1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 1
Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor
►B KOMMISSIONENS OTTENDE DIREKTIV
af 15. juni 1978
om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer
(78/633/EØF)
(EFT L 206 af 29.7.1978, s. 43)
Ændret ved:
Tidende
nr. side dato
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EØF af 30. juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Kommissionens direktiv 84/4/EØF af 20. december 1983 L 15 28 18.1.1984
▼B
KOMMISSIONENS OTTENDE DIREKTIV
af 15. juni 1978
om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle
kontrol med foderstoffer
(78/633/EØF)
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —
under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europæiske økono-
miske Fællesskab.
under henvisning til Rådets direktiv 70/373/EØF af 20. juli 1970 om
indførelse af fællesskabsprøveudtagningsmåder og -analysemetoder for
så vidt angår den officielle kontrol med foderstoffer (1), senest ændretved tiltrædelsesakten, særlig artikel 2, og
ud fra følgende betragtninger:Ved nævnte direktiv er det fastsat, at den officielle kontrol med foder-
stoffer til konstatering af, om de betingelser, der er fastsat på grundlagaf administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser om foderstof-fernes beskaffenhed og sammensætning, er opfyldt, foretages efter
fællesskabsprøveudtagningsmåder og -analysemetoder;
der er allerede ved Kommissionens direktiver 71/250/EØF af 15. juni
1971(
2), 71/393/EØF af 18. november 1971(3), 72/199/EØF af 27. april
1972(4), 73/46/EØF af 5. december 1972(5) 74/203/EØF af 25. marts
1974(6), 75/84/EØF af 20. december 1974(7) og 76/372/EØF af 1.
marts1976(8) fastsat en række fællesskabsanalysemetoder; i betragt-
ning af den hastighed, hvormed arbejdet siden da er skredet frem, bør
der fastsættes en ottende serie af metoder;
de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med
udtalelse fra Den stående Foderstofkomité —
UDSTEDT FØLGENDE DIREKTIV:
Artikel 1
1. Medlemsstaterne foreskriver, at analyserne i forbindelse med den
officielle kontrol af foderstoffer for så vidt angår deres indhold af zink-bacitracin, flavophospholipol, jern, kobber, mangan og zink skal fore-tagesefter de metoder, der er bes krevet i bilaget til dette direktiv.
Artikel 2
Medlemsstaterne sætter den 1. januar 1979 de nødvendige administra-
tivt eller ved lov fastsatte bestemmelser i kraft for at efterkommebestemmelserne i dette direktiv. De underretter straks Kommissionenherom.
Artikel 3
Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 2
(1) EFT nr. L 170 af 3. 8. 1970, s. 2.
(2) EFT nr. L 155 af 12. 7. 1971, s. 13.
(3) EFT nr. L 279 af 20. 12. 1971, s. 7.
(4) EFT nr. L 123 af 29. 5. 1972, s. 6.
(5) EFT nr. L 83 af 30. 3. 1973, s. 21.
(6) EFT nr. L 108 af 22. 4. 1974, s. 7.
(7) EFT nr. L 32 af 5. 2. 1975, s. 26.
(8) EFT nr. L 102 af 15. 4. 1976, s. 8.▼M1
▼B
▼B
BILAG
1.BESTEMMELSE AF ZINKBACITRACIN
— ved diffusion på agarplader —
1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden anvendes til bestemmelse af zinkbacitracin i foderstoffer og
forblandinger. Undergrænsen for bestemmelsen er 5 mg/kg (5 ppm)(1).
2. PRINCIP
Prøven ekstraheres ved pH 2 med en blanding af methanol, vand, salt-
syre og natriumsulfidopløsning. Natriumsulfidet tilsættes for at udfælde
opløselige kobbersalte, der kan påvirke bestemmelsen. Ekstratets pH
indstilles til 6,5, og der inddampes (om nødvendigt) og fortyndes.
Ekstraktets antibiotiske styrke bestemmes ved at måle diffusionen af
zinkbacitracin i et agarsubstrat podet med Micrococcus luteus (flavus) .
Diffusionen viser sig ved dannelse af zoner, hvori mikroorganismens
vækst er hæmmet. Diameteren af disse zoner anses for at være direkte
proportional med logaritmen til den antibiotiske styrke inden for de
anvendte koncentrationer af antibiotikum.
3. TESTORGANISME: MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS) ATCC
10240
3.1.Opbevaring af stamkulturen
Micrococcus luteus (flavus) podes på skråagar med næringssubstrat
(4.1) og inkuberesi 24 timer ved 30º C. Kulturen opbevaresi køles kab
ved ca. 4º C. Den ompodeshver anden uge.
3.2.Fremstilling af bakteriesuspension (a)
Væksten fra et skråagarglas (3.1) opslæmmes med 2 til 3 ml natriumch-
loridopløsning (4.3). Denne opslæmning anvendes til podning af 250 ml
næringssubstrat (4.1) i en Roux-kolbe, og der inkuberes i 18 til 20 timer
ved 30º C. Væksten opslæmmes i 25 ml natriumchloridopløsning (4.3)
og fortyndes 10 gange med samme opløsning. Opslæmningens lystrans-
mission skal være ca. 75 % målt ved 650 nm mod
natriumchloridopløsning (4.3) i en 1 cm celle. Opslæmningen kan opbe-
varesved ca. 4º C i en uge.
4. NÆRINGSSUBSTRATER OG REAGENSER
4.1.Næringssubstrat (b)
Kødpepton 6,0 g,
Trypton 4,0 g,Gærekstrakt 3,0 g,Kødekstrakt 1,5 g,Glucose 1,0 g,Agar 10,0 til 20,0 g,Vand 1 000 ml,pH 6,5 til 6,6 (efter sterilisering).
4.2.Testsubstrat (
b)
Trypton 10,0 g,
Gærekstrakt 3,0 g,Kødekstrakt 1,5 g,Glucose 1,0 g,Agar 10,0 til 20,0 g,Tween 80 1 ml,Vand 1 000 ml,pH 6,5 (efter sterilisering).
4.3. Natriumchloridopløsning, 0,8 % (w/v): 8 g natriumchlorid opløses i
vand, fortyndes til 1 000 ml og steriliseres.1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 3
(1) 1 mg zinkbacitracin af foderstofkvalitet svarer til 42 internationale enheder (IE).
(a) Andre metoder kan anvendes, forudsat at det er bevist, at de giver tilsvarende bakterie-
suspensioner.
(b) Ethvert næringssubstrat af tilsvarende sammensætning, som er i handelen, og som giver
de samme resultater, kan anvendes.▼M2
▼M2
4.4. Blanding af methanol, vand og saltsyre (4.6): 80: 17,5: 2,5 (v/v/v).
4.5.Phosphatbuffer, pH 6,5
Kaliumhydrogenphosphat, K2HPO422,15 g,
Kaliumhydrogenphosphat, KH2PO427,85 g,
Vand til 1 000 ml.
4.6. Saltsyre, d: 1,18—1,19
4.7. Saltsyre, 0,1 M.
4.8. Natriumhydroxid, 1 M.4.9. Natriumsulfidopløsning, ca. 0,5 M.4.10. Bromkresolpurpur, 0,04 % (w/v) opløsning: 0,1 g bromkresolpurpur
opløses i 18,5 ml 0,01 M natriumhydroxid. Der fyldes op til 250 ml
med vand og blandes.
4.11 Standardpræparat: zinkbacitracin af kendt styrke (i IE).
5. STANDARDOPLØSNINGER
Der afvejesen mængde zinkbacitracin (4.11) s varende til 1 050 IE
(ifølge den opgivne styrke). Der tilsættes 5 ml 0,1 M saltsyre (4.7), og
efter 15 minutters henstand tilsættes 30 ml vand. pH indstilles til 4,5
med phosphatbufferen (4.5) (ca. 4 ml), hvorefter der fyldes op til 50 ml
med vand og blandesomhyggeligt (1 ml = 21 IE).
Af denne stamopløsning fremstilles ved successiv fortynding med phos-
phatbufferen (4.5) følgende opløsninger:
S
80,42 IE/ml,
S40,21 IE/ml,
S20,105 IE/ml,
S10,0525 IE/ml.
6. FREMSTILLING AF EKSTRAKT OG TESTOPLØSNINGER
6.1.Ekstraktion
6.1.1.Forblandingerogmineralskefoderstoffer
2,0 til 5,0 g af prøven afvejes, og efter tilsætning af 29,0 ml af blan-
dingen (4.4) og 1,0 ml natriumsulfidopløsning (4.9) rystes kortvarigt.
Det kontrolleres, at pH er ca. 2. Der rystes i 10 min., tilsættes 30 ml
phosphatbuffer (4.5), rystes i 15 minutter og centrifugeres. Der udtages
en passende mængde af supernatanten, og pH indstilles til 6,5 med 1 M
natriumhydroxid (4.8) enten ved hjælp af et pH-meter eller med brom-
kresolpurpuropløsningen (4.10) som indikator.
Der fortyndesmed phos phatbuffer (4.5) indtil et forventet zinkbacitra-
cinindhold på 0,42 IE/ml (= U8).
6.1.2.Proteinkoncentrater
10,0 g af prøven afvejes, og efter tilsætning af 49,0 ml af blandingen
(4.4) og 1,0 ml natriumsulfidopløsning (4.9) rystes kortvarigt. Det
kontrolleres, at pH er ca. 2. Der rystes i 10 minutter, tilsættes 50 ml
phosphatbuffer (4.5), rystes i 15 minutter og centrifugeres. Der udtages
en passende mængde af supernatanten, og pH indstilles til 6,5 med 1 M
natriumhydroxidopløsning (4.8) enten ved hjælp af et pH-meter eller
med bromkresolpurpuropløsningen (4.10) som indikator. Der inddampes
til ca. halvt volumen på rotationsfordamper ved højst 35º C.
Der fortyndesmed phos phatbuffer (4.5) indtil et forventet zinkbacitra-
cinindhold på 0,42 IE/ml (= U8).
6.1.3.Andrefoderstoffer
10,0 g af prøven afvejes(20,0 g ved et forventet zinkbacitracinindhold
på 5 mg/kg). Der tilsættes 24 ml af blandingen (4.4) og 1,0 ml natrium-
sulfidopløsning (4.9), hvorefter der homogeniseres i 10 minutter. Der
tilsættes 25 ml phosphatbuffer (4.5), rystes i 15 minutter og centrifu-
geres. Der udtages 20 ml af supematanten, og pH indstilles til 6,5 med
1 M natriumhydroxid (4.8) enten ved hjælp af et pH-meter eller med
bromkresolpurpuropløsningen (4.10) som indikator. Der inddampes til
ca. 4 ml på rotationsfordamper ved højst 35º C. Remanensen fortyndes
med phosphatbuffer (4.5) indtil et forventet zinkbacitracinindhold på
0,42 IE/ml (= U8).1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 4
▼M2
6.2.Testopløsninger
Opløsningerne U4(forventet indhold: 0,21 IE/ml), U2(forventet indhold
0,105 IE/ml) og U1(forventet indhold: 0,0525 IE/ml) fremstilles af
opløsning U8ved successiv fortynding (1: 1) med phosphatbuffer (4.5).
7. TESTMETODE
7.1.Podning af testsubstratet
Testsubstratet (4.2) podes med bakteriesuspensionen (3.2) ved ca. 50º
C. På plader med testsubstrat (4.2) bestemmes forud den mængde
bakteriesuspension, der giver de største og tydeligste hæmningszoner
med de forskellige koncentrationer af zinkbacitracin.
7.2.Forberedelse af pladerne
Diffusionen i agar udføres på plader med de fire koncentrationer af
standardopløsningen (S8,S4,S2,S1) og de fire koncentrationer af testo-
pløsningen (U8,U4,U2og U1). Disse fire koncentrationer af ekstrakt og
standard skal nødvendigvis alle findes på hver plade. Der bør derfor
vælges plader, der er store nok til at rumme mindst otte huller i
agarsubstratet med en diameter på 10 til 13 mm og mindst 30 mm
mellem hullernes centrum. Testen kan udføres på plader, der består af
en glasplade med en aluminium- eller plastring ovenpå, 200 mm i
diameter og 20 mm høj.
Pladerne påhældes substrat (4.1), der er podet som angivet i 7.1, så der
opnåset ca. 2 mm tykt lag (60 ml til en plade på 200 mm i diameter).
Pladerne anbringes vandret til størkning, hullerne udstanses, og nøjag-
tigt afmålte mængder af test- og standardopløsning anbringes i
hullerne (mellem 0,10 og 0,15 ml pr. hul, afhængig af diameteren),
Hver koncentration skal anbringes mindst fire gange, således at hver
bestemmelse er baseret på en aflæsning af 32 hæmningszoner.
7.3.Inkubation
Pladerne inkuberesi 16 til 18 timer ved 30º C ± 2º C.
8. BEDØMMELSE
Hæmningszonernes diameter måles med 0,1 mm nøjagtighed. Middel-
diameteren for hver koncentration afsættes på semilogaritmisk papir,
således at de viser logaritmen til koncentrationen i forhold til
hæmningszonernes diameter. Der indtegnes den »bedst tilpassede« rette
linje for henholdsvis standardopløsningen og ekstratet, f.eks. som vist
nedenfor.
Det »bedst tilpassede punkt« for den laveste værdi for standardopløs-
ningen (SL) bestemmes ved hjælp af formlen:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Det »bedst tilpassede punkt« for den højeste værdi for standardopløs-
ningen (SH) bestemmes ved hjælp af formlen:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
På tilsvarende måde beregnes det »bedst tilpassede punkt« for den
laveste værdi for ekstratet (UL) og den højeste værdi for ekstratet
(UH) ved at erstatte s1,s2,s4og s8med u1,u2,u4og u8i ovennævnte
formler.
De beregnede SL- og SH-værdier indtegnespå s amme millimeterpapir
og forbindes til den »bedst tilpassede linje« for standardopløsningen.
UL- og UH-værdierne indtegnespå tils varende måde og forbindestil
den »bedst tilpassede linje« for ekstratet.
Hvis der ikke er stoffer til stede, som forstyrrer analysen, vil linjerne
være parallelle. Til praktiske formål kan linjerne betragtes som værende
parallelle, hvisværdierne (SH-SL) og (UH-UL) ikke afgiver mere end
10 % fra middelværdien.
Såfremt linjerne viser sig ikke at være parallelle. kan enten u1og s1eller u8og s8udelades, og SL, SH, UL og UH beregnes ved hjælp af
de alternative formler, for at opnå de alternative »bedst tilpassede
linjer«:1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 5
▼M2
(a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6eller5s1þ2s4/C0s8
6
(b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6eller5s8þ2s4/C0s2
6
og tilsvarende for UL og UH. De samme kriterier for parallelisme skal
være opfyldt. Det noteresi den endelige rapport, at res ultatet er
beregnet ud fra tre koncentrationer.
Hvislinjerne kan betragtess om værende parallelle, beregneslogaritmen
til den relative styrke (log A) ved hjælp af én af følgende formler alt
efter om der er anvendt 3 eller 4 koncentrationer til at bestemme paral-
lelismen.
Forfirekoncentrationer
(c) log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Fortrekoncentrationer
(d) log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
eller
(d′) log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Prøveekstraktets styrke = den pågældende standards styrke × A:
(U8=S8×A )
Hvisden relative s tyrke ligger uden for området 0,5 til 2,0, gentages
analysen med den fornødne tilpasning af zinkbacitracin i ekstrakterne
eller, hvis dette ikke er muligt, i standardopløsningerne. Hvis den rela-
tive styrke ikke kan bringes inden for det krævede interval, må de
resultater, der opnås, betragtes som tilnærmede og dette bør anføres i
den endelige rapport.
Hvislinjerne ikke kan betragtess om værende parallelle, gentages
bestemmelsen. Hvis der stadig ikke opnås parallelisme, må bestem-
melsen betragtes som utilfredsstillende.
Resultatet udtrykkes i milligram zinkbacitracin pr. kilogram foderstof.
9. REPETERBARHED
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, udført på samme
prøve af samme person, bør ikke overstige:
— 2 mg/kg i absolut værdi for et indhold af zinkbacitracin på til og
med 10 mg/kg;
— 20 % i forhold til den højeste værdi for et indhold på over 10 og til
og med 25 mg/kg;
— 5 mg/kg i absolut værdi for et indhold på over 25 til og med 50 mg/
kg;
— 10 % i forhold til den højeste værdi for et indhold på over 50 mg/
kg.
2.BESTEMMELSE AF FLAVOPHOSPHOLIPOL - VED DIFFUSION PÅ
AGARPLADER
1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden anvendes til bestemmelse af flavophospholipol i foderstoffer,
koncentrater og forblandinger. Undergrænsen for bestemmelse er 1 mg/
kg (1 ppm).
2. PRINCIP
Prøven ekstraheres med fortyndet methanol ved opvarmning under
tilbagesvaling. Efter centrifugering oprenses ekstraktet (om nødvendig)1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 6
▼B
▼B
ved behandling med ionbytter og fortyndes. Dets antibiotiske styrke
bestemmes ved at måle diffusionen af flavophospholipol i et agarsub-
strat podet med Staphylococcus aureus . Diffusionen fremtræder som
hæmning af mikroorganismens vækst i zoner. Diameteren af disse zoner
anses for at have en retlinjet sammenhæng med logaritmen til den anti-
biotiske styrke for de anvendte antibiotiske koncentrationer.
3. MIKROORGANISME: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P
3.1.Opbevaring af stamkulturen
Staphylococcus aureus podes på skråagar med næringssubstrat (4.1) og
inkuberesi 24 timer ved 37º C. Kulturen opbevaresi køles kab ved ca.
4º C og ompodesen gang om måneden på s kråagar.
3.2.Fremstilling af bakteriesuspension (a)
To skråagarglas med testorganismen (3.1) ompodes en gang om ugen,
inkuberesi 24 timer ved 37º C og opbevaresi køles kab ved 4º C. 24
timer før styrkebestemmelsen podes bakterien over på to til fire skråa-
garglas med næringssubstrat (4.1). Glassene inkuberes i 16—18 timer
ved 37º C. Væksten suspenderes i natriumchloridopløsning (4.3).
Lystransmissionen i supensionen skal være ca. 40% over for natriumch-
loridopløsning (4.3) målt ved 578 nm i en l cl-celle.
4. NÆRINGSSUBSTRATER OG REAGENSER
4.1.Næringssubstrat (b)
Kødpepton 6,0 g
Tryptone 4,0 gGærekstrakt 3,0 g
Kødekstrakt 1,5 g
Glukose 1,0 gAgar 15,0 gVand 1 000 mlpH 6,5 (efter sterilisering).
4.2.Testsubstrat
4.2.1.Bundlag (
c)
Kødpepton 6,0 g
Gærekstrakt 3,0 gKødekstrakt 1,5 gAgar 10,0 g
Vand 1 000 ml
pH 6,5 (efter sterilisering)
4.2.2.Dæklag
Som 4.1, med tilsætning af 2,0 g silicone antifoam emulsion(
d).
4.3. Natriumchloridopløsning 0,4 % (w/v): 4 g natriumchlorid p.a. opløses i
vand og fortyndes til 1 000 ml; steriliseres.
4.4. Methanol, ren.4.5. Methanol 50 % (v/v): 500 ml methanol (4.4.) fortyndesmed 500 ml
vand.
4.6. Methanol 80 % (v/v): 800 ml methanol (4.4.) fortyndesmed 200 ml
vand.
4.7. Tris(hydroxymethyl) aminomethan p.a.4.8. Kaliumchlorid i methanolopløsning 1,5 % (w/v): 1,5 g kaliumchlorid
p.a. opløses i 20 ml vand, methanol (4.4) tilsættes ad 100 ml.
4.9. Kationbytter: Dowex 50 WX 8, 20—50 mesh, Na form (kat. Serva
nr. 41 600) eller tilsvarende.1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 7
(a) Andre metoder kan anvendes, forudsat at det er bevist, at de giver en tilsvarende bakte-
riesuspension.
(b) Ethvert næringssubstrat af tilsvarende sammensætning, som er i handelen og som giver
de samme resultater, kan anvendes, f.eks. Oxoid Antibiotic Medium 1 (CM 327) med
tilsætning af Oxoid agar nr. 3 (L 13).
(c) Ethvert næringssubstrat af tilsvarende sammensætning, som giver de samme resultater,
kan anvendes, f.eks. Oxoid Antibiotic Medium 2 (CM 335) med tilsætning af Oxoidagar nr. 3 (L 13).
(
d) F. eks.SE 2 fra Wacker Chemie GmbH, München.
▼B
4.10. Anionbytter: Dowex 1X2, 50—100 mesh, Cl form (kat. Serva
nr. 41 010) eller tilsvarende. Opbevares før brugen i 12—24 timer i
80 % methanol (4.6).
4.11. Glasuld4.12. pH-indikatorpapir (pH 6,6—8,1).4.13. Askorbinsyre.
4.14. Standardpræparat: flavophospholipol af kendt styrke.
5. APPARATUR
5.1. Glasrør til chromatografi, indre diameter: 9 mm, længde: 150—200 mm,
udstyret med stophane i den indsnævrede del forneden og slib (for
tilslutning til skilletragten (5.2) foroven.
5.2. Skilletragt 250 ml, udstyret med stophane og slib.
5.3. 250 ml Erlenmeyer kolbe med slib.5.4. Tilbageløbskøler med slib.
6. STANDARDOPLØSNINGER
En nøjagtig afvejet mængde af standardpræparatet (4.14) opløses i 50 %
methanol (4.5.) og fortyndes således at der fremkommer en stamopløs-
ning indeholdende 100µ g flavophospholipol pr. ml. Opbevaret i
tilproppede flasker ved 4º C vil denne opløsning være holdbar i indtil
2 måneder.
Af denne stamopløsning fremstilles ved successiv fortynding med 50 %
methanol (4.5) følgende opløsninger:
s
80,2 µg/ml
s40,1 µg/ml
s20,05 µg/ml
s10,025µg/ml
7. FREMSTILLING AF EKSTRAKTET
7.1.Ekstraktion
7.1.1.Koncentrater,forblandingerogmineralfoder
2,0 til 5,0 g af prøven afvejes, og 150 mg askorbinsyre (4.13) tilsættes.
Prøven homogeniseres med 150 ml 50 % methanol (4.5) i en Erlen-
meyer kolbe (5.3) og indstilles på pH 8,1—8,2 med ca. 400 mg tris
(hydroxymethyl) aminomethan (4.7). pH kontrolleresmed indikator-
papir (4.12). Efter henstand i 15 minutter korrigeres pH atter til
8,1—8,2 med tris(hydroxymethyl) aminomethan (4.7). Der kogesi 10
minutter med tilbagesvaling (5.4) under konstant omrøring. Efter afkø-
ling centrifugeres blandingen og ekstraktet dekanteres.
7.1.2.Andetfoder
5,0 til 30,0 g af prøven med et indhold af mindst 30 µg flavophospho-
lipol afvejes. Prøven homogenieseres med 150 ml 50 % methanol (4.5)
i en Erlenmeyer kolbe (5.3) hvorefter pH indstilles på 8,1—8,2 med ca.
400 mg tris(hydroxymethyl) aminomethan (4.7). pH kontrolleresmed
indikatorpapir (4.12). Efter henstand i 15 minutter korrigeres pH på ny
til 8,1—8,2 med tris(hydroxymethyl aminomethan (4.7). Der kogesi
10 minutter med tilbagesvaling (5.4) under konstant omrøring. Efter
afkøling centrifugeres blandingen og ekstraktet dekanteres.
7.2Oprensning (dette kan udelades for koncentrater, forblandinger og
mineralfoder)
110 ml af ekstraktet blandes med 11 g af kationbytteren (4.9), koges i
et minut med tilbagesvaling (5.4) under konstant omrøring. Kationbyt-
teren skilles fra ved centrifugering eller filtrering. 100 ml ekstrakt
blandesmed 150 ml methanol (4.4) og opløs ningen lagresi 12—15
timer ved 4º C. Den fremkomne udfældning filtreresfra i kold tils tand.
En prop af glasuld (4.11) anbringes i den nedre ende af et glasrør (5.1),
5 ml anionbytter (4.10) hældes i røret og søjlen udvaskes med 100 ml
80 % methanol (4.6). Ved hjælp af tragten (5.2) overføresminds t 100 ml
koncentrat, som forventes at indeholde 16µ g flavophospholipol (200 ml
til 30 g prøve af foder med 1 ppm) til søjlen. Om nødvendigt fortyndes
filtrated med 80 % methanol (4.6) før overførsel til søjlen for at opnå et
forventet flavophospholindhold på 16µgpr. 100 ml. Tilpas væketil-
førslen til ca. 2 ml/minut. Den udstrømmende væske kasseres. Derefter1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 8
▼B
udvaskes kolonnen med 50 ml 80 % methanol (4.6) og den udstrøm-
mende væske kasseres.
Flavophospholipol elueres med en methanolisk kaliumchloridopløsning
(4.8) idet tilledningen holdespå omkring 2 ml pr. minut. 50 ml af
eluatet opsamles i et måleglas, 30 ml vand tilsættes og der blandes.
Opløsningen forventes at have et flavophospholipolindhold på 0,2µgpr.
ml (= u8).
7.3Testopløsninger
Om nødvendigt (dvs. når oprensning er undladt) fortyndes den i 7.1.1
fremstillede ekstrakt med 50 % methanol (4.5) med henblik på at opnå
et forventet indhold af flavophospholipol på 0,2 µg pr. ml (= u8).
Af opløsning u8 fremstilles opløsning u4 (forventet indhold: 0,1 µ g/ml,
u2(forventet indhold: 0,05µ g/ml) og u1(forventet indhold: 0,025µ g/
ml) ved hjælp af successive fortyndinger (1 + 1) med 50 % methanol
(4.5).
8. TESTUDFØRELSE
8.1.Podning af testsubstratet
Testsubstratet (4.2.2) podes med bakteriesuspensionen (3.2) ved ca. 50º
C. Ved forudgående forsøg på plader med testsubstrat (4.2.2)
bestemmes den mængde bakteriesuspension, der er nødvendig for at
give de største og tydeligste hæmningszoner med de forskellige koncen-
trationer af flavophospholipol (ca. 30 ml pr. liter).
8.2Fremstilling af pladerne
Testen udføres på plader med diffusion i agar af de fire koncentrationer
af standardopløsning (s8,s4,s2og s1) og de fire koncentrationer af testo-
pløsning (u8,u4,u2og u1). Disse fire koncentrationer af ekstrakt og
standard skal nødvendigvis alle fire findes på hver plade. Der bør
derforvælges plader, der er store nok til at rumme mindst 8 huller i
agarsubstratet med en diameter på 10—13 mm og mindst 30 mm
mellem hullernes centrum. Testen kan udføres på plader, der består afen glasplade med en aluminium- eller plastring over, der er 200 mm i
diameter og 20 mm høj.
Pladerne påhældes substrat (4.2.1) til et 1,5 mm tykt lag (45 ml for en
plade på 200 mm i diameter). Pladerne anbringesvandret til s tørkning.
Herefter påhældesdæklaget (4.2.2), der er podet s om anført under
punkt 8.1, således at der opnås et 1 mm tykt lag (30 ml for en plade
på 200 mm i diameter). Pladerne anbringesatter vandret til s tørkning,
hullerne udstanses og nøjagtige mængder af test- og standardopløsnin-
gerne anbringesi hullerne (mellem 0,10 og 0,15 ml pr. hul, afhængig
af diameteren).
Hver koncentration skal anbringes mindst fire gange, således at hver
bestemmelse er baseret på en aflæsning af 32 hæmningszoner.
8.3Inkubering
Pladerne inkuberesi 16—18 timer ved 28—30º C.
9. BEDØMMELSE
Hæmningszonernes diameter måles til nærmeste 0,1 mm. Middeldiame-
trene for hver koncentration afsættes på semilogaritmisk papir, således
at de viser logaritmen til koncentrationerne over for hæmningszonernes
diameter. Der indtegnes den »bedst tilpassede« rette linie for
henholdsvis standardopløsningen og ekstraktet f.eks. som vist nedenfor.
Det »bedst tilpassede punkt« (estimeret optimum) for den laveste værdi
for standardopløsningen (SL) bestemmes ved hjælp af formlen:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Det »bedst tilpassede punkt« (estimeret optimum) for den højeste værdi
for standardopløsningen (SH) bestemmes ved hjælp af formlen:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C0s1
10
På tilsvarende måde beregnes »det bedst tilpassede punkt« for den
laveste værdi for ekstraktet (UL) og den højeste værdi for ekstraktet1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 9
▼B
(UH) ved at erstatte s1,s2,s4og s8med u1,u2,u4og u8i ovennævnte
formler.
De beregnede SL- og SH-værdier indtegnespå s amme millimeterpapir
og forbindes til »bedst tilpassede rette linie« for standardopløsningen.
UL- og UH-værdierne indtegnespå tils varende måde og forbindestil
»bedst tilpassede rette linie« for ekstraktet.
Hvis der ikke er stoffer tilstede, som forstyrrer analysen, vil linierne
være parallelle, hvisværdien (SH—SL) og (UH—UL) ikke varierer
mere fra middelværdien end 10 %.
Såfremt linierne viser sig ikke at være parallelle, kan enten u1og s1eller u8og s8udeladesog SL, SH, UL og UH beregnesved hjælp af
den alternative formel for at opnå de alternative »bedst tilpassede
linier«:
(a′)S L¼5s1þ2s2/C0s4
6eller5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S L¼5s4þ2s2/C0s1
6eller5s8þ2s4/C0s2
6
og tilsvarende for UL og UH. Det kontrolleres om de alternative »bedst
tilpassede linier« er parallelle som ovenfor. Det noteres i den endelige
rapport, at resultatet er beregnet ud fra tre koncentrationer.
Hvis linierne kan betragtes somparallelle beregneslogaritmen til den
relative styrke (log. A) ved hjælp af en af følgende formler.
For4koncentrationer
(c) log :A¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
For3koncentrationer
(d) log :A¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
eller
(d′) log :A¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Faktisk styrke = formodet styrke × relativ styrke
Hvislinierneikkekanbetragtessomparallelle gentages bestemmelsen.
Hvis der stadig ikke opnås parallelisme beregnes logaritmen til den
relative styrke (log. A) ved hjælp af formel (c). Det opnåede resultat
skal imidlertid anses for omtrentligt og dette bemærkes i den endelige
rapport.
10. REPETERBARHED
Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, udført på samme
prøve af samme analytiker, bør ikke overstige:
0,5 mg/kg i absolut værdi for et indhold af flavophospholipol fra 1 til
2 mg/kg,
25 % i forhold til den højeste værdi for indhold der er større end 2 og
op til 10 mg/kg,
20 % i forhold til den højeste værdi for indhold der er større end 10 og
op til 25 mg/kg,
5 mg/kg i absolut værdi for indhold større end 25 og op til 50 mg/kg,
10 % i forhold til den højeste værdi for indhold over 50 mg/kg.
3.BESTEMMELSE AF MIKROMINERALERNE JERN, KOBBER,
MANGAN OG ZINK
1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE
Metoden gør det muligt at bestemme mikromineralerne jern, kobber,
mangan og zink i foderstoffer. De nedre grænser for bestemmelsen er:1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 10
▼B
jern (Fe) 20 mg/kg
kobber (Cu) 10 mg/kg
mangan (Mn) 20 mg/kg
zink (Zn) 20 mg/kg
2. PRINCIP
Prøven opløses i saltsyre, efter at eventuelt organisk materiale er destru-
eret. Jern, kobber, mangan og zink bestemmes efter en passende
fortynding ved anvendelse af atomabsorptionsspektrofotometri.
3. REAGENSER
IndledningVed fremstillingen af reagenser og analyseopløsninger anvendes vand,
som ikke indeholder de kationer, der skal bestemmes. Vandet renses
enten ved en dobbelt destillation af vandet i et borsilikat- eller kvarts-
destillationsapparat eller gennem dobbelt behandling på ionbytter.
Kemikalierne skal mindst være analysekvalitet (p.a). Fravær af de mine-
raler, som skal bestemmes, kontrolleres ved blindbestemmelse. Om
nødvendigt skal kemikalierne yderligere renses.
I stedet for stamopløsninger, som beskrevet nedenfor, kan kommercielle
stamopløsninger anvendes på betingelse af de kontrolleres før brug.
3.1. Saltsyre p.a., d = 1,193.2. 6 N saltsyre p.a.3.3. 0,5 N saltsyre p.a.3.4. Flussyre 38—40 % (v/v) med et jernindhold på mindre end 1 mg/ Fe/l
og med en inddampningsrest på mindre end 10 mg (som sulfat)/1.
3.5. Svovlsyre p.a., d = 1,84.3.6. Hydrogenperoxid p.a., ca. 100 vol. ilt 30 vægtprocent).3.7. Jernstamopløsning I (1000 µg Fe/ml) fremstilles som følger:
opløs 1 g jerntråd p.a. i 200 ml 6 N saltsyre (3.2), tilsæt 16 ml hydro-
genperoxid (3.6) og fyld op til 1 l med vand.
3.7.1. Jernstamopløsning II (100 µ g Fe/ml) fremstilles ved fortynding af
stamopløsning (3.7) 1 + 9 med vand.
3.8. Kobberstamopløsning I (1000 µ g Cu/ml) fremstilles som følger: opløs
1 g kobber i pulverform (p.a.) i 25 ml 6 N saltsyre (3.2), tilsæt 5 ml
hydrogenperoxid (3.6) og fyld op til 1 l med vand.
3.8.1. Kobberstamopløsning II (10 µ g Cu/ml) fremstilles ved fortynding af
stamopløsning (3.8) 1 + 9 med vand og fortynd derefter den opnåede
opløsning 1 + 9 med vand.
3.9. Manganopløsning I (1000 µ g Mn/ml fremstilles som følger: opløs 1 g
mangan i pulver (p.a.) i 25 ml 6 N saltsyre (3.2) og fyld op til 1 l med
vand.
3.9.1. Manganopløsning II (10 µg Mn/ml) fremstilles ved fortynding af stam-
opløsning (3.9) 1 + 9 med vand og fortynd derefter den opnåede
opløsning 1 + 9 med vand.
3.10. Zinkstamopløsning I (1000 µ g Zn/ml) fremstilles som følger: opløs 1 g
zink i bånd eller bladform (p.a.) i 25 ml 6 N saltsyre (3.2) og fyld op til
1 l med vand.
3.10.1 Zinkstamopløsning II (10 µ g Zn/ml) fremstilles ved fortynding af stam-
opløsning (3.10) 1 + 9 med vand og fortynd derefter den opnåede
opløsning 1 + 9 med vand.
3.11. Lanthankloridopløsning fremstilles som følger: opløs 12 g lanthanoxid i
150 ml vand, tilsæt 100 ml 6 N saltsyre (3.2) og fyld op til 1 l med
vand.
4. APPARATUR
4.1. Muffelovn med temperaturregulering og pyrometer.4.2. Glasvarer skal være af modstandsdygtigt borsilikat, og det anbefales, at
apparaturer udelukkende anvendes til bestemmelse af mineraler.
4.3. Platindigel eller kvartsdigel.1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 11
▼B
4.4. Atomabsorptionsspektrofotometer som fylder metodens krav med
hensyn til følsomhed og nøjagtighed i det krævede område.
5. FREMGANGSMÅDE
5.1.Prøver indeholdende organisk stof
5.1.1.Foraskningogopløsningafprøvetil analyse (*)
i) i) Afvej med 0,2 mg'snøjagtighed, 5—10 g af prøven i en kvarts -
eller platindigel (4.3.) (se bemærkning b), prøven tørres i en ovn
ved 105 ºC, og digelen anbringesi en kold muffelovn (4.1). Ovnen
lukkes(s e bemærkning c), og temperaturen øgesgradvistil
450—475 ºC i løbet af ca. 90 min. Denne temperatur holdesi
4—16 timer (f.eks. natten over) for at fjerne organisk materiale
hvorefter ovnen åbnestil afkøling (s e bemærkning d).
Asken fugtes med vand og overføres til et 250 ml bægerglas.
Digelen skylles med i alt ca. 5 ml saltsyre (3.1), der overføres
langsomt og omhyggeligt til bægerglasset (en voldsom reaktion
kan forekomme på grund af dannelse af CO2).
Tilsæt saltsyre (3.1) dråbevis under omrøring, indtil enhver brus-
ning er ophørt. Inddamp til tørhed under lejlighedsvis omrøring
med en glasspatel.
Dernæst tilsættes 15 ml 6 N saltsyre (3.2) til inddampningsresten
efterfulgt af ca. 120 ml vand. Der omrøres med glasspatelen, der
forbliver i bægerglasset, som derefter tildækkes med et urglas.
Indholdet bringestil s vag kogning og holdespå kogepunktet, indtil
der tilsyneladende ikke opløses mere aske. Filtrer gennem et aske-
frit filterpapir i en 250 ml målekolbe (se ii). Vask bægerglas og
filter med 5 ml varm 6 N saltsyre (3.2) og 2 gange med kogende
vand. Fyld målekolben op til mærket med vand (HCl koncentration
ca. 0,5 N).
ii) Hvis bundfaldet på filtret er sort (kulstof), sættes den tilbage i
ovnen, og der foraskes igen ved 450—475º C. Denne foraskning,
som kun kræver nogle få timer (ca. 3—5 timer), er gennemført,
når asken er hvid eller næsten hvid. Opløs asken i ca. 2 ml saltsyre
(3.1), inddamp til tørhed og tilsæt 5 ml 6 N saltsyre (3.2). Opvarm,
filtrer opløsningen i målekolben og fyld op til mærket med vand
(ca. 0,5 N HCl-koncentration).
Bemærkninger:
a) Ved bestemmelse af mikromineraler er det vigtigt at være klar over
risikoen for forurening især med zink, kobber og jern. Derfor skal
det udstyr, som anvendes til forbehandling af prøverne, være fri for
disse metaller.
For at mindske den almindelige forureningsrisiko arbejdes i en
støvfri atmosfære med pinligt rent udstyr og omhyggeligt afvaskede
glasvarer. Bestemmelsen af zink er særlig følsom over for mange
typer forurening f.eks. fra glas, reagenser, støv osv.
b) Vægten af den prøve, som skal foraskes, skal beregnes ud fra det
omtrentlige forventede indhold af mikromineraler i foderstoffet i
relation til det anvendte spektrofotometers følsomhed. For visse
foderstoffer, hvis mikromineralindhold er lavt, kan det være nødven-
digt at starte med en prøve på 10—20 g og begrænse den endelige
opløsning til kun 100 ml.
c) Foraskning skal udføres i en lukket ovn uden gennemblæsning med
luft eller ilt.
d) Pyrometerets temperaturudvisning må ikke overstige 475º C.
5.1.2.Spektrofotometrisk bestemmelse
5.1.2.1. Fremstilling af standardopløsninger1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 12
(*) Grøntfoder (frisk eller tørret) indeholder ofte store mængder vegetabilsk silicium, som
kan binde mikromineraler, og derfor må fjernes. Ved prøver af sådanne foderstoffer
skal derfor følgende ændrede fremgangsmåde anvendes. Udfør det under 5.1.1 i)
beskrevne indtil filtreringen. Vask filterpapiret indeholdende den uopløselige rest 2gange med kogende vand og anbring det i en platindigel (4.3). Forask i muffelovnen(4.1) ved en temperatur under 550º C indtil alt kulstofholdigt materiale fuldstændig erforsvundet. Afkøl, tilsæt nogle få dråber vand efterfulgt af 10—15 ml flussyre (3.4) og
inddamp til tørhed ved ca. 150º C. Hvis der stadig er silicium i inddampningsresten,
genopløses denne i nogle få ml flussyre (3.4) og inddampes til tørhed. Tilsæt 5 dråbersvovlsyre (3.5) og opvarm, indtil der ikke mere afgives hvide dampe. Efter tilsætningaf 5 ml 6 N saltsyre (3.2) og ca. 30 ml vand opvarmes opløsningen; derefter filtreresdenne ned i en 250 ml målekolbe, og der fyldesop til mærket med vand (HCl koncen-
tration ca. 0,5 N). Fortsæt derefter bestemmelsen fra 5.1.3.
▼B
For hver af de grundstoffer, som skal bestemmes, skal der ud fra stam-
opløsningerne 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 og 3.10.1 fremstilles en række
standardopløsninger (100 ml målekolber) hver med en HCl koncentra-
tion på ca. 0,5 N og (ved jern, mangan og zink) en lanthanklorid
koncentration svarende til 0,1 % La (w/v). De valgte koncentrationer
for mikromineraler skal ligge inden for det anvendte spektrofotometers
følsomhedsområde. Eksempelvis er i tabellerne nedenfor angivet
sammensætningen af typiske rækker af standardopløsninger. Afhængig
af Spektrofotometer og detsføls omhed kan det imidlertid blive nødven-
digt at vælge andre koncentrationer
Jern
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml stamopløsning
II (3.7.1)0 0,5 1 2 3 4 5
(1 ml = 100 µg Fe)
+ Ml 6 N HCl
(3.2)7 7 77777
+ 10 ml lanthankloridopløsning (3.11) fyld op til 100 ml med vand
Kobber
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 0,1
ml stamopløsning
II (3.8.1)012468 1 0
(1 ml = 10 µg Cu)
+ ml 6 N HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Fyld op til 100 ml med vand
Mangan
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml stamopløsning
II (3.9.1)012468 1 0
(1 ml = 10 µg Mn)
+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lanthankloridopløsning (3.11) og fyld op til 100 ml med vand
Zink
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml stamopløsning
(3.10.1)0 0,5 1 2 4 6 8
(1 ml = 10 µg Zn)
+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lanthankloridopløsning (3.11) og fyld op til 100 ml med vand
5.1.2.2 Fremstilling af prøveopløsning til analyse
Til bestemmelse af kobber kan den opløsning, som er fremstillet under
5.1.1, normalt direkte anvendes. Hvis det er nødvendigt at bringe dens
koncentration ind i standardopløsningernes område, kan en alikvot del
afpitteresi en 100 ml målekolbe, derefter fyldesop til mærket 0,5 N
saltsyre (3.3).
Til bestemmelse af jern, mangan og zink afpitteres en alikvot del af den
af 5.1.1 fremstillede opløsning i en 100 ml målekolbe, der tilsættes
10 ml lanthankloridopløsning (3.11), og der fyldes op til mærket med
0,5 N saltsyre (3.3).
(se også 8, »Bemærkning«).1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 13
▼B
5.1.2.3. Blindbestemmelsen skal indeholde alle trinene under fremgangsmåden,
blot skal prøvematerialet udelades. Standardopløsning »0« må ikke
anvendess om blind.
5.1.2.4. Måling af atomabsorption
Atomabsorptionen for standardopløsningerne og den opløsning som skal
analyseres, måles ved anvendelse af en oxiderende luftacetylenflamme
ved følgende bølgelængder:
Fe 248,3 nm
Cu 324,8 nm
Mn 279,5 nm
Zn 213,8 nm
Hver af målingerne gentagesfire gange.
5.2.Mineralske foderstoffer
Hvis prøven ikke indeholder organisk materiale, er forudgående forask-
ning unødvendig. Fremgangsmåden i 5.1.1 i) følges, idet der startes fra
afsnit 2. Fordampning under tilstedeværelse af flussyre kan udelades.
6. BEREGNING AF RESULTATER
Ved anvendelse af en kalibreringskurve beregnes koncentrationen af
mikromineralet i den opløsning, som skal analyseres, og resultatet
udtrykkesi mg mikromineral pr. kg prøve (ppm).
7. REPETERBARHED
Forskellen mellem resultaterne af de to sideløbende bestemmelser,
udført på samme prøve af samme analytiker, bør ikke overstige:
— 5 mg/kg i absolut værdi for mikromineralindhold op til 50 mg/kg;
— 10 % af de højeste resultat for mikromineralindhold fra 50 til
100 mg/kg;
— 10 mg/kg i absolut værdi for mikromineralindhold fra 100 til
200 mg/kg;
— 5 % af det højeste resultat for mikromineralindhold over 200 mg/kg.
8. BEMÆRKNING
Tilstedeværelse af store mængder fosfater kan interfere på bestem-
melsen af jern, mangan og zink. Denne interferens skal korrigeres
gennem tilsætning af en lanthankloridopløsning (3.11). Hvis imidlertid
vægtforholdetCaþMg
P2 i prøven, kan tilsætning af lanthanklorid
(3.11) til den opløsning, som skal analyseres og til standardopløsnin-
gerne, udelades.1978L0633 — DA — 20.12.1983 — 002.001 — 14