
altid oprenses ifølge IUPAC-metode 2.507, der anvendes til bestem-
melse af polære stoffer ioxyderet oli e.
4.3.1. Forberedelse af chromatografikolonne
Kolonnen (4.1.3) fyldes med ca. 30 ml elueringsvæske (4.2.3), derefter
indsættes glasuld (4.2.5) i kolonnen, og ved hjælp af glasstangen (4.1.5)
skubbes glasulden ned ibunden af kolonnen.
I et 100 ml bægerglas opslæmmes 25 g silicagel (4.2.4) i 80 ml elue-
ringsblanding (4.2.3), som derefter overføres til kolonnen ved hjælp af
en glastragt (4.1.6).
For at sikre sig, at al silicagelen er overført til kolonnen, skylles bæger-
glasset med elueringsblandingen, og skyllevæsken hældes ligeledes ned
ikolonnen.
Der åbnes for hanen, så væsken kan løbe ud af kolonnen, indtil den står
ca. 1 cm over silicagelen.
4.3.2. Kolonnechromatografi
2,5 ± 0,1 g olie, der om nødvendigt er filtreret, homogeniseret og tørret
iforvejen, afvejes med 0,001 g nøjagti ghed ien 50 ml målekolbe
(4.1.7). Olien opløses i ca. 20 ml elueringsvæske (4.2.3), som om
nødvendigt opvarmes lidt for at få den i opløsning. Olien afkøles ved
stuetemperatur og volumen justeres med elueringsvæske.
Ved hjælp af en fuldpipette overføres 20 ml opløsning til kolonnen, der
er forberedt ioverensstemmelse med 4.3.1, der åbnes for hanen og
væsken eluerer, indtil den er på højde med silicagelen.
Der elueres dernæst med 150 ml elueringsvæske (4.2.3), med en
hastighed på ca. 2 ml/min (det vil tage ca. 60-70 minutter at lade
150 ml løbe gennem kolonnen).
Eluatet opsamles ien 250 ml rundkolbe (4.1.1), der iforvejen er tareret
og nøjagtigt afvejet. Efter at væsken er inddampet (Rotavapor), afvejes
remanensen, som vil blive anvendt ved fremstilling af opløsningen til
HPLC-analyse og ved fremstilling af methylester.
Udbyttet af prøven fra kolonnen skal være mindst 90 % for kategori-
erne ekstra jomfru, jomfru og almindelig raffineret olivenolie, og
mindst 80 % for bomolie og olivenolie af presserester.
4.4.HPLC-analyse
4.4.1. Prøveforberedelse til chromatografianalyse
Der fremstilles en 5 % opløsning af den prøve, der skal analyseres, ved
at der afvejes 0,5 ± 0,001 g af prøven ien 10 ml målekolbe, hvorefter
der fyldes op til 10 ml med opløsningsmiddel (4.2.9).1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 86
▼M13
4.4.2. Fremgangsmåde
Chromatografisystemet gøres klar, og der pumpes elueringsvæske
(4.2.8) igennem med en hastighed af 1,5 ml/min. til rensning af hele
systemet. Der ventes, indtil basislinjen er blevet stabil. Derefter
indsprøjtes 10 µl af prøven forberedt som under 4.3.
4.4.3. Beregning og angivelse af resultaterne
Der anvendes intern standard, dvs. at summen af toparealerne svarende
til de forskellige triglycerider sættes lig med 100 %. Den procentvise
andel af hvert triglycerid beregnes efter formlen:
% triglycerid = topareal × 100/summen af alle toparealer
idet resultatet angives med to decimaler.
Note 1: Elueringsrækkefølgen kan bestemmes ved beregning af det
ækvivalente kulstofantal, ofte defineret ved udtrykket ECN = CN −
2n, hvor CN er kulstofantallet, og n er antallet af dobbeltbindinger.
Det kan beregnes mere nøjagtigt, hvis dobbeltbindingens placering
tages i betragtning. Hvis no,nlog nlner antallet af dobbeltbindinger i
henholdsvis olie-, linol- og linolensyre, kan det ækvivalente kulstofantal
beregnes efter formlen:
EN = CN − dono−dlnl−dlnnln
hvor koefficienterne do,dlog dlnkan beregnes ved hjælp af reference-
triglyceriderne. Under de betingelser, der er specificeret ved denne
metode, vil resultatet ligge tæt ved:
ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln)
Note 2: Eksempler: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377
Note 3: Med flere referencetriglycerider er det også muligt at beregne
opløsningsevnen med hensyn til triolein:
α=R T1/ RT triolein
ved hjælp af den reducerede retentionstid RT1= RT − RT opløsnings-
middel.
Ud fra en afbildning af log αmod f (antal dobbeltbindinger) kan reten-
tionstiderne for alle de triglycerider af fedtsyrer, som findes i
referencetriglyceriderne, bestemmes (se figur 2).
Note 4: Kolonnen skal være så effektiv, at toppene af LLL (trilinolein)
adskilles tydeligt fra toppene af triglyceriderne med næsten samme
retentionstid. Elueringen fortsættes, indtil ECN 52-toppen.
Note 5: Der sikres en præcis måling af alle relevante toparealer for
denne bestemmelse, hvis den anden top svarende til ECN 50 giver
50 % af fuldt udslag på skriveren.
4.5.Beregning af triglyceridernes sammensætning
4.5.1. Bestemmelse af fedtsyresammensætningen
Fedtsyresammensætningen bestemmes ved hjælp af den gaschromato-
grafiske EF-metode, der er omhandlet i bilag X A til forordning (EØF)
nr. 2568/91, ved anvendelse af en kapillarkolonne. Methylesterne frem-
stilles efter metoden i bilag X B i ovennævnte forordning
(natriummethylat i en alkoholopløsning).
4.5.2. Fedtsyrer, der indgår i beregningen
Glyceriderne grupperes på grundlag af deres ækvivalente kulstofantal
(Equivalent Carbon Number − ECN) som anført i tabellen nedenfor.
Der er kun medtaget fedtsyrer med 16 eller 18 kulstofatomer, fordi
kun disse er af betydning for olivenolie.
Fedtsyre (AG) ForkortelseMolekylvægt
(MW)ECN
Palmitinsyre P 256,4 16
Palmitolsyre Po 254,4 14Stearinsyre S 284,5 181991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 87
▼M13
Fedtsyre (AG) ForkortelseMolekylvægt
(MW)ECN
Oliesyre O 282,5 16
Linolsyre L 280,4 14Linolensyre Ln 278,4 12
4.5.3. Omregning af areal % til mol for alle fedtsyrer
mol P ¼areal % P
MW Pmol S ¼areal % S
MW Smol Po ¼areal % Po
MW Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
mol O ¼areal % O
MW Omol L ¼areal % L
MW Lmol Ln ¼areal % Ln
MW Ln
4.5.4. Normalisering af fedtsyrerne til 100 %
mol % P 1 ;2;3 ðÞ ¼mol P /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)mol % S 1 ;2;3 ðÞ ¼
mol S /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼mol Po /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % O 1 ;2;3 ðÞ ¼mol O /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % L 1 ;2;3 ðÞ ¼mol L /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼mol Ln /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Resultaterne giver den procentvise andel af hver fedtsyre i mol % i den
samlede position (1, 2 og 3) for TAG.
Derefter beregnes summen af de mættede fedtsyrer P og S (SFA) og de
umættede fedtsyrer Po, O, L og Ln (UFA):
mol % SFA = mol % P + mol % S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)mol % UFA = 100 − mol % SFA
4.5.5. Beregning af fedtsyresammensætningen i 2- og 1-3-positio-
nerne iTAG
Fedtsyrerne fordeles i tre grupper som følger: to identiske for 1- og 3-
positionerne og én for 2-positionen med forskellige koefficienter for de
mættede (P og S) og umættede syrer (Po, O, L og Ln).
4.5.5.1. Mættede fedtsyrer i 2-positionen [P(2) og S(2)]
mol % P(2) = mol % P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)mol % S(2) = mol % S (1,2,3) * 0,061991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 88
▼M13
4.5.5.2. Umættede fedtsyrer i 2-positionen [Po(2), O(2), L(2) og Ln(2)]:
mol % Po 2 ðÞ ¼mol % Po 1 ;2;3 ðÞ
mol % UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0 mol % S 2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)mol % O 2 ðÞ ¼
mol % O 1 ;2;3 ðÞ
mol % UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0 mol % S 2 ðÞ ½/C138
mol % L 2 ðÞ ¼mol % L 1 ;2;3 ðÞ
mol % UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0 mol % S 2 ðÞ ½/C138
mol % Ln 2 ðÞ ¼mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
mol % UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0 mol % S 2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3. Fedtsyrer i 1- og 3-positionerne [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3)
og Ln(1,3)]:
mol % P 1 ;3ðÞ ¼mol % P 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % P 2 ðÞ
2þmol % P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)mol % S 1 ;3ðÞ ¼
mol % S 1 ;2;3 ðÞ /C0mol % S 2 ðÞ
2þmol % S 1 ;2;3 ðÞ
mol % Po 1 ;3ðÞ ¼mol % Po 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % Po 2 ðÞ
2þmol % Po 1 ;2;3 ðÞ
mol % O 1 ;3ðÞ ¼mol % O 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % O 2 ðÞ
2þmol % O 1 ;2;3 ðÞ
mol % L 1 ;3ðÞ ¼mol % L 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % L 2 ðÞ
2þmol % L 1 ;2;3 ðÞ
mol % Ln 1 ;3ðÞ ¼mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % Ln 2 ðÞ
2þmol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Beregning af triglycerider
4.5.6.1. TAG med én fedtsyre (AAA, her LLL, PoPoPo)
mol % AAA ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % A 2 ðÞ/C3 mol % A 1 ;3ðÞ
10 000(7)
4.5.6.2. TAG med to fedtsyrer (AAB, her PoPoL, PoLL)
mol % AAA ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % A 2 ðÞ/C3 mol % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
mol % ABA ¼
mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % B 2 ðÞ/C3 mol % A 1 ;3ðÞ
10 000
4.5.6.3. TAG med tre forskellige fedtsyrer (ABC, her OLLn, PLLn, PoOLn,
PPoLn)
mol % ABC ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % B 2 ðÞ/C3 mol % C 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) mol % BCA ¼
mol % B 1 ;3ðÞ /C3 mol % C 2 ðÞ/C3 mol % A 1 ;3ðÞ /C3 2
10 000
mol % CAB ¼mol % C 1 ;3ðÞ /C3mol % A 2 ðÞ/C3mol % B 1 ;3ðÞ /C32
10 0001991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 89
▼M13
4.5.6.4. ECN 42-holdige triglycerider
De følgende ECN 42-holdige triglycerider beregnes i overensstemmelse
med ligning 7, 8 og 9 i den rækkefølge, der er bestemt af den forven-
tede eluering i HPLC (normalt kun tre toppe).
LLLPoLL og den positionelle isomer LPoLOLLn og de positionelle isomerer OLnL og LnOLPoPoL og den positionekke isomer PoLPoPoOLn og de positionelle isomerer OPoLn og OLnPoPLLn og de positionelle isomerer LLnP og LnPLPoPoPoSLnLn og den positionelle isomer LnSLn
PPoLn og de positionelle isomerer PLnPo og PoPLn
De ECN 42-holdige triglycerider er givet ved summen af de ni trigly-
cerider, inklusive deres positionelle isomerer. Resultaterne angives med
mindst to decimaler.
5.Evaluering af resultaterne
Den beregnede teoretiske sammensætning og den sammensætning, der
er bestemt ved HPLC-analysen, sammenlignes. Hvis differencen
mellem HPLC-data minus teoretiske data overstiger de værdier, der er
anført i forordningen for den pågældende oliekategori, indeholder
prøven frøolie.
Bemærk: Resultaterne angives med én decimal.
6.Eksempel (Tallene henviser til afsnittene i beskrivelsen af metoden)
4.5.1. Beregning af mol % fedtsyrer på gr undlag af GLC-data
(areal %)
Der fremkommer følgende data for fedtsyresammensætningen ved
GLC:
FA
MWP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
Areal % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Omregning af areal % til mol for alle fedtsyrer
mol P ¼10
256 ;4¼0;03900 mol P Se formel (1)
mol S ¼3
284 ;5¼0;01054 mol S Se formel (1)
mol Po ¼1
254 ;4¼0;00393 mol Po Se formel (1)
mol O ¼75
282 ;5¼0;26549 mol O Se formel (1)
mol L ¼10
280 ;4¼0;03566 mol L Se formel (1)
mol Ln ¼1
278 ;4¼0;003594 mol Ln Se formel (1)
I alt = 0,35822 mol TAG1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 90
▼M13
4.5.4. Normalisering af fedtsyrerne til 100 %
mol % P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 mol P /C3100
0;35822 mol¼10;888 % Se formel (2)
mol % S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 mol S /C3100
0;35822 mol¼2;944 % Se formel (2)
mol % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 mol Po /C3100
0;35822 mol¼1;097 % Se formel (2)
mol % O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 mol O /C3100
0;35822 mol¼74;113 % Se formel (2)
mol % L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 mol L /C3100
0;35822 mol¼9;956 % Se formel (2)
mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 mol Ln /C3100
0;35822 mol¼1;003 % Se formel (2)
mol % ialt = 100,0 %
Sum af mættede og umættede fedtsyrer i 1-, 2-, 3-position i TAG:
mol % SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Se formel (3)
mol % UFA = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Se formel (3)
4.5.5. Beregning af fedtsyresammensætningen i 2- og 1-3-positio-
nerne iTAG
4.5.5.1. Mættede fedtsyrer i 2-positionen [P(2) og S(2)]
mol % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 % Se formel (4) Se formel (4)
mol % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 % Se formel (4) Se formel (4)
4.5.5.2. Umættede fedtsyrer i 1,3-positionen [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og Ln(1,3)]
mol % Po 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 mol % Se formel (5)
mol % O 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 mol % Se formel (5)
mol % L 2 ðÞ ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458 mol % Se formel (5)
mol % Ln 2 ðÞ ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154 mol % Se formel (5)
4.5.5.3. Fedtstyrer i 1,3-positionerne [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og
Ln(1,3)]
mol % P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 mol % Se formel (6)
mol % S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 mol % Se formel (6)
mol % Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 mol % Se formel (6)
mol % O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 mol % Se formel (6)
mol % L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 mol % Se formel (6)
mol % Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927 mol % Se formel (6)1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 91
▼M13
4.5.6. Beregning af triglycerider
På grundlag af den beregnede fedtsyresammensætning i sn-2- og sn-1,3-
positionerne (se ovenfor):
FA i1,3-pos. 2-pos.
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %I alt 100,0 % 100,0 %
beregnes følgede triglycerider:
LLL
PoPoPoPoLL med 1 positionel isomerSLnLn med 1 positionel isomerPoPoL med 1 positionel isomerPPoLn med 2 positionelle isomererOLLn med 2 positionelle isomererPLLn med 2 positionelle isomererPoOLn med 2 positionelle isomerer
4.5.6.1. TAG med én fedtsyre (LLL, PoPoPo) Se formel (7)
mol % LLL =
9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10 000= 0,09708 mol LLL
mol % PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10 000= 0,00013 mol PoPoPo
4.5.6.2. TAG med to fedtyrer (PoLL, SLnLn, PoPoL) Se formel (8)
mol % PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,02141
mol % LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10 000= 0,01070
0,03211 mol PoLL
mol % SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,00093
mol % LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10 000= 0,00002
0,00095 mol SLnLn
mol % PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,00236
mol % PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10 000= 0,00118
0,00354 mol PoPoL1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 92
▼M13
4.5.6.3. TAG med tre forskellige fedtsyrer (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) Se
formel (9)
mol % PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,00375
mol % LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10 000= 0,00012
mol % PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10 000= 0,00375
0,00762 mol PPoLn
mol % OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,14577
mol % LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,14577
mol % LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10 000= 0,14577
0,43671 mol OLLn
mol % PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,03400
mol % LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10 000= 0,00111
mol % LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10 000= 0,03400
0,06911 mol PLLn
mol % PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10 000= 0,01605
mol % LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10 000= 0,01605
mol % OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10 000= 0,01605
0,04815 mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 mol TAG1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 93
▼M14
Figur 1: Afbildning af log αmod f (antal dobbeltbindinger)
La: laurinsyre; My: myristinsyre; P: palmitinsyre; St: stearinsyre; O:
oliesyre; L: linolsyre; Ln: linolensyre.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 94
▼M14
Figur 2: Sojaolie
Figur 3: Sojaolie/olivenolie 30/70
1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 95
▼M14
Figur 4: Olivenolie
1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 96
▼M19
BILAG XIX
BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ALIFATISKE ALKOHOLER
VED GASKROMATOGRAFI PÅ KAPILLARSØJLE
1. ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden beskriver en fremgangsmåde til at bestemme indholdet af de
enkelte alifatiske alkoholer og det samlede indhold af alifatiske alko-
holer ifedtstoffer.
2. METODENS PRINCIP
Fedtstoffer, tilsat 1-eicosanol som intern standard, forsæbes med
kaliumhydroxid i ethanolopløsning, hvorefter de ikke-forsæbelige
stoffer ekstraheres med diethylether. Alkoholfraktionen separeres fra
ekstrakten af ikke-forsæbelige stoffer ved kromatografi på basiske kisel-
gelplader. De alkoholer, der er indvundet fra kiselgelen, omdannes til
trimethylsilylethere og analyseres ved gaskromatografi på kapillarsøjle.
3. APPARATUR
3.1. 250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib3.2. 500 ml skilletragt3.3. 250 ml kolber3.4. komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm
glasplader.
3.5. ultraviolet lampe med en bølgelængde på 366 eller 254 nm3.6. 100 og 500 µl mikrosprøjter
3.7. en cylindrisk filtertragt med G3-glasfritte (porøsitet 15-40 µm), med en
diameter på ca. 2 cm og en højde på ca. 5 cm, egnet til vakuumfiltre-
ring og med et 12/21 udvendigt konisk glasslib
3.8. en 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendigt konisk glasslib,
som filtertragten (punkt 3.7) kan monteres på
3.9. et 10 ml prøverør med konisk bund og tætsluttende prop3.10. en gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsøjle, har et split-
tersystem og består af:
3.10.1. et termostatkammer til søjler, som kan opretholde den ønskede tempe-
ratur med en nøjagtighed på 1 ºC
3.10.2. en injektionsenhed med temperaturindstilling, med et fordampningsele-
ment af silanglas
3.10.3. en flammeioniseringsdetektor og en omformer-forstærker
3.10.4. en integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-
forstærkeren (punkt 3.10.3), og som har en svartid på ikke over ét
sekund og variabel papirhastighed
3.11. en kapillarsøjle af glas eller kvartsglas, med en længde på 20-30 m, en
indre diameter på 0,25-0,32 mm, indvendig belagt med SE-52– eller
SE-54–væskefase eller tilsvarende i en ensartet tykkelse på mellem
0,10 og 0,30 µm
3.12. en 10 µl gaskromatografi-mikrosprøjte med hærdet kanyle.
3.13. præcisionsvægt med en følsomhed på 1 mg (angivelse af 0,1 mg).
4. REAGENSER
4.1. kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanolopløsning: 130 g kaliumhydroxid
(titer: min. 85 %) opløses i 200 ml destilleret vand under afkøling, og
der fyldes op med ethanol til 1 liter. Opløsningen opbevares i veltil-
proppede, mørke glasflasker
4.2. diethylether, analyseren4.3. vandfrit natriumsulfat, analyserent4.4. glasplader belagt med kiselgel uden fluorescensindikator, tykkelse
0,25 mm (kan fås brugsfærdige i handelen)1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 97
▼M19
4.5. kaliumhydroxid, ca. 0,2 N, i ethanolopløsning: 13 g kaliumhydroxid
opløses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter
4.6. benzen, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.7. acetone, til kromatografi (punkt 5.2.2)4.8. hexan, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.9. diethylether, til kromatografi (punkt 5.2.2)
4.10. chloroform, analyseren
4.11. referenceopløsning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phyto-
steroler, 5 %-opløsning i chloroform
4.12. 2,7-dichlorfluorescein, 0,2 %-opløsning i ethanol. Gøres svagt basisk
ved tilsætning af nogle få dråber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidopløs-
ning
4.13. vandfri pyridin til kromatografi4.14. hexamethyldisilazan
4.15. trimethylchlorsilan
4.16. standardopløsninger af trimethylsilylethere (TMSE) af de alifatiske
alkoholer fra C
20til C28, friskfremstillede ud fra blandinger af rene alko-
holer
4.17. 1-eicosanol, 0,1 % (m/v)–opløsning i chloroform (intern standard)
4.18. bæregas: hydrogen eller helium, ren, til gaskromatografi
4.19. hjælpegas: nitrogen, ren, til gaskromatografi.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1.Fremstilling af de uforsæbelige stoffer
5.1.1. Et rumfang 0,1 %-1-eicosanolopløsning i chloroform (punkt 4.17), der
indeholder en mængde 1-eicosanol (man kan ligeledes anvende 1-
eneicosanol) svarende til ca. 10 % af indholdet af alifatiske alkoholer i
den del af prøven, der er taget ud til bestemmelsen, overføres til 250 ml-
kolben ved hjælp af 500 µl-mikrosprøjten. F.eks. sættes til 5 g af
prøven 250 µl 0,1 %–1-eicosanolopløsning, hvis undersøgelsen gælder
olivenolier eller frøolier, og 1 500 µl, hvis det gælder olie fra oliven-
presserester.
Prøven inddampes til tørhed i en nitrogenstrøm, hvorefter 5 g af den
tørrede, filtrerede prøve afvejes nøjagtigt og overføres til den samme
kolbe.
5.1.2. 50 ml 2 N–opløsning af kaliumhydroxid i ethanol tilsættes, refluxsva-
leren påsættes, og væsken opvarmes til svag kogning på vandbad
under vedvarende, kraftig omrøring, indtil forsæbningen er sket (opløs-
ningen bliver klar). Opvarmningen fortsættes i endnu 20 minutter,
derefter tilsættes 50 ml destilleret vand ovenfra gennem svaleren,
svaleren tages af, og kolben afkøles til ca. 30 ºC.
5.1.3. Kolbens indhold overføres kvantitativt til en 500 ml–skilletragt, idet der
skylles flere gange med destilleret vand, i alt ca. 50 ml. Ca. 80 ml
diethylether tilsættes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og får
lov til at henstå (note 1).
Den nedre vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt.
Yderligere to ekstraktioner foretages på den vandige fase på samme
måde, idet der bruges 60-70 ml diethylether hver gang.
Note 1: En eventuel emulsion kan brydes ved tilsætning af en lille
mængde ethyl- eller methylalkohol ved hjælp af en spray.
5.1.4. Etherekstrakterne samles i én skilletragt og vaskes med destilleret vand
(50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver neutral reaktion.
Når vaskevandet er fjernet, tørres ekstrakterne med vandfrit natrium-
sulfat og filtreres over vandfrit natriumsulfat ned i en på forhånd vejet
250 ml-kolbe, idet tragt og filter vaskes med små mængder diethylether.
5.1.5. Etheren destilleres ned til nogle få ml og bringes derefter til tørhed
under et let undertryk eller i en nitrogenstrøm, tørres fuldstændigt i en
ovn ved 100 ºC i ca. 15 minutter og vejes efter afkøling i en ekssik-
kator.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 98
▼M19
5.2.Separation af alkoholfraktionen
5.2.1. Forberedelse af de basiske plader: Kiselgelpladerne (punkt 4.4)
nedsænkes fuldstændig i 0,2 N-opløsningen af kaliumhydroxid i ethanol
(punkt 4.5) i10 sekunder, tørrer under emhætte i2 ti mer og sættes ti l
si dst ien ovn ved 100 ºC i1 ti me.
Pladeren tages ud af ovnen og opbevares i en ekssikkator med calcium-
chlorid, til de skal bruges (plader, der er behandlet på denne måde, skal
anvendes inden 15 dage).
Note 2: Når basiske kiselgelplader benyttes til at separere alkoholfrak-
tionen, er det ikke nødvendigt at behandle de ikke-forsæbelige
stoffer med aluminiuoxid. På denne måde holdes alle sure
forbindelser (fedtsyrer og andre syrer) tilbage på basislinjen,
og båndet med alifatiske alkoholer og terpenalkoholer bliver
klart adskilt fra sterolbåndet.
5.2.2. Der hældes 65:35 (v/v)-hexan/ethyletherblanding i kromatografika-
mmeret til en højde på ca. 1 cm (*).
Kammeret lukkes med det dertil passende låg og henstår i ca. en halv
time, så at der opnås ligevægt mellem væske og damp. Strimler af
filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringes på kammerets
indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. en tredjedel
og giver en mere ensartet og regelmæssig eluering af komponenterne.
Note 3: Kromatografiblandingen bør udskiftes for hver test for at opnå
fuldstændig reproducerbare elueringsbetingelser.
5.2.3. Der fremstilles en ca. 5 %-opløsning af de ikke-forsæbelige stoffer
(punkt 5.1.5) ichloroform. Med 100 µl-mikrosprøjten afsættes med
0,3 ml af denne opløsning på en kromatografiplade (punkt 5.2.1), ca.
2 cm fra den ene ende, en streg, som er så tynd og ensartet som muligt.
På linje med stregen placeres 2-3 µl af alkoholreferenceopløsningen
(punkt 4.11) i den ene ende af pladen, så båndet med de alifatiske alko-
holer kan identificeres efter eluering.
5.2.4. Pladen anbringes i kromatografikammeret, der er forberedt som angivet
ipunkt 5.2.2. Temperaturen bør holdes mellem 15 og 20 ºC. Kammeret
lukkes straks med låget, og der elueres, indtil opløsningsmiddelfronten
er ca. 1 cm fra pladens øverste kant.
Derpå fjernes pladen fra kromatografikammeret, og man lader opløs-
ningsmidlet fordampe i en strøm af varm luft eller ved at lade pladen
stå en kort tid under emhætte.
5.2.5. Pladen sprøjtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluroresceinopløsningen.
Båndet med alifatiske alkoholer identificeres ved, at det ligger på linje
med pletten fra referenceopløsningen, hvorefter båndet med alifatiske
alkoholer og båndet umiddelbart derover, som indeholder triterpenalko-
holer, markeres med en sort blyant.
Note 4: Anvisningen om at udtage både båndet med alifatiske alkoholer
og båndet med triterpenalkoholer skyldes, at under denne
metodes betingelser er der en betydelig mængde alifatiske
alkoholer ibåndet med tri terpenalkoholer.
5.2.6. Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede område af. Det
fjernede materiale pulveriseres fint og placeres i filtertragten (punkt
3.7). Der tilsættes 10 ml varm chloroform, blandes omhygeligt med
metalspatelen og filtreres under vakuum; filtratet opsamles i den
koniske kolbe (punkt 3.8), der er forbundet med filtertagten.
Materialet i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml ad
gangen), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er forbundet med
filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af 4-5 ml, som overføres
til det på forhånd vejede 10 ml–prøverør (punkt 3.9), og der inddampes
til tørhed med let opvarmning i en svag strøm af nitrogen. Remanensen
genopløses i nogle få dråber acetone, der inddampes igen til tørhed,
røret placeres ien ovn ved 105 ºC ica. 10 mi nutter, og det afsvales i
en ekssikkator og vejes.
Remanensen iprøverøret udgør alkoholfrakti onen.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 99
(*) I disse tilfælde i særdeleshed benyttes 95:5 (v/v)–benzen/acetoneblandingen for at
opnå god adskillelse af båndene.
▼M19
5.3.Fremstilling af trimethylsilylethere (TMSE)
5.3.1. Til prøverøret med alkoholfraktionen sættes silyleringsreagenset, der
består af en 9:3:1 (v/v/v)-blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/
trimethylchlorsilan (note 5), i en mængde af 50 µl pr. milligram
alkohol, idet enhver optagelse af fugt undgås (note 6).
Note 5: Brugsfærdige opløsninger kan fås i handelen. Man kan også få
andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-
trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimethylchlorsilan, som
skal fortyndes med et lige så stort rumfang vandfri pyridin.
Note 6: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver
ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller
fremkommer en lyserød farve, er det tegn på, at der er fugt til
stede, eller at reagenset ikke er i orden. Hvis det forekommer,
må prøven gentages.
5.3.2. Prøverøret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i
vejret på det), indtil alkoholerne er fuldstændig opløst. Efter mindst 15
minutters henstand ved stuetemperatur centrifugeres der i nogle få
minutter. Den klare opløsning er parat til gaskromatografisk analyse.
5.4.Gaskromatografisk analyse
5.4.1. Forberedende operationer, konditionering af søjlen
5.4.1.1. Søjlen monteres i gaskromatografen, idet indløbsenden forbindes med
injektoren, der står i forbindelse med splittersystemet, og udløbsenden
forbindes med detektoren. Der foretages en generel kontrol af gaskro-
matografienheden (lækager fra gaskredsløbene, detektorens effektivitet,
splittersystemets og skriversystemets effektivitet osv.).
5.4.1.2. Hvis søljen skal bruges for første gang, anbefales det, at den underka-
stes en konditionering. Man lader en svag gasstrøm passere gennem
søjlen og tænder så for gaskromatografienheden, derefter begynder
man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20 ºC over driftstem-
peraturen (note 7). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer,
derefter sættes hele systemet i driftstilstand (justering af gasstrømme
og splitter, antændelse a flammen, forbindelse til den elektroniske
skriver, justering af søjlekammeret, detektorens og injektorens tempe-
ratur osv.), og derefter optegnes signalet med en følsomhed, der er
mindst to gange større end den, man agter at anvende til analysen.
Basislinjens forløb skal være lige, uden toppe af nogen art, og den må
ikke drive. Drivning nedad af en lige linje tyder på lækage fra søjlens
forbindelser, drivning opad tyder på utilstrækkelig konditionering af
søjlen.
Note 7: Konditioneringstemperaturen skal altid være mindst 20 ºC
lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den
anvendte stationære fase.
5.4.2. Valg af driftsbetingelser
5.4.2.1. Der anbefales følgende vejledende driftsbetingelser:
— søjletemperatur: først konstant temperatur 180 ºC i8 mi nutter,
derefter programmeret stigning med 5 ºC/minut op til 260 ºC og
endelig 15 minutter ved 260 ºC
— fordampertemperatur: 280 ºC— detektortemperatur: 290 ºC— bæregassens lineære hastighed: helium 20-35 cm/s, hydrogen 30-
50 cm/s
— splitterforhold: fra 1:50 til 1:100— instrumentets følsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale dæmpning— registreringsfølsomhed: 1-2 mV fuld skala
— papirhastighed: 30-60 cm/time
— mængde stof injiceret: 0,5-1 µl TMSE-opløsning.
Disse betingelser kan varieres alt efter søjlens og gaskromatografens
egenskaber, så man opnår kromatogrammer, der opfylder følgende krav:
— Retentionstiden for C
26-alkohol skal være 18 ± 5 minutter.
— Toppen for C22-alkohol skal være 80 ± 20 % af fuld skala for
olivenolie og 40 ± 20 % af fuld skala for frøolier.
5.4.2.2. For at kontrollere ovenstående krav foretages gentagne injektioner af
prøveblandinger af alkohol-TMSE, og driftsbetingelserne justeres, så
de bedste resultater opnås.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 100
▼M19
5.4.2.3. Integrationsparametrene for toppene må fastsættes sådan, at de giver
korrekte værdier for de relevante toppe.
5.4.3. Udførelse af analysen
5.4.3.1. Med 10 µl-mikrosprøjten opsuges 1 µl hexan, 0,5 µl luft og derefter
0,5-1 µl af prøveopløsningen. Stemplet trækkes længere ud, så kanylen
tømmes. Kanylen trykkes gennem injektionsenhedens membran, og
efter 1-2 sekunder injiceres hurtigt; derefter fjernes kanylen langsomt
efter ca. 5 sekunder.
5.4.3.2. Skriveren skal køre, indtil alle alkohol-TMSE er fuldstændig elueret.
Basislinjen skal til stadighed opfylde kravene (punkt 5.4.1.2).
5.4.4. Identifikation af toppene
De enkelte toppe identificeres på basis af retentionstiderne og ved
sammenligning med blandinger af alkohol-TMSE, der er analyseret
under de samme betingelser.
Figur 1 viser et kromatogram for alkoholfraktionen af en jomfruolie.
5.4.5. Kvantitativ vurdering
5.4.5.1. Toparealerne for 1-eicosanol og de alifatiske alkoholer C22,C24,C26og
C28beregnes ved hjælp af integratoren.
5.4.5.2. Koncentrationen af de enkelte simple alifatiske alkoholer beregnes i mg
pr. 1 000 g fedtstof som følger:
hvor:
Ax= toparealet for alkohol x
As= arealet af 1-eicosanoltoppen
ms= massen af tilsat 1-eicosanol i milligram
m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.
6. ANGIVELSE AF RESULTATER
Koncentrationerne af simple alifatiske alkoholer angives i mg pr.
1 000 g fedtstof og deres sum som »total mængde alifatiske alkoholer«.1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 101
▼M19
TILLÆG
Bestemmelse af gassens lineære hastighed
Med gaskromatografen indstillet på normale driftsbetingelser injiceres 1-3 µl
methan (eller propan), og man måler den tid, det tager for gassen at passere
gennem søjlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen frem-
kommer (tM).
Den lineære hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er søjlens længde i cm,
og tM er den målte tid i sekunder.
Figur 1: Kromatogram af alkoholfraktionen af en jomfruolie
1 = eicosanol
2 = docosanol
3 = tricosanol4 = tetracosanol
5 = pentacosanol
6 = hexacosanol7 = heptacosanol8 = octacosanol1991R2568 — DA — 01.11.2003 — 020.001 — 102