Dette dokument er et dokumentationsredskab, og institutionerne påtager sig intet ansvar herfor  
►B KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) Nr. 440/2008  
af 30. maj 2008  
om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) 
Nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for 
kemikalier (REACH)  
(EØS-relevant tekst)  
(EUT L 142 af 31.5.2008, s. 1)  
Ændret ved:  
Tidende  
nr. side  dato  
►M1 Kommissionens forordning (EF) nr. 761/2009 af 23. juli 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Kommissionens forordning (EU) nr. 1152/2010 af 8. december 2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Kommissionens forordning (EU) nr. 640/2012 af 6. juli 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Kommissionens forordning (EU) nr. 260/2014 af 24. januar 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Kommissionens forordning (EU) nr. 900/2014 af 15. juli 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1
KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) Nr. 440/2008  
af 30. maj 2008  
om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa- 
Parlamentets og Rådets forordning (EF) Nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for 
kemikalier (REACH)
 
(EØS-relevant tekst)  
KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —  
under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fælles ­
skab,  
under henvisning til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) 
nr. 1907/2006 af 18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om opret ­
telse af et europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommissionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF (
 1 ), særlig artikel 13, stk. 3, og  
ud fra følgende betragtninger:  
(1) I henhold til forordning (EF) nr. 1907/2006 skal der på EU-plan 
fastlægges forsøgsmetoder til undersøgelse af stoffer, hvis forsøg er påkrævet til fremskaffelse af oplysninger om stoffers iboende egenskaber.
 
(2) I Rådets direktiv 67/548/EØF af 27. juni 1967 om tilnærmelse af 
lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer (
 2 ) indeholder bilag V metoderne til bestemmelse 
af stoffers og præparaters fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og økotoksicitet. Ved direktiv 2006/121/EF er bilag V til direktiv 67/548/EØF udgået med virkning fra den 1. juni 2008.
 
(3) Forsøgsmetoderne i bilag V til direktiv 67/548/EØF bør 
indarbejdes i denne forordning.  
(4) Denne forordning udelukker ikke, at der anvendes andre testme ­
toder, når blot deres anvendelse er i overensstemmelse med artikel 13, stk. 3, i forordning 1907/2006.  ▼
B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) EUT L 396 af 30.12.2006, s. 1. Berigtiget i EUT L 136 af 29.5.2007, s. 3. 
( 2 ) EFT 196 af 16.8.1967, s. 1. Senest ændret ved Europa-Parlamentets og 
Rådets direktiv 2006/121/EF (EUT L 396 af 30.12.2006, s. 850. Berigtiget i EUT L 136 af 29.5.2007, s. 281) —  denne henvisning ajourføres, når 30. 
tilpasning til den tekniske udvikling er offentliggjort .
 (5) Ved udformningen af forsøgsmetoderne bør der i fuldt omfang 
tages hensyn til principperne om at erstatte, begrænse og raffinere brugen af dyr i procedurer, især når der bliver rådighed over validerede metoder, som kan erstatte, begrænse eller raffinere dyreforsøg.
 
(6) De i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstem ­
melse med udtalelse fra det udvalg, der er nedsat ved artikel 133 i forordning (EØF) nr. 1907/2006 —
 
UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:  
Artikel 1  
De forsøgsmetoder, der skal anvendes i forbindelse med forordning (EF) 
nr. 1907/2006, er fastlagt i bilaget til nærværende forordning.  
Artikel 2  
Kommissionen revurderer efter behov forsøgsmetoderne i denne forord ­
ning med henblik på at erstatte, begrænse eller raffinere forsøg med hvirveldyr.
 
Artikel 3  
Alle henvisninger til bilag V til direktiv 67/548/EØF skal betragtes som 
henvisninger til nærværende forordning.  
Artikel 4  
Denne forordning træder i kraft dagen efter offentliggørelsen i  Den 
Europæiske Unions Tidende . 
Den anvendes fra den 1. juni 2008.  
Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i 
hver medlemsstat.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
BILAG  
DEL A: METODER TIL BESTEMMELSE AF FYSISK/KEMISKE 
EGENSKABER  
INDHOLDSFORTEGNELSE 
A.1. Smelte-/frysepunkt 
A.2. Kogepunkt 
A.3. Relativ massefylde A.4. Damptryk 
A.5. Overfladespænding 
A.6. Vandopløselighed A.8. Fordelingskoefficient 
A.9. Flammepunkt 
A.10. Antændelighed (faste stoffer) A.11. Antændelighed (gasser) A.12. Antændelighed (kontakt med vand) 
A.13. Væskers og faste stoffers pyroforiske egenskaber 
A.14. Eksplosive egenskaber A.15. Selvantændelsestemperatur for væsker og gasser 
A.16. Relativ selvantændelsestemperatur for faste stoffer 
A.17. Oxiderende egenskaber (faste stoffer) A.18. Polymerers antalsmiddelmolekylvægt og molekylvægtsfordeling A.19. Polymerers indhold af lavmolekylære bestanddele 
A.20. Polymerers opløselighed/ekstraherbarhed i vand 
A.21. Oxiderende egenskaber (væsker) A.22. Fibres længdevægtede geometriske middeldiameter
 
▼M4 
A.23. Fordelingskoefficient (1-octanol/vand): slow-stirring-metoden  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. SMELTE-/FRYSEPUNKT  
1. METODE  
De fleste af de beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejled ­
ningen (1). Grundprincipperne er anført i henvisning (2) og (3).  
1.1. INDLEDNING  
De beskrevne metoder og apparater kan anvendes til bestemmelse af 
smeltepunktet for kemiske stoffer uanset renheden.  
De beskrevne metoder og apparater kan anvendes til bestemmelse af 
smeltepunktet for kemiske stoffer uanset renheden. Valg af metode afhænger af arten af det stof, der skal undersøges. Det er således afgørende, om stoffet let, vanskeligt eller slet ikke kan pulveriseres.
 
For nogle stoffer er bestemmelse af fryse- eller størkningspunkt mere 
hensigtsmæssigt, og der er i denne metode medtaget standarder for 
sådanne bestemmelser.  
Hvis det som følge af stoffets særlige egenskaber er umuligt at 
bestemme nogen af ovenstående parametre, kan det være hensigts ­
mæssigt at bestemme et flydepunkt.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Smeltepunktet defineres som den temperatur, ved hvilken faseover ­
gangen fra fast til flydende tilstand finder sted ved atmosfæretryk, og 
denne temperatur svarer i det ideale tilfælde til temperaturen ved 
frysepunktet.  
Da faseovergangen for mange stoffer finder sted over et temperatur ­
interval, beskrives den ofte som smeltepunktsintervallet.  
Enhedsomregning (K til  o C) 
t = T – 273,15  
t: er temperaturen i grader celsius (  o C) 
T: er temperaturen i kelvin (K)  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt 
stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest bruges 
til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resul ­
tater opnået med andre metoder.  
Der er i henvisningerne (4) angivet nogle referencestoffer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. METODENS PRINCIP  
Temperaturen (temperaturintervallet) for faseovergangen fra fast til 
flydende tilstand eller fra flydende til fast tilstand bestemmes. I praksis bestemmes temperaturen ved begyndende smeltning/frysning og ved 
endelig smeltning/frysning under opvarmning/afkøling af en prøve af 
stoffet ved atmosfæretryk. Der er beskrevet fem typer metoder: kapillar ­
metoder, varmebordsmetoder, frysepunktsbestemmelser, termoanalyse og flydepunktsbestemmelse (som udviklet til mineralolier).
 
Det kan i nogle tilfælde være mere hensigtsmæssigt at bestemme 
frysepunktet end smeltepunktet.  
1.4.1.  Kapillarmetode  
1.4.1.1.  Smeltepunktsapparater med væskebad  
En lille mængde af det findelte stof fyldes i et kapillarrør og pakkes 
tæt. Røret opvarmes sammen med et termometer, og temperaturstig ­
ningen indstilles til mindre end ca. 1 K/min under den egentlige smeltning. Temperaturen ved begyndende og endelig smeltning 
bestemmes.
 
1.4.1.2.  Smeltepunktsapparater med metalblok  
Som beskrevet under 1.4.1.1 bortset fra, at kapillarrøret og termo ­
meteret er anbragt i en opvarmet metalblok og kan iagttages gennem huller i blokken.
 
1.4.1.3.  Bestemmelse med fotocelle  
Prøven i kapillarrøret opvarmes automatisk i en metalcylinder. En 
lysstråle sendes via et hul i cylinderen gennem stoffet og ind på en 
nøjagtigt indstillet fotocelle. De fleste stoffers optiske egenskaber ændres under smeltning fra at være uigennemsigtige til gennemsig ­
tige. Derved øges den lysmængde, som når frem til fotocellen, og 
der sendes et stopsignal til en digitalindikator, som viser tempera ­
turen af et platinmodstandstermometer anbragt i varmekammeret. Denne metode kan ikke anvendes for visse stærkt farvede stoffer.
 
1.4.2.  Varmeborde  
1.4.2.1.  Koflers varmebænk  
Koflers varmebænk består af to elektrisk opvarmede metalstykker med 
forskellig varmeledningsevne og er udformet sådan, at dens tempera ­
turgradient i længderetningen er næsten lineær. Varmebænken kan spænde over temperaturområdet fra 283 K til 573 K og er forsynet 
med en særlig anordning til temperaturaflæsning, som består af en 
skyder med en viser, og en fane, og som er særligt udformet til den enkelte bænk. Smeltepunktet bestemmes ved, at det pågældende stof lægges i et tyndt lag direkte på bænkens overflade, hvorefter der på få 
sekunder opstår en skarp skillelinje mellem flydende og fast fase. 
Temperaturen på skillelinjen aflæses ved at indstille viseren på denne.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Smeltemikroskop  
Der anvendes en række varmeborde med mikroskop til smeltepunkts ­
bestemmelser på meget små stofmængder. I de fleste varmeborde måles temperaturen med et følsomt termoelement, men undertiden anvendes 
også kviksølvtermometre. Et typisk smeltepunktsapparat, bestående af 
varmebord med mikroskop, er udstyret med et varmekammer indehol ­
dende en metalplade, hvorpå prøven anbringes i en slæde. I midten af metalpladen er der et hul, hvorigennem der kan sendes lys fra mikro ­
skopets belysningsspejl. Når apparatet er i brug, er kammeret lukket 
med en glasplade for at forhindre luftens adgang til prøven.
 
Opvarmningen af prøven reguleres med en rheostat. Kræves meget 
nøjagtige målinger kan der for optisk anisotrope stoffer anvendes polariseret lys.
 
1.4.2.3.  Meniskmetoden  
Denne metode anvendes kun for polyamider.  
Den temperatur, ved hvilken forskydningen af en silikonoliemenisk, 
som er indesluttet mellem et varmebord og et dækglas hvilende på 
polyamid-prøveemnet, iagttages visuelt.  
1.4.3.  Metode til bestemmelse af frysepunkt  
Prøven anbringes i en særlig type reagensglas og anbringes i et 
apparat til bestemmelse af frysepunkt. Prøven afkøles under stadig 
langsom omrøring, og temperaturen måles med passende mellemrum. 
Når temperaturen er konstant ved flere aflæsninger, anføres denne temperatur (korrigeret for termometerfejl) som frysepunktet.
 
Underafkøling skal undgås ved, at der opretholdes ligevægt mellem 
den faste fase og væskefasen.  
1.4.4.  Termoanalyse  
1.4.4.1.  Differential termoanalyse (DTA)  
Ved denne metode registreres temperaturforskellen mellem stoffet og 
et referencemateriale som funktion af temperaturen, imedens stoffet og referencematerialet følger samme temperaturprogram. En fase ­
overgang i stoffet ledsaget af en enthalpiændring viser sig ved en 
endoterm (smeltning) eller exoterm (frysning) afvigelse fra den regi ­
strerede grundlinje.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Differential scanning kalorimetri (DSC)  
Ved denne metode registreres forskellen i den energimængde, der 
tilføres stoffet og et referencemateriale, som funktion af temperatu ­
ren, imedens stoffet og referencematerialet følger samme tempera ­
turprogram. Denne forskel svarer til den energimængde, der er 
nødvendig for at opretholde en temperaturforskel på nul mellem stoffet og referencematerialet. En faseovergang i stoffet ledsaget af en enthalpiændring viser sig ved en endoterm (smeltning) eller 
exoterm (frysning) afvigelse fra den registrerede grundlinje.
 
1.4.5.  Flydepunkt  
Denne metode er udviklet til mineralolier og er egnet til olieagtige 
stoffer med lavt smeltepunkt.  
Efter først at være opvarmet afkøles prøven med en bestemt hastig ­
hed, og dens flydeegenskaber undersøges med 3 K's mellemrum. Den laveste temperatur, ved hvilken der kan iagttages bevægelse i stoffet, registreres som flydepunktet.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Anvendelighed og nøjagtighed for de forskellige metoder til bestem ­
melse af smeltepunkt/smeltepunktsinterval er angivet i følgende tabel:  
TABEL: METODERNES ANVENDELIGHED  
A. Kapillarmetoder  
Målemetode For stoffer, som 
kan pulveriseres For stoffer, som 
ikke let pulveri ­
seres Temperaturom ­
råde Skønnet (  1 ) 
nøjagtighed Foreliggende stan ­
dard 
Smeltepunkts- 
apparater med 
væskebad ja enkelte 273 til 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Smeltepunkts- 
apparater med metalblok ja enkelte 293 til > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Bestemmelse med 
fotocelle ja adskillige ved 
hjælp af særligt 
udsryr 253 til 573 K ± 0,5 K
 
( 1 ) Afhængig af instrumenttype og stoffets renhed.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Varmeborde og frysemetoder  
Målemetode For stoffer, som 
kan pulveriseres For stoffer, 
som ikke let 
pulveriseres Temperaturom ­
råde Skønnet (  1 ) 
nøjagtigned Foreliggende 
standard  
Koflers varme ­
bænk ja nej 283 K til 
> 573 K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
345176 
Smekemikroskop ja enkelte 273 K til 
> 573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Meniskmetode nej kun for polya ­
mider 293 K til 
> 573 K ± 0,5 K IS0 1218 (E) 
Frysepunkts ­
metoder ja ja 223 K til 
573 K ± 0,5 K f.eks. BS 4695  
( 1 ) Afhængig af instrumenttype og stoffets renhed.  
C. Termoanalyse  
Målemetode For stoffer, som 
kan pulveriseres For stoffer, 
som ikke let 
pulveriseres Temperaturom ­
råde Skønnet (  1 ) 
nøjagtighed Foreliggende 
standard  
Differential 
termoanalyse ja ja 173 K til 
1 273 K op til 600 K 
± 0,5 K op til 
1 273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76 
Differential scan ­
ning kalorimetri ja ja 173 K til 
1 273 K op til 600 K 
± 0,5 K op til 
1 273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Afhxngig af instrumenttype og stoffets renhed.  
D. Flydepunkt  
Målemetode For stoffer, som 
kan pulveriseres For stoffer, 
som ikke let 
pulveriseres Temperaturom ­
råde Skønnet (  1 ) 
nø-jagtighcd Foreliggende 
standard  
Flydepunkt for mineral ­
olier og olie ­
agtige stoffer for mineralolier 
og olieagtige 
stoffer 223 K til 323 K ± 0,3 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Afhængig af instrumenttype og stoffets renhed.  
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE  
Fremgangsmåden er for næsten alle undersøgelsesmetoderne 
beskrevet i internationale og nationale standarder (se tillægget).  
1.6.1.  Kapillarrørsmetoder  
Fint pulveriserede stoffer udviser ved langsom opvarmning sædvan ­
ligvis et smeltningsforløb som vist på figur 1.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Figur 1
  
Under smeltepunktsbestemmelsen noteres temperaturerne ved begyn ­
dende og endelig smeltning.  
1.6.1.1.  Smeltepunktsapparater med væskebad  
Figur 2 viser en type standardiseret smeltepunktsapparat 
(JIS K 0064). Apparatet er fremstillet af glas, og alle mål er angivet i mm.
 
Figur 2
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Badvæske:  
Der vælges en passende væske. Valget afhænger af, hvor højt et 
smeltepunkt der skal bestemmes, f.eks. paraffinolie for smeltepunkter 
op til 473 K og silikonolie for smeltepunkter op til 573 K.  
For smeltepunkter over 523 K kan der anvendes en blanding af 3 
dele svovlsyre og 2 dele kaliumsulfat (masseforhold). Anvendes denne blanding, skal der træffes passende sikkerhedsforholdsregler.
 
Termometer:  
Man bør kun anvende termometre, som opfylder kravene i de 
følgende eller tilsvarende standarder:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Fremgangsmåde:  
Det tørre stof pulveriseres fint i en morter og fyldes i kapillarrøret, 
som er lukket i den ene ende, således at fyldningshøjden er ca. 3 mm 
efter tæt pakning. For at opnå en ensartet pakket prøve lader man kapillarrøret falde fra en højde af ca. 700 mm gennem et lodret glasrør ned på et urglas.
 
Det fyldte kapillarrør anbringes i badet, således at den midterste del 
af termometerets kviksølvbeholder berører den del af kapillarrøret, 
som prøven befinder sig i. Sædvanligvis anbringes kapillarrøret i apparatet, når badets temperatur er ca. 10 K under smeltepunktet.
 
Badvæsken opvarmes med en temperaturstigning på ca. 3 K/min 
under omrøring af væsken. Når temperaturen er ca. 10 K under 
det forventede smeltepunkt, indstilles temperaturstigningen til højst 
1 K/min.  
Beregning:  
Smeltepunktet beregnes således:  
T = T  D + 0,00016 (T  D – T  E ) n 
hvor:  
T = korrigeret smeltepunktstemperatur i K  
T D = temperaturaflæsning af termometer D i K  
T E = temperaturaflæsning af termometer E i K  
n = antallet af gradinddelinger på den udestående del af termo ­
meter D's kviksøjle.  
1.6.1.2.  Smeltepunktapparatar med metalblok  
Apparat:  
Dette består af:  
— en cylindrisk metalblok, hvis øverste del er hul og danner et 
kammer (se figur 3)  
— en metalprop med to eller flere huller, som muliggør anbringelse 
af rør i metalklodsen  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— et opvarmningssystem for metalklodsen, f.eks. i form af en elek ­
trisk modstand indbygget i blokken  
— en rheostat til regulering af energitilførslen, hvis der anvendes 
elektrisk opvarmning  
— fire vinduer af varmeresistent glas i kammerets sidevægge, 
anbragt diametralt og vinkelret på hinanden. Foran et af disse 
vinduer er der anbragt en lup til iagttagelse af kapillarrøret. De tre andre vinduer tjener til belysning af indersiden af kammeret ved hjælp af lamper
 
— et kapillarrør af varmeresistent glas lukket i den ene ende 
(se 1.6.1.1).  
Termometer:  
Se standarderne i 1.6.1.1. Termoelektriske måleinstrumenter med 
tilsvarende nøjagtighed kan også anvendes.  
Figur 3
  
1.6.1.3.  Bestemmelse med fotocelle  
Apparat og fremgangsmåde:  
Apparatet består af et metalkammer med et automatisk opvarmnings ­
system. Tre kapillarrør fyldes som i 1.6.1.1 og anbringes i ovnen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Der er mulighed for flere lineære temperaturstigninger til kalibrering 
af apparatet, og temperaturstigningen indstilles elektrisk til en 
passende forudvalgt konstant og lineær hastighed. Skrivere viser den øjeblikkelige ovntemperatur og temperaturen af stoffet i kapillar ­
rørene.
 
1.6.2.  Varmeborde  
1.6.2.1.  Koflers varmebænk  
Se tillæg.  
1.6.2.2.  Smeltemikroskop  
Se tillæg.  
1.6.2.3.  Meniskmetode (polyamider)  
Se tillæg.  
Opvarmingshastigheden ved smeltepunktet skal være mindre end 1 
K/min.  
1.6.3.  Metoder til bestemmelse af frysepunkt  
Se tillæg.  
1.6.4.  Termoanalyse  
1.6.4.1.  Differential termoanalyse  
Se tillæg.  
1.6.4.2.  Differential scanning kalorimetri  
Se tillæg.  
1.6.5.  Bestemmelse af flydepunkt  
Se tillæg.  
2. DATA  
I visse tilfælde er termometerkorrektion nødvendig.  
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— anvendt metode  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder) og even ­
tuelt indledende oprensningstrin  
— den skønnede nøjagtighed.  
Som smeltepunkt anføres gennemsnittet af mindst to målinger, der 
ligger inden for den skønnede nøjagtighed (jf. tabellerne).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Hvis forskellen mellem temperaturen ved begyndende og endelig 
smeltning ligger inden for metodens nøjagtighed, angives tempera ­
turen ved den endelige smeltning som smeltepunktet; i modsat fald angives begge temperaturer.
 
Hvis stoffet dekomponerer eller sublimerer, inden smeltepunktet er 
nået, anføres den temperatur, hvor dette fænomen er iagttaget.  
Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af 
resultaterne især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstand 
skal anføres.  
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 505-515.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Tillæg  
Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstående standarder.  
1. Kapillarmetoder  
1.1. Smeltepunktsapparater med væskebad 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapilarverfarehn 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products.
 
1.2. Smeltepunktsapparater med metalblok 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunst ­
stoffen 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of »melting point«  
2. Varmeborde  
2.1. Koflers varmebænk 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Smeltemikroskop 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen. 
2.3. Meniskmetode (polyamider) 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of »melting point«  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion mate ­
rials 
NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination 
du »point de fusion« methode du 
menisque  
3. Metoder til bestemmelse af frysepunkt  
BS 4633 Method for the determination of 
crystallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling 
Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de petrole: determination de la 
temperature de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsiiuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Methode de determination du point de 
cristallisation (point de Congelation 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Termoanalyse  
4.1. Differential termoanalyse 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Differential scanning kalorimetri 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
 
5. Bestemmelse af flydepunkt  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des 
produits du petrole: Point de trouble 
et point d'ecoulement limite — 
Monsterneming en ontleding van aard ­
olieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils — Determination of 
pour point
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. KOGEPUNKT  
1. METODE  
Flertallet af de beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejled ­
ningen (1). Grundprincipperne er anført i henvisning (2) og (3).  
1.1. INDLEDNING  
De her beskrevne metoder kan anvendes for alle væsker og lavts ­
meltende stoffer, forudsat at der ikke indtræder nogen kemisk 
reaktion under kogepunktet (f.eks. autooxidation, omlejring eller 
nedbrydning). Metoderne kan anvendes for alle væsker uanset renhe ­
den. 
De metoder, hvor der benyttes bestemmelse med fotocelle, og de, der 
er baseret på termoanalyse, fremhæves specielt, da de kan benyttes til bestemmelse af både smelte- og kogepunkt. Desuden kan disse 
målinger udføres automatisk.
 
Den dynamiske metode har den fordel, at den også kan benyttes til 
bestemmelse af damptryk, og det er ikke nødvendigt at korrigere 
kogepunktstemperaturen til standardtryk (101,325 kPa), da standard ­
trykket kan indstilles med en pressostat under målingen.  
Bemærkninger:  
Urenheders indflydelse på kogepunktsbestemmelsen afhænger stærkt 
af deres art. Hvis der i prøven er flygtige urenheder, som vil kunne få indflydelse på resultaterne, kan stoffet eventuelt renses.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Standardkogepunktet defineres som den temperatur, ved hvilken en 
væskes damptryk er 101,325 kPa.  
Måles kogepunktet ikke ved standardatmosfæretryk, kan damptryk ­
kets afhængighed af temperaturen beskrives ved Clausius-Clapeyrons ligning:
 
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ konstant  
hvor:  
P = stoffets damptryk i pascal  
ΔH v = stoffets fordampningsvarme i J mol  -1 
R = gaskonstanten = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = den absolutte temperatur i K  
Kogepunktet opgives i forhold til det aktuelle tryk under målingen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Omregninger  
Tryk (enhed kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(»bar« er stadig tilladt, men anbefales ikke)  
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(enhederne »mm Hg« og »Torr« er ikke tilladt).  
1 atm = standardatmosfære = 101 325 Pa 
(»atm«-enheden er ikke tilladt).  
Temperatur (enhed: K)  
t = T – 273,15  
t: er temperaturen i grader celsius (  o C) 
T: er termodynamisk temperaturen i kelvin (K)  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt 
stof undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til 
lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater 
opnået med andre metoder.  
Der er i de metoder, der er anført i tillægget, angivet nogle reference ­
stoffer.  
1.4. METODENS PRINCIP  
Der er fem metoder til bestemmelse af kogepunkt (kogepunktsinter ­
val), som er baseret på måling af den temperatur, ved hvilken prøven koger, og to metoder baseret på termoanalyse.
 
1.4.1.  Bestemmelse ved hjælp af ebulliometer  
Ebullitometre blev oprindeligt udviklet til molekylvægtsbestemmelse 
via kogepunktsforhøjelse, men de er også velegnede til nøjagtige kogepunktsbestemmelser. Et meget enkelt apparat er beskrevet i 
ASTM D 1120-72 (se tillæg). I dette apparat opvarmes væsken 
under ligevægtsbetingelser ved atmosfæretryk, indtil den koger.
 
1.4.2.  Dynamisk metode  
Ved denne metode måles dampens fortætningstemperatur ved hjælp 
af et egnet termometer anbragt i tilbagesvaleren under kogning. Trykket kan varieres ved denne metode.
 
1.4.3.  Destillationsmetode til bestemmelse af kogepunkt  
Ved denne metode destilleres væsken, og dampens fortætningstem ­
peratur samt destillatmængden måles.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Siwoloboffs metode  
En prøve opvarmes i et prøverør, som er nedsænket i et varmebad. 
Et tilsmeltet kapillarrør med en luftboble i den nederste ende er nedsænket i prøverøret.
 
1.4.5.  Bestemmelse med fotocelle  
Der foretages automatisk fotoelektrisk måling af opstigende bobler 
under anvendelse af Siwoloboffs princip.  
1.4.6.  Differential termoanalyse  
Ved denne metode registreres temperaturforskellen mellem stoffet og 
et referencemateriale som funktion af temperaturen, imedens stoffet 
og referencematerialet følger samme temperaturprogram. En fase ­
overgang i stoffet ledsaget af en enthalpiændring viser sig ved en endoterm afvigelse (kogning) fra den registrerede grundlinje.
 
1.4.7.  Differential scanning kalorimetri  
Ved denne metode registreres forskellen i den energimængde, der 
tilføres stoffet og et referencemateriale, som funktion af temperatu ­
ren, imedens stoffet og referencematerialet følger samme tempera ­
turprogram. Denne forskel svarer til den energimængde, der er nødvendig for at opretholde en temperaturforskel på nul mellem 
stoffet og referencematerialet. En faseovergang i stoffet ledsaget af 
en enthalpiændring viser sig ved en endoterm afvigelse (kogning) fra den registrerede grundlinje.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Anvendelighed og nøjagtighed for de forskellige metoder til bestem ­
melse af kogepunkt/kogepunktsinterval er angivet i tabel 1.  
Tabel 1  
Sammenligning af metoderne  
Målemetode Skønnet nøjagtighed Foreliggende standard  
Ebulliometer ± 1,4 K (op ril 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (op til 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Dynamisk metode ± 0,5 K (op til 600 K) (  2 ) 
Destillationsforløb (kogepunkts ­
interval) ± 0,5 K (op til 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Siwoloboff's metode ± 2 K (op til 600 K) (  2 ) 
Bestemmelse med fotocelle ± 0,3 K (ved 373 K) (  2 ) 
Differential termoanalyse ± 0,5 K (op til 600 K) ± 2,0 
K (op til 1 273 K) ASTM E 537-76 
Differential scanning kalorimetri ± 0,5 K (op til 600 K) ± 2,0 
K (op til 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Denne nøjagtighed gælder kun for det simple apparat, som er beskrevet i f.eks. ASTM D 1120-72, den kan forbedres 
med mere raffinerede ebulliometre. 
( 2 ) Gælder kun for rene stoffer. Anvendelse under andre betingelser skal begrundes.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE  
Nogle af metodernes fremgangsmåder er beskrevet i internationale 
og nationale standarder (se tillæg).  
1.6.1.  Ebulliometer  
Se tillæg.  
1.6.2.  Dynamisk metode  
Se metode A.4 til bestemmelse af damptryk.  
Den kogetemperatur, der iagttages ved et tryk på 101,325 kPa, note ­
res. 
1.6.3.  Destillationsforløb (kogepunktsinterval)  
Se tillæg.  
1.6.4.  Siwoloboffs metode  
Prøven opvarmes i et smeltepunktsapparat i et prøverør med en 
diameter på ca. 5 mm (figur 1).  
Figur 1 viser en model af et standardiseret smelte- og kogepunkts ­
apparat (JIS K 0064) (fremstillet af glas, alle mål i millimeter).  
Figur 1
  
Et kapillarrør, som er tilsmeltet ca. 1 cm over den nederste ende, 
anbringes i prøverøret. Der fyldes så meget prøve i, at den tilsmel ­
tede del af kapillarrøret befinder sig under væskeoverfladen. Prøve ­
røret med kapillarrøret fastgøres til termometeret med en elastik eller 
fastholdes støttet fra siden (se figur 2).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Figur 2  
Siwoloboff's princip  Figur 3  
Modificeret princip
  
Badvæsken vælges under hensyntagen til kogepunktet. Ved en 
temperatur på op til 573 K kan der benyttes silikonolie. Flydende paraffin må kun anvendes op til 473 K. Badvæsken opvarmes først med en hastighed på 3 K pr. minut under omrøring. Ca. 10 K under 
det forventede kogepunkt sænkes varmetilførslen, så temperaturstig ­
ningen bliver mindre end 1 K pr. minut. Når temperaturen nærmer sig kogepunktet, begynder der at strømme bobler ud af kapillarrøret.
 
Kogepunktet er den temperatur, hvor boblestrømmen under et kort ­
varigt temperaturfald standser og væsken begynder at stige op i kapillarrøret. Termometeraflæsningen viser stoffets kogepunkt.
 
I det modificerede princip (figur 3) bestemmes kogepunktet i et 
smeltepunktskapillarrør. Det trækkes ud til en ca. 2 cm lang tynd spids (a), og en smule af prøven suges op heri. Den åbne ende af det tynde kapillarrør tilsmeltes, så der dannes en lille luftboble ved 
enden. Ved opvarmning i smeltepunktsapparatet (b) udvider luft ­
boblen sig. Kogepunktet ligger ved den temperatur, hvor stofproppen når op i højde med badvæskens overflade (c).
 
1.6.5.  Bestemmelse med fotocelle  
Prøven opvarmes i et kapillarrør i en opvarmet metalblok.  
Via passende huller i blokken sendes der en lysstråle gennem stoffet 
ind til en nøjagtigt kalibreret fotocelle.  
Medens temperaturen i prøven stiger, undviger der enkelte bobler fra 
kapillarrøret. Når kogepunktet er nået, vokser antallet af bobler vold ­
somt. Herved ændres intensiteten af det lys, som fotocellen modtager, så der sendes et stopsignal til den indikator, der viser 
temperaturen af et platinmodstandstermometer, der er anbragt i 
blokken
 
Denne metode er særlig anvendelig, da den kan benyttes til bestem ­
melser under stuetemperatur ned til 253,15 K (– 20  o C) uden 
ændringer ved apparaturet. Instrumentet skal blot anbringes i et 
kuldebad.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Termoanalyse  
1.6.6.1.  Differential termoanalyse  
Se tillæg.  
1.6.6.2.  Differential scanning kalorimetri  
Se tillæg.  
2. DATA  
Ved små afvigelser fra standardtryk (maks. ± 5 kPa) korrigeres 
kogepunktstemperaturerne ved hjælp af Sidney-Youngs ligning:  
T n = T + (f  T x Δp) 
hvor 
Δ p = (101,325 – p) [bemærk fortegnet]  
p = trykket målt i kPa  
f T = kopepunktets ændring med trykker i K/kPa  
T = målt kogepunkt i K  
T n = kogepunkt i K, korrigeret til standardtryk  
I ovennævnte nationale og internationale standarder findes der 
temperaturkorrektionsfaktorer f  T for mange stoffer og udtryk til 
tilnærmelse af dem.  
Eksempelvis anføres i DIN 53171 følgende grove korrektioner for 
opløsningsmidler i maling:  
Tabel 2  
Temperaturkorrektionsfaktorer f  T 
Temperatur T korrektionsfaktor f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 
373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 
448,15 0,37 
473,15 0,39 498,15 0,41 
523,15 0,44 
548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— anvendt metode  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder) og even ­
tuel indledende rensning  
— den skønnede nøjagtighed.  
Som kogepunkt anføres gennemsnittet af mindst to målinger, der 
ligger inden for den skønnede nøjagtighed (jf. tabel 1).  
De målte kogetemperaturer og gennemsnittet heraf skal anføres, og 
det tryk, hvorved målingerne er foretaget, opgives i kPa. Trykket skal helst ligge nær standardatmosfæretryk.
 
Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af 
resultaterne især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstand skal anføres.
 
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the 
Council C (81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London 1975, volume II.  
(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publica ­
tions, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Tillæg  
Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstående standarder  
1. Ebulliometer  
1.1. Smeltepunktsapparater med væskebad 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Destillationsforløb (kogepunktsinterval)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distil ­
lation characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation:determination du rendement et 
de l'intervalle de distillation  
3. Differential termoanalyse og differential scanning kalorimetri  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of diffe ­
rential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. RELATIV MASSEFYLDE  
1. METODE  
De beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejledningen (1). 
Grundprincipperne er anført i henvisning (2).  
1.1. INDLEDNING  
De beskrevne metoder til bestemmelse af relativ massefylde kan 
anvendes for faste stoffer og væsker uanset renheden. De forskellige 
metoder, som kan anvendes, er anført i tabel 1.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Den relative massefylde, D  4 20 , af faste stoffer og væsker er forholdet 
mellem massen af et rumfang af det undersøgte stof bestemt ved 
20 o C og massen af det samme rumfang vand bestemt ved 4  o C. 
Den relative massefylde er dimensionsløs.  
Massefylden, P, af et stof er dets masse m divideret med dets 
rumfang v.  
Massefylden, P, opgives i kg/m  3 (SI-enheder).  
1.3. REFERENCESTOFFER (1) (3)  
Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt 
stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater 
opnået med andre metoder.
 
1.4. METODERNES PRINCIP  
Der benyttes fire typer metoder.  
1.4.1.  Opdriftsmetoder  
1.4.1.1.  Aræometer  (for væsker)  
Der kan opnås tilstrækkelig nøjagtige og hurtige massefyldebestem ­
melser med aræometre, hvor massefylden af en væske udledes af 
flydehøjden ved aflæsning på en skala.  
1.4.1.2.  Hydrostatisk vægt  (for væsker og faste stoffer)  
Forskellen mellem massen af en prøve i henholdsvis atmosfærisk luft 
og en passende væske (f.eks. vand) kan anvendes til at bestemme dens massefylde.
 
For faste stoffer er den fundne massefylde kun repræsentativ for den 
bestemte prøve, som er anvendt til bestemmelsen. Til bestemmelse af væskers massefylde vejes et legeme med kendt rumfang v først i 
atmosfærisk luft og dernæst i væsken.
 
1.4.1.3.  Metode med nedsænket legeme  (for væsker) (4)  
Ved denne metode bestemmes en væskes massefylde ud fra 
forskellen mellem resultaterne af vejning af væsken før og efter 
nedsænkning af et legeme med kendt rumfang her.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Pyknometermetoder  
Pyknometre af forskellig udformning og med kendt rumfang kan 
anvendes for faste stoffer og væsker. Massefylden beregnes ud fra masseforskellen mellem det fulde og det tomme pyknometer og dets 
kendte rumfang.
 
1.4.3.  Luftsammenligningspyknometer  (for faste stoffer)  
Massefylden af et fast stof i enhver form kan bestemmes ved stue ­
temperatur med et gassammenligningspyknometer. Rumfanget af en 
prøve af stoffet måles i atmosfærisk luft eller i en inaktiv luftart i en 
beholder med korrigeret rumfangsinddeling. Til beregning af massefylden foretages efter rumfangsbestemmelsen en bestemmelse af prøvens masse.
 
1.4.4.  Oscillerende densitometer  (5) (6) (7)  
Massefylden af en væske kan bestemmes med et oscillerende densi ­
tometer. En mekanisk oscillator i form af et U-rør sættes i svingning ved sin resonansfrekvens, der afhænger af dens masse. Når der 
indføres en prøve heri, ændres oscillatorens resonansfrekvens. Appa ­
ratet kalibreres med to væsker med kendt massefylde. Disse stoffer vælges fortrinsvis således, at deres massefylde ligger i hver sin ende af det pågældende måleområde.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Anvendeligheden af de forskellige metoder, der anvendes til bestem ­
melse af den relative massefylde, er opstillet i tabellen.  
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE  
Tillægget indeholder en liste over nogle standarder, hvorfra yder ­
ligere tekniske detaljer kan hentes.  
Målingerne skal udføres ved 20  o C, og der foretages mindst to 
bestemmelser.  
2. DATA  
Se standarderne.  
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— anvendt metode  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (art og urenheder) og eventuel 
indledende rensning.  
Den under 1.2 definerede relative massefylde  D 20 
4 rapporteres tillige 
med det undersøgte stofs fysiske tilstand.  
Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af 
resultaterne, især vedrørende urenheder og stoffets fysiske tilstand, 
skal anføres.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabel  
Metodernes anvendelighed  
Målemetode Massefylde Maksimal dyna ­
misk viskositet Foreliggende standarder 
fast stof væske  
1.4.1.1. Aræometer ja 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Hydrostatik vægt a) faste stoffer ja ISO 1183 (A) b) væsker ja 5 Pa S ISO 901 og 758 
1.4.1.3. Metode med nedsænket 
legeme ja 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2. Pyknometer ISO 3507 
a) faste stoffer ja ISO 1183 (B), NF 
T 20-053 
b) væsker ja 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Luftssammenligningspyk ­
nometer ja DIN 55990 Teil 3, 
DIN 53243 
1.4.4. Oscillerende densitometer ja 5 Pa s
 
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Intersci ­
ence Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 508.  
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.II, 427- 
430. 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297-302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen 
Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeu ­
tische Industrie, 1975, vol. 37, 717 - 726.  
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im 
Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Tillæg  
Der findes supplerende tekniske oplysninger i nedenstående standarder:  
1. Opdriftsmetoder  
1.1. Aræometer 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of liquids — Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters
 
1.2. Hydrostatisk vægt  
For faste stoffer  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use — 
Determination of the density of solids other than powders and cellular products 
— Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
For væsker  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 og ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method  
1.3. Metode med nedsænket legeme 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of density; immersed body method
 
2. Pyknometermetoder  
2.1. For væsker 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kine ­
matic viscosity of less than 100,10  -6 m 2 s -1 
at 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 
100,10  -6 m 2 s -1 at 20  o C, applicable in 
particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids 
with higher vapour pressure, approxima ­
tely 1 bar at 90
 o C) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high a 
vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol — water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by 
pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic 
compounds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer 
method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products 
by the capillary — stoppered pycnometer 
method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric 
method
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. For faste stoffer 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in 
powder and liquids — Pyknometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Luftsammenligningspyknometer  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. DAMPTRYK  
1. METODE  
Metoden er ækvivalent med OECD TG 104 (2004).  
1.1. INDLEDNING  
Denne reviderede version af metode A.4 (1) omfatter én supplerende 
metode, effusionsmetoden: isoterm termogravimetri, som er udviklet 
til stoffer med meget lavt tryk (ned til 10  –10 Pa). Da der er et særligt 
behov for metoder til måling af damptrykket af stoffer med lavt damptryk, er de øvrige procedurer i denne metode revurderet med 
hensyn til andre anvendelsesområder.
 
Ved termodynamisk ligevægt er damptrykket af et rent stof alene en 
funktion af temperaturen. Grundprincipperne findes beskrevet andet ­
steds (2)(3).  
Ingen enkelt måleteknik kan anvendes på hele trykområdet fra 
mindre end 10  –10 til 10  5 Pa. I denne metode til damptrykmåling 
indgår otte metoder, som kan anvendes i forskellige damptrykinter ­
valler. I tabel 1 sammenlignes de forskellige metoders anvendelighed og måleområde. Metoderne kan kun bruges på forbindelser, der ikke dekomponeres under de pågældende testbetingelser. I tilfælde, hvor 
de eksperimentelle metoder af tekniske grunde ikke kan anvendes, 
kan et tilnærmet damptryk beregnes, og i tillægget beskrives en anbefalet beregningsmetode.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Ved damptrykket af et stof forstås mætningstrykket over stoffet i fast 
eller flydende tilstand.  
Som trykenhed bør anvendes SI-enheden, der er pascal (Pa). 
Nedenfor er angivet andre, tidligere anvendte enheder og de 
tilhørende omregningsfaktorer: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfære = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
SI-enheden for temperatur er kelvin (K). Omregning af grader celsius 
til kelvin sker med formlen:  
T = t + 273,15  
hvor T er kelvin-temperaturen eller den termodynamiske temperatur, 
og t er temperaturen i grader celsius.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabel 1  
Målemetode Stof Anslået repeter ­
barhed Anslået Repro ­
ducerbarhed Anbefalet område 
Faststof Væske  
Den dynamiske 
metode Letsmelteligt Ja indtil 25 % 
1 til 5 % indtil 25 % 
1 til 5 % 10 3 Pa til 
2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa til 
10 5 Pa 
Den statiske 
metode Ja Ja 5 til 10 % 5 til 10 % 10 Pa til 10  5 Pa 
10 –2 Pa til 
10 5 Pa (  1 ) 
Isoteniskop- 
metoden Ja Ja 5 til 10 % 5 til 10 % 10  2 Pa til 10  5 Pa 
Effusionsmetoden: 
damptrykbalance Ja Ja 5 til 20 % indtil 50 % 10  –3 til 1 Pa 
Effusionsmetoden: 
Knudsen-celle Ja Ja 10 til 30 % — 10  –10 til 1 P 
Effusionsmetoden: 
isotermisk termo ­
gravimetri Ja Ja 5 til 30 % indtil 50 % 10  –10 til 1 Pa 
Gasmætnings ­
metoden Ja Ja 10 til 30 % indtil 50 % 10  –10 til 10  3 Pa 
Metoden med rote ­
rende kugle Ja Ja 10 til 20 % — 10  –4 til 0,5 Pa  
( 1 ) Ved brug af kapacitansmanometer.  
1.3. TESTENS PRINCIP  
Sædvanligvis bestemmes damptrykket ved forskellige temperaturer. 
Inden for et begrænset temperaturområde er logaritmen til damptrykket 
af et rent stof en lineær funktion af den reciprokke termodynamiske temperatur ifølge den forenklede Clausius-Clapeyron-ligning:
 
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ konstant  
hvor:  
p = damptrykket i pascal  
ΔHv = fordampningsvarmen i J mol  –1 
R = den universelle gaskonstant, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperaturen i K  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. REFERENCESTOFFER  
Referencestoffer behøver ikke anvendes. De bruges hovedsagelig til 
lejlighedsvis kontrol af en metodes præstationer og til at sammen ­
ligne resultaterne fra forskellige metoder.  
1.5. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.5.1.  Den dynamiske metode (Cottrells metode)  
1.5.1.1.  Princip  
Damptrykket bestemmes ved måling af stoffets kogepunktstempe ­
ratur ved forskellige givne tryk mellem ca. 10  3 og 10  5 Pa. 
Metoden anbefales også til kogepunktsbestemmelse. Til det formål 
er metoden brugbar op til 600 K. Væskers kogepunktstemperatur er 
ca. 0,1 °C højere i en dybde af 3-4 cm end ved overfladen på grund af det hydrostatiske tryk fra væskesøjlen. I Cottrells metode (4) er termometeret placeret i dampen over væskeoverfladen, og den 
kogende væske bringes til konstant at pumpe sig selv ud over termo ­
meterets kugle. Kuglen er dækket af et tyndt lag væske, der er i ligevægt med dampen ved atmosfæretryk. Termometeret viser derfor det sande kogepunkt uden fejl pga. overhedning eller hydrostatisk 
tryk. Den oprindelige pumpe, som Cottrell anvendte, ses i figur 
1. Rør A indeholder den kogende væske. En indlejret platintråd B i bunden gør kogningen mere ensartet. Siderøret C fører til en kondensator, og kappen D forhindrer det kolde kondensat i at nå 
termometeret E. Når væsken i A koger, bliver bobler og væske 
opfanget af tragten og via de to arme af pumpen F ledt ud over termometerets kugle.  
Figur 1
 Figur 2
  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrell-pumpe (4)  
A: Termoelement  
B: Vakuum-stødpudevolumen  
C: Trykmåler  
D: Vakuum  
E: Målepunkt  
F: Varmeelement, ca. 150 W  
1.5.1.2.  Apparatur  
I figur 2 er vist et meget nøjagtigt apparat, der arbejder efter Cottrells 
princip. Det består af et rør med en kogesektion i underdelen, en 
svaler i midten og en afgang med flange i overdelen. Cottrell- pumpen er anbragt i kogesektionen, der opvarmes af en elektrisk varmepatron. Temperaturen måles af et termoelement med kappe 
eller af et modstandstermometer, der er ført gennem flangen foroven. 
Afgangen er tilsluttet trykreguleringssystemet. Dette består af en vakuumpumpe, et stødpudevolumen, en trykregulator for tilførsel af nitrogen til trykregulering og et manometer.
 
1.5.1.3.  Fremgangsmåde  
Stoffet anbringes i kogesektionen. Faste stoffer, der ikke er pulverfor ­
mige, kan volde problemer, som dog undertiden kan løses ved opvarm ­
ning af kølekappen. Apparatet forsegles ved flangen, og stoffet afgas ­
ses. Skumdannende stoffer kan ikke måles med denne metode.  
Derefter sættes det laveste ønskede tryk, og der tændes for opvarm ­
ningen. Samtidig tilsluttes temperaturføleren til en skriver.  
Ligevægt er nået, når der registreres konstant kogetemperatur ved 
konstant tryk. Særlig omhu må udvises for at undgå stødkogning. 
Desuden skal kondensationen i svaleren være fuldstændig. Ved damptryksbestemmelse for letsmeltelige faste stoffer skal man passe på, at svaleren ikke bliver tilstoppet.
 
Efter at dette ligevægtspunkt er nået, sættes et højere tryk. Processen 
fortsættes på denne måde, indtil 10  5 Pa er nået (i alt 5 til 
10 målepunkter). Som kontrol gentages ligevægtspunkterne ved faldende værdier af trykket.
 
1.5.2.  Den statiske metode  
1.5.2.1.  Princip  
Ved den statiske metode (5) bestemmes damptrykket i termodyna ­
misk ligevægt ved en fastlagt temperatur. Metoden er velegnet til enkeltstoffer samt væsker og faste stoffer bestående af flere kompo ­
nenter i området fra 10
 –1 til 10  5 Pa samt, med tilstrækkelig omhu, i 
området 1 til 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Apparatur  
Apparatet består af et termostatbad (præcision ± 0,2 K), en prøve ­
beholder tilsluttet en vakuumledning, et manometer og et system til trykregulering. Prøvekammeret (figur 3a) er tilsluttet vakuumled ­
ningen gennem en ventil og et differensmanometer (et U-rør inde ­
holdende en egnet manometervæske), der fungerer som nulindikator. I differensmanometeret kan anvendes kviksølv, siliconeolie og phtha ­
later, afhængigt af trykområdet og teststoffets kemiske egenskaber. 
Kviksølv bør dog om muligt undgås af hensyn til miljøet. Teststoffet 
må ikke være nævneværdigt opløseligt i væsken i U-røret eller kunne reagere med denne. I stedet for U-røret kan anvendes en trykmåler 
(figur 3b). I manometeret kan kviksølv anvendes i området fra 
normalt tryk ned til 10
 2 Pa, mens siliconeolier og phthalater er 
egnede ved tryk under 10  2 Pa ned til 10 Pa. Der findes andre tryk ­
målere, som kan anvendes ved tryk under 10  2 Pa, og opvarmede 
membrankapacitetsmanometre kan endda bruges ved tryk under 
10 –1 Pa. Temperaturen måles enten på ydervæggen af den beholder, 
som indeholder prøven, eller i selve beholderen.  
1.5.2.3.  Fremgangsmåde  
I det i figur 3a beskrevne apparatur fyldes U-røret med den valgte 
væske, som skal afgasses ved forhøjet temperatur, før der aflæses. 
Teststoffet anbringes i apparatet og afgasses ved reduceret temperatur. For prøver med flere komponenter skal temperaturen være tilstrækkelig lav til at sikre, at materialets sammensætning ikke ændres. Ligevægt 
kan nås hurtigere ved omrøring. Prøven kan køles med flydende 
nitrogen eller tøris, men der må udvises forsigtighed, så kondensation af luft eller pumpevæske undgås. Mens ventilen over prøvebeholderen er åben, tilsluttes sugningen i nogle minutter for at fjerne luften. Om 
nødvendigt gentages afgasningen nogle gange.  
Figur 3a
 Figur 3b
  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Når prøven opvarmes med lukket ventil, stiger damptrykket. Derved 
ændres væskeligevægten i U-røret. For at kompensere herfor lukkes 
der nitrogen eller luft ind i apparatet, indtil differenstrykindikatoren igen viser nul. Det nødvendige tryk hertil kan aflæses på manome ­
teret eller på et instrument med større præcision. Dette tryk svarer til 
stoffets damptryk ved måletemperaturen. På det i figur 3b viste appa ­
ratet aflæses damptrykket direkte.
 
Damptrykket bestemmes med passende små temperaturintervaller 
(ca. 5 til 10 målepunkter i alt) op til den ønskede maksimumtempe ­
ratur.  
Lavtemperaturaflæsningerne skal gentages som kontrol. Hvis 
værdierne fra gentagelserne ikke falder sammen med den kurve, der er opnået ved stigende temperatur, kan dette have følgende årsa ­
ger:
 
i) prøven indeholder stadig luft (f.eks. ved højviskøse materialer) 
eller flygtige stoffer, der frigives ved opvarmning  
ii) stoffet undergår en kemisk reaktion i det undersøgte temperatur ­
område (f.eks. dekomposition eller polymerisering).  
1.5.3.  Isoteniskop-metoden  
1.5.3.1.  Princip  
Isoteniskopet (6) bygger på den statiske metodes princip. I 
metoden anbringes en prøve i en kugle, der holdes ved konstant 
temperatur og er tilsluttet til et manometer og en vakuumpumpe. Urenheder, der er flygtigere end stoffet, fjernes ved afgasning ved reduceret tryk. Prøvens damptryk ved de valgte temperaturer afba ­
lanceres ved et kendt tryk af inert gas. Isoteniskopet er oprinde ­
ligt udviklet til måling af damptrykket af visse flydende kulbrin ­
ter, men egner sig også til undersøgelse af faste stoffer. Metoden egner sig normalt ikke til systemer med flere komponenter. 
Resultaterne er kun behæftet med små fejl for prøver indehol ­
dende ikke-flygtige urenheder. Det anbefalede område er 10
 2 til 
10 5 Pa. 
1.5.3.2.  Apparatur  
Et eksempel på en måleanordning er vist i figur 4. En komplet 
beskrivelse kan findes i ASTM D 2879-86 (6).  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Fremgangsmåde  
Når teststoffet er en væske, fungerer den selv som manometervæske 
i differensmanometeret. Isoteniskopet påfyldes så meget af væsken, at manometerets kugle og korte gren er fyldt. Isoteniskopet tilslutte et vakuumsystem og udpumpes, hvorefter det fyldes med nitrogen. 
Udpumpningen og gennemskylningen af systemet gentages to gange 
for at fjerne tilbageværende oxygen. Det påfyldte isoteniskop anbringes vandret, så prøven fordeler sig i et tyndt lag i prøvekuglen og manometeret. Trykket i systemet nedsættes til 133 Pa, og prøven 
opvarmes forsigtigt, til den netop koger (fjernelse af opløste gasser). 
Isoteniskopet anbringes derefter, så prøven løber tilbage i kuglen og fylder manometerets korte gren. Trykket holdes på 133 Pa. Prøve ­
kuglens udtrukne spids opvarmes med en svag flamme, indtil den 
afgivne damp fra teststoffet har udvidet sig så meget, at en del af 
prøven fra den øverste del af kuglen og manometergrenen fortrænges ind i manometeret og derved danner et dampfyldt, nitrogenfrit rum. Isoteniskopet anbringes derefter i et termostatbad, og nitrogentrykket 
indstilles, til det er lig prøvens. I ligevægt er nitrogentrykket lig med 
teststoffets damptryk.
 
Figur 4
  
Til faste stoffer anvendes som manometervæske siliconeolie eller 
phthalater, afhængigt af tryk- og temperaturområdet. Den afgassede manometervæske fyldes i en udposning på isoteniskopets lange gren. Det faste stof, der skal undersøges, anbringes i prøvekuglen og 
afgasses ved en forhøjet temperatur. Derefter holdes isoteniskopet 
skråt, så manometervæsken kan løbe ind i U-røret.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Effusionsmetoden: damptrykvægt  (7) 
1.5.4.1.  Princip  
Teststoffet opvarmes i en lille ovn og anbringes i en udpumpet 
glasklokke. Ovnen er dækket af et låg med små huller med kendt 
diameter. Den damp, som fra stoffet afgives gennem et af hullerne, 
ledes op mod vægtskålen på en meget fintmærkende vægt, der lige ­
ledes er placeret i den udpumpede glasklokke. I nogle udformninger er vægtskålen omgivet af en køleboks, der leder varmen bort til 
omgivelserne ved varmeledning, og den køles ved stråling, så den 
udslippende damp kondenserer på den. Dampstrålens impuls påfører en kraft på vægten. Damptrykket kan beregnes på to måder: direkte 
af kraften på vægtskålen og af fordampningshastigheden ved hjælp 
af Hertz-Knudsen-ligningen (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10 3 
M s 
hvor:  
G = fordampningshastighed (kg s  –1 m –2 ) 
M = molær masse (g mol  –1 ) 
T = temperatur (K)  
R = den universelle gaskonstant (J mol  –1 K –1 ) 
P = damptryk (Pa)  
Det anbefalede område er 10  –3 til 1 Pa.  
1.5.4.2.  Apparatur  
Det generelle princip i apparatet er vist i figur 5.  
Figur 5
  
A: Bundplade F: Køleboks og kølestang 
B: Drejespoleinstrument G: Muffelovn 
C: Glasklokke H: Dewarkar med flydende nitrogen 
D: Vægt med vægtskål I: Måling af prøvens temperatur E: Anordning til måling af vakuum J: Teststof
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Effusionsmetoden: Knudsen-celle  
1.5.5.1.  Princip  
Metoden bygger på bestemmelse af den masse af dampformigt 
teststof, der pr. tidsenhed strømmer ud af en Knudsen-celle (8) 
gennem en mikroskopisk åbning under ekstremt vakuum. Massen 
af udstrømmede damp kan enten bestemmes af cellens massetab eller ved at lade dampen kondensere ved lav temperatur og bestemme den fordampede stofmængde ved kromatografi. Damp ­
trykket beregnes ved at anvende Hertz-Knudsen-relationen (se 
punkt 1.5.4.1) med korrektionsfaktorer, der afhænger af apparatu ­
rets parametre (9). Det anbefalede område er 10
 –10 til 1 Pa (10) ­
(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Apparatur  
Apparatets generelle princip er illustreret i figur 6.  
Figur 6
  
1: Vakuumtilslutning 7: Skruelåg 
2: Huller fra platinmodstandstermometer 
eller temperaturmåling og -kontrol 8: Vingemøtrikker 
3: Låg til vakuumbeholder 9: Bolte 
4: O-ring 10: Effusionsceller af rustfrit stål 5: Vakuumbeholder af aluminium 11: Varmepatron 6: Anordning til isætning og udtagning af 
effusionsceller
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Effusionsmetoden: isotermisk termogravimetri  
1.5.6.1.  Princip  
Metoden bygger på bestemmelse af stigningen i teststoffets fordamp ­
ningshastighed ved forhøjet temperatur og atmosfæretryk ved hjælp 
af termogravimetri (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Fordampnings ­
hastighederne v  T bestemmes ved, at den valgte forbindelse 
eksponeres for en atmosfære af langsomt strømmende inert gas, mens vægttabet overvåges ved fastlagte isotermiske temperaturer T 
i kelvin i passende tidsrum. Damptrykkene p
 T beregnes af v  T -værdi­
erne ved udnyttelse af den lineære sammenhæng mellem logaritmen til damptrykket og logaritmen til fordampningshastigheden. Om 
nødvendigt kan der ekstrapoleres til temperaturerne 20 og 25 °C 
ved regressionsanalyse af log p
 T som funktion af 1/T. Metoden er 
egnet til stoffer med damptryk helt ned til 10  –10 Pa (10  –12 mbar) og 
med en renhed så tæt som muligt på to 100 % for at undgå fejl ­
fortolkning af målte vægttab.  
1.5.6.2.  Apparatur  
Det generelle princip i testopstillingen er vist i figur 7.  
Figur 7
  
Prøveholderpladen er ophængt i en mikrovægt i et kammer med 
kontrolleret temperatur, hvor der strømmer tør nitrogengas forbi 
den, som fjerner de fordampede molekyler af teststof. Efter at have forladt kammeret bliver gasstrømmen renset i en sorptions ­
enhed.
 
1.5.6.3.  Fremgangsmåde  
Teststoffet påføres som et homogent lag på en matteret glasplade. 
For faste stoffer vædes pladen ensartet med en opløsning af stoffet i et egnet opløsningsmiddel og tørres i inert atmosfære. Målingen sker ved, at den overtrukne plade hænges op i den termogravimetriske 
analysator, hvorefter dens vægttab registreres kontinuerligt som funk ­
tion af tiden.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Fordampningshastigheden v  T ved en nærmere angivet temperatur 
beregnes af prøvepladens vægttab Dm ved hjælp af udtrykket  
v T ¼ Δm 
F Ö t ðg cm  –2 h –1 Þ 
hvor F er teststoflagets overfladeareal, sædvanligvis prøvepladens 
overfladeareal, og t er tiden svarende til vægttabet Δm. 
Damptrykket p  T beregnes af funktionen for fordampningshastigheden 
v T : 
log p  T = C + D log v  T 
hvor C og D er konstanter, der er specifikke for den anvendte testop ­
stilling og afhænger af målekammerets diameter og af gassens strøm ­
ningshastighed. Disse konstanter bestemmes én gang for alle ved 
måling på et sæt forbindelser med kendt damptryk og regression 
af log p  T mod log v  T (11)(21)(22).  
Sammenhængen mellem damptrykket p  T og temperaturen T i kelvin 
er givet ved  
log p  T = A + B 1/T  
hvor A og B er konstanter, der fås ved regression af log p  T mod 1/T. 
Heraf kan damptrykket ved en vilkårlig temperatur beregnes ved ekstrapolation.
 
1.5.7.  Gasmætningsmetoden  (23)  
1.5.7.1.  Princip  
En inert gas ledes ved rumtemperatur og med kendt flowhastighed 
gennem eller hen over en prøve af teststoffet, tilstrækkelig langsomt 
til at sikre mætning. Det er afgørende, at gassen når til mætning. Det transporterede stof opfanges, sædvanligvis med hjælp af et sorptions ­
middel, og dets mængde bestemmes. I stedet for opsamling af 
dampen og efterfølgende analyse kan man benytte in-line analyse, 
f.eks. ved gaskromatrografi, til kvantitativ bestemmelse af den trans ­
porterede mængde materiale. Damptrykket beregnes, idet det forudsættes, at idealgasloven gælder, og at det totale tryk af en 
gasblanding er lig summen af gassernes partialtryk. Teststoffets parti ­
altryk, dvs. damptrykket, beregnes af det kendte totale gasvolumen og vægten af det transporterede materiale.
 
Gasmætningsmetoden er anvendelig på faste og flydende stoffer. 
Den kan anvendes på damptryk ned til 10  –10 Pa (10)(11)(12)(13) ­
(14). Metoden er mest pålidelig ved damptryk under 10  3 Pa. Over 
10 3 Pa bliver damptrykket sædvanligvis overvurderet, antagelig som 
følge af aerosoldannelse. Da damptrykket måles ved stuetemperatur, undgår man at skulle ekstrapolere fra høje temperaturer, hvilket ofte 
kan medføre alvorlige fejl.
 
1.5.7.2.  Apparatur  
Metoden kræver brug af et termostateret hus. Skitsen i figur 8 viser 
et hus, der med tre holdere til faste og tre til flydende prøver giver mulighed for tredobbelte analyser af enten et fast eller et flydende 
teststof. Temperaturen styres med en nøjagtighed på ± 0,5 °C eller 
bedre.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Figur 8
  
Som bæregas anvendes sædvanligvis nitrogen, men brug af en anden 
gas kan undertiden være nødvendig (24). Bæregassen skal være tør. Gasstrømmen opdeles i 6 strømme, der styres ved hjælp af nåleven ­
tiler (med en åbning på ca. 0,79 mm) og ledes ind i huset gennem et 
kobberrør med en lysning på 3,8 mm. Efter temperaturudligning 
ledes gassen gennem prøven og sorptionsfælden og forlader huset.
 
Faste prøver anbringes med glasuldspropper på hver side i et glasrør 
med 5 mm lysning (se figur 9). Figur 10 viser en prøveholder til 
væskeformige prøver og sorptionssystemet. Den mest reproducerbare metode til måling af væskers damptryk er at påføre væsken på glas ­
pellets eller på et inert sorptionsmiddel såsom silica og pakke 
holderen med disse pellets. Bæregassen kan i stedet ledes gennem 
en grov glasfritte og gennemboble en kolonne med flydende teststof.  
Figur 9
 Figur 10
  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Sorptionssystemet indeholder en forreste sorptionssektion og en 
backup-sorptionssektion. Ved meget lave damptryk et det kun små 
mængder, der indfanges af sorptionsmidlet, og adsorption til glas ­
ulden og glasrøret mellem prøven og sorptionsmidlet kan være et alvorligt problem.
 
En anden effektiv metode til opsamling af det fordampede materiale 
er dampfælder kølet med tøris. De giver ikke modtryk i mætnings ­
kolonnen, og det opfangede materiale kan let fjernes fuldstændigt.  
1.5.7.3.  Fremgangsmåde  
Flowhastigheden af den udstrømmende bæregas måles ved rumtempe ­
ratur. Flowhastigheden kontrolleres ofte under testen for at sikre 
nøjagtig bestemmelse af det totale volumen bæregas. Hertil bør fortrinsvis anvendes kontinuerlig overvågning med et masseflowmeter. For at gasfasen skal blive mættet, kan det være nødvendigt med en ret 
lang kontakttid og dermed en lav flowhastighed af gassen (25).
 
Ved testens slutning skal den forreste sorptionssektion og backup- 
sorptionssektionen analyseres hver for sig. Stoffet på hver sektion 
desorberes ved tilsætning af et opløsningsmiddel. De resulterende opløsninger analyseres kvantitativt til bestemmelse af den desorbe ­
rede vægt fra hver sektion. Valg af analysemetode (herunder valg af 
sorptionsmiddel og opløsningsmiddel til desorption) træffes ud fra teststoffets beskaffenhed. Effektiviteten af desorptionen bestemmes ved, at en kendt mængde teststof injiceres på sorptionsmidlet, hvor ­
efter det desorberes, og den genfundne mængde bestemmes. Det er 
vigtigt at bestemme effektiviteten af desorptionen ved en koncen ­
tration svarende til prøvens og under samme betingelser som i testen.
 
For at sikre, at bæregassen er mættet med teststof, anvendes tre 
forskellige flowhastigheder af gassen. Hvis det beregnede damptryk viser sig at være uafhængigt af flowhastigheden, kan gassen antages 
at være mættet.
 
Damptrykket beregnes af udtrykket:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
hvor:  
P = damptryk (Pa)  
W = masse af det fordampede teststof (g)  
V = volumen af den mættede gas (m  3 ) 
R = den universelle gaskonstant 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatur (K)  
M = teststoffets molmasse (g mol  –1 ) 
De målte volumener skal korrigeres for tryk- og temperaturforskelle 
mellem flowmeteret og mætningskolonnen.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Roterende kugle  
1.5.8.1.  Princip  
I metoden anvendes et viskosimeter, hvis måleelement er en lille 
stålkugle, som holdes svævende i et magnetisk felt og sættes i rota ­
tion af roterende felter (26)(27)(28). Kuglens rotationshastighed 
måles med detektorspoler. Når kuglen har nået en given rotations ­
hastighed, sædvanligvis ca. 400 o./min., standses energitilførslen til kuglen, som derefter bremses af gasfriktionen. Faldet i rotations ­
hastigheden registreres som funktion af tiden. Damptrykket afledes 
af den trykafhængige nedbremsning af stålkuglen. Det anbefalede 
område er 10
 –4 til 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Apparatur  
Testopstillingen er vist skematisk i figur 11. Målehovedet er placeret 
i et termostateret hus, der er reguleret inden for 0,1 °C. Prøvehol ­
deren er placeret i et separat hus, der ligeledes er reguleret inden for 0,1 °C. Alle de øvrige dele af testopstillingen holdes ved højere temperatur for at undgå kondensation. Hele apparatet er tilsluttet et 
højvakuum-system.
 
Figur 11
  
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. DATA  
Damptrykket skal bestemmes ved mindst to temperaturer med en af 
ovenstående metoder. I området 0 til 50 °C bør fortrinsvis anvendes tre eller flere temperaturer for at eftervise damptrykkurvens linearitet. Ved effusionsmetoden (Knudsen-celle og isotermisk termogravime ­
tri) og ved gasmætningsmetoden anbefales 120 til 150 °C som 
temperaturområde for målingen i stedet for 0 til 50 °C.
 
2.2. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
— den anvendte metode  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— nøjagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder) og even ­
tuelle indledende rensningstrin  
— mindst to værdier af damptryk og temperatur (helst tre eller flere) 
— i området fra 0 til 50 °C (eller 120 til 150 °C)  
— mindst en af temperaturerne bør være 25 °C eller derunder, hvis 
dette er teknisk muligt med den valgte metode  
— alle originale data  
— en kurve over log p som funktion af 1/T  
— et beregnet damptryk ved 20 eller 25 °C.  
Hvis der iagttages en omdannelse (tilstandsændring, dekomposition), 
skal følgende oplysninger noteres:  
— ændringens art  
— den temperatur, ved hvilken ændringen finder sted ved atmos ­
færetryk  
— damptryk ved 10 og 20 °C under omdannelsestemperaturen 
og 10 og 20 °C over denne temperatur (bortset fra omdannelse fra fast stof til gas).
 
Alle oplysninger og bemærkninger, der er relevante for fortolkningen 
af resultaterne, skal rapporteres, specielt hvad angår urenheder og stoffets fysiske tilstand.
 
3. LITTERATUR  
(1) De Europæiske Fællesskabers Tidende  L 383 A, 26-47 (1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
(3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.
 
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
(5) NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa — Static 
method.  
(6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure 
— temperature relationship and initial decomposition tempera ­
ture of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa — Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532.
 
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000).  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22-28.  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269-278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122.
 
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147.
 
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide 
Science 5 (1974) 393-400.
 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Rela ­
tionship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesti ­
cide Science 13 (1982) 161-168.
 
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used 
in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- 
Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512-20.  
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th 
ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C.  
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 
88 (2002).  
(23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Regi ­
ster, Washington DC.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Tillæg  
Metode til tilnærmet beregning  
INDLEDNING  
Tilnærmede værdier af damptrykket kan anvendes:  
— til at afgøre, hvilken testmetode der er velegnet  
— til at give et skøn eller en grænseværdi i tilfælde, hvor den eksperimentelle 
metode af tekniske grunde ikke kan anvendes.  
METODE TIL TILNÆRMET BEREGNING  
Damptrykket af faste stoffer og væsker kan beregnes tilnærmet med den modi ­
ficerede Watson-korrelation (a). De eneste eksperimentelle data, der kræves, er 
det normale kogepunkt. Metoden kan anvendes i hele trykområdet fra 10  5 Pa til 
10 –5 Pa. 
Detaljerede oplysninger om metoden findes i »Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods« (b). Se også OECD Environmental Monograph No.67 (c).  
BEREGNINGSMETODE  
Damptrykket beregnes af følgende udtryk:  
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b " 
1 – Í 
3 – 2  T 
T b Î m 
T 
T b – 2m Í 
3 – 2  T 
T b Î m – 1 
ln T 
T b # 
hvor:  
T = den betragtede temperatur  
T b = normalkogepunktet  
P vp = damptrykket ved temperaturen T  
ΔH vb = fordampningsvarmen  
ΔZ b = kompressibilitetsfaktoren (anslået værdi 0,97)  
m = en empirisk faktor, der afhænger af den fysiske tilstand ved den 
betragtede temperatur  
Endvidere gælder:  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
hvor K  F er en empirisk faktor, der tager hensyn til stoffets polaritet. Faktoren K  F 
er for en række forbindelser af forskellig art angivet i reference (b).  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
I mange tilfælde indeholder de foreliggende data en angivelse af kogepunktet ved 
reduceret tryk. I så fald beregnes damptrykket af følgende udtryk:  
ln P vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 " 
1 – Í 
3 – 2  T 
T 1 Î m T 1 
T – 2m Í 
3 – 2  T 
T 1 Î m – 1 
ln T 
T 1 # 
hvor T  1 er kogepunktet ved det reducerede tryk P  1 . 
RAPPORT  
Hvis den tilnærmede beregningsmetode anvendes, skal beregningen være fuld ­
stændig dokumenteret i rapporten.  
REFERENCER  
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure 
Assessment (1993).  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. OVERFLADESPÆNDING  
1. METODE  
De beskrevne metoder er baseret på OECD-testvejledningen (1). 
Grundprincipperne er anført i henvisning (2).  
1.1. INDLEDNING  
De beskrevne metoder anvendes til måling af vandige opløsningers 
overfladespænding.  
Ved udførelsen af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplys ­
ninger om stoffets vandopløselighed, struktur, hydrolyseegenskaber 
og kritiske koncentrationer for micelledannelse.  
De følgende metoder kan anvendes for de fleste kemiske stoffer 
uanset renheden.  
Måling af overfladespænding ved ringtensiometermetoden er 
begrænset til vandige opløsninger med en dynamisk viskositet på mindre end ca. 200 mPa s.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Den frie overfladeenthalpi pr. overfladearealenhed betegnes som 
overfladespændingen.  
Overfladespændingen angives i:  
N/m (SI-enhed) eller  
mN/m (SI-underenhed)  
1 N/m = 10  3 dyn/cm  
1 mN/m = 1 dyn/cm i det gamle cgs-system  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt 
stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til 
lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater 
opnået med andre metoder.  
Referencestoffer, som dækker et bredt udvalg af overfladespændin ­
ger, er angivet i henvisning (1) og (3).  
1.4. METODERNES PRINCIP  
Metoderne er baseret på måling af den største kraft, der skal udøves 
lodret på en stigbøjle eller ring i kontakt med væskeoverfladen af en prøve i et målekar, for at denne kontakt brydes, eller den lodrette 
kraft, som skal udøves på en plade, hvis ene kant er i kontakt med 
prøvens overflade, for at den dannede hinde brydes.
 
Stoffer, hvis opløselighed i vand er mindst 1 mg/l, testes i vandig 
opløsning ved én koncentration.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Disse metoder kan give større nøjagtighed, end der må forventes 
krævet ved miljøvurderinger.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE  
Der fremstilles en opløsning af stoffet i destilleret vand. Koncen ­
trationen af denne opløsning skal være 90 % af stoffets mætnings ­
koncentration i vand; er denne koncentration større end 1 g/l, 
benyttes der en koncentration på 1 g/l til testen. Stoffer med en 
opløselighed i vand på mindre end 1 mg/l behøver ikke at testes.  
1.6.1.  Plademetoden  
Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface active agents — determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.2.  Stigbøjlemetoden  
Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface active agents — determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.3.  Ringmetoden  
Se ISO 304 og NF T 73-060 (Surface active agents — determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.4.  OECD-harmoniseret ringmetode  
1.6.4.1.  Apparatur  
Kommercielt tilgængelige tensiometre er tilstrækkelige til denne 
måling. De består af følgende dele:  
— bevægeligt prøvebord  
— kraftmålingssystem  
— målelegeme (ring)  
— målekar.  
1.6.4.1.1. B e v æ g e l i g t p r ø v e b o r d  
Det bevægelige prøvebord anvendes til understøttelse af det 
termostaterede målekar, som rummer den væske, der skal undersø ­
ges. Sammen med kraftmålingssystemet er det monteret på et stativ.  
1.6.4.1.2. K r a f t m å l i n g s s y s t e m  
Kraftmålingssystemet (se figuren) er placeret over prøvebordet. Usik ­
kerheden ved kraftmålingen må ikke overstige ± 10  –6 N, svarende til 
en usikkerhed på ± 0,1 mg ved en vejning. Oftest er måleskalæn på de kommercielt tilgængelige tensiometre inddelt i mN/m, således at 
overfladespændingen direkte kan aflæses i mN/m med en 
nøjagtighed på 0,1 mN/m.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. M å l e l e g e m e ( r i n g )  
Ringen er sædvanligvis fremstillet af en platin-iridium-tråd med en 
tykkelse på ca. 0,4 mm og en middelomkreds på 60 mm. Trådringen 
er ophængt vandret fra en metalstang og en trådbærearm, som danner forbindelsen til kraftmålingssystemet (se figuren).
 
Figur  
Målelegeme  
(alle dimensioner er i mm)
  
1.6.4.1.4. M å l e k a r  
Målekarret, som rummer testopløsningen, skal være et termostateret 
glaskar. Det skal have en sådan form, at temperaturen af testopløs ­
ningen og gasfasen herover er konstant under målingen, og at prøven 
ikke kan fordampe. Cylindriske glaskar med en indre diameter på 
mindst 45 mm er acceptable.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Klargøring af apparatet  
1.6.4.2.1. R e n g ø r i n g  
Glaskar rengøres omhyggeligt. Om nødvendigt vaskes de først med 
varm chromsvovlsyre og dernæst med en tyktflydende phosphorsy ­
reopløsning (83 til 98 w/w % H  3 PO 4 ). Herefter skylles omhyggeligt i 
ledningsvand og endelig vaskes i redestilleret vand til neutral 
reaktion. Til sidst tørres karrene, eller de skylles i noget af den 
prøvevæske, som skal måles.  
Ringen renses først grundigt i vand, så alle vandopløselige stoffer 
fjernes. Derefter nedsænkes den et øjeblik i chromsvovlsyre, skylles i redestilleret vand til neutral reaktion og opvarmes til sidst et øjeblik 
over en methanolflamme.
 
Bemærk:  
Forurening med stoffer, som ikke opløses eller destrueres af chroms ­
vovlsyre eller phosphorsyre, som f.eks. silikoner, fjernes ved hjælp af et passende organisk opløsningsmiddel.
 
1.6.4.2.2. K a l i b r e r i n g a f a p p a r a t e t  
Apparatet klargøres ved, at nulpunktet justeres, og apparatet 
indstilles til pålidelig aflæsning i mN/m.  
Opstilling:  
Apparatet skal stilles i vater, f.eks. ved hjælp af et vaterpas på 
tensiometrets fod, idet man justerer stilleskruerne.  
Nulpunktsindstilling:  
Efter montering af ringen i apparatet, men inden den nedsænkes i 
væsken, skal tensiometerviseren indstilles på nul, og man kontrolle ­
rer, at ringen er parallel med væskeoverfladen. Til dette kan væske ­
overfladen anvendes som et spejl.  
Kalibreringer:  
Prøvekalibreringen kan udføres ved en af de følgende to metoder:  
a) ved hjælp af lodder: dette er en fremgangsmåde, hvor ryttere af 
kendt masse mellem 0,1 og 1,0 g anbringes på ringen. Kalibre ­
ringsfaktoren Φ a , som alle instrumentaflæsninger skal multipli ­
ceres med, bestemmes ifølge ligning (1). 
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
hvor:  
σ r ¼ mg 
2b ðmN =mÞ 
m = rytterens masse (g)  
g = tyngdeaccelerationen (981 cm s  -2 ved havoverfladen)  
b = ringens middelomkreds (cm)  
σ a = tensiometeraflæsningen efter anbringelse af rytteren på 
ringen (mN/m).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) ved hjælp af vand: dette er en fremgangsmåde, hvor der anvendes 
rent vand, hvis overfladespænding ved f.eks. 23  o C er 72,3 
mN/m. Denne fremgangsmåde er hurtigere at udføre end vægt ­
kalibreringen, men der er altid risiko for, at vandets overflade ­
spænding er ændret ved forurening med spor af overfladeaktive 
stoffer.  
Kalibreringsfaktoren, Φ b , som alle instrumentaflæsninger skal 
multipliceres med, bestemmes ifølge ligning (2). 
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
hvor:  
σ o = litteraturværdi for vands overfladespænding (mN/m)  
σ g = målt værdi for vands overfladespænding (mN/m) ved 
samme temperatur  
1.6.4.3.  Testforberedelse  
Der fremstilles vandige opløsninger med passende koncentrationer af 
de stoffer, som skal undersøges. Opløsningerne må ikke indeholde 
uopløst stof.  
Opløsningerne holdes ved konstant temperatur (± 0,5  o C). Idet en 
opløsnings overfladespænding ændres i målekarret med tiden, må der 
foretages adskillige målinger på forskellige tidspunkter, og der afsættes en kurve, der viser overfladespændingen som funktion af tiden. Når overfladespændingen ikke ændres yderligere, er ligevægts ­
tilstanden nået.
 
Støv og gasformig forurening med andre stoffer forstyrrer målingen, 
hvorfor arbejdet bør udføres under et beskyttende dække.  
1.6.5.  Testbetingelser  
Målingerne foretages ved ca. 20  o C, og temperaturen skal holdes 
inden for ± 0,5  o C. 
1.6.6.  Udførelse af testen  
De opløsninger, som skal måles, fyldes i det omhyggeligt rengjorte 
målekar, idet man undgår skumning. Målekarret anbringes på appa ­
ratets prøvebord. Bordet med målekarret hæves, indtil ringen er 
nedsænket fuldstændigt i den opløsning, som skal måles. Derefter 
sænkes bordet jævnt og gradvis (med en hastighed på ca. 0,5 cm/min) for at løsrive ringen fra overfladen, indtil den største kraft er nået. Det væskelag, som hænger ved ringen, må ikke fjernes fra denne. 
Når målingen er udført, nedsænkes ringen atter i væsken, og 
målingen gentages, indtil der opnås konstante værdier for overflade ­
spændingen. Den tid, der er gået fra overførsel af opløsningen til målekarret og til selve målingen udføres, noteres ved hver bestem ­
melse. Aflæsningerne skal foretages ved den største kraft, som 
kræves til løsrivning af ringen fra væskeoverfladen.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. DATA  
For at beregne overfladespændingen skal den værdi, som er aflæst i 
mN/m på apparatet, først multipliceres med kalibreringsfaktoren Φ a 
eller Φ b (afhængigt af den anvendte kalibreringsmetode). Dette giver 
en værdi, som kun gælder tilnærmelsesvis, og som derfor kræver 
korrektion.  
Harkins og Jordan (4) har empirisk bestemt korrektionsfaktorer for 
værdier af overfladespændingen, som er bestemt med ringmetoden; disse faktorer afhænger af ringens dimensioner, væskens massefylde og dens overfladespænding.
 
Da det er besværligt for hver enkelt måling at bestemme korrektions ­
faktoren ud fra Harkins og Jordans tabeller for at beregne overflade ­
spænding, kan man for vandige opløsninger benytte en forenklet 
metode, hvor de korrigerede værdier for overfladespændingen direkte aflæses i den nedenstående tabel (der anvendes interpolation til aflæsninger, som ligger mellem tabelværdierne).
 
Tabel  
Korrektion af den målte overfladespænding  
Kun for vandige opløsninger, p = 1 g/cm  3 
R = 9,55 mm (gennemsnitlig ringradius) 
r = 0,185 mm (ringtrådens radius)  
Eksperimentel værdi (mN/m) Korrigeret værdi (mN/m) 
kalibrering med lodder (se 1.6.4.2.2. 
a)) kalibrering med vand (se 1.6.4.2.2. b))  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Eksperimentel værdi (mN/m) Korrigeret værdi (mN/m) 
kalibrering med lodder (se 1.6.4.2.2. 
a)) kalibrering med vand (se 1.6.4.2.2. b))  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 
70 65,2 69,9 
72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 —
 
Denne tabel er udarbejdet på basis af Harkins-Jordan korrektioner, 
og ligner den, der er i DIN-standarden (DIN 53914) for vand og 
vandige opløsninger (massefylde ρ = 1 g/cm  3 ) og for en kommerciel 
tilgængelig ring med dimensionerne R = 9,55 mm (middelringradius) og r = 0,185 mm (ringtrådens radius). Tabellen angiver korrigerede værdier for overfladespændingsmålinger, der er foretaget efter kali ­
brering med lodder eller vand.
 
Alternativt kan overfladespændingen uden forudgående kalibrering 
beregnes efter følgende formel:  
σ ¼ fxF 
4πR 
hvor:  
F = kraften målt på dynamometeret, idet hinden brydes  
R = ringens radius  
f = korrektionsfaktoren (1)  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— anvendt metode  
— anvendt type vand eller opløsning  
— nøjagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder)  
— måleresultater: overfladespænding (aflæsning) med angivelse af 
både de enkelte målinger, deres middelværdi og den korrigerede 
middelværdi (med hensyn til apparatfaktoren og korrektionstabel ­
len) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— opløsningens koncentration  
— testtemperaturen  
— den anvendte opløsnings alder, og specielt den tid, der er forløbet 
mellem fremstillingen af opløsningen og målingen  
— beskrivelse af overfladespændingens tidsafhængighed efter over ­
førsel til målekarret  
— alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af 
resultaterne, især vedrørende urenheder og stoffets fysiske 
tilstandsform.  
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE  
På baggrund af vands overfladespænding på 72,75 mN/m ved 20  o C 
anses stoffer med en overfladespænding på mindre end 60 mN/m bestemt ved denne metode for at være overfladeaktive.
 
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV  
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. VANDOPLØSELIGHED  
INDLEDNING  
1. Denne metode svarer til OECD Test Guideline (TG) 105 (1995). Denne 
metode er en revideret version af den oprindelige TG 105, som blev vedtaget i 1981. Der er ingen indholdsmæssig forskel mellem den nuvæ ­
rende version og versionen fra 1981. Det er primært formatet, som er 
ændret. Revisionen var baseret på EU-testmetoden »Vandopløselighed« (1).
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
2. Et stofs vandopløselighed kan i betragtelig grad afhænge af tilstedeværelsen 
af urenheder. Metoden omfatter bestemmelse af opløseligheden i vand af 
stoffer, som i det væsentlige er rene, og som er stabile i vand og ikke 
flygtige. Inden vandopløseligheden bestemmes, er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om teststoffets strukturformel, damptryk, dissociations ­
konstant og hydrolyse som funktion af pH.
 
3. To metoder, kolonne-eluerings-metoden og kolbe-metoden, som omfatter 
opløselighed henholdsvis under og over 10  –2 g/l, er beskrevet i denne test ­
metode. En simpel foreløbig test er også beskrevet. Den gør det muligt at 
bestemme, hvor meget materiale der omtrentligt skal anvendes i den ende ­
lige test, og hvor lang tid der omtrentligt kræves til at opnå mætning.  
DEFINITIONER OG ENHEDER  
4. Et stofs opløselighed i vand er mætningskoncentrationen af stoffet i vand 
ved en given temperatur.  
5. Opløselighed i vand angives i masse pr. rumfang opløsning. SI-enheden 
er kg/m  3 (g/l kan dog også anvendes).  
REFERENCEKEMIKALIER  
6. Anvendelse af referencekemikalier er ikke påkrævet, når et teststof skal 
undersøges.  
BESKRIVELSE AF METODERNE  
Testbetingelser  
7. Testen udføres helst ved 20 °C ± 0,5 °C. Den valgte temperatur bør holdes 
konstant i alle relevante dele af udstyret.  
Indledende test  
8. Stigende mængder vand tilsættes trinvist ved stuetemperatur til ca. 0,1 g af 
prøven (faste teststoffer skal være pulveriserede) i et 10 ml måleglas med 
glasprop. Efter hver tilsætning af vand omrystes blandingen kraftigt i 10 minutter, og det undersøges visuelt, om der er noget uopløst af prøven tilbage. Hvis prøven eller dele af prøven forbliver uopløst, efter at der er 
tilsat 10 ml vand, fortsættes testen i et 100 ml måleglas. Den anslåede 
opløselighed er angivet i tabel 1 nedenfor under den mængde tilsat vand,
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
der netop forårsagede en fuldstændig opløsning af prøven. Hvis opløselig ­
heden er lav, kan det tage lang tid at opløse et teststof, og henstandstiden 
øges til mindst 24 timer. Hvis teststoffet stadig ikke er opløst efter 24 timer, øges henstandstiden yderligere (op til 96 timer), eller der foretages yder ­
ligere fortynding, så det kan afgøres, om kolonne-eluerings- eller 
kolbe-metoden skal anvendes.
 
Tabel 1  
ml vand til 0,1 g opløseligt 
stof 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
omtrentlig opløselighed i g/l > 1 000 1 000 til 
200 200 til 
100 100 til 50 50 til 10 10 til 1 < 1  
Kolonne-eluerings-metoden  
Princip  
9. Denne metode er baseret på eluering af teststoffet med vand fra en mikro ­
kolonne, der indeholder et inert bæremateriale, som er belagt med overskud af teststoffet (2). Opløseligheden i vand angives ved massekoncentrationen i 
eluatet, når den har nået et plateau som en funktion af tiden.
 
Apparatur  
10. Apparaturet består af en mikrokolonne (figur 1), som holdes ved konstant 
temperatur. Den er forbundet til en recirkulationspumpe (figur 2) eller en 
niveaubeholder (figur 3). Mikrokolonnen indeholder et inert bæremateriale, 
som holdes på plads af en lille prop af glasuld, der også fungerer som filter for partikler. Mulige materialer, der kan anvendes som bæremateriale, er glaskugler, diatoméjord eller andet inert materiale.
 
11. Mikrokolonnen i figur 1 kan anvendes til konfigurationen med recirkula ­
tionspumpe. Den har et headspace, der sikrer plads til fem bed-rumfang 
(som kasseres ved begyndelsen af testen) og rumfanget af fem prøver 
(som udtages til analyse under testen). Alternativt kan størrelsen reduceres, hvis vand kan tilsættes systemet under testen som erstatning for de første fem bed-rumfang, der fjernes med urenheder. Kolonnen tilsluttes med slange 
fremstillet af et inert materiale til recirkulationspumpen, som kan levere ca. 
25 ml/h. Recirkulationspumpen kan f.eks. være en slangepumpe eller en membranpumpe. Det skal omhyggeligt sikres, at der ikke sker kontamine ­
ring af og/eller adsorption på slangematerialet.
 
12. Et system med niveaubeholder er vist skematisk i figur 3. I dette system er 
mikrokolonnen udstyret med en envejsstophane. Tilslutningen til niveaube ­
holderen består af en glasslibforbindelse og slange fremstillet af et inert 
materiale. Flowhastigheden fra niveaubeholderen bør være ca. 25 ml/h.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Figur 1
  
Mål i mm  
A. Forbindelse til glasslib  
B. Headspace  
C. Indvendig: 5  
D. Udvendig: 19  
E. Glasuldsprop  
F. Stophane  
Figur 2
  
A. Ligevægt til atmosfæren  
B. Flowmeter  
C. Mikrokolonne  
D. Termostatstyret cirkulationspumpe  
E. Recirkulationspumpe  
F. Tovejshane til prøveudtagning  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Figur 3
  
A. Niveaubeholder (f.eks. 2,5 l standflaske)  
B. Kolonne  
C. Fraktionssamler  
D. Termostat  
E. Teflonslange  
F. Glasslibforbindelse  
G. Vandslange (mellem termostat og kolonne, indre diameter: ca. 8 mm)  
13. Ca. 600 mg bæremateriale overføres til en 50 ml rundbundet kolbe. En 
passende mængde af teststoffet opløses i et flygtigt opløsningsmiddel af analysekvalitet, og en passende mængde af denne opløsning tilsættes bære ­
materialet. Opløsningsmidlet afdampes fuldstændigt, f.eks. i en rotationsfor ­
damper, da bærematerialet ellers ikke kan vandmættes i elueringstrinnet som 
følge af fordelingseffekter på overfladen. Det behandlede bæremateriale henstilles til kvældning i to timer i ca. 5 ml vand, hvorefter suspensionen overføres til mikrokolonnen. Alternativt kan det tørre behandlede bærema ­
teriale hældes i mikrokolonnen, der er fyldt med vand, og derefter henstå i 
ca. to timer til opnåelse af ligevægt.
 
14. Afsætningen på bærematerialet kan give problemer, der kan føre til fejl ­
agtige resultater, f.eks. hvis teststoffet afsættes som en olie. Sådanne 
problemer bør undersøges, og detaljerne bør rapporteres.  
Fremgangsmåde baseret på recirkulationspumpe  
15. Væskestrømmen gennem kolonnen startes. Det anbefales at bruge en flow ­
hastighed på ca. 25 ml/h, hvilket svarer til ca. 10 bed-rumfang pr. time for den beskrevne kolonne. Som minimum kasseres de første fem bed-rumfang, så vandopløselige urenheder fjernes. Derefter køres pumpen, indtil der er 
opnået ligevægt, defineret ved, at fem på hinanden følgende prøver giver 
koncentrationer, der ikke afviger mere end ± 30 % på tilfældig måde. Disse prøver bør være adskilt fra hinanden ved tidsintervaller, der svarer til et gennemløb af mindst 10 bed-rumfang. Afhængigt af den anvendte analyse ­
metode kan det med fordel påvises ved hjælp af en kurve over koncen ­
tration/tid, at ligevægt er opnået.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Fremgangsmåde baseret på niveaubeholder  
16. Successive fraktioner af eluatet opsamles og analyseres ved hjælp af den 
valgte metode. Fraktioner fra det midterste elueringsområde, hvor koncen ­
trationerne er konstante inden for ± 30 % i mindst fem på hinanden 
følgende prøver, anvendes til at bestemme opløseligheden.  
17. Dobbeltdestilleret vand er den foretrukne eluent. Deioniseret vand med en 
modstand over 10 megohm/cm og et samlet indhold af organisk kulstof 
under 0,01 % kan også anvendes.  
18. Ved begge fremgangsmåder udføres endnu et forsøg med halvt så høj flow ­
hastighed som det første. Hvis resultaterne fra de to forsøg stemmer overens, 
er testen tilfredsstillende. Hvis den målte opløselighed er højere ved den 
lavere flowhastighed, skal halveringen af flowhastigheden fortsættes, indtil to på hinanden følgende forsøg giver samme opløselighed.
 
19. Ved begge fremgangsmetoder kontrolleres fraktionerne for tilstedeværelse af 
kolloidt materiale ved hjælp af Tyndall-effekten. Tilstedeværelse af partikler gør testen værdiløs, og den bør gentages efter forbedring af kolonnens filtreringsfunktion.
 
20. pH i alle prøver måles, helst ved hjælp af særligt indikatorpapir.  
Kolbe-metoden  
Princip  
21. Teststoffet opløses (faste stoffer skal være pulveriserede) i vand ved en 
temperatur noget over testtemperaturen. Når mætning er opnået, afkøles blandingen og opbevares ved testtemperatur. Hvis det ved passende prøve ­
tagning i øvrigt sikres, at mætningsligevægten er nået, kan målingen fore ­
tages direkte ved testtemperaturen. Derefter bestemmes massekoncentra ­
tionen af teststoffet i den vandige opløsning, der ikke må indeholde uopløste partikler, ved hjælp af en passende analysemetode (3).
 
Apparatur  
22. Der er behov for følgende materialer:  
— normalt laboratorieglasudstyr og -instrumentering  
— udstyr til rystning/omrøring af opløsninger ved kontrolleret konstant 
temperatur  
— eventuelt en centrifuge (helst termostateret) til emulsioner og  
— analyseudstyr.  
Fremgangsmåde  
23. Den mængde teststof, der er nødvendig for at mætte det ønskede rumfang 
vand, anslås ud fra den foreløbige test. Ca. fem gange denne mængde stof 
afvejes i hver af tre glasbeholdere med glasprop (f.eks. centrifugeglas eller kolber). En mængde vand, der er bestemt ved hjælp af analysemetoden og opløselighedsområdet, tilsættes hver beholder. Beholderne lukkes tæt til og 
omrystes ved 30 °C. Der anvendes ryste- eller omrørerudstyr, som kan 
operere ved konstant temperatur, f.eks. magnetomrøring i et termostatbad. Efter en dag henstilles én af beholderne til opnåelse af ligevægt i 24 timer ved testtemperaturen, og den rystes lejlighedsvis. Indholdet i beholderen 
centrifugeres derefter ved testtemperaturen, og koncentrationen af teststoffet 
i den klare vandige fase bestemmes med en passende analysemetode. De
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
andre to kolber behandles på samme måde efter forudgående opnåelse af 
ligevægt ved 30 °C i henholdsvis to og tre dage. Hvis de koncentrationer, 
der måles i mindst to af beholderne, ikke adskiller sig med mere end 15 %, er testen tilfredsstillende. Hvis resultaterne fra beholder 1, 2 og 3 viser en stigende tendens, gentages hele testen med længere tider til opnåelse af 
ligevægt.
 
24. Testen kan også udføres uden forudgående henstand ved 30 °C. Der opnås 
et skøn over, hvor hurtigt mætningsligevægten indstiller sig, ved udtagning af prøver, indtil omrøringstiden ikke længere indvirker på de målte koncen ­
trationer.
 
25. pH i alle prøver måles, helst ved hjælp af særligt indikatorpapir.  
Analytiske bestemmelser  
26. Der foretrækkes en stofspecifik analysemetode, eftersom små mængder af 
opløselige urenheder kan forårsage store fejl i den målte opløselighed. 
Eksempler på sådanne metoder omfatter gas- eller væskekromatografi, titre ­
ring, fotometri og voltametri.  
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
Kolonne-eluerings-metoden  
27. For hvert forsøg udregnes middelværdien og standardafvigelsen for mindst 
fem på hinanden følgende prøver udtaget ved mætningsplateauet. Forskellen mellem middelværdierne fra to test med forskellige flowhastigheder må ikke være større end 30 %.
 
Kolbe-metoden  
28. Der beregnes et gennemsnit af de enkelte resultater fra hver af de tre kolber, 
og forskellen mellem dem må ikke være større end 15 %.  
Testrapport  
Kolonne-eluerings-metoden  
29. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
— resultaterne af den foreløbige test  
— kemisk identitet og kemiske urenheder (eventuelle indledende rensnings ­
trin) 
— koncentration, flowhastighed og pH for hver enkelt prøve  
— middelværdi og standardafvigelse for mindst fem prøver fra mætnings ­
plateauet fra hvert forsøg  
— gennemsnittet af to successive, acceptable forsøg  
— vandtemperaturen under mætningsprocessen  
— analysemetoden  
— arten af det anvendte bæremateriale  
— afsætning på bærematerialet  
— anvendt opløsningsmiddel  
— tegn på eventuel kemisk ustabilitet af stoffet under testen  
— alle oplysninger af betydning for vurdering af resultaterne, især 
vedrørende urenheder og teststoffets fysiske tilstandsform.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Kolbe-metoden  
30. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
— resultaterne af den foreløbige test  
— kemisk identitet og kemiske urenheder (eventuelle indledende rensnings ­
trin) 
— de enkelte analyseresultater og gennemsnittet, når der er bestemt mere 
end én værdi for hver kolbe  
— pH af hver enkelt prøve  
— gennemsnittet af værdierne for de forskellige kolber, der stemte overens  
— testtemperaturen  
— analysemetoden  
— tegn på eventuel kemisk ustabilitet af stoffet under testen  
— alle oplysninger af betydning for vurdering af resultaterne, især 
vedrørende urenheder og teststoffets fysiske tilstandsform.  
LITTERATUR:  
(1) Bilag til Kommissionens direktiv 92/69/EØF af 31. juli 1992 om syttende 
tilpasning til den tekniske udvikling af Rådets direktiv 67/548/EØF om 
tilnærmelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer, EFT L 383 A af 29.12.1992, s. 54.
 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility — Column elution method.  
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. FORDELINGSKOEFFICIENT  
1. METODE  
Den beskrevne »rystekolbemetode« er baseret på OECD-testvejled ­
ningen (1).  
1.1. INDLEDNING  
Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplys ­
ninger om stoffets strukturformel, dissociationskonstant, vandopløse ­
lighed, hydrolyse, opløselighed i n-octanol og overfladespænding.  
Målinger på ioniserbare stoffer udføres på den ikke-ioniserede form 
(fri syre eller fri base) dvs. ved anvendelse af en passende buffer med en pH-værdi på mindst 1 enhed under (fri syre) eller over (fri 
base) stoffets pK-værdi.
 
Testmetoden omfatter to særskilte fremgangsmåder — rystekolbeme ­
toden og højtydende væskekromatografi (HPLC). Førstnævnte er brugbar, når værdien af log Pow (se definitionerne nedenfor) ligger 
mellem — 2 og 4, og sidstnævnte i området mellem 0 og 6. Førend 
nogen af fremgangsmåderne påbegyndes, foretages der er foreløbigt skøn over fordelingskoefficienten.
 
Rystekolbemetoden kan kun benyttes for stoffer, der i alt væsentligt 
er rene, og som er opløselige i vand og n-octanol. Den kan ikke anvendes til overfladeaktive materialer (for hvilke der anføres en beregnet værdi eller et skøn baseret på opløseligheden i henholdsvis 
n-octanol og vand).
 
HPLC-metoden kan ikke benyttes til stærke syrer og baser, metal ­
komplekser, overfladeaktive stoffer og stoffer, der reagerer med elue ­
ringsmidlet. For sådanne materialer anføres der en beregnet værdi 
eller et skøn baseret på opløseligheden i henholdsvis n-octanol og vand.
 
HPLC-metoden er mindre følsom end rystekolbemetoden over for 
urenheder i teststoffet. Ikke desto mindre kan urenheder i visse tilfælde vanskeliggøre fortolkningen af resultaterne på grund af usikker tilforordning af toppene. For blandinger med et uopløst 
bånd anføres en øvre og nedre grænse for log P.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Fordelingkoefficienten (P) defineres som forholdet mellem lige ­
vægtskoncentrationerne (c  i ) af et stof, der er opløst i et tofasesystem 
bestående af to stort set ublandbare opløsningsmidler. I tilfældet n- 
octanol og vand:  
p ow ¼ c n Ä octanol 
c vand 
Fordelingskoefficienten (P) er derfor et forhold mellem to koncen ­
trationer og opgives ofte som titalslogaritmen (log P).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
Rystekolbemetoden  
Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt 
stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater 
opnået med andre metoder.
 
HPLC-metoden  
For at kunne korrelere målte HPLC-data for et stof med dets P-værdi 
må der fastlægges en kalibreringskurve for log P mod kromatogra ­
fiske data, som er baseret på mindst seks referencepunkter. Det er op til brugeren at vælge de egnede referencestoffer. Så vidt muligt skal 
der være mindst ét referencestof med en P
 ow -værdi, der ligger over 
teststoffets, og mindst ét med en P  ow -værdi under teststoffets. For 
værdier af log P under 4 kan kalibreringen baseres på data opnået 
med rystekolbemetoden. For værdier af log P over 4 kan kalibre ­
ringen baseres på validerede litteraturværdier, hvis de stemmer overens med beregnede værdier. Af hensyn til nøjagtigheden anbe ­
fales at vælge referencestoffer, der strukturmæssigt ligner teststoffet.
 
Der foreligger omfattende lister med værdier for log P  ow for mange 
grupper af kemikalier (2)(3). Hvis der ikke foreligger data om 
fordelingskoefficienter for strukturmæssigt beslægtede stoffer, kan 
der bruges en mere generel kalibrering foretaget med andre referen ­
cestoffer.  
Der er i tillæg 2 en liste over anbefalede referencestoffer og deres 
P ow -værdier  
1.4. METODENS PRINCIP  
1.4.1.  Rystekolbemetoden  
For at kunne bestemme fordelingskoefficienten må der opnås lige ­
vægt mellem alle komponenterne i systemet, og koncentrationerne af 
de i de to faser opløste stoffer må bestemmes. En gennemgang af 
litteraturen herom har vist, at der kan benyttes en række forskellige teknikker til at løse dette problem, dvs. omhyggelig blanding af de to faser og bestemmelse af ligevægtskoncentrationen af det undersøgte 
stof efter adskillelse af faserne.
 
1.4.2.  HPLC-metoden  
HPLC udføres på analytiske kolonner pakket med en kommercielt 
tilgængelig fast fase indeholdende lange kulbrintekæder (f.eks. C  8 , 
C 18 ) kemisk bundet til silica. Indsprøjtes der kemikalier på en sådan 
kolonne, vil de vandre gennem den med forskellig hastighed, da deres fordeling mellem den mobile fase og den stationære kulbrin ­
tefase ikke er den samme. Kemikalieblandinger elueres i rækkefølge 
efter hydrofobicitet, idet de vandopløselige kemikalier elueres først 
og de olieopløselige sidst, alt efter deres kulbrinte/vand-fordelings ­
koefficient. Derved kan sammenhængen mellem retentionstiden på en sådan kolonne (med omvendt fase) og n-octanol/vand-fordelings ­
køfficienten fastslås. Fordelingskoefficienten udledes af kapacitets ­
faktoren k, der er givet ved udtrykket:
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
hvor t  r er teststoffets retentionstid og t  o er den tid, et opløsnings ­
middelmolekyle i gennemsnit bruger på at komme gennem kolonnen (kolonnens dødtid).
 
Der kræves ikke kvantitative analysemetoder, og det er kun nødven ­
digt at bestemme retentionstiderne.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
1.5.1.  Repeterbarhed  
Rystekolbemetoden  
For at opnå en tilstrækkeligt nøjagtig fordelingskoefficient foretages 
der dobbeltbestemmelse under tre forskellige testbetingelser, hvor både stofmængden og forholdet mellem opløsningsmidlerne kan varieres. De fundne værdier af fordelingskoefficienten skal, når de 
udtrykkes som titalslogaritmer, ligge inden for et interval på ± 0,3.
 
HPLC-metoden  
For at øge tilliden til målingen foretages der dobbeltbestemmelse. 
Værdier af log P beregnet ud fra de enkelte målinger skal ligge inden 
for et interval på ± 0,1.  
1.5.2.  Følsomhed  
Rystekolbemetoden  
Metodens måleområde afgrænses af analysemetodens påvisnings ­
grænse. Den skal tillade bestemmelse af værdier for log P  ow i 
området fra 2 til 4 (under visse omstændigheder op til 5), når koncentrationen af opløst stof ikke er større end 0,01 mol pr. liter i nogen af faserne.
 
HPLC-metoden  
Med HPLC-metoden kan der skønnes fordelingskoefficienter i log 
P ow -området fra 0 til 6.  
Normalt kan en forbindelses fordelingskoefficient skønnes med en afvi ­
gelse på mindre end ± 1 fra den værdi, der opnås med rystekolbemeto ­
den. Typiske korrelationer fremgår af henvisning (4)(5)(6)(7)(8). Der 
kan normalt opnås større nøjagtighed, hvis der anvendes korrelations ­
kurver bestemt med strukturmæssigt beslægtede referencestoffer (9).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Specificitet  
Rystekolbemetoden  
Nernsts fordelingslov gælder kun for fortyndede opløsninger ved 
konstant temperatur, tryk og pH. Den gælder kun for et enkelt stof, der er fordelt mellem to rene opløsningsmidler. Hvis der fore ­
kommer flere opløste stoffer i den ene eller i begge faser samtidig, 
kan dette påvirke resultaterne.
 
Dissociering eller associering af de opløste molekyler resulterer i 
afvigelser fra Nernsts fordelingslov. At fordelingskoefficienten afhænger af opløsningens koncentration er tegn på en sådan afvi ­
gelse.
 
På grund af de mange involverede ligevægte, må metoden ikke 
anvendes på ioniserbare stoffer uden korrektion. For sådanne stoffer kan det overvejes at benytte bufferopløsninger i stedet for 
vand; i så fald skal bufferens pH ligge mindst 1 enhed fra stoffets 
pKa, og dette pH's relevans for miljøet skal overvejes
 
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.6.1.  Indledende skøn over fordelingskoefficienten  
Der kan dannes et skøn over fordelingskoefficienten enten ved 
beregning (se tillæg 1), hvilket foretrækkes, eller i givet fald ud 
fra teststoffets opløselighed i de rene opløsningsmidler (10).  
1.6.2.  Rystekolbemetoden  
1.6.2.1.  Forberedelser  
n-octanol: bestemmelsen af fordelingskoefficienten udføres med 
reagenser af analysekvalitet.  
vand: der anvendes vand, som er destilleret eller dobbeltdestilleret i 
glas- eller kvartsapparatur. Til ioniserbare forbindelser benyttes der 
bufferopløsninger i stedet for vand, hvis der er gode grunde hertil.  
Bemærk:  
Der må ikke bruges vand taget direkte fra en ionbytter.  
1.6.2.1.1. F o r m æ t n i n g a f o p l ø s n i n g s m i d l e r n e  
Før en fordelingskoefficient bestemmes, mættes hver af de faser, der 
indgår i opløsningsmiddelsystemet, med den anden fase ved rystning 
ved forsøgstemperaturen. Hertil er det praktisk at ryste to store stand ­
flasker med henholdsvis n-octanol af analysekvalitet og vand med tilstrækkelig meget af det andet opløsningsmiddel på et mekanisk 
rysteapparat i 24 timer, og derefter lade dem henstå så længe, at 
faserne skiller og der er opnået mætning.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. F o r b e r e d e l s e a f t e s t e n  
Testbeholderen skal være næsten helt fyldt af tofasesystemet. Derved 
hindres materialetab ved fordampning. Stofmængder og volumenfor ­
hold fastlægges på grundlag af:  
— det foreløbige skøn over fordelingskoefficienten (se ovenfor)  
— den mængde teststof, der mindst kræves til analysen  
— en øvre koncentrationsgrænse på 0,01 mol/l for begge faser.  
Der udføres tre test. I den første bruges det beregnede volumenfor ­
hold mellem n-octanol og vand; i den anden divideres dette forhold med 2, og i det tredje multipliceres det med 2 (f.eks. 1:1, 1:2 og 2:1).
 
1.6.2.1.3. T e s t s t o f  
Der fremstilles en stamopløsning i n-octanol, der på forhånd er 
mættet med vand. Denne stamopløsnings koncentration bestemmes 
nøjagtigt, inden den anvendes til bestemmelse af fordelingskoeffici ­
enten. Den opbevares under betingelser, hvor den er stabil.  
1.6.2.2.  Testbetingelser  
Testtemperaturen skal holdes konstant (± 1  o C) og ligge mellem 20 
og 25  o C. 
1.6.2.3.  Fremgangsmåde ved målingen  
1.6.2.3.1. O p n å e l s e a f f o r d e l i n g s l i g e v æ g t  
For hver af testbetingelserne benyttes der to testbeholdere, der hver 
indeholder den nødvendige nøjagtigt afmålte mængde af de to opløs ­
ningsmidler og den nødvendige mængde stamopløsning.  
n-octanolfaserne afmåles volumetrisk. Testbeholderne kan enten 
anbringes i et egnet rysteapparat eller rystes i hånden. Når et centri ­
fugeglas benyttes, anbefales en hurtig 180  o drejning om tværaksen af 
glasset, hvorved den indespærrede luft stiger op gennem de to faser. Erfaringen viser, at 50 sådanne drejninger normalt er tilstrækkeligt 
til, at fordelingsligevægten indtræder. For en sikkerheds skyld anbe ­
fales det at foretage 100 drejninger i løbet af 5 minutter.
 
1.6.2.3.2. F a s e a d s k i l l e l s e  
Blandingen kan om nødvendigt centrifugeres, så faserne adskilles. 
Det gøres i en laboratoriecentrifuge ved stuetemperatur; hvis der benyttes en centrifuge uden temperaturregulering, henstår centrifuge ­
glassene i én time ved testtemperaturen til opnåelse af ligevægt før 
analyse.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analyse  
Til bestemmelse af fordelingskoefficienten må koncentrationen af 
teststoffet i begge faser bestemmes. Det kan gøres ved, at der for hver testbetingelse udtages en delprøve af hver fase fra hvert glas, 
som analyseres ved den valgte metode. Den samlede mængde stof i 
begge faser beregnes og sammenlignes med den oprindeligt tilsatte stofmængde.
 
Prøven af vandfasen udtages på en sådan måde, at risikoen for, at 
den indeholder spor af n-octanol, bliver minimal, nemlig med en 
glasinjektionssprøjte. Fra starten skal sprøjten være delvis fyldt 
med luft, som langsomt trykkes ud, medens kanylen føres ned gennem n-octanollaget. En passende mængde af vandfasen suges op i sprøjten, som hurtigt trækkes op af opløsningen, og kanylen 
fjernes. Sprøjtens indhold kan nu benyttes som den vandige prøve. 
Koncentrationen i de to adskilte faser skal helst bestemmes ved en stofspecifik metode. Eksempelvis er følgende analysemetoder egnede:
 
— fotometriske metoder  
— gaskromatografi  
— højtydende væskekromatografi (HPLC).  
1.6.3.  HPLC-metoden  
1.6.3.1.  Forberedelser  
Apparatur  
Der kræves en væskekromatograf med pulsationsfri pumpe og 
passende detektionssystem. Det anbefales at bruge injektionsventil med injektionsspiral. Polære grupper i den stationære fase kan 
nedsætte HPLC-kolonnens ydeevne væsentligt. Derfor må stationære 
faser have det lavest mulige procentindhold af polære grupper (11). Der kan anvendes kommercielle mikroniserede pakkematerialer med omvendt fase eller færdigpakkede kolonner. Der kan eventuelt 
anbringes en beskyttelseskolonne mellem injektionssystemet og 
analysekolonnen.
 
Mobil fase  
Der anvendes methanol og vand af HPLC-kvalitet til fremstilling af 
elueringsvæsken, som afgasses før brugen. Der benyttes isokratisk 
eluering. Den anvendte methanol/vand-blanding skal indeholde mindst 25 % vand. Til eluering af forbindelser med en log P på 6 på én time ved en flowhastighed på 1 ml/min vil en blanding af 
methanol og vand i forholdet 3:1 (v/v) typisk være tilfredsstillende. 
For forbindelser med en høj log P-værdi kan det være nødvendigt at nedsætte elueringstiden (også for referencestofferne) ved at benytte en mindre polær mobil fase eller en kortere kolonne.
 
Stoffer med meget lav opløselighed i n-octanol har tendens til at give 
unormalt lave værdier for log P  ow med HPLC-metoden; undertiden 
følger sådanne forbindelsers toppe opløsningsmiddelfronten. Dette 
skyldes sandsynligvis, at fordelingsprocessen er for langsom til, at der opnås ligevægt inden for den tid, en HPLC-adskillelse normalt tager. I så fald kan nedsættelse af flowhastigheden og/eller mind ­
skelse af methanol/vand-forholdet være et virkningsfuldt middel til at 
opnå en pålidelig værdi.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Både teststof og referencestoffer skal være opløselige i den mobile 
fase i en så høj koncentration, at de kan påvises. Der må kun 
undtagelsesvis benyttes tilsætningsstoffer til methanol/vand-blandin ­
gen, da tilsætningsstoffer vil ændre kolonnens egenskaber. Til kromatogrammer med tilsætningsstoffer skal der altid anvendes en 
separat kolonne af samme type. Hvis methanol/vand ikke er egnet, 
kan der anvendes andre blandinger af vand og organiske opløsnings ­
midler, f.eks. ethanol/vand eller acetonitril/vand.
 
For ioniserbare stoffer er elueringsvæskens pH kritisk. Det skal ligge 
inden for kolonnens driftsområde, som normalt er fra 2 til 8. Det anbefales at anvende buffer. Man må være omhyggelig med at undgå saltudfældning og ødelæggelse af kolonnen, hvilket kan forekomme 
med visse blandinger af organisk fase og buffer. Det tilrådes ikke at 
foretage HPLC-målinger med silicabaserede stationære faser med pH over 8, da alkalisk mobil fase kan føre til, at kolonnens ydeevne hurtigt falder.
 
Opløste stoffer  
Referencestoffer skal være af renest mulige kvalitet. Til testnings- og 
kalibreringsformål opløses stofferne om muligt i den mobile fase.  
Testningsbetingelser  
Under målingen må temperaturen ikke variere med mere end ± 2 K.  
1.6.3.2.  Måling  
Beregning af dødtiden t  o 
Dødtiden t  o kan bestemmes enten med en homolog række (f.eks. n- 
alkylmethylketoner) eller med organiske stoffer, der ikke holdes tilbage (f.eks. thiourinstof eller formamid). Til beregning af dødtiden 
t
 o ud fra en homolog række, indsprøjtes der mindst syv elementer af 
en homolog række, og retentionstiderne bestemmes. Bruttoretentions ­
tiderne t  r (n c + 1)  afbildes mod t  r(n c),  og i regressionsligningen:  
t r (n c + 1)  = a + b t  r (n c)  
bestemmes afskæringen a og hældningskoefficienten b (n  c = antallet 
af kulstofatomer). Dødtiden er da givet ved:  
t o = a/(l -b)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Kalibreringskurve  
Næste trin består i at konstruere en korrelationskurve af log k mod 
log P for passende referencestoffer. I praksis indsprøjtes der samtidig mellem fem og ti standardreferencestoffer, hvis log P ligger i det forventede område, og retentionstiderne bestemmes, helst med en 
integrationsskriver, der er koblet til detektionssystemet. De tilsva ­
rende logaritmer til kapacitetsfaktorerne, log k, beregnes og afsættes mod den log P, der er bestemt ved rystekolbemetoden. Kalibreringen foretages regelmæssigt, mindst én gang dagligt, så der kan tages 
højde for eventuelle ændringer i kolonnens ydeevne.
 
Bestemmelse af teststoffets kapacitetsfaktor  
Teststoffet indsprøjtes som en så lille mængde mobil fase som mulig. 
Retentionstiden bestemmes (dobbeltbestemmelse), hvorved kapaci ­
tetsfaktoren k kan beregnes. Ud fra korrelationskurven over referen ­
cestofferne kan teststoffets fordelingskoefficient interpoleres. Ved meget lave og meget høje fordelingskoefficienter er det nødvendigt at ekstrapolere. I sådanne tilfælde må man være særlig opmærksom 
på regressionslinjens konfidensgrænser.
 
2. DATA  
Rystekolbemetoden  
De målte P-værdiers pålidelighed kan kontrolleres ved sammenlig ­
ning af gennemsnittet af dobbeltbestemmelserne med det samlede gennemsnit.
 
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)  
— en beregnet værdi eller et skøn baseret på de enkelte opløselig ­
heder, hvis metoderne ikke kan anvendes (f.eks. overfladeaktivt 
materiale)  
— alle oplysninger og bemærkninger af betydning for vurdering af 
resultaterne især vedrørende urenheder og stoffets fysiske 
tilstand.  
For rystekolbemetoden:  
— resultatet af et eventuelt indledende skøn  
— den temperatur, som bestemmelsen er foretaget ved  
— data om de analysemetoder, der er benyttet til koncentrations ­
bestemmelser  
— eventuel centrifugeringstid og -hastighed  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— målte koncentrationer i begge faser for hver bestemmelse (der 
skal således rapporteres i alt 12 koncentrationer)  
— massen af teststof, det anvendte volumen af hver fase i hver 
testbeholder og den samlede beregnede mængde teststof i hver 
fase efter indstilling af ligevægt  
— den beregnede værdi for fordelingskoefficienten (P) og gennem ­
snittet for hvert sæt testbetingelser samt gennemsnittet af samt ­
lige bestemmelser. Eventuelle tegn på, at fordelingskoefficienten 
er koncentrationsafhængig anføres i rapporten  
— de enkelte P-værdiers standardafvigelse fra gennemsnittet  
— gennemsnitsværdien af P fra alle bestemmelser anføres tillige 
som titalslogaritmen  
— den beregnede teoretiske værdi af P  ow , når denne værdi er 
bestemt eller når den målte værdi er > 10  4 
— pH af det anvendte vand og af vandfasen under forsøget  
— begrundelse for anvendelse af buffere i stedet for vand, deres 
sammensætning, koncentration og pH, samt vandfasens pH før og efter forsøget.
 
For HPLC-metoden:  
— resultatet af et eventuelt foreløbigt skøn  
— test- og referencestoffer og deres renhedsgrad  
— det temperaturinterval, som bestemmelserne er foretaget ved  
— det pH, som bestemmelserne er foretaget ved  
— detaljerede oplysninger om analyse- og beskyttelseskolonne, 
mobil fase og detektionssystem  
— retentionsdata og litteraturværdier for log P for referencestoffer 
benyttet ved kalibrering  
— detaljerede oplysninger om den fittede regressionslinje (log k 
mod log P)  
— gennemsnitlige retentionsdata og interpoleret log P-værdi for test ­
stoffet  
— beskrivelse af udstyr og driftsbetingelser  
— elueringsprofiler  
— den mængde test- og referencestof, der er indført i kolonnen  
— dødtiden og hvordan den er målt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosp ­
here, 1980, vol. 80, 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 219.  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
675. 
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.
 
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method.
 
(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
1459.  
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
525. 
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, 1113.  
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
382. 
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York 1979.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984.  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Base1, 1978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Tillæg 1  
Metoder til beregning/estimering  
INDLEDNING  
I Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) er der en generel 
indføring i beregningsmetoder samt data og eksempler.  
Beregnede værdier for P  ow kan benyttes:  
— til at afgøre, hvilken forsøgsmetode der er mest velegnet (rystekolbemetoden: 
log P  ow — 2 til 4; HPLC-metoden: log P  ow 0 til 6)  
— til at vælge de bedste forsøgsbetingelser (f.eks. referencestoffer til HPLC- 
metoden og volumenforholdet mellem n-octanol og vand til rystekolbemeto ­
den) 
— som intern laboratoriekontrol for eventuelle forsøgsfejl  
— til at give et skøn over P  ow i de tilfælde, hvor man af tekniske årsager ikke 
kan anvende eksperimentelle metoder.  
ESTIMERINGSMETODER  
Foreløbigt skøn over fordelingskoefficienten  
Der kan foretages et skøn over værdien af fordelingskoefficienten ved hjælp af 
teststoffets opløselighed i de rene opløsningsmidler: Hertil benyttes:  
P estimate ¼ saturation c  nÄoctanol  
saturation c  water 
BEREGNINGSMETODER  
Princippet bag beregningsmetoderne  
Alle beregningsmetoder er baseret på formel fragmentering af molekylet i 
passende delstrukturer, for hvilke man har pålideligt kendskab til log P  ow - 
bidrag. Log P  ow for hele molekylet beregnes dernæst som summen af fragment ­
værdierne plus summen af korrektionsudtryk for intramolekylære vekselvirknin ­
ger. 
Der foreligger lister over fragmentkonstanter og korrektionsudtryk (b)(c)(d)(e). 
Nogle af dem ajourføres regelmæssigt (b).  
Kvalitetskriterier  
Sædvanligvis aftager beregningsmetodens pålidelighed med, at det undersøgte 
stofs kompleksitet stiger. For simple molekyler med lav molekylvægt og en eller to funktionelle grupper kan der forventes en afvigelse på 0,1 til 0,3 mellem resultatet af forskellige fragmenteringsmetoder og den målte værdi for 
log P
 ow . Fejlmargenen kan være større for mere komplekse molekyler. Den 
afhænger af, om der foreligger fragmentkonstanter og hvor pålidelige de er, samt af, om intramolekylære vekselvirkninger (f.eks. hydrogenbindinger) erken ­
des, og om korrektionsudtrykkene anvendes korrekt (mindre problematisk med 
computerprogrammet CLOGP-3) (b). For ioniserbare forbindelsers vedkommende 
har det stor betydning, at ladningen eller ioniseringsgraden bedømmes korrekt.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Fremgangsmåde ved beregningen  
Hanschs π-metode  
Den oprindelige konstant for hydrofobe substituenter, π, som indførtes af Fujita 
m.fl. (f), defineres ved  
π x = log P  ow (PhX) – log P  ow (PhH)  
hvor P  ow (PhX) er fordelingskoefficienten for et aromatisk derivat og P  ow (PhH) 
er stamforbindelsens fordelingskoefficient  
(f.eks. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) – log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 – 2,13 = 0,71).  
Ifølge sin definition gælder π-metoden navnlig for aromatisk substitution. Der 
findes tabeller med π-værdier for en lang række substituenter (b)(c)(d). De 
benyttes til beregning af log P  ow for aromatiske molekyler og delstrukturer.  
Rekkers metode  
Efter Rekker (g) beregnes værdien af log P  ow således:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j ðvekselvirkningsudtryk Þ 
hvor f  i er de forskellige molekylfragmentkonstanter og a  i er den hyppighed, 
hvormed de forekommer i det pågældende molekyle. Korrektionsudtrykkene 
kan udtrykkes som et heltalsmultiplum af én enkelt konstant C  m (den såkaldte 
»magiske konstant«). Fragmentkonstanterne f  i og C  m er bestemt på grundlag af 
en liste med 1 054 eksperimentelt bestemte værdier af P  ow (825 forbindelser) ved 
hjælp af flerdimensional regressionsanalyse (c)(h). Vekselvirkningsudtrykkene 
bestemmes efter faste regler, der er beskrevet i henvisning (e)(h)(i).  
Hansch-Leos metode  
Efter Hansch og Leo (c) beregnes værdien af log P  ow således:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
hvor f  i er de forskellige molekylfragmentkonstanter, F  j er korrektionsudtrykkene, 
og a  i , og b  j er de hertil hørende hyppigheder. Ud fra eksperimentelt bestemte 
værdier af P  ow har man ved at prøve sig frem kunnet opstille en liste over atom- 
og gruppefragmentværdier og en liste over korrektionsudtryk F  j (såkaldte »fak ­
torer«). Korrektionsudtrykkene er ordnet i flere forskellige klasser (a)(c). Det er forholdsvis kompliceret og tidkrævende at tage hensyn til alle regler og korrek ­
tionsudtryk. Der er udviklet edb-programmer hertil (b).
 
Kombineret metode  
Beregningen af log P  ow for komplekse molekyler kan forbedres betydeligt, hvis 
molekylet deles op i større delstrukturer, som man har pålidelige log P  ow -værdier 
for, enten fra tabeller (b)(c) eller fra egne målinger. Sådanne fragmenter (f.eks. heterocykliske forbindelser, anthraquinon, azobenzen) kan dernæst kombineres 
med Hanschs π-værdier eller Rekkers eller Leos fragmentkonstanter.
 
Bemærkninger  
i) Beregningsmetoderne kan kun anvendes på helt eller delvis ioniserede forbin ­
delser, hvis de nødvendige korrektionsfaktorer kan tages i betragtning.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Hvis der må antages at forekomme intramolekylære hydrogenbindinger, må 
det hertil svarende korrektionsudtryk (ca. + 0,6 til + 1,0 log P  ow -enheder) 
lægges til (a). Rumlige modeller og spektroskopiske data kan afsløre, om der kan være tale om sådanne bindinger i molekylet
 
iii) Hvis flere tautomere former er mulige, benyttes den mest sandsynlige form 
som grundlag for beregningen.  
iv) Man skal nøje følge med i revisioner af lister over fragmentkonstanter.  
Rapport  
Ved anvendelse af beregningsmetoder skal testrapporten om muligt indeholde 
følgende oplysninger:  
— beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)  
— angivelse af alle muligheder for intramolekylære hydrogenbindinger, dissocia ­
tion, ladning eller andre særlige forhold (f.eks. tautomeri)  
— beskrivelse af beregningsmetoden  
— identifikation af de anvendte datas oprindelse  
— særlige valg af fragmenter  
— udtømmende dokumentation af beregningen.  
HENVISNINGER  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chill. Ther. 1979, vol. 
14, 479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol.1.  
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Tillæg 2  
Anbefalede referencestoffer til HPLC-metoden  
nr. referencestof log  ow pKa 
1 2-butanon 0,3 
2 4-acetylpyridin 0,5 3 anilin 0,9 4 acetanilid 1,0 
5 benzylalkohol 1,1 
6 p-methoxyphenol 1,3 pKa = 10,26 7 phenoxyeddikesyre 1,4 pKa = 3,12 8 phenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrophenol 1,5 pKa = 3,96 
10 benzonitril 1,6 11 phenylacetonitril 1,6 12 4-methylbenzylalkohol 1,6 13 acetophenon 1,7 14 2-nitrophenol 1,8 pKa = 7,17 
15 3-nitrobenzoesyre 1,8 pKa = 3,47 
16 4-chloranilin 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzen 1,9 18 kanelalkohol 1,9 19 benzoesyre 1,9 pKa = 4,19 20 p-cresol 1,9 pKa = 10,17 21 kanelsyre 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anisol 2,1 23 methylbenzoat 2,1 24 benzen 2,1 
25 3-methylbenzoesyre 2,4 pKa = 4,27 
16 4-chlorphenol 2,4 pKa = 9,1 27 trichlorethylen 2,4 28 atrazin 2,6 29 ethylbenzoat 2,6 30 2,6-dichlorbenzonitril 2,6 31 3-chlorbenzoesyre 2,7 pKa = 3,82 32 toluen 2,7 33 1-naphthol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dichloranilin 2,8 
35 chlorbenzen 2,8 
36 allylphenylether 2,9 37 brombenzen 3,0
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
nr. referencestof log  ow pKa 
38 ethylbenzen 3,2 
39 benzophenon 3,2 
40 4-phenylphenol 3,2 pKa = 9,54 
41 thymol 3,3 
42 1,4-dichlorbenzen 3,4 43 diphenylamin 3,4 pKa = 0,79 44 naphthalen 3,6 45 phenylbenzoat 3,6 46 isopropylbenzen 3,7 47 2,4,6-trichlorphenol 3,7 pKa = 6 48 biphenyl 4,0 
49 benzylbenzoat 4,0 
50 2,4-dinitro-6-sec-butylphenol 4,1 51 1,2,4-trichlorbenzen 4,2 52 dodecansyre 4,2 53 diphenylether 4,2 54 n-butylbenzen 4,5 55 phenanthren 4,5 56 fluoranthen 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6-diphenylpyridin 4,9 59 triphenylamin 5,7 
60 DDT 6,2 
Andre referencestoffer med lav log P
 ow 
1 nikotinsyre - 0,07  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. FLAMMEPUNKT  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplys ­
ninger om stoffets brændbarhed. Metoden kan anvendes for 
væsker, hvis dampe kan antændes af en antændelseskilde. De opreg ­
nede testmetoder er kun pålidelige i de flammepunktsintervaller, der er anført ved de enkelte metoder.
 
Ved valg af metode skal det tages med i overvejelserne, om der kan 
ske en kemisk reaktion mellem stoffet og testbeholderen.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Flammepunktet er den laveste temperatur, korrigeret til et tryk på 
101,325 kPa, ved hvilken en væske under de i metoden fastsatte betingelser udvikler dampe i en sådan mængde, at de danner en brændbar blanding med luft i testbeholderen.
 
Enheder:  o C 
t = T – 273,15  
(t er i  o C og T er i K)  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt 
stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til 
lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammenligning med resultater 
opnået med andre metoder.  
1.4. METODENS PRINCIP  
Stoffet anbringes i en testbeholder og opvarmes eller afkøles til 
testtemperaturen efter den fremgangsmåde, der er beskrevet i den 
enkelte testmetode. Der udføres antændelsesforsøg til konstatering 
af, om prøven antændes ved testtemperaturen eller ikke.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
1.5.1.  Repeterbarhed  
Repeterbarheden varierer alt efter flammepunktsområdet og den 
anvendte metode; højst 2  o C. 
1.5.2.  Følsomhed  
Følsomheden afhænger af den anvendte testmetode.  
1.5.3.  Specificitet  
Nogle af testmetoderne er begrænset til et bestemt flammepunkts ­
interval, og deres specificitet afhænger af andre stofegenskaber 
(f.eks. høj viskositet).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.6.1.  Forberedelser  
Der anbringes en prøve af stoffet i testapparatet efter 1.6.3.1 og/eller 
1.6.3.2.  
Af sikkerhedshensyn anbefales det, at der kun anvendes en lille test, 
dvs. ca. 2 cm  3 , af energirige og giftige stoffer.  
1.6.2.  Testbetingelser  
For så vidt som det er foreneligt med sikkerhedskravene, skal appa ­
ratet anbringes et trækfrit sted.  
1.6.3.  Udførelse af testen  
1.6.3.1.  Ligevægtsmetoden  
Se ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 og ISO 3679.  
1.6.3.2.  Ikke-ligevægtsmetoden  
Abel apparat:  
Se BS 2000 part 170, NF M07-011 og NF T66-009.  
Abel-Pensky apparat:  
Se EN 57, DIN 51755 part 1 (for temperaturer fra 5  o C til 65  o C), 
DIN 51755 part 2 (for temperaturer under 5  o C) og NF M07-036.  
Tag apparat:  
Se ASTM D 56.  
Pensky-Martens apparat:  
See ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 og NF 
M07-019.  
Bemærkninger:  
Hvis der ved en ikke-ligevægtsmetode i 1.6.3.2 findes et flamme ­
punkt på 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C eller 55 ± 2  o C, skal det bekræftes ved 
en ligevægtsmetode med samme apparat.  
Til anmeldelsesformål kan der kun bruges metoder, der giver flam ­
mepunktstemperaturen.  
Til bestemmelse af flammepunktet af tyktflydende opløsningsmiddel ­
holdige væsker (maling, lim og lignende) må der kun benyttes appa ­
rater og testmetoder, der er egnede til bestemmelse af tyktflydende 
væskers flammepunkt.  
Se ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 og DIN 53213 part 1.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. DATA  
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)  
— angivelse af den anvendte metode samt eventuelle afvigelser 
herfra  
— resultaterne og supplerende bemærkninger af betydning for 
vurdering af dem.  
4. HENVISNINGER  
Ingen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  ANTÆNDELIGHED (FASTE STOFFER)  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplys ­
ninger om stoffets eventuelle eksplosive egenskaber.  
Testen udføres kun på stoffer, der foreligger som pulver, granulat 
eller pasta.  
For ikke at medtage alle stoffer, der kan antændes, men kun dem, 
der brænder hurtigt eller på en måde, der er særlig farlig, anses kun de stoffer, hvis forbrændingshastighed overstiger en vis værdi, for at 
være let antændelige.
 
Det kan være særlig farligt, hvis forglødning kan fortsætte gennem 
metalpulver, da en brand er vanskelig at slukke. Metalpulver, hvori 
forglødningen kan udbrede sig i et bestemt tidsrum, anses for let 
antændelige.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Forbrændingstiden udtrykkes i sekunder.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ikke specificeret.  
1.4. METODENS PRINCIP  
Stoffet anbringes i en ca. 250 mm lang ubrudt stribe, og der fore ­
tages en indledende screeningstest til bestemmelse af, om der efter 
antænding med en gasflamme sker en forbrænding, der breder sig 
med åben flamme eller ved glødning. Hvis forbrændingen breder sig mere end 200 mm hen ad striben i løbet af et bestemt tidsrum, udføres der et komplet testprogram til bestemmelse af forbrændings ­
hastigheden.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen anført.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.6.1.  Indledende screeningprøve  
Stoffet anbringes på en ikke-brændbar ikke-porøs dårligt varmele ­
dende plade i en ca. 250 mm lang, 20 mm bred og 10 mm høj 
ubrudt stribe. En gasflamme (mindste diameter 5 mm) holdes hen 
til den ene ende af striben, indtil pulveret bryder i brand, dog højst 2 minutter (5 minutter for pulver af metal og metallegeringer). Det noteres, om forbrændingen breder sig 200 mm hen ad striben i løbet 
af testperioden på 4 minutter (40 minutter for metalpulver). Hvis 
stoffet ikke bryder i brand eller forbrændingen ikke med åben flamme eller ved glødning breder sig 200 mm hen ad striben i 
løbet af testperiodens 4 minutter (40 minutter), anses stoffet ikke 
for at være let antændeligt, og yderligere testning er ikke påkrævet. Hvis forbrændingen i stoffet breder sig 200 mm hen ad striben på mindre end 4 minutter eller mindre end 40 for metalpulver, gennem ­
føres nedenstående test (1.6.2).
 
1.6.2.  Test af forbrændingshastigheden  
1.6.2.1.  Forberedelse  
Stoffer, der foreligger som pulver eller granulat, fyldes løst i en 
250 mm lang form, der har trekantet tværsnit med indvendig højde 
10 mm og bredde 20 mm. På hver side af formen i længderetningen 
er der anbragt en metalplade, der rager 2 mm op over det trekantede tværsnits overkant (se figuren). Derefter lader man tre gange formen 
falde ned på et fast underlag fra 2 cm's højde. Om nødvendigt fyldes 
formen op igen. Sidestykkerne fjernes, og overskydende materiale skrabes af. Der lægges en ikke-brændbar ikke-porøs dårligt varme ­
ledende plade oven på formen, det hele vendes om, og formen 
fjernes.
 
Pasta-agtige stoffer bredes ud på en ikke-brændbar ikke-porøs dårligt 
varmeledende plade i en 250 mm lang pølse med et tværsnit på 
ca. 1 cm  2 . 
1.6.2.2.  Testbetingelser  
Er stoffet følsomt over for fugt, gennemføres testen så hurtigt som 
muligt efter, at stoffet er taget ud af beholderen.  
1.6.2.3.  Udførelse af prøvningen  
Volden anbringes i et stinkskab på tværs af luftstrømmen.  
Lufthastigheden skal være tilstrækkelig til at forhindre, at røgen 
slipper ud i laboratoriet, og må ikke ændres under prøvningen. 
Omkring apparatet opstilles der en skærm til beskyttelse mod træk.  
Volden antændes i den ene ende med en gasflamme (diameter 
mindst 5 mm). Når forbrændingen har forplantet sig 80 mm, måles 
udbredelseshastigheden over de næste 100 mm.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Testen udføres seks gange, hver gang med en ren kold plade, 
medmindre der observeres et positivt resultat tidligere.  
2. DATA  
Forbrændingstiden fra den indledende screeningstest (1.6.1) og den 
korteste forbrændingstid i op til seks test (1.6.2.3) er relevante for 
vurderingen.  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)  
— en nøjagtig beskrivelse af det testede stof, dets fysiske tilstands ­
form og dets fugtindhold  
— resultaterne af den indledende screeningstest og af testen af 
forbrændingshastigheden, hvis den er udført  
— alle yderligere bemærkninger af betydning for vurdering af resul ­
taterne.  
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE  
Stoffer, der foreligger i form af pulver, granulat eller pasta, anses for 
at være let antændelige, hvis forbrændingstiden i nogen af de test, 
der er udført efter 1.6.2, er mindre end 45 sekunder. Pulver af metal eller en metallegering anses for at være let antændeligt, hvis det kan antændes og flammen eller reaktionszonen forplanter sig over hele 
testen på 10 minutter eller derunder.
 
4. HENVISNINGER  
NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Tillæg  
Figur  
Form og tilbehor til fremstilling af volden  
(alle mal i millimeter)
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  ANTÆNDELIGHED (GASSER)  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Med denne metode kan det bestemmes, om en gas blandet med luft 
ved stuetemperatur (ca. 20  o C) og atmosfæretryk kan antændes, og i 
så fald i hvilket koncentrationsområde. Blandinger med stigende koncentrationer af prøvegassen med luft påvirkes med en elektrisk gnist, og det iagttages, om der sker antændelse.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Området for antændelighed er koncentrationsområdet mellem den 
nedre og den øvre eksplosionsgrænse. Nedre og øvre eksplosions ­
grænse er de koncentrationsgrænser for den antændelige gas i blan ­
ding med luft, ved hvilke der ikke sker nogen flammeudbredelse.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ikke specificeret.  
1.4. METODENS PRINCIP  
Koncentrationen af gassen i luft øges trinvis, og blandingen påvirkes 
ved hvert trin med en elektrisk gnist.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ikke anført.  
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.6.1.  Apparatur  
Testbeholderen er en opretstående glascylinder med en indre 
diameter på mindst 50 mm og en højde på mindst 300 mm. Antæn ­
delseselektroderne er placeret 60 mm over cylinderens bund med en indbyrdes afstand på 3 til 5 mm. Cylinderen er forsynet med en 
trykaflastningsåbning. Apparatet skal afskærmes, så eventuelle 
eksplosionsskader begrænses.
 
Som antændelseskilde anvendes en stående induktionsgnist med en 
varighed på 0,5 sek. Den dannes af en højspændingstransformator med en sekundærspænding på 10 til 15 kV (største tilførte effekt 300 W). I henvisning (2) er der vist et eksempel på et egnet apparat.
 
1.6.2.  Testbetingelser  
Testen skal udføres ved stuetemperatur (ca. 20  o C). ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Udførelse af testen  
Ved hjælp af doseringspumper ledes en gas/luftblanding med kendt 
koncentration ind i glascylinderen. Blandingen påvirkes med en gnistudladning, og det iagttages, om der ved antændelseskilden 
opstår en flamme, som forplanter sig af sig selv. Gaskoncentrationen 
varieres i intervaller på 1 vol. %, indtil der sker antændelse som beskrevet ovenfor.
 
Hvis det ud fra kendskab til gassens kemiske struktur må formodes, 
at gassen ikke kan antændes, og sammensætningen af den støkiome ­
triske blanding med luft kan beregnes, behøver man kun at afprøve blandinger fra 10 % under til 10 % over det støkiometriske blan ­
dingsforhold.
 
2. DATA  
Den eneste information, der er relevant for bestemmelse af denne 
egenskab, er, om der forekommer flammeudbredelse.  
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)  
— beskrivelse af det anvendte apparat med angivelse af dimensioner  
— den temperatur, som testen er udført ved  
— de afprøvede koncentrationer og de opnåede resultater  
— testens resultat: ikke-antændelig eller let antændelig gas  
— konkluderes det, at gassen er ikke-antændelig, anføres det 
koncentrationsområde, hvor prøvning med 1 % intervaller har 
fundet sted  
— alle oplysninger og bemærkninger, der er relevante for fortolk ­
ningen af resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. 
Redeker und H. Schacke. »Entwicklung einer Standard-Appa ­
ratur zur Messung von Explosionsgrenzen«. Chem.-Ing.-Tech., 
1984, vol. 56, 2, 126-127.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  ANTÆNDELIGHED (KONTAKT MED VAND)  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Denne testmetode kan anvendes til bestemmelse af, om et stof ved 
reaktion med vand udvikler farlige mængder gas, der eventuelt er let 
antændelig.  
Testmetoden kan anvendes til både væsker og faste stoffer. Den kan 
ikke anvendes til stoffer, der spontant bryder i brand, når de kommer 
i kontakt med luften.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Let antændelig: stoffer, som ved kontakt med vand eller fugtig luft 
udvikler let antændelige gasser i farlige mængder, dvs. mindst 1 
liter/kg pr. time.  
1.3. METODENS PRINCIP  
Testen foregår trinvis som beskrevet nedenfor; testen kan afbrydes, 
når der sker antænding. Hvis det vides, at stoffet ikke reagerer vold ­
somt med vand, kan man begynde med trin 4 (1.3.4).  
1.3.1.  Trin 1  
Teststoffet anbringes i et kar med destilleret vand ved 20  o C, og det 
konstateres, om den udviklede gas bryder i brand.  
1.3.2.  Trin 2  
Teststoffet anbringes på et stykke filtrerpapir, der flyder på over ­
fladen i en skål med destilleret vand ved 20  o C, og det konstateres, 
om den udviklede gas bryder i brand. Filtrerpapiret tjener udeluk ­
kende til at holde stoffet samlet på ét sted for at øge chancerne for 
antændelse.  
1.3.3.  Trin 3  
Teststoffet arrangeres i en ca. 2 cm høj bunke med en diameter på 
ca. 3 cm. Der tilsættes et par dråber vand til bunken, og det konsta ­
teres, om den udviklede gas bryder i brand.  
1.3.4.  Trin 4  
Teststoffet blandes med destilleret vand ved 20  o C, og gasudviklin ­
gens hastighed måles hver time over en periode på 7 timer. Hvis hastigheden efter 7 timer er uregelmæssig eller stigende, forlænges 
måleperioden, dog højst til 5 dage. Testen kan afbrydes, hvis hastig ­
heden på noget tidspunkt overstiger 1 liter/kg pr. time.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. REFERENCESTOFFER  
Ikke specificeret.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ikke anført.  
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE  
1.6.1.  Trin 1  
1.6.1.1.  Testbetingelser  
Testen udføres ved stuetemperatur (ca. 20  o C). 
1.6.1.2.  Udførelse af testen  
En lille mængde af teststoffet (ca. 2 mm i diameter) anbringes i et 
kar med destilleret vand. Det noteres, i) om der udvikles gas, og ii) 
om gassen bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behøves der 
ikke yderligere testning, idet stoffet anses for farligt.  
1.6.2.  Trin 2  
1.6.2.1.  Apparatur  
Et stykke filtrerpapir anbringes fladt flydende på overfladen af destil ­
leret vand i en egnet beholder, f.eks. en afdampningsskål med en diameter på 100 mm.
 
1.6.2.2.  Testbetingelser  
Testen udføres ved stuetemperatur (ca. 20  o C). 
1.6.2.3.  Udførelse af testen  
En lille mængde af teststoffet (ca. 2 mm diameter) anbringes midt på 
filtrerpapiret. Det noteres, i) om der udvikles gas, og ii) om gassen 
bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behøves der ikke yder ­
ligere testning, idet stoffet anses for farligt.  
1.6.3.  Trin 3  
1.6.3.1.  Testbetingelser  
Testen udføres ved stuetemperatur (ca. 20  o C). 
1.6.3.2.  Udførelse af testen  
Teststoffet anbringes i en ca. 2 cm høj bunke på ca. 3 cm i diameter 
med en fordybning i toppen. Der anbringes et par dråber vand i fordybningen, og det noteres, i) om der udvikles gas, og ii) om 
gassen bryder i brand. Hvis gassen bryder i brand, behøves der 
ikke yderligere testning, idet stoffet anses for farligt.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  Trin 4  
1.6.4.1.  Apparatur  
Der anvendes et apparat som vist på figuren.  
1.6.4.2.  Testbetingelser  
Det undersøges visuelt, om beholderen med teststof indeholder 
pulver på under 500 μm (partikelstørrelse). Hvis pulver udgør 
mere end 1 % (w/w) af den samlede prøve eller prøven er smuld ­
rende, formales hele testen til pulver inden testen, så der tages hensyn til reduktion af partikelstørrelsen under opbevaring og hånd ­
tering; i alle andre tilfælde undersøges testen i den stand, hvori den 
er modtaget. Testen udføres ved stuetemperatur (ca. 20
 o C) og 
atmosfæretryk.  
1.6.4.3.  Udførelse af testen  
Der anbringes 10-20 ml vand i apparatets tildrypningstragt og 10 g 
stof i den koniske kolbe. Den udviklede gasmængde kan måles ved enhver egnet metode. Tildrypningstragtens hane åbnes, så vandet løber ned i kolben, og et stopur startes. Gasudviklingen måles hver 
time over en periode på 7 timer. Hvis gasudviklingen er uregel ­
mæssig i denne periode eller stiger hen mod periodens slutning, fortsættes målingerne i op til 5 døgn. Hvis gasudviklingen på noget tidspunkt kommer over 1 liter/kg pr. time, kan testen afbrydes. 
Testen gentages yderligere to gange.
 
Hvis gassens kemiske sammensætning ikke er kendt, foretages der 
en analyse af den. Hvis gassen indeholder let antændelige bestand ­
dele, og det ikke vides, om hele blandingen er let antændelig, frem ­
stilles der en blanding med samme sammensætning, som test efter 
metode A.11.  
2. DATA  
Stoffet anses for farligt, hvis  
— det spontant bryder i brand på noget trin af testen  
eller 
— der udvikles brændbar gas i større mængde end 1 liter/kg pr. 
time.  
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)  
— eventuel forbehandling af teststoffet  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— resultatet af testen (trin 1, 2, 3 og 4)  
— den udviklede gas' kemiske sammensætning  
— gasudviklingshastigheden, hvis trin 4 (1.6.4) udføres  
— alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkningen 
af resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the 
hydrolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Tillæg  
Figur  
Apparatur
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13  VÆSKERS OG FASTE STOFFERS PYROFORISKE 
EGENSKABER  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Testmetoden kan anvendes for væsker og faste stoffer, der i små 
mængder spontant bryder i brand kort tid efter at være kommet i kontakt med luften ved stuetemperatur (ca. 20
 o C). 
Stoffer, der skal udsættes for luftens påvirkning i flere dage eller 
timer ved stuetemperatur, førend der sker antændelse, omfattes ikke af denne testmetode.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Stoffer anses for at være selvantændelige, hvis de bryder i brand 
eller forkuller under betingelserne i 1.6.  
Det kan også være påkrævet at undersøge væskers selvantændelse 
med metode A.15 Selvantændelsestemperatur (væsker og gasser).  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ikke specificeret.  
1.4. METODENS PRINCIP  
Stoffet, fast eller flydende, blandes med en inaktiv bærer og bringes i 
kontakt med luften ved stuetemperatur i 5 minutter. Væsker, der ikke bryder i brand, absorberes dernæst på filtrerpapir og udsættes for 
luftens påvirkning ved omgivende temperatur (ca. 20
 o C) i 
5 minutter. Flydende og faste stoffer, der bryder i brand, og væsker, der bryder i brand eller får filtrerpapiret til at forkulle, anses for at være selvantændelige.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Repeterbarhed: på grund af den sikkerhedsmæssige betydning er et 
enkelt positivt resultat tilstrækkeligt til, at stoffet anses for selv ­
antændeligt.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Apparatur  
Der fyldes et ca. 5 mm tykt lag diatoméjord i en porcelænsskål med 
en diameter på ca. 10 cm ved stuetemperatur (ca. 20  o C). 
Bemærk:  
Diatoméjord eller et andet tilsvarende inaktivt stof, som er let at få 
fat i, antages at repræsentere den jord, som teststoffet kunne blive spildt på i tilfælde af uheld.
 
Der behøves tørt filtrerpapir til test af væsker, som ikke bryder i 
brand ved kontakt med luften, når de er blandet med et inaktivt 
bæremateriale.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Udførelse af testen  
a) Faste stoffer i pulverform  
Fra en højde af ca. 1 m hældes 1-2 cm  3 af pulveret ned på en ikke- 
brændbar flade, og det iagttages, om stoffet bryder i brand under 
faldet eller inden for 5 minutter derefter.  
Testen udføres seks gange, medmindre der sker antændelse.  
b) Væsker  
Ca. 5 cm  3 af testvæsken hældes ud i den klargjorte porcelænsskål, og 
det iagttages, om stoffet bryder i brand, inden der er gået 5 minutter.  
Hvis der ikke sker antændelse i nogen af de seks forsøg, udføres 
følgende forsøg:  
Med en injektionssprøjte sprøjtes 0,5 ml af prøven ud på et bøjet 
stykke filtrerpapir, og det iagttages, om der inden for 5 minutter sker 
antændelse eller forkulning af filtrerpapiret. Forsøget udføres 3 gange, medmindre der sker antændelse eller forkulning.
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATERNE  
Testen kan afbrydes, så snart et af forsøgene giver positivt resultat.  
2.2. EVALUERING  
Hvis stoffet bryder i brand inden 5 minutter efter, at det er tilsat til 
en inaktiv bærer og blevet udsat for luftens påvirkning, eller hvis en 
væske får et stykke filtrerpapir til at forkulle eller bryde i brand, inden 5 minutter efter at stoffet er tilsat og blevet udsat for luftens påvirkning, anses stoffet (væsken) for at være selvantændeligt.
 
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)  
— resultaterne af testen  
— alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkningen 
af resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
 
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  EKSPLOSIVE EGENSKABER  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Metoden indeholder et testsystem til bestemmelse af, om et fast eller 
pastaagtigt stof frembyder eksplosionsfare, når det udsættes for 
påvirkning med en flamme (varmefølsomhed) eller ved slag eller friktion (følsomhed over for mekanisk påvirkning), og om en væske frembyder eksplosionsfare, når den udsættes for påvirkning 
med en flamme eller ved slag.
 
Metoden består af tre dele:  
a) en test for varmefølsomhed (1)  
b) en test for følsomhed over for slagpåvirkning (1)  
c) en test for følsomhed over for friktionspåvirkning (1).  
Metoden giver data til vurdering af sandsynligheden for, at der ved 
visse almindelige påvirkninger fremkaldes en eksplosion. Metoden tilsigter ikke at fastslå, om stoffet overhovedet kan bringes til at 
eksplodere.
 
Metoden er egnet til bestemmelse af, om et stof frembyder en 
eksplosionfare (varmefølsomhed og mekanisk følsomhed) under de særlige betingelser, der er specificeret i direktivet. Metoden er baseret på en række apparattyper, som i vidt omfang anvendes inter ­
nationalt (1), og som sædvanligvis giver brugbare resultater. Det 
erkendes, at metoden ikke er definitiv. Der kan benyttes andet appa ­
ratur end det specificerede, forudsat at det er internationalt anerkendt, og at de fundne resultater kan korreleres til resultater opnået med det 
specificerede apparatur.
 
Testen behøver ikke at udføres, hvis det på grundlag af foreliggende 
termodynamiske oplysninger (f.eks. dannelsesvarme eller dekompo ­
neringsvarme) og/eller en strukturformel, hvori visse reaktive grupper (2) ikke indgår, må anses for hævet over enhver rimelig 
tvivl, at stoffet er ude af stand til hurtig dekomponering ledsaget 
af gasudvikling eller varmefrigørelse (dvs. at stoffet ikke frembyder nogen eksplosionsfare). For væsker kræves der ikke test for friktions ­
følsomhed.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Eksplosiv:  
Stoffer, som kan eksplodere ved flammepåvirkning, eller som er 
følsomme over for slag eller friktion (eller mere følsomme over 
for mekanisk påvirkning end 1,3-dinitrobenzen i et alternativt appa ­
rat). 
1.3. REFERENCESTOFFER  
1,3-dinitrobenzen, teknisk krystallinsk produkt, sigtet på 0,5 mm 
sigte, til friktions- og slagpåvirkningsmetoden.  
Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, hexogen, cyclonite — 
CAS 121-82-4), omkrystalliseret i vandig cyclohexanon, vådsigtet 
på 250 μm sigte og tilbageholdt på en 150 μm sigte, tørret ved 
103 ± 2  o C (i 4 timer) til anden række friktions- og slagprøvninger.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. METODENS PRINCIP  
Der kræves indledende testning til bestemmelse af, hvordan de tre 
følsomhedstest kan udføres under betryggende forhold.  
1.4.1.  Test for sikker håndtering (3)  
Af sikkerhedshensyn foretages der før den egentlige test en indle ­
dende test bestående i, at en meget lille testmængde (ca. 10 mg) 
opvarmes fritliggende i en gasflamme, og påvirkes med slag i et passende apparat og ved friktion ved hjælp af en hammer mod en ambolt eller et andet friktionsapparat. Formålet er at fastslå, om 
stoffet er så følsomt og eksplosivt, at den foreskrevne følsomheds ­
test, især for varmefølsomhed, må udføres under iagttagelse af særlige forholdsregler, så operatøren ikke kan komme til skade.
 
1.4.2.  Varmefølsomhed (virkningen af en flamme)  
Metoden består i opvarmning af stoffet i et stålrør, der er lukket med 
en mundingsplade. Ved hjælp af mundingsplader med forskellige 
huldiametre kan det bestemmes, om stoffet er tilbøjeligt til at eksplo ­
dere under stærk varmepåvirkning og veldefineret indeslutningsgrad.  
1.4.3.  Mekanisk følsomhed (slag)  
Metoden består i, at stoffet udsættes for et slag med et specificeret 
lod, der falder fra en specificeret højde.  
1.4.4.  Mekanisk følsomhed (friktion)  
Metoden består i, at et fast eller pastaagtigt stof udsættes for friktion 
mellem standardoverflader med specificeret belastning og ved speci ­
ficeret relativ bevægelse.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ikke anført.  
1.6. BESKRIVELSE AF METODERNE  
1.6.1.  Varmefølsomhed (virkningen af en flamme)  
1.6.1.1.  Apparatur  
Apparaturet består af et engangsstålrør med lukkeanordning (figur 1) 
anbragt i en opvarmnings- og beskyttelsesanordning. Røret er af 
dybtrukket stålplade (se tillægget) og har en indvendig diameter på 24 mm, en længde på 75 mm og en godstykkelse på 0,5 mm. Røret har i den åbne ende en flange, så det kan lukkes med mundings ­
pladen ved hjælp af en todelt forskruning (møtrik og krave med 
gevind). Mundingspladen er trykmodstandsdygtig og har et hul i midten. Møtrikken og kraven med gevind er fremstillet i chrom- manganstål (se tillægget), som er gnistfrit op til 800
 o C. Der fore ­
ligger mundingsplader med en række forskellige huldiametre, som er 
fremstillet i 6 mm tykt varmebestandigt stål (se tillægget).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Testbetingelser  
Normalt testes stoffet i den tilstand, hvori det er modtaget, men i 
visse tilfælde, f.eks. hvis det foreligger i presset, støbt eller anden kompakt form, kan det være nødvendigt at knuse stoffet før testen.
 
For faste stoffer bestemmes den mængde materiale, der skal 
anvendes til testen, ved en to-trins procedure. Først fyldes der i et tareret rør 9 cm
 3 af stoffer, som nedstampes med en kraft på 80 N 
fordelt over hele rørtværsnittet. Af sikkerhedshensyn eller i tilfælde, 
hvor stoffet kan ændre fysisk form ved kompression, kan der benyttes andre påfyldningsmetoder; eksempelvis er stampning ikke egnet, hvis stoffet er meget friktionsfølsomt. Hvis materialet kan 
komprimeres, tilsættes der mere og stampes, indtil røret er fyldt til 
en højde af 55 mm fra overkanten. Den samlede mængde, der er brugt til fyldning af røret til denne højde, bestemmes, og der tilsættes endnu 2 portioner, som stampes med en kraft på 80 N. Der tilsættes 
materiale med stampning eller fjernes materiale, så røret er fyldt til 
15 mm fra overkanten. Det andet trin foregår ved, at der først tilsættes og stampes en tredjedel af den samlede mængde, der blev brugt til det første trin. Der tilsættes endnu 2 portioner med stamp ­
ning med 80 N, og materialets højde i røret justeres til 15 mm fra 
overkanten ved tilsætning eller fjernelse af materiale. Til hvert forsøg anvendes den mængde fast stof, der er fundet ved dette andet trin; påfyldningen sker i 3 lige store portioner, der hver komprimeres til 
9 cm
 3 med den fornødne kraft. (Dette gøres lettest ved anvendelse af 
afstandsringe).  
Væsker og geler fyldes i røret til en højde af 60 mm, idet det for 
gelernes vedkommende nøje påses, at der ikke dannes luftbobler. 
Kraven med gevind føres op om røret nedefra, den valgte mundings ­
plade indsættes, og møtrikken strammes efter smøring med et molyb ­
dænsulfidbaseret smøremiddel. Det er yderst vigtigt at kontrollere, at 
der hverken har sat sig stof mellem flangen og pladen eller i gevin ­
det. 
Opvarmningen sker med propan, der fra en industriel trykflaske med 
trykregulator (60-70 mbar) ledes gennem en måler og fordeles lige ­
ligt til 4 brændere gennem en manifold (hvilket kontrolleres ved 
visuel inspektion af brændernes flammer). Brænderne er placeret omkring prøvekammeret som vist på figur 1. De 4 brænderes samlede forbrug er på ca. 3,2 liter propan pr. minut. Der kan 
anvendes andre brændstoffer og brændere, men opvarmningshastig ­
heden skal være som specificeret i figur 3. Uanset det anvendte apparatur skal opvarmningshastigheden regelmæssigt kontrolleres med dibutylphthalatfyldte rør, som vist på figur 3.
 
1.6.1.3.  Udførelse af testene  
Hver test varer, indtil røret enten sønderdeles eller røret har været 
opvarmet i 5 minutter. En test, hvorved røret sønderdeles i tre eller flere fragmenter, som eventuelt hænger sammen med smalle metal ­
strimler som vist på figur 2, vurderes som en eksplosion. En test, der 
fører til færre fragmenter eller ingen fragmentering, betragtes ikke 
som en eksplosion.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Der udføres først tre test med en mundingsplade med et 6,0 mm hul, 
og opnås der ingen eksplosion, udføres endnu tre test med en 
mundingsplade med et 2,0 mm hul. Finder der eksplosion sted under én af disse forsøgsrækker, er yderligere testning ikke påkrævet.
 
1.6.1.4.  Evaluering  
Testens resultat anses for positivt, hvis der sker eksplosion i én af 
ovennævnte forsøgsrækker.  
1.6.2.  Mekanisk følsomhed (slag)  
1.6.2.1.  Apparatur (figur 4)  
Hoveddelene af et typisk faldhammerapparat er en støbt stålblok med 
bundplade, ambolt, stander, styr, faldlodder, frigørelsesmekanisme og 
prøveholder. Stålambolten på 100 mm (diameter) × 70 mm (højde) 
er skruet fast oven på en stålblok på 230 mm (længde) × 250 mm (bredde) × 200 mm (højde) med støbt bundplade på 450 mm (længde) × 450 mm (bredde) × 60 mm (højde). En stander bestående 
af et sømløst trukket stålrør er fastgjort i en holder, der er fastskruet 
bag på stålblokken. Apparatet er forankret til en massiv betonklods på 60 × 60 × 60 cm med fire skruer, så styrene er fuldstændig lodrette og faldlodderne kan falde frit. Der findes lodder på 5 og 
10 kg fremstillet i massivt stål. Loddernes slaghoved er af hærdet 
stål, HRC 60 til 63, og har en diameter på mindst 25 mm.
 
Testen er indeholdt i en slaganordning bestående af to massive stål ­
cylindre anbragt koaksialt over hinanden i en hul cylindrisk styrering af stål. Stålcylindrene skal have en diameter på 10 (- 0,003, - 0,005) mm og en højde på 10 mm og have polerede endeflader, afrundede 
kanter (krumningsradius 0,5 mm) og en hårdhed på HRC 58 til 
65. Den hule cylinder skal have en udvendig diameter på 16 mm, en poleret udboring på 10 (+ 0,005, + 0,010) mm og en højde på 13 mm. Slaganordningen samles på en mellemambolt (diameter 
26 mm, højde 26 mm) af stål og centreres med en ring, hvori der 
er huller til bortledning af eksplosionsprodukterne.
 
1.6.2.2.  Testbetingelser  
Testvolumenet skal være på 40 mm  3 eller det volumen, der passer til 
et alternativt apparat. Faste stoffer testes i tør tilstand og forberedes 
således  
a) stoffer i pulverform sigtes (0,5 mm sigte); alt hvad der passerer 
gennem sigten bruges til testen  
b) stoffer, der foreligger i presset, støbt eller anden kompakt form, 
findeles og sigtes; sigtefraktionen fra 0,5 mm til 1 mm diameter bruges til testen og skal være repræsentativ for det oprindelige stof.
 
Stoffer, som normalt forekommer i pastaform skal om muligt testes i 
tør tilstand og under alle omstændigheder efter fjernelse af størst 
mulig mængde opløsningsmiddel. Ved test af væsker er der en 
afstand på 1 mm mellem den øverste og den nederste stålcylinder.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Udførelse af testen  
Der udføres seks forsøg, hvor 10 kg's loddet falder fra en højde af 
0,40 m (40 J). Forekommer der eksplosion i et af de 6 forsøg med 40 J, udføres der en ny række på seks forsøg, hvor et 5 kg's lod 
falder fra en højde af 0,15 m (7,5 J). I andre apparater sammenlignes 
prøven med det valgte referencestof ved hjælp af en fastlagt procedure (f.eks. up-and-down teknik).
 
1.6.2.4.  Evaluering  
Testresultatet anses for positivt, hvis der sker eksplosion (opflamning 
og knald betragtes som eksplosion) i mindst ét af forsøgene med det 
specificerede slagapparat, eller hvis prøven er mere følsom end 1,3- dinitrobenzen eller RDX i en alternativ slagtest.
 
1.6.3.  Mekanisk følsomhed (friktion)  
1.6.3.1.  Apparatur (figur 5)  
Friktionsapparatet består af en støbt bundplade af stål, hvorpå frik ­
tionsanordningen er monteret. Den består af en fastsiddende porce ­
lænsstift og en bevægelig porcelænsplade. Porcelænspladen fast ­
holdes i en slæde, der glider på to styr. Slæden er via en forbindel ­
sesstang, en krumtap og et passende gear forbundet med en elmotor, 
således at porcelænspladen bevæges 10 mm frem og tilbage under porcelænsstiften én gang. Porcelænsstiften kan belastes f.eks. med 120 eller 360 newton.
 
Porcelænspladerne er flade og er fremstillet af hvidt teknisk porcelæn 
(ruhed 9 til 32 μm) og har dimensionerne 25 mm (længde) × 25 mm 
(bredde) × 5 mm (højde). Den cylindriske porcelænsstift, der lige ­
ledes er fremstillet af hvidt teknisk porcelæn, har en længde på 
15 mm, en diameter på 10 mm og ru kugleformede endeflader 
med en krumningsradius på 10 mm.  
1.6.3.2.  Testbetingelser  
Prøvevolumenet skal være på 10 mm  3 eller det volumen, der passer 
til et alternativt apparat.  
Faste stoffer testes i tør tilstand og forberedes således:  
a) stoffer i pulverform sigtes (0,5 mm sigte); alt hvad der passerer 
gennem sigten bruges til testen  
b) stoffer, der foreligger i presset, støbt eller anden kompakt form, 
findeles og sigtes; sigtefraktionen < 0,5 mm diameter bruges til 
testen.  
Stoffer, som normalt forekommer i pastaform skal om muligt testes i 
tør tilstand. Hvis stoffet ikke kan tørres, skal pastaen (efter fjernelse af størst mulig mængde opløsningsmiddel) testes som et 0,5 mm tykt 
lag med en bredde på 2 mm og en længde på 10 mm, der udlægges 
med en skabelon.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Udførelse af testen  
Porcelænsstiften anbringes på prøven, og belastningen påsættes. Ved 
udførelse af testen skal skuremærkerne på porcelænspladen vende på tværs af bevægelsesretningen. Det må nøje påses, at der er tilstræk ­
keligt testmateriale under stiften, og at pladen bevæger sig korrekt 
under stiften. Til anbringelse af pastaagtige stoffer på pladen anvendes der en 0,5 mm tyk skabelon med et åbent felt på 2 × 10 mm. Porcelænspladen skal bevæge sig 10 mm frem og tilbage 
under porcelænsstiften i løbet af 0,44 sekunder. Hver del af porce ­
lænspladen og -stiften må kun bruges én gang; de to ender af en stift kan bruges til to forsøg og de to flader af en plade kan hver bruges 
til tre forsøg.
 
Der udføres seks forsøg med en belastning på 360 N. Forekommer 
der eksplosion i et af disse seks forsøg, udføres der en ny række på seks forsøg med en belastning på 120 N. I andre apparater sammen ­
lignes prøven med det valgte referencestof ved hjælp af en fastlagt 
procedure (f.eks. up-and-down teknik).
 
1.6.3.4.  Evaluering  
Testresultatet anses for positivt, hvis der sker eksplosion (knitren 
og/eller knald eller opflamning betragtes som eksplosion) i mindst ét af forsøgene med det specificerede friktionsapparat, eller hvis de tilsvarende kriterier i en alternativ friktionstest er opfyldt.
 
2. DATA  
Principielt anses et stof for at være eksplosionsfarligt i direktivets 
forstand, hvis der ved testen for varme-, slag- eller friktionsføl ­
somhed opnås et positivt resultat.  
3. RAPPORTERING  
3.1. PRØVNINGSRAPPORTEN  
Prøvningsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— teststoffets betegnelse, sammensætning, renhed, fugtindhold mv.  
— prøvens fysiske tilstandsform samt oplysning om, om den er 
knust, findelt og/eller sigtet  
— iagttagelser under testen for varmefølsomhed (f.eks. testmasse, 
antal fragmenter mv.)  
— iagttagelser under testen for mekanisk følsomhed (f.eks. dannelse 
af væsentlige røgmængder eller fuldstændig dekomponering uden knald, flammer, gnister, knitren mv.)
 
— resultaterne af hver forsøgstype  
— videnskabelig begrundelse for eventuel anvendelse af et alterna ­
tivt apparat, samt godtgørelse af korrelationen mellem resulta ­
terne med det specificerede apparat og resultaterne med et tilsva ­
rende apparat  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— nyttige bemærkninger, såsom henvisning til forsøg med lignende 
produkter, som kan være relevante for korrekt fortolkning af 
resultaterne  
— alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkning af 
resultaterne.  
3.2. FORTOLKNING OG EVALUERING AF RESULTATERNE  
I testrapporten skal alle resultater, der anses for ukorrekte, unormale 
eller ikke-repræsentative, nævnes. Hvis der skal ses bort fra nogle af 
resultaterne, skal dette forklares og resultaterne af supplerende eller 
alternativ test oplyses. Kan der ikke redegøres for et unormalt resul ­
tat, skal det tages for pålydende, og stoffet skal klassificeres i over ­
ensstemmelse hermed.  
4. HENVISNINGER  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6-13 and 30-42.  
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — 
Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Tillæg  
Eksempel på materialespecifikation for varmefølsomhedstesting (se DIN 1623)  
(1) Rør: Materialespecifikation nr. 1.0336.505 g  
(2) Mundingsplade: Materialespecifikation nr. 1.4873  
(3) Krave med gevind og møtrik: Materialespecifikation nr. 1.3817  
Figur 1  
Apparat til testing for varmefølsomhed  
(alle dimensioner i mm)
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Figur 2  
Test for varmefølsomed  
Eksempler på fragmentering
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Figur 3  
Kalibrering af opvarmingshastigeden ved test af varmefølsomed
  
Kurve over temeraturforløbet mod tiden ved opvarmning af dibutylphthalat (27 cm  3 i et lukket 
rør (mundingslade med 1,5 mm hul) med et propanflow på 3,2 litter/minut. Temperaturen er 
målt med chromel/alumel-termoelement med 1 mm indkapsling i rustfrit stål, anbragt central 
43 mm under rørets overkant. Mellen 135  o C og 285  o C skal opvarmningshastigheden være 
185-215 K/minut.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Figur 4  
Apparat til slagprøvning  
(alle dimensioner i mm)
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Figur 4  
Fortstat
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Figur 5  
Apparat til friktionsfølsomhed
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  SELVANTÆNDELSESTEMPERATUR FOR VÆSKER OG 
GASSER  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Eksplosive stoffer og stoffer, der spontant bryder i brand i kontakt 
med luften, underkastes ikke denne test. Testproceduren kan anvendes for gasser, væsker og dampe, som kan antændes af en hed overflade under tilstedeværelse af luft.
 
Selvantændelsestemperaturen kan påvirkes betydeligt i nedadgående 
retning af katalytiske urenheder, af overfladematerialet og af en 
større testbeholder.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Tendensen til selvantændelse udtrykkes ved selvantændelsestempera ­
turen. Selvantændelsestemperaturen er den laveste temperatur, ved 
hvilken teststoffet bryder i brand i blanding med luft under de i 
testmetoden definerede betingelser.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
I standarderne (se 1.6.3) er der nævnt referencestoffer. De skal først 
og fremmest tjene til lejlighedsvis kontrol af metoden og til sammen ­
ligning med resultater opnået med andre metoder.  
1.4. METODENS PRINCIP  
Ved metoden bestemmes den laveste temperatur af den indvendige 
overflade af et lukket rum, ved hvilken en gas, damp eller væske, der 
sprøjtes ind i rummet, bryder i brand.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Repeterbarheden afhænger af området for selvantændelsestempera ­
turen og af den anvendte testmetode.  
Følsomheden og specificiteten afhænger af den anvendte testmetode.  
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.6.1.  Apparatur  
Apparaturet er beskrevet i den metode, der henvises til i 1.6.3.  
1.6.2.  Testbetingelser  
En prøve af stoffet testes i overensstemmelse med den metode, der 
henvises til i 1.6.3.  
1.6.3.  Udførelse af testen  
Se IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056 og NF T 20- 
037. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. DATA  
Testtemperaturen, atmosfæretrykket, den anvendte mængde prøvema ­
teriale og tidsrummet, indtil der sker antændelse, registreres.  
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger  
— nøjagtig beskrivelse af stoffet (betegnelse og urenheder)  
— den anvendte testmængde og atmosfæretrykket  
— det anvendte apparatur  
— måleresultaterne (testtemperatur, resultaterne af antændelsen og 
det hertil svarende tidsrum)  
— alle yderligere oplysninger, der er relevante for fortolkningen af 
resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
Ingen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  RELATIV SELVANTÆNDELSESTEMPERATUR FOR FASTE 
STOFFER  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Eksplosive stoffer og stoffer, der spontant bryder i brand i kontakt 
med luften, underkastes ikke denne test.  
Formålet med denne test er at fremskaffe foreløbige oplysninger om 
faste stoffers selvantændelighed ved høj temperatur.  
Hvis den varme, der udvikles enten ved stoffets reaktion med luften 
eller ved eksoterm dekomponering, ikke bortledes hurtigt nok til 
omgivelserne, sker der en opvarmning, der fører til selvantændelse. 
Selvantændelse kan derfor finde sted, når varmeproduktionen sker hurtigere end varmeafgivelsen.
 
Testmetoden egner sig til foreløbig screening af faste stoffer. Da 
antændelse og forbrænding af faste stoffer er meget kompleks, bør den selvantændelsestemperatur, der bestemmes ved denne metode, 
kun benyttes til sammenligningsformål.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Den selvantændelsestemperatur, der bestemmes ved denne metode, 
er den laveste omgivende temperatur udtrykt i  o C, hvorved en 
bestemt mængde af et stof bryder i brand under veldefinerede betin ­
gelser.  
1.3. REFERENCESTOF  
Ingen.  
1.4. METODENS PRINCIP  
En bestemt mængde af teststoffet anbringes i en ovn ved stuetem ­
peratur; medens ovntemperaturen hæves med 0,5  o C/min til smelte ­
punktet, dog højst til 400  o C, registreres temperaturen midt i prøven 
som funktion af tiden. I forbindelse med denne test benævnes den 
ovntemperatur, ved hvilken prøvens temperatur når op på 400  o C ved 
selvopvarmning, selvantændelsestemperaturen.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.6.1.  Apparatur  
1.6.1.1.  Ovn  
En temperaturprogrammeret laboratorieovn (volumen ca. 2 liter) med 
fri konvektion og eksplosionsaflastning. For at imødegå enhver 
eksplosionsfare må eventuelle dekomponeringsgasser ikke kunne 
komme i berøring med varmelegemet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Terning af ståltrådsnet  
Et stykke ståltrådsnet med maskevidden 0,045 mm skæres ud efter 
tegningen i figur 1. Det foldes til terninger, hvor den ene side er åben, og fastholdes med ståltråd.
 
1.6.1.3.  Termoelementer  
Egnede termoelementer.  
1.6.1.4.  Skriver  
En to-kanals skriver, der er kalibreret op til 600  o C eller en tilsva ­
rende spænding.  
1.6.2.  Testbetingelser  
Stoffer testes i den form, de modtages i.  
1.6.3.  Udførelse af testen  
Terningen fyldes med teststoffet, og der bankes let på den under 
tilsætning af mere af stoffet, indtil den er helt fyldt. Dernæst ophænges terningen midt i ovnen ved stuetemperatur. Det ene termoelement anbringes midt i terningen, det andet mellem terningen 
og ovnvæggen til måling af ovntemperaturen.
 
Ovntemperaturen og prøvetemperaturen registreres løbende, mens 
ovntemperaturen hæves til 400  o C, dog højst til stoffets smeltepunk ­
tet, med en hastighed på 0,5  o C/min.  
Antændelse af stoffet vil vise sig som en meget stejl temperaturstig ­
ning i prøven sammenlignet med ovntemperaturen.  
2. DATA  
Den ovntemperatur, ved hvilken prøven som følge af selvopvarm ­
ning når op på en temperatur på 400  o C, er relevant for evaluering 
(se figur 2).  
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— en beskrivelse af teststoffet  
— måleresultaterne, herunder temperatur/tid-kurven  
— alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkningen 
af resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Figur 1  
Tegning af 20 mm testterning
  
Figur 2  
Typisk temperatur/tid-kurve
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  OXIDERENDE EGENSKABER (FASTE STOFFER)  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Ved udførelse af denne test er det nyttigt at have forhåndsoplys ­
ninger om stoffets eventuelle eksplosive egenskaber.  
Denne test kan ikke anvendes på væsker, gasser, eksplosive og 
yderst let antændelige stoffer samt organiske peroxider.  
Det er ikke nødvendigt at udføre denne test, hvis det på grundlag af 
strukturformelen kan godtgøres, at stoffet med stor sandsynlighed 
ikke kan reagere eksotermt med et brændbart materiale.  
Der udføres en indledende test til konstatering af, om den egentlige 
test skal udføres under iagttagelse af særlige forsigtighedsregler.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Reaktionstid: den reaktionstid i sekunder, der kræves, for at 
reaktionszonen breder sig hen ad en vold, efter den fremgangsmåde, der er beskrevet i 1.6.
 
Reaktionshastighed: udtrykkes i millimeter pr. sekund.  
Største reaktionshastighed: den største af de reaktionshastigheder, der 
bestemmes med blandinger indeholdende 10 til 90 vægtprocent af 
det oxiderende stof.  
1.3. REFERENCESTOF  
Som referencestof til testen og screeningstesten benyttes bariumnitrat 
(analysekvalitet).  
Referenceblandingen er den blanding af bariumnitrat og pulveriseret 
cellulose, fremstillet efter 1.6, som har den største reaktionshastighed 
(normalt en blanding indeholdende 60 vægtprocent bariumnitrat).  
1.4. METODENS PRINCIP  
Af sikkerhedshensyn udføres der en indledende screeningstest. Viser 
denne indledende test klart, at stoffet har oxiderende egenskaber, behøves der ikke yderligere testing. Er dette ikke tilfældet, underka ­
stes stoffet en fuldstændig test.
 
Ved den fuldstændige test blandes teststoffet og et veldefineret 
brændbart stof i forskellige forhold. Hver blanding arrangeres i en 
vold, der antændes i den ene ende. Den største målte reaktions ­
hastighed sammenlignes med referenceblandingens største reaktions ­
hastighed.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Alle påkrævede formalings- og blandemetoder kan anvendes under 
den forudsætning, at den største reaktionshastighed i hver af de seks 
enkeltforsøg ikke afviger fra det aritmetiske gennemsnit med mere 
end 10 %.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.6.1.  Forberedelse  
1.6.1.1.  Teststof  
Prøven reduceres til en partikelstørrelse på < 0,125 mm på følgende 
måde: Teststoffet sigtes, hvorefter den tilbageholdte fraktion 
formales, og denne fremgangsmåde gentages, indtil hele test ­
mængden har passeret sigten.  
Alle formalings- og sigtemetoder, der opfylder kvalitetskriterierne, 
kan anvendes.  
Før fremstilling af blandingen tørres stoffet ved 105  o C til konstant 
vægt. Hvis teststoffets dekomponeringstemperatur er lavere end 
105  o C, tørres stoffet ved en passende lavere temperatur.  
1.6.1.2.  Brændbart stof  
Som brændbart stof anvendes der pulveriseret cellulose af den type, 
der bruges til tyndtlagskromatografi eller søjlekromatografi. En type, 
hvor 85 % af fibrene har en længde på mellem 0,020 og 0,075 mm, 
har vist sig egnet. Cellulosepulveret sigtes på en sigte med en maske ­
vidde på 0,125 mm. Der bruges cellulose fra samme batch til hele testen.
 
Før fremstilling af blandingen tørres cellulosepulveret ved 105  o C til 
konstant vægt.  
Hvis der benyttes savsmuld til den indledende test, fremstilles dette 
ved opsamling af den fraktion, der passerer gennem en sigte med 
maskevidden 1,6 mm, omhyggelig blanding og tørring ved 105  o C i 
4 timer i et højst 25 mm tykt lag. Efter afkøling opbevares savs ­
muldet i en lufttæt beholder, der fyldes så meget som praktisk 
muligt, indtil der bruges, helst inden 24 timer efter tørringen.  
1.6.1.3.  Antændelseskilde  
Som antændelseskilde anvendes der en gasflamme (diameter mindst 
5 mm). Anvendes der en anden antændelseskilde (f.eks. ved test i inert atmosfære), skal dette begrundes og kilden beskrives i rappor ­
ten.
 
1.6.2.  Udførelse af testen  
Bemærk:  
Blandinger af oxiderende stoffer med cellulose eller savsmuld skal 
betragtes som potentielt eksplosive og behandles med passende 
forsigtighed.  
1.6.2.1.  Indledende test  
2 vægtdele tørret stof blandes omhyggeligt med 1 vægtdel tørret 
cellulose eller savsmuld, og der tildannes en lille kegleformet bunke af blandingen med en grundfladediameter på 3,5 cm og en 
højde på 2,5 cm, ved at fylde blandingen løst i en kegleformet form 
(f.eks. en laboratorietragt med tilproppet stilk).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Bunken anbringes på en kold ikke-brændbar ikke-porøs dårligt 
varmeledende plade. Testen udføres i stinkskab på samme måde 
som testen i 1.6.2.2.  
Antændelseskilden bringes i berøring med bunken. Den efterfølgende 
reaktions voldsomhed og varighed iagttages og registreres.  
Hvis reaktionen er voldsom, skal stoffet anses for oxiderende.  
Hvis resultatet på nogen måde er tvetydigt, skal den nedenfor 
beskrevne fuldstændige udbredelsestest udføres.  
1.6.2.2.  Udbredelsestest  
Der fremstilles en række blandinger af oxiderende stof og cellulose 
indeholdende fra 10 til 90 vægtprocent oxiderende stof og med inter ­
valler på 10 vægtprocent. I grænsetilfælde anvendes der blandinger 
derimellem, så den største reaktionshastighed bestemmes mere nøjagtigt.
 
Volden tildannes ved hjælp af en 250 mm lang metalform, der har 
trekantet tværsnit med indvendig højde 10 mm og bredde 20 mm. På 
hver side af formen i længderetningen er der anbragt en metalplade, 
der rager 2 mm op over det trekantede tværsnits overkant (se figu ­
ren). Denne indretning fyldes løst med et lille overskud af blandin ­
gen. Efter at man har ladet formen falde ned på et fast underlag fra 
2 cm's højde en gang, skrabes overskuddet af med en skråtstillet 
plade. Sidestykkerne fjernes, og det resterende pulver glattes ud med en valse. Der lægges en ikke-brændbar ikke-porøs dårligt varmeledende plade oven på formen, det hele vendes om, og 
formen fjernes.
 
Volden anbringes i et stinkskab på tværs af luftstrømmen.  
Lufthastigheden skal være tilstrækkelig til at forhindre, at røgen 
slipper ud i laboratoriet, og må ikke ændres under testen. Omkring 
apparatet opstilles der en skærm til beskyttelse mod træk.  
Da cellulose og visse teststoffer er hygroskopiske, skal testen udføres 
så hurtigt som muligt.  
Volden antændes i den ene ende ved berøring med en flamme.  
Når reaktionszonen har forplantet sig 30 mm, måles dens udbredel ­
seshastighed over de næste 200 mm.  
Testen udføres med referencestoffet og mindst én gang med hver af 
blandingerne af teststof med cellulose.  
Hvis den fundne største reaktionshastighed er væsentligt større end 
referenceblandingens, kan testen afbrydes; i modsat fald gentages 
forsøget fem gange med hver af de tre blandinger, der giver den 
største reaktionshastighed.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Hvis der er mistanke om, at der er fremkommet et falsk positivt 
resultat, gentages testen med et inert materiale med tilsvarende parti ­
kelstørrelse i stedet for cellulosen, f.eks. kiselgur. Alternativt kan den blanding af teststof og cellulose, som har den højeste reaktionshastig ­
hed, testes i inert atmosfære (< 2 % v/v oxygen).
 
2. DATA  
Af sikkerhedshensyn anses den største reaktionshastighed — og ikke 
gennemsnittet — for at være den karakteristiske oxiderende egenskab 
ved det undersøgte stof.  
Den højeste værdi af reaktionshastigheden af en serie på seks forsøg 
med en given blanding er relevant for vurderingen.  
Hver enkelt blandings højeste reaktionshastighed afbildes mod 
koncentrationen af oxiderende stof. Den største reaktionshastighed aflæses på kurven.
 
De seks værdier af reaktionshastigheden, som er fundet med den 
blanding, der har den største reaktionshastighed, må ikke afvige fra 
det aritmetiske gennemsnit med mere end 10 %; i modsat fald må 
formalings- og blandemetoderne forbedres.  
Den fundne største reaktionshastighed sammenlignes med reference ­
blandingens største reaktionshastighed (se 1.3).  
Hvis der udføres test i inert atmosfære, sammenlignes den største 
reaktionshastighed med referenceblandingens største reaktions ­
hastighed bestemt i inert atmosfære.  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— det undersøgte stofs identitet, sammensætning, renhedsgrad, 
vandindhold, m.v.  
— eventuel behandling af prøven (f.eks. formaling eller tørring)  
— den benyttede antændelseskilde  
— måleresultaterne  
— reaktionsforløbet (f.eks. forbrænding med flammer fra overfla ­
den, gennembrænding af hele materialet og oplysninger om forbrændingsprodukter)
 
— alle yderligere bemærkninger, der er relevante for fortolkningen 
af resultaterne, herunder en beskrivelse af reaktionens vold ­
somhed (flamme, gnister, røg, ulmen, m.v.) og omtrentlige 
varighed i den indledende sikkerheds/screeningstest, både af test- og referencestoffet
 
— resultaterne af test med et inert stof  
— eventuelle resultater af test i inert atmosfære.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE  
Et stof skal anses for oxiderende, hvis  
a) der sker voldsom reaktion under den indledende test  
b) den største reaktionshastighed af de blandinger, der er undersøgt 
ved fuldstændig testning, er højere end eller lige så høj som 
referenceblandingens (dvs. cellulose og bariumnitrat) største 
reaktionshastighed.  
For at undgå falske positive resultater skal de resultater, der opnås 
ved test af stoffet med et inert materiale og/eller i inert atmosfære, 
også tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
TILLÆG  
Figur  
Form og tilbehor til fremstilling af provolden  
(alle dimensioner i mm)
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  POLYMERERS ANTALSMIDDELMOLEKYLVÆGT OG 
MOLEKYLVÆGTSFORDEL ING  
1. METODE  
Denne gelpermeationskromatografiske metode er en gengivelse af 
OECD Test Guideline 118 (1996). Grundprincipper og yderligere 
tekniske oplysninger findes i henvisning (1).  
1.1. INDLEDNING  
Da polymerer kan have vidt forskellige egenskaber, er det umuligt at 
beskrive én metode med nøjagtig angivelse af alle betingelser for adskillelse og evaluering, som dækker alle tænkelige særtilfælde, der 
kan forekomme under adskillelse af polymerer. Især er komplekse 
polymersystemer ofte uegnede til gelpermeationskromatografi (GPC). Er det ikke praktisk muligt at foretage GPC, kan molekylvægten bestemmes ved andre metoder (se tillægget). I så fald skal der 
gives en begrundelse for valget af metode og en fuldstændig beskri ­
velse af den.
 
Den beskrevne metode er baseret på DIN-standard 55672 (1). Heri 
findes der detaljerede oplysninger om, hvordan forsøgene udføres, og hvordan dataene evalueres. Hvis det bliver nødvendigt at ændre på 
forsøgsbetingelserne, skal disse ændringer begrundes. Der kan 
benyttes andre standarder, hvis der gives nøjagtige henvisninger dertil. I den beskrevne metode benyttes der polystyrenprøver med kendt polydispersitet til kalibrering; for visse polymerer, f.eks. 
vandopløselige polymerer og langkædede forgrenede polymerer, 
kan det være nødvendigt at ændre på dette.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Antalsmiddelmolekylvægten M  n og vægtmiddelmolekylvægten M  w 
bestemmes ved følgende udtryk: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
hvor 
H i er detektorsignalets højde over basislinjen ved retentionsvolumen V  i 
M i er molekylvægten af polymerfraktionen ved retentionsvolumen V  i 
n er antallet af datapunkter.  
Bredden af molekylvægtsfordelingen, som er et mål for systemets 
dispersitet, er givet ved forholdet M  w /M n . ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
Da GPC er en relativ metode, må der foretages en kalibrering. Hertil 
benyttes der normalt lineære polystyrenstandarder med kendte middelmolekylvægte Mn og Mw og kendt snæver molekylvægtsfor ­
deling. Kalibreringskurven kan kun benyttes til bestemmelse af 
molekylvægten af den ukendte prøve, hvis der er valgt identiske betingelser for separation af prøven og standarden.
 
Den sammenhæng mellem molekylvægt og elueringsvolumen, der 
bestemmes, gælder kun for de særlige betingelser ved det bestemte 
forsøg. Disse betingelser er først og fremmest temperatur, opløs ­
ningsmiddel (eller opløsningsmiddelblanding), kromatograferings ­
betingelser og adskillelseskolonne eller -kolonnesystem.  
Den molekylvægt, der på denne måde bestemmes for prøven, er 
relativ og betegnes »polystyrenækvivalent molekylvægt«. Det bety ­
der, at molekylvægten kan afvige mere eller mindre fra den absolutte værdi, afhængigt af strukturmæssige og kemiske forskelle mellem 
standard og prøve. Hvis der benyttes en anden standard, f.eks. poly ­
ethylenglycol, polyethylenoxid, polymethylmethacrylat eller polya ­
crylsyre, skal dette begrundes.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Både molekylvægtfordelingen og middelmolekylvægten af prøven 
(både M  n og M  w ) kan bestemmes ved GPC. GPC er en særlig 
type væskekromatografi, hvor prøvens bestanddele adskilles efter 
hydrodynamisk volumen (2).  
Adskillelsen sker, mens prøven passerer gennem en kolonne med 
porøst materiale, typisk en organisk gel. Små molekyler kan 
trænge ind i porerne, mens store molekyler ikke kan. På denne 
måde får de store molekyler en kortere vejlængde, så de elueres først. Mellemstore molekyler trænger ind i nogle af porerne og elueres senere. De mindste molekyler, hvis hydrodynamiske radius 
er mindre end gelens porer, kan trænge ind i alle porer og elueres 
sidst.
 
I den ideelle situation er kun molekylernes størrelse bestemmende for 
adskillelsen, men i praksis er det umuligt helt at undgå interferens fra 
absorption. Uensartet kolonnepakning og dødvolumener kan forværre 
dette forhold (2).  
Detektoren arbejder med f.eks. brydningsindeks eller UV-absorption 
og giver en simpel fordelingskurve. For at få hæftet faktiske mole ­
kylvægtsværdier på kurven, må kolonnen kalibreres ved at lede 
polymerer med kendt molekylvægt og helst stort set samme struktur, 
f.eks. forskellige polystyrenstandarder, gennem den. Resultatet er typisk en gauss-kurve, undertiden trukket ud i en lille hale i den lavmolekylære ende, hvor den lodrette akse viser mængden (i vægt) 
af de forskellige eluerede molekyler, og den vandrette akse viser 
logaritmen til molekylvægten.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Repeterbarheden (den relative standardafvigelse) bør være mindre 
end 0,3 % for det eluerede volumen. Den krævede repeterbarhed for analysen skal sikres ved korrektion med intern standard, hvis 
et kromatogram evalueres tidsafhængigt og ikke opfylder oven ­
nævnte kriterium (1). Polydispersiteten afhænger af standardernes molekylvægt. For polystyrenstandarder er følgende værdier typiske: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p er standardens molekylvægt ved toppens maksimum)  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Fremstilling af standardopløsninger af polystyren  
Polystyrenstandarderne opløses ved omhyggelig blanding med det 
valgte elueringsmiddel. Ved fremstillingen skal der nøje tages hensyn til producentens anvisninger.
 
Hvilken koncentration der vælges, afhænger af forskellige faktorer, 
f.eks. injektionsvolumen, opløsningens viskositet og detektorens følsomhed. Det maksimale injektionsvolumen skal tilpasses til kolon ­
nens længde, så man undgår overbelastning. Typisk er injektions ­
volumen for en GPC-kolonne på 30 cm × 7,8 mm normalt mellem 
40 og 100 μl til analytisk separation. Større rumfang kan tillades, 
men det bør ikke overstige 250 μl. Det optimale forhold mellem 
injektionsvolumen og koncentration må fastlægges inden den egent ­
lige kalibrering af kolonnen.
 
1.6.2.  Fremstilling af testopløsning  
I princippet gælder der samme krav ved fremstilling af testopløsnin ­
gen. Prøven opløses i et egnet opløsningsmiddel, f.eks. tetrahydro ­
furan (THF), ved omhyggelig omrystning. Der må under ingen 
omstændigheder benyttes ultralydbad til opløsningen. Om nødven ­
digt kan testopløsningen renses på membranfilter med en porestør ­
relse mellem 0,2 og 2 μm. 
I den endelige rapport skal det oplyses, om der er uopløste partikler 
til stede, idet det kan skyldes højmolekylære bestanddele. Der 
benyttes en egnet metode til at bestemme den procentvise vægt ­
mængde af de uopløste partikler. Opløsningerne benyttes inden for et døgn.
 
1.6.3.  Apparatur  
— opløsningsmiddelbeholder  
— afgasningsapparat (hvis påkrævet)  
— pumpe  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— pulsdæmper (hvis påkrævet)  
— injektionssystem  
— kromatografikolonner  
— detektor  
— flowmeter (hvis påkrævet)  
— skriver/databehandlingsenhed  
— affaldsbeholder.  
Det skal sikres, at GPC-systemet er ufølsomt over for de anvendte 
opløsningsmidler (f.eks. ved brug af kapillarrør af stål til THF).  
1.6.4.  Injektions- og opløsningsmiddeltilførselssystem  
Der sættes et veldefineret volumen af prøveopløsningen på kolonnen, 
enten med en autosampler eller manuelt i en skarpt afgrænset zone. 
For hurtig tilbagetrækning eller indtrykning af stemplet i injektions ­
sprøjten ved manuel indsprøjtning kan medføre ændringer i den iagt ­
tagne molekylvægtsfordeling. Systemet for tilførsel af opløsnings ­
middel skal så vidt muligt være pulsationsfrit, helst indeholde en 
pulsdæmper. Flowet skal være omkring 1 ml/min.  
1.6.5.  Kolonne  
Afhængigt af prøven karakteriseres polymeren enten på en enkelt 
kolonne eller på flere serieforbundne kolonner. I handelen fås en 
række porøse kolonnematerialer med veldefinerede egenskaber (f.eks. porestørrelse og øvre og nedre grænse). Valget af separa ­
tionsgel og kolonnelængde afhænger af prøvens egenskaber (hydro ­
dynamisk volumen og molekylvægtsfordeling) og af de specifikke 
adskillelsesbetingelser såsom opløsningsmiddel, temperatur og flow ­
hastighed (1) (2) (3).
 
1.6.6.  Teoretiske bunde  
Den kolonne eller kolonnekombination, der benyttes til adskillelse, 
skal karakteriseres ved antallet af teoretiske bunde. Ved brug af THF som opløsningsmiddel gøres dette ved, at man sætter en opløsning af 
ethylbenzen eller et andet passende ikke-polært opløst stof på en 
kolonne af kendt længde. Antallet af teoretiske bunde er givet ved følgende udtryk: 
N ¼ 5; 54 Í
 V e 
W 1=2 Î 2 
eller N ¼ 16 Í V e 
W Î 2 
hvor 
N = er antallet af teoretiske bunde  
V e = er elueringsvolumenet ved toppens maksimum  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = er toppens bredde ved basislinjen  
W 1/2 = er toppens bredde i halv højde  
1.6.7.  Adskillelseseffektiviteten  
Ud over antallet af teoretiske bunde, som er en størrelse, der 
bestemmer båndbredden, spiller også adskillelseseffektiviteten en 
rolle, og den bestemmes ved kalibreringskurvens stejlhed. En kolonnes adskillelseseffektivitet er givet ved følgende sammenhæng:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
Kolonnens tværsnit ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
hvor 
V e, Mx = er elueringsvolumenet for polystyren med molekyl ­
vægten  M x 
V e,(10.Mx)  = er elueringsvolumenet for polystyren med en ti gange 
så høj molekylvægt  
Systemets adskillelsesevne defineres normalt som følger:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
hvor 
V e1 og V e2 = er elueringsvolumen for de to polystyrenstandarder 
ved toppenes maksimum  
W 1 og W 2 = er toppenes bredde ved basislinjen  
M 1 og M 2 = er molekylvægtene ved toppenes højde (normalt en 
forskel på en faktor 10).  
R-værdien for kolonnesystemet bør være større end 1,7 (4).  
1.6.8.  Opløsningsmidler  
Alle opløsningsmidler skal være af høj renhed (for THF en renheds ­
grad på 99,5 %). Opløsningsmiddelbeholderen (om nødvendigt med 
inert atmosfære) skal rumme tilstrækkelig meget til, at kolonnen kan kalibreres, og der kan analyseres flere prøver. Opløsningsmidlet skal afgasses, inden det pumpes videre til kolonnen.
 
1.6.9.  Temperaturregulering  
Temperaturen i de kritiske komponenter (injektionssløjfe, kolonner, 
detektor og rør og slanger) skal være konstant og passe til det valgte 
opløsningsmiddel.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detektor  
Detektoren har til formål at give et kvantitativt mål for koncentra ­
tionen af teststoffet i eluatet fra kolonnen. For at gøre den uundgåe ­
lige forbredning af toppene mindst mulig skal detektorcellens 
volumen være så lille som muligt. Det må ikke være større end 
10 μl, undtagen for detektorer baseret på lysspredning og viskositet. 
Sædvanligvis benyttes der differentialrefraktometri til detektering. Hvis særlige egenskaber ved prøve eller elueringsmiddel kræver 
det, kan der benyttes andre detektortyper, f.eks. UV/VIS-, IR- eller 
viskositetsdetektor.
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. DATA  
Der henvises til DIN-standarden (1) for så vidt angår detaljerede 
evalueringskriterier og krav til dataindsamling og -behandling.  
Der udføres to uafhængige forsøg med hver prøve. De analyseres 
hver for sig.  
M n , M  w , M  w /M n og M  p anføres for hver måling. Det skal udtryk ­
kelig anføres, at de målte værdier er relative værdier svarende til den benyttede standards molekylvægt.
 
Efter at retentionsvolumen eller retentionstid (eventuelt korrigeret 
ved hjælp af intern standard) er bestemt, afbildes værdier af log 
M p (M p er maksimum for kalibreringsstandardens top) mod en af 
disse størrelser. Der kræves mindst to kalibreringspunkter i hver molekylvægtsdekade og mindst fem målepunkter for hele kurven; sidstnævnte bør spænde over prøvens formodede molekylvægt. Slut ­
punktet i kalibreringskurvens lavmolekylære ende fastlægges ved n- 
hexylbenzen eller et andet passende ikke-polært stof. Antals- og vægtmiddelmolekylvægten bestemmes i reglen ved elektronisk data ­
behandling på grundlag af udtrykkene i punkt 1.2. Til brug for 
manuel behandling er der yderligere oplysninger i ASTM D 
3536/91 (3).
 
Fordelingskurven skal forelægges i form af en tabel eller en figur 
(frekvens eller kumulativ sum mod log M). I en grafisk fremstilling skal en molekylær dekade normalt svare til ca. 4 cm i bredden, og 
den maksimale tophøjde skal være ca. 8 cm høj. I tilfælde af en 
integreret fordeling skal forskellen mellem 0 og 100 % på ordinaten være ca. 10 cm.
 
2.2. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
2.2.1.  Teststof:  
— foreliggende oplysninger om teststoffet (identitet, tilsætningsstof ­
fer, urenheder)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— beskrivelse af behandling af prøven, iagttagelser, problemer.  
2.2.2.  Instrumenter:  
— beholder til elueringsmiddel, inert gas, afgasning af eluerings ­
middel, elueringsmidlets sammensætning, urenheder  
— pumpe, pulsdæmper, injektionssystem  
— separationskolonner (fabrikat, alle specifikationer for kolonnen, 
såsom porestørrelse og separationsmaterialets art, samt antal, længde og rækkefølge af de anvendte kolonner)
 
— antal teoretiske bunde i kolonnen (eller kolonnekombinationen), 
adskillelseseffektivitet (systemets adskillelsesevne)  
— oplysninger om toppenes symmetri  
— kolonnetemperatur, temperaturregulering  
— detektor (måleprincip, type, cellevolumen)  
— eventuelt flowmeter (fabrikat, måleprincip)  
— dataopsamlings- og databehandlingssystem (hardware og 
software).  
2.2.3.  Kalibrering af systemet:  
— detaljeret beskrivelse af den metode, der er benyttet til fremstil ­
ling af kalibreringskurven  
— oplysninger om kvalitetskriterier for metoden (f.eks. korrelations ­
koefficient, sum af afvigelsers kvadrater)  
— oplysninger om alle ekstrapoleringer, forudsætninger og tilnær ­
melser, der er gjort under forsøget og dataevalueringen og 
-behandlingen  
— alle målinger, der er benyttet til fremstilling af kalibreringskur ­
ven, skal dokumenteres i en tabel, som indeholder følgende oplysninger om hvert enkelt kalibreringspunkt:
 
— prøvens navn  
— fabrikant  
— karakteristiske værdier af parametrene M  p , M  n , M  w og 
M w /M n , som oplyst af fabrikanten eller udledt ved efterføl ­
gende målinger samt detaljerede oplysninger om måleme ­
toden  
— injektionsvolumen og -koncentration  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— benyttet M  p -værdi ved kalibrering  
— elueringsvolumen eller korrigeret retentionstid målt ved 
topmaksimum  
— M  p -værdi beregnet ved topmaksimum  
— procentvis fejl på den beregnede M  p -værdi og kalibrerings ­
værdien.  
2.2.4.  Evaluering:  
— evaluering på tidsbasis: angivelse af, hvilke metoder der benyttes 
til at sikre den krævede reproducerbarhed (korrektionsmetode, 
intern standard, m.v.)  
— oplysninger om, om evalueringen er foretaget på grundlag af 
elueringsvolumen eller retentionstid  
— oplysninger om begrænsningerne for evalueringen, hvis en top 
ikke er fuldstændigt analyseret  
— beskrivelse af eventuelle udglatningsmetoder  
— procedurer for tilberedning og forbehandling af prøven  
— tilstedeværelse af eventuelle uopløste partikler  
— injektionsvolumen ( μl) og injektionskoncentration (mg/ml)  
— iagttagelser, der tyder på afvigelser fra den ideelle GPC-profil  
— detaljeret beskrivelse af alle ændringer i testproceduren  
— detaljerede oplysninger om usikkerhedsintervaller  
— alle øvrige oplysninger og iagttagelser, der er relevante for 
fortolkningen af resultaterne.  
3. HENVISNINGER  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Tillæg  
Eksempler på andre metoder til bestemmelse af antalsmiddelmolekylvægt 
(M n ) for polymerer  
Gelpermeationskromatografi er den foretrukne metode til bestemmelse af M  n , 
især når der er rådighed over et sæt standarder med tilnærmelsesvis samme 
struktur som den pågældende polymer. Hvis der er praktiske problemer med at 
udføre GPC, eller hvis der allerede er en formodning om, at stoffet ikke kan opfylde det fastsatte M
 n -kriterium (og dette ønskes bekræftet), er der alternative 
metoder til rådighed, f.eks.:  
1. Brug af kolligative egenskaber  
1.1. Ebullioskopi/kryoskopi  
består i at måle et opløsningsmiddels kogepunktsforhøjelse (ebullio ­
skopi) eller frysepunktssænkning (kryoskopi), når polymeren tilsættes. 
Metoden bygger på, at den opløste polymers indvirkning på væskens 
kogepunkt/frysepunkt afhænger af dens molekylvægt (1) (2).  
Anvendelsesområde: M  n < 20 000.  
1.2. Damptrykssænkning  
består i at måle damptrykket af en valgt referencevæske før og efter 
tilsætning af en kendt mængde polymer (1) (2).  
Anvendelsesområde: M  n < 20 000 (teoretisk; i praksis dog af 
begrænset værdi).  
1.3. Membranosmometri  
bygger på det osmotiske princip, dvs. opløsningsmiddelmolekylers 
naturlige tendens til at passere gennem en semipermeabel membran fra en tynd til en mere koncentreret opløsning for at etablere lige ­
vægt. Ved testen har den tynde opløsning en koncentration på nul, 
mens den mere koncentrerede opløsning indeholder polymeren. 
Opløsningsmidlets bevægelse gennem membranen giver en trykfor ­
skel, der afhænger af polymerens koncentration og molekylvægt (1) (3) (4).
 
Anvendelsesområde: M  n < 20 000-200 000.  
1.4. Vapour Phase Osmometry  
Gasfaseosmometri består i at sammenligne fordampningshastigheden 
i en ren opløsningsmiddelaerosol med mindst tre aerosoler, der inde ­
holder den pågældende polymer i forskellige koncentrationer (1) (5) (6).
 
Anvendelsesområde: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Endegruppeanalyse  
For at kunne bruge denne metode skal man have kendskab både til 
polymerens overordnede struktur og til kædetermineringsgruppernes karakter (endegrupperne skal kunne skelnes fra hovedskelettet ved f.eks. NMR eller titrering/derivatisering). Ved bestemmelse af den 
molekylære koncentration af endegrupper i polymeren kan man nå 
frem til en værdi for molekylvægten (7) (8) (9).
 
Anvendelsesområde: M  n op til 50 000 (idet pålideligheden aftager).  
3. Henvisninger  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York.  
(2) Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by 
Membrane Osmometry. American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania.  
(4) Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 
25-52.  
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.
 
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Deter ­
minationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
(7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 
In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
 
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139- 
2146.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  POLYMERERS INDHOLD AF LAVMOLEKYLÆRE 
BESTANDDELE  
1. METODE  
Denne gelpermeationskromatografiske metode er en gengivelse af 
OECD Test Guideline 119 (1996). Grundprincipper og yderligere 
tekniske oplysninger findes i henvisningerne.  
1.1. INDLEDNING  
Da polymerer kan have vidt forskellige egenskaber, er det umuligt at 
beskrive én metode med nøjagtig angivelse af alle betingelser for 
adskillelse og evaluering, som dækker alle tænkelige særtilfælde, der kan forekomme under adskillelse af polymerer. Især er komplekse polymersystemer ofte uegnede til gelpermeationskromatografi (GPC). 
Er det ikke praktisk muligt at foretage GPC, kan molekylvægten 
bestemmes ved andre metoder (se tillægget). I så fald skal der gives en begrundelse for valget af metode og en fuldstændig beskri ­
velse af den.
 
Den beskrevne metode er baseret på DIN-standard 55672 (1). Heri 
findes der detaljerede oplysninger om, hvordan forsøgene udføres, og hvordan dataene evalueres. Hvis det bliver nødvendigt at ændre på 
forsøgsbetingelserne, skal disse ændringer begrundes. Der kan 
benyttes andre standarder, hvis der gives nøjagtige henvisninger dertil. I den beskrevne metode benyttes der polystrenprøver med kendt polydispersitet til kalibrering; for visse polymerer, f.eks. 
vandopløselige polymerer og langkædede forgrenede polymerer, 
kan det være nødvendigt at ændre på dette.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Lavmolekylære bestanddele defineres arbitrært som bestanddele med 
en molekylvægt på mindre end 1 000 dalton.  
Antalsmiddelmolekylvægten M  n og vægtmiddelmolekylvægten M  w 
bestemmes ved følgende udtryk: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
hvor 
H I = er detektorsignalets højde over basislinjen ved retentions ­
volumen V  i 
M i = er molekylvægten af polymerfraktionen ved retentions ­
volumen V  i , og n er antallet af datapunkter  
Bredden af molekylvægtsfordelingen, som er et mål for systemets 
dispersitet, er givet ved forholdet M  w /M n . ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
Da GPC er en relativ metode, må der foretages en kalibrering. Hertil 
benyttes der normalt lineære polystyrenstandarder med kendte middelmolekylvægte M
 n og M  w og kendt snæver molekylvægtsfor ­
deling. Kalibreringskurven kan kun benyttes til bestemmelse af 
molekylvægten af den ukendte prøve, hvis der er valgt identiske betingelser for separation af prøven og standarden.
 
Den sammenhæng mellem molekylvægt og elueringsvolumen, der 
bestemmes, gælder kun for de særlige betingelser ved det bestemte 
forsøg. Disse betingelser er først og fremmest temperatur, opløs ­
ningsmiddel (eller opløsningsmiddelblanding), kromatograferings ­
betingelser og adskillelseskolonne eller -kolonnesystem.  
Den molekylvægt, der på denne måde bestemmes for prøven, er 
relativ og betegnes »polystyrenækvivalent molekylvægt«. Det bety ­
der, at molekylvægten kan afvige mere eller mindre fra den absolutte værdi, afhængigt af strukturmæssige og kemiske forskelle mellem 
standard og prøve. Hvis der benyttes en anden standard, f.eks. poly ­
ethylenglycol, polyethylenoxid, polymethylmethacrylat eller polya ­
crylsyre, skal dette begrundes.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Både molekylvægtfordelingen og middelmolekylvægten af prøven 
(både M  w og M  n ) kan bestemmes ved GPC. GPC er en særlig 
type væskekromatografi, hvor prøvens bestanddele adskilles efter 
hydrodynamisk volumen (2).  
Adskillelsen sker, mens prøven passerer gennem en kolonne med 
porøst materiale, typisk en organisk gel. Små molekyler kan 
trænge ind i porerne, mens store molekyler ikke kan. På denne 
måde får de store molekyler en kortere vejlængde, så de elueres først. Mellemstore molekyler trænger ind i nogle af porerne og elueres senere. De mindste molekyler, hvis hydrodynamiske radius 
er mindre end gelens porer, kan trænge ind i alle porer og elueres 
sidst.
 
I den ideelle situation er kun molekylernes størrelse bestemmende for 
adskillelsen, men i praksis er det umuligt helt at undgå interferens fra 
absorption. Uensartet kolonnepakning og dødvolumener kan forværre 
dette forhold (2).  
Detektoren arbejder med f.eks. brydningsindeks eller UV-absorption 
og giver en simpel fordelingskurve. For at få hæftet faktiske mole ­
kylvægtsværdier på kurven, må kolonnen kalibreres ved at lede 
polymerer med kendt molekylvægt og helst stort set samme struktur, 
f.eks. forskellige polystyrenstandarder, gennem den. Resultatet er typisk en gauss-kurve, undertiden trukket ud i en lille hale i den lavmolekylære ende, hvor den lodrette akse viser mængden (i vægt) 
af de forskellige eluerede molekyler, og den vandrette akse viser 
logaritmen til molekylvægten.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Af denne kurve udledes indholdet af lavmolekylære bestanddele. 
Beregningen er kun nøjagtig, hvis de lavmolekylære bestanddele 
modsvarer polymeren som helhed på massebasis.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Repeterbarheden (den relative standardafvigelse) bør være mindre 
end 0,3 % for det eluerede volumen. Den krævede repeterbarhed 
for analysen skal sikres ved korrektion med intern standard, hvis et kromatogram evalueres tidsafhængigt og ikke opfylder oven ­
nævnte kriterium (1). Polydispersiteten afhænger af standardernes 
molekylvægt. For polystyrenstandarder er følgende værdier typiske 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
M p et standardens molekylvægt ved toppens maksimum)  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Fremstilling af standardopløsninger af polystyren  
Polystyrenstandarderne opløses ved omhyggelig blanding med det 
valgte elueringsmiddel. Ved fremstillingen skal der nøje tages hensyn til producentens anvisninger.
 
Hvilken koncentration der vælges, afhænger af forskellige faktorer, 
f.eks. injektionsvolumen, opløsningens viskositet og detektorens 
følsomhed. Det maksimale injektionsvolumen skal tilpasses til kolon ­
nens længde, så man undgår overbelastning. Typisk er injektions ­
volumen for en GPC-kolonne på 30 cm × 7,8 mm normalt mellem 40 og 100 μl til analytisk separation. Større rumfang kan tillades, 
men det bør ikke overstige 250 μl. Det optimale forhold mellem 
injektionsvolumen og koncentration må fastlægges inden den egent ­
lige kalibrering af kolonnen.
 
1.6.2.  Fremstilling af testopløsning  
I princippet gælder der samme krav ved fremstilling af testopløsnin ­
gen. Prøven opløses i et egnet opløsningsmiddel, f.eks. tetrahydro ­
furan (THF) ved omhyggelig omrystning. Der må under ingen 
omstændigheder benyttes ultralydbad til opløsningen. Om nødven ­
digt kan testopløsningen renses på membranfilter med en porestør ­
relse mellem 0,2 og 2 μm. 
I den endelige rapport skal det oplyses, om der er uopløste partikler 
til stede, idet det kan skyldes højmolekylære bestanddele. Der benyttes en egnet metode til at bestemme den procentvise vægt ­
mængde af de uopløste partikler. Opløsningerne benyttes inden for 
et døgn.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Korrektion for indhold af urenheder og additiver  
Det er normalt nødvendigt at korrigere indholdet af bestanddele med 
M < 1 000 for bidrag fra ikke-polymere bestanddele (f.eks. uren ­
heder og/eller additiver), medmindre der allerede er målt et 
indhold på < 1 %. Dette gøres ved direkte analyse på polymerop ­
løsningen eller GPC-eluatet.  
Hvis eluatet efter passage af kolonnen er for fortyndet til yderligere 
analyse, må det koncentreres. Det kan være nødvendigt at inddampe eluatet til tørhed og genopløse det. Eluatet skal koncentreres på en 
sådan måde, at der med sikkerhed ikke sker ændringer i det. Behand ­
lingen af eluatet efter GPC-trinnet vil afhænge af, hvilken analyse ­
metode der anvendes til kvantitativ bestemmelse.
 
1.6.4.  Apparatur  
GPC-udstyr bestående af følgende komponenter:  
— opløsningsmiddelbeholder  
— afgasningsapparat (hvis påkrævet)  
— pumpe  
— pulsdæmper (hvis påkrævet)  
— injektionssystem  
— kromatografikolonner  
— detektor  
— flowmeter (hvis påkrævet)  
— skriver/databehandlingsenhed  
— affaldsbeholder  
Det skal sikres, at GPC-systemet er ufølsomt over for de anvendte 
opløsningsmidler (f.eks. ved brug af kapillarrør af stål til THF).  
1.6.5.  Injektions- og opløsningsmiddeltilførselssystem  
Der sættes et veldefineret volumen af prøveopløsningen på kolonnen, 
enten med en autosampler eller manuelt i en skarpt afgrænset zone. For hurtig tilbagetrækning eller indtrykning af stemplet i injektions ­
sprøjten ved manuel indsprøjtning kan medføre ændringer i den iagt ­
tagne molekylvægtsfordeling. Systemet for tilførsel af opløsnings ­
middel skal så vidt muligt være pulsationsfrit, helst indeholde en pulsdæmper. Flowet skal være omkring 1 ml/min.
 
1.6.6.  Kolonne  
Afhængigt af prøven karakteriseres polymeren enten på en enkelt 
kolonne eller på flere serieforbundne kolonner. I handelen fås en 
række porøse kolonnematerialer med veldefinerede egenskaber 
(f.eks. porestørrelse og øvre og nedre grænse). Valget af separa ­
tionsgel og kolonnelængde afhænger af prøvens egenskaber (hydro ­
dynamisk volumen og molekylvægtsfordeling) og af de specifikke 
adskillelsesbetingelser såsom opløsningsmiddel, temperatur og flow ­
hastighed (1) (2) (3).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Teoretiske bunde  
Den kolonne eller kolonnekombination, der benyttes til adskillelsen, 
skal karakteriseres ved antallet af teoretiske bunde. Ved brug af THF som opløsningsmiddel gøres dette ved, at man sætter en opløsning af 
ethylbenzen eller et anden passende ikke-polært opløst stof på en 
kolonne af kendt længde. Antallet af teoretiske bunde er givet ved følgende udtryk: 
N ¼ 5; 54 Í
 V e 
W 1=2 Î2 
eller N ¼ 16 Í V e 
W Î2 
hvor,  
N = er antallet af teoretiske bunde  
V e = er elueringsvolumenet ved toppens maksimum  
W = er toppens bredde ved basislinjen  
W 1/2 = er toppens bredde i halv højde  
1.6.8.  Adskillelsereffektiviteten  
Ud over antallet af teoretiske bunde, som er en størrelse, der 
bestemmer båndbredden, spiller også adskillelseseffektiviteten en rolle, og den bestemmes ved kalibreringskurvens stejlhed. En kolonnes adskillelseseffektivitet er givet ved følgende sammenhæng:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
Kolonnens tværsnit ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
hvor 
V e, Mx = er elueringsvolumenet for polystyren med molekyl ­
vægten M  x 
V e,(10.Mx)  = er elueringsvolumenet for polystyren med en ti gange 
så høj molekylvægt  
Systemets adskillelsesevne defineres normalt som følger:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
hvor 
V e1 og V e2 = er elueringsvolumen for de to polystyrenstandarder 
ved toppenes maksimum  
W 1 og W 2 = er toppenes bredde ved basislinjen  
M 1 og M 2 = er molekylvægtene ved toppenes højde (normalt en 
forskel på en faktor 10).  
R-værdien for kolonnesystemet bør være større end 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Opløsningsmidler  
Alle opløsningsmidler skal være af høj renhed (for THF en renheds ­
grad på 99,5 %). Opløsningsmiddelbeholderen (om nødvendigt med inert atmosfære) skal rumme tilstrækkelig meget til, at kolonnen kan 
kalibreres, og der kan analyseres flere prøver. Opløsningsmidlet skal 
afgasses, inden det pumpes videre til kolonnen.
 
1.6.10.  Temperaturregulering  
Temperaturen i de kritiske komponenter (injektionssløjfe, kolonner, 
detektor og rør og slanger) skal være konstant og passe til det valgte 
opløsningsmiddel.  
1.6.11.  Detektor  
Detektoren har til formål at give et kvantitativt mål for koncentra ­
tionen af teststoffet i eluatet fra kolonnen. For at gøre den uundgåe ­
lige forbredning af toppene mindst mulig skal detektorcellens volumen være så lille som muligt. Det må ikke være større end 10 
μl, undtagen for detektorer baseret på lysspredning og viskositet. 
Sædvanligvis benyttes der differentialrefraktometri til detektering. Hvis særlige egenskaber ved prøve eller elueringsmiddel kræver 
det, kan der benyttes andre detektortyper, f.eks. UV/VIS-, IR-eller 
viskositetsdetektor.
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. DATA  
Der henvises til DIN-standarden (1) for så vidt angår detaljerede 
evalueringskriterier og krav til dataindsamling og -behandling.  
Der udføres to uafhængige forsøg med hver prøve. De analyseres 
hver for sig. Det er i alle tilfælde vigtigt også at bestemme data for blindprøver, der er behandlet på samme måde som prøven.
 
Det skal udtrykkelig anføres, at de målte værdier er relative værdier 
svarende til den benyttede standards molekylvægt.  
Efter at retentionsvolumen eller retentionstid (eventuelt korrigeret 
ved hjælp af intern standard) er bestemt, afbildes værdier af log M
 p (M p er maksimum for kalibreringsstandardens top) mod en af 
disse størrelser. Der kræves mindst to kalibreringspunkter i hver 
molekylvægtsdekade og mindst fem målepunkter for hele kurven; sidstnævnte bør spænde over prøvens formodede molekylvægt. Slut ­
punktet i kalibreringskurvens lavmolekylære ende fastlægges ved n- 
hexylbenzen eller et andet passende ikke-polært stof. Den del af 
kurven, der svarer til molekylvægte under 1 000, bestemmes og korrigeres efter behov for urenheder og additiver. Elueringskurverne evalueres i reglen ved elektronisk databehandling. Til brug for 
manuel behandling er der yderligere oplysninger i ASTM D 3536- 
91 (3).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Uopløselig polymer, der måtte være tilbageholdt på kolonnen, vil 
efter al sandsynlighed have en molekylvægt, der er større end den 
opløselige fraktions, så hvis den lades ude af betragtning, vil indholdet af lavmolekylære bestanddele blive anslået for højt. I tillægget er der en vejledning i, hvordan indholdet af lavmolekylære 
bestanddele korrigeres for uopløselig polymer.
 
Fordelingskurven skal forelægges i form af en tabel eller en figur 
(frekvens eller kumulativ sum mod log M). I en grafisk fremstilling 
skal en molekylær dekade normalt svare til ca. 4 cm i bredden, og 
den maksimale tophøjde skal være ca. 8 cm høj. I tilfælde af en integreret fordeling skal forskellen mellem 0 og 100 % på ordinaten 
være ca. 10 cm.
 
2.2. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
2.2.1.  Teststof:  
— Foreliggende oplysninger om teststoffet (identitet, tilsætningsstof ­
fer, urenheder)  
— Beskrivelse af behandling af prøven, iagttagelser, problemer.  
2.2.2.  Instrumenter:  
— Beholder til elueringsmiddel, inert gas, afgasning af eluerings ­
middel, elueringsmidlets sammensætning, urenheder  
— Pumpe, pulsdæmper, injektionssystem  
— Separationskolonner (fabrikat, alle specifikationer for kolonnen, 
såsom porestørrelse og separationsmaterialets art, samt antal, længde og rækkefølge af de anvendte kolonner)
 
— Antal teoretiske bunde i kolonnen (eller kolonnekombinationen), 
adskillelseseffektivitet (systemets adskillelsesevne)  
— Oplysninger om toppenes symmetri  
— Kolonnetemperatur, temperaturregulering  
— Detektor (måleprincip, type, cellevolumen)  
— Eventuelt flowmeter (fabrikat, måleprincip)  
— Dataopsamlings- og databehandlingssystem (hardware og 
software).  
2.2.3.  Kalibrering af systemet:  
— Detaljeret beskrivelse af den metode, der er benyttet til fremstil ­
ling af kalibreringskurven  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— Oplysninger om kvalitetskriterier for metoden (f.eks. korrela ­
tionskoefficient, sum af afvigelsers kvadrater  
— Oplysninger om alle ekstrapoleringer, forudsætninger og tilnær ­
melser, der er gjort under forsøget og dataevalueringen og -behandlingen
 
— Alle målinger, der er benyttet til fremstilling af kalibreringskur ­
ven, skal dokumenteres i en tabel, som indeholder følgende oplysninger om hvert enkelt kalibreringspunkt:
 
— prøvens navn  
— fabrikant  
— karakteristiske værdier af parametrene M  p , M  n , M  w , og 
M w /M n , som oplyst af fabrikanten udledt ved efterfølgende 
målinger samt detaljerede oplysninger om målemetoden  
— injektionsvolumen og -koncentration  
— benyttet M  p -værdi ved kalibrering  
— elueringsvolumen eller korrigeret retentionstid målt ved 
topmaksimum  
— M  p -værdi beregnet ved topmaksimum  
— procentvis fejl på den beregnede M  p -værdi og kalibrerings ­
værdien.  
2.2.4.  Oplysninger om indholdet af lavmolekylære bestanddele:  
— beskrivelse af de metoder, der er benyttet til analysen, og 
hvordan forsøgene er udført  
— oplysninger om det procentvise indhold (w/w) af lavmolekylære 
bestanddele i forhold til hele prøven  
— oplysninger om urenheder, additiver og andre ikke-polymere 
bestanddele i vægtprocent i forhold til hele prøven  
2.2.5.  Evaluering:  
— Evaluering på tidsbasis: angivelse af, hvilke metoder der benyttes 
til at sikre den krævede reproducerbarhed (korrektionsmetode, 
intern standard, m.v.)  
— Oplysninger om, om evalueringen er foretaget på grundlag af 
elueringsvolumen eller retentionstid  
— Oplysninger om begrænsningerne for evalueringen, hvis en top 
ikke er fuldstændigt analyseret  
— Beskrivelse af eventuelle udglatningsmetoder  
— Procedurer for tilberedning og forbehandling af prøven  
— Tilstedeværelse af eventuelle uopløste partikler  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— Injektionsvolumen ( μl) og injektionskoncentration (mg/ml)  
— Iagttagelser, der tyder på afvigelser fra den ideelle GPC-profil  
— Detaljeret beskrivelse af alle ændringer i testproceduren  
— Detaljerede oplysninger om usikkerhedsintervaller  
— Alle øvrige oplysninger og iagttagelser, der er relevante for 
fortolkningen af resultaterne.  
3. HENVISNINGER  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Tillæg  
Vejledning i, hvordan indholdet af lavmolekylære bestanddele korrigeres for 
uopløselig polymer  
Indhold af uopløselig polymer i prøven vil medføre et vist massetab under GPC- 
analysen. Den uopløselige polymer tilbageholdes irreversibelt på kolonnen eller 
prøvefiltret, mens den opløselige del af prøven passerer gennem kolonnen. Hvis 
tilvæksten i polymerens brydningsindeks (dn/dc) kan skønnes eller måles, kan man få et skøn over, hvor stor en masse der er gået tabt på kolonnen. I så fald foretages korrektionen ved hjælp af en ekstern kalibrering med standardmaterialer 
med kendt koncentration og dn/dc, så refraktometerets udslag kalibreres. I neden ­
stående eksempel er der benyttet en standard af poly (methylmethacrylat) (pMMA).
 
Ved ekstern kalibrering med henblik på analyse af acrylpolymere analyseres en 
pMMA-standard med kendt koncentration i tetrahydrofuran ved GPC, og de 
fremkomme data benyttes til bestemmelse af refraktometerkonstanten efter 
følgende udtryk:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
hvor 
K = er refraktometerkonstanten (i mikrovolt-sekund/ml)  
R = er pMMA-standardens udslag (mikrovolt-sekund)  
C = er pMMA-standardens koncentration (i mg/ml)  
V = er injektionsvolumenet (i ml), og  
dn/dc = er brydningsindekstilvæksten for pMMA i tetrahydrofuran (i ml/mg)  
Følgende data er typiske for en pMMA-standard:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg  
Den fremkomne K-værdi på 3,05 × 10  11 benyttes derefter til beregning af det 
teoretiske detektorudslag, hvis 100 % af polymeren elueres gennem detektoren.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  POLYMERERS OPLØSELIGHED/EKSTRAHERBARHE D I 
VAND  
1. METODE  
Den beskrevne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 
120 (1997). Yderligere tekniske oplysninger findes i henvisning (1).  
1.1. INDLEDNING  
For visse polymerer, f.eks. emulsionspolymerer, kan det være 
nødvendigt at gøre yderligere forberedelser, inden den nedenfor beskrevne metode kan benyttes. Metoden kan ikke anvendes for 
flydende polymerer og polymerer, der kan reagere med vand under 
testbetingelserne.
 
Når metoden ikke er bekvem eller er umulig at benytte, må 
opløseligheden/ekstraherbarheden undersøges ved andre metoder. I så fald skal gives alle detaljer og en begrundelse for valget af 
metode.
 
1.2. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Polymerers opløselighed/ekstraherbarhed i vandigt medium 
bestemmes ved hjælp af kolbemetoden (jf. A.6 Vandopløselighed — kolbemetoden) med de i det følgende beskrevne ændringer.
 
1.4. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.5.1.  Udstyr  
Der er brug for følgende udstyr til metoden:  
— findelingsapparat, f.eks. mølle, til fremstilling af partikler med 
kendt størrelse  
— rysteapparat med mulighed for temperaturregulering  
— membranfilter  
— egnet analyseudstyr  
— standardsigter  
1.5.2.  Prøveforberedelse  
En repræsentativ prøve skal først findeles til en partikelstørrelse 
mellem 0,125 og 0,25 mm bestemt med passende sigter. Af hensyn til prøvens stabilitet, kan køling være påkrævet under 
formalingen. Materialer af gummiagtig karakter kan knuses ved 
flydende nitrogens temperatur (1).
 
Hvis det ikke er muligt at nå ned på den krævede partikelstørrelse, 
skal der tilstræbes den mindst mulige partikelstørrelse, og det 
opnåede resultat anføres. Det oplyses i rapporten, hvordan den 
findelte prøve har været opbevaret indtil udførelse af testen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Fremgangsmåde  
Der afvejes 3 prøver på hver 10 g af teststoffet i 3 glaskolber med 
glasprop, og der tilsættes 1 000 ml vand til hver kolbe. Hvis det ikke er praktisk muligt at håndtere 10 g af polymeren, anvendes den 
største mængde, der kan håndteres, og vandmængden reduceres 
tilsvarende.
 
Kolberne lukkes tæt til og omrystes ved 20  o C. Der benyttes en 
anordning, der kan arbejde ved konstant temperatur. Efter 24 timer centrifugeres eller filtreres indholdet af hver enkelt kolbe, og poly ­
merkoncentrationen i den klare vandfase bestemmes med en 
passende analysemetode. Findes der ingen passende analysemetoder 
for vandfasen, kan den samlede opløselighed/ekstraherbarhed skønnes ud fra den tørre vægt af filterkagen eller bundfaldet fra centrifugeringen.
 
Normalt er det nødvendigt at skelne kvantitativt mellem urenheder 
og additiver på den ene side og lavmolekylære forbindelser på den anden side. Ved gravimetrisk bestemmelse er det ligeledes vigtigt at 
medtage en blindprøve uden teststof, så der tages højde for restmate ­
riale hidrørende fra forsøgets udførelse.
 
Polymerers opløselighed/ekstraherbarhed i vand ved 37  o C ved pH 2 
og pH 9 kan bestemmes som beskrevet ved udførelse af eksperi ­
mentet ved 20  o C. pH indstilles ved hjælp af egnede bufferopløs ­
ninger, syrer eller baser, f.eks. saltsyre, eddikesyre, natrium- eller kaliumhydroxid af analysekvalitet eller ammoniak.
 
Der udføres en eller to prøver, afhængigt af den benyttede analyse ­
metode. Når der findes tilstrækkelig specifikke metoder til direkte analyse af vandfasen for polymerkomponenten, skulle én prøve som 
ovenfor beskrevet være tilstrækkeligt. Hvis der derimod ikke findes 
sådanne metoder og polymerens opløselighed/ekstraherbarhed må bestemmes indirekte ved analyse af det vandige ekstrakts indhold af organisk kulstof i alt (TOC), bør der udføres endnu en prøve. 
Prøven bør gentages endnu en gang, denne gang med en ti gange 
mindre polymermængde men samme vandmængde som ved den første prøve.
 
1.5.4.  Analyse  
1.5.4.1.  Test udført med kun én prøvestørrelse  
I nogle tilfælde findes der metoder til direkte analyse af polymer ­
komponenter i vandfasen. Alternativt kan man overveje indirekte at analysere for opløste/ekstraherede polymerkomponenter ved at 
bestemme den samlede mængde opløste bestanddele og korrigere 
for ikke-polymerspecifikke komponenter.
 
Analyse af vandfasen for samtlige polymerforbindelser kan foretages 
ved 
enten en tilstrækkelig følsom metode, f.eks.  
— TOC-bestemmelse ved nedbrydning til CO  2 med persulfat eller 
dichromat efterfulgt af måling ved IR eller kemisk analyse  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— atomabsorptionsspektrometri (AAS) eller induktivt koblet plas ­
maemissionsspektrometri (ICP) for silicium- eller metalholdige 
polymerer  
— UV-absorption ellerr spektrofluorimetri for arylpolymerer  
— LC-MS for lavmolekylære prøver  
eller ved vakuuminddampning af det vandige ekstrakt til tørhed og 
analyse af remanensen ved spektroskopi (IR, UV m.v.) eller 
AAS/ICP.  
Hvis det ikke er praktisk muligt at gennemføre en analyse af selve 
vandfasen, ekstraheres vandekstraktet med et organisk opløsnings ­
middel, der ikke er blandbart med vand, f.eks. en chloreret kulbrinte. 
Derefter afdampes opløsningsmidlet, og remanensen analyseres som ovenfor for indhold af den pågældende polymer. Bestanddele i denne remanens, som identificeres som urenheder eller additiver, fratræk ­
kes, når selve polymerens opløselighed/ekstraherbarhed beregnes.
 
Når der er forholdsvis store stofmængder til stede, kan det være 
nødvendigt at foretage f.eks. HPLC- eller GC-analyse af remanensen for at skelne urenheder fra monomere og monomerderivater, så det 
virkelige indhold af sidstnævnte kan bestemmes.
 
I nogle tilfælde vil simpel afdampning af det organiske opløsnings ­
middel og vejning af den tørre remanens være tilstrækkeligt.  
1.5.4.2.  Test udført med to forskellige prøvestørrelser  
Alle vandige ekstrakter analyseres for TOC.  
Der foretages gravimetrisk bestemmelse af den del af prøven, der 
ikke er gået i opløsning. Hvis der efter centrifugering eller filtrering 
af de enkelte kolbers indhold stadig sidder polymerrester fast på kolbens væg, skylles kolben med filtratet, indtil der ikke længere er synlige rester i kolben. Derefter centrifugeres eller filtreres filtratet 
igen. Filterkagen eller bundfaldet fra centrifugeringen tørres ved 
40
 o C under vakuum og vejes. Tørringen fortsættes til konstant vægt.  
2. DATA  
2.1. TEST UDFØRT MED KUN ÉN PRØVESTØRRELSE  
Resultaterne for hver enkelt kolbe og gennemsnittet for de 3 kolber 
anføres i masseenheder pr. volumen opløsning (typisk mg/l) eller 
masse pr. masse polymerprøve (typisk mg/g). Desuden anføres 
prøvens vægttab (beregnet som vægten af det opløste stof divideret med prøvens begyndelsesvægt). De relative standardafvigelser (RSD) beregnes. Der anføres enkelttal for den samlede stofmængde 
(polymer + nødvendige additiver) og for polymer alene (dvs. efter 
subtraktion af bidraget fra disse additiver).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. TEST UDFØRT MED TO FORSKELLIGE PRØVESTØRRELSER  
De enkelte TOC-værdier for de vandige ekstrakter fra de to tredob ­
beltforsøg og gennemsnitsværdien for hvert forsøg anføres i masseenheder pr. volumen opløsning (typisk mg C/l) eller masse 
pr. masse polymerprøve (typisk mg C/g).
 
Ingen forskel mellem resultaterne for højt og lavt forhold mellem 
prøve og vand er tegn på, at alle ekstraherbare komponenter faktisk er ekstraheret. I så fald er direkte analyse normalt ikke påkrævet.
 
Vægten af hver enkelt remanens anføres, også i procent af den 
oprindelige prøve. Der beregnes et gennemsnit for hvert forsøg. 
Det procentvise indhold af opløselige og ekstraherbare stoffer i den oprindelige prøve er givet ved forskellen mellem 100 og de fundne procenttal.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
3.1.1.  Teststof:  
— Foreliggende oplysninger om teststoffet (identitet, tilsætningsstof ­
fer, urenheder, indhold af lavmolekylære bestanddele).  
3.1.2.  Forsøgsbetingelser:  
— beskrivelse af den anvendte fremgangsmåde og forsøgsbetingel ­
serne  
— beskrivelse af analyse- og detekteringsmetoder.  
3.1.3.  Resultater:  
— resultaterne for opløselighed/ekstraherbarhed i mg/l; enkeltvær ­
dier og gennemsnit for ekstraktionsforsøgene i de forskellige 
opløsninger, opdelt på polymer og urenheder, additiver m.v.  
— resultaterne for opløselighed/ekstraherbarhed i mg/g polymer  
— TOC-værdier for vandige ekstrakter, vægt af opløst stof og 
beregnet procentværdi, hvis målt  
— pH af hver enkelt prøve  
— oplysninger om blindprøver  
— oplysninger om teststoffets eventuelle kemiske ustabilitet både 
under testproceduren og under analyseringen  
— alle oplysninger, der har betydning for fortolkning af resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fur 
Prufzwecke.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  OXIDERENDE EGENSKABER (VÆSKER)  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med denne metode er måling af væskers potentiale for 
forøgelse af brændbare stoffers forbrændingshastighed eller -intensi ­
tet, eller deres potentiale for sammen med et brændbart stof at danne en selvantændelig blanding, når de to stoffer blandes grundigt. Metoden bygger på FN's prøve for oxiderende væsker (1) og er 
ækvivalent med denne. Da nærværende metode A.21 imidlertid 
primært er bestemt til at opfylde kravene i forordning (EF) nr. 1907/2006, kræves kun sammenligning med ét referencestof. 
Forventes prøvningsresultaterne anvendt til andre formål, kan 
sammenligning med flere referencestoffer dog være nødvendig (
 1 ). 
Denne prøve kræves ikke udført, når det af strukturformlen uden 
rimelig tvivl fremgår, at stoffet er ude af stand til at reagere ekso ­
termt med et brændbart materiale.  
Før prøven udføres, vil det være nyttigt at råde over foreløbige 
oplysninger om stoffets eventuelle potentielle eksplosionsfarlighed.  
Denne prøve finder ikke anvendelse på faste stoffer, gasser, eksplo ­
sive eller letantændelige stoffer samt organiske peroxider.  
Denne prøve kræves ikke udført, når prøvningsresultater for prøve ­
stoffet foreligger fra FN-prøven for oxiderende væsker (1).  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Den gennemsnitlige trykstigningstid er gennemsnitsværdien af de 
ved prøvningen foretagne målinger af den tid, det tager prøveblan ­
dingen at frembringe en trykstigning fra 690 kPa til 2 070 kPa over 
atmosfære-trykket.  
1.3. REFERENCESTOF  
Som referencestof anvendes 65 % (w/w) salpetersyre (analytisk 
kvalitet) (  2 ). ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Som f.eks. i rammerne af FN's transportregulativer. 
( 2 ) Syren skal inden prøven titreres for at bekræfte dens styrke.
 Hvis forsøgslederen forventer, at prøveresultaterne senere kan tænkes 
anvendt til andre formål (  1 ), kan også andre referencestoffer om 
ønsket afprøves (  2 ). 
1.4. PRØVNINGSMETODENS PRINCIP  
Prøvevæsken blandes med fibercellulose i masseforholdet 1:1 og 
overføres til en trykbeholder. Forekommer der under blanding eller 
overføring selvantændelse, er yderligere prøvning unødvendig.  
Hvis selvantændelse ikke opstår, gennemføres hele prøven. Blan ­
dingen opvarmes i en trykbeholder, og gennemsnitstiden for en tryk ­
stigning fra 690 kPa til 2 070 kPa over atmosfæretrykket beregnes. Resultatet sammenholdes med den gennemsnitlige trykstigningstid for blandingen af referencestof og cellulose i forholdet 1:1.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
I en serie bestående af 5 forsøg på samme stof må ingen resultater 
afvige mere end 30 % fra det aritmetiske gennemsnit. Resultater, som afviger over 30 % fra gennemsnittet, skal kasseres, blandings- 
og påfyldningsproceduren forbedres, og prøvningen gentages.
 
1.6. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.6.1.  Forberedelse  
1.6.1.1.  Brændbart stof  
Tørret fibercellulose med fiberlængde mellem 50 og 250 μm og 
gennemsnitsdiameter 25 μm anvendes som brændbart stof (  3 ). Dette 
tørres til konstant vægt i et højst 25 mm tykt lag ved 105  o C i 4 
timer og opbevares i exsikkator med tørremiddel, indtil det er afkølet 
og klart til brug. Vandindholdet i den tørrede cellulose skal være 
under 0,5 % på tør massebasis (  4 ). Om nødvendigt forlænges tørre ­
tiden for at opnå dette (  5 ). Der skal anvendes cellulose fra samme 
batch under hele prøven.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Som f.eks. i rammerne af FN's transportregulativer. 
( 2 ) F.eks. anvendes i reference (1) 50 % (w/w) perchlorsyre og 40 % (w/w) natriumchlorat. 
( 3 ) F.eks. Whatman cellulosepulver til søjlekromatografi CF 11, katalog nr. 4021 050. 
( 4 ) Bekræftet ved (f.eks.) Karl-Fisher titrering. 
( 5 ) Alternativt kan dette vandindhold også opnås (f.eks.) ved opvarmning til 105  o C under 
vakuum i 24 timer.
 1.6.1.2.  Apparatur  
1.6.1.2.1. T r y k b e h o l d e r  
Prøvningen skal udføres med en trykbeholder. Beholderen er en cylin ­
drisk trykbeholder af stål med længde 89 mm og Ø udvendig 60 mm (se figur 1). To modstående flader af beholderen er bearbejdet (således at beholderens tværsnit er reduceret til 50 mm) for at lette fastholdelsen 
under montering af tændrør og udluftnings-prop. Beholderen, hvis 
boring er Ø 20 mm, er indvendigt falset i hver ende til en dybde af 19 mm og forsynet med gevind til isætning af 1'' britisk standardrør (BSP)eller tilsvarende metrisk størrelse. Et trykudtag i form af et 
siderør er skruet ind i beholderens hvælvede overflade 35 mm fra 
den ene ende og i en vinkel på 90
 o med de bearbejdede overflader. 
Til montering af siderøret er udført en 12 mm dyb boring med gevind til ½'' BSP (eller tilsvarende metrisk størrelse) på enden af siderøret. Om 
nødvendigt anvendes en pakning af inaktivt materiale for at sikre 
gastæt samling. Grenrøret rager 55 mm uden for trykbeholderens hus og har en boring på 6 mm. Enden af siderøret er falset og forsynet med gevind for tilslutning af tryk-transducer af membrantypen. Enhver tryk ­
måleanordning kan anvendes, forudsat at den ikke påvirkes af de varme 
gasser eller nedbrydningsprodukter og reagerer på en trykstigning på 690-2 070 kPa inden for højst 5 ms.
 
Den ende af trykbeholderen, som er længst fra siderøret, lukkes med et 
tændrør, som er monteret med to elektroder, hvoraf den ene er isoleret fra rørets hus, og den anden er jordforbundet til huset. Den modsatte 
ende af trykbeholderen lukkes med en sprængskive (sprængningstryk 
ca. 2 200 kPa), som fastholdes af en låseprop med boring Ø 20 mm. Om nødvendigt anvendes til tændrøret en pakning af inaktivt materiale for at sikre gastæt samling. Et stativ (figur 2) holder enheden i korrekt 
stilling under brug. Stativet består sædvanligvis af en fod af blødt stål 
med målene 235 mm × 184 mm × 6 mm og et 185 mm langt stykke firkantet hulprofil 70 mm × 70 mm × 4 mm.
 
I den ene ende af hulprofilen bortskæres en del af hver af to modstå ­
ende sider, således at man opnår en struktur, som har to ben med flade sider og opadtil fortsætter i et 86 mm langt stykke intakt kasseprofil. Enderne af disse flade sider skæres af i en vinkel på 
60
 o med det vandrette plan og svejses fast på fodpladen. I den ene 
side af fodstykkets øverste ende foretages en 22 mm bred og 46 mm dyb udfræsning, som giver plads til siderøret, når trykbeholderen med tændrøret først sænkes ned i kasseprofilstativet. Forneden på 
kasseprofilens indvendige overflade fastsvejses et stykke stål med 
bredde 30 mm og tykkelse 6 mm, der fungerer som afstandsstykke. Til fastholdelse af trykbeholderen anvendes to 7 mm fingerskruer, som sidder i skruehuller i den modstående flade. Nedefra støttes 
trykbeholderen af to 12 mm brede bånd af 6 mm tykt stål, fastsvejst 
på sidestykkerne, som ligger op ad kasseprofilens nederste ende.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. T æ n d s y s t e m  
Tændsystemet består af en 25 cm lang Ni/Cr ledning Ø 0,6 mm med 
en modstand på 3,85 ohm/m. Ledningen er spiralviklet ved hjælp af 
en stang Ø 5 mm og fastgjort til tændrørets elektroder. Spiralen skal være udformet på en af de i figur 3 viste måder. Afstanden fra beholderens bund til tændspolens underside skal være 20 mm. Er 
elektroderne ikke justerbare, skal enderne af tændtråden mellem 
spolen og beholderens underside være isoleret med en keramisk foring. Ledningen opvarmes af en konstant strømforsyning, som kan yde mindst 10 A.
 
1.6.2.  Prøvens udførelse  ( 1 ) 
Apparatet, komplet med tryktransducer og opvarmningssystem, men 
uden sprængskive, anbringes under-støttet med tændrøret nedad. I et bægerglas blandes 2,5 g af prøvevæsken med 2,5 g tørret cellulose 
ved hjælp af en glasspatel (
 2 ). Mens blandingen finder sted, skal der 
være anbragt sikkerhedsskærm mellem operatøren og blandingen. Hvis der under blanding eller overføring sker selvantændelse, er yderligere prøvning unødvendig. Blandingen påfyldes trykbeholderen 
i små portioner ved at banke let, idet man sørger for at blandingen 
pakkes tæt omkring tændspolen og har god kontakt til denne. Det er vigtigt at spolen ikke forvrides under denne pakkeproces, da prøv ­
ningen ellers kan give forkerte resultater (
 3 ). Sprængskiven sættes på 
plads, og låseproppen skrues forsvarligt fast. Den fyldte beholder 
overføres til støttefoden med sprængskiven opad; støttefoden skal anbringes i et passende armeret stinkskab eller en brandcelle. Strøm ­
forsyningen tilsluttes tændrørets udvendige klemmer, og der påføres 
10 A. Tiden fra sammenblandingen påbegyndes til strømmen sluttes, 
må ikke overstige 10 minutter.
 
Tryktransducerens signal registreres på et passende system, hvormed den 
opnåede trykprofil både kan vurderes og optegnes permanent (f.eks. en transientoptager koblet til en punktskriver). Blandingen opvarmes, indtil sprængskiven brydes, eller til der er gået mindst 60 s. Hvis sprængskiven 
ikke brydes, lader man blandingen afkøle, før apparatet forsigtigt adskil ­
les, efter at der er truffet forholdsregler over for eventuelt overtryk. Der udføres 5 prøver med prøvestof og referencestof(fer). Den tid, det tager trykket at stige fra 690 kPa til 2 070 kPa over atmosfæretrykket, noteres. 
Den gennemsnitlige trykstigningstid beregnes.
 
I visse tilfælde kan et stof frembringe en trykstigning (for høj eller 
for lav), som skyldes kemiske reaktioner, der ikke karakteriserer 
stoffets oxiderende egenskaber. I så fald kan det være nødvendigt at gentage prøven med et inaktivt stof, f.eks. diatoméjord (kiselgur), i stedet for cellulose for at klarlægge reaktionens art.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Blandingen af oxiderende stoffer og cellulose skal behandles som eksplosionsfarlig og 
håndteres med tilbørlig forsigtighed. 
( 2 ) I praksis kan dette gøres ved at man fremstiller en 1:1 blanding af prøvevæske og 
cellulose i større mængde end nødvendigt til prøven og overfører 5 ± 0,1 g til tryk ­
beholderen. Blandingen skal være frisk fremstillet til hver prøvning. 
( 3 ) Navnlig må spolens naboviklinger ikke røre hinanden.
 2. DATA  
Trykstigningstider for både prøvestof og referencestof(fer). Trykstig ­
ningstider for eventuelle prøver udført med inaktivt stof.  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
De gennemsnitlige trykstigningstider for prøvestof og reference ­
stof(fer) beregnes.  
Den gennemsnitlige trykstigningstid for eventuelle prøver udført med 
inaktivt stof beregnes.  
I tabel 1 er givet nogle eksempler på resultater.  
Tabel 1  
Eksempler på resultater  ( a ) 
Stof (  b ) Gennemsnitlig trykstigningstid for en 1:1 blanding med 
cellulose 
(ms) 
Ammoniumdichromat, mættet vandig opløsning 20 800 
Calciumnitrat, mættet vandig opløsning 6 700 
Ferrinitrat, mættet vandig opløsning 4 133 
Lithiumperchlorat, mættet vandig opløsning 1 686 
Magnesiumperchlorat, mættet vandig opløsning 777 
Nikkelnitrat, mættet vandig opløsning 6 250 
Salpetersyre, 65 % 4 767 (  c ) 
Perchlorsyre, 50 % 121 (  c ) 
Perchlorsyre, 55 % 59 
Kaliumnitrat, 30 % vandig opløsning 26 690 
Sølvnitrat, mættet vandig opløsning (  d ) 
Natriumchlorat, 40 % vandig opløsning 2 555 (  c ) 
Natriumnitrat, 45 % vandig opløsning 4 133  
Inaktivt stof  
Vandxellulose (  d ) 
( a ) Vedrørende FN-transportklassifikation henvises til ref. (1). 
( b ) Mættede opløsninger skal fremstilles ved 20  o C. 
( c ) Gennemsnitsværdi af sammenlignende laboratorieprøvninger. 
( d ) Det maksimale tryk 2 070 kPa ikke nået.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. RAPPORT  
3.1. PRØVNINGSRAPPORT  
Prøvningsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
— det afprøvede stofs identitet, sammensætning, renhed mv.  
— prøvestoffets koncentration  
— metode benyttet til tørring af den anvendte cellulose  
— vandindholdet i den anvendte cellulose  
— måleresultaterne  
— resultater af eventuelle prøvninger med inaktivt stof  
— beregnede gennemsnitlige trykstigningstider  
— eventuelle afvigelser fra denne metode og begrundelsen derfor  
— alle supplerende oplysninger og bemærkninger, som er relevante 
for fortolkningen af resultaterne.  
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE (  1 ) 
Prøvningsresultaterne bedømmes på grundlag af:  
a) om blandingen af prøvestof og cellulose selvantænder, og  
b) sammenholdelse af den gennemsnitlige tid, der går til en tryk ­
stigning fra 690 kPa til 2 070 kPa, med den tilsvarende værdi for referencestoffet (-stofferne).
 
Et væskeformigt stof anses for oxiderende, når:  
a) en blanding af stoffet og cellulose i masseforholdet 1:1 selv ­
antænder, eller  
b) den gennemsnitlige trykstigningstid af en blanding af prøvestoffet 
og cellulose i masseforholdet 1:1 højst er lig den gennemsnitlige 
trykstigningstid for en blanding af 65 % (w/w) vandig salpeter ­
syre og cellulose i masseforholdet 1:1.  
For at undgå falske positive resultater må bedømmelsen af resulta ­
terne om nødvendigt også inddrage resultaterne af prøvning af stoffet med inaktivt materiale.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Vedrørende fortolkning af resultater med brug af flere referencestoffer i henhold til FN's 
transportregulativer henvises til reference (1).
 4. HENVISNINGER  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3  rd revised edition. UN Publica ­
tion No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: 
Test for oxidizing liquids.  
Fig. 1  
Trykbeholder
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Fig. 2  
Stativ
  
Fig. 3  
Tændsystem
  
Note: Begge disse opstillinger kan bruges.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  FIBRES LÆNGDEVÆGTEDE GEOMETRISKE MIDDELDIA ­
METER  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Denne metode beskriver en procedure til måling af den længdevæg ­
tede geometriske middeldiameter (Length Weighted Geometric Mean 
Diameter — LWGMD) af syntetiske mineralfibre i løs vægt (Man Made Mineral Fibres — MMMF). Idet LWGMD af populationen med 95 % sandsynlighed vil ligge mellem 95 % konfidensgrænserne 
(LWGMD ± to standardfejl) af prøven, vil den fremkomne værdi 
(testværdien) være den laveste 95 % konfidensgrænse af prøven (dvs. LWGMD — 2 standardfejl). Metoden er baseret på et opdateret udkast (juni 1994) til HSE's industriprocedure, som blev fastlagt på 
et møde mellem ECFIA og HSE i Chester den 26. september 1993, 
og som er udviklet for og med udgangspunkt i et yderligere forsøg blandt forskellige laboratorier (1, 2). Denne målemetode kan anvendes til at bestemme fiberdiameteren af bulk-materialer eller 
produkter, der indeholder MMMF'er, herunder ildfaste keramiske 
fibre (RCF), Man-Made Vitreous Fibres (MMVF — fællesbetegnelse for syntetiske fibre indeholdende siliciumdioxid og en række andre 
metaloxider) og endelig krystallinske og polykrystallinske fibre.
 
Længdevægtning er en metode, der skal kompensere for den virk ­
ning af diameterfordelingen, der skyldes brud på lange fibre, når 
materialer udsættes for prøveudtagning eller håndtering. Der 
anvendes geometrisk statistik (geometrisk middelværdi) til at måle størrelsesfordelingen af MMMF-diametre, idet disse diametre almin ­
deligvis har størrelsesfordelinger, der tilnærmer sig log-normal.
 
Måling af både længde og diameter er ensformigt og tidskrævende, 
men hvis man kun måler de fibre, der rører en uendelig tynd linje på 
et SEM-synsfelt, vil sandsynligheden for at vælge en given fiber være proportional med dens længde. Da der her tages hensyn til længden i beregninger om længdevægtning, er der kun behov for 
diameteren, hvorefter LWGMD-2SE kan beregnes som beskrevet.
 
1.2. DEFINITIONER  
Partikel : et objekt med et længde-breddeforhold på mindre end 3:1.  
Fiber : et objekt med et længde-breddeforhold (formatforhold) på 
mindst 3:1.  
1.3. ANVENDELSESOMRÅDE OG BEGRÆNSNINGER  
Metoden er udviklet med fokus på diameterfordelinger med median ­
diametre fra 0,5 μm til 6 μm. Større diametre kan måles ved hjælp af 
mindre SEM-forstørrelser, men metoden bliver gradvist mere begrænset med finere fiberfordelinger, og derfor anbefales en 
TEM-måling (transmission electron microscope), hvis mediandiame ­
teren er under 0,5 μm.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. Principper for testmetoden  
Der udtages en række repræsentative kerneprøver fra fibertæppet 
eller fra de løse bulkfibre. Bulkfibrene afkortes i en knusningsproces, hvorefter der spredes en repræsentativ delprøve i vand. Der udtages 
måleprøver, der filtreres gennem et polykarbonatfilter med en pore ­
størrelse på 0,2 μm, hvorefter de forberedes til undersøgelse i scan ­
ning-elektronmikroskop (SEM-teknologi). Fiberdiametrene måles ved en skærmforstørrelse på x 10 000 eller højere (
 1 ) ved hjælp af en 
linjeskæringspunktmetode for at give et objektivt estimat af median ­
diameteren. Det laveste 95 % konfidensinterval (baseret på en en- sidet test) beregnes for at give et estimat af den laveste værdi af 
materialets geometriske middelfiberdiameter.
 
1.5. Beskrivelse af testmetoden  
1.5.1.  Sikkerhedsforanstaltninger  
Medarbejdernes eksponering for luftbårne fibre bør minimeres, og 
der bør anvendes aftræksskab eller handskekasse ved håndtering af 
tørre fibre. Der bør gennemføres periodisk overvågning af medarbej ­
dernes eksponering med henblik på at vurdere effektiviteten af de anvendte kontrolmetoder. Ved arbejde med MMMF'er skal der bæres engangshandsker for at reducere hudirritation og for at forebygge 
krydskontaminering.
 
1.5.2.  Apparatur og udstyr  
— presse og matricer (der kan producere 10 MPa)  
— polykarbonat-kapillærfilter med en porestørrelse på 0,2 μm 
(25 mm diameter)  
— membranfilter i ester-cellulose med en porestørrelse på 5 μm til 
brug som backing-filter  
— apparatur til glasfiltrering (eller engangsfiltreringssystemer), der 
passer til filtre med en diameter på 25 mm (f.eks. Millipore glas- 
mikroanalysesæt, type nr. XX10 025 00)  
— frisk destilleret vand, der er filtreret gennem et filter med en 
porestørrelse på 0,2 μm for at fjerne mikroorganismer  
— sputter-coater med guld eller guld/palladium target  
— scanning elektronmikroskop med en opløsning ned til 10 nm og 
med forstørrelse x 10 000  
— diverse: spatler, skalpelblade type 24, pincetter, SEM-rør, carbon- 
lim eller carbon-klæbebånd, silver-dag  
— ultralydsonde eller bordmonteret ultralydsbad  
— kerneprøvebor eller propbor til udtagelse af kerneprøver af 
MMMF-tæppe.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Denne forstørrelsesværdi gælder for 3 μm fibre. For 6 μm fibre vil en forstørrelse 
på × 5 000 være mere passende.
 1.5.3.  Testprocedure  
1.5.3.1.  Prøveudtagning  
Til tæpper og måtter anvendes der et 25 mm kerneprøvebor eller 
propbor til udtagning af stikprøver af tværsnittet. De bør være jævnt 
fordelt over hele bredden af et kort stykke tæppe eller udtages fra 
tilfældige områder, hvis der er lange tæppelængder til rådighed. Man kan anvende det samme udstyr til udtagning af tilfældige stikprøver fra løse fibre. Hvis det er muligt, skal der udtages seks stikprøver for 
at afspejle lokale variationer i bulkmaterialet.
 
De seks kerneprøver knuses med et pressestempel på 50 mm 
diameter ved 10 MPa. Materialet blandes med spatel og presses 
igen ved 10 MPa. Endelig fjernes materialet fra pressen og opbe ­
vares i en lukket glasflaske.  
1.5.3.2.  Behandling af stikprøver  
Hvis det er nødvendigt, kan det organiske bindemiddel fjernes ved at 
anbringe fibrene i en ovn ved 450 °C i ca. en time.  
Ved hjælp af Cone-and-Quarter-teknikken opdeles stikprøven (dette 
skal udføres i et støvskab).  
Med en spatel tilsættes en lille mængde (< 0,5 g) af stikprøven 
til 100 ml frisk destilleret vand, der er filtreret gennem et 0,2 μm 
membranfilter (alternative former for ultra-rent vand kan også 
bruges, hvis de har vist sig tilfredsstillende). Prøven dispergeres omhyggeligt ved hjælp af en ultralyd-sonde med en effekt på 100 W, der er indstillet, så der opstår kavitation. (Hvis der ikke 
kan tilvejebringes en sonde, kan følgende metode anvendes: Ryst 
og vend i 30 sekunder; derefter ultralydsbehandling i bordmonteret ultralydsbad i fem minutter, og endelig skal der igen rystes og vendes i 30 sekunder).
 
Umiddelbart efter dispersion af fibrene udtages der et antal måle ­
prøver (f.eks. tre måleprøver på 3, 6 og 10 ml) med en pipette med stor åbning (kapacitet: 2-5 ml).
 
Hver delprøve vacuumfiltreres gennem et 0,2 μm polykarbonatfilter 
med et MEC backing-filter med en porestørrelse på 5 μm og med en 
25 mm glasfiltertragt med cylindrisk beholder. Der hældes ca. 5 ml filtreret destilleret vand i tragten, og delprøven tilføres derefter lang ­
somt vandet med pipette, idet pipettespidsen holdes under væske ­
overfladen. Pipette og beholder skal gennemskylles omhyggeligt efter afpipetteringen, idet tynde fibre har en tendens til at samles på overfladen.
 
Filtret fjernes forsigtigt og tages af fra backing-filtret, inden det 
sættes til tørre i en beholder.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Med en vippende bevægelse udskæres et kvart eller et halvt filte ­
rudsnit af det filtrerede bundfald ved hjælp af et skalpelblad 
type 24. Udskæringen anbringes forsigtigt på en SEM-stub ved hjælp af en klæbende carbon-tab eller carbon-lim. Der skal påsættes Silver-dag mindst tre steder for at optimere den elektriske kontakt på 
filterkanterne og på stubben. Når den påførte lim/silver-dag er tør, 
sputtercoates ca. 50 nm guld eller guld/palladium på overfladen af bundfaldet.
 
1.5.3.3.  Kalibrering og betjening af SEM  
1.5.3.3.1. K a l i b r e r i n g  
SEM-kalibrering bør kontrolleres mindst en gang om ugen (og helst 
hver dag) ved hjælp af et Certified Calibration Grid. Kalibreringen 
bør kontrolleres i forhold til en certificeret standard. Hvis den målte værdi (SEM) ikke ligger inden for ± 2 % af den certificerede værdi, skal SEM-kalibreringen gentages eller justeres.
 
SEM skal kunne arbejde med mindst en synlig minimumdiameter på 
0,2 μm ved hjælp af en reel stikprøvematrix ved en forstørrelse 
på x 2 000.  
1.5.3.3.2. B e t j e n i n g  
SEM skal arbejde ved 10 000 forstørrelse (  1 ) og indstilles til at give 
en god opløsning med et acceptabelt billede ved langsomme scan- 
rates, f.eks. 5 sekunder pr. frame. Selv om betjeningen af forskellige 
SEM'er kan variere noget, så gælder det generelt, at man for at opnå den bedste synlighed og opløsning ved materialer med relativt lav atomvægt bør anvende stigende spændinger på 5-10 keV og indstille 
apparaturet til lille punktstørrelse og kort arbejdsafstand. Da man 
arbejder lineært gennem materialet, skal man vælge en 0
 o hældning for at minimere genfokusering eller, hvis SEM'en er 
udstyret med et eucentrisk trin, skal denne arbejdsafstand anvendes. 
Der kan vælges en lavere forstørrelse, hvis materialet ikke indeholder 
små (diameter) fibre, og fiberdiameteren er stor (> 5 μm). 
1.5.3.4.  Størrelsesvurdering  
1.5.3.4.1. U n d e r s ø g e l s e v e d l i l l e f o r s t ø r r e l s e t i l v u r d e r i n g 
a f s t i k p r ø v e n  
Først skal stikprøven undersøges ved lille forstørrelse for at afdække 
eventuel sammenklumpning af store fibre og for at vurdere fibertæt ­
heden. Hvis der konstateres for stor sammenklumpning, anbefales det, at der forberedes en ny prøve.
 
Af hensyn til den statistiske nøjagtighed er det nødvendigt at måle et 
minimumsantal fibre. Ligeledes er høj fibertæthed at foretrække, da 
undersøgelse af tomme felter er tidskrævende og uden værdi for analysen. Hvis filtret derimod er overbelastet, er det svært at måle alle målbare fibre, og desuden risikerer man ikke at få målt de små 
fibre, da de let ligger skjult af de større fibre.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) For 3 μm fibres vedkommende, se forrige note.
 En systematisk fejl i retning af en for høj værdi af LWGMD kan 
optræde som følge af fibertætheder på over 150 fibre pr. millimeter 
lineært snit. På den anden side vil lave fiberkoncentrationer forøge analysetiden, og derfor kan det ofte bedre betale sig at forberede en prøve med en tæthed, der ligger nær optimal tæthed, end at blive ved 
med at tælle på filtre med lave koncentrationer. Den optimale fiber ­
tæthed vil give et gennemsnit på ca. et eller to tælbare fibre pr. felt ved 5 000 forstørrelse. Den optimale tæthed vil imidlertid afhænge af størrelsen (diameteren) af fibrene. Derfor skal analysemedarbejderen 
støtte sig til en ekspertvurdering for at kunne afgøre, om fibertæt ­
heden er nær ved det optimale eller ej.
 
1.5.3.4.2. L æ n g d e v æ g t n i n g a f f i b e r d i a m e t r e  
Det er kun de fibre, der rører (eller ligger på tværs af) en (uendelig) 
tynd linje afsat på SEM'ens skærm, der tælles. Derfor er der afsat en 
horisontal (eller vertikal) linje tværs gennem skærmens centrum.  
Alternativt er der afsat et enkelt punkt i skærmens centrum, hvorefter 
der foretages en kontinuerlig scanning i en retning på tværs af filtret. 
Enhver fiber, der har et formatforhold større end 3:1, og som berører eller går gennem dette punkt, bliver underkastet måling af diameter, hvorefter resultatet registreres.
 
1.5.3.4.3. S t ø r r e l s e s v u r d e r i n g a f f i b r e  
Det anbefales, at der måles mindst 300 fibre. Hver fiber måles kun 
én gang ved skæringspunktet med den linje eller det punkt, der er 
afsat på billedet (eller tæt ved skæringspunktet, hvis fiberkanterne er 
skjult). Hvis man støder på fibre med uensartede tværsnit, skal man foretage en måling, der repræsenterer fiberens gennemsnitsdiameter. Man skal være meget omhyggelig med at udpege kanten og måle 
den korteste afstand mellem fiberens kanter. Størrelsesvurderingen 
kan ske online eller offline på lagrede billeder eller fotos. Det anbe ­
fales at bruge systemer til halvautomatisk billedmåling, der henter data direkte ind i et regneark, da de sparer tid og udelukker afskrifts ­
fejl. Endelig automatiserer de beregningerne.
 
Enderne af lange fibre skal undersøges ved lille forstørrelse for at 
sikre, at de ikke krummer tilbage i målefeltet og derved måles flere 
gange.  
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATERNE  
Fiberdiametre følger almindeligvis ikke en normalfordeling. Hvis 
man gennemfører en log-transformation, er det dog muligt at opnå 
en fordeling, der ligger nær ved normalfordelingen.  
Den aritmetiske middelværdi (mean lnD) og standardafvigelsen 
(SD  lnD ) af den naturlige logaritme (lnD) til n fiberdiametre (D) 
beregnes. 
mean lnD ¼ ∑ lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ðlnD – mean lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
Standardafvigelsen divideres med kvadratroden af antallet af 
målinger (n) for at nå frem til standardfejlen (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD ﬃﬃﬃ n p (3) 
To gange standardfejlen trækkes fra middelværdien, og eksponenti ­
alfunktionen af denne værdi (middelværdi minus to standardfejl) beregnes for at få den geometriske middelværdi minus to geome ­
triske standardfejl. 
LWGMD – 2SE ¼ e
 ðmean lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT  
Testrapporten skal mindst indeholde følgende oplysninger:  
— værdien af LWGMD-2SE  
— enhver afvigelse og især de afvigelser, der vil kunne påvirke 
præcisionen eller nøjagtigheden af resultaterne med tilhørende 
behørigt begrundede tilfælde.  
4. REFERENCER  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. Februar 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method 
to measure the length-weigthed geometric mean fibre diame ­
ter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/ ­
MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23.  FORDELINGSKOEFFICIENT (1-OCTANOL/VAND): SLOW- 
STIRRING-METODEN  
INDLEDNING  
1. Denne metode svarer til OECD Test Guideline (TG) 123 (2006). 1-Octanol/ 
vand-fordelingskoefficienten (P  OW ) er for P  OW -værdier svarende til log P  OW 
på indtil 8,2 blevet bestemt nøjagtigt med slow-stirring-metoden (1). 
Metoden er derfor velegnet til direkte eksperimentel bestemmelse af P  OW 
for stærkt hydrofobe stoffer.  
2. Andre metoder, der beskriver fremgangsmåden til bestemmelse af 1-octanol/ 
vand-fordelingskoefficienten (P  OW ), er »shake-flask«-metoden (2) og 
bestemmelse af P  OW ud fra retentionsmønsteret ved omvendt-fase HPLC 
(3). »Shake-flask«-metoden er tilbøjelig til at give artefakter på grund af 
overførsel af mikrodråber af octanol til den vandige fase. For stigende P  OW 
vil tilstedeværelse af sådanne dråber i den vandige fase medføre stadig større 
overvurdering af teststoffets koncentration i vandet. Metoden kan derfor kun 
anvendes på stoffer med log P  OW < 4. I den anden metode anvendes pålide ­
lige, direkte bestemte P  OW -værdier til kalibrering af sammenhængen mellem 
HPLC-retentionsmønsteret og de målte P  OW -værdier. Der er desuden 
udarbejdet et udkast til en OECD-guideline til bestemmelse af 1-octanol/ 
vand-fordelingskoefficienterne for ioniserbare stoffer (4), men den bør ikke anvendes.
 
3. Denne metode er udviklet i Nederlandene. Præcisionen af de beskrevne 
metoder er valideret og optimeret i en ringtest med deltagelse af 15 labo ­
ratorier (5).  
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
Signifikans og anvendelse  
4. For inerte organiske stoffer er der konstateret en meget signifikant sammen ­
hæng mellem stoffernes 1-octanol/vand-fordelingskoefficient (P  OW ) og 
bioakkumuleringen i fisk. Desuden er P  OW påvist at være korreleret såvel 
med toksicitet over for fisk som med deres sorption af kemikalier til faste 
stoffer, som f.eks. jord og sedimenter. En omfattende gennemgang af disse sammenhænge er givet i reference (6).
 
5. En lang række forskellige sammenhænge er fastlagt mellem 1-octanol/vand- 
fordelingskoefficienten og andre miljøtoksikologisk og miljøkemisk rele ­
vante stofegenskaber. I konsekvens heraf er 1-octanol/vand-fordelingskoef ­
ficienten blevet en nøgleparameter såvel ved vurdering af kemikaliers miljø ­
farlighed som ved forudsigelse af deres skæbne i miljøet.  
Anvendelsesområde  
6. Slow-stirring-metoden antages at nedsætte dannelsen af mikrodråber af 1- 
octanol i vandfasen. Derved undgås den overvurdering af teststofkoncen ­
trationen i den vandige fase, der skyldes teststofmolekyler knyttet til sådanne dråber. Slow-stirring-metoden er derfor særlig velegnet til bestem ­
melse af P
 OW for stoffer med en forventet log P  OW -værdi på 5 eller derover, 
hvor shake-flask-metoden (2) er tilbøjelig til at give fejlagtige resultater.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINITIONER OG ENHEDER  
7. Et stofs fordelingskoefficient mellem vand og et lipofilt opløsningsmiddel 
(1-octanol) karakteriserer kemikaliets ligevægtsfordeling mellem de to faser. Fordelingskoefficienten mellem vand og 1-octanol (P
 OW ) defineres som 
forholdet mellem ligevægtskoncentrationerne af teststoffet i 1-octanol 
mættet med vand (C  O ) og i vand mættet med 1-octanol (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Den er et koncentrationsforhold og er derfor dimensionsløs. Den angives 
oftest ved sin titalslogaritme (log P  OW ). P  OW er temperaturafhængig, og 
rapporterede data skal derfor omfatte måletemperaturen.  
METODENS PRINCIP  
8. Til bestemmelse af fordelingskoefficienten bliver vand, 1-octanol og teststof 
bragt i ligevægt med hinanden ved konstant temperatur. Derefter bestemmes teststoffets koncentration i de to faser.
 
9. Den her foreslåede slow-stirring-metode mindsker de eksperimentelle vanske ­
ligheder, der er forbundet med dannelse af mikrodråber, når shake-flask- 
metoden benyttes. I slow-stirring-metoden bliver vand, 1-octanol og teststof 
bragt i ligevægt med hinanden i en termostatstyret reaktionsbeholder med omrører. Transporten af stoffer mellem faserne fremskyndes ved omrøring. Ved omrøringen opstår der en vis turbulens, der øger stoftransporten mellem 
1-octanol og vand, uden at der dannes mikrodråber (1).
 
TESTMETODENS ANVENDELIGHED  
10. Da tilstedeværelse af andre stoffer end teststoffet kan tænkes at have indfly ­
delse på teststoffets aktivitetskoefficient, skal teststoffet afprøves i ren form. 
Den reneste gængse kvalitet af teststoffet til bestemmelsen af fordelingen 1- 
octanol/vand skal anvendes.  
11. Denne metode finder anvendelse på rene stoffer, der ikke dissocierer eller 
associerer, og som ikke udviser nævneværdig overfladeaktivitet. Den kan anvendes til bestemmelse af 1-octanol/vand-fordelingskoefficienten for sådanne stoffer og for blandinger. Når metoden anvendes på blandinger, 
afhænger de målte fordelingsforhold 1-octanol/vand dels af den testede 
blandings kemiske sammensætning, dels af sammensætningen af den elek ­
trolytblanding, der anvendes som vandig fase. Forudsat der træffes supple ­
rende foranstaltninger, kan metoden også anvendes på stoffer, der 
dissocierer eller associerer (afsnit 12).
 
12. Som følge af de mange forskellige ligevægte, der optræder ved fordelingen 
mellem 1-octanol/vand af dissocierende forbindelser som organiske syrer og 
phenoler, organiske baser og metalorganiske forbindelser, er fordelingsfor ­
holdet i 1-octanol/vand en betinget konstant, der afhænger stærkt af elek ­
trolytsammensætningen (7) (8). Bestemmelse af fordelingsforholdet i 1-octa ­
nol/vand kræver derfor styring og rapportering af pH og elektrolytsammen ­
sætning i testen. Vurdering af sådanne fordelingsforhold kræver ekspertvi ­
den. Ud fra størrelsen af dissociationskonstanterne må der vælges passende pH-værdier, således at der bestemmes et fordelingsforhold for hver ionise ­
ringstilstand. Til testning af metalorganiske forbindelser skal de anvendte 
buffere være ikke-kompleksdannende (8). På grundlag af kendskabet til vandige opløsningers kemi (kompleksdannelseskonstanter, dissociationskon ­
stanter) må testbetingelserne vælges, så at det er muligt at fastlægge, i hvilke 
former teststoffet optræder i den vandige fase. Ionstyrken skal holdes iden ­
tisk i alle test ved anvendelse af en baggrundselektrolyt.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Teststoffer med lav vandopløselighed eller høj P  OW kan volde vanskelighe ­
der, fordi koncentrationen i vandfasen bliver meget lav og derfor vanskeligt 
kan bestemmes nøjagtigt. Det beskrives i metoden, hvordan dette problem gribes an.
 
OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET  
14. Kemiske reagenser skal være af analytisk kvalitet eller bedre. Det anbefales, 
at der enten anvendes umærket teststof med kendt kemisk sammensætning 
og helst mindst 99 % renhed eller radioaktivt mærket teststof med kendt 
kemisk sammensætning og radiokemisk renhed. Anvendes der radioaktive tracerstoffer med kort halveringstid, skal der korrigeres for henfald. Hvis der anvendes radioaktivt mærket teststof, skal analysemetoden være specifik for 
det pågældende kemiske stof for at sikre, at den målte radioaktivitet hænger 
direkte sammen med teststoffet.
 
15. Log P  OW kan enten bestemmes ved hjælp af gængs software til bestemmelse 
af log P  OW eller ud fra forholdet mellem opløselighederne i de to opløs ­
ningsmidler.  
16. Før man udfører en test til bestemmelse af P  OW med slow-stirring-metoden, 
skal der foreligge følgende oplysninger om teststoffet:  
a) strukturformel  
b) egnede analysemetoder til bestemmelse af stoffets koncentration i vand 
og 1-octanol  
c) dissociationskonstant(er) for ioniserbare stoffer (OECD Guideline 112 
(9)) 
d) vandopløselighed (10)  
e) abiotisk hydrolyse (11)  
f) umiddelbar bionedbrydelighed (12)  
g) damptryk (13).  
BESKRIVELSE AF METODEN  
Udstyr og apparatur  
17. Der kræves sædvanligt laboratorieudstyr, herunder specielt følgende:  
— magnetomrørere og teflonbelagte magneter til omrøring af vandfasen  
— egnet analyseudstyr til bestemmelse af teststoffets koncentration i det 
forventede koncentrationsområde  
— omrørerbeholder med bundhane. Afhængigt af den skønnede P  OW -værdi 
og detektionsgrænsen (LOD) for teststoffet må det overvejes at anvende en reaktionsbeholder med kapacitet på mere end én liter, men med samme geometri, for at der kan udtages et tilstrækkeligt volumen vand 
til kemisk ekstraktion og analyse. Derved bliver koncentrationerne i det 
vandige ekstrakt højere, og den analytiske bestemmelse dermed mere pålidelig. En tabel med anslåede værdier af det minimale nødvendige volumen, detektionsgrænsen for teststoffet, dets anslåede log P
 OW og 
dets vandopløselighed er givet i tillæg 1. Tabellen er baseret på sammen ­
hængen mellem log P  OW og forholdet mellem opløseligheden i octanol 
og vand som angivet af Pinsuwan et al. (14):  
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
hvor:  
SR ¼ S oct=S w (i molaritet)  
og på den af Lyman (15) angivne relation til forudsigelse af vandop ­
løselighed. En vandopløselighed, der er beregnet med ligningen i tillæg 
1, må anses for et foreløbigt skøn. Det bemærkes, at det står brugeren frit at foretage en beregning af vandopløseligheden ved hjælp af enhver relation, der måtte anses for bedre til at beskrive sammenhængen mellem 
hydrofobicitet og opløselighed. For faste stoffer anbefales det f.eks. at 
lade smeltepunktet indgå i skønnet over opløseligheden. Hvis en modi ­
ficeret ligning anvendes, må det efterprøves, at ligningen til beregning af opløseligheden i octanol stadig kan anvendes. Tillæg 2 indeholder en 
skematisk tegning af en omrørerbeholder med glaskappe og et volumen 
på ca. en liter. Beholderen i tillæg 2 har vist sig at have hensigtsmæssige proportioner, som bør bibeholdes, hvis der anvendes udstyr af anden størrelse
 
— en anordning til at fastholde en konstant temperatur er ubetinget 
nødvendig under slow-stirring-testen.  
18. Beholderen skal være udført i inert materiale, så der kan ses bort fra adsorp ­
tion til beholderens overflade.  
Fremstilling af testopløsningerne  
19. Til bestemmelsen af P  OW skal der anvendes 1-octanol af reneste handels ­
kvalitet (over 99 %). Rensning af den anvendte 1-octanol ved ekstraktion 
med syre, base og vand og efterfølgende tørring anbefales. Derudover kan 
1-octanol renses ved destillation. Til fremstilling af standardopløsningerne af teststofferne skal der bruges renset 1-octanol. Vandet, der benyttes til 
bestemmelse af P
 OW , skal enten være destilleret i glas eller kvarts, hidrøre 
fra et rensningssystem eller være af HPLC-kvalitet. Destilleret vand skal filtreres gennem et 0,22 μm filter, og der skal indgå blindprøver for at 
kontrollere, at der ikke er urenheder, der kan gribe forstyrrende ind i 
bestemmelsen af teststoffet i de koncentrerede ekstrakter. Hvis der anvendes 
et glasfiberfilter, skal det renses ved opvarmning til 400 °C i mindst tre timer.
 
20. Inden testen mættes de to faser gensidigt ved ækvilibrering i en tilstrækkelig 
stor beholder. Dette opnås ved langsom omrøring (slow-stirring) af tofase ­
systemet i to døgn.  
21. Der udtages en passende mængde teststof, som opløses i 1-octanol (mættet 
med vand). Fordelingskoefficienten 1-octanol/vand bestemmes i fortyndede opløsninger i 1-octanol og vand. Koncentrationen af teststoffet bør derfor ikke være over 70 % af opløseligheden, og ikke over 0,1 M i nogen af 
faserne (1). De anvendte 1-octanol-opløsninger skal være fri for opslæm ­
mede faste partikler af teststof.
 
22. Der udtages en passende mængde teststof, som opløses i 1-octanol (mættet 
med vand). Hvis den anslåede værdi af P  OW er over fem, skal det sikres, at 
de i testen anvendte 1-octanol-opløsninger er fri for opslæmmede partikler af teststoffet. Til dette formål benyttes følgende fremgangsmåde til kemikalier med en anslået log P
 OW -værdi > 5:  
— Teststoffet opløses i 1-octanol (mættet med vand).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— Opløsningen henstår så længe, at opslæmmede partikler når at bund ­
fælde sig. Mens bundfældelsen står på, overvåges koncentrationen af 
teststoffet.  
— Når de målte koncentrationer i 1-octanol-opløsningen er blevet stabile, 
fortyndes stamopløsningen med et passende volumen 1-octanol.  
— Koncentrationen af den fortyndede stamopløsning måles. Hvis den målte 
koncentration er i overensstemmelse med den foretagne fortynding, kan den fortyndede stamopløsning anvendes til slow-stirring-testen.
 
Ekstraktion og analyse af prøver  
23. Til assay af teststoffet skal der anvendes en valideret analysemetode. De for 
analysen ansvarlige skal dokumentere, at koncentrationerne både i den vand ­
mættede 1-octanol-fase og i den 1-octanol-mættede vandfase er over kvan ­
tificeringsgrænsen for den anvendte analysemetode gennem hele testen. Når 
det er nødvendigt at bruge ekstraktion, skal genfindingen af teststoffet ved analysen af vandfasen og 1-octanol-fasen bestemmes inden testen. Analyse ­
signalet skal korrigeres for blindværdi, og det skal sikres, at der ikke kan 
overføres analysand fra én prøve til en anden.
 
24. På grund af de ret lave koncentrationer i vandfasen af et hydrofobt teststof 
vil det antagelig være nødvendigt at ekstrahere vandfasen med et organisk opløsningsmiddel og forkoncentrere ekstrakten inden analyse. Af samme grund er det nødvendigt at reducere et eventuelt indhold i blindprøverne. 
Det kræver, at der anvendes opløsningsmidler af høj renhed, fortrinsvis 
opløsningsmidler til reststofanalyse. Derudover vil omhyggelig rensning af det anvendte glasapparatur(f.eks. vask med opløsningsmiddel eller opvarm ­
ning til høj temperatur) medvirke til at undgå krydskontaminering.
 
25. Et skøn over log P  OW kan fås af et beregningsprogram eller ved en ekspert ­
vurdering. Hvis værdien er over seks, skal blindkorrektioner og overførsel af 
analysand nøje overvåges. Hvis den anslåede værdi af log P  OW er over seks, 
er det desuden obligatorisk at bruge en surrogatstandard til korrektion for genfinding, for at der kan opnås en høj forkoncentrationsfaktor. Til 
tilnærmet beregning af en log P
 OW -værdi findes der på markedet forskellige 
softwareprogrammer (  1 ), f.eks. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) 
og ACD log P (19). Metoderne til tilnærmet beregning er beskrevet i refe ­
rencerne (20-22).  
26. Kvantificeringsgrænserne (LOQ) for bestemmelse af teststoffet i 1-octanol 
og vand fastlægges med anerkendte metoder. Som tommelfingerregel kan 
metodens kvantificeringsgrænse sættes til den koncentration i vand eller 1- octanol, der frembringer et signal/støjforhold på 10. Der skal vælges en passende metode til ekstraktion og forkoncentrering, og genfindingsværdi ­
erne ved analysen skal ligeledes angives. Forkoncentreringsfaktoren skal 
vælges, så der opnås et signal af den nødvendige størrelse ved den analy ­
tiske bestemmelse.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Denne oplysning er kun til orientering for brugerne. Andre tilsvarende softwarepro ­
grammer kan anvendes, hvis det kan dokumenteres, at de giver de samme resultater.
 27. På grundlag af analysemetodens parametre og de forventede koncentrationer 
bestemmes den omtrentlige prøvemængde, der er nødvendig for at få en 
nøjagtig bestemmelse af teststofkoncentrationen. Det bør undgås at tage vandprøver, der er for små til at give et tilstrækkeligt analysesignal. Lige ­
ledes bør det undgås at tage vandprøver, der er alt for store, da der i så fald 
kan være for lidt vand tilbage til det nødvendige mindste antal analyser (n = 
5). I tillæg 1 er angivet det minimale prøvevolumen som funktion af behol ­
dervolumen, detektionsgrænse for teststoffet og opløselighed af teststoffet.
 
28. Kvantificering af teststoffet foretages ved sammenholdelse med kalibrerings ­
kurverne for den pågældende forbindelse. Koncentrationerne i de analyse ­
rede prøver skal ligge i intervallet mellem den højeste og den laveste 
koncentration af standard.  
29. For teststoffer med en anslået log P  OW -værdi højere end seks skal der før 
ekstraktion tilsættes en surrogatstandard til vandet for at registrere tab under 
ekstraktion og forkoncentrering af vandprøverne. For at der kan korrigeres nøjagtigt for genfindingsgraden, skal surrogaternes egenskaber nøje svare til teststoffets eller være identiske dermed. Til det formål bør der fortrinsvis 
anvendes (stabile) isotopmærkede analoger af de undersøgte stoffer (f.eks. 
deuterium- eller
 13 C-mærkede). Hvis det ikke er muligt at anvende stabile, 
isotopmærkede analoger, f.eks.  13 C eller  2 H, skal det ud fra pålidelige 
litteraturdata godtgøres, at surrogaternes fysisk-kemiske egenskaber ligger 
meget tæt på teststoffets. Under væske-væske ekstraktion af vandfasen 
kan der dannes emulsioner. Emulsionsdannelsen kan begrænses ved tilsæt ­
ning af salt og ved at lade emulsionen sætte sig natten over. De anvendte metoder til ekstraktion og forkoncentrering af prøverne skal beskrives.
 
30. Prøverne af 1-octanolfasen kan om nødvendigt fortyndes med et passende 
opløsningsmiddel inden analyse. Desuden anbefales brug af surrogatstan ­
darder til korrektion for genfindingsgraden for stoffer, som har udvist stor variation ved genfindingsforsøgene (relativ standardafvigelse > 10 %).
 
31. Analysemetoden skal beskrives i detaljer. Herunder angives ekstraktions ­
metode, forkoncentrerings- og fortyndingsfaktor, instrumentparametre, kali ­
breringsrutine, kalibreringsområde, analytisk genfinding af teststoffet i vand, 
tilsætning af surrogatstandarder til korrektion for genfindingsgrad, blindvær ­
dier, detektionsgrænser og kvantificeringsgrænser.  
Testens udførelse  
Optimale volumenforhold 1-octanol/vand  
32. Ved valg af volumenet af vand og volumenet af 1-octanol skal følgende 
forhold tages i betragtning: kvantificeringsgrænsen i 1-octanol og vand, de 
forkoncentreringsfaktorer, der anvendes på vandprøverne, de udtagne prøve ­
volumener af 1-octanol og vand samt de forventede koncentrationer. Af hensyn til forsøgets udførelse skal volumenet af 1-octanol i slow-stirring- systemet vælges, så 1-octanol-laget er tilstrækkelig tykt (> 0,5 cm) til, at der 
kan tages prøver af 1-octanol-fasen uden at forstyrre denne.
 
33. Til bestemmelse af forbindelser med log P  OW på 4,5 og derover anvendes 
typisk et forhold mellem faserne på 20-50 ml 1-octanol og 950-980 ml vand 
i en beholder på én liter.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Testbetingelser  
34. Under testen skal reaktionsbeholderen være termostateret med en tempera ­
turvariation på under 1 °C. Assayet skal udføres ved 25 °C.  
35. Testsystemet skal være beskyttet mod dagslys, enten ved brug af mørke ­
kammer eller ved indpakning af reaktionsbeholderen i alufolie.  
36. Testen skal (så vidt muligt) udføres i støvfrit miljø.  
37. Systemet 1-octanol-vand omrøres, til det har nået ligevægt. Der foretages et 
indledende pilotforsøg, hvor ækvilibreringsperioden bestemmes ved 
slow-stirring metoden med regelmæssig prøveudtagning af vand og 1-octa ­
nol. Der skal gå mindst fem timer mellem prøveudtagningerne.  
38. Hver P  OW -bestemmelse skal ske ved hjælp af mindst tre uafhængige 
slow-stirring-test.  
Bestemmelse af ækvilibreringstiden  
39. Ligevægt antages at være nået, når afbildning af koncentrationsforholdet i 1- 
octanol/vand mod tiden i fire tidspunkter resulterer i en regressionslinje med en hældning, der ikke er signifikant forskellig fra nul ved et p-niveau på 0,05. Der skal ækvilibreres i mindst ét døgn, før prøvetagningen påbegyn ­
des. For stoffer med en anslået log P
 OW -værdi på mindre end fem kan 
prøveudtagning som tommelfingerregel finde sted på dag to og tre. For mere hydrofobe forbindelser kan det være nødvendigt med længere ækvili ­
breringstid. For en forbindelse med en log P
 OW på 8,23 (decachlorbiphenyl) 
var 144 timer tilstrækkeligt til ækvilibrering. Opnåelse af ligevægt vurderes 
ved gentagne prøvetagninger fra samme forsøgsbeholder.  
Start af testen  
40. Ved testens start fyldes reaktionsbeholderen med vand mættet med 1-octa ­
nol. Det afventes, at blandingen antager den termostaterede temperatur.  
41. Den ønskede mængde teststof (opløst i det nødvendige volumen 1-octanol 
mættet med vand) tilsættes forsigtigt til reaktionsbeholderen. Dette er et 
afgørende trin i testen, da det er nødvendigt at undgå turbulent opblanding af de to faser. Til dette formål kan 1-octanol-fasen langsomt afpipetteres op mod væggen af testbeholderen, tæt på vandoverfladen. Den vil derved flyde 
ned ad glasvæggen og danne en film på oversiden af vandfasen. Dekanter 
aldrig 1-octanol direkte i kolben; undgå, at der drypper 1-octanol direkte ned i vandet.
 
42. Efter start af omrøringen skal omrøringshastigheden øges langsomt. Hvis 
omrørermotoren ikke kan indstilles passende, må brug af en transformator 
overvejes. Omrøringshastigheden skal indstilles, så der dannes en hvirvel med en dybde på 0,5 til højst 2,5 cm i grænsefladen mellem vand og 1- octanol. Hvis hvirvlens dybde er over 2,5 cm, skal omrøringshastigheden 
mindskes, da der ellers kan dannes mikrodråber af 1-octanol i vandfasen, 
hvilket vil medføre overvurdering af teststofkoncentrationen i vandet. Den anbefalede maksimale omrøringshastighed svarende til 2,5 cm er baseret på resultaterne af ring-testen (5). Den repræsenterer et kompromis mellem 
hurtigst mulig ækvilibrering og begrænsning af dannelsen af mikrodråber 
af 1-octanol.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Prøveudtagning og behandling af prøverne  
43. Ved prøvetagning skal omrøreren være afbrudt, og bevægelsen i væskerne 
skal være ophørt. Når prøverne er taget, startes omrøreren igen langsomt som ovenfor beskrevet, hvorefter hastigheden øges gradvis.
 
44. Prøver af vandfasen tages fra en hane i bunden af reaktionsbeholderen. 
Dødvolumenet af vand i hanerne skal altid kasseres (i den i tillæg 2 viste beholder er det ca. 5 ml). Vandet i hanerne bliver ikke omrørt og er derfor 
ikke i ligevægt med hovedmængden. Notér volumenet af vandprøverne, og 
sørg for, at indholdet af teststof i det kasserede vand medregnes ved opstil ­
ling af massebalancen. Fordampningstabet skal minimeres ved at lade vandet løbe roligt ned i skilletragten, så laget af vand/1-octanol ikke forstyr ­
res.
 
45. Prøverne af 1-octanol fås ved at udtage en lille aliquot (ca. 100 μl) fra 1- 
octanol-laget med en 100 mikroliter sprøjte udført helt i glas-metal. Der skal udvises forsigtighed for at ikke at forstyrre grænsefladen. Volumenet af den 
udtagne væskeprøve noteres. En lille aliquot er tilstrækkeligt, da prøven af 
1-octanol bliver fortyndet.
 
46. Overflødige overførselstrin for prøverne bør undgås. Der benyttes derfor 
vejning til bestemmelse af prøvevolumenet. For vandprøvernes vedkom ­
mende kan dette ske ved opsamling af vandprøven i en skilletragt, der i 
forvejen indeholder det nødvendige volumen opløsningsmiddel.  
DATA OG RAPPORTERING  
47. I denne metode bestemmes P  OW ved tre slow-stirring-test (tre forsøgsenhe ­
der) med det undersøgte stof under identiske betingelser. Den regressions ­
linje, der anvendes til påvisning af ligevægt, skal være baseret på resulta ­
terne af mindst fire på hinanden følgende bestemmelser af C  O /C W . Derved 
kan variansen beregnes som et mål for usikkerheden på det beregnede gennemsnit for hver forsøgsenhed.
 
48. P  OW kan karakteriseres ved variansen af de data, der opnås for hver forsøgs ­
enhed. På grundlag heraf beregnes P  OW som det vægtede gennemsnit af 
resultaterne fra de enkelte forsøgsenheder. Ved beregningen vægtes resulta ­
terne for forsøgsenhederne med deres reciprokke varians. Derved opnås, at data med stor variation (udtrykt ved variansen) og dermed mindre pålide ­
lighed får mindre indflydelse på resultatet end data med lille varians.
 
49. Analogt hermed beregnes den vægtede standardafvigelse. Denne karakteri ­
serer repeterbarheden af målingen af P  OW . Hvis den vægtede standardafvi ­
gelse er lav, har P  OW -bestemmelsen en høj grad af repeterbarhed inden for 
samme laboratorium. Den formelle statistiske behandling af data er 
beskrevet nedenfor.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Behandling af resultater  
Påvisning af opnåelse af ligevægt  
50. For hvert prøvetagningstidspunkt beregnes logaritmen til forholdet mellem 
teststoffets koncentration i 1-octanol og vand (log (C  O /C W )). Opnåelse af 
kemisk ligevægt påvises ved afbildning af dette forhold mod tiden. Når denne kurve går over i et plateau bestående af mindst fire på hinanden 
følgende tidspunkter, er ligevægt nået, og stoffet er reelt opløst i 1-octanol. 
Hvis ikke, må testen fortsættes, indtil fire på hinanden følgende tidspunkter giver en hældning, der ikke er signifikant forskellig fra 0 ved et p-niveau på 0,05 som tegn på, at C
 O /C W er uafhængig af tiden.  
Beregning af log P  OW 
51. Log P  OW for den pågældende forsøgsenhed beregnes som det vægtede 
gennemsnit af log C  o /C w for den del af kurven over log C  o /C w som funktion 
af tiden, hvor ligevægt er påvist at være indtrådt. Det vægtede gennemsnit 
beregnes ved at vægte data med den reciprokke varians, så indflydelsen af 
data på slutresultatet bliver omvendt proportional med usikkerheden på data.  
Gennemsnitlig log P  OW 
52. Gennemsnitsværdien af log P  OW for forskellige forsøgsenheder beregnes 
som gennemsnittet af resultaterne for de enkelte forsøgsenheder, vægtet 
med den pågældende varians.  
Beregningen foretages således:  
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
hvor:  
log P  OW,i = værdien af log P  OW for den individuelle forsøgsenhed i  
log P  OW,Av  = det vægtede gennemsnit af de enkelte bestemmelser af log 
P OW 
w i = den statistiske vægt, der tildeles værdien af log P  OW for den 
individuelle forsøgsenhed i  
Den reciprokke varians af log P  OW,i anvendes som w  i 
(w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 ) 
53. Fejlen på gennemsnittet af log P  OW beregnes som repeterbarheden af log 
C O /C W , bestemt i ligevægtsfasen i de enkelte forsøgsenheder. Den udtrykkes 
som den vægtede standardafvigelse på log P  OW,Av  (σ log Pow,Av  ), der igen er 
et mål for fejlen på log P  OW,Av  . Den vægtede standardafvigelse kan 
beregnes af den vægtede varians var  log Pow,Av  på følgende måde:  
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Symbolet n er antal forsøgsenheder.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Testrapport  
54. Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:  
Teststof:  
— generisk navn, kemisk navn, CAS-nummer, strukturformel (som viser 
placeringen af det mærkede atom, når radioaktivt mærket stof anvendes) og relevante fysisk-kemiske egenskaber (se afsnit 17)
 
— renhed (urenheder) af teststoffet  
— for mærkede kemikalier, nominel renhed af radioaktiv mærkning samt 
molær aktivitet (hvis relevant)  
— den foreløbige anslåede værdi af log P  OW og den metode, hvormed 
denne værdi er beregnet.  
Testbetingelser:  
— dato for testenes udførelse  
— testtemperaturen  
— volumen 1-octanol og vand ved testens start  
— volumen af de udtagne prøver af 1-octanol og vand  
— volumen 1-octanol og vand, der er tilbage i testbeholderne  
— beskrivelse af forsøgsbeholdere og omrøringsforhold (den geometriske 
form af omrørermagneten og af forsøgsbeholderen, hvirvelhøjden i mm 
samt omrøringshastigheden, når denne kendes)  
— de analysemetoder, der er anvendt til bestemmelse af teststoffet, og 
metodernes kvantificeringsgrænse  
— prøvetagningstidspunkter  
— pH af den vandige fase og, når pH justeres for ioniserbare molekyler, de 
anvendte buffere  
— antal gentagelser.  
Resultater:  
— repeterbarhed og følsomhed af de anvendte analysemetoder  
— de fundne koncentrationer af teststoffet i 1-octanol og vand som funk ­
tion af tiden  
— opstilling af en massebalance  
— temperatur og standardafvigelse, eller temperaturområde under testen  
— regression af koncentrationsforholdet på tiden  
— gennemsnitlig log P  ow,Av  -værdi og standardfejlen herpå  
— diskussion og fortolkning af resultaterne  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— eksempler på rådata for repræsentative analyser (alle rådata skal opbe ­
vares i henhold til GLP-normer), herunder genfindingsværdier for surro ­
gater, antal niveauer anvendt ved kalibrering (sammen med kriterierne for korrelationskoefficienten for kalibreringskurven) og resultaterne af QA/QC
 
— når den foreligger: valideringsrapport for assaymetoden (angives under 
referencer).  
LITTERATUR:  
(1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the »slow-stirring« method. Envi ­
ron. Toxicol. Chem. 8: 499-512.  
(2) Kapitel A.8 i dette bilag, Fordelingskoefficient.  
(3) Kapitel A.8 i dette bilag, Fordelingskoefficient.  
(4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable 
Substances. Paris.  
(5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01.  
(6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
(7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
(8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596-2602.
 
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 
Dissociation Constants in Water. Paris.  
(10) Kapitel A.6 i dette bilag, Vandopløselighed.  
(11) Kapitel C.7 i dette bilag, Nedbrydning — Abiotisk nedbrydning: hydrolyse 
som funktion af pH.  
(12) Kapitel C.4 — del II til VII (Metode A til F) i dette bilag, Bestemmelse af 
let bionedbrydelighed.  
(13) Kapitel A.4 i dette bilag, Damptryk.  
(14) Pinsuwan S, Li A og Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623- 
626. 
(15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 til 2-52.
 
(16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA.  
(17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, 
Reehl WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, D.C.  
(21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479-488.  
(22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen 
Chemie : 386-390.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Tillæg 1  
Regneark til beregning af mindste vandvolumen, der er nødvendigt til 
detektion af teststoffer med forskellige log P  OW -værdier i vandig fase  
Forudsætninger:  
— Maksimumsvolumen af de enkelte aliquoter = 10 % af totalvolumenet; 5 
aliquoter = 50 % af totalvolumenet.  
— Teststofkoncentration  ¼ 0; 7 Ü opløselighedenihverfase. Ved lavere koncen ­
tration skal der bruges større volumener.  
— Anvendt volumen til bestemmelse af detektionsgrænse = 100 ml.  
— Log P  OW mod log S  W og log P  OW mod SR (S  OCT /S W ) er rimelige frem ­
stillinger af de sammenhænge, der gælder for teststofferne.  
Beregning af S  w 
log P  ow ligning log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E + 00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E + 00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Beregning af S  oct 
log P  ow ligning S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E + 04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E + 04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E + 04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E + 04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E + 05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E + 05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E + 05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E + 05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E + 05  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Total masse af 
teststof 
(mg) Mass  oct /Mass  water Mass  H2O 
(mg) Conc  H2O 
(mg/l) Mass  oct 
(mg) Conc  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Beregning af volumener  
Nødvendigt minimumsvolumen for H  2 O-fasen ved hver LOD-koncentration  
log K  ow LOD (mikrogram/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volumen 
anvendt til 
LOD (l) 0,1 
Nøgle til beregninger  
Repræsenterer < 10 % af totalt volumen af vandig fase, 1-liters ækvilibrerings ­
beholder.  
Repræsenterer < 10 % af totalt volumen af vandig fase, 2-liters ækvilibrerings ­
beholder.  
Repræsenterer < 10 % af totalt volumen af vandig fase, 5-liters ækvilibrerings ­
beholder.  
Repræsenterer < 10 % af totalt volumen af vandig fase, 10-liters ækvilibrerings ­
beholder.  
Over 10 % af selv 10-liters ækvilibreringsbeholderen.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Oversigt over nødvendigt volumen som funktion af vandopløselighed og log P  ow 
Minimumsvolumen til H  2 O-fasen ved hver LOD-koncentration (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogram/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogram/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volumen anvendt til 
LOD (l) 0,1 
Tillæg 2  
Eksempel på beholder med glaskappe til slow-stirring-test til 
bestemmelse af P  OW
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
DEL B: METODER TIL BESTEMMELSE AF TOKSICITET OG ANDRE 
SUNDHEDSVIRKNINGER  
Indholdsfortegnelse 
GENEREL INDLEDNING 
B.1.A. AKUT ORAL TOKSICITET — FASTDOSISMETODEN B.1.B. AKUT ORAL TOKSICITET — AKUT TOKSICITETSKLAS ­
SEMETODEN 
B.2. AKUT TOKSICITET (INHALATION) 
B.3. AKUT TOKSICITET (DERMAL) 
B.4. AKUT TOKSICITET: HUDIRRITATION/ÆTSNING 
B.5. AKUT TOKSICITET, ØJENIRRITATION B.6. HUDSENSIBILISERING 
B.7. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, 
ORAL) HOS GNAVERE 
B.8. SUBAKUT TOKSICITET (INHALATION): 28-DAGES 
FORSØG 
B.9. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, 
DERMAL) 
B.10. MUTAGENICITET — IN VITRO-TEST FOR KROMOSOMA ­
BERRATIONER I CELLER FRA PATTEDYR 
B.11. MUTAGENICITET — IN VIVO-TEST FOR KROMOSOMA ­
BERRATIONER I KNOGLEMARV HOS PATTEDYR 
B.12. MUTAGENICITET — IN VIVO-TEST FOR MIKROKERNER I 
ERYTHROCYTTER HOS PATTEDYR 
B.13/14. MUTAGENICITET — TILBAGEMUTATIONSTEST MED 
BAKTERIER 
B.15. MUTAGENICITETSTESTNING OG SCREENING FOR 
KARCINOGENICITET GENMUTATION — SACCHARO ­
MYCES CEREVISIAE 
B.16. MITOTISK REKOMBINATION — SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE 
B.17. MUTAGENICITET — IN VITRO-TEST FOR GENMUTATION 
I PATTEDYRCELLER 
B.18. DNA-SKADE OG DNA-REPARATION — UNSCHEDULED 
DNA SYNTHESIS — PATTEDYRCELLER IN VITRO 
B.19. SØSTERKROMATID OMBYGNING (SCE) IN VITRO 
B.20. KØNSBUNDET RECESSIV LETAL TEST — DROSOPHILA 
MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. CELLETRANSFORMATIONSTEST — PATTEDYRCELLER 
IN VITRO 
B.22. DOMINANT LETAL TEST — GNAVER 
B.23. TEST FOR KROMOSOMABERRATIONER I SPERMATOGO ­
NIER HOS PATTEDYR 
B.24. SPOTTEST — MUS B.25. ARVELIG TRANSLOKATION HOS MUS B.26. SUBKRONISK ORAL TOKSICITETSTEST — ET 90-DAGES 
FORSØG OVER GENTAGNE ORALE DOSERS TOKSICITET 
PÅ GNAVERE 
B.27. SUBKRONISK ORAL TOKSICITETSTEST — ET 90-DAGES 
FORSØG OVER GENTAGNE ORALE DOSERS TOKSICITET 
PÅ IKKE-GNAVERE 
B.28. SUBKRONISK TOKSICITET, OPTAGELSE GENNEM HUDEN 
— 90 DAGES GENTAGEN DOSERING PÅ HUD UNDER ANVENDELSE AF GNAVERE 
B.29. SUBKRONISK TOKSICITET (INHALATION): 90-DAGES 
FORSØG 
B.30. FORSØG VEDRØRENDE KRONISK TOKSICITET B.31. PRÆNATAL UDVIKLINGSTOKSICITETSUNDERSØGELSE B.32. KARCINOGENICITETSFORSØG B.33. KOMBINERET FORSØG VEDRØRENDE KARCINOGENICI ­
TET/KRONISK TOKSICITET 
B.34. REPRODUKTIONSTOKSICITETSUNDERSØGELSE I EN 
GENERATION 
B.35. REPRODUKTIONSTOKSICITETSUNDERSØGELSE I TO 
GENERATIONER 
B.36. TOKSIKOKINETIK 
B.37. FORSINKET NEUROTOKSICITET VED ORGANISKE PHOSP ­
HORFORBINDELSER EFTER AKUT EKSPONERING 
B.38. FORSINKET NEUROTOKSICITET VED ORGANISKE PHOSP ­
HORFORBINDELSER GENTAGEN DOSIS — 28 DAGE 
B.39. TEST FOR UNSCHEDULED DNA-SYNTESE (UDS) MED 
PATTEDYRLEVERCELLER IN VIVO 
B.40. IN VITRO-HUDÆTSNING: MÅLING AF TRANSKUTAN ­
ELEKTRISK MODSTAND (TER) 
B.40.A. IN VITRO-HUDÆTSNING: TEST MED HUMAN HUDMODEL
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41. IN VITRO 3T3 NRU-FOTOTOKSICITETSTEST 
B.42. HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEK ­
NUDER 
B.43. NEUROTOKSICITETSUNDERSØGELSE I GNAVERE 
B.44. HUDABSORPTION: IN VIVO-METODE 
B.45. HUDABSORPTION: IN VITRO-METODE B.46. IN VITRO-HUDIRRITATION: TESTMETODE MED REKON ­
STRUERET HUMAN EPIDERMIS 
B.47. OKSECORNEA-UKLARHEDS- OG -PERMEABILITETSTEST ­
METODEN (BCOP-TESTMETODEN) TIL IDENTIFIKATION AF ØJENÆTSENDE STOFFER OG STÆRKT ØJENIRRITE ­
RENDE STOFFER 
B.48. ISOLERET KYLLINGEØJE-TESTMETODEN (ICE-TESTME ­
TODEN) TIL IDENTIFIKATION AF ØJENÆTSENDE 
STOFFER OG STÆRKT ØJENIRRITERENDE STOFFER 
B.49. IN VITRO-MIKROKERNETEST I PATTEDYRCELLER 
B.50. HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNU ­
DER: DA 
B.51. HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNU ­
DER: BrdU-ELISA
 
▼M4 
B.52. AKUT TOKSICITET (INHALATION) — AKUT TOKSICI ­
TETSKLASSEMETODEN  
▼M5 
B.53. UNDERSØGELSE AF NEUROTOKSICITET UNDER UDVIK ­
LINGEN 
B.54. UTERUSTESTEN I GNAVERE: EN KORTTIDSSCREENING ­
TEST FOR ØSTROGENECITET 
B.55. HERSHBERGER-TESTEN I ROTTER: EN KORTTIDSSCRE ­
ENINGTEST FOR (ANTI)ANDROGENE EGENSKABER 
B.56. UDVIDET REPRODUKTIONSTOKSICITETSUNDERSØ ­
GELSE I ÉN GENERATION 
B.57. H295R STEROIDSYNTESETESTEN 
B.58. GENMUTATIONSTEST I SOMATISKE CELLER OG 
KØNSCELLER FRA TRANSGENE GNAVERE  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
GENEREL INDLEDNING  
A. BESKRIVELSE AF TESTSTOFFET  
Teststoffets sammensætning, herunder de vigtigste urenheder, og dets 
relevante fysisk-kemiske egenskaber, herunder dets stabilitet, skal 
være kendt forud for enhver undersøgelse af toksicitet.  
Teststoffets fysisk-kemiske egenskaber giver en række vigtige oplys ­
ninger for valget af administrationsmåde, udformningen af hver enkelt undersøgelse samt håndtering og opbevaring af teststoffet.
 
Forud for undersøgelsen bør der udvikles en analysemetode til kvali ­
tativ og kvantitativ bestemmelse af stoffet (herunder vigtige urenhe ­
der, såfremt dette er muligt) i doseringsmediet og i det biologiske materiale.
 
Alle oplysninger om teststoffets identitet, fysisk-kemiske egenskaber, 
renhed og adfærd medtages i testrapporten.  
B. PASNING AF DYR  
Ved toksicitetstest er det afgørende, at der føres nøje kontrol med 
testmiljøet, og at dyrene passes korrekt.  
i) Miljø  
Miljøet i forsøgsstalde og -bure skal afpasses efter dyrearten. For 
rotter, mus og marsvin er en rumtemperatur på 22 ± 3  o C og en 
relativ luftfugtighed på 30-70 % passende; for kaniner bør tempera ­
turen være på 20 ± 3  o C og den relative luftfugtighed på 30-70 %.  
Nogle forsøgsteknikker er særlig følsomme over for temperaturafvi ­
gelser, og i sådanne tilfælde indeholder beskrivelsen af testmetoden nærmere oplysninger om passende forsøgsbetingelser. Ved alle undersøgelser af toksiske virkninger skal temperaturen og luftfugtig ­
heden kontrolleres, registreres og anføres i den afsluttende forsøgs ­
rapport.
 
Der bør anvendes kunstig belysning, som følger en rytme med 12 
timers lys og 12 timers mørke. Oplysninger om belysningsrytmen 
registreres og anføres i den afsluttende forsøgsrapport.  
Medmindre andet er angivet i metoden, kan dyrene opbevares i bure 
hver for sig eller i små grupper af samme køn, dog højst fem dyr pr. bur.
 
I rapporter over dyreforsøg er det vigtigt at anføre, hvilken type bure 
der er anvendt, og hvor mange dyr der har været i hvert bur, såvel 
under eksponering for det kemiske stof som i en efterfølgende obser ­
vationsperiode.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Fodring  
Foderet skal opfylde alle de ernæringskrav, som den pågældende art 
af forsøgsdyr stiller. Hvis teststofferne indgives med foder, kan reaktioner mellem teststoffet og foderbestanddele medføre, at 
næringsværdien nedsættes. Muligheden af en sådan reaktion skal 
tages i betragtning, når forsøgsresultaterne fortolkes. Der kan anvendes normalt laboratoriefoder med ubegrænset forsyning af drik ­
kevand. Valget af foder kan afhænge af, at teststoffet skal kunne 
iblandes foderet på passende måde, hvis teststoffet indgives med 
foderet.
 
Forureninger i foderet, som vides at influere på toksiciteten, må ikke 
forefindes i interfererende koncentrationer.  
C. ALTERNATIV TESTNING  
Den Europæiske Union har sat sig som mål at udvikle og validere 
alternative metoder, som kan give oplysninger på samme niveau som 
de nuværende dyreforsøg, men som anvender færre dyr, forårsager mindre smerte, eller hvor brugen af dyr fuldstændig kan undgås.
 
Efterhånden som sådanne metoder udvikles, skal de så vidt muligt 
tages i anvendelse i forbindelse med risikobeskrivelse og efterføl ­
gende klassifikation og etikettering baseret på den potentielle fare 
ved de pågældende stoffer.  
D. VURDERING OG FORTOLKNING  
Ved vurdering og fortolkning af resultaterne af dyreforsøg og in 
vitro-undersøgelser skal der tages hensyn til, at der er grænser for, i hvilket omfang de kan ekstrapoleres direkte til mennesker, doku ­
mentation for skadelige virkninger på mennesker, hvor sådan fore ­
ligger, skal derfor anvendes til at bekræfte testresultaterne.
 
E. HENVISNINGER  
De fleste af disse metoder er udviklet inden for rammerne af OECD's 
program for retningslinjer for forsøgsvirksomhed (OECD-Test Guidelines) og bør udføres i overensstemmelse med principperne 
for god laboratoriepraksis, så der kan opnås størst mulig »gensidig 
accept af data«.
 
Yderligere oplysninger kan findes i henvisningerne i OECD-retnings ­
linjerne og relevant litteratur, der er offentliggjort andetsteds.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1.A.  AKUT ORAL TOKSICITET — FASTDOSISMETODEN  
1. METODE  
Denne forsøgsmetode svarer til OECD TG 420 (2001)  
1.1. INDLEDNING  
I traditionelle metoder til bestemmelse af akut giftighed anvendes 
dyrenes død som effektparameter. I 1984 foreslog British Toxicology Society en ny metode til bestemmelse af akut giftighed, baseret på 
administration af stoffet i en række faste dosisniveauer (1). Med 
denne metode undgik man at anvende dyrenes død som effektpara ­
meter, men støttede sig i stedet til observation for tydelige tegn på toksicitet ved et af en række faste dosisniveauer. Efter in vivo-vali ­
dering, dels i Det Forenede Kongerige (2), dels internationalt (3), 
blev metoden indført som forsøgsmetode i 1992. Efterfølgende er de statistiske egenskaber af fastdosismetoden evalueret ved hjælp af matematiske modeller i en række undersøgelser (4}(5)(6). 
Tilsammen har in vivo-undersøgelser og modelforsøg vist, at 
metoden er reproducerbar, kræver færre dyr og medfører færre lidelser end traditionelle metoder, og at den gør det muligt at rangordne stofferne på tilsvarende måde som andre metoder til 
bestemmelse af akut giftighed.
 
Vejledning i valg af den mest hensigtsmæssige forsøgsmetode til et 
givet formål kan findes i Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing (7). Samme dokument indeholder desuden supplerende oplys ­
ninger om udførelse og fortolkning af forsøg efter metode B.1.A.  
Undersøgelsens princip indebærer, at der i hovedundersøgelsen kun 
anvendes moderat toksiske doser, og at man undgår at administrere 
doser, som forventes at være dødelige. Ligeledes undgår man at 
administrere doser, der vides at medføre udtalt smerte og lidelse pga. ætsende eller stærkt irriterende virkning. Dyr, som er mori ­
bunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende 
lidelser, skal aflives humant og betragtes ved fortolkningen af 
forsøgsresultaterne på samme måde som dyr, der er døde under forsøget, Kriterierne for aflivning af moribunde eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller forestående død er 
genstand for en særskilt vejledning (8).
 
Metoden giver oplysninger om de farlige egenskaber og gør det 
muligt at rangordne og klassificere stofferne efter det globale harmo ­
niserede system (GHS) til klassificering af kemiske stoffer med akut toksisk virkning (9).
 
Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle forelig ­
gende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stof ­
fets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, 
resultaterne af andre in vitro- eller in vivo-tokstcitetsundersøgelser af 
stoffet, toksikologiske data for strukturelt beslægtede stoffer, samt stoffets forventede anvendelse(r). Disse oplysninger er nødvendige for til alle parters tilfredshed at godtgøre, at forsøget har betydning 
for beskyttelsen af menneskers sundhed, og vil desuden være nyttige 
ved valg af passende startdosis.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. DEFINITIONER  
Akut oral toksicitet : de sundhedsmæssigt uønskede virkninger, som 
optræder efter oral indgift af en enkelt dosis af et teststof eller efter flere doser indgivet i løbet af 24 timer.
 
Forsinket død : det forhold, at dyret ikke inden for 48 timer dør eller 
fremtræder moribund, men dør senere inden for den 14 dage lange 
observationsperiode.  
Dosis : den mængde teststof, som indgives. Dosis angives som vægt ­
mængde teststof pr. vægtenhed forsøgsdyr (f.eks. mg/kg).  
Synlig toksicitet : et generelt udtryk, som angiver klare tegn på 
toksicitet efter indgift af teststoffet (eksempler herpå findes i (3)), således at der ved den næsthøjeste faste dosis enten kan forventes svære smerter og vedvarende tegn på svære lidelser, moribund status 
(kriterier herfor er beskrevet i Humane Endpoints Guidance Docu ­
ment (8)), eller størstedelen af dyrene forventes at dø.
 
GHS : Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures. Et fælles projekt mellem OECD (sundhed og miljø), FN's ekspertudvalg vedrørende transport af farligt gods (fysisk-kemiske egenskaber) og ILO (faremærkning og -angivelse), 
koordineret af Interorganisation Programme for the Sound Manage ­
ment of Chemicals (IOMC).
 
Overhængende død : det forhold, at moribund tilstand eller død 
forventes at indtræffe inden næste planlagte observationstidspunkt. Som tegn på denne tilstand i gnavere kan nævnes kramper, sideleje, 
liggende stilling og tremor.
 
LD 50 (middel letaldosis) : den statistisk beregnede enkeltdosis af et 
teststof, som ved oral indgift kan forventes at medføre døden hos 
50 % af dyrene, LD  50 -værdien angives som vægtmængde teststof pr, 
vægtenhed kropsvægt af forsøgsdyret.  
Grænsedosis : en dosis, som danner øvre grænse for testen (2 000 
eller 5 000 mg/kg).  
Moribund tilstand : en tilstand, hvor dyret er døende eller ikke vil 
overleve, selv om det behandles (se nærmere i Humane Endpoint Guidance Document (8)).
 
Forudsigelig død : tilstedeværelse af kliniske tegn, som antyder, at 
døden vil indtræffe på et kendt tidspunkt før forsøgets planlagte afslut ­
ning, f.eks. at dyret er ude af stand til at bevæge sig hen til vand eller 
føde (se nærmere i Humane Endpoint Guidance Document (8)).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Grupper af dyr af samme køn modtager trinvis stigende faste doser 
på 5, 50, 300 og 2 000 mg/kg (undtagelsesvis kan anvendelse af en yderligere fast dosis på 5 000 mg/kg overvejes, se punkt 1.6.2). På 
grundlag af en forundersøgelse vælges begyndelsesdosis som den 
dosis, der forventes at frembringe nogen tegn på toksicitet uden at medføre svær toksisk effekt eller dødelighed. De kliniske tegn og forhold, der er forbundet med smerte, lidelse og forestående død, er 
detaljeret beskrevet i en separat OECD-vejledning (8). Yderligere 
grupper af dyr kan behandles med højere eller lavere faste doser. Denne procedure fortsættes, indtil man har fastlagt den dosis, som 
medfører synlig toksicitet eller højst ét dødsfald, eller der ikke ses 
nogen effekt af den højeste dosis, eller der optræder dødsfald ved den laveste dosis.
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Valg af dyreart  
Den foretrukne gnaverart er rotter, men en anden gnaverart kan 
anvendes. Sædvanligvis anvendes hundyr (7). Baggrunden herfor er, at litteraturundersøgelser af konventionelle LD
 50 -forsøg viser, at 
de to køn sædvanligvis ikke udviser stor forskel i følsomhed, men 
hvis der er forskel, er hundyr sædvanligvis lidt mere følsomme end handyr (10). Foreligger der imidlertid for strukturelt beslægtede stoffer oplysninger om toksikologiske eller toksikokinetiske egenska ­
ber, som tyder på, at hanner må forventes at være mere følsomme 
end hunner, bør handyr anvendes. Udføres forsøget i hanner, skal fyldestgørende begrundelse herfor gives.
 
Der anvendes raske unge dyr af sædvanligt benyttede laboratori ­
estammer. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. Hvert dyr skal ved doseringens begyndelse være mellem 8 og 12 uger gammelt, og dets vægt afvige højst ± 20 % fra gennemsnits ­
vægten af eventuelle tidligere behandlede dyr.
 
1.4.2.  Opstaldning og fodring  
Temperaturen i forsøgsdyrsrummet skal være 22  o C (± 3  o C). Den 
relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og bør ikke være over 
70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør 
tilstræbes, Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt labo ­
ratoriefoder med fri adgang til drikkevand, Dyrene i en given dosis ­
gruppe kan være anbragt i samme bur, men antallet af dyr i buret må 
ikke bevirke, at det er vanskeligt at observere de enkelte dyr.
 
1.4.3.  Klargøring af dyrene  
Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan 
identificeres, og holdes i burene i mindst fem døgn forud for dose ­
ringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Tilberedning af doser  
Sædvanligvis bør teststoffet administreres i samme volumen på alle 
de anvendte dosisniveauer, idet man varierer koncentrationen i præparatet. Når det førdige testpræparat eller den færdige testblan ­
ding er flydende, kan anvendelse af ufortyndet teststof, dvs. med 
konstant koncentration, være mest relevant for den efterfølgende risikovurdering af stoffet, og nogle myndigheder stiller da også krav herom, I begge tilfælde må det maksimale volumen for 
indgift ikke overskrides. Den maksimale væskemængde, som kan 
indgives ad gangen, afhænger af forsøgsdyret størrelse, Til gnavere må rumfanget normalt ikke overskride 1 ml/100 g kropsvægt, ved 
vandige opløsninger kan det dog overvejes at anvende 2 ml/100 g 
kropsvægt. Ved formulering af doseringspræparatets anbefales det så vidt muligt at benytte en vandig opløsning/suspension/emulsion, efter ­
fulgt (i prioriteret rækkefølge) af en opløsning/suspension/emulsion i olie 
(f.eks, majsolie) og derefter eventuelt en opløsning i andre vehikler. For 
andre vehikler end vand skal vehiklets toksiske egenskaber være kendt, Doserne skal tilberedes kort før indgift, medmindre præparatets hold ­
barhed inden for anvendelsesperioden kendes og er godtgjort at være 
tilfredsstillende.
 
1.5. FREMGANGSMÅDE  
1.5.1.  Administration of doserne  
Teststoffet indgives som enkeltdosis med gastrisk sonde eller et 
passende intubationsrør. Kan den pågældende stofmængde ikke 
indgives som enkeltdosis, kan den undtagelsesvis indgives opdelt i 
få enkelte dele af den samlede dosis over en periode på højst 24 timer.
 
Dyrene skal være fastende inden doseringen (f.eks. skal rotter natten 
over ikke have foder, men adgang til vand; mus skal i 3-4 timer ikke have foder, men adgang til vand), Efter fasteperioden vejes dyrene, og teststoffet indgives. Når stoffet er indgivet, kan dyrene unddrages 
føde i yderligere 3-4 timer for rotter og 1-2 timer for mus. Når en 
dosis indgives delt over et vist tidsrum, kan det afhængigt af dette tidsrum være nødvendigt at give dyrene foder og adgang til vand.
 
1.5.2.  Forundersøgelse  
Forundersøgelsen har til formål at bestemme en passende startdosis i 
hovedundersøgelsen. Teststoffet indgives sekventielt til de enkelte 
dyr som angivet i skemaerne i bilag 1. Forundersøgelsen afsluttes, når det kan afgøres, hvilken startdosis der skal anvendes i hoved ­
undersøgelsen (eller når der er et dødsfald ved den laveste faste 
dosis).
 
Startdosis til forundersøgelsen vælges blandt de faste dosisniveauer 
5, 50, 300 og 2 000 mg/kg som den dosis, der forventes at medføre 
synlig toksicitet, om muligt baseret på dokumentation i form af in 
vivo- og in vitro-data for samme kemiske stof og for strukturelt beslægtede stoffer. I mangel af sådanne oplysninger anvendes en startdosis på 300 mg/kg.
 
Doseringerne af de enkelte dyr finder sted med et interval på mindst 
24 timer. Alle dyr observeres i mindst 14 dage.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Undtagelsesvis, og kun når det kan begrundes konkret ud fra 
myndighedsregler, kan det overvejes at anvende et supplerende 
højeste fast dosisniveau på 5 000 mg/kg (se bilag 3). Af dyrevel ­
færdsmæssige grunde anbefales det at undgå testning i området svarende til 2 000-5 000 mg/kg i GHS kategori 5, og dette bør 
kun overvejes, når det er overvejende sandsynligt, at resultaterne 
af et sådant forsøg have direkte relevans for beskyttelsen af menne ­
skers eller dyrs sundhed eller miljøet.
 
Hvis et dyr dør ved den laveste faste dosis (5 mg/kg) i forundersø ­
gelsen, er fremgangsmåden normalt at standse forsøget og indplacere stoffet i GHS kategori 1 (som vist i bilag 1). Hvis klassificeringen kræves nærmere bekræftet, kan man dog frivilligt vælge følgende 
supplerende procedure: Endnu et dyr doseres med 5 mg/kg. Hvis 
dette dyr dør, vil det bekræfte GHS kategori 1, og undersøgelsen standses straks. Hvis dyret overlever, kan yderligere højst tre dyr behandles med 5 mg/kg. På grund af den høje dødsrisiko bør disse 
dyr af dyrevelfærdsmæssige grunde doseres sekventielt. Tidsrummet 
mellem doseringen af de enkelte dyr skal være tilstrækkeligt til at fastslå, at det foregående dyr må forventes at overleve. Indtræffer der endnu et dødsfald, skal doseringen straks indstilles, og ingen yder ­
ligere dyr doseres, Da optræden af endnu et dødsfald (uanset det 
testede antal dyr på ophørstidspunktet) falder ind under udfald A (to eller flere dødsfald), følger man klassificeringsreglen i bilag 2 ved fast dosis 5 mg/kg (dvs. kategori 1. hvis der er to eller flere 
dødsfald, og kategori 2 hvis der er højst et dødsfald), Derudover 
indeholder bilag 4 vejledning i, hvordan man foretager klassifice ­
ringen i EU's system, indtil det nye GHS er indført.
 
1.5.3.  Hovedundersøgelsen  
1.5.3.1.  Antal dyr og dosisniveauer  
De enkelte trin, der skal følges efter testning ved startdosis, er 
angivet i skemaerne i bilag 2. Der skal vælges en af følgende tre muligheder: enten afbrydelse af forsøget og tilordning af stoffet til 
den pågældende fareklasse, eller testning ved et højere fast dosis ­
niveau, eller testning ved et lavere fast dosisniveau. Af hensyn til dyrenes beskyttelse vil et dosisniveau, der medførte død i forunder ­
søgelsen, ikke blive gentaget i hovedundersøgelsen (se bilag 2). 
Erfaringen viser, at det mest sandsynlige udfald ved startdosis ­
niveauet er, at stoffet kan klassificeres, uden at yderligere testning er nødvendig.
 
For hvert af de undersøgte dosisniveauer vil der normalt blive 
anvendt i alt fem dyr af ét køn. De fem dyr består af det dyr fra forundersøgelsen, som blev doseret ved det valgte dosisniveau, samt yderligere fire dyr (undtagen når et af hovedundersøgelsens dosis ­
niveauer undtagelsesvis ikke indgik i forundersøgelsen).
 
Tidsintervallet mellem doseringerne på hvert niveau bestemmes ud 
fra de toksiske symptomers indsætten, varighed og sværhed. Behand ­
lingen af dyrene ved næste dosering skal vente, indtil det kan 
antages, at de tidligere doserede dyr vil overleve. Det anbefales, at man om nødvendigt lader gå 3-4 dage mellem doseringerne på hvert dosisniveau for at få den nødvendige tid til at iagttage en eventuel 
forsinket toksisk virkning. Tidsintervallet kan korrigeres til en 
passende størrelse, f.eks. hvis den opnåede respons er inkonklusiv.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Overvejes det at anvende en fast højeste dosis på 5 000 mg/kg, 
følger man proceduren i bilag 3 (se også punkt 1.6.2).  
1.5.3.2.  Grænsetest  
Grænsetesten anvendes fortrinsvis i situationer, hvor forsøgslederen 
har oplysninger om, at teststoffet må forventes at være atoksisk, dvs, 
kun er toksisk i doser over de grænsedoser, der er fastsat i bestem ­
melserne. Oplysninger om teststoffets giftighed kan fås ud fra viden om tilsvarende testede stoffer eller tilsvarende testede blandinger eller produkter, idet der tages hensyn til art og procentuelt indhold 
af de stoffer, der vides at være af toksikologisk betydning, Når der 
foreligger få eller slet ingen oplysninger om teststoffets toksicitet, eller når stoffet forventes at være toksisk, skal hovedundersøgelsen udføres.
 
Når den normale fremgangsmåde følges, vil en startdosis ved forunder ­
søgelsen på 2 000 mg/kg (eller undtagelsesvis 5 000 mg/kg) efterfulgt af 
en dosering af fire yderligere dyr tjene som grænsetest med henblik på 
denne guideline.  
1.6. OBSERVATIONER  
Efter doseringen iagttages dyrene enkeltvis mindst én gang i de 
første 30 minutter, og periodisk de første 24 timer, under særlig 
opmærksomhed de første 4 timer, derefter dagligt, gennem i alt 14 dage, bortset fra tilfælde, hvor dyrene må tages ud af undersøgelsen og aflives humant af dyrevelfærdsmæssige grunde eller findes døde. 
Imidlertid bør observationsperioden ikke fastsættes ufravigeligt, Den 
bør fastlægges ud fra de toksiske reaktioners indsætten og restitu ­
tionsperiodens længde og kan således forlænges, når det skønnes nødvendigt. Tidspunkterne for toksiske symptomers indsætten og 
forsvinden er vigtige, navnlig hvis der er tendens til forsinkede 
toksiske symptomer (11), Alle observationer registreres systematisk, og der føres individuel protokol for hvert dyr.
 
Viser dyrene fortsat tegn på toksicitet, vil supplerende observationer 
være nødvendige. Observationerne skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slimhinder, respirationssystem, kredsløb, autonomt 
nervesystem og centralnervesystem, samt somatomotorisk aktivitet 
og adfærdsmønster. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, sløvhed, søvn og koma. De principper og kriterier, der er sammenfattet i Humane Endpoints 
Guidance Document, skal ligeledes tages i betragtning (8). Dyr, som 
findes at være moribunde, og dyr, som udviser svære smerter eller vedvarende tegn på svære lidelser, skal aflives humant. Når dyr aflives af humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet 
registreres så nøjagtigt som muligt.
 
1.6.1.  Kropsvægt  
Vægten af hvert enkelt dyr bestemmes kort før indgift af teststoffet 
og derefter mindst én gang om ugen. Vægtændringer beregnes og 
registreres. Ved forsøgets slutning vejes de overlevende dyr, som 
derefter aflives humant.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Patologi  
Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller tages ud 
af forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes makrosko ­
pisk undersøgelse. Alle makroskopiske patologiske forandringer regi ­
streres for hvert dyr. For dyr, som overlever i 24 timer eller længere 
efter den første dosering, kan man endvidere overveje mikroskopisk undersøgelse af organer, som udviser makroskopiske patologiske forandringer, da dette kan give nyttige oplysninger.
 
2. DATA  
Der skal forefindes data for de enkelte dyr. Derudover opstilles i 
tabelform for hver forsøgsgruppe oplysninger om antal dyr ved 
forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af huma ­
nitære grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af 
toksiske virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet, 
samt obduktionsfund.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er 
relevante:  
Teststof:  
— fysisk tilstand, renhed og, når det er relevant, fysisk-kemiske 
egenskaber (herunder isomeri)  
— identifikationsdata, herunder CAS-nummer.  
For eventuelt vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.  
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte art/stamme  
— dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes  
— dyrenes antal, alder og køn (og, i givet fald, begrundelse for brug 
af handyr i stedet for hundyr)  
— oprindelse, opstaldning, foder osv.  
Forsøgsbetingelser:  
— enkeltheder vedrørende teststoffets formulering, herunder beskri ­
velse af den fysiske tilstand af det indgivne materiale  
— oplysninger om administrationen af teststoffet, herunder dose ­
ringsvolumen og doseringstidspunkt  
— oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder foderets 
art og oprindelse, vandets oprindelse)  
— begrundelse for valg af startdosis.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Resultater:  
— opstilling i tabelform af effekter og dosisniveau for hvert dyr 
(dvs, dyr, som viser tegn på toksicitet, herunder mortalitet, og virkningernes art, sværhed og varighed)
 
— opstilling i tabelform af kropsvægt og ændringer i kropsvægt  
— de enkelte dyrs vægt på doseringsdagen, derefter med én uges 
mellemrum, samt på døds- eller aflivningstidspunktet  
— dato og klokkeslæt for dyrets død, hvis denne indtræder før den 
planlagte aflivning  
— for hvert dyr, toksiske virkningers indsætten, tidsforløb og hvor ­
vidt de er reversible  
— for hvert dyr, obduktionsfund og, i givet fald, histopatologiske 
fund.  
Diskussion og fortolkning af resultater.  
Konklusioner,  
4. HENVISNINGER  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicitiy (1984). 
Special report: a new approach to the classification of 
substances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, 85-92.  
(2) Van den Heuvel. M.J., Dayan. A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of 
substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.
 
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Petling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. 
Chem. Toxicol. 28, 469-482.  
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.  
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol.
 
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002), 
Statistical evaluation of the revised fixed dose procediire.- Hum, Exp. Toxicol., 21, 183-196.
 
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assesment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.ll [http://webnetl.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 
24-no-0,FF.html].
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.  
(11) Chan P.K and A.W. Haves (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3
 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd New York, 
USA.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
BILAG 1  
FREMGANGSMÅDE VED FORUNDERSØGELSEN

 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
BILAG 2  
FREMGANGSMÅDE VED HOVEDUNDERSØGELSEN

 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
BILAG 3  
KRITERIER FOR KLASSIFICERING AF TESTSTOFFER MED 
FORVENTET LD  50 -VÆRDI OVER 2 000 MG/KG, UDEN AT 
TESTNING ER NØDVENDIG  
Kriterierne for farekategori 5 skal give mulighed for at udpege teststoffer, som 
udviser relativ risiko for akut gifitighed, men som under visse omstændigheder 
kan udgøre en fare for følsomme populationer. For disse stoffer forventes en oral eller dermal LD
 50 i området 2 000-5 000 mg/kg, eller tilsvarende doser for andre 
administrationsveje, I følgende tilfælde kan et teststof klassificeres i farekatego ­
rien defineret ved: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (kategori 5 i GHS):  
a) hvis de kan tilordnes denne kategori i henhold til enhvert af skemaerne i 
bilag 2 på grundlag af dødsfrekvensen  
b) hvis foreliggende pålidelige oplysninger viser, at LD  50 ligger i området 
svarende til kategori 5, eller hvis andre dyreundersøgelser eller toksiske virk ­
ninger i mennesker viser, at der er grund til stærke sundhedsmæssige betæn ­
keligheder  
c) ved ekstrapolation, skønsmæssig beregning eller måling af data, når der ikke 
er grundlag for at tilordne stoffet til en farligere klasse, og  
— foreliggende pålidelige oplysninger viser betydelig toksisk virkning på 
mennesker, eller  
— der iagttages dødelighed ved testning op til værdierne svarende til kategori 
4 ved oral administration, eller  
— ekspertvurderinger bekræfter, at der er væsentlige kliniske tegn på toksi ­
citet ved testning op til værdierne svarende til kategori 4, bortset fra diarré, pilorektion eller uplejet udseende af pels, eller
 
— ekspertvurderinger bekræfter pålidelige oplysninger om potentiale for 
væsentlige akutte virkninger i de andre dyreforsøg.  
TESTNING VED DOSER OVER 2 000 MG/KG  
Et supplerende øvre fast dosisniveau på 5 000 mg/kg kan undtagelsesvis over ­
vejes, når konkrete myndighedsbestemmelser gør det nødvendigt. Dyrevelfærds ­
mæssige grunde taler imod testning af dyr ved 5 000 mg/kg, og et sådant forsøg 
bør kun overvejes, når dets resultater med overvejende sandsynlighed vil få 
direkte relevans for beskyttelsen af dyrs eller menneskers sundhed (9),  
Forundersøgelse  
Reglerne i bilag 1 for anvendelse af den sekventielle metode udvides til at 
omfatte dosisniveauet 5 000 mg/kg. Når startdosis i forundersøgelsen er 5 000 mg/kg, vil udfald A (død) kræve testning af endnu et dyr ved 
2 000 mg/kg; udfald B og C (synlig toksicitet eller ingen toksicitet) vil tillade, 
at 5 000 mg/kg vælges som startdosis i hovedundersøgelsen. Tilsvarende gælder, at hvis der anvendes en anden startdosis end 5 000 mg/kg, skal forsøget udvides til 5 000 mg/kg i tilfælde af udfald B eller C ved 2 000 mg/kg; fås derefter udfald 
A ved 5 000 mg/kg, skal startdosis i hovedundersøgelsen være 2 000 mg/kg, og 
fås udfald B og C, skal startdosis i hovedundersøgelsen være 5 000 mg/kg
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Hovedundersøgelse  
Reglerne i bilag 2 for anvendelse af den sekventielle metode udvides til at 
omfatte dosisniveauet 5 000 mg/kg, Når startdosis i forundersøgelsen er 5 000 mg/kg, vil udfald A ( ≥ 2 dødsfald) kræve testning af endnu en gruppe 
ved 2 000 mg/kg; udfald B (synlig toksicitet og/eller ≤ 1 dødsfald) eller C (ingen 
toksicitet) vil medføre, at stoffet ikke skal klassificeres i henhold til GHS. Tilsva ­
rende gælder, at hvis der anvendes en anden startdosis end 5 000 mg/kg, vil forsøget blive udvidet til 5 000 mg/kg i tilfælde af udfald C ved 2 000 mg/kg; et efterfølgende udfald A ved 5 000 mg/kg vil placere stoffet i GHS kategori 5, 
mens udfald B eller C vil medføre, at stoffet ikke skal klassificeres.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
BILAGÂ 4  
TESTMETODE B.l a  
Vejledning i klassificering efter EU-systemet i overgangsperioden indtil fuld gennemfÃ,relse af det globale harmoniserede klass ifikationssystem (GHS) (fra henvisning (8))

 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1.B.  AKUT ORAL TOKSICITET — AKUT 
TOKSICITETSKLASSEMETODEN  
1. METODE  
Metoden svarer til OECD TG 423 (2001).  
1.1. INDLEDNING  
Akut toksisitetsklassemetoden (1) er en trinvis metode, hvor der 
anvendes tre dyr af samme køn på hvert trin. Afhængigt af 
dyrenes dødelighed og/eller moribunde tilstand kræves i gennemsnit 2-4 trin til vurdering af den akutte toksicitet af et teststof. Metoden er reproducerbar, kræver meget få dyr og gør det muligt at vurdere 
stofferne efter giftighed på tilsvarende måde som andre metoder til 
bestemmelse af akut toksicitet. Akut toksicitetsklassemetoden bygger på biometriske vurderinger (2)(3)(4)(5) med faste doser, der er spredt således, at et stofs giftighed kan bestemmes med henblik på klas ­
sificering og risikovurdering, Metoden blev indført i 1996 og er 
blevet grundigt valideret in vivo over for LD
 50 -data fra litteraturen, 
både nationalt (6) og internationalt (7).  
Vejledning i valg af den mest hensigtsmæssige forsøgsmetode til et 
givet formål kan findes i Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing (8). Samme dokument indeholder desuden supplerende oplys ­
ninger om udførelse og fortolkning af forsøg efter metode B.1.B.  
Man behøver ikke indgive stofferne i doser, der vides at medføre udtalt 
smerte og lidelse på grund af ætsende eller stærkt irriterende virkning. 
Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære 
og vedvarende lidelser, skal aflives humant og betragtes ved fortolk ­
ningen af forsøgsresultaterne på samme måde som dyr, der er døde under forsøget. Kriterierne for aflivning af moribunde eller stærkt 
lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller forestående 
død er genstand for en særskilt vejledning (9).
 
Metoden giver oplysninger om de farlige egenskaber og gør det 
muligt at vurdere stofferne efter giftighed og klassificere stofferne efter det globale harmoniserede system (GHS) til klassificering af 
kemiske stoffer med akut toksisk virkning (10).
 
I princippet er metoden ikke beregnet til bestemmelse af en nøjagtig 
LD 50 -værdi, men giver mulighed for at fastlægge nogle ekspone ­
ringsintervaller, inden for hvilke der forventes dødelighed, idet død af en del af dyrene fortsat er testens vigtigste effektparameter. For at 
en LD
 50 -værdi kan bestemmes med metoden, skal mindst to dosis ­
niveaer resultere i større dødelighed end 0 % og lavere end 100 %. Ved at benytte en række på forhånd fastlagte doser, uafhængigt af teststoffet, og ved eksplicit at basere klassifikationen på antal dyr, 
der observeres i forskellige tilstande, får laboratoriet bedre mulighed 
for at opnå sammenhængende og repeterbare resultater.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle forelig ­
gende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stof ­
fets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo og in vitro toksicitetsunder ­
søgelser af stoffet, toksikologiske data for strukturelt beslægtede 
stoffer, samt stoffets forventede anvendelse(r). Disse oplysninger er 
nødvendige, for at det til alle parters tilfredshed kan godtgøres, at forsøget har betydning for beskyttelsen af menneskers sundhed, og vil desuden være nyttige ved valg af den bedst egnede startdosis.
 
1.2. DEFINITIONER  
Akut oral toksicitet:  de sundhedsmæssigt uønskede virkninger, som 
optræder efter oral indgift af en enkelt dosis af et stof eller efter flere doser indgivet i løbet af 24 timer.
 
Forsinket død:  det forhold, at dyret ikke inden for 48 timer dør eller 
fremtræder moribund, men dør senere inden for den 14 dage lange observationsperiode.
 
Dosis:  den mængde teststof, som indgives. Dosis angives som vægt ­
mængde teststof pr. vægtenhed forsøgsdyr (f.eks. mg/kg).  
GHS:  Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures. Et tælles projekt mellem OECD (sundhed og miljø), FN's ekspertudvalg vedrørende transport af farligt gods (fysisk-kemiske egenskaber) og ILO (faremærkning og -angivelse) 
koordineret af Interorganisation Programme for the Sound Manage ­
ment of Chemicals (IOMC).
 
Overhængende død:  det forhold, at moribund tilstand eller død 
forventes at indtræffe inden næste planlagte observationstidspunkt. 
Som tegn på denne tilstand i gnavere kan nævnes kramper, sideleje, liggende stilling og tremor (Se nærmere i Humane End point Guidance Document (9)).
 
LD 50 (middel oral letaldosis):  den statistisk beregnede enkeltdosis 
af et teststof, som ved oral indgift kan forventes at medføre døden hos 50 % af dyrene. LD
 50 -værdien angives som vægtmængde test ­
stof pr. vægtenhed kropsvægt af forsøgsdyret (mg/kg).  
Grænsedosis:  en dosis, som danner øvre grænse for testen (2 000 
eller 5 000 mg/kg).  
Moribund tilstand:  en tilstand, hvor dyret er døende eller ikke vil 
overleve, selv om det behandles (se nærmere i Humane Endpoint Guidance Document (9)).
 
Forudsigelig død:  tilstedeværelse af kliniske tegn. Som antyder, at 
døden vil indtræffe på et kendt tidspunkt før forsøgets planlagte afslutning; f.eks. at dyret er ude af stand til at bevæge sig hen 
til vand eller føde (se nærmere i Humane Endpoint Guidance Docu ­
ment (9)).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Metoden bygger på en trinvis fremgangsmåde, hvor der på hvert trin 
anvendes det mindst mulige antal dyr, og man opnår tilstrækkelig information om teststoffets akutte giftighed til, at det kan klassifice ­
res. Stoffet gives oralt til en gruppe forsøgsdyr ved en af de fastlagte 
doser. Stoffet testes ved en trinvis fremgangsmåde, hvor der på hvert trin anvendes tre dyr af samme køn (normalt hunner). Stofrelateret dødelighed (eller fravær heraf) af de behandlede dyr på det ene trin 
bestemmer næste trin, dvs.:
 
— ingen yderligere testning nødvendig  
— dosering af yderligere tre dyr med samme dosis  
— dosering af yderligere tre dyr på næste højere eller lavere dosis ­
niveau.  
Detaljer vedrørende testmetoden er beskrevet i bilag 1. Metoden 
giver mulighed for vurdering af stoffets klassificering i en af de 
toksicitetsklasser, der er bestemt ved fast afgrænsede LD  50 -værdier.  
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Valg af dyreart  
Den foretrukne gnaverart er rotter, men andre gnaverarter kan anven ­
des. Sædvanligvis anvendes hundyr (9). Baggrunden herfor er, at litteraturundersøgelser af konventionelle LD
 50 -forsøg viser, at de to 
køn sædvanligvis ikke udviser stor forskel i følsomhed, men hvis der 
er forskel, er hundyr sædvanligvis lidt mere følsomme end handyr (11). Foreligger der imidlertid for strukturelt beslægtede stoffer toksi ­
kologiske eller toksikokinetiske oplysninger, som tyder på, at hanner 
må forventes at være mere følsomme end hunner, bør handyr anven ­
des. Udføres forsøget i hanner, skal fyldestgørende begrundelse herfor gives.
 
Der anvendes raske unge dyr af sædvanligt benyttede laboratori ­
estammer. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. 
Hvert dyr skal ved doseringens begyndelse være mellem 8 og 12 uger gammelt, og dets vægt afvige højst ± 20 % fra gennemsnits ­
vægten af eventuelle tidligere doserede dyr.
 
1.4.2.  Opstaldning og fodring  
Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22  o C (± 3  o C). Den 
relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og bør ikke være over 
70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør 
tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt labo ­
ratoriefoder med fri adgang til drikkevand. Dyrene i en given dosis ­
gruppe kan være anbragt i samme bur, men antallet af dyr i buret må 
ikke vanskeliggøre observation af de enkelte dyr.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Klargøring af dyrene  
Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan 
identificeres, og holdes i burene i mindst 5 døgn forud for doserin ­
gen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne.  
1.4.4.  Tilberedning af doser  
Sædvanligvis anvendes samme volumen til indgift af teststoffet på 
alle de anvendte dosisniveauer, idet man varierer koncentrationen i 
det indgivne præparat. Er det færdige produkt eller den færdige blanding flydende, kan anvendelse af ufortyndet teststof, dvs. med konstant koncentration, være mest relevant for den efterfølgende 
risikovurdering af stoffet, og af nogle myndigheder stilles da også 
krav herom. I begge tilfælde må det maksimale volumen for indgift ikke overskrides. Den maksimale væskemængde, som kan indgives ad gangen, afhænger af forsøgsdyret størrelse. Til gnavere må 
rumfanget normalt ikke overskride 1 ml/100 g kropsvægt. ved 
vandige opløsninger kan det dog overvejes at anvende 2 ml/100 g kropsvægt. Ved formulering af doseringspræparatet anbefales det så vidt muligt at benytte en vandig opløsning/suspension/emulsion, efterfulgt (i 
prioriteret rækkefølge) af en opløsning/suspension/emulsion i olie (f.eks. 
majsolie) og derefter eventuelt en opløsning i andre vehikler. For andre vehikler end vand skal vehiklets toksiske egenskaber være kendt. Doserne skal tilberedes kort før indgift, medmindre præparatets hold ­
barhed inden for anvendelsesperioden kendes og er godtgjort at være 
tilfredsstillende.
 
1.5. FREMGANGSMÅDE  
1.5.1.  Administration of doserne  
Teststoffet indgives ved gavage som én enkelt dosis med gastrisk 
sonde eller et passende intubationsrør. Er det ikke muligt at indgive 
den pågældende stofmængde som en enkelt dosis, kan den undtagel ­
sesvis undtagelsesvis indgives opdelt i få enkelte dele af den samlede dosis over en periode på højst 24 timer.
 
Dyrene skal være fastende inden doseringen (f.eks. skal rotter natten 
over ikke have foder, men adgang til vand. mus skal i 3-4 timer ikke 
have foder, men adgang til vand). Efter fasteperioden vejes dyrene, 
og teststoffet indgives, Når stoffet er indgivet, kan dyrene unddrages føde i yderligere 3-4 timer for rotter og 1-2 timer for mus. Når en dosis indgives delt over et vist tidsrum, kan det alt efter dette tidsrum 
være nødvendigt at give dyrene foder og adgang til vand.
 
1.5.2.  Antal dyr og dosisniveauer  
Der anvendes tre dyr til hvert trin. Som startdosis anvendes et af fire 
faste niveauer, 5, 50, 300 og 2 000 mg/kg kropsvægt. Som startdosis 
skal anvendes den, der med størst sandsynlighed forventes at frem ­
kalde dødelighed i nogle af de doserede dyr. I skemaerne i bilag 1 beskrives den procedure, der skal følges for hver startdosis. 
Derudover giver bilag 4 vejledning i, hvordan man foretager klas ­
sificeringen i EU's system, indtil det nye GHS er indført.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Når de foreliggende oplysninger tyder på, at der næppe kan forventes 
dødelighed ved den højeste startdosis (2 000 mg/kg kropsvægt), skal 
der udføres en grænsetest. Når der ikke foreligger nogen oplysninger om teststoffet, anbefales 300 mg/kg kropsvægt som startdosis af dyrevelfærdsmæssige grunde.
 
Tidsintervallet mellem doseringerne på hvert niveau bestemmes ud 
fra de toksiske symptomers indsætten, varighed og sværhed. Behand ­
lingen af dyrene ved næste dosering skal vente, indtil det er sikkert, at de tidligere doserede dyr vil overleve.
 
Undtagelsesvis, og kun når det kan begrundes konkret ud fra 
myndighedsregler, kan det overvejes at anvende et supplerende 
højeste fast dosisniveau på 5 000 mg/kg (se bilag 2), Af dyrevel ­
færdsmæssige grunde anbefales det at undgå testning i området svarende til GHS-kategori 5 (2 000-5 000 mg/kg), som kun bør over ­
vejes, når resultaterne af et sådant forsøg med overvejende sandsyn ­
lighed ventes at få direkte relevans for beskyttelsen af dyrs eller menneskers sundhed eller miljøet.
 
1.5.3.  Grænsetest  
Grænsetesten anvendes fortrinsvis i situationer, hvor forsøgslederen 
har oplysninger om, at teststoffet må forventes at være atoksisk, dvs. 
kun er toksisk i doser over de grænsedoser, der er fastsat i bestem ­
melserne. Oplysninger om teststoffets toksicitet kan fås ud fra viden om tilsvarende testede stoffer eller tilsvarende testede blandinger 
eller produkter, idet der tages hensyn til art og procentuelt indhold 
af de stoffer, der vides at være af toksikologisk betydning. Når der kun foreligger få eller slet ingen oplysninger om teststoffets toksici ­
tet, eller når stoffet forventes at være toksisk, bør hovedundersø ­
gelsen udføres.
 
Der kan udføres en grænsetest ved ét dosisniveau på 2 000 mg/kg 
kropsvægt med seks dyr (tre dyr på hvert trin). Undtagelsesvis kan der i grænsetesten anvendes et dosisniveau på 5 000 mg/kg krops ­
vægt med tre dyr (se bilag 2). Hvis dette medfører teststofrelateret 
mortalitet, kan yderligere testning på næste lavere dosisniveau være nødvendig.
 
1.6 OBSERVATIONER  
Efter doseringen iagttages dyrene enkeltvis mindst én gang i de 
første 30 minutter, og periodisk de første 24 timer, under særlig 
opmærksomhed de første 4 timer, derefter dagligt, gennem i alt 14 
dage, bortset fra tilfælde, hvor dyrene må tages ud af undersøgelsen og aflives humant af dyrevelfærdsmæssige grunde eller findes døde. Imidlertid bør observationsperioden ikke fastsættes ufravigeligt. Den 
fastlægges ud fra de toksiske reaktioners indsætten og restitutions ­
periodens længde og kan således forlænges, når det skønnes nødven ­
digt. Tidspunkterne for toksiske symptomers indsætten og forsvinden er vigtige, navnlig hvis der er tendens til forsinkede toksiske symp ­
tomer (12). Alle observationer registreres systematisk i og der føres 
individuel protokol for hvert dyr.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Viser dyrene fortsat tegn på toksicitet, vil supplerende observationer 
være nødvendige, Observationerne skal omfatte forandringer i hud, 
pels, øjne og slimhinder, respirationssystem, kredsløb, autonome nervesystem og centralnervesystem, samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Man skal være opmærksom på, om der kan 
iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, sløvhed, søvn og coma. 
Ligeledes skal der tages hensyn til principperne og kriterierne i Humane Endpoints Guidance Document (9). Dyr, som findes at være moribunde, og dyr, som udviser svære smerter eller vedvarende 
tegn på svære lidelser, skal aflives humant. Når dyr aflives af 
humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet registreres så nøjagtigt som muligt.
 
1.6.1.  Kropsvægt  
Vægten af hvert enkelt dyr bestemmes kort før indgift af teststoffet 
og derefter mindst én gang om ugen. Vægtændringer beregnes og registreres. Ved forsøgets slutning vejes de overlevende dyr, som derefter aflives humant.
 
1.6.2.  Patologi  
Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller tages ud 
af forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes makrosko ­
pisk undersøgelse. Alle makroskopiske patologiske forandringer regi ­
streres for hvert dyr. Endvidere kan det overvejes at foretage mikro ­
skopisk undersøgelse af organer, som udviser makroskopiske forandringer, da dette kan give nyttige oplysninger.
 
2. DATA  
Der skal forefindes data for de enkelte dyr. Derudover opstilles i 
tabelform for hver forsøgsgruppe antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, døds ­
tidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske virkninger og 
disses tidsmæssige forløb og reversibilitet, samt obduktionsfund.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. Forsøgsrapport  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er 
relevante:  
For teststoffet:  
— fysisk tilstand, renhed og, når det er relevant, fysisk-kemiske 
egenskaber (herunder isomeri)  
— identifikationsdata, herunder CAS-nummer.  
For eventuelt vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.  
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte art/stamme  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes  
— dyrenes antal, alder og køn (og, i givet fald, begrundelse for brug 
af handyr i stedet for hundyr)  
— oprindelse, opstaldning, foder osv.  
Forsøgsbetingelser:  
— enkeltheder vedrørende teststoffets formulering, herunder beskri ­
velse af det indgivne materiales fysiske tilstand;  
— oplysninger om administrationen af teststoffet, herunder dose ­
ringsvolumen og doseringstidspunkt:  
— oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder foderets 
art og oprindelse, vandets oprindelse)  
— begrundelse for valg af startdosis.  
Resultater:  
— opstilling i tabelform af effekter og dosisniveau for hvert dyr 
(dvs. dyr, som viser tegn på toksicitet, herunder mortalitet; og 
virkningernes art, sværhed og varighed)  
— opstilling i tabelform af kropsvægt og ændringer i kropsvægt  
— de enkelte dyrs vægt på doseringsdagen, derefter med én uges 
mellemrum, samt på døds- eller aflivningstidspunktet  
— dato og klokkeslæt for dyrets død, hvis denne indtræder før den 
planlagte aflivning  
— for hvert dyr, toksiske virkningers indsætten, tidsforløb og hvor ­
vidt de er reversible  
— for hvert dyr, obduktionsfund og, i givet fald, histopatologiske 
fund.  
Diskussion og fartolkning af resultater.  
Konklusioner.  
4. HENVISNINGER  
(1) Roll R., Hiifer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Pers ­
pectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.
 
(2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität van Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.
 
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129-134.  
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Tosic- Class Method 
— An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455- 
470. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.  
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
 
(10) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/ 
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14- no-24-no-0,FF.html].
 
(11) Lipnick R.L, Cotnivo. J.A, Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., 
Walter A.P. Chu I: Goddard M, Segal L., Springer J.A. and 
Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, 223-231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy. Principles und Methods of Toxicology. 
Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
BILAG 1  
FREMGANGSMÅDE, SOM SKAL FØLGES FOR HVER STARTDOSIS  
GENERELLE BEMÆRKNINGER  
For hver startdosis er anvist korrekt fremgangsmåde i den pågældende forsøgs ­
plan i dette bilag.  
— Bilag 1 A: Startdosis er 5 mg/kg kropsvægt  
— Bilag 1 B: Startdosis er 50 mg/kg kropsvægt  
— Bilag 1 C: Startdosis er 300 mg/kg kropsvægt  
— Bilag 1 D: Startdosis er 2 000 mg/kg kropsvægt  
Ved forsøgsgangen følges pilene, afhængigt af antallet af humant aflivede eller 
døde dyr.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
BILAG I A  
FREMGANGSMÅDE VED ANVENDELSE AF EN STARTDOSIS PÅ 5 MG/KG KROPSV ÆGT

 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
BILAG 1 B  
FREMGANGSMÅDE VED EN STARTDOSIS PÅ 50 MG/KG KROPSVÆGT

 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
BILAG 1 C  
FREMGANGSMÅDE VED EN STARTDOSIS PÅ 300 MG/KG KROPSVÆGT

 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
B1LAG 1 D  
FREMGANGSMÅDE VED EN STARTDOSIS PÅ 2 000 MG/KG KROPSVÆGT

 BILAG 2  
KRITERIER FOR KLASSIFICERING AF TESTSTOFFER MED 
FORVENTET LD  50 OVER 2 000 MG/KG UDENAT TESTNING ER 
NØDVENDIG  
Kriterierne for farekategori 5 skal gøre det muligt at udpege teststoffer, som 
udviser relativ lav risiko for akut giftighed, men som under visse omstændig ­
heder kan udgøre en fare for følsomme populationer. For disse stoffer forventes en oral eller dermal LD
 50 i området 2 000-5 000 mg/kg, eller tilsvarende doser 
for andre administrationsveje. i følgende tilfælde skal et teststof klassificeres 
i farekategorien defineret ved: 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg 
(kategori 5 i GHS):  
a) Hvis de hører hjemme i denne kategori i henhold til enhver af testskemaerne i 
bilag l A-l D på grundlag af dødsfrekvensen  
b) hvis foreliggende pålidelige oplysninger viser, at LD  50 ligger i området 
svarende til kategori 5, eller hvis andredyreundersøgelser eller toksiske virk ­
ninger i mennesker viser, at der er grund til alvorlige sundhedsmæssige 
betænkeligheder  
c) ved ekstrapolation, skønsmæssig ansættelse eller måling af data. når der ikke 
er grundlag for at tilordne stoffet til en farligere klasse, og  
— foreliggende pålidelige oplysninger viser betydelig toksisk virkning på 
mennesker, eller  
— der iagttages dødelighed ved testning op til værdierne svarende til kategori 
4 ved oral indgift, eller  
— ekspertvurderinger bekræfter, at der ved testning op til værdierne svarende 
til kategori 4 findes væsentlige kliniske tegn på toksicitet, bortset fra 
diarré, pilorektion eller uplejet udseende af pels. eller  
— ekspertvurderinger bekræfter pålidelige oplysninger om potentiale for 
væsentlige akutte virkninger i de andre dyreforsøg.  
TESTNING VED DOSER OVER 2 000 MG/KG  
Dyrevelfærdsmæssige hensyn taler imod testning i området 5 000 mg/kg i kate ­
gori 5 (5 000 mg/kg), og et sådant forsøg bør kun overvejes, når dets resultater 
med overvejende sandsynlighed må forventes at få direkte relevans for beskyt ­
telsen af dyrs eller menneskers sundhed eller miljøet (10). Der bør ikke udføres 
yderligere forsøg ved højere dosisniveauer.  
Er testning ved 5 000 mg/kg nødvendig, kræves kun ét trin (dvs. tre dyr). Hvis 
det først doserede dyr dør, fortsættes testningen ved 2 000 mg/kg efter skemaerne i bilag 1. Overlever det første dyr, doseres to dyr mere. Hvis kun ét af de tre dyr dør, er den forventede LD
 50 -værdi over 5 000 mg/kg. Hvis begge dyr dør, fort ­
sætter doseringen ved 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
BILAG 3  
TESTMETODE B.1 b. Vejledning i klassificering efter EU-systemet i overgangsperioden 
indtil fuld gennemførelse af det globale harmoniserede klassifikationssystem (GHS) (fra 
henvisning (8))
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. AKUT TOKSICITET (INHALATION)  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline 403 (2009) (1). Den 
oprindelige Test Guideline 403 (TG 403) for akut toksicitet ved inhalation blev vedtaget i 1981. Formålet med denne reviderede testmetode B.2 (som 
svarer til den reviderede TG 403) er at sikre mere fleksibilitet, reducere 
omfanget af dyreforsøg og opfylde myndighedsbestemmelser. Den revide ­
rede testmetode omfatter to typer forsøg: en traditionel LC
 50 -protokol og en 
koncentration × tid-protokol (C × t). Denne testmetode er primært kende ­
tegnet ved dens evne til at tilvejebringe en koncentrationsresponsrelation 
varierede fra ikke-dødelige til dødelige resultater med henblik på at få en gennemsnitlig dødelig dosis (LC
 50 ), ikke-dødelig tærskelkoncentration 
(f.eks. LC  01 ) og hældning og dens evne til at identificere mulig kønsspecifik 
modtagelighed. C × t-protokollen bør anvendes, når specifikke myndigheds ­
bestemmelser eller videnskabelige behov nødvendiggør forsøg med dyr i forskellige tidsrum, f.eks. med henblik på planlægning af nødberedskab [f.eks. udledning af værdier for Acute Exposure Guideline 
Levels (AEGL), Emergency Response Planning Guidelines (ERPG) eller 
Acute Exposure Threshold Levels (AETL)] eller med henblik på fysisk planlægning.
 
2. Vejledning i udførelse og fortolkning af forsøgene i forbindelse med denne 
testmetode findes i Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity 
Testing (GD 39) (2).  
3. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i 
slutningen af dette kapitel og i GD 39 (2).  
4. Denne testmetode muliggør karakterisering og kvantitativ risikovurdering af 
testkemikaliet og gør det muligt at vurdere og klassificere testkemikalierne i 
overensstemmelse med forordning (EF) nr. 1272/2008 (3). GD 39 (2) beskriver, hvordan den mest hensigtsmæssige metode til akut testning 
vælges. Hvis der kun kræves oplysninger om klassificering og mærkning, 
anbefales generelt kapitel B.52 i dette bilag (4) [se GD 39 (2)]. Denne testmetode B.2 er ikke specifikt beregnet til test af særlige materialer, som f.eks. tungtopløselige isometriske eller fiberholdige materialer eller 
fremstillede nanomaterialer.
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
5. Inden test i overensstemmelse med denne metode overvejes, bør alle tilgæn ­
gelige oplysninger om testkemikaliet, herunder eksisterende forsøg (f.eks. 
kapitel B.52 i dette bilag (4)), hvis data understøtter, at der ikke udføres yderligere test, overvejes af testlaboratoriet med henblik på at minimere omfanget af dyreforsøg. Oplysninger, der kan hjælpe med at vælge de 
mest hensigtsmæssige arter, stammer, køn, eksponeringsformer og testkon ­
centrationer, omfatter testkemikaliets identitet, kemiske struktur og fysisk-kemiske egenskaber, resultater af in vitro- eller in vivo-toksicitetstest, forventede anvendelser og potentialet for human 
eksponering, tilgængelige (Q)SAR-data og toksikologiske data vedrørende 
strukturelt relaterede stoffer [se GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Test af ætsende og/eller irriterende testkemikalier ved koncentrationer, der 
forventes at forvolde stærk smerte og lidelse, bør så vidt muligt undgås. 
Ætsnings-/irritationsstyrken skal evalueres af eksperter ved hjælp af doku ­
mentation, som f.eks. erfaringer fra mennesker og dyr (f.eks. fra forsøg med gentagen dosering udført ved koncentrationer, der ikke er ætsende/irriteren ­
de), eksisterende in vitro-data [f.eks. fra kapitel B.40 (5) og kapitel B.40.A 
(6) i dette bilag eller OECD TG 435 (7)], pH-værdier, information fra lignende stoffer eller andre relevante data med henblik på at undersøge, om yderligere test kan undgås. Når konkrete myndighedsbestemmelser gør 
det nødvendigt (f.eks. i forbindelse med planlægning af nødberedskab), kan 
denne testmetode bruges til eksponering af dyr for sådanne materialer, fordi det giver forsøgslederen eller den primære investigator mulighed for at vælge målkoncentrationerne. Målkoncentrationerne bør dog ikke have 
svære irriterende/ætsende virkninger, men alligevel være tilstrækkelige til 
at hæve koncentrations-responskurven til et niveau, der opfylder testens lovgivningsmæssige eller videnskabelige formål. Disse koncentrationer bør vælges i hvert enkelt tilfælde, og den valgte koncentration bør begrundes [se 
GD 39 (2)].
 
TESTENS PRINCIP  
7. Denne reviderede testmetode B.2 har til formål at tilvejebringe tilstrækkelige 
oplysninger om den akutte toksicitet af et testkemikalie til, at det kan klas ­
sificeres, og til at tilvejebringe data om dødelighed (f.eks. LC  50 , LC  01 og 
hældning) for et eller begge køn, hvis det er nødvendigt til de kvantitative risikovurderinger. Denne testmetode omfatter to metoder. Den første metode er en traditionel protokol, hvor grupper af dyr eksponeres for en grænse ­
koncentration (grænsetest) eller en serie af koncentrationer i en trinvis frem ­
gangsmåde i en forudbestemt periode på normalt fire timer. Andre ekspone ­
ringsvarigheder kan anvendes for at opfylde konkrete myndighedsbestem ­
melser. Den anden metode er en C × t-protokol, hvor grupper af dyr 
eksponeres for en grænsekoncentration eller en serie af flere koncentrationer 
i flere perioder.
 
8. Dyr, som er døende, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og 
vedvarende lidelser, bør aflives humant og betragtes ved fortolkningen af testresultatet på samme måde som dyr, der er døde under testen. Kriterierne for aflivning af døende eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå 
forudsigelig eller forestående død er genstand for en særskilt vejledning 
(OECD Guidance Document No. 19 on Humane Endpoints) (8).
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
9. Der anvendes raske unge dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. 
Den foretrukne art er rotter, og der bør gives begrundelse, hvis en anden art 
anvendes.  
Forberedelse af dyrene  
10. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. På eksponerings ­
dagen bør dyrene være unge voksne, der er mellem 8 og 12 uger gamle, og 
deres kropsvægt bør være inden for ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert 
køn af tidligere eksponerede dyr i samme alder. Dyrene udtages på tilfældig måde og mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres. Dyrene holdes i deres bure i mindst fem dage, inden testen påbegyndes, så de tilvænnes labora ­
torieforholdene. Dyrene tilvænnes også testudstyret i en kort perioden inden 
testen, da det vil mindske stress forårsaget af introduktionen til et nyt miljø.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Dyreopdræt og -sundhed  
11. Temperaturen i forsøgsdyrrummet bør være 22 ± 3 °C. Den relative 
fugtighed bør være 30-70 %, selv om det muligvis ikke er muligt, hvis vand bruges som vehikel. Før og efter eksponering bør dyr generelt 
holdes i bur i grupper efter køn og koncentration, men antallet af dyr pr. 
bur må ikke bevirke, at det er vanskeligt at observere de enkelte dyr, og bør minimere tab som følge af kannibalisme og slagsmål. Hvis dyr alene eksponeres gennem næsen, skal de muligvis tilvænnes fastspændingsslanger. 
Disse slanger må ikke påføre dyrene unødig fysisk, termisk eller bevægel ­
sesmæssig belastning. Fastspænding kan påvirke fysiologiske effektparame ­
tre, som f.eks. kropstemperatur (hypertermi) og/eller respiratorisk minutvo ­
lumen. Hvis der foreligger generiske data, som viser, at sådanne ændringer 
ikke forekommer i nævneværdigt omfang, er tilvænning til fastspændings ­
slangerne ikke nødvendig. Dyr, der med hele kroppen eksponeres for en aerosol, bør holdes i individuelle bure under eksponeringen for at undgå, at 
testaerosolen filtreres gennem pelsen på de andre dyr i buret. Der kan 
anvendes normalt og godkendt laboratoriefoder, dog ikke under ekspone ­
ring, med ubegrænset forsyning af drikkevand. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke.
 
Inhalationskamre  
12. Karakteren af testkemikaliet og formålet med testen bør overvejes ved valget 
af inhalationskammer. Den foretrukne eksponeringsform er gennem næsen 
(dette udtryk omfatter kun hoved, kun næse og kun snude). Eksponering 
gennem næsen foretrækkes generelt i forbindelse med test af flydende eller faste aerosoler og dampe, der kan kondensere og danne aerosoler. Særlige 
formål med forsøget kan bedre opfyldes ved eksponering af hele kroppen, 
men dette skal begrundes i forsøgsrapporten. For at sikre en stabil atmos ­
fære, når der anvendes et kammer til hele kroppen, må forsøgsdyrenes totale volumen ikke overstige 5 % af kammerets volumen. Principperne for teknik ­
kerne til eksponering gennem næsen eller eksponering af hele kroppen samt 
deres særlige fordele og ulemper er beskrevet i GD 39 (2).
 
EKSPONERINGSBETINGELSER  
Administration af koncentrationer  
13. Eksponering gennem næsen kan være af enhver varighed på op til seks 
timer for rotter. Hvis mus eksponeres gennem næsen, må eksponeringstiden 
generelt ikke overstige fire timer. Der gives en begrundelse, hvis test af længere varighed er påkrævet [se GD 39 (2)]. Dyr, der eksponeres for aerosoler i kamre til hele kroppen, bør holdes i individuelle bure for at 
undgå, at de indtager testkemikaliet som følge af soignering af de andre 
dyr. Dyrene bør ikke fodres i eksponeringsperioden. Dyret skal have adgang til vand under helkropseksponering.
 
14. Dyr eksponeres for testkemikaliet i form af en gas, dampe, aerosoler eller en 
blanding heraf. Den fysiske tilstand, der skal testes, afhænger af testkemi ­
kaliets fysisk-kemiske egenskaber, den valgte koncentration og/eller den fysiske form, der højst sandsynligt vil være til stede under håndteringen og anvendelsen af testkemikaliet. Hygroskopiske og kemisk reaktive testke ­
mikalier bør testes under tørre luftforhold. Der må ikke skabes eksplosive 
koncentrationer.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Partikelstørrelsesfordeling  
15. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for alle aerosoler og dampe, der 
kan kondensere og danne aerosoler. For at sikre, at alle relevante områder af luftvejene eksponeres, anbefales aerosoler med en massemedian af den aero ­
dynamiske diameter (MMAD) i området fra 1 til 4 μm med en geometrisk 
standardafvigelse ( σ
 g ) i området fra 1,5 til 3,0 (2) (9) (10). Der bør ydes en 
rimelig indsats for at overholde denne standard, men en ekspertvurdering gives, hvis det ikke er muligt. Partikler fra tungmetalrøg kan f.eks. være 
mindre end denne standard, og ladede partikler, fibre og hygroskopiske 
materialer (som udvides i luftvejenes fugtige miljø) kan overstige standar ­
den.
 
Fremstilling af testkemikalie i vehikel  
16. Der kan anvendes et vehikel til at frembringe et testkemikalie med den 
rigtige koncentration og partikelstørrelse i atmosfæren. Generelt foretrækkes 
vand. Partikelformigt materiale kan underkastes mekaniske processer for at 
opnå den krævede partikelstørrelsesfordeling. Det skal dog omhyggeligt sikres, at testkemikaliet ikke dekomponerer eller ændres. Hvis mekaniske processer menes at have ændret teststoffets sammensætning (f.eks. ekstreme 
temperaturer som følge af friktion under formaling), bør testkemikaliets 
sammensætning kontrolleres analytisk. Kontaminering af testkemikaliet skal undgås. Det er ikke nødvendigt at teste granulat, der ikke er letsmuld ­
rende, og som netop er formuleret, så det ikke kan inhaleres. Der bør 
anvendes en slidtest til at dokumentere, at der ikke frembringes respirable 
partikler under håndteringen af granulat. Hvis en slidtest frembringer respi ­
rable stoffer, bør der udføres en inhalationstoksicitetstest.
 
Kontroldyr  
17. En sideløbende negativ (luft)kontrolgruppe er ikke nødvendig. Hvis et andet 
vehikel end vand bruges til at frembringe testatmosfæren, skal en vehikel ­
kontrolgruppe kun anvendes, hvis historiske inhalationstoksicitetsdata ikke 
foreligger. Hvis et toksicitetsforsøg vedrørende et testkemikalie, der er 
formuleret i et vehikel, ikke påviser toksicitet, følger det, at vehiklet er ikke-toksisk ved den testede koncentration. Der er derfor ikke brug for en vehikelkontrol.
 
OVERVÅGNING AF EKSPONERINGSBETINGELSER  
Luftgennemstrømning i kammer  
18. Luftgennemstrømningen gennem kammeret skal nøje kontrolleres, overvåges 
løbende og registreres mindst én gang i timen under eksponering. Overvåg ­
ningen af koncentrationen (eller stabiliteten) i testatmosfæren indgår i 
målingen af alle dynamiske parametre og giver indirekte mulighed for at 
kontrollere alle relevante dynamiske parametre for generering af atmosfæren. Genindånding i kamre til eksponering gennem næsen skal undgås, hvis luftgennemstrømningen gennem eksponeringssystemet ikke er tilstrækkelig 
til at tilvejebringe en dynamisk gennemstrømning i den kemiske testatmos ­
fære. Der er fastlagte metodologier, der kan bruges til at påvise, at genind ­
ånding ikke finder sted under de valgte driftsbetingelser (2) (11). Iltkoncen ­
trationen skal være mindst 19 %, og kuldioxidkoncentrationen må ikke 
overstige 1 %. Hvis der er grund til at antage, at disse standarder ikke 
kan overholdes, skal ilt- og kuldioxidkoncentrationerne måles.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Kammerets temperatur og relative fugtighed  
19. Kammerets temperatur skal være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed i 
dyrenes vejrtrækningszone skal ved eksponering gennem næsen og helkropseksponering overvåges og registreres mindst tre gange ved varig ­
heder af op til fire timer og hver time ved kortere varigheder. Den relative 
fugtighed bør være 30-70 %, men dette er ikke altid muligt (f.eks. ved test af vandbaserede blandinger) eller kan ikke måles på grund af testkemikaliets indvirkning på testmetoden.
 
Testkemikalie: nominel koncentration  
20. Når det er muligt, bør den nominelle eksponeringskoncentration i kammeret 
beregnes og registreres. Den nominelle koncentration er massen af det gene ­
rerede testkemikalie divideret med den samlede mængde luft, der passerer 
gennem kammersystemet. Den nominelle koncentration bruges ikke til at karakterisere dyrenes eksponering, men en sammenligning af den nominelle koncentration og den faktiske koncentration giver en indikation af testsyste ­
mets genereringseffektivitet og kan derfor bruges til at opdage eventuelle 
genereringsproblemer.
 
Testkemikalie: faktisk koncentration  
21. Den faktiske koncentration er koncentrationen af testkemikaliet ved dyrenes 
vejrtrækningszone i et inhalationskammer. Faktiske koncentrationer kan 
bestemmes med specifikke metoder (f.eks. direkte prøveudtagning, adsorp ­
tive eller kemisk reaktive metoder og efterfølgende analytisk karakterisering) eller med ikke-specifikke metoder, som f.eks. gravimetrisk filteranalyse. 
Brugen af gravimetrisk analyse er kun acceptabel for pulverbaserede 
enkeltkomponent-aerosoler eller aerosoler af væsker med lav flygtighed og bør støttes af hensigtsmæssige testkemikaliespecifikke karakteriseringer udført før forsøget. Koncentrationen af pulverbaserede 
flerkomponent-aerosoler kan også bestemmes ved hjælp af gravimetrisk 
analyse. Det kræver dog analysedata, der viser, at det luftbårne materiales sammensætning svarer til udgangsmaterialet. Hvis denne information ikke er tilgængelig, kan det være nødvendigt at gentage analysen af testkemikaliet 
(ideelt i dets luftbårne tilstand) med regelmæssige intervaller i løbet af 
forsøget. For aerosoliserede stoffer, der kan fordampe eller sublimere, bør det påvises, at alle faser er indsamlet ved hjælp af den valgte metode. Målkoncentrationer, nominelle koncentrationer og faktiske koncentationer 
angives i forsøgsrapporten, men kun de faktiske koncentrationer bruges i 
de statistiske analyser til at beregne letale koncentrationer.
 
22. Der anvendes så vidt muligt én batch af testkemikaliet, og prøven opbevares 
under forhold, der bevarer dens renhed, homogenitet og stabilitet. Inden forsøget påbegyndes, bør testkemikaliet karakteriseres, herunder dets 
renhed og, hvis det er teknisk muligt, identitet og mængde af identificerede 
kontaminanter og urenheder. Dette kan påvises ved hjælp af bl.a. følgende data: retentionstid og relativt topareal, molekylvægt fra massespektroskopi- eller gaskromatografianalyser eller andre vurderinger. Selv om testlaborato ­
riet ikke er ansvarligt for prøvens identitet, bør testlaboratoriet af hensyn til 
sikkerheden bekræfte rekvirentens karakterisering i hvert fald på en begrænset måde (f.eks. farve, fysisk form osv.).
 
23. Eksponeringsatmosfæren holdes så konstant som muligt og overvåges konti ­
nuerligt og/eller i intervaller afhængigt af analysemetoden. Hvis intervalba ­
seret prøveudtagning anvendes, bør der udtages atmosfæreprøver i kammeret 
mindst to gange i løbet af et forsøg med en varighed på fire timer. Hvis det 
ikke er muligt på grund af begrænsede luftgennemstrømningshastigheder eller lave koncentrationer, kan en prøve udtages over hele eksponerings ­
perioden. Hvis der forekommer markante udsving fra prøve til prøve, bør 
der anvendes fire prøver pr. eksponering for de næste testede koncentratio ­
ner. De enkelte prøver for koncentrationen i kammeret bør ikke afvige fra
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
middelkoncentrationen med mere end ± 10 % for gasser og dampe eller 
± 20 % for flydende eller faste aerosoler. Tiden til ækvilibrering af 
kammer (t  95 ) beregnes og registreres. Varigheden af en eksponering 
strækker sig over den tid, hvor testkemikaliet genereres, og det omfatter den tid, der kræves for at opnå t
 95 . Vejledning i beregning af t  95 findes i 
GD 39 (2).  
24. For meget komplekse blandinger, der består af gasser/dampe og aerosoler 
(f.eks. forbrændingsatmosfærer og testkemikalier genereret af formåls ­
bestemte slutprodukter/apparater), kan hver fase opføre sig forskelligt i et 
inhalationskammer, og der udvælges derfor mindst ét indikatorstof (ana ­
lysand), normalt det primære aktivstof i blandingen, fra hver fase (gas/damp og aerosol). Hvis testkemikaliet er en blanding, rapporteres analysekoncen ­
trationen for blandingen og ikke kun for det aktive stof eller komponenten 
(analysand). Yderligere oplysninger om faktiske koncentrationer findes i GD 
39 (2).
 
Testkemikalie: partikelstørrelsesfordeling  
25. Aerosolers partikelstørrelsesfordeling bestemmes mindst to gange i løbet af 
hver eksponering på fire timer ved hjælp af en kaskadeimpaktor eller et 
andet instrument, f.eks. et instrument til aerodynamisk partikelstørrelses ­
bestemmelse. Hvis der kan påvises ækvivalens mellem de resultater, der er opnået ved hjælp af kaskadeimpaktoren eller et alternativt instrument, kan det alternative instrument bruges i hele forsøget. Et andet apparat, 
f.eks. et gravimetrisk filter eller en impinger/gas bubbler, anvendes parallelt 
med det primære instrument til at bekræfte det primære instruments opsam ­
lingseffektivitet. Den massekoncentration, der fås ved hjælp af partikelstør ­
relsesanalysen, skal være inden for rimelige grænser af den massekoncen ­
tration, der fås ved hjælp af filteranalyse [se GD 39 (2)]. Hvis ækvivalens 
kan påvises i forsøgets tidligere fase, kan yderligere bekræftelsesmålinger udelades. Af hensyn til dyrevelfærden træffes der foranstaltninger for at minimere inkonklusive data, der kan gøre det nødvendigt at gentage en 
eksponering. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for dampe, hvis der 
er mulighed for, at kondensering af dampe kan føre til dannelsen af en aerosol, eller hvis der konstateres partikler i en dampatmosfære med poten ­
tiale for blandede faser (se afsnit 15).
 
FREMGANGSMÅDE  
26. To forsøgstyper er beskrevet nedenfor: en traditionel protokol og en C × 
t-protokol. Begge protokoller kan omfatte et forforsøg, et hovedforsøg 
og/eller en grænsetest (traditionel protokol) eller testning ved en grænsekon ­
centration (C × t). Hvis et køn vides at være mere modtagelig, kan forsøgs ­
lederen vælge at udføre disse forsøg alene ved hjælp af det mest modtage ­
lige køn. Hvis andre gnaverarter end rotter eksponeres gennem næsen, kan 
de maksimale eksponeringsvarigheder justeres for at minimere artsspecifikke lidelser. Inden forsøget påbegyndes, undersøges alle tilgængelige data med henblik på at minimere omfanget af dyreforsøg. Data, der er indhentet ved 
hjælp af kapitel B.52 i dette bilag 4, kan f.eks. overflødiggøre behovet for et 
forforsøg og kan også vise, om et køn er mere modtageligt [se GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
TRADITIONEL PROTOKOL  
Generelle betragtninger: Traditionel protokol  
27. I et traditionelt forsøg eksponeres grupper af dyr for et testkemikalie i en 
bestemt tidsperiode (oftest 4 timer) i et kammer til eksponering gennem næsen eller helkropseksponering. Dyr eksponeres for en grænsekoncentra ­
tion (grænsetest) eller mindst tre koncentrationer i en trinvis fremgangsmåde 
(hovedforsøg). Et forforsøg kan udføres inden hovedforsøget, medmindre 
der allerede foreligger visse informationer om testkemikaliet, f.eks. et tidligere udført B.52-forsøg [se GD 39 (2)].
 
Forforsøg: traditionel protokol  
28. Et forforsøg bruges til at skønne testkemikaliets styrke, identificere køns ­
betingede forskelle i modtagelighed og hjælpe med at vælge eksponerings ­
koncentrationer til hovedforsøget eller grænsetesten. Når koncentrationerne vælges til forforsøget, anvendes alle tilgængelige informationer, herunder tilgængelige (Q)SAR-data og data vedrørende lignende kemikalier. Højst 
tre hanner og tre hunner bør eksponeres ved hver koncentration (3 
dyr/køn kan være nødvendigt for at fastslå en kønsbetinget forskel). Et forforsøg kan omfatte én koncentration, men flere koncentrationer kan om nødvendigt testes. Et forforsøg bør ikke teste så mange dyr og koncentra ­
tioner, at det ligner et hovedforsøg. Et tidligere udført B.52-forsøg (4) kan 
bruges i stedet for et forforsøg [se GD 39 (2)].
 
Grænsetest: traditionel protokol  
29. En grænsetest bruges, når testkemikaliet vides eller forventes at være stort 
set ikke-toksisk, dvs. det fremkalder toksisk respons, der kun ligger over den fastsatte grænsekoncentration. I en grænsetest eksponeres en gruppe af tre 
hanner og tre hunner for testkemikaliet ved en grænsekoncentration. Oplys ­
ninger om testkemikaliets toksicitet kan fås ud fra viden om tilsvarende testede kemikalier, idet der tages hensyn til art og procentuelt indhold af de stoffer, der vides at være af toksikologisk betydning. Når der kun fore ­
ligger få eller slet ingen oplysninger om testkemikaliets toksicitet, eller når 
testkemikaliet forventes at være toksisk, bør hovedforsøget udføres.
 
30. Valget af grænsekoncentrationer afhænger normalt af lovgivningskrav. Når 
forordning (EF) nr. 1272/2008 anvendes, er grænsekoncentrationerne for 
gasser, dampe og aerosoler henholdsvis 20 000 ppm, 20 mg/l og 5 mg/l (eller den højest opnåelige koncentration) (3). Det kan være en teknisk udfordring at generere testkoncentrationer af visse testkemikalier, især som 
dampe og aerosoler. Ved test af aerosoler bør det primære mål være at opnå 
en respirabel partikelstørrelse (MMAD på 1-4 μm). For de fleste testkemi ­
kalier er det muligt ved en koncentration på 2 mg/l. Test af aerosoler ved en koncentration på mere end 2 mg/l bør kun forsøges, hvis der kan opnås en 
respirabel partikelstørrelse [se GD 39 (2)]. I henhold til forordning (EF) 
nr. 1272/2008 bør test, der overstiger en grænsekoncentration, undgås af hensyn til dyrevelfærden (3). Grænsekoncentrationen bør kun overvejes, når resultaterne af en sådan test med overvejende sandsynlighed ventes at få 
direkte relevans for beskyttelsen af menneskers sundhed (3), og der skal 
gives en begrundelse i forsøgsrapporten. I tilfælde af potentielt eksplosive testkemikalier skal der udvises forsigtighed for at undgå forhold, der kan fremkalde eksplosion. For at undgå unødvendig brug af dyr bør et testforsøg 
gennemføres uden dyr inden grænsetesten, så det sikres, at betingelserne i 
kammeret for en grænsetest kan opnås.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Hvis der observeres mortalitet eller døende tilstand ved grænsekoncentratio ­
nen, kan resultaterne af grænsetesten bruges som et forforsøg med henblik 
på yderligere test ved andre koncentrationer (se hovedforsøg). Hvis et test ­
kemikalies fysiske eller kemiske egenskaber gør det umuligt at opnå en grænsekoncentration, testes den højest opnåelige koncentration. Hvis 
mindre end 50 % letalitet forekommer ved den højest opnåelige koncen ­
tration, er yderligere test ikke nødvendig. Hvis grænsekoncentrationen ikke kan opnås, gives en forklaring og understøttende data i forsøgsrappor ­
ten. Hvis den højest opnåelige koncentration af en damp ikke fremkalder 
toksicitet, skal testkemikaliet muligvis genereres som en flydende aerosol.
 
Hovedforsøg: traditionel protokol  
32. Et hovedforsøg udføres typisk med fem hanner og fem hunner (eller 5 dyr af 
det mest modtagelige køn, hvis det kendes) pr. koncentrationsniveau med mindst tre koncentrationsniveauer. Der skal bruges tilstrækkelige koncen ­
trationsniveauer til at opnå en robust statistisk analyse. Tidsintervallet 
mellem eksponeringsgrupperne bestemmes ud fra de toksiske symptomers 
indsætten, varighed og sværhed. Eksponering af dyrene ved det næste koncentrationsniveau udsættes, indtil der er rimelig sikkerhed for, at de tidligere testede dyr vil overleve. Det giver forsøgslederen mulighed for at 
justere målkoncentrationen for den næste eksponeringsgruppe. Som følge af 
afhængigheden af avancerede teknologier er dette ikke altid praktisk muligt i inhalationsforsøg, og derfor bør eksponeringen af dyr ved det næste koncen ­
trationsniveau baseres på tidligere erfaring og videnskabelig vurdering. GD 
39 (2) bør anvendes ved test af blandinger.
 
KONCENTRATION × TID-PROTOKOL (C × T)  
Generelle betragtninger: C × t-protokol  
33. Et trinvist C × t-forsøg kan overvejes som alternativ til en traditionel 
protokol ved vurdering af inhalationstoksicitet (12) (13) (14). Denne frem ­
gangsmåde gør det muligt at eksponere dyr for et testkemikalie ved flere koncentrationsniveauer og i flere tidsrum. Alle test udføres i et kammer til 
eksponering gennem næsen (helkropskamre er ikke anvendelige i forbin ­
delse med denne protokol). Et flowdiagram i tillæg 1 illustrerer denne protokol. En simuleringsanalyse har vist, at den traditionelle protokol og C × t-protokollen begge kan give robuste LC
 50 -værdier, men C × 
t-protokollen er generelt bedre til at give robuste LC  01 - og LC  10 -værdier 
(15).  
34. En simuleringsanalyse har vist, at det generelt er tilstrækkeligt at anvende to 
dyr pr. C × t-interval (et pr. køn ved brug af begge køn eller to af det mest 
modtagelige køn), når der testes fire koncentrationer og fem eksponerings ­
varigheder i et hovedforsøg. Under visse omstændigheder kan forsøgs ­
lederen vælge at bruge to rotter pr. køn pr. C × t-interval (15). Hvis der bruges to dyr pr. køn pr. koncentration og tidspunkt, kan det reducere bias 
og variabiliteten af estimaterne, øge succesraten for estimeringen og 
forbedre konfidensintervallet. I tilfælde af utilstrækkelig tilpasning til de data, der er brugt til estimeringen (ved brug af et dyr pr. køn eller to dyr af det mest modtagelige køn), kan en femte eksponeringskoncentration også 
være tilstrækkelig. Yderligere vejledning om det antal dyr og koncentratio ­
ner, der skal anvendes i et C × t-forsøg, findes i GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Forforsøg: C × t-protokol  
35. Et forforsøg bruges til at skønne testkemikaliets styrke og til at hjælpe med 
at vælge eksponeringskoncentrationer til hovedforsøget. Det kan være nødvendigt at udføre et forforsøg med op til tre dyr/køn/koncentration [se 
Appendix III i GD 39 (2)] for at vælge en hensigtsmæssig startkoncentration 
til hovedforsøget og minimere antallet af anvendte dyr. Der skal muligvis bruges tre dyr pr. køn for at fastslå en kønsbetinget forskel. Disse dyr bør eksponeres over én varighed, normalt 240 minutter. Muligheden for at skabe 
tilstrækkelige testatmosfærer bør vurderes i løbet af de tekniske forudgående 
test uden dyr. Det er generelt ikke nødvendigt at udføre et forforsøg, hvis mortalitetsdata er tilgængelige fra et B.52-forsøg (4). Når den indledende 
målkoncentration vælges i et B.2-forsøg, bør forsøgslederen overveje de 
mortalitetsmønstre, der er observeret i evt. tilgængelige B.52-forsøg (4) for begge køn og alle testede koncentrationer [se GD 39 (2)].
 
Startkoncentration: C × t-protokol  
36. Startkoncentrationen (eksponeringssession I) (tillæg 1) er enten en grænse ­
koncentration eller en koncentration, som forsøgslederen har valgt ud fra 
forforsøget. Grupper af ét dyr/køn eksponeres for denne koncentration i flere tidsrum (f.eks. 15, 30, 60, 120 eller 240 minutter), så i alt 10 dyr eksponeres (kaldes eksponeringssession I) (tillæg 1).
 
37. Valget af grænsekoncentrationer afhænger normalt af lovgivningskrav. Når 
forordning (EF) nr. 1272/2008 anvendes, er grænsekoncentrationerne for 
gasser, dampe og aerosoler henholdsvis 20 000 ppm, 20 mg/l og 5 mg/l 
(eller den højest opnåelige koncentration) (3). Det kan være en teknisk udfordring at generere testkoncentrationer af visse testkemikalier, især som dampe og aerosoler. Ved test af aerosoler bør målet være at opnå en respi ­
rabel partikelstørrelse (dvs. en MMAD på 1-4 μm) ved en grænsekoncen ­
tration på 2 mg/l. Dette er muligt for de fleste testkemikalier. Test af aerosoler ved en koncentration på mere end 2 mg/l bør kun forsøges, hvis der kan opnås en respirabel partikelstørrelse [se GD 39 (2)]. I henhold til 
forordning (EF) nr. 1272/2008 bør test, der overstiger en grænsekoncen ­
tration, undgås af hensyn til dyrevelfærden (3). Test, der overstiger en grænsekoncentration, bør kun overvejes, når resultaterne af en sådan test med overvejende sandsynlighed ventes at få direkte relevans for beskyttelsen 
af menneskers sundhed (3), og der skal gives en begrundelse i forsøgs ­
rapporten. I tilfælde af potentielt eksplosive testkemikalier skal der udvises forsigtighed for at undgå forhold, der kan fremkalde eksplosion. For at undgå unødvendig brug af dyr bør et testforsøg gennemføres uden 
dyr inden test ved startkoncentrationen, så det sikres, at betingelserne i 
kammeret for denne koncentration kan opnås.
 
38. Hvis der observeres mortalitet eller døende tilstand ved startkoncentrationen, 
kan resultaterne ved denne koncentration bruges som udgangspunkt for yderligere test ved andre koncentrationer (se hovedforsøg). Hvis et testke ­
mikalies fysiske eller kemiske egenskaber gør det umuligt at opnå en græn ­
sekoncentration, testes den højest opnåelige koncentration. Hvis mindre end 
50 % letalitet forekommer ved den højest opnåelige koncentration, er yder ­
ligere test ikke nødvendig. Hvis grænsekoncentrationen ikke kan opnås, gives en forklaring og understøttende data i forsøgsrapporten. Hvis den 
højest opnåelige koncentration af en damp ikke fremkalder toksicitet, skal 
testkemikaliet muligvis genereres som en flydende aerosol.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Hovedforsøg: C × t-protokol  
39. Startkoncentrationen (eksponeringssession I) (tillæg 1), som testes i hoved ­
forsøget, er enten en grænsekoncentration eller en koncentration, som forsøgslederen har valgt ud fra forforsøget. Hvis mortalitet er blevet obser ­
veret under eller efter eksponeringssession I, bruges den minimumsekspone ­
ring (C × t), der resulterer i mortalitet, som rettesnor ved bestemmelsen af koncentrationen og eksponeringsperioderne til eksponeringssession II. Hver efterfølgende eksponeringssession afhænger af den forudgående session (se 
tillæg 1).
 
40. For mange testkemikalier er de resultater, der fås ved startkoncentrationen 
kombineret med tre yderligere eksponeringssessioner med et mindre tids ­
interval (dvs. den geometriske afstand mellem eksponeringsperioder som angivet af faktoren mellem successive perioder, generelt √2), tilstrækkelige 
til at bestemme C × t-mortalitetsforholdet (15), men det kan være en fordel 
af bruge en femte eksponeringskoncentration [se tillæg 1 og GD 39 (2)]. Oplysninger om den matematiske behandling af resultater til C × t-protokollen findes i tillæg 1.
 
OBSERVATIONER  
41. Dyrene bør hyppigt observeres klinisk i eksponeringsperioden. Efter 
eksponering bør kliniske observationer foretages mindst to gange på eksponeringsdagen eller hyppigere, hvis det begrundes af dyrenes respons 
på behandlingen, og derefter mindst én gang dagligt i sammenlagt 14 dage. 
Varigheden af observationsperioden er ikke fast, men bestemmes ud fra arten og tidspunktet for indtræden af kliniske tegn og varigheden af resti ­
tutionsperioden. Tidspunkterne for toksiske symptomers indsætten og 
forsvinden er vigtige, navnlig hvis der er tendens til forsinkede toksiske 
symptomer. Alle observationer registreres systematisk, og der føres indivi ­
duel protokol for hvert dyr. Dyr, som findes at være døende, og dyr, som udviser svære smerter og/eller vedvarende tegn på svære lidelser, skal 
aflives humant af hensyn til dyrevelfærden. Stor omhu bør udvises ved 
undersøgelser for kliniske tegn på toksicitet for at sikre, at indledningsvist dårligt udseende og forbigående respirationsændringer, der er resultatet af selve eksponeringen, ikke forveksles med toksicitet relateret til testkemika ­
liet, som kræver tidlig aflivning af dyrene. De principper og kriterier, der er 
sammenfattet i Guidance Document on Humane Endpoints (GD 19), skal tages i betragtning (7). Når dyr aflives af humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet registreres så nøjagtigt som muligt.
 
42. Observationer i burene skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slim ­
hinder, respirationssystem, kredsløb, autonomt nervesystem og centralnerve ­
system samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Hvis det er 
muligt, registreres evt. sondring mellem lokale og systemiske virkninger. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, sløvhed, søvn og koma. Målingen af rektal temperatur 
kan dokumentere refleks-bradypnø eller hypo-/hypertermia relateret til 
behandling eller fangenskab.
 
Kropsvægt  
43. Det enkelte dyrs vægt registreres én gang i tilvænningsperioden, på 
eksponeringsdagen inden eksponeringen (dag 0) og mindst på dag 1, 3 og 
7 (og derefter ugentligt), og den registreres på tidspunktet for død eller aflivning, hvis det indtræder efter dag 1. Kropsvægt anerkendes som en kritisk indikator for toksicitet, og dyr med et vedvarende vægttab på ≥ 
20 % sammenlignet med vægten for forsøget, overvåges nøje. Overlevende 
dyr vejes og aflives humant ved afslutningen af perioden efter eksponering.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologi  
44. Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller aflives og tages 
ud af forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes makroskopisk obduktion. Hvis makroskopisk obduktion ikke kan udføres umiddelbart efter 
opdagelsen af et dødt dyr, nedkøles (ikke fryses) dyret ved en temperatur, 
der er tilstrækkeligt lav til at minimere autolyse. Makroskopisk obduktion udføres så hurtigt som muligt, helst inden for en eller to dage. Alle makro ­
skopiske patologiske forandringer registreres for hvert dyr med særligt fokus 
på forandringer i luftvejene.
 
45. Yderligere undersøgelser, der på forhånd er medtaget som standard, kan 
overvejes for at udvide den fortolkningsmæssige værdi af undersøgelsen, 
f.eks. vejning af overlevende rotters lunger og tilvejebringelse af dokumen ­
tation for irritation ved hjælp af mikroskopisk undersøgelse af luftvejene. Undersøgte organer kan også omfatte organer, som udviser makroskopiske 
patologiske forandringer hos dyr, som overlever i 24 timer eller længere, og 
organer, som vides eller forventes at være påvirket. Mikroskopisk undersø ­
gelse af hele luftvejene kan give nyttige informationer i forbindelse med testkemikalier, der reagerer med vand, f.eks. syrer og hygroskopiske testke ­
mikalier.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
46. Der skal fremlægges data for de enkelte dyr om kropsvægt og obduktions ­
fund. For hver testgruppe opstilles i tabelform kliniske observationsdata om 
antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske 
virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet samt obduktions ­
fund.
 
Testrapport  
47. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er relevante:  
Forsøgsdyr og pasning  
— beskrivelse af burforhold, herunder: antal (eller ændring i antal) dyr pr. 
bur, strøelse, omgivende temperatur og relativ fugtighed, lysperiode og 
foder  
— anvendt art/stamme og begrundelse for anvendelse af andre arter end 
rotte 
— dyrenes antal, alder og køn  
— randomiseringsmetode  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens 
art/oprindelse, vandets oprindelse)  
— beskrivelse af konditionering før test, herunder foder, karantæne og 
behandling for sygdom.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Testkemikalie  
— fysisk tilstand, renhed og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber 
(herunder isomeri)  
— identifikationsoplysninger og CAS-nr. (Chemical Abstract Services 
Registry Number), hvis det kendes.  
Vehikel  
— begrundelse for brug af vehikel og begrundelse for valg af vehikel, hvis 
dette ikke er vand  
— historiske eller samtidige data, der viser, at vehiklet ikke påvirker resul ­
tatet af forsøget.  
Inhalationskammer  
— beskrivelse af inhalationskammeret, herunder dimensioner og rumfang  
— oprindelse og beskrivelse af udstyr anvendt til eksponering af dyr og til 
generering af atmosfære  
— apparatur til måling af temperatur, fugtighed, partikelstørrelse og faktisk 
koncentration  
— luftkilde, behandling af tilført/udledt luft og konditioneringssystem  
— metoder, der er anvendt til kalibrering af apparatur for at sikre en 
homogen testatmosfære  
— trykforskel (positiv eller negativ)  
— eksponeringsporte pr. kammer (eksponering gennem næsen); placering 
af dyr i systemet (helkropseksponering)  
— testatmosfærens tidsmæssige homogenitet/stabilitet  
— placering af temperatur- og fugtighedssensorer og udtagning af stikprøve 
af testatmosfære i kammer  
— luftgennemstrømningshastigheder, luftgennemstrømningshastighed/eks ­
poneringsport (eksponering gennem næsen) eller dyrebelastning/kammer (helkropseksponering)
 
— information om det apparatur, der er anvendt til at måle ilt og kuldioxid, 
hvis det er relevant  
— tid, der kræves til at opnå ligevægt i inhalationskammeret (t  95 ) 
— antal volumenændringer pr. time  
— evt. måleudstyr.  
Eksponeringsdata  
— begrundelse for valg af målkoncentration i hovedforsøget  
— nominelle koncentrationer (samlet masse af det genererede testkemikalie 
i inhalationskammeret divideret med den samlede mængde luft, der passerer gennem kammeret)
 
— faktiske koncentrationer af testkemikaliet indsamlet fra dyrenes vejrtræk ­
ningszone; for blandinger, der producerer heterogene fysiske former 
(gasser, dampe eller aerosoler), kan hver enkelt analyseres separat  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— alle luftkoncentrationer rapporteres i masseenheder (f.eks. mg/l, mg/m  3 
osv.); volumenenheder (f.eks. ppm, ppb osv.) kan også rapporteres i 
parentes  
— partikelstørrelsesfordeling, massemedian af den aerodynamiske 
diameter (MMAD) og geometrisk standardafvigelse ( σg), herunder 
deres beregningsmetoder; individuelle partikelstørrelsesanalyse rappor ­
teres  
Testbetingelser  
— nærmere oplysninger om fremstilling af testkemikalie, herunder oplys ­
ninger om fremgangsmåder anvendt til at reducere partikelstørrelsen af faste materialer eller fremstille opløsninger af testkemikaliet; hvis meka ­
niske processer har ændret testkemikaliets sammensætning, medtages 
resultaterne af analyser, som bekræfter testkemikaliets sammensætning
 
— en beskrivelse (helst med diagram) af det apparatur, der bruges til at 
generere testatmosfæren og til at eksponere dyrene for testatmosfæren  
— nærmere oplysninger om den anvendte analysemetode og validerings ­
metode (herunder genfindingsgrad for testkemikaliet fra prøvemediet)  
— begrundelse for valget af testkoncentrationer.  
Resultater  
— opstilling i tabelform af temperatur, fugtighed og luftgennemstrømning i 
kammer  
— opstilling i tabelform af data om nominel og faktisk koncentration i 
kammer  
— opstilling i tabelform af data om partikelstørrelse i tabelform, herunder 
data om indsamling af analyseprøve, partikelstørrelsesfordeling og beregning af MMAD og σ
 g 
— opstilling i tabelform af responsdata og koncentrationsniveau for hvert 
dyr (dvs. dyr, som viser tegn på toksicitet, herunder mortalitet, og virk ­
ningernes art, sværhed, tidspunkt for indtræden og varighed)  
— kropsvægten for det enkelte dyr registreret på forsøgsdage; dato og 
klokkeslæt for dyrets død, hvis denne indtræder før planlagt aflivning; 
for hvert dyr, toksiske virkningers indsætten, tidsforløb, og hvorvidt de er reversible
 
— for hvert dyr evt. obduktionsfund og histopatologiske fund  
— estimater af letalitet (f.eks. LC  50 eller LD  01 ) herunder 95 % konfidens ­
grænser, og hældning (hvis omfattet af evalueringsmetoden)  
— statistisk relation, herunder estimat af eksponenten n (C × t-protokol); 
navnet på den anvendte statistiske software anføres.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Diskussion og fortolkning af resultater  
— Der lægges særlig vægt på beskrivelsen af de metoder, der er anvendt til 
at opfylde denne testmetodes kriterier, f.eks. grænsekoncentrationen eller 
partikelstørrelsen.  
— Partiklernes respirabilitet i lyset af de overordnede resultater beskrives, 
især hvis partikelstørrelseskriteriet ikke kunne opfyldes  
— Der gives en forklaring, hvis det var nødvendigt at foretage human 
aflivning af dyr, som udviste svære smerter og/eller vedvarende tegn 
på svære lidelser, baseret på kriterierne i OECD Guidance Document on Humane Endpoints (8).
 
— Hvis test i henhold til kapitel B.52 i dette bilag (4) blev afbrudt til fordel 
for denne testmetode B.2, gives en begrundelse.  
— Konsistensen mellem de metoder, der er anvendt til at bestemme nomi ­
nelle og faktiske koncentrationer og relationen mellem den faktiske koncentration og den nominelle koncentration beskrives i den overord ­
nede vurdering af forsøget.
 
— Den sandsynlige dødsårsag og den fremherskende virkningsmåde (syste ­
misk i forhold til lokal) beskrives.  
LITTERATUR:  
(1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Findes på: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39. Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(3) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 
16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006, EUT L 353 
af 31.12.2008, s. 1.
 
(4) Kapitel B.52 i dette bilag, Akut inhalationstoksicitet — Akut 
toksisitetsklassemetoden (ATC).  
(5) Kapitel B.40 i dette bilag, In vitro-hudætsning: måling af transkutan elek ­
trisk modstand (TER).  
(6) Kapitel B.40.A i dette bilag, In vitro-hudætsning: test med human 
hudmodel.  
(7) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corro ­
sion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. 
Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition. Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Paris. Findes på: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of 
Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.  
(10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J og Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167.  
(12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
 
(13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
 
(14) Ten Berge WF og Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.  
(15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104. Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
DEFINITION  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Tillæg 1  
C × t-protokol  
1. Et trinvist koncentration × tid-forsøg (C × t) kan overvejes som alternativ til 
en traditionel protokol ved vurdering af inhalationstoksicitet (12) (13) (14). Det udføres fortrinsvis, når specifikke myndighedsbestemmelser eller viden ­
skabelige behov nødvendiggør forsøg med dyr i forskellige tidsrum, f.eks. 
med henblik på planlægning af nødberedskab eller med henblik på fysisk 
planlægning. Metoden indledes normalt med test af en grænsekoncentration (eksponeringssession I), hvor dyrene eksponeres for et testkemikalie i fem perioder (f.eks. 15, 30, 60, 120 og 240 minutter), så der opnås flere varig ­
heder inden for én eksponeringssession (se figur 1). Når forordning (EF) 
nr. 1272/2008 anvendes, er grænsekoncentrationerne for gasser, dampe og aerosoler henholdsvis 20 000 ppm, 20 mg/l og 5 mg/l. Disse koncentrationer må kun overskrides, hvis myndighedsbestemmelser eller videnskabelige 
behov nødvendiggør test ved disse koncentrationer (se afsnit 37 i kapitel 
B.2).
 
2. Hvis der foreligger begrænsede eller ingen oplysninger om toksiciteten af 
testkemikalie, bør der udføres et forforsøg, hvor grupper på højst tre dyr pr. 
køn eksponeres for de målkoncentrationer, som forsøgslederen har valgt, 
generelt i 240 minutter.  
3. Hvis en grænsekoncentration testes i løbet af eksponeringssession I, og der 
observeres mindre end 50 % mortalitet, kræves der ikke yderligere testning. Hvis forholdet mellem koncentration/tid/respons skal bestemmes på højere 
niveauer end den angivne grænsekoncentration på grund af myndigheds ­
bestemmelser eller videnskabelige behov, bør den næste eksponering ske ved et højere niveau, f.eks. to gange grænsekoncentrationen (dvs. 2 L i 
figur 1).
 
4. Hvis toksicitet observeres ved grænsekoncentrationen, skal der foretages 
yderligere testning (hovedforsøg). Disse yderligere eksponeringer gennem ­
føres ved lavere koncentrationer (i figur 1: Eksponeringssession II, III eller IV) eller ved højere koncentrationer i kortere tid (i figur 1: Eksponerings ­
session IV) i tidsrum, der er tilpasset og ikke så stor spredning.
 
5. Testen (startkoncentration og yderligere koncentrationer) gennemføres med 
ét dyr/køn pr. koncentration/tidspunkt eller med to dyr af det mest modtage ­
lige køn pr. koncentration/tidspunkt. Under visse omstændigheder kan 
forsøgslederen vælge at bruge to rotter pr. køn pr. koncentration/tidspunkt 
(eller fire dyr af det mest modtagelige køn pr. koncentration/tidspunkt) (15). Hvis der bruges to dyr pr. køn pr. koncentration/tidspunkt, reduceres i de fleste tilfælde bias og variabiliteten af estimaterne, succesraten for estime ­
ringen øges, og konfidensintervallet forbedres i forhold til protokollen som 
beskrevet her. Nærmere detaljer findes i GD 39 (2).
 
6. Ideelt bør hver eksponeringssession gennemføres på én dag. Det gør det 
muligt at udsætte den næste eksponering, indtil der er rimelig sikkerhed for overlevelse, og det giver forsøgslederen mulighed for at justere målkoncen ­
trationen for den næste eksponeringsgruppe. Hver eksponeringssession bør 
indledes med den gruppe, der skal eksponeres i længst tid, f.eks. 240 minutter-eksponeringsgruppen efterfulgt af 120 minutter-eksponerings ­
gruppen osv. Hvis dyr i 240 minutter-gruppen f.eks. dør efter 90 minutter 
eller viser alvorlige tegn på toksicitet (f.eks. ekstreme forandringer i respi ­
rationsmønster, f.eks. besværet vejrtrækning), giver det ingen mening af eksponere en gruppe i 120 minutter, fordi mortaliteten sandsynligvis vil være 100 %. Forsøgslederen bør derfor vælge kortere eksponeringsvarig ­
heder til den pågældende koncentration (f.eks. 90, 65, 45, 33 og 25 minut ­
ter).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Koncentrationen i kammeret måles hyppigt for at bestemme den tidsvægtede 
gennemsnitskoncentration for hver eksponeringsvarighed. Dødstidspunktet 
for hvert dyr anvendes så vidt muligt i den statistiske analyse (i stedet for eksponeringsvarigheden).
 
8. Resultaterne af de første fire eksponeringssessioner undersøges med henblik 
på at identificere datamangler i koncentration-tidskurven (se figur 1). Ved 
utilstrækkelig tilpasning kan der gennemføres endnu en eksponering (femte 
koncentration). Koncentration og eksponeringsvarighed for den femte eksponering bør vælges, så denne mangel dækkes.
 
9. Alle eksponeringssessioner (herunder den første eksponeringssession) 
anvendes til at beregne forholdet mellem koncentration/tid/respons ved 
hjælp af statistisk analyse (16). Hvis det er muligt, anvendes den tidsvæg ­
tede gennemsnitskoncentration og eksponeringsvarigheden indtil død (hvis død indtræder i løbet af eksponeringen) for hvert C × t-interval.
 
Figur 1  
Hypotetisk illustration af forholdet mellem koncentration/tid/mortalitet hos 
rotter
  
Åbne symboler = overlevende; udfyldte symboler = døde dyr  
Trekanter = hunner; cirkler = hanner  
Ubrudt linje = LC  50 -værdier (interval 7,5-240 min.) for hanner med n = 1  
Punkteret linje = LC  50 -værdier (interval 7,5-240 min.) for hunner med n = 1  
Stiplede linjer = hypotetiske LC  50 -værdier for hanner og hunner, hvis n havde 
været lig med 2 (12).  
Ordliste  
Koncentration:  
Eksponeringstid:  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Nedenfor findes et eksempel på en trinvis procedure:  
Eksponeringssession I — Test ved grænsekoncentration (se figur 1)  
— Ét dyr pr. køn pr. koncentration/tidspunkt; 10 dyr i alt (  a ) 
— Målkoncentration (  b ) = grænsekoncentration  
— Fem grupper af dyr eksponeres ved denne målkoncentration i 
henholdsvis 15, 30, 60, 120 og 240 minutter  
↓ 
Eksponeringssession II  ( c ) — Hovedforsøg  
— Ét dyr pr. køn pr. koncentration/tidspunkt; 10 dyr i alt  
— Fem grupper af dyr eksponeres ved en lavere koncentration (  d ) (1/2 L) i 
lidt længere tid (fordelt ved hjælp af faktor √2; se figur 1).  
↓ 
Eksponeringssession III — Hovedforsøg  
— Ét dyr pr. køn pr. koncentration/tidspunkt; 10 dyr i alt  
— Fem grupper af dyr eksponeres ved en lavere koncentration (  d ) (1/4 L) i 
lidt længere tid (fordelt ved hjælp af faktor √2; se figur 1).  
↓ 
Eksponeringssession IV ′ — Hovedforsøg  
— Ét dyr pr. køn pr. koncentration/tidspunkt; 10 dyr i alt  
— Fem grupper af dyr eksponeres ved en lavere koncentration (  d ) (1/8 L) i 
lidt længere tid (fordelt ved hjælp af faktor √2; se figur 1).  
↓ eller  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Hvis der ikke findes oplysninger om kønsbetinget modtagelighed, anvendes rotter af 
begge køn,  dvs.  et dyr/køn pr. koncentration. Ud fra de eksisterende informationer, 
eller hvis det i løbet af eksponeringen konstateres, at det ene køn er mere modtageligt, 
anvendes 10 dyr af det mest modtagelige køn (to dyr pr. koncentration/tidspunkt) ved 
hvert koncentrationsniveau i den efterfølgende test. 
( b ) Når forordning (EF) nr. 1272/2008 anvendes, er grænsekoncentrationerne for gasser, 
dampe og aerosoler henholdsvis 20 000 ppm, 20 mg/l og 5 mg/l. I tilfælde af forventet 
toksicitet eller afhængigt af resultaterne af forforsøget vælges lavere startkoncentrationer. I tilfælde af myndighedsbestemmelser eller videnskabelige behov kan der anvendes 
højere koncentrationer. 
(
 c ) Ideelt udsættes eksponering af dyrene ved det næste koncentrationsniveau, indtil der er 
rimelig sikkerhed for, at de tidligere testede dyr vil overleve. Det giver forsøgslederen 
mulighed for at justere målkoncentrationen for den næste eksponeringsgruppe. 
( d ) Den minimumsdosis (koncentration × tid), der resulterede i mortalitet under test med 
startkoncentrationen (første eksponeringssession) bruges som udgangspunkt ved fastlæg ­
gelsen af den næste kombination af koncentration og eksponeringsvarigheder. Koncen ­
trationen reduceres typisk med det halve (1/2 L), og dyrene eksponeres i en ny tids ­
periode med et mindre interval ved hjælp af en geometrisk opdeling af eksponerings ­
perioder med faktor 1,4 ( √2; se reference 11) omkring det tidspunkt, hvor den mindste 
letale dosis (tid × koncentration) blev observeret i løbet af den første eksponering. I 
denne figur (figur 1) blev mortalitet i eksponeringssession I først observeret ved 15 
minutter. Varighederne i session II er derfor centreret omkring 30 minutter og er 15, 
21 30, 42 og 60 minutter. Efter de første to eksponeringer anbefales det, at dataene 
indsættes i en figur som vist ovenfor, og det bør kontrolleres, om forholdet mellem 
koncentration og tid har en vinkel på 45 grader (n = 1), eller om forholdet mellem 
koncentration-tid-respons er mindre stejlt (f.eks. n = 2) eller stejlere (n = 0,8). I sidst ­
nævnte tilfælde anbefales det på det kraftigste, at de næste koncentrationer og varigheder 
tilpasses tilsvarende.
 Eksponeringssession IV — Hovedforsøg  
— Ét dyr pr. køn pr. koncentration/tidspunkt; 10 dyr i alt  
— Fem grupper af dyr eksponeres ved en højere koncentration (  e ) (2 L) i 
lidt kortere tid (fordelt ved hjælp af faktor √2; se figur 1).  
Matematisk behandling af resultater til C × t-protokollen  
11. En C × t-fremgangsmåde med fire eller fem eksponeringskoncentrationer og 
fem varigheder giver henholdsvis 20 eller 25 datapunkter. Med disse data ­
punkter kan C × t-forholdet beregnes ved hjælp af statistisk analyse (16):  
Ligning 1  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
hvor C = koncentration; t = eksponeringsvarighed, eller  
Ligning 2  
Response ¼ ƒðC n tÞ 
hvor n ¼ b 1=b 2: 
Ved hjælp af ligning 1 kan LC  50 -værdien beregnes for en given tidsperiode 
(f.eks. 4 timer, 1 time, 30 minutter eller en tidsperiode inden for de testede 
tidsperioder) ved hjælp af P = 5 (50 % respons). Bemærk, at Habers regel kun gælder, når n = 1. LC
 01 kan beregnes ved hjælp af P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) I visse tilfælde kan det være nødvendigt at øge koncentrationen (2 L) i løbet af et nyt 
tidsinterval med et endnu mindre interval ved hjælp af en geometrisk opdeling af 
eksponeringsperioder med faktor 1,4 ( √2) omkring det tidspunkt, hvor den mindste 
letale dosis (tid × koncentration) blev observeret i løbet af den første eksponering. 
Minimumseksponeringsvarigheden bør overstige 5 minutter. Maksimumseksponerings ­
varigheden bør ikke overstige 8 timer.
 B.3. AKUT TOKSICITET (DERMAL)  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B (punkt A).  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B (punkt B).  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Teststoffet påføres huden på flere grupper af forsøgsdyr i graduerede 
doser, idet der anvendes en bestemt dosis til hver enkelt gruppe. Der foretages observationer af virkningerne, herunder død. Dyr, der dør under forsaget, obduceres. Ved slutningen af forsøget aflives og 
obduceres overlevende dyr.
 
Det kan være nødvendigt, at dyr, der viser vedvarende symptomer på 
stærk smerte eller lidelse, aflives på human måde. Undersøgelse af stoffer på en måde, som på grund af deres ætsende eller lokalirrite ­
rende egenskaber vides at volde betydelig smerte og lidelse, er ikke 
påkrævet.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Forberedelser  
Dyrene holdes under forsøgsbetingelser med hensyn til miljø og 
fodring i mindst fem dage, inden forsøget påbegyndes. Unge, 
sunde, kønsmodne dyr fordeles randomiseret i forsøgsgrupper, inden forsøget sættes i gang. Ca. 24 timer før forsøget påbegyndes, klippes eller barberes dyrene på ryggen. Under denne procedure må 
man passe på ikke at beskadige huden, da det kan ændre dens 
permeabilitet. Mindst 10 % af legemets overflade skal gøres klar til påføring af teststoffet. Ved testning af faste stoffer, som i givet fald kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstrækkeligt med vand 
eller om nødvendigt med et passende vehikel, så der sikres god 
kontakt med huden. Hvis der anvendes et vehikel, bør man tage hensyn til, om vehiklet har indflydelse på hudens permeabilitet for teststoffet. Flydende teststoffer påføres normalt ufortyndet.
 
1.6.2.  Forsøgsbetingelser  
1.6.2.1.  Forsøgsdyr  
Der kan anvendes voksne rotter eller kaniner. Der kan anvendes 
andre dyrearter, men i så fald skal dette være begrundet. Der benyttes dyr af almindeligt anvendte stammer. For begge køn af forsøgsdyr gælder det, at vægten af de anvendte dyr ikke må 
variere mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvægt ved 
forsøgets begyndelse.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Antal og køn  
Der anvendes mindst fem dyr (af samme køn) til hvert dosisniveau. 
Hunnerne må ikke have født og må ikke være drægtige. Foreligger der oplysninger om, at et bestemt køn er væsentligt mere følsomt, 
benyttes der dyr af dette køn.
 
Bemærk:  Ved anvendelse af højere dyr end gnavere til undersøgelse 
af akut toksicitet skal det overvejes, om antallet af dyr kan nedsættes. Doserne skal fastlægges med omhu, og man skal bestræbe sig på ikke at benytte højere doser end moderat toksiske doser. I sådanne 
undersøgelser bør indgift af dødelige doser af teststoffet undgås.
 
1.6.2.3.  Dosisniveauer  
Der anvendes et tilstrækkeligt antal dosisniveauer, mindst tre, og 
disse skal være valgt således, at der opnås en graduering af de 
toksiske virkninger og dødeligheden i testgrupperne. Der bør ved valg af dosis tages hensyn til eventuelle hudirriterende eller ætsende virkninger. Der skal være tilstrækkelige data til, at der 
kan optegnes en dosis-virkningskurve og om muligt foretages en 
rimelig bestemmelse af LD
 50 . 
1.6.2.4.  Grænsetest  
Der kan med en gruppe på fem dyr af hvert køn udføres en græn ­
setest med en dosis på mindst 2 000 mg/kg legemsvægt efter den ovenfor beskrevne procedure. Optræder der teststofrelaterede døds ­
fald, kan gennemførelse af en fuldstændig undersøgelse komme i 
betragtning.
 
1.6.2.5.  Observationsperiode  
Observationsperioden skal være mindst 14 dage. Observationsperio ­
dens varighed bør dog ikke fastsættes rigoristisk, men bestemmes ud 
fra de toksiske reaktioner, hvornår disse indtræder, og af restitutions ­
periodens længde; den kan således forlænges, såfremt det anses for nødvendigt. Tidspunktet for, hvornår symptomer på toksicitet 
erkendes og forsvinder, samt dødstidspunktet er vigtige, navnlig 
hvis der er tendens til, at der indtræffer sene dødsfald.
 
1.6.3.  Fremgangsmåde  
Dyrene holdes i hver sit bur. Teststoffet påføres jævnt over et 
område, som svarer til ca. 10 % af den samlede legemsoverflade. Med stærkt toksiske stoffer kan der anvendes et mindre område, men stoffet bør påføres så tyndt og ensartet og over så stor en del af 
området som muligt.
 
Teststoffet skal holdes i kontakt med huden ved hjælp af en porøs 
gazeforbinding og en ikke-hudirriterende klæbestrimmel i en 
eksponeringsperiode på 24 timer. Teststedet skal desuden tildækkes på en sådan måde, at gazeforbindingen og teststoffet holdes sikkert på plads, så at dyrene ikke kan indtage teststoffet. Der kan anvendes 
andre foranstaltninger, som forhindrer dyrene i at indtage teststoffet; 
dog kan fuldstændig immobilisering ikke anbefales.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Ved eksponeringsperiodens afslutning fjernes tilbagesiddende test ­
stof, idet der f.eks. anvendes vand eller et andet egnet middel til 
at rense huden.  
Der foretages systematiske observationer, som registreres for hvert 
enkelt dyr. Observationerne skal foretages hyppigt i løbet af den 
første dag. Der skal foretages en grundig klinisk undersøgelse 
mindst én gang hver arbejdsdag. Herudover bør dyrene dagligt observeres, så det mindst mulige antal dyr går tabt for undersøgelsen, dvs. at dyr, der findes døde, obduceres eller nedkøles, og at svage 
eller døende dyr isoleres eller aflives.
 
Inspektionen af dyrene skal omfatte forandringer i pels, behandlet 
hud, øjne og slimhinder, derudover åndedræt og kredsløb, det auto ­
nome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet samt adfærds ­
mønsteret. Der bør foretages omhyggelig observation af rystelser, kramper, spytflåd, diarré, apati, søvn og bevidstløshed. Dødstids ­
punktet skal noteres så præcist som muligt. De dyr, der dør under 
forsøget, og de, der overlever til forsøgets afslutning, obduceres. Alle 
makroskopisk-patologiske forandringer registreres. På indikation udtages der vævsprøver til histopatologisk undersøgelse.
 
Vurdering af toksiciteten hos det modsatte køn  
Efter afslutning af undersøgelsen med det ene køn testes en gruppe 
på fem dyr af det modsatte køn, så det konstateres, om dyr af dette køn er væsentligt mere følsomme over for teststoffet. I enkelte 
tilfælde kan anvendelse af færre dyr være velbegrundet. Foreligger 
der tilstrækkelige oplysninger om, at dyr af det køn, der er testet, er væsentligt mere følsomme, er test med dyr af det modsatte køn ikke påkrævet.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved 
begyndelsen af forsøget, dødstidspunkt for de enkelte dyr, antal dyr, der udviser andre symptomer på toksicitet, beskrivelse af toksiske 
virkninger og obduktionsresultater. Dyrenes individuelle vægt 
bestemmes og registreres, kort før teststoffet påføres, derefter ugent ­
ligt og endelig på dødstidspunktet. Vægtændringer beregnes og regi ­
streres for alle dyr, der lever mere end én dag efter påføringen af 
teststoffet. Aflivning af dyr på human måde på grund af lidelse og 
smerte fremkaldt af teststoffet registreres som teststofrelaterede døds ­
fald. LD
 50 bestemmes efter en anerkendt metode.  
Evaluering af data bør omfatte sammenhæng, hvis en sådan findes, 
mellem dyrenes eksponering for teststof og hyppighed og grad af 
alle forandringer, herunder adfærdsmæssige og kliniske symptomer, makroskopisk-patologiske forandringer, ændringer i legemsvægt, dødelighed og eventuelle andre toksiske virkninger.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— dyreart/stamme, herkomst, miljøbetingelser, foder osv.  
— forsøgsbetingelser (herunder hvordan huden er renset og forbin ­
dingstypen; med eller uden okklusion)  
— dosisniveauer (med angivelse af typen af vehikel, hvor et sådant 
er anvendt, samt koncentration)  
— forsøgsdyrenes køn  
— tabelopstilling over reaktioner efter køn og dosis (dvs, antal dyr, 
der er døde eller aflivet under forsøget; antal dyr, der har vist 
symptomer på toksicitet; antal eksponerede dyr)  
— dødstidspunktet efter eksponeringen, begrundelse og kriterier for 
human aflivning af dyr  
— alle observationer  
— LD  50 for det køn, der har været genstand for en fuldstændig 
undersøgelse, bestemt efter 14. dag med angivelse af beregnings ­
metode  
— 95 % konfidensinterval for LD  50 (hvor det er muligt)  
— dosis/dødelighedskurve og hældning, hvor beregningsmetoden 
muliggør det  
— obduktionsfund  
— eventuelle histopatologiske fund  
— resultater af forsøg med det modsatte kan  
— diskussion af resultaterne (med særlig opmærksomhed på, 
hvordan human aflivning af dyr under forsøget kan have 
indvirket på den beregnede LD  50 ) 
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. VURDERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B (punkt D).  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B (punkt E).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. AKUT TOKSICITET: HUDIRRITATION/ÆTSNING  
1. METODE  
Metoden er ækvivalent med OECD TG 404 (2002),  
1.1. INDLEDNING  
Ved udarbejdelse af denne ajourførte metode er der lagt særlig vægt 
på mulige forbedringer, dels vedrørende dyrevelfærd, dels 
vedrørende hensyntagen til alle foreliggende oplysninger om test ­
stoffet for at undgå unødvendige forsøg med laboratoriedyr, I metoden indgår en anbefaling om, at man før iværksættelse af den 
beskrevne in vivo-test for ætsning/irritation fremkaldt af stoffet 
gennemfører en weight-of-the-evidence-analyse af foreliggende rele ­
vante data, Er de foreliggende data utilstrækkelige, kan de udbygges ved sekventiel testning (1). Den anbefalede testningsstrategi, som 
omfatter validerede og anerkendte in vitro-test, er givet som bilag 
til denne metodebeskrivelse. Når det er hensigtsmæssigt, anbefales det desuden, at man i den indledende in vivo-test anbringer de tre testlapper successivt i stedet for samtidigt på dyret.
 
Både den videnskabelige kvalitet og dyrenes velfærd fremmes ved, 
at in vivo-test ikke udføres, før alle relevante data om stoffets poten ­
tielle hudætsende eller irriterende egenskaber er vurderet ved weight- of-the-evidence-analyse. Sådanne data består af dokumentation fra 
foreliggende undersøgelser i mennesker og/eller laboratoriedyr, 
dokumentation for ætsende/irriterende virkning af et eller flere struk ­
turelt beslægtede stoffer eller af blandinger af sådanne stoffer, data, som viser at stoffet er stærkt surt eller alkalisk (2)(3), og resultater af 
validerede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test (4)(5)(5a). En 
sådan analyse skulle mindske behovet for in vivo-testning for hudætsende/irriterende virkning af stoffer, som allerede er tilstræk ­
kelig undersøgt i andre undersøgelser vedrørende disse to 
endepunkter.
 
En foretrukken testningsstrategi, som indebærer udførelse af valide ­
rede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test for ætsning/irritation, er medtaget som bilag til denne metodebeskrivelse, Strategien blev udviklet på en OECD-workshop (6) og enstemmigt anbefalet af 
deltagerne heri, og den er vedtaget som anbefalet testningsstrategi i 
det globalt harmoniserede system for klassificering af kemiske stoffer (GHS) (7). Skønt sekventiel testning ikke indgår som en del af 
testmetode B.4, anbefales det at følge denne testningsstrategi før 
iværksættelse af in vivo-forsøg, For nye stoffer anbefales den trinvise testningsstrategi til at indhente videnskabeligt forsvarlige oplysninger om stoffets ætsende/irriterende virkning. For eksisterende stoffer, 
som ikke er tilstrækkelig undersøgt for hudætsning/irritation, bør 
strategien anvendes til at supplere de mangelfulde data. Anvendes en anden testningsstrategi eller -metode, eller beslutter man sig for ikke at følge den trinvise testningsstrategi, bør dette begrundes.
 
Hvis de ætsende eller irriterende egenskaber ikke kan bestemmes ved 
weight-of-the-evidence-analyse i henhold til den sekventielle test ­
ningsstrategi, bør in vivo-testning overvejes (jf. bilaget).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. DEFINITIONER  
Hudirritation:  fremkaldelse af reversibel skade på huden ved appli ­
kation af teststoffet i indtil fire timer.  
Hudætsning:  fremkaldelse af irreversibel skade på huden, dvs, 
synlig nekrose gennem epidermis og ned i dermis efter applikation 
af teststoffet i indtil fire timer. Typiske ætsningsreaktioner er sår, 
blødning, blodige skorper, efter 14 dages observation affarvning som følge af blegning af huden, hele områder med alopeci samt ardannelse. Tvivlsomme læsioner bør overvejes vurderet ved histop ­
atologisk undersøgelse.
 
1.3. METODENS PRINCIP  
En enkelt dosis af teststoffet påføres på huden af et forsøgsdyr; de 
ubehandlede hudområder af dyret tjener som kontrol. Graden af irritation/ætsning bestemmes og klassificeres med de foreskrevne intervaller og beskrives yderligere, således at virkningerne evalueres 
komplet. Undersøgelsen skal strække sig over tilstrækkelig lang tid 
til, at de iagttagne virkningers reversibilitet eller irreversibilitet kan vurderes.
 
Dyr, som viser tegn på stærk lidelse og/eller smerte i nogen del af 
forsøget, aflives humant, og teststoffet vurderes tilsvarende, Kriterier 
for afgørelsen om human aflivning af døende og stærkt lidende dyr 
kan findes i henvisning (8).  
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Forberedelse til in vivo-forsøget  
1.4.1.1.  Valg af dyreart  
Det fortrukne forsøgsdyr er albinokaninen, og der anvendes raske 
unge kønsmodne dyr. Anvendes andre arter, skal der fremlægges 
begrundelse herfor.  
1.4.1.2.  Forberedelse af dyrene  
Ca. 24 timer før forsøget fjernes pelsen ved tæt klipning af dyrenes 
ryg. Der drages omsorg for at undgå beskadigelse af huden, og kun dyr med sund, intakt hud må anvendes.
 
Visse kaninstammer har pletter med tæt hårvækst, som er mere eller 
mindre fremtrædende, afhængigt af årstiden. Sådanne områder med 
tæt hårvækst må ikke anvendes som testområder.  
1.4.1.3.  Miljøbetingelser og fodring  
Dyrene holdes i hver sit bur. Temperaturen i forsøgslokalet skal være 
20 o C (± 3  o C) for kaniner. Den relative luftfugtighed skal være 
mindst 30 % og må ikke være over 70 %, hvilket dog ikke gælder under under rengøring af lokalet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 
timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder 
og fri adgang til drikkevand.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  Prøveprocedure  
1.4.2.1.  Applikation af teststoffet  
Teststoffet påføres på et lille område (ca. 6 cm  2 ) af huden og dækkes 
med en gazelap, som holdes på plads med en ikke-hudirriterende 
klæbestrimmel. Hvis der anvendes flydende eller pastaagtige teststof ­
fer, kan det være nødvendigt at påføre teststoffet på gazelappen, og derefter placere lappen på huden. I ekspositionsperioden bør test ­
stoffet holdes i løs kontakt med huden ved hiælp af en passende 
semiokklusiv forbinding. Hvis teststoffet påføres på gazelappen, skal 
denne fastgøres til huden, således at der er god kontakt og ensartet fordeling af stoffet på huden. Dyret må ikke have adgang til gaze ­
lappen og skal være forhindret i at kunne indtage eller inhalere 
teststoffet.
 
Væskeformige teststoffer anvendes sædvanligvis ufortyndet. Ved 
testning af faste stoffer som — hvis det er hensigtsmæssigt — kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstrækkeligt med den mindst mulige mængde vand eller om nødvendigt med et passende 
vehikel for at sikre god kontakt med huden. Anvendes andre vehikler 
end vand, må dette kun have minimal indflydelse på teststoffets hudirriterende virkning.
 
Ved slutningen af ekspositionsperioden, som normalt er fire timer, 
fjernes tilbagesiddende teststof, så vidt muligt ved hjælp af vand eller 
et egnet oplysningsmiddel, idet man skal undgå at påvirke det frem ­
komne respons eller beskadige epidermis.  
1.4.2.2.  Dosisniveau  
Testarealet påføres 0,5 ml flydende eller 0,5 g fast eller halvflydende 
teststof.  
1.4.2.3.  Indledende test (in vivo-hudirritations/ætsningstest i ét dyr)  
Det anbefales kraftigt, at in vivo-testen indledende kun udføres i ét 
dyr, navnlig når stoffet mistænkes for at have potentiale for ætsning. Dette er i overensstemmelse med den sekventielle testningsstrategi 
(jf. bilag 1).
 
Når et stof er bedømt som ætsende på grundlag af weight-of-the- 
evidence-analyse, kræves ikke yderligere dyreforsøg. For størstedelen 
af de stoffer, som mistænkes for at være ætsende, er yderligere in vivo-testning sædvanligvis unødvendig. I tilfælde, hvor der menes at 
være behov for supplering af mangelfulde data, kan en begrænset 
testning i dyr gennemføres med følgende fremgangsmåde: Der anbringes successivt indtil tre prøvelapper på dyret. Den første lap fjernes efter tre minutter. Ses ingen alvorlig hudirritation, anbringes 
endnu en prøvelap, som fjernes efter en time. Viser iagttagelserne på 
dette trin, at ekspositionen humant kan udvides til fire timer, anbringes en tredje lap, som fjernes efter fire timer, hvorpå responset vurderes.
 
Iagttages en ætsende virkning efter nogen af de tre sekventielle 
ekspositioner, afsluttes forsøget straks. Iagttages ingen ætsende virk ­
ning, efter at den sidste lap er fjernet, observeres dyret i 14 dage, 
medmindre der udvikler sig ætsning på et tidligere tidspunkt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
I tilfælde, hvor teststoffet ikke forventes at frembringe ætsning, men 
kan være irriterende, anbringes en enkelt lap på ét dyr i fire timer.  
1.4.2.4.  Verifikationstest (in vivo-hudirritationstest i flere dyr)  
Er der ikke iagttaget ætsende virkning i det indledende forsøg, skal 
den irriterende eller negative respons verificeres i indtil to yderligere dyr, hver med én lap, ved en ekspositionsperiode på fire timer. Iagt ­
tages en irriterende virkning i det indledende forsøg, kan verifika ­
tionsforsøget udføres sekventielt eller ved eksposition af yderligere 
to dyr samtidigt. Er det indledende forsøg undtagelsesvis ikke udført, kan to-tre dyr behandles med en enkelt lap, som fjernes efter fire timer. Anvendes to dyr som begge udviser samme respons, er yder ­
ligere testning unødvendig. I modsat fald udføres forsøget også på 
det tredje dyr. Er responset usikkert, kan det være nødvendigt at evaluere resultaterne ved brug af flere dyr.
 
1.4.2.5.  Observationsperiode  
Undersøgelsen skal strække sig over tilstrækkelig lang tid til, at de 
iagttagne virkningers reversibilitet eller irreversibilitet kan vurderes. 
Forsøget skal imidlertid afsluttes, når som helst dyrene viser vedva ­
rende tegn på stærk smerte eller lidelser. For at bestemme reversi ­
biliteten af virkningerne skal dyrene iagttages indtil 14 dage efter 
fjernelse af lapperne. Iagttages reversibilitet inden 14 dage, afsluttes 
forsøget på dette tidspunkt.  
1.4.2.6.  Kliniske iagttagelser og klassificering af hudreaktioner  
Alle dyr undersøges for tegn på erythem og ødem, og responset 
tildeles score-værdi ved 60 minutter og derefter ved 24, 48 og 72 
timer efter fjernelse af lappen. Til det indledende forsøg i ét dyr 
undersøges testområdet desuden straks efter fjernelse af lappen. Hudreaktioner klassificeres og registreres efter inddelingen i neden ­
stående tabel. Er der hudskade, som ikke kan identificeres som irri ­
tation eller ætsning ved 72 timer, kan det være nødvendigt at fort ­
sætte iagttagelsen indtil dag 14 for at fastslå reversibiliteten af virk ­
ningerne. Foruden iagttagelsen for irritation skal alle lokale toksiske virkninger, således tab af hudens fedtstofindhold, og alle systemiske 
bivirkninger (f.eks. kliniske symptomer på toksicitet samt krops ­
vægt), beskrives fuldstændigt og registreres. Til afklaring af en usikker respons bør histopatologisk undersøgelse indgå i vurderin ­
gen.
 
Klassificering af hudrespons er nødvendigvis subjektiv. For at give 
en mere ensartet klassificering af hudresponset og for at bistå prøv ­
ningslaboratorierne og dem, som foretager og fortolker iagttagel ­
serne, må iagttagelserne foretages af personer, som er tilstrækkelig 
fortrolige med det anvendte score-system (se nedenstående tabel). Det kan være nyttigt at anvende en illustreret vejledning i klassifi ­
cering af hudirritation og andre læsioner (9).
 
2. DATA  
2.1. PRÆSENTATION OF RESULTATER  
Undersøgelsens resultater, som sammenfattes i tabelform i den ende ­
lige testrapport, skal dække alle punkter i afsnit 3.1.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. VURDERING AF RESULTATER  
Score-værdierne for hudirritation vurderes i tilknytning til læsio ­
nernes art, sværhedsgrad og reversibilitet eller manglende reversibili ­
tet. De enkelte score-værdier repræsenterer ikke en absolut standard 
for et stofs irritationsfremkaldende egenskaber, da andre virkninger 
af teststoffet ligeledes vurderes. I stedet må de enkelte score-værdier betragtes som vejledende værdier, som skal evalueres sammen med alle undersøgelsens øvrige fund.
 
Hudlæsionernes reversibilitet skal tages i betragtning ved bedøm ­
melse af irritationsrespons. Hvis respons som alopeci (af et begrænset område) hyperkeratose, hyperplasi og skældannelse persi ­
sterer indtil slutningen af den 14-dags observationsperiode, anses 
teststoffet for irriterende.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Rationale for in vivo-testning: weight-of-evidence-analyse af allerede 
foreliggende testdata, herunder resultater af den sekventielle test ­
ningsstrategi:  
— beskrivelse af relevante oplysninger fra foreliggende tidligere 
forsøg  
— oplysninger, som fremgår af de enkelte trin i testningsstrategien  
— beskrivelse af udførte in vitro-test med detaljeret beskrivelse af 
de anvendte metoder samt resultater opnået med prøve- og refe ­
rence stof  
— weight-of-the-evidence-analyse med henblik på udførelse af in 
vivo-undersøgelse.  
Prøvestof:  
— identifikationsoplysninger (f.eks. CAS-nummer, oprindelse, 
renhed, kendte urenheder, batch-nummer)  
— fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. pH. flygtig ­
hed, opløselighed, stabilitet)  
— for blandinger, sammensætning og relativ procentdel af bestand ­
delene.  
Vehikel:  
— identifikation, koncentration (i givet fald), anvendt volumen  
— begrundelse for valg af vehikel.  
For forsøgsdyrene:  
— anvendt art/stamme, rationale for anvendelse af andre dyr end 
albinokaniner  
— antal dyr af hvert køn  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse og slutning  
— alder ved forsøgets begyndelse  
— dyrenes oprindelse, forsøgsbetingelser, kost osv.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Omstændigheder ved forsøget:  
— teknik ved præparation af anbringelsesstedet for lapperne  
— enkeltheder vedrørende anvendte lapmaterialer og teknik ved 
anbringelse af lappen  
— enkeltheder vedrørende præparation og påføring og fjernelse af 
teststoffet.  
Resultater:  
— opstilling i tabelform af score-værdier for irritation/ætsning for 
hvert dyr ved alle måletidspunkter  
— beskrivelse af alle iagttagne læsioner  
— forklarende beskrivelse af art og grad af den iagttagne irritation 
eller ætsning, samt eventuelle histopatologiske fund  
— beskrivelse af andre skadelige lokale (f.eks. tab af hudens fedt ­
indhold) og systemiske virkninger foruden hudirritation eller 
ætsning.  
— Diskussion af resultater  
4. HENVISNINGER  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain: M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner I., Giuliani, A., Grav, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19-26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, VL (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. 
ATLA 26, 709-720.  
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, »Skin Irritation«, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Bruxelles.
 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M. Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998) The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483-524.  
(5a) Forsøgsmetode B.40 Hudætsning.  
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Afholdt i Solna, Sverige, den 22.-24. januar 1996 
(http://wwwl.oecd1.org/ehs/test/background.htm).  
(7) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, som vedtaget på det 28. fælles møde mellem OECD's kemikalieudvalg og arbejdsgruppe vedrørende 
kemikalier, november 1998 (http://wwwl.oecd1.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition. 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Satety Publitations. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/ 
test/monos.htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances. Washington, DC, august 1990.
 
[kan rekvireres fra OECD's sekretariat].  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabel I  
KLASSIFICERING AF HUDREAKTIONER  
Erythem og escharadannelse  
Intet erythem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Meget let erythem (knapt diagnosticerbart) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Veldefineret erythem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Moderat til svært erythem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Svært erythem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør 
klassificering af erythemet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Maksimumværdi: 4  
Ødemdannelse  
Intet ødem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Meget let ødem (næppe synligt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Let ødem (tydeligt afgrænset hævet område) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Moderat ødem (hævet ca. 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Svært ødem (hævet mere end 1 mm og udstrækning ud over det 
eksponerede område) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Maksimumværdi: 4  
Til afklaring af usikre responser kan histopatologisk undersøgelse foretages.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
BILAG  
Sekventiel testningsstrategi for hudirritation og ætsning  
GENERELLE OVERVEJELSER  
Af hensyn til den videnskabelige kvalitet og dyrenes velfærd er det vigtigt at 
undgå unødvendig brug af dyr og at minimere alle forsøg, som kan forventes at 
fremkalde svære reaktioner i dyr. Alle oplysninger om et stofs potentielle 
hudætsende og irriterende egenskaber skal vurderes, før in vivo-testning over ­
vejes. Det kan tænkes, at der allerede foreligger tilstrækkelige vidnesbyrd til, at teststoffets hudætsende eller irriterende potentiale kan klassificeres uden labora ­
torieforsøg i dyr, Ved hjælp af weight-of-the-evidence-analyse og en sekventiel 
testningsstrategi kan behovet for in vivo-testning således nedsættes til et mini ­
mum, navnlig når stoffet forventes at fremkalde svære reaktioner.
 
Det anbefales, at de foreliggende oplysninger om stoffers hud irriterende og 
ætsende egenskaber vurderes ved weight-of-the-evidence-analyse for at afgøre, om der bortset fra in vivo-hudundersøgelser bør udføres supplerende undersø ­
gelser til yderligere karakterisering af et sådant potentiale. Når yderligere under ­
søgelser er nødvendige, anbefales det at benytte den sekventielle testningsstrategi til udbygning af de relevante forsøgsdata. For ikke tidligere testede stoffer anvendes den sekventielle testningsstrategi til at udbygge det sæt data, som er 
nødvendigt til vurdering af stoffets potentiale for hudirritation/ætsning. Den i 
dette bilag beskrevne testningsstrategi er udviklet på en OECD-workshop (1) og senere bekræftet og udvidet i form af Harmonised Integrated Hazard Clas ­
sification System for Human Health and Enviranmental Effects of Chemical 
Substanses, som vedtoges på det 28. fælles møde mellem OECD's kemikalieud ­
valg og arbejdsgruppe vedrørende kemikalier i november 1998 (2).
 
Skønt denne sekventielle testning ikke indgår som en del af testmetode B.4, er 
det den anbefalede strategi til bestemmelse af hudirritation/ætsning. Strategien repræsenterer både bedste praksis og en etisk standard for in vivo-testning af hudirritation/ætsning. Metoden giver vejledning i udførelse af in vivo-forsøg og 
sammenfatter de faktorer, som man bør tage i betragtning før et sådant forsøg 
påbegyndes. Strategien tilvejebringer en metode til evaluering af foreliggende oplysninger om teststoffets hudirriterende og ætsende egenskaber og en trinvis fremgangsmåde til at generere relevante data om stoffer, som har behov for 
yderligere undersøgelse eller ikke er blevet undersøgt, Den giver desuden anbe ­
falinger før udførelse af validerede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test for hudætsning/irritation under nærmere bestemte forhold.
 
BESKRIVELSE AF STRATEGIEN FOR VURDERING OG TESTNING  
Før man iværksætter test som led i den sekventielle testningsstrategi (vist i 
figuren), skal alle foreliggende oplysninger vurderes for at fastlægge nødvendig ­
heden af in vivo-hudtest. Skønt vurdering af enkeltparametre (f.eks ekstremt pH) i sig selv kan tænkes at give væsentlige oplysninger, må alle de foreliggende oplysninger betragtes under ét. Som grundlag for en afgørelse baseret på weight- 
of-the-evidence må alle relevante oplysninger om virkningerne af det pågældende 
stof og af analoge stoffer evalueres, og et rationale for afgørelsen fremlægges. Primært må de foreliggende data om stoffets virkning på dyr og mennesker tillægges vægt, efterfulgt af resultaterne af in vitro- eller ex vivo-testning, Når 
det på nogen måde er muligt, bør  in vivo -undersøgelser af ætsende stoffer 
undgås. I testningsstrategien bør følgende faktorer tages i betragtning:
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Vurdering af foreliggende data fra mennesker og dyr (trin 1) . Foreliggende data 
fra mennesker, f.eks. kliniske undersøgelser eller arbejdsmiljøundersøgelser, og 
case-undersøgelser fra f.eks. toksicitetsundersøgelser med enkelt eller gentagen hudeksposition bør primært tages i betragtning, da de giver oplysninger direkte om virkningerne på huden. Stoffer med kendt irriterende eller ætsende virkning 
og stoffer, for hvilke der foreligger klare vidnesbyrd om fravær af ætsende eller 
irriterende virkning, behøver ikke testes in vivo.
 
Analyse af struktur/aktivitet (trin  2). Resultater fra eventuelle undersøgelser af 
strukturelt beslægtede stoffer skal tages i betragtning. Når der for strukturelt beslægtede stoffer eller blandinger af sådanne stoffer foreligger tilstrækkelige data fra mennesker og/eller dyr til at bestemme deres hudætsende/irriterende 
potentiale, kan teststoffet antages at ville frembringe samme respons. I sådanne 
tilfælde behøver teststoffet ikke testes. Negative data fra undersøgelser af struk ­
turelt beslægtede stoffer eller blandinger af sådanne stoffer udgør ikke tilstræk ­
keligt bevis for fravær af ætsende eller irriterende egenskaber af et stof i den 
sekventielle testningsstrategi. Potentialet for både hudætsning og hudirritation bør 
fastlægges ved validerede og anerkendte metoder til struktur/aktivitet analyse.
 
Fysisk-kemiske egenskaber og kemisk reaktivitet (trin 3 ). Stoffer, som udviser 
ekstremt pH som ≤ 2,0 og ≥ 11,5 kan have stærke lokale virkninger. Hvis et 
ekstremt pH er grundlaget for at udpege et stof som hudætsende, kan også dets syre/basereserve (eller bufferkapacitet) tages i betragtning (3)(4). Hvis buffer ­
kapaciteten tyder på, at et stof muligvis ikke er hudætsende, udføres videre 
testning til bekræftelser heraf, fortrinsvis med brug af en valideret og anerkendt in vitro- eller ex vivo-test (jf. trin 5 og 6).
 
Hudtoksicitet (trin 4).  Er et kemisk stof påvist meget toksisk ved optagelse 
gennem huden, kan  in vivo -undersøgelse af dets hudirriterende/ætsende egen ­
skaber muligvis ikke gennemføres i praksis, fordi den mængde teststof, som 
normalt påføres, kan overstige det stærkt toksiske niveau og følgelig vil medføre død eller svære lidelser for dyrene. Når der i forvejen er udført en hudtoksicitetsundersøgelse i albinokaniner med en dosering op til grænsen på 
2 000 mg/kg kropsvægt eller højere, uden at man herved har fundet hudirritation 
eller ætsning, er yderligere testning for hudirritation/ætsning muligvis overflødig. Vurdering af akut hudtoksicitet på grundlag af tidligere udførte undersøgelser kræver en række overvejelser. For eksempel kan de rapporterede oplysninger om 
hudlæsioner være ufuldstændige. Testning og observationer kan være gjort i 
andre arter end kaniner, og der kan være store artsforskelle i følsomheden af responset. Endvidere kan den form, hvori teststoffet er tilført dyrene, have være uegnet til vurdering af hudirritation/ætsning (f.eks stoffets fortynding ved under ­
søgelse af hudtoksicitet (5)), I de tilfælde, hvor der foreligger veldesignede og 
veludførte hudtoksicitetsundersøgelser i kaniner, kan negative fund anses som tilstrækkelig dokumentation for, at stoffet ikke er ætsende eller irriterende.
 
Resultater af in vitro- eller ex vivo-undersøgelser (trin 5 og 6).  Stoffer, som har 
udvist ætsende eller stærkt irriterende egenskaber i en valideret og anerkendt in vitro- eller ex vivo-undersøgelse (6)(7), hvis design er rettet mod vurdering af 
disse særlige virkninger, behøver ikke testes i dyr. Sådanne stoffer må antages at 
ville frembringe tilsvarende svære virkninger in vivo.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
In vivo-test i kaniner (trin  7 og 8) . Hvis weight-of the-evidence-analyse giver 
grundlag for at udføre  in vivo -forsøg, bør disse begynde med en indledende test i 
ét dyr. Viser denne test, at stoffet ætser huden, bør der ikke udføres yderligere test. Er der ikke fundet ætsende virkning i det indledende forsøg, skal det irriterende eller negative respons verificeres i indtil to yderligere dyr med en 
ekspositionsperiode på fire timer. Hvis der iagttages en irriterende virkning i 
det indledende forsøg, kan der udføres et sekventielt verifikationsforsøg, eller yderligere to dyr kan eksponeres samtidigt.
 
HENVISNINGER  
(1) OECD (1996), Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, afholdt i Solna, Sverige, den 22.- 24. januar 1996 (http://www.1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
(2) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, 
som vedtaget på det 28. fælles møde mellem OECD's kemikalieud ­
valg og arbejdsgruppe vedrørende kemikalier, november 1998 (http://www.1oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P, Fentem J.H., Balls M, Botham P.A., Curren R.D, Earl L.K, 
Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26.709-720.
 
(4) Young, J.R. How, M.J., Walker, A.P., Worth. W.M.H. (1988). Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substances, Without Testing on Animals. Toxic  in Vitro , 2 (1) s. 19-26.  
(5) Patil, S.M., Patrick. E, Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and  in Vitro  
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (red.): Dermatotoxicology. Femte udgave ISBN 1-56032-356-6, kapitel 31, 411-436.
 
(6) Forsøgmetode B.40.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter. H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results 
and evaluation by the Management Team. Toxicology  in Vitro  12, 
s. 483-524.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Figur  
EN STRATEGI FOR TESTNING OG VURDERING AF HUDIRRITATION/ÆTSNING
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. AKUT TOKSICITET, ØJENIRRITATION  
1. METODE  
Metoden er ækvivalent med OECD TG 405 (2002).  
1.1. INDLEDNING  
Ved udarbejdelse af denne ajourførte metode er der lagt særlig vægt 
på de forbedringer, som kan opnås ved at vurdere alle foreliggende oplysninger om teststoffet med henblik på at undgå unødvendige forsøg med laboratoriedyr og dermed komme betænkeligheder 
omkring dyrenes velfærd i møde. I metoden indgår en anbefaling 
om, at der før iværksættelse af den beskrevne in vivo-test for akut øjenirritation/ætsning udføres en weight-of-the-evidence-analyse (1) af foreliggende relevante data, Er de foreliggende data utilstrække ­
lige, anbefales det, at de suppleres ved sekventiel testning (2)(3). 
Den anbefalede testningsstrategi, som omfatter validerede og aner ­
kendte in vitro-test, er givet som bilag til denne metodebeskrivelse, Derudover anbefales det at udføre en in vivo-test for 
hudirritation/ætsning med henblik på at kunne forudsige ætsning af 
øjet, før en in vivo-øjentest overvejes gennemført.
 
Både den videnskabelige kvalitet og dyrenes velfærd fremmes ved, 
at in vivo-test ikke udføres, før alle relevante data om stoffets poten ­
tielle øjenætsende eller -irriterende egenskaber er vurderet ved weight-of-the-evidence-analyse, Sådanne data består af dokumenta ­
tion fra foreliggende undersøgelser i mennesker og/eller laboratorie ­
dyr, dokumentation for ætsende/irriterende virkning af et eller flere strukturelt beslægtede stoffer eller af blandinger af sådanne stoffer, data, som viser at stoffet er stærkt surt eller alkalisk (4)(5), og 
resultater af validerede og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test 
for hudætsning og -irritation (6)(6a). Undersøgelserne kan enten have været udført inden en weight-of-the-evidence-analyse eller efterfølgende som resultat heraf.
 
For visse stoffer kan en sådan analyse vise, at der er behov for in 
vivo-undersøgelser af stoffets potentiale for ætsning/irritation af øjnene, I alle sådanne tilfælde skal man, før en in vivo-øjentest 
påtænkes, helst først udføre en undersøgelse af stoffets virkninger 
på hud in vivo og vurdere denne i henhold til forsøgsmetode B.4 (7). Anvendelse af weight-of-the-evidence-analyse og sekventiel test ­
ningsstrategi skulle mindske behovet for in vivo-testning for 
ætsende/irriterende virkning på øjet af stoffer, som allerede er 
tilstrækkelig undersøgt i andre undersøgelser. Kan stoffets potentiale for ætsning eller irritation af øjet ikke bestemmes ved den sekventi ­
elle testningsstrategi, selv efter udførelse af en in vivo-undersøgelse 
af hudætsning og irritation, kan der udføres en in vivo-test for 
ætsning/irritation af øjet.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
En anbefalet testningsstrategi, som indebærer udførelse af validerede 
og anerkendte in vitro- eller ex vivo-test for ætsning/irritation, er 
medtaget som bilag til denne metodebeskrivelse. Strategien blev udviklet på en OECD-workshop (8) og enstemmigt anbefalet af deltagerne heri, og den er vedtaget som anbefalet testningsstrategi i 
det globalt harmoniserede system for klassificering af kemiske stoffer 
(GHS) (9). Skønt sekventiel testning ikke indgår som en del af testmetode B.4, anbefales det at følge denne testningsstrategi, før in vivo-forsøg iværksættes, For nye stoffer anbefales den trinvise 
testningsstrategi til at indhente videnskabeligt forsvarlige oplysninger 
om stoffets ætsende/irriterende virkning. For eksisterende stoffer, som ikke er tilstrækkelig undersøgt for øjenætsning/irritation, bør man følge denne strategi for at supplere de mangelfulde data, 
Anvendes en anden testningsstrategi eller -metode, eller beslutter 
man sig for ikke at følge den trinvise testningsstrategi, bør dette begrundes.
 
1.2. DEFINITIONER  
Øjenirritation  er frembringelse af forandringer i øjet, som opstår 
efter påføring af et teststof på øjets anteriore overflade, og som er 
fuldt reversible inden for 21 dage efter påføring.  
Ætsning af øjet  er frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller 
alvorlig fysisk synsnedsættelse, som opstår efter påføring af et test ­
stof på øjets anteriore overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter påføring.
 
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
En enkelt dosis af teststoffet påføres dyrets ene øje; det ubehandlede 
øje tjener som kontrol. Graden af øjenirritation/ætsning vurderes ved tildeling af score-værdier til læsionerne af conjunctiva, cornea og iris med bestemte intervaller, Andre virkninger på øjet og systemiske 
negative virkninger beskrives ligeledes, således at man har en fuld ­
stændig bedømmelse af virkningerne. Undersøgelsen skal strække sig over tilstrækkelig lang tid til, at virkningernes reversibilitet eller irreversibilitet kan vurderes.
 
Dyr, som viser tegn på stærk lidelse og/eller smerte i nogen del af 
forsøget, aflives humant, og teststoffet vurderes tilsvarende, Kriterier for human aflivning af døende og stærkt lidende dyr kan findes i 
reference (10).
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Forberedelse til in vivo-forsøget  
1.4.1.1.  Valg af art  
Det foretrukne forsøgsdyr er albinokaninen, og der anvendes raske 
unge kønsmodne dyr. Anvendes andre arter, skal der fremlægges 
begrundelse herfor.  
1.4.1.2.  Forberedelse af dyrene  
På hvert af de foreløbigt udvalgte dyr undersøges begge øjne højst 
24 timer før testen begynder. Dyr, som udviser øjenirritation eller 
øjendefekter, eller som i forvejen har beskadiget cornea, må ikke 
anvendes.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Miljøbetingelser og fodring  
Dyrene holdes i hver sit bur. Temperaturen i forsøgslokalet skal være 
20 o C (± 3  o C) for kaniner. Den relative luftfugtighed skal være 
mindst 30 % og helst ikke være over 70 %, hvilket dog ikke 
gælder under rengøring af lokalet, men 50-60 % bør tilstræbes. 
Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder og fri adgang til drikkevand.
 
1.4.2.  Prøveprocedure  
1.4.2.1.  Applikation af teststoffet  
Teststoffet anbringes i conjunctivalsækken af det ene øje på hvert 
dyr, idet det nederste øjenlåg forsigtigt trækkes lidt ud fra øjeæblet. Derefter holdes øjenlågene sammen i ca. et sekund for at forhindre, 
at noget af stoffet løber ud. Det ubehandlede øje fungerer som 
kontrol.
 
1.4.2.2.  Skylning  
I mindst 24 timer efter instillation af teststoffet må der ikke foretages 
skylning af forsøgsdyrenes øjne, bortset fra faststof (jf. punkt 1.4.2.3.2) eller i tilfælde af øjeblikkeligt indsættende ætsende eller 
irriterende virkning. Ved 24 timer kan øjet skylles, hvis det anses for 
hensigtsmæssigt.
 
Anvendelse af en satellitgruppe af dyr til undersøgelse af virkningen 
af skylningen kan ikke anbefales, medmindre det er videnskabeligt 
begrundet, Er en satellitgruppe nødvendig, skal den bestå af to kani ­
ner. Skylningsomstændighederne skal nøje dokumenteres, således skylningstidspunkt, skyllevæskens sammensætning og temperatur samt skylningens varighed, anvendt væskevolumen og -hastighed.
 
1.4.2.3.  Dosisniveau  
1.4.2.3.1  Undersøgelse af væsker  
Ved undersøgelse af flydende stoffer anvendes 0,1 ml. Der må ikke 
anvendes pumpespray til direkte instillation af stoffet i øjet. I stedet 
sprøjtes væske ud af sprayflasken og opsamles i et kar, før der 
instilleres 0,1 ml i øjet.  
1.4.2.3.2.  Undersøgelse af faste stoffer  
Ved undersøgelse af faste stoffer, pastaer og fintfordelte faste stoffer 
anvendes et volumen på 0,1 ml eller en vægtmængde på højst 
100 mg. Prøvestoffet rives til finkornet støv. Partiklernes volumen måles efter let sammenpresning, f.eks. frembragt ved små slag på målekarret. Er det faste teststof ikke forsvundet fra dyrets øje ad 
naturlig vej på det første observationstidspunkt 1 time efter behand ­
lingen, kan øjet skylles med saltvand eller destilleret vand.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3.  Undersøgelse af aerosoler  
Det anbefales, at alle pumpesprayprodukter og aerosoler opsamles 
før instillation i øjet. Som eneste undtagelse gælder stoffer, som er 
under tryk i aerosolbeholder og ikke kan opsamles på grund af fordampning. I sådanne tilfælde holdes øjet åbent, og teststoffet administreres i øjet med et enkelt pust på ca. ét sekund fra en 
afstand af 10 cm direkte foran øjet. Afstanden kan variere afhængigt 
af trykket i aerosolbeholderen og dens indhold. Der må drages omsorg for at undgå skade på øjet som følge af trykket i spraydåsen. I visse tilfælde kan der være brug for at vurdere potentialet for 
»mekanisk« skade på øjet forårsaget af forstøvningens styrke.
 
Den afgivne dosis fra aerosolbeholderen kan vurderes ved at simu ­
lere prøven på følgende måde: Stoffet sprøjtes på vejepapir gennem 
en åbning af størrelse som et kaninøje placeret umiddelbart foran 
papiret. Papirets vægtforøgelse anvendes som omtrentligt mål for den mængde, der tilføres øjet ved forstøvning. For flygtige stoffer kan dosis vurderes ved vejning af den modtagende beholder før og 
efter udtagning af teststof.
 
1.4.2.4.  Indledende test (in vivo-øjenirritations/ætsningstest i ét dyr  
Som nævnt i den sekventielle teststrategi (se bilag 1), anbefales det 
stærkt, at in vivo-testen indledende udføres i kun ét dyr.  
Viser denne test, at stoffet virker ætsende eller stærkt irriterende på 
øjet ved brug af den beskrevne fremgangsmåde, bør der ikke udføres yderligere test for øjenirritation.
 
1.4.2.5.  Lokalanæstetika  
Der kan anvendes lokalanæstetika efter stillingtagen i hvert enkelt 
tilfælde. Hvis weight-of-the-evidence-analysen viser, at stoffet har smertevoldende potentiale, eller hvis den indledende testning viser, 
at der vil komme en smertefuld reaktion, kan der bruges et lokala ­
næstetikum før instillation af teststoffet. Art, koncentration og dose ­
ring af lokalanæstetikum bør vælges omhyggeligt med henblik på at sikre, at dets anvendelse ikke medfører forskelle i reaktionen på 
teststoffet. Kontroløjet lokalbedøves på tilsvarende måde.
 
1.4.2.6.  Verifikationstest (in vivo-øjenirritationstest i yderligere dyr)  
Har det indledende forsøg ikke vist ætsende virkning, bør det irrite ­
rende eller negative respons verificeres i indtil to yderligere dyr. Iagttages der i det indledende forsøg en svær irriterende virkning, 
som tyder på, at der måske kan forventes en stærk (irreversibel) 
virkning i verifikationsforsøget, anbefales det at udføre dette sekven ­
tielt i ét dyr ad gangen frem for at eksponere yderligere to dyr samtidig. Udviser det andet dyr ætsning eller svær irritation, standses 
forsøget. Til verifikation af en svag eller moderat irritationsrespons 
kan det være nødvendigt at anvende yderligere dyr.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Observationsperiode  
lagttagelsesperioden skal være tilstrækkelig lang til, at de iagttagne 
virkningers omfang og reversibilitet kan vurderes fuldt ud. Forsøget skal dog afsluttes, når som helst dyrene viser vedvarende tegn på 
stærk smerte eller lidelser (9). For at bestemme reversibiliteten af 
virkningerne skal dyrene sædvanligvis iagttages indtil 21 dage efter administration af teststoffet. Iagttages reversibilitet inden 21 dage, afsluttes forsøget på dette tidspunkt.
 
1.4.2.7.1.  Kliniske iagttagelser og klassificering af øjenreaktioner  
Øjnene undersøges 1, 24, 48 og 72 timer efter påføring af teststoffet. 
Dyrene skal ikke forblive længere i forsøget, end indtil dette har har 
givet definitive oplysninger. Dyr, som viser tegn på stærk lidelse og/eller smerte i nogen del af forsøget, skal omgående aflives humant, og teststoffet vurderes tilsvarende, Når følgende øjenlæ ­
sioner optræder efter instillation af teststoffet, skal dyret aflives 
humant: perforation af cornea eller nævneværdig ulceration af cornea, herunder staphylom; blod i forreste øjenkammer; uklarhed af cornea af grad 4, persisterende i 48 timer; manglende reaktion på 
lys (irisrespons grad 2), persisterende i 72 timer; ulceration af 
conjunctivaslimhinden; nekrose af conjunctivae eller blinkhinde; rynker i cornea. Begrundelsen herfor er, at sådanne læsioner sædvan ­
ligvis er irreversible.
 
For dyr, som ikke udvikler øjenlæsioner, kan forsøget afsluttes 
tidligst 3 dage efter instillation, Dyr med lette til moderate læsioner observeres, indtil læsionerne forsvinder, eller i 21 dage, på hvilket 
tidspunkt forsøget afsluttes, På dag 7, 14 og 21 foretages observation 
til bestemmelse af læsionernes status og reversibilitet eller irreversi ­
bilitet.
 
Graden af øjenreaktion (conjunctivae, cornea and iris) registreres ved 
hver undersøgelse (tabel I). Alle andre læsioner i øjet (f.eks. pannus, farvning) og systemiske negative virkning skal ligeledes rapporteres.
 
Undersøgelse af reaktionerne kan lettes ved brug af lup-briller, hånd ­
spaltelampe, binokulært mikroskop eller andre hensigtsmæssige hjæl ­
pemidler. Efter registrering af observationerne i 24 timer kan øjnene 
undersøges yderligere med fluorescein.  
Klassificeringen af øjenrespons er nødvendigvis subjektiv. For at 
give en mere ensartet klassificering af øjenresponset og for at bistå 
prøvningslaboratorieme og dem, som foretager og fortolker iagttagel ­
serne, må iagttagelserne foretages af personer, som er tilstrækkeligt fortrolige med det anvendte score-system. Klassificeringen af øjen ­
respons foretages blindt.
 
2. DATA  
2.2. VURDERING AF RESULTATER  
Score-værdierne for øjenirritation vurderes i tilknytning til læsio ­
nernes art, sværhedsgrad og reversibilitet eller manglende reversibili ­
tet, De enkelte score-værdier repræsenterer ikke en absolut standard 
for et stofs irritationsfremkaldende egenskaber, da de også omfatter andre virkninger af teststoffet. I stedet må de enkelte score-værdier betragtes som vejledende værdier, som kun er meningsfulde, når de 
støttes af en fuldstændig beskrivelse og evaluering af alle observa ­
tioner.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Rationale for in vivo-testning: weight-of-the-evidence-analyse af 
allerede foreliggende testdata, herunder resultater af den sekventielle testningsstrategi
 
— beskrivelse af relevante oplysninger fra foreliggende tidligere 
forsøg  
— oplysninger afledt af de enkelte trin i testningsstrategien  
— beskrivelse af udførte in vitro test med detaljeret beskrivelse af 
de anvendte metoder og resultater opnået med prøve- og referen ­
cestof  
— beskrivelse af den udførte in vivo-undersøgelse af 
hudirritation/ætsning med angivelse af opnåede resultater  
— weight-of-the-evidence-analyse med henblik på udførelse af in 
vivo-undersøgelse.  
Prøvestof:  
— identifikationsoplysninger (f.eks, CAS-nummer, oprindelse, 
renhed, kendte urenheder, batch-nummer)  
— fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. pH, flygtig ­
hed, opløselighed, stabilitet, reaktion med vand)  
— for blandinger, sammensætning og relativ procentdel af bestand ­
delene  
— hvis et lokalanæstetikum benyttes, identifikation, renhed, art, 
dosis og potentiel interaktion med teststoffet.  
Vehikel:  
— identifikation, koncentration (i givet fald), anvendt volumen  
— begrundelse for valg af vehikel.  
For forsøgsdyrene:  
— anvendt art/stamme, rationale for anvendelse af andre dyr end 
albinokaniner  
— hvert dyrs alder ved forsøgets begyndelse  
— antal dyr af hvert køn i testgruppe og kontrolgruppe (hvis 
nødvendigt)  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse og slutning  
— oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.  
Resultater:  
— beskrivelse af den anvendte metode til fastlæggelse af irritations ­
score på hvert observationstidspunkt (f.eks. håndspaltelampe, 
binokulært mikroskop, fluorescein)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— angivelse i tabelform af irritations/ætsningsresponsdata for hvert 
dyr på hvert observationstidspunkt, indtil dyret ophører med 
forsøget  
— forklarende beskrivelse af grad og art af den iagttagne irritation 
eller ætsning  
— beskrivelse af alle andre iagttagne læsioner i øjet (f.eks. karind ­
vækst, pannusdannelse, adhæsion, farvning)  
— beskrivelse af ikke-okulære lokale og systemiske negative virk ­
ninger og eventuelle histopatologiske fund.  
Diskussion af resultater.  
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATER  
Resultaterne af øjenirritationsundersøgelser i laboratoriedyr kan kun i 
begrænset omfang overføres til mennesker. I mange tilfælde er albi ­
nokaniner mere følsomme end mennesker for øjenirriterende eller -ætsende stoffer.
 
Fortolkning af data skal ske med forbehold, så man undgår at 
medtage irritation forårsaget af sekundær infektion.  
4. HENVISNINGER  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L., Giuliani, A. Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410- 429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., 
Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies, ATLA 27, 161-177.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19-26.
 
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227-231.  
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483-524.
 
(6a) Forsøgsmetode B.40 Hudætsning.  
(7) Forsøgsmetode B.4. Akut toksicitet: Hudirritation/ætsning.  
(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Afholdt i Solna, Sverige, den 22.-24. januar 1996 
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, som vedtaget på det 28. fælles møde mellem OECD's kemikalieudvalg og arbejdsgruppe vedrørende kemikalier, november 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).
 
(10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on 
Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/ 
monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabel I  
KLASSIFICERING AF ØJENSKADER  
Cornea  
Uklarhed: graden af uklarhed aflæses i det tætteste område (*) 
Ingen ulceration eller uklarhed . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Spredte eller diffuse uklare områder (ikke bestående i en let mattering af 
den normale glans); detaljer i iris klart synlige . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Let skelneligt halvgennemsigtigt område; detaljerne i iris let slørede . 2 Område med perlemorsglans; ingen detaljer i iris synlige; pupilstørrelse 
kan knapt skelnes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Cornea uklar; iris ikke skelnelig gennem uklarheden . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Maksimum: 4  
NOTER  
(*) Området med corneauklarhed skal angives.  
Iris 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Markant fordybede rugae, kongestion, hævelse, moderat hyperæmi 
omkring cornea; eller injektion; iris reagerer på lys (træg lysreaktion anses for en virkning) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Blødning, massiv ødelæggelse, eller ingen reaktion på lys . . . . . . . . . . . 2
 
Maksimum: 2  
Conjunctivae  
Rødme (af conjunctiva palpebrae og conjunctiva bulbi; bortset fra cornea og iris) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Nogle blodkar hyperæmiske (injektion) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Diffus, blodrød farve; de enkelte kar ikke let skelnelige . . . . . . . . . . . . . 2 
Diffus oksekødsfarvet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3  
Maksimum: 3  
Chemosis  
Hævelse (om øjenlåg og/eller blinkhinder) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Nogen unormal hævelse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Tydelig hævelse med delvis udkrængning af øjenlåg . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Hævelse med øjenlåg omtrent halvt lukket . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Hævelse med øjenlåg mere end halvt lukket . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Maksimum: 4  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
BILAG  
Sekventiel testningsstrategi for øjenirritation og ætsning  
GENERELLE OVERVEJELSER  
Såvel hensynet til den videnskabelige kvalitet som til dyrenes velfærd taler for at 
undgå unødvendig brug af dyr og at minimere alle forsøg, som kan forventes at 
fremkalde svære reaktioner i dyr. Alle oplysninger om et stofs potentielle øjenæt ­
sende og irriterende egenskaber skal vurderes, før in vivo-testning overvejes. Der foreligger muligvis allerede tilstrækkelige vidnesbyrd til, at teststoffets potentiale for ætsning eller irritation af øjnene kan klassificeres, uden at der behøves labo ­
ratorieforsøg udført med dyr. Ved hjælp af weight-of-the-evidence-analyse og en 
sekventiel testningsstrategi kan behovet for in vivo-testning således nedsættes til et minimum, navnlig når stoffet forventes at fremkalde svære reaktioner.
 
Det anbefales, at de foreliggende oplysninger om stoffers øjenirriterende og 
ætsende egenskaber vurderes ved weight-of-the-evidence-analyse for at afgøre, om der ud over in vivo-øjenundersøgelser bør udføres supplerende undersøgelser til nærmere karakterisering af et sådant potentiale. Når yderligere undersøgelser 
er nødvendige, anbefales det at benytte den sekventielle testningsstrategi til fast ­
læggelse af de relevante forsøgsdata. For ikke tidligere testede stoffer anvendes den sekventielle testningsstrategi til at fastlægge det sæt data, som er nødvendigt til vurdering af stoffets potentiale for øjenirritation/ætsning. Den i dette bilag 
beskrevne testningsstrategi er udviklet på en OECD-workshop (1). Den er 
senere blevet bekræftet og udvidet i form af Harmonised Integrated Hazard Clas ­
sification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, som vedtoges på det 28, fælles møde mellem OECD's kemikalieud ­
valg og arbejdsgruppe vedrørende kemikalier i november 1998 (2).
 
Skønt denne sekventielle testning ikke indgår som en del af testmetode B.5, er 
det den anbefalede strategi til bestemmelse af øjenirritation/ætsning. Strategien 
repræsenterer både bedste praksis og en etisk standard for in vivo-testning af 
øjenirritation/ætsning. Testmetoden giver vejledning i udførelse af in vivo-forsøg og sammenfatter de faktorer, som bør tages i betragtning, før et sådant forsøg påbegyndes, Strategien tilvejebringer en metode til evaluering af foreliggende 
oplysninger om teststoffets øjenirriterende og ætsende egenskaber og en trinvis 
fremgangsmåde til at generere relevante data om stoffer, som har behov for yderligere undersøgelse eller ikke er blevet undersøgt, Strategien indebærer, at der først udføres validerede og anerkendte in vivo- eller ex vivo-test, og derefter 
forsøgsmetode B.4, hudirritation/ætsning, alt efter omstændighederne (3)(4).
 
BESKRIVELSE AF DEN TRINVISE TESTNINGSSTRATEGI  
Før man iværksætter test som led i den sekventielle testningsstrategi (vist i 
figuren), skal alle foreliggende oplysninger vurderes for at afgøre nødvendig ­
heden af in vivo-øjentest. Skønt vurdering af enkeltparametre (f.eks. ekstremt pH) i sig selv kan tænkes at give væsentlige oplysninger, må alle de foreliggende oplysninger betragtes under ét, Som grundlag for en afgørelse baseret på weight- 
of-the-evidence må alle relevante oplysninger om virkningerne af det pågældende 
stof og af analoge stoffer evalueres, og et rationale for afgørelsen fremlægges. Primært må foreliggende oplysninger om stoffets virkning på dyr og mennesker tillægges vægt, efterfulgt af resultaterne af in vivo. eller ex vivo-testning. Når det 
på nogen måde er muligt, bør in vivo-undersøgelser af ætsende stoffer undgås. I 
testningsstrategien bør følgende faktorer tages i betragtning;
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Vurdering af foreliggende data fra mennesker og dyr (trin 1).  Foreliggende data 
fra mennesker, f.eks. kliniske undersøgelser eller arbejdsmiljøundersøgelser, case- 
undersøgelser og/eller data fra dyreforsøg fra f.eks. øjenstudier skal primært tages i betragtning, da de giver oplysninger direkte vedrørende virkninger på øjnene. Derefter vurderes foreliggende data fra undersøgelser af hudætsning/irritation i 
mennesker og/eller dyr. Stoffer med kendt ætsende eller irriterende virkning på 
øjet bør ikke instilleres i øjenene på dyr, hvilket ligeledes gælder stoffer, som virker ætsende eller irriterende på huden, da disse må anses for at virke ætsende og/eller irriterende også på øjnene. Stoffer, for hvilke der foreligger tilstrækkelig 
dokumentation for manglende ætsende og irriterende virkning fra tidligere øjen ­
studier, bør heller ikke testes i in vivo-øjenstudier.
 
Analyse af struktur/aktivitetrelationer (trin 2).  Resultater fra eventuelle undersø ­
gelser af strukturelt beslægtede stoffer skal tages i betragtning, Når der for 
strukturelt beslægtede stoffer eller blandinger af sådanne stoffer foreligger 
tilstrækkelige data fra mennesker og/eller dyr til at bestemme deres potentiale for ætsning/irritation af øjnene, kan teststoffet antages at ville frembringe samme responser. I sådanne tilfælde behøver teststoffet ikke nødvendigvis testes. Nega ­
tive data fra undersøgelser af strukturelt beslægtede stoffer eller blandinger af 
sådanne stoffer udgør ikke tilstrækkeligt bevis for fravær af ætsende eller irrite ­
rende egenskaber af et stof i den sekventielle testningsstrategi. Potentialet for ætsende og og irriterende virkning på både hud og øje bør fastlægges ved 
validerede og anerkendte metoder til analyse af struktur/aktivitetrelationer.
 
Fysisk-kemiske og kemisk reaktivitet (trin 3).  Stoffer, som udviser ekstremt pH 
som ≤ 2,0 eller ≤ 11,5, kan have stærke lokal virkninger. Hvis et ekstremt pH er 
grundlaget for at udpege et stof som ætsende eller irriterende for øjnene, kan 
også dets syre/basereserve (eller bufferkapacitet) tages i betragtning (5)(6). Tyder 
stoffets bufferkapacitet på, at det muligvis ikke virker ætsende på øjnene, bør dette bekræftes ved videre testning, fortrinsvis med brug af en valideret og anerkendt in vitro- eller ex vivo-test (jf, trin 5 og 6).
 
Hensyntagen til andre foreliggende oplysninger (trin 4).  Alle foreliggende oplys ­
ninger om systemisk toksicitet ved påføring på huden vurderes på dette trin. Teststoffets akutte toksicitet ved optagelse gennem huden skal ligeledes tages i 
betragtning. Er teststoffet påvist at være meget toksisk ved optagelse gennem 
huden, behøver det ikke nødvendigvis testes i øjenene. Skønt der ikke nødven ­
digvis er sammenhæng mellem akut toksicitet ved optagelse gennem huden og øjenirritation/ætsning, kan man gå ud fra, at når et agens er meget toksisk ved 
optagelse gennem huden, vil det ligeledes vise sig meget toksisk ved instillation i 
øjet. Sådanne oplysninger kan ligeledes tages i betragtning mellem trin 2 og 3.
 
Resultater af in vitro- eller ex vivo-undersøgelser (trin 5 og 6).  Stoffer, som har 
udvist ætsende eller stærkt irriterende egenskaber i en in vitro- eller ex vivo- 
undersøgelse (7)(8), som er valideret og anerkendt specielt til vurdering af 
ætsende/irriterende virkning på øjne eller hud, behøver ikke testes i dyreforsøg. Sådanne stoffer må antages at ville frembringe tilsvarende svære virkninger in vivo. Foreligger der ikke validerede og anerkendte in vitro- og/eller ex vivo-test, 
springes trin 5 og 6 over og fortsættes direkte med trin 7.
 
Vurdering af stoffets hudirriterende eller ætsende virkning in vivo (trin 7).  Når 
ovennævnte undersøgelser ikke udgør tilstrækkelig dokumentation til at foretage en konklusiv weight-of-the-evidence-analyse af et stofs potentielle 
irriterende/ætsende virkning på øjet, bestemmer man først dets potentiale for in 
vivo-hudirritation/ætsning ved hjælp af forsøgsmetode B.4 (4) og det tilhørende bilag (9). Er stoffet påvist at forårsage ætsning eller svær hudirritation, bør det anses for øjenætsende, medmindre andre oplysninger taler for en anden konklu ­
sion. Der behøver således ikke foretages nogen in vivo-øjentest. Er stoffet ikke 
ætsende eller ikke stærkt hudirriterende, udføres en in vivo-øjentest.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
In vivo-test i kaniner (trin 8 og 9).  In vivo-øjentestning bør begynde med en 
indledende test i ét dyr. Viser stoffet sig i denne test ætsende eller stærkt irrite ­
rende på øjet, bør yderligere test ikke udføres. Viser testen ingen ætsende eller ingen stærkt irriterende virkninger, udføres en verifikationstest i yderligere to dyr.
 
HENVISNINGER  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Afholdt i Solna, Sverige, den 22.-24. januar 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human 
Health and Environmental Effects of Chemical Substances, som vedtaget på det 
28. fælles møde mellem OECD's kemikalieudvalg og arbejdsgruppe vedrørende kemikalier, november 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies, ATLA 27, 161-177.  
(4) Forsøgsmetode B.4. Akut toksicitet: hudirritation/ætsning.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.  
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol, 12, 
227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results 
and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 
s. 483-524.
 
(8) Forsøgsmetode B.40 Hudætsning.  
(9) Bilag til forsøgsmetode B.4: Sekventiel testningsstrategi for hudirritation og 
ætsning.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Figur  
En strategi for testning og vurdering af øjenirritation/ætsning
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. HUDSENSIBILISERING  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Bemærkninger:  
I et system for klassifikation af den toksicitet, der er relevant for 
folkesundheden, er det af stor betydning at have følsomme test, som kan afsløre stoffer, der kan virke hudsensibiliserende på mennesker.
 
Der findes ikke én enkelt testmetode, hvorved man med sikkerhed 
kan identificere alle stoffer, som kan virke hudsensibiliserende på 
mennesker, og som kan anvendes til alle stoffer.  
Der skal ved valg af test tages hensyn til en række faktorer såsom 
stoffets fysiske egenskaber, herunder dets evne til at trænge gennem 
huden.  
Der er udviklet to testtyper med anvendelse af marsvin: adjuvans ­
typen, hvor en allergisk tilstand forstærkes, når teststoffet opløses eller opslæmmes i Freunds komplette adjuvans (FCA), og typen 
uden adjuvans.
 
Test af adjuvanstypen vil normalt forudsige et stofs sandsynlige 
hudsensibiliserende virkning hos mennesker mere præcist end de metoder, hvor der ikke benyttes Freunds komplette adjuvans, og 
bliver derfor foretrukket.
 
Maksimeringstest på marsvin (Guinea-Pig Maximization Test — 
GPMT) er en meget anvendt test af adjuvanstypen. Skønt en række andre metoder kan benyttes til at undersøge et stofs potentielle 
hudsensibiliserende virkning, er GPMT den foretrukne metode af 
adjuvanstypen.
 
Test uden adjuvans (hvor Buehlertesten er den foretrukne) bliver for 
mange kemiske stofgrupper anset for at være mindre følsom.  
Der kan i visse tilfælde, være gode grunde til at vælge Buehlertesten 
med lokal påføring i stedet for den intradermale injektion, der benyttes i maksimeringstesten på marsvin. Der skal gives en viden ­
skabelig begrundelse for anvendelse af Buehlertesten.
 
I denne metode beskrives maksimeringstesten på marsvin (GPMT) 
og Buehlertesten. Der kan anvendes andre metoder, forudsat at de er tilstrækkeligt validerede, og at valget er videnskabeligt begrundet.
 
Hvis testresultatet i en af de anerkendte screeningstest er positivt, er 
det tilladt at betegne stoffet som potentielt sensibiliserende og det er 
måske ikke nødvendigt at udføre yderligere marsvineforsøg. Hvis stoffet er negativt i en af de anerkendte screeningsmetoder, skal 
der udføres en marsvinetest, hvor der bruges de fremgangsmåder, 
der er beskrevet i denne testmetode.
 
Se også den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. DEFINITIONER  
Hudsensibilisering : (allergisk kontaktdermatitis) er en immunologisk 
hudreaktion på et stof. Hos mennesker kan reaktionerne være karak ­
teriseret ved kløen, erytem, ødem, papler, vesikler, blærer eller en 
kombination heraf. Andre arter kan have andre reaktioner f.eks. kun 
erytem og ødem.  
Induktionseksponering : eksperimentel eksponering af et individ for et 
teststof med henblik på fremkaldelse af hypersensibel tilstand.  
Induktionsperiode : tidsrum på mindst en uge efter en induktionseks ­
ponering, under hvilken en hypersensibel tilstand kan være opstået.  
Provokationseksponering : eksperimentel eksponering — efter en 
induktionsperiode — af et tidligere behandlet individ for et teststof til konstatering af, om individet reagerer hypersensibelt.
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
Den anvendte forsøgsmetodes følsomhed og pålidelighed vurderes 
hver sjette måned med anvendelse af stoffer, der vides at have 
mildt til moderat hudsensibiliserende egenskaber.  
I en velgennemført test bør der for mildt/moderat sensibiliserende 
stoffer ventes en reaktion på mindst 30 % i en adjuvanstest og 
mindst 15 % i en test uden adjuvans.  
Følgende stoffer foretrækkes:  
CAS-nummer Einecs-nummer Einecs-navn Fælles navn  
101-86-0 202-983-3 α-hexylkanelaldehyd α-hexylkanelaldehyd 
149-30-4 205-736-8 benzothiazol-2-thiol (mercap ­
tobenzothiazol) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzocain norcain  
Under visse omstændigheder vil andre kontrolstoffer, der opfylder de 
ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Forsøgsdyrene udsættes først for teststoffet med intradermale injek ­
tioner og/eller epidermal applikation (induktionseksponering). Efter en hvileperiode på 10-14 dage (induktionsperiode), hvor der kan udvikle sig immunrespons, udsættes dyrene for en provokationsdosis. 
Omfanget og graden af hudens reaktion på provokationsekspone ­
ringen i forsøgsdyrene sammenlignes med resultater fra kontroldyr, der har fået placebo-behandling i induktionsperioden og dernæst er eksponeret for provokationsdosis.
 
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODERNE  
Hvis det anses for nødvendigt at fjerne teststoffet, bør dette gøres 
med vand eller et passende opløsningsmiddel, uden at den frem ­
kaldte reaktion ændres eller overhuden beskadiges.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Maksimeringstest på marsvin (Guinea-Pig Maximization Test — 
GPMT)  
1.5.1.1. F o r b e r e d e l s e r  
Unge, sunde, kønsmodne albinomarsvin tilvænnes laboratoriebetin ­
gelserne i mindst fem dage forud for testen. Før forsøget begyndes, 
fordeles dyrene randomiseret i behandlingsgrupper. Behåring fjernes ved klipning, barbering eller eventuelt med kemiske midler, afhæn ­
gigt af testmetode. Huden må ikke irriteres. Dyrene vejes, inden 
forsøget påbegyndes, og ved forsøgets afslutning.
 
1.5.1.2. F o r s ø g s b e t i n g e l s e r  
1.5.1.2.1. Forsøgsdyr  
Der benyttes albinomarsvin af almindeligt anvendte stammer.  
1.5.1.2.2. Antal og køn  
Der kan anvendes handyr og/eller hundyr. Hvis der benyttes hundyr, 
må de ikke have født, og de må ikke være drægtige.  
Forsøgsgruppen skal bestå af mindst ti dyr og kontrolgruppen af 
mindst fem dyr. Hvis der anvendtes mindre end tyve forsøgsmarsvin og ti kontrolmarsvin og det ikke er muligt at konkludere, at test ­
stoffet er sensibiliserende, anbefales det stærkt at teste stoffet i yder ­
ligere dyr, så der i alt er tale om mindst tyve forsøgsdyr og ti 
kontroldyr.
 
1.5.1.2.3. Dosisniveauer  
Den koncentration af teststoffet, der anvendes ved hver induktions ­
eksponertng, må ikke forårsage systemiske gener og skal være den størst mulige, der forårsager mild til moderat hudirritation. Provoka ­
tionskoncentrationen skal være den størst mulige, der ikke femkalder 
hudirritation. Hvis nødvendigt kan de relevante koncentrationer bestemmes ved hjælp af en pilotundersøgelse med to eller tre dyr. Det bør overvejes at bruge FCA-behand! ede dyr til dette formål.
 
1.5.1.3. F r e m g a n g s m å d e  
1.5.1.3.1. Induktion  
Dag 0 — forsøgsgruppe  
Tre intradermale injektioner på 0,1 ml gives parvis i skulderpartiet 
— hvorfra hårlaget er fjernet — således, at hvert injektionspar består 
af en injektion på hver side af midterlinjen.  
Injektion 1: en blanding i forholdet 1:1 (volumenprocent) af FCA/ ­
vand eller fysiologisk saltopløsning.  
Injektion 2: teststoffet i et passende vehikel i den udvalgte koncen ­
tration.  
Injektion 3: teststoffet i den valgte koncentration i en blanding i 
forholdet 1:1 (volumenprocent) FCA/vand eller fysiologisk saltopløs ­
ning.  
I injektion 3 opløses vandopløselige stoffer i vandfasen før de 
blandes med FCA. Fedtopløselige eller uopløselige stoffer 
opslæmmes i FCA forud for blanding med den vandige fase. Test ­
stoffets slutkoncentration skal være den samme som i injektion 2.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Injektion 1 og 2 placeres tæt på hinanden og nærmest ved hovedet, 
mens injektion 3 placeres i den bageste del af testområdet.  
Dag 0 — kontrolgruppe  
Tre intradermale injektioner på 0,1 ml gives parvis på samme måde 
som for forsøgsdyrene.  
Injektion 1: en blanding i forholdet 1:1 (volumenprocent) FCA/vand 
eller fysiologisk saltopløsning.  
Injektion 2: det ufortyndede vehikel.  
Injektion 3: en 50 vægtprocent formulering af vehiklet i en blanding 
i forholdet 1:1 (volumenprocent) af FCA/vand eller fysiologisk saltopløsning.
 
Dag 5-7 — forsøgsgruppe og kontrolgruppe  
Hvis stoffet ikke er hudirriterende, fremkaldes der, ca. 24 timer inden 
den lokale induktionsapplikation, en lokal irritation ved behandling 
af testområdet med 0,5 ml 10 % natriumlaurylsulfat i vaseline, efter 
klipning og/eller barbering.  
Dag 6-8 — forsøgsgruppe  
Testområdet klippes. Et stykke filtrerpapir (2 × 4 cm) gennemvædes 
med teststoffet, der er blandet med et passende vehikel, og anbringes på testområdet og fastholdes med en okklusiv forbinding i 48 timer. Valget af vehikel skal begrundes. Faste stoffer pulveriseres og inkor ­
poreres i et passende vehikel. Væske kan eventuelt anvendes direkte.
 
Dag 6-8 — kontrolgruppe  
Testområdet klippes. Vehikel alene anbringes på tilsvarende måde på 
testområdet og fastholdes med en okklusiv forbinding i 48 timer.  
1.5.1.3.2. Provokation  
Dag 20-22 — forsøgs- og kontrolgruppe  
Både i forsøgsgruppen og i kontrolgruppen befries dyrenes flanke for 
hår. På forsøgsdyrenes ene side anbringes en lap eller en kapsel med teststoffet, og, hvis det er relevant, kan der også anbringes en lap 
eller en kapsel med rent vehikel på den anden side. Lapperne holdes 
i kontakt med huden i 24 timer med en okklusiv forbinding.
 
1.5.1.3.3. Observation og scoring: forsøgs- og kontrolgruppe  
— ca. 21 timer efter at lappen er fjernet, renses provokationsområdet 
og befries om nødvendigt for hår  
— ca. 3 timer senere (ca. 48 timer efter påføring af provokations ­
dosis) observeres hudens reaktion, som registreres efter den 
scoringsskala, der er vist i tillægget  
— ca. 24 timer efter denne observation foretages endnu en obser ­
vation (72 timer), som registreres.  
Blindlæsning af forsøgs- og kontroldyrene anbefales.  
Hvis det er nødvendige at uddybe resultaterne af den første provoka ­
tionseksponering, bør det overvejes at foretage endnu en provoka ­
tionseksponering (dvs. en fornyet provokation), eventuelt med en ny 
kontrolgruppe, ca. 1 uge efter den første eksponering. En fornyet 
provokation kan også foretages på den oprindelige kontrolgruppe.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Alle hudreaktioner og alle usædvanlige virkninger, herunder syste ­
miske reaktioner, af både induktions- og provokationseksponeringen 
skal observeres og registreres i henhold til Magnusson/Kligmans scoringsskala (se tillægget). Andre teknikker, f.eks. histopatologisk undersøgelse og måling af hudfortykkelse, kan benyttes til afklaring 
af tvetydige reaktioner.
 
1.5.2.  Buehlertest  
1.5.2.1. F o r b e r e d e l s e r  
Unge, sunde, kønsmodne albinomarsvin tilvænnes laboratoriebetin ­
gelserne i mindst fem dage forud for testen. Før forsøget begyndes, fordeles dyrene randomiseret i behandlingsgrupper. Behåring fjernes ved klipning, barbering eller eventuelt med kemiske midler, afhæn ­
gigt af testmetode. Huden må ikke irriteres. Dyrene vejes, inden 
forsøget påbegyndes, og ved forsøgets afslutning.
 
1.5.2.2. F o r s ø g s b e t i n g e l s e r  
1.5.2.2.1. Forsøgsdyr  
Der benyttes albinomarsvin af almindeligt anvendte stammer.  
1.5.2.2.2. Antal og køn  
Der kan anvendes handyr og/eller hundyr. Hvis der benyttes hundyr, 
må de ikke have født, og de må ikke være drægtige.  
Forsøgsgruppen skal bestå af mindst 20 dyr og kontrolgruppen af 
mindst 10 dyr.  
1.5.2.2.3. Dosisniveauer  
Der vælges en så høj koncentration af teststoffet for hver induktions ­
eksponering, at der fremkaldes en mild, men ikke overdreven irrita ­
tion. Provokationskoncentrationen bør være den størst mulige, der 
ikke fremkalder irritation. Hvis nødvendigt kan de relevante koncen ­
trationer bestemmes ved hjælp af en pilotundersøgelse med to eller tre dyr.
 
For vandopløselige teststoffer kan der som vehikel bruges vand eller 
en fortyndet, ikke-irriterende opløsning af et overfladeaktivt stof. For 
andre teststoffer foretrækkes 80 % ethanol/vand til induktionseks ­
ponering og acetone til provokationseksponering.  
1.5.2.3. F r e m g a n g s m å d e  
1.5.2.3.1. Induktion  
Dag 0 — forsøgsgruppe  
Dyrene befries for hår (klippes tæt) på den ene flanke. Testlappesy ­
stemet skal være gennemvædet med teststoffet i et egnet vehikel (valg af vehikel skal begrundes; væsker kan eventuelt anvendes direkte).
 
Testlappesystemet anbringes på testområdet og fastholdes i kontakt 
med huden med en okklusiv lap eller kapsel og en passende forbin ­
ding i seks timer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Testlappesystemet skal være okklusivt. Et stykke gaze er passende: 
det kan være rundt eller firkantet, af en størrelse på ca. 4-6 cm  2 . For 
at sikre okklusion foretrækkes det, at dyrenes bevægelsesfrihed begrænses med passende midler. Hvis der anvendes bandage, kan yderligere eksponering være nødvendig.
 
Dag 0 — kontrolgruppe  
Dyrene befries for hår (klippes tæt) på den ene flanke. Vehiklet alene 
anbringes på testområdet på tilsvarende måde som for forsøgsgrup ­
pen. Testlappesystemet fastholdes i kontakt med huden med en 
okklusiv lap eller kapsel og en passende forbinding i seks timer. Hvis det kan påvises, at der ikke er behov for en placebo-kontrol ­
gruppe, kan en ikke forud testet kontrolgruppe (naive control group) 
bruges.
 
Dag 6-8 og 13-15 — forsøgs- og kontrolgruppen  
På dag 6-8 og igen på dag 13-15 foretages samme påføring som på 
dag 0 på samme testområde (om nødvendigt befriet for hår).  
1.5.2.3.2. Provokation  
Dag 27-29 — forsøgs- og kontrolgruppe  
Både i forsøgsgruppen og i kontrolgruppen befries dyrene for hår 
(klippes tæt) på den anden flanke. Bagest på flanken på forsøgs- og 
kontroldyrene anbringes en okklusiv lap eller kapsel med en passende mængde teststof i den højest mulige koncentration, der ikke fremkalder irritation.
 
Hvis det er relevant, anbringes desuden en okklusiv lap eller kapsel 
med vehikel alene forrest på flanken på såvel forsøgs- som kontrol ­
dyr. Lapper og kapsler fastholdes i kontakt med huden med en passende forbinding i seks timer.
 
1.5.2.3.3. Observation og scoring  
— ca. 21 timer efter at lappen er fjernet, befries provokations ­
området for hår  
— ca. tre timer senere (ca. 30 timer efter påføring af provokations ­
lap) observeres hudens reaktion, og denne registreres i henhold 
til den scoringsskala, der er vist i tillægget  
— ca. 24 timer efter observationen efter 30 timer (dvs. 54 timer 
efter påføring af provokationslap) observeres hudens reaktioner igen og registreres.
 
Blindlæsning af forsøgs- og kontroldyrene anbefales.  
Hvis det er nødvendigt at uddybe resultaterne af den første provoka ­
tionseksponering, bør det overvejes at foretage endnu en provoka ­
tionseksponering (dvs. en fornyet provokation), eventuelt med en ny 
kontrolgruppe, ca. en uge efter den første eksponering. En fornyet 
provokation kan også foretages på den oprindelige kontrolgruppe.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Alle hudreaktioner og alle usædvanlige virkninger, herunder syste ­
miske reaktioner, af både induktions- og provokationseksponeringen 
skal observeres og registreres i henhold til Magnussen/Kligmans scoringsskala (se tillægget). Andre teknikker, f.eks. histopatologisk undersøgelse og måling af hudfortykkelse, kan benyttes til afklaring 
af tvetydige reaktioner.
 
2. DATA (GPMT og Buehlertest)  
Data opstilles i tabelform, som angiver hudens reaktion ved hver 
enkelt observation af hver enkelt dyr.  
3. RAPPORTERING (GPMT og Buehlertest)  
Hvis der udføres en screeningtest inden marsvinetesten, skal der 
sammen med de resultater, der er opnået med test- og reference ­
stofferne, gives en beskrivelse af eller henvisning til testen (f.eks. Mouse Ear Swelling Test (MEST)), herunder oplysninger om frem ­
gangsmåde.
 
Forsøgsrapport (GPMT og Buehlertest)  
Forsøgsrapporten skal om muligt indholde følgende oplysninger:  
Forsøgsdyr:  
— anvendt marsvinestamme  
— dyrenes antal, alder og køn  
— herkomst, laboratoriemiljø, foder osv.  
— hver enkelt dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  
Forsøgsbetingelser:  
— metode til forberedelse af stedet for anbringelse af lap  
— oplysninger om anvendte lapmaterialer og metode til anbringelse 
af lapper  
— resultat af forundersøgelse med konklusioner om de induktions- 
og provokationskoncentrationer, der skal anvendes i testen  
— oplysninger om teststoffets tilberedning, påføring og fjernelse  
— begrundelse for valg af vehikel  
— de vehikel- og teststofkoncentrationer, der er anvendt til induk ­
tions- og provokationseksponering, og den samlede mængde stof, 
der er anvendt til induktion og provokation.  
Resultater:  
— resumé af resultaterne af den seneste følsomheds- og pålidelig ­
hedskontrol (jf. 1.3), herunder oplysninger om anvendt stof, 
koncentration og vehikel  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— oplysninger om observationerne af hver enkelt dyr, herunder 
scoringssystem  
— beskrivende redegørelse for de observerede virkningers art og 
styrke  
— eventuelle histopatologiske fund.  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
Denne metode svarer til TG 406 fra OECD.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Tillæg  
TABEL  
Magnusson/Kligmans scoringsskala til vurdering af reaktionerne på 
provokationslappetest  
0 = ingen synlig forandring  
1 = afgrænset eller pletvis erytem  
2 = moderat og sammenflydende erytem  
3 = kraftigt erytem og hævelse.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, ORAL) 
HOS GNAVERE  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline 407 (2008). Den oprinde ­
lige Test Guideline 407 blev vedtaget i 1981. I 1995 blev en revideret 
udgave vedtaget med henblik på at indhente flere informationer fra de 
anvendte forsøgsdyr, navnlig om neurotoksicitet og immunotoksicitet.  
2. I 1998 indledte OECD en højtprioriteret aktivitet, der havde til formål at 
revidere de eksisterende Test Guidelines og udvikle nye Test Guidelines for 
screening og test af potentielle hormonforstyrrende stoffer (8). Et element af 
denne aktivitet var at opdatere de eksisterende OECD-retningslinjer for »toksicitet ved gentagen dosering (28 dage, oral) hos gnavere« (TG 407) med parametre, der kunne bruges til at påvise testkemikaliers hormonfor ­
styrrende aktiviteter. Denne fremgangsmåde blev underkastet et omfattende 
internationalt program, som omfattede test af relevansen og anvendeligheden af de yderligere parametre, disse parametres effektivitet for kemikalier med (anti)østrogen, (anti)androgen og (anti)thyreoid aktivitet samt reproducer ­
barhed inden for og mellem laboratorier og de nye parametres interferens 
med de parametre, der krævedes i henhold til den tidligere TG 407. Den store datamængde, der blev indhentet herved, er samlet og evalueret i detaljer i en omfattende OECD-rapport (9). Denne opdaterede testmetode 
B.7 (svarende til TG 407) er resultatet af de erfaringer og resultater, der er 
opnået i løbet af det internationale testprogram. Denne testmetode gør det muligt at placere visse virkninger fremkaldt af hormonforstyrrende stoffer i sammenhæng med andre toksiske virkninger.
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER  
3. Efter at en akut toksicitetstest er udført med henblik på primær vurdering af 
et kemisk stofs toksicitet, kan man udføre en oral toksicitetstest, hvor man anvender gentagne doser til bestemmelse og evaluering af stoffets toksiske egenskaber. Denne testmetode har til formål at undersøge virkningerne på en 
meget bred vifte af potentielle mål for toksicitet. Den skaffer viden om 
mulige trusler mod sundheden, som kan opstå ved gentagen eksponering i en relativt begrænset periode, herunder virkninger på nervesystemet, immun ­
systemet og det endokrine system. Med hensyn til disse effektparametre 
tager metoden sigte på at identificere kemikalier med neurotoksisk poten ­
tiale, som i givet fald bør undersøges nøjere, og kemikalier, der påvirker skjoldbruskkirtlens fysiologi. Den kan også tilvejebringe data om kemika ­
lier, der påvirker mandlige og/eller kvindelige kønsorganer hos unge voksne 
dyr, og kan give en indikation af de immunologiske effekter.
 
4. Resultaterne af denne testmetode B.7 bør anvendes til fareidentifikation og 
risikovurdering. De resultater, der fås ved hjælp af de endokrinrelaterede parametre, bør ses i sammenhæng med »OECD Conceptual Framework for 
Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals« (11). Metoden 
omfatter det grundlæggende forsøg vedrørende toksicitet ved gentagen dose ­
ring, der kan bruges til kemikalier, for hvilke et 90-dages forsøg ikke er berettiget (f.eks. når produktionsmængden ikke overstiger visse grænser), 
eller som et forforsøg forud for et langtidsforsøg. Eksponeringsvarigheden 
bør være 28 dage.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Det internationale program, der blev gennemført med henblik på at validere 
parametre, der kan bruges til at påvise et testkemikalies potentielle hormon ­
forstyrrende aktivitet, viste, at kvaliteten af de data, der indhentes ved hjælp af denne testmetode B.7, i høj grad afhænger af testlaboratoriets erfaring. Dette gælder specifikt for den histopatologiske bestemmelse af cykliske 
forandringer i de kvindelige kønsorganer og for bestemmelsen af vægten 
af de små hormonafhængige organer, der er vanskelige at dissekere. Der er udarbejdet vejledning om histopatologi (19). Den findes på OECD's offent ­
lige websted for »Test Guidelines«. Den har til formål at hjælpe patologer i 
deres undersøgelser og øge testens sensitivitet. En lang række parametre 
blev vurderet at være indikative for endokrinrelateret toksicitet og er medtaget i testmetoden. Parametre, for hvilke der ikke forelå tilstrækkelige data til at påvise anvendelighed, eller som kun gav svage beviser i valide ­
ringsprogrammet på deres evne til at hjælpe med at påvise hormonforstyr ­
rende stoffer, foreslås som valgfrie effektparametre (se tillæg 2).
 
6. På grundlag af data genereret i valideringsprocessen skal det understreges, at 
testens sensitivitet ikke er tilstrækkelig til at identificere alle stoffer med 
(anti)androgene eller (anti)østrogene virkemåder (9). Testen anvendes ikke i en livsfase, der er mest sensitiv over for hormonforstyrrelser. Ved hjælp af testmetoden blev der dog i løbet af valideringsprocesserne identificeret stof ­
fer, som svagt og stærkt påvirker skjoldbruskkirtlens funktion, og stærkt og 
moderat hormonforstyrrende stoffer, der virker gennem østrogene eller androgene receptorer, men i de fleste tilfælde blev der ikke identificeret hormonforstyrrende stoffer, som svagt påvirker østrogene eller androgene 
receptorer. Den kan derfor ikke beskrives som en test til screening af 
hormonforstyrrende aktivitet.
 
7. Manglen på virkninger med tilknytning til disse virkemåder kan derfor ikke 
antages at være bevis for manglende virkning på det endokrine system. 
Hvad angår virkninger fremkaldt af hormonforstyrrende stoffer, bør stofka ­
rakterisering derfor ikke alene baseres på resultaterne af denne testmetode, men bør anvendes i en »weight of evidence«-tilgang, der bruger alle eksi ­
sterende data om et kemikalie til at karakterisere potentiel hormonforstyr ­
rende aktivitet. Myndigheders afgørelser vedrørende hormonforstyrrende aktivitet (stofkarakterisering) bør derfor baseres på en bred tilgang og ikke alene resultaterne af anvendelsen af denne testmetode.
 
8. Det anerkendes, at alle dyreforsøg skal overholde lokale standarder for 
dyrepleje. De anførte beskrivelser af pleje og behandling er minimumsstan ­
darder og tilsidesættes af evt. strengere lokale bestemmelser. Nærmere 
anvisninger i human behandling af dyr findes i OECD (14).  
9. De anvendte definitioner er anført i tillæg 1.  
TESTENS PRINCIP  
10. Testkemikaliet administreres oralt dagligt i forskellige doser til forskellige 
grupper af forsøgsdyr, idet hver gruppe får en bestemt dosis i en periode på 
28 dage. I eksponeringsperioden observeres dyrene hver dag omhyggeligt 
for tegn på toksicitet. Dyr, der dør eller aflives under forsøget, obduceres, og de overlevende dyr aflives og obduceres ved forsøgets afslutning. Et 28- dages forsøg tilvejebringer informationer om virkningerne af gentagen oral 
eksponering og kan angive behovet for yderligere forsøg med længere 
varighed. Det kan også give informationer om, hvilke koncentrationer der
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
skal vælges til forsøg med længere varighed. Data, der udledes ved hjælp af 
testmetoden, bør kunne anvendes til at karakterisere testkemikaliets toksici ­
tet, indikere dosis-responsforholdet og bestemme det laveste dosisniveau (NOAEL).
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
11. Rotten er den foretrukne gnaverart, selv om andre gnaverarter kan anvendes. 
Hvis de parametre, der er anført i denne testmetode B.7, undersøges hos andre gnaverarter, gives en detaljeret begrundelse. Selv om det er biologisk 
plausibelt, at andre arter reagerer på giftstoffer på næsten samme måde som 
rotter, kan brugen af mindre arter resultere i øget variabilitet som følge af de tekniske udfordringer, der er forbundet med dissekering af små organer. I det internationale valideringsprogram til påvisning af hormonforstyrrende 
stoffer var rotter den eneste anvendte art. Der anvendes unge raske dyr af 
sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. Doseringen bør begynde snarest muligt efter fravænning, og i hvert fald før dyrene er ni uger gamle. Ved forsøgets 
begyndelse bør den indbyrdes vægtforskel være minimal og ikke overstige 
± 20 % af gennemsnittet for hvert køn. Hvis et forsøg med gentagen oral dosis gennemføres som et forforsøg forud for et langtidsforsøg, bør der så 
vidt muligt anvendes dyr fra samme stamme og herkomst i begge forsøg.
 
Opbevaring og fodring  
12. Alle fremgangsmåder skal overholde lokale standarder for pleje af forsøgs ­
dyr. Temperaturen i forsøgslokalet skal være 22  o C (± 3  o C). Den relative 
luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke være over 70 %, hvilket dog ikke gælder under rengøring af lokalet, men 50-60 % bør tilstræbes. 
Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. 
Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. Ved valg af foder kan der tages hensyn til nødvendigheden 
af at sikre passende iblanding af testkemikaliet, når denne administrations ­
måde anvendes. Dyrene bør anbringes i bure med små grupper af samme køn. Dyrene kan anbringes enkeltvis, hvis det er videnskabeligt begrundet. Hvis flere dyr anbringes i samme bur, bør der højst være fem dyr pr. bur.
 
13. Foderet analyseres regelmæssigt for forurenende stoffer. En prøve af foderet 
opbevares, indtil rapporten er udarbejdet.  
Forberedelse af dyrene  
14. Der udvælges tilfældigt sunde unge voksne dyr til kontrol- og behandlings ­
gruppen. Burene bør anbringes på en sådan måde, at deres placering får 
mindst mulig indvirkning. Dyrene identificeres entydigt og holdes i deres bure i mindst fem dage, inden behandlingsforsøget påbegyndes, så de tilvænnes laboratorieforholdene.
 
Fremstilling af doser  
15. Testkemikaliet indgives gennem sonde eller i føden eller drikkevandet. Den 
orale administrationsmetode afhænger af forsøgets formål og testkemikaliets 
fysiske/kemiske/toksikokinetiske egenskaber.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Om nødvendigt opløses eller opslæmmes testkemikaliet i et egnet vehikel. 
Det anbefales, at man som første valg vurderer muligheden af at benytte en 
vandig opløsning/suspension, derefter en opløsning/suspension i olie (f.eks. majsolie), og først derefter eventuel opløsning i andre vehikler. For andre midler end vand bør de toksiske egenskaber kendes. Testkemikaliets 
stabilitet i vehiklet skal bestemmes.
 
FREMGANGSMÅDE  
Dyrenes antal og køn  
17. Der anvendes mindst 10 dyr (5 hunner og 5 hanner) ved hvert dosisniveau. 
Hvis der påregnes aflivning af dyr under forsøget, bør det oprindelige antal 
forøges med det antal dyr, man påregner at aflive i løbet af forsøget. Det kan overvejes at udsætte en yderligere satellitgruppe på 10 dyr (5 af hvert køn) i kontrolgruppen og i gruppen med den højeste dosis, således at man 
kan observere evt. reversibilitet, persistens eller forsinket indtræden af toksi ­
citet i mindst 14 dage efter behandlingen.
 
Dosering  
18. Generelt skal der anvendes mindst tre testgrupper og en kontrolgruppe, men 
hvis andre data ikke giver anledning til at forvente virkning af en dosis på 1 000 mg/kg kropsvægt/dag, kan en grænsetest udføres. Foreligger der ikke 
passende data, kan der udføres et dosisbestemmende forsøg (»range 
finding«) (dyr af samme stamme og herkomst) til bestemmelse af de doser, der skal anvendes. Bortset fra behandling med testkemikaliet skal dyrene i kontrolgruppen håndteres på samme måde som dyrene i testgrup ­
perne. Hvis der anvendes et vehikel, doseres kontrolgruppen med samme 
mængde vehikel som den gruppe, der modtager den højeste dosis.
 
19. Dosisniveauerne udvælges under hensyntagen til eventuelle foreliggende 
data om testkemikaliet eller beslægtede kemikaliers toksicitet og (toksiko)ki ­
netik. Den højeste dosis vælges med henblik på fremkaldelse af toksiske effekter, men ikke død eller alvorlig lidelse. Normalt vælges en faldende række dosisniveauer til påvisning af eventuelt dosisafhængigt respons og 
niveau, hvor skadelige effekter ikke kan observeres ved det laveste 
dosisniveau (NOAEL). Det optimale interval mellem to doser er ofte en faktor på 2-4, og tilføjelse af en fjerde forsøgsgruppe er ofte at foretrække frem for anvendelse af meget store intervaller (f.eks. mere end en faktor på 
10) mellem dosisniveauerne.
 
20. Hvis der observeres generel toksicitet (f.eks. reduceret kropsvægt, virkninger 
på lever, hjerte, lunger eller nyrer osv.) eller andre forandringer, der even ­
tuelt ikke er toksiske virkninger (f.eks. reduceret indtagelse af føde eller 
forstørret lever), bør de observerede virkninger på de immonologiske, neuro ­
logiske eller endokrine effektparametre fortolkes med forsigtighed.  
Grænsetest  
21. Hvis en test med et dosisniveau på mindst 1 000 mg/kg kropsvægt/dag eller, 
ved administration gennem foder eller drikkevand, en tilsvarende procentdel i foderet eller drikkevandet (baseret på bestemmelse af kropsvægten), udført 
efter nedenstående fremgangsmåde, ikke fremkalder erkendbare toksiske 
virkninger, og hvis der ikke på grundlag af data fra strukturelt beslægtede stoffer kan ventes toksiske virkninger, kan et fuldstændigt forsøg med anvendelse af tre dosisniveauer betragtes som unødvendigt. Grænsetesten 
er kun relevant, hvis human eksponering indicerer, at der er behov for 
anvendelse af et højere dosisniveau.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Administration af doser  
22. Dyrene får testkemikaliet syv gange ugentlig hver uge i 28 dage. Hvis 
testkemikaliet indgives med sonde, skal det gøres i en enkelt dosis, med anvendelse af en mavesonde eller et passende intubationsrør. Den maksi ­
male væskemængde, som kan administreres ad gangen, afhænger af forsøgs ­
dyrets størrelse. Dette volumen må højst være 1 ml/100 g kropsvægt, bortset fra vandige opløsninger, af hvilke der kan anvendes 2 ml/100 g kropsvægt. Bortset fra lokalirriterende eller ætsende stoffer, hvis effekt sædvanligvis 
forstærkes ved højere koncentration, skal variation af testvolumenet mini ­
meres ved at justere koncentrationen, så volumenet er konstant ved alle dosisniveauer.
 
23. For testkemikalier, som administreres i foderet eller drikkevandet, er det 
vigtigt at sikre, at det pågældende testkemikalie i den anvendte mængde 
ikke griber ind i den normale ernærings- eller vandbalance. Ved admini ­
stration af testkemikaliet i foderet kan det enten gives ved konstant koncen ­
tration i foderet (ppm) eller ved et konstant dosisniveau i forhold til dyrets 
kropsvægt; den anvendte mulighed skal specificeres. Ved administration 
med sonde skal dosis gives på tilsvarende tidspunkt hver dag og efter behov justeres, så dosisniveauet holdes konstant i forhold til kropsvægten. Hvis et forsøg med gentagen dosis anvendes som et forforsøg forud for et 
langtidsforsøg, bør foderet være det samme i begge forsøg.
 
Observationer  
24. Observationsperioden varer 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til 
opfølgningsobservationer holdes i mindst 14 dage uden indgift af testkemi ­
kalie, således at det kan registreres, om der er forsinkede, vedvarende eller 
reversible toksiske virkninger.  
25. Der foretages generelle kliniske observationer mindst én gang om dagen, om 
muligt på det eller de samme tidspunkter hver dag og under hensyntagen til, hvornår de forventede virkninger efter dosering er stærkest. Dyrenes sund ­
hedstilstand registreres. Dyrene observeres for morbiditet og mortalitet 
mindst to gange om dagen.
 
26. Én gang før den første eksponering (med henblik på individbaserede 
sammenligninger) og mindst én gang om ugen derefter foretages der indgå ­
ende kliniske observationer af alle dyrene. Med henblik på disse observa ­
tioner tages dyrene ud af deres egne bure og anbringes i et standardinde ­
lukke. Observationerne udføres om muligt på samme tidspunkt hver gang. De skal noteres omhyggeligt, fortrinsvis ved anvendelse af et scorings ­
system, eksplicit defineret af testlaboratoriet. Det er vigtigt at sikre, at test ­
betingelserne varierer minimalt, og at observationerne om muligt foretages 
af observatører, der ikke har kendskab til behandlingen. Observationerne bør bl.a. omfatte ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion, ekskretion og autonom aktivitet (f.eks. tåreflod, strittende hårlag, pupilstør ­
relse, usædvanligt respirationsmønster). Forandringer i gang, stilling og 
respons på håndtering såvel som tilstedeværelse af toniske og kloniske bevægelser, stereotypi (f.eks. overdreven pudsning, repetitive cirkelbevægel ­
ser) eller bizar opførsel (f.eks. selvmutilation, baglæns gang) skal også 
noteres (2).
 
27. I den fjerde eksponeringsuge vurderes reaktiviteten over for sensoriske 
stimuli af forskellig art (2) (f.eks. auditive, visuelle og proprioceptive stimuli) (3) (4) (5), gribestyrke og motorisk aktivitet (7). Nærmere oplys ­
ninger om de fremgangsmåder, der kan benyttes, findes i de respektive 
referencer. Andre alternative fremgangsmåder end de refererede kan imid ­
lertid anvendes.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Funktionelle observationer i den fjerde eksponeringsuge kan udelades, hvis 
forsøget gennemføres som et forforsøg til et efterfølgende forsøg vedrørende 
subkronisk toksicitet (90 dage). I så fald medtages de funktionelle observa ­
tioner i det opfølgende forsøg. På den anden side kan data vedrørende funktionelle observationer fra forsøget med gentagen dosis lette valget af 
dosisniveauer for et efterfølgende forsøg vedrørende subkronisk toksicitet.
 
29. Undtagelsesvis kan funktionsundersøgelser udelades på grupper, der på 
anden vis viser tegn på toksicitet i en grad, der vil have afgørende indfly ­
delse på funktionsundersøgelserne.  
30. Ved obduktion kan brunstcyklus for alle hundyr bestemmes (frivilligt) ved 
at tage vaginalt smear. Disse observationer skaffer viden om brunstcyklus ­
fasen på aflivningstidspunktet og bidrager til den histologiske evaluering af østrogenfølsomt væv [se vejledning om histopatologi (19)].
 
Kropsvægt og foder-/vandindtagelse  
31. Alle dyr skal vejes mindst én gang ugentlig. Mængden af foderindtagelse 
skal beregnes mindst én gang ugentlig. Hvis testkemikaliet administreres via drikkevandet, skal vandindtagelsen beregnes mindst én gang ugentlig.
 
Hæmatologisk undersøgelse  
32. Følgende hæmatologiske undersøgelser foretages ved forsøgsperiodens 
afslutning: hæmatokrit, hæmoglobinkoncentration, erythrocyttælling, retiku ­
locyttælling, total og differential leucocyttælling, blodpladetælling og en 
måling af koaguleringsevne/tid. Andre analyser, som bør udføres, hvis test ­
kemikaliet eller dets putative metabolitter har eller mistænkes at have oxide ­
rende egenskaber, omfatter methæmoglobinkoncentration og Heinz-legemer.  
33. Der tages blodprøver fra et bestemt, angivet sted, lige inden eller i forbin ­
delse med aflivning af dyrene; prøverne opbevares under passende betingel ­
ser. Dyrene skal være fastende inden aflivning (  1 ). 
Klinisk biokemi  
34. Klinisk-biokemiske bestemmelser med henblik på undersøgelse af vigtige 
toksiske virkninger i væv, og navnlig i nyrer og lever, foretages med blod ­
prøver, der udtages fra alle dyr lige inden eller i forbindelse med dyrenes 
aflivning (bortset fra dem, der er fundet døende, og/eller som er aflivet 
under forsøget). Undersøgelser af plasma eller serum skal omfatte natrium, kalium, glukose, total kolesterol, urinstof, kreatinin, total protein og albu ­
min, mindst to enzymer, hvis forekomst kan være tegn på hepatocellulære 
effekter (f.eks. alanin-aminotransferase, aspartat-aminotransferase, alkalisk fosfatase, γ-glutamyltranspeptidase og glutamat-dehydrogenase), og galdesy ­
rer. Målinger af yderligere enzymer (fra lever eller andre organer) og bili ­
rubin kan under visse omstændigheder give nyttige oplysninger.
 
35. Følgende urinanalyser kan eventuelt udføres i forsøgets sidste uge til 
bestemmelse af: udseende, volumen, osmolalitet eller specifik vægtfylde, 
pH, protein, glukose og blod/blodceller.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Til en del analyser på serum og plasma, mest udtalt for glukose, foretrækkes fastende 
blodprøver. Hovedårsagen er den øgede variation, som uundgåeligt følger ikke-faste, og 
som vil kunne maskere små effekter og derved gøre tolkningen vanskelig. På den anden 
side vil faste kunne influere på dyrenes almindelige stofskifte, specielt i forsøg, hvor 
foderindtagelse står centralt, og derved forstyrre den daglige belastning med testkemika ­
liet. Hvis der benyttes faste, bør analyserne udføres efter de funktionelle observationer i 
forsøgets fjerde uge.
 36. Yderligere bør man overveje at måle plasma- eller serummarkører for 
generel vævsskade. Andre bestemmelser, der bør foretages, hvis testkemi ­
kaliets kendte egenskaber kan eller forventes at kunne indvirke på tilsva ­
rende metaboliske funktioner, omfatter kalcium, fosfat, triglycerider, visse hormoner og cholinesterase. Disse bør måles i forbindelse med kemikalier af 
særlige typer eller fra tilfælde til tilfælde.
 
37. Selv om der i den internationale evaluering af de endokrinrelaterede effekt ­
parametre ikke blev påvist en klar fordel med henblik på bestemmelse af 
thyreoideahormoner (T3 og T4) og TSH, kan det være nyttigt at opbevare plasma- eller serumprøver for at måle T3, T4 og TSH (frivillig), hvis der er tegn på en virkning på hypofyse-thyroidea-aksen. Disse prøver kan opbe ­
vares nedfrosne ved – 20 °C. Følgende faktorer kan påvirke variabiliteten og 
de absolutte koncentrationer af hormonanalyserne:
 
— aflivningstidspunkt på grund af variation i hormonkoncentrationer i løbet 
af døgnet  
— aflivningsmetode, der har til formål at undgå unødig stress af dyrene, 
som kan påvirke hormonkoncentrationerne  
— analysesæt til hormonanalyser, der kan have forskellige standardkurver.  
Definitiv identifikation af thyroidea-aktive kemikalier baseret på histopato ­
logisk analyse er mere pålidelig end analyse baseret på hormonniveauer.  
38. Plasmaprøver, der specifikt er beregnet til hormonanalyse, tages på et tilsva ­
rende tidspunkt på dagen. Det anbefales, at T3-, T4- og TSH-analyser over ­
vejes i tilfælde af ændringer af histologi for thyroidea. De numeriske værdier, der fås ved analyse af hormonkoncentrationer, varierer ved anven ­
delse af forskellige analysesæt på markedet. Det betyder, at der muligvis 
ikke kan opstilles effektivitetskriterier baseret på ensartede historiske data. 
Alternativet bør laboratorierne tilstræbe at holde variationskoefficienterne til kontrol under 25 for T3 og T4 og under 35 for TSH. Alle koncentrationer registreres i ng/ml.
 
39. Hvis der ikke foreligger passende data fra tidligere forsøg, bør det overvejes 
at bestemme hæmatologiske og klinisk-biokemiske variable, inden ekspone ­
ring påbegyndes, eller så vidt muligt hos en gruppe dyr, der ikke er med i 
forsøgsgrupperne.  
PATOLOGI  
Makroskopisk obduktion  
40. Alle dyr, som indgår i forsøget, skal have udført en fuldstændig, detaljeret 
makroskopisk obduktion, hvilket inkluderer omhyggelig undersøgelse af alle 
overflader, alle åbninger, og kraniets, brystkassens og abdomens kaviteter og 
deres indhold.  Lever, nyrer, binyrer, testikler, bitestikler, prostata og vesi ­ 
culae seminales med prostata anterior (coagulating glands) (som én samlet enhed),
 thymus, milt, hjerne og  hjerte skal på alle dyr renses for andet 
vedhængende væv som behørigt (undtaget er de dyr, der findes døende 
og/eller aflives undervejs i forsøget) og vejes snarest muligt efter dissek ­
tionen for at undgå udtørring. Forsigtighed skal udvises ved trimming af prostata for at undgå punktering af de væskefyldte vesiculae seminales. 
Alternativt kan vesiculae seminales og prostata trimmes og vejes efter fikse ­
ring.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. To andre væv kan også vejes snarest muligt efter dissektionen for at undgå 
udtørring: ovarier (vådvægt) og uterus med cervix (vejledning om udtagning 
og forberedelse af uterusvæv med henblik på vejning findes i OECD TG 440 (18)).
 
42. Skjoldbruskkirtlens vægt (frivillig) bestemmes efter fiksering. Trimming bør 
også foretages omhyggeligt og først efter fiksering for at undgå beskadigelse af vævet. Beskadiget væv kan kompromittere den histopatologiske analyse.
 
43. Følgende væv skal præserveres ved hjælp af det mest passende fikserings ­
middel både med henblik på vævstypen og den følgende histopatologiske undersøgelse (se afsnit 47): alle
 makroskopiske læsioner,  hjerne (repræsen ­
tative regioner, herunder cerebrum, cerebellum og pons),  rygmarv, øjne,  
mavesæk, tyktarm og tyndtarm (herunder Peyerpletter),  lever, nyrer, binyrer,  
milt, hjerte, thymus, skjoldbruskkirtel, spiserør og lunger (præserveret ved oppumpning med fikseringsmiddel og efterfølgende immersion),
 gonader  
(testikler og æggestokke), sekundære kønsorganer (uterus med cervix, bite ­
stikler, prostata og vesiculae seminales med prostata anterior (coagulating 
glands),  vagina, urinblære, lymfeknuder [ud over den nærmeste drænende 
lymfeknude bør en anden lymfeknude udtages på baggrund af laboratoriets erfaring (15)],
 perifer nerve (ischias- eller tibianerven), om muligt tæt på 
musklen,  skeletmuskel og  knogle med  knoglemarv (afsnit eller som alterna ­
tivt et nyligt præpareret knoglemarvsaspirat). Det anbefales, at testikler fikseres ved immersion i Bouins eller modificeret Davidsons fikserings ­
middel (16) (17). Tunica albuginea punkteres forsigtigt og overfladisk i 
begge ender af organet med en kanyle, der muliggør hurtig penetration af 
fikseringsmidlet. Kliniske og andre fund kan foranledige undersøgelse af andet væv. Også særlige organer, der sandsynligvis kan være mål for test ­
kemikaliets kendte virkninger, bør præserveres.
 
44. Følgende væv kan give værdifulde indikationer på endokrinrelaterede virk ­
ninger: gonader (testikler og æggestokke), sekundære kønsorganer (uterus 
med cervix, bitestikler, vesiculae seminales med prostata anterior (coagula ­
ting glands), dorsolateral og ventral prostata), vagina, hypofyse, brystkirtler fra handyr, skjoldbruskkirtel og binyrer. Forandringer i brystkirtler fra handyr er ikke tilstrækkeligt dokumenteret, men denne parameter kan 
være meget sensitiv over for stoffer med østrogen virkemåde. Observation 
af organer/væv, der ikke er anført i afsnit 43, er frivillig (se tillæg 2).
 
45. I vejledningen om histopatologi (19) findes der flere oplysninger om 
dissekering, fiksering, udtagning af snit og histopatologisk undersøgelse af 
endokrine væv.  
46. I det internationale testprogram blev der fremskaffet dokumentation for, at 
små hormonforstyrrende virkninger af kemikalier med ringe evne til at 
påvirke homeostase for kønshormoner kan identificeres ud fra forstyrrelse af synkroniseringen af brunstcyklussen i forskellige væv og ikke i så høj grad ud fra direkte histopatologiske forandringer i hundyrenes kønsorganer. 
Selv om der ikke blev fremskaffet definitivt bevis for sådanne virkninger, 
anbefales det, at bevis for mulig asynkronicitet i brunstcyklussen tages i betragtning ved fortolkningen af histopatologiske undersøgelser af ægge ­
stokke (follikulære celler og theca-granulosaceller), uterus, cervix og 
vagina. Cyklusfasen bestemt ved vaginalt smear kan, hvis den vurderes, 
også medtages i denne sammenligning.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatologi  
47. En komplet histopatologisk undersøgelse skal udføres af de præserverede 
organer og væv på alle dyrene i kontrol- og højdosisgrupperne. Undersø ­
gelserne skal omfatte alle dyrene i de andre grupper, også hvis der obser ­
veres ændringer i højdosisgruppen, der kan tilskrives belastningen.  
48. Alle makroskopiske læsioner undersøges.  
49. Hvis der anvendes en satellitgruppe, skal der på dyrene i denne gruppe 
udføres histopatologisk undersøgelse af væv og organer, på hvilke der var vist ændringer i behandlingsgruppen.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
50. Der skal fremlægges data for de enkelte dyr. Yderligere skal alle data 
opsummeres i tabeller, der for hver testgruppe viser antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr fundne døde i løbet af testen eller aflivede af humane grunde og tidspunktet for deres død, det antal dyr, der udviser tegn på 
toksicitet, en beskrivelse af disse tegn inklusive tidspunktet for deres begyn ­
delse, deres varighed og toksicitetsgraden; det antal dyr, der har læsioner, typen af læsioner og den procentdel af dyrene, der udviser de forskellige typer af læsion.
 
51. Når det er muligt, bedømmes resultaterne ved en egnet og almindeligt 
anerkendt statistisk metode. Sammenligninger af virkningen i et dosis ­
interval bruges til at undgå brugen af flere t-test. Valg af statistisk metode skal finde sted i forbindelse med fastlæggelsen af forsøgets design.
 
52. Med henblik på kvalitetskontrol foreslås det, at historiske kontroldata 
indsamles, og at variationskoefficienter beregnes for numeriske data, især 
for parametre med relation til bestemmelse af hormonforstyrrende effekter. 
Disse data kan bruges i forbindelse med sammenligninger, når de faktiske forsøg evalueres.
 
Testrapport  
53. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Testkemikalie:  
— fysiske egenskaber, renhedsgrad og fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikationsdata.  
For eventuelt vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.  
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte art/stamme  
— dyrenes antal, alder og køn  
— herkomst, miljøbetingelser, kost osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse  
— begrundelse for andre arter end rotte.  
Testbetingelser:  
— begrundelse for valg af dosisniveau  
— oplysninger om formuleringen af testkemikalie/fodertilberedning, opnået 
koncentration, præparatets stabilitet og homogenitet  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— oplysninger om administration af testkemikaliet  
— eventuel omregning fra testkemikaliekoncentration (ppm) i føde/drikke ­
vand til faktisk dosis (mg pr. kg kropsvægt pr. dag)  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet.  
Valgfrie undersøgte effektparametre  
— liste over valgfrie undersøgte effektparametre.  
Resultater:  
— kropsvægt og ændringer i kropsvægt  
— foderindtagelse og indtagelse af vand, om muligt  
— data vedrørende toksicitet sat over for køn og dosis, inklusive toksici ­
tetstegnene  
— art, sværhedsgrad og varighed af kliniske symptomer (hvad enten disse 
er reversible eller ikke)  
— vurdering af sanseevne, gribestyrke og motorisk aktivitet  
— hæmatologiske målinger med relevante udgangsværdier  
— klinisk-biokemiske målinger med relevante udgangsværdier  
— kropsvægt ved aflivning og organvægte  
— obduktionsfund  
— en detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund  
— data for absorption, hvis de forefindes  
— når det er hensigtsmæssigt, statistisk behandling af resultaterne.  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Androgenicitet:  et kemikalies evne til at fungere som et naturligt androgent 
hormon (f.eks. testosteron) i en pattedyrsorganisme.  
Antiandrogenicitet:  et kemikalies evne til at undertrykke virkemåden for et 
naturligt androgent hormon (f.eks. testosteron) i en pattedyrsorganisme.  
Antiøstrogenicitet:  et kemikalies evne til at undertrykke virkemåden for et 
naturligt østrogent hormon (f.eks. østradiol 17ß) i en pattedyrsorganisme.  
Antithyreoid aktivitet:  et kemikalies evne til at undertrykke virkemåden for et 
naturligt thyreoideahormon (f.eks. T  3 ) i en pattedyrsorganisme.  
Dosering:  et generelt udtryk, som indbefatter dosis, doseringens hyppighed og 
anvendelsens varighed.  
Dosis:  den mængde teststof, som indgives. Dosis angives som vægt af testkemi ­
kalie pr. enhed af forsøgsdyrets vægt pr. dag (f.eks. mg/kg kropsvægt/dag) eller 
som en konstant koncentration i foderet.  
Synlig toksicitet:  et generelt udtryk, som angiver klare tegn på toksicitet efter 
indgift af testkemikaliet. De bør være tilstrækkelige til risikovurdering og bør 
være af en sådan karakter, at en forøgelse af den indgivne dosis må forventes at 
resultere i udviklingen af svære toksiske virkninger og sandsynlig mortalitet.  
NOAEL:  forkortelsen for »no-observed-adverse-effect level« (niveau uden obser ­
verbare negative effekter), dvs. det højeste dosisniveau, hvor der ikke observeres behandlingsrelaterede negative virkninger.
 
Østrogenicitet:  et kemikalies evne til at fungere som et naturligt østrogent 
hormon (f.eks. østradiol 17ß) i en pattedyrsorganisme.  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  
Thyreoid aktivitet:  et kemikalies evne til at fungere som et naturligt thyreoi ­
deahormon (f.eks. T  3 ) i en pattedyrsorganisme.  
Validering:  en videnskabelig proces, der har til formål at karakterisere de opera ­
tionelle krav og begrænsninger vedrørende en testmetode og påvise dens pålide ­
lighed og relevans i forbindelse med et bestemt formål.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Tillæg 2  
Anbefalede effektparametre til påvisning af hormonforstyrrende stoffer i 
testmetode B.7  
Obligatoriske effektparametre Valgfrie effektparametre 
Vægt  
— Testikler 
— Bitestikler 
— Binyrer 
— Prostata og vesiculae seminales 
med prostata anterior — Æggestokke 
— Uterus med cervix 
— Skjoldbruskkirtlen  
Histopatologi  
— Gonader: 
— Testikler — Æggestokke 
— Sekundære kønsorganer: 
— Bitestikler — Prostata og vesiculae seminales 
med prostata anterior 
— Uterus med cervix 
— Binyrer — Skjoldbruskkirtlen 
— Vagina — Vaginalt smear 
— Brystkirtler fra handyr — Hypofyse
 
Hormonmåling  
— Cirkulationsniveau for T3 og T4 
— Cirkulationsniveau for TSH  
LITTERATUR:  
(1) OECD (Paris, 1992). Chairman's Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity.  
(2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
(3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.  
(5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
(6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
 
(8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 
407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No. 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
(10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods 
for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No. 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
(11) OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.htm l
 
(12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
(13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endo ­
crine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
(14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7.  
(15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404-407.  
(16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. I: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE og Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, s. 52-85.
 
(17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002) Fixation 
of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
 
(18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No.440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
(19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endo ­
crine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. SUBAKUT TOKSICITET (INHALATION): 28-DAGES FORSØG  
RESUMÉ  
Denne reviderede testmetode B.8 har til formål at tilvejebringe en fuld karakte ­
risering af testkemikaliets toksicitet ved inhalation efter gentagen eksponering i 
en begrænset periode (28 dage) og at fremskaffe data til kvantitative inhalations ­
risikovurderinger. Grupper bestående af mindst fem hangnavere og fem hungna ­
vere eksponeres i seks timer om dagen i 28 dage for a) testkemikaliet ved tre eller flere koncentrationsniveauer, b) filtreret luft (negativ kontrol) og/eller c) 
vehiklet (vehikelkontrol). Dyr eksponeres generelt fem dage om ugen, men 
eksponering i syv dage om ugen tillades også. Hanner og hunner testes altid, men de eksponeres muligvis ved forskellige koncentrationsniveauer, hvis det vides, at det ene køn er mere modtageligt for et bestemt testkemikalie. Denne 
metode giver forsøgslederen fleksibilitet til at medtage satellitgrupper (reversi ­
bilitet), bronchieskylning (BAL), neurologiske test og yderligere kliniske patolo ­
giske og histopatologiske evalueringer med henblik på at opnå en bedre karak ­
terisering af testkemikaliets toksicitet.
 
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline 412 (2009). Den oprinde ­
lige Test Guideline 412 (TG 412) for subakut toksicitet ved inhalation blev 
vedtaget i 1981 (1). Denne testmetode B.8 (som svarer til den reviderede TG 412) er blevet opdateret, så den afspejler det videnskabelige niveau og for at opfylde nuværende og fremtidige lovgivningskrav.
 
2. Denne metode gør det muligt at karakterisere negative virkninger efter 
gentagen daglig inhalationseksponering for et testkemikalie i 28 dage. Data, der udledes af 28-dages forsøg med subakut toksicitet ved inhalation, 
kan bruges til kvantitative risikovurderinger [hvis de ikke efterfølges af et 
90-dages forsøg med subkronisk toksicitet ved inhalation (kapitel B.29 i dette bilag)]. Dataene kan også give informationer om, hvilke koncentra ­
tioner der skal vælges til forsøg med længere varighed, f.eks. 90-dages 
forsøg med subakut toksicitet ved inhalation. Denne testmetode er ikke 
specifikt beregnet til test af nanomaterialer. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i slutningen af dette kapitel og i Guidance Document 39 (2).
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
3. Alle tilgængelige informationer om testkemikaliet bør overvejes af testlabo ­
ratoriet inden gennemførelsen af forsøget med henblik på at forbedre kvali ­
teten af forsøget og minimere omfanget af dyreforsøg. Informationer, der kan hjælpe med at vælge de mest hensigtsmæssige testkoncentrationer, omfatter testkemikaliets identitet, kemiske struktur og fysisk-kemiske egen ­
skaber, resultater af in vitro- eller in vivo-toksicitetstest, forventede anven ­
delser og potentialet for human eksponering, tilgængelige (Q)SAR-data og toksikologiske data vedrørende strukturelt relaterede kemikalier samt data udledt af forsøg med akut toksicitet ved inhalation. Hvis neurotoksicitet 
forventes eller observeres i løbet af forsøget, kan forsøgslederen vælge at 
inkludere relevante evalueringer, som f.eks. FOB (Functional Observational Battery) og måling af motorisk aktivitet. Selv om tidspunkterne for ekspone ­
ring kan være afgørende i forhold til de specifikke undersøgelser, må 
gennemførelsen af disse ekstra aktiviteter ikke påvirke det grundlæggende 
forsøgsdesign.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Fortyndinger af ætsende eller irriterende testkemikalier kan testes ved 
koncentrationer, der giver den ønskede toksicitetsgrad [se GD 39 (2)]. Når 
dyr eksponeres for sådanne materialer, bør målkoncentrationerne være så lave, at de ikke medfører udtalt smerte og lidelse, men de bør alligevel være tilstrækkelige til at hæve koncentrations-responskurven til et niveau, 
der opfylder testens lovgivningsmæssige eller videnskabelige formål. Disse 
koncentrationer bør vælges i det enkelte tilfælde, fortrinsvis på grundlag af målrettede dosisbestemmende forsøg (»range finding«), der giver infor ­
mation om den kritiske effektparameter, irritationstærskel og tidspunkt for 
indtræden (se afsnit 11-13). Der gives en begrundelse for valget af koncen ­
tration.
 
5. Dyr, som er døende, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og 
vedvarende lidelser, skal aflives humant. Dyr, som er døende, betragtes på samme måde som dyr, der dør i løbet i forsøget. Kriterierne for aflivning af 
døende eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller 
forestående død er genstand for en særskilt vejledning (OECD Guidance Document No. 19 on Humane Endpoints) (3).
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
6. Der anvendes raske unge gnavere af sædvanligt benyttede laboratoriestam ­
mer. Rotten er det foretrukne forsøgsdyr. Begrundelse skal anføres, hvis der anvendes andre dyrearter.
 
Forberedelse af dyrene  
7. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. På randomise ­
ringsdagen bør dyrene være unge voksne, der er mellem syv og ni uger 
gamle. Deres kropsvægt bør være inden for ± 20 % af gennemsnitsvægten 
for hvert køn. Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres, og holdes i burene i mindst fem døgn forud for forsøgets start, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne.
 
Dyreopdræt og -sundhed  
8. Dyrene identificeres individuelt med subkutane transpondere, hvis det er 
muligt, for at lette observationer og undgå forvirring. Temperaturen i 
forsøgsdyrrummet bør være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed bør være 
30-70 %, selv om det muligvis ikke er muligt, hvis vand bruges som vehi ­
kel. Før og efter eksponering bør dyr generelt holdes i bur i grupper efter køn og koncentration, men antallet af dyr pr. bur må ikke bevirke, at det er 
vanskeligt at observere de enkelte dyr, og bør minimere tab som følge af 
kannibalisme og slagsmål. Hvis dyr alene eksponeres gennem næsen, skal de muligvis tilvænnes fastspændingsslanger. Disse slanger må ikke påføre dyrene unødig fysisk, termisk eller bevægelsesmæssig belastning. Fastspæn ­
ding kan påvirke fysiologiske effektparametre, som f.eks. kropstemperatur 
(hypertermi) og/eller respiratorisk minutvolumen. Hvis der foreligger gene ­
riske data, som viser, at sådanne ændringer ikke forekommer i nævnevær ­
digt omfang, er tilvænning til fastspændingsslangerne ikke nødvendig. Dyr, 
der med hele kroppen eksponeres for en aerosol, bør holdes i individuelle 
bure under eksponeringen for at undgå, at testaerosolen filtreres gennem pelsen på de andre dyr i buret. Der kan anvendes normalt og godkendt laboratoriefoder, dog ikke under eksponering, med ubegrænset forsyning 
af drikkevand. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys 
og 12 timers mørke.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalationskamre  
9. Karakteren af testkemikaliet og formålet med testen bør overvejes ved valget 
af inhalationskammer. Den foretrukne eksponeringsform er gennem næsen (dette udtryk omfatter kun hoved, kun næse og kun snude). Eksponering 
gennem næsen foretrækkes generelt i forbindelse med test af flydende eller 
faste aerosoler og dampe, der kan kondensere og danne aerosoler. Særlige formål med testen kan bedre opfyldes ved eksponering af hele kroppen, men dette skal begrundes i testrapporten. For at sikre en stabil atmosfære, når der 
anvendes et kammer til hele kroppen, må forsøgsdyrenes totale volumen 
ikke overstige 5 % af kammerets volumen. Principperne for teknikkerne til eksponering gennem næsen eller eksponering af hele kroppen samt 
deres særlige fordele og ulemper er beskrevet i GD 39 (2).
 
TOKSICITETSFORSØG  
Grænsekoncentrationer  
10. I modsætning til forsøg med akut toksicitet er der ingen definerede græn ­
sekoncentrationer i 28-dages forsøg med subakut toksicitet ved inhalation. Den testede maksimumskoncentration baseres på: 1) den højest opnåelige 
koncentration, 2) »worst case« eksponeringsniveau for mennesker, 3) 
behovet for at sikre tilstrækkelig iltforsyning og/eller 4) hensyn til dyrevel ­
færd. Hvis der ikke foreligger databaserede grænser, kan de akutte grænser i forordning (EF) nr. 1272/2008 (13) anvendes (dvs. op til en maksimums ­
koncentration på 5 mg/l for aerosoler, 20 mg/l for dampe og 20 000 ppm for 
gasser); se GD 39 (2). Der gives en begrundelse, hvis det er nødvendigt at overskride disse grænser ved test af gasser eller meget flygtige testkemika ­
lier (f.eks. kølemidler). Grænsekoncentrationen bør fremkalde klar toksicitet 
uden at forårsage unødig stress for dyrene eller påvirke deres levetid (3).
 
Dosisbestemmende forsøg  
11. Inden hovedforsøget påbegyndes, kan det være nødvendigt at udføre et 
dosisbestemmende forsøg (»range finding«). Et dosisbestemmende forsøg 
er mere omfattende end et forforsøg, fordi det ikke er begrænset til valg af koncentration. Viden, der opnås fra et dosisbestemmende forsøg, kan resultere i et vellykket hovedforsøg. Et dosisbestemmende forsøg kan 
f.eks. fremskaffe teknisk information om analysemetoder, partikelstørrelses ­
fordeling, opdagelse af toksiske mekanismer, klinisk patologi og histopato ­
logiske data samt estimeringer af de mulige NOAEL- og MTC-koncentrationer i et hovedforsøg. Forsøgslederen kan vælge at bruge 
det dosisbestemmende forsøg til at identificere tærsklen for irritation af 
luftvejene (f.eks. ved hjælp af histopatologisk undersøgelse af luftvejene, lungefunktionstest eller bronchieskylning), den øvre koncentration, der tåles uden unødig belastning af dyrene, og de parametre, der bedst karakteriserer 
et testkemikalies toksicitet.
 
12. Et dosisbestemmende forsøg kan omfatte et eller flere koncentrations ­
niveauer. Højst tre hanner og tre hunner bør eksponeres ved hvert koncen ­
trationsniveau. Et dosisbestemmende forsøg bør vare mindst fem dage og generelt højst 14 dage. En begrundelse for valget af koncentrationer til 
hovedforsøget gives i forsøgsrapporten. Formålet med hovedforsøget er at 
påvise et forhold mellem koncentration-respons med udgangspunkt i det, der forventes at være den mest sensitive effektparameter. Den laveste koncen ­
tration bør ideelt være en NOAEL-koncentration, mens den højeste koncen ­
tration bør fremkalde klar toksicitet uden at forårsage unødig stress for 
dyrene eller påvirke deres levetid (3).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Når koncentrationerne vælges til det dosisbestemmende forsøg, anvendes 
alle tilgængelige informationer, herunder data om forholdet mellem struktur 
og aktivitet og data vedrørende lignende kemikalier (se afsnit 3). Et dosis ­
bestemmende forsøg kan bekræfte/afvise, hvad der betragtes som de mest sensitive mekanistisk baserede effektparametre, f.eks. organofosfaters 
hæmning af kolinesterasen, erythrocytotoksiske stoffers dannelse af methæ ­
moglobin, thyreoideahormoner (T
 3 , T 4 ) for thyreotoksikanter, protein, eller 
neutrofiler i bronchieskylning for uskadelige svært opløselige partikler eller lungeirriterende aerosoler.
 
Hovedforsøg  
14. Hovedforsøget vedrørende subakut toksicitet omfatter generelt tre koncen ­
trationsniveauer og også en samtidig negativ kontrolgruppe (luft) og/eller 
vehikelgruppe, hvis det er nødvendigt (se afsnit 17). Alle tilgængelige data 
bør anvendes som hjælp til at vælge hensigtsmæssige eksponeringsniveauer, herunder resultaterne af systemiske toksicitetsforsøg, metabolisme og kinetik (der bør lægges særlig vægt på at undgå høje koncentrationsniveauer, der 
mætter kinetiske processer). Hver testgruppe består af mindst 10 gnavere (5 
hanner og 5 hunner), der eksponeres for testkemikaliet i seks timer om dagen i fem dage om ugen i en periode på fire uger (samlet forsøgsvarighed på 28 dage). Dyr kan også eksponeres i syv dage om ugen (f.eks. ved test af 
inhalerede lægemidler). Hvis det vides, at det ene køn er mere modtageligt 
for et bestemt testkemikalie, kan kønnene eksponeres ved forskellige koncentrationsniveauer for at observere forholdet mellem 
koncentration-respons som beskrevet i afsnit 15. Hvis andre gnaverarter 
end rotter eksponeres gennem næsen, kan de maksimale eksponeringsvarig ­
heder justeres for at minimere artsspecifikke lidelser. Der bør gives en begrundelse, når der anvendes en eksponeringsvarighed på mindre end 6 
timer/dag, eller når det er nødvendigt at gennemføre et forsøg med langvarig 
helkropseksponering (f.eks. 22 timer/dag) [se GD 39 (2)]. Dyrene bør ikke fodres i eksponeringsperioden, medmindre eksponeringen varer længere end seks timer. Dyret skal have adgang til vand under helkropseksponering.
 
15. De valgte målkoncentrationer bør identificere målorganet (-organerne) og 
påvise et klart forhold mellem koncentration og respons:  
— Det højeste koncentrationsniveau bør medføre toksiske virkninger, men 
ikke medføre langvarige symptomer eller letalitet, som kan forhindre en meningsfuld evaluering.
 
— De mellemste koncentrationsniveauerne bør vælges med sådanne inter ­
valler, at der frembringes graduerede toksiske effekter mellem effekterne ved den laveste og den højeste koncentration.
 
— Det laveste koncentrationsniveau bør kun have ringe eller ingen toksisk 
virkning.  
Satellitforsøg (reversibilitetsforsøg)  
16. Et satellitforsøg (reversibilitetsforsøg) kan bruges til at observere reversi ­
bilitet, persistens eller forsinket indtræden af toksicitet i mindst 14 dage 
efter behandlingen. Satellitgrupper består af fem hanner og fem hunner, der eksponeres samtidig med forsøgsdyrene i hovedforsøget. Satellitforsøgs ­
grupper bør eksponeres for testkemikaliet ved det højeste koncentrations ­
niveau, og der bør efter behov være samtidige luft- og/eller vehikelkontrol ­
grupper (se afsnit 17).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Kontroldyr  
17. Dyr i den samtidige negative (luft)kontrolgruppe bør behandles på samme 
måde som forsøgsdyrene, bortset fra at de eksponeres for filtreret luft i stedet for testkemikaliet. Hvis vand eller et andet stof bruges til at frem ­
bringe testatmosfæren, skal en vehikelkontrolgruppe inkluderes i forsøget i 
stedet for en negativ (luft)kontrolgruppe. Vand bør så vidt muligt anvendes som vehikel. Når vand bruges som vehikel, eksponeres kontroldyrene for luft med samme fugtighed som de eksponerede grupper. Valget af et 
hensigtsmæssigt vehikel baseres på et korrekt gennemført forforsøg eller 
historiske data. Hvis et vehikels toksicitet ikke er velkendt, kan forsøgs ­
lederen vælge at bruge en negativ (luft)kontrol og en vehikelkontrol, men 
det frarådes på det kraftigste. Hvis historiske data viser, at vehiklet er 
ikke-toksisk, er der ikke behov for en negativ (luft)kontrolgruppe, og der anvendes kun en vehikelkontrol. Hvis et forforsøg vedrørende et testkemi ­
kalie, der er formuleret i et vehikel, ikke påviser toksicitet, følger det, at 
vehiklet er ikke-toksisk ved den testede koncentration, og at denne vehikel ­
kontrol bør anvendes.
 
EKSPONERINGSBETINGELSER  
Administration af koncentrationer  
18. Dyr eksponeres for testkemikaliet i form af en gas, dampe, aerosoler eller en 
blanding heraf. Den fysiske tilstand, der skal testes, afhænger af testkemi ­
kaliets fysisk-kemiske egenskaber, den valgte koncentration og/eller den 
fysiske form, der højst sandsynligt vil være til stede under håndteringen 
og anvendelsen af testkemikaliet. Hygroskopiske og kemisk reaktive testke ­
mikalier bør testes under tørre luftforhold. Der må ikke skabes eksplosive koncentrationer. Partikelformigt materiale kan underkastes mekaniske 
processer for at reducere partikelstørrelsen. Nærmere detaljer findes i GD 
39 (2).
 
Partikelstørrelsesfordeling  
19. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for alle aerosoler og dampe, der 
kan kondensere og danne aerosoler. For at sikre, at alle relevante områder af 
luftvejene eksponeres, anbefales aerosoler med en massemedian af den aero ­
dynamiske diameter (MMAD) i området fra 1 til 3 μm med en geometrisk 
standardafvigelse ( σ g ) i området fra 1,5 til 3,0 (4). Der bør ydes en rimelig 
indsats for at overholde denne standard, men en ekspertvurdering gives, hvis 
det ikke er muligt. Partikler fra tungmetalrøg kan f.eks. være mindre end denne standard, og ladede partikler og fibre kan overstige den.
 
Fremstilling af testkemikalie i vehikel  
20. Ideelt testes testkemikaliet uden et vehikel. Hvis det er nødvendigt at bruge 
et vehikel til at frembringe en passende koncentration og partikelstørrelse af 
testkemikaliet, bør der fortrinsvis anvendes vand. Når et testkemikalie er opløst i et vehikel, skal dets stabilitet påvises.
 
OVERVÅGNING AF EKSPONERINGSBETINGELSER  
Luftgennemstrømning i kammer  
21. Luftgennemstrømningen gennem eksponeringskammeret skal nøje kontrolle ­
res, overvåges løbende og registreres mindst én gang i timen under ekspone ­
ring. Realtidsovervågning af koncentrationen (eller den tidsmæssige stabili ­
tet) i testatmosfæren indgår i målingen af alle dynamiske parametre og giver indirekte mulighed for at kontrollere alle relevante dynamiske parametre for inhalation. Hvis koncentrationen overvåges i realtid, kan frekvensen for 
måling af luftgennemstrømning reduceres til én måling pr. eksponering pr. 
dag. Genindånding i kamre til eksponering gennem næsen skal undgås.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
Iltkoncentrationen skal være mindst 19 %, og kuldioxidkoncentrationen må 
ikke overstige 1 %. Hvis der er grund til at antage, at denne standard ikke 
kan overholdes, skal ilt- og kuldioxidkoncentrationerne måles. Hvis målinger på den første eksponeringsdag viser, at disse gasser er på passende niveauer, kræves der ikke yderligere målinger.
 
Kammerets temperatur og relative fugtighed  
22. Kammerets temperatur skal være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed i 
dyrenes vejrtrækningszone skal ved eksponering gennem næsen og 
helkropseksponering overvåges og registreres hver time under eksponering, hvis det er muligt. Den relative fugtighed bør være 30-70 %, men dette er ikke altid muligt (f.eks. ved test af vandbaserede blandinger) eller kan ikke 
måles på grund af testkemikaliets indvirkning på testmetoden.
 
Testkemikalie: nominel koncentration  
23. Når det er muligt, bør den nominelle eksponeringskoncentration i kammeret 
beregnes og registreres. Den nominelle koncentration er massen af det gene ­
rerede testkemikalie divideret med den samlede mængde luft, der passerer gennem inhalationskammersystemet. Den nominelle koncentration bruges 
ikke til at karakterisere dyrenes eksponering, men en sammenligning af 
den nominelle koncentration og den faktiske koncentration giver en indika ­
tion af testsystemets genereringseffektivitet og kan derfor bruges til at opdage eventuelle genereringsproblemer.
 
Testkemikalie: faktisk koncentration  
24. Den faktiske koncentration er koncentrationen af testkemikaliet målt ved 
dyrenes vejrtrækningszone i et inhalationskammer. Faktiske koncentrationer kan bestemmes med specifikke metoder (f.eks. direkte prøveudtagning, adsorptive eller kemisk reaktive metoder og efterfølgende analytisk karak ­
terisering) eller med ikke-specifikke metoder, som f.eks. gravimetrisk filter ­
analyse. Brugen af gravimetrisk analyse er kun acceptabel for pulverbase ­
rede enkeltkomponent-aerosoler eller aerosoler af væsker med lav flygtighed og bør støttes af hensigtsmæssige testkemikaliespecifikke karakteriseringer 
udført før testen. Koncentrationen af pulverbaserede flerkomponent-aero ­
soler kan også bestemmes ved hjælp af gravimetrisk analyse. Det kræver dog analysedata, der viser, at det luftbårne materiales sammensætning svarer til udgangsmaterialet. Hvis denne information ikke er tilgængelig, kan det 
være nødvendigt at gentage analysen af testkemikaliet (ideelt i dets luftbårne 
tilstand) med regelmæssige intervaller i løbet af forsøget. For aerosoliserede stoffer, der kan fordampe eller sublimere, bør det påvises, at alle faser er indsamlet ved hjælp af den valgte metode.
 
25. Der anvendes så vidt muligt én batch af testkemikaliet i hele forsøgets 
varighed, og prøven opbevares under forhold, der bevarer dens renhed, homogenitet og stabilitet. Inden forsøget påbegyndes, bør testkemikaliet karakteriseres, herunder dets renhed og, hvis det er teknisk muligt, identitet 
og mængde af identificerede kontaminanter og urenheder. Dette kan påvises 
ved hjælp af bl.a. følgende data: retentionstid og relativt topareal, molekyl ­
vægt fra massespektroskopi- eller gaskromatografianalyser eller andre vurde ­
ringer. Selv om testlaboratoriet ikke er ansvarligt for prøvens identitet, bør 
testlaboratoriet af hensyn til sikkerheden bekræfte rekvirentens karakterise ­
ring i hvert fald på en begrænset måde (f.eks. farve, fysisk form osv.).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Eksponeringsatmosfæren skal være så konstant som praktisk muligt. Appa ­
ratur til realtidsovervågning, f.eks. et aerosolfotometer til måling af aerosoler 
eller en kulbrinteanalysator til dampe, kan bruges til at påvise eksponerings ­
betingelsernes stabilitet. Den faktiske koncentration i kammeret måles mindst tre gange i løbet af hver eksponeringsdag for hvert eksponerings ­
niveau. Hvis det ikke er muligt på grund af begrænsede luftgennemstrøm ­
ningshastigheder eller lave koncentrationer, kan én prøve pr. eksponerings ­
periode accepteres. Ideelt udtages denne prøve over hele eksponeringsperio ­
den. De enkelte prøver for koncentrationen i kammeret bør ikke afvige fra 
middelkoncentrationen i kammeret med mere end ± 10 % for gasser og 
dampe eller ± 20 % for flydende eller faste aerosoler. Tiden til ækvilibrering af kammer (t
 95 ) beregnes og registreres. Varigheden af en eksponering 
strækker sig over den tid, hvor testkemikaliet genereres. Det omfatter den 
tid, der kræves for at opnå ækvilibrering af kammeret (t  95 ) og henfald. 
Vejledning i beregning af t  95 findes i GD 39 (2).  
27. For meget komplekse blandinger, der består af gasser/dampe, og aerosoler 
(f.eks. forbrændingsatmosfærer og testkemikalier genereret af specialdrevne slutprodukter/-apparater), kan hver fase opføre sig forskelligt i et inhala ­
tionskammer. Der udvælges derfor mindst ét indikatorstof (analysand), 
normalt det primære aktivstof i blandingen, fra hver fase (gas/damp og 
aerosol). Hvis testkemikaliet er en blanding, rapporteres analysekoncentra ­
tionen for blandingen som helhed og ikke kun for det aktive stof eller indikatorstoffet (analysand). Yderligere oplysninger om faktiske koncentra ­
tioner findes i GD 39 (2).
 
Testkemikalie: partikelstørrelsesfordeling  
28. Aerosolers partikelstørrelsesfordeling bestemmes mindst ugentligt for hvert 
koncentrationsniveau ved hjælp af en kaskadeimpaktor eller et andet instru ­
ment, f.eks. et instrument til aerodynamisk partikelstørrelsesbestemmelse 
(APS). Hvis der kan påvises ækvivalens mellem de resultater, der er opnået ved hjælp af kaskadeimpaktoren eller et alternativt instrument, kan det alternative instrument bruges i hele forsøget.
 
29. Et andet apparat, f.eks. et gravimetrisk filter eller en impinger/gas bubbler, 
anvendes parallelt med det primære instrument til at bekræfte det primære 
instruments opsamlingseffektivitet. Den massekoncentration, der fås ved hjælp af partikelstørrelsesanalysen, skal være inden for rimelige grænser af den massekoncentration, der fås ved hjælp af filteranalyse [se GD 39 
(2)]. Hvis ækvivalens kan påvises ved alle de koncentrationer, der testes i 
forsøgets tidligere fase, kan yderligere bekræftelsesmålinger udelades. Af hensyn til dyrevelfærden træffes der foranstaltninger for at minimere inkon ­
klusive data, der kan gøre det nødvendigt at gentage et forsøg.
 
30. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for dampe, hvis der er mulighed 
for, at kondensering af dampe kan føre til dannelsen af en aerosol, eller hvis 
der konstateres partikler i en dampatmosfære med potentiale for blandede 
faser.  
OBSERVATIONER  
31. Dyrene bør hyppigt observeres klinisk før, under og efter eksponerings ­
perioden. Hyppigere observationer kan være påkrævet afhængigt af 
dyrenes respons på eksponeringen. Hvis observation af dyrene hindres af fastspændingsslanger på dyrene, dårligt belyste helkropskamre eller uigen ­
nemsigtige atmosfærer, observeres dyrene omhyggeligt efter eksponering. 
Observationer inden næste dags eksponering kan omfatte vurdering af rever ­
sibilitet eller forværring af toksiske virkninger.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Alle observationer registreres, og der føres individuel protokol for hvert dyr. 
Når dyr aflives af humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet 
registreres så nøjagtigt som muligt.  
33. Observationer i burene skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slim ­
hinder, respirationssystem, kredsløb, autonomt nervesystem og centralnerve ­
system samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, 
sløvhed, søvn og koma. Målingen af rektal temperatur kan dokumentere 
refleks-bradypnø eller hypo-/hypertermia relateret til behandling eller fangenskab. Forsøgsprotokollen kan omfatte yderligere vurderinger, f.eks. kinetik, bioovervågning, lungefunktion, retention af tungtopløselige stoffer, 
der akkumuleres i lungevæv, og adfærdsændringer.
 
KROPSVÆGT  
34. Det enkelte dyrs vægt registreres kort før den første eksponering (dag 0) og 
derefter to gange om ugen (f.eks. hver fredag og mandag for at påvise 
restitution i løbet af en eksponeringsfri weekend eller med et tidsinterval, der gør det muligt at vurdere systemisk toksicitet), og på døds- eller afliv ­
ningstidspunktet. Hvis der ikke er nogen virkninger i de første to uger, 
måles kropsvægten ugentligt i resten af forsøgsperioden. Hvis der anvendes 
satellitdyr (reversibilitet), vejes de ugentligt i hele restitutionsperioden. Ved forsøgets afslutning vejes alle dyr umiddelbart inden aflivning med henblik på at beregne forholdet mellem organ- og kropsvægt uden bias.
 
INDTAGELSE AF FØDE OG VAND  
35. Foderindtagelse måles ugentligt. Vandindtagelse kan også måles.  
KLINISK PATOLOGI  
36. Klinisk patologisk vurdering foretages for alle dyr, herunder kontrol- og 
satellitdyr (reversibilitet), når de aflives. Tidsintervallet med den sidste eksponering og blodtapning registreres, navnlig når den undersøgte effekt ­
parameter hurtigt rekonstitueres. Prøvetagning efter eksponering er indiceret 
for parametre med en kort plasmahalveringstid (f.eks. COHb, CHE og MetHb).
 
37. I tabel 1 vises de kliniske patologiske parametre, der generelt kræves i 
forbindelse med alle toksikologiforsøg. Rutinemæssig urinanalyse er ikke påkrævet, medmindre den indiceres af forventede eller observerede toksiske 
virkninger. Forsøgslederen kan vælge at undersøge yderligere parametre 
med henblik på at opnå en bedre karakterisering af testkemikaliets toksicitet (f.eks. cholinesterase, lipider, hormoner, syre/basebalance, methæmoglobin eller Heinz-legemer, kreatinkinase, myeloid/erythroid-forhold, troponiner, 
arterielle blodgasser, lactat-dehydrogenase, sorbitol-dehydrogenase, 
glutamat-dehydrogenase og γ-glutamyltranspeptidase).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabel 1  
Standardparametre for klinisk patologi  
Hæmatologisk undersøgelse  
Erythrocyttælling 
Hæmatokrit 
Hæmoglobinkoncentration Middelcellehæmoglobin Middelcellevolumen 
Middelcellehæmoglobinkoncentration 
Retikulocyttælling Leukocyttal 
Differentialtælling 
Trombocyttal Koaguleringsevne (vælg én): — protrombintid 
— koaguleringstid 
— partiel tromboplastintid
 
Klinisk-kemisk undersøgelse  
Glukose (*) 
Total kolesterol 
Triglycerider BUN 
Total bilirubin 
Kreatinin Protein Albumin 
Globulin Alanin-aminotransferase 
Aspartat-aminotransferase 
Alkalisk fosfatase Kalium 
Natrium 
Kalcium Fosfor Chlorid
 
Urinanalyse (valgfri)  
Udseende (farve og turbiditet) 
Volumen 
Specifik vægtfylde eller osmolalitet 
pH Total protein 
Glukose 
Blod/blodceller  
(*) Da en langvarig fasteperiode kan medføre bias i glukosemålinger hos de behand ­
lede dyr i forhold til kontroldyrene, afgør forsøgslederen, om det er hensigtsmæs ­
sigt, at dyrene faster. Hvis en fasteperiode anvendes, bør den være tilpasset den 
anvendte art. For rotter kan den være 16 timer (natten over). Bestemmelse af 
fasteglukose kan foretages efter faste natten over i løbet af den sidste ekspone ­
ringsuge eller efter faste natten over inden obduktion (i sidstnævnte tilfælde 
sammen med alle de øvrige kliniske patologiske parametre).  
38. Når der er bevis for, at de nedre luftveje (dvs. alveolerne) er det primære 
afsætnings- og retentionssted, kan bronchieskylning (BAL) anvendes til 
kvantitativt at analysere hypotesebaserede parametre for dosis/virkning med fokus på alveolitis, lungebetændelse og fosfolipidose. Det gør det muligt at undersøge forandringer i dosis/respons og tidsforløb i forbindelse 
med alveoleskader. BAL-væsken kan analyseres for total og differentieret 
leukocyttal, total protein og lactat-dehydrogenase. Andre parametre, der kan overvejes, er parametre, der indicerer lysosomale skader, fosfolipidose, fibrose og irritationsinflammation eller allergisk inflammation, som kan 
omfatte bestemmelse af pro-inflammatoriske cytokiner/kemokiner. 
BAL-målinger supplerer generelt resultaterne af histopatologiske undersøgel ­
ser, men kan ikke erstatte dem. Vejledning i udførelse af lungeskylning findes i GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
MAKROSKOPISKE PATOLOGISKE FORANDRINGER OG ORGAN ­
VÆGT  
39. Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller tages ud af 
forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes komplet exsanguina ­
tion (hvis muligt) og makroskopisk obduktion. Tidsrummet mellem afslut ­
ningen på hvert dyrs sidste eksponering og dets aflivning registreres. Hvis obduktion ikke kan udføres umiddelbart efter opdagelsen af et dødt dyr, nedkøles (ikke fryses) dyret ved en temperatur, der er tilstrækkeligt lav til 
at minimere autolyse. Makroskopisk obduktion udføres så hurtigt som 
muligt, helst inden for en eller to dage. Alle makroskopiske patologiske forandringer registreres for hvert dyr med særligt fokus på forandringer i 
luftvejene.
 
40. I tabel 2 vises de organer og væv, der skal præserveres i et passende 
medium under makroskopisk obduktion med henblik på mulig histopatolo ­
gisk undersøgelse. Forsøgslederen afgør, om organer og væv i [kantet paren ­
tes] og andre organer og væv skal præserveres. Organer i  fed trimmes og 
vejes i våd tilstand så hurtigt som muligt efter dissektionen for at undgå udtørring. Skjoldbruskkirtel og bitestikler bør kun vejes, hvis artefakter fra 
trimming kan hindre histopatologisk evaluering. Væv og organer fikseres i 
10 % bufret formalin eller et andet egnet fikseringsmiddel, straks obduktion er udført, men højst 24-48 timer inden trimming afhængigt af det anvendte 
fikseringsmiddel.
 
Tabel 2  
Organer og væv, der præserveres under makroskopisk obduktion  
Binyrer  
Knoglemarv (og/eller nyligt aspirat)  
Hjerne  (herunder udsnit af cerebrum, cere ­
bellum og medulla/pons)  
[Øjne (retina, synsnerve) og øjenlåg]  
Hjerte  
Nyrer  
Larynx (3 niveauer, 1 niveau, som omfatter 
basis af strubelåget)  
Lever  
Lunge  (alle lungelapper på et niveau, 
herunder hovedbronchier)  
Lymfeknuder fra lungens hilum, navnlig ved 
tungtopløselige testkemikalier. Ved mere detaljerede undersøgelser og/eller forsøg 
med immunologisk fokus kan yderligere 
lymfeknuder overvejes, f.eks. lymfeknuder fra de mediastinale, cervikale/submandibulære og/eller aurikulære områder.
 
Nasopharyngeale væv (mindst niveauer; 1 
niveau for at medtage nasopharyngeal kanalen og NALT (Nasal Associated Lymp ­
hoid Tissue)
 
Øsofagus  
[Bulbus olfactorius]  
Æggestokke  Vesiculae seminales  
Rygmarv (cervikal, midt-torakal og lumbal)  
Milt 
Mavesæk  
Testikler  
Brisler  
Skjoldbruskkirtlen  
Spiserør (mindst 2 niveauer, herunder 1 
længdesnit gennem carina og 1 tværsnit)  
[Urinblære]  
Uterus  
Alle større læsioner  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Lunger udtages hele og intakte, vejes og behandles med et passende fikse ­
ringsmiddel ved et tryk på 20-30 cm vand for at sikre, at lungestrukturen 
bevares (5). Snit udtages for alle lapper på et niveau, herunder hovedbron ­
chier, men hvis der udføres lungeskylning, udtages en ikkeskyllet lap på tre niveauer (ikke serielle snit).
 
42. Mindst fire niveauer af nasopharyngealt væv undersøges, hvoraf det ene 
omfatter nasopharyngeal-kanalen (5, 6, 7, 8, 9), så der kan udføres en tilstrækkelig undersøgelse af pladeepitel, transitionelt epitel (respiratorisk uden cilier), respiratorisk epitel (respiratorisk med cilier) og lugteepitel 
samt drænende lymfevæv (NALT; 10, 11). Tre niveauer af larynx undersø ­
ges, og et af disse niveauer skal omfatte basis af strubelåget (12). Mindst to niveauer af luftrøret undersøges, herunder et længdesnit gennem carina i bifurkationen af de ekstrapulmonal bronchier og et tværsnit.
 
HISTOPATOLOGI  
43. Der foretages en histopatologisk evaluering af alle organer og væv, der er 
anført i tabel 2, for kontrolgruppen og gruppen med den højeste koncen ­
tration og for alle dyr, der dør eller aflives under forsøget. Særligt luft ­
vejene, målorganerne og større læsioner skal undersøges. Organer og væv 
med læsioner i gruppen med den højeste koncentration undersøges i alle 
grupper. Forsøgslederen kan vælge at udføre histopatologiske evalueringer for yderligere grupper for at påvise et klart forhold mellem koncentration og respons. Hvis der anvendes en satellitgruppe (reversibilitet), skal der på 
dyrene i denne gruppe udføres histopatologisk evaluering af væv og organer, 
hvor der var vist ændringer i behandlingsgruppen. Hvis der er usædvanligt mange dyr, der dør tidligt, eller andre problemer i højeksponeringsgruppen, som kompromitterer signifikansen af data, foretages en histopatologisk 
undersøgelse af den næste lavere koncentration. Makroskopiske observa ­
tioner korreleres så vidt muligt med mikroskopiske fund.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
44. Der skal fremlægges data for de enkelte dyr om kropsvægt, foderindtagelse, 
klinisk patologi, makroskopisk patologi, organvægt og histopatologi. For hver testgruppe opstilles i tabelform kliniske observationsdata om antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, 
antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære 
grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet samt obduktionsfund. Alle kvantitative og uventede resultater evalueres ved hjælp af en passende 
statistisk metode. Enhver generelt accepteret statistisk metode kan anvendes, 
og de statistiske metoder skal vælges under planlægningen af forsøget.
 
Testrapport  
45. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er relevante:  
Forsøgsdyr og pasning  
— beskrivelse af burforhold, herunder: antal (eller ændring i antal) dyr pr. 
bur, strøelse, omgivende temperatur og relativ fugtighed, lysperiode og 
foder  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— anvendt art/stamme og begrundelse for anvendelse af andre arter end 
rotte kildedata og historiske data, hvis de vedrører dyr, der er eksponeret 
under lignende eksponerings-, bur- og fasteforhold  
— dyrenes antal, alder og køn  
— randomiseringsmetode  
— beskrivelse af konditionering før test, herunder foder, karantæne og 
behandling for sygdom.  
Testkemikalie  
— fysisk tilstand, renhed og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber 
(herunder isomeri)  
— identifikationsoplysninger og CAS-nr. (Chemical Abstract Services 
Registry Number), hvis det kendes.  
Vehikel  
— begrundelse for brug af vehikel og begrundelse for valg af vehikel, hvis 
dette ikke er vand  
— historiske eller samtidige data, der viser, at vehiklet ikke påvirker resul ­
tatet af forsøget.  
Inhalationskammer  
— detaljeret beskrivelse af inhalationskammeret, herunder rumfang og et 
diagram  
— oprindelse og beskrivelse af udstyr anvendt til eksponering af dyr og til 
generering af atmosfære  
— apparatur til måling af temperatur, fugtighed, partikelstørrelse og faktisk 
koncentration  
— luftkilde og konditioneringssystem  
— metoder, der er anvendt til kalibrering af apparatur for at sikre en 
homogen testatmosfære  
— trykforskel (positiv eller negativ)  
— eksponeringsporte pr. kammer (eksponering gennem næsen); placering 
af dyr i systemet (helkropseksponering)  
— testatmosfærens stabilitet  
— placering af temperatur- og fugtighedssensorer og udtagning af stikprøve 
af testatmosfære i kammer  
— behandling af tilført/udledt luft  
— luftgennemstrømningshastigheder, luftgennemstrømningshastighed/eks ­
poneringsport (eksponering gennem næsen) eller dyrebelastning/kammer 
(helkropseksponering)  
— tid, der kræves til at opnå ligevægt i inhalationskammeret (t  95 ) 
— antal volumenændringer pr. time  
— evt. måleudstyr.  
Eksponeringsdata:  
— begrundelse for valg af målkoncentration i hovedforsøget  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— nominelle koncentrationer (samlet masse af det genererede testkemikalie 
i inhalationskammeret divideret med den samlede mængde luft, der 
passerer gennem kammeret)  
— faktiske koncentrationer af testkemikaliet indsamlet fra dyrenes vejrtræk ­
ningszone; for blandinger, der producerer heterogene fysiske former 
(gasser, dampe eller aerosoler), kan hver enkelt analyseres separat  
— alle luftkoncentrationer rapporteres i masseenheder (f.eks. mg/l, mg/m  3 
osv.) i stedet for volumenenheder (ppm, ppb osv.)  
— partikelstørrelsesfordeling, massemedian af den aerodynamiske 
diameter (MMAD) og geometrisk standardafvigelse ( σg), herunder 
deres beregningsmetoder; individuelle partikelstørrelsesanalyse rapporte ­
res. 
Testbetingelser  
— nærmere oplysninger om fremstilling af testkemikalie, herunder oplys ­
ninger om fremgangsmåder anvendt til at reducere partikelstørrelsen af faste materialer eller fremstille opløsninger af testkemikaliet
 
— en beskrivelse (helst med diagram) af det apparatur, der bruges til at 
generere testatmosfæren og til at eksponere dyrene for testatmosfæren  
— nærmere oplysninger om udstyr, der anvendes til overvågning af tempe ­
ratur, fugtighed og luftgennemstrømning i kammer (dvs. fastlæggelse af 
en kalibreringskurve)  
— nærmere oplysninger om udstyr, der anvendes til at udtage prøver til 
bestemmelse af koncentration og partikelstørrelsesfordeling i kammer  
— nærmere oplysninger om den anvendte analysemetode og validerings ­
metode (herunder genfindingsgrad for testkemikaliet fra prøvemediet)  
— randomiseringsmetode til tildeling af dyr til test- og kontrolgrupper  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens 
art/oprindelse, vandets oprindelse)  
— begrundelse for valget af testkoncentrationer.  
Resultater  
— opstilling i tabelform af temperatur, fugtighed og luftgennemstrømning i 
kammer  
— opstilling i tabelform af data om nominel og faktisk koncentration i 
kammer  
— opstilling i tabelform af data om partikelstørrelse i tabelform, herunder 
data om indsamling af analyseprøve, partikelstørrelsesfordeling og beregning af MMAD og σ
 g 
— opstilling i tabelform af responsdata og koncentrationsniveau for hvert 
dyr (dvs. dyr, som viser tegn på toksicitet, herunder mortalitet, og virk ­
ningernes art, sværhed, tidspunkt for indtræden og varighed)  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— opstilling i tabelform af de enkelte dyrs vægt  
— opstilling i tabelform af foderindtagelse  
— opstilling i tabelform af kliniske patologiske data  
— for hvert dyr evt. obduktionsfund og histopatologiske fund  
— opstilling i tabelform af eventuelle andre målte parametre.  
Diskussion og fortolkning af resultater  
— Der lægges særlig vægt på beskrivelsen af de metoder, der er anvendt til 
at opfylde denne testmetodes kriterier, f.eks. grænsekoncentrationen eller partikelstørrelsen.
 
— Partiklernes respirabilitet i lyset af de overordnede resultater beskrives, 
især hvis partikelstørrelseskriteriet ikke kunne opfyldes.  
— Konsistensen mellem de metoder, der er anvendt til at bestemme nomi ­
nelle og faktiske koncentrationer og relationen mellem den faktiske koncentration og den nominelle koncentration beskrives i den overord ­
nede vurdering af forsøget.
 
— Den sandsynlige dødsårsag og den fremherskende virkningsmåde (syste ­
misk i forhold til lokal) beskrives.  
— Der gives en forklaring, hvis det var nødvendigt at foretage human 
aflivning af dyr, som udviste svære smerter og/eller vedvarende tegn på svære lidelser, baseret på kriterierne i OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3).
 
— Målorganet (-organerne) identificeres.  
— NOAEL og LOAEL bestemmes.  
LITTERATUR:  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test 
Guideline No. 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency.  
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, s. 229-258.
 
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. I: Waalkes MP og Ward JM (eds) Carcinogenesis. TARGET Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
 
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijve ­
stijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopha ­
ryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 
16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer 
og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 
1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006, EUT L 353 af 31.12.2008, s. 1.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. TOKSICITET VED GENTAGEN DOSERING (28 DAGE, 
DERMAL)  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B (punkt A).  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B (punkt B).  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Teststoffet påføres dagligt huden i graduerede doser på grupper af 
forsøgsdyr, idet der anvendes en bestemt dosis til hver gruppe gennem en periode på 28 dage. I eksponeringspenoden observeres dyrene dagligt for symptomer på toksisk virkning. Dyr, der dør 
under forsøget, obduceres, og ved forsøgets afslutning aflives og 
obduceres de overlevende dyr.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Forberedelser  
Dyrene holdes under forsøgsbetingelser med hensyn til miljø og 
fodring i mindst fem dage, inden forsøget påbegyndes. Unge sunde dyr fordeles randomiseret i forsøgs- og kontrolgrupper, inden 
forsøget sættes i gang. Kort før forsøget indledes, klippes dyrene 
på ryggen. Såfremt dyrene barberes, bør det ske ca. 24 timer, inden forsøget indledes. Klipningen eller barberingen må som regel gentages med en uges mellemrum. Man må ved klipning og barbe ­
ring passe på ikke at beskadige huden. Mindst 10 % af kroppens 
overflade klargøres til påføring af teststoffet. Ved afgørelse af, hvilket og hvor stort et område der skal klippes, bør der tages 
hensyn til dyrets vægt. Ved testning af faste stoffer, som i givet 
fald kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstrækkeligt med vand eller om nødvendigt med et passende vehikel, så der sikres god kontakt med huden. Flydende teststoffer påføres normalt ufortyndet. 
Teststoffet påføres dagligt 5-7 dage om ugen.
 
1.6.2.  Forsøgsbetingelser  
1.6.2.1.  Forsøgsdyr  
Der kan anvendes voksne rotter, kaniner eller marsvin. Der kan også 
anvendes andre dyrearter, men i så fald skal det begrundes.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Ved forsøgets begyndelse må vægten af de anvendte dyr ikke variere 
mere end ± 20 % fra en rimelig gennemsnitsvægt.  
1.6.2.2.  Antal og køn  
Der anvendes mindst ti dyr (fem hunner og fem hanner) med sund 
hud til hvert dosisniveau. Hunnerne må ikke have født og må ikke 
være drægtige. Hvis der påregnes aflivning af dyr under forsøget, skal det oprindelige antal dyr forøges med det antal dyr, man påregner at aflive i løbet af forsøget. Man kan samtidig udsætte en 
satellitgruppe på ti dyr (fem af hvert køn) for den højeste dosis i 28 
dage og gennem en periode på 14 dage efter forsøget observere, om der er reversible, varige eller forsinkede toksiske virkninger. Der anvendes tillige en satellitgruppe på ti kontroldyr (fem af hvert køn).
 
1.6.2.3.  Dosisniveauer  
Der skal anvendes mindst tre dosisniveauer samt en kontrolgruppe 
eller en vehikelkontrolgruppe, såfremt der benyttes vehikel. Ekspone ­
ringsperioden er på mindst seks timer dagligt. Teststoffet påføres på 
omtrent samme tidspunkt hver dag, og doserne justeres med jævne mellemrum (én gang eller to gange om ugen), så de er konstante i forhold til dyrenes legemsvægt. Dyrene i kontrolgruppen behandles 
nøjagtigt som dyrene i forsøgsgrupperne, bortset fra påføring af test ­
stoffet. Hvis der anvendes et vehikel til at lette doseringen, skal vehikelkontrolgruppen eksponeres på samme måde som forsøgsgrup ­
perne og påføres samme mængde vehikel som den gruppe, der 
modtager den højeste dosis. Den højeste dosis bør have toksisk virk ­
ning, men kun medføre få eller ingen dødsfald. Det laveste dosis ­
niveau bør ikke have nogen toksisk virkning overhovedet. Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for 
stoffet, skal det laveste dosisniveau overskride denne eksponering. 
Middeldosis skal helst frembringe så svage observerbare toksiske virkninger som muligt. Hvis der anvendes mere end tre dosis ­
niveauer, bør de vælges således, at der opnås graduering af de 
toksiske virkninger. I grupperne med lav og middel dosis og i kontrolgrupperne skal dødeligheden holdes på et lavt niveau, så der bliver mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne.
 
Hvis påføring af teststoffet forårsager alvorlig hudirritation, sænkes 
koncentrationen, hvilket kan medføre, at andre toksiske virkninger på det højeste dosisniveau svækkes eller forsvinder. Hvis huden er 
blevet alvorligt beskadiget, kan det være nødvendigt at afslutte 
forsøget og foretage et nyt forsøg med lavere koncentrationer.
 
1.6.2.4.  Grænsetest  
Hvis der i en indledende undersøgelse med en dosis på 1 000 mg/kg 
legemsvægt eller en større dosis fastsat ud fra kendskab til den eksponering, mennesker kan blive udsat for, ikke konstateres nogen toksisk virkning, kan yderligere test betragtes som unødven ­
dige.
 
1.6.2.5.  Observationsperiode  
Dyrene observeres dagligt for symptomer på toksicitet. Dødstids ­
punkt og tidspunkter for toksicitetssymptomers fremkomst og 
forsvinden registreres.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Fremgangsmåde  
Dyrene holdes i hvert sit bur. Den ideelle dosering består i påføring 
af teststoffet syv dage om ugen i en periode på 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til opfølgningsobservationer holdes i yder ­
ligere 14 dage uden påføring af teststof, således at det kan regi ­
streres, om toksiske virkninger er reversible, eller om de vedvarer. Den daglige eksponeringsperiode er på mindst seks timer.
 
Teststoffet påføres jævnt over et område, som svarer til ca. 10 % af 
den samlede legemsoverflade. Med stærkt toksiske stoffer kan der anvendes et mindre område, men stoffet skal påføres så tyndt og ensartet over en så stor del af området som muligt.
 
Teststoffet skal holdes i kontakt med huden ved hjælp af en porøs 
gazeforbinding og en ikke-hudirriterende klæbestrimmel. Teststedet skal desuden tildækkes på en sådan måde, at gazeforbindingen og 
teststoffet holdes sikkert fast, så at dyrene ikke kan indtage teststof ­
fet. Der kan anvendes andre foranstaltninger, som forhindrer dyrene i at indtage teststoffet; dog kan fuldstændig immobilisering ikke anbe ­
fales. Alternativt kan der benyttes en beskyttelseskrave.
 
Ved eksponeringsperiodens afslutning fjernes tilbagesiddende test ­
stof, idet der f.eks. anvendes vand eller et andet egnet middel til at rense huden.
 
Alle dyr observeres dagligt, og toksicitetssymptomer registreres, 
herunder hvornår disse symptomer optræder første gang, hvor længe de varer, og hvor kraftige de er. Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, øjne og slimhinder, åndedræt og 
kredsløb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske akti ­
vitet og adfærdsmønsteret. Dyrene vejes én gang om ugen. Det anbefales, at der også holdes regnskab med den ugentlige fødeind ­
tagelse. Dyrene observeres med jævne mellemrum, så dyr ikke går 
tabt for undersøgelsen på grund af f.eks. kannibalisme, autolyse af 
væv eller forveksling. Ved forsøgets slutning aflives og obduceres alle overlevende dyr med undtagelse af dem i satellitgrupperne. 
Døende dyr og dyr, der viser symptomer på stærk smerte eller 
lidelse, fjernes, så snart de iagttages, hvorefter de aflives på human måde og obduceres.
 
Ved forsøgets afslutning skal alle dyr inklusive kontrolgruppen 
underkastes følgende undersøgelser:  
1) hæmatologisk analyse omfattende mindst hæmatokrit, hæmoglo ­
binkoncentration, erythrocyttælling, total og differential leucocyt ­
tælling og et mål for koaguleringsevnen  
2) klinisk biokemisk blodanalyse omfattende mindst en lever- og 
nyrefunktionsparameter: serum alanin aminotransferase (ALAT), 
serum aspartat aminotransferase (ASAT), urinstof, albumin, krea ­
tinin, total bilirubin og total serumprotein.  
Andre bestemmelser, der kan være påkrævet for en fyldestgørende 
toksikologisk vurdering, er calcium, phosphor, chlorid, natrium, 
kalium, glucose efter faste, lipidanalyser, hormoner, 
syre/basebalance, methæmoglobin og cholinesteraseaktivitet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Der kan udføres yderligere klinisk-biokemiske analyser, hvor det 
skønnes nødvendigt for videre undersøgelse af observerede 
virkninger.  
1.6.4.  Makroskopisk undersøgelse  
Alle forsøgsdyrene underkastes en fuldstændig makroskopisk under ­
søgelse. Lever, nyrer, binyrer og testes vejes så hurtigt som muligt 
efter udtagningen, så udtørring undgås. Væv og organer, dvs. normal 
og eksponeret hud, lever, nyrer, milt, testes, binyrer, hjerte og målorganer (dvs. organer, der udviser makroskopiske læsioner eller forandringer i størrelse), opbevares i et passende medium med 
henblik på eventuel senere histopatologisk undersøgelse.
 
1.6.5.  Histopatologisk undersøgelse  
Der foretages en histologisk undersøgelse af præpareret væv og 
organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe, der har været udsat for den største dosis. Observeres der i gruppen med 
den højeste dosis vævs- eller organdefekter, som kan tilskrives test ­
stoffet, undersøges de samme væv og organer i grupperne med lavere dosis. Dyrene i satellitgruppen underkastes en histologisk undersøgelse, især de væv og organer, der udviser virkning i de 
øvrige grupper.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antallet af dyr 
ved begyndelsen af forsøget, og for hver type læsion det antal dyr, 
der udviser den pågældende læsion.  
Evaluering af samtlige observationer skal baseres på en passende 
statistisk metode. Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes.  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— dyreart/stamme, herkomst, miljøbetingelser, foder osv.  
— forsøgsbetingelser (herunder forbindingstypen: med eller uden 
okklusion)  
— dosisniveauer (med angivelse af vehikel, hvor et sådant er 
anvendt) samt koncentration  
— nuleffektniveau, hvor det er muligt  
— oplysninger om toksiske reaktioner opdelt efter køn og dosis  
— angivelse af dyrenes dødstidspunkt under forsøget eller over ­
levelse til forsøgets slutning  
— toksiske og andre virkninger  
— for hvert enkelt abnormitetstegn det tidspunkt, hvor det er obser ­
veret, og dets senere udvikling  
— foder- og legemsvægt  
— hæmatologiske analyser og samtlige resultater  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— klinisk-biokemiske analyser og samtlige resultater  
— obduktionsfund  
— detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund  
— eventuel statistisk behandling af resultaterne  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. VURDERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B (punkt D).  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B (punkt E).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENICITET — IN VITRO-TEST FOR 
KROMOSOMABERRATIONER I CELLER FRA PATTEDYR  
1. METODE  
Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 473 In 
Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med in vitro-testen for kromosomaberrationer er at påvise, 
om et stof eller andet forårsager strukturelle kromosomafvigelser i dyrkede pattedyrceller (1) (2) (3). Der er to typer strukturændringer, kromosomtypen og kromatidtypen. De fleste kemiske mutagener 
forårsager ændringer af kromatidtypen, men også ændringer af 
kromosomtypen forekommer. Ploiditetsforøgelse kan være tegn på, at et kemisk stof er i stand til at fremkalde antalsafvigelser. Den foreliggende metode er imidlertid ikke beregnet til at påvise antals ­
afvigelser og benyttes ikke rutinemæssigt til dette formål. Kromo ­
sommutationer og lignende er årsag til mange genetiske sygdomme hos mennesker, og meget tyder på, at kromosommutationer og 
lignende, som ændrer på onkogener og tumorsuppressorgener i 
somatiske celler, medvirker ved induktion af kræft hos mennesker og i forsøgsdyr.
 
I in vitro-testen for kromosomaberrationer kan der benyttes kulturer 
af etablerede cellelinjer, cellestammer eller primære cellekulturer. Cellerne udvælges på grundlag af deres vækstegenskaber ved dyrk ­
ning, karotypens stabilitet, kromosomtal, kromosomdiversitet og 
hyppighed af spontane kromosomaberrationer.
 
Ved udførelse af in vitro-test er det i reglen nødvendigt at benytte en 
exogen kilde til metabolismeaktivering. Et sådant metabolismeaktive ­
ringssystem kan ikke fuldstændig efterligne betingelserne i et levende pattedyr. Man må omhyggeligt undgå betingelser, som 
fører til et positivt resultat, der ikke skyldes selve mutageniciteten, 
men kan være forårsaget af ændringer i pH eller osmolalitet eller høj cytotoksicitet (4) (5).
 
Testen benyttes til at screene for stoffer, der kan være mutagene eller 
carcinogene hos pattedyr. Mange af de stoffer, der giver positivt resultat med denne test, er kræftfremkaldende hos pattedyr, men 
der er ikke fuldstændig korrelation mellem testen og carcinogenicitet. 
Korrelationen afhænger af den kemiske sammensætning, og der er stadig tydeligere tegn på, at nogle carcinogener ikke påvises ved denne test, fordi de lader til at virke ved andre mekanismer end 
direkte beskadigelse af dna.
 
Se også den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Aberration af kromatidtypen:  beskadigelse af kromosomstrukturen 
i form af brud på enkeltkromatider eller brud på og sammenføjning 
af kromatider.  
Aberration af kromosomtypen:  beskadigelse af kromosomstruk ­
turen i form af brud på — eller brud på og sammenføjning af — 
begge kromatider på samme sted.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endofordobling:  en proces, hvorved cellekernen efter en S-fase i 
dna-replikationen ikke fortsætter over i mitosen, men påbegynder 
endnu en S-fase. Resultatet er kromosomer med 4, 8, 16, ... kroma ­
tider.  
Gap:  en akromatisk beskadigelse, som er mindre end ét kromatid 
bred, og hvor forskydning af kromatiderne er minimal.  
Mitoseindeks:  forholdet mellem antallet af celler i metafase og det 
samlede antal celler i en population; det viser populationens formeringsgrad.
 
Antalsafvigelse:  ændring i kromosomtallet i forhold til det for de 
pågældende celler normale antal.  
Polyploidi:  et multiplum af det haploide kromosomtal (n), som ikke 
er det diploide tal (dvs. 3n, 4n osv.).  
Strukturel ændring:  ændring i kromosomstrukturen, som kan iagt ­
tages ved mikroskopi i celledelingens metafase i form af deletioner 
og fragmenter, intrachange og interchange.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Cellekulturer udsættes for teststoffet både med og uden metabolis ­
meaktivering. Efter forud fastsatte tidsrum efter at være udsat for teststoffet behandles kulturerne med et metafasestandsende stof 
(f.eks. Colcemid
 ® eller colchicin), hvorefter de høstes og farves; 
dernæst undersøges metafasecellerne mikroskopisk for forekomst af kromosomaberrationer.
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Præparater  
1.4.1.1.  Celler  
Der kan benyttes en række forskellige cellelinjer, -stammer og 
primære cellekulturer, herunder humane celler (f.eks. fibroblaster 
fra kinesisk hamster eller perifere blodlymfocytter fra det perifere blod hos mennesker eller andre pattedyr).
 
1.4.1.2.  Substrater og dyrkningsforhold  
Til vedligeholdelse af kulturerne benyttes der egnede dyrkningssub ­
strater og inkuberingsbetingelser (dyrkningsflaskcr, CO  2 -koncentra ­
tion, temperatur og luftfugtighed). Etablerede cellelinjer og -stammer 
kontrolleres regelmæssigt for stabilt karakteristisk kromosomtal og mycoplasmakontaminering; i tilfælde af kontaminering anvendes kulturen ikke. Cellernes normale cyklustid og dyrkningsbetingelserne 
skal være kendt.
 
1.4.1.3.  Fremstilling af kulturer  
Etablerede cellelinjer og -stammer: Celler udtages fra stamkulturer 
og udsås i dyrkningssubstrat med en sådan tæthed, at kulturerne ikke 
flyder sammen inden høst, og inkuberes ved 37  o C. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Lymfocytter: fuldblod, der er behandlet med antikoaguleringsmiddel 
(f.eks, heparin), eller lymfocytter fra sunde individer tilsættes til 
dyrkningssubstratet, der indeholder et mitogen (f.eks. phytohæ ­
magglutinin), og inkuberes ved 37  o C. 
1.4.1.4.  Metabolismeaktivering  
Cellerne udsættes for teststoffet både med og uden et egnet metabo ­
lismeaktiveringssystem. Det mest almindeligt anvendte system er en 
cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af 
levere fra rotter, der har været behandlet med enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), eller en blanding af phenobarbiton og β-naphthoflavon (10) (11) (12).
 
Postmitokondriefraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1- 
10 % (v/v) i det færdige testsubstrat. Et metabolismeaktiverings ­
systems beskaffenhed kan afhænge af, hvilken kemisk klasse test ­
stoffet tilhører. I nogle tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at benytte postmitokondriefraktion i mere end én koncentration.
 
Nogle udviklingstendenser, f.eks. genetisk konstruktion af cellelinjer, 
der udtrykker specifikke aktiverende enzymer, kan rumme potentiale for endogen aktivering. Valget af en bestemt cellelinje skal 
begrundes sagligt (f.eks. ved, at cytochrom P450-coenzymet er rele ­
vant for teststoffets metabolisme).
 
1.4.1.5.  Teststof/testpræparat  
Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløs ­
ningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende inden behandling 
af cellerne. Teststoffer i væskeform kan enten tilsættes direkte til 
testsystemet eller fortyndes inden behandlingen. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
 
1.4.2.  Testbetingelser  
1.4.2.1.  Opløsningsmiddel/bærestof  
Der må ikke være mistanke om, at opløsningsmiddel/bærestof 
reagerer kemisk med teststoffet, og opløsningsmiddel/bærestof må hverken hæmme cellernes overlevelse eller S9-aktiviteten. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal 
brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbefales 
i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem. Ved undersøgelse af stoffer, der er ustabile i vand, skal de organiske opløsningsmidler være vandfrie. 
Vand kan fjernes med tilsætning af molekylsi.
 
1.4.2.2.  Eksponeringskoncentrationer  
Stoffets cytotoksicitet, dets opløselighed i testsystemet samt 
ændringer i pH og osmolalitet er blandt de kriterier, der skal tages hensyn til ved valg af højeste koncentration.
 
Cytotoksiciteten bestemmes med og uden metabolismeaktivering i 
hovedforsøget ved hjælp af en passende indikator for celleintegritet og -vækst, f.eks. konfluens, antal levedygtige celler eller mitosein ­
deks. Det kan være hensigtsmæssigt at bestemme cytotoksicitet og 
opløselighed ved et indledende forsøg.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Der benyttes mindst tre analyserbare koncentrationer. Hvis der er tale 
om cytoksicitet, skal koncentrationerne dække et interval fra største 
toksicitet til ringe eller ingen toksicitet; det betyder normalt, at koncentrationerne højst er adskilt med en faktor mellem 2 og √10. På højsttidspunktet skal konfluens, celleantal eller mitoseindeks 
være faldet signifikant ved den højeste koncentration (mere end 
50 %). Mitoseindekset er kun et direkte mål for cytotoksisk/cytostatisk virkning og afhænger af, hvor lang tid der er forløbet efter behandlingen. Mitoseindeks er dog acceptabel for 
dyrkning i rystekolber, hvor andre toksicitetsmål er besværlige eller 
ubrugelige i praksis. Oplysninger om cellecyklens kinetik, såsom den gennemsnitlige generationstid (AGT), kan benyttes som supplerende information. AGT er imidlertid et overordnet gennemsnit, der ikke 
altid afslører forsinkede subpopulationer, og selv en lille forøgelse af 
den gennemsnitlige generationstid kan føre til en meget betydelig forsinkelse af tidspunktet for optimalt udbytte af aberrationer.
 
For stoffer, der er forholdsvis ikke-cytotoksiske, må testkoncentra ­
tionen højst være 5 μl/ml, 5 mg/ml eller 0,01 M (den laveste af de 
tre). 
For forholdsvis uopløselige stoffer, der ikke er toksiske ved koncen ­
trationer under opløselighedsgrænsen, skal der som højeste dosis 
benyttes en koncentration, der er højere end opløselighedsgrænsen 
i det samlede dyrkningssubstrat ved behandlingens afslutning. I nogle tilfælde (f.eks. når toksicitet kun optræder over den laveste koncentration med uopløselighed) tilrådes det at gennemføre testen 
ved mere end én koncentration med synlig udfældning. Det kan være 
hensigtsmæssigt at bedømme opløseligheden både ved behandlingens begyndelse og afslutning, eftersom opløseligheden kan ændre sig under eksponeringen i testsystemet som følge af, at der er celler 
S9. serum mv. til stede. Uopløselighed kan iagttages med det 
blotte øje. Bundfald må ikke have indflydelse på bedømmelsen.
 
1.4.2.3.  Negative og positive kontrolprøver  
I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative 
(opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolprøver, såvel med som 
uden metabolismeaktivering. Når der benyttes metabolismeaktive ­
ring, bør der som positivt kontrolkemikalie anvendes et, der kræver aktivering for at virke mutagent.
 
1 positive kontrolprøver benyttes der et kendt clastogen i en 
mængde, der forventes at give reproducerbar og påviselig forøgelse i forhold til baggrundsværdierne, hvorved testsystemets følsomhed godtgøres.
 
Der vælges sådanne koncentrationer i de positive kontrolprøver, at 
virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem. Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer:
 
Metabolismeaktivering Stof CAS nr. Einecs nr.  
Ingen exogen metabolismeak ­
tivering Methylmethansulfonat 66-27-3 200-625-0 
Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Metabolismeaktivering Stof CAS nr. Einecs nr.  
Ethylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
4-Nitroquinoline-N-oxid 56-57-5 200-281-1 
Exogen metabolismeaktivering Benzo[a]pyrene 50-32-8 200-028-5 
Cyclophosphamid 
Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Der kan benyttes andre egnede stoffer til positiv kontrol. Hvis der er 
mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer.  
Der skal i hver høst indgå negative kontrolprøver, hvor behandlings ­
mediet kun består af opløsningsmiddel eller bærestof, og som 
behandles på samme måde som de øvrige kulturer. Desuden skal der være ubehandlede kontrolprøver, medmindre der foreligger tidligere opnåede kontroldata, der viser, at det valgte opløsnings ­
middel ingen skadelige eller mutagene virkninger har.
 
1.4.3.  Fremgangsmåde  
1.4.3.1.  Behandling med teststof  
Celler under formering behandles med teststoffet med og uden tilste ­
deværelse af et metabolismeaktiveringssystem. Behandling af lymfo ­
cytter påbegyndes ca. 2 døgn efter stimulering med mitogen.  
1.4.3.2. Der benyttes normalt dobbeltbestemmelse ved hver koncentration, 
hvilket også stærkt tilrådes for negative kontrolprøver (kontrolprover med opløsningsmiddel). Hvis det på grundlag af tidligere forsøg kan 
godtgøres, at forskellen mellem dobbeltbestemmelser (13) (14) er 
minimal, kan enkeltbestemmelse ved hver koncentration accepteres.
 
Gasformige og flygtige stoffer testes ved en egnet metode, f.eks. i 
forseglede dyrkningsflasker (15) (16).  
1.4.3.3.  Høst af kulturer  
I det første forsøg udsættes cellerne for teststoffet både med og uden 
metabolismeaktivering i 3-6 timer, og der udtages prøve efter et 
tidsrum, der svarer til ca.1,5 gange cellecykluslængden, regnet fra 
behandlingens begyndelse (12). Fører denne protokol til negativt resultat både med og uden aktivering, udføres endnu et forsøg, denne gang med kontinuerlig behandling indtil prøveudtagning 
efter et tidsrum, der svarer til ca. 1,5 gange en normal cellecyklus. 
Nogle kemiske stoffer er det lettere at bestemme ved behandlings/prøveudtagningstider på mere end 1,5 gange cellecy ­
klussen. Negativt resultat med metabolismeaktivering skal bekræftes 
i hvert enkelt tilfælde. Anses bekræftelse af negative resultater ikke 
for nødvendige, skal dette begrundes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Kromosompræparering  
Cellekulturerne behandles med Colcemid  ® eller colchicin normalt 1- 
3 timer før høst. Høst og kromosompræparering skal foregå særskilt for hver enkelt kultur. Kromosompræpareringen består i hypotonisk 
behandling af cellerne, fiksering og farvning.
 
1.4.3.5.  Analyse  
Alle objektglas, herunder positive og negative kontrolprøver, kodes 
uafhængigt inden mikroskoperingen. Da fikseringen ofte medfører, at en del af metafasecellerne går i stykker, og kromosomerne går tabt, bør bedømte celler indeholde et antal centromerer svarende til 
kromosomtallet ± 2 for alle celletyper. Der skal bedømmes mindst 
200 vel fordelte metafaser pr. koncentration og kontrolgruppe, lige ­
ligt fordelt mellem eventuelle dobbeltprøver. Dette antal kan sættes ned, hvis der iagttages høje aberrationstal.
 
Selv om testens formål er at påvise ændringer i kromosomstrukturen, 
er det vigtigt også at notere polyploidi og endofordobling, hvis dette 
konstateres.  
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Da cellen er forsøgets måleenhed, bedømmes det, hvilken procentdel 
af cellerne der har ændret kromosomstruktur. Forskellige struktur ­
ændringer noteres med antal og hyppighed for både forsøgs- og 
kontrolkulturer. Gaps noteres særskilt og registreres, men medregnes 
normalt ikke i den samlede aberrationshyppighed.  
Sideløbende målinger af cytotoksicitet for alle behandlede og nega ­
tive kontrolkulturer i hovedforsøget registreres ligeledes.  
Dataene præsenteres for hver enkelt kultur. Desuden sammenfattes 
alle data i tabelform.  
Der findes ingen krav til verifikation af et klart positivt resultat. 
Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere undersøgelser, helst med ændrede forsøgsbetingelser. Der er redegjort for behovet for bekræftelse af negative resultater i punkt 1.4.3.3. Ved opfølgende 
forsøg kan man overveje at ændre på undersøgelsens parametre, så 
de bedømte forsøgsbetingelser udvides. Blandt de undersøgelsespara ­
metre, der kan ændres på, er koncentrationernes spredning og meta ­
bolismeaktiveringen.
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
Der findes en række kriterier for opnåelse af et positivt resultat, 
f.eks. en koncentrationsafhængig forøgelse eller en reproducerbar 
forøgelse af antallet af celler med kromosomaberrationer. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testre ­
sultaterne (3) (13). Statistisk signifikans bør ikke være den eneste 
faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
En forøgelse i antallet af polyploide celler kan være tegn på, at 
teststoffet er i stand til at inhibere mitoseprocesser og fremkaldte 
kromosomantalsafvigelser. En forøgelse af antallet af celler med endofordoblede kromosomer kan være tegn på, at teststoffet kan inhibere cellecyklussens forløb (17) (18).
 
Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for 
mutagent i dette system.  
De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i 
sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvety ­
digt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.
 
Et positivt resultat af en in vitro-test for kromosomaberrationer viser, 
at teststoffet fremkalder ændringer i kromosomstrukturen i dyrkede somatiske celler fra pattedyr. Et negativt resultat viser, at teststoffet 
under testbetingelserne ikke fremkalder ændringer i kromosomstruk ­
turen i dyrkede somatiske celler fra pattedyr.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— begrundelse for valg af bærestof  
— teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, 
hvis den kendes  
Celler:  
— celletype og -kilde  
— den valgte celletypes karyotypiske karakteristika og egnethed  
— eventuelt fravær af mycoplasma  
— oplysninger om cellecyklussens længde  
— bloddonorers køn. fuldblod eller fraseparerede lymfocytter samt 
benyttet mitogen  
— eventuelt antal passager  
— eventuelle metoder til vedligehold af cellekulturer  
— normalt kromsomtal  
Testbetingelser:  
— det metafasestandsende stofs betegnelse og koncentration og 
længden af cellernes udsættelse for stoffet  
— begrundelse for valg af koncentrationer og antal kulturer, 
herunder f.eks. eventuelle cytotoksicitetsdata og opløseligheds ­
begrænsninger  
— substratsammensætning og eventuel CO  2 -koncentration  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— teststoffets koncentration  
— volumen af tilsat bærestof og teststof  
— inkuberingstemperatur  
— inkuberingstid  
— behandlingens varighed  
— celletæthed ved udsåning, hvis det er relevant  
— metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, 
herunder acceptkriterier  
— positive og negative kontrolprøver  
— metoder til præparering af objektglas  
— kriterier for bedømmelse af aberrationer  
— antal analyserede metafaser  
— metoder til måling af toksicitet  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ 
eller tvetydig  
Resultater:  
— tegn på toksicitet, f.eks. konfluens, cellecyklusdata, celletælling 
og mitoseindeks  
— tegn på udfældning  
— data om pH og osmolalitet i behandlingsmediet, hvis disse 
værdier er målt  
— definitioner af aberrationer, herunder gaps  
— antal celler med kromosomaberrationer og typen af disse, anført 
særskilt for hver behandlet kultur og kontrolkultur  
— eventuel iagttaget ændring i ploidigrad  
— dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt  
— eventuelle statistiske analyser  
— data for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og 
positive kontrolprøver  
— data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og posi ­
tive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser
 
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and 
Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender. A, (ed) 
Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.  
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985), The  In Vitro  Chromo­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5. Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford. pp. 427-432.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S, 
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M.A., Andersen, G. and Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutaden 10 
(suppl. 10), pp. 1-175.
 
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPLMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.
 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells, Mutation Res., 268. pp. 297-305.  
(6) Arnes, B.N., McCann, J,. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the 
Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Muta ­
tion Res., 31, pp. 347-364.  
(7) Maron, D.M. and Arnes, B.N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
 
(8) Natarajan. A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. 
and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/ 
Carcinogens after Activation in a Microsomal System  In 
Vitro,  J. Induction of Chromosome Aberrations and Sister 
Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimet ­
hylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat- 
Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90.  
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In Vitro,  Mutation Res., 66, pp. 277-290.  
(10) Elliot, B.M., Combes. R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D,G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alterna ­
tives to Aroclar 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Berid, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activalion in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85-88.
 
(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M. Jr., Iven, J.L., 
Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994), 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261.  
(13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., 
Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from  
in Vitro  Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mula ­
genicity Test Data, Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University 
Press, Cambridge, pp. 141-154.  
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994), Replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149.  
(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/ ­
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.I., Schaich, K.M. (eds), 
Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, 
pp. 91-103.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
 
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mulation Res., 119, pp. 403-413.
 
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer 
Res., 43, pp. 1362-1364.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENICITET — IN VIVO-TEST FOR 
KROMOSOMABERRATIONER I KNOGLEMARV HOS 
PATTEDYR  
1. METODE  
Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 475 
Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. INDLEDNING  
In vitro-testen for kromosomaberrationer hos pattedyr benyttes til at 
påvise, om et teststof forårsager strukturelle kromosomafvigelser i knoglemarvceller hos dyr, normalt gnavere (1) (2) (3) (4). Der er 
to typer strukturændringer, kromosomtypen og kromatidtypen. Ploi ­
ditetsforøgelse kan være tegn på, at et kemisk stof er i stand til at fremkalde antalsafvigelser. De fleste kemiske mutagener forårsager ændringer af kromosomtypen, men også ændringer af kromatidtypen 
forekommer. Kromosommutationer og lignende er årsag til mange 
genetiske sygdomme hos mennesker, og meget tyder på, at kromo ­
sommutationer og lignende, som ændrer på onkogener og tumorsup ­
pressorgener i somatiske celler, medvirker ved induktion af kræft hos 
mennesker og i forsøgssystemet.
 
Der benyttes rutinemæssigt gnavere i denne test. Knoglemarv er 
målvævet i denne test, da det er et væv med høj vaskularisation 
og består af celler med kort cyklustid, som er lette at isolere og behandle. Metoden omfatter ikke andre arter og væv.
 
Denne test for kromosomaberrationer er særlig relevant for en vurdering 
af risikoen for mutationsfremkaldelse, da den giver mulighed for at tage sådanne faktorer som in vivo-metabolisme, farmakokinetik og DNA- reparationsprocesser i betragtning, selv om de kan variere fra art til art 
og fra væv til væv. En in vivo-test er ligeledes nyttig til yderligere 
undersøgelse af mutagene virkninger, der er påvist ved en in vitro-test.
 
Hvis der er grund til at tro, at teststoffet eller en reaktiv metabolit 
ikke vil nå frem til målvævet, er denne test ikke egnet.  
Se også den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Aberration af kromatidtypen:  beskadigelse af kromosomstrukturen 
i form af brud på enkeltkromatider eller brud på og sammenføjning 
af kromatider.  
Aberration af kromsomtypen:  beskadigelse af kromosomstrukturen 
i form af brud på — eller brud på og sammenføjning af — begge kromatider på samme sted.
 
Endofordobling:  en proces, hvorved cellekernen efter en S-fase i 
DNA-replikationen ikke fortsætter over i mitosen, men påbegynder endnu en S-fase. Resultatet er kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider.
 
Gap:  en akromatisk beskadigelse, som er mindre end ét kromatid 
bred, og hvor misalignment af kromatiderne er minimal.  
Antalsafvigelse:  ændring af kromosomtallet i forhold til det for de 
pågældende celler normale antal.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Polyploidi:  et multiplum af det haploide kromosomtal (n), som ikke 
er det diploide tal (dvs. 3n, 4n osv.).  
Strukturel ændring:  ændring i kromosomstrukturen, som kan iagt ­
tages ved mikroskopi i celledelingens metafase i form af deletioner 
og fragmenter, intrachange og interchange.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Dyrene udsættes for teststoffet på passende måde og aflives efter 
passende tidsrum efter eksponeringen. Inden aflivningen behandles dyrene med et metafasestandsende stof (f.eks. colchicin eller Colce ­
mid
 ® ). Der fremstilles derefter præparater af knoglemarvceller, som 
farves, og metafasecellerne undersøges for kromosomaberrationer.  
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Præparater  
1.4.1.1.  Valg af dyreart  
Der benyttes sædvanligvis rotter, mus og kinesiske hamstere, selv 
om andre egnede pattedyrarter kan benyttes. Der bør anvendes almindeligt brugte laboratoriestammer af unge sunde voksne dyr. Ved undersøgelsens begyndelse bør vægtvariationen mellem dyrene 
være mindst mulig og ikke over ±20 % af gennemsnitsvægten for 
hvert køn.
 
1.4.1.2.  Miljø og fordring  
Der gælder de almindelige forhold som beskrevet i den generelle 
indledning til del B, blot bør der tilstræbes en fugtighed på 50-60 %.  
1.4.1.3.  Forberedelse af dyrene  
Der udvælges tilfældigt sunde unge voksne dyr til kontrol- og 
behandlingsgruppen. Burene bør anbringes på en sådan måde, at 
deres placering får mindst mulig indvirkning. Dyrene identificeres entydigt. Dyrene tilvænnes til laboratorieforholdene i mindst fem dage.
 
1.4.1.4.  Fremstilling uf doser  
Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløs ­
ningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende, inden de gives 
til dyrene. Teststoffer i væskeform kan enten gives direkte til dyrene eller fortyndes først. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræpara ­
ter, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
 
1.4.2.  Testbetingelser  
1.4.2.1.  Opløsningsmiddel/bærestof  
Opløsningsmiddel/bærestof må ikke have toksiske virkninger ved de 
benyttede doser og må ikke mistænkes for at reagere kemisk med teststoffet. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. 
Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et 
vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Kontrolgrupper  
I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative 
(opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolgrupper af begge køn. Bortset fra behandling med teststof skal dyrene i kontrolgrupperne 
behandles på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.
 
Positive kontrolprøver skal frembringe strukturelle ændringer in vivo 
ved en dosis, der forventes at give en påviselig forøgelse i forhold til 
baggrundsværdierne. Der vælges sådanne doser i de positive kontrol ­
prøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem. Det kan 
accepteres, at den positive kontrol indgives på anden måde end test ­
stoffet, og at der kun foretages én prøveudtagning. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer. Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer:
 
Stof CAS nr. Einecs nr.  
Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
Cyclophosphamid 
Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5
 
Der skal ved hver prøveudtagning indgå negative kontrolgrupper, 
som kun er behandlet med opløsningsmiddel eller bærestof, og 
ellers behandlet på samme måde som behandlingsgrupperne, medmindre tidligere kontroldata har vist en acceptabel variation 
mellem dyr og hyppighed af celler med kromosomafvigelser. Hvis 
der kun udtages én negativ kontrolprøve, er det mest hensigtsmæs ­
sigt at gøre det ved første prøveudtagning. Desuden skal der være ubehandlede kontrolgrupper, medmindre der foreligger tidligere 
opnåede eller offentliggjorte kontroldata, der viser, at det valgte 
opløsningsmiddel/bærestof ingen skadelige eller mutagene virkninger har.
 
1.5. FREMGANGSMÅDE  
1.5.1.  Dyrenes antal og køn  
Hver behandlet gruppe og kontrolgruppe skal bestå af mindst fem 
analyserbare dyr af hvert køn. Hvis der på det tidspunkt, hvor under ­
søgelsen foretages, foreligger data fra undersøgelser med samme 
dyreart og med samme indgiftsmåde, som viser, at der ikke er nogen væsentlig toksicitetsforskel mellem de to køn, er test med 
kun ét køn tilstrækkeligt. Hvis udsættelsen af mennesker for det 
kemiske stof er kønsspecifik, som det f.eks. er tilfældet med visse farmaceutiske stoffer, skal testen udføres med dyr af det pågældende køn.
 
1.5.2.  Behandlingsplan  
Teststofferne indgives fortrinsvis i en enkelt dosis. De kan også 
indgives i to deldoser, dvs. to behandlinger samme dag med kun 
nogle få timers interval, hvorved det bliver lettere at indgive et større 
materialevolumen. Indgift på anden måde skal begrundes sagligt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Der udtages prøver på to tidspunkter efter endagsbehandling. For 
gnavere udtages første prøve normalt 1,5 normal cellecykluslængde 
(som normalt er 12-18 timer) efter behandlingen. Da det optimale tidspunkt for påvisning af kromosomaberrationer kan afhænge af, hvor lang tid der er påkrævet for optagelse og metabolisme af test ­
stoffet, og af teststoffets indvirkning på cellecyklussens kinetik, 
anbefales det at udtage endnu en prøve 24 timer efter den første. Indgives stoffet over mere end én dag, udtages der blot én prøve, når der er gået 1,5 normal cellecykluslængde efter den sidste behandling.
 
Inden aflivningen gives dyrene en intraperitoneal injektion med en 
passende dosis metafasestandsende stof (f.eks. Colcemid  ® eller 
colchicin). Der udtages prøve af forsøgsdyrene efter et passende 
tidsrum. For mus er dette tidsrum ca. tre-fem timer, for kinesisk hamster ca. fire-fem timer. Cellerne høstes fra knoglemarven og analyseres for kromosomaberrationer.
 
1.5.3.  Dosisniveauer  
Hvis der gennemføres en forprøve til bestemmelse af dosisinterval, 
fordi der ikke foreligger nogen egnede data, bør den udføres i samme 
laboratorium med samme art, stamme, køn og behandlingsmåde, som agtes benyttet i hovedundersøgelsen (5). Er der tale om toksicitet, benyttes der tre dosisniveauer for første prøveudtagningstidspunkt. 
Disse dosisniveauer skal dække et interval fra maksimal toksicitet 
til næsten ingen eller ingen toksicitet. Ved den efterfølgende prøveudtagning behøves kun den højeste dosis benyttet, Den højeste dosis defineres som den dosis, der fremkalder sådanne tegn 
på toksicitet, at højere dosis med samme indgiftsmønster må 
forventes at medføre død. Stoffer med specifik biologisk aktivitet ved lav ikke-toksisk dosis (f.eks. hormoner og mitogener) kan 
danne undtagelser fra disse dosisfastsættelseskriterier og bør 
evalueres individuelt. Højeste dosis kan også defineres som en dosis, der i nogen grad udviser tegn på toksicitet i knoglemarven (f.eks. mitoseindeks nedsat med mere end 50 %).
 
1.5.4.  Grænsetest  
Hvis der ved en test med én dosis på mindst 2 000 mg/kg legems ­
vægt indgivet på én gang eller i to omgange samme dag ikke kan 
iagttages nogen toksiske virkninger, og hvis man på grundlag af data om strukturmæssigt beslægtede stoffer ikke forventer gentoksicitet, kan en fuldstændig undersøgelse med tre dosisniveauer anses for 
unødvendig. For længerevarende undersøgelser er grænsedosis på 
2 000 mg/kg legemsvægt pr. dag for behandlinger over højst 14 dage og på 1 000 mg/kg legemsvægt pr. dag for behandlinger over mere end 14 dage. Den forventede eksponering af mennesker kan 
foranledige, at der benyttes en højere dosis i grænsetesten.
 
1.5.5.  Indgift af doser  
Teststoffet indgives normalt ved tvangsfodring med sonde eller en 
passende intubationskanyle eller ved intraperitoneal injektion. Andre indgiftsmåder kan accepteres, hvis de kan begrundes. Hvor stor en væskemængde der kan indgives ad gangen ved tvangsfodring eller 
injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Mængden bør højst 
være på 2 ml pr. 100 g legemsvægt. Anvendelse af større rumfang skal begrundes. Bortset fra lokal-irriterende og ætsende stoffer, som normalt vil have kraftigere virkninger ved højere koncentrationer, bør 
testvolumenet variere så lidt som muligt, idet koncentrationen juste ­
res, så volumenet bliver det samme ved alle dosisniveauer.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Præparering af kromosomer  
Umiddelbart efter aflivningen udtages knoglemarven, som udsættes 
for hypotonisk væske og fikseres. Derefter stryges cellerne ud på objektglas og farves.
 
1.5.7.  Analyse  
Mitoseindekset bestemmes som udtryk for cytotoksiciteten i mindst 
1 000 celler pr. dyr for alle behandlede dyr (inkl. positive kontroldyr) og ubehandlede (negative) kontroldyr.
 
For hvert dyr bør mindst 100 celler analyseres. Dette antal kan sættes 
ned, hvis der iagttages et stort antal aberrationer. Alle objektglas, herunder positive og negative kontrolprøver, kodes uafhængigt 
inden mikroskoperingen. Da præpareringen af objektglas ofte 
medfører, at en del af metafasecellerne går i stykker og kromo ­
somerne går tabt, bør bedømte celler indeholde et antal centromerer svarende til kromosomtallet 2n ± 2.
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Data for de enkelte dyr præsenteres i tabelform. Forsøgsenheden er 
et dyr. For hvert dyr registreres antallet af bedømte celler, antallet af aberrationer pr. celle og den procentdel af cellerne, der har kromo ­
somaberrationer. Forskellige typer strukturelle kromosomændringer 
skal anføres med antal og hyppighed for behandlingsgrupper og kontrolgrupper. Gaps registreres særskilt og oplyses, men medregnes ikke generelt i den totale aberrationshyppighed. Hvis der ikke er tegn 
på forskellig reaktion hos de to køn, kan dataene samles med henblik 
på statistisk analyse.
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
Der findes en række kriterier for at afgøre, om et resultat er positivt, 
f.eks. en dosisafhængig forøgelse af andelen af celler med kromo ­
somaberrationer eller en tydelig forøgelse af antallet af celler med 
aberrationer hos en enkeltdosisgruppe på et bestemt prøveudtag ­
ningstidspunkt. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved 
evalueringen af testresultaterne (6). Statistisk signifikans bør ikke 
være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt. Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere test, helst med ændring af forsøgsbetingelserne.
 
En forøgelse af ploiditetsgraden kan være tegn på, at teststoffet er i 
stand til at fremkalde kromosomantalsafvigelser. En forøget endo ­
fordobling kan være tegn på, at teststoffet kan inhibere cellecyklus ­
sens forløb (7) (8).  
Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for 
mutagent i dette system.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i 
sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig 
bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvety ­
digt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.  
Et positivt resultat af en in vivo-test for kromosomaberrationer viser, 
at teststoffet fremkalder kromosomaberrationer i knoglemarven hos den undersøgte art. At negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder kromosomaberrationer i knogle ­
marven hos den undersøgte art.
 
Sandsynligheden for, at teststoffet eller dets metabolitter når frem til 
det almindelige kredsløb eller specifikt til målvævet (f.eks. systemisk 
toksicitet), bør diskuteres.  
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— begrundelse for valg af bærestof  
— teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, 
hvis den kendes  
Forsøgsdyr:  
— anvendt art/stamme  
— antal dyr samt deres alder og køn  
— oprindelse, miljø, føde mv.  
— de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse, samt interval, 
gennemsnit og standardafvigelse for legemsvægten for hver 
enkelt gruppe  
Testbetingelser:  
— positive og negative (bærestof/opløsningsmiddel) kontrolgrupper  
— data fra en eventuel forprøve til bestemmelse af dosisinterval  
— begrundelse for valg af dosisniveau  
— detaljerede oplysninger om præparering af teststoffet  
— detaljerede oplysninger om indgift af teststoffet  
— begrundelse for indgiftsvej  
— eventuelle metoder til kontrol af, at teststoffet er nået frem til det 
almindelige kredsløb eller målvævet  
— eventuel omregning fra teststofkoncentration (ppm) i 
føde/drikkevand til faktisk dosis (mg pr. kg legemsvægt pr. dag)  
— detaljerede oplysninger om føde- og vandkvalitet  
— detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan  
— metoder til måling af toksicitet  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— det metafasestandsende stofs betegnelse og koncentration og 
behandlingens varighed  
— metoder til præparering af objektglas  
— kriterier for bedømmelse af aberrationer  
— antal analyserede celler pr. dyr  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ 
eller tvetydig  
Resultater:  
— tegn på toksicitet  
— mitoseindex  
— antal aberrationer og type. anført særskilt for hvert dyr  
— samlet antal aberrationer pr. gruppe med gennemsnit og standard ­
afvigelse  
— antal celler med aberrationer pr. gruppe med gennemsnit og 
standardafvigelse  
— eventuel iagttaget ændring i ploiditetsgrad  
— dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt  
— eventuelle statistiske analyser  
— data for sideløbende negative kontrolprøver  
— data for tidligere negative kontrolprøver med angivelse af inter ­
valler, gennemsnit og standardafvigelser  
— data for sideløbende positive kontrolprøver  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) Adler, L.D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry 
(eds.). IRL Press, Oxford. Washington D.C., pp. 27 5-306.  
(2) Preston. R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H. McFee, A.F. 
and Shelby, M. (1987), Mammalian  In Vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165.
 
(3) Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D.G., Bootman, 
J. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays, in: 
D.J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing Report. Part I revised, Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
 
(4) Tice, R.R. Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, 
D.H., Holden, H.E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Paccie ­
rotti, F., Preston, R.J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, S. and 
Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the  In 
Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, 
Mutation Res., 312, pp. 305-312.  
(5) Fielder, R.J., Alleen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen 
Society Working Group: Dose setting in in Vivo Mutagenicity 
Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D.P., Andersen, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, 
G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, 
J.R.K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic 
Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutage ­
nicity Test Data. D.J. Kirkland, (ed.) Cambridge University 
Press, Cambridge, pp. 184-232.  
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 
119, pp. 403-413.  
(8) Huang. Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1 364.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENICITET — IN VIVO-TEST FOR MIKROKERNER I 
ERYTHROCYTTER HOS PATTEDYR  
1. METODE  
Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 474 
Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (1997).  
1.1. INDLEDNING  
In vivo-testen for mikrokerner hos pattedyr benyttes til påvisning af 
skader, som teststoffet har forvoldt på kromosomer eller mitoseappa ­
ratet i erythroblaster, ved analyse af erythrocytter i prøver fra knog ­
lemarv og/eller det perifere blod hos dyr, sædvanligvis gnavere.  
Formålet med mikrokernetesten er at påvise stoffer, der forvolder 
cytogenetiske skader, som medfører dannelse af mikrokerner inde ­
holdende tiloversblevne kromosomfragmenter eller hele kromosomer.  
Når en erythroblast i knoglemarven udvikler sig til en polykromatisk 
erythrocyt, udstødes cellekernen, og en eventuel dannet mikrokerne kan blive tilbage i det ellers kernefri cytoplasma. I disse celler er 
mikrokerner let synlige, da de ellers ikke har nogen kerne. Forøget 
forekomst af polykromatiske erythrocytter med mikrokerne hos behandlede dyr er tegn på inducerede kromosomskader.
 
I denne test benyttes der rutinemæssigt knoglemarv hos gnavere, da 
der i dette væv produceres polykromatiske erythrocytter. Måling af umodne (polykromatiske) erythrocytter med mikrokeme i det perifere blod kan også accepteres i andre arter, hvor det er vist, at milten ikke 
kan fjerne erythrocytter med mikrokerner, eller at deres følsomhed 
over for stoffer, der forårsager strukturelle eller antalsmæssige kromosomaberrationer, er tilstrækkelig. Mikrokerner kan genkendes på en række kriterier, bl.a. om der er en DNA-centromer til stede. 
Det vigtigste endpoint er hyppigheden af umodne (polykromatiske) 
erythrocyter med mikrokerne. Det antal modne (normokromatiske) erythrocytter i det perifere blod, som indeholder mikrokerner, ud af et givet antal modne erythrocytter kan også benyttes som endpoint 
for testen, når dyrene behandles kontinuerligt i mindst fire uger.
 
Denne in vivo-test for mikrokerner hos pattedyr er særlig relevant for 
vurdering af den reelle mutagenitetsfare, idet den tager højde for 
sådanne faktorer som in vivo-metabolisme, farmakokinetik og 
DNA-reparationsprocesser, selv om disse kan variere fra art til art, væv til væv og genetisk endpoint til genetisk endpoint. En in vivo- test er ligeledes nyttig til yderligere undersøgelse af mutagene virk ­
ninger, der er påvist ved en in vitro-test.
 
Hvis der er grund til at tro, at teststoffet eller en reaktiv metabolit 
ikke vil nå frem til målvævet, er denne test ikke egnet.  
Se også den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. DEFINITIONER  
Centromer:  region(er) af et kromosom, hvortil tentrådene er 
påhæftet under celledeling, således at datterkromosomerne kan ordnes i forhold til dattercellernes poler.
 
Mikrokerner:  små ekstrakerner, der er adskilt fra cellens hoved ­
kerne, og som dannes under mitosens telofase (meiose) ud fra efter ­
ladte kromosomfragmenter eller hele kromosomer.  
Normochromatisk erythrocyt:  moden erythrocyt. der mangler ribo ­
somer og kan skelnes fra umodne polykromatiske erythrocytter ved ribosomselektiv farvning.
 
Polychromatisk erythocyt:  umoden erythrocyt på et udviklingsmel ­
lemstadium, som stadig indeholder ribosomer og derfor kan skelnes fra modne normokromatiske erythrocytter ved ribosomselektiv farv ­
ning.
 
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Dyrene udsættes for teststoffet på passende måde. Hvis der benyttes 
knoglemarv, aflives dyrene på et passende tidspunkt efter behandlin ­
gen, hvorefter knoglemarven udtages, og der fremstilles præparater 
og farves (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Hvis der benyttes perifert blod, 
tages der blodprøver på et passende tidspunkt efter behandlingen, hvorefter der fremstilles udstrygningspræparater og farves (4) (8) (9) (10). I undersøgelser med perifert blod bør der gå så kort tid 
som muligt mellem sidste eksponering og cellehøst. Præparaterne 
analyseres for tilstedeværelse af mikrokerner.
 
1.4. BESKRIVELSE AE TESTMETODEN  
1.4.1.  Præparater  
1.4.1.1.  Valg af dyreart  
Der anbefales mus eller rotter, hvis der bruges knoglemarv, selv om 
andre egnede pattedyrarter kan benyttes. Bruges der perifert blod, 
anbefales mus. Dog kan enhver egnet pattedyrart benyttes, hvis dens milt ikke kan fjerne erythrocytter med mikrokerne, eller hvis den er vist at være tilstrækkelig følsom til at påvise stoffer, der 
forårsager strukturelle eller antalsmæssige kromosomaberrationer. 
Der bør anvendes almindeligt brugte laboratoriestammer af unge sunde dyr. Ved undersøgelsens begyndelse bør vægtvariationen mellem dyrene være mindst mulig og ikke over ± 20 % af gennem ­
snitsvægten for hvert køn.
 
1.4.1.2.  Miljø og fodring  
Der gælder de almindelige forhold som beskrevet i den generelle 
indledning til del B, blot bør der tilstræbes en fugtighed på 50-60 %.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Forberedelse af dyrene  
Der udvælges tilfældigt unge sunde voksne dyr til kontrol- og 
behandlingsgruppen. Dyrene identificeres entydigt. Dyrene tilvænnes til laboratorieforholdene i mindst fem dage. Burene bør anbringes på 
en sådan måde, at deres placering får mindst mulig indvirkning.
 
1.4.1.4.  Fremstilling af doser  
Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløs ­
ningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende, inden de gives til dyrene. Teststoffer i væskeform kan enten gives direkte til dyrene 
eller fortyndes først. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræpara ­
ter, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
 
1.4.2.  Testbetingelser  
1.4.2.1.  Opløsningsmiddel/bærestof  
Opløsningsmiddel/bærestof må ikke have toksiske virkninger ved de 
benyttede doser og må ikke mistænkes for at reagere kemisk med 
teststoffet. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et 
vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem.
 
1.4.2.2.  Kontrolgrupper  
I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative 
(opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolgrupper af begge køn. Bortset fra behandling med teststof skal dyrene i kontrolgrupperne 
behandles på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.
 
Positive kontrolprøver skal frembringe mikrokerner in vivo ved en 
dosis, der forventes at give en påviselig forøgelse i forhold til baggrundsværdierne. Der vælges sådanne doser i de positive kontrol ­
prøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' 
identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem. Det kan 
accepteres, at den positive kontrol indgives på anden måde end test ­
stoffet, og at der kun foretages én prøveudtagning. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer. 
Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer:
 
Stof CAS nr. Einecs nr.  
Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 
N-ethyl-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 Cyclophosphamid 
Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Der skal ved hver prøveudtagning indgå negative kontroldyr, som 
kun er behandlet med opløsningsmiddel eller bærestof og ellers 
behandlet på samme måde som behandlingsgrupperne, medmindre tidligere kontroldata har vist en acceptabel variation mellem dyr indbyrdes og acceptabel hyppighed af celler med mikrokerner. 
Hvis der kun udtages én negativ kontrolprøve, er det mest hensigts ­
mæssigt at gøre det ved første prøveudtagning. Desuden skal der være ubehandlede kontrolgrupper, medmindre der foreligger tidligere opnåede eller offentliggjorte kontroldata, der viser, at det valgte 
opløsningsmiddel ingen skadelige eller mutagene virkninger har.
 
Hvis der benyttes perifert blod, kan en forbehandlingsprøve også 
accepteres som sideløbende negativ kontrolprøve, men kun i de korte undersøgelser (f.eks. 1-3 behandlinger), når de opnåede resul ­
tater ligger inden for det forventede interval for den forudgående 
kontrolprøve.
 
1.5. FREMGANGSMÅDE  
1.5.1.  Dyrenes antal og køn  
Hver behandlet gruppe og kontrolgruppe skal bestå af mindst fem 
analyserbare dyr af hvert køn (11). Hvis der på det tidspunkt, hvor undersøgelsen foretages, foreligger data fra undersøgelser med samme dyreart og med samme indgiftsmåde, som viser, at der ikke 
er nogen væsentlig toksicitetsforskel mellem de to køn, er test med 
kun ét køn tilstrækkelig. Hvis udsættelsen af mennesker for det kemiske stof er kønsspecifik, som det f.eks. er tilfældet med visse farmaceutiske stoffer, skal testen udføres med dyr af det pågældende 
køn.
 
1.5.2.  Behandlingsplan  
Der kan ikke anbefales nogen standardbehandlingsplan (dvs. 1, 2 
eller flere behandlinger med 24 timers mellemrum). Prøver fra læng ­
dervarende indgiftsplaner er acceptable, når blot der i undersøgelsen 
er påvist en positiv virkning eller — for en negativ undersøgelse — der er påvist toksicitet, eller grænsedosis har været anvendt, og når indgiften er fortsat indtil prøveudtagningen. Prøvestoffet kan også 
indgives i to deldoser, dvs. to behandlinger samme dag med kun 
nogle få timers interval, hvorved det bliver lettere at indgive et større materialevolumen.
 
Testen kan udføres på følgende to måder:  
a) Dyrene behandles med teststoffet én gang, Der udtages prøver af 
knoglemarv mindst to gange, første gang tidligst 24 timer efter behandlingen, med passende intervaller mellem prøverne, sidste prøve dog senest 48 timer efter behandlingen. Prøveudtagning 
tidligere end 24 timer efter behandlingen skal begrundes. Der 
udtages prøver af perifert blod mindst to gange, tidligst 36 timer efter behandlingen og med passende intervaller efter den første prøve, sidste prøve dog senest efter 72 timer. Når der i en 
prøve er konstateret positiv reaktion, er yderligere prøveudtagning 
ikke nødvendig.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) Benyttes der to eller flere daglige behandlinger (f.eks. to eller 
flere behandlinger med 24 timers mellemrum) udtages der for 
knoglemarvs vedkommende prøver én gang mellem 18 og 24 timer efter den sidste behandling, og for perifert blods vedkom ­
mende én gang mellem 36 og 48 timer efter den sidste behand ­
ling (12).
 
Derudover kan der udtages prøver på andre tidspunkter, hvis det er 
relevant.  
1.5.3.  Dosisniveauer  
Hvis der gennemføres en forprøve til bestemmelse af dosisinterval, 
fordi der ikke foreligger nogen egnede data, bør den udføres i samme 
laboratorium med samme art, stamme, køn og behandlingsmåde som agtes benyttet i hovedundersøgelsen (13). Er der tale om toksicitet, benyttes der tre dosisniveauer for første prøveudtagningstidspunkt. 
Disse dosisniveauer skal dække et interval fra maksimal toksicitet 
til næsten ingen eller ingen toksicitet. Ved den efterfølgende prøveudtagning behøves kun den højeste dosis benyttet. Den højeste dosis defineres som den dosis, der fremkalder sådanne tegn 
på toksicitet, at højere dosis med samme indgiftsmønster må 
forventes at medføre død. Stoffer med specifik biologisk aktivitet ved lav ikke-toksisk dosis (f.eks. hormoner og mitogener) kan danne undtagelser fra disse dosisfastsættelseskriterier og bør 
evalueres individuelt. Højeste dosis kan også defineres som en 
dosis, der i nogen grad udviser tegn på toksicitet i knoglemarven (f.eks. en nedsættelse af andelen af umodne erythrocytter i forhold til 
totale erythrocytter i knoglemarv eller perifert blod).
 
1.5.4.  Grænsetest  
Hvis der ved en test med én dosis på mindst 2 000 mg p. kg legems ­
vægt indgivet på én gang eller i to omgange samme dag ikke kan 
iagttages nogen toksiske virkninger, og hvis man på grundlag af data om strukturnæssigt beslægtede stoffer ikke forventer gentoksicitet, kan en fuldstændig undersøgelse med tre dosisniveauer anses for 
unødvendig, for længerevarende undersøgelser er grænsedosis på 
2 000 mg pr. kg legemsvægt pr. dag for behandlinger over højst 14 dage og på 1 000 mg pr. kg legemsvægt pr. dag for behandlinger 
over mere end 14 dage. Den forventede eksponering af mennesker 
kan foranledige, at der benyttes en højere dosis i grænsetesten.
 
1.5.5.  Indgift af doser  
Teststoffet indgives normalt ved tvangsfodring med sonde eller en 
passende intubationskanyle eller ved intraperitoneal injektion. Andre indgiftsmåder kan accepteres, hvis de kan begrundes. Hvor stor en væskemængde, der kan indgives ad gangen ved tvangsfodring eller 
injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Mængden bør højst 
være på 2 ml pr. 100 g legemsvægt. Anvendelse af større rumfang skal begrundes. Bortset fra lokalirriterende og ætsende stoffer, som normalt vil have kraftigere virkninger ved højere koncentrationer, bør 
testvolumenet variere så lidt som muligt, idet koncentrationen juste ­
res, så volumenet bliver det samme ved alle dosisniveauer.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Præparering af knoglemarv/blod  
Knoglemarvceller udtages normalt fra lårben eller skinneben umid ­
delbart efter aflivningen. Sædvanligvis udtages cellerne fra lårben eller skinneben, hvorefter de præpareres og farves med velkendte 
metoder. Perifert blod udtages fra halevenen eller et andet egnet 
blodkar. Blodlegemerne farves straks supravitalt (8) (9) (10), eller der fremstilles udstrygningspræparater, der derefter farves. Ved at bruge en DNA-specifik farvning (f.eks. acridinorange (14) eller 
Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) kan man undgå nogle af de 
artifakter, der optræder ved ikke-DNA-specifik farvning. Denne fordel udelukker ikke, at der benyttes konventionelle farvestoffer 
(f.eks. Giemsa). Supplerende systemer (f.eks. cellulosekolonner til 
fjernelse af kerneindeholdende celler (16)) kan også benyttes, forudsat at de er påvist at fungere tilfredsstillende ved præparering af mikrokerner i laboratoriet.
 
1.5.7.  Analyse  
For hvert dyr bestemmes andelen af umodne erythrocytter i forhold 
til det samlede antal (umodne og modne) erythrocytter, idet der 
tælles mindst 200 erythrocytter i alt for knoglemarv og 1 000 eryth ­
rocytter for perifert blod (17). Alle objektglas, herunder positive og negative kontrolprøver, kodes uafhængigt inden mikroskoperingen. 
For hvert dyr bedømmes mindst 2 000 umodne erythrocytter for 
forekomst af umodne etythrocytter med risikokerner. Der kan opnås yderligere information ved bedømmelse af modne erythro ­
cytter for indhold af mikrokerner. Ved analyse af objektglas må 
andelen af umodne erythrocytter i forhold til totale erythrocytter 
ikke være mindre end 20 % af kontrolværdien. Når dyrene behandles kontinuerligt i fire uger eller derover, kan også mindst 2 000 modne erythrocytter pr. dyr bedømmes for forekomst af mikrokerner. 
Systemer til automatisk analyse (billedanalyse og flow-cytometri af 
celleopslæmninger) er acceptable som alternativer til manuel evalue ­
ring, hvis de er behørigt begrundet og valideret.
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Data for de enkelte dyr præsenteres i tabelform. Forsøgsenheden er 
et dyr. For hvert dyr registreres antallet af bedømte umodne eryth ­
rocytter, antallet af umodne erythrocytter med mikrokerne og antallet af umodne erythrocytter i forhold til det samlede antal erythrocytter. Hvis dyrene behandles kontinuerligt i mere end fire uger, anføres 
også dataene for modne erythrocytter, hvis de foreligger. Andelen af 
umodne erythrocytter i forhold til totale erythrocytter oplyses for hvert dyr, og, hvis det skønnes hensigtsmæssigt, procentdelen af erythrocytter med mikrokerne. Hvis der ikke er tegn på forskellig 
reaktion hos de to køn, kan dataene samles med henblik på statistisk 
analyse.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
Der findes en række kriterier for at afgøre, om et resultat er positivt, 
f.eks. en dosisafhængig forøgelse af antallet af celler med mikro ­
kerner eller en tydelig forøgelse af antallet af celler med mikrokerner 
hos en enkeltdosisgruppe på et bestemt prøveudtagningstidspunkt. 
Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (18) (19). Statistisk signifikans bør ikke være den 
eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt. 
Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere test, helst med ændring af forsøgsbetingelserne.
 
Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for 
mutagent i dette system.  
De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i 
sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvety ­
digt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.
 
Et positivt resultat af mikrokernetesten viser, at teststoffet fremkalder 
mikrokerner, som følge af beskadigelse af kromosomer eller mitose ­
apparat hos erythroblaster i den undersøgte art. Et negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder mikro ­
kerner hos umodne erythrocytter i den undersøgte art.
 
Sandsynligheden for, at teststoffet eller dets metabolitter når frem til 
det almindelige kredsløb eller specifikt til målvævet (f.eks. systemisk 
toksicitet), bør diskuteres.  
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— begrundelse for valg af bærestof  
— teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, 
hvis den kendes  
Forsøgsdyr:  
— anvendt art/stamme  
— antal dyr samt deres alder og køn  
— oprindelse, miljø, føde mv.  
— de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse, samt interval, 
gennemsnit og standardafvigelse for legemsvægten for hver 
enkelt gruppe  
Testbetingelser:  
— positive og negative (bærestof/opløsningsmiddel) kontrolgrupper  
— data fra en eventuel forprøve til bestemmelse af dosisinterval  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— begrundelse for valg af dosisniveau  
— detaljerede oplysninger om præparering af teststoffet  
— detaljerede oplysninger om indgift af teststoffet  
— begrundelse for indgiftsvej  
— eventuelle metoder til kontrol af at teststoffet er nået frem til det 
almindelige kredsløb eller målvævet  
— eventuel omregning fra teststofkoncentration (ppm) i 
føde/drikkevand til faktisk dosis (mg pr. kg. legemsvægt pr. dag)  
— detaljerede oplysninger om fode- og vandkvalitet  
— detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan  
— metoder til præparering af objektglas  
— metoder til måling af toksicitet  
— kriterier for bedømmelse af umodne erythrocytter med mikro ­
kerner  
— antal analyserede celler pr. dyr  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ 
eller tvetydig  
Resultater:  
— tegn på toksicitet  
— andel af umodne erythrocytter i forhold til total erythrocytter  
— antal umodne erythrocytter med mikrokerner, anført særskilt for 
hvert dyr  
— gennemsnit ± standardafvigelse for umodne erythrocytter med 
mikrokerner for hver gruppe  
— dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt  
— anvendte statistiske analyser og metoder  
— data for sideløbende og tidligere negative kontrolprøver  
— data for sideløbende positive kontrolprøver  
— Diskussion af resultaterne  
— Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) Heddle, J.A. (1973), A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.  
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mulation Res., 31, 
pp. 9-15.  
(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M, Kirkhart, B., Mavour ­
nin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983), The Induc ­
tion of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation 
Res. 123, pp. 61-118.  
(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C, Salamone, M.F. 
and Heddie, J.A. (1990), The  In Vivo  Micronucleus Assay in 
Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of 
the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, 
Mutation Res., 239, pp. 29-80.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J.T. Schlegel, R. Choy. W.N., and Wehr, C.M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, cd. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, pp., 555-558.
 
(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite. M., Margolin, G.H., 
Ramel, C, Salamone, M.F., Tice, R.R. and Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.
 
(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R. and Shelby, M.E. 
(1990), The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits 
Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.
 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, 
Mutation Res. 245, pp. 245-249.
 
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryth ­
rocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.
 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis 
Study Group of the Environmental Mutagen Society of 
Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 15 3-159.
 
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blac ­
key, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti, 
F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. 
(1994),  In Vivo,  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, 
Mutation Res., 312. pp. 293-304.  
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313- 
319.
 
(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, 
D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in  In Vivo  Mutagenicity 
Assays, Mutagenesis. 7, pp. 313-319.
 
(14) Hayashi, M., Sofuni, T, and Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.  
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Eriythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res. 120, pp. 269-275.
 
(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104.  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995), Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res. 
347, pp. 97-99.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D.G. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetics Assay, 
in: D.J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committe on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing Report, Part 1, revised, 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
 
(19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and 
Savage, J.R.K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGENICITET — TILBAGEMUTATIONSTEST MED 
BAKTERIER  
1. METODE  
Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 471 Bacte ­
rial Reverse Mutation Test (1997).  
1.1. INDLEDNING  
I tilbagemutationstesten med bakterier benyttes der aminosyrekræ ­
vede stammer af Salmonella typhimurium og Escherichia coli til at 
påvise punktmutationer med substitution, addition eller deletion af et eller nogle få dna-basepar (1) (2) (3). Princippet i denne tilbagemu ­
tationstest med bakterier er, at den påviser mutationer, som tilbage ­
muterer mutationer i teststammerne og dermed sætter bakterien i 
stand til at syntetisere en essentiel aminosyre. Revertantbakterierne påvises ved deres evne til at vokse uden den aminosyre, som den oprindelige teststamme kræver.
 
Punktmutationer er årsagen til mange genetiske sygdomme hos 
mennesker, og der er meget, der tyder på, at punktmutationer i onkogener og tumorsuppressorgener i somatiske celler spiller en rolle for dannelse af tumorer hos mennesker og i forsøgsdyr. 
Tilbagemutationstesten med bakterier er hurtig, billig og forholdsvis 
let at udføre. Mange teststammer har forskellige egenskaber, der gør dem mere følsomme til påvisning af mutationer, bl.a. responsive dna- sekvenser på reversionsstedet, høj cellepermeabilitet for store mole ­
kyler og manglende dna-reparationssystemer eller forstærkede fejlbe ­
hæftede dna-reparationsprocesser. Teststammernes specificitet kan give nyttige oplysninger om, hvilke typer mutationer et gentoksisk stof inducerer. Der findes en meget stor database med resultater for 
en lang række strukturer med tilbagemutationstest med bakterier, og 
der er udviklet veletablerede metodologier for test af kemikalier med forskellige fysiske og kemiske egenskaber, herunder flygtige forbin ­
delser.
 
Se også den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
En tilbagemutationstest  med enten Salmonella typhimurium eller 
Escherichia coli påviser mutation i en aminosyrekrævende stamme 
(histidin eller tryptophan) til en stamme, der er uafhængig af tilførsel af aminosyren udefra.
 
Mutagener for baseparsubstitution  er stoffer, der forårsager en 
baseændring i dna'et. I en tilbagemutationstest kan denne ændring 
ske samme sted som den oprindelige mutation eller et andet sted i bakteriens genom.
 
Læserammemutagener  er stoffer, der medfører insertion eller dele ­
tion af et eller flere basepar i dna'et, således at RNA'ets læseramme 
ændres.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.5. INDLEDENDE OVERVEJELSER  
I tilbagemutationstesten med bakterier benyttes der prokaroytiske 
celler, som adskiller sig fra pattedyrceller med hensyn til f.eks. optagelse, metabolisme, kromosomstruktur og dna-reparationsproces ­
ser. In vitro-test kræver normalt en exogen kilde til metabolismeak ­
tivering. In vitro-metabolismeaktiveringssystemer kan ikke fuld ­
stændig efterligne in vivo-forholdene i pattedyr. Testen vil derfor ikke give direkte oplysninger om et stofs mutagene og carcinogene 
potentiale i pattedyr.
 
Tilbagemutationstesten med bakterier anvendes generelt til en indle ­
dende screening for gentoksiske virkninger og, især, punktmutations ­
inducerende aktivitet. Det er ved hjælp af en omfattende database 
påvist, at mange kemiske stoffer, som giver positivt resultat i denne 
test, også har mutagen virkning i andre test. Der findes mutagene stolfer, der ikke er påvist ved denne test; årsagen hertil kan tilskrives det påviste endpoints specifikke karakter, forskelle i metabolismeak ­
tivering og forskelle i biotilgængelighed. På den anden side kan 
faktorer, der øger tilbagemutationstestens følsomhed, føre til et for højt skøn over stoffets mutagene aktivitet.
 
Tilbagemutationstesten med bakterier kan være uegnet til evaluering 
af bestemte klasser af kemiske stoffer, f.eks. stærkt baktericide 
forbindelser (f.eks. visse antibiotika) og forbindelser, der antages 
(eller vides) at gribe specifikt ind i pattedyrcellers replikationssystem (f.eks. visse topoisomeraseinhibitorer og visse nucleosidanaloger). I sådanne tilfælde kan mutationstest i pattedyr være mere velegnede.
 
Selv om mange af de stoffer, der er positive i denne test, er kræft ­
fremkaldende hos pattedyr, er korrelationen ikke fuldstændig. Den 
afhænger af den kemiske klasse, og der findes carcinogener, der ikke påvises ved denne test, fordi de virker via andre ikke-gentoksiske mekanismer eller mekanismer, der ikke findes i bakterieceller.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Opslæmninger af bakterieceller udsættes for teststoffet med og uden 
et exogent metabolismeaktiveringssystem. Ved pladeinkorporerings ­
metoden blandes disse opslæmninger med en topagar og hældes ud på et minimalsubstrat. Ved præinkubationsmetoden inkuberes 
behandlingsblandingen, hvorefter den blandes med topagar inden 
udhældning på minimalsubstrat. For begge metoders vedkommende tælles revertantkolonierne efter to-tre dages inkubation, og der sammenlignes med antallet af spontane revertantkolonier på kontrol ­
pladerne med opløsningsmiddel.
 
Der er beskrevet en række fremgangsmåder for udførelse af tilbage ­
mutationstesten med bakterier, Blandt de mest almindeligt benyttede er pladeinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4), præinkubations ­
metoden (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktuationsmetoden (9) (10) og 
suspensionsmetoden (11). Der er beskrevet modifikationer til test 
af gasser og dampe (12).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
De i denne metode beskrevne fremgangsmåder vedrører især pladein ­
korporeringsmetoden og præinkubationsmetoden. De er begge accep ­
table til udførelse af forsøgene både med og uden metabolismeaktive ­
ring. Nogle stoffer, bl.a. kortkædede alifatiske nitrosaminer, divalente metaller, aldehyder, azofarvestoffer og diazoforbindelser, pyrollizidi ­
nalkaloider, allylforbindelser og nitroforbindelser (3), kan mest effek ­
tivt påvises ved præinkubationsmetoden. Det er også kendt, at visse klasser af mutagener ikke altid påvises ved standardmetoder som f.eks. pladeinkorporeringsmetoden og præinkubationsmetoden. Sådanne 
tilfælde bør betragtes som »særtilfælde«, og det anbefales kraftigt at 
anvende alternative metoder til påvisning i disse tilfælde. Følgende »særtilfælde« er konstateret (samt eksempler på fremgangsmåder, der kan benyttes til påvisning): azofarvestoffer og diazoforbindelser (3) (5) 
(6) (13), gasser og flygtige stoffer (12) (14) (15) (16) og glycosider (17) 
(18), Afvigelser fra standardmetoden skal begrundes sagligt.
 
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.5.1.  Præparater  
1.5.1.1.  Bakterier  
Friske bakteriekulturer fremdyrkes til den sidste del af den eksponen ­
tielle fase eller til begyndelsen af den stationære fase (ca. 10  9 celler 
pr. ml). Kulturer sidst i den stationære fase bør ikke benyttes. Det er 
vigtigt, at de kulturer, der benyttes i forsøgene, har et højt indhold af levedygtige bakterier. Titeren kan godtgøres enten ved hjælp af tidligere kontroldata for vækstkurver eller ved bestemmelse af 
antallet af levedygtige celler i det enkelte forsøg ved udpladning.
 
Som inkubationstemperatur anbefales 37  o C. 
Der skal benyttes mindst fem bakteriestammer, deriblandt fire 
stammer af S. typhimurium (TA1535; TA1537 eller TA97a eller TA97; TA98; og TA100), som er påvist at være pålidelige, og hvis respons er reproducerbar mellem laboratorier. Disse fire S. 
typhimurium-stammer har GC-basepar på de primære reversionssted, 
og det vides, at de ikke altid påviser visse oxiderende mutagener, tværbindende stoffer og hydraziner. Sådanne stoffer kan påvises med 
E. coli WP2-stammer eller S. typhimurium TA102 (19), som har 
AT-basepar på det primære reversionssted. Derfor kan følgende kombination af stammer anbefales:
 
— S. typhimurium TA 1535, og  
— S. typhimurium TA 1537, TA97 eller TA97a, og  
— S. typhimurium TA98, og  
— S. typhimurium TA100, og  
— E. coli WP2 uvrA, eller E. coli WP2 uvrA (pKM101) eller S. 
typhimurium TA102.  
For at kunne påvise tværbindende mutagener kan det foretrækkes at 
vælge TA102 eller at tilføje en DNA-reparationsdygtig stamme af E. 
coli (f.eks. E. coli WP2 eller E. coli WP2 (pKM101)).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Der benyttes anerkendte metoder til stamkulturfremstilling, markørve ­
rifikation og opbevaring. For hver enkelt frosset kulturpræparat påvises 
den aminosyrebetingede vækst (histidin for S. typhimurium-stammer og tryptophan for E. coli-stammer). Andre fænotypiske egenskaber skal kontrolleres på lignende måde, således tilstedeværende eller mang ­
lende R-faktorplasmider, når det er relevant (dvs. ampicillinresistens 
hos TA98-stammen, TA-100- og TA97a- eller TA97-stammcn, WP2 uvrA-stammen og WP2 uvrA (pKM101)-stammen, samt ampicillin- og tetracyclinresistens hos TA102-stammen), tilstedeværelse af karakteri ­
stiske mutationer (dvs. rfa-mutation hos S. typhimurium ved hjælp af 
følsomhed over for krystalviolet og uvrA-mutation hos E. coli eller uvrB-mutation hos S. typhimurium ved hjælp af følsomhed over for ultraviolet lys) (2) (3). Stammerne skal ligeledes give kimtal for spon ­
tane revertanter inden for den hyppighed, der må forventes ud fra 
laboratoriets hidtidige kontroldata, og helst inden for den hyppighed, der er angivet i litteraturen.
 
1.5.1.2.  Substrat  
Der benyttes en egnet minimalagar (f.eks. med Vogel-Bonner mini ­
malsubstrat E og glucose) og en topagar med histidin og biotin eller tryptophan, så der tillades nogle få celledelinger (1) (2) (9).
 
1.5.1.3.  Metabolismeaktivering  
Bakterierne udsættes for teststoffet både med og uden et egnet meta ­
bolismeaktiveringssystem. Det mest almindeligt anvendte system er en cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af 
levere fra rotter, der har været behandlet med enzyminducerede 
stoffer såsom Aroclor 1254 (1) (2) eller en blanding af phenobar ­
biton og β-naphthoflavon (18) (20) (21). Postmitokondriefraktionen 
anvendes normalt i en koncentration på 5-30 % (v/v) i S9-blandin ­
gen. Valg af metabolismeaktiveringssystem og dets beskaffenhed kan 
afhænge af, hvilken kemisk klasse teststoffet tilhører. I nogle tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at benytte postmitokondriefraktion i mere end én koncentration. For azofarvestoffer og diazoforbindelser 
kan et reduktivt metabolismeaktiveringssystem være mere velegnet 
(6) (13).
 
1.5.1.4.  Teststof/testpræparat  
Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløs ­
ningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende inden behandling af bakterierne. Teststoffer i væskeform kan enten tilsættes direkte til testsystemet eller fortyndes inden behandlingen. Der benyttes frisk 
fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at 
opbevaring er acceptabel.
 
Der må ikke være mistanke om, at opløsningsmiddel/bærestof 
reagerer kemisk med teststoffet, og opløsningsmiddel/bærestof skal 
være kompatibel med bakteriernes overlevelse og S9-aktiviteten (22). 
Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbe ­
fales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt 
opløsningsmiddel/bærestofsystem. Ved undersøgelse af stoffer, der er 
ustabile i vand, skal de organiske opløsningsmidler være vandfrie.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Testbetingelser  
1.5.2.1.  Teststammer (se punkt 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Eksponeringskoncentration  
Stoffets cytotoksicitet og dets opløselighed i den endelige testblan ­
ding er blandt de kriterier, der skal tages hensyn til ved valg af 
højeste koncentration.  
Det kan være hensigtsmæssigt at bestemme toksicitet og opløse ­
lighed ved et indledende forsøg. Cytotoksicitet kan påvises ved et fald i antallet af revertantkolonier, ved en opklaring eller hæmning af baggrundsvæksten eller ved graden af overlevelse i de behandlede 
kulturer. Et stofs cytotoksicitet kan ændres ved, at der er metabolis ­
meaktiveringssystemer til stede. Uopløselighed bedømmes ved, at der med det blotte øje kan iagttages udfældning i slutblandingen 
under de faktiske forsøgsbetingelser.
 
Der anbefales en maksimal testkoncentration af opløselige ikke-cyto ­
toksiske stoffer på 5 mg/plade eller 5 μl/plade. For ikke-cytotoksiske 
stoffer, der ikke er opløselige med 5 mg/plade eller 5 μl/plade, skal 
en eller flere af de undersøgte koncentrationer være uopløselig i slutblandingen. Teststoffer, der er cytotoksiske allerede under 
5 mg/plade eller 5 μl/plade. testes op til den cytotoksiske koncen ­
tration. Bundfald må ikke have indflydelse på bedømmelsen.
 
Der benyttes mindst fem forskellige analyserbare koncentrationer af 
teststoffer med en afstand på ca. en halv logaritme ( √10) mellem 
koncentrationerne i det indledende forsøg. Ved undersøgelse af en koncentration/respons-sammenhæng kan mindre intervaller være 
hensigtsmæssigt. Test ved koncentrationer over 5 mg/plade eller 5 
μl/plade kan tages under overvejelse, når bedømmelsen vedrører 
stoffer med et betydeligt indhold af potentielt mutagene urenheder.
 
1.5.2.3.  Negative og positive kontrolprøver  
I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative 
(opløsningsmiddel eller bærestof) stammespecifikke kontrolprøver, 
såvel med som uden metabolismeaktivering. Der vælges en sådan 
koncentration i den positive kontrol, at det enkelte forsøg effektivitet godtgøres.
 
Ved forsøg med metabolismeaktivering udvælges positive kontrolre ­
ferencestoffer ud fra den valgte type bakteriestamme.  
Nedenfor er der eksempler på stoffer, som er egnede som positive 
kontrolstoffer i forsøg med metabolismeaktivering:  
CAS nr. Einecs nr. Stof  
781-43-1 212-308-4 9,10-dimethylanthracen 
57-97-6 200-359-5 7,1 2-dimethylbenz[ a]anthracen 
50-32-8 200-028-5 benzo[a]pyren 
613-13-8 210-330-9 2-aminoanthracen  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
CAS nr. Einecs nr. Stof  
50-18-0 cyclophosphamid 
6055-19-2 200-015-4 cyclophosphamidmonohydrat  
Følgende stof er egnet som positivt kontrolstof ved reduktiv meta ­
bolismeaktivering:  
CAS nr. Einecs nr. Stof  
573-58-0 209-358-4 Congo-rødt  
2-aminoanthracen bør ikke anvendes som eneste indikator for, om 
.S9-blandingen er effektiv. Hvis der benyttes 2-aminoanthracen, skal hver batch af S9 tillige karakteriseres med et mutagen, der kræver 
metabolismeaktivering med mikrosomenzymer, f.eks, benzo[a]pyren 
eller dimethylbenzanthracen.
 
Nedenfor er der eksempler på stoffer til brug som stammespecifikke 
positive kontrolstoffer i forsøg uden exogen metabolismeaktivering:  
CAS nr. Einecs nr. Stof Stamme  
26628-22-8 247-852-1 natriumazid TA 1535 og TA 100 
607-57-8 210-138-5 2-nitrofluoren TA 98 
90-45-9 201-995-6 9-aminoacridin TA 1537, TA 97 og TA 97a 
17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 og TA 97a 
80-15-9 201-254-7 cumenbydroperoxid TA 102 50-07-7 200-008-6 mitomycin C WP2 uvrA og TA 102 
70-25-7 200-730-1 N-ethyl-N-nitro-N-nitrosogua ­
nidin WP2, WP2 uvrA og WP2 uvrA 
(pKM101) 
56-57-5 200-281-1 4-nitroquinolin-l-oxid WP2, WP2 uvrA og WP2 uvrA 
(pKM101) 
3688-53-7 furylfuramid (AF2) plasmidholdige stammer
 
Der kan benyttes andre egnede referencestoffer til positiv kontrol. 
Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer.
 
Der skal indgå negative kontrolprøver, der kun består af opløsnings ­
middel eller bærestof uden teststof, og som behandles på samme måde som de øvrige testgrupper. Desuden skal der være ubehandlede kontrolprøver, medmindre der foreligger tidligere opnåede kontrol ­
data, der viser, at det valgte opløsningsmiddel ingen skadelige eller 
mutagene virkninger har.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Fremgangsmåde  
Ved pladeinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4) uden metabolismeak ­
tivering blandes normalt 0,05 ml eller 0,1 ml testopløsning, 0,1 ml frisk bakteriekultur (indeholdende ca. 10
 8 levedygtige celler) og 0,5 
ml steril buffer med 2,0 ml topagar. Ved forsøg med metabolismeak ­
tivering blandes normalt ca. 0,5 ml metabolismeaktiveringsblanding, indeholdende en passende mængde postmitokondriefraktion (5-30 % (v/v) i metabolismeaktiveringsblandingen), med topagaren (2,0 ml), 
bakterierne og teststoffet/testopløsningen. Indholdet i de enkelte glas 
blandes og hældes ud over overfladen på en minimalagarplade. Topagaren henstilles til størkning inden inkubering.
 
Ved præinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6) forinkuberes 
teststof/testopløsning sammen med teststammen (indeholdende ca. 10
 8 levedygtige celler) og steril buffer eller metabolismeaktiverings ­
systemet (0,5 ml) normalt i 20 minutter ved 30-37  o C, inden der 
blandes med topagaren, og blandingen hældes ud på overfladen af en 
minimalagarplade. Normalt blandes 0,05 ml eller 0,1 ml teststof/testopløsning, 0,1 ml bakteriekultur og 0,5 ml S9-blanding 
eller steril buffer med 2,0 ml topagar. Glassene bør under forinku ­
beringen beluftes i rysteapparat.
 
Til forsvarlig bestemmelse af variationen udføres der tredobbelt 
udpladning ved hvert dosisniveau. Dobbelt udpladning kan accepte ­
res, hvis den begrundes sagligt. Tab af en plade af og til gør ikke 
nødvendigvis testen ubrugelig.  
Gasformige og flygtige stoffer testes ved en egnet metode, f.eks. i 
forseglede dyrkningsflasker (12) (14) (15) (16).  
1.5.4.  Inkubering  
Alle plader i hvert forsøg inkuberes ved 37  o C i 48-72 timer. Efter 
inkuberingen tælles antallet af revertantkolonier pr. plade.  
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Dataene forelægges som antallet af revertantkolonier pr. plade. Også 
antallet af revertantkolonier på både negative (opløsningsmiddelkon ­
trol og en eventuel ubehandlet kontrol) og positive kontrolplader oplyses. Tallene for hver enkelt plade, gennemsnittet af revertantko ­
lonier pr. plade og standardafvigelsen opgives for teststoffet og for 
positive og negative kontrolplader (ubehandlede og/eller med opløs ­
ningsmiddel).
 
Der findes ingen krav til verifikation af et klart positivt resultat. 
Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere undersøgelser, helst med ændrede forsøgsbetingelser. Negative resultater bekræftes efter en vurdering af de enkelte tilfælde. Anses bekræftelse af negative 
resultater ikke for nødvendige, skal dette begrundes. Ved opfølgende 
forsøg kan man overveje at ændre på undersøgelsens parametre, så de bedømte forsøgsbetingelser udvides. Blandt de undersøgelsespara ­
metre, der kan ændres på, er koncentrationernes spredning, behand ­
lingsmetoden (pladeinkorporering eller væske-præinkubation) og 
metabolismeaktiveringen.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
Der findes en række kriterier for, om der er opnået et positivt resul ­
tat, f.eks. en koncentrationsafhængig forøgelse af antallet af rever ­
tantkolonier pr. plade i det undersøgte interval og/eller en repro ­
ducerbar forøgelse af antallet af revertantkolonier pr. plade ved en 
eller flere koncentrationer, for mindst én stamme med eller uden metabolismeaktivering (23). Der bør i første række ses på resulta ­
ternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som 
hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (24). Statistisk 
signifikans bør dog ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt.
 
Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for 
mutagent i denne test.  
De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i 
sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvety ­
digt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.
 
Et positivt resultat af en tilbagemutationstest med bakterier viser, at 
teststoffet fremkalder punktmutationer ved basesubstitution eller læserammeforskydning i genomet hos Salmonella typhimurium og/eller Escherichia coli. Et negativt resultat viser, at teststoffet 
under testbetingelserne ikke er mutagent i den undersøge organisme.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— begrundelse for valg af bærestof  
— teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, 
hvis den kendes  
Stammer:  
— anvendte stammer  
— antal celler pr. kultur  
— karakteristika for stammen  
Testbetingelser:  
— mængde teststof pr. plade (mg/plade eller μl/plade) med begrun ­
delse for valg af dosis og pladeantal pr. koncentration  
— anvendte substrater  
— metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, 
herunder acceptkriterier  
— behandlingsmetoder  
Resultater:  
— tegn på toksicitet  
— tegn på udfældning  
— kimtal for de enkelte plader  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— gennemsnitligt antal revertantkolonier pr. plade og standardafvi ­
gelsen  
— dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt  
— eventuelle statistiske analyser  
— data for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og 
positive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit 
og standardafvigelser  
— data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og posi ­
tive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og standardafvigelser
 
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the 
Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Muta ­
tion Res., 31, pp. 347-364.  
(2) Maron, D.M. and Arnes, B.N. (1983), Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173- 215.
 
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt. S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233.
 
(4) Kier, L.D., Brusick, D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., 
Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortel ­
mans. K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The  
Salmonella  typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A 
Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240.  
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto. Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 
pp. 91-96.  
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, 
Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285.
 
(7) Gatehouse. D.G. Rowland. I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. 
and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic 
Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D.J. Kirkland, 
Cambridge University Press, pp. 13-61.  
(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (198 7), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. food Safety. 8. pp. 167-177.
 
(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976), Use of 
a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutations Res., 38, pp. 33-42.
 
(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. 
Bridges (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. 
J., Legator, M., Nichols, \V. and Ramel, C, Elsevier, Amster ­
dam-New York-Oxford, pp. 141-161.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella typhimurium,  Environmental Mutagene ­
sis, 3, pp. 453-465.  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 
307, pp. 335-344.  
(13) Prival, M.]., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and 
Vaughan, V.L. (1984), Mutagenicity of Benzidinc and Benzi ­
dine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modi ­
fied Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47.  
(14) Zeiger, E., Anderson B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and 
Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. 
Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. 
Mutagen. 19, pp. 2-141.  
(15) Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R.G. (1977), 
Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology. D. Scott, B. 
Bridges and F. Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, 
pp. 249-258.
 
(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.,G. and Claxton, 
L.D, (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic 
Activity of Volatile Organic Chemicals in the 
Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis. 9, pp. 421-441.
 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A. Shirai, M., Sawamura, M. and 
Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring 
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in  Salomonella typhimurium . Cancer Res., 39, pp. 
3780-3782.
 
(18) Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Arnes, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dictary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.
 
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wcdd, D. J. and Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of  Salmonella lyphimurium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, 
pp. 285-291.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer or Metabolic Activation Systems, in:  In Vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
 
(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Tatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  in viiro  Genotoxicity 
Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.  
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Arnes, B.N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/ Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350.
 
(23) Claxton, L.D., Allen J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nest ­
mann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial 
Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G.A.T. Green, M.H.L, Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D.J., 
Cambridge University Press, pp. 28-65.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  MUTAGENICITETSTESTNING OG SCREENING FOR KARCI ­
NOGENICITET GENMUTATION — SACCHAROMYCES 
CEREVlSIAE  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
En række forskellige haploide og diploide stammer af gæren  Saccha­
romyces cerevisiae  kan anvendes ved undersøgelse af genmutationer, 
som induceres af kemiske stoffer med og uden metabolisk aktivering.  
Man har anvendt fremadmutationssystemer med haploide stammer 
f.eks, ved bestemmelse af mutation fra røde, adeninafhængige mutanter (ade-1, ade-2) til dobbelt adeninafhængige hvide mutanter og selektive systemer som induktion af canavanin-resistens og cyclo ­
heximid-resistens.
 
Det bedst validerede tilbagemutationssystem bygger på anvendelse af 
den haploide stamme XV185-14C, der er bærer af ochre nonsense ­
mutationerne ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 og trp 5-48, og som muterer tilbage med baseparsubstitutionsmutagener, der inducerer punktmuta ­
tioner eller ochre suppressormutationer. XV185-14C er også bærer af 
his 1-7 markøren, som er en missense-mutation, der hovedsagelig 
muterer tilbage ved mutationer i andre loci, og markøren hom 3-10, der muterer tilbage med frameshift-mutagener.
 
Den eneste bredt anvendte diploide stamme af S. cerevisiae er D  7 , 
der er homozygot i ilv 1-92.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
Opløsninger af teststof og kontrol fremstilles umiddelbart inden 
testen under anvendelse af et passende vehikel. Hvis der anvendes 
organiske kemiske forbindelser, som er uopløselige i vand, kan orga ­
niske opløsningsmidler som ætanol, acetone eller dimetylsulfoxid (DMSO) bruges i koncentrationer på op til 2 % v/v. Koncentrationen 
af vehiklet bør ikke medføre nogen ændring i cellevitalitet og vækst ­
karakteristika.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g  
Cellerne eksponeres for teststoffet både med og uden tilsætning af et 
passende eksogent metabolisk aktiveringssystem.  
Det hyppigst anvendte system består af en co-faktorberiget postmito ­
chondrisk fraktion af lever fra gnavere, som er forbehandlede med 
enzyminducerende stoffer. Andre dyrearter, væv, postmitochondriske fraktioner eller fremgangsmåder kan også være egnede til metabolisk aktivering.
 
Forsøgsbetingelser  
T e s t s t a m m e r  
Den haploide stamme XV 185-14C og den diploide stamme D  7 er de 
hyppigst anvendte i genmutationsundersøgelser. Også andre stammer 
kan være egnede.  
M e d i e r  
Ved bestemmelse af overlevelsesgrad og antal mutanter anvendes 
passende kulturmedier.  
N e g a t i v e o g p o s i t i v e k o n t r o l l e r  
Sideløbende med testkulturerne dyrkes positive kontrolkulturer, 
ubehandlede kontrolkulturer og kontrolkulturer med det anvendte opløsningsmiddel. Der anvendes egnede positive kontrolstoffer for 
hvert enkelt genetisk endpoint.
 
E k s p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n e r  
Der anvendes mindst fem forskellige koncentrationer af teststoffet 
med passende intervaller mellem koncentrationerne. Når der testes 
toksiske stoffer, bør den højeste koncentration ikke reducere over ­
levelsesgraden til mindre end 5 til 10 %. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes under anvendelse af passende fremgangs ­
måder op til opløselighedsgrænsen. Den højeste koncentration af 
ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i vand, fastlægges 
fra stof til stof.
 
I n k u b a t i o n s b e t i n g e l s e r  
Pladerne inkuberes i fire til syv dage mellem 28 og 30  o C i mørke.  
S p o n t a n e m u t a t i o n s f r e k v e n s e r  
Der anvendes subkulturer med spontane mutationsfrekvenser, som 
ligger inden for de almindeligt accepterede områder.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
A n t a l p a r a l l e l l e p l a d e r  
Der anvendes mindst tre parallelle plader for hver koncentration ved 
bestemmelsen af prototrofer, som er fremkommet ved genmutation, og af cellernes levedygtighed. Når man tester markører, der som hom 3-10 har en lav mutationsfrekvens, må antallet af plader forøges, 
således at der kan tilvejebringes en statistisk relevant mængde data.
 
Fremgangsmåde  
Stammer af S. cerevisiae eksponeres normalt ved test i væske, hvortil 
der anvendes enten celler i stationærfase eller celler i vækstfase. 
Indledende undersøgelser bør udføres med celler i vækstfase, 1-5 × 
10 7 celler pr. ml eksponeres for teststoffet i op til 18 timer ved 28 til 
37 o C under omrystning. Hvis det er nødvendigt, tilsættes en 
passende mængde metabolisk aktiveringssystem under eksponerin ­
gen. Efter eksponeringen centrifugeres og vaskes cellerne, hvorefter 
de udsås på et egnet kulturmedium. Når inkubationen er slut, regi ­
streres induktionen af genmutationer og antal overlevende på hver plade. Hvis den første undersøgelse er negativ, bør en anden udføres 
under anvendelse af celler i stationærfase. Hvis den første undersø ­
gelse er positiv, skal det efterprøves i et passende uafhængigt forsøg.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform. Antal optalte kolonier, antal mutanter, 
overlevelsesfrekvens samt mutationsfrekvens angives. Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg, Evalueringen af data baseres på 
passende statistiske metoder.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— den anvendte stamme  
— forsøgsbetingelser: celler i stationær fase eller vækstfase, medi ­
ernes sammensætning, inkubationstemperatur og -periode, meta ­
bolisk aktiveringssystem  
— eksponeringsbetingelser: eksponeringskoncentrationer, frem ­
gangsmåde og varighed, eksponeringstemperatur, positive og 
negative kontroller  
— antal optalte kolonier, antal mutanter, overlevelses- og mutations ­
frekvens, om muligt dosis-responsforhold, statistisk evaluering af data
 
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  MITOTISK REKOMBINATION — SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Der kan hos Saccharomyces cerevisiae konstateres mitotisk rekom ­
bination mellem gener (eller mere generelt mellem et gen og dets centromer) og inden for det samme gen. Den førstnævnte form kaldes mitotisk overkrydsning og frembringer reciprokke typer, 
mens den sidstnævnte som oftest ikke er reciprok og kaldes genbyt ­
ning. Overkrydsning bestemmes almindeligvis ved frembringelse af recessive homozygote kolonier eller sektorer i en heterozygot stamme, mens genbytning bestemmes ved frembringelse af prototrofe 
revertanter i en auxotrof heteroallel stamme, som bærer to forskel ­
lige, defekte alleler af det samme gen. De hyppigst anvendte stammer ved undersøgelse af mitotisk genbytning er D
 4 (med hete ­
roallele ade 2 og trp 5), BZ  34 (med heteroallel arg 4), D  7 (med 
heteroallel trp 5) og JD  1 (med heteroallele his 4 og trp 5). Mitotisk 
overkrydsning, som frembringer røde og lyserøde sektorer, kan undersøges i D
 5 og D  7 (der også kan bruges til bestemmelse af 
mitotisk genbytning og tilbagemutation af ilv 1-92), idet begge 
stammer bærer heteroallele komplementære alleler til ade 2.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
Opløsninger af teststof og kontrol- eller referencestoffer fremstilles 
umiddelbart inden testen under anvendelse af et passende opløs ­
ningsmiddel. Hvis der anvendes organiske kemiske forbindelser, som er uopløselige i vand, kan organiske opløsningsmidler som ætanol, acetone eller dimetylsulfoxid (DMSO) bruges i koncentra ­
tioner på op til 2 % v/v. Koncentrationen af vehiklet bør ikke 
medføre nogen ændring i cellevitalitet og vækstkarakteristika.
 
M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g  
Cellerne eksponeres for teststof både med og uden tilsætning af et 
passende eksogent metabolisk aktiveringssystem. Det hyppigst 
anvendte system består af en co-faktorberiget postmitochondrisk fraktion af lever fra gnavere, som er forbehandlede med enzymindu ­
cerende stoffer. Andre dyrearter, væv, postmitochondriske fraktioner 
eller fremgangsmåder kan også være egnede til metabolisk aktive ­
ring.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Forsøgsbetingelser  
T e s t s t a m m e r  
De hyppigst anvendte stammer er de diploide D  4 , D  5 , D  7 og JD  1 . 
Også andre stammer kan være egnede.  
M e d i e r  
Ved bestemmelse af overlevelsesgrad og mitotisk rekombinationsfre ­
kvens anvendes passende kulturmedier.  
N e g a t i v e o g p o s i t i v e k o n t r o l l e r  
Sideløbende med testkulturerne dyrkes positive kontrolkulturer, 
ubehandlede kontrolkulturer og kontrolkulturer med det anvendte 
opløsningsmiddel. Der anvendes egnede positive kontrolstoffer for hvert enkelt genetisk endpoint.
 
E k s p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n e r  
Der anvendes mindst fem forskellige koncentrationer af teststoffet 
med passende intervaller mellem koncentrationerne. Herunder må 
man tage hensyn til faktorer som cytotoksicitet og opløselighed. 
De laveste koncentrationer bør ikke have nogen indvirkning på cellernes levedygtighed. Når der testes toksiske stoffer, bør den højeste koncentration ikke reducere overlevelsesgraden til mindre 
end 5 til 10 %. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes 
under anvendelse af passende fremgangsmåder op til opløseligheds ­
grænsen. Den højeste koncentration af ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i vand, fastlægges fra test til test.
 
Celler i stationær fase eller vækstfase kan eksponeres for teststoffet i 
op til 18 timer. Benyttes der lange eksponeringsperioder, bør kulturerne dog undersøges mikroskopisk for sporedannelse, idet disses tilstedeværelse gør testen værdiløs.
 
I n k u b a t i o n s b e t i n g e l s e r  
Pladerne inkuberes i fire til syv dage mellem 28 og 30  o C i mørke. 
Plader, som anvendes til bestemmelse af røde og lyserøde homozy ­
gote sektorer, der er frembragt ved mitotisk overkrydsning, opbe ­
vares i køleskab (omkring 4  o C) i yderligere en til to dage inden 
optælling for at muliggøre udvikling af de rene pigmenterede kolo ­
nier. 
S p o n t a n e m i t o t i s k e r e k o m b i n a t i o n s f r e k v e n s e r  
Der anvendes subkulturer med spontane mitotiske frekvenser, som 
ligger inden for de almindeligt accepterede områder.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
A n t a l p a r a l l e l l e p l a d e r  
Der anvendes mindst tre parallelle plader for hver koncentration ved 
bestemmelsen af prototrofer, som er fremkommet ved mitotisk genbytning, og af cellernes levedygtighed. Når man tester recessive homozygoter, som er frembragt ved mitotisk overkrydsning, forøges 
antallet af plader, således at der opnås et passende antal kolonier.
 
Fremgangsmåde  
Stammer af S. cerevisiae eksponeres normalt ved test i væske, hvortil 
der anvendes enten celler i stationær fase eller celler i vækstfase. 
Indledende undersøgelser bør udføres med celler i vækstfase. 1-5 × 
10 7 celler pr. ml eksponeres for teststoffet i op til 18 timer ved 28 til 
37 o C under omrystning. Under eksponeringen tilsættes en passende 
mængde metabolisk aktiveringssystem.  
Efter eksponeringen centrifugeres og vaskes cellerne, hvorefter de 
udsås på et egnet kulturmedium. Når inkubationen er slut, registreres 
induktionen af mitotisk rekombination og antal overlevende på hver 
plade.  
Hvis den første undersøgelse er negativ, bør en anden udføres under 
anvendelse af celler i stationær fase. Hvis den første undersøgelse er positiv, skal det efterprøves i et passende uafhængigt forsøg.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform. Antal optalte kolonier, antal rekombinan ­
ter, overlevelsesgrad samt rekombinationsfrekvens angives.  
Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg.  
Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— den anvendte stamme  
— forsøgsbetingelser: celler i stationær fase eller vækstfase, medi ­
ernes sammensætning, inkubationstemperatur og -periode, meta ­
bolisk aktiveringssystem  
— eksponeringsbetingelser: eksponeringskoncentrationer, frem ­
gangsmåde og varighed, eksponeringstemperatur, positive og negative kontroller
 
— antal optalte kolonier, antal rekombinanter, overlevelses- og 
rekombinationsfrekvens, om muligt dosis/responsforhold, 
statistisk evaluering af data  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENICITET — IN VITRO-TEST FOR GENMUTATION 
I PATTEDYRCELLER  
1. METODE  
Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 476 In 
Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (1997).  
1.1. INDLEDNING  
In vitro-testen for genmutation i pattedyrceller kan benyttes til at 
påvise genmutationer, som induceres af kemiske stoffer. Blandt egnede cellelinjer er muselymfomceller L5178Y, cellelinjerne 
CHO, CHO-AS52 og V79 fra kinesisk hamster og humane lymfo ­
blastceller TK6 (1). I disse cellelinjer benyttes som genetiske end- points almindeligvis bestemmelse af mutationer ved thymidin-kinase (TK), hypoxantin-guanin-fosforibosyl-transferase (HPRT) og et 
transgen af xanthin-guanin-fosforibosyl-transferase (XPRT). I TK-, 
HPRT- og XPRT-mutationstestene påvises forskellige spektre af genetiske hændelser. Med TK og XPRT kan der på grund af deres autosomale placering påvises genetiske hændelser (f.eks. større dele ­
tioner), der ikke kan påvises ved HPRT-locus'et på X-kromosomer 
(2) (3) (4) (5) (6).
 
I in vitro-testen for genmutation i pattedyrceller kan der benyttes 
kulturer af etablerede cellelinjer eller cellestammer. Cellerne udvælges på grundlag af deres vækstegenskaber ved dyrkning og den spontane mutationsfrekvens' stabilitet.
 
Normalt kræver en in vitro-test, at der benyttes en exogen metabolis ­
meaktivering. Et sådant metabolismeaktiveringssystem kan ikke fuld ­
stændigt efterligne forholdene i pattedyr in vivo. Man må omhygge ­
ligt undgå forhold, der fører til resultater, der ikke afspejler egentlig mutagenicitet. Positive resultater, der ikke afspejler egentlig mutage ­
nicitet, kan være forårsaget af ændringer i pH eller osmolalitet eller 
høj cytotoksicitet (7).
 
Testen benyttes til screening for stoffer, der kan være mutagene eller 
carcinogene hos pattedyr. Mange af de stoffer, der er positive ved denne test, er carcinogene hos pattedyr, men korrelationen mellem denne test og carcinogenicitet er ikke fuldstændig. Den afhænger af 
den kemiske klasse, og stadig mere tyder på, at der findes carcino ­
gener, der ikke påvises ved denne test, fordi de tilsyneladende virker gennem andre ikke-gentoksiske mekanismer eller mekanismer, der ikke findes i bakterieceller (6).
 
Se også den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Fremadmutation:  En genmutation fra forældretypen til mutanten, 
som medfører ændring i eller tab af det kodede proteins enzymakti ­
vitet.  
Basesubstitutionsmutagen:  Et stof, der fremkalder substitution af et 
eller flere DNA-basepar.  
Læserammemutagen:  Et stof, der fremkalder addition eller deletion 
af et eller flere basepar i DNA-molekylet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Fænotypeekspressionsperiode:  Et tidsrum, hvorunder uændrede 
genprodukter gradvis forsvinder fra nylig muterede celler.  
Mutanthyppighed:  Antallet af observerede mutantceller divideret 
med antallet af levedygtige celler.  
Relativ total vækst:  Forøgelsen af celleantallet i et tidsrum, 
sammenlignet med en kontrolpopulation af celler: beregnes som 
produktet af suspensionsvæksten i forhold til den negative kontrol og klondannelseseffektiviteten i forhold til den negative kontrol.
 
Relativ suspensionsvækst:  Forøgelsen af celleantallet i ekspres ­
sionsperioden i forhold til den negative kontrol.  
Levedygtighed:  De behandlede cellers klondannelseseffektivitet på 
tidspunktet for selektiv udpladning efter ekspressionsperioden.  
Overlevelse:  De behandlede cellers klondannelseseffektivitet ved 
udpladningen efter behandlingsperioden; overlevelsen udtrykkes 
normalt i forhold til overlevelsen i kontrolcellepopulationen.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Celler, som mangler thymidinkinase TK på grund af fremadmuta ­
tionen TK  +/– → TK  –/– , er resistente over for de cytotoksiske virk ­
ninger af pyridinanalogen trifluorthymidin (TFT). Celler, som har thymidinkinase, er følsomme over for TFT, som inhiberer celleme ­
tabolismen og standser den videre celledeling. Det betyder, at 
mutantceller kan formere sig under tilstedeværelse af TFT, mens normale celler, der indeholder thymidinkinase, ikke kan. På tilsva ­
rende måde kan celler, der mangler HPRT eller XPRT, udvælges ved 
deres modstandsdygtighed over for henholdsvis 6-thioguanin (TG) 
og 8-azaguanin (AG). Hvis der i en af genmutationstestene med pattedyrceller testes et stof, der er baseanalogt med det selektive stof eller beslægtet hermed, må der først ses nøje på teststoffets 
egenskaber. Eksempelvis bør enhver mistanke om, at teststoffet har 
selektiv toksicitet over for mutantceller og ikke-mutantceller, under ­
søges. Det vil sige, at det selektive system/stofs egnethed skal bekræftes, når der testes stoffer, der kemisk er beslægtet med det 
selektive stof (8).
 
Celler i suspensionskultur eller enkeltlagskultur udsættes for test ­
stoffet både med og uden metabolismeaktivering i et passende tids ­
rum, hvorefter der ved dyrkning i subkultur påvises cytotoksicitet og 
gives mulighed for fænotypeekspression, inden mutanterne udvælges 
(9) (10) (11) (12) (13). Cytotoksiciteten bestemmes sædvanligvis ved at måle kulturernes relative klondannelseseffektivitet (overlevelse) eller deres relative totale vækst efter behandlingsperioden. De 
behandlede kulturer holdes så lang tid i vækstmediet, afhængigt af 
hvert valgt locus og celletype, at fænotypeekspressionen af induce ­
rede mutationer bliver næsten optimal. Mutanthyppigheden bestemmes ved udsåning af et kendt antal celler i et medium, der 
indeholder det selektive stof, til påvisning af mutantceller og i et 
medium uden selektivt stof til bestemmelse af klondannelseseffekti ­
viteten (levedygtigheden). Efter en passende inkuberingstid tælles kolonierne. Mutanthyppigheden afledes af antallet af mutantkolonier 
i det selektive medium og antallet af kolonier i det ikke-selektive 
medium.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Præparater  
1.4.1.1.  Celler  
En lang række cellelinjer lader sig anvende i denne test, herunder 
subkloner af L5178Y, CHO, CHO-AS52, V-79 og TK6-celler. For 
de celletyper, der benyttes i denne test, bør der være påvist følsomhed over for kemiske mutagener, høj klondannelseseffektivitet og stabil spontan mutationshyppighed. Cellerne bør kontrolleres for 
forurening med mycoplasma og bør ikke anvendes, hvis de er forure ­
net.
 
Testen bør tilrettelægges med forud fastlagt følsomhed og styrke. 
Antallet af celler, kulturer og koncentrationer af teststof bør afspejle 
disse valgte parametre (14). Det mindste antal levedygtige celler, der overlever behandling og benyttes i testens faser, baseres på den spontane mutationshyppighed. Som rettesnor kan der anvendes et 
celleantal, der er mindst ti gange den reciprokke spontane mutations ­
hyppighed. Det anbefales dog, at der mindst anvendes10
 6 celler. Der 
skal foreligge tilstrækkelige historiske data om cellesystemet til at dokumentere, at testen har konstant høj effektivitet.
 
1.4.1.2.  Medier og dyrkningsbetingelser  
Der benyttes egnede dyrkningsmedier og inkuberingsbetingelser 
(dyrkningsbeholdere. temperatur, CO  2 -koncentration, luftfugtighed). 
Medier vælges efter, hvilke selektive systemer og celletyper der 
benyttes i testen. Det er især vigtigt at vælge sådanne dyrknings ­
betingelser, at både mutantcellers og ikke-mutantcellers vækst og kolonidannelse bliver optimal under ekspressionsperioden.
 
1.4.1.3.  Fremstilling af kulturer  
Cellerne opformeres fra stamkulturer, udsås i dyrkningsmedium og 
inkuberes ved 37  o C. Det kan være nødvendigt at rense kulturerne 
for allerede-eksisterende mutanter, inden de benyttes i denne test.  
1.4.1.4.  Metabolismeaktivering  
Cellerne udsættes for teststoffet både med og uden et egnet metabo ­
lismeaktiveringssystem. Det mest almindeligt anvendte system er en 
cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af levere fra rotter, der har været behandlet med enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) eller en blanding af 
phenobarbiton og β-naphthoflavon (19) (20).
 
Postmitokondriefraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1- 
10 % (v/v) i det færdige testsubstrat. Valget af metabolismeaktive ­
ringssystem og dets beskaffenhed kan afhænge af, hvilken kemisk 
klasse teststoffet tilhører. I nogle tilfælde vil det være hensigtsmæs ­
sigt at benytte postmitokondriefraktion i mere end én koncentration.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Nogle udviklingstendenser, f.eks. genetisk konstruktion af cellelinjer, 
der udtrykker specifikke aktiverende enzymer, kan rumme potentiale 
for endogen aktivering. Valget af en bestemt cellelinje skal begrundes sagligt (f.eks. ved, at cytochrom P450-coenzymet er rele ­
vant for teststoffets metabolisme).
 
1.4.1.5.  Teststof/testpræparat  
Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløs ­
ningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende inden behandling af cellerne. Teststoffer i væskeform kan enten tilsættes direkte til 
testsystemet eller fortyndes inden behandlingen. Der benyttes frisk 
fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
 
1.4.2.  Testbetingelser  
1.4.2.1.  Opløsningsmiddel/bærestof  
Der må ikke være mistanke om. at opløsningsmiddel/bærestof 
reagerer kemisk med teststoffet, og opløsningsmiddel/bærestof må 
hverken hæmme cellernes overlevelse eller S9-aktiviteten. Benyttes 
der andre opløsningsmiddel/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt 
opløsningsmiddel/bærestofsystem. Ved undersøgelse af stoffer, der 
er ustabile i vand, skal de organiske opløsningsmidler være vandfrie. Vand kan fjernes ved tilsætning af molekylsi.
 
1.4.2.2.  Eksponeringskoncentrationer  
Stoffets cytotoksicitet, dets opløselighed i testsystemet samt 
ændringer i pH og osmolalitet er blandt de kriterier, der skal tages hensyn til ved valg af højeste koncentration.
 
Cytotoksiciteten bestemmes med og uden metabolismeaktivering i 
hovedforsøget ved hjælp af en passende indikator for celleintegritet og -vækst, f.eks. relativ klondannelseseffektivitet (overlevelse) eller relativ total vækst. Det kan være hensigtsmæssigt at bestemme cyto ­
toksicitet og opløselighed ved et indledende forsøg.
 
Der benyttes mindst fire analyserbare koncentrationer. Hvis der er 
tale om cytotoksicitet, skal koncentrationerne dække et interval fra største toksicitet til ringe eller ingen toksicitet; det betyder normalt, 
at koncentrationerne højst er adskilt med en faktor mellem 2 og 
√10. Hvis den højeste koncentration er baseret på cytotoksicitet, 
bør den føre til en relativ overlevelse (relativ klondannelseseffekti ­
vitet) eller relativ total vækst på ca. 10-20 % (ikke under 10 %). For 
stoffer, der er forholdsvis ikke-cytotoksiske, må testkoncentrationen 
højst være 5 mg/ml, 5 μl/ml eller 0,01 M (den laveste af de tre).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Forholdsvis uopløselige stoffer testes op til eller over opløseligheds ­
grænsen ved dyrkningsbetingelserne. Tegn på uopløselighed bør 
konstateres i det endelige behandlingsmedium, som cellerne udsættes for. Det kan være hensigtsmæssigt at bedømme opløseligheden både ved behandlingens begyndelse og afslutning, eftersom opløselig ­
heden kan ændre sig under eksponeringen i testsystemet som følge 
af, at der er celler, S9, serum mv. til stede. Uopløselighed kan iagt ­
tages med det blotte øje. Bundfald må ikke have indflydelse på bedømmelsen.
 
1.4.2.3.  Kontrolprøver  
I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative 
(opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolprøver, såvel med som 
uden metabolismeaktivering, Når der benyttes metabolismeaktive ­
ring, bør der som positivt kontrolkemikalie anvendes et, der kræver aktivering for at virke mutagent.
 
Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer.  
Metabolismeaktive ­
ring Locus Stof CAS nr. Einecs nr.  
Ingen exogen 
metabolismeak ­
tivering HPRT Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
TK (små og 
store kolo ­
nier) Methylmethansulfonat 66-27-3 200-625-0 
XPRT Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Exogen metabolis ­
meaktivering HFRT 3-methylcholanthren 56-49-5 200-276-4 
N-nitrosodimethylamin 62-75-9 200-549-8 7,1 2-dimethylbenzanthracen 57-97-6 200-359-5 
TK (små og 
store kolo ­
nier) Cyclophosphamid 50-18-0 200-015-4 
Cyclophosphamidmonohydrat 6055-19-2 
Benzo[ a]pyren 50-32-8 200-028-5 
3-methylcholanthren 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-nitrosodimethylamin (ved højt 
indhold af S9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[ a]pyren 50-32-8 200-028-5
 
Der kan benyttes andre egnede stoffer til positiv kontrol, f.eks. kan et 
laboratorium, der har en historisk database over 5-brom-2'-deoxyu ­
ridin (CAS nr. 59-14-3, Einecs nr. 200-415-9), også benytte dette 
referencestof. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk 
beslægtede stoffer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Der skal indgå negative kontrolprøver, hvor behandlingsmediet kun 
består af opløsningsmiddel eller bærestof, og som behandles på 
samme måde som de øvrige kulturer. Desuden skal der være ubehandlede kontrolprøver, medmindre der foreligger tidligere opnåede kontroldata, der viser, at det valgte opløsningsmiddel 
ingen skadelige eller mutagene virkninger har.
 
1.4.3.  Fremgangsmåde  
1.4.3.1.  Behandiing med teststof  
Celler under formering udsættes for teststoffet både med og uden 
metabolismeaktivering. Eksponeringen skal vare en passende tid 
(normalt har tre-fem timer den fornødne virkning). Eksponeringen kan strække sig over én eller flere cellecyklusser.
 
Ved hver undersøgt koncentration benyttes der enten en eller to 
behandlede kulturer. Benyttes der kun én kultur, øges antallet af koncentrationer, således at der bliver tilstrækkeligt mange kulturer til analyse (dvs. mindst otte analyserbare koncentrationer). Der bør 
anvendes to negative kontrolkulturer (opløsningsmiddel).
 
Gasformige og flygtige stoffer testes ved en egnet metode, f.eks. i 
forseglede dyrkningsflasker (21) (22).  
1.4.3.2.  Måling af overlevelse, levedygtighed og mutanthyppighed  
Efter eksponeringen vaskes cellerne og dyrkes med henblik på at 
bestemme overlevelsen og give mulighed for ekspression af mutant ­
fænotypen. Måling af cytotoksicitet ved bestemmelse af kulturernes 
relative klondannelseseffektivitet (overlevelse) eller relative totale vækst påbegyndes normalt efter behandlingsperioden.
 
Hvert locus har et fast mindste tidsrum, som kræves til nær optimal 
fænotypeekspression af nyligt inducerede mutanter (HPRT og XPRT kræver mindst seks-otte dage og TK mindst to dage). Cellerne dyrkes i medier med og uden selektivt stof med henblik på bestem ­
melse af henholdsvis antallet af mutanter og klondannelseseffektivi ­
teten. Måling af levedygtigheden (der benyttes til beregning af mutanthyppigheden) påbegyndes efter ekspressionstiden ved udplad ­
ning på ikke-selektivt medium.
 
Hvis teststoffet reagerer positivt i L5178Y TK  +/– -testen, bestemmes 
kolonistørrelsen i mindst en af testkulturerne (den højeste positive koncentration) og i de positive og negative kontrolkulturer. Hvis teststoffet reagerer negativt i L517SY TK
 +/– -testen, bestemmes kolo ­
nistørrelsen i de positive og negative kontrolkulturer. Også ved 
undersøgelser med TK6TK  +/– kan kolonistørrelsen bestemmes.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Dataene skal omfatte bestemmelse af cytotoksicitet og levedygtighed, 
kimtælling og mutanthyppighed for de behandlede kulturer og 
kontrolkulturerne. I tilfælde af positiv reaktion i L5178Y TK  +/– - 
testen, bedømmes kolonierne ud fra kriterier om små og store kolo ­
nier ved mindst én koncentration af teststoffet (højeste positive koncentration) og med den negative og positive kontrol. Den mole ­
kylære og cytogenetiske natur af mutanter i både store og små kolo ­
nier er udforsket detaljeret (23) (24). I TK
 +/– -testen bedømmes kolo ­
nierne efter kriterier for normalt voksende (store) og langsomt 
voksende (små) kolonier (25). De mutantceller, der har de mest 
alvorlige genetiske skader, har længere fordoblingstider og danner derfor mindre kolonier. Sådanne skader ligger typisk fra tab af hele genet til karyotypisk synlige kromosomaberrationer. Induktion af 
mutanter i små kolonier har været tilskrevet kemikalier, der frem ­
kalder kromosomaberrationer, der kan ses med det blotte øje (26). Mindre alvorligt berørte mutantceller vokser med omtrent samme hastighed som modercellerne og danner store kolonier.
 
Overlevelsen (den relative klondannelseseffektivitet) eller den rela ­
tive totale vækst skal oplyses. Mutanthyppigheden opgives som antallet af mutantceller i forhold til antallet af overlevende celler.
 
Der anføres data for hver enkelt kultur. Derudover sammenfattes alle 
data i tabelform.  
Der findes ingen krav til verifikation af et klart positivt resultat. 
Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere undersøgelser, helst med ændrede forsøgsbetingelser. Negative resultater bekræftes efter 
en vurdering af de enkelte tilfælde. Anses bekræftelse af negative 
resultater ikke for nødvendigt, skal dette begrundes. Ved forsøg til opfølgning af tvetydige eller negative resultater bør man overveje at ændre på undersøgelsens parametre, så de bedømte forsøgsbetin ­
gelser udvides. Blandt de undersøgelsesparametre. der kan ændres 
på, er koncentrationernes spredning og metabolismeaktiveringen.
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING Af RESULTATER  
Der findes en række kriterier for, om der er opnået et positivt resul ­
tat, f.eks. en koncentrationsafhængig eller reproducerbar forøgelse af mutanthyppigheden. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpe ­
middel ved evalueringen af testresultaterne. Statistisk signifikans 
bør ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som positivt.
 
Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for 
mutagent i denne test.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i 
sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig 
bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvety ­
digt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.  
Et positivt resultat af en in vitro-test for genmutation i pattedyrceller 
viser, at teststoffet fremkalder genmutationer i de benyttede dyrkede pattedyrceller. En positiv koncentrationsafhængig reproducerbar 
respons er mest sigende. Et negativt resultat viser, at teststoffet 
under testbetingelserne ikke fremkalder genmutationer i de benyttede dyrkede pattedyrceller.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— begrundelse for valg af opløsningsmiddel/bærestof  
— teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, 
hvis den kendes.  
Celler:  
— celletype og -ilde  
— antal cellekulturer  
— eventuelt antal passager  
— eventuelle metoder til vedligehold af cellekultur  
— fravær af mycoplasma  
Testbetingelser:  
— begrundelse for valg af koncentrationer og antal kulturer, 
herunder f.eks. eventuelle cytotoksicitetsdata og opløseligheds ­
begrænsninger  
— substratsammensætning og eventuel CO  2 -koncentration  
— teststoffets koncentration  
— volumen af tilsat bærestof og teststof  
— inkuberingstemperatur  
— inkuberingstid  
— behandlingens varighed  
— celletæthed under behandlingen  
— metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, 
herunder acceptkriterier  
— positive og negative kontrolprøver  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— ekspressionsperiodens længde (herunder antal udsåede celler, 
subkulturer og eventuel feeding)  
— selektive agenser  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ 
eller tvetydig  
— metoder til tælling af levedygtige celler og mutantceller  
— definition af kolonier, hvor størrelse og type lægges til grund 
(herunder kriterier for, hvilke kolonier der er »små« og »store«)  
Resultater:  
— tegn på toksicitet  
— tegn på udfældning  
— data om pH og osmolalitet under udsættelsen for teststoffet, hvis 
disse værdier er målt  
— kolonistørrelse, hvis den er bedømt, i hvert fald for negative og 
positive kontrolkulturer  
— laboratoriets kapacitet til at påvise mutanter i små kolonier med 
L 5178Y TK  +/– -systemet  
— dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt  
— eventuelle statistiske analyser  
— data for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og 
positive kontrolprøver  
— data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og posi ­
tive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og 
standardafvigelser  
— mutanthyppighed  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, 
K.R. (eds.) (1987), Banbury Report 28: Mammalian Cell 
Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968), Mammalian Cell Gene ­
tics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells  In Vitro,  Proc. Natl. Acad. Sri. USA, 
61, pp. 1306-1312.
 
(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, pp. 467-485.
 
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, 
K.L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse 
Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 
394-403.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C. S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of 
Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, pp. 121-128.  
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M, Nishi, Y., 
Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group 
Report. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, pp. 235-239.
 
(7) Scott. D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity 
Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.
 
(8) Clive, D., McCuen, R. Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavour ­
nin, K.H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in 
Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251.
 
(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988), 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster 
Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environment Protection 
Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, pp. 17-36.
 
(10) Li. A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., 
Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C, Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987), A Guide for the Performance of the 
Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phospho ­
ribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141.
 
(11) Liber, H.I., Yandell, D.W. and Little, J.B. (1989). A Compa ­
rison of Mutation Induction at the TK and HPRT Lod in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res. 216, pp. 9-17.
 
(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and 1CR 191-Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147.
 
(13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984), Procedures 
for the L5178Y/TK  +/– — TK  +/– Mouse Lymphoma Cell 
Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, 
New York, pp. 239-268.
 
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M, Green, M.H.L., Cole, 
J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: 
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland 
D.J., ed., Cambridge University Press, pp. 66-101.
 
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res., 46, pp. 36 5-37 3.
 
(16) Arnes, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, 
pp. 347-364.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and 
Brown M.M.M. (1979), Validation and Characterisation of 
the L5178Y/TK  +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay 
System, Mutat Res., 59, pp. 61-108.  
(18) Maron, D.M. and Arnes, B.N. (1983), Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173- 215.
 
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.C, 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alterna ­
tives to Aroclor 1254-Induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, in  In Vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot. R.M. (eds.) Elsevier, North- 
Holland, pp. 85-88.
 
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/ 
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile 
Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L, Schaich, K.M, (eds.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.
 
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
 
(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and 
Hozier, J.C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells, Proc. Natl. Acad. Sti. USA. 87, pp, 51-55.
 
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C. Howard, B.E., Batson, 
A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluo ­
rothymidine-Resistant (TFT  r ) Mutants of L5178Y/TK  +/- Mouse 
Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174.  
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and I.ittle, J.B. (1990), Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, pp. 
89-102.
 
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990), Comparison of Chromo ­
some Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient 
Mutant Frequency in L5178Y/TK  +/- — 3.7.2C Mouse Lymp ­
homa Cells, Mutagenesis 5, pp.609-614.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  DNA-SKADE OG DNA-REPARATION — UNSCHEDULED 
DNA SYNTHESIS — PATTEDYRCELLER IN VITRO  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Ved Unscheduled DNA Synthesis (UDS) test undersøges dna-repa ­
rationen efter bortskæring og fjernelse af skader, som er induceret af kemiske eller fysiske agentia. Testen bygger på inkorporering af tritiummærket thymidin (
 3 H-TdR) i pattedyrcellers dna, når disse 
celler ikke er i S-fase. Optagelsen af  3 H-TdR kan måles ved auto ­
radiografi eller væskescintillationstælling (LSC) af dna fra de eksponerede celler. Medmindre der anvendes primærkulturer af rotte ­
hepatocytter, eksponeres dyrkede pattedyrceller for teststoffet med og 
uden et eksogen metabolisk aktiveringssystem. UDS-test kan også 
foretages i in vivo-systemer.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
Teststof samt kontrol- og referencestoffer tilsættes kulturmediet eller 
opløses eller suspenderes i egnede vehikler og tilsættes derefter kulturmediet inden testen. Den derved opnåede vehikelkoncentration 
bør ikke påvirke cellernes levedygtighed.
 
Der kan anvendes primærkulturer af rottehepatocytter, humane 
lymfocytter eller etablerede cellelinjer (f.eks. humane diploide fibro ­
blaster).  
Cellerne eksponeres for teststoffet med og uden et passende meta ­
bolisk aktiveringssystem.  
Forsøgsbetingelser  
A n t a l k u l t u r e r  
Ved autoradiografisk påvisning af UDS anvendes mindst to og ved 
LSC seks kulturer (eller mindre hvis det er videnskabeligt begrundet) 
for hvert eksperimentelt punkt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
N e g a t i v e o g p o s i t i v e k o n t r o l l e r  
Der foretages sideløbende både positiv og negativ (ubehandlet 
og/eller vehikel) kontrol med og uden metabolisk aktivering i hvert forsøg.
 
Som positiv kontrol ved anvendelse af rottehepatocytter kan f.eks. 
benyttes 7,12-DMBA (7,12-dimetylbenzanthracen) eller 2-AAF (2- acetylaminofluoren). Som positiv kontrol ved anvendelse af etable ­
rede cellelinjer kan f.eks. benyttes 4-NQO (4-nitroquinolin-N-oxid) 
både i forbindelse med autoradiografisk registrering og LSC uden metabolisk aktivering. Når der anvendes metaboliske aktiverings ­
systemer kan f.eks. N-dimetylnitrosamin benyttes til positiv kontrol.
 
E k s p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n e r  
Der anvendes en række forskellige koncentrationer af teststoffet over 
et interval, som dækker alle påvirkninger. Den højeste koncentration bør have en vis cytotoksisk virkning. Stoffer, som er relativt uopløse ­
lige i vand, testes op til opløselighedsgrænsen. Den højeste koncen ­
tration af ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i vand, fastlægges fra test til test.
 
C e l l e r  
Der benyttes passende vækstmedier, CO  2 -koncentration, temperatur 
og fugtighed til opretholdelse af kulturerne. Det undersøges regel ­
mæssigt, om etablerede cellelinjer er kontamineret med mycoplasma.  
M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g  
Der anvendes ikke metaboliske aktiveringssystemer i forbindelse 
med primærkulturer af hepatocytter. Etablerede cellelinjer og lymfo ­
cytter eksponeres for teststoffer både med og uden et passende meta ­
bolisk aktiveringssystem.  
Fremgangsmåde  
F o r b e r e d e l s e a f k u l t u r e r  
Etablerede cellelinjer fremstilles på basis af stamkulturer (f.eks. ved 
trypsinering eller afrystning) og udsås med passende tæthed i dyrk ­
ningsskåle, hvorefter de inkuberes ved 37  o C. 
Primære rottehepatocytkulturer etableres, når hepatocytter umiddel ­
bart efter isolering anbringes i et passende medium og får lov til at 
hæfte sig til den voksende overflade.  
Humane lymfocytkulturer dyrkes under anvendelse af dertil egnede 
teknikker.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
E k s p o n e r i n g a f k u l t u r e r n e f o r t e s t s t o f f e t  
Primærkulturer af rottehepatocytter  
Rottehepatocytter eksponeres for teststoffet kort tid efter isolering i 
et passende tidsrum i et medium, som indeholder  3 H-TdR. Efter 
eksponeringen fjernes cellerne fra mediet, hvorefter de vaskes, 
fikseres og tørres. Pladerne dyppes i en autoradiografisk emulsion 
(alternativt kan »stripping« -film anvendes) og eksponeres, fremkal ­
des, farves og tælles.  
Etablerede cellelinjer og lymfocytter  
Autoradiografisk teknik:  Cellekulturerne eksponeres først for test ­
stoffet i et passende tidsrum og derefter for  3 H-TdR. Eksponerings ­
perioderne afhænger af stofferne, de metaboliske aktiveringssystemer og celletyperne. Eksponeringen for
 3 H-TdR bør enten foregå 
samtidig med eksponeringen for teststoffet eller få minutter efter, 
således at UDS måles på det tidspunkt, hvor aktiviteten er størst. 
Valget mellem de to fremgangsmåder afhænger af risikoen for inter ­
aktion mellem teststoffet og  3 H-TdR. Det er muligt at skelne mellem 
UDS og semi-konservativ dna replication, idet den sidstnævnte 
proces inhiberes ved anvendelse af f.eks. argininfattige medier, et 
lavt serumindhold eller tilsætning af hydroxyurinstof til kulturmediet.  
LSC-måling af UDS:  Inden eksponering for teststoffet blokeres 
cellernes overgang til S-fasen som tidligere beskrevet. Derefter eksponeres cellerne på samme måde som ved den autoradiografiske 
teknik. Umiddelbart efter inkubationen ekstraheres cellernes dna og 
det totale dna-indhold samt mængden af inkorporeret
 3 H-TdR måles.  
Når de nævnte teknikker anvendes på humane lymfocytter, er det 
unødvendigt at hæmme den semi-konservative dna replication, med 
mindre der er tale om stimulerede kulturer.  
Analyse  
A u t o r a d i o g r a f i s k m å l i n g  
Ved måling af UDS i dyrkede celler medregnes kerner i S-fasen 
ikke. Der tælles mindst 50 celler pr. koncentration. Objektglassene 
kodes før tællingen. På hvert glas tælles en række forskellige tilfæl ­
digt valgte områder med stor indbyrdes afstand. Mængden af inkor ­
poreret  3 H-TdR i cytoplasmaet bestemmes ved tælling i tre områder 
på størrelse med kernen i hver optalt celles cytoplasma.  
L S C - m å l i n g  
Ved LSC-måling af UDS anvendes et passende antal kulturer pr. 
koncentration og pr. kontrolforsøg.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg.  
2. DATA  
Data opstilles i tabelform.  
2.1. AUTORADIOGRAFISK MÅLING  
Mængden af inkorporeret  3 H-TdR i cytoplasmaet og antallet af korn, 
som registreres i cellekerneområdet, anføres separat.  
Fordelingen af mængden af inkorporeret  3 H-TdR i cytoplasmaet og 
antallet af korn pr. kerne kan beskrives ved hjælp af middel, median 
og modus.  
2.2. LSC-MÅLING  
Ved LSC-måling angives  3 H-TdR indlejringen som dpm/ μg dna. 
Indlejringsfordelingen kan beskrives ved hjælp af middel dpm/ μg 
dna med tilhørende standardafgivelse.  
Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— de anvendte celler, tæthed og antal passager på eksponeringstids ­
punktet, antal cellekulturer  
— metoder til opretholdelse af cellekulturer, herunder medium, 
temperatur og CO  2 -koncentration  
— teststof, vehikel, koncentrationer og begrundelse for valget af de 
anvendte koncentrationer  
— detaljerede oplysninger om de metaboliske aktiveringssystemer  
— eksponeringsplan  
— positiv og negativ kontrol  
— den anvendte autoradiografiske teknik  
— fremgangsmåde ved blokering af cellernes overgang til S-fasen  
— fremgangsmåde ved ekstration af dna og bestemmelse af det 
totale dna-indhold ved LSC-målingen  
— om muligt dosis-responsforhold  
— statistisk evaluering  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  SØSTERKROMATID OMBYTNING (SCE) IN VITRO  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Søsterkromatid ombytning (SCE) test er en korttidstest, som 
anvendes til påvisning af reciprok udveksling af DNA mellem 
de to søsterkromatider i et kromosom under replikation. Ved 
SCE sker der en udveksling af dna replikationsprodukter ved tilsyneladende homologe loci. Udvekslingsprocessen bygger antage ­
ligt på brud og genforening af dna-kæder, men dens molekylære 
grundlag er næsten ukendt. For at kunne påvise SCE er det 
nødvendigt at differentialmærke søsterkromatiderne, hvilket kan gøres ved at inkorporere bromdeoxyuridin (BrdU) i kromo ­
somernes dna gennem to cellecykler.
 
Pattedyrceller eksponeres in vitro for teststoffet med og uden et 
eksogent metabolisk aktiveringssystem fra pattedyr, hvis dette skønnes relevant, og dyrkes gennem to cellecykler i et medium, som indholder BrdU. Cellerne behandles med en tentrådsinhibitor 
(f.eks. colchicin) med henblik på at akkumulere celler på et 
metafaselignende trin i mitosen (c-metafase), hvorefter de høstes og præpareres til kromosomanalyse.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
— Der kan anvendes primærkulturer (humane lymfocytter) eller 
etablerede cellelinjer (f.eks. Chinese Hamster Ovary celler). 
Ved anvendelse af cellelinjer bør det undersøges, om kulturen 
er kontamineret med mycoplasma.  
— Der anvendes egnede kulturmedier og inkubationsbetingelser 
(temperatur, dyrkningsskåle, CO  2 -koncentration og fugtighed).  
— Teststoffet tilsættes kulturmediet eller opløses eller suspenderes i 
et egnet vehikel, inden cellerne eksponeres. Den derved opnåede koncentration af vehikel i testkulturen bør ikke påvirke cellernes levedygtighed eller vækstrate og en mulig påvirkning af SCE- 
frekvensen kontrolleres ved dyrkning af en kontrolkultur i opløs ­
ningsmidlet.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Cellerne eksponeres for teststoffet både med og uden et eksogent 
metabolisk aktiveringssystem fra pattedyr. Når der benyttes celle ­
typer med endogen metabolisk aktivering, bør aktiveringsform og -hastighed være egnet til den kemiske stofklasse, der testes.
 
Forsøgsbetingelser  
A n t a l k u l t u r e r  
Der anvendes mindst to parallelle kulturer for hvert eksperimentelt 
punkt.  
P o s i t i v o g n e g a t i v k o n t r o l  
Som positiv kontrol anvendes i hvert enkelt forsøg både en direkte 
virkende kemisk forbindelse og en forbindelse, som kræver metabo ­
lisk aktivering. Desuden foretages vehikelkontrol.  
Følgende kemiske forbindelser kan f.eks. anvendes til positiv 
kontrol:  
— direkte virkende forbindelse:  
— ætylmetansulfonat  
— indirekte virkende forbindelse:  
— cyclofosfamid.  
Når det skønnes relevant, bør der foretages supplerende positiv 
kontrol med anvendelse af en kemisk forbindelse af samme kemiske stofklasse som teststoffet.
 
E k s p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n e r  
Der anvendes mindst tre koncentrationer af teststoffet med passende 
intervaller mellem koncentrationerne. Den højeste koncentration bør 
have en tydelig toksisk virkning, men den må ikke forhindre den nødvendige celledeling. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes under anvendelse af passende fremgangsmåder op til opløselig ­
hedsgrænsen. Den højeste koncentration af ikke-toksiske teststoffer, 
som er frit opløselige i vand, fastlægges fra test til test.
 
Fremgangsmåde  
D y r k n i n g  
Cellelinjer etableres på basis af stamkulturer (f.eks. ved trypsinering 
eller afrystning) og udsås med passende tæthed i dyrkningsskåle, 
hvorefter de inkuberes ved 37  o C. Når der er tale om monolagskul ­
turer, justeres antallet af celler pr. kulturskål, således at kulturerne på høsttidspunktet højst dækker 50 % af vækstarealet. Cellerne kan også dyrkes i suspension. Humane lymfocytkulturer dyrkes under anven ­
delse af dertil egnede teknikker på basis af hepariniseret blod og 
inkuberes ved 37
 o C. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
E k s p o n e r i n g  
Celler i eksponentiel vækstfase eksponeres for teststoffet i et 
passende tidsrum. Som oftest vil en eller to timer være tilstrækkeligt, men i nogle tilfælde kan eksponeringsperioden udvides til at dække to fulde cellecykler. Celler, hvis endogene metaboliske aktivering er 
utilstrækkelig, eksponeres både med og uden tilsætning af et 
passende metabolisk aktiveringssystem. Efter eksponeringen vaskes cellerne frie for teststof og dyrkes gennem to cellecykler i et medium, som indeholder BrdU. Alternativt kan cellerne eksponeres 
for teststoffet og BrdU samtidigt gennem en periode svarende til to 
cellecykler.
 
Humane lymfocytter eksponeres, mens de befinder sig i semisynkron 
tilstand.  
Cellerne analyseres under deres anden deling efter eksponeringen, 
hvilket sikrer, at eksponeringsperioden dækker størstedelen af de 
følsomme faser i cellecyclus. Alle kulturer, som er tilsat BrdU, 
opbevares og manipuleres i mørke eller svagt lys fra glødelamper frem til cellerne høstes for at minimere fotolysen af dna, som inde ­
holder BrdU.
 
H ø s t a f c e l l e r  
Cellekulturerne behandles med en tentrådsinhibitor (f.eks. colchicin) 
en til fire timer, før de høstes. Høst og kromosompræparering foregår 
særskilt for hver enkelt kultur.  
K r o m o s o m p r æ p a r e r i n g o g f a r v n i n g  
Ved kromosompræpareringen anvendes cytogenetiske standardtek ­
nikker. Farvning på objektglas med henblik på at påvise SCE kan foretages på en række forskellige måder (f.eks. fluorescens plus Giemsafarvning).
 
A n a l y s e  
Antallet af celler, som underkastes analyse, baseres på den spontane 
SCE-frekvens i kontrolforsøg. Normalt undersøges mindst 25 
velpræparerede metafaser pr. kultur for SCE. Objektglassene kodes før analysen. Ved analyse af humane lymfocytter medtages kun metafaser med 46 centromerer. Ved analyse af etablerede cellelinjer 
medtages kun metafaser med det modale antal centromerer ± 2. Det 
anføres, hvorvidt ombytning i mærkningen omkring centromeret betragtes som SCE. Resultaterne efterprøves i et uafhængigt forsøg.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform. Antal SCE pr. metafase og antal SCE pr. 
kromosom anføres separat for alle eksponerede kulturer og kontrol ­
kulturer.  
Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— de anvendte celler, metoder til opretholdelse af cellekulturer  
— forsøgsbetingelser: mediernes sammensætning, CO  2 -koncentra ­
tion, teststofkoncentration, det anvendte vehikel, inkubationstem ­
peratur, eksponeringsperiode, den anvendte tentrådsinhibitor plus oplysninger om koncentration og behandlingens varighed, det 
anvendte metaboliske aktiveringssystem, positiv og negativ 
kontrol
 
— antal cellekulturer pr. eksperimentelt punkt  
— detaljerede oplysninger om objektpræpareringsteknikken  
— antal analyserede metafaser (separate oplysninger for hver enkelt 
kultur)  
— gennemsnitligt antal SCE pr. celle og pr. kromosom (data 
angives separat for hver kultur)  
— SCE-registreringskriterier  
— begrundelse for valget af doser  
— om muligt dosis-responsforhold  
— statistisk evaluering  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  KØNSBUNDET RECESSIV LETAL TEST — DROSOPHILA 
MELANOGASTER  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Ved kønsbundet recessiv letal test (SLRL) under anvendelse af Dros ­
ophila melanogaster undersøges forekomsten af både punktmuta ­
tioner og mindre tabsmutationer hos insektets afkom. Der er tale om en fremadmutationstest, hvorved det er muligt at screene ca. 800 loci på X-kromosomet med henblik på registrering af mutatio ­
ner. Dette antal udgør ca. 80 % af alle X-kromosomets loci. X- 
kromosomet udgør omkring en femtedel af den samlede haploide kromosommængde.
 
Mutationer i Drosophila melanogasters X-kromosom kommer fæno ­
typisk til udtryk hos hanner, som er bærere af det muterede gen. Når mutationen under hemizygote betingelser er letal, konstateres dette som fravær af en af de to typer hanner, der normalt findes i en 
heterozygot huns afkom. I SLRL-testen udnyttes dette forhold ved 
hjælp af specielt arrangerede kromosomer med særlige markører.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
S t a m m e r  
Der kan anvendes hanner af veldefinerede vildtypestammer og 
hunner fra Muller-5-stammen. Hunner fra andre stammer med 
passende mærkning og multipelt inverterede X-kromosomer kan 
også anvendes.  
T e s t s t o f  
Teststoffet opløses i vand. Stoffer, som er uopløselige i vand, kan 
opløses eller suspenderes i egnede bærestoffer (f.eks, en blanding af ætanol og Tween-60 eller -80) og derefter fortyndes i vand eller 
saltvand inden indgift. Dimetylsulfoxid bør ikke benyttes som bære ­
stof.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
A n t a l  
Testen udformes således, at testfølsomhed og -specificitet er fastlagt 
på forhånd. Den spontane mutationsfrekvens, som registreres i kontrolforsøg, vil være af stor betydning for antallet af eksponerede kromosomer, der skal analyseres.
 
A d m i n i s t r a t i o n s m å d e  
Eksponeringen kan foregå ved oral indgivelse, injektion eller ved 
udsættelse for gasser eller dampe. Teststoffet kan eventuelt indgives 
i en sukkeropløsning. Om nødvendigt kan det opløses i en 0,7 % NaCl-opløsning og injiceres i thorax eller abdomen.
 
N e g a t i v e o g p o s i t i v e k o n t r o l l e r  
Der foretages negativ (vehikel) og positiv kontrol. Hvis der fore ­
ligger egnede historiske kontroldata fra laboratorieforsøg, er det 
imidlertid ikke nødvendigt at foretage sideløbende kontrol.  
E k s p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n e r  
Der anvendes tre eksponeringskoncentrationer. Til en foreløbig 
vurdering kan anvendes en enkelt koncentration, som enten kan være den højeste koncentration, insekterne kan tåle, eller en koncen ­
tration, som forårsager nogen grad af toksisk virkning. Ved ikke- 
toksiske stoffer eksponeres for de størst mulige koncentrationer.
 
F r e m g a n g s m å d e  
Vildtypehanner (tre til fem dage gamle) eksponeres for teststoffet og 
parres enkeltvis med flere jomfruelige hunner fra Muller-5-stammen 
eller fra andre stammer med passende markører (multipelt inverte ­
rede X-kromosomer). Hunnerne udskiftes med nye jomfruelige hunner hver anden eller hver tredje dag, indtil hele kønscellecyklus er dækket. Hunnernes afkom registreres med henblik på konstatering 
af letale effekter, som svarer til eksponeringens virkning på 
henholdsvis modne sædceller, spermatider i sene stadier eller middel ­
stadier, spermatider i tidlige stadier, spermatocytter og spermatogo ­
nier.
 
Heterozygote F  1 -hunner fra de ovennævnte krydsninger parres indi ­
viduelt (dvs. en hun pr. glas) med deres brødre. I F  2 -generationen 
registreres hver bestand med henblik på konstatering af fravær af vildtypehanner. Hvis en bestand er afkom af en F
 1 -hun, som synes 
at bære et letalt gen i det parentale X-kromosom (dvs. der optræder 
ingen hanner med det eksponerede kromosom), testes døtre af denne hun med samme genotype med henblik på konstatering af, om den letale effekt gentages i næste generation.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform. Antal testede X-kromosomer, antal ufrugt ­
bare hanner og antal letale kromosomer anføres for hver ekspone ­
ringskoncentration og for hver enkelt af de eksponerede hanners 
parringsperioder. Ligeledes anføres antal klynger af forskellig stør ­
relse pr. han. Alle resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Evalueringen af kønsbunden recessiv letal test baseres på passende 
statistiske metoder. I tilfælde af ophobning af generationer med 
recessive letale gener, som stammer fra en enkelt han, registreres disse og evalueres på et passende statistisk grundlag.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— stammer: de anvendte Drosophila-stammer, insekternes alder, 
antal eksponerede hanner, antal sterile hanner, antal etablerede F
 2 -bestande, antal F  2 -bestande uden afkom, antal kromosomer 
med letale gener på hvert kønscellestadium  
— kriterier for fastlæggelse af størrelsen af de eksponerede grupper  
— forsøgsbetingelser: detaljeret beskrivelse af eksponerings- og stik ­
prøvetagningsplan, eksponeringskoncentrationer, toksicitetsdata, 
negativ (opløsningsmiddel) og positiv kontrol, såfremt der fore ­
tages kontrol  
— kriterier for registrering af letale mutationer  
— om muligt dosis-responsforhold  
— statistisk evaluering  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  CELLETRANSFORMATIONSTEST — PATTEDYRCELLER IN 
VITRO  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIPPER FOR TESTMETODEN  
Kulturer af pattedyrceller kan anvendes til påvisning in vitro af 
fænotypiske forandringer, som induceres af kemiske forbindelser, 
der forbindes med maligne transformationer in vivo. Hyppigt anvendte celletyper er C3H10T
 1/2 , 3T3, SHE, Fischer-rotte, og 
testene bygger på forandringer i cellemorfologien, vækstevnen eller 
forankringsevnen i blød agar. Der findes også mindre hyppigt anvendte systemer, som bruges til undersøgelse af andre fysiologiske eller morfologiske forandringer i celler som følge af eksponering for 
karcinogene kemiske forbindelser. Der er ikke beskrevet nogen 
direkte virkningsmekanistisk forbindelse mellem cancer og de gene ­
tiske endpoints, der anvendes i disse in vitro test. Nogle af testsy ­
stemerne kan anvendes til påvisning af tumorpromotorer. Den cyto ­
toksiske effekt kan bestemmes ved måling af teststoffets påvirkning 
af evnen til at danne kolonier (kloningsstyrken) eller af kulturernes vækstrater. Formålet med at måle den cytotoksiske effekt er at konstatere, om eksponeringen for teststoffet er toksikologisk rele ­
vant, men kan ikke benyttes til beregning af transformationsfre ­
kvensen i alle test, eftersom nogle kræver lang inkubationstid og/eller overførsel til nye plader.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
C e l l e r  
Der kan anvendes en række forskellige cellelinjer eller primærceller, 
afhængigt af hvilken transformationstest der foretages. Forsøgs ­
lederen må sikre, at de anvendte celler undergår relevante fænoty ­
piske forandringer efter eksponering for kendte karcinogener, og 
forsøgslederens eget laboratorium må have påvist og dokumenteret den anvendte tests validitet og pålidelighed.
 
M e d i u m  
Der anvendes medier og forsøgsbetingelser i overensstemmelse med 
den anvendte transformationstest.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
T e s t s t o f  
Teststoffet tilsættes kulturmediet eller opløses eller suspenderes i et 
egnet vehikel, inden cellerne eksponeres. Den derved opnåede vehi ­
kelkoncentration bør ikke påvirke cellernes levedygtighed, vækstrate eller transformationsfrekvens.
 
M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g  
Cellerne eksponeres for teststoffet både med og uden et eksogent 
metabolisk aktiveringssystem fra pattedyr. Når der benyttes celler 
med endogen metabolisk aktivering, bør det være påvist, at aktive ­
ringsformen egner sig til den form for kemisk forbindelse, der testes.  
Forsøgsbetingelser  
P o s i t i v e o g n e g a t i v e k o n t r o l l e r  
Som positiv kontrol anvendes i hvert enkelt forsøg både en direkte 
virkende kemisk forbindelse og en forbindelse, som kræver metabo ­
lisk aktivering. Desuden foretages negativ (vehikel) kontrol.  
Følgende kemiske forbindelser kan f.eks. anvendes til positiv 
kontrol:  
— direkte virkende forbindelser:  
— etylmetansulfonat  
— β-propiolacton  
— forbindelser som kræver metabolisk aktivering:  
— 2-acetylaminofluoren  
— 4-dimetylaminoazobenzen  
— 7,12-dimetylbenzanthracen.  
Når det skønnes relevant, bør der foretages supplerende positiv 
kontrol med anvendelse af en forbindelse af samme kemiske stof ­
klasse som teststoffet.  
E k s p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n e r  
Der anvendes en række forskellige koncentrationer af teststoffet, 
således at der frembringes koncentrationsafhængige toksiske virknin ­
ger. Den højeste koncentration bør medføre en lav overlevelsesgrad, 
og overlevelsesgraden ved den laveste koncentration bør være af 
samme størrelsesorden som ved det negative kontrolforsøg. Stoffer, som er relativt uopløselige i vand, testes under anvendelse af passende fremgangsmåder op til opløselighedsgrænsen. Den højeste 
koncentration af ikke-toksiske teststoffer, som er frit opløselige i 
vand, fastlægges fra test til test.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Fremgangsmåde  
Cellerne eksponeres i en passende periode afhængig af det anvendte 
testsystem. Dette kan indebære gentagne doseringer med udskiftning af medium (og om nødvendigt ny metabolisk aktivering), hvis der er tale om langvarig eksponering. Celler, hvis endogene metaboliske 
aktivering er utilstrækkelig, testes både med og uden et passende 
metabolisk aktiveringssystem. Efter eksponeringen vaskes cellerne frie for teststof, hvorefter de dyrkes med henblik på at lade den transformerede fænotype, testen bygger på, komme til udtryk og 
med henblik på bestemmelse af transformationsfrekvensen. Alle 
resultater efterprøves i et uafhængigt forsøg.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform og kan foreligge i forskellige former 
afhængigt af den anvendte test. Der kan f.eks. være tale om optæl ­
ling på plader, registrering af positive plader eller antal transfor ­
merede celler. Når det er relevant, udtrykkes overlevelsesgraden 
som en procentdel af overlevelsen i kontrolforsøgene, og transfor ­
mationsfrekvensen udtrykkes som antal transformerede celler pr. overlevende. Evalueringen af data baseres på passende statistiske 
metoder.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— den anvendte celletype, antal cellekulturer, metoder til oprethol ­
delse af cellekulturer  
— forsøgsbetingelser: teststofkoncentration, anvendt vehikel, inku ­
bationstemperatur, inkubationstid, eksponeringens varighed og 
frekvens, celletæthed under eksponeringen, det anvendte ekso ­
gene metaboliske aktiveringssystem, positive og negative kontroller, specifikation af den fænotype testen bygger på, det 
anvendte selektive system (hvis et sådant er anvendt), begrun ­
delse for valget af doser
 
— metoder til registrering af levedygtige og transformerede celler  
— statistisk evaluering  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  DOMINANT LETAL TEST — GNAVER  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Dominante letale virkninger forårsager, at fostret dør. Nå der ved 
eksponering for kemiske forbindelser induceres dominante letale mutationer, er dette et tegn pi, at forsøgsdyreartens kønscellevæv 
er blevet afficeret. Der er bred enighed om, at dominante letale 
gener opstår på grund af kromosomskader (strukturelle og numeriske anomalier). Hvis eksponerede hunners afkom dør på det embryonale stade, kan dette også skyldes toksiske virkninger.
 
Normalt eksponeres hanner for teststoffet, hvorefter de parres med 
ueksponerede jomfruelige hunner. Kønscellernes forskellige stadier kan undersøges separat ved anvendelse af på hinanden følgende 
parringsperioder. Forøgelsen af antallet af døde implantater pr. hun 
i den eksponerede gruppe i forhold til antallet af døde implantater pr. hun i kontrolgruppen er udtryk for den letale virkning efter implan ­
tation. Den letale virkning før implantation kan vurderes på grundlag 
af optælling af corpora lutea eller ved sammenligning af det totale 
antal implantater pr. hun i de eksponerede grupper og kontrolgrup ­
pen. Den totale dominante letale virkning er summen af de letale virkninger før og efter implantation. Beregningen af den totale domi ­
nante letale virkning baseres på sammenligning af antallet af levende 
implantater pr. hun i forsøgsgruppen og antallet af levende implan ­
tater pr. hun i kontrolgruppen. Fald i antallet af implantater i bestemte tidsperioder kan skyldes celledrab (af spermatocytter 
og/eller spermatogonier).
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
Hvis det er muligt, opløses eller suspenderes teststoffet i fysiologisk 
saltvand. Kemiske forbindelser, som er uopløselige i vand, opløses eller suspenderes i egnede vehikler. Det anvendte vehikel bør ikke 
interferere med teststoffet eller have nogen toksisk virkning. Testop ­
løsningen anvendes umiddelbart efter fremstillingen.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Forsøgsbetingelser  
A d m i n i s t r a t i o n s m å d e  
Normalt gives hele dosis på en gang. Der kan også anvendes dose ­
ring ad flere gange, når der er toksikologisk begrundelse herfor. Sædvanligvis indgives teststoffet ved oral intubering eller intraperi ­
toneal injektion. Der kan også benyttes andre former for indgift.
 
F o r s ø g s d y r  
Rotter eller mus anbefales som forsøgsdyr. Sunde og fuldt køns ­
modne dyr fordeles randomiseret i forsøgs- og kontrolgrupper.  
A n t a l o g k ø n  
Der anvendes et passende antal hanner under hensyntagen til den 
spontane variation i den biologiske egenskab, der danner grundlag for testen. Det valgte antal baseres på den på forhånd fastlagte test ­
følsomhed og signifikansstyrke. I et typisk forsøg vil antallet af 
hanner være tilstrækkeligt til, at mellem 30 og 50 hunner bliver drægtige i hver parringsperiode.
 
N e g a t i v e o g p o s i t i v e k o n t r o l l e r  
Normalt foretages sideløbende positiv og negativ (vehikel) kontrol i 
hvert forsøg. Når der foreligger acceptable positive kontrolresultater fra nyligt foretagne forsøg i samme laboratorium, kan disse dog 
anvendes i stedet for sideløbende positiv kontrol. Positive kontrol ­
stoffer anvendes i tilstrækkeligt lave doser (f.eks. MMS, i.p., 10 mg/ ­
kg) til at vise testens følsomhed.
 
D o s i s n i v e a u e r  
Der anvendes normalt tre forskellige dosisniveauer. Den største dosis 
bør forårsage tegn på toksisk virkning eller nedsætte de eksponerede dyrs fertilitet. I nogle tilfælde vil et enkelt højt dosisniveau være tilstrækkeligt.
 
G r æ n s e t e s t  
Når der er tale om ikke-toksiske stoffer, testes en enkeltdosis 
på 5 g/kg eller gentagen indgift af 1 g/kg/dag.  
Fremgangsmåde  
Der kan anvendes flere forskellige doseringsskemaer. Normalt gives 
hele dosis på en gang, men andre skemaer lader sig også anvende.  
Hannerne parres efter doseringen individuelt med en eller to ikke- 
doserede jomfruelige hunner i på hinanden følgende perioder af passende længde. Hunnerne placeres hos hannerne i en periode svarende til mindst en ægcyklus, eller indtil parringen har fundet 
sted, hvilket konstateres ved tilstedeværelse af sperma i vagina 
eller en vaginalprop.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Antallet af parringer efter doseringen fastlægges på grundlag af dose ­
ringsskemaet, som skal sikre, at alle kønscellestadier er repræsenteret 
efter doseringen.  
Hunner aflives i anden halvdel af drægtighedsperioden, og uterus' 
indhold undersøges med henblik på bestemmelse af antallet af levende og døde implantater. Ovarierne undersøges med henblik på 
bestemmelse af antallet af corpora lutea.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform med angivelse af antal hanner samt antal 
drægtige og ikke drægtige hunner. Resultaterne af hver enkelt parring, herunder identificering af hver enkelt han og hun anføres 
individuelt. For hver hun anføres parringsuge, hannens dosis og 
antallet af levende og døde implantater.
 
Beregningen af den totale dominante letale virkning baseres på 
sammenligning af antallet af levende implantater pr. hun i forsøgs ­
gruppen og antallet af levende implantater pr. hun i kontrolgruppen. 
Forholdet mellem døde og levende implantater i forsøgsgruppen 
sammenlignes med forholdet i kontrolgruppen med henblik på bestemmelse af den letale virkning efter implantation.
 
Hvis data registreres som tidlige og sene dødsfald, skal dette fremgå 
af tabellerne. Hvis der foretages vurdering af den letale virkning før 
implantation, anføres denne. Den letale virkning før implantation kan 
beregnes som forskellen mellem antallet af corpora lutea og antallet af implantater eller som et lavere gennemsnitligt antal implantationer 
pr. uterus i forhold til kontrolparringerne.
 
Evalueringen af data baseres på passende statistiske metoder.  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— dyreart, stamme, de anvendte dyrs alder og vægt, antal dyr af 
hvert køn i forsøgs- og kontrolgrupperne  
— teststof, bærestof, de anvendte dosisniveauer og begrundelse for 
valget af disse, negativ og positiv kontrol, toksicitetsdata  
— administrationsmåde og doseringens varighed  
— parringsskema  
— metode til konstatering af, om parring har fundet sted  
— aflivningstidspunkt  
— kriterier for registrering af dominante letale gener  
— om muligt dosis-responsforhold  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— statistisk evaluering  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  TEST FOR KROMOSOMABERRATIONER I 
SPERMATOGONIER HOS PATTEDYR  
1. METODE  
Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 48 3 
Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med in vivo-testen for kromosomaberrationer i spermato ­
gonier hos pattedyr er et påvise, om et stof forårsager strukturelle 
kromosomafvigelser i spermatogonier fra pattedyr (1) (2) (3) (4) (5). Der er to typer strukturændringer, kromosomtypen og kromatidtypen. De fleste kemiske mutagener forårsager ændringer af kromatidtypen, 
men også ændringer af kromosomtypen forekommer. Den forelig ­
gende metode er ikke beregnet til at påvise antalsafvigelser og benyttes ikke rutinemæssigt til det formål. Kromosommutationer og lignende er årsag til mange genetiske sygdomme hos mennesker.
 
Ved denne test måles kromosomhændelser i spermatogonier, og den 
forventes derfor at kunne forudsige induktion af arvelige mutationer i kimceller.
 
Der benyttes rutinemæssigt gnavere i denne test. Ved denne cytoge ­
netiske in vivo-test påvises kromosomaberrationer ved spermatogo ­
niers mitose. Metoden omfatter ikke andre målceller.  
For at påvise aberrationer af kromatidtypen i spermatogonier må den 
første mitotiske celledeling efter behandlingen undersøges, inden eventuelle skader går tabt ved efterfølgende celledelinger. Der kan indhentes yderligere information fra behandlede spermatogonstam ­
celler ved meiotisk kromosomanalyse for aberrationer af kromosom ­
typen ved diakinese-metafase I, når de behandlede celler bliver til spermatocytter.
 
Denne in vivo-test er tilrettelagt til at vise, om stoffer, der er 
mutagene over for somatiske celler, også er aktive i kimceller. 
Derudover er spermatogontesten relevant for en vurdering af den reelle mutagenicitetsfare, idet der tages hensyn til sådanne faktorer 
som in vivo-metabolisme, farmakokinetik og dna-reparationsproces ­
ser.
 
I testiklerne er der flere generationer af spermatogonier til stede, som 
udviser forskellig følsomhed over for kemisk behandling. På denne 
måde repræsenterer de påviste aberrationer den samlede reaktion fra 
behandlede spermatogonpopulationer, hvor resultatet domineres af de mere talrige differentierede spermatogonier. Forskellige generationer af spermatogonier er, alt efter deres placering i testiklerne, i varie ­
rende grad i berøring med det almindelige kredsløb på grund af den 
fysiske og fysiologiske Sertoli-cellebarriere og blod-testikelbarrieren.
 
Hvis der er grund til at tro, at teststoffet eller en reaktiv metabolit 
ikke vil nå frem til målvævet, er denne test ikke egnet.  
Se også den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. DEFINITIONER  
Aberration af kromatidtypen:  beskadigelse af kromosomstrukturen 
i form af brud på enkeltkromatider eller brud på og sammenføjning af kromatider.
 
Aberration af kromosomtypen:  beskadigelse af kromosomstruk ­
turen i form af brud på — eller brud på og sammenføjning af — begge kromatider på samme sted.
 
Gap:  en kromatisk beskadigelse, som er mindre end ét kromatid 
bred, og hvor misalignment af kromatiderne er minimal.  
Antalsafvigelse:  ændring i kromosomtallet i forhold til det for de 
pågældende dyr normale antal.  
Polyploidi:  et multiplum af det haploide kromosomtal (n), som ikke 
er det diploide tal (dvs. 3n, 4n osv.).  
Strukturel ændring:  ændring i kromosomstrukturen, som kan iagt ­
tages ved mikroskopi i celledelingens metafase i form af deletioner, 
intrachange og interchange.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Dyrene udsættes for teststoffet på passende måde og aflives efter 
passende tidsrum efter eksponeringen. Inden aflivningen behandles 
dyrene med et metafasestandsende stof (f.eks. colchicin eller Colce ­
mid  ® ). Der fremstilles derefter præparater af kimceller, som farves, 
og metafasecellerne undersøges for kromosomaberrationer.  
1.4. BESKRIVELSE AE TESTMETODEN  
1.4.1.  Præparater  
1.4.1.1.  Valg af dyreart  
Der benyttes sædvanligvis hanmus og -hamstere, selv om hanner af 
andre egnede pattedyrarter kan benyttes. Der bør anvendes alminde ­
ligt brugte laboratoriestammer af unge sunde voksne dyr. Ved under ­
søgelsens begyndelse bør vægtvariationen mellem dyrene være mindst mulig og ikke over ± 20 % af gennemsnitsvægten.
 
1.4.1.2.  Miljø og fodring  
Der gælder de almindelige forhold som beskrevet i den generelle 
indledning til del B, blot bør der tilstræbes en fugtighed på 50-60 %.  
1.4.1.3.  Forberedelse af dyrene  
Der udvælges tilfældigt sunde unge voksne handyr til kontrol- og 
behandlingsgruppen. Burene bør anbringes på en sådan måde, at 
deres placering får mindst mulig indvirkning. Dyrene identificeres 
entydigt. Dyrene tilvænnes laboratorieforholdene i mindst fem dage.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Fremstilling af doser  
Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløs ­
ningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende, inden de gives til dyrene. Teststoffer i væskeform kan enten gives direkte til dyrene 
eller fortyndes først. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræpara ­
ter, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
 
1.4.2.  Testbetingelser  
1.4.2.1.  Opløsningsmiddel/bærestof  
Opløsningsmiddel/bærestof må ikke have toksiske virkninger ved de 
benyttede doser og må ikke mistænkes for at reagere kemisk med teststoffet. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. 
Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et 
vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem.
 
1.4.2.2.  Kontrolgrupper  
I alle forsøg medtages der sideløbende både positive og negative 
(opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolgrupper. Bortset fra behand ­
ling med teststof skal dyrene i kontrolgrupperne behandles på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.
 
Positive kontrolprøver skal frembringe strukturelle ændringer i sper ­
matogonier in vivo ved en dosis, der forventes at give en påviselig 
forøgelse i forhold til baggrundsværdierne.  
Der vælges sådanne doser i de positive kontrolprøver, at virknin ­
gerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umid ­
delbart afsløres for den, der aflæser dem. Det kan accepteres, at den 
positive kontrol indgives på anden måde end teststoffet, og at der 
kun foretages én prøveudtagning. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede stoffer. Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer:
 
Stof CAS nr. Einecs nr.  
Cyclophosphamid 
Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cyclohexylamin 108-91-8 203-629-0 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
Monomer acrylamid 79-06-1 201-173-7 Triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5
 
Der skal ved hver prøveudtagning indgå negative kontroldyr, som 
kun er behandlet med opløsningsmiddel eller bærestof og ellers behandlet på samme måde som behandlingsgrupperne, medmindre 
tidligere kontroldata har vist en acceptabel variation mellem dyr 
indbyrdes og acceptabel hyppighed af celler med kromosomafvigel ­
ser. Desuden skal der være ubehandlede kontrolgrupper, medmindre der foreligger tidligere opnåede eller offentliggjorte kontroldata, der 
viser, at det valgte opløsningsmiddel ingen skadelige eller mutagene 
virkninger har.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. FREMGANGSMÅDE  
1.5.1.  Dyrenes antal  
Hver behandlet gruppe og kontrolgruppe skal bestå af mindst fem 
analyserbare handyr.  
1.5.2.  Behandlingsplan  
Teststofferne indgives fortrinsvis ad én eller to gange (dvs. som én 
behandling eller to behandlinger). De kan også indgives i to deldo ­
ser, dvs. to behandlinger samme dag med kun nogle få timers inter ­
val, hvorved det bliver lettere at indgive et større materialevolumen. 
Indgift på anden måde skal begrundes sagligt.  
I gruppen med højeste dosis udtages der prøver på to tidspunkter 
efter behandling. Da teststoffet kan indvirke på cellecyklussens kine ­
tik, udtages der er tidlig og en sen prøve, nemlig ca. 24 timer og ca. 48 timer efter behandlingen. For alle andre doser end den højeste 
dosis udtages en prøve 24 timer eller 1,5 gange cellecyklus efter 
behandlingen, medmindre et andet prøveudtagningstidspunkt vides at være bedre egnet til påvisning af virkninger (6).
 
Der kan desuden udtages prøver på andre tidspunkter. For kemika ­
lier, der kan fremkalde kromosom-lagging eller have S-uafhængige 
virkninger, kan tidligere prøveudtagning være hensigtsmæssigt (1).  
Det vurderes i det enkelte tilfælde, om en behandlingsplan med 
gentagen indgift er velegnet. Ved behandling med gentagen indgift aflives dyrene 24 timer (1,5 cellecykluslængde) efter sidste behand ­
ling. Der kan udtages yderligere prøver, hvis det er hensigtsmæssigt.
 
Inden aflivningen gives dyrene en intraperitoneal injektion med en 
passende dosis metafasestandsende stof (f.eks. Colcemid  ® eller 
colchicin). Der udtages prøver af forsøgsdyr efter et passende tids ­
rum. For mus er dette tidsrum ca. tre-fem timer, for hamster ca. fire- fem timer.
 
1.5.3.  Dosisniveauer  
Hvis der gennemføres en forprøve til bestemmelse af dosisinterval, 
fordi der ikke foreligger nogen egnede data, bør den udføres i samme 
laboratorium med samme art, stamme og behandlingsmåde, som agtes benyttet i hovedundersøgelsen (7). Er der tale om toksicitet, benyttes der tre dosisniveauer for første prøveudtagningstidspunkt. 
Disse dosisniveauer skal dække et interval fra maksimal toksicitet 
til næsten ingen eller ingen toksicitet. Ved den efterfølgende prøveudtagning behøves kun den højeste dosis benyttet. Den højeste dosis defineres som den dosis, der fremkalder sådanne tegn 
på toksicitet, at højere dosis med samme indgiftsmønster må 
forventes at medføre død.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Stoffer med specifik biologisk aktivitet ved lav ikke-toksisk dosis 
(f.eks. hormoner og mitogener) kan danne undtagelser fra disse 
dosisfastsættelseskriterier og bør evalueres individuelt. Højeste dosis kan også defineres som en dosis, der i nogen grad udviser tegn på toksicitet i spermatogonier (f.eks. et lavere forhold mellem 
spermatogonmitoser og første og anden meiosemetafaser: faldet må 
ikke være større end 50 %).
 
1.5.4.  Grænsetest  
Hvis der ved en test med én dosis på mindst 2 000 mg pr. kg 
legemsvægt indgivet ved én eller i to behandlinger på samme dag, 
ikke kan iagttages nogen toksiske virkninger, og hvis man på grundlag af data om strukturnæssigt beslægtede stoffer ikke forventer gentoksicitet, kan en fuldstændig undersøgelse med tre dosisniveauer 
anses for unødvendig. Den forventede eksponering af mennesker kan 
foranledige, at der benyttes en højere dosis i grænsetesten.
 
1.5.5.  Indgift af doser  
Teststoffet indgives normalt ved tvangsfodring med sonde eller en 
passende intubationskanyle eller ved intraperitoneal injektion. Andre indgiftsmåder kan accepteres, hvis de kan begrundes. Hvor stor en væskemængde, der kan indgives ad gangen ved tvangsfodring eller 
injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Mængden bør højst 
være på 2 ml pr. 100 g legemsvægt. Anvendelse af større rumfang skal begrundes. Bortset fra lokalirriterende og ætsende stoffer, som normalt vil have kraftigere virkninger ved højere koncentrationer, bør 
testvolumenet variere så lidt som muligt, idet koncentrationen juste ­
res, så volumenet bliver det samme ved alle dosisniveauer.
 
1.5.6.  Præparering af kromosomer  
Umiddelbart efter aflivningen udtages der celleopslæmninger fra en 
eller begge testikler, som udsættes for hyptonisk væske og fikseres. Derefter stryges cellerne ud på objektglas og farves.
 
1.5.7.  Analyse  
For hvert dyr bør mindst 100 godt fordelte metafaseceller analyseres 
(dvs. mindst 500 metafaseceller pr. gruppe). Dette antal kan sættes ned, hvis der iagttages et stort antal aberrationer. Alle objektglas, 
herunder positive og negative kontrolprøver, kodes uafhængigt 
inden mikroskoperingen. Da fikseringen ofte medfører, at en del af metafasecellerne går i stykker, og kromosomerne går tabt, bør bedømte celler indeholde et antal centromerer svarende til kromo ­
somtallet 2n ± 2.
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Data for de enkelte dyr præsenteres i tabelform. Forsøgsenheden er 
et dyr. For hvert dyr registreres antallet af celler med strukturelle 
kromosomaberrationer, og antallet af kromosomaberrationer pr. celle bedømmes. Forskellige typer strukturelle kromosomaberrationer skal anføres med antal og hyppighed for behandlingsgrupper og kontrol ­
grupper. Gaps registreres særskilt og oplyses, men medregnes ikke 
generelt i den totale aberrationshyppighed.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Hvis der iagttages såvel mitose som meiose, bestemmes forholdet 
mellem spermatogonmitoser og første og anden meiosemetafase som 
et mål for cytotoksiciteten for alle behandlede dyr og negative kontroldyr i en samlet prøve på 100 celler under deling for hvert dyr. Hvis der kun iagttages mitose, bestemmes mitoseindekset i 
mindst 1 000 celler for hvert dyr.
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
Der findes en række kriterier for at afgøre, om et resultat er positivt, 
f.eks. en dosisafhængig forøgelse af andelen af celler med kromo ­
somaberrationer eller en tydelig forøgelse af antallet af celler med aberrationer hos en enkeltdosisgruppe på et bestemt prøveudtag ­
ningstidspunkt. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske 
relevans. Statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (8). Statistisk signifikans bør ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes som 
positivt. Tvetydige resultater bør afklares ved yderligere test, helst 
med ændring af forsøgsbetingelserne.
 
Et teststof, der ikke opfylder ovennævnte kriterier, anses ikke for 
mutagent i dette system.  
De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i 
sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvety ­
digt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.
 
Et positivt resultat af en in vivo-test for kromosomaberrationer i 
spermatogonier hos pattedyr viser, at teststoffet fremkalder struktu ­
relle kromosomaberrationer i kimceller hos den undersøgte art. Et 
negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke frem ­
kalder strukturelle kromosomaberrationer i kimceller hos den under ­
søgte art.  
Sandsynligheden for, at teststoffet eller dets metabolitter når frem til 
målvævet, bør diskuteres.  
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— begrundelse for valg af bærestof  
— teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, 
hvis den kendes  
Forsøgsdyr:  
— anvendt art/stamme  
— antal dyr og deres alder  
— oprindelse, miljø, føde mv.  
— de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse, samt interval, 
gennemsnit og standardafvigelse for legemsvægten for hver 
enkelt gruppe  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Testbetingelser:  
— data fra en eventuel forprøve til bestemmelse af dosisinterval  
— begrundelse for valg af dosisniveau  
— begrundelse for indgiftsvej  
— detaljerede oplysninger om præparering af teststoffet  
— detaljerede oplysninger om indgift af teststoffet  
— begrundelse for aflivningstidspunkter  
— eventuel omregning fra teststofkoncentration (ppm) i 
føde/drikkevand til faktisk dosis (mg pr. kg legemsvægt pr. dag)  
— detaljerede oplysninger om føde- og vandkvalitet  
— detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan  
— metoder til måling af toksicitet  
— det metafasestandsende stofs betegnelse og koncentration og 
behandlingens varighed  
— metoder til præparering af objektglas  
— kriterier for bedømmelse af aberrationer  
— antal analyserede celler pr. dyr  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ 
eller tvetydig  
Resultater:  
— tegn på toksicitet  
— mitoseindeks  
— forholdet mellem spermatogonmitoser og første og anden meio ­
semetafase  
— antal aberrationer og type, anført særskilt for hvert dyr  
— samlet antal aberrationer pr. gruppe  
— antal celler med aberrationer pr. gruppe  
— dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt  
— eventuelle statistiske analyser  
— data for sideløbende negative kontrolprøver  
— data for tidligere negative kontrolprøver med angivelse af inter ­
valler, gennemsnit og standardafvigelser  
— data for sideløbende positive kontrolprøver  
— eventuelt iagttagne ploidiændringer  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. HENVISNINGER  
(1) Adler, I.D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel. C, 
Lambert B., and Magnusson, J. (eds.) Liss, New York, pp. 477-484.
 
(2) Adler. I.D. (1984), Cytogenic tests in Mammals. In: Mutageni ­
city Testing: a Practical Approach, ed. S. Venitt and J.M. Parry, IRL. Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
 
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E. (1964), An Air-Drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cyto ­
genetics and Cell Genetics. 3. pp. 289-294.  
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and 
Henderson L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirk ­
land (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report. Part 1 revised, Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melboume, 
Sydney, pp. 115-141.
 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res. 52. pp. 207-209.
 
(6) Adler, I.D., Shelby, M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., 
Pacchierotti, F., Shibuya, T, and Tanaka, N. (1994), Inter ­
national Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test 
Procedures. Summary- Report of the Working Group on 
Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318.  
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland D.J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis. 7, pp. 313-319.
 
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays, in: D.J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines 
for Mutagenicity Testing, report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  SPOTTEST — MUS  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIPPER FOR TESTMETODEN  
Spottesten er en in vivo-test i mus, hvor musefostre på det embryo ­
nale stade eksponeres for kemiske forbindelser. Målcellerne i 
fostrene er melanoblasterne, og målgenerne er de gener, der 
bestemmer pelshårenes pigmentering. Fostrene er heterozygote i et antal af disse pelsfarvegener. Ved mutation eller tab af det dominante allel i en melanoblast ved en række genetiske hændelser kommer den 
recessive fænotype til udtryk i de celler, der dannes fra denne stam ­
celle, hvilket fører til anderledes farvede pletter i musens pels. Mængden af afkom med sådanne pletter, dvs. mutationer, registreres og sammenlignes med den tilsvarende mængde blandt afkom af 
hunmus, der kun har været eksponeret for opløsningsmidlet. Ved 
spottesten i mus konstateres formodede somatiske mutationer i fosterceller.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
Teststoffet opløses eller suspenderes sà vidt muligt i isotonisk salt ­
vand. Kemiske forbindelser, som er uopløselige i vand, opløses eller 
suspenderes i passende vehikler. Det anvendte vehikel må ikke indvirke på teststoffet eller forårsage toksiske effekter. Fremstillingen af teststofpræparationen foretages umiddelbart inden anvendelsen.
 
F o r s ø g s d y r  
Mus af stammen T-stock (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, 
c ch p/c ch p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, 
s/s) parres med enten stammen HT-stock (pallid, nonagouti, brachy ­
pody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, In fz/ln fz; pearl pe/pe) eller C57 BL (nonagouti, a/a). Andre egnede krydsninger som NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) og DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; 
dilute, d/d) kan anvendes, under forudsætning af, at afkommet er 
nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
A n t a l o g k ø n  
Der anvendes et antal drægtige hunner, som er tilstrækkeligt stort til, 
at der produceres en passende mængde afkom for hver af de anvendte doser. Holdstørrelsen kan anslås på grundlag af antallet af observerede pletter hos de eksponerede mus og kontroldatas stør ­
relsesorden. Et resultat kan først accepteres som negativt, hvis mindst 
300 unger af hunner, som har været eksponeret for den største dosis, er undersøgt.
 
P o s i t i v e o g n e g a t i v e k o n t r o l l e r  
Der foretages sideløbende kontrol med mus, som kun eksponeres for 
vehikel (negativ kontrol). Historiske kontroldata fra samme labora ­
torium kan, under forudsætning af at der er tale om homogene data, indregnes med henblik på at forøge testens sensitivitet. Der bør foreligge positive kontroldata fra nyligt foretagne forsøg i samme 
laboratorium med en kemisk forbindelse, som vides at være 
mutagen i denne test, i tilfælde af at der ikke konstateres nogen mutagen virkning af teststoffet.
 
A d m i n i s t r a t i o n s m å d e  
Sædvanligvis indgives teststoffet ved oral intubering eller intraperi ­
toneal injektion i de drægtige hunner. Inhalation og andre admini ­
strationsmåder kan anvendes, hvis de er hensigtsmæssige.  
D o s i s n i v e a u e r  
Der anvendes mindst to doseringer, hvoraf den ene skal medføre 
tegn på toksisk virkning eller reduceret kuldstørrelse. Ikke-toksiske 
stoffer testes under anvendelse af så store doser som praktisk muligt.  
Fremgangsmåde  
Normalt gives forsøgsdyrene hele dosis på en gang på drægtigheds ­
periodens dag 8, 9 eller 10, idet dag 1 er den dag, vaginalproppen 
observeres første gang. Disse dage svarer til 7,25, 8,25 og 9,25 dage 
efter befrugtningen. Gentagne doseringer kan foretages på disse dage.
 
A n a l y s e  
Afkommet blindkodes og eventuelle pigmenterede pletter registreres 
mellem tre og fire uger efter fødslen. Der skelnes mellem tre typer pletter:
 
a) hvide pletter inden for en afstand af 5 mm fra den ventrale 
midtlinje; disse pletter antages at være et resultat af celledrab (WMVS)
 
b) gule agouti-agtige pletter på eller omkring pattevorter, kønsåbnin ­
ger, strube, axiller, lyske og midt i panden; disse pletter antages at være et resultat af fejldifferentiering (MDS)
 
c) pigmenterede og hvide pletter tilfældigt fordelt i pelsen; disse 
pletter antages at være et resultat af somatiske mutationer (RS).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Alle tre typer registreres, men kun den sidstnævnte, RS, et genetisk 
relevant. Hvis der er problemer med at skelne mellem MDS og RS, 
kan der benyttes fluorescensmikroskopi af hårprøver.  
Synlige morfologiske abnormiteter hos afkommet registreres også.  
2. DATA  
Det samlede antal undersøgte unger og antal unger med en eller flere 
pletter, som antages at være et resultat af somatisk mutation, anføres. 
Data fra forsøgsgrupper og negativ kontrolgruppe sammenlignes ved hjælp af egnede statistiske metoder. Data anføres også pr. kuld.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORTEN  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— de anvendte stammer  
— antal drægtige hunner i forsøgs- og kontrolgrupperne  
— den gennemsnitlige kuldstørrelse i forsøgs- og kontrolgrupperne 
ved fødslen, og når ungerne er vænnet fra  
— dosisniveauer  
— opløsningsmiddel  
— den dag i drægtighedsperioden, hvor doseringen finder sted  
— administreringsform  
— det samlede antal undersøgte unger og antal unger med WMVS, 
MDS og RS i forsøgs- og kontrolgrupperne  
— makroskopiske morfologiske abnormiteter  
— om muligt dosis-responsforhold for RS  
— statistisk evaluering  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  ARVELIG TRANSLOKATION HOS MUS  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Ved test af arvelig translokation hos mus konstateres strukturelle og 
numeriske kromosomforandringer i pattedyrskønsceller udtrykt i førstegenerations afkom. Kromosomforandringerne, der måles, er reciprokke translokationer, og, når afkommet også omfatter hundyr, 
tab af et X-kromosom. Bærere af translokationer og XO-hunner har 
nedsat fertilitet, hvilket udnyttes ved udvælgelsen af F
 1 -afkom med 
henblik på cytogenetisk analyse. Visse typer translokationer (X-auto ­
some og c-t-typen) forårsager fuldstændig sterilitet. Translokationer 
konstateres cytogenetisk i meiosens diakinese-metafase I hos hanner, 
som enten kan være af F  1 -generationen eller sønner af F  1 -hunner. 
XO-hunner identificeres cytogenetisk ved, at kromosomtallet i knog ­
lemarvmitoser kun er 39.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
Teststoffet opløses i isotonisk saltvand. Uopløselige stoffer opløses 
eller suspenderes i egnede vehikler. Teststofopløsning anvendes 
umiddelbart efter fremstillingen. Hvis der anvendes et vehikel med henblik på at lette doseringen, må det ikke interferere med teststoffet eller have nogen toksisk virkning.
 
A d m i n i s t r a t i o n s m å d e  
Sædvanligvis indgives teststoffet ved oral intubering eller intraperi ­
toneal injektion. Andre administrationsmåder kan være hensigtsmæs ­
sige. 
F o r s ø g s d y r  
Som forsøgsdyr benyttes mus, idet disse giver de letteste betingelser 
med hensyn til avl og cytologisk verifikation. Der kræves ikke nogen 
bestemt stamme. Hvis det påregnes at teste fertiliteten, bør den 
anvendte stammes gennemsnitlige kuldstørrelse være over otte og relativt konstant.
 
Der anvendes sunde kønsmodne dyr.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
A n t a l d y r  
Det nødvendige antal dyr afhænger af den spontane translokations ­
frekvens og den induktionsfrekvens, som er nødvendig for at opnå et positivt resultat.
 
Normalt gennemføres testen ved undersøgelse af F  1 -hanner. Der 
undersøges mindst 500 F  1 -hanner pr. dosis. Hvis der tillige anvendes 
F 1 -hunner, undersøges 300 af hvert køn.  
N e g a t i v e o g p o s i t i v e k o n t r o l l e r  
Adækvate kontroldata, stammende fra sideløbende og historiske 
kontrolforsøg, skal være tilgængelige. Når der foreligger acceptable positive kontrolresultater fra undersøgelser foretaget for nyligt i det samme laboratorium, kan disse anvendes i stedet for en sideløbende 
positiv kontrol.
 
D o s i s n i v e a u e r  
Der testes en dosis, normalt den største dosis med minimal toksisk 
virkning, men uden indflydelse på reproduktion eller overlevelse. Hvis dosis-responsforholdet skal bestemmes, anvendes yderligere to mindre doser. Ikke-toksiske stoffer testes under anvendelse af så 
store doser som praktisk muligt.
 
Fremgangsmåde  
E k s p o n e r i n g o g p a r r i n g  
Der kan anvendes to forskellige eksponeringsskemaer. I det hyppigst 
anvendte skema gives hele dosis på en gang. Teststoffet kan også gives syv dage om ugen i 35 dage. Antallet af parringer efter 
eksponeringen afhænger af eksponermgsskemaet og skal være stort 
nok til at sikre, at alle eksponerede kønscellestadier kan undersøges. Efter parringen placeres hunnerne i hver sit bur, Ved fødslen regi ­
streres dato, kuldstørrelse og afkommets køn. Alle hanner blandt 
afkommet vænnes fra og hunnerne frasorteres, medmindre de 
medtages i forsøget.
 
T e s t a f h e t e r o z y g o t i e f t e r t r a n s l o k a t i o n  
Der anvendes en af to mulige metoder:  
— fertilitetsundersøgelse af F  1 -generationen med efterfølgende veri ­
fikation af mulige translokationsbærere ved hjælp af cytogenetisk analyse
 
— cytogenetisk analyse af alle F  1 -hanner uden forudgående udvæl ­
gelse på grundlag af fertilitetsundersøgelser.  
a) Fertilitetsundersøgelse  
Nedsat fertilitet hos F  1 -generationens medlemmer kan konstateres 
ved observation af kuldstørrelsen og/eller analyse af de parrede 
hundyrs uterusindhold.  
Forinden fastlægges der kriterier for normal og nedsat fertilitet 
hos den anvendte stamme.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Observation af kuldstørrelse:  De F  1 -hanner, som skal undersø ­
ges, placeres i hver sit bur sammen med hunner fra samme 
forsøg eller fra bestanden. Fra og med 18 dage efter parringen iagttages burene dagligt. Kuldstørrelse og køn i F
 2 -generationen 
registreres ved fødslen, hvorefter kuldene fjernes. Hvis der testes 
F 1 -hunner, bevares de små F  2 -kuld med henblik på yderligere 
undersøgelser. Konstatering af, om hunner er translokations ­
bærere, forgår ved cytogenetisk analyse af translokation hos en vilkårlig han blandt deres afkom. XO-hunner identificeres 
gennem ændring af forholdet mellem hanner og hunner i deres 
afkom fra 1:1 til 1:2. Ved en sekventielt ordnet fremgangsmåde elimineres normale F
 1 -dyr fra den videre undersøgelse, hvis stør ­
reisen af det første F  2 -kuld er lig med eller højere end en på 
forhånd fastsat normalværdi. I modsat fald observeres det andet 
eller tredje F  2 -kuld.  
F 1 -dyr, der ikke kan klassificeres som normale efter observation 
af op til tre F  2 -kuld underkastes enten yderligere undersøgelse 
ved analyse af de parrede hunners uterusindhold eller ved direkte cytogenetisk analyse.
 
Analyse af uterusindholdet:  Den nedsatte kuldstørrelse hos trans ­
lokationsbærere skyldes, at fostrene dør på det embryonale stade, 
så et stort antal døde implantater tyder på translokation hos forsøgsdyret. De F
 1 -hanner, som skal undersøges, parres hver 
især med to til tre hunner. Ved daglig undersøgelse mellem kl. 
10 og 12 om formiddagen af forekomsten af vaginalprop, konsta ­
teres det, om befrugtning har fundet sted. Hunnerne aflives 14 til 16 dage senere, og antallet af levende og døde implantater i uteri 
registreres.
 
b) Cytogenetisk analyse  
Der fremstilles testikelpræparater ved lufttørringsteknik. Trans ­
lokationsbærere identificeres på grundlag af multivalente konfigurationer i primære spermatocytters diakinese-metafase I. 
Hvis der observeres mindst to celler med multivalente konfigu ­
rationer betragtes det som bevist, at forsøgsdyret er transloka ­
tionsbærer.
 
Når der ikke gennemføres udvælgelse på basis af fertilitetsunder ­
søgelser, undersøges alle F  1 -hanner cytogenetisk. Der foretages 
mikroskopisk undersøgelse af mindst 25 diakinese-metafaser I pr. 
han. F  1 -hanner med små testikler og defekt meiose, som standser 
før diakinesen, samt F  1 -hunner, som formodes at være XO- 
bærere, underkastes undersøgelse af mitotiske metafaser i sper ­
matogonier eller knoglemarv. Hvis der observeres usædvanlig 
lange og/eller korte kromosomer i ti celler, betragtes det som 
påvist, at der er tale om en translokation, som gør hanner sterile (c-t-typen). Visse X-autosome translokationer, som gør hanner sterile, kan kun identificeres ved båndanalyse af mitose ­
kromosomer. Hvis der observeres 39 kromosomer i ti mitoser, 
betragtes det som påvist, at der er tale om en XO-hun.
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform.  
Den gennemsnitlige kuldstørrelse og kønsfordeling i forældregenera ­
tionens afkom ved fødslen og ved afvænningen angives for hver 
parringsperiode.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Med henblik på vurdering af F  1 -dyrenes fertilitet anføres den 
gennemsnitlige kuldstørrelse efter de normale parringer og hver 
enkelt kuldstørrelse efter parring af F  1 -translokationsbærere. Efter 
analyse af uterusindhold anføres det gennemsnitlige antal levende og døde implantater efter normale parringer og antallet af levende 
og døde implantater efter hver enkelt parring af F
 1 -translokations ­
bærere.  
Efter cytogenetisk analyse af diakinese-metafaser I anføres antallet af 
multivalente konfigurationer og det totale antal undersøgte celler for 
hver enkelt translokationsbærer.  
Det samlede antal parringer og parringsperiodernes længde anføres 
for sterile F  1 -dyr. Der gives detaljerede oplysninger om testikelvægt 
og cytogenetisk analyse.  
Den gennemsnitlige kuldstørrelse, F  2 -afkommets kønsfordeling og 
resultaterne af den cytogenetiske analyse anføres for XO-hunner.  
Hvis mulige F  1 -translokationsbærere udvælges ved fertilitetsundersø ­
gelser, skal tabellerne indeholde oplysninger om, hvor mange af de udvalgte dyr der senere viste sig at være heterozygote efter trans ­
lokation.
 
Data fra negative og positive kontrolforsøg rapporteres på lignende 
måde.  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— stamme, dyrenes alder, de doserede dyrs vægt  
— antal af forældredyr af hvert køn i forsøgs- og kontrolgrupper  
— forsøgsbetingelser, detaljeret beskrivelse af dyrenes behandling, 
dosisniveau, opløsningsmidler, parringsskema  
— afkommets antal og køn for hver enkelt hun, antal og køn af 
afkom, som opdrættes med henblik på translokationsanalyse  
— translokationsanalytiske kriterier og analysetidspunkt  
— antal translokationsbærere samt detaljeret beskrivelse af disse, 
herunder avlingsdata og oplysninger om uterusindhold, hvis 
sådanne foreligger  
— cytogenetisk fremgangsmåde og detaljerede oplysninger om den 
mikroskopiske analyse, helst vedlagt billeder  
— statistisk evaluering  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. EVALUERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  SUBKRONISK ORAL TOKSICITETSTEST — ET 90-DAGES 
FORSØG OVER GENTAGNE ORALE DOSERS TOKSICITET 
PÅ GNAVERE  
1. METODE  
Denne metode til udførelse af en subkronisk oral toksicitetstest 
svarer til OECD TG 408 (1998).  
1.1. INTRODUKTION  
Efter at en akut eller gentagen 28-dages toksicitetstest er udført med 
henblik på primær vurdering af et kemisk stofs toksicitet, kan man udføre en subkronisk oral toksicitetstest, hvor man anvender 
gentagne doser til bestemmelse og evaluering af stoffets toksiske 
egenskaber. Undersøgelsen på 90 dage skaffer viden om mulige trusler mod sundheden, som kan opstå ved gentagen belastning i en længere periode, som dækker afvænning, modning og den 
første del af voksenlivet. Undersøgelsen skaffer viden om større 
toksiske virkninger, peger på, hvilke organer der rammes og mulig ­
heden for akkumulation; den kan give et overslag over det belast ­
ningsniveau, der kan være skadeligt, uden at det bemærkes, som igen 
kan anvendes til valg af dosis til undersøgelser af kronisk effekt og 
til fastlæggelse af sikkerhedskriterier for, hvad mennesker kan tåle.
 
Metoden lægger yderligere vægt på virkninger på neurologiske 
områder og peger på virkninger på det immunologiske og reproduk ­
tive system. Nødvendigheden af omhyggelig klinisk observation af dyrene for at opnå størst mulig viden bliver ligeledes understreget. Undersøgelsen skulle muliggøre identifikation af kemikalier med 
neurotoksiske virkninger og virkninger på det immunologiske og 
reproduktive system, som kan føre til yderligere dybdegående under ­
søgelser.
 
Se også den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Dosis:  Mængden af indgivet testkemikalium. Dosis angives som 
vægt (g, mg) eller som vægt af testkemikalium i forhold til dyrets vægt (f.eks. mg/kg) eller en konstant del af føden (ppm).
 
Dosering : Er et generelt udtryk for dosis, hyppighed af indgift og 
varigheden af indgiften.  
NOAEL:  Er en forkortelse for det niveau, der ikke medfører obser ­
veret skadelig virkning, og er det højeste dosisniveau, hvor ingen 
negative virkninger, der kan tilskrives behandlingen, er fundet.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Testkemikaliet administreres peroralt dagligt i forskellige doser til 
forskellige grupper af forsøgsdyr, idet hver gruppe får en bestemt dosis i en periode på 90 dage. I denne periode observeres dyrene nøje for tegn på forgiftning. Dyr, der dør eller aflives, mens testen 
står på, bliver obduceret, og ved undersøgelsens afslutning bliver 
resten af dyrene aflivet og obduceret.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Forberedelse af dyrene  
Der anvendes sunde dyr, som er tilvænnet laboratorieforholdene i 
mindst fem dage, og som ikke før har været anvendt til eksperimen ­
ter. Dyrene beskrives hvad angår art, stamme, hvorfra de kommer 
(kilde), køn, vægt og/eller alder. Dyrenes randomiseres til henholdsvis kontrol og behandlingsgruppe. Bure skal anbringes, så deres placering får mindst mulig betydning. Hvert dyr tildeles et 
eget, særligt identifikationsnummer.
 
1.4.2.  Fremstilling af doser  
Stoffet, der skal undersøges, indgives gennem sonde eller i føden 
eller drikkevandet. Måden at indgive på afhænger af undersøgelsens 
formål og testmaterialets fysisk-kemiske egenskaber.  
Om nødvendigt opløses eller opslæmmes stoffet i et passende medie. 
Hvor muligt anbefales det først at forsøge at anvende vandige opløs ­
ninger eller opslæmninger; dernæst overvejes opløsninger eller 
opslæmninger i olie (f.eks. majsolie) og først derefter andre opløs ­
nings-/opslæmningsmidler. For andre midler end vand bør de toksiske egenskaber kendes. Testkemikaliets stabilitet i forbindelse 
med indgiften bør fastslås.
 
1.4.3.  Testomstændighederne  
1.4.3.1.  Forsøgsdyrene  
Den foretrukne art er rotten, men andre gnaverarter, f.eks. mus, kan 
anvendes. Almindeligt anvendte laboratoriestammer af unge, sunde, 
voksne dyr bør anvendes. Hundyrene skal ikke have haft unger og ikke være gravide. Indgiften bør begynde snarest efter fravænning, og i hvert fald før dyrene er ni uger gamle. Ved forsøgets begyndelse 
bør den indbyrdes vægtforskel være minimal og ikke overstige ± 
20 % af gennemsnittet for hvert køn. Når forsøget foretages som forløber for en længerevarende toksicitetsstudie, bør man i begge forsøg anvende samme stamme og fra samme kilde.
 
1.4.3.2.  Antal og køn  
Mindst 20 dyr (10 af hvert køn) bør anvendes for hvert dosisniveau. 
Hvis man planlægger at aflive nogle dyr undervejs i forsøget, skal antallet af dyr, der påbegynder forsøget, forøges tilsvarende. Ud fra 
tidligere opnået viden om kemikaliet eller nære analoge stoffer bør 
man overveje en yderligere »satellit«-gruppe på ti dyr (fem af hvert køn) i kontrollen og i gruppen med den højeste dosis, således at man efter forsøgsperioden kan observere evt. reversibilitet eller vedva ­
rende følger af behandlingen. Varigheden af denne observations ­
periode afhænger af, hvilke virkninger man vil følge.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Dosisstørrelse  
Mindst tre dosisstørrelser og en sideløbende kontrol bør anvendes, 
undtagen i tilfælde af en begrænset test (se 1.4.3.4). Dosisstørrelsen kan afhænge af tidligere tilsvarende forsøg eller forsøg med henblik 
på opsøgning af dosisgrænser og skal tage hensyn til kendte toksi ­
kologiske og toksokinetiske data for testkemikaliet eller tilsvarende stoffer. Medmindre kemikaliets fysisk-kemiske natur eller biologiske effekt sætter grænser, bør den højeste dosisstørrelse vælges med 
henblik på toksisk virkning, men ikke på død eller alvorlig lidelse. 
Faldende dosisstørrelse bør vælges med henblik på at påvise en eventuel dosisrelateret virkning og det niveau, der ikke medfører 
observeret skadelig virkning (NOAEL). To til firedobbelte intervaller 
er ofte bedst til fastlæggelse af faldende dosisstørrelser, og tilføjelse af en fjerde test-gruppe er ofte at foretrække frem for brug af meget store intervaller (f.eks. mere end en faktor på 6-10) mellem dosis ­
størrelserne.
 
Kontrolgruppen skal være en ubehandlet gruppe eller en gruppe, der 
får det eventuelle medie, i hvilket de behandlede dyr får kemikaliet. Bortset fra behandlingen skal dyrene i kontrolgruppen behandles nøjagtigt som dyrene i testgruppen. Hvis kemikaliet indgives i et 
medie, skal kontrolgruppen have mediet i den størst anvendte 
mængde. Hvis testkemikaliet indgives via foderet, og hvis dette medfører reduceret fødeindtagelse, kan det være nyttigt med en 
gruppe, der parallelfodres mængdemæssigt, således at et eventuelt 
vægttab kan tilskrives, at foderet har en dårlig smag, respektive virker toksisk.
 
Man bør overveje mediets eller eventuelle additivers egenskaber med 
hensyn til absorption, distribution, stofskifte eller retention af testke ­
mikalium; virkningen på testkemikaliets kemiske egenskaber, som 
igen kan have indflydelse på dets toksiske egenskaber; og indfly ­
delsen på føde- eller vandindtag eller dyrenes ernæringsmæssige 
tilstand.  
1.4.3.4.  Grænsetest  
Et totalforsøg med tre dosisstørrelser behøves næppe udført, hvis 
man ikke forventer nogen toksisk effekt ud fra kendskab til struktu ­
relt beslægtede stoffer, og hvis der ikke ses nogen skadelig virkning 
ved forsøg som beskrevet ovenfor med enkelt dosis svarende til 
mindst 1 000 mg/kg legemsvægt/dag. Grænsetest er konklusive, undtagen hvis belastning af mennesker indikerer nødvendigheden af anvendelse af en større dosis.
 
1.5. FREMGANGSMÅDE  
1.5.1.  Dosisadministration  
Dyrene får testkemikaliet syv gange ugentlig hver uge i 90 dage. 
Ethvert andet regime, f.eks. fem gange ugentlig, skal begrundes. 
Hvis testkemikaliet indgives med sonde, skal det gøres i en enkelt 
dosis, med anvendelse af en mavesonde eller passende intubations ­
rør. Det maksimale væskevolumen, der kan tilføres ad gangen, afhænger af dyrets størrelse. Volumen bør ikke overstige 
1 ml/100 g kropsvægt, undtaget vandige opløsninger, hvor man 
kan indgive 2 ml/100 g kropsvægt. Undtaget irritative og ætsende stoffer, som normalt vil have øget generende effekt ved større koncentrationer, bør variationen i testvolumen begrænses ved juste ­
ring af koncentrationen af testkemikaliet for at sikre et konstant 
volumen ved alle dosisstørrelser.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Det er vigtigt at sikre, at de kvantiteter af kemikalier, som indtages 
via føden eller drikkevandet, ikke får indflydelse på den normale 
ernæring eller vandbalancen. Når testkemikaliet tilføres med føden, kan man tilføre det enten som en konstant del af føden (ppm) eller en konstant dosisstørrelse i forhold til dyrets vægt; det, man vælger, 
skal specificeres. Tilføres kemikaliet via sonde, bør det gøres på 
samme tidspunkt hver dag, og dosisstørrelse skal rettes til, så den udgør en konstant størrelse i forhold til dyrets vægt. Hvis et 90- dages forsøg foretages som forløber for et langtids kronisk-toksici ­
tetsforsøg, skal der i begge forsøg gives samme fødesammensætning.
 
1.5.2.  Observationer  
Observationsperioden skal mindst vare 90 dage. Dyrene i satellit ­
gruppen, hvor man vil foretage »follow-up« -observationer, skal 
beholdes i en passende periode uden behandling, med henblik på 
konstatering af fortsat eller ophør af toksisk virkning.  
Almindelig klinisk observation bør foretages mindst en gang om 
dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er), idet man tager i betragt ­
ning, hvornår maksimal effekt kan forventes efter indgift. Dyrenes 
kliniske tilstand bør noteres. Mindst to gange daglig, sædvanligvis morgen og aften, undersøges alle dyrene for tegn på morbiditet eller mortalitet.
 
I hvert fald før første belastning (for at tage højde for individuelle 
forskelle) og en gang ugentlig derefter bør detaljerede kliniske under ­
søgelse foretages af alle dyrene. Disse undersøgelser skal foretages uden for burene, fortrinsvis på et standardareal og på samme tid i 
hvert tilfælde. De skal noteres omhyggeligt, fortrinsvis ved anven ­
delse af et scoringssystem, eksplicit defineret af undersøgelseslabo ­
ratoriet. Man bør bestræbe sig på, at variationerne i observations ­
betingelserne er mindst mulige. Blandt de fund, der skal noteres, 
(men ikke som de eneste) er ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, 
forekomst af sekretion og ekskreter og autonom aktivitet (f.eks. tåreflåd, hårrejsning, pupilstørrelse, usædvanligt respirationsmønster). Forandringer i gang, stilling og respons på håndtering såvel som 
tilstedeværelse af toniske og kloniske bevægelser, stereotypi (f.eks. 
overdreven pudsning, repetitive cirkelbevægelser) eller bizar opførsel (f.eks. selvmutilation, baglæns gang) skal også noteres (1).
 
Oftalmologisk undersøgelse ved hjælp af oftalmoskop eller andet, 
passende udstyr bør udføres, før første gang testkemikaliet tilføres 
og ved afslutning af forsøget, fortrinsvis på alle dyrene, men i hvert fald på dem, der fik højeste dosis og på kontrollerne. Hvis der opdages øjenforandringer, skal alle dyrene undersøges.
 
Hen imod slutningen af belastningsperioden og i hvert fald ikke 
tidligere end uge 11 foretages undersøgelser af reaktion på senso ­
riske stimuli af forskellig slags (1) (f.eks. auditoriske, visuelle og proprioceptive stimuli) (2), (3), (4), vurdering af gribestyrke (5) og 
af motorisk aktivitet (6). Nærmere detaljer af de procedurer, der kan 
foretages, findes i de respektive referencer. Andre, alternative frem ­
gangsmåder end de refererede kan imidlertid også anvendes.
 
Funktionsundersøgelser kan udelades nær forsøgets afslutning, hvis 
tilsvarende data kan findes i andre tilsvarende forsøg og de daglige 
kliniske undersøgelser ikke påviste funktionelle mangler.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Undtagelsesvis kan funktionsundersøgelser udelades på grupper, der 
på anden vis viser tegn på forgiftning i en grad, der vil have afgø ­
rende indflydelse på funktionsundersøgelserne.  
1.5.2.1.  Kropsvægt og føde/vandindtagelse  
Alle dyr skal vejes mindst en gang ugentlig. Mængden af fødeind ­
tagelse skal beregnes mindst en gang ugentlig. Hvis testkemikaliet 
administreres via drikkevandet, skal vandindtagelsen beregnes mindst en gang ugentlig. Vandforbruget bør også tages i betragtning, når belastningen foretages via føden eller via sonde, da drikkeaktiviteten 
kan ændres herved.
 
1.5.2.2.  Hæmatologi og klinisk biokemi  
Stedet, hvor blodprøver tages, bør angives, og de bør gemmes på 
passende vis. Ved forsøgets afslutning tages der prøver lige før eller 
i forbindelse med aflivningen af dyrene.  
Følgende hæmatologiske undersøgelser bør foretages ved forsøgets 
afslutning, og når blodprøver bliver indsamlet undervejs: hæmatokrit, hæmoglobinkoncentrationen, erytrocyttal, leukocyttal og differential ­
tælling, trombocyttal og koagulationstid/koagulationsevnen.
 
Klinisk biokemiske analyser, som kan vise toksisk virkning på væv, 
specielt på lever og nyrer, skal udføres på blodprøver taget fra alle dyrene lige før eller i forbindelse med aflivningen (undtaget er de 
dyr, der findes moribunde og/eller aflives undervejs i forsøget). På 
samme måde, som gælder for hæmatologiske prøver, undersøges også blodprøver taget undervejs. Det anbefales at tage fastende blodprøver (
 1 ). Analyser på serum og plasma bør inkludere: natrium, 
kalium, glukose, total kolesterol, carbamid, BUN, kreatinin, total 
protein og albumin, og mere end to enzymer, der belyser den hepa ­
tocellulære effekt (f.eks. alanin aminotransferase, aspartat amino ­
transferase, alkalisk fosfatase, gamma glutamyl transpeptidase og 
sorbitol dehydrogenase). Derudover kan inkluderes måling af andre 
enzymer (fra lever eller andetsteds), galdesure salte, som kan give nyttig information i visse tilfælde.
 
I den sidste uge af forsøget kan eventuelt følgende urinanalyser 
udføres, idet timediuresen måles: udseende, volumen, osmolalitet eller vægtfylde, pH, protein, glukose og blod eller blodceller.
 
Yderligere bør man overveje at måle serummarkører for generel 
vævsskade. Andre analyser, som bør udføres, hvis testkemikaliets 
egenskaber vides eller formodes at afficere beslægtede metaboliske markører, inkluderer calcium, fosfor, fastende triglycerider, specielle hormoner, methæmoglobin og kolinesterase. Disse bør måles i 
forbindelse med kemikalier af særlige typer eller fra tilfælde til 
tilfælde.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Til en del analyser på serum og plasma, mest udtalt for glukose, foretrækkes fastende 
blodprøver. Hovedårsagen er den øgede variation, som uundgåeligt følger ikke-faste, og 
som vil kunne maskere små effekter og derved gøre tolkningen vanskelig. På den anden 
side vil faste kunne influere på dyrenes almindelige stofskifte, specielt i forsøg, hvor 
fødeindtagelse står centralt, og derved forstyrre den daglige belastning med testkemika ­
liet. Hvis blodprøver tages fastende, skal de tages efter udførelsen af de funktionelle 
observationer.
 Almindeligvis må man have en fleksibel indstilling ud fra dyrearten 
og de observerede og/eller forventede virkninger af et givet kemika ­
lium.  
Hvis der ikke er tilstrækkeligt kendskab til de biokemiske eller 
hæmatologiske udgangsværdier, bør man overveje om disse analyser 
skal foretages, før belastningen begynder, men det anbefales almin ­
deligvis ikke (7).  
1.5.2.3.  Makroskopisk obduktion  
Alle dyrene, som indgår i forsøget, skal have udført en fuldstændig, 
detaljeret makroskopisk obduktion, hvilket inkluderer omhyggelig 
undersøgelse af alle overflader, alle åbninger, og kraniets, brystkas ­
sens og abdomens kaviteter og deres indhold. Lever, nyrer, binyrer, testes, bitestikler, uterus, ovarier, thymus, milt, hjerne og hjerte skal på alle dyr renses for andet vedhængende væv som behørigt (und ­
taget er de dyr, der findes moribunde og/eller aflives undervejs i 
forsøget) og vejes snarest muligt efter dissektionen for at undgå udtørring.
 
Følgende væv skal præserveres ved hjælp af det mest passende 
fiksationsmedie både med henblik på vævstypen og den følgende histopatologiske undersøgelse: alle større læsioner, hjernen (repræ ­
sentative regioner, inklusive cerebrum, cerebellum og medulla/pons), 
rygmarven (fra tre niveauer: cervikal, midt-torakal og lumbal), hypo ­
fyse, tyreoidea og paratyreoidea, tymus, øsofagus, spytkirtlerne, mavesækken, tynd- og tyktarm, (inklusive de Peyerske plaques) 
lever, pankreas, nyrer, binyrer, milt, hjerte, luftrør og lunger (bevaret 
ved indblæsning med fiksativ og påfølgende neddypning), aorta, gonader, uterus, sekundære kønsorganer, brystkirtlerne fra hundy ­
rene, prostata, urinblære, galdeblære (mus), lymfeknuder (helst en 
lymfeknude, som dækker belastningsvejen, og en anden langt 
derfra for at dække den systemiske virkning), perifer nerve (ischia ­
dicus eller tibialis) helst nær ved musklen, en sektion af knogle ­
marven (og/eller frisk knoglemarvsaspirat), hud og øjne (hvis oftal ­
mologisk undersøgelse viste ændringer), Kliniske og andre fund kan 
foranledige undersøgelse af andet væv. Også særlige organer, der sandsynligvis kan være mål for testkemikaliets kendte virkninger, bør præserveres.
 
1.5.2.4.  Histopatologi  
En komplet histopatologisk undersøgelse skal udføres af de præser ­
verede organer og væv på alle dyrene i kontrol- og højdosisgrup ­
perne. Undersøgelserne skal omfatte alle dyrene i de andre grupper, 
også hvis der observeres ændringer i højdosisgruppen, der kan tilskrives belastningen.
 
Alle større læsioner skal undersøges.  
Hvis der anvendes en »satellit«-gruppe, skal der på dem udføres 
histopatologisk undersøgelse af væv og organer, på hvilke der var 
vist ændringer i den belastede gruppe.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. DATA  
Alle data skal anføres. Yderligere skal alle data opsummeres i tabel ­
ler, der for hver testgruppe viser antal dyr ved forsøgets begyndelse, 
antal dyr fundne døde i løbet af testen eller aflivede af humane 
grunde og tidspunktet for deres død, det antal dyr, der udviser tegn på forgiftning, en beskrivelse af disse tegn inklusive tidspunktet for deres begyndelse, deres varighed og forgiftningsgraden; det antal 
dyr, der har læsioner, typen af læsioner og den procentdel af dyrene, 
der udviser de forskellige typer af læsion.
 
Hvor det er muligt, skal tallene evalueres ved hjælp af en passende 
og accepteret statistisk metode. Den statistiske metode og de data, 
der skal analyseres med den, skal vælges under planlægningen af 
forsøget.  
2.2. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal inkludere følgende informationer:  
2.2.1.  Testkemikalium:  
— fysiske egenskaber, renhedsgrad og fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikationsdata  
— indgivelsesmåde, som begrundes, hvis der ikke er tale om drik ­
kevand.  
2.2.2.  Dyreart:  
— anvendte art og stamme  
— antal dyr, deres alder og køn  
— kilde, opbevaringsforhold, føde osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  
2.2.3.  Forsøgsbetingelser:  
— rationale for valg af dosismængde  
— detaljer vedrørende testkemikaliets form/opblanding i føden, 
resulterende koncentration, stabilitet og homogenitet  
— detaljer vedrørende indgift af testkemikaliet  
— sande dosis (mg/kg kropsvægt/dag) og omregningsfaktor fra test ­
kemikaliets koncentration i føde/vand (ppm) til sand dosis, hvis 
muligt  
— detaljer vedrørende kvalitet af vand og føde.  
2.2.4.  Resultater:  
— kropsvægt og ændringer i kropsvægt  
— fødeindtagelse og indtagelse af vand, om muligt  
— data vedrørende forgiftning sat over for køn og dosis, inklusive 
forgiftningstegnene  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— art, alvor og varighed af det klinisk observerede (om det obser ­
verede er reversibelt)  
— resultater af oftalmologisk undersøgelse  
— vurdering, hvis muligt, af sanseaktiviteter, gribestyrke og moto ­
risk aktivitet  
— hæmatologiske målinger med relevante udgangsværdier  
— klinisk-biokemiske målinger med relevante udgangsværdier  
— slutvægt, organernes vægt og organ/kropsvægtforholdene  
— sektionsfund  
— en detaljeret beskrivelse af de histopatologiske fund  
— data for absorption, hvis de forefindes  
— statistisk behandling af resultaterne, hvor rimeligt.  
Diskussion af resultater  
Konklusioner  
3. HENVISNINGER  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologie 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999-1003.  
(3) Gad. S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in lndustrial 
Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691-704.  
(4) Moser. V.C, Mc Daniel, K.M. Phillips, P.M. (1991). Rat Strain 
and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, pp. 267-283.
 
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C, Riley M.T. (1979). A 
Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb 
grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 
233-236.  
(6) Crofton K.M., Howard J.L, Moser V.C, Gill M.W., Reiter L.W., 
Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicolo ­
gical Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599-609.
 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). Harmonisation of 
Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies, 
Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  SUBKRONISK ORAL TOKSICITETSTEST — ET 90-DAGES 
FORSØG OVER GENTAGNE ORALE DOSERS TOKSICITET 
PÅ IKKE-GNAVERE  
1. METODE  
Denne metode til udførelse af en subkronisk oral toksictetstest svarer 
til OECD TG 409 (1998).  
1.1. INTRODUKTION  
Efter at en akut eller gentagen 28-dages toksicitetstest er udført med 
henblik på primær vurdering af et kemisk stofs toksicitet, kan man udføre en subkronisk oral toksicitetstest, hvor man anvender 
gentagne doser til bestemmelse og evaluering af stoffets toksiske 
egenskaber. Undersøgelsen på 90 dage skaffer viden om mulige trusler mod sundheden, som kan opstå ved gentagen belastning i en periode med hurtig vækst, modning og den første del af voksen ­
livet. Undersøgelsen skaffer viden om større toksiske virkninger, 
peger på, hvilke organer der rammes og muligheden for akkumula ­
tion; den kan give et overslag over det belastningsniveau, der kan være skadeligt, uden at det bemærkes, som igen kan anvendes til 
valg af dosis til undersøgelser af kronisk effekt og til fastlæggelse af 
sikkerhedskriterier for, hvad mennesker kan tåle.
 
Undersøgelsesmetoder muliggør, at man på dyrearter, der ikke er 
gnavere, finder frem til negative virkninger ved belastning med kemikalier, og den bør kun bruges:
 
— hvor virkninger i andre undersøgelser peger på nødvendigheden 
af afklaring/karakterisering i en anden dyreart end gnavere, eller  
— hvor toksiko-kinetiske undersøgelser peger på, at anvendelse af 
en speciel dyreart, der ikke er gnaver, er det mest relevante valg blandt laboratoriedyr, eller
 
— hvor andre specielle grunde retfærdiggør anvendelsen af dyrear ­
ter, der ikke er gnavere.  
Se ligeledes den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Dosis:  Mængden af indgivet testkemikalium. Dosis angives som 
vægt (g, mg) eller som vægt af testkemikalium i forhold til dyrets 
vægt (f.eks. mg/kg) eller en konstant del af føden (ppm).  
Dosering:  Er et generelt udtryk for dosis, hyppighed af indgift og 
varigheden af indgiften.  
NOAEL:  Er en forkortelse for det niveau, der ikke medfører obser ­
veret skadelig virkning, og er det højeste dosisniveau, hvor ingen 
negative virkninger, der kan tilskrives behandlingen, er fundet.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Testkemikaliet administreres peroralt dagligt i forskellige doser til 
forskellige grupper af forsøgsdyr, idet hver gruppe får en bestemt dosis i en periode på 90 dage. I denne periode observeres dyrene nøje for tegn på forgiftning. Dyr, der dør eller aflives, mens testen 
står på, bliver obduceret og ved undersøgelsens afslutning bliver 
resten af dyrene aflivet og obduceret.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Valg af dyreart  
Den hyppigst anvendte ikke-gnaverdyreart er hunden, som bør være 
af en veldefineret race; beagle-hunde er ofte anvendt. Af andre arter 
bruges f.eks. også grise og minigrise. Primater anbefales ikke, og 
brug af dem skal forsvares. Der skal anvendes unge, sunde dyr, og for hunde bør belastningen begynde fortrinsvis ved 4- til 6-måne ­
dersalderen og ikke senere end ved 9-månedersalderen. Når der er 
tale om et primærforsøg efterfulgt af et langtidsforsøg med kronisk 
toksicitet, bør man anvende samme dyreart i begge forsøg.
 
1.4.2.  Forberedelse af dyrene  
Der anvendes sunde dyr, som er tilvænnet laboratorieforholdene og 
som ikke før har været anvendt til eksperimenter. Varigheden af tilvænning afhænger af den valgte dyreart og kilden. Mindst fem 
dage for hunde og grise, der er opdrættet til formålet og hører til i 
en stedlig koloni, men mindst to uger for disse dyr, hvis de kommer udefra. Dyrene beskrives hvad angår art, stamme, hvorfra de kommer (kilde), køn, vægt og/eller alder. Dyrene randomiseres til henholdsvis 
kontrol og behandlingsgruppe. Bure skal anbringes, så deres place ­
ring får mindst mulig betydning. Hvert dyr tildeles et eget, særligt identifikationsnummer.
 
1.4.3.  Fremstilling af doser  
Stoffet, der skal undersøges, kan indgives via føden eller drikke ­
vandet, ved hjælp af sonde eller i kapsler. Måden at indgive på 
gennem munden afhænger af undersøgelsens formål og testmateria ­
lets fysisk-kemiske egenskaber.  
Om nødvendigt opløses eller opslæmmes stoffet i et passende medie. 
Hvor muligt anbefales det først at forsøge at anvende vandige opløs ­
ninger eller opslæmninger; dernæst overvejes opløsninger eller opslæmninger i olie (f.eks. majsolie) og først derefter andre opløs ­
nings-/opslæmningsmidler. For andre midler end vand bør de 
toksiske egenskaber kendes. Testkemikaliets stabilitet i forbindelse med indgiften bør fastslås.
 
1.5. FREMGANGSMÅDE  
1.5.1.  Antal dyr og deres køn  
Mindst otte dyr (fire af hvert køn) bør anvendes for hvert dosis ­
niveau. Hvis man planlægger at aflive nogle dyr undervejs i forsøget, 
skal antallet af dyr, der påbegynder forsøget, forøges tilsvarende. Antallet af dyr ved forsøgets afslutning må være tilstrækkelig stort, så evalueringen af den toksiske virkning er mulig. Ud fra tidligere 
opnået viden om kemikaliet eller nære analoge stoffer bør man over ­
veje en yderligere »satellit«-gruppe på otte dyr (fire af hvert køn) i kontrollen og i gruppen med den højeste dosis, således at man efter forsøgsperioden kan observere evt. reversibilitet eller vedvarende 
følger af behandlingen. Varigheden af denne observationsperiode 
afhænger af, hvilke virkninger man vil følge.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Dosisstørrelse  
Mindst tre dosisstørrelser og en sideløbende kontrol bør anvendes, 
undtagen i tilfælde af en begrænset test (se 1.5.3). Dosisstørrelsen kan afhænge af tidligere tilsvarende forsøg eller forsøg med henblik 
på opsøgning af dosisgrænser og skal tage hensyn til kendte toksi ­
kologiske og toksokinetiske data for testkemikaliet eller tilsvarende stoffer. Medmindre kemikaliets fysisk-kemiske natur eller biologiske effekt sætter grænser, bør den højeste dosisstørrelse vælges med 
henblik på toksisk virkning, men ikke på død eller alvorlig lidelse. 
Faldende dosisstørrelse bør vælges med henblik på at påvise en eventuel dosisrelateret virkning og det niveau, der ikke medfører 
observeret skadelig virkning (NOAEL). To til firedobbelte intervaller 
er ofte bedst til fastlæggelse af faldende dosisstørrelser, og tilføjelse af en fjerde testgruppe er ofte at foretrække frem for brug af meget store intervaller (f.eks. mere end en faktor på 6-10) mellem dosis ­
størrelserne.
 
Kontrolgruppen skal være en ubehandlet gruppe eller en gruppe, der 
får det eventuelle medie, i hvilket de behandlede dyr får kemikaliet. Bortset fra behandlingen skal dyrene i kontrolgruppen behandles 
nøjagtigt som dyrene i testgruppen. Hvis kemikaliet indgives i et 
medie, skal kontrolgruppen have mediet i den størst anvendte mængde. Hvis testkemikaliet indgives via foderet, og hvis dette medfører reduceret fødeindtagelse, kan det være nyttigt med en 
gruppe, der parallelfodres mængdemæssigt, således at et eventuelt 
vægttab kan tilskrives, at foderet har en dårlig smag, respektive virker toksisk.
 
Man bør overveje mediets eller eventuelle additivers egenskaber med 
hensyn til absorption, distribution, stofskifte eller retention af testke ­
mikalium; virkningen på testkemikaliets kemiske egenskaber, som igen kan have indflydelse på dets toksiske egenskaber; og indfly ­
delsen på føde- eller vandindtag eller dyrenes ernæringsmæssige 
tilstand.
 
1.5.3.  Grænse-test  
Et totalforsøg med tre dosisstørrelser behøves næppe udført, hvis 
man ikke forventer nogen toksisk effekt ud fra kendskab til struktu ­
relt beslægtede stoffer, og hvis der ikke ses nogen skadelig virkning ved forsøg som beskrevet ovenfor med enkelt dosis svarende til mindst 1 000 mg/kg legemsvægt/dag. Grænsetest er konklusive, 
undtagen hvis belastning af mennesker indikerer nødvendigheden 
af anvendelse af en større dosis.
 
1.5.4.  Dosisadministration  
Dyrene får test-kemikaliet syv gange ugentlig hver uge i 90 dage. 
Ethvert andet regime, f.eks. fem gange ugentlig, skal begrundes. 
Hvis testkemikaliet indgives med sonde, skal det gøres i en enkelt dosis, med anvendelse af en mavesonde eller passende intubations ­
rør. Det maksimale væskevolumen, der kan tilføres ad gangen, 
afhænger af dyrets størrelse. Normalt bør volumen holdes så lavt 
som muligt. Undtaget irritative og ætsende stoffer, som normalt vil have øget generende effekt ved større koncentrationer, bør varia ­
tionen i testvolumen begrænses ved justering af koncentrationen af 
testkemikaliet for at sikre et konstant volumen ved alle dosisstørrel ­
ser.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Det er vigtigt at sikre, at de kvantiteter af kemikalier, som indtages 
via føden eller drikkevandet, ikke får indflydelse på den normale 
ernæring eller vandbalancen. Når testkemikaliet tilføres med føden, kan man tilføre det enten som en konstant del af føden (ppm) eller en konstant dosisstørrelse i forhold til dyrets vægt; det, man vælger, 
skal specificeres. Tilføres kemikaliet via sonde eller kapsel, bør det 
gøres på samme tidspunkt hver dag, og dosisstørrelse skal rettes til, så den udgør en konstant størrelse i forhold til dyrets vægt. Hvis et 90-dages forsøg foretages som forløber for et langtids kronisk-toksi ­
citetsforsøg, skal der i begge forsøg gives samme fødesammensæt ­
ning.
 
1.5.5.  Observationer  
Observationsperioden skal mindst vare 90 dage. Dyrene i »satellit«- 
gruppen, hvor man vil foretage »follow-up« -observationer, skal 
beholdes i en passende periode uden behandling, med henblik på konstatering af fortsat eller ophør af toksisk virkning.
 
Almindelig klinisk observation bør foretages mindst en gang om 
dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er), idet man tager i betragt ­
ning, hvornår maksimal effekt kan forventes efter indgift. Dyrenes kliniske tilstand bør noteres. Mindst to gange daglig, sædvanligvis 
morgen og aften, undersøges alle dyrene for tegn på morbiditet eller 
mortalitet.
 
I hvert fald før første belastning (for at tage højde for individuelle 
forskelle) og en gang ugentlig derefter bør detaljerede kliniske under ­
søgelse foretages af alle dyrene. Disse undersøgelser skal foretages, hvor det er praktisk muligt, uden for burene, på et standardareal og fortrinsvis på samme tid i hvert tilfælde. Man bør bestræbe sig på. at 
variationerne i observationsbetingelserne er mindst mulige. Blandt de 
fund, der skal noteres (men ikke som de eneste), er ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion og ekskreter og autonom aktivitet (f.eks. tåreflåd, hårrejsning, pupilstørrelse, usæd ­
vanligt respirationsmønster). Forandringer i gang, stilling og respons 
på håndtering såvel som tilstedeværelse af toniske og kloniske bevæ ­
gelser, stereotypi (f.eks. overdreven pudsning, repetitive cirkelbevæ ­
gelser) eller bizar opførsel skal også noteres.
 
Oftalmologisk undersøgelse ved hjælp af oftalmoskop eller andet 
passende udstyr bør udføres, før test-kemikaliet tilføres første gang og ved afslutning af forsøget, fortrinsvis på alle dyrene, men i hvert 
fald på dem, der fik højeste dosis og på kontrollerne. Hvis der 
opdages øjenforandringer. der kan tilskrives behandlingen, skal alle dyrene undersøges.
 
1.5.5.1.  Kropsvægt og føde/vandindtagelse  
Alle dyr skal vejes mindst en gang ugentlig. Mængden af fødeind ­
tagelse skal beregnes mindst en gang ugentlig. Hvis test-kemikaliet administreres via drikkevandet, skal vandindtagelsen beregnes mindst en gang ugentlig. Vandforbruget bør også tages i betragtning, når 
belastningen foretages via føden eller via sonde, da drikkeaktiviteten 
kan ændres herved.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hæmalologi og klinisk biokemi  
Stedet, hvor blodprøver tages, bør angives, og de bør gemmes på 
passende vis. Ved forsøgets afslutning tages der prøver lige før eller i forbindelse med aflivningen af dyrene.
 
Hæmatologi, inkluderende hæmatokrit, hæmoglobinkoncentration, 
tælling af røde og hvide blodlegemer, differentialtælling, trombocyt ­
tælling og et mål for koagulationsevnen, som f.eks. koagulationstid, 
protrombintid eller tromboplastintid, bør måles før forsøget påbegyn ­
des, siden hver måned eller midtvejs i forsøget og endelig ved forsøgets afslutning.
 
Klinisk kemiske målinger med henblik på undersøgelse af toksisk 
virkning på væv og specielt på nyrer og lever skal foretages på blodprøver taget fra alle dyrene ved forsøgets begyndelse, siden 
enten hver måned eller midtvejs i forsøget og til sidst ved forsøgets 
afslutning. Man bør måle elektrolytbalancen, kulhydratstofskiftet og lever- og nyrefunktionen. Valg af særlige målinger vil afhænge af testkemikaliets virkningsmåde. Dyrene bør faste, afhængig af dyrear ­
ten, før blodprøvetagningen. Det foreslås, at man måler calcium, 
fosfor, klorid, kalium, natrium, fastende glukose, alanin aminotrans ­
ferase, aspartat aminotransferase, ornitin decarboksylase, gammaglu ­
tamyl transpeptidase, carbamid, albumin, serumkreatinin, total bili ­
rubin og total serumprotein.
 
Urinanalyser bør udføres i hvert fald ved begyndelsen, midtvejs og 
ved afslutningen af forsøget, med opsamling af timediuresen. 
Analyserne inkluderer udseende, volumen, osmolalitet eller vægt ­
fylde, pH, protein, glukose og blod/blodceller. Andre parametre kan inkluderes, hvor man finder det nødvendigt at udvide undersø ­
gelsen af en eller flere observerede virkninger.
 
Herudover bør man overveje måling af markører for generel vævs ­
skade. Andre målinger, som kan være nødvendige for en tilstræk ­
kelig toksikologisk vurdering, inkluderer analyser af lipider, hormo ­
ner, syre/base-balancen, methæmoglobin, og hæmning af kolineste ­
rasen. Hvor det skønnes nødvendigt, kan andre biokemiske målinger inddrages for at udvide undersøgelsen af observerede virkninger. 
Disse bør måles i forbindelse med kemikalier af særlige typer eller 
fra tilfælde til tilfælde.
 
Almindeligvis må man have en fleksibel indstilling ud fra dyrearten 
og de observerede og/eller forventede virkninger af et givet kemika ­
lium.  
1.5.5.3.  Makroskopisk obduktion  
Alle dyr, som indgår i forsøget, skal have udført en fuldstændig, 
detaljeret makroskopisk obduktion, hvilket inkluderer omhyggelig undersøgelse af alle overflader, alle åbninger, og kraniets, brystkas ­
sens og abdomens kaviteter og deres indhold. Lever med galdeblære, 
nyrer, binyrer, testes, bitestikler, ovarier, uterus, tyreoidea med para ­
tyreoideae. thymus, milt hjerne og hjerte skal på alle dyr renses for andet vedhængende væv som behørigt (undtaget er de dyr, der findes 
moribunde og/eller aflives undervejs i forsøget) og vejes snarest 
muligt efter dissektionen for at undgå udtørring.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Følgende væv skal præserveres ved hjælp af det mest passende 
fiksationsmedie både med henblik på vævstypen og den følgende 
histopatologiske undersøgelse: alle større læsioner, hjernen (repræ ­
sentative regioner, inklusive cerebrum, cerebellum og medulla/pons), rygmarven (fra tre niveauer: cervikal, midt-torakal og lumbal), hypo ­
fyse, øjne. tyreoidea, paratyreoideae, tymus, øsofagus, spytkirtlerne, 
mavesækken, tynd- og tyktarm, (inklusive de Peyerske plaques) lever, galdeblære, pankreas, nyrer, binyrer, milt, hjerte, luftrør og lunger, aorta, gonader, uterus, sekundære kønsorganer, brystkirtlerne 
fra hundyrene, prostata, urinblære, lymfeknuder (helst en lymfek ­
nude, som dækker belastningsvejen, og en anden langt derfra for at dække den systemiske virkning), perifer nerve (ischiadicus eller tibialis) helst nær ved musklen, en sektion af knoglemarven (og/eller 
frisk knoglemarvsaspirat), hud. Kliniske og andre fund kan foranle ­
dige undersøgelse af andet væv. Også særlige organer, der sandsyn ­
ligvis kan være mål for testkemikaliets kendte virkninger, bør præserveres.
 
1.5.5.4.  Histopatologi  
En komplet histopatologisk undersøgelse skal udføres af de præser ­
verede organer og væv på i hvert fald alle dyrene i kontrol- og højdosisgrupperne. Undersøgelsen skal omfatte alle dyrene i de andre gruppe også, hvis der observeres ændringer i højdosisgruppen, 
der kan tilskrives belastningen.
 
Alle større læsioner skal undersøges.  
Hvis der anvendes en »satellit« -gruppe, skal der på dem udføres 
histopatologisk undersøgelse af væv og organer, på hvilke der var 
vist ændringer i den belastede gruppe.  
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. DATA  
Alle data skal anføres. Yderligere skal alle data opsummeres i tabel ­
ler, der for hver testgruppe viser antal dyr ved forsøgets begyndelse, 
antal dyr fundne døde i løbet af testen eller aflivede af humane grunde og tidspunktet for deres død, det antal dyr, der udviser tegn på forgiftning, en beskrivelse af disse tegn inklusive tidspunktet 
for deres begyndelse, deres varighed og forgiftningsgraden: det antal 
dyr. der har læsioner, typen af læsioner og den procentdel af dyrene, der udviser de forskellige typer af læsion.
 
Hvor det er muligt, skal tallene evalueres ved hjælp af en passende 
og accepteret statistisk metode. Den statistiske metode og de data, 
der skal analyseres med den, skal vælges under planlægningen af 
forsøget.  
2.2. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal inkludere følgende informationer:  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Testkemikalium:  
— fysiske egenskaber, renhedsgrad og fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikationsdata  
— indgivelsesmåde, som begrundes, hvis der ikke er tale om drik ­
kevand.  
2.2.2.  Dyreart:  
— anvendte art og stamme  
— antal dyr, deres alder og køn  
— kilde, opbevaringsforhold, føde osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  
2.2.3.  Forsøgsbetingelser:  
— rationale for valg af dosismængde  
— detaljer vedrørende test-kemikaliets form/opblanding i føden, 
resulterende koncentration, stabilitet og homogenitet  
— detaljer vedrørende indgift af testkemikaliet  
— sande dosis (mg/kg kropsvægt/dag) og omregningsfaktor fra test ­
kemikaliets koncentration i føde/vand (ppm) til sand dosis, hvis 
muligt  
— detaljer vedrørende kvalitet af vand og føde.  
2.2.4.  Resultater:  
— kropsvægt og ændringer i kropsvægt  
— fødeindtagelse og indtagelse af vand, om muligt  
— data vedrørende forgiftning sat over for køn og dosis, inklusive 
forgiftningstegnene  
— art, alvor og varighed af det klinisk observerede (om det obser ­
verede er reversibelt)  
— oftalmologisk undersøgelse  
— hæmatologiske målinger med relevante udgangsværdier  
— klinisk-biokemiske målinger med relevante udgangsværdier  
— slutvægt, organernes vægt og organ/kropsvægtforholdene  
— sektionsfund  
— en detaljeret beskrivelse af de histopatologiske fund  
— data for absorption, hvis de forefindes  
— statistisk behandling af resultaterne, hvor rimeligt  
Diskussion af resultater  
Konklusioner  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  SUBKRONISK TOKSICITET, OPTAGELSE GENNEM HUDEN 
— 90 DAGES GENTAGEN DOSERING PÅ HUD UNDER 
ANVENDELSE AF GNAVERE  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Teststoffet påføres dagligt huden på grupper af forsøgsdyr, idet der 
gives en bestemt gradueret dosis til hver gruppe gennem en periode 
på 90 dage. Dyrene observeres dagligt i forsøgsperioden. Eventuelle 
tegn på toksicitet registreres. De dyr, der dør under forsøget eller aflives ved afslutningen af forsøget, obduceres.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Forberedelser  
Dyrene holdes under forsøgsbetingelserne med hensyn til miljø og 
fodring i mindst fem dage inden forsøget påbegyndes. Unge, sunde, dyr fordeles randomiseret i grupper. Kort før forsøget indledes, klippes pelsen på ryggen på forsøgsdyrene. Såfremt pelsen barberes 
bort, bør det ske ca. 24 timer, inden forsøget indledes. Klipningen 
eller barberingen må som regel gentages med en uges mellemrum. Man må ved klipning eller barbering passe på ikke at beskadige huden. Mindst 10 % af dyrets overflade skal kunne anvendes til 
påføring af teststoffet. Ved afgørelse af, hvilket og hvor stort et 
område, der skal klippes, bør der tages hensyn til dyrets vægt. Ved testning af faste stoffer, som — hvis det er hensigtsmæssigt — kan pulveriseres, skal teststoffet fugtes tilstrækkeligt med vand 
eller om nødvendigt med et passende vehikel for at sikre god kontakt 
med huden. Flydende teststoffer påføres normalt ufortyndet. Der skal anvendes daglig applikation fem til syv dage ugentligt.
 
1.6.2.  Forsøgsbetingelser  
1.6.2.1. F o r s ø g s d y r  
Der kan anvendes voksne rotter eller kaniner. Der kan anvendes 
andre dyrearter, men i så fald skal dette være begrundet. Der 
benyttes dyr af almindeligt anvendte stammer, For begge køn af 
forsøgsdyr gælder det, at variationen i deres vægt ikke må overskride ± 20 % af en rimelig gennemsnitsvægt. Hvis en undersøgelse af subkronisk toksicitet udføres som et forstudium til en langtidsunder ­
søgelse, bør samme dyreart og stamme anvendes i begge undersø ­
gelser.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
1.6.2.2. A n t a l o g k ø n  
Der anvendes mindst 20 dyr (10 hunner og 10 hanner) med sund hud 
til hvert dosisniveau. Hunnerne må ikke have født og må ikke være drægtige. Hvis der påregnes aflivning af dyr under forsøget, skal det 
oprindelige antal dyr forøges med det antal dyr, man påregner at 
aflive i løbet af forsøget. Man kan samtidig udsætte en satellitgruppe på 20 dyr (10 af hvert køn) for den højeste koncentration i 90 dage og gennem en periode på 28 dage efter forsøget observere, om der er 
reversible, varige eller sent opståede toksiske virkninger.
 
1.6.2.3. D o s i s n i v e a u e r  
Der skal anvendes mindst tre dosisniveauer samt en kontrolgruppe 
eller en vehikelkontrolgruppe, såfremt der benyttes vehikel. Ekspone ­
ringsperioden er på mindst seks timer dagligt. Teststoffet påføres på omtrent samme tidspunkt hver dag, og doserne justeres med jævne 
mellemrum (én gang eller to gange om ugen), så de er konstante i 
forhold til dyrenes legemsvægt. Dyrene i kontrolgruppen behandles nøjagtigt som dyrene i forsøgsgrupperne, bortset fra påføring af test ­
stoffet. Hvis der anvendes et vehikel til at lette doseringen, skal 
vehikelkontrolgruppen eksponeres på samme måde som forsøgsgrup ­
perne og påføres samme mængde vehikel som den gruppe, der modtager den højeste dosis. Den højeste dosis bør have toksisk virk ­
ning, men kun medføre få eller ingen dødsfald. Det laveste dosis ­
niveau bør ikke have nogen toksisk virkning overhovedet. Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet, skal det laveste dosisniveau overskride denne eksponering. 
Middeldosis skal helst frembringe så svage observerbare toksiske 
virkninger som muligt. Hvis der anvendes mere end tre dosis ­
niveauer, bør de vælges således, at der opnås graduering af de toksiske virkninger. I grupperne med lav og middel dosis og i 
kontrolgrupperne skal dødeligheden holdes på et lavt niveau, så 
der bliver mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne.
 
Hvis teststoffet forårsager alvorlig hudirritation, bør koncentrationen 
sænkes, og der kan derved ske en reduktion eller et fuldstændigt bortfald af de øvrige toksiske effekter på den højeste dosis. Hvis huden er blevet alvorligt beskadiget, kan det være nødvendigt at 
afbryde forsøget og foretage et nyt forsøg med en lavere koncen ­
tration.
 
1.6.3. G r æ n s e t e s t  
Hvis et dosisniveau på 1 000 mg/kg legemsvægt eller et højere 
dosisniveau fastsat ud fra kendskabet til den eventuelle eksponering, mennesker udsættes for, ikke giver nogen toksisk virkning, kan yder ­
ligere forsøg betragtes som unødvendige.
 
1.6.4. O b s e r v a t i o n s p e r i o d e  
Dyrene observeres dagligt, og det registreres, om der optræder tegn 
på toksicitet. Dødstidspunkt og tidspunkt for toksicitetstegns 
optræden og forsvinden skal registreres.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
1.6.5.  Fremgangsmåde  
Dyrene skal holdes i hvert sit bur. Den ideelle doseringer påføring af 
teststoffet syv dage om ugen i en periode på 90 dage.  
Eventuelle satellitgrupper beregnet til efterfølgende observationer bør 
holdes under observation i yderligere 28 dage, efter at påføringen af teststoffet er afsluttet, således at man har mulighed for at registrere, 
om toksiske virkninger er reversible eller om de persisterer. Eksposi ­
tionsperioden skal være seks timer dagligt.
 
Teststoffet påføres jævnt over et område, som svarer til ca. 10 % af 
den samlede kropsoverflade. Med stærkt toksiske stoffer kan der 
anvendes et mindre område, men stoffet bør påføres så tyndt og ensartet og over så stor en del af området som muligt.
 
Teststoffet holdes i kontakt med huden ved hjælp af en porøs gaze ­
forbinding og en ikke-hudirriterende klæbestrimmel. Teststedet skal desuden dækkes på en sådan måde, at gazeforbindingen og teststoffet holdes sikkert fast, så det sikres, at dyrene ikke indtager teststoffet. 
Der kan anvendes andre foranstaltninger, som forhindrer dyrene i at 
indtage teststoffet, men man bør ikke immobilisere dem fuldstændigt.
 
Ved eksponeringsperiodens slutning fjernes eventuelt tilbagesiddende 
teststof, idet der anvendes vand eller en anden egnet metode til at rense huden.
 
Alle dyr observeres dagligt, og det registreres, om der optræder tegn 
på toksicitet, hvornår disse tegn optræder første gang, hvor længe de varer, og hvor kraftige de er. Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels, øjne og slimhinder, åndedræt og kreds ­
løb, det autonome og centrale nervesystem, den motoriske aktivitet 
og adfærdsmønstret. Der holdes ugentligt regnskab med foderind ­
tagelsen, og dyrene vejes en gang om ugen. Dyrene observeres med jævne mellemrum med henblik på, at det mindst mulige antal 
dyr går tabt for undersøgelsen på grund af f.eks. kannibalisme, auto ­
lyse af væv eller forveksling. Ved forsøgets afslutning aflives og obduceres alle tilbageværende dyr med undtagelse af satellitgrup ­
perne. Døende dyr skal fjernes og obduceres, så snart de registreres.
 
Alle dyr inklusive kontrolgruppen underkastes normalt følgende 
undersøgelser:  
a) Oftalmologisk undersøgelse med anvendelse af et oftalmoskop 
eller lignende passende udstyr skal foretages inden påføring af teststoffet og ved undersøgelsens afslutning. Det må foretrækkes, 
at alle dyr undersøges, men sker dette ikke, undersøges mindst 
den gruppe, der påføres den højeste dosis og kontrolgruppen. Hvis der observeres forandringer i øjnene, skal alle dyrene under ­
søges.
 
b) Hæmatologiske undersøgelser omfattende hæmatokrit, hæmoglo ­
binkoncentration, erytrocyttælling, total og differential leukocyt ­
tælling, måling af koaguleringsevne f.eks. koagulationstid, 
protrombintid, tromboplastintid eller blodpladetælling skal fore ­
tages ved forsøgets afslutning.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) Klinisk biokemisk analyse af blod skal foretages ved afslutningen 
af forsøget. Relevante analyseområder for alle forsøg er elektro ­
lytbalance, kulhydratstofskifte, lever- og nyrefunktion. Valg af specifikke test afhænger af observationer af teststoffets virkning. Følgende bestemmelser kan foreslås: kalcium, fosfor, klorid, 
natrium, kalium, fasteglukose (fasteperioden vil afhænge af 
dyrearten), serum alanin aminotransferase (ALAT), serum aspartat aminotransferase (ASAT), ornitin decarboxylase, gamma glutamyl transpeptidase, urinstof, albumin, kreatinin, total bili ­
rubin og total serumprotein. Andre bestemmelser, der kan være 
påkrævede i en adækvat toksikologisk vurdering, omfatter lipid ­
analyser, hormonanalyser, syre/basebalance, methæmoglobin, cholinesteraseaktivitet. Der kan anvendes yderligere klinisk- 
biokemisk analyse, hvor det skønnes nødvendigt for en videre 
undersøgelse af de observerede virkninger.
 
d) Rutinemæssig urinanalyse er ikke påkrævet, medmindre den indi ­
ceres af forventede eller observerede toksiske virkninger.  
Hvis historiske basaldata er inadækvate, skal man gøre sig over ­
vejelser over anvendelsen af hæmatologiske og klinisk biokemiske 
parametre, inden forsøget begynder.  
M a k r o s k o p i s k u n d e r s ø g e l s e  
Alle forsøgsdyrene skal underkastes en fuldstændig makroskopisk 
vurdering, der omfatter undersøgelse af kropsoverflade, alle krops ­
åbninger og kranie-, thorax- og abdominalhulerne og deres indhold. 
Lever, nyrer, binyrer og testikler vejes så hurtigt som muligt efter 
dissektion for at undgå udtørring, Følgende væv og organer skal opbevares i et passende medium med henblik på mulig senere histopatologisk undersøgelse: alle væv og organer, som udviser 
læsioner, hjerne, herunder snit af medulla/pons, den cerebellare og 
cerebrale cortex, hypofyse, skjoldbrusk/biskjoldbruskkirtel, thymus ­
væv, (trakea), lunger, hjerte, aorta, spytkirtler, lever, milt, nyrer, binyrer, bugspytkirtel, kønskirtler, uterus, assesoriske kønskirtler, 
galdeblære (hvis den findes), spiserør, mavesæk, duodenum, jeju ­
num, ileum, coecum, tyktarm, endetarm, urinblære, en repræsentativ lymfeknude, (kvindelig brystkirtel), (lårmuskulatur), perifer nerve, (øjne), (sternum med benmarv), (femur inklusive ledflade), (rygmarv 
i tre forskellige snit — cervikalt, midt for thorax og lumbalt) og 
(exorbitale tårekirtler). Væv, der er nævnt i parentes, behøver kun undersøges, hvis der er tale om toksicitetstegn eller kan sættes i forbindelse med målorganer.
 
H i s t o p a t o l o g i s k e u n d e r s ø g e l s e r  
a) Der skal foretages en fuldstændig histopatologisk undersøgelse af 
organer og væv fra dyrene i kontrolgruppen og i den gruppe, der 
har fået påført den højeste dosis.  
b) Alle alvorlige læsioner skal undersøges.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 419
 
c) Målorganer skal også undersøges i øvrige doserede grupper.  
d) Når der anvendes rotter, undersøges lungerne fra dyrene i den 
lavest doserede og de middeldoserede grupper histopatologisk 
med henblik på konstatering af tegn på infektion, idet dette giver en egnet vurdering af dyrenes helbredstilstand. Der er ikke rutinemæssigt behov for yderligere histopatologiske under ­
søgelser af dyrene i disse grupper, men organer, som viser tegn 
på læsioner i den gruppe, der har fået påført den højeste dosis, skal altid undersøges.
 
e) Dyrene i en eventuel satellitgruppe skal underkastes en histop ­
atologisk undersøgelse af de væv og organer, der udviser toksisk 
påvirkning i de øvrige grupper.  
2. DATA  
Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved 
begyndelsen af forsøget, antal dyr med læsioner og for hver type af 
læsioner den procentdel dyr, der udviser den pågældende læsion, 
Evaluering af resultaterne skal baseres på en passende statistisk metode. Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— dyreart, stamme, herkomst, miljøbetingelser, foder osv.  
— forsøgsbetingelser  
— dosisniveauer (med angivelse af vehikel, hvor et sådant er 
anvendt) samt koncentration  
— oplysninger om toksisk reaktion inddelt efter køn og dosis  
— ikke toksisk dosis, hvis en sådan er konstateret  
— dødstidspunkt under forsøget eller overlevelse af forsøgsdyr til 
forsøgets slutning  
— toksiske eller andre virkninger  
— observationstidspunkt for hvert enkelt abnormitetstegn og den 
senere udvikling af abnormiteten  
— data for foder og vægt  
— oftalmologiske fund  
— hæmatologiske undersøgelser og samtlige resultater  
— klinisk biokemiske analyser og samtlige resultater (herunder 
resultater af urinanalyse)  
— obduktionsfund  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund  
— eventuel statistisk behandling af resultaterne  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. VURDERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  SUBKRONISK TOKSICITET (INHALATION): 90-DAGES 
FORSØG  
RESUMÉ  
Denne reviderede testmetode B.29 har til formål at tilvejebringe en fuld karak ­
terisering af testkemikaliets toksicitet ved inhalation i en subkronisk varighed (90 
dage) og at fremskaffe robuste data til kvantitative inhalationsrisikovurderinger. 
Grupper bestående af 10 hangnavere og 10 hungnavere eksponeres i seks timer om dagen i 90 dage (13 uger) for a) testkemikaliet ved tre eller flere koncen ­
trationsniveauer, b) filtreret luft (negativ kontrol) og/eller c) vehiklet (vehikelkon ­
trol). Dyr eksponeres generelt fem dage om ugen, men eksponering i syv dage 
om ugen tillades også. Hanner og hunner testes altid, men de eksponeres muligvis ved forskellige koncentrationsniveauer, hvis det vides, at det ene køn er mere modtageligt for et bestemt testkemikalie. Denne metode giver forsøgs ­
lederen fleksibilitet til at medtage satellitgrupper (reversibilitet), aflivninger under 
forsøget, bronchieskylning (BAL), neurologiske test og yderligere kliniske pato ­
logiske og histopatologiske evalueringer med henblik på at opnå en bedre karak ­
terisering af testkemikaliets toksicitet.
 
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline 413 (2009). Den oprinde ­
lige Test Guideline 413 (TG 413) for subkronisk toksicitet ved inhalation blev vedtaget i 1981 (1). Denne testmetode B.29 (som svarer til den revide ­
rede TG 413) er blevet opdateret, så den afspejler det videnskabelige niveau 
og for at opfylde nuværende og fremtidige lovgivningskrav.
 
2. Forsøg med subkronisk toksicitet ved inhalation bruges primært til at fast ­
lægge lovgivningsmæssige koncentrationer med henblik på at vurdere risici for arbejdstagere på arbejdspladsen. De bruges også til at vurdere risikoen 
for mennesker i boliger, ved transport og miljøet. Denne metode gør det 
muligt at karakterisere negative virkninger efter gentagen daglig inhalations ­
eksponering for et testkemikalie i 90 dage (ca. 10 % af en rottes levetid). Data, der udledes af forsøg med subkronisk toksicitet ved inhalation, kan 
bruges til kvantitative risikovurderinger og til udvælgelse af koncentrationer 
til kroniske forsøg. Denne testmetode er ikke specifikt beregnet til test af nanomaterialer. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne test ­
metode, er anført i slutningen af dette kapitel og i Guidance Document 39 
(2).
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
3. Alle tilgængelige informationer om testkemikaliet bør overvejes af testlabo ­
ratoriet inden gennemførelsen af forsøget med henblik på at forbedre kvali ­
teten af forsøget og minimere omfanget af dyreforsøg. Informationer, der kan hjælpe med at vælge de mest hensigtsmæssige testkoncentrationer, omfatter testkemikaliets identitet, kemiske struktur og fysisk-kemiske egen ­
skaber, resultater af in vitro- eller in vivo-toksicitetstest, forventede anven ­
delser og potentialet for human eksponering, tilgængelige (Q)SAR-data og toksikologiske data vedrørende strukturelt relaterede kemikalier samt data udledt af andre forsøg med gentagen eksponering. Hvis neurotoksicitet 
forventes eller observeres i løbet af forsøget, kan forsøgslederen vælge at 
inkludere relevante evalueringer, som f.eks. FOB (Functional Observational Battery) og måling af motorisk aktivitet. Selv om tidspunkterne for ekspone ­
ring kan være afgørende i forhold til de specifikke undersøgelser, må 
gennemførelsen af disse ekstra aktiviteter ikke påvirke det grundlæggende 
forsøgsdesign.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Fortyndinger af ætsende eller irriterende testkemikalier kan testes ved 
koncentrationer, der giver den ønskede toksicitetsgrad. Se GD 39 (2) for 
yderligere oplysninger. Når dyr eksponeres for sådanne materialer, bør målkoncentrationerne være så lave, at de ikke medfører udtalt smerte og lidelse, men de bør alligevel være tilstrækkelige til at hæve 
koncentrations-responskurven til et niveau, der opfylder testens lovgivnings ­
mæssige eller videnskabelige formål. Disse koncentrationer bør vælges i det enkelte tilfælde, fortrinsvis på grundlag af målrettede dosisbestemmende forsøg (»range finding«), der giver information om den kritiske effektpara ­
meter, irritationstærskel og tidspunkt for indtræden (se afsnit 11-13). Der 
gives en begrundelse for valget af koncentration.
 
5. Dyr, som er døende, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og 
vedvarende lidelser, skal aflives humant. Dyr, som er døende, betragtes på samme måde som dyr, der dør i løbet i forsøget. Kriterierne for aflivning af 
døende eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller 
forestående død er genstand for en særskilt vejledning (OECD Guidance Document No. 19 on Humane Endpoints) (3).
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
6. Der anvendes raske unge gnavere af sædvanligt benyttede laboratoriestam ­
mer. Rotten er det foretrukne forsøgsdyr. Begrundelse skal anføres, hvis der anvendes andre dyrearter.
 
Forberedelse af dyrene  
7. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. På randomise ­
ringsdagen bør dyrene være unge voksne, der er mellem syv og ni uger 
gamle. Deres kropsvægt bør være inden for ± 20 % af gennemsnitsvægten 
for hvert køn. Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres, og holdes i burene i mindst fem døgn forud for forsøgets start, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne.
 
Dyreopdræt og -sundhed  
8. Dyrene identificeres individuelt med subkutane transpondere, hvis det er 
muligt, for at lette observationer og undgå forvirring. Temperaturen i 
forsøgsdyrrummet bør være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed bør være 
30-70 %, selv om det muligvis ikke er muligt, hvis vand bruges som vehi ­
kel. Før og efter eksponering bør dyr generelt holdes i bur i grupper efter køn og koncentration, men antallet af dyr pr. bur må ikke bevirke, at det er 
vanskeligt at observere de enkelte dyr, og bør minimere tab som følge af 
kannibalisme og slagsmål. Hvis dyr alene eksponeres gennem næsen, skal de muligvis tilvænnes fastspændingsslanger. Disse slanger må ikke påføre dyrene unødig fysisk, termisk eller bevægelsesmæssig belastning. Fastspæn ­
ding kan påvirke fysiologiske effektparametre, som f.eks. kropstemperatur 
(hypertermi) og/eller respiratorisk minutvolumen. Hvis der foreligger gene ­
riske data, som viser, at sådanne ændringer ikke forekommer i nævnevær ­
digt omfang, er tilvænning til fastspændingsslangerne ikke nødvendig. Dyr, 
der med hele kroppen eksponeres for en aerosol, bør holdes i individuelle 
bure under eksponeringen for at undgå, at testaerosolen filtreres gennem pelsen på de andre dyr i buret. Der kan anvendes normalt og godkendt laboratoriefoder, dog ikke under eksponering, med ubegrænset forsyning 
af drikkevand. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys 
og 12 timers mørke.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalationskamre  
9. Karakteren af testkemikaliet og formålet med testen bør overvejes ved valget 
af inhalationskammer. Den foretrukne eksponeringsform er gennem næsen (dette udtryk omfatter kun hoved, kun næse og kun snude). Eksponering 
gennem næsen foretrækkes generelt i forbindelse med test af flydende eller 
faste aerosoler og dampe, der kan kondensere og danne aerosoler. Særlige formål med testen kan bedre opfyldes ved eksponering af hele kroppen, men dette skal begrundes i testrapporten. For at sikre en stabil atmosfære, når der 
anvendes et kammer til hele kroppen, må forsøgsdyrenes totale volumen 
ikke overstige 5 % af kammerets volumen. Principperne for teknikkerne til eksponering gennem næsen eller eksponering af hele kroppen samt 
deres særlige fordele og ulemper er beskrevet i GD 39 (2).
 
TOKSICITETSFORSØG  
Grænsekoncentrationer  
10. I modsætning til forsøg med akut toksicitet er der ingen definerede græn ­
sekoncentrationer i forsøg med subkronisk toksicitet ved inhalation. Den 
testede maksimumskoncentration baseres på: 1) den højest opnåelige koncentration, 2) »worst case« eksponeringsniveau for mennesker, 3) 
behovet for at sikre tilstrækkelig iltforsyning og/eller 4) hensyn til dyrevel ­
færd. Hvis der ikke foreligger databaserede grænser, kan de akutte grænser i forordning (EF) nr. 1272/2008 (13) anvendes (dvs. op til en maksimums ­
koncentration på 5 mg/l for aerosoler, 20 mg/l for dampe og 20 000 ppm for 
gasser); se GD 39 (2). Det gives en begrundelse, hvis det er nødvendigt at 
overskride disse grænser ved test af gasser eller meget flygtige testkemika ­
lier (f.eks. kølemidler). Grænsekoncentrationen bør fremkalde klar toksicitet uden at forårsage unødig stress for dyrene eller påvirke deres levetid (3).
 
Dosisbestemmende forsøg  
11. Inden hovedforsøget påbegyndes, er det oftest nødvendigt at udføre et dosis ­
bestemmende forsøg (»range finding«). Et dosisbestemmende forsøg er mere omfattende end et forforsøg, fordi det ikke er begrænset til valg af koncen ­
tration. Viden, der opnås fra et dosisbestemmende forsøg, kan resultere i et 
vellykket hovedforsøg. Et dosisbestemmende forsøg kan f.eks. fremskaffe 
teknisk information om analysemetoder, partikelstørrelsesfordeling, opda ­
gelse af toksiske mekanismer, klinisk patologi og histopatologiske data samt estimeringer af de mulige NOAEL- og MTC-koncentrationer i et 
hovedforsøg. Forsøgslederen kan vælge at bruge det dosisbestemmende 
forsøg til at identificere tærsklen for irritation af luftvejene (f.eks. ved hjælp af histopatologisk undersøgelse af luftvejene, lungefunktionstest eller bronchieskylning), den øvre koncentration, der tåles uden unødig 
belastning af dyrene, og de parametre, der bedst karakteriserer et testkemi ­
kalies toksicitet.
 
12. Et dosisbestemmende forsøg kan omfatte et eller flere koncentrations ­
niveauer. Afhængigt af de valgte effektparametre eksponeres 3-6 hanner 
og 3-6 hunner ved hvert koncentrationsniveau. Et dosisbestemmende forsøg bør vare mindst fem dage og generelt højst 28 dage. En begrundelse for valget af koncentrationer til hovedforsøget gives i forsøgsrapporten. 
Formålet med hovedforsøget er at påvise et forhold mellem 
koncentration-respons med udgangspunkt i det, der forventes at være den mest sensitive effektparameter. Den laveste koncentration bør ideelt være en NOAEL-koncentration, mens den højeste koncentration bør fremkalde klar 
toksicitet uden at forårsage unødig stress for dyrene eller påvirke deres 
levetid (3).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Når koncentrationerne vælges til det dosisbestemmende forsøg, anvendes 
alle tilgængelige informationer, herunder data om forholdet mellem struktur 
og aktivitet og data vedrørende lignende kemikalier (se afsnit 3). Et dosis ­
bestemmende forsøg kan bekræfte/afvise, hvad der betragtes som de mest sensitive mekanistisk baserede effektparametre, f.eks. organofosfaters 
hæmning af kolinesterasen, erythrocytotoksiske stoffers dannelse af methæ ­
moglobin, thyreoideahormoner (T
 3 , T 4 ) for thyreotoksikanter, protein, eller 
neutrofiler i bronchieskylning for uskadelige svært opløselige partikler eller lungeirriterende aerosoler.
 
Hovedforsøg  
14. Hovedforsøget vedrørende subkronisk toksicitet omfatter generelt tre 
koncentrationsniveauer og også en samtidig negativ kontrolgruppe (luft) og/eller vehikelgruppe, hvis det er nødvendigt (se afsnit 18). Alle tilgænge ­
lige data bør anvendes som hjælp til at vælge hensigtsmæssige ekspone ­
ringssniveauer, herunder resultaterne af systemiske toksicitetsforsøg, meta ­
bolisme og kinetik (der bør lægges særlig vægt på at undgå høje koncen ­
trationsniveauer, der mætter kinetiske processeer). Hver testgruppe består af 
10 hangnavere og 10 hungnavere, der eksponeres for testkemikaliet i seks 
timer om dagen i fem dage om ugen i en periode på 13 uger (samlet forsøgsvarighed på mindst 90 dage). Dyr kan også eksponeres i syv dage om ugen (f.eks. ved test af inhalerede lægemidler). Hvis det vides, at det ene 
køn er mere modtageligt for et bestemt testkemikalie, kan kønnene 
eksponeres ved forskellige koncentrationsniveauer for at observere forholdet mellem koncentration-respons som beskrevet i afsnit 15. Hvis andre gnave ­
rarter end rotter eksponeres gennem næsen, kan de maksimale eksponerings ­
varigheder justeres for at minimere artsspecifikke lidelser. Der bør gives en 
begrundelse, når der anvendes en eksponeringsvarighed på mindre end 6 timer/dag, eller når det er nødvendigt at gennemføre et forsøg med langvarig helkropseksponering (f.eks. 22 timer/dag) [se GD 39 (2)]. Dyrene bør ikke 
fodres i eksponeringsperioden, medmindre eksponeringen varer længere end 
seks timer. Dyret skal have adgang til vand under helkropseksponering.
 
15. De valgte målkoncentrationer bør identificere målorganet (-organerne) og 
påvise et klart forhold mellem koncentration og respons:  
— Det højeste koncentrationsniveau bør medføre toksiske virkninger, men 
ikke medføre langvarige symptomer eller letalitet, som kan forhindre en meningsfuld evaluering.
 
— De mellemste koncentrationsniveauerne bør vælges med sådanne inter ­
valler, at der frembringes graduerede toksiske effekter mellem effekterne 
ved den laveste og den højeste koncentration.  
— Det laveste koncentrationsniveau bør kun have ringe eller ingen toksisk 
virkning.  
Aflivninger under forsøget  
16. Hvis der påregnes aflivning af dyr under forsøget, bør antallet af dyr på 
hvert eksponeringsniveau forøges med det antal dyr, der aflives, inden 
forsøget afsluttes. Der gives en begrundelse for aflivning under forsøget, 
og der redegøres for aflivningerne i statistiske analyser.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Satellitforsøg (reversibilitetsforsøg)  
17. Et satellitforsøg (reversibilitetsforsøg) kan bruges til at observere reversi ­
bilitet, persistens eller forsinket indtræden af toksicitet i mindst 14 dage efter behandlingen. Satellitgrupper består af 10 hanner og 10 hunner, der 
eksponeres samtidig med forsøgsdyrene i hovedforsøget. Satellitforsøgs ­
grupper bør eksponeres for testkemikaliet ved det højeste koncentrations ­
niveau, og der bør efter behov være samtidige luft- og/eller vehikelkontrol ­
grupper (se afsnit 18).
 
Kontroldyr  
18. Dyr i den samtidige negative (luft)kontrolgruppe bør behandles på samme 
måde som forsøgsdyrene, bortset fra at de eksponeres for filtreret luft i stedet for testkemikaliet. Hvis vand eller et andet stof bruges til at frem ­
bringe testatmosfæren, skal en vehikelkontrolgruppe inkluderes i forsøget i 
stedet for en negativ (luft)kontrolgruppe. Vand bør så vidt muligt anvendes 
som vehikel. Når vand bruges som vehikel, eksponeres kontroldyrene for luft med samme fugtighed som de eksponerede grupper. Valget af et hensigtsmæssigt vehikel baseres på et korrekt gennemført forforsøg eller 
historiske data. Hvis et vehikels toksicitet ikke er velkendt, kan forsøgs ­
lederen vælge at bruge en negativ (luft)kontrol og en vehikelkontrol, men det frarådes på det kraftigste. Hvis historiske data viser, at vehiklet er ikke-toksisk, er der ikke behov for en negativ (luft)kontrolgruppe, og der 
anvendes kun en vehikelkontrol. Hvis et forforsøg vedrørende et testkemi ­
kalie, der er formuleret i et vehikel, ikke påviser toksicitet, følger det, at vehiklet er ikke-toksisk ved den testede koncentration, og at denne vehikel ­
kontrol bør anvendes.
 
EKSPONERINGSBETINGELSER  
Administration af koncentrationer  
19. Dyr eksponeres for testkemikaliet i form af en gas, dampe, aerosoler eller en 
blanding heraf. Den fysiske tilstand, der skal testes, afhænger af testkemi ­
kaliets fysisk-kemiske egenskaber, den valgte koncentration og/eller den 
fysiske form, der højst sandsynligt vil være til stede under håndteringen og anvendelsen af testkemikaliet. Hygroskopiske og kemisk reaktive testke ­
mikalier bør testes under tørre luftforhold. Der må ikke skabes eksplosive 
koncentrationer. Partikelformige materialer kan underkastes mekaniske 
processer for at reducere partikelstørrelsen. Nærmere detaljer findes i GD 39 (2).
 
Partikelstørrelsesfordeling  
20. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for alle aerosoler og dampe, der 
kan kondensere og danne aerosoler. For at sikre, at alle relevante områder af 
luftvejene eksponeres, anbefales aerosoler med en massemedian af den aero ­
dynamiske diameter (MMAD) i området fra 1 til 3 μm med en geometrisk 
standardafvigelse ( σ g ) i området fra 1,5 til 3,0 (4). Der bør ydes en rimelig 
indsats for at overholde denne standard, men en ekspertvurdering gives, hvis 
det ikke er muligt. Partikler fra tungmetalrøg kan f.eks. være mindre end 
denne standard, og ladede partikler og fibre kan overstige den.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Fremstilling af testkemikalie i vehikel  
21. Ideelt testes testkemikaliet uden et vehikel. Hvis det er nødvendigt at bruge 
et vehikel til at frembringe en passende koncentration og partikelstørrelse af testkemikaliet, bør der fortrinsvis anvendes vand. Når et testkemikalie er 
opløst i et vehikel, skal dets stabilitet påvises.
 
OVERVÅGNING AF EKSPONERINGSBETINGELSER  
Luftgennemstrømning i kammer  
22. Luftgennemstrømningen gennem eksponeringskammeret skal nøje kontrolle ­
res, overvåges løbende og registreres mindst én gang i timen under ekspone ­
ring. Realtidsovervågning af koncentrationen (eller den tidsmæssige stabili ­
tet) i testatmosfæren indgår i målingen af alle dynamiske parametre og giver 
indirekte mulighed for at kontrollere alle relevante dynamiske parametre for inhalation. Hvis koncentrationen overvåges i realtid, kan frekvensen for måling af luftgennemstrømning reduceres til én måling pr. eksponering pr. 
dag. Genindånding i kamre til eksponering gennem næsen skal undgås. 
Iltkoncentrationen skal være mindst 19 %, og kuldioxidkoncentrationen må ikke overstige 1 %. Hvis der er grund til at antage, at denne standard 
ikke kan overholdes, skal ilt- og kuldioxidkoncentrationerne måles. Hvis 
målinger på den første eksponeringsdag viser, at disse gasser er på passende niveauer, kræves der ikke yderligere målinger.
 
Kammerets temperatur og relative fugtighed  
23. Kammerets temperatur skal være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed i 
dyrenes vejrtrækningszone skal ved eksponering gennem næsen og helkropseksponering overvåges og registreres hver time under eksponering, hvis det er muligt. Den relative fugtighed bør være 30-70 %, men dette er 
ikke altid muligt (f.eks. ved test af vandbaserede blandinger) eller kan ikke 
måles på grund af testkemikaliets indvirkning på testmetoden.
 
Testkemikalie: nominel koncentration  
24. Når det er muligt, bør den nominelle eksponeringskoncentration i kammeret 
beregnes og registreres. Den nominelle koncentration er massen af det gene ­
rerede testkemikalie divideret med den samlede mængde luft, der passerer gennem inhalationskammersystemet. Den nominelle koncentration bruges ikke til at karakterisere dyrenes eksponering, men en sammenligning af 
den nominelle koncentration og den faktiske koncentration giver en indika ­
tion af testsystemets genereringseffektivitet og kan derfor bruges til at opdage eventuelle genereringsproblemer.
 
Testkemikalie: faktisk koncentration  
25. Den faktiske koncentration er koncentrationen af testkemikaliet målt ved 
dyrenes vejrtrækningszone i et inhalationskammer. Faktiske koncentrationer kan bestemmes med specifikke metoder (f.eks. direkte prøveudtagning, adsorptive eller kemisk reaktive metoder og efterfølgende analytisk karak ­
terisering) eller med ikke-specifikke metoder, som f.eks. gravimetrisk filter ­
analyse. Brugen af gravimetrisk analyse er kun acceptabel for pulverbase ­
rede enkeltkomponent-aerosoler eller aerosoler af væsker med lav flygtighed og bør støttes af hensigtsmæssige testkemikaliespecifikke karakteriseringer 
udført før testen. Koncentrationen af pulverbaserede flerkomponent-aero ­
soler kan også bestemmes ved hjælp af gravimetrisk analyse. Det kræver
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
dog analysedata, der viser, at det luftbårne materiales sammensætning svarer 
til udgangsmaterialet. Hvis denne information ikke er tilgængelig, kan det 
være nødvendigt at gentage analysen af testkemikaliet (ideelt i dets luftbårne tilstand) med regelmæssige intervaller i løbet af forsøget. For aerosoliserede stoffer, der kan fordampe eller sublimere, bør det påvises, at alle faser er 
indsamlet ved hjælp af den valgte metode.
 
26. Der anvendes så vidt muligt én batch af testkemikaliet i hele forsøgets 
varighed, og prøven opbevares under forhold, der bevarer dens renhed, 
homogenitet og stabilitet. Inden forsøget påbegyndes, bør testkemikaliet karakteriseres, herunder dets renhed og, hvis det er teknisk muligt, identitet og mængde af identificerede kontaminanter og urenheder. Dette kan påvises 
ved hjælp af bl.a. følgende data: retentionstid og relativt topareal, molekyl ­
vægt fra massespektroskopi- eller gaskromatografianalyser eller andre vurde ­
ringer. Selv om testlaboratoriet ikke er ansvarligt for prøvens identitet, bør testlaboratoriet af hensyn til sikkerheden bekræfte rekvirentens karakterise ­
ring i hvert fald på en begrænset måde (f.eks. farve, fysisk form osv.).
 
27. Eksponeringsatmosfæren skal være så konstant som praktisk muligt. Appa ­
ratur til realtidsovervågning, f.eks. et aerosolfotometer til måling af aerosoler eller en kulbrinteanalysator til dampe, kan bruges til at påvise eksponerings ­
betingelsernes stabilitet. Den faktiske koncentration i kammeret måles 
mindst tre gange i løbet af hver eksponeringsdag for hvert eksponerings ­
niveau. Hvis det ikke er muligt på grund af begrænsede luftgennemstrøm ­
ningshastigheder eller lave koncentrationer, kan én prøve pr. eksponerings ­
periode accepteres. Ideelt udtages denne prøve over hele eksponeringsperio ­
den. De enkelte prøver for koncentrationen i kammeret bør ikke afvige fra 
middelkoncentrationen i kammeret med mere end ± 10 % for gasser og dampe eller ± 20 % for flydende eller faste aerosoler. Tiden til ækvilibrering af kammer (t
 95 ) beregnes og registreres. Varigheden af en eksponering 
strækker sig over den tid, hvor testkemikaliet genereres. Det omfatter den 
tid, der kræves for at opnå ækvilibrering af kammeret (t  95 ) og henfald. 
Vejledning i beregning af t  95 findes i GD 39 (2).  
28. For meget komplekse blandinger, der består af gasser/dampe, og aerosoler 
(f.eks. forbrændingsatmosfærer og testkemikalier genereret af specialdrevne 
slutprodukter/-apparater), kan hver fase opføre sig forskelligt i et inhala ­
tionskammer. Der udvælges derfor mindst ét indikatorstof (analysand), normalt det primære aktivstof i blandingen, fra hver fase (gas/damp og aerosol). Hvis testkemikaliet er en blanding, rapporteres analysekoncentra ­
tionen for blandingen som helhed og ikke kun for det aktive stof eller 
indikatorstoffet (analysand). Yderligere oplysninger om faktiske koncentra ­
tioner findes i GD 39 (2).
 
Testkemikalie: partikelstørrelsesfordeling  
29. Aerosolers partikelstørrelsesfordeling bestemmes mindst ugentligt for hvert 
koncentrationsniveau ved hjælp af en kaskadeimpaktor eller et andet instru ­
ment, f.eks. et instrument til aerodynamisk partikelstørrelsesbestemmelse (APS). Hvis der kan påvises ækvivalens mellem de resultater, der er 
opnået ved hjælp af kaskadeimpaktoren eller et alternativt instrument, kan 
det alternative instrument bruges i hele forsøget.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Et andet apparat, f.eks. et gravimetrisk filter eller en impinger/gas bubbler, 
anvendes parallelt med det primære instrument til at bekræfte det primære 
instruments opsamlingseffektivitet. Den massekoncentration, der fås ved hjælp af partikelstørrelsesanalysen, skal være inden for rimelige grænser af den massekoncentration, der fås ved hjælp af filteranalyse [se GD 39 
(2)]. Hvis ækvivalens kan påvises ved alle de koncentrationer, der testes i 
forsøgets tidligere fase, kan yderligere bekræftelsesmålinger udelades. Af hensyn til dyrevelfærden træffes der foranstaltninger for at minimere inkon ­
klusive data, der kan gøre det nødvendigt at gentage et forsøg.
 
31. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for dampe, hvis der er mulighed 
for, at kondensering af dampe kan føre til dannelsen af en aerosol, eller hvis 
der konstateres partikler i en dampatmosfære med potentiale for blandede faser.
 
OBSERVATIONER  
32. Dyrene bør hyppigt observeres klinisk før, under og efter eksponerings ­
perioden. Hyppigere observationer kan være påkrævet afhængigt af dyrenes respons på eksponeringen. Hvis observation af dyrene hindres af fastspændingsslanger på dyrene, dårligt belyste helkropskamre eller uigen ­
nemsigtige atmosfære, observeres dyrene omhyggeligt efter eksponering. 
Observationer inden næste dags eksponering kan omfatte vurdering af rever ­
sibilitet eller forværring af toksiske virkninger.
 
33. Alle observationer registreres, og der føres individuel protokol for hvert dyr. 
Når dyr aflives af humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet 
registreres så nøjagtigt som muligt.  
34. Observationer i burene skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slim ­
hinder, respirationssystem, kredsløb, autonomt nervesystem og centralnerve ­
system samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, 
sløvhed, søvn og koma. Målingen af rektal temperatur kan dokumentere 
refleks-bradypnø eller hypo-/hypertermia relateret til behandling eller fangenskab. Forsøgsprotokollen kan omfatte yderligere vurderinger, f.eks. kinetik, bioovervågning, lungefunktion, retention af tungtopløselige stoffer, 
der akkumuleres i lungevæv, og adfærdsændringer.
 
KROPSVÆGT  
35. Det enkelte dyrs vægt registreres kort før den første eksponering (dag 0) og 
derefter to gange om ugen (f.eks. hver fredag og mandag for at påvise 
restitution i løbet af en eksponeringsfri weekend eller med et tidsinterval, der gør det muligt at vurdere systemisk toksicitet), og på døds- eller afliv ­
ningstidspunktet. Hvis der ikke er nogen virkninger i de første fire uger, 
måles kropsvægten ugentligt i resten af forsøgsperioden. Hvis der anvendes 
satellitdyr (reversibilitet), vejes de ugentligt i hele restitutionsperioden. Ved forsøgets afslutning vejes alle dyr umiddelbart inden aflivning med henblik på at beregne forholdet mellem organ- og kropsvægt uden bias.
 
INDTAGELSE AF FØDE OG VAND  
36. Foderindtagelse måles ugentligt. Vandindtagelse kan også måles.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLINISK PATOLOGI  
37. Klinisk patologisk vurdering foretages for alle dyr, herunder kontrol- og 
satellitdyr (reversibilitet), når de aflives. Tidsintervallet med den sidste eksponering og blodtapning registreres, navnlig når den undersøgte effekt ­
parameter hurtigt rekonstitueres. Prøvetagning efter eksponering er indiceret 
for parametre med en kort plasmahalveringstid (f.eks. COHb, CHE og MetHb).
 
38. I tabel 1 vises de kliniske patologiske parametre, der generelt kræves i 
forbindelse med alle toksikologiforsøg. Rutinemæssig urinanalyse er ikke 
påkrævet, medmindre den indiceres af forventede eller observerede toksiske virkninger. Forsøgslederen kan vælge at undersøge yderligere parametre med henblik på at opnå en bedre karakterisering af testkemikaliets toksicitet 
(f.eks. cholinesterase, lipider, hormoner, syre/basebalance, methæmoglobin 
eller Heinz-legemer, kreatinkinase, myeloid/erythroid-forhold, troponiner, arterielle blodgasser, lactatdehydrogenase, sorbitaldehydrogenase, glutamat ­
dehydrogenase og γ-glutamyltranspeptidase).
 
Tabel 1  
Standardparametre for klinisk patologi  
Hæmatologisk undersøgelse  
Erythrocyttælling 
Hæmatokrit 
Hæmoglobinkoncentration Middelcellehæmoglobin Middelcellevolumen 
Middelcellehæmoglobinkoncentration 
Retikulocyttælling Leukocyttal 
Differentialtælling 
Trombocyttal Koaguleringsevne (vælg én): — protrombintid 
— koaguleringstid 
— partiel tromboplastintid
 
Klinisk-kemisk undersøgelse  
Glukose (*) 
Total kolesterol Triglycerider 
BUN 
Total bilirubin Kreatinin Total protein 
Albumin 
Globulin Alanin-aminotransferase 
Aspartat-aminotransferase Alkalisk fosfatase 
Kalium 
Natrium Kalcium Fosfor 
Chlorid
 
Urinanalyse (valgfri)  
Udseende (farve og turbiditet) 
Volumen 
Specifik vægtfylde eller osmolalitet pH Total protein 
Glukose 
Blod/blodceller
 
(*) Da en langvarig fasteperiode kan medføre bias i glukosemålinger hos de behand ­
lede dyr i forhold til kontroldyrene, afgør forsøgslederen, om det er hensigtsmæs ­
sigt, at dyrene faster. Hvis en fasteperiode anvendes, bør den tilpasses den 
anvendte art. For rotter kan den være 16 timer (natten over). Bestemmelse af 
fasteglukose kan foretages efter faste natten over i løbet af den sidste ekspone ­
ringsuge eller efter faste natten over inden obduktion (i sidstnævnte tilfælde 
samme med alle de øvrige kliniske patologiske parametre).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Når der er bevis for, at de nedre luftveje (dvs. alveolerne) er det primære 
afsætnings- og retentionssted, kan bronchieskylning (BAL) anvendes til 
kvantitativt at analysere hypotesebaserede parametre for dosis/virkning med fokus på alveolitis, lungebetændelse og fosfolipidose. Det gør det muligt at undersøge forandringer i dosis/respons og tidsforløb i forbindelse 
med alveoleskader. BAL-væsken kan analyseres for total og differentieret 
leukocyttal, total protein og lactat-dehydrogenase. Andre parametre, der kan overvejes, er parametre, der indicerer lysosomale skader, fosfolipidose, fibrose og irritationsinflammation eller allergisk inflammation, som kan 
omfatte bestemmelse af pro-inflammatoriske cytokiner/kemokiner. BAL- 
målinger supplerer generelt resultaterne af histopatologiske undersøgelser, men kan ikke erstatte dem. Vejledning i udførelse af lungeskylning findes i GD 39 (2).
 
OFTALMOLOGISK UNDERSØGELSE  
40. Ved hjælp af et oftalmoskop eller et tilsvarende instrument foretages oftal ­
mologiske undersøgelser af fundus, refraktionsmedier, iris og conjunctivae 
for alle dyr inden administration af testkemikaliet og for kontrolgruppen og 
gruppen med den højeste højkoncentration ved forsøgsafslutning. Hvis der observeres forandringer i øjnene, undersøges alle dyr i de andre grupper, herunder satellitgruppen (reversibilitet).
 
MAKROSKOPISKE PATOLOGISKE FORANDRINGER OG ORGAN ­
VÆGT  
41. Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller tages ud af 
forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes komplet exsanguina ­
tion (hvis muligt) og makroskopisk obduktion. Tidsrummet mellem afslut ­
ningen på hvert dyrs sidste eksponering og dets aflivning registreres. Hvis obduktion ikke kan udføres umiddelbart efter opdagelsen af et dødt dyr, 
nedkøles (ikke fryses) dyret ved en temperatur, der er tilstrækkeligt lav til 
at minimere autolyse. Makroskopisk obduktion udføres så hurtigt som muligt, helst inden for en eller to dage. Alle makroskopiske patologiske forandringer registreres for hvert dyr med særligt fokus på forandringer i 
luftvejene.
 
42. I tabel 2 vises de organer og væv, der skal præserveres i et passende 
medium under makroskopisk obduktion med henblik på mulig histopatolo ­
gisk undersøgelse. Forsøgslederen afgør, om organer og væv i [kantet paren ­
tes] og andre organer og væv skal præserveres. Organer i  fed trimmes og 
vejes i våd tilstand så hurtigt som muligt efter dissektionen for at undgå 
udtørring. Skjoldbruskkirtel og bitestikler bør kun vejes, hvis artefakter fra trimming kan hindre histopatologisk evaluering. Væv og organer fikseres i 10 % bufret formalin eller et andet egnet fikseringsmiddel, straks obduktion 
er udført, men højst 24-48 timer inden trimming afhængigt af det anvendte 
fikseringsmiddel.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 431
Tabel 2  
Organer og væv, der præserveres under makroskopisk obduktion  
Binyrer  
Aorta  
Knoglemarv (og/eller nyligt aspirat)  
Hjerne  (herunder udsnit af cerebrum, cere ­
bellum og medulla/pons)  
Cæcum  
Tyktarm  
Duodenum  
[Bitestikler ] 
[Øjne (retina, synsnerve) og øjenlåg]  
Femur og knæled  
Galdeblære (hvis en sådan forefindes)  
[Harderian-kirtler]  
Hjerte  
Ileum  
Jejunum  
Nyrer  
[Tårekirtler (ekstraorbitale)]  
Larynx (3 niveauer, herunder basis af strube ­
låget)  
Lever  
Lunge  (alle lungelapper på et niveau, 
herunder hovedbronchier)  
Lymfeknuder fra lungens hilum, navnlig ved 
tungtopløselige testkemikalier. Ved mere detaljerede undersøgelser og/eller forsøg 
med immunologisk fokus kan yderligere 
lymfeknuder overvejes, f.eks. lymfeknuder fra de mediastinale, cervikale/submandibulære og/eller aurikulære områder.
 
Lymfeknuder (distale fra indgangssted)  
Brystkirtler (hundyr)  
Muskel (lår)  
Nasopharyngeale væv (mindst 4 niveauer; 1 
niveau for at medtage 
nasopharyngeal-kanalen og NALT (Nasal Associated Lymphoid Tissue)
 Øsofagus  
[Bulbus olfactorius]  
Æggestokke  
Bugspytkirtler  
Paratyreoideae  
Perifer nerve (ischias- eller tibianerven), om 
muligt tæt på musklen  
Hypofyse  
Prostata  
Rectum  
Spytkirtler  
Vesiculae seminales  
Hud 
Rygmarv (cervikal, midt-torakal og lumbal)  
Milt 
Sternum  
Mavesæk  
Tænder  
Testikler  
Brisler  
Skjoldbruskkirtlen  
Tunge  
Spiserør (mindst 2 niveauer, herunder 1 
længdesnit gennem carina og 1 tværsnit)  
[Ureter]  
[Urethra]  
[Urinblære]  
Uterus  
Målorganer  
Alle større læsioner og masser  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Lunger udtages hele og intakte, vejes og behandles med et passende fikse ­
ringsmiddel ved et tryk på 20-30 cm vand for at sikre, at lungestrukturen 
bevares (5). Snit udtages for alle lapper på et niveau, herunder hovedbron ­
chier, men hvis der udføres lungeskylning, udtages en ikkeskyllet lap på tre niveauer (ikke serielle snit).
 
44. Mindst fire niveauer af nasopharyngealt væv undersøges, hvoraf det ene 
omfatter nasopharyngeal-kanalen (5) (6) (7) (8) (9), så der kan udføres en tilstrækkelig undersøgelse af pladeepitel, transitionelt epitel (respiratorisk uden cilier), respiratorisk epitel (respiratorisk med cilier) og lugteepitel 
samt drænende lymfevæv (NALT) (10) (11). Tre niveauer af larynx under ­
søges, og et af disse niveauer skal omfatte basis af strubelåget (12). Mindst to niveauer af luftrøret undersøges, herunder et længdesnit gennem carina i bifurkationen af de ekstrapulmonal bronchier og et tværsnit.
 
HISTOPATOLOGI  
45. Der foretages en histopatologisk evaluering af alle organer og væv, der er 
anført i tabel 2, for kontrolgruppen og gruppen med den højeste højkoncen ­
tration og for alle dyr, der dør eller aflives under forsøget. Særligt luft ­
vejene, målorganerne og større læsioner skal undersøges. Organer og væv 
med læsioner i gruppen med den højeste koncentration undersøges i alle 
grupper. Forsøgslederen kan vælge at udføre histopatologiske evalueringer for yderligere grupper for at påvise et klart forhold mellem koncentration og respons. Hvis der anvendes en satellitgruppe (reversibilitet), skal der på 
dyrene i denne gruppe udføres histopatologisk evaluering af væv og organer, 
på hvilke der var vist ændringer i behandlingsgruppen. Hvis der er usæd ­
vanligt mange dyr, der dør tidligt, eller andre problemer i højeksponerings ­
gruppen, som kompromitterer signifikansen af data, foretages en histopato ­
logisk undersøgelse af den næste lavere koncentration. Makroskopiske 
observationer korreleres så vidt muligt med mikroskopiske fund.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
46. Der skal fremlægges data for de enkelte dyr om kropsvægt, foderindtagelse, 
klinisk patologi, makroskopisk patologi, organvægt og histopatologi. For hver testgruppe opstilles i tabelform kliniske observationsdata om antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, 
antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære 
grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet samt obduktionsfund. Alle kvantitative og tilfældige resultater evalueres ved hjælp af en passende 
statistisk metode. Enhver generelt accepteret statistisk metode kan anvendes, 
og de statistiske metoder skal vælges under planlægningen af forsøget.
 
Testrapport  
47. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er relevante:  
Forsøgsdyr og pasning  
— beskrivelse af burforhold, herunder: antal (eller ændring i antal) dyr pr. 
bur, strøelse, omgivende temperatur og relativ fugtighed, lysperiode og 
foder  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— anvendt art/stamme og begrundelse for anvendelse af andre arter end 
rotte kildedata og historiske data, hvis de vedrører dyr, der er eksponeret 
under lignende eksponerings-, bur- og fasteforhold  
— dyrenes antal, alder og køn  
— randomiseringsmetode  
— beskrivelse af konditionering før test, herunder foder, karantæne og 
behandling for sygdom.  
Testkemikalie  
— fysisk tilstand, renhed og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber 
(herunder isomeri)  
— identifikationsoplysninger og CAS-nr. (Chemical Abstract Services 
Registry Number), hvis det kendes.  
Vehikel  
— begrundelse for brug af vehikel og begrundelse for valg af vehikel, hvis 
dette ikke er vand  
— historiske eller samtidige data, der viser, at vehiklet ikke påvirker resul ­
tatet af forsøget.  
Inhalationskammer  
— detaljeret beskrivelse af inhalationskammeret, herunder rumfang og et 
diagram  
— oprindelse og beskrivelse af udstyr anvendt til eksponering af dyr og til 
generering af atmosfære  
— apparatur til måling af temperatur, fugtighed, partikelstørrelse og faktisk 
koncentration  
— luftkilde og konditioneringssystem  
— metoder, der er anvendt til kalibrering af apparatur for at sikre en 
homogen testatmosfære  
— trykforskel (positiv eller negativ)  
— eksponeringsporte pr. kammer (eksponering gennem næsen); placering 
af dyr i systemet (helkropseksponering)  
— testatmosfærens stabilitet  
— placering af temperatur- og fugtighedssensorer og udtagning af stikprøve 
af testatmosfære i kammer  
— behandling af tilført/udledt luft  
— luftgennemstrømningshastigheder, luftgennemstrømningshastighed/eks ­
poneringsport (eksponering gennem næsen) eller dyrebelastning/kammer 
(helkropseksponering)  
— tid, der kræves til at opnå ligevægt i inhalationskammeret (t  95 ) 
— antal volumenændringer pr. time  
— evt. måleudstyr.  
Eksponeringsdata  
— begrundelse for valg af målkoncentration i hovedforsøget  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— nominelle koncentrationer (samlet masse af det genererede testkemikalie 
i inhalationskammeret divideret med den samlede mængde luft, der 
passerer gennem kammeret)  
— faktiske koncentrationer af testkemikaliet indsamlet fra dyrenes vejrtræk ­
ningszone; for blandinger, der producerer heterogene fysiske former 
(gasser, dampe eller aerosoler), kan hver enkelt analyseres separat  
— alle luftkoncentrationer rapporteres i masseenheder (f.eks. mg/l, mg/m  3 
osv.) i stedet for volumenenheder (ppm, ppb osv.)  
— partikelstørrelsesfordeling, massemedian af den aerodynamiske 
diameter (MMAD) og geometrisk standardafvigelse ( σg), herunder 
deres beregningsmetoder; individuelle partikelstørrelsesanalyse rapporte ­
res. 
Testbetingelser  
— nærmere oplysninger om fremstilling af testkemikalie, herunder oplys ­
ninger om fremgangsmåder anvendt til at reducere partikelstørrelsen af faste materialer eller fremstille opløsninger af testkemikaliet;
 
— en beskrivelse (helst med diagram) af det apparatur, der bruges til at 
generere testatmosfæren og til at eksponere dyrene for testatmosfæren  
— nærmere oplysninger om udstyr, der anvendes til overvågning af tempe ­
ratur, fugtighed og luftgennemstrømning i kammer (dvs. fastlæggelse af 
en kalibreringskurve)  
— nærmere oplysninger om udstyr, der anvendes til at udtage prøver til 
bestemmelse af koncentration og partikelstørrelsesfordeling i kammer  
— nærmere oplysninger om den anvendte analysemetode og validerings ­
metode (herunder genfindingsgrad for testkemikaliet fra prøvemediet)  
— randomiseringsmetode til tildeling af dyr til test- og kontrolgrupper  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens 
art/oprindelse, vandets oprindelse)  
— begrundelse for valget af testkoncentrationer.  
Resultater  
— opstilling i tabelform af temperatur, fugtighed og luftgennemstrømning i 
kammer  
— opstilling i tabelform af data om nominel og faktisk koncentration i 
kammer  
— opstilling i tabelform af data om partikelstørrelse i tabelform, herunder 
data om indsamling af analyseprøve, partikelstørrelsesfordeling og beregning af MMAD og σ
 g 
— opstilling i tabelform af responsdata og koncentrationsniveau for hvert 
dyr (dvs. dyr, som viser tegn på toksicitet, herunder mortalitet, og virk ­
ningernes art, sværhed, tidspunkt for indtræden og varighed)  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— opstilling i tabelform af de enkelte dyrs vægt  
— opstilling i tabelform af foderindtagelse  
— opstilling i tabelform af kliniske patologiske data  
— for hvert dyr evt. obduktionsfund og histopatologiske fund  
Diskussion og fortolkning af resultater  
— Der lægges særlig vægt på beskrivelsen af de metoder, der er anvendt til 
at opfylde denne testmetodes kriterier, f.eks. grænsekoncentrationen eller 
partikelstørrelsen.  
— Partiklernes respirabilitet i lyset af de overordnede resultater beskrives, 
især hvis partikelstørrelseskriteriet ikke kunne opfyldes.  
— Konsistensen mellem de metoder, der er anvendt til at bestemme nomi ­
nelle og faktiske koncentrationer og relationen mellem den faktiske 
koncentration og den nominelle koncentration beskrives i den overord ­
nede vurdering af forsøget.  
— Den sandsynlige dødsårsag og den fremherskende virkningsmåde (syste ­
misk i forhold til lokal) beskrives.  
— Der gives en forklaring, hvis det var nødvendigt at foretage human 
aflivning af dyr, som udviste svære smerter og/eller vedvarende tegn på svære lidelser, baseret på kriterierne i OECD Guidance Document 
on Humane Endpoints (3).
 
— Målorganet (-organerne) identificeres.  
— NOAEL og LOAEL bestemmes.  
LITTERATUR:  
(1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test 
Guideline No. 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing , 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(4) Whalan JE og Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide 
Programs, United States Environmental Protection Agency.  
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
s. 229-258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. I: Waalkes MP og Ward JM (eds) Carcinogenesis. TARGET Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
 
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijve ­
stijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopha ­
ryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 
16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer 
og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 
1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006, EUT L 353 af 31.12.2008, s. 1.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  FORSØG VEDRØRENDE KRONISK TOKSICITET  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 452 (2009). Den 
oprindelige TG 452 blev vedtaget i 1981. Denne reviderede testmetode B.30 
blev udviklet for at tage højde for den seneste udvikling på området for 
dyrevelfærd og myndighedsbestemmelser (1) (2) (3) (4). Denne testmetode B.30 er opdateret parallelt med revisionen af kapitel B.32 i dette bilag (Karcinogenicitetsforsøg) og kapitel B.33 i dette bilag (Kombineret forsøg 
vedrørende karcinogenicitet/kronisk toksicitet) med det formål at fremskaffe 
yderligere oplysninger fra de dyr, der bruges i forsøget, og flere oplysninger om dosisvalg. Denne testmetode er designet, så den kan bruges til test af en bred vifte af kemikalier, herunder pesticider og industrikemikalier.
 
2. De fleste forsøg vedrørende kronisk toksicitet gennemføres ved hjælp af 
gnaverarter, og det er derfor hensigten, at denne testmetode primært 
anvendes i forsøg på sådanne arter. Hvis sådanne forsøg er nødvendige 
på ikke-gnavere, kan testmetodens principper og fremgangsmåder anvendes sammen med de principper og fremgangsmåder, der er beskrevet i kapitel B.27 i dette bilag (Subkronisk oral toksicitetstest — et 90-dages forsøg over 
gentagne orale dosers toksicitet på ikke-gnavere (5), med de nødvendige 
ændringer som beskrevet i OECD Guidance Document No. 116 (6).
 
3. De tre primære administrationsveje i forsøg vedrørende kronisk toksicitet er 
oral indgift, dermal applikation og inhalation. Valget af administrationsvej afhænger af testkemikaliets fysisk-kemiske karakteristika og den måde, hvorpå mennesker primært eksponeres for testkemikaliet. Yderligere oplys ­
ninger om valg af administrationsvej findes i OECD Guidance Document 
No. 116 (6).
 
4. Denne testmetode fokuserer på oral eksponering, den administrationsvej, der 
oftest bruges i forsøg vedrørende kronisk toksicitet. Langvarige forsøg vedrørende kronisk toksicitet, der involverer eksponering via inhalation eller dermal applikation, kan også være nødvendige i forbindelse med 
vurdering af risici for menneskers sundhed og/eller påkrævet i medfør af 
lovgivningen, men betydelig teknisk kompleksitet er forbundet med begge eksponeringsveje. Sådanne forsøg skal designes i hvert enkelt tilfælde, selv om den testmetode, der er beskrevet her til vurdering og evaluering af 
kronisk toksicitet ved oral administration, kan bruges som udgangspunkt 
for en protokol for inhalationsforsøg og/eller dermale forsøg, hvad angår anbefalinger vedrørende behandlingsperioder, kliniske og patologiske para ­
metre osv. Der findes OECD-vejledninger om administration af testkemika ­
lier ved hjælp af inhalation (6) (7) og dermal applikation (6). Kapitel B.8 i 
dette bilag (8) og kapitel B.29 i dette bilag (9) bør sammen med OECD Guidance Document on Acute Inhalation Testing (7) specifikt anvendes ved design af forsøg med længere varighed, der involverer eksponering via 
inhalation. Kapitel B.9 i dette bilag (10) anvendes, hvis forsøget vedrører 
dermal applikation.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Forsøget vedrørende kronisk toksicitet skaffer viden om mulige sundheds ­
farer, som kan opstå ved gentagen eksponering i løbet af en betydelig del af 
de anvendte arters levetid. Forsøget tilvejebringer oplysninger om de toksiske virkninger af testkemikaliet, peger på, hvilke organer der rammes, og muligheden for akkumulation. Det kan også give et estimat 
af niveauet uden observerbare negative effekter (NOAEL), som kan 
anvendes ved fastsættelse af sikkerhedskriterier for menneskers eksponering. Nødvendigheden af omhyggelig klinisk observation af dyrene for at opnå størst mulig viden bliver ligeledes understreget.
 
6. De forsøgsformål, der er omfattet af denne testmetode, omfatter:  
— identifikation af et testkemikalies kroniske toksicitet  
— identifikation af målorganer  
— karakterisering af forholdet mellem dosis og virkning  
— identifikation af NOAEL eller udgangspunkt for fastlæggelse af 
benchmark-dosis (BMD)  
— forudsigelse af kroniske toksicitetsvirkninger på niveauer for menne ­
skelig eksponering  
— data til testhypoteser vedrørende virkningsmåde (6).  
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
7. Ved vurderingen og evalueringen af de toksikologiske karakteristika for et 
testkemikalie inddrages alle tilgængelige informationer om testkemikaliet af testlaboratoriet inden gennemførelsen af forsøget, således at forsøget foku ­
seres på effektiv test af potentialet for kronisk toksicitet, og således at 
omfanget af dyreforsøg minimeres. Informationer, der kan hjælpe med at 
fastlægge forsøgsdesignet, omfatter testkemikaliets identitet, kemiske struktur og fysisk-kemiske egenskaber, informationer om virkningsmåde, resultater af in vitro- eller in vivo-toksicitetstest, forventede anvendelser 
og potentialet for human eksponering, tilgængelige (Q)SAR-data og toksi ­
kologiske data vedrørende strukturelt relaterede kemikalier, tilgængelige toksikokinetiske data (kinetiske data ved enkelt og gentagen eksponering) samt data udledt af andre forsøg med gentagen eksponering. Bestemmelsen 
af kronisk toksicitet bør kun udføres, når indledende informationer om 
toksicitet er indhentet fra 28-dages eller 90-dages toksicitetstest med gentagen dosering. Det bør overvejes at benytte en faseinddelt testtilgang til kroniske test som et led i den overordnede vurdering af de potentielle 
sundhedsskadelige virkninger af et bestemt testkemikalie (11) (12) (13) (14).
 
8. De statistiske metoder, der i betragtning af forsøgsdesignet og -formålene er 
mest relevante til analyse af resultater, fastlægges, inden forsøget påbegyn ­
des. Det skal bl.a. overvejes, om statistikkerne skal omfatte justering for overlevelse og analyse i tilfælde af afslutning af en eller flere grupper før tid. Vejledning om relevante statistiske analyser og nøglereferencer til inter ­
nationalt anerkendte statistiske metoder findes i Guidance Document No. 
116 (6) og Guidance Document No. 35 (15).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Når et forsøg vedrørende kronisk toksicitet gennemføres, skal de vejledende 
principper og overvejelser, der er beskrevet i OECD Guidance Document 
No. 19 (16), navnlig afsnit 62, altid følges. I det afsnit anføres følgende: »I forsøg, der omfatter gentagen dosering, hvor et dyr udviser kliniske tegn, som er progressive og fører til yderligere forværring, træffes der en infor ­
meret beslutning om, hvorvidt dyret skal aflives. Beslutningen bør baseres 
på en overvejelse af værdien af de oplysninger, der kan indhentes, hvis dyret beholdes i forsøget, i forhold til dets generelle tilstand. Hvis det besluttes at beholde dyret i forsøget, øges frekvensen af observationer efter behov. Uden 
at påvirke testens formål kan det også være muligt midlertidigt at stoppe 
doseringen, hvis det letter dyrets smerte eller lidelse, eller at reducere test ­
dosis«.
 
10. Detaljeret vejledning om og diskussion af principperne for dosisvalg i forsøg 
vedrørende kronisk toksicitet og karcinogenicitet findes i Guidance Docu ­
ment No. 116 (6) og to publikationer fra International Life Sciences Institute (17) (18). Den centrale strategi for dosisvalg afhænger af forsøgets primære mål (afsnit 6). Ved valg af hensigtsmæssige dosisniveauer skal der sikres en 
balance mellem på den ene side farescreening og på den anden side karak ­
terisering af lavdosisrespons og deres relevans. Dette er især relevant, hvis der gennemføres et kombineret forsøg vedrørende kronisk toksicitet og karcinogenicitet (kapitel B.33 i dette bilag) (afsnit 11).
 
11. Det bør overvejes at udføre et kombineret forsøg vedrørende både kronisk 
toksicitet og karcinogenicitet (kapitel B.33 i dette bilag) i stedet for at udføre et separat forsøg vedrørende kronisk toksicitet (denne testmetode B.30) og et separat karcinogenicitetsforsøg (kapitel B.32 i dette bilag). Den kombinerede 
test sparer både tid og omkostninger i forhold til gennemførelsen af to 
separate forsøg, uden at det kompromitterer kvaliteten af data i den kroniske fase eller fasen vedrørende karcinogenicitet. Principperne for dosisvalg (afsnit 9 og 20-25) bør dog overvejes nøje ved gennemførelsen af et kombi ­
neret forsøg vedrørende både kronisk toksicitet og karcinogenicitet (kapitel 
B.33 i dette bilag), og det anerkendes også, at separate forsøg kan være nødvendige for at overholde visse lovgivningsbestemmelser.
 
12. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i 
slutningen af dette kapitel og i Guidance Document No. 116 (6).  
TESTENS PRINCIP  
13. Testkemikaliet administreres dagligt i graduerede doser til flere grupper af 
forsøgsdyr, normalt i en periode på 12 måneder, men der kan vælges kortere eller længere varigheder afhængigt af lovgivningskravene (se afsnit 33). Den valgte varighed skal være så lang, at virkninger af kumulativ toksicitet kan 
manifestere sig, uden at det konfunderer virkningerne af geriatriske 
forandringer. Afvigelser fra eksponeringsvarigheden på 12 måneder skal begrundes, især ved kortere varigheder. Testkemikaliet administreres normalt oralt, selv om test ved inhalation eller dermal applikation også 
kan anvendes. Forsøgsdesignet kan også omfatte en eller flere aflivninger 
i løbet af forsøget, f.eks. ved tre og seks måneder, og yderligere dyr kan inkluderes for at tage højde for dette (se afsnit 19). I denne periode obser ­
veres dyrene nøje for tegn på toksicitet. Dyr, der dør eller aflives under 
forsøget, obduceres, og de overlevende dyr aflives og obduceres ved 
forsøgets afslutning.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
14. Denne testmetode omhandler primært vurdering og evaluering af kronisk 
toksicitet hos gnavere (se afsnit 2), selv om det anerkendes, at lignende forsøg på ikke-gnavere kan være påkrævet i medfør af lovgivningen. Valget af dyreart skal begrundes. Design og gennemførelse af forsøg 
vedrørende kronisk toksicitet på ikke-gnavere skal baseres på de principper, 
der er beskrevet i denne testmetode, og de principper, der er beskrevet i kapitel B.27 i dette bilag (Subkronisk oral toksicitetstest — et 90-dages forsøg over gentagne orale dosers toksicitet på ikke-gnavere (5). Yderligere 
oplysninger om valg af dyreart og -stamme findes i OECD Guidance Docu ­
ment No. 116 (6).
 
15. Den foretrukne art i denne testmetode er rotten, men andre gnaverarter, 
f.eks. mus, kan anvendes. Rotter og mus er de foretrukne forsøgsmodeller på grund af deres relativt korte levetid, deres udbredte anvendelse i farma ­
kologiske og toksikologiske forsøg, deres modtagelighed for tumorinduktion 
og tilgængeligheden af tilstrækkeligt karakteriserede stammer. Som følge af 
disse karakteristika findes der en stor mængde data om deres fysiologi og patologi. Der anvendes unge raske dyr af sædvanligt benyttede laboratori ­
estammer. Forsøget vedrørende kronisk toksicitet gennemføres på dyr af 
samme stamme og herkomst som de dyr, der blev anvendt i forforsøgene 
af kortere varighed. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige.
 
Opbevaring og fodringsbetingelser  
16. Dyrene kan anbringes enkeltvis eller i bure med små grupper af samme køn. 
Enkeltvis anbringelse bør kun anvendes, hvis det er videnskabeligt begrun ­
det. Burene bør anbringes på en sådan måde, at deres placering får mindst mulig indvirkning. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og ikke over 
70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. 
Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. Foderet skal opfylde alle de ernæringskrav, som den pågæl ­
dende art af forsøgsdyr stiller, og indholdet af forureninger i foderet, 
herunder, men ikke begrænset til pesticidrester, persistente organiske miljø ­
gifte, fytoøstrogener, tungmetaller og mycotoksiner, der kan påvirke testre ­
sultatet, skal være så lavt som muligt. Analytiske oplysninger om ernæring 
og koncentration af forurenende stoffer i foderet genereres periodisk, som 
minimum i begyndelsen af forsøget og derefter, når der sker ændringer i det anvendte parti, og de registreres i den endelige rapport. Analytiske oplys ­
ninger om det anvendte drikkevand i forsøget bør også anføres. Ved valg af 
foder kan der tages hensyn til nødvendigheden af at sikre passende iblan ­
ding af testkemikaliet og opfylde dyrenes ernæringsbehov, når denne admi ­
nistrationsmåde anvendes.
 
Forberedelse af dyrene  
17. Der anvendes raske dyr, som er akklimatiseret til laboratoriemiljøet i mindst 
syv døgn og ikke tidligere er indgået i forsøg. Hvis der anvendes gnavere, 
bør doseringen indledes snarest efter fravænning og akklimatisering, og helst inden dyrene er otte uger gamle. Forsøgsdyrene skal være karakteriseret med hensyn til art, stamme, oprindelse, køn, vægt og alder. Ved forsøgets begyn ­
delse skal vægtvariationen for hvert køn af de anvendte dyr være mindst 
mulig og må for hvert køn ikke overstige ± 20 % af gennemsnitsvægten for
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
alle dyr i forsøget. Dyrene randomiseres til henholdsvis kontrol og behand ­
lingsgruppe. Efter randomisering bør der for hvert køn ikke være signifi ­
kante forskelle i den gennemsnitlige kropsvægt mellem grupperne. Hvis der er statistisk signifikante forskelle, gentages randomiseringstrinnet, hvis det er muligt. Hvert dyr tildeles et unikt identifikationsnummer og mærkes perma ­
nent med dette nummer ved hjælp af tatovering, mikrochipimplantation eller 
anden egnet metode.
 
FREMGANGSMÅDE  
Dyrenes antal og køn  
18. Begge køn anvendes. Der anvendes et antal dyr, der sikrer, at der ved 
afslutningen af forsøget er tilstrækkeligt mange dyr i hver gruppe til at foretage en grundig biologisk og statistisk evaluering. Hvis der anvendes gnavere, skal der normalt anvendes mindst 20 dyr pr. køn pr. gruppe til 
hvert dosisniveau. Hvis der anvendes ikke-gnavere, anbefales mindst 4 dyr 
pr. køn pr. gruppe. I forsøg med mus skal der evt. bruges flere dyr i hver dosisgruppe til at udføre alle de krævede hæmatologiske undersøgelser.
 
Reserve til aflivninger under forsøget, satellitgrupper og sentineldyr  
19. Forsøget kan omfatte reserver til aflivninger under forsøget (mindst 10 dyr/ 
køn/gruppe), f.eks. ved 6 måneder, for at fremskaffe oplysninger om 
progression af toksikologiske virkninger og mekanistisk information, hvis det er videnskabeligt begrundet. Hvis sådanne oplysninger allerede er tilgængelige fra tidligere toksicitetsforsøg med gentagen dosering 
vedrørende testkemikaliet, er aflivninger under forsøget muligvis ikke viden ­
skabeligt begrundet. Satellitgrupper kan medtages med henblik på at over ­
våge reversibiliteten af toksikologiske virkninger induceret af det undersøgte testkemikalie. Disse begrænses normalt til det højeste dosisniveau i forsøget 
plus kontrol. En yderligere gruppe af sentineldyr (typisk 5 dyr pr. køn) kan 
om nødvendigt også inkluderes med henblik på overvågning af sygdoms ­
status i løbet af forsøget (22). Hvis aflivninger eller inklusion af satellit- eller sentinelgrupper planlægges undervejs i forsøget, skal antallet af dyr i 
forsøgsdesignet forøges med det antal dyr, der planlægges aflivet inden 
forsøgets afslutning. Disse dyr underkastes de samme observationer, herunder kropsvægt og foder-/vandindtagelse, hæmatologiske, 
klinisk-biokemiske og patologiske undersøgelser som dyrene i hovedfor ­
søgets kroniske toksicitetsfase, selv om der også kan medtages reserver (i grupperne for aflivning under forsøget) til målinger alene af specifikke nøgleparametre, som f.eks. neurotoksicitet eller immunotoksicitet.
 
Dosisgrupper og dosering  
20. Vejledning om alle aspekter af dosisvalg og intervaller mellem dosis ­
niveauer findes i Guidance Document No. 116 (6). Mindst tre dosisniveauer 
og en sideløbende kontrol bør anvendes, undtagen i tilfælde af en begrænset test (se afsnit 27). Dosisniveauer baseres generelt på resultaterne af forsøg med gentagen dosis af kortere varighed eller dosisbestemmende forsøg 
(»range finding«) og skal tage hensyn til kendte toksikologiske og toksoki ­
netiske data for testkemikaliet eller tilsvarende kemikalier.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Medmindre der optræder begrænsninger som følge af testkemikaliets 
fysisk-kemiske tilstand eller biologiske egenskaber, vælges normalt det 
højeste dosisniveau, som gør det muligt at identificere de primære målorganer og samtidig undgå lidelse, svære toksiske virkninger, morbiditet eller død. Under hensyntagen til de faktorer, der er anført i afsnit 22, vælges 
det højeste dosisniveau, der fremkalder toksicitetstegn f.eks. en formind ­
skelse af kropsvægten (mindre end 10 %).
 
22. Afhængigt af forsøgets formål (se afsnit 6) kan der dog vælges en højeste 
dosis, der er lavere end den dosis, der fremkalder toksicitetstegn, f.eks. hvis 
en dosis fremkalder en negativ virkning , som giver anledning til bekymring, 
men alligevel har ringe indvirkning på levetid eller kropsvægt . Den højeste 
dosis bør ikke overstige 1 000 mg/kg kropsvægt/dag (grænsedosis, se afsnit 
27). 
23. Dosisniveauer og dosisintervaller kan vælges, så der fastlægges et forhold 
mellem dosis og respons og en NOAEL eller et andet ønsket resultat af forsøget, f.eks. en BMD (se afsnit 25) på det laveste dosisniveau. Faktorer, 
der skal tages i overvejelse ved fastlæggelsen af de laveste doser, omfatter 
dosis-responskurvens forventede hældning, de doser, hvor der kan fore ­
komme vigtige forandringer i metabolismen, eller den toksiske virkning, 
hvor en tærskel forventes, eller hvor et udgangspunkt for lavdosisekstrapo ­
lation forventes.
 
24. Det valgte dosisinterval afhænger af testkemikaliets karakteristika og kan 
ikke beskrives i denne testmetode, men to- til firedobbelte intervaller er ofte 
bedst til fastlæggelse af faldende dosisstørrelser, og tilføjelse af en fjerde 
testgruppe er ofte at foretrække frem for brug af meget store intervaller (f.eks. mere end en faktor på 6-10) mellem dosisstørrelserne. Faktorer på mere end 10 bør generelt undgås og skal i givet fald begrundes.
 
25. Som yderligere beskrevet i Guidance Document No. 116 (6) skal følgende 
bl.a. overvejes i forbindelse med dosisvalg:  
— kendte eller mistænkte ikke-lineariteter eller inflektionspunkter i 
dosis-respons  
— toksikokinetik og dosisintervaller, hvor metabolisk induktion, mætning 
eller ikke-linearitet mellem eksterne og interne doser forekommer eller 
ikke forekommer  
— præcursorlæsioner, virkningsmarkører eller indikatorer for underliggende 
biologiske nøgleprocessers virkning  
— vigtige (eller mistænkte) aspekter af virkningsmåde, som f.eks. dosis, 
hvorved cytotoksicitet begynder at stige , hormonniveauer forstyrres, 
homøstatiske mekanismer belastes osv.  
— områder af dosis-responskurven, hvor der kræves særlig robust estime ­
ring, f.eks. i intervaller for den forventede BMD eller en mistænkt 
tærskel  
— overvejelse af forventede eksponeringsniveauer for mennesker.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Kontrolgruppen skal være ubehandlet eller behandles med vehikel, hvis et 
sådant anvendes til administration af testkemikaliet. Bortset fra behandling 
med testkemikaliet skal dyrene i kontrolgruppen håndteres på samme måde som dyrene i testgrupperne. Hvis der anvendes et vehikel, doseres kontrol ­
gruppen med vehiklet i det største anvendte volumen blandt dosisgrupperne. 
Hvis et testkemikalie administreret i foderet medfører væsentligt reduceret 
foderindtagelse på grund af foderets dårligere smag, kan det være nyttigt med en kontrolgruppe, der parallelfodres.
 
27. Hvis det ud fra informationer fra forforsøg kan forventes, at en test, der 
gennemføres med et dosisniveau svarende til mindst 1 000 mg/kg krops ­
vægt/dag og de fremgangsmåder, der er beskrevet for dette forsøg, næppe 
vil fremkalde negative virkninger, og hvis toksicitet ikke forventes ud fra 
kendskab til strukturelt beslægtede kemikalier, kan et fuldstændigt forsøg med anvendelse af tre dosisniveauer betragtes som unødvendigt. En grænse på 1 000 mg/kg kropsvægt/dag er kun relevant, hvis human eksponering 
indicerer, at der er behov for anvendelse af et højere dosisniveau.
 
Fremstilling af doser og administration af testkemikalie  
28. Testkemikaliet indgives normalt oralt via foderet eller drikkevandet eller 
gennem sonde. Yderligere oplysninger om administrationsveje og -metoder findes i OECD Guidance Document No. 116 (6). Valget af administra ­
tionsvej og -metode afhænger af formålet med forsøget, testkemikaliets 
fysisk-kemiske karakteristika, dets biotilgængelighed og den måde, hvorpå mennesker primært eksponeres for testkemikaliet. Der gives en begrundelse for den valgte administrationsvej og -metode. Af hensyn til dyrevelfærden 
bør oral sonde kun anvendes i forbindelse med stoffer, for hvilke denne 
administrationsvej og -metode med rimelighed repræsenterer en potentiel eksponeringsmåde for mennesker (f.eks. lægemidler). I forbindelse med kemikalier, der bruges i fødevarer eller miljøet, administreres testkemikaliet 
typisk via foderet eller drikkevandet. I nogle scenarier, f.eks. erhvervs ­
mæssig eksponering, kan andre administrationsveje være mere hensigtsmæs ­
sige.
 
29. Om nødvendigt opløses eller opslæmmes testkemikaliet i et egnet vehikel. 
For vehiklet og andre tilsætningsstoffer skal følgende karakteristika tages i betragtning: dets effekt på testkemikaliets absorption, fordeling, metabolisme 
og retention, dets indvirkning på testkemikaliets kemiske egenskaber med 
deraf følgende ændring af dettes toksiske egenskaber, og dets indvirkning på dyrenes føde- og vandindtagelse og ernæringstilstand. Det anbefales, at man som første valg vurderer muligheden af at benytte en vandig opløsning/sus ­
pension, derefter en opløsning/suspension i olie (f.eks. majsolie) og først 
derefter eventuel opløsning i andre vehikler. For andre vehikler end vand bør vehiklets toksiske egenskaber være kendt. Der bør forefindes oplys ­
ninger om testkemikaliets stabilitet og homogeniteten af doseringsopløs ­
ninger eller foder (hvis det er relevant) ved den anvendte administrations ­
form (f.eks. gennem foder).
 
30. For testkemikalier, som administreres i foderet eller drikkevandet, er det 
vigtigt at sikre, at det pågældende testkemikalie i den anvendte mængde ikke griber ind i den normale ernærings- eller vandbalance. I langvarige toksicitetsforsøg med administration via foderet må testkemikaliets koncen ­
tration i foderet normalt ikke overstige en øvre grænse på 5 % af den 
samlede fodermængde for at undgå ernæringsmæssige ubalancer. Når test ­
kemikaliet administreres i foderet, kan det administreres som en konstant koncentration i foderet (mg/kg foder eller ppm) eller som en konstant dosis ­
størrelse i forhold til dyrets kropsvægt (mg/kg kropsvægt) beregnet ugent ­
ligt. Det anvendte alternativ anføres.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Ved oral administration gives testkemikaliet dagligt til dyrene (syv dage om 
ugen) normalt i en periode på 12 måneder (se også afsnit 33), men der kan 
vælges kortere eller længere varigheder afhængigt af lovgivningskravene. Ethvert andet dosisregime, f.eks. fem gange ugentlig, skal begrundes. Ved dermal applikation behandles dyrene normalt med testkemikaliet i mindst 
seks timer om dagen, syv dage om ugen, som beskrevet i kapitel B.9 i dette 
bilag (10), i en periode på 12 måneder. Eksponering ved inhalation gennem ­
føres seks timer om dagen, syv dage om ugen, men eksponering fem dage om ugen kan anvendes, hvis det begrundes. Eksponeringen varer normalt 12 
måneder. Hvis andre gnaverarter end rotter eksponeres gennem næsen, kan 
de maksimale eksponeringsvarigheder justeres for at minimere artsspecifikke lidelser. Der bør gives en begrundelse, når der anvendes en eksponerings ­
varighed på mindre end seks timer om dagen. Se også kapitel B.8 i dette 
bilag (8).
 
32. Hvis testkemikaliet indgives med sonde, skal det gøres i en enkelt dosis, 
med anvendelse af en mavesonde eller et passende intubationsrør på samme tidspunkt hver dag. Normalt administreres én dosis en gang dagligt. Hvis et 
kemikalie f.eks. er et lokalirriterende stof, kan den daglige dosis dog admi ­
nistreres som en deldosis (to gange om dagen). Det maksimale væskevolu ­
men, som kan administreres ad gangen, afhænger af forsøgsdyrets størrelse. Volumenet skal være så lavt som praktisk muligt og må normalt ikke over ­
stige 1 ml/100 g kropsvægt for gnavere (22). Variationer i testvolumen skal 
minimeres ved at justere koncentrationerne, så der sikres et konstant volumen ved alle dosisniveauer. Dette gælder dog ikke potentielt ætsende eller irriterende kemikalier, som skal fortyndes for at undgå alvorlige lokale 
virkninger. Test ved koncentrationer, der sandsynligvis kan være ætsende 
eller irriterende for mave-tarmkanalen bør undgås.
 
Forsøgets varighed  
33. Denne testmetode er primært designet som et 12-måneders forsøg 
vedrørende kronisk toksicitet, men forsøgsdesignet gør det også muligt at 
udføre forsøg med enten kortere (f.eks. 6 eller 9 måneder) eller længere 
(f.eks. 18 eller 24 måneder) varighed, afhængigt af de specifikke lovgiv ­
ningskrav eller mekanistiske formål. Afvigelser fra eksponeringsvarigheden på 12 måneder skal begrundes, især ved kortere varigheder. Satellitgrupper, 
der medtages med henblik på at overvåge reversibiliteten af toksikologiske 
virkninger induceret af det undersøgte testkemikalie, bevares uden dosering i en periode på mindst fire uger og højst en tredjedel af den samlede forsøgs ­
varighed efter ophør af eksponering. Yderligere oplysninger, herunder over ­
vejelser om overlevelse i forsøget, findes i OECD Guidance Document No. 
116 (6).
 
OBSERVATIONER  
34. Alle dyr kontrolleres for morbiditet eller mortalitet, normalt morgen og 
aften, alle ugens dage. Almindelig klinisk observation bør foretages mindst én gang om dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er), idet man 
tager i betragtning, hvornår maksimal effekt kan forventes efter sondeind ­
gift.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Detaljerede kliniske undersøgelser gennemføres af alle dyrene i hvert fald 
før første eksponering (for at tage højde for individuelle forskelle), ved 
slutningen af den første uge af forsøget og derefter en gang månedlig. Protokollen for undersøgelser tilrettelægges, således at variationer mellem individuelle undersøgere minimeres, og således at den er uafhængig af test ­
gruppen. Disse undersøgelser skal foretages uden for burene, fortrinsvis på 
et standardareal og på samme tid i hvert tilfælde. De skal noteres omhyg ­
geligt, fortrinsvis ved anvendelse af et scoringssystem, eksplicit defineret af testlaboratoriet. Man bør bestræbe sig på, at variationerne i undersøgelses ­
betingelserne er mindst mulige. Undersøgelserne bør bl.a. omfatte ændringer 
i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion, ekskretion og autonom aktivitet (f.eks. tåreflod, strittende hårlag, pupilstørrelse, usædvanligt respi ­
rationsmønster). Forandringer i gang, stilling og respons på håndtering såvel 
som tilstedeværelse af toniske og kloniske bevægelser, stereotypi (f.eks. 
overdreven pudsning, repetitive cirkelbevægelser) eller bizar opførsel (f.eks. selvmutilation, baglæns gang) skal også noteres (24).
 
36. Oftalmologisk undersøgelse ved hjælp af oftalmoskop eller andet passende 
udstyr bør udføres på alle dyr inden første administration af testkemikaliet. 
Ved forsøgets afslutning foretages denne undersøgelse helst på alle dyr, men 
i det mindste på alle dyr i højdosis- og kontrolgrupperne. Hvis der opdages øjenforandringer, der kan tilskrives behandlingen, skal alle dyrene undersø ­
ges. Hvis strukturel analyse eller andre informationer antyder øjentoksicitet, 
øges frekvensen af øjenundersøgelser.
 
37. For kemikalier, hvor tidligere 28-dages eller 90-dages toksicitetstest med 
gentagen dosering har indiceret et neurotoksisk potentiale, kan reaktiviteten over for sensoriske stimuli af forskellig art (24) (f.eks. auditive, visuelle og 
proprioceptive stimuli) (25), (26), (27), gribestyrke (28) og motorisk akti ­
vitet (29) eventuelt vurderes inden påbegyndelsen af forsøget og derefter med tre måneders mellemrum, indtil der er gået 12 måneder, og ved forsøgs ­
afslutning (hvis senere end 12 måneder). Nærmere oplysninger om de frem ­
gangsmåder, der kan benyttes, findes i de respektive referencer. Andre 
alternative fremgangsmåder end de refererede kan imidlertid også anvendes.
 
38. For kemikalier, hvor tidligere 28-dages eller 90-dages toksicitetstest med 
gentagen dosering har indiceret et immunotoksisk potentiale, kan yderligere 
undersøgelser af denne effektparameter udføres ved forsøgsafslutning.  
Kropsvægt, foder-/vandindtagelse og foderudnyttelse  
39. Alle dyr vejes ved begyndelsen af behandlingen, mindst én gang om ugen i 
de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden. Foderindtagelse 
og -udnyttelse måles mindst én gang om ugen i de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden. Vandindtagelse måles mindst én gang om ugen i de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden, når 
testkemikaliet administreres i vandet. Måling af vandindtagelse bør også 
overvejes i forsøg, hvor drikkeaktiviteten ændres.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hæmatologiske og klinisk-biokemiske prøver  
40. I forsøg med gnavere foretages hæmatologisk undersøgelse af mindst 10 
handyr og 10 hundyr pr. gruppe ved 3, 6 og 12 måneder og ved forsøgs ­
afslutning (hvis senere end 12 måneder), og de samme dyr anvendes i hele 
forsøget. I forsøg med mus skal der evt. bruges satellitdyr for at kunne 
udføre alle de krævede hæmatologiske undersøgelser (se afsnit 18). I forsøg med ikke-gnavere udtages prøver fra et mindre antal dyr (f.eks. 4 dyr pr. køn og pr. gruppe i hundeforsøg) ved mellemliggende prøvetag ­
ningstidspunkter og ved forsøgsafslutning som beskrevet for gnavere. 
Målinger ved 3 måneder foretages ikke hos hverken gnavere eller ikke-gnavere, hvis der ikke er konstateret virkninger på hæmatologiske 
parametre i et tidligere 90-dages forsøg gennemført ved hjælp af sammen ­
lignelige dosisniveauer. Blodprøver udtages fra et udpeget sted, f.eks. ved hjertepunktur eller fra retro-orbital sinus, under bedøvelse.
 
41. Følgende parametre bør undersøges (30): total og differential leucocyttæl ­
ling, erythrocyttælling, blodpladetælling, hæmoglobinkoncentration, hæma ­
tokrit, middelcellevolumen (MCV), middelcellehæmoglobin (MCH), middelcellehæmoglobinkoncentration (MCHC), protrombintid og aktiveret 
partiel tromboplastintid. Andre parametre for hæmatologi, som f.eks. 
Heinz-legemer eller andre atypiske parametre for erythrocytmorfologi eller methæmoglobin, kan måles afhængigt af testkemikaliets toksicitet. Generelt bør der benyttes en fleksibel tilgang afhængigt af de observerede og/eller 
forventede virkninger af et givet testkemikalie. Hvis testkemikaliet har 
indvirkning på det hæmopoietiske system, kan retikulocyttællinger og knog ­
lemarvcytologi også være indiceret, selv om de ikke skal foretages rutine ­
mæssigt.
 
42. Klinisk kemiske målinger med henblik på undersøgelse af toksisk virkning 
på væv og specielt på nyrer og lever skal foretages på blodprøver taget fra 
mindst 10 handyr og 10 hundyr pr. gruppe med samme tidsintervaller som 
de hæmatologiske undersøgelser og med anvendelse af de samme dyr i hele forsøget. I forsøg med mus skal der evt. bruges satellitdyr for at kunne udføre alle de krævede klinisk kemiske målinger. I forsøg med 
ikke-gnavere udtages prøver fra et mindre antal dyr (f.eks. fire dyr pr. 
køn og pr. gruppe i hundeforsøg) ved mellemliggende prøvetagningstids ­
punkter og ved forsøgsafslutning som beskrevet for gnavere. Målinger ved 3 måneder foretages ikke hos hverken gnavere eller ikke-gnavere, hvis der 
ikke er konstateret virkninger på klinisk-biokemiske parametre i et tidligere 
90-dages forsøg gennemført ved hjælp af sammenlignelige dosisniveauer. Dyrene (dog ikke mus) bør faste inden blodprøvetagning. Følgende para ­
metre bør undersøges (30): glukose, urea (urinstof), kreatinin, total protein, 
albumin, kalcium, natrium, kalium, total kolesterol, mindst to relevante test 
med henblik på hepatocellulær evaluering (alanin-aminotransferase, aspartat-aminotransferase, glutamat-dehydrogenase og totale galdesyrer) (31) og mindst to relevante test med henblik på hepatobiliær evaluering 
(alkalisk fosfatase, gamma-glutamyl-transferase, 5 ′-nucleotidase, total bili ­
rubin og totale galdesyrer) (31). Andre klinisk-kemiske parametre, som f.eks. fastende triglycerider, specielle hormoner og kolinesterase, kan måles afhængigt af testkemikaliets toksicitet. Der skal generelt benyttes en 
fleksibel tilgang afhængigt af den observerede og/eller forventede virkning 
af et testkemikalie.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Urinanalyser udføres på mindst 10 handyr og 10 hundyr pr. gruppe med 
samme tidsintervaller som de hæmatologiske og klinisk-kemiske undersø ­
gelser. Målinger ved 3 måneder foretages ikke, hvis der ikke er konstateret virkninger på urinanalyse i et tidligere 90-dages forsøg gennemført ved hjælp af sammenlignelige dosisniveauer. Følgende liste over parametre 
indgik i en ekspertanbefaling vedrørende kliniske patologiforsøg (30): udse ­
ende, volumen, osmolalitet eller vægtfylde, pH, total protein og glukose. Andre parametre omfatter keton, urobilinogen, bilirubin og hæmaturi. Andre parametre kan inkluderes, hvis det er nødvendigt at udvide undersøgelsen af 
en eller flere observerede virkninger.
 
44. Der er generel enighed om, at hæmatologiske og klinisk-biokemiske base ­
linevariabler er nødvendige inden behandling i forbindelse med hundefor ­
søg, men de er ikke nødvendige i forsøg med gnavere (30). Hvis de histo ­
riske baselinedata (se afsnit 50) er utilstrækkelige, bør det overvejes at fremskaffe sådanne data.
 
Patologi  
Makroskopisk obduktion  
45. Alle dyr, som indgår i forsøget, skal have udført en fuldstændig, detaljeret 
makroskopisk obduktion, hvilket inkluderer omhyggelig undersøgelse af alle overflader, alle åbninger, og kraniets, brystkassens og abdomens kaviteter og 
deres indhold. Der kan dog også medtages reserver (i grupperne for afliv ­
ning under forsøget) til målinger alene af specifikke nøgleparametre, som f.eks. neurotoksicitet eller immunotoksicitet (se afsnit 19). Disse dyr under ­
kastes dog ikke obduktion og de fremgangsmåder, der er beskrevet i det 
følgende. Sentineldyr skal evt. obduceres, men det afgøres af forsøgslederen 
i hvert enkelt tilfælde.
 
46. Organvægte registreres for alle dyr, bortset fra dyr som er udelukket i 
medfør af sidste del af afsnit 45. Binyrer, hjerne, bitestikler, hjerte, nyrer, lever, ovarier, milt, testikler, skjoldbruskkirtel (vejet efter fiksering, med 
paratyreoideae) og uterus skal på alle dyr renses for andet vedhængende 
væv som behørigt (undtaget er de dyr, der findes døende og/eller aflives undervejs i forsøget) og vejes snarest muligt efter dissektionen for at undgå udtørring. I forsøg med mus er vejningen af binyrer valgfri.
 
47. Følgende væv skal præserveres ved hjælp af det mest passende fikserings ­
middel både med henblik på vævstypen og den følgende histopatologiske 
undersøgelse (se afsnit 32) (væv i kantet parentes er valgfrit): 
Alle større læsioner Hjerte Bugspytkirtel Mavesæk (formave, kirtel ­
mave) 
Binyrer Ileum Biskjoldbruskkirtel [Tænder] 
Aorta Jejunum Perifer nerve Testikler Hjerne (herunder udsnit af 
cerebrum, cerebellum og medulla/pons) Nyre Hypofyse Brisler 
Cæcum Tårekirtel (ekstraorbital) Prostata Skjoldbruskkirtel 
Cervix Lever Rectum [Tunge]
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
Prostata anterior Lunge Spytkirtel Luftrør 
Tyktarm Lymfeknuder (både 
overfladiske og dybe) Vesiculae seminales Urinblære 
Duodenum Brystkirtel (obligatorisk 
for hundyr og, hvis de 
er synligt dissekerbare, for handyr) Skeletmuskel Uterus med cervix 
Epididymis [Øvre luftveje, herunder 
næse, muslingeben og 
paranasale sinusser] Hud [Ureter] 
Øje (herunder retina) Øsofagus Rygmarv (på tre 
niveauer: (cervikal, 
midt-torakal og lumbal) [Urethra] 
[Femur med led] [Bulbus olfactorius] Milt Vagina 
Galdeblære (for andre arter 
end rotte) Æggestok [Sternum] Sektion af knoglemarven og/ 
eller frisk knoglemarvsaspirat 
Harderian-kirtel
 
I tilfælde af parrede organer, f.eks. nyrer og binyrer, præserveres begge 
organer. Kliniske og andre fund kan foranledige undersøgelse af andet væv. Også særlige organer, der sandsynligvis kan være mål for testkemika ­
liets kendte virkninger, bør præserveres. I forsøg, der omfatter dermal appli ­
kation, skal de organer, der er opført på listen over organer til præservation 
ved oral administration, præserveres, og specifik prøvetagning og præserva ­
tion af huden fra applikationsstedet skal foretages. I inhalationsforsøg skal listen over væv, der skal præserveres og undersøges fra luftvejene, følge 
anbefalingerne i kapitel B.8 i dette bilag (8) og kapitel B.29 i dette bilag (9). 
For andre organer/væv (og i tillæg til de væv, der specifikt er præserveret fra luftvejene) skal de organer, der er anført for oral administration, under ­
søges.
 
Histopatologi  
48. Der foreligger vejledning om bedste praksis i forbindelse med gennem ­
førelsen af toksikologiske patologiforsøg (32). De histopatologiske undersø ­
gelser skal som minimum omfatte:  
— alle væv fra højdosis- og kontrolgruppen  
— alle væv fra dyr, som er døde eller aflivet under forsøget  
— alle væv, som udviser makroskopiske abnormiteter  
— målvæv eller væv, der udviser behandlingsrelaterede forandringer i 
højdosisgruppen, fra dyr i alle andre dosisgrupper  
— i tilfælde af parrede organer, f.eks. nyrer og binyrer, præserveres begge 
organer.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
49. Der skal fremlægges data for de enkelte dyr for alle evaluerede parametre. 
Yderligere skal alle data opsummeres i tabeller, der for hver testgruppe viser antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr fundne døde i løbet af testen eller aflivede af humane grunde og tidspunktet for deres død, det antal dyr, 
der udviser tegn på toksicitet, en beskrivelse af disse tegn, inklusive tids ­
punktet for deres begyndelse, deres varighed og toksicitetsgraden; det antal dyr, der har læsioner, typen af læsioner og den procentdel af dyrene, der udviser de forskellige typer af læsion. I oversigtstabeller anføres middel- og 
standardafvigelser (for kontinuerlige testdata) for dyr, der udviser toksiske 
virkninger eller læsioner, samt gradueringen af læsioner.
 
50. Historiske kontroldata kan være værdifulde i forbindelse med fortolkningen 
af forsøgsresultaterne, f.eks. hvis der er tegn på, at data fra de samtidige kontroller er væsentligt afvigende i forhold til nylige data fra kontroldyr fra samme forsøgslaboratorium/koloni. Historiske kontroldata, som evalueres, 
bør være indgivet fra samme laboratorium og vedrøre dyr af samme alder 
og stamme og være genereret inden for fem år forud for det aktuelle forsøg.
 
51. Hvor det er muligt, skal tallene evalueres ved hjælp af en passende og 
accepteret statistisk metode. Den statistiske metode og de data, der skal analyseres med den, skal vælges under planlægningen af forsøget (se afsnit 8). Ved udvælgelse bør der tages behov for evt. justeringer for over ­
levelse.
 
Testrapport  
52. Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:  
Testkemikalie:  
— fysiske egenskaber, renhedsgrad og fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikationsdata  
— testkemikaliets kilde  
— batchnummer  
— certifikat for kemisk analyse.  
For eventuelt vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.  
For forsøgsdyrene:  
— anvendt art/stamme og begrundelse for anvendelse  
— dyrenes antal, køn og alder ved forsøgets begyndelse  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— herkomst, miljøbetingelser, kost osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  
Testbetingelser:  
— begrundelse for valg af administrationsvej og dosis  
— de statistiske metoder, der er anvendt til dataanalyse, hvis relevant  
— oplysninger om formuleringen af testkemikalie/fodertilberedning  
— analysedata om opnået koncentration, stabilitet og homogenitet for 
tilberedningen  
— administrationsvej og nærmere oplysninger om administrationen af test ­
kemikaliet  
— eksponering gennem næsen og helkropseksponering for inhalations ­
forsøg  
— faktiske doser (mg/kg kropsvægt/dag) og omregningsfaktor fra testkemi ­
kaliets koncentration i foder/vand (mg/kg eller ppm) til faktisk dosis, 
hvis muligt  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet.  
Resultater (opsummerende data og data for individuelle dyr opstilles i tabel ­
form):  
— data om overlevelse  
— kropsvægt og ændringer i kropsvægt  
— foderindtagelse, beregning af foderudnyttelse og indtagelse af vand, hvis 
muligt  
— data vedrørende toksicitet sat over for køn og dosis, inklusive toksici ­
tetstegnene  
— art, incidens (og, hvis vurderet sværhedsgrad) og varighed af kliniske 
symptomer (hvad enten disse er reversible eller ikke)  
— oftalmologisk undersøgelse  
— hæmatologiske målinger  
— klinisk-biokemiske målinger  
— urinanalyser  
— resultat af undersøgelser af neurotoksicitet eller immunotoksicitet  
— kropsvægt ved forsøgets afslutning  
— organvægt (og deres forhold, hvis relevant)  
— obduktionsfund  
— en detaljeret beskrivelse af alle behandlingsrelaterede histopatologiske 
fund 
— data for absorption, hvis de forefindes.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Evt. statistisk behandling af resultaterne  
Diskussioner af resultater, herunder:  
— forhold mellem dosis og respons  
— overvejelse af oplysninger om virkningsmåde  
— diskussion af tilgange til modellering  
— bestemmelse af BMD, NOAEL eller LOAEL  
— historiske kontroldata  
— relevans for mennesker.  
Konklusioner  
LITTERATUR:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rom, 1995), internt arbejds ­
dokument, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
 
(3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.  
(4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
 
(5) Kapitel B.27 i dette bilag, Subkronisk oral toksicitetstest — et 90-dages 
forsøg over gentagne orale dosers toksicitet på ikke-gnavere.  
(6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 og 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, findes på OECD's offentlige websted for Test Guidelines på www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
(7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No.39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
(8) Kapitel B.8 i dette bilag, Subakaut toksicitet (inhalation), 28-dages forsøg.  
(9) Kapitel B.29 i dette bilag, Subkronisk toksicitet (inhalation): 90-dages 
forsøg.  
(10) Kapitel B.9 i dette bilag, Toksicitet ved gentagen dosering (28 dage, 
dermal).  
(11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human 
Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.  
(12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
(13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69-98.  
(15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
(16) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation.
 
(17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and 
Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
(18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(19) Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 
om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (EUT L 276 af 20.10.2010, s. 33).
 
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
(21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
(22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems.  
(23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.  
(24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
(25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
(28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  
(29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. 
Teratol. 13: 599-609.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(31) EMEA-dokument (udkast) »Non-clinical guideline on drug-induced hepa ­
totoxicity« (Dok. ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 
131. ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  PRÆNATAL UDVIKLINGSTOKSICITETSUNDERSØGELSE  
1. METODE  
Metoden er gengivet efter OECD TG (2001).  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med denne metode til udviklingstoksicitetsundersøgelse er 
at skaffe generel information om virkningerne af prænatal ekspone ­
ring på det drægtige forsøgsdyr og på organismen, mens den 
udvikles in utero; heri kan også indgå en vurdering af maternel påvirkning såvel som død, strukturabnormiteter og ændret vækst af fosteret. Skønt funktionelle mangler er en vigtig del af udviklingen, 
indgår de ikke i denne forsøgsmetode. Funktionelle mangler kan i 
stedet undersøges i et særskilt forsøg eller ved at denne undersøgelse suppleres med anvendelse af metoden til undersøgelse af udviklings ­
neurotoksicitet. Til undersøgelse for funktionelle mangler og andre 
postnatale effekter kan anvendes metoderne fra reproduktionstoksici ­
tetsundersøgelse i to generationer og udviklingsneurotoksicitets ­
undersøgelse.
 
Denne metode kan kræve individuel tilpasning på grundlag af 
konkret viden om f.eks. teststoffets fysisk-kemiske eller toksikolo ­
giske egenskaber. En sådan tilpasning kan godtages, når det på over ­
bevisende måde videnskabeligt dokumenteres, at tilpasningen vil 
gøre forsøget mere informativt. I sådanne tilfælde skal denne viden ­
skabelige dokumentation være nøje beskrevet i forsøgsrapporten.  
1.2. DEFINITIONER  
Udviklingstoksikologi:  Undersøgelse af de ugunstige virkninger på 
organismens udvikling, som kan forårsages af eksposition før konceptionen, under den prænatale udvikling og posnatalt i tiden 
indtil kønsmodning. Hovedmanifestationerne af toksisk virkning på 
udviklingen er 1) organismens død, 2) strukturabnormiteter, 3) ændret vækst og 4) funktionelle mangler. Udviklingstoksikologi er tidligere hovedsagelig blevet betegnet teratologi.
 
Negativ virkning:  Enhver sådan behandlingsrelateret afvigelse fra 
grundlinjen, som forringer en organismes overlevelsesevne, repro ­
duktionsevne eller tilpasningsevne til omgivelserne. Udviklingstoksi ­
kologi omfatter i bredeste forstand enhver virkning, som interfererer med den normale udvikling af conceptus både før og efter fødslen.
 
Ændret vækst:  Ændring i afkommets organ- eller kropsvægt eller 
-størrelse.  
Forandringer (abnormiteter):  Strukturelle forandringer i udviklin ­
gen, herunder både misdannelser og afvigelser (28).  
Misdannelse/væsentlig abnormitet:  Strukturforandring, som anses 
for skadelig for dyret (og kan være dødelig), og som sædvanligvis er 
sjælden.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Afvigelse/mindre abnormitet:  Strukturændring, som anses for at 
have ingen eller ringe skadelig virkning for dyret; kan være forbigå ­
ende og kan optræde forholdsvis hyppigt i kontrolpopulationen.  
Conceptus:  Det samlede produkt af et befrugtet æg på ethvert 
stadium af udviklingen fra befrugtning til fødsel, herunder ekstraem ­
bryonale membraner samt selve embryo eller føtus.  
Implantation (nidation):  Fasthæftning af blastocysten til det 
indvendige epitel i uterus, herunder penetration af uterusepitelet og 
indlejring i endometriet.  
Embryo:  Organismens tidlige stadium eller udviklingsstadium, 
specielt det fremvoksende produkt af æggets befrugtning, efter at 
længdeaksen viser sig, og indtil alle hovedstrukturer er til stede.  
Embryotoksisk:  Skadelig for den normale struktur, udvikling, vækst 
og eller levedygtighed af et embryo.  
Føtus:  Det ufødte afkom i den postembryonale periode.  
Føtotoksicitet:  Skadevirkning på den normale struktur, udvikling, 
vækst og eller levedygtighed af et føtus.  
Abort:  Præmatur udstødelse fra uterus af konceptionsprodukter, dvs. 
af embryonet eller af et ikke levedygtigt føtus.  
Resorption:  Et conceptus, som efter at have være implanteret i 
uterus er dødt og er ved at blive resorberet eller er blevet det.  
Tidlig resorption:  Tegn på implantation uden genkendeligt 
embryo/føtus.  
Sen resorption:  Et dødt embryo eller føtus med ydre degenerative 
forandringer.  
NOAEL:  forkortelse for »no-observed-adverse-effect level«, dvs, 
den højeste dosis eller det højeste eksponeringsniveau, hvor der 
ikke observeres behandlingsrelaterede negative virkninger.  
1.3. REFERENCESTOF  
Intet.  
1.4. FORSØGSMETODENS PRINCIP  
Teststoffet administreres normalt til drægtige dyr, i det mindste fra 
implantationsdagen til én dag før planlagt aflivning, som bør finde 
sted så kort som muligt før det forventede fødselstidspunkt, uden at der er risiko for tab af data som følge af for tidlig fødsel. Det er ikke hensigten, at metoden alene skal omhandle organogeneseperioden 
(f.eks. dag 5-15 hos gnavere og dag 6-18 hos kaniner), men, når 
det er hensigtsmæssigt, også virkninger fra præimplantationsperioden gennem hele drægtighedsperioden indtil dagen før kejsersnit. Kort inden kejsersnittet aflives hundyrene, uterusindholdet undersøges, og 
føtus bedømmes for synlige udvendige abnormiteter og bløddels- og 
skeletforandringer.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. BESKRIVELSE AF FORSØGSMETODEN  
1.5.1.  Valg af dyreart  
Det anbefales, at forsøget udføres i den mest relevante dyreart, og at 
de anvendte laboratoriedyr er af arter og stammer, som sædvanligvis 
benyttes til teratogenicitetsforsøg. Den foretrukne art gnavere er 
rotter, og den foretrukne art ikke-gnavere er kaniner. Anvendes andre dyrearter, bør dette begrundes.
 
1.5.2.  Omgivende miljø og fodring af dyrene  
Temperaturen i forsøgslokalet skal være 22  o C (± 3  o C) for gnavere 
og 18  o C (± 3  o C) for kaniner, Den relative luftfugtighed skal være 
mindst 30 % og helst ikke over 70 % undtagen under rengøring af 
rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig 
bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand,
 
Parring bør finde sted i bure egnede til formålet. Par bør fortrinsvis 
holdes for sig, men gruppevis anbringelse af få dyr kan også 
godtages.  
1.5.3.  Forberedelse af dyrene  
Der anvendes raske dyr, som er akklimatiseret til laboratoriemiljøet i 
mindst fem døgn og ikke tidligere er indgået i forsøg. Forsøgsdyrene skal være karakteriseret med hensyn til art, stamme, oprindelse, køn, vægt og/eller alder. Dyrene i alle forsøgsgrupper skal så vidt muligt 
være af ensartet vægt og alder, På hvert dosisniveau skal anvendes 
unge voksne hundyr, som ikke tidligere har født. Hunnerne parres med hanner af samme art og stamme, idet parring af søskendedyr undgås. For gnavere er drægtighedsperiodens dag 0 den dag, hvor 
der observeres en vaginal prop og/eller semen; for kaniner er dag 0 
sædvanligvis dagen for coitus eller for kunstig insemination, hvis denne teknik anvendes. De parrede hunner fordeles uden skævhed mellem kontrol- og behandlingsgruppeme. Burene arrangeres såle ­
des, at eventuelle virkninger af burenes placering minimeres. Hvert 
dyr tilordnes et unikt identifikationsnummer. Parrede hunner fordeles uden skævhed mellem kontrol- og behandlingsgrupperne, og hvis hunnerne parres holdvis, skal dyrene i hvert hold fordeles ligeligt 
mellem grupperne. Tilsvarende skal hunner, som insemineres af 
samme han, fordeles jævnt mellem grupperne.
 
1.6. FREMGANGSMÅDE  
1.6.1.  Dyrenes antal og køn  
I hver behandlings- og kontrolgruppe skal der være tilstrækkeligt 
med hunner til, at der ved obduktion fås ca. 20 hundyr med implan ­
tationssteder. Hvis der færre end 16 dyr med implantationssteder i en gruppe, kan det blive anset for utilstrækkeligt. Mortalitet af moder ­
dyrene gør ikke nødvendigvis undersøgelsens resultater ugyldige, 
forudsat at den ikke er over ca. 10 %.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Tilberedning af doser  
Anvendes et vehikel eller andet tilsætningsstof, skal følgende egen ­
skaber tages i betragtning: Indvirkningen på teststoffets absorption, fordeling, metabolisme og retention eller udskillelse; eventuel sådan 
indvirkning på teststoffets kemiske egenskaber, som kan ændre dets 
toksiske egenskaber, samt indvirkningen på dyrenes føde- og vandindtagelse eller ernæringstilstand, Vehiklet må hverken være udviklingstoksisk eller påvirke reproduktionen.
 
1.6.3.  Dosering  
Normalt administreres teststoffet dagligt fra implantationstidspunktet 
(f.eks. dag 5 efter parring) til dagen inden det planlagte kejsersnit. 
Hvis eventuelle indledende undersøgelser ikke tyder på et stort potentiale for præimplantationstab, kan behandlingen udvides til at omfatte hele drægtighedsperioden fra parringen til dagen før den 
planlagte aflivning. Det er velkendt, at uhensigtsmæssig behandling 
eller stress i drægtighedsperioden kan medføre prænatalt tab. For at sikre mod prænatalt tab som følge af ikke-behandlingsrelaterede faktorer skal man undgå unødvendig håndtering af drægtige dyr 
samt stress forårsaget af ydre faktorer som støj.
 
Der skal være mindst tre dosisgrupper og en sideløbende kontrol ­
gruppe. Raske dyr skal fordeles uden skævhed mellem kontrol- og 
behandlingsgrupperne. Dosisniveauerne bør vælges med sådanne 
intervaller, at der frembringes en gradueret toksisk effekt. Medmindre doseringen må begrænses pga. teststoffets fysisk- kemiske eller biologiske egenskaber, vælges den højeste dosering 
således, at den har en vis udviklingstoksisk effekt og/eller toksisk 
effekt på moderdyret (kliniske symptomer eller vægttab), men uden at den forårsager død eller alvorlige lidelser. Der skal være mindst ét mellemniveau, som fremkalder det laveste observerbare niveau af 
toksisk effekt. Den laveste dosering må hverken medføre tegn på 
materiel toksicitet eller udviklingstoksicitet. Der vælges en aftagende række dosisniveauer. som giver mulighed for at påvise en eventuel dosisafhængig respons samt det niveau, som ikke medfører tegn på 
skadelig effekt (NOAEL). Ved fastlæggelse af den aftagende række 
dosisniveauer svarer de optimale intervaller ofte til en faktor to til fire, og i mange tilfælde må tilføjelse af en fjerde behandlingsgruppe foretrækkes frem for meget store intervaller (f.eks. større end en 
faktor 10) mellem dosisniveauerne. Skønt målet er at fastlægge en 
maternel NOAEL, kan undersøgelser, hvor en sådan dosis ikke fast ­
lægges, også være acceptable (1).
 
Doseringen vælges under hensyntagen til eventuelle foreliggende 
toksicitetsdata samt supplerende oplysninger om metabolisme og toksikokinetik af teststof eller beslægtede stoffer. Sådanne oplys ­
ninger kan desuden være med til at godtgøre det hensigtsmæssige 
i den valgte dosering.
 
Der skal være en sideløbende kontrolgruppe. Kontrolgruppen skal 
være ubehandlet eller behandles med vehikel, hvis et sådant 
anvendes til administration af teststoffet. Alle grupper skal 
modtage samme volumen af enten teststof eller bærestof. Dyrene i kontrolgruppen (-grupperne) skal håndteres på samme måde som behandlingsgruppen. Kontrolgrupper på vehikel skal modtage dette 
i den største mængde, det anvendes i (som til behandlingsgruppen på 
laveste dosis).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Grænseprøve  
Såfremt et oralt testdosisniveau på mindst 1 000 mg/kg kropsvægt/ ­
døgn med de til dette forsøg beskrevne metoder ikke frembringer observerbar toksisk virkning i de drægtige dyr eller deres afkom, og 
såfremt foreliggende data (f.eks. fra strukturelt og/eller metabolisk 
beslægtede forbindelser) ikke giver anledning til at forvente nogen virkning, skal et komplet forsøg med tre dosisniveauer ikke absolut anses for nødvendigt. Den påregnede eksponering af mennesker kan 
tilsige, at der anvendes et højere oralt dosisniveau end det. der er 
anvendt i grænseforsøget. For andre administrationsmåder — f.eks. inhalation eller dermal applikation — kan teststoffets fysisk-kemiske 
egenskaber ofte være bestemmende for og begrænse det maksimale 
opnåelige ekspositionsniveau (f.eks. må dermal applikation ikke forårsage alvorlige lokale toksiske virkninger).
 
1.6.5  Administration af doser  
Teststoffet administreres sædvanligvis oralt med sonde. Anvendes 
anden administrationsvej, skal forsøgslederen begrunde valget, og 
passende modifikationer kan være nødvendige (2)(3)(4). Teststoffet bør administreres på omtrent samme tidspunkt hver dag.
 
Doseringen til det enkelte dyr bør normalt baseres på den seneste 
bestemmelse af dyrets vægt. I drægtighedsperiodens sidste trimester 
må justering af doseringen dog ske med varsomhed. Doseringen bør 
på grundlag af foreliggende data vælges, så man undgår kraftig maternel toksicitet, Konstateres der kraftig toksisk effekt i de behandlede moderdyr, skal disse aflives af humane grunde. Viser 
flere drægtige dyr tegn på stærk toksicitet, bør man overvejs at 
indstille forsøget for den pågældende dosisgruppe. Administreres stoffet med sonde, bør dette fortrinsvis ske som enkeltdosis ved hjælp af gastrisk sonde eller et passende intubationsrør. Den maksi ­
male væskemængde, som kan administreres ad gangen, afhænger af 
forsøgsdyrets størrelse. Dette volumen må højst være 1 ml/100 g kropsvægt, bortset fra vandige opløsninger, af hvilke der kan 
anvendes 2 ml/100 g kropsvægt. Anvendes majsolie som vehikel, 
må volumenet ikke overstige 0,4 ml/100 g kropsvægt. Variationer i testvolumen skal ved justering af koncentrationerne minimeres, så der sikres et konstant volumen for alle dosisgrupper.
 
1.6.6.  Iagttagelse af moderdyrene  
Klinisk observation skal foretages og registreres mindst én gang 
dagligt, fortrinsvis på samme tidspunkt(er) hver dag, idet man retter sig efter tidspunktet for den forventede maksimale effekt af indgivelsen. Dyrenes tilstand registreres, herunder dødelighed, mori ­
bund tilstand, væsentlige adfærdsændringer og alle tegn på åbenbar 
toksicitet.
 
1.6.7.  Kropsvægt og fødeindtagelse  
Dyrene vejes på drægtighedsperiodens dag 0 eller, for tidsparrede 
dyr leveret fra en ekstern opdrætter, på den første dag i doserings ­
perioden, og derefter mindst hver tredje dag i doseringsperioden samt 
på dagen for den planlagte aflivning.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Fødeindtagelsen registreres med tre dages mellemrum, hvilket skal 
falde sammen med kropsvægtbestemmelsen.  
1.6.8.  Post-mortem undersøgelse  
Hunnerne aflives ét døgn for den forventede fødsel. Hunner, som 
inden den planlagte aflivning viser tegn på abort eller for tidlig 
fødsel, aflives og underkastes grundig makroskopisk undersøgelse.  
Ved forsøgets slutning eller ved indtræden af død under forsøget 
undersøges moderdyret makroskopisk for eventuelle strukturabnormi ­
teter eller patologiske forandringer. Vurderingen af hundyrene under 
kejsersnittet og de efterfølgende undersøgelser af føtus bør fortrinsvis 
ske uden kendskab til behandlingsgruppen for at minimere skævhed.  
1.6.9.  Undersøgelse af uterusindholdet  
Umiddelbart efter undersøgelsens afslutning eller snarest muligt efter 
dødens indtræden udtages uterus, og dyrenes drægtighedsstatus fast ­
slås. Uteri, som fremtræder ikke-gravide, undersøges nærmere (f.eks. med ammoniumsulfidfarvning til gnavere og Salewski-farvning som en velegnet alternativ metode til kaniner) med henblik på bekræftelse 
af den ikke-gravide status (5).
 
De gravide uteri inklusive cervix vejes. Vægten af den gravide 
uterus skal ikke bestemmes for dyr, som findes døde i løbet af undersøgelsen.
 
Antal corpora lutea hos drægtige dyr bestemmes.  
Uterusindholdet undersøges for antal døde embryoner eller føtus 
samt levende fostre, Resorptionsgraden beskrives, for at det relative dødstidpunkt for conceptus skønsvis kan fastsættes (se punkt 1.2).
 
1.6.10.  Undersøgelse af føtus  
For hvert føtus bestemmes køn og kropsvægt.  
Hvert føtus undersøges for ydre forandringer (6).  
Føtus undersøges for skelet- og bløddelsforandringer (f.eks. variatio ­
ner, misdannelser og abnormiteter) (7)(8)(9)(10)(11)(12) ­
(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24). Det må foretræk ­
kes, at føtale forandringer kategoriseres, men dette er ikke et krav. Har kategorisering fundet sted, skal det klart angives, efter hvilke kriterier hver kategori er fastlagt. Særlig opmærksomhed skal udvises 
over for reproduktionssystemet, som skal undersøges for tegn på 
forandringer i udviklingen.
 
For gnavere skal ca, halvdelen af hvert kuld præpareres og under ­
søges for skeletforandringer. Den resterende del præpareres og 
undersøges for bløddelsforandringer med anerkendte eller egnede 
metoder til seriesnit eller omhyggelig makroskopisk dissektion.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
For ikke-gnavere, f.eks. kaniner, skal alle fostre undersøges for både 
bløddels- og skeletforandringer. Disse fostre vurderes for bløddels ­
forandringer ved omhyggelig dissektion. herunder også metoder til nærmere vurdering af hjertets indvendige struktur (25). Hovedet på halvdelen af de således undersøgte fostre fjernes og præpareres til 
undersøgelse af bløddelsforandringer (herunder øjne, hjerne, næse ­
svælg og tunge), idet der anvendes sædvanlige seriesnitmetoder (26) eller en metode med tilsvarende følsomhed. Kroppen af disse fostre og de resterende intakte fostre behandles og undersøges for skelet ­
forandringer med anvendelse af de samme metoder som beskrevet 
for gnavere.
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Data rapporteres for hver enkelt moderdyr og dets afkom og 
sammenfattes i tabelform med angivelse, for hver forsøgsgruppe, af antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, tidspunkt for even ­
tuel død eller humanitær aflivning, antal drægtige hundyr, antal dyr, 
som viser tegn på toksisk virkning, beskrivelse af iagttagne toksici ­
tetstegn, herunder begyndelsestidspunkt, varighed og sværhed af alle toksiske virkninger, arten af de fund, der er gjort på embryo/føtus, 
samt alle relevante data vedrørende afkommet.
 
Talresultaterne evalueres med en passende statistisk metode, hvor 
kuldet benyttes som enhed for dataanalysen, Der anvendes en almin ­
delig anerkendt statistisk metode; valg af statistiske metoder skal 
indgå som en del af undersøgelsens design og skal begrundes. 
Data fra dyr, som ikke overlever indtil den planlagte aflivning, skal ligeledes rapporteres. Disse data kan, når det er relevant, indgå i gruppegennemsnittet. Relevansen af data for sådanne dyr 
og dermed om de skal indgå i et gruppegennemsnit eller ikke, skal 
begrundes og vurderes på individuel basis.
 
2.2. VURDERING AF RESULTATER  
Fundene i den prænatale udviklingstoksikologiske undersøgelse skal 
vurderes med hensyn til de iagttagne effekter. I vurderingen skal 
indgå følgende oplysninger:  
— maternelle og embryonale/føtale testresultater, herunder vurdering 
af sammenhæng, eller mangel herpå, mellem dyrenes udsættelse 
for teststoffet og forekomst og sværhedsgrad af alle fund  
— de anvendte kriterier for inddeling af føtale eksterne, bløddels- og 
skeletforandringer, såfremt inddeling er foretaget  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— når det er hensigtsmæssigt, historiske kontroldata, som kan være 
nyttige ved tolkning af undersøgelsesresultaterne  
— de tal, der ligger til grund for beregning af alle procenttal og 
indekser  
— når det er hensigtsmæssigt, fyldestgørende statistisk analyse af 
undersøgelsesresultaterne, med tilstrækkelige oplysninger om analysemetoden til, at en uafhængig rapportør/statistiker kan 
revurdere og eftergøre analysen.
 
I enhver undersøgelse, som viser fravær af toksiske virkninger, skal 
nødvendigheden af supplerende undersøgelser til bestemmelse af 
teststoffets absorption og biotilgængelighed diskuteres.  
2.3. FORTOLKNING AF RESULTATER  
En prænatal udviklingstoksicitetsundenøgelse giver oplysninger om 
virkningerne af gentagen eksponering for et stof på moderdyrene og 
på den intrauterine udvikling af afkommet. Undersøgelsens resultater skal fortolkes i sammenhæng med fundene fra subkroniske, repro ­
duktions-, toksikokinetiske og andre undersøgelser. Da der lægges 
vægt både på almen toksisk respons i form af maternel toksicitet og 
på udviklingstoksikologiske endpoints, vil undersøgelsens resultater i nogen grad gøre det muligt at skelne mellem de udviklingsmæssige effekter, som ikke er ledsaget af en almen toksisk virkning, og 
dem, som kun påføres på niveauer, som også er toksiske for moder ­
dyret (27).
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende specifikke oplysninger:  
For teststoffet:  
— fysisk form og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikation, herunder CAS-nummer, hvis dette kendes/findes  
— renhed.  
For eventuelt vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.  
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte art og stamme  
— antal dyr og deres alder  
— oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  
For forsøgsbetingelserne:  
— rationale for valg af dosisniveau  
— oplysninger om vedrørende formuleringen af 
teststof/fodertilberedning, opnået koncentration, tilberedningens 
stabilitet og homogenitet  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— oplysninger om administration af teststoffet  
— i givet fald, omregning fra teststofkoncentration i 
foder/drikkevand (ppm) til faktisk dosis (mg/kg kropsvægt/døgn)  
— miljøbetingelser  
— oplysninger om foderets og vandets kvalitet.  
Resultater:  
Data vedrørende materiel toksisk respons for hver dosisgruppe, 
inklusive, men ikke begrænset til:  
— antal dyr som indgår ved forsøgets start, antal overlevende dyr, 
antal drægtige, antal aborterende, antal dyr, som føder for tidligt  
— dato for dødens indtræden under forsøget eller hvorvidt dyrene 
overlevede til slutningen  
— data fra dyr, som ikke overlever indtil den planlagte aflivning, 
skal rapporteres, men skal ikke indgå i den statistiske gruppe ­
sammenligning  
— dag for iagttagelse af hvert abnormt klinisk symptom og dets 
efterfølgende forløb  
— kropsvægt. kropsvægtændring og vægten af den gravide uterus, 
herunder kropsvægtændring korrigeret for vægten af den gravide 
uterus (ikke obligatorisk)  
— fødeindtagelse og (hvis den måles) vandindtagelse  
— obduktionsfund, herunder vægt af uterus  
— NOAEL-niveau for maternel og udviklingsmæssig effekt skal 
rapporteres.  
Udviklingsmæssige endpoints for kuld med implantater, herunder:  
— antal corpora lutea  
— antal implantationer, antal og procentdel levende og døde fostre 
og resorptioner  
— antal og procentdel præ- og postimplantationstab.  
Udviklingsmæssige endpoints for kuld med levende fostre, herunder:  
— antal og procentdel levende afkom  
— kønsfordeling  
— føtal kropsvægt, helst for hvert køn og for begge køn samlet  
— udvendige, bløddels- og skeletmisdannelser og andre relevante 
forandringer  
— eventuelle inddelingskriterier  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— samlet antal og procentdel fostre og kuld med ydre, bløddels- 
eller skeletforandringer, samt type og incidens af enkeltabnormi ­
teter og andre relevante forandringer.  
Diskussion af resultaterne.  
Konklusioner.  
4. HENVISNINGER  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Inf 
luence of Study Design on the Estimation of Benchmark 
Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.  
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicologv 14; 386-398.
 
(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT 
Activities 17; 1-8.  
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E- 
Speciflc Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.
 
(5) Salewski, E. (1964) Färbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterus der Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experi ­
menielle Pathologie 247:367.
 
(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
(7) Inouye, M. (1976) Ditferential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Cengenital Anomalies 16; 171-173.
 
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Technique 
for Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32; :381-391.
 
(9) Kimmel. C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229-242.  
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects 
of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.  
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morpho ­
logy 127:291-306.  
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320.  
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9; :398-408.  
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations? Teratology 8: 309-316.  
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol. Teratology 46: 169-181.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.
 
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of 
Anatomy 41; 411-445.
 
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for 
Fetal Bone. Slam Technology 39; 61-63.  
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.
 
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 
181-188.
 
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the 
Rat Skeleton. Thomas, Springfield, II.  
(22) Wilson. J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.
 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Tera ­
tology, Vol. 4. Plenum, NY.  
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity, Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.
 
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.  
(26) Van Julsingha, F.B. and CG. Bennett (1977) A Dissseting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, 
D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of 
Chicago, Chicago, II, pp, 126-144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment, Federal Register 56; 63798-63826.
 
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249-292.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  KARCINOGENICITETSFORSØG  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 451 (2009). Den 
oprindelige TG 451 vedrørende karcinogenicitetsforsøg blev vedtaget i 1981. Denne reviderede testmetode B.32 blev udviklet for at tage højde 
for den seneste udvikling på området for dyrevelfærd og lovgivningskrav 
(2) (3) (4) (5) (6). Denne testmetode B.32 er opdateret parallelt med revi ­
sionen af kapitel B.30 i dette bilag (Forsøg vedrørende kronisk toksicitet) og kapitel B.33 i dette bilag (Kombineret forsøg vedrørende karcinogenicitet/ 
kronisk toksicitet) med det formål at fremskaffe yderligere oplysninger fra 
de dyr, der bruges i forsøget, og flere oplysninger om dosisvalg. Denne testmetode B.32 er designet, så den kan bruges til test af en bred vifte af kemikalier, herunder pesticider og industrikemikalier. Det skal dog bemær ­
kes, at andre oplysninger og krav kan være gældende for lægemidler (se 
International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals).
 
2. De fleste karcinogenicitetsforsøg gennemføres ved hjælp af gnaverarter, og 
det er derfor hensigten, at denne testmetode primært anvendes i forsøg på 
sådanne arter. Hvis sådanne forsøg er nødvendige på ikke-gnavere, kan testmetodens principper og fremgangsmåder anvendes sammen med de prin ­
cipper og fremgangsmåder, der er beskrevet i kapitel B.27 i dette bilag 
(Subkronisk oral toksicitetstest — et 90-dages forsøg over gentagne orale 
dosers toksicitet på ikke-gnavere, med de nødvendige ændringer. Yderligere vejledning findes i OECD Guidance Document No. 116 (7).
 
3. De tre primære administrationsveje i karcinogenicitetsforsøg er oral indgift, 
dermal applikation og inhalation. Valget af administrationsvej afhænger af testkemikaliets fysisk-kemiske karakteristika og den måde, hvorpå menne ­
sker primært eksponeres for testkemikaliet. Yderligere oplysninger om valg 
af administrationsvej findes i Guidance Document No. 116 (7).
 
4. Denne testmetode fokuserer på oral eksponering, den administrationsvej, der 
oftest bruges i karcinogenicitetsforsøg. Karcinogenicitetsforsøg, der invol ­
verer eksponering via inhalation eller dermal applikation, kan også være 
nødvendige i forbindelse med vurdering af risici for menneskers sundhed 
og/eller påkrævet i medfør af lovgivningen, men betydelig teknisk komplek ­
sitet er forbundet med begge eksponeringsveje. Sådanne forsøg skal designes i hvert enkelt tilfælde, selv om den testmetode, der er beskrevet 
her til vurdering og evaluering af karcinogenicitet ved oral administration, 
kan bruges som udgangspunkt for en protokol for inhalationsforsøg og/eller dermale forsøg, hvad angår anbefalinger vedrørende behandlingsperioder, kliniske og patologiske parametre osv. Der findes OECD-vejledninger om 
administration af testkemikalier ved hjælp af dermal applikation (7) og 
inhalation (7) (8). Kapitel B.8 i dette bilag (9) og kapitel B.29 i dette bilag (10) bør sammen med OECD Guidance Document on Acute Inhalation Testing (8) specifikt anvendes ved design af forsøg med længere varighed, 
der involverer eksponering via inhalation. Kapitel B.9 i dette bilag (11) 
anvendes, hvis forsøget vedrører dermal applikation.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Karcinogenicitetsforsøget skaffer viden om mulige sundhedsfarer, som kan 
opstå ved gentagen eksponering i løbet af en periode, der kan vare de 
anvendte arters levetid. Forsøget tilvejebringer oplysninger om de toksiske virkninger af testkemikaliet, herunder potentiel karcinogenicitet, og kan pege på, hvilke organer der rammes, og muligheden for akkumulation. Det kan 
også give et estimat af niveauet uden observerbare negative 
effekter (NOAEL) og, i tilfælde af ikke-genotoksiske karcinogener, af tumorrespons, som kan anvendes ved fastsættelse af sikkerhedskriterier for menneskers eksponering. Nødvendigheden af omhyggelig klinisk observa ­
tion af dyrene for at opnå størst mulig viden bliver ligeledes understreget.
 
6. De forsøgsformål, der er omfattet af denne testmetode, omfatter:  
— identifikation af et testkemikalies karcinogene egenskaber, der fører til 
en øget incidens af neoplasmer, øget andel af ondartede neoplasmer eller en reduktion i tiden til forekomsten af neoplasmer sammenlignet med samtidige kontrolgrupper
 
— identifikation af målorganer for karcinogenicitet  
— identifikation af tid til fremkomst af neoplasmer  
— karakterisering af forholdet mellem dosis-respons og tumor  
— identifikation af NOAEL eller udgangspunkt for fastlæggelse af 
benchmark-dosis (BMD)  
— ekstrapolering af karcinogene virkninger til eksponeringsniveauer for 
mennesker ved lav dosis  
— data til testhypoteser vedrørende virkningsmåde (2) (7) (12) (13) (14) 
(15).  
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
7. Ved vurderingen og evalueringen af den potentielle karcinogenicitet af et 
testkemikalie inddrages alle tilgængelige informationer om testkemikaliet af 
testlaboratoriet inden gennemførelsen af forsøget, således at forsøget foku ­
seres på effektiv test af potentialet for karcinogenicitet, og således at omfanget af dyreforsøg minimeres. Information om og overvejelse af virk ­
ningsmåden for et mistænkt karcinogen (2) (7) (12) (13) (14) (15) er særlig 
vigtig, fordi det optimale design kan variere, afhængigt af om testkemikaliet 
er et kendt eller mistænkt genotoksisk karcinogen. Yderligere vejledning om overvejelser vedrørende virkningsmåde findes i Guidance Document No. 116 (7).
 
8. Informationer, der kan hjælpe med at fastlægge forsøgsdesignet, omfatter 
testkemikaliets identitet, kemiske struktur og fysisk-kemiske egenskaber, resultater af in vitro- eller in vivo-toksicitetstest, herunder genotoksicitets ­
test, forventede anvendelser og potentialet for human eksponering, 
tilgængelige (Q)SAR-data, data om mutagenicitet/genotoksicitet og toksiko ­
logiske data vedrørende strukturelt relaterede kemikalier, tilgængelige toksi ­
kokinetiske data (kinetiske data ved enkelt og gentagen eksponering) samt 
data udledt af andre forsøg med gentagen eksponering. Vurderingen af 
karcinogenicitet bør udføres, når indledende informationer om toksicitet er
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
indhentet fra 28-dages eller 90-dages toksicitetstest med gentagen dosering. 
Kortvarige test med cancerinitiering-/fremme kan også give nyttige oplys ­
ninger. Det bør overvejes at benytte en faseinddelt testtilgang til karcinoge ­
nicitetstest som et led i den overordnede vurdering af de potentielle sund ­
hedsskadelige virkninger af et bestemt testkemikalie (16) (17) (18) (19).  
9. De statistiske metoder, der i betragtning af forsøgsdesignet og -formålene er 
mest relevante til analyse af resultater, fastlægges, inden forsøget påbegyn ­
des. Det skal bl.a. overvejes, om statistikkerne skal omfatte justering for overlevelse, analyse af kumulative tumorrisici i forhold til overlevelsesvarig ­
hed, analyse af tid til tumor og analyse i tilfælde af afslutning af en eller 
flere grupper før tid. Vejledning om relevante statistiske analyser og nøgle ­
referencer til internationalt anerkendte statistiske metoder findes i Guidance Document No. 116 (7) og Guidance Document No. 35 (20).
 
10. Når et karcinogenicitetsforsøg gennemføres, skal de vejledende principper 
og overvejelser, der er beskrevet i OECD Guidance Document No. 19 (21), 
navnlig afsnit 62, altid følges. I det afsnit anføres følgende: »I forsøg, der omfatter gentagen dosering, hvor et dyr udviser kliniske tegn, som er progressive og fører til yderligere forværring, træffes der en informeret 
beslutning om, hvorvidt dyret skal aflives. Beslutningen bør baseres på en 
overvejelse af værdien af de oplysninger, der kan indhentes, hvis dyret beholdes i forsøget, i forhold til dets generelle tilstand. Hvis det besluttes at beholde dyret i forsøget, øges frekvensen af observationer efter behov. 
Uden at påvirke testens formål kan det også være muligt midlertidigt at 
stoppe doseringen, hvis det letter dyrets smerte eller lidelse, eller at reducere testdosis«.
 
11. Detaljeret vejledning om og diskussion af principperne for dosisvalg i forsøg 
vedrørende kronisk toksicitet og karcinogenicitet findes i Guidance Docu ­
ment No. 116 (7) og to publikationer fra International Life Sciences Institute (22) (23). Den centrale strategi for dosisvalg afhænger af forsøgets primære mål (afsnit 6). Ved valg af hensigtsmæssige dosisniveauer skal der sikres en 
balance mellem på den ene side farescreening og på den anden side karak ­
terisering af lavdosisrespons og deres relevans. Dette er især relevant, hvis der gennemføres et kombineret forsøg vedrørende kronisk toksicitet og karcinogenicitet (kapitel B.33 i dette bilag) (afsnit 12).
 
12. Det bør overvejes at udføre et kombineret forsøg vedrørende både kronisk 
toksicitet og karcinogenicitet (kapitel B.33 i dette bilag) i stedet for at udføre 
et separat forsøg vedrørende kronisk toksicitet (kapitel B.30 i dette bilag) og et separat karcinogenicitetsforsøg (denne testmetode B.32). Den kombine ­
rede test sparer både tid og omkostninger i forhold til gennemførelsen af to 
separate forsøg, uden at det kompromitterer kvaliteten af data i den kroniske 
fase eller fasen vedrørende karcinogenicitet. Principperne for dosisvalg (afsnit 11 og 22-25) bør dog overvejes nøje ved gennemførelsen af et kombineret forsøg vedrørende både kronisk toksicitet og karcinogenicitet 
(kapitel B.33 i dette bilag), og det anerkendes også, at separate forsøg 
kan være nødvendige for at overholde visse lovgivningsbestemmelser.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i 
slutningen af dette kapitel og i Guidance Document No. 116 (7).  
TESTENS PRINCIP  
14. Testkemikaliet administreres normalt oralt dagligt i forskellige doser til 
forskellige grupper af forsøgsdyr i størstedelen af deres levetid. Test ved inhalation eller dermal applikation også kan anvendes. Dyrene observeres nøje for tegn på toksicitet og for udvikling af neoplastiske læsioner. Dyr, der 
dør eller aflives under forsøget, obduceres, og de overlevende dyr aflives og 
obduceres ved forsøgets afslutning.
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
15. Denne testmetode omfatter primært vurdering og evaluering af karcinogeni ­
citet hos gnavere (afsnit 2). Brugen af ikke-gnavere kan overvejes, hvis de tilgængelige data viser, at de er mere relevante for forudsigelsen af sund ­
hedsvirkningerne hos mennesker. Valget af dyreart skal begrundes. Den 
foretrukne gnaverart er rotten, men andre gnaverarter, f.eks. mus, kan anven ­
des. Selv om anvendelsen af mus i karcinogenicitetstest oftest er af begrænset nytte (24) (25) (26), kræves forsøg på mus stadig i henhold til visse lovgivningsbestemmelser, medmindre det påvises, at et sådant forsøg 
ikke er videnskabeligt nødvendigt. Rotter og mus er de foretrukne forsøgs ­
modeller på grund af deres relativt korte levetid, deres udbredte anvendelse i farmakologiske og toksikologiske forsøg, deres modtagelighed for tumorin ­
duktion og tilgængeligheden af tilstrækkeligt karakteriserede stammer. Som 
følge af disse karakteristika findes der en stor mængde data om deres 
fysiologi og patologi. Yderligere oplysninger om valg af dyreart og -stamme findes i OECD Guidance Document No. 116 (7).
 
16. Der anvendes unge raske dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. 
Karcinogenicitetsforsøget bør gennemføres på dyr af samme stamme og herkomst som de dyr, der blev anvendt i forforsøgene af kortere varighed. Hvis det vides, at dyr af denne stamme og herkomst giver problemer med at 
opfylde de accepterede kriterier for overlevelse i langvarige forsøg [se 
Guidance Document No. 116 (7)], bør det overvejes at bruge en stamme, der har en acceptabel overlevelsesfrekvens, til det langvarige forsøg. Hundy ­
rene må ikke have født og må ikke være drægtige.
 
Opbevaring og fodring  
17. Dyrene kan anbringes enkeltvis eller i bure med små grupper af samme køn. 
Enkeltvis anbringelse bør kun anvendes, hvis det er videnskabeligt 
begrundet (27) (28) (29). Burene bør anbringes på en sådan måde, at deres placering får mindst mulig indvirkning. Temperaturen i forsøgsdyr ­
rummet skal være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed skal være 
mindst 30 % og ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, 
men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. Foderet skal opfylde alle 
de ernæringskrav, som den pågældende art af forsøgsdyr stiller, og indholdet 
af forureninger i foderet, herunder, men ikke begrænset til pesticidrester,
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
persistente organiske miljøgifte, fytoøstrogener, tungmetaller og mycotoksi ­
ner, der kan påvirke testresultatet, skal være så lavt som muligt. Analytiske 
oplysninger om ernæring og koncentration af forurenende stoffer i foderet genereres periodisk, som minimum i begyndelsen af forsøget og derefter, når der sker ændringer i det anvendte parti, og de registreres i den endelige 
rapport. Analytiske oplysninger om det anvendte drikkevand i forsøget bør 
også anføres. Ved valg af foder kan der tages hensyn til nødvendigheden af at sikre passende iblanding af testkemikaliet og opfylde dyrenes ernærings ­
behov, når denne administrationsmåde anvendes.
 
Forberedelse af dyrene  
18. Der anvendes raske dyr, som er akklimatiseret til laboratoriemiljøet i mindst 
syv døgn og ikke tidligere er indgået i forsøg. Hvis der anvendes gnavere, bør doseringen indledes snarest efter fravænning og akklimatisering, og helst 
inden dyrene er otte uger gamle. Forsøgsdyrene skal være karakteriseret med 
hensyn til art, stamme, oprindelse, køn, vægt og alder. Ved forsøgets begyn ­
delse skal vægtvariationen for hvert køn af det anvendte dyr være mindst 
mulig og må for hvert køn ikke overstige ± 20 % af gennemsnitsvægten for 
alle dyr i forsøget. Dyrene randomiseres til henholdsvis kontrol og behand ­
lingsgruppe. Efter randomisering bør der for hvert køn ikke være signifi ­
kante forskelle i den gennemsnitlige kropsvægt mellem grupperne. Hvis der 
er statistisk signifikante forskelle, gentages randomiseringstrinnet, hvis det er 
muligt. Hvert dyr tildeles et unikt identifikationsnummer og mærkes perma ­
nent med dette nummer ved hjælp af tatovering, mikrochipimplantation eller anden egnet metode.
 
FREMGANGSMÅDE  
Dyrenes antal og køn  
19. Begge køn anvendes. Der anvendes et antal dyr, der sikrer, at der kan fore ­
tages en grundig biologisk og statistisk evaluering. Hver dosisgruppe og samtidig kontrolgruppe skal derfor bestå af mindst 50 dyr af hvert køn. Afhængigt af formålet med forsøget kan den statistiske styrke af nøgleesti ­
mater forøges ved differentielt og ulige at tildele dyr til de forskellige dosis ­
grupper, idet der tildeles mere end 50 dyr til lavdosisgrupperne, f.eks. for at skønnedet karcinogene potentiale ved lave doser. Det skal dog anerkendes, at en moderat forøgelse af gruppestørrelsen kun vil give en forholdsvis lille 
forøgelse af forsøgets statistiske styrke. Yderligere oplysninger om forsøgets 
statistiske design og valg af dosisniveauer med henblik på at maksimere den statistiske styrke findes i Guidance Document No. 116 (7).
 
Reserve til aflivninger under forsøget og satellitgrupper (sentineldyr)  
20. Forsøget kan omfatte reserver til aflivninger under forsøget, f.eks. ved 12 
måneder, for at fremskaffe oplysninger om progression af neoplastiske forandringer og mekanistisk information, hvis det er videnskabeligt begrun ­
det. Hvis sådanne oplysninger allerede er tilgængelige fra tidligere toksici ­
tetsforsøg med gentagen dosering vedrørende testkemikaliet, er aflivninger under forsøget muligvis ikke videnskabeligt begrundet. Hvis aflivninger under forsøget indgår i forsøgsdesignet, skal antallet af dyr i hver dosis ­
gruppe, som planlægges aflivet under forsøget, normalt være 10 dyr pr. køn, 
og det samlede antal dyr i forsøgsdesignet forøges med det antal dyr, der planlægges aflivet inden forsøgets afslutning. En yderligere gruppe af senti ­
neldyr (typisk 5 dyr pr. køn) kan om nødvendigt også inkluderes med 
henblik på overvågning af sygdomsstatus i løbet af forsøget (30). 
Nærmere detaljer findes i Guidance Document No. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Dosisgrupper og dosering  
21. Vejledning om alle aspekter af dosisvalg og intervaller mellem dosis ­
niveauer findes i Guidance Document No. 116 (7). Der skal være mindst tre dosisgrupper og en sideløbende kontrolgruppe. Dosisniveauer baseres 
generelt på resultaterne af forsøg med gentagen dosis af kortere varighed 
eller dosisbestemmende forsøg (»range finding«) og skal tage hensyn til kendte toksikologiske og toksokinetiske data for testkemikaliet eller tilsva ­
rende kemikalier.
 
22. Medmindre der optræder begrænsninger som følge af testkemikaliets 
fysisk-kemiske tilstand eller biologiske egenskaber, vælges det højeste dosis ­
niveau, som gør det muligt at identificere de primære målorganer og samtidig undgå lidelse, svære toksiske virkninger, morbiditet eller død. Under hensyntagen til de faktorer, der er anført i afsnit 23, vælges 
normalt det højeste dosisniveau, der fremkalder toksicitetstegn f.eks. en 
formindskelse af kropsvægten (mindre end 10 %). Afhængigt af forsøgets formål (se afsnit 6) kan der dog vælges en højeste dosis, der er lavere end den dosis, der fremkalder toksicitetstegn, f.eks. hvis en dosis fremkalder en  
negativ virkning,  som giver anledning til bekymring, men alligevel har ringe 
indvirkning på levetid eller kropsvægt .
 
23. Dosisniveauer og dosisintervaller kan vælges, så der fastlægges et forhold 
mellem dosis og respons og, afhængigt af testkemikaliets virkningsmåde, en NOAEL eller et andet ønsket resultat af forsøget, f.eks. en BMD (se afsnit 
25) på det laveste dosisniveau. Faktorer, der skal tages i overvejelse ved 
fastlæggelsen af de laveste doser, omfatter dosis-responskurvens forventede hældning, de doser, hvor der kan forekomme vigtige forandringer i meta ­
bolismen, eller den toksiske virkning, hvor en tærskel forventes, eller hvor 
et udgangspunkt for lavdosisekstrapolation forventes.
 
24. Det valgte dosisinterval afhænger af testkemikaliets karakteristika og kan 
ikke beskrives i denne testmetode, men to- til firedobbelte intervaller er ofte 
bedst til fastlæggelse af faldende dosisstørrelser, og tilføjelse af en fjerde testgruppe er ofte at foretrække frem for brug af meget store intervaller 
(f.eks. mere end en faktor på 6-10) mellem dosisstørrelserne. Faktorer på 
mere end 10 bør generelt undgås og skal i givet fald begrundes.
 
25. Som beskrevet i Guidance Document No. 116 (7) skal følgende bl.a. over ­
vejes i forbindelse med dosisvalg:  
— kendte eller mistænkte ikke-lineariteter eller inflektionspunkter i 
dosis-respons  
— toksikokinetik og dosisintervaller, hvor metabolisk induktion, mætning 
eller ikke-linearitet mellem eksterne og interne doser forekommer eller ikke forekommer
 
— præcursorlæsioner, virkningsmarkører eller indikatorer for underliggende 
biologiske nøgleprocessers virkning  
— vigtige (eller mistænkte) aspekter af virkningsmåde, som f.eks. dosis, 
hvorved cytotoksicitet begynder at stige, hormonniveauer forstyrres, 
homøstatiske mekanismer belastes osv.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— områder af dosis-responskurven, hvor der kræves særlig robust estime ­
ring, f.eks. i intervaller for den forventede BMD eller en mistænkt 
tærskel  
— overvejelse af forventede eksponeringsniveauer for mennesker.  
26. Kontrolgruppen skal være ubehandlet eller behandles med vehikel, hvis et 
sådant anvendes til administration af testkemikaliet. Bortset fra behandling 
med testkemikaliet skal dyrene i kontrolgruppen håndteres på samme måde 
som dyrene i testgrupperne. Hvis der anvendes et vehikel, doseres kontrol ­
gruppen med vehiklet i det største anvendte volumen blandt dosisgrupperne. Hvis et testkemikalie administreret i foderet medfører væsentligt reduceret 
fødeindtagelse på grund af foderets dårligere smag, kan det være nyttigt med 
en kontrolgruppe, der parallelfodres.
 
Fremstilling af doser og administration af testkemikalie  
27. Testkemikaliet indgives normalt oralt via foderet eller drikkevandet eller 
gennem sonde. Yderligere oplysninger om administrationsveje og -metoder 
findes i OECD Guidance Document No. 116 (7). Valget af administra ­
tionsvej og -metode afhænger af formålet med forsøget, testkemikaliets fysisk-kemiske karakteristika, dets biotilgængelighed og den måde, hvorpå mennesker primært eksponeres for testkemikaliet. Der gives en begrundelse 
for den valgte administrationsvej og -metode. Af hensyn til dyrevelfærden 
bør oral sonde kun anvendes i forbindelse med stoffer, for hvilke denne administrationsvej og -metode med rimelighed repræsenterer en potentiel eksponeringsmåde for mennesker (f.eks. lægemidler). I forbindelse med 
kemikalier, der bruges i fødevarer eller miljøet, administreres testkemikaliet 
typisk via foderet eller drikkevandet. I nogle scenarier, f.eks. erhvervs ­
mæssig eksponering, kan andre administrationsveje være mere hensigtsmæs ­
sige.
 
28. Om nødvendigt opløses eller opslæmmes testkemikaliet i et egnet vehikel. 
For vehiklet og andre tilsætningsstoffer skal følgende karakteristika tages i 
betragtning: dets effekt på testkemikaliets absorption, fordeling, metabolisme 
og retention, dets indvirkning på testkemikaliets kemiske egenskaber med deraf følgende ændring af dettes toksiske egenskaber, og dets indvirkning på dyrenes føde- og vandindtagelse og ernæringstilstand. Det anbefales, at man 
som første valg vurderer muligheden af at benytte en vandig opløsning/sus ­
pension, derefter en opløsning/suspension i olie (f.eks. majsolie) og først derefter eventuel opløsning i andre vehikler. For andre vehikler end vand bør vehiklets toksiske egenskaber være kendt. Der bør forefindes oplys ­
ninger om testkemikaliets stabilitet og homogeniteten af doseringsopløs ­
ninger eller foder (hvis det er relevant) ved den anvendte administrations ­
form (f.eks. gennem foder).
 
29. For testkemikalier, som administreres i foderet eller drikkevandet, er det 
vigtigt at sikre, at det pågældende testkemikalie i den anvendte mængde ikke griber ind i den normale ernærings- eller vandbalance. I langvarige toksicitetsforsøg med administration via foderet må testkemikaliets koncen ­
tration i foderet normalt ikke overstige en øvre grænse på 5 % af den 
samlede fodermængde for at undgå ernæringsmæssige ubalancer. Når test ­
kemikaliet administreres i foderet, kan det administreres som en konstant koncentration i foderet (mg/kg foder eller ppm) eller som en konstant dosis ­
størrelse i forhold til dyrets kropsvægt (mg/kg kropsvægt) beregnet ugent ­
ligt. Det anvendte alternativ anføres.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Ved oral administration gives testkemikaliet dagligt til dyrene (7 dage om 
ugen) normalt i en periode på 24 måneder (se også afsnit 32). Ethvert andet 
dosisregime, f.eks. fem gange ugentlig, skal begrundes. Ved dermal appli ­
kation behandles dyrene normalt med testkemikaliet i mindst seks timer om dagen, syv dage om ugen, som beskrevet i kapitel B.9 i dette bilag (11), i en 
periode på 24 måneder. Eksponering ved inhalation gennemføres seks timer 
om dagen, syv dage om ugen, men eksponering fem dage om ugen kan anvendes, hvis det begrundes. Eksponeringen varer normalt 24 måneder. Hvis andre gnaverarter end rotter eksponeres gennem næsen, kan de maksi ­
male eksponeringsvarigheder justeres for at minimere artsspecifikke lidelser. 
Der bør gives en begrundelse, når der anvendes en eksponeringsvarighed på mindre end seks timer om dagen. Se også kapitel B.8 i dette bilag (9).
 
31. Hvis testkemikaliet indgives med sonde, skal det gøres i en enkelt dosis, 
med anvendelse af en mavesonde eller et passende intubationsrør på samme 
tidspunkt hver dag. Normalt administreres én dosis en gang dagligt. Hvis et kemikalie f.eks. er et lokalirriterende stof, kan den daglige dosis dog admi ­
nistreres som en deldosis (to gange om dagen). Den maksimale væske ­
mængde, som kan administreres ad gangen, afhænger af forsøgsdyrets stør ­
relse. Volumenet skal være så lavt som praktisk muligt og må normalt ikke overstige 1 ml/100 g kropsvægt for gnavere (31). Variationer i testvolumen skal minimeres ved at justere koncentrationerne, så der sikres et konstant 
volumen ved alle dosisniveauer. Dette gælder dog ikke potentielt ætsende 
eller irriterende kemikalier, som skal fortyndes for at undgå alvorlige lokale virkninger. Test ved koncentrationer, der sandsynligvis kan være ætsende eller irriterende for mave-tarmkanalen bør undgås.
 
Forsøgets varighed  
32. Varigheden af forsøget er normalt 24 måneder for gnavere, dvs. størstedelen 
af de anvendte dyrs levetid. Der kan anvendes kortere eller længere forsøgs ­
varigheder afhængigt af levetiden for den stamme af dyr, der anvendes i forsøget, men varigheden skal begrundes. For bestemte stammer af mus, f.eks. AKR/J, C3H/J eller C57BL/6J, kan en varighed på 18 måneder 
være mere hensigtsmæssig. I det følgende gives der oplysninger om forsøgs ­
varighed, afbrydelse af forsøget og overlevelse. Yderligere vejledning, herunder overvejelse af, om negativ karcinogenicitet kan accepteres i forhold til overlevelse i forsøget, findes i OECD Guidance Document No. 
116 (7).
 
— Afbrydelse af forsøget skal overvejes, når antallet af overlevende i de 
laveste dosisgrupper eller kontrolgrupper falder til under 25 %.  
— Hvis kun gruppen med den højeste dosis dør før tiden på grund af 
toksicitet, bør det ikke medføre afbrydelse af forsøget.  
— Overlevelse vurderes separat for hvert køn.  
— Forsøget bør ikke forlænges ud over det punkt, hvor dataene fra forsøget 
ikke længere er tilstrækkelige til at understøtte en statistisk gyldig 
evaluering.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
OBSERVATIONER  
33. Alle dyr kontrolleres for morbiditet eller mortalitet, normalt morgen og 
aften, alle ugens dage. Dyrene kontrolleres desuden en gang om dagen for specifikke tegn af toksikologisk relevans, idet man tager i betragtning, 
hvornår maksimal effekt kan forventes efter sondeindgift. Særlig opmærk ­
somhed rettes mod udviklingen af tumorer, og på tidspunktet for den første tumordannelse registreres lokalisering, dimensioner, fremtræden og progres ­
sion af hver makroskopisk synlig eller palpabel tumor.
 
Kropsvægt, foder-/vandindtagelse og foderudnyttelse  
34. Alle dyr vejes ved begyndelsen af behandlingen, mindst én gang om ugen i 
de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden. Foderindtagelse 
og -udnyttelse måles mindst én gang om ugen i de første 13 uger og derefter 
mindst én gang om måneden. Vandindtagelse måles mindst én gang om ugen i de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden, når testkemikaliet administreres i vandet. Måling af vandindtagelse bør også 
overvejes i forsøg, hvor drikkeaktiviteten ændres.
 
Hæmatologiske, klinisk-biokemiske og patologiske undersøgelser  
35. For at udlede flest mulige informationer fra forsøget, især med hensyn til 
virkningsmåde, kan blodprøver efter forsøgslederens vurdering udtages med 
henblik på hæmatologiske og klinisk-biokemiske undersøgelser. Urinanalyse kan også være relevant. Yderligere vejledning om fordelene ved at udtage sådanne prøver i forbindelse med karcinogenicitetsforsøg findes i Guidance 
Document No. 116 (7). Hvis det vurderes at være relevant, kan blodprøver 
udtages med henblik på hæmatologiske og klinisk-biokemiske undersøgelser udtagning og urinanalyse som en del af aflivningen under forsøget (afsnit 20) og ved forsøgsafslutning på mindst 10 dyr pr. køn pr. gruppe. Blod ­
prøver udtages fra et udpeget sted, f.eks. ved hjertepunktur eller fra 
retro-orbital sinus, under bedøvelse og opbevares under hensigtsmæssige forhold. Blodsmears kan også forberedes til undersøgelse, navnlig hvis knoglemarv tilsyneladende er målorganet, selv om der ikke er enighed om 
værdien af en sådan undersøgelse i forbindelse med vurderingen af karci ­
nogent/onkogent potentiale (32).
 
PATOLOGI  
Makroskopisk obduktion  
36. Alle dyr, som indgår i forsøget, skal med undtagelse af sentineldyr (se afsnit 
20) og andre satellitdyr have udført en fuldstændig, detaljeret makroskopisk 
obduktion, hvilket inkluderer omhyggelig undersøgelse af alle overflader, 
alle åbninger samt kraniets, brystkassens og abdomens kaviteter og deres indhold. Sentineldyr og andre satellitdyr skal evt. obduceres, men det afgøres af forsøgslederen i hvert enkelt tilfælde. Organvægt indgår 
normalt ikke i karcinogenicitetsforsøg, da geriatriske forandringer og i 
senere faser udviklingen af tumorer konfunderer anvendeligheden af data om organvægt. Organvægt kan dog være vigtig til at udføre en weight of evidence-evaluering og overvejelser vedrørende virkningsmåde. Hvis organ ­
vægt indgår i et satellitforsøg, registreres værdierne senest et år efter 
forsøgsstart.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Følgende væv skal præserveres ved hjælp af det mest passende fikserings ­
middel både med henblik på vævstypen og den følgende histopatologiske 
undersøgelse (se afsnit 33) (væv i kantet parentes er valgfrit): 
Alle større læsioner Hjerte Bugspytkirtel Mavesæk (formave, kirtel ­
mave) 
Binyrer Ileum Biskjoldbruskkirtel [Tænder] Aorta Jejunum Perifer nerve Testikler 
Hjerne (herunder udsnit af 
cerebrum, cerebellum og 
medulla/pons) Nyre Hypofyse Brisler 
Cæcum Tårekirtel (ekstraorbital) Prostata Skjoldbruskkirtel 
Cervix Lever Rectum [Tunge] 
Prostata anterior Lunge Spytkirtel Luftrør Tyktarm Lymfeknuder (både 
overfladiske og dybe) Vesiculae seminales Urinblære 
Duodenum Brystkirtel (obligatorisk 
for hundyr og, hvis de er synligt dissekerbare, for handyr) Skeletmuskel Uterus med cervix 
Epididymis [Øvre luftveje, herunder 
næse, muslingeben og 
paranasale sinusser] Hud [Ureter] 
Øje (herunder retina) Øsofagus Rygmarv (på tre 
niveauer: (cervikal, 
midt-torakal og lumbal) [Urethra] 
[Femur med led] [Bulbus olfactorius] Milt Vagina 
Galdeblære (for andre arter 
end rotte) Æggestok [Sternum] Sektion af knoglemarven og/ 
eller frisk knoglemarvsaspirat 
Harderian-kirtel
 
I tilfælde af parrede organer, f.eks. nyrer og binyrer, præserveres begge 
organer. Kliniske og andre fund kan foranledige undersøgelse af andet 
væv. Også særlige organer, der sandsynligvis kan være mål for testkemika ­
liets kendte virkninger, bør præserveres. I forsøg, der omfatter dermal appli ­
kation, skal de organer, der er opført på listen over organer til præservation 
ved oral administration, præserveres, og specifik prøvetagning og præserva ­
tion af huden fra applikationsstedet skal foretages. I inhalationsforsøg skal listen over væv, der skal præserveres og undersøges fra luftvejene, følge anbefalingerne i kapitel B.8 og B.29 i dette bilag. For andre organer/væv 
(og i tillæg til de væv, der specifikt er præserveret fra luftvejene) skal de 
organer, der er anført for oral administration, undersøges.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatologi  
38. Der foreligger vejledning om bedste praksis i forbindelse med gennem ­
førelsen af toksikologiske patologiforsøg (33). Følgende væv skal som minimum undersøges:
 
— alle væv fra højdosis- og kontrolgruppen  
— alle væv fra dyr, som er døde eller aflivet under forsøget  
— alle væv, som udviser makroskopiske abnormiteter, herunder tumorer  
— når behandlingsrelaterede histopatologiske forandringer observeres i 
højdosisgruppen, undersøges disse væv fra alle dyr i alle andre dosis ­
grupper  
— i tilfælde af parrede organer, f.eks. nyrer og binyrer, præserveres begge 
organer.  
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
39. Der skal fremlægges data for de enkelte dyr for alle evaluerede parametre. 
Yderligere skal alle data opsummeres i tabeller, der for hver testgruppe viser 
antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr fundne døde i løbet af testen eller aflivede af humane grunde og tidspunktet for deres død, det antal dyr, der udviser tegn på toksicitet, en beskrivelse af disse tegn, inklusive tids ­
punktet for deres begyndelse, deres varighed og toksicitetsgraden; det antal 
dyr, der har læsioner, typen af læsioner og den procentdel af dyrene, der udviser de forskellige typer af læsion. I oversigtstabeller anføres middel- og standardafvigelser (for kontinuerlige testdata) for dyr, der udviser toksiske 
virkninger eller læsioner, samt gradueringen af læsioner.
 
40. Historiske kontroldata kan være værdifulde i forbindelse med fortolkningen 
af forsøgsresultaterne, f.eks. hvis der er tegn på, at data fra de samtidige 
kontroller er væsentligt afvigende i forhold til nylige data fra kontroldyr fra 
samme forsøgslaboratorium/koloni. Historiske kontroldata, som evalueres, bør indgives fra samme laboratorium og vedrøre dyr af samme alder og stamme genereret i de fem år forud for det aktuelle forsøg.
 
41. Hvor det er muligt, skal tallene evalueres ved hjælp af en passende og 
accepteret statistisk metode. Den statistiske metode og de data, der skal analyseres med den, skal vælges under planlægningen af forsøget (se 
afsnit 9). Ved udvælgelse bør der tages behov for evt. justeringer for over ­
levelse.
 
Testrapport  
42. Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:  
Testkemikalie:  
— fysiske egenskaber, renhedsgrad og fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikationsdata  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— testkemikaliets kilde  
— batchnummer  
— certifikat for kemisk analyse.  
For eventuelt vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.  
For forsøgsdyrene:  
— anvendt art/stamme og begrundelse for anvendelse  
— dyrenes antal, alder og køn ved forsøgsstart  
— herkomst, miljøbetingelser, kost osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  
Testbetingelser:  
— begrundelse for valg af administrationsvej og dosis  
— de statistiske metoder, der er anvendt til dataanalyse, hvis relevant  
— oplysninger om formuleringen af testkemikalie/fodertilberedning  
— analysedata om opnået koncentration, stabilitet og homogenitet for 
tilberedningen  
— administrationsvej og nærmere oplysninger om administrationen af test ­
kemikaliet  
— eksponering gennem næsen og helkropseksponering for inhalations ­
forsøg  
— faktiske doser (mg/kg kropsvægt/dag) og omregningsfaktor fra testkemi ­
kaliets koncentration i foder/vand (mg/kg eller ppm) til faktisk dosis, hvis muligt
 
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet.  
Resultater (opsummerende data og data for individuelle dyr opstilles i tabel ­
form)  
Generelt  
— data om overlevelse  
— kropsvægt og ændringer i kropsvægt  
— foderindtagelse, evt. beregning af foderudnyttelse og indtagelse af vand 
(hvis relevant)  
— toksikokinetiske data (hvis de forefindes)  
— oftalmoskopi (hvis tilgængelig)  
— hæmatologi (hvis tilgængelig)  
— klinisk kemi (hvis tilgængelig).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Kliniske fund  
— tegn på toksicitet  
— incidens (og sværhedsgrad, hvis de er vurderet) af abnormiteter  
— art, sværhedsgrad og varighed af kliniske symptomer (hvad enten disse 
er forbigående eller permanente).  
Obduktionsdata  
— kropsvægt ved forsøgets slutning  
— organvægt og deres forhold, hvis relevant  
— obduktionsfund; incidens og sværhedsgrad af abnormiteter.  
Histopatologi  
— ikkeneoplastiske histopatologiske fund  
— neoplastiske histopatologiske fund  
— korrelation mellem makroskopiske og mikroskopiske fund  
— detaljeret beskrivelse af alle behandlingsrelaterede histopatologiske fund, 
herunder sværhedsgrader  
— rapport om peer review af objektglas.  
Evt. statistisk behandling af resultaterne  
Diskussioner af resultater, herunder:  
— diskussion af tilgange til modellering  
— dosis-responsforhold  
— historiske kontroldata  
— overvejelse af oplysninger om virkningsmåde  
— bestemmelse af BMD, NOAEL eller LOAEL  
— relevans for mennesker.  
Konklusioner  
LITTERATUR:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rom, 1995), internt arbejds ­
dokument, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) Kapitel B.27 i dette bilag, Subkronisk oral toksicitetstest — et 90-dages 
forsøg over gentagne orale dosers toksicitet på ikke-gnavere.  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 og 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
findes på OECD's offentlige websted for Test Guidelines på www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
(9) Kapitel B.8 i dette bilag, Subakut toksicitet (inhalation): 28-dages forsøg  
(10) Kapitel B.29 i dette bilag, Subkronisk toksicitet (inhalation): 90-dages 
forsøg  
(11) Kapitel B.9 i dette bilag, Toksicitet ved gentagen dosering (28 dage, 
dermal).  
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 
36:793-801.  
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE og Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.  
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.  
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on 
Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human 
Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.  
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. The Acquisition and Application 
of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in 
Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 
36: 9-35.  
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69-98.  
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, 
Paris.  
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in 
Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 
837.
 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC.  
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN og Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
(25) Usui T, Griffiths SA og Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. I D'Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen's University Press, Belfast. s. 279-284.
 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
 
(27) Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 
om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (EUT L 276 af 20.10.2010, s. 33).
 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of 
Health and Human Services.  
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of 
Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. A good practice guide to the administration of substances and 
removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxi ­
cology 21:15-23.
 
(32) Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  KOMBINERET FORSØG VEDRØRENDE KARCINOGENICITET/ 
KRONISK TOKSICITET  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 453 (2009). Den 
oprindelige TG 453 blev vedtaget i 1981. Denne opdaterede testmetode 
B.33 blev udviklet for at tage højde for den seneste udvikling på området for dyrevelfærd og lovgivningskrav (1) (2) (3) (4) (5). Denne testmetode B.33 er opdateret parallelt med revisionen af kapitel B.32 i dette bilag 
(Karcinogenicitetsforsøg) og kapitel B.30 i dette bilag (Forsøg vedrørende 
kronisk toksicitet) med det formål at fremskaffe yderligere oplysninger fra de dyr, der bruges i forsøget, og flere oplysninger om dosisvalg. Denne testmetode er designet, så den kan bruges til test af en bred vifte af kemi ­
kalier, herunder pesticider og industrikemikalier. Det skal dog bemærkes, at 
andre oplysninger og krav kan være gældende for lægemidler (se Inter ­
national Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals).
 
2. De fleste forsøg vedrørende kronisk toksicitet og karcinogenicitet gennem ­
føres ved hjælp af gnaverarter, og det er derfor hensigten, at denne testme ­
tode primært anvendes i forsøg på sådanne arter. Hvis sådanne forsøg er 
nødvendige på ikke-gnavere, kan testmetodens principper og fremgangs ­
måder anvendes sammen med de principper og fremgangsmåder, der er beskrevet i kapitel B.27 i dette bilag (Subkronisk oral toksicitetstest — et 
90-dages forsøg over gentagne orale dosers toksicitet på ikke-gnavere (6), 
med de nødvendige ændringer som beskrevet i OECD Guidance Document No. 116 (7).
 
3. De tre primære administrationsveje i forsøg vedrørende kronisk toksicitet/ 
karcinogenicitet er oral indgift, dermal applikation og inhalation. Valget af administrationsvej afhænger af testkemikaliets fysisk-kemiske karakteristika og den måde, hvorpå mennesker primært eksponeres for testkemikaliet. 
Yderligere oplysninger om valg af administrationsvej findes i Guidance 
Document No. 116 (7).
 
4. Denne testmetode fokuserer på oral eksponering, den administrationsvej, der 
oftest bruges i forsøg vedrørende kronisk toksicitet og karcinogenicitet. Langvarige forsøg, der involverer eksponering via inhalation eller dermal applikation, kan også være nødvendige i forbindelse med vurdering af risici 
for menneskers sundhed og/eller påkrævet i medfør af lovgivningen, men 
betydelig teknisk kompleksitet er forbundet med begge eksponeringsveje. Sådanne forsøg skal designes i hvert enkelt tilfælde, selv om den testme ­
tode, der er beskrevet her til vurdering og evaluering af kronisk toksicitet og 
karcinogenicitet ved oral administration, kan bruges som udgangspunkt for 
en protokol for inhalationsforsøg og/eller dermale forsøg, hvad angår anbe ­
falinger vedrørende behandlingsperioder, kliniske og patologiske parametre osv. Der findes OECD-vejledninger om administration af testkemikalier ved 
hjælp af inhalation (7) (8) og dermal applikation (7). Kapitel B.8 i dette 
bilag (9) og kapitel B.29 i dette bilag (10) bør sammen med OECD Guidance Document on Acute Inhalation Testing (8) specifikt anvendes ved design af forsøg med længere varighed, der involverer eksponering 
via inhalation. Kapitel B.9 i dette bilag (11) anvendes, hvis forsøget 
vedrører dermal applikation.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Det kombinerede forsøg vedrørende karcinogenicitet/kronisk toksicitet 
skaffer viden om mulige sundhedsfarer, som kan opstå ved gentagen 
eksponering i løbet af en periode, der kan vare de anvendte arters levetid. Forsøget tilvejebringer oplysninger om de toksiske virkninger af testkemi ­
kaliet, herunder potentiel karcinogenicitet, og kan pege på, hvilke organer 
der rammes, og muligheden for akkumulation. Det kan også give et estimat 
af niveauet uden observerbare negative effekter (NOAEL) og, i tilfælde af ikke-genotoksiske karcinogener, af tumorrespons, som kan anvendes ved fastsættelse af sikkerhedskriterier for menneskers eksponering. Nødvendig ­
heden af omhyggelig klinisk observation af dyrene for at opnå størst mulig 
viden bliver ligeledes understreget.
 
6. De forsøgsformål, der er omfattet af denne testmetode, omfatter:  
— identifikation af et testkemikalies karcinogene egenskaber, der fører til 
en øget incidens af neoplasmer, øget andel af ondartede neoplasmer eller en reduktion i tiden til forekomsten af neoplasmer sammenlignet med 
samtidige kontrolgrupper
 
— identifikation af tid til fremkomst af neoplasmer  
— identifikation af et testkemikalies kroniske toksicitet  
— identifikation af målorganer for kronisk toksicitet og karcinogenicitet  
— karakterisering af forholdet mellem dosis og virkning  
— identifikation af NOAEL eller udgangspunkt for fastlæggelse af 
benchmark-dosis (BMD)  
— ekstrapolering af karcinogene virkninger til eksponeringsniveauer for 
mennesker ved lav dosis  
— forudsigelse af kroniske toksicitetsvirkninger på niveauer for menne ­
skelig eksponering  
— data til testhypoteser vedrørende virkningsmåde (2) (7) (12) (13) (14) 
(15).  
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
7. Ved vurderingen og evalueringen af den potentielle karcinogenicitet og 
kroniske toksicitet af et testkemikalie inddrages alle tilgængelige infor ­
mationer om testkemikaliet af testlaboratoriet inden gennemførelsen af forsøget, således at forsøget fokuseres på effektiv test af potentialet for dets toksikologiske egenskaber, og således at omfanget af dyreforsøg mini ­
meres. Information om og overvejelse af virkningsmåden for et mistænkt 
karcinogen (2) (7) (12) (13) (14) (15) er særlig vigtig, fordi det optimale design kan variere, afhængigt af om testkemikaliet er et kendt eller mistænkt genotoksisk karcinogen. Yderligere vejledning om overvejelser vedrørende 
virkningsmåde findes i Guidance Document No. 116 (7).
 
8. Informationer, der kan hjælpe med at fastlægge forsøgsdesignet, omfatter 
testkemikaliets identitet, kemiske struktur og fysisk-kemiske egenskaber, 
evt. oplysninger om virkningsmåde, resultater af in vitro- eller in 
vivo-toksicitetstest, herunder genotoksicitetstest, forventede anvendelser og potentialet for human eksponering, tilgængelige (Q)SAR-data, data om mutagenicitet/genotoksicitet og toksikologiske data vedrørende strukturelt 
relaterede kemikalier, tilgængelige toksikokinetiske data (kinetiske data 
ved enkelt og gentagen eksponering) samt data udledt af andre forsøg
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
med gentagen eksponering. Bestemmelsen af kronisk toksicitet/karcinogeni ­
citet bør kun udføres, når indledende informationer om toksicitet er 
indhentet fra 28-dages eller 90-dages toksicitetstest med gentagen dosering. Kortvarige test med cancerinitiering-/fremme kan også give nyttige oplys ­
ninger. Det bør overvejes at benytte en faseinddelt testtilgang til karcinoge ­
nicitetstest som et led i den overordnede vurdering af de potentielle sund ­
hedsskadelige virkninger af et bestemt testkemikalie (16) (17) (18) (19).
 
9. De statistiske metoder, der i betragtning af forsøgsdesignet og -formålene er 
mest relevante til analyse af resultater, fastlægges, inden forsøget påbegyn ­
des. Det skal bl.a. overvejes, om statistikkerne skal omfatte justering for overlevelse, analyse af kumulative tumorrisici i forhold til overlevelsesvarig ­
hed, analyse af tid til tumor og analyse i tilfælde af afslutning af en eller 
flere grupper før tid. Vejledning om relevante statistiske analyser og nøgle ­
referencer til internationalt anerkendte statistiske metoder findes i Guidance 
Document No. 116 (7) og Guidance Document No. 35 (20).
 
10. Når et karcinogenicitetsforsøg gennemføres, skal de vejledende principper 
og overvejelser, der er beskrevet i OECD Guidance Document No. 19 (21), 
navnlig afsnit 62, altid følges. I det afsnit anføres følgende: »I forsøg, der omfatter gentagen dosering, hvor et dyr udviser kliniske tegn, som er progressive og fører til yderligere forværring, træffes der en informeret 
beslutning om, hvorvidt dyret skal aflives. Beslutningen bør baseres på en 
overvejelse af værdien af de oplysninger, der kan indhentes, hvis dyret beholdes i forsøget, i forhold til dets generelle tilstand. Hvis det besluttes at beholde dyret i forsøget, øges frekvensen af observationer efter behov. 
Uden at påvirke testens formål kan det også være muligt midlertidigt at 
stoppe doseringen, hvis det letter dyrets smerte eller lidelse, eller at reducere testdosis.«
 
11. Detaljeret vejledning om og diskussion af principperne for dosisvalg i forsøg 
vedrørende kronisk toksicitet og karcinogenicitet findes i Guidance Docu ­
ment No. 116 (7) og to publikationer fra International Life Sciences Institute 
(22) (23). Den centrale strategi for dosisvalg afhænger af forsøgets primære mål (afsnit 6). Ved valg af hensigtsmæssige dosisniveauer skal der sikres en balance mellem på den ene side farescreening og på den anden side karak ­
terisering af lavdosisrespons og deres relevans. Dette er især relevant i 
forbindelse med dette kombinerede forsøg vedrørende karcinogenicitet/kro ­
nisk toksicitet.
 
12. Det bør overvejes at udføre dette kombinerede forsøg vedrørende kronisk 
toksicitet og karcinogenicitet i stedet for at udføre et separat forsøg 
vedrørende kronisk toksicitet (kapitel B.30 i dette bilag) og et separat karci ­
nogenicitetsforsøg (kapitel B.32 i dette bilag). Den kombinerede test sparer både tid og omkostninger og reducerer i et vist omfang det nødvendige antal forsøgsdyr i forhold til gennemførelsen af to separate forsøg, uden at det 
kompromitterer kvaliteten af data i den kroniske fase eller fasen vedrørende 
karcinogenicitet. Principperne for dosisvalg (afsnit 11 og 22-26) bør dog overvejes nøje ved gennemførelsen af et kombineret forsøg vedrørende både kronisk toksicitet og karcinogenicitet, og det anerkendes også, at separate 
forsøg kan være nødvendige for at overholde visse lovgivningsbestemmel ­
ser. Yderligere vejledning om designet af det kombinerede forsøg vedrørende karcinogenicitet/kronisk toksicitet for at opnå maksimal effekt af forsøget med hensyn til muligheder for at reducere det anvendte antal 
forsøgsdyr og strømline de forskellige testprocedurer findes i Guidance 
Document No. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i 
slutningen af dette kapitel og i Guidance Document No. 116 (7).  
TESTENS PRINCIP  
14. Forsøgsdesignet omfatter to parallelle faser, en kronisk fase og en karcino ­
genicitetsfase (se henholdsvis afsnit 34 og 35 for oplysninger om varighed). 
Testkemikaliet administreres normalt oralt, selv om test ved inhalation eller dermal applikation også kan anvendes. I forbindelse med den kroniske fase administreres testkemikaliet dagligt i graduerede doser til flere grupper af 
forsøgsdyr, normalt i en periode på 12 måneder, men der kan vælges kortere 
eller længere varigheder afhængigt af lovgivningskravene (se afsnit 34). Den valgte varighed skal være så lang, at virkninger af kumulativ toksicitet kan manifestere sig, uden at det konfunderer virkningerne af geriatriske 
forandringer. Forsøgsdesignet kan også omfatte en eller flere aflivninger i 
løbet af forsøget, f.eks. ved tre og seks måneder, og yderligere dyr kan inkluderes for at tage højde for dette (se afsnit 20). I forbindelse med karcinogenicitetsfasen administreres testkemikaliet dagligt til flere grupper 
af forsøgsdyr i størstedelen af dyrenes levetid. I begge faser observeres 
dyrene nøje for tegn på toksicitet og for udvikling af neoplastiske læsioner. Dyr, der dør eller aflives under forsøget, obduceres, og de overlevende dyr aflives og obduceres ved forsøgets afslutning.
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
15. Denne testmetode omfatter primært vurdering og evaluering af kronisk 
toksicitet og karcinogenicitet hos gnavere (afsnit 2). Brugen af ikke-gnavere kan overvejes, hvis de tilgængelige data viser, at de er mere 
relevante for forudsigelsen af sundhedsvirkningerne hos mennesker. Valget 
af dyreart skal begrundes. Den foretrukne gnaverart er rotten, men andre gnaverarter, f.eks. mus, kan anvendes. Selv om anvendelsen af mus i karci ­
nogenicitetstest oftest er af begrænset nytte (24) (25) (26), kræves forsøg på 
mus stadig i henhold til visse lovgivningsbestemmelser, medmindre det påvises, at et sådant forsøg ikke er videnskabeligt nødvendigt. Rotter og mus er de foretrukne forsøgsmodeller på grund af deres relativt korte leve ­
tid, deres udbredte anvendelse i farmakologiske og toksikologiske forsøg, 
deres modtagelighed for tumorinduktion og tilgængeligheden af tilstrække ­
ligt karakteriserede stammer. Som følge af disse karakteristika findes der en stor mængde data om deres fysiologi og patologi. Design og gennemførelse 
af forsøg vedrørende kronisk toksicitet/karcinogenicitet på ikke-gnavere skal 
baseres på de principper, der er beskrevet i denne testmetode, og de prin ­
cipper, der er beskrevet i kapitel B.27 i dette bilag (Subkronisk oral toksici ­
tetstest — et 90-dages forsøg over gentagne orale dosers toksicitet på 
ikke-gnavere (6). Yderligere oplysninger om valg af dyreart og -stamme 
findes i OECD Guidance Document No. 116 (7).
 
16. Der anvendes unge raske dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. 
Det kombinerede forsøg vedrørende karcinogenicitet/kronisk toksicitet bør gennemføres på dyr af samme stamme og herkomst som de dyr, der blev 
anvendt i forforsøgene vedrørende toksicitet af kortere varighed. Hvis det 
vides, at dyr af denne stamme og herkomst giver problemer med at opfylde de accepterede kriterier for overlevelse i langvarige forsøg [se Guidance Document No. 116 (7)], bør det dog overvejes at bruge en stamme, der 
har en acceptabel overlevelsesfrekvens, til det langvarige forsøg. Hundyrene 
må ikke have født og må ikke være drægtige.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Opbevaring og fodringsbetingelser  
17. Dyrene kan anbringes enkeltvis eller i bure med små grupper af samme køn. 
Enkeltvis anbringelse bør kun anvendes, hvis det er videnskabeligt begrundet (27) (28) (29). Burene bør anbringes på en sådan måde, at 
deres placering får mindst mulig indvirkning. Temperaturen i forsøgsdyr ­
rummet skal være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 
12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt 
laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. Foderet skal opfylde alle de ernæringskrav, som den pågældende art af forsøgsdyr stiller, og indholdet 
af forureninger i foderet, herunder, men ikke begrænset til pesticidrester, 
persistente organiske miljøgifte, fytoøstrogener, tungmetaller og mycotoksi ­
ner, der kan påvirke testresultatet, skal være så lavt som muligt. Analytiske oplysninger om ernæring og koncentration af forurenende stoffer i foderet 
genereres periodisk, som minimum i begyndelsen af forsøget og derefter, 
når der sker ændringer i det anvendte parti, og de registreres i den endelige rapport. Analytiske oplysninger om det anvendte drikkevand i forsøget bør også anføres. Ved valg af foder kan der tages hensyn til nødvendigheden af 
at sikre passende iblanding af testkemikaliet og opfylde dyrenes ernærings ­
behov, når denne administrationsmåde anvendes.
 
Forberedelse af dyrene  
18. Der anvendes raske dyr, som er akklimatiseret til laboratoriemiljøet i mindst 
syv døgn og ikke tidligere er indgået i forsøg. Hvis der anvendes gnavere, bør doseringen indledes snarest efter fravænning og akklimatisering, og helst 
inden dyrene er otte uger gamle. Forsøgsdyrene skal være karakteriseret med 
hensyn til art, stamme, oprindelse, køn, vægt og alder. Ved forsøgets begyn ­
delse skal vægtvariationen for hvert køn af de anvendte dyr være mindst mulig og må for hvert køn ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten for 
alle dyr i forsøget. Dyrene randomiseres til henholdsvis kontrol og behand ­
lingsgruppe. Efter randomisering bør der for hvert køn ikke være signifi ­
kante forskelle i den gennemsnitlige kropsvægt mellem grupperne. Hvis der er statistisk signifikante forskelle, gentages randomiseringstrinnet, hvis det er 
muligt. Hvert dyr tildeles et unikt identifikationsnummer og mærkes perma ­
nent med dette nummer ved hjælp af tatovering, mikrochipimplantation eller anden egnet metode.
 
FREMGANGSMÅDE  
Dyrenes antal og køn  
19. Begge køn anvendes. Der anvendes et antal dyr, der sikrer, at der kan 
foretages en grundig biologisk og statistisk evaluering. For gnavere bør hver dosisgruppe (som beskrevet i afsnit 22) og den samtidige kontrol ­
gruppe beregnet til forsøgets karcinogenicitetsfase indeholde mindst 50 
dyr af hvert køn. Afhængigt af formålet med forsøget kan den statistiske styrke af nøgleestimater forøges ved differentielt og ulige at tildele dyr til de forskellige dosisgrupper, idet der tildeles mere end 50 dyr til lavdosisgrup ­
perne, f.eks. for at skønne det karcinogene potentiale ved lave doser. Det 
skal dog anerkendes, at en moderat forøgelse af gruppestørrelsen kun vil give en forholdsvis lille forøgelse af forsøgets statistiske styrke. For gnavere bør hver dosisgruppe (som beskrevet i afsnit 22) og den samtidige kontrol ­
gruppe beregnet til forsøgets kronisk toksicitetsfase indeholde mindst 10 dyr 
af hvert køn. Det bemærkes, at dette antal er lavere end i forsøget
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
vedrørende kronisk toksicitet (kapitel B.30 i dette bilag). Fortolkningen af 
data fra det reducerede antal dyr pr. gruppe i den kronisk toksicitetsfase af 
dette kombinerede forsøg støttes dog af data fra det større antal dyr i forsøgets karcinogenicitetsfase. I forsøg med mus skal der evt. bruges flere dyr i hver dosisgruppe i den kroniske toksicitetsfase til at udføre alle 
de krævede hæmatologiske undersøgelser. Yderligere oplysninger om 
forsøgets statistiske design og valg af dosisniveauer med henblik på at maksimere den statistiske styrke findes i Guidance Document No. 116 (7).
 
Reserve til aflivninger under forsøget, satellitgruppe og sentineldyr  
20. Forsøget kan omfatte reserver til aflivninger under forsøget, f.eks. ved seks 
måneder for den kroniske toksicitetsfase, for at fremskaffe oplysninger om 
progression af ikke-neoplastiske forandringer og mekanistisk information, 
hvis det er videnskabeligt begrundet. Hvis sådanne oplysninger allerede er tilgængelige fra tidligere toksicitetsforsøg med gentagen dosering vedrørende testkemikaliet, er aflivninger under forsøget muligvis ikke viden ­
skabeligt begrundet. De dyr, der anvendes i forsøgets kroniske toksicitets ­
fase, normalt af 12 måneders varighed (afsnit 34), fremskaffer data om aflivning under forsøget til forsøgets karcinogenicitetsfase, hvilket sikrer en generel reduktion i det anvendte antal dyr. Satellitgrupper kan medtages 
med henblik på at overvåge reversibiliteten af toksikologiske virkninger 
induceret af det undersøgte testkemikalie. Disse begrænses normalt til det højeste dosisniveau i forsøget plus kontrol. En yderligere gruppe af senti ­
neldyr (typisk fem dyr pr. køn) kan om nødvendigt også inkluderes med 
henblik på overvågning af sygdomsstatus i løbet af forsøget (30). Yderligere 
vejledning om forsøgsdesignet med henblik på at medtage dyr til aflivning under forsøget samt satellit- og sentineldyr, samtidig med at det samlede antal dyr i forsøget minimeres, findes i Guidance Document No. 116 (7).
 
21. Hvis satellitdyr og/eller aflivninger under forsøget indgår i forsøgsdesignet, 
skal antallet af dyr i hver dosisgruppe, som medtages til dette formål, normalt være 10 dyr pr. køn, og det samlede antal dyr i forsøgsdesignet 
forøges med det antal dyr, der planlægges aflivet inden forsøgets afslutning. 
Dyr, der planlægges aflivet under forsøget, og satellitdyr underkastes de samme observationer, herunder kropsvægt og foder-/vandindtagelse, hæma ­
tologiske, klinisk-biokemiske og patologiske undersøgelser som dyrene i 
hovedforsøgets kroniske toksicitetsfase, selv om der også kan medtages 
reserver (i grupperne for aflivning under forsøget) til målinger alene af specifikke nøgleparametre, som f.eks. neurotoksicitet eller immunotoksicitet.
 
Dosisgrupper og dosering  
22. Vejledning om alle aspekter af dosisvalg og intervaller mellem dosis ­
niveauer findes i Guidance Document No. 116 (7). Der skal være mindst 
tre dosisgrupper og en sideløbende kontrolgruppe for både den kroniske 
toksicitetsfase og karcinogenicitetsfasen. Dosisniveauer baseres generelt på resultaterne af forsøg med gentagen dosis af kortere varighed eller dosis ­
bestemmende forsøg (»range finding«) og skal tage hensyn til kendte toksi ­
kologiske og toksokinetiske data for testkemikaliet eller tilsvarende kemika ­
lier.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. For forsøgets kroniske toksicitetsfase kan et fuldstændigt forsøg med anven ­
delse af tre dosisniveauer betragtes som unødvendigt, hvis det kan forventes, 
at en test, der gennemføres med et dosisniveau svarende til mindst 1 000 mg/kg kropsvægt/dag, næppe vil fremkalde negative virkninger. Dette bør baseres på informationer fra forforsøg og det forhold, at toksicitet ikke 
forventes ud fra kendskab til strukturelt beslægtede kemikalier. En grænse 
på 1 000 mg/kg kropsvægt/dag er kun relevant, hvis human eksponering indicerer, at der er behov for anvendelse af et højere dosisniveau.
 
24. Medmindre der optræder begrænsninger som følge af testkemikaliets 
fysisk-kemiske tilstand eller biologiske egenskaber, vælges det højeste dosis ­
niveau, som gør det muligt at identificere de primære målorganer og 
samtidig undgå lidelse, svære toksiske virkninger, morbiditet eller død. 
Normalt vælges det højeste dosisniveau, der fremkalder toksicitetstegn, f.eks. en formindskelse af kropsvægten (mindre end 10 %). Afhængigt af forsøgets formål (se afsnit 6) kan der dog vælges en højeste dosis, der er 
lavere end den dosis, der fremkalder toksicitetstegn, f.eks. hvis en dosis 
fremkalder en negativ virkning, som giver anledning til bekymring, men alligevel har ringe indvirkning på levetid eller kropsvægt.
 
25. Dosisniveauer og dosisintervaller kan vælges, så der fastlægges et forhold 
mellem dosis og respons og, afhængigt af testkemikaliets virkningsmåde, en NOAEL eller et andet ønsket resultat af forsøget, f.eks. en BMD (se afsnit 
27). Faktorer, der skal tages i overvejelse ved fastlæggelsen af de laveste 
doser, omfatter dosis-responskurvens forventede hældning, de doser, hvor der kan forekomme vigtige forandringer i metabolismen, eller den toksiske virkning, hvor en tærskel forventes, eller hvor et udgangspunkt for lavdosi ­
sekstrapolation forventes. Når et kombineret forsøg vedrørende karcinoge ­
nicitet/kronisk toksicitet gennemføres, er det primære mål at fremskaffe oplysninger til vurdering af karcinogenicitetsrisici, og oplysninger om kronisk toksicitet er normalt det sekundært mål. Dette skal erindres, når 
dosisniveauer og dosisintervaller vælges til forsøget.
 
26. Det valgte dosisinterval afhænger af forsøgsformålene og testkemikaliets 
karakteristika og kan ikke beskrives i denne testmetode, men to- til firedob ­
belte intervaller er ofte bedst til fastlæggelse af faldende dosisstørrelser, og tilføjelse af en fjerde testgruppe er ofte at foretrække frem for brug af meget store intervaller (f.eks. mere end en faktor på 6-10) mellem dosisstørrel ­
serne. Faktorer på mere end 10 bør generelt undgås og skal i givet fald 
begrundes.
 
27. Som beskrevet i Guidance Document No. 116 (7) skal følgende bl.a. over ­
vejes i forbindelse med dosisvalg:  
— kendte eller mistænkte ikke-lineariteter eller inflektionspunkter i 
dosis-respons  
— toksikokinetik og dosisintervaller, hvor metabolisk induktion, mætning 
eller ikke-linearitet mellem eksterne og interne doser forekommer eller ikke forekommer
 
— præcursorlæsioner, virkningsmarkører eller indikatorer for underliggende 
biologiske nøgleprocessers virkning  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— vigtige (eller mistænkte) aspekter af virkningsmåde, som f.eks. dosis, 
hvorved cytotoksicitet begynder at stige, hormonniveauer forstyrres, 
homøstatiske mekanismer belastes osv.  
— områder af dosis-responskurven, hvor der kræves særlig robust estime ­
ring, f.eks. i intervaller for den forventede BMD eller en mistænkt tærskel
 
— overvejelse af forventede eksponeringsniveauer for mennesker, navnlig 
med hensyn til valget af mellemhøje og lave doser.  
28. Kontrolgruppen skal være ubehandlet eller behandles med vehikel, hvis et 
sådant anvendes til administration af testkemikaliet. Bortset fra behandling 
med testkemikaliet skal dyrene i kontrolgruppen håndteres på samme måde 
som dyrene i testgrupperne. Hvis der anvendes et vehikel, doseres kontrol ­
gruppen med vehiklet i det største anvendte volumen blandt doseringsgrup ­
perne. Hvis et testkemikalie administreret i foderet medfører væsentligt 
reduceret fødeindtagelse på grund af foderets dårligere smag, kan det 
være nyttigt med en kontrolgruppe, der parallelfodres.  
Fremstilling af doser og administration af testkemikalie  
29. Testkemikaliet indgives normalt oralt via foderet eller drikkevandet eller 
gennem sonde. Yderligere oplysninger om administrationsveje og -metoder findes i OECD Guidance Document No. 116 (7). Valget af administra ­
tionsvej og -metode afhænger af formålet med forsøget, testkemikaliets 
fysisk-kemiske karakteristika, dets biotilgængelighed og den måde, hvorpå mennesker primært eksponeres for testkemikaliet. Der gives en begrundelse for den valgte administrationsvej og -metode. Af hensyn til dyrevelfærden 
bør oral sonde kun anvendes i forbindelse med stoffer, for hvilke denne 
administrationsvej og -metode med rimelighed repræsenterer en potentiel eksponeringsmåde for mennesker (f.eks. lægemidler). I forbindelse med kemikalier, der bruges i fødevarer eller miljøet, administreres testkemikaliet 
typisk via foderet eller drikkevandet. I nogle scenarier, f.eks. erhvervs ­
mæssig eksponering, kan andre administrationsveje være mere hensigtsmæs ­
sige.
 
30. Om nødvendigt opløses eller opslæmmes testkemikaliet i et egnet vehikel. 
For vehiklet og andre tilsætningsstoffer skal følgende karakteristika tages i 
betragtning: dets effekt på testkemikaliets absorption, fordeling, metabolisme og retention, dets indvirkning på testkemikaliets kemiske egenskaber med deraf følgende ændring af dettes toksiske egenskaber, og dets indvirkning på 
dyrenes føde- og vandindtagelse og ernæringstilstand. Det anbefales, at man 
som første valg vurderer muligheden af at benytte en vandig opløsning/sus ­
pension, derefter en opløsning/suspension i olie (f.eks. majsolie), og først derefter eventuel opløsning i andre vehikler. For andre vehikler end vand 
bør vehiklets toksiske egenskaber være kendt. Der bør forefindes oplys ­
ninger om testkemikaliets stabilitet og homogeniteten af doseringsopløs ­
ninger eller foder (hvis det er relevant) ved den anvendte administrations ­
form (f.eks. gennem foder).
 
31. For testkemikalier, som administreres i foderet eller drikkevandet, er det 
vigtigt at sikre, at det pågældende testkemikalie i den anvendte mængde ikke griber ind i den normale ernærings- eller vandbalance. I langvarige toksicitetsforsøg med administration via foderet må testkemikaliets koncen ­
tration i foderet normalt ikke overstige en øvre grænse på 5 % af den 
samlede fodermængde for at undgå ernæringsmæssige ubalancer. Når test ­
kemikaliet administreres i foderet, kan det administreres som en konstant koncentration i foderet (mg/kg foder eller ppm) eller som en konstant dosis ­
størrelse i forhold til dyrets kropsvægt (mg/kg kropsvægt) beregnet ugent ­
ligt. Det anvendte alternativ anføres.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Ved oral administration gives testkemikaliet dagligt til dyrene (syv dage om 
ugen) normalt i en periode på 12 måneder (den kroniske fase) eller 24 
måneder (karcinogenicitetsfasen) (se også afsnit 33 og 34). Andre doserings ­
regimer, f.eks. fem dage om ugen, skal begrundes. Ved dermal applikation behandles dyrene normalt med testkemikaliet i mindst seks timer om dagen, 
syv dage om ugen, som beskrevet i kapitel B.9 i dette bilag (11), i en 
periode på 12 måneder (den kroniske fase) eller 24 måneder (karcinogenici ­
tetsfasen). Eksponering ved inhalation gennemføres seks timer om dagen, syv dage om ugen, men eksponering fem dage om ugen kan anvendes, hvis 
det begrundes. Eksponeringen varer normalt 12 måneder (den kroniske fase) 
eller 24 måneder (karcinogenicitetsfasen). Hvis andre gnaverarter end rotter eksponeres gennem næsen, kan de maksimale eksponeringsvarigheder justeres for at minimere artsspecifikke lidelser. Der bør gives en begrun ­
delse, når der anvendes en eksponeringsvarighed på mindre end seks timer 
om dagen. Se også kapitel B.8 i dette bilag (9).
 
33. Hvis testkemikaliet indgives med sonde, skal det gøres i en enkelt dosis, 
med anvendelse af en mavesonde eller et passende intubationsrør på samme 
tidspunkt hver dag. Normalt administreres én dosis en gang dagligt. Hvis et kemikalie f.eks. er et lokalirriterende stof, kan den daglige dosis dog admi ­
nistreres som en deldosis (to gange om dagen). Den maksimale væske ­
mængde, som kan administreres ad gangen, afhænger af forsøgsdyrets stør ­
relse. Volumenet skal være så lavt som praktisk muligt og må normalt ikke overstige 1 ml/100 g kropsvægt for gnavere (31). Variationer i testvolumen skal minimeres ved at justere koncentrationerne, så der sikres et konstant 
volumen ved alle dosisniveauer. Dette gælder dog ikke potentielt ætsende 
eller irriterende kemikalier, som skal fortyndes for at undgå alvorlige lokale virkninger. Test ved koncentrationer, der sandsynligvis kan være ætsende eller irriterende for mave-tarmkanalen, bør undgås.
 
Forsøgets varighed  
34. Doseringsperioden og varigheden af dette forsøgs kroniske fase er normalt 
12 måneder, men forsøgsdesignet gør det også muligt at udføre forsøg med 
enten kortere (f.eks. seks eller ni måneder) eller længere (f.eks. 18 eller 24 måneder) varighed, afhængigt af de specifikke lovgivningskrav eller mekani ­
stiske formål. Afvigelser fra eksponeringsvarigheden på 12 måneder skal 
begrundes, især ved kortere varigheder. Alle dosisgrupper, der er tildelt til 
denne fase, afsluttes på det tidspunkt, der er fastsat til evaluering af kronisk toksicitet og ikke-neoplastisk patologi. Satellitgrupper, der medtages med 
henblik på at overvåge reversibiliteten af toksikologiske virkninger induceret 
af det undersøgte testkemikalie, bevares uden dosering i en periode på mindst fire uger og højst en tredjedel af den samlede forsøgsvarighed efter ophør af eksponering.
 
35. Varigheden af forsøgets karcinogenicitetsfase er normalt 24 måneder for 
gnavere, dvs. størstedelen af de anvendte dyrs levetid. Der kan anvendes kortere eller længere forsøgsvarigheder afhængigt af levetiden for den stamme af dyr, der anvendes i forsøget, men varigheden skal begrundes. 
For bestemte stammer af mus, f.eks. AKR/J, C3H/J eller C57BL/6J, kan en 
varighed på 18 måneder være mere hensigtsmæssig. I det følgende gives der oplysninger om forsøgsvarighed, afbrydelse af forsøget og overlevelse. Yderligere vejledning, herunder overvejelse af, om negativ karcinogenicitet 
kan accepteres i forhold til overlevelse i forsøget, findes i OECD Guidance 
Document No. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Afbrydelse af forsøget skal overvejes, når antallet af overlevende i de 
laveste dosisgrupper eller kontrolgrupper falder til under 25 %.  
— Hvis kun gruppen med den højeste dosis dør før tiden på grund af 
toksicitet, bør det ikke medføre afbrydelse af forsøget.  
— Overlevelse vurderes separat for hvert køn.  
— Forsøget bør ikke forlænges ud over det punkt, hvor dataene fra forsøget 
ikke længere er tilstrækkelige til at understøtte en statistisk gyldig 
evaluering.  
OBSERVATIONER (DEN KRONISKE TOKSICITETSFASE)  
36. Alle dyr kontrolleres for morbiditet eller mortalitet, normalt morgen og 
aften, alle ugens dage. Almindelig klinisk observation bør foretages mindst én gang om dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er), idet man 
tager i betragtning, hvornår maksimal effekt kan forventes efter sondeind ­
gift.
 
37. Detaljerede kliniske undersøgelser gennemføres af alle dyrene i hvert fald 
før første eksponering (for at tage højde for individuelle forskelle), ved 
slutningen af den første uge af forsøget og derefter en gang månedlig. 
Protokollen for undersøgelser tilrettelægges, således at variationer mellem individuelle undersøgere minimeres, og således at den er uafhængig af test ­
gruppen. Disse undersøgelser skal foretages uden for burene, fortrinsvis på 
et standardareal og på samme tid i hvert tilfælde. De skal noteres omhyg ­
geligt, fortrinsvis ved anvendelse af et scoringssystem, eksplicit defineret af testlaboratoriet. Man bør bestræbe sig på, at variationerne i undersøgelses ­
betingelserne er mindst mulige. Observationerne bør bl.a. omfatte ændringer 
i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion, ekskretion og autonom 
aktivitet (f.eks. tåreflod, strittende hårlag, pupilstørrelse, usædvanligt respi ­
rationsmønster). Forandringer i gang, stilling og respons på håndtering såvel som tilstedeværelse af toniske og kloniske bevægelser, stereotypi (f.eks. 
overdreven pudsning, repetitive cirkelbevægelser) eller bizar opførsel 
(f.eks. selvmutilation, baglæns gang) skal også noteres (32).
 
38. Oftalmologisk undersøgelse ved hjælp af oftalmoskop eller andet passende 
udstyr bør udføres på alle dyr inden første administration af testkemikaliet. 
Ved forsøgets afslutning foretages denne undersøgelse helst på alle dyr, men 
i det mindste på alle dyr i højdosis- og kontrolgrupperne. Hvis der opdages øjenforandringer, der kan tilskrives behandlingen, skal alle dyrene undersø ­
ges. Hvis strukturel analyse eller andre informationer antyder øjentoksicitet, 
øges frekvensen af øjenundersøgelser.
 
39. For kemikalier, hvor tidligere 28-dages eller 90-dages toksicitetstest med 
gentagen dosering har indiceret et neurotoksisk potentiale, kan reaktiviteten over for sensoriske stimuli af forskellig art (32) (f.eks. auditive, visuelle og 
proprioceptive stimuli) (33), (34), (35), gribestyrke (36) og motorisk akti ­
vitet (37) eventuelt vurderes inden påbegyndelsen af forsøget og derefter med tre måneders mellemrum, indtil der er gået 12 måneder, og ved forsøgs ­
afslutning (hvis senere end 12 måneder). Nærmere oplysninger om de frem ­
gangsmåder, der kan benyttes, findes i de respektive referencer. Andre 
alternative fremgangsmåder end de refererede kan imidlertid også anvendes.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. For kemikalier, hvor tidligere 28-dages eller 90-dages toksicitetstest med 
gentagen dosering har indiceret et immunotoksisk potentiale, kan yderligere 
undersøgelser af denne effektparameter udføres ved forsøgsafslutning.  
Kropsvægt, foder-/vandindtagelse og foderudnyttelse  
41. Alle dyr vejes ved begyndelsen af behandlingen, mindst én gang om ugen i 
de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden. Foderindtagelse 
og -udnyttelse måles mindst én gang om ugen i de første 13 uger og derefter 
mindst én gang om måneden. Vandindtagelse måles mindst én gang om ugen i de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden, når testkemikaliet administreres i vandet. Måling af vandindtagelse bør også 
overvejes i forsøg, hvor drikkeaktiviteten ændres.
 
Hæmatologiske og klinisk-biokemiske prøver  
42. I forsøg med gnavere foretages hæmatologisk undersøgelse af alle 
forsøgsdyr (10 handyr og 10 hundyr pr. gruppe) ved 3, 6 og 12 måneder 
og ved forsøgsafslutning (hvis senere end 12 måneder). I forsøg med mus 
skal der evt. bruges satellitdyr for at kunne udføre alle de krævede hæma ­
tologiske undersøgelser (se afsnit 19). I forsøg med ikke-gnavere udtages prøver fra et mindre antal dyr (f.eks. 4 dyr pr. køn og pr. gruppe i hunde ­
forsøg) ved mellemliggende prøvetagningstidspunkter og ved forsøgsafslut ­
ning som beskrevet for gnavere. Målinger ved tre måneder foretages ikke hos hverken gnavere eller ikke-gnavere, hvis der ikke er konstateret virk ­
ninger på hæmatologiske parametre i et tidligere 90-dages forsøg gennem ­
ført ved hjælp af sammenlignelige dosisniveauer. Blodprøver udtages fra et 
udpeget sted, f.eks. ved hjertepunktur eller fra retro-orbital sinus, under bedøvelse.
 
43. Følgende parametre bør undersøges (38): total og differential leucocyttæl ­
ling, erythrocyttælling, blodpladetælling, hæmoglobinkoncentration, hæma ­
tokrit, middelcellevolumen (MCV), middelcellehæmoglobin (MCH), middelcellehæmoglobinkoncentration (MCHC), protrombintid og aktiveret 
partiel tromboplastintid. Andre parametre for hæmatologi, som f.eks. 
Heinz-legemer eller andre atypiske parametre for erythrocytmorfologi eller methæmoglobin, kan måles afhængigt af testkemikaliets toksicitet. Generelt 
bør der benyttes en fleksibel tilgang afhængigt af de observerede og/eller 
forventede virkninger af et givet testkemikalie. Hvis testkemikaliet har indvirkning på det hæmopoietiske system, kan retikulocyttællinger og knog ­
lemarvcytologi også være indiceret, selv om de ikke skal foretages rutine ­
mæssigt.
 
44. Klinisk kemiske målinger med henblik på undersøgelse af toksisk virkning 
på væv og specielt på nyrer og lever skal foretages på blodprøver taget fra 
alle forsøgsdyr (10 handyr og 10 hundyr pr. gruppe) med samme tidsinter ­
valler som de hæmatologiske undersøgelser. I forsøg med mus skal der evt. bruges satellitdyr for at kunne udføre alle de krævede klinisk kemiske målinger. I forsøg med ikke-gnavere udtages prøver fra et mindre antal 
dyr (f.eks. 4 dyr pr. køn og pr. gruppe i hundeforsøg) ved mellemliggende 
prøvetagningstidspunkter og ved forsøgsafslutning som beskrevet for gnavere. Målinger ved tre måneder foretages ikke hos hverken gnavere eller ikke-gnavere, hvis der ikke er konstateret virkninger på 
klinisk-biokemiske parametre i et tidligere 90-dages forsøg gennemført 
ved hjælp af sammenlignelige dosisniveauer. Dyrene (dog ikke mus) bør
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
faste inden blodprøvetagning (  1 ). Følgende parametre bør undersøges (38): 
glukose, urea (urinstof), kreatinin, total protein, albumin, kalcium, natrium, 
kalium, total kolesterol, mindst to relevante test med henblik på hepatocel ­
lulær evaluering (alanin-aminotransferase, aspartat-aminotransferase, glutamat-dehydrogenase og totale galdesyrer) (39) og mindst to relevante 
test med henblik på hepatobiliær evaluering (alkalisk fosfatase, 
gamma-glutamyl-transferase, 5 ′-nucleotidase, total bilirubin og totale galde ­
syrer) (39). Andre klinisk-kemiske parametre, som f.eks. fastende triglyce ­
rider, specielle hormoner og kolinesterase, kan måles afhængigt af testke ­
mikaliets toksicitet. Der skal generelt benyttes en fleksibel tilgang afhængigt 
af den observerede og/eller forventede virkning af et testkemikalie.
 
45. Urinanalyser udføres på alle forsøgsdyr (10 handyr og 10 hundyr pr. 
gruppe) med samme tidsintervaller som de hæmatologiske og 
klinisk-kemiske undersøgelser. Målinger ved tre måneder foretages ikke, hvis der ikke er konstateret virkninger på urinanalyse i et tidligere 90- dages forsøg gennemført ved hjælp af sammenlignelige dosisniveauer. 
Følgende liste over parametre indgik i en ekspertanbefaling vedrørende 
kliniske patologiforsøg (38): udseende, volumen, osmolalitet eller vægtfylde, pH, total protein og glukose. Andre parametre omfatter keton, urobilinogen, bilirubin og hæmaturi. Andre parametre kan inkluderes, hvis det er nødven ­
digt at udvide undersøgelsen af en eller flere observerede virkninger.
 
46. Der er generel enighed om, at hæmatologiske og klinisk-biokemiske base ­
linevariabler er nødvendige inden behandling i forbindelse med hundefor ­
søg, men de er ikke nødvendige i forsøg med gnavere (38). Hvis de histo ­
riske baselinedata (se afsnit 58) er utilstrækkelige, bør det overvejes at fremskaffe sådanne data.
 
PATOLOGI  
Makroskopisk obduktion  
47. Alle dyr, som indgår i forsøget, skal normalt have udført en fuldstændig, 
detaljeret makroskopisk obduktion, hvilket inkluderer omhyggelig undersø ­
gelse af alle overflader, alle åbninger, og kraniets, brystkassens og abdomens kaviteter og deres indhold. Der kan dog også medtages reserver (i grupperne for aflivning under forsøget) til målinger alene af specifikke 
nøgleparametre, som f.eks. neurotoksicitet eller immunotoksicitet (se afsnit 
21). Disse dyr underkastes dog ikke obduktion og de fremgangsmåder, der er beskrevet i det følgende. Sentineldyr skal evt. obduceres, men det afgøres af forsøgslederen i hvert enkelt tilfælde.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Til en del analyser på serum og plasma, mest udtalt for glukose, foretrækkes fastende 
blodprøver. Hovedårsagen er den øgede variation, som uundgåeligt følger ikkefaste, og 
som vil kunne maskere små effekter og derved gøre tolkningen vanskelig. På den anden 
side vil faste kunne influere på dyrenes almindelige stofskifte, specielt i forsøg, hvor 
foderindtagelse står centralt, og derved forstyrre den daglige belastning med testkemika ­
liet. Alle dyr bør vurderes i samme fysiologiske tilstand, og detaljerede eller neurologiske 
vurderinger bør derfor efter planen gennemføres en anden dag end udtagningen af de 
klinisk-biokemiske prøver.
 48. Organvægte registreres for alle dyr, bortset fra dyr som er udelukket i 
medfør af sidste del af afsnit 47. Binyrer, hjerne, bitestikler, hjerte, nyrer, 
lever, ovarier, milt, testikler, skjoldbruskkirtel (vejet efter fiksering, med paratyreoideae) og uterus skal på alle dyr renses for andet vedhængende væv som behørigt (undtaget er de dyr, der findes døende og/eller aflives 
undervejs i forsøget) og vejes snarest muligt efter dissektionen for at undgå 
udtørring.
 
49. Følgende væv skal præserveres ved hjælp af det mest passende fikserings ­
middel både med henblik på vævstypen og den følgende histopatologiske 
undersøgelse (se afsnit 40) (væv i kantet parentes er valgfrit): 
Alle større læsioner Hjerte Bugspytkirtel Mavesæk (formave, kirtel ­
mave) 
Binyrer Ileum Biskjoldbruskkirtel [Tænder] 
Aorta Jejunum Perifer nerve Testikler Hjerne (herunder udsnit af 
cerebrum, cerebellum og 
medulla/pons) Nyre Hypofyse Brisler 
Cæcum Tårekirtel (ekstraorbital) Prostata Skjoldbruskkirtel 
Cervix Lever Rectum [Tunge] 
Prostata anterior Lunge Spytkirtel Luftrør 
Tyktarm Lymfeknuder (både 
overfladiske og dybe) Vesiculae seminales Urinblære 
Duodenum Brystkirtel (obligatorisk 
for hundyr og, hvis de 
er synligt dissekerbare, for handyr) Skeletmuskel Uterus med cervix 
Epididymis [Øvre luftveje, herunder 
næse, muslingeben og 
paranasale sinusser] Hud [Ureter] 
Øje (herunder retina) Øsofagus Rygmarv (på tre 
niveauer: (cervikal, 
midt-torakal og lumbal) [Urethra] 
[Femur med led] [Bulbus olfactorius] Milt Vagina 
Galdeblære (for andre arter 
end rotte) Æggestok [Sternum] Sektion af knoglemarven og/ 
eller frisk knoglemarvsaspirat 
Harderian-kirtel
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
I tilfælde af parrede organer, f.eks. nyrer og binyrer, præserveres begge 
organer. Kliniske og andre fund kan foranledige undersøgelse af andet 
væv. Også særlige organer, der sandsynligvis kan være mål for testkemika ­
liets kendte virkninger, bør præserveres. I forsøg, der omfatter dermal appli ­
kation, skal de organer, der er opført på listen over organer ved oral admini ­
stration, undersøges, og specifik prøvetagning og præservation af huden fra 
applikationsstedet skal foretages. I inhalationsforsøg skal listen over væv, der skal præserveres og undersøges fra luftvejene, følge anbefalingerne i kapitel B.8 i dette bilag (9) og kapitel B.29 i dette bilag (10). For andre 
organer/væv (og i tillæg til de væv, der specifikt er præserveret fra luft ­
vejene) skal de organer, der er anført for oral administration, undersøges.
 
Histopatologi  
50. Der foreligger vejledning om bedste praksis i forbindelse med gennem ­
førelsen af toksikologiske patologiforsøg (40). De histopatologiske undersø ­
gelser skal som minimum omfatte:  
— alle væv fra højdosis- og kontrolgruppen  
— alle væv fra dyr, som er døde eller aflivet under forsøget  
— alle væv, som udviser makroskopiske abnormiteter  
— målvæv eller væv, der udviser behandlingsrelaterede forandringer i 
højdosisgruppen, fra dyr i alle andre dosisgrupper  
— i tilfælde af parrede organer, f.eks. nyrer og binyrer, præserveres begge 
organer.  
OBSERVATIONER (KARCINOGENICITETSFASEN)  
51. Alle dyr kontrolleres for morbiditet eller mortalitet, normalt morgen og 
aften, alle ugens dage. Dyrene kontrolleres desuden en gang om dagen for specifikke tegn af toksikologisk relevans. Ved sondeforsøg kontrolleres dyrene i perioden umiddelbart inden doseringen. Særlig opmærksomhed 
rettes mod udviklingen af tumorer, og på tidspunktet for den første tumor ­
dannelse registreres lokalisering, dimensioner, fremtræden og progression af hver makroskopisk synlig eller palpabel tumor.
 
52. Alle dyr vejes ved begyndelsen af behandlingen, mindst én gang om ugen i 
de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden. Foderindtagelse 
og -udnyttelse måles mindst én gang om ugen i de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden. Vandindtagelse måles mindst én gang om ugen i de første 13 uger og derefter mindst én gang om måneden, når 
testkemikaliet administreres i vandet. Måling af vandindtagelse bør også 
overvejes i forsøg, hvor drikkeaktiviteten ændres.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hæmatologiske, klinisk-biokemiske og patologiske undersøgelser  
53. For at udlede flest mulige informationer fra forsøget, især med hensyn til 
virkningsmåde, kan blodprøver efter forsøgslederens vurdering udtages med henblik på hæmatologiske og klinisk-biokemiske undersøgelser. Urinanalyse 
kan også være relevant. Data om dyr, der anvendes i forsøgets kroniske 
toksicitetsfase, normalt af 12 måneders varighed (afsnit 34), fremskaffer oplysninger om disse parametre. Yderligere vejledning om fordelene ved at udtage sådanne prøver i forbindelse med karcinogenicitetsforsøg findes 
i Guidance Document No. 116 (7). Hvis blodprøver udtages, tages de ved 
slutningen af forsøgsperioden lige før eller i forbindelse med aflivningen af dyrene. Blodprøver udtages fra et udpeget sted, f.eks. ved hjertepunktur eller 
fra retro-orbital sinus, under bedøvelse. Blodsmears kan også forberedes til 
undersøgelse, navnlig hvis knoglemarv tilsyneladende er målorganet, selv om der ikke er enighed om værdien af en sådan undersøgelse i karcinoge ­
nicitetsfasen i forbindelse med vurderingen af karcinogent/onkogent poten ­
tiale (38).
 
PATOLOGI  
Makroskopisk obduktion  
54. Alle dyr, som indgår i forsøget, skal med undtagelse af sentineldyr (se afsnit 
20) og andre satellitdyr have udført en fuldstændig, detaljeret makroskopisk obduktion, hvilket inkluderer omhyggelig undersøgelse af alle overflader, alle åbninger samt kraniets, brystkassens og abdomens kaviteter og deres 
indhold. Sentineldyr og andre satellitdyr skal evt. obduceres, men det 
afgøres af forsøgslederen i hvert enkelt tilfælde. Organvægt indgår normalt ikke i karcinogenicitetsforsøg, da geriatriske forandringer og i senere faser udviklingen af tumorer konfunderer anvendeligheden af data 
om organvægt. Organvægt kan dog være vigtig til at udføre en weight of 
evidence-evaluering og overvejelser vedrørende virkningsmåde. Hvis organ ­
vægt indgår i et satellitforsøg, registreres værdierne senest et år efter forsøgsstart.
 
55. Følgende væv skal præserveres ved hjælp af det mest passende fikserings ­
middel både med henblik på vævstypen og den følgende histopatologiske undersøgelse (se afsnit 40) (væv i kantet parentes er valgfrit): 
Alle større læsioner Hjerte Bugspytkirtel Mavesæk (formave, kirtel ­
mave) 
Binyrer Ileum Biskjoldbruskkirtel [Tænder] 
Aorta Jejunum Perifer nerve Testikler Hjerne (herunder udsnit af 
cerebrum, cerebellum og 
medulla/pons) Nyre Hypofyse Brisler 
Cæcum Tårekirtel (ekstraorbital) Prostata Skjoldbruskkirtel 
Cervix Lever Rectum [Tunge] Prostata anterior Lunge Spytkirtel Luftrør Tyktarm Lymfeknuder (både 
overfladiske og dybe) Vesiculae seminales Urinblære
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
Duodenum Brystkirtel (obligatorisk 
for hundyr og, hvis de 
er synligt dissekerbare, for handyr) Skeletmuskel Uterus med cervix 
Epididymis [Øvre luftveje, herunder 
næse, muslingeben og 
paranasale sinusser] Hud [Ureter] 
Øje (herunder retina) Øsofagus Rygmarv (på tre 
niveauer: (cervikal, 
midt-torakal og lumbal) [Urethra] 
[Femur med led] [Bulbus olfactorius] Milt Vagina 
Galdeblære (for andre arter 
end rotte) Æggestok [Sternum] Sektion af knoglemarven og/ 
eller frisk knoglemarvsaspirat 
Harderian-kirtel
 
I tilfælde af parrede organer, f.eks. nyrer og binyrer, præserveres begge 
organer. Kliniske og andre fund kan foranledige undersøgelse af andet væv. Også særlige organer, der sandsynligvis kan være mål for testkemika ­
liets kendte virkninger, bør præserveres. I forsøg, der omfatter dermal appli ­
kation, skal de organer, der er opført på listen over organer ved oral admini ­
stration, undersøges, og specifik prøvetagning og præservation af huden fra applikationsstedet skal foretages. I inhalationsforsøg skal listen over væv, der skal præserveres og undersøges fra luftvejene, følge anbefalingerne i 
kapitel B.8 i dette bilag (8) og kapitel B.29 i dette bilag (9). For andre 
organer/væv (og i tillæg til de væv, der specifikt er præserveret fra luft ­
vejene) skal de organer, der er anført for oral administration, undersøges.
 
Histopatologi  
56. Der foreligger vejledning om bedste praksis i forbindelse med gennem ­
førelsen af toksikologiske patologiforsøg (40). Følgende væv skal som minimum undersøges:
 
— alle væv fra højdosis- og kontrolgruppen  
— alle væv fra dyr, som er døde eller aflivet under forsøget  
— alle væv, som udviser makroskopiske abnormiteter, herunder tumorer  
— når behandlingsrelaterede histopatologiske forandringer observeres i 
højdosisgruppen, undersøges disse væv fra alle dyr i alle andre dosis ­
grupper  
— i tilfælde af parrede organer, f.eks. nyrer og binyrer, præserveres begge 
organer.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
DATA OG RAPPORTERING (KARCINOGENICITET OG KRONISK 
TOKSICITET)  
Data  
57. Der skal fremlægges data for de enkelte dyr for alle evaluerede parametre. 
Yderligere skal alle data opsummeres i tabeller, der for hver testgruppe viser antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr fundne døde i løbet af testen 
eller aflivede af humane grunde og tidspunktet for deres død, det antal dyr, 
der udviser tegn på toksicitet, en beskrivelse af disse tegn, inklusive tids ­
punktet for deres begyndelse, deres varighed og toksicitetsgraden; det antal dyr, der har læsioner, typen af læsioner og den procentdel af dyrene, der 
udviser de forskellige typer af læsion. I oversigtstabeller anføres middel- og 
standardafvigelser (for kontinuerlige testdata) for dyr, der udviser toksiske virkninger eller læsioner, samt gradueringen af læsioner.
 
58. Historiske kontroldata kan være værdifulde i forbindelse med fortolkningen 
af forsøgsresultaterne, f.eks. hvis der er tegn på, at data fra de samtidige 
kontroller er væsentligt afvigende i forhold til nylige data fra kontroldyr fra samme forsøgslaboratorium/koloni. Historiske kontroldata, som evalueres, bør indgives fra samme laboratorium og vedrøre dyr af samme alder og 
stamme genereret i de fem år forud for det aktuelle forsøg.
 
59. Hvor det er muligt, skal tallene evalueres ved hjælp af en passende og 
accepteret statistisk metode. Den statistiske metode og de data, der skal analyseres med den, skal vælges under planlægningen af forsøget (se afsnit 9). Ved udvælgelse bør der tages behov for evt. justeringer for over ­
levelse.
 
60. Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:  
Testkemikalie:  
— fysiske egenskaber, renhedsgrad og fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikationsdata  
— testkemikaliets kilde  
— batchnummer  
— certifikat for kemisk analyse.  
For eventuelt vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.  
For forsøgsdyrene:  
— anvendt art/stamme og begrundelse for anvendelse  
— dyrenes antal, alder og køn ved forsøgsstart  
— herkomst, miljøbetingelser, kost osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 500
Testbetingelser:  
— begrundelse for valg af administrationsvej og dosis  
— de statistiske metoder, der er anvendt til dataanalyse, hvis relevant  
— oplysninger om formuleringen af testkemikalie/fodertilberedning  
— analysedata om opnået koncentration, stabilitet og homogenitet for 
tilberedningen  
— administrationsvej og nærmere oplysninger om administrationen af test ­
kemikaliet  
— eksponering gennem næsen og helkropseksponering for inhalations ­
forsøg  
— faktiske doser (mg/kg kropsvægt/dag) og omregningsfaktor fra testkemi ­
kaliets koncentration i foder/vand (mg/kg eller ppm) til faktisk dosis, 
hvis muligt  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet.  
Resultater (opsummerende data og data for individuelle dyr opstilles i tabel ­
form):  
Generelt  
— data om overlevelse  
— kropsvægt og ændringer i kropsvægt  
— foderindtagelse, beregning af foderudnyttelse og indtagelse af vand, hvis 
muligt  
— toksikokinetiske data, hvis de forefindes.  
— oftalmoskopi (hvis tilgængelig)  
— hæmatologi (hvis tilgængelig)  
— klinisk kemi (hvis tilgængelig).  
Kliniske fund  
— tegn på toksicitet  
— incidens (og sværhedsgrad, hvis de er vurderet) af abnormiteter  
— art, sværhedsgrad og varighed af kliniske symptomer (hvad enten disse 
er forbigående eller permanente).  
Obduktionsdata  
— kropsvægt ved forsøgets slutning  
— organvægt og deres forhold, hvis relevant  
— obduktionsfund; incidens og sværhedsgrad af abnormiteter.  
Histopatologi  
— ikkeneoplastiske histopatologiske fund  
— neoplastiske histopatologiske fund  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— korrelation mellem makroskopiske og mikroskopiske fund  
— detaljeret beskrivelse af alle behandlingsrelaterede histopatologiske fund, 
herunder sværhedsgrader  
— rapport om peer review af objektglas.  
Evt. statistisk behandling af resultaterne  
Diskussioner af resultater, herunder:  
— diskussion af tilgange til modellering  
— dosis-responsforhold  
— historiske kontroldata  
— overvejelse af oplysninger om virkningsmåde  
— bestemmelse af BMD, NOAEL eller LOAEL  
— relevans for mennesker.  
Konklusioner  
LITTERATUR:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rom, 1995), internt arbejds ­
dokument, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208
 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445  
(6) Kapitel B.27 i dette bilag, Subkronisk oral toksicitetstest — et 90-dages 
forsøg over gentagne orale dosers toksicitet på ikke-gnavere.  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 og 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
findes på OECD's offentlige websted for Test Guidelines på www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) Kapitel B.8 i dette bilag. Subkronisk toksicitet (inhalation): 28-dages forsøg  
(10) Kapitel B.29 i dette bilag, Subkronisk toksicitet (inhalation): 90-dages 
forsøg  
(11) Kapitel B.9 i dette bilag, Toksicitet ved gentagen dosering (28 dage, 
dermal).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.  
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Moderniza ­
tion of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.  
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.  
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.  
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN og Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
(25) Usui T, Griffiths SA og Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. I D'Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen's University Press, Belfast. s. 279-284.  
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 
om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (EUT L 276 
af 20.10.2010, s. 33).  
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of 
Health and Human Services.  
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experi ­
ments. ISBN 3-906255-06-9.
 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems.  
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxi ­
cology, 21:15-23.
 
(32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
(33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
(36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 
(37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. 
Teratol. 13: 599-609.  
(38) Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(39) EMEA-dokument (udkast) »Non-clinical guideline on drug-induced hepa ­
totoxicity« (Dok. ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  REPRODUKTIONSTOKSICITETSUNDERSØGELS E I EN 
GENERATION  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Se den generelle indledning til del B.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Flere grupper af han- og hundyr doseres med teststoffet, idet der 
gives en dosis pr. gruppe. Handyr doseres under væksten og under mindst en fuldstændig spermiedannelsescyklus (ca. 56 dage for mus 
og 70 dage for rotter) med henblik på at fremkalde sundhedsmæssige 
uønskede virkninger, teststoffet måtte have på spermatogenesen.
 
Hundyr i F  0 -generationen doseres i mindst to fuldstændige østrale 
perioder for at fremkalde de skadelige virkninger, teststoffet even ­
tuelt måtte have på brunsten. Derefter parres dyrene. Begge køn doseres med teststof i parringsperioden, og derefter doseres kun 
hundyrene i drægtighedsperioden og laktationsperioden. Hvis dose ­
ring med teststof foregår ved inhalation, kræves ændringer af metoden.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Ingen.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Forberedelser  
Unge, sunde, kønsmodne dyr fordeles randomiseret i grupper. 
Dyrene holdes under forsøgsbetingelser med hensyn til miljø og fodring i mindst fem dage, inden forsøget påbegyndes. Det anbefa ­
les, at teststoffet administreres med foderet eller drikkevandet. Andre 
former for administration kan også accepteres. Alle dyr skal doseres på samme måde i hele forsøgsperioden. Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsætningsstoffer for at lette doseringen, skal det være 
påvist, at de ikke har nogen toksisk virkning. Dyrene skal doseres 
med teststoffet syv dage om ugen.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
F o r s ø g s d y r  
Valg af dyreart  
Rotten eller musen er de foretrukne forsøgsdyr. Stammen bør ikke 
have en lav fertilitet. Der benyttes sunde dyr, som ikke tidligere har været anvendt i forsøg. Forsøgsdyrene bør være velbeskrevne med 
hensyn til art, stamme, køn, vægt og/eller alder.
 
For at få en adækvat vurdering af fertilitet skal både han- og hundyr 
undersøges. Alle dyr i forsøgsgrupper og kontrolgrupper skal være 
fravænnet, før dosering påbegyndes.  
Antal og køn  
Hver enkelt forsøgs- og kontrolgruppe skal indeholde tilstrækkelig 
mange dyr, til at der kan findes ca. 20 drægtige hundyr, som er nær ved eller på fødetidspunktet.
 
Formålet hermed er at sikre, at der produceres tilstrækkelig meget 
afkom, til at der kan foretages en meningsfuld vurdering af teststof ­
fets potentielle virkning på fertilitet, drægtighed og moderdyrenes 
adfærd i F  0 -generationen samt dieadfærd, vækst og udvikling i F  1 - 
generationen fra undfangelse til dyrene er vænnet fra.  
F o r s ø g s b e t i n g e l s e r  
Foder og vand gives ad libitum. Når fødetidspunktet nærmer sig, 
placeres de drægtige hundyr i hvert sit bur, idet der benyttes føde ­
bure eller yngelbure, og dyrene kan eventuelt forsynes med materiale 
til redebygning.  
D o s i s n i v e a u e r  
Der anvendes mindst tre forskellige dosisniveauer samt en kontrol ­
gruppe. Hvis der anvendes et vehikel, doseres kontrolgruppen med 
samme mængde vehikel som den gruppe, der modtager den højeste 
dosis. Hvis et teststof fører til formindsket foderindtagelse eller inter ­
fererer med absorption og stofskifte, kan det være nødvendigt at anvende en kontrolgruppe, som er matchet med hensyn til foder. 
Medmindre der optræder begrænsninger som følge af teststoffets 
fysisk-kemiske natur eller biologiske egenskaber, bør den højeste dosis forårsage toksisk virkning, men ikke dødsfald i forældre (F
 0 )-generationen. Middeldosis (evt. flere) bør fremkalde de 
mindste konstaterbare toksiske virkninger af teststoffet, og den 
laveste dosis bør ikke have nogen toksisk effekt hverken på forældregenerationen eller afkommet, Hvis stoffet indgives med mavesonde eller i kapsel, bør den dosis, som hvert enkelt dyr 
modtager, udregnes på grundlag af dyrets legemsvægt og ugentligt 
tilpasses ændringer i denne legemsvægt. Dosering af drægtige hundyr kan baseres på legemsvægten på dag 0 eller 6, hvis man ønsker det.
 
G r æ n s e t e s t  
Hvis der ikke konstateres nogen virkning på reproduktionen ved en 
dosis på mindst 1 000 mg/kg af et lavtoksisk stof, kan yderligere testning betragtes som unødvendig. Hvis en indledende undersøgelse, hvor kun den højeste dosis benyttes, klart viser toksisk virkning på 
moderdyret, men ikke har nogen skadelig virkning på fertiliteten, kan 
yderligere testning betragtes som unødvendig.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
Fremgangsmåde  
F o r s ø g s p l a n  
Daglig dosering af forældre (F  0 )-generationen indledes, når dyrene er 
mellem fem og ni uger gamle, og efter at de er vænnet fra og akklimatiseret i mindst fem dage. Hvis der anvendes rotter, fortsættes 
doseringen i ti uger før parringsperioden (ved mus otte uger). Handy ­
rene skal enten aflives og undersøges efter parringsperioden, eller man kan fortsætte med at indgive dem teststoffet frem til en mulig produktion af et andet kuld, hvorefter de aflives og undersøges, et 
stykke tid før undersøgelsen afsluttes. Dosering af forældregenera ­
tionens hundyr indledes efter mindst fem dages akklimatisering og fortsætter mindst to uger før parring. Daglig dosering af F
 0 -hundy­
rene fortsættes gennem den tre uger lange parringsperiode, drægtig ­
hedsperioden og op til F  1 -generationen er vænnet fra. Man bør over ­
veje eventuelle ændringer i forsøgsplanen, hvis der foreligger infor ­
mationer om teststoffet fra specielle stofskifteundersøgelser eller undersøgelse af akkumulation.
 
P a r r i n g  
Der kan anvendes parring i forholdet 1:1 (et handyr og et hundyr) 
eller 1:2 (et handyr og to hundyr) i undersøgelser af reproduktions ­
toksicitet.  
Anvendes 1:1 parring, anbringes et hundyr med ethandyr, indtil der 
indtræder drægtighed, eller tre uger er gået, Hver morgen undersøges 
hundyrene for tilstedeværelse af sperma eller vaginalprop. Drægtig ­
hedsperiodens dag 0 fastlægges under hensyntagen til spermatoge ­
nesen som den dag, hvor der observeres vaginalprop eller sperma.  
De par, som ikke parrer sig, bør undersøges for fastlæggelse af 
årsagen til den tilsyneladende ufrugtbarhed.  
Dette kan gøres ved, at dyrene f.eks. får lejlighed til at parre sig med 
han- eller hundyr, hvis frugtbarhed er påvist, ved mikroskopisk undersøgelse af reproduktionsorganerne og ved undersøgelse af den østrale periode eller spermatogenesen.
 
K u l d s t ø r r e l s e  
De dyr, som doseres i fertilitetsundersøgelsen, bør have lov til at 
yngle normalt og pleje deres afkom frem til afvænning uden stan ­
dardisering.  
Hvis der gennemføres standardisering, foreslås følgende fremgangs ­
måde. Mellem dag 1 og 4 efter fødslen, standardiseres hvert kuld, ved at overskydende unger fjernes, således at hvert kuld kommer så tæt som muligt på at bestå af fire handyr og fire hundyr,
 
Hvis det på grund af antallet af han- og hundyr ikke er muligt at 
standardisere hvert kuld, så det indeholder fire af hvert køn, kan 
delvis standardisering accepteres (f.eks. fem handyr og tre hundyr). 
Der foretages ikke standardisering af kuld på mindre end otte unger.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
O b s e r v a t i o n  
Dyrene inspiceres mindst en gang om dagen under hele forsøget. 
Relevante adfærdsændringer, tegn på vanskelig eller forlænget fødsel og alle toksicitetstegn herunder mortalitet, registreres. Før og under parringsperioden registreres foderindtagelsen ugentligt. I 
drægtighedsperioden kan foderindtagelsen (og vandindtagelsen, 
hvis teststoffet administreres heri) registreres dagligt. Efter fødslen og i dieperioden måles foderindtagelsen på de samme dage, som kuldene vejes. Han- og hundyr af F
 0 -generationen vejes den dag, 
doseringen indledes og derefter en gang om ugen. Disse observa ­
tioner bar rapporteres individuelt for hvert enkelt udvokset dyr.  
Drægtighedsperioden beregnes fra dag 0. Hvert kuld undersøges så 
hurtigt som muligt efter fødslen for at fastslå ungernes antal og køn, antal dødfødte og levendefødte og forekomst af makroskopisk synlige abnormiteter.
 
Døde unger og unger, som aflives på dag 4, skal opbevares og 
undersøges for mulige defekter. Levende unger tælles, og kuldet 
vejes morgenen efter fødslen, på dag 4 og dag 7, og derefter en 
gang om ugen indtil undersøgelsens afslutning, hvor dyrene skal vejes individuelt.
 
Fysiske eller adfærdsmæssige abnormiteter, som observeres hos 
hundyrene eller afkommet skal registreres.  
Patologisk undersøgelse  
M a k r o s k o p i s k u n d e r s ø g e l s e  
F o -generationsdyr, som aflives efter eller dør under forsøget, under ­
søges makroskopisk med henblik på konstatering af strukturelle 
abnormiteter eller patologiske forandringer, idet opmærksomheden 
særlig rettes mod reproduktionssystemet. Døde eller døende unger undersøges for defekter.
 
H i s t o p a t o l o g i s k u n d e r s ø g e l s e  
Ovarier, uterus, cervix, vagina, testikler, bitestikler, sædblærer, 
prostata, accessoriske kønskirtler, hypofyse og målorgan(er) fra alle dyr i F
 0 -generationen præpareres med henblik på mikroskopisk 
undersøgelse. Skulle det undtagelsesvist forekomme, at disse 
organer endnu ikke har været underkastet undersøgelse i andre forsøg med multipel dosering, undersøges organerne fra dyrene i den gruppe, der har modtaget den højeste dosis, og i kontrolgruppen 
samt de dyr, som er døde under forsøget, mikroskopisk, hvis det er 
praktisk muligt.
 
Hvis der konstateres abnormiteter i organer fra disse dyr, undersøges 
disse organer også hos alle andre dyr i F  0 -generationen. Der fore ­
tages i så fald mikroskopisk undersøgelse af alle væv, som udviser makroskopisk patologiske forandringer. Som anført i afsnittet parring 
kan reproduktionsorganerne fra dyr, som formodes at være ufrugt ­
bare, også underkastes mikroskopisk undersøgelse.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. DATA  
Data opstilles i tabelform, som for hver gruppe viser antal dyr ved 
begyndelsen af forsøget, antal frugtbare handyr, antal drægtige hundyr, typer af forandringer og den procentdel dyr, som udviser 
hver enkelt type forandring.
 
Evaluering af resultaterne baseres så vidt muligt på en passende 
statistisk metode. Enhver anerkendt statistisk metode kan anvendes.  
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— anvendt dyreart/stamme  
— oplysning om toksisk respons inddelt efter køn og dosis, 
herunder fertilitet, drægtighed og afkommets levedygtighed  
— dødstidspunkt under forsøget eller overlevelse til forsøgets afslut ­
ning eller planlagt aflivningstidspunkt  
— tabel med angivelse af vægten af hvert enkelt kuld, ungernes 
gennemsnitlige vægt og hver enkelt unges vægt ved forsøgets 
afslutning  
— toksisk eller anden virkning på reproduktion, afkom, postnatal 
vækst  
— observationstidspunkt for hvert enkelt abnormitetstegn og den 
senere udvikling af abnormiteten  
— data for foder- og legemsvægt for Fo-generationen  
— obduktionsfund  
— detaljeret beskrivelse af alle mikroskopiske fund  
— eventuel statistisk behandling af resultaterne  
— diskussion af resultaterne  
— fortolkning af resultaterne.  
3.2. VURDERING OG FORTOLKNING  
Se den generelle indledning til del B.  
4. HENVISNINGER  
Se den generelle indledning til del B.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  REPRODUKTIONSTOKSICITETSUNDERSØGELS E I TO 
GENERATIONER  
1. METODE  
Metoden er gengivet efter OECD TG 416 (2001).  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med denne metode til reproduktionsundersøgelse i to gene ­
rationer er at skaffe generelle oplysninger om et teststofs effekter på 
forplantningssystemets integritet og funktion hos han- og hundyr, herunder gonadefunktion, brunstcyklus, parringsadfærd, konception, drægtighed, fødsel, laktation og fravænning samt afkommets vækst 
og udvikling. Undersøgelsen kan desuden give oplysninger om test ­
stoffets effekter på den neonatale morbiditet og mortalitet samt fore ­
løbige data om præ- og postnatal udviklingstoksicitet, foruden at tjene som vejledning for efterfølgende forsøg. Ud over at undersøge 
F
 l -generationens vækst og udvikling har metoden til formål at 
vurdere forplantningssystemets integritet og funktion hos han- og hundyr samt vækst og udvikling i F
 2 -generationen. For at skaffe 
supplerende viden om udviklingstoksicitet og funktionelle mangler 
kan man enten supplere denne protokol med forsøgsafsnit, som alt 
efter behov er baseret på metoder til undersøgelse af udviklingstok ­
sicitet og/eller udviklingsneurotoksicitet, eller gøre disse endpoints til genstand for særskilte forsøg med egnede forsøgsmetoder.
 
1.2. FORSØGSMETODENS PRINCIP  
Teststoffet administreres i graduerede doseringer til flere grupper 
hanner og hunner. Hannerne i P-generationen (F  0 -generationen) 
modtager stoffet i vækstperioden og i mindst én hel spermatogene ­
secyklus (ca. 56 døgn hos mus og 70 døgn hos rotter) for at frem ­
kalde eventuelle negative virkninger på spermatogenesen. Effekterne 
på sperma bestemmes ved en række spermaparametre (f.eks. sper ­
miemorfologi og -motilitet) og ved fremstilling af vævspræparater til detaljeret histopatologisk undersøgelse. Hvis der foreligger data vedrørende spermatogenesen fra et tidligere forsøg med gentagen 
dosering af tilstrækkelig varighed, f.eks. et 90-dages forsøg, 
behøver hannerne i P-generationen ikke indgå i vurderingen. Det anbefales dog at opbevare prøver eller digitale optagelser af spermier 
fra P-generationen med henblik på senere vurdering. Hunner i P- 
generationen doseres i vækstperioden og gennem flere hele brunst ­
cyklusser for at bestemme eventuelle negative virkninger af test ­
stoffet på den normale brunstcyklus, Teststoffet administreres til 
forældredyrene (P) i parringsperioden, gennem den resulterende 
drægtighedsperiode og gennem fravænningsperioden af afkommet F
 1 , Fra fravænningstidspunktet administreres stoffet til F  1 -afkommet 
under dettes opvækst og ind i voksenalderen, parringsperioden og 
frembringelse af en F  2 -generation, indtil F  2 -generationen er 
fravænnet.  
Alle dyr iagttages klinisk og undersøges patologisk for tegn på 
toksicitet med særlig vægt på integritet og funktion af forplantnings ­
systemet hos han- og hundyr samt afkommets vækst og udvikling.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3 BESKRIVELSE AF FORSØGSMETODEN  
1.3.1.  Valg af dyreart  
Rotten er den foretrukne art til forsøget. Anvendes andre arter, bør 
dette begrundes, og passende modifikationer vil være nødvendige. 
Der bør ikke anvendes stammer med ringe frugtbarhed eller kendt 
høj forekomst af udviklingsdefekter. Ved forsøgets begyndelse skal vægtvariationen mellem de anvendte dyr være mindst mulig og for hvert køn ikke over 20 % af gennemsnitsvægten.
 
1.3.2.  Miljøbetingelser og fodring  
Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22  o C (± 3  o C). Den 
relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og bør ikke overstige 
70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt labo ­
ratoriefoder og fri adgang til drikkevand. Valget af foder kan 
afhænge af nødvendigheden af at sikre passende iblanding af test ­
stoffet, når denne administrationsmåde anvendes.
 
Dyrene kan enten anbringes enkeltvis eller i bure med små grupper 
af samme køn. Parring bør finde sted i bure egnede til formålet. Efter tegn på kopulation anbringes de parrede hunner enkeltvis i fødebure 
eller yngelbure. De parrede rotter kan også holdes i små grupper og 
adskilles en eller to dage før fødslen. Parrede dyr skal forsynes med egnet og nærmere bestemt redemateriale, når fødselstidspunktet nærmer sig.
 
1.3.3.  Forberedelse af dyrene  
Der anvendes raske unge dyr. som er akklimatiseret til laboratorie ­
miljøet i mindst fem døgn og ikke tidligere er indgået i forsøg, 
Forsøgsdyrene skal være karakteriseret med hensyn til art, stamme, oprindelse, køn, vægt og/eller alder. Eventuelle søskenderelationer mellem dyrene skal være kendt, så parring af søskende undgås. 
Dyrene fordeles randomiseret i forsøgs- og kontrolgrupper (stratifi ­
cering efter kropsvægt anbefales). Burene skal arrangeres således, at eventuelle virkninger af burenes placering er mindst mulig. Hvert dyr tilordnes et unikt identifikationsnummer, For P-generationen skal 
dette ske inden doseringen begynder, For F
 1 -generationen skal 
dette ske ved fravænningen for dyr, som udvælges til parring. For alle udvalgte F
 1 -dyr registreres, hvilket kuld de er fra. Når det over ­
vejes at benytte individuel vejning af unger eller foretage funktions ­
test, anbefales, at ungerne identificeres individuelt snarest efter 
fødslen.  
Forældredyr (P) skal være 5 til 9 uger gamle, når doseringen påbe ­
gyndes. Dyrene i alle forsøgsgrupper skal så vidt muligt være af 
ensartet vægt og alder.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. FREMGANGSMÅDE  
1.4.1.  Dyrenes antal og køn  
I hver behandlings- og kontrolgruppe skal der være tilstrækkeligt 
med dyr til, at gruppen ved eller nær fødselstidspunktet består af 
helst mindst 20 drægtige hunner, For stoffer, som er årsag til 
uønskede behandlingsrelaterede virkninger (f.eks. sterilitet, stærk toksicitet i den høje dosering), kan dette eventuelt være umuligt. Formålet er at producere tilstrækkeligt med afkom til at sikre en 
meningsfuld vurdering af teststoffets potentiale for påvirkning af 
fertilitet, drægtighed og moderdyrenes adfærd og diegivning, F
 l - 
afkommets vækst og udvikling fra undfangelsen til fuld kønsmod ­
ning, og udviklingen af dettes afkom (F  2 ), frem til dyrene er vænnet 
fra. Hvis det ikke er lykkedes at frembringe det ønskede antal dræg ­
tige dyr (dvs. 20), er undersøgelsen ikke dermed nødvendigvis ugyl ­
dig, og der bør finde en konkret vurdering sted i det enkelte tilfælde.  
1.4.2.  Tilberedning af doser  
Det anbefales, at teststoffet administreres oralt (i foderet, i drikke ­
vandet eller med sonde), medmindre en anden administrationsvej (f.eks. dermal applikation eller inhalation) anses for mere velegnet.
 
Om nødvendigt opløses eller opslæmmes teststoffet i et egnet vehikel. 
Det anbefales, at man som første valg vurderer muligheden af at benytte 
en vandig opløsning/suspension, derefter en opløsning/suspension i olie (f.eks. majsolie), og først derefter eventuel opløsning i andre vehikler. For andre vehikler end vand må vehiklets toksiske egenskaber være 
kendt. Teststoffets stabilitet i vehiklet skal bestemmes.
 
1.4.3.  Dosering  
Der skal være mindst tre dosisgrupper og en sideløbende kontrol ­
gruppe. Medmindre der optræder begrænsninger som følge af test ­
stoffets fysisk-kemiske natur eller biologiske egenskaber, skal den 
højeste dosering vælges således, at den giver toksisk effekt, men 
ikke død eller alvorlige lidelser. I tilfælde af uventet dødelighed er forsøg med en dødelighed på under ca. 10 % i forældregenerationen (P) normalt stadig acceptable. Der vælges en aftagende række dosis ­
niveauer, som giver mulighed for at påvise en eventuel dosis ­
afhængig respons samt det niveau, hvor ingen skadelig effekt iagt ­
tages (NOAEL). Ved fastlæggelse af en sådan aftagende række dosisniveauer vil det optimale interval ofte svare til en faktor to til 
fire, og i mange tilfælde må det foretrækkes at tilføje en fjerde 
behandlingsgruppe frem for at operere med meget store intervaller (f.eks. større end en faktor 10) mellem dosisniveauerne. I undersø ­
gelser med indgift i foderet bør dosisintervallet ikke være større end 
svarende til en faktor 3. Doseringen vælges under hensyntagen til 
eventuelle foreliggende toksicitetsdata, især resultaterne af forsøg med gentagen dosering. Eventuelle foreliggende oplysninger om metabolisme og kinetik af teststoffet eller beslægtede stoffer skal 
ligeledes tages i betragtning. Sådanne oplysninger kan desuden 
være med til at godtgøre det hensigtsmæssige i den valgte dosering.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Kontrolgruppen skal være ubehandlet eller behandles med vehikel, 
hvis et sådant anvendes til administration af teststoffet. Bortset fra 
behandling med teststof skal dyrene i kontrolgruppen (-grupperne) håndteres på samme måde som behandlingsgruppen. Anvendes vehi ­
kel, skal dyrene i kontrolgruppen modtage vehiklet i det største 
anvendte volumen. Hvis et teststof administreret i foderet medfører 
reduceret fødeindtagelse eller -udnyttelse, kan parvis fodring sammen med kontrolgruppen være nødvendig. I stedet for parvis fodring sammen med kontrolgruppen kan anvendes data fra kontrollerede 
undersøgelser, som er udformet til vurdering af virkningerne af 
nedsat fødeindtagelse på reproduktionsparametrene.
 
For vehiklet og andre tilsætningsstoffer skal følgende egenskaber 
tages i betragtning: Dets effekt på teststoffets absorption, fordeling, metabolisme og retention, dets eventuelle indvirkning på teststoffets kemiske egenskaber med deraf følgende ændring af dettes toksiske 
egenskaber, og dets indvirkning på dyrenes føde- og vandindtagelse 
og ernæringstilstand.
 
1.4.4.  Grænsetest  
Såfremt et oralt enkeltdosisniveau på mindst 1 000 mg/kg 
kropsvægt/døgn eller en ækvivalent procentdel tilsat foderet eller 
drikkevandet med de til dette forsøg beskrevne metoder hverken 
frembringer observerbar toksisk virkning i forældredyrene eller deres afkom, og såfremt foreliggende data fra strukturelt og/eller metabolisk beslægtede forbindelser ikke giver anledning til at 
forvente nogen virkning, er et komplet forsøg med flere dosis ­
niveauer ikke nødvendigvis påkrævet, Grænsetesten skal være gældende, medmindre den påregnede udsættelse af mennesker tilsiger, at der anvendes et højere oralt dosisniveau. For andre admi ­
nistrationsmåder — f.eks. inhalation eller dermal applikation — kan 
teststoffets fysisk-kemiske egenskaber, f.eks. opløseligheden, ofte være bestemmende for og begrænsende for det maksimale opnåelige ekspositionsniveau.
 
1.4.5.  Administration af doser  
Dyrene modtager teststoffet syv dage om ugen. Oral administration 
(foder, drikkevand eller sonde) er at foretrække. Anvendes anden administrationsvej, bør valget begrundes, og passende modifikationer kan være nødvendige. Alle dyr skal modtage stoffet på samme måde 
i den pågældende forsøgsperiode. Administreres teststoffet med 
sonde, skal en gastrisk sonde anvendes. Der må ikke på én gang gives et væskevolumen over 1 ml/l00 g kropsvægt (for majsolie ikke over 0,4 ml/100 g kropsvægt), bortset fra vandige opløsninger, som 
kan gives i mængder på 2 ml/100 g kropsvægt, Hvis der ikke er tale 
om lokalirriterende eller ætsende stoffer, hvis effekt sædvanligvis er værre ved højere koncentration, skal variabiliteten af testvolumenet minimeres gennem justering af koncentrationen, således at der sikres 
et konstant volumen ved alle dosisniveauer. I forsøg med indgift 
gennem sonde vil ungerne normalt kun få teststoffet indirekte gennem mælken, indtil den direkte dosering begynder ved fravæn ­
ning. I forsøg med indgift gennem foder eller drikkevand vil ungerne 
desuden modtage teststoffet direkte, når de begynder selv at æde i 
den sidste del af laktationsperioden.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
For stoffer administreret i foderet eller drikkevandet er det vigtigt at 
sikre, at det pågældende teststof i den anvendte mængde ikke griber 
ind i den normale ernærings- eller vandbalance, Ved indgift af test ­
stoffet i foderet kan stoffet enten gives ved konstant koncentration i foderet (ppm) eller ved et konstant dosisniveau i forhold til dyrets 
kropsvægt; det skal angives, hvilken mulighed der er valgt. Ved 
indgift med sonde skal dosis gives pa tilsvarende tidspunkt hver dag og skal justeres mindst en gang om ugen, så dosisniveauet holdes konstant i forhold til kropsvægten. Ved justering af dose ­
ringen via sonde på grundlag af vægten skal kendskabet til 
fordelingsforholdene i placenta tages betragtning,
 
1.4.6.  Forsøgsplaner  
Den daglige indgift til hanner og hunner i forældregenerationen (P) 
begynder, når dyrene er 5 til 9 uger gamle. Den daglige dosering af 
hanner og hunner i F  1 -generationen begynder ved fravænningen; 
man bør have for øje. at ved administration af teststoffet i foder eller drikkevand kan ungerne i F
 1 -gruppen blive direkte eksponeret 
for teststoffet allerede i laktationsperioden. For begge køn (P og F  1 ) 
skal doseringen fortsætte i mindst 10 uger før parringsperioden. Doseringen fortsætter hos begge køn i den to uger lange parrings ­
periode. Når der ikke længere er brug for handyrene til vurdering af 
reproduktionstoksiske virkninger, aflives de af humane grunde og 
undersøges. For hunner i forældregenerationen (P) fortsætter dose ­
ringen gennem hele drægtighedspeiioden og indtil fravænning af afkommet i F
 1 -generationen. Ændringer i doseringsplanen må over ­
vejes ud fra de foreliggende oplysninger om teststoffet, herunder 
foreliggende toksicitetsdata, induktion af metabolisering samt bioakkumulering. Doseringen til det enkelte dyr bør normalt baseres på den seneste individuelle bestemmelse af dyrets vægt. I 
drægtighedsperiodens sidste trimester må dog udvises forsigtighed 
med justering af doseringen.
 
Behandlingen af hanner og hunner i P- og F  1 -generationen skal 
fortsætte til forsøgets afslutning, Af humane grunde aflives alle 
voksne hanner og hunner i P- og F  1 -generationen, når der ikke 
længere er brug for dem til vurdering af reproduktionstoksiske virk ­
ninger. Af humane grunde aflives de dyr i F  1 generationen, som ikke 
udvælges til parring, og alle dyr i F  2 -generationen.  
1.4.7.  Parringsmetode  
1.4.7.1.  Parring af forældregenerationen (P)  
Til hver parring anbringes hver hun sammen med én han på samme 
dosisniveau (1:1 parring), indtil kopulation finder sted eller der er 
gået to uger. Hunnerne undersøges hver dag for tilstedeværelse af 
sperma eller vaginalprop. Drægtighedsperiodens dag 0 er den dag, hvor der findes en vaginalprop eller sperma. Lykkes parring ikke, kan fornyet parring af hunnerne med afprøvede hanner fra samme 
gruppe overvejes. De parrede dyr skal være tydeligt identificeret i 
data. Parring af søskende skal undgås.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  Parring af F  1 
Til parring af F  l -afkommet vælges mindst én han og én hun fra hvert 
kuld ved afvænningen til parring med andre unger på samme dosis ­
niveau, men fra et andet kuld, med henblik på frembringelse af F  2 - 
generationen. Valg af unger fra hvert kuld skal ske tilfældigt, når der 
ikke iagttages væsentlige forskelle i kropsvægt eller udseende mellem magerne fra kuldene. Iagttages sådanne forskelle, vælges den bedste repræsentant for hvert kuld. Det mest pragmatiske er at 
dette sker på vægtbasis, men det kan være mere hensigtsmæssigt at 
lade det ske på basis af udseendet. F
 1 -afkommet må ikke parres, før 
de er fuldt kønsmodne.  
Par uden afkom vurderes med henblik på bestemmelse af den 
tilsyneladende årsag til steriliteten. Dette kan bestå i at give 
mulighed for en ekstra parring med afprøvede fædre eller mødre, makroskopisk undersøgelse af kønsorganerne og undersøgelse af brustcyklus eller spermatogenese.
 
1.4.7.3.  Anden parring  
I visse tilfælde, således ved behandlingsrelaterede ændringer i kuld ­
størrelse eller tvivlsom effekt af første parring, anbefales det, at de voksne dyr i P- eller F
 1 -generationen parres igen, så de får endnu et 
kuld unger. Det anbefales, at de hanner eller hunner, som ikke har 
frembragt afkom, parres igen med påvist yngledygtige dyr af det 
modsatte køn. Hvis det skønnes nødvendigt at producere et ekstra kuld i nogen af generationerne, skal dyrene parres igen ca. en uge efter fravænning af sidste kuld.
 
1.4.7.4.  Kuldstørrelse  
Dyrene skal yngle på normal måde og pleje afkommet indtil fravæn ­
ning. Standardisering af kuldstørrelserne er frivillig. Anvendes stan ­
dardisering, skal metoden beskrives i detaljer.  
1.5. OBSERVATIONER  
1.5.1.  Klinisk observation  
Dyrene observeres dagligt klinisk, og ved sondeindgift foretages 
denne observation under hensyntagen til tidspunktet for den forven ­
tede maksimale virkning efter administrationen. Adfærdsændringer, 
tegn på vanskelig eller langstrakt fødsel og alle tegn på toksicitet 
registreres. En yderligere, mere detaljeret undersøgelse af hvert dyr foretages mindst en gang ugentligt, hvilket passende kan ske i forbindelse med vejning af dyret. Alle dyr iagttages to gange 
dagligt for morbiditet ug mortalitet, i weekenden én gang dagligt 
når det er hensigtsmæssigt.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2.  Forældredyrenes kropsvægt og føde- og vandindtagelse  
Forældredyrene (P og F  1 ) vejes den første dag de modtager stoffet 
og derefter mindst en gang om ugen. Hunnerne i forældregeneratio ­
nerne (P og F  1 ) vejes som minimum på dag 0, 7, 14, og 20 eller 21 i 
drægtighedsperioden, i laktationsperioden på de dage, hvor kuldene 
vejes, samt på aflivningsdagen. Disse iagttagelser rapporteres indivi ­
duelt for hvert voksent dyr. I tiden før parring og i drægtigheds ­
perioden skal fødeindtagelsen måles mindst en gang om ugen. 
Vandindtagelsen skal måles mindst en gang om ugen, hvis teststoffet 
gives i vandet.  
1.5.3.  Brunstcyklus  
Hos hunnerne i P- og F  1 -generationen vurderes brunstcyklussens 
længde og normale forløb med vaginalt smear før parring samt ikke obligatorisk i parringsperioden, indtil der findes tegn på parring, Udtagning af celleprøve fra vagina/cervix skal ske forsigtigt for at 
undgå forstyrrelse af slimhinden med efterfølgende induktion af 
pseudodrægtighed (1).
 
1.5.4.  Spermaparametre  
For alle hanner i P- og F  1 generationen registreres vægten af testes 
og epididymides ved forsøgets slutning, og det ene af hvert organ 
udtages til histopatologisk undersøgelse (se punkt 1.5.7, 1.5.8.1). Fra en delmængde bestående af mindst 10 hanner af hver gruppe hanner i P- og F
 1 -generationen anvendes de øvrige testes og epididymides til 
tælling af henholdsvis homogeniseringsresistente spermatider og 
spermiebeholdning i cauda epididymidis. For samme delmængde af hanner opsamles sperma fra cauda epididymidis eller vas deferens til undersøgelse af spermiemotilitet og spermiemorfologi. Hvis der iagt ­
tages behandlingsrelaterede virkninger eller der i andre undersøgelser 
er fundet tegn på en mulig påvirkning af spermatogenesen, skal spermaundersøgelse finde sted hos alle hanner i hver dosisgruppe; ellers kan optællingen indskrænkes til kontrolgruppen og hannerne i 
højdosisgrupperne i P og F
 1 . 
Det samlede antal homogeniseringsresistente testikulære spermatider 
og spermier i cauda epididymidis opgøres (2)(3). Spermiebehold ­
ningen i cauda kan beregnes af spermiekoncentration og -volumen 
i den suspension, der benyttes til den kvalitative vurdering og 
antallet af spermier, som opsamles ved findeling og/eller homogeni ­
sering af det øvrige caudavæv. Optællingen på den valgte delmængde af hanner af alle dosisgrupper foretages straks efter afliv ­
ning af dyrene, medmindre prøverne fryses og analyseres senere, I 
disse tilfælde kan kontroldyrene og højdosisgruppen analyseres først. Hvis der ikke optræder behandlingsrelaterede virkninger (på f.eks, spermietal, -motilitet og -morfologi), behøver de andre dosisgrupper 
ikke analyseres. Findes der behandlingsrelaterede virkninger i 
højdosisgruppen, skal grupperne på lavere dosis også analyseres.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Motiliteten af spermier i epididymis (eller ductus deferens) 
bedømmes eller optages på videobånd straks efter aflivning. Udtag ­
ning af af spermier skal ske på en måde, så skaden er mindst muligt, og spermierne fortyndes med henblik på motilitetsanalyse med acceptable metoder (4). Procentdelen af fremadbevægelige (progres ­
sivt motile) spermier bestemmes enten subjektivt eller objektivt. 
Foretages der computerassisteret motilitetsanalyse (5)(6)(7)(8)(9)(10) er beregningen af progressiv motilitet baseret på brugerdefinerede tærskelværdier for gennemsnitsvejlængde, hastighed og retlinjethed 
(lineært indeks). Hvis der optages videobånd af prøverne (11) eller 
billederne på anden måde registreres på obduktionstidspunktet, kan den efterfølgende analyse af handyr i P- og F
 1 -generationen 
indskrænkes til kontrol- og højdosisgrupppen, medmindre der 
konstateres behandlingsrelaterede virkninger, i hvilket tilfælde også 
grupperne på de lavere doseringer skal bedømmes. I mangel af videooptagelse eller digitalt billede skal alle prøver fra alle behand ­
lingsgrupper analyseres ved obduktionen.
 
Der foretages en morfologisk bedømmelse af en spermaprøve fra 
epididymis (eller vas deferens), Spermier (mindst 200 i hver prøve) undersøges som fikserede, våde præparater (12) og klassifi ­
ceres som enten normale eller anormale. Som eksempel på morfolo ­
giske spermieabnormiteter kan nævnes sammensmeltning, isoleret hoved og misdannet hoved og/eller hale. Optællingen finder sted på den udvalgte delmængde af hanner fra alle grupper enten straks 
efter aflivning af dyrene eller senere baseret på videobånd og digitale 
optagelser, Smears kan, når først de er fikseret, undersøges senere. I disse tilfælde kan kontroldyrene og højdosisgruppen analyseres først. Hvis der ikke optræder behandlingsrelaterede virkninger (f.eks. virk ­
ninger på spermiemorfologien), behøver de andre dosisgrupper ikke 
analyseres. Når der konstateres behandlingsrelaterede virkninger i højdosisgruppen, skal grupperne på lavere dosering også analyseres.
 
Hvis nogen af ovennævnte parametre for spermieevaluering allerede 
er undersøgt som led i en systemisk toksicitetsundersøgelse af mindst 90 dages varighed, behøver de ikke nødvendigvis gentages i to generationers forsøget. Det anbefales dog, at prøver eller digitale 
optagelser af spermier fra P-generationen opbevares for at give 
mulighed for senere vurdering, hvis dette viser sig nødvendigt.
 
1.5.5.  Afkom  
Hvert kuld undersøges hurtigst muligt efter fødslen (dag 0 i lakta ­
tionsperioden) til bestemmelse af ungernes antal og køn. dødfødte, levendefødte og tilstedeværelse af alvorlige abnormiteter. Unger, som findes døde på dag 0 bør, hvis de ikke er opløst, helst undersøges for 
eventuelle defekter og dødsårsag og præserveres. Levende unger 
tælles og vejes enkeltvis ved fødslen (dag 0 i laktationsperioden) eller på dag 1, og derefter på de regelmæssige vejningsdage, dvs, på dag 4, 7, 14 og 21 i laktationsperioden. Fysiske eller adfærds ­
mæssige abnormiteter iagttaget hos moderdyr eller afkom skal regi ­
streres.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Afkommets fysiske udvikling skal registreres, hovedsagelig som stig ­
ning i kropsvægt, Andre fysiske parametre (f.eks åbning af ører og 
øjne, tandfrembrud, hårvækst) kan give supplerende oplysninger, men evalueringen deraf bør fortrinsvis finde sted sammen med data vedrørende kønsmodning (f.eks. alder og kropsvægt på tids ­
punktet for åbning af vagina eller for den balano-præputiale separa ­
tion) (13). Det anbefales at udføre funktionelle undersøgelser (f.eks udvikling i motorisk aktivitet, sansefunktioner, reflekser) på F
 1 -gene­
rationen før og/eller efter afvænning, medmindre sådanne undersø ­
gelser indgår i særskilte forsøg: Især gælder dette undersøgelser 
relateret til kønsmodningen. For de fravænnede unger i F  1 -genera­
tionen, som er udvalgt til parring, bestemmes alderen på tidspunktet for åbning af vagina og separation af præputium. På ungerne i F
 2 - 
generationen måles den anogenitale afstand ved dag 0 efter fødslen, 
når dette tilsiges af forandringer i Figenerationens kønssammensæt ­
ning eller tidspunktet for kønsmodning.  
Funktionsundersøgelser kan udelades for grupper, som på anden 
måde viser tydelige tegn på negative påvirkninger (f.eks. væsentligt nedsat tilvækst osv.). Foretages der funktionsundersøgelser, skal 
disse ikke omfatte de unger, der er udvalgt til parring.
 
1.5.6  Makroskopisk undersøgelse ved obduktion  
Ved forsøgets slutning eller ved indtræden afdød under undersø ­
gelsen undersøges alle forældredyr (P og F  l ), alle unger med ydre 
abnormiteter eller kliniske symptomer samt en (et) tilfældigt udvalgt unge/køn/kuld fra både F
 l - og F  2 -generationen makroskopisk for 
eventuelle strukturabnormiteter og patologiske forandringer. Særligt 
kønsorganerne skal undersøges. Unger, som aflives af humane grunde i moribund tilstand samt døde unger, når de ikke er opløst, undersøges for eventuelle defekter og/eller dødsårsag og præserveres.
 
På alle førstegangsfødende hunner undersøges uterus på en måde, 
som ikke vanskeliggør histopatologisk bedømmelse, for tilstedevæ ­
relse af og antal implantationssteder.  
1.5.7.  Organvægt  
Ved forsøgets afslutning bestemmes kropsvægt og vægten af 
følgende organer på alle forældredyr i P-generationen og F  1 -genera­
tionen (parrede organer vejes enkeltvis):  
— uterus, ovarier  
— testes, epididymides (total og cauda)  
— prostata  
— vesiculae seminales med prostata anterior (coagulating glands) og 
disses væskeindhold samt prostata (som én samlet enhed)  
— hjerne, lever, nyrer, milt, hypofyse, skjoldbruskkirtel og binyrer 
samt kendte målorganer.  
Kropsvægten ved forsøgets slutning bestemmes for under i F  1 - og 
F 2 -generationen, som udvælges til obduktion, og følgende organer 
fra den (det) ene tilfældigt udvalgte unge/køn/kuld (se punkt 1.5.6) 
vejes: hjerne, milt og thymus.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Resultaterne af den makroskopiske obduktion og organvejningen 
sammenholdes, når det er praktisk muligt, med observationer fra 
andre forsøg med gentagen dosering.  
1.5.8.  Histopatologi  
1.5.8.1.  Forældredyr  
Følgende organer og væv fra forældredyr (P og F  1 ) eller repræsen ­
tative prøver deraf fikseres og opbevares i et passende medium til histopatologisk undersøgelse:
 
— vagina, uterus med cervix og ovarier (præserveret i hensigtsmæs ­
sigt fiksativ)  
— én testis (præserveret i Bouins fiksativ eller tilsvarende), én 
epididymis, vesiculae seminales, prostata og prostata anterior (coagulating gland)
 
— tidligere udpegede målorgan(er) fra alle de dyr i P- og F  1 -gene­
rationen, som er udvalgt til parring.  
Af ovennævnte præserverede organer og væv foretages fuldstændig 
histopatologisk undersøgelse for alle de dyr i højdosis- og kontrol ­
grupperne i P- og F  1 -generationen, som er udvalgt til parring. Under ­
søgelse af ovarierne fra dyrene i P-generationen er ikke obligatorisk. 
De organer fra lav- og mellemdosisgrupperne, som udviser behand ­
lingsrelaterede forandringer, skal ligeledes undersøges som led i fast ­
sættelsen af NOAEL. Derudover skal den histopatologiske undersø ­
gelse omfatte kønsorganerne fra de dyr i lav- og mellemdosisgrup ­
pen, som mistænkes for nedsat fertilitet, fordi de f.eks. ikke har 
været i stand til at parre sig, undfange, besvangre eller føde rask afkom, eller hvis brunstcyklus, spermietal -motilitet eller -morfologi var påvirket. Alle makroskopiske forandringer som atrofi eller 
tumorer undersøges.
 
Detaljeret histopatologisk undersøgelse af testes (f.eks. med Bouins 
fiksativ, paraffinfiksering og tværsnit af 4-5 μm's tykkelse) skal fore ­
tages til påvisning af behandlingsrelaterede effekter som manglende frigivelse af spermatider, manglende kimcellelag eller -typer, multi ­
nukleære kæmpeceller eller vandring af spermatogene celler ind i 
lumen (14). Undersøgelse af den intakte epididymis skal omfatte 
caput, corpus og cauda, hvilket kan ske ved vurdering af et længdes ­
nit. Epididymis skal gennemgås med henblik på leukocytinfiltration, ændret forekomst af celletyper, afvigende celletyper, og fagocytose 
af spermier. Til undersøgelse af handyrenes kønsorganer kan 
anvendes PAS- og hæmatoxylinfarvning.
 
Ovariet i postlaktationsperioden skal indeholde primordial- og 
voksende follikler foruden de store corpora lutea fra laktationsperio ­
den. Den histopatologiske undersøgelse skal kunne påvise en even ­
tuel kvalitativ forringelse af bestanden af primordialfollikler. For hundyr i F
 1 -generationen foretages en kvantitativ vurdering af 
primordialfolliklerne; antal dyr, valg af ovariesnit og størrelsen af 
prøvesnit skal være statistisk tilpasset den anvendte vurderings ­
metode. Undersøgelsen skal omfatte en optælling af primordialfol ­
likler, hvilket kan kombineres med optælling af små voksende follik ­
ler, med henblik på sammenligning af ovarierne i behandlingsgmppe 
og kontrolgruppe (15)(16)(17)(18)(19).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Fravænnede unger  
Makroskopisk abnormt væv og målorganer fra alle unger med ydre 
abnormiteter eller kliniske symptomer samt fra den/det ene tilfældigt udvalgte unge/køn/kuld fra både F
 1 - og F  2 -generationen, som ikke er 
udvalgt til parring, fikseres og opbevares i et passende medium til 
histopatologisk undersøgelse. Det præserverede væv skal gennemgå fuld histopatologisk karakterisering med særlig vægt på kønsorga ­
nerne.
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Data rapporteres for hver forsøgsgruppe og generation og sammen ­
fattes i tabelform med angivelse, for hver forsøgsgruppe og hver 
generation, af antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, tidspunkt for eventuel død eller humanitær aflivning, antal fertiele 
dyr, antal drægtige hundyr, antal dyr, som viser tegn på toksisk 
virkning, beskrivelse af iagttagne toksicitetstegn, herunder begyndel ­
sestidspunkt, varighed og sværhed af alle de toksiske virkninger, arten af de fund, der er gjort på forældredyr og afkom, arten af de 
histopatologiske forandringer, og alle relevante data om kuldene.
 
Til bedømmelse af talmateriale anvendes en hensigtsmæssig, almin ­
delig anerkendt statistisk metode; valg af statistiske metoder skal indgå som en del af undersøgelsens design og skal begrundes. 
Statistiske modeller for dosis-respons-sammenhæng kan være 
nyttige til dataanalyse. Rapporten skal indeholde tilstrækkelige oplysninger om analysemetoden til, at en uafhængig rapportør/statistiker kan revurdere og gentage analysen.
 
2.2. VURDERING AF RESULTATER  
Fundene i denne reproduktionsundersøgelse i to generationer 
vurderes med hensyn til de iagttagne effekter, herunder obduktions ­
fund og mikroskopiske fund. Vurderingen skal omfatte sammen ­
hæng, eller mangel herpå, mellem dyrenes udsættelse for teststoffet og tilstedeværelse eller fravær, incidens og sværhedsgrad af abnor ­
miteter, herunder makroskopiske forandringer, identificerede 
målorganer, påvirkning af fertiliteten, unormale kliniske fund, 
påvirkning af reproduktions- og ynglepræstationer, kropsvægtfor ­
andringer, indvirkning på mortaliteten og eventuelle toksiske effek ­
ter. Prøvestoffets fysisk-kemiske egenskaber og eventuelle forelig ­
gende toksikokinetiske data skal indgå i vurderingen af forsøgets 
resultater.
 
En korrekt udført reproduktions-toksicitetsundersøgelse skal give et 
tilfredsstillende skøn over nulvirkningsniveauet og indsigt i negative 
virkninger på reproduktion, fødsel, laktation og postnatal udvikling, 
herunder vækst og kønsmodning.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. FORTOLKNING AF RESULTATER  
En reproduktionstoksicitetsundersøgelse i to generationer giver 
oplysninger om virkningerne af gentagen eksponering for et stof i alle faser af reproduktionscyklussen. Navnlig giver undersøgelsen 
oplysninger om reproduktionsparametre og om afkommets udvikling, 
vækst, kønsmodning og overlevelse. Undersøgelsens resultater skal fortolkes i sammenhæng med fundene i forsøgene vedrørende subkronisk toksicitet, prænatal udviklingstoksicitet, toksikokinetik 
og andre foreliggende undersøgelser. Undersøgelsens resultater kan 
anvendes til at vurdere behovet for yderligere undersøgelse af et kemisk stof. Undersøgelsens resultater kan i begrænset omfang over ­
føres til mennesker. Resultaterne kan bedst anvendes til at give 
oplysninger om nulvirkningsniveau og tilladelig eksponering af mennesker (20)(21)(22)(23).
 
3. RAPPORTERING  
FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
For teststoffet:  
— fysisk form og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikationsdata  
— renhed.  
For eventuel vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand.  
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte art/stamme  
— dyrenes antal, alder og køn  
— oprindelse, miljøbetingelser, kost, redematerialer osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  
For forsøgsbetingelserne:  
— rationale for valg af dosisniveau  
— oplysninger om formuleringen af teststof/fodertilberedning, 
opnået koncentration  
— tilberedningens stabilitet og homogenitet  
— oplysninger om administration af teststoffet  
— i givet fald, omregning fra teststofkoncentration i 
foder/drikkevand (ppm) til opnået dosis (mg/kg kropsvægt/døgn)  
— oplysninger om foderets og vandets kvalitet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
For resultaterne:  
— fødeindtagelse og vandforbrug, hvis disse foreligger, foderudnyt ­
telse (kropsvægtforøgelse pr. gram indtaget foder), og forbrug af 
forsøgsmateriale for P- og F  1 dyrene, bortset fra perioden hvor 
dyrene har været sammen og for mindst den sidste tredjedel af laktationsperioden
 
— absorptionsdata (hvis de foreligger)  
— kropsvægtdata for dyrene i P- og F  1 -generationen udvalgt til 
parring  
— vægtdata for kuld og unger  
— kropsvægt ved aflivning og absolut og relativ organvægt for 
forældredyrene  
— art, sværhedsgrad og varighed af kliniske symptomer (hvad enten 
disse er reversible eller ikke)  
— tidspunktet for dødens indtræden under forsøget eller hvorvidt 
dyrene overlevede til forsøgets afslutning  
— toksisk respons fordelt på køn og dosering, med angivelse af 
indekstal for parring, fertilitet, drægtighed, fødsel, levedygtighed og laktation; rapporten skal angive de tal, der er benyttet til beregning af sådanne indekser
 
— toksisk effekt eller andre effekter på reproduktion, afkom, post ­
natal vækst osv.  
— obduktionsfund  
— detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund  
— antal hunner i P- og F  1 -generationen med normal brunstcyklus, 
og cyklussens længde  
— totalt antal spermier i cauda epididymis, procentdel progressivt 
motile spermier, procentdel morfologisk normale spermier, og 
procentdel spermier med hver af de fundne abnormiteter  
— tid indtil parring, inkl. antal døgn indtil parring finder sted  
— drægtighedsperiodens længde  
— antal implantationer, corpora lutea, kuldstørrelse  
— antal levendefødte og postimplantationstab  
— antal unger med makroskopisk synlige abnormiteter, antal små 
uudviklede unger skal angives, hvis de er optalt  
— data vedrørende fysiske kendetegn hos unger, og andre data 
vedrørende den postnatale udvikling; Det skal begrundes, 
hvilke fysiske kendetegn der er evalueret  
— i det omfang det er relevant, data vedrørende iagttagelser af 
funktioner hos unger og voksne  
— når det er hensigtsmæssigt, statistisk behandling af resultaterne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Diskussion af resultater.  
Konklusioner, herunder NOAEL (højeste niveau uden tegn på 
skadelig effekt) for moderdyr og afkom.  
4. HENVISNINGER  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduc ­
tion in Mummals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston 
and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
(2) Gray, L.E. et al, (1989). A Dose-Response Analysis of Metho ­
xychlor-lnduced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108.
 
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of 
Reproduction und Fertility 54:103-107.  
(4) Kimefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. 
Reproductive Toxicology 5:39 44.  
(5) Seed. J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237-244.
 
(6) Chapin, R.E. et al. (1992).Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility. Reproductive Toxicology 6:267-273.  
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421.  
(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologie Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458.  
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxi ­
cology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.
 
(10) Toth. G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat 
Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Admini ­
stration: Methodologie and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10:401-415.
 
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomi ­
crographie Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy 8:330-337.  
(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.
 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction 17:298303.  
(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
 
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, 
Orlando, Florida.  
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.
 
(17) Manson, J.M. and Y.J.Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5:379-383.  
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. 
and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
 
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, I. Doull, and CD. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male 
Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Prin ­
ciples and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.). Raven Press, New York.
 
(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOKSIKOKINETIK  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD TG 417 (2010). Forsøg vedrørende et 
testkemikalies toksikokinetik (TK) gennemføres for at fremskaffe tilstrække ­
lige oplysninger om dets absorption, fordeling, biotransformation (dvs. 
metabolisme) og udskillelse til at relatere koncentration eller dosis til den 
observerede toksicitet og til at opnå en forståelse af dets toksicitetsmeka ­
nisme. TK kan hjælpe med at forstå toksikologiforsøgene ved at påvise, at forsøgsdyrene systematisk eksponeres for testkemikaliet, og ved at afdække 
de omsættende dele (oprindeligt kemikalie/metabolitter). Grundlæggende 
TK-parametre, der er fastlagt ud fra disse forsøg, giver også information om potentialet for akkumulering af testkemikaliet i væv og/eller organer og potential for induktion af biotransformation som følge af eksponeringen for 
testkemikaliet.
 
2. TK-data kan bidrage til en vurdering af relevansen og tilstrækkeligheden af 
toksicitetsdata vedrørende dyr med henblik på ekstrapolering til fare- og/eller risikovurderinger for mennesker. TK-forsøg kan endvidere give 
nyttige oplysninger til fastlæggelse af dosisniveauer til toksicitetsforsøg 
(lineær i forhold til ikke-lineær kinetik), virkninger af administrationsvej, biotilgængelighed og forhold vedrørende forsøgsdesign. Visse typer TK-data kan bruges til udvikling af fysiologisk baserede toksikokinetiske 
modeller (PBTK).
 
3. Metabolit-/TK-data kan anvendes på vigtige områder og kan f.eks. give 
forslag om mulige toksiciteter og virkningsmåder og deres sammenhæng med dosisniveau og eksponeringsvej. Metabolismedata kan desuden frem ­
skaffe oplysninger, der kan bruges til vurdering af den toksikologiske signi ­
fikans af eksponering for eksogent producerede metabolitter af testkemika ­
liet.
 
4. Tilstrækkelige TK-data kan anvendes til støtte for yderligere accept og 
anvendelse af tilgange baseret på kvantitative forhold mellem struktur og 
aktivitet, analogislutninger eller gruppering i forbindelse med sikkerheds ­
evalueringen af kemikalier. Kinetikdata kan også bruges til at evaluere den toksikologiske relevans af andre forsøg (f.eks. in vivo og in vitro).
 
5. Medmindre en anden administrationsvej nævnes (se f.eks. afsnit 74-78), 
gælder denne testmetode for oral administration af testkemikaliet.  
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
6. Der stilles forskellige krav og anføres forskellige behov i lovgivningerne 
med hensyn til måling af effektparametre og parametre vedrørende toksiko ­
kinetik for de forskellige kemikalieklasser (f.eks. pesticider, biocider og 
industrikemikalier). I modsætning til de fleste testmetoder beskriver denne 
testmetode TK-test, der involverer flere målinger og effektparametre. I frem ­
tiden vil der muligvis blive udviklet flere nye testmetoder og/eller vejled ­
ninger, som beskriver hver effektparameter separat og i flere detaljer. For så 
vidt angår denne testmetode, fastlægger det enkelte lovgivningssystem, 
hvilke test eller vurderinger der skal gennemføres.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Der er adskillige forsøg, der kan udføres for at evaluere et testkemikalies 
TK-opførsel i lovgivningsøjemed. Afhængigt af de konkrete lovgivnings ­
behov eller situationer er det dog ikke nødvendigt at udføre alle disse mulige forsøg for at evaluere et testkemikalie. Designet af TK-forsøg skal være fleksibelt og tage hensyn til karakteristika for det undersøgte testke ­
mikalie. I nogle tilfælde skal kun et bestemt sæt spørgsmål undersøges for at 
behandle fare- og risikoforholdene i forbindelse med et testkemikalie. I nogle situationer indsamles TK-data i forbindelse med evalueringen i andre toksikologiforsøg. I andre situationer skal der udføres yderligere 
og/eller mere omfattende TK-forsøg, hvis det kræves i henhold til lovgiv ­
ningen, og/eller hvis nye spørgsmål rejses under evalueringen af testkemi ­
kaliet.
 
8. Alle tilgængelige informationer om testkemikaliet samt relevante metabo ­
litter og analoger bør overvejes af testlaboratoriet inden gennemførelsen af forsøget med henblik på at forbedre kvaliteten af forsøget og minimere omfanget af dyreforsøg. Dette kan omfatte data fra andre relevante testme ­
toder (in vivo-forsøg, in vitro-forsøg og/eller in silico-evalueringer). 
Fysisk-kemiske egenskaber, såsom et testkemikalies fordelingskoefficient octanol/vand (udtrykt som log P
 OW ), pKa, vandopløselighed, damptryk og 
molekylvægt, kan bruges i forbindelse med planlægningen af et forsøg og 
fortolkning af resultater. De kan bestemmes ved hjælp af hensigtsmæssige metoder som beskrevet i de relevante testmetoder.
 
BEGRÆNSNINGER  
9. Denne testmetode er ikke designet til at tage højde for særlige omstændig ­
heder, f.eks. drægtige eller diegivende dyr og afkom, eller til at evaluere 
potentielle reststoffer i eksponerede dyr, der anvendes i fødevareproduktio ­
nen. Data fra et B.36-forsøg kan dog bruges som baggrundsinformation ved design af specifikke forsøg til sådanne undersøgelser. Denne testmetode er 
ikke beregnet til test af nanomaterialer. I henhold til en rapport om en 
foreløbig gennemgang af OECD Test Guidelines med hensyn til deres rele ­
vans for nanomaterialer kan TG 417 (svarer til denne testmetode B.36) muligvis ikke anvendes i forbindelse med nanomaterialer (1).
 
DEFINITIONER  
10. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i 
tillæg.  
HENSYN TIL DYREVELFÆRD  
11. Vejledning om human behandling af dyr findes i OECD Guidance Docu ­
ment No. 19 (2). Det anbefales, at den OECD-vejledning benyttes ved alle 
in vivo- og in vitro-forsøg, der er beskrevet i denne testmetode.  
BESKRIVELSE AF METODERNE  
Pilotforsøg  
12. Pilotforsøg anbefales og tilskyndes i forbindelse med valg af forsøgspara ­
metre til TK-forsøg (f.eks. metabolisme, massebalance, analysemetoder, dosisbestemmelse, udånding af CO
 2 osv.). Karakterisering af nogle af 
disse parametre kan betyde, at det ikke er nødvendigt at bruge radioaktivt 
mærkede kemikalier.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Valg af dyr  
Art 
13. Den dyreart (og stamme), der bruges til TK-test, skal helst være den samme 
som den, der anvendes i andre toksikologiske forsøg udført med det pågæl ­
dende testkemikalie. Normalt anvendes rotter, da de hyppigt anvendes i toksikologiske forsøg. Andre eller yderligere arter kan anvendes, hvis 
kritiske toksikologiforsøg giver bevis for signifikant toksicitet hos disse 
arter, eller hvis det dokumenteres, at deres toksicitet/toksikokinetik er mere relevant for mennesker. Der skal gives en begrundelse for valg af dyreart og stamme.
 
14. Medmindre andet nævnes, henviser denne testmetode til rotten som forsøgs ­
dyr. Visse aspekter af metode skal muligvis ændres, hvis andre forsøgsarter bruges.
 
Alder og stamme  
15. Der anvendes unge raske voksne dyr (normalt 6-12 uger gamle på dose ­
ringstidspunktet) (se også afsnit 13 og 14). Der skal gives en begrundelse, hvis der bruges dyr, som ikke er unge voksne. Alle dyr skal være af samme alder ved forsøgets begyndelse. Med hensyn til vægt må det enkelte dyr 
ikke afvige mere end ± 20 % fra testgruppens gennemsnitsvægt. Ideelt 
anvendes den stamme, der også blev anvendt til at etablere den toksikolo ­
giske database for testkemikaliet.
 
Dyrenes antal og køn  
16. For hver testet dosis anvendes mindst fire dyr af et køn. Der gives en 
begrundelse for kønnet af de valgte dyr. Det bør overvejes at bruge begge 
køn (4 handyr og 4 hundyr), hvis der foreligger beviser, som understøtter signifikante kønsrelaterede forskelle i toksicitet.
 
Opbevaring og fodringsbetingelser  
17. Dyr opbevares generelt i individuelle bure i forsøgsperioden. Flere dyr i 
samme bur kan begrundes i særlige tilfælde. Belysningen skal være kunstig 
og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Temperaturen i forsøgsdyr ­
rummet skal være 22 °C (± 3 °C), og den relative fugtighed skal være 30- 70 %. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang 
til drikkevand.
 
Testkemikalie  
18. Et radioaktivt mærket testkemikalie med  14 C anvendes i forbindelse med 
alle aspekter af massebalance- og metabolitbestemmelse i forsøget. Hvis det kan påvises, at:
 
— massebalance- og metabolitbestemmelse kan evalueres tilstrækkeligt ved 
hjælp af det umærkede testkemikalie, og  
— den analytiske specificitet og sensitivitet af den metode, der anvendes 
med et ikkeradioaktivt testkemikalie, er lig med eller større end den, der 
kan opnås med det radioaktivt mærkede testkemikalie  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
er det ikke nødvendigt at bruge et radioaktivt mærket testkemikalie. Andre 
radioaktive og stabile isotoper kan desuden anvendes, hvis elementet f.eks. 
er ansvarligt for eller indgår i den toksiske del af testkemikaliet. Hvis det er muligt, placeres det radioaktivt mærkede stof i en kernedel af det metabolsk stabile molekyle (det er ikke ombytteligt, det fjernes ikke metabolsk som 
CO
 2 , og det bliver ikke en del af organismens »one-carbon pool«). Det kan 
være nødvendigt at mærke flere steder eller bestemte områder af molekylet for at følge testkemikaliets metabolske skæbne.
 
19. Testkemikalier med og uden radioaktiv mærkning analyseres ved hjælp af 
hensigtsmæssige metoder med henblik på at bestemme renhed og identitet. 
Den radioaktive renhed af det radioaktive testkemikalie skal være det højest mulige for et bestemt testkemikalie (den skal ideelt være mere end 95 %), og det skal tilstræbes at identificere urenheder, der er tilstede ved eller over 
2 %. Renheden skal rapporteres sammen med identiteten og andelen af 
identificerede urenheder. I lovgivningsbestemmelser kan der gives yderligere vejledning i definitionen og specifikationen af testkemikalier, der består af blandinger og metoder til bestemmelse af renhed.
 
Valg af dosis  
Pilotforsøg  
20. Normalt er en enkelt oral dosis nok til pilotforsøget. Dosen skal være 
ikke-toksisk, men høj nok til at muliggøre identifikation af metabolitter i 
excreta (og plasma, hvis det er relevant) og til at opfylde det anførte formål 
med pilotforsøget som anført i afsnit 12 i denne testmetode.  
Hovedforsøg  
21. Til hovedforsøgene foretrækkes mindst to doser, da oplysninger indsamlet 
fra mindst to dosisgrupper kan bruges som en hjælp til at fastlægge dosis i andre toksicitetsforsøg og til at foretage en dosis-responsvurdering af alle ­
rede tilgængelige toksicitetstest.
 
22. Hvis to doser administreres, skal begge doser være høje nok til at muliggøre 
identifikation af metabolitter i excreta (og plasma, hvis det er relevant). 
Information fra tilgængelige toksicitetsdata skal overvejes ved valg af 
dosis. Hvis sådanne data ikke er tilgængelige (f.eks. fra forsøg vedrørende akut oral toksicitet med registrering af kliniske tegn på toksicitet eller fra toksicitetsforsøg med gentagen dosering), kan en værdi for den højeste 
dosis, der er lavere end LD
 50 - (oral og dermal administration) eller LC  50 
(inhalation)-estimatet eller lavere end den laveste værdi af det estimerede 
interval for akut toksicitet, overvejes. Den laveste dosis skal være en brøkdel af den højeste dosis.
 
23. Hvis kun et dosisniveau undersøges, skal dosen ideelt være høj nok til at 
muliggøre identifikation af metabolitter i excreta (og plasma, hvis det er relevant) uden at producere synlig toksicitet. Der gives en begrundelse, hvis der ikke medtages et andet dosisniveau.
 
24. Hvis virkningen af dosen på de kinetiske processer skal bestemmes, er to 
doser muligvis ikke nok, og mindst én dosis skal være tilstrækkeligt høj til at mætte disse processer. Hvis området under koncentration-tidskurven for plasma (AUC) ikke er lineært mellem de to dosisniveauer, der er anvendt i 
hovedforsøget, er det en stærk indikation af, at mætning af en eller flere af 
de kinetiske processer sker et sted mellem de to dosisniveauer.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. For testkemikalier af lav toksicitet bør en maksimal dosis på 1 000 mg/kg 
kropsvægt (oral og dermal administration) anvendes (for oplysninger om 
inhalation henvises til kapitel B.2 i dette bilag; denne dosis overstiger typisk ikke 2 mg/l). Kemikaliespecifikke overvejelser kan gøre det nødven ­
digt at anvende en højere dosis, afhængigt af lovgivningen. Valg af dosis 
skal altid begrundes.
 
26. Toksikokinetiske data og data om fordeling i væv ved enkelt dosis kan være 
nok til at bestemme potentialet for akkumulering og/eller persistens. Under visse omstændigheder kan gentagen dosisadministration dog være 
nødvendig i) for i yderligere detaljer at afdække potentialet for akkumule ­
ring og/eller persistens eller ændringer i TK (dvs. enzyminduktion og -inhi ­
bition) eller ii) for at opfylde de gældende lovgivningskrav. Hvis et forsøg omfatter gentagen dosering, er det normalt tilstrækkeligt at anvende den lave 
dosis, men under visse omstændigheder kan det være nødvendigt også at 
anvende en høj dosis (se også afsnit 57).
 
Administration af testkemikalie  
27. Testkemikaliet skal opløses eller suspenderes homogent i det vehikel, der 
også blev anvendt til de andre toksicitetsforsøg med anvendelse af oral sonde, der er udført med testkemikaliet, hvis oplysninger om vehiklet er 
tilgængelige. Der gives en begrundelse for valg af vehikel. Valg af vehikel 
og doseringsvolumen skal være en del af forsøgsdesignet. Testkemikaliet administreres sædvanligvis via sonde. Administration med gelatinekapsler eller iblandet foderet kan være bedre i visse situationer (begrundelse gives 
i begge tilfælde). Den faktiske dosis, der er administreret til hvert dyr, 
bekræftes.
 
28. Hvor stor en væskemængde, der kan indgives ad gangen via oral sonde, 
afhænger af forsøgsdyrenes størrelse, typen af dosisvehikel, og om dyrene 
haft adgang til foder inden administration af testkemikaliet. Der gives en 
begrundelse for administration eller begrænsning af foder inden dosering. Normalt bør volumen holdes så lavt som muligt for både vandige og ikke ­
vandige vehikler. Dosisvolumen må normalt ikke overstige 10 ml/kg krops ­
vægt for gnavere. Volumen af vehikler, der anvendes i forbindelse med 
mere lipofile testkemikalier, kan starte ved 4 ml/kg kropsvægt. Når daglig faste er kontraindiceret, bør lavere dosisvolumen (f.eks. 2-4 ml/kg krops ­
vægt) overvejes ved gentagen dosering. Når det er muligt, bør det overvejes 
at bruge et dosisvolumen svarende til det, der er anvendt i andre orale 
sondeforsøg med testkemikaliet.
 
29. Intravenøs (IV) administration af testkemikaliet og måling af testkemikaliet i 
blod og/eller excreta kan anvendes til at bestemme biotilgængelighed eller 
relativ oral absorption. Ved et IV-forsøg administreres en enkelt dosis (nor ­
malt svarende til, men ikke højere end den laveste orale dosis) af testkemi ­
kaliet ved hjælp af et hensigtsmæssigt vehikel. Dette materiale bør admini ­
streres i et passende volumen (f.eks. 1 ml/kg kropsvægt) på det valgte 
administrationssted på mindst fire dyr af det mest egnede køn (begge køn 
kan anvendes, hvis det er begrundet, se afsnit 16). En fuldt opløst eller suspenderet dosistilberedning er nødvendig ved IV-administration af testke ­
mikaliet.. Vehiklet til IV-administration må ikke opvirke blodintegriteten 
eller blodgennemstrømningen. Ved infusion af testkemikaliet med en infu ­
sionspumpe rapporteres infusionshastigheden, som skal være den samme for
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
alle dyr. Bedøvelse anvendes, hvis et kateter indsættes i halsvenen (til 
administration af testkemikaliet og/eller udtagning af blod), eller hvis 
femoralarterien anvendes til administration. Typen af bedøvelse bør over ­
vejes, da den kan påvirke toksikokinetikken. Dyrene skal have mulighed for at restituere sig tilstrækkeligt inden administration af testkemikaliet og 
vehiklet.
 
30. Andre administrationsveje, f.eks. dermal applikation og inhalation (se afsnit 
74-78), kan anvendes i forbindelse med visse testkemikalier under hensyn ­
tagen til deres fysisk-kemiske egenskaber og menneskers forventede anven ­
delse eller eksponering.  
Målinger  
Massebalance  
31. Massebalance bestemmes ved at lægge den procentdel af den administrerede 
(radioaktive) dosis, der udskilles i urin, fæces og udåndet luft, sammen med den procentdel, der er til stede i væv, resten af kadaveret og vaskevand fra bure (se afsnit 46). Generelt vurderes en total genfinding af det admini ­
strerede testkemikalie (radioaktivitet) på > 90 % at være tilstrækkelig.
 
Absorption  
32. Der kan fås en indledende estimering af absorptionen ved at ekskludere 
procentdelen af dosen i mave-tarmkanalen og/eller fæces fra bestemmelsen af massebalancen. Se afsnit 33 for oplysninger om beregning af den procent ­
vise absorption. Se afsnit 44-49 for oplysninger om undersøgelse af excreta. 
Hvis den præcise absorptionsgrad efter oral administration ikke kan 
bestemmes ud fra massebalanceforsøg (f.eks. hvis mere end 20 % af den administrerede dosis er til stede i fæces), kan yderligere undersøgelser være 
nødvendige. Disse forsøg kan omfatte enten 1) oral administration af test ­
kemikaliet og måling af testkemikaliet i galde eller 2) oral og intravenøs administration af testkemikaliet og måling af det nettovolumen af testkemi ­
kalie, der er til stede i urin plus udåndet luft plus kadaver ved hver af de to 
administrationsveje. I begge forsøgsdesign foretages måling af radioaktivitet 
som en surrogatmetode til kemikaliespecifik analyse af testkemikaliet plus metabolitter.
 
33. Hvis udskillelse i galde undersøges, anvendes oftest oral administration. I 
dette forsøg lægges et kateter i galdegangen på mindst fire dyr af det mest 
egnede køn (eller begge køn, hvis det er begrundet), og en enkelt dosis af testkemikaliet administreres. Efter administration af testkemikaliet overvåges udskillelsen af radioaktivitet/testkemikalie i galde så længe som nødvendigt 
for at anslå den procentdel af den administrerede dosis, der udskilles ad 
denne vej, og denne værdi kan bruges til direkte at beregne den orale absorptionsgrad:
 
Procent absorption  ¼ ðmængde i galde þ urin þ udåndet luftqua 
þ kadaver uden indhold i mave  Ä tarmkanal
=administreret mængde  Ü 100 
34. I nogle testkemikalieklasser kan der ske direkte sekretion af den absorberede 
dosis på tværs af tarmmembraner. I sådanne tilfælde er målingen af den procentvise dosis i fæces efter en oral dosis via kateter i rottens galdekanal ikke repræsentativ for den uabsorberede dosis. Hvis tarmsekretion vurderes 
at forekomme, anbefales det, at den absorberede procentdel af dosis baseres 
på den absorption, der beregnes ved at sammenligne udskillelse efter oral administration med udskillelse efter intravenøs administration (intakt rotte eller rotte med kateter i galdekanal) (se afsnit 35). Hvis kvantificering af 
tarmsekretion vurderes at være nødvendig, bør udskillelse i galdegangen hos 
rotten med kateter i galdekanalen måles efter intravenøs dosisadministration.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biotilgængelighed  
35. Biotilgængelighed kan bestemmes ud fra plasma-/blodkinetikken for de 
orale og intravenøse grupper (se afsnit 50-52) ved hjælp af specifik kemisk analyse af testkemikaliet og/eller relevante metabolitter, og et radio ­
aktivt mærket testkemikalie er derfor ikke påkrævet. Beregningen af testke ­
mikaliets eller relevante metabolitters biotilgængelighed (F) foretages derefter på følgende måde:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDosis  IV=Dosis  exp Þ 
hvor AUC er området under koncentration-tidskurven for plasma, og exp er 
den eksperimentelle administrationsvej (oral, dermal eller via inhalation).  
36. I forbindelse med risikovurdering af systemiske virkninger foretrækkes 
generelt biotilgængelighed af den toksiske komponent generelt frem for 
den procentvise absorption, når systemiske koncentrationer fra dyreforsøg sammenlignes med analoge bioovervågningsdata fra undersøgelser af erhvervsmæssig eksponering. Situationen kan blive mere kompleks, hvis 
doserne er i det ikke-lineære område, så det er vigtigt at den toksikokine ­
tiske screening udpeger doser i det lineære område.
 
Fordeling i væv  
37. Kendskab til fordelingen i væv af et testkemikalie og/eller dets metabolitter 
er afgørende for at kunne identificere målvæv og forstå de bagvedliggende toksicitetsmekanismer og for at få oplysninger om testkemikaliets potentiale, 
metabolitakkumulering og persistens. Procentdelen af den samlede (radio ­
aktive) dosis i væv og resten af kadaveret bør som minimum måles ved afslutningen af udskillelsesforsøget (f.eks. op til syv dage efter dosis eller mindre afhængigt af testkemikaliets specifikke opførsel). Hvis testkemikalie 
ikke spores i væv ved forsøgsafslutning (f.eks. fordi testkemikaliet er blevet 
elimineret inden forsøgsafslutning på grund af en kort halveringstid), bør det omhyggeligt sikres, at data ikke fejlfortolkes. I en sådan situation under ­
søges fordelingen i væv på det tidspunkt, hvor koncentrationen af testkemi ­
kaliet (og/eller dets metabolit) topper i plasma/blod (T
 max ), eller hvor udskil ­
lelse i urinen topper, alt efter hvad der er relevant (se afsnit 38). Det kan desuden være nødvendigt at indsamle væv på andre tidspunkter med henblik på at bestemme fordelingen i væv af testkemikaliet og/eller dets metabolit ­
ter, evaluere betydningen af tid (hvis relevant), hjælpe med at bestemme 
massebalance og/eller som krævet af en kompetent myndighed. Væv, der indsamles, omfatter lever, fedt, mave-tarmkanal, nyre, milt, fuldblod, reste ­
rende kadaver, væv fra målorganer og andet væv (f.eks. skjoldbruskkirtel, 
erytrocytter, kønsorganer, hud, øjne (især fra pigmenterede dyr) af potentiel 
signifikans for den toksikologiske evaluering af testkemikaliet. Analyse af yderligere væv på samme tidspunkter bør overvejes for at udnytte dyrene mest muligt, og hvis målorgantoksicitet observeres i forsøg vedrørende 
subkronisk eller kronisk toksicitet. Den (radioaktive) restkoncentration og 
forholdet mellem væv og plasma (blod) rapporteres også.
 
38. Evaluering af fordelingen i væv på flere tidspunkter, f.eks. tidspunktet for 
spidskoncentration i plasma/blod (dvs. T  max ) eller spidsudskillelse i urin, 
fremskaffet fra de forskellige forsøg vedrørende plasma-/blodkinetik eller 
udskillelse, kan også være nødvendig eller kræves af en kompetent myndig ­
hed. Disse oplysninger kan bruges til at forstå toksicitet og testkemikaliets potentiale, metabolitakkumulering og persistens. Udvælgelsen af prøver skal 
begrundes. Prøver til analyse skal generelt være de samme som ovennævnte 
(se afsnit 37).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Kvantificering af radioaktivitet til forsøg vedrørende fordeling i væv kan 
udføres ved hjælp af dissekering, homogenisering, forbrænding og/eller 
opløsning af organer efterfulgt af væskescintillationstælling af opsamlede rester. Bestemte teknikker, som er på forskellige udviklingstrin, f.eks. kvan ­
titativ helkropsautoradiografi og mikroskopisk autoradiografi af receptor, 
kan vise sig at være nyttige til bestemmelse af fordelingen af et testkemi ­
kalie i organer og/eller væv (3) (4).
 
40. For andre eksponeringsveje end oral indsamles og analyseres specifikke 
væv, f.eks. lunger i inhalationsforsøg og hud i dermale forsøg. Se afsnit 74-78.
 
Metabolisme  
41. Excreta (og plasma, hvis relevant) indsamles til identifikation og kvantifi ­
cering af uforandret testkemikalie og uforandrede metabolitter som beskrevet i afsnit 44-49. Pooling af excreta med henblik på at lette identifikationen af 
metabolitter i en bestemt dosisgruppe accepteres. Det anbefales, at metabo ­
litter fra hver tidsperiode profileres. Hvis det ikke er muligt på grund af manglende prøver og/eller radioaktivitet, kan pooling af urin og fæces på tværs af flere tidspunkter accepteres, men pooling på tværs af køn eller 
doser accepteres ikke. Der anvendes hensigtsmæssige kvalitative og kvanti ­
tative metoder til at analysere urin, fæces, udåndet radioaktivitet fra behand ­
lede dyr og galde, hvis det er relevant.
 
42. Der bør ydes en rimelig indsats for at identificere alle metabolitter, der 
udgør 5 % eller mere af den administrerede dosis, og fastlægge et metabo ­
lisk system for testkemikaliet. Testkemikalier, der er karakteriseret i excreta 
som bestående af 5 % eller mere af den administrerede dosis, identificeres. Identifikation betyder den præcise strukturelle bestemmelse af komponenter. Identifikation opnås typisk ved at bruge co-kromatografi af metabolitten 
med kendte standarder ved hjælp af to forskellige systemer eller ved at 
bruge teknikker, der kan foretage positiv strukturel identifikation, som f.eks. massespektroskopi, kernemagnetisk resonans (NMR) osv. Hvis co-kromatografi anvendes, kan kromatografiske teknikker, der anvender 
samme stationære fase med to forskellige opløsningsmiddelsystemer, ikke 
anvendes til at foretage verifikation af metabolitidentitet ved hjælp af to teknikker, da metoderne ikke er uafhængige. Identifikation ved hjælp af co-kromatografi foretages ved hjælp af to forskellige og analytisk uafhæn ­
gige systemer, f.eks. tyndtlagskromatografi (reverse og normal fase) (TLC) 
og højtydende væskekromatografi (HPLC). Hvis den kromatografiske adskillelse er af passende kvalitet, er yderligere bekræftelse ved hjælp af spektroskopi ikke nødvendig. Alternativt kan entydig identifikation også 
opnås ved at bruge metoder, der frembringer strukturelle oplysninger, som 
f.eks. væskekromatografi-massespektroskopi (LC-MS) eller væskekromato ­
grafi/tandem massespektroskopi (LC-MS/MS), gaskromatografi/massespek ­
troskopi (GC-MS) og NMR-spektrometri.
 
43. Hvis identifikation af metabolitter, der udgør 5 % eller mere af den admini ­
strerede dosis, ikke er mulig, gives der en begrundelse/forklaring i den 
endelige rapport. Det kan være hensigtsmæssigt at identificere metabolitter, som udgør mindre end 5 % af den administrerede dosis, for at få en bedre forståelse af metaboliseringsvejen i forbindelse med fare- og/eller risikovur ­
deringen af testkemikaliet. Strukturel bekræftelse skal så vidt muligt gives. 
Det kan omfatte profilering i plasma eller blod eller andet væv.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Udskillelse  
44. Hastigheden og graden af udskillelse af den administrerede dosis bestemmes 
ved at måle den procentdel af dosen (radioaktiv), der er genfundet i urin, fæces og udåndet luft. Disse data vil også medvirke til at bestemme 
massebalance. De testkemikaliekvantiteter (radioaktivitet), der er elimineret 
i urin, fæces og udåndet luft, bestemmes med passende tidsintervaller (se afsnit 47-49). Forsøg med gentagne doser designes, så data om udskillelse kan indsamles med henblik på at opfylde målene i afsnit 26. Derved kan 
forsøgene sammenlignes med enkeltdosisforsøg.
 
45. Hvis et pilotforsøg har vist, at der ikke udskilles en signifikant mængde af 
testkemikaliet (radioaktivitet) (i henhold til afsnit 49) gennem udåndet luft, er det ikke nødvendigt at indsamle udåndet luft i hovedforsøget.
 
46. Hvert dyr placeres i et separat metabolismebur med henblik på indsamling 
af excreta (urin, fæces og udåndet luft). Efter hver indsamlingsperiode (se 
afsnit 47-49) skylles metabolismeburene med opløsningsmiddel (»burvask«) for at sikre maksimal genfinding af testkemikaliet (radioaktivitet). Indsam ­
lingen af excreta afsluttes på dag 7, eller når mindst 90 % af den admini ­
strerede dosis er genfundet, alt efter hvad der forekommer først.
 
47. De samlede mængder af testkemikaliet (radioaktivitet) i urin bestemmes på 
mindst to tidspunkter på den første indsamlingsdag, hvoraf det ene skal være 24 timer efter dosering, og derefter dagligt indtil forsøgsafslutning. Der bør vælges mere end to indsamlingspunkter på dag 1 (f.eks. ved 6, 12 og 24 
timer). Resultaterne af pilotforsøg analyseres for oplysninger om alternative 
eller yderligere indsamlingstidspunkter. Der gives en begrundelse for valg af indsamlingstidsplan.
 
48. De samlede mængder af testkemikaliet (radioaktivitet) i fæces bestemmes 
dagligt fra og med 24 timer efter dosering indtil forsøgsafslutning, 
medmindre pilotforsøg påviser alternative eller yderligere indsamlingstids ­
punkter. Der gives en begrundelse for valg af alternative indsamlingstids ­
planer.  
49. Indsamlingen af udåndet CO  2 og andre flygtige materialer kan afbrydes i et 
forsøg, hvis mindre end 1 % af den administrerede dosis findes i den udån ­
dede luft i løbet af en indsamlingsperiode på 24 timer.  
Forsøg vedrørende tidsforløb  
Plasma-/blodkinetik  
50. Formålet med disse forsøg er at opnå estimater af grundlæggende 
TK-parametre [f.eks. C  max , T max , halveringstid (t  1/2 ), AUC] for testkemika ­
liet. Disse forsøg kan gennemføres med en dosis eller mere sandsynligt med to eller flere doser. Dosis fastlægges ud fra karakteren af forsøget og/eller det undersøgte væv. Der skal evt. bruges kinetiske data til at afklare spørgs ­
mål, som f.eks. testkemikaliets biotilgængelighed, og/eller afklare virkningen 
af dosen på clearance (f.eks. at afklare, om clearance mættes på en dosis ­
afhængig måde).
 
51. Til disse forsøg anvendes der mindst fire dyr pr. køn pr. dosisgruppe. Der 
gives en begrundelse for kønnet af de valgte dyr. Det bør overvejes at bruge 
begge køn (4 handyr og 4 hundyr), hvis der foreligger beviser, som under ­
støtter signifikante kønsrelaterede forskelle i toksicitet.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Efter administration af testkemikaliet (radioaktivt mærket) udtages blod ­
prøver fra hvert dyr på passende tidspunkter ved hjælp af en hensigtsmæssig 
prøveudtagningsteknik. Volumenet og antallet af blodprøver, der kan udtages pr. dyr, kan være begrænset af potentielle virkninger af gentagen prøvetagning på dyrets sundhed/fysiologi og/eller analysemetodens sensiti ­
vitet. Prøver analyseres for hvert enkelt dyr. Under visse omstændigheder 
(f.eks. karakterisering af metabolitter) kan det være nødvendigt at samle prøver fra flere dyr i en pool. Poolede prøver identificeres tydeligt, og der gives en forklaring. Hvis et radioaktivt mærket testkemikalie anvendes, kan 
analysen af total tilstedeværende radioaktivitet være tilstrækkelig. I så fald 
analyseres den totale radioaktivitet i fuldblod og plasma eller plasma og røde blodlegemer, således at blod-/plasmaforholdet kan beregnes. Under andre omstændigheder kan mere specifikke undersøgelser, der kræver iden ­
tifikation af moderstof og/eller metabolitter eller vurdering af proteinbinding, 
være nødvendige.
 
Kinetik for andet væv  
53. Formålet med disse forsøg er at fremskaffe oplysninger om tidsforløb for at 
afklare spørgsmål vedrørende f.eks. toksisk virkningsmåde, bioakkumulering 
og biopersistens via bestemmelse af koncentrationen af testkemikaliet i 
forskellige væv. Valget af væv og antallet af tidspunkter, der evalueres, afhænger af det undersøgte væv og den toksikologiske database for testke ­
mikaliet. Designet af disse kinetiske forsøg vedrørende andet væv baseres på 
information fremskaffet som beskrevet i afsnit 37-40. Forsøgene kan omfatte 
enkeltdosering eller gentagen dosering. Der gives en detaljeret begrundelse for den valgte tilgang.
 
54. Årsagerne til at udføre kinetiske forsøg med andet væv kan omfatte:  
— bevis for forlænget halveringstid i blod, hvilket antyder mulig akkumu ­
lering af testkemikaliet i forskellige væv  
— ønske om at undersøge, om der er opnået et steady state-niveau i 
bestemte væv (i forsøg med gentagen dosering, hvor der er opnået et 
tilsyneladende steady state-niveau for testkemikaliet i blod, kan man f.eks. også ønske at bekræfte, at der er opnået et steady state-niveau i målvæv).
 
55. For disse typer forsøg vedrørende tidsforløb administreres en passende dosis 
af testkemikaliet til mindst fire dyr pr. dosis pr. tidspunkt, og tidsforløbet for fordelingen i de udvalgte vævstyper overvåges. Der anvendes kun ét køn, 
medmindre der observeres kønsspecifik toksicitet. Om total radioaktivitet 
eller moderstof og/eller metabolitter analyseres, afhænger af det undersøgte spørgsmål. Fordeling i væv vurderes ved hjælp af hensigtsmæssige teknik ­
ker.
 
Enzyminduktion/-inhibition  
56. Forsøg, der omhandler de mulige virkninger af enzyminduktion/-inhibition 
eller biotransformation af testkemikaliet i løbet af forsøget, kan være nødvendige i følgende tilfælde:
 
1) Tilgængelige beviser indicerer en sammenhæng mellem testkemikaliets 
biotransformation og øget toksicitet.  
2) De tilgængelige toksicitetsdata indicerer en ikke-lineær sammenhæng 
mellem dosis og metabolisme.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3) Resultaterne af forsøg vedrørende identifikation af metabolitter påviser 
en potentielt toksisk metabolit, der muligvis er blevet produceret af en 
enzymbane, der er induceret af testkemikaliet.  
4) Til forklaring af virkninger, der påstås at hænge sammen med enzymin ­
duktionsfænomener.  
5) Hvis toksikologisk signifikante forandringer i testkemikaliets metaboliske 
profil observeres via in vitro- eller in vivo-eksperimenter med forskellige 
arter eller under forskellige betingelser, skal de involverede enzymer 
muligvis karakteriseres (f.eks. fase I-enzymer, som f.eks. isoenzymer af det cytochrom P450-afhængige monooxygenasesystem, fase II-enzymer, som f.eks. isoenzymer af sulfotransferase eller uridindiphosphat-glucuro ­
nosyltransferase, eller andre relevante enzymer). Disse oplysninger kan 
bruges til at evaluere relevansen af ekstrapolering mellem arter.
 
57. Der skal anvendes hensigtsmæssige forsøgsprotokoller med passende vali ­
dering og begrundelse til at evaluere ændringer i TK relateret til testkemi ­
kaliet. Eksempler på forsøgsdesign omfatter gentagen dosering med ikke ­
mærket testkemikalie efterfulgt af en enkelt radioaktivt mærket dosis på dag 14 eller gentagen dosering med radioaktivt mærket testkemikalie og prøve ­
tagning på dag 1, 7 og 14 med henblik på at bestemme metabolitprofiler. 
Gentagen dosering med radioaktivt mærket testkemikalie kan også give 
oplysninger om bioakkumulering (se afsnit 26).
 
SUPPLERENDE TILGANGE  
58. Supplerende tilgange ud over de in vivo-forsøg, der er beskrevet i denne 
testmetode, kan give nyttige oplysninger om absorption, fordeling, metabo ­
lisme eller eliminering af et testkemikalie i visse arter.  
Anvendelse af in vitro-oplysninger  
59. Flere spørgsmål om metabolismen af testkemikaliet kan undersøges i in 
vitro-forsøg baseret på hensigtsmæssige testsystemer. Nyligt isolerede eller dyrkede hepatocytter og subcellulære fraktioner (f.eks. mikrosomer og 
cytosol- eller S9-fraktion) fra leveren kan bruges til at studere mulige meta ­
bolitter. Lokal metabolisme i målorganet, f.eks. lunge, kan være interessant i forbindelse med risikovurdering. Til sådanne formål kan mikrosomfraktioner af målvæv være anvendelige. Forsøg med mikrosomer kan bruges til at 
undersøge potentielle køns- og livsfaseforskelle og karakterisere enzympa ­
rametre (K
 m og V  max ), som kan medvirke til at vurdere dosisafhængigheden 
af metabolisme i forhold til eksponeringsniveauer. Mikrosomer kan desuden hjælpe med at identificere de specifikke mikrosomenzymer, der er involveret 
i metabolismen af testkemikaliet, hvilket kan være relevant ved ekstrapole ­
ring mellem arter (se også afsnit 56). Potentialet for induktion af biotrans ­
formation kan også undersøges ved hjælp af subcellulære leverfraktioner (f.eks. mikrosomer o g cytosol) fra dyr, der på forhånd er behandlet med 
det undersøgte testkemikalie, in vitro via forsøg med hepatocytinduktion 
eller fra specifikke cellelinjer, der udtrykker relevante enzymer. Under visse omstændigheder og hensigtsmæssige forhold kan det overvejes at anvende sub-cellulære fraktioner af menneskeligt væv til at bestemme poten ­
tielle artsforskelle, hvad angår biotransformation. Resultaterne af in 
vitro-undersøgelser kan også bruges til at udvikle PBTK-modeller (5).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. In vitro-forsøg vedrørende dermal absorption kan give yderligere oplysnin ­
ger, som kan karakterisere absorption (6).  
61. Primære cellekulturer fra leverceller og friske vævsudsnit kan anvendes til at 
undersøge samme spørgsmål som levermikrosomer. I nogle tilfælde kan 
specifikke spørgsmål besvares ved hjælp af cellelinjer med defineret udtryk af det relevante enzym eller ved hjælp af konstruerede cellelinjer. I nogle tilfælde kan det være nyttigt at undersøge inhibitionen og induktionen 
af specifikke cytochrom P450-isozymer (f.eks. CYP1A1, 2E1, 1A2 m.fl.) 
og/eller fase II-enzymer af moderstoffet ved hjælp af in vitro-forsøg. De indhentede informationer kan bruges i forbindelse med stoffer med tilsva ­
rende struktur.
 
Brug af toksikokinetiske data fra toksicitetsforsøg som supplerende 
oplysninger  
62. Analyse af blod-, vævs- eller excretaprøver fremskaffet i forbindelse med 
gennemførelsen af andre toksicitetsforsøg kan tilvejebringe data om biotil ­
gængelighed, ændringer i plasmakoncentration over tid (AUC, C  max ), 
bioakkumuleringspotentiale, clearance-hastigheder og køns- eller livsfasebe ­
tingede ændringer i metabolisme og kinetik.  
63. Overvejelsen af forsøgsdesignet kan omfatte besvarelse af spørgsmål 
vedrørende: mætning af absorptions-, biotransformations eller udskillelses ­
veje ved højere dosisniveauer, funktionen af nye metaboliske veje ved 
højere doser og begrænsningen af toksiske metabolitter til højere doser.  
64. Andre overvejelser i forbindelse med farevurdering kan omfatte spørgsmål, 
som f.eks.:  
— aldersrelateret sensitivitet som følge af forskelle i blod-hjernebarrierens 
tilstand samt nyre- og eller detoksificeringskapaciteten  
— sensitivitet for delpopulation som følge af forskelle i biotransformations ­
kapacitet eller andre TK-forskelle  
— grad af eksponering af foster ved transplacental overførsel af kemikalier 
eller af den nyfødte via laktation.  
Brug af toksikokinetisk modellering  
65. Toksikokinetiske modeller kan bruges til forskellige formål i forbindelse 
med fare- og risikovurdering, som f.eks. forudsigelse af systemisk ekspone ­
ring og intern vævsdosis. Specifikke spørgsmål vedrørende virkningsmåde 
kan undersøges, og disse modeller kan danne grundlaget for ekstrapolering på tværs af arter, eksponeringsveje, doseringsmønstre og risikovurdering for mennesker. Data, som kan bruges til at udvikle PBTK-modeller for et 
testkemikalie for en given art, omfatter 1) fordelingskoefficienter, 2) bioke ­
miske konstanter og fysiologiske parametre, 3) absorptionsparametre, der er specifikke for eksponeringsvejen, og 4) kinetiske in vivo-data til modeleva ­
luering [f.eks. clearanceparametre for relevante (> 10 %) udskillelsesveje 
samt K
 m og V  max for metabolisme]. De forsøgsdata, der bruges i forbindelse 
med modeludvikling, skal genereres med videnskabeligt forsvarlige metoder, og modelresultaterne skal evalueres. Parametre, der er specifikke for testke ­
mikaliet og arten, f.eks. absorptionshastigheder og konstanter for fordeling 
mellem blod/væv og metabolisk hastighed, bestemmes ofte for at lette 
udvikling af generelle eller fysiologisk baserede modeller (7).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
DATA OG RAPPORTERING  
66. Forsøgsrapporten bør indeholde en indholdsfortegnelse.  
Selve rapporten  
67. Selve rapporten skal indeholde de oplysninger, der er omfattet af denne 
testmetode, opdelt i følgende kapitler og afsnit:  
Resumé  
68. Dette afsnit af forsøgsrapporten skal indeholde et resumé af forsøgsdesignet 
og en beskrivelse af de anvendte metoder. I afsnittet fremhæves også de centrale fund med hensyn til massebalance, karakter og omfang af metabo ­
litter, vævsrester, clearance-hastighed, bioakkumuleringspotentiale, køns ­
betingede forskelle osv. Resuméet skal være så detaljeret, at fundene kan 
evalueres.
 
Indledning  
69. I dette afsnit af rapporten anføres forsøgsmål, -rationale og -design, og der 
gives relevante referencer og baggrundsoplysninger.  
Materialer og metoder  
70. Dette afsnit i rapporten skal indeholde detaljerede beskrivelser af alle rele ­
vante forhold, herunder:  
a) Testkemikalie  
I dette underafsnit identificeres testkemikaliet: kemisk navn, molekylær ­
struktur, kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af dets kemiske sammen ­
sætning, kemisk renhed, samt type og kvantiteter af evt. urenheder, hvis det er muligt. Det skal også indeholde oplysninger om fysisk-kemiske 
egenskaber, herunder fysisk tilstand, farve, opløselighed og/eller 
fordelingskoefficient, stabilitet og ætsende virkning, hvis det er relevant. Hvis det er relevant, anføres oplysninger om isomere. Hvis testkemikaliet er radioaktivt mærket, anføres følgende oplysninger om følgende i dette 
underafsnit: radionukleidtype, mærkets placering, specifik aktivitet og 
radiokemisk renhed.
 
Evt. vehikel, fortyndingsmidler, suspensionsmidler og blødgøringsmidler 
eller andre materialer, der anvendes til administration af testkemikaliet, anføres eller beskrives.
 
b) Forsøgsdyr  
I dette afsnit anføres oplysninger om forsøgsdyrene, herunder udvælgelse 
af og begrundelse for art, stamme og alder ved forsøgets begyndelse, køn 
samt kropsvægt, sundhedsstatus og dyreopdræt og -sundhed.  
c) Metoder  
Dette afsnit skal indeholde detaljer om det anvendte forsøgsdesign og de 
anvendte metoder. Det skal bl.a. indeholde:  
1) en begrundelse for evt. ændring af eksponeringsvej og eksponerings ­
betingelser  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2) en begrundelse for valget af dosisniveauer  
3) en beskrivelse af evt. pilotforsøg, der er indgår i forsøgsdesignet for 
de opfølgende forsøg; baggrundsdata for pilotforsøg indgives  
4) en beskrivelse af tilberedningen af doseringsopløsningen og typen af 
evt. opløsningsmiddel eller vehikel  
5) antal behandlingsgrupper og dyr i hver gruppe  
6) dosisniveauer og -volumen (og dosens specifikke aktivitet, når radio ­
aktivitet anvendes)  
7) administrationsveje og -metoder  
8) doseringshyppighed  
9) evt. fasteperiode  
10) total radioaktivitet pr. dyr  
11) håndtering af dyr  
12) prøvetagning og -håndtering  
13) analysemetoder anvendt til separation, kvantificering og identifika ­
tion af metabolitter  
14) påvisningsgrænse for de anvendte metoder  
15) andre anvendte forsøgsmålinger og -fremgangsmåder (herunder vali ­
dering af metoder til metabolitanalyse).  
d) Statistisk analyse:  
Hvis statistisk analyse bruges til at analysere forsøgsfund, skal rapporten 
indeholde tilstrækkelige oplysninger om den anvendte analysemetode og det anvendte computerprogram, således at en uafhængig reviewer/sta ­
tistiker kan revurdere og gentage analysen.
 
Hvis der bruges systemer, som modellerer forsøg, som f.eks. PBTK, skal 
præsentationen af modeller indeholder en udførlig beskrivelse af model ­
len, således at der kan foretages en uafhængig gentagelse og validering af modellen (se afsnit 65 og tillæg: Definitioner).
 
Resultater  
71. Alle data opsummeres og opstilles i tabelform med relevant statistisk evalue ­
ring og beskrives i afsnittets tekst. Data om radioaktivitetsmåling opsum ­
meres og fremlægges, for så vidt det er relevant for forsøget, typisk som mikrogram- eller milligram-ækvivalenter pr. prøvemasse, men andre enheder kan anvendes. I dette afsnit indsættes grafiske illustrationer af fundene, 
reproduktioner af repræsentative kromatografi- og spektrometridata, identi ­
fikation/kvantificering af metabolitter og foreslåede metaboliske veje, herunder metabolitternes molekylærstruktur. Følgende oplysninger angives desuden i dette afsnit, for så vidt de er relevante:
 
1) kvantitet og procentdel af genfunden radioaktivitet i urin, fæces, udåndet 
luft samt urin og fæces i vaskevand fra bure  
— I forbindelse med dermale forsøg angives også data om genfinding af 
testkemikaliet fra behandlet hud, hudvask og tilbageværende radio ­
aktivitet i hudbeskyttelse og metabolismebur samt resultater af forsøg 
med hudvask. Se afsnit 74-77 for en yderligere diskussion.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— I forbindelse med inhalationsforsøg anføres også data om genfinding 
af testkemikaliet i lunger og nasale væv (8). Se afsnit 78 for en 
yderligere diskussion  
2) fordeling i væv rapporteret som procentdel af administreret dosis og 
koncentration (mikrogram-ækvivalenter pr. g væv), og forhold mellem 
væv og blod eller væv og plasma  
3) materialebalance udviklet fra hvert forsøg, der omfatter analyse af 
kropsvæv og excreta  
4) plasmakoncentrationer og toksikokinetiske parametre (biotilgængelighed, 
AUC, Cmax, Tmax, clearance og halveringstid) efter administration via de relevante eksponeringsveje
 
5) hastighed og grad af absorption af testkemikaliet efter administration via 
de relevante eksponeringsveje  
6) kvantiteter af testkemikaliet og metabolitter (rapporteret som en 
procentdel af den administrerede dosis) indsamlet i excreta  
7) reference til data i tillæg, der indeholder data om individuelle dyr for alle 
undersøgte effektparametre (f.eks. dosisadministration, genfunden procent, koncentrationer, TK-parametre osv.)
 
8) illustration af de foreslåede metaboliske veje og metabolitternes moleky ­
lærstruktur.  
Diskussion og konklusioner  
72. I dette afsnit skal forfatterne:  
1) anføre en foreslået metabolisk vej baseret på resultaterne af metabo ­
lismen og elimineringen af testkemikaliet  
2) diskutere potentielle arts- og kønsspecifikke forskelle med hensyn til 
testkemikaliets eliminering og/eller biotransformation  
3) opstille data om og diskutere identifikationen og omfanget af metabolit ­
ter, clearance-hastigheder, bioakkumuleringspotentiale og koncentration 
af moderstof- og/eller metabolitrester i væv samt mulige dosisbetingede ændringer i TK-parametre, for så vidt det er relevant
 
4) i dette afsnit anføre alle relevante TK-data indhentet i forbindelse med 
gennemførelsen af toksicitetsforsøg  
5) angive en præcis konklusion, der underbygges af forsøgsfundene  
6) efter behov indsætte yderligere relevante afsnit.  
73. I yderligere afsnit indsættes understøttende bibliografiske oplysninger, tabel ­
ler, figurer, tillæg osv.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATIVE EKSPONERINGSVEJE  
Dermal  
Dermal behandling  
74. I dette afsnit gives der specifikke oplysninger om undersøgelsen af toksiko ­
kinetikken for testkemikaliet ved dermal eksponering. Med hensyn til 
dermal absorption henvises der til kapitel B.44 i dette bilag [Hudabsorption: in vivo-metode (9)]. I forbindelse med andre effektparametre, f.eks. fordeling og metabolisme, kan denne testmetode B.36 anvendes. Der 
anvendes et eller flere dosisniveauer ved dermal behandling. Testkemikaliet 
(f.eks. ufortyndet, fortyndet eller formuleret materiale, der indeholder test ­
stoffet og påføres huden) skal være det samme (eller en realistisk erstatning herfor) som det, mennesker eller andre potentielle målarter kan blive 
eksponeret for. Dosisniveauer vælges i overensstemmelse med afsnit 20- 
26 i denne testmetode. Faktorer, der kan tages i betragtning ved valg af dermal dosis, omfatter forventet human eksponering og/eller doser, hvor toksicitet er observeret i andre forsøg vedrørende dermal toksicitet. De 
dermale doser skal om nødvendigt opløses i et egnet vehikel og påføres i 
en mængde, der er tilstrækkelig til at levere doserne. Kort før forsøget indledes, klippes forsøgsdyrene på ryggen. Såfremt pelsen barberes bort, bør det ske ca. 24 timer, inden forsøget indledes. Under denne procedure 
må man passe på ikke at beskadige huden, da det kan ændre dens permea ­
bilitet. Mindst 10 % af kroppens overflade skal gøres klar til påføring af testkemikaliet. I tilfælde af stærkt toksiske kemikalier kan området være mindre end 10 %, men en så stor del af området som muligt bør dækkes 
med et tyndt og ensartet lag. Det samme behandlingsområde anvendes til 
alle dermale testgrupper. De behandlede områder beskyttes med en passende kappe, som fastgøres. Dyrene anbringes enkeltvis i bure.
 
75. Der gennemføres et forsøg med hudvask med henblik på at vurdere den 
mængde, af den anvendte dosis af testkemikaliet, der kan fjernes fra huden ved at vaske det behandlede hudområde med mild sæbe og vand. Dette forsøg kan også hjælpe med at bestemme massebalancen, når testkemikaliet 
administreres ved dermal applikation. I dette forsøg med hudvask påføres en 
enkelt dosis af testkemikaliet på to dyr. Dosis vælges i overensstemmelse med afsnit 23 i denne testmetode (se også afsnit 76 for en diskussion af hudkontakttid). De mængder af testkemikaliet, der genfindes i vaskevandet, 
bestemmes med henblik på at vurdere, hvor effektivt testkemikaliet fjernes 
ved vask.
 
76. Medmindre det ikke er muligt på grund af ætsning, påføres testkemikaliet 
huden og forbliver der i mindst seks timer. Når beskyttelseskappen fjernes, 
vaskes det behandlede område ved hjælp af den fremgangsmåde, der er beskrevet i forsøget med hudvask (se afsnit 75). Både beskyttelseskappe og vaskevand analyseres for rester af testkemikaliet. Ved afslutningen af 
forsøgene aflives alle dyrene humant i overensstemmelse med (2), og den 
behandlede hud fjernes. Et relevant udsnit af den behandlede hud analyseres for rester af testkemikaliet (radioaktivitet).
 
77. I forbindelse med toksikokinetisk vurdering af lægemidler kan der i over ­
ensstemmelse med den gældende lovgivning anvendes forskellige frem ­
gangsmåder.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalation  
78. Der anvendes en enkelt koncentration (eller flere, hvis det er nødvendigt) af 
testkemikaliet. Koncentrationerne vælges i overensstemmelse med afsnit 20- 26 i denne testmetode. Inhalationsbehandlinger gennemføres ved hjælp af et 
apparat med en »næsekegle« eller anordning til behandling af kun hovedet 
for at forhindre absorption via andre eksponeringsveje (8). Hvis andre betin ­
gelser for inhalationseksponering anvendes, dokumenteres begrundelsen for ændringen. Varigheden af eksponering ved inhalation defineres. Ekspone ­
ringsvarigheden er typisk 4-6 timer.
 
LITTERATUR:  
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.
 
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
(3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.  
(4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micro ­
scopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
 
(5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d'Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt 
W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
 
(6) Kapitel B.45 i dette bilag, Hudabsorption: in vitro-metode.  
(7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No. 9. Genève, World Health Organiza ­
tion, International Programme on Chemical Safety.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) Kapitel B.44 i dette bilag, Hudabsorption: in vivo-metode.  
(10) Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural 
Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
(11) Gibaldi M og Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Tillæg  
DEFINITIONER  
Absorption : proces(ser) for optagelse af kemikalier i eller på tværs af væv. 
Absorption henviser til moderstoffet og alle dets metabolitter. Må ikke forveksles 
med »biotilgængelighed«.  
Akkumulering  (bioakkumulering): Forøgelse af mængden af et testkemikalie 
over tid i væv (normalt fedtvæv, efter gentagen eksponering); hvis tilførslen af et testkemikalie til kroppen er større end den hastighed, hvormed det elimineres, 
akkumulerer organismen testkemikaliet, og der kan opnås toksiske koncentra ­
tioner af et testkemikalie.
 
ADME : akronym for »Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion« 
(absorption, fordeling, metabolisme og udskillelse«.  
AUC : (område under koncentration-tidskurven for plasma): området under 
en i et diagram over koncentrationen af et testkemikalie i plasma over tid. Det repræsenterer den samlede mængde af testkemikaliet, der absorberes af 
kroppen i en fastsat periode. Under lineære betingelser er AUC (fra nultid til 
uendeligt) proportional med den samlede mængde af testkemikaliet, der absor ­
beres af kroppen, uanset absorptionshastighed.
 
Autoradiografi : (helkropsautoradiografi): bruges til kvalitativt eller kvantitativt 
at lokalisere et radioaktivt testkemikalie i væv. I denne teknik anvendes røntgen ­
film og nu også digital fosfor-imaging til at visualisere radioaktivt mærkede 
molekyler eller fragmenter af molekyler ved at registrere den stråling, der 
udsendes fra det undersøgte objekt. Kvantitativ helkropsautoradiografi har visse fordele sammenlignet med organdissekering, hvad angår evaluering af testkemi ­
kaliets fordeling og vurderingen af den samlede genfinding og opløsning af 
radioaktivt materiale i væv. Det er f.eks. en vigtig fordel, at teknikken kan bruges i forbindelse med pigmenterede dyremodeller til at vurdere en mulig sammenhæng mellem testkemikaliet og melanin, som kan binde visse molekyler. 
Teknikken kan give anvendelige helkropsbilleder af bindingssteder med høj 
kapacitet/lav affinitet, men den kan være mindre effektiv til at genkende speci ­
fikke steder, som f.eks. receptorbindingssteder, hvor detektering kræver relativt høj opløsning og sensitivitet. Når autoradiografi anvendes, gennemføres forsøg 
med henblik på at bestemme massebalancen af det administrerede stof som en 
separat gruppe eller i et forsøg, der er adskilt fra forsøget vedrørende fordeling i væv, hvor alle excreta (herunder evt. også udåndet luft) og hele kadavre homo ­
geniseres og analyseres ved hjælp af væskescintillationstælling.
 
Udskillelse via galde : Udskillelse via galdegangen.  
Bioakkumulering : se »Akkumulering«.  
Biotilgængelighed : fraktion af den administrerede dosis, der når det systemiske 
kredsløb eller gøres tilgængeligt på stedet for fysiologisk aktivitet. Normalt henviser biotilgængeligheden af et testkemikalie til moderstoffet, men kan også 
henvise til dets metabolit. Det vedrører kun én kemisk form.  Bemærk:  Biotil­
gængelighed og absorption er ikke det samme. Forskellen mellem f.eks. oral absorption (dvs. tilstedeværelse i tarmvæg og portalkredsløb) og biotilgænge ­
lighed (dvs. tilstedeværelse i systemisk blod og væv) kan opstå ved kemisk 
nedbrydning som følge af bl.a. metabolisme i tarmvæg eller transport af efflux 
tilbage til tarmlumen eller præsystemisk metabolisme i leveren (10). Biotilgæn ­
gelighed af den toksiske komponent (moderstof eller en metabolit) er en afgø ­
rende parameter, når en intern værdi af den eksterne NOAEL eller BMD 
(anvendt dosis) skal udledes i forbindelse med vurdering af risiko for mennesker 
(ekstrapolering fra høj til lav dosis eller ekstrapolering mellem administrations ­
veje). I forbindelse med levervirkninger efter oral administration er oral absorp ­
tion tilstrækkelig. For alle andre virkninger end ved indgangsstedet er biotilgæn ­
gelighed generelt en mere pålidelig parameter til brug i risikovurdering end 
absorption.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Biopersistens : se »Persistens«.  
Biotransformation : kemisk (enzym)omdannelse af et undersøgt testkemikalie til 
et andet kemikalie i kroppen. Synonymt med »metabolisme«.  
C max : enten maksimal (spids)koncentration af blod (plasma/serum) efter admini ­
stration eller maksimal (spids)udskillelse (i urin eller fæces) efter administration.  
Clearance-hastighed : kvantitativ måling af den hastighed, hvormed et testkemi ­
kalie fjernes fra blod, plasma eller et bestemt væv pr. tidsenhed.  
Rum : strukturel eller biokemisk del (eller enhed) af en krop, et væv eller en 
celle, der er adskilt fra resten.  
Afgiftningsveje : serie af trin, der fører til eliminering af toksiske kemikalier i 
kroppen, enten ved metabolisk ændring eller udskillelse.  
Fordeling : spredning af et testkemikalie og dets afledte stoffer i en organisme.  
Enzymer/isozymer : proteiner, der katalyserer kemiske reaktioner. Isozymer er 
enzymer, der katalyserer lignende kemiske reaktioner, men som har en anden 
aminosyresekvens.  
Enzymparametre : K m : Michaelis-konstant og V  max : maksimal velocitet.  
Udskillelse : proces(ser), hvorved et administreret testkemikalie og/eller dets 
metabolitter fjernes fra kroppen.  
Eksogent : indført fra eller produceret uden for organismen eller systemet.  
Ekstrapolering : følgeslutning af en eller flere ukendte værdier på grundlag af 
det, der er kendt, eller som er observeret.  
Halveringstid (t  1/2 ): den tid, der går, inden koncentrationen af testkemikaliet er 
reduceret til det halve i et rum. Værdien henviser typisk til koncentrationen i plasma eller mængden af testkemikaliet i hele kroppen.
 
Induktion/enzyminduktion : enzymsyntese som respons på miljøpåvirkende eller 
inducerende molekyle.  
Linearitet/lineær kinetik : En proces, der er lineær med hensyn til kinetik, når 
alle overførselshastigheder mellem rum er proportionale med de tilstedeværende 
mængder eller koncentrationer, dvs. første orden. Som følge deraf er clearance- og fordelingsvolumener konstante, og det samme gælder halveringstid. De opnåede koncentrationer er proportionale med doseringshastigheden (ekspone ­
ring), og akkumulering er mere forudsigelig. Linearitet/ikke-linearitet kan 
vurderes ved at sammenligne relevante parametre, f.eks. AUC, efter forskellige doser eller efter enkelt og gentagen eksponering. Manglende dosisafhængighed kan indicere mætning af de enzymer, der er involveret i metabolismen af stoffet. 
En forøgelse af AUC efter gentagen eksponering sammenlignet med enkelt 
eksponering kan indicere inhibition af metabolisme, og en reduktion i AUC kan indicere induktion af metabolisme [se også (11)].
 
Massebalance : opgørelse af det testkemikalie, der tilføres og forlader systemet.  
Materialebalance : se »Massebalance«.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Toksicitetsmekanisme (-måde)/virkningsmekanisme (-måde) : virkningsmeka ­
nisme er specifikke biokemiske interaktioner, gennem hvilke et testkemikalie 
producerer sin virkning. Virkningsmåde henviser til mere generelle veje, der fører til et testkemikalies toksicitet.
 
Metabolisme : synonymt med »biotransformation«.  
Metabolitter : produkter af metabolisme eller metaboliske processer.  
Oral absorption : den procentdel af dosen af testkemikalie, der absorberes fra 
administrationsstedet (f.eks. mave-tarmkanalen). Denne kritiske parameter kan bruges til at bestemme den fraktion af det administrerede testkemikalie, der når 
portalvenen og efterfølgende leveren.
 
Fordelingskoefficient : kaldes også distributionskoefficienten og er et mål for et 
kemikalies differentierede opløselighed i to opløsningsmidler.  
Peak-niveau i blod (plasma/serum) : Maksimal (spids)koncentration i blod 
(plasma/serum) efter administration (se også »C  max «). 
Persistens (biopersistens) : Langvarig tilstedeværelse af et kemikalie (i et biolo ­
gisk system) som følge af resistens mod nedbrydning/eliminering.  
Analogislutning : information om effektparameter for et eller flere kemikalier 
bruges til at forudsige effektparameteren for målkemikaliet.  
Mikroskopisk autoradiografi af receptor  (eller Mikroautoradiografi af recep ­
tor): denne teknik kan bruges til at undersøge xenobiotisk interaktion med bestemte vævssteder eller cellepopulationer, f.eks. i forsøg vedrørende receptor ­
binding eller specifikke virkningsmåder, der kræver høj opløsning og høj sensi ­
tivitet, som ikke kan opnås med andre teknikker, som f.eks. helkropsautoradio ­
grafi.
 
Administrationsvej  (oral, intravenøs, dermal, inhalation osv.): henviser til den 
måde, hvorpå kemikalier indgives i kroppen (f.eks. oralt med mavesonde, oralt via foderet, dermalt, ved inhalation, intravenøst osv.).
 
Mætning : tilstand, hvorved en eller flere af de kinetiske processer (f.eks. absorp ­
tion, metabolisme eller clearance) er på deres højeste (dvs. »mættede«).  
Sensitivitet : en metode eller et instruments evne til at skelne mellem måleresul ­
tater, som repræsenterer forskellige niveauer af en undersøgt variabel.  
Steady state-niveau i blod (plasma) : ikke-ligevægtstilstand for et åbent system, 
hvor alle kræfter, der påvirker systemet, præcist opvejes af modsatte kræfter på 
en sådan måde, at alle dets komponenter er stationære i koncentration, selv om stoffet strømmer gennem systemet.
 
Systemmodellering  (fysiologibaseret toksikokinetisk, farmakokinetisk, fysiologi ­
baseret farmakokinetisk, biologisk osv.): abstrakt model, der bruger matematisk sprog til at beskrive systemets funktion.
 
Målvæv : væv, hvor den primære skadelige virkning af en toksikant manifesteres.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Testkemikalie : ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  
Fordeling i væv : reversibel bevægelse af et testkemikalie fra et sted i kroppen til 
et andet. Fordeling i væv kan undersøges ved hjælp af organdissekering, homo ­
genisering, forbrænding og væskescintillationstælling eller kvalitativ og/eller kvantitativ helkropsautoradiografi. Førstnævnte kan bruges til at fremskaffe 
oplysninger om koncentration og genfunden procentdel i væv og resten af kada ­
veret af de samme dyr, men ikke oplysninger om opløsning for alle væv, og kan have en samlet genfinding, der er mindre end ideel (< 90 %). Se definitionen af sidstnævnte ovenfor.
 
T max : tid til at nå C  max . 
Toksikokinetik  (farmakokinetik): undersøgelse af absorption, fordeling, metabo ­
lisme og udskillelse af kemikalier over tid.  
Validering af modeller : proces, hvor det vurderes, om en model er egnet til 
ensartet at beskrive de tilgængelige toksikokinetiske data. Modeller kan evalueres ved statistisk og visuelt at sammenligne modelforudsigelser med forsøgsværdier i 
forhold til en fælles uafhængig variabel (f.eks. tid). Omfanget af evaluering 
begrundes på baggrund af den tiltænkte anvendelse af modellen.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  FORSINKET NEUROTOKSICITET VED ORGANISKE 
PHOSPHORFORBINDELSER EFTER AKUT EKSPONERING  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Ved vurdering af stoffers toksiske virkninger er det vigtigt at under ­
søge visse stofgruppers mulighed for at fremkalde specifikke former for neurotoksicitet, som i givet fald ikke kan påvises i andre toksici ­
tetsundersøgelser. Visse organiske phosphorforbindelser har vist sig 
at forårsage forsinket neurotoksicitet og bør undersøges med henblik 
herpå.
 
Der kan anvendes in vitro-screeningtest til identificering af stoffer, 
som kan forårsage forsinket polyneuropati; negative resultater af in vitro-undersøgelser kan imidlertid ikke bruges som dokumentation for, at teststoffet ikke er neurotoksisk.
 
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Organiske phosphorforbindelser  omfatter uladede estere, thioestere 
og anhydrider af organiske phosphorsyrer, phosphonsyrer og phosp ­
horamidsyrer eller tilsvarende phosphosthiosyrer, phosphonthiosyrer og phosphorthioamidsyrer eller andre stoffer, der kan forårsage den 
forsinkede neurotoksicitet, der til tider forekommer for denne stof ­
gruppe.
 
Forsinket neurotoksicitet  er et syndrom, der er knyttet til langvarig, 
forsinket opståen af ataxi, distal axonopati i rygmarv og perifere nerver og inhibition og aldring af neurotoksisk esterase (NTE) i nervevæv.
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
Et referencestof kan testes med en positiv kontrolgruppe som middel 
til at påvise, at den undersøgte arts reaktion ikke har ændret sig signifikant under laboratorieforsøgsbetingelserne.
 
Et eksempel på et meget anvendt neurotoksisk stof er tri-o-tolylp ­
hosphat (CAS nr. 78-30-8, Einecs nr. 201-103-5, CAS-nomenklatur: phosphorsyre, tris(2-methylphenyl)ester), også kendt som tris-o- 
cresylphosphat.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Teststoffet indgives oralt i en enkelt dosis til tamhøner, som om 
nødvendigt har været beskyttet mod akutte kolinerge effekter. 
Dyrene observeres i 21 dage for unormal adfærd, ataxi og paralyse. 
Der foretages biokemiske målinger, navnlig inhibition af neurotok ­
sisk esterase, på tilfældigt udvalgte høner fra hver gruppe, normalt 24 og 48 timer efter indgift. 21 dage efter eksponering aflives de 
resterende høner, og der foretages en histopatologisk undersøgelse af 
udvalgt nervevæv.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.5.1.  Forberedelser  
Unge, sunde kønsmodne høner, der er fri for virussygdomme og 
medicinering, der kan interferere med undersøgelsen, og hvis gang 
er normal, fordeles randomiseret i forsøgs- og kontrolgrupper og 
tilvænnes laboratoriebetingelserne i mindst fem dage inden undersø ­
gelsens påbegyndelse.  
Der anvendes bure eller indelukker, der giver hønsene fri bevæge ­
lighed, og som tillader uhindret observation af dyrenes gang.  
Teststoffet bør normalt indgives oralt med mavesonde, gelatinekap ­
sler eller en tilsvarende metode. Væsker kan indgives ufortyndet eller opløst i et passende vehikel, som f.eks. majsolie; faste stoffer bør om 
muligt opløses, eftersom store doser faste stoffer i gelatinekapsler 
ikke altid absorberes effektivt. For ikke-vandige vehikler skal vehik ­
lets toksiske egenskaber kendes eller i givet fald bestemmes inden forsøget.
 
1.5.2.  Forsøgsbetingelser  
1.5.2.1.  Forsøgsdyr  
Unge, kønsmodne læggehøner (Gallus gallus domesticus) på otte til 
tolv måneder anbefales. Der anvendes racer og stammer af standard ­
størrelse, og hønsene bør normalt være opdrættet under betingelser, som tillader bevægelsesfrihed.
 
1.5.2.2.  Antal og køn  
Ud over forsøgsgruppen anvendes både en vehikelkontrolgruppe og 
en positiv kontrolgruppe. Vehikelkontrolgruppen behandles på 
samme måde som forsøgsgruppen, med undtagelse af administration af teststoffet.
 
Der anvendes et tilstrækkeligt antal høner i hver gruppe, så mindst 
seks høns kan aflives med henblik på biokemisk bestemmelse (tre på 
hvert af de to valgte tidspunkter) og seks kan overleve den 21 dage lange observationsperiode med henblik på patologisk undersøgelse.
 
Den positive kontrolgruppe kan undersøges samtidig eller kan være 
en nylig historisk kontrolgruppe. Gruppen indeholder mindst seks 
høner, der behandles med et kendt neurotoksisk stof med forsinket 
virkning, tre høner til biokemisk undersøgelse og tre høner til pato ­
logisk undersøgelse. Regelmæssig ajourføring af historiske data anbefales. Der tilvejebringes nye data om positiv kontrol, hvis det 
pågældende laboratorium har ændret væsentlige elementer (f.eks. 
stamme, foder, laboratoriemiljø) i forsøgets gennemførelse.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Dosisniveauer  
Der gennemføres en forundersøgelse med et passende antal høner og 
dosisniveaugrupper med henblik på at fastsætte det dosisniveau, der skal anvendes i hovedundersøgelsen. En vis dødelighed er normalt 
nødvendig i denne forundersøgelse til fastsættelse af en passende 
dosis til hovedundersøgelsen. For at forhindre dødsfald som følge af akutte kolinerge effekter kan imidlertid atropin eller et andet beskyttende middel, der vides ikke at interferere med forsinkede 
neurotoksiske reaktioner, anvendes. En række forskellige testmetoder 
kan anvendes til at vurdere den højeste ikke dødelige dosis af test ­
stofferne (se metode B.l.A). Historiske data fra undersøgelser af 
høner eller andre toksikologiske oplysninger kan også anvendes 
som støtte ved valg af dosis.
 
Dosisniveauet for teststoffet i hovedundersøgelsen bør være så højt 
som muligt under hensyntagen til resultaterne af forundersøgelsen og 
den øvre dosisgrænse på 2 000 mg/kg legemsvægt. Eventuel døde ­
lighed må ikke forhindre, at et tilstrækkeligt antal dyr overlever med henblik på biokemisk undersøgelse (seks) og histologisk undersø ­
gelse (seks) efter 21 dage. Atropin eller et andet beskyttende 
middel, der vides ikke at interferere med forsinkede neurotoksiske 
raktioner, anvendes for at forhindre dødsfald som følge af akutte kolinerge effekter.
 
1.5.2.4.  Grænsetest  
Hvis et forsøg udført efter de her beskrevne retningslinjer med et 
dosisniveau på mindst 2 000 mg/kg legemsvægt/dag ikke fremkalder 
observerbare toksiske virkninger, og hvis der ikke kan ventes toksisk virkning på grundlag af data fra strukturelt beslægtede stoffer, kan en undersøgelse med anvendelse af en højere dosis betragtes som unød ­
vendig. Grænsetesten er kun relevant, hvis human eksponering indi ­
cerer, at der er behov for anvendelse af et højere dosisniveau.
 
1.5.2.5.  Observationsperiode  
Observationsperioden varer 21 dage.  
1.5.3.  Fremgangsmåde  
Efter indgift af et beskyttende middel til forhindring af dødsfald som 
følge af akut kolinerg effekt indgives teststoffet i en enkelt dosis.  
1.5.3.1. Generelle observationer  
Observationsperioden starter umiddelbart efter eksponering. Alle 
hønerne observeres omhyggeligt flere gange i løbet af de første to dage og derefter mindst en gang dagligt i en periode på 21 dage eller 
indtil det fastlagte aflivningstidspunkt, Alle tegn på toksicitet regi ­
streres, herunder tidspunktet for indtræden af unormal adfærd og dennes type, grad og varighed. Ataxi måles efter en talskala med mindst fire niveauer, og paralyse registreres. Mindst to gange om 
ugen udtages de høner, der er udvalgt til patologisk undersøgelse, af 
burene og underkastes en periode med tvungen motorisk aktivitet, som f.eks. stigeklatring, med henblik på at lette observationen af minimale toksiske virkninger. Døende dyr og dyr, der viser symp ­
tomer på stærk smerte eller lidelse, fjernes, så snart de iagttages, 
hvorefter de aflives på human måde og obduceres.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2. Legemsvægt  
Alle hønerne vejes lige inden indgift af teststoffet og mindst én gang 
om ugen derefter.  
1.5.3.3. Biokemisk undersøgelse  
Seks vilkårligt udvalgte høner fra hver forsøgs- og vehikelkontrol ­
gruppe og tre høner fra den positive kontrolgruppe (hvis denne guppe undersøges samtidig) aflives inden for få dage efter indgift, 
og hjernen og den lumbale rygmarv præpareres og undersøges for 
inhibition af neurotoksisk esterase. Normalt aflives tre haner fra vehikelkontrolgruppen og fra hver forsøgsgruppe efter 24 timer og tre efter 48 timer, mens de tre høner fra den positive kontrolgruppe 
aflives efter 24 timer. Hvis observation af kliniske tegn på forgift ­
ning (dette kan ofte vurderes ved observation af tidspunktet for indtræden af kolinerge symptomer) indicerer, at det toksiske stof udskiltes meget langsomt, kan det være bedre at udtage væv fra 
tre høner på hvert af to andre tidspunkter mellem 24 timer og 72 
timer efter administration.
 
Hvis det skønnes hensigtsmæssigt, kan der også foretages analyser af 
acetylcholinesterase (AChE) på disse prøver. Spontan reaktivering af AChE kan imidlertid indtræde in vivo og således føre til, at stoffets AChE-inhiberende aktivitet undervurderes.
 
1.5.3.4. Makroskopisk undersøgelse  
Den makroskopiske undersøgelse af alle dyrene (aflivet efter 
forsøgets afslutning eller under forsøget, fordi de var døende) omfatter observation af udseende af hjerne og rygmarv.
 
1.5.3.5. Histopatologisk undersøgelse  
Der foretages en mikroskopisk undersøgelse af nervevæv fra dyr, der 
overlever observationsperioden, og som ikke er anvendt til de bioke ­
miske undersøgelser. Væv fikseres in situ ved anvendelse af perfu ­
sionsmetoder. Snittene bør omfatte cerebellum (længdesnit langs midterlinjen), medulla oblongata, rygmarv og de perifere nerver. Rygmarvssnit tages fra det øvre cervikale segment, midt i brysthulen 
og det lumbosakrale område. Der tages snit af det distale område af 
tibianerven og dens udløbere til musculus gastrocnemius og af ischi ­
asnerven. Snittene farves med passende myelin- og axonspecifikke farver.
 
2. DATA  
Hvis resultaterne for de udvalgte endepunkter i denne metode (bio ­
kemi, histopatologi og adfærdsobservation) er negative, kræves der normalt ikke yderligere undersøgelse for forsinket neurotoksicitet. 
Ved tvetydige eller inkonklusive resultater for disse endepunkter 
kan yderligere vurdering være nødvendig.
 
Der tilvejebringes individuelle data. Herudover opstilles alle data i 
tabelform, der for hver forsøgsgruppe viser antallet af dyr ved forsøgets start, antallet af dyr, der udviser læsioner, adfærdsmæssige eller biokemiske virkninger, typen og graden af disse læsioner eller 
virkninger og procentdelen af dyr, der udviser hver enkelt type eller 
grad af læsion eller virkning.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Resultaterne af denne undersøgelse vurderes med hensyn til inci ­
densen og sværhedsgraden af og korrelationen mellem adfærdsmæs ­
sige, biokemiske og histopatologiske virkninger og eventuelle andre observerede virkninger i forsøgs- og kontrolgrupper.
 
Resultater i talform vurderes med passende og generelt accepterede 
statistiske metoder. De anvendte statistiske metoder udvælges i 
forbindelse med forsøgets udformning.  
3. RAPPORTERING  
FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
Forsøgsdyr:  
— anvendt stamme  
— dyrenes antal og alder  
— herkomst, laboratoriemiljø osv.  
— hvert af dyrenes vægt ved forsøget begyndelse.  
Forsøgsbetingelser  
— oplysninger om teststoffets formulering, stabilitet og homogeni ­
tet, hvor dette er relevant  
— begrundelse for valg af vehikel  
— oplysninger om indgift af teststoffet  
— oplysninger om foder- og vandkvalitet  
— begrundelse for valg af dosis  
— angivelse af indgivne doser, herunder oplysninger om vehiklet og 
det indgivne stofs volumen og fysiske form  
— oplysninger om eventuelle beskyttelsesmidler og om indgift 
heraf.  
Resultater:  
— data for legemsvægt  
— data for toksiske reaktioner pr. gruppe, herunder dødelighed  
— de kliniske observationers art, grad og varighed (reversible eller 
ej) 
— en detaljeret beskrivelse af biokemiske metoder og fund  
— obduktionsfund  
— en detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund  
— eventuel statistisk behandling af resultaterne.  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
Denne metode svarer til TG 418 fra OECD.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  FORSINKET NEUROTOKSICITET VED ORGANISKE 
PHOSPHORFORBINDELSER GENTAGEN DOSIS — 28 DAGE  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Ved vurdering af stoffers toksiske virkninger er det vigtigt at under ­
søge visse stofgruppers mulighed for at fremkalde specifikke former for neurotoksicitet, som i givet fald ikke kan påvises i andre toksici ­
tetsundersøgelser. Visse organiske phosphorforbindelser har vist sig 
at forårsage forsinket neurotoksicitet og bør undersøges med henblik 
herpå.
 
Der kan anvendes in vitro-screeningtest til identificering af stoffer, 
som kan forårsage forsinket polyneuropati; negative resultater af in 
vitro-undersøgelser kan imidlertid ikke bruges som dokumentation 
for, at teststoffet ikke er neurotoksisk.  
Denne 28 dages test for forsinket neurotoksicitet giver oplysninger 
om mulige sundhedsrisici som følge af gentagen eksponering i et 
begrænset tidsrum. Testen giver oplysninger om dosis/respons og 
kan danne grundlag for en vurdering af et nul-effekt-niveau (NOA ­
EL), som kan anvendes ved fastsættelse af sikkerhedskriterier for eksponering.
 
Se den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Organiske phosphorforbindelser  omfatter uladede estere, thioestere 
og anhydrider af organiske phosphorsyrer, phosphonsyrer og phosp ­
horamidsyrer eller tilsvarende phosphorthiosyrer, phosphonthiosyrer og phosphorthioamidsyrer eller andre stoffer, der kan forsårsage den 
forsinkede neurotoksicitet, der til tider forekommer for denne stof ­
gruppe.
 
Forsinket neurotoksicitet  er et syndrom, der er knyttet til langvarig, 
forsinket opståen af ataxi, distal axonopati i rygmarv og perifere 
nerver og inhibition og aldring af neurotoksisk esterase (NTE) i nervevæv.
 
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Daglige doser af teststoffet indgives oralt til høner i 28 dage. Dyrene 
observeres mindst en gang dagligt for unormal adfærd, ataxi og 
paralyse indtil 14 dage efter sidste dosis. Der foretages biokemiske 
målinger, navnlig inhibition af neurotoksisk esterase (NTE), på tilfældigt udvalgte høner fra hver gruppe, normalt 24 og 48 timer efter sidste dosis. To uger efter sidste dosis aflives de resterende 
høner, og der foretages en histopatologisk undersøgelse af udvalgt 
nervevæv.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Forberedelser  
Unge, sunde kønsmodne høner, der er fri for virussygdomme og 
medicinering, der kan interferere med undersøgelsen, og hvis gang 
er normal, fordeles randomiseret i forsøgs- og kontrolgrupper og 
tilvænnes laboratoriebetingelserne i mindst fem dage inden undersø ­
gelsens påbegyndelse.  
Der anvendes bure eller indelukker, der giver hønsene fri bevæge ­
lighed, og som tillader uhindret observation af dyrenes gang.  
Teststoffet bør normalt indgives oralt med mavesonde, gelatinekap ­
sler eller en tilsvarende metode. Væsker kan indgives ufortyndet eller opløst i et passende vehikel, som f.eks. majsolie; faste stoffer bør om muligt opløses, eftersom store doser faste stoffer i gelatinekapsler 
ikke altid absorberes effektivt. For ikke-vandige vehikler skal vehik ­
lets toksiske egenskaber kendes eller i givet fald bestemmes inden forsøget.
 
1.4.2.  Forsøgsbetingelser  
1.4.2.1.  Forsøgsdyr  
Unge, kønsmodne høner (Gallus gallus domesticus) på otte til tolv 
måneder anbefales. Der anvendes racer og stammer af standardstør ­
relse, og hønerne bør normalt være opdrættet under betingelser, som 
tillader bevægelsesfrihed.  
1.4.2.2.  Antal og køn  
Der anvendes generelt mindst tre forsøgsgrupper og en vehikelkon ­
trolgruppe. Vehikelkontrolgruppen behandles på samme måde som forsøgsgruppen, med undtagelse af administration af teststoffet.
 
Der anvendes et tilstrækkeligt antal høner i hver gruppe, så mindst 
seks høner kan aflives med henblik på biokemisk bestemmelse (tre 
på hvert af de to valgte tidspunkter) og seks kan overleve den 14 dage lange observationsperiode efter eksponering med henblik på patologisk undersøgelse.
 
1.4.2.3.  Dosisniveauer  
Dosisniveauerne vælges under hensyntagen til resultaterne af en test 
for forsinket neurotoksicitet efter akut eksponering og eventuelle 
andre foreliggende data vedrørende teststoffets toksicitet eller kinetik. 
Det højeste dosisniveau vælges med henblik på at inducere toksiske virkninger, om muligt forsinket neurotoksicitet, men ikke død eller tydelig lidelse. Herefter vælges en række dosisniveauer i faldende 
størrelse til påvisning af dosisrelaterede reaktioner og fravær af 
erkendbare virkninger (NOAEL) ved det laveste dosisniveau.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4.  Grænsetest  
Hvis et forsøg udført efter de her beskrevne retningslinjer med et 
dosisniveau på mindst 1 000 mg/kg legemsvægt/dag ikke fremkalder observerbare toksiske virkninger, og hvis der ikke kan ventes 
toksiske virkninger på grundlag af data fra strukturelt beslægtede 
stoffer, kan en undersøgelse med anvendelse af en højere dosis betragtes som unødvendig. Grænsetesten er kun relevant, hvis human eksponering indicerer, at der er behov for anvendelse af et 
højere dosisniveau.
 
1.4.2.5.  Observationsperiode  
Dyrene observeres mindst en gang dagligt i eksponeringsperioden og 
14 dage efter, medmindre de skal obduceres.  
1.4.3.  Fremgangsmåde  
Dyrene indgives teststoffet syv dage om ugen i en periode på 28 
dage.  
1.4.3.1.  Generelle observationer  
Observationsperioden starter umiddelbart efter eksponering. Alle 
hønerne observeres omhyggeligt mindst en gang daglig i de 28 
dage og i 14 dage efter eksponering, eller indtil det fastlagte afliv ­
ningstidspunkt. Alle tegn på toksicitet registreres, herunder tids ­
punktet for indtræden af unormal adfærd og dennes type, grad og 
varighed. Observationerne omfatter, men er ikke begrænset til, 
unormal adfærd. Ataxi måles efter en talskala med mindst fire niveauer, og paralyse registreres. Mindst to gange om ugen udtages hønerne af burene og underkastes en periode med tvungen 
motorisk aktivitet, som f.eks. stigeklatring, med henblik på at lette 
observationen af minimale toksiske virkninger. Døende dyr og dyr, der viser symptomer på stærk smerte eller lidelse, fjernes, så snart de iagttages, hvorefter de aflives på human måde og obduceres.
 
1.4.3.2.  Legemsvægt  
Alle hønsene vejes lige inden indgift af teststoffet og mindst én gang 
om ugen derefter.  
1.4.3.3.  Biokemisk undersøgelse  
Seks vilkårligt udvalgte høner fra hver forsøgs- og vehikelkontrol ­
gruppe aflives få dage efter indgift af sidste dosis, og hjernen og den lumbale rygmarv præpareres og undersøges for inhibition af neuro ­
toksisk esterase, Derudover kan det være nyttigt at præparere og 
undersøge ischiasnervevæv for inhibition af neurotoksisk esterase. Normalt aflives tre høner fra kontrolgruppen og fra hver forsøgs ­
gruppe 24 timer og tre 48 timer efter sidste dosis. Hvis data fra 
undersøgelsen for akut toksicitet eller andre undersøgelser (f.eks. 
toksikokinetik) indicerer, at andre tidspunkter for aflivning efter sidste dosis er bedre end de her nævnte, anvendes disse med angi ­
velse af begrundelsen herfor.
 
Hvis det skønnes hensigtsmæssigt, kan der også foretages analyser af 
acetylcholinesterase (AChE) på disse prøver. Spontan reaktivering af 
AChE kan imidlertid indtræde in vivo og således føre til, at stoffets 
AChE-inhiberende aktivitet undervurderes.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4.  Makroskopisk undersøgelse  
Den makroskopiske undersøgelse af alle dyrene (aflivet efter 
forsøgets afslutning eller under forsøget, fordi de var døende) omfatter observation af hjerne og rygmarv.
 
1.4.3.5.  Histopatologisk undersøgelse  
Der foretages en mikroskopisk undersøgelse af nervevæv fra dyr, der 
overlever observationsperioden, og som ikke er anvendt til de bioke ­
miske undersøgelser. Væv fikseres in situ ved anvendelse af perfu ­
sionsmetoder. Snittene bør omfatte cerebellum (længdesnit langs midterlinjen) medulla oblongata, rygmarv og de perifere nerver. Rygmarvssnit tages fra det øvre cervikale segment, midt i brysthulen 
og det lumbosakrale område. Der tages snit af det distale område af 
tibianerven og dens udløbere til musculus gastrocnemius og ischias ­
nerven. Snittene farves med passende myelin- og axonspecifikke farver. Først foretages der en mikroskopisk undersøgelse af præser ­
veret væv fra alle dyrene i kontrolgruppen og højdosisgruppen. Hvis 
der er tegn på virkninger i højdosisgruppen, foretages der også en mikroskopisk undersøgelse af høner fra mellem- og lavdosisgrup ­
perne.
 
2. DATA  
Hvis resultaterne for de udvalgte endepunkter i denne metode (bio ­
kemi, histopatologi og adfærdsobservation) er negative, kræves der 
normalt ikke yderligere undersøgelse for forsinket neurotoksicitet 
Ved tvetydige eller inkonklusive resultater for disse endepunkter kan yderligere vurdering være nødvendig.
 
Der tilvejebringes individuelle data. Herudover opstilles alle data i 
tabelform, der for hver forsøgsgruppe viser antallet af dyr ved forsøgets start, antallet af dyr, der udviser læsioner, adfærdsmæssige 
eller biokemiske virkninger, typen og graden af disse læsioner eller 
virkninger og procentdelen af dyr, der udviser hver enkelt type eller grad af læsion eller virkning.
 
Resultaterne af denne undersøgelse vurderes med hensyn til inci ­
densen og sværhedsgraden og af korrelationen mellem adfærdsmæs ­
sige, biokemiske og histopatologiske virkninger og eventuelle andre 
observerede virkninger i forsøgs- og kontrolgrupper.  
Resultater i talform vurderes med passende og generelt accepterede 
statistiske metoder. De anvendte statistiske metoder udvælges i 
forbindelse med forsøgets udformning.  
3. RAPPORTERING  
FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
Forsøgsdyr:  
— anvendt stamme  
— dyrenes antal og alder  
— herkomst, laboratoriemiljø osv.  
— hvert af dyrenes vægt ved forsøgets begyndelse.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
Forsøgsbetingelser:  
— oplysninger om teststoffets formulering, stabilitet og homogeni ­
tet, hvor dette er relevant  
— begrundelse for valg af vehikel  
— oplysninger om indgift af teststoffet  
— oplysninger om foder- og vandkvalitet  
— begrundelse for valg af dosis  
— angivelse af indgivne doser, herunder oplysninger om vehiklet og 
det indgivne stofs volumen og fysiske form  
— begrundelse for valg af andre tidspunkter for biokemisk bestem ­
melse end efter 24 og 48 timer.  
Resultater  
— data for legemsvægt  
— data for toksiske reaktioner pr. dosisniveau, herunder dødelighed  
— nul-effekt-niveau (NOAEL)  
— de kliniske observationers art, grad og varighed (reversible eller 
ej) 
— en detaljeret beskrivelse af biokemiske metoder og fund  
— obduktionsfund  
— en detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund  
— eventuel statistisk behandling af resultaterne.  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
Denne metode svarer til TG 419 fra OECD.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  TEST FOR UNSCHEDULED DNA-SYNTESE (UDS) MED 
PATTEDYRLEVERCELLER IN VIVO  
1. METODE  
Denne metode er en gengivelse af OECD Test Guideline 486 
Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver 
Cells  In Vivo  (1997).  
1.1. INDLEDNING  
Formalet med testen for unscheduled DNA-syntese (UDS) med 
pattedyrleverceller in vivo er at påvise, om et teststof inducerer 
dna-reparation i levercellerne hos de behandlede dyr (1) (2) (3) (4).  
Denne in vivo-test indeholder en metode til undersøgelse af kemika ­
liers gentoksiske virkninger i leveren. Det målte endpoint er tegn på 
dna-beskadigelse og deraf følgende reparation i leverceller. Leveren er 
normalt det sted, hvor absorberede stoffer først og fremmest metaboli ­
seres. Den er derfor et egnet sted til in vivo-måling af dna-beskadigelse.  
Hvis der er grund til at tro, at teststoffet ikke vil nå frem til målvæ ­
vet, er denne test ikke egnet.  
Endpoint for unscheduled DNA-syntese (UDS) måles ved at 
bestemme optagelsen af mærkede nukleosider i celler, hvor der 
ikke foregår planmæssig dna-syntese (S-fase). Den mest benyttede teknik består i at bestemme optagelsen af tritiummærket thymidin (
 3 H-TdR) ved autoradiografi. Der bør fortrinsvis benyttes rottelevere 
i UDS-test in vivo. Der kan benyttes andet væv end levervæv, men 
det er ikke omfattet af denne metode.  
Påvisningen af et UDS-respons afhænger af, hvor mange dna-baser 
der er skåret ud og erstattet på det beskadigede sted. Derfor er UDS- 
testen særlig værdifuld til påvisning af stoffremkaldt »longpatch repair« (20-30 baser). Til gengæld er følsomheden over for »short ­
patch repair« (1-3 baser) meget lavere. Endvidere kan der optræde 
mutagene hændelser som følge af manglende reparation, forkert repa ­
ration eller forkert replikation af dna-skader. UDS-metodens reaktion er ikke noget mål for, i hvor høj grad reparationsprocessen er lykke ­
des. Ydermere er det muligt, at et mutagen reagerer med dna, men at 
dna-beskadigelsen ikke repareres ved en udskæringsreparationspro ­
ces. De beskedne specifikke oplysninger om mutagen aktivitet, som UDS-testen giver, opvejes af, at dens endpoint potentielt har høj følsomhed, eftersom det måles i hele genomet.
 
Se også den generelle indledning til del B.  
1.2. DEFINITIONER  
Celler under reparation:  et NNG-tal, der er højere end en forud 
fastsat værdi, som det laboratorium, der udfører testen, skal begrunde.  
Nettokernekorn (NNG):  kvantitativt mål for cellers UDS-aktivitet 
ved en autoradiografisk UDS-test; tallet beregnes ved at trække gennemsnitsantallet af cytoplastmakorn i kerneækvivalente områder af cytoplasmaet (CG) fra antallet af kernekorn (NG), dvs. NNG = 
NG-CG. NNG-tallet beregnes for den enkelte celle, hvorefter tallene 
samles i puljer for celler i samme kultur, for parallelle kulturer osv.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Unscheduled DNA-syntese (UDS):  dna-reparationssyntese efter 
udskæring og fjernelse af en dna-streng, der indeholder en region, 
der er beskadiget af kemiske stoffer eller fysiske påvirkninger.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
UDS-testen med pattedyrleverceller in vivo viser dna-reparationssyn ­
tese efter udskæring og fjernelse af en dna-streng, der indeholder en region, der er beskadiget af kemiske stoffer eller fysiske påvirknin ­
ger. Testen baseres sædvanligvis på indsætning af
 3 H-TdR i dna'et i 
leverceller, hvor der er lav forekomst af celler i cellecyklussens S- 
fase. Optagelse af  3 H-TdR bestemmes normalt ved autoradiografi, 
eftersom denne teknik, i modsætning til f.eks. væskescintillation, ikke er følsom over for interferens fra celler i S-fase.
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Præparater  
1.4.1.1.  Valg af dyreart  
Der benyttes sædvanligvis rotter, selv om andre egnede pattedyrarter 
kan benyttes. Der bør anvendes almindeligt brugte laboratori ­
estammer af unge sunde voksne dyr. Ved undersøgelsens begyndelse 
bør vægtvariationen mellem dyrene være mindst mulig og ikke over 
± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn.  
1.4.1.2.  Miljø og fodring  
Der gælder de almindelige forhold som beskrevet i den generelle 
indledning til del B, blot bør der tilstræbes en fugtighed på 50-60 %.  
1.4.1.3.  Forberedelse af dyrene  
Der udvælges tilfældigt sunde unge voksne dyr til kontrol- og 
behandlingsgruppen. Burene bør anbringes på en sådan måde, at deres placering får mindst mulig indvirkning. Dyrene identificeres entydigt og holdes i deres bure i mindst fem dage, inden undersø ­
gelsen påbegyndes, så de tilvænnes laboratorieforholdene.
 
1.4.1.4.  Teststof/testpræparat  
Teststoffer i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløs ­
ningsmidler eller bærestoffer og fortyndes passende, inden de gives til dyrene. Teststoffer i væskeform kan enten gives direkte til dyrene eller fortyndes først. Der benyttes frisk fremstillede teststofpræpara ­
ter, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
 
1.4.2.  Testbetingelser  
1.4.2.1.  Opløsningsmiddel/bærestof  
Opløsningsmiddel/bærestof må ikke have toksiske virkninger ved de 
benyttede doser og må ikke mistænkes for at reagere kemisk med teststoffet. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte, skal brugen af dem underbygges med kompatibilitetsdata. 
Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et 
vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Kontrolgrupper  
I hver individuelt gennemført del af forsøget medtages der sidelø ­
bende både positive og negative (opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolgrupper. Bortset fra behandling med teststof skal dyrene i 
kontrolgrupperne behandles på samme måde som dyrene i behand ­
lingsgrupperne.
 
Positive kontrolstoffer bør være stoffer, der vides at fremkalde UDS, 
når de indgives i en dosis, der forventes at give en påviselig forøgelse i forhold til baggrundsværdierne. Positive kontrolstoffer, der kræver metabolismeaktivering, bør benyttes i doser, der frem ­
bringer moderat reaktion (4). Doserne kan vælges på en sådan måde, 
at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' iden ­
titet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem. Nedenfor er opregnet eksempler på positive kontrolstoffer:
 
Prøveudtagningstidspunkt Stof CAS nr. Einecs nr.  
Tidlig prøveudtagning (2-4 timer) N-nitrosodimethylamin 62-75-9 200-249-8 
Sen prøveudtagning N-2-fluorenylacetamid 53-96-3 200-188-6  
Der kan anvendes andre egnede positive kontrolstoffer. Det kan 
accepteres, at den positive kontrol indgives på anden måde end test ­
stoffet.  
1.5. FREMGANGSMÅDE  
1.5.1.  Dyrenes antal og køn  
Der anvendes tilstrækkelig mange dyr til, at der er taget hensyn til 
den naturlige variation i reaktionerne på testen. Der skal være mindst tre analyserbare dyr i hver gruppe. Er der indsamlet en betydelig historisk database, kræves der kun et eller to dyr i sideløbende 
negative og positive kontrolgrupper.
 
Hvis der på det tidspunkt, hvor undersøgelsen foretages, foreligger 
data fra undersøgelser med samme dyreart og med samme indgifts ­
måde, som viser, at der ikke er nogen væsentlig toksicitetsforskel mellem de to køn, er test med kun et køn, helst hanner, tilstrække ­
ligt. Hvis udsættelsen af mennesker for det kemiske stof er kønsspe ­
cifik, som det f.eks. er tilfældet med visse farmaceutiske stoffer, skal 
testen udføres med dyr af det pågældende køn.
 
1.5.2.  Behandlingsplan  
Teststofferne indgives normalt i en enkelt behandling.  
1.5.3.  Dosisniveauer  
Normalt benyttes der to dosisniveauer. Den højeste dosis defineres 
som den dosis, der fremkalder sådanne tegn på toksicitet, at højere dosis med samme indgiftsmønster må forventes at medføre død. 
Normalt bør laveste dosis være mellem 50 % og 25 % af den 
højeste dosis.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Stoffer med specifik biologisk aktivitet ved lav ikke-toksisk dosis 
(f.eks. hormoner og mitogener) kan danne undtagelser fra disse 
dosisfastsættelseskriterier og bør evalueres individuelt. Hvis der gennemføres en forprøve til bestemmelse af dosisinterval, fordi der ikke foreligger nogen egnede data, bør den udføres i samme labora ­
torium med samme art, stamme, køn og behandlingsmåde, som agtes 
benyttet i hovedundersøgelsen.
 
Højeste dosis kan også defineres som en dosis, der i nogen grad 
udviser tegn på toksicitet i leveren (f.eks. pyknotiske kerner).  
1.5.4.  Grænsetest  
Hvis der ved en test med én dosis på mindst 2 000 mg pr. kg 
legemsvægt indgivet på én gang eller i to omgange samme dag 
ikke kan iagttages nogen toksiske virkninger, og hvis man på grundlag af data om strukturmæssigt beslægtede stoffer ikke forventer gentoksicitet, er en fuldstændig undersøgelse muligvis 
ikke nødvendig. Den forventede eksponering af mennesker kan 
foranledige, at der benyttes en højere dosis i grænsetesten.
 
1.5.5.  Indgift af doser  
Teststoffet indgives normalt ved tvangsfodring med sonde eller en 
passende intubationskanyle. Andre indgiftsmåder kan accepteres, hvis de kan begrundes. Intraperitoneal injektion anbefales ikke, da leveren derved kan udsættes for teststoffet direkte og ikke via kreds ­
løbet. Hvor stor en væskemængde, der kan indgives ad gangen ved 
tvangsfodring eller injektion, afhænger af forsøgsdyrenes størrelse. Mængden bør højst være på 2 ml pr. 100 g legemsvægt. Anvendelse af større rumfang skal begrundes. Bortset fra lokalirriterende og 
ætsende stoffer, som normalt vil have kraftigere virkninger ved 
højere koncentrationer, bør testvolumenet variere så lidt som muligt, idet koncentrationen justeres, så volumenet bliver det samme ved alle dosisniveauer.
 
1.5.6.  Præparering af leverceller  
Leverceller fra behandlede dyr præpareres normalt 12-16 timer efter 
indgiften. Medmindre reaktionen på dette tidspunkt er tydeligt posi ­
tiv, er desuden yderligere en tidlig prøveudtagning (normalt to-fire 
timer efter indgiften) sædvanligvis påkrævet. Andre tidspunkter for prøveudtagning kan benyttes, når de kan begrundes med toksikoki ­
netiske data.
 
Korttidskulturer af pattedyrleverceller etableres sædvanligvis ved 
perfusion af leveren in situ med collagenase, idet man lader frisk 
dissocierede leverceller sætte sig fast på en egnet flade. Leverceller 
fra negative kontroldyr skal have en levedygtighed (5) på mindst 50 %.
 
1.5.7.  Bestemmelse af UDS  
Nyligt isolerede pattedyrleverceller inkuberes normalt i et medium, 
der indeholder  3 H-TdR i et passende tidsrum, f.eks. tre-otte timer. 
Når inkubationstiden er afsluttet, fjernes mediet fra cellerne, som dernæst kan inkuberes i et medium, der indeholder overskud af 
umærket thymidin, så ikke-indbygget radioaktivitet (»cold chase«) 
bliver mindst mulig. Cellerne skylles, fikseres og tørres. Ved længere inkuberingstider er »cold chase« ikke altid nødvendigt. Objektglassene dyppes i autoradiografiemulsion, eksponeres i 
mørke (f.eks. i køleskab i 7-14 dage), fremkaldes og farves, og de 
eksponerede sølvkorn tælles. Der fremstilles to-tre objektglas pr. dyr.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Analyse  
De præparede objektglas skal indeholde tilstrækkelig mange celler 
med normal morfologi til, at der kan foretages en meningsfyldt vurdering af UDS. Præparaterne undersøges mikroskopisk for tegn 
på åbenlys cytotoksicitet (f.eks. pyknose eller nedsat radioaktiv 
mærkning).
 
Objektglassene kodes, inden kornene tælles. Normalt bedømmes der 
100 celler fra hvert dyr på mindst to objektglas; bedømmelse af 
mindre end 100 celler pr. dyr skal begrundes. Der tælles ikke korn for celler i S-fase, men andelen af celler i S-fase kan registreres.
 
Den mængde  3 H-TdR, der indbygges i kerner og cytoplasma i 
morfologisk normale celler, og som giver sig udtryk i afsættelse af sølvkorn, bestemmes med egnede metoder.
 
Der foretages korntælling over kernerne (kernekorn, NG) og kerne ­
ækvivalente områder over cytoplasmaet (cytoplasmakorn, CG). CG- tallene fremkommer enten ved at tage de kraftigst mærkede cytoplas ­
maområder eller ved at tage gennemsnittet af to-tre tilfældigt fore ­
tagne tællinger af cytoplasmakorn i nærheden af kernerne. Der kan 
benyttes andre tællemetoder (f.eks. helcelletælling), hvis de kan begrundes (6).
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Dataene præsenteres for hvert enkelt objektglas og hvert enkelt dyr. 
Desuden sammenfattes alle data i tabel form. For hver celle, hvert dyr og hver dosis og tidspunkt beregnes tallet for nettokernekorn (NNG) ved at trække CG-tallene fra NG-tallene. Hvis der tælles 
»celler under reparation«, skal de kriterier, der benyttes til definering 
af »celler under reparation«, begrundes og underbygges med tidligere og sideløbende negative kontroldata. Talresultater kan evalueres ved statistiske metoder. Eventuelt benyttede statistiske test skal vælges og 
begrundes, inden undersøgelsen gennemføres.
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
Nedenfor følger nogle eksempler på kriterier for positiv/negativ reaktion: 
positiv (i) NNG-værdier, der er højere end en forud 
fastsat tærskelsværdi, som er begrundet med udgangspunkt i laboratoriets tidligere data 
eller 
(ii) NNG-værdier, der er signifikant større end 
sideløbende kontrol 
negativ (i) NNG-værdier, der er inden for eller under en 
kontroltærskelværdi, der bygger på tidligere resultater eller 
(ii) NNG-værdier, der ikke er signifikant større 
end sideløbende kontrol
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Dataenes biologiske relevans skal tages i betragtning, f.eks. sådanne 
parametre som variation mellem dyr, sammenhæng mellem dosis og 
respons og cytotoksicitet. Statistiske metoder kan benyttes som hjæl ­
pemiddel ved evalueringen af testresultaterne. Statistisk signifikans bor ikke være den eneste faktor, der afgør, om resultatet bedømmes 
som positivt.
 
De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i 
sjældne tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvety ­
digt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.
 
Et positivt resultat af en test for unscheduled DNA-syntese (UDS) 
med pattedyrleverceller in vivo viser, at teststoffet inducerer dna- skader i pattedyrleverceller in vivo, som kan repareres ved unsche ­
duled DNA-syntese in vivo. Et negativt resultat viser, at teststoffet 
under testbetingelserne ikke inducerer dna-skader, der kan påvises 
ved denne test.
 
Sandsynligheden for, at teststoffet eller dets metabolitter når frem til 
målvævet (f.eks. systemisk toksicitet), bør diskuteres.  
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— begrundelse for valg af bærestof  
— teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof, 
hvis den kendes  
Forsøgsdyr:  
— anvendt art/stamme  
— antal dyr og deres alder og køn  
— oprindelse, miljø, føde mv.  
— de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse, samt interval, 
gennemsnit og standardafvigelse for legemsvægten for hver enkelt gruppe
 
Testbetingelser:  
— positive og negative (bærestof/opløsningsmiddel) kontrolgrupper  
— data fra en eventuel forprøve til bestemmelse af dosisinterval  
— begrundelse for valg af dosisniveau  
— detaljerede oplysninger om præparering af teststoffet  
— detaljerede oplysninger om indgift af teststoffet  
— begrundelse for indgiftsvej  
— eventuelle metoder til kontrol af, at teststoffet er nået frem til det 
almindelige kredsløb eller målvævet  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— eventuel omregning fra teststofkoncentration (ppm) i 
føde/drikkevand til faktisk dosis (mg pr. kg legemsvægt pr, dag)  
— detaljerede oplysninger om føde- og vandkvalitet  
— detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan  
— metoder til måling af toksicitet  
— metoder til præparering og dyrkning af leverceller  
— anvendt autoradiografiteknik  
— antal præparerede objektglas og antal bedømte celler  
— evalueringskriterier  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ 
eller tvetydig  
Resultater:  
— gennemsnitsværdier af kernekorn, cytoplasmakorn og nettokerne ­
korn for hvert enkelt objektglas, dyr og gruppe  
— dosis/respons-sammenhæng, når det er muligt  
— eventuelle statistiske analyser  
— tegn på toksicitet  
— data for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og 
positive kontrolprøver  
— data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og posi ­
tive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit og 
standardafvigelser  
— antal »celler under reparation«, hvis det er bestemt  
— antal celler i S-fase, hvis det er bestemt  
— cellernes levedygtighed  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G. 
(1985), An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.  
(2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, H., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the  In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair 
Assay, Mutation Res., 189, pp. 12-133.
 
(3) Kennelly, J.C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson 
B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell I. de G. (1993), In 
Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D.J. and Fox, M., 
(eds.), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part II revised, Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, pp. 52-77.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D.J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C.A. and 
Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and In Vivo,  Mutations Res., 312, pp. 263-285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initital 
Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepato ­
cytes Used for the  In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), 
Mutation Res., 291, pp. 21-27.  
(6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.L. (1982), Detec ­
tion of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/ln Vitro Hepato ­
cyte DNA Repair Assay,  Environ Mutagen,  4, pp. 553-562.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  IN VITRO-HUDÆTSNING: MÅLING AF TRANSKUTAN 
ELEKTRISK MODSTAND (TER)  
1. METODE  
Denne testmetode er ækvivalent med OECD TG 430 (2004).  
1.1. INDLEDNING  
Hudætsning defineres som fremkomsten af irreversibel vævsødelæg ­
gelse i huden efter påføring af teststof (jf. definitionen i Globally Harmonised System for the Classification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures (GHS)) (1). Med denne metode opnås der 
en procedure, hvor ætsning kan vurderes uden brug af levende dyr.
 
Vurderingen af hudætsning har typisk omfattet brug af 
laboratoriedyr (2). Betænkelighederne ved de smerter og lidelser, der er forbundet med denne fremgangsmåde, er omhandlet i revi ­
sionen af testmetode B.4, som muliggør bestemmelse af hudætsning 
ved hjælp af alternative in vitro-metoder, så dyrene undgår smerter og lidelser.
 
Første trin mod definitionen af alternative test, der kan anvendes til 
test af hudætsning, og som kan anvendes i lovgivningsøjemed, var 
gennemførelsen af prævalideringsundersøgelser (3). Herefter blev der gennemført (6)(7)(8) en formel valideringsundersøgelse af in vitro- 
metoder til vurdering af hudætsning (4)(5). På baggrund af resultatet 
af disse undersøgelser og anden offentliggjort litteratur henstilles det, at følgende test anvendes til vurdering af in vivo-hudætsning (9) ­
(10)(11): test med human hudmodel (se testmetode B.40.A) og test 
til måling af transkutan elektrisk modstand (denne metode).
 
I henhold til valideringsundersøgelserne og andre offentliggjorte 
undersøgelser kan målingen af transkutan elektrisk modstand (TER) i rottehud (12)(13) på pålidelig vis skelne mellem stoffer, 
der er hudætsende, og stoffer, der ikke er hudætsende.
 
Den test, der er beskrevet i denne metode, muliggør identifikation af 
ætsende kemiske stoffer og blandinger. Den muliggør endvidere identifikation af stoffer og blandinger, der ikke er hudætsende, 
med støtte af væsentlig dokumentation om bestemmelse ved hjælp 
af andre eksisterende oplysninger (f.eks. pH, forholdet mellem struktur og aktivitet samt human- og/eller dyredata) (1)(2)(11)(14). Den giver ikke tilstrækkelige oplysninger om hudirritation og 
muliggør heller ikke underinddeling af ætsende stoffer som tilladt i 
henhold til GHS-systemet (Globally Harmonised Classification System) (1).
 
For fuldt ud at kunne vurdere de lokale virkninger på huden efter en 
enkelt dermal eksponering anbefales det at følge den sekventielle 
teststrategi, der fremgår af testmetode B.4 (2) og GHS-systemet (Globally Harmonised System) (1). Denne teststrategi omfatter gennemførelse af in vitro-test for hudætsning (som beskrevet i 
forbindelse med denne metode) og hudirritation, inden test i 
levende dyr overvejes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. DEFINITION  
In vivo-hudætsning:  er fremkomsten af irreversibel ødelæggelse af 
huden, nemlig synlig nekrose gennem epidermis til dermis, efter applikation af et teststof i op til fire timer. Typiske eksempler på 
ætsende reaktioner er ulcera, blødning, blodige sår og ved slutningen 
af observationsperioden på 14 dage misfarvning som følge af afbleg ­
ning af huden, hele områder af alopecia og ar. Histopatologisk undersøgelse bør overvejes for at evaluere tvivlsomme læsioner.
 
Transkutan elektrisk modstand (TER):  er et mål for hudens elek ­
triske impedans som en modstand i kiloohm. En simpel og robust metode til vurdering af barrierefunktion, hvor passagen af ioner 
gennem hud registreres ved hjælp af en Wheatstone-målebro.
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
Tabel 1  
Referencestoffer  
Navn EINECS nr. CAS nr.  
1,2-diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Stærkt ætsende 
acrylsyre 201-177-9 79-10-7 Stærkt ætsende 2-tert-butylphenol 201-807-2 88-18-6 Ætsende 
kaliumhydroxid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Ætsende 
svovlsyre (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Ætsende octansyre (kaprylsyre) 204-677-5 124-07-02 Ætsende 4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Ikke ætsende eugenol 202-589-1 97-53-0 Ikke ætsende phenethylbromid 203-130-8 103-63-9 Ikke ætsende 
tetrachlorethylen 204-825-9 27-18-4 Ikke ætsende 
isostearinsyre 250-178-0 30399-84-9 Ikke ætsende 4-(methylthio)-benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Ikke ætsende
 
De fleste af de anførte kemiske stoffer er hentet fra listen over 
kemiske stoffer, der var udvalgt til den internationale ECVAM-vali ­
deringsundersøgelse (4). De er udvalgt ud fra følgende kriterier:  
i) der skal være et lige stort antal ætsende og ikke-ætsende stoffer  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) der skal medtages stoffer, som findes i handelen, og som dækker 
de fleste af de relevante kemiske grupper  
iii) der skal indgå stærkt ætsende og mindre ætsende stoffer for at 
muliggøre skelnen mellem ætsningsstyrke  
iv) de udvalgte kemiske stoffer skal kunne håndteres på et labora ­
torium, uden at der opstår andre alvorlige risici end risikoen for ætsning.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Testmaterialet påføres i op til 24 timer på den epidermale overflade 
af hudlapper i et testsystem med to rum, hvor hudlapperne fungerer som adskillelse mellem de to rum. Hudlapperne tages fra 28-30 dage 
gamle rotter, der er aflivet på en human måde. Ætsende stoffer 
identificeres ved deres evne til at beskadige stratum corneum og svække dets barrierefunktion, hvilket kan måles som en reduktion i den naturlige TER under en tærskelværdi (12). For rottehud-TER er 
der valgt en tærskelværdi på 5 k Ω på baggrund af omfattende data 
om en lang række kemiske stoffer, hvor langt de fleste værdier var enten klart langt over (ofte > 10 k Ω) eller langt under (ofte < 3 k Ω) 
denne værdi (12). Stoffer, som ikke er ætsende hos dyr, men som er 
irriterende eller ikke-irriterende, medfører generelt ikke en TER 
under denne tærskelværdi. Brugen af andre hudpræparater eller andet apparatur kan endvidere ændre tærskelværdien og nødvendig ­
gøre yderligere validering.
 
Testproceduren omfatter et farvebindingstrin til bekræftende test af 
positive resultater i TER, herunder værdier omkring 5 k Ω. Farve­
bindingstrinnet viser, om stigningen i gennemtrængeligheden for 
ioner skyldes fysisk ødelæggelse af stratum corneum. TER- metoden med rottehud har vist sig at kunne forudsige in vivo- ætsningen hos kaniner vurderet i henhold til testmetode B.4 (2). 
Det bør bemærkes, at in vivo-kanintesten er særdeles konservativ 
med hensyn til hudætsning og hudirritation sammenlignet med lappe ­
prøven med human hud (15).
 
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.5.1.  Dyr  
Rotter er valgt, fordi deres huds følsomhed over for kemiske stoffer i 
denne test tidligere er påvist (10). Rottens alder (når hudprøven 
tages) og stamme er særligt vigtig for at sikre, at hårfolliklerne er 
i hvile, inden væksten af voksenhår begynder.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Hårene på ryggen og flanken af unge (ca. 22 dage gamle) han- eller 
hunrotter af (Wistar-stammen eller lignende stamme) fjernes omhyg ­
geligt med en lille dyresaks. Dyrene vaskes dernæst omhyggeligt, idet der gnubbes, og det pågældende hudområde holdes neddyppet i en opløsning af antibiotika, som f.eks. indeholder streptomycin, peni ­
cillin, chloramphenicol og amphotericin i koncentrationer, der er høje 
nok til at hæmme bakterievækst. Dyrene vaskes igen med antibiotika på tredje- og fjerdedagen efter den første vask og skal anvendes inden tre dage efter den anden vask, når stratum corneum har rege ­
nereret sig efter fjernelsen af hår.
 
1.5.2.  Fremstilling af hudlapper  
Dyrene aflives på human måde, når de er 28-30 dage gamle. Alderen 
er kritisk. Ryghuden fjernes fra hvert dyr, og overflødigt fedtvæv 
fjernes omhyggeligt, idet det skrælles af huden. Hudlapper med en diameter på ca. 20 mm udtages. Huden kan gemmes, inden lapperne anvendes, hvis det er påvist, at positive og negative kontroldata 
svarer til de data, der opnås med frisk hud.
 
Hver hudlap anbringes for enden af et rør af PTFE (polytetrafluo ­
rethylen), idet det sikres, at den epidermale overflade er i kontakt med røret. En O-ring af gummi sættes tætsluttende omkring rørets ende for at holde huden på plads, og overflødigt væv klippes af. 
Rørets og O-ringens dimensioner fremgår af figur 2. O-ringen af 
gummi forsegles derefter omhyggeligt til enden af PTFE-røret med vaseline. Røret fastholdes ved hjælp af fjederklemmer i et ydre kammer, som indeholder en MgSO
 4 -opløsning (154 mM) (figur 1). 
Hudlappen skal være fuldstændigt dækket af MgSO  4 -opløsningen. 
Der kan fremstilles op til 10-15 hudlapper af huden fra en enkelt rotte.
 
Inden testen begynder, måles den elektriske modstand i to hudlapper 
for at kontrollere den enkelte dyrehuds kvalitet. For begge hudlapper skal modstanden være større end 10 k Ω, hvis resten af lapperne skal 
anvendes i testen. Hvis modstanden er mindre end 10 k Ω, kasseres 
resten af lapperne fra den pågældende hud.
 
1.5.3.  Påføring af test- og kontrolstoffer  
Samtidige positive og negative kontrolværdier skal anvendes i hver 
undersøgelse for at sikre, at forsøgsmodellen fungerer korrekt. Der skal anvendes hudlapper fra et enkelt dyr. Som positive og negative 
kontrolstoffer foreslås henholdsvis 10 M saltsyre og destilleret vand.
 
Flydende teststoffer (150 μl) påføres på den epidermale overflade 
inde i røret. Ved faste teststoffer skal tilstrækkeligt af stoffet 
påføres hudlappen, så hele overfladen er dækket af stoffet. Der tilsættes deioniseret vand (150 μl) oven på stoffet, og røret rystes 
forsigtigt. For at sikre maksimal kontakt med huden kan det være 
nødvendigt at opvarme visse faste stoffer til 30
 o C, så de smelter 
eller blødgøres, eller formale dem til granulat eller pulver.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Der bruges tre hudlapper til hvert test- og kontrolstof. Teststofferne 
skal sidde på huden i 24 timer ved 20-23  o C. Teststoffet fjernes 
under rindende ledningsvand med en temperatur på højst 30  o C, 
indtil der ikke kan fjernes mere af stoffet.  
1.5.4.  TER-målinger  
Hudens impedans måles, idet TER måles ved hjælp af en Wheats ­
tone-lavvoltvekselstrømsmålebro (13). De generelle specifikationer 
for broen er en driftsspænding på 1-3 volt, en sinusformet eller rektangulært formet vekselstrøm på 50-1 000 Hz og et måleområde på mindst 0,1-30 k Ω. Den målebro, der anvendes i valideringsunder ­
søgelsen, måler induktans, kapacitet og modstand op til værdier på 
henholdsvis 2 000 H, 2 000 μF og 2 M Ω ved frekvenser på 100 Hz 
eller 1 kHz ved hjælp af serier eller parallelle værdier. I forbindelse med TER-ætsningstesten registreres målingerne af modstand ved en 
frekvens på 100 Hz og ved hjælp af serieværdier. Før den elektriske 
modstand måles, reduceres hudens overfladespænding ved tilsætning af 70 % ethanol i så tilstrækkelig mængde, at hele hudens overflade dækkes. Efter nogle få sekunder fjernes ethanolen, og vævet fugtes 
ved tilsætning af 3 ml MgSO
 4 -opløsning (154 mM). Elektroderne fra 
målebroen anbringes på hver sin side af hudlappen for at måle modstanden i k Ω/hudlap (figur 1). Elektrodedimensioner og 
længden af elektroderne under krokodillenæbbene ses i figur 
2. Krokodillenæbbet på den indre elektrode hviler på toppen af 
PTFE-røret under modstandsmålingen, hvorved man sikrer sig, at et konstant stykke af elektroden er nede i MgSO
 4 -opløsningen. 
Den ydre elektrode er anbragt inde i det ydre kammer, så den 
rører ved kammerbunden. Afstanden mellem fjederklemmen og 
bunden af PTFE-røret skal holdes konstant (figur 2), da den har indflydelse på den målte modstand. Det betyder, at afstanden mellem den indre elektrode og hudlappen skal være konstant og så 
lille som mulig (1-2 mm).
 
Hvis den målte modstand er større end 20 k Ω, kan dette skyldes, at 
rester af teststoffet ligger som en belægning på hudlappens overflade. 
Man kan forsøge at fjerne denne belægning ved at holde en tommel ­
finger iført en gummitut for PTFE-røret og ryste røret i ca. 10 sekunder. Derefter kasseres MgSO
 4 -opløsningen, og målingen 
gentages med en ny MgSO  4 -opløsning.  
Testapparaturets og forsøgsprocedurens egenskaber og dimensioner 
kan have indflydelse på de opnåede TER-værdier. Tærskelværdien for ætsning, 5 k Ω, blev bestemt med det apparatur og den frem ­
gangsmåde, der er beskrevet i denne metode. Hvis testbetingelserne 
ændres, kan der blive tale om andre tærskel- og kontrolværdier. Det 
anbefales derfor, at metoden og tærskelværdien for modstand kali ­
breres ved at teste en række referencestandarder, der vælges blandt de kemikalier, som blev anvendt i valideringsundersøgelsen (4) (5), 
eller blandt de kemiske grupper, der svarer til de undersøgte kemiske 
stoffer. Tabel 1 viser et sæt relevante referencestoffer.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Farvebindingsmetoder  
Eksponering for visse ikke-ætsende stoffer kan bevirke, at 
modstanden falder til under tærskelværdien på 5 k Ω, hvorved 
ioner kan passere gennem stratum corneum, hvilket sænker den elek ­
triske modstand (5). Neutrale organiske stoffer og kemikalier med 
overfladeaktive egenskaber (herunder rengøringsmidler, emulgatorer og andre overfladeaktive stoffer) kan fjerne hudfedt og gøre barrieren gennemtrængelig for ioner. Hvis TER-værdierne for teststofferne er 
mindre end eller omkring 5 k Ω, og der ikke forekommer synlige 
ødelæggelser, skal farvestoffets evne til at trænge ned i kontrolvævet og det behandlede væv vurderes med henblik på at afgøre, om de 
opnåede TER-værdier skyldes øget hudgennemtrængelighed eller 
hudætsning (3)(5). I sidstnævnte tilfælde, hvor stratum corneum er ødelagt, trænger farvestoffet sulforhodamin B efter påføring på hudoverfladen hurtigt ned og farver det underliggende væv. Netop 
dette farvestof er stabilt i forbindelse med en lang række kemiske 
stoffer og påvirkes ikke af den ekstraktionsprocedure, der er beskrevet i det følgende.
 
1.5.5.1.  Påføring og fjernelse af farvestoffet sulforhodamin B  
Efter TER-undersøgelsen fjernes magnesiumsulfatopløsningen fra 
røret, og huden undersøges omhyggeligt for synlige ødelæggelser. Hvis der ikke forekommer synlig større ødelæggelse, påføres 150 
μl af en 10 % (w/v)-opløsning af sulforhodamin B (Acid Red 52; 
C.I. 45100, EINECS nr. 222-529-8, CAS nr. 3520-42-1) i destilleret vand på den epidermale overflade af hver hudlap i 2 timer. Disse hudlapper vaskes derefter under vandhanen i ca. 10 sekunder med 
vand, der ikke er varmere end stuetemperatur, for at fjerne 
overskydende/ikke-bundet farvestof. Hver hudlap fjernes omhygge ­
ligt fra PTFE-røret og anbringes i et glas (f.eks. et 20 ml-glas til scintillationsmålinger) indeholdende deioniseret vand (8 ml). Glasset 
rystes forsigtigt i 5 minutter for at fjerne yderligere ikke-bundet 
farvestof. Denne skylning gentages, hvorefter hudlapperne fjernes og anbringes i glas, der indeholder 5 ml af en 30 % (w/v)-opløsning af natriumdodecylsulfat (SDS) i destilleret vand. Glassene inkuberes 
ved 60
 o C til næste dag.  
Efter inkubationen fjernes og kasseres hudlapperne, og den tilbage ­
værende opløsning centrifugeres i 8 minutter ved 21  o C (relativ 
centrifugalkraft ~ 175 × g). 1 ml af supernatanten fortyndes 5 gange (v/v) (dvs. 1 ml + 4 ml) med en 30 % (w/v) SDS-opløsning 
i destilleret vand. Opløsningens ekstinktion/optical density (OD) 
måles ved 565 nm.
 
1.5.5.2.  Beregning af farveindhold  
Mængden af sulforhodamin B pr. hudlap beregnes ud fra OD-værdi ­
erne (5) (sulforhodamin B's molære ekstinktionskoefficient ved 565 nm = 8,7 × l0
 4 ; molekylvægten = 580). Farveindholdet 
bestemmes for hver hudlap ved hjælp af en speciel kalibreringskurve, 
hvorefter et gennemsnitligt farveindhold beregnes for flergangs ­
bestemmelser.  
2. DATA  
De målte resultater for modstand (k Ω) og eventuelt gennemsnitligt 
farveindhold ( μg/hudlap) i teststoffet og i positive og negative 
kontroller skal fremlægges i tabelform, herunder også data fra 
flergangsbestemmelser/gentagne undersøgelser, gennemsnitsværdier 
og individuelle værdier.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. FORTOLKNING AF RESULTATER  
De gennemsnitlige TER-resultater godkendes, hvis de samtidige 
positive og negative kontrolværdier falder inden for de acceptable intervaller for metoden i testlaboratoriet. De acceptable modstands ­
intervaller for den metode og det apparatur, der er beskrevet ovenfor, 
er anført i følgende tabel:
 
Kontrol Stof Modstandsin ­
terval (kΩ) 
Positiv 10M saltsyre 0,5 - 1,0 
Negativ Destilleret vand 10 - 25  
De gennemsnitlige resultater for farvebinding godkendes, hvis de 
samtidige positive og negative kontrolværdier falder inden for de acceptable intervaller for metoden. De foreslåede acceptable inter ­
valler for farveindhold for de kontrolstoffer, den metode og det appa ­
ratur, der er beskrevet ovenfor, er anført i følgende tabel:
 
Kontrol Stof Interval af 
farveindhold 
(μg/hudlap)  
Positiv 10M saltsyre 40-100 
Negativ Destilleret vand 15-35  
Teststoffet betragtes ikke som værende hudætsende:  
i) hvis den gennemsnitlige TER-værdi for teststoffet er større end 5 
kΩ, eller  
ii) hvis den gennemsnitlige TER-værdi er mindre end eller lig med 5 
kΩ, og 
— hudlappen ikke udviser synlig ødelæggelse, og  
— det gennemsnitlige farveindhold ligger langt under det 
gennemsnitlige farveindhold, der samtidig er målt i den posi ­
tive kontrol på 10M HCl.  
Teststoffet betragtes som værende hudætsende:  
i) hvis den gennemsnitlige TER-værdi er mindre end eller lig med 5 
kΩ, og hudlappen er synligt beskadiget, eller  
ii) hvis den gennemsnitlige TER-værdi er mindre end eller lig med 5 
kΩ, og 
— hudlappen ikke udviser synlig ødelæggelse, men  
— det gennemsnitlige farveindhold er større end eller lig med 
det gennemsnitlige farveindhold, der samtidig er målt i den 
positive kontrol på 10M HC1.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Test- og kontrolstoffer:  
— kemiske navne, f.eks. IUPAC- eller CAS-navn og -nummer, hvis 
de kendes  
— stoffets eller præparatets renhed og sammensætning (i procent ­
dele efter vægt) og dets fysiske form  
— fysiske-kemiske egenskaber, f.eks. fysisk tilstand, pH, stabilitet 
og opløselighed i vand, som er relevante for undersøgelsen  
— eventuel behandling af test-/kontrolstoffet inden testen (f.eks. 
opvarmning, formaling)  
— eventuelt kendt stabilitet.  
Forsøgsdyr:  
— anvendt stamme og køn  
— alder på dyr anvendt som donordyr  
— kilde, opbevaring, kost osv.  
— oplysninger om fremstillingen af hudlapper.  
Testbetingelser:  
— kalibreringskurver for testapparatur  
— kalibreringskurver for gennemførelse af farvebindingstest  
— detaljer om den anvendte testprocedure til TER-målinger  
— detaljer om den anvendte testprocedure til eventuel måling af 
farvebinding  
— beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren  
— beskrivelse af de anvendte evalueringskriterier.  
Resultater:  
— angivelse i tabelform af data fra TER-måling og eventuel farve ­
bindingsmåling for hvert enkelt dyr og hver enkelt hudlap  
— beskrivelse af andre observerede virkninger.  
Diskussion af resultater  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification 
System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. 
http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono 
(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
(2) Testmetode B.4. Akut toksicitet: hudirritation/ætsning.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., 
Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report and recommendations of ECVAM 
Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471- 482.
 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G., and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483- 524.  
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62 pp.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH 
Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 
(9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275- 
280. 
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin 
Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro 
test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods, National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/episbrd.pdf.
 
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st- 
2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27* 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat.
 
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  
in vitro  skin corrosivity test — modifications and validation. 
Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic. in Vitro 6, 191-194.  
(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., 
Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of 
the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. 
ATLA 26: 709-720.  
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7-17.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Figur 1  
Apparatur til TER-test med rottehud
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Figur 2  
Dimensioner på anvendte PFTE-rør, ydre rør og elektroder
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Kritiske faktorer for det ovenfor viste apparatur:  
— PTFE-rørets indvendige diameter  
— længden af elektroderne i forhold til PTFE-røret og det ydre rør, 
så hudlappen ikke berøres af elektroderne, og så en standard ­
længde af elektroden er i kontakt med MgSO  4 -opløsningen  
— mængden af MgSO  4 -opløsning i det ydre rør bør sikre en væske ­
dybde i forhold til niveauet i PFTE-røret som vist i figur 1  
— hudlappen bør være tilstrækkeligt fastgjort til PFTE-røret, så den 
elektriske måling er et sandt mål for hudens egenskaber.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40.A.  IN VITRO-HUDÆTSNING: TEST MED HUMAN 
HUDMODEL  
1. METODE  
Denne testmetode er ækvivalent med OECD TG 431 (2004).  
1.1. INDLEDNING  
Hudætsning defineres som fremkomsten af irreversibel vævsødelæg ­
gelse i huden efter påføring af teststof (jf. definitionen i Globally Harmonised System for the Classification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures (GHS)) (1). Denne testmetode kræver ikke 
brug af levende dyr eller dyrevæv til vurdering af hudætsning.
 
Vurderingen af hudætsning har typisk omfattet brug af laboratoriedyr 
(2). Betænkelighederne ved de smerter og lidelser, der er forbundet med denne fremgangsmåde, er omhandlet i revisionen af testmetode 
B.4, som muliggør bestemmelse af hudætsning ved hjælp af alterna ­
tive in vitro-metoder, så dyrene undgår smerter og lidelser.
 
Første trin mod definitionen af alternative test, der kan anvendes til 
test af hudætsning, og som kan anvendes i lovgivningsøjemed, var 
gennemførelsen af prævalideringsundersøgelser (3). Herefter blev der 
gennemført (6)(7)(8) en formel valideringsundersøgelse af in vitro- metoder til vurdering af hudætsning (4)(5). På baggrund af resultatet 
af disse undersøgelser og anden offentliggjort litteratur (9) henstilles 
det, at følgende test anvendes til vurdering af in vivo-hudætsning (10)(11)12)(13): test med human hudmodel (denne metode) og test til måling af transkutan elektrisk modstand (se testmetode B.40).
 
I henhold til valideringsundersøgelserne kan test baseret på humane 
hudmodeller (3)(4)(5)(9) på pålidelig vis skelne mellem stoffer, der er hudætsende, og stoffer, der ikke er hudætsende. Med forsøgspro ­
tokollen var det endvidere muligt at skelne mellem stærkt 
hudætsende og mindre stærkt hudætsende stoffer.
 
Den test, der er beskrevet i denne metode, muliggør identifikation af 
ætsende kemiske stoffer og blandinger. Den muliggør endvidere identifikation af stoffer og blandinger, der ikke er hudætsende, 
med støtte af væsentlig dokumentation om bestemmelse ved hjælp 
af andre eksisterende oplysninger (f.eks. pH, forholdet mellem struktur og aktivitet samt human- og/eller dyredata) (1)(2)(13)(14). Den giver normalt ikke tilstrækkelige oplysninger om hudirritation 
og muliggør heller ikke underinddeling af ætsende stoffer som tilladt 
i henhold til GHS-systemet (Globally Harmonised Classification System) (1).
 
For fuldt ud at kunne vurdere de lokale virkninger på huden efter en 
enkelt dermal eksponering anbefales det at følge den sekventielle 
teststrategi, der fremgår af testmetode B.4 (2) og GHS-systemet (Globally Harmonised System) (1). Denne teststrategi omfatter gennemførelse af in vitro-test for hudætsning (som beskrevet i 
forbindelse med denne metode) og hudirritation, inden test i 
levende dyr overvejes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. DEFINITIONER  
In vivo-hudætsning:  er fremkomsten af irreversibel ødelæggelse af 
huden, nemlig synlig nekrose gennem epidermis til dermis, efter applikation af et teststof i op til fire timer. Typiske eksempler på 
ætsende reaktioner er ulcera, blødning, blodige sår og ved slutningen 
af observationsperioden på 14 dage misfarvning som følge af afbleg ­
ning af huden, hele områder af alopecia og ar. Histopatologisk undersøgelse bør overvejes for at evaluere tvivlsomme læsioner.
 
Cellernes levedygtighed:  er en parameter, der måler den samlede 
aktivitet i en cellepopulation (f.eks. evnen hos cellulær mitokondrial 
dehydrogenase til at reducere det livsvigtige farvestof MTT), og 
som, afhængigt af det valgte endpoint og testens udformning, korre ­
lerer med det totale antal celler og/eller deres levedygtighed.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Tabel 1  
Referencestoffer  
Navn EINECS nr. CAS nr.  
1,2-diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Stærkt ætsende 
acrylsyre 201-177-9 79-10-7 Stærkt ætsende 
2-tert-butylphenol 201-807-2 88-18-6 Ætsende 
kaliumhydroxid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Ætsende svovlsyre (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Ætsende octansyre (kaprylsyre) 204-677-5 124-07-02 Ætsende 4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Ikke ætsende eugenol 202-589-1 97-53-0 Ikke ætsende 
phenethylbromid 203-130-8 103-63-9 Ikke ætsende 
tetrachlorethylen 204-825-9 27-18-4 Ikke ætsende isostearinsyre 250-178-0 30399-84-9 Ikke ætsende 4-(methylthio)-benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Ikke ætsende
 
De fleste af de anførte kemiske stoffer er hentet fra listen over 
kemiske stoffer, der var udvalgt til den internationale ECVAM-vali ­
deringsundersøgelse (4). De er udvalgt ud fra følgende kriterier:  
i) der skal være et lige stort antal ætsende og ikke-ætsende stoffer  
ii) der skal medtages stoffer, som findes i handelen, og som dækker 
de fleste af de relevante kemiske grupper  
iii) der skal indgå stærkt ætsende og mindre ætsende stoffer for at 
muliggøre skelnen mellem ætsningsstyrke  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) de udvalgte kemiske stoffer skal kunne håndteres på et labora ­
torium, uden at der opstår andre alvorlige risici end risikoen for 
ætsning.  
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Teststoffet påføres på en tredimensional human hudmodel, som 
mindst omfatter en rekonstrueret epidermis med et fungerende 
stratum corneum. Ætsende stoffer identificeres ved deres evne til at bringe cellers levedygtighed (f.eks. påvist med MTT-reduktions ­
testen (15)) ned under en fastlagt tærskelværdi efter en bestemt 
eksponeringstid. Testmetoden med forsøgsopstilling med human 
hud er baseret på den hypotese, at kemikalier er ætsende, når de er i stand til at trænge gennem stratum corneum ved diffusion eller erosion og er cytotoksiske for de underliggende cellelag.
 
1.4.1.  Procedure  
1.4.1.1.  Humane hudmodeller  
Humane hudmodeller kan konstrueres eller købes i handelen (f.eks. 
EpiDerm™-og EPISKIN™-modellerne) (16)(17)(18)(19), eller de 
kan udvikles eller konstrueres i testlaboratoriet (20)(21). Det aner ­
kendes, at brugen af human hud er underlagt nationale og internatio ­
nale etiske hensyn og betingelser. En ny model bør valideres (som minimum i det omfang, der er beskrevet i 1.4.1.1.2). Humane 
hudmodeller, der anvendes i forbindelse med denne test, skal over ­
holde følgende:
 
1.4.1.1.1. A l m i n d e l i g e m o d e l b e t i n g e l s e r  
Humane keratinocytter skal anvendes til at konstruere epithel. Der 
skal være flere lag af levedygtige epithelceller til stede under et fungerende stratum corneum. Hudmodellen kan også have lag med en stromal komponent. Stratum corneum skal være flerlaget og have 
den nødvendige fedtprofil til at udgøre en effektiv barriere, der kan 
modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markører. Modellens fysiske udformning skal forhindre, at stof passerer uden om stratum 
corneum til det levedygtige væv. Passage af kemiske teststoffer uden 
om stratum corneum vil forringe modelleringen af hudens ekspone ­
ring. Hudmodellen skal være fri for kontamination med bakterier (herunder mykoplasma) og svampe.
 
1.4.1.1.2. F u n k t i o n s m æ s s i g e m o d e l b e t i n g e l s e r  
Graden af levedygtighed kvantificeres normalt ved hjælp MTT eller 
andre livsvigtige farvestoffer, der omdannes metabolisk. I disse 
tilfælde skal absorbansen (optical density (OD)) i det ekstraherede 
(opløste) farvestof fra den negative kontrol være mindst 20 gange større end absorbansen i ekstraktionsmidlet alene (se oversigten i (22)). Vævet i den negative kontrol skal have stabil kultur (levere 
enslydende levedygtighedsmålinger) i hele testeksponeringsperioden. 
Stratum corneum skal være tilstrækkeligt robust til at modstå hurtig gennemtrængning af visse cytotoksiske kemiske markørstoffer (f.eks. 1 % Triton X-100). Denne egenskab kan bedømmes ud fra den 
eksponeringstid, der er nødvendig for at reducere cellelevedygtig ­
heden med 50 % (ET
 50 ) (for the EpiDerm™- og EPISKIN™- 
modellen er det f.eks. > 2 timer). Vævet skal give reproducerbarhed over længere tid og helst mellem laboratorier. Det skal endvidere 
kunne forudsige referencestoffernes ætsningsstyrke (se tabel 1), når 
det anvendes i forbindelse med den valgte forsøgsprotokol.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Påføring af test- og kontrolstoffer  
Der anvendes to vævsprøver til hver behandling (eksponeringstid), 
inkl. kontroller. Ved flydende stoffer skal der påføres tilstrækkeligt teststof til, at hudoverfladen dækkes (mindst 25 μl/cm
 2 ). Ved faste 
stoffer skal der påføres tilstrækkeligt stof til, at huden dækkes med et 
jævnt lag. Stofferne skal fugtes med deioniseret eller destilleret vand for at sikre god hudkontakt. Om nødvendigt skal de males til et pulver, før de påføres. Påføringsmetoden skal være velegnet til det 
pågældende teststof (se f.eks. henvisning (5)). Efter eksponerings ­
perioden skal teststoffet omhyggeligt vaskes af hudoverfladen med en buffer eller 0,9 % NaCl.
 
Samtidige positive og negative kontrolværdier skal anvendes i hver 
undersøgelse for at sikre, at forsøgsmodellen fungerer korrekt. Som 
positivt kontrolstof foreslås iseddikesyre eller 8N KOH. Som nega ­
tivt kontrolstof foreslås 0,9 % NaCl eller vand.  
1.4.1.3.  Måling af cellelevedygtighed  
Enhver kvantitativ, godkendt metode kan anvendes til at måle 
cellernes levedygtighed. Målingen af levedygtighed skal endvidere kunne anvendes sammen med en tredimensional hudmodel. Ikke- 
specifik farvebinding må ikke interferere med levedygtighedsmålin ­
gen. Proteinbindende farvestoffer og farvestoffer, som ikke undergår metabolisk omdannelse (f.eks. Neutral Red), kan derfor ikke anven ­
des. Den hyppigst anvendte måling er MTT-reduktionstesten [3-(4,5- 
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Thiazolyl Blue: 
EINECS nr. 206-069-5, CAS nr. 298-93-1], som har vist sig at give nøjagtige og reproducerbare resultater (5), men andre kan anvendes. Hudlappen lægges i en MTT-opløsning af passende koncentration 
(f.eks. 0,3-1 mg/ml) ved en passende inkubationstemperatur i tre 
timer. Det udfældede blå formazan ekstraheres ved hjælp af et opløs ­
ningsmiddel (isopropanol), og formazankoncentrationen beregnes ud 
fra måling af absorbans ved en bølgelængde mellem 540 og 595 nm.
 
Teststoffets kemiske reaktion med det livsvigtige farvestof kan efter ­
ligne den metaboliske reaktion i cellerne, hvilket resulterer i en falsk levedygtighedsmåling. Dette har vist sig at ske, når et sådant teststof ikke fjernes fuldstændigt fra huden ved skylning (9). Hvis teststoffet 
reagerer direkte med det levedygtige farvestof, skal der anvendes 
yderligere kontroller til at spore og korrigere for teststoffernes inter ­
ferens med levedygtighedsmålingen (9)(23).
 
2. DATA  
For hver hudlap skal der for teststof og for positive og negative 
kontroller fremlægges absorbansværdier og beregnede tal for procen ­
tuel cellelevedygtighed i tabelform, herunder data fra 
flergangsbestemmelser/gentagne bestemmelser, gennemsnitsværdier 
og enkeltværdier.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. FORTOLKNING AF RESULTATER  
De absorbansværdier, som måles ved hver undersøgelse, anvendes til 
beregning af den procentuelle levedygtighed i forhold til en negativ kontrol, som vilkårligt sættes til 100 %. Den procentuelle tærskel ­
værdi af cellelevedygtighed, som adskiller ætsende fra ikke-ætsende 
stoffer (eller som skelner mellem forskellige grader af ætseevne), skal klart defineres, dokumenteres og påvises at være hensigtsmæs ­
sig. Generelt bliver disse tærskelværdier fastlagt under testoptimerin ­
gen, afprøvet i prævalideringsfasen og bekræftet ved en validerings ­
undersøgelse. Følgende benyttes f.eks. ved forudsigelse af ætsnings ­
evne i forbindelse med EpiDerm™ -modellen (9):
 
Teststoffet betragtes som værende hudætsende:  
i) hvis levedygtigheden efter tre minutters eksponering er mindre 
end 50 %, eller  
ii) hvis levedygtigheden efter tre minutters eksponering er større end 
eller lig med 50 %, og levedygtigheden efter en times ekspone ­
ring er mindre end 15 %.  
Teststoffet betragtes ikke som værende hudætsende:  
i) hvis levedygtigheden efter tre minutters eksponering er større end 
eller lig med 50 %, og levedygtigheden efter en times ekspone ­
ring er større end eller lig med 15 %.  
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Test- og kontrolstof:  
— kemiske navne, f.eks. IUPAC- eller CAS-navn og -nummer, hvis 
de kendes  
— stoffets eller præparatets renhed og sammensætning (i procent ­
dele efter vægt)  
— fysiske-kemiske egenskaber, f.eks. fysisk tilstand, pH, stabilitet 
og opløselighed i vand, som er relevante for undersøgelsen  
— eventuel behandling af test-/kontrolstoffet inden testen (f.eks. 
opvarmning, formaling)  
— eventuelt kendt stabilitet.  
Begrundelse for valg af hudmodel og forsøgsprotokol.  
Testbetingelser:  
— anvendt cellesystem  
— kalibreringsinformationer for udstyr anvendt til måling af celle ­
levedygtighed (f.eks. spektrofotometer)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— komplet dokumentation for den anvendte hudmodel, herunder 
godkendelsen heraf  
— detaljer om den anvendte testprocedure  
— anvendte testdoser  
— beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren  
— reference til historiske data for modellen  
— beskrivelse af de anvendte evalueringskriterier.  
Resultater:  
— angivelse i tabelform af data fra hver enkelt testprøve  
— beskrivelse af andre observerede virkninger.  
Diskussion af resultater.  
Konklusion  
4. HENVISNINGER  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and 
Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:/ 
/www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- mono(2001)6.
 
(2) Testmetode B.4. Akut toksicitet: hudirritation/ætsning.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and 
Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, L, Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471- 
482. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team Toxic  In Vitro  12, 483-524.
 
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62 pp.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp. 371-401.
 
(10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275- 
280. 
(11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.  
(12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation 
of EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemi ­
cals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology 
Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st- 
2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat.  
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
 
(15) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55-63.  
(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy 
testing. Toxic. In Vitro 8, 889-891.  
(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural charac ­
terization of reconstructed skin models. International Journal of 
Pharmaceutics. 203, 211-225.  
(18) Tinois E., Gaetani Q., Gayraud B., Dupont D., Rougier A., 
Pouradier D.X. (1994). The Episkin model: Successful recon ­
struction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxi ­
cology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 
133-140.  
(19) Tinois E., Tiollier J., Gaucherand M., Dumas H., Tardy M., 
Thivolet J. (1991). In vitro and post -transplantation differen ­
tiation of humankeratinocytes grown on the human type IV 
collagen film of a bilayereddermal substitute. Experimental Cell Research 193: 310-319.
 
(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and 
Rosenberg, H.(1992). The organotypic culture of human skin 
keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, 163-171.
 
(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living 
skin construct for clinical applications. Biotechnology and 
Bioengineering 43/8, 747-756.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical 
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to 
measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84.  
(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation 
study on  in vitro  tests for acute skin irritation: results and 
evaluation by the Management Team. Toxic. In VItro 15, 57-93.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  IN VITRO 3T3 NRU-FOTOTOKSICITETSTEST  
1. METODE  
Denne metode er ækvivalent med OECD TG 432 (2004).  
1.1. INDLEDNING  
Fototoksicitet defineres som det toksiske respons på et stof, der 
påføres kroppen, og som enten er blevet fremkaldt af eller forstærket af (kan konstateres ved lavere doser) eksponering for lys, eller som 
er forårsaget af bestråling af huden efter systemisk indgift af et stof.
 
In vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten anvendes til at afdække det 
fototoksiske potentiale i et testmateriale, når det exciteres ved 
lyspåvirkning. Testen evaluerer fotocytotoksicitet ud fra den relative reduktion i levedygtigheden af de celler, der udsættes for det kemiske stof under lyspåvirkning, sammenlignet med samme situa ­
tion uden lys. De stoffer, som identificeres ved denne test, er sand ­
synligvis fototoksiske in vivo efter systemisk påføring og fordeling på huden eller efter lokal påføring.
 
Der er rapporteret om mange typer kemiske stoffer, der fremkalder 
fototoksiske virkninger (1)(2)(3)(4). Et fælles træk er deres evne til 
at absorbere lysenergi inden for sollysets spektrum. Ifølge fotoke ­
miens grundlov (Grotthaus-Draper-loven) forudsætter fotoreaktion en tilstrækkelig optaget lysmængde. Derfor skal man, inden man over ­
vejer en biologisk testning, bestemme testkemikaliets absorptions ­
spektrum for UV/synligt lys i henhold til OECD Test Guideline 
101. Det er påstået, at det kemiske stof sandsynligvis ikke er foto ­
reaktivt, hvis den molære ekstinktions- og absorptionskoefficient er mindre end 10 liter × mol
 -1 × cm  -1 . Et kemisk stof af denne type 
behøver ikke nødvendigvis at blive testet i in vitro 3T3 NRU-foto ­
toksicitetstesten eller i nogen anden biologisk test for skadelige foto ­
kemiske virkninger (1)(5). Se også bilag 1.  
Pålideligheden og relevansen af in vitro 3T3 NRU-fototoksicitets ­
testen er blevet evalueret for nylig (6)(7)(8)(9). In vitro 3T3 NRU- fototoksicitetstesten har vist sig at kunne forudsige akutte fototoksici ­
tetsvirkninger på dyr og mennesker in vivo. Testen er ikke beregnet 
til at forudsige andre skadelige virkninger, der måtte opstå fra samtidig påvirkning fra et kemisk stof og lys. Eksempelvis påviser den ikke fotogenotoksicitet, fotoallergi eller fotocarcinogenicitet, og 
den er heller ikke beregnet til vurdering af fototoksisk styrke. Testen 
er endvidere ikke beregnet til at påvise indirekte mekanismer ved fototoksicitet, virkninger af stofskifteprodukter på testmaterialet eller virkninger af blandinger.
 
Hvor anvendelsen af metaboliserende systemer er et generelt krav til 
alle in vitro-testninger til forudsigelse af genotoksisk og carcinogent 
potentiale, er der indtil nu i forbindelse med fototoksikologi kun få 
tilfælde, hvor der kræves metabolisk transformation for at få det kemiske stof til at reagere som fototoksin in vivo eller in vitro. Det anses derfor hverken som nødvendigt eller videnskabeligt 
begrundet at gennemføre nærværende testning med et metabolisk 
aktiverings system.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. DEFINITIONER  
Strålingsintensitet:  intensiteten af ultraviolet (UV) eller synligt lys, 
der falder på en overflade. Intensiteten måles i W/m  2 eller mW/cm  2 . 
Lysdosis:  mængden (= intensitet × tid) af ultraviolet (UV) eller 
synligt lys, der falder på en overflade, udtrykt i joule (= W × s) pr. overfladeareal, f.eks. J/m
 2 eller J/cm  2 . 
UV-lys, bølgelængdeområder:  følgende betegnelser er anbefalet af 
CIE (Den Internationale Belysningskommission): UVA (315- 
400 nm), UVB (280-315 nm) og UVC (100-280 nm). Der anvendes også andre betegnelser. Grænsen mellem UVB og UVA sættes ofte ved 320 nm, og UVA kan inddeles i UV-A1 og UV-A2, hvor 
grænsen ligger ved ca. 340 nm.
 
Cellernes levedygtighed:  parameter, der måler den samlede aktivitet 
i en cellepopulation (f.eks. optagelse af det livsvigtige farvestof 
Neutral Red i cellelysosomer), hvilket, afhængigt af det målte ende ­
punkt og det anvendte testdesign, korrelerer med det samlede celle ­
antal og/eller cellevitaliteten.  
Relativ cellelevedygtighed:  cellelevedygtighed udtrykt i forhold til 
negative kontroller (opløsningsmiddel), der har været gennem hele 
testforløbet (enten +Irr eller –Irr), og som ikke er behandlet med kemiske teststoffer.
 
PIF (fotoirritationsfaktor):  faktor, der beregnes ved sammenligning 
mellem to lige effektive cytotoksiske koncentrationer (IC  50 ) af det 
kemiske teststof ved fravær af (–Irr) og ved tilstedeværelse af (+Irr) i en ikke-cytotoksisk bestråling med UVA/synligt lys.
 
IC 50 : koncentrationen af det kemiske teststof, der reducerer cellele ­
vedygtigheden med 50 %.  
MPE (gennemsnitlig lyseffekt):  måling, der er afledt af en mate ­
matisk analyse af de koncentrationsresponskurver, der fremkommer 
ved fravær af (–Irr) og ved tilstedeværelse af (+Irr) i en ikke-cyto ­
toksisk bestråling med UVA/synligt lys.  
Fototoksicitet:  akut toksisk respons, der fremkommer efter den 
første eksponering af huden for visse kemiske stoffer og efterføl ­
gende eksponering for lys, eller som er fremkaldt på samme måde ved hudbestråling efter systemisk indgift af et kemisk stof.
 
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
In vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten er baseret på en sammenlig ­
ning mellem cytotoksiciteten af et kemisk stof, når det afprøves med 
og uden eksponering for en ikke-cytotoksisk dosis af simuleret sollys. Cytotoksicitet er i denne testning udtrykt som en koncentra ­
tionsafhængig reduktion af optagelsen af det livsvigtige farvestof 
Neutral Red som målt 24 timer efter behandling med det kemiske 
teststof og bestråling (10). NR er et svagt kationisk farvestof, der let gennemtrænger cellemembraner ved ikke-diffusion og akkumuleres intracellulært i lysosomer. Forandringer i overfladen i den sensitive 
lysosommembran fører til lysosomal ustabilitet og andre forandrin ­
ger, der gradvist bliver uoprettelige. Den type forandringer, der forårsages af miljøfremmede stoffer, medfører et fald i optagelsen og bindingen af NR. Det er således muligt at skelne mellem leve ­
dygtige, beskadigede og døde celler, hvilket er grundlaget for denne 
test.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Balb/c 3T3-celler dyrkes i 24 timer, så der dannes encellede lag. To 
96-huls plader for hvert kemisk teststof præinkuberes med otte 
forskellige koncentrationer af teststoffet i 1 time. Derefter eksponeres den ene af de to plader for den højeste ikke-cytotoksiske strålings ­
dose, mens den anden plade holdes i mørke. På begge plader 
erstattes behandlingsmediet derefter af kulturmedium, og efter 
endnu 24 timers inkubation bestemmes cellelevedygtigheden ved Neutral Red-optagelsen. Cellelevedygtigheden udtrykkes som en procentdel i forhold til ubehandlede kontrolkulturer med opløsnings ­
middel og beregnes for hver testkoncentration. For at forudsige det 
fototoksiske potentiale sammenholdes koncentrationerne for samme respons med og uden stråling, sædvanligvis på IC
 50 -niveau, dvs. den 
koncentration, der reducerer cellelevedygtigheden til 50 % sammen ­
lignet med de ubehandlede kontroller.  
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Forberedelser  
1.4.1.1.  Celler  
I valideringsundersøgelserne blev der anvendt en permanent muse- 
fibroblast cellelinje, Balb/c 3T3, klon 31, enten fra American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA, eller fra European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Det 
Forenede Kongerige, og det anbefales derfor at anskaffe materiale 
fra en velanskrevet cellebank. Hvis der blot kan påvises ækvivalens, kan der anvendes andre celler eller cellelinjer til samme testpro ­
cedure, hvis kulturforholdene er tilpasset cellernes specifikke behov.
 
Celler bør regelmæssigt undersøges for, at de ikke indeholder mycoplas ­
masmitte, og de bør kun anvendes, hvis de er absolut smittefrie (11).  
Det er vigtigt, at cellernes UV-følsomhed undersøges regelmæssigt i 
henhold til den procedure for kvalitetskontrol, som er beskrevet i 
denne metode. Eftersom cellers UVA-følsomhed kan stige med 
antallet af cellegenerationer, bør der anvendes Balb/c 3T3 celler med lavest muligt antal, helst mindre end 100 (se punkt 1.4.2.2.2 og bilag 2).
 
1.4.1.2.  Medier og dyrkningsbetingelser  
Der bør anvendes korrekte dyrkningsmedie- og inkubationsforhold til 
rutinemæssige celledyrkninger under testproceduren. For Balb/c 3T3- celler er de korrekte forhold f.eks. DMEM (Dulbecco's Modified 
Eagle's Medium) suppleret med 10 % serum fra nyfødte kalve, 
4 mM glutamin, penicillin (100 IU), streptomycin (100 g/ml) og inkubation i fugtig atmosfære ved 37
 o C, 5-7,5 % CO  2 , afhængigt 
af buffer (se punkt 1.4.1.4, andet afsnit). Der er især vigtigt, at 
dyrkningsforholdene for cellekulturen tillader en cellecyklustid 
inden for cellernes eller cellelinjernes normale historiske område.  
1.4.1.3.  Forberedelse af kulturerne  
Celler fra nedfrosne kulturer podes i kulturmedier ved passende 
tæthed og dyrkes i subkultur mindst en gang, inden de anvendes i 
in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Celler, der anvendes til fototoksicitetstesten, podes i et kulturmedium 
med passende tæthed, så kulturerne ikke løber sammen ved testens 
afslutning, dvs. cellelevedygtigheden bestemmes 48 timer efter podning af cellerne. For Balb/c 3T3-celler, der dyrkes på 96-huls plader, er den anbefalede podningstæthed for cellerne 1 × 10
 4 celler 
pr. hul.  
For hver test podes kemikalieceller ensartet i to separate 96-huls 
plader, der begge sideløbende gennemfører hele testproceduren 
under identiske kulturforhold med undtagelse af den tid, hvor den ene af pladerne bestråles (+Irr), og den anden holdes i mørke (–Irr).
 
1.4.1.4.  Forberedelse af teststof  
Teststoffer skal være friske og forberedes umiddelbart inden brug, 
medmindre data påviser, at de er stabile ved opbevaring. Det anbe ­
fales, at enhver form for kemisk håndtering og den indledende 
behandling af cellerne udføres under lysforhold, der udelukker 
fotoaktivering eller nedbrydning af teststoffet inden bestråling.  
Testkemikalierne skal være opløst i buffer-saltopløsninger, f.eks. 
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), eller andre fysiologiske buffer-opløsninger, der skal være fri for proteinkomponenter og 
lysabsorberende komponenter (f.eks. pH-indikatorfarver og vitami ­
ner) for at undgå interferens under bestråling. Da celler under bestrå ­
ling holdes uden for CO
 2 -inkubatoren i ca. 50 minutter, skal man 
være særligt påpasselig for at undgå alkalisering. Hvis der anvendes 
svage buffere som f.eks. EBSS, kan alkalisering undgås ved at inku ­
bere cellerne ved 7,5 % CO  2 . Hvis cellerne inkuberes ved kun 5 % 
CO 2 , skal der vælges en stærkere buffer.  
Testkemikalier med begrænset opløselighed i vand skal opløses i et 
passende opløsningsmiddel. Hvis der anvendes opløsningsmiddel, skal det forefindes i et konstant volumen i alle kulturer, dvs. i de 
negative (opløsningsmiddel)kontroller og i alle koncentrationer af 
testkemikaliet, og det skal være ikke-cytotoksisk ved den pågæl ­
dende koncentration. Der skal vælges en sådan koncentration af testkemikaliet, at man undgår udfældning og uklare opløsninger.
 
Dimethylsulfoxid (DMSO) og ethanol (EtOH) er de anbefalede 
opløsningsmidler. Andre opløsningsmidler med lav cytotoksicitet 
kan også være velegnede. Inden brug skal alle opløsningsmidler vurderes for specifikke egenskaber f.eks. reaktion med testkemika ­
liet, quenching af den fototoksiske effekt, evne til at opfange radi ­
kaler og/eller kemisk stabilitet i opløsningen.
 
Vortexblanding og/eller ultralydbehandling og/eller opvarmning til 
passende temperaturer kan anvendes for at fremme opløsningen, 
medmindre dette kan påvirke testkemikaliets stabilitet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Betingelser for bestråling  
1.4.1.5.1. L y s k i l d e  
Valg af den rette lyskilde og filtre er en afgørende faktor i fototok ­
sicitetstestning. Lys i UVA-området og det synlige område forbindes almindeligvis med fototoksiske reaktioner in vivo (3)(12), hvorimod UVB ofte er mindre relevant, men kraftigt cytotoksisk. Cytotoksici ­
teten stiger 1 000 gange, når bølgelængden går fra 313 til 280 nm 
(13). Kriterierne for valg af passende lyskilde skal bl.a. omfatte krav om, at lyskilden udsender bølgelængder, der absorberes af testkemi ­
kaliet (absorptionsspektrum), og at lysmængden (der kan opnås 
inden for en acceptabel eksponeringstid) skal være tilstrækkelig til 
bestemmelse af kendte fotocytotoksiske kemiske stoffer. Endvidere skal bølgelængder og de anvendte doser ikke påføre testsystemet unødige skader, f.eks. som følge af varmestråling (det infrarøde 
område).
 
Simulering af sollys med solsimulatorer anses for at være den opti ­
male kunstlyskilde. Fordelingen af bestråling s styrken i den filtre ­
rede solsimulator skal ligge tæt på fordelingen i udendørs dagslys, som det fremgår af (14). Både xenonlysbuer og (doterede) kviksølv ­
metalhalogenidlysbuer anvendes som solsimulatorer (15). Sidst ­
nævnte har den fordel, at de udsender mindre varme og er billigere, men ligheden med sollys er knap så perfekt som xenonlysbuernes. Eftersom alle solsimulatorer udsender væsentlige mængder UVB, 
skal de være behørigt filtrerede for at dæmpe de stærkt cytotoksiske 
UVB-bølgelængder. Da plastmaterialer til cellekulturer indeholder UV-stabilisatorer, skal spektret måles gennem den samme type 96- 
huls pladelåg, som anvendes ved testningen. Uanset hvilke forholds ­
regler der er taget for at dæmpe dele af spektret ved filtrering eller som følge af uundgåelige filtereffekter fra udstyret, må det spektrum, der måles på under disse filtre, ikke afvige fra standard udendørs 
dagslys (14). Et eksempel på den spektrale strålingsintensitetsfor ­
deling i den filtrerede solsimulator, der anvendes i valideringsunder ­
søgelsen i in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten, fremgår af (8)(16). Se også bilag 2, figur 1.
 
1.4.1.5.2. D o s i m e t r i  
Lysintensiteten kontrolleres regelmæssigt før hver fototoksicitetstest 
ved hjælp af et bredbåndet UV-meter. Intensiteten måles gennem den samme type 96-huls pladelåg, som anvendes ved testen. UV-meteret skal være kalibreret til kilden. UV-meterets ydelse kontrolleres, og til 
dette formål anbefales det at anvende et ekstra UV-meter af samme 
type og med samme kalibrering som reference. Det optimale ville være, med lidt længere mellemrum, at anvende et spektroradiometer til måling af den spektrale intensitet af den filtrerede lyskilde og til 
kontrol af kalibreringen af det bredbåndede UV-meter.
 
En dosis på 5 J/cm  2 (målt i UVA-området) er blevet bestemt til at 
være ikke-cytotoksisk for Balb/c 3T3-celler og tilstrækkelig kraftig til at få kemiske stoffer til at udløse fototoksiske reaktioner (6) (17). For at nå op på 5 J/cm
 2 inden for en periode på 50 min blev 
intensiteten f.eks. justeret til 1,7 mW/cm  2 . Se bilag 2, figur 
2. Hvis der anvendes en anden cellelinje eller en anden lyskilde, skal strålingsdosen eventuelt kalibreres, så der vælges en dosering, der ikke er skadelig for cellerne, men samtidig tilstrækkelig til at 
udløse standardfototoksiner. Lyseksponeringens varighed beregnes 
på følgende måde:
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ bestrålinsgdosis ðJ= cm  2 Þ Ü 1000 
strålingsitensitet ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1J = 1 Wsek)  
1.4.2.  Forsøgsbetingelser  
1.4.2.1.  Teststoffets koncentrationer  
Koncentrationsområdet for et kemisk stof, der testes henholdsvis 
med (+Irr) og uden (–Irr) lys, skal nøje fastlægges ud fra eksperi ­
menter til bestemmelse af dosisområde. Det kan være nyttigt at vurdere opløseligheden fra starten og ved 60 min (eller ved den 
behandlingstid, der skal anvendes), idet opløseligheden kan ændre 
sig efterhånden eller i løbet af eksponeringstiden. For at undgå toksi ­
citet fremkaldt af forkerte kulturforhold eller af stærkt sure eller alkaliske kemikalier skal pH-værdien i cellekulturer, der er tilsat 
testkemikalier, ligge i området 6,5 - 7,8.
 
Den højeste koncentration af teststoffet skal ligge inden for fysiolo ­
giske testforhold. F.eks. skal belastende osmotiske og pH-mæssige 
forhold undgås. Afhængigt af teststof kan det være nødvendigt at overveje andre fysisk-kemiske egenskaber som faktorer til fastlæg ­
gelse af den højeste testkoncentration. Med hensyn til relativt opløse ­
lige stoffer, der ikke er toksiske ved koncentrationer op til mætnings ­
punktet, skal den højest mulige koncentration testes. Generelt skal man undgå udfældning af teststoffet ved enhver testkoncentration. Den maksimale koncentration af et teststof bør ikke overstige 
1 000 μg/ml. Osmolalitet bør ikke overstige 10 mM. Der skal 
anvendes en geometrisk fortyndingsrække bestående af otte teststof ­
koncentrationer med en konstant fortyndingsfaktor (se punkt 2.1, andet afsnit).
 
Hvis der findes oplysninger (fra et eksperiment til områdebestem ­
melse) om, at testkemikaliet ikke er cytotoksisk op til grænsekoncen ­
trationen i mørkeeksperimentet (–Irr), men at det er stærkt cytotok ­
sisk, når det bestråles (+Irr), kan man for at overholde kvalitetskra ­
vene til relevante data vøæge andre koncentrationsområder for (+Irr)- eksperimentet end dem, der er valgt for (–Irr)-eksperimentet.
 
1.4.2.2.  Kontrolkulturer  
1.4.2.2.1. C e l l e r n e s s t r å l i n g s f ø l s o m h e d , e t a b l e r i n g a f 
h i s t o r i s k e d a t a  
Celler skal kontrolleres regelmæssigt (ca. ved hver femte cellegene ­
ration) for følsomhed over for lyskilden ved at vurdere deres leve ­
dygtighed efter at være eksponeret for stigende doser af bestråling. 
Til denne vurdering skal der anvendes adskillige bestrålingsdoser og 
også niveauer, der er væsentligt højere end de værdier, der anvendes ved 3T3 NRU-fototoksicitetstest. Disse doser kvantificeres lettest ved at måle UV-dele af lyskilden. Celler podes med den tæthed, der er 
anvendt i in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten, og bestråles den 
følgende dag. Cellelevedygtigheden bestemmes en dag senere ud fra Neutral Red-optagelsen. Det skal påvises, at den heraf følgende højeste ikke-cytotoksiske dosis (f.eks. i valideringsundersøgelsen: 5 
J/cm
 2 [UVA]) var tilstrækkelig til at klassificere referencekemikali ­
erne (tabel 1) korrekt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. S t r å l i n g s f ø l s o m h e d , k o n t r o l a f d e n a k t u e l l e t e s t  
Testen overholder kvalitetskriterierne, hvis de bestrålede 
negative/opløsningsmiddelholdige kontrolkulturer udviser en leve ­
dygtighed på mere end 80 % sammenlignet med ikke-bestrålede negative/opløsningsmiddelholdige kontroller.
 
1.4.2.2.3. L e v e d y g t i g h e d e n f o r k o n t r o l k u l t u r e r m e d o p l ø s ­
n i n g s m i d d e l  
Den absolutte absorbans (optical density) (OD  540 NRU  ) for Neutral 
Red ekstraheret fra kontrolkulturer med opløsningsmiddel indikerer, 
om de 1 × 10  4 celler, der er podet pr. hul, har vokset med normal 
fordoblingstid i løbet af testens to dage. En testning opfylder de accepterede kriterier, hvis middelværdien af OD
 540 NRU  for de 
ubehandlede kontrolkulturer er ≥ 0,4 (dvs. ca. 20 gange baggrund ­
sopløsningsmidlets absorbans).  
1.4.2.2.4. P o s i t i v k o n t r o l  
Et velkendt fototoksisk kemisk stof skal undersøges sideløbende med 
hver in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstest. Klorpromazin (CPZ) kan anbefales hertil. For CPZ, der testes ifølge standardprotokollen for in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten, er der defineret følgende godken ­
delseskriterier for afprøvningen: bestrålet CPZ (+Irr): IC
 50 = 0,1 til 
2,0 g/ml, ikke-bestrålet CPZ (–Irr): IC  50 = 7,0 til 90,0 g/ml. Fotoirri ­
tationsfaktoren (PIF) skal være > 6. Den positive kontrols historiske ydelse skal overvåges.
 
Andre fototoksiske kemikalier, der er velegnede i forhold til den 
kemiske klasse eller opløselighedskarakteristikken af det kemiske stof, der skal evalueres, kan anvendes som sideløbende positiv 
kontrol i stedet for klorpromazin.
 
1.4.3.  Testprocedure (6)(7)(8)(16)(17)  
1.4.3.1.  Første dag  
Der anbringes 100 μl kulturmedium i de ydre huller i en 96-huls 
mikrotiterplade til vævskultur (= negative kontroller). I de øvrige 
huller tilsættes 100 μl af en cellesuspension med 1 × 10  5 celler/ml 
i kulturmedium (= 1 × 10  4 celler/hul). Der skal klargøres to plader 
for hver serie af individuelle teststofkoncentrationer samt til opløs ­
ningsmiddelkontrollen og den positive kontrol.  
Cellerne inkuberes i 24 timer (se punkt 1.4.1.2), indtil de danner et 
halvt sammenflydende encellet lag. Denne inkubationsperiode 
tillader cellegendannelse, adhæsion og eksponentiel vækst.  
1.4.3.2.  Anden dag  
Efter inkubation dekanteres kulturmediet fra cellerne, som vaskes 
omhyggeligt med 150 μl af det bufferopløsningsmiddel, der blev 
anvendt til inkubationen. Der tilsættes 100 μl af bufferen med den 
korrekte koncentration af teststoffet eller opløsningsmidlet (kontrol ­
kultur med opløsningsmiddel). Der benyttes otte forskellige koncen ­
trationer af teststoffet. Cellerne med teststoffet inkuberes i mørke i 
60 minutter (se punkt 1.4.1.2 og punkt 1.4.1.4, andet afsnit).  
Blandt de to plader, der er klargjort til hver serie koncentrationer af 
teststof og kontrolmateriale, udvælges der en tilfældig plade til 
bestemmelse af cytotoksicitet (–Irr), dvs. kontrolpladen, og desuden 
en behandlingsplade til bestemmelse af fotocytotoksicitet (+Irr).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
+Irr-eksponeringen gennemføres ved at bestråle cellerne ved stue ­
temperatur i 50 minutter gennem låget på 96-huls pladen med den 
størst mulige strålingsdosis, der ikke er cytotoksisk (se også bilag 2). Ikke-bestrålede plader (–Irr) opbevares ved stuetemperatur i en mørk kasse i 50 minutter (= lyseksponeringstiden).
 
Testopløsningen dekanteres fra, og der vaskes to gange omhyggeligt 
med 150 μl af den bufferopløsning, der anvendes til inkubation, men 
som ikke indeholder teststoffet. Bufferen erstattes med kulturmediet, 
og der inkuberes til næste dag (18-22 timer). Se punkt 1.4.1.2.  
1.4.3.3.  Tredjedag:  
1.4.3.3.1 M i k r o s k o p i s k e v a l u e r i n g  
Med et fasekontrast-mikroskop undersøges cellerne med hensyn til 
vækst, morfologi og enkeltlagets integritet. Ændringer i cellemorfo ­
logi og påvirkninger af cellevækst registreres.  
1.4.3.3.2. T e s t a f o p t a g e l s e n a f N e u t r a l R e d  
Cellerne vaskes med 150 μl forvarmet buffer. Vaskeopløsningen fjernes 
ved at banke let på pladen. Der tilsættes 100 μl af en 50 μg/ml Neutral 
Red (NR) (3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazinhydrochlorid, 
EINECS nr. 209-035-8; CAS nr. 553-24-2; C.I. 50040) til dyrknings ­
mediet uden serum (16), og der inkuberes som beskrevet i punkt 1.4.1.2 i tre timer. Efter inkubation fjernes Neutral Red-mediet, og cellerne vaskes 
med 150 μl buffer. Efter dekantering fjernes overskydende buffer med 
sugende papir eller ved centrifugering.
 
Der tilsættes nøjagtig 150 μl Neutral Red-desorptionsopløsning (frisk 
fremstillet af 49 dele vand + 50 dele ethanol + 1 del eddikesyre).  
Mikrotiterpladen rystes forsigtigt på en mikrotiterpladeshaker i 
10 minutter, indtil al Neutral Red er ekstraheret fra cellerne, og der er dannet en homogen opløsning.
 
OD af Neutral Red-ekstraktet måles ved 540 nm i et spektrofoto ­
meter med blindprøver som reference. Resultaterne gemmes i et 
passende filformat med henblik på senere analyse.  
2. DATA  
2.1. DATAKVALITET OG -MÆNGDE  
Resultaterne af undersøgelsen skal give mulighed for en relevant 
analyse af koncentration/respons fremkommet med og uden bestrå ­
ling og, hvis det er muligt, af den koncentration af kemisk stof, hvor 
cellelevedygtigheden reduceres til 50 % (IC  50 ). Hvis der påvises 
cytotoksicitet, skal både koncentrationsområdet og enkeltkoncentra ­
tionerne fastsættes på en sådan måde, at der kan tilpasses en kurve til forsøgsdataene.
 
Hvis resultaterne er enten klart positive eller klart negative (se punkt 
2.3, første afsnit), vil første forsøg, der understøttes af et eller flere 
foreløbige eksperimenter til bestemmelse af dosisområde, være 
tilstrækkeligt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Usikre og tvetydige resultater skal kontrolleres ved at gentage under ­
søgelsen (se også punkt 2.4, andet afsnit). I disse tilfælde kan det være 
påkrævet at ændre forsøgsbetingelserne for at opnå et klart resultat. Forsøgsbetingelser, der kan ændres, er bl.a. koncentrationsområde, inkubationstid før bestråling og eksponeringstid. En kortere ekspone ­
ringstid kan være relevant for stoffer, der er ustabile i vandig opløsning.
 
2.2. EVALUERING AF RESULTATERNE  
Til evaluering af resultaterne kan der beregnes en fotoirritationsfaktor 
(PIF) eller en gennemsnitlig lyseffekt (MPE).  
Ved beregning af parametrene for fotocytotoksicitet (se nedenfor) 
skal de spredte koncentration-responsværdier tilnærmes en passende 
kontinuerlig koncentration-responskurve (model). Kurven tilnærmes 
normalt til dataene ved hjælp af en ikke-lineær regressionsmetode (18). For at kunne vurdere virkningen af dataafvigelser på den tilpas ­
sede kurve anbefales det at gennemføre en bootstrap-proces.
 
Fotoirritationsfaktoren (PIF) beregnes ved hjælp af følgende formel:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Hvis der ikke kan beregnes en IC  50 med eller uden lys, kan der ikke 
fastlægges en PIF for testmaterialet. Den gennemsnitlige lyseffekt (MPE) er baseret på en sammenligning af de færdige koncentrations ­
responskurver (19). Den defineres som et vægtet gennemsnit af 
repræsentative sæt af lyseffektværdier:
 
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Lyseffekten PE  C ved en given koncentration C defineres som produktet 
af responseffekt RE  C og dosiseffekt DE  C dvs. PE  C = RE  C × DE  C . 
Responseffekt RE  C er forskellen mellem den konstaterede respons 
med og uden lys, dvs. RE  C = R  c (–Irr) – R  c (+Irr). Dosiseffekten 
beregnes ved hjælp af:  
DE  c ¼ Æ Æ Æ Æ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ 
hvor C* repræsenterer ækvivalenskoncentrationen, dvs. den koncen ­
tration, hvor et +Irr respons svarer til et –Irr respons ved koncen ­
tration C. Hvis C* ikke kan bestemmes, fordi responsværdierne i 
+Irr kurven systematisk er højere eller lavere end RC (–Irr), sættes dosiseffekten til 1. Vægtningsfaktorerne w
 i fremkommer ved den 
højeste responsværdi, dvs. w  i = MAX {R  i (–Irr), R  i (-Irr) }. Koncen ­
trationstabellen C; udvælges, så der er lige mange punkter i hvert af 
de koncentrationsintervaller, som de koncentrationsværdier, der anvendes i eksperimentet, afgrænser. Beregningen af MPE er begrænset til den højeste koncentrationsværdi, hvor mindst en af 
de to kurver udviser en responsværdi på mindst 10 %. Hvis denne 
højeste koncentration er højere end den højeste koncentration, der er blevet anvendt i +Irr-forsøget, sættes den resterende del af +Irr- kurven til responsværdien »0«. Afhængigt af om MPE-værdien er 
større end en korrekt udvalgt skæringsværdi (MPE
 C = 0,15) eller ej, 
klassificeres stoffet som fototoksisk.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
En softwarepakke til beregning af PIF og MPE kan bestilles 
hos (20).  
2.3. FORTOLKNING AF RESULTATER  
På grundlag af valideringsundersøgelsen (8) vil et teststof med en 
PIF < 2 eller en MPE < 0,1 give resultatet: »ingen fototoksicitet«. En PIF > 2 men < 5 eller en MPE > 0,1 men < 0,15 vil give resultatet: 
»sandsynlig fototoksicitet«, og en PIF > 5 eller en MPE > 0,15 vil 
give resultatet: »fototoksicitet«.
 
Alle laboratorier, der starter brug af denne test op, skal undersøge de 
referencematerialer, der er opstillet i tabel 1, inden de begynder at 
teste stoffer for fototoksicitet. PIF- eller MPE-værdier skal ligge tæt 
op ad værdierne i tabel 1.  
Tabel 1  
Kemisk beteg ­
nelse EINECS nr. CAS nr. PIF MPE Absorptions ­
maksima Opløsningsm ­
iddel (  1 ) 
Amiodaron HCl 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27 - 0,54 242 nm 
300 nm 
(skulder) ethanol 
Klorpromazin 
HCl 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33 - 0,63 309 nm ethanol 
Norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34 - 0,90 316 nm acetonitril 
Anthracen 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19 - 0,81 356 nm acetonitril Protoporphyrin 
IX, dinatrium 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54 - 0,74 402 nm ethanol 
L-Histidin [7006-35-1] ingen PIF 0,05 - 0,10 211 nm vand 
Hexachlorophen 200-733-8 [70-30-4] 1,1 - 1,7 0,00 - 0,05 299 nm 
317 nm 
(skulder) ethanol 
Natriumlauryl ­
sulfat 205-788-1 [151-21-3] 1,0 - 1,9 0,00 - 0,05 ingen 
absorption vand
 
( 1 ) Opløsningsmiddel anvendt til måling af absorption.  
2.4. FORTOLKNING AF DATA  
Hvis der kun kan konstateres fototoksiske virkninger ved den højeste 
testkoncentration (specielt i forbindelse med vandopløselige teststof ­
fer), skal der indgå andre overvejelser i risikovurderingen. Det kan f.eks. være data om hudabsorption og ophobning af det kemiske stof 
i huden og/eller data fra andre test, f.eks. test af det kemiske stof in 
vitro i dyrehud eller human hud eller hudmodeller.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Hvis der ikke påvises nogen toksicitet (+Irr og –Irr), og hvis dårlig 
opløselighed har begrænset de mulige koncentrationer, kan man 
betvivle testens egnethed til det pågældende stof, og der bør gennem ­
føres bekræftende undersøgelser baseret på en anden model.  
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT  
Testrapporten skal mindst indeholde følgende oplysninger:  
Teststof:  
— identifikationsdata, trivialnavne, generiske navne og IUPAC- og 
CAS-nummer, hvis kendt  
— fysiske egenskaber og renhedsgrad  
— fysiske-kemiske egenskaber, som er relevante for undersøgelsen  
— absorptionsspektrum for UV/synligt lys  
— stabilitet og foto stabilitet, hvis kendt.  
Opløsningsmiddel:  
— begrundelse for valg af opløsningsmiddel  
— teststoffets opløselighed i opløsningsmidlet  
— mængden (i procent) af opløsningsmiddel i kulturmediet.  
Celler:  
— celletype og oprindelse  
— fravær af mycoplasma  
— antal cellegenerationer, hvis kendt  
— cellernes strålingsfølsomhed målt med det strålingsudstyr, der 
anvendes i in vitro 3T3 NRU-fototoksicitetstesten.  
Testbetingelser (1) ved  inkubation før og efter eksponering for kemi ­
kaliet:  
— type og sammensætning af dyrkningsmedium  
— omstændigheder ved inkubationen (C0  2 -koncentration, tempera ­
tur, fugtighed)  
— varighed af inkubationen (før og efter eksponeringen for kemi ­
kaliet).  
Testbetingelser (2)  ved eksponering for kemikaliet:  
— begrundelse for valg af koncentrationer af teststoffet både med 
og uden bestråling  
— hvis stoffet er tungtopløseligt, og cytotoksicitet ikke er påvist: 
begrundelse for den største koncentration, der er anvendt ved undersøgelsen
 
— type og sammensætning af dyrkningsmedium (buffer-saltopløs ­
ning)  
— varigheden af eksponering for det kemiske stof.  
Testbetingelser (3)  ved bestråling:  
— begrundelse for valg af lyskilde  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— producent og type af lyskilde og radiometer  
— lyskildens spektrale strålingskarakteristik  
— det anvendte filters transmissions-/absorptionskarakteristik  
— det anvendte radio meters karakteristik og detaljeret beskrivelse 
af dets kalibrering  
— afstanden mellem lyskilden og testsystemet  
— UVA-strålingsintensiteten (irradians) for den pågældende afstand 
udtrykt i mW/cm  2 
— varigheden af udsættelsen for UV/synligt lys  
— UVA-dosis (strålingsintensitet × tid) udtrykt i J/cm  2 
— temperaturen i cellekulturen under bestråling og den tilsvarende 
cellekultur, der samtidig opbevares i mørke.  
Testbetingelser (4) ved  Neutral Red-levedygtighedstest:  
— sammensætning af Neutral Red-mediet  
— varigheden af inkubationen med Neutral Red  
— omstændigheder ved inkubationen (C0  2 -koncentration, tempera ­
tur, fugtighed)  
— omstændigheder ved ekstraktion af Neutral Red (ekstraktionsmid ­
del, varighed)  
— bølgelængde anvendt ved den spektrofotometriske aflæsning af 
OD for Neutral Red  
— eventuel sekundær bølgelængde (reference)  
— indhold af spektrofotometers eventuelle negative kontroller.  
Resultater:  
— cellelevedygtighed for hver koncentration af teststoffet udtrykt 
som en procentdel af levedygtigheden i kontrolkulturerne  
— koncentrations-/responskurver (koncentration af teststoffet over 
for den relative cellelevedygtighed) fremkommet i samhørende +Irr og –Irr eksperimenter
 
— analyse af data af koncentrations-/responskurverne: hvis muligt 
beregning/kalkulation af IC  50 (+Irr) og IC  50 (–Irr)  
— sammenligning af de to koncentrations-/responskurver, som er 
fremkommet med og uden bestråling, enten ved beregning af fotoirritationsfaktor (PIF) eller ved beregning af den gennemsnit ­
lige lyseffekt (MPE)
 
— kriterier for accept af test, samtidig negativ kontrol  
— absolut levedygtighed (OD af Neutral Red-ekstrakt) for bestrå ­
lede og ikke-bestrålede celler  
— forklarende data for den negative kontrol, gennemsnit og stan ­
dardafvigelse  
— kriterier for accept af test, samtidig positiv kontrol  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— IC50(+Irr) og IC  50 (–Irr) og PIF/MPE for den positive kontrols 
kemiske stof  
— forklarende data for den positive kontrols kemiske stof: 
IC 50 (+Irr) og IC  50 (–Irr) og PIF/MPE, gennemsnit og standard ­
afvigelse.  
Diskussion af resultater  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of 
substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 
95-102.  
(2) Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In »Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry« Vol. 3 part 1. North Holland Publishing 
Co. Amsterdam. p XI-XXXV.  
(3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and 
Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The 
report and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314-348.
 
(4) Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In »The science of 
Photobiology« Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New 
York. 2nd edition, p 79-110.  
(5) OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 »Guidance Document 
On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water« Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.  
(6) Spielmann, H., Balls, M., Doring, B., Holzhiitter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., 
Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  
phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 
cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793-796.
 
(7) Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7-8.
 
(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pecho ­
vitch, G. De Silva, O., Holzhutter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., 
Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., 
Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA/n  vitro  phototoxicity validation study: results of 
phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. 
Toxic. In Vitro 12, 305-327.
 
(9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, 
Berlin, 30  th -31 th October 2001, Secretariat's Final Summary 
Report, 15  th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon 
request from the Secretariat.  
(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett, 24, 119-124.  
(11) Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control 
for cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In »Dermatotoxicology«, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515-530.
 
(13) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829.  
(14) ISO 10977. (1993). Photography — Processed photographie 
colour films and paper prints — Methods for measuring image stability.
 
(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275.
 
(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA — Standard Operating Procedure: 
In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 
September, 1998. 18 pgs.  
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter 
chemicals from Annex VII of the European Union Directive 
76/768/EEC, in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679-708.
 
(18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical 
modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. 
Systems 3, 127-138.  
(19) Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of in vitro photo ­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 445-462.
 
(20) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377 
_2349687_1_1_1_1,00.html  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
BILAG 1  
3T3 NRU PT's rolle i forhold til de forskellige trin i fototoksicitetstest af kemikalier
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
BILAG 2  
Figur 1  
Spektraleffektfordeling i en filtreret solsimulator
  
(Se punkt 1.4.1.5, andet afsnit)  
Figur 1 viser et eksempel på en acceptabel spektralintensitetsfordeling i en filtreret solsimulator. 
Målingerne er fra den doterede metalhalogenidkilde, der anvendes i valideringstesten i 3T3 NRU 
PT (6)(8)(17). Kurverne viser to forskellige filtres virkning og den supplerende filtereffekt af låget på en 96-huls cellekulturplade. H2-filter blev kun anvendt i forbindelse med testsystemer, der tolererer en større mængde UVB (test med hudmodel og fotohæmolysetest af røde blodlegemer). 
I 3T3 NRU-PT blev H1-filteret anvendt. Af figuren fremgår, at supplerende filtreringseffekt fra 
pladelåget hovedsagelig konstateres i UVB-området, hvor det tillader tilstrækkeligt UVB i bestrå ­
lingsspektret til at excitere kemikalier, der typisk absorberer i UVB-området, som f.eks. Amiodaron (se tabel 1).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Figur 2  
Balb/c 3T3-cellers bestrålingsfølsomhed (målt i UVA-området)  
Cellelevedygtighed ( % Neutral Red-optagelse i mørkekontroller)
  
(se punkt 1.4.1.5.2, andet afsnit, samt punkt 1.4.2.2.1 og 1.4.2.2.2)  
Balb/c 3T3-cellers følsomhed for bestråling med solsimulatoren under valideringstesten af 3T3 
NRU-fototoksicitetstesten målt i UVA-området. Figuren viser de resultater, man kom frem til i syv forskellige laboratorier forud for valideringsundersøgelsen (1). De to kurver med åbne symboler 
repræsenterer gamle celler (stort antal cellegenerationer), der måtte udskiftes med nye celler, og 
kurverne med udfyldte symboler viser celler med acceptabel bestrålingstolerance.
 
På baggrund af disse data blev den højeste ikke-cytotoksiske bestrålingsdosis på 5 J/cm  2 fastlagt 
(lodrette stiplede linje). Den vandrette stiplede linje viser den maksimale acceptable bestrålings ­
effekt, der omtales i punkt 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER  
INDLEDNING  
1. OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder baseret på 
denne vejledning bliver med mellemrum gennemgået på baggrund af den 
videnskabelige udvikling, behovet for ny lovgivning og hensynet til dyre ­
velfærden. Den oprindelige testmetode (TM) til bestemmelse af hudsensi ­
bilisering i mus, assay på lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guide ­
line 429, kapitel B.42 i dette bilag), er allerede blevet vedtaget (1). En 
validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i 
litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Den ajourførte LLNA er baseret på en evaluering af erfaringerne og videnskabelige data (12). Der er tale om endnu en TM til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) 
potentiale for hudsensibilisering i dyr. I den anden TM (dvs. OECD Test 
Guideline 406, kapitel B.6 i dette bilag) anvendes marsvin, navnlig maksi ­
meringstesten på marsvin og Buehlertesten (13). LLNA har visse fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 (13), hvad angår dyrevelfærd. 
Denne ajourførte LLNA-TM rummer et sæt ydeevnestandarder (tillæg 1) til 
brug for vurdering af valideringsstatus for nye og/eller modificerede test ­
metoder, som funktionelt og mekanisk svarer til LLNA, i overensstemmelse med principperne i OECD Guidance Document No. 34 (14).
 
2. LLNA består i undersøgelse af induktionsfasen i hudsensibilisering og giver 
kvantitative data, som er velegnede til at vurdere dosis/responsforholdet. Det skal bemærkes, at de let til moderat sensibiliserende stoffer, der anbe ­
fales som velegnede positive kontrolstoffer (PC) ved marsvineforsøg (dvs. 
B.6, OECD Test Guideline 406) (13) også er egnede til brug i forbindelse 
med LLNA (6) (8) (15). En reduceret version af LLNA (rLLNA), hvor der anvendes op til 40 % færre dyr, er også beskrevet som en mulighed i denne TM (16) (17) (18). rLLNA kan anvendes, når det er lovgivningsmæssigt 
nødvendigt at bekræfte en negativ forudsigelse af et potentielt hudsensi ­
biliserende stof, forudsat at alle andre LLNA-protokolspecifikationer over ­
holdes som beskrevet i denne TM. En forudsigelse af et negativt resultat bør være baseret på alle foreliggende oplysninger som beskrevet i punkt 4. 
Inden anvendelsen af rLLNA-metoden skal der fremlægges klare begrun ­
delser og et klart videnskabeligt rationale derfor. Hvis der imod forventning opnås et positivt eller tvetydigt resultat i rLLNA, kan det være nødvendigt at foretage yderligere forsøg for at fortolke eller uddybe resultatet. rLLNA 
bør ikke anvendes til fareidentifikation af hudsensibiliserende teststoffer, når 
der er brug for oplysninger om dosis-responsforholdet såsom underindde ­
ling i henhold til forordning (EF) nr. 1272/2008 om klassificering, mærk ­
ning og emballering af stoffer og blandinger og FN's globale harmoniserede 
system for klassificering og mærkning af kemikalier.
 
DEFINITIONER  
3. De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 2.  
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER  
4. LLNA er en alternativ metode til at udpege potentielle hudsensibiliserende 
kemikalier. Dette indebærer ikke, at LLNA i alle tilfælde bør benyttes i 
stedet for marsvinetesten (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13), men 
snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvanligvis ikke længere kræver yderligere bekræftelse. Testlaboratoriet bør inden 
forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. 
Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- og in 
vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for struk ­
turelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA er egnet til brug for stoffet (i lyset af begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA — se punkt 5) og som støtte 
ved valg af dosis.
 
5. LLNA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke brugen af dyr til 
vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. Den giver imidlertid 
mulighed for at mindske det nødvendige antal dyr til dette formål. Desuden 
repræsenterer LLNA en væsentligt mere sofistikeret måde (mindre smerte og angst) at anvende dyr til allergisk kontaktsensibiliseringstest på. LLNA er baseret på immunologiske hændelser, som udløses af kemikalier i induk ­
tionsfasen af sensibiliseringen. I modsætning til marsvinetest, (dvs. B.6, 
OECD Test Guideline 406) (13) kræver LLNA ikke, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. Desuden kræver LLNA ikke anvendelse af et adjuvans, således som det er tilfældet for 
maksimeringstesten på marsvin (13). LLNA mindsker således dyrenes lidel ­
ser. Trods LLNA's fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 må man have for øje, at metoden har visse begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guideline 406 nødvendige (13) (f.eks. falsk negative 
resultater i LLNA for visse metaller, falsk positive resultater for visse 
hudirriterende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (19) (20) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stofgrupper eller stoffer, der inde ­
holder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede sammenhænge (con ­
founders) (21), kan desuden gøre marsvinetest nødvendige (dvs. B.6, OECD 
Test Guideline 406) (13). I lyset af den begrænsede valideringsdatabase primært bestående af pesticidformuleringer er der endvidere større sandsyn ­
lighed for, at LLNA giver et positivt resultat i forbindelse med disse typer 
teststoffer (22) i forhold til marsvinetesten. I forbindelse med testning af 
formuleringer kan man imidlertid overveje at inkludere lignende stoffer med kendte resultater som referencestoffer for at påvise, at LLNA fungerer korrekt (se punkt 16). Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør 
LLNA kunne anvendes til testning af alle stoffer, medmindre disse stoffer 
har egenskaber, som kan have indflydelse på LLNA-metodens nøjagtighed.
 
TESTPRINCIPPET  
6. Det tilgrundliggende princip for LLNA består i, at den sensibiliserende 
agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner 
påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammenholde den 
gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige 
proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behandlingsgruppe og prolifera ­
tionen i den sideløbende VC-gruppe kaldes stimulationsindekset (SI) og 
skal være mindst tre, før teststoffet kan klassificeres som en potentielt 
hudsensibiliserende agens. De her beskrevne metoder bygger på anvendelse af in vivo radioaktiv mærkning til måling af øget celleproliferation i de drænende aurikulære lymfeknuder. Andre endepunkter til bedømmelse af 
antallet af celler under formering kan imidlertid anvendes, forudsat af 
ydeevnestandarderne opfyldes fuldt ud (tillæg 1).
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
BESKRIVELSE AF ASSAYET  
Valg af dyreart  
7. Mus må foretrækkes til denne test. Der anvendes unge voksne hunmus af 
stamme CBA/Ca eller CBA/J, som ikke har født og ikke er drægtige. Ved 
forsøgets begyndelse skal dyrene være 8-12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten. Alternativt kan der anvendes andre stammer og 
handyr, når der er genereret tilstrækkelige data til at dokumentere, at der 
ikke er væsentlige stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i LLNA-respons.
 
Miljøbetingelser og fodring  
8. Mus bør anbringes i grupper (23), medmindre der fremlægges et fyldestgø ­
rende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal 
være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af 
lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand.
 
Forberedelse af dyrene  
9. Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identifi ­
ceres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i 
mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til 
forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner.
 
Fremstilling af forsøgsopløsninger  
10. Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og 
fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier 
såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor 
ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraher ­
bare bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er accep ­
tabel.
 
Pålidelighedskontrol  
11. Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præsta ­
tioner er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og repro ­
ducerbarhed som et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelses ­
orden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, 
at assayet bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbar ­
heden og sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyndigheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den enkelte undersøgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til 
de relevante myndigheder inden udførelsen af LLNA. Det anbefales 
derfor at foretage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde eventuelle krav ved regelmæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol 
skal fremkalde en positiv LLNA-respons ved det eksponeringsniveau, som 
forventes at give en stigning i SI, som er mere end 3 større end i den
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
negative kontrolgruppe. PC-dosis vælges, således at den ikke forårsager for 
stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er 
reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 20 er for højt). De foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexylkanelaldehyd (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 101-86-0) i acetone: olivenolie (4:1, v/v) og 
5 % mercaptobenzothiazol (CAS nr. 149-30-4) i  N,N -dimethylformamid (se 
tillæg 1, tabel 1). Under visse omstændigheder vil andre positive kontrol ­
stoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes.
 
12. Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være 
situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af 
det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt udfører LLNA (dvs. udfører LLNA mindst én gang om måneden) og har 
oprettet en historisk PC-database, der påviser laboratoriets evne til at skabe 
reproducerbare og nøjagtige resultater med positive kontroller. Laboratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompetence til at udføre LLNA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive kontrol i 
mindst 10 uafhængige forsøg udført inden for en rimelig periode (dvs. inden 
for et år).
 
13. Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en procedu ­
reændring af LLNA (f.eks. ændring af uddannet personale, ændring af testmaterialer og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), 
og disse ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. Der skal tages 
hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden af den alle ­
rede oprettede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at 
oprette en ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er 
sammenhængende.
 
14. Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en 
PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv 
kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstræk ­
kelige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den 
ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konse ­
kvenser bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sidelø ­
bende positive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige posi ­
tive kontroller. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sidelø ­
bende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan anvendes færre mus (12).
 
15. Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at frem ­
kalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse 
godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (24). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end 
teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende 
positive kontrol.
 
16. Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan 
referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at 
påvise denne type teststoffers potentiale for hudsensibilisering korrekt. 
Egnede referencestoffer skal have følgende egenskaber:  
— strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der 
testes, tilhører  
— kendte fysisk/kemiske egenskaber  
— støttedata fra LLNA  
— støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
TESTPROCEDURE  
Antal dyr og dosisniveauer  
17. Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige 
koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende 
behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (side ­
løbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-14). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved 
periodisk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med 
prøvestof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.
 
18. Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning (3) og 
(5). Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 
50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges 
et fyldestgørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncen ­
trationsserier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut toksicitet og hudirritation) og strukturelle og 
fysisk-kemiske oplysninger om det pågældende teststof (og/eller strukturelt 
beslægtede stoffer) tages i betragtning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig 
eksponering uden systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation 
(3) (25). Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt at foretage en prescreening (se punkt 21-24).
 
19. Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således 
at testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den 
fremstillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De 
anbefalede vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v),  N,N -dimethylformamid, 
methylethylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (19), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt ratio ­
nale derfor. I visse situationer kan det som yderligere kontrol være nødven ­
digt med et klinisk relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori teststoffet markedsføres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikel ­
systemet bør indeholde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke 
straks løber af, ved at inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % 
Pluronic® L92). Vehikler kun bestående af vand bør således undgås.
 
20. Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere 
variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 35). 
Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus 
i PC-gruppen, når der indsamles data for de enkelte dyr (12). Nogle tilsyns ­
myndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. Nogle tilsynsmyndigheder accepterer imidlertid poolede data, og i disse 
tilfælde kan brugerne vælge at indsamle data for de enkelte dyr eller 
poolede data.
 
Prescreening  
21. Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste 
dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA. Formålet med prescre ­
eningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, der skal 
anvendes i LLNA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplysninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksicitet (se punkt 24) og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det maksimale dosis ­
niveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige 
koncentration for faste stoffer eller opslæmninger.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for 
LLNA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en vurdering 
af lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til hver enkel dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosis ­
gruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder 
kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation på 
påføringsstedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslutning af forsøget (dag 6). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (25). Der foretages målinger af 
øretykkelsen med en tykkelsesmåler (f.eks. et digitalt mikrometer eller en 
Peacock Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 (inden administration af dosis), på dag 3 (ca. 48 timer efter den første dosis) og på dag 6. På dag 6 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, 
der foretages, efter at dyrene er blevet humant aflivet. For stærk lokal 
hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 og/eller en forøgelse af 
øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (26) (27). Den højeste dosis i 
LLNA-hovedundersøgelsen skal være den næsthøjeste dosis i prescreenings ­
koncentrationsserien (se punkt 18), som ikke inducerer systemisk toksicitet 
og/eller for stærk lokal hudirritation.
 
Tabel 1  
Erytemscorer  
Observation Score  
Intet erytem 0 
Meget let erytem (knapt diagnosticerbart) 1 Veldefineret erytem 2 Moderat til svært erytem 3 
Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som 
umuliggør klassificering af erytemet 4
 
23. Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (26) (27) er en statistisk 
signifikant forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrolmusene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende 
stoffer i LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Selv om statistisk signi ­
fikante forøgelser kan forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet specifikt forbundet med for stærk irritation (30) (32) (33) (34).
 
24. Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (35) (36), 
hvis de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA-hovedundersøgelsen: 
ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og 
kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soignerings ­
aktiviteten, markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirations ­
mønstre (f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom 
åndenød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og 
vandindtagelsen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 6 og dødelighed tages i 
betragtning ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter 
eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (37).
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Forsøgsplanen for hovedundersøgelsen  
25. Forsøgsplanen for assayet er følgende:  
— Dag 1:  Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske 
observationer. Dorsum af hvert øre påføres 25 μl af den pågældende test ­
stofkoncentration, af vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sidelø ­
bende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15)  
— Dag 2 og 3:  Påføringen fra dag 1 gentages.  
— Dag 4 og 5:  Ingen behandling.  
— Dag 6:  Hvert dyrs vægt registreres. 250 μl sterilt phosphatbufferet 
saltopløsning (PBS) indeholdende 20 μCi (7,4 × 10  5 Bq) tritieret 
( 3 H)-methylthymidin injiceres i alle testdyr og kontroldyr gennem hale ­
venen. Alternativt injiceres 250 μL sterilt phosphatbufferet 
saltopløsning (PBS) indeholdende 2 μCi (7,4 × 10  4 Bq)  125 I-iododeo ­
xyuridin og 10  –5 M fluordeoxyuridin i alle dyr gennem halevenen. Fem 
timer (5 t) senere aflives dyrene. De drænende aurikulære lymfeknuder 
fra hvert museøre eksciseres og pooles i PBS for hvert dyr (enkeltdyrs ­
metode). Alternativt eksciseres og pooles lymfeknuderne fra hvert øre i 
PBS for hver behandlingsgruppe (metode med poolet behandlingsgrup ­
pe). Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (12). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af 
øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved hjælp af 
øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen.
 
Fremstilling af cellesuspensioner  
26. En enkeltcellesuspension af lymfeknudeceller (LNC), eksciseret bilateralt 
ved hjælp af enkeltdyrsmetoden eller alternativt ved hjælp af metoden med poolet behandlingsgruppe, fremstilles ved forsigtig mekanisk disaggre ­
gering gennem 200 μm trådnet af rustfrit stål eller en anden acceptabel 
teknik til fremstilling af en enkeltcellesuspension. Lymfeknudecellerne 
vaskes to gange med overskud af saltvand med phosphatbuffer, og dna fældes med 5 % trichloreddikesyre (TCA) ved 4 °C i 18 timer (3). De dannede pellets genopslæmmes enten i 1 ml TCA og overføres til scin ­
tillationsglas indeholdende 10 ml scintillatorvæske til
 3 H-tælling, eller over ­
føres direkte i gammatælleglas til tælling af  125 I. 
Bestemmelse af celleproliferationen (optagen radioaktivitet)  
27. Optagelsen af  3 H-methylthymidin måles ved β-scintillationstælling som 
antal disintegrationer pr. minut (DPM). Optagelsen af  125 I-ioddeoxyuridin 
måles ved  125 I-tælling og angives også som DPM. Afhængigt af den valgte 
metode angives optagelsen som DPM/dyr (individuel metode) eller DPM/ 
behandlingsgruppe (poolet metode).  
Reduceret LLNA  
28. I visse situationer, når det er lovgivningsmæssigt nødvendigt at bekræfte en 
negativ forudsigelse af et potentielt hudsensibiliserende stof, kan der 
anvendes en frivillig rLLNA-protokol (16) (17) (18), hvor der anvendes 
færre dyr, forudsat at alle andre LLNA-protokolspecifikationer overholdes som beskrevet i denne TM. Inden anvendelsen af rLLNA-metoden skal der fremlægges klare begrundelser og et klart videnskabeligt rationale derfor. 
Hvis der opnås et positivt eller tvetydigt resultat, kan det være nødvendigt 
at foretage yderligere forsøg for at fortolke eller uddybe resultatet.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Det reducerede antal dosisgrupper er den eneste forskel mellem LLNA- og 
rLLNA-testprotokollerne, og rLLNA tilvejebringer derfor ikke oplysninger 
om dosis-responsforholdet. rLLNA bør derfor ikke anvendes, når der er behov for oplysninger om dosis-responsforholdet. Som ved flerdosis-LLNA skal den teststofkoncentration, der evalueres i rLLNA, 
være den maksimale koncentration, som ikke inducerer åbenbar systemisk 
toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation hos musen (se punkt 18).
 
OBSERVATIONER  
Kliniske observationer  
30. Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle 
kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, 
der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudæts ­
ning, og som skal aflives (37).
 
Kropsvægt  
31. Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets 
begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning.  
BEREGNING AF RESULTATER  
32. Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som 
stimulationsindeks (SI). Ved enkeltdyrsmetoden fås SI-værdien ved at dividere den gennemsnitlige DPM/dyr fra hver stoftestgruppe og 
PC-gruppen med den gennemsnitlige DPM/mus fra opløsningsmiddel/vehi ­
kelkontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1. Ved metoden med poolet behandlingsgruppe fås SI ved division af den poolede optagelse af radioaktivitet for hver behandlings ­
gruppe med den poolede optagelse for VC-gruppen. Resultatet er den 
gennemsnitlige SI-værdi.
 
33. I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 3. 
Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og opløsningsmidlets/ 
vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedøm ­
melsen af, om et tvetydigt resultat anses for at være positivt (4) (5) (6).  
34. Hvis det er nødvendigt at uddybe de opnåede resultater, bør teststoffets 
forskellige egenskaber tages i betragtning, herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om det medfører for stærk 
lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagttagne 
dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der redegjort mere indgående for andetsteds (7).
 
35. Indsamling af data om radioaktivitet for den enkelte mus gør det muligt at 
foretage en statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en evalue ­
ring af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenligninger af test ­
grupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og sideløbende VC-gruppe). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til 
parvis sammenligning. Ved valg af passende statistisk analysemetode bør under ­
søgeren være opmærksom på mulige forskelle i varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkepara ­
metrisk statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være 
nødsaget til at udføre SI-beregninger og statistiske analyser med og uden visse 
datapunkter (til tider kaldet »outliers«).
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
36. Data opstilles i tabelform. Ved enkeltdyrsmetoden angives de individuelle 
DPM-værdier, gruppens gennemsnitlige DPM/dyr, det tilknyttede fejlled 
(f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammen ­
holdt med den sideløbende VC-gruppe. Ved metoden med poolet behand ­
lingsgruppe vises den gennemsnitlige/mediane DPM og det gennemsnitlige 
SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende VC-gruppe.  
Testrapport  
37. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Test- og kontrolstoffer:  
— identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, 
oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer)  
— fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, 
opløselighed)  
— for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene.  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt 
volumen)  
— begrundelse for valg af vehikel.  
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte CBA-musestamme  
— dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes  
— antal dyr og deres alder  
— dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.  
Testbetingelser:  
— nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet  
— begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, 
hvis en sådan er udført)  
— anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført 
teststof  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens 
art/oprindelse, vandets oprindelse).  
— detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan  
— metoder til måling af toksicitet  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ  
— nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse 
for, hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og 
resultater.  
Pålidelighedskontrol:  
— sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, 
herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel  
— data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative 
kontrolprøver fra prøvelaboratoriet  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for 
og laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og 
en rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra laboratoriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget en sideløbende positiv kontrol.
 
Resultater:  
— de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæs ­
sige aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, 
SEM) for hver behandlingsgruppe  
— tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel 
hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr  
— en tabel med individuelle (enkeltdyrsmetode) eller gennemsnitlige/mediane 
(metode med poolet behandlingsgruppe) DPM-værdier og SI-værdier for 
hver behandlingsgruppe  
— det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for DPM/mus 
for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outlieranalyse for hver behandlingsgruppe ved enkeltdyrsmetoden
 
— beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til 
variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne ved 
enkeltdyrsmetoden  
— dosis-responsforholdet  
— statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt.  
Behandling af resultater:  
— Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet 
fald statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det under ­
søgte stof må anses for hudirriterende.  
LITTERATUR  
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. Toxi ­
col., 30, 165-169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 13-31.  
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53, 563-79.
 
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999-1002.  
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985-997.
 
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327-33.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins,  Toxicol ., 146, 49-59.
 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258-273.
 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274-286.
 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249-257.
 
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ LLNAPerfStds.pdf]
 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemi ­
cals No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment 
No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses 
to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281-284.  
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181-185.  
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research 
Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre 
for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]
 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. 
The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test 
Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordi ­
nated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available 
at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90-96.
 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication 
Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]  
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.  
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http://www. 
oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]  
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: 
Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised 
Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: 
National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [ http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  Toxi­
col. Appl. Pharmacol ., 153, 83-94.  
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245-256.
 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491-506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and 
Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60-68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, 
Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Tillæg 1  
Ydeevnestandarder til brug for vurdering af foreslåede lignende eller 
modificerede LLNA-testmetoder til bedømmelse af hudsensibilisering  
INDLEDNING  
1. Formålet med ydeevnestandarder er at fastslå grundlaget for bedømmelsen 
af nye testmetoder, både beskyttede (dvs. ophavsretsbeskyttede, varemær ­
kebeskyttede og registrerede) og ikkebeskyttede, som værende tilstrækkelig nøjagtige og pålidelige til bestemte testformål. Disse ydeevnestandarder for validerede og anerkendte testmetoder kan anvendes til at evaluere pålide ­
ligheden og nøjagtigheden af andre lignende metoder (i daglig tale »me- 
too«-test), som er baseret på lignende videnskabelige principper, og til at måle eller forudsige den samme biologiske eller toksiske effekt (14).
 
2. Inden indførelsen af modificerede metoder (dvs. foreslåede potentielle forbed ­
ringer af en godkendt testmetode) skal der foretages en bedømmelse af de foreslåede ændringers effekt på testresultatet og af, i hvilket omfang disse ændringer berører de oplysninger, der er tilgængelige for de øvrige dele i vali ­
deringsprocessen. Afhængigt af antallet og arten af de foreslåede ændringer, de 
genererede data og støttedokumentation for disse ændringer, skal de enten underkastes den samme valideringsproces som beskrevet for en ny test eller, hvis det er hensigtsmæssigt, en begrænset vurdering af pålideligheden og rele ­
vansen på grundlag af anerkendte ydeevnestandarder (14).
 
3. Lignende eller modificerede metoder, der foreslås anvendt i forbindelse med 
denne TM, skal vurderes med hensyn til pålidelighed og nøjagtighed ved 
hjælp af kemikalier, der repræsenterer hele LLNA-pointskalaen. For at undgå unødvendig brug af dyr opfordres metodeudviklere på det kraftigste til at rådføre sig med de kompetente myndigheder inden iværksættelsen af 
valideringsundersøgelser i overensstemmelse med ydeevnestandarderne og 
vejledningen i denne TM.
 
4. Disse harmoniserede ydeevnestandarder er baseret på de harmoniserede 
ydeevnestandarder US-ICCVAM, EU-ECVAM og japanske JaCVAM (12) 
for vurdering af validiteten af lignende eller modificerede versioner af LLNA. Ydeevnestandarderne indeholder de centrale dele af testmetoden, anbefalede referencekemikalier og standarder for nøjagtighed og pålidelig ­
hed, som den foreslåede metode som minimum skal opfylde.
 
I. Centrale dele af testmetoden  
5. For at sikre, at en lignende eller modificeret LLNA-metode funktionelt og 
mekanisk svarer til LLNA og måler den samme biologiske effekt, skal 
følgende dele inkluderes i testprotokollen:  
— Teststoffet skal påføres begge musens ører.  
— Lymfocytproliferationen måles i de lymfeknuder, som dræner påførings ­
stedet for teststoffet.  
— Lymfocytproliferationen måles i induktionsfasen i hudsensibilisering.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— For teststoffer skal den højeste dosis være den maksimale koncentration, 
som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirri ­
tation hos musen. For positive referencekemikalier skal den højeste dosis være mindst lige så høj som de tilsvarende referencekemikaliers EC3-værdier i LLNA (se tabel 1) uden at inducere systemisk toksicitet 
og/eller for stærk lokal hudirritation hos musen.
 
— Alle undersøgelser skal omfatte en sideløbende vehikelkontrol, og når 
det er relevant, foretages der også en sideløbende positiv kontrol.  
— Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe.  
— Der indsamles data for de enkelte dyr eller poolede data.  
Hvis nogle af disse kriterier ikke opfyldes, kan disse ydeevnestandarder 
ikke anvendes til validering af den lignende eller modificerede metode.  
II. Minimumsliste over referencekemikalier  
6. I de harmoniserede ydeevnestandarder US-ICCVAM, EU-ECVAM og 
japanske JaCVAM (12) er der blevet identificeret 18 referencekemikalier, der som minimum skal anvendes, og fire valgfrie referencekemikalier (dvs. stoffer, der gav enten falsk positive eller falsk negative resultater i LLNA 
sammenholdt med resultaterne af forsøg med mennesker og marsvin (B.6 
eller OECD Test Guideline 406) (13), og således gør det muligt at påvise en tilsvarende eller bedre ydeevne end LLNA), som er inkluderet i LLNA-ydeevnestandarderne. Kriterierne for udvælgelse af disse kemikalier 
var:
 
— Listen over referencekemikalier indeholdt den type stoffer, der typisk 
testes for potentiale for hudsensibilisering, og det responsområde, som kan måles eller forudsiges i LLNA.
 
— Stofferne havde veldefinerede kemiske strukturer.  
— LLNA-data fra marsvinetest, (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13) 
og (hvis muligt) data for mennesker var tilgængelige for hvert stof.  
— Stofferne var gængse.  
De anbefalede referencekemikalier er angivet i tabel 1. Studier baseret på de 
anbefalede referencekemikalier evalueres i det vehikel, som er angivet i tabel 1. Hvis et stof på listen ikke kan fås, kan der benyttes andre stoffer, 
som opfylder de nævnte udvælgelseskriterier, hvis der gives tilstrækkelig 
begrundelse.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabel 1  
Anbefalede referencekemikalier for LLNA-ydeevnestandarderne  
Antal Kemikalier (  1 ) CAS-nr. Form Veh (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 EC3-interval LLNA vs. 
marsvin LLNA vs. 
human  
1 5-chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on (CMI)/2- 
methyl-4-isothiazolin-3-on (MI) (  5 ) 26172-55- 
4/2682-20-4 Fly. DMF 0,009 1 0,0045-0,018 IB +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Fast AOO 0,049 15 0,025-0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-phenylendiamin 106-50-3 Fast AOO 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 
4 Cobaltchlorid 7646-79-9 Fast DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 5 Isoeugenol 97-54-1 Fly. AOO 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 6 2-mercaptobenzothiazol 149-30-4 Fast DMF 1,7 1 0,85-3,4 IB +/+ +/+ 7 Citral 5392-40-5 Fly. AOO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 8 Hexachloraceton 101-86-0 Fly. AOO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 
9 Eugenol 97-53-0 Fly. AOO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Phenylbenzoat 93-99-2 Fast AOO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 11 Kanelalkohol 104-54-1 Fast AOO 21 1 10,5-42 IB +/+ +/+ 12 Imidazolidinyl urea 39236-46-9 Fast DMF 24 1 12-48 IB +/+ +/+ 13 Methylmethacrylat 80-62-6 Fly. AOO 90 1 45-100 IB +/+ +/+ 14 Chlorbenzen 108-90-7 Fly. AOO 25 1 Ikke relevant Ikke rele ­
vant –/– –/ (*) 
15 Isopropanol 67-63-0 Fly. AOO 50 1 Ikke relevant Ikke rele ­
vant –/– –/+
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Antal Kemikalier (  1 ) CAS-nr. Form Veh (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 EC3-interval LLNA vs. 
marsvin LLNA vs. 
human  
16 Mælkesyre 50-21-5 Fly. DMSO 25 1 Ikke relevant Ikke rele ­
vant –/– –/ (*) 
17 Methylsalicylat 119-36-8 Fly. AOO 20 9 Ikke relevant Ikke rele ­
vant –/– –/– 
18 Salicylsyre 69-72-7 Fast AOO 25 1 Ikke relevant Ikke rele ­
vant –/– –/– 
Frivillige stoffer til påvisning af forbedret ydeevne i forhold til LLNA 
19 Natriumlaurylsulfat 151-21-3 Fast DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Ethylenglycoldimethacrylat 97-90-5 Fly MEK 28 1 14-56 IB +/– +/+ 21 Xylen 1330-20-7 Fly AOO 95,8 1 47,9-100 IB +/ (**) +/– 22 Nikkelchlorid 7718-54-9 Fast DMSO 5 2 Ikke relevant Ikke rele ­
vant –/+ –/+
 
Forkortelser: AOO = acetone: olivenolie (4:1, v/v); CAS-nr. = Chemical Abstracts Service Number; DMF =  N,N -dimethylformamid; DMSO = dimethylsulfoxid; DNCB = 2,4-dinitrochlorobenzen; EC3 = den estimerede 
koncentration, der skal til for at fremkalde en tre gange stigning i stimulationsindekset; Marsvin = marsvinetestresultat (dvs.  B.6 eller OECD Test Guideline 406) (13); HCA = hexylkanelaldehyd; Fly = flydende; LLNA = resultat 
af assay på lokale lymfeknuder i mus (dvs. B.42 eller OECD Test Guideline 429) (1); MEK = methylethylketon; NA = ikke relevant,  da stimulationsindekset er < 3; IB = ikke beregnet, da data hidrører fra en enkelt undersøgelse; 
Fast = faste; Veh = testvehikel. 
(*) Antages ikke at være et sensibiliserende stof for mennesker, da der ikke blev fundet nogen kliniske lappetestresultater, de t er ikke inkluderet som et lappetestkit til påvisning af allergi, og der blev ikke fundet nogen 
caserapporter om human sensibilisering. 
(**) Der foreligger ingen data fra marsvinetest. 
( 1 ) Kemikalier fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel. 
( 2 ) Som følge af den potentielle indvirkning af forskellige vehikler på LLNA's ydeevne bør det anbefalede vehikel for hvert refer encekemikalie anvendes (24) (32). 
( 3 ) Middelværdi, hvor der var mere end en EC3-værdi. For negative stoffer (dvs. med stimulationsindeks < 3) angives den højeste t estede koncentration. 
( 4 ) Antal LLNA-undersøgelser, som dataene hidrører fra. 
( 5 ) Forhandles under betegnelsen Kathon CG (CAS-nr. 55965-84-9), der er en blanding af CMI og MI i forholdet 1:3. De relative kon centrationer af hver komponent ligger i intervallet 1,1 % til 1,25 % (CMI) og 0,3 % til 
0,45 % (MI). De inaktive komponenter er magnesiumsalte (21,5 % til 24 %) og kobbernitrat (0,15 % til 0,17 %), og resten af form uleringen er 74 % til 77 % vand. Kathon CG forhandles allerede gennem Sigma-Aldrich and 
Rohm and Haas (nu Dow Chemical Corporation).
 III. Fastlagte standarder for nøjagtighed og pålidelighed  
7. Nøjagtigheden af en lignende eller modificeret LLNA-metode skal som 
minimum være den samme som for LLNA-ydeevnestandarderne, når den 
vurderes på grundlag af de 18 referencekemikalier, der som minimum skal anvendes. Den nye eller modificerede metode skal resultere i en korrekt klassificering baseret på en »ja/nej«-afgørelse. Alle de referencekemikalier, 
der som minimum skal anvendes, klassificeres ikke altid korrekt ved den 
nye eller modificerede metode. Hvis et af de milde sensibiliserende stoffer f.eks. blev klassificeret forkert, kan en begrundelse for fejlklassificeringen og relevante supplerende data (f.eks. testresultater med korrekte klassifice ­
ringer af andre stoffer med samme fysiske, kemiske og sensibiliserende 
egenskaber som det fejlklassificerede referencekemikalie) anses som doku ­
mentation for samme ydeevne. I så fald vurderes valideringsstatus for den nye eller modificerede LLNA-testmetode fra sag til sag.
 
Reproducerbarhed inden for laboratorier  
8. Ved bestemmelse af reproducerbarheden inden for laboratorier skal en ny 
eller modificeret LLNA-metode vurderes ved hjælp af et sensibiliserende stof, som er velkarakteriseret i LLNA. LLNA-ydeevnestandarderne er således baseret på de variable resultater af gentagne test af 
hexylkanelaldehyd (HCA). Ved vurdering af pålideligheden inden for labo ­
ratorier skal de beregnede koncentrationstærskelværdier (ECt-værdier) for HCA udledes fire gange med mindst en uges mellemrum mellem forsøgene. Reproducerbarheden inden for laboratorier er acceptabel, hvis laboratoriet i 
hver HCA-test kan opnå ECt-værdier på mellem 5 % og 20 %, hvilket 
udgør 0,5-2 gange den EC3-middelværdi, der er specificeret for HCA (10 %) i LLNA (se tabel 1).
 
Reproducerbarhed mellem laboratorier  
9. Ved bedømmelsen af reproducerbarheden mellem laboratorier skal en ny 
eller modificeret LLNA-metode vurderes ved hjælp af to sensibiliserende 
stoffer, som er velkarakteriserede i LLNA. LLNA-ydeevnestandarderne er baseret på de variable resultater af HCA- og 2,4- dinitrochlorobenzen (DNCB)-test i forskellige laboratorier. ECt-værdierne 
afledes uafhængigt af en enkelt undersøgelse udført i mindst tre forskellige 
laboratorier. For at påvise, at reproducerbarheden mellem laboratorier er acceptabel, skal det enkelte laboratorium opnå ECt-værdier på 5 %-20 % og 0,025 %-0,1 % for DNCB, hvilket udgør 0,5-2 gange den EC3-middel ­
værdi, der er specificeret for henholdsvis HCA (10 %) og DNCB (0,05 %) i 
LLNA (se tabel 1).
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
Tillæg 2  
Definitioner  
Nøjagtighed: Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede 
referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som 
den andel korrekte udfald, testmetoden fører til (14).
 
Referencestof: Et sensibiliserende eller ikkesensibiliserende stof, der anvendes 
som standard til sammenligning med et teststof. Et referencestof skal have 
følgende egenskaber: i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; ii) strukturel 
og funktionel lighed med den stofgruppe, der testes; iii) kendte fysisk/kemiske egenskaber; iv) støttedata om kendte virkninger og v) kendt styrke i det ønskede responsområde.
 
Beregnet koncentrationstærskel (ECt): Beregnet koncentration af det teststof, der 
er påkrævet for at fremkalde et stimulationsindeks, der er indikativt for en positiv respons.
 
Beregnet koncentration tre (EC3): Beregnet koncentration af det teststof, der er 
påkrævet for at fremkalde et stimulationsindeks på tre.  
Falsk negativ: Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som 
negativt eller ikkeaktivt, selv om det rent faktisk er positivt eller aktivt.  
Falsk positiv: Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som 
positivt eller aktivt, selv om det rent faktisk er negativt eller ikkeaktivt.  
Fare: Potentielle skadelige virkninger for menneskers sundhed og miljøet. De 
skadelige virkninger fremkaldes kun, hvis eksponeringen er tilstrækkelig.  
Reproducerbarhed mellem laboratorier: Mål for, i hvilken grad forskellige kvali ­
ficerede laboratorier kan opnå de samme resultater kvalitativt og kvantitativt, når de anvender samme protokol og tester de samme teststoffer. Reproducerbarheden 
mellem laboratorier bestemmes forud for og under valideringsprocessen og angi ­
ver, i hvilken grad en test kan overføres mellem laboratorier med et vellykket resultat. Kaldes også ekstern reproducerbarhed (14).
 
Reproducerbarhed inden for laboratorier: Bestemmelse af, i hvilken grad kvali ­
ficeret personale på det samme laboratorium kan reproducere resultater ved 
anvendelse af en specifik protokol på forskellige tidspunkter. Kaldes også intern reproducerbarhed (14).
 
Me-too-test: Gængs udtryk for en testmetode, som strukturelt og funktionelt 
ligner en valideret og anerkendt referencetestmetode. En sådan testmetode under ­
kastes ofte en catch-up-validering. Benyttes som synonym for tilsvarende test ­
metode (14).  
Outlier: En outlier er en observation, der er markant anderledes end andre 
værdier i en tilfældig stikprøve af en population.  
Ydeevnestandarder (PS): Standarder, som med udgangspunkt i en valideret test ­
metode giver mulighed for at vurdere, om en foreslået testmetode, som er meka ­
nistisk og funktionelt tilsvarende, er sammenlignelig. De indeholder bl.a.: i) de centrale dele af testmetoden, ii) en minimumsliste med referencekemikalier, som er udvalgt blandt de kemikalier, der er benyttet til at påvise, at den validerede 
testmetodes ydeevne er acceptabel, iii) de sammenlignelige niveauer af 
nøjagtighed og pålidelighed, som er fastsat efter, hvad der er opnået med den validerede testmetode, og som det skal påvises, at den foreslåede testmetode kan yde, ved vurdering ud fra minimumslisten med referencekemikalier (14).
 
Beskyttet testmetode: En testmetode, hvor fremstilling og distribution er beskyttet 
af patenter, ophavsrettigheder, varemærker osv.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Kvalitetssikring: En forvaltningsproces, hvor overholdelsen af laboratoriets test ­
standarder, krav og registreringsprocedurer og nøjagtigheden af dataoverførsler 
vurderes af personer, der er uafhængige af de personer, der udfører forsøget.  
Referencekemikalier: Kemikalier, der anvendes i valideringsprocessen, hvor 
respons i in vitro eller in vivo-referencetestsystemet eller de pågældende arter allerede er kendt. Disse kemikalier skal være repræsentative for de kemiske 
stofgrupper, som testmetoden forventes at blive anvendt på, og skal repræsentere 
hele det forventede responsområde for de kemikalier, som den anvendes til, fra kraftig til svag eller negativ respons. Det kan være nødvendigt at anvende forskellige referencekemikalier i de forskellige faser i valideringsprocessen og 
til forskellige testmetoder og testformål (14).
 
Relevans: Beskrivelse af sammenhængen mellem testen og den pågældende virk ­
ning og dens meningsfuldhed og brugbarhed til et bestemt formål. Det angives, i hvilket omfang testen måler eller forudsiger den pågældende biologiske virkning korrekt. Testmetodens nøjagtighed (konkordans) indgår i vurderingen af dens 
relevans (14).
 
Pålidelighed: Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i 
og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og 
mellem laboratorier (14).
 
Hudsensibilisering: En immunologisk proces, der udløses, når en disponeret 
person eksponeres for en inducerende kemisk allergen, som fremkalder en kutan immunrespons, der kan føre til udviklingen af kontaktsensibilisering.
 
Stimulationsindeks (SI): En værdi, der beregnes for at vurdere et teststofs poten ­
tiale for hudsensibilisering, og som er forholdet mellem proliferation i behand ­
lingsgrupperne og proliferationen i den sideløbende vehikelkontrolgruppe.  
Teststof (eller testkemikalie): Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af 
denne TM.  
Valideret testmetode: En testmetode, for hvilken der er gennemført validerings ­
undersøgelser for at fastslå relevansen (herunder nøjagtigheden) og pålidelig ­
heden til et bestemt formål. Det er vigtigt at være opmærksom på, at en valideret 
testmetode måske ikke har tilstrækkelig ydeevne med hensyn til nøjagtighed og pålidelighed til at være acceptabel til det planlagte formål (14).
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  NEUROTOKSICITETSUNDERSØGELSE I GNAVERE  
1. METODE  
Metoden svarer til OECD TG 424 (1997).  
Denne forsøgsmetode har til formål at give den nødvendige infor ­
mation for at kunne bekræfte eller nærmere karakterisere af den 
potentielle neurotoksicitet af kemiske stoffer i voksne dyr. Den kan enten kombineres med eksisterende metoder til toksicitetsundersø ­
gelse ved gentagen indgift eller kan udføres som en separat under ­
søgelse. Det anbefales at konsultere OECD Guidance Document on 
Neurotoxicity Testing Strategies and Methods (1) med henblik på design af undersøgelser baseret på denne testmetode. Navnlig er dette vigtigt, hvis man overvejer at ændre på de observationer og 
testprocedurer, som anbefales til rutinemæssig brug af metoden. Det 
nævnte Guidance Document er udarbejdet med henblik på at lette valget af andre testprocedurer til brug under givne omstændigheder.
 
Vurdering af udviklingsneurotoksicitet er ikke omfattet af denne 
metode.  
1.1. INDLEDNING  
Ved vurdering af kemiske stoffers toksiske egenskaber er det vigtigt, 
at potentialet for neurotoksiske virkninger tages i betragtning. I metoden til systemisk toksicitetsundersøgelse med gentagen indgift indgår allerede screening for neurotoksisk potentiale. Metoden kan 
benyttes til at fastlægge design for en undersøgelse, der supplerer 
eller bekræfter de neurotoksiske virkninger, som er set i undersøgel ­
serne for systemisk toksicitet ved gentagen indgift. Når man betragter det neurotoksiske potentiale af visse kategorier af 
kemiske stoffer, kan disse tænkes at ville blive vurderet mere 
korrekt, hvis denne metode anvendes, uden at man på forhånd har fået nogen indikation af stoffernes neurotoksiske potentiale fra forsøg med systemisk toksicitet ved gentagen indgift. Sådanne betragtninger 
kan f.eks. bestå i.
 
— observation af neurologiske symptomer eller neuropatologiske 
forandringer i andre toksicitetsundersøgelser end forsøg med gentagen indgift, eller
 
— strukturelt slægtskab eller andre oplysninger, der kæder stofferne 
sammen med kendte neurotoksiske stoffer.  
Derudover kan det i andre tilfælde være hensigtsmæssig at benytte 
denne metode; for nærmere enkeltheder henvises til (1).  
Denne metode er udviklet således, at den kan tilpasses med henblik 
på at bekræfte givne histopatologiske og adfærdsmæssige neurotok ­
siske egenskaber ved et kemisk stof foruden at karakterisere og 
kvantificere den neurotoksiske respons.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Tidligere blev neurotoksicitet anset for at være ensbetydende med 
neuropati ledsaget af neuropatologiske forandringer eller af neurolo ­
gisk dysfunktion, som f.eks. kramper, lammelse eller tremor. Skønt neuropati er en vigtig manifestation af neurotoksicitet, er det nu klart, at der er mange symptomer på toksisk effekt på nervesystemet 
(f.eks. nedsat motorisk koordination, nedsat sansefunktion, indlæ ­
rings- og hukommelsesdysfunktion), som ikke nødvendigvis afspejler sig i neuropati eller i andre typer forsøg.
 
Denne neurotoksicitets-forsøgsmetode er udformet med henblik på at 
finde væsentlige neuroadfærdsmæssige og neuropatologiske virk ­
ninger i voksne gnavere. Skønt adfærdspåvirkninger, også uden morfologiske forandringer, kan afspejle en negativ påvirkning af 
organismen, er det ikke alle adfærdsændringer, der er specifikke 
for nervesystemet. Derfor bør eventuelle observerede forandringer vurderes i sammenhæng med sideløbende histopatologiske, hæmoto ­
logiske og biokemiske data foruden data vedrørende andre former for 
systemisk toksicitet. I de test, der anvendes i denne metode til karak ­
terisering og kvantificering af neurotoksisk respons, indgår speci ­
fikke histopatologiske og adfærdsmæssige metoder, som yderligere kan understøttes gennem elektrofysiologiske og/eller biokemiske 
undersøgelser (1)(2)(3)(4).
 
Neurotoksiske stoffer kan virke på en række steder i nervesystemet 
og ved forskellige mekanismer. Da der ikke findes nogen enkelt 
række test, der giver mulighed for tilbundsgående vurdering af det 
neurotoksiske potentiale af alle stoffer, kan det være nødvendigt at anvende andre in vivo- eller in vitro-test, som er specifikt rettet mod den observerede eller forventede form for neurotoksisk virkning.
 
Denne testmetode kan desuden, i forbindelse med den vejledning, 
der gives i OECD's Guidance Document on Neurotoxicity Testing 
Strategies and Methods (1), anvendes tit nærmere karakterisering 
eller forbedring af følsomheden af kvantificeringen af dosis-respons ­
forholdet med henblik på at kunne opstille et bedre skøn over No Observed Adverse Effect Level (NOAEL), eller på at underbygge 
kendte eller formodede farer ved det kemiske stof. For eksempel kan 
der udformes undersøgelser til fastlæggelse og vurdering af neuro ­
toksiske mekanismer eller supplering af de oplysninger, der allerede kan fås ved hjælp af grundlæggende neuroadfærdsmæssige og neuro ­
patologiske observationsmetoder. Sådanne undersøgelser behøver 
ikke dublere de data, der fås ved brug af de i denne metode anbe ­
falede standardmetoder, når sådanne data allerede foreligger og ikke anses for nødvendige til fortolkning af undersøgelsens resultater.
 
Denne neurotoksikologiske undersøgelse, anvendt alene eller i 
kombination, giver oplysninger, som kan:  
— fastslå, om nervesystemet påvirkes permanent eller reversibelt af 
det testede kemiske stof  
— bidrage til karakterisering af de nervesystemforandringer, der er 
forbundet med udsættelse for det kemiske stof, og til forståelsen 
af den underliggende mekanisme  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— fastlægge dosis- og tidsrespons-forholdet med henblik på bestem ­
melse af et skønnet niveau, der er uden observerede sundheds ­
mæssigt uønskede effekter, (og som kan danne grundlag for fast ­
sættelse af sikkerhedsniveau for det kemiske stof).  
I metoden administreres teststoffet oralt. Andre administrationsveje 
(f.eks. ved dermal applikation eller inhalation) kan være mere velegnede og kan kræve tilpasning af den anbefalede fremgangs ­
måde. Overvejelser vedrørende valg af administrationsvej bygger 
på stoffets profil med hensyn til eksponering af mennesker og på 
foreliggende toksikologiske og kinetiske oplysninger.
 
1.2. DEFINITIONER  
Sundhedsmæssigt uønsket virkning:  enhver sådan behandlingsrela ­
teret afvigelse fra den normale variation, som forringer en orga ­
nismes overlevelsesevne, reproduktionsevne eller tilpasningsevne til 
omgivelserne.  
Dosis:  den mængde teststof, som indgives. Dosis angives som vægt ­
mængde (g, mg) teststof pr. vægtenhed forsøgsdyr (f.eks. mg/kg), 
eller som fast koncentration i føden (ppm).  
Dosering:  et generelt udtryk, som indbefatter dosis, doseringens 
hyppighed og anvendelsens varighed.  
Neurotoksicitet:  en negativ ændring i nervesystemets struktur eller 
funktion som følge af udsættelse for et kemisk, biologisk eller fysisk 
agens.  
Neurotoksisk agens:  ethvert kemisk, biologisk eller fysisk agens 
med potentiale til at fremkalde neurotoksicitet.  
NOAEL:  forkortelse for »no-observed-adverse-effect level«, dvs. det 
højeste dosisniveau, hvor der ikke observeres behandlingsrelaterede 
uønskede virkninger.  
1.3. PRINCIP FOR TESTMETODEN  
Teststoffet administreres oralt ved forskellige doser til forskellige 
grupper af gnavere. Normalt kræves gentagen dosering, og dosis ­
regimet kan være 28 dages indgift, subkronisk (90 dage) eller 
kronisk (1 år eller længere). Procedurerne i denne testmetode kan 
ligeledes anvendes til et forsøg for akut neurotoksicitet. Dyrene testes, således at man kan påvise og karakterisere anomalier af adfærdsmæssig eller neurologisk art. I hver observationsperiode 
vurderes adfærden på en række punkter, som kan tænkes påvirket 
af neurotoksiske stoffer. Ved testens slutning bliver en undergruppe af dyr af hvert køn fra hver gruppe perfunderet in situ, og af hjerne, rygmarv og perifere nerver fremstilles snit, som undersøges.
 
Når undersøgelsen fungerer som enkeltstående undersøgelse til scre ­
ening for neurotoksicitet eller til karakterisering af neurotoksiske virkninger, kan de dyr i hver gruppe, som ikke er anvendt til perfu ­
sion og efterfølgende histopatologisk undersøgelse (se tabel 1), 
anvendes til specifikke neuroadfærdsmæssige, neuropatolotiske, neurokemiske eller elektrofysiologiske procedurer, som kan supplere de data, man har fået ved hjælp af standardundersøgelserne i denne 
metode (1). Sådanne supplerende procedurer kan være særlig nyttige, 
når empiriske observationer eller forventede virkninger peger på neurotoksicitet af specifik art eller med et specifikt mål. Alternativt kan de tilbageværende dyr anvendes til vurderinger som f.eks. dem, 
der foreskrives i metoder til toksicitetsundersøgelser med gentagen 
indgift i gnavere.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Når procedurerne i denne forsøgsmetode kombineres med procedu ­
rerne i andre forsøgsmetoder, skal antallet af dyr være tilstrækkeligt 
til at opfylde kravene om observationer i begge undersøgelser.  
1.4. BESKRIVELSE AF FORSØGSMETODEN  
1.4.1.  Valg af dyreart  
Den foretrukne gnaverart er rotter, emn en anden gnaverart kan 
anvendes, når begrundelse herfor gives. Der anvendes unge raske dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Hundyrene må 
ikke have født og må ikke være drægtige. Doseringen skal normalt 
begynde snarest muligt efter fravænning, fortrinsvis senest ved seks ugers alderen, og under alle omstændigheder før ni ugers alderen. Når denne undersøgelse kombineres med andre undersøgelser, kan 
det dog være nødvendigt at tilpasse dette alderskrav. Ved forsøgets 
begyndelse må vægtvariationen mellem de anvendte dyr ikke være over 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn. Når en kortvarig toksicitetsundersøgelse med gentagen dosering udføres som indled ­
ning til en langvarig undersøgelse, skal de anvendte dyr i de to 
undersøgelser være af samme stamme og oprindelse.
 
1.4.2.  Opstaldning og fodring  
Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22  o C (± 3  o C). Den 
relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. 
Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 
timers mørke. Høj intermitterende støj skal holdes på et minimum. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. Ved valg af foder kan der tages hensyn til nødven ­
digheden af at sikre passende iblanding af teststoffet, når denne 
administrationsmåde anvendes. Dyrene kan enten anbringes enkeltvis eller i bure med små grupper af samme køn.
 
1.4.3.  Klargøring af dyrene  
Unge raske dyr tilordnes behandlings- og kontrolgrupper på tilfældig 
måde. Burene arrangeres, så at eventuelle virkninger af burenes 
placering minimeres, Dyrene mærkes entydigt, så de enkelte dyr 
kan identificeres, og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne.
 
1.4.4.  Indgiftsvej og fremstilling af doserne  
Metoden vedrører specifikt oral indgift af teststoffet. Oral indgift kan 
ske ved gavage, tilsætning til foder eller drikkevand, eller gennem kapsler. Der kan anvendes andre adrninistrationsveje (f.eks. dermal 
applikation eller inhalation), men i så fald kan det blive nødvendigt 
at tilpasse den anbefalede fremgangsmåde. I overvejelser vedrørende valg af administrationsvej indgår stoffets profil med hensyn til eksponering af mennesker og foreliggende toksikologiske og kine ­
tiske oplysninger. Den valgte administrationsvej og deraf følgende 
ændringer af procedurerne i denne forsøgsmetode skal begrundes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Om nødvendigt opløses eller opslæmmes teststoffet i et egnet vehi ­
kel. Det anbefales, at man som første valg vurderer muligheden af at 
benytte en vandig opløsning/suspension, efterfulgt af en opløsning/suspension i olie (f.eks majsolie), og derefter eventuel opløsning i andre vehikler. Vehiklets toksiske egenskaber skal 
være kendt. Derudover skal følgende egenskaber ved vehiklet tages 
i betragtning: dets effekt på teststoffets absorption, fordeling, meta ­
bolisme og retention med deraf følgende eventuel ændring af dettes toksiske egenskaber, og dets indvirkning på dyrenes føde- og 
vandindtagelse og ernæringstilstand.
 
1.5. PROCEDURER  
1.5.1.  Dyrenes antal og køn  
Når undersøgelsen udføres som enkeltstående undersøgelse, skal der 
anvendes mindst 20 dyr (10 hunner og 10 hanner) i hver dosis- og 
kontrolgruppe til detaljeret klinisk og funktionsmæssig observation. 
Af disse 10 hanner og 10 hunner udvælges mindst fem hanner og fem hunner, som perfunderes in situ og gennemgår detaljeret neuro ­
histopatologisk undersøgelse ved forsøgets afslutning. Når kun et 
begrænset antal dyr i en given dosisgruppe observeres for tegn på 
neurotoksiske virkninger, skal det overvejes at lade de pågældende dyr indgå blandt dem, der udvælges til perfusion. Når undersøgelsen 
udføres i kombination med en toksicitetsundersøgelse med gentagen 
dosering, skal antallet af dyr være tilstrækkeligt til at opfylde målene i begge undersøgelser. Det minimale antal dyr i hver gruppe ved forskellige kombinationer af undersøgelser er givet i tabel 1. Hvis 
der planlægges interimsaflivninger eller restitutionsgrupper til obser ­
vation for toksiske virkningers reversibilitet, persistens eler forsin ­
kede indtræden efter behandling, eller hvis supplerende observationer overvejes, skal antal dyr øges, så der er tilstrækkeligt med dyr til 
rådighed for observation og histopatologisk undersøgelse.
 
1.5.2.  Behandlings- og kontrolgruppe  
Sædvanligvis skal der være mindst tre dosisgrupper og en kontrol ­
gruppe, men hvis andre data ikke giver anledning til at forvente virkning af en gentagen dosis på 1 000 mg/kg kropsvægt/dag, kan 
en grænsetest udføres. Foreligger der ikke egnede data, kan der 
udføres et dosistitreringsforsøg for at lette fastlæggelsen af de doser, der skal anvendes. Bortset fra behandling med teststof skal 
dyrene i kontrolgruppen håndteres på samme måde som dyrene i 
behandlingsgruppen. Anvendes vehikel til administration af teststof ­
fet, skal dyrene i kontrolgruppen modtage vehiklet i den største anvendte volumen.
 
1.5.3.  Kvalitetskontrol  
Det laboratorium, som udfører undersøgelsen, skal fremlægge data, 
som godtgør laboratoriets egnethed til at udføre undersøgelsen og følsomheden af de anvendte metoder. Sådanne data skal dokumen ­
tere evnen til at påvise og, når det er hensigtsmæssigt, kvantificere 
ændringer i de forskellige effektparametre, som anbefales observeret, 
således autonome symptomer, sensorisk reaktionsformåen, gribestyrke af lemmerne og motorisk aktivitet. Oplysninger om kemiske stoffer, som fremkalder forskellige former for neurotoksisk 
respons og kan anvendes som positive kontrolstoffer, findes i henvis ­
ning (2) til (9). Historiske data kan anvendes, hvis den eksperimen ­
telle metode i alt væsentligt er den samme. Jævnlig ajourføring af historiske data anbefales. Når forsøgslaboratoriet på væsentlige 
punkter ændrer udførelsen af forsøget eller procedurerne, skal der 
forelægges nye data, som godtgør metodernes fortsatte følsomhed.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4.  Valg af dosis  
Dosisniveauet vælges under hensyntagen til eventuelle foreliggende 
toksicitets- og kinetikdata for teststoffet og beslægtede stoffer. Det højeste dosisniveau vælges med henblik på at fremkalde neurotok ­
sisk effekt eller tydelig systemisk toksisk effekt. Derefter vælges en 
aftagende række dosisniveauer, som giver mulighed for at påvise en eventuel dosisafhængig respons, og som laveste dosisniveau et niveau, hvor ingen skadelig effekt iagttages (NOAEL). I princippet 
skal dosisniveauerne fastsættes således, at de primære toksiske virk ­
ninger på nervesystemet kan skelnes fra virknigner knyttet til den systemiske toksicitet. I mange tilfælde vil to til tre intervaller være 
optimalt, og ofte må det foretrækkes at tilføje en fjerde behandlings ­
gruppe frem for at operere med meget store intervaller (f.eks. større end en faktor 10) mellem dosisniveauerne. Når der foreligger et rimeligt skøn over den humane eksponering, må også dette tages i 
betragtning.
 
1.5.5.  Grænsetest  
Når et dosisniveau på mindst 1 000 mg/kg kropsvægt/døgn med de 
beskrevne metoder ikke fremkalder observerbar neurotoksisk virk ­
ning, og når heller ikke foreliggende data fra strukturelt og/eller 
metabolisk beslægtede forbindelser giver anledning til at forvente nogen virkning, er et komplet forsøg med tre dosisniveauer ikke nødvendigvis påkrævet. Den forventede eksponering af mennesker 
kan betyde, at der anvendes et højere oralt dosisniveau i grænse ­
forsøget. For andre indgiftsmåder — f.eks. inhalation eller dermal applikation — kan teststoffets fysisk-kemiske egenskaber ofte være bestemmende for det maksimale opnåelige eksponiringsniveau. Til 
brug for en oral akut undersøgelse bør dosis ved grænsetesten være 
mindst2 000 mg/kg.
 
1.5.6  Administration af doserne  
Dyrene doseres med teststoffet dagligt syv dage om ugen i en 
periode af mindst 28 dage; bruges fem-dages dosisregime eller 
kortere eksponeringstid, skal dette begrundes, Administreres test ­
stoffet ved gavage, skal det ske som enkeltdosis med gastrisk sonde eller et passende intubationsrør. Den maksimale væske ­
mængde, som kan indgives ad gangen, afhænger af forsøgsdyret 
størrelse. Dette volumen må højst være 1 ml/100 g kropsvægt. Ved vandige opløsninger kan det dog overvejes at anvende indtil 2 ml/100 g kropsvægt. Bortset fra lokalirriterende eller ætsende stof ­
fer, hvis effekt sædvanligvis forstærkes ved højere koncentration, 
skal variation af testvolumenet minimeres ved at justere koncentra ­
tionen, så volumenet er konstant ved alle dosisniveauer.
 
For teststoffer, som administreres i foderet eller drikkevandet, er det 
vigtigt at sikre, at det pågældende stof i den anvendte mængde ikke griber ind i den normale ernærings- eller vandbalance. Ved indgift af teststoffet i foderet kan stoffet enten gives ved konstant koncentra ­
tion i foderet (ppm) eller ved et konstant dosisniveau i forhold til 
dyrets kropsvægt; den anvendte mulighed skal specificeres. Ved indgift med sonde skal dosis gives på tilsvarende tidspunkt hver dag og efter behov justeres, så dosisniveauet holdes konstant i 
forhold til kropsvægten. Når der som indledning til en langtidsunder ­
søgelse udføres et korttids-toksicitetsforsøg med gentagen dosering, skal der i de to undersøgelser anvendes ensartet foder. Når det i et akut toksicitetsforsøg ikke er muligt at indgive den pågældende 
stofmængde som en enkelt dosis, kan den undtagelsesvis admini ­
streres delt inden for en periode af højst 24 timer.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6. OBSERVATION  
1.6.1.  Hyppighed af observationer og test  
I forsøg med gentagen dosering skal observationsperioden omfatte 
doseringsperioden. I akutte undersøgelser skal iagttages en 14-dages 
efterbehandlingsperiode. For dyr i satellitgrupper, som holdes uden 
eksponering i en efterbehandlingsperiode, skal observationerne lige ­
ledes omfatte denne periode.  
Observationerne skal finde sted tilstrækkelig hyppigt til at maksimere 
sandsynligheden for at påvise eventuelle adfærdsmæssige og/eller neurologiske anomalier. Observationerne skal fortrinsvis finde sted 
på samme tidspunkt hver dag, idet man retter sig efter tidspunktet for 
den forventede maksimale effekt af indgiften. I tabel 2 vises hyppig ­
heden af de kliniske observationer og funktionsprøver. Hvis kinetiske eller andre data fra tidligere undersøgelser viser, at der bør benyttes 
andre tidspunkter til observationer, test eller post-observationsperio ­
der, skal der benyttes en alternativ plan med henblik på at skaffe flest mulige oplysninger. Eventuelle ændringer af planen skal begrundes.
 
1.6.1.1.  Observationer af almindelig sundhedstilstand og mortalitet/morbiditet  
Alle dyr observeres nøje mindst en gang dagligt med hensyn til deres 
almindelige helbredstilstand og to gange dagligt for morbiditet og mortalitet.
 
1.6.1.2.  Detaljerede kliniske observationer  
Der foretages detaljerede kliniske observationer af alle dyr, som er 
udvalgt til dette formål (se tabel 1) én gang inden første eksponering (for at sammenligne gentagne observationer af samme individ) og 
derefter med forskellige intervaller, alt efter undersøgelsens varighed 
(se tabel 2). Ved restitutionsperiodens slutning foretages detaljerede kliniske observationer af satellit-restitutionsgrupperne. Detaljerede 
kliniske observationer finder sted uden for opholdsburet på en 
»open field«. Observationerne registreres nøje med brug af bedøm ­
melsessystemer, der omfatter kriterier eller bedømmelsesskalaer for hver af de til observationerne hørende målinger. De anvendte krite ­
rier eller skalaer skal være tydeligt fastlagt af testlaboratoriet. Der 
skal drages omsorg for at sikre, at variationerne i forsøgsbetingel ­
serne er mindst mulige (ikke systematisk behandlingsrelaterede) og at observationerne foretages af faguddannede observatører, som er 
uden viden om den pågældende behandling.
 
Det anbefales, at observationerne udføres på struktureret måde, 
således at veldefinerede kriterier (herunder definition af »normal ­
området«) systematisk finder anvendelse på hvert dyr på hvert obser ­
vationstidspunkt. »Normalområdet« skal være veldokumenteret. Alle observerede tegn skal registreres. Også størrelsesordenen af de obser ­
verede tegn registreres, mår det er muligt. De kliniske observationer 
skal omfatte, men er ikke begrænset til, ændringer i hud, skin, øjne, 
slimhinder, optræden af sekretion og ekskretion samt autonom akti ­
vitet (f.eks. tåreflåd, pilorektion, pupilstørrelse, usædvanligt respira ­
tionsmønster og/eller mundrespiration, eventuelle symptomer 
vedrørende vandladning eller defækation, samt farveforandringer af 
urinen).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Eventuel usædvanlig respons med hensyn til kropsstilling, aktivitets ­
niveau (f.eks nedsat eller øget udforskning af »open field«) og 
koordinering af bevægelser registreres ligeledes. Ændringer i gangen (f.eks vralten, ataksi), stilling (f.eks. pukkelrygget) og reaktion på håndtering samt optræden af kloniske eller toniske bevæ ­
gelser, kramper eller tremor, stereotypier (f.eks. overdreven pleje af 
pels, usædvanlige bevægelser af hovedet, gentagne cirkelbevægelser) eller bizar adfærd (bidning eller overdreven slikning, selvmutilering, baglæns gang, vokalisation) eller aggression protokolleres.
 
1.6.1.3.  Funktionsprøver  
I lighed med de detaljerede kliniske observationer skal funktions ­
prøver udføres én gang før eksponering og derefter hyppigt for 
alle dyr, der er udvalgt til dette formål (se tabel 1). Hyppigheden af funktionsprøverne fastsættes ligeledes i henhold til undersøgelsens varighed (se tabel 2). Ud over de i tabel 2 angivne observations ­
perioder foretages observation af satellit-restitutionsgrupper så tæt 
som muligt på tidspunktet for den afsluttende aflivning. Funktions ­
prøverne skal omfatte sensorisk reaktionsformåen på forskellige stimuli (f.eks auditive, visuelle og proprioceptive (5)(6)(7)), bedøm ­
melse af lemmernes gribestyrke (8) samt bedømmelse af motorisk 
aktivitet (9). Den motoriske aktivitet måles med en automatiseret anordning, som kan registrere både fald og stigning i aktivitet. Anvendes et andet system, skal dette være kvantitativt, og dets 
følsomhed og pålidelighed skal være godtgjort. Hver anordning 
skal afprøves for at sikre varig pålidelighed af og overensstemmelse mellem anordningerne. Nærmere detaljer om de fremgangsmåder, der kan benyttes, er givet i de pågældende litteraturhenvisninger. Hvis 
der ikke er data, som peger på potentielle neurotoksiske virkninger 
(f.eks. vedrørende struktur-aktivitet, epidemiologiske data, andre toksikologiundersøgelser), må man overveje mere specialiserede test af sensoriske og motoriske funktioner eller indlæring og hukom ­
melse for at undersøge disse mulige virkninger i nærmere detaljer. 
Nærmere oplysninger om specialiserede test og deres anvendelse er givet i (1).
 
Undtagelsesvis kan man i den pågældende test udelade dyr, som 
viser tegn på toksicitet af et omfang, som vil forstyrre funktions ­
testen væsentligt. Elimination af dyr fra en funktionstest skal begrun ­
des. 
1.6.2.  Kropsvægt og foder-/vandindtagelse  
I undersøgelser af indtil 90 dages varighed skal alle dyr vejes mindst 
én gang om ugen, og ligeledes mindst én gang om ugen måles foderindtagelsen (vandindtagelsen, når teststoffet administreres i 
vandet). I langtidsundersøgelser vejes alle dyr mindst én gang om 
ugen i de første 13 uger, derefter mindst én gang hver fjerde uge. Foderindtagelsen (vandindtagelsen, når teststoffet indgives i vandet) måles mindst én gang om ugen de første 13 uger, derefter ca. hver 
tredje måned, medmindre dyrenes sundhedstilstand eller ændringer i 
kropsvægt tilsiger noget andet.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3.  Oftalmologi  
I undersøgelser af længere varighed end 28 dage foretages oftalmo ­
logisk undersøgelse med oftalmoskop eller tilsvarende egnet instru ­
ment inden indgift af teststoffet og ved undersøgelsens slutning, helst 
på alle dyr, men i det mindste på dyr i højdosis- og kontrolgrup ­
perne. Hvis der findes øjenforandringer eller de kliniske symptomer viser, at der er behov derfor, skal alle dyr undersøges. I langtids ­
undersøgelser skal der endvidere foretages en oftalmologisk under ­
søgelse ved 13 uger. Oftalmologisk undersøgelse behøver ikke 
udføres, når sådanne data allerede foreligger fra andre undersøgelser med tilsvarende varighed og dosisniveau.
 
1.6.4.  Hæmatologiske og klinisk-biokemiske prøver  
Når neurotoksicitetsundersøgelsen udføres i kombination med en 
systemisk toksicitetsundersøgelse med gentagen dosering, foretages hæmatologisk undersøgelse og klinisk-biokemiske bestemmelser som 
angivet i den pågældende metode til systemiske toksicitetsforsøg. 
Prøvetagning skal ske således, at en eventuel påvirkning af neuroad ­
færd bliver mindst mulig.
 
1.6.5.  Histopatologi  
Den neuropatologiske undersøgelse skal være udformet, så den 
supplerer og udvider de observationer, der er gjort i undersøgelsens in vivo-fase. Væv fra mindst fem dyr/køn/gruppe (se tabel 1 og 
næste afsnit) fikseres in situ med almindeligt anerkendte perfusions- 
og fiksationsteknikker (se henvisning (3), kapitel 5, og henvisning (4), kapitel 50). Alle makroskopiske forandringer protokolleres. Når undersøgelsen udføres som enkeltstående screening for neurotoksi ­
citet eller til karakterisering af neurotoksiske virkninger, kan de 
resterende dyr enten bruges til specifikke neuroadfærdsmæssige (10) ­
(11), neuropatologiske (10)(11)(12)(13), neurokemiske (10)(11)(14) ­
(15) eller elektrofysiologiske (10)(11)(16)(17) procedurer, som kan 
supplere de her beskrevne procedurer og undersøgelser, eller til at 
øge det antal dyr, som undersøges histopatologisk. Sådanne supple ­
rende procedurer kan være særligt nyttige, når empiriske observa ­
tioner eller forventede virkninger peger på neurotoksicitet af specifik 
art eller med specifikt målorgan (2)(3). Alternativt kan de resterende 
dyr også bruges til rutinemæssig patologisk bedømmelse som beskrevet i metoden til undersøgelser med gentagen dosering.
 
Alle paraffinindstøbte vævsprøver farves med en all-round farve ­
metode som hematoxylin-eosin og undersøges mikroskopisk. Hvis der observeres eller formodes at være tegn på perifer neuropati. 
skal plastindstøbte prøver af perifert nervevæv undersøges. Kliniske 
symptomer kan også give anledning til, at der vælges supplerende prøvetagningssteder eller benyttes specialfarvning. Vejledning om supplerende prøvetagningssteder kan findes i (3)(4). Passende speci ­
alfarvning til påvisning af bestemte typer patologiske forandringer 
kan ligeledes være nyttig (18).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Repræsentative snit af centralnervesystem og det perifere nervesy ­
stem undersøges histologisk (se henvisning (3), kapitel 5 og henvis ­
ning (4), kapitel 50). De undersøgte områder skal normalt omfatte forhjerne, den centrale del af cerebrum, herunder et snit gennem hippocampus, midterhjernen, cerebellum, pons, medulla oblongata, 
øjet med nervus opticus og retina, rygmarven med intumescentia 
cervicalis og lumbalis, de dorsale rodganglier, fibre fra de dorsale og ventrale rødder, den proksimale del af nervus sciaticus, den prok ­
simale del af nervus tibialis (ved knæene) og lægmuskelgrenene af 
nervus tibialis. Der skal være både tværsnit og længdesnit af 
rygmarv og perifere nerver. Man skal være opmærksom på nervesy ­
stemets kar. En prøve af skeletmuskel, helst lægmusklen, skal lige ­
ledes undersøges. Især skal man være opmærksom på celle- og fiber ­
struktur i de dele af centralnervesystem og det perifere nervesystem, 
der særligt påvirkes af neurotoksiske stoffer.
 
Vejledning i de neuropatologiske forandringer, der typisk resulterer 
af toksisk påvirkning, findes i henvisning (3)(4). Trinvis undersø ­
gelse af vævsprøverne anbefales, således at snittene fra højdosisgrup ­
perne først sammenlignes med dem fra kontrolgrupperne. Ses ingen 
neuropatologiske forandringer i prøverne fra disse grupper, er efter ­
følgende analyse unødvendig. Er der neuropatologiske forandringer i højdosisgruppen, skal prøver fra hvert af de potentielt berørte væv 
fra mellem- og lavdosisgrupperne kodes og undersøges sekventielt.
 
Findes der ved den kvalitative undersøgelse tegn på neuropatologiske 
forandringer, udføres endnu en undersøgelse af alle de dele af nerve ­
systemet, som udviser sådanne forandringer. Snit fra alle dosis ­
grupper fra hver af de potentielt berørte regioner kodes og under ­
søges vilkårligt uden kendskab til koden. For hver forandring regi ­
streres dens frekvens og sværhed. Når alle regioner fra alle dosis ­
grupper er blevet bedømt, kan koden brydes og statistisk analyse 
foretages til bedømmelse af dosis-respons-forholdet. For hver 
forandring skal der gives eksempler på beskrivelse af forskellige sværhedsgrader.
 
De neuropatologiske fund bedømmes i sammenhæng med de 
adfærdsmæssige observationer og målinger samt øvrige data fra 
forudgående og sideløbende toksicitetsundersøgelser af teststoffet.  
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Der skal forefindes data for de enkelte dyr. Derudover sammenfattes 
alle data i tabelform med angivelse, for hver forsøgs- og kontrol ­
gruppe, af antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som er 
fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, tids ­
punkt for eventuel død eller humanitær aflivning, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, beskrivelse af de observerede toksici ­
tetstegn, herunder begyndelsestidspunkt, varighed, art og sværhed af 
alle toksiske virkninger, antal dyr, som udviser forandringer, 
herunder forandringernes art og sværhed.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
Undersøgelsens fund bedømmes med hensyn til forekomst, sværhed 
og korrelation mellem neuroadfærdsmæssige og neuropatologiske virkninger (foruden neurokemiske og elektrofysiologiske virkninger, 
når supplerende undersøgelser indgår) samt eventuelle andre obser ­
verede negative virkninger. Når det er muligt, bedømmes resultaterne ved en egnet og almindeligt anerkendt statistisk metode. Valg af statistisk metode skal finde sted i forbindelse med fastlæggelsen af 
undersøgelsens design.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
For teststoffet:  
— fysisk beskaffenhed (herunder isomeri, renhed og fysisk-kemisk 
egenskaber)  
— identifikationsdata.  
For eventuelt vehikel:  
— begrundelse for valg af vehikel.  
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte art/stamme  
— dyrenes antal, alder og køn  
— oprindelse, opstaldning, foder, osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse.  
For forsøgsbetingelserne:  
— oplysninger om formuleringen af teststof/fodertilberedning, 
opnået koncentration, tilberedningens stabilitet og homogenitet  
— specifikation af de indgivne doser, herunder enkeltheder 
vedrørende vehiklet, volumen og fysisk tilstand af det indgivne materiale
 
— oplysninger om administration af teststoffet  
— begrundelse for de valgte dosisniveauer  
— begrundelse for administrationsvej og eksponeringens varighed  
— i givet fald, omregning fra teststofkoncentration i 
foder/drikkevand (ppm) til opnået dosis (mg/kg kropsvægt/døgn)  
— enkeltheder vedrørende foderets og vandets kvalitet.  
For observationer og testprocedurer:  
— enkeltheder vedrørende tilordningen af dyrene i hver gruppe til 
perfusionsundergrupper  
— enkeltheder vedrørende bedømmelsessystemet, herunder kriterier 
og bedømmelsesskalaer for hver i de til de detaljerede kliniske 
observationer hørende målinger  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— detaljeret beskrivelse af funktionstest af sensorisk reaktionsfor ­
måen på forskellige stimuli (f.eks. auditive, visuelle og proprio ­
ceptive), til bedømmelse af lemmernes gribestyrke, til vurdering af motorisk aktivitet (herunder enkeltheder vedrørende automati ­
serede anordninger til detektion af aktivitet) samt eventuelle 
andre procedurer, som anvendes
 
— detaljeret beskrivelse af oftalmologiske undersøgelser og, i givet 
fald, hæmatologiske og klinisk biokemiske undersøgelser med 
relevante normalværdier  
— detaljeret beskrivelse af de enkelt neuroadfærdsmæssige, neuro ­
patologiske, neurokemiske og elektrofysiologiske procedurer.  
Resultater:  
— kropsvægt/kropsvægtændringer, herunder kropsvægt ved afliv ­
ning 
— fødeindtagelse og vandindtagelse, når det er relevant  
— data vedrørende toksisk respons for hvert køn og dosisniveau, 
herunder toksicitetstegn og dødelighed  
— art, sværhedsgrad og varighed (indsætten og efterfølgende forløb) 
af detaljerede kliniske observationer (hvad enten disse er rever ­
sible eller ikke)  
— detaljeret beskrivelse af resultaterne af alle funktionstest  
— obduktionsfund  
— detaljeret beskrivelse af resultaterne af alle neuroadfærdsmæssige, 
neuropatologiske og neurokemiske eller elektrofysiologiske fund, 
hvis de foreligger  
— data vedrørende absorption og metabolisme, hvis de foreligger  
— når det er hensigtsmæssigt, statistisk behandling af resultaterne  
Diskussion af resultaterne:  
— oplysninger vedrørende dosis-respons-forhold  
— eventuelle andre toksiske virkningers sammenhæng med en 
konklusion vedrørende teststoffets neurotoksiske potentiale  
— angivelse af NOAEL  
Konklusioner:  
— det anbefales, at der afgives en konkret erklæring om den 
samlede neurotoksicitet af teststoffet.  
4. HENVISNINGER  
(1) OECD Giudance Document on Neorutoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.  
(2) Test Guidline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to 
Chemicals.
 
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds, Williams and Wilkins, Battimore/London.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980), Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999- 
1003.  
(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indu ­
strial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.  
(7) Moser, V.C., McDaniel. K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observa ­
tional Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic, 
Appl, Pharmacol., 108, 267-283.  
(8) 8. Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxi ­
col., 1, 233-236.  
(9) 9. Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., 
Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Inter ­
laboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Impli ­
cation for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol., 13, 599-609.  
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker, New York.  
(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.  
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, 343-352.  
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.
 
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.
 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299-335.
 
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams 
and Wilkins Co.,. Baltimore/London, pp. 726-742.  
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livings ­
tone. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabel 1  
Mindste antal dyr pr. gruppe, når neuroloksicitetsundersøgelsen udføres separat eller i kombination med andre 
undersøgelser  
Neurotoksicitetsundersøgelse udført som: 
Separat undersøgelse Kombineret med 
28-dages forsøg Kombineret med 
90-dages forsøg Kombineret med 
det kroniske 
toksicitetsforsøg  
Samlet antal dyr pr. gruppe 10 hanner og 
10 hunner 10 hanner og 
10 hunner 15 hanner og 
15 hunner 25 hanner og 
25 hunner 
Antal dyr udvalgt til funk ­
tionstestning, herunder detaljerede kliniske obser ­
vationer 10 hanner og 
10 hunner 10 hanner og 
10 hunner 10 hanner og 
10 hunner 10 hanner og 
10 hunner 
Antal dyr udvalgt til perfu ­
sion in situ og neurohistop ­
atologisk undersøgelse 5 hanner og 
5 hunner 5 hanner og 
5 hunner 5 hanner og 
5 hunner 5 hanner og  
5 hunner 
Antal dyr udvalgt til obser ­
vation af toksicitet ved gentagen dosering/subkronisk/kronisk 
forsøg, hæmatologisk 
undersøgelse, klinisk-bioke ­
misk undersøgelse, histop ­
atologisk undersøgelse osv. 
som angivet i de respektive  
Guidelines  5 hanner og 
5 hunner 10 hanner (
 1 ) og 10 
hunner (  1 ) 20 hanner (  1 ) og 
20 hunner (  1 ) 
Eventuelle supplerende 
observationer 5 hanner og 
5 hunner  
( 1 ) Heri indgår fem dyr, som er udvalgt til funktionstestning og detaljerede kliniske observationer som led i neurotoksicitetsund ersø­
gelsen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabel 2  
Hyppighed af kliniske observationer og funktionstest  
Type observationer Undersøgelsens varighed 
Akut 28-dages 90-dages Kronisk  
I alle dyr Generel sund ­
hedstilstand dagligt dagligt dagligt dagligt 
Mortalitet/morbi ­
ditet To gange dagligt To gange dagligt To gange dagligt To gange dagligt 
I dyr, som er 
udvalgt til observa ­
tion af funktioner Detaljerede 
kliniske observa ­
tioner — inden første 
eksponering 
— senest 8 
timer efter 
dosering ved 
det skønnede tidspunkt for maksimal 
effekt 
— på dag 7 og 
14 efter dosering — inden første 
eksponering 
— derefter en 
gang om 
ugen — inden første 
eksponering 
— én gang 
under den 
første eller 
anden uges eksponering 
— derefter en 
gang om 
måneden — inden første 
eksponering 
— én gang efter 
den første 
måneds 
eksponering 
— derefter hver 
tredje måned 
Funktionsprøver — inden første 
eksponering 
— senest 8 
timer efter dosering det 
skønnede 
tidspunkt for maksimal effekt 
— på dag 7 og 
14 efter dosering — inden første 
eksponering 
— under den 
fjerde uges behandling 
så nær 
ekspone­
ringsperio ­
dens slut­
ning som 
muligt — inden første 
eksponering 
— én gang 
under den første eller 
anden uges 
eksponering 
— derefter en 
gang om 
måneden — inden første 
eksponering 
— én gang efter 
den første måneds 
eksponering 
— derefter hver 
tredje måned
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  HUDABSORPTION: IN VIVO-METODE  
1. METODE  
Denne testmetode er ækvivalent med OECD TG 427 (2004).  
1.1. INDLEDNING  
Skønt det for mange kemiske stoffers vedkommende hovedsagelig er 
gennem huden, at eksponering forekommer, anvendes der oral indgift i de fleste toksikologiske undersøgelser i forsøgsdyr. I denne guideline beskrives en in vivo-undersøgelsesmetode for 
perkutan absorption, der danner det bindeled, man behøver for at 
ekstrapolere fra orale undersøgelser og foretage en sikkerhedsvurde ­
ring efter eksponering af huden.
 
For at få adgang til kredsløbet må et stof trænge gennem mange 
cellelag i huden. For de fleste stoffers vedkommende er det hastig ­
hedsbestemmende lag stratum corneum, der består af døde celler. 
Hudens permeabilitet afhænger dels af det kemiske stofs lipofile 
egenskaber, dels af tykkelsen af det yderste lag af epidermis, og dels faktorer som stoffets molekylvægt og koncentration. Hud fra rotter og kaniner er sædvanligvis mere permeabel end hud fra 
mennesker, mens permeabiliteten af hud fra marsvin og aber bedre 
svarer til menneskets.
 
Metoder til måling af perkutan absorption kan inddeles i to katego ­
rier: in vivo og in vitro. In vivo-metoderne er gode til at give oplys ­
ninger om hudabsorptionen i forskellige laboratoriedyrearter. I den senere tid er der udviklet in vitro-metoder. Med dem undersøges 
transporten gennem dyre- eller menneskehud i hel eller partiel 
tykkelse til et væskereservoir. In vitro-metoden er beskrevet i en særskilt testmetode (1). Med henblik på valg af den bedst egnede metode under de givne betingelser anbefales det at støtte sig til 
OECD's Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption 
Studies (2), der nærmere beskriver in vivo- og in vitro-metodernes anvendelighed.
 
Med den her beskrevne in vivo-metode kan prøvestoffets penetration 
gennem huden til det systemiske rum bestemmes. Teknikken har fundet udbredt anvendelse i en længere årrække (3)(4)(5)(6)(7). 
Skønt in vitro-undersøgelser af perkutan absorption i mange tilfælde 
kan være hensigtsmæssige, kan der forekomme situationer, hvor kun et in vivo-forsøg giver de nødvendige oplysninger.
 
Fordelene ved in vivo-metoden er, at der anvendes et fysiologisk og 
metabolisk intakt system, at dyrearten er den samme som i mange toksicitetsundersøgelser, og at metoden kan tilpasses andre dyrearter. Ulemperne er, at der anvendes levende dyr, at der må bruges radio ­
aktivt mærket stof for lettere at skaffe pålidelige resultater, at den 
tidlige absorptionsfase er vanskelig at bestemme, og at permeabili ­
teten af hud fra den foretrukne art (rotte) afviger fra den menne ­
skelige huds. Hud fra dyr er sædvanligvis lettere permeabel, hvilket 
kan medføre overvurdering af den perkutane absorption i mennesker 
(6)(8)(9). Ætsende stoffer bør ikke testes i levende dyr.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. DEFINITIONER  
Uabsorberet dosis : den del af dosis, der vaskes af hudoverfladen 
efter eksponering, og den, der findes på den ikke lukkede afdækning, samt den del, der påvises at forflygtiges fra huden under ekspone ­
ringen.
 
Absorberet dosis (in vivo) : den del af dosis, der er til stede i urin, 
vaskevand fra bure, fæces, udåndingsluft (hvis den måles), blod, væv (hvis dette opsamles) og resten af kadaveret efter fjernelse af huden fra påføringsstedet.
 
Absorberbar dosis , den del af dosis, der er til stede på eller i huden 
efter afvaskning.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Teststoffet, helst radioaktivt mærket, påføres den glatragede hud på 
dyrene i en eller flere passende doseringer i form af en repræsentativ, 
ibrugværende formulering. Testpræparatet efterlades i kontakt med 
huden i et fast tidsrum under en passende afdækning (ikke tillukket, delvis tillukket eller helt tillukket), der forhindrer, at dyret indtager testpræparatet. Når eksponeringstiden er gået, fjernes afdækningen, 
huden renses med passende rengøringsmiddel, afdækning og rengø ­
ringsmaterialer opbevares til analyse, og der anlægges en ny afdæk ­
ning. Før, under og efter eksponeringsperioden holdes dyrene i indi ­
viduelle metabolismebure, og ekskreter og udåndingsluft fra de 
pågældende perioder opsamles til analyse. Opsamling af udåndings ­
luft kan undlades, når der foreligger fyldestgørende oplysninger om, at der slet ikke eller kun i ringe omfang dannes radioaktive metabo ­
litter. Normalt er der i hver undersøgelse flere grupper dyr, der 
eksponeres for testpræparatet. Én gruppe aflives ved udløb af 
eksponeringsperioden. De øvrige grupper aflives efterfølgende efter en fast tidsplan (2). Ved udløb af prøvetagningsperioden aflives de resterende dyr, blod opsamles til analyse, påføringsstedet fjernes til 
analyse, og kadaveret analyseres for eventuelt ikke udskilt stof. 
Prøvernes indhold bestemmes med egnede metoder, og graden af perkutan absorption beregnes (6)(8)(9).
 
1.4. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.4.1.  Valg af dyreart  
Den mest anvendte art er rotten, men der kan også anvendes ubehå ­
rede stammer eller arter med en hudabsorptionsrate bedre svarende 
til menneskets (3)(6)(7)(8)(9). Der benyttes unge voksne, raske dyr 
af samme køn (handyr er standardvalget) af sædvanligt anvendte laboratoriestammer. Ved testens begyndelse må intet dyr afvige mere end ± 20 % fra gennemsnitsvægten. Som eksempel på 
egnede dyr kan nævnes hanrotter på 200 g–250 g, navnlig i 
øverste halvdel af dette område.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Dyrenes antal og køn  
Der skal være en gruppe på mindst fire dyr af samme køn for hvert 
testpræparat og hvert planlagt sluttidspunkt. Hver gruppe dyr aflives efter forskellige tidsrum, f.eks. ved afslutningen af eksponerings ­
perioden (typisk 6 eller 24 timer) og efterfølgende (f.eks. 48 og 72 
timer). Er der påvist væsentlig forskel i hudtoksicitet mellem hanner og hunner, vælges det følsomste køn. I modsat fald vælges enten det ene eller det andet køn.
 
1.4.3.  Miljøbetingelser og fodring  
Temperaturen i forsøgslokalet skal være 22  o C (± 3  o C). Den relative 
luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset 
fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belys ­
ningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Der anvendes sædvanligt laboratoriefoder og fri adgang til 
drikkevand. Under forsøget, og helst også under akklimatiseringen, 
skal dyrene være anbragt enkeltvis i metabolismebure. Risikoen for spild af foder og vand skal nedsættes til det mindst mulige, da man ellers vil få upålidelige resultater.
 
1.4.4.  Forberedelse af dyrene  
Dyrene mærkes, så de kan identificeres enkeltvis, og holdes i burene 
i mindst fem døgn forud for forsøgets begyndelse, for at de kan 
akklimatisere sig til laboratorieomgivelserne.  
Efter akklimatiseringsperioden og ca. 24 timer inden dosering 
glatrages et hudområde omkring skuldre og ryg på hvert dyr. Dette skal ske forsigtigt, så skrabning af huden undgås, da beskadiget hud har andre permeabilitetsegenskaber end intakt hud. Efter glatragning 
og ca. 24 timer før påføring af prøvestoffet på huden (se punkt 1.4.7) 
aftørres huden med acetone for at fjerne talg. Supplerende vask med sæbe og vand frarådes, da eventuelle sæberester kan fremme absorp ­
tionen af teststoffet. Arealet skal have en størrelse, der muliggør en 
pålidelig beregning af den absorberede mængde teststof pr. cm
 2 hud, 
helst mindst 10 cm  2 . Denne arealstørrelse er praktisk mulig på rotter 
med kropsvægt 200-250 g. Efter forberedelse sættes dyrene tilbage i metabolismeburene.
 
1.4.5.  Teststof  
Teststoffet er den enhed, hvis penetrationsegenskaber skal undersø ­
ges. Ideelt bør teststoffet være radioaktivt mærket.  
1.4.6.  Testpræparat  
Testpræparatet (f.eks. ufortyndet, fortyndet eller formuleret materiale, 
der indeholder teststoffet og påføres huden) skal være det samme 
(eller en realistisk erstatning herfor) som det, mennesker eller andre 
potentielle målarter kan blive eksponeret for. Enhver afvigelse fra det »ibrugværende« præparat skal begrundes. Om nødvendigt opløses eller opslæmmes teststoffet i et egnet bærestof. For andre bærestoffer 
end vand skal dets absorptionsegenskaber og potentielle vekselvirk ­
ning med teststoffet være kendt.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  Påføring på huden  
Et påføringssted med et nærmere bestemt overfladeareal afgrænses 
på hudoverfladen. En kendt mængde testpræparat fordeles derefter jævnt på stedet. Sædvanligvis anvendes en mængde svarende til den 
potentielle eksponering af mennesker, typisk 1-5 mg/cm
 2 for faste 
stoffer og indtil 10 μl/cm  2 for væsker. Eventuelle andre mængder 
skal begrundes i de forventede anvendelsesbetingelser, forsøgets målsætning eller testpræparatets fysiske egenskaber. Efter påføring 
beskyttes det behandlede område mod vartning. Figur 1 viser et 
eksempel på en typisk anordning. Sædvanligvis tildækkes påførings ­
stedet med en ikke lukket afdækning (f.eks. permeabel nylongaze). 
Ved påføring af ubegrænsede doser bør påføringsstedet dog være 
tillukket. Når genfindingen af et halvflygtigt på grund af fordamp ­
ning mindskes uacceptabelt (se også punkt 1.4.10, første afsnit), skal det fordampede stof opfanges i et aktivt kulfilter, der dækker 
påføringsanordningen (se figur 1). Det er vigtigt at eventuelle 
sådanne anordninger ikke beskadiger huden, absorberer testpræpa ­
ratet eller reagerer med dette. Dyrene sættes tilbage i hvert sit meta ­
bolismebur med henblik på opsamling af ekskreter.
 
1.4.8.  Varighed af eksponering og prøvetagning  
Eksponeringens varighed er tidsrummet mellem påføring af testpræpa ­
ratet og fjernelse af dette ved afvaskning af huden. Der vælges en eksponeringsperiode (typisk 6 eller 24 timer), som er relevant i forhold 
til forventede eksponeringsvarighed for mennesker. Efter eksponerings ­
perioden holdes dyrene i metabolismeburene indtil den planmæssige afslutning. Dyrene observeres for tegn på toksicitet/unormale reaktioner med regelmæssige mellemrum under hele forsøget. Ved afslutningen af 
eksponeringsperioden observeres den behandlede hud for synlige tegn 
på irritation.
 
Metabolismeburene skal muliggøre separat opsamling af urin og 
fæces under hele undersøgelsen. Desuden skal de muliggøre opsam ­
ling af  14 C-carbondioxid og flygtige  14 C-carbonforbindelser, som 
analyseres hvis de dannes i en mængde af over 5 %. Urin, fæces 
og udskilte væsker (f.eks.  14 C-carbondioxid og flygtige C-forbindel ­
ser) opsamles individuelt fra hver gruppe på hvert prøvetagningstids ­
punkt. Åbne bure kan anvendes, hvis det er tilstrækkeligt dokumen ­
teret, at der kun i ringe omfang eller slet ikke dannes radioaktive 
metabolitter.  
Ekskreter opsamles i eksponeringsperioden indtil 24 timer efter den 
indledende hudkontakt og derefter dagligt til forsøgets slutning. Normalt vil tre opsamlingstidspunkter for ekskreter være tilstrække ­
ligt, men testpræparatets påtænkte formål eller foreliggende kinetiske 
data kan tilsige, at andre tidspunkter vil være mere hensigtsmæssige, 
eller at de må suppleres.
 
Ved eksponeringsperiodens slutning aftages beskyttelsesanordningen 
fra hvert dyr og opbevares separat med henblik på analyse. Den behandlede hud fra alle dyr vaskes mindst tre gange med rengørings ­
middel og passende servietter. Der skal vises omhu for at undgå 
kontaminering af andre dele af kroppen. Rengøringsmidlet skal 
være repræsentativt for sædvanlig hygiejnepraksis, f.eks. sæbevand. Endelig skal huden tørres. Alle servietter og alt vaskevand opbevares med henblik på analyse. På dyr i grupperne svarende til efterføl ­
gende tidspunkter anlægges en frisk afdækning til at beskytte det 
behandlede sted, hvorefter dyrene sættes tilbage i hvert sit bur.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Afsluttende procedurer  
For hver gruppe aflives de enkelte dyr på det fastsatte tidspunkt, og 
blod opsamles til analyse. Beskyttelsesanordning eller afdækning fjernes med henblik på analyse. Huden fra påføringsstedet og et 
tilsvarende areal af ikke-doseret, glatraget hud fjernes fra hvert dyr 
til separat analyse. For at skaffe flere oplysninger om teststoffets fordeling kan påføringsstedet spaltes, så stratum corneum adskilles fra det underliggende epidermis. Fastlæggelse af denne fordelings 
tidsmæssige forløb efter eksponeringsperioden vil give et fingerpeg 
om teststoffets skæbne i stratum corneum. For at lette spaltningen af huden (efter den endelige hudvask og aflivning af dyret) fjernes hver 
afdækning. Huden fra påføringsstedet eksciseres fra rotten sammen 
med det ringformede parti af omgivende hud og hæftes op på en plade. Et stykke tape lægges på hudoverfladen med et let tryk, og tapen fjernes sammen med en del af stratum corneum. Der fortsættes 
med flere tapestykker, indtil tapen ikke længere hænger fast i 
hudoverfladen, når hele stratum corneum er fjernet. Alle tapestykker fra hvert dyr kan lægges i en enkelt beholder, som derefter tilsættes et vævsopløsende middel for at opløse stratum corneum. Alle poten ­
tielle målvæv kan fjernes med henblik på separat bestemmelse, før 
resten af kadaveret analyseres for absorberet dosis. Kadaveret af hvert enkelt dyr opbevares til analyse. Sædvanligvis vil analyse af det totale indhold være tilstrækkelig. Målorganer kan udtages til 
separat analyse (hvis det tilsiges af andre undersøgelser). Blærens 
indhold af urin på det planmæssige aflivningstidspunkt hældes sammen med den foregående urinopsamling. Efter at ekskreterne fra metabolismeburene på det planmæssige aflivningstidspunkt er 
opsamlet, vaskes burene og deres opsamlingsanordning med et 
passende opløsningsmiddel. Andet potentielt kontamineret udstyr analyseres ligeledes.
 
1.4.10.  Analyse  
I alle undersøgelser skal opnås tilstrækkelig genfinding (dvs. 
gennemsnitligt 100 ± 10 % af radioaktiviteten). Er genfindingen 
uden for dette område, skal det begrundes. Den tilførte mængde 
dosis i hver prøve bestemmes med behørigt validerede metoder.  
I de statistiske overvejelser skal indgå et mål for variansen mellem 
gentagelserne for hver påføring.  
2. DATA  
Følgende målinger foretages for hvert dyr på hvert prøvetagnings ­
tidspunkt af teststoffet og/eller dets metabolitter. Foruden individu ­
elle data angives gennemsnitsværdier for hvert prøvetagningstids ­
punkt.  
— den mængde, der er knyttet til beskyttelsesanordningerne  
— den mængde der kan fjernes fra huden  
— den mængde i eller på huden, der ikke kan vaskes af huden  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— mængde i de udtagne blodprøver  
— mængde i ekskreter og udåndingsluft (hvis relevant)  
— resterende mængde i kadaveret og eventuelle organer, der er 
udtaget til separat analyse.  
Ud fra mængden af teststof og/eller metabolitter i ekskreter, udån ­
dingsluft, blod og kadaver kan den totale absorberede mængde på 
hvert tidspunkt bestemmes. Desuden kan man beregne mængde test ­
stof absorberet pr. cm  2 hud, der er eksponeret for teststoffet i 
eksponeringsperioden.  
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal dække de krav, der er fastsat i protokollen, 
herunder en begrundelse for det anvendte testsystem, og skal 
omfatte følgende:  
Teststof:  
— identifikationsdata (f.eks. CAS-nummer, hvis det foreligger, 
oprindelse, renhed (radiokemisk renhed), kendte urenheder, batchnummer)
 
— fysisk form, fysiske-kemiske egenskaber (f.eks. pH, flygtighed, 
opløselighed, stabilitet, molekylvægt og log P  ow ). 
Testpræparat:  
— formulering og begrundelse for dens anvendelse  
— nærmere oplysninger om testpræparatet: anvendt mængde, opnået 
koncentration, bærestof, stabilitet og homogenitet.  
Forsøgsdyr:  
— den anvendte art/stamme  
— dyrenes antal, alder og køn  
— dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved forsøgets begyndelse og slutning.  
Forsøgsbetingelser:  
— nærmere oplysninger om administration af testpræparatet 
(påføringssted, assaymetoder, tillukket/ikke tillukket, volumen, ekstraktion, påvisning)
 
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet.  
Resultater:  
— eventuelle tegn på toksicitet  
— absorptionsdata i tabelform (udtrykt som hastighed, mængde eller 
procentdel)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— totale genfindingsværdier i forsøget  
— fortolkning af resultater, sammenholdelse med eventuelle forelig ­
gende oplysninger om perkutan absorption af teststoffet.  
Diskussion af resultater  
Konklusioner  
4. HENVISNINGER  
(1) Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method.  
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph 
No. 20.  
(4) Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements. J. Am. Coll. Toxicol. 8(5), 829-835.
 
(5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
(6) EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and 
Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
 
(7) EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances.  
(8) Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28, 369-373.  
(9) Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some 
organic compounds through the skin in man. J. Invest Dermatol. 54, 399-404.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Figur 1  
Eksempel på typisk anordning til afgrænsning og beskyttelse af påføringsstedet på 
huden ved in vivo-undersøgelser af perkutan absorption
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  HUDABSORPTION: IN VITRO-METODE  
1. METODE  
Denne testmetode er ækvivalent med OECD TG 428 (2004).  
1.1. INDLEDNING  
Metodens formål er undersøgelse af teststoffers absorption ved 
påføring af disse på eksciseret hud. Den kan enten kombineres med metoden til hudabsorption in vivo (1) eller anvendes separat. Vedrørende udformningen af undersøgelser baseret på denne testme ­
tode anbefales det at konsultere OECD's vejledning »Guidance 
Document for the Conduct of Skin Absorption Studies« (2). OECD's vejledning er udarbejdet for at lette valget af egnede in vitro-metoder til anvendelse under nærmere bestemte omstændig ­
heder og derigennem sikre pålideligheden af de resultater, der fås 
ved brug af metoden.
 
Metoder til måling af hudabsorption og afgivelse til huden kan 
inddeles i to kategorier: in vivo og in vitro. In vivo-metoder til hudabsorptionsundersøgelser er veletablerede og giver farmakokine ­
tiske oplysninger i en række dyrearter. En in vivo-metode er 
beskrevet særskilt i en anden testmetode (1). Også in vitro-metoder 
er i mange år blevet anvendt til måling af hudabsorption. Skønt der ikke er udført formelle valideringsundersøgelser af de in vitro-meto ­
der, der er omfattet af denne testmetode, var OECD-eksperter i 1999 
enige om, at in vitro-metoden (3) var tilstrækkeligt underbygget med 
evaluerede data. I vejledningen (2) underbygges metoden yderligere, bl.a. med et betydeligt antal direkte sammenligninger af in vitro- og in vivo-metoder. Emnet er gennemgået i en række monografier, hvor 
der detaljeret redegøres for baggrunden for anvendelse af en in vitro- 
metode (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). Med in vitro-metoder måles diffusionen af kemiske stoffer ind i og tværs gennem hud til en væskebeholder, idet der enten kan bruges ikke-levende hud og 
således alene måles diffusion, eller frisk, metabolisk aktiv hud til 
måling af både diffusion og hudmetabolisme. Sådanne metoder har især fundet anvendelse til screening af kemiske stoffers indtrængen i og optagelse gennem hud fra forskellige formuleringer og kan 
desuden være nyttige som modeller ved vurdering af perkutan 
absorption i mennesker.
 
In vitro-metoden er ikke nødvendigvis anvendelig på alle situationer 
eller på alle klasser af kemiske stoffer. In vitro-metoden kan være brugbar til indledende kvalitativ evaluering af hudpenetration. I visse tilfælde kan det være nødvendigt efterfølgende at supplere med in 
vivo-data. Med henblik på nærmere fastlæggelse af situationer, hvor 
in vitro-metoden vil være egnet, henvises til vejledningen (2). Mere detaljerede oplysninger til støtte for denne afgørelse findes i (3).
 
I beskrivelsen af denne metode redegøres for generelle principper for 
måling af teststoffers absorption af og afgivelse til eksciseret hud. Der kan anvendes hud fra mange pattedyrarter, herunder mennesker. Hudens permeabilitetsegenskaber bevares efter ekscision fra kroppen, 
da den vigtigste diffusionsbarriere er det ikke-levende stratum 
corneum; der ikke er fundet aktiv transport af kemiske stoffer gennem huden. Skønt huden er påvist at kunne metabolisere visse kemiske stoffer under perkutan absorption (6), er processen er ikke 
hastighedsbegrænsende for den faktisk absorberede dosis, selv om 
den kan påvirke arten af de stoffer, der træder ind i blodet.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. DEFINITIONER  
Uabsorberet dosis:  den del af dosis, der vaskes af hudoverfladen 
efter eksponering, og den, der findes på den ikke lukkede afdækning, samt den del, der påvises at forflygtiges fra huden under ekspone ­
ringen.
 
Absorberet dosis (in vitro):  massen af teststof, der tilføres recep ­
torvæsken eller det systemiske kredsløb inden for et nærmere fastlagt tidsrum.
 
Absorberbar dosis (in vitro):  den del af dosis, der er til stede på 
eller i huden efter afvaskning.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Teststoffet, som kan være radioaktivt mærket, påføres på overfladen 
af en hudprøve, der danner adskillelse mellem de to kamre i en 
diffusionscelle. Stoffet efterlades på huden i et fastlagt tidsrum 
under nærmere angivne betingelser, hvorefter det fjernes med en passende rensningsmetode. Der udtages prøver af receptorvæsken på tidspunkter fordelt over hele forsøget, og prøverne analyseres 
for teststoffet og/eller dets metabolitter.
 
Anvendes metabolisk aktive systemer, kan teststoffets metabolitter 
analyseres med egnede metoder. Ved forsøgets slutning bestemmes den kvantitative fordeling af teststoffet og dets metabolitter, når det 
er relevant.
 
Under passende betingelser, der er beskrevet i denne metode og i 
vejledningen (2), måles teststoffets absorption i løbet af et givet tidsrum ved analyse af receptorvæsken og den behandlede hud. Test ­
stof, der er tilbageblevet i huden, anses for absorberet, medmindre 
det kan vises at absorptionen kan bestemmes alene ud fra værdier for receptorvæsken. Efter analyse af de øvrige komponenter (materiale vasket af huden og materiale tilbageholdt i hudlagene) kan der fore ­
tages en nærmere vurdering af data, herunder teststoffets totale 
fordeling og genfindingsprocent.
 
For at godtgøre testsystemets ydeevne og pålidelighed, således som 
det anvendes i det pågældende laboratorium, skal der for relevante 
referencestoffer foreligge resultater, som udviser overensstemmelse med offentliggjort litteratur om den anvendte metode. Dette krav kan tænkes opfyldt ved test af et passende referencestof (fortrinsvis 
med lipofile egenskaber, der ligner teststoffets) sideløbende med 
teststoffet eller ved fremlæggelse af fyldestgørende historiske data for en række referencestoffer med forskellige lipofile egenskaber (f.eks. koffein, benzoesyre og testosteron).
 
1.4. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.4.1.  Diffusionscelle  
En diffusionscelle består af et donorkammer og et receptorkammer, 
hvorimellem huden anbringes (en typisk udformning er vist i figur 1). Cellen skal slutte tæt omkring huden og skal lette prøvetagning fra og opblanding af receptoropløsningen, som er i kontakt med 
undersiden af huden, og skal derudover give gode muligheder for 
temperaturregulering af cellen og dens indhold. Både statiske diffu ­
sionsceller og gennemstrømningsceller kan godtages. Donorkam ­
meret er sædvanligvis utillukket under eksponering for en endelig 
dosis af testpræparatet, men kan være tillukket ved ubegrænsede 
doser og ved visse scenarier med endelig dosis.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Receptorvæske  
En receptorvæske af fysiologisk karakter må foretrækkes, men også 
væske af anden art kan anvendes, når dette begrundes. Receptorvæ ­
skens nøjagtige sammensætning skal angives. Det skal godtgøres, at 
teststoffet er tilstrækkelig opløseligt i receptorvæsken, så denne ikke 
virker som en barriere for absorptionen. Desuden må receptorvæsken ikke påvirke hudpræparatets integritet. I gennemstrømningssystemer må gennemstrømningshastigheden ikke være sådan, at den hæmmer 
teststoffets diffusion til receptorvæsken. I systemer med statisk celle 
skal væsken være under konstant omrøring, og der skal regelmæssigt tages prøver af væsken. Undersøges metabolismen, skal receptorvæ ­
sken kunne holde huden levende under hele forsøget.
 
1.4.3.  Hudpræparater  
Hud fra mennesker eller dyr kan anvendes. Det anerkendes, at 
brugen af human hud er underlagt nationale og internationale etiske hensyn og betingelser. Levende hud må foretrækkes, men 
også ikke-levende hud kan anvendes, forudsat at hudens integritet 
kan godtgøres. Såvel membraner bestående af epidermis (fraspaltet ad enzymatisk, termisk eller kemisk vej) som delhudspræparater 
(tykkelse typisk 200-400 μm) fremstillet med dermatom, kan 
godtages. Hud i fuld tykkelse kan anvendes, men for stor tykkelse (> ca. 1 mm) må undgås, medmindre det specielt er nødvendigt til bestemmelse af teststoffet i hudens forskellige lag. Den valgte art, 
anatomiske placering og præparationsteknik skal begrundes. 
Der kræves acceptable data fra mindst fire gentagelser for hvert testpræparat.
 
1.4.4.  Hudpræparatets integritet  
Korrekt præparation af huden er afgørende. Ved uhensigtsmæssig 
håndtering kan stratum corneum blive beskadiget, hvorfor integri ­
teten af den præparerede hud må kontrolleres. Undersøges hudmeta ­
bolisme, skal huden anvendes snarest muligt efter excisionen og ved 
betingelser, der vides at støtte den metaboliske aktivitet. Som hoved ­
regel skal nyeksciseret hud anvendes inden for 24 timer, men den acceptable opbevaringsperiode kan afhænge af det enzymsystem, der deltager i metaboliseringen, samt af opbevaringstemperaturen (13). 
For hudpræparater, der har været opbevaret inden brug, skal der 
forelægges dokumentation for, at barrierefunktionen er bevaret.
 
1.4.5.  Teststof  
Teststoffet er den enhed, hvis penetrationsegenskaber skal undersø ­
ges. Ideelt bør teststoffet være radioaktivt mærket.  
1.4.6.  Testpræparat  
Testpræparatet (f.eks. ufortyndet, fortyndet eller formuleret materiale, 
der indeholder teststoffet og påføres huden) skal være det samme (eller en realistisk erstatning herfor) som det, mennesker eller andre 
potentielle målarter kan blive eksponeret for. Enhver afvigelse fra det 
»ibrugværende« præparat skal begrundes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  Teststoffets koncentration og formuleringer  
Normalt anvendes flere koncentrationer af teststoffet, således at over ­
grænsen for potentiel eksponering af mennesker er inkluderet. Tilsvarende må det overvejes at teste en række typiske 
formuleringer.
 
1.4.8.  Påføring på huden  
Når mennesker eksponeres for kemiske stoffer, er der sædvanligvis 
tale om endelige doser. For at påføringen skal modsvare forholdene ved eksponering af mennesker, skal der således normalt anvendes 1- 
5 mg/cm
 2 hud for faste stoffer og indtil 10 μl/cm  2 for væsker. 
Mængden skal være begrundet i de forventede anvendelsesbetingel ­
ser, undersøgelsens målsætning eller testpræparatets fysiske egenska ­
ber. F.eks. kan påføringen på hudoverfladen svare til »ubegrænset«, 
når der anvendes et stort volumen pr. arealenhed.  
1.4.9.  Temperatur  
Kemiske stoffers passive diffusion (og dermed deres hudabsorption) 
er temperaturafhængig. Diffusionskammeret og huden skal holdes ved konstant temperatur tæt på den normale hudtemperatur på 32 ± 1
 o C. Forskellige cellekonstruktioner kræver forskellig temperatur 
af vandbad eller varmeplade for at sikre, at receptor/hud er i det 
fysiologiske normalområde. Fugtigheden skal helst være mellem 30 og 70 %.
 
1.4.10.  Varighed af eksponering og prøvetagning  
Eksponeringen af huden for testpræparatet kan strække sig over hele 
forsøgets varighed eller over kortere tid (med henblik på efterligning 
af en given type human eksponering). Overskydende testpræparat 
vaskes af huden med et passende rengøringsmiddel, og vaskevandet opsamles til analyse. Fremgangsmåden ved fjernelse af testpræparatet bør afhænge af de forventede anvendelsesbetingelser og skal begrun ­
des. Normalt kræves en prøvetagningsperiode på 24 timer for at få 
en fyldestgørende karakterisering af absorptionsprofilen. Da hudens integritet kan begynde at forringes efter 24 timer, bør prøvetagnings ­
tidspunkterne normalt ikke strække sig ud over 24 timer. Så lang en 
periode er ikke nødvendigvis påkrævet for teststoffer, der hurtigt 
trænger gennem huden, men til testning af langsomt penetrerende teststoffer kan længere tid behøves. Prøvetagning fra receptorvæsken skal ske med en frekvens, der gør det muligt at optegne en kurve 
over teststoffets absorptionsprofil.
 
1.4.11.  Afsluttende procedurer  
Alle testsystemets komponenter analyseres, og genfindingsgraden 
bestemmes. Det gælder donorkammer, skyllevand til hudoverflade, hudpræparat og receptorvæske/-kammer. I nogle tilfælde kan huden opdeles i det eksponerede hudareal og hudarealet under celleflangen, 
samt i fraktioner bestående af stratum corneum, epidermis og dermis, 
som analyseres hver for sig.
 
1.4.12.  Analyse  
I alle undersøgelser skal opnås tilstrækkelig genfinding (målet bør 
være et gennemsnit på 100 ± 10 % af radioaktiviteten, og eventuel afvigelse herfra skal begrundes). Teststofindhold i receptorvæske, 
hudpræparat, vaskevand fra hudoverfladen og skyllevand fra appa ­
raturet bestemmes med en egnet metode.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. DATA  
Der redegøres for analysen af receptorvæsken, teststoffets fordeling i 
testsystemet, og absorptionsprofilens sammenhæng med tiden. Når der eksponeres ved betingelser svarende til en begrænset dosis, beregnes 
mængde vasket af huden, mængde bundet til huden (og til de forskel ­
lige hudlag, hvis disse analyseres) samt mængde i receptorvæsken (hastighed og mængde eller procentdel af påført dosis). Hudabsorption kan undertiden udtrykkes alene med receptorvæskedata. Når der er 
teststof tilbage i huden ved slutningen af undersøgelsen, kan det dog 
være nødvendigt at medregne det i den samlede absorberede mængde (se punkt 66 i henvisning (3)). Når der eksponeres med ubegrænset 
dosis, kan data gøre det muligt at beregne en permeabilitetskonstant 
(Kp). I så fald er den absorberede procentdel ikke relevant.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal dække de krav, der er fastsat i protokollen, 
herunder en begrundelse for det anvendte testsystem, og skal omfatte følgende:
 
Teststof:  
— fysisk form, fysisk-kemiske egenskaber (i det mindste molekyl ­
vægt og log P  ow ), renhed (radiokemisk renhed)  
— identifikationsoplysninger (f.eks. batchnummer)  
— opløselighed i receptorvæske.  
Testpræparat:  
— formulering og begrundelse for dens anvendelse  
— homogenitet.  
Forsøgsbetingelser:  
— kilder og hudområde, præparationsmetode, opbevaringsbetin ­
gelser inden brug, eventuel forbehandling (rengøring, antibiotisk behandling osv.), målinger af hudintegritet, metabolisk status, begrundelse for valget
 
— cellens udformning, receptorvæskens sammensætning, receptor ­
væskens gennemstrømningshastighed eller prøvetagningstids ­
punkter og -metoder  
— nærmere oplysninger om påføring af testpræparatet og kvantifi ­
cering af den påførte dosis  
— eksponeringens varighed  
— nærmere beskrivelse af fjernelsen af testpræparatet fra huden, 
f.eks. skylning af huden  
— nærmere beskrivelse af hudanalyse og eventuelle fraktionerings ­
teknikker, der anvendt til at vise fordelingen i huden  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— metoder til vask af celle og udstyr  
— assaymetoder, ekstraktionsteknikker, detektionsgrænser og vali ­
dering af analysemetoder.  
Resultater:  
— totale genfindingsværdier i forsøget (påført dosis ≡ 
hudvaskevand + hud + receptorvæske + vand fra celleskylninger)  
— tabeller over genfindingen i hver af disse afdelinger  
— absorptionsprofil  
— absorptionsdata i tabelform (udtrykt som hastighed, mængde eller 
procentdel).  
Diskussion af resultaterne  
Konklusioner  
4. REFERENCER  
(1) Testmetode B.44. Hudabsorption: in vivo-metode.  
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
 
(4) Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton.  
(5) Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro  Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237-241.
 
(6) Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro  Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC 
Press, Boca Raton.  
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, 
ECETOC, Brussels.  
(8) Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd 
ChemTox, 37, 191-205.
 
(9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
(10) Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al.  (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
(11) Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
(12) Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
(13) Jewell, C, Heylings, J.R., Clowes, H.M. And Williams, F.M. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitroch ­
lorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356-365.  
Figur 1  
Eksempel på typisk udformning af statisk diffusionscelle til in vitro-undersøgelse 
af perkutan absorption
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IN VITRO-HUDIRRITATION: TESTMETODE MED 
REKONSTRUERET HUMAN EPIDERMIS  
INDLEDNING  
1. Hudirritation defineres som fremkomsten af reversible hudskader efter 
påføring af testkemikalie i op til 4 timer [som defineret i FN's globale 
harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS) og Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 16. december 2008 om klassificering, mærkning og embal ­
lering af stoffer og blandinger (1) (3)]. Denne testmetode (TM) omfatter en 
in vitro-procedure, som kan anvendes til fareidentifikation af lokalirriterende stoffer (stoffer og blandinger) i kategori 2 ifølge FN GHS og EU CPL (1) (2) (3). I EU og andre regioner, der ikke har indført den valgfrie kategori 3 
ifølge FN GHS (milde lokalirriterende stoffer), kan denne TM også 
anvendes til at identificere ikkeklassificerede stoffer, dvs. stoffer i FN GHS og EU CLP »Ingen kategori« (1) (3). Denne TM kan anvendes til 
at bestemme stoffers hudirritation og udgøre en selvstændig erstatningstest 
for in vivo-testning for hudirritation i en trindelt testningsstrategi (4) og kapitel B.4 i dette bilag).
 
2. Vurderingen af hudirritation har typisk omfattet brug af forsøgsdyr [OECD 
Test Guideline 404, kapitel B.4 i dette bilag] (4). Af hensyn til dyrevel ­
færden blev B.4 revideret i 2004 og giver nu mulighed for at bestemme 
hudætsning/hudirritation ved hjælp af en trindelt teststrategi, der består af validerede in vitro- eller ex vivo-metoder, hvorved det undgås, at dyr udsættes for smerter og lidelser. Der er blevet vedtaget tre in 
vitro-testmetoder — OECD Test Guidelines 430, 431 og 435 (5) (6) (7) 
— hvoraf to er indføjet som kapitel B.40 og B.40a i dette bilag, som er relevante for ætsningsdelen af den trindelte teststrategi beskrevet i B.4 eller 
OECD Test Guideline 404 (4).
 
3. Denne TM's endepunkt for menneskers sundhed er hudirritation. Den 
bygger på rekonstrueret human epidermis (RhE), som på grund af dets overordnede udformning (brug af humant afledte ikketransformerede epider ­
miskeratinocytter som cellekilde og brug af repræsentativt væv og cellear ­
kitektur) ret nøje efterligner de biokemiske og fysiologiske egenskaber i de 
øvre dele af menneskers hud, dvs. epidermis. Denne TM rummer også et sæt ydeevnestandarder (tillæg 2) til brug for vurdering af lignende og 
modificerede RhE-baserede metoder udviklet af Europæiske Center for 
Validering af Alternative Metoder (ECVAM) (8) i overensstemmelse med principperne i OECD Guidance Document No. 34 (9).
 
4. Der er tre validerede metoder, der følger denne TM. En in vitro-testmetode, 
hvor der benyttes en RhE-model, som forhandles under betegnelsen 
EpiSkin  TM (den validerede referencemetode — VRM), har været underka ­
stet prævaliderings-, optimerings- og valideringsundersøgelser (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20). To andre in vitro-RhE-metoder til testning af hudirritation, som fås i handelen, har vist samme resultater som 
VRM-metoden i en validering baseret på ydeevnestandarder (21), nemlig 
EpiDerm
 TM SIT (EPI-200)- og SkinEthic  TM RHE-metoderne (22).  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Inden en foreslået lignende eller modificeret in vitro-RhE-metode ud over 
VRM-, EpiDerm  TM SIT (EPI-200)- eller SkinEthic  TM RHE-metoderne kan 
benyttes i forbindelse med lovgivningen, skal dens pålidelighed og relevans (nøjagtighed) og grænserne for dens påtænkte anvendelse bestemmes, så det er sikkert, at den på de punkter er sammenlignelig med VRM-metoden, og 
det skal ske i overensstemmelse med ydeevnestandarderne i denne TM 
(tillæg 2). Det anbefales desuden at konsultere OECD's baggrundsdokument om in vitro-testning for hudirritation inden udvikling og validering af en lignende eller modificeret in vitro-RhE-metode og fremlæggelse af lovfor ­
slag til vedtagelse (23).
 
DEFINITIONER  
6. De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.  
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER  
7. Der er en begrænsning for TM'en, som påvist i valideringsundersøgelsen 
(16), nemlig at den ikke giver mulighed for klassificering af kemikalier i 
den valgfrie kategori 3 ifølge FN GHS (milde lokalirriterende stoffer) (1). Når den benyttes som en delvis erstatningstest, kan det være nødvendigt at udføre en opfølgende in vivo-test for at bedømme det fulde potentiale for 
hudirritation (4 og kapitel B.4 i dette bilag). Det anerkendes, at brugen af 
human hud er underlagt nationale og internationale etiske hensyn og betin ­
gelser.
 
8. Denne TM er relevant for in vitro-hudirritationsdelen af den trindelte 
teststrategi beskrevet i B.4 (OECD Test Guideline 404) om 
hudirritation/ætsning (4). Selv om denne TM ikke giver fyldestgørende 
oplysninger om hudætsning, skal det bemærkes, at B.40a (OECD Test Guideline 431) om hudætsning er baseret på det samme RhE-testsystem, skønt der anvendes en anden protokol (kapitel B.40a). Denne metode er 
baseret på RhE-modeller, hvor der anvendes humane keratinocytter, som 
derfor in vitro repræsenterer de pågældende arters målorgan. Den omfatter endvidere direkte det indledende trin i den inflammatoriske kaskade/aktionsmekanisme (cellebeskadigelse og vævsbeskadigelse, der 
forårsager lokalt traume), som forekommer i forbindelse med in 
vivo-irritation. Der er blevet testet en lang række forskellige kemikalier i forbindelse med valideringen af denne TM, og den empiriske database for valideringsundersøgelsen omfattede 58 kemikalier i alt (16) (18) (23). Den 
kan benyttes til test af faste stoffer, væsker, halvfaste stoffer og vokser. 
Væsker kan være vandige eller ikkevandige, og faste stoffer kan være opløselige eller uopløselige i vand. Faste stoffer skal males til et fint pulver, før de påføres, når det overhovedet er muligt. Der kræves ingen 
anden forbehandling af teststoffet. Gasser og aerosoler er endnu ikke 
vurderet ved en valideringsundersøgelse (24). Selv om det er tænkeligt, at disse stoffer kan undersøges ved hjælp af RhE-teknologi, muliggør den nuværende TM ikke undersøgelse af gasser og aerosoler. Det skal bemær ­
kes, at kraftigt farvede kemikalier kan interferere med målingen af cellele ­
vedygtighed og behovet for at anvende tilpassede kontrolprøver til korrek ­
tioner (se punkt 24-26).
 
9. En analyseserie bestående af tre vævsgentagelser bør være tilstrækkelig for 
et teststof, når klassificeringen er entydig. I tilfælde af tvetydige resultater såsom diskordante gentagne målinger, og/eller hvis den gennemsnitlige 
levedygtighed er 50 ± 5 %, skal det overvejes at lave en anden analyseserie 
samt en tredje, hvis resultaterne af de første to analyseserier er diskordante.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
TESTPRINCIPPET  
10. Teststoffet påføres på en tredimensional RhE-model, som består af ikke ­
transformerede humant afledte epidermiskeratinocytter, som ved dyrkning 
har dannet en stærkt differentieret flerlagsmodel af den humane epidermis. Den består af velordnede basallag, stratum spinosum og stratum granulosum og et flerlaget stratum corneum med intercellulære lamellære lipidlag fra 
samme lipidklasser, som dem man finder in vivo.
 
11. Kemikalieinduceret hudirritation i form af erytem og ødem er resultatet af 
en kaskade af begivenheder, der indledes med gennemtrængning af stratum corneum og beskadigelse af de underliggende keratinocytlag. De døende 
keratinocytter frigiver mediatorer, der starter den inflammatoriske kaskade, 
der påvirker cellerne i dermis, navnlig de stromale og endotele celler. Det er dilatationen og den øgede permeabilitet i de endotele celler, som producerer den observerede erytem og ødem (24). Ved de RhE-baserede metoder måles 
de udløsende begivenheder i kaskade.
 
12. Cellernes levedygtighed i RhE-modeller måles ved, at enzym omdanner 
vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ­
bromid, thiazolylblåt; CAS-nr. 298-93-1)] til et blåt formazansalt, der måles 
kvantitativt efter ekstraktion fra vævene (25). Lokalirriterende stoffer iden ­
tificeres ved deres evne til at nedsætte cellernes levedygtighed til en bestemt tærskelværdi eller derunder (f.eks. ≤ 50 % for lokalirriterende stoffer i 
kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP). Afhængigt af de lovgivningsrammer, 
inden for hvilke resultaterne af denne TM anvendes, kan kemikalier, der 
fører til en levedygtighed for cellerne, der ligger over den fastlagte tærskel, betragtes som ikkeirriterende stoffer (dvs. > 50 % »Ingen kategori«).
 
GODTGØRELSE AF KOMPETENCE  
13. Inden et laboratorium påbegynder rutinemæssig brug af en valideret metode, 
der følger denne TM, bør de godtgøre deres tekniske kompetence ved hjælp 
af de 10 anbefalede referencekemikalier i tabel 1. For lignende testmetoder, der udvikles under denne TM, eller modificeringer af en af de tre validerede 
metoder skal ydeevnestandarderne i tillæg 2 til denne TM opfyldes inden 
anvendelse af metoden i lovgivningsøjemed.
 
14. Som led i godtgørelsen af kompetence anbefales det, at brugeren kontrol ­
lerer vævenes barriereegenskaber efter modtagelse som beskrevet i RhE-modellen. Det er navnlig vigtigt, hvis vævene sendes over lang 
afstand/lange perioder. Når en metode er blevet helt fastlagt, og kompe ­
tencen er blevet godtgjort, er det ikke nødvendigt at kontrollere disse egen ­
skaber rutinemæssigt. Ved rutinemæssig brug af en metode anbefales det imidlertid at kontrollere barriereegenskaberne med jævne mellemrum.
 
Tabel 1  
Referencekemikalier  ( 1 ) 
Kemisk stof CAS-nr. In vivo-score (  2 ) Fysisk form UN GHS-/EU 
CLP-kategori  
naphthaleneddikesyre 86-87-3 0 Fast Ingen kat. 
isopropanol 67-63-0 0,3 Flydende Ingen kat.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Kemisk stof CAS-nr. In vivo-score (  2 ) Fysisk form UN GHS-/EU 
CLP-kategori  
methylstearat 112-61-8 1 Fast Ingen kat. 
heptylbutyrat 5870-93-9 1,7 Flydende Ingen kat. 
(Valgfri kat. 
3) ( 3 ) ( 4 ) 
hexylsalicylat 6259-76-3 2 Flydende Ingen kat. 
(Valgfri kat. 
3) ( 3 ) ( 4 ) 
cyclamenaldehyd 103-95-7 2,3 Flydende Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 2,7 Flydende Kat. 2 kaliumhydroxid (5 % aq.) 1310-58-3 3 Flydende Kat. 2 
1-methyl-3-phenyl-1-piperazin 5271-27-2 3,3 Fast Kat. 2 
heptanal 111-71-7 3,4 Flydende Kat. 2
 
( 1 ) Disse referencekemikalier udgør en delmængde af de referencekemikalier, der anvendes i valideringsundersøgelsen. 
( 2 ) In vivo-score i overensstemmelse med B.4 og OECD Test Guideline 404 (4). 
( 3 ) I denne testmetode betragtes stoffer i den valgfrie kategori 3 (milde lokalirriterende stoffer) i FN GHS som ikkeklassificere de 
(»Ingen kategori«). 
( 4 ) Kategori 3 i FN GHS anvendes ikke i henhold til EU CLP.  
TESTPROCEDURE  
15. Nedenfor følger en beskrivelse af komponenter og procedurer i en 
RhE-metode til vurdering af hudirritation. En RhE-model kan konstrueres, fremstilles internt eller købes i handelen. Standardprocedurer (SOP) for EpiSkin
 TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) og SkinEthic  TM RHE er tilgængelige 
(26) (27) (28). Test bør udføres på følgende måde:  
Komponenterne i rhe-testmetoden  
Almindelige betingelser  
16. Der skal anvendes ikketransformerede humane keratinocytter til at 
konstruere epithelet. Der skal være flere lag af levedygtige epithelceller 
(basallag, stratum spinosum, stratum granulosum) til stede under et funge ­
rende stratum corneum. Stratum corneum skal være flerlaget og indeholde den fedtprofil, der gør den til en effektiv barriere, der kan modstå hurtig 
gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS eller Triton 
X-100. Barrierefunktionen kan bedømmes enten ved at bestemme den koncentration, hvor et markørstof nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC
 50 ) efter en fast eksponeringstid, eller ved at bestemme den 
eksponeringstid, der er nødvendig for at nedsætte levedygtigheden med 
50 % (ET  50 ), når markørstoffet påføres i en nærmere angivet fast koncen ­
tration. RhE-modellens fysiske udformning skal forhindre, at stof passerer uden om stratum corneum til det levedygtige væv, hvilket ville forringe 
modelleringen af hudens eksponering. RhE-modellen skal være fri for 
kontamination med bakterier, virus, mykoplasma og svampe.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Funktionsmæssige betingelser  
Levedygtighed  
17. MTT-assayet foretrækkes til kvantificering af levedygtigheden (25). 
Brugerne af RhE-modellen skal sikre, at hver batch af den anvendte 
RhE-model overholder de fastlagte kriterier for den negative kontrol (NC). Absorbansen (optisk densitet — OD) af det rene ekstraktions ­
middel skal være tilstrækkelig lav, dvs. OD < 0,1. Udvikleren/leverandøren 
af RhE-modellen skal fastsætte et interval (øvre og nedre grænse) for 
acceptable OD-værdier for negativ kontrol (i metodebetingelserne for hudirritationstesten), og acceptintervallerne for de tre validerede metoder er angivet i tabel 2. Det skal godtgøres, at vævet fra behandling med 
negativ kontrol er en stabil kultur (leverer enslydende levedygtighedsmålin ­
ger) i hele testeksponeringsperioden.
 
Tabel 2  
Intervaller for acceptable OD-værdier for negativ kontrol  
Nedre acceptgrænse Øvre acceptgrænse  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Barrierefunktion  
18. Stratum corneum og dets lipidsammensætning skal være tilstrækkelig til at 
modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS 
eller Triton X-100, bestemt ved IC  50 eller ET  50 (tabel 3).  
Morfologi  
19. Der skal udføres en histologisk undersøgelse af RhE-modellen for human 
epidermis-lignende struktur (herunder flerlaget stratum corneum).  
Reproducerbarhed  
20. Resultaterne af testmetoden med positive (PC) og negative (NC) kontrol ­
prøver skal udvise tidsmæssig reproducerbarhed.  
Kvalitetskontrol  
21. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen skal sikre og påvise, at hver 
batch af den anvendte RhE-model overholder veldefinerede produktions ­
godkendelseskriterier, hvoraf  levedygtighed  (punkt 17),  barrierefunktion  
(punkt 18) og  morfologi  (punkt 19) er de vigtigste. Brugerne af metoden 
skal have adgang til disse data, således at de kan medtage disse oplysninger 
i testrapporten. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen (eller forsøgs ­
lederen, hvis modellen er internt fremstillet) skal fastsætte et interval for acceptable værdier af IC
 50 eller ET  50 (øvre og nedre grænse). Kun resulta ­
ter, der er fremkommet med kvalificerede væv, kan accepteres til at give en 
pålidelig vurdering af lokalirriterende klassificering. Nedenfor er accept ­
intervallerne for de tre validerede metoder angivet som eksempler i tabel 3.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabel 3  
Eksempler på batchgodkendelseskriterier til kvalitetskontrol  
Nedre acceptgrænse Øvre acceptgrænse  
EpiSkin  TM (SM) 
(behandling i 18 timer med SDS) 
(26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 t ET  50 = 8,7 t 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 t ET  50 = 9,0 t  
Påføring af test- og kontrolstoffer  
22. Der anvendes mindst tre vævsgentagelser for hvert testkemikalie og til 
kontroller pr. analyseserie. For både flydende og faste stoffer gælder det, at der skal påføres tilstrækkelig meget testkemikalie til, at epidermisover ­
fladen dækkes med et jævnt lag, samtidig med at uendelig dosis undgås, 
dvs. mindst 25 μL/cm
 2 eller 25 mg/cm  2 . I tilfælde af faste stoffer fugtes 
epidermisoverfladen med deioniseret eller destilleret vand inden påføringen, så kontakten mellem det kemiske teststof og epidermisoverfladen forbedres. 
Faste stoffer bør testes som fint pulver, når det overhovedet er muligt. Efter 
eksponeringsperioden vaskes teststoffet omhyggeligt af epidermisoverfladen med vandig buffer eller 0,9 % NaCl. Afhængigt af, hvilke af de tre vali ­
derede RhE-metoder der anvendes, kan eksponeringsperioden variere 
mellem 15 og 60 minutter og inkubationstemperaturen mellem 20 og 
37 °C. Disse eksponeringsperioder og temperaturer optimeres for hver RhE-metode og repræsenterer metodernes forskellige iboende egenskaber. Der er nærmere oplysninger i de tre metoders standardprocedurer (SOP) 
(26) (27) (28).
 
23. Der skal i hver analyseserie anvendes sideløbende negative og positive 
kontroller (PC), så det godtgøres, at levedygtigheden (NC), barrierefunk ­
tionen og vævets deraf følgende følsomhed (med kontrolstoffet) ligger inden for et forud fastsat acceptinterval. Som positivt kontrolstof foreslås 
5 % vandig SDS. Som negativt kontrolstof foreslås vand eller phosphatbuf ­
feret saltopløsning (PBS).
 
Måling af cellelevedygtighed  
24. Det vigtigste i testproceduren er, at levedygtigheden ikke måles umiddelbart 
efter eksponeringen med testkemikalierne, men først efter en tilstrækkelig lang inkubationsperiode i frisk substrat af de renskyllede væv fra behand ­
lingen. En sådan periode betyder, dels at huden kan kommer sig over svagt 
cytotoksiske virkninger, dels at eventuelle cytotoksiske virkninger træder tydeligt frem. En inkubationsperiode efter behandlingen på 42 timer viste sig i testoptimeringsfasen (11) (12) (13) (14) (15) at være optimal.
 
25. MTT-assayet er en valideret kvantitativ metode, som skal benyttes til 
måling af cellelevedygtigheden i forbindelse med denne TM. Den er 
forenelig med brug i et tredimensionalt væv. Vævsprøven anbringes i en 
MTT-opløsning af passende koncentration (f.eks. 0,3-1 mg/ml) i tre timer. Det udfældede blå formazan ekstraheres fra vævet med et opløsningsmiddel (f.eks. isopropanol eller sur isopropanol), og formazankoncentrationen 
beregnes ud fra måling af absorbansen i et højst ± 30 nm bredt filterbånd 
ved 570 nm.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Teststoffets optiske egenskaber eller dets kemiske reaktion med MTT kan 
interferere med målingen og føre til et forkert skøn over levedygtigheden 
(da teststoffet kan standse, mindske eller forårsage farvedannelsen). Det kan forekomme, hvis et specifikt testkemikalie ikke bliver fjernet fuldstændigt fra vævet ved skylning, eller hvis det er trængt ned i epidermis. Hvis test ­
stoffet reagerer direkte med MTT (MTT-opløsning), hvis det selv er farvet, 
eller hvis det bliver farvet under behandlingen af vævet, skal der anvendes yderligere kontroller til at spore og korrigere for teststoffernes interferens med levedygtighedsmålingen. Det er nærmere beskrevet, hvordan der korri ­
geres for MTT-reduktion og farvestoffernes interferens, i SOP'erne for de 
tre validerede metoder (26) (27) (28).
 
Acceptkriterier  
27. For hver metode med gyldige RhE-modelbatcher (se punkt 21) skal væv, 
der er behandlet med negativ kontrol, give absorbansresultater, der afspejler 
kvaliteten af de væv, der har været underkastet alle forsendelses- og modtagelsestrin og alle protokolprocesser. Absorbansværdierne af kontrol ­
lerne må ikke ligge lavere end forud fastsatte nedre grænser. På tilsvarende 
måde skal væv, der er behandlet med positiv kontrol, dvs. 5 % vandig SDS, 
afspejle vævenes evne til at reagere på et lokalirriterende stof under aktuelle forsøgsvilkår (26) (27) (28). Der skal defineres passende mål for den tilknyttede variation mellem multiple bestemmelser på samme væv (f.eks. 
skal en eventuel standardafvigelse ligge inden for det ensidige tolerancein ­
terval på 95 % beregnet på grundlag af historiske data, der for VRM-standardafvigelser er ≤ 18 %).
 
Fortolkning af resultater og prædiktionsmodel  
28. De absorbansværdier, som måles ved hver undersøgelse, anvendes til bereg ­
ning af den procentuelle levedygtighed i forhold til den negative kontrol, som vilkårligt sættes til 100 %. Den tærskelværdi for cellelevedygtigheds ­
procent, som adskiller lokalirriterende stoffer fra ikkeklassificerede stoffer, 
og de statistiske metoder, der benyttes til at vurdere resultaterne og udpege 
lokalirriterende stoffer, skal klart defineres, dokumenteres og bevises at være hensigtsmæssige. Tærskelværdierne for vurdering som lokalirriterende er som følger:
 
— Teststoffet betragtes som værende hudirriterende i kategori 2 ifølge FN 
GHS/EU CLP, hvis vævslevedygtigheden efter eksponering og inkuba ­
tion efter behandling er mindre end eller lig med ( ≤) 50 %  
— Afhængigt af de lovgivningsrammer, inden for hvilke resultaterne af 
denne TM anvendes, betragtes teststoffet som værende ikkehudirrite ­
rende ifølge FN GHS/EU CLP »Ingen kategori«, hvis vævslevedygtig ­
heden efter eksponering og inkubation efter behandling er større end (>) 
50 %.  
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
29. For hver analyseserie skal data fra de enkelte multipelbestemmelser (f.eks. 
absorbansværdier og beregnet cellelevedygtighedsprocent for hvert testke ­
mikalie samt klassificeringen) fremlægges i tabelform, herunder data fra eventuelle gentagelser af forsøget. Desuden skal gennemsnit og standard ­
afvigelse angives for hver analyseserie. For hvert testkemikalie oplyses der 
om eventuelt iagttagne vekselvirkninger med MTT-reagenset og farvede 
teststoffer.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Testrapport  
30. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Test- og kontrolstoffer:  
— kemiske navne, f.eks. CAS-navn og -nummer, hvis de kendes  
— stoffets renhed og sammensætning (i vægtprocent)  
— fysisk-kemiske egenskaber, som er relevante for undersøgelsen (f.eks. 
fysisk tilstand, stabilitet og flygtighed, pH og opløselighed i vand, hvis 
kendt)  
— eventuel behandling af test-/kontrolstoffet inden testen (f.eks. opvarm ­
ning, formaling)  
— opbevaringsforhold.  
Begrundelse for valg af RhE-model og forsøgsprotokol.  
Testbetingelser:  
— anvendt cellesystem  
— komplet dokumentation for den anvendte RhE-model, herunder om dens 
ydeevne. Der skal bl.a. gives oplysning om:  
i) levedygtighed  
ii) barrierefunktion  
iii) morfologi  
iv) reproducerbarhed og prædiktionsevne  
v) kvalitetskontroller (QC) i modellen  
— detaljer om den anvendte testprocedure  
— anvendte testdoser, eksponeringens varighed og længden af inkubations ­
perioden efter behandlingen  
— beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren  
— reference til historiske data for modellen. Der skal bl.a. gives oplysning 
om: 
i) om QC-dataene kan accepteres, sammenlignet med data om tidligere 
batcher  
ii) om positive og negative kontrolværdier kan accepteres, sammen ­
lignet med gennemsnit og intervaller for positive og negative kontroller
 
— beskrivelse af de anvendte evalueringskriterier, herunder begrundelse for 
valg af prædiktionsmodellens afskæringspunkt(er)  
— reference til historiske kontroldata.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Resultater:  
— angivelse i tabelform af data fra hvert enkelt testkemikalie for hver 
analyseserie og fra hver flergangsbestemmelse  
— angivelse af kontrolprøver anvendt til direkte MTT-opløsninger og/eller 
farvede teststoffer  
— beskrivelse af andre observerede virkninger.  
Behandling af resultater  
Konklusioner  
LITTERATUR  
(1) UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ ghs_rev03/03files_e.html]
 
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the »Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards«, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Available at: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(3) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 
16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer 
og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006. EUT L 353 
af 31.12.2008, s. 1.
 
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Available 
at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Available at: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Available 
at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A 
prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.  
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refine ­
ment of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 
16, 765–770.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol 
for the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests — An assessment 
of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.  
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM valida ­
tion process, ATLA 33, 329-349.  
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, 
R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., 
Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute 
skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative 
Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.
 
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., 
Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619.
 
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 
351-358.
 
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human 
skin models to  in vitro  skin irritation testing. Available at: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory 
Committee (ESAC29), 5 November 2008. Available at: [http://ecvam.jrc. ec.europa.eu]
 
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/ document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1 _1_1,00.html]
 
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231-243.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55-63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min – 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Available at: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Avai ­
lable at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York.  
(30) Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical 
progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the appro ­
ximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the 
classification, packaging and labelling of dangerous substances, OJ L 225, 21.8.2001, p.1.
 
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. 
Contact Dermatitis 51, 1-4.  
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, 
H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays 
and animal  in vivo  data, ALTEX, 14, 359-365.
 
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact 
Dermatitis, 62, 109-116.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Tillæg 1  
Definitioner  
Nøjagtighed:  Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede 
referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som 
den andel korrekte udfald, testmetoden fører til (9).
 
Cellelevedygtighed:  En parameter, der måler den samlede aktivitet i en cellepo ­
pulation, f.eks. udtrykt ved de cellulære mitokondriedehydrogenasers evne til at 
reducere vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazo ­
liumbromid, thiazolylblåt], og som, afhængigt af det valgte endepunkt og testens udformning, korrelerer med det totale antal levende celler og/eller deres levedyg ­
tighed.
 
Konkordans:  Den er et mål for ydeevnen af en testmetode, der fører til katego ­
riske resultater, og er et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes som synonym for »nøjagtighed« og defineres som andelen af alle kemikalier, der 
klassificeres korrekt som positive eller negative. (9).
 
ET 50 : Kan bedømmes ved at bestemme den eksponeringstid, der er nødvendig for 
at nedsætte cellernes levedygtighed med 50 % ved påføring af et markørstof i en 
nærmere angivet fast koncentration; se også IC  50 . 
EU CLP (Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 
16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger):  Gennemfører FN's globale harmoniserede system for klassificering 
og mærkning af kemikalier (stoffer og blandinger) (GHS) i Den Europæiske 
Union (EU) (3).
 
De Forenede Nationers (FN) GHS (Globally Harmonized System of Classifica ­
tion and Labelling of Chemicals [det globale harmoniserede system for klas ­
sificering og mærkning af kemikalier]):  Et system til klassificering af kemikalier 
(stoffer og blandinger) efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare med tilhørende kommunikationselementer såsom 
piktogrammer, signalord, risikosætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdata ­
blade, således at oplysninger om kemikaliernes skadelige virkninger kan videre ­
formidles med henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejds ­
tagere, transportører, forbrugere og redningspersonel) og miljø (1).
 
IC 50 : Kan bedømmes ved at bestemme den koncentration, hvor et markørstof 
nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC  50 ) efter en fast eksponeringstid; se 
også ET  50 . 
Uendelig dosis:  Den mængde testkemikalie, som er påført på epidermis ud over 
den mængde, der er nødvendig for helt at dække epidermisoverfladen på ensartet måde.
 
Me-too-test:  Gængs udtryk for en testmetode, som strukturelt og funktionelt 
ligner en valideret og anerkendt referencetestmetode. En sådan testmetode under ­
kastes ofte en catch-up-validering. Benyttes som synonym for tilsvarende test ­
metode (9).  
Ydeevnestandarder (PS):  Standarder, som med udgangspunkt i en valideret test ­
metode giver mulighed for at vurdere, om en foreslået testmetode, som er meka ­
nistisk og funktionelt tilsvarende, er sammenlignelig. De indeholder bl.a.: i) de 
centrale dele af testmetoden, ii) en minimumsliste med referencekemikalier, som 
er udvalgt blandt de kemikalier, der er benyttet til at påvise, at den validerede testmetodes ydeevne er acceptabel, iii) de sammenlignelige niveauer af nøjagtighed og pålidelighed, som er fastsat efter, hvad der er opnået med den 
validerede testmetode, og som det skal påvises, at den foreslåede testmetode kan 
yde, ved vurdering ud fra minimumslisten med referencekemikalier (9).
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Referencekemikalier:  Kemikalier, der anvendes i valideringsprocessen, hvor 
respons i in vitro- eller in vivo -referencetestsystemet eller de pågældende arter 
allerede er kendt. Disse kemikalier skal være repræsentative for de kemiske stofgrupper, som testmetoden forventes at blive anvendt på, og skal repræsentere hele det forventede responsområde for de kemikalier, som den anvendes til, fra 
kraftig til svag eller negativ respons. Det kan være nødvendigt at anvende 
forskellige referencekemikalier i de forskellige faser i valideringsprocessen og til forskellige testmetoder og testformål (9).
 
Relevans:  Beskrivelse af sammenhængen mellem testen og den pågældende virk ­
ning og dens meningsfuldhed og brugbarhed til et bestemt formål. Det angives, i 
hvilket omfang testen måler eller forudsiger den pågældende biologiske virkning 
korrekt. Testmetodens nøjagtighed (konkordans) indgår i vurderingen af dens relevans (9).
 
Pålidelighed:  Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i 
og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme 
protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og 
mellem laboratorier (9).  
Erstatningstest:  En test, der erstatter en test, der bruges rutinemæssigt og er 
godkendt til fareidentifikation og/eller risikovurdering, og som vurderes at 
sikre en tilsvarende eller bedre beskyttelse af menneskers og dyrs sundhed 
eller miljøet alt afhængigt af situationen i forhold til den godkendte test, til alle testsituationer og alle kemikalier (9).
 
Følsomhed:  Andelen af alle positive/aktive testkemikalier, der klassificeres 
korrekt ved testen. Den er et mål for nøjagtigheden af en testmetode, der fører 
til kategoriske resultater, og har stor betydning for vurdering af en testmetodes 
relevans (9).  
Hudirritation:  Fremkaldelse af reversibel skade på huden ved påføring af test ­
stoffet i indtil 4 timer. Hudirritation er en lokalt fremkaldt ikkeimmunogen 
reaktion, som indtræder kort tid efter stimuleringen (29). Den karakteriseres 
især ved, at den reversible proces indebærer inflammatoriske reaktioner og de fleste af de karakteristiske kliniske tegn på irritation (rødme, ødem, kløe og smerte), der er knyttet til en inflammatorisk proces.
 
Specificitet:  Andelen af alle negative/inaktive testkemikalier, der klassificeres 
korrekt ved testen. Den er et mål for nøjagtigheden af en testmetode, der fører 
til kategoriske resultater, og har stor betydning for vurdering af en testmetodes relevans (9).
 
Trindelt testningsstrategi:  Testning, hvor der anvendes sekventielle testmetoder. 
Testmetoderne på de enkelte trin udvælges på grundlag af resultaterne på det 
tidligere testtrin (9).  
Testkemikalie (eller teststof):  Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af 
denne TM.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Tillæg 2  
Ydeevnestandarder til brug for vurdering af foreslåede lignende eller 
modificerede in vitro-(rhe)-metoder med rekonstrueret human epidermis 
for hudirritation  
INDLEDNING  
1. Formålet med ydeevnestandarder er at fastslå grundlaget for bedømmelsen 
af nye metoder, både beskyttede (dvs. ophavsretsbeskyttede, varemærkebe ­
skyttede og registrerede) og ikkebeskyttede, som værende tilstrækkelig nøjagtige og pålidelige til bestemte testformål. Disse ydeevnestandarder for validerede og anerkendte testmetoder kan anvendes til at evaluere påli ­
deligheden og nøjagtigheden af andre analoge metoder (i daglig tale »me- 
too«-test), som er baseret på lignende videnskabelige principper, og til at måle eller forudsige den samme biologiske eller toksiske effekt (9).
 
2. Inden indførelsen af modificerede metoder, dvs. foreslåede potentielle forbed ­
ringer af en godkendt metode, skal der foretages en bedømmelse af de foreslåede 
ændringers effekt på testresultatet og af, i hvilket omfang disse ændringer berører de oplysninger, der er tilgængelige for de øvrige dele i valideringspro ­
cessen. Afhængigt af antallet og arten af de foreslåede ændringer, de genererede 
data og støttedokumentation for disse ændringer, skal de enten underkastes den 
samme valideringsproces som beskrevet for en ny test eller, hvis det er hensigts ­
mæssigt, en begrænset vurdering af pålideligheden og relevansen på grundlag af anerkendte ydeevnestandarder (9).
 
3. Lignende (me-too-) eller modificerede metoder af de tre validerede metoder 
[EpiSkin  TM (den validerede referencemetode — VRM), EpiDerm  TM SIT 
(EPI-200) og SkinEthic  TM RHE], der foreslås anvendt i forbindelse med 
denne TM, skal vurderes med hensyn til pålidelighed og nøjagtighed ved 
hjælp af kemikalier, der repræsenterer hele Draize-pointskalaen for irrita ­
tion. Når foreslåede testmetoder bedømmes ved hjælp af de 20 anbefalede referencekemikalier, der opfylder ydeevnestandarderne (tabel 1), skal de 
foreslåede lignende eller modificerede metoder have samme niveau af påli ­
delighed og nøjagtighed som VRM eller et højere niveau (tabel 2) (2) (16). De nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier, der skal opnås, er angivet i punkt 8-12 i dette tillæg. Der indgår ikkeklassificerede og klassificerede (FN 
GHS/EU CLP »Ingen kategori«) og klassificerede (kategori 2 ifølge FN 
GHS/EU CLP) (1) kemikalier, således at pålideligheden og nøjagtigheden med hensyn til følsomhed, specificitet og generel nøjagtighed af den fores ­
låede testmetode kan sammenlignes med VRM. Inden metoden tages i brug 
til test af nye kemikalier, skal det fastslås, om den er pålidelig og — 
afhængigt af lovgivningsrammerne, inden for hvilke dataene genereres — om den kan identificere hudirriterende kemikalier i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP »Ingen kategori« korrekt.
 
4. Disse ydeevnestandarder er baseret på EU-ECVAM (8), der er opdateret i 
overensstemmelse med FN's GHS- og EU's CLP-system for klassificering og mærkning (1) (3). De oprindelige ydeevnestandarder blev fastlagt efter 
afslutning af valideringsundersøgelsen (21) og var baseret på EU's klas ­
sificeringssystem som fastlagt i Kommissionens direktiv 2001/59/EF af 6. august 2001 om 28. tilpasning til den tekniske udvikling af Rådets direktiv 67/548/EØF om tilnærmelse af lovgivning om klassificering, 
emballering og etikettering af farlige stoffer (
 1 ). Som følge af vedtagelsen  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) EFT L 225 af 21.8.2001, s. 1.
 af FN's GHS-system for klassificering og mærkning i EU ((EU CLP) (3), 
der skete i perioden mellem afslutningen af valideringsundersøgelsen og færdig ­
gørelsen af denne TM, er ydeevnestandarderne blevet opdateret (8). Denne opdatering vedrører navnlig ændringer af i) PS-referencekemikalierne og ii) de fastlagte nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier (2) (23).
 
YDEEVNESTANDARDER TIL BRUG FOR IN VITRO-RhE-TESTMETODER 
FOR HUDIRRITATION  
5. Ydeevnestandarderne omfatter følge tre elementer (9):  
I) De centrale dele af testmetoden  
II) Minimumsliste over referencekemikalier  
III) Definerede nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier  
I) De centrale dele af testmetoden  
6. Disse indeholder central strukturelle, funktionelle og metodemæssige dele af 
en valideret metode, der skal inkluderes i protokollen for en foreslået 
lignende eller modificeret metode, der er mekanistisk og funktionelt tilsva ­
rende. Disse dele omfatter unikke karakteristika ved metoden, kritiske meto ­
demæssige detaljer og kvalitetskontrolforanstaltninger. Inkluderingen af de centrale dele af testmetoden vil medvirke til at sikre, at en lignende eller 
modificeret foreslået metode er baseret på samme begreber som den tilsva ­
rende VRM (9). De centrale dele af testmetoden beskrives nærmere i punkt 16-21 i TM'en, og test bør udføres på følgende måde:
 
— Almindelige modelbetingelser (punkt 16).  
— Funktionsmæssige betingelser, der omfatter:  
— levedygtighed (punkt 17)  
— barrierefunktion (punkt 18)  
— morfologi (punkt 19)  
— reproducerbarhed (punkt 20)  
— kvalitetskontrol (punkt 21)  
II) Minimumsliste over referencekemikalier  
7. Referencekemikalier benyttes til at fastslå, om en foreslået lignende eller 
modificeret metode, som er bevist at have tilstrækkelig strukturel og funk ­
tionel lighed med VRM, eller som består i en mindre modifikation af en af 
de tre validerede metoder, har samme niveau af pålidelighed og nøjagtighed 
som VRM (2) (8) (16) (23). De 20 anbefalede referencekemikalier i tabel 1 omfatter kemikalier fra forskellige kemiske stofgrupper (dvs. kemiske kate ­
gorier baseret på funktionelle grupper) og repræsenterer hele 
Draize-pointskalaen (fra ikkeirriterende til stærkt irriterende). På listen er 
der 10 kemikalier i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og 10 ikkeklas ­
sificerede kemikalier, heraf tre kemikalier i den valgfrie kategori 3 ifølge FN GHS. I denne testmetode betragtes stoffer i den valgfrie kategori 3 som 
ikkeklassificerede (»Ingen kategori«). Kemikalierne i tabel 1 udvælges 
blandt de kemikalier, der anvendes i optimeringsfasen efter prævalideringen og i VRM-valideringsundersøgelsen, på grundlag af kemisk funktion og fysisk form (14) (18). Disse referencekemikalier er det mindste antal kemi ­
kalier, der skal indgå i vurderingen af nøjagtighed og pålidelighed af en 
foreslået lignende eller modificeret metode, men bør ikke anvendes til
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
udvikling af nye metoder. Hvis et stof på listen ikke kan fås, kan der 
benyttes andre kemikalier, som der foreligger tilstrækkelige in 
vivo-referencedata om, primært de kemikalier, der anvendes i optimerings ­
fasen efter prævalideringen eller i VRM-valideringsundersøgelsen. Hvis det ønskes for at udbygge vurderingen af den foreslåede metodes nøjagtighed, 
kan der tilføjes flere kemikalier, som repræsenterer andre kemiske stofgrup ­
per, og som der foreligger tilstrækkelige in vivo-referencedata om, til mini ­
mumslisten over referencekemikalier.
 
Tabel 1  
Minimumslisten over referencestoffer til bestemmelse af nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier for lignende eller 
modificerede RhE-metoder til testning af hudirritation  ( 1 ) 
Kemikalie CAS-nummer Fysisk form In vivo-vurdering VRM in 
vitro-kategori FN GHS/EU CLP in 
vivo-kategori  
1-brom-4-chlorbutan 6940-78-9 Flydende 0 Kat. 2 Ingen kat. 
diethylphthalat 84-66-2 Flydende 0 Ingen kat. Ingen kat. naphthaleneddikesyre 86-87-3 Fast 0 Ingen kat. Ingen kat. 
allylphenoxyacetat 7493-74-5 Flydende 0,3 Ingen kat. Ingen kat. 
isopropanol 67-63-0 Flydende 0,3 Ingen kat. Ingen kat. 4-(methylthio)-benzaldehyd 3446-89-7 Flydende 1 Kat. 2 Ingen kat. methylstearat 112-61-8 Fast 1 Ingen kat. Ingen kat. 
heptylbutyrat 5870-93-9 Flydende 1,7 Ingen kat. Ingen kat. 
hexylsalicylat 6259-76-3 Flydende 2 Ingen kat. Ingen kat. cinnamaldehyd 104-55-2 Flydende 2 Kat. 2 Ingen kat. 
(Valgfri kat. 3 ) (
 3 ) 
1-decanol  ( 2 ) 112-30-1 Flydende 2,3 Kat. 2 Kat. 2  
cyclamenaldehyd 103-95-7 Flydende 2,3 Kat. 2 Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 Flydende 2,7 Kat. 2 Kat. 2 2-chlormethyl-3,5-dimethyl- 
4-methoxypyridin HC1 86604-75-3 Fast 2,7 Kat. 2 Kat. 2  
di-n-propyldisulfid  (
 2 ) 629-19-6 Flydende 3 Ingen kat. Kat. 2  
kaliumhydroxid (5 % aq.) 1310-58-3 Flydende 3 Kat. 2 Kat. 2 benzenthiol, 5-(1,1-dimethy ­
lethyl)-2-methyl 7340-90-1 Flydende 3,3 Kat. 2 Kat. 2 
1-methyl-3-phenyl-1-pipe ­
razin 5271-27-2 Fast 3,3 Kat. 2 Kat. 2
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Kemikalie CAS-nummer Fysisk form In vivo-vurdering VRM in 
vitro-kategori FN GHS/EU CLP in 
vivo-kategori  
heptanal 111-71-7 Flydende 3,4 Kat. 2 Kat. 2 
tetrachlorethylen 127-18-4 Flydende 4 Kat. 2 Kat. 2  
( 1 ) Kemikalierne er udvalgt på grundlag af følgende kriterier: i) kemikalierne fås i handelen, ii) de repræsenterer hele 
Draize-pointskalaen (fra ikkeirriterende til stærkt irriterende), iii) de har en veldefineret kemisk struktur, iv) de er repræs entative 
for de typer kemisk funktion, der indgår i valideringsprocessen, og de har ikke nogen ekstremt toksisk profil (f.eks. kræftfrem kal­
dende eller reproduktionstoksiske) og indebærer heller ikke urimeligt høje bortskaffelsesomkostninger. 
( 2 ) Kemikalier, der er irriterende for kaniner, men hvor der foreligger pålidelig dokumentation for, at de er ikkeirriterende for  menne­
sker (31) (32) (33). 
( 3 ) I henhold til FN GHS, ikke i henhold til EU CLP.  
III) Definerede nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier  
8. Med henblik på at fastslå pålideligheden og relevansen af foreslåede lignende 
eller modificerede metoder, der ønsker overført mellem laboratorier, skal alle 20 referencekemikalier i tabel 1 testes i mindst tre laboratorier. Hvis den foreslåede 
metode kun skal anvendes i et laboratorium, er der imidlertid ikke noget krav om 
testning i flere laboratorier i forbindelse med valideringen. Det er imidlertid af afgørende betydning, at sådanne valideringsundersøgelser vurderes af inter ­
nationalt anerkendte uafhængige valideringsorganer i overensstemmelse med 
internationale retningslinjer (9). I hvert laboratorium skal alle 20 referenceke ­
mikalier testes ved uafhængige analyseserier, der foretages med forskellige vævsbatcher og på tilstrækkeligt adskilte tidspunkter. Hver analyseserie skal 
bestå af minimum tre parallelt testede vævsgentagelser for hvert inkluderet 
testkemikalie og negative og positive kontrolprøve.
 
9. Beregningen af den foreslåede testmetodes nøjagtigheds- og pålideligheds ­
værdier skal foretages under hensyntagen til alle fire nedennævnte kriterier 
under ét, således at det sikres, at alle værdierne for nøjagtighed og pålide ­
lighed beregnes på en forud fastlagt og konsekvent måde.  
1. Kun data fra analyseserier i komplette analysesekvenser kan anvendes 
som grundlag for beregningen af metodevariationen og prædiktionsevnen 
(nøjagtigheden) inden for laboratoriet og mellem laboratorier.  
2. Hvert deltagende laboratorium skal fastsætte den endelige klassificering 
af de enkelte referencekemikalier ud fra gennemsnittet af levedygtig ­
heden over de forskellige analyseserier i en komplet analysesekvens.  
3. Kun data fra kemikalier, som har komplette analysesekvenser i alle 
deltagende laboratorier, kan anvendes som grundlag for beregningen af 
metodevariationen mellem laboratorier.  
4. Beregningen af nøjagtighedsværdierne skal foretages på grundlag af de 
forskellige deltagende laboratorier egne forudsigelser for de 20 referenceke ­
mikalier.  
I denne forbindelse består en  analysesekvens  af tre uafhængige analysese ­
rier fra et laboratorium for et testkemikalie. En  komplet analysesekvens  er 
en analysesekvens fra et laboratorium for et testkemikalie, hvor alle tre 
serier er gyldige. Dette indebærer, at en enkelt ugyldig analyseserie ugyl ­
diggør hele analyseserien af de tre analyseserier.  
Reproducerbarhed inden for laboratoriet  
10. En vurdering af reproducerbarheden inden for laboratoriet skal vise, at klas ­
sificeringerne (kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og »Ingen kategori«) ved 
forskellige uafhængige analyseserier med de 20 referencekemikalier i ét 
enkelt laboratorium er overensstemmende i 90 % af tilfældene eller derover.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Reproducerbarhed mellem laboratorier  
11. En vurdering af reproducerbarheden mellem laboratorier er ikke afgørende, 
hvis de foreslåede metoder kun skal benyttes i ét laboratorium. For metoder, 
der ønskes overført mellem laboratorier, skal klassificeringerne (kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og »Ingen kategori«) ved forskellige uafhængige analyseserier med de 20 referencekemikalier, der foretages i helst mindst tre 
laboratorier, være overensstemmende i 80 % af tilfældene eller derover.
 
Prædiktionsevne (nøjagtighed)  
12. Nøjagtigheden med hensyn til følsomhed, specificitet og generel 
nøjagtighed af en foreslået lignende eller modificeret metode skal være sammenlignelig eller bedre end nøjagtigheden af en VRM under hensyn ­
tagen til yderligere oplysninger om relevansen i de pågældende arter (tabel 
2). Følsomheden skal være 80 % eller derover (2) (8) (23). Der er imidlertid en yderligere særlig begrænsning for følsomheden af den foreslåede in vitro-metode, da kun to in vivo-kemikalier i kategori 2,  1-decanol  og di- 
n-propyldisulfid,  må fejlklassificeres som ikkeklassificerede (»Ingen katego ­
ri«) af mere end et deltagende laboratorium. Specificiteten skal være 70 % eller derover (2) (8) (23). Der er ingen yderligere begrænsning med hensyn til specificiteten af den foreslåede in vitro-metode, dvs. at de deltagende 
laboratorier kan fejlklassificere ethvert ikkeklassificeret in vivo-kemikalie, 
så længe testmetodens endelige specificitet ligger inden for det acceptable interval. Den generelle nøjagtighed skal være 75 % eller derover (2) (8) (23). Selv om den beregnede følsomhed af VRM for de 20 referencekemi ­
kalier i tabel 1 er 90 %, skal den definerede minimumsfølsomhedsværdi for 
en lignende eller modificeret metode være 80 % for at kunne blive betragtet som gyldig, da både  1-decanol  (et borderline-kemikalie) og  di-n-propyl 
propyldisulfid  (et falsk negativ af VRM) vides at være ikkeirriterende for 
mennesker (31) (32) (33), selv om de er identificeret som lokalirriterende 
stoffer i kanintesten. Eftersom RhE-modeller er baseret på celler af menne ­
skelig oprindelse, kan de anvendes til at identificere disse kemikalier som ikkeirriterende (FN GHS/EU CLP »Ingen kategori«).
 
Tabel 2  
Krævet prædiktionsevne for nøjagtighed med hensyn til følsomhed, specificitet og generel 
nøjagtighed, for at en lignende eller modificeret metode skal kunne betragtes som gyldig  
Følsomhed Specificitet Generel nøjagtighed  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Undersøgelsesacceptkriterier  
13. Det er muligt, at et eller flere forsøg vedrørende et eller flere kemikalier 
opfylder/ikke opfylder acceptkriterierne for test- og kontrolstofferne eller ikke kan accepteres af andre årsager. Der kan foretages højst to yderligere 
forsøg (»gentagelse af forsøg«) for hvert testkemikalie for at supplere mang ­
lende data. Da der ved gentagelse af forsøg skal anvendes sideløbende negative og positive kontroller, må der mere præcist udføres højst to yder ­
ligere analyseserier for hvert testkemikalie.
 
14. Selv efter gentagelse af forsøg er det tænkeligt, at kravet om mindst tre 
gyldige analyseserier for hvert testkemikalie ikke opfyldes for hvert enkelt referencekemikalie i alle deltagende laboratorier, hvilket resulterer i en ufuldstændig datamatrix. I disse tilfælde skal følgende tre kriterier alle 
opfyldes, for at datasættene skal kunne betragtes som acceptable:
 
1. Alle 20 referencekemikalier skal have mindst en komplet analysese ­
kvens.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. I mindst tre deltagende laboratorier skal mindst 85 % af analysesekven ­
serne være komplette (for 20 kemikalier, dvs. at tre ugyldige analysese ­
kvenser i et laboratorium tillades).  
3. Mindst 90 % af alle mulige analysesekvenser fra mindst tre laboratorier 
skal være komplette (for 20 kemikalier testet i tre laboratorier, dvs. at i alt seks ugyldige analysesekvenser tillades).
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B.47.  OKSECORNEA-UKLARHEDS- OG -PERMEABILITETSTESTME ­
TODEN (BCOP-TESTMETODEN) TIL IDENTIFIKATION AF ØJENÆTSENDE STOFFER OG STÆRKT ØJENIRRITERENDE 
STOFFER
 
INDLEDNING  
1. Oksecornea-uklarheds- og -permeabilitetstestmetoden (BCOP [Bovine 
Corneal Opacity and Permeability]-testmetoden) er en  in vitro -testmetode, 
som under visse omstændigheder og med særlige begrænsninger kan 
anvendes til at klassificere stoffer og blandinger som »øjenætsende 
stoffer og stærkt øjenirriterende stoffer« (1) (2) (3). For denne testmetode er stærkt øjenirriterende stoffer defineret som dem, der inducerer øjenlæ ­
sioner, der persisterer hos kaninen i mindst 21 dage efter administration. 
Selv om den ikke betragtes som gyldig som fuldstændig erstatning for  in 
vivo-kaninøjentesten, anbefales BCOP anvendt som del af en trindelt test ­
ningsstrategi for forskriftsmæssig klassificering og mærkning inden for et specifikt anvendelsesområde (domæne) (4) (5). Teststoffer og -blandinger 
(6) kan klassificeres som øjenætsende stoffer eller stærkt øjenirriterende 
stoffer uden yderligere testning hos kaniner. Et stof, der er testet negativt, vil skulle testes hos kaniner ved anvendelse af en sekventiel testnings ­
strategi som anført i OECD Test Guideline 405 (7) (kapitel B. 5 i dette 
bilag).
 
2. Formålet med denne testmetode er at beskrive de procedurer, som 
anvendes til at vurdere et teststofs potentielle øjenætsning eller stærke 
øjenirritation som målt ved dets evne til at inducere uklarhed og øget 
permeabilitet i en isoleret oksecornea. Toksiske virkninger på cornea måles ved: (i) nedsat lystransmission (uklarhed) og (ii) øget passage af farvestoffet natriumfluorescein (permeabilitet). Uklarheds- og permeabili ­
tetsvurderingerne af cornea efter eksponering for et teststof kombineres til 
udledning af en  in vitro -irritationsscore (IVIS,  In Vitro  Irritancy Score), 
som anvendes til at klassificere teststoffets irritationsniveau.
 
3. Øjenirriterende stoffer, som inducerer læsioner, der forsvinder på mindre 
end 21 dage, og ikke-øjenirriterende stoffer er også testet ved anvendelse af BCOP-testmetoden. BCOP-testmetodens nøjagtighed og pålidelighed for stoffer i disse kategorier er imidlertid ikke vurderet formelt.
 
4. Definitioner findes i tillæg 1.  
INDLEDENDE BETRAGTNINGER OG BEGRÆNSNINGER  
5. Denne testmetode er baseret på Interagency Coordinating Committee on 
the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) BCOP Test Method 
Protocol (8), som blev udviklet efter en international valideringsundersø ­
gelse (4) (5) (9) med bidrag fra European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) og Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM). Protokollen er baseret på oplysninger fra 
Institute for In Vitro Sciences (IIVS) og INVITTOX Protocol 124 (10), 
som er den protokol, der blev anvendt til den af De Europæiske Fælles ­
skaber sponsorerede prævalideringsundersøgelse af BCOP-assayet, som blev gennemført i 1997-1998. Begge disse protokoller er baseret på 
BCOP-assaymetodikken, som først blev rapporteret af Gautheron  
et al.  (11).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. De identificerede begrænsninger for denne testmetode er baseret på de høje 
falsk positiv-rater for alkoholer og ketoner og den høje falsk negativ-rate 
for faste stoffer i valideringsdatabasen (se punkt 44) (5). Når stoffer i disse kemiske og fysiske stofgrupper udelukkes fra databasen, forbedres BCOP's nøjagtighed på tværs af EU-, EPA- og GHS-klassificeringssystemerne 
væsentligt (5). Som følge af formålet med dette assay (dvs. alene identi ­
fikation af øjenætsende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer) er falsk negativ-rater ikke kritiske, eftersom sådanne stoffer efterfølgende vil blive testet hos kaniner eller med andre tilstrækkeligt validerede  in vitro - 
test, alt efter de forskriftsmæssige krav, ved anvendelse af en sekventiel 
testningsstrategi med en »weight of evidence«-tilgang. Den nuværende valideringsdatabase har desuden ikke muliggjort en tilstrækkelig vurdering af visse kemiske stofgrupper eller produktgrupper (f.eks. blandinger). 
Undersøgerne vil imidlertid kunne overveje at anvende denne testmetode 
til alle typer af testmateriale (herunder blandinger), hvor et positivt resultat vil kunne accepteres som indikativt for en øjenætsningsrespons eller svær øjenirritationsrespons. Positive resultater for alkoholer eller ketoner bør 
dog fortolkes med forsigtighed som følge af risikoen for overfortolkning.
 
7. Alle procedurer med okseøjne og oksecorneae skal følge testfacilitetens 
gældende forskrifter og procedurer for håndtering af animalske materialer, 
hvilket omfatter, men ikke er begrænset til, væv og vævsvæsker. Det 
anbefales at benytte universale laboratorieforsigtighedsregler (12).  
8. Testmetoden har den begrænsning, at selv om den tager højde for nogle af 
de øjenvirkninger, som vurderes i kaninøjenirritationstestmetoden, og til en 
vis grad deres sværhedsgrad, tager den ikke højde for conjunctiva- og 
irisskader. Desuden kan reversibiliteten af cornealæsioner ikke vurderes i sig selv med BCOP-assayet, men det er på grundlag af kaninøjenunder ­
søgelser foreslået, at en vurdering af den indledende cornealæsionsdybde 
kan anvendes til at skelne mellem irreversible og reversible virkninger (13). Endelig muliggør BCOP-testmetoden ikke vurdering af den potenti ­
elle systemiske toksicitet i forbindelse med øjeneksponering.
 
9. Der er bestræbelser i gang for yderligere at karakterisere anvendeligheden 
af og begrænsningerne for BCOP-assayet til identifikation af ikke-stærkt irriterende stoffer og ikke-irriterende stoffer (se også punkt 45). Brugerne opfordres også til at forsyne valideringsorganisationer med prøver og/eller 
data med henblik på formel vurdering af mulige fremtidige anvendelser af 
BCOP-testmetoden, herunder anvendelse til identifikation af ikke-stærkt irriterende stoffer og ikke-irriterende stoffer.
 
10. Ethvert laboratorium bør, når det påbegynder brug af dette assay, benytte 
kompetencekemikalierne i tillæg 2. Et laboratorium kan benytte disse kemikalier til at godtgøre sin tekniske kompetence vedrørende brug af BCOP-testmetoden, inden det påbegynder fremsendelse af 
BCOP-assaydata med henblik på forskriftsmæssig fareklassificering.
 
PRINCIP FOR TESTMETODEN  
11. BCOP-testmetoden er en organotypisk model, som kortvarigt opretholder 
normal fysiologisk og biokemisk funktion af oksecornea  in vitro . Ved 
denne testmetode vurderes teststoffets beskadigende virkning ved kvanti ­
tative målinger af ændringer i cornea-uklarhed og -permeabilitet med henholdsvis et opacitometer og et spektrofotometer til synligt lys. Begge målinger anvendes til at beregne en IVIS, som anvendes til at tildele en  in 
vitro -irritationsfareklassificeringskategori med henblik på forudsigelse af et 
teststofs  in vivo -øjenirritationspotentiale (se Beslutningskriterier).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. I BCOP-testmetoden anvendes isolerede corneae fra øjnene fra friskslagtet 
kvæg. Cornea-uklarhed måles kvantitativt som omfanget af lystransmission 
gennem cornea. Permeabilitet måles kvantitativt som mængden af farve ­
stoffet natriumfluorescein, der passerer gennem den fulde tykkelse af cornea som detekteret i mediet i det bageste kammer. Teststofferne tilføres 
til cornea-epiteloverfladen ved tilsætning til corneaholderens forreste 
kammer. I tillæg 3 findes en beskrivelse af og et diagram over en cornea ­
holder, som anvendes i BCOP-testmetoden. Corneaholdere kan købes i handelen fra forskellige kilder eller konstrueres.
 
Kilde til okseøjne og deres alder samt udvælgelse af dyrearter  
13. Kvæg, som sendes til slagterier, aflives typisk enten med henblik på 
anvendelse til konsum eller anden kommerciel udnyttelse. Kun raske dyr, som anses for egnede til at indgå i menneskets fødekæde, anvendes som kilde til corneae til brug i BCOP-testen. Eftersom vægtintervallet for 
kvæg er bredt og afhænger af race, alder og køn, er der ingen anbefalet 
vægt for dyrene på slagtetidspunktet.
 
14. Der kan forekomme variationer i corneadimensioner ved anvendelse af 
øjne fra dyr med forskellig alder. Corneae med en vandret diameter > 30,5 mm og værdier for den centrale corneatykkelse (CCT) på 
≥ 1 100 μm stammer i almindelighed fra kvæg, som er mere end otte år 
gamle, mens corneae med en vandret diameter < 28,5 mm og CCT < 900 μm i almindelighed stammer fra kvæg, som er mindre end fem år 
gamle (14). Derfor anvendes der typisk ikke øjne fra kvæg, som er mere 
end 60 måneder gamle. Øjne fra kvæg, som er mindre end 12 måneder 
gamle, har traditionelt ikke været anvendt, eftersom disse øjne stadig er i udviklingsfasen, og corneatykkelsen og -diameteren er betydeligt mindre 
end det rapporterede for øjne fra voksent kvæg. Anvendelse af corneae fra 
yngre (dvs. 6-12 måneder gamle) dyr er imidlertid tilladelig, eftersom det giver visse fordele, såsom øget tilgængelighed, et snævert aldersinterval og nedsat risiko for potentiel arbejdstagereksponering for bovin spongiform 
encefalopati (BSE) (15). Da yderligere vurdering af betydningen af corne ­
astørrelse eller -tykkelse for responsen på ætsende og irriterende stoffer ville være nyttig, opfordres brugerne til at rapportere den estimerede alder og/eller vægt for de dyr, hvorfra de corneae, der undersøges, stammer.
 
Indsamling og transport af øjne til laboratoriet  
15. Øjnene indsamles af slagteriarbejdere. For at minimere mekanisk og anden 
beskadigelse af øjnene skal de enukleeres hurtigst muligt efter dyrenes aflivning. For at hindre, at øjnene eksponeres for potentielt irriterende stoffer, må slagteriarbejderne ikke anvende rensemiddel, når de skyller 
dyrenes hoveder.
 
16. Øjnene skal nedsænkes helt i Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) i en 
beholder med en passende størrelse og transporteres til laboratoriet på en sådan måde, at ødelæggelse og/eller bakteriekontaminering minimeres. Eftersom øjnene indsamles under slagteprocessen, vil de kunne blive 
eksponeret for blod og andre biologiske substanser, herunder bakterier 
og andre mikroorganismer. Det er derfor vigtigt at sikre, at risikoen for kontaminering minimeres (f.eks. ved at opbevare beholderen med øjnene på våd is, ved at tilsætte antibiotika til den HBSS, som øjnene opbevares i 
under transport [f.eks. penicillin i en koncentration på 100 IE/ml og strep ­
tomycin i en koncentration på 100 mg/ml]).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Tidsintervallet mellem indsamling af øjnene og anvendelsen af corneae i 
BCOP-testen skal minimeres (typisk indsamling og anvendelse samme 
dag), og det skal påvises, at intervallets varighed ikke påvirker assayre ­
sultaterne negativt. Disse resultater er baseret på udvælgelseskriterierne for øjnene, såvel som de positive og negative kontrolresponser. Alle de øjne, 
som anvendes i assayet, skal stamme fra samme gruppe øjne, som er 
indsamlet på en bestemt dag.
 
Udvælgelseskriterier for øjne, der anvendes i BCOP-testen  
18. Når øjnene er ankommet til laboratoriet, undersøges de omhyggeligt for 
defekter, herunder øget uklarhed, ridser og neovaskularisering. Der 
anvendes kun corneae fra øjne, som er fri for sådanne defekter.  
19. Kvaliteten af hver enkelt cornea vurderes også på senere assaytrin. 
Corneae med en uklarhed på mere end syv uklarhedsenheder (BEMÆRK: 
opacitometeret skal kalibreres med uklarhedsstandarder, som anvendes til at fastlægge uklarhedsenhederne, se tillæg 3) efter en indledende entimes 
ligevægtsindstillingsperiode skal kasseres.
 
20. Hver behandlingsgruppe (teststof, samtidige negative og positive kontrol ­
ler) består af minimum tre øjne. Der skal anvendes tre corneae som nega ­
tive kontrolcorneae i BCOP-assayet. Eftersom alle corneae ekscideres fra 
det hele øjeæble og anbringes i corneakamrene, er der mulighed for hånd ­
teringsforårsagede artefakter i de individuelle cornea-uklarheds- og -per ­
meabilitetsværdier (inklusive negativ kontrol). Uklarheds- og permeabili ­
tetsværdierne for de corneae, der fungerer som negativ kontrol, anvendes 
desuden til at korrigere uklarheds- og -permeabilitetsværdierne for testar ­
tikel- og positiv kontrol-behandlede corneae i IVIS-beregningerne.  
TESTPROCEDURE  
Klargøring af øjnene  
21. Corneae, som er fri for defekter, fridissekeres således, at der stadig er en 2- 
3 mm sclerakant tilbage til hjælp ved efterfølgende håndtering, idet det tilstræbes at undgå at beskadige cornea-epitelet og -endotelet. Isolerede 
corneae anbringes i specialdesignede corneaholdere, der består af forreste 
og bageste rum, som grænser op til henholdsvis epitel- og endotelsiden af cornea. Begge kamre fyldes rigeligt op med forvarmet Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (bageste kammer først), idet det sikres, at der 
ikke dannes bobler. Derpå bringes anordningen i ligevægt ved 32 ± 1 °C i 
mindst en time for at gøre det muligt for corneae at komme i ligevægt med mediet og opnå normal metabolisk aktivitet i den grad, det er muligt (den tilnærmelsesvise temperatur af cornea-overfladen  in vivo  er 32 °C).
 
22. Efter ligevægtsindstillingsperioden tilsættes frisk forvarmet EMEM til 
begge kamre, og der aflæses basislinje-uklarhed for hver cornea. Alle corneae, som har makroskopisk vævsbeskadigelse (f.eks. ridser, pigmente ­
ring, neovaskularisering) eller en uklarhed > 7 uklarhedsenheder, kasseres. 
Den gennemsnitlige uklarhed for alle corneae, som er bragt i ligevægt, beregnes. Minimum tre corneae med uklarhedsværdier tæt på medianvær ­
dien for alle corneae udvælges som negative (eller opløsningsmiddel-) 
kontrolcorneae. De resterende corneae fordeles derpå i en behandlings ­
gruppe og en positiv kontrolgruppe.
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Eftersom varmekapaciteten for vand er højere end for luft, giver vand mere 
stabile temperaturbetingelser til inkubering. Derfor anbefales det at benytte 
et vandbad til at holde corneaholderen og dens indhold ved 32 ± 1 °C. Der kan dog også anvendes luftinkubatorer under forudsætning af omhyggelig opretholdelse af temperaturstabilitet (f.eks. ved forvarmning af holdere og 
medier).
 
Applikation af teststoffet  
24. Der anvendes to forskellige behandlingsprotokoller - en for væsker og 
overfladeaktive stoffer (faste stoffer eller væsker) og en for 
ikke-overfladeaktive stoffer.  
25. Væsker testes ufortyndede, mens overfladeaktive stoffer testes ved en 
koncentration på 10 % vægt/volumen i en 0,9 % natriumchloridopløsning, destilleret vand eller et andet opløsningsmiddel, som er påvist ikke at 
påvirke testsystemet negativt. Halvfaste stoffer, cremer og vokser testes 
typisk som væsker. Der skal gives passende begrundelse for alternative fortyndingskoncentrationer. Corneae eksponeres for væsker og overflade ­
aktive stoffer i 10 minutter. Anvendelse af andre eksponeringstider skal 
ledsages af tilstrækkeligt videnskabeligt rationale.
 
26. Ikke-overfladeaktive faste stoffer testes typisk som opløsninger eller 
opslæmninger ved en koncentration på 20 % i en 0,9 % natriumchloridop ­
løsning, destilleret vand eller et andet opløsningsmiddel, som er påvist ikke at påvirke testsystemet negativt. Under visse omstændigheder og 
med behørig videnskabelig begrundelse kan faste stoffer også testes i 
ren form ved direkte applikation på cornea-overfladen ved anvendelse af metoden med åbent kammer (se punkt 29). Corneae eksponeres for faste stoffer i fire timer, men som for væsker og overfladeaktive stoffer kan der 
anvendes alternative eksponeringstider med tilstrækkeligt videnskabeligt 
rationale.
 
27. Der kan anvendes forskellige behandlingsmetoder alt efter teststoffets 
fysiske natur og kemiske egenskaber (f.eks. faste stoffer, væsker, viskøse kontra ikke-viskøse væsker). I den forbindelse er det absolut påkrævet at sikre, at teststoffet dækker epiteloverfladen tilstrækkeligt, og 
at det fjernes tilstrækkeligt under skylletrinene. Der anvendes typisk en 
metode med lukket kammer for ikke-viskøse til let viskøse flydende test ­
stoffer, mens der typisk anvendes en metode med åbent kammer for halv ­
viskøse og viskøse flydende teststoffer og for rene faste stoffer.
 
28. Ved metoden med lukket kammer indføres der tilstrækkeligt teststof (750 
μl) til at dække cornea-epitelsiden i det forreste kammer gennem dose ­
ringshullerne på kammerets overside, og hullerne lukkes efterfølgende med kammerpropperne under eksponeringen. Det er vigtigt at sikre, at hver cornea eksponeres for et teststof i det rette tidsinterval.
 
29. Ved metoden med åbent kammer fjernes vindueslåseringen og glasvinduet 
fra det forreste kammer inden behandling. Kontrol- eller teststoffet (750 μl 
- nok teststof til at dække cornea helt) påføres direkte på 
cornea-epiteloverfladen ved anvendelse af en mikropipette. Hvis et teststof er vanskeligt at pipettere, kan teststoffet fyldes i en pipette med positiv fortrængning under tryk som hjælp til dosering. Pipettespidsen på pipetten 
med positiv fortrængning indsættes i sprøjtens doseringsspids, således at 
materialet kan fyldes over i fortrængningsspidsen under tryk. Samtidig trykkes sprøjtestemplet ned, efterhånden som pipettestemplet trækkes opad. Hvis der dukker luftbobler op i pipettespidsen, fjernes testartiklen 
(den presses ud), og processen gentages, indtil spidsen er fyldt uden luft ­
bobler. Om nødvendigt kan der anvendes en normal sprøjte (uden kanyle), eftersom en sådan sprøjte dels muliggør afmåling af et nøjagtigt volumen teststof og dels letter applikation på cornea-epiteloverfladen. Efter dose ­
ringen sættes glasvinduet på plads på det forreste kammer for at genskabe 
et lukket system.
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubering efter eksponering  
30. Efter eksponeringsperioden fjernes teststoffet, den negative kontrol eller 
det positive kontrolstof fra det forreste kammer, og epitelet vaskes mindst 
tre gange (eller indtil der ikke længere er synlige tegn på teststof) med EMEM (som indeholder phenolrødt). Der anvendes phenolrødt-holdigt medium til skylning, eftersom et farveskift for phenolrødt kan anvendes 
som indikator for effektiviteten af bortskylning af sure eller basiske mate ­
rialer. Corneae vaskes mere end tre gange, hvis indikatoren phenolrødt stadig er misfarvet (gul eller violet), eller hvis teststoffet stadig er synligt. Når teststoffet er fjernet fra mediet, foretages en afsluttende skylning af 
corneae med EMEM (uden phenolrødt). EMEM (uden phenolrødt) 
anvendes til afsluttende skylning for at sikre fjernelse af phenolrødt fra det forreste kammer inden uklarhedsmålingen. Derefter fyldes det forreste kammer igen med frisk EMEM uden phenolrødt.
 
31. For væsker eller overfladeaktive stoffer inkuberes corneae efter skylning i 
yderligere to timer ved 32 ± 1 °C. Længere tid efter eksponering kan være 
nyttig under visse omstændigheder og kan overvejes i hvert enkelt tilfælde. Corneae, som er behandlet med faste stoffer, skylles grundigt ved afslut ­
ningen af den fire timer lange eksponeringsperiode, men kræver ikke 
yderligere inkubering.
 
32. Ved afslutningen af inkuberingsperioden efter eksponeringen for væsker 
og overfladeaktive stoffer og ved afslutningen af den fire timer lange 
eksponeringsperiode for ikke-overfladeaktive faste stoffer registreres uklar ­
heden og permeabiliteten for hver cornea. Desuden observeres hver cornea visuelt, og væsentlige observationer registreres (f.eks. vævsafskalning, 
resterende teststof, uensartede uklarhedsmønstre). Disse observationer 
kan være vigtige, da de kan give sig udslag i variationer i opacitometer ­
aflæsningerne.
 
Kontrolstoffer  
33. Der indgår samtidige negative eller opløsningsmiddel/vehikel-kontroller og 
positive kontroller i hvert forsøg.  
34. Ved test af et flydende stof i en koncentration på 100 % medtages der ved 
BCOP-testmetoden en samtidig negativ kontrol (f.eks. 0,9 % natriumchlo ­
ridopløsning eller destilleret vand), således at der kan detekteres ikke-specifikke ændringer i testsystemet og opnås en basislinje for assayets endepunkter. Det sikrer også, at assaybetingelserne ikke fejlagtigt resul ­
terer i en irritationsrespons.
 
35. Ved test af fortyndet væske, overfladeaktivt stof eller fast stof medtages 
der ved BCOP-testmetoden en samtidig opløsningsmiddel/vehikel-kontrol ­
gruppe, således at der kan detekteres ikke-specifikke ændringer i testsy ­
stemet og opnås en basislinje for assayets endepunkter. Kun et opløsningsmiddel/vehikel, som er påvist ikke at påvirke testsystemet nega ­
tivt, kan anvendes.
 
36. Der medtages et kendt øjenirriterende stof som samtidig positiv kontrol i 
hvert forsøg for at verificere, at der induceres en passende respons. Eftersom BCOP-assayet anvendes i denne testmetode til identifikation af ætsende eller stærkt irriterende stoffer, skal den positive kontrol ideelt set 
være et referencestof, som inducerer en svær respons ved denne testme ­
tode. For at sikre, at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør størrelsesordenen af irritationsresponsen imid ­
lertid ikke være overdrevent stor.
 
37. Eksempler på positive kontroller for flydende teststoffer er dimethylfor ­
mamid eller 1 % natriumhydroxid. Et eksempel på en positiv kontrol for 
faste teststoffer er 20 % (vægt/volumen) imidazol i 0,9 % natriumchlori ­
dopløsning.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Referencestoffer er nyttige i forbindelse med vurdering af øjenirritations ­
potentialet for ukendte kemikalier fra en særlig kemisk stofgruppe eller 
produktgruppe eller vurdering af det relative irritationspotentiale for et øjenirriterende stof inden for et specifikt område af irritationsresponser.
 
Målte endepunkter  
39. Uklarhed bestemmes ud fra omfanget af lystransmission gennem cornea. 
Cornea-uklarhed måles kvantitativt ved hjælp af et opacitometer, hvorved der opnås uklarhedsværdier målt på en kontinuert skala.
 
40. Permeabilitet bestemmes ud fra mængden af farvestoffet natriumfluore ­
scein, der trænger gennem alle corneacellelag (dvs. fra epitelet på den udvendige cornea-overflade til endotelet på den indvendige 
cornea-overflade). Der tilsættes 1 ml natriumfluoresceinopløsning (hen ­
holdsvis 4 mg/ml ved test af væsker og overfladeaktive stoffer og 5 mg/ml ved test af ikke-overfladeaktive faste stoffer) til det forreste kammer i corneaholderen, som grænser op til epitelsiden af cornea, 
mens det bageste kammer, som grænser op til endotelsiden af cornea, 
fyldes med frisk EMEM. Derpå inkuberes holderen i vandret position i 90 ± 5 min ved 32 ± 1 °C. Mængden af natriumfluorescein, der kommer ind i det bageste kammer, måles kvantitativt ved hjælp af UV/VIS-spek ­
trofotometri. Spektrofotometriske målinger vurderet ved 490 nm registreres 
som OD
 490 - (OD = optisk tæthed) eller absorbansværdier, som måles på 
en kontinuert skala. Fluoresceinpermeabilitetsværdierne bestemmes ved anvendelse af OD
 490 -værdier, som er opnået med et spektrofotometer til 
synligt lys ved brug af en 1 cm standardvejlængde.  
41. Der kan alternativt anvendes en 96-brønds mikrotiterpladeaflæser, forudsat 
at (i) pladeaflæserens lineære interval for bestemmelse af 
fluorescein-OD  490 -værdier kan fastlægges; og at (ii) volumenet af fluore ­
sceinprøverne i 96-brønds pladen er korrekt, således at der opnås OD  490 - 
værdier svarende til 1 cm standardvejlængden (dette kan kræve en helt 
fuld brønd [sædvanligvis 360 ml]).  
DATA OG RAPPORTERING  
Datavurdering  
42. Efter at uklarhedsværdier og gennemsnitlige permeabilitets-(OD  490 -)vær­
dier er korrigeret for baggrundsuklarheds- og negativ 
kontrol-permeabilitets-OD  490 -værdier, skal den gennemsnitlige uklarheds ­
værdi og den gennemsnitlige permeabilitets-OD  490 -værdi for hver behand ­
lingsgruppe kombineres i en empirisk udledt formel for at beregne en  in 
vitro -irritationsscore (IVIS) for hver behandlingsgruppe som følger:  
IVIS = gennemsnitlig uklarhedsværdi + (15 × gennemsnitlig 
permeabilitets-OD  490 -værdi)  
Sina et al. (16) rapporterede, at denne formel blev udledt under interne og 
sammenlignende laboratorieundersøgelser. Data genereret for i alt 36 
forbindelser i en undersøgelse med deltagelse af flere laboratorier blev underkastet flerdimensional analyse for at bestemme ligningen for den bedste tilpasning mellem in vivo- og in vitro-data. Denne analyse blev 
udført af forskere i to forskellige virksomheder, som udledte næsten iden ­
tiske ligninger.
 
43. Uklarheds- og permeabilitetsværdierne bør også vurderes uafhængigt for at 
fastslå, om et teststof kun inducerede ætsning eller stærk irritation ud fra ét 
af de to endepunkter (se Beslutningskriterier).  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Beslutningskriterier  
44. Et stof, som inducerer en IVIS ≥ 55,1, defineres som et ætsende stof eller 
stærkt irriterende stof. Som anført i punkt 1 skal der, hvis teststoffet ikke 
identificeres som øjenætsende stof eller stærkt øjenirriterende stof, gennemføres yderligere testning med henblik på klassificering og mærk ­
ning. BCOP-testmetoden har en generel nøjagtighed på 79 % (113/143) til 
81 % (119/147), en falsk positiv-rate på 19 % (20/103) til 21 % (22/103) 
og en falsk negativ-rate på 16 % (7/43) til 25 % (10/40) i sammenligning med in vivo -kaninøjentestmetodedata klassificeret i henhold til EPA- (1), 
EU- (2) eller GHS- (3) klassificeringssystemerne. Når stoffer i visse 
kemiske (dvs. alkoholer, ketoner) eller fysiske (dvs. faste stoffer) stof ­
grupper udelukkes fra databasen, ligger nøjagtigheden af BCOP på tværs af EU-, EPA- og GHS-klassificeringssystemerne fra 87 % (72/83) til 92 % (78/85), falsk positiv-raterne ligger fra 12 % (7/58) til 16 % (9/56), og 
falsk negativ-raterne ligger fra 0 % (0/27) til 12 % (3/26).
 
45. Selv hvis der ikke opnås en klassificering som øjenætsende stof eller 
stærkt øjenirriterende stof for et teststof, kan BCOP-dataene være nyttige sammen med testdata fra  in vivo -kaninøjentesten eller fra en tilstrækkeligt 
valideret  in vitro -test til yderligere vurdering af anvendeligheden af og 
begrænsningerne for BCOP-testmetoden til identifikation af ikke-stærkt irriterende stoffer og ikke-irriterende stoffer (et Guidance Document om anvendelse af  in vitro -øjentoksicitetstestmetoder er under udarbejdelse).
 
Undersøgelsesacceptkriterier  
46. En test betragtes som acceptabel, hvis den positive kontrol giver en IVIS, 
der er inden for to standardafvigelser fra det aktuelle historiske gennem ­
snit, som skal ajourføres mindst hver tredje måned eller hver gang, der 
gennemføres en acceptabel test på laboratorier, hvor der sjældent gennem ­
føres test (dvs. sjældnere end en gang om måneden). Negative eller opløsningsmiddel/vehikel-kontrolresponser skal resultere i uklarheds- og permeabilitetsværdier, der er mindre end de fastsatte øvre grænser for 
baggrundsuklarheds- og -permeabilitetsværdier for oksecorneae behandlet 
med den respektive negative kontrol eller opløsningsmiddel/ vehikel-kontrol.
 
Testrapport  
47. Testrapporten skal omfatte følgende oplysninger, hvis de er relevante for 
undersøgelsens gennemførelse:  
Test- og kontrolstoffer  
Kemisk(e) navn(e), såsom det strukturnavn, der anvendes af Chemical 
Abstracts Service (CAS), efterfulgt af andre navne, hvis sådanne kendes;  
CAS-registreringsnummeret (RN), hvis det kendes;  
renhed og sammensætning af stoffet eller blandingen (i vægtprocent) i det 
omfang, disse oplysninger er tilgængelige;  
fysisk-kemiske egenskaber, såsom fysisk tilstand, flygtighed, pH, stabilitet, 
kemisk stofgruppe og vandopløselighed, som er relevante for undersøgel ­
sens gennemførelse;  
behandling af test/kontrol-stofferne inden testning, hvis det er relevant 
(f.eks. opvarmning, formaling);  
stabilitet, hvis den kendes.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Oplysninger om sponsoren og testfaciliteten  
Navn og adresse på sponsoren, testfaciliteten og undersøgelseslederen;  
identifikation af kilden til øjnene (dvs. den facilitet, hvor de er indsamlet);  
opbevarings- og transportbetingelser for øjnene (f.eks. dato og klokkeslæt 
for øjenindsamling, tidsinterval inden påbegyndelse af testning, transport ­
medier og temperaturbetingelser, eventuelle anvendte antibiotika);  
særlige karakteristika ved de dyr, som øjnene er indsamlet fra (f.eks. 
donordyrenes alder, køn, vægt), hvis de er tilgængelige.  
Begrundelse for den anvendte testmetode og protokol  
Testmetodeintegritet  
Den procedure, som anvendes til at sikre integriteten (dvs. nøjagtighed og 
pålidelighed) af testmetoden over tid (f.eks. periodisk testning af kompe ­
tencestoffer, anvendelse af historiske negative og positive kontroldata).  
Kriterier for en acceptabel test  
Acceptable samtidige positive og negative kontrolintervaller på grundlag af 
historiske data;  
acceptable samtidige referencekontrolintervaller på grundlag af historiske 
data, hvis det er relevant.  
Testbetingelser  
Beskrivelse af det anvendte testsystem;  
den anvendte corneaholdertype;  
kalibreringsoplysninger for udstyr anvendt til måling af uklarhed og 
permeabilitet (f.eks. opacitometer og spektrofotometer);  
oplysninger om de anvendte oksecorneae, herunder specifikation af deres 
kvalitet;  
detaljer om den anvendte testprocedure;  
anvendt(e) teststofkoncentration(er);  
beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren;  
reference til historiske data for modellen (f.eks. negative og positive 
kontroller, kompetencestoffer, referencestoffer);  
beskrivelse af de anvendte vurderingskriterier.  
Resultater  
Angivelse i tabelform af data fra hver enkelt testprøve (f.eks. uklarheds- 
og OD  490 -værdier og beregnet IVIS for teststoffet og de positive kontrol ­
ler, negative kontroller og referencekontrollerne [hvis de er medtaget] 
rapporteret i tabelform, herunder data fra flergangsbestemmelser/gentagne bestemmelser, hvis det er relevant, og gennemsnit ± standardafvigelsen for hvert forsøg);
 
beskrivelse af andre observerede virkninger.  
Diskussion af resultaterne  
Konklusion  
LITTERATUR  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B- 
96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 
16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af 
stoffer og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006 (EØS-relevant tekst). EUT L 353 af 31.12.2008, s. 1.
 
(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York 
& Geneva: United Nations Publications, 2007. Se følgende websted:  
[http://www.unece.org /trans/danger/publi/ghs/g hs_rev02/02files_e.html].  
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants (Erklæ ­
ring om konklusionen på den retrospektive ICCVAM-undersøgelse af organotypiske  in vitro -assays som screeningstest til identifikation 
af potentielle øjenætsende stoffer og stærkt øjenirriterende stoffer). 
Se følgende websted:
 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
(6) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 
18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af 
samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommis ­
sionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 
76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF. EUT L 396 af 30.12.2006, s. 1.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Se følgende websted:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html].  
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol. I: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants 
and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
(9) ICCVAM (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal 
Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06- 
4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm].  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. 
Ispra, Italien: European Centre for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the 
Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of 
Infectious Agents in Healthcare Settings. Se følgende websted:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106-117.
 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  
Can. J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl 
Toxicol  26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background Review Document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm].  
(18) ICCVAM (2006). Background Review Document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Se følgende 
websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm].  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Cornea:  Den transparente del af øjeæblets forside, som dækker øjets iris og 
pupil, og hvorigennem lys kommer ind i øjets indre.  
Corneapermeabilitet:  Kvantitativ måling af beskadigelsen af cornea-epitelet ud 
fra bestemmelse af mængden af farvestoffet natriumfluorescein, der trænger gennem alle corneacellelag.
 
Cornea-uklarhed:  Måling af graden af cornea-uigennemsigtighed efter ekspone ­
ring for et teststof. Øget cornea-uklarhed er indikativt for beskadigelse af cornea. Uklarhed kan vurderes subjektivt som i Draize-kaninøjentesten eller objektivt med et instrument, såsom et »opacitometer«.
 
EPA-kategori I:  Ætsende virkning (irreversibel ødelæggelse af øjenvæv) eller 
corneabeskadigelse eller -irritation, som persisterer mere end 21 dage (1).  
EU-kategori R41:  Frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller alvorlig fysisk 
synsnedsættelse, som opstår efter applikation af et teststof på øjets anteriore overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter applikation (2).
 
Falsk negativ-rate:  Den andel af alle positive stoffer, som ved en testmetode 
fejlagtigt identificeres som negative. Dette er én indikator for testmetodens ydeevne.
 
Falsk positiv-rate:  Den andel af alle negative stoffer, som ved en testmetode 
fejlagtigt identificeres som positive. Dette er én indikator for testmetodens 
ydeevne.  
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of 
Chemicals [det globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier]):  Et system til klassificering af kemikalier (stoffer og blandinger) 
efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare 
med tilhørende kommunikationselementer, såsom piktogrammer, signalord, risi ­
kosætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om stoffernes og blandingernes skadelige virkninger kan videreformidles med 
henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportø ­
rer, forbrugere og redningspersonel) og miljø (3).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHS-kategori 1:  Frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller alvorlig fysisk 
synsnedsættelse, som opstår efter applikation af et teststof på øjets anteriore 
overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter applikation (3).  
Ikke-irriterende stof:  Stoffer, der ikke er klassificeret som øjenirriterende stoffer 
i EPA-kategori I, II eller III, EU-kategori R41 eller R36 eller GHS-kategori 1, 2A eller 2B.
 
In vitro -irritationsscore (IVIS):  En empirisk udledt formel, som anvendes i 
BCOP-assayet, og hvorved den gennemsnitlige uklarhedsværdi og den gennem ­
snitlige permeabilitetsværdi for hver behandlingsgruppe kombineres i en enkelt  in 
vitro -score for hver behandlingsgruppe.  IVIS  = gennemsnitlig 
uklarhedsværdi + (15 x gennemsnitlig permeabilitetsværdi).  
Negativ kontrol:  Et ubehandlet replikat, som indeholder alle komponenterne fra 
et testsystem. Denne prøve behandles sammen med de teststofbehandlede prøver 
og andre kontrolprøver for at fastslå, om opløsningsmidlet interagerer med test ­
systemet.  
Nøjagtighed:  Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede 
referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af »relevans«. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans« forstået som 
den andel korrekte udfald, testmetoden fører til.
 
Opacitometer:  Et instrument, som anvendes til at måle »cornea-uklarhed« ved 
kvantitativ vurdering af lystransmission gennem cornea. Det typiske instrument har to rum, som hver har sin egen lyskilde og fotocelle. Det ene rum anvendes til den behandlede cornea, mens det andet anvendes til at kalibrere og nulstille 
instrumentet. Lys fra en halogenlampe sendes gennem et kontrolrum (et væske ­
tomt kammer uden vinduer) til en fotocelle og sammenlignes med det lys, som er sendt gennem forsøgsrummet, som rummer kammeret med cornea, til en foto ­
celle. Forskellen i lystransmission fra fotocellerne sammenlignes, og der vises en 
numerisk uklarhedsværdi på et digitalt display.
 
Opløsningsmiddel/vehikel-kontrol:  En ubehandlet prøve, som indeholder alle 
komponenterne fra et testsystem, herunder opløsningsmidlet eller vehiklet, og som behandles sammen med de teststofbehandlede prøver og andre kontrolprøver for at fastlægge basislinjeresponsen for de prøver, som er behandlet med test ­
stoffet opløst i det samme opløsningsmiddel eller vehikel. Ved test sammen med 
en samtidig negativ kontrol påviser denne prøve også, hvorvidt opløsningsmidlet eller vehiklet interagerer med testsystemet.
 
Positiv kontrol:  Et replikat, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem 
og er behandlet med et stof, som vides at inducere en positiv respons. For at 
sikre, at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over 
tid, bør størrelsesordenen af den svære respons ikke være overdrevent stor.  
Potentiel fare:  Den iboende egenskab ved et middel eller en situation, som kan 
forårsage skade, når en organisme, et system eller en (sub)population eksponeres for det pågældende middel.
 
Pålidelighed:  Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i 
og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme 
protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarheden inden for og mellem laboratorier og repeterbarheden inden for laboratorier.
 
Referencestof:  Et stof, som anvendes som standard til sammenligning med et 
teststof. Et referencestof skal have følgende egenskaber: (i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; (ii) strukturel og funktionel lighed med den stof ­
gruppe, der testes; (iii) kendte fysiske/kemiske egenskaber; (iv) støttedata om 
kendte virkninger og (v) kendt styrke i det ønskede responsområde.
 
Stærkt øjenirriterende stof:  (a) Et stof, som forårsager vævsbeskadigelse i øjet 
efter applikation på øjets anteriore overflade, som ikke er forsvundet inden for 21 dage efter applikation, eller som forårsager alvorlig fysisk synsnedsættelse; (b) 
stoffer, der er klassificeret som øjenirriterende stoffer i GHS-kategori 1, 
EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Trindelt testning:  Ved anvendelse af den trindelte testningsstrategi gennemgås 
alle eksisterende oplysninger om et teststof i en bestemt rækkefølge ved anven ­
delse af en »weight of evidence«-proces på hvert trin for at fastslå, om der foreligger tilstrækkelige oplysninger til at træffe en fareklassificeringsafgørelse, inden der fortsættes til næste trin. Hvis et teststofs irritationspotentiale kan fast ­
sættes på grundlag af de eksisterende oplysninger, er der ikke behov for yder ­
ligere testning. Hvis et teststofs irritationspotentiale ikke kan fastsættes på grundlag af de eksisterende oplysninger, udføres en trinvis sekventiel dyrefor ­
søgsprocedure, indtil der kan foretages en utvetydig klassificering.
 
Valideret testmetode:  En testmetode, for hvilken der er gennemført validerings ­
undersøgelser for at fastslå relevansen (herunder nøjagtigheden) og pålidelig ­
heden til et bestemt formål. Det er vigtigt at være opmærksom på, at en valideret testmetode måske ikke har tilstrækkelig ydeevne med hensyn til nøjagtighed og pålidelighed til at være acceptabel til det planlagte formål.
 
»Weight of evidence«:  En proces, hvor styrkerne og svaghederne ved forskellige 
oplysninger afvejes for at nå frem til og underbygge en konklusion om et stofs 
farepotentiale.  
Øjenirriterende stof:  (a) Et stof, der frembringer en reversibel ændring i øjet 
efter applikation på øjets anteriore overflade; (b) stoffer, der er klassificeret som 
øjenirriterende stoffer i EPA-kategori II eller III, EU-kategori R36 eller 
GHS-kategori 2A eller 2B (1) (2) (3).  
Øjenætsende stof:  (a) Et stof, som forårsager irreversibel vævsbeskadigelse i 
øjet; (b) stoffer, der er klassificeret som øjenirriterende stoffer i GHS-kategori 1, EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Tillæg 2  
Kompetencestoffer til BCOP-testmetoden  
Inden laboratorier påbegynder rutinemæssig brug af en testmetode, der følger 
denne testmetode, bør de godtgøre deres tekniske kompetence ved korrekt iden ­
tifikation af øjenætsnings-klassificeringen for de ti anbefalede stoffer i tabel 1. Disse stoffer er udvalgt således, at de repræsenterer det responsområde for lokal øjen-irritation/ætsning, som er baseret på resultater fra  in vivo -kaninøjentesten 
(TG 405) (dvs. stoffer, der i henhold til UN GHS er i kategori 1, 2A, 2B 
eller ikke er klassificeret og mærket) (3) (7). Hvad angår den validerede anven ­
delighed af disse assays (dvs. alene til identifikation af øjenætsende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer), er der imidlertid kun to testudfald i relation til klassifi ­
cering (ætsende stof/stærkt irriterende stof eller ikke-ætsende stof/ikke-stærkt 
irriterende stof), hvormed kompetencen kan godtgøres. Andre udvælgelseskrite ­
rier var, at stofferne er kommercielt tilgængelige, at der er tilgængelige  in vivo - 
referencedata af høj kvalitet, og at der findes data af høj kvalitet for de to  in 
vitro -metoder, for hvilke der er Test Guidelines under udarbejdelse. Derfor blev 
irriterende stoffer udvalgt fra den af ICCVAM anbefalede liste over 122 referen ­
cestoffer til validering af  in vitro -øjentoksicitetstestmetoder (se Appendix H, 
ICCVAM Recommended Reference Substances List) (5). Referencedata findes 
i ICCVAM Background Review Documents for BCOP-testmetoden og isoleret kyllingeøje-testmetoden (ICE [Isolated Chicken Eye]-testmetoden) (17) (18).
 
Tabel 1  
Anbefalede stoffer til godtgørelse af teknisk kompetence i anvendelse af BCOP  
Stof CASRN Kemisk 
stof-gruppe (  1 ) Fysisk form  In vivo - 
klassifice ­
ring (  2 ) In vitro -klassificering (  3 ) 
Benzalkoniumch ­
lorid (5 %) 8001-54-5 Oniumforbin ­
delse Flydende Kategori 1 Ætsende stof/stærkt irrite ­
rende stof 
Chlorhexidin 55-56-1 Amin, amidin Fast Kategori 1 Ætsende stof/stærkt irrite ­
rende stof 
Dibenzoyl-L- 
vinsyre 2743-38-6 Carboxylsyre, 
ester Fast Kategori 1 Ætsende stof/stærkt irrite ­
rende stof 
Imidazol 288-32-4 Heterocyklisk Fast Kategori 1 Ætsende stof/stærkt irrite ­
rende stof 
Trichloreddikesyre 
(30 %) 76-03-9 Carboxylsyre Flydende Kategori 1 Ætsende stof/stærkt irrite ­
rende stof 
2,6-dichlor- 
benzoyl- chlorid 4659-45-4 Acylhalogenid Flydende Kategori 2A Ikke-ætsende stof/ikke-stærkt 
irriterende stof 
Ethyl-2-methyla ­
ceto-acetat 609-14-3 Keton, ester Flydende Kategori 2B Ikke-ætsende stof/ikke-stærkt 
irriterende stof 
Ammoniumnitrat 6484-52-2 Uorganisk salt Fast Kategori 2A Ikke-ætsende stof/ikke-stærkt 
irriterende stof  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Stof CASRN Kemisk 
stof-gruppe (  1 ) Fysisk form  In vivo - 
klassifice ­
ring (  2 ) In vitro -klassificering (  3 ) 
Glycerol 56-81-5 Alkohol Flydende Ikke mærket Ikke-ætsende stof/ikke-stærkt 
irriterende stof 
n-hexan 110-54-3 Carbonhydrid 
(acyklisk) Flydende Ikke mærket Ikke-ætsende stof/ikke-stærkt 
irriterende stof  
Forkortelser: CASRN = Chemical Abstracts Service Registry Number 
( 1 ) De kemiske stofgrupper for hvert teststof blev fastsat ved anvendelse af et standardklassificeringsskema baseret på National Library 
of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)-klassificeringssystemet (se følgende websted: http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Baseret på resultater fra  in vivo -kaninøjentesten (OECD TG 405) og brug af UN GHS (3) (7). 
( 3 ) Baseret på resultater fra BCOP og ICE.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Tillæg 3  
BCOP-CORNEAHOLDEREN  
1. BCOP-corneaholderne er fremstillet af et inaktivt materiale (f.eks. polypro ­
pylen). Holderne består af to halvdele (et forreste og et bageste kammer) og har to ens cylindriske indre kamre. Hvert kammer kan rumme et volumen på 
5 ml og er afgrænset af et glasvindue, gennem hvilket der foretages uklar ­
hedsmålinger. Hvert indre kammer har en diameter på 1,7 cm og en dybde på 2,2 cm (
 1 ). Der er anbragt en o-ring på det bageste kammer for at 
forhindre lækager. Corneae anbringes med endotelsiden nedad på de 
bageste kamres o-ring, og de forreste kamre anbringes på epitelsiden af 
corneae. Kamrene holdes på plads med tre rustfri skruer, som er placeret på de udvendige kammerkanter. Der er placeret et glasvindue for enden af hvert kammer, som kan fjernes, så der er let adgang til cornea. Der er også 
anbragt en o-ring mellem glasvinduet og kammeret for at forhindre lækager. 
To huller på hvert kammers overside muliggør tilførsel og fjernelse af medium og testforbindelser. De er lukket med gummihætter i behandlings- og inkuberingsperioderne.
 
Ordforklaring  
Glass disc: Glasplade  
PTFE-O-ring: PTFE-O-ring  
Refill: Påfyldning  
Hanger: Ophæng  
Cap: Hætte  
Nut: Møtrik  
O-ring: O-ring  
Posterior compartment: Bageste kammer  
Anterior compartment: Forreste kammer  
Fixing screws: Fastgørelsesskruer  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) De angivne dimensioner gælder for en corneaholder, som anvendes til køer i alderen fra 
12 til 60 måneder. Hvis der anvendes dyr i alderen fra 6 til 12 måneder, vil holderen i 
stedet skulle konstrueres sådan, at hvert kammer kan rumme et volumen på 4 ml, og 
hvert af de indre kamre har en diameter på 1,5 cm og en dybde på 2,2 cm. For enhver 
nykonstrueret corneaholder er det meget væsentligt, at forholdet mellem det eksponerede 
corneaoverfladeareal og det bageste kammers volumen er det samme som forholdet i den 
traditionelle corneaholder. Det er nødvendigt for at sikre, at permeabilitetsværdierne 
bestemmes korrekt til beregning af IVIS ved hjælp af den foreslåede formel.
 OPACITOMETERET  
2. Opacitometeret er en anordning til måling af lystransmission. Lys fra en 
halogenlampe sendes gennem et kontrolrum (et væsketomt kammer uden 
vinduer) til en fotocelle og sammenlignes med det lys, som er sendt gennem forsøgsrummet, som rummer kammeret med cornea, til en fotocelle. Forskellen i lystransmission fra fotocellerne sammenlignes, og der vises 
en numerisk uklarhedsværdi på et digitalt display. Uklarhedsenhederne fast ­
lægges.
 
3. Opacitometeret skal give en lineær respons for en række uklarhedsaflæs ­
ninger, som omfatter de til de forskellige klassificeringer anvendte tærskel ­
værdier, som er beskrevet med den anvendte Prediction Model (dvs. op til 
den tærskelværdi, som er bestemmende for klassificering som ætsning/stærk 
irritation). For at sikre lineære og nøjagtige aflæsninger op til 75-80 uklar ­
hedsenheder er det nødvendigt at kalibrere opacitometeret ved hjælp af en række kalibratorer. Kalibratorerne (uigennemsigtige polyesterark) anbringes 
i kalibreringskammeret (et corneakammer, som er konstrueret til at rumme 
kalibratorerne), hvorefter opacitometeret aflæses. Kalibreringskammeret er konstrueret til at rumme kalibratorerne i ca. samme position mellem lyset 
og fotocellen, som corneae vil blive anbragt i under uklarhedsmålingerne. 
Opacitometeret kalibreres først til 0 uklarhedsenheder ved anvendelse af kalibreringskammeret uden isat kalibrator. Derpå anbringes tre forskellige kalibratorer en efter en i kalibreringskammeret, og uklarhederne måles. Kali ­
brator 1, 2 og 3 skal give uklarhedsaflæsninger svarende til deres forud 
fastsatte værdier på henholdsvis 75, 150 og 225 uklarhedsenheder ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B.48.  ISOLERET KYLLINGEØJE-TESTMETODEN (ICE- 
TESTMETODEN) TIL IDENTIFIKATION AF ØJENÆTSENDE 
STOFFER OG STÆRKT ØJENIRRITERENDE STOFFER  
INDLEDNING  
1. Isoleret kyllingeøje-testmetoden (ICE [Isolated Chicken Eye]-testmetoden) 
er en  in vitro -testmetode, som under visse omstændigheder og med særlige 
begrænsninger kan anvendes til at klassificere stoffer og blandinger som 
»øjenætsende stoffer og stærkt øjenirriterende stoffer« (1) (2) (3). I denne 
testmetode er stærkt irriterende stoffer defineret som dem, der inducerer øjenlæsioner, der persisterer hos kaninen i mindst 21 dage efter admini ­
stration. Selv om den ikke betragtes som gyldig som fuldstændig erstat ­
ning for  in vivo -kaninøjentesten, anbefales ICE anvendt som del af en 
trindelt testningsstrategi for forskriftsmæssig klassificering og mærkning inden for et specifikt anvendelsesområde (domæne) (4) (5). Teststoffer og -blandinger (6), som er positive i dette assay, kan klassificeres som 
øjenætsende stoffer eller stærkt øjenirriterende stoffer uden yderligere test ­
ning hos kaniner. Et stof, der er testet negativt, vil skulle testes hos kaniner ved anvendelse af en sekventiel testningsstrategi som anført i 
OECD Test Guideline 405 (7) (kapitel B. 5 i dette bilag).
 
2. Formålet med denne testmetode er at beskrive de procedurer, som 
anvendes til at vurdere et teststofs potentielle øjenætsning eller stærke øjenirritation som målt ved dets evne til at inducere toksicitet i et enuk ­
leeret kyllingeøje. Toksiske virkninger på cornea måles ved (i) en kvali ­
tativ vurdering af uklarhed, (ii) en kvalitativ vurdering af epitelbeskadi ­
gelse på grundlag af applikation af fluorescein på øjet (fluoresceinreten ­
tion), (iii) en kvantitativ måling af øget tykkelse (opsvulmning) og (iv) en kvalitativ vurdering af makroskopisk morfologisk overfladebeskadigelse. 
Vurderingerne af cornea-uklarhed, -opsvulmning og -beskadigelse efter 
eksponering for et teststof evalueres individuelt, hvorefter de kombineres til udledning af en Eye Irritancy Classification (øjenirritationsklassifice ­
ring).
 
3. Øjenirriterende stoffer, som inducerer læsioner, der forsvinder på mindre 
end 21 dage, og ikke-øjenirriterende stoffer er også testet ved anvendelse af ICE-testmetoden. ICE-testmetodens nøjagtighed og pålidelighed for stoffer i disse kategorier er imidlertid ikke vurderet formelt.
 
4. Definitioner findes i tillæg 1.  
INDLEDENDE BETRAGTNINGER OG BEGRÆNSNINGER  
5. Denne testmetode er baseret på Interagency Coordinating Committee on 
the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) ICE Test Method Protocol (8), som blev udviklet efter en international valideringsundersø ­
gelse (4) (5) (9) med bidrag fra European Centre for the Validation of 
Alternative Methods, Japanese Center for the Validation of Alternative Methods og TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology (Nederlandene). Protokollen er baseret på oplys ­
ninger fra offentliggjorte protokoller, såvel som TNO's aktuelt anvendte 
protokol (10) (11) (12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. De identificerede begrænsninger for denne metode er baseret på falsk 
positiv-raten for alkoholer og falsk negativ-raterne for faste stoffer og 
overfladeaktive stoffer (se punkt 47) (4). Når stoffer i disse kemiske og fysiske stofgrupper udelukkes fra databasen, forbedres ICE's nøjagtighed på tværs af EU-, EPA- og GHS-klassificeringssystemerne væsentligt (4). 
Som følge af formålet med dette assay (dvs. alene identifikation af øjenæt ­
sende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer) er falsk negativ-rater ikke kriti ­
ske, eftersom sådanne stoffer efterfølgende vil blive testet hos kaniner eller med andre tilstrækkeligt validerede  in vitro -test, alt efter de forskriftsmæs ­
sige krav, ved anvendelse af en sekventiel testningsstrategi med en 
»weight of evidence«-tilgang. Den nuværende valideringsdatabase har desuden ikke muliggjort en tilstrækkelig vurdering af visse kemiske stof ­
grupper eller produktgrupper (f.eks. blandinger). Undersøgerne vil imid ­
lertid kunne overveje at anvende denne testmetode til test af alle materia ­
letyper (herunder blandinger), hvor et positivt resultat vil kunne accepteres som indikativt for en øjenætsningsrespons eller svær øjenirritationsrespons. Positive resultater for alkoholer skal dog fortolkes med forsigtighed som 
følge af risikoen for overfortolkning.
 
7. Alle procedurer med kyllingeøjne skal følge testfacilitetens gældende 
forskrifter og procedurer for håndtering af humane eller animalske mate ­
rialer, hvilket omfatter, men ikke er begrænset til, væv og vævsvæsker. Det anbefales at benytte universale laboratorieforsigtighedsregler (15).
 
8. Testmetoden har den begrænsning, at selv om den tager højde for nogle af 
de øjenvirkninger, som vurderes i kaninøjenirritationstestmetoden, og til en 
vis grad deres sværhedsgrad, tager den ikke højde for conjunctiva- og irisskader. Desuden kan reversibiliteten af cornealæsioner ikke vurderes i sig selv med ICE-testmetoden, men det er på grundlag af kaninøjenunder ­
søgelser foreslået, at en vurdering af den indledende cornealæsionsdybde 
kan anvendes til at skelne mellem irreversible og reversible virkninger (16). Endelig muliggør ICE-testmetoden ikke vurdering af den potentielle systemiske toksicitet i forbindelse med øjeneksponering.
 
9. Der er bestræbelser i gang for yderligere at karakterisere anvendeligheden 
af og begrænsningerne for ICE-testmetoden til identifikation af ikke-stærkt 
irriterende stoffer og ikke-irriterende stoffer (se også punkt 48). Brugerne opfordres også til at forsyne valideringsorganisationer med prøver og/eller 
data med henblik på formel vurdering af mulige fremtidige anvendelser af 
ICE-testmetoden, herunder anvendelse til identifikation af ikke-stærkt øjenirriterende stoffer og ikke-øjenirriterende stoffer.
 
10. Ethvert laboratorium bør, når det påbegynder brug af dette assay, benytte 
kompetencekemikalierne i tillæg 2. Et laboratorium kan benytte disse 
kemikalier til at godtgøre sin tekniske kompetence vedrørende brug af 
ICE-testmetoden, inden det påbegynder fremsendelse af ICE-data med henblik på forskriftsmæssig fareklassificering.
 
PRINCIP FOR TESTMETODEN  
11. ICE-testmetoden er en organotypisk model, som kortvarigt opretholder 
kyllingeøjets funktion  in vitro . Ved denne testmetode vurderes teststoffets 
beskadigende virkning ved bestemmelse af cornea-opsvulmning, -uklarhed 
og -fluoresceinretention. Mens de to sidstnævnte parametre indebærer en kvalitativ vurdering, medfører analyse af cornea-opsvulmning, at der skal foretages en kvantitativ vurdering. Hver måling konverteres enten til en 
kvantitativ score, som anvendes til beregning af et samlet Irritation Index 
(irritationsindeks), eller tildeles en kvalitativ kategorisering, som anvendes til at tildele en  in vitro -klassificering med hensyn til øjenætsning og stærk 
øjenirritation. Begge disse udfald kan derpå anvendes til at forudsige et 
teststofs  in vivo -potentiale for øjenætsning og stærk øjenirritation (se 
Beslutningskriterier).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Kilde til kyllingeøjne og deres alder  
12. Historisk set er der til dette assay anvendt øjne indsamlet fra kyllinger på 
et slagteri, hvor de aflives med henblik på anvendelse til konsum, hvilket 
eliminerer behovet for forsøgsdyr. Kun øjnene fra raske dyr, som anses for egnede til at indgå i menneskets fødekæde, anvendes.
 
13. Selv om der ikke er gennemført en kontrolleret undersøgelse til vurdering 
af den optimale kyllingealder, har de ved denne testmetode anvendte 
kyllinger historisk set haft samme alder og vægt som de på et fjerkræs ­
lagteri traditionelt behandlede vårkyllinger (dvs. ca. 7 uger gamle kyllinger med en vægt på 1,5-2,5 kg).
 
Indsamling og transport af øjne til laboratoriet  
14. Hovederne skal fjernes umiddelbart efter sedering af kyllingerne, som 
sædvanligvis sker ved elektrisk stød, og incision i halsen med henblik på afblødning. Der skal findes en lokal kilde til kyllinger tæt på labora ­
toriet, således at deres hoveder kan overføres fra slagteriet til laboratoriet 
hurtigt nok til, at ødelæggelse og/eller bakteriekontaminering minimeres. 
Tidsintervallet mellem indsamlingen af kyllingehovederne og anvendelsen af øjnene ved ICE-testmetoden skal minimeres (det skal typisk være to timer eller derunder), og det skal påvises, at intervallets varighed ikke 
påvirker assayresultaterne negativt. Disse resultater er baseret på udvæl ­
gelseskriterierne for øjnene såvel som de positive og negative kontrolres ­
ponser. Alle de øjne, som anvendes i assayet, skal stamme fra samme gruppe øjne, som er indsamlet på en bestemt dag.
 
15. Eftersom øjnene fridissekeres i laboratoriet, transporteres de intakte 
hoveder fra slagteriet ved omgivende temperatur i plastkasser befugtet med håndklæder, som er vædet med isotonisk saltvand.
 
Udvælgelseskriterier for øjne, der anvendes i ICE-testen  
16. Øjne med højt niveau af basislinjefluoresceinfarvning (dvs. > 0,5) eller høj 
cornea-uklarhedsscore (dvs. > 0,5) efter enukleering kasseres.  
17. Hver behandlingsgruppe og samtidige positive kontrol består af mindst tre 
øjne. Den negative kontrolgruppe eller opløsningsmiddelkontrollen (hvis 
der anvendes et andet opløsningsmiddel end saltvand) består af mindst ét 
øje. 
TESTPROCEDURE  
Klargøring af øjnene  
18. Øjenlågene ekscideres forsigtigt og uden at beskadige cornea. Der fore ­
tages en hurtig vurdering af cornea-integriteten ved at påføre en dråbe 2 % 
(vægt/volumen) natriumfluorescein på cornea-overfladen i nogle få sekun ­
der, hvorefter der skylles med isotonisk saltvand. De fluoresceinbehand ­
lede øjne undersøges derefter med et spaltelampemikroskop for at sikre, at cornea er ubeskadiget (dvs. har scorer for fluoresceinretention og 
cornea-uklarhed ≤ 0,5).
 
19. Er cornea ubeskadiget, fridissekeres øjet helt fra kraniet uden at beskadige 
cornea. Øjeæblet trækkes ud af øjenhulen ved et fast tag i blinkhinden med en kirurgisk tang, og øjenmusklerne skæres over med en bøjet, stumpendet 
saks. Det er vigtigt at undgå corneabeskadigelse som følge af overdrevent 
tryk (dvs. komprimeringsartefakter).
 
20. Når øjet fjernes fra øjenhulen, skal der medfølge en synlig vedhængende 
del af synsnerven. Efter fjernelsen fra øjenhulen anbringes øjet på et 
absorberende underlag, hvorefter blinkhinden og andet bindevæv skæres 
væk. ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Det enukleerede øje anbringes i en rustfri stålholder med cornea i lodret 
position. Derefter indsættes holderen i et kammer i superfusionsapparatet 
(16). Holderne skal anbringes sådan i superfusionsapparatet, at det isoto ­
niske saltvand drypper ned over hele cornea. Temperaturen i superfusions ­
apparatets kamre skal være reguleret til 32 ± 1,5 °C. Tillæg 3 indeholder et 
diagram over et typisk superfusionsapparat og øjenholderne, som kan 
købes i handelen eller konstrueres. Apparatet kan modificeres, så det opfylder det enkelte laboratoriums behov (f.eks. så det kan rumme et andet antal øjne).
 
22. Efter anbringelsen i superfusionsapparatet undersøges øjnene igen med et 
spaltelampemikroskop for at sikre, at de ikke er blevet beskadiget under 
dissektionsproceduren. På dette tidspunkt måles også corneatykkelsen. Den 
måles ved corneas toppunkt ved anvendelse af dybdemålingsanordningen på spaltelampemikroskopet. Øjne med (i) en fluoresceinretentionsscore på > 0,5; (ii) en cornea-uklarhed på > 0,5 eller (iii) eventuelle yderligere tegn 
på beskadigelse skal udskiftes. Af de øjne, der ikke kasseres ud fra nogen 
af ovennævnte kriterier, kasseres øjne med en corneatykkelse, som afviger mere end 10 % fra gennemsnitsværdien for alle øjne. Brugerne skal være opmærksomme på, at spaltelampemikroskoper kan give forskellige cornea ­
tykkelsesmålinger alt efter indstillingen af spaltebredden. Spaltebredden 
skal indstilles til 0,095 mm.
 
23. Når alle øjnene er undersøgt og godkendt, inkuberes de i ca. 45 til 60 
minutter for at bringe dem i ligevægt med testsystemet inden dosering. Efter ligevægtsindstillingsperioden foretages en nulpunktsreferencemåling af corneatykkelse og -uklarhed, som vil fungere som basislinje (dvs. tid = 
0). Den ved fridissekering bestemte fluoresceinscore anvendes som basis ­
linjemåling for det endepunkt.
 
Applikation af teststoffet  
24. Umiddelbart efter nulpunktsreferencemålingerne fjernes øjet (i sin holder) 
fra superfusionsapparatet og anbringes i vandret position, hvorefter test ­
stoffet påføres på cornea.  
25. Flydende teststoffer testes typisk ufortyndede, men kan fortyndes, hvis det 
anses for nødvendigt (f.eks. som del af undersøgelsens design). Det fore ­
trukne opløsningsmiddel til fortyndede stoffer er fysiologisk saltvand. Der 
kan imidlertid også anvendes alternative opløsningsmidler under kontrol ­
lerede betingelser, men egnetheden af andre opløsningsmidler end fysio ­
logisk saltvand skal påvises.  
26. Flydende teststoffer påføres på cornea således, at hele overfladen af cornea 
dækkes jævnt med teststoffet. Standardvolumenet er 0,03 ml.  
27. Om muligt bør faste stoffer formales så fint som muligt med morter og 
støder eller et tilsvarende formalingsværktøj. Pulveret påføres på cornea således, at overfladen dækkes jævnt med teststoffet. Standardmængden er 0,03 g.
 
28. Når teststoffet (flydende eller fast) har været påført i 10 sekunder, skylles 
det væk fra øjet med isotonisk saltvand (ca. 20 ml) ved omgivende tempe ­
ratur. Øjet (i sin holder) sættes derefter tilbage i superfusionsapparatet i sin 
oprindelige opretstående position.  
Kontrolstoffer  
29. Der skal indgå samtidige negative kontroller eller opløsningsmiddel/ 
vehikel-kontroller og positive kontroller i hvert forsøg.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Ved test af væsker i en koncentration på 100 % eller faste stoffer anvendes 
fysiologisk saltvand som den samtidige negative kontrol ved 
ICE-testmetoden, således at ikke-specifikke ændringer i testsystemet kan påvises, og det kan sikres, at assaybetingelserne ikke fejlagtigt resulterer i en irritationsrespons.
 
31. Ved test af fortyndede væsker medtages en samtidig opløsningsmiddel/ 
vehikel-kontrolgruppe ved testmetoden, således at ikke-specifikke 
ændringer i testsystemet kan påvises, og det kan sikres, at assaybetingel ­
serne ikke fejlagtigt resulterer i en irritationsrespons. Som anført i punkt 25 kan der kun anvendes et opløsningsmiddel/vehikel, som er påvist ikke 
at påvirke testsystemet negativt.
 
32. Der medtages et kendt øjenirriterende stof som samtidig positiv kontrol i 
hvert forsøg for at verificere, at der induceres en passende respons. Eftersom ICE-assayet anvendes i denne testmetode til identifikation af 
ætsende eller stærkt irriterende stoffer, skal den positive kontrol være et 
referencestof, som inducerer en svær respons ved denne testmetode. For at sikre, at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolres ­
pons over tid, bør størrelsesordenen af den svære respons imidlertid ikke 
være overdrevent stor. Der skal genereres tilstrækkelige  in vitro -data for 
den positive kontrol, således at der kan beregnes et statistisk defineret acceptabelt interval for den positive kontrol. Hvis der ikke er tilstrækkelige historiske ICE-testmetodedata tilgængelige for en bestemt positiv kontrol, 
kan det være nødvendigt at gennemføre undersøgelser for at tilvejebringe 
disse oplysninger.
 
33. Eksempler på positive kontroller for flydende teststoffer er 10 % eddike ­
syre eller 5 % benzalkoniumchlorid, mens eksempler på positive kontroller for faste teststoffer er natriumhydroxid eller imidazol.
 
34. Referencestoffer er nyttige i forbindelse med vurdering af øjenirritations ­
potentialet for ukendte kemikalier fra en særlig kemisk stofgruppe eller produktgruppe eller vurdering af det relative irritationspotentiale for et øjenirriterende stof inden for et specifikt område af irritationsresponser.
 
Målte endepunkter  
35. Behandlede corneae vurderes inden behandlingen og fra og med 30, 75, 
120, 180 og 240 minutter (± 5 minutter) efter skylningen efter behandlin ­
gen. Med disse tidspunkter opnås et passende antal målinger over fireti ­
mers behandlingsperioden, samtidig med at der er tilstrækkelig tid mellem 
målingerne til at foretage de fornødne observationer for alle øjnene.  
36. De vurderede endepunkter er cornea-uklarhed, -opsvulmning og -fluore ­
sceinretention og morfologiske virkninger på cornea (f.eks. erosion eller løsning af epitelet). Alle endepunkterne med undtagelse af fluoresceinre ­
tention (som kun bestemmes inden behandlingen og 30 minutter efter 
teststofeksponeringen) bestemmes på hvert af de ovennævnte tidspunkter.
 
37. Det tilrådes at tage fotografier for at dokumentere cornea-uklarhed og 
-fluoresceinretention, morfologiske virkninger på cornea og, hvis det udføres, histopatologi.
 
38. Efter den afsluttende undersøgelse efter fire timer opfordres brugerne til at 
konservere øjnene i et egnet fikseringsmiddel (f.eks. neutralbufret 
formalin) med henblik på eventuel histopatologisk undersøgelse.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Cornea-opsvulmning bestemmes ud fra corneatykkelsesmålinger foretaget 
med et optisk pachymeter på et spaltelampemikroskop. Den udtrykkes i 
procent og beregnes ud fra corneatykkelsesmålinger ved hjælp af følgende formel:
 
" 
cornea tykkelse til tiden t  Ä cornea tykkelse til tiden  ¼ 0 
cornea tykkelse til tide  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Den gennemsnitlige procentvise cornea-opsvulmning for alle testøjnene 
beregnes for alle observationstidspunkter. Ud fra den højeste gennemsnits ­
score for cornea-opsvulmning som observeret på et hvilket som helst tids ­
punkt opnås der derefter en samlet kategoriscore for hvert teststof.  
41. Beregningen af cornea-uklarhed baseres på scoring af det område af 
cornea, hvor uklarheden er mest udtalt. Den gennemsnitlige 
cornea-uklarhedsværdi for alle testøjnene beregnes for alle observations ­
tidspunkter. Ud fra den højeste gennemsnitsscore for cornea-uklarhed som observeret på et hvilket som helst tidspunkt opnås der derefter en samlet kategoriscore for hvert teststof (tabel 1).
 
Tabel 1  
Cornea-uklarhedsscorer  
Score Observation  
0 Ingen uklarhed 
0,5 Meget ubetydelig uklarhed 1 Spredte eller diffuse områder; detaljer i iris ses tydeligt 2 Let skelneligt gennemskinneligt område; detaljer i iris er lidt utydelige 
3 Stærk cornea-uklarhed; ingen specifikke detaljer i iris er synlige; pupillens stør ­
relse er kun lige akkurat skelnelig 
4 Fuldstændig cornea-uklarhed; iris er ikke synlig
 
42. Den gennemsnitlige fluoresceinretentionsværdi for alle testøjnene beregnes 
kun for 30-minutters observationstidspunktet, og herudfra opnås den 
samlede kategoriscore for hvert teststof (tabel 2).  
Tabel 2  
Fluoresceinretentionsscorer  
Score Observation  
0 Ingen fluoresceinretention 
0,5 Meget ubetydelig enkeltcellefarvning 
1 Enkeltcellefarvning spredt ud over hele det behandlede område af cornea 
2 Fokal eller sammenflydende enkeltcellefarvning med høj tæthed 3 Fluorescein er tilbageholdt i store sammenflydende områder af cornea
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Morfologiske virkninger omfatter »erosion« af cornea-epitelceller, »løs ­
ning« af epitelet, »tiltagende ruhed« af cornea-overfladen og »fastklæben« 
af teststoffet til cornea. Disse resultater kan have varierende sværhedsgrad og kan forekomme samtidig. Klassificeringen af disse resultater er subjektiv og baseret på undersøgerens fortolkning.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Datavurdering  
44. Resultaterne for cornea-uklarhed, -opsvulmning og -fluoresceinretention 
skal vurderes særskilt for at finde frem til en ICE-stofgruppe for hvert endepunkt. Derefter kombineres ICE-stofgrupperne for hvert endepunkt for 
at opnå en Irritancy Classification (irritationsklassificering) for hvert test ­
stof.
 
Beslutningskriterier  
45. Når hvert af endepunkterne er vurderet, kan der fastsættes ICE-stofgrupper 
på grundlag af forudfastsatte intervaller. Fortolkning af corneatykkelse (tabel 3), -uklarhed (tabel 4) og -fluoresceinretention (tabel 5) ved anven ­
delse af fire ICE-stofgrupper udføres ud fra følgende skalaer:
 
Tabel 3  
ICE-klassificeringskriterier for corneatykkelse  
Gennemsnitlig cornea-opsvulmning (%) (*) ICE-stofgruppe  
0-5 I 
> 5-12 II 
> 12-18 (> 75 min efter behandling) II 
> 12-18 ( ≤ 75 min efter behandling) III 
> 18-26 III > 26-32 (> 75 min efter behandling) III > 26-32 ( ≤ 75 min efter behandling) IV 
> 32 IV
 
(*) Cornea-opsvulmningsscorerne gælder kun, hvis tykkelsen er målt med et Haag-Streit BP900-spaltelam ­
pemikroskop med dybdemålingsanordning nr. I og indstilling af spaltebredden til 9½, som svarer til 0,095 mm. Brugerne skal være opmærksomme på, at spaltelampemikroskoper kan give forskellige cornea ­
tykkelsesmålinger alt efter indstillingen af spaltebredden.
 
Tabel 4  
ICE-klassificeringskriterier for uklarhed  
Gennemsnitlig maksimal uklarhedsscore (*) ICE-stofgruppe  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Se tabel 1.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabel 5  
ICE-klassificeringskriterier for gennemsnitlig fluoresceinretention  
Gennemsnitlig fluoresceinreten-tionsscore 30 
minutter efter behandling (*) ICE-stofgruppe  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Se tabel 2.  
46. Den samlede  in vitro -irritationsklassificering for et teststof fastsættes ved 
at aflæse den irritationsklassificering, der svarer til kombinationen af kate ­
gorier opnået for cornea-opsvulmning, -uklarhed og -fluoresceinretention, og gå ud fra oversigten i tabel 6.
 
Tabel 6  
Samlede  in vitro -irritationsklassificeringer  
Klassificering Kombinationer af de 3 endepunkter  
Ætsende stof/Stærkt irriterende stof 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 
2 × IV, 1 × I (*) 
Cornea-uklarhed ≥ 3 efter 30 min (for mindst 2 
øjne) Cornea-uklarhed = 4 på et hvilket som helst 
tidspunkt (for mindst 2 øjne) 
Markant løsning af epitelet (for mindst 1 øje)
 
(*) Disse kombinationer er mindre sandsynlige.  
47. Som anført i punkt 1 skal der, hvis teststoffet ikke identificeres som 
øjenætsende stof eller stærkt øjenirriterende stof, gennemføres yderligere 
testning med henblik på klassificering og mærkning. ICE-testmetoden har en generel nøjagtighed på 83 % (120/144) til 87 % (134/154), en falsk positiv-rate på 6 % (7/122) til 8 % (9/116) og en falsk negativ-rate på 
41 % (13/32) til 50 % (15/30) til identifikation af øjenætsende stoffer og 
stærkt øjenirriterende stoffer i sammenligning med  in vivo -kaninøjentest ­
metodedata klassificeret i henhold til EPA- (1), EU- (2) eller GHS- (3) klassificeringssystemerne. Når stoffer i visse kemiske (dvs. alkoholer og 
overfladeaktive stoffer) og fysiske (dvs. faste stoffer) stofgrupper 
udelukkes fra databasen, ligger nøjagtigheden af ICE på tværs af EU-, EPA- og GHS-klassificeringssystemerne fra 91 % (75/82) til 92 % (69/75), falsk positiv-raterne ligger fra 5 % (4/73) til 6 % (4/70), og falsk 
negativ-raterne ligger fra 29 % (2/7) til 33 % (3/9) (4).
 
48. Selv hvis der ikke opnås en klassificering som øjenætsende stof eller 
stærkt øjenirriterende stof for et teststof, kan ICE-dataene være nyttige 
sammen med testdata fra  in vivo -kaninøjentesten eller fra en tilstrækkeligt 
valideret  in vitro -test til yderligere vurdering af anvendeligheden af og 
begrænsningerne for ICE-testmetoden til identifikation af ikke-stærkt irri ­
terende stoffer og ikke-irriterende stoffer (et Guidance Document om 
anvendelse af  in vitro -øjentoksicitetstestmetoder er under udarbejdelse).  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Undersøgelsesacceptkriterier  
49. En test betragtes som acceptabel, hvis de samtidige negative kontroller 
eller vehikel/opløsningsmiddel-kontroller og de samtidige positive 
kontroller giver en Irritancy Classification (irritationsklassificering) inden for henholdsvis ikke-irriterende og stærkt irriterende/ætsende stofgrupper.
 
Testrapport  
50. Testrapporten skal omfatte følgende oplysninger, hvis de er relevante for 
undersøgelsens gennemførelse:  
Test- og kontrolstoffer  
Kemisk(e) navn(e), såsom det strukturnavn, der anvendes af Chemical 
Abstracts Service (CAS), efterfulgt af andre navne, hvis sådanne kendes;  
CAS-registreringsnummeret (RN), hvis det kendes;  
renhed og sammensætning af stoffet eller blandingen (i vægtprocent) i det 
omfang, disse oplysninger er tilgængelige;  
fysisk-kemiske egenskaber, såsom fysisk tilstand, flygtighed, pH, stabilitet, 
kemisk stofgruppe og vandopløselighed, som er relevante for undersøgel ­
sens gennemførelse;  
behandling af test/kontrol-stofferne inden testning, hvis det er relevant 
(f.eks. opvarmning, formaling);  
stabilitet, hvis den kendes.  
Oplysninger om sponsoren og testfaciliteten  
Navn og adresse på sponsoren, testfaciliteten og undersøgelseslederen;  
identifikation af kilden til øjnene (f.eks. den facilitet, hvor de er 
indsamlet);  
opbevarings- og transportbetingelser for øjnene (f.eks. dato og klokkeslæt 
for øjenindsamling, tidsinterval inden påbegyndelse af testning);  
særlige karakteristika ved de dyr, som øjnene er indsamlet fra (f.eks. 
donordyrenes alder, køn, vægt), hvis de er tilgængelige.  
Begrundelse for den anvendte testmetode og protokol  
Testmetodeintegritet  
Den procedure, som anvendes til at sikre integriteten (dvs. nøjagtighed og 
pålidelighed) af testmetoden over tid (f.eks. periodisk testning af kompe ­
tencestoffer, anvendelse af historiske negative og positive kontroldata).  
Kriterier for en acceptabel test  
acceptable samtidige referencekontrolintervaller på grundlag af historiske 
data, hvis det er relevant.  
Testbetingelser  
Beskrivelse af det anvendte testsystem;  
det anvendte spaltelampemikroskop (f.eks. modellen);  
instrumentindstillinger for det anvendte spaltelampemikroskop;  
oplysninger om de anvendte kyllingeøjne, herunder specifikation af deres 
kvalitet;  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
detaljer om den anvendte testprocedure;  
anvendt(e) teststofkoncentration(er);  
beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren;  
reference til historiske data for modellen (f.eks. negative og positive 
kontroller, kompetencestoffer, referencestoffer);  
beskrivelse af de anvendte vurderingskriterier.  
Resultater  
Beskrivelse af andre observerede virkninger.  
Fotografier af øjnene, hvis det er relevant.  
Diskussion af resultaterne  
Konklusion  
LITTERATUR  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B- 
96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
(2) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 
16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 
67/548/EØF og 1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) 
nr. 1907/2006 (EØS-relevant tekst). EUT L 353 af 31.12.2008, s. 1.
 
(3) United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Clas ­
sification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, 
UN New York & Geneva, 2007. Se følgende websted:  
[http://www.unece.org /trans/danger/publi/ghs/g hs_rev02/02files_e.html].  
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants (Erklæ ­
ring om konklusionen på den retrospektive ICCVAM-undersøgelse af organotypiske  in vitro -assays som screeningstest til identifikation 
af potentielle øjenætsende stoffer og stærkt øjenirriterende stoffer). 
Se følgende websted:
 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(6) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 
18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af 
samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et 
europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommis ­
sionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 
76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 
93/105/EF og 2000/21/EF. EUT L 396 af 30.12.2006, s. 1.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Se følgende websted:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340, en_2649_34377_37051368_ 
1_1_1_1,00.html].  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method 
Protocol. I: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
(9) ICCVAM (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle 
Park: National Toxicology Program. Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_ice.htm].  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuc ­
leated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76.
 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye 
test (CEET). Se følgende websted:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. 
(1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol . 
35:23-37.
 
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the 
Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). 
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Se følgende websted:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays.  Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106-117.  
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background Review Document, Current Status of  
In Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm].  
(19) ICCVAM (2006). Background Review Document, Current Status of  
In Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Se følgende websted:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm].  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Cornea:  Den transparente del af øjeæblets forside, som dækker øjets iris og 
pupil, og hvorigennem lys kommer ind i øjets indre.  
Cornea-opsvulmning:  En objektiv måling i ICE-testen af graden af 
cornea-udvidelse efter eksponering for et teststof. Den udtrykkes i procent og beregnes ud fra corneatykkelsesmålinger ved basislinje (inden dosering) og tykkelsen registreret med regelmæssige intervaller efter eksponering for testma ­
terialet i ICE-testen. Graden af cornea-opsvulmning er indikativ for beskadigelse 
af cornea.
 
Cornea-uklarhed:  Måling af graden af cornea-uigennemsigtighed efter ekspone ­
ring for et teststof. Øget cornea-uklarhed er indikativt for beskadigelse af cornea.  
EPA-kategori I:  Ætsende virkning (irreversibel ødelæggelse af øjenvæv) eller 
corneabeskadigelse eller -irritation, som persisterer mere end 21 dage (1).  
EU-kategori R41:  Frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller alvorlig fysisk 
synsnedsættelse, som opstår efter applikation af et teststof på øjets anteriore 
overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter applikation (2).  
Falsk negativ-rate:  Den andel af alle positive stoffer, som ved en testmetode 
fejlagtigt identificeres som negative. Dette er én indikator for testmetodens 
ydeevne.  
Falsk positiv-rate:  Den andel af alle negative stoffer, som ved en testmetode 
fejlagtigt identificeres som positive. Dette er én indikator for testmetodens ydeevne.
 
Fluoresceinretention:  En subjektiv måling i ICE-testen af det omfang, hvori 
natriumfluorescein tilbageholdes af epitelceller i cornea efter eksponering for et 
teststof. Graden af fluoresceinretention er indikativ for beskadigelse af cornea-epitelet.
 
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of 
Chemicals [det globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier]):  Et system til klassificering af kemikalier (stoffer og blandinger) 
efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare 
med tilhørende kommunikationselementer, såsom piktogrammer, signalord, risi ­
kosætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om stoffernes og blandingernes skadelige virkninger kan videreformidles med 
henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportø ­
rer, forbrugere og redningspersonel) og miljø (3).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHS-kategori 1:  Frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller alvorlig fysisk 
synsnedsættelse, som opstår efter applikation af et teststof på øjets anteriore 
overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter applikation (3).  
Ikke-irriterende stof:  Stoffer, der ikke er klassificeret som øjenirriterende stoffer 
i EPA-kategori I, II eller III, EU-kategori R41 eller R36 eller GHS-kategori 1, 2A 
eller 2B (1) (2) (3).  
Negativ kontrol:  Et ubehandlet replikat, som indeholder alle komponenter fra et 
testsystem. Denne prøve behandles sammen med de teststofbehandlede prøver og 
andre kontrolprøver for at fastslå, om opløsningsmidlet interagerer med testsy ­
stemet.  
Nøjagtighed:  Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede 
referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af »relevans«. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som den andel korrekte udfald, testmetoden fører til.
 
Opløsningsmiddel/vehikel-kontrol:  En ubehandlet prøve, som indeholder alle 
komponenterne fra et testsystem, herunder opløsningsmidlet eller vehiklet, og som behandles sammen med de teststofbehandlede prøver og andre kontrolprøver 
for at fastlægge basislinjeresponsen for de prøver, som er behandlet med test ­
stoffet opløst i det samme opløsningsmiddel eller vehikel. Ved test sammen med en samtidig negativ kontrol påviser denne prøve også, hvorvidt opløsningsmidlet eller vehiklet interagerer med testsystemet.
 
Positiv kontrol:  Et replikat, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem 
og er behandlet med et stof, som vides at inducere en positiv respons. For at 
sikre, at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over 
tid, bør størrelsesordenen af den svære respons ikke være overdrevent stor.  
Potentiel fare:  Den iboende egenskab ved et middel eller en situation, som kan 
forårsage skade, når en organisme, et system eller en (sub)population eksponeres 
for det pågældende middel.  
Pålidelighed:  Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i 
og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme 
protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier og repeterbarhed inden for laboratorier.
 
Referencestof:  Et stof, som anvendes som standard til sammenligning med et 
teststof. Et referencestof skal have følgende egenskaber: (i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; (ii) strukturel og funktionel lighed med den stof ­
gruppe, der testes; (iii) kendte fysiske/kemiske egenskaber; (iv) støttedata om 
kendte virkninger og (v) kendt styrke i det ønskede responsområde.
 
Spaltelampemikroskop:  Et instrument, som anvendes til direkte undersøgelse af 
øjet under forstørrelse tilvejebragt af et binokulært mikroskop ved frembringelse 
af et stereoskopisk, retvendt billede. Ved ICE-testmetoden anvendes dette instru ­
ment til at betragte de anteriore strukturer i kyllingeøjet såvel som til objektiv måling af corneatykkelse med et dybdemålingsanordningstilbehør.
 
Stærkt øjenirriterende stof:  (a) Et stof, som forårsager vævsbeskadigelse i øjet 
efter applikation på øjets anteriore overflade, som ikke er reversibel inden for 21 dage efter applikation, eller som forårsager alvorlig fysisk synsnedsættelse; (b) 
stoffer, der er klassificeret som øjenirriterende stoffer i GHS-kategori 1, 
EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).
 
Trindelt testning:  Ved anvendelse af den trindelte testningsstrategi gennemgås 
alle eksisterende oplysninger om et teststof i en bestemt rækkefølge ved anven ­
delse af en »weight of evidence«-proces på hvert trin for at fastslå, om der foreligger tilstrækkelige oplysninger til at træffe en fareklassificeringsafgørelse, inden der fortsættes til næste trin. Hvis et teststofs irritationspotentiale kan fast ­
slås på grundlag af de eksisterende oplysninger, er der ikke behov for yderligere 
testning. Hvis et teststofs irritationspotentiale ikke kan fastsættes på grundlag af de eksisterende oplysninger, udføres en trinvis sekventiel dyreforsøgsprocedure, indtil der kan foretages en utvetydig klassificering.
 
Valideret testmetode:  En testmetode, for hvilken der er gennemført validerings ­
undersøgelser for at fastslå relevansen (herunder nøjagtigheden) og pålidelig ­
heden til et bestemt formål. Det er vigtigt at være opmærksom på, at en valideret 
testmetode måske ikke har tilstrækkelig ydeevne med hensyn til nøjagtighed og 
pålidelighed til at være acceptabel til det planlagte formål.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
»Weight of evidence«:  En proces, hvor styrkerne og svaghederne ved forskellige 
oplysninger afvejes for at nå frem til og underbygge en konklusion om et stofs 
farepotentiale.  
Øjenirriterende stof:  (a) Et stof, der frembringer en reversibel ændring i øjet 
efter applikation på øjets anteriore overflade; (b) stoffer, der er klassificeret som øjenirriterende stoffer i EPA-kategori II eller III, EU-kategori R36 eller 
GHS-kategori 2A eller 2B (1) (2) (3).
 
Øjenætsende stof:  (a) Et stof, der forårsager irreversibel vævsbeskadigelse i øjet; 
(b) stoffer, der er klassificeret som øjenirriterende stoffer i GHS-kategori 1, EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).
 ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Tillæg 2  
KOMPETENCEKEMIKALIER TIL ICE-TESTMETODEN  
Inden laboratorier påbegynder rutinemæssig brug af en testmetode, der følger 
denne testmetode, bør de godtgøre deres tekniske kompetence ved korrekt iden ­
tifikation af øjenætsningsklassificeringen for de ti anbefalede stoffer i tabel 1. Disse stoffer er udvalgt således, at de repræsenterer det responsområde for lokal øjen-irritation/ætsning, som er baseret på resultater fra  in vivo -kaninøjentesten 
(TG 405) (dvs. stoffer, der i henhold til UN GHS er i kategori 1, 2A, 2B 
eller ikke er klassificeret og mærket) (3) (7). Hvad angår den validerede anven ­
delighed af disse assays (dvs. alene til identifikation af øjenætsende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer), er der imidlertid kun to testudfald i relation til klassifi ­
cering (ætsende stof/stærkt irriterende stof eller ikke-ætsende stof/ikke-stærkt 
irriterende stof), hvormed kompetencen kan godtgøres. Andre udvælgelseskrite ­
rier var, at stofferne er kommercielt tilgængelige, at der er tilgængelige  in vivo - 
referencedata af høj kvalitet, og at der findes data af høj kvalitet for de to  in 
vitro -metoder, for hvilke der er Test Guidelines under udarbejdelse. Derfor blev 
irriterende stoffer udvalgt fra den af ICCVAM anbefalede liste over 122 referen ­
cestoffer til validering af  in vitro -øjentoksicitetstestmetoder (se Appendix H, 
ICCVAM Recommended Reference Substances List) (4). Referencedata findes 
i ICCVAM Background Review Documents for oksecornea-uklarheds- og -per ­
meabilitetstestmetoden (BCOP [Bovine Corneal Opacity and Permeability]-test ­
metoden) og ICE-testmetoden (18) (19).
 
Tabel 1  
Anbefalede stoffer til godtgørelse af teknisk kompetence i anvendelse af ICE  
Kemikalium CASRN Kemisk 
stof-gruppe (  1 ) Fysisk form  In vivo -klassifice ­
ring (  2 ) In vitro -klassificering (  3 ) 
Benzalkonium 
chlorid (5 %) 8001-54-5 Onium forbin ­
delse Flydende Kategori 1 Ætsende stof/stærkt 
irriterende stof 
Chlorhexidin 55-56-1 Amin, amidin Fast Kategori 1 Ætsende stof/stærkt 
irriterende stof 
Dibenzoyl-L-vinsyre 2743-38-6 Carboxylsyre, 
ester Fast Kategori 1 Ætsende stof/stærkt 
irriterende stof 
Imidazol 288-32-4 Heterocyklisk Fast Kategori 1 Ætsende stof/stærkt 
irriterende stof 
Trichloreddike syre 
(30 %) 76-03-9 Carboxylsyre Flydende Kategori 1 Ætsende stof/stærkt 
irriterende stof 
2,6-dichlor-benzoyl- 
chlorid 4659-45-4 Acylhalogenid Flydende Kategori 2A Ikke-ætsende 
stof/ikke-stærkt irri ­
terende stof 
Ethyl-2-methylaceto- 
acetat 609-14-3 Keton, ester Flydende Kategori 2B Ikke-ætsende 
stof/ikke-stærkt irri ­
terende stof 
Ammonium nitrat 6484-52-2 Uorganisk salt Fast Kategori 2A Ikke-ætsende 
stof/ikke-stærkt irri ­
terende stof  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Kemikalium CASRN Kemisk 
stof-gruppe (  1 ) Fysisk form  In vivo -klassifice ­
ring (  2 ) In vitro -klassificering (  3 ) 
Glycerol 56-81-5 Alkohol Flydende Ikke mærket Ikke-ætsende 
stof/ikke-stærkt irri ­
terende stof 
n-hexan 110-54-3 Carbonhydrid 
(acyklisk) Flydende Ikke mærket Ikke-ætsende 
stof/ikke-stærkt irri ­
terende stof  
Forkortelser: CASRN = Chemical Abstracts Service Registry Number 
( 1 ) De kemiske stofgrupper for hvert teststof blev fastsat ved anvendelse af et standardklassificeringsskema baseret på National Library 
of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)-klassificeringssystemet (se følgende websted: http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Baseret på resultater fra  in vivo -kaninøjentesten (OECD TG 405) og brug af UN GHS (3) (7). 
( 3 ) Baseret på resultater fra BCOP og ICE.  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Tillæg 3  
Diagrammer over ICE-superfusionsapparatet og øjenholderne  
(Se Burton et al. (17) for yderligere generiske beskrivelser af superfusionsapparatet og 
øjenholderen)
  ▼M2 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  IN VITRO-MIKROKERNETEST I PATTEDYRCELLER  
INDLEDNING  
1. En in vitro-mikrokernetest (MNvit-test) er en genotoksicitetstest til påvis ­
ning af mikrokerner (MN) i cytoplasma i interfaseceller. Mikrokerner kan 
dannes ud fra acentriske kromosomfragmenter (dvs. uden en centromer), 
eller hele kromosomer, som ikke kan migrere til polerne under celledelin ­
gens anafase. Assayet påviser klastogene og aneugene kemikaliers (stoffer og blandinger) virkninger (1) (2) i celler, der er blevet delt under eller efter 
eksponering for teststoffet. I denne testmetode (TM) kan der anvendes 
protokoller med og uden aktinpolymeriseringsinhibitoren cytochalasin B (cytoB). Tilsætningen af cytoB inden mitosen muliggør identifikation og selektiv analyse af mikrokerneforekomsten i celler, der har afsluttet mitosen, 
da sådanne celler er binukleære (3) (4). I denne TM kan der desuden 
anvendes protokoller uden cytokineseblokerende stof, hvis det kan doku ­
menteres, at analyserede cellepopulation har undergået mitose.
 
2. Ud over anvendelse af MNvit-assayet til identifikation af kemikalier (stoffer 
og blandinger), der inducerer mikrokerner, kan anvendelsen af et cytokine ­
seblokerende stof, immunkemisk mærkning af kinetokorer eller hybridise ­
ring med centromeriske/telomeriske prober (fluorescerende in 
situ-hybridisering (FISH)) også tilvejebringe oplysninger om mekanismerne for kromosomskade og mikrokernedannelse (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Mærknings- og hybridiseringsprocedurerne kan 
anvendes i tilfælde af øget mikrokernedannelse, hvis forsøgslederen 
ønsker at bestemme, om forøgelsen skyldtes klastogene og/eller aneugene begivenheder.
 
3. Mikrokerner er skader, der er blevet overført til datterceller, hvorimod 
kromosomaberrationer i metafaseceller ikke nødvendigvis er overført. Da mikrokerner i interfaseceller kan vurderes relativt objektivt, behøver labo ­
ratoriepersonalet kun at bestemme, om cellerne har delt sig eller ej, og hvor 
mange celler der indeholder en mikrokerne. Præparaterne kan derfor bedømmes relativt hurtigt, og analysen kan automatiseres. Det gør det praktisk at bedømme tusindvis i stedet for hundredvis af celler pr. behand ­
ling, hvilket øger assayets ydeevne. Da mikrokerner kan dannes ud fra 
tiloversblevne kromosomer, er det endeligt muligt at påvise aneuploidiindu ­
cerende stoffer, som er vanskelige at undersøge i konventionelle test for kromosomaberrationer, f.eks. OECD Test Guideline 473 (kapitel B.10 i 
dette bilag) (17). MNvit-assayet kan dog ikke anvendes til at differentiere 
polyploidiinducerende kemikalier fra klastogenicitetinducerende kemikalier uden særlige teknikker såsom FISH, der er beskrevet i punkt 2.
 
4. MNvit-assayet er en in vitro-metode, der typisk anvender dyrkede celler fra 
mennesker eller gnavere. Den danner et solidt grundlag for in vitro-undersøgelse af potentialet for kromosomskade, da både aneugener 
og klastogener kan påvises.
 
5. MNvit-assayet er solid og effektiv til en lang række celletyper og til påvis ­
ning af forekomsten eller fraværet af cytoB. Der findes omfattende data, der 
påviser gyldigheden af MNvit-assayet, hvor der anvendes forskellige celle ­
linjer fra gnavere (CHO, V79, CHL/IU ogL5178Y) og humane lymfocytter (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31), herunder navnlig de internationale valideringsundersøgelser koordineret af 
Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) 
og rapporterne fra den internationale workshop vedrørende testning for
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
genotoksicitet (4) (16). De tilgængelige data er desuden blevet revurderet i 
forbindelse med en retrospektiv weight-of-evidence-undersøgelse gennem ­
ført af Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) under Europa-Kommissionen, og ECVAM's videnska ­
belige rådgivende udvalg (ESAC) har godkendt testmetoden som videnska ­
beligt underbygget (32) (33) (34). Anvendelsen af den humane lymfoblast ­
cellelinje TK6 (35), HepG2-celler (36) (37) og primære embryoceller fra syrisk hamster (38) er blevet beskrevet, selv om de ikke er blevet anvendt i valideringsundersøgelser.
 
DEFINITIONER  
6. De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.  
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
7. Normalt kræver en in vitro-test, at der benyttes en eksogen metabolisk 
aktivering, medmindre cellerne er metabolisk kompetente i forhold til test ­
stoffet. Metabolismeaktiveringssystemet efterligner ikke fuldstændigt in 
vivo-forholdene. Man må desuden omhyggeligt undgå betingelser, som fører til et artefakt positivt resultat, der ikke skyldes selve mutageniciteten, men kan være forårsaget af faktorer som væsentlige ændringer i pH eller 
osmolalitet eller af høj cytotoksicitet (39) (40) (41). Hvis et testkemikalie 
forårsager en pH-ændring af mediet på tilsætningstidspunktet, skal pH juste ­
res, helst ved buffering af stamopløsningen, således at alle voluminer ved alle testkoncentrationer og for alle kontrolprøver forbliver de samme.
 
8. Ved analyse af induktion af mikrokerner er det afgørende, at både behand ­
lede og ubehandlede kulturer har undergået mitose. Den mest informative 
fase for bedømmelse af mikrokerner er i celler, som har afsluttet mitosen 
under eller efter behandling med teststoffet.  
TESTPRINCIPPET  
9. Cellekulturer fra mennesker eller pattedyr eksponeres for teststoffet både 
med og uden en eksogen metabolisk aktivering, medmindre der anvendes celler med en tilstrækkelig metaboliseringsevne. I alle forsøg medtages sideløbende positive kontrolprøver (PC) og kontrolprøver med 
opløsningsmiddel/bærestof (VC).
 
10. Under eller efter eksponering for teststoffet dyrkes cellerne i tilstrækkelig 
lang tid til, at kromosom- eller tentrådsskade medfører dannelse af mikro ­
kerner i interfaseceller. Ved induktion af aneuploidi skal teststoffet normalt være til stede under mitosen. Høstede og farvede interfaseceller analyseres for tilstedeværelse af mikrokerner. Ideelt set bør mikrokerner kun 
bedømmes i celler, som har afsluttet mitosen under eksponering for test ­
stoffet eller i påkommende tilfælde i perioden efter eksponering. I kulturer, som er blevet behandlet med et cytokineseblokerende stof, gøres dette ved kun at bedømme binukleære celler. Såfremt der ikke anvendes et cytokine ­
seblokerende stof, er det vigtigt at påvise, at det er sandsynligt, at de 
analyserede celler er blevet delt under eller efter eksponering for teststoffet. For alle protokoller er det vigtigt at påvise, at der er sket celleproliferation i både kontrolkulturerne og de behandlede kulturer, og omfanget af den test ­
stofinducerede cytotoksicitet eller cytostase skal vurderes i kulturerne (eller 
i parallelle kulturer), som bedømmes for forekomst af mikrokerner.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
BESKRIVELSE AF ASSAYET  
Præparater  
11. Der kan anvendes dyrkede primære perifere blodlymfocytter fra det perifere 
blod hos mennesker (5) (19) (42) (43) og en række cellelinjer fra gnavere 
såsom CHO, V79, CHL/IU, og L5178Y-celler (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Anvendelsen af andre cellelinjer og -typer skal være baseret på dokumenteret ydeevne i assayet som beskrevet i afsnittet om 
acceptkriterier. Da baggrundsforekomsten af mikrokerner vil påvirke 
assayets følsomhed, anbefales det, at der anvendes celletyper med en lav, stabil baggrundsforekomst af mikrokernedannelse.
 
12. Perifere humane blodlymfocytter skal udtages fra unge (ca. 18-35 år), 
sunde, ikkerygende personer uden nylige kendte eksponeringer for genotok ­
siske kemikalier eller bestråling. Hvis celler fra mere end en doner pooles, 
skal antallet af donorer angives. Mikrokerneforekomsten forøges med alde ­
ren, og denne udvikling er mere markant hos kvinder end hos mænd (44), og der skal tages i betragtning ved udvælgelsen af donorceller til pooling.
 
Medier og dyrkningsbetingelser  
13. Til vedligeholdelse af kulturerne benyttes der egnede dyrkningssubstrater og 
inkuberingsbetingelser (dyrkningsflasker, CO  2 -koncentration, temperatur og 
fugtighed). Etablerede cellelinjer og -stammer kontrolleres regelmæssigt for stabilt normalt kromosomtal og mykoplasmakontaminering, og i tilfælde af kontaminering, eller hvis det normale kromosomtal har ændret sig, 
anvendes kulturen ikke. Cellernes normale cykluslængde og dyrkningsbetin ­
gelserne i laboratoriet skal være kendt. Ved anvendelse af cytokinesebloke ­
ringsmetoden skal koncentrationen af cytokineseinhibitoren optimeres for den særlige celletype og påvise et godt udbytte af binukleære celler til 
bedømmelse.
 
Fremstilling af kulturer  
14. Etablerede cellelinjer og -stammer: Celler udtages fra stamkulturer og udsås 
i dyrkningssubstrat med en sådan tæthed, at kulturerne ikke flyder sammen inden høst, og inkuberes ved 37 °C.
 
15. Lymfocytter: Fuldblod, der er behandlet med antikoaguleringsmiddel (f.eks. 
heparin), eller fraseparerede lymfocytter dyrkes i substratet, der indeholder et mitogen, f.eks. phytohæmagglutinin (PHA), inden eksponering for test ­
stoffet og cytoB.
 
Metabolisk aktivering  
16. Eksogene metaboliserende systemer skal anvendes, når der gøres brug af 
celler med utilstrækkelige endogene metaboliske egenskaber. Det mest almindeligt anvendte system er en cofaktorsuppleret postmitokondriefrak ­
tion (S9), der fremstilles af levere fra rotter, der har været behandlet med 
enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (45) (46) eller en blanding af 
phenobarbiton og β-naphthoflavon (46) (47) (48) (49). Den sidstnævnte 
blanding er ikke i strid med Stockholmkonventionen om persistente orga ­
niske miljøgifte (50) og forordning (EF) nr. 850/2004 om persistente orga ­
niske miljøgifte (66) og har vist sig at være lige så effektiv som Aroclor 
1254 til induktion af oxidaser med blandet funktion (46) (47) (48) (49). S9- fraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1-10 % (v/v) i det færdige testsubstrat. Et metabolismeaktiveringssystems beskaffenhed kan 
afhænge af, hvilken kemisk klasse teststoffet tilhører, og i nogle tilfælde 
vil det være hensigtsmæssigt at benytte mere end én S9-koncentration.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Genetisk konstruerede cellelinjer, der udtrykker specifikke aktiverende 
enzymer fra mennesker eller gnavere, kan fjerne behovet for et eksogen 
metabolisk aktiveringssystem og kan anvendes som testceller. I disse tilfælde skal valget af en bestemt cellelinje begrundes sagligt f.eks. ved, at oxidaserne med blandet funktion er relevante for teststoffets metabolisme 
(51), og at de er følsomme over for kendte klastogener og aneugener (se 
særskilt afsnit om acceptkriterier). Man skal være opmærksom på, at test ­
stoffet ikke altid metaboliseres af de(n) udtrykte oxidase(r) med blandet funktion. I dette tilfælde indebærer negative testresultater ikke, at teststoffet 
ikke kan fremkalde mikrokerner.
 
Fremstilling af teststof  
18. Testkemikalier i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløsnings ­
midler eller bærestoffer og fortyndes eventuelt inden behandling af cellerne. Testkemikalier i væskeform kan enten tilsættes direkte til testsystemet 
og/eller fortyndes inden behandlingen. Gasser og flygtige stoffer skal 
testes ved passende modifikation af standardprotokollerne, f.eks. i forseg ­
lede dyrkningsflasker (52) (53). Der benyttes frisk fremstillede teststofpræ ­
parater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
 
Testbetingelser  
Opløsningsmidler/bærestoffer  
19. Opløsningsmidlet/bærestoffet må ikke reagere med teststoffet eller hæmme 
cellernes overlevelse eller S9-aktiviteten ved den anvendte koncentration. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte (f.eks. 
vand, dyrkningssubstrat, dimethylsulfoxid), skal brugen af dem underbygges 
med data, der viser deres kompatibilitet med teststoffet og fraværet af genetisk toksicitet. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem.
 
Anvendelse af cytoB som cytokineseblokerende stof  
20. Et af de vigtigste aspekter i forbindelse med MNvit-assayet er at sikre, at de 
bedømte celler har afsluttet mitosen under behandlingen eller i påkommende tilfælde i inkubationsperioden efter behandlingen. CytoB har været det mest 
anvendte stof til at hæmme cytokinese, da det hæmmer samlingen af aktin 
og således forhindrer deling af datterceller efter mitose, hvilket resulterer i dannelsen af binukleære celler (5) (54) (55). Bedømmelsen af mikrokerne kan således begrænses til celler, der har undergået mitose under eller efter 
behandling. Teststoffets indvirkning på celleproliferationens kinetik kan 
måles samtidigt. CytoB bør anvendes som cytokineseblokerende stof, når der gøres brug af humane lymfocytter, da cellecykluslængder varierer inden for kulturer og mellem donorer, og da det ikke er alle lymfocytter, der 
reagerer på PHA. Der har været anvendt andre metoder ved test af celle ­
linjer for at bestemme, om de bedømte celler har delt sig (se punkt 26).
 
21. Laboratoriet skal vælge den passende koncentration af cytoB for hver celle ­
type for at opnå den optimale forekomst af binukleære celler i kontrolkul ­
turerne med opløsningsmiddel/bærestof. Den passende koncentration af 
cytoB ligger normalt mellem 3 og 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Måling af celleproliferation og cytotoksicitet og valg af eksponeringskon ­
centrationer  
22. Ved valg af højeste koncentration af teststoffet, der skal testes, bør man 
undgå koncentrationer, der kan frembringe artefakt positiv respons, f.eks. koncentrationer, der frembringer for høj cytotoksicitet, udfældning i et dyrk ­
ningssubstrat og væsentlige ændringer i pH eller osmolalitet (39) (40) (41).
 
23. Målinger af celleproliferation foretages for at sikre, at de behandlede celler 
har undergået mitose under assayet, og at behandlingerne udføres med 
passende cytotoksicitet (se punkt 29). Cytotoksiciteten bestemmes med og uden metabolisk aktivering i celler, der kræver metabolisk aktivering, ved hjælp af relativ forøgelse af celletal (RICC) eller relativ 
populationsfordobling (RPD) (se formlerne i tillæg 2), medmindre cytoB 
anvendes. Ved anvendelse af cytoB kan cytotoksiciteten bestemmes ved hjælp af replikationsindekset (RI) (se formlen i tillæg 2).
 
24. Behandling af kulturer med cytoB og måling af de relative forekomster af 
mononukleære, binukleære og multinukleære celler i kulturen er en nøjagtig metode til kvantificering af indvirkningen på celleproliferationen og en 
behandlings cytotoksiske eller cytostatiske virkning (5) og sikrer, at der 
udelukkende bedømmes celler, som delte sig under eller efter behandling.
 
25. I undersøgelser med cytoB kan cytostase/cytotoksicitet kvantificeres ved 
hjælp af proliferationsindekset for cytokineseblokerende stof (CBPI) (5) (26) (56) eller udledes af RI fra mindst 500 celler pr. kultur (se formlerne 
i tillæg 2). Når cytoB anvendes til vurdering af celleproliferationen, 
bestemmes CBPI eller RI ud fra mindst 500 celler pr. kultur. Disse målinger kan indgå i vurderingen af cytotoksiciteten ved at sammenligne værdier i de behandlede kulturer og kontrolkulturerne. Vurdering af andre cytotoksici ­
tetsmarkører (f.eks. konfluens, celleantal, apoptose, nekrose, antal 
metafaser) kan give nyttige oplysninger.
 
26. I undersøgelser uden cytoB er det nødvendigt at påvise, at de bedømte 
celler i kulturen er blevet delt under eller efter behandling med teststoffet, idet der i modsat fald kan fremkaldes et falsk negativt respons. De metoder, 
der er blevet anvendt til at sikre, at de celler, som bedømmes, har delt sig, 
omfatter inkorporering og efterfølgende påvisning af bromdeoxyuridin (BrdU) til identifikation af celler, der har replikeret sig (57), dannelse af kloner, når celler fra etablerede cellelinjer behandles og bedømmes in situ 
på et mikroskopobjektglas (proliferationsindeks (PI)) (25) (26) (27) (28), 
eller måling af relativ populationsfordobling (RPD) eller relativ forøgelse af celletal (RICC) eller andre påviste metoder (16) (56) (58) (59) (se formlerne i tillæg 2). Vurdering af andre cytotoksicitets- eller cytostasemarkører (f.eks. 
konfluens, celleantal, apoptose, nekrose, antal metafaser) kan give nyttige 
oplysninger.
 
27. Der benyttes mindst tre analyserbare testkoncentrationer. For at opnå dette 
kan det være nødvendigt at udføre forsøget med et større antal koncen ­
trationer med tætte intervaller og analysere mikrokernedannelsen i disse 
koncentrationer med passende cytotoksicitet. En alternativ strategi er at 
udføre en indledende cytotoksicitetstest for at indsnævre koncentrations ­
området for den endelige test.  
28. Den højeste koncentration bør frembringe en cytotoksicitet på 55 ± 5 %. 
Højere niveauer kan inducere kromosomskade som en bivirkning af cyto ­
toksicitet (60). Hvis der er tale om cytotoksicitet, skal de valgte koncen ­
trationer dække et interval fra det, der frembringer en cytotoksicitet på 55 ± 
5 %, til ringe eller ingen cytotoksicitet.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Hvis der ikke observeres cytotoksicitet eller bundfald, må testkoncentra ­
tionen højst være 0,01 M, 5 mg/ml eller 5 μl/ml (den laveste af de tre). 
De valgte koncentrationer til analyse skal generelt adskilles med en spred ­
ning på højst 10. I forbindelse med teststoffer med en stejl koncentrations-responskurv kan det være nødvendigt at mindske spred ­
ningen af teststofkoncentrationerne, således at kulturer med moderat og 
lav toksicitet også bedømmes.
 
30. Når opløselighed er en begrænsende faktor, skal den højeste koncentration, 
hvis den ikke er begrænset af cytotoksicitet, være den laveste koncentration 
med synlig udfældning i kulturer, forudsat at bundfaldet ikke har indfly ­
delse på bedømmelsen. Evalueringen af udfældningen foretages ved hjælp af metoder som lysmikroskopi, og vedvarende bundfald eller bundfald, der 
fremkommer under dyrkningen (efter behandlingens afslutning), noteres.
 
Kontrolprøver  
31. Der foretages sideløbende positive kontrolprøver og kontrolprøver med 
opløsningsmiddel/bærestof med og uden metabolisk aktivering i hvert 
forsøg.  
32. Positive kontrolprøver anvendes til at påvise de anvendte cellers og test ­
protokollens evne til at identificere klastogener og aneugener og til at 
bekræfte S9-blandingens metaboliske egenskaber. I positive kontrolprøver benyttes kendte induktorer af mikrokernedannelse i koncentrationer, der forventes at give små, men reproducerbare forøgelser i forhold til baggrund ­
sværdierne, hvorved testsystemets følsomhed godtgøres. Der vælges 
sådanne koncentrationer i de positive kontrolprøver, at virkningerne er tyde ­
lige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem.
 
33. Et klastogen, der kræver metabolisk aktivering (f.eks. cyclofosfamid, enzo[ ­
a]pyren), anvendes til påvisning af den metaboliske evne og testsystemets evne til at påvise klastogener. Andre positive kontrolprøver kan anvendes, 
hvis der er grund til det. Da nogle positive kontrolprøver, som kræver 
metabolisk aktivering, kan være aktive uden eksogen metabolisk aktivering i visse behandlingssituationer eller i visse cellelinjer, skal behovet for meta ­
bolisk aktivering og S9-blandingens aktivitet testes i de valgte cellelinjer og 
ved de valgte koncentrationer.
 
34. For indeværende er der ingen kendte aneugener, som kræver metabolisk 
aktivering for at bedømme deres gentoksiske virkninger (16). Positive 
kontrolprøver til påvisning af aneugen aktivitet, der accepteres i dag, er 
f.eks. colchicin og vinblastin. Der kan anvendes andre kemikalier, hvis de udelukkende eller primært inducerer mikrokerner gennem aneugen aktivitet. For at undgå behovet for to positive kontrolprøver (for klastogenicitet og 
aneugenicitet) uden metabolisk aktivering kan aneugenicitetskontrollen 
fungere som positiv kontrolprøve uden S9, og klastogenicitetskontrollen kan anvendes til at teste tilstrækkeligheden af det anvendte metaboliske aktiveringssystem. Positive kontrolprøver for både klastogenicitet og aneu ­
genicitet skal anvendes i celler, som ikke kræver S9. Anbefalede positive 
kontrolprøver er angivet i tillæg 3.
 
35. Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede positive 
kontrolstoffer. Alle anvendte positive kontrolstoffer skal være egnet for 
celletypen og aktiveringsforholdene.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Der skal i hver høst indgå negative (opløsningsmiddel eller bærestof) 
kontrolprøver. Desuden skal der anvendes ubehandlede negative kontrol ­
prøver (uden opløsningsmiddel/bærestof), medmindre der foreligger offent ­
liggjorte eller historiske kontroldata fra laboratorieforsøg, der viser, at det valgte opløsningsmiddel ved de anvendte koncentrationer ikke har nogen 
genotoksiske eller andre skadelige virkninger.
 
TESTPROCEDURE  
Behandlingsplan  
37. For at maksimere sandsynligheden for at påvise aneugeners eller klastoge ­
ners aktivitet i en bestemt fase i cellecyklussen er det vigtigt, at et tilstræk ­
keligt antal celler behandles med teststoffet i alle cellecyklussens faser. 
Behandlingsplanen for cellelinjer og primære cellekulturer kan derfor 
være forskellig fra behandlingsplanen for lymfocytter, der kræver stimule ­
ring med mitogen for at sætte cellecyklussen i gang, og disse behandles i punkt 41-43 (16).
 
38. Teoretiske overvejelser og offentliggjorte data (18) viser, at de fleste aneu ­
gener og klastogener vil blive påvist efter en kortvarig behandlingsperiode på 3-6 timer med eller uden tilsætning af S9, efterfølgende fjernelse af teststoffet og en vækstperiode på 1,5-2 gange en normal cellecyklus (6). 
Cellerne udtages efter et tidsrum, der svarer til ca. 1,5-2 gange den normale 
(dvs. ubehandlede) cellecykluslængde, regnet fra behandlingens start eller afslutning (se tabel 1). Prøveudtagnings- og restitutionsperioden kan udvi ­
des, hvis man ved eller har mistanke om, at teststoffet påvirker cellecyklus ­
længden (f.eks. ved test af nucleosidanaloger).
 
39. På grund af den potentielle cytotoksiske virkning af S9-blandinger til 
dyrkede pattedyrceller udvides eksponeringsperioden til at dække 1,5-2 gange en normal cellecyklus uden tilsætning af S9. Udvides eksponerings ­
perioden er der flere muligheder for behandling af cellerne med testkemi ­
kaliet uden og med tilsætning af cytoB. Med disse valgmuligheder tages der højde for situationer, der kan give anledning til bekymring over risikoen for interaktion mellem teststoffet og cytoB.
 
40. De anbefalede behandlingsplaner fremgår af tabel 1. Disse generelle 
behandlingsplaner kan ændres afhængigt af teststoffets stabilitet eller reakti ­
vitet eller de anvendte cellers særlige vækstegenskaber. Alle behandlinger skal indledes og afsluttes, medens cellevæksten stadig er eksponentiel. Der 
redegøres nærmere for denne tidsplan i punkt 41-47 nedenfor.
 
Tabel 1  
Tidsplan for cellebehandling og høst for MNvit-assayet  
Lymfocytter, primærceller og cellelinjer 
behandlet med cytoB + S9 Behandles i 3-6 timer med tilsætning af S9 
S9 og behandlingsmediet fjernes 
Friskt medium og cytoB tilsættes 
Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus. 
– S9 
Kortvarig ekspone ­
ring Behandles i 3-6 timer 
Behandlingsmediet fjernes 
Friskt medium og cytoB tilsættes Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Udvidet eksponering  Valgmulighed A:  Behandles i 1,5-2 gange en 
normal cellecyklus med tilsætning af cytoB 
Høstes ved afslutningen af eksponeringsperio ­
den. 
Valgmulighed B:  Behandles i 1,5-2 gange en 
normal cellecyklus 
Teststoffet fjernes Friskt medium og cytoB tilsættes Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus. 
Cellelinjer behandlet uden cytoB 
(Samme behandlingsplan som anført ovenfor, bortset fra at der ikke tilsættes cytoB)
 
Lymfocytter, primærceller og cellelinjer behandlet med cytoB  
41. For lymfocytter er den mest effektive tilgang at indlede eksponeringen for 
teststoffet 44-48 timer efter PHA-stimuleringen, når synkroniseringen af 
cyklussen er afsluttet (5). I det første assay behandles cellerne i 3-6 timer 
med teststoffet uden og med tilsætning af S9. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium med cytoB, og cellerne høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus.
 
42. Hvis de to første test med kortvarig (3-6 timer) behandling er negative eller 
tvetydige, udvides eksponeringsperioden uden tilsætning af S9. Der findes to behandlingsmuligheder, som er lige brugbare. Det kan imidlertid være 
mere hensigtsmæssigt at vælge valgmulighed A i forbindelse med stimule ­
rede lymfocytter, hvor den eksponentielle vækst kan være faldende 96 timer efter stimulering. Desuden vil cellekulturerne ikke have konflueret på tids ­
punktet for den endelige prøveudtagning ved anvendelse af valgmulighed B.
 
— Valgmulighed A: Cellerne behandles med teststoffet i et tidsrum, der 
svarer til 1,5-2 gange en normal cellecyklus, og høstes ved afslutningen af eksponeringsperioden.
 
— Valgmulighed B: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en 
normal cellecyklus. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter yderligere 1,5-2 gange en normal cellecyklus.
 
43. Primærceller og cellelinjer behandles på samme måde som lymfocytter, 
bortset fra at det ikke er nødvendigt at stimulere dem med PHA i 44-48 timer. Andre celler end lymfocytter skal eksponeres på en sådan måde, at 
cellerne ved afslutningen af eksponeringsperioden fortsat er i den logarit ­
miske vækstfase.
 
Cellelinjer uden cytoB  
44. Celler behandles i 3-6 timer med og uden tilsætning af S9. Behandlings ­
mediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter 1,5-2 
gange en normal cellecyklus.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Hvis de to første test med kortvarig (3-6 timer) behandling er negative eller 
tvetydige, udvides eksponeringsperioden (uden tilsætning af S9). Der findes 
to behandlingsmuligheder, som er lige brugbare.  
— Valgmulighed A: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en 
normal cellecyklus og høstes ved afslutningen af eksponeringsperioden.  
— Valgmulighed B: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en 
normal cellecyklus. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter yderligere 1,5-2 gange en normal cellecyklus.
 
46. I encellede lag kan der være mitotiske celler (runde celler, der er løsrevet 
fra overfladen) til stede efter eksponeringen på 3-6 timer. Da disse mitotiske 
celler løsrives nemt, kan de gå tabt, når mediet med teststoffet fjernes. Det 
er vigtigt at indsamle disse celler, når kulturerne vaskes, og at føre dem tilbage til kulturerne for ikke at miste celler, der er i mitose, og hvor der er risiko for dannelse af mikrokerner på høsttidspunktet.
 
Antal kulturer  
47. Der benyttes dobbeltbestemmelse ved hver koncentration af teststof og for 
negative kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bærestof. Hvis det på 
grundlag af data fra tidligere laboratorieforsøg kan godtgøres, at forskellen mellem dobbeltbestemmelser er minimal, kan enkeltbestemmelse accepteres. Benyttes der kun én kultur, anbefales det at øge antallet af koncentrationer 
til analyse.
 
Cellehøst og præparering af objektglas  
48. Høst og præparering foregår særskilt for hver enkelt kultur. Præpareringen 
af celler kan bestå i hypotonisk behandling, men dette er ikke nødvendigt, 
hvis der opnås en tilstrækkelig spredning af cellerne på anden vis. Der kan anvendes forskellige teknikker til præparering af objektglas, forudsat at der fremstilles cellepræparater af høj kvalitet til bedømmelse. Cellens cyto ­
plasma anvendes til påvisning af mikrokerner og (ved cytokineseblokerings ­
metoden) pålidelig identifikation af binukleære celler.
 
49. Objektglassene kan farves ved hjælp af forskellige metoder, f.eks. med 
Giemsa- eller fluorescerende dna-specifikke farvestoffer (59). Ved at bruge en dna-specifik farvning (f.eks. acridinorange (61) eller Hoechst 
33258 plus pyronin-Y (62)) kan man undgå nogle af de artifakter, der 
optræder ved ikke-dna-specifik farvning. Anti-kinetokor-antistoffer, FISH med pancentromeriske dna-prober eller primet in situ-mærkning med pancentromerspecifikke primere og egnet dna-kontrastfarvning kan 
anvendes til identifikation af mikrokerners indhold (kromosom/kromosom ­
fragment), hvis der er brug for mekanistisk information og dannelsen heraf (15) (16). Andre metoder til differentiering mellem klastogener og aneu ­
gener kan anvendes, hvis de har vist sig at være effektive.
 
Analyse  
50. Alle objektglas, herunder kontrolprøver med opløsningsmiddel/bærestof, 
kodes uafhængigt inden mikroskoperingen. Alternativt analyseres kodede 
prøver ved hjælp af et valideret system til automatisk flow-cytometri- 
eller billedanalyse.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. I cytoB-behandlede kulturer analyseres mikrokerneforekomsten i mindst 
2 000 binukleære celler pr. koncentration (mindst 1 000 binukleære celler 
pr. kultur, to kulturer pr. koncentration). Benyttes der kun én kultur, bedømmes mindst 2 000 binukleære celler pr. koncentration fra den pågæl ­
dende kultur. Hvis der er væsentligt færre end 1 000 binukleære celler pr. 
kultur, eller færre end 2 000, hvis der kun benyttes én kultur, til bedøm ­
melse i hver koncentration, og hvis der ikke påvises en væsentlig forøgelse af antallet af mikrokerner, gentages testen med flere celler eller i mindre toksiske koncentrationer afhængigt af forholdene. Det er vigtigt at undlade 
at bedømme binukleære celler med uregelmæssige former, eller hvor de to 
kerner har en meget forskellig størrelse, og binukleære celler må heller ikke forveksles med ujævnt udstrøgne multinukleære celler. Celler med mere end to hovedkerner analyseres ikke for forekomsten af mikrokerner, da mikro ­
kerneforekomsten i forvejen kan være højere i disse celler (63) (64). Det er 
acceptabelt at bedømme mononukleære celler, hvis det påvises, at teststoffet griber ind i cytoB-aktiviteten.
 
52. I cellelinjer, der ikke behandles med cytoB, bedømmes mikrokerneforekom ­
sten i mindst 2 000 celler pr. koncentration (mindst 1 000 celler pr. kultur, to kulturer pr. koncentration). Benyttes der kun én kultur pr. koncentration, bedømmes mindst 2 000 celler fra den pågældende kultur.
 
53. Når cytoB anvendes, bestemmes CBPI eller RI til vurdering af cellepro ­
liferationen (se tillæg 2) ud fra mindst 500 celler pr. kultur. Ved behandling uden tilsætning af cytoB er det afgørende at dokumentere, at de celler, der 
bedømmes, har formeret sig, jf. punkt 24-27.
 
Acceptkriterier  
54. Et laboratorium, der ønsker at udføre det MNvit-assay, der er beskrevet i 
denne TM, skal påvise, at det har kompetence til på pålidelig og nøjagtig 
vis at identificere kemikalier med kendt aneugen og klastogen aktivitet og med eller uden metabolisk aktivering såvel som kendte negative kemikalier på grundlag af referencekemikalierne i tillæg 3. Som dokumentation for dets 
kompetence til at udføre denne TM korrekt skal laboratoriet dokumentere, 
at kernedelingen af de celler, der bedømmes for mikrokernedannelse, er afsluttet, hvis testen udføres uden tilsætning af cytoB.
 
55. Det anbefales at anvende kemikalierne i tillæg 3 som referencekemikalier. 
Det er muligt at tilføje eller erstatte kemikalier, hvis deres aktivitet er kendt, og hvis de inducerer mikrokerner ved hjælp af de samme mekanismer, og hvis det påvises, at de er egnede for de kemikalier, som skal testes ved 
hjælp af MNvit-assayet. Begrundelsen kan omfatte en valideringsundersø ­
gelse af en bred vifte af stoffer eller en undersøgelse med fokus på et snævrere spektrum baseret på teststoffets kemiske gruppe eller de under ­
søgte skadevirkninger.
 
56. Kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bærestof og ubehandlede kulturer 
bør resultere i reproducerbart lave og konsistente mikrokerneforekomster (typisk 5-25 mikrokerner/1 000 celler for de celletyper, der er identificeret 
i punkt 11). Andre celletyper kan have andre responsintervaller, der skal 
fastslås ved valideringen af deres anvendelse i MNvit-assayet. Data fra negative kontrolprøver med opløsningsmiddel og positive kontrolprøver anvendes til at fastslå historiske kontrolintervaller. Disse værdier indgår i 
vurderingen af, om de sideløbende negative/positive kontrolprøver opfylder 
kravene til forsøg.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Hvis der foreslås mindre ændringer til protokollen (f.eks. anvendelse af 
automatiserede i stedet for manuelle bedømmelsesteknikker, anvendelse af 
en ny celletype), skal ændringens effektivitet påvises, inden den modifice ­
rede protokol kan accepteres. Det skal i denne forbindelse påvises, at det er muligt at identificere de vigtigste mekanismer for kromosomskade og 
gevinst eller tab, og at der kan opnås korrekte positive og negative resultater 
for den enkelte stofgruppe eller det brede spektrum af stoffer, der skal testes.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Behandling af resultater  
58. Ved cytokineseblokeringsmetoden tages der kun højde for forekomsten af 
binukleære celler med mikrokerner (uafhængigt af antallet af mikrokerner 
pr. celle) ved vurdering af induktionen af mikrokerner. Det er ikke obliga ­
torisk at bedømme antallet af celler med en, to eller flere mikrokerner, men det kan give nyttige oplysninger.
 
59. Der foretages sideløbende målinger af cytotoksicitet og/eller cytostase for 
alle behandlede kulturer samt kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bære ­
stof (58). Ved cytokineseblokeringsmetoden udregnes CBPI eller RI for alle behandlede kulturer og kontrolkulturer som målinger af cellecyklusforsin ­
kelse. Hvis cytoB ikke anvendes, anvendes RPD-, RICC- eller PI-metoden 
(se tillæg 2).
 
60. Der anføres data for hver enkelt kultur. Desuden sammenfattes alle data i 
tabelform.  
61. Når kemikalier inducerer mikrokerne i MNvit-assayet, kan det skyldes, at de 
fremkalder kromosombrud, kromosomtab eller en kombination heraf. Yder ­
ligere analyse med anvendelse af anti-kinetokor-antistof, centromeriske in 
situ-prober eller andre metoder kan anvendes til at bestemme, om induk ­
tionen af mikrokerner skyldes klastogen og/eller aneugen aktivitet.  
Evaluering og fortolkning af resultater  
62. Der er ingen krav om verifikation af et klart positivt eller negativt resultat ved 
hjælp af yderligere forsøg. Tvetydige resultater kan afklares ved analyse af yderligere 1 000 celler fra alle kulturerne for at undgå tab af blinding. Hvis 
denne tilgang ikke afklarer resultatet, udføres der yderligere test. Ved opføl ­
gende forsøg bør det overvejes at ændre undersøgelsesparametrene og udvide eller indskrænke forsøgsbetingelserne i relevant omfang. Blandt de undersøgel ­
sesparametre, der kan ændres på, er testkoncentrationernes spredning, tids ­
planen for behandling og cellehøst og/eller metabolismeaktiveringen.
 
63. Der findes en række kriterier for opnåelse af et positivt resultat, f.eks. en 
koncentrationsafhængig forøgelse eller en statistisk signifikant forøgelse af antallet af celler med mikrokerner. Der bør i første række ses på resulta ­
ternes biologiske relevans. Det kan være nyttigt at undersøge, om de obser ­
verede værdier ligger inden eller uden for det historiske kontrolinterval, ved 
vurderingen af responsets biologiske signifikans. Egnede statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (65). Dosis-responsforholdet skal imidlertid også indgå i bedømmelsen af de 
statistiske testresultater. Reproducerbarhed og historiske data skal også 
tages i betragtning.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i nogle 
tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af 
teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvetydigt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.
 
65. Et positivt resultat af MNvit-assayet viser, at teststoffet fremkalder kromo ­
sombrud eller kromosomtab i dyrkede celler fra pattedyr. Et negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder kromosombrud og/eller gevinst eller tab af kromosomer i dyrkede celler fra pattedyr.
 
Testrapport  
66. Testrapporten skal som minimum omfatte følgende oplysninger, hvis de er 
relevante for undersøgelsens gennemførelse:  
Testkemikalie  
— identifikationsoplysninger, CAS-nr. (Chemical Abstract Services 
Registry Number) og EF-nr.  
— fysiske egenskaber og renhedsgrad  
— fysisk-kemiske egenskaber, som er relevante for undersøgelsen  
— testkemikaliets reaktivitet med opløsningsmiddel/bærestof eller celle ­
dyrkningsmedium  
Opløsningsmiddel/bærestof  
— begrundelse for valg af opløsningsmiddel/bærestof  
— teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof  
Celler  
— den valgte celletype og oprindelse  
— den valgte celletypes egnethed  
— eventuelt fravær af mykoplasma  
— oplysninger om cellecyklussens længde, fordoblingstid eller prolifera ­
tionsindeks  
— ved anvendelse af humane lymfocytter, bloddonorers køn, alder og 
antal, hvis det er relevant  
— ved anvendelse af humane lymfocytter, om fuldblod eller fraseparerede 
lymfocytter eksponeres  
— eventuelt antal passager  
— eventuelle metoder til opretholdelse af cellekulturer  
— normalt kromosomtal  
— cellecyklussens normale længde (negativ kontrol)  
Testbetingelser  
— det cytokineseblokerende stofs (f.eks. cytoB) betegnelse og koncentra ­
tion og længden af cellernes udsættelse for stoffet  
— begrundelse for valg af koncentrationer og antal kulturer, herunder even ­
tuelle cytotoksicitetsdata og opløselighedsbegrænsninger  
— substratsammensætning og eventuel CO  2 -koncentration  
— teststofkoncentrationer  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— koncentration (og/eller volumen) af tilsat bærestof og teststof  
— inkubationstemperatur og -periode  
— behandlingens varighed  
— høsttidspunkt efter behandling  
— celletæthed ved udsåning, hvis det er relevant  
— metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, herunder 
acceptkriterier  
— positive og negative kontrolprøver  
— anvendte metoder til præparering af objektglas og farvningsteknik  
— kriterier for identifikation af mikrokerner  
— antal analyserede celler  
— metoder til måling af cytotoksicitet  
— eventuelle supplerende oplysninger vedrørende cytotoksicitet  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller 
tvetydig  
— anvendte statistiske analysemetoder  
— metoder som f.eks. anvendelse af kinetokor-antistof til bestemmelse af, 
om mikrokerner indeholder hele kromosomer eller kromosomfragmen ­
ter. 
Resultater  
— anvendt måling af cytotoksicitet, f.eks. CBPI eller RI ved anvendelse af 
cytokineseblokeringsmetoden, RICC, RPD eller PI, når cytokineseblo ­
keringsmetoden ikke anvendes, andre relevante observationer, f.eks. 
cellekonfluens, apoptose, nekrose, antal metafaser, forekomst af binuk ­
leære celler  
— tegn på udfældning  
— data om pH og osmolalitet i behandlingsmediet, hvis disse værdier er 
målt 
— definition af acceptable celler til analyse  
— fordeling af mono-, bi- og multinukleære celler ved anvendelse af en 
cytokineseblokeringsmetode  
— antal celler med mikrokerner, anført særskilt for hver behandlet kultur 
og kontrolkultur, og bestemmelse af, om de er indsamlet fra binukleære eller mononukleære celler, hvis det er relevant
 
— koncentrations-responssammenhængen, når det er muligt  
— kemiske data (koncentrationer og opløsningsmidler) for sideløbende 
negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver  
— kemiske data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og posi ­
tive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit, standard ­
afvigelser og konfidensinterval (f.eks. 95 %)  
— statistisk analyse og eventuelle P-værdier.  
Behandling af resultater  
Konklusioner  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
LITTERATUR  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1-4.  
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3-15.  
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233-246.  
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167-172.
 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084-1104.  
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193-198.  
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34-43.
 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9-20.  
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Clas ­
sification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with biotinylated 
gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297-302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluore ­
scence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329-334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a 
centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205-213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519-525.  
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes follo ­
wing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor 
fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 
9-20.  
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centro ­
meric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 372, 
233-245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211-219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153-163.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines]  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13-36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37-60.
 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61-87.  
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobay ­
ashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and 
Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  
micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 88-124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), 
SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125-152.  
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187-208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 45- 
59. 
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81-116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemi ­
cally induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183-190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55-71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells — results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137-163.
 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 517, 123-134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569-580.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1-152.  
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16-17 November, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/ 
index.htm]  
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271-283.  
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and 
Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105-115.
 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257-260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315-328.
 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61-70.
 
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147-205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 297- 
305. 
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789-886.  
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes,  Mutation Res. , 147, 29-36.  
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11-18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocy ­
tes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the 
frequency of micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31-45.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173-215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55-65.
 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175-177.
 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85-88.  
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51-59.  
(50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: 
[http://www.pops.int/]  
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An invest ­
igation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 247- 
274.
 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Muta ­
tion Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., Costa, 
D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New 
York, Plenum, pp. 91-103.  
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795-801.
 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a 
detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35-44.
 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 521, 103-112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to »Report from the  in vitro  micronucleus assay working group«,  Mutation 
Res., 564, 97-100.
 
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61-65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1-3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169-184.
 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191-201.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241-247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269-275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, 241-247.  
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65-75.  
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467.  
(66) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 850/2004 af 29. april 
2004 om persistente organiske miljøgifte og om ændring af direktiv 79/ ­
117/EØF, EUT L 158 af 30.4.2004, s. 7.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Tillæg 1  
Definitioner  
Aneugen:  Alle stoffer eller processer, der ved interaktion med komponenterne i 
den mitotiske og meiotiske celledelingscyklus forårsager aneuploidi i celler eller organismer.
 
Aneuploidi:  Enhver afvigelse fra det normale diploide (eller haploide) kromo ­
somtal af et eller flere kromosomer, men ikke af et eller flere komplette kromo ­
somsæt (polyploidi)  
Apoptose:  Programmeret celledød karakteriseret ved en række trin, der forårsager 
opløsning af celler i membranbundne partikler, som herefter elimineres ved 
fagocytose eller afstødning.  
Celleproliferation:  Forøgelse af celleantal som følge af mitotisk celledeling  
Centromer:  Dna-region af et kromosom, hvor begge kromatider holdes sammen, 
og hvorpå begge kinetokorer er bundet side om side.  
Klastogen:  Alle stoffer eller processer, der forårsager strukturelle kromosomaber ­
rationer i populationer af celler eller organismer.  
Cytokinese:  Celledeling umiddelbart efter mitose, hvorved der dannes to datter ­
celler, som hver indeholder en enkelt kerne.  
Proliferationsindeks for cytokineseblokerende stof (CBPI):  Andelen af celler efter 
anden deling i den behandlede population i forhold til den ubehandlede kontrol 
(se formlen i tillæg 2).  
Cytostase:  Hæmning af cellevækst (se formlen i tillæg 2)  
Cytotoksicitet:  Skadelige virkninger i cellestruktur eller -funktion, der i sidste 
ende forårsager celledød.  
Genotoksisk:  Et generelt udtryk, der omfatter alle former for dna- eller kromo ­
sombeskadigelse, herunder brud, omlejring af addukter, mutationer, kromosoma ­
berrationer og aneuploidi. Det er ikke alle former for gentoksiske virkninger, der 
forårsager mutationer eller stabil kromosomskade.  
Interfaseceller:  Celler, der ikke er i mitosefase.  
Kinetokor:  En proteinstruktur, der er samlet ved et kromosoms centromer, hvortil 
tentrådene er påhæftet under celledeling, således at datterkromosomerne kan 
ordnes i forhold til dattercellernes poler.  
Mikrokerner:  Små ekstrakerner, der er adskilt fra cellens hovedkerne, og som 
dannes under mitosens eller meiosens telofase ud fra efterladte kromosomfrag ­
menter eller hele kromosomer.  
Mitose:  Deling af cellekernen, der normalt inddeles i profase, prometafase, 
metafase, anafase og telofase.  
Mitoseindeks:  Forholdet mellem antallet af celler i metafase og det samlede antal 
celler i en population; det viser populationens celleformeringsgrad.  
Mutagen:  Forårsager arvelige ændringer af dna-baseparsekvens(er) i gener eller i 
kromosomstrukturen (kromosomaberrationer).  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Non-disjunction:  Forbundne kromatiders manglende evne til at dele sig og spalte 
sig korrekt til dattercellerne under udvikling, hvorved der dannes datterceller med 
anormale kromosomtal.  
Polyploidi:  Numeriske kromosomaberrationer i celler eller organismer, der invol ­
verer et eller flere komplette kromosomsæt, men ikke et enkelt kromosom eller kromosomer (aneuploidi).
 
Proliferationsindeks (PI):  Metode til måling af cytotoksicitet, hvis der ikke 
anvendes cytoB (se formlen i tillæg 2)  
Relativ forøgelse af celletal (RICC):  Metode til måling af cytotoksicitet, hvis der 
ikke anvendes cytoB (se formlen i tillæg 2).  
Relativ populationsfordobling (RPD):  Metode til måling af cytotoksicitet, hvis 
der ikke anvendes cytoB (se formlen i tillæg 2).  
Replikationsindeks (RI):  Andelen af afsluttede celledelingscyklusser i den 
behandlede kultur i forhold til den ubehandlede kontrol i eksponerings- og resti ­
tutionsfasen (se formlen i tillæg 2).  
Testkemikalie (eller teststof):  Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af 
denne TM.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Tillæg 2  
Formler for vurdering af cytotoksicitet  
1. Hvis cytoB anvendes , baseres evalueringen af cytotoksicitet på proliferations ­
indekset for cytokineseblokerende stof (CBPI) eller replikationsindekset (RI) (16) 
(58). CBPI angiver det gennemsnitlige antal cellecyklusser pr. celle under ekspone ­
ringen for cytoB og kan anvendes til at beregne celleproliferationen. RI angiver det relative antal kerner i behandlede kulturer sammenholdt med kontrolkulturerne og kan anvendes til at beregne cytostase i procent.
 
% cytostase = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
og: 
T = kultur til behandling af testkemikalier  
C = kultur til vehikelkontrol  
hvor:  
CBPI ¼ ððantal mononukleære celler Þ þ ð2 Ü antal binukleære celler Þ þ ð3 Ü antal multinukleære celler ÞÞ 
ðantal celler i altÞ 
Et CBPI på 1 (alle celler er mononukleære) svarer til en cytostase på 100 %.  
Cytostase = 100 – RI  
RI ¼ ððantal binukleære celler Þ þ ð2 Ü antal multinukleære celler ÞÞ ö ðantal celler i altÞ T 
ððantal binukleære celler Þ þ ð2 Ü antal multinukleære celler ÞÞ ö ðantal celler i altÞ C Ü 100  
T = behandlede kulturer  
C = kontrolkulturer  
2. Et RI på 53 % angiver således, at i forhold til antallet af celler, der delte sig 
til binukleære og multinukleære celler i kontrolkulturen, var der kun 53 % af disse celler, der delte sig i den behandlede kultur, dvs. 47 % cytostase.
 
3. Hvis cytoB ikke anvendes , anbefales evaluering af cytotoksicitet baseret på 
relativ forøgelse af celletal (RICC) eller relativ populationsfordobling (RPD) (58), da der ved begge metoder tages højde for den andel af cellepopulationen, som har delt sig.
 
RICC ¼ ðforøgelse af antallet af celler i behandlede kulturer  ðtil slut — i startenÞÞ 
ðforøgelse af antallet af celler i kontrolkulturer  ðtil slut — i startenÞÞ Ü 100  
RPD ¼ ðantal populationsfordoblinger i behandlede kulturer Þ 
ðantal populationsfordoblinger i kontrolkulturer Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
hvor:  
Populationsfordobling = [log (celleantal efter behandling ÷ oprindeligt cellean ­
tal)] ÷ log 2  
4. Et RICC eller RPD på 53 % angiver således 47 % cytotoksicitet/cytostase.  
5. Ved anvendelse af et proliferationsindeks (PI) kan cytotoksiciteten vurderes 
ved optælling af antallet af kloner med 1 celle (cl1), 2 celler (cl2), 3-4 celler (cl4) og 5-8 celler (cl8).
 
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. PI er også blevet anvendt som et værdifuldt og pålideligt cytotoksicitets ­
parameter for cellelinjer dyrket in situ uden cytoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Tillæg 3  
Anbefalede referencekemikalier til vurdring af ydeevne  ( 1 ) 
Kategori Kemikalie CAS-nr. EF-nr.  
1. Aktive klastogener uden metabolisk aktivering 
Cytosinarabinosid 147-94-4 205-705-9 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
2. Klastogener, som kræver metabolisk aktivering 
Benzo(a)pyren 50-32-8 200-028-5 
Cyclofosfamid 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugener 
Colchicin 64-86-8 200-598-5 Vinblastin 143-67-9 205-606-0 
4. Negative stoffer 
Di-(2-ethylhexyl)phthalat 117-81-7 204-211-0 
Nalidixinsyre 389-08-2 206-864-7 Pyren 129-00-0 204-927-3 Natriumchlorid 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Referencekemikalierne er de anbefalede kemikalier. Det er muligt at tilføje eller erstatte kemikalier på listen over referenc ekemi­
kalier, hvis deres aktivitet er kendt, og hvis de inducerer mikrokerner ved hjælp af de samme mekanismer, og hvis det påvises, at de 
er egnede for de kemikalier, som skal testes ved hjælp af MNvit-assayet. Afhængigt af formålet kan begrundelsen også omfatte en  
valideringsundersøgelse af en bred vifte af stoffer eller en undersøgelse med fokus på et snævrere spektrum baseret på teststof fets 
kemiske gruppe eller de undersøgte skadevirkninger.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER: DA  
INDLEDNING  
1. OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder bliver med 
mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling, 
behovet for ny lovgivning og hensynet til dyrevelfærden. Den oprindelige testmetode (TM) (B.42) til bestemmelse af hudsensibilisering i mus, assay på 
lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guideline 429), er blevet revideret 
(1). En validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). I LLNA anvendes radioisotopisk thymidin eller jod til måling af lymfocytproliferation, og assayet har derfor 
begrænset anvendelse, når fremstilling, anvendelse eller bortskaffelse af 
radioaktivitet er problematisk. LLNA: DA (udviklet af Daicel Chemical Industries, Ltd.) er en ikkeradioaktiv modificering af LLNA, der kvantificerer adenosintrifosat (ATP)-indholdet ved hjælp af bioluminescens som indikator 
for lymfocytproliferation. LLNA: DA-testmetoden er blevet valideret og 
gennemgået og anbefales af et internationalt peer review-panel, der vurderer, at metoden med visse begrænsninger kan anvendes til at udpege hudsensi ­
biliserende og ikkehudsensibiliserende kemikalier (10) (11) (12) (13). TM'en 
anvendes til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) potentiale for 
hudsensibilisering i dyr. I kapitel B.6 i dette bilag og i OECD Test Guideline 406 anvendes marsvin, navnlig maksimeringstesten på marsvin og Buehler ­
testen (14). LLNA (kapitel B.42 i dette bilag, OECD Test Guideline 429) og 
de to ikkeradioaktive modificeringer, LLNA: DA (kapitel B.50 i dette bilag, 
OECD Test Guideline 442 A) og LLNA: BrdU-ELISA (kapitel B.51 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 B), har alle en fordel frem for marsvine ­
testene i B.6 og OECD Test Guideline 406 (14) med hensyn til begrænsning 
og forfinelse af anvendelsen af dyr.
 
2. I lighed med LLNA består LLNA: DA i undersøgelse af induktionsfasen i 
hudsensibilisering og giver kvantitative data, som er velegnede til at vurdere 
dosis/responsforholdet. Evnen til at påvise hudsensibiliserende stoffer uden at det er nødvendigt at anvende dna-radioaktivt mærkede stoffer, fjerner risi ­
koen for erhvervsmæssig eksponering for radioaktivitet og imødegår 
problemer med bortskaffelse af affald. Det kan skabe grundlag for øget 
anvendelse af mus til påvisning af hudsensibiliserende stoffer, hvilket vil mindske anvendelsen af marsvin til test for potentiale for hudsensibilisering (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (14).
 
DEFINITIONER  
3. De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.  
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER  
4. LLNA: DA er en modificeret LLNA-metode til at udpege potentielle hudsen ­
sibiliserende kemikalier med bestemte begrænsninger. Det indebærer ikke 
nødvendigvis, at LLNA: DA altid skal anvendes i stedet for LLNA eller 
marsvinetest (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (14), men snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvanligvis 
ikke længere kræver yderligere bekræftelse (10) (11). Testlaboratoriet bør 
inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struk ­
tur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- 
og in vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for strukturelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA: DA er egnet til brug for stoffet (i lyset af 
begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA: DA [se punkt 5]) 
og som støtte ved valg af dosis.
 
5. LLNA: DA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke brugen af dyr til 
vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. Den giver imidlertid mulighed for at mindske antallet af dyr til dette formål i forhold til marsvi ­
netest (B.6, OECD Test Guideline 406) (14). LLNA: repræsenterer desuden 
en væsentligt mere sofistikeret måde (mindre smerte og angst) at anvende 
dyr til allergisk kontaktsensibiliseringstest på, idet LLNA: DA i modsætning til B.6 og OECD Test Guideline 406 ikke kræver, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. På trods af 
LLNA: DA-metodens fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 
(14) er der visse begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guide ­
line 406 nødvendige, f.eks. test af visse metaller, falsk positive resultater for visse hudirriterende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (6) (1 og 
kapitel B.42 i dette bilag) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stof ­
grupper eller stoffer, der indeholder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede sammenhænge (confounders) (16), kan desuden gøre marsvinetest nødvendige (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406 (14). Det anbefales, at de 
begrænsninger, der er blevet identificeret for LLNA (1 og kapitel B.42 i 
dette bilag), ligeledes finder anvendelse for LLNA: DA (10). Derudover er det muligvis ikke hensigtsmæssig at anvende LLNA: DA til test af stoffer, der påvirker ATP-niveauet (f.eks. stoffer, der fungerer som ATP-inhibitorer), 
eller stoffer der påvirker den nøjagtige måling af intracellulær ATP (f.eks. 
forekomst af ATP-nedbrydende enzymer, forekomst af ekstracellulær ATP i lymfeknuden). Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør LLNA: DA kunne anvendes til testning af alle stoffer, medmindre disse stoffer har egen ­
skaber, som kan have indflydelse på LLNA: DA-metodens nøjagtighed. Der 
skal desuden tages hensyn til muligheden for tvetydige positive resultater ved stimulationsindeks (SI)-værdier på mellem 1,8 og 2,5 (se punkt 31-32). Dette er baseret på valideringsdatabasen over 44 stoffer med et SI på 1,8 eller 
derover (se punkt 6), for hvilke LLNA: DA identificerede alle 32 
LLNA-sensibiliserende stoffer korrekt, men identificerede tre ud af 12 LLNA-ikkesensibiliserende stoffer med SI-værdier på mellem 1,8 og 2,5 (dvs. tvetydige positive resultater) forkert (10). Da det samme datasæt blev 
anvendt til fastsættelse af SI-værdierne og beregning af testens prædiktions ­
evne, kan de anførte resultater imidlertid være en overvurdering af den reelle prædiktionsevne.
 
TESTMETODENS PRINCIP  
6. Det tilgrundliggende princip for LLNA: DA består i, at den sensibiliserende 
agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner 
påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den 
påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammenholde den gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige 
proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem 
den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behandlingsgruppe og
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
proliferationen i den sideløbende VC-gruppe kaldes stimulationsindekset (SI) 
og skal være mindst 1,8, før teststoffet kan vurderes nærmere som en poten ­
tielt hudsensibiliserende agens. De her beskrevne metoder bygger på anven ­
delse af måling af ATP-indhold ved hjælp af bioluminescens (vides at korre ­
lere med antal levende celler) (17) til måling af øget celleproliferation i de 
drænende aurikulære lymfeknuder (18) (19). Ved bioluminescensmetoden 
anvendes luciferaseenzymet til at katalysere dannelsen af lys fra ATP og luciferin på grundlag af følgende reaktion:
 
ATP + luciferin  + O 2
 Oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + lys 
Den udsendte lysintensitet er lineært forbundet til ATP-koncentrationen og 
måles ved hjælp af et luminometer. Luciferin-luciferaseassayet er en følsom metode til kvantificering af ATP, der benyttes til en lang række formål (20).
 
BESKRIVELSE AF ASSAYET  
Valg af dyreart  
7. Mus må foretrækkes til denne test. Valideringsundersøgelser for LLNA: DA 
blev udelukkende udført med CBA/J-stammen, som derfor betragtes som den 
foretrukne stamme (12) (13). Der anvendes unge voksne hunmus, som ikke 
har født og ikke er drægtige. Ved forsøgets begyndelse skal dyrene være 8- 12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten. Alternativt kan der 
anvendes andre stammer og handyr, når der er genereret tilstrækkelige data 
til at dokumentere, at der ikke er væsentlige stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i LLNA: DA-respons.
 
Miljøbetingelser og fodring  
8. Mus bør anbringes i grupper (21), medmindre der fremlægges et fyldestgø ­
rende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen 
i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal 
være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt 
laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand.
 
Forberedelse af dyrene  
9. Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identifi ­
ceres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for 
at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner.
 
Fremstilling af forsøgsopløsninger  
10. Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og 
fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier 
kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraherbare 
bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne frem ­
stilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Pålidelighedskontrol  
11. Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præstationer 
er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og reproducer ­
barhed på et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelsesorden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, at assayet 
bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbarheden og 
sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyn ­
digheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den enkelte under ­
søgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til de relevante 
myndigheder inden udførelsen af LLNA. DA. Det anbefales derfor at fore ­
tage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde eventuelle krav ved regel ­
mæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol skal 
fremkalde en positiv LLNA: DA-respons ved det eksponeringsniveau, som 
forventes at give en stigning i SI, som er mere end 1,8 større end i den negative kontrolgruppe. PC-dosis vælges, således at den ikke forårsager for stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er 
reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 10 er for højt). De 
foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexylkanelaldehyd (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 101-86-0) og 25 % eugenol (CAS-nr. 97-53- 0) i acetone: olivenolie (4:1, v/v). Under visse omstændigheder vil andre 
positive kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anven ­
des, såfremt valget heraf kan begrundes.
 
12. Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være 
situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af 
det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt 
udfører LLNA: DA (dvs. udfører LLNA: DA mindst én gang om måneden) 
og har oprettet en historisk PC-database, der påviser laboratoriets evne til at skabe reproducerbare og nøjagtige resultater med positive kontroller. Labo ­
ratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompetence til at udføre LLNA: 
DA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive 
kontrol i mindst 10 uafhængige forsøg udført inden for en rimelig periode (dvs. inden for et år).
 
13. Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en ændring af 
LLNA: DA (f.eks. ændring af uddannet personale, ændring af testmaterialer 
og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), og disse 
ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. Der skal tages hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden af den allerede opret ­
tede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at oprette en 
ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er sammenhæn ­
gende.
 
14. Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en 
PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstrække ­
lige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den 
regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konsekvenser 
bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sideløbende posi ­
tive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige positive kontrol ­
ler. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sideløbende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på 
grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan anvendes 
færre mus (22).
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at frem ­
kalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse 
godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (23). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end 
teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende 
positive kontrol.
 
16. Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan 
referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at påvise denne type stoffers potentiale for hudsensibilisering. Egnede referen ­
cestoffer skal have følgende egenskaber:
 
— strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der 
testes, tilhører  
— kendte fysisk/kemiske egenskaber  
— støttedata fra LLNA: DA  
— støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker.  
TESTPROCEDURE  
Antal dyr og dosisniveauer  
17. Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige 
koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende 
behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (sidelø ­
bende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved perio ­
disk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med prøve ­
stof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i 
behandlingsgrupperne.
 
18. Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning (2) og 
(24). Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 
50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges 
et fyldestgørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncen ­
trationsserier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut toksicitet og hudirritation) og strukturelle og 
fysisk-kemiske oplysninger om det pågældende teststof (og/eller strukturelt 
beslægtede stoffer) tages i betragtning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig eksponering uden systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation 
(24) (25). Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt 
at foretage en prescreening (se punkt 21-24).
 
19. Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således at 
testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den frem ­
stillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De anbefalede 
vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v), N,N-dimethylformamid, methylet ­
hylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (6), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale derfor. I visse 
situationer kan det som yderligere kontrol være nødvendigt med et klinisk 
relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori teststoffet markeds ­
føres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikelsystemet bør inde ­
holde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke straks løber af, ved at 
inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % Pluronic® L92). Vehikler 
kun bestående af vand bør således undgås.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere 
variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning 
af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 33). Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus i PC-gruppen, når der indsamles data for de enkelte dyr (22). Nogle tilsyns ­
myndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. 
Regelmæssig indsamling af data for de enkelte dyr øger dyrevelfærden, idet man undgår gentagelse af forsøg, som ville være nødvendige, hvis tilsyns ­
myndigheder på et senere tidspunkt stiller andre krav til de teststofresultater, 
der oprindeligt blev indsamlet på én måde (f.eks. på grundlag af poolede data 
for dyr), (f.eks. krav om data for de enkelte dyr).
 
Prescreening  
21. Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste 
dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA: DA. Formålet med pres ­
creeningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, der skal 
anvendes i LLNA: DA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplys ­
ninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksicitet (se punkt 24) 
og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det maksimale dosis ­
niveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige koncentration for faste stoffer eller opslæmninger.
 
22. Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for LLNA: 
DA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en vurdering af 
lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til hver enkel 
dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosis ­
gruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation på påførings ­
stedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslutning af forsøget 
(dag 8). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (25). Der foretages målinger af øretykkelsen med en tykkelsesmåler (f.eks. et digitalt mikrometer eller en Peacock 
Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 (inden administration af dosis), på dag 3 
(ca. 48 timer efter den første dosis), på dag 7 (24 timer før afslutning) og på dag 8. På dag 8 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, der foretages, efter at dyrene er blevet humant 
aflivet. For stærk lokal hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 
og/eller en forøgelse af øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (26) (27). 
Den højeste dosis i LLNA: DA-hovedundersøgelsen skal være den næst ­
højeste dosis i prescreeningskoncentrationsserien (se punkt 18), som ikke 
inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation.
 
Tabel 1  
Erytemscorer  
Observation Score  
Intet erytem 0 
Meget let erytem (knapt diagnosticerbart) 1 Veldefineret erytem 2
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Observation Score  
Moderat til svært erytem 3 
Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klas ­
sificering af erytemet 4 
23. Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (26) (27) er en statistisk signifikant 
forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrol ­
musene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende stoffer i LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Selv om statistisk signifikante forøgelser kan 
forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet specifikt forbundet 
med for stærk irritation (30) (31) (32) (33) (34).
 
24. Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (35), hvis 
de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det 
maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA: DA-hovedundersøgelsen: 
ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soigneringsakti ­
viteten, markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirationsmøn ­
stre (f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom ånde ­
nød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og vandind ­
tagelsen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af 
kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 8 og dødelighed tages i betragtning 
ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (36).
 
Forsøgsplanen for hovedundersøgelsen  
25. Forsøgsplanen for assayet er følgende:  
— Dag 1:  Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske 
observationer. Dorsum af hvert øre påføres 1 % natriumlaurylsulfat (SLS) i form af en vandig opløsning ved hjælp af 
en børste dyppet i SLS-opløsningen, således at hele dorsum af hvert øre 
dækkes med fire til fem strøg. En time efter SLS-behandlingen påføres dorsum af hvert øre 25 μl af den pågældende teststofkoncentration, af 
vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sideløbende eller nylig, 
afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15)
 
— Dag 2, 3 og 7:  Proceduren fra dag 1 for forbehandling med 1 % 
SLS-vandopløsningen og påføring af teststoffet gentages.  
— Dag 4, 5 og 6:  Ingen behandling.  
— Dag 8:  Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske 
observationer. Ca. 24-30 timer efter påføringen på dag 7 aflives dyrene humant. De drænende aurikulære lymfeknuder fra hvert museøre eksci ­
seres og behandles særskilt i en phosphatbufferet saltopløsning (PBS) 
for hvert dyr. Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og 
dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (22). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved 
hjælp af øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på 
yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Fremstilling af cellesuspensioner  
26. Fra hver mus fremstilles en bilateralt eksciseret enkeltcellesuspension af 
lymfeknudeceller (LNC) ved at anbringe lymfeknuderne mellem to objekt ­
glas og påføre et let tryk for at knuse knuderne. Når det er konstateres, at vævet er blevet spredt ud i et tyndt lag, adskilles de to objektglas. Vævet på begge objektglas opslæmmes i PBS ved at holde hvert objektglas i vinkel 
over petriskålen og rense det med PBS, samtidigt med at vævet skrabes af 
objektglasset med en celleskraber. Lymfeknuder i negative kontroldyr er desuden små, så det er vigtigt, at de håndteres forsigtigt for at undgå en kunstig indvirkning på SI-værdier. Der anvendes en samlet volumen på 1 ml 
PBS til rensning af begge objektglas. LNC-suspensionen i petriskålen homo ­
geniseres let med celleskraberen. Der udtages en 20 μL-prøve af 
LNC-suspensionen med en mikropipette, idet det sikres, at den synlige membran ikke udtages, og prøven blandes herefter med 1,98 ml PBS til 
fremstilling af en 2 ml-prøve. Der fremstilles herefter en ny 2 ml-prøve 
efter samme metode, således at der fremstilles to prøver for hvert dyr.
 
Bestemmelse af celleproliferationen (måling af ATP-indholdet i lymfocytter)  
27. Forøgelser af ATP-indholdet i lymfeknuder måles ved hjælp af 
luciferin/luciferasemetoden med et ATP-målekit, der måler bioluminescens i relative lysenheder (RLU). Testperioden fra tidspunktet for aflivning af 
dyret til måling af ATP-indholdet for hvert enkelt dyr skal være ens og 
ligge inden for ca. 30 minutter, da det vurderes, at ATP-indholdet reduceres gradvist efter aflivning af dyret (12). Procedurerne fra ekscision af aurikulære lymfeknuder til måling af ATP skal således afsluttes inden for 20 minutter på 
grundlag af en forud fastlagt tidsplan, der gælder for alle dyr. 
ATP-luminescensen måles i hver 2 ml-prøve, således at der indsamles i alt to ATP-målinger for hvert dyr. Den gennemsnitlige ATP-luminescens måles herefter og anvendes i efterfølgende beregninger (se punkt (30).
 
OBSERVATIONER  
Kliniske observationer  
28. Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle 
kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. 
Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, 
der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudæts ­
ning, og som skal aflives (36).
 
Kropsvægt  
29. Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets begyn ­
delse og ved den planmæssige humane aflivning.  
BEREGNING AF RESULTATER  
30. Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som den gennemsnitlige 
SI-værdi. SI-værdien fås ved at dividere den gennemsnitlige RLU/mus i hver stoftestgruppe og PC-gruppen med den gennemsnitlige RLU/mus for 
opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for 
de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 
1,8 (10) Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og opløs ­
ningsmidlets/vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedømmelsen af, om et tvetydigt resultat (dvs. en SI-værdi på mellem 1,8 og 2,5) anses for at være positivt (2) (3) (37).
 
32. I tilfælde af tvetydige resultater med en SI på mellem 1,8 og 2,5 vil det være 
hensigtsmæssigt at tage højde for yderligere oplysninger som f.eks. dosis-responsforholdet, dokumentation for systemisk toksicitet eller for 
stærk irritation og i påkommende tilfælde statistisk signifikans sammen 
med SI-værdierne for at få bekræftet, at disse resultater er positive (10). Teststoffets forskellige egenskaber bør ligeledes tages i betragtning, herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om 
det medfører for stærk lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagt ­
tagne dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der redegjort mere indgående for andetsteds (4).
 
33. Indsamling af data for den enkelte mus gør det muligt at foretage en 
statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en evaluering af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenligninger af test ­
grupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og sideløbende (opløs ­
ningsmiddel/bærestof) kontrolgrupper). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til parvis sammenligning. Ved valg af passende statistisk 
analysemetode bør undersøgeren være opmærksom på mulige forskelle i 
varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkeparametrisk statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være nødsaget til at udføre SI-beregninger og 
statistiske analyser med og uden visse datapunkter (til tider kaldet »outli ­
ers«).
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
34. Data opstilles i tabelform med angivelse af det enkelte dyrs RLU-værdier, 
gruppens gennemsnitlige RLU/dyr, det tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den side ­
løbende opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppe.
 
Testrapport  
35. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Test- og kontrolstoffer:  
— identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, 
oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer)  
— fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, 
opløselighed)  
— for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene.  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt 
volumen)  
— begrundelse for valg af vehikel  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte CBA-musestamme  
— dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes  
— antal dyr og deres alder  
— dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.  
Testbetingelser:  
— oprindelse, batchnummer og producentens oplysninger om 
kvalitetssikring/kvalitetskontrol for ATP-kittet  
— nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet  
— begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, 
hvis en sådan er udført)  
— anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført 
teststof  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens 
art/oprindelse, vandets oprindelse)  
— detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan  
— metoder til måling af toksicitet  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ  
— nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse for, 
hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og resultater.  
Pålidelighedskontrol:  
— sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, 
herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel  
— data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative 
(opløsningsmiddel/bærestof) kontrolprøver fra prøvelaboratoriet  
— hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for og 
laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og en 
rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra labora ­
toriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget en side ­
løbende positiv kontrol.  
Resultater:  
— de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæs ­
sige aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for hver behandlingsgruppe
 
— tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel 
hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr  
— tidspunktet for aflivning af dyr og tidspunktet for måling af ATP for 
hvert dyr  
— en tabel med RLU-værdier for de enkelte mus og SI-værdier for hver 
behandlingsgruppe  
— det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for RLU/mus 
for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outlieranalyse for hver 
behandlingsgruppe  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til 
variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne  
— dosis-responsforholdet  
— statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt.  
Behandling af resultater:  
— Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet fald 
statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det undersøgte stof må anses for hudirriterende.
 
LITTERATUR  
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available 
at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999-1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985-997.  
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327-333.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins.  Toxicol ., 146, 49-59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH 
Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258-273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274-286.  
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM 
review process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249-257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. 
Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: 
National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [ 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characteri ­
zation and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 
1-10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11-26.
 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896-1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol ., 55, 90-96.
 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81-88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth ., 72, 127-132.  
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Devel ­
opment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacte ­
rial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27-34.  
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346-370.  
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf]
 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71-89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 13-31.  
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs. 
nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].  
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195-206.
 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  Toxi­
col. Appl. Pharmacol. , 153, 83-94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245-256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491-506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60-68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
(36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53 563-79.  
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Nøjagtighed:  Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede 
referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af 
relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som 
den andel korrekte udfald, testmetoden fører til (38).  
Referencestof:  Et sensibiliserende eller ikkesensibiliserende stof, der anvendes 
som standard til sammenligning med et teststof. Et referencestof skal have følgende egenskaber: i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; ii) strukturel 
og funktionel lighed med den stofgruppe, der testes; iii) kendte fysisk/kemiske 
egenskaber; iv) støttedata om kendte virkninger og v) kendt styrke i det ønskede responsområde.
 
Falsk negativ:  Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som 
negativt eller ikkeaktivt, selv om det rent faktisk er positivt eller aktivt.  
Falsk positiv:  Et stof, som ved en test fejlagtigt identificeres som positivt eller 
aktivt, selv om det rent faktisk er negativt eller ikkeaktivt.  
Fare:  Potentielle skadelige virkninger for menneskers sundhed og miljøet. De 
skadelige virkninger fremkaldes kun, hvis eksponeringen er tilstrækkelig.  
Reproducerbarhed mellem laboratorier:  Mål for, i hvilken grad forskellige kvali ­
ficerede laboratorier kan opnå de samme resultater kvalitativt og kvantitativt, når 
de anvender samme protokol og tester de samme teststoffer. Reproducerbarheden mellem laboratorier bestemmes forud for og under valideringsprocessen og angi ­
ver, i hvilken grad en test kan overføres mellem laboratorier med et vellykket 
resultat. Kaldes også ekstern reproducerbarhed (38).
 
Reproducerbarhed inden for laboratorier:  Bestemmelse af, i hvilken grad kvali ­
ficeret personale på det samme laboratorium kan reproducere resultater ved anvendelse af en specifik protokol på forskellige tidspunkter. Kaldes også intern reproducerbarhed (38).
 
Outlier:  En outlier er en observation, der er markant anderledes end andre 
værdier i en tilfældig stikprøve af en population.  
Kvalitetssikring:  En forvaltningsproces, hvor overholdelsen af laboratoriets test ­
standarder, krav og registreringsprocedurer og nøjagtigheden af dataoverførsler vurderes af personer, der er uafhængige af de personer, der udfører forsøget.
 
Pålidelighed:  Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i 
og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier (38).
 
Hudsensibilisering:  En immunologisk proces, der udløses, når en disponeret 
person eksponeres for en inducerende kemisk allergen, som fremkalder en 
kutan immunrespons, der kan føre til udviklingen af kontaktsensibilisering.  
Stimulationsindeks (SI):  En værdi, der beregnes for at vurdere et teststofs poten ­
tiale for hudsensibilisering, og som er forholdet mellem proliferation i behand ­
lingsgrupperne og proliferationen i den sideløbende vehikelkontrolgruppe.  
Teststof (eller testkemikalie):  Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af 
denne TM.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER: 
BrdU-ELISA  
INDLEDNING  
1. OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder bliver med 
mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling, behovet for ny lovgivning og hensynet til dyrevelfærden. Den oprindelige 
testmetode (TM) (B.42) til bestemmelse af hudsensibilisering i mus, assay 
på lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guideline 429), er blevet revideret (1 og kapitel B.42 i dette bilag). En validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) 
(7) (8) (9). I LLNA anvendes radioisotopisk thymidin eller jod til måling af 
lymfocytproliferation, og assayet har derfor begrænset anvendelse, når frem ­
stilling, anvendelse eller bortskaffelse af radioaktivitet er problematisk. LLNA: BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immunosorbent Assay] er en ikke 
radioaktiv modificering af LLNA-TM, der anvender ikkeradioaktivt mærket 
5-brom-2-deoxyuridin (BrdU) (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 59- 14-3) i et ELISA-baseret testsystem til måling af lymfocytproliferation. LLNA: BrdU-ELISA er blevet valideret og gennemgået og anbefales af 
et internationalt uafhængigt peer review-panel, der vurderer, at metoden 
med visse begrænsninger kan anvendes til at udpege hudsensibiliserende og ikkehudsensibiliserende kemikalier (10) (11) (12). TM'en anvendes til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) potentiale for hudsensibili ­
sering i dyr. I kapitel B.6 i dette bilag og i OECD Test Guideline 406 
anvendes marsvin, navnlig maksimeringstesten på marsvin og Buehlertesten (13). LLNA (kapitel B.42 i dette bilag, OECD Test Guideline 429) og de to ikkeradioaktive modificeringer, LLNA: BrdU-ELISA (kapitel B.51 i dette 
bilag, OECD Test Guideline 442 B) og LLNA: DA (kapitel B.50 i dette 
bilag, OECD Test Guideline 442 A), har alle en fordel frem for marsvine ­
testene i B.6 og OECD Test Guideline 406 (13) med hensyn til begræns ­
ning og forfinelse af anvendelsen af dyr.
 
2. I lighed med LLNA består LLNA: BrdU-ELISA i undersøgelse af induk ­
tionsfasen i hudsensibilisering og giver kvantitative data, som er velegnede til at vurdere dosis/responsforholdet. Evnen til at påvise hudsensibiliserende 
stoffer uden at det er nødvendigt at anvende dna-radioaktivt mærkede stof ­
fer, fjerner risikoen for erhvervsmæssig eksponering for radioaktivitet og imødegår problemer med bortskaffelse af affald. Det kan skabe grundlag for øget anvendelse af mus til påvisning af hudsensibiliserende stoffer, hvilket 
kan mindske anvendelsen af marsvin til test for potentiale for hudsensi ­
bilisering (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13).
 
DEFINITIONER  
3. De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.  
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER  
4. LLNA: BrdU-ELISA er en modificeret LLNA-metode til at udpege poten ­
tielle hudsensibiliserende kemikalier med bestemte begrænsninger. Det 
indebærer ikke nødvendigvis, at LLNA: BrdU-ELISA altid skal anvendes 
i stedet for LLNA eller marsvinetest (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13), men snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvan ­
ligvis ikke længere kræver yderligere bekræftelse (10) (11). Testlaboratoriet 
bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struk ­
tur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- 
og in vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for strukturelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA: BrdU-ELISA er egnet til brug for stoffet 
(i lyset af begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA: 
BrdU-ELISA [se punkt 5]) og som støtte ved valg af dosis.
 
5. LLNA: BrdU-ELISA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke 
brugen af dyr til vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. 
Den giver imidlertid mulighed for at mindske antallet af dyr til dette formål i forhold til marsvinetest (B.6, OECD Test Guideline 406) (13). LLNA: BrdU-ELISA repræsenterer desuden en væsentligt mere sofistikeret 
måde (mindre smerte og angst) at anvende dyr til allergisk kontaktsensi ­
biliseringstest på, idet LLNA: BrdU-ELISA i modsætning til B.6 og OECD Test Guideline 406 ikke kræver, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. Desuden kræver LLNA: BrdU-ELISA 
ikke anvendelse af et adjuvans, således som det er tilfældet for maksime ­
ringstesten på marsvin (kapitel B.6 i dette bilag, 13). LLNA: BrdU-ELISA mindsker således dyrenes lidelser. På trods af LLNA: BrdU-ELISA-meto ­
dens fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 (13) er der visse 
begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guideline 406 nødven ­
dige, f.eks. test af visse metaller, falsk positive resultater for visse hudirri ­
terende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (6) (1) og kapitel B.42 i dette bilag) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stofgrupper eller 
stoffer, der indeholder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede 
sammenhænge (confounders) (15), kan desuden gøre marsvinetest nødven ­
dige (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406 (13)). Det anbefales, at de begrænsninger, der er blevet identificeret for LLNA (1 og kapitel B.42 i 
dette bilag), ligeledes finder anvendelse for LLNA: BrdU-ELISA (10). 
Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør LLNA: BrdU-ELISA kunne anvendes til testning af alle kemikalier, medmindre disse kemikalier har egenskaber, som kan have indflydelse på LLNA: BrdU-ELISA-meto ­
dens nøjagtighed. Der skal desuden tages hensyn til muligheden for tvety ­
dige positive resultater ved stimulationsindeks (SI)-værdier på mellem 1,6 og 1,9 (se punkt 31-32). Dette er baseret på valideringsdatabasen over 43 stoffer med et SI på 1,6 eller derover (se punkt 6), for hvilke LLNA: 
BrdU-ELISA identificerede alle 32 LLNA-sensibiliserende stoffer korrekt, 
men identificere tre ud af 11 LLNA-ikkesensibiliserende stoffer med SI-værdier på mellem 1,6 og 1,9 (dvs. tvetydige positive resultater) (10) forkert. Da det samme datasæt blev anvendt til fastsættelse af SI-værdierne 
og beregning af testens prædiktionsevne, kan de anførte resultater imidlertid 
være en overvurdering af den reelle prædiktionsevne.
 
TESTMETODENS PRINCIP  
6. Det tilgrundliggende princip for LLNA: BrdU-ELISA består i, at den sensi ­
biliserende agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et 
kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammen ­
holde den gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behand ­
lingsgruppe og proliferationen i den sideløbende VC-gruppe kaldes 
stimulationsindekset (SI) og skal være mindst 1,6, før teststoffet kan
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
vurderes nærmere som en potentielt hudsensibiliserende agens. De her 
beskrevne metoder bygger på anvendelse af måling af BrdU-indholdet til 
måling af øget celleproliferation i de drænende aurikulære lymfeknuder. BrdU er beslægtet med thymidin og er ligeledes inkorporeret i dna-cellerne under formering. Inkorporeringen af BrdU måles ved hjælp 
af ELISA, der anvender et BrdU-specifikt antistof, som også mærkes med 
peroxydase. Når substratet tilsættes, reagerer peroxydasen med substratet og der frembringes et farvet produkt, som kvantificeres ved en bestemt absor ­
bans ved hjælp af en mikrotiterpladeaflæser.
 
BESKRIVELSE AF ASSAYET  
Valg af dyreart  
7. Mus må foretrækkes til denne test. Valideringsundersøgelser for LLNA: 
BrdU-ELISA blev udelukkende udført med CBA/JN-stammen, som derfor betragtes som den foretrukne stamme (10) (12). Der anvendes unge voksne 
hunmus, som ikke har født og ikke er drægtige. Ved forsøgets begyndelse 
skal dyrene være 8-12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnits ­
vægten. Alternativt kan der anvendes andre stammer og handyr, når der er 
genereret tilstrækkelige data til at dokumentere, at der ikke er væsentlige 
stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i BrdU-ELISA-respons.
 
Miljøbetingelser og fodring  
8. Mus bør anbringes i grupper (16), medmindre der fremlægges et fyldestgø ­
rende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen 
i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal 
være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå 
af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt 
laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand.
 
Forberedelse af dyrene  
9. Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identifi ­
ceres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i 
mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til 
forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner.
 
Fremstilling af forsøgsopløsninger  
10. Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og 
fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor 
ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraher ­
bare bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er accep ­
tabel.
 
Pålidelighedskontrol  
11. Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præsta ­
tioner er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og repro ­
ducerbarhed som et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelses ­
orden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv 
kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, 
at assayet bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbar ­
heden og sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyndigheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den 
enkelte undersøgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til 
de relevante myndigheder inden udførelsen af LLNA. BrdU-ELISA. Det
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
anbefales derfor at foretage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, 
således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde 
eventuelle krav ved regelmæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol skal fremkalde en positiv LLNA: BrdU-ELISA-respons ved det eksponeringsniveau, som forventes at give en stigning i SI, som er mere 
end 1,6 større end i den negative kontrolgruppe). PC-dosis vælges, således 
at den ikke forårsager for stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 14 er for højt). De foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexyl ­
kanelaldehyd (CAS-nr. 101-86-0) og 25 % eugenol (CAS-nr. 97-53-0) i 
acetone: olivenolie (4:1, v/v). Under visse omstændigheder vil andre posi ­
tive kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes.
 
12. Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være 
situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af 
det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt udfører LLNA: BrdU-ELISA (dvs. udfører LLNA: BrdU-ELISA mindst én gang om måneden) og har oprettet en historisk PC-database, der påviser 
laboratoriets evne til at skabe reproducerbare og nøjagtige resultater med 
positive kontroller. Laboratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompe ­
tence til at udføre LLNA: BrdU-ELISA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive kontrol i mindst 10 uafhængige forsøg 
udført inden for en rimelig periode (dvs. inden for et år).
 
13. Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en procedu ­
reændring af LLNA: BrdU-ELISA (f.eks. ændring af uddannet personale, 
ændring af testmaterialer og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), og disse ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. 
Der skal tages hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden 
af den allerede oprettede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at oprette en ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er sammenhængende.
 
14. Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en 
PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om 
negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv 
kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstræk ­
kelige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er 
opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den 
ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konse ­
kvenser bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sidelø ­
bende positive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige posi ­
tive kontroller. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sidelø ­
bende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan 
anvendes færre mus (17).
 
15. Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at frem ­
kalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse 
godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (18). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end 
teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende 
positive kontrol.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan 
referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at 
påvise denne type teststoffers potentiale for hudsensibilisering korrekt. Egnede referencestoffer skal have følgende egenskaber:
 
— strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der 
testes, tilhører  
— kendte fysisk/kemiske egenskaber  
— støttedata fra LLNA: BrdU-ELISA  
— støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker.  
TESTPROCEDURE  
Antal dyr og dosisniveauer  
17. Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige 
koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende 
behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (side ­
løbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved 
periodisk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med 
prøvestof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.
 
18. Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning 2 og 19. 
Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 50 %, 
25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges et fyldest ­
gørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncentrations ­
serier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut 
toksicitet og hudirritation) og strukturelle og fysisk-kemiske oplysninger om 
det pågældende teststof (og/eller strukturelt beslægtede stoffer) tages i betragt ­
ning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig eksponering uden systemisk toksi ­
citet og/eller for stærk lokal hudirritation (19) (20 og kapitel B.4 i dette bilag). 
Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt at foretage en prescreening (se punkt 21-24).
 
19. Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således 
at testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den 
fremstillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De 
anbefalede vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v),  N,N -dimethylformamid, 
methylethylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (6), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale 
derfor. I visse situationer kan det som yderligere kontrol være nødvendigt 
med et klinisk relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori test ­
stoffet markedsføres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikelsy ­
stemet bør indeholde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke 
straks løber af, ved at inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % 
Pluronic® L92). Vehikler kun bestående af vand bør således undgås.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere 
variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning 
af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 33). Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus i PC-gruppe, når der indsamles data for de enkelte dyr (17). Nogle tilsyns ­
myndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. 
Regelmæssig indsamling af data for de enkelte dyr øger dyrevelfærden, idet man undgår gentagelse af forsøg, som ville være nødvendige, hvis tilsyns ­
myndigheder på et senere tidspunkt stiller andre krav til de teststofresultater, 
der oprindeligt blev indsamlet på én måde (f.eks. på grundlag af poolede 
data for dyr), (f.eks. krav om data for de enkelte dyr).
 
Prescreening  
21. Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste 
dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA: BrdU-ELISA. Formålet 
med prescreeningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, 
der skal anvendes i LLNA: BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplysninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksi ­
citet (se punkt 24) og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det 
maksimale dosisniveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige koncentration for faste stoffer eller opslæmninger.
 
22. Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for LLNA: 
BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en 
vurdering af lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til 
hver enkel dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosisgruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation 
på påføringsstedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslut ­
ning af forsøget (dag 6). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (20 og kapitel B.4 i dette bilag). Der foretages målinger af øretykkelsen med en tykkelsesmåler 
(f.eks. et digitalt mikrometer eller en Peacock Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 
(inden administration af dosis), på dag 3 (ca. 48 timer efter den første dosis) og på dag 6. På dag 6 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, der foretages, efter at dyrene er blevet humant 
aflivet. For stærk lokal hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 
og/eller en forøgelse af øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (21) (22). 
Den højeste dosis i LLNA: BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen skal være den næsthøjeste dosis i prescreeningskoncentrationsserien (se punkt 18), som 
ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation.
 
Tabel 1  
Erytemscorer  
Observation Score  
Intet erytem 0 
Meget let erytem (knapt diagnosticerbart) 1 Veldefineret erytem 2
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Observation Score  
Moderat til svært erytem 3 
Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som 
umuliggør klassificering af erytemet 4 
23. Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (21) (22) er en statistisk signifi ­
kant forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrolmusene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende stoffer i LLNA (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Selv om statistisk signifikante 
forøgelser kan forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet 
specifikt forbundet med for stærk irritation (25) (26) (27) (28) (29).
 
24. Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (30), hvis 
de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det 
maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA: BrdU-ELISA: ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soigneringsaktiviteten, 
markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirationsmønstre 
(f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom åndenød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og vandindtagel ­
sen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske 
tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 6 og dødelighed tages i betragtning ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser 
tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (31).
 
Forsøgsplanen for hovedundersøgelsen  
25. Forsøgsplanen for assayet er følgende:  
— Dag 1:  Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske 
observationer. Dorsum af hvert øre påføres 25 μl af den pågældende test ­
stofkoncentration, af vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sidelø ­
bende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15).  
— Dag 2 og 3:  Påføringen fra dag 1 gentages.  
— Dag 4:  Ingen behandling.  
— Dag 5:  En opløsning på 0,5 ml (5 mg/mus) af BrdU (10 mg/ml) 
injiceres intraperitonealt.  
— Dag 6:  Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske 
observationer. Ca. 24 timer (24 t) efter BrdU-injektionen aflives dyrene humant. De drænende aurikulære lymfeknuder fra hvert museøre eksci ­
seres og behandles særskilt i en phosphatbufferet saltopløsning (PBS) 
for hvert dyr. Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og 
dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (17). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved 
hjælp af øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på 
yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen.
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Fremstilling af cellesuspensioner  
26. Fra hver mus fremstilles en bilateralt eksciseret enkeltcellesuspension af 
lymfeknudeceller (LNC) ved forsigtig mekanisk disaggregering gennem 
200 μm trådnet af rustfrit stål eller en anden acceptabel teknik til fremstil ­
ling af en enkeltcellesuspension (f.eks. anvendelse af en pistil i plast til engangsbrug til knusning af lymfeknuderne, der herefter ledes gennem en 
#70 nylonmaske). Proceduren for fremstilling af LNC-suspensionen er 
meget vigtig i dette assay, og alle operatører skal derfor sætte sig ind i denne procedure på forhånd. Lymfeknuder i negative kontroldyr er desuden små, så det er vigtigt at de håndteres forsigtigt for at undgå en kunstig 
indvirkning på SI-værdier. LNC-suspensionens målvolumen skal i hvert 
enkelt tilfælde justeres til en bestemt optimal volumen (ca. 15 ml). Den optimale volumen er baseret på opnåelsen af en gennemsnitlig absorbans for NC-gruppen, der ligger inden for intervallet 0,1- 0,2.
 
Bestemmelse af celleproliferationen (måling af BrdU-indholdet i dna af 
lymfocytter)  
27. BrdU måles ved hjælp af ELISA med kommercielt kit (f.eks. Roche 
Applied Science, Mannheim, Germany, Catalogue Number 11 647 229 001). Kort beskrevet tilsættes 100 μl af LNC-suspensionen til hullerne i 
en fladbundet tredobbelt mikroplade. Efter fiksering og denaturering af 
LNC tilsættes anti-BrdU-antistof til hvert hul og henstår til reaktion. Anti-BrdU-antistoffet vaskes efterfølgende af, hvorefter substratopløsningen tilsættes og henstår til fremstilling af kromogen. Herefter måles absorbans 
ved 370 nm med en referencebølgelængde på 492 nm. Testbetingelserne 
skal altid optimeres (se punkt 26).
 
OBSERVATIONER  
Kliniske observationer  
28. Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle 
kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. 
Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. 
Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudæts ­
ning, og som skal aflives (31).
 
Kropsvægt  
29. Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets 
begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning.  
BEREGNING AF RESULTATER  
30. Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som den gennemsnitlige 
SI-værdi. SI-værdien fås ved at dividere det gennemsnitlige 
BrdU-mærkningsindeks/mus i hver stoftestgruppe og PC-gruppen med det 
gennemsnitlige BrdU-mærkningsindeks/mus for opløsningsmiddel/vehikel ­
kontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1.
 
BrdU-mærkningsindekset defineres som:  
BrdU-mærkningsindeks = (ABS  em — ABS blank  em ) – (ABS  ref — ABS 
blank  ref ) 
Hvor: em = emissionsbølgelængde og ref = referencebølgelængde.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 
1,6 (10). Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og 
opløsningsmidlets/vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedømmelsen af, om et tvetydigt resultat (dvs. en SI-værdi på mellem 1,6 og 1,9) anses for at være positivt (3) (6) (32).
 
32. I tilfælde af tvetydige resultater med en SI på mellem 1,6 og 1,9 vil det 
være hensigtsmæssigt at tage højde for yderligere oplysninger som f.eks. 
dosis-responsforholdet, dokumentation for systemisk toksicitet eller for stærk irritation og i påkommende tilfælde statistisk signifikans sammen med SI-værdierne for at få bekræftet, at disse resultater er positive (10). 
Teststoffets forskellige egenskaber bør ligeledes tages i betragtning, 
herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om det medfører for stærk lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagttagne dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der 
redegjort mere indgående for andetsteds (4).
 
33. Indsamling af data om radioaktivitet for den enkelte mus gør det muligt at 
foretage en statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en 
evaluering af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenlig ­
ninger af testgrupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og side ­
løbende (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolgrupper). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af 
dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til parvis sammenligning. Ved 
valg af passende statistisk analysemetode bør undersøgeren være opmærksom på mulige forskelle i varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkeparametrisk 
statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være 
nødsaget til at udføre SI-beregninger og statistiske analyser med og uden visse datapunkter (til tider kaldet »outliers«).
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
34. Data opstilles i tabelform med angivelse af de enkelte dyrs 
BrdU-mærkningsindeksværdier, gruppens gennemsnitlige BrdU-mærknings ­
indeks/dyr, det tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende opløsningsmid ­
del/vehikelkontrol-gruppe.
 
Testrapport  
35. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Test- og kontrolstoffer:  
— identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, 
oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer)  
— fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, 
opløselighed)  
— for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene.  
Opløsningsmiddel/bærestof:  
— identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt 
volumen)  
— begrundelse for valg af vehikel  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
For forsøgsdyrene:  
— den anvendte CBA-musestamme  
— dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes  
— antal dyr og deres alder  
— dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.  
Testbetingelser:  
— oprindelse, batchnummer og producentens oplysninger om 
kvalitetssikring/kvalitetskontrol (antistoffets følsomhed og specificitet 
og påvisningsgrænsen) for ELISA-kittet  
— nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet  
— begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, 
hvis en sådan er udført)  
— anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført 
teststof  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens 
art/oprindelse, vandets oprindelse).  
— detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan  
— metoder til måling af toksicitet  
— kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ  
— nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse 
for, hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og resultater.
 
Pålidelighedskontrol:  
— sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, 
herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel  
— data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative 
(opløsningsmiddel/bærestof) kontrolprøver fra prøvelaboratoriet  
— hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for 
og laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og en rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra 
laboratoriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget 
en sideløbende positiv kontrol.
 
Resultater:  
— de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæs ­
sige humane aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for hver behandlingsgruppe
 
— tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel 
hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr  
— en tabel med mærkningsindekser for de enkelte mus og SI-værdier for 
hver behandlingsgruppe  
— det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for mærk ­
ningsindeks/mus for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outli ­
eranalyse for hver behandlingsgruppe  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til 
variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne  
— dosis-responsforholdet  
— statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt.  
Behandling af resultater:  
— Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet 
fald statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det under ­
søgte stof må anses for hudirriterende.  
LITTERATUR  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Avai ­
lable at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.  
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.
 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH 
Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM 
review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/ 
TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134.
 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90-96.
 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine 
Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Avai ­
lable at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA PerfStds.pdf]
 
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13- 31.
 
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
 
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background 
Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environ ­
mental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206.  
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxi ­
col. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 
60-68.
 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.  
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023-1028.  
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ Tox_workshop.htm].
 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79.
 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available 
at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Nøjagtighed:  Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede 
referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af 
relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som 
den andel korrekte udfald, testmetoden fører til (33).  
Referencestof:  Et sensibiliserende eller ikkesensibiliserende stof, der anvendes 
som standard til sammenligning med et teststof. Et referencestof skal have følgende egenskaber: i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; ii) strukturel 
og funktionel lighed med den stofgruppe, der testes; iii) kendte fysisk/kemiske 
egenskaber; iv) støttedata om kendte virkninger og v) kendt styrke i det ønskede responsområde.
 
Falsk negativ:  Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som 
negativt eller ikkeaktivt, selv om det rent faktisk er positivt eller aktivt (33).  
Falsk positiv:  Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som 
positivt eller aktivt, selv om det rent faktisk er negativt eller ikkeaktivt (33).  
Fare:  Potentielle skadelige virkninger for menneskers sundhed og miljøet. De 
skadelige virkninger fremkaldes kun, hvis eksponeringen er tilstrækkelig.  
Reproducerbarhed mellem laboratorier:  Mål for, i hvilken grad forskellige kvali ­
ficerede laboratorier kan opnå de samme resultater kvalitativt og kvantitativt, når 
de anvender samme protokol og tester de samme teststoffer. Reproducerbarheden mellem laboratorier bestemmes forud for og under valideringsprocessen og angi ­
ver, i hvilken grad en test kan overføres mellem laboratorier med et vellykket 
resultat. Kaldes også ekstern reproducerbarhed (33).
 
Reproducerbarhed inden for laboratorier:  Bestemmelse af, i hvilken grad kvali ­
ficeret personale på det samme laboratorium kan reproducere resultater ved anvendelse af en specifik protokol på forskellige tidspunkter. Kaldes også intern reproducerbarhed (33).
 
Outlier:  En outlier er en observation, der er markant anderledes end andre 
værdier i en tilfældig stikprøve af en population.  
Kvalitetssikring:  En forvaltningsproces, hvor overholdelsen af laboratoriets test ­
standarder, krav og registreringsprocedurer og nøjagtigheden af dataoverførsler vurderes af personer, der er uafhængige af de personer, der udfører forsøget.
 
Pålidelighed:  Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i 
og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier (33).
 
Hudsensibilisering:  En immunologisk proces, der udløses, når en disponeret 
person eksponeres for en inducerende kemisk allergen, som fremkalder en 
kutan immunrespons, der kan føre til udviklingen af kontaktsensibilisering.  
Stimulationsindeks (SI):  En værdi, der beregnes for at vurdere et teststofs poten ­
tiale for hudsensibilisering, og som er forholdet mellem proliferation i behand ­
lingsgrupperne og proliferationen i den sideløbende vehikelkontrolgruppe.  
Teststof (eller testkemikalie):  Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af 
denne TM.  ▼M3 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  AKUT TOKSICITET (INHALATION) — AKUT 
TOKSICITETSKLASSEMETODEN  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 436 (2009). Den 
første TG 403 for akut toksicitet ved inhalation blev vedtaget i 1981 og er 
siden blevet revideret (se kapitel B.2 i dette bilag (1)). Efter vedtagelsen af 
akut toksicitetsklassemetoden (oral) (kapitel B.1.B i dette bilag) (5) vurde ­
rede man, at en akut toksicitetsklassemetode (inhalation) (ATC) skulle udvikles (2) (3) (4). En retrospektiv resultatvurdering af ATC-testmetoden 
for akut toksicitet ved inhalation viste, at metoden med fordel kan anvendes 
i forbindelse med klassificering og mærkning (6). ATC-testmetoden for inhalation er en trinvis metode, hvor der anvendes faste målkoncentrationer til at rangordne toksiciteten af testkemikaliet. Letalitet er en central effekt ­
parameter, men dyr, som udviser svære smerter og/eller vedvarende tegn på 
svære lidelser eller er døende, aflives humant for at mindske deres lidelser. Vejledning om parametre for human behandling af dyr findes i OECD Guidance Document No. 19 (7).
 
2. Vejledning i udførelse og fortolkning af forsøgene i forbindelse med denne 
testmetode findes i Guidance Document No. 39 (GD 39) (8).  
3. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i 
tillæg 1 og GD 39 (8).  
4. Testmetoden giver oplysninger om de farlige egenskaber og gør det muligt 
at rangordne og klassificere testkemikaliet i henhold til forordning (EF) 
nr. 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (9). Hvis der kræves punktestimater af LC
 50 -værdier eller 
analyser af koncentration-respons, anvendes kapitel B.2 i dette bilag (1) 
som testmetode. Yderligere vejledning i valg af testmetode findes i GD 
39 (8). Denne testmetode er ikke specifikt beregnet til test af særlige mate ­
rialer, som f.eks. tungtopløselige isometriske eller fiberholdige materialer eller fremstillede nanomaterialer.
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
5. Inden test i overensstemmelse med denne metode overvejes, bør alle tilgæn ­
gelige oplysninger om testkemikaliet, herunder eksisterende forsøg, hvis 
data understøtter, at der ikke udføres yderligere test, overvejes af testlabo ­
ratoriet med henblik på at minimere omfanget af dyreforsøg. Oplysninger, der kan hjælpe med at vælge de mest hensigtsmæssige arter, stammer, køn, 
eksponeringsformer og testkoncentrationer, omfatter testkemikaliets identitet, 
kemiske struktur og fysisk-kemiske egenskaber, resultater af in vitro- eller in vivo-toksicitetstest, forventede anvendelser og potentialet for human eksponering, tilgængelige (Q)SAR-data og toksikologiske data vedrørende 
strukturelt relaterede stoffer. Koncentrationer, der forventes at forvolde stærk 
smerte og lidelse, på grund af ætsende (
 1 ) eller stærkt irriterende virkning, 
bør ikke testes ved hjælp af denne testmetode [se GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Evalueringen af ætsende virkning kan af eksperter ved hjælp af dokumentation, som 
f.eks. erfaringer fra mennesker og dyr, eksisterende (in vitro-) data, f.eks. kapitel B.40 
(10) og B.40.A (11) i dette bilag eller OECD TG 435 (12), pH-værdier, information fra 
lignende stoffer eller andre relevante data.
 TESTENS PRINCIP  
6. Metoden bygger på en trinvis fremgangsmåde, hvor der opnås tilstrækkelig 
information om teststoffets akutte toksicitet ved inhalation i en ekspone ­
ringsperiode på fire timer til, at det kan klassificeres. Andre eksponerings ­
varigheder kan anvendes for at opfylde konkrete myndighedsbestemmelser. 
For hver af de fastlagte koncentrationstrin anvendes der tre dyr af hvert køn. Afhængigt af dyrenes dødelighed og/eller døende tilstand kan to trin være nok til at vurdere testkemikaliets akutte toksicitet. Hvis det dokumenteres, at 
det ene køn er mere modtageligt end det andet, kan testen fortsættes med 
kun det mest modtagelige køn. Resultatet af det forudgående trin afgør det efterfølgende trin, f.eks.:
 
a) ingen yderligere testning nødvendig  
b) testning af tre dyr pr. køn eller  
c) testning af seks dyr af det mest modtagelige køn, dvs. at kun de laveste 
estimater for toksisk klasse baseres på seks dyr pr. testkoncentrations ­
gruppe, uanset køn.  
7. Dyr, som er døende, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og 
vedvarende lidelser, bør aflives humant og betragtes ved fortolkningen af 
testresultaterne på samme måde som dyr, der er døde under testen. Kriteri ­
erne for aflivning af døende eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller forestående død er genstand for en særskilt vejled ­
ning (OECD Guidance Document No. 19 on Humane Endpoints) (7).
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
8. Der anvendes raske unge dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. 
Den foretrukne art er rotter, og der bør gives begrundelse, hvis en anden art anvendes.
 
Forberedelse af dyrene  
9. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. På eksponerings ­
dagen bør dyrene være unge voksne, der er mellem 8 og 12 uger gamle, og 
deres kropsvægt bør være inden for ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert 
køn af tidligere eksponerede dyr i samme alder. Dyrene udtages på tilfældig måde og mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres. Dyrene holdes i deres bure i mindst fem dage, inden testen påbegyndes, så de tilvænnes labora ­
torieforholdene. Dyrene tilvænnes også testudstyret i en kort perioden inden 
testen, da det vil mindske stress forårsaget af introduktionen til et nyt miljø.
 
Dyreopdræt og -sundhed  
10. Temperaturen i forsøgsdyrrummet bør være 22 ± 3 °C. Den relative 
fugtighed bør være 30-70 %, selv om det muligvis ikke er muligt, hvis 
vand bruges som vehikel. Før og efter eksponering bør dyr generelt holdes i bur i grupper efter køn og koncentration, men antallet af dyr pr. bur må ikke bevirke, at det er vanskeligt at observere de enkelte dyr, og bør 
minimere tab som følge af kannibalisme og slagsmål. Hvis dyr alene 
eksponeres gennem næsen, skal de muligvis tilvænnes fastspændingsslanger. Disse slanger må ikke påføre dyrene unødig fysisk, termisk eller bevægel ­
sesmæssig belastning. Fastspænding kan påvirke fysiologiske effektparame ­
tre, som f.eks. kropstemperatur (hypertermi) og/eller respiratorisk minutvo ­
lumen. Hvis der foreligger generiske data, som viser, at sådanne ændringer
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
ikke forekommer i nævneværdigt omfang, er tilvænning til fastspændings ­
slangerne ikke nødvendig. Dyr, der med hele kroppen eksponeres for en 
aerosol, bør holdes i individuelle bure under eksponeringen for at undgå, at testaerosolen filtreres gennem pelsen på de andre dyr i buret. Der kan anvendes normalt og godkendt laboratoriefoder, dog ikke under ekspone ­
ring, med ubegrænset forsyning af drikkevand. Belysningen skal være 
kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke.
 
Inhalationskamre  
11. Karakteren af testkemikaliet og formålet med testen bør overvejes ved valget 
af inhalationskammer. Den foretrukne eksponeringsform er gennem næsen (dette udtryk omfatter kun hoved, kun næse og kun snude). Eksponering 
gennem næsen foretrækkes generelt i forbindelse med test af flydende eller 
faste aerosoler og dampe, der kan kondensere og danne aerosoler. Særlige formål med testen kan bedre opfyldes ved eksponering af hele kroppen, men dette skal begrundes i testrapporten. For at sikre en stabil atmosfære, når der 
anvendes et kammer til hele kroppen, må forsøgsdyrenes totale volumen 
ikke overstige 5 % af kammerets volumen. Principperne for teknikkerne til eksponering gennem næsen eller eksponering af hele kroppen samt deres særlige fordele og ulemper er beskrevet i GD 39 (8).
 
EKSPONERINGSBETINGELSER  
Administration af koncentrationer  
12. Der anbefales en fast eksponeringsvarighed på fire timer, ekskl. ækvilibre ­
ringstid. Der kan være behov for andre varigheder for at opfylde specifikke 
krav. Dette begrundes dog i forsøgsrapporten [se GD 39 (8)]. Dyr, der 
eksponeres i kamre til hele kroppen, bør holdes i individuelle bure for at undgå, at de indtager testkemikaliet som følge af soignering af de andre dyr. Dyrene bør ikke fodres i eksponeringsperioden. Dyret skal have adgang til 
vand under helkropseksponering.
 
13. Dyr eksponeres for testkemikaliet i form af en gas, dampe, aerosoler eller en 
blanding heraf. Den fysiske tilstand, der skal testes, afhænger af testkemi ­
kaliets fysisk-kemiske egenskaber, den valgte koncentration og/eller den 
fysiske form, der højst sandsynligt vil være til stede under håndteringen og anvendelsen af testkemikaliet. Hygroskopiske og kemisk reaktive testke ­
mikalier bør testes under tørre luftforhold. Der må ikke skabes eksplosive 
koncentrationer.
 
Partikelstørrelsesfordeling  
14. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for alle aerosoler og dampe, der 
kan kondensere og danne aerosoler. For at sikre, at alle relevante områder af luftvejene eksponeres, anbefales aerosoler med en massemedian af den aero ­
dynamiske diameter (MMAD) i området fra 1 til 4 μm med en geometrisk 
standardafvigelse ( σ
 g ) i området fra 1,5 til 3,0 (8) (13) (14). Der bør ydes en 
rimelig indsats for at overholde denne standard, men en ekspertvurdering gives, hvis det ikke er muligt. Partikler fra tungmetalrøg kan f.eks. være mindre end denne standard, og ladede partikler, fibre og hygroskopiske 
materialer (som udvides i luftvejenes fugtige miljø) kan overstige standar ­
den.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Fremstilling af testkemikalie i vehikel  
15. Der kan anvendes et vehikel til at frembringe et testkemikalie med den 
rigtige koncentration og partikelstørrelse i atmosfæren. Generelt foretrækkes vand. Partikelformigt materiale kan underkastes mekaniske processer for at 
opnå den krævede partikelstørrelsesfordeling. Det skal dog omhyggeligt 
sikres, at testkemikaliet ikke dekomponerer eller ændres. Hvis mekaniske processer menes at have ændret teststoffets sammensætning (f.eks. ekstreme temperaturer som følge af friktion under formaling), bør testkemikaliets 
sammensætning kontrolleres analytisk. Kontaminering af testkemikaliet 
skal undgås. Det er ikke nødvendigt at teste granulat, der ikke er letsmuld ­
rende, og som netop er formuleret, så det ikke kan inhaleres. Der bør 
anvendes en slidtest til at dokumentere, at der ikke frembringes respirable 
partikler under håndteringen af granulat. Hvis en slidtest frembringer respi ­
rable partikler, bør der udføres en inhalationstoksicitetstest.
 
Kontroldyr  
16. En sideløbende negativ (luft)kontrolgruppe er ikke nødvendig. Hvis et andet 
vehikel end vand bruges til at frembringe testatmosfæren, skal en vehikel ­
kontrolgruppe kun anvendes, hvis historiske inhalationstoksicitetsdata ikke 
foreligger. Hvis et toksicitetsforsøg vedrørende et testkemikalie, der er formuleret i et vehikel, ikke påviser toksicitet, følger det, at vehiklet er ikke-toksisk ved den testede koncentration. Der er derfor ikke brug for en 
vehikelkontrol.
 
OVERVÅGNING AF EKSPONERINGSBETINGELSER  
Luftgennemstrømning i kammer  
17. Luftgennemstrømningen gennem kammeret skal nøje kontrolleres, overvåges 
løbende og registreres mindst én gang i timen under eksponering. Overvåg ­
ningen af koncentrationen (eller stabiliteten) i testatmosfæren indgår i målingen af alle dynamiske parametre og giver indirekte mulighed for at kontrollere alle relevante dynamiske parametre for generering af atmosfæren. 
Genindånding i kamre til eksponering gennem næsen skal undgås, hvis 
luftgennemstrømningen gennem eksponeringssystemet ikke er tilstrækkelig til at tilvejebringe en dynamisk gennemstrømning i den kemiske testatmos ­
fære. Der er fastlagte metodologier, der kan bruges til at påvise, at genind ­
ånding ikke finder sted under de valgte driftsbetingelser (8) (15). Iltkoncen ­
trationen skal være mindst 19 %, og kuldioxidkoncentrationen må ikke overstige 1 %. Hvis der er grund til at antage, at disse standarder ikke kan overholdes, skal ilt- og kuldioxidkoncentrationerne måles.
 
Kammerets temperatur og relative fugtighed  
18. Kammerets temperatur skal være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed i 
dyrenes vejrtrækningszone skal ved eksponering gennem næsen og 
helkropseksponering overvåges og registreres mindst tre gange ved varig ­
heder af op til fire timer og hver time ved kortere varigheder. Den relative fugtighed bør være 30-70 %, men dette er ikke altid muligt (f.eks. ved test 
af vandbaserede blandinger) eller kan ikke måles på grund af testkemikaliets 
indvirkning på testmetoden.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Testkemikalie: nominel koncentration  
19. Når det er muligt, bør den nominelle eksponeringskoncentration i kammeret 
beregnes og registreres. Den nominelle koncentration er massen af det gene ­
rerede testkemikalie divideret med den samlede mængde luft, der passerer 
gennem kammersystemet. Den nominelle koncentration bruges ikke til at 
karakterisere dyrenes eksponering, men en sammenligning af den nominelle koncentration og den faktiske koncentration giver en indikation af testsyste ­
mets genereringseffektivitet og kan derfor bruges til at opdage eventuelle 
genereringsproblemer.
 
Testkemikalie: faktisk koncentration  
20. Den faktiske koncentration er koncentrationen af testkemikaliet ved dyrenes 
vejrtrækningszone i et inhalationskammer. Faktiske koncentrationer kan 
bestemmes med specifikke metoder (f.eks. direkte prøveudtagning, adsorp ­
tive eller kemisk reaktive metoder og efterfølgende analytisk karakterisering) 
eller med ikke-specifikke metoder, som f.eks. gravimetrisk filteranalyse. 
Brugen af gravimetrisk analyse er kun acceptabel for pulverbaserede enkeltkomponent-aerosoler eller aerosoler af væsker med lav flygtighed og bør støttes af hensigtsmæssige testkemikaliespecifikke karakteriseringer 
udført før testen. Koncentrationen af pulverbaserede 
flerkomponent-aerosoler kan også bestemmes ved hjælp af gravimetrisk analyse. Det kræver dog analysedata, der viser, at det luftbårne materiales sammensætning svarer til udgangsmaterialet. Hvis denne information ikke er 
tilgængelig, kan det være nødvendigt at gentage analysen af testkemikaliet 
(ideelt i dets luftbårne tilstand) med regelmæssige intervaller i løbet af forsøget. For aerosoliserede stoffer, der kan fordampe eller sublimere, bør det påvises, at alle faser er indsamlet ved hjælp af den valgte metode. 
Målkoncentrationer, nominelle koncentrationer og faktiske koncentrationer 
angives i forsøgsrapporten, men kun de faktiske koncentrationer bruges i de statistiske analyser til at beregne letale koncentrationer.
 
21. Der anvendes så vidt muligt én batch af testkemikaliet, og prøven opbevares 
under forhold, der bevarer dens renhed, homogenitet og stabilitet. Inden 
forsøget påbegyndes, bør testkemikaliet karakteriseres, herunder dets 
renhed og, hvis det er teknisk muligt, identitet og mængde af identificerede kontaminanter og urenheder. Dette kan påvises ved hjælp af bl.a. følgende data: retentionstid og relativt topareal, molekylvægt fra massespektroskopi- 
eller gaskromatografianalyser eller andre vurderinger. Selv om testlaborato ­
riet ikke er ansvarligt for prøvens identitet, bør testlaboratoriet af hensyn til sikkerheden bekræfte rekvirentens karakterisering i hvert fald på en begrænset måde (f.eks. farve, fysisk form osv.).
 
22. Eksponeringsatmosfæren holdes så konstant som muligt og overvåges konti ­
nuerligt og/eller i intervaller afhængigt af analysemetoden. Hvis intervalba ­
seret prøveudtagning anvendes, bør der udtages atmosfæreprøver i kammeret mindst to gange i løbet af et forsøg med en varighed på fire timer. Hvis det ikke er muligt på grund af begrænsede luftgennemstrømningshastigheder 
eller lave koncentrationer, kan en prøve udtages over hele eksponerings ­
perioden. Hvis der forekommer markante udsving fra prøve til prøve, bør der anvendes fire prøver pr. eksponering for de næste testede koncentratio ­
ner. De enkelte prøver for koncentrationen i kammeret bør ikke afvige fra 
middelkoncentrationen i kammeret med mere end ± 10 % for gasser og 
dampe eller ± 20 % for flydende eller faste aerosoler. Tiden til ækvilibrering af kammer (t
 95 ) beregnes og registreres. Varigheden af en eksponering 
strækker sig over den tid, hvor testkemikaliet genereres, og det omfatter 
den tid, der kræves for at opnå t  95 . Vejledning i beregning af t  95 findes i 
GD 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. For meget komplekse blandinger, der består af gasser/dampe og aerosoler 
(f.eks. forbrændingsatmosfærer og testkemikalier genereret af formåls ­
bestemte slutprodukter/apparater), kan hver fase opføre sig forskelligt i et inhalationskammer, og der udvælges derfor mindst ét indikatorstof (ana ­
lysand), normalt det primære aktivstof i blandingen, fra hver fase (gas/damp 
og aerosol). Hvis testkemikaliet er en blanding, rapporteres analysekoncen ­
trationen for den samlede blanding og ikke kun for det aktive stof eller komponenten (analysand). Yderligere oplysninger om faktiske koncentra ­
tioner findes i GD 39 (8).
 
Testkemikalie: partikelstørrelsesfordeling  
24. Aerosolers partikelstørrelsesfordeling bestemmes mindst to gange i løbet af 
hver eksponering på fire timer ved hjælp af en kaskadeimpaktor eller et andet instrument, f.eks. et instrument til aerodynamisk partikelstørrelses ­
bestemmelse. Hvis der kan påvises ækvivalens mellem de resultater, der 
er opnået ved hjælp af kaskadeimpaktoren eller et alternativt instrument, 
kan det alternative instrument bruges i hele forsøget. Et andet apparat, f.eks. et gravimetrisk filter eller en impinger/gas bubbler, anvendes parallelt 
med det primære instrument til at bekræfte det primære instruments opsam ­
lingseffektivitet. Den massekoncentration, der fås ved hjælp af partikelstør ­
relsesanalysen, skal være inden for rimelige grænser af den massekoncen ­
tration, der fås ved hjælp af filteranalyse [se GD 39 (8)]. Hvis ækvivalens 
kan påvises i forsøgets tidligere fase, kan yderligere bekræftelsesmålinger 
udelades. Af hensyn til dyrevelfærden træffes der foranstaltninger for at minimere inkonklusive data, der kan gøre det nødvendigt at gentage en eksponering. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for dampe, hvis der 
er mulighed for, at kondensering af dampe kan føre til dannelsen af en 
aerosol, eller hvis der konstateres partikler i en dampatmosfære med poten ­
tiale for blandede faser (se afsnit 14).
 
FREMGANGSMÅDE  
Hovedforsøg  
25. Der anvendes tre dyr pr. køn eller seks dyr af det mest modtagelige køn på 
hvert trin. Hvis andre gnaverarter end rotter eksponeres gennem næsen, kan 
de maksimale eksponeringsvarigheder justeres for at minimere artsspecifikke 
lidelser. Det koncentrationsniveau, der anvendes som startdosis, vælges blandt de fire fastsatte niveauer, og det indledende koncentrationsniveau skal være det, der med størst sandsynlighed forventes at fremkalde toksicitet 
i nogle af de doserede dyr. Forsøgsplanerne for gasser, dampe og aerosoler 
(anført i tillæg 2-4) repræsenterer test med afskæringsværdierne for CLP-kategori 1-4 (9) for gasser (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (tillæg 2), for dampe (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (tillæg 3) og for aerosoler (0,05, 0,5, 
1, 5 mg/l/4h) (tillæg 4). Kategori 5, som ikke er gennemført i 
forordning (EF) nr. 1272/2008 (9), vedrører koncentrationer over de pågæl ­
dende grænsekoncentrationer. For hver startkoncentration gælder den pågæl ­
dende forsøgsplan. I forsøgsplanen følges pilene, afhængigt af antallet af 
humant aflivede eller døde dyr, indtil en kategorisering kan foretages.
 
26. Tidsintervallet mellem eksponeringsgrupperne bestemmes ud fra de toksiske 
symptomers indsætten, varighed og sværhed. Eksponering af dyrene ved det 
næste koncentrationsniveau udsættes, indtil der er rimelig sikkerhed for, at de tidligere testede dyr vil overleve. Der bør gå 3-4 dage mellem ekspone ­
ringerne på hvert koncentrationsniveau for at få den nødvendige tid til at 
iagttage en eventuel forsinket toksisk virkning. Tidsintervallet kan korrigeres 
efter behov, f.eks. hvis den opnåede respons er inkonklusiv.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Grænsetest  
27. En grænsetest bruges, når testkemikaliet vides eller forventes at være stort 
set ikke-toksisk, dvs. det fremkalder toksisk respons, der kun ligger over den fastsatte grænsekoncentration. Oplysninger om testkemikaliets toksicitet kan 
fås ud fra viden om tilsvarende testede stoffer eller blandinger, idet der tages 
hensyn til art og procentuelt indhold af de stoffer, der vides at være af toksikologisk betydning. Når der kun foreligger få eller slet ingen oplys ­
ninger om testkemikaliets toksicitet, eller når testkemikaliet forventes at 
være toksisk, bør hovedforsøget udføres [se GD 39 (8) for yderligere vejled ­
ning].
 
28. Ved hjælp af den sædvanlige fremgangsmåde eksponeres tre dyr pr. køn 
eller seks dyr af det mest modtagelige køn for koncentrationer på 
henholdsvis 20 000 ppm for gasser, 20 mg/l for dampe og 5 mg/l for støv/ 
tåge (hvis det er muligt). Dette udgør grænsetesten for denne testmetode. Ved test af aerosoler bør det primære mål være at opnå en respirabel partikelstørrelse (dvs. MMAD på 1-4 μm). For de fleste testkemikalier er 
det muligt ved en koncentration på 2 mg/l. Test af aerosoler ved en koncen ­
tration på mere end 2 mg/l bør kun forsøges, hvis der kan opnås en respi ­
rabel partikelstørrelse [se GD 39 (8)]. I henhold til GHS (16) bør test, der overstiger en grænsekoncentration, undgås af hensyn til dyrevelfærden. Test 
i GHS-kategori 5 (16), som ikke er gennemført i forordning (EF) 
nr. 1272/2008 (9), bør kun overvejes, når resultaterne af en sådan test med overvejende sandsynlighed ventes at få direkte relevans for beskyttelsen af menneskers sundhed, og der skal gives en begrundelse i forsøgsrapporten. 
I tilfælde af potentielt eksplosive testkemikalier skal der udvises forsigtighed 
for at undgå forhold, der kan fremkalde eksplosion. For at undgå unød ­
vendig brug af dyr bør et testforsøg gennemføres uden dyr inden grænse ­
testen, så det sikres, at betingelserne i kammeret for en grænsetest kan 
opnås.
 
OBSERVATIONER  
29. Dyrene bør hyppigt observeres klinisk i eksponeringsperioden. Efter 
eksponering bør kliniske observationer foretages mindst to gange på 
eksponeringsdagen eller hyppigere, hvis det begrundes af dyrenes respons på behandlingen, og derefter mindst én gang dagligt i sammenlagt 14 dage. Varigheden af observationsperioden er ikke fast, men bestemmes ud fra 
arten og tidspunktet for indtræden af kliniske tegn og varigheden af resti ­
tutionsperioden. Tidspunkterne for toksiske symptomers indsætten og forsvinden er vigtige, navnlig hvis der er tendens til forsinkede toksiske symptomer. Alle observationer registreres systematisk, og der føres indivi ­
duel protokol for hvert dyr. Dyr, som findes at være døende, og dyr, som 
udviser svære smerter og/eller vedvarende tegn på svære lidelser, skal aflives humant af hensyn til dyrevelfærden. Stor omhu bør udvises ved undersøgelser for kliniske tegn på toksicitet for at sikre, at indledningsvist 
dårligt udseende og forbigående respirationsændringer, der er resultatet af 
selve eksponeringen, ikke forveksles med toksicitet relateret til testkemika ­
liet. De principper og kriterier, der er sammenfattet i Humane Endpoints Guidance Document, skal ligeledes tages i betragtning (7). Når dyr aflives af 
humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet registreres så 
nøjagtigt som muligt.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Observationer i burene skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slim ­
hinder, respirationssystem, kredsløb, autonomt nervesystem og centralnerve ­
system samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Hvis det er muligt, registreres evt. sondring mellem lokale og systemiske virkninger. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, 
spytflåd, diarré, sløvhed, søvn og koma. Målingen af rektal temperatur 
kan dokumentere refleks-bradypnø eller hypo-/hypertermia relateret til behandling eller fangenskab.
 
Kropsvægt  
31. Det enkelte dyrs vægt registreres én gang i tilvænningsperioden, på 
eksponeringsdagen inden eksponeringen (dag 0) og mindst på dag 1, 3 og 7 (og derefter ugentligt), og den registreres på tidspunktet for død eller 
aflivning, hvis det indtræder efter dag 1. Kropsvægt anerkendes som en 
kritisk indikator for toksicitet, og dyr med et vedvarende vægttab på ≥ 
20 % sammenlignet med vægten for forsøget, overvåges nøje. Overlevende dyr vejes og aflives humant ved afslutningen af perioden efter eksponering.
 
Patologi  
32. Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller aflives og tages 
ud af forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes makroskopisk obduktion. Hvis makroskopisk obduktion ikke kan udføres umiddelbart efter 
opdagelsen af et dødt dyr, nedkøles (ikke fryses) dyret ved en temperatur, 
der er tilstrækkeligt lav til at minimere autolyse. Makroskopisk obduktion udføres så hurtigt som muligt, helst inden for en eller to dage. Alle makro ­
skopiske patologiske forandringer registreres for hvert dyr med særligt fokus 
på forandringer i luftvejene.
 
33. Yderligere undersøgelser, der på forhånd er medtaget som standard, kan 
overvejes for at udvide den fortolkningsmæssige værdi af undersøgelsen, f.eks. vejning af overlevende rotters lunger og tilvejebringelse af dokumen ­
tation for irritation ved hjælp af mikroskopisk undersøgelse af luftvejene. 
Undersøgte organer kan omfatte organer, som udviser makroskopiske pato ­
logiske forandringer hos dyr, som overlever i 24 timer eller længere, og organer, som vides eller forventes at være påvirket. Mikroskopisk undersø ­
gelse af hele luftvejene kan give nyttige informationer i forbindelse med 
testkemikalier, der reagerer med vand, f.eks. syrer og hygroskopiske testke ­
mikalier.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
34. Der skal fremlægges data for de enkelte dyr om kropsvægt og obduktions ­
fund. For hver testgruppe opstilles i tabelform kliniske observationsdata om 
antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske 
virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet samt obduktions ­
fund.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Testrapport  
35. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er relevante:  
Forsøgsdyr og pasning  
— beskrivelse af burforhold, herunder: antal (eller ændring i antal) dyr pr. 
bur, strøelse, omgivende temperatur og relativ fugtighed, lysperiode og 
foder  
— anvendt art/stamme og begrundelse for anvendelse af andre arter end 
rotte 
— dyrenes antal, alder og køn  
— randomiseringsmetode  
— nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens 
art/oprindelse, vandets oprindelse)  
— beskrivelse af konditionering før test, herunder foder, karantæne og 
behandling for sygdom.  
Testkemikalie  
— fysisk tilstand, renhed og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber 
(herunder isomeri)  
— identifikationsoplysninger og CAS-nr. (Chemical Abstract Services 
Registry Number), hvis det kendes.  
Vehikel  
— begrundelse for brug af vehikel og begrundelse for valg af vehikel, hvis 
dette ikke er vand  
— historiske eller samtidige data, der viser, at vehiklet ikke påvirker resul ­
tatet af forsøget.  
Inhalationskammer  
— beskrivelse af inhalationskammeret, herunder dimensioner og rumfang  
— oprindelse og beskrivelse af udstyr anvendt til eksponering af dyr og til 
generering af atmosfære  
— apparatur til måling af temperatur, fugtighed, partikelstørrelse og faktisk 
koncentration  
— luftkilde, behandling af tilført/udledt luft og konditioneringssystem  
— metoder, der er anvendt til kalibrering af apparatur for at sikre en 
homogen testatmosfære  
— trykforskel (positiv eller negativ)  
— eksponeringsporte pr. kammer (eksponering gennem næsen); placering 
af dyr i systemet (helkropseksponering)  
— testatmosfærens tidsmæssige homogenitet/stabilitet  
— placering af temperatur- og fugtighedssensorer og udtagning af stikprøve 
af testatmosfære i kammer  
— luftgennemstrømningshastigheder, luftgennemstrømningshastighed/eks ­
poneringsport (eksponering gennem næsen) eller dyrebelastning/kammer (helkropseksponering)
 
— information om det apparatur, der er anvendt til at måle ilt og kuldioxid, 
hvis det er relevant  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— tid, der kræves til at opnå ligevægt i inhalationskammeret (t  95 ) 
— antal volumenændringer pr. time  
— evt. måleudstyr.  
Eksponeringsdata:  
— begrundelse for valg af målkoncentration i hovedforsøget  
— nominelle koncentrationer (samlet masse af det genererede testkemikalie 
i inhalationskammeret divideret med den samlede mængde luft, der 
passerer gennem kammeret)  
— faktiske koncentrationer af testkemikaliet indsamlet fra dyrenes vejrtræk ­
ningszone; for testblandinger, der producerer heterogene fysiske former (gasser, dampe eller aerosoler), kan hver enkelt analyseres separat
 
— alle luftkoncentrationer rapporteres i masseenheder (f.eks. mg/l, mg/m  3 
osv.); volumenenheder (f.eks. ppm og ppb) kan også rapporteres i 
parentes  
— partikelstørrelsesfordeling, massemedian af den aerodynamiske 
diameter (MMAD) og geometrisk standardafvigelse ( σg), herunder 
deres beregningsmetoder; individuelle partikelstørrelsesanalyse rapporte ­
res. 
Testbetingelser  
— nærmere oplysninger om fremstilling af testkemikalie, herunder oplys ­
ninger om fremgangsmåder anvendt til at reducere partikelstørrelsen af 
faste materialer eller fremstille opløsninger af testkemikaliet; hvis meka ­
niske processer har ændret testkemikaliets sammensætning, medtages resultaterne af analyser, som bekræfter testkemikaliets sammensætning
 
— en beskrivelse (helst med diagram) af det apparatur, der bruges til at 
generere testatmosfæren og til at eksponere dyrene for testatmosfæren  
— nærmere oplysninger om den anvendte analysemetode og validerings ­
metode (herunder genfindingsgrad for testkemikaliet fra prøvemediet)  
— begrundelse for valget af testkoncentrationer.  
Resultater  
— opstilling i tabelform af temperatur, fugtighed og luftgennemstrømning i 
kammer  
— opstilling i tabelform af data om nominel og faktisk koncentration i 
kammer  
— opstilling i tabelform af data om partikelstørrelse i tabelform, herunder 
data om indsamling af analyseprøve, partikelstørrelsesfordeling og beregning af MMAD og σ
 g 
— opstilling i tabelform af responsdata og koncentrationsniveau for hvert 
dyr (dvs. dyr, som viser tegn på toksicitet, herunder mortalitet, og virk ­
ningernes art, sværhed og varighed)  
— kropsvægten for det enkelte dyr registreret på forsøgsdage; dato og 
klokkeslæt for dyrets død, hvis denne indtræder før planlagt aflivning; 
for hvert dyr, toksiske virkningers indsætten, tidsforløb, og hvorvidt de 
er reversible  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— for hvert dyr evt. obduktionsfund og histopatologiske fund  
— klassificering i CLP-kategori og afskæringsværdi for LC  50 . 
Diskussion og fortolkning af resultater  
— Der lægges særlig vægt på beskrivelsen af de metoder, der er anvendt til 
at opfylde denne testmetodes kriterier, f.eks. grænsekoncentrationen eller partikelstørrelsen.
 
— Partiklernes respirabilitet i lyset af de overordnede resultater beskrives, 
især hvis partikelstørrelseskriteriet ikke kunne opfyldes  
— Konsistensen mellem de metoder, der er anvendt til at bestemme nomi ­
nelle og faktiske koncentrationer og relationen mellem den faktiske koncentration og den nominelle koncentration beskrives i den overord ­
nede vurdering af forsøget.
 
— Den sandsynlige dødsårsag og den fremherskende virkningsmåde (syste ­
misk i forhold til lokal) beskrives.  
— Der gives en forklaring, hvis det var nødvendigt at foretage human 
aflivning af dyr, som udviste svære smerter og/eller vedvarende tegn 
på svære lidelser, baseret på kriterierne i OECD Guidance Document on Humane Endpoints (7).
 
LITTERATUR:  
(1) Kapitel B.2 i dette bilag, Akut toksicitet (Inhalation).  
(2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W og Schlede E (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254.
 
(3) Diener W, Kayser D og Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549.
 
(4) Diener W og Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alterations to 
LD/LC  50 Tests. ALTEX 1: 129-134.  
(5) Kapitel B.1 i dette bilag, Akut inhalationstoksicitet — Akut toksisitetsklas ­
semetode.  
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft 
TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment N. 105. Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition. Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Findes på: [http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines]
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39. OECD, Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]
 
(9) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 
16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 
1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006, EUT L 353 
af 31.12.2008, s. 1.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) Kapitel B.40 i dette bilag, In vitro-hudætsning: måling af transkutan elek ­
trisk modstand (TER).  
(11) Kapitel B.40.A i dette bilag, In vitro-hudætsning: test med human 
hudmodel.  
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl . Toxicol. 18: 321-327.
 
(15) Pauluhn J og Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167  
(16) FN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York og 
Genève. Findes på: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_ 
welcome_e.html].  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Tillæg 2  
Fremgangsmåde, som skal følges for hver startkoncentration for gasser 
(ppm/4h)  
Generelle bemærkninger (  1 ) 
For hver startkoncentration følges den forsøgsplan, der er anført i dette tillæg.  
Tillæg 2a: startkoncentration er 100 ppm  
Tillæg 2b: startkoncentration er 500 ppm  
Tillæg 2c: startkoncentration er 2 500 ppm  
Tillæg 2d: startkoncentration er 20 000 ppm  
Ved testfremgangsmåden følges pilene, afhængigt af antallet af humant aflivede 
eller døde dyr.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) I de følgende tabeller henvises der til GHS — Globally Harmonized System of Clas ­
sification and Labelling of Chemicals. Den tilsvarende EU-klassificering er 
forordning (EF) nr. 1272/2008. Ved akut toksicitet (inhalation) gennemføres kategori 5 
ikke ved forordning (EF) nr. 1272/2008 (9).
 Tillæg 2a  
Akut toxicitet (inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 100 ppm/4 t for gasser
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Tillæg 2b  
Akut toxicitet (inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 500 ppm/4 t for gasser
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Tillæg 2c  
Akut toxicitet (inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 2 500 ppm/4 t for gasser
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Tillæg 2d  
Akut toxicitet (inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 20 000 ppm/4 t for gasser
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Tillæg 3  
Fremgangsmåde, som skal følges for hver startkoncentration for dampe 
(mg/l/4h)  
Generelle bemærkninger (  1 ) 
For hver startkoncentration følges den forsøgsplan, der er anført i dette tillæg.  
Tillæg 3a: startkoncentration er 0,5 mg/l  
Tillæg 3b: startkoncentration er 2,0 mg/l  
Tillæg 3c: startkoncentration er 10 mg/l  
Tillæg 3d: startkoncentration er 20 mg/l  
Ved testfremgangsmåden følges pilene, afhængigt af antallet af humant aflivede 
eller døde dyr.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) I de følgende tabeller henvises der til GHS — Globally Harmonized System of Clas ­
sification and Labelling of Chemicals. Den tilsvarende EU-klassificering er 
forordning (EF) nr. 1272/2008. Ved akut toksicitet (inhalation) gennemføres kategori 5 
ikke ved forordning (EF) nr. 1272/2008 (9).
 Appendix 3a  
Akut toxicitet (inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 0,5 mg/L/4 t for dampe
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Tillæg 3b  
Akut Toxicitet (Inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 2 mg/4 t for dampe
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Tillæg 3c  
Akut Toxicitet (Inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 10 mg/L/4 t for dampe
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Tillæg 3d  
Akut Toxicitet (Inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 20 mg/L/4 t for dampe
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Tillæg 4  
Fremgangsmåde, som skal følges for hver startkoncentration for aerosoler 
(mg/l/4h)  
Generelle bemærkninger (  1 ) 
For hver startkoncentration følges den forsøgsplan, der er anført i dette tillæg.  
Tillæg 4a: startkoncentration er 0,05 mg/l  
Tillæg 4b: startkoncentration er 0,5 mg/l  
Tillæg 4c: startkoncentration er 1 mg/l  
Tillæg 4d: startkoncentration er 5 mg/l  
Ved testfremgangsmåden følges pilene, afhængigt af antallet af humant aflivede 
eller døde dyr.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) I de følgende tabeller henvises der til GHS — Globally Harmonized System of Clas ­
sification and Labelling of Chemicals. Den tilsvarende EU-klassificering er 
forordning (EF) nr. 1272/2008. Ved akut toksicitet (inhalation) gennemføres kategori 5 
ikke ved forordning (EF) nr. 1272/2008 (9).
 Tillæg 4a  
Akut Toxicitet (Inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 0,05 mg/L/4 t for dampe
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Tillæg 4b  
Akut toxicitet (inhalation):  
Fremgansmåde med startkoncentration på 0,5 mg/L/4 t for aerosoler
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Tillæg 4c  
Akut toxicitet (inhalation):  
Fremgansmåde med startkoncentration på 1 mg/L/4 t for aerosoler
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Tillæg 4d  
Akut Toxicitet (Inhalation):  
Fremgangsmåde med startkoncentration på 5 mg/L/4 t for aerosoler
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  UNDERSØGELSE AF NEUROTOKSICITET UNDER 
UDVIKLINGEN  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD-testvejledningen (TG) 426 (2007). På et 
møde i København i juni 1995 drøftede en OECD-arbejdsgruppe om repro ­
duktion og udviklingstoksicitet behovet for at ajourføre den eksisterende OECD-testvejledning for reproduktion og udviklingstoksicitet og for at udforme nye retningslinjer for de endepunkter, som endnu ikke er dækket 
(1). Arbejdsgruppen anbefalede, at der blev skrevet en testvejledning for 
udviklingsneurotoksicitet på grundlag af en vejledning fra den amerikanske miljøstyrelse (EPA-vejledning), som siden er blevet revideret (2). I juni 1996 blev der afholdt et andet møde i København for at hjælpe sekretariatet 
med at skitsere rammerne for en ny testvejledning vedrørende udviklings ­
neurotoksicitet, bl.a. de vigtigste elementer som f.eks. oplysninger om valg af dyrearter, doseringsperiode, testperiode, endepunkter, der skal vurderes, og kriterier for vurdering af resultater. Der blev udgivet en amerikansk 
vejledning i vurdering af neurotoksicitetsrisici i 1998 (3). Et 
OECD-konsultationsmøde med eksperter og en ILSI Risk Science Institute-workshop blev afholdt umiddelbart efter hinanden i oktober 2000, og i 2005 blev der afholdt et konsultationsmøde med eksperter i 
Tokyo. Disse møder blev holdt for at drøfte de videnskabelige og tekniske 
spørgsmål vedrørende den nuværende testvejledning, og der blev taget hensyn til anbefalingerne fra møderne (4)(5)(6)(7) i forbindelse med udvik ­
lingen af denne testmetode. Supplerende information om, hvilken adfærd, 
fortolkning og terminologi der skal anvendes til denne testmetode, kan ses i 
OECD's vejledning nr. 43 om reproduktiv toksicitetsundersøgelse og -vur ­
dering (8) og nr. 20 om neurotoksicitetstest (9).
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
2. Det er kendt, at en række kemikalier forårsager en neurotoksisk påvirkning 
af udviklingen hos mennesker og andre arter (10)(11)(12)(13). En bestem ­
melse af potentialet for udviklingsneurotoksicitet kan være nødvendig for at vurdere og evaluere et kemikalies toksiske egenskaber. Udviklingsneurotok ­
sicitetsundersøgelser skal resultere i data, bl.a. karakteriseringer af dosis ­
respons og om de potentielle funktionelle og morfologiske virkninger, der kan opstå på afkommets ikkefærdigudviklede nervesystem ved eksponering in utero og i den første levetid.
 
3. En udviklingsneurotoksicitetsundersøgelse kan gennemføres som en særskilt 
undersøgelse, som en del af en reproduktionstoksicitetsundersøgelse og/eller en neurotoksicitetsundersøgelse af voksne (f.eks. testmetode B.34 (14), B.35 
(15), B.43 (16)) eller som tillæg til en prænatal udviklingstoksicitetsunder ­
søgelse (f.eks. testmetode B.31 (17)). Når udviklingsneurotoksicitetsunder ­
søgelsen indgår i eller knyttes til en anden undersøgelse, er det afgørende at bevare begge undersøgelsestypers integritet. Alle test skal overholde 
gældende lovgivning eller statslige og institutionelle retningslinjer for 
anvendelsen af forsøgsdyr i forskning (f.eks. 18).
 
4. Testlaboratoriet bør inden testens udførelse gennemgå alle tilgængelige 
oplysninger om testkemikaliet. Disse oplysninger skal omfatte kemikaliets 
identitet og struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af andre 
in vitro- eller in vivo-toksicitetstest af kemikaliet, toksikologiske data om strukturelt beslægtede stoffer, samt stoffets forventede anvendelse(r). Disse oplysninger er nødvendige for til alle parters tilfredshed at godtgøre, at 
testen har afgørende betydning for beskyttelsen af menneskers sundhed, 
og vil desuden være nyttige ved valg af passende startdosis.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
PRINCIP FOR TESTEN  
5. Testkemikaliet indgives til dyr under drægtighed og laktation. Moderdyr 
testes for at vurdere virkningerne hos drægtige og diegivende hunner og 
kan også give komparativ information (moderdyr kontra afkom). Afkom udvælges vilkårligt fra kuld med henblik på en vurdering af neurotoksici ­
teten. Vurderingen består af observationer for at afsløre større neurologiske 
og adfærdsmæssige abnormiteter, bl.a. vurdering af fysisk udvikling, 
adfærdsudvikling, motorisk aktivitet, motoriske og sensoriske funktioner samt indlæring og hukommelse og vurdering af hjernevægt og neuropato ­
logi under postnatal udvikling og voksenliv.
 
6. Når testmetoden gennemføres som en særskilt undersøgelse, kan der 
anvendes yderligere tilgængelige dyr i hver gruppe til særlige neuroadfærds ­
mæssige, neuropatologiske, neurokemiske eller elektrofysiologiske procedu ­
rer, der kan supplere de data, der fås fra undersøgelser, som anbefales for denne testmetode (16)(19)(20)(21). De supplerende procedurer kan være 
særligt nyttige, når empiriske observationer, forventede virkninger eller 
virkningsmekanisme/virkemåde peger på neurotoksicitet af en bestemt art. Disse supplerende procedurer kan anvendes hos både moderdyr og unger. Endvidere kan ex vivo- eller in vitro-procedurer også følges, så 
længe disse procedurer ikke ændrer in vivo-procedurernes integritet.
 
FORBEREDELSER TIL TESTEN  
Valg af dyreart  
7. Den foretrukne dyreart er rotten, men andre arter kan bruges, når det er 
hensigtsmæssigt. Det skal dog bemærkes, at det antal drægtighedsdage og dage efter fødslen, der er anført i denne testmetode, gælder specifikt for de 
hyppigst anvendte rottestammer, og der bør vælges sammenlignelige dage, 
hvis der bruges en anden art eller en usædvanlig stamme. Anvendes der en anden art, skal dette begrundes med toksikologiske, farmakokinetiske og/eller andre data. I begrundelsen anføres, om der findes artsspecifikke 
postnatale neuroadfærdsmæssige og neuropatologiske vurderinger. Hvis en 
tidligere test har givet anledning til bekymringer, bør den art/stamme, som blev anvendt, gennemgås. På grund af forskellige rottestammers forskellige ydeevneegenskaber skal der foreligge dokumentation for, at den valgte 
stamme har tilstrækkelig fertilitet og modtagelighed. Andre arters pålide ­
lighed og følsomhed i forbindelse med detektion af udviklingsneurotoksi ­
citet dokumenteres.
 
Miljøbetingelser og fodring  
8. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luft ­
fugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under 
rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være 
kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Det er også muligt at vende lyscyklussen forud for parring og i undersøgelsens løbetid for at foretage vurderinger af funktionelle og adfærdsmæssige endepunkter i 
mørke perioder (under rødt lys), dvs. i den tid dyrene er normalt aktive 
(22). Alle ændringer i lys-mørkecyklussen bør omfatte tilstrækkelig tid til akklimatisering, så dyrene kan tilpasse sig den nye cyklus. Der kan anvendes normalt laboratoriefoder med ubegrænset forsyning af drikkevand. 
Arten af foder og vand rapporteres, og begge dele analyseres for forure ­
nende stoffer.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Dyrene kan anbringes individuelt eller i bure i små grupper af samme køn. 
Parring bør finde sted i bure, der er egnede til formålet. Efter tegn på 
kopulation eller senest på drægtighedsperiodens dag 15 anbringes parrede hunner hver for sig i fødebure eller yngelbure. Burene skal anbringes såle ­
des, at mulige virkninger som følge af burenes placering minimeres. Parrede 
hunner skal forsynes med egnet og nærmere bestemt redemateriale, når 
fødselstidspunktet nærmer sig. Det er velkendt, at uhensigtsmæssig behand ­
ling eller stress i drægtighedsperioden kan medføre negative resultater, herunder prænatalt tab og forandringer i prænatal og postnatal udvikling. 
For at sikre mod prænatalt tab som følge af ikkebehandlingsrelaterede 
faktorer skal drægtige dyr håndteres med omhu, og stress forårsaget af ydre faktorer som støj skal undgås.
 
Forberedelse af dyrene  
10. Der anvendes sunde dyr, som er tilvænnet laboratorieforholdene, og som 
ikke tidligere har været anvendt til eksperimenter, medmindre undersøgelsen 
indgår i en anden undersøgelse (se pkt. 3). Dyrene beskrives med hensyn til 
stamme, kilde, køn, vægt og alder. Hvert dyr tildeles og mærkes med sit eget identifikationsnummer. Dyrene i alle testgrupper skal så vidt muligt være af ensartet vægt og alder og skal ligge inden for normalområdet for 
den art eller stamme, der undersøges. På hvert dosisniveau anvendes unge 
voksne hundyr, som ikke tidligere har født. Det bør sikres, at søskendedyr ikke parres. Dag 0 i drægtighedsperioden (GD 0) er den dag, hvor der observeres en vaginal prop og/eller sperma. Der bør gives tilstrækkelig 
tid til akklimatisering (f.eks. 2-3 dage) ved køb af drægtige dyr fra en 
leverandør. Parrede hunner fordeles uden skævhed mellem kontrol- og behandlingsgrupperne og fordeles så vidt muligt ligeligt mellem grupperne (f.eks. anbefales en stratificeret vilkårlig procedure for at sikre en jævn 
fordeling mellem alle grupper f.eks. baseret på kropsvægt). Hunner, som 
insemineres af samme han, fordeles jævnt mellem grupperne.
 
FREMGANGSMÅDE  
Dyrenes antal og køn  
11. I hver test- og kontrolgruppe skal der være et tilstrækkeligt antal drægtige 
hunner, som kan eksponeres for testkemikaliet, for at sikre, at der 
produceres et passende antal unger med henblik på vurdering af neurotok ­
siciteten. I alt 20 kuld anbefales på hvert dosisniveau. Doseringsdesign med gentagne eller forskudte grupper er tilladt, hvis det samlede antal kuld pr. gruppe opnås, og der anvendes passende statistiske modeller til forklaring af 
gentagelser.
 
12. På eller før dag 4 efter fødslen (PND 4) (dagen for fødslen er PND 0) skal 
størrelsen på hvert kuld tilpasses ved at fjerne ekstra unger ved vilkårlig udvælgelse for at få en ensartet kuldstørrelse for alle kuld (23). Kuldstør ­
relsen bør ikke overstige den gennemsnitlige kuldstørrelse for den anvendte 
stamme af gnavere (8-12). Kuldet skal så vidt muligt have lige mange han- 
og hununger. Selektiv fjernelse af unger, f.eks. baseret på kropsvægt, er ikke hensigtsmæssigt. Efter standardiseringen af kuld (aflivning) og før den videre test af funktionelle endepunkter skal de enkelte unger, der skal testes 
før og efter fravænning, mærkes individuelt efter en egnet human metode til 
identificering af unger (f.eks. 24).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Fordeling af dyr til funktionelle og adfærdsmæssige test, hjernevejning 
og neuropatologiske vurderinger  
13. Testmetoden giver mulighed for forskellige tilgange til fordeling af dyr 
eksponeret in utero og gennem laktation til funktionelle og adfærdsmæssige test, kønsmodning, bestemmelse af hjernevægt og neuropatologisk vurde ­
ring (25). Andre test af neuroadfærdsfunktion (f.eks. social adfærd), neuro ­
kemiske eller neuropatologiske undersøgelser kan tilføjes i det enkelte 
tilfælde, så længe integriteten af de oprindelige nødvendige test ikke skades.
 
14. Ungerne udvælges fra hver dosisgruppe og fordeles til endepunktsvurde ­
ringer på eller efter PND 4. Ungerne bør udvælges, således at begge køn fra 
hvert kuld i hver dosisgruppe så vidt muligt bliver ligeligt repræsenteret i alle test. Til test af motorisk aktivitet bør det samme par han- og hununger testes i alle aldersklasser før fravænning (se pkt. 35). Til alle andre test kan 
de samme eller særskilte par han- og hundyr fordeles til forskellige adfærd ­
stest. Det kan være nødvendigt at fordele forskellige unger til kognitive funktionstest for fravænnede i modsætning til testen for voksne for at undgå, at disse målinger påvirkes af virkningerne af alder og forudgående 
træning (26)(27). Ved fravænning (PND 21) kan unger, der ikke udvælges 
til test, aflives humant. Evt. ændringer i fordelingerne af unger rapporteres. Den statistiske måleenhed er kuldet (eller moderdyret) og ikke ungen.
 
15. Der er forskellige måder at fordele unger på til eksperimenter før og efter 
fravænning, kognitive test, patologiske undersøgelser osv. (se figur 1 vedrørende generelt design og tillæg 1 for eksempler på fordeling). Det anbefalede minimumsantal dyr i hver dosisgruppe for undersøgelser før 
og efter fravænning er følgende: 
Kliniske observationer og kropsvægt Alle dyr 
Detaljerede kliniske observationer 20/køn (1/køn/kuld) Hjernevægt (efter fiksering) PND 11-22 10/køn (1/kuld) Hjernevægt (ufikseret) ~ PND 70 10/køn (1/kuld) Neuropatologi (immersions- eller perfu ­
sionsfiksering) PND 11-22 10/køn (1/kuld) 
Neuropatologi (perfusionsfiksering) PND 
~70 10/køn (1/kuld) 
Kønsmodning 20/køn (1/køn/kuld) 
Øvrige udviklingsmæssige kendetegn (valg ­
frit) Alle dyr 
Adfærdsudvikling 20/køn (1/køn/kuld) 
Motorisk aktivitet 20/køn (1/køn/kuld) 
Motorisk og sensorisk funktion 20/køn (1/køn/kuld) 
Indlæring og hukommelse 10/køn (
 a ) (1/kuld)  
( a ) Afhængigt af de kognitive funktionstests følsomhed bør det overvejes at undersøge 
et større antal dyr, f.eks. op til én han og én hun pr. kuld (se tillæg 1 vedrørende 
fordeling af dyr) (OECD's vejledning 43 (8) indeholder yderligere vejledning om 
prøvestørrelse).  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dosering  
16. Der anvendes mindst tre dosisstørrelser og en sideløbende kontrol. Dosis ­
størrelserne vælges med sådanne intervaller, at der opnås en gradueret 
toksisk effekt. Medmindre kemikaliets fysisk-kemiske eller biologiske egen ­
skaber sætter grænser for doseringen, vælges det højeste doseringsniveau således, at det har en vis toksisk effekt på moderdyret (f.eks. kliniske tegn, 
vægttab (højst 10 %) og/eller evidens for en dosisbegrænsende toksicitet i et 
målorgan). Den høje dosis kan begrænses til 1 000 mg/kg/dag kropsvægt med visse undtagelser. F.eks. kan den forventede humane eksponering foranledige, at der benyttes en højere dosis. Alternativt foretages pilotunder ­
søgelser eller foreløbige ‘range-finding’-undersøgelser for at bestemme de 
højeste doser, der skal anvendes for at give en minimal grad af toksicitet hos moderdyret. Hvis testkemikaliet har vist sig at være udviklingstoksisk enten i en standardudviklingstoksicitetsundersøgelse eller i en pilotundersø ­
gelse, bør den højeste dosisstørrelse være den maksimale dosis, der ikke 
påfører for stærk toksicitet hos afkommet eller in utero- eller neonatal død eller deformationer, der er tilstrækkeligt alvorlige til at udelukke en meningsfuld vurdering af neurotoksiciteten. Den laveste dosering må 
hverken medføre tegn på maternel toksicitet eller udviklingstoksicitet, 
herunder neurotoksicitet. Der vælges faldende dosisstørrelse med henblik på at påvise en evt. dosisrelateret respons, og det niveau, som ikke medfører observeret skadelig virkning (NOAEL), eller doser nær detektionsgrænsen, 
således at der kan bestemmes en benchmarkdosis. For at fastlægge den 
aftagende række dosisstørrelser svarer de optimale intervaller ofte til en faktor to til fire, og i mange tilfælde må tilføjelse af en fjerde behandlings ­
gruppe ofte foretrækkes frem for meget store intervaller (f.eks. større end en 
faktor 10) mellem dosisstørrelserne.
 
17. Doseringen vælges under hensyntagen til alle foreliggende toksicitetsdata 
samt supplerende oplysninger om metabolisme og toksikokinetik af testke ­
mikalie eller beslægtede stoffer. Sådanne oplysninger kan desuden være med til at godtgøre, at den valgte dosering er hensigtsmæssig. Direkte dosering til unger bør overvejes på grundlag af eksponering og farmakoki ­
netiske oplysninger (28)(29). Fordele og ulemper overvejes omhyggeligt, 
før der foretages direkte doseringsundersøgelser (30).
 
18. Den sideløbende kontrolgruppe skal være ubehandlet eller behandles med 
vehikel, hvis et sådant anvendes til indgift af testkemikaliet. Alle dyr skal normalt have samme mængde af enten testkemikalie eller vehikel på grundlag af kropsvægt. Anvendes et vehikel eller andet tilsætningsstof for 
at lette doseringen, tages følgende egenskaber i betragtning: indvirkningen 
på testkemikaliets absorption, distribution, metabolisme og retention af test ­
kemikaliet; evt. indvirkning på testkemikaliets kemiske egenskaber, som kan ændre dets toksiske egenskaber, samt indvirkningen på dyrenes 
foder- og vandindtagelse eller ernæringstilstand. Vehiklet må ikke skabe 
virkninger, der vanskeliggør fortolkningen af undersøgelsen, og det må heller ikke være neuroadfærdsmæssigt toksisk eller påvirke reproduktion eller udvikling. For nye vehikler skal der inkluderes en ubehandlet kontrol ­
gruppe ud over vehikelkontrolgruppen. Dyrene i kontrolgruppen/-grupperne 
behandles nøjagtigt som dyrene i testgruppen/-grupperne.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Indgift af doser  
19. Testkemikalie eller vehikel indgives ad den vej, som er mest relevant i 
forhold til human eksponering, og på grundlag af de foreliggende oplys ­
ninger om metabolisme og fordeling i forsøgsdyrene. Indgiftsvejen er normalt oral (f.eks. gennem sonde, i føden eller i drikkevandet), men andre veje (f.eks. gennem huden eller ved inhalation) kan benyttes alt 
efter kendetegn og forventede eller kendte eksponeringsveje for mennesker 
(OECD's vejledning 43 (8) indeholder yderligere oplysninger). Den valgte indgiftsvej skal begrundes. Testkemikaliet indgives på omtrent samme tids ­
punkt hver dag.
 
20. Dosis til det enkelte dyr baseres normalt på den seneste bestemmelse af 
dyrets kropsvægt. I den sidste tredjedel af drægtighedsperioden må justering 
af doseringen dog ske med varsomhed. Konstateres der kraftig toksisk 
effekt hos de behandlede moderdyr, skal disse aflives på en human måde.  
21. Testkemikaliet eller -vehiklet indgives som minimum dagligt til parrede 
hunner fra implantationstidspunktet (GD 6) og i hele laktationsperioden 
(PND 21), så ungerne eksponeres for testkemikaliet under den præ- og postnatale neurologiske udvikling. Den alder, hvor doseringen starter, og doseringens varighed og frekvens kan justeres, hvis der er dokumentation 
for et forsøgsdesign, som er mere relevant i forhold til menneskers ekspone ­
ring. Doseringsvarigheden justeres til andre arter for at sikre eksponering i alle tidlige perioder af hjerneudviklingen (dvs. svarende til prænatal og tidlig postnatal hjernevækst hos mennesker). Dosering kan begynde fra 
drægtighedsperiodens begyndelse (GD 0), om end man skal være 
opmærksom på risikoen for, at testkemikaliet forårsager letal virkning før implantation. Ved at indgive kemikaliet på GD 6 kan denne risiko undgås, men udviklingsstadierne mellem GD 0 og 6 vil så ikke blive behandlet. 
Køber et laboratorium tidsparrede dyr, er det upraktisk at begynde dose ­
ringen på GD 0, og i så fald vil GD 6 være en god begyndelsesdag. Testlaboratoriet fastsætter doseringen efter relevant information om testke ­
mikaliets virkninger, tidligere erfaringer og logistiske hensyn. Dette kan 
betyde, at doseringen udvides ud over fravænningen. Dosering bør ikke 
forekomme på dagen for fødslen, hvis dyret ikke er helt færdig med at føde sit afkom. Normalt antages det, at ungernes eksponering sker 
gennem modermælken. Dog bør direkte dosering af unger overvejes i 
tilfælde, hvor der ikke er tegn på, at ungerne eksponeres kontinuerligt. Tegn på kontinuerlig eksponering kan hentes fra f.eks. farmakokinetiske oplysninger, toksicitet hos afkommet eller ændringer i biomarkører (28).
 
OBSERVATIONER  
Observationer på moderdyr  
22. Alle moderdyr observeres nøje mindst én gang dagligt med hensyn til deres 
almindelige helbredstilstand, herunder morbiditet og mortalitet  
23. I behandlings- og observationsperioder foretages detaljerede kliniske obser ­
vationer jævnligt (mindst to gange ved dosering i drægtighedsperioden og to gange ved dosering i laktationsperioden), idet der anvendes mindst 10 
moderdyr pr. dosisniveau. Dyrene observeres uden for deres eget bur af 
uddannede teknikere, der ikke kender til dyrenes behandling, og efter stan ­
dardiserede procedurer for at minimere dyrenes stress og forudindtagethed hos observatøren og maksimere pålideligheden mellem observatører. Hvor 
det er muligt, anbefales det, at observationerne i en given undersøgelse 
foretages af den samme tekniker.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Tilstedeværelsen af observerede tegn registreres. Også størrelsesordenen af 
de observerede tegn registreres, når det er muligt. De kliniske observationer 
omfatter, men er ikke begrænset til, ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion og autonom aktivitet (f.eks. tåreflåd, piloerektion, pupilstørrelse, usædvanligt respirationsmønster og/eller mundrespiration og 
evt. symptomer vedrørende vandladning eller defækation).
 
25. Evt. usædvanlig respons med hensyn til kropsstilling, aktivitetsniveau 
(f.eks. nedsat eller øget udforskning af ‘open field’) og koordinering af bevægelser registreres ligeledes. Ændringer i gangen (f.eks. vralten, ataksi), 
kropsstilling (f.eks. pukkelrygget) og reaktion på håndtering samt optræden 
af kloniske eller toniske bevægelser, kramper eller tremor, stereotypier (f.eks. overdreven pleje af pels, usædvanlige bevægelser med hovedet, gentagne cirkelbevægelser) eller bizar adfærd (bidning eller overdreven 
slikning, selvmutilering, baglæns gang, vokalisation) eller aggression 
protokolleres.
 
26. Alle tegn på toksicitet registreres, herunder dato og klokkeslæt for 
indtræden af unormal adfærd samt grad og varighed.  
27. Dyrene vejes på doseringstidspunktet mindst én gang om ugen under hele 
undersøgelsen, på eller tæt på fødselstidspunktet og på PND 21 (fravæn ­
ning). I forsøg med indgift gennem sonde vejes moderdyr mindst to gange om ugen. Doser justeres på tidspunktet for bestemmelse af hver kropsvægt, 
som det er hensigtsmæssigt. Fødeindtagelse måles én gang om ugen som 
minimum under drægtighed og laktation. Vandindtagelse måles mindst én gang om ugen, hvis eksponering sker gennem vandforsyningen.
 
Observationer af afkom  
28. Alt afkom observeres nøje mindst én gang dagligt for tegn på toksicitet 
samt for morbiditet og mortalitet.  
29. I behandlings- og observationsperioder foretages mere detaljerede kliniske 
observationer af afkommet. Afkommet (mindst én unge/køn/kuld) obser ­
veres af uddannede teknikere, der ikke kender til dyrenes behandling, og 
efter standardiserede procedurer for at minimere forudindtagethed hos observatøren og maksimere pålideligheden mellem observatører. Hvor det er muligt, anbefales det, at observationerne foretages af den samme tekni ­
ker. Som minimum overvåges endepunkterne, jf. pkt. 24 og 25, med hensyn 
til det udviklingstrin, som observeres, hvis det er relevant.
 
30. Alle tegn på toksicitet hos afkommet registreres, herunder dato og klok ­
keslæt for indtræden af unormal adfærd samt grad og varighed.  
Fysiske og udviklingsmæssige kendetegn  
31. Ændringer i udviklingskendetegn før fravænningen (f.eks. åbning af ydre 
ører og øjne, frembrud af fortand) hænger tæt sammen med kropsvægt (30)(31). Kropsvægt kan være den bedste indikator for fysisk udvikling. 
Måling af udviklingsmæssige kendetegn anbefales derfor kun, når der på 
forhånd er tegn på, at disse endepunkter vil give ekstra oplysninger. Tids ­
punkter for vurdering af disse parametre er anført i tabel 1. Alt efter de forventede virkninger og resultaterne af de indledende målinger kan det 
være tilrådeligt at tilføje ekstra tidspunkter eller foretage målingerne på 
andre udviklingstrin.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Det anbefales at benytte postkoital alder i stedet for postnatal alder ved 
vurdering af fysisk udvikling (33). Hvis unger testes på fravænningsdagen, 
anbefales det, at denne test udføres før den faktiske fravænning for at undgå en forvirrende effekt fremkaldt af stress i forbindelse med fravænningen. Endvidere bør test af unger efter fravænning ikke ske i de første to dage 
efter fravænningen.
 
Tabel 1  
Tidsplan for vurdering af fysiske og udviklingsmæssige kendetegn samt 
funktionelle/adfærdsmæssige endepunkter  ( a ) 
Aldersperioder 
Endepunkter Før fravænning (  b ) Unge (  b ) Unge voksne (  b ) 
Fysiske og udviklingsmæssige kendetegn  
Kropsvægt og kliniske 
observationer én gang om ugen (  c ) mindst hver anden 
uge mindst hver anden 
uge 
Hjernevægt PND 22 (  d ) ved afslutning 
Neuropatologi PND 22 (  d ) ved afslutning 
Kønsmodning — hvis det er relevant — 
Øvrige udviklingsmæs ­
sige kendetegn (  e ) hvis det er relevant — —  
Funktionelle/adfærdsmæssige kendetegn  
Adfærdsudvikling Mindst to målinger Motorisk aktivitet (her ­
under tilvænning) 1-3 gange (
 f ) — én gang 
Motorisk og sensorisk 
funktion — én gang én gang 
Indlæring og hukom ­
melse — én gang én gang  
( a ) Denne tabel viser, hvor mange gange der som minimum skal foretages målinger. Alt efter de forventede 
virkninger og resultaterne af de indledende målinger kan det være tilrådeligt at tilføje ekstra tidspunkter 
(f.eks. ældre dyr) eller foretage målingerne på andre udviklingstrin. 
( b ) Det anbefales, at unger ikke testes de første to dage efter fravænningen (se pkt. 32). Anbefalet alder for 
test af unge er: indlæring og hukommelse = PND 25 ± 2, motorisk og sensorisk funktion = PND 25 ± 2. 
Anbefalet alder for test af unge voksne er PND 60-70. 
( c ) Kropsvægt måles mindst to gange om ugen ved direkte dosering af unger med henblik på justering af 
doser på et tidspunkt med hurtig forøgelse af kropsvægten. 
( d ) Hjernevægt og neuropatologi kan evt. vurderes på et tidligere tidspunkt (f.eks. PND 11) (se pkt. 39). 
( e ) Andre udviklingsmæssige kendetegn ud over kropsvægt (f.eks. åbning af øjne) registreres, når det er 
relevant (se pkt. 31). 
( f ) Se pkt. 35.  
33. Levende unger tælles og kønsbestemmes, f.eks. ved visuel kontrol eller 
måling af den anogenitale afstand (34)(35), og hver unge i et kuld vejes 
individuelt ved fødslen eller snarest efter, mindst én gang om ugen under laktation og herefter mindst én gang hver anden uge. Når kønsmodningen er vurderet, bestemmes dyrets alder og kropsvægt på tidspunktet for åbning af 
vagina (36) og separation af præputium (37) for mindst én han og en hun 
pr. kuld.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Adfærdsudvikling  
34. Udvikling af udvalgte adfærdsformer måles hos mindst én unge/køn/kuld i 
den relevante aldersperiode, idet de samme unger anvendes på alle testdage 
til alle vurderede adfærdsformer. Målingsdagene fordeles jævnt over perioden for at definere enten den normale eller behandlingsrelaterede ændring i udviklingen af den pågældende adfærd (38). Følgende er eksem ­
pler på adfærdsformer, hvis ontogenese kan vurderes: opretningsrefleks, 
negativ geotaxis og motorisk aktivitet (38)(39)(40).
 
Motorisk aktivitet  
35. Motorisk aktivitet overvåges (41)(42)(43)(44)(45) inden fravænningen og i 
den voksne periode. Med hensyn til test på fravænningstidspunktet henvises til pkt. 32. Testsessionen skal være lang nok til at påvise ubehandlede kontroldyrs tilvænning i løbet af sessionen. Anvendelse af motorisk aktivitet 
til at vurdere individets adfærdsudvikling anbefales kraftigt. Hvis testen 
bruges som en test af adfærdsudvikling, anvendes de samme dyr til alle testsessioner før afvænning. Testen skal ske tilstrækkeligt hyppigt til at 
vurdere udviklingen i tilvænningen i løbet af sessionen (44). Dette kan 
kræve tre eller flere tidsperioder forud for og inklusive fravænningsdagen (f.eks. PND 13, 17, 21). Test af de samme dyr eller dyr fra samme kuld skal også ske i voksenalderen, tæt på undersøgelsens afslutning (f.eks. PND 
60-70). Der kan om nødvendigt foretages test på supplerende dage. Moto ­
risk aktivitet overvåges af et automatisk aktivitetsregistrerende apparat, som skal kunne afsløre både stigninger og fald i aktiviteten (dvs. at reference ­
aktiviteten som målt af apparatet ikke må være så lav, at fald ikke afsløres, 
og heller ikke så høj, at aktivitetsstigninger ikke registreres). Hvert apparat 
testes efter standardprocedurer for så vidt muligt at sikre operationens påli ­
delighed på tværs af apparater og dage. Så vidt muligt skal behandlings ­
grupperne være ligeligt fordelt på tværs af apparaterne. Hvert dyr testes 
individuelt. Behandlingsgrupper udlignes på tværs af testgange for at 
undgå sammenblanding af cirkadiske aktivitetsrytmer. Man skal bestræbe sig på at sikre, at variationer i testbetingelserne er minimale og ikke syste ­
matisk relateres til behandlingen. Blandt de variabler, der kan påvirke 
mange adfærdsmålinger, bl.a. motorisk aktivitet, er lydniveau, testburets 
størrelse og form, temperatur, relativ luftfugtighed, lysforhold, lugte, brug af eget bur eller nyt testbur og forstyrrelser fra omgivelserne.
 
Motorisk og sensorisk funktion  
36. Motorisk og sensorisk funktion undersøges i detaljer mindst én gang for 
modningsperioden og én gang i den unge voksenperiode (f.eks. PND 60- 70). Med hensyn til test på fravænningstidspunktet henvises til pkt. 32. Der 
skal foretages tilstrækkeligt mange forsøg til at sikre en passende kvantitativ 
prøvetagning af sensoriske modaliteter (f.eks. somatosensoriske, vestibu ­
lære) og motoriske funktioner (f.eks. styrke, koordination). Nogle få eksem ­
pler på test for motorisk og sensorisk funktion er træk/tryk-respons (46), 
opretningsrefleks (47)(48), auditiv startle tilvænning (40)(49)(50)(51)(52) 
(53)(54) og evokerede potentialer (55).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Indlærings- og hukommelsesforsøg  
37. En associativ indlærings- og hukommelsestest gennemføres efter fravæn ­
ning (f.eks. 25 ± 2 dage) og for unge voksne (PND 60 og derover). Med 
hensyn til forsøg på fravænningstidspunktet henvises til pkt. 32. Den samme eller (en) særskilt(e) test kan benyttes på disse to udviklingstrin. Der er mulighed for en vis fleksibilitet i valget af test for indlæring og 
hukommelse hos fravænnede og voksne rotter. Testen/-ene designes dog 
således, at de opfylder to kriterier. For det første vurderes indlæringen enten som en ændring på tværs af flere gentagne indlæringstest eller -ses ­
sioner eller i test, der omfatter et enkelt forsøg, med henvisning til en 
betingelse, som sikrer kontrol med ikkeassociative virkninger af trænings ­
eksperimentet. For det andet skal testen/-ene omfatte en vis måling af hukommelsen (kort- eller langtids-) ud over oprindelig indlæring (færdig ­
hed), men denne hukommelsesmåling kan ikke rapporteres, da der mangler 
en færdighedsmåling, der fås fra samme test. Hvis indlærings- og hukom ­
melsestesten/-ene viser en virkning af testkemikaliet, kan det overvejes at foretage supplerende test for at udelukke alternative fortolkninger baseret på ændringer i sensorisk, motivationsmæssig og/eller motorisk kapacitet. Ud 
over ovenstående to kriterier anbefales det, at indlærings- og hukommelses ­
testen vælges på grundlag af sin påviste følsomhed over for den undersøgte kemikalieklasse, hvis disse oplysninger er tilgængelige i litteraturen. I mangel af sådanne oplysninger omfatter eksempler på test, der kan fore ­
tages for at opfylde ovenstående kriterier: passiv undgåelse (43)(56)(57), 
delayed-matching-to-position for den voksne rotte (58) og for den spæde rotte (59), olfaktorisk konditionering (43)(60), Morris' vandlabyrint (61)(62)(63), Biel- eller Cincinnati-labyrinten (64)(65), radialarmslabyrint 
(66), T-labyrint (43) og tilegnelse og fastholdelse af ‘schedule-controlled’ 
adfærd (26)(67)(68). Supplerende test beskrives i litteraturen for fravænnede (26)(27) og voksne rotter (19)(20).
 
Obduktion  
38. Moderdyr kan aflives efter fravænning af afkommet.  
39. Den neuropatologiske vurdering af afkommet sker ved hjælp af væv fra dyr, 
der er aflivet på en human måde på PND 22 eller på et tidligere tidspunkt mellem PND 11 og PND 22 samt ved testens afslutning. For afkom aflivet 
efter PND 22 vurderes hjernevæv. For dyr aflivet ved testens afslutning 
vurderes væv fra både centralnervesystemet (CNS) og det perifere nervesystem (PNS). Dyr aflivet på PND 22 eller tidligere kan fikseres ved enten immersion eller perfusion. Dyr aflivet ved testens afslutning 
fikseres ved perfusion. I forbindelse med alle aspekter af præpareringen 
af vævsprøver, fra perfusion af dyrene over dissektion af vævsprøver, vævs ­
behandling og farvning på objektglas følges et afbalanceret design, således at hver batch indeholder repræsentative prøver fra hver dosisgruppe. 
OECD's vejledning nr. 20 (9) indeholder supplerende vejledning om neuro ­
patologiske undersøgelser. Se endvidere (103).
 
Behandling af vævsprøver  
40. Alle større abnormiteter, der er synlige på obduktionstidspunktet noteres. 
Udtagne vævsprøver skal repræsentere alle større dele af nervesystemet. Vævsprøverne præserveres i et egnet fiksativ og behandles ifølge standar ­
diserede offentliggjorte histologiske protokoller (69)(70)(71) (103). Paraffin ­
fiksering er acceptabelt for væv fra CNS og PNS, men osmium ved post ­
fiksering sammen med epoxyfiksering kan være hensigtsmæssigt, når der
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
kræves en højere adskillelsesgrad (f.eks. for perifere nerver ved mistanke 
om perifer neuropati og/eller til morfometrisk analyse af perifere nerver). 
Hjernevæv udtaget til morfometrisk analyse fikseres i egnede medier ved alle dosisniveauer samtidig for at undgå skrumpning, der kan optræde i forbindelse med langvarig opbevaring i fiksativ (6).
 
Neuropatologisk undersøgelse  
41. Formålet med den kvalitative undersøgelse er:  
i) at identificere områder i nervesystemet, der viser tegn på neuropatolo ­
giske forandringer  
ii) at identificere typer af neuropatologiske forandringer, der følger af 
eksponering for testkemikaliet  
iii) at bestemme de neuropatologiske forandringers sværhedsgrader.  
Repræsentative histologiske snit af vævsprøver undersøges i mikroskop af 
en uddannet patolog for tegn på neuropatologiske forandringer. Alle neuro ­
patologiske forandringer tildeles en subjektiv sværhedsgrad. En 
hematoxylin-eosin-farvning kan være tilstrækkelig til at vurdere hjernesnit af dyr, der er aflivet humant på PND 22 eller tidligere. En myelinfarvning (f.eks. luxol fast blue/cresyl violet) og en sølvfarvning (f.eks. Bielschow ­
skys eller Bodians farvestoffer) anbefales til snit af CNS- og PNS-væv fra 
dyr aflivet ved testens afslutning. Med forbehold for patologens faglige vurdering og typen af observerede forandringer kan andre farver findes egnede til at identificere og karakterisere særlige typer af forandringer 
(f.eks. gliafibrillært surt protein (GFAP) eller lektin histokemi til at 
vurdere glia- og mikrogliaforandringer (72), fluoro-jade til at afsløre nekrose (73)(74) eller sølvfarve specifikt til neural degeneration (75)).
 
42. En morfometrisk (kvantitativ) vurdering udføres, da disse data kan bidrage 
til at detektere en behandlingsrelateret virkning og er værdifulde i fortolk ­
ningen af behandlingsrelaterede forskelle i hjernevægt eller morfologi (76)(77). Nervevæv udtages og præpareres med henblik på morfometrisk vurdering. Morfometriske vurderinger kan omfatte f.eks. lineære målinger 
eller arealmålinger af særlige hjerneområder (78). Lineære målinger eller 
arealmålinger kræver brug af homologe snit, der er omhyggeligt udvalgt på grundlag af pålidelige mikroskopiske kendetegn (6). Stereologi kan anvendes til at identificere behandlingsrelaterede virkninger på parametre 
såsom volumen eller celleantal til bestemte neuroanatomiske områder 
(79)(80)(81)(82)(83)(84).
 
43. Hjernerne undersøges for evt. tegn på behandlingsrelaterede neuropatolo ­
giske forandringer, og der udtages passende prøver fra alle større dele af hjernen (f.eks. bulbus olfactorius, cortex cerebralis, hippocampus, basal ­
ganglier, thalamus, hypothalamus, midterhjernen (tectum, tegmentum og 
pedunculus cerebri), pons, medulla oblongata, cerebellum) for at sikre en grundig undersøgelse. Det er vigtigt, at snit for alle dyr tages i samme plan. Hos voksne, der er humant aflivet ved undersøgelsens afslutning, udtages 
repræsentative snitprøver af rygmarven og PNS. De undersøgte områder 
skal omfatte øjet med nervus opticus og retina, rygmarven med intumes ­
centia cervicalis og lumbalis, fibre fra de dorsale og ventrale rødder, den proksimale del af nervus sciaticus, den proksimale del af nervus tibialis (ved 
knæet) og lægmuskelgrenene af nervus tibialis. Der skal være både tværsnit 
og længdesnit af rygmarv og perifere nerver.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Den neuropatologiske evaluering skal omfatte en undersøgelse for tegn på 
udviklingsskader på nervesystemet (6)(85)(86)(87)(88)(89) ud over cellefor ­
andringer (f.eks. neuronal vakuolation, degeneration, nekrose) og vævsfor ­
andringer (f.eks. gliosis, leukocytinfiltration, cystedannelse). I den forbin ­
delse er det vigtigt at skelne behandlingsrelaterede virkninger fra normale 
udviklingshændelser, som man ved, opstår på et udviklingstrin svarende til 
aflivningstidspunktet (90). Eksempler på væsentlige forandringer, der peger på udviklingsskade, omfatter, men er ikke begrænset til:
 
— forandringer i den makroskopisk synlige størrelse eller form af bulbus 
olfactorius, cerebrum eller cerebellum  
— forandringer i forskellige hjerneområders relative størrelse, bl.a. fald 
eller stigninger i områdestørrelse som følge af tab eller persistens af 
normalt transiente cellepopulationer eller axonale projektioner (f.eks. 
eksternt germinallag på cerebellum, corpus callosum)  
— forandringer i proliferation, migration og differentiation, som viser sig 
ved områder med stærk apoptose eller nekrose, klynger eller spredte 
populationer af ektopiske, desorienterede eller misdannede neuroner eller forandringer i forskellige cortikale strukturlags relative størrelse
 
— forandringer i myeliniseringsmønstre, herunder en samlet størrelses ­
reduktion eller ændret farvning af myelinerede strukturer  
— tegn på hydrocephalus, især udvidelse af ventrikler, stenosis af 
aqueductus cerebri og tyndere cerebralhemisfærer.  
Analyse af neuropatologiske forandringers dosis-responssammenhæng  
45. Følgende trinvise procedure anbefales til kvalitative og kvantitative neuro ­
patologiske analyser. Først sammenlignes snit fra højdosisgrupper med snit 
fra kontrolgruppen. Hvis der ikke findes tegn på neuropatologiske 
forandringer i dyrene fra højdosisgruppen, kræves der ingen yderligere analyse. Findes der tegn på neuropatologiske forandringer i højdosisgrup ­
pen, undersøges dyr fra mellem- og lavdosisgrupperne. Hvis højdosis ­
gruppen afsluttes på grund af død eller anden konfunderet toksicitet, 
analyseres høj- og mellemdosisgrupperne for neuropatologiske forandringer. Er der tegn på neurotoksicitet i lavere dosisgrupper, udføres en neuropato ­
logisk analyse i de pågældende grupper. Såfremt der findes behandlings ­
relaterede neuropatologiske forandringer ved den kvalitative og kvantitative undersøgelse, bestemmes dosisafhængigheden for forekomst, frekvens og læsionernes eller de morfometriske forandringers sværhedsgrad på grundlag 
af en vurdering af alle dyr fra alle dosisgrupper. Alle hjerneområder, der 
udviser tegn på neuropatologisk forandring medtages i denne vurdering. For hver læsionstype beskrives de kendetegn, som anvendes til at definere hver sværhedsgrad, med angivelse af de symptomer, der er benyttet til at diffe ­
rentiere hver grad. Frekvensen af hver læsionstype og sværhedsgraden heraf 
registreres, og der udføres en statistisk analyse for at evaluere arten af en dosis-responssammenhæng. Det anbefales at anvende kodede objektglas (91).
 
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
46. Data rapporteres individuelt og opsummeres i tabelform, der for hver test ­
gruppe viser typer af forandringer og antal moderdyr, afkom efter køn samt kuld og med angivelse af hver type forandring. Er der foretaget direkte 
postnatal eksponering af afkom, rapporteres eksponeringsvej, -varighed og 
-periode.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Evaluering og fortolkning af resultater  
47. En udviklingsneurotoksicitetsundersøgelse skal indeholde oplysninger om 
virkningerne af gentagen eksponering for et kemikalie i in utero- og den 
tidlige postnatale udvikling. Da vægten ligger på endepunkter for både generel toksicitet og udviklingsneurotoksicitet, vil resultaterne af undersø ­
gelsen gøre det muligt at skelne mellem neuroudviklingsmæssige virknin ­
ger, som opstår uden generel maternel toksicitet, og dem, der kun kommer 
til udtryk på niveauer, som også er toksiske for moderdyret. På grund af det komplekse samspil mellem undersøgelsesdesign, statistisk analyse og dataenes biologiske signifikans, kræver en adækvat fortolkning af udvik ­
lingsneurotoksicitetsdata en ekspertvurdering (107)(109). Ved fortolkning af 
testresultater følges en ‘weight-of-evidence’-tilgang (20)(92)(93)(94). Evt. mønstre i adfærdsmæssige eller morfologiske resultater samt tegn på dosis ­
respons diskuteres. Data fra alle undersøgelser af relevans for evalueringen 
af udviklingsneurotoksicitet, bl.a. humanepidemiologiske undersøgelser eller 
caserapporter og eksperimentelle dyreunderstudier (f.eks. toksikokinetiske data, oplysninger om struktur/aktivitet, data fra andre toksicitetsundersøgel ­
ser) medtages i denne karakterisering. Dette omfatter forholdet mellem 
doser af testkemikaliet og tilstedeværelse eller mangel, incidens og 
omfang af en evt. neurotoksisk virkning for hvert køn (20)(95).
 
48. Evalueringen af data skal indeholde en diskussion af både biologisk og 
statistisk signifikans. Statistisk analyse skal ses som et værktøj, der 
guider snarere end bestemmer fortolkningen af data. Manglende statistisk 
signifikans må ikke være det eneste rationale for at konkludere, at der mangler en behandlingsrelateret virkning, ligesom statistisk signifikans 
ikke må være den eneste begrundelse for at konkludere, at der foreligger 
en behandlingsrelateret virkning. For at sikre mod mulige falsk negative fund og de iboende vanskeligheder med at »bevise et negativt fund« skal tilgængelige positive og tidligere kontroldata diskuteres, især når der ikke er 
nogen behandlingsrelaterede virkninger (102)(106). Sandsynligheden for 
falsk positive fund diskuteres i lyset af den samlede statistiske evaluering af dataene (96). Evalueringen skal indeholde en evt. sammenhæng mellem observerede neuropatologiske og adfærdsmæssige forandringer.
 
49. Alle resultater analyseres ved hjælp af statistiske modeller, som egner sig til 
testens design (108). Valget af en parametrisk eller ikkeparametrisk analyse begrundes ved inddragelse af faktorer såsom dataenes art (transformerede eller ej) og fordelingen heraf samt den valgte statistiske analyses relative 
robusthed. Undersøgelsens formål og design skal være styrende for valget 
af statistiske analyser for at minimere type I-fejl (falsk positive) og type II-fejl (falsk negative) (96)(97)(104)(105). Udviklingsundersøgelser med arter, som føder flere unger på én gang, og hvor der testes mange unger 
pr. kuld, skal inkludere kuldet i den statistiske model for at sikre mod en 
oppustet type I-fejlhyppighed (98)(99)(100)(101). Den statistiske måleenhed er kuldet og ikke ungen. Forsøgene designes, så dyr fra samme kuld ikke behandles som uafhængige observationer. Et evt. endepunkt, som gentagne 
gange måles hos det samme individ, analyseres under anvendelse af 
statistiske modeller, der tager højde for, at målingerne ikke er uafhængige.
 
Testrapport  
50. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Testkemikaliet  
— fysisk form og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber  
— identifikationsdata, herunder kilde  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— præparatets renhed og kendte og/eller forventede urenheder  
Evt. vehikel  
— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand eller fysiologisk 
saltvand.  
Forsøgsdyr  
— den anvendte art og stamme samt begrundelse for anvendelse af andet 
end rotter  
— leverandør af forsøgsdyr  
— antal dyr samt deres køn og alder ved testens begyndelse  
— oprindelse, miljøbetingelser, kost, vand osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse.  
Testbetingelser  
— rationale for valg af dosisniveau  
— rationale for doseringsvej og tidsperiode  
— specifikationer af indgivne doser, herunder oplysninger om vehikel og 
det indgivne stofs volumen og fysiske form  
— oplysninger om formuleringen af testkemikalie/fodertilberedning, opnået 
koncentration, tilberedningens stabilitet og homogenitet  
— anvendt metode til entydig identifikation af moderdyr og afkom  
— en detaljeret beskrivelse af de(n) randomiseringsprocedure(r), der er 
fulgt ved fordeling af moderdyr på behandlingsgrupper, udvælgelse af 
unger til aflivning og fordeling af unger til testgrupper  
— oplysninger om indgift af testkemikaliet  
— evt. omregning fra testkemikaliekoncentration (ppm) i foder/drikkevand 
eller inhalation til opnået dosis (mg/kg kropsvægt/dag)  
— miljøbetingelser  
— oplysninger om kvaliteten af foder og vand (f.eks. fra vandhanen, destil ­
leret)  
— datoer for undersøgelsens begyndelse og afslutning.  
Observationer og testprocedurer  
— en detaljeret beskrivelse af procedurer anvendt til at standardisere obser ­
vationer og procedurer samt operationelle definitioner for bedømmelse 
af observationer  
— en liste over alle anvendte testprocedurer og begrundelse for anven ­
delsen heraf  
— oplysninger om de anvendte adfærdsmæssige/funktionelle, patologiske, 
neurokemiske eller elektrofysiologiske procedurer, herunder oplysninger 
og detaljer om automatiserede anordninger  
— procedurer til kalibrering og sikring af anordningernes ækvivalens og 
afbalancering af behandlingsgrupper i testprocedurer  
— en kort begrundelse for evt. beslutninger baseret på faglig vurdering.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Resultater (individuelle og resumé, herunder middeltal og varians, når det 
er relevant)  
— antal dyr ved undersøgelsens begyndelse og antal ved undersøgelsens 
afslutning  
— antal dyr og kuld anvendt til hver testmetode  
— identifikationsnummer for hvert dyr og hvert kuld, det kom fra  
— kuldstørrelse og gennemsnitsvægt ved fødslen fordelt på køn  
— data om kropsvægt og kropsvægtændringer, herunder slutvægt, for 
moderdyr og afkom  
— evt. data om føde- og vandindtagelse (f.eks. hvis testkemikaliet indgives 
i vand)  
— data for toksiske reaktioner efter køn og dosisniveau, herunder tegn på 
toksicitet eller mortalitet, bl.a. evt. tidspunkt og dødsårsag  
— de detaljerede kliniske observationers art, grad, varighed, startdato og 
klokkeslæt samt efterfølgende forløb  
— scoreværdi for hvert udviklingskendetegn (vægt, kønsmodning og 
adfærdsudvikling) på hvert observationstidspunkt  
— en detaljeret beskrivelse af alle adfærdsmæssige, funktionelle, neuropa ­
tologiske, neurokemiske og elektrofysiologiske fund efter køn, herunder både stigninger og fald i forhold til kontrolgrupper
 
— obduktionsfund  
— hjernevægt  
— evt. diagnoser udledt af neurologiske tegn og læsioner, herunder natur ­
ligt forekommende sygdomme eller tilstande  
— billeder af eksemplariske fund  
— ‘low-power’-billeder til at vurdere homologien af snit anvendt til morfo ­
metri  
— data om absorption and metabolisme, herunder evt. supplerende data fra 
en separat toksikokinetisk undersøgelse  
— statistisk behandling af resultater, herunder statistiske modeller anvendt 
til analyse af data og resultater, uanset om de var signifikante eller ej  
— liste over forsøgsmedarbejdere, bl.a. uddannelse.  
Diskussion af resultater  
— oplysninger om dosisrespons fordelt på køn og gruppe  
— evt. andre toksiske virkningers sammenhæng med en konklusion 
vedrørende testkemikaliets neurotoksiske potentiale fordelt på køn og gruppe
 
— evt. toksikokinetiske oplysningers indvirkninger på konklusionerne  
— virkningernes ligheder med kendte neurotoksiske stoffer  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— data, der støtter testmetodens pålidelighed og følsomhed (dvs. positive 
og tidligere kontroldata)  
— evt. sammenhæng mellem neuropatologiske og funktionelle virkninger  
— NOAEL eller benchmarkdosis for moderdyr og afkom fordelt på køn og 
gruppe.  
Konklusioner  
— en diskussion af den samlede fortolkning af data baseret på resultater, 
herunder en konklusion om, hvorvidt testkemikaliet forårsagede udvik ­
lingsneurotoksicitet og NOAEL.  
LITTERATUR  
1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. København, Danmark, 13.- 
14. juni 1995.  
2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. 
US EPA 712-C-98-239. Tilgængelig på: [http://www.epa.gov/opptsfrs/ 
OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].  
3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Tilgængelig på: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordis ­
play.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].  
4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize devel ­
opmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral 
effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.  
5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001) Methods to identify and characterize developmental 
neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.
 
6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize devel ­
opmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93-100.  
7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., USA, 23.- 
25. oktober 2000.  
8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Paris, juli 2008. Tilgængelig på: [http://search.oecd.org/officialdo ­
cuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].
 
9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity 
Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, september 2003. Tilgæn ­
gelig på: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_ 1916054_1_1_1_1,00.html].
 
10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990). Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.
 
11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002). Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.  
13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998). Handbook of Developmental Neuro ­
toxicology, 1  st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
14) Kapitel B.34 i dette bilag, Reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én 
generation.  
15) Kapitel B.35 i dette bilag, Reproduktionstoksicitetsundersøgelse i to 
generationer.  
16) Kapitel B.43 i dette bilag, Neurotoksicitetsundersøgelse i gnavere.  
17) Kapitel B.31 i dette bilag, Prænatal udviklingstoksicitetsundersøgelse.  
18) Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 
2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. 
EUT L 276 af 20.10.2010, s. 33.  
19) WHO (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Tilgængelig på: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm].
 
20) WHO (2001). Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Prin ­
ciples and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World 
Health Organization Publications, Genève. Tilgængelig på: [http://www.in ­
tox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].  
21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995). Neurotoxicology: Approaches and 
Methods, 1  st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997). Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19:499-509.  
23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997). The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.  
24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977). Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110-112.  
25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989). Implementation of a 
primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.
 
26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979). Ontogeny of Learning and Memory. 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987). 
Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.
 
28) Zoetis, T., Walls, I. (2003). Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, 
Washington, DC.  
29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005). Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.  
30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999). Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.  
31) ICH (1993). ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity 
to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use.
 
32) Lochry, E.A. (1987). Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998). Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.
 
34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999). Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.
 
35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000). Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, 
but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.
 
36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985). Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.
 
37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977). Preputial sepa ­
ration as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.
 
38) Spear, L.P. (1990). Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.  
39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975). Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.  
40) Adams, J. (1986). Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of 
Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, s. 67-100.
 
41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979). Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.  
42) Robbins, T.W. (1977). A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
New York, s. 37-82.
 
43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993). Developmental neuro ­
toxicity following neonatal exposure to 3,3 ′-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.  
44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985). Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.  
45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991). Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.
 
46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997). 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405-411.  
47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998). A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals. 
Physiol. Behav., 64:661-669.  
48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977). A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589-591.  
49) Davis, M. (1984). The mammalian startle response. In: Neural Mecha ­
nisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, 
s. 287-351  
50) Koch, M. (1999). The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107- 
128. 
51) Crofton, K.M. (1992). Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In TARGET Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, 
Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, s. 181-211.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989). Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199-211.  
53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994). Solvent-induced ototo ­
xicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25-30.
 
54) Ison, J.R. (1984). Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437-445.  
55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992). Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. In: TARGET Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. s. 125-145.  
56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990). Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3 ′-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105:321-332.  
57) Bammer, G. (1982). Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.
 
58) Bushnell, P.J. (1988). Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237-244.  
59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989). Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.  
60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984). Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465-479.  
61) Morris, R. (1984). Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.  
62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989). The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.  
63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001). Applications of the Morris water 
maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.  
64) Vorhees, C.V. (1987). Maze learning in rats: A comparison of perfor ­
mance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.
 
65) Vorhees, C.V. (1997). Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.  
66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988). Impaired Biel 
and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.
 
67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983). Delayed behavioral toxi ­
city of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Phar ­
macol., 71:342-352.  
68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981). Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.  
69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000). Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 
122-131.  
70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994). Laboratory 
Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, s. 84-107.  
71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002). Theory and Practice of Histological 
Techniques, 5  th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996). Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.
 
73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000). Fluoro-Jade B: A high affinity 
tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123- 130.
 
74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001). 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365-372.  
75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994). 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and 
physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.
 
76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Vralten-Besrenden, I.D.H., Ligander, M.M., Gundersen, H.J. (2005a). Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing 
on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.
 
77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Vralten-Besrenden, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, 
H.J. (2005b). 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after 
prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.
 
78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979). Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 
1:129-135.  
79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998). Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.
 
80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998). Stereology: A prac ­
tical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305- 
310. 
81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993). Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.  
82) Schmitz, C. (1997). Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.  
83) West, M.J. (1999). Stereological methods for estimating the total number 
of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 
22:51-61.  
84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005). Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813-831.  
85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994). Patterns of 
growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.
 
86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995). Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294-298.  
87) Jensen KF, Catalano SM. (1998). Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slik ­
ker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3-41.  
88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999). Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70-74.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000). Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056-1060.
 
90) Friede, R. L. (1989). Developmental Neuropathology. Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin.  
91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992). Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.
 
92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996). Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.  
93) US EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A.  
94) US EPA (1996). Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274-56322.  
95) Miljøstyrelsen (1995). Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodo ­
logy, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Øster ­
gaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5:113-126.  
97) Gad, S.C. (1989). Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 
08:21-27.  
98) Abby, H., Howard, E. (1973). Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.  
99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975). Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165-172.  
100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992). Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221-228.  
101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985). Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.
 
102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004). A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.
 
103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc 
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006). A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 
34:296-313.
 
104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992). The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.
 
105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985). Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.
 
106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008). Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. 
Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.
 
107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008). Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology 
and Teratology, 30(4):288-325.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008). Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.
 
109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008). Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Figur 1  
Generel forsøgsplan for funktionelle/adfærdsmæssige test, neuropatologisk evaluering og 
hjernevægt. Dette diagram er baseret på beskrivelsen i pkt. 13-15 (PND = postnatal day, 
dag 0 efter fødslen). Eksempler på fordeling af dyr er anført i tillæg 1.
  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Tillæg 1  
1. Eksempler på mulige fordelinger er beskrevet og opstillet i tabelform neden ­
for. Disse eksempler er anført for at illustrere, at fordelingen af forsøgsdyr 
til forskellige forsøgsparadigmer kan foretages på flere forskellige måder.  
Eksempel 1  
2. En gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) 
bruges til test vedrørende adfærdsudvikling før fravænning. Af disse dyr aflives 10 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) humant på PND 22. Hjernerne fjernes, vejes og præpareres til histopatologisk 
undersøgelse. Endvidere indsamles data om hjernevægt under anvendelse 
af ufikserede hjerner fra de resterende 10 hanner og 10 hunner pr. dosisniveau.
 
3. En anden gruppe på 20 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. 
kuld) bruges til funktionelle/adfærdsmæssige test efter fravænning (detalje ­
rede kliniske observationer, motorisk aktivitet, auditiv startle og kognitive 
funktionsforsøg hos unge voksne) og vurdering af alder ved kønsmodning. Af disse dyr bedøves 10 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) og fikseres via perfusion ved undersøgelsens afslutning (ca. PND 70). 
Efter supplerende fiksering in situ fjernes hjernen og præpareres til neuro ­
patologisk undersøgelse.
 
4. Til kognitive funktionstest med unge voksne (f.eks. PND 60-70) anvendes 
en tredje gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld). Af disse dyr aflives 10 dyr/køn/gruppe (én han eller én hun pr. kuld) ved undersøgelsens afslutning, og hjernen fjernes og vejes.
 
5. De resterende 20 dyr/køn/gruppe udtages til evt. supplerende test.  
Tabel 1  
Unge nr. (  a ) 
Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test 
m f  
1 5 20 m + 20 f Adfærdsudvikling 
10 m + 10 f PND 22 hjernevægt/neuropato ­
logi/morfometri 
10 m + 10 f PND 22 hjernevægt 
2 6 20 m + 20 f Detaljerede kliniske observa ­
tioner 
20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Kønsmodning 
20 m + 20 f Motorisk og sensorisk funktion 
20 m + 20 f Indlæring og hukommelse (PND 
25) 
10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt/neuro ­
patologi/morfometri ~ PND 70
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Unge nr. (  a ) 
Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test 
m f  
3 7 20 m + 20 f Indlæring og hukommelse (unge 
voksne) 
10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt ~ PND 
70 
4 8 — Reservedyr til udskiftninger 
eller supplerende test  
( a ) Til dette eksempel reduceres kuldene ved aflivning til fire hanner og fire hunner. 
Hanunger nummereres fra 1 til 4, hununger fra 5 til 8.  
Eksempel 2  
6. En gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) 
bruges til test vedrørende adfærdsudvikling før fravænning. Af disse dyr aflives 10 unger/køn/dosisniveau (én han eller én hun pr. kuld) humant på PND 11. Hjernerne fjernes, vejes og præpareres til histopatologisk under ­
søgelse.
 
7. En anden gruppe på 20 dyr/køn/dosisniveau (én han og én hun pr. kuld) 
bruges til undersøgelser efter fravænning (detaljerede kliniske observationer, 
motorisk aktivitet, vurdering af alder ved kønsmodning samt motorisk og sensorisk funktion). Af disse dyr bedøves 10 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) og fikseres via perfusion ved undersøgelsens 
afslutning (ca. PND 70). Efter supplerende fiksering in situ fjernes hjernen, 
vejes og præpareres til neuropatologisk undersøgelse.
 
8. Til kognitive funktionstest med unge og unge voksne anvendes 10 unger/ 
køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld). Der anvendes forskel ­
lige dyr til forsøg med kognitive funktionstest på PND 23 og unge voksne. Ved afslutningen aflives de 10 dyr/køn/gruppe, der er testet som voksne, 
hjernen fjernes og vejes.
 
9. De resterende 20 dyr/køn/gruppe, der ikke er udvalgt til forsøg, aflives og 
kasseres ved fravænning.  
Tabel 2.  
Unge nr. (  a ) 
Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test 
m f  
1 5 20 m + 20 f Adfærdsontogenese 
10 m + 10 f PND 11 hjernevægt/neuropato ­
logi/morfometri 
2 6 20 m + 20 f Detaljerede kliniske observa ­
tioner 
20 m + 20 f Motorisk aktivitet 
20 m + 20 f Kønsmodning 20 m + 20 f Motorisk og sensorisk funktion 
10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt/neuro ­
patologi/morfometri ~ PND 70
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Unge nr. (  a ) 
Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test 
m f  
3 7 10 m + 10 f (  b ) Indlæring og hukommelse (PND 
23) 
3 7 10 m + 10 f (  b ) Indlæring og hukommelse (unge 
voksne) 
Ung voksen hjernevægt 
4 8 — Dyr aflives og kasseres PND 21.  
( a ) Til dette eksempel reduceres kuldene ved aflivning til fire hanner og fire hunner. 
Hanunger nummereres fra 1 til 4, hununger fra 5 til 8. 
( b ) Forskellige unger bruges til kognitive test på PND 23 og unge voksne (f.eks. lige/ 
ulige kuld fra i alt 20).  
Eksempel 3  
10. En gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) 
bruges til hjernevejning og neuropatologisk undersøgelse på PND 11. Af 
disse dyr aflives 10 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. 
kuld) humant på PND 11, og hjerner fjernes, vejes og præpareres til histop ­
atologisk undersøgelse. Endvidere indsamles data om hjernevægt under anvendelse af ufikserede hjerner fra de resterende 10 hanner og 10 
hunner pr. dosisniveau.
 
11. En anden gruppe på 20 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. 
kuld) bruges til adfærdsontogenese (motorisk aktivitet) undersøgelser efter fravænning (motorisk aktivitet og vurdering af alder ved kønsmodning) 
samt kognitive funktionstest med unge
 
12. Endnu en gruppe på 20 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. 
kuld) bruges til motoriske og sensoriske funktionstest (auditiv startle) og detaljerede kliniske observationer. Af disse dyr bedøves 10 dyr/køn/dosis ­
niveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) og fikseres via perfusion ved 
undersøgelsens afslutning (ca. PND 70). Efter supplerende fiksering in situ fjernes hjernen, vejes og præpareres til neuropatologisk undersøgelse.
 
13. En anden gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau anvendes til kognitive funk ­
tionstest med unge voksne (dvs. én han og én hun pr. kuld). Af disse dyr 
aflives 10 dyr/køn/gruppe (dvs. én han eller én hun pr. kuld) ved undersø ­
gelsens afslutning, og hjernen fjernes og vejes.  
Tabel 3  
Unge nr. (  a ) 
Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test 
m f  
1 5 10 m + 10 f PND 11 hjernevægt/neuropato ­
logi/morfometri 
10 m + 10 f PND 11 hjernevægt 
2 6 20 m + 20 f Adfærdsontogenese (motorisk 
aktivitet) 
20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Kønsmodning 
20 m + 20 f Indlæring og hukommelse (PND 
27)
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Unge nr. (  a ) 
Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test 
m f  
3 7 20 m + 20 f Auditiv startle (unge og unge 
voksne) 
20 m + 20 f Detaljerede kliniske observa ­
tioner 
10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt/neuro ­
patologi/morfometri ~ PND 70 
4 8 20 m + 20 f Indlæring og hukommelse (unge 
voksne) 
10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt  
( a ) Til dette eksempel reduceres kuldene ved aflivning til fire hanner og fire hunner. 
Hanunger nummereres fra 1 til 4, hununger fra 5 til 8.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Tillæg 2  
Definitioner  
Kemikalie: et stof eller en blanding.  
Testkemikalie: et stof eller en blanding, som testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  UTERUSTESTEN I GNAVERE: EN KORTTIDSSCREENINGTEST 
FOR ØSTROGENECITET  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD-testvejledningen (TG) 440 (2007). 
OECD indledte en højt prioriteret aktivitet i 1998 med at revidere eksiste ­
rende vejledninger og udvikle nye vejledninger for screening og test af potentielt hormonforstyrrende stoffer (1). Ét element i denne aktivitet var 
at udvikle en testvejledning for det uterotrofiske bioassay med gnavere. Det 
uterotrofiske bioassay med gnavere blev herefter underkastet et omfattende valideringsprogram, herunder udarbejdelse af et detaljeret background docu ­
ment (2)(3) og gennemførelse af omfattende intra- og interlaboratorieunder ­
søgelser for at vise bioassayets relevans og reproducerbarhed med et potent 
referenceøstrogen, en stærk østrogenreceptoragonist og et negativt referen ­
cekemikalie (4)(5)(6)(7)(8)(9). Denne testmetode B.54 bygger på erfarin ­
gerne fra valideringstestprogrammet og de derved opnåede resultater med 
østrogenagonister.
 
2. Det uterotrofiske bioassay er en korttidsscreeningtest, der havde sin oprin ­
delse i 1930'erne (27)(28) og først blev standardiseret til screening af et ekspertudvalg i 1962 (32)(35). Det er baseret på forøgelsen af uterusvægt 
eller uterotrofisk respons (se gennemgang i 29). Det evaluerer et kemikalies 
evne til at fremkalde biologiske aktiviteter i overensstemmelse med agoni ­
ster eller antagonister i naturlige østrogener (f.eks. 17ß-estradiol). Det bruges dog langt mindre til påvisning af antagonister end af agonister. Uterus 
reagerer på østrogener på to måder. En første reaktion er en vægtforøgelse 
på grund af vandimbibition. Denne reaktion efterfølges af vægtforøgelse på grund af vævsvækst (30). Uterusreaktioner hos rotter og mus er kvalitativt sammenlignelige.
 
3. Dette bioassay tjener som et in vivo-screeningassay, og anvendelsen heraf 
skal ses i forbindelse med ‘OECD Conceptual Framework for the Testing 
and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals’ (tillæg 2). I denne konceptramme ligger det uterotrofiske bioassay på niveau 3 som et in 
vivo-assay, der giver data om en enkelt endokrin mekanisme, nemlig 
østrogenicitet.
 
4. Det uterotrofiske bioassay er beregnet til at blive inkluderet i en række in 
vitro- og in vivo-test med henblik på at afdække kemikalier med potentiale til at interagere med det endokrine system, så man i sidste ende kan foretage 
vurderinger af risici for menneskers sundhed og miljøet. OECD's valide ­
ringsprogram anvendte både stærke og svage østrogenagonister til at vurdere, hvor effektivt assayet kan identificere østrogene kemikalier (4)(5)(6)(7)(8). Derved blev testprocedurens følsomhed over for østrogena ­
gonister påvist ud over en god reproducerbarhed i og mellem laboratorier.
 
5. Med hensyn til negative kemikalier blev der kun medtaget ét »negativt« 
referencekemikalie, der allerede var rapporteret negativt ved uterotrofisk assay samt in vitro-receptorbinding og receptorassays i valideringsprogram ­
met, men supplerende testdata, som ikke vedrørte OECD-valideringspro ­
grammet, er blevet evalueret og har yderligere underbygget specificiteten 
af det uterotrofiske bioassay til screening for østrogenagonister (16).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER  
6. Østrogenagonister og -antagonister fungerer som ligander for østrogenrecep ­
torer a og b og kan henholdsvis aktivere eller hæmme receptorernes trans ­
kriptionsaktivitet. Dette kan potentielt føre til sundhedsrisici, herunder skadevirkninger for reproduktion og udvikling. Derfor er der behov for hurtigt at kunne vurdere og evaluere et kemikalie som en mulig østrogena ­
gonist eller -antagonist. Selv om en ligands affinitet for en østrogenreceptor 
eller transkriptionsaktivering af reportergener in vitro er informativ, er det kun en af flere determinanter for mulig fare. Andre determinanter kan omfatte metabolisk aktivering og deaktivering ved optagelse i kroppen, 
fordeling til målvæv og clearance fra kroppen, i hvert fald delvis afhængigt 
af indgiftsvejen og det kemikalie, der testes. Dette medfører behov for at screene et kemikalies mulige aktivitet in vivo under relevante betingelser, medmindre kemikaliets kendetegn vedrørende Absorption — Distribution — 
Metabolisme — Eliminering (ADME) allerede giver tilstrækkelig infor ­
mation. Uterusvæv reagerer med hurtig og kraftig vækst på stimulering med østrogener, især hos forsøgsgnavere, hvor brunstcyklussen varer ca. fire dage. Gnaverarter, navnlig rotten, anvendes også bredt i toksicitets ­
undersøgelser til risikobeskrivelse. Derfor er gnaverens uterus et egnet 
målorgan for in vivo-screening af østrogenagonister og -antagonister.
 
7. Denne testmetode er baseret på de protokoller, der blev anvendt i OECD's 
valideringsundersøgelse, og som har vist sig at være pålidelige og repeter ­
bare i intra- og interlaboratorieundersøgelser (5)(7). I øjeblikket findes der to metoder, nemlig den ovariektomiserede metode for voksne hunner (OVX- voksen-metode) og den ikkekønsmodne ikkeovariektomiserede metode (den 
ikkekønsmodne metode). Det blev påvist i OECD-valideringstestprogram ­
met, at begge metoder har sammenlignelig følsomhed og reproducerbarhed. Da den ikkekønsmodne metode har en intakt HPG-akse (hypotalamus-hypo ­
fyse-gonade) er den dog noget mindre specifik, men dækker et bredere 
undersøgelsesområde end det ovariektomiserede dyr, fordi den kan reagere 
på kemikalier, der interagerer med HPG-aksen i stedet for blot østrogenre ­
ceptoren. Rottens HGP-akse er funktionel omkring 15-dages alderen. Før kan puberteten ikke fremskyndes med behandlinger som GnRH. Da hunner 
begynder at komme i puberteten før åbningen af vagina, vil hunnen have 
flere stille cyklusser, der ikke fører til vaginalåbning eller ovulation, men der er visse hormonale svingninger. Hvis et kemikalie stimulerer HPG-aksen direkte eller indirekte, medfører det for tidligt indtrædende pubertet, tidlig 
ovulation og fremskyndet vaginalåbning. Det er ikke kun kemikalier, der 
påvirker HPG-aksen, som gør dette, men nogle former for foder med højere niveauer af omsættelig energi end andre vil stimulere vækst og fremskynde vaginalåbning uden at være østrogene. Sådanne kemikalier vil ikke frem ­
kalde en uterotrofisk reaktion ved OVX på voksne dyr, da deres HPG-akse 
ikke fungerer.
 
8. Af hensyn til dyrevelfærden foretrækkes metoden med ikkekønsmodne 
rotter, da man undgår kirurgisk forbehandling af dyrene og også undgår, 
at dyr, som ser ud til at være ved at gå i brunst, evt. ikke anvendes (se pkt. 
30). ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Den uterotrofiske respons har ikke udelukkende østrogen oprindelse, dvs. at 
andre kemikalier end østrogenagonister og -antagonister også kan give en 
reaktion. F.eks. kan relativt høje doser af progesteron, testosteron eller forskellige syntetiske progestiner alle føre til en stimulerende reaktion (30). En evt. reaktion kan analyseres histologisk for keratinisering og forhor ­
ning af vagina (30). Uanset reaktionens mulige oprindelse bør et positivt 
udfald af et uterotrofisk bioassay normalt give anledning til handling med henblik på yderligere afklaring. Supplerende tegn på østrogenicitet kan komme fra in vitro-assays såsom assays om ER-binding og transkriptions ­
aktivering eller fra andre in vivo-assays såsom assayet om kvindelig 
pubertet.
 
10. Under hensyntagen til, at det uterotrofiske bioassay fungerer som et in 
vivo-screeningassay, tjente den anvendte valideringstilgang både dyrevel ­
færdshensyn og en trinvis teststrategi. Med henblik herpå bestræbte man sig på at foretage en streng validering af reproducerbarhed og følsomhed 
for østrogenicitet — den vigtigste bekymring i forbindelse med mange 
kemikalier — mens antiøstrogenecitetselementet i assayet ikke fik megen opmærksomhed. Kun ét antiøstrogen med stærk aktivitet blev testet, eftersom antallet af kemikalier med en klar antiøstrogen profil (ikke tilsløret 
af en vis østrogenaktivitet) er meget begrænset. Således er denne testmetode 
dedikeret til den østrogene protokol, mens protokollen med beskrivelse af assayets antagonistform er indeholdt i en vejledning (37). Assayets repro ­
ducerbarhed og følsomhed for kemikalier med rent antiøstrogen aktivitet vil 
blive tydeligere defineret senere, når testproceduren har været anvendt ruti ­
nemæssigt i nogen tid, og flere kemikalier med denne virkningsmodalitet er blevet identificeret.
 
11. Det er anerkendt, at alle dyrebaserede procedurer skal overholde lokale 
standarder for pasning af dyr. Nedenstående beskrivelser af pleje og behand ­
ling er minimumsstandarder og vil blive erstattet af lokale forskrifter såsom 
Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 
om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (38). OECD har udarbejdet yderligere vejledning om human behandling af dyr (25).
 
12. Som med alle assays, der anvender levende dyr, er det væsentligt at sikre, at 
dataene virkelig er nødvendige, før assayet påbegyndes. Eksempler på to 
forhold, hvor data kan være påkrævet:  
— højt eksponeringspotentiale (niveau 1 i konceptrammen, tillæg 2) eller 
tegn på østrogenicitet (niveau 2) for at undersøge, hvorvidt sådanne 
virkninger kan optræde in vivo  
— virkninger, der indikerer østrogenicitet i in vivo-test på niveau 4 eller 5, 
for at underbygge, at virkningerne var knyttet til en østrogen mekanisme, som ikke kan klarlægges ved hjælp af in vitro-test.
 
13. Definitioner anvendt i denne testmetode er anført i tillæg 1.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
PRINCIP FOR TESTEN  
14. Af hensyn til følsomheden bygger det uterotrofiske bioassay på et dyrefor ­
søgssystem, hvor hypotalamus-hypofyse-ovarieaksen ikke er funktionel, 
hvilket fører til lave endogene niveauer af cirkulerende østrogen. Det vil sikre, at uterus har en lav udgangsvægt, og at der bliver en maksimal spredning af reaktioner på indgivne østrogener. To østrogenfølsomme 
tilstande hos hungnavere opfylder dette krav:
 
i) ikkekønsmodne hunner efter fravænning og før pubertet  
ii) unge voksne hunner efter ovariektomi med tilstrækkelig tid til regression 
af uterusvævet.  
15. Testkemikaliet indgives dagligt ved oral sonde eller subkutan injektion. 
Graduerede testkemikaliedoser indgives til mindst to behandlingsgrupper 
(se vejledning i pkt. 33) af forsøgsdyr med ét dosisniveau pr. gruppe og en indgiftsperiode på tre på hinanden følgende dage for den ikkekønsmodne metode og en indgiftsperiode på mindst tre på hinanden følgende dage for 
OVX-voksen-metoden. Dyrene obduceres ca. 24 timer efter den sidste dosis. 
For østrogenagonister undersøges behandlede dyregruppers gennemsnitlige uterusvægt i forhold til vehikelgruppen for en statistisk signifikant forøgelse. En statistisk signifikant forøgelse i gennemsnitlig uterusvægt for en test ­
gruppe viser en positiv respons i dette bioassay.
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af dyreart  
16. Der kan bruges almindeligt anvendte gnaverstammer. Som eksempel blev 
Sprague-Dawley og Wistar-stammer af rotter anvendt under valideringen. Stammer med uteri, som man ved eller har mistanke om, er mindre respon ­
sive, bruges ikke. Laboratoriet skal påvise den anvendte stammes følsomhed 
som foreskrevet i pkt. 26 og 27.
 
17. Rotter og mus er rutinemæssigt blevet anvendt i det uterotrofiske bioassay 
siden 1930'erne. OECD's valideringsundersøgelser blev kun udført med rotter baseret på en forståelse af, at begge arter forventes at være ækviva ­
lente, og derfor burde én art være nok til den globale validering med henblik 
på at spare ressourcer og dyr. Rotten er den foretrukne art i de fleste 
reproduktions- og udviklingstoksicitetsundersøgelser. Eftersom der findes en omfattende historisk database for mus og for derfor at udvide anvendel ­
sesområdet for den uterotrofiske bioassay-testmetode med gnavere til anven ­
delsen af mus som forsøgsarter, blev der udført en begrænset opfølgende 
valideringsundersøgelse med mus (16). En ‘bridging’-metode med et begrænset antal testkemikalier og deltagende laboratorier og uden kodet stikprøvetest blev valgt i overensstemmelse med det oprindelige ønske om 
at spare ressourcer og dyr. Denne ‘bridging’-valideringsundersøgelse viser 
for det uterotrofiske bioassay med unge vokse ovariektomiserede mus, at data opnået med rotter og mus kvalitativt og kvantitativt stemmer udmærket overens. Selv om resultatet af det uterotrofiske bioassay måske er foreløbigt 
i forhold til en langtidsundersøgelse, giver det mulighed for, at dyr fra den 
samme stamme og kilde kan anvendes i begge undersøgelser. ‘Bridging’- metoden blev begrænset til OVX-mus, og rapporten giver ikke et robust datasæt, der kan validere den ikkekønsmodne model. Den ikkekønsmodne 
model for mus kommer således ikke i betragtning under den nuværende 
testmetodes anvendelsesområde.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. I nogle tilfælde kan mus derfor anvendes i stedet for rotter. Denne art skal 
begrundes i toksikologiske, farmakokinetiske og/eller andre kriterier. 
Ændringer i protokollen kan være nødvendige for mus. F.eks. er mus' fødeindtagelse målt på kropsvægt højere end rotters, og derfor skal det fytoøstrogene indhold i foderet være lavere for mus end for 
rotter(9)(20)(22).
 
Miljøbetingelser og fodring  
19. Alle procedurer skal overholde lokale standarder for pasning af forsøgsdyr. 
Disse beskrivelser af pasning og behandling er minimumsstandarder og vil 
blive erstattet af lokale forskrifter såsom Europa-Parlamentets og Rådets 
direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (38). Temperaturen i forsøgsdyrrummet 
skal være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % 
og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50- 60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke.
 
20. Laboratoriefoder og drikkevand gives ad libitum. Unge voksne dyr kan 
opbevares i bure hver for sig eller i grupper på op til tre dyr. På grund af de ikkekønsmodne dyrs unge alder anbefales social gruppeanbringelse
 
21. Et højt fytoøstrogenniveau i laboratoriefoder er kendt for at øge uterus ­
vægten hos gnavere i tilstrækkelig grad til at påvirke det uterotrofiske 
bioassay (13)(14)(15). Et højt niveau af fytoøstrogener og omsættelig 
energi i laboratoriefoder kan også føre til tidlig pubertet, hvis der anvendes ikkekønsmodne dyr. Tilstedeværelsen af fytoøstrogener stammer primært fra tilsætningen af soja- og lucerneprodukter i laboratoriefoderet, og koncen ­
trationer af fytoøstrogener i standardlaboratoriefoder har vist sig at variere 
fra batch til batch (23). Kropsvægt er en vigtig variabel, da den hænger sammen med mængden af indtaget foder. Derfor varierer den faktisk indtagne dosis fytoøstrogen fra samme foder mellem arter og efter 
alder (9). For ikkekønsmodne hunrotter kan fødeindtagelsen målt efter 
kropsvægt være ca. det dobbelte af indtagelsen for ovariektomiserede unge voksne hunner. For unge voksne mus kan fødeindtagelsen målt efter kropsvægt være næsten det firedobbelte af indtagelsen for ovariektomiserede 
unge voksne hunrotter.
 
22. Resultater af det uterotrofiske bioassay (9)(17)(18)(19) viser imidlertid, at 
begrænsede mængder af fytoøstrogener i foderet er acceptabelt og ikke 
reducerer bioassayets følsomhed. Vejledende bør fytoøstrogenniveauerne i 
foder ikke overstige 350 μg genistein-ækvivalenter/gram laboratoriefoder til 
ikkekønsmodne Sprague Dawley- og Wistar-hunrotter (6)(9). Et sådant foder bør også være passende ved test på unge voksne ovariektomiserede rotter, 
fordi fødeindtagelsen målt efter kropsvægt er mindre hos unge voksne 
sammenlignet med ikkekønsmodne dyr. Hvis voksne ovariektomiserede mus eller mere fytoøstrogenfølsomme rotter anvendes, skal man overveje en forholdsmæssig reduktion i fytoøstrogenniveauet i foderet (20). 
Endvidere kan forskelle i tilgængelig metabolisk energi fra forskelligt 
foder føre til tidsforskydninger i pubertetens start (21)(22).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Forud for undersøgelsen kræves en omhyggelig udvælgelse af foder uden et 
højt fytoøstrogenniveau (se vejledning (6)(9)) eller metabolisk energi, der 
kan forstyrre resultaterne (15)(17)(19)(22)(36). Det er en vigtig kontrol af begge disse faktorer at sikre, at laboratoriets testsystem fungerer korrekt som fastsat i pkt. 26 og 27. Som en beskyttelsesforanstaltning i overensstem ­
melse med god laboratoriepraksis (GLP) udtages der repræsentative prøver 
af hver batch foder, som indgives i løbet af undersøgelsen, med henblik på mulig analyse af fytoøstrogenindholdet (f.eks. i tilfælde af høj uteruskontrol ­
vægt i forhold til tidligere kontroller eller en uhensigtsmæssig respons på 
referenceøstrogenet, 17-alfa-ethinylestradiol). Alikvoter analyseres som led i 
undersøgelsen eller fryses ved – 20 °C eller på en sådan måde, at prøven ikke nedbrydes før analyse.
 
24. Nogle former for strøelse kan indeholde naturligt forekommende østrogene 
eller antiøstrogene kemikalier (f.eks. er det kendt, at majskolber påvirker 
rotters cyklus og ser ud til at være antiøstrogene). Det valgte strøelsesmate ­
riale skal indeholde så lidt østrogen som muligt.  
Forberedelse af dyr  
25. Forsøgsdyr uden tegn på sygdom eller fysiske abnormiteter tilordnes vilkår ­
ligt til kontrol- og behandlingsgrupper. Burene anbringes således, at mulige 
virkninger som følge af burenes placering minimeres. Dyrene mærkes indi ­
viduelt. Ikkekønsmodne dyr opbevares helst i bur med moderdyr eller pleje ­
moderdyr indtil fravænning under akklimatisering. Akklimatiseringsperioden 
forud for undersøgelsens start skal være omkring fem dage for unge voksne 
dyr og for ikkekønsmodne dyr leveret med moderdyr eller plejemoderdyr. Såfremt der fås fravænnede ikkekønsmodne dyr uden moderdyr, kan en kortere akklimatiseringsperiode blive nødvendig, da dosering skal starte 
umiddelbart efter fravænning (se pkt. 29).
 
FREMGANGSMÅDE  
Kontrol af laboratoriets kompetence  
26. Der er to forskellige muligheder for at kontrollere laboratoriets kompetence:  
— periodisk kontrol i forhold til en indledende positiv grundkontrolunder ­
søgelse (se pkt. 27). Mindst hver sjette måned og hver gang der sker en 
ændring, som kan påvirke assayets resultater (f.eks. en ny foderformule ­
ring, ændringer i dissektionspersonale, ændring af dyrestamme eller -leverandør osv.), skal testsystemets (dyremodellens) responsivitet kontrolleres ved hjælp af en passende dosis (baseret på den positive 
grundkontrol, jf. pkt. 27) af et referenceøstrogen: 17a-ethinylestradiol 
(CAS-nr. 57-63-6) (EE)
 
— brug af sideløbende kontroller ved at inkludere en gruppe, som får en 
passende dosis referenceøstrogen, i hvert assay.  
Reagerer systemet ikke som forventet, skal testbetingelserne undersøges og 
ændres i overensstemmelse hermed. Det anbefales, at den dosis reference ­
østrogen, der skal anvendes ved hver tilgang, er ca. ED70-80.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Positiv grundkontrolundersøgelse —  Før et laboratorium første gang 
gennemfører en undersøgelse i henhold til denne testmetode,påvises labora ­
toriets kompetence gennem en test af dyremodellens responsivitet ved at fastlægge et referenceøstrogens dosisrespons: 17a-ethinylestradiol (CAS- nr. 57-63-6) (EE) med minimum fire doser. Uterusvægtrespons sammen ­
lignes med etablerede tidligere data (se reference (5)). Hvis denne positive 
grundkontrol ikke giver de forventede resultater, undersøges testbetingel ­
serne og ændres.
 
Dyrenes antal og vilkår  
28. Hver behandlings- og kontrolgruppe skal omfatte mindst seks dyr (gælder 
protokoller for både den ikkekønsmodne og OVX-voksen-metoden).  
Ikkekønsmodne dyrs alder  
29. Til det uterotrofiske bioassay med ikkekønsmodne dyr skal fødselsdatoen 
anføres. Doseringen skal begynde tidligt nok til at sikre, at den fysiologiske 
forøgelse af endogene østrogener i forbindelse med puberteten endnu ikke 
har fundet sted, når indgiften af testkemikaliet afsluttes. På den anden side er der tegn på, at meget unge dyr kan være mindre følsomme. Ved define ­
ring af den optimale alder skal hvert laboratorium tage udgangspunkt i sine 
egne baggrundsdata om kønsmodning.
 
Som generel vejledning kan dosering af rotter begynde straks efter en tidlig 
fravænning på PND 18 (idet dagen for fødslen er PND 0). Dosering af rotter skal helst fuldføres på PND 21, men under alle omstændigheder før PND 25, for efter den alder bliver hypothalamus-hypofyse-ovarie-aksen funktio ­
nel, og det endogene østrogenniveau kan begynde at stige med en samtidig 
stigning i uterus' gennemsnitlige basislinjevægt og en stigning i gruppens standardafvigelser (2)(3)(10)(11)(12).
 
Procedure for ovariektomi  
30. For ovariektomiserede hunrotter og -mus (behandlings- og kontrolgrupper) 
foretages ovariektomi i 6-8-ugersalderen. For rotter skal der gå mindst 14 
dage mellem ovariektomi og den første dags indgift for at give uterus 
mulighed for at trække sig sammen til en minimal stabil basislinje. For mus skal der gå mindst syv dage mellem ovariektomi og den første dags indgift. Da små mængder ovarievæv er tilstrækkelige til at producere bety ­
delige mængder af cirkulerende østrogen (3), skal dyrene testes før brug ved 
at observere epithelceller skrabet fra vagina i mindst fem på hinanden følgende dage (f.eks. dag 10-14 efter ovariektomi for rotters vedkommende). Hvis dyrene viser tegn på, at de er ved at gå i brunst, skal de ikke bruges. 
Ved obduktion skal ovariestilkene undersøges for tegn på evt. tilstedevæ ­
relse af ovarievæv. I givet fald skal dyret ikke anvendes i beregningerne (3).
 
31. Ovariektomiproceduren begynder med, at dyret bedøves korrekt og lægges 
på maven. Incisionen til åbning af den dorsolaterale abdominalvæg skal være ca. 1 cm på langs ved midtpunktet mellem ribbenenes margo inferior og crista iliaca og nogle få millimeter lateralt i forhold til lændemusklens 
laterale kant. Ovariet fjernes fra bughulen til et aseptisk felt. Ovariet skæres 
fra ved overgangen mellem æggeleder og corpus uteri. Efter bekræftelse af, at der ikke forekommer massiv blødning, lukkes abdominalvæggen med sutur, og huden lukkes med autoclips eller egnet sutur. Ligaturpunkterne 
vises skematisk i figur 1. Passende postoperativ analgesi bruges som anbe ­
falet af en dyrlæge med erfaring i pleje af gnavere.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Kropsvægt  
32. I OVX-voksen-metoden hænger kropsvægt og uterusvægt ikke sammen, 
fordi uterusvægten påvirkes af hormoner såsom østrogener, men ikke af 
vækstfaktorer, der regulerer kropsstørrelsen. Derimod hænger kropsvægten sammen med uterusvægten i den ikkekønsmodne model under kønsmodning (34). Ved påbegyndelse af undersøgelsen skal vægtvariationen for de 
anvendte dyr i den ikkekønsmodne model derfor være minimal og må 
ikke overstige ± 20 % af middelvægten. Det betyder, at kuldstørrelsen skal være standardiseret af producenten for at sikre, at afkom fra andre moderdyr bliver fodret med det samme. Dyr tilordnes til grupper (kontrol- 
og behandlingsgrupper) ved randomiseret vægtfordeling, således at hver 
gruppes gennemsnitlige kropsvægt ikke er statistisk anderledes end en anden gruppes. Man skal, så vidt det er praktisk muligt, være opmærksom på ikke at tilordne dyr fra samme kuld til samme behandlingsgruppe uden at 
øge antallet af kuld, der anvendes til undersøgelsen.
 
Dosering  
33. For at fastslå, om et testkemikalie kan have østrogen virkning in vivo, er to 
dosisgrupper og en kontrolgruppe normalt tilstrækkeligt, og dette design foretrækkes derfor af hensyn til dyrevelfærden. Hvis formålet er enten at opnå en dosisrepræsentativ kurve eller at ekstrapolere til lavere doser, er der 
behov for mindst tre dosisgrupper. Hvis der kræves information ud over 
identificeringen af østrogen aktivitet (såsom et skøn over styrke), må man overveje et andet dosisregime. Med undtagelse af behandling med testkemi ­
kaliet behandles dyr i kontrolgruppen på samme måde som testgruppens dyr. 
Hvis der bruges et vehikel til indgift af testkemikaliet, skal kontrolgruppen 
modtage den samme mængde vehikel, som bruges til den behandlede gruppe (eller den største mængde, der bruges til testgrupperne, hvis der er forskel grupperne imellem).
 
34. Formålet i tilfælde af det uterotrofiske bioassay er at vælge doser, der sikrer 
dyrenes overlevelse, og som er uden væsentlig toksicitet eller lidelse for 
dyrene efter tre på hinanden følgende dages indgift af kemikaliet indtil en 
maksimal dosis på 1 000 mg/kg/dag. Alle dosisniveauer foreslås og vælges under hensyntagen til evt. eksisterende toksicitets- og (toksiko-)kinetiske data om testkemikaliet eller materiale i den forbindelse. Med hensyn til 
det højeste dosisniveau skal der først tages hensyn til LD50 og/eller infor ­
mation om akut toksicitet for at undgå død eller alvorlig lidelse for dyrene (24)(25)(26). Den højeste dosis repræsenterer den maksimalt tolererede dosis (MTD). En undersøgelse foretaget med et dosisniveau, som skabte 
en positiv uterotrofisk respons, ville også blive godkendt. Til screening er 
store intervaller (f.eks. enheder a en halv logaritme svarende til en dosispro ­
gression på 3,2 eller op til enheder a en logaritme) mellem doseringerne normalt acceptable. Foreligger der ikke passende data, kan der udføres en 
range-finding-undersøgelse til bestemmelse af de doser, der skal anvendes.
 
35. Hvis den østrogene styrke for en agonist kan anslås ved in vitro- (eller in 
silico-) data, kan disse alternativt inddrages med henblik på valg af dosis. 
F.eks. anslås den mængde af testkemikaliet, som vil fremkalde uterotrofisk respons svarende til referenceagonisten (ethinylestradiol), efter sine relative in vitro-styrker i forhold til ethinylestradiol. Man vil få den højeste testdosis 
ved at gange denne ækvivalente dosis med en passende faktor, f.eks. 10 
eller 100.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Overvejelser over ‘range-finding’  
36. Om nødvendigt kan der udføres en range-finding-undersøgelse med nogle få 
dyr. I den forbindelse kan OECD's vejledning nr. 19 (25) bruges til at 
definere kliniske tegn på toksicitet eller lidelse for dyrene. Såfremt det er muligt inden for denne range-finding-undersøgelse, kan uteri efter tre dages indgift eksciseres og vejes ca. 24 timer efter den sidste dosis. Disse data kan 
herefter bruges som input til design af hovedundersøgelsen (vælg en accep ­
tabel maksimumsdosis og lavere doser, og anbefal antallet af dosisgrupper).
 
Indgift af doser  
37. Testkemikaliet indgives ved oral sonde eller subkutan injektion. Dyrevel ­
færdshensyn og toksikologiske aspekter såsom relevansen for den måde, hvorpå mennesker eksponeres for kemikaliet (f.eks. oral sonde til modelind ­
tagelse, subkutan injektion til modelinhalation eller dermal absorption), test ­
kemikaliets fysisk-kemiske egenskaber og især eksisterende toksikologisk information og data om metabolisme og kinetik (f.eks. behov for at undgå førstepassage-metabolisme, bedre effektivitet ad en særlig vej) skal tages i 
betragtning ved valg af indgiftsvej.
 
38. Det anbefales først at overveje en vandig opløsning/suspension, hvor det er 
muligt. Men da de fleste østrogene ligander eller deres metaboliske prækur ­
sorer normalt er hydrofobe, er den mest almindelige fremgangsmåde at anvende en opløsning/suspension i olie (f.eks. majs-, jordnødde-, sesam- 
eller olivenolie). Disse olier har imidlertid forskelligt kalorie- og fedtind ­
hold, og vehiklet kan derfor påvirke det samlede indtag af omsættelig energi og derved potentielt ændre de målte endepunkter såsom uterusvægt, især ved den ikkekønsmodne metode (33). Forud for undersøgelsen testes derfor 
ethvert vehikel, der skal anvendes, i forhold til kontrolgrupper uden vehikel. 
Testkemikalier kan opløses i en minimal mængde på 95 % ethanol eller andre egnede opløsningsmidler og fortyndes til endelige arbejdskoncentra ­
tioner i testvehiklet. Opløsningsmidlets toksiske karakteristika skal være 
kendt og testes i en særskilt kontrolgruppe, som kun får opløsningsmiddel. 
Hvis testkemikaliet anses for stabilt, kan svag opvarmning og kraftig meka ­
nisk påvirkning bruges til at fremme opløsningen af testkemikaliet. Testke ­
mikaliets stabilitet i vehiklet skal bestemmes. Er testkemikaliet stabilt, mens 
undersøgelsen står på, kan en startalikvot af testkemikaliet klargøres, og de 
angivne fortyndinger af dosis tilberedes dagligt.
 
39. Doseringstidspunktet vil afhænge af den anvendte model (jf. pkt. 29 om den 
ikkekønsmodne model og pkt. 30 om OVX-voksen-modellen). Ikkekøns ­
modne hunrotter doseres dagligt med testkemikaliet i tre på hinanden 
følgende dage. En tredages behandling anbefales også til ovariektomiserede 
hunrotter, men længere eksponeringer er acceptable og kan forbedre detek ­
tionen af svagt aktive kemikalier. For ovariektomiserede hunmus skulle en anvendelsesvarighed på tre dage være tilstrækkeligt uden en væsentlig fordel 
ved en udvidelse på op til syv dage for stærke østrogenagonister. Denne 
sammenhæng blev dog ikke påvist for svage østrogener i valideringsunder ­
søgelsen (16), så doseringen skal udvides til syv på hinanden følgende dage for OVX-voksne mus.Dosis indgives på samme tidspunkter hver dag. 
Doserne justeres efter behov, så der bevares en konstant dosis i forhold 
til dyrets kropsvægt (f.eks. mg af testkemikaliet pr. kg kropsvægt pr. dag). Med hensyn til testvolumen skal variationen på grundlag af kropsvægt begrænses ved at justere koncentrationen af testopløsningen for at sikre et 
konstant volumen på grundlag af kropsvægt ved alle dosisstørrelser og for 
alle indgiftsveje.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Når testkemikaliet indgives ved sonde, skal dyrene have det i en enkeltdosis 
ved hjælp af en gastrisk sonde eller et passende intubationsrør. Hvor stor en 
daglig væskemængde, der kan indgives på én gang, afhænger af forsøgs ­
dyrets størrelse. Lokale retningslinjer for pleje af dyr skal følges, men mængden bør ikke overstige 5 ml/kg kropsvægt undtagen i tilfælde af 
vandige opløsninger, hvor der kan bruges 10 ml/kg kropsvægt.
 
41. Når testkemikaliet indgives ved subkutan injektion, skal det ske i en enkelt 
daglig dosis. Doserne indgives i de dorsoskapulære og lumbale regioner via steril nål (f.eks. kaliber 23 eller 25) og en tuberkulinsprøjte. Det er valgfrit, 
om injektionsområdet barberes. Evt. tab eller lækage på injektionsstedet eller 
ufuldstændig dosering registreres. Den samlede injicerede mængde pr. rotte pr. dag må ikke overstige 5 ml/kg kropsvægt fordelt på to injektionssteder undtagen i tilfælde af vandige opløsninger, hvor der kan bruges 10 ml/kg 
kropsvægt.
 
Bemærkninger  
Generelle og kliniske observationer  
42. Generelle kliniske observationer foretages mindst én gang om dagen og 
hyppigere, hvis der observeres tegn på toksicitet. Observationer skal helst udføres på samme tidspunkt(er) hver dag og under hensyntagen til perioden 
for den forventede maksimale virkning efter dosering. Alle dyr observeres 
for mortalitet, morbiditet og generelle kliniske tegn såsom ændringer i adfærd, hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion og ekskretion samt autonom aktivitet (f.eks. tåreflåd, piloerektion, pupilstørrelse, usædvan ­
ligt respirationsmønster).
 
Kropsvægt og foderindtagelse  
43. Alle dyr vejes dagligt til nærmeste 0,1 g fra indledningen af behandlingen, 
dvs. når dyrene fordeles i grupper. Som valgfri måling kan mængden af indtaget foder i behandlingsperioden måles pr. bur ved at veje fodrings ­
systemerne. Resultaterne for foderindtagelsen udtrykkes i gram pr. rotte 
pr. dag.
 
Dissektion og måling af uterusvægt  
44. 24 timer efter den sidste behandling aflives rotterne humant. Ideelt set skal 
obduktionsrækkefølgen være vilkårlig på tværs af grupperne for at undgå 
progression direkte op eller ned i forhold til dosisgrupper, som kan påvirke 
dataene lidt. Formålet med bioassayet er at måle både vådvægten og tørvægten af uterus. Vådvægten omfatter uterus og luminalvæskeindhold. Tørvægten måles, efter at luminalindholdet af uterus er blevet presset ud 
og fjernet.
 
45. Før dissektion skal vagina undersøges med hensyn til åbningsstatus hos 
ikkekønsmodne dyr. Dissektionsproceduren begynder ved at åbne abdomi ­
nalvæggen ved skambenssymfysen. Herefter fjernes evt. livmoderhorn og 
ovarier fra den dorsale abdominalvæg. Urinblære og urinledere fjernes fra 
den ventrale og laterale side af uterus og vagina. Fibrøs adhæsion mellem rektum og vagina fjernes, til forbindelsespunktet mellem vaginalåbning og perinealhud kan identificeres. Uterus og vagina frigøres fra kroppen ved 
foretage en incision i vaginalvæggen lige over forbindelsespunktet i perine ­
alhuden som vist i figur 2. Uterus fjernes fra kropsvæggen ved forsigtigt at
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
skære det uterine mesenterium dorsolateralt ved tilhæftningspunktet i hele 
længden af hvert livmoderhorn. Når uterus er fjernet fra kroppen, skal hånd ­
teringen gå tilstrækkelig hurtigt til, at vævsudtørring undgås. Vægttab på grund af udtørring bliver større ved små væv såsom uterus (23). Er der ovarier, fjernes disse ved æggelederen, idet tab af luminalvæske fra 
livmoderhornet undgås. Såfremt dyret er blevet ovariektomiseret, undersøges 
ovariestilkene for tilstedeværelse af evt. ovarievæv. Overskydende fedt og bindevæv renses væk. Vagina fjernes fra uterus lige under cervix, således at cervix forbliver sammen med corpus uteri som vist i figur 2.
 
46. Hver uterus overføres til en entydigt mærket og vejet beholder (f.eks. en 
petriskål eller et plastvejekar), idet man fortsat omhyggeligt undgår udtør ­
ring før vejning (f.eks. kan filterpapir, der er let fugtet med saltvand, lægges 
i beholderen). Uterus med luminalvæske vejes til nærmeste 0,1 mg (uterus' 
vådvægt).  
47. Hver uterus behandles herefter individuelt med henblik på fjernelse af lumi ­
nalvæske. Begge livmoderhorn perforeres eller skæres på langs. Uterus 
placeres på et let fugtigt filterpapir (f.eks. Whatman nr. 3) og presses forsigtigt med et andet stykke let fugtigt filterpapir, så luminalvæsken fjernes helt. Uterus uden luminalvæske vejes til nærmeste 0,1 mg (uterus' 
tørvægt).
 
48. Vægten af uterus ved testens afslutning kan bruges til at sikre, at den 
ikkekønsmodne intakte rottes rette alder ikke blev overskredet. Dog er 
tidligere data om den rottestamme, laboratoriet anvendte, afgørende i den 
forbindelse (se pkt. 56 med hensyn til fortolkning af resultaterne).  
Valgfrie undersøgelser  
49. Efter vejning kan uterus fikseres i 10 % neutral bufferformalin med henblik 
på histopatologisk undersøgelse efter hematoxylin-eosin (HE)-farvning. 
Vagina kan undersøges i overensstemmelse hermed (se pkt. 9). Endvidere 
kan der med henblik på kvantitativ sammenligning foretages en morfome ­
trisk måling af endometrial epithelium.  
DATA OG RAPPORTERING  
Data  
50. Undersøgelsesdataene skal omfatte:  
— antal dyr ved assayets start  
— antal dyr, der blev fundet døde under assayet eller aflivet af humane 
grunde, og deres identitet samt dato og tidspunkt for evt. død eller human aflivning
 
— antal dyr, der viser tegn på toksicitet, og deres identitet samt en beskri ­
velse af de observerede tegn på toksicitet, herunder begyndelsestids ­
punkt, varighed og sværhed af alle toksiske virkninger  
— antal dyr, der udviser læsioner, og deres identitet samt en beskrivelse af 
læsionernes art.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Individuelle dyredata registreres med kropsvægt, vådvægt af uterus og 
tørvægt af uterus. Ensidede statistiske analyser for agonister anvendes til 
at bestemme, om indgiften af et testkemikalie har ført til en statistisk signi ­
fikant (p < 0,05) stigning i uterusvægt. Passende statistiske analyser udføres for at teste, om der er behandlingsrelaterede ændringer i tør- og vådvægt af 
uterus. F.eks. kan dataene vurderes ved en kovariansanalysemetode 
(ANCOVA) med kropsvægt ved obduktion som kovariablen. En varians ­
stabiliserende logaritmisk transformation kan udføres på uterusdata forud for dataanalysen. Dunnett og Hsus test er hensigtsmæssig til at foretage parvise 
sammenligninger af hver dosisgruppe i forhold til vehikelkontrolgrupperne 
og til at beregne konfidensintervaller. Studentiserede residualplots kan bruges til at detektere mulige outliers og til at vurdere variansernes homo ­
genitet. Disse procedurer blev anvendt i OECD's valideringsprogram, der 
benytter PROC GLM i det statistiske analysesystem (SAS Institute, Cary 
NC), version 8 (6)(7).
 
52. Den endelige rapport skal indeholde:  
Testlaboratorium  
— ansvarligt personale og deres undersøgelsesansvar  
— data fra den positive basislinjekontroltest og periodiske positive kontrol ­
data (se pkt. 26 og 27).  
Testkemikalie  
— karakterisering af testkemikalier  
— fysisk form og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber  
— blanding af fortyndinger: metode og frekvens  
— evt. data genereret vedrørende stabilitet  
— evt. analyser af testopløsninger.  
Vehikel  
— karakterisering af testvehikel (art, leverandør og batch)  
— begrundelse for valg af vehikel (hvis andet end vand).  
Forsøgsdyr  
— art og stamme samt begrundelse for valget heraf  
— leverandør og særlig leverandør  
— alder ved levering med fødselsdato  
— ved ikkekønsmodne dyr, om de er leveret med moder- eller plejedyr og 
dato for fravænning  
— oplysninger om procedure for akklimatisering af dyr  
— antal dyr pr. bur  
— oplysninger om metode til individuel identifikation af dyr og grupper.  
Assaybetingelser  
— oplysninger om randomiseringsproces (dvs. anvendt metode)  
— rationale for valg af dosis  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— oplysninger om testkemikaliets formulering, opnåede koncentrationer 
heraf, stabilitet og homogenitet  
— oplysninger om indgift af testkemikalie og rationale for valg af ekspone ­
ringsvej  
— foder (navn, type, leverandør, indhold, og hvis det er kendt, fytoøst ­
rogenniveau)  
— vandkilde (f.eks. hanevand eller filtreret vand) og tilførsel (ved rør fra en 
stor beholder, i flasker osv.)  
— strøelse (navn, type, leverandør, indhold)  
— registrering af anbringelsesforhold, belysningsinterval, rumtemperatur og 
luftfugtighed, rengøring af rummet  
— detaljeret beskrivelse af procedurer for obduktion og vejning af uterus  
— beskrivelse af statistiske procedurer.  
Resultater  
For individuelle dyr  
— vægt fra alle daglige individuelle kropsvejninger (fra fordeling i grupper 
til obduktion) (til nærmeste 0,1 g)  
— hvert dyrs alder (i dage, idet fødselsdagen regnes som dag 0), når indgift 
af testkemikaliet begynder  
— dato og tidspunkt for indgift af hver dosis  
— beregnet volumen og dosering indgivet og observationer af evt. dose ­
ringstab under eller efter indgiften  
— daglig registrering af status for dyr, herunder relevante symptomer og 
observationer  
— mistænkt dødsårsag (hvis fundet under undersøgelsen i moribund tilstand 
eller død)  
— dato og tidspunkt for human aflivning med tidsinterval til seneste dose ­
ring 
— vådvægt af uterus (til nærmeste 0,1 mg) og evt. observationer af lumi ­
nale væsketab under dissektion og forberedelse til vejning  
— tørvægt af uterus (til nærmeste 0,1 mg).  
For hver gruppe af dyr  
— gennemsnitlig daglig kropsvægt (til nærmeste 0,1 g) og standardafvi ­
gelser (fra fordeling i grupper til obduktion)  
— gennemsnitlig vådvægt af uterus og gennemsnitlig tørvægt af uterus (til 
nærmeste 0,1 mg) og standardafvigelser  
— daglig foderindtagelse, hvis den måles (beregnet som gram foderind ­
tagelse pr. dyr)  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— resultater af statistiske analyser med sammenligning af både våd- og 
tørvægt af uterus for behandlede grupper i forhold til de samme 
målinger i vehikelkontrolgrupperne  
— resultater af statistisk analyse med sammenligning af den samlede krops ­
vægt og kropsvægtforøgelsen i de behandlede grupper i forhold til de 
samme målinger i vehikelkontrolgrupperne.  
53. Resumé af vigtige vejledningsoplysninger om testmetoden  
Rotte Mus  
Dyr 
Stamme Stamme af almindeligt anvendte forsøgsgnavere Antal dyr Minimum seks dyr pr. dosisgruppe Antal grupper Minimum to testgrupper (se vejledning i pkt. 33) og en negativ 
kontrolgruppe 
Med hensyn til vejledning om positive kontrolgrupper henvises 
til pkt. 26 og 27.  
Miljøbetingelser og fodring  
T
 o i forsøgslokalet 22 °C ± 3 °C 
Relativ luftfugtighed 50-60 % og ikke under 30 % eller over 70 % Daglig belysningssekvens 12 timers lys, 12 timers mørke Foder og drikkevand Ad libitum Anbringelse Individuelt eller i grupper på op til tre dyr (social gruppean ­
bringelse anbefales for ikkekønsmodne dyr) 
Foder og strøelse Fytoøstrogener med lavt niveau anbefales i foder og strøelse  
Protokol  
Metode Den ikkekønsmodne, ikkeova ­
riektomiserede metode (den foretrukne) 
Den ovariektomiserede metode 
for voksne hunner Den ovariektomiserede metode 
for voksne hunner 
Alder for dosering af 
ikkekønsmodne dyr Tidligst PND 18. Dosering 
skal være afsluttet før PND 25 Ikke relevant under den aktu ­
elle testmetodes anvendel ­
sesområde 
Alder for ovariektomi Mellem seks og otte uger Alder for dosering af 
ovariektomiserede dyr Der skal gå mindst 14 dage 
mellem ovariektomi og den første indgiftsdag. Der skal gå mindst syv dage 
mellem ovariektomi og den første indgiftsdag. 
Kropsvægt Variation i kropsvægt skal være minimal og må ikke overstige 
± 20 % af middelvægten.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Rotte Mus  
Dosering  
Indgiftsvej Oral sonde eller subkutan injektion Indgiftsfrekvens Én daglig dosis Volumen til sonde og 
injektion ≤ 5ml/kg kropsvægt (eller op til 10 ml/kg kropsvægt i tilfælde af 
vandige opløsninger) (på to injektionssteder for den subkutane 
vej) 
Indgiftens varighed Tre på hinanden følgende dage 
for den ikkekønsmodne model 
Minimum tre på hinanden 
følgende dage for 
OVX-modellen Syv på hinanden følgende dage 
for OVX-modellen 
Obduktionstidspunkt Ca. 24 timer efter sidste dosis  
Resultater  
Positiv respons Statistisk signifikant stigning i den gennemsnitlige uterusvægt 
(våd- og/eller tørvægt) 
Referenceøstrogen 17 α-ethinylestradiol
 
VEJLEDNING I FORTOLKNING OG GODKENDELSE AF RESUL ­
TATER  
54. Generelt skal en test for østrogenicitet betragtes som positiv, hvis der er en 
statistisk signifikant stigning i uterusvægt (p< 0,05) i det mindste ved det 
høje dosisniveau sammenlignet med kontrolgruppen, der kun får opløsnings ­
middel. Et positivt resultat understøttes yderligere af, at der påvises en biologisk plausibel sammenhæng mellem dosis og responsens størrelses ­
orden, idet man skal være opmærksom på, at testkemikaliets overlappende 
østrogene og antiøstrogene aktiviteter kan påvirke dosis-responskurvens form.
 
55. Man skal passe på ikke at overskride den maksimalt tolererede dosis for at 
sikre en meningsfuld fortolkning af data. Reduktion af kropsvægt, kliniske 
tegn og andre fund vurderes grundigt i den forbindelse.  
56. En vigtig overvejelse ved godkendelse af data fra det uterotrofiske bioassay 
er uterusvægten hos vehikelkontrolgruppen. Høje kontrolværdier kan skade 
bioassayets responsivitet og evne til at detektere meget svage østrogenago ­
nister. Litteraturgennemgang og data genereret under valideringen af det uterotrofiske bioassay tyder på, at tilfælde af høje kontrolgennemsnit 
faktisk forekommer spontant, især hos ikkekønsmodne dyr (2)(3)(6)(9). 
Da uterusvægten hos ikkekønsmodne rotter afhænger af mange variabler såsom stamme eller kropsvægt, kan der ikke sættes nogen endelig øvre grænse for uterusvægten. Som vejledning kan det siges, at hvis tørvægten 
af uterus hos ikkekønsmodne kontrolrotter ligger mellem 40 og 45 mg, skal 
resultaterne betragtes som mistænkelige, og en uterusvægt på over 45 mg kan betyde, at testen skal gennemføres igen. Dette skal dog overvejes i hvert enkelt tilfælde (3)(6)(8). Ved forsøg med voksne rotter vil en ufuldstændig 
ovariektomi efterlade ovarievæv, som kan producere endogent østrogen og 
forsinke nedgangen i uterusvægt.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Vehikelkontrol med tørvægt af uterus under 0,09 % kropsvægt for ikkekøns ­
modne hunrotter og under 0,04 % for ovariektomiserede unge voksne 
hunner ser ud til at give acceptable resultater [se tabel 31 (2)]. Hvis kontro ­
luterusvægten er større end disse tal, skal forskellige faktorer undersøges, bl.a. dyrenes alder, korrekt ovariektomi, fytoøstrogener i foderet osv., og et 
negativt assayresultat (ingen tegn på østrogen aktivitet) skal anvendes med 
forsigtighed.
 
58. Tidligere data for vehikelkontrolgrupperne opbevares i laboratoriet. Tidligere 
data for reaktioner på positive referenceøstrogener såsom 17a-ethinylestra ­
diol opbevares også på laboratoriet. Laboratorierne kan også teste responsen 
på kendte svage østrogenagonister. Alle disse data kan sammenlignes med tilgængelige data (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) for at sikre, at laboratoriets metoder 
giver tilstrækkelig følsomhed.
 
59. Tørvægten af uterus viste mindre variabilitet i løbet af OECD's validerings ­
undersøgelse end vådvægten af uterus (6)(7). Imidlertid vil en signifikant respons i hver måling vise, at testkemikaliet er positivt over for østrogen ­
aktivitet.
 
60. Den uterotrofiske respons skyldes ikke udelukkende østrogen, men et positivt 
resultat af bioassayet skal normalt fortolkes som bevis for østrogent potentiale 
in vivo og skal normalt give anledning til foranstaltninger med henblik på 
yderligere afklaring (se pkt. 9 og ‘OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals’, bilag 2).
 
Figur 1  
Skematisk diagram, der viser den kirurgiske fjernelse af ovarier
  
Proceduren begynder ved at åbne den dorsolaterale abdominalvæg ved midt ­
punktet mellem ribbenenes margo inferior og crista iliaca og nogle få milli ­
meter lateralt i forhold til lændemusklens laterale kant. Ovarierne lokaliseres i bughulen. På et aseptisk felt fjernes ovarierne herefter fysisk fra bughulen, 
idet der lægges en ligatur mellem ovarie og uterus for at kontrollere blød ­
ning, og ovariet frigøres ved incision over ligaturen ved forbindelsespunktet mellem æggeleder og hvert livmoderhorn. Efter bekræftelse af, at der ikke forekommer væsentlig blødning, lukkes abdominalvæggen med sutur, og 
huden lukkes, f.eks. med autoclips eller sutur. Dyrene skal have mulighed 
for at komme sig, og uterusvægten for at gå ned i mindst 14 dage før brug.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Figur 2  
Fjernelse og præparering af uterusvæv til vægtmåling
  
Proceduren begynder ved at åbne abdominalvæggen ved skambenssymfysen. 
Herefter frigøres evt. ovarier samt livmoderhorn fra den dorsale abdominalvæg. 
Urinblære og urinledere fjernes fra den ventrale og laterale side af uterus og 
vagina. Fibrøs adhæsion mellem rektum og vagina frigøres, til forbindelses ­
punktet mellem vaginalåbning og perinealhud kan identificeres. Uterus og vagina frigøres fra kroppen ved foretage en incision i vaginalvæggen lige over 
forbindelsespunktet i perinealhuden som vist på figuren. Uterus frigøres fra 
kropsvæggen ved forsigtigt at skære det uterine mesenterium dorsolateralt ved tilhæftningspunktet i hele længden af hvert livmoderhorn. Efter fjernelse fra kroppen renses overskydende fedt og bindevæv væk. Evt. ovarier fjernes ved 
æggelederen, idet tab af luminalvæske fra livmoderhornet undgås. Såfremt dyret 
er blevet ovariektomiseret, undersøges ovariestilkene for tilstedeværelse af evt. ovarievæv. Vagina fjernes fra uterus lige under cervix, således at cervix forbliver sammen med corpus uteri som vist på figuren. Uterus kan herefter vejes.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Antiøstrogenicitet  er et kemikalies evne til at undertrykke virkningen af estradiol 
17ß i et pattedyrs organisme.  
Kemikalie  betyder et stof eller en blanding.  
Fødselsdato  er dag 0 efter fødslen (PND).  
Dosering  er en generel term, som omfatter dosis samt doseringsfrekvens og 
-varighed.  
Dosis  er mængden af indgivet testkemikalie. For det uterotrofiske bioassay 
udtrykkes dosis som vægt af et testkemikalie pr. enhed af forsøgsdyrets krops ­
vægt pr. dag (f.eks. mg/kg kropsvægt/dag).  
Maksimalt tolereret dosis (MTD)  er den højeste mængde af et kemikalie, som 
ikke dræber forsøgsdyrene, når det indgives i kroppen (betegnes LD  0 ) (IUPAC, 
1993).  
Østrogenicitet  er et kemikalies evne til at fungere som estradiol 17ß i et patte ­
dyrs organisme.  
Postnatal dag X  er den X. levedag efter fødselsdagen (PND).  
Følsomhed  er andelen af alle positive/aktive kemikalier, som klassificeres 
korrekt ved testen. Det er et mål for nøjagtigheden af en testmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en 
testmetodes relevans.
 
Specificitet  er andelen af alle negative/inaktive kemikalier, som klassificeres 
korrekt ved testen. Det er et mål for nøjagtigheden af en testmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en 
testmetodes relevans.
 
Testkemikalie  betyder et stof eller en blanding, som testes ved hjælp af denne 
testmetode.  
Uterotrofisk  er en term, der bruges til at beskrive en positiv påvirkning af 
væksten af uterine væv.  
Validering  er en videnskabelig proces til at karakterisere en testmetodes opera ­
tionelle krav og begrænsninger og påvise dens pålidelighed og relevans til et 
bestemt formål.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Tillæg 2
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 NOTER TIL RAMMEN  
Note 1:  Det er muligt at gå ind og ud på alle niveauer; afhænger af arten 
af eksisterende informationsbehov med henblik på fare- og 
risikovurdering.  
Note 2:  På niveau 5 skal økotoksikologi omfatte endepunkter, der viser 
skadelige virkningsmekanismer og potential skade på befolkningen.
 
Note 3:  Når en multimodal model dækker flere single endpoint assays, 
vil modellen erstatte brugen af de pågældende single endpoint assays.
 
Note 4:  Vurderingen af hvert kemikalie skal ske i hvert enkelt tilfælde 
under inddragelse af al tilgængelig information og under hensyn ­
tagen til rammeniveauernes funktion.  
Note 5:  Rammen omfatter ikke alt på det givne tidspunkt. På niveau 3, 4 
og 5 omfatter den assays, der enten er tilgængelige, eller hvor valideringen er på vej. Med hensyn til sidstnævnte er disse fore ­
løbigt inkluderet. Når de er udviklet og valideret, vil de blive 
formelt tilføjet til rammen.
 
Note 6:  Niveau 5 omfatter ikke kun endelige test. Test inkluderet på dét 
niveau bidrager til generel fare- og risikovurdering.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
LITTERATUR  
1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.-11. marts 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic 
Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.
 
3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Utero ­
trophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520.
 
4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental 
Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.
 
5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785-94.  
6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.  
7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp. 111:1530-1549
 
8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp. 111:1550-1558.
 
9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.  
10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolifera ­
tive pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587.  
11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985) The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- estradiol. Endocrinology 117:2229-2237.
 
12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleisch ­
mann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active 
UV screens. SÖFW-J. 127:10-15.  
13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science 118:650-651.  
14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxi ­
col. 13:425-427.  
15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo 
responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec. 
106:369-373.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Utero ­
trophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67.  
17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002) Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157.  
18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.
 
19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the kovarians changes in the imma ­
ture rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620.
 
20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, 
Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of 
vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485.  
21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol. 20:343-347.  
22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381- 
393.
 
23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci. 37:596-601.
 
24) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320-333.  
28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33-41.  
29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288-305.
 
30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284-291.  
31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press.  
33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endo ­
crine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401-416.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159-184.  
35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808.  
36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evalua ­
tion of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro 
assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414.  
37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay 
Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.
 
38) Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 
2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål 
(EUT L 276 af 20.10.2010, s. 33).  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  HERSHBERGER-TESTEN I ROTTER: EN KORTTIDSSCRE ­
ENINGTEST FOR (ANTI)ANDROGENE EGENSKABER  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD-testvejledningen (TG) 441 (2009). 
OECD indledte en højt prioriteret aktivitet i 1998 med at revidere eksiste ­
rende vejledninger og udvikle nye vejledninger for screening og test af potentielt hormonforstyrrende stoffer (1). Et element i denne aktivitet var 
at udvikle en testvejledning for Hershberger-bioassayet med rotter. Dette 
assay blev først i 1962 standardiseret af et officielt ekspertudvalg som screeningværktøj for androgene kemikalier (2), efter at lægemiddelindu ­
strien havde brugt det i flere årtier. I 2001-2007 gennemgik 
Hershberger-bioassayet med rotter et omfattende valideringsprogram, 
herunder udarbejdelse af et Background Review Document (23), udarbej ­
delse af et detaljeret dokument om metoder (3), udvikling af en dissektions ­
vejledning (21) og gennemførelse af omfattende intra- og interlaboratorieun ­
dersøgelser for at vise bioassayets pålidelighed og reproducerbarhed. Disse 
valideringsundersøgelser blev foretaget med et potent referenceandrogen (testosteron propionat (TP)), to potente syntetiske androgener (trenbolona ­
cetat og methyltestosteron), et potent antiandrogent lægemiddel (flutamid), 
en potent syntesehæmmer (finasterid) af det naturlige androgen (dihydrote ­
stosteron-DHT), flere ugentlige antiandrogene pesticider (linuron, vinclozo ­
lin, procymidon, p,p‘DDE’), en potent 5 α reduktasehæmmer (finasterid) og 
to kendte negative kemikalier (dinitrophenol og nonylphenol) (4) (5) (6) (7) 
(8). Denne testmetode er resultatet af de årelange erfaringer med bioassayet og erfaringerne fra valideringstestprogrammet og de der opnåede resultater.
 
2. Hershberger-bioassayet er en korttidsscreeningtest in vivo under anvendelse 
af sekundært væv fra hannens forplantningssystem. Assayet havde sin 
oprindelse i 1930'erne og blev ændret i 1940'erne, så det kom til at 
omfatte androgenresponsive muskler i hannens forplantningssystem (2) (9-15). I 1960'erne blev over 700 mulige androgener evalueret ved hjælp af en standardiseret version af protokollen (2) (14), og anvendelsen af 
assayet til både androgener og antiandrogener blev betragtet som en stan ­
dardmetode i 1960'erne (2) (15). Det aktuelle bioassay er baseret på vægt ­
ændringerne i fem androgenafhængige væv hos den kastrerede peripuber ­
tære hanrotte. I bioassayet evalueres et kemikalies evne til at fremkalde 
biologiske virkninger i overensstemmelse med androgene agonister, antago ­
nister eller 5 α-reduktasehæmmere. De fem androgenafhængige målvæv, der 
er omfattet af denne testmetode, er ventral prostata (VP), vesiculae 
seminales (SV) (plus væsker og prostata anterior (coagulating glands)), 
levator ani-bulbocavernosus-musklen (LABC), parrede Cowpers kirtler (COW) og glans penis (GP). Hos kastrerede peripubertære hanrotter reagerer disse fem væv alle på androgener med en stigning i absolut vægt. 
Når de samme væv stimuleres til at øge vægten gennem indgift af et potent 
referenceandrogen, reagerer alle fem væv på antiandrogener med et fald i absolut vægt. Den primære model for Hershberger-bioassayet har været den kirurgisk kastrerede peripubertære han, som blev valideret i fase 1, 2 og 3 i 
Hershberger-valideringsprogrammet.
 
3. Hershberger-bioassayet fungerer som et mekanistisk in vivo-screeningassay 
for androgenagonister, androgenantagonister og 5a-reduktasehæmmere, og anvendelsen heraf skal ses i forbindelse med ‘OECD Conceptual Frame ­
work for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals’ 
(tillæg 2). I denne konceptramme ligger Hershberger-bioassayet på niveau 3 
som et in vivo-assay, der giver data om en enkelt endokrin mekanisme,
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
nemlig (anti)androgenicitet. Det skal indgå i en række in vitro- og in 
vivo-test med henblik på at afdække kemikalier med potentiale til at inter ­
agere med det endokrine system, så man i sidste ende kan foretage vurde ­
ringer af farer og risici for menneskers sundhed og miljøet.  
4. Af hensyn til dyrevelfærden i forbindelse med kastrationsproceduren 
ønskede man den intakte (ukastrerede), stimulerede og fravænnede han 
som en alternativ model til Hershberger-bioassayet for at undgå kastration. 
Testmetoden med stimulerede fravænnede dyr blev valideret (24). Ved valideringsundersøgelserne så udgaven af Hershberger-bioassayet med fravænnede dyr dog ikke ud til konsekvent at kunne detektere virkninger 
på androgenafhængige organers vægt af svage antiandrogener ved de 
testede doser. Derfor blev det ikke inkluderet i denne testmetode. I anerken ­
delse af at anvendelsen heraf ikke blot kan give fordele for dyrevelfærden, men også kan give information om andre virkningsmåder, er det tilgænge ­
ligt i OECD's vejledning 115 (25).
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER  
5. Androgenagonister og -antagonister fungerer som ligander for androgenre ­
ceptoren og kan henholdsvis aktivere eller hæmme receptorkontrolleret gentranskription. Endvidere hæmmer nogle kemikalier omdannelsen af 
testosteron til mere potent naturlig androgen dihydrotestosteron i nogle 
androgene målvæv (5a-reduktasehæmmere). Disse kemikalier kan potentielt føre til sundhedsrisici, herunder skadevirkninger for reproduktion og udvik ­
ling. Derfor er der et lovgivningsmæssigt behov for hurtigt at vurdere og 
evaluere et kemikalie som en mulig androgenagonist eller -antagonist eller 
5a-reduktasehæmmer. Selv om en ligands affinitet for en androgenreceptor som målt ved receptorbinding eller transkriptionsaktivering af reportergener in vitro er informativ, er det ikke den eneste determinant for mulig fare. 
Andre determinanter omfatter metabolisk aktivering og deaktivering ved 
optagelse i kroppen, kemikaliefordeling til målvæv og clearance fra krop ­
pen. Dette skaber behov for at screene et kemikalies mulige aktivitet in vivo under relevante betingelser og relevant eksponering. In vivo-evaluering er 
mindre kritisk, hvis kemikaliets kendetegn med hensyn til absorption, distri ­
bution, metabolisme og eliminering (ADME) er kendt. Androgenafhængige væv reagerer med hurtig og kraftig vækst på stimulering med androgener, især hos kastrerede peripubertære hanrotter. Gnaverarter, navnlig rotten, 
anvendes også bredt i toksicitetsundersøgelser til risikobeskrivelse. Derfor 
er den assayversion, som anvender kastrerede peripubertære rotter og de fem målvæv i dette assay, egnet til in vivo-screening af androgenagonister og -antagonister og 5a-reduktasehæmmere.
 
6. Denne testmetode er baseret på de protokoller, der blev anvendt i OECD's 
valideringsundersøgelse, og som har vist sig at være pålidelige og repeter ­
bare i intra- og interlaboratorieundersøgelser (4) (5) (6) (7) (8). Både andro ­
gene og antiandrogene procedurer præsenteres i denne testmetode.  
7. Selv om der var en vis variation i den TP-dose, de forskellige laboratorier 
brugte til at detektere antiandrogener i OECD's valideringsprogram for 
Hershberger-bioassay (0,2 mod 0,4 mg/kg/dag, subkutan injektion), var 
der kun en lille forskel mellem disse to protokolvariationer i evnen til at detektere svag eller stærk antiandrogen aktivitet. Det er dog klart, at TP-dosen ikke skal være så høj, at den blokerer virkningerne af svage 
androgenreceptorantagonister (AR), eller så lav, at de androgene væv kun 
udviser en lille vækstrespons selv uden samtidig indgift af antiandrogen.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Vækstresponsen i de enkelte androgenafhængige væv skyldes ikke udeluk ­
kende androgen, hvilket vil sige, at andre kemikalier end androgenagonister 
kan ændre vægten af visse væv. Dog underbygger vækstresponsen i flere væv samtidig en mere androgenspecifik mekanisme. F.eks. kan høje doser af potent østrogen øge vægten af vesiculae seminales. Dog reagerer de 
øvrige androgenafhængige væv i assayet ikke på samme måde. Antiandro ­
gene kemikalier kan fungere som enten androgenreceptorantagonister eller 5a-reduktasehæmmere. 5a-reduktasehæmmere har variabel virkning, fordi omdannelsen til mere potent dihydrotestosteron varierer efter væv. Antian ­
drogener, som hæmmer 5 α-reduktase, såsom finasterid har mere udtalte 
virkninger i ventral prostata end andre væv sammenlignet med en potent AR-antagonist som flutamid. Denne forskel i vævsrespons kan bruges til at differentiere mellem AR-medierede og 5 α-reduktasemedierede virknings ­
måder. Desuden hænger den androgene receptor udviklingsmæssigt 
sammen med andre steroidhormoner, og visse andre hormoner kan — når de indgives ved høje suprafysiologiske doseringsniveauer — binde og antagonisere de vækstfremmende virkninger af TP (13). Endvidere er det 
også plausibelt, at styrket steroidmetabolisme og en konsekvent sænkning af 
serumtestosteron kan reducere androgenafhængig vævsvækst. Derfor skal et positivt udfald i Hershberger-bioassayet normalt evalueres efter en såkaldt ‘weight of evidence’-tilgang, bl.a. in vitro-assays, f.eks. assays om AR- og 
østrogenreceptorbinding (ER) og tilsvarende assays om transkriptionsakti ­
vering eller andre in vivo-assays, der undersøger lignende androgene målvæv, såsom assayet om hannens pubertet, 15-dages assay af voksen han eller 28- eller 90-dagesundersøgelser med gentagen dosis.
 
9. Erfaringerne viser, at xenobiotiske androgener er sjældnere end xenobiotiske 
antiandrogener. Forventningen er, at Hershberger-bioassayet oftest vil blive 
anvendt til screening af antiandrogener. Imidlertid kan proceduren for at 
teste for androgener ikke desto mindre anbefales for steroide eller steroid ­
lignende kemikalier eller for kemikalier, for hvilke et tegn på mulige andro ­
gene virkninger blev afledt af metoder indeholdt i konceptrammens niveau 
1 eller 2 (tillæg 2). På samme måde kan der observeres skadevirkninger i forbindelse med (anti)androgene profiler i niveau 5-assays, hvilket skaber behov for at vurdere, om et kemikalie har en endokrin virkningsmåde.
 
10. Det er anerkendt, at alle dyrebaserede procedurer skal overholde lokale 
standarder for pasning af dyr. Nedenstående beskrivelser af pleje og 
behandling er minimumsstandarder og vil blive erstattet af lokale forskrifter 
såsom Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (26). OECD har udarbejdet yderligere vejledning om human behand ­
ling af dyr (17).
 
11. Som i ethvert bioassay, hvor der benyttes forsøgsdyr, skal det nøje over ­
vejes, om det er nødvendigt at udføre den pågældende undersøgelse. Grund ­
læggende kan der være to grunde til en sådan beslutning:  
— højt eksponeringspotentiale (niveau 1 i konceptrammen) eller tegn på 
(anti)androgenicitet i in vitro-assays (niveau 2) til støtte for undersø ­
gelser af, om sådanne virkninger kan optræde in vivo  
— virkninger i overensstemmelse med (anti)androgenicitet i in vivo-test på 
niveau 4 eller 5 til støtte for undersøgelser af den specifikke virknings ­
måde, f.eks. for at fastslå, om virkningerne skyldtes en (anti)androgen 
mekanisme.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Definitioner anvendt i denne testmetode er anført i tillæg 1.  
PRINCIP FOR TESTEN  
13. Hershberger-bioassayet opnår sin følsomhed ved at anvende hanner med en 
minimal endogen androgenproduktion. Dette opnås ved at anvende kastre ­
rede hanner, forudsat at der gives en passende tid efter kastration, så målvæ ­
vene kan vende tilbage til en minimal og ensartet basislinjevægt. Ved screening af potentiel androgen aktivitet er der således lave endogene 
niveauer af cirkulerende androgener, HPG-aksen (hypotalamus-hypofyse- 
gonade) gøres ude af stand til at kompensere via feedbackmekanismer, vævenes evne til at reagere maksimeres, og variabiliteten i vævets udgangs ­
vægt minimeres. Ved screening af potentiel antiandrogen aktivitet kan der 
opnås en mere konsistent vævsvægtforøgelse, når vævene stimuleres af et 
referenceandrogen. Som følge heraf kræver Hershberger-bioassayet kun seks dyr pr. dosisgruppe, mens det til andre assays med intakte pubertære eller voksne hanner foreslås at anvende 15 hanner pr. dosisgruppe.
 
14. Peripubertære hanner kastreres på passende vis under anvendelse af 
godkendte bedøvelsesmidler og aseptisk teknik. Smertestillende midler 
indgives i de første dage efter operation for at fjerne gener efter indgrebet. Kastration øger assayets præcision med hensyn til at detektere svage andro ­
gener og antiandrogener ved at fjerne kompenserende endokrine feed ­
backmekanismer, som er til stede i det intakte dyr, og som kan mildne 
virkningerne af indgivne androgener og antiandrogener, og ved at fjerne den store variation i serumtestosteronniveauer mellem individerne. Derfor mindsker kastration antallet af dyr, som det er nødvendigt at screene for 
disse endokrine aktiviteter.
 
15. Ved screening for potentiel androgen aktivitet indgives testkemikaliet 
dagligt ved oral sonde eller subkutan injektion i en periode på 10 på hinanden følgende dage. Testkemikalier indgives til minimum to behand ­
lingsgrupper af forsøgsdyr med ét dosisniveau pr. gruppe. Dyrene obduceres 
ca. 24 timer efter den sidste dosis. En statistisk signifikant stigning i vægten 
af to eller flere målorganer hos testkemikaliegrupperne sammenlignet med vehikelkontrolgruppen viser, at testkemikaliet er positivt for potentiel androgen aktivitet (se pkt. 60). Androgener som trenbolon, der ikke kan 
være 5α-reduceret, har mere udtalte virkninger på LABC og GP over for 
TP, men alle væv skal udvise øget vægt.
 
16. Ved screening for potentiel antiandrogen aktivitet indgives testkemikaliet 
dagligt ved oral sonde eller subkutan injektion i en periode på 10 på hinanden følgende dage sammen med daglige TP-doser (0,2 eller 0,4 
mg/kg/dag) ved subkutan injektion. Det blev fastslået i valideringsprogram ­
met, at enten 0,2 eller 0,4 mg TP/kg/dag kunne bruges, da begge var effektive til detektion af antiandrogener, og derfor skal kun én dosis vælges til brug i assayet. Graduerede testkemikaliedoser indgives til 
minimum tre behandlingsgrupper af forsøgsdyr med ét dosisniveau pr. 
gruppe. Dyrene obduceres ca. 24 timer efter den sidste dosis. Et statistisk signifikant fald i vægten af to eller flere målorganer hos de grupper, der får testkemikaliet plus TP, sammenlignet med kontrolgruppen, der kun får TP, 
viser, at testkemikaliet er positivt for potentiel antiandrogen aktivitet (se pkt. 
61).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Valg af art og stamme  
17. Rotten er rutinemæssigt blevet anvendt i Hershberger-bioassays siden 
1930'erne. Skønt det er biologisk plausibelt, at både rotter og mus vil 
udvise de samme reaktioner, er rotter den foretrukne art til Hershberger-bioassayet på grundlag af 70 års erfaring med rottemodellen. Da Hershberger-bioassaydata desuden måske er foreløbige forud for en 
langtidsundersøgelse af flere generationer, giver det mulighed for, at dyr 
fra den samme art, stamme og kilde kan anvendes i begge undersøgelser.
 
18. Denne protokol giver laboratorier mulighed for at udvælge den rottestamme, 
der skal anvendes i assayet, og som normalt skal være den, det deltagende 
laboratorium tidligere har brugt. Almindeligt anvendte forsøgsrottestammer 
kan anvendes. Dog skal stammer, der bliver kønsmodne betydeligt senere end ved 42-dages alderen, ikke anvendes, da kastration af disse hanner, når de er 42 dage, kan udelukke måling af vægten af glans penis, hvilket først 
kan ske, efter at forhuden er adskilt fra penisskaftet. Således bør stammer 
afledt af Fisher 344-rotten kun anvendes i sjældne tilfælde. Fisher 344- rotten bliver kønsmoden på et andet tidspunkt end andre mere almindeligt anvendte stammer såsom Sprague Dawley- eller Wistar-stammerne (16). 
Skal en sådan stamme anvendes, skal laboratoriet kastrere dem, når de er 
lidt ældre, og påvise den anvendte stammes følsomhed. Rationalet bag valget af rottestamme skal klart angives af laboratoriet. Hvis screeningas ­
sayet kan gennemføres som en forundersøgelse til en undersøgelse med 
gentagen oral dosis, en reproduktions- og udviklingsundersøgelse eller en 
langtidsundersøgelse, skal der helst bruges dyr fra samme stamme og kilde i alle undersøgelser.
 
Miljøbetingelser og fodring  
19. Alle procedurer skal overholde alle lokale standarder for pasning af forsøgs ­
dyr. Disse beskrivelser af pasning og behandling er minimumsstandarder og vil blive erstattet af strengere lokale forskrifter såsom Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 om beskyttelse af 
dyr, der anvendes til videnskabelige formål (26). Temperaturen i forsøgs ­
dyrrummet skal være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestå ­
ende af 12 timers lys og 12 timers mørke.
 
20. På grund af dyrenes unge alder og den kendsgerning, at rotter er sociale 
dyr, foretrækkes gruppeanbringelse frem for isolering. Når man anbringer to eller tre dyr pr. bur, undgår man sammenklumpning og dermed forbundet 
stress, som kan forstyrre den hormonale kontrol med udviklingen af sekun ­
dært kønsvæv. Burene renses grundigt for at fjerne mulige forurenende stoffer og anbringes således, at mulige virkninger som følge af burenes placering minimeres. Bure af korrekt størrelse (~ 2 000 cm
 2 ) vil forhindre 
sammenklumpning.  
21. Hvert dyr identificeres individuelt (f.eks. øremærke eller tag) under anven ­
delse af en human metode. Identifikationsmetoden registreres.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Laboratoriefoder og drikkevand gives ad libitum. Laboratorier, der udfører 
Hershberger-bioassays, skal bruge det laboratoriefoder, som normalt bruges 
i deres kemiske testarbejde. I valideringsundersøgelserne af bioassayet blev der ikke observeret virkninger eller variabilitet, som skyldtes kosten. Foderet registreres normalt, og en prøve på laboratoriefoderet opbevares 
til evt. fremtidig analyse.
 
Resultatkrav til androgenafhængig organvægt  
23. Under valideringsundersøgelsen var der intet bevis for, at et fald i krops ­
vægt påvirkede stigninger eller fald i væksten i målvævenes vægt (dvs. 
væv, som skulle vejes i den pågældende undersøgelse).  
24. Blandt de forskellige rottestammer, som med held blev anvendt i valide ­
ringsprogrammet, er den androgenafhængige organvægt større hos de tungere rottestammer end hos de lettere. Derfor omfatter resultatkravene til Hershberger-bioassayet ikke absolut forventede organvægtværdier for 
positive og negative kontroller.
 
25. Fordi variationskoefficienten for et væv har en omvendt sammenhæng med 
statistisk opløsningsgrad, er ydeevnekriterierne for Hershberger-bioassayet 
baseret på maksimale variationskoefficienter for hvert væv (tabel 1). Varia ­
tionskoefficienterne er afledt af OECD's valideringsundersøgelser. I tilfælde af negative resultater undersøger laboratorierne variationskoefficienterne fra 
kontrolgruppen og højdosisbehandlingsgruppen for at fastslå, om 
performance-kriteriet om maksimal variationskoefficient er overskredet.
 
26. Undersøgelsen gentages, når: 1) tre eller flere af de 10 mulige individuelle 
variationskoefficienter i kontrol- og højdosisbehandlingsgrupperne over ­
skrider de fastsatte maksimumsværdier for agonist- og antagonistundersø ­
gelser i tabel 1, og 2) mindst to målvæv var marginalt ubetydelige, dvs. 
r-værdier mellem 0,05 og 0,10.  
Tabel 1  
Maksimalt tilladelige variationskoefficienter bestemt for sekundære 
målkønsvæv for kastratmodellen i OECD's valideringsundersøgelser  ( 1 ). 
Væv Antiandrogene virk ­
ninger Androgene virkninger  
Vesiculae seminales 40 % 40 % 
Ventral prostata 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Cowpers kirtler 35 % 55 % 
Glans penis 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Tærskelvariationskoefficienten for et givet væv blev identificeret fra en graf af variations ­
koefficientværdier — anført fra sekventielt mindste til største — for alle gennemsnit fra 
alle forsøg i valideringsundersøgelsen under anvendelse af en bestemt model (agonist 
eller antagonist). Tærskelvariationskoefficienten blev læst fra det punkt, hvor interval ­
lerne mellem de næsthøjeste variationskoefficienter i serien er dramatisk større end de 
foregående få variationskoefficienter — »brudpunktet«. Det skal bemærkes, at skønt 
denne analyse identificerede relativt pålidelige »brudpunkter« for assayets antagonist ­
model, viste variationskoefficientkurver for agonistassayet en mere ensartet stigning, 
hvilket gør identificeringen af en tærskelvariationskoefficient noget tilfældig efter 
denne metode.
 FREMGANGSMÅDE  
Overholdelse af lovgivning og laboratoriekontrol  
27. I modsætning til det uterotrofiske assay (kapitel B.54 i dette bilag) er en 
påvisning af laboratoriets kompetence før iværksættelse af undersøgelsen 
ikke nødvendig ved Hershberger-assayet, fordi der som en integreret del af assayet samtidig foretages positive (testosteronpropionat og flutamid) og negative kontroller.
 
Dyrenes antal og vilkår  
28. Hver test- og kontrolgruppe skal omfatte minimum seks dyr. Dette gælder 
for både androgene og antiandrogene protokoller.  
Kastration  
29. Der skal være en indledende akklimatiseringsperiode på flere dage efter 
modtagelse af dyrene for at sikre, at dyrene er sunde og trives. Da dyr, 
som er kastreret, før de er 42 dage gamle eller før PND 42, måske ikke 
viser tegn på præputial separation, skal dyrene kastreres på PND 42 eller senere, ikke før. Dyrene kastreres under bedøvelse ved at lægge et indsnit i scrotum og fjerne både testes og epididymides med ligering af blodkar og 
sædgange. Efter bekræftelse af, at der ikke er opstået blødning, lukkes 
scrotum med sutur eller autoclips. Dyrene behandles med smertestillende midler i de første par dage efter operationen for at mildne evt. gener efter indgrebet. Købes kastrerede dyr fra en dyreleverandør, skal leverandøren 
garantere dyrenes alder og status for kønsmodning.
 
Akklimatisering efter kastration  
30. Dyrene fortsætter akklimatiseringen til laboratorieforholdene for at give 
vægten af målvævet tid til at falde i mindst syv dage efter kastration. 
Dyrene observeres dagligt, og dyr med tegn på sygdom eller fysiske abnor ­
miteter fjernes. Således kan behandling med iværksættelse af dosering (som undersøges) påbegyndes allerede på PND 49, men senest på PND 60. Alderen ved obduktion bør ikke være mere end PND 70. Denne fleksibilitet 
giver et laboratorium mulighed for at planlægge forsøgsarbejdet effektivt.
 
Kropsvægt og grupperandomisering  
31. Forskellene i individuel kropsvægt er en kilde til variabilitet i vævsvægt 
både inden for og imellem grupper af dyr. Stigende variabilitet i vævsvægt 
resulterer i en øget variationskoefficient og nedsætter assayets statistiske styrke (undertiden omtalt som assayets følsomhed). Derfor kontrolleres variationer i kropsvægt både eksperimentelt og statistisk.
 
32. Eksperimentel kontrol betyder, at der produceres små variationer i krops ­
vægt i og mellem undersøgelsesgrupperne. For det første må usædvanligt små eller store dyr undgås og må ikke placeres i en undersøgelseskohorte. 
Ved undersøgelsens start bør dyrenes vægtvariation ikke overstige ± 20 % 
af gennemsnitsvægten (f.eks. 175 g ± 35 g for kastrerede peripubertære rotter). For det andet tilordnes dyr til grupper (kontrol- og behandlings ­
grupper) ved randomiseret vægtfordeling, således at hver gruppes gennem ­
snitlige kropsvægt ikke er statistisk forskellig fra en anden gruppes. Den 
anvendte blokrandomiseringsprocedure registreres.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Da toksicitet kan nedsætte de behandlede gruppers kropsvægt i forhold til 
kontrolgruppens, kan kropsvægten på den første dags indgift af testkemi ­
kaliet bruges som statistisk kovarians, ikke kropsvægten ved obduktion.  
Dosering  
34. Til at fastslå, om et testkemikalie kan have androgen virkning in vivo, er to 
dosisgrupper for testkemikaliet plus positive og vehikel- (negative) kontrol ­
grupper (se pkt. 43) normalt tilstrækkelige, og dette design foretrækkes 
derfor af hensyn til dyrevelfærden. Hvis formålet er enten at opnå en dosis ­
responskurve eller at ekstrapolere til lavere doser, er der behov for mindst tre dosisgrupper. Hvis der kræves information ud over identificeringen af androgen aktivitet (såsom et skøn over styrke), må man overveje et andet 
dosisregime. For at teste for antiandrogener indgives testkemikaliet sammen 
med en referenceandrogenagonist. Der skal således bruges mindst tre test ­
grupper med forskellige doser af testkemikaliet og en positiv og en negativ kontrolgruppe (se pkt. 44). Med undtagelse af behandling med testkemika ­
liet behandles dyr i kontrolgruppen på samme måde som testgruppens dyr. 
Hvis der anvendes et vehikel til indgift af testkemikaliet, skal kontrol ­
gruppen modtage vehiklet i den højeste mængde, der bruges til testgrupperne.
 
35. Alle dosisniveauer foreslås og vælges under hensyntagen til evt. eksiste ­
rende toksicitets- og (toksiko-)kinetiske data om testkemikaliet eller mate ­
riale i den forbindelse. Ved det højeste dosisniveau tages der for det første hensyn til LD
 50 og/eller information om akut toksicitet for at undgå død, 
alvorlig lidelse eller gener for dyrene (17) (18) (19) (20) og for det andet til 
tilgængelige oplysninger om doser anvendt i subkroniske og kroniske 
undersøgelser. Generelt må den højeste dosis ikke forårsage en reduktion i dyrenes endelige kropsvægt på mere end 10 % af kontrolvægten. Den højeste dosis skal være enten 1) den højeste dosis, som sikrer dyrets over ­
levelse, og som er uden væsentlig toksicitet eller gener for dyrene efter 10 
på hinanden følgende dages indgift af op til en maksimal dosis på 1 000 mg/kg/dag (se pkt. 36), eller 2) en dosis, der fremkalder (anti)androgene virkninger, alt efter hvilken der er lavest. Til screening er store intervaller, 
f.eks. enheder a en halv logaritme (svarende til en dosisprogression på 3,2) 
eller enheder a en logaritme mellem doseringerne, acceptable. Foreligger der ikke passende data, kan der udføres en range-finding-undersøgelse (se pkt. 37) til bestemmelse af de doser, der skal anvendes.
 
Grænsedosis  
36. Såfremt en test med en grænsedosis på 1 000 mg/kg kropsvægt/dag og en 
lavere dosis ved anvendelse af procedurerne for denne undersøgelse ikke 
fremkalder en statistisk signifikant ændring i kønsorganernes vægt, kan supplerende dosisniveauer anses for unødvendige. Grænsedosis gælder, medmindre data om human eksponering viser, at der er behov for anven ­
delse af et højere dosisniveau.
 
Overvejelser over ‘range-finding’  
37. Om nødvendigt kan der udføres en foreløbig range-finding-undersøgelse 
med fem dyr for at vælge de egnede dosisgrupper [ved hjælp af metoder til bestemmelse af akut giftighed (kapitel B.1.A, B.1.B i dette bilag (27), OECD-testvejledning 425 (19))]. Formålet med Hershberger-bioassayet er at 
vælge doser, der sikrer dyrenes overlevelse, og som er uden væsentlig 
toksicitet eller gener for dyrene efter 10 på hinanden følgende dages
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
indgift af kemikaliet indtil en grænsedosis på 1 000 mg/kg/dag som anført i 
pkt. 35 og 36. I den forbindelse kan OECD's vejledning (17) bruges til at 
definere kliniske tegn på toksicitet eller lidelse for dyrene. Såfremt det er muligt inden for denne range-finding-undersøgelse, kan målvævene eksci ­
seres efter 10 dages indgift og vejes ca. 24 timer efter indgift af den sidste 
dosis. Disse data kan herefter bruges som input til valg af doser i hoved ­
undersøgelsen.
 
Referencekemikalier og vehikel  
38. Referenceandrogenagonisten skal være testosteronpropionat (TP), 
CAS-nr. 57-82-5. Reference-TP-doseringen kan være enten 0,2 mg/kg 
kropsvægt/dag eller 0,4 mg/kg kropsvægt/dag. Referenceandrogenantagoni ­
sten skal være flutamid (FT), CAS-nr. 1311-84-7. Reference-FT-doseringen skal være 3 mg/kg kropsvægt/dag, og FT indgives sammen med reference-TP-doseringen.
 
39. Det anbefales først at overveje en vandig opløsning/suspension, hvor det er 
muligt. Da mange androgene ligander eller deres metaboliske prækursorer 
imidlertid normalt er hydrofobe, er den mest almindelige fremgangsmåde at anvende en opløsning/suspension i olie (f.eks. majs-, jordnødde-, sesam- eller olivenolie). Testkemikalier kan opløses i en minimal mængde på 
95 % ethanol eller andre egnede opløsningsmidler og fortyndes til endelige 
arbejdskoncentrationer i testvehiklet. Opløsningsmidlets toksiske karakteri ­
stika skal være kendt og bør testes i en særskilt kontrolgruppe, som kun får opløsningsmiddel. Hvis testkemikaliet anses for stabilt, kan svag opvarm ­
ning og kraftig mekanisk påvirkning bruges til at fremme opløsningen af 
testkemikaliet. Testkemikaliets stabilitet i vehiklet skal bestemmes. Er test ­
kemikaliet stabilt, mens undersøgelsen står på, kan en startalikvot af test ­
kemikaliet tilberedes, og de angivne fortyndinger af dosis tilberedes dagligt, 
idet man må passe på, at prøverne ikke kontamineres og ødelægges.
 
Indgift af doser  
40. TP indgives ved subkutan injektion og FT i oral sonde.  
41. Testkemikaliet indgives ved oral sonde eller subkutan injektion. Dyrevel ­
færdshensyn og testkemikaliets fysisk-kemiske egenskaber tages i betragt ­
ning ved valg af indgiftsvej. Endvidere skal der tages hensyn til toksikolo ­
giske aspekter såsom relevansen af menneskers vej til eksponering for kemikaliet (f.eks. oral sonde over for modelindtagelse, subkutan injektion over for modelinhalation eller hudadsorption) og eksisterende toksikologisk 
information og data om metabolisme og kinetik (f.eks. behov for at undgå 
førstepassage-metabolisme, bedre effektivitet via en bestemt vej), før der iværksættes omfattende langtidstest, hvis der opnås positive resultater ved injektion.
 
42. Dyrene doseres på samme måde og med samme tidsinterval i 10 dage i træk 
med ca. 24 timers intervaller. Dosisniveauet justeres dagligt på grundlag af 
de samtidige daglige målinger af kropsvægt. Dosisvolumen og indgiftstids ­
punkt registreres på hver eksponeringsdag. Man skal passe på ikke at over ­
skride den maksimale dosis, jf. pkt. 35, for at sikre en meningsfuld data ­
fortolkning. Reduktion af kropsvægt, kliniske tegn og andre fund vurderes 
grundigt i den forbindelse. Ved oral sondefodring anvendes en mavesonde  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
eller en passende intubationskanyle. Hvor stor en væskemængde, der kan 
indgives på én gang, afhænger af forsøgsdyrets størrelse. Lokale retnings ­
linjer for pleje af dyr skal følges, men mængden bør ikke overstige 5 ml/kg kropsvægt undtagen i tilfælde af vandige opløsninger, hvor der kan bruges 10 ml/kg kropsvægt. Ved subkutane injektioner indgives doserne i de 
dorsoskapulære og lumbale regioner ved hjælp af en steril nål (f.eks. 
kaliber 23 eller 25) og en tuberkulinsprøjte. Det er valgfrit, om injektions ­
området barberes. Evt. tab eller lækage på injektionsstedet eller ufuld ­
stændig dosering registreres. Det samlede injicerede volumen pr. rotte pr. 
dag må ikke overstige 0,5 ml/kg kropsvægt.
 
Særlige procedurer for androgenagonister  
43. Til testen for androgenagonister er vehiklet den negative kontrol, og den 
TP-behandlede gruppe er den positive kontrol. Biologisk aktivitet i over ­
ensstemmelse med androgenagonister testes ved at give behandlingsgrup ­
perne et testkemikalie i de valgte doser i 10 dage i træk. Vægten af de fem sekundære kønsvæv fra testkemikaliegrupperne sammenlignes med vehikel ­
gruppen for statistisk signifikante vægtstigninger.
 
Særlige procedurer for androgenantagonister og 5 α-reduktasehæmmere  
44. Til testen for androgenantagonister og 5 α-reduktasehæmmere er den 
TP-behandlede gruppe den negative kontrol, og gruppen, der samtidig har 
fået referencedoser af TP og FT, er den positive kontrolgruppe. Biologisk 
aktivitet i overensstemmelse med androgenantagonister og 5 α-reduktase ­
hæmmere testes ved at indgive en referencedosis TP og testkemikaliet i 10 dage i træk. Vægten af de fem sekundære kønsvæv fra TP-plus-testke ­
mikaliegrupperne sammenlignes med den gruppe, der kun har fået 
reference-TP, for statistisk signifikante vægtstigninger.
 
OBSERVATIONER  
Kliniske observationer  
45. Generelle kliniske observationer foretages mindst én gang om dagen og 
hyppigere, hvis der observeres tegn på toksicitet. Observationer skal helst udføres på samme tidspunkt(er) hver dag og under hensyntagen til perioden for den forventede maksimale virkning efter dosering. Alle dyr observeres 
for mortalitet, morbiditet og generelle kliniske tegn såsom ændringer i 
adfærd, hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion og ekskretion samt autonom aktivitet (f.eks. tåreflåd, piloerektion, pupilstørrelse, usæd ­
vanligt respirationsmønster).
 
46. Et dyr, som findes død, fjernes og bortskaffes uden yderligere dataanalyse. 
Et dyrs mortalitet før obduktion registreres i undersøgelsesrapporten sammen med evt. umiddelbare dødsårsager. Et moribund dyr aflives 
humant. Moribunde og efterfølgende aflivede dyr registreres i undersøgel ­
sesrapporten med umiddelbare morbiditetsårsager.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Kropsvægt og foderindtagelse  
47. Alle dyr vejes dagligt til nærmeste 0,1 g begyndende lige før indledningen 
af behandlingen, dvs. når dyrene fordeles i grupper. Som valgfri måling kan 
mængden af indtaget foder i behandlingsperioden måles pr. bur ved at veje fodringssystemerne. Resultaterne for foderindtagelsen udtrykkes i gram pr. rotte pr. dag.
 
Dissektion og måling af vævs- og organvægt  
48. Ca. 24 timer efter den sidste indgift af testkemikaliet aflives rotterne og 
afblødes ifølge de normale procedurer for det laboratorium, som forestår undersøgelsen, og obduktionen udføres. Den humane aflivningsmetode regi ­
streres i laboratorierapporten.
 
49. Ideelt set skal obduktionsrækkefølgen være vilkårlig på tværs af grupper for 
at undgå progression direkte op eller ned i forhold til dosisgrupper, som kan 
påvirke dataene. Evt. fund ved obduktionen, dvs. patologiske ændringer/ synlige læsioner, noteres og rapporteres.
 
50. De fem androgenafhængige væv (VP, SV, LABC, COW, GP) vejes. Disse 
væv udtages, renses omhyggeligt for overskydende bindevæv og fedt, og deres friske (ufikserede) vægt bestemmes. Hvert væv håndteres med særlig omhu for at undgå tab af væsker og udtørring, som kan give betydelige fejl 
og variabilitet ved at nedsætte den registrerede vægt. Flere af vævene kan 
være meget små eller vanskelige at dissekere, hvilket vil skabe variabilitet. Derfor er det vigtigt, at personer, der udfører dissektion af sekundære køns ­
væv, kender standardprocedurerne for dissektion af disse væv. OECD har 
udgivet en manual for standardoperationsprocedurer (SOP) ved dissektion 
(21). Omhyggelig træning efter SOP-vejledningen vil minimere en potentiel kilde til variation i undersøgelsen. Ideelt set skal den samme prosektor være ansvarlig for dissektion af et givet væv for at fjerne individuelle forskelle i 
vævsbehandling. Hvis dette ikke er muligt, udformes obduktionen således, 
at hver prosektor dissekerer et givet væv fra alle behandlingsgrupper i modsætning til, at én person dissekerer alle væv fra en kontrolgruppe, mens en anden er ansvarlig for behandlingsgrupperne. Hvert sekundært 
kønsvæv vejes uden aftørring til nærmeste 0,1 mg, og vægtværdierne regi ­
streres for hvert dyr.
 
51. Flere af vævene kan være meget små eller vanskelige at dissekere, hvilket 
vil skabe variabilitet. Tidligere arbejde har vist en række variationskoeffi ­
cienter, som ser ud til at afvige på grund af laboratoriets kompetence. I nogle få tilfælde er der konstateret store forskelle i absolut vævsvægt såsom VP og COW hos et bestemt laboratorium.
 
52. Vægt af lever, parrede nyrer og parrede binyrer er valgfrie målinger. Igen 
skal væv være renset for bindevævshinder og fedt. Leveren vejes og regi ­
streres til nærmeste 0,1 g, og de parrede nyrer og binyrer vejes og regi ­
streres til nærmeste 0,1 mg. Lever, nyrer og binyrer påvirkes ikke blot af 
androgener, de giver også nyttige indekser for systemisk toksicitet.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Serummåling af luteiniserende hormon (LH), follikelstimulerende 
hormon (FSH) og testosteron (T) er valgfri. Serum-T-niveauer er nyttige 
til at fastslå, om testkemikaliet fremkalder levermetabolisme af testosteron og sænker serumniveauer. Uden T-data kunne en sådan virkning se ud til at ske via en antiandrogen mekanisme. LH-niveauer giver information om et 
antiandrogens evne til ikke blot at reducere organvægt, men også til at 
påvirke hypothalamus-hypofyse-funktionen, hvilket i langtidsundersøgelser kan fremkalde testistumorer FSH er et vigtigt hormon for spermatogenesen. Serum T4 og T3 er også valgfrie målinger, der giver nyttig supplerende 
information om evnen til at forstyrre thyroidehormonbalancen. Såfremt 
hormonmålingerne skal foretages, bedøves rotterne forud for obduktion, og blod udtages ved hjertepunktur, og bedøvelsesmetoden vælges omhyg ­
geligt, således at den ikke påvirker hormonmålingen. Serumtilberednings ­
metoden, kilden til radioimmunanalyse eller andet måleudstyr, analytiske 
procedurer samt resultater registreres. LH-niveauer anføres som ng pr. ml serum, og T anføres også som ng pr. ml serum.
 
54. Dissektionen af væv beskrives som følger, idet der er udgivet en detaljeret 
dissektionsvejledning med fotografier som supplerende materiale som led i valideringsprogrammet (21). En dissektionsvideo er også tilgængelig fra den koreanske fødevare- og lægemiddelstyrelses hjemmeside (22).
 
— Med dyrets ventrale overflade opad fastslås, om penis' forhud er adskilt 
fra glans penis. I bekræftende fald trækkes forhuden tilbage, og glans penis fjernes, vejes (nærmeste 0,1 mg), og vægten registreres.
 
— Åbn abdominalhud og -væg, så viscera ligger blottede. Såfremt de valg ­
frie organer vejes, fjernes og vejes leveren til nærmeste 0,1 g, mave og indvolde fjernes, de parrede nyrer og binyrer fjernes og vejes til 
nærmeste 0,1 mg. Ved denne dissektion eksponeres blæren, og dissek ­
tionen af hannens sekundære målvæv påbegyndes.
 
— VP dissekeres ved at adskille blæren fra det ventrale muskellag, idet 
bindevævet skæres langs midterlinjen. Fjern blæren fortil imod vesiculae 
seminales (SV), så venstre og højre prostatalap blotlægges ventralt (dækket af et lag fedt). Adskil omhyggeligt fedtet fra højre og venstre VP-lap. Fjern forsigtigt højre VP-lap fra uretra, og disseker uretralappen. 
Hold fast i højre VP-lap, og fjern forsigtigt venstre VP-lap fra uretra, og 
disseker. Vej til nærmeste 0,1 mg, og registrer vægten.
 
— For at dissekere vesiculae seminales med prostata anterior (SVGC) 
fjernes blæren bagtil, så vas deferens og højre og venstre lap af vesi ­
culae seminales med prostata anterior (SVCG) blotlægges. Forebyg væskelækage ved hjælp af en karklemme ved grunden af SVCG'erne, hvor vas deferens hæfter på uretra. Disseker omhyggeligt SVCG'erne 
med karklemmen på plads, rens for fedt og adneksa, placer i et tareret 
vejekar, fjern karklemmen, vej til nærmeste 0,1 mg, og registrer vægten.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— For at dissekere levator ani-bulbocavernosus-musklerne (LABC) blot ­
lægges musklerne og penis' basis. LA-musklerne vikler sig omkring 
colon, mens LA anterior og BC-musklerne hæfter på bulbus penis. Hud og adneksa fra det perianale område, der strækker sig fra penis' basis til den forreste del af anus, fjernes. BC-musklerne dissekeres 
gradvist fra bulbus penis og væv. Colon skæres i to, og hele LABC 
kan dissekeres og fjernes. LABC renses for fedt og adneksa, vejes til nærmeste 0,1 mg, og vægten registreres.
 
— Efter fjernelse af LABC er de runde Cowpers (COW) eller bulbouretrale 
kirtler synlige ved basis af og lidt dorsalt i forhold til bulbus penis. For at forhindre væskelækage er omhyggelig dissektion påkrævet for at 
undgå at ramme den tynde kapsel. Vej de parrede COW til nærmeste 
0,1 mg, og registrer vægten.
 
— Hvis der tabes væske fra en kirtel under obduktion og dissektion, skal 
det registreres.  
55. Hvis vurderingen af hvert kemikalie kræver obduktion af flere dyr, end det 
er rimeligt for en enkelt dag, kan undersøgelsens start forskydes over to på 
hinanden følgende dage, hvilket fører til forskydning af obduktion og 
arbejdet i den forbindelse over to dage. Foretages en sådan forskydning, anvendes halvdelen af dyrene pr. behandlingsgruppe pr. dag.
 
56. Kadavere bortskaffes på passende vis efter obduktion.  
RAPPORTERING  
Data  
57. Data rapporteres individuelt (dvs. kropsvægt, vægt af sekundære kønsvæv, 
valgfrie målinger og andre reaktioner og observationer) og for hver gruppe 
af dyr (gennemsnit og standardafvigelser for alle målingerne). Data opsum ­
meres i tabelform. Dataene skal vise antallet af dyr ved testens begyndelse, antallet af dyr, som blev fundet døde under testen eller fundet med tegn på toksicitet, en beskrivelse af de observerede tegn på toksicitet, herunder 
begyndelsestidspunkt, varighed og sværhedsgrad.
 
58. Den endelige rapport skal indeholde:  
Testlaboratorium  
— laboratoriets navn, placering  
— forsøgsleder og andre medarbejdere og deres undersøgelsesansvar  
— datoer for undersøgelsens begyndelse og afslutning, dvs. henholdsvis 
første dag for indgift af testkemikaliet og sidste dag for obduktion.  
Testkemikalie  
— oprindelse, parti-/batchnummer, betegnelse, renhed, leverandørens fuld ­
stændige adresse og karakterisering af testkemikalie(r)  
— fysisk form og, hvor det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber  
— opbevaringsforhold samt metode og frekvens for tilberedning af fortyn ­
ding 
— evt. data genereret vedrørende stabilitet  
— evt. analyser af testopløsninger/-suspensioner.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Vehikel  
— karakterisering af vehikel (betegnelse, leverandør og batchnr.)  
— begrundelse for valg af vehikel (hvis andet end vand).  
Forsøgsdyr og procedurer for dyrehold  
— anvendt art/stamme og begrundelse for valg  
— dyrenes oprindelse eller leverandør, herunder fuldstændig adresse  
— antal leverede dyr og deres alder  
— miljøbetingelser (temperatur, belysning osv.)  
— foder (navn, type, leverandør, partinummer, indhold, og hvis det er 
kendt, fytoøstrogenniveauer)  
— strøelse (navn, type, leverandør, indhold)  
— anbringelsesforhold og antal dyr pr. bur.  
Assaybetingelser  
— alder ved kastration og akklimatiseringens varighed efter kastration  
— de enkelte dyrs vægt ved undersøgelsens begyndelse (til nærmeste 
0,1 g)  
— randomiseringsproces og registrering af fordelingen til vehikel-, 
reference-, testkemikaliegrupper og bur  
— kropsvægtgennemsnit og -standardafvigelse for hver gruppe for hver 
vejedag under hele undersøgelsen  
— rationale for valg af dosis  
— indgift af testkemikalie og rationale for valg af eksponeringsvej  
— i tilfælde af assay for antiandrogenicitet, TP-behandling (dosis og volu ­
men)  
— testkemikaliebehandling (dosis og volumen)  
— doseringstidspunkt  
— obduktionsprocedurer, herunder afblødningsmetoder og evt. bedøvelses ­
midler  
— hvis der foretages serumanalyser, oplyses metode Hvis der f.eks. fore ­
tages radioimmunanalyse (RIA), rapporteres RIA-procedure, leverandør af RIA-udstyr, udstyrets udløbsdatoer, procedurer for scintillationstæl ­
ling og standardisering.
 
Resultater  
— daglige observationer for hvert dyr under dosering, herunder:  
— kropsvægt (til nærmeste 0,1 g)  
— (evt.) kliniske tegn  
— måling af eller notater vedrørende foderindtagelse  
— obduktionsobservationer for hvert dyr, herunder:  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— obduktionsdato  
— dyrets behandlingsgruppe  
— dyret id  
— prosektor  
— tidspunkt på dagen, hvor obduktion og dissektion er foretaget  
— dyrets alder  
— endelig kropsvægt ved obduktion med angivelse af statistisk signifikant 
stigning eller fald  
— rækkefølge for afblødning og dissektion af dyret ved obduktion  
— vægt for de fem androgenafhængige målvæv:  
— ventral prostata (til nærmeste 0,1 mg)  
— vesiculae seminales med prostata anterior, inkl. væske (parrede til 
nærmeste 0,1 mg)  
— levator ani plus bulbocavernosus-muskelkompleks (til nærmeste 0,1 mg)  
— Cowpers kirtler (frisk vægt — parrede, til nærmeste 0,1 mg)  
— glans penis (frisk vægt til nærmeste 0,1 mg)  
— vægt af valgfrie væv, hvis de måles:  
— lever (til nærmeste 0,1 g)  
— nyrer (parrede, til nærmeste 0,1 mg)  
— binyrer (parrede, til nærmeste 0,1 mg)  
— generelle bemærkninger og kommentarer  
— evt. serumanalyser af hormoner  
— serum LH (valgfrit — ng pr. ml serum)  
— serum T (valgfrit — ng pr. ml serum)  
— generelle bemærkninger og kommentarer.  
Opsummering af data  
Data opsummeres i tabelform indeholdende prøvestørrelse for hver gruppe, 
middelværdi og standardmiddelfejl eller standardafvigelse. Tabellerne skal 
indeholde kropsvægt ved obduktion, ændringer i kropsvægt fra doseringens 
begyndelse indtil obduktion, vægt af sekundære målkønsvæv og evt. valgfri organvægt.
 
Diskussion af resultater  
Analyse af resultater  
59. Krops- og organvægt ved obduktion analyseres statistisk for kendetegn 
såsom varianshomogenitet med passende transformation af data efter 
behov. Behandlingsgrupper sammenlignes med en kontrolgruppe under 
anvendelse af teknikker såsom ANOVA efterfulgt af parvise sammenlig ­
ninger (f.eks. Dunnetts ensidede test) og kriteriet for statistisk forskel, f.eks. p ≤ 0,05. De grupper, som opnår statistisk signifikans, identificeres. 
»Relativ organvægt« bør dog undgås på grund af de ugyldige statistiske 
antagelser, der ligger til grund for denne datamanipulation.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. For androgen agonisme skal kontrollen være testgruppen, som kun får 
vehikel. Et testkemikalies karakteristiske virkemåde kan føre til forskellige 
relative reaktioner mellem væv, f.eks. trenbolon, som ikke kan være 5 α- 
reduceret og har mere udtalte virkninger på LABC og GP, end TP har. En statistisk signifikant stigning (p ≤ 0,05) i to eller flere af de fem androgen ­
afhængige målvævs vægt (VP, LABC, GP, CG og SVCG) betragtes som et 
positivt androgenagonistresultat, og alle målvæv bør udvise en vis grad af vækstforøgelse. En kombineret evaluering af alle sekundære kønsorganers vævsreaktioner kan fås gennem en passende flerdimensional dataanalyse. 
Dette kan forbedre analysen, især i tilfælde, hvor kun et enkelt væv giver en 
statistisk signifikant respons.
 
61. For androgenantagonisme skal kontrollen være den testgruppe, som kun får 
referenceandrogen (kun testosteronpropionat). Et testkemikalies karakteri ­
stiske virkemåde kan føre til forskellige relative reaktioner mellem væv, 
f.eks. har 5 α-reduktasehæmmere som finasterid mere udtalte virkninger på 
ventral prostata end andre væv sammenlignet med potente AR-antagonister såsom flutamid. En statistisk signifikant reduktion (p ≤ 0,05) i to eller flere 
af de fem androgenafhængige målvævs vægt (VP, LABC, GP, CG og 
SVCG) i forhold til TP-behandling alene betragtes som et positivt andro ­
genantagonistresultat, og alle målvæv bør udvise en vis grad af vækstre ­
duktion. En kombineret evaluering af alle sekundære kønsorganers vævs ­
reaktioner kan fås gennem en passende flerdimensional dataanalyse. Dette 
kan forbedre analysen, især i tilfælde, hvor kun et enkelt væv giver en 
statistisk signifikant respons.
 
62. Data opsummeres i tabelform indeholdende middelværdi, standardmiddelfejl 
(standardafvigelse vil også være acceptabel) og prøvestørrelse for hver gruppe. Individuelle datatabeller medtages også. De individuelle værdier, 
middelværdi, standardmiddelfejl (standardafvigelse) og variationskoeffici ­
entværdier for kontroldataene undersøges for at fastslå, om de opfylder acceptable kriterier for konsistens med forventede tidligere værdier. Varia ­
tionskoefficienter, der overskrider variationskoefficientværdier anført i tabel 
1 (se pkt. 25 og 26) for hver organvægt, afgør, om der er fejl i dataregi ­
strering eller -indlæsning, eller om laboratoriet endnu ikke har behersket nøjagtig dissektion af de androgenafhængige væv, og yderligere uddannel ­
se/praksis er berettiget. Normalt er variationskoefficienter (standardafvi ­
gelsen divideret med den gennemsnitlige organvægt) reproducerbar fra labo ­
ratorium til laboratorium og fra undersøgelse til undersøgelse. De fremlagte data skal som minimum omfatte: vægt af ventral prostata, vesiculae semi ­
nales, levator ani plus bulbocavernosus, Cowpers kirtler, glans penis, lever 
samt kropsvægt og kropsvægtændring fra begyndelsen af doseringen til 
obduktion. Dataene kan også præsenteres efter kovariansjustering for krops ­
vægt, men dette erstatter ikke fremlæggelse af de ujusterede data. Såfremt præputial separation (PPS) ikke forekommer i nogen af grupperne, regi ­
streres desuden PPS-forekomsten, der sammenlignes statistisk med kontrol ­
gruppen under anvendelse af Fisher Exact-testen.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Ved kontrol af computerindlæsninger af data med de originale datablade 
med henblik på nøjagtighed skal organvægtværdier, som ikke er biologisk 
plausible eller varierer med mere end tre standardafvigelser fra den pågæl ­
dende behandlingsgruppes gennemsnit, nøje undersøges, og man kan være nødt til at se bort fra dem, da de sandsynligvis er registreringsfejl.
 
64. En sammenligning af undersøgelsesresultater med OECD's variationskoef ­
ficientværdier (i tabel 1) er ofte et vigtigt skridt i fortolkningen af under ­
søgelsesresultaternes validitet. Tidligere data for vehikelkontrolgrupper opbevares i laboratoriet. Tidligere data for reaktioner på positive reference ­
kemikalier såsom TP og FT skal også opbevares i laboratoriet. Laboratori ­
erne kan også periodisk teste reaktionen på kendte svage androgenagonister 
og -antagonister og opbevare disse data. Disse data kan sammenlignes med tilgængelige OECD-data for at sikre, at laboratoriets metoder giver tilstræk ­
kelig statistisk præcision og styrke.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Androgen  er en term, der bruges til at beskrive en positiv påvirkning af væksten 
af androgenafhængige væv.  
Antiandrogen  er et kemikalies evne til at undertrykke virkningen af TP i et 
pattedyrs organisme.  
Kemikalie  betyder et stof eller en blanding.  
Fødselsdato  er dag 0 efter fødslen (PND).  
Dosis  er mængden af indgivet testkemikalie. For Hershberger-bioassayet 
udtrykkes dosis som vægt af et testkemikalie pr. enhed af forsøgsdyrets krops ­
vægt pr. dag (f.eks. mg/kg kropsvægt/dag).  
Dosering  er en generel term, som omfatter dosis samt doseringsfrekvens og 
-varighed.  
Moribund  er en term, der bruges til at beskrive et dyr, som er døende.  
Postnatal dag X  er den X. levedag efter fødselsdagen (PND).  
Følsomhed  er en testmetodes evne til korrekt at identificere kemikalier, der har 
den egenskab, som der testes for.  
Specificitet  er en testmetodes evne til korrekt at identificere kemikalier, der ikke 
har den egenskab, som der testes for.  
Testkemikalie  betyder et stof eller en blanding, som testes ved hjælp af denne 
testmetode.  
Validering  er en videnskabelig proces til at karakterisere en testmetodes opera ­
tionelle krav og begrænsninger og påvise dens pålidelighed og relevans til et 
bestemt formål.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Tillæg 2
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 NOTER TIL RAMMEN  
Note 1:  Det er muligt at gå ind og ud på alle niveauer; afhænger af arten 
af eksisterende informationsbehov med henblik på fare- og 
risikovurdering.  
Note 2:  På niveau 5 skal økotoksikologi omfatte endepunkter, der viser 
skadelige virkningsmekanismer og potential skade på befolkningen.
 
Note 3:  Når en multimodal model dækker flere single endpoint assays, 
vil modellen erstatte brugen af de pågældende single endpoint 
assays.  
Note 4:  Vurderingen af hvert kemikalie skal ske i hvert enkelt tilfælde 
under inddragelse af al tilgængelig information og under hensyn ­
tagen til rammeniveauernes funktion.  
Note 5:  Rammen omfatter ikke alt på det givne tidspunkt. På niveau 3, 4 
og 5 omfatter den assays, der enten er tilgængelige, eller hvor valideringen er på vej. Med hensyn til sidstnævnte er disse fore ­
løbigt inkluderet. Når de er udviklet og valideret, vil de blive 
formelt tilføjet til rammen.
 
Note 6:  Niveau 5 omfatter ikke kun endelige test. Test inkluderet på dét 
niveau bidrager til generel fare- og risikovurdering.  
LITTERATUR  
1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.-11. marts 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antian ­
drogenic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Protocols in 
Toxicology  16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.  
4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testo ­
sterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30.  
5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists 
and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate 
Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.
 
9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413-422.  
10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306- 
1314.  
11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38-44.  
12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119.
 
13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180.  
14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220.
 
16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p 38.  
17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
19) OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
21) Supplemental materials for Owens et al. (2006) The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. Se afsnit II, The dissection guidance provided to 
the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf
 
22) Korea Food and Drug Administration. Visuelt opslagsværk om 
Hershberger-assayproceduren, herunder en dissektionsvideo. http:// rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html
 
23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties. Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
26) Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 
2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål 
(EUT L 276 af 20.10.2010, s. 33).  
27) Følgende kapitler i dette bilag:  
B.1.A, Akut oral toksicitet — fastdosismetoden  
B.1.B, Akut oral toksicitet — akut toksicitetsklassemetoden  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56  UDVIDET REPRODUKTIONSTOKSICITETSUNDERSØG ELSE I 
ÉN GENERATION  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD-testvejledningen (TG) 443 (2012). Den 
er baseret på forslaget fra International Life Science Institute (ILSI)-Health and Environmental Sciences Institute (HESI), Agricultural Chemical Safety Assessment (ACSA) Technical Committee til en F
 1 -udvidet 
livsstadie-reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation som offent ­
liggjort i Cooper et al., 2006 (1). Der er foretaget flere forbedringer og præciseringer i undersøgelsesdesignet for at sikre fleksibilitet og understrege betydningen af at begynde med eksisterende viden og samtidig bruge obser ­
vationer i levende live til at styre og skræddersy testen. Denne testmetode 
giver en detaljeret beskrivelse af den operationelle udførelse af en udvidet reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation. Testmetoden inde ­
holder en beskrivelse af tre kohorter af F
 1 -dyr:  
kohorte 1: vurdering af reproduktions-/udviklingsmæssige endepunkter. 
Denne kohorte kan udvides til at omfatte en F  2 -generation  
kohorte 2: vurdering af den potentielle virkning af kemikalieeksponering på 
det endnu ikke færdigudviklede nervesystem  
kohorte 3: vurdering af den potentielle virkning af kemikalieeksponering på 
det endnu ikke færdigudviklede immunsystem.  
2. Beslutninger om, hvorvidt den anden generation skal vurderes, og udvik ­
lingsneurotoksicitetskohorten og/eller udviklingsimmunotoksicitetskohorten udelades, skal afspejle eksisterende viden om det kemikalie, som evalueres, 
samt forskellige myndigheders behov. Formålet med testmetoden er at 
skaffe oplysninger om, hvordan undersøgelsen kan udføres, og vise, hvordan hver kohorte skal evalueres.
 
3. Proceduren for beslutningen om, hvad der internt udløser produktionen af 
en anden generation, beskrives i OECD's vejledning 117 (39) for de rege ­
ludstedende myndigheder, som anvender interne triggere.  
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG FORMÅL  
4. Hovedformålet med den udvidede reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én 
generation er at vurdere specifikke livsstadier, som ikke er dækket af andre typer af toksicitetsundersøgelser, og teste for virkninger, der kan forekomme som resultat af eksponering for kemikalier før og efter fødslen. Som ende ­
punkter for reproduktionsevnen er det planen, at der som første trin bruges 
evt. tilgængelig information fra undersøgelser med gentagen dosis (bl.a. screeningundersøgelser af reproduktionstoksicitet, f.eks. OECD TG 422 (32)) eller korttidsscreeningassays af hormonforstyrrende stoffer (f.eks. et 
uterotrofisk assay — testmetode B.54 (36) og Hershberger-assay — test ­
metode B.55 (37)) til at detektere virkninger på hanners og hunners repro ­
duktionsorganer. Det kunne omfatte spermatogenese (testikulær histopato ­
logi) for hanner og brunstcyklusser, follikeltælling/oocytmodning og ovarie ­
integritet (histopatologi) for hunner. Den udvidedereproduktionstoksicitets ­
undersøgelse i én generation tjener herefter som test for endepunkterne for reproduktionsevnen, som kræver samspil mellem hanner og hunner, hunner med conceptus og hunner med afkom og F
 1 -generationen indtil efter køns ­
modning (se OECD's vejledning 151, som underbygger denne testmetode 
(40)).  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Testmetoden er udformet, så den giver en evaluering af kemikaliers præ- og 
postnatale virkninger på udviklingen samt en grundig evaluering af syste ­
misk toksicitet hos drægtige og diegivende hunner og ungt og voksent afkom. En detaljeret undersøgelse af vigtige udviklingsmæssige endepunkter såsom afkommets levedygtighed, neonatale sundhed, udviklingsmæssige 
status ved fødslen og fysiske og funktionsmæssige udvikling indtil voksen ­
alderen forventes at afdække bestemte målorganer hos afkommet. Endvidere vil undersøgelsen give og/eller bekræfte oplysninger om et testkemikalies virkninger på voksne hanners og hunners forplantningssystemers integritet 
og ydeevne. Specifikt, men ikke udelukkende, betragtes følgende parametre: 
gonadefunktion, brunstcyklus, modning af sperma i epididymis, parrings ­
adfærd, konception, drægtighed, nedkomst og diegivning. Endvidere vil oplysninger fra udviklingsneurotoksicitets- og udviklingsimmunotoksicitets ­
vurderingerne karakterisere potentielle virkninger i de pågældende systemer. 
Data afledt af disse test bør give mulighed for at bestemme niveauer uden observerede negative effekter (NOAEL'er), laveste niveauer for observerede negative effekter (LOAEL'er) og/eller benchmarkdoser for de forskellige 
endepunkter og/eller kan bruges til at karakterisere virkninger detekteret i 
tidligere undersøgelser med gentagen dosis og/eller tjene som vejledning for efterfølgende test.
 
6. En skematisk tegning af protokollen kan ses i figur 1. Testkemikaliet 
indgives kontinuerligt i graduerede doser til forskellige grupper af køns ­
modne hanner og hunner. Denne forældregeneration (P-generation — F  0 ) 
modtager testkemikaliet i en defineret periode før parring (valgt på grundlag af tilgængelig information om testkemikaliet, men mindst to uger) og i en to uger lang parringsperiode. P-hanner behandles yderligere mindst indtil 
fravænning af F
 1 . De behandles i mindst 10 uger. De kan behandles læng ­
ere, hvis der er behov for at afklare virkninger på reproduktionen. Behand ­
ling af P-hunnerne fortsættes under drægtighed og diegivning, indtil deres kuld er fravænnet (dvs. 8-10 ugers behandling). F
 1 -afkommet modtager 
yderligere behandling med testkemikaliet fra fravænning til voksenalderen. 
Hvis en anden generation vurderes (se OECD's vejledning 117 (39)), skal F
 1 -afkommet fortsat være under behandling indtil fravænningen af F  2 , eller 
indtil undersøgelsen afsluttes.  
7. Kliniske observationer og patologiske undersøgelser udføres på alle dyr for 
tegn på toksicitet med særlig vægt på hanners og hunners forplantnings ­
systemers integritet og ydeevne samt afkommets sundhed, vækst, udvikling og funktionsevne. Ved fravænningen tilordnes udvalgte unger til særlige 
undergrupper (kohorte 1-3, se pkt. 33 og 34 og figur 1) til yderligere 
undersøgelser, bl.a. kønsmodning, kønsorganernes integritet og funktion, neurologiske og adfærdsmæssige endepunkter samt immunfunktioner.
 
8. Ved gennemførelse af undersøgelsen følges de vejledende principper og 
overvejelser, der er anført i OECD's vejledning nr. 19, om anerkendelse, 
vurdering og anvendelse af kliniske tegn som humane endepunkter for 
forsøgsdyr, der bruges i sikkerhedsevalueringer (34).  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Når et tilstrækkeligt antal undersøgelser er tilgængelige til at konstatere, 
hvordan dette nye undersøgelsesdesign virker, skal testmetoden gennemgås 
og om nødvendigt revideres på baggrund af de indhøstede erfaringer.  
Figur 1  
Skema over den udvidede reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation
  
BESKRIVELSE AF METODEN/FORBEREDELSER TIL TESTEN  
Dyr 
Valg af dyreart og stamme  
10. Valget af art til reproduktionstoksicitetstesten overvejes nøje med udgangs ­
punkt i al tilgængelig information. På grund af omfanget af baggrundsdata 
og sammenligneligheden med generelle toksicitetstest foretrækkes rotten 
dog normalt, og kriterier og henstillinger i denne testmetode vedrører denne art. Hvis en anden art anvendes, skal det begrundes, og relevante ændringer i protokollen vil være nødvendige. Stammer med lav frugtbarhed 
eller en velkendt høj forekomst af spontane udviklingsdefekter bør ikke 
anvendes.
 
Alder, kropsvægt og inddragelseskriterier  
11. Der anvendes sunde forældredyr, som ikke har været omfattet af tidligere 
testprocedurer. Både hanner og hunner skal undersøges, og hunnerne må ikke tidligere have født eller være drægtige. P-dyrene skal være kønsmodne, 
af samme vægt (inden for køn) ved indledning af doseringen, være af 
samme alder (ca. 90 dage) ved parring og være repræsentative for den undersøgte art og stamme. Dyrene akklimatiseres i mindst fem dage efter ankomst. Dyrene tilordnes vilkårligt til kontrol- og behandlingsgrupper på 
en måde, som giver sammenlignelige gennemsnitlige kropsvægtværdier 
mellem grupperne (dvs. ± 20 % af gennemsnittet).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Miljøbetingelser og fodring  
12. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 °C (± 3 °C). Den relative 
luftfugtighed skal være 30-70 % med et ideelt niveau på 50-60 %. Den kunstige belysning fastsættes til 12 timers lys og 12 timers mørke. Der 
kan anvendes normalt laboratoriefoder med ubegrænset forsyning af drik ­
kevand. Foderets fytoøstrogene indhold overvåges nøje, da et højt fytoøst ­
rogenniveau i foderet kan påvirke visse reproduktionsmæssige endepunkter. Standardiseret foder med oplyst sammensætning og reduceret indhold af 
østrogene kemikalier anbefales (2) (30). Valget af foder kan påvirkes af 
behovet for at sikre en passende iblanding af testkemikaliet, når denne indgiftsmåde anvendes. Testkemikaliets indhold, homogenitet og stabilitet 
i foderet skal kontrolleres. Foder og drikkevand analyseres jævnligt for 
forurenende stoffer. Prøver på hver batch foder, der anvendes under under ­
søgelsen, opbevares under passende forhold (f.eks. frosset ved – 20 °C), indtil rapporten er færdig, i tilfælde af at resultaterne kræver en yderligere 
analyse af foderingredienserne.
 
13. Dyrene anbringes i bure i små grupper af samme køn og behandlings ­
gruppe. De kan anbringes enkeltvis for at undgå mulige skader (f.eks. 
hanner efter parringsperioden). Parring skal finde sted i egnede bure. Efter bevis for kopulation anbringes hunner, som antages at være drægtige, 
separat i fødsels- eller yngelbure, hvor de forsynes med passende og defi ­
neret redemateriale. Kuldene anbringes med deres mødre indtil fravænning. F
 1 -dyr anbringes i små grupper af samme køn og behandlingsgruppe fra 
fravænning til undersøgelsens afslutning. Hvis det er sagligt begrundet, kan 
dyrene anbringes individuelt. Indholdet af fytogenøstrogener i det valgte 
strøelsesmateriale skal være minimalt.  
Antal og identifikation af dyr  
14. Normalt skal hver forsøgs- og kontrolgruppe indeholde et tilstrækkeligt 
antal parrede dyr til, at der kan blive mindst 20 drægtige hunner pr. dosis ­
gruppe. Formålet hermed er at sikre, at der produceres tilstrækkelig meget afkom til, at der kan foretages en meningsfuld vurdering af kemikaliets potentielle virkning på fertilitet, drægtighed og moderdyrenes adfærd i 
P-generationen samt vækst og udvikling i F
 1 -generationen fra konception 
til kønsmodning. Hvis det ikke lykkes at frembringe det ønskede antal drægtige dyr, er undersøgelsen ikke nødvendigvis ugyldig, og der bør finde en konkret vurdering sted i det enkelte tilfælde, idet en mulig årsags ­
sammenhæng med testkemikaliet overvejes.
 
15. Hvert P-dyr tildeles et entydigt identifikationsnummer, før doseringen påbe ­
gyndes. Såfremt tidligere laboratoriedata tyder på, at en signifikant del af hunnerne måske ikke har regelmæssige (fire- eller femdages) brunstcyklus ­
ser, anbefales det at foretage en vurdering af brunstcyklusserne før behand ­
lingens start. Alternativt kan gruppestørrelsen øges for at sikre, at mindst 20 
hunner i hver gruppe har regelmæssige (fire- eller femdages) brunst ­
cyklusser ved behandlingens begyndelse. Alt F
 1 -afkom identificeres enty ­
digt, når de nyfødte undersøges første gang på dag 0 eller 1 efter 
fødslen (PND) Under hele undersøgelsen registreres det for alle udvalgte 
F 1 -dyr og evt. F  2 -dyr, hvilket kuld de er fra.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Testkemikalie  
Tilgængelig information om testkemikaliet  
16. Det er vigtigt at gennemgå eksisterende information med henblik på beslut ­
ninger om indgiftsvej, valg af vehikel, valg af dyreart, valg af doseringer og 
potentielle ændringer af doseringsplan. Derfor skal alle relevante tilgænge ­
lige informationer om testkemikaliet, dvs. fysisk-kemiske, toksikokinetiske (herunder artsspecifik metabolisme), toksikodynamiske egenskaber, struktur-aktivitetsrelationer (SAR), metaboliske processer in vitro, resultater 
af tidligere toksicitetsundersøgelser og relevant information om strukturelt 
beslægtede stoffer, tages i betragtning ved planlægning af den udvidede reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation. Foreløbig information om absorption, distribution, metabolisme og eliminering (ADME) og 
bioakkumulation kan afledes af kemisk struktur, fysisk-kemiske data, 
omfanget af plasmaproteinbinding eller toksikokinetiske (TK) undersøgel ­
ser, mens resultater af toksicitetsundersøgelser giver supplerende infor ­
mation, f.eks. om NOAEL, metabolisme eller induktion af metabolisering.
 
Overvejelser om toksikokinetiske data  
17. TK-data fra tidligere gennemførte range-finding-undersøgelser af dosis eller 
andre undersøgelser er ikke påkrævede, selv om de er særdeles nyttige ved planlægningen af undersøgelsesdesign, valg af dosisniveauer og fortolkning af resultater. Særligt nyttige er data, som: 1) kontrollerer eksponering af 
ikkefærdigudviklede fostre samt unger for testkemikaliet (eller relevante 
metabolitter), 2) giver et skøn over intern dosimetri og 3) evaluerer potentiel dosisafhængig mætning af kinetiske processer. Evt. supplerende TK-data såsom metabolitprofiler, koncentrationstidsforløb osv. skal også overvejes. 
Supplerende TK-data kan også indsamles i løbet af hovedundersøgelsen, 
forudsat at det ikke griber forstyrrende ind i indsamling og fortolkning af hovedundersøgelsens endepunkter.
 
Som en generel vejledning vil følgende TK-datasæt være nyttige i planlæg ­
ningen af den udvidede reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation:
 
— sen drægtighed (f.eks. den 20. dag i drægtighedsperioden) — moderens 
blod, fostrets blod  
— midt i diegivningsperioden (PND 10) — moderens blod, ungens blod 
og/eller mælk  
— tidlig fravænningsperiode (f.eks. PND 28) — prøver fra det fravænnede 
dyr. 
Der udvises fleksibilitet ved bestemmelsen af specifikke analyter (f.eks. 
oprindeligt kemikalie og/eller metabolitter) og prøveudtagningsplan. F.eks. 
vil antallet af og tidspunkter for prøveindsamlinger på en given prøveind ­
samlingsdag afhænge af eksponeringsvej og forudgående viden om TK-egenskaber hos ikkedrægtige dyr. Til foderundersøgelser er prøvetag ­
ning på et enkelt konsistent tidspunkt på hver af disse dage tilstrækkeligt, 
mens sondedosering kan kræve yderligere prøvetagningstidspunkter for at opnå et bedre skøn over spektret af interne doser. Det er dog ikke nødven ­
digt at generere et fuldt koncentrationstidsforløb på nogen af prøvetagnings ­
dagene. Om nødvendigt kan blod samles efter køn inden for kuld med 
henblik på foster- og neontalanalyser.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Indgiftsvej  
18. Ved valg af indgiftsvej tages hensyn til de(n) vej(e), som er mest relevant(e) 
i forbindelse med human eksponering. Skønt protokollen er designet til indgift af testkemikaliet gennem foderet, kan den ændres til indgift ad 
andre veje (drikkevand, sonde, inhalation, dermal optagelse) alt efter kemi ­
kaliets karakteristika og de ønskede oplysninger.
 
Valg af vehikel  
19. Hvor det er nødvendigt, opløses eller suspenderes kemikaliet i et egnet 
vehikel. Hvor det er muligt, anbefales det først at se på anvendelsen af en vandig opløsning/suspension og herefter en opløsning/suspension i olie (f.eks. majsolie). For andre vehikler end vand skal vehiklets toksiske egen ­
skaber være kendt. Anvendelsen af vehikler med potentiel iboende toksicitet 
skal undgås (f.eks. acetone, DMSO). Testkemikaliets stabilitet i vehiklet skal bestemmes. Der tages hensyn til følgende karakteristika, hvis et vehikel eller andet tilsætningsstof anvendes til at lette doseringen: indvirk ­
ningen på testkemikaliets absorption, distribution, metabolisme eller reten ­
tion; virkninger på testkemikaliets kemiske egenskaber, som kan ændre dets toksiske karakteristika, samt indvirkningen på dyrenes føde- og vandind ­
tagelse eller ernæringstilstand.
 
Valg af dosis  
20. Normalt skal undersøgelsen omfatte mindst tre dosisniveauer og en sidelø ­
bende kontrol. Ved valg af passende dosisniveauer skal undersøgeren se på 
al tilgængelig information, herunder doseringsinformation fra tidligere 
undersøgelser, TK-data fra drægtige eller ikkedrægtige dyr, omfanget af mælkeoverførsel og skøn over human eksponering. Hvis tilgængelige TK-data viser dosisafhængig mætning af TK-processer, skal høje dosis ­
niveauer, der klart viser mætning, omhyggeligt undgås, forudsat naturligvis, 
at menneskers eksponeringer forventes at ligge en del under mætningspunk ­
tet. I sådanne tilfælde skal det højeste dosisniveau ligge på eller bare lidt over vendepunktet for overgangen til ikkelineær TK-adfærd.
 
21. I mangel af relevante TK-data baseres dosisniveauerne på toksiske virk ­
ninger, medmindre de er begrænset af testkemikaliets fysisk-kemiske 
art. Er dosisniveauerne baseret på toksicitet, vælges den højeste dosis med det formål at fremkalde en vis systemisk toksicitet, men ikke dyrets død eller alvorlig lidelse.
 
22. En faldende række dosisniveauer vælges for at påvise evt. dosisafhængige 
virkninger og fastslå NOAEL'er eller doser nær detektionsgrænsen, som vil 
give mulighed for at udlede en benchmarkdosis for de mest følsomme endepunkter. For at undgå store dosismellemrum mellem NOAEL'er og LOAEL'er er to- eller firefoldsintervaller ofte optimalt. Det foretrækkes 
ofte at tilføje en fjerde testgruppe i stedet for at anvende et meget stort 
interval (f.eks. mere end en faktor 10) mellem doserne.
 
23. Med undtagelse af behandling med testkemikaliet håndteres dyr i kontrol ­
gruppen på samme måde som testgruppens dyr. Denne gruppe skal være ubehandlet eller have placebo eller være en vehikelkontrolgruppe, hvis der 
anvendes et vehikel til indgift af testkemikaliet. Hvis der bruges et vehikel, 
skal kontrolgruppen have vehiklet i den højeste mængde, der bruges.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Grænsetest  
24. Såfremt der ikke er evidens for toksicitet ved en dosis på mindst 1 000 
mg/kg kropsvægt/dag i undersøgelser med gentagen dosis, eller hvis data fra strukturelt og/eller metabolisk beslægtede kemikalier, som ligner 
hinanden med hensyn til in vivo/in vitro-metaboliske egenskaber ikke 
giver anledning til at forvente toksicitet, er en undersøgelse med flere dosis ­
niveauer måske ikke nødvendig. I sådanne tilfælde kunne den udvidede reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation foretages med en 
kontrolgruppe og en enkelt dosis på mindst 1 000 mg/kg kropsvægt/dag. 
Skulle der imidlertid blive konstateret evidens for reproduktions- eller udviklingsmæssig toksicitet ved denne grænsedosis, vil yderligere undersø ­
gelser ved lavere dosisniveauer være påkrævet for at identificere NOAEL. 
Disse grænsetestovervejelser gælder kun, når human eksponering ikke indi ­
kerer behovet for et højere dosisniveau.
 
PROCEDURER  
Eksponering af afkom  
25. Fodereksponering er den foretrukne indgiftsmetode. Hvis der udføres under ­
søgelser med indgift gennem sonde, skal det bemærkes, at ungerne normalt 
kun får testkemikaliet indirekte gennem mælken, indtil direkte dosering 
begynder for dem ved fravænning. I undersøgelser med indgift gennem foder eller drikkevand vil ungerne desuden modtage testkemikaliet direkte, 
når de begynder selv at æde i den sidste uge af laktationsperioden. 
Ændringer i undersøgelsesdesignet skal overvejes, når udskillelse af testke ­
mikaliet i mælken er dårlig, og hvis der mangler evidens for, at afkommet stadig eksponeres. I disse tilfælde overvejes en direkte dosering af unger i 
laktationsperioden på grundlag af tilgængelig TK-information, toksicitet i 
afkommet eller ændringer i biomarkører (3) (4). Fordele og ulemper over ­
vejes omhyggeligt, før der foretages undersøgelser med direkte dosering på unger i laktationsperioden (5).
 
Doseringsplan og indgift af doser  
26. Nogle oplysninger om brunstcyklusser, histopatologi for hanners og hunners 
forplantningssystem og analyse af testis-/epididymissperma kan være 
tilgængelige fra tidligere toksicitetsundersøgelser med gentagen dosis af passende varighed. Varigheden af behandlingen før parring i den udvidede reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation har derfor til formål at 
detektere virkninger på funktionsændringer, der kan forstyrre parrings ­
adfærd og befrugtning. Behandlingen før parring skal være tilstrækkeligt lang til at opnå ligevægtseksponeringsbetingelser hos P-hanner og -hunner. En to uger lang behandling før parring anses for passende for begge køn i 
de fleste tilfælde. For hunner dækker dette tre til fire fulde brunstcyklusser 
og bør være tilstrækkeligt til at detektere evt. skadevirkninger på cyklicite ­
ten. For hanner svarer det til den tid, der er nødvendig for epididymal transit af modnende spermatozoer, og bør give mulighed for at detektere 
posttestikulære virkninger på spermaen (under de sidste stadier af spermia ­
tion og spermamodning i epididymis) ved parring. Ved testens afslutning, når tidspunkterne fastsættes for histopatologisk undersøgelse af testikler og epididymis og analyse af spermaparametre, vil P- og F
 1 -hannerne have 
været eksponeret i mindst én hel spermatogen proces ((6) (7) (8) (9) og 
OECD's vejledning 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Eksponeringsscenarierne for hanner før parring kan justeres, hvis testikel ­
toksicitet (forringelse af spermatogenesen) eller virkninger på spermainte ­
gritet og -funktion er blevet klart identificeret i tidligere undersøgelser. På samme måde kan kendte virkninger af testkemikaliet på brunstcyklussen og dermed befrugtningsdygtigheden for hunner begrunde andre eksponerings ­
scenarier før parring. I særlige tilfælde kan det være acceptabelt, at behand ­
ling af P-hunner først indledes, efter at der er opnået et spermapositivt smear (se OECD's vejledning 151 (40)).
 
28. Når doseringsperioden før parring er fastlagt, behandles dyrene kontinuerligt 
med testkemikaliet syv dage om ugen indtil obduktion. Alle dyr doseres ved samme metode. Dosering fortsætter i den to uger lange parringsperiode og 
for P-hunner gennem drægtighed og laktation indtil afslutningen af testen 
efter fravænning. Hanner behandles på samme måde indtil testens afslutning på det tidspunkt, hvor F
 1 -dyrene er vænnet fra. Til obduktion prioriteres 
hunnerne højest, idet de obduceres på samme laktationsdag. Obduktion af 
hanner kan spredes over et større antal dage alt efter laboratoriets faciliteter. 
Medmindre den direkte dosering af udvalgte F  1 -hanner og -hunner er 
iværksat i laktationsperioden, påbegyndes den ved fravænning og fortsætter indtil planlagt obduktion alt efter kohortetilordningen.
 
29. Når kemikalier indgives via foder eller drikkevand, er det vigtigt at sikre, at 
de pågældende mængder af testkemikaliet ikke griber forstyrrende ind i den 
normale ernærings- eller vandbalance. Når testkemikaliet indgives i foderet, 
kan der bruges enten en konstant foderkoncentration (ppm) eller en konstant dosisstørrelse i forhold til dyrets kropsvægt. Den valgte mulighed angives.
 
30. Indgives testkemikaliet ved sonde, må den indgivne væskemængde på én 
gang normalt ikke overskride 1 ml/100 g kropsvægt (0,4 ml/100 g krops ­
vægt er maksimum for olie, f.eks. majsolie). Hvis der ikke er tale om 
lokalirriterende eller ætsende kemikalier, hvis effekt sædvanligvis er værre 
ved højere koncentrationer, skal variabiliteten af testvolumenet minimeres gennem justering af koncentrationen, således at der sikres et konstant volumen ved alle dosisniveauer. Behandlingen indgives på samme tids ­
punkter hver dag. Dosis til hvert dyr baseres normalt på den seneste indi ­
viduelle bestemmelse af kropsvægt og justeres mindst én gang om ugen for voksne hanner og voksne ikkedrægtige hunner og hver anden dag for drægtige hunner og F
 1 -dyr, når indgiften sker før fravænning, og i to 
uger efter fravænningen. Hvis TK-data viser en lav placentaoverførsel af 
testkemikaliet, kan man være nødt til at justere sondedosis i den sidste drægtighedsuge for at undgå at indgive en alt for toksisk dosis til moder ­
dyret. På dagen for fødslen må hunner ikke behandles med sonde eller 
andre indgiftsformer, hvor dyret skal håndteres. Det er bedre at undlade 
indgift af testkemikaliet den dag frem for at forstyrre fødselsprocessen.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Parring  
31. Hver P-hun anbringes sammen med en enkelt vilkårligt udvalgt ubeslægtet 
han fra samme dosisgruppe (1:1-parring), indtil der observeres evidens for 
kopulation, eller der er gået to uger. Hvis der ikke er hanner nok, f.eks. på grund af død inden parring, kan der parres en eller flere hanner, som allerede har været parret (1:1) med en anden hun/andre hunner, således at 
alle hunner parres. Dag 0 i drægtighedsperioden defineres som den dag, 
hvor evidens for parring bekræftes (der observeres vaginalprop eller sper ­
ma). Dyr adskilles snarest muligt, efter at evidens for kopulation er obser ­
veret. Hvis parring ikke er sket efter to uger, adskilles dyrene uden yder ­
ligere mulighed for parring. De parrede dyr skal være tydeligt identificeret i 
dataene.
 
Kuldstørrelse  
32. På dag 4 efter fødslen standardiseres hvert kuld, ved at overskydende unger 
fjernes ved vilkårlig udvælgelse, således at hvert kuld kommer så tæt som muligt på at bestå af fem handyr og fem hundyr pr. kuld. Selektiv fjernelse 
af unger, f.eks. baseret på kropsvægt, er ikke hensigtsmæssig. Når antallet 
af han- eller hununger gør det umuligt at få fem af hvert køn i hvert kuld, er en delvis standardisering (f.eks. seks hanner og fire hunner) acceptabel.
 
Udvælgelse af unger til undersøgelser efter fravænning (se figur 1)  
33. Ved fravænning (omkring PND 21) vælges unger fra alle tilgængelige kuld, 
op til 20 pr. dosis- og kontrolgruppe, til yderligere undersøgelser og 
beholdes indtil kønsmodning (medmindre tidligere test er påkrævet). Ungerne vælges vilkårligt, bortset fra at de, der tydeligvis er mindst (dyr med en kropsvægt over to standardafvigelser under den gennemsnitlige 
vægt for unger i det respektive kuld), ikke medtages, da de sandsynligvis 
ikke vil være repræsentative for behandlingsgruppen.
 
På PND 21 tilordnes de udvalgte F  1 -unger vilkårligt til en af de tre kohorter 
af dyr, som følger:  
kohorte 1 (1A og 1B)= reproduktions-/udviklingstoksicitetstest  
kohorte 2 (2A og 2B)= udviklingsneurotoksicitetstest  
kohorte 3= udviklingsimmunotoksicitetstest.  
Kohorte 1A: Én han og én hun/ét kuld/én gruppe (20/køn/gruppe): priori ­
teret udvælgelse til primær vurdering af virkninger på forplantningssystemer 
og af generel toksicitet.  
Kohorte 1B: Én han og én hun/ét kuld/én gruppe (20/køn/gruppe): priori ­
teret udvælgelse til opfølgende vurdering af reproduktionsevnen ved at 
parre F  1 -dyr ved vurdering (se OECD's vejledning 117 (39)) og for at få 
supplerende histopatologiske data i tilfælde af mistanke om reproduktions- 
eller hormonforstyrrende stoffer, eller når resultaterne fra kohorte 1A er 
usikre.  
Kohorte 2A: I alt 20 unger pr. gruppe (10 hanner og 10 hunner pr. gruppe, 
én han eller én hun pr. kuld) tilordnes til neuroadfærdstest efterfulgt af neurohistopatologisk vurdering som voksne.
 
Kohorte 2B: I alt 20 unger pr. gruppe (10 hanner og 10 hunner pr. gruppe, 
én han eller én hun pr. kuld) tilordnes til neurohistopatologisk vurdering 
ved afvænning (PND 21 eller PND 22). Hvis antallet af dyr er utilstræk ­
keligt, skal der helst tilordnes dyr til kohorte 2A.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Kohorte 3: I alt 20 unger pr. gruppe (10 hanner og 10 hunner pr. gruppe, én 
pr. kuld, hvor det er muligt). Yderligere unger kan være nødvendige fra 
kontrolgruppen til at fungere som positive kontroldyr i det T-celleafhængige antistofresponsassay (TDAR) på PND 56 ± 3.
 
34. Skulle der være et utilstrækkeligt antal unger i et kuld til alle kohorter, er 
kohorte 1 vigtigst, da den kan udvides til at producere en F  2 -generation. 
Ekstra unger kan tilordnes til alle kohorter i tilfælde af særlige hensyn, f.eks. hvis et kemikalie mistænkes for at være et stof med neurotoksisk, 
immunotoksisk eller reproduktionstoksisk virkning. Disse unger kan 
anvendes til undersøgelser på forskellige tidspunkter eller til evaluering af supplerende endepunkter. Unger, som ikke tilordnes til kohorter, vil blive underkastet klinisk-biokemiske målinger (pkt. 55) og makroskopisk obduk ­
tion (pkt. 68).
 
Anden parring af P-dyr  
35. En anden parring anbefales normalt ikke for P-dyr, da man derved mister 
vigtige oplysninger om antallet af implantationssteder (og således data om 
den letale virkning efter implantation og perinatalt tab, som er indikatorer 
for et muligt teratogent potentiale) for det første kuld. Behovet for at kontrollere eller klarlægge en virkning hos eksponerede hunner kan opfyldes bedre ved at udvide undersøgelsen til at omfatte en parring af 
F
 1 -generationen. En anden parring af P-hanner med ubehandlede hunner 
er dog altid en mulighed for at tydeliggøre usikre resultater eller for yder ­
ligere at karakterisere fertilitetsvirkninger observeret ved den første parring.  
OBSERVATIONER I LEVENDE LIVE  
Kliniske observationer  
36. For P- og de udvalgte F  1 -dyr foretages der en generel klinisk observation én 
gang om dagen. Ved sondedosering skal tidspunktet for kliniske observa ­
tioner ligge før og efter doseringen (for mulige tegn på toksicitet i forbin ­
delse med maksimal plasmakoncentration). Relevante adfærdsændringer, 
tegn på vanskelig eller langvarig fødsel og alle tegn på toksicitet registreres. To gange dagligt og i weekenden én gang dagligt observeres alle dyr for svær toksicitet, morbiditet og mortalitet.
 
37. Endvidere foretages en mere detaljeret undersøgelse af alle P- og F  1 -dyr 
(efter fravænning) én gang om ugen, hvilket passende kan ske i forbindelse med vejning af dyret, hvilket mindsker håndteringsstress. Observationerne 
foretages omhyggeligt og registreres under anvendelse af bedømmelses ­
systemer, som er defineret af testlaboratoriet. Det er vigtigt at sikre, at variationer i testbetingelserne er minimale. Observationerne rettes bl.a. mod ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion og 
ekskretion samt autonom aktivitet (f.eks. tåreflåd, piloerektion, pupilstør ­
relse, usædvanligt respirationsmønster). Tillige registreres ændringer i gang, kropsholdning og reaktion på håndtering såvel som forekomst af kloniske eller toniske bevægelser, stereotyp optræden (f.eks. overdreven 
soignering, stadig kredsen i cirkelbevægelser) eller mærkelig adfærd 
(f.eks. selvmutilation, baglæns gang).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Kropsvægt og foder-/vandindtagelse  
38. P-dyr vejes den første doseringsdag og siden mindst én gang om ugen. 
Endvidere vejes diegivende P-dyr på de samme dage, som ungerne i 
deres kuld vejes (se pkt. 44). Alle F  1 -dyr vejes individuelt ved fravænning 
(PND 21) og siden mindst én gang om ugen. Kropsvægten registreres også den dag, de når puberteten (når præputial separation eller vaginal åbning er 
afsluttet). Alle dyr vejes ved aflivning.
 
39. I løbet af undersøgelsen registreres foder- og vandindtagelse (såfremt test ­
kemikaliet indgives i drikkevandet) mindst én gang om ugen den samme dag som vejningen af dyrets kropsvægt (undtagen i den periode, hvor 
dyrene er sammen). Foderindtagelsen for hvert bur med F
 1 -dyr registreres 
ugentligt og påbegyndes ved udvælgelsen til de respektive kohorter.  
Brunstcyklusser  
40. Foreløbig information om testkemikaliets virkninger på brunstcyklussen kan 
allerede være tilgængelig fra tidligere toksicitetsundersøgelser med gentagen 
dosis og kan bruges til udformning af en testkemikaliespecifik protokol til 
den udvidede reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation. Normalt vil vurderingen af brunstcyklus (ved vaginal cytologi) starte ved begyn ­
delsen af behandlingsperioden og fortsætte, indtil parringen er bekræftet 
eller til afslutningen af den to uger lange parringsperiode. Hvis hunnerne 
er blevet screenet for normal brunstcyklus før behandlingen, er det nyttigt at fortsætte med smearing, når behandlingen starter, men hvis man er bekymret for uspecifikke virkninger ved behandlingens begyndelse (såsom 
en markant reduktion i foderindtagelse i begyndelsen), kan dyrene få lov til 
at tilpasse sig behandlingen i op til to uger før begyndelsen af den tougers smearingperiode, der fører til parringen. Udvides hunnens behandlings ­
periode på denne måde (dvs. til en fireugers behandling før parring), bør 
man tænke på at købe dyrene yngre og udvide hannens behandlingsperiode 
før parring. Udtagning af celleprøve fra vagina/cervix skal ske forsigtigt for at undgå forstyrrelse af slimhinden med efterfølgende fremkaldelse af pseu ­
dodrægtighed (10) (11).
 
41. Vaginalt smear undersøges dagligt for alle F  1 -hunner i kohorte 1A efter 
indtræden af vaginalåbning, og indtil det første forhornede smear er regi ­
streret, for at bestemme tidsintervallet mellem disse to hændelser. Brunst ­
cyklusser for alle F  1 -hunner i kohorte 1A overvåges også i en periode på to 
uger fra omkring PND 75. Skulle parring af F  1 -generationen blive nødven ­
dig, følges desuden den vaginale cytologi i kohorte 1B fra tidspunktet for parring, indtil der er evidens for parringen.
 
Parring og drægtighed  
42. Ud over standardendepunkter (f.eks. kropsvægt, foderindtagelse, kliniske 
observationer, herunder mortalitets-/morbiditetskontroller) registreres dato ­
erne for parring, datoen for insemination og datoen for fødsel, og det prækoitale interval (parring til insemination) og drægtighedens varighed (insemination til fødsel) beregnes. P-hunner undersøges omhyggeligt på 
tidspunktet for forventet fødsel for evt. tegn på dystoki. Evt. abnormiteter 
i redeadfærd eller yngelpleje registreres.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Den dag, fødslen går i gang, er laktationsdag 0 (LD 0) for moderdyret og 
postnatal dag 0 (PND 0) for afkommet. Alternativt kan alle sammenlig ­
ninger også baseres på postkoital tid for ikke at sammenblande postnatale udviklingsdata og forskelle i drægtighedens varighed, men tidspunktet for fødslen skal dog også registreres. Dette er særligt vigtigt, når testkemikaliet 
påvirker drægtighedens varighed.
 
Parametre for afkom  
44. Hvert kuld undersøges snarest muligt efter fødslen (PND 0 eller 1) for at 
fastslå ungernes antal og køn, dødfødte, levendefødte og tilstedeværelse af 
alvorlige abnormiteter (eksternt synlige abnormiteter såsom ganespalte, 
subkutane blødninger, anormal hudfarve eller -tekstur, tilstedeværelse af navlestreng, manglende mælk i maven, tilstedeværelse af indtørrede sekre ­
ter). Desuden skal den første kliniske undersøgelse af nyfødte omfatte en 
kvalitativ vurdering af kropstemperatur, aktivitetsstatus og reaktion på hånd ­
tering. Unger, som findes døde på PND 0 eller senere, undersøges for mulige defekter og dødsårsag. Levende unger tælles og vejes individuelt på PND 0 eller PND 1 og regelmæssigt herefter, f.eks. som minimum på 
PND 4, 7, 14 og 21. Kliniske undersøgelser i forhold til dyrenes alder 
gentages, når afkommet vejes, eller oftere, hvis der er gjort konkrete fund ved fødslen. Tegn, der skal noteres, omfatter, men er ikke begrænset til, ydre abnormiteter, ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af 
sekretion og ekskretion samt autonom aktivitet. Tillige registreres ændringer 
i gang, kropsholdning og reaktion på håndtering såvel som forekomsten af kloniske eller toniske bevægelser, stereotyp optræden eller mærkelig adfærd.
 
45. Hver unges anogenitale afstand (AGD) måles mindst én gang fra PND 0 til 
PND 4. Ungens kropsvægt registreres den dag, AGD måles, og AGD normaliseres til et mål for ungens størrelse, helst kubikroden af kropsvægten 
(12). Tilstedeværelsen af brystvorter/areolae hos hanunger kontrolleres på 
PND 12 eller 13.
 
46. Alle udvalgte F  1 -unger vurderes dagligt for balano-præputial separation eller 
åbning af vagina for henholdsvis hanner og hunner, og vurderingen 
begynder før den dag, hvor disse endepunkter forventes nået, for at konsta ­
tere, om kønsmodningen indtræder tidligt. Evt. abnormiteter i kønsorganer såsom vedvarende vaginaltråd, hypospadia eller spaltet penis noteres. F
 1 - 
dyrs kønsmodenhed sammenlignes med fysisk udvikling ved at bestemme 
alder og kropsvægt ved balano-præputial separation eller åbning af vagina 
for henholdsvis hanner og hunner (13).  
Vurdering af potentiel udviklingsneurotoksicitet (kohorte 2A og 2B)  
47. 10 hanner og 10 hunner i kohorte 2A og 10 hanner og 10 hunner i kohorte 
2B fra hver behandlingsgruppe (for hver kohorte: én han eller én hun pr. 
kuld, idet alle kuld repræsenteres af mindst én vilkårligt udvalgt unge) anvendes til neurotoksicitetsvurderinger. Kohorte 2A-dyr underkastes auditiv startle, ‘functional observational battery’, motorisk aktivitet (se 
pkt. 48-50) og neuropatologiske vurderinger (se pkt. 74-75). Man skal 
bestræbe sig på at sikre, at variationer i alle testbetingelser er minimale
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
og ikke systematisk relateres til behandlingen. Blandt variabler, som kan 
påvirke adfærden, er lydstyrke (f.eks. intermitterende støj), temperatur, luft ­
fugtighed, belysning, lugte, tidspunkt på dagen og forstyrrelser fra omgi ­
velserne. Resultater af neurotoksicitetsassays fortolkes i forhold til relevante tidligere kontrolreferenceintervaller. Kohorte 2B-dyr anvendes til neuropa ­
tologisk vurdering på PND 21 eller PND 22 (se pkt. 74-75).
 
48. En auditiv startle-test udføres på PND 24 (± 1 dag) under anvendelse af dyr 
i kohorte 2A. Testdagen afbalanceres med behandlings- og kontrolgrupper. 
Hver session består af 50 forsøg. Ved udførelse af den auditive startle-test 
bestemmes den gennemsnitlige responsamplitude på hver blok a 10 forsøg (fem blokke a 10 forsøg), idet testbetingelserne optimeres, så der skabes tilvænning inden for den enkelte session. Disse procedurer skal være i 
overensstemmelse med testmetode B.53 (35).
 
49. På et passende tidspunkt mellem PND 63 og PND 75 underkastes kohorte 
2A-dyrene et ‘functional observational battery’ og en automatiseret test af 
motorisk aktivitet. Disse procedurer skal være i overensstemmelse med 
testmetode B.43 (33) og B.53 (35). ‘Functional observational battery’ omfatter en grundig beskrivelse af forsøgsdyrets udseende, adfærd og funk ­
tionsmæssige integritet. Dette vurderes gennem observationer i dyrets eget 
bur, efter fjernelse til et standardareal til observation (åbent felt), hvor dyret bevæger sig frit, og gennem manipulationstest. Progressionen går fra den mindst til den mest interaktive test. En liste over målinger er anført i tillæg 
1. Alle dyr observeres nøje af uddannede observatører, som ikke kender 
dyrenes behandlingsstatus og følger standardiserede procedurer for at mini ­
mere variabilitet, som skyldes observatørerne. Hvor det er muligt, anbefales det, at den samme observatør vurderer dyrene i en given test. Hvis det ikke 
er muligt, skal det påvises, at der er en vis pålidelighed mellem observa ­
tørerne. For hver parameter i gruppen af adfærdstest anvendes der ekspli ­
citte operationelt definerede bedømmelseskriterier og -skalaer. Om muligt udvikles der objektive kvantitative mål for observationsendepunkter, der 
omfatter subjektiv rangordning. Med hensyn til motorisk aktivitet testes 
hvert dyr individuelt. Testsessionen skal være lang nok til at påvise kontrol ­
dyrenes tilvænning inden for den enkelte session. Motorisk aktivitet over ­
våges af et automatisk aktivitetsregistrerende apparat, som skal kunne 
afsløre både stigninger og fald i aktiviteten (dvs. at referenceaktiviteten 
som målt af anordningen ikke må være så lav, at fald ikke afsløres, og heller ikke så høj, at aktivitetsstigninger ikke registreres). Hver anordning testes efter standardprocedurer for så vidt muligt at sikre operationens påli ­
delighed på tværs af anordninger og dage. Så vidt muligt skal behandlings ­
grupperne være ligeligt fordelt over anordningerne. Behandlingsgrupper udlignes på tværs af testgange for at undgå sammenblanding af cirkadiske aktivitetsrytmer.
 
50. Såfremt eksisterende information viser behov for andre funktionstest (f.eks. 
sensorisk, social, kognitiv), integreres disse uden at skade integriteten af de øvrige evalueringer, som foretages i undersøgelsen. Hvis testen udføres med 
de samme dyr, som bruges til standard auditiv startle, functional observa ­
tional battery og test af motorisk aktivitet, fastsættes der forskellige test for at minimere risikoen for at skade integriteten af disse test. Supplerende procedurer kan være særligt nyttige, når empiriske observationer, forventede 
virkninger eller virkningsmekanisme/virkemåde peger på neurotoksicitet af 
en bestemt art.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Vurdering af potentiel udviklingsimmunotoksicitet (kohorte 3)  
51. På PND 56 (± 3 dage) anvendes 10 hanner og 10 hunner i kohorte 3 fra 
hver behandlingsgruppe (én han eller én hun pr. kuld, alle kuld repræsen ­
teret med mindst én unge, vilkårligt udvalgt) i et T-celleafhængigt antisto ­
fresponsassay, dvs. den primære IgM-antistofrespons på et T-celleafhængigt antigen såsom røde blodlegemer fra får (Sheep Red Blood Cells, SRBC) 
eller Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), i overensstemmelse med aktuelle 
immunotoksicitetstestprocedurer (14) (15). Reaktionen kan evalueres ved at tælle specifikke plaquedannende celler (plaque-forming cells — PFC) i milten eller ved at bestemme SRBC- eller KLH-specifikt IgM-antistoftiter 
i serummet gennem ELISA ved maksimal respons. Reaktionerne topper 
typisk fire (PFC-respons) eller fem (ELISA) dage efter intravenøs immuni ­
sering. Hvis den primære antistofrespons analyseres ved at tælle plaquedan ­
nende celler, er det tilladt at evaluere undergrupper af dyr på forskellige 
dage, forudsat at tidspunkterne for undergruppens immunisering og afliv ­
ning er fastsat således, at PFC'er tælles ved den maksimale respons, under ­
grupperne indeholder lige mange han- og hununger fra alle dosisgrupper, herunder kontrolgrupper, og undergrupperne evalueres ved omtrent samme 
alder efter fødslen (PND). Eksponering for testkemikaliet vil fortsætte, indtil 
dagen før miltene indsamles med henblik på PFC-respons eller serum til ELISA-assayet.
 
Opfølgende vurdering af potentiel reproduktionstoksicitet (kohorte 1B)  
52. Kohorte 1B-dyr kan fastholdes i behandling ud over PND 90 og bruges til 
avl for at få en F  2 -generation, hvis det er nødvendigt. Hanner og hunner fra 
samme dosisgruppe anbringes sammen (idet det undgås at parre søskende) i op til to uger fra eller efter PND 90, men ikke efter PND 120. Procedurerne er de samme som for P-dyr. Dog kan det på grundlag af ‘weight of 
evidence’ være tilstrækkeligt at aflive kuldene på PND 4 i stedet for at 
følge dem til fravænning eller senere.
 
AFSLUTTENDE OBSERVATIONER  
Klinisk biokemi/hæmatologi  
53. Systemiske virkninger overvåges hos P-dyrene. Fastende blodprøver fra et 
bestemt sted tages fra 10 vilkårligt udvalgte P-hanner og -hunner pr. dosis ­
gruppe ved undersøgelsens afslutning, opbevares under passende betingelser 
og underkastes delvis eller fuldstændig hæmatologisk undersøgelse, klinisk-biokemisk undersøgelse, assay af T4 og TSH eller andre undersø ­
gelser i henhold til den kendte virkningsprofil for testkemikaliet (se OECD's 
vejledning 151 (40)). Følgende hæmatologiske parametre undersøges: 
hæmatokrit, hæmoglobinkoncentration, erythrocyttælling, total og differen ­
tial leucocyttælling, blodpladetælling og koaguleringstid/-evne. Undersø ­
gelser af plasma eller serum omfatter: glukose, total cholesterol, urinstof, 
kreatinin, total protein og albumin, mindst to enzymer, hvis forekomst kan 
være tegn på hepatocellulære effekter (f.eks. alanin aminotransferase, aspartat aminotransferase, alkalisk phosphatase, gamma glutamyl transpep ­
tidase og sorbitol dehydrogenase). Målinger af yderligere enzymer og galde ­
syrer kan under visse omstændigheder give nyttige oplysninger. Der kan 
desuden tages blodprøver fra alle dyr, som opbevares til mulig analyse på et
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
senere tidspunkt for yderligere at afklare usikre virkninger eller generere 
interne eksponeringsdata. Såfremt der ikke er planer om en anden parring af 
P-dyr, tages blodprøverne lige før eller som en del af proceduren ved den fastsatte aflivning. Hvis dyr beholdes, tages blodprøver, et par dage før dyrene parres for anden gang. Medmindre eksisterende data fra undersø ­
gelser med gentagen dosis viser, at parameteren ikke påvirkes af testkemi ­
kaliet, udføres urinanalyse forud for afslutningen af undersøgelsen, og følgende parametre evalueres: udseende, volumen, osmolalitet eller specifik vægtfylde, pH, protein, glukose, blod og blodceller, cellerester. Urin kan 
også opsamles for at overvåge udskillelsen af testkemikaliet og/eller 
metabolitter.
 
54. Systemiske virkninger overvåges også hos F  1 -dyrene. Fastende blodprøver 
fra et bestemt sted tages fra 10 vilkårligt udvalgte kohorte 1A-hanner og -hunner pr. dosisgruppe ved afslutningen, opbevares under passende betin ­
gelser og underkastes standardklinisk-biokemisk undersøgelse, herunder 
vurdering af serumniveauer for skjoldbruskkirtelhormoner (T4 og TSH), hæmatologisk undersøgelse (total og differential leucocyttælling plus eryth ­
rocyttælling) og urinanalyse.
 
55. Overskydende unger på PND 4 underkastes makroskopisk obduktion, og 
det overvejes at måle serumthyroidhormonkoncentrationer (T4). Om nødvendigt kan neonatalt (PND 4) blod samles efter kuld til biokemiske undersøgelser/thyroidhormonanalyser. Blod samles også til T4- og 
TSH-analyse fra fravænnede individer, som underkastes makroskopisk 
obduktion på PND 22 (F
 1 -unger, der ikke er valgt til kohorter).  
Spermaparametre  
56. Spermaparametre måles hos alle P-generationshanner, medmindre eksiste ­
rende data viser, at spermaparametrene er upåvirkede i en 90-dagesunder ­
søgelse. Undersøgelse af spermaparametre udføres for alle kohorte 1A- 
hanner.  
57. Ved afslutningen registreres testis- og epididymis-vægt for alle P- og F  1 - 
(kohorte 1A) hanner. Mindst én testis og én epididymis udtages til histop ­
atologisk undersøgelse. De resterende eksemplarer af epididymis anvendes 
til tælling af spermiebeholdning i cauda epididymidis (16) (17). Endvidere 
opsamles sperma fra cauda epididymidis (eller vas deferens) efter metoder, som minimerer skaden, til vurdering af spermiemotilitet og -morfologi (18).
 
58. Spermiemotilitet kan enten vurderes straks efter aflivning eller registreres til 
senere analyse. Procentdelen af fremadbevægelige (progressivt motile) sper ­
mier bestemmes enten subjektivt eller objektivt gennem computerassisteret motilitetsanalyse (19) (20) (21) (22) (23) (24). Til bedømmelse af spermie ­
morfologi undersøges en spermaprøve fra epididymis (eller vas deferens) 
som fikserede eller våde præparater (25) og med mindst 200 spermatozoer 
pr. prøve klassificeret som enten normale (både hoved og midterstykke/hale ser normale ud) eller anormale. Som eksempel på morfologiske spermie ­
abnormiteter kan nævnes sammensmeltning, isoleret hoved og misdannet 
hoved og/eller hale (26). Misdannede eller store spermahoveder kan være 
tegn på defekter i spermiationen.
 
59. Hvis spermaprøver fryses, udstrygninger fikseres, og billeder til spermamo ­
tilitetsanalyse registreres ved obduktionen (27), kan efterfølgende analyse begrænses til hanner i kontrol- og højdosisgrupperne. Observeres der imid ­
lertid behandlingsrelaterede virkninger, vurderes de lavere dosisgrupper 
også.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Makroskopisk obduktion  
60. Ved testens afslutning eller for tidlig død obduceres alle P- og F  1 -dyr og 
undersøges makroskopisk for evt. strukturabnormiteter eller patologiske 
forandringer. Særlig opmærksomhed rettes mod kønsorganerne. Unger, som aflives af humane grunde i moribund tilstand, samt døde unger regi ­
streres og undersøges, når de ikke er opløst, for evt. defekter og/eller døds ­
årsag og præserveres.
 
61. For voksne P- og F  1 -hunner undersøges et vagina-smear på obduktions ­
dagen for at bestemme stadiet i brunstcyklussen og muliggøre korrelation med den histopatologiske undersøgelse af kønsorganerne. På alle P-hunner 
(og evt. F
 1 -hunner) undersøges uterus på en måde, som ikke vanskeliggør 
histopatologisk bedømmelse, for tilstedeværelse af og antal implantationssteder.
 
Organvægt og vævspræservering — P- og voksne F  1 -dyr 
62. Ved testens afslutning bestemmes kropsvægt og vådvægt af alle nedenfor 
anførte organer fra alle P-dyr og alle voksne F  1 -dyr fra relevante kohorter 
(anført nedenfor) snarest muligt efter dissektion for at undgå udtørring. Disse organer præserveres herefter under passende betingelser. Medmindre 
andet er anført, kan parrede organer vejes enkeltvis eller sammen i over ­
ensstemmelse med det udførende laboratoriums sædvanlige praksis.
 
— Uterus (med æggeledere og cervix), ovarier  
— testes, epididymides (total og cauda for prøverne, som anvendes til 
spermatælling)  
— prostata (dorsolateral og ventral del sammen). Man skal være forsigtig 
ved rensning af prostatakomplekset for at undgå at punktere de væske ­
fyldte vesiculae seminales. I tilfælde af en behandlingsrelateret virkning 
på den samlede prostatavægt dissekeres de dorsolaterale og ventrale segmenter omhyggeligt efter fiksering og vejes separat
 
— vesiculae seminales med prostata anterior og deres væsker (som én 
enhed)  
— hjerne, lever, nyrer, hjerte, milt, thymus, hypofyse, skjoldbruskkirtel 
(efter fiksering), binyrer og kendte målorganer eller -væv.  
63. Ud over de her anførte organer præserveres prøver af perifer nerve, muskel, 
rygmarv, øje plus synsnerve, mave-tarmkanal, urinblære, lunge, spiserør 
(med vedhæftet skjoldbruskkirtel og biskjoldbruskkirtel), knoglemarv, vas deferens (hanner), brystkirtler (hanner og hunner) og vagina under passende 
betingelser.
 
64. Alle organer fra kohorte 1A-dyr vejes og præserveres til histopatologisk 
undersøgelse.  
65. Til undersøgelse af immunotoksiske virkninger fremkaldt før eller efter 
fødslen underkastes 10 hanner og 10 hunner fra kohorte 1A fra hver 
behandlingsgruppe (én han og én hun pr. kuld, idet alle kuld repræsenteres med mindst én vilkårligt udvalgt unge) følgende undersøgelser:
 
— vejning af lymfeknuder i tilknytning til og med afstand til eksponerings ­
vejen (ud over vejningen af binyrerne, thymus og milt, der allerede er 
udført for alle kohorte 1A-dyr)  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analyse af splenisk lymfocytsubpopulation (CD4+ og CD8+ 
T-lymfocytter, B-lymfocytter og naturlige dræberceller) under anven ­
delse af halvdelen af milten, idet den anden halvdel af milten præser ­
veres til histopatologisk bedømmelse.  
En analyse af spleniske lymfocytsubpopulationer i ikkeimmuniserede dyr 
(kohorte 1A) vil afgøre, om eksponeringen hænger sammen med et skifte i 
den immunologiske ligevægtsfordeling af »hjælper«- (CD4+) eller cytotok ­
siske (CD8+) thymusderiverede lymfocytter eller naturlige dræber- (NK) celler (hurtige reaktioner på neoplastiske celler og patogener).
 
66. Følgende organer fra kohorte 1B-dyr vejes, og tilsvarende væv præserveres 
til bloktrinnet:  
— vagina (ikke vejet)  
— uterus med cervix  
— ovarier  
— testes (mindst én)  
— epididymides  
— vesiculae seminales og prostata anterior  
— prostata  
— hypofyse  
— identificerede målorganer.  
Der foretages histopatologisk undersøgelse i kohorte 1B, hvis resultaterne 
fra kohorte 1A er usikre, eller i tilfælde af mistanke om reproduktions- eller hormonforstyrrende stoffer.
 
67. Kohorte 2A og 2B: Udviklingsneurotoksicitetstest (PND 21 eller PND 22 
og voksent afkom). Kohorte 2A-dyr aflives efter adfærdstest med registre ­
ring af hjernevægt og fuldstændig neurohistopatologisk undersøgelse med henblik på neurotoksicitetsvurdering. Kohorte 2B-dyr aflives på PND 21 eller PND 22 med registrering af hjernevægt og mikroskopisk undersøgelse 
af hjernen med henblik på neurotoksicitetsvurdering. Perfusionsfiksering er 
nødvendig for kohorte 2A-dyr og valgfri for kohorte 2B-dyr, jf. testmetode B.53 (35).
 
Organvægt og vævspræservering — fravænnede F  1 -dyr 
68. Unger, som ikke er udvalgt til kohorter, herunder små uudviklede unger, 
aflives efter fravænning på PND 22, medmindre resultaterne viser behov for yderligere undersøgelser i levende live. Aflivede unger underkastes makro ­
skopisk obduktion, herunder en vurdering af kønsorganerne, jf. pkt. 62 og 
63. For op til 10 unger pr. køn pr. gruppe fra så mange kuld som muligt 
vejes hjerne, milt og thymus og opbevares under passende betingelser. Endvidere kan brystvæv for disse han- og hununger præserveres til videre mikroskopisk analyse (
 1 ) (se OECD's vejledning 151 (40)). Større anomalier 
og målvæv gemmes til evt. histologisk undersøgelse.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Forskning har vist, at brystkirtlen, især under udviklingen i de tidlige livsstadier, er et 
følsomt endepunkt for østrogenaktivitet. Det anbefales at medtage endepunkter, som 
involverer brystkirtler fra unger af begge køn, i denne testmetode, når den valideres.
 Histopatologi — P-dyr  
69. En fuldstændig histopatologisk undersøgelse af alle organer anført i pkt. 62 
og 63 udføres for alle P-dyr i højdosis- og kontrolgrupperne. De organer, 
som udviser behandlingsrelaterede forandringer, undersøges ligeledes for alle dyr fra lavdosisgrupperne som led i fastsættelsen af NOAEL. Derudover omfatter den histopatologiske undersøgelse kønsorganerne fra 
alle dyr, som mistænkes for nedsat fertilitet, fordi de f.eks. ikke har 
været i stand til at parre sig, undfange, besvangre eller føde rask afkom, eller hvis brunstcyklus, spermietal, -motilitet eller -morfologi var påvirket, samt alle makroskopiske forandringer.
 
Histopatologi — F  1 -dyr 
Kohorte 1-dyr  
70. En fuldstændig histopatologisk undersøgelse af organerne anført i pkt. 62 
og 63 udføres for alle voksne kohorte 1-dyr i højdosis- og kontrolgrup ­
perne. Alle kuld skal være repræsenteret med mindst én unge pr. køn. De organer og væv, som udviser behandlingsrelaterede forandringer og alle 
makroskopiske læsioner, undersøges ligeledes for alle dyr fra lavdosisgrup ­
perne som led i fastsættelsen af NOAEL. Til bedømmelse af virkninger fremkaldt før eller efter fødslen på lymfoide organer foretages også en histopatologisk undersøgelse af indsamlede lymfeknuder og knoglemarv 
fra 10 hanner og 10 hunner i kohorte 1A ved siden af den histopatologiske 
undersøgelse af thymus, milt og binyrer, som allerede er udført på alle 1A- dyr.
 
71. Der foretages en histopatologisk undersøgelse af reproduktions- og endo ­
krint væv fra alle kohorte 1B-dyr behandlet til bloktrinnet som beskrevet i pkt. 66 i tilfælde af mistanke om reproduktions- eller hormonforstyrrende stoffer. Er resultaterne fra kohorte 1A usikre, foretages også en histologisk 
undersøgelse af kohorte 1B.
 
72. Ovarier fra voksne hunner skal indeholde primordial- og voksende follikler 
foruden corpora lutea. Derfor sigter den histopatologiske undersøgelse mod 
en kvantitativ vurdering af primordial- og voksende follikler foruden 
corpora lutea i F  1 -hunner. Antallet af dyr, valg af ovariesnit og størrelsen 
af prøvesnit skal være statistisk tilpasset den anvendte vurderingsmetode. En follikeltælling kan først foretages på kontrol- og højdosisdyr, og ved 
skadevirkning hos sidstnævnte undersøges lavere dosisgrupper. Undersø ­
gelsen skal omfatte en optælling af primordialfollikler, hvilket kan kombi ­
neres med optælling af små voksende follikler, med henblik på sammen ­
ligning af ovarierne i behandlings- og kontrolgrupper (se OECD's vejled ­
ning 151 (40)). Vurdering af corpora lutea foretages parallelt med test for 
brunstcyklus, så der kan tages hensyn til cyklusstadiet i vurderingen. Ægge ­
leder, uterus og vagina undersøges for passende organtypisk udvikling.
 
73. Detaljerede histopatologiske undersøgelser af testiklerne foretages på F  1 - 
hanner for at identificere behandlingsrelaterede virkninger på testisdifferen ­
tiering og -udvikling samt på spermatogenesen (38). Når det er muligt, undersøges snit af rete testis. Caput, corpus og cauda fra epididymis og 
vas deferens undersøges for passende organtypisk udvikling og for de 
krævede parametre for P-hanner.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 877
Kohorte 2-dyr  
74. Neurohistopatologiske undersøgelser foretages for alle højdosis- og 
kontroldyr i kohorte 2A pr. køn efter fuldførelse af neuroadfærdstest (efter PND 75, men ikke efter PND 90). Histopatologisk undersøgelse af 
hjernen foretages for alle højdosis- og kontroldyr i kohorte 2B pr. køn på 
PND 21 eller PND 22. De organer eller væv, som udviser behandlings ­
relaterede forandringer, skal ligeledes undersøges for dyr fra lavere dosis ­
grupper som led i fastsættelsen af NOAEL. For kohorte 2A- og 2B-dyr 
undersøges mange snit fra hjernen, så det er muligt at undersøge bulbus 
olfactorius, cortex cerebralis, hippocampus, basalganglier, thalamus, hypot ­
halamus, midterhjernen (tectum, tegmentum og pedunculus cerebri), hjerne ­
stamme og cerebellum. Kun for kohorte 2A undersøges øjne (retina og 
synsnerve) og prøver af perifer nerve, muskel og rygmarv. Alle neurohi ­
stologiske procedurer skal være i overensstemmelse med testmetode B.53 (35).
 
75. Morfometriske (kvantitative) vurderinger foretages på repræsentative 
områder af hjernen (homologe snit nøje udvalgt på grundlag af pålidelige 
mikroskopiske kendetegn) og kan omfatte lineære målinger og/eller 
arealmålinger af specifikke hjerneregioner. Der tages mindst tre på hinanden følgende snit ved hvert kendetegn (niveau) for at vælge det mest homologe 
og repræsentative snit for det specifikke hjerneområde, der skal vurderes. 
Neuropatologen skal udvise passende dømmekraft med hensyn til, om snit forberedt til måling er homologe med andre i prøvesættet og derfor egnede til indgå i det, eftersom især lineære målinger kan ændre sig over en relativt 
kort afstand (28). Snit, som ikke er homologe, bruges ikke. Målet er at 
udtage prøver fra alle dyr, der er udtaget til det formål (10/køn/dosisniveau), men mindre antal kan dog stadig være tilstrækkeligt. Imidlertid vil prøver fra færre end seks dyr/køn/dosisniveau normalt ikke blive anset for tilstræk ­
keligt til denne testmetodes formål. Stereologi kan anvendes til at identifi ­
cere behandlingsrelaterede virkninger på parametre såsom volumen eller celleantal til bestemte neuroanatomiske områder. I forbindelse med alle aspekter af præpareringen af vævsprøver, fra vævsfiksering over dissektion 
af vævsprøver og vævspræparering til farvning på objektglas, følges et 
afbalanceret design, således at hver batch indeholder repræsentative prøver fra hver dosisgruppe. Når der skal bruges morfometriske eller stereo ­
logiske analyser, indlejres hjernevævet i et passende medium ved alle dosis ­
niveauer samtidig for at undgå de skrumpningsartefakter, der kan optræde i 
forbindelse med langvarig opbevaring i fiksativ.
 
RAPPORTERING  
Data  
76. Data rapporteres individuelt og opsummeres i tabelform. For hver test ­
gruppe og hver generation rapporteres følgende, hvor det er relevant: antal dyr ved testens begyndelse, antal dyr fundet døde under testen eller 
aflivet humant, tidspunkt for død eller human aflivning, antal frugtbare dyr, 
antal drægtige hunner, antal hunner, som har født et kuld, og antal dyr, der viser tegn på toksicitet. En beskrivelse af toksiciteten samt tidspunktet for 
de toksiske virkningers indtræden, varighed og sværhedsgrad medtages 
også.
 
77. Numeriske resultater vurderes efter en relevant og accepteret statistisk 
metode. De statistiske metoder vælges som en del af undersøgelsesdesignet og skal på passende vis behandle ikkenormale data (f.eks. optællingsdata), censurerede data (f.eks. begrænset observationstid), ikke uafhængige (f.eks. 
kuldeffekter og gentagne målinger) samt ulige varianser. Generaliserede 
lineære blandede modeller og dosisresponsmodeller dækker en bred klasse
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
af analytiske værktøjer, som kan være relevante for data genereret under 
denne testmetode. Rapporten skal indeholde tilstrækkelig information om 
analysemetoden og det anvendte computerprogram, til at en uafhængig rapportør/statistiker kan vurdere/revurdere analysen.
 
Vurdering af resultater  
78. Fundene vurderes med hensyn til de observerede virkninger, bl.a. obduktion 
og mikroskopiske fund. Vurderingen omfatter sammenhængen — eller manglen herpå — mellem dosis og tilstedeværelse, forekomst og sværheds ­
grad af anomalier, bl.a. makroskopiske læsioner. Målorganer, fertilitet, 
kliniske anomalier, reproduktions- og ynglepræstationer, ændringer i krops ­
vægt, mortalitet og evt. andre toksiske eller udviklingsmæssige virkninger vurderes også. Særlig opmærksomhed rettes mod kønsspecifikke forandrin ­
ger. Testkemikaliets fysisk-kemiske egenskaber og evt. TK-data, herunder 
placentaoverførsel og mælkeudskillelse, inddrages i vurderingen af 
testresultaterne.
 
Testrapport  
79. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger, der er fremkommet i 
denne undersøgelse fra P- og F  1 -dyr samt F  2 -dyr (hvor det er relevant).  
Testkemikalie  
— alle relevante tilgængelige oplysninger om testkemikaliets kemiske, 
toksikokinetiske og toksikodynamiske egenskaber  
— identifikationsoplysninger  
— renhed.  
Evt. vehikel  
— begrundelse for valg af vehikel (hvis det er andet end vand).  
Forsøgsdyr  
— anvendt art/stamme  
— dyrenes antal, alder og køn  
— oprindelse, miljøbetingelser, kost, redematerialer osv.  
— de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse  
— vaginaludstrygning for P-hunner før behandlingens påbegyndelse (hvis 
der indsamles data på det tidspunkt)  
— parringsoptegnelser for P-generationen med angivelse af, hvilke hanner 
og hunner der er parret med hinanden, og parringssucces  
— optegnelser over, hvilket kuld voksne F  1 -generationsdyr er fra.  
Testbetingelser  
— rationale for valg af dosisniveau  
— oplysninger om testkemikaliets formulering/fodertilberedning, opnåede 
koncentrationer  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— tilberedningens stabilitet og homogenitet i vehikel eller bærer (f.eks. 
kost, drikkevand), i blod og/eller mælk under anvendelsesbetingelserne 
og opbevaring mellem anvendelser  
— oplysninger om indgift af testkemikaliet  
— omregning af testkemikaliets koncentration (ppm) i foder/drikkevand til 
faktisk dosis (mg/kg kropsvægt/dag), hvis det er relevant  
— oplysninger om foder- og vandkvalitet (herunder kostsammensætning, 
hvis oplysningerne foreligger)  
— detaljeret beskrivelse af randomiseringsprocedurer for udvælgelse af 
unger til aflivning og tilordning af unger til testgrupper  
— miljøbetingelser  
— liste over forsøgsmedarbejdere, bl.a. uddannelse.  
Resultater (resumé og individuelle data efter køn og dosis)  
— foderindtagelse, evt. vandindtagelse, foderudnyttelse (kropsvægtfor ­
øgelse pr. gram indtaget foder bortset fra perioden, hvor dyrene har været sammen, og under laktation) og indtagelse af testkemikalie (for indgift i foder/drikkevand) for P- og F
 1 -dyr 
— absorptionsdata (evt.)  
— kropsvægtdata for P-dyr  
— kropsvægtdata for udvalgte F  1 -dyr efter fravænning  
— dødstidspunkt under testen, eller hvorvidt dyrene overlevede til under ­
søgelsens afslutning  
— art, alvor og varighed af det klinisk observerede (om det observerede er 
reversibelt)  
— data om hæmatologiske og klinisk-kemiske undersøgelser samt urinana ­
lyse, bl.a. TSH og T4  
— fænotypisk analyse af miltceller (T-, B-, NK-celler)  
— knoglemarvens cellularitet  
— data om toksisk respons  
— antal P- og F  1 -hunner med normal eller anormal brunstcyklus og cyklus ­
varighed  
— tid til parring (prækoitalt interval, antal dage mellem den dag, dyrene 
sættes sammen, og den faktiske parring)  
— toksiske eller andre virkninger på reproduktion, herunder antal og 
procentdele dyr, som fuldførte parring, drægtighed, fødsel og laktation 
af hanner, der fremkaldte drægtighed, af hunner med tegn på dystoki/ langvarig eller vanskelig fødsel
 
— varighed af drægtighed og evt. fødsel  
— antal implantater, kuldstørrelse og procentdel hanunger  
— antal og procentdel postimplantationstab, levende fødsler og dødfødsler  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— vægtdata for kuld og unger (hanner, hunner og begge), antal små 
uudviklede unger, hvis de er optalt  
— antal unger med makroskopisk synlige abnormiteter  
— toksiske virkninger på afkom, postnatal vækst, levedygtighed osv.  
— data vedrørende fysiske kendetegn hos unger og andre data vedrørende 
den postnatale udvikling  
— data om F  1 -dyrenes kønsmodning  
— i det omfang det er relevant, data vedrørende iagttagelser af funktioner 
hos unger og voksne  
— kropsvægt ved aflivning og absolut og relativ organvægt for P-dyr og 
voksne F  1 -dyr 
— obduktionsfund  
— detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund  
— totalt antal spermier i cauda epididymis, procentdel progressivt motile 
spermier, procentdel morfologisk normale spermier og procentdel sper ­
mier med hver af de fundne abnormiteter for P- og F  1 -hanner  
— antal follikler i P- og F  1 -hunners ovarier og deres modningsstadie, hvor 
det er relevant  
— optælling af corpora lutea i F  1 -hunners ovarier  
— statistisk behandling af resultaterne, når det er relevant.  
Kohorte 2-parametre  
— en detaljeret beskrivelse af procedurer anvendt til at standardisere obser ­
vationer og procedurer samt operationelle definitioner for bedømmelse af observationer
 
— en liste over alle anvendte testprocedurer og begrundelse for anven ­
delsen heraf  
— oplysninger om de anvendte adfærdsmæssige/funktionelle, neuropatolo ­
giske og morfometriske procedurer, herunder oplysninger og detaljer om 
automatiserede anordninger  
— procedurer for kalibrering og sikring af anordningernes ækvivalens og 
afbalancering af behandlingsgrupper i testprocedurer  
— kort begrundelse for evt. beslutninger baseret på faglig vurdering  
— detaljeret beskrivelse af alle adfærdsmæssige, funktionelle, neuropatolo ­
giske og morfometriske fund efter køn og dosisgruppe, herunder både 
stigninger og fald i forhold til kontrolgrupper  
— hjernevægt  
— evt. diagnoser udledt af neurologiske tegn og læsioner, herunder natur ­
ligt forekommende sygdomme eller tilstande  
— billeder af eksemplariske fund  
— ‘low-power’-billeder til at vurdere homologien af snit anvendt til morfo ­
metri  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— statistisk behandling af resultater, herunder statistiske modeller anvendt 
til analyse af data og resultater, uanset om de var signifikante eller ej  
— evt. andre toksiske virkningers sammenhæng med en konklusion 
vedrørende testkemikaliets neurotoksiske potentiale fordelt på køn og dosisgruppe
 
— evt. toksikokinetiske oplysningers indvirkninger på konklusionerne  
— data, der støtter testmetodens pålidelighed og følsomhed (dvs. positive 
og tidligere kontroldata)  
— evt. sammenhæng mellem neuropatologiske og funktionelle virkninger  
— NOAEL- eller benchmarkdosis for moderdyr og afkom fordelt på køn 
og dosisgruppe  
— diskussion af den samlede datafortolkning baseret på resultaterne, 
herunder en konklusion om, hvorvidt kemikaliet forårsagede udviklings ­
neurotoksicitet og NOAEL.  
Kohorte 3-parametre  
— serum-IgM-antistoftiter (sensibilisering over for SRBC eller KLH) eller 
spleniske IgM-PFC-enheder (sensibilisering over for SRBC)  
— TDAR-metodens effektivitet bekræftes som led i optimeringsprocessen 
for laboratorier, der foretager analysen første gang, og periodisk (f.eks. årligt) for alle laboratorier
 
— diskussion af den samlede datafortolkning baseret på resultaterne, 
herunder en konklusion om, hvorvidt kemikaliet forårsagede udviklings ­
immunotoksicitet og NOAEL.  
Diskussion af resultater  
Konklusioner, herunder NOAEL-værdier for virkninger på forældre og 
afkom  
Alle oplysninger, som ikke er fremkommet under undersøgelsen, men er 
nyttige for fortolkningen af resultaterne (f.eks. virkningernes ligheder med kendte neurotoksiske stoffer), anføres også.
 
Fortolkning af resultater  
80. En udvidet reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation vil om 
nødvendigt give information om virkningerne af gentagen eksponering for et kemikalie i alle faser af reproduktionscyklussen. Navnlig giver undersø ­
gelsen information om forplantningssystemet og om endepunkter 
vedrørende afkommets udvikling, vækst, overlevelse og funktioner indtil 
PND 90.
 
81. Ved fortolkning af undersøgelsens resultater tages der hensyn til alle tilgæn ­
gelige oplysninger om kemikaliet, bl.a. fysisk-kemiske, TK- og toksikody ­
namiske egenskaber, tilgængelige relevante oplysninger om strukturelt 
beslægtede stoffer og resultater af tidligere gennemførte toksicitetsundersø ­
gelser med testkemikaliet (f.eks. akut toksicitet, toksicitet efter gentagen anvendelse, mekanistiske undersøgelser og undersøgelser til vurdering af, 
om der er betydelige kvalitative og kvantitative artsforskelle i metaboliske 
egenskaber in vivo-/in vitro). Resultaterne af den makroskopiske obduktion og organvejningen sammenholdes med observationer fra andre undersø ­
gelser med gentagen dosering, når det er praktisk muligt. Fald i væksten 
hos afkom kan sammenholdes med testkemikaliets påvirkning af mælkens 
sammensætning (29).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Kohorte 2 (udviklingsneurotoksicitet)  
82. Neuroadfærdsmæssige og neuropatologiske resultater fortolkes i forbindelse 
med alle fund efter en ‘weight-of-evidence’-tilgang med ekspertvurdering. 
Evt. mønstre i adfærdsmæssige eller morfologiske fund samt tegn på dosis ­
respons diskuteres. Evalueringen af udviklingsneurotoksicitet, bl.a. humane ­
pidemiologiske undersøgelser eller caserapporter og undersøgelser med 
dyreforsøg (f.eks. toksikokinetiske data, oplysninger om struktur/aktivitet, 
data fra andre toksicitetsundersøgelser), medtages i denne karakterisering. Evalueringen af data skal indeholde en diskussion af både biologisk og statistisk signifikans. Evalueringen skal indeholde en evt. sammenhæng 
mellem observerede neuropatologiske og adfærdsmæssige forandringer. 
Med hensyn til vejledning om fortolkning af udviklingsneurotoksicitets ­
resultater henvises til testmetode B.53 (35) og Tyl et al., 2008 (31).
 
Kohorte 3 (udviklingsimmunotoksicitet)  
83. Undertrykkelse eller styrkelse af immunfunktionen som vurderet gennem 
TDAR (T-celleafhængig antistofrespons) vurderes i forbindelse med alle 
iagttagelser. TDAR-resultatets signifikans kan underbygges af andre virk ­
ninger på immunologisk relaterede indikatorer (f.eks. knoglemarvens cellu ­
laritet, vægt og histopatologiske undersøgelser af lymfevæv, lymfocyt 
subset distribution). Virkninger fastslået ved TDAR kan være mindre 
meningsfulde, i tilfælde af at andre toksiciteter observeres ved lavere eksponeringskoncentrationer.
 
84. Med hensyn til fortolkningen af reproduktions- og neurotoksicitetsresultater 
henvises til OECD's vejledning 43 (26).  
LITTERATUR  
1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. 
Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers 
and K.E. Whitby (2006). ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment’, Critical Reviews in Toxico ­
logy, 36, 69-98.
 
2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999). ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’, Lab. Anim. Sci., 49, 530- 536.
 
3) Zoetis, T. and I. Walls (2003). Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.
 
4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005). ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI 
Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.  
5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999). ‘Stimulating Rese ­
arch to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’, Toxicological 
Sciences, 49, 1-4.  
6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995). ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction — a Literature Survey’, Journal of the American College of Toxi ­
cologists, 14, 293-327.  
7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003). ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’, 
Regulatory Toxicology and Pharmacology, 37, 356-369.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies’, Journal of Toxicological Sciences, 25, 1-21.
 
9) Creasy, D.M. (2003). ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’, Birth Defects Research, Part B, 68, 408-415.  
10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007). ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.
 
11) Sadleir, R.M.F.S. (1979). ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, 
Cambridge, New York.  
12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999). ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.
 
13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977). ‘Preputial Sepa ­
ration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’, 
Biological Reproduction, 17, 298-303.  
14) Ladics, G.S. (2007). ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’, Methods, 41, 9-19.  
15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004). ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’, Toxicology, 
197, 23-35.  
16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989). ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’, Fundamental and Applied Toxicology, 12, 92-108.
 
17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978). ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’, Journal 
of Reproduction and Fertility, 54, 103-107.  
18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991). ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’. Reproductive 
Toxicology, 5, 39-44.  
19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996). 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’, Reproductive Toxicology, 10, 237- 244.
 
20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992). ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’, Reproductive Toxicology, 6, 267-273.
 
21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992). ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration’, Journal of Andrology, 13, 409-421.
 
22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991). ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’, Reproductive Toxicology, 5, 
449-458.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993). ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida, s. 319-333.
 
24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989). ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’, 
Journal of Andrology, 10, 401-415.  
25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992). ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’, Reproductive Toxicology, 6, 491-505.  
26) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Paris.  
27) Working, P.K., M. Hurtt (1987). ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’, Journal of Andrology, 8, 330-337.  
28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006). ‘A Best Practices Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing — for Today’, Toxicological Patho ­
logy, 34, 296-313.
 
29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006). ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’, Food Chemicals Toxicology, 44, 8-16.
 
30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007). ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet 
Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in 
CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’, Envi ­
ronmental health perspectives, 115(12), 1717-1726.
 
31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008). ‘Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental 
Endpoints’, Neurotoxicology and Teratology, 30: 349-381.
 
32) OECD (1996). Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test, OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris.
 
33) Kapitel B.43 i dette bilag, Neurotoksicitetsundersøgelse i gnavere  
34) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
35) Kapitel B.53 i dette bilag, Udviklingsneurotoksicitetsundersøgelse  
36) Kapitel B.54 i dette bilag, Uterotrofisk bioassay med gnavere: en korttids ­
screeningtest for østrogene egenskaber  
37) Kapitel B.55 i dette bilag, Hershberger-bioassay med rotter: et korttids ­
screeningassay for (anti)androgene egenskaber  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
38) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris.  
39) OECD (2011). Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.
 
40) OECD (2013). Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OECD, Paris.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Tillæg 1  
Målinger og observationer medtaget i ‘functional observational battery’ (kohorte 2A)  
Eget bur og åbent felt Ved manipulation Fysiologi  
Kropsholdning Let at flytte Temperatur 
Ufrivillige kloniske eller toniske 
bevægelser Let at håndtere Kropsvægt 
Lukning af øjenlåg Muskeltonus Pupilrespons 
Piloerektion Respons på tilnærmelse Pupilstørrelse 
Spytflåd Berøringsrespons Tåreflåd Auditiv respons Vokalisationer Respons på knibning i halen Rejse sig op Opretningsrespons Ganganomalier Valgusfod ved ‘landing’ 
Vækningstærskel Gribestyrke i forlemmer 
Stereotypi Gribestyrke i baglemmer Mærkelig adfærd Pletter Respiratoriske anomalier
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Tillæg 2  
DEFINITIONER  
Kemikalie : et stof eller en blanding.  
Testkemikalie : et stof eller en blanding, som testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  H295R STEROIDSYNTESETESTEN  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD-testvejledningen (Test Guideline (TG) 
456 (2011)). OECD iværksatte i 1998 en højt prioriteret aktivitet om revi ­
sion af eksisterende og udvikling af nye testretningslinjer til screening og test af potentielle hormonforstyrrende kemikalier. OECD's konceptuelle ramme for test og vurdering af hormonforstyrrende kemikalier fra 2002 
(Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrup ­
ting Chemicals) består af fem trin, som hvert svarer til et forskelligt niveau af biologisk kompleksitet(1). I det in vitro-H295R-steroidgenese-assayet (H295R), der er beskrevet i denne testmetode, bruges en human adrenocar ­
cinomcellelinje (NCI-H295R-celler). Der er tale om et niveau 2-in 
vitro-assay, der tilvejebringer mekanistiske data til brug for screening og prioritering. Udvikling og standardisering af assayet som en screening for kemiske virkninger på steroidgenese, specifikt produktionen af 17 β-østradiol 
(E2) og testosteron (T), blev foretaget i en flertrinsproces. H295R-assayet er 
blevet optimeret og valideret (2) (3) (4) (5).
 
2. Formålet med H295R-steroidgenese-assayet er at detektere kemikalier, der 
påvirker produktion af E2 og T. Formålet med H295R-assayet er at iden ­
tificere xenobiotika, hvis målsted(er) (target site) er de endogene kompo ­
nenter, der omfatter den intracellulære biokemiske vej, som begynder med kædereaktionen fra cholesterol til produktionen af E2 og/eller T. Formålet 
med H295R-assayet er ikke at identificere kemikalier, der påvirker steroid ­
genese på grund af indvirkning på hypothalamus-hypofyse-gonadal-aksen. Målet med assayet er at finde et ja-nej-svar med hensyn til et kemikalies potentiale til at fremkalde eller reducere produktionen af T og E2. Der kan 
dog opnås kvantitative resultater i visse tilfælde (se pkt. 53-54). Assayets 
resultater udtrykkes i relative forandringer i hormonproduktionen sammen ­
lignet med opløsningsmiddelkontrollerne (SC'er). Målet med assayet er ikke at tilvejebringe specifikke mekanistiske oplysninger om interaktionen 
mellem testkemikaliet og det endokrine system. Forskning under anvendelse 
af cellelinjen har haft som formål at identificere virkninger på specifikke enzymer og intermediære hormoner såsom progesteron (2).
 
3. Definitioner og forkortelser brugt i denne testmetode er beskrevet i bilaget. 
En detaljeret protokol med instruktioner om, hvordan man fremstiller opløs ­
ninger, dyrker celler og gennemfører forskellige af testens aspekter findes i bilag I-III til OECD's dokument ‘Multi-Laboratory Validation of the H295R 
Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol 
Production’ (4).
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER  
4. Fem forskellige enzymer, der katalyserer seks forskellige reaktioner, indgår 
i biosyntesen af steroide kønshormoner. Enzymatisk omdannelse af chole ­
sterol til pregnenolon ved hjælp af cytochrom-P450 (CYP)-cholesterol-side ­
kædespaltningsenzymet (CYP11A) udgør det første trin i en række bioke ­
miske reaktioner, der kulminerer i syntesen af steroide slutprodukter. 
Afhængigt af rækkefølgen af de næste to reaktioner deles den steroidgene 
vej i to, Δ 5 -hydroxysteroid-vejen og Δ 4 -ketosteroid-vejen, som samles i 
produktionen af androstenedion (figur 1).  
5. Androstenedion omdannes til testosteron (T) af 17 β-hydroxysteroid-dehy ­
drogenase (17 β-HSD). Testosteron er både et mellem- og et sluthormon ­
produkt. Hos hannen kan T omdannes til dihydrotestosteron (DHT) af 5 α- 
reduktase, som findes i cellemembraner, kernemembran og endoplasmatisk retikulum af målvæv med androgen effekt såsom prostata og sædblærer. 
DHT er meget kraftigere som androgen end T og betragtes også som et 
sluthormonprodukt. H295R-assayet måler ikke DHT (se pkt. 10).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Det enzym i den steroidgene veje, der omdanner androgene kemikalier til 
østrogene kemikalier, er aromatase (CYP19). CYP19 omdanner T til 17 β- 
østradiol (E2) og androstenedion til østron. E2 og T betragtes som slut ­
produkthormoner i den steroidgene vej.  
7. Specificiteten af CYP17'-lyaseaktivitet adskiller sig med hensyn til de inter ­
mediære substrater fra art til art. Hos mennesket foretrækker enzymet 
substrater af Δ 5 -hydroxysteroid-vejen (pregnenolon), mens substrater i Δ 4 - 
ketosteroid-vejen (progesteron) foretrækkes hos rotter (19). Sådanne forskelle i CYP17-lyaseaktiviteten kan forklare visse artsafhængige forskelle 
i reaktionen på kemikalier, der ændrer steroidgenese in vivo (6). Det er 
påvist, at H295-celler er dem, der kommer tættest på at afspejle ekspres ­
sionen af adrenalenzym og steroidproduktionsmønstret hos voksne menne ­
sker (20), men er kendt for at udtrykke enzymer for både Δ
 5 -hydroxyste ­
roid-vejen og Δ 4 -ketosteroid-vejen samt for androgensyntese (7) (11) (13) 
(15).  
Figur 1  
Steroidgen vej i H295R-celler
  
NB 
Enzymer er markeret med kursiv, hormoner med fede typer, og pile viser 
syntesens retning. Grå bagrund viser corticosteroid-veje/-produkter. Kønste ­
roidveje/-produkter er anført i en cirkel. CYP = cytochrom P450, HSD = 
hydroxysteroid-dehydrogenase, DHEA = dehydroepiandrosteron.  
8. Den humane H295R-adreno-carcinomcellelinje er en brugbar in vitro-model 
til at undersøge effekten på steroidhormonsyntesen (2) (7) (8) (9) (10). 
H295R-cellelinjen udtrykker gener, der koder for alle de vigtigste enzymer for ovennævnte steroidgenese (11) (15) (figur 1). Dette er en enestående egenskab, fordi in vivo-ekspressionen af disse gener er specifik 
for væv og udviklingsstadium, hvor et enkelt væv eller enkelt udviklings ­
stadium typisk ikke udtrykker alle gener, der er involveret i steroidgenese (2). H295R-celler har fysiologiske karakteristika som zonalt udifferentierede adrenalceller hos menneskefostre (11). Cellerne repræsenterer et unikt in 
vitro-system, idet de har evnen til at producere alle de steroidhormoner, 
der findes i binyrebarken og kønskirtlerne hos voksne, hvilket gør det muligt at teste for virkninger på både corticosteroid-syntesen og produk ­
tionen af kønssteroidhormoner som androgener og østrogener, selv om 
assayet kun blev godkendt til påvisning af T og E2. Forandringer registreret 
af testsystemet i form af ændringer i produktionen af T og E2 kan skyldes
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
en lang række forskellige interaktioner mellem testkemikalier og steroidgen ­
funktioner, der er udtrykt af H295R-cellerne. Disse omfatter modulering af 
ekspressionen, syntesen eller funktionen af enzymer, der er involveret i produktionen, transformationen eller fjernelsen af steroidhormoner (12) (13) (14). Inhibering af hormonproduktion kan skyldes direkte kompetitiv 
binding til et enzym i vejen, indvirkning på medvirkende faktorer såsom 
NADPH (nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat) og cAMP (cyklisk adenosinmonophosphat), og/eller forøgelse af steroidmetabolisme eller suppression af genekspression af visse enzymer i den steroidgene vej. 
Mens inhibering kan være en funktion af både direkte og indirekte 
processer i hormonproduktionen, er induktion typisk indirekte, idet den f.eks. indvirker på medvirkende faktorer såsom NADPH og cAMP (som i forbindelse med forskolin), sænker steroidmetabolisme (13) og/eller opre ­
gulerer den steroidgene genekspression.
 
9. H295R-assayet har flere fordele:  
— Det gør det muligt at påvise både stigninger og fald i produktionen af 
både T og E2.  
— Det gør det muligt direkte at vurdere et kemikalies potentielle indvirk ­
ning på cellers levedygtighed/cytotoksicitet. Dette er vigtigt, fordi det 
gør det muligt at sondre mellem virkninger, der skyldes cytotoksicitet, 
og virkninger, der skyldes den direkte interaktion mellem kemikalier og steroidgene veje, hvilket ikke er muligt i vævseksplantatsystemer, der består af flere celletyper med varierende sensitivitet og funktionaliteter.
 
— Det kræver ikke brug af dyr.  
— H295R-cellelinjen er kommercielt tilgængelig.  
10. Assayets største begrænsninger er følgende:  
— Dets metaboliske kapacitet er ukendt, men sandsynligvis ret begrænset. 
Kemikalier, der skal være metabolisk aktiveret, vil derfor sandsynligvis 
mangle i dette assay.  
— H295R, der er afledt af adrenalvæv, indeholder enzymer, som kan frem ­
stille gluco- og mineralcorticoiderne samt kønshormonerne. Indvirk ­
ningen på produktionen af gluco- og mineralcorticoider kan derfor påvirke de T- og E2-niveauer, der er observeret i assayet.
 
— Det måler ikke DHT og forventes derfor ikke at påvise kemikalier, der 
hæmmer 5 α-reduktase. I så fald kan Hershberger-assayet (16) anvendes.  
— H295R-assayet påviser ikke kemikalier, der forstyrrer steroidgenesen 
ved at påvirke hypothalamus-hypofyse-gonadal-aksen (HPG), da dette kun kan undersøges hos intakte dyr.
 
PRINCIP FOR TESTEN  
11. Formålet med assayet er påvisning af kemikalier, der påvirker produktionen 
af T og E2. T er også et mellemprodukt i vejen til produktion af E2. 
Assayet kan påvise kemikalier, der typisk inhiberer eller inducerer den 
steroidgene vejs enzymer.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Assayet gennemføres normalt under almindelige celledyrkningsbetingelser i 
cellekulturplader med 24 brønde. Alternativt kan der bruges andre plade ­
størrelser i assayet. Podnings- og forsøgsbetingelser skal dog tilpasses tilsvarende for at sikre overholdelse af ydeevnekriterierne.
 
13. Efter en akklimatiseringsperiode på 24 timer i multibrøndplader udsættes 
cellerne i 48 timer for syv koncentrationer af testkemikaliet, mindst in 
triplo. Opløsningsmiddel og en kendt inhibitor og inducer af hormonpro ­
duktion anvendes i en fast koncentration som negative og positive kontrol ­
ler. Efter eksponeringsperioden fjernes mediet fra hver brønd. Cellelevedyg ­
tigheden i hver brønd analyseres umiddelbart efter fjernelsen af mediet. 
Hormonkoncentrationer i mediet kan måles under anvendelse af forskellige 
metoder, herunder kommercielt tilgængelige hormonmålekit og/eller instru ­
mentelle teknikker såsom væskekromatografi-massespektometri (LC-MS). Data udtrykkes som foldsændring i forhold til opløsningsmiddelkontrollen 
og laveste koncentration med observeret effekt (Lowest-Observed-Effect- 
Concentration (LOEC)). Hvis assayet er negativt, angives den højeste testede koncentration som koncentration uden observeret effekt (No-Obser ­
ved-Effect-Concentration (NOEC)). Konklusioner vedrørende et kemikalies 
evne til at påvirke steroidgenese baseres på mindst to uafhængige testkør ­
sler. Den første testkørsel fungerer som en range-finding-kørsel med efter ­
følgende tilpasning af koncentrationer for kørsel 2 og 3, hvis der opstår problemer med opløselighed eller cytotoksicitet, eller kemikaliets aktivitet 
ser ud til at være i slutningen af de testede koncentrationsinterval.
 
DYRKNINGSPROCEDURE  
Cellelinje  
14. NCI-H295R-cellerne er kommercielt tilgængelige fra American Type 
Culture Collections (ATCC) efter underskrivelse af en 
materialeoverførselsaftale (MTA) (  1 ). 
Indledning  
15. På grund af forandringer i cellernes kapacitet til at producere E2 i takt med 
stigende alder/antal generationer (2) dyrkes cellerne efter en specifik protokol, før de bruges, og antal generationer efter optøning af cellerne og antal gene ­
rationer på tidspunktet for nedfrysningen af cellerne og placering deraf i 
flydende nitrogen for opbevaring noteres. Det første tal viser det faktiske antal cellegenerationer og det andet beskriver antal generationer på det tids ­
punkt, hvor cellerne blev nedfrosset og efterfølgende opbevaret. Celler, der 
f.eks. blev nedfrosset efter femte generation, optøet og derefter spaltet tre 
gange (fire generationer, hvor frisk optøede celler tæller som generation 1), efter at de blev dyrket igen, betegnes generation 4,5. Et eksempel på en plan for nummerering findes i valideringsrapportens bilag I (4).
 
16. Der anvendes et stammedium som grundlag for berigede og frosne medier. 
Beriget medium er en nødvendig komponent i forbindelse med dyrkning af celler. Frysemedium er specifikt udviklet med henblik på langtidsnedfrys ­
ning af celler til opbevaring uden indvirkning på dem. Før brug analyseres 
Nu-serum (eller et tilsvarende serum med samme egenskaber, der påviseligt 
producerer data, som opfylder testkravene og kvalitetskontrolkravene), som er en bestanddel af beriget medium, for baggrundskoncentrationer af T og E2. Fremstillingen af disse opløsninger er beskrevet i bilag II til validerings ­
rapporten (4).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128, ATCC, Manassas, VA, USA, [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Efter igangsættelse af en H295R-cellekultur på baggrund af en oprindelig 
ATCC-batch skal cellerne dyrkes i fem generationer, dvs. at cellerne deles 
fire gange). Derefter nedfryses femtegenerationsceller i flydende nitrogen med henblik på opbevaring. Før cellerne nedfryses, foretages der en kørsel af fjerdegenerationscellerne i en kvalitetskontrolplade (se pkt. 36-37) for at 
efterprøve, om grundproduktionen af hormoner og reaktionen på positive 
kontrolkemikalier opfylder kvalitetskontrolkriterierne for assayet som fast ­
lagt i tabel 5.
 
18. H295R-celler skal dyrkes, nedfryses og opbevares i flydende nitrogen for at 
sikre, at der altid er celler af passende generation/alder til rådighed til 
dyrkning og anvendelse. Det maksimale antal generationer, efter der er at 
iværksat dyrkning af en ny (  1 ) eller nedfrossen (  2 ) batch af celler, der kan 
accepteres til brug for H295R-assayet, må ikke overstige 10. Der kan f.eks. accepteres 4,5-10,5 generationer for cellekulturer fra en batch, der er 
nedfrosset i generation 5. For celler, hvor dyrkningen iværksættes fra 
disse nedfrosne batches, følges proceduren i pkt. 19. Disse celler dyrkes i mindst fire (4) yderligere generationer (generation 4,5), før de anvendes til 
test.
 
Stamceller fra nedfrossen beholdning  
19. Proceduren for at iværksætte dyrkning eller test af celler fra nedfrossen 
beholdning bruges, når en ny batch af celler hentes fra opbevaring i flydende nitrogen. Yderligere oplysninger om denne procedure findes i 
bilag III til valideringsrapporten (4). Celler fjernes fra opbevaring i flydende 
nitrogen, optøs hurtigt, anbringes i beriget medium i et centrifugeglas, centrifugeres ved stuetemperatur, genopslæmmes i beriget medium og over ­
føres til en dyrkningsflaske. Mediet udskiftes dagen efter. H295R-cellerne 
dyrkes i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO
 2 i atmosfærisk luft, og 
mediet fornyes 2-3 gange ugentligt. Når cellerne er omtrent 85-90 % sammenflydende, skal de spaltes. Cellespaltning er nødvendig for at sikre, at cellerne er sunde, at de vokser celler og for at have celler til rådighed til 
bioassays. Cellerne skylles tre gange i phosphatbufferet saltopløsning (PBS, 
uden Ca
 2+ Mg 2+. ) og udskilles fra dyrkningsflasken ved tilsætning af et 
passende adskillelsesenzym, f.eks. trypsin, i PBS (uden Ca  2+ Mg 2+ ). Umid­
delbart efter at cellerne adskilles fra dyrkningsflasken, indstilles enzympro ­
cessen ved tilsætning af beriget medium i forholdet 3 × den mængde, der er 
anvendt til enzymbehandlingen. Celler anbringes i et centrifugeglas, centri ­
fugeres ved stuetemperatur, supernatanten fjernes, og cellemassen genopslæmmes i beriget medium. En passende mængde celleopløsning 
placeres i den nye dyrkningsflaske. Mængden af celleopløsning tilpasses, 
så cellerne er sammenflydende inden for 5-7 dage. Det anbefalede subdyrk ­
ningsforhold er 1:3 til 1:4. Pladen mærkes omhyggeligt. Cellerne er nu klar til brug i assayet, og overskydende celler nedfryses i flydende nitrogen som 
beskrevet i pkt. 20.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) ‘Ny batch’ betyder en frisk batch af celler fra ATCC. 
( 2 ) ‘Nedfrossen batch’ betyder celler, der er dyrket tidligere og senere nedfrosset på et andet 
laboratorium end ATCC.
 Nedfrysning af H295R-celler (fremstilling af celler til opbevaring i 
flydende nitrogen)  
20. Til fremstilling af H295R-celler til nedfrysning følges den ovenfor beskrevne 
procedure for spaltning af celler indtil fasen med genopslæmming af celle ­
massen i bunden af centrifugeglasset. Her genopslæmmes cellemassen i fryse ­
medium. Opløsningen overføres til et kryogent hætteglas, mærkes omhygge ­
ligt og nedfryses ved – 80 °C i 24 timer, hvorefter det kryogene hætteglas 
overføres til opbevaring i flydende nitrogen. Yderligere oplysninger om denne procedure findes i bilag III til valideringsrapporten (4).
 
Udpladning og præinkubation af celler til test  
21. Det nødvendige antal af 24-brøndsplader, fremstillet som beskrevet i pkt. 
19, afhænger af antallet af kemikalier, der skal testes, og cellernes konfluens i dyrkningsskålene. Generelt er der i en dyrkningsflaske (75 cm
 2 ) med 80- 
90 % sammenflydende celler nok til 1-1 1/2 plader (med 24 brønde) med en 
måltæthed på 200 000-300 000 celler pr. ml medium, hvilket resulterer i 
omtrent 50-60 % konfluens i brøndene efter 24 timer (figur 2). Dette er typisk den optimale celletæthed til hormonproduktion i assayet. Ved højere tætheder ændres produktionsmønstrene for både T og E2. Før assayet fore ­
tages for første gang, anbefales det at teste forskellige podningstætheder i 
størrelsesordenen 200 000-300 000 celler pr. ml, og den tæthed, der resul ­
terer i en konfluens på 50-60 % i brønden efter 24 timer, vælges til yder ­
ligere eksperimenter.
 
Figur 2  
Fotomikrograf af H295R-celler med en podningstæthed på 50 % i en dyrkningsplade 
med 24 brønde efter 24 timer taget ved kant (A) og i midten (B) af en brønd.
  
22. Mediet afpipetteres fra dyrkningsflasken, og cellerne skylles tre gange med 
sterilt PBS (uden Ca  2+ Mg 2+ ). En enzymopløsning (i PBS) tilsættes for at 
adskille cellerne fra dyrkningsflasken. Efter at cellerne har haft passende tid 
til at adskilles, standses enzymprocessen ved tilsætning af beriget medium i 
forholdet 3 × den mængde, der er anvendt til enzymbehandlingen. Celler  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
anbringes i et centrifugeglas, centrifugeres ved stuetemperatur, superna ­
tanten fjernes, og cellemassen genopslæmmes i beriget medium. Celletæt ­
heden beregnes ved hjælp af f.eks. et hæmocytometer eller celletæller. Celleopløsningen fortyndes til den ønskede udpladningstæthed og blandes omhyggeligt for at sikre en homogen celletæthed. Cellerne udplades med 1 
ml af celleopløsningen/brønden, og plader og brønde mærkes. De podede 
plader inkuberes ved 37 °C under 5 % CO
 2 i atmosfærisk luft i 24 timer, så 
cellerne kan binde sig til brøndene.  
KVALITETSKONTROLKRAV  
23. Det er vigtigt, at der anbringes nøjagtige mængder opløsning og prøver i 
brøndene under dosering, fordi disse mængder bestemmer de koncentratio ­
ner, der bruges i beregningerne af assayets resultater.  
24. Før iværksættelse af celledyrkning og efterfølgende test skal hvert labora ­
torium påvise sit hormonmålesystems følsomhed (punkt 29-31).  
25. Hvis der skal anvendes antistofbaserede hormonmålingsassays, analyseres 
de kemikalier, der skal testes, for deres potentiale til at forstyrre det måle ­
system, de anvendes til at kvantificere T og E2 som beskrevet i pkt. 32 forud for igangsættelsen af testen.
 
26. DMSO er det anbefalede opløsningsmiddel til assayet. Hvis der bruges et 
andet opløsningsmiddel, skal følgende fastslås:  
— testkemikaliets, forskolins og procloraz' opløselighed i opløsningsmidlet  
— cytotoksiciteten som en funktion af opløsningsmidlets koncentration.  
Det anbefales, at den maksimalt tilladelige opløsningsmiddelkoncentration 
ikke overstiger en 10 × fortynding af den mindst cytotoksiske koncentration af opløsningsmidlet.
 
27. Før testen gennemføres for første gang, gennemfører laboratoriet et test ­
forsøg for at godtgøre, at det er i stand til at opretholde og fremstille en 
passende cellekultur, og at de opfylder de forsøgsmæssige betingelser for 
kemisk test som beskrevet i pkt. 33-35.  
28. Når der iværksættes test med en ny batch, køres en kontrolplade før brug af 
en ny batch af celler for at vurdere cellernes adfærd som beskrevet i pkt. 36-37.
 
Hormonmålesystemets ydeevne  
Metodens sensitivitet, nøjagtighed, præcision og krydsreaktivitet i forhold til 
prøvematrix  
29. Alle laboratorier kan frit vælge deres eget hormonmålesystem til analyse af 
produktionen af T og E2 med H295R-celler, blot det opfylder ydeevne ­
kriterierne, herunder bestemmelsesgrænsen (LOQ). Nominelt er disse 100 pg/ml for T og 10 pg/ml for E2, baseret på de basalhormonniveauer, der er observeret i valideringsundersøgelserne. Der kan dog anvendes højere eller 
lavere niveauer afhængigt af basalhormonniveauet, som det laboratorium, 
der foretager analysen, har opnået. Forud for initiering af kvalitetskontrol ­
pladen og testkørsler påviser laboratoriet, at det hormonassay, der skal anvendes, kan måle hormonkoncentrationer i beriget medium med tilstræk ­
kelig nøjagtighed og præcision til at opfylde kvalitetskontrolkriterierne i 
tabel 1 og 5, ved at analysere beriget medium spiked med en intern
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
hormonkontrol. Beriget medium spikes med mindst tre koncentrationer af 
hvert hormon (f.eks. 100, 500 og 2 500 pg/ml T og 10, 50 og 250 pg/ml 
E2, eller de lavest mulige koncentrationer baseret på påvisningsgrænserne for det valgte hormonmålesystem kan bruges til de laveste spike-koncentrationer for T og E2) og analyseres. Målte hormonkoncen ­
trationer af ikke-ekstraherede prøver skal ligge inden for 30 % af de nomi ­
nelle koncentrationer, og variationer mellem replikatmålinger af samme prøve må ikke overstige 25 % (se også tabel 8 for yderligere kvalitetskon ­
trolkriterier). Hvis disse kvalitetskontrolkriterier er opfyldt, antages det, at 
det valgte hormonmåleassay er tilstrækkelig nøjagtigt, præcist og ikke 
krydsreagerer med komponenter i mediet (prøvematrix), således at der kunne forventes en betydelig indflydelse på assayets resultat. I så fald kræves der ikke ekstraktion af prøver før målingen af hormoner.
 
30. Er kvalitetskontrolkriterierne i tabel 1 og 8 ikke opfyldt, kan der opstå en 
signifikant matrixeffekt, og der bør gennemføres et forsøg med ekstraheret spiked medium. Et eksempel på en ekstraktionsprocedure er beskrevet i 
bilag II til valideringsrapporten (4). Der bør foretages tredobbelte målinger 
af hormonkoncentrationerne i de ekstraherede prøver. (
 1 ) Hvis det kan påvi ­
ses, at mediets komponenter efter ekstraktion ikke forstyrrer hormonpåvis ­
ningsmetoden som defineret i kvalitetskontrolkriterierne, bør alle yderligere 
forsøg foretages med ekstraherede prøver. Hvis kvalitetskontrolkriterierne 
ikke kan opfyldes efter ekstraktion, er det anvendte hormonmålesystem ikke egnet til anvendelse i H295R-steroidgenese-assayet, og der bør anvendes en anden metode til hormonpåvisning.
 
Standardkurve  
31. Hormonkoncentrationerne i opløsningsmiddelkontrollerne (SC) bør ligge 
inden for den lineære del af standardkurven. SC-værdierne bør ligge tæt på midten af den lineære del for at sikre, at induktion og inhibering af 
hormonsyntese kan måles. De fortyndinger af medium (eller ekstrakter), der 
skal måles, udvælges i overensstemmelse hermed. Det lineære forhold bestemmes under anvendelse af en velegnet statistisk tilgang.
 
Test for kemisk interferens  
32. Hvis der skal anvendes antistofbaserede assays såsom ELISA (Enzyme- 
Linked Immunosorbent Assays) og RIA (Radio-Immuno Assays) til at måle hormoner, testes hvert testkemikalie for potentiel interferens med det 
hormonmålesystem, der skal bruges, før iværksættelse af den faktiske test af 
kemikalierne (bilag III til valideringsrapporten(4)), fordi nogle kemikalier kan forstyrre disse test (17). Hvis der optræder en interferens på ≥ 20 % af 
basalhormonproduktion for T og/eller E2 som fastslået ved hormonanalyse, 
køres interferenstesten (Chemical Hormone Assay Interference Test) (som 
beskrevet i bilag III til valideringsrapporten (4) afsnit 5.0) for alle fortyn ­
dinger af testkemikaliets stamopløsning for at identificere den tærskeldosis,
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) NB: Hvis ekstraktion er påkrævet, foretages der tre gentagne målinger for hvert ekstrakt. 
Hver prøve ekstraheres kun én gang.
 hvor der optræder betydelig interferens ( ≥ 20 %). Hvis interferensen er 
under 30 %, kan resultaternes korrigeres for denne. Hvis interferensen over ­
stiger 30 %, er dataene ugyldige, og dataene ved disse koncentrationer bør kasseres. Hvis et testkemikalie interfererer med et hormonmålesystem ved mere end en ikkecytotoksisk koncentration, bør der anvendes et andet 
hormonmålesystem. For at undgå interferens fra kontaminerende kemikalier 
anbefales det at ekstrahere hormoner fra mediet ved hjælp af et dertil egnet opløsningsmiddel. Mulige metoder kan findes i valideringsrapporten (4).
 
Tabel 1  
Ydeevnekriterier for hormonmålesystemer  
Parameter Kriterium  
Målemetodens sensitivitet Bestemmelsesgrænse (LOQ) 
T: 100 pg/ml, E2: 10 pg/ml (  a ) 
Effektiviteten af hormonekstraktion 
(kun når ekstraktion er nødvendig) De gennemsnitlige genvindingspro ­
center (baseret på tredobbelte målin ­
ger) for spinkede mængder hormon må ikke afvige mere end 30 % fra den mængde, der blev tilsat. 
Kemisk interferens (kun systemer 
baseret på antistof) Der bør ikke indtræde nogen 
væsentlig ( ≥ 30 % af basalhormon ­
produktionen af det respektive 
hormon) krydsreaktivitet med de 
hormoner, der er fremstillet af cellerne (
 b ), ( c ) 
( a ) NB : Metodemålegrænser er baseret på værdierne for basalhormonproduktion i 
tabel 5 og på ydeevne. Hvis der kan sikres en større basalhormonproduktion, kan grænsen være større. 
(
 b ) Nogle T- og E2-antistoffer kan krydsreagere med androstendion og østron ved en 
større procentdel. I disse tilfælde er det ikke muligt at fastslå effekten på 17 β-HSD 
nøjagtigt. Dataene kan dog stadig give nyttige oplysninger om effekten på 
østrogen- eller androgenproduktionen generelt. I disse tilfælde bør data udtrykkes 
som androgen-/østrogenreaktioner snarere end E2 og T. 
( c ) Disse omfatter: cholesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoxycorticosteron, 
corticosteron, aldosteron, 17 α-pregnenolon, 17 α-progesteron, deoxycortisol, corti ­
sol, DHEA, androstenedion og østron.  
Godkendelsestest af laboratoriet  
33. Før ukendte kemikalier testes, skal et laboratorium påvise, at det er i stand 
til at fremstille og opretholde en egnet cellekultur, og at det opfylder test ­
betingelserne for at sikre en vellykket gennemførelse af assayet, ved at gennemføre en godkendelsestest af laboratoriet. Da kvaliteten af et assay 
hænger direkte sammen med det laboratoriepersonale, der gennemfører 
dette, bør disse procedurer delvist gentages, hvis der sker ændringer i personalesammensætningen.
 
34. Denne godkendelsestest gennemføres under de samme betingelser som 
beskrevet i pkt. 38-40, idet celler udsættes for syv stigende koncentrationer af stærke, moderate og svage inducere og inhibitorer samt et negativt 
kemikalie (se tabel 2). Specifikt omfatter de kemikalier, der skal testes, 
den stærke inducer forskolin (CAS-nr. 66575-29-9), den stærke inhibitor
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
prochloraz (CAS-nr. 67747-09-5), den moderate inducer atrazin (CAS- 
nr. 1912-24-9), den moderate inhibitor aminoglutethimid (CAS-nr. 125- 
84-8), den svage inducer (E2-produktion) og den svage inhibitor (T-produk ­
tion) bisphenol A (CAS-nr. 80-05-7) samt den negative kemiskel humant chorion-gonadotropin (HCG) (CAS-nr. 9002-61-3) som vist i tabel 2. Sepa ­
rate plader køres for alle kemikalier under anvendelse af det format, der er 
vist i tabel 6. En kvalitetskontrolplade (tabel 4, pkt. 36-37) indgår i hver daglig kørsel for kompetencekemikalierne.
 
Tabel 2  
Kompetencekemikalier og eksponeringskoncentrationer  
Kompetencekemikalie Testkoncentrationer [ μM] 
Prochloraz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskolin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrazin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutethimid 0 (  a ), 0,03, 0,1, 3, 10, 30, 100 
Bisphenol A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) (DMSO) opløsningsmiddelkontrol (0), 1 μl DMSO/brønd  
Udsættelse af H295R for kompetencekemikalier bør ske i plader med 24 
brønde under laboratoriets godkendelsestest. Dosering er i μM for alle doser 
af testkemikalier. Doser bør indgives i DMSO ved 0,1 % v/v pr. brønd. Alle 
testkoncentrationer testes i tredobbelte brønde (tabel 6). Separate plader køres for hvert kemikalie. En kvalitetskontrolplade indgår i hver daglig kørsel.
 
35. Analyser af cellelevedygtighed og hormoner gennemføres som anført i pkt. 
42-46. Tærskelværdien (laveste observerede effektkoncentration, LOEC) og klassificeringsafgørelser rapporteres og sammenlignes med værdierne i tabel 3. Dataene betragtes som acceptable, hvis de opfylder LOEC og klassifice ­
ringsafgørelsen i tabel 3.
 
Tabel 3  
Tærskelværdier (LOEC) og klassificeringsafgørelse for kompetencekemikalier  
CAS-nr. LOEC [μM] Klassificeringsafgørelse 
T E2 T E2  
Prochloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (Inhibering) + (Inhibering) 
Forskolin 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (Induktion) + (Induktion) 
Atrazin 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (Induktion) + (Induktion) 
Aminoglutet ­
himid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (Inhibering) + (Inhibering)  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
CAS-nr. LOEC [μM] Klassificeringsafgørelse 
T E2 T E2  
Bisphenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (Inhibering) + (Induktion) 
HCG 9002-61-3 n/a n/a Negativ Negativ  
( a ) +, positiv 
n/a: ikke relevant, da der ikke bør indtræde ændringer efter udsættelse for ikkecytotoksiske koncentrationer ved negativ kontrol.
 
Kvalitetskontrolplade  
36. Kvalitetskontrolpladen (QC-plade) bruges til at kontrollere H295R-cellernes 
ydeevne under standarddyrkningsforhold og til at oprette en historisk data ­
base for hormonkoncentrationer i opløsningsmiddelkontroller og negative 
kontroller samt andre kvalitetskontrolmålinger over tid.  
— H295R-cellers ydeevne bør vurderes ved hjælp af en QC-plade for hver 
ny ATCC-batch eller efter anvendelse af nedfrosne celler for første gang, medmindre laboratoriets godkendelsestest (punkt 32-34) er kørt 
med samme cellebatch.
 
— En QC-plade giver en fuldstændig vurdering af assaybetingelserne 
(f.eks. cellernes levedygtighed, opløsningsmiddelkontroller, negative og positive kontroller samt levedygtighed intra- og inter-assay) ved 
test af kemikalier og bør indgå i hver testkørsel.
 
37. QC-testen foretages i en plade med 24 brønde og følger samme procedurer 
for inkubation, dosering, cellelevedygtighed/-cytotoksicitet, hormonekstrak ­
tion og hormonanalyse som beskrevet i pkt. 38-46 for test af kemikalier. QC-pladen indeholder tomme brønde, opløsningsmiddelkontroller og to 
koncentrationer af en kendt inducer (forskolin, 1, 10 μM) og inhibitor 
(prochloraz, 0,1, 1 μM) fra E2- og T-syntese. Desuden bruges MeOH i 
udvalgte brønde som en positiv kontrol til levedygtigheds-/cytotoksicitetsassayet. Der findes en detaljeret beskrivelse 
af pladen i tabel 4. De kriterier, der skal opfyldes på QC-pladen, findes i 
tabel 5. Den minimale basalhormonproduktion for T og E2 skal opnås i både opløsningsmiddelkontrol og tomme brønde.
 
Tabel 4  
Kvalitetskontrolpladelayout for test af ydeevne for ikkeudsatte H295R-celler og celler, 
der udsættes for kendte inhibitorer (PRO = prochloraz) og stimulatorer (FOR = 
forskolin) ved produktion af E2 og T. Efter afslutningen af eksponeringsforsøget og fjernelse af mediet tilsættes en 70 % methanolopløsning til alle MeOH-brønde med henblik på en positiv kontrol for cytotoksicitet (se cytotoksicitetassay i bilag III til 
valideringsrapporten (4))
 
1 2 3 4 5 6  
A Tom (  a ) Tom (  a ) Tom (  a ) Tom (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Tom (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Tom (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Celler i tomme brønde tilsættes kun medium (f.eks. ikke opløsningsmiddel). 
( b ) Methanol (MeOH) tilsættes  efter  afslutningen af udsættelsen, og efter at mediet er fjernet fra disse 
brønde. 
( c ) DMSO-opløsningsmiddelkontrol (1 μl/well).  
Tabel 5  
Ydeevnekriterier for kvalitetskontrolplade  
T E2  
Basalhormonproduktion i 
opløsningsmiddelsmidde ­
lkontrollen (SC) ≥ 5 gange LOQ ≥ 2,5 gange LOQ 
Induktion (10 μM 
forskolin) ≥ 1,5 gange SC ≥ 7,5 gange SC 
Inhibition (1 μM prochlo ­
raz) ≤ 0,5 gange SC ≤ 0,5 gange SC  
PROCEDURE FOR EKSPONERING FOR TESTKEMIKALIE  
38. De præinkuberede celler fjernes fra inkubatoren (punkt 21) og kontrolleres 
under et mikroskop for at sikre, at de er i god stand (binding og morfologi) før dosering.
 
39. Cellerne anbringes i et biosikkerhedskabinet, og det berigede medium 
fjernes og erstattes med nyt beriget medium (1 ml/brønd). DMSO er det 
foretrukne opløsningsmiddel til denne testmetode. Hvis der imidlertid er grund til at bruge andre opløsningsmidler, beskrives rationalet. Cellerne udsættes for testkemikaliet ved tilsætning af 1 μl af den passende stamop ­
løsning i DMSO (se bilag II til valideringsrapporten (4)) pr. 1 ml beriget 
medium (brøndvolumen). Dette resulterer i en endelig koncentration på 0,1 % DMSO i brøndene. For at sikre tilstrækkelig blanding foretrækkes det generelt, at den passende stamopløsning af testkemikaliet i DMSO 
blandes med beriget medium for at sikre den ønskede endelige koncen ­
tration for hver dosis, og at blandingen tilsættes hver brønd umiddelbart efter fjernelse af det gamle medium. Hvis denne mulighed vælges, skal koncentrationen af DMSO (0,1 %) være den samme i alle brønde. 
Brønde med de to største koncentrationer bedømmes visuelt ved hjælp af 
et stereomikroskop med henblik på påvisning af evt. dannelse af bundfald eller uklarheder som en indikation for ufuldstændig opløselighed i testke ­
mikaliet. Hvis noget sådant (uklarheder eller dannelse af bundfald) konsta ­
teres, undersøges brønde med lavere koncentrationer også (osv.), og 
koncentrationer, der ikke gik fuldstændigt i opløsning, udelukkes fra yder ­
ligere evaluering og analyse. Pladen anbringes igen i inkubatoren ved 37 °C under en 5 % CO
 2 i atmosfærisk luft i 48 timer. Layoutet for testkemika ­
liepladen er vist i tabel 6. Stamopløsning 1-7 viser placering af stigende 
doser af testkemikaliet.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabel 6  
Doseringsprincip for udsættelse af H295R-celler for testkemikalier i en plade med 24 
brønde.  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Stamopløs ­
ning 4 Stamopløs ­
ning 4 Stamopløs ­
ning 4 
B Stamopløs ­
ning 1 Stamopløs ­
ning 1 Stamopløs ­
ning 1 Stamopløs ­
ning 5 Stamopløs ­
ning 5 Stamopløs ­
ning 5 
C Stamopløs ­
ning 2 Stamopløs ­
ning 2 Stamopløs ­
ning 2 Stamopløs ­
ning 6 Stamopløs ­
ning 6 Stamopløs ­
ning 6 
D Stamopløs ­
ning 3 Stamopløs ­
ning 3 Stamopløs ­
ning 3 Stamopløs ­
ning 7 Stamopløs ­
ning 7 Stamopløs ­
ning 7  
40. Efter 48 timer fjernes eksponeringspladerne fra inkubatoren, og hver brønd 
kontrolleres under mikroskop for cellernes tilstand (binding, morfologi, grad 
af konfluens) og tegn på cytotoksicitet. Mediet fra hver brønd deles i to lige store mængder (ca. 490 μl hver) og overføres til to særskilte hætteglas, som 
mærkes korrekt (dvs. en aliquot med henblik på at sikre en ekstra prøve for 
hver brønd). For at forhindre udtørring af cellerne fjernes mediet en række 
eller kolonne ad gangen og erstattes med mediet med henblik på levedygtigheds-/cytotoksicitetassayet af cellen. Hvis cellers levedygtighed/ cytotoksicitet ikke måles med det samme, tilsættes 200 μl PBS med Ca
 2+ og 
Mg 2+ til hver brønd. Medierne nedfryses til – 80 °C indtil videre behand ­
ling for at analysere hormonkoncentrationer (se pkt. 44-46). Mens T og E2 i medium opbevaret ved – 80 °C generelt er stabile i mindst tre måneder, skal hormonstabiliteten under opbevaring dokumenteres i hvert laboratorium.
 
41. Umiddelbart efter at have fjernet mediet bestemmes cellens levedygtighed/ 
cytotoksicitet for hver eksponeringsplade.  
Bestemmelse af cellelevedygtighed  
42. Et assay vedrørende cellers levedygtighed/cytotoksicitet kan bruges til at 
bestemme testkemikaliets potentielle effekt på cellers levedygtighed. Assayet skal tilvejebringe en korrekt måling af procentdelen af levedygtige 
celler i en brønd, eller det skal påvise, at det er direkte sammenligneligt 
med (en lineær funktion af) Live/Dead® Assay (se bilag III i validerings ­
rapporten (4)). Et alternativt assay, der har vist sig at fungere lige så godt, er testen MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromi ­
d](18). Bedømmelsen af cellelevedygtigheden under anvendelse af oven ­
stående metoder er en relativ måling, der ikke nødvendigvis står i et lineært forhold til det absolutte antal celler i en brønd. En analytiker bør derfor parallelt foretage en subjektiv visuel bedømmelse af hver brønd, og 
der bør tages digitale billeder af SC'er og de to største ikkecytotoksiske 
koncentrationer, som arkiveres med henblik på senere vurdering af reel celletæthed, hvis dette skulle blive nødvendigt. Hvis en visuel inspektion eller levedygtigheds-/cytotoksicitetsassayet viser, at der har været en stig ­
ning i antal celler, skal denne tilsyneladende stigning kontrolleres. Hvis der 
konstateres en stigning i celletallet ved kontrol, anføres dette i testrapporten. Cellelevedygtigheden udtrykkes i forhold til middelreaktionen i SC'erne, der betragtes som 100 % levedygtige celler, og beregnes for det anvendte 
cellelevedygtigheds-/cytotoksicitetsassay. For MTT-assayet kan følgende 
formel bruges:
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% levedygtige celler =  (reaktion i brønd – middelreaktion i 
MeOH-behandlede [= 100 % døde] brønde) ÷ (middelreaktion i 
SC-brønde – middelreaktion i MeOH-behandlede [= 100 % døde] brønde)  
43. Brønde med en levedygtighed på under 80 % i forhold til den gennemsnit ­
lige levedygtighed i SC'erne (= 100 % levedygtighed) bør ikke indgå i den 
endelige dataanalyse. Inhibering af steroidgenese ved næsten 20 % cytotok ­
sicitet bør evalueres omhyggeligt for at sikre, at cytotoksicitet ikke er årsagen til inhiberingen.
 
Hormonanalyse  
44. Hvert laboratorium kan bruge et hormonmålesystem efter eget valg til 
analysen af T og E2. Overskydende aliquoter af medium fra hver behand ­
lingsgruppe kan anvendes til fremstilling af fortyndinger med henblik på at sikre, at koncentrationen ligger inden for den lineære del af standardkurven. 
Som anført i pkt. 29 skal hvert laboratorium påvise, at deres hormonmåle ­
system (f.eks. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) overholder kvalitetskon ­
trolkriterierne, ved at analysere beriget medium spiked med en intern hormonkontrol forud for gennemførelsen af kvalitetskontrolkørsler eller 
test af kemikalier. For at sikre, at testsystemets komponenter ikke forstyrrer 
målingen af hormoner, kan det være nødvendigt at ekstrahere disse fra mediet før måling (se pkt. 30 for betingelserne for, hvornår ekstraktion er nødvendig eller ikke). Det anbefales at foretage ekstraktion efter procedu ­
rerne i bilag III til valideringsrapporten (4).
 
45. Hvis der anvendes kommercielt testkit til måling af hormonproduktionen, 
bør hormonanalysen foretages som beskrevet i testkitproducentens manua ­
ler. De fleste producenter har en unik procedure for gennemførelse af 
hormonanalyser. Prøvefortyndinger skal tilpasses, således at de forventede 
hormonkoncentrationer for opløsningsmiddelkontrollerne kommer til at ligge i midten af den lineære del af standardkurven for det enkelte assay 
(bilag III i valideringsrapporten (4)). Værdier uden for den lineære del af 
standardkurven kasseres.
 
46. Endelige hormonkoncentrationer beregnes som følger:  
Eksempel: 
Ekstraheret: 450 μl medium 
Rekonstitueret i: 250 μl assaybuffer 
Fortynding i assay: 1:10 (så prøven kommer til at ligge 
inden for standardkurvens lineære del) 
Hormonkoncentration i assay: 150 pg/ml (allerede tilpasset koncentra ­
tion pr. ml analyseret prøve) 
Genvinding: 89 % Endelig hormonkoncentration = (Hormonkoncentration (pr. ml) ÷ 
genvinding) (fortyndingsfaktor) 
Endelig hormonkoncentration = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Udvælgelse af testkoncentration  
47. Der bør gennemføres mindst to uafhængige kørsler af assayet. Medmindre 
forudgående information om f.eks. opløselighedsgrænser eller cytotoksicitet 
giver et grundlag for udvælgelse af testkoncentrationer, anbefales det at sprede testkoncentrationerne i den først kørsel efter log
 10 -intervaller, hvor 
10 -3 M er den maksimale koncentration. Hvis kemikaliet er opløseligt og 
ikkecytotoksisk ved de testede koncentrationer, og hvis den første kørsel var 
negativ for alle koncentrationer, skal det bekræftes i endnu en kørsel under samme betingelser som for den først kørsel (tabel 7). Hvis resultaterne af den første kørsel er tvetydige (dvs. at foldsændringen adskiller sig statistisk 
signifikant fra SC'en ved kun en koncentration) eller positive (dvs. at folds ­
ændringen ved to eller flere koncentrationer er statistisk signifikant) bør testen gentages som angivet i tabel 7 ved at forfine de valgte testkoncen ­
trationer. Testkoncentrationer ved kørsel to og tre (hvis relevant) tilpasses 
på basis af resultaterne af den første kørsel ved at isolere koncentrationer, 
der fremkalder en effekt, under anvendelse af et koncentrationsinterval på 1/2-log (hvis den oprindelige kørsel på 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 μM f.eks. resulterede i induktioner ved 1 og 10 μM, bør de koncentrationer, 
der testes i den anden kørsel, være 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), 
medmindre der skal anvendes lavere koncentrationer for at sikre en LOEC. I sidstnævnte tilfælde bør der i den anden kørsel anvendes mindst fem koncentrationer under den laveste koncentration, der blev testet i den 
første kørsel under anvendelse af en 1/2-logaritmisk skala. Hvis den anden 
kørsel ikke bekræfter den første (dvs. at den statistiske signifikans ikke optræder ved den tidligere positivt testede koncentration ± 1 koncentrations ­
forøgelse), skal der foretages et tredje forsøg under anvendelse af de oprin ­
delige testbetingelser. Tvetydige resultater i første kørsel betragtes som 
negative, hvis den observerede effekt ikke kunne bekræftes i de to efter ­
følgende kørsler. Tvetydige resultater betragtes som positive reaktioner (virkning), når reaktionen kan bekræftes i mindst endnu en kørsel inden 
for en koncentrationsforhøjelse på a ± 1 (se afsnit 55 med hensyn til data ­
fortolkningsproceduren).
 
Tabel 7  
Afgørelsesmatrix for mulige resultatscenarier  
Kørsel 1 Kørsel 2 Kørsel 3 Afgørelse 
Scenario Afgørelse Scenario Afgørelse Scenario Positiv Negativ  
Negativ Bekræft (  a ) Negativ Stop X 
Negativ Bekræft (  a ) Positiv Forfin (  b ) Negativ X 
Tvetydig (  c ) Forfin (  b ) Negativ Bekræft (  a ) Negativ X 
Tvetydig (  c ) Forfin (  b ) Negativ Bekræft (  a ) Positiv X 
Tvetydig (  c ) Forfin (  b ) Positiv X 
Positiv Forfin (  b ) Negativ Bekræft (  a ) Positiv X  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Kørsel 1 Kørsel 2 Kørsel 3 Afgørelse 
Scenario Afgørelse Scenario Afgørelse Scenario Positiv Negativ  
Negativ Bekræft (  a ) Positiv Forfin (  b ) Positiv X 
Positiv Forfin (  b ) Positiv Stop X  
( a ) Bekræft foregående kørsel under anvendelse af samme forsøgsdesign. 
( b ) Gennemfør assayet igen med et koncentrationsinterval på 1/2-log (isolering af den koncentration, der var signifikant forskell ig 
i det foregående forsøg). 
( c ) Foldsændring ved én koncentration er statistisk signifikant forskellig fra SC'en  
Kvalitetskontrol af testpladen  
48. Ud over at opfylde kriterierne for kvalitetskontrolpladen skal andre kvali ­
tetskriterier vedrørende acceptabel variation mellem hormonmålesystemers 
replikatbrønde, kontraforsøg, linearitet og sensitivitet, variabilitet mellem 
kontrahormonmålinger af samme prøve samt genvindingsprocent af hormon-spikes efter ekstraktion af medium (hvis relevant: se pkt. 30 
vedrørende krav til ekstraktion) opfyldes. Disse kvalitetskriterier findes i 
tabel 8. Data skal ligge inden for de acceptable intervaller som fastlagt for hver parameter, der skal tages i betragtning til yderligere evaluering. Hvis disse kriterier ikke opfyldes, anføres det i regnearket, at kvalitetskon ­
trolkriterierne ikke blev opfyldt for den pågældende prøve, og prøven 
analyseres igen eller fjernes fra datasættet.
 
Tabel 8  
Acceptable intervaller og/eller variation (%) for parametre for H295R-assayets testplade  
(LOQ: Bestemmelsesgrænse for hormonmålesystemet. CV: Variationskoefficient. SC: 
Opløsningsmiddelkontrol. DPM: Disintegrationer pr. minut)  
Sammenligning mellem T E2  
Basalhormonproduktion i 
SC'er Fold større end LOQ ≥ 5-fold ≥ 2,5-fold 
Eksponeringsforsøg — 
inden for CV for SC'er 
(replikatbrønde) Absolutte koncentrationer ≤ 30 % ≤ 30 % 
Eksponeringsforsøg — 
mellem plade-CV for 
SC'er (replikatforsøg) Foldsændring ≤ 30 % ≤ 30 % 
Hormonmålesystem — 
sensitivitet Påviselig fold-reduktion i 
forhold til SC ≥ 5-fold ≥ 2,5-fold 
Hormonmålesystem — 
replikatmåling af CV for SC'er (
 a ) Absolutte koncentrationer ≤ 25 % ≤ 25 % 
Ekstraktion af medium — 
genvinding af intern 3H- standard (hvis relevant) DPM ≥ 65 % nominelt
 
( a ) Henviser til replikatmålinger af samme prøve.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
DATAANALYSE OG RAPPORTERING  
Dataanalyse  
49. For at evaluere den relative stigning/nedgang i kemisk ændret hormonpro ­
duktion normaliseres resultaterne til den gennemsnitlige SC-værdi for hver 
testplade, og resultaterne udtrykkes som ændringer i forhold til SC'en i hver testplade. Alle data udtrykkes som gennemsnitlig ± 1 standardafvigelse (SD).
 
50. Kun hormondata fra brønde med en cytotoksicitet på under 20 % medtages 
i dataanalysen. Relative ændringer beregnes som følger:  
Relativ ændring =  (hormonkoncentration i hver brønd) ÷ (middel-hormon ­
koncentration i alle opløsningsmiddelkontrolbrønde).  
51. Hvis der ved visuel inspektion af brønden eller som påvist i 
levedygtigheds-/cytotoksicitetsassayet, jf. beskrivelse i pkt. 42, viser sig at være en stigning i celletal, kontrolleres denne tilsyneladende stigning. Hvis 
en stigning i celletal kontrolleres, anføres dette i testrapporten.
 
52. Før de statistiske analyser vurderes antagelserne vedrørende normalitet og 
varianshomogenitet. Normalitet bør evalueres under anvendelse af standard ­
sandsynlighedsplots eller en anden hensigtsmæssig statistisk metode (f.eks. 
Shapiro-Wilk-test). Hvis dataene (foldsændringer) ikke er normalt fordelt, 
forsøges der foretaget en transformation af dataene for at tilnærme dem en normal fordeling. Hvis dataene er normalt fordelt eller nærmer sig en normal fordeling, analyseres forskellene mellem kemiske koncentrations ­
grupper og SC'er ved hjælp af en parametertest (f.eks. Dunnetts test), 
hvor koncentration er den uafhængige og reaktion (foldsændring) den afhængige variabel. Hvis data ikke er normalt fordelt, bruges en hensigts ­
mæssig ikkeparametertest (f.eks. Kruskal Wallis eller Steels many-one rank 
test). Forskelle anses som signifikante ved p ≤ 0,05. Statistiske evalueringer 
baseres på middelværdier for hver brønd, der repræsenterer uafhængige replikatdatapunkter. Det forventes, at det på grund af det store interval 
mellem doser i den første kørsel (log
 10 -skala) i mange tilfælde ikke vil 
være muligt at beskrive klare koncentration-reaktion-forhold, hvor de to største doser vil ligge i den lineære del af sigmoidkurven. I den første kørsel eller ethvert andet datasæt, hvor dette forhold opstår (f.eks. hvor 
det ikke er muligt at anslå en maksimal virkning), anvendes statistik med 
fast variabel, type I, som beskrevet ovenfor.
 
53. Hvis flere end to datapunkter ligger i den lineære del af kurven, og hvor det 
er muligt at beregne maksimal virkning — som forventet for nogle af 
andenkørslerne, der foretages ved hjælp af et semi-log-interval for ekspone ­
ringskoncentrationer — følges en probit-, logit- eller anden hensigtsmæssig regressionsmodel til at beregne virkningsfulde koncentrationer (f.eks. EC50 og EC20).
 
54. Resultater anføres både grafisk (blokdiagram, der repræsenterer gennem ­
snitlig ± 1 SD) og i tabelform (LOEC/NOEC, virkningsretning og styrke af maksimal reaktion, der indgår i dataenes del om dosisrespons) (se f.eks. figur 3). Vurdering af data anses kun for at være gyldig, hvis den er baseret 
på mindst to uafhængigt af hinanden gennemførte kørsler. Et forsøg eller en 
kørsel anses for at være uafhængig, hvis den er foretaget på en anden dato under anvendelse af et nyt sæt opløsninger og kontroller. Koncentrationsi ­
onsintervallet i kørsel 2 og 3 (hvis nødvendig) kan skræddersyes på 
grundlag af resultaterne af kørsel 1 for at sikre en bedre definition af det 
dosisresponsinterval, der indeholder LOEC (se pkt. 47).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Figur 3  
Eksempel på præsentation og evaluering af data fra H295R-assayet i grafisk form og tabelform.  
Asterisker indikerer statistisk signifikante forskelle i forhold til opløsningsmiddelkontrollen (p< 0,05). LOEC: 
Lavest observerede effektive koncentration. maks. ændring: Maksimal styrke af den observerede reaktion ved 
enhver koncentration i forhold til SC-middel-reaktion (= 1)
  
Kemikalie LOEC Maks. ændring  
Forskolin 0,01 0,15 fold 
Letrozol 0,001 29 fold  
Procedure for datafortolkning  
55. Et testkemikalie anses for at være positivt, hvis fold-induktionen er statistisk 
forskellig (p ≤ 0,05) fra opløsningsmiddelkontrollen ved to nærtliggende 
koncentrationer i mindst to uafhængige kørsler (tabel 7). Et testkemikalie anses for at være negativt efter to uafhængige negative kørsler eller tre 
kørsler omfattende to negative og en tvetydig eller positiv kørsel. Hvis 
data fra tre uafhængige forsøg ikke opfylder afgørelseskriterierne i tabel 7, kan forsøgsresultaterne ikke fortolkes. Resultater ved koncentrationer, der overstiger opløselighedgrænserne eller ved cytotoksiske koncentrationer 
bør ikke medtages i fortolkningen af resultater.
 
Testrapport  
56. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Testlaboratorium  
— laboratoriets navn, placering  
— forsøgsleder og andre medarbejdere og deres undersøgelsesansvar  
— datoer for undersøgelsens begyndelse og afslutning.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Testkemikalie, reagens og kontroller  
— betegnelse (navn eller CAS-nr.), oprindelse, parti-/batchnummer, renhed, 
leverandør og beskrivelse af testkemikaliet, reagenser og kontroller  
— testkemikaliets fysiske form og relevante fysisk-kemiske egenskaber  
— opbevaringsforhold samt metode og frekvens for tilberedning af testke ­
mikalier, reagenser og kontroller  
— testkemikaliets stabilitet.  
Celler  
— kilde til og type celler  
— antal cellegenerationer (identifikation af cellegeneration) for celler 
anvendt i testen  
— beskrivelse af procedurer for opretholdelse af cellekulturer.  
Prætestkrav (hvis relevant)  
— beskrivelse af resultater af test af kemisk interferens i hormonassay  
— beskrivelse og resultater af målinger af effektivitet af hormonekstraktion  
— standard- og kalibreringskurver for alle analytiske assays  
— detektionsgrænser for udvalgte analytiske assays.  
Testbetingelser  
— mediers sammensætning  
— testkemikaliets koncentration  
— celletæthed (anslået eller målt cellekoncentration efter 24 og 48 timer)  
— testkemikaliets opløselighed (grænse for opløselighed, hvis denne er 
fastlagt)  
— inkubationtid og -betingelser.  
Testresultater  
— rådata for hver brønd for kontroller og testkemikalier — hver replikat ­
måling i form af de oprindelige data tilvejebragt af det instrument, der er brugt til at måle hormonproduktion (f.eks. OD, fluorescensenheder, DPM osv.)
 
— validering af normalitet eller forklaring på datatransformation  
— middelreaktioner ± 1 SD for hver målt brønd  
— data for cytotoksicitet (testkoncentrationer, der har forårsaget cytotoksi ­
citet)  
— bekræftelse på opfyldelse af kvalitetskontrolkriterier  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— relativ forandring sammenlignet med opløsningsmiddelkontrol korrigeret 
for cytotoksicitet  
— et blokdiagram, der viser relativ (foldsændring) ved hver koncentration, 
SD og statistisk signifikans som anført i pkt. 49-54.  
Fortolkning af data  
— Anvend datafortolkningsproceduren på resultaterne, og drøft fund.  
Diskussion  
— Er der indikationer fra undersøgelsen vedrørende muligheden af, at 
T/E2-dataene kan være påvirket af indirekte indvirkning på gluco- og mineral-corticoid-veje?
 
Konklusioner  
LITTERATUR  
1) OECD (2002). OECD Conceptual Framework for the Testing and 
Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, i bilag 2 til kapitel B.54 i dette bilag.
 
2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006). Human adrenocarcinoma (H295R) cells for 
rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone 
production, Toxicol. Appl. Pharmacol., 217, 114-124.  
3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. 
P. (2007). The OECD validation program of the H295R steroidgenesis 
assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies. Env. Sci. Pollut. Res., 14, 23 — 30.
 
4) OECD (2010), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Paris. Tilgængelig på [http://www.oecd.org/document/30/ 0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html]
 
5) OECD (2010). Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Paris. Tilgængelig på: [http://www.oecd.org/docu ­
ment/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html]  
6) Battelle (2005). Detailed Review Paper on Steroidogenesis. Tilgængelig 
på: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_ 
29_05.pdf]  
7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004). 
Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. 
Sci., 81, 78-89.  
8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002). Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by 
various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells, Toxicol. Appl. Pharmacol., 182, 44-54.
 
9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010). Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model devel ­
opment for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118: 265-272.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(0) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010). 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137-1148.  
11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990). Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis, Cancer Res., 50, 5488-5496.
 
12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010). Ozonation attenuates the steroi ­
dogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the 
H295R cell line, Chemosphere, 80:578-584.  
13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005). Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, 
Environ. Sci. Technol., 39:2777-2785.
 
14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010). 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Pol. Res., 
17:1137-1148.
 
15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993). Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. 
Endocrinol. Metab., 77, 731-737.
 
16) Kapitel B.55 i dette bilag: Hershberger-bioassay med rotter: et korttids ­
screeningassay for (anti)androgene egenskaber.  
17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976). Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2, 222-231.
 
18) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 65, 55-63.
 
19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.  
20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006). 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484- 
492.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 909
Tillæg  
DEFINITIONER  
Konfluens  betyder den tilladte celledækning af eller -spredning over 
kulturmediet.  
Kemikalie  betyder et stof eller en blanding.  
CV betegner variationskoefficienten som defineret som forholdet mellem en 
fordelings standardafvigelse og dens aritmetiske gennemsnit.  
CYP  står for cytochrom-P450-mono-oxygenaser, en familie af gener og enzymer 
produceret heraf, der indgår i katalysering af en lang række biokemiske reaktio ­
ner, herunder syntese og metabolisme af steroidhormoner.  
DPM  er disintegration pr. minut. Det er antal atomer i en bestemt mængde 
radioaktivt materiale, der påviseligt er henfaldet på ét minut.  
E2 er 17β-østradiol, det vigtigste østrogen i pattedyrssystemer.  
H295R -celler er humane adreno-carcinomceller, der har de fysiologiske karakte ­
ristika som zonalt udifferentierede adrenalceller hos menneskefostre, og som udtrykker alle enzymerne i den steroidgene vej. De kan erhverves fra ATCC.
 
Frysemedium  bruges til at nedfryse og opbevare frosne celler. Det består af 
stammedium BD NuSerum og dimethylsulfoxid.  
Lineært interval  er det interval i standardkurven for et hormonmålesystem, hvor 
resultaterne er proportionale med koncentrationen i den analyt, der findes i prøven.
 
LOQ  står for Limit of Quantification og er den mindste mængde af et kemikalie, 
der kan skelnes fra fraværet af samme kemikalie (en tom værdi) inden for et fastsat konfidensinterval. For denne metode defineres LOQ typisk af producenten af testsystemerne, medmindre andet er angivet.
 
LOEC  står for ‘Lowest Observed Effect Concentration’, dvs. det laveste koncen ­
trationsniveau, ved hvilket assayresponsen er statistisk forskellig fra opløsnings ­
middelkontrollens.  
NOEC  står for ‘No Observed Effect Concentration’, hvilket er den højeste 
testede koncentration, hvis assayet ikke tilvejebringer en positiv respons.  
Generation  er det antal gange, celler deles efter initiering af en dyrkning fra 
nedfrosne celler. Den første generation, der blev iværksat fra den nedfrosne beholdning, betegnes som nr. et (1). Celler, der har delt sig én gang, betegnes 
generation 2 osv.
 
PBS er Dulbeccos phosphatbufferede saltopløsning.  
Kvalitetskontrol , forkortelse QC, henviser til de målinger, der skal sikre gyldige 
data.  
Kvalitetskontrolplade  er en 24-brøndsplade indeholdende to koncentrationer af 
de positive og negative kontroller og anvendes til overvågning af resultaterne af 
en ny batch celler eller tilvejebringelse af positive kontroller til assayet i forbin ­
delse med test af kemikalier.  
Kørsel  er et uafhængigt forsøg karakteriseret ved et nyt sæt opløsninger og 
kontroller.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Stammedium  er grundlaget for fremstillingen af andre reagenser. Det består af 
en 1:1-blanding af Dulbeccos Modified Eagle's Medium og Ham's F-12 Nutrient 
mixture (DMEM/F12) i 15 mM HEPES-buffer uden phenolrød eller natriumbi ­
carbonat. Natriumbicarbonat tilsættes som buffer, se bilag II til valideringsrap ­
porten (4).  
Beriget medium  består af stammedium plus BD Nu-Serum og ITS+ premium 
mix, se bilag II til valideringsrapport (4).  
Steroidgenese  er den syntesevej, der fører fra cholesterol til forskellige steroid ­
hormoner. Flere mellemprodukter i steroidsyntesevejen såsom progesteron og testosteron er vigtige hormoner selv, men fungerer også som precursorer for hormoner længere ned ad syntesevejen.
 
T står for testosteron, en af de to vigtigste androgener i pattedyrssystemer.  
Testkemikalie  er stoffer eller blandinger, der testes med denne testmetode.  
Testplade  er den plade, hvor H295R-celler eksponeres for testkemikalier. Test ­
plader indeholder opløsningsmiddelkontrollen og testkemikalierne i syv koncen ­
trationsniveauer in triplo.  
Trypsin 1X  er en fortyndet opløsning af enzymet trypsin, en 
bygspytkirtel-serinprotease, der anvendes til at løsne celler fra en celledyrknings ­
plade, se bilag III til valideringsrapporten (4).  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  GENMUTATIONSTEST I SOMATISKE CELLER OG 
KØNSCELLER FRA TRANSGENE GNAVERE  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD-testvejledningen (TG) 488 (2013). EU's 
testmetoder er tilgængelige for en lang række in vitro-mutationsassays, der kan påvise kromosomale mutationer og/eller genmutationer. Der findes test ­
metoder for in vivo-slutpunkter (dvs. kromosomale afvigelser og ikkeplan ­
lagt DNA-syntese). Disse måler dog ikke genmutationer. Assays af muta ­
tioner hos transgene gnavere (transgenic rodent, TGR) opfylder behovet for praktiske og lettilgængelige in vivo-test for genmutationer.
 
2. TGR-mutationsassays er beskrevet indgående (24) (33). Hertil anvendes 
transgene rotter og mus, der indeholder flere kopier af kromosomt inte ­
grerede plasmid- eller fagshuttlevektorer. Transgenerne indeholder reporter ­
gener til påvisning af forskellige typer mutationer induceret in vivo med testkemikalier.
 
3. Mutationer, der opstår hos en gnaver, bedømmes ved at genvinde transgenet 
og analysere reportergenets fænotype i en bakteriel vært, der er mangelfuld for reportergenet. TGR-genmutationsassays måler mutationer induceret i 
genetisk neutrale gener genvundet fra praktisk talt et hvilket som helst 
væv hos gnaveren. Disse assays omgår derfor mange af de eksisterende begrænsninger ved undersøgelsen af in vivo-genmutation i endogene gener (f.eks. begrænsede væv egnet til analyse, negativ/positiv udvælgelse 
i forhold til mutationer osv.).
 
4. ‘Weight of evidence’ tyder på, at transgener reagerer på mutagener på 
samme måde som på endogene gener, især med hensyn til påvisning af 
baseparsubstitution, læserammeforskydninger samt små deletioner og inser ­
tioner (24).  
5. International Workshops on Genotoxicity Testing (IWGT) har godkendt 
medtagelsen af TGR-genmutationassays til in vivo-påvisning af genmuta ­
tioner og har anbefalet en protokol for deres gennemførelse (15)(29). Denne 
testmetode er baseret på disse anbefalinger. Yderligere analyse, som under ­
støtter anvendelsen af denne protokol, findes i (16).  
6. Det forventes, at det fremover kan være muligt at kombinere et 
TGR-genmutationsassay med en undersøgelse af toksicitet ved gentagen indgift (kapitel B.7 i dette bilag). Data skal dog sikre, at TGR-genmutationsassayets sensitivitet ikke påvirkes ved at afkorte tids ­
rummet mellem afslutningen på indgiftsperioden og prøvetagningsperioden 
med én dag, som det gøres i undersøgelsen af toksicitet ved gentagen indgift, sammenlignet med tre dage som brugt i TGR-genmutationsassayet. Der er også behov for data, som viser, at resul ­
tatet af assayet med gentagen indgift ikke påvirkes negativt ved at anvende 
en transgen stamme og ikke traditionelle gnaverstammer. Når disse data foreligger, vil testmetoden blive ajourført.
 
7. Definitioner af nøgletermer findes i bilaget.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
8. TGR-genmutationsassays, hvortil der er tilstrækkelige data til rådighed til at 
understøtte deres brug i denne testmetode, er: lacZ bakteriofag mus (Mutaä ­
mus), lacZ plasmid mus, gpt delta (gpt og Spi  – ) mus og rotte, lacI mus og 
rotte (Big Blue®), som gennemført under standardbetingelser. Desuden kan det cII-positive-udvælgelsesassay bruges til at evaluere mutationer i Big 
Blue® og Mutaä-musemodeller. Mutagenese hos TGR-modellerne vurderes 
normalt som mutanthyppighed. Om nødvendigt kan en molekylær analyse af mutationerne dog tilvejebringe supplerende oplysninger (se pkt. 24).
 
9. Disse in vivo-genmutationstest hos gnavere er særligt relevante for en 
vurdering af risikoen for mutationsfremkaldelse, idet reaktionerne i assayene 
afhænger af in vivo-metabolisme, farmakokinetik, DNA-reparationspro ­
cesser og translesion-DNA-syntese, om end disse kan variere efter art, væv og type DNA-beskadigelse. Et in vivo-assay vedrørende genmutationer 
er ligeledes nyttigt til yderligere undersøgelse af mutagene virkninger, der er 
påvist af et in vitro-system, og til opfølgning på resultater af test, hvor der er anvendt andre in vivo-endepunkter (24). Ud over kausalt at være 
associeret med induktion af kræft er genmutation et relevant endepunkt 
for forudsigelse af mutationsbaserede ikkekræftsygdomme i somatiske væv (12) (13) samt sygdomme overført gennem kimcellelinjen.
 
10. Hvis der er tegn på, at testkemikaliet eller en relevant metabolit ikke når 
frem til væv af interesse, er det ikke relevant at foretage et 
TGR-genmutationsassay.  
PRINCIP FOR TESTEN  
11. I de assays, der er beskrevet i pkt. 8, er målgenets oprindelse bakteriel eller 
bakteriofag, og det genvindes fra gnaverens genomiske DNA ved at inkor ­
porere transgenet i en λ-bakteriofag eller plasmid shuttlevektor. Proceduren 
omfatter ekstraktion af genomisk DNA fra det interessante gnavervæv, in vitro-behandling af det genomiske DNA (dvs. pakning af λ-vektorer eller 
ligering og elektroporering af plasmider for at genvinde shuttlevektoren) og 
efterfølgende påvisning af mutationer i bakterielle værter under passende forhold. I disse assays anvendes neutrale transgener, der uden problemer kan genvindes fra de fleste væv.
 
12. Basisforsøget vedrørende TGR-genmutation omfatter behandling af 
gnaveren med et kemikalie i et vist tidsrum. Kemikalier kan indgives på den mest egnede måde, herunder implantation (f.eks. test af medicinsk anordning). Det samlede tidsrum, hvor et dyr er doseret, betegnes indgifts ­
perioden. Indgift følges normalt af en periode forud for aflivning, hvor 
kemikaliet ikke længere indgives, og hvor ikkereparerede DNA-læsioner fikseres til stabile mutationer. I litteraturen er denne periode blevet betegnet på forskellig måde — manifestationstid, fikseringstid eller ekspressionstid. 
Tidsrummets afslutning er tidspunktet for prøvetagning (15) (29). Når dyret 
er aflivet, isoleres genomisk DNA fra væv af interesse og oprenses.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Data for et enkelt væv pr. dyr fra flere pakninger/ligeringer aggregeres 
almindeligvis, og mutanthyppigheden evalueres normalt ved hjælp af en 
total på mellem 10  5 og 10  7 plaquedannende eller kolonidannende enheder. 
Når der anvendes positive selektionsmetoder, bestemmes det samlede antal plaquedannende enheder med et særskilt sæt ikkeselektive plader.
 
14. Positive selektionsmetoder er udviklet for at lette påvisningen af mutationer 
i både gpt-genet [gpt-deltamus og -rotte, gpt  – fænotype (20) (22) (28)] og 
lacZ-gen [Muta™-mus eller lacZ-plasmid mus (3) (10) (11) (30)], mens lacI 
-genmutationer i Big Blue®-dyr påvises gennem en ikkeselektiv metode, der identificerer mutanter gennem dannelse af farvede (blå) plaques. Positiv selektionsmetodologi anvendes også til at påvise punktmutationer, der 
opstår i cII -genet i λ-bakteriofag shuttlevektoren [Big Blue®-mus eller 
-rotte og Muta™-mus (17)] og deletionsmutationer i λ red-og gam-gener 
[Spi
 – selektion i gpt-deltamus og -rotte (21) (22) (28)]. Mutanthyppighed 
beregnes ved at dividere antallet af plaques/plasmider indeholdende muta ­
tioner i transgenet med det totale antal plaques/plasmider genvundet fra den 
samme DNA-prøve. I undersøgelser af TGR-genmutationer er mutanthyp ­
pigheden den rapporterede parameter. Desuden kan en mutationshyppighed bestemmes som fraktionen af celler, der bærer uafhængige mutationer. 
Denne beregning kræver korrektion for klonekspansion ved sekventering 
af de genvundne mutanter (24).
 
15. Mutationer, der er konstateret i lacI, lacZ, cII og gpt-punkt-mutationsassays, 
består primært af baseparsubstitutionsmutationer, læserammemutationer og små insertioner/deletioner. Disse mutationstypers relative andel af spontane 
mutationer svarer til, hvad der er konstateret for det endogene Hprt-gen. 
Store deletioner påvises kun med Spi
 – selektionen og lacZ-plasmidassayene 
(24). Mutationer af interesse er in vivo-mutationer, der opstår hos musen eller rotten. In vivo- og ex vivo-mutationer, der kan opstå under 
fag-/plasmid-genvinding, -replikation eller -reparation, er relativt sjældne 
og kan i nogle systemer identificeres specifikt eller udelukkes af bakterie ­
værten/det positive selektionssystem.
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Forberedelser  
Valg af dyreart  
16. Der findes en lang række forskellige modeller til detektering af genmutation 
hos mus, og disse systemer er blevet bredere anvendt end modeller for transgene rotter. Hvis rotter tydeligvis er mere hensigtsmæssige modeller 
end mus (f.eks. i forbindelse med undersøgelser af mekanismen for carci ­
nogenese for en tumor, der kun er konstateret i rotter, at korrelere med en toksicitetsundersøgelse for rotter, eller, hvis det vides, at rotters metabo ­
lisme er mere repræsentativ for menneskers metabolisme), bør brug af 
modeller for transgene rotter overvejes.
 
Miljø og fodringsbetingelser  
17. Temperaturen i dyreforsøgslokalet bør ideelt være 22 °C (± 3 °C). Skønt 
den relative fugtighed bør være mindst 30 % og helst ikke overstige 70 % 
bortset fra under rengøring, bør målet være at sikre en konstant relativ 
fugtighed på 50-60 %. Belysningen bør være kunstig med 12 timers lys  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
og 12 timers mørke. For så vidt angår fodring, kan der anvendes et konven ­
tionelt laboratoriefoder med ubegrænset adgang til vand. Valget af foder 
kan påvirkes af behovet for at sikre en passende tilblanding af et testkemi ­
kalie, når dette indgives ad denne vej. Dyr bør anbringes i små grupper (højst fem) af samme køn, hvis der ikke forventes aggressiv adfærd. Dyr 
kan opbevares individuelt, hvis dette er sagligt begrundet.
 
Klargøring af dyrene  
18. Sunde, unge, seksuelt modne voksne dyr (8-12 uger ved start af behandling) 
udvælges vilkårligt til kontrol- og behandlingsgrupper. Dyrene identificeres 
unikt. Dyrene akklimatiseres til laboratorieforholdene i mindst fem dage. Burene indrettes på en sådan måde, at de mulige følger af burets placering minimeres. Ved undersøgelsens start bør variationen i dyrenes vægt være 
minimal og ikke overstige ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn.
 
Fremstilling af doser  
19. Faste testkemikalier opløses eller suspenderes i passende opløsningsmidler 
eller vehikler eller iblandes foder eller drikkevand før indgift i dyrene. 
Flydende testkemikalier kan indgives direkte eller opløses før indgift. Til inhalationseksponering kan testkemikalier indgives som gas, damp eller en fast/flydende aerosol, afhængigt af deres fysisk-kemiske egenskaber. Der 
bør anvendes friske fremstillinger af testkemikaliet, medmindre stabilitets ­
data påviser, at opbevaring er acceptabelt.
 
Testbetingelser  
Opløsningsmiddel/vehikel  
20. Opløsningsmidlet/vehiklet må ikke frembringe toksiske virkninger ved de 
anvendte dosismængder og må ikke mistænkes for at indgå i kemisk reaktion med testkemikaliet. Hvis der anvendes andre end velkendte opløs ­
ningsmidler/vehikler, skal deres anvendelse understøttes af referencedata om 
deres kompatibilitet. Det anbefales så vidt muligt først at overveje at anvende vandige opløsningsmidler/vehikler.
 
Positive kontroller  
21. Samtidigt behandlede positive kontroldyr bør normalt anvendes. For labo ­
ratorier, der har godtgjort deres kompetence (se pkt. 23) og rutinemæssigt bruger disse assays, kan DNA fra tidligere behandlede positive kontroldyr 
indgå i hver undersøgelse for at bekræfte metodens succes. Sådant DNA fra 
tidligere forsøg bør hentes fra samme art og væv af interesse og opbevares korrekt (se pkt. 36). Når der anvendes samtidige positive kontroller, er det ikke nødvendigt at indgive dem ad samme vej som testkemikaliet, men det 
bør være kendt, at de positive kontroller fremkalder mutationer i et eller 
flere væv af interesse for testkemikaliet. Doserne af de positive kontrolke ­
mikalier bør udvælges, således at de frembringer svage eller moderate virk ­
ninger med henblik på en kritisk vurdering af assayets udførelse og sensi ­
tivitet. Eksempler på positive kontrolkemikalier og nogle af deres målvæv 
findes i tabel 1.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabel 1  
Eksempler på positive kontrolkemikalier og nogle af deres målvæv  
Positivt kontrolkemikalie og 
CAS-nr. EINECS-navn og EINECS-nr. Specifikationer Målvæv for mutationer 
Rotte Mus  
N-ethyl-n-nitrosourinstof 
[CAS-nr. 759-73-9] N-ethyl-n-nitrosourinstof 
[212-072-2] Mutagen med 
direkte virkning Lever, lunge Knoglemarv, 
tyktarm, colon-epitel, tarm, 
lever, lunge, milt, 
nyre, ovarie-granu ­
losaceller, hanlige kimceller 
Ethylcarbamat (urethan) 
[CAS-nr. 51-79-6] Urethan 
[200-123-1] Mutagen, kræver 
metabolisme, men 
frembringer kun 
svage virkninger Knoglemarv, 
formave, tyndtarm, 
lever, lunge, milt 
2,4-diaminotoluen 
[CAS-nr. 95-80-7] 4-methyl-m-phenylen ­
diamin 
[202-453-1] Mutagen, kræver 
metabolisme, også positiv i Spi
 – - 
assayet Lever Lever 
Benzo[a]pyren 
[CAS-nr. 50-32-8] Benzo[def]chrysen 
[200-028-5] Mutagen, kræver 
metabolisme Lever, væv, Knoglemarv, bryst, 
tyktarm, formave, 
proventriculus, hjerte, lever, lunge, hanlige kimceller
 
Negative kontroller  
22. Negative kontroller, kun behandlet med opløsningsmiddel eller vehikel og 
ellers behandlet på samme måde som behandlingsgrupperne, bør indgå for 
hver prøvetagningsperiode. Hvis der ikke foreligger historiske eller offent ­
liggjorte kontroldata, som viser, at det valgte opløsningsmiddel/vehikel ikke fremkalder skadelige eller mutagene virkninger, bør ubehandlede kontroller også indgå for hver prøvetagningsperiode for at sikre godkendelse af 
vehikelkontrollen.
 
Kontrol af laboratoriets kompetence  
23. Kompetence med hensyn til disse assays bør fastslås ved godtgørelse af 
kapaciteten til at reproducere forventede resultater ud fra offentliggjorte data (24) for: 1) mutanthyppigheder med positive kontrolkemikalier (inkl. svage reaktioner) såsom dem, der er anført i tabel 1, ikkemutagener og vehikel ­
kontroller og 2) genvinding af transgener fra genomisk DNA (f.eks. 
pakningseffektivitet).
 
Sekventering af mutanter  
24. Til regulatoriske anvendelser er DNA-sekventering af mutanter ikke 
nødvendig, især ikke hvor der er opnået et klart positivt eller negativt 
resultat. Datasekventering kan dog være nyttig, når der observeres stor 
variation mellem dyrene. I disse tilfælde kan sekventering anvendes til at udelukke muligheden af ‘jackpots’ eller klonhændelser ved at identificere andelen af unikke mutanter fra et bestemt væv. Sekventering af ca. 10 
mutanter pr. væv pr. dyr burde være nok til blot at fastslå, om klonmutanter 
bidrager til mutanthyppigheden. Sekventering af op til 25 mutanter kan
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
være nødvendig for at korrigere mutanthyppigheden matematisk for klona ­
litet. Sekventering af mutanter kan også overvejes, når der konstateres små 
stigninger i mutanthyppighed (som lige overstiger de ubehandlede kontrol ­
værdier). Forskelle i mutantspektret mellem mutantkolonierne fra behand ­
lede og ubehandlede dyr kan støtte en mutagen virkning (29). Mutations ­
spektre kan også anvendes til udvikling af mekanistiske hypoteser. Når 
sekventering skal indgå i undersøgelsesprotokollen, skal der udvises særlig omhyggelighed med udformningen af sådanne undersøgelser, især i henseende til antallet af mutanter, der sekventeres pr. prøve, for at opnå 
tilstrækkelig virkning ifølge den statistiske model, der er anvendt (se 
pkt. 43).
 
FREMGANGSMÅDE  
Dyrenes antal og køn  
25. Antallet af dyr pr. gruppe bør fastlægges på forhånd, så der er nok til at 
opnå den nødvendige statistiske styrke til at påvise mindst én fordobling af mutanthyppigheden. Med hensyn til størrelse består en gruppe af mindst fem dyr. Hvis den statistiske styrke ikke er tilstrækkelig, øges antallet af dyr 
dog efter behov. Der bør normalt anvendes handyr. Der kan være tilfælde, 
hvor det er berettiget kun at teste hundyr. Det gælder f.eks., når der testes lægemidler beregnet for kvinder, eller når man undersøger kvindespecifik metabolisme. Hvis der er signifikante forskelle mellem kønnene i henseende 
til toksicitet eller metabolisme, skal der anvendes både hanner og hunner.
 
Indgiftsperiode  
26. Baseret på observationer af, at mutationer akkumuleres med hver behand ­
ling, er et regimen med gentagen dosis nødvendig — med daglige behand ­
linger i en periode på 28 dage. Dette anses almindeligvis for acceptabelt til 
både generering af en tilstrækkelig akkumulering af mutationer af svage mutagener og til sikring af en eksponeringstid, der er tilstrækkelig til at 
påvise mutationer i langsomt opformerende organer. Alternative behand ­
lingsprogrammer kan være egnede til visse evalueringer, og disse alternative doseringsplaner begrundes sagligt i protokollen. Behandlinger bør ikke være kortere end den tid, der skal anvendes til den fuldstændige induktion af alle 
de relevante metaboliserende enzymer, og kortere behandlinger kan kræve 
brug af flere prøvetagningsperioder, der passer til organer med forskellige formeringsgrader. Under alle omstændigheder skal al tilgængelig infor ­
mation (f.eks. om generel toksicitet eller metabolisme og farmakokinetik) 
bruges i begrundelsen for en protokol, især i forbindelse med afvigelser fra 
ovenstående standardanbefalinger. Behandlingstider på over otte uger kan øge sensitiviteten, men bør forklares tydeligt og begrundes, eftersom lange behandlingstider kan frembringe en tilsyneladende stigning i mutanthyppig ­
heden gennem klonekspansion (29).
 
Dosisstørrelse  
27. Dosisstørrelsen baseres på resultaterne af en dosis-range-finding-undersø ­
gelse med måling af den generelle toksicitet, som gennemført med anven ­
delse af samme eksponeringsmåde, eller baseres på resultaterne af allerede 
eksisterende subakutte toksicitetsundersøgelser. Ikketransgene dyr af samme gnaverstamme kan anvendes til at bestemme dosisintervaller. For at tilveje ­
bringe information om dosisreaktion (se pkt. 28) bør hovedundersøgelsen 
omfatte en fuldstændig undersøgelse, der omfatter en negativ kontrolgruppe 
(se pkt. 22) og mindst tre dosisniveauer med passende indbyrdes afstand,
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
undtagen hvor grænsedosis er anvendt. Topdosis bør være den maksimalt 
tolererede dosis (MTD). MTD defineres som den dosis, der frembringer 
tegn på toksicitet, som indicerer, at højere dosisniveauer baseret på samme doseringsplan ville forventes at medføre letalitet. Kemikalier med specifikke biologiske aktiviteter ved lave ikketoksiske doser (såsom 
hormoner og mitogener) og kemikalier, der udviser mætning af toksikoki ­
netiske egenskaber, kan være undtagelser fra doseringskriterierne og bør evalueres på ad hoc-basis. De anvendte dosisniveauer bør dække et interval fra maksimal til lav eller ingen toksicitet.
 
Grænsetest  
28. Hvis dosis-range-finding-undersøgelser eller eksisterende data fra relaterede 
gnaverstammer indicerer, at en behandlingsplan med mindst grænsedosis (se nedenfor) ikke udløser observerbare toksiske virkninger, og hvis genotok ­
sicitet ikke ville være forventelig på grundlag af data fra strukturelt beslæg ­
tede kemikalier, betragtes en fuldstændig undersøgelse under anvendelse af tre dosisniveauer ikke som nødvendig. For en indgiftsperiode på 28 dage (dvs. 28 daglige behandlinger) er grænsedosis 1 000 mg/kg kropsvægt/dag. 
For indgiftsperioder på 14 dage eller mindre er grænsedosis 2 000 mg/kg/ 
kropsvægt/dag (doseringsplaner, der ikke omfatter 28 daglige behandlinger, bør begrundes sagligt i protokollen, se pkt. 26).
 
Indgift af doser  
29. Testkemikaliet indgives normalt ved tvangsfodring med sonde eller en 
passende intubationskanyle. Generelt bør den forventede indgiftsmåde for mennesker overvejes i forbindelse med udformningen af et assay. Andre indgiftsmåder (såsom drikkevand, subkutant, intravenøst, topisk, inhalation, 
intratrachealt, i kost eller implantation) kan accepteres, hvis de kan begrun ­
des. Intraperitoneal injektion anbefales ikke, da det ikke er en fysiologisk relevant måde for human eksponering. Hvor stor en væskemængde der kan indgives ad gangen ved tvangsfodring eller injektion, afhænger af forsøgs ­
dyrenes størrelse. Mængden bør højst være på 2 ml/100 g kropsvægt. 
Anvendelse af større rumfang begrundes. Bortset fra lokalirriterende eller ætsende stoffer, som normalt vil have kraftigere virkninger ved højere koncentrationer, bør testvolumenet variere så lidt som muligt, idet koncen ­
trationen justeres, så volumenet bliver det samme ved alle dosisniveauer.
 
Prøveudtagningstid  
Somatiske celler  
30. Prøveudtagningstiden er en kritisk variabel, fordi den bestemmes af den 
periode, der medgår til mutationernes fiksering. Denne periode er vævsspe ­
cifik og ser ud til at afhænge af cellepopulationens omdannelsestid, hvor 
knoglemarv og tarm er hurtige respondenter og leveren meget langsommere. 
Et egnet kompromis for måling af mutanthyppighed i både hurtigt og lang ­
somt formerende væv er 28 fortløbende daglige behandlinger (som anført i pkt. 26) og prøveudtagning tre dage efter den sidste behandling, selv om 
den maksimale mutanthyppighed ikke nødvendigvis viser sig i langsomt 
formerende væv under disse forhold. Hvis langsomt formerende væv er af særlig betydning, kan en senere prøveudtagningstid på 28 dage efter indgiftsperioden på 29 dage være mere hensigtsmæssig (16) (29). I 
sådanne tilfælde erstatter den senere prøveudtagning den tre dage lange 
prøveudtagningstid og kræver saglig begrundelse.
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Kimceller  
31. TGR-assays er velegnede til at undersøge induktion af genmutation i 
hanlige kimceller (7) (8) (27), hvor tidsintervaller og kinetik for spermato ­
genese er veldefineret (27). Det lave antal æg, der er tilgængelige for 
analyse, selv efter super-ovulation, og det forhold, at der ikke er en 
DNA-syntese i oocytten, udelukker bestemmelse af mutation i hunlige kimceller under anvendelse af transgene assays (31).
 
32. Prøveudtagningstiden for hanlige kimceller bør fastlægges på en sådan 
måde, at der udtages prøve af de udsatte celletyper igennem hele kimcel ­
leudviklingen, og at det stadium, der er mål for udtagningen, er blevet 
tilstrækkeligt eksponeret. Udviklingen af kimceller fra 
spermatogonie-stamceller til moden sperma, der når vas deferens/cauda epididymis, er ~49 dage for mus (36) og ~70 dage for rotter (34) (35). 
Efter eksponering i 28 dage med en efterfølgende prøveudtagningsperiode 
på tre dage udgør akkumuleret sperma fra vas deferens/cauda epididymis (7)(8) en cellepopulation, der har været eksponeret i omtrent sidste halvdel af spermatogenesen, som omfatter den meiotiske og postmeiotiske periode, 
men ikke spermatogonie- eller kimcelleperioden. For at sikre tilstrækkelig 
udtagning af celler i vas deferens/cauda epididymis, der var spermatogonie-kimceller i eksponeringsperioden, er der behov for en yder ­
ligere prøveudtagningsperiode på mindst syv uger (mus) eller 10 uger (rot ­
ter) efter behandlingens afslutning.
 
33. Celler, der er ekstruderet fra sædkanaler efter behandling i 28 + 3 dage, 
omfatter en blandet population, der er beriget for alle stadier i kimcellernes 
udvikling (7) (8). Prøveudtagning af disse celler med henblik på påvisning af genmutation giver ikke en lige så nøjagtig vurdering af de stadier, hvor der induceres kimcellemutationer, som ved prøveudtagning af spermato ­
zooer fra vas deferens/cauda epididymis (eftersom et interval af kimcelle ­
typer er udtaget fra kanalerne, og nogle af de somatiske celler vil konta ­
minere denne cellepopulation). Prøveudtagning af celler fra sædkanaler ud over spermatozooer fra vas deferens/cauda epididymis efter en prøveudtag ­
ningsperiode på kun 28 + 3 dage vil dog give en vis dækning af ekspone ­
rede celler på tværs af de fleste faser i kimcelleudviklingen og kan være nyttig med hensyn til påvisning af visse kimcellemutagener.
 
Bemærkninger  
34. Der bør foretages generelle kliniske observationer mindst én gang om 
dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er) hver dag og under hensyntagen til det tidspunkt, hvor de forventede virkninger efter dosering topper. 
Dyrenes helbredstilstand registreres. Alle dyr observeres mindst to gange 
dagligt for morbiditet og mortalitet. Alle dyr vejes mindst én gang om ugen og ved aflivning. Foderindtag måles mindst én gang ugentligt. Hvis testke ­
mikaliet indgives via drikkevandet, måles vandindtaget ved hvert vandskift 
og mindst én gang ugentligt. Dyr, der udviser ikkedødelig indikation for for 
høj toksicitet, bør aflives før testperiodens udløb (23).
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Opsamling af væv  
35. Rationalet for at indsamle væv beskrives klart. Eftersom det er muligt at 
undersøge mutationsinduktion i næsten alle væv, bør udvælgelse af det væv, 
der skal indsamles, være baseret på begrundelsen for, at man foretager undersøgelsen, og evt. eksisterende data om mutagenicitet, carcinogenicitet eller toksicitet for det undersøgte kemikalie. Vigtige faktorer, der bør indgå 
i overvejelserne, er indgiftsmåde (baseret på sandsynlige humane ekspone ­
ringsveje), den forventede vævsdistribution og den mulige handlingsmeka ­
nisme. Findes der ikke baggrundsinformation, bør der indsamles flere soma ­
tiske væv, som kan være af interesse. Der bør være eksempler på hurtigt og 
langsomt formerende væv og kontaktstedsvæv. Desuden bør der indsamles 
og lagres spermatozoer fra vas deferens/cauda epididymis og celler i udvik ­
ling fra sædkanalerne (som beskrevet i pkt. 32 og 33), hvis det senere skulle blive nødvendigt at analysere kimcellemutagenicitet. Organer vejes, og for 
større organer bør samme område indsamles for alle dyr.
 
Opbevaring af væv og DNA  
36. Væv (eller vævshomogenater) skal opbevares ved eller under – 70 °C og 
bruges til isolation af DNA inden for fem år. Isoleret DNA, opbevaret 
nedkølet ved 4 °C i dertil egnede buffere, bør optimalt anvendes til muta ­
tionsanalyse inden for et år.  
Udvælgelse af væv til mutantanalyse  
37. Valg af væv baseres på følgende overvejelser: 1) indgiftsmåde eller første 
kontaktsted (f.eks. proventriculus, hvis indgift sker oralt, lunge, hvis indgift 
sker gennem inhalation, eller hud, hvis der er anvendt topisk påføring) og 2) farmakokinetiske parametre observeret i generelle toksicitetsundersøgelser, der indicerer konfiguration, retention og akkumulering af væv, eller 
målorganer for toksicitet. Hvis der foretages opfølgende undersøgelser til 
carcinogenicitetsundersøgelser, bør det overvejes at anvende målvæv for carcinogenicitet. Valget af væv til analyse skal maksimere påvisningen af kemikalier med direkte virkende in vitro-mutagener, som hurtigt metaboli ­
seres, er yderst reaktive eller dårligt absorberede, eller kemikalier, for hvilke 
målvævet bestemmes af indgiftsmåden (6).
 
38. I mangel af baggrundsinformation og under hensyntagen til kontaktstedet, 
der bestemmes af indgiftsmåden, skal leveren og mindst ét hurtigt delende 
væv (f.eks. proventiculus eller knoglemarv) vurderes for mutagenicitet. I de fleste tilfælde kan ovenstående krav opfyldes med analyser af to omhygge ­
ligt udvalgte væv, men i nogle tilfælde er der behov for tre eller flere. Hvis 
der er grund til at være specifikt bekymret over kimcellevirkninger, 
herunder positive reaktioner i somatiske celler, vurderes kimcellevæv for mutationer.
 
Målemetoder  
39. Der findes sædvanlige laboratoriemetoder eller offentliggjorte metoder til 
påvisning af mutanter for de anbefalede transgene modeller: lacZ lambda bakteriofag og plasmid (30), lacI-mus (2) (18), gpt-deltamus (22), gpt-deltarotte (28), cII (17). Modifikationer begrundes og dokumenteres. 
Data fra flere pakninger kan aggregeres og bruges til at opnå et tilstrække ­
ligt antal plaques eller kolonier. Behovet for et stort antal pakningsreak ­
tioner for at opnå det rigtige antal plaques kan være en indikation for dårlig DNA-kvalitet. I sådanne tilfælde skal data behandles med forsigtighed, da 
de kan være upålidelige. Det optimale samlede antal plaques eller kolonier 
pr. DNA-prøve bestemmes af den statistiske sandsynlighed for at påvise
 ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
tilstrækkelig mange mutanter ved en given spontan mutanthyppighed. Gene ­
relt kræver det mindst 125 000-300 000 plaques, hvis den spontane mutant ­
hyppighed er i størrelsesordenen 3 × 10  –5 (15). For Big Blue® lacI-assayet 
er det vigtigt at påvise, at hele rækken af mutant-farvefænotyper kan påvises ved at inddrage et relevant antal farvekontroller i hver udpladning. Væv og 
deraf følgende prøver (emner) behandles og analyseres ved hjælp af et 
blokforsøg, hvor emner fra vehikel-/opløsningsmiddelkontrolgruppen, den positive kontrolgruppe (evt.) eller positivt kontrol-DNA (hvor det er rele ­
vant), og hver behandlingsgruppe behandles sammen.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Behandling af resultater  
40. Individuelle dyredata fremlægges i tabelform. Forsøgsenheden er dyret. 
Rapporten skal omfatte det samlede antal plaquedannende enheder (pfu) eller kolonidannende enheder (cfu), antal mutanter samt mutanthyppighed 
for hvert væv fra hvert dyr. Hvis der er flere paknings-/redningsreaktioner, 
skal antallet af reaktioner pr. DNA rapporteres. Der skal indhentes data for hver enkelt reaktion, men kun det samlede antal pfu eller cfu skal anføres. Data om toksicitet og kliniske tegn skal anføres, jf. pkt. 34. Evt. sekvente ­
ringsresultater fremlægges for hver analyseret mutant, og deraf følgende 
beregninger af mutationshyppighed for hvert dyr og væv skal vises.
 
Statistisk evaluering og fortolkning af resultater  
41. Der findes flere kriterier for fastlæggelse af et positivt resultat såsom en 
dosisrelateret stigning i mutanthyppigheden eller en klar stigning i mutant ­
hyppigheden i en enkelt dosisgruppe sammenlignet med opløsningsmiddel- /vehikelkontrolgruppen. Mindst tre behandlede dosisgrupper skal analyseres for at tilvejebringe tilstrækkelige data til analyse af dosisreaktion. Mens 
resultaternes biologiske relevans skal være det primære hensyn, kan der 
benyttes statistiske metoder som en hjælp til at evaluere testresultaterne (4) (14) (15) (25) (26). I de anvendte statistiske test skal dyret betragtes som forsøgsenheden.
 
42. Et testkemikalie, for hvilket resultaterne ikke opfylder ovenstående kriterier 
for et væv, betragtes som ikkemutagent i dette assay. Med hensyn til den biologiske relevans af et negativt resultat skal vævets eksponering 
bekræftes.
 
43. Med hensyn til DNA-sekventeringsanalyser findes der en række statistiske 
metoder, som kan anvendes til at fortolke resultaterne (1) (5) (9) (19).  
44. Overvejelser om, hvorvidt de observerede værdier ligger inden eller uden 
for det historiske kontrolområde, kan være retningsgivende for evalueringen 
af reaktionens biologiske signifikans (32).  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Testrapport  
45. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Testkemikalie  
— identifikationsdata og CAS-nummer, hvis kendt  
— kilde, source, referencenummer, hvis muligt  
— fysiske egenskaber og renhedsgrad  
— fysisk-kemiske egenskaber af relevans for undersøgelsens gennemførelse  
— testkemikaliets stabilitet, hvis kendt.  
Opløsningsmiddel/vehikel  
— begrundelse for valg af vehikel  
— testkemikaliets opløselighed og stabilitet i opløsningsmidlet/vehiklet, 
hvis kendt  
— fastlæggelse af sammensætning af diæt, drikkevand eller inhalationspræ ­
parat  
— analytisk bestemmelse af sammensætninger (f.eks. stabilitet, homogeni ­
tet, nominel koncentration).  
Testdyr  
— anvendt art/stamme og begrundelse herfor  
— dyrenes antal, alder og køn  
— kilde, miljøbetingelser, føde osv.  
— dyrenes individuelle vægt ved forsøgets start, herunder interval for 
kropsvægt, middel- og standardafvigelse for hver gruppe.  
Testbetingelser  
— positive og negative (vehikel/opløsningsmiddel) kontroldata  
— data fra range-finding-undersøgelse  
— rationale for valg af dosismængde  
— detaljer vedrørende fremstilling af testkemikaliet  
— detaljer vedrørende indgift af testkemikaliet  
— rationale for indgiftsmåde  
— metoder for måling af animalsk toksicitet, herunder om muligt histop ­
atologiske eller hæmatologiske analyser samt hyppighed for observa ­
tioner og kropsvejninger  
— metoder til kontrol af, at testkemikaliet nåede målvævet, eller generel 
cirkulation, hvis der er opnået negative resultater  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— faktisk dosis (mg/kg kropsvægt/dag) beregnet på baggrund af testkemi ­
kaliets koncentration i foder/drikkevand (ppm) og forbrug, hvis relevant  
— detaljer vedrørende foder og vandkvalitet  
— detaljeret beskrivelse af behandling og prøveudtagningsplaner samt 
begrundelser for valg  
— aflivningsmetode  
— procedurer for isolering og bevaring af væv  
— metoder for isolering af gnaveres genomiske DNA, elimination af trans ­
gener fra genomisk DNA og overførsel af transgent DNA til en bakte ­
rievært  
— kilde og partinummer for alle celler, kits og reagenser (hvis relevant)  
— metode til kvantitativ bestemmelse af mutanter  
— metoder til molekylær analyse af mutanter og anvendelse til korrektion 
for klonalitet og/eller beregning af mutationshyppighed, hvis relevant.  
Resultater  
— dyrs tilstand før og i løbet af testperioden, herunder tegn på toksicitet  
— krops- og organvægt ved aflivning  
— for hvert væv/dyr, antal mutanter, antal af evaluerede plaques eller 
kolonier, mutanthyppighed  
— for hver vævs-/dyregruppe, antal pakningsreaktioner pr. DNA-prøve, 
totalt antal af mutanter, gennemsnitlig mutanthyppighed, standardafvi ­
gelse  
— forhold mellem dosis-respons, hvor muligt  
— for hvert væv/dyr, antal uafhængige mutanter og gennemsnitlig mutant ­
hyppighed, hvis der er foretaget molekylær analyse  
— sideløbende og historisk negative kontroldata med intervaller samt 
middel- og standardafvigelser  
— samtidige positive kontroldata (eller ikkesamtidige positiv 
DNA-kontroldata)  
— analytiske bestemmelser, hvis tilgængelige (f.eks. DNA-koncentrationer 
brugt i pakning, DNA-sekventeringsdata)  
— statistiske analyser og anvendte metoder.  
Diskussion af resultaterne  
Konklusion  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
LITTERATUR  
1) Adams, W.T. and T.R. Skopek (1987). ‘Statistical Test for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’, J. Mol. Biol., 194: 391-396.  
2) Bielas, J.H. (2002). ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’, Mutation Res., 518: 107-112.  
3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995). ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo 
Mutations’ Nature, 377(6550): 657-659  
4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995). ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’, Environ. Mol. Mutagen, 25(3): 
246-255.  
5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996). ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’, Environ. Mol. Mutagen, 28: 405-413.
 
6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999). ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens’, Mutagenesis, 14(1): 141-151.
 
7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper 
(1995). ‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced 
by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7485-7489.
 
8) Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997). ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’, Mutation Res., 388(2-3): 197-212.
 
9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000). ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’, Genetics, 156: 1411-1418.  
10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg (1989). ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971-7975.
 
11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993). ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive E. coli Host’, Biotechniques, 14(3): 326, 330.  
12) Erikson, R.P. (2003). ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’, Mutation Res., 543: 125-136.  
13) Erikson, R.P. (2010). ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’, Mutation Res.,  705: 96-106 . 
14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998). ‘Statistical Analysis of 
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’, Mutagenesis, 13(3): 249-255.
 
15) Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. 
Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Trans ­
genic Mutation Assays’, Environ. Mol. Mutagen., 35: 253-259.
 
16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003). ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’, Environ. Mol. 
Mutagen., 41: 1-6.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996). ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Muta ­
tions in a Bacteriophage λ Transgene TARGET’, Proc. Natl. Acad. Sci. 
USA, 93(17): 9073-9078.  
18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990). ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212-218.
 
19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008). ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772-778.  
20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996). ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi — and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465-470.
 
21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999). ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’, 
Environ. Mol. Mutagen., 34(1): 9-15.  
22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000). ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’, Mutation Res., 
455(1–2): 191-215.  
23) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, ENV/ 
JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
24) OECD (2009). Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OECD, Paris.  
25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995). ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231-245.  
26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, … 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997). ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249-289.
 
27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006). ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164-193.
 
28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010). ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78.
 
29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. 
Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003). ‘In vivo Trans ­
genic Mutation Assays’, Mutation Res., 540: 141-151.
 
30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996). ‘Bacteriophage λ and Plasmid lacZ 
Transgenic Mice for studying Mutations in vivo’ in: G. Pfeifer (ed.), 
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, 
Plenum Press, New York, NY, USA, pp. 391–410.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005). ‘A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’, Mutation Res., 578(1-2): 117- 123.
 
32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011). ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control 
Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.  
33) OECD (2011). Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Paris.  
(34) Clermont, Y. (1972). ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198- 236.
 
35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006). ‘The Epidi ­
dymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, 
Elsevier, the Netherlands, s. 1071-1148.  
36) Russell, L.B. (2004). ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25-36.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Tillæg  
DEFINITIONER  
Indgiftsperiode : samlet periode, i hvilken et dyr doseres.  
Baseparsubstitution : en type mutation, der forårsager erstatning af en enkelt 
DNA-nukleotidbase med en anden DNA-nukleotidbase.  
Capsid : den proteinskal, der omgiver en viruspartikel.  
Kemikalie : et stof eller en blanding.  
Klonal ekspansion : fremstilling af mange celler fra en enkelt (mutant) celle.  
Kolonidannende enhed (cfu) : måling af antal levedygtige bakterier.  
Concatamer : et langt kontinuerligt biomolekyle bestående af flere identiske 
kopier forbundet i serier.  
Cos-site : et enkeltstrenget DNA med 12 nukleotider, der findes i begge ender af 
den bakteriofage lambdas dobbeltstrengede genom.  
Deletion : en mutation, hvor genomet mister en eller flere (sekventielle) 
nukleotider.  
Elektropolering : påføring af elektriske impulser for at øge cellemembranernes 
gennemtrængelighed.  
Endogent gen : et gen, der hører til genomet.  
Extra-binomial variation : større variabilitet i gentagne skøn over en popula ­
tionsandel, der ville være forventet, hvis populationen havde en binomial fordeling.
 
Læserammemutation : en genetisk mutation forårsaget af insertioner eller dele ­
tioner af et antal nukleotider, der ikke er deleligt med tre, i en DNA-sekvens, der koder for et protein/peptid.
 
Insertion : tilføjelse af et eller flere nukleotidbasepar i en DNA-sekvens.  
Jackpot : et stort antal mutanter, der er opstået gennem klonekspansion fra en 
enkelt mutation.  
Store deletioner : deletioner i DNA af en eller flere kilobaser (der er effektivt 
deleteret med Spi  – selektionen og lacZ-plasmidassays).  
Ligering : den kovalente forbinding af to ender af DNA-molekyler under anven ­
delse af DNA-base.  
Mitogen : et kemikalie, der stimulerer en celle til at igangsætte celledeling og 
udløser mitose (dvs. celledeling).  
Neutralt gen : et gen, der ikke påvirkes af positive eller negative selektive pres.  
Pakning : syntese af infektiøse fag-partikler fra et præparat af fag-capsider og 
haleproteiner og en concatamer af DNA-fag-molekyler. Almindeligt brugt til at 
pakke DNA klonet på en lambdavektor (adskilt af cos-sites) i infektiøse lambdapartikler.
 
Pakningseffektivitet : den effektivitet, hvormed pakkede bakteriofager genvindes 
i værtsbakterier.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Plaquedannende enhed (pfu) : måling af antal levedygtige bakteriofag.  
Punktmutation : en generel term for en mutation, der kun påvirker en lille 
sekvens DNA, herunder små insertioner, deletioner og basesubstitutioner.  
Positiv udvælgelse : en metode, der tillader, at kun mutanter overlever.  
Reportergen : et gen, hvis mutantgenprodukt er let at påvise.  
Prøveudtagningstid : afslutningen på det tidsrum forud for aflivning, hvor kemi ­
kaliet ikke indgives, og hvor ubearbejdede DNA-skader fikseres i stabile mutationer.
 
Shuttlevektor : en vektor, der er er udformet, så den kan opformere to forskellige 
værtsarter. Følgelig kan DNA indsat i en shuttlevektor testes eller manipuleres i 
to forskellige celletyper eller to forskellige organismer.  
Testkemikalie : Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  
Transgene : af, relateret til eller værende en organisme, hvis genom allerede er 
blevet ændret ved overførsel af et gen eller gener fra en anden art.  ▼M5 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
DEL C: METODER TIL BESTEMMELSE AF ØKOTOKSICITET  
INDHOLDSFORTEGNELSE 
C.1. AKUT TOKSICITET FOR FISK 
C.2. DAPHNIA SP. AKUT IMMOBILISATIONSTEST C.3. FERSKVANDSALGER OG CYANOBAKTERIER, VÆKST ­
HÆMNINGSTEST 
C.4. BESTEMMELSE AF »LET« BIONEDBRYDELIGHED 
DEL I. GENERELLE BETRAGTNINGER 
DEL II. DOC-ELIMINERING (METODE C.4-A) DEL III. MODIFICERET OECD-SCREENINGTEST (METODE C.4-B) DEL IV. CO
 2 -UDVIKLING (METODE C.4-C) 
DEL V. MANOMETRISK RESPIROMETRI (METODE C.4-D) 
DEL VI. CLOSED BOTTLE TEST (METODE C.4-E) DEL VII. MITI-TEST (METODE C.4-F) C.5. NEDBRYDNING — BIOKEMISK OXYGENFORBRUG 
C.6. NEDBRYDNING — KEMISK OXYGENFORBRUG 
C.7. NEDBRYDNING — ABIOTISK NEDBRYDNING: HYDRO ­
LYSE SOM FUNKTION AF pH 
C.8. TOKSICITET FOR REGNORME — TEST I SYNTETISK JORD C.9. BIOLOGISK NEDBRYDNING — ZAHN-WELLENS TEST C.10. SIMULERINGSFORSØG VEDRØRENDE AEROB SPILDE ­
VANDSRENSNING: C.10.A: AKTIVEREDE SLAMENHEDER — C.10.B: BIOFILM 
C.11. BIOLOGISK NEDBRYDNING — AKTIVERET SLAM — 
RESPIRATIONSHÆMNINGSTEST 
C.12. BIOLOGISK NEDBRYDNING — MODIFICERET SCAS-TEST C.13. BIOKONCENTRERING: GENNEMSTRØMNINGSTEST MED 
FISK 
C.14. VÆKSTTEST PÅ FISKEYNGEL 
C.15. FISK, KORTTIDSTOKSICITETSTEST PÅ  FISKEEMBRYONER  
OG BLOMMESÆKYNGEL 
C.16. HONNINGBIER — AKUT ORAL TOKSICITETSTEST 
C.17. HONNINGBIER — AKUT KONTAKTTOKSICITETSTEST C.18. ADSORPTION/DESORPTION MED EN BATCH-LIGEVÆGT ­
METODE
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. BESTEMMELSE AF ADSORPTIONSKOEFFICIENTEN ( K OC ) I 
JORD OG I KLOAKSLAM MED HPLC (HIGH PERFOR ­
MANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) 
C.20.  DAPHNIA MAGNA  FORMERINGSTEST 
C.21. JORDMIKROORGANISMER: KVÆLSTOFOMDANNELSES ­
TEST 
C.22. JORDMIKROORGANISMER: KULSTOFOMDANNELSES ­
TEST 
C.23. AEROB OG ANAEROB OMDANNELSE I JORD 
C.24. AEROB OG ANAEROB OMDANNELSE I AKVATISKE SEDI ­
MENTSYSTEMER 
C.25. AEROB MINERALISERING I OVERFLADEVAND — SIMU ­
LERET BIONEDBRYDNINGSFORSØG 
C.26.  LEMNA  SP. VÆKSTHÆMNINGSTEST  
▼M4 
C.27. TOKSICITETSTEST SEDIMENT/VAND PÅ CHIRONOMIDER 
MED FORURENET SEDIMENT 
C.28. TOKSICITETSTEST SEDIMENT/VAND PÅ CHIRONOMIDER 
MED FORURENET VAND 
C.29. LET BIONEDBRYDELIGHED — CO  2 I LUKKEDE BEHOL ­
DERE (HEADSPACE-TEST) 
C.30. BIOAKKUMULERING I TERRESTRISKE OLIGOCHAETER  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. AKUT TOKSICITET FOR FISK  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med denne test er at bestemme et stofs akutte dødelige 
toksicitet for ferskvandsfisk. Det er ønskeligt at have flest mulige 
oplysninger om stoffets vandopløselighed, damptryk, kemiske stabili ­
tet, dissociationskonstanter og bionedbrydelighed, når man skal vælge, med hvilken testmetode (statisk, semistatisk eller gennemløb) 
der mest hensigtsmæssigt kan opnås tilfredsstillende konstante 
koncentrationer af teststoffet under testens forløb.
 
Øvrige oplysninger (f.eks. strukturformel, renhedsgrad, art og 
procentdel af betydende urenheder, tilstedeværelse og mængde af 
tilsætningsstoffer, samt n-octanol/vand-fordelingskoefficienten) bør tages i betragtning både ved planlægningen af testen og ved fortolk ­
ningen af testresultaterne.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Akut toksicitet er erkendbar skadelig virkning, der fremkaldes hos en 
organisme inden for kort tid (dage) ved eksponering for et stof. I denne test udtrykkes akut toksicitet som middel dødelig koncentra ­
tion (LC
 50 ), dvs, den koncentration i vand, som dræber 50 % af 
fiskene i en forsøgsgruppe under kontinuerlig eksponering i en vis 
periode, som skal angives.  
Alle koncentrationer af teststoffet er angivet i vægt pr. volume ­
nenhed (mg/l). De kan også udtrykkes i vægtforhold (mg/kg).  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Der kan anvendes et referencestof til at godtgøre, at forsøgsdyrenes 
følsomhed ikke har ændret sig væsentligt under forsøgsbetingelserne i laboratorier.
 
Der er ikke specificeret nogen referencestoffer til denne test.  
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Der kan udføres en grænsetest med 100 mg/l til konstatering af, om 
LC 50 er større end denne koncentration.  
Fiskene udsættes for teststoffet i vand i en række koncentrationer i 
96 timer. Dødeligheden registreres med højst 24 timers mellemrum, 
og man beregner om muligt de koncentrationer, der på hvert obser ­
vationstidspunkt dræber 50 % af fiskene (LC  50 ). 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Kvalitetskriterierne gælder for såvel grænsetesten som den komplette 
testmetode.  
Dødeligheden i kontrolgruppen må ikke overstige 10 % (eller én 
fisk, hvis der benyttes mindre end ti fisk) ved testens afslutning.  
Koncentrationen af opløst oxygen skal være højere end 60 % af 
mætning gennem hele testen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Koncentrationen af teststoffet skal være op til 80 % af startkoncen ­
trationen gennem hele testen.  
For stoffer, der let opløses i testmediet og giver stabile opløsninger, 
dvs. stoffer, der ikke i væsentlig grad fordamper, nedbrydes, hydro ­
lyseres eller adsorberes, kan startkoncentrationen antages at være lig 
med den nominelle koncentration. Det skal godtgøres, at koncen ­
trationen har været opretholdt gennem hele testen, og at kvalitets ­
kriterierne er opfyldt.  
For stoffer, som  
i) er tungt opløselige i testmediet eller  
ii) kan danne stabile emulsioner eller dispersioner eller  
iii) er ustabile i vandig opløsning,  
skal der som værdi for startkoncentrationen anvendes den koncentra ­
tion, som er målt i opløsningen (eller hvis dette ikke er teknisk muligt, målt i vandsøjlen) ved testens begyndelse. Koncentrationen bestemmes 
efter, at der opnået ligevægt, men førend testfisk kommes i.
 
I alle disse tilfælde skal yderligere målinger foretages i løbet af 
testen for at sikre, at koncentrationen har været opretholdt eller kvali ­
tetskriterierne har været opfyldt.  
pH må ikke variere med mere end 1 enhed.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Der kan anvendes tre typer procedurer:  
Statisk test:  
Toksicitetstest, hvor der ikke foregår gennemløb af testopløsning. 
(Opløsningerne udskiftes ikke under testens forløb).  
Semi-statisk test:  
Test uden gennemløb af testopløsning, men hvor hele testopløs ­
ningen udskiftes med regelmæssige lange mellemrum (f.eks. hver 24. time).
 
Gennemstrømningstest:  
Toksicitetstest, hvor vandet i testkamrene løbende udskiftes, og hvor 
teststoffet transporteres med udskiftnings-vandet.  
1.6.1.  Reagenser  
1.6.1.1.  Teststofopløsninger  
Der fremstilles stamopløsninger af den påkrævede styrke ved opløs ­
ning af stoffet i deioniseret vand eller vand som beskrevet i 1.6.1.2.  
De valgte testkoncentrationer fremstilles ved fortynding af stamop ­
løsningen, Hvis der testes høje koncentrationer, kan stoffet opløses 
direkte i det vand, der ellers anvendes til fortynding.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Stoffer testes normalt kun op til opløselighedsgrænsen, For visse 
stoffer (f.eks. stoffer, som er tungt opløselige i vand, som har en 
høj P  ow -værdi, eller som danner en stabil dispersion og ikke en ægte 
opløsning i vand) kan det accepteres, at der anvendes en testkoncen ­
tration, der er større end opløseligheden, så det sikres, at den højeste 
opløste/stabile koncentration er nået. Det er dog vigtigt, at denne 
koncentration ikke på anden måde forstyrrer testsystemet (f.eks. dannelse af en hinde af stoffet på vandoverfladen, så vandet ikke iltes, osv.).
 
Der kan tages ultralyd, organiske opløsningsmidler, emulgatorer eller 
dispergeringsmidler til hjælp til fremstilling af stamopløsninger af 
stoffer, der er tungt opløselige i vand, og til dispergering af sådanne stoffer i testmediet. Hvis der anvendes hjælpestoffer, skal alle testkoncentrationer indeholde samme mængde hjælpestof, og der 
anvendes en ekstra kontrolgruppe, der udsættes for samme koncen ­
tration af hjælpestoffet, som er anvendt i testserien. Sådanne hjælpe ­
stoffer anvendes i den lavest mulige koncentration, der i hvert 
tilfælde ikke må være større end 100 mg/l i testmediet.
 
Testen gennemføres uden justering af pH, Hvis der konstateres en 
væsentlig pH-ændring, anbefales det at gentage testen med justeret pH, og disse resultater rapporteres. I så fald justeres stamopløsnin ­
gens pH til samme værdi som i det vand, der anvendes til fortyn ­
ding, medmindre der er særlige grunde til at undlade dette. Til 
justering af pH foretrækkes HCl og NaOH. Justering af pH skal foregå på en sådan måde, at koncentrationen af teststof i stamop ­
løsningen ikke ændres væsentligt. Hvis teststoffet reagerer kemisk 
eller udfældes ved justeringen, rapporteres dette.
 
1.6.1.2.  Vand til opbevaring og fortynding  
Der kan benyttes drikkevand (ikke forurenet med potentielt skadelige 
koncentrationer af chlor, tungmetaller eller andre stoffer), råvand af egnet kvalitet eller kunstigt fremstillet ferskvand (se tillæg 1). Der 
foretrækkes vand med en total hårdhed mellem 10 og 250 mg/l (som 
CaCO
 3 ) og med et pH mellem 6,0 og 8,5.  
1.6.2.  Apparatur  
Alt apparatur skal være af kemisk inert materiale.  
— automatisk fortyndingssystem (for gennemstrømningstest)  
— oxygenmåleudstyr  
— udstyr til bestemmelse af vandets hårdhed  
— passende apparatur til temperaturkontrol  
— pH-meter.  
1.6.3.  Testfisk  
Fiskene skal være i god helbredstilstand og uden synlige 
misdannelser.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Arterne udvælges på grundlag af praktiske kriterier såsom, om de er 
til rådighed hele året, hvor lette de er at holde, om de er egnede til 
testning, og hvor følsomme de er, samt andre økonomiske, biolo ­
giske og økologiske faktorer af betydning. Hensynet til dataenes sammenlignelighed og den allerede gennemførte internationale 
harmonisering (henvisning (1)) bør ligeledes tages i betragtning 
ved valg af fiskearterne.
 
Tillæg 2 indeholder en liste over de fiskearter, der anbefales til 
gennemførelse af denne test; zebrafisk og regnbueørred foretrækkes.  
1.6.3.1.  Opbevaring  
Testfisk skal fortrinsvis komme fra en enkelt bestand og være af 
samme længde og alder. Fiskene skal holdes i mindst 12 dage 
under følgende betingelser:  
Belastning:  
Passende for systemet (recirkulation eller gennemstrømning) og 
fiskearten.  
Vand:  
Se 1.6.1.2.  
Lys: 
12 til 16 timers lys dagligt.  
Koncentration af opløst oxygen:  
Mindst 80 % mætning.  
Fodring:  
Dagligt eller tre gange ugentligt, sidste gang 24 timer før testen 
påbegyndes.  
1.6.3.2.  Dødelighed  
Efter en 48 timers tilpasningsperiode registreres dødeligheden, og 
følgende kriterier anvendes;  
— større end 10 % af populationen på syv dage:  
Hele partiet kasseres  
— mellem 5 og 10 % af populationen:  
Observationsperioden forlænges med yderligere syv dage.  
Hvis der ikke sker flere dødsfald, accepteres partiet; i modsat fald 
må det kasseres  
— mindre end 5 % af populationen:  
Partiet accepteres.  
1.6.4.  Tilvænning  
Alle fisk skal udsættes for vand af den kvalitet og med den tempe ­
ratur, som vil blive anvendt i testen, i mindst syv dage, før de tages i 
anvendelse.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Testens udførelse  
Forud for den endelige test kan der udføres en indledende test med 
det formål at skaffe oplysninger om, hvilke koncentrationer der skal anvendes i den endelige test.
 
Ud over testserien medtages en kontrolgruppe uden teststof og i 
givet fald en kontrolgruppe med hjælpestof.  
Der vælges en statisk test, en semi-statisk test eller en gennemstrøm ­
ningstest alt efter teststoffets fysiske og kemiske egenskaber, idet den 
bedst egnede til opfyldelse af kvalitetskriterierne vælges.  
Fiskene udsættes for stoffet, som beskrevet nedenfor:  
— varighed: 96 timer  
— antal dyr: mindst 7 pr, koncentration  
— kar: af passende størrelse i forhold til den anbefalede belastning  
— belastning: For statiske og semi-statiske test anbefales 1 g/l som 
den maksimale belastning; for gennemstrømningstest kan større 
belastning accepteres  
— testkoncentration: mindst fem koncentrationer med et konstant 
indbyrdes forhold på ikke over 2,2, som så vidt muligt dækker 
hele dødelighedsintervallet fra 0 til 100 %  
— vand: se 1.6.1.2  
— lys: 12 til 16 timers lys dagligt  
— temperatur: passende for arten (tillæg 2) men inden for ± 1  o C i 
den enkelte test  
— koncentration af opløst oxygen: ikke mindre end 60 % af 
mætning ved den valgte temperatur  
— fodring: ingen.  
Fiskene inspiceres efter de første 2 til 4 timer og derefter med højst 
24 timers mellemrum. Fisk betragtes som døde, hvis berøring af 
haleroden ikke giver nogen reaktion og der ikke er synlige respira ­
tionsbevægelser. Døde fisk fjernes, når de observeres, og dødelig ­
heden registreres. Synlige abnormaliteter (f.eks. tab af ligevægt, ændringer i svømmeadfærd, respirationsbevægelser og pigmentering) 
registreres.
 
pH, opløst oxygen og temperatur måles dagligt.  
Grænsetest  
En grænsetest med 100 mg/l til konstatering af, om LC  50 er større 
end denne koncentration kan anvendes, hvis den fremgangsmåde, som er anført i denne testmetode, benyttes,
 
Hvis stoffet er af en sådan art, at der ikke kan opnås en koncentration på 
100 mg/l i testvandet, udføres grænsetesten ved stoffets mætningskon ­
centration (eller den højeste koncentration, ved hvilken der dannes en 
stabil dispersion) i det anvendte medium (se også 1.6.1.1).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Grænsetesten udføres med 7-10 fisk og en eller to kontrolgrupper af 
samme størrelse. (Ifølge binomialteorien er der ved anvendelse af 10 
fisk 99,9 % sikkerhed for, at LC  50 er større end den anvendte 
koncentration, hvis dødeligheden er nul. Med 7, 8 eller 9 fisk giver en dødelighed på nul 99 % sikkerhed for, at LC
 50 er større 
end den anvendte koncentration).  
Hvis der sker dødsfald, må der gennemføres en komplet undersø ­
gelse. Eventuelle subletale virkninger registreres.  
2. DATA OG EVALUERING  
For hvert af de tidspunkter, hvor der er foretaget observationer (efter 
24, 48, 72 og 96 timer), afsættes den procentvise dødelighed mod 
koncentrationen på logaritmisk sandsynlighedspapir.  
For hvert observartionstidspunkt skønnes om muligt LC  50 og konfi­
densgrænserne (p = 0,05) ved hjælp af standardprocedurer; disse 
værdier afrundes til ét, eller højst to betydende cifre (eksempler på 
afrunding til to cifre: 173,5 til 170; 0,127 til 0,13; 1,21 til 1,2).  
I de tilfælde, hvor hældningen af koncentration/responsprocentkurven er 
for stejl til, at LC  50 kan beregnes, er et skøn ud fra kurven tilstrækkeligt.  
Hvis to på hinanden følgende koncentrationer med et indbyrdes 
forhold på 2,2 giver en dødelighed på 0 og 100 %, er disse to værdier tilstrækkelige til angivelse af, i hvilket interval LC
 50 ligger.  
Hvis det bemærkes, at teststoffet ikke kan holdes stabilt eller homo ­
gent, skal dette anføres, og resultaterne må fortolkes med forsigtig ­
hed. 
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— oplysninger om testfisk (videnskabeligt navn, stamme, leveran ­
dør, eventuel forbehandling, størrelse samt hvor mange der er anvendt ved hver restkoncentration)
 
— hvor det vand, der er anvendt til fortynding, kommer fra og dets 
vigtigste kemiske egenskaber (pH, hårdhed og temperatur)  
— for stoffer, der er tungtopløselige i vand, hvilken metode der er 
anvendt til fremstilling af stam- og testopløsning  
— koncentrationen af eventuelle hjælpestoffer  
— en liste over de anvendte koncentrationer og alle foreliggende 
oplysninger om testkemikaliets stabilitet i testopløsningen ved 
disse koncentrationer  
— metoder og resultater, hvis der er udført kemiske analyser  
— resultaterne af en eventuel grænsetest  
— begrundelse for og detaljer vedrørende den valgte testprocedure 
(f.eks. statisk, semi-statisk, doseringshastighed, gennemstrøm ­
ningshastighed, beluftning, antal fisk, osv.)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— beskrivelse af testudstyret  
— lysforhold  
— koncentrationen af opløst oxygen, pH og temperatur i testopløs ­
ningerne hver 24. time  
— godtgørelse af, at kvalitetskriterierne er opfyldt  
— en tabel med den kumulative dødelighed for hver koncentration 
og for kontrolgruppen (samt i givet fald for kontrolgruppen med 
hjælpestof) på alle de anbefalede observationstidspunkter  
— afbildning af koncentration/responsprocentkurve ved testens 
afslutning  
— om muligt LC  50 -værdier på alle de anbefalede observationstids ­
punkter (med 95 % konfidensgrænser)  
— hvilke statistiske metoder der er anvendt til bestemmelse af LC  50 
— hvis der er benyttet et referencestof, de fundne resultater  
— højeste testkoncentration, der ikke forårsager nogen dødsfald 
inden for testperioden  
— laveste testkoncentration, der forårsager 100 % dødelighed inden 
for testperioden.  
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates.  
(2) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Brachydanio rerio  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-303 June 1985.  
(3) AFNOR — Determination of the acute toxidty of a substance 
to Salmo gairdneri  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-305 June 1985.  
(4) ISO 7346/1,/2 and/3 — Water Quality — Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish  (Bra­
chydanio rerio  Harailton-Buchanan —  Teleostei, Cyprinidae).  
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow- 
through method.  
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmet ­
hoden — Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 
(15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506 — Water — Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia recticulata,  1980.  
(9) Environmental Protection Agency. Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians, The Committee on Methods for Toxidty Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
 
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Commission of the European Communities, Inter-Laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979.
 
(14) Verfahrenvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P, und Boje, R. Okotoxikologie, Grund ­
lagen fur die ökotoxikologische Bewertung von Umwekchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
 
(16) Finney, D.J., Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.
 
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, 
vol. 4, 3-32.  
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelinck). American Society for Testing and Materials. 
ASTM STP 634, 1977, 65-84.
 
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Tillæg 1  
Kunstigt fremstillet ferskvand  
Eksempel på vand egnet til fortynding  
Alle kemikalier skal være af analysekvalitet.  
Vandet skal være destilleret vand af god kvalitet eller deioniseret vand med en 
ledningsevne på mindre end 5 μScm  -1 . 
Vanddestillationsapparatet må ikke indeholde dele af kobber.  
Stamopløsninger  
CaCl  2 — 2H  2 O (calciumchlorid dihydrat): 
opløses i vand og fortyndes til 1 liter 11,76 g 
MgSO  4 — 7H  2 O (magnesiumsulfat heptahydrat): 
opløses i vand og fortyndes til 1 liter 4,93 g 
NaHCO  3 (natriumhydrogencarbonat): 
opløses i vand og fortyndes til 1 liter 2,59 g 
KC1 (kaliumchlorid): 
opløses i vand og fortyndes til 1 liter 0,23 g  
Kunstigt fremstillet ferskvand til fortynding  
25 ml af hver af de fire stamopløsninger blandes, og der fortyndes til 1 liter med 
vand.  
Opløsningen beluftes, indtil koncentrationen af opløst oxygen svarer til værdien 
ved mætning.  
pH skal være 7,8 ± 0,2.  
Om nødvendigt justeres pH med NaOH (natriumhydroxid) eller HC1 (saltsyre).  
Det således fremstillede vand til fortynding henstår i ca. 12 timer og beluftes ikke 
yderligere.  
Summen af Ca- og Mg-ioner i denne opløsning er 2,5 mmol/l. Forholdet mellem 
Ca- og Mg-ioner er 4:1 og mellem Na- og K-ioner 10:1. Opløsningens totale 
alkalinitet er 0,8 mmol/l.  
Afvigelser ved fremstillingen af fortyndingsvandet må ikke medføre ændringer i 
vandets sammensætning og egenskaber.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Tillæg 2  
Fiskearter, der anbefales til testning  
Anbefalede aner Anbefalet tempe ­
raturinterval (  o C) Anbefalet længde 
af testdyr (cm)  
Bracbydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Zebrafisk 20 til 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Fathead minnow 20 til 24 5,0 ± 2,5  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linnaeus 1758) Karpe 20 til 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliiae)  
Cyprinodontidae(Tomminck og Schlegel 1850) japansk risfisk 20 til 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Guppy 20 til 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae ) (Rafinesque Linnaeus 1758) 20 til 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) Regenbueørred 12 til 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
naeus 1758) Guldfisk 20 til 24 6,0 ± 2,0
 
Opdrætsbetingelser  
De ovenfor nævnte fisk er lette at opdrætte og/eller let tilgængelige hele året 
rundt. De kan opdrættes enten i dambrug eller i laboratoriet under sygdoms- og 
parasitfrie forhold, sådan at forsøgsdyrene er sunde og af kendt afstamning. Disse fisk er tilgængelige i store dele af verden.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Tillæg 3  
Eksempel på kurve over koncentration mod dødelighed  
Eksempel på bestemmelse af LC  50 på log/sandsynlighedspapir
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. DAPHNIA SP. AKUT IMMOBILISATIONSTEST  
1. METODE  
Den her beskrevne akutte immobilisationstest er ækvivalent med 
OECD TG 202 (2004).  
1.1. INDLEDNING  
Metoden beskriver en akut toksicitetstest til vurdering af kemiske 
stoffers virkning på dafnier. Så vidt muligt er anvendt eksisterende 
testmetoder (1)(2)(3).  
1.2. DEFINITIONER  
I forbindelse med denne metode anvendes følgende definitioner:  
EC 50 : er den koncentration, der er fundet at immobilisere 50 % af 
dafnierne i løbet af en nærmere angivet eksponeringsperiode. Benyttes en anden definition, skal dette angives tillige med den 
tilhørende henvisning.
 
Immobilisering:  Dyr, der ikke er i stand til at svømme inden for 15 
sekunder efter forsigtig omrystning af testkarret, anses for at være immobiliseret (uanset om de stadig kan bevæge antennerne).
 
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Unge dafnier, som ved testens begyndelse er mindre end 24 timer 
gamle, eksponeres for forskellige koncentrationer af prøvestoffet i et 
tidsrum af 48 timer. Ved 24 og 48 timer registreres immobiliserin ­
gen, og der sammenholdes med kontrolværdier. Resultaterne analyseres med henblik på beregning af EC
 50 ved 48h (se defini ­
tioner i punkt 1.2). Bestemmelse af EC  50 ved 24h er ikke obligato ­
risk. 
1.4. OPLYSNINGER OM PRØVESTOFFET  
Prøvestoffets vandopløselighed og damptryk skal være kendt, og til 
kvantitativ bestemmelse af stoffet i prøveopløsningerne skal der fore ­
ligge en pålidelig analysemetode med dokumenteret genfindingsgrad og bestemmelsesgrænse. Nyttige oplysninger om stoffet er dets 
strukturformel, renhed, stabilitet i vand og over for lys, P
 ow samt 
resultater af en nedbrydelighedstest (se metode C.4).  
Anm.:  For stoffer, der er vanskelige at teste som følge af deres 
fysiske-kemiske egenskaber, er der vejledning i (4).  
1.5. REFERENCESTOFFER  
Der kan testes et referencestof for EC  50 for at sikre, at forsøgsbetin ­
gelserne er pålidelige. Hertil anbefales det at benytte de giftstoffer, 
der anvendes i internationale ringtest (  1 ) (1)(5). Test med reference ­
stof bør helst finde sted hver måned og mindst to gange årligt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Ifølge resultaterne af sådanne ringtest og en teknisk berigtigelse af ISO 6341 ligger EC  50 
— 24 h for kaliumdichromat (K  2 Cr 2 O 7 ) mellem 0,6 mg/l og 1,7 mg/l.
 1.6. KVALITETSKRITERIER  
Følgende præstationskriterier tjener til at afgøre om en test er gyldig:  
— i kontrolprøverne, herunder kontrollen indeholdende opløsnings ­
midlet, må højst 10 % af dafnierne blive immobiliseret  
— koncentrationen af opløst oxygen skal ved testens afslutning være 
≥ 3 mg/l i kontrol- og testkar.  
Anm.:  Med henblik på det første kriterium må højst 10 % af 
kontroldafnierne udvise immobilisering eller andre tegn på sygdom 
eller stress såsom affarvning eller usædvanlig adfærd som f.eks. fast ­
sidden i vandoverfladen.  
1.7. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.7.1.  Apparatur  
Testkar og andet apparatur, der kommer i berøring med prøveop ­
løsningerne, skal være udført helt i glas eller andet kemisk inaktivt materiale. Som testkar anvendes normalt reagensglas eller bægerglas; hver gang disse anvendes, skal de forinden være rengjort med 
sædvanlige laboratoriemetoder. Testkarrene skal være løst tildækket 
for at mindske vandtab ved fordampning og for at undgå, at der kommer støv i opløsningerne. Flygtige stoffer testes i helt fyldte lukkede kar, der er store nok til at forhindre at oxygenkoncentra ­
tionen bliver en begrænsende faktor eller for lav (se punkt 1.6 og 
punkt 1.8.3, første afsnit).
 
Derudover anvendes der et eller flere af følgende udstyr: oxygen ­
meter (med mikroelektrode eller andet egnet udstyr til måling af 
opløst oxygen i prøver med lille volumen); pH-meter; egnet appa ­
ratur til temperaturregulering; udstyr til bestemmelse af total mængde organisk kulstof (TOC); udstyr til bestemmelse af kemisk iltforbrug 
(COD); udstyr til bestemmelse af hårdhed osv.
 
1.7.2.  Testorganisme  
Daphnia magna Straus er den foretrukne art, men andre egnede  
Daphnia -arter kan anvendes (f.eks. Daphnia pulex). Ved testens 
begyndelse skal dyrene være under 24 timer gamle, og for at 
mindske variabiliteten anbefales det stærkt, at man ikke anvender første kuld afkom. Dyrene skal hidrøre fra en sund bestand (dvs. fri for tegn på stress som høj dødelighed, tilstedeværelse af hanner 
og ephippia, forsinket frembringelse af første kuld, affarvede dyr 
osv.). Alle organismer, der anvendes i en given test, skal udgå fra kulturer etableret fra samme bestand af dafnier. Dyrene i bestanden skal holdes under vækstbetingelser (lys, temperatur, medium) 
svarende til de i testen anvendte. Skal der til testen benyttes et 
andet vækstmedium end de sædvanligvis anvendte vækstmedier til dafnier, er det god praksis at anvende en akklimatiseringsperiode inden testen. Denne består i, at dafnier fra kuldet opholder sig i 
fortyndingsvand ved testtemperaturen i mindst 48 timer, inden 
testen begynder.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Opbevarings- og fortyndingsvand  
Som opbevarings- og fortyndingsvand kan accepteres råvand (over ­
flade- eller grundvand), rekonstitueret vand eller afkloret lednings ­
vand, såfremt dafnier kan overleve i vandet i et tidsrum svarende til 
dyrknings-, akklimatiserings- og testperioden uden at vise tegn på 
stress. Vand er egnet som testvand, når det er i overensstemmelse med de kemiske karakteristika for fortyndingsvand i bilag 1. Vandets kvalitet skal være konstant under hele testen. Rekonstitueret vand 
kan fremstilles ved, at deioniseret eller destilleret vand tilsættes 
nærmere bestemte mængder reagenser af anerkendt analysekvalitet. Eksempler på rekonstitueret vand er givet i (1) og (6) og i 
bilag 2. Det skal bemærkes, at metalholdige stoffer ikke bør testes 
med medier indeholdende kendte chelaterende stoffer som M4- og M7-medierne i bilag 2. pH skal være mellem 6 og 9. Til  Daphnia 
magna  anbefales en hårdhed på mellem 140 og 250 mg/l (som 
CaCO
 3 ), men mindre hårdhed kan også være hensigtsmæssig til 
andre arter af Daphnia. Fortyndingsvandet kan luftes inden dets anvendelse i testen, så det er mættet med opløst oxygen.
 
Anvendes råvand, skal kvalitetsparametrene måles mindst to gange 
årligt, samt hver gang der er formodning om, at de kan have ændret sig væsentligt (se foregående afsnit og bilag 1). Måling af tungme ­
taller (f.eks. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) skal ligeledes foretages. 
Anvendes afkloret ledningsvand, er daglig chlorbestemmelse ønske ­
lig. Hidrører fortyndingsvandet fra overflade- eller grundvand, skal dets ledningsevne og totale organiske kulstofindhold (TOC) eller kemiske iltforbrug (COD) bestemmes.
 
1.7.4.  Testopløsninger  
Sædvanligvis fremstilles testopløsningerne i de valgte koncentra ­
tioner ved fortynding af en stamopløsning. Stamopløsninger skal fortrinsvis fremstilles ved opløsning af prøvestoffet i fortyndingsvan ­
det. Brug af opløsningsmidler, emulgatorer og dispergeringsmidler 
skal så vidt muligt undgås. I visse tilfælde kan sådanne forbindelser 
dog være nødvendige for at få en tilpas koncentreret stamopløsning. Vejledning om egnede opløsningsmidler, emulgatorer og disperge ­
ringsmidler er givet i (4). I alle tilfælde må indholdet af prøvestof i 
testopløsningerne ikke overstige stoffets opløselighed i fortyndings ­
vandet.
 
Testen skal udføres uden justering af pH. Hvis pH ikke holder sig i 
området 6-9, kan der efterfølgende foretages endnu en test, hvor 
stamopløsningens pH er justeret til pH af fortyndingsvandet, før prøvestof tilsættes. pH-justeringen skal ske således, at stamopløsnin ­
gens koncentration ikke ændres nævneværdigt, og så det ikke 
forårsager en kemisk reaktion eller udfældning af prøvestoffet. HCl 
og NaOH må foretrækkes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. FREMGANGSMÅDE  
1.8.1.  Eksponeringsbetingelser  
1.8.1.1.  Testgrupper og kontrolgrupper  
Testkarrene påfyldes det korrekte rumfang fortyndingsvand og 
prøvestofopløsning. Luft/vand-volumenforholdet i karret skal være 
ens i test- og kontrolgruppen. Dafnierne overføres derefter til test ­
karrene. For hver testkoncentration og til kontrol skal anvendes mindst 20 dyr, helst opdelt i fire grupper på hver fem dyr. Der 
skal være mindst 2 ml testopløsning for hvert dyr (altså 10 ml til 
fem dafnier pr. testkar). Er prøvestofkoncentrationen ikke stabil, kan testen udføres i et system med halvstatisk udskiftning eller et 
gennemstrømningssystem.
 
Foruden behandlingsserien testes én kontrolserie med fortyndings ­
vand og én kontrolserie indeholdende et eventuelt opløsningsmiddel.  
1.8.1.2.  Testkoncentrationer  
Der kan udføres et forberedende forsøg til fastlæggelse af koncen ­
trationsområdet for den endelige test, medmindre oplysninger om 
prøvestoffets toksicitet allerede foreligger. Herunder eksponeres dafnierne for en række vidt forskellige koncentrationer af prøvestof ­
fet. Fem dafnier eksponeres for hver testkoncentration i op til 48 
timer, og flerdobbeltbestemmelse er ikke nødvendigt. Eksponerings ­
perioden kan afkortes (f.eks. til 24 timer eller derunder), hvis egnede data i det forberedende forsøg kan opnås på kortere tid.
 
Der skal anvendes mindst fem testkoncentrationer. Disse vælges som 
en kvotientrække med en kvotient på helst ikke over 2,2. Anvendes 
færre end fem koncentrationer, skal dette begrundes. Den højeste testede koncentration skal helst medføre 100 % immobilisering, mens den laveste helst ikke må medføre nogen observerbar effekt.
 
1.8.1.3.  Inkuberingsbetingelser  
Temperaturen skal være mellem 18  o C og 22  o C og skal i den 
enkelte test være konstant inden for ± 1  o C. En cyklus bestående 
af 16 timers lys og 8 timers mørke anbefales. Fuldstændigt mørke er også acceptabelt, specielt for prøvestoffer, der er ustabile i lys.
 
Testkarrene må ikke beluftes under testen. Testen udføres uden juste ­
ring af pH. Dafnierne må ikke fodres under testen.  
1.8.1.4.  Varighed  
Testens varighed er 48 timer.  
1.8.2.  Bemærkninger  
Hvert testkar kontrolleres for immobiliserede dafnier 24 og 48 timer 
efter testens begyndelse. (se definitionerne i punkt 1.2). Ud over 
immobilitet rapporteres om al unormal adfærd eller fremtræden.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Analytiske målinger  
Ved testens begyndelse og slutning måles opløst oxygen og pH i 
kontrolprøve(r) og i den højeste prøvestofkoncentration. Koncentra ­
tionen af opløst oxygen i kontrollerne skal være i overensstemmelse 
med validitetskriteriet (se punkt 1.6). pH må normalt ikke variere 
mere end 1,5 enhed i nogen enkelt test. Temperaturen måles sædvan ­
ligvis i kontrolkarrene eller i den omgivende luft og skal helst regi ­
streres kontinuerligt under testen eller i det mindste ved testens 
begyndelse og slutning.  
Prøvestofkoncentrationen måles i det mindste ved den højeste og 
laveste prøvestofkoncentration ved testens begyndelse og 
slutning (4). Det anbefales at resultaterne baseres på de målte koncentrationer. Hvis prøvestofkoncentrationen kan dokumenteres at have været holdt tilfredsstillende inden for ± 20 % af den nomi ­
nelle eller målte begyndelseskoncentration under hele testen, kan 
resultaterne dog baseres på de nominelle eller målte begyndelsesvær ­
dier.
 
1.9. GRÆNSETEST  
Med den i denne metode beskrevne fremgangsmåde kan udføres en 
grænsetest ved en prøvestofkoncentration på 100 mg/l, dog ikke højere end stoffets opløselighed i testmediet, med henblik på at godtgøre at EC
 50 er større end denne koncentration. Til grænsetesten 
anvendes 20 dafnier (helst opdelt i fire grupper på hver fem dyr), og 
samme antal kontroldyr. Hvis der forekommer immobilisering, udføres en fuld undersøgelse. Al observeret unormal adfærd regi ­
streres.
 
2. DATA  
Data sammenfattes i tabeller, der for hver behandlings- og kontrol ­
gruppe viser det anvendte antal dafnier og immobiliserede dyr ved hver observation. Der optegnes en kurve over procentdel immobili ­
serede dyr ved 24 timer og 48 timer som funktion af prøvestofkon ­
centrationen. Der anvendes passende statistiske metoder (f.eks. probabalistisk analyse osv.) til beregning af kurvehældninger og EC
 50 med 95 % konfidensintervaller (p = 0,05) (7) (8).  
Når standardmetoder til beregning af EC  50 ikke kan anvendes på de 
målte data, benyttes den højeste koncentration, der ikke medfører 
immobilitet, og den laveste koncentration, der medfører 100 % 
immobilitet, til tilnærmet beregning af EC  50 (idet denne sættes til 
det geometriske gennemsnit af de to koncentrationer).  
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende:  
Teststof:  
— fysisk form og, når det er relevant, fysiske-kemiske egenskaber  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— kemiske identifikationsdata, herunder renhed.  
Den testede dyreart:  
— kilde til og art af Daphnia, leverandør af kilden (hvis den kendes) 
og anvendte vækstbetingelser (herunder foderets oprindelse, art 
og mængde samt fodringshyppighed).  
Testbetingelser:  
— beskrivelse af testkarrene: karrenes art, opløsningens volumen, 
antal dafnier pr. testkar, antal testkar (gentagelser) pr. koncen ­
tration  
— metoder til fremstilling af stam- og testopløsninger herunder 
eventuelle opløsnings- og dispergeringsmidler, samt anvendte koncentrationer
 
— oplysninger om fortyndingsvandet: oprindelse og kvalitetskarak ­
teristika (pH, hårdhed, Ca/Mg-forhold, Na/K-forhold, alkalinitet, 
ledningsevne osv.); hvis rekonstitueret vand anvendes, dettes sammensætning
 
— inkubationsbetingelser: temperatur, lysintensitet og -periodicitet, 
opløst oxygen, pH osv.  
Resultater:  
— antal og procentdel dafnier, der er blevet immobiliseret eller 
udviser negativ påvirkning (herunder unormal opførsel) i kontrol ­
dyrene og i hver behandlingsgruppe, på hvert observationstids ­
punkt, samt beskrivelse af arten af de iagttagne virkninger  
— resultater og dato for test udført med referencestof, hvis de fore ­
ligger  
— nominelle prøvekoncentrationer og resultat af alle analyser til 
bestemmelse af prøvestofkoncentrationen i testkarrene; metodens genfindingsgrad og bestemmelsesgrænse skal ligeledes rappor ­
teres
 
— alle fysiske-kemiske målinger af temperatur, pH og opløst 
oxygen, som er foretaget under testen  
— EC  50 ved 48 h for immobilisering, med konfidensintervaller og 
kurver over den tilpassede model, der anvendt til beregning heraf, dosis-responskurvers hældning og middelfejlen herpå; 
statistiske metoder, der er anvendt til bestemmelse af EC
 50 ; (til­
svarende data vedrørende immobilisering ved 24 h skal ligeledes rapporteres, når de er målt)
 
— forklaring vedrørende eventuel afvigelse fra testmetoden, og 
hvorvidt afvigelsen påvirkede testresultaterne.  
4. HENVISNINGER  
(1) ISO 6341. (1996). Water quality — Determination of the inhi ­
bition of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) — Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines — Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/1 
1. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 
23. Paris 2000.
 
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daph­
nia.
 
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 — American 
Society for Testing and Materials. Pp. 65-84.
 
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
Bilag 1  
NOGLE KEMISKE KARAKTERISTIKA AF ACCEPTABELT 
FORTYNDINGSVAND  
Stof Koncentration  
Partikler < 20 mg/l 
Total mængde organisk kulstof (TOC) < 2 mg/l 
Ikke-ioniseret ammoniak < 1 μg/l 
Chloroverskud < 10 μg/l 
Total mængde organiske fosforpesticider < 50 ng/l Total mængde organiske chlorpesticider plus polychlorerede 
biphenyler < 50 ng/l 
Total mængde organisk chlor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
Bilag 2  
EKSEMPLER PÅ VELEGNET REKONSTITUERET TESTVAND  
ISO-testvand (1)  
Stamopløsninger (enkeltstof) Rekonstitueret vand fremstilles 
ved tilsætning af følgende 
rumfang stamopløsninger til 1 
liter vand (*) Stof Mængde tilsat til 1 liter 
vand (*)  
Calciumchlorid 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Magnesiumsulfat 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Natriumbicarbonat 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Kaliumchlorid 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Vand af passende renhed, f.eks. deioniseret, destilleret eller behandlet ved omvendt 
osmose, fortrinsvis med ledningsevne ikke over 10 μS.cm  -1 . 
Elendt medium M7 og M4  
Akklimatisering til Elendt medium M4 og M7  
I nogle laboratorier har det medført problemer at overføre dafnier direkte til M4- 
og M7-medium. Dog er med noget held anvendt gradvis akklimatisering, dvs. flytning fra eget medium til 30 % Elendt efterfulgt af 60 % Elendt og derefter 
100 % Elendt. En akklimatiseringsperiode på helt op til en måned kan være 
nødvendig.
 
Fremstilling  
Mikronæringsstoffer  
Først fremstilles der separate stamopløsninger (I) af hvert mikronæringsstof i 
vand af passende renhed, f.eks. deioniseret, destilleret eller behandlet ved omvendt osmose. Af disse forskellige stamopløsninger (I) fremstilles én enkelt stamopløsning (II) indeholdende alle mikronæringsstoffer (kombineret opløs ­
ning), dvs.:
 
Stamopløsning(er) I (enkeltstof) Mængde tilsat til vand 
(mg/l) Koncentration (i forhold 
til medium M4) Til fremstilling af den kombinerede stamopløsning 
II tilsættes følgende mængde stamopløsning I til 
vand (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 gange 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000 gange 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 gange 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Stamopløsning(er) I (enkeltstof) Mængde tilsat til vand 
(mg/l) Koncentration (i forhold 
til medium M4) Til fremstilling af den kombinerede stamopløsning 
II tilsættes følgende mængde stamopløsning I til 
vand (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000 gange 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000 gange 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 gange 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000 gange 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000 gange 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 gange 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000 gange 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 gange 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 gange 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 gange 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000 gange — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000 gange — — 
De to opløsninger af Na  2 EDTA og FeSO  4 fremstilles hver for sig, hældes sammen og autoklaveres straks. 
Derved fås: 
2 l Fe-EDTA opløsning 1 000 gange 20,0 5,0  
M 4 - o g M 7 - m e d i u m  
M4- og M7-medierne fremstilles af stamopløsning II, makronæringsstoffer og 
vitaminer på følgende måde:  
Mængde tilsat til vand 
(mg/l) Koncentration (i forhold 
til medium M4) Mængde stamopløsning II tilsat til fremstilling 
afmediet (ml/l) 
M4 M7  
Stamopløsning II (kombi ­
nerede sporstoffer) 20 gange 50 50 
Stamopløsninger af makro ­
næringsstoffer (enkeltstof) 
CaCl  2 • 2H  2 0 293 800 1 000 gange 1,0 1,0 
MgSO  4 • 7H  2 O 246 600 2 000 gange 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 gange 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 gange 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 • 9H  2 O 50 000 5 000 gange 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 gange 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 gange 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 gange 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Mængde tilsat til vand 
(mg/l) Koncentration (i forhold 
til medium M4) Mængde stamopløsning II tilsat til fremstilling 
afmediet (ml/l) 
M4 M7  
Kombineret vitamin- 
stamopløsning — 10 000 gange 0,1 0,1 
Den kombinerede vitamin-stamopløsning fremstilles ved tilsætning af de tre vitaminer til 1 liter vand som vist 
nedenfor: 
Thiaminhydrochlorid 750 10 000 gange 
Cyanocobalamin (B  12 ) 10 10 000 gange 
Biotin 7,5 10 000 gange  
Den kombinerede vitamin-stamopløsning opbevares nedfrosset i små aliquoter. 
Vitaminer tilsættes til medierne kort inden disse anvendes.  
NB: For at undgå saltudfældning ved fremstilling af de komplette medier 
tilsætter man først aliquoterne af stamopløsningerne til 500-800 ml deioni ­
seret vand, hvorefter der fyldes op til 1 liter.  
NB: M4-mediet blev første gang beskrevet i Elendt, B. P. (1990): Selenium 
deficiency in crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in  
Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. FERSKVANDSALGER OG CYANOBAKTERIER, VÆKSTHÆM ­
NINGSTEST  
1. METODE  
Metoden er ækvivalent med OECD TG 201 (2006) (1).  
1.1. INDLEDNING  
Testmetoderne bliver med mellemrum gennemgået og ajourført på 
baggrund af den videnskabelige udvikling. Der er nødvendigt at revidere testmetode C.3, således at den omfatter flere arter og opfylder kravene til risikovurdering og klassificering af kemiske 
stoffer. Revisionen er foretaget på grundlag af de omfattende prak ­
tiske erfaringer med testen, den videnskabelige udvikling inden for algetoksicitetsundersøgelser samt de kontrollerende myndigheders udstrakte anvendelse af testen, siden denne oprindeligt blev indført.
 
1.2. DEFINITIONER  
I denne testmetode anvendes følgende definitioner og forkortelser:  
Biomasse , den tørre vægt af levende materiale, som er til stede i en 
population, i et givet volumen, f.eks. mg alger/liter testopløsning. 
»Biomasse« defineres sædvanligvis som masse, men skal i denne test forstås som masse pr. volumenenhed. I denne test anvendes typisk målinger af surrogater for biomasse som f.eks. celletal, fluore ­
scens mv., hvorfor betegnelsen »biomasse« ligeledes dækker disse 
surrogatmåleværdier.
 
Variationskoefficient , et dimensionsløst mål for variabiliteten af en 
parameter, defineret som forholdet mellem standardafvigelsen og 
middelværdien. Den kan også angives i procent. Middelværdien af 
variationskoefficienten for den gennemsnitlige specifikke vækst ­
hastighed i replikate kontrolkulturer beregnes som følger:  
1. Variationskoefficienten beregnes som % af den gennemsnitlige 
specifikke væksthastighed ved hjælp af de trinvist beregnede 
daglige vækstrater for den pågældende replikat.  
2. Der beregnes et gennemsnit af alle værdier beregnet i 
punkt 1. Deraf fås den gennemsnitlige variationskoefficient for den beregnede trinvise daglige specifikke vækstrate i replikate kontrolkulturer.
 
ECx , den koncentration af teststof opløst i testsubstratet, der 
medfører en væksthæmning på x % (f.eks. 50 %) af testorganismen inden for en angiven eksponeringsperiode (som angives udtrykkeligt, hvis den er forskellig fra den fulde eller normale testperiode). For 
entydigt at skelne mellem EC-værdier afledt af vækstrate (»rate«) 
eller af udbytte (»yield«) benyttes de respektive symboler »E
 r C« 
og »E  y C«. 
Næringssubstrat , det komplette, syntetiske næringssubstrat, hvori 
algerne vokser, når de eksponeres for teststoffet. Teststoffet vil 
normalt være opløst i testsubstratet.  
Væksthastighed  (gennemsnitlig specifik væksthastighed ), den 
logaritmiske stigning i biomasse i eksponeringsperioden.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Laveste koncentration med observeret effekt (Lowest Observed 
Effect Concentration, LOEC) , den laveste testede koncentration, 
ved hvilken stoffet har vist statistisk signifikant (p < 0,05) vækst ­
nedsættende virkning i forhold til kontrolprøverne inden for en given eksponeringsperiode. Alle testkoncentrationer over LOEC skal dog 
have en skadelig virkning mindst svarende til den, der iagttages ved 
LOEC. Er disse to betingelser ikke opfyldt, skal der fyldestgørende redegøres for, hvordan den pågældende LOEC (og dermed NOEC) er valgt.
 
Nuleffekt-koncentration (No Observed Effect Concentration 
(NOEC)) , testkoncentrationen umiddelbart under LOEC.  
Responsvariabel , en variabel, som anvendes til vurdering af den 
toksiske virkning og er afledt af vilkårlige målte parametre, der beskriver biomassen ved andre beregningsmetoder. I nærværende 
metode er vækstrater og udbytte responsvariabler, der er afledt ved 
måling af biomasse direkte eller af et af de nævnte surrogater.
 
Specifik væksthastighed , en responsvariabel, der er defineret som 
forholdet mellem ændringen i den naturlige logaritme til en obser ­
vationsparameter (i nærværende testmetode, biomasse) og det tilsva ­
rende tidsrum.  
Udbytte , værdien af en målevariabel ved eksponeringsperiodens 
slutning minus værdien af variablen ved eksponeringsperiodens 
start, dvs. stigningen i biomasse under testen.  
1.3. TESTMETODENS ANVENDELIGHED  
Metoden er bedst anvendelig på vandopløselige stoffer, som under 
forsøgsbetingelserne forventes at forblive i vandet. Til testning af stoffer, der er flygtige, stærkt adsorberende, farvede eller tungtop ­
løselige i vand, eller som kan ændre tilgængeligheden af nærings ­
stoffer eller mineraler i testsubstratet, kan visse ændringer af den 
beskrevne fremgangsmåde være nødvendige (f.eks. lukket system eller konditionering af testbeholderne). Anvisninger for nogle sådanne ændringer er givet i (2) (3) (4).
 
1.4. TESTENS PRINCIP  
Testens formål er at bestemme teststoffets påvirkning af væksten af 
ferskvandsmikroalger og/eller cyanobakterier. Testorganismer i 
eksponentiel vækst eksponeres for teststoffet i batchkulturer i et tidsrum af normalt 72 timer. Til trods for testens forholdsvis korte 
varighed giver den mulighed for at vurdere virkningerne på flere 
generationer.
 
Systemets respons er væksthæmningen i en række algekulturer 
(testenheder), der eksponeres for forskellige koncentrationer af et teststof. Responsen udtrykkes som funktion af eksponeringskoncen ­
trationen og sammenholdes med gennemsnitsvæksten i replikate, 
ikke eksponerede kulturer. For at systemets respons på toksiske virk ­
ninger kan komme fuldt til udtryk (optimal følsomhed), lader man kulturerne vokse uhæmmet eksponentielt med tilstrækkelige nærings ­
stoffer og kontinuerlig belysning tilstrækkelig længe til, at 
hæmningen af den specifikke væksthastighed kan måles.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Vækst og væksthæmning bestemmes kvantitativt ved måling af alge ­
biomassen som funktion af tiden. Algebiomasse defineres som tør 
vægt pr. volumenenhed, f.eks. mg alger/liter testopløsning. Tør vægt er imidlertid vanskelig at måle, hvorfor der anvendes surrogatpara ­
metre. Af sådanne surrogater er celletal det mest anvendte. Andre 
surrogatparametre er cellevolumen, fluorescens, optisk tæthed mv. 
Omregningsfaktoren mellem den målte surrogatparameter og biomassen skal være kendt.
 
Endepunktet for testen er væksthæmning, udtrykt som logaritmisk 
stigning i biomasse (gennemsnitlig specifik væksthastighed) i 
eksponeringsperioden. Ud fra de gennemsnitlige specifikke vækst ­
hastigheder, der er registreret i en række testopløsninger, bestemmes 
den koncentration, der frembringer en bestemt hæmning x % (f.eks. 
50 %) af væksthastigheden, og denne udtrykkes som E  r C x (f.eks. 
E r C 50 ). 
Når denne metode anvendes i forbindelse med EU-lovgivningen, 
skal resultaterne beregnes på grundlag af den gennemsnitlige speci ­
fikke væksthastighed af de grunde, der er anført i punkt 2.2. I metoden anvendes udbytte som en supplerende responsvariabel, der 
kan være nødvendig for at efterkomme myndighedsbestemmelser i 
visse stater. Udbyttet defineres som biomassen ved eksponerings ­
periodens slutning minus biomassen ved eksponeringsperiodens start. Ud fra det udbytte, der er registreret i en række testopløsninger, 
bestemmes den koncentration, der frembringer en bestemt hæmning 
x % (f.eks. 50 %) i udbyttet, og denne angives som E
 y C x (f.eks. 
E y C 50 ). 
Derudover kan den laveste koncentration med observeret effekt 
(LOEC) og nuleffekt-koncentrationen (NOEC) bestemmes statistisk.  
1.5. OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET  
Med henblik på fastsættelse af testbetingelser vil det være nyttigt at 
kende teststoffets strukturformel, renhed, lysstabilitet, stabilitet under 
testbetingelserne, lysabsorptionsegenskaber, pKa og resultaterne af 
omdannelsesundersøgelser, herunder bionedbrydeligheden i vand.  
Teststoffets vandopløselighed, octanol/vand-fordelingskoefficient 
(P ow ) og damptryk skal være kendt, og til kvantitativ bestemmelse 
af stoffet i testopløsningerne skal der foreligge en pålidelig analyse ­
metode, hvis genfindingsevne og detektionsgrænse rapporteres.  
1.6. REFERENCESTOF  
Til kontrol af testmetoden kan testes et eller flere referencestoffer, 
f.eks. 3,5-dichlorphenol, som er anvendt i den internationale ringtest 
(4). Kaliumdichromat kan ligeledes anvendes som referencestof for grønalger. Det er ønskeligt, at der testes et referencestof mindst to gange årligt.
 
1.7. TESTENS VALIDITET  
Til afgørelse af, om en test er valid, anvendes følgende præstations ­
kriterier:  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Biomassen i kontrolkulturerne skal være steget eksponentielt med 
mindst en faktor 16 i løbet af testperioden på 72 timer. Dette 
svarer til en specifik væksthastighed på 0,92 dag  –1 . For de oftest 
anvendte arter er væksthastigheden sædvanligvis betydeligt højere (se tillæg 1). Dette kriterium er ikke nødvendigvis 
opfyldt for arter, der er mere langsomtvoksende end de i 
tillæg 1 anførte. I så fald må testperioden forlænges, så der opnås en vækst til mindst det 16-dobbelte i kontrolkulturerne, og så væksten er eksponentiel i hele testperioden. For at opret ­
holde uhæmmet eksponentiel vækst under testen kan testperioden 
afkortes til ikke under 48 h, når blot den minimale multiplika ­
tionsfaktor på 16 nås.
 
— Den gennemsnitlige variationskoefficient af den trinvise speci ­
fikke væksthastighed (ved 72-timers test, dag 0-1, 1-2 og 2-3) i kontrolkulturerne (se punkt 1.2 under »variationskoefficient«) 
må ikke være over 35 %. Vedrørende beregning af trinvis 
specifik væksthastighed: se andet afsnit i punkt 2.2.1. Kriteriet gælder for gennemsnitsværdien af variationskoefficienterne for replikate kontrolkulturer.
 
— Variationskoefficienten for de gennemsnitlige specifikke vækst ­
hastigheder i hele testperioden i replikate kontrolkulturer må ikke 
være over 7 % i test med  Pseudokirchneriella subcapitata  og 
Desmodesmus subspicatus . For andre, mindre hyppigt benyttede 
testede arter må værdien ikke være over 10 %.  
1.8. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.8.1.  Apparatur  
Testbeholdere og andet apparatur, der kommer i berøring med testop ­
løsningerne, skal være udført helt i glas eller andet kemisk inaktivt materiale. Det pågældende udstyr skal være omhyggelig vasket for at 
sikre, at ingen organiske eller uorganiske kontaminanter kan forstyrre 
algevæksten eller testopløsningernes sammensætning.
 
Som testbeholdere anvendes sædvanligvis glaskolber af en størrelse, 
der giver tilstrækkeligt kulturvolumen til målingerne under testen og tilstrækkelig masseoverførsel af CO
 2 fra atmosfæren (se andet afsnit i 
punkt 1.8.9). Bemærk, at der skal være tilstrækkeligt væskevolumen 
til de analytiske bestemmelser (se femte afsnit i punkt 1.8.11).  
Derudover er der brug for følgende udstyr eller en del deraf:  
— dyrkningsapparatur: Det anbefales at benytte et kabinet eller 
kammer med mulighed for fastholdelse af den valgte inkuba ­
tionstemperatur inden for ± 2 °C.  
— instrumenter til lysmåling: Man må være opmærksom på, at den 
anvendte metode til lysintensitetsmåling, specielt den anvendte 
type detektor (kollektor), vil påvirke måleværdien. Til målingerne skal fortrinsvis benyttes en sfærisk detektor (4 π-detektor) (som 
reagerer på direkte og reflekteret lys fra alle vinkler over og 
under måleplanet) eller en 2 π-detektor (som reagerer på lys 
fra alle vinkler over måleplanet).
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— apparatur til bestemmelse af algebiomasse: Celletal, der er den 
oftest anvendte surrogatparameter for algebiomasse, kan 
bestemmes med en elektronisk partikeltæller, et mikroskop med tællekammer eller et flowcytometer. Andre biomassesurrogater kan måles med flowcytometer, fluorimeter, spektrofotometer 
eller kolorimeter. Det er hensigtsmæssigt at beregne en omreg ­
ningsfaktor fra celletal til tør vægt. Ved spektrofotometrisk bestemmelse af lave biomassekoncentrationer kan det være nødvendigt at bruge kuvetter med en lysvej på mindst 4 cm 
for at få brugbare målinger.
 
1.8.2.  Testorganismer  
Der kan anvendes forskellige arter af ikke-fastsiddende mikroalger 
og cyanobakterier. De i tillæg 1 opførte stammer har vist sig 
velegnede ved brug af fremgangsmåden i denne testmetode.  
Benyttes andre arter, skal stamme og/eller oprindelse angives. Det 
skal være godtgjort, at der kan opretholdes eksponentiel vækst af de 
valgte testalger i hele testperioden under de givne betingelser.  
1.8.3.  Næringssubstrat  
To alternative næringssubstrater, OECD-substratet og AAP-substra ­
tet, anbefales. Substraternes sammensætning er angivet i tillæg 2. Bemærk, at de to mediers initiale pH-værdi og bufferkapa ­
citet (som regulerer pH-stigningen) er forskellige. Testningen kan 
derfor give forskelligt resultat afhængigt af substratet, specielt ved 
test af ioniserende stoffer.
 
Til visse formål kan det være nødvendigt at modificere substratet, 
f.eks. ved testning af metaller og chelaterende midler, eller når test ­
ning finder sted ved afvigende pH-værdier. Modificerede substrater skal beskrives i detaljer og deres anvendelse begrundes (3) (4).
 
1.8.4.  Initial biomassekoncentration  
Den initiale biomasse i testkulturerne skal være ens i alle testkulturer 
og tilstrækkelig lav til at muliggøre eksponentiel vækst i hele inku ­
bationsperioden uden risiko for, at næringsstoffer opbruges. Den 
initiale biomasse må ikke udgøre mere end 0,5 mg/l som tør vægt. Følgende initiale cellekoncentrationer anbefales:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 × 10
 3 -10 4 celler/ml  
Desmodesmus subspicatus  2-5 × 10  3 celler/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 celler/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 celler/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 -10 5 celler/ml  
1.8.5.  Teststofkoncentrationer  
Der kan udføres indledende test til at fastlægge det koncentrations ­
område, hvor der kan forventes effekt. Til den endelige test skal 
vælges mindst fem koncentrationer, der er ordnet i en geometrisk serie med en faktor på højst 3,2. For teststoffer med flad koncen ­
trations-responskurve kan en højere faktor være berettiget. Koncen ­
trationsserien skal fortrinsvis dække det område, der medfører 5- 
75 % hæmning af algevæksthastigheden.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Replikater og kontroller  
Testens design skal indeholde tre replikater ved hver testkoncentra ­
tion. Hvis der ikke kræves bestemmelse af NOEC, kan testens design ændres, så der anvendes flere forskellige koncentrationer og færre 
replikater for hver koncentration. Der skal være mindst tre replikater 
af kontrolprøverne, og ideelt dobbelt så mange som antallet af repli ­
kater for hver testkoncentration.
 
Der kan fremstilles et separat sæt testopløsninger til analytisk 
bestemmelse af teststofkoncentrationerne (se fjerde og sjette afsnit i punkt 1.8.11).
 
Anvendes et opløsningsmiddel til at bringe teststoffet i opløsning, 
skal testen omfatte ekstra kontroller indeholdende opløsningsmidlet i samme koncentration som i testkulturerne.
 
1.8.7.  Fremstilling af podekultur  
For at lade de testede alger tilpasse sig til testbetingelserne og sikre, 
at algerne er i den eksponentielle vækstfase, når de benyttes til 
podning af testopløsningerne, fremstilles en podekultur i testsub ­
stratet 2-4 dage, før testen begynder. Mængden af algebiomasse 
skal tilpasses, så der bliver eksponentiel vækst i podekulturen, 
indtil testen begynder. Podekulturen skal inkuberes under samme betingelser som testkulturerne. Stigningen i biomasse i podekulturen skal måles for at sikre, at væksten er inden for normalområdet for 
den pågældende teststamme under dyrkningsbetingelserne. Et 
eksempel på fremgangsmåden ved dyrkning af alger er beskrevet i tillæg 3. For at undgå synkrone celledelinger under testen kan et ekstra formeringstrin af podekulturen være nødvendigt.
 
1.8.8.  Fremstilling af testopløsninger  
Alle testopløsninger skal indeholde samme koncentration af nærings ­
substrat og initial biomasse af testalger. Testopløsningerne af de valgte koncentrationer fremstilles sædvanligvis ved, at en stamopløs ­
ning af teststoffet opblandes med vækstmedium og podekultur. 
Stamopløsningerne fremstilles normalt ved opløsning af teststoffet i 
testsubstrat.
 
Opløsningsmidler, f.eks. acetone, t-butylalkohol og dimethylfor ­
mamid, kan bruges som bæremedier, når tungtopløselige stoffer 
skal tilsættes testsubstratet (2) (3). Opløsningsmidlets koncentration må ikke være over 100 μl/l, og det skal tilsættes i samme koncen ­
tration til alle kulturer (også kontrollerne) i testserien.
 
1.8.9.  Inkubation  
Testbeholderne lukkes med luftgennemtrængelige propper. Testbe ­
holderne omrystes og anbringes i dyrkningsapparatet. Under testen skal algerne holdes opslæmmet og CO
 2 -overførslen lettes. Kontinu ­
erlig omrystning eller omrøring er derfor nødvendig. Kulturerne skal 
være reguleret til en temperatur i området 21 til 24 °C, og den 
fastsatte temperatur skal holdes inden for ± 2 °C. Til andre arter end de i tillæg 1 anførte, f.eks. tropiske arter, kan højere tempera ­
turer være hensigtsmæssigt, forudsat at validitetskriterierne kan 
opfyldes. Det anbefales at placere kolberne i tilfældig orden og 
dagligt bytte rundt på dem i inkubatoren.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
pH af kontrolsubstratet må højst stige med 1,5 enheder under testen. 
For metaller og forbindelser, der kun er delvis ioniseret ved pH- 
værdier omkring testens pH, kan det være nødvendigt at begrænse pH-afvigelsen for at få reproducerbare og veldefinerede resultater. Begrænsning af afvigelsen til < 0,5 pH-enhed er teknisk mulig og 
kan opnås ved at sikre tilstrækkelig CO
 2 -masseoverførsel fra den 
omgivende luft til testopløsningen, f.eks. ved at øge omrystnings ­
hastigheden. En anden mulighed er at nedsætte CO  2 -behovet ved 
enten at reducere den initiale biomasse eller testens varighed.  
Den overflade, som kulturerne inkuberes på, skal have kontinuerlig, 
ensartet fluorescerende belysning, f.eks. af typen »cool-white« eller »daylight«. Forskellige stammer af alger og cyanobakterier har 
forskelligt lysbehov. Der skal vælges en passende lysintensitet i 
forhold til den anvendte organisme. Til de anbefalede arter af grønalger skal lysintensiteten i testopløsningernes niveau vælges i området 60-120 μE·m
 –2 ·s –1 , målt i det fotosyntetisk effektive bølge ­
længdeområde 400-700 nm med en egnet detektor. Visse arter, 
navnlig  Anabaena flos-aquae , vokser godt ved lavere lysintensitet 
og kan tage skade af højere intensitet. Til sådanne arter bør vælges en gennemsnitlig lysintensitet i området 40-60 μE·m
 –2 ·s –1 . 
(For lysmåleinstrumenter kalibreret i lux vil den anbefalede lysinten ­
sitet på 60-120 μE·m  –2 ·s –1 med cool-white-lys tilnærmelsesvis svare 
til området 4 440-8 880 lux.) Lysintensiteten må ikke afvige mere end ± 15 % fra den gennemsnitlige lysintensitet i hele inkubations ­
området.
 
1.8.10.  Testens varighed  
Testens varighed er normalt 72 timer. Kortere eller længere varighed 
kan dog anvendes, forudsat at alle validitetskriterierne i punkt 1.7 
kan opfyldes.  
1.8.11.  Målinger og analytiske bestemmelser  
Algebiomassen i hver kolbe bestemmes mindst én gang dagligt i hele 
testperioden. Hvis målingerne foretages på små volumener, der er udtaget af testopløsningen med pipette, bør disse ikke erstattes.
 
Måling af biomasse foretages enten ved manuel celletælling i mikro ­
skop eller med en elektronisk partikeltæller (i celletal og/eller biovo ­
lumen). Andre teknikker kan anvendes, f.eks. flowcytometri, in vitro 
eller in vivo chlorophyl-fluorescens (6) (7) eller optisk densitet, 
forudsat at der kan påvises tilfredsstillende korrelation med biomasse i hele det biomasseområde, der forekommer under testen.
 
Opløsningernes pH skal måles ved testens start og slutning.  
Hvis der foreligger en analysemetode til bestemmelse af teststoffet i 
det anvendte koncentrationsområde, skal testopløsningerne 
analyseres til efterprøvning af intialkoncentrationerne og af, at 
eksponeringskoncentrationerne overholdes under testen.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Hvis eksponeringskoncentrationerne under testen forventes at afvige 
mindre end 20 % fra de nominelle værdier, kan det være tilstræk ­
keligt at bestemme en høj og en lav teststofkoncentration og en koncentration omkring den forventede EC
 50 ved testens begyndelse 
og slutning. Når koncentrationen ikke kan forventes at holde sig 
inden for 80-120 % af den nominelle værdi, anbefales analytisk 
bestemmelse af alle testkoncentrationer ved testens begyndelse og slutning. Til flygtige, ustabile eller stærkt adsorberende stoffer anbe ­
fales det at udtage supplerende prøver til analyse med 24 timers 
mellemrum i hele eksponeringsperioden for bedre at bestemme 
tabet af teststof. For sådanne stoffer vil ekstra replikater være nødvendige. I alle tilfælde behøver teststofkoncentrationen kun bestemmes på én replikat testbeholder ved hver testkoncentration 
(eller på indholdet af de poolede beholdere for hver replikat).
 
Testmedier, der er fremstillet specielt til analyse af eksponeringskon ­
centrationerne under testen, skal behandles på samme måde som 
dem, der anvendes til testning, dvs. podes med alger og inkuberes ved identiske betingelser. Hvis koncentrationen af opløst teststof 
kræves analyseret, kan det være nødvendigt at separere algerne fra 
substratet. Separationen skal fortrinsvis ske ved centrifugering med lav g-kraft, tilstrækkelig til at få algerne til at bundfælde.
 
Hvis det kan konstateres, at prøvestofkoncentrationen har været holdt 
tilfredsstillende inden for ± 20 % af den nominelle eller målte begyn ­
delseskoncentration under hele testen, kan analysen af resultaterne 
baseres på nominelle eller målte startværdier. Er afvigelsen fra den 
nominelle eller målte initialkoncentration større end ± 20 %, skal analysen af resultaterne baseres på den geometriske middelkoncen ­
tration under eksponeringen eller på modeller, der beskriver faldet i 
teststofkoncentrationen (3) (8).
 
Algevæksthæmning er et mere dynamisk testsystem end de fleste 
andre korttidstest for akvatisk toksicitet. De faktiske eksponerings ­
koncentrationer kan derfor være vanskelige at fastlægge, navnlig for adsorberende stoffer, der testes ved lav koncentration. I sådanne 
tilfælde er stoffets forsvinden fra opløsningen ved adsorption til 
den voksende algebiomasse ikke ensbetydende med, at det forsvinder fra testsystemet. Ved analysen af testresultatet skal det kontrolleres, om et fald i teststofkoncentrationen under testen ledsages af et fald i 
væksthæmningen. Hvis det er tilfældet, kan det overvejes at benytte 
en egnet model, der beskriver faldet i teststofkoncentrationen (8). Hvis ikke, kan det være hensigtsmæssigt at basere analysen af resul ­
taterne på de initiale (nominelle eller målte) koncentrationer.
 
1.8.12.  Andre observationer  
Der skal foretages mikroskopisk undersøgelse for at verificere, at 
podekulturen fremtræder normal og sund, og konstatere, om algernes 
udseende er unormalt ved testens slutning (som en mulig følge af 
eksponeringen for teststoffet).  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Grænsetest  
Under visse omstændigheder, f.eks. når en indledende test viser, at 
teststoffet er uden toksiske virkninger i koncentrationer på op til 100 mg·l
 –1 , dog ikke over stoffets opløselighed i testsubstratet, kan 
der udføres en grænsetest, hvor reaktionen i en kontrolgruppe 
sammenholdes med reaktionen i én behandlingsgruppe (100 mg·l  –1 
eller en koncentration lig med opløseligheden). Det anbefales kraf ­
tigt, at dette understøttes ved analyse af eksponeringskoncentratio ­
nen. Alle de beskrevne testbetingelser og validitetskriterier gælder 
for grænsetesten, bortset fra, at antallet af behandlingsreplikater skal være mindst seks. Responsvariablerne i kontrol- og behandlings ­
gruppen kan analyseres med en statistisk test til sammenligning af 
middelværdier, f.eks. Students t-test. Er variansen i de to grupper uens, skal der anvendes en t-test justeret for forskel i varians.
 
1.8.14.  Modifikation i tilfælde af stærkt farvede stoffer  
Belysningen (lysintensiteten) skal ligge i den højeste ende af det 
interval, der forskrives i testmetoden, dvs. 120 μE·m  –2 ·s –1 eller 
højere.  
Lysvejen forkortes ved at reducere testopløsningernes volumen (til 
intervallet 5-25 ml).  
Der sørges for tilstrækkelig omrøring (f.eks. ved moderat rystning), 
for at algerne kan blive udsat for stærk belysning ved kulturover ­
fladen.  
2. DATA  
2.1. OPTEGNING AF VÆKSTKURVER  
Biomassen i testbeholderne kan angives i enheder svarende til den til 
målingen anvendte surrogatparameter (f.eks. celletal eller fluore ­
scens).  
Der opstilles en tabel over den beregnede biomassekoncentration i 
testkulturer og kontroller sammen med teststofkoncentrationer og 
måletidspunkter, målt med en mindste opløsning på hele timer, og 
derudfra optegnes vækstkurverne. Både logaritmisk og lineær afbild ­
ning kan være nyttig på dette første trin, men logaritmisk afbildning er obligatorisk og giver sædvanligvis en bedre fremstilling af varia ­
tionerne i vækstmønsteret i løbet af testperioden. Bemærk, at 
eksponentiel vækst frembringer en ret linje, når den afbildes på en logaritmisk skala, og at linjens hældning angiver den specifikke væksthastighed.
 
Ud fra kurverne undersøges det, om kontrolkulturerne vokser 
eksponentielt med den forventede hastighed igennem hele testen. 
Alle datapunkter og kurvernes udseende kontrolleres kritisk, og rådata og de anvendte metoder gås efter for eventuelle fejl. Navnlig kontrolleres alle datapunkter, der synes at afvige med en 
systematisk fejl. Det er indlysende, at hvis metodefejl kan konsta ­
teres og/eller må anses for stærkt sandsynlige, må det pågældende punkt markeres som afvigende og udelades af den efterfølgende statistiske analyse. (En algekoncentration på nul i den ene af tre 
replikate testbeholdere kan tyde på, at beholderen enten ikke er 
blevet podet korrekt eller ikke har været tilstrækkelig rengjort.) Begrundelsen for at afvise et datapunkt som afvigende skal klart angives i testrapporten. Som begrundelse godtages kun (sjældne) 
metodefejl, ikke blot ringe præcision. Til identifikation af afvigende 
værdier har statistiske metoder kun begrænset værdi ved problemer af denne art og kan ikke erstatte en faglig vurdering. Afvigende værdier (mærket som sådanne) skal helst bibeholdes blandt de data ­
punkter, der vises ved efterfølgende fremstilling af data i grafer eller 
tabeller.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. RESPONSVARIABLER  
Testens formål er at bestemme teststoffets virkninger på væksten af 
alger. I nærværende testmetode beskrives to responsvariabler, da medlemsstaterne har forskellige præferencer og myndighedskrav. For at testresultaterne skal kunne godtages i alle medlemsstater, 
skal virkningerne vurderes ved hjælp af begge de nedenfor beskrevne 
responsvariabler a) og b).
 
a) gennemsnitlig specifik væksthastighed: Denne responsvariabel 
beregnes på grundlag af den logaritmiske stigning i biomasse i 
løbet af testperioden, angivet pr. døgn.  
b) udbytte: Denne responsvariabel er biomassen ved testens slutning 
minus biomassen ved testens start.  
Når denne metode anvendes i forbindelse med EU-lovgivningen, 
skal resultaterne beregnes på grundlag af den gennemsnitlige speci ­
fikke væksthastighed, af de grunde, der er anført nedenfor. Det skal 
bemærkes, at toksicitetsværdier beregnet ved hjælp af disse to responsvariabler ikke er sammenlignelige, og denne forskel må haves for øje ved anvendelse af testens resultater. EC
 x -værdier 
baseret på gennemsnitlig specifik væksthastighed (E  r C x ) vil sædvan ­
ligvis være højere end resultater baseret på udbytte (E  y C x ), når test ­
betingelserne i denne metode er overholdt, hvilket følger af det matematiske grundlag for de to beregningsmåder. Dette må ikke 
opfattes som en forskel i følsomhed mellem de to responsvariabler, 
men kun, at der er tale om to matematisk forskellige størrelser. Begrebet gennemsnitlig specifik væksthastighed bygger på det gene ­
relle eksponentielle vækstmønster for alger i ikke-begrænsede 
kulturer, mens toksicitet vurderes på grundlag af virkningerne på 
væksthastigheden og ikke afhænger af den absolutte størrelse af den specifikke væksthastighed af kontrollen, koncentrations-respons ­
kurvens hældning eller testens varighed. Resultater, der er baseret på 
responsvariablen udbytte, afhænger derimod af alle disse øvrige vari ­
abler. E
 y C x afhænger af den specifikke væksthastighed af de algear ­
ter, der anvendes i hver test, og af den maksimale specifikke vækst ­
hastighed, som kan variere mellem de forskellige arter og endda 
algestammer. Denne responsvariabel bør ikke anvendes til at 
sammenligne følsomheden over for giftstoffer hos forskellige alge ­
arter eller -stammer. Skønt det videnskabeligt foretrukne grundlag til vurdering af toksicitet er den gennemsnitlige specifikke væksthastig ­
hed, indeholder nærværende testmetode toksicitetsvurderinger baseret 
på udbytte for at imødekomme de aktuelle myndighedskrav i visse stater.
 
2.2.1.  Gennemsnitlig specifik væksthastighed  
Den gennemsnitlige specifikke væksthastighed for en given periode 
beregnes som den logaritmiske stigning i biomasse ved hjælp af ligningen for hver enkelt testbeholder med kontrol- og behandlings ­
prøver:
 
μ iÄj ¼ lnX j – lnX i 
t j – t i , (dag  –1 ) 
hvor:  
μ i-j : er den gennemsnitlige specifikke væksthastighed fra tiden  i til j 
X i : er biomassen til tiden  i 
X j : er biomassen til tiden  j. ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
For hver behandlings- og kontrolgruppe beregnes en gennemsnitlig 
væksthastighed samt estimater for variansen.  
Den gennemsnitlige specifikke væksthastighed i hele testperioden 
(sædvanligvis dag 0-3) beregnes ved at bruge den nominelt podede 
biomasse som startværdi i stedet for en målt startværdi, da der 
herved sædvanligvis opnås størst præcision. Hvis udstyret til biomas ­
semåling tillader tilstrækkelig nøjagtig bestemmelse af den lille mængde podet biomasse (f.eks. med flowcytometer), kan den målte 
initiale biomassekoncentration anvendes. Desuden foretages trinvis 
beregning af den specifikke væksthastighed for hver dag af testen (dag 0-1, 1-2 og 2-3), og det undersøges, om væksthastigheden i kontrollen forbliver konstant (se validitetskriterierne i punkt 1.7). Er 
den specifikke væksthastighed væsentligt lavere på dag ét end den 
totale gennemsnitlige specifikke væksthastighed, kan dette tyde på, at der er tale om en lag-fase. Mens en lag-fase i kontrolkulturerne kan minimeres og i praksis elimineres ved korrekt formering af forkul ­
turen, kan en lag-fase i eksponerede kulturer tyde på, at der er tale om 
restitution efter indledende toksisk stress, eller at eksponeringen efter den initiale eksponering er mindsket pga. tab af teststof (herunder sorption på algebiomassen). Trinvis beregning af væksthastigheden 
kan derfor anvendes til at vurdere teststoffets virkninger i ekspone ­
ringsperioden. Væsentlige forskelle mellem den trinvist beregnede væksthastighed og den gennemsnitlige væksthastighed tyder på en afvigelse fra konstant eksponentiel vækst, og nøje granskning af vækst ­
kurverne er da nødvendig.
 
Den procentuelle hæmning af væksthastigheden beregnes for hver 
behandlingsreplikat af udtrykket:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
hvor:  
%I r : procent hæmning af den gennemsnitlige specifikke vækst ­
hastighed  
μ C : middelværdi af den gennemsnitlige specifikke væksthastighed 
(μ) i kontrolgruppen  
μ T : gennemsnitlig specifik væksthastighed for behandlingsreplika ­
ten. 
Når der anvendes opløsningsmiddel til fremstilling af testopløsnin ­
gerne, skal hæmningen i procent beregnes ved hjælp af opløsnings ­
middelkontroller i stedet for kontroller uden opløsningsmiddel.  
2.2.2.  Udbytte  
Udbyttet beregnes som biomassen ved testens slutning minus 
biomassen ved testens start for hver enkelt beholder med kontrol- 
eller behandlingsprøve. For hver testkoncentration og kontrol beregnes en gennemsnitsværdi af udbyttet samt estimater for varian ­
sen. Udbyttehæmningen i procent (%I
 y ) kan beregnes for hver 
behandlingsreplikat som følger:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
hvor:  
% I  y : udbyttehæmning i procent  
Y C : gennemsnitligt udbytte i kontrolgruppen  
Y T : størrelsen af udbyttet for behandlingsreplikaten.  
2.3. OPTEGNING AF KONCENTRATIONS-RESPONSKURVE  
Hæmningen i procent afsættes som funktion af logaritmen til test ­
stofkoncentrationen, og grafen undersøges nøje, idet der ses bort fra 
alle datapunkter, der er udpeget som afvigende i første fase. Der lægges en jævn linje gennem datapunkterne, enten på fri hånd eller med computer-interpolation, for at få et første indtryk af 
koncentrations-responssammenhængen, hvorefter der fortsættes med 
en mere dybtgående metode, helst en computerbaseret statistisk metode. Afhængigt af den påtænkte anvendelse af data, dataenes kvalitet (præcision) og mængde samt adgangen til værktøjer til data ­
analyse kan det blive besluttet (undertiden med god grund) at standse 
dataanalysen på dette trin og blot aflæse nøgletallene EC
 50 og EC  10 
(og/eller EC  20 ) på frihåndskurven (se også afsnittet nedenfor om 
stimulerende virkninger). Af gyldige grunde til ikke at benytte en 
statistisk metode kan nævnes:  
— Data er ikke egnede til at give mere pålidelige resultater ved 
hjælp af computermetoder end ved et fagligt skøn — nogle computerprogrammer kan i sådanne situationer endda være ude 
af stand til at finde en pålidelig løsning (f.eks. hvis iterationen 
ikke konvergerer).
 
— Stimuleret vækstrespons kan ikke behandles fyldestgørende med 
de forhåndenværende computerprogrammer (se nedenfor).  
2.4. STATISTISKE METODER  
Målet er at formulere en kvantitativ koncentrations-responssammen ­
hæng ved hjælp af regressionsanalyse. Der kan anvendes vægtet 
lineær regression efter forudgående lineariserende transformation af 
responsdataene — til f.eks. probit-, logit- eller Weibull-enheder (9), men det må foretrækkes at benytte ikke-lineære regressionsmetoder, da de bedre håndterer de uundgåelige uregelmæssigheder i data og 
afvigelser fra jævne fordelinger. I området tæt på ingen hæmning 
eller total hæmning kan sådanne uregelmæssigheder blive forstørret af transformationen og derved forstyrre analysen (9). Det må bemær ­
kes, at standardanalysemetoder, hvor der bruges probit-, logit- eller 
Weibull-transformerede variabler, er bestemt til brug på quantale 
data (f.eks. død eller overlevelse) og må modificeres for at kunne håndtere vækst- eller biomassedata. Særlige metoder til bestemmelse af EC
 x -værdier ud fra kontinuerte data findes i henvisning 
(10) (11) (12). Brugen af ikke-lineær regressionsanalyse er 
nærmere beskrevet i tillæg 4.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
For hver responsvariabel, der skal analyseres, anvendes koncentra ­
tions-responsrelationen til at beregne punktestimater for EC  x -værdier. 
Når det er muligt, skal der bestemmes 95 % konfidensgrænser for hvert estimat. Responsdataenes tilpasningsgrad til regressions ­
modellen vurderes enten grafisk eller statistisk. Regressionsanalysen 
skal foretages ud fra responsværdierne for de enkelte replikater, ikke 
gruppegennemsnit. Hvis ikke-lineær kurvetilpasning er vanskelig eller umulig på grund af for stor spredning i data, kan problemet omgås ved udførelse af regressionen på gruppegennemsnittet som en 
praktisk måde at mindske indflydelsen fra formodet afvigende 
værdier på. Når denne mulighed udnyttes, skal det i testrapporten anføres, at der her er afveget fra den normale procedure, fordi kurve ­
tilpasning med de enkelte replikater ikke har givet et godt resultat.
 
Hvis de tilgængelige regressionsmodeller eller -metoder er uegnede 
til dataene, kan estimater og konfidensgrænser for EC  50 desuden fås 
ved lineær interpolation med bootstrapping (13).  
For at beregne et estimat for LOEC og dermed NOEC og for test ­
stoffets virkninger på væksthastigheden må middelværdierne for 
behandlingerne sammenholdes ved hjælp af variansanalyse. Gennem ­
snittet for hver koncentration sammenholdes derefter med gennem ­
snittet for kontrollerne ved hjælp af en egnet multisammenlignings- 
eller trend test-metode. Dunnetts eller Williams’ test kan eventuelt 
bruges (14) (15) (16) (17) (18). Det skal vurderes, om variansana ­
lysens forudsætning om varianshomogenitet er opfyldt. Denne vurde ­
ring kan foretages grafisk eller ved en formel test (18). Hertil kan 
Levenes eller Bartletts test anvendes Manglende opfyldelse af 
forudsætningen om varianshomogenitet kan undertiden afhjælpes ved logaritmisk transformation af dataene. Hvis variansen er ekstremt heterogen og ikke kan korrigeres ved transformation, må analyse 
med step-down Jonkheere trend test overvejes. Der er supplerende 
vejledning for bestemmelse af NOEC i (12).
 
Den senere tids videnskabelige udvikling har ført til en anbefaling 
om, at NOEC-begrebet afskaffes og erstattes med regressionsbase ­
rede punktestimater for EC  x . Der er ikke fastlagt en passende værdi 
af x til denne algetest. Et område på 10 til 20 % synes at være 
passende (afhængigt af den valgte responsvariabel), og det må fore ­
trækkes at rapportere både EC  10 og EC  20 . 
2.5. VÆKSTSTIMULATION  
Ved lave koncentrationer ses undertiden vækststimulation (negativ 
hæmning). Dette kan enten skyldes hormese (»toksisk stimulation«), 
eller at der er tilsat vækststimulerende faktorer sammen med testma ­
terialet til det anvendte minimalsubstrat. Bemærk, at tilsætning af uorganiske næringsstoffer ikke skulle have nogen direkte virkning, 
da testsubstratet skal indeholde overskud af næringsstoffer under hele 
testen. Sædvanligvis kan der ses bort fra lavdosisstimulation i EC
 50 - 
beregninger, medmindre den er ekstrem. Er den ekstrem, eller skal der beregnes en EC
 x -værdi for en lav x-værdi, kan særlige 
procedurer dog være nødvendige. Om muligt bør det undgås at 
lade stimulerende responsværdier udgå af dataanalysen, og kan den forhåndenværende kurvetilpasningssoftware ikke acceptere en lav grad af stimulation, kan der anvendes lineær interpolation med boots ­
trapping. Hvis stimulationen er ekstrem, kan det overvejes at 
anvende en hormese-model (19).
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. IKKE-TOKSISK VÆKSTHÆMNING  
Lysabsorberende teststoffer kan nedsætte væksthastigheden, fordi de 
ved at skygge mindsker den tilgængelige lysmængde. Sådanne fysiske virkninger må adskilles fra toksiske virkninger ved ændring 
af testbetingelserne og skal rapporteres særskilt. Vejledning findes i 
(2) (3).
 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende:  
Teststof:  
— fysisk tilstand og relevante fysisk-kemiske egenskaber, herunder 
vandopløselighed  
— kemiske identifikationsdata, herunder renhed.  
Testede arter:  
— stamme, leverandør eller kilde og anvendte dyrkningsbetingelser.  
Testbetingelser:  
— startdato og varighed for testen  
— beskrivelse af testens design: testbeholdere, kulturvolumen, 
biomassetæthed ved testens start  
— substratets sammensætning  
— testkoncentrationer og replikater (f.eks. antal replikater, antal test ­
koncentrationer og den anvendte geometriske progression)  
— beskrivelse af fremstillingen af testopløsningerne, herunder brug 
af opløsningsmiddel osv.  
— dyrkningsapparatur  
— lysintensitet og -kvalitet (kilde, homogenitet)  
— temperatur  
— testede koncentrationer: de nominelle testkoncentrationer og alle 
resultater af bestemmelser af teststofkoncentrationen i testbehol ­
derne. Metodens genfindingsgrad og kvantificeringsgrænse i test ­
matrixen skal rapporteres  
— alle fravigelser af nærværende testmetode  
— metode til bestemmelse af biomasse og påvisning af korrelation 
mellem den målte parameter og den tørre vægt.  
Resultater:  
— pH-værdi ved testens start og slutning for alle behandlinger  
— biomasse for hver kolbe ved hvert målepunkt samt metode til 
måling af biomasse  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— vækstkurver (biomasse som funktion af tiden)  
— beregnede responsvariabler for hver behandlingsreplikat, med 
gennemsnitsværdier og variationskoefficient for replikaterne  
— grafisk fremstilling af sammenhængen mellem koncentration og 
virkning  
— estimater for toksiciteten for responsvariablerne, f.eks. EC  50 , 
EC 10 , EC  20 med tilhørende konfidensintervaller. LOEC og 
NOEC (hvis disse er beregnet) og de statistiske metoder, der 
anvendt til at bestemme dem  
— hvis variansanalyse er anvendt, størrelsen af den virkning, det er 
muligt at påvise (f.eks. mindste signifikante forskel)  
— enhver vækststimulation, der er fundet ved nogen behandling  
— eventuelle andre observerede effekter, f.eks. morfologiske 
ændringer af algerne  
— diskussion af resultaterne, herunder den eventuelle betydning af 
fravigelser fra nærværende testmetode.  
4. LITTERATUR  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test.  
(2) ISO 1998 Water quality — Guidance for algal growth inhibi ­
tion tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442.
 
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and 
Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.  
(4) ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667-16.  
(5) ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. ISO 
8692.  
(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth 
inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.  
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceano ­
graphy 22,5 (1977), pp.919-925.  
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal 
bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079.  
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713-718.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494.
 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, 
MN.
 
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121.
 
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482-491.  
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
 
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Tillæg 1  
Stammer, der er påvist at være velegnede til testen  
Grønalger  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (tidligere benævnt  Selenastrum capricornu ­
tum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (tidligere benævnt  Scenedesmus subspicatus ) 
86.81 SAG  
Diatoméer  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cyanobakterier  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Kilder til stammer  
De anbefalede stammer fås som monokulturer fra følgende samlinger (i alfabetisk 
rækkefølge):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110-2209  
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UNITED KINGDOM  
SAG: Collection of Algal Cultures  
Inst. Plant Physiology  
University of Göttingen  
Nicholausberger Weg 18  
3400 Göttingen  
TYSKLAND  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Udseende og karakteristika af anbefalede arter  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Udseende Krumme, 
skrueformede 
enkeltceller Ovale, hoved ­
sagelig 
enkeltceller Stave Kæder af 
ovale celler Stave 
Størrelse (L × W), μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Cellevolumen ( μm 3 /celle) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Tør vægt af celle (mg/celle) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Væksthastighed (  3 ) (dag  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Målt med elektronisk partikeltæller. 
( 2 ) Beregnet af størrelsen. 
( 3 ) Hyppigste observerede væksthastighed i OECD-substrat ved en lysintensitet på ca. 70 μE·m  –2 ·s –1 og 21 °C.  
Særlige anbefalinger for dyrkning og håndtering af de anbefalede testarter  
Pseudokirchneriella subcapitata og Desmodesmus subspicatus  
Disse grønalgearter er sædvanligvis lette at holde i forskellige næringssubstrater. 
Oplysninger om egnede substrater kan fås fra kultursamlingerne. Cellerne er normalt solitære, og måling af celletætheden kan let foretages med elektronisk 
partikeltæller eller i mikroskop.
 
Anabaena flos-aquae  
Stamkulturer kan holdes med forskellige næringssubstrater. Det er især vigtigt at 
undgå, at batchkulturen kommer ud af den logaritmiske vækstfase, når den fornyes, da restitution på dette punkt er vanskelig.
 
Anabaena flos-aquae  udvikler aggregater af sammenfiltrede kæder af celler. 
Størrelsen af aggregaterne kan være forskellig, afhængigt af dyrkningsbetingel ­
serne. Det kan være nødvendigt at bryde sådanne aggregater op, før biomassen kan bestemmes ved tælling i mikroskop eller med en elektronisk partikeltæller.
 
For at nedsætte variabiliteten af tællingerne kan kæderne brydes op ved sonike ­
ring af delprøver. Hvis sonikeringen fortsættes længere end nødvendigt for at 
bryde kæderne til kortere længder, kan cellerne blive ødelagt. Intensitet og 
varighed af sonikeringen skal være ens for alle behandlinger.  
For at medvirke til at kompensere for variabiliteten skal der tælles et tilstrække ­
ligt antal felter på hæmocytometeret (mindst 400 celler). Derved fås mere pålide ­
lige tæthedsbestemmelser i mikroskop.  
Til bestemmelse af det totale cellevolumen af Anabaena kan en elektronisk 
partikeltæller anvendes efter forudgående forsigtig sonikering for at bryde celle ­
kæderne. Sonikeringsenergien skal tilpasses, så bristning af celler undgås.  
Ved hjælp af hvirvelomrører eller en tilsvarende velegnet metode skal det sikres, 
at den anvendte algesuspension til podning af testbeholderne er godt opblandet 
og homogen.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Testbeholderne anbringes på et roterende eller frem- og tilbagegående rystebord 
ved ca. 150 o./min. I stedet kan der anvendes intermitterende omrystning for at 
mindske Anabaenas tilbøjelighed til sammenklumpning. I tilfælde af sammen ­
klumpning skal der drages omsorg for, at prøverne til biomassebestemmelse bliver repræsentative. Energisk omrystning kan være nødvendig før prøvetagning 
for at skille algeklumperne ad.
 
Synechococcus leopoliensis  
Stamkulturer kan holdes med forskellige næringssubstrater. Oplysninger om 
egnede substrater kan fås fra kultursamlingerne.  
Synechococcus leopoliensis  vokser som solitære, stavformede celler. Cellerne er 
meget små, hvilket komplicerer tælling i mikroskop til biomassebestemmelse. Elektroniske partikeltællere, der er udstyret til tælling af partikler ned til ca. 1 μm, er gode. In vitro fluorometrisk måling kan ligeledes anvendes.
 
Navicula pelliculosa  
Stamkulturer kan holdes med forskellige næringssubstrater. Oplysninger om 
egnede substrater kan fås fra kultursamlingerne. Bemærk, at substratet skal inde ­
holde silikat.  
Navicula pelliculosa  kan danne aggregater under visse vækstbetingelser. På 
grund af dannelse af lipider vil algecellerne undertiden have tendens til at akku ­
mulere i overfladefilmen. Under sådanne omstændigheder må der ved udtagning af delprøver til biomassebestemmelse træffes særlige foranstaltninger for at sikre, 
at prøverne er repræsentative. Det kan være nødvendigt med kraftig omrystning, 
f.eks. med en hvirvelomrører.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Tillæg 2  
Næringssubstrater  
Et af nedenstående to næringssubstrater kan anvendes:  
OECD-substrat: Det oprindelige substrat fra OECD TG 201, også i henhold til 
ISO 8692  
US. EPA-substrat AAP, ligeledes i henhold til ASTM.  
Til fremstilling af sådanne substrater skal anvendes kemikalier af reagens- eller 
analysekvalitet og deioniseret vand.  
Sammensætning af AAP-substratet (US. EPA) og OECD TG 201-substratet  
Komponent EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Det molære forhold mellem EDTA og jern er lidt over 1. Derved undgås udfældning af jern, samtidig med at 
chelatering af tungmetalioner minimeres.  
I testen med diatoméen  Navicula pelliculosa  skal begge substrater suppleres med 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 O til en koncentration på 1,4 mg Si/l.  
Substratets pH opnås ved ligevægt mellem substratets carbonatsystem og partial ­
trykket af CO  2 i atmosfærisk luft. En omtrentlig sammenhæng mellem pH ved 
25 °C og den molære bicarbonatkoncentration er givet ved:  
pH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Ved 15 mg NaHCO  3 /l er pH  eq = 7,5 (U.S. EPA-substrat), og ved 50 mg 
NaHCO  3 /l er pH  eq = 8,1 (OECD-substrat).  
Testsubstraternes sammmensætning af grundstoffer  
Grundstof EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Fremstilling af OECD-substrat  
Næringsstof Koncentration i stamopløsning 
Stamopløsning 1: makronæringsstoffer  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Stamopløsning 2: jern  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Stamopløsning 3: sporstoffer  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Stamopløsning 4: bicarbonat  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Stamopløsningen steriliseres ved membranfiltrering (middelporediameter 0,2 μm) 
eller autoklavering (120 °C, 15 min.). Opløsningerne opbevares i mørke ved 4 °C.  
Stamopløsning 2 og 4 må ikke autoklaveres, men skal steriliseres ved membran ­
filtrering.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Næringssubstrater fremstilles ved tilsætning af et passende volumen stamopløs ­
ning 1-4 til vand:  
Til 500 ml steriliseret vand tilsættes der:  
— 10 ml stamopløsning 1  
— 1 ml stamopløsning 2  
— 1 ml stamopløsning 3  
— 1 ml stamopløsning 4.  
Der tilsættes steriliseret vand til 1 000 ml.  
Giv substratet tid til at ækvilibrere med atmosfærens CO  2 , om nødvendigt ved 
nogle timers gennembobling med sterilfiltreret luft.  
Fremstilling af AAP-substrat  
A1.1. 1 ml af hver stamopløsning i A1.2.1-A1.2.7 tilsættes til ca. 900 ml 
deioniseret eller destilleret vand og fortyndes derefter til 1 liter.  
A1.2. Stamopløsninger af makronæringsstoffer fremstilles ved opløsning af 
nedenstående i 500 ml deioniseret eller destilleret vand. Reagens A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 og A1.2.4 kan kombineres til én stamopløsning.
 
A1.2.1.  NaNO  3 -12,750 g  
A1.2.2.  MgCl  2 ·6H  2 O -6,082 g  
A1.2.3.  MgCl  2 ·2H  2 O -2,205 g  
A1.2.4. Stamopløsning af mikronæringsstoffer — (se A1.3)  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O -7,350 g  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 -0,522 g  
A1.2.7.  NaHCO  3 -7,500 g  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O — se bemærkning A1.1.  
BEMÆRKNING A1.1: Anvendes kun til diatomé-testarter. Kan 
tilsættes direkte (202,4 mg) eller som stamopløsning til en endelige 
Si-koncentration i substratet på 20 mg/l.  
A1.3. Stamopløsningen af mikronæringsstoffer fremstilles ved opløsning af 
nedenstående i 500 ml deioniseret eller destilleret vand:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 -92,760 mg  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O -207,690 mg  
A1.3.3.  ZnCl  2 -1,635 mg  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O -79,880 mg  
A1.3.5.  CoCl  2 · 6H  2 O -0,714 mg  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 · 2H  2 O -3,630 mg  
A1.3.7.  CuCl  2 · 2H  2 O -0,006 mg  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O -150,000 mg [dinatrium-(ethylendinitrilo-)tetraacetat]  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O -0,005 mg, se bemærkning A1.2.  
BEMÆRKNING A1.2: Bruges kun i substrat til stamkulturer af diato ­
méarter.  
A1.4. pH justeres til 7,5 ± 0,1 med 0,1  N eller 1,0  N NaOH eller HCl.  
A1.5. Substratet filtreres over i en steril beholder, enten gennem et 0,22 μm 
membranfilter, hvis der skal bruges partikeltæller, eller et 0,45 μm 
filter, hvis der ikke skal bruges partikeltæller.  
A1.6. Substratet opbevares i mørke ved ca. 4 °C, til det skal bruges.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Tillæg 3  
Eksempel på fremgangsmåde ved dyrkning af alger  
Almindelige bemærkninger  
Formålet med dyrkningen efter følgende metode er at fremstille algekulturer til 
toksicitetstest.  
Det skal ved hjælp af egnede metoder sikres, at algekulturerne ikke er inficeret 
med bakterier. Axeniske kulturer kan være ønskeligt, men der skal fremstilles og 
anvendes monokulturer af alger.  
Alle operationer skal udføres med steril teknik for at undgå kontaminering med 
bakterier og andre alger.  
Udstyr og materialer  
Se under testmetode: Apparatur.  
Metoder til fremstilling af algekulturer  
Fremstilling af næringssubstrater (medier):  
Alle næringssalte i substratet fremstilles som koncentrerede stamopløsninger, der 
opbevares mørkt og koldt. Disse opløsninger steriliseres ved filtrering eller auto ­
klavering.  
Substratet fremstilles ved, at den korrekte mængde stamopløsning sættes til 
destilleret vand, idet der udvises omhu for at undgå kontaminering. Til faste 
substrater tilsættes 0,8 procent agar.  
Stamkultur:  
Stamkulturerne er små algekulturer, der regelmæssigt overføres til friskt substrat 
og anvendes som udgangsmateriale ved testen. Hvis kulturerne ikke jævnligt 
bruges, udstryges de på skråagarrør. Herfra overføres de til friskt substrat 
mindst hver anden måned.  
Stamkulturerne dyrkes i koniske kolber indeholdende det pågældende substrat 
(volumen ca. 100 ml). Når algerne inkuberes ved 20 °C med kontinuerlig belys ­
ning, skal de overføres en gang om ugen.  
Ved overførslen føres en del af den »gamle« kultur med sterile pipetter til en 
kolbe med friskt substrat, så initialkoncentrationen for hurtigtvoksende arter er ca. 100 gange mindre end i den gamle kultur.
 
Væksthastigheden for en art kan bestemmes af vækstkurven. Kendes denne, kan 
man beregne, ved hvilken tæthed kulturen skal overføres til nyt substrat. Dette 
skal ske, før kulturen når dødsfasen.  
Forkultur:  
Forkulturen har til formål at producere en mængde alger, der er egnede til 
podning af testkulturer. Forkulturen inkuberes under testbetingelserne og anven ­
des, mens den endnu er i eksponentiel vækst, normalt efter en inkubationsperiode 
på 2 til 4 dage. Når algekulturer indeholder deforme eller abnorme celler, skal de kasseres.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Tillæg 4  
Dataanalyse ved ikke-lineær regression  
Generelle betragtninger  
Responsen i algetest og andre test af mikrobiel vækst — vækst af biomasse — er 
i sig selv en kontinuert eller metrisk variabel — en proceshastighed, når vækst ­
hastigheden anvendes, og integralet af væksthastigheden med hensyn til tiden, 
når biomasse vælges. Begge henføres til den tilsvarende gennemsnitsrespons for replikate, ikke-eksponerede kontroller, der udviser maksimal respons ved de anvendte betingelser — med lys og temperatur som de primære bestemmende 
faktorer i algetesten. Systemet er distribueret eller homogent, og biomassen kan 
betragtes som en helhed uden hensyn til enkeltceller. Variansfordelingen for den type respons, der ses i et sådant system, afhænger udelukkende af eksperimen ­
telle faktorer (dette beskrives typisk ved, at fejlen er log-normalfordelt eller 
normalfordelt). Dette er modsat typiske bioassay-responser med kvantale data, 
hvor det dominerende bidrag til variansen ofte antages at være de enkelte orga ­
nismers tolerance (der typisk er binomialfordelt). Responsen fra kontrollerne er her nulniveau eller baggrundsniveau.
 
I det ukomplicerede tilfælde aftager den normaliserede eller relative respons, r, 
monotont fra 1 (ingen hæmning) til 0 (100 procents hæmning). Bemærk, at der 
til alle responser er knyttet en fejl, og at tilsyneladende negative hæmningsvær ­
dier ved beregningen kan tilskrives tilfældige fejl alene.  
Regressionsanalyse  
Modeller  
Med regressionsanalyse tilstræbes det at beskrive koncentrations-responskurven 
som en matematisk regressionsfunktion Y = f (C) eller oftere F (Z), hvor Z = log C. Med den omvendte funktion C = f
 –1 (Y) kan der beregnes EC  x - 
værdier, herunder EC  50 , EC  10 og EC  20 , med tilhørende 95 % konfidensgrænser. 
Flere forskellige enkle matematiske funktioner har vist sig velegnede til at 
beskrive den koncentrations-responssammenhæng, der optræder i væksthæm ­
ningstest med alger. Af sådanne funktioner kan nævnes den logistiske ligning, 
den asymmetriske Weibull-ligning og log-normalfordelingsfunktionen, der alle er 
S-formede kurver, der asymptotisk går mod én for C → 0, og mod nul for 
C → uendeligt.  
Anvendelse af modeller med kontinuerte tærskelfunktioner (f.eks. »the Kooijman 
model for inhibition of population growth« Kooijman et al. 1996) er for nylig blevet foreslået som et alternativ til asymptotiske modeller. I denne model 
antages, at der ikke er nogen virkninger ved koncentrationer under en bestemt 
tærskel, EC0+, som estimeres ved at ekstrapolere responskoncentrationsforholdet til skæring med koncentrationsaksen ved hjælp af en simpel kontinuert funktion, 
der ikke er differentiabel i udgangspunktet.
 
Bemærk, at analysen kan bestå i en simpel minimering af summer af residual ­
kvadrater (når variansen forudsættes konstant) eller af vægtede kvadrater, når der 
kompenseres for variansheterogenitet.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Fremgangsmåde  
Fremgangsmåden kan sammenfattes således: Der vælges en passende funktion, 
Y = f (C), som tilpasses til dataene ved ikke-lineær regression. Det må fore ­
trækkes at anvende målinger fra hver enkelt kolbe frem for gennemsnitsværdier for replikaterne, da man derved får mest mulig information fra dataene. Hvis 
variansen derimod er høj, tyder praktisk erfaring på, at der ved brug af gennem ­
snitsværdier af replikaterne fås en mere robust matematisk beregning, der er mindre påvirkelig af systematiske fejl i data end bibeholdelse af de enkelte datapunkter.
 
Den tilpassede kurve og de målte data afsættes, og det undersøges, om tilpas ­
ningen af kurven er tilfredsstillende. Analyse af residualer kan være et særdeles 
nyttigt redskab til dette formål. Hvis den valgte funktion for koncentrations- responssammenhængen ikke beskriver hele kurven eller en vigtig del af denne som f.eks. responsen i koncentrationslavpunktet, vælges en anden mulighed for 
kurvetilpasning — f.eks. en ikke-symmetrisk kurve som Weibul-funktionen i 
stedet for en symmetrisk. Negativ hæmning kan være et problem ved brug af f.eks. log-normalfordelingsfunktionen, så der også her er brug for en alternativ regressionsfunktion. Det kan ikke anbefales at tildele en nulværdi eller en lille 
positiv værdi til sådanne negative værdier, da det forvrænger fejlfordelingen. Det 
kan være hensigtsmæssigt at foretage separate kurvetilpasninger, f.eks. på den del af kurven, hvor hæmningen er lille, for at beregne et estimat for EC
 low x -værdi­
erne. Af den tilpassede ligning beregnes (ved »omvendt beregning«, C = f  –1 (Y)) 
karakteristiske punktestimater EC  x , og som minimum rapporteres EC  50 -værdien 
og et eller to estimater for EC  low x . De praktiske erfaringer fra testningerne har 
vist, at algetesten sædvanligvis er tilstrækkelig præcis til at give et rimelig 
nøjagtigt estimat ved 10 % hæmning, hvis der er tilstrækkeligt med datapunkter 
— medmindre der ved lave koncentrationer optræder stimulation som konfunde ­
rende faktor. Nøjagtigheden af et estimat for EC  20 er ofte betydeligt bedre end af 
en EC  10 -værdi, da EC  20 sædvanligvis ligger på den tilnærmelsesvis lineære del af 
den centrale del af koncentrations-responskurven. Undertiden kan EC  10 være 
vanskelig at fortolke på grund af vækststimulation. Selv om EC  10 således 
normalt fås med tilstrækkelig nøjagtighed, anbefales det således, at man desuden altid rapporterer EC
 20 -værdien.  
Vægtningsfaktorer  
Den eksperimentelle varians er sædvanligvis ikke konstant, men indeholder 
typisk en proportional komponent, hvorfor rutinemæssig brug af vægtet regres ­
sion vil være en fordel. Vægtningsfaktorerne til en sådan analyse antages normalt at være omvendt proportionale med variansen:
 
W i = 1/Var(r  i ) 
Mange regressionsprogrammer kan bruges til vægtet regressionsanalyse med 
vægtningsfaktorer angivet i en tabel. For nemheds skyld bør vægtningsfaktorerne normaliseres ved multiplikation med n/ ∑ w
 i (hvor n er antallet af datapunkter), 
således at deres sum bliver lig én.  
Normalisering af respons  
Normalisering med gennemsnitsresponsen i kontrollerne medfører visse principi ­
elle problemer foruden en ret kompliceret variansstruktur. Når responsværdierne divideres med kontrollernes gennemsnitsrespons for at få hæmningen i procent, 
indføres derved en ekstra fejl, der skyldes fejlen på middelværdien for kontrol ­
lerne. Medmindre denne fejl er ubetydelig, skal vægtningsfaktorerne i regres ­
sionen og konfidensgrænserne korrigeres for kovarians med kontrollen (17). Bemærk, at det er vigtigt med en høj præcision af estimatet for middelværdien 
af responsen i kontrollerne, for at den samlede varians af den relative repons kan 
blive minimeret. Denne varians kan angives således:
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
(indeks i henviser til koncentrationsniveau i og indeks 0 til kontrollerne)  
Y i = Relativ respons = r  i /r 0 = 1 — I = f (C  i ) 
med variansen:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) ≈ (∂Y i /∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i /∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
og, eftersom  
(∂ Y i /∂ r i ) = 1/r  0 , og (∂ Y i /∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
med normalfordelte data og replikaterne m  i og m  0 : 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
bliver den totale varians af den relative respons Y  i : 
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Fejlen på middelværdien for kontrollerne er omvendt proportional med kvadra ­
troden af det antal replikater af kontrollerne, som gennemsnittet er beregnet af, 
og undertiden kan det være berettiget at medtage historiske data for på denne 
måde at mindske fejlen stærkt. En alternativ metode er at undlade normalisering af dataene og i stedet tilpasse de absolutte responsværdier, også responsdata for kontrollerne, men herved indføres responsværdien for kontrollerne som en ekstra 
parameter, der skal indgå i tilpasningen ved ikke-lineær regression. Med en 
sædvanlig to-parametres regressionsligning kræver denne metode tilpasning af tre parametre og dermed flere datapunkter end ikke-lineær regression på data, der er normaliseret med en forud fastlagt respons for kontrollerne.
 
Omvendte konfidensintervaller  
Beregning af konfidensintervaller i ikke-lineær regression ved hjælp af omvendt 
estimation er ret kompliceret og hører ikke til standardvalgene i almindelige statistikprogrampakker. Tilnærmede konfidensgrænser kan beregnes med stan ­
dardprogrammer til ikke-lineær regression med re-parameterisering (Bruce og 
Versteeg, 1992), hvorved den matematiske ligning omskrives med de ønskede punktestimater, f.eks. med EC
 10 og EC  50 som de parametre, der skal estimeres. 
(Lad funktionen være I = f ( α, β, koncentration), og benyt definitionsrelationerne 
f (α, β, EC  10 ) = 0,1 og f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 til at erstatte funktionen f ( α, β, 
koncentration) med den ækvivalente funktion g (EC  10 , EC  50 , koncentration.)  
En mere direkte beregning (Andersen et al, 1998) foretages ved at bibeholde den 
oprindelige ligning og bruge Taylor-udvikling omkring middelværdierne af r  i og r  0 . 
På det seneste har »boot strap«-metoder vundet udbredelse. I sådanne metoder 
estimeres en empirisk variansfordeling ved hjælp af de målte data sammen med 
hyppig resampling, der styres af en generator af tilfældige tal.  
Referencer  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485-1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. BESTEMMELSE AF »LET« BIONEDBRYDELIGHED  
DEL I.  GENERELLE BETRAGTNINGER  
I.1. INDLEDNING  
Der er beskrevet seks metoder til screening af kemikalier for let 
bionedbrydelighed i aerobt vandigt miljø:  
a) Eliminering af opløst organisk kulstof (DOC) (metode C.4-A)  
b) Modificeret OECD-screeningtest — eliminering af DOC (metode 
C.4-B)  
c) Kuldioxidudvikling (modificeret Sturm-test) (metode C.4-C)  
d) Manometrisk respirometri (metode C.4-D)  
e) Closed Bottle Test (metode C.4-E)  
f) MITI-test (Ministry of International Trade and Industry — Japan) 
(metode C.4-F)  
Del I indeholder generelle betragtninger og betragtninger, der gælder 
for alle seks test. I del II-VII findes de punkter, der er specifikke for 
de enkelte test. Tillæggene indeholder definitioner, formler og 
vejledende oplysninger.  
I 1988 gennemførte OECD en ringtest, som viste, at metoderne giver 
indbyrdes overensstemmende resultater. Imidlertid kan en bestemt 
metode foretrækkes, alt efter det undersøgte stofs fysiske egenskaber.  
I.2. VALG AF METODE  
For at kunne vælge den bedst egnede metode er det afgørende at 
have kendskab til kemikaliets opløselighed, damptryk og adsorp ­
tionsegenskaber. Den kemiske struktur eller formel bør kendes for at kunne beregne den teoretiske værdi og/eller kontrollere målte 
værdier af parametre som f.eks. ThOD, ThCO
 2 , DOC, TOC og 
COD (se bilag I og II).  
Testkemikalier, der er opløselige i vand med mindst 100 mg/l og 
ikke-flygtige og ikke-adsorberende, kan vurderes ved alle metoderne. Af tabel 1 fremgår, hvilke metoder der er egnede for kemikalier, der 
er tungtopløselige i vand, flygtige eller adsorberende. I bilag III er 
det beskrevet, hvordan man kan bære sig ad med tungt vandopløse ­
lige og flygtige kemikalier. Kemiske stoffer med moderat flygtighed kan testes i DOC-henfaldsmetoden, hvis der er tilstrækkelig luftrum i 
testbeholderen (som skal tillukkes passende). I dette tilfælde skal der 
benyttes en abiotisk kontrolkolbe, som tillader ethvert fysisk tab.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabel 1  
Testmetodernes anvendelsesområder  
Test Analysemetode Egnet til stoffer, der er: 
tungt opløselige flygtige adsorberende  
DOC-eliminering Opløst organisk kulstof – – ± 
Mod. OECD DOC-elim. Opløst organisk kulstof – – ± CO
 2 -udvikling Respirometri: CO  2 -udvik­
ling + – + 
Manometrisk respirometri Manometrisk respirometri: 
oxygenforbrug + ± + 
Closed Bottle Respirometri: opløst oxygen ± + + 
MITI Respirometri: oxygenfor ­
brug + ± +  
Oplysninger om testmaterialets renhed eller forholdet mellem dets 
hovedtebstanddele er nødvendige for fortolkning af de fundne resul ­
tater, især hvis de er små eller usikre.  
Oplysninger om testkemikaliets toksicitet over for bakterier 
(bilag IV) kan være til nytte ved valg af passende testkoncentrationer 
og kan være afgørende for korrekt fortolkning af lave værdier for 
bionedbrydning.  
I.3. REFERENCESTOFFER  
Til kontrol af fremgangsmåden benyttes der referencestoffer, som 
opfylder kriterierne for let bionedbrydelighed, og som testes i en 
separat kolbe parallelt med de øvrige prøver.  
Anilin (frisk destilleret), natriumacetat og natriumbenzoat er egnede 
kemikalier. Alle disse referencekemikalier nedbrydes ved disse meto ­
der, selv når der ikke tilsættes inoculum.  
Det har været fremført, at man burde finde frem til et referenceke ­
mikalie, der er let nedbrydeligt men kræver tilsætning af inoculum, selv i Closed Bottle-metoden. Kaliumhydrogenphthalat har været 
foreslået, men der mangler endnu konkret bevis med dette stof, før 
det kan accepteres som et referencestof.
 
I metoder, der er baseret på respirometri, kan nitrogenholdige forbin ­
delser påvirke oxygenoptagelsen på grund af nitrifikation (se bilag II 
og V).  
I.4. TESTMETODERNES PRINCIP  
Teststoffet opløses eller opslæmmes i et uorganisk medium, inocu ­
leres og inkuberes under aerobe forhold i mørke eller dæmpet lys. Den del af DOC i opløsningen, der stammer fra inoculum, skal være 
så lavt som muligt i forhold til den del, der stammer fra teststoffet. 
Der tages hensyn til inoculums endogene aktivitet ved at køre paral ­
lelle blindprøver med inoculum men uden teststof i opløsningen, selvom cellernes endogene aktivitet under tilstedeværelse af stoffet 
ikke præcis svarer til denne i den endogene kontrol. Et referencestof 
benyttes parallelt for at kontrollere, hvorledes procedurerne fungerer.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
I reglen følges nedbrydningen ved bestemmelse af parametre såsom 
DOC, CO  2 -dannelse og oxygenoptagelse, og der foretages målinger 
med tilstrækkeligt hyppige intervaller, således at begyndelsen og afslutningen af bionedbrydningen kan identificeres. Med automatiske respirometre sker målingen kontinuerligt. Undertiden måles både 
DOC og en anden parameter, men det er normalt kun tilfældet ved 
testens begyndelse og slutning. Der kan også anvendes specifik kemisk analyse til bedømmelse af den primære nedbrydning af test ­
stoffet og til bestemmelse af koncentrationen af eventuelle mellem ­
produkter (obligatorisk i MITI-testen).
 
Normalt løber testen over 28 dage. Når bionedbrydningskurven har 
nået et plateau ved mindst tre målinger, kan testen dog afbrydes. 
Hvis kurven viser, at bionedbrydningen er begyndt men ikke har 
nået et plateau inden de 28 dage, kan testen forlænges ud over denne periode.
 
I.5. KVALITETSKRITERIER  
I.5.1.  Reproducerbarhed  
Som følge af bionedbrydningens natur og den blandede bakteriepo ­
pulation i inoculum, foretages der mindst dobbeltbestemmelse.  
Den almindelige erfaring er, at variationen mellem gentagelser bliver 
mindre, desto større startkoncentrationen af mikroorganismer i test ­
mediet er. Ringtest har desuden vist, at der kan være betydelige forskelle mellem de resultater, forskellige laboratorier når frem til, men der opnås generelt god overensstemmelse med let bionedbryde ­
lige forbindelser.
 
I.5.2.  Testens gyldighed  
En test anses for gyldig, hvis forskellene mellem de to yderste 
værdier for teststoffets forsvinden ved en multibestemmelse i 
plateau-fasen, ved afslutningen af testen eller ved afslutningen af 
10 døgns-vinduet er mindre end 20 %, og hvis den procentvise nedbrydning af referencestoffet har nået niveauet for let bionedbry ­
delighed inden for 14 dage. Hvis ikke begge betingelser er opfyldt, 
gentages testen. Da metoderne er ret strikse, betyder lave værdier 
ikke nødvendigvis, at stoffet ikke er bionedbrydeligt under miljøfor ­
hold, men at der kræves yderligere arbejde til bestemmelse af bionedbrydeligheden.
 
Er nedbrydningen i en toksicitetstest med både teststof og referen ­
cekemikalie mindre end 35 % (baseret på DOC) eller 25 % (baseret på ThOD eller ThCO
 2 ) på 14 dage, må testkemikaliet antages at 
være hæmmende (se også bilag IV). Testrækken gentages, om 
muligt med lavere teststofkoncentration og/eller højere inoculumkon ­
centration, dog højst 30 mg tørstof pr. liter.  
I.6. GENERELLE PROCEDURER  
De generelle betingelser for testene er sammenfattet i tabel 
2. Apparatur og forsøgsomstændigheder, der er specifikke for en 
bestemt test, er beskrevet senere under den pågældende test.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 982
Tabel 2  
Testbetingelser  
Test DOC-elimine ­
ring CO 2 -udvikling Manometrisk 
respirometri Modificeret 
OECD-scre ­
ening Closed Bottle MITI(I)  
Teststofkon ­
centration 
i mg/t 100 2-10 100 mg DOC/l 10-40 10-20 10-40 mg ThOD/l 50-100 5-10 
Inoculumkon ­
centration (omtrentligt 
antal celler 
pr. liter) ≤ 30 mg/l TS 
eller ≤ 100 ml spildev and pr. l 
(10
 7 -10 8 ) 0,5 ml 
sekundært 
spildevand 
pr. 1 
(10 5 ) < 5 ml spil ­
devand pr. l 
(10 4 -10 6 ) 30 mg/l TS 
(10 7 -10 8 ) 
Grundstof ­
koncentration i uorganisk 
medium 
(i mg/l) 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 
Mg 2,2 2,2 6,6 
Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05 - 0,1 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 helst 7,0 
Temperatur 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = opløst organisk kulstof ThOD = teoretisk 
oxygenforbrug TS = tørstof i suspension  
I.6.1.  Vand  
Det deioniserede eller destillerede vand, der benyttes, må hverken 
indeholde toksiske stoffer (f.eks. Cu  ++ -ioner) i hæmmende mængder 
eller organisk kulstof svarende til mere end 10 % af testmaterialets 
organiske kulstof. Denne høje renhed er nødvendig for at undgik 
høje blindværdier. Forureninger kan stamme fra naturlige urenheder og fra ionbytterharpikser og lyseret materiale fra bakterier og alger. Til hver testserie anvendes kun én bestemt batch af vand, som i 
forvejen er kontrolleret ved DOC-analyse. En sådan kontrol er 
ikke nødvendig for Closed Bottle-testen, men oxygenforbruget fra vandet skal være lavt.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Stamopløsninger af uorganiske medium  
Der fremstilles stamopløsninger af uorganiske medier med passende 
koncentrationer af salte til brug ved fremstilling af testopløsningerne. Følgende stamopløsninger kan (med forskellige fortyndingsforhold) 
anvendes til DOC-eliminering, modificeret OECD-screening, CO
 2 - 
udvikling, manometrisk respirometri og Closed Bottle-test.  
Fortyndingsforholdene og for MITI-testens vedkommende fremstil ­
ling af det specifikke uorganiske medium, er anført under de enkelte 
metoder.  
Stamopløsninger:  
Følgende stamopløsninger fremstilles ud fra reagenser af analyse ­
kvalitet: 
a) monokaliumdihydrogenorthophosphat, KH  2 PO 4 8,50 g 
dikaliummonohydrogenorthophosphat, K  2 HPO  4 21,75 g 
dinatriummonohydrogenorthophosphat dihydrat, 
Na 2 HPO  4 2H 2 O 33,40 g 
ammoniumchlorid, NH  4 Cl 0,50 g 
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter. Opløsnin ­
gens pH skal være 7,4. 
b) calciumchlorid, vandfrit, CaCl  2 27,50 g 
eller calciumchlorid dihydrat, CaCl  2 2H 2 O 36,40 g 
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter. 
c) magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO  4 7H 2 O 22,50 g 
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter. 
d) jern(III)chlorid hexahydrat, FeCl  3 6H 2 0 0,25 g 
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter.  
Anmærkning:  For at undgå at skulle fremstille denne opløsning 
umiddelbart før brugen tilsættes der 1 dråbe koncentreret HCl eller 0,40 g ethylendiamintetraeddikesyre dinatriumsalt (EDTA) pr. liter.
 
I.6.3.  Stamopløsninger af kemikalier  
Hvis opløseligheden er større end 1 g/l opløses f.eks. 1-10 g af test- 
eller referencekemikalie i deioniseret vand, og der fortyndes til 1 
liter. I modsat fald fremstilles stamopløsningen i det uorganiske medium, eller kemikaliet tilsættes direkte til det uorganiske medium. Jf. bilag III for håndtering af mindre opløselige kemikalier; 
dog må der i MITI-testen (metode C.4-F) hverken anvendes opløs ­
ningsmidler eller emulgatorer.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Inoculum  
Inoculum kan stamme fra en række forskellige kilder, f.eks. aktivt 
slam, spildevandsafløb (ikke chloreret), overfladevand og -jord eller en blanding af disse. Aktivt slam til DOC-eliminering, CO
 2 -udvikling 
og manometrisk respirometri skal udtages fra et rensningsanlæg eller et 
laboratorieanlæg, der først og fremmest behandler husholdningsspilde ­
vand. Inoculum fra andre kilder har vist sig at føre til større spredning af resultaterne. Til den modificerede OECD-screening og Closed 
Bottle-testen kræves der et mere fortyndet inoculum uden slampartik ­
ler, og som kilde foretrækkes sekundært afløbsvand fra et rensnings ­
anlæg for husholdningsspildevand eller et anlæg i laboratorieskala. Til 
MITI-testen fremstilles inoculum fra en blanding af kilder, hvilket er 
beskrevet under denne specifikke test.
 
I.6.4.1.  Inoculum fra aktivt slam  
Der udtages en frisk prøve af aktivt slam fra beluftningstanken ved 
et rensningsanlæg eller et laboratorieanlæg, der fortrinsvis behandler 
husholdningsspildevand. Om nødvendigt fjern grove partikler fra ved 
filtrering gennem en finmasket sigte og hold herefter slammet aerobt.  
Alternativt kan slammet henstå til bundfældning eller centrifugeres 
(f.eks. ved 1 100 g i 10 min), efter at grove partikler er fjernet. Supernatanten fjernes. Slammet kan vaskes i uorganisk medium. Det koncentrerede slam opslæmmes til en koncentration på 3-5 g 
opslæmmet tørstof pr. liter, hvorefter det beluftes indtil anvendelse.
 
Slammet skal tages fra et ordentligt fungerende normalt anlæg. 
Slammet vaskes, hvis det er nødvendigt at tage det fra et stærkt 
belastet rensningsanlæg, eller et renseanlæg, som menes at indeholde 
hæmmende stoffer. Det genopslæmmede slam henstår til bundfæld ­
ning eller centrifugeres efter grundig blanding, supernatanten fjernes, og det vaskede slam genopslæmmes i uorganisk medium. Denne 
fremgangsmåde gentages, indtil slammet menes at være fri for over ­
skud af substrat eller hæmmende stoffer.
 
Lige før brugen udtages der en prøve af det fuldstændigt genopslæm ­
mede slam eller af det ubehandlede slam, til bestemmelse af mængden af opslæmmet tørstof.
 
Et andet alternativ er at homogenisere aktivt slam (3-5 g opslæmmet 
tørstof pr. liter). Slammet behandles i en mekanisk blender i 2 min ved middel hastighed. Det homogeniserede slam henstår til bund ­
fældning i 30 min eller om nødvendigt længere, og væsken dekan ­
teres fra til brug som inoculum i en mængde på 10 ml pr. liter 
uorganisk medium.
 
I.6.4.2.  Andre inoculumkilder  
Det kan fremstilles af sekundært afløbsvand fra et rensningsanlæg 
eller et laboratorieanlæg, der overvejende behandler husholdnings ­
spildevand. Der udtages en frisk prøve, der opbevares under aerobe forhold under transporten. Den henstår til bundfældning i 1 time eller filtreres gennem et groft.papirfilter, og denne væske opbe ­
vares under aerobe forhold indtil brugen. Op til 100 ml af denne 
inoculumtype kan bruges pr. liter medium.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Overfladevand er en yderligere inoculumkilde. I dette tilfælde 
udtages en prøve af egnet overfladevand, f.eks, flod- eller søvand, 
som opbevares under aerobe forhold indtil anvendelsen. Om nødven ­
digt kan inoculum koncentreres ved filtrering eller centrifugering.  
I.6.5.  Forkonditionering af inoculum  
De fremstillede inocula kan forkonditioneres til forsøgsbetingelserne, 
men må ikke tilvænnes til testkemikaliet. Forkonditioneringen består i beluftning af aktivt slam i uorganisk medium eller af sekundært afløbsvand i 5-7 dage ved stuetemperatur. Undertiden gør forkondi ­
tionering metoderne mere præcise, idet blindværdierne reduceres. Det 
anses for unødvendigt at forkonditionere MITI-inoculum.
 
I.6.6.  Abiotiske kontrolprøver  
Om nødvendig: foretages der kontrol af eventuel abiotisk nedbryd ­
ning af teststoffet ved bestemmelse af DOC-tab, oxygenoptagelse og kuldioxidudvikling i sterile kontrolprøver, der ikke indeholder inocu ­
lum. Der steriliseres ved membranfiltrering (0,2 - 0,45 μm); eller ved 
tilsætning af et passende toksisk stof i passende koncentration. Hvis 
der benyttes membranfiltrering, skal prøverne tages aseptisk for at opretholde steriliteten. Med mindre adsorption af teststoffet i forvejen er blevet udelukket, skal test, som måler bionedbrydning 
som DOC-fjernelse, inkludere en abiotisk kontrol, som inoculeres og 
forgiftes. Dette gælder særligt for inocula med aktiveret slam.
 
I.6.7.  Antal kolber  
For hver test er antallet af kolber i en typisk forsøgsrække beskrevet 
under den enkelte metode.  
Følgende typer af kolber kan bruges:  
— testopslæmning: indeholder teststof og inoculum  
— inoculumblind: indeholder kun inoculum  
— procedurekontrol: indeholder referencestof og inoculum  
— abiotisk steril kontrol: sterile, indeholder teststof (I.6.6)  
— adsorptionskontrol: indeholder teststof, inoculum og sterilise ­
rende stof  
— toksicitetskontrol: indeholder teststof, referencestof og inoculum.  
Bestemmelser i testopslæmning og inoculumblind skal obligatorisk 
foretages sideløbende. Det anbefales ligeledes at foretage sidelø ­
bende bestemmelser i den anden kolbe.  
Det er dog ikke altid muligt. Man må sørge for, at der udtages 
tilstrækkeligt med prøver eller foretages tilstrækkeligt mange aflæs ­
ninger til, at den procentvise eliminering i 10-dages-vinduet kan 
vurderes.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. DATA OG EVALUERING  
Ved beregning af den procentvise nedbrydning D  t anvendes gennem ­
snitsværdierne af dobbeltbestemmelserne af parameteren i testop ­
slæmningen og inoculumblindprøven. Formlerne er givet i afsnittene 
om de enkelte testmetoder. Nedbrydningens forløb vises grafisk med 
angivelse af 10-dages-vinduet. Den procentvise eliminering ved afslutningen af 10-dages-vinduet og ved plateauet eller testens afslut ­
ning beregnes og rapporteres.
 
I de respirometriske test kan nitrogenholdige forbindelser indvirke på 
oxygenoptagelsen som følge af nitrifikation (se bilag II og V).  
I.7.1.  Nedbrydning målt ved bestemmelse af DOC  
Den procentuelle nedbrydning (D  t ) på ethvert prøvetagningstidspunkt 
skal beregnes særskildt for kolberne, som indeholder teststof, idet gennemsnitsværdierne af dobbeltbestemmelseme af DOC benyttes 
for at kunne bedømme pålideligheden af testen (se I.5.2). Den 
beregnes ved at bruge følgende udtryk:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100 
hvor:  
D t = % nedbrydning til tidspunktet t  
C o = gennemsnitlig startkoncentration af DOC i kulturmediet 
med teststof og inoculum (mg DOC/l)  
C t = gennemsnitskoncentration af DOC i kulturmediet med test ­
stof og inoculum til tidspunktet t (mg DOC/l)  
C bo = gennemsnitlig startkoncentration af DOC i blindprøve med 
uorganisk medium og inoculum (mg DOC/l)  
C bt = gennemsnitskoncentration af DOC i blindprøve med 
uorganisk medium og inoculum til tidspunktet t (mg DOC/l).
 
Alle koncentrationer bestemmes eksperimentelt.  
I.7.2.  Nedbrydning målt ved specifik analyse  
Når der foreligger specifikke analysedata, beregnes den primære 
bionedbrydning ved udtrykket:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
hvor 
D t = % nedbrydning til tidspunktet t, normalt 28 dage  
S a = restmængde teststof i medium med inoculum ved testens 
afslutning (mg)  
S b = restmængde teststof i blindprøve kun med vand/medium og 
teststof (mg)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3.  Abiotisk nedbrydning  
Når en abiotisk kontrol bruges, beregnes den procentuelle abiotiske 
nedbrydning ved at bruge  
% abiotisk nedbrydning  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
hvor 
C S(0) = DOC-koncentrationen, sterilkontrollen på dag 0  
C s(t) = DOC-koncentrationen, sterilkontrollen på dag t  
I.8. RAPPORTERING  
Testrapporten skal om muligt indeholde følgende oplysninger:  
— test- og referencekemikalier og deres renhed  
— testbetingelser  
— inoculum: art og udtagningssted(er), koncentration og eventuel 
forkonditionering  
— art og andel af industrispildevand i afløbsvandet, hvis kendt  
— testens varighed og temperatur  
— for tungt opløselige testkemikalier, den foretagne behandling  
— anvendt testmetode; ændringer i fremgangsmåden skal begrundes 
videnskabeligt  
— forsøgsresultater i skema  
— eventuelt iagttagne hæmningsfænomener  
— eventuelt iagttagen abiotisk nedbrydning  
— eventuelle data fra specifikke kemiske analyser  
— om muligt analytiske data vedrørende nedbrydningsprodukter  
— afbildning af den procentvise nedbrydning mod tiden for både 
test- og referencestof med tydelig angivelse af lag-periode, nedbrydningstid, 10-dages-vindue og hældning (se bilag I). 
Hvis der i testen benyttes pålidelighedskriterier kan gennem ­
snittet af nedbrydningsprocenterne i kolberne indeholdende test ­
stoffet benyttes til fremstilling af grafen
 
— procentvis eliminering efter 10-dages-vinduet og ved enten 
plateau eller testens afslutning.  
DEL II.  DOC-ELIMINERING  (Metode C.4-A)  
II.1. METODENS PRINCIP  
En afmålt mængde uorganisk medium indeholdende inoculum og, 
som den nominelle eneste organiske kulstofkilde, teststof i kendt 
koncentration (10-40 mg/l) beluftes i mørke eller dæmpet lys ved 
22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Nedbrydningen følges ved hyppig DOC-analyse i en periode på 28 
dage. Bionedbrydningsgraden beregnes ved at udtrykke koncentra ­
tionen af fjernet DOC (korrigeret for koncentrationen i inoculum ­
blindprøven) i procent af startkoncentrationen af DOC. Den primære bionedbrydning kan også beregnes ud fra supplerende 
kemisk analyse ved inkubationsperiodens begyndelse og afslutning.
 
II.2. BESKRIVELSE AF METODEN  
II.2.1.  Apparatur  
a) Koniske kolber, f.eks. 250 ml op til 2 1, afhængigt af det volu ­
men, der kræves til DOC-analyse  
b) Rysteapparat til de koniske kolber, enten med automatisk tempe ­
raturkontrol eller anbragt i et lokale med konstant temperatur, og 
tilstrækkelig kraftigt til, at forholdene holdes aerobe i alle kolberne
 
c) Filtreringsapparatur med passende membraner  
d) DOC-analysator  
e) Apparatur til bestemmelse af opløst oxygen  
f) Centrifuge.  
II.2.2.  Fremstilling af uorganisk medium  
Se I.6.2 om fremstilling af stamopløsning.  
10 ml af opløsning (a) blandes med 800 ml fortyndingsvand, og af 
opløsning (b), (c) og (d) tilsættes der 1 ml af hver, hvorefter der 
fyldes op til 1 l med fortyndingsvand.  
II.2.3.  Fremstilling og forkonditionering af inoculum  
Inoculum kan stamme fra en række forskellige kilder: aktivt slam, 
spildevandsafløb, overfladevand og -jord eller en blanding af disse.  
Se I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. og I.6.5.  
II.2.4.  Klargøring af kolberne  
Eksempelvis kan der overføres 800 ml portioner af uorganisk 
medium til koniske 2-liters kolber, hvorefter der tilsættes så meget 
af stamopløsningerne af test- og referencestof til de forskellige kolber, at kemikaliekoncentrationen bliver på 10-40 mg DOC pr. liter. Kontroller pH-værdier og juster om nødvendigt til 7,4. Der 
tilsættes inoculum fra aktivt slam eller en anden kilde (se I.6.4) til 
en slutkoncentration på højst 30 mg opslæmmet tørstof pr. liter. Der klargøres også inoculumkontrolprøver i uorganisk medium uden test- og referencekemikalier.
 
Om nødvendigt kan der medtages en kolbe til kontrol af. om test ­
kemikaliet har en hæmmende virkning, ved tilsætning af omtrent lige 
store mængder test- og referencekemikalie til uorganisk medium indeholdende inoculum.
 
Der kan også om nødvendigt inkluderes en steril kolbe. dvs. en 
kolbe uden inoculum, til undersøgelse af, om testkemikaliet 
nedbrydes abiotisk (se I.6.6.).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Hvis testkemikaliet mistænkes for i væsentlig grad at kunne adsor ­
beres til glas, slampartikler eller lign., foretages desuden en indle ­
dende vurdering af denne adsorption og dermed af testens egnethed for det pågældende testkemikalie (se tabel 1). Benyt en flaske inde ­
holdende teststoffet, inoculum og det steriliserende stof.
 
Alle kolber fyldes op til 1 liter med uorganisk medium, og efter 
blanding udtages der en prøve af hver kolbe til bestemmelse af startkoncentrationen af DOC (se bilag II, punkt 4). Kolbernes åbning tildækkes, f.eks. med aluminiumfolie, på en sådan måde, at 
luften frit kan passere ind og ud af kolberne. Dernæst startes testen 
ved, at kolberne anbringes i rysteapparatet.
 
II.2.5.  Antal kolber i en typisk testrække  
Kolbe 1 og 2: testopslæmning  
Kolbe 3 og 4: inoculumblind  
Kolbe 5: procedurekontrol  
anbefalet og om nødvendigt:  
Kolbe 6: abiotisk steril kontrol  
Kolbe 7: adsorptionskontrol  
Kolbe 8: toksicitetskontrol  
Se I.6.7.  
II.2.6.  Gennemførelse af testen  
Under testens forløb foretages der dobbeltbestemmelse af DOC- 
koncentrationen i alle kolberne med bestemte tidsintervaller og så 
ofte, at både i 10-dages-vinduets start og den procentvise fjernelse ved 10-dages-vinduets afslutning kan konstateres. Der udtages kun netop så meget af testopslæmningen, som er nødvendigt til analysen.
 
Inden prøveudtagningen kompenseres der for eventuelt fordamp ­
ningstab fra kolberne ved tilsætning af vand (I.6.1). Inden prøven udtages, blandes kulturmediet omhyggeligt, idet det påses, at mate ­
riale på kolbens sider først bringes i opløsning eller opslæmning. Der 
centrifugeres eller filtreres på membranfilter (se bilag II, punkt 4) straks efter prøveudtagningen. Den filtrerede eller centrifugerede prøve analyseres samme dag; ellers kan den opbevares i højst 48 
timer ved 2-4
 o C eller i længere tid ved højst – 18  o C. 
II.3. DATA OG RAPPORTERING  
II.3.1.  Behandling af resultaterne  
Den procentvise nedbrydning til tidspunktet t beregnes som anført 
under I.7.1 (DOC-bestemmelse) og eventuelt som under I.7.2 (spe ­
cifik analyse).  
Alle resultater noteres på de tilhørende skemaer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Resultaternes gyldighed  
Se I.5.2.  
II.3.3.  Rapportering  
Se I.8.  
II.4. RESULTATSKEMA  
Nedenfor er vist et eksempel på et resultatskema.  
DOC-ELIMINERING  
1. LABORATORIUM  
2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE  
3. TESTSTOF  
Navn:  
Stamopløsningens koncentration: … mg/l stof  
Begyndelseskoncentration i mediet, t  0 : … mg/l stof  
4. INOCULUM  
Kilde:  
Behandling:  
Eventuel forkonditionering:  
Koncentrationen af opslæmmet tørstof i reaktionsblandingen: 
… mg/l  
5. KULSTOFBESTEMMELSER  
Kulstofanalysator:  
Kolbe nr. DOC efter n dage (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testkemikalie plus 
inoculum 
1 a 1 
a 2 
a, gnsn. 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, gnsn. 
C b(t) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Kolbe nr. DOC efter n dage (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Inoculumblind ­
prøve uden testke ­
mikalie 3 c 1 
c 2 
c, gnsn.C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, gnsn. 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VURDERING AF RÅDATA  
Kolbe nr. % nedbrydning efter n dage 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Gnsn. (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Gennemsnittet af D  1 og D  2 skal ikke tages, hvis der er en betydelig forskel.  
Anmærkning:  Der kan benyttes tilsvarende formler for referenceke ­
mikaliet og toksicitetskontrolprøverne.  
7. ABIOTISK KONTROL  (frivillig)  
Tid (dage) 
0 t  
DOC-koncentration (mg/l) i sterilkontrol C s(0) C s(t) 
% abiotisk nedbrydning  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFIK KEMISK ANALYSE  (frivillig)  
Restmængde af teststof ved 
afslutning af test (mg/l) % primær nedbrydning  
Sterilkontrol S  b ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Restmængde af teststof ved 
afslutning af test (mg/l) % primær nedbrydning  
Inoculerer testmedium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
DEL III.  MODIFICERET 0ECD-SCREENINGTEST  (Metode 
C.4-B)  
III.1. METODENS PRINCIP  
Til en afmålt mængde uorganisk medium indeholdende teststof i 
kendt koncentration (10-40 mg/l) som den nominelle eneste organisk 
kulstofkilde, tilsættes der 0,5 ml spildevandsinoculum pr. liter. Blan ­
dingen beluftes i mørke eller dæmpet lys ved 22 ± 2  o C. 
Nedbrydningen følges ved hyppig DOC-analyse i en periode på 28 
dage. Bionedbrydningsgraden beregnes ved at udtrykke koncentra ­
tionen af fjernet DOC (korrigere' for koncentrationen i inoculum ­
blindprøven) i procent af startkoncentrationen af DOC. Den primære bionedbrydning kan også beregnes ud fra supplerende kemisk analyse ved inkubationsperiodens begyndelse og afslutning.
 
III.2. BESKRIVELSE AF METODEN  
III.2.1. Apparatur  
a) Koniske kolber, f.eks. 250 ml op til 2 1, afhængigt af det volu ­
men, der kræves til DOC-analyse  
b) Rysteapparat til de koniske kolber, enten med automatisk tempe ­
raturkontrol eller anbragt i et lokale med konstant temperatur, og 
tilstrækkelig kraftigt til, at forholdene holdes aerobe i alle 
kolberne  
c) Filtreringsapparatur med passende membraner  
d) DOC-analysator  
e) Apparatur til bestemmelse af opløst oxygen  
f) Centrifuge.  
III.2.2.  Fremstilling af uorganisk medium  
Se I.6.2 om fremstilling af stamopløsning.  
10 ml af opløsning (a) blandes med 800 ml fortyndingsvand, og af 
opløsning (b), (c) og (d) tilsættes der 1 ml af hver, hvorefter der 
fyldes op til 1 l med fortyndingsvand.  
I denne metode anvendes der kun 0,5 ml spildevand pr. liter 
som.inoculum, og derfor kan det være nødvendigt at tilsætte yder ­
ligere sporstoffer og vækstfaktorer til mediet. Dette gøres ved tilsæt ­
ning af 1 ml af hver af følgende opløsninger pr, liter medium (slut ­
volumen).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Opløsning af sporstoffer: 
Mangansulfat tetrahydrat, MnSO  4 4H,0 39,9 mg 
Borsyre, H  3 BO 4 57,2 mg 
Zinksulfat heptahydrat, ZnSO  4 7H 2 O 42,8 mg 
Ammoniumheptamolybdat (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Jernchelat (FeCl  3 ethylendiamintetraeddikesyre) 100,0 mg 
opløses i vand og fortyndes til 1 000 ml. Vitaminopløsning: Gærekstrakt 15,0 mg
 
opløses i 100 ml vand. Der steriliseres ved filtrering igennem 0,2 μm 
membranfilter, hvis opløsningen friskfremstilles hver gang.  
III.2.3.  Fremstilling og forkonditionering af inoculum  
Inokulum tages fra det sekundære afløb fra et spildevandsanlæg eller 
et laboratorieanlæg, som fortrinsvis modtager husholdningsspilde ­
vand. Se I.6.4.2 og I.6.5.  
0,5 ml pr. liter uorganisk næringsstofopløsning benyttes.  
III.2.4.  Klargøring af kolberne  
Eksempelvis kan der overføres 800 ml portioner af uorganisk 
medium til koniske 2-liters kolber, hvorefter der tilsættes så meget af stamopløsningerne af test- og referencestof til de forskellige kolber, at kemikaliekoncentrationen bliver på 10-40 mg DOC pr, 
liter. Kontroller pH-værdier og juster om nødvendigt til 7,4. Der 
tilsættes 0,5 ml spildevand pr. liter (se I.6.4.2.) til kolberne som inoculum. Der klargøres også inoculumkontrolprøver i uorganisk medium uden test- og referencekemikalier.
 
Om nødvendigt kan der medtages en kolbe til kontrol af, om test ­
kemikaliet virker hæmmende; der tilsættes omtrent lige store 
mængder test- og referencekemikalie til uorganisk medium indehol ­
dende inoculum.  
Der kan også om nødvendigt inkluderes en steril kolbe, dvs. en 
kolbe uden inoculum, til kontrol af, om testkemikaliet nedbrydes abiotisk (se I.6.6).
 
Hvis testkemikaliet mistænkes for i væsentlig grad at kunne adsor ­
beres til glas, slampartikler eller lign., foretages desuden en indle ­
dende vurdering af denne adsorption og dermed af testens egnethed 
for det pågældende testkemikalie (se tabel 1). Benyt en kolbe inde ­
holdende teststoffet, inoculum og det steriliserende stof.  
Alle kolber fyldes op til 1 liter med uorganisk medium, og efter 
blanding udtages der en prøve af hver kolbe til bestemmelse af startkoncentrationen af DOC (se tillæg II, punkt 4). Kolbernes åbning tildækkes, f.eks. med aluminiumfolie, på en sådan måde, at 
luften frit kan passere ind og ud af kolberne, Dernæst startes testen 
ved, at kolberne anbringes i rysteapparatet,
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Antal kolber i en typisk testrække  
Kolbe 1 og 2: testopslæmning  
Kolbe 3 og 4: inoculumblind  
Kolbe 5: procedurekontrol  
anbefalet og om nødvendigt:  
Kolbe 6: abiotisk steril kontrol  
Kolbe 7: adsorptionskontrol  
Kolbe 8: toksicitetskontrol  
Se I.6.7.  
III.2.6.  Gennemførelse af testen  
Under testens forløb foretages der dobbeltbestemmelse af DOC- 
koncentrationen i alle kolberne med bestemte tidsintervaller og så ofte, at både 10-dages vinduets start og den procentvise fjernelse ved 10-dages-vinduets afslutning kan konstateres. Der udtages kun netop 
så meget af testopslæmningen, som er nødvendig til analysen.
 
Inden prøveudtagningen kompenseres der for eventuelt fordamp ­
ningstab fra kolberne ved tilsætning af fortyndingsvand (I.6.1.). Inden prøven udtages, blandes kulturmediet omhyggeligt, idet mate ­
riale på kolbens sider først bringes i opløsning eller opslæmning. Der 
centrifugeres eller filtreres på membranfilter (se bilag II.4.) straks efter prøveudtagningen. Den filtrerede eller centrifugerede prøve analyseres samme dag; ellers kan den opbevares i højst 48 timer 
ved 2-4
 o C eller i længere tid ved højst – 18  o C. 
ΙII.3. DATA OG RAPPORTERING  
III.3.1.  Behandling af resultaterne  
Den procentvise nedbrydning til tidspunktet t beregnes som anført 
under I.7.1. (DOC-bestemmelse) og eventuelt som under I.7.2. (spe ­
cifik analyse).  
Alle resultater noteres på de tilhørende skemaer.  
III.3.2. Resultaternes gyldighed  
Se I.5.2.  
III.3.3. Rapportering  
Se I.8.  
IIΙ.4. RESULTATSKEMA  
Nedenfor er vist et eksempel på et resultatskema.  
MODIFICERET OECD-SCREENINGTEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. TESTSTOF  
Navn:  
Stamopløsningens koncentration: … mg/l stof  
Begyndelseskoncentration i mediet, t  0 : … mg/l stof  
4. INOCULUM  
Kilde:  
Behandling:  
Eventuel forkonditionering:  
Koncentrationen af opslæmmet tørstof i reaktionsblandingen: 
… mg/l  
5. KULSTOFBESTEMMELSER  
Kulstofanalysator:  
Kolbe nr. DOC efter n dage (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testkemikalie plus 
inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, gnsn. 
Ca (t) 
2 b 1 
b 2 
b, gnsn. 
Cb (t) 
Inoculumblind ­
prøve uden testke ­
mikalie 3 C 1 
C 2 
C, gnsn. C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, gnsn. 
Cd (t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VURDERING AF RÅDATA  
Kolbe nr. % nedbrydning efter n dage 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Kolbe nr. % nedbrydning efter n dage 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Gnsn. (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Gennemsnittet af D  1 og D  2 skal ikke tages, hvis der er en betydelig forskel.  
Anmærkning : Der kan benyttes tilsvarende formler for referenceke ­
mikaliet og toksicitetskontrolprøverne.  
7. ABIOTISK KONTROL  (frivillig)  
Tid (dage) 
0 t  
DOC-koncentration (mg/l) i sterilkontrol C s(o) C s(t) 
% abiotisk nedbrydning  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFIK KEMISK ANALYSE  (frivillig)  
Restmængde af teststof ved 
afslutning af test % primær nedbrydning  
Sterilkontrol S  b 
Inoculeret testmedium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
DEL IV. CO  2 -UDVIKLING (Metode C.4-C)  
IV.1. METODENS PRINCIP  
En afmålt mængde uorganisk medium indeholdende inoculum og, 
som den nominelle eneste organiske kulstofkilde, teststof i kendt 
koncentration (10-20 mg DOC eller TOC/1) beluftes ved gennem ­
ledning af kuldioxidfri luft med kontrolleret hastighed i mørke eller i diffust lys. Nedbrydningen følges gennem 28 dage ved bestemmelse af den dannede mængde kuldioxid, idet den opsamles i barium- eller 
natriumhydroxid og måles enten ved titrering af det resterende 
hydroxid eller som uorganisk kulstof. Den mængde kuldioxid, som er udviklet af testkemikaliet (korrigeret for inoculumblindværdien), udtrykkes i procent af ThCO
 2 . Graden af bionedbrydning kan også 
beregnes ud fra supplerende DOC-analyser ved inkubationsperiodens 
begyndelse og afslutning.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. BESKRIVELSE AF METODEN  
IV.2.1.  Apparatur  
a) Kolber, 2-5 l, alle forsynet med beluftningsrør, der næsten når 
ned til bunden af beholderen, og afgangsåbning  
b) Magnetomrørere, når der testes tungtopløselige kemikalier  
c) Gasabsorptionsflasker  
d) Udstyr til styring og måling af luftgennemstrømning  
e) Apparatur til udvaskning af kuldioxid, til fremstilling af kuldio ­
xidfri luft; alternativt kan der benyttes CO  2 -fri oxygen og CO  2 -fri 
nitrogen på stålflaske i det rette blandingsforhold (20 % O  2 og 
80 % N  2 ) 
f) Udstyr til bestemmelse af kuldioxid, enten titrimetrisk eller ved 
en eller anden form for analysator for uorganisk kulstof  
g) Membranfiltreringsapparatur (valgfrit)  
h) DOC-analysator (valgfri).  
IV.2.2.  Fremstilling af uorganisk medium  
Se I.6.2 om fremstilling af sumopløsning.  
10 ml af opløsning (a) blandes med 800 ml fortyndingsvand, og af 
opløsning (b), (c) og (d) tilsættes der 1 ml af hver, hvorefter der fyldes op til 1 l med fortyndingsvand.
 
IV.2.3.  Fremstilling og forkonditionering af inoculum  
Inoculum kan stamme fra en række forskellige kilder: aktivt slam, 
spildevandsafløb, overfladevand og -jord eller en blanding af disse.  
Se I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. og I.6.5.  
IV .2.4.  Klargøring af kolberne  
Følgende volumen- og vægtangivelser gælder som eksempel for 5- 
liters kolber med 3 l opslæmning. Anvendes der mindre rumfang, 
tilpasses værdierne, dog skal den dannede mængde kuldioxid kunne bestemmes nøjagtigt.
 
Der overføres 2 400 ml uorganisk medium til hver 5-liters kolbe. Der 
tilsættes så meget klargjort aktivt slam (se I.6.4.1 og I.6.5), at koncentrationen af opslæmmet tørstof bliver højst 30 mg/l i de 3 liter slutblanding. Alternativt kan det klargjorte slam først fortyndes 
med uorganisk medium til en opslæmning indeholdende 
500-1 000 mg/l, hvorefter en del heraf tilsættes til 5-liters kolbens indhold til en koncentration på 30 mg/l; dette giver større nøjagtig ­
hed. Der kan benyttes andre inoculumkilder (se I.6.4.2).
 
Disse blandinger beluftes natten over med CO  2 -fri luft, så al kuldio ­
xiden drives ud af systemet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Test- og referencestof tilsættes hver for sig som v.h.a. kendte 
mængder af stamopløsninger til replikakolberne, så der opnås en 
koncentration på 10-20 mg DOC eller TOC pr. liter; til nogle af kolberne tilsættes der ingen kemikalier, og de fungerer som inocu ­
lumkontrolprøver. Tungtopløselige teststoffer tilsættes direkte til 
kolberne på vægt- eller volumenbasis, eller håndteres som beskrevet 
i bilag III.
 
Om nødvendigt kan der medtages en kolbe til kontrol af, om test ­
kemikaliet virker hæmmende; der tilsættes både test- og reference ­
kemikalie til samme koncentration som i de andre kolber.  
Der kan også om nødvendigt inkluderes en steril kolbe, dvs. en 
kolbe uden inoculum, til kontrol af, om testkemikaliet nedbrydes 
abiotisk (se I.6.6}. Steriliser ved tilsætning af et giftigt stof i en passende koncentration.
 
1 alle kolberne fyldes der op til et opslætnningsvolumen på 3 l ved 
tilsætning af uorganisk medium, der i forvejen er gennemluftet med 
CO 2 -fri luft. Der kan eventuelt udtages prøver til DOC-analyse (se 
bilag II.4) og/eller specifik analyse. Absorptionsflaskerne forbindes til kolbernes afgangsåbning.
 
Hvis der anvendes bariumhydroxid, serieforbindes der 3 absorptions ­
flasker med hver 100 ml 0,0125 M bariumhydroxidopløsning til hver 
5-liters kolbe. Opløsningen skal være fri for bundfald af sulfat og carbonat, og dens styrke skal bestemmes umiddelbart før brugen. Anvendes der natriumhydroxid forbindes der 2 fælder, hvor den 
sidste fungerer som kontrol af, at al kuldioxiden er absorberet i 
den første. Absorptionsflasker med serumflaskelukker er egnede. Der anbringes 200 ml 0,05 M natriumhydroxid i hver flaske, hvilket er tilstrækkeligt til at absorbere hele den mængde kuldioxid, 
der udvikles, når testkemikaliet nedbrydes fuldstændigt. Selv en 
friskfremstillet natriumhydroxidopløsning vil altid indeholde spor af carbonat; dette korrigeres der for ved subtraktion af blindprøvens carbonatindhold.
 
IV.2.5.  Antal kolber i en typisk testrække  
Kolbe 1 og 2: testopslæmning  
Kolbe 3 og 4: inoculumblind  
Kolbe 5: procedurekontrol  
anbefalet og om nødvendigt:  
Kolbe 6: abiotisk steril kontrol  
Kolbe 7: toksicitetskontrol  
Se I.6.7.  
IV.2.6.  Gennemførelse af testen  
Testen indledes ved gennembobling af opslæmningerne med 30- 
100 ml CO  2 -fri luft pr. minut. Der udtages regelmæssigt prøver af 
kuldioxidabsorbenten til analyse for CO  2 -indhold. Det anbefales, at 
der i de første 10 dage foretages analyser hver anden eller tredje dag 
og derefter hver femte dag indtil den 28. dag, således at 10-dages- 
vinduet kan identificeres.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
På den 28. dag udtages der (eventuelt) prøver til DOC-analyse 
og/eller specifik analyse, opslæmningernes pH måles, og der tilsættes 
1 ml koncentreret saltsyre til hver kolbe; kolberne beluftes natten over, så al kuldioxid drives ud af testopslæmningerne. På den 29. dag foretages den sidste analyse af udviklet kuldioxid.
 
På de dage, hvor CO  2 bestemmes, fjernes den bariumhydroxidab ­
sorptionsflaske, der er nærmest kolben, og indholdet titreres med 
0,05 M HCl med phenolphthalein som indikator. De øvrige absorp ­
tionsflasker rykkes én plads nærmere kolben, og der anbringes en ny flaske indeholdende 100 ml friskfremstillet 0,0125 M bariumhy ­
droxyd bagest i serien. Titreringerne foretages efter behov, f.eks. 
når der er betragteligt bundfald i den første flaske og intet synligt 
i den anden, dog mindst én gang ugentligt. Anvendes der NaOH som absorptionsmiddel, udtages der med en injektionssprøjte en lille prøve (afhængigt af den anvendte kulstofanalysator) af natriumhy ­
droxidopløsningen i den flaske, der er nærmest ved kolben. Prøven 
sprøjtes ind i IC-delen af kulstofanalysatoren til direkte analyse af den udviklede kuldioxid.
 
Indholdet af den anden absorptionsflaske analyseres først ved testens 
afslutning, så der kan korrigeres for eventuel overførsel af kuldioxid.  
IV.3. DATA OG RAPPORTERING  
IV.3.1.  Behandling af resultaterne  
Den absorberede CO  2 -mængde er efter titrering givet ved:  
mg CO  2 = [(100 × C  B – 0,5 × V × C  A )] × 44  
hvor:  
V = den mængde HCl, der forbruges til titrering af de 100 ml 
absorptionsmiddel (ml)  
C B = bariumhydroxidopløsningens koncentration (M)  
C A = saltsyreopløsningens koncentration (M).  
Hvis C  B = 0,0125 M og C  A = 0,05 M, skal der anvendes 50 ml til 
titrering af 100 ml bariumhydroxid, og CO  2 -mængden er givet ved:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCl til titrering  ¼ 1; 1 Ü ml HCl  
I dette tilfælde skal der altså anvendes en faktor på 1,1 ved omreg ­
ning fra det rumfang HCl, der medgår til titrering, til det antal mg 
CO 2 , der er udviklet.  
Den vægtmængde CO  2 , der dannes af inoculum alene og af 
inoculum plus testkemikalie, beregnes ud fra de pågældende titre ­
ringsværdier, og forskellen er den vægtmængde CO  2 , som testkemi ­
kaliet alene udvikler.  
Hvis f.eks. inoculum alene kræver 48 ml til titreringen og inoculum 
plus testkemikalie kræver 45 ml, fås  
CO 2 fra inoculum = 1,1 × (50-48) = 2,2 rng  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 fra inoculum plus testkemikalie = 1,1 × (50-45) = 5,5 mg  
og den vægtmængde CO  2 , som testkemikaliet har udviklet, bliver 
altså 3,3 mg.  
Den procentvise bionedbrydning beregnes ved:  
% nedbrydning ¼ mg udviklet CO  2 Ü 100 
ThCO  2 Ü mg tilsat testkemikalie  
eller 
% nedbrydning ¼ mg udviklet CO  2 Ü 100 
mg tilsat TOC i testen  Ü 3; 67 
idet 3,67 er omregningsfaktoren (44/12) fra kulstof til kuldioxid.  
Den procentvise nedbrydning efter et givet tidsrum beregnes ved 
summering af de enkelte procentdele af ThCO  2 , der er målt indtil 
det pågældende tidspunkt.  
Anvendes der natriumhydroxid som absorptionsmiddel, beregnes den 
udviklede CO  2 - mængde, udtrykt som IC (mg), ved multiplikation af 
absorptionsmidlets IC- koncentration med dets volumen.  
Den procentvise nedbrydning beregnes ved:  
% ThCO  2 ¼ mg IC i testkolbe Ä mg IC i blindprøve 
mg TOC tilsat som testkemikalie  Ü 100 
Det fjernede DOC beregnes (eventuelt) som beskrevet under 
I.7. Dette og alle øvrige resultater noteres på de tilhørende skemaer.  
IV.3.2.  Resultaternes gyldighed  
IC-indholdet i testkemikalieopslæmningen i uorganisk medium ved 
testens begyndelse skal være mindre end 5 % af TC, og den udvik ­
lede CO  2 -mængde i inoculumblindprøven må ved testens afslutning 
normalt ikke overstige 40 mg pr. liter medium. Hvis der findes værdier på over 70 mg CO
 2 pr. liter, gennemgås data og forsøgs ­
teknikker kritisk.  
Se også I.5.2.  
IV.3.3.  Rapportering  
Se I.8.  
IV.4. RESULTATSKEMA  
Nedenfor er vist et eksempel på et resultatskema.  
KULDIOXIDUDVIKLING  
1. LABORATORIUM  
2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE  
3. TESTSTOF  
Navn:  
Stamopløsningens koncentration: … mg/l stof  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Begyndelseskoncentration i mediet: … mg/l stof  
Total C tilsat til kolben: … mg C  
ThCO  2 : … mgCO  2 
4. INOCULUM  
Kilde:  
Behandling:  
Eventuel forkonditionering:  
Koncentrationen af opslæmmet tørstof i reaktionsblandingen: 
… mg/l  
5. KULDIOXIDUDVIKLING OG NEDBRYDELIGHED  
Metode: Ba(OH)  2 /NaOH/andet  
Tid 
(dage) udviklet CO  2 
test (mg) udviklet CO  2 
blind (mg) udviklet CO  2 
kumuleret (mg) 
(test minus blindprøve) % ThCO  2 
kumuleret  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 gnsn. 3 
4 gnsn. 1 2 1 2 gnsn.  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Anmærkning : Der kan benyttes en tilsvarende opstilling for referen ­
cekemikaliet og toksicitetskontrolprøverne.  
6. KULSTOFANALYSE  (valgfri)  
Kulstofanalysator:  
Tid (dage) Blindprøve mg/l Testkemikalie mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) eller ved inkuberingens afslutning.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% DOC fjernet ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. ΑΒΙOTISΚ NEDBRYDNING  (valgfri)  
% abiotisk nedbrydning  ¼ CO  2 Ä udvikling i steril kolbe efter 28 dage  ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100  
DEL V.  MANOMETRISK RESPIROMETRI  (Metode C.4-D)  
V.1. METODENS PRINCIP  
En afmålt mængde uorganisk medium indeholdende inoculum og, 
som den nominelle eneste organiske kulstofkilde, teststof i kendt 
koncentration (100 mg teststof pr. liter svarende til mindst 50- 
100 mg ThOD pr. l) omrøres i en lukket kolbe ved konstant tempe ­
ratur (± 1  o C eller mindre) i op til 28 dage, Oxygenforbruget 
bestemmes enten ved måling af den mængde oxygen (fremstillet 
elektrolytisk), der kræves til opretholdelse af konstant gasvolumen 
i respirometerkolben, eller ud fra volumen- eller trykændringen (eller en kombination af dem) i apparatet. Udviklet kuldioxid absorberes i en kaliumhydroxidopløsning eller andet egnet absorptionsmiddel. 
Den oxygenmængde, testkemikaliet har optaget (korrigeret for den 
parallelle inoculumblindprøves optagelse), udtrykkes som procent af ThOD eller COD. Frivilligt kan primær bionedbrydning også beregnes ved supplerende specifik analyse ved begyndelsen og slut ­
ningen af inkuberingen, og fuldstændig bionedbrydning ved analyse 
af DOC.
 
V.2. BESKRIVELSE AF METODEN  
V.2.1.  Apparatur  
a) Egnet respirometer  
b) Temperaturregulering inden for ± 1  o C eller mindre  
c) Membranfiltreringsapparatur (valgfrit)  
d) Kulstofanalysator (valgfri).  
V.2.2.  Fremstilling af uorganisk medium  
Se I.6.2. om fremstilling af stamopløsning.  
10 ml af opløsning (a) blandes med 800 ml fortyndingsvand, og af 
opløsning (b), (c) og (d) tilsættes der 1 ml af hver, hvorefter der 
fyldes op til 1 l med fortyndingsvand.  
V.2.3.  Fremstilling og forkonditionering af inoculum  
Inoculum kan stamme fra en række forskellige kilder: aktivt slam, 
spildevandsafløb, overfladevand og -jord eller en blanding af disse.  
Se I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. og I.6.5.  
V.2.4.  Klargøring af kolberne  
Ud fra stamopløsningerne fremstilles der særskilte opløsninger af 
test- og referencestof i uorganisk medium med en kemikaliekoncen ­
tration på normalt 100 mg/l (svarende til mindst 50-100 mg ThOD 
pr. l).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
ThOD beregnes ud fra dannelsen af ammoniumsalte, medmindre der 
forventes nitrifikation; i så fald baseres beregningen på nitratdan ­
nelsen (se bilag II.2).  
pH måles og justeres om nødvendigt til 7,4 ± 0,2.  
Tungtopløselige stoffer tilsættes på et senere tidspunkt (se nedenfor).  
Hvis teststoffets toksicitet skal bestemmes, fremstilles endnu en 
opløsning i uorganisk medium, som indeholder både test- og refe ­
rencestof i samme koncentration som i de enkelte opløsninger.  
Hvis bestemmelse af den fysisk-kemiske oxygenoptagelse er påkræ ­
vet, fremstilles der en opløsning af teststof i en koncentration på 
normalt 100 mg ThOD pr. l som er blevet steriliseret ved tilsæt ­
ningen af et passende giftigt stof (se I.6.6.).  
Den nødvendige mængde af henholdsvis test- og referencestofopløs ­
ningerne overføres til mindst to kolber (dobbeltbestemmelse). Der klargøres yderligere kolber med uorganisk medium alene (inoculum ­
blindprøver) og hvis nødvendigt med den blandede test- og referen ­
cestofopløsning og med den sterile opløsning.
 
Hvis teststoffet er tungtopløseligt, tilsættes det direkte på dette tids ­
punkt, enten på vægtbasis eller volumenbasis, eller ved håndtering som beskrevet i bilag III. Der tilsættes kaliumhydroxid, natriumhy ­
droxidperler eller et andet absorptionsmiddel til CO
 2 -absorbtions ­
kamrene.  
V.2.5.  Antal kolber i en typisk testrække  
Kolbe 1 og 2: testopslæmning  
Kolbe 3 og 4: inoculumblind  
Kolbe 5: procedurekontrol  
anbefalet og om nødvendigt:  
Kolbe 6: abiotisk steril kontrol  
Kolbe 7: toksicitetskontrol  
Se I.6.7.  
V.2.6.  Gennemførelse af testen  
Beholderne henstår, indtil de har nået den ønskede temperatur, og 
der tilsættes klargjort aktivt slam eller et andet inoculum til de 
pågældende beholdere, så der opnås en koncentration af opslæmmet tørstof på højst 30 mg/l. Apparaturet samles, omrøringen sættes i gang, der kontrolleres for lufttæthed, og oxygenoptagelsesmålingen 
påbegyndes. Normalt kræves der ikke anden pasning end de nødven ­
dige aflæsninger og daglig kontrol af, at temperaturen er korrekt og omrøringen tilstrækkelig.
 
Oxygenoptagelsen beregnes på grundlag af hyppige regelmæssige 
aflæsninger, foretaget efter apparaturfabrikantens anvisninger. Ved inkubationsperiodens afslutning, normalt 28 dage, måles pH i 
kolberne, navnlig hvis oxygenoptagelsen er meget lav eller større 
end ThODNH
 4 (for nitrogenholdige forbindelser).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Om nødvendigt udtages der før og efter inkuberingen prøver fra 
respirometerkolberne til DOC-analyse eller specifik kemisk analyse 
(se bilag II.4). Man skal sørge for, at rumfanget af den testopslæm ­
ning, der er tilbage i kolben efter den første prøveudtagning, er kendt. Hvis teststoffet er N-holdigt, bestemmes koncentrationsfor ­
øgelsen af nitrit og nitrat over 28 dage, og korrektionen for oxygen ­
forbruget ved nitrifikation beregnes (bilag V).
 
V.3. DATA OG RAPPORTERING  
V.3.1.  Behandling af resultaterne  
Testkemikaliets oxygenoptagelse (mg) efter et givet tidsrum (korri ­
geret for inoculumblindprøvens oxygenoptagelse i samme tidsrum) 
divideres med vægten af den anvendte teststofmængde. Herved frem ­
kommer BOD udtrvkt i mg oxygen pr. mg testsrof. dvs.  
BOD ¼ ðmg O  2 optaget af teststof Ä mg O  2 optaget af blindprøven Þ 
ðmg teststof i kolben Þ 
= mg O  2 pr. mg teststof.  
Den procentvise bionedbrydning beregnes enten ved:  
% bionedbrydning ¼ % ThOD ¼ BODðmg O  2=mg kemikalieÞ 
ThODðmg O  2 kemikalieÞ Ü 100 ; 
eller 
% COD ¼ BODðmg O  2=mg kemikalieÞ 
CODðmg O  2 kemikalieÞ Ü 100 
Det bemærkes, at de to metoder ikke nødvendigvis giver samme 
resultat; førstnævnte metode bør foretrækkes.  
Der benyttes den ThOD (NH  4 eller NO  3 ), der svarer til det forelig ­
gende kendskab til nitrifikation (bilag II.2). Sker der ufuldstændig 
nitrifikation beregnes korrektionen for oxygenforbruget til nitrifika ­
tionen ud fra ændringerne i nitrit- og nitratkoncentrationen (bilag V).  
Hvis det vælges at foretage bestemmelser af organisk kulstof og/eller 
af et specifikt kemikalie, beregnes den procentvise nedbrydning som 
beskrevet under punkt I.7.  
Alle resultater noteres på de tilhørende skemaer.  
V.3.2.  Resultaternes gyldighed  
Inoculumblindprøvens oxygenoptagelse er normalt 20-30 mg O  2 /l på 
28 dage og bør ikke være større end 60 mg/l. Findes der værdier over 60 mg/l, må data og forsøgsteknikker gennemgås kritisk. Hvis pH ligger uden for intervallet 6-8,5 og teststoffets oxygenoptagelse 
er mindre end 60 %, gentages testen med lavere teststofkoncentra ­
tion.
 
Se også I.5.2.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Rapportering  
Se I.8.  
V.4. RESULTATSKEMA  
Nedenfor er vist et eksempel på et resultatskema.  
MANOMETRISK RESPIROMETRI  
1. LABORATORIUM  
2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE  
3. TESTSTOF  
Navn:  
Stamopløsningens koncentration: … mg/l  
Begyndelseskoncentration i mediet, C  o : … mg/l  
Volumen i testkolbe (V): … ml  
ThOD eller COD: … mg O  2 /mg teststof (NH  4 , NO  3 ) 
4. INOCULUM  
Kilde:  
Behandling:  
Eventuel forkonditionering:  
Koncentrationen af opslæmmet tørstof: reaktionsblandingen: 
… mg/l  
5. OXYGENOPTAGELSE: BIONEDBRYDELIGHED  
Tid (dage) 
0 7 14 21 28  
O 2 opt. (mg) 
teststof 1 
2 
a, gnsn. 
O 2 opt. (mg) 
blindprøve 3 
4 
b, gnsn. 
Korrigeret 
BOD (mg) (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
BOD pr. mg 
teststof ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Tid (dage) 
0 7 14 21 28  
% nedbrydning 
edbrydning  
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Gnsn. (*)  
V = volumen af medium i testkolben. 
(*) Germemsnittet af D  1 og D  2 skal ikke tages, hvis der er en betydelig forskel.  
Anmærkning : Der kan anvendes en tilsvarende opstilling for refe ­
rence kemi kaliet og toksicitetskontrolprøveme.  
6. KORREKTION FOR NITRIFIKATION  (se bilag V)  
Dag 0 28 forskel  
i) Nitratkoncentration (mg N/l) (N) 
ii) Oxygenækvivalent (4,57 × Ν × V) (mg) — — 
iii) Nitritconcentration (mg N/l) (N) iv) Oxygenækvivalent (3,43 × Ν × V) (mg) — — 
ii) + iv) Total oxygenækvivalent — —
 
7. KULSTOFANALYSE  (valgfri)  
Kulstofanalysator:  
Tid (dage) Blindprøve mg/l Testkemikalie mg/l  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) eller ved inkuberingens afslutning.  
% DOC fjernet ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100 
8. SPECIFIK KEMIKALIEBESTEMMELSE  (valgfri)  
S b = koncentrationen af testkemikalie i steril kontrolkolbe efter 
28 dage  
S a = koncentrationen af testkemikalie i kolbe med inoculum 
efter 28 dage  
% biodegradation ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. ABIOTISK NEDBRYDNING  (valgfri)  
a = oxygenforbruget i sterile kolber efter 28 dage (mg)  
Oxygenforbrug pr : mg teststof ¼ a Ü 100 
C o V ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(se afsnit 1 og 3)  
% abiotisk nedbrydning  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
DEL VI.  CLOSED BOTTLE TEST  (metode C.4-E)  
VI.1. TESTMETODENS PRINCIP  
Til en sædvanligvis 2-5 mg/l opløsning af teststoffet i uorganisk 
medium tilsættes der inoculum bestående af et forholdvis lille antal 
mikroorganismer fra en blandet population, og opløsningen opbe ­
vares i mørke ved konstant temperatur i helt fyldte lukkede kolber. Nedbrydningen følges gennem 28 dage ved analyse af opløst 
oxygen. Den oxygenmængde, som teststoffet har forbrugt, korrigeres 
for den oxygenmængde, der er forbrugt i den parallelle inoculum ­
blindprøve, og udtrykkes i procent af ThOD eller COD.
 
VI.2. BESKRIVELSE AF METODEN  
VI.2.1.  Apparatur  
a) BOD-kolber med glasprop, f.eks. 250-300 ml  
b) vandbad eller inkuberingsapparat, som kan holde kolberne ved 
konstant temperatur (± 1  o C eller mindre) i mørke  
c) store glasflasker (2-5 1) til fremstilling af medium og opfyldning 
af BOD-kolberne  
d) oxygenelektrode og -måler eller udstyr og reagenser til Winkler- 
titrering.  
VI.2.2.  Fremstilling af uorganisk medium  
Se I.6.2 om fremstilling af stamopløsning.  
1 ml af opløsning (a), (b), (c) og (d) fortyndes til 1 liter med vand.  
VI.2.3.  Fremstilling af inoculum  
Inoculum tages normalt fra det sekundære afløb fra et spildevands ­
anlæg eller et laboratorieanlæg, som fortrinsvis modtager hushold ­
ningspildevand. En alternativ inoculumkilde er overfladevand. Brug 
normalt fra en dråbe (0,05 ml) til 5 ml filtrat pr. liter medium. 
Afprøvninger kan være nødvendige for at klarlægge det optimale volumen for et givet afløb (se I.6.4.2 og I.6.5).
 
VI.2.4.  Klargøring af kolberne  
Det uorganiske medium beluftes kraftigt i mindst 20 minutter. En 
given forsøgsrække udføres med uorganisk medium fra samme 
batch. Normalt er mediet klar til brug efter henstand i 20 timer ved testtemperaturen. Som kontrol bestemmes koncentrationen af opløst oxygen; værdien skal ligge omkring 9 mg/l ved 20
 o C. Al 
overføring og opfyldning med det luftmættede medium udføres, uden 
at der dannes bobler, f.eks. med en hævert.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Der klargøres parallelle grupper af BOD-kolber til samtidige forsøg 
med test- og referencestof. Der samles så mange BOD-kolber, inklu ­
sive inoculumblindprøver, at der mindst kan foretages dobbelt ­
bestemmelse af oxygenforbruget med den ønskede hyppighed, f.eks. efter 0, 7, 14, 21 og 28 dage. Det kan være nødvendigt at 
anvende flere kolber, hvis man vil være sikker på at kunne identifi ­
cere 10-dages-vinduet.
 
De store kolber fyldes en tredjedel op med fuldt beluftet uorganisk 
medium. Dernæst tilsættes der så meget stamopløsning af test- og referencestof til forskellige kolber, at deres slutkoncentration normalt ikke bliver større end 10 mg/l. Til en særskilt kolbe med kontrol ­
medium tilsættes der ingen kemikalier.
 
For at være sikker på, at inoculumaktiviteten ikke begrænses, må 
koncentrationen af opløst oxygen ikke falde til under 0,5 mg/l i BOD-kolberne, hvilket begrænser testkemikaliets koncentration til ca. 2 mg/l. Af tungt nedbrydelige stoffer og stoffer med lavt 
ThOD kan der dog anvendes 5-10 mg/l. I visse tilfælde tilrådes 
det at køre parallelle serier med teststof i to forskellige koncentra ­
tioner, f.eks. 2 og 5 mg/l. Normalt beregnes ThOD på basis af dannelsen af ammoniumsalte, men hvis der forventes eller vides at 
ske nitrifikation, beregnes værdien på grundlag af nitratdannelsen 
(ThOD
 NO3 : se bilag II.2). Sker der ufuldstændig nitrifikation korri ­
geres der for de ændringer i nitrit- og nitratkoncentrationen, der er bestemt ved analyse (se bilag V).
 
Endnu en serie kolber er påkrævet, hvis teststoffets toksicitet skal 
undersøges (f.eks. hvis der tidligere er fundet en lav bionedbrydelig ­
hedsværdi).  
Hertil klargøres der endnu en stor kolbe med beluftet uorganisk 
medium (ca. en tredjedel fuld) plus teststof og referencestof normalt i samme slutkoncentrationer som i de andre kolber.
 
Der tilsættes inoculum til kolberne i form af sekundært afløbsvand 
(fra 1 dråbe (ca. 0,05 ml) til 5 ml pr. liter) eller f.eks. flodvand (se 
I.6.4.2). Endelig fyldes der op med beluftet uorganisk medium ved hjælp af en slange, der når helt ned til bunden, så det bliver tilstræk ­
kelig omrøring.
 
VI.2.5.  Antal kolber i en typisk testrække  
I en rypisk testrække anvendes følgende antal kolber:  
— mindst 10 med teststof og inoculum (restopslæmning)  
— mindst 10 kun med inoculum (inoculumblindprøve)  
— mindst 10 med referencestof og inoculum (procedurekontrol)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— og i givet fald 6 kolber med teststof, referencestof og inoculum 
(toksicitetskontrol). Til sikker identifikation af 10-dages-vinduet 
kræves der dog det dobbelte antal kolber.  
VI.2.6. Gennemførelse af testen  
De fremstillede opløsninger fordeles straks i de pågældende grupper 
af BOD-kolber, idet de suges op fra den nederste fjerdedel af den passende store kolbe (ikke bunden) med en slange, og således at alle 
BOD-kolberne fyldes helt. Eventuelle luftbobler fjernes ved en let 
banken på kolbens side. Starttidskolberne analyseres straks for opløst oxygen enten ved Winklers metode eller med elektrode. Indholdet i kolberne kan opbevares til senere analyse efter Winklers metode, 
hvis der straks tilsættes mangan(II)sulfat og natriumhydroxid (det 
første Winkler- reagens). De omhyggeligt tilproppede kolber, hvor oxygenet er fikseret som brunt hydratiseret mangan(III)oxid, opbe ­
vares i mørke ved 10-20
 o C i højst 24 timer, inden Winkler-testen 
gøres færdig. De resterende kolber tiilproppes, idet man sørger for, at der ikke indesluttes nogen luftbobler, og de inkuberes ved 20
 o C i 
mørke. Parallelt med hver serie skal der være en fuldstændig serie til 
bestemmelse af inoculumblindværdien. Under de 28 dages inkube ­
ring udtages der med bestemte mellemrum (mindst en gang om ugen) mindst 2 kolber af hver serie til analyse for opløst oxygen.
 
Med ugentlig prøveudtagning skulle den procentvise fjernelse kunne 
bedømmes i et 14-dages-vindue, mens der ved prøveudtagning hver 
tredje til fjerde dag, hvilket kræver omtrent det dobbelte antal kolber, bliver mulighed for identificering af 10-dages-vinduet.
 
For N-holdige stoffers vedkommende må der korrigeres for oxygen ­
forbrug ved eventuel nitrifikation. Hertil anvendes der en O  2 -elek­
trode til bestemmelse af koncentrationen af opløst oxygen, hvorefter der udtages en prøve fra BOD-kolben til analyse for nitrit og nitrat. Den forbrugte oxygenmængde beregnes på grundlag af forøgelsen i 
nitrit- og nitratkoncentrationen (se bilag V).
 
V.3. DATA OG RAPPORTERING  
VI.3.1.  Behandling af resultaterne  
Først beregnes BOD efter hvert tidsinterval ved at trække oxygen ­
tabet (mg O  2 pr. l) i inoculumblindprøven fra oxygentabet i kolben 
med teststof. Dette korrigerede oxygentab divideres med teststoffets 
koncentration (mg/1), hvorved den specifikke BOD fremkommer i mg oxygen pr. mg teststof. Den procentvise bionedbrydelighed beregnes ved at dividere den specifikke BOD med den specifikke 
ThOD (beregnet som anført i bilag II.2) eller COD (bestemt ved 
analyse, se bilag II.3), dvs.:
 
BOD ¼ ðmg O  2 optaget af teststof Ä mg O  2 optaget af blindprøven Þ 
ðmg teststof i kolben Þ ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 pr. mg teststof.  
% nedbrydning ¼ BOD ðmg O  2=mg teststof Þ 
ThODðmg O  2=mg teststof Þ Ü 100 
eller 
% nedbrydning ¼ BOD ðmg O  2=mg teststof Þ 
CODðmg O  2=mg teststof Þ Ü 100 
Det bemærkes, at de to metoder ikke nødvendigvis giver samme 
resultat; førstnævnte metode foretrækkes.  
Der benyttes den ThOD (NH  4 eller ΝΟ  3 ), der svarer til det forelig ­
gende kendskab til nitrifikation (bilag II.2). Sker der ufuldstændig nitrifikation beregnes korrektionen for oxygenforbruget til nitrifika ­
tionen ud fra ændringerne i nitrit- og nitratkoncentrationen (bilag V).
 
VI.3.2.  Resultaternes gyldighed  
Inoculumblindprøvens oxygentab bør ikke være større end 1,5 mg 
opløst oxygen pr. liter efter 28 dage. Findes der højere værdier, må 
forsøgsteknikkerne gennemgås kritisk. Restkoncentrationen af oxygen i testkolberne må ikke falde til under 0,5 mg/l på noget tidspunkt. Målinger af så lavt oxygenindhold er kun gyldige, hvis 
den anvendte målemetode for opløst oxygen tillader nøjagtig måling 
af så lave indhold.
 
Se også I.5.2.  
VI.3.3.  Rapportering  
Se I.8.  
VI.4. RESULTATSKEMA  
Nedenfor er vist et eksempel på et resultatskema.  
CLOSED BOTTLE TEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE  
3. TESTSTOF  
Navn:  
Stamopløsningens koncentration: … mg/l  
Begyndelseskoncentration i kolbe: … mg/l  
ThOD eller COD: … mg O  2 /mg teststof  
4. INOCULUM  
Kilde:  
Behandling:  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
Eventuel forkonditionering:  
Koncentrationen i reaktionsblandingen: … ml/l  
5. DO-BESTEMMELSE  
Metode: Winkler/elektrode  
Kolbeanalyser  
Inkuberingstid (dage) DO (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Blindprøve (uden 
teststof) 1 C  1 
2 C  2 
Gennemsnit 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Teststof 1 a  1 
2 a  2 
Gennemsnit 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Anmærkning : Der kan anvendes en tilsvarende opstilling for referen ­
cekemikaliet og toksicitetskontrolprøverne  
6. KORREKTION FOR NITRIFIKATION  (se bilag V)  
Inkuberingstid (dage) 0 n  1 n 2 n 3 
i) Nitratkoncentration (mg N/l) 
ii) Ændring i nitratkoncentration (mg N/l) — 
iii) Oxygenækvivalent (mg/l) — 
iv) Nitritkoncentration (mg N/l) 
v) Ændring i nitritkoncentration (mg N/l) — 
vi) Oxygenækvivalent (mg/l) — 
iii) + vi) Total oxygenækvivalent (mg/l) —  
7. TAB AF DO: % NEDBRYDNING  
Tab efter n dage (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
Kolbe 1: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
Kolbe 2: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Tab efter n dage (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
Kolbe 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
konc : af test Ü ThOD for stof 
Kolbe 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
konc : af test Ü ThOD for stof 
% D gnsn. (*)  D 1 Ä D 2 
2 
(*) Tag ikke gennemsnittet, hvis der er en betydelig forskel mellem replikaterne.  
m to = værdi i testkolbe til tid 0  
m tx = værdi i testkolbe til tid x  
m bo = gennemsnitsblindværdi til tid 0  
m bx = gennemsnitsblindværdi til tid x  
Der foretages desuden korrektion for nitrifikation som beregnet i 
punkt 6.  
8. BLINDPRØVER FOR TAB AF DO  
Oxygenforbrug i blindprøve: (m  bo – m  b28 ) mg/l. Dette forbrug 
har betydning for testens gyldighed og må højst være 1,5 mg/l.  
DEL VII.  ΜITI-TEST  (Metode C.4-F)  
VII.1. METODENS PRINCIP  
Oxygenoptagelsen i en omrørt opløsning eller opslæmning af test ­
stoffet i uorganisk medium, som er tilsat inoculum i form af særligt 
dyrkede ikke-tilvænnede mikroorganismer, måles automatisk gennem 
en periode på 28 dage i et mørklagt lukket respirometer ved 25 ± 1  o C. 
Den udviklede kuldioxid absorberes i natriumhydroxid. Bionedbryde ­
ligheden udtrykkes som den optagne oxygenmængde (korrigeret for 
blindprøvens optagelse) i procent af den teoretiske oxygenoptagelse 
(ThOD). Også den procentvise primære bionedbrydelighed beregnes, nemlig på grundlag af supplerende specifikke kemiske analyser ved inkuberingens begyndelse og slutning og eventuelt ved DOC-analyse.
 
VII.2. BESKRIVELSE AF METODEN  
VII.2.1.  Apparatur  
a) Automatisk elektrolytisk BOD-meter eller respirometer, normalt 
med 6 kolber på hver 300 ml og med skåle til CO  2 -absorptions ­
middel  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Lokale med konstant temperatur og/eller vandbad på 25 ± 1  o C 
eller mindre  
c) Membranfiltreringsudstyr (valgfrit)  
d) Kulstofanalysator (valgfri).  
VII.2.2.  Fremstilling af uorganisk medium  
Følgende stamopløsninger fremstilles ud fra reagenser af analyse ­
kvalitet og vand (I.6.I): 
a) monokaliumdihydrogenorthophosphat, KH  2 PO 4 8,50 g 
dikaliummonohydrogenorthophosphat, K  2 HPO  4 21,75 g 
dinatriummonohydrogenorthophosphat dodeca ­
hydrat, Na  2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
ammoniumchlorid, NH  4 Cl 1,70 g 
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter. 
Opløsningens pH skal være 7,2. 
b) magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g 
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter. 
c) calciumchlorid, vandfrit, CaCl  2 27,50 g 
Opløses 1 vand og fortyndes til 1 liter. 
d) jern(III)chlorid hexahydrat, FcCl  3 6 H  2 O 0,25 g 
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter.  
Der udtages 3 ml af opløsning a), b), c) og d), som fortyndes til 1 
liter. 
VII.2.3.  Fremstilling af inoculum  
Der indsamles friske prøver fra mindst 10 lokaliteter, hovedsagelig 
områder, hvor der anvendes og udledes forskellige kemikalier. Fra sådanne lokaliteter som spildevandsanlæg, vandløb, søer og 
havområder indsamles 1-liters prøver af slam, overfladejord, vand, 
mv., og det hele blandes grundigt. Materiale, der flyder ovenpå, fjernes, og efter henstand indstilles supernatantens pH til 7 ± 1 med natriumhydroxid og phosphorsyre.
 
Der benyttes en passende mængde filtrat til at fylde en »fill-and- 
draw« aktiv slambeholder, og væsken beluftes i ca. 23 1/2 time. 
30 minutter efter at beluftningen er standset, borthældes ca. 1/3 af det samlede supernatantvolumen, og der tilsættes en lige så stor mængde af en opløsning (med pH 7), der indeholder 0,1 % glucose, 
0,1 % pepton og 0,1 % monokaliumorthophosphat, og beluftningen 
genoptages. Dette gentages hver dag. Slamenheden drives efter god praksis: Afløbsvandet skal være klart, temperaturen skal holdes på 25 ± 2
 o C, pH skal være 7 ± 1, slam skal bundfældes godt, tilstrækkelig 
beluftning skal opretholdes for at holde blandingen aerob hele tiden, 
protozoer skal være til stede, og slamaktiviteten skal testes mod referencestoffet mindst hver tredje måned. Slammet må tidligst anvendes som inoculum efter en måneds drift og ikke senere end 
efter fire måneders drift. Derefter udtages der regelmæssigt prøver fra 
mindst 10 lokaliteter hver tredje måned.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
For at holde det friske og det gamle slam på samme aktivitet, 
blandes den filtrerede supernatant fra aktivt slam i brug med en 
lige så stor mængde filtreret supernatant fra en frisk indsamlet blan ­
ding fra 10 kilder, og denne væske opdyrkes som ovenfor nævnt. 18- 24 timer efter at enheden er fyldt op, kan der udtages slam til brug 
som inoculum.
 
VII.2.4.  Klargøring af kolber  
Der klargøres 6 kolber som følger:  
nr. 1: teststof i fortyndingsvand, 100 mg/l  
nr. 2, 3 og 4: teststof fortyndet med uorganisk medium til 100 mg/l  
nr. 5: referencestof (f.eks. anilin) fortyndet med uorganisk medium 
til 100 mg/l  
nr. 6: rent uorganisk medium  
Tungtopløselige teststoffer tilsættes direkte på vægt- eller volumen ­
basis eller håndteres som beskrevet i bilag III, bortset fra, at der 
hverken må benyttes opløsningsmidler eller emulgatorer. Der anbringes CO
 2 -absorptionsmiddel i alle kolber i den særlige skål. 
pH i kolbe nr. 2, 3 og 4 justeres til 7,0.  
VII.2.5.  Gennemførelse af testen  
Der tilsættes en lille mængde inoculum til kolbe nr. 2, 3 og 4 
(testopslæmninger), nr. 5 (aktivitetskontrol) og nr. 6 (inoculumblind ­
prøve), således at koncentrationen af opslæmmet tørstof bliver på 30 mg/l. Der tilsættes ikke inoculum til kolbe nr. 1, der tjener som abiotisk kontrol. Udstyret samles, der kontrolleres for lufttæt ­
hed, omrørerne startes, og oxygenoptagelsesmålingen startes i mørke. 
Temperaturen, omrøringen og den coulometriske oxygenoptagelses ­
skriver kontrolleres dagligt, og eventuelle farveændringer i kolberne noteres. Oxygenoptagelsen i de 6 kolber aflæses direkte v.h.a. en 
passende metode, f.eks. på sekskanalsskriveren, som giver en 
BOD-kurve. Ved inkuberingens afslutning, normalt efter 28 dage, måles pH i kolberne, og koncentrationen af resterende teststof og af eventuelle mellemprodukter og, når der er tale om vandopløselige 
stoffer, eventuelt DOC-koncentrationen bestemmes (bilag II.4). Der 
må udvises særlig omhu, når der er tale om flygtige kemikalier. Forventes der nitrifikation, bestemmes om muligt nitrat- og nitritkon ­
centrationen.
 
VII.3. DATA OG RAPPORTERING  
VII.3.1.  Behandling af resultaterne  
Teststoffets oxygenfarbrug (mg) efter et givet tidsrum, korrigeret for 
oxygenoptagelsen i inoculumblindprøven efter samme tidsrum, divideres med den anvendte vægtmængde teststof. Herved frem ­
kommer BOD udtrykt som mg oxygen pr. mg teststof, dvs.
 
BOD ¼ ðmg O  2 optaget af teststoffet  Ä mg O  2 optaget af blindprøven Þ 
ðmg teststof i kolben Þ 
= mg O  2 pr. mg teststof.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Den procentvise bionedbrydning fremkommer af:  
% bionedbrydning ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2=mg kemikalieÞ 
ThOD ðmg O  2=mg kemikalieÞ Ü 100  
For blandinger beregnes ThOD på samme måde som for enkeltstof ­
fer, nemlig på grundlag af grundstofanalysen. Den ThOD, der benyt ­
tes, (ThOD  NH4 eller ThOD  NO3 ) afhænger af, om der slet ikke sker 
nitrifikation eller der sker fuldstændig nitrifikation (bilag II.2). Sker der ufuldstændig nitrifikation beregnes korrektionen for oxygenfor ­
bruget til nitrifikationen ud fra ændringerne i nitrit- og nitratkoncen ­
trationen (bilag V).
 
Den procentvise primære bionedbrydning beregnes ud fra den 
mængde af det specifikke (oprindelige) kemikalie, der forsvinder 
(se I.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 %  
Er der forsvundet teststof i kolbe nr. 1, som måler fysisk og kemisk 
nedbrydning, anføres dette, og teststoffets koncentration (S  b ) i denne 
kolbe efter 28 dage benyttes til beregning af den procentvise bioned ­
brydning.  
Foretages der (valgfrie) bestemmelser af DOC, beregnes den procent ­
vise fuldstændige bionedbrydning ved:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100 %  
som anført under punkt I.7.1. Er der forsvundet teststof (DOC) i 
kolbe nr. 1, som måler fysisk og kemisk nedbrydning, benyttes DOC-koncentrationen i denne kolbe til beregning af den procentvise 
bionedbrydning.
 
Alle resultater noteres på de tilhørende skemaer.  
VII.3.2.  Resultaternes gyldighed  
Inoculumblindprøvens oxygenforbrug er normalt 20-30 mg O  2 /l på 
28 dage og bør ikke være større end 60 mg/l. Findes der værdier 
over 60 mg/l, må data og forsøgsteknikker gennemgås kritisk. Hvis 
pH ligger uden for intervallet 6-8,5 og teststoffets oxygenforbrug er mindre end 60 %, gentages testen med lavere teststofkoncentration.
 
Se også I.5.2.  
Hvis den procentvise nedbrydning af anilin beregnet ud fra oxygen ­
forbrug ikke er større end 40 % efter 7 dage og 65 % efter 14 dage, anses testen for ugyldig.
 
VII.3.3.  Rapportering  
Se I.8.  
VII.4. RESULTATSKEMA  
Nedenfor er vist et eksempel på et resultatskema.  
MITI (I) TEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATO VED TESTENS BEGYNDELSE  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. TESTSTOF  
Navn:  
Stamopløsningens koncentration: … mg/l stof  
Begyndelseskoncentration i kolbe, C  o : … mg/l stof  
Reaktions blandingens volumen, V: … ml  
ThOD eller COD: … mg O  2 /l 
4. INOCULUM  
Lokaliteter for prøveudtagning: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 
3) … 8) … 
4) … 9) … 5) … 10) …
 
Koncentration af opslæmmet tørstof i det aktive slam efter 
akklimatisering med syntetisk spildevand: … mg/l  
Rumfang af aktivt slam pr. liter slutmedium: … ml  
Slamkoncentration i slutmedium: mg/l  
5. OXYGENOPTAGELSE: BIONEDBRYDEL IGHED  
Respirometertype:  
Tid (dage) 
0 7 14 21 28  
O 2 optag, (mg) 
teststof a 1 
a 2 
a 3 
O 2 optag, (mg) 
blindprøve b 
Korrigeret O  2 opt. 
(mg) (a 1 -b) 
(a 2 -b) 
(a 3 -b) 
BOD pr. mg test ­
stof ða Ä bÞ 
C o V Kolbe 1 
Kolbe 2 Kolbe 3 
% nedbrydning
 
BOD 
ThOD Ü 100 2 3 
2 3 
gnsn. (*)
 
(*) Tag ikke gennemsnittet, hvis der er en betydelig forskel mellem replikaterne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Anmærkning : Der kan anvendes en tilsvarende opstilling for referen ­
cekemikaliet og toksicitetskontrolprøverne.  
6. KULSTOFANALYSE (valgfri)  
Kulstofanalysator:  
Kolbe DOC 
% DOC fjernet Gennemsnit 
Målt Korrigeret  
Vand + teststof a 
Slam + teststof b  1 b 1 -c 
Slam + teststof b  2 b 2 -c 
Slam + teststof b  3 b 3 -c 
Kontrolblind c — — —  
% DOC forsvundet :  a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100  
7. DATA FRA SPECIFIK KEMISK ANALYSE  
Restmængde af teststof ved testens 
afslutning % nedbrydning  
blindprøve med vand S  b 
medium med inoculum S a1 
S a2 
S a3 
% nedbrydning ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
% nedbrydning beregnes for kolbe a  1 , a 2 og a  3 . 
8. BEMÆRKNINGER  
En kurve over BOD mod tiden skal vedlægges, hvis den fore ­
ligger.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
Bilag I  
FORKORTELSER OG DEFINITIONER  
DO: Opløst oxygen (mg/l) er koncentrationen af opløst oxygen i en vandig 
prøve.  
BOD: Biokemisk oxygenforbrug (g) er den mængde oxygen, som mikroorga ­
nismer forbruger under metabolisme af teststoffet; udtrykkes også i g 
optaget oxygen pr. g teststof (se metode C.6).  
COD: Kemisk oxygenforbrug (g) er den mængde oxygen, der forbruges ved 
oxidation af teststoffet med varm dichromat i sur væske; det er et mål 
for den tilstedeværende mængde oxiderbart stof; udtrykkes også i g forbrugt oxygen pr. g teststof (se metode C.6).
 
DOC: Opløst organisk kulstof er den mængde organisk kulstof, der er til stede 
i opløsning, passerer gennem et 0,45 μm filter, eller forbliver i centri ­
fugatet efter centrifugering ved 40 000 ms  -2 ± (4 000 g) i 15 minutter.  
ThOD: Teoretisk oxygenforbrug (mg) er den samlede mængde oxygen, der 
kræves til fuldstændig oxidation af et kemisk stof; det beregnes på 
grundlag af bruttoformlen (se bilag II, punkt 2) og udtrykkes også i mg oxygen pr. mg teststof.
 
ThCO  2 : Teoretisk kuldioxid (mg) er den mængde kuldioxid, der ifølge bereg ­
ninger på grundlag af teststoffets kendte eller målte kulstofindhold skulle dannes ved fuldstændig nedbrydning af teststoffet; den udtrykkes også i mg udviklet kuldioxid pr. mg teststof.
 
TOC: En prøves totale indhold af organisk kulstof er summen af organisk 
kulstof i opløsning og i opslæmning.  
IC: Uorganisk kulstof  
TC: En prøves totale kulstofindhold er summen af organisk og uorganisk 
kulstof.  
Primær bionedbrydning:  
er en sådan ændring af et stofs kemiske struktur, fremkaldt ad biologisk vej, at 
stoffet mister sine specifikke egenskaber.  
Fuldstændig bionedbrydning (aerob):  
er den nedbrydningsgrad, der er nået, når mikroorganismer har opbrugt et teststof 
fuldstændigt under samtidig dannelse af kuldioxid, vand, uorganiske salte og nye cellebestanddele (biomasse).
 
Let bionedbrydelig:  
kendetegner en arbitrær klasse af kemikalier, der har klaret visse specifikke 
screeningstest for fuldstændig bionedbrydning; disse test er så krævende, at 
sådanne stoffer i vandigt miljø under aerobe forhold hurtigt vil blive fuldstændigt 
nedbrudt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Inherent (potentielt) bionedbrydelig:  
karakteriserer en klasse af kemikalier, som ved enhver anerkendt bionedbrydelig ­
hedstest klart har vist sig at kunne omdannes ved bionedbrydning (primær eller fuldstændig).
 
Behandlingsmulighed:  
er muligheden for at fjerne et stof ved biologisk spildevandsrensning uden at 
spildevandsrensningsprocessernes normale forløb forstyrres. Generelt er alle let bionedbrydelige, men ikke alle inherent bionedbrydelige, stoffer mulige at behandle. Abiotiske processer kan også spille ind.
 
Lag-periode:  
er det tidsrum, der i en elimineringstest forløber fra inokuleringen, indtil nedbryd ­
ningsprocenten er mindst 10 %. Lag-perioden er ofte stærkt varierende og vanskeligt reproducerbar.
 
Nedbrydnings tid:  
er tidsrummet mellem lagperiodens afslutning og det tidspunkt, hvor nedbryd ­
ningen har nået 90 % af sin maksimale værdi.  
10-dages-vindue:  
er den periode på 10 dage, der begynder, når nedbrydningen er nået op på 10 %.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
Bilag II  
BEREGNING OG BESTEMMELSE AF PASSENDE 
HOVEDPARAMETRE  
Der vil afhængigt af den valgte metode være behov for forskellige hovedpara ­
metre. I dette afsnit beskrives, hvordan disse værdier udledes. Parametrenes 
anvendelse er beskrevet i de enkelte metoder.  
1. Kulstofindhold  
Kulstofindholdet kan enten beregnes ud fra teststoffets grundstofsammen ­
sætning elier bestemmes ved elementaranalyse.  
2. Teoretisk oxygenforbrug (ThOD)  
Det teoretiske oxygenforbrug (ThOD) kan beregnes, hvis grundstofsam ­
mensætningen er kendt, og ellers bestemmes ved elementaranalyse. For 
forbindelsen:  
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
er det uden nitrifikation  
ThOD  NH4 ¼ 16 ð2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oÞ 
MW  mg/mg  
og med nitrifikation  
ThOD  NO3 ¼ 16ð2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2na Ä oÞ 
MW  mg/mg  
3. Kemisk oxygenforbrug (COD)  
Det kemiske oxygenforbrug (COD) bestemmes efter metode C.6.  
4. Opløst organisk kulstof (DOC)  
Opløst organisk kulstof (DOC) defineres som den organiske kulstofmængde 
i et kemikalie eller en kemikalie-blanding, som i vandig opløsning kan passere gennem et 0,45 μm filter.
 
Der udtages prøver fra testbeholderne, som straks filtreres gennem filtre ­
ringsudstyret, der er forsynet med et passende membranfilter. De første 20 ml af filtratet bortkastes (ved små filtre kan denne mængde reduceres). Der opsamles en mængde på 10-20 ml til kulstofanalyse (ved indsprøjtning 
mindre, afhængigt af den anvendte kulstofanalysator). DOC-koncentra ­
tionen bestemmes ved hjælp af en organisk kulstofanalysator, som tillader nøjagtig bestemmelse af en kulstofkoncentration på mindre end 10 % af startkoncentrationen af DOC i testen.
 
Kan filtrerede prøver ikke analyseres samme arbejdsdag, kan de opbevares i 
højst 48 timer i køleskab ved 2-4  o C eller i længere tid ved – 18  o C. 
Anmærkninger:  
Membranfiltre er ofte behandlet med overfladeaktive stoffer, så de bliver 
mere hydrofile. De kan derfor indeholde op til flere mg opløseligt organisk 
kulstof, som vil gribe forstyrrende ind i bionedbrydehghedsbestemmelsen. De overfladeaktive stoffer og andre opløselige organiske stoffer fjernes fra filtrene ved kogning i demineraliseret vand i 3 gange 1 time. Derefter kan 
filtrene opbevares i vand i op til 1 uge. Benyttes der engangsfiltre, må hvert 
parti kontrolleres for afgivelse af opløseligt organisk kulstof.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
På visse typer membranfiltre kan der ske adsorption af teststoffet. Det 
tilrådes derfor at kontrollere, at teststoffet ikke tilbageholdes på filteret.  
Centrifugering ved 40 000 ms~  2 (4 000 g) i 15 minutter kan træde i stedet 
for filtrering, når der skal skelnes mellem TOC og DOC. Metoden er ikke pålidelig ved en startkoncentration på < 10 mg DOC pr. l, da enten ikke alle bakterier fjernes eller noget af kulstoffet i bakteriernes cytoplasma 
genopløses.
 
BIBLIOGRAFI  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed., Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen 
Demand, 1965, Ρ 65. 
— Wagner, R. Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38409 Teil 41 — Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser- 
, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauer ­
stoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschüß Wasserwesen (NAW) in 
DIN Deutsches Institut fur Normung e.V.
 
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
Bilag IIΙ 
VURDERING AF TUNGTOPLØSELIGE STOFFERS 
BIONEDBRYDELIGHED  
Nedenstående forhold kræver særlig opmærksomhed ved test af tungtopløselige 
stoffers bionedbrydelighed.  
Homogene væsker vil sjældent volde problemer ved prøveudtagningen, hvorimod 
det anbefales at homogenisere faste materialer på passende måde, således at fejl 
som følge af inhomogenitet undgås. Der må udvises særlig omhu, når der skal udtages en repræsentativ prøve på nogle få mg af blandinger af kemikalier og af stoffer, der indeholder store mængder urenheder.
 
Under testen kan der anvendes forskellige former for omrøring. Omrøringen skal 
blot være så kraftig, at kemikaliet holdes dispergeret, og overophedning, stærk 
skumning og voldsomme forskydningskræfter skal undgås.  
Der kan benyttes en emulgator tii at frembringe en stabil dispersion af kemikaliet. 
Emulgatoren må ikke være toksisk for bakterier og må hverken kunne bioned ­
brydes eller vare skumdannende under testbetingelserne.  
Der gælder samme kriterier for opløsningsmidler som for emulgatorer.  
Det frarådes at benytte faste bærematerialer til faste teststoffer, hvorimod de kan 
være egnede til olieagtige stoffer.  
Når der anvendes hjælpestoffer såsom emulgatorer, opløsningsmidler og bære ­
materialer, udføres der en blindprøve med hjælpestoffet.  
Alle tre respirometertest, CO  2 , BOD og MITI, kan benyttes til undersøgelse af 
tungtopløselige stoffers bionedbrydelighed.  
BIBLIOGRAFI  
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly-soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833.  
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
Bilag IV  
VURDERING AF BIONEDBRYDELIGHEDEN AF KEMISKE STOFFER, 
DER MISTÆNKES FOR AT VÆRE TOKSISKE FOR INOCULUM  
Hvis et kemisk stof, som underkastes en test for let bionedbrydelighed, ikke 
synes at være bionedbrydeligt, tilrådes det at følge nedenstående fremgangsmåde, 
hvis der ønskes skelnet mellem hæmning og manglende nedbrydelighed (Rey ­
nolds et al., 1987).  
Der anvendes samme eller tilsvarende inoculum til toksicitetstest som til bioned ­
brydningstest.  
For at kunne vurdere toksiciteten af kemikalier, der undersøges i test for let 
bionedbrydelighed, kan man anvende en af følgende metoder eller en kombina ­
tion af dem: Hæmning af slammets respirationshastighed (aktiveret slam — 
respirationshæmningstest — direktiv 88/302/EØF); BOD og/eller væksthæm ­
ningstest.  
Hvis hæmning som følge af toksicitet skal undgås, anbefales det at benytte test ­
stofkoncentrationer i test for let bionedbrydelighed, som er højst 1/10 af de EC  50 - 
værdier (eller højst de EC  20 -værdicr), der er fundet ved toksicitetstest. Stoffer, 
hvis EC  50 er sterre end 300 mg/l, vil næppe have toksiske virkninger i test for let 
bionedbrydelighed.  
En EC  50 på mindre end 20 mg/l vil sandsynligvis skabe betydelige vanskelig ­
heder for den efterfølgende testning. Testkoncentrationerne skal være lave, 
hvilket kræver anvendelse af den strenge og følsomme Closed Bottle-test eller af
 14 C-mærket materiale. Alternativt kan der ved tilvænning af inoculum blive 
mulighed for at benytte højere teststofkoncentrationer. I sidstnævnte tilfælde 
mister testen for let bionedbrydelighed dog sin specifikke karakter.  
BIBLIOGRAFI  
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
Bilag V  
KORREKTION AF NITRIFIKATIONENS INTERFERENS PÅ 
OXYGENOPTAGELSEN  
Fejl ved at undlade at tage hensyn til nitrifikation ved vurdering af bionedbry ­
deligheden af teststoffer, der ikke indeholder N, er minimal (højst 5 %), selv om 
oxidationen af mediets indhold af ammonium-N svinger vilkårligt fra testprøve til 
blindprøve. For teststoffer, der indeholder N, kan der imidlertid opstå væsentlige fejl.
 
Hvis der sker ufuldstændig nitrifikation, kan reaktionsblandingens iagttagne 
oxygenoptagelse korrigeres for den oxygenmængde, der er medgået til oxidation 
af ammonium til nitrit og nitrat, hvis ændringerne i nitrit- og nitratkoncentra ­
tionen under inkuberingen bestemmes under hensyntagen til følgende reaktions ­
ligninger: 
2 NH  4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
brutto: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Ud fra ligning (1) bliver oxygenoptagelsen ved oxidation af 28 g nitrogen i form 
af ammoniumchlorid (NH  4 Cl) til nitrit 96 g, dvs. en faktor på 3,43 (96/28). På 
tilsvarende måde bliver oxygenoptagelsen ved oxidation af 28 g nitrogen til nitrat (3) 128 g, dvs. en faktor på 4,57 (128/28).
 
Da reaktionerne er sekventielle, idet de finder sted p.g.a. hver deres bakteriearter, 
kan nitritkoncentrationen stige eller falde; i sidstnævnte tilfælde vil der blive dannet en ækvivalent mængde nitrat. Derfor bliver oxygenforbruget ved nitrat ­
dannelsen 4,57 gange forøgelsen i nitratkoncentrationen, hvorimod den oxygen ­
mængde, der er involveret i nitritdannelsen, er 3,43 gange forøgelsen i nitritkon ­
centrationen, eller ved et fald i nitritkoncentrationen, et oxygentab på —3,43 gange koncentrationsfaldet.
 
Det vil sige, at 
O 2 -forbrug ved nitratdannelse = 4,57 × N-nitratkoncentrations ­
forøgelsen (4) 
og 
O 2 -forbrug ved nitritdannelse = 3,43 × N-nitritkoncentrationsfor ­
øgelsen (5) 
og 
O 2 -tab ved nitritomdannelse = – 3,43 × N-nitratkoncentrations ­
faldet (6) 
Derved bliver 
O 2 -forbrug til nitrifikation = ± 3,43 × N-nitritkoncentrations ­
ændringen + 4,57 × N-nitratkoncentrationsforøgelsen (7) 
og dermed 
O 2 -forbrug til C-oxidation = samlet iagttaget forbrug — forbrug 
til nitrifikation (8). 
Alternativt kan oxygenoptagelsen som følge af nitrifikation som en første tilnær ­
melse sættes til 4,57 × tilvæksten i oxideret N, hvis kun total oxyderet Ν 
bestemmes.  
Den korrigerede værdi for oxygenforbruget til C-oxidation sammenlignes dernæst 
med ThOD  NH4 beregnet efter bilag II.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. NEDBRYDNING — BIOKEMISK OXYGENFORBRUG  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med metoden er måling af det biokemiske oxygenforbrug 
(BOD) for faste eller flydende organiske stoffer.  
Data, som opnås med denne test, vedrører vandopløselige stoffer; 
dog kan, i det mindste i princippet, flygtige stoffer samt stoffer 
med lav vandopløselighed også testes.  
Denne metode kan kun anvendes på organiske testmaterialer, der 
ikke virker hæmmende for bakterier ved den koncentration, som anvendes ved testen. Hvis testmaterialet ikke lader sig opløse ved 
testkoncentrationen, kan det være nødvendigt at anvende særlige 
foranstaltninger, såsom ultralyddispersion for at opnå god dispersion af testmaterialet.
 
Oplysninger om kemikaliets toksicitet kan være nyttige for fortolkningen 
af lave resultater og ved valget af passende testkoncentrationer.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
BOD defineres som den mængde opløst oxygen, der kræves til 
biokemisk oxidation af en nærmere angivet mængde opløsning af stoffet under foreskrevne betingelser.
 
Resultatet udtrykkes som g BOD pr. g undersøgt stof.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Brug af et egnet referencestof til kontrol af inoculums aktivitet er 
ønskelig.  
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
En afmålt mængde stof, opløst eller dispergeret i et egnet og godt 
gennemluftet medium, podes med mikroorganismer og inkuberes ved 
konstant kendt temperatur i mørke.  
BOD bestemmes som forskellen mellem indholdet af opløst oxygen 
ved forsøgets begyndelse og ved forsøgets afslutning. Forsøgets varighed skal være mindst fem dage og ikke over 28 dage.
 
Der udføres parallelt en blindprøve uden indhold af reststof.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
En BOD-bestemmelse kan ikke betragtes som en gyldig bestemmelse 
af et stofs bionedbrydelighed, men kun som en screeningtest.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
En foreløbig opløsning eller dispersion af stoffet fremstilles for at 
opnå en BOD-koncentration, som er forenelig med den anvendte 
metode. BOD bestemmes derpå efter en hvilken som helst egnet 
national eller international standardmetode.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. DATA OG EVALUERING  
BOD-indholdet i opløsningen beregnes efter den valgte standardme ­
tode og omregnes til g BOD pr. g stof.  
3. RAPPORTERING  
Den anvendte metode skal anføres.  
Det biokemiske oxygenforbrug skal være gennemsnittet af mindst tre 
gyldige målinger.  
Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for fortolkningen 
skal rapporteres, navnlig med hensyn til stoffets egen sammensæt ­
ning, urenheder, fysiske tilstand og toksiske virkninger, som vil kunne påvirke resultaterne.
 
Eventuel brug af tilsætningsstof til at hindre biologisk nitrifikation 
skal rapporteres.  
4. HENVISNINGER  
Liste over standardiserede metoder, f.eks.  
NF Τ 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik 
(BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, 
London.  
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n 
days. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. NEDBRYDNING — KEMISK OXYGENFORBRUG  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med denne metode er at måle det kemiske oxygenforbrug 
(COD) for faste og flydende organiske stoffer på en vilkårlig stan ­
dardiseret måde under bestemte laboratoriebetingelser.  
Oplysninger om stoffets formel vil være nyttige ved gennemførelse 
af testen og for fortolkningen af de opnåede resultater (f.eks. halo ­
gensalte, organiske jern(II)salte, organiske chlorforbindelser).  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Det kemiske oxygenforbrug er et mål for et stofs evne til at kunne 
oxideres, og det udtrykkes som den ækvivalente mængde oxygen i det oxiderende reagens, der forbruges af stoffet under bestemte labo ­
ratoriebetingelser.
 
Resultatet udtrykkes som g COD pr. g undersøgt stof.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Anvendelse af referencestoffer er ikke påkrævet, hver gang et nyt 
stof skal undersøges. Referencestoffer skal først og fremmest tjene til lejlighedsvis kalibrering af metoden og til sammenligning med resul ­
tater opnået med andre metoder.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
En afmålt mængde af stoffet, opløst eller dispergeret i vand, oxideres 
med kaliumdichromat i stærkt svovlsur opløsning med sølvsulfat som katalysator under tilbagesvaling i to timer. Den uforbrugte mængde dichromat bestemmes ved titrering med en standardopløs ­
ning af ferroammoniumsulfat.
 
I tilfælde af chlorholdige stoffer tilsættes mercurisulfat (  1 ) for at 
nedsætte interferens fra chlorid.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Da metoden har en vis vilkårlig karakter, må COD betragtes som en 
»oxiderbarhedsindikator«, der er et praktisk mål for indholdet af 
organisk stof.  
Chlorid kan forstyrre målingen; også uorganiske reducerende eller 
oxiderende stoffer kan forstyrre COD-bestemmelsen.  
Visse cykliske forbindelser og mange flygtige stoffer (f.eks. lavere 
fedtsyrer) oxideres ikke fuldstændigt ved denne metode.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Der fremstilles en foreløbig opløsning eller dispersion af stoffet, 
således at der opnås en COD-værdi mellem 250 og 600 mg pr. liter.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Brugte opløsninger, der indeholder mercurisalte, behandles således, at der ikke spredes 
kviksølv: i miljøet.
 Bemærkning:  
I tilfælde af vanskeligt opløselige og ikke dispergerbare stoffer kan 
der afvejes en mængde fint pulveriseret eller væskeformigt stof 
svarende til ca. 5 mg COD, som overføres til forsøgsopstillingen med vand.
 
Det kemiske oxygenforbrug kan ofte, og især for stoffer med ringe 
opløselighed, med fordel bestemmes med en variant af metoden, 
nemlig et lukket system med trykudligning (H. Kelkenberg, 1975). 
Med denne modifikation kan der ofte med held foretages kvantitativ bestemmelse af forbindelser, der kun vanskeligt kan bestemmes ved konventionelle metoder, f.eks. eddikesyre. Metoden duer dog ikke til 
pyridin. Forøgelse af kaliumdichromatkoncentrationen til 0,25 Ν 
(0,0416 M) som anført i henvisning (1) kan lette den direkte afvej ­
ning af 5-10 mg stof, hvilket er en betingelse for COD-bestemmelse på stoffer med ringe vandopløselighed (henvisning (2)).
 
I øvrigt bestemmes COD derefter ved hjælp af en egnet national eller 
international standardmetode.  
2. DATA OG EVALUERING  
COD-indholdet i forsøgskolben beregnes i henhold til den valgte 
standardmetode og omregnes til g COD pr. g teststof.  
3. RAPPORTERING  
Den anvendte referencemetode skal anføres.  
Det kemiske oxygenforbrug skal være et gennemsnit af mindst tre 
målinger. Alle oplysninger og bemærkninger af betydning for 
fortolkningen af resultaterne skal rapporteres, navnlig med hensyn 
til stoffets egen sammensætning, urenheder og fysiske tilstand (hvis de kendes), som vil kunne påvirke resultaterne.
 
Anvendelse af mercurisulfat til formindskelse af interferens fra 
chlorid skal rapporteres.  
4. HENVISNINGER  
(1) Kelkenberg, H. Z, von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  
Liste over standardiserede metoder, f.eks.:  
NBN Τ 91-201: Determination of the chemical oxygen 
demand.  
ISBN 0 11 7512494: Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF Τ 90-101: Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = water analysis: Determination of the chemical 
oxygen: demand.  
DIN 38409-H-41: Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3: Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060: Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. NEDBRYDNING — ABIOTISK NEDBRYDNING: HYDROLYSE 
SOM FUNKTION AF pH  
1. METODE  
Denne testmetode er ækvivalent med OECD TG 111 (2004).  
1.1. INDLEDNING  
Kemiske stoffer kan tilføres overfladevande ved direkte udledning, 
vinddrift, afstrømning, afvanding, affaldsbortskaffelse, udledning fra industri, husholdninger eller landbrug samt ved afsætning fra atmos ­
færen og kan i sådanne vande omdannes ved kemiske (f.eks. hydro ­
lyse, oxidation), fotokemiske og/eller mikrobielle processer. I denne 
vejledning beskrives en laboratoriemetode til vurdering af abiotisk hydrolytisk omdannelse af kemiske stoffer i akvatiske systemer ved de i miljøet normalt forekommende pH-værdier (pH 4-9), baseret på 
eksisterende guidelines (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
 
Formålet med forsøgene er at bestemme i) hydrolysehastigheden af 
prøvestoffet som funktion af pH og ii) identitet eller art af samt 
dannelses- og nedbrydningshastighed for hydrolyseprodukter, som 
organismer kan blive udsat for. Sådanne undersøgelser kan være påkrævede for kemiske stoffer, der direkte tilføres vand eller må forventes at nå miljøet ad de andre veje beskrevet ovenfor.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Se bilag 2.  
1.3. METODENS ANVENDELSESOMRÅDE  
Metoden finder anvendelse på alle kemiske stoffer (umærkede eller 
mærkede), for hvilke der foreligger en tilstrækkelig nøjagtig og følsom analysemetode. Den finder anvendelse på tungtflygtige og ikke-flygtige forbindelser med tilstrækkelig vandopløselighed. 
Metoden bør ikke anvendes på stoffer, der er letflygtige fra vand 
(f.eks. rygningsmidler eller organiske opløsningsmidler) og således ikke kan holdes i opløsning under de her beskrevne forsøgsbetingel ­
ser. Den kan være vanskelig at anvende på stoffer med meget ringe 
vandopløselighed (8).
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Sterile vandige bufferopløsninger med forskellige pH-værdier (pH 4, 
7 og 9) behandles med prøvestoffet og inkuberes i mørke under kontrollerede laboratoriebetingelser (ved konstant temperatur). Efter 
passende tidsintervaller analyseres bufferopløsningerne for prøve ­
stoffet og for hydrolyseprodukter. Anvendelse af mærket prøvestof (f.eks.
 14 C) letter opstilling af en massebalance.  
I metoden anvendes en trinvis fremgangsmåde som illustreret og 
forklaret i bilag 1. Hvert trin udløses af resultaterne af det foregående 
trin. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. OPLYSNINGER OM PRØVESTOFFET  
Til måling af hydrolysehastighed kan anvendes umærket eller 
mærket prøvestof. Til undersøgelse af hydrolysevejen og opstilling af massebalance er mærket stof sædvanligvis at foretrække; i særlige 
tilfælde er mærkning dog ikke absolut nødvendig.
 14 C-mærkning 
anbefales, men andre isotoper, såsom  13 C, 15 N eller  3 H, kan ligeledes 
være nyttige. Mærket bør så vidt muligt placeres i molekylets mest stabile del(e). Indeholder prøvestoffet således én ring, skal denne 
ring være mærket; indeholder stoffet to eller flere ringe, kan det 
være nødvendigt med separate undersøgelser til fastlæggelse af skæbnen af hver mærket ring og til at skaffe tilstrækkelige oplys ­
ninger om dannelsen af hydrolyseprodukter. Prøvestoffets renhed 
skal være mindst 95 %.
 
Før udførelse af et hydrolyseforsøg bør følgende oplysninger om 
prøvestoffet foreligge:  
a) vandopløselighed (testmetode A.6)  
b) opløselighed i organiske opløsningsmidler  
c) damptryk (testmetode A.4) og/eller Henrys lovkonstant  
d) fordelingskoefficient n-oktanol/vand (testmetode A.8)  
e) dissociationskonstant (pK  a ) (OECD Guideline 112) (9)  
f) når det er hensigtsmæssigt, direkte og indirekte fototransfor ­
mationshastighed i vand.  
Der bør foreligge analysemetoder til kvantitativ bestemmelse afprø ­
vestoffet og, hvis relevant, identifikation og kvantitativ bestemmelse 
af hydrolyseprodukter i vandige opløsninger (se også punkt 1.7.2).  
1.6. REFERENCESTOFFER  
Når det er muligt, bør der anvendes referencestoffer til identifikation 
og kvantitativ bestemmelse af hydrolyseprodukter ved spektrosko ­
piske og kromatografiske metoder eller andre metoder med tilstræk ­
kelig følsomhed.  
1.7. KVALITETSKRITERIER  
1.7.1.  Genfinding  
Analyse af mindst dobbelte bufferopløsninger eller af ekstrakter 
deraf efter tilsætning af prøvestoffet giver et første fingerpeg om analysemetodens repeterbarhed og om ensartetheden af tilsætningen 
af prøvestoffet. Genfindingsgraden for senere forsøgsstadier fås af de 
respektive massebalancer (når mærket stof anvendes). Genfindingen bør være mellem 90 % og 110 % for mærkede og umærkede kemiske stoffer (7). Hvis det er teknisk vanskeligt at nå dette 
område, er en genfindingsgrad på 70 % for umærkede kemiske 
stoffer acceptabel, men skal begrundes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Analysemetodens repeterbarhed og følsomhed  
Repeterbarheden af de(n) analysemetode(r), der senere anvendes til 
kvantificering af prøvestoffet og hydrolyseprodukter, kan kontrol ­
leres ved dobbeltanalyse af de samme bufferopløsninger (eller af 
ekstrakter deraf), efter at der er dannet en tilstrækkelig mængde 
hydrolyseprodukter til kvantitativ bestemmelse.  
Analysemetoden skal være tilstrækkelig følsom til at kvantificere 
prøvestofkoncentrationer ned til 10 % eller derunder af begyndelses ­
koncentrationen. Hvis det er relevant, skal analysemetoderne desuden 
være tilstrækkelig følsomme til kvantificering af eventuelle hydro ­
lyseprodukter, der udgør 10 % eller mere af den tilsatte mængde (til et vilkårligt tidspunkt under undersøgelsen) ned til 25 % eller 
derunder af deres spidskoncentration.
 
1.7.3.  Konfidensintervaller for hydrolysekinetikdata  
Der beregnes og angives konfidensintervaller for alle regressions ­
koefficienter, hastighedskonstanter, halveringstider og eventuelle andre kinetikparametre (f.eks. DT
 50 ). 
1.8. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.8.1.  Udstyr og apparatur  
Undersøgelsen udføres i glasbeholdere (f.eks. reagensglas eller små 
kolber), om nødvendigt i mørke og under sterile betingelser, 
medmindre foreløbige oplysninger (som f.eks. n-oktanol-vand 
fordelingskoefficienten) viser, at prøvestoffet kan adhærere til glas. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at overveje alternative materialer (som f.eks. Teflon). Problemet med adhæsion til glas kan 
desuden løses ved en eller flere af følgende metoder:
 
— bestemmelse af den masse prøvestof og hydrolyseprodukter, der 
er sorberet til prøvebeholderen  
— anvendelse af ultralydsbad  
— vask af alt glasapparatur i opløsningsmiddel ved hvert prøvetag ­
ningsinterval  
— anvendelse af færdigformuleret produkt  
— anvendelse af ekstra hjælpefortynder ved tilsætning af prøvestof 
til systemet; som hjælpefortynder må undgås stoffer der hydro ­
lyserer prøvestoffet.  
Til inkubering af de forskellige prøveopløsninger skal normalt 
anvendes temperaturstyrede vandbade eller termostaterede inkubato ­
rer. 
Sædvanligt laboratorieudstyr skal være til rådighed, herunder specielt 
følgende:  
— pH-meter  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analyseapparatur som f.eks. GC, HPLC og TLC med passende 
detektionssystem til analyse af radioaktivt mærkede eller umær ­
kede stoffer eller til omvendt isotopfortyndingsmetode  
— instrumenter til identifikation (f.eks. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR, mv.)  
— væskescintillationstæller  
— skilletragte til væske-væske ekstraktion  
— udstyr til koncentrering af opløsninger og ekstrakter (f.eks. rota ­
tionsfordamper)  
— temperaturreguleringsanordning (f.eks. vandbad).  
Kemiske reagenser, f.eks. følgende:  
— organiske opløsningsmidler af analysekvalitet, således hexan, 
dichlormethan mv.  
— scintillationsvæske  
— bufferopløsninger (som nærmere angivet i pkt. 1.8.3).  
Alt glasudstyr, vand af analysekvalitet og bufferopløsninger, som 
anvendes i hydrolyseforsøgene, skal være steriliseret.  
1.8.2.  Tilsætning af prøvestoffet  
Prøvestoffet tilsættes som vandig opløsning til de forskellige buffe ­
ropløsninger (se bilag 3). Om nødvendigt kan man for at få opløst tilstrækkeligt af stoffet tilsætte lidt vandopløseligt opløsningsmiddel 
(f.eks. acetonitril, acetone, ethanol) når prøvestoffet tilsættes og 
fordeles, men normalt ikke i større mængde end 1 % v/v. Anven ­
delse af opløsningsmidler i højere koncentration (f.eks. til tungtop ­
løselige prøvestoffer) er kun tilladt, hvis det godtgøres at opløsnings ­
midlet er uden indflydelse på hydrolysen afprøvestoffet.
 
Rutinemæssig brug af formuleret produkt kan ikke anbefales, da det 
ikke kan udelukkes at hjælpestoffer i formuleringen vil påvirke hydrolyseprocessen. For prøvestoffer der er tungtopløselige i vand, og for stoffer der adhærerer til glas (se 1.8.1) kan anvendelse af det 
formulerede stof dog være et hensigtsmæssigt alternativ.
 
Prøvestoffet bør anvendes i én koncentration, der ikke bør være over 
0,01 M eller det halve af mætningskoncentrationen (se bilag 1).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Bufferopløsninger  
Hydrolyseforsøget udføres ved pH 4, 7 og 9. Vand og kemikalier 
anvendt til fremstilling af sådanne bufferopløsninger skal være af analysekvalitet. I bilag 3 beskrives nogle nyttige buffersystemer. 
Man må være opmærksom på, at det anvendte buffersystem kan 
influere på hydrolysehastigheden, og er dette tilfældet, må der vælges et andet buffersystem (
 1 ). 
pH af hver bufferopløsning skal kontrolleres med et kalibreret pH- 
meter med en nøjagtighed på mindst 0,1 ved den foreskrevne tempe ­
ratur.  
1.8.4.  Forsøgsbetingelser  
1.8.4.1.  Forsøgstemperatur  
Hydrolyseforsøgene skal udføres ved konstant temperatur. Til brug 
ved ekstrapolation er det vigtigt, at temperaturen holdes konstant inden for ± 0,5
 o C. 
Der bør udføres et indledende forsøg (trin 1) ved en temperatur på 
50 o C, hvis prøvestoffets hydrolyseegenskaber er ukendte. Kinetiske 
forsøg på efterfølgende trin udføres ved mindst tre temperaturer (her ­
under forsøget ved 50  o C), medmindre prøvestoffet ved trin 1- 
forsøget er fundet stabilt over for hydrolyse. Det foreslås at anvende et temperaturområde på 10-70
 o C (idet mindst én temperatur 
bør være under 25  o C), der således dækker rapporteringstempera ­
turen på 25  o C og størstedelen af det temperaturområde, der fore ­
kommer i marken.  
1.8.4.2.  Lys og oxygen  
Alle hydrolyseforsøg skal udføres med en metode, der bevirker at 
fotolytiske effekter undgås. Der skal træffes alle nødvendige 
forholdsregler til undgåelse af oxygen (f.eks. ved gennembobling 
med helium, nitrogen eller argon i 5 minutter, før opløsningen frem ­
stilles).  
1.8.4.3.  Forsøgets varighed  
Forprøven strækker sig over 5 døgn, hvorimod de efterfølgende 
forsøg fortsætter indtil prøvestoffet er 90 % hydrolyseret, dog højst 30 døgn.
 
1.8.5.  Forsøgets udførelse  
1.8.5.1.  Forprøve (trin 1)  
Forprøven udføres ved 50 ± 0,5  o C og pH 4,0, 7,0 og 9,0. Iagttages 
mindre end 10 % hydrolyse efter 5 døgn (t  0,5 25 o C > 1 år), anses 
prøvestoffet for hydrolytisk stabilt, og yderligere forsøg kræves normalt ikke. Vides stoffet at være ustabilt ved miljømæssigt rele ­
vante temperaturer (
 2 ), er forprøve unødvendig. Analysemetoden skal 
være tilstrækkelig præcis og følsom til at påvise en reduktion på 10 % af begyndelseskoncentrationen.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey og Mill anbefaler brug af borat- eller acetatbuffer i stedet for fosfat (11). 
( 2 ) Sådanne oplysninger kan komme fra andre kilder, således hydrolysedata for strukturelt 
beslægtede forbindelser, fra litteraturen eller fra andre semikvantitative forprøver med 
hydrolyse af prøvestoffet i en tidligere udviklingsfase.
 1.8.5.2.  Hydrolyse af ustabile stoffer (trin 2)  
Forsøget på næste trin (avanceret) udføres ved de pH-værdier, hvor 
prøvestoffet i ovennævnte forprøve er fundet ustabilt. De bufrede opløsninger af prøvestof termostateres ved de valgte temperaturer. 
Med henblik på fastlæggelse af førsteordens-kinetik analyseres hver 
reaktionsopløsning med tidsintervaller svarende til mindst seks adskilte datapunkter, normalt svarende til mellem 10 % og 90 % hydrolyse af prøvestoffet. De enkelte gentagelsesprøver (mindst 
dobbeltprøver, der opbevares i separate reaktionsbeholdere) udtages, 
og indholdet analyseres på hvert af mindst seks prøvetagningstids ­
punkter (svarende til mindst tolv datapunkter med gentagelser). Det 
anses for uhensigtsmæssigt at anvende en enkelt bulkprøve og heraf 
udtage de enkelte aliquoter af prøveopløsningen på hvert prøvetag ­
ningstidspunkt, da der derved ikke tages hensyn til analysevariatio ­
nen, og da kontamination af prøveopløsningen kan være et problem. 
Sterilitetskontrol udføres ved afslutningen af det efterfølgende trin 
(dvs. ved 90 % hydrolyse eller efter 30 døgn). Iagttages ingen nedbrydning (dvs. omdannelse), anses sterilitskontrol dog for unød ­
vendig.
 
1.8.5.3.  Identifikation af hydrolyseprodukter (trin 3)  
De vigtigste hydrolyseprodukter, i det mindste dem, der udgør 
> 10 % af den tilførte dosis, identificeres med egnede analysemeto ­
der. 
1.8.5.4.  Ikke-obligatoriske forsøg  
For hydrolytisk ustabile prøvestoffer kan supplerende forsøg ved 
andre pH-værdier end 4, 7 og 9 være nødvendige. Det kan således være nødvendigt at foretage et forsøg ved større surhedsgrad (f.eks. pH 1,2) ved en enkelt fysiologisk relevant temperatur (37
 o C). 
2. DATA  
Mængden af prøvestof og af eventuelle hydrolyseprodukter angives 
i % af den anvendte begyndelseskoncentration og, når det er 
hensigtsmæssigt, i mg/l for hvert prøvetagningsinterval og for hver pH-værdi og forsøgstemperatur. Anvendes mærket prøvestof, skal der desuden opstilles en massebalance, angivet i procent af den 
anvendte begyndelseskoncentration.
 
De logaritmisk transformerede prøvestofkoncentrationsdata afbildes 
grafisk som funktion af tiden. Alle vigtige hydrolyseprodukter, i det mindste dem der udgør ≥ 10 % af den anvendte dosis, identifi ­
ceres, og deres logaritmisk transformerede koncentration afsættes 
som for moderstoffet til påvisning af deres dannelses- og nedbryd ­
ningshastighed.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Der skal foretages en nøjagtigere bestemmelse af halveringstider eller 
DT 50 -værdier ved passende kinetiske modelberegninger. For hvert 
pH og hver temperatur angives halveringstid og/eller DT  50 (med 
konfidensinterval) sammen med en beskrivelse af den anvendte 
model, den kinetiske orden og determinationskoefficienten (r  2 ). 
Samme beregninger foretages desuden for hydrolyseprodukterne, når det er relevant.
 
For kinetikforsøg udført ved forskellige temperaturer angives hastig ­
hedskonstanterne for hydrolysen svarende til en pseudoførsteordens ­
reaktion (k  obs ) som funktion af temperaturen. Beregningen baseres på 
opdeling af k  obs i hastighedskonstanter for syrekatalyseret, neutral og 
basekatalyseret hydrolyse (hhv. k  H , k neutral  og k  Oh ) og på Arrhenius- 
ligningen:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
hvor A  i og B  i er regressionskonstanterne beregnet af hhv. akseafskæ ­
ring og hældning af de bedst tilnærmede linjer, der genereres ved 
lineær regression af ln k  i mod den reciprokke absolutte temperatur i 
kelvin (T). Ved at anvende Arrhenius-relationen på sur, neutral og basekatalyseret hydrolyse kan pseudoførsteordens hastighedskon ­
stanter og dermed halveringstider beregnes for andre temperaturer, 
for hvilke det ikke er praktisk muligt at bestemme hastighedskon ­
stanten direkte eksperimentelt (10).
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
De fleste hydrolysereaktioner følger en tilsyneladende førsteordens 
kinetik, hvorfor halveringstiden er koncentrationsuafhængig (jf. ligning 4 i bilag 2). Derfor kan laboratorieresultater opnået i området 10
 -2 til 10  -3 M sædvanligvis anvendes på virkelige forhold 
(10 -6 M) (10). Mabey og Mill (11) har rapporteret om flere eksem ­
pler på god overensstemmelse mellem hydrolysehastigheder målt i rent vand og råvand for forskellige kemiske stoffer, forudsat at pH og temperatur måles.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal mindst indeholde følgende oplysninger:  
Teststof:  
— trivialnavn, kemisk navn, CAS-nummer, strukturformel (med angi ­
velse af mærkets placering, når radioaktivt mærket stof anvendes) og relevante fysiske/kemiske egenskaber (se punkt 1.5)
 
— renhed (urenheder) afprøvestoffet  
— for mærkede stoffer, renhed af radioaktiv mærkning samt molær 
aktivitet (hvis relevant).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Bufferopløsninger:  
— fremstillingsdato og nærmere oplysninger om fremstillingen  
— anvendte buffere og vand  
— bufferopløsningernes molaritet og pH.  
Forsøgsbetingelser:  
— dato for forsøgenes udførelse  
— anvendt mængde prøvestof  
— tilsætning afprøvestoffet: fremgangsmåde og anvendte opløs ­
ningsmidler (type og mængde)  
— volumen bufret prøvestofopløsning, som er inkuberet  
— beskrivelse af det anvendte inkubationssystem  
— pH og temperatur under forsøget  
— prøvetagningstidspunkter  
— ekstraktionsmetode(r)  
— metoder til kvantitativ bestemmelse og identifikation afprøve ­
stoffet og dets hydrolyseprodukter i bufferopløsningerne  
— antal gentagelser af bestemmelsen.  
Resultater:  
— de anvendte analysemetoders repeterbarhed og følsomhed  
— genfinding (procentangivelser for en gyldig undersøgelse er givet 
i punkt 1.7.1)  
— resultater af gentagne bestemmelser og gennemsnitsværdier, 
opstillet i tabel  
— ved anvendelse afmærket prøvestof, massebalance før, under og 
efter forsøgene  
— resultater af forprøven  
— diskussion og fortolkning af resultaterne  
— alle oprindelige data og talværdier.  
Følgende oplysninger er kun nødvendige, når hydrolysehastigheden 
bestemmes:  
— koncentrationstidskurver over prøvestof og relevante hydrolyse ­
produkter, for hver pH-værdi og temperatur  
— tabeller over beregningsresultater baseret på Arrhenius-ligningen 
for temperaturen 20  o C/25  o C, sammen med pH, hastighedskon ­
stant (h  -1 eller døgn  -1 ), halveringstid eller DT  50 , temperatur (  o C) 
herunder konfidensintervaller og korrelationskoefficienter (r  2 ), 
eller tilsvarende oplysninger  
— formodet hydrolysevej.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. HENVISNINGER  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals Nr. 111, vedtaget 12. maj 1981.  
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) Den Europæiske Union (EU) (1995). Kommissionens direktiv 
95/36/EF om ændring af Rådets direktiv 91/414/EØF om markedsføring af plantebeskyttelsesmidler. Bilag V: Skæbne og opførsel i miljøet.
 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (oktober 1980).
 
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch (red.).  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and 
Assessment Nr. 23.
 
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 — 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Skriftlig version af mundtlig præsentation ved 14. årsmøde i Society of Environ ­
mental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, november 
1993).
 
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental condi ­
tions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
Bilag 1  
Trinvis forsøgsplan for hydrolyse
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
Bilag 2  
Definitioner og enheder  
SI-enheder  skal anvendes i alle tilfælde.  
Teststof:  ethvert stof, hvad enten det er moderstoffet eller relevante omdannel ­
sesprodukter.  
Omdannelsesprodukter:  alle stoffer hidrørende fra biotisk eller abiotisk omdan ­
nelse af prøvestoffet.  
Hydrolyseprodukter:  alle stoffer hidrørende fra hydrolytisk omdannelse af 
prøvestoffet.  
Ved hydrolyse  forstås reaktionen af et prøvestof RX med vand, resulterende i 
nettoudskiftning af gruppen X med OH på reaktions stedet: 
RX + HOH → ROH +HX [1]  
I denne forenklede proces er den hastighed, hvormed koncentrationen af RX 
aftager, givet ved 
hastighed = k [H  2 O] [RX] andenordens reaktion 
eller 
hastighed = k [RX] førsteordens reaktion  
afhængigt af det hastighedsbestemmende trin. Da vand er til stede i stort over ­
skud i forhold til prøvestoffet, beskrives denne type reaktion sædvanligvis som 
en pseudoførsteordens reaktion, hvor den iagttagne hastighedskonstant er givet ved relationen 
k
 obs = k[H  2 O] [2]  
og kan bestemmes af udtrykket (  1 ) 
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
hvor 
t = tiden  
og C  o , C t = koncentration af RX til tiden 0 og t.  
Denne konstant har dimensionen (tid)  -1 , og halveringstiden for reaktionen (den 
tid, det tager, før 50 % af RX har reageret) er givet ved  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Halveringstid:  (t 0,5 ) er den tid, der går, før 50 % prøvestoffet er hydrolyseret, 
når reaktionen kan beskrives ved førsteordens kinetik; den er uafhængig af 
koncentrationen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
( 1 ) Hvis kurven over logaritmisk transformerede data som funktion af tiden ikke peger på en 
lineær funktion (svarende til en førsteordens reaktion), kan hastighedskonstanten for 
hydrolyse af prøvestoffet ikke bestemmes af ligning [3].
 DT 50 (Disappearance Time 50):  er den tid, i løbet af hvilken koncentrationen 
afprøvestoffet mindskes med 50 %; den er forskellig fra halveringstiden t  0,5 , når 
reaktionen ikke følger førsteordens kinetik.  
Skønsmæssig beregning af k ved forskellige temperaturer  
Når hastighedskonstanterne kendes for to temperaturer, kan hastighedskonstan ­
terne for andre temperaturer beregnes ved hjælp af Arrhenius-ligningen:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T eller ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Ved afbildning af ln k mod 1/T fås en ret linje med hældning –E/R,  
hvor:  
k = hastighedskonstanten, målt ved forskellige temperaturer  
Ε = aktiveringsenergi (kJ/mol)  
Τ = absolut temperatur (K)  
R = gaskonstanten (8,314 J/mol.K)  
Aktiveringsenergien er beregnet ved regressionsanalyse eller af følgende udtryk:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 Í 1 
T 1 Ä 1 
T 2 Î 
hvor: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
Bilag 3  
Buffersystemer  
A. CLARK OG LUBS:  
Bufferblandinger efter CLARK og LUBS  ( 1 ) 
Sammensætning pH  
0,2 N HCl og 0,2 N KCl ved 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl fortyndet til 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl fortyndet til 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl fortyndet til 100 ml 1,4 
13,15 ml HCl + 25 ml KCl fortyndet til 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl fortyndet til 100 ml 1,8 
5,3 ml HCl + 25 ml KCl fortyndet til 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl fortyndet til 100 ml 2,2  
0,1 M kaliumbiphthalat + 0,1 N HCl ved 20  o C 
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 2,2 39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 2,8 20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 3,0 
14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 3,4 
5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 3,6 
2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml biphthalat til 100 ml 3,8  
0,1 M kaliumbiphthalat + 0,1 N NaOH ved 20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 4,0 
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 4,2 7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 4,6 
17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
( 1 ) De i tabellerne angivne pH-værdier er beregnet af potentialemålinger ved hjælp af Sørensens standardligninger 
(1909). De tilsvarende pH-værdier er 0,04 enhed højere end værdierne i tabellerne.
 Sammensætning pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biphthalat til 100 ml 6,0
 
Bufferblandinger efter CLARK og LUBS (fortsat) 
0,1 M monokaliumphosphat +0,1 N NaOH ved 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 6,0 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 B0 3 i 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH ved 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 9,6 40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 9,8 43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml 10,0
 
B. KOLTHOFF OG VLEESCHHOUWER:  (*) 
Citratbuffere efter KOLTHOFF og VLEESCHHOUWER  
Sammensætning pH  
0,1 M monokaliumcitrat og 0,1 N HCl ved 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat til 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat til 100 ml 2,4 
36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat til 100 ml 2,6 
30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat til 100 ml 2,8 
23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat til 100 ml 3,0 
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat til 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat til 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat til 100 ml 3,6  
0,1 M monokaliumcitrat og 0,1 N NaOH ved 18  o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 4,2 
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 4,4 
31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 5,0 
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 5,4 
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 5,6 
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 5,8 
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml 6,0  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) For at undgå skimmelvækst tilsættes en lille krystal thymol eller tilsvarende.
 C. SØRENSEN:  
Boratblandinger efter SØRENSEN  
Sammensætning Sørensen 
18 o C Walbum, pH ved 
ml Borax ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M borax + 0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 
6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M borax + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 
8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 
7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Phosphatblandinger efter SØRENSEN  
Sammensætning pH  
0,0667 M monokaliumphosphat + 0,0667 M dinatriumphosphat ved 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOKSICITET FOR REGNORME  
TEST I SYNTETISK JORD  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
I denne laboratorietest tilsættes teststoffet til syntetisk jord, hvori der 
anbringes orme i 14 dage. Efter denne periode (og eventuelt efter syv dage) undersøges stoffets dødelige virkning på regnormene. Testen giver en metode til i løbet af relativt kort tid at foretage en screening 
af kemikaliers virkning på regnorme ved optagelse gennem huden 
eller føden.
 
1.2. DEFINITION OG ENHED  
LC 50 : Koncentration af et stof, som kan forventes at forårsage 50 % 
af testdyrenes død i løbet af testperioden.  
1.3. REFERENCESTOF  
Der anvendes regelmæssigt et referencestof til påvisning af, at test ­
systemets følsomhed ikke har ændret sig signifikant.  
Som referencestof anbefales analytisk rent chloracetamid.  
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Jord er et variabelt medium, så der anvendes en omhyggeligt defi ­
neret syntetisk lerjord til denne test. Der holdes voksne regnorme af arten Eisenia foetida (se anmærkningen i tillægget) i en veldefineret syntetisk jord, som er behandlet med forskellige koncentrationer af 
teststoffet. Beholdernes indhold spredes på en bakke 14 dage (og 
eventuelt syv dage) efter forsøgets indledning, og der optælles for hver koncentration, hvor mange regnorme der har overlevet.
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Testen er beregnet til at være så reproducerbar som muligt med 
hensyn til testsubstrat og organisme. Dødeligheden hos kontroldy ­
rene må ikke overstige 10 % ved testens afslutning; ellers er testen 
ugyldig.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Materialer  
1.6.1.1. T e s t s u b s t r a t  
Der anvendes veldefineret syntetisk jord som grundsubstrat.  
a) Grundsubstrat (vægtprocent tørstof)  
— 10 % sphagnum (så nær pH 5,5 til 6,0 som muligt uden 
synlige planterester og findelt)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaolinholdigt ler, helst med over 50 % kaolinit  
— ca. 69 % industrielt kvartssand (overvejende finsand med over 
50 % af en partikelstørrelse på 0,05 til 0,2 mm). Hvis stoffet 
ikke er tilstrækkeligt let at opslæmme i vand, holdes 10 g pr. testbeholder tilbage for blanding med teststoffet senere
 
— ca. 1 % calciumcarbonat (CaCO  3 ), pulveriseret, kemisk rent, 
tilsat for at få en pH-værdi på 6,0 ± 0,5.  
b) Testsubstrat  
Testsubstratet består af grundsubstrat, teststof og deioniseret 
vand.  
Vandindholdet svarer til ca. 25 til 42 vægtprocent af grundsub ­
stratets tørstof. Substratets vandindhold bestemmes ved tørring af en prøve til konstant vægt ved 105
 o C. Hovedkriteriet er, at den 
syntetiske jord er befugtet så meget, at der ikke er noget stående 
vand. Blandingen foretages omhyggeligt, således at der bliver en jævn fordeling af teststoffet og substratet. Metoden for tilsætning af teststoffet til substratet skal rapporteres.
 
c) Kontrolsubstrat  
Kontrolsubstratet bestir af grundsubstrat og vand. Hvis der 
anvendes et tilsætningsstof, skal et ekstra kontrolsubstrat inde ­
holde samme mængde af tilsætningsstoffet.  
1.6.1.2. T e s t b e h o l d e r e  
Glasbeholdere med er rumfang på ca. en liter (hensigtsmæssigt 
tildækket med plastlåg, skåle eller plastfolie med ventilationshuller), fyldt med en mængde vådt test- eller kontrolsubstrat svarende til 
500 g substrattørstof.
 
1.6.2.  Testbetingelser  
Beholderne opbevares i klimakamre ved en temperatur pi 20 ± 2  o C 
og i konstant lys; Lysstyrken bør være 400 til 800 lux.  
Testperioden er på 14 dage, men dødeligheden kan eventuelt 
vurderes syv dage efter testens indledning.  
1.6.3.  Fremgangsmåde  
T e s t k o n c e n t r a t i o n e r  
Koncentrationerne af teststof udtrykkes som stoffets vægt i forhold 
til grundsubstratets tørstofvægt (mg/kg).  
F o r p r ø v e  
Det koncentrationsområde, der netop forårsager dødelighed fra 0 til 
100 % kan bestemmes ved en forprøve, der giver viden om de 
koncentrationsintervaller, der skal anvendes ved den endelige test.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Stoffet bør testes i følgende koncentrationer: 1 000, 100, 10, 1 og 0,1 
mg/stof/kg testsubstrat (tørstofvægt).  
Hvis der skal foretages en fuldstændig endelig test, vil én testgruppe 
pr. koncentration og én til den ubehandlede kontrolgruppe med hver 
ti orme være tilstrækkelig til forprøven.  
E n d e l i g t e s t  
Resultaterne af forprøven anvendes til at vælge mindst fem koncen ­
trationer i en kvotientrække, der går fra 0 til 100 % dødelighed, og 
hvor den konstante faktor ikke må være over 1,8.  
Ved test med disse koncentrationsrækker vil LC  50 -værdien og dens 
konfidensgrænser kunne skønnes med størst mulig nøjagtighed.  
Ved den endelige test anvendes der mindst fire testgrupper pr. 
koncentration og fire ubehandlede kontrolgrupper med hver ti 
orme. Resultaterne af disse gentagne grupper angives som en middel ­
værdi og en standardafvigelse.  
Hvis to på hinanden følgende koncentrationer med et forhold på 1,8 
kun giver 0 og 100 % dødelighed, er disse to værdier tilstrækkelige som angivelse for LC
 50 -intervallet.  
B l a n d i n g a f g r u n d s u b s t r a t e t o g t e s t s t o f f e t  
Når det er muligt, tilberedes teststoffet uden anden tilsætning end 
vand. Umiddelbart før testens indledning blandes en emulsion eller dispersion af teststoffet i deioniseret vand eller andet opløsnings ­
middel med grundsubstratet eller sprøjtes jævnt ud over dette med 
en fin kromatografisprøjte eller lignende.
 
Hvis teststoffet ikke er opløseligt i vand, kan det opløses i den 
mindst mulige mængde af et passende organisk opløsningsmiddel (f.eks. hexan, acetone eller chloroform).
 
Kun midler, der let fordamper, må bruges til at opløse, dispergere 
eller emulgere teststoffet. Testsubstratet beluftes inden brug, Den fordampede vandmængde erstattes. Kontrolsubstratet må indeholde 
eventuelle tilsætningsstoffer i samme mængde.
 
Hvis teststoffet ikke kan opløses, dispergeres eller emulgeres i orga ­
niske opløsningsmidler, blandes en blanding af finsand af formalet 
kvarts og den til behandling af 500 g tørstofvægt syntetisk jord nødvendige mængde teststof med 490 g tørstofvægt testsubstrat.
 
For hver testgruppe anbringes en mængde vådt testsubstrat svarende 
til 500 g tørstofvægt i hver glasbeholder, og ti regnorme, der i 24 timer er blevet tilvænnet i et lignende vådt grundsubstrat og derefter 
hurtigt afskyllet og afdryppet på filtrerpapir før brugen, anbringes på 
testsubstratets overflade.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Beholderne tildækkes med perforerede plastlåg, skåle eller folie for 
at forhindre, at substratet indtørrer, og de opbevares under testbetin ­
gelser i 14 dage.  
Vurderingerne foretages 14 dage (og eventuelt syv dage) efter testens 
indledning. Substratet spredes på en plade af glas eller rustfrit stål. Regnormene undersøges, og antallet af overlevende regnorme 
bestemmes. Regnorme anses for døde, hvis de ikke reagerer på en 
let, mekanisk påvirkning af forender.
 
I tilfælde af at undersøgelsen foretages efter syv dage, fyldes 
substratet atter i beholderen, og de overlevende regnorme genan ­
bringes på den samme testsubstratoverflade.  
1.6.4.  Testorganismer  
Testorganismerne bør være voksne Eisenia foetida (se anmærkningen 
i tillægget) (mindst to måneder gamle med bælte) af en vægt (våd) 
på 300 til 600 mg. (Med hensyn til opdrætningsmetode henvises til tillægget).
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING OG VURDERING AF RESULTATERNE  
De anvendte teststofkoncentrationer rapporteres med henvisning til 
den procentvise dødelighed for hver koncentration.  
Når de opnåede data er dækkende, kan LC  50 og dens konfidens ­
grænser (p = 0,05) bestemmes ved brug af standardmetoder (Litch ­
field and Wilcoxon, 1949, eller tilsvarende metode). LC  50 angives 
som mg teststof pr, kg testsubstrat (tørstofvægt).  
I de tilfælde, hvor koncentrationskurvens hældning er for stejl til, at 
LC 50 kan beregnes, er en grafisk bestemmelse af denne værdi 
tilstrækkelig.  
Hvis to på hinanden følgende koncentrationer med et forhold på 1,8 
kun giver 0 og 100 % dødelighed, er disse to værdier tilstrækkelige 
som angivelse for LC  50 -intervallet.  
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— angivelse af, at testen er foretaget i overensstemmelse med oven ­
stående kvalitetskriterier  
— angivelse af den foretagne test (forprøve og/eller endelig test)  
— nøje beskrivelse af testbetingelserne eller angivelse af, at testen er 
foretaget i overensstemmelse med metoden; eventuelle afvigelser skal rapporteres
 
— nøje beskrivelse af, hvorledes teststoffet er blevet iblandet i 
grundsubstratet  
— oplysninger om testorganismer (art, alder, gennemsnitsvægt samt 
minimums- og maksimumsvægt, betingelserne for avl og opdræt ­
ning samt leverandør)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— angivelse af den anvendte metode til bestemmelse af LC  50 
— testresultaterne, herunder alle anvendte data  
— beskrivelse af observerede symptomer eller adfærdsændringer 
hos testorganismerne  
— dødelighed i kontrolgrupperne  
— LC  50 eller højeste testkoncentration uden dødelighed og laveste 
testkoncentration med en dødelighed på 100 % 14 dage (og eventuelt syv dage) efter testens indledning
 
— afbildning af koncentrationsresponskurven  
— resultater, der er opnået med referencestoffet enten i forbindelse 
med den pågældende test eller ved tidligere kvalitetskontrol ­
undersøgelser.  
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the 
Council C(81) 30 Final.  
(2) Edwards, C. A. and Lofty, 1977. Biology of Earthworms. 
London: Chapman and Hall, 331 pp.  
(3) Bouche, M. B. 1972. Lombriciens de France, Écologie et Systé ­
matique. Publ. Institut National de la Recherche Agronomique, 671 pp.
 
(4) Litchfield, J. T.and Wilcoxon J., 1949. A simplified method of 
evaluaring dose-effect experiments J. Pharm. Exp. Therap., vol. 
96, 99-113.  
(5) EEC 1983. Development of a standardized labotatory method 
for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR. 8714 EN.
 
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden, in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Tillæg  
Avl og opdrætning af ormene før test  
Med henblik på avl anbringes 30 til 50 voksne orme i en avlekasse med frisk 
substrat og fjernes efter 14 dage. Disse dyr kan bruges til avl af senere grupper. De regnorme, der klækkes af kokonerne, anvendes til test, når de er kønsmodne 
(under de foreskrevne betingelser efter to til tre måneders forløb).
 
Avls- og opdrætningsbetingelser  
Klimakammer: temperatur 20 ± 2  o C, helst med konstant lys (lysintensitet 400 
til 800 lux).  
Avlekasser: Egnede lave beholdere med et rumfang på 10 til 20 l.  
Substrat: Eisenia foetida kan opdrættes i forskellige dyreekskrementer. 
Som avlsmedium kan anbefales en blanding af lige dele tørv og ko- eller hestegødning. Substratet må have en pH-værdi på ca. 6 til 7 (justeret med calciumcarbonat) og lav ionlednings ­
evne (under 6 mmhos eller 0,5 % saltkoncentration). 
Substratet bør være fugtigt, men ikke for vådt.
 
Andre egnede fremgangsmåder ud over ovennævnte metode 
kan benyttes.  
Anmærkning:  Der findes to racer af Eisenia foetida, som nogle systematikere har 
klassificeret som arter (Bouche, 1972). De er morfologisk set omtrent ens, men den ene, Eisenia foetida foetida, har typisk tværgående striber på leddene, hvad den anden, Eisenia foetida andrei, ikke har, og dennes farve er rødbroget. Så vidt 
muligt bør Eisenia foetida andrei anvendes. Andre arter kan anvendes, hvis den 
fornødne metodik er til rådighed.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIOLOGISK NEDBRYDNING  
ZAHN-WELLENS TEST  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Metoden har til formål at vurdere vandopløselige ikke flygtige orga ­
niske stoffers potentielle fuldstændige bionedbrydelighed, når de skal udsættes for forholdsvis høje koncentrationer af mikroorganismer under en statisk test.
 
Der kan forekomme fysisk/kemisk adsorption på de opslæmmede 
artikler, og der må tages hensyn hertil, når resultaterne fortolkes 
(jf. 3.2).  
De stoffer, der skal undersøges, anvendes i koncentrationer svarende 
til DOC-værdier i området 50 til 400 mg/l eller COD-vædier i området 100 til 1 000 mg/l (DOC = opløst organisk kulstof; COD 
= kemisk iltforbrug). Disse forholdsvis høje koncentrationer har den 
fordel, at de i analytisk henseende er pålidelige. Forbindelser med toksiske egenskaber kan hæmme eller hindre nedbrydningsprocessen.
 
Ved denne metode anvendes måling af koncentrationer af opløst 
organisk kulstof eller af det kemiske iltforbrug til bedømmelse af 
teststoffets fuldstændige biologiske nedbrydning.  
Samtidig anvendelse af en specifik analysemetode kan muliggøre 
vurdering af stoffets primære biologiske nedbrydning (dvs. den oprindelige kemiske forbindelses forsvinden).
 
Metoden finder kun anvendelse pi de organiske teststoffer, som ved 
koncentrationen under testen:  
— er opløselige i vand under forsøgsbetingelserne  
— har forsvindende lavt damptryk under forsøgsbetingelserne  
— ikke hæmmer bakterier  
— kun adsorberes i testsystemet i begrænset omfang  
— ikke forsvinder fra testopløsningen som følge af skumning.  
Oplysninger om mængdeforholdet mellem teststoffets hovedbestand ­
dele vil være til nytte ved fortolkning af resultaterne, især hvis disse 
er lave eller usikre.  
Ved fortolkningen af lave resultater og ved valget af passende test ­
koncentrationer er det ønskeligt at have oplysninger om stoffets 
giftvirkning over for mikroorganismer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Nedbrydningsgraden ved testens afslutning anføres således: Biolo ­
gisk nedbrydelighed i Zahn-Wellens test:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
hvor:  
D T = biologisk nedbrydning ( %) ved tidspunktet T  
C A = DOC (eller COD)-værdier i forsøgsblandingen, målt tre 
timer efter igangsætning af testen (mg/l). (DOC = opløst organisk kulstof, COD = kemisk iltforbrug)
 
C T = DOC- eller COD-værdier i forsøgsblandingen ved tids ­
punktet for prøveudtagning (mg/l)  
C B = DOC- eller COD-værdi for blindprøven ved tidspunktet 
for prøveudtagning (mg/l)  
C BA = DOC- eller COD-værdi for blindprøven, målt tre timer 
efter igangsætning af testen (mg/l).  
Nedbrydningsgraden afrundes til nærmeste hele procent.  
Den procentvise nedbrydning er angiver som den procentvise DOC- 
(eller COD-) fjernelse af teststoffet.  
Forskellen mellem den værdi, der er målt efter tre timer, og den 
beregnede, eller helst målte, startværdi kan give nyttige oplysninger om stoffets eliminering (jf. 3.2 »Fortolkning af resultater«).
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
I visse tilfælde kan referencestoffer være nyttige ved undersøgelse af 
nye stoffer; der kan dog endnu ikke anbefales bestemte reference ­
stoffer.  
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Aktiveret slam, uorganiske næringsstoffer og teststoffet, der er den 
eneste kulstofkilde i vandig opløsning, anbringes sammen i en glas ­
beholder på 1 til 4 liter, som er forsynet med omrøring og beluftning. Blandingen omrøres og beluftes ved 20 til 25
 o C under indirekte 
belysning eller mørke i op til 28 dage. Nedbrydningsprocessen 
følges ved bestemmelse af DOC- (eller COD-) værdier i den filtre ­
rede opløsning en gang dagligt eller regelmæssigt med et andet passende mellemrum. Forholdet mellem den eliminerede DOC 
(eller COD) efter hvert tidsrum og værdier tre timer efter starten 
udtrykkes som procentvis biologisk nedbrydning og er et mål for nedbrydningsgraden på dette tidspunkt. Resultatet afbildes mod tiden, hvorved kurven over biologisk nedbrydning fremkommer.
 
Hvis der anvendes en specifik analysemetode, kan ændringer i det 
oprindelige stofs koncentration som følge af biologisk nedbrydning 
måles (primær bionedbrydelighed).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Det er ved ringtest godtgjort, at denne metodes reproducerbarhed er 
tilfredsstillende.  
Metodens følsomhed afhænger hovedsagelig af blindprøvens varia ­
tioner og i mindre grad af nøjagtigheden ved bestemmelsen af opløst organisk kulstof og teststofkoncentrationen i væsken.
 
1.6. BESKRIVELSE AF FREMGANGSMÅDEN  
1.6.1.  Forberedelser  
1.6.1.1. R e a g e n s e r  
vand: drikkevand med mindre end 5 mg organisk kulstof pr. liter. 
Koncentrationen af calcium- og magnesiumioner må ikke overstige 
2,7 mmol/l tilsammen; i modsat fald må der fortyndes passende med 
deioniseret eller destilleret vand 
svovlsyre, analyseren (A.R.): 50 g/l 
natriumhydroxidopløsning, A.R.: 40 g/l opløsning af uorganiske næringsstoffer: i 1 1 deioniseret 
vand opløses: 
Ammoniumchlorid, NH
 4 Cl, A.R.: 38,5 g 
Natriumdihydrogenphosphat, NaH  2 PO 4 . 2H  2 O, A.R.: 33,4 g 
Kaliumdihydrogenphosphat, KH  2 PO 4 , A.R.: 8,5 g 
Dikaliummonohydrogenphosphat, K  2 HPO  4 , A.R.: 21,75 g  
Blandingen fungerer dels som næringsstofkilde, dels som buffersy ­
stem.  
1.6.1.2. A p p a r a t u r  
glasbeholdere på 1 til 4 (f.eks. cylindriske beholdere)  
omrører med rørehoved af glas eller metal på en passende aksel 
(omrøreren bør rotere 5 til 10 cm over beholderens bund). Der kan 
i stedet anvendes en magnetomrører med en 7 til 10 cm lang magnet ­
pind 
glasrør med indvendig diameter på 2 til 4 mm til beluftning. Rørets 
åbning bør befinde sig ca. 1 cm over beholderens bund  
centrifuge (ca. 3 550 g)  
pH-meter  
apparat til måling af opløst ilt  
papirfiltre  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
apparatur til membranfiltrering  
membranfiltre med porestørrelse 0,45 μm. Membranfiltre er kun 
egnede, hvis der er vished for, at de hverken afgiver kulstof eller absorberer stoffet under filtreringen
 
analyseudstyr ti! bestemmelse af indholdet af organisk kulstof og det 
kemiske iltforbrug.  
1.6.1.3. T i l b e r e d n i n g a f i n o c u l u m  
Aktiveret slam fra et biologisk rensningsanlæg vaskes (flere gange) 
med vand (jf. ovenfor) ved centrifugering eller dekantering.  
Det aktiverede slam skal være i passende stand. Sådant slam kan fås 
fra et velfungerende anlæg til spildevandsrensning. For at få så mange forskellige bakteriestammer som muligt kan det være bedre at blande inocula fra forskellige kilder (f.eks. forskellige rensnings ­
anlæg, jordekstrakter, flodvand osv.).
 
Det aktiverede slams aktivitet kontrolleres, jf. »egnethedskontrol«.  
1.6.1.4. F r e m s t i l l i n g a f t e s t o p l ø s n i n g e r n e  
Til testbeholderen sættes 500 ml vand, 2,5 ml opløsning af 
uorganiske næringsstoffer pr. liter samt en mængde aktiveret slam, der svarer til 0,2 til 1,0 g tørstof pr. liter færdigblanding. Der 
tilsættes en så stor mængde stamopløsning af teststoffer, at den 
færdige blanding får en DOC-koncentration på 50 til 400 mg/l. Det tilsvarende COD-interval er 100 til 1 000 mg/l. Der fyldes op til i alt 1 til 4 l med vand. Valg af det samlede volumen afhænger af 
det antal prøver, der skal udtages til DOC- eller COD-bestemmelser, 
og det nødvendige analysevolumen.
 
Normalt kan et volumen på 2 l betragtes som tilstrækkeligt. Mindst 
én kontrolbeholder (blindprøve) sættes i gang samtidig med hver testserie; den indeholder kun aktiveret slam og opløsning af uorganiske næringsstoffer fortyndet med vand til samme totalvo ­
lumen som i testbeholderne.
 
1.6.2.  Testens gennemførelse  
Testbeholderne omrøres med magnetomrørere eller propelomrørere 
under indirekte belysning eller i mørke ved 20 til 25  o C. Beluftning 
sker med komprimeret luft, der om nødvendigt renses med et 
vatfilter og en vaskeflaske. Det må påses, at slammet ikke bund ­
fælder, og at iltkoncentrationen ikke falder til under 2 mg/l.  
pH-værdien kontrolleres regelmæssigt (f.eks. dagligt) og indstilles 
om nødvendigt til pH 7 til 8.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Lige før prøveudtagningen kompenseres der for tab ved fordampning 
ved tilsætning af deioniseret eller destilleret vand. Det kan f.eks. 
anbefales at afmærke væskehøjden i beholderen, før testen startes. Der sættes nye mærker efter hver prøveudtagning (uden beluftning og omrøring). De første-prøver udtages altid tre timer efter testens 
start, således at det kan konstateres, om testmaterialet adsorberes på 
det aktiverede slam.
 
Elimineringen af testmaterialet følges ved DOC- eller COD-bestem ­
melser dagligt eller regelmæssigt med et andet interval. Prøverne fra testbeholderen og blindforsøget filtreres gennem et omhyggeligt vasket papirfilter. De første 5 ml filtrat bortkastes. Slam, der er 
vanskeligt at filtrere, kan fjernes ved først at centrifugere i ti min. 
Der foretages mindst dobbeltbestemmelse af DOC og COD. Testens løber i op til 28 dage.
 
Anmærkning:  Prøver, der stadig er uklare, filtreres gennem et 
membranfilter. Membranfiltrene må hverken afgive eller adsorbere 
organisk materiale.  
E g n e t h e d s k o n t r o l a f d e t a k t i v e r e d e s l a m  
I hver testserie bør indgå en beholder, der indeholder et kendt stof, 
således at man kan kontrollere egnetheden af det aktiverede slam. Til dette formål er diethylenglycol fundet egnet.
 
A d a p t a t i o n  
Hvis der foretages analyser med forholdsvis korte mellemrum (f.eks, 
dagligt), vil adaptation klart fremgå af nedbrydningskurven (jf. figur 2). Testen bør derfor ikke sættes i gang umiddelbart før weekenden.
 
Hvis der forekommer adaptation ved slutningen af perioden, kan 
testen fortsættes, indtil nedbrydningen er afsluttet.  
Anmærkning:  Hvis der er behov for større viden om det adapterede 
slams opførsel, udsattes det samme aktiverede slam endnu engang 
for det samme testmateriale efter følgende fremgangsmåde:  
Omrøringen og beluftningen standses, og man lader det aktiverede 
slam bundfælde sig. Den ovenstående væske fjernes, der fyldes op til 
2 l med vand og omrøres i 15 minutter, og blandingen henstår til ny bundfældning. Efter fjernelse af den ovenstående væske anvendes det tilbageblevne slam til gentagelse af testen med det samme materiale 
som under punkt 1.6.1.4 og 1.6.2. Det aktiverede slam kan isoleres 
ved centrifugering i stedet for bundfældning.
 
Det adapterede slam kan eventuelt blandes med frisk slam, så man 
når op på i alt 0,2 til 1,0 g tørstof pr. liter.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l y s e  
Normalt filtreres prøver gennem et omhyggeligt vasket papirfilter (til 
vask anvendes deioniseret vand).  
Prøver, der stadig er uklare, filtreres gennem et membranfilter 
(0,45 μm). 
Der foretages dobbeltbestemmelse af DOC-koncentrationen i prøve ­
filtraterne (de første 5 ml bortkastes) med TOC-instrumentet. Hvis 
filtratet ikke kan analyseres-samme dag, skal det opbevares i køle ­
skab til næste dag. Længere tids opbevaring kan ikke anbefales.  
COD-koncentrationen bestemmes i prøvefiltraterne med et COD- 
analyseudstyr efter den fremgangsmåde, der er beskrevet i henvis ­
ning (2) nedenfor.  
2. DATA OG VURDERING  
Der foretages mindst dobbeltbestemmelse af DOC- og COD-koncen ­
trationerne i prøverne ifølge 1.6.2. Nedbrydningen ved tidspunktet T 
beregnes med den formel (med definitioner), der anført under 1.2.  
Nedbrydningsgraden afrundes til nærmeste hele procent. Den 
nedbrydning, der opnås ved slutningen af testen, anføres som »den biologiske nedbrydelighed ved Zahn-Wellens test«.
 
Anmærkning : Hvis der opnås fuldstændig nedbrydning før testpe ­
rioden er udløbet og dette resultat bekræftes ved endnu en analyse den følgende dag, kan testen afsluttes.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— stoffets begyndelseskoncentration  
— alle andre oplysninger og forsøgsresultaterne vedrørende teststof ­
fet, et eventuelt referencestof og blindforsøget  
— koncentrationen efter tre timer  
— kurve over biologisk nedbrydning med forklaring  
— hvornår og hvor prøveorganismerne er udtaget, adaptionsgrad, 
anvendt koncentration osv.  
— fyldestgørende begrundelse for alle afvigelser fra fremgangs ­
måden.  
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATER  
Gradvis fjernelse af DOC (COD) i løbet af dage eller uger viser, at 
teststoffet nedbrydes biologisk.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Fysisk/kemisk adsorbtion kan dog i visse tilfælde spille en vis rolle, 
og et tegn herpå er, at der inden for de første tre timer sker fuld ­
stændig eller delvis fjernelse, og at forskellen mellem supernatantvæ ­
sken fra kontrolforsøget og prøven bliver liggende på et uventet lavt niveau.
 
Det er nødvendigt at foretage yderligere testning, hvis der skal 
skelnes mellem biologisk nedbrydning (eller delvis biologisk 
nedbrydning) og adsorption.  
Dette kan gøres på flere måder, mest troværdigt ved at anvende 
supernatantvæsken som inoculum i en basissat test (helst en respiro ­
metrisk test).  
Teststoffer, der giver høj fjernelse af DOC (COD), som ikke skyldes 
adsorption, ved denne test, bør betragtes som potentielt biologisk nedbrydelige. Delvis fjernelse, som ikke skyldes adsorption, betyder, at kemikaliet i hvert fald i et vist omfang nedbrydes biologisk. Ringe 
eller ingen fjernelse af DOC (COD) kan skyldes, at teststoffet 
hæmmer mikroorganismerne; dette kan undertiden også vise sig ved, at slammet opløses og forsvinder, hvorved supernatantvæsken bliver uklar. Testen bør gentages med en lavere koncentration af 
teststof.
 
Anvendelse af en stofspecifik analysemetode eller  14 C-mærket test ­
stof kan give større følsomhed. Hvis der anvendes  l4 C-mærket test ­
stof, vil påvisning af  14 CO 2 bekræfte, at der er tale om biologisk 
nedbrydning.  
Dersom resultaterne anføres som primær biologisk nedbrydning, bør 
der om muligt anføres en forklaring pi den kemiske strukturændring, som fører til, at analyseresultaterne for det oprindelige teststof falder.
 
Valget af analysemetode skal underbygges, og analyseresultaterne for 
blindprøven skal anføres.  
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981 Test Guideline 302 B. Decision of the 
Council C(81) 30 Final.  
(2) Bilag V C.9 Nedbrydning: Kemisk iltforbrug. Kommissionens 
direktiv 84/449/EØF,  De Europæiske Fællesskabers Tidende,  
L 251 af 19.9.1984.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Tillæg  
EKSEMPLER PÅ EVALUERING 
Organisk forbindelse: 4-ethoxybenzoesyre 
Teoretisk testkoncentration: 600 mg/l Teoretisk DOC: 390 mg/l 
Inoculum rensningsanlægget ... 
Koncentration: 1 g tørstof pr. liter Eventuel adaptation: ikke adapteret Analyse: DOC-bestemmelse 
Testmængde: 3 ml 
Kontrolstof: diethylenglycol Stoffets toksicitet ingen giftvirkning under 1 000 mg/l 
anvendt prøve: fermeteringsglas
 
Tidspunkt Kontrolstof Teststof 
Blindprøve 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l DOC netto 
mg/1 Nedbryd­
ning 
% DOC (  1 ) 
mg/l DOC netto 
mg/l Nedbryd­
ning 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 timer 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 
1 dag 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 dage 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dage 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 dage 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 dage 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 dage 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 dage 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 dage 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Gennemsnit af tredobbeltbestemmelse.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Figur 1  
Eksempler på kurver over biologisk nedbrydning
  
Figur 2  
Eksempler på slamadaptation
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  SIMULERINGSFORSØG VEDRØRENDE AEROB 
SPILDEVANDSRENSNING: C.10.A: AKTIVEREDE SLAMENHEDER — 
C.10.B: BIOFILM  
C.10.A:. Aktiverede slamenheder  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 303 (2001). I 
1950'erne opdagede man, at nye overfladeaktive stoffer forårsagede omfat ­
tende skumdannelse i spildevandsrensningsanlæg og i floder. De blev ikke 
fuldstændigt elimineret i den aerobe behandling, og i visse tilfælde begræn ­
sede de elimineringen af andre organiske stoffer. På den baggrund blev der indledt mange undersøgelser af, hvordan overfladeaktive stoffer kunne fjernes fra spildevand, og om nye industrifremstillede kemikalier kunne 
indgå i spildevandsrensning. Til det blev der anvendt to modelenheder, 
der repræsenterede de to hovedtyper af aerob biologisk spildevandsrensning (aktiveret slam og nedsivningsfiltrering). Det ville have været umuligt og 
meget dyrt at distribuere alle nye kemikalier og overvåge store rensnings ­
anlæg, selv på lokalt plan.
 
INDLEDENDE OVERVEJELSER  
Aktiverede slamenheder  
2. Modeller for aktiverede slamenheder er beskrevet i størrelser fra 300 ml op 
til ca. 2 000 ml. Nogle efterlignede nøje fuldskalaanlæg med tanke til bund ­
fældning af slam, hvor det bundfældede slam blev pumpet tilbage til beluft ­
ningstanken, mens andre ikke var udstyret med bundfældningsanlæg, f.eks. 
Swisher (1). Størrelsen på forsøgsenhederne er et kompromis. De skal på den ene side være store nok til mekanisk drift og produktion af et tilstræk ­
keligt volumen af prøver, uden at det påvirker driften, og på den anden side 
må de ikke være så store, at det stiller for store krav til plads og materiale ­
forbrug.
 
3. To typer forsøgsenheder, der anvendes hyppigt og med tilfredsstillende 
resultat, er Husmann-enheder (2) og Porous Pot-enheder (porøse krukker) (3) (4), der først blev anvendt i forsøg med overfladeaktive stoffer. Begge 
disse typer er beskrevet i denne testmetode. Andre typer har også været 
anvendt med tilfredsstillende resultater, f.eks. Eckenfelder (5). På grund af de relativt høje omkostninger og den store arbejdsindsats, der kræves for at udføre denne simuleringstest, blev der parallelt med disse gennemført 
enklere og billigere screeningstest, som er beskrevet i kapitel C.4 A-F i 
dette bilag (6). Erfaringer med mange overfladeaktive stoffer og andre kemikalier har vist, at de stoffer, der bestod screeningstestene (let bioned ­
brydelige), også blev nedbrudt i simuleringstesten. Nogle af de stoffer, der 
ikke bestod screeningstestene, bestod testene for iboende bionedbrydelighed 
(kapitel C.12 (7) og C.19 (8) i dette bilag), men kun nogle fra denne gruppe blev nedbrudt i simuleringstesten, hvorimod de kemikalier, der ikke bestod testene for iboende bionedbrydelighed, ikke blev nedbrudt i simulerings ­
testene (9) (10) (11).
 
4. I visse tilfælde er det tilstrækkeligt at gennemføre simuleringstests under et 
enkelt sæt driftsbetingelser. Resultaterne udtrykkes som den procentvise 
eliminering af testkemikaliet eller af opløst organisk kulstof (DOC). En sådan test beskrives i denne testmetode. I modsætning til den foregående version af dette kapitel, der kun beskrev én type forsøgsenheder til behand ­
ling af syntetisk spildevand i koblet tilstand, der anvendte en forholdsvis 
grov slamoverløbsmetode, giver denne tekst mulighed for en række
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
variationer. Alternativer til typen af forsøgsenheder, virkningsmåde samt 
spildevands- og slambortskaffelse beskrives. Denne tekst ligger tæt op ad 
teksten i ISO 11733 (12), der blev nøje gennemgået i forbindelse med forberedelsen. Metoden har dog ikke været underkastet en ringtest.
 
5. Til andre formål skal koncentrationen af testkemikaliet i udløbet kendes 
mere præcist, og der er derfor behov for en mere omfattende metode. Over ­
løbsprocenten for slam skal f.eks. kontrolleres mere præcist hele døgnet og i 
løbet af hele testperioden, og enhederne skal fungere ved forskellige over ­
løbsprocenter. For at opnå en fyldestgørende metode bør testene ligeledes gennemføres ved to eller tre forskellige temperaturer. En sådan metode er 
beskrevet af Birch (13) (14) og sammenfattet i tillæg 6. Den nuværende 
viden er imidlertid ikke tilstrækkelig til at afgøre, hvilken af de kinetiske modeller der kan anvendes i forbindelse med bionedbrydning af kemikalier ved spildevandsrensning og i vandmiljøet generelt. Anvendelsen af 
Monod-kinetik, der beskrives i tillæg 6 som et eksempel, er begrænset til 
kemikalier, der forekommer i en koncentration på 1 mg/l og derover, men dette er efter nogle forskeres opfattelse endnu ikke dokumenteret. Tillæg 7 omhandler test ved koncentrationer, der mere realistisk afspejler koncen ­
trationerne i spildevand. Disse test og testene i tillæg 6 er dog anført i 
tillæg og ikke som separate testmetoder.
 
Filtre  
6. Det har været meget mindre fokus på modeller med nedsivningsfiltre. Det 
skyldes sandsynligvis, at de er mere besværlige og ikke så kompakte som modeller baseret på aktiveret slam. Gerike et al. har udviklet nedsivnings ­
filtre og anvendt dem i koblet tilstand ((15). Disse filtre var relativt store 
(højde 2 m, volumen 60 l), og hvert filter krævede en spildevandsmængde på helt op til 2 l/h. Baumann et al. (16) simulerede nedsivningsfiltre ved at sætte strips af »polyesterfleece« ind i rør på 1 m (14 mm indvendig diame ­
ter), efter at stripsene havde været nedsænket i koncentreret aktiveret slam i 
30 minutter. Testkemikaliet blev som eneste C-kilde i en opløsning af mineralsalte hældt ned i det lodrette rør, hvorefter den biologiske nedbryd ­
ning blev vurderet ud fra målinger af DOC i udløbet og CO
 2 i den udledte 
gas. 
7. Biofiltre er blevet simuleret på en anden måde (15). De indre overflader af 
roterende rør, der var skråtstillet i en spids vinkel i forhold til vandret, blev tilført spildevand (ca. 250 ml/h) med og uden testkemikaliet. De opsamlede udløb blev derefter analyseret for opløst organisk kulstof (DOC) og/eller det 
specifikke testkemikalie.
 
TESTENS PRINCIP  
8. Denne metode er udviklet til at bestemme elimineringen og den primære 
og/eller ultimative biologiske nedbrydning af vandopløselige organiske kemikalier ved hjælp af aerobe mikroorganismer i et kontinuerligt drevet testsystem, der simulerer processen for aktiveret slam. Et let biologisk 
nedbrydeligt organisk materiale og det organiske testkemikalie forsyner 
mikroorganismerne med kulstof og energi.
 
9. To kontinuerligt drevne testenheder (anlæg med aktiveret slam eller porøse 
krukker) køres parallelt under identiske betingelser, der vælges, så de passer til testens formål. Normalt er den gennemsnitlige hydrauliske retentionstid 
seks timer, og den gennemsnitlige slamalder (slamretentionstid) er 6-10 
dage. Slam bortskaffes ved hjælp af én af to metoder, hvor testkemikaliet normalt tilsættes indløbet (organisk medium) på den ene enhed i en koncen ­
tration på mellem 10 mg/l DOC og 20 mg/l DOC. Den anden enhed bruges 
som kontrolenhed for at bestemme den biologiske nedbrydning af det orga ­
niske medium.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. I hyppigt udtagne prøver af udløbet bestemmes først og fremmest det 
opløste organiske kulstof eller det kemiske iltforbrug (COD). Ligeledes 
bestemmes ud fra specifikke analyser koncentrationen af testkemikaliet (hvis påkrævet) i spildevandet fra den enhed, der får tilført testkemikaliet. Det antages, at forskellen mellem koncentrationerne af DOC eller COD i 
udløbet fra test- og kontrolenhederne skyldes testkemikaliet eller dets orga ­
niske metabolitter. Forskellen sammenlignes med koncentrationen af DOC eller COD i indløbet, der skyldes det tilførte testkemikalie, med henblik på at bestemme elimineringen af testkemikaliet.
 
11. Bionedbrydning kan normalt adskilles fra bioadsorption ved omhyggeligt at 
undersøge kurven for elimineringstid og bekræftes normalt af en test for 
umiddelbar bionedbrydning, hvor der anvendes et akklimatiseret inokulum 
fra den enhed, der får tilført testkemikaliet.  
OPLYSNINGER OM TESTKEMIKALIET  
12. Testkemikaliets renhed, vandopløselighed, flygtighed og adsorptionsegen ­
skaber skal være kendt, for at resultaterne kan fortolkes korrekt. Normalt 
kan flygtige og uopløselige kemikalier ikke testes, medmindre der træffes særlige forholdsregler (se tillæg 5). Den kemiske struktur, eller i det mindste den empiriske formel, skal også kendes for at kunne beregne de teoretiske 
værdier og/eller kontrollere parametrenes målte værdier, f.eks. teoretisk 
iltforbrug (ThOD), opløst organisk kulstof (DOC) og kemisk iltforbrug (COD).
 
13. Oplysninger om testkemikaliets toksicitet over for mikroorganismer (se 
tillæg 4) kan bruges ved valg af hensigtsmæssige testkoncentrationer og 
kan være afgørende for korrekt fortolkning af lave værdier for bionedbryd ­
ning.  
TÆRSKELVÆRDIER  
14. I den første anvendelse af denne simuleringstest (kontroltest) i forbindelse 
med primær bionedbrydning af overfladeaktive stoffer skal der fjernes over 
80 % af det specifikke kemikalie, inden det overfladeaktive stof må markedsføres. Hvis værdien 80 % ikke opnås, kan denne simuleringstest (kontroltest) anvendes, og det overfladeaktive stof må markedsføres, hvis 
over 90 % af det specifikke kemikalie er elimineret. For kemikalier er der 
generelt ikke tale om at bestå/dumpe, og derfor kan den opnåede værdi for eliminering benyttes i forbindelse med omtrentlige beregninger af den sand ­
synlige koncentration i miljøet, der kan bruges i vurderinger af risici fra 
kemikalier. Resultater har en tendens til at følge et mønster med alt eller 
intet. I en række forsøg med rene kemikalier viste den procentvise elimine ­
ring af DOC sig at være over 90 % i mere end tre fjerdedele og over 80 % i mere end 90 % af de kemikalier, der viste sig at have en signifikant værdi 
for bionedbrydelighed.
 
15. Der er relativt få kemikalier (f.eks. overfladeaktive stoffer) til stede i spil ­
devand i de koncentrationer (ca. 10 mg C/l), der anvendes i denne test. 
Nogle kemikalier kan være hæmmende ved disse koncentrationer, mens kinetikken for eliminering af andre kemikalier kan være forskellig ved lave koncentrationer. En mere præcis vurdering af nedbrydningen kunne 
gennemføres ved hjælp af modificerede metoder, hvor man benytter reali ­
stisk lave koncentrationer af testkemikaliet, og de indsamlede data kunne bruges til at beregne kinetiske konstanter. De nødvendige forsøgsteknikker er imidlertid endnu ikke fuldt validerede, og de kinetiske modeller, der 
beskriver reaktionerne med hensyn til bionedbrydning, er heller ikke 
udarbejdet (se tillæg 7).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
REFERENCEKEMIKALIER  
16. For at sikre, at forsøget gennemføres korrekt, bør kemikalier, hvis opførsel 
kendes, jævnligt testes sideløbende med undersøgelsen af testkemikalier. Sådanne kemikalier omfatter adipinsyre, 2-phenylphenol, 1-naphthol, 
diphensyre, 1-naphthoesyre osv. (9) (10) (11).
 
FORSØGSRESULTATERNES REPRODUCERBARHED  
17. Der har udarbejdet langt færre rapporter om simuleringstest end om test for 
let bionedbrydelighed. Reproducerbarheden mellem (samtidige) replikater er god (inden for 10-15 %) for testkemikalier, der er nedbrudt 80 % eller mere, 
mens der for mindre nedbrudte kemikalier er større variationer. Ligeledes er 
der i forbindelse med visse borderline-kemikalier konstateret meget spredte resultater (f.eks. 10 % og 90 %) på forskellige tidspunkter i løbet af testpe ­
rioden på ni uger.
 
18. Der er konstateret meget begrænset forskel i de resultater, der er opnået med 
de to typer forsøgsenheder. Visse kemikalier er dog i højere grad og mere konsistent blevet nedbrudt i forbindelse med husholdningsspildevand end 
med syntetisk spildevand som defineret af OECD.
 
BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
Apparatur  
Testsystem  
19. Testsystemet for et enkelt testkemikalie består af en testenhed og en styreen ­
hed. I de tilfælde, hvor der kun gennemføres specifikke analyser (primær 
bionedbrydning), kræves der dog kun en testenhed. En og samme 
styreenhed kan benyttes til flere forskellige testenheder, der modtager enten de samme eller forskellige testkemikalier. I tilfælde af kobling (tillæg 3) skal hver enkelt testenhed have sin egen styreenhed. Testsystemet 
kan være en aktivslamanlægsmodel, dvs. en Husmann-enhed (tillæg 1, figur 
1) eller en porøs krukke (tillæg 1, figur 2). I begge tilfælde kræves opbe ­
varingstanke af tilstrækkelig størrelse til indløb og udløb, og der kræves pumper til dosering af indløbet enten blandet med opløsningen af testkemi ­
kaliet eller separat.
 
20. Hver aktivslamanlægsenhed består af en beluftningstank med en kendt kapa ­
citet på ca. 3 l aktiveret slam og en separator (sekundær klaringstank), der 
indeholder ca. 1,5 l. De anførte volumener kan i et vist omfang ændres ved 
at justere separatorens højde. Tanke af forskellige størrelser tillades, hvis de benyttes med tilsvarende hydrauliske belastninger. Hvis det ikke er muligt at holde temperaturen i testlokalet inden for det ønskede område, anbefales det 
at benytte tanke med vandkappe med temperaturreguleret vand. En luft ­
pumpe eller doseringspumpe pumper det aktiverede slam fra separatoren over i beluftningstanken enten kontinuerligt eller intermitterende med regel ­
mæssige intervaller.
 
21. Systemet med porøse krukker består af en indre porøs cylinder med en 
konisk bund, der er monteret inde i en lidt større tank af samme form, men som er fremstillet af et vandtæt plastmateriale. Et velegnet materiale til en porøs krukke er porøs polyethylen med en maksimal porestørrelse på 
90 μm og en tykkelse på 2 mm. Slammet adskilles fra det behandlede 
organiske materiale i kraft af differentieret passage gennem den porøse væg. Udløbet opsamles i det ringformede rum, hvorfra det løber over i opsamlingstanken. Der sker ingen bundfældning, og der intet returløb af 
slam. Hele systemet kan opstilles i et termostatstyret vandbad. Porøse 
krukker kan i starten blive tilstoppede og dermed løbe over. I så fald skal
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
den porøse foring udskiftes med en ren foring, efter at slammet er suget fra 
krukken over i en ren spand, og den tilstoppede foring er fjernet. Efter 
aftørring af den vandtætte udvendige cylinder monteres en ren foring, og slammet returneres til krukken. Slam, der sidder fast på siderne af den tilstoppede foring, skrabes også omhyggeligt af og hældes tilbage. Rengør 
først tilstoppede krukker med en tynd vandstråle, så fastsiddende slam fjer ­
nes. Nedsænk derefter krukkerne i en fortyndet opløsning af natriumhypoch ­
lorit og dernæst i vand, og afskyl dem til sidst omhyggeligt i vand.
 
22. Der kræves særlige teknikker til beluftning af slammet i beluftningstankene i 
begge systemer, f.eks. sintrede klodser (diffusionssten) og trykluft. Luften skal renses, eventuelt ved at passere et særligt filter, og skylles. En passende 
luftmængde skal passere gennem systemet for at opretholde de aerobe betin ­
gelser og for at holde slammet konstant i suspension i løbet af testen.
 
Filtreringsapparat eller centrifuge  
23. Apparatur til filtrering af prøver ved hjælp af membranfiltre med passende 
porøsitet (nominel åbningsdiameter 0,45 μm) til adsorption af opløselige 
organiske kemikalier med mindst mulig frigivelse af organisk kulstof. Hvis der benyttes filtre, som frigiver organisk kulstof, vaskes disse filtre omhyggeligt med varmt vand for at fjerne afgivet organisk kulstof. Alter ­
nativt kan der benyttes en centrifuge med en kapacitet på 40 000 m/s
 2 . 
Analyseudstyr  
24. Apparatur, der bruges til bestemmelse af:  
— DOC (opløst organisk kulstof) og TOC (samlet organisk kulstof) eller 
COD (kemisk iltforbrug)  
— specifikt kemikalie, hvis påkrævet  
— suspenderede stoffer, pH, iltkoncentration i vand  
— temperatur, syreindhold og alkalinitet  
— ammoniak, nitrit og nitrat, hvis testen gennemføres under nitrificerende 
forhold.  
Vand  
25. Ledningsvand, der indeholder under 3 mg/l DOC. Bestem alkalinitet, hvis 
den ikke allerede er kendt.  
26. Deioniseret vand, der indeholder under 2 mg/l DOC.  
Organisk materiale  
27. Syntetisk spildevand, husholdningsspildevand eller en blanding heraf kan 
anvendes som organisk materiale. Det er påvist (11) (14), at anvendelsen af husholdningsspildevand alene ofte medfører øget eliminering af DOC i procent og endda eliminering og bionedbrydning af visse kemikalier, som 
ikke nedbrydes biologisk, når der anvendes syntetisk spildevand som defi ­
neret af OECD. Endelig stabiliserer konstant eller intermitterende tilsætning af husholdningsspildevand ofte det aktiverede slam og dermed den vigtige evne til effektiv bundfældelse. Derfor anbefales brugen af husholdningsspil ­
devand. Mål koncentrationen af DOC eller COD i alle nye batches med 
organisk materiale. Det organiske materiales aciditet eller alkalinitet bør være kendt. Det organiske materiale skal muligvis tilsættes en velegnet buffer (natriumhydrogencarbonat eller kaliumdihydrogenfosfat), hvis mate ­
rialets aciditet eller alkalinitet er lav, for at holde en pH-værdi på ca. 7,5 
± 0,5 i beluftningstanken under udførelsen af testen. Mængden af buffer, der skal tilsættes, og tidspunktet for, hvornår den skal tilsættes, afgøres i hvert enkelt tilfælde. Når blandinger benyttes enten kontinuerligt eller intermitte ­
rende, skal DOC (eller COD) i blandingen holdes på et nogenlunde konstant 
niveau, f.eks. ved hjælp af fortynding med vand.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Syntetisk spildevand  
28. Opløs i én liter ledningsvand: pepton: 160 mg; kødekstrakt: 110 mg; urin ­
stof: 30 mg; vandfrit dikaliumhydrogenfosfat (K  2 HPO  4 ): 28 mg; natriumch ­
lorid (NaCl): 7 mg; calciumchloriddihydrat (CaCl  2 .2H  2 O): 4 mg; magne ­
siumsulfatheptahydrat (Mg  2 SO 4 .7H  2 0): 2 mg. Dette eksempel på syntetisk 
spildevand som defineret af OECD giver en middel DOC-koncentration i indløbet på ca. 100 mg/l. Der kan også benyttes andre sammensætninger med ca. den samme DOC-koncentration, og som ligger tættere på rigtigt 
spildevand. Hvis der kræves et knapt så koncentreret indløb, kan det synte ­
tiske spildevand fortyndes (f.eks. 1:1) med ledningsvand for at opnå en koncentration på ca. 50 mg/l. Et sådant svagere indløb vil give mulighed 
for en bedre vækst af nitrificerende organismer, og denne modifikation bør 
anvendes, hvis simuleringen af nitrificerende spildevandsplanter skal under ­
søges. Dette syntetiske spildevand kan fremstilles ved hjælp af destilleret vand i koncentreret form og opbevares ved ca. 1 °C i op til én uge. Fortynd 
efter behov med ledningsvand. (Dette materiale er ikke tilfredsstillende. 
Kvælstofkoncentrationen er f.eks. meget høj, og kulstofindholdet relativt lavt, men der er ikke foreslået en bedre løsning, bortset fra tilførsel af mere fosfat som buffer og ekstra pepton).
 
Husholdningsspildevand  
29. Benyt frisk bundfældet spildevand, der indsamles dagligt fra et rensnings ­
anlæg, der hovedsagelig modtager husholdningsspildevand. Spildevandet 
indsamles før den primære sedimentering fra overløbskanalen ved den primære sedimenteringstank eller fra indløbet til aktivslamanlægget, og det skal stort set være uden grove partikler. Spildevandet kan benyttes efter flere 
dages opbevaring (normalt dog højst syv dage) ved ca. 4 °C, hvis det 
dokumenteres, at DOC (eller COD) ikke falder væsentligt (dvs. med mindre end 20 %) under opbevaringen. For at begrænse forstyrrelserne af systemet bør DOC (eller COD) af hver ny batch justeres inden brug, så der 
opnås en passende konstant værdi, f.eks. ved fortynding med ledningsvand.
 
Aktiveret slam  
30. Aktiveret slam til inokulering indsamles fra beluftningstanken i et velfun ­
gerende spildevandsanlæg eller fra en aktiveret slamenhed i laboratorieskala, der hovedsagelig behandler husholdningsspildevand.
 
Stamopløsninger af testkemikaliet  
31. I forbindelse med kemikalier, der er tilstrækkelig opløselige, fremstilles 
stamopløsninger i passende koncentrationer (f.eks. 1-5 g/l) i demineraliseret 
vand eller i den mineralske del af det syntetiske spildevand. Oplysninger om uopløselige og flygtige kemikalier findes i tillæg 5. Bestem DOC og samlet organisk kulstof (TOC) i stamopløsningen, og gentag målingerne for hver 
ny batch. Hvis forskellen mellem DOC og TOC er større end 20 %, skal 
testkemikaliets vandopløselighed kontrolleres. Sammenlign DOC eller koncentrationen af testkemikaliet målt ved hjælp af specifik analyse af stamopløsningen med den nominelle værdi for at fastslå, hvorvidt genfin ­
dingen er god nok (normalt kan > 90 % forventes). Især for dispersioner 
skal det fastslås, hvorvidt DOC kan benyttes som analytisk parameter, eller om der kun kan anvendes en analyseteknik, der er specifik for det pågæl ­
dende testkemikalie. Centrifugering af prøverne er obligatorisk i forbindelse 
med dispersioner. For hver ny batch skal DOC, COD eller testkemikaliet 
måles med specifikke analyser.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Bestem pH-værdien i stamopløsningen. Ekstreme værdier viser, at tilsæt ­
ningen af kemikaliet kan påvirke pH-værdien af det aktiverede slam i test ­
systemet. I det tilfælde neutraliseres stamopløsningen med små mængder af uorganisk syre eller base for at opnå en pH-værdi på 7 ± 0,5. Undgå dog udfældning af testkemikaliet.
 
FREMGANGSMÅDE  
33. Fremgangsmåden er beskrevet for aktiverede slamanlæg. Den skal tilpasses 
på enkelte områder til brug i systemet med porøse krukker.  
Fremstilling af inokulum  
34. Ved begyndelsen af testen podes testsystemet med aktiveret slam eller med 
et inokulum, der indeholder en lav koncentration af mikroorganismer. Hold 
inokulum beluftet ved stuetemperatur, indtil det er opbrugt, og brug det 
inden for 24 timer. I det første tilfælde udtages en prøve af aktiveret slam fra beluftningstanken i et effektivt drevet biologisk spildevandsrensnings ­
anlæg eller et laboratorierensningsanlæg, der primært modtager hushold ­
ningsspildevand. Hvis nitrificerende forhold skal simuleres, udtages slam 
fra et nitrificerende spildevandsrensningsanlæg. Bestem koncentrationen af suspenderede stoffer, og koncentrer om nødvendigt slammet ved bundfæld ­
ning, så testsystemet tilføres et minimalt volumen. Sørg for, at udgangs ­
koncentrationen af faststof er ca. 2,5 g/l.
 
35. I det andet tilfælde anvendes 2-10 ml/l udløb fra et biologisk anlæg til 
rensning af husholdningsspildevand som inokulum. For at få så mange 
forskellige bakteriearter som muligt kan det være nyttigt at tilføje inokula 
fra forskellige andre kilder, f.eks. overfladevand. I så fald vil det aktiverede slam udvikle sig og vokse i testsystemet.
 
Dosering af organisk materiale  
36. Sørg for, at beholdere til indløb og udløb samt rørsystem fra indløbstanke 
og til udløbstanke er omhyggeligt rengjorte for at fjerne mikrobiel vækst fra starten og i løbet af testen. Testsystemerne samles på et sted, hvor tempe ­
raturen er kontrolleret (normalt inden for 20-25 °C). Hvis det ikke er muligt, 
benyttes testanlæg med vandkappe. Fremstil en tilstrækkelig mængde af det 
krævede organiske materiale (afsnit 27-29). Fyld først beluftningstank og separator med det organiske materiale, og tilsæt inokulum (afsnit 34 og 35). Start beluftningen, så slammet holdes opslæmmet og i aerob tilstand, og 
påbegynd dosering af indløb og genanvendelse af det bundfældede slam. 
Hæld organisk materiale fra opbevaringstankene over i beluftningstankene (afsnit 20 og 21) i test- og kontrolenhederne, og opsaml de respektive udløb i tilsvarende opbevaringstanke. For at opnå den normale hydrauliske reten ­
tionstid på seks timer pumpes det organiske materiale ved 0,5 l/h. Denne 
hastighed bekræftes ved at måle den daglige mængde organisk materiale og registrere reduktionen i volumen af materialet i opbevaringstankene. Andre doseringsmetoder anvendes, hvis virkningen af intermitterende frigivelse og 
»chok«-tilsætning af kemikalier skal bestemmes.
 
37. Hvis det organiske materiale er fremstillet til brug i en periode længere end 
én dag, skal det nedkøles til ca. 4 °C eller konserveres på anden måde for at 
forhindre mikrobiel vækst og bionedbrydning uden for testenhederne (afsnit 
29). Hvis der benyttes syntetisk spildevand, kan en koncentreret stamop ­
løsning fremstilles og opbevares ved ca. 4 °C (f.eks. 10 gange den normale koncentration, afsnit 28). Denne stamopløsning kan omhyggeligt opblandes 
med den korrekte mængde ledningsvand inden brug. Den kan også tilføres 
direkte, mens den korrekte mængde ledningsvand tilføres separat.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dosering af testkemikalie  
38. Tilsæt den korrekte mængde stamopløsning af testkemikaliet (afsnit 31) til 
opbevaringstanken med indløb, pump det direkte med en separat pumpe over i beluftningstanken. Den normale gennemsnitlige testkoncentration i 
indløbet bør være mellem 10 mg/l og 20 mg/l DOC med en højeste koncen ­
tration på maks. 50 mg/l. Hvis vandopløseligheden af testkemikaliet er lav, eller hvis der er sandsynlighed for, at der vil opstå toksiske virkninger, skal koncentrationen reduceres til 5 mg/l DOC eller mindre, men kun hvis der 
benyttes en relevant specifik analysemetode (dispergerede testkemikalier, der 
er tungtopløselige i vand, kan tilsættes ved hjælp af særlige tilsætningstek ­
nikker, se tillæg 5).
 
39. Begynd at tilsætte testkemikaliet efter en periode, hvor systemet har stabili ­
seret sig og effektivt reducerer DOC i det organiske materiale (ca. 80 %). Det er vigtigt at kontrollere, at alle enheder fungerer lige effektivt, inden testkemikaliet tilsættes. Hvis de ikke gør det, hjælper det normalt at blande 
de enkelte slamportioner og derefter fordele slammet i lige store portioner til 
de enkelte enheder. Når et inokulum af (ca.) 2,5 g/l (tørvægt) aktiveret slam er brugt, kan testkemikaliet tilsættes fra begyndelsen af testen, idet direkte tilsætning af stigende mængder fra begyndelsen har den fordel, at det akti ­
verede slam bedre kan tilpasse sig testkemikaliet. Uanset hvordan testkemi ­
kaliet tilsættes, bør gennemstrømningshastigheden og/eller volumen i opbe ­
varingstankene måles med regelmæssige intervaller.
 
Håndtering af aktiveret slam  
40. I løbet af testen stabiliserer koncentrationen af faststofferne i aktiveret slam 
sig normalt mellem grænseværdier, uanset det anvendte inokulum, i inter ­
vallet mellem 1 og 3 g/l (tørvægt) afhængigt af kvalitet og koncentration af 
det organiske materiale, driftsbetingelser, de anvendte mikroorganismers fysiske tilstand og påvirkningen fra testkemikaliet.
 
41. Bestem enten de suspenderede stoffer i beluftningstankene bestemmes 
mindst én gang om ugen, og bortskaf det overskydende slam for at holde koncentrationen på 1 g/l til 3 g/l (tørvægt), eller kontroller den gennemsnit ­
lige slamalder ved en konstant værdi, normalt inden for intervallet 6 til 10 
dage. Hvis der f.eks. er valgt en slamretentionstid på otte dage, skal der 
dagligt fjernes og bortskaffes 1/8 af det aktiverede slams volumen i beluft ­
ningstanken. Dette skal udføres dagligt eller fortrinsvis ved hjælp af en automatisk intervaldrevet pumpe. Selv om koncentrationen af suspenderede 
stoffer holdes konstant eller inden for et snævert interval, opnås der ikke en 
konstant slamretentionstid (SRT), som er den driftsvariabel, der bestemmer værdien af koncentrationen af testkemikaliet i udløbet.
 
42. I løbet af hele testen skal slam, der sidder på væggene i beluftningstank og 
separator, fjernes, så det igen suspenderes. Kontroller og rengør regelmæs ­
sigt alle rør og slanger for at forhindre dannelsen af biofilm. Recirkuler det bundfældede slam fra separatoren til beluftningstanken, helst ved hjælp af 
intermitterende pumpning. Der sker ingen recirkulation i systemet med 
porøse krukker. Det skal dog kontrolleres, at der er indsat rene indvendige krukker, inden volumen i tanken stiger væsentligt (afsnit 21).
 
43. Der kan forekomme dårlig bundfældning og tab af slam i 
Husmann-enhederne. Dette kan afhjælpes ved samtidig at udføre en eller 
flere af de handlinger, der er anført nedenfor, i test- og kontrolenheder:  
— Frisk slam eller flokkuleringsmiddel (f.eks. 2 ml/krukke på 50 g/l FeCl  3 ) 
tilsættes med regelmæssige mellemrum, f.eks. hver uge. Det skal dog 
kontrolleres, at der ikke sker nogen reaktion eller udfældning af testke ­
mikaliet med FeCl  3 . ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— Trykluftpumpen kan erstattes med en slangepumpe, således at slam kan 
recirkuleres i en strøm, der omtrentligt svarer til den krævede indløbs ­
strøm, og således at der kan dannes en anaerob zone i det bundfældede slam (trykluftpumpens geometri begrænser minimumsgennemstrøm ­
ningen af returslam til ca. det 12-dobbelte af indløbets).
 
— Slammet kan intermitterende pumpes fra separatoren til beluftnings ­
tanken, f.eks. 5 minutter hver 2,5 time for at recirkulere 1-1,5 l/h.  
— Et ikke-toksisk skumdæmpningsmiddel i mindste koncentration kan 
bruges til at forhindre tab som følge af skumdannelse (f.eks. siliko ­
neolie).  
— Luft kan presses gennem slammet i separatoren i korte chokbølger 
(f.eks. 10 sekunder hver time).  
— Det organiske materiale kan tilsættes beluftningstanken med 
bestemte intervaller (f.eks. 3-10 minutter hver time).  
Kontrol og analyse  
44. Med regelmæssige mellemrum måles den opløste iltkoncentration, tempera ­
turen og pH-værdien af det aktiverede slam i beluftningstankene. Sørg for, at der altid er tilstrækkeligt ilt til stede (> 2 mg/l), og at temperaturen holdes 
inden for det krævede interval (normalt 20-25 °C). Hold pH på 7,5 ± 0,5 
ved at tilsætte små mængder uorganisk base eller syre til beluftningstanken eller til indløbet eller ved at øge det organiske materiales bufferkapacitet (se afsnit 27). I forbindelse med nitrifikation udvikles syre. Oxidering af 1 mg 
N producerer en mængde, der svarer til ca. 7 mg CO
 3 – . Målefrekvensen 
afhænger af den parameter, der skal måles, og af systemets stabilitet og kan variere mellem daglige og ugentlige målinger.
 
45. Måling af DOC eller COD i indløb til kontrol- og testbeholdere. Koncen ­
trationen af testkemikalie i testindløbet måles ved hjælp af specifik analyse, eller den anslås ud fra koncentrationen i stamopløsningen (afsnit 31), den 
anvendte mængde og mængden af spildevand, der tilføres testenheden. Det 
anbefales, at koncentrationen af testkemikaliet beregnes for at reducere variabiliteten i koncentrationsdata.
 
46. Der udtages relevante prøver fra det indsamlede udløb (f.eks. sammensatte 
prøver over 24 timer), og de filtreres gennem en membran med em pore ­
størrelse på 0,45 μm. De kan også centrifugeres ved ca. 40 000 m/s  2 i ca. 15 
minutter. Centrifugering bør benyttes, hvis filtrering er besværlig. Der fore ­
tages mindst dobbeltbestemmelse af DOC eller COD for at måle den ulti ­
mative bionedbrydning og evt. den primære bionedbrydning ved hjælp af en analyse, der er specifik for testkemikaliet.
 
47. Anvendelsen af COD kan medføre analyseproblemer ved lave koncentra ­
tioner og anbefales derfor kun, hvis der benyttes en tilstrækkelig høj test ­
koncentration (ca. 30 mg/l). Ved kraftigt adsorberende kemikalier anbefales 
det ligeledes, at mængden af adsorberet kemikalie i slammet måles ved 
hjælp af en analyseteknik, der er specifik for testkemikaliet.  
48. Hyppigheden af prøvetagning afhænger af testens forventede varighed. En 
anbefalet hyppighed er tre gange pr. uge. Når enhederne kører effektivt, kan der gå fra en uge til højst seks uger efter tilsætning af testkemikaliet, inden tilpasningsfasen har nået et stabilt niveau (steady state). Der indsamles 
mindst 15 gyldige værdier i plateaufasen (afsnit 59), som normalt varer 
tre uger, inden testresultatet evalueres. Testen kan gennemføres, hvis der opnås en tilstrækkelig elimineringsgrad (f.eks. > 90 %), og disse 15 værdier, som repræsenterer analyser, der er udført hver arbejdsdag i tre uger, er 
tilgængelige. Testvarigheden bør normalt ikke overstige 12 uger efter tilsæt ­
ning af testkemikaliet.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Hvis slammet nitrificerer, og hvis testkemikaliets indvirkning på nitrifice ­
ringen skal undersøges, analyseres prøverne fra test- og kontrolenhedernes 
udløb mindst én gang om ugen, for så vidt angår ammoniak og/eller nitrit samt nitrat.
 
50. Alle analyser gennemføres så hurtigt som muligt, især målinger af nitrogen. 
Hvis analyserne forsinkes, opbevares prøverne mørkt ved ca. 4 °C i flasker med tætsluttende låg. Hvis prøverne skal opbevares i mere end 48 timer, 
skal de konserveres ved hjælp af dybfrysning, syring (f.eks. 10 ml/l af en 
opløsning på 400 g/l af svovlsyre) eller tilsætning af et hensigtsmæssigt toksisk stof (f.eks. 20 ml/l af en 10 g/l-opløsning af kviksølv (II)-chlorid). 
Det sikres, at konserveringsteknikken ikke påvirker analyseresultaterne.
 
Kobling af testenheder  
51. Hvis kobling (tillæg 3) anvendes, skal der dagligt udveksles den samme 
mængde aktiveret slam (150-1 500 ml for beluftningstanke med 3 l væske) 
mellem testenhedens beluftningstank og kontrolenhedens beluftningstank. 
Hvis testkemikaliet adsorberer kraftigt til slammet, er det kun separatorernes svømmelag, der skal skiftes. I begge tilfælde skal der benyttes en korrek ­
tionsfaktor for at beregne testresultaterne (afsnit 55).
 
DATA OG RAPPORTERING  
Behandling af resultater  
52. Beregn procentdelen af DOC- eller COD-eliminering af testkemikaliet for 
hver tidsbaseret vurdering ved hjælp af ligningen:  
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
hvor 
D t = % eliminering af DOC eller COD på tidspunktet t  
C s = DOC eller COD i indløb, der skyldes testkemikaliet, fortrinsvis 
anslået ud fra stamopløsningen (mg/l)  
E = målt DOC- eller COD-værdi i testudløb på tidspunktet t (mg/l)  
E o = målt DOC- eller COD-værdi i kontroludløb på tidspunktet t (mg/l)  
53. Graden af DOC- eller COD-eliminering af det organiske materiale i kontro ­
lenheden er nyttig viden i forbindelse med vurderingen af den biologiske nedbrydning af det aktiverede slam i løbet af testen. Beregn den procentvise eliminering ved hjælp af ligningen:
 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
hvor 
D B = % eliminering af DOC eller COD af det organiske materiale i 
kontrolenheden på tidspunktet t  
C M = DOC eller COD af det organiske materiale i kontrolindløbet (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Beregn evt. den procentvise eliminering af DOC eller COD fremkaldt af det 
organiske materiale plus testkemikaliet i testenheden ved hjælp af ligningen:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
hvor 
D T = % eliminering af DOC eller COD i samlet testindløb  
C T = DOC eller COD af samlet testindløb eller beregnet ud fra stamop ­
løsning (mg/l)  
54. Beregn elimineringen af testkemikaliet målt ved hjælp af en specifik 
analysemetode på hvert vurderingstidspunkt ved hjælp af ligningen:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
hvor 
D ST = % primær eliminering af testkemikalie på tidspunktet t  
S i = målt eller estimeret koncentration af testkemikalie i testindløb (mg/l)  
S e = målt koncentration af testkemikalie i testudløb på tidspunktet t 
(mg/l)  
55. Hvis der er benyttet koblet tilstand, skal der kompenseres for fortyndingen 
af testkemikaliet i beluftningstanken som følge af slamudskiftning ved hjælp af en korrektionsfaktor (se tillæg 3). Hvis der er benyttet en gennemsnitlig 
hydraulisk retentionstid på seks timer, og halvdelen af volumenet af det 
aktiverede slam er udskiftet i beluftningstanken, skal de fastsatte daglige elimineringsværdier (D
 t , afsnit 52) korrigeres for at opnå en korrekt elimi ­
neringsgrad, D  tc , af testkemikaliet ved hjælp af ligningen:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Angivelse af testresultater  
56. Indtegn den procentvise eliminering D  t (eller D  tc ) og eventuelt D  st i forhold 
til tiden (se tillæg 2). Ud fra formen på testkemikaliets elimineringskurve (i sig selv eller som DOC) kan der drages en række konklusioner om elimi ­
neringsprocessen.
 
Adsorption  
57. Hvis der konstateres en høj DOC-eliminering af testkemikaliet fra begyn ­
delsen af testen, elimineres testkemikaliet sandsynligvis ved adsorption til de aktiverede faststoffer i slam. Dette kan bevises ved at bestemme det adsor ­
berede testkemikalie ved hjælp af specifikke analyser. Sædvanligvis 
forbliver DOC-elimineringen af adsorberbare kemikalier ikke høj i løbet 
af hele testen. Normalt sker der en høj grad af eliminering i starten, hvor ­
efter den falder til en ligevægtsværdi. Hvis det adsorberbare testkemikalie på en eller anden måde kan forårsage akklimatisering af den mikrobielle popu ­
lation, vil DOC-elimineringen af testkemikaliet efterfølgende stige og nå op 
på en høj plateauværdi.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Lag-fase  
58. Som ved statiske screeningstest kræver mange testkemikalier en lag-fase, 
inden der sker fuld bionedbrydning. I lag-fasen sker der en akklimatisering eller tilpasning af de nedbrydende bakterier næsten uden eliminering af 
testkemikaliet, og derefter begynder disse bakteriers indledningsvise vækst. 
Denne fase afsluttes, og nedbrydningsfasen indledes, når ca. 10 % af den oprindelige mængde testkemikalie er elimineret (efter mulighed for eventuel adsorption). Lag-fasen er ofte stærkt varierende og vanskelig at reproducere.
 
Plateaufase  
59. En elimineringskurves plateaufase i en kontinuerlig test defineres som den 
fase, hvor den maksimale nedbrydning finder sted. Plateaufasen bør vare mindst tre uger og have ca. 15 målte gyldige værdier.
 
Middelelimineringsgrad for testkemikalie  
60. Beregn middelværdien ud fra elimineringsværdierne (D  t ) for testkemikaliet i 
plateaufasen. Afrundet til nærmeste heltal (1 %) angiver den graden af eliminering af testkemikaliet. Det anbefales endvidere at beregne 95 %- konfidensintervallet af middelværdien.
 
Eliminering af organisk materiale  
61. Indtegn procentdelen af eliminering af DOC eller COD af det organiske 
materiale i kontrolenheden (D  B ) i forhold til tiden. Angiv middelgraden af 
eliminering på samme måde som for testkemikaliet (afsnit 60).  
Indikation for bionedbrydning  
62. Hvis testkemikaliet ikke tydeligt adsorberes til det aktiverede slam, og 
elimineringskurven har en typisk form for en bionedbrydningskurve med 
lag-, nedbrydnings- og plateaufaser (afsnit 58 og 59), kan den målte elimi ­
nering med sikkerhed tilskrives bionedbrydning. Hvis der er sket en høj eliminering i starten, kan simuleringstesten ikke differentiere mellem biolo ­
giske og abiotiske elimineringsprocesser. I sådanne tilfælde, og hvis der i 
øvrigt er tvivl om den biologiske nedbrydning (f.eks. hvis der optræder stripning), skal de adsorberede testkemikalier analyseres, eller yderligere statiske test af bionedbrydning gennemføres baseret på parametre, der 
klart indicerer biologiske processer. Sådanne test omfatter metoder til 
oxygenoptagelse [kapitel C.4 D, E og F i dette bilag (6)], test med måling af kuldioxidproduktion [kapitel C.4 C i dette bilag (6)] eller ISO Headspace-metoden (18), der benytter et præeksponeret inokulum fra simu ­
leringstesten. Hvis både DOC-elimineringen og den specifikke eliminering 
af kemikaliet er målt, indicerer signifikante forskelle (hvis førstnævnte er lavere end sidstnævnte) mellem de eliminerede procentdele, at der i udløbet forekommer mellemliggende organiske produkter, som kan være sværere at 
nedbryde end det oprindelige kemikalie.
 
Testresultaternes validitet  
63. Oplysninger om den normale biologiske nedbrydningsproces af inokulum 
fås, når elimineringsgraden af det organiske materiale (afsnit 53) i kontro ­
lenheden fastlægges. Testen anses for at være gyldig, hvis graden af DOC- 
eller COD-eliminering i kontrolenhederne er > 80 % efter to uger, og der 
ikke er gjort unormale observationer.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Hvis der er benyttet et let biologisk nedbrydeligt kemikalie (reference), bør 
graden af bionedbrydning (D  t , afsnit 52) være > 90 %.  
65. Hvis testen gennemføres under nitrificerende forhold, bør middelkoncentra ­
tionen i udløb være < 1 mg/l ammoniak-N og < 2 mg/l nitrit-N.  
66. Hvis disse kriterier (afsnit 63-65) ikke opfyldes, gentages testen ved hjælp af 
et inokulum fra en anden kilde, hvorefter et referencekemikalie testes, og 
alle forsøgsprocedurer kontrolleres.  
Testrapport  
67. Testrapporten skal indeholde følgende:  
Testkemikalie:  
— identifikationsdata  
— fysisk form og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber.  
Testbetingelser:  
— typen af testsystem; evt. modificeringer for test af uopløselige og flyg ­
tige kemikalier  
— typen af organisk materiale  
— art og andel af industrispildevand i spildevandet, hvis kendt  
— inokulum, art og prøvetagningssted(er), koncentration og evt. forkondi ­
tionering  
— stamopløsning af testkemikalie: DOC- og TOC-indhold; tilberedning i 
tilfælde af suspension; anvendt testkoncentration; årsager, hvis uden for intervallet 10-20 mg/l DOC; tilsætningsmetode; dato for første tilsæt ­
ning; evt. ændringer
 
— gennemsnitlig slamalder og gennemsnitlig hydraulisk retentionstid, slam ­
overløbsmetode, metoder til afhjælpning af fyldning, tab af slam osv.  
— anvendte analyseteknikker  
— testtemperatur  
— kvaliteter af slamfyld, slamvolumenindeks (SVI), faste stoffer, der er 
suspenderet (MLSS)  
— enhver afvigelse fra standardprocedurer og alle omstændigheder, der kan 
have påvirket resultaterne.  
Testresultater:  
— alle målte data (DOC, COD, specifikke analyser, pH-værdi, temperatur, 
iltkoncentration, suspenderede stoffer og N-kemikalier, hvis det er rele ­
vant)  
— alle beregnede værdier af D  t (eller D  tc ), D  B og D  St opstillet i tabelform 
og elimineringskurver  
— oplysninger om lag- og plateaufaser, testvarighed, elimineringsgraden af 
testkemikaliet og det organiske materiale i kontrolenheden, statistiske oplysninger og udtryk for biologisk nedbrydelighed og testens validitet
 
— diskussion af resultater.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
LITTERATUR:  
(1) Swisher RD (1987). »Surfactant Biodegradation«, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, 1085 s.  
(2) German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents 
in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706.  
(3) Painter HA og King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, Det Forenede Kongerige.
 
(4) Painter HA og King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. 
Res. 12: 909-915.  
(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
(6) Kapitel C.4 i dette bilag, Bestemmelse af let bionedbrydelighed.  
(7) Kapitel C.12 i dette bilag, Biologisk nedbrydning — modificeret 
SCAS-test.  
(8) Kapitel C.19 i dette bilag, Bestemmelse af adsorptionskoefficienten (K  OC ) i 
jord og i kloakslam med HPLC (high performance liquid chromatography).  
(9) Gerike P og Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173.
 
(10) Gerike P og Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclu ­
sions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.  
(11) Painter HA og Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. s 113-138, i: Laboratory tests for simula ­
tion of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
(12) ISO 11733 (1995; revideret 2004). Evaluation of the elimination and biode ­
gradability of organic substances in an aqueous medium — activated sludge simulation test.
 
(13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33-48.  
(14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340-343.  
(15) Gerike P, Fischer WK og Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758.
 
(16) Baumann U, Kuhn G og Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214-220.  
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. s. 91-98 
ISBN 011 751661 9.  
(18) ISO 14593 (1998). Water Quality — Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Tillæg 1  
Figur 1  
Udstyr til vurdering af bionedbrydelighed  
Husmann-enhed
  
A. Opbevaringstank  
B. Doseringspumpe  
C. Beluftningskammer (kapacitet: 3 l)  
D. Sedimentationsbeholder  E. Trykluftpumpe  
F. Opsamlingstank  
G. Beluftningsanordning  
H. Flowmeter  
Figur 2  
Udstyr til vurdering af bionedbrydelighed  
Porøse krukker
  
A. Opbevaringstank  
B. Doseringspumpe  
C. Porøs beluftningstank  
D. Ydre tæt beholder  E. Opsamlingstank  
F. Diffuser  
G. Flowmeter  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Figur 3  
Porøs krukke som beluftningstank – 3 l
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Tillæg 2  
Eksempel på en elimineringskurve
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Tillæg 3  
[TIL ORIENTERING]  
KOBLING AF TESTENHEDER  
For at forsøge at udligne de mikrobielle populationer i slam i en testenhed, der 
tilføres spildevand og et testkemikalie, og i en kontrolenhed, der kun tilføres 
spildevand, blev der indført en daglig udskiftning af slam (1). Proceduren kaldes kobling, og metoden er kendt som koblede enheder. Kobling blev i starten udført ved hjælp af aktiverede slamenheder (Husmann), men det anvendes også i forbin ­
delse med porøse krukker (2) (3). Der er ikke konstateret væsentlige forskelle i 
resultaterne mellem ikke-koblede og koblede enheder, hverken med Husmann-enheder eller porøse krukker, så der opnås ingen fordel ved at bruge tid og energi på at koble enhederne.
 
Udveksling af slam kan give indtryk af en ret omfattende eliminering, idet nogle 
af testkemikalierne overføres, og koncentrationerne af testkemikaliet i test- og kontroludløbet bliver næsten ens. Der skal derfor anvendes korrektionsfaktorer, som afhænger af den andel, der udskiftes, og den hydrauliske middelretentions ­
tid. Der er offentliggjort nærmere oplysninger om beregningen (1).
 
Beregn den korrigerede DOC- eller COD-elimineringsgrad ved hjælp af den 
generelle formel:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
hvor 
D tc = korrigeret % DOC- eller COD-eliminering  
D t = konstateret % DOC- eller COD-eliminering  
a = udskiftningens andel af de aktiverede slamenheders volumen  
r = gennemsnitlig hydraulisk retentionstid (t)  
Eksempel: Hvis halvdelen af beluftningstankens volumen udskiftes (a = 0,5), og 
den gennemsnitlige hydrauliske retentionstid er seks timer, anvendes følgende korrigerende formel:
 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LITTERATUR  
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
 
(2) Painter HA og Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD 
Activated Sludge Simulation Test. s. 113-138. I: Laboratory Tests for Simu ­
lation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
(3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, 
Stevenage, Det Forenede Kongerige.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Tillæg 4  
EVALUERING AF HÆMNINGEN AF DET AKTIVEREDE SLAM  
Proces med testkemikalier  
1. Visse kemikalier (eller spildevand) bliver muligvis ikke nedbrudt eller elimi ­
neret i simuleringstesten, og de kan endog have en hæmmende effekt på 
slammets mikroorganismer. Andre kemikalier nedbrydes biologisk ved lave koncentrationer, men er hæmmende ved højere koncentrationer (hormese). Der kan være påvist hæmmende effekter på et tidligere stadium, eller det kan 
være bestemt ved hjælp af en toksicitetstest, hvor der er anvendt et inokulum, 
der svarer til eller er identisk med det, der blev anvendt i simuleringstesten (1). Eksempler på sådanne metoder er hæmning af iltoptagelse [kapitel C.11 i dette bilag (2) og ISO 8192(3)] eller hæmning af vækst af slamorganismer 
[ISO 15522 (4)].
 
2. I simuleringstesten vil enhver hæmning vise sig ved, at forskellen i opløst 
organisk kulstof (DOC) eller kemisk iltforbrug (COD) mellem udløbet fra 
testbeholderen og udløbet fra kontrollen er større end det DOC, der er tilsat som testkemikalie. Udtrykt på en anden måde vil den procentvise eliminering af DOC (og det biokemiske iltforbrug (BOD), COD og/eller NH
 + 4 ) af det 
organiske materiale blive reduceret ved behandling i kraft af tilstedeværelsen 
af testkemikaliet. Hvis det sker, gentages testen, hvor koncentrationen af testkemikaliet reduceres, indtil der nås et niveau, hvor der ikke sker nogen hæmning, og måske reduceres yderligere, indtil testkemikaliet er biologisk 
nedbrudt. Hvis testkemikaliet (eller spildevandet) imidlertid har negative 
virkninger på processen ved alle testede koncentrationer, tyder det på, at kemikaliet er svært og muligvis umuligt at behandle biologisk. Det er dog 
værd at gentage testen med aktiveret slam fra en anden kilde og/eller under ­
kaste slammet en langsommere akklimatisering.
 
3. Hvis testkemikaliet omvendt elimineres biologisk i første forsøg i simule ­
ringstesten, skal koncentrationen forøges, hvis der skal indsamles viden om, hvorvidt kemikaliet kan være hæmmende.
 
4. Når man forsøger at bestemme grader af hæmning, skal man være opmærk ­
som, at den aktiverede slampopulation kan undergå forandringer, så mikro ­
organismerne over tid kan udvikle en tolerance over for et hæmmende kemi ­
kalie.  
5. Beregning af hæmningsgrad:  
Den overordnede procentvise eliminering R  o , af BOD, DOC, COD osv., kan 
for test- og kontrolenheder beregnes ved hjælp af ligningen:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
hvor:  
I = indløbets koncentration af BOD, DOC, COD mv. i forbindelse med 
test- eller kontrolbeholdere (mg/l)  
E = udløbets koncentrationer (mg/l).  
I og E skal korrigeres for DOC, der skyldes testkemikaliet i testenhederne. 
Ellers vil beregningerne af den procentvise hæmning ikke blive korrekt.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Graden af hæmning forårsaget af tilstedeværelsen af testkemikaliet kan 
beregnes ved hjælp af ligningen:  
% hæmning ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
hvor:  
R c = procentvis eliminering i kontrolbeholderne  
R t = procentvis eliminering i testbeholderne.  
LITTERATUR  
(1) Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
(2) Kapitel C.11 i dette bilag, Biologisk nedbrydning — aktiveret slam — 
respirationshæmningstest.  
(3) ISO 8192 (2007) Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
(4) ISO 15522 (1999) Water Quality — Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Tillæg 5  
Testkemikalier, der er tungtopløselige i vand — flygtige kemikalier  
Kemikalier, der er tungtopløselige i vand  
Der er tilsyneladende kun offentliggjort enkelte rapporter om test af vandopløse ­
lige og uopløselige kemikalier i forbindelse med spildevandsrensning (1) (2) (3).  
Der findes ingen enkeltstående metode til dispergering af testkemikalier, der kan 
benyttes på alle uopløselige kemikalier. To af de fire metodetyper, der er 
beskrevet i ISO 10634 (4), kan muligvis bruges til at dispergere testkemikalier med henblik på simuleringstest. Det drejer sig om brug af emulgeringsmidler og/eller ultralyd. Det skal godtgøres, at den resulterende dispergering er stabil i 
perioder på mindst 24 timer. Velstabiliserede dispergeringer, der etableres under 
konstant omrøring i en beholder (afsnit 38), skal derefter overføres til en beluft ­
ningstank, der holdes adskilt fra husholdningsspildevand (eller syntetisk spilde ­
vand).
 
Hvis dispergeringerne er stabile, undersøges det, hvordan testkemikaliet kan 
bestemmes i dispergeret form. Det er ikke sandsynligt, at DOC vil være velegnet. 
Der skal derfor etableres en specifik analysemetode for testkemikaliet, som kan 
anvendes på udløb, faststoffer i udløb og aktiveret slam. Testkemikaliets skæbne i simuleringen af processen for aktiveret slam bestemmes derefter i flydende og faste faser. Derefter fastsættes en »massebalance« med henblik på at afgøre, om 
testkemikaliet er blevet biologisk nedbrudt. Det indicerer dog kun den primære 
biologiske nedbrydning. Påvisning af ultimativ biologisk nedbrydning sker ved at anvende af en respirometertest for let biologisk nedbrydelighed (kapitel C.4 i dette bilag (5) C, F eller D), hvor inokulumslam eksponeres for testkemikaliet i 
simuleringstesten.
 
Flygtige kemikalier  
Udførelsen af simuleringer af spildevandsrensning på flygtige kemikalier er både 
kontroversiel og problematisk. Ligesom for testkemikalier, der er tungtopløselige 
i vand, er der offentliggjort meget få rapporter, der beskriver simuleringstest af flygtige kemikalier. En konventionel type apparatur til fuldstændig opblanding tilpasses ved at forsegle beluftnings- og sedimentationstankene, måle og styre 
luftstrømmen ved hjælp af flowmetre og lede den udgangsgas gennem udskillere 
med henblik på at indsamle flygtigt organisk materiale. I nogle tilfælde benyttes en vakuumpumpe til at suge udgangsgassen gennem en »kold« udskiller eller en udsugningsudskiller med Tenax og silicagel med henblik på gaskromatografiske 
analyser. Testkemikaliet i udskilleren kan bestemmes analytisk.
 
Testen udføres i to etaper. Først kører enhederne uden slam, men hvor syntetisk 
spildevand og testkemikaliet pumpes ind i beluftningstanken. Prøver fra indløb, 
udløb og udgangsgas indsamles og analyseres for testkemikaliet i et par dage. Ud fra de indsamlede data kan den procentdel (R
 vs ) af testkemikaliet, der strippes fra 
systemet, beregnes.  
Derefter gennemføres den normale biologiske test (med slam) under samme 
driftsbetingelser som stripningsundersøgelsen. Der udføres ligeledes DOC- eller 
COD-målinger for at kontrollere, at enhederne fungerer effektivt. Der udføres 
lejlighedsvise analyser for at bestemme testkemikaliet i indløb, udløb og udgangsgas i den første del af testen. Efter akklimatisering gennemføres hyppi ­
gere analyser. Ud fra steady state-data beregnes procentdelen af den eliminering 
af testkemikaliet fra væskefasen, der sker som følge af alle processer (R
 T ) (fysisk 
og biologisk), og andelen af (R  V ), der er strippes fra systemet.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Beregning:  
a) I den ikke-biologiske test beregnes procentdelen (R  VP ) af det testmateriale, 
der strippes fra systemet, ved hjælp af ligningen:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
hvor 
R VP = eliminering af testkemikalie ved fordampning (%)  
S VP = testkemikalie opsamlet i udskiller udtrykt som tilsvarende koncentra ­
tion i væskefasen (mg/l)  
S IP = koncentration af testkemikalie i indløb (mg/l).  
b) I den biologiske test beregnes procentdelen (R  V ) af det testmateriale, der 
strippes fra systemet, ved hjælp af ligningen:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
hvor 
R V = eliminering af testkemikalie ved fordampning i biologisk test (%)  
S V = testkemikalie opsamlet i udskiller i biologisk test udtrykt som tilsva ­
rende koncentration i det flydende indløb (mg/l)  
S I = koncentration af testkemikalie i indløb (mg/l).  
c) I den biologiske test beregnes den procentdel (R  T ) af testkemikaliet, der 
fjernes af alle processer, ved hjælp af ligningen:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
hvor 
S E = koncentration af testkemikalie i det (flydende) udløb (mg/l).  
d) Den procentdel (R  BA ), der fjernes ved bionedbrydning plus adsorption, 
beregnes ved hjælp af ligningen:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Der udføres separate test for at bestemme, om testkemikaliet er adsorberet. 
Hvis det er tilfældet, skal der foretages yderligere korrektion.  
e) En sammenligning mellem den andel af testkemikalie, der strippes fra de 
biologiske (R  v ) og de ikke-biologiske testsystemer (R  vp ), viser den generelle 
virkning, som biologisk behandling har på emissionen af testkemikaliet i 
atmosfæren.  
Eksempel : Benzen  
Slamretentionstid = 4 dage  
Syntetisk spildevand: retentionstid = 8 timer  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Således …  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % og R  BA = 85 %.  
Benzen anses derfor ikke til at blive adsorberet til slam.  
LITTERATUR  
(1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
(2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
(3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
(4) ISO 10634 (1995) Water Quality — Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalua ­
tion of their biodegradability in an aqueous medium.  
(5) Kapitel C.4 i dette bilag, Bestemmelse af let bionedbrydelighed.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Tillæg 6  
Virkninger af slamretentionstid (SRT) på mulighederne for at behandle 
kemikalier  
INDLEDNING  
1. Den metode, der beskrives i selve teksten, har til formål at afdække, om de 
testede kemikalier (normalt kemikalier, der er inhærent biologisk nedbryde ­
lige, men ikke let biologisk nedbrydelige) kan nedbrydes biologisk inden for de rammer, der eksisterer i større spildevandsanlæg. Resultaterne udtrykkes 
som procentvis eliminering og procentvis bionedbrydning. Driftsforholdene i 
aktivslamenhederne og valget af indløb giver mulighed for temmelig store variationer i koncentrationen af testkemikaliet i udløbet. Testene udføres ved kun én nominel koncentration af slamfaststoffer eller én nominel 
slamretentionstid (SRT), og de beskrevne slamoverløbssystemer kan 
bevirke, at SRT-værdien varierer betydeligt i løbet af testen, både fra dag til dag og i løbet af dagen.
 
2. I denne variant (1) (2) holdes SRT inden for meget snævrere grænser i løbet 
af hver periode på 24 timer (på samme måde som i stort forhold), hvilket fører til en mere konstant koncentration i udløb. Det anbefales at bruge husholdningsspildevand, idet det giver mere konsistente og højere procentvis 
eliminering. Virkningerne af en række SRT-værdier undersøges, og i en 
mere detaljeret undersøgelse kan virkningerne af forskellige temperaturinter ­
valler på forskellige udløbs koncentration bestemmes.
 
3. Der er endnu ikke generel enighed om de anvendelige kinetiske modeller, 
når kemikalier bionedbrydes i forbindelse med spildevandsrensning. Monod-modellen for bakteriel vækst og substratudnyttelse blev valgt (1) (2) til brug på de indsamlede data, idet metoden var beregnet til kun at 
blive brugt på kemikalier, der var produceret i store mængder, og som 
resulterede i spildevandskoncentrationer over 1 mg/l. Validiteten af den forenklede model og de angivne beregninger blev bekræftet ved hjælp af en serie alkoholethoxylater med varierende grader af primær bionedbryde ­
lighed (2) (3).
 
Bemærk:  Denne variantmetode ligger tæt op ad teksten til denne testmetode 
C.10-A, og det er kun de afvigende oplysninger, der herefter 
angives.  
TESTENS PRINCIP  
4. Enheder med porøse krukker til aktiveret slam, som er beregnet til at lette 
(næsten) kontinuerligt overløb af blandet væske, således at slamretentions ­
tiden (SRT eller θ s ) kan styres meget præcist, anvendes i ikke-koblet tilstand 
over et interval af SRT'er og evt. et interval af temperaturer. Retentionstiden er normalt 2-10 dage, og temperaturen ligger mellem 5 og 20 °C. Spilde ­
vandet, helst husholdningsspildevand, tilsættes sammen med en opløsning af 
testkemikaliet separat til enhederne i intervaller for at opnå den krævede 
retentionstid for spildevandet (3-6 timer) og den krævede koncentration af testkemikaliet i indløbet. Kontrolenheder, der ikke tilføres testkemikalier, kører parallelt med henblik på sammenligning.
 
5. Andre former for apparatur kan benyttes, men der skal udvises stor omhu 
for at opnå effektiv styring af SRT. Hvis der anvendes anlæg, som omfatter en sedimenteringsenhed, skal der f.eks. tages højde for tab af faststoffer via anlæggets udløb. Endelig skal der også tages særlige forholdsregler for at 
undgå fejl forårsaget af variationer i mængden af slam i sedimenterings ­
enheden.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Enhederne drives ved hvert af de valgte sæt betingelser. Når ligevægtstil ­
standen er nået, opnås de gennemsnitlige steady state-koncentrationer af 
testkemikaliet i udløbet og evt. DOC i løbet af en periode på ca. tre uger. Ud over at vurdere den procentvise eliminering af testkemikaliet og evt. DOC udtrykkes forholdet mellem driftsforholdene i et anlæg og koncen ­
trationen i udløbet grafisk. På den baggrund kan tentative kinetiske 
konstanter beregnes, og de betingelser, hvorunder testkemikaliet kan behandles, kan forudsiges.
 
OPLYSNINGER OM TESTKEMIKALIET  
7. Kapitel C.10 A, afsnit 12 og 13, finder anvendelse.  
TÆRSKELVÆRDIER  
8. Kapitel C.10 A, afsnit 14 og 15, finder anvendelse.  
REFERENCETESTKEMIKALIE  
9. Kapitel C.10 A, afsnit 16, finder anvendelse.  
FORSØGSRESULTATERNES REPRODUCERBARHED  
10. Kapitel C.10 A, afsnit 17 og 18, finder anvendelse.  
BESKRIVELSE AF METODEN  
Apparatur  
11. En velegnet enhed er det modificerede system med porøse krukker (tillæg 
6.1). Det består af en indvendig beholder (eller foring) fremstillet af porøst polypropylen med en tykkelse på 3,2 mm og en porestørrelse på ca. 90 μm. 
Samlingen er stumpsvejset. (Det giver en mere robust enhed end den, der er 
beskrevet i afsnit 21 i dette kapitel, C.10 A.) Foringen er indsat i en tæt ydre beholder af polyethylen, der består af to dele: en cirkelrund fod, hvori der er boret huller til to luftslanger og en slange til slamoverløb, samt en påmon ­
teret cylinder, der skrues fast på foden, og som er forsynet med et udløb, der 
er placeret, så der opnås et bestemt volumen (3 l) i den porøse krukke. En af luftslangerne er udstyret med en diffuser-sten, og den anden afslutter åbent og er placeret vinkelret på stenen i krukken. Dette system frembringer 
turbulens, der sikrer, at krukkens indhold blandes effektivt, og at der 
opnås koncentrationer af opløst ilt over 2 mg/l.
 
12. Et passende antal enheder opbevares ved kontrollerede temperaturer i inter ­
vallet fra 5-20 °C (± 1 °C) enten i vandbad eller i lokaler med konstant 
rumtemperatur. Ved hjælp af pumper tilføres opløsningen af testkemikaliet og bundfældet spildevand til beluftningstankene i de angivne doser (0-1,0 ml/min. og 0-25 ml/min.), og ved hjælp af en tredje pumpe fjernes 
affaldsslam fra beluftningstankene. Den nødvendige meget lave strømnings ­
hastighed for affaldsslam opnås ved hjælp af en pumpe, der indstilles til en højere hastighed og kun kører i intervaller styret af en timer. Pumpen kører f.eks. pumpen i 10 sekunder pr. minut, hvor den pumper med 3 ml/min., 
hvilket giver en strømningshastighed for affaldsslam på 0,5 ml/min.
 
Filtreringsapparat eller centrifuge  
13. Kapitel C10 A, afsnit 23, finder anvendelse.  
Analyseudstyr  
14. Kapitel C.10 A, afsnit 24, finder anvendelse.  
Vand  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Kapitel C.10 A, afsnit 25 og 26, finder anvendelse.  
Organisk materiale  
16. Kapitel C.10 A, afsnit 27, finder anvendelse.  
Syntetisk spildevand  
17. Kapitel C.10 A, afsnit 28, finder anvendelse.  
Husholdningsspildevand  
18. Kapitel C.10 A, afsnit 29, finder anvendelse.  
Aktiveret slam  
19. Kapitel C10 A, afsnit 30, finder anvendelse.  
Stamopløsninger af testkemikaliet  
20. Kapitel C.10 A, afsnit 31 og 32, finder anvendelse.  
FREMGANGSMÅDE  
Fremstilling af inokulum  
21. Kapitel C.10 A, kun afsnit 34, finder anvendelse — brug aktiveret slam 
(ca. 2,5 g/l).  
Antal testenheder  
22. Til en enkel test, f.eks. måling af den procentvise eliminering, kræves kun 
en enkelt SRT. Hvis der skal indsamles data til beregning af tentative kinetiske konstanter, kræves der dog fire eller fem SRT-værdier. Der 
vælges normalt værdier mellem 2 og 10 dage. I praksis udføres en test 
med fire eller fem SRT'er samtidig ved én temperatur. Ved udvidede forsøg benyttes de samme SRT-værdier eller måske et andet interval af værdier ved andre temperaturer inden for et interval fra 5-20 °C. Ved 
primær bionedbrydning (hovedanvendelse) kræves normalt kun én enhed 
pr. sæt betingelser. For at opnå den ultimative biologiske nedbrydelighed kræves en kontrolenhed for hvert sæt betingelser, og denne enhed tilføres spildevand, men ikke testkemikalie. Hvis testkemikaliet anses for at være til 
stede i det brugte spildevand, skal der anvendes kontrolenheder i forbindelse 
med vurderingen af den primære biologiske nedbrydning, hvorefter bereg ­
ningerne korrigeres som nødvendigt.
 
Dosering af organisk materiale og testkemikalie  
23. Kapitel C.10 A, afsnit 36-39, finder anvendelse. Det bør dog bemærkes, at 
opløsningen af testkemikalier doseres separat, og at der benyttes forskellige 
overløbsprocenter for slam. Strømningshastigheder for indløb, udløb og 
slamoverløb overvåges og justeres eventuelt inden for ± 10 % f.eks. to gange om dagen. Hvis der opstår problemer i forbindelse med analyseme ­
toderne, når der benyttes husholdningsspildevand, kan testen gennemføres 
med syntetisk spildevand. Det skal dog sikres, at de forskellige medier giver 
sammenlignelige kinetiske data.
 
Håndtering af enheder til aktiveret slam  
24. Kapitel C.10 A, afsnit 40 til 43, finder anvendelse. SRT kontrolleres dog 
kun ved »konstant« slamoverløb.  
Prøvetagning og analyse  
25. Kapitel C.10 A, afsnit 44-50, finder anvendelse. Dog skal koncentrationen af 
testkemikaliet og evt. DOC bestemmes. COD bør ikke anvendes.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
DATA OG RAPPORTERING  
Behandling af resultater  
26. Kapitel C.10 A, afsnit 52-54, finder anvendelse.  
Angivelse af testresultater  
27. Kapitel C.10 A, afsnit 56-62, finder anvendelse.  
Beregning af kinetiske konstanter  
28. Det er mere realistisk at anføre testkemikaliets gennemsnitlige steady 
state-koncentration i udløbet og beskrive, hvordan denne værdi varierer 
med driftsforhold, end at anføre den procentvise primære biologiske 
nedbrydning. Dette kan gøres ved hjælp af ligningen (6) i tillæg 6.2, der kan give værdier til K
 S , μ m og θ SC , den kritiske slamretentionstid.  
(Alternativt kan de omtrentlige værdier for K  S og μm fås ved hjælp af et 
simpelt computerprogram, som tilpasser den teoretiske kurve, der er 
beregnet ud fra ligning 2 (tillæg 6.2), til de målte forsøgsværdier. Selv om en given løsning ikke vil være unik, kan der fås en brugbar tilnærmelse af K
 S og μ m .) 
Resultaters variabilitet  
29. Det er velkendt, at der opnås variable værdier for kinetiske parametre for 
forskellige kemikalier. Det antages, at de forhold, som slammet er udviklet 
under, og de aktuelle betingelser i testen (som i afsnit 5 og i andre test ­
forløb) i væsentlig grad påvirker de resulterende værdier. Et af aspekterne ved denne variabilitet er blevet behandlet af Grady et al. (4), der har fores ­
lået, at udtrykkene »extant« og »intrinsic« burde anvendes i forbindelse med 
to ekstreme forhold, der repræsenterer grænserne for den fysiologiske 
tilstand, en dyrkning kan opnå i forbindelse med et kinetisk eksperiment. Hvis tilstanden ikke må ændres under testen, afspejler de kinetiske parame ­
terværdier de forhold i miljøet, hvorfra mikroorganismerne blev udtaget. 
Disse værdier kaldes »extant« eller i daglig tale »eksisterende«. Ved det 
andet ekstreme forhold, hvor testens betingelser går ud på at tillade den fulde udvikling af proteinsyntesesystemet og tillade den størst mulige vækstrate, kaldes de opnåede kinetiske parametre »intrinsic«, og de er kun 
afhængige af substratets tilstand og bakterietyperne i dyrkningen. Som en 
vejledning kan man tænke på, at »extant values« opnås ved at holde forholdet mellem koncentrationen af substrat og kompetente mikroorga ­
nismer (S
 o /X o ) lavt, f.eks. 0,025, hvorimod der er tale om »intrinsic values«, 
når forholdet er højt, f.eks. mindst 20. I begge tilfælde skal S  o være lig med 
eller større end den relevante værdi for Ks (halvmætningskonstanten).  
30. Variabilitet og andre facetter ved bionedbrydningskinetik blev for nylig 
diskuteret i forbindelse med en SETAC-workshop (5). Disse forsøg — 
rapporterede og planlagte — vil give et klarere indblik i kinetikken i spilde ­
vandsrensningsanlæg og medvirke til at give en bedre forståelse af eksiste ­
rende data, ligesom de vil medvirke til mere relevante designs til fremtidige testmetoder.
 
LITTERATUR:  
(1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33-48.  
(2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340-343.  
(3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady CPL, Smets BF og Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742-748.  
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop hos Port Sunlight, Det Forenede Kongerige. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4.-6. sept. 1996. SETAC- 
Europe, Bruxelles.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Tillæg 6.1  
Porøs krukke med SRT-styring
  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Tillæg 6.2  
Beregning af kinetiske konstanter  
1. Når det antages, at Monod-kinetik gør sig gældende, og på baggrund af en 
massebalance af aktive faststoffer og substrat i det aktiverede slamsystem (1) kan der opnås følgende steady state-udtryk:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
eller 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
hvor:  
S 1 = koncentration af substrat i udløb, (mg/l)  
K S = halvmætningskonstant, den koncentration, hvor μ = μ m /2 (mg/l)  
μ = specifik vækstrate (d  –1 ) 
μ m = maksimumsværdi for μ m (d –1 ) 
K d = specifik henfaldsrate for aktive faststoffer (d  –1 ) 
θ S = slammets gennemsnitlige retentionstid, SRT (d)  
En undersøgelse af denne ligning fører til følgende konklusioner:  
i) Udløbets koncentration er uafhængig af koncentrationen i indløbet (S  0 ). 
Derfor varierer den procentvise biologiske nedbrydning med indløbets 
koncentration, S  0 . 
ii) Den eneste parameter for anlægsstyring, der påvirker S  1 , er slamreten ­
tionstiden, θ S . 
iii) For en given koncentration i indløbet, S  0 , vil der være en kritisk slam ­
retentionstid:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
hvor:  
θ SC = kritisk slamretentionstid, under hvilken de kompetente mikro ­
organismer vaskes ud af anlægget.  
iv) Da de andre parametre i ligning (2) er knyttet til vækstkinetik, vil 
temperaturen sandsynligvis påvirke substratniveauet i udløbet og den kritiske slamalder, dvs. at den slamretentionstid, der er nødvendig for at opnå en bestemt behandlingsgrad, stiger med faldende temperatur.
 
2. På baggrund af en massebalance af faststoffer i systemet med porøse 
krukker og forudsat, at faststofkoncentration i anlæggets udløb, X  2 , er lav 
i forhold til koncentrationen i beluftningstanken, X  1 , vil slamretentionstiden 
være  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
og 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
hvor:  
V = beluftningstankens volumen (l)  
X 1 = faststofkoncentration i beluftningstank (mg/l)  
X 2 = faststofkoncentrationen i udløb, (mg/l)  
Q 0 = gennemstrømningshastighed for indløb (l/d)  
Q 1 = gennemstrømningshastighed for affaldsslam (l/d)  
Derved kan slamretentionstiden styres ved enhver forudvalgt værdi ved at 
styre gennemstrømningshastigheden for affaldsslam, Q  1 . 
Konklusioner:  
3. Testens hovedformål er derfor at kunne forudsige udløbets koncentration og 
dermed niveauerne af testkemikalie i det modtagende vand.  
4. Ved at afsætte S  1 i forhold til θ S kan den kritiske slamretentionstid, θ SC , 
nogle gange evalueres direkte, f.eks. kurve 3 i figur 1. Når dette ikke er muligt, kan θ
 SC beregnes, sammen med omtrentlige værdier for μ m og K  S , 
ved at afsætte S  1 i forhold til S  1 •θ S . 
En ændring af ligningen (1) giver  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Hvis K  d er lille, bliver 1 + θ s • K  d ~ 1 og [5]:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Grafen skulle dermed blive en lige linje (se figur 2) af hældningen 1/ μ m og 
skære K  S /μ m — altså θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Figur 1  
Tre temperaturer; fem SRT'er
  
Figur 2  
Regressionslinje SRT · S 1 over for S  1 ved T = 5 °C
  
Ordliste : 
Udløbskoncentration  
Kurve.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Tillæg 7  
TEST VED LAVT ( μg/l) KONCENTRATIONSOMRÅDE  
1. Mange kemikalier er normalt til stede i vandmiljøet i meget lave koncen ­
trationer ( μg/l) — selv i spildevand. Ved disse koncentrationer fungerer de 
sandsynligvis ikke som primære substrater, der fremmer vækst. Der er større sandsynlighed for, at de nedbrydes som sekundære substrater uden vækst 
sideløbende med en række forskellige naturligt forekommende kulstofkemi ­
kalier. Nedbrydningen af sådanne kemikalier passer derfor ikke ind i den model, der er beskrevet i tillæg 6. Der findes mange modeller, der kan anvendes, og der kan anvendes flere modeller samtidig under de betingelser, 
der gælder i spildevandsrensningssystemer. Der kræves betydeligt mere 
forskning at belyse dette problem.
 
2. I mellemtiden kan den fremgangsmåde, der er beskrevet i selve teksten 
(kapitel C.10 A), følges, men kun i forbindelse med primær biologisk nedbrydelighed, hvor der er tale om passende lave koncentrationer (< 100 μg/l) og en valideret analysemetode. Den procentvise biologiske nedbryd ­
ning kan beregnes (se afsnit 54 i testmetoden), når blot der tages højde for 
de abiotiske processer (adsorption, flygtighed osv.). Et eksempel er den undersøgelse, der blev gennemført af Nyholm m.fl. (1) (2), der benyttede en firetimers cyklus i et fill and draw-system. De rapporterede om 
pseudo-førsteordenskonstanter for fem kemikalier, der blev tilsat syntetisk 
spildevand i en mængde fra 5 til 100 μg/l. I forbindelse med ultimativ 
biologisk nedbrydelighed kan der anvendes
 14 C-mærkede testkemikalier. 
En beskrivelse af dette ligger uden for omfanget af denne testmetode, idet 
der endnu ikke er fastlagt alment accepterede fremgangsmåder, selv om et 
forslag til en metode for ISO 14592 (3) indeholder en vejledning om brugen af
 14 C-mærkede kemikalier.  
SCAS-test  
3. Senere blev en enkel totrinstest foreslået (4) (5) (6). Metoden med semi ­
kontinuerligt aktiveret slam (SCAS) benyttes i kortvarige kinetiske test på 
prøver, der er udtaget fra SCAS-enhederne. SCAS-systemet kører med kendte værdier for slamoverløb (i modsætning til den oprindelige C.12- testmetode) og tilføres modificeret syntetisk spildevand som defineret af 
OECD eller husholdningsspildevand. Det syntetiske spildevand blev modi ­
ficeret (på grund af en ændret pH-værdi og slammets dårlige sedimentations ­
evne) ved at tilføre fosfat som buffer, gærekstrakt, jernklorid (III), spor ­
stoffer og salte, og dets COD blev forøget til ca. 750 mg/l ved at forøge 
koncentrationen af pepton og kødekstrakt. Enhederne kørte i en 24-timers 
cyklus: beluftning i 23 timer, slamoverløb, sedimentering, eliminering af supernatant (udløb) efterfulgt af tilsætning af syntetisk spildevand plus test ­
kemikalie, op til 100 μg/l (dvs. ved ca. samme koncentration som i den 
kortvarige test). En gang om ugen udskiftes 10 % af den samlede mængde 
slam med frisk slam for at opretholde en afbalanceret mikrobiel population.
 
4. Koncentrationerne af testkemikaliet i starten og ved afslutningen af beluft ­
ningen måles, og testen fortsættes, indtil der opnås en konstant eliminering 
af testkemikaliet. Det kan tage fra en uge til flere måneder.  
Kortvarig test  
5. En kortvarig test (f.eks. 8 timer) gennemføres for at bestemme den (pseudo) 
første ordens kinetiske hastighedskonstant for henfaldet af testkemikaliet i 
aktiveret slam af kendte, men andre oprindelser og historikker. Der udtages 
slamprøver fra SCAS-reaktorerne — ved afslutningen af en beluftnings ­
periode, når koncentrationen af organisk substrat er lav — i løbet af et akklimatiseringsforsøg (afsnit 3 og 4). Med henblik på sammenligning 
kan slam også udtages fra en parallel SCAS-enhed, der ikke er eksponeret 
for testkemikaliet. Blandinger af slam og testkemikalie, der tilsættes i to
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
eller flere koncentrationer i området 1-50 μg/l, beluftes uden tilførsel af 
syntetisk spildevand eller andre organiske substrater. Den tilbageværende 
mængde testkemikalie i opløsningen bestemmes med regelmæssige inter ­
valler, f.eks. hver time afhængigt af kemikaliets nedbrydning, i en periode på højst 24 timer. Prøverne centrifugeres inden relevant analyse.
 
Beregninger  
6. Data fra SCAS-enhederne anvendes til beregning af den procentvise elimi ­
nering af testkemikaliet (afsnit 54). En gennemsnitlig hastighedskonstant, K
 1 , (normaliseret med hensyn til koncentration af suspenderede faststoffer) 
kan beregnes ved hjælp af:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
hvor:  
t = beluftningstid (23 timer)  
C e = koncentration ved afslutning af beluftningsperiode ( μg/l) 
C i = koncentration ved start af beluftning ( μg/l) 
SS = koncentration af faststof i aktiveret slam (g/l)  
7. I den kortvarige test afsættes den tilbageværende log %-koncentration i 
forhold til tid, og hældningen af den første del (10-50 % nedbrydning) af 
kurven svarer til K  1 , (pseudo) første ordens konstant. Konstanten normali ­
seres med hensyn til koncentrationen af slamfaststoffer ved at dividere hældningen med koncentrationen af slamfaststoffer. Det rapporterede resultat skal også indeholde oplysninger om startkoncentrationer af testkemikaliet og 
de suspenderede faststoffer, slamretentionstid, slamtilførsel og kilde samt 
oplysninger om (evt.) præeksponering for testkemikaliet.
 
Resultaters variabilitet  
8. Variabilitet og andre facetter ved bionedbrydningskinetik blev for nylig 
diskuteret i forbindelse med en SETAC-workshop (7). Disse forsøg — rapporterede og planlagte — vil give et klarere indblik i kinetikken i spilde ­
vandsrensningsanlæg og medvirke til at give en bedre forståelse af eksiste ­
rende data, ligesom de vil medvirke til mere relevante designs til fremtidige 
testmetoder.
 
LITTERATUR  
(1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A og Schultz 
B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. 
Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353.  
(2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O og Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510.
 
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality — Evalua ­
tion of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations in water.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP og Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864.
 
(5) Berg UT og Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735.  
(6) Miljøstyrelsen. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. 
Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Miljø- og Energiministeriet, København.
 
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop hos Port Sunlight, Det Forenede Kongerige. Eds. 
Hales, SG. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4.-6. sept. 1996. SETAC- Europe, Bruxelles.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilm  
INDLEDNING  
1. Simuleringstest anvendes normal i forbindelse med kemikalier, der ikke har 
bestået en screeningstest for let bionedbrydelighed (kapitel C.4 A-F i dette bilag (9)), men som har bestået en test for iboende bionedbrydelighed. I enkelte tilfælde anvendes simuleringstest ligeledes i forbindelse med et 
kemikalie, som man ønsker flere oplysninger om, især kemikalier, der fore ­
kommer i store mængder, og normalt anvendes testen af aktiveret slam (C.10 A). Under visse omstændigheder kræves der dog specifikke oplys ­
ninger om, hvordan et kemikalie reagerer over for forskellige metoder til 
spildevandsrensning, som f.eks. biofilm, nedsivnings- eller nedrislingsfiltre, 
roterende biologiske kontaktorer og fluide bede. Der er udviklet forskellige former for apparatur til dette formål.
 
2. Gerike et al. (1) benyttede store nedsivningsfiltre i pilotanlægsstørrelse i 
sammenkoblet tilstand. Disse filtre var meget pladskrævende og krævede relativt store mængder spildevand eller syntetisk spildevand. Truesdale et al. (2) har beskrevet mindre filtre (diameter: 6 fod × 6 tommer), hvortil der blev 
tilført overfladeaktivt naturligt spildevand, men disse filtre var stadig ret 
pladskrævende. Der krævedes hele 14 uger til at udvikle en »moden« biofilm, og der krævedes yderligere 4-8 uger efter den første tilsætning af det overfladeaktive teststof, inden akklimatiseringen fandt sted.
 
3. Baumann et al. (3) udviklede et meget mindre filter, hvori der blev anvendt 
»polyester-fleece«, som var dyppet i aktiveret slam som det inaktive medie til at støtte biofilmen. Testkemikaliet blev anvendt som eneste kulstofkilde, og bionedbrydeligheden blev vurderet ud fra målinger af opløst organisk 
kulstof (DOC) i indløb og udløb og ud fra mængden af CO
 2 i udgangs ­
gassen.  
4. En helt anden tilgang blev benyttet af Gloyna et al . (4), som opfandt den 
roterende rørreaktor. På den indvendige overflade af det roterende rør dyrkes 
en biofilm på det kendte overfladeareal ved passage af indløb tilført i toppen 
af røret, der er skråtstillet i en lille vinkel i forhold til vandret. Reaktoren er blevet brugt dels til at undersøge den biologiske nedbrydelighed af over ­
fladeaktive stoffer (5) og dels til at undersøge den optimale tykkelse af 
biofilm og diffusionen gennem filmen (6). Forfatterne har videreudviklet 
reaktoren og modificeret den, så man kan bestemme mængden af CO
 2 i 
udgangsgassen.  
5. Den roterende rørreaktor er anerkendt af den britiske »Standing Committee 
of Analysts« som en standardmetode til vurdering af både den biologiske 
nedbrydelighed af kemikalier (7) og muligheder for spildevandsrensning og toksicitet i spildevand (8). Fordelene ved den metode, der beskrives her, er, at den er enkel, kompakt og reproducerbar, og at den kun kræver relativt 
små mængder af organisk materiale.
 
TESTENS PRINCIP  
6. Syntetisk spildevand eller husholdningsspildevand sammen med testkemika ­
lie, iblandet eller alene, tilføres den indvendige overflade af et langsomt roterende skråtstillet rør. På den indvendige overflade dannes et lag af mikroorganismer, der ligner dem, der findes på medier i biofiltre. Reakto ­
rens driftsbetingelser vælges, så man opnår en passende eliminering af 
organisk stof og eventuelt oxidation af ammoniak.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Udløbet fra røret opsamles, hvorefter det enten sedimenteres og/eller filtreres 
for organisk opløst kulstof (DOC) og/eller for testkemikalie ved hjælp af en 
specifik metode, inden det analyseres. Kontrolenheder, der ikke får tilført testkemikalier, kører parallelt under samme forhold med henblik på sammenligning. Forskellen mellem koncentrationerne af DOC i udløbet 
fra test- og kontrolenhederne antages at skyldes testkemikaliet og stoffets 
organiske metabolitter. Denne forskel sammenlignes med koncentrationen af det tilsatte testkemikalie (som DOC) for at beregne elimineringen af testke ­
mikaliet.
 
8. Biologisk nedbrydelighed kan normalt skelnes fra biologisk adsorption ved 
omhyggelig undersøgelse af kurven for elimineringstid. Der kan normalt opnås bekræftelse ved at gennemføre en test for let biologisk nedbryde ­
lighed (iltoptagelse eller kuldioxidproduktion) ved hjælp af et akklimatiseret 
inokulum, der er udtaget ved afslutningen af testen fra de reaktorer, der får 
tilført testkemikaliet.
 
OPLYSNINGER OM TESTKEMIKALIET  
9. Testkemikaliets renhed, vandopløselighed, flygtighed og adsorptionskarakte ­
ristik skal være kendt, for at resultaterne kan fortolkes korrekt.  
10. Flygtige og tungtopløselige kemikalier kan ikke testes, medmindre der tages 
særlige forholdsregler (se tillæg 5 til kapitel C.10 A). Den kemiske struktur, eller i det mindste den empiriske formel, skal ligeledes være kendt, hvis man vil beregne de teoretiske værdier og/eller kontrollere parametrenes målte 
værdier, f.eks. teoretisk iltforbrug (ThOD), DOC.
 
11. Oplysninger om testkemikaliets toksicitet over for mikroorganismer (se 
tillæg 4 til kapitel C.10 A) kan anvendes i forbindelse med valg af passende 
testkoncentrationer og kan være afgørende for korrekt fortolkning af lave 
værdier for bionedbrydning.  
TÆRSKELVÆRDIER  
12. Den primære biologiske nedbrydning af de overfladeaktive stoffer skulle 
oprindeligt nå op på 80 % eller mere, inden kemikaliet kunne markedsføres. Hvis værdien 80 % ikke opnås, kan denne simuleringstest (kontroltest) 
anvendes, og det overfladeaktive stof kan markedsføres, hvis over 90 % 
af det specifikke kemikalie er elimineret. For kemikalier er der generelt ikke tale om at bestå/dumpe, og derfor kan den opnåede værdi for fjernelse 
benyttes i forbindelse med omtrentlige beregninger af den sandsynlige 
koncentration i miljøet, der kan bruges i vurderinger af risici fra kemikalier. I en række forsøg med rene kemikalier viste den procentvise eliminering af DOC sig at være over 90 % i mere end tre fjerdedele og over 80 % i mere 
end 90 % af de kemikalier, der viste sig at have en signifikant værdi for 
biologisk nedbrydelighed.
 
REFERENCEKEMIKALIER  
13. For at sikre korrekt udførelse af forsøget kan det være nyttigt med jævne 
mellemrum at teste referencekemikalier, hvis adfærd er velkendt. Sådanne kemikalier omfatter adipinsyre, 2-phenylphenol, 1-naphthol, diphensyre og 
1-naphthoesyre.
 
FORSØGSRESULTATERNES REPRODUCERBARHED  
14. Den relative standardafgivelse mellem test blev af et laboratorium i Det 
Forenede Kongerige målt til at være 3,5 % og mellem testene 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Apparatur  
Roterende rørreaktorer  
15. Apparaturet (se figur 1 og 2 i tillæg 8) består af en samling akrylrør, der 
hver måler 30,5 cm i længden og har en indvendig diameter på 5 cm. 
Rørene er anbragt på gummihjul, der er monteret på en metalramme. Hvert rør har en udvendig flange, ca. 0,5 cm dyb, der skal fastholde det på hjulene. Den indvendige overflade er gjort ru ved hjælp af groft ståluld, 
og der er en 0,5 cm dyb indvendig flange i rørets øverste ende (indløb) til at 
holde på væsken. Rørene er skråtstillede i en vinkel på ca. én grad i forhold til vandret for at opnå den nødvendige kontakttid, når testmediet ledes ind i et rent rør. Hjulene med gummidæk roteres ved hjælp af en langsom motor 
med variabel hastighed. Temperaturen i rørene styres ved at installere appa ­
raturet i konstant rumtemperatur.
 
16. Ved at placere hvert enkelt rørreaktor inde i et lidt større lukket rør og gøre 
forbindelserne gastætte kan CO  2 -udgangsgassen opsamles i en alkalisk 
opløsning til efterfølgende måling (6).  
17. For hvert rør opbevares forsyning til 24 timer af et organisk materiale, evt. 
tilsat et testkemikalie, i en 20 l opbevaringsbeholder (A) (se figur 2). Opløs ­
ningen af testkemikalie kan evt. doseres separat. Tæt på bunden i hver opbevaringsbeholder er der en udgang, hvorfra der går et rørsystem af 
f.eks. silikonegummi via en slangepumpe (B) til et glas eller akrylrør, der 
går 2-4 cm ind i den øverste ende (tilløb) af det skrå rør (C). Udløb kan dryppe fra den nederste ende af det skrå rør og opsamles i en anden opbevaringsbeholder (D). Udløbet sedimenteres eller filtreres inden analyse.
 
Filtreringsapparat eller centrifuge  
18. Apparatur til filtrering af prøver ved hjælp af membranfiltre med passende 
porøsitet (nominel åbningsdiameter 0,45 μm) til adsorption af organiske 
kemikalier med mindst mulig frigivelse af organisk kulstof. Hvis der 
benyttes filtre, som frigiver organisk kulstof, vaskes disse filtre omhyggeligt med varmt vand for at fjerne afgivet organisk kulstof. Alternativt kan der benyttes en centrifuge med en kapacitet på 40 000 m/s
 2 . 
19. Analyseudstyr til bestemmelse af:  
— DOC/samlet organisk kulstof (TOC) eller kemisk iltforbrug (COD)  
— specifikt kemikalie (HPLC, GC osv.), hvis påkrævet  
— pH, temperatur, syreindhold og alkalinitet  
— ammoniak, nitrit og nitrat, hvis testene gennemføres under nitrificerende 
forhold.  
Vand  
20. Ledningsvand, der indeholder under 3 mg/l DOC.  
21. Destilleret eller deioniseret vand, der indeholder under 2 mg/l DOC.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Organisk materiale  
22. Syntetisk spildevand, husholdningsspildevand eller en blanding heraf kan 
anvendes som organisk materiale. Det er påvist, at anvendelsen af hushold ­
ningsspildevand alene ofte medfører øget eliminering af DOC i procent (i 
aktiveret slam) og endda bionedbrydning af visse kemikalier, som ikke 
nedbrydes biologisk, når der anvendes syntetisk spildevand som defineret af OECD. Derfor anbefales brugen af husholdningsspildevand. Mål koncen ­
trationen af DOC (eller COD) i alle nye batches med organisk materiale. Det 
organiske materiales aciditet eller alkalinitet bør være kendt. Det organiske 
materiale skal muligvis tilsættes en velegnet buffer (natriumhydrogencar ­
bonat eller kaliumhydrogenfosfat), hvis mediets aciditet eller alkalinitet er 
lav, for at holde en pH-værdi på ca. 7,5 ± 0,5 i reaktoren i løbet af testen. 
Mængden af buffer og tidspunktet for, hvornår den skal tilsættes, afgøres i hvert enkelt tilfælde.
 
Syntetisk spildevand  
23. Opløs i én liter ledningsvand: pepton: 160 mg; kødekstrakt: 110 mg; urin ­
stof: 30 mg; vandfrit dikaliumhydrogenfosfat (K  2 HPO  4 ): 28 mg; natriumch ­
lorid (NaCl): 7 mg; calciumchloriddihydrat (CaCl  2 .2H  2 O): 4 mg; magne ­
siumsulfatheptahydrat (Mg  2 SO 4 .7H  2 0): 2 mg. Dette eksempel på syntetisk 
spildevand som defineret af OECD giver en middel DOC-koncentration i 
indløbet på ca. 100 mg/l. Der kan også benyttes andre sammensætninger med ca. den samme DOC-koncentration, og som ligger tættere på rigtigt spildevand. Dette syntetiske spildevand kan fremstilles ved hjælp af destil ­
leret vand i koncentreret form og opbevares ved ca. 1 °C i op til én uge. 
Fortynd efter behov med ledningsvand. (Dette materiale er ikke tilfredsstil ­
lende. Kvælstofkoncentrationen er f.eks. meget høj, og kulstofindholdet relativt lavt, men der er ikke foreslået en bedre løsning, bortset fra tilførsel 
af mere fosfat som buffer og ekstra pepton).
 
Husholdningsspildevand  
24. Benyt frisk bundfældet spildevand, der indsamles dagligt fra et rensnings ­
anlæg, der hovedsageligt modtager husholdningsspildevand. Det indsamles 
fra overløbskanalen på den primære sedimenteringstank eller fra indløbet til 
aktivslamanlægget, og det skal stort set være uden grove partikler. Spilde ­
vandet kan benyttes efter flere dages opbevaring ved ca. 4 °C, hvis det 
dokumenteres, at DOC (eller COD) ikke falder væsentligt (dvs. med 
mindre end 20 %) under opbevaringen. For at begrænse forstyrrelserne af systemet bør DOC (eller COD) af hver ny batch justeres inden brug, så der opnås en passende konstant værdi, f.eks. ved fortynding med ledningsvand.
 
Smøremiddel  
25. Glycerol eller olivenolie kan bruges til smøring af rullerne i slangepumpen. 
Begge smøremidler kan bruges på rør af silikonegummi.  
Stamopløsninger af testkemikaliet  
26. I forbindelse med kemikalier, der er tilstrækkelig opløselige, fremstilles 
stamopløsninger i passende koncentrationer (f.eks. 1-5 g/l) i demineraliseret vand eller i den mineralske del af det syntetiske spildevand. Se tillæg 5 i kapitel C.10-A om uopløselige kemikalier. Denne metode er ikke velegnet 
til flygtige kemikalier uden at være modificeret til de rørformede reaktorer 
(afsnit 16). Bestem DOC og samlet organisk kulstof (TOC) i stamopløs ­
ningen, og gentag målingerne for hver ny batch. Hvis forskellen mellem DOC og TOC er større end 20 %, skal testkemikaliets vandopløselighed 
kontrolleres. Sammenlign DOC eller koncentrationen af testkemikaliet 
målt ved hjælp af specifik analyse af stamopløsningen med den nominelle
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
værdi for at fastslå, hvorvidt genfindingen er god nok (normalt kan > 90 % 
forventes). Især for dispersioner skal det fastslås, hvorvidt DOC kan 
benyttes som analytisk parameter, eller om der kun kan anvendes en analyseteknik, der er specifik for det pågældende testkemikalie. Centrifuge ­
ring af prøverne er obligatorisk i forbindelse med dispersioner. For hver ny 
batch skal DOC, COD eller testkemikaliet måles med specifikke analyser.
 
27. Bestem pH-værdien i stamopløsningen. Ekstreme værdier viser, at tilsæt ­
ningen af kemikaliet kan påvirke pH-værdien af det aktiverede slam i test ­
systemet. I det tilfælde neutraliseres stamopløsningen med små mængder af uorganisk syre eller base for at opnå en pH-værdi på 7 ± 0,5. Undgå dog udfældning af testkemikaliet.
 
FREMGANGSMÅDE  
Tilberedning af organisk materiale til dosering  
28. Sørg for, at beholdere til indløb og udløb samt rørsystem fra indløbstanke 
og til udløbstanke er omhyggeligt rengjorte for at fjerne mikrobiel vækst fra starten og i løbet af testen.
 
29. Det syntetiske spildevand (afsnit 23) skal fremstilles frisk hver dag, enten af 
faststofferne eller af den koncentrerede stamopløsning i en passende fortyn ­
ding med ledningsvand. Afmål den korrekte mængde i en cylinder, og hæld 
det i en ren indløbstank. Tilsæt om nødvendigt den nødvendige mængde 
stamopløsning af testkemikaliet eller referencekemikaliet til det syntetiske spildevand før fortynding. Hvis det er mere praktisk eller nødvendigt for at undgå spild af testkemikaliet, kan der fremstilles en separat fortyndet opløs ­
ning af testkemikaliet i en separat beholder, som tilføres de skråtstillede rør 
ved hjælp af en anden doseringspumpe.
 
30. Alternativt (og fortrinsvis) kan der benyttes sedimenteret husholdningsspil ­
devand (afsnit 24), der opsamles frisk hver dag, hvis det er muligt.  
Brug af roterende rørreaktorer  
31. Der kræves to identiske rørreaktorer til vurdering af ét testkemikalie, og de 
opstilles i et rum med konstant rumtemperatur, normalt 22 ± 2 °C.  
32. Juster slangepumperne til at pumpe 250 ± 25 ml/h af det organiske materiale 
(uden testkemikalie) over i de skråtstillede rør, der roteres ved 18 ± 2 rpm. Smøremidlet (afsnit 25) smøres på pumperørene inden brug og med jævne mellemrum i løbet af testen for at sikre korrekt funktion og for at forlænge 
rørenes levetid.
 
33. Juster rørenes hældningsvinkel til vandret for at give mulighed for en resi ­
denstid på 125 ± 12,5 sek. for det tilførte materiale i et rent rør. Anslå 
retentionstiden ved at tilsætte en ikke-biologisk markør (f.eks. NaCl, inaktivt farvestof). Den tid, det tager at nå spidskoncentrationen i udløbet, antages at være den gennemsnitlige retentionstid (når der er mest muligt film til stede, 
kan retentionstiden nå op på ca. 30 minutter).
 
34. Formålet med disse værdier, hastigheder og tider er at nå frem til tilstræk ­
kelig eliminering (> 80 %) af DOC (eller COD) og for at kunne opnå 
nitrificerede udløb. Gennemstrømningshastigheden ændres, hvis elimine ­
ringen ikke er tilstrækkelig, eller hvis der ydelsen på et bestemt rensnings ­
anlæg skal simuleres. I sidstnævnte tilfælde justeres tilsætningen af det 
organiske materiale, indtil ydelsen i reaktoren passer til ydelsen i rensnings ­
anlægget.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inokulation  
35. Luftbåren inokulation kan være tilstrækkelig til at starte væksten af mikro ­
organismer, når der benyttes syntetisk spildevand, men ellers tilsættes 1 ml/l sedimenteret spildevand til tilløbet i tre dage.
 
Målinger  
36. Med regelmæssige mellemrum kontrolleres det, at dosering og rotations ­
hastighed ligger inden for de angivne grænser. Ligeledes måles 
pH-værdien i udløbet, især hvis der forventes nitrifikation.  
Prøvetagning og analyse  
37. Metode, mønster og frekvens for prøvetagning vælges i overensstemmelse 
med testens formål. Tag f.eks. stikprøver af indløb og udløb, eller indsaml 
prøver over en længere periode f.eks. 3-6 timer. I den første periode — uden 
testkemikalie — tages prøverne to gange om ugen. Filtrer prøverne gennem membraner eller i centrifuge ved ca. 40 000 m/s
 2 i ca. 15 minutter (afsnit 
18). Det kan være nødvendigt at lade prøverne bundfældes og/eller at grov ­
filtrere prøverne inden membranfiltrering. Foretag som minimum dobbelt ­
bestemmelse af DOC (eller COD) samt BOD, ammoniak og nitrit/nitrat, hvis det er påkrævet.
 
38. Alle analyser udføres hurtigst muligt efter indsamling og tilberedning af 
prøverne. Hvis analyserne forsinkes, opbevares prøverne mørkt ved ca. 
4 °C i flasker med tætsluttende låg. Hvis prøverne skal opbevares i mere end 48 timer, skal de konserveres ved hjælp af dybfrysning, syring eller ved tilsætning af et velegnet toksisk kemikalie (f.eks. 20 ml/l af en 10 g/l 
opløsning af kviksølv (II) chlorid). Det sikres, at konserveringsteknikken 
ikke påvirker analyseresultaterne.
 
Indkøringsperiode  
39. I denne periode vokser overfladen på biofilmen, så den opnår en optimal 
tykkelse. Dette varer normalt ca. to uger og bør ikke vare længere end seks uger. Elimineringen (afsnit 44) af DOC (eller COD) tiltager og når en 
plateauværdi. Når plateauet er nået med samme værdi i begge rør, udvælges 
et af dem til at være kontrol for resten af testen, hvor deres ydelse skal forblive konsistent.
 
Tilsætning af testkemikalie  
40. På dette tidspunkt tilsættes testkemikaliet til den anden reaktor i den 
korrekte koncentration, normalt 10-20 mg C/l. Kontrollen tilføres fortsat 
kun organisk materiale.  
Akklimatiseringsperiode  
41. Foretag fortsat analyser for DOC (eller COD) to gange om ugen. Hvis den 
primære biologiske nedbrydningsevne skal vurderes, måles koncentrationen af testkemikaliet også ved hjælp af en specifik analyse. Lad der gå fra en til seks uger (eller længere under særlige forhold), efter at testkemikaliet første 
gang blev tilsat, for at opnå akklimatisering. Når den procentvise eliminering 
(afsnit 43-45) når op på maksimumsværdi, registreres 12-15 gyldige værdier i plateaufasen over ca. 3 uger med henblik på at evaluere den gennemsnit ­
lige procentvise eliminering. Testen betragtes for afsluttet, hvis der er opnået 
en tilstrækkelig høj grad af eliminering. Testen bør normalt ikke vare mere 
end 12 uger efter den første tilsætning af testkemikaliet.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Skred på filmen  
42. Der sker med relativt regelmæssige mellemrum en pludselig eliminering af 
større mængder af overskydende film fra rørene, også kaldet skred. For at sammenligneligheden mellem resultaterne ikke påvirkes, gennemføres 
testene over mindst to fulde cyklusser med vækst og skred.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Behandling af resultater  
43. Beregn procentdelen af DOC- eller COD-eliminering af testkemikaliet for 
hver tidsbaseret vurdering ved hjælp af ligningen:  
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
hvor:  
D t = procentvis eliminering af DOC eller COD på tidspunktet t  
Cs = koncentration af DOC eller COD i indløb, der skyldes testkemikaliet, 
fortrinsvis anslået ud fra koncentrationen og den tilførte mængde i stamopløsningen (mg/l)
 
E = målt DOC eller COD i testudløb på tidspunktet t (mg/l)  
Eo = målt DOC eller COD i kontroludløb på tidspunktet t (mg/l).  
Gentag beregningen for referencekemikaliet, hvis det testes.  
Kontrolreaktorens ydelse  
44. Graden af DOC- eller COD-eliminering (D  B ) af det organiske materiale i 
kontrolreaktoren er nyttig viden i forbindelse med vurderingen af den biolo ­
giske nedbrydning af biofilmen i løbet af testen. Beregn den procentvise 
eliminering ved hjælp af ligningen:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
hvor:  
Cm = DOC eller COD af det organiske materiale i kontrolindløb (mg/l).  
45. Beregn elimineringen (D  ST ) af testkemikaliet (hvis den måles) målt ved 
hjælp af en specifik analysemetode på hvert vurderingstidspunkt ved 
hjælp af ligningen:  
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
hvor:  
Si = målt eller fortrinsvis estimeret koncentration af testkemikalie i 
testindløb (mg/l)  
Se = målt koncentration af testkemikalie i testudløb på tidspunktet t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Hvis analysemetoden giver en positiv værdi i uændret spildevand svarende 
til S  c mg/l, beregnes den procentvise eliminering (D  SC ) ved hjælp af lignin ­
gen: 
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Angivelse af testresultater  
46. Indtegn den procentvise eliminering D  t og D  ST (eller D  SC ) i forhold til tiden 
(se tillæg 2 til kapitel C.10- A). Aflæs gennemsnitsafvigelsen (afrundet til 
nærmeste heltal) og standardafvigelsen af 12-15 værdier for D  T (og evt. for 
D ST ) fra plateaufasen som den procentvise eliminering af testkemikaliet. Ud 
fra formen på elimineringskurven kan der drages en række konklusioner om 
elimineringsprocesserne.  
Adsorption  
47. Hvis der konstateres en høj DOC-eliminering af testkemikaliet fra begyn ­
delsen af testen, elimineres testkemikaliet sandsynligvis ved adsorption til 
biofilmen. Dette kan bevises ved at bestemme det adsorberede testkemikalie i faststoffer, der er skredet af filmen. Sædvanligvis forbliver elimineringen af DOC af adsorberbare kemikalier ikke høj i løbet af hele testen. Normalt sker 
der en høj grad af eliminering i starten, hvorefter den falder til en ligevægts ­
værdi. Hvis det adsorberbare testkemikalie kan forårsage akklimatisering af den mikrobielle population, vil DOC-elimineringen af testkemikaliet efter ­
følgende stige og nå op på en høj plateauværdi.
 
Lag-fase  
48. Som ved statiske screeningstest kræver mange testkemikalier en lag-fase, 
inden der sker fuld bionedbrydning. I lag-fasen sker der en akklimatisering 
eller tilpasning af de kompetente bakterier næsten uden eliminering af test ­
kemikaliet, og derefter begynder disse bakteriers indledningsvise vækst. Denne fase afsluttes, og nedbrydningsfasen antages vilkårligt at begynde, når ca. 10 % af den oprindelige mængde testkemikalie er elimineret (efter 
mulighed for eventuel adsorption). Lag-fasen er ofte stærkt varierende og 
vanskelig at reproducere.
 
Plateaufase  
49. En elimineringskurves plateaufase i en kontinuerlig test defineres som den 
fase, hvor den maksimale nedbrydning finder sted. Denne fase bør vare mindst tre uger og have ca. 12-15 målte gyldige værdier.
 
Middelelimineringsgrad for testkemikaliet  
50. Beregn middelværdien ud fra elimineringsværdierne D  t (og evt. D  st ) for 
testkemikaliet i plateaufasen. Afrundet til nærmeste heltal (1 %) angiver det graden af eliminering af testkemikaliet. Det anbefales endvidere at beregne 95 %-konfidensintervallet af middelværdien. På tilsvarende måde 
beregnes middelværdien (D
 B ) for eliminering af det organiske materiale i 
kontrolbeholderen.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Indikation for bionedbrydning  
51. Hvis testkemikaliet ikke tydeligt adsorberer til biofilmen, og eliminerings ­
kurven har en typisk form for en bionedbrydningskurve med lag-, nedbrydnings- og plateaufaser (afsnit 48 og 49), kan den målte eliminering 
med sikkerhed tilskrives bionedbrydning. Hvis der er sket en høj eliminering 
i starten, kan simuleringstesten ikke differentiere mellem biologiske og abiotiske elimineringsprocesser. I sådanne tilfælde, og hvis der i øvrigt er tvivl om den biologiske nedbrydning (f.eks. hvis der optræder stripning), 
skal de adsorberede testkemikalier analyseres i filmprøver, eller yderligere 
statiske test af bionedbrydning gennemføres baseret på parametre, der klart indicerer biologiske processer. Sådanne test omfatter metoder til oxygen ­
optagelse (kapitel C.4 i dette bilag D, E og F) (9) eller en test, der måler 
CO
 2 -produktion (kapitel C.4-C i dette bilag eller Headspace-metoden) (10). 
Som inokulum anvendes præeksponeret biofilm fra den relevante reaktor.  
52. Hvis både DOC-elimineringen og den specifikke eliminering af kemikaliet 
er målt, indicerer signifikante forskelle (hvis førstnævnte er lavere end sidst ­
nævnte) mellem de eliminerede procentdele, at der i udløbet forekommer 
mellemliggende organiske produkter, som kan være sværere at nedbryde end 
det oprindelige kemikalie.  
Testresultaternes validitet  
53. Testen anses for at være gyldig, hvis graden af DOC- eller COD-eliminering 
(D B ) i kontrolenhederne er > 80 % efter to uger, og der ikke er gjort 
unormale observationer.  
54. Hvis der er testet et let biologisk nedbrydeligt (reference) kemikalie, bør 
graden af biologisk nedbrydelighed være > 90 %, og forskellen mellem 
dobbeltværdier bør ikke overstige 5 %. Hvis disse to kriterier ikke opfyldes, gennemgås forsøgsprocedurerne, og/eller husholdningsspildevand indhentes fra en anden kilde.
 
55. Tilsvarende bør forskellene mellem værdier for biologisk nedbrydelighed fra 
eventuelle dobbeltenheder, der behandler et testkemikalie, ikke afvige mere 
end 5 %. Hvis dette kriterium ikke opfyldes, men eliminering er høj, fort ­
sættes analysen i yderligere tre uger. Hvis elimineringen er lav, undersøges de hæmmende effekter på testkemikaliet, hvis de ikke er kendte. Testen gentages med en lavere koncentration af testkemikalie, hvis det er muligt.
 
Testrapport  
56. Testrapporten skal indeholde følgende:  
Testkemikalie:  
— identifikationsdata  
— fysisk form og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber.  
Testbetingelser:  
— enhver modifikation af testsystemet, især hvis der testes uopløselige eller 
flygtige stoffer  
— typen af organisk materiale  
— art og andel af industriaffald i spildevandet (hvis anvendt og kendt)  
— inokulationsmetode  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— stamopløsning af testkemikalie — indhold af DOC (opløst organisk 
kulstof) og TOC (samlet organisk kulstof); hvordan blev den fremstillet 
(hvis suspension); anvendte testkoncentration(er), hvis uden for inter ­
vallet 10-20 mg/l DOC, angives årsager; tilsætningsmetode; dato for første tilsætning; enhver ændring i koncentrationen
 
— gennemsnitlig hydraulisk retentionstid (uden vækst), rørets rotations ­
hastighed, omtrentlig vinkel på hældning, hvis muligt  
— oplysninger om skred (tid og intensitet)  
— testtemperatur og -interval  
— anvendte analyseteknikker.  
Testresultater:  
— alle målte, relevante data (DOC, COD, specifikke analyser, pH-værdi, 
temperatur og N-kemikalier)  
— alle beregnede værdier af D  t (eller D  tc ), D  B og D  s opstillet i tabelform og 
elimineringskurver  
— oplysninger om lag- og plateaufaser, testvarighed, elimineringsgraden af 
testkemikaliet, referencekemikaliet (hvis testet) og det organiske mate ­
riale i kontrolenheden, statistiske oplysninger og udtryk for biologisk nedbrydelighed og testens validitet
 
— diskussion af resultater.  
LITTERATUR:  
(1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758.
 
(2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable 
material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.  
(3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. 
Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.  
(4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
(5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trick ­
ling filter. JAOCS 43: 92-94.  
(6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.  
(7) Her Majesty's Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London.
 
(8) Her Majesty's Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
 
(9) Kapitel C.4 i dette bilag, Bestemmelse af let bionedbrydelighed A-F.  
(10) ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Tillæg 8  
Figur 1  
Roterende rør
  
Ordliste:  
Oversigt  
Visning A/B  
Drivhjul  
Frihjul  
Drivmotor  
Reduktionsgear  
Indvendig flange  
Hældningsmekanisme  
Vinkeldrev  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Figur 2  
Strømningsdiagram
  
A: Tilsætningstank  
B: Slangepumpe  
C: Roterende rør  
D: Opsamlingsbeholder til udløb  
DEFINITIONER  
Testkemikalie: ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  
Kemikalier: »Det bør bemærkes, at termen »kemikalie« er brugt i bred forstand i 
UNCED-aftalerne og de efterfølgende dokumenter og omfatter stoffer, produkter, blandinger, præparater eller alle andre termer, der anvendes i eksisterende systemer til at angive dækning«.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIOLOGISK NEDBRYDNING  
AKTIVERET SLAM — RESPIRATIONSHÆMNINGSTEST  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Den beskrevne metode vurderer virkningen af et teststof på mikro ­
organismer ved måling af respirationshastigheden under definerede betingelser ved forskellige koncentrationer af teststoffet.
 
Formålet med metoden er at give en hurtig screening-metode til 
identifikation af stoffer, der kan påvirke et aerobt mikrobielt rens ­
ningsanlæg uheldigt, og at indikere passende ikke-hæmmende 
koncentrationer af teststoffer til anvendelse i bionedbrydelighedstest.  
Inden den endelige test kan der udføres en forprøve. Den giver 
oplysninger om det koncentrationsinterval, som skal anvendes i hovedtesten.
 
I testen indgår to kontroltest, én i begyndelsen og én i slutningen af 
testrækken, Desuden bør hvert parti aktiveret slam også kontrolleres ved brug af et referencestof.
 
Metoden kan lettest benyttes for stoffer, der på grund af deres 
opløselighed i vand og ringe flygrighed sandsynligvis vil forblive i 
vandet.  
Det kan for stoffer med begrænset opløselighed i testmediet vise sig 
umuligt at bestemme EC  50 . 
Resultater, der er baseret på oxygenoptagelse, kan føre til fejlslut ­
ninger, hvis teststoffet har tendens til at afkoble oxidativ phospho ­
rylering.  
Det er nyttigt at have følgende oplysninger, når testen skal foretages:  
— vandopløselighed  
— damptryk  
— strukturformel  
— teststoffets renhed.  
Anbefaling  
Aktiveret slam kan indeholde potentielt patogene organismer og skal 
håndteres med forsigtighed.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Respirationshastigheden er oxygenforbruget hos mikroorganismer i 
aerobt spildevandsslam og udtrykkes almindeligvis i mg O  2 pr. mg 
slam pr. time.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Til beregning af et teststofs hæmmende virkning i en bestemt 
koncentration udtrykkes respirationshastigheden som en procentdel 
af gennemsnittet af to kontrolrespirationshasrigheder:  
Í 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Î 
Ü 100 ¼ % hæmning  
hvor:  
R s = oxygenforbruget ved testkoncetrationen af teststoffet  
RC 1 = oxygenforbruget, kontrol 1  
RC 2 = oxygenforbruget, kontrol 2.  
I forbindelse med denne metode er EC  50 den koncentration af test ­
stoffet, hvorved respirationen er 50 % af den, som kontroltesten viser 
under de i denne metode beskrevne betingelser.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Det anbefales at bruge 3,5-dichlorphenol, som vides at hæmme respi ­
ration, som referencestof og at teste det for EC  50 for hvert parti 
aktiveret slam for at kontrollere, at slammets følsomhed ikke er unormal.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Respirationshastigheden i aktiveret slam tilført en standardmængde 
syntetisk spildevand måles efter en kontakttid på 30 minutter og/eller tre timer. Respirationshastigheden i det samme aktiverede slam ved 
forskellige koncentrationer af teststoffet under i øvrigt identiske 
betingelser måles også. Teststoffets hæmmende virkning ved en bestemt koncentration udtrykkes som en procentdel af middelrespi ­
rationshastigheden i to kontroltest. Der beregnes en EC
 50 -værdi ud 
fra bestemmelser ved forskellige koncentrationer.  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Testresultaterne er gyldige, hvis:  
— respirationshastigheden i de to kontroltest ligger inden for 15 % 
af hinanden  
— EC  50 (30 minutter og/eller tre timer) for 3,.5-dichlorphenol ligger 
inden for det accepterede område på 5 til 30 mg/l.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Reagenser  
1.6.1.1. O p l ø s n i n g e r a f t e s t s t o f f e t  
Teststofopløsningerne frisklaves ved undersøgelsens indledning ved 
brug af en stamopløsning. En stamopløsningskoncentration på 0,5 g/l 
er egnet, hvis nedenstående anbefalede fremgangsmåde følges.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. O p l ø s n i n g a f k o n t r o l s t o f f e t  
Der fremstilles som eksempel en 3,5-dichlorphenolopløsning ved at 
opløse 0,5 g 3,5-dichlorphenol i 10 ml 1 M NaOH og fortynde med destilleret vand til ca. 30 ml; derefter tilsættes under omrøring 0,5 M 
H
 2 SO 4 til det punkt, hvor udfældning begynder — der kræves ca. 
8 ml 0,5 M H  2 SO 4 — og endelig fortyndes blandingen med destil ­
leret vand til 1 l. pH skulle derefter være omkring 7 til 8.  
1.6.1.3. S y n t e t i s k s p i l d e v a n d  
Der kan tillaves syntetisk spildevand ved opløsning af følgende 
mængder stof i 1 l vand:  
— 16 g pepton  
— 11 g kødekstrakt  
— 3 g urea  
— 0,7 g NaCl  
— 0,4 g CaCl  2 .2H  2 O 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 0 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Note 1 : Dette syntetiske spildevand er 100 gange så koncentreret 
som det, der er beskrevet i OECD Technical Report »Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants 
used in synthetic detergents« af 11. juni 1976 med tilsætning af 
dikaliumhydrogenphosphat.
 
Note 2:  Hvis det fremstillede medium ikke anvendes straks, skal det 
opbevares i mørke ved 0 til 4  o C, dog ikke længere end en uge og 
under forhold som ikke giver anledning til ændring i sammensætnin ­
gen. Medium kan også steriliseres forud for oplagringen, eller der 
kan tilsættes pepton og kødekstrakt, kort tid før testen udføres. Umiddelbart før brug blandes omhyggeligt og pH justeres.
 
1.6.2.  Apparatur  
Måleapparatur: Det er ikke afgørende, hvordan apparaturet nærmere 
er udformet. Der må imidlertid ikke være luftmellemrum mellem væske og prop, og sonden skal slutte tæt til kolbens hals.
 
Der kræves normalt laboratorieudstyr og især følgende:  
— måleapparatur  
— beluftningsapparatur  
— pH-elektrode og -måleudstyr  
— O  2 -elektrode.  
1.6.3.  Forberedelse af inoculum  
Som mikrobielt inoculum til testen anvendes aktiveret slam fra et 
rensningsanlæg, der overvejende behandler husholdningsspildevand.  
På laboratoriet kan grovere praktikler om nødvendigt fjernes ved kort 
henstand, f.eks. 15 minutter, efterfulgt af dekantering af det øverste 
lag med finere slampartikler. Alternativt kan slammet anvendes efter 
blanding i få sekunder i blender.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Hertil kommer, at slammet bør vaskes med vand (fra hanen) eller en 
isotonisk opløsning, hvis hæmmende stoffer kan forudses at være til 
stede. Efter centrifugering dekanteres supernatanten fra, hvilket gentages tre gange.
 
En mindre mængde af slammet afvejes og tørres. Herudfra kan 
beregnes den mængde af vådt slam, som skal suspenderes i vand for at opnå et aktivt slam med et indhold af faste bestanddele suspen ­
deret i en blandet væske på 2 til 4 g/l. Dette svarer til en koncen ­
tration på 0,8 til 1,6 g/l i testmediet, hvis den nedenfor anbefalede 
procedure følges.
 
Hvis slammet ikke kan anvendes den dag, det er indsamlet, tilsættes 
der 50 ml syntetisk spildevand til hver liter aktiveret slam, der er 
fremstillet som ovenfor beskrevet; slammet beluftes derefter natten over ved 20 ± 2
 o C. Det holdes derefter beluftet, indtil det anvendes 
den følgende dag. Inden anvendelsen kontrolleres pH, som om 
nødvendigt bufferes til pH 6 til 8. De faste bestanddele, der er 
suspenderet i den blandede væske, bestemmes som beskrevet i fore ­
gående afsnit.  
Hvis der er behov for at anvende det samme parti slam de efter ­
følgende dage (højst fire dage), tilsættes yderligere 50 ml syntetisk spildevand ved hver arbejdsdags slutning.
 
1.6.4.  Fremgangsmåde  
Varighed/kontakttid: 30 minutter og/eller tre timer under 
beluftning 
Vand: Drikkevand (om nødvendigt befriet for 
chlor) 
Lufttilførsel: Ren, oliefri luft. Luftgennemstrømning 
0,5 til 1,0 l/min. 
Måleapparatur: Fladbundet kolbe som f.eks. en BOD- 
kolbe (se figur 1) 
Oxygenmåler: Oxygenelektrode med tilhørende skriver 
Næringsopløsning: Syntetisk spildevand (se ovenfor) Teststof: Testopløsningen laves frisk ved testens 
begyndelse 
Referencestof: F.eks. 3,5-dichlorphenol (mindst tre 
koncentrationer) 
Kontroltest: Inokuleret prøve uden teststof 
Temperatur: 20 ± 2
 o C. 
Nedenfor gives forslag til en eksperimentel procedure, der kan følges 
for både testen og referencestoffet i tre-timers kontaktperioden:  
Der anvendes flere beholdere (f.eks. et-liters bægerglas).  
Der benyttes mindst fem koncentrationer med et fast koncentrations ­
forhold på helst ikke over 3,2.  
På tidspunktet »0« fortyndes 16 ml af det syntetiske spildevand med 
vand til 300 ml. Der tilsættes 200 ml af det mikrobielle inoculum, og hele 
blandingen (500 ml) hældes i en første beholder (første kontrol C  1 ). ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Testbeholderen skal gennemluftes kontinuerligt for at sikre, at opløst 
ilt (O  2 ) ikke falder under 2,5 mg/l, og at iltkoncentrationen er i 
størrelsesorden 6,5 mg/l umiddelbart før målingen af respirations ­
hastigheden.  
På tidspunkt »15 minutter« (15 minutter er et vilkårligt, men bekvemt 
interval) gentages ovenstående proces, bortset fra at der tilsættes 100 ml teststofstamopløsning til de 16 ml syntetisk spildevand, før der tilsættes vand ti! 300 ml og mikrobielt inoculum til i alt 500 ml. 
Denne blanding hældes dernæst et andet bægerglas og beluftes som 
omhandler ovenfor. Denne proces gentages med 15 minutters inter ­
valler med forskellige mængder teststofstamopløsning, således at der bliver en række beholdere med forskellige koncentrationer af teststof ­
fet. Til slut fremstilles en anden kontrol (C
 2 ). 
Efter tre timers forløb måles pH, og efter god blanding hældes en del 
af den første beholders indhold over i måleapparaturet, og respira ­
tionshastigheden måles over en periode pi indtil ti minutter.  
Denne bestemmelse gentages for hver beholders indhold med 
15 minutters intervaller, således at kontakttiden for hver beholder 
bliver tre timer.  
Referencestoffet testes med hver parti mikrobielt inoculum på samme 
måde.  
Et andet system (f.eks. mere end en oxygenmåler) vil være nødven ­
digt, når der skal foretages målinger efter 30 minutters kontakt.  
Hvis der kræves måling af det kemiske oxygenforbrug, må der frem ­
stilles andre beholdere, som indeholder teststof, syntetisk spildevand 
og vand, men ikke aktiveret slam. Oxygenforbruget måles og regi ­
streres efter en beluftningstid på 30 minutter og/eller tre timer (kon ­
takttid).  
2. DATA OG VURDERING  
Respirationshastigheden beregnes ud fra skriverkurven som mg 
O 2 /l × h mellem ca. 6,5 mg O  2 /l og 2,5 mg O  2 /l, eller over en ti minutters 
periode, hvis respirationshastigheden er lav. Den del af respirationskur ­
ven, som respirationshastigheden måles over, skal være lineær.  
Hvis respirationshastighedeme i de to kontroltest ikke ligger inden 
for 15 % af hinanden, eller hvis referencestoffets EC  50 (30 minutter 
og/eller tre timer) ikke ligger inden for det accepterede område (5 til 
30 mg/l for 3,5-dichlorphenol), er testen ugyldig og må gentages.  
Hæmningsprocenten beregnes ved hver testkoncentration (se 1.2). 
Hæmningsprocenten aftegnes mod koncentration på semilogaritmisk papir (eller probit), og der udledes en EC
 50 -værdi.  
95 %-konfidensgrænserne for EC  50 -værdierne kan bestemmes ved 
hjælp af standardprocedurer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— teststof: data for kemisk identifikation  
— testsystem: kilde, koncentration og eventuel forbehandling af det 
aktiverede slam  
— testbetingelser:  
— reaktionsblandingens pH før respirationsmåling  
— testtemperatur  
— testens varighed  
— referencestof og dets målte EC  50 
— eventuel abiotisk oxygenoptagelse  
— resultater:  
— alle målte data  
— hæmningskurve og metode til beregning af EC  50 
— EC  50 , og om muligt 95 % konfidensgrænser, EC  50 og EC  20 
— alle observationer og eventuelle afgivelser fra denne testme ­
tode, som kan have haft indflydelse på resultatet.  
3.2. FORTOLKNING AF DATA  
EC 50 værdien må kun betragtes som vejledende for teststoffets sand ­
synlige toksicitet for enten spildevandsbehandling med aktiveret slam eller mikroorganismer i spildevand, da de komplekse vekselvirknin ­
ger, der forekommet i miljøet, ikke kan simuleres nøjagtigt i en 
laboratorietest. Hertil kommer, at teststoffer, som har en hæmmende effekt på ammoniakoxidation, også kan give anledning til atypiske hæmningskurver. Sådanne kurver må fortolkes med forsigtighed.
 
4. HENVISNINGER  
(1) International Standard ISO/8192 — 1986.  
(2) Broecker, B. and Zahn, R., Water Research 11, 1997, s. 165.  
(3) Brown, D., Hitz, H. R. and Schaefer, L., Chemosphere 10, 
s. 245 (1981).  
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries), Recommended Method No. 3 03, også beskrevet af:
 
(5) B. Robra, Wasser/Abwasser 117, s. 80 (1976).  
(6) W. Schefer, Textilveredlung 6, s. 247 (1977).  
(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209. Decision of the 
Council C(81) 30 Final.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIOLOGISK NEDBRYDNING  
MODIFICERET SCAS-TEST  
1. METODE  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med denne metode er at bedømme den potentielle fuld ­
stændige bionedbrydelighed af vandopløselige, ikke-flygtige orga ­
niske stoffer, når disse udsættes for ret høje koncentrationer af mikroorganismer over et længere tidsrum. I dette tidsrum holdes 
mikroorganismerne i live ved en daglig tilførsel af næring bestående 
af bundfældet spildevand. (I forbindelse med weekenden kan spilde ­
vandet opbevares ved 4
 o C, eller det syntetiske spildevand til 
OECD's confirmatory test kan anvendes).  
Der kan finde fysisk-kemisk adsorption sted på de suspenderede 
faste stoffer, og der skal tages hensyn hertil ved fortolkningen af 
resultaterne (jf. 3.2).  
På grund af den flydende fases lange opholdstid (36 timer), og da 
der med mellemrum tilføres næringsstoffer, simulerer testen ikke de 
normale vilkår i et spildevandsanlæg. De resultater, der er opnået 
med forskellige teststoffer, viser, at denne metode har en høj bioned ­
brydningsevne.  
Delbetingelser, der skabes i denne metode, letter i høj grad selektion 
og/eller adaptation af mikroorganismer, der er i stand til at nedbryde teststoffet. (Denne fremgangsmåde kan ligeledes anvendes til at at fremstille akklimatiserede inocula til brug i andre test).
 
I denne test vurderes teststoffernes fuldstændige bionedbrydelighed 
ved måling af koncentrationen af opløst organisk kulstof (DOC). Det bør foretrækkes at bestemme koncentrationen af opløst organisk 
kulstof efter oprensning af den sure opløsning snarere end som 
forskellen mellem total C og uorganisk C.
 
Ved samtidig brug af en specifik analysemetode kan teststoffets 
primære nedbrydning (nedbrydning af en oprindelige kemiske struk ­
tur) vurderes.  
Denne metode kan kan anvendes på organiske teststoffer, som ved 
den i analysen anvendte koncentration:  
— er opløselige i vand (mindst 20 mg opløst organisk kulstof/l)  
— har et ubetydeligt damptryk  
— ikke er hæmmende over for bakterier  
— ikke adsorberes væsentligt i testsystemet  
— ikke går tabt ved, at testopløsningen skummer.  
Teststoffets indhold af organisk kulstof skal være bekendt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Oplysninger om de relative mængder af teststoffets hovedkompo ­
nenter vil være nyttige for fortolkningen af de opnåede resultater, 
specielt i de tilfælde, hvor resultaterne er lave eller marginale.  
Oplysninger om stoffets toksicitet for mikroorganismer kan være 
nyttige for fortolkningen for lidet signifikante resultater og for valg 
af en egnet testkoncentration.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
C T = koncentration af organisk kulstof i teststoffet, til stede i eller 
tilsat det bundfældende spildevand ved begyndelsen af beluft ­
ningsperioden (mg/l)  
C t = koncentrationen af opløst organisk kulstof i supernatanten ved 
afslutningen af beluftningsperioden (mg/l)  
C c = koncentrationen af opløst organisk kulstof i kontrollens super ­
natant ved afslutningen af beluftningsperioden (mg/l).  
Bionedbrydeligheden defineres i denne test som det organiske 
kulstofs orsvinden. Bionedbrydningen kan udtrykkes som:  
1. Den procentvise forsvinden D  da af den mængde af stoffet, der 
tilføres dagligt:  
D da ¼ C T Ä ðC t Ä C c Þ 
C T Ü 100  [1]  
hvor:  
D da = nedbrydning/daglig tilførsel.  
2. Den procentvise forsvinden D  ssd af den mængde stof, der er til 
stede ved hver dags begyndelse:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2 (a)] 
¼ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2 (b)]  
hvor:  
D ssd = nedbrydning/stof ved dagens begyndelse.  
Indekserne i og (i+ 1) henviser til testdagen.  
Ligning [2(a)] bør anvendes, hvis spildevandets indhold af opløst 
organisk kulstof svinger fra dag til dag, medens ligning [2(b)] kan 
anvendes, når mængden af opløst organisk kulstof er forholdsvis 
konstant fra dag til dag.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
I visse tilfælde kan referencestoffer være nyttige ved undersøgelsen 
af et nyt stof. Der kan imidlertid ikke anbefales noget bestemt refe ­
rencestof.  
Der angives oplysninger om flere forskellige stoffer, der er evalueret 
i ringtest (jf. tillæg 1), først og fremmest for at testmetoden af og til kan kalibreres, men også for at resultaterne kan sammenlignes, hvis 
der anvendes en anden metode.
 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Aktiveret slam fra et biologisk rensningsanlæg placeres i en semi- 
kontinuerlig aktiveret slamenhed (semi-continous activated sludge — 
SCAS). Teststoffet og bundfældet husholdningsspildevand tilføres, 
og blandingen beluftes i 23 timer. Beluftningen indstilles derefter, slammet gives tid til at bundfælde sig, og supernatantvæsken fjernes.
 
Det tilbageblevne slam i beluftningskammeret iblandes dernæst en 
yderligere mængde af teststoffet og spildevandet, hvorefter cyklussen begynder forfra.
 
Bionedbrydning konstateres ved at bestemme indholdet af opløst 
organisk kulstof i supernatantvæsken. Dette resultat sammenlignes med resultatet af analysen af væsken fra en kontrolenhed, som kun er tilført bundfældet spildevand.
 
Såfremt der anvendes en specifik analysmetode, kan ændringer i 
koncentrationen af det oprindelige stof som følge af bionedbryd ­
ningen måles (primær bionedbrydelighed).  
1.5. KVALITETSKRITERIER  
Denne metodes reporducerbarhed, baseret på fjernelse af opløst orga ­
nisk kulstof, er endnu ikke fastslået. (For så vidt angår primær bionedbrydning, er der opnået meget nøjagtige data for let nedbryde ­
lige stoffer).
 
Metodens følsomhed afhænger i vid udstrækning af variabiliteten i 
blindprøven og i mindre grad af den nøjagtighed, hvormed indholdet 
af opløst organisk kulstof kan bestemmes, eller af væskens indhold 
af teststof ved påbegyndelsen af hver enkelt cyklus.  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTPROCEDUREN  
1.6.1.  Forberedelse  
Et tilstrækkeligt antal rene beluftningsenheder (i stedet kan den 
oprindelige 1,5 l SCAS-prøveenhed anvendes) og lufttilførselsslanger 
(figur 1) for hvert enkelt teststof og til kontrollen klargøres. Den komprimerede luft, der tilføres testenhederne, renses med er vatfilter og bør være fri for organisk kulstof og være forudmættet med vand, 
så fordampningstab reduceres.
 
Fra et aktiveret slamanlæg, der primært behandler husholdningsspil ­
devand, tages en prøve af blandet væske, indeholdende 1 til 4 g 
suspenderet fast stof pr. liter. Til hver beluftningsenhed kræves ca. 
150 ml af den blandede væske.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Stamopløsninger af teststoffet tilberedes i destilleret vand. Den 
normalt krævede koncentration er 400 mg organisk kulstof pr. liter 
hvilket giver en koncentration af teststoffet på 20 mg/l ved påbegyn ­
delsen af hver beluftningscyklus, såfremt der ikke finder bionedbryd ­
ning sted.  
Der; kan anvendes højere koncentrationer, hvis toksiciteten over for 
mikroorganismerne tillader det.  
Slamopløsningernes indhold af organisk kulstof måles.  
1.6.2.  Testbetingelser  
Testen bar foretages ved 20 til 25  o C. 
Der anvendes en høj koncentration af aerobe mikroorganismer (fra 1 
til 4 g suspenderet fast stof pr. liter), og den effektive opholdstid er 
36 timer. Det kulstofholdige materiale i det tilførte spildevand iltes 
grundigt, sædvanligvis inden otte timer efter påbegyndelsen af hver beluftningscyklus. Derefter respirerer slammet endogent i resten af beluftningsperioden, hvorunder det eneste tilgængelige substrat er 
teststoffet, medmindre også dette metaboliseres hurtigt. Disse 
forhold, kombineret med daglig genpodning af prøven, når hushold ­
ningsspildevand anvendes som medium, giver uhyre gunstige betin ­
gelser for såvel akklimatisering som høj grad af bionedbrydning.
 
1.6.3.  Gennemførelsen af testen  
Der fremstilles en prøve af blandet væske fra en laboratorieenhed, 
der overvejende behandler husholdningsspildevand eller fra et egnet 
aktiveret slamanlæg, og prøven opbevares under aerobe betingelser indtil anvendelsen i laboratoriet. Hver beluftningsenhed samt kontro ­
lenheden påfyldes 150 ml (hvis den oprindelige SCAS-test anvendes, 
multipliceres de anførte volumener med 10) blandet væske, og 
beluftningen påbegyndes. Efter 23 timers forløb indstilles beluftnin ­
gen, og slammet bundfældes i 45 minutter. Hanen på hver kolbe åbnes successivt, og der udtages 100 ml af supernatantvæsken. Der 
klargøres en prøve bundfældet husholdningsspildevand umiddelbart 
før brug, og 100 ml heraf tilsættes det tilbageblevne slam i hver beluftningsenhed. Beluftningen påbegyndes på ny. På dette stadium tilsættes intet teststof. Enhederne tilsættes dagligt husholdningsspil ­
devand, men kun indtil det tidspunkt, hvor bundfældningen resulterer 
i en klar supernatant væske. Dette tager sædvanligvis op til to uger, hvorefter det opløste organiske kulstof i supernatantvæsken ved afslutningen af hver beluftningscyklus nærmer sig en konstant værdi.
 
Ved afslutningen af dette tidsrum blandes de forskellige bundfældede 
slamprøver, og 50 ml af denne blandede slamprøve tilsættes til hver enhed.
 
Der tilsættes 95 ml bundfældet spildevand og 5 ml vand til kontro ­
lenhederne, og 95 ml bundfældet spildevand plus 5 ml af den pågæl ­
dende stamopløsning af teststoffet (400 mg/l) til testenhederne. Beluftningen påbegyndes atter og fortsættes i 23 timer. Slammet bundfældes i 45 minutter, og supernatantvæsken fjernes og 
analyseres for opløst organisk kulstof.
 
Ovenstående påfyldnings- og aftapningsprocedure gentages dagligt 
under hele testens forløb.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Inden bundfældningen kan det være nødvendigt at rense enhedernes 
vægge for at forhindre akkumulering af faste stoffer over væskens 
niveau. For at undgå krydskontaminering anvendes der en separat skraber eller børste for hver enkelt enhed.
 
Ideelt set bør indholdet af opløst organisk kulstof i supernatantvæ ­
skerne bestemmes dagligt, selv om mindre hyppige analyser kan tillades. Inden analysen filtreres væskerne gennem vaskede membranfiltre med en porestørrelse på 0,45 μm, eller væskerne 
centrifugeres. Membranfiltre er egnede, hvis der er sikkerhed for, 
at de hverken afgiver kulstof eller adsorberer stoffet under filtrerin ­
gen. Prøvens temperatur må ikke overstige 40
 o C, så længe den er i 
centrifugen.  
Testens varighed er ubestemt for stoffer, der udviser ringe eller ingen 
bionedbrydning. Erfaringerne viser dog, at den generelt bør vare mindst 12 uger, men ikke længere end 26 uger.
 
2. DATA OG EVALUERING  
Værdierne for indholdet af opløst kulstof i supernatant væskerne i 
testenhederne og i kontrolenhederne afbildes mod tiden i et koordi ­
natsystem.  
Efterhånden som nedbrydningen skrider frem, vil niveauet i testen ­
heden nærme sig niveauet i kontrolenheden. Når forskellen mellem de ro niveauer er konstant i tre på hinanden følgende målinger, 
gennemføres der et tilstrækkeligt antal yderligere målinger til en 
statistisk behandling af dataene, og den procentvise bionedbrydning af teststoffet beregnes (D
 da eller D  ssd , jf. 1.2).  
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal om muligt indeholde følgende:  
— fuldstændige oplysninger om spildevandets art, om hvilken type 
enhed der er anvendt samt om forsøgsresultaterne vedrerende 
teststoffet, referencestoffet, hvis et sådan er anvendt, og blind ­
prøven  
— temperatur  
— kurve for det organiske kulstofs forsvinden, med beskrivelse af 
beregningsmetode (jf. 1.2)  
— dato og sted for prøveudtagning af aktiveret slam og spildevand, 
status vedrørende adaptation, koncentration osv.  
— videnskabelige grunde til eventuelle ændringer i testproceduren  
— underskrift og dato.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. FORTOLKNING AF RESULTATERNE  
Eftersom det stof, der kan testes med denne metode, ikke vil være let 
bionedbrydeligt, vil enhver forsvinden af opløst organisk kulstof, som udelukkende skyldes bionedbrydning, normalt forløbe gradvis 
over dage eller uger, undtagen i sådanne tilfælde, hvor akklimatise ­
ringen er pludselig, hvilket fremgår af en abrupt forsvinden efter nogle uger.
 
Fysisk-kemisk adsorption kan imidlertid nogle gange spille en bety ­
delig rolle. Dette er tilfældet, når der ved begyndelsen indtræder en 
fuldstændig eller delvis forsvinden af det tilsatte opløste organiske kulstof. Hvad der derefter sker, afhænger af forskellige faktorer, såsom adsorptionsgraden og koncentrationen af suspenderet fast 
stof i det bortkastede spildevand. Forskellen mellem koncentrationen 
af opløst organisk kulstof i kontrol- og testenhedernes supernatant ­
væsker øges sædvanligvis gradvis fra den først indtrufne værdi, og denne forskel forbliver dernæst på den nye værdi under resten af 
forsøget, medmindre der finder akklimatisering sted.
 
Når der skal skelnes mellem bionedbrydning (eller delvis bioned ­
brydning) og adsorption, er yderligere analyser påkrævet. Dette kan gøres på flere forskellige måder, men den mest pålidelige metode er at anvende supernatantvæsken, eller slam, som podestof 
i en basissættest (helst en respirometrisk test).
 
Teststoffet, der resulterer i omfattende, ikke adsorptiv forsvinden af 
opløst organisk kulstof, bør i denne test betragtes som potentielt bionedbrydeligt. Delvis ikke-adsorptiv forsvinden tyder på, at 
stoffet i hvert fald er bionedbrydeligt til en vis grad.
 
Ringe eller ingen forsvinden af opløst organisk kulstof kan skyldes 
teststoffets hæmning af mikroorganismerne. Dette kan ligeledes afsløres af lysis og tab af slam, hvilket giver uklare supernatantvæ ­
sker. Testen bør i så fald gentages med anvendelse af en lavere 
koncentration af teststoffet.
 
Anvendelsen af en specifik analysemetode eller C-14-mærket teststof 
kan give større følsomhed. Anvendes der et C-14-teststof, vil genfin ­
ding af  14 CO 2 bekræfte, at der har fundet bionedbrydning sted.  
Såfremt der ligeledes angives resultater for primær bionedbrydning, 
bør der om muligt gives en forklaring på den forandring i den 
kemiske struktur, der medfører, at det oprindelige teststof ikke kan påvises.
 
Valideringen af analysemetoden skal anføres sammen med værdierne 
for blindprøvemediet.  
4. HENVISNINGER  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A. Decision of the 
Council C(81) 30 Final.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Tillæg 1  
SCAS-test: eksempel på resultater  
Stof C T 
(mg/l) C t –C c 
(mg/l) Procent bioned ­
brydning 
D da Testens varighed 
(dage)  
4-acetylaminobenzensulfonat 17,2 2,0 85 40 
Tetrapropylonbenzensulfonat 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrophenol 16,9 0,8 95,3 40 
Diethylen glycol 16,5 0,2 98,8 40 
Anilin 16,9 1,7 95,9 40 Cyclopentantetracarboxylat 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Tillæg 2  
Eksempel på apparatur
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOKONCENTRERING: GENNEMSTRØMNINGSTEST MED 
FISK  
1. METODE  
Denne biokoncentreringsmetode er en gengivelse af OECD Test 
Guideline 305 (1996).  
1.1. INDLEDNING  
I denne metode beskrives en fremgangsmåde for karakterisering af 
stoffers biokoncentreringspotentiale i fisk under gennemstrømning. Test ved gennemstrømning er langt at foretrække, men også semis ­
tatiske systemer tillades, forudsat at gyldighedskriterierne er opfyldt.
 
Testen er så detaljeret beskrevet, at den kan udføres, samtidig med at 
der er tilstrækkelig frihed til at tilpasse tilrettelægningen af forsøgene til særlige forhold i laboratorierne og teststoffernes særlige egenska ­
ber. Metoden er bedst til stabile organiske kemiske stoffer med en 
log P
 ow .-værdi mellem 1,5 og 6,0 (1), men den kan også anvendes 
for ekstremt lipofile stoffer (med log P  ow > 6,0). Den på forhånd 
skønnede biokoncentreringsfaktor (BCF), undertiden benævnt K  B , 
for sådanne ekstremt lipofile stoffer vil normalt være højere end den værdi af ligevægtsbiokoncentreringsfaktoren (BCF
 SS ), man må 
forvente at finde ved laboratorieforsøg. Forhåndsskøn over biokon ­
centreringsfaktoren for organiske stoffer med log P  ow -værdier op til 
ca. 9,0 kan beregnes efter udtrykket i Bintein et al (2). De parametre, der karakteriserer biokoncentreringspotentialet, er hastighedskon ­
stanten for optagelse (k
 1 ), hastighedskonstanten for udskillelse (k  2 ) 
og BCF  SS . 
Radioaktivt mærkede teststoffer kan gøre analyse af vand- og fiske ­
prøver lettere og kan benyttes til at afgøre, om der skal foretages identifikation og kvantitativ bestemmelse af nedbrydningsprodukter. 
Hvis den samlede mængde radioaktivt restmateriale måles (f.eks. ved 
forbrænding eller opløsning af væv), vil BCF blive baseret på den oprindelige forbindelse, eventuelle tilbageholdte metabolitter og assimileret kulstof. BCF-værdier, der baseres på det samlede 
indhold af radioaktivt materiale, kan derfor ikke altid sammenlignes 
direkte med en BCF-værdi, der er bestemt ved specifik kemisk analyse for den oprindelige forbindelse alene.
 
Ved undersøgelser med radioaktivt mærkede stoffer kan der benyttes 
oprensningsprocedurer til bestemmelse af BCF baseret på den oprin ­
delige forbindelse, og de vigtigste metabolitter kan om nødvendigt karakteriseres. Man kan også kombinere en undersøgelse af metabo ­
lisme i fisk med en biokoncentreringsundersøgelse ved at analysere 
og identificere stofrester i væv.
 
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Ved biokoncentrering/bioakkumulering  forstås en koncentrationsfor ­
øgelse af teststoffet i eller på en organisme (eller specificerede væv deraf) i forhold til koncentrationen af teststoffet i det omgivende 
medium.
 
Ved biokoncentreringsfaktoren  (BCF eller K  B ) på et givet tidspunkt 
under optagelsesfasen af akkumuleringstesten forstås koncentrationen af teststoffet i/på fiskene eller specificerede væv deraf (C
 f i μg/g 
(ppm)) divideret med koncentrationen af det kemiske stof i det omgi ­
vende medium (C  w i μg/ml (ppm)).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Ligevægtsbiokoncentreringsfaktoren  (BCF  SS eller K  B ) ændrer sig 
ikke væsentligt over et længere tidsrum, idet koncentrationen af test ­
stoffet i det angivende medium er konstant i dette tidsrum.  
Man taler om et  plateau  eller en  ligevægtstilstand  i afbildningen af 
teststoffet i fisk (C  f ) mod tiden, når kurven bliver parallel med tids ­
aksen, når tre på hinanden følgende analyser af C  f i prøver, der er 
udtaget med mindst to dages mellemrum, ligger inden for ± 20 % af 
hinanden, og når der ikke er nogen signifikante forskelle mellem de tre prøveudtagningsperioder. Ved pooling af prøver til analyse, 
kræves der mindst fire på hinanden følgende analyser. For teststoffer, 
der optages langsomt, vil et interval på syv dage være mere passende.
 
En biokoncentreringsfaktor,  der er beregnet direkte ud fra kinetiske 
hastighedskonstanter (k  1 /k 2 ), betegnes den kinetiske koncentrerings ­
faktor, BCF  k . 
Ved octanol-vand fordelingskoefficienten  (P  ow ) forstås forholdet 
mellem et kemisk stofs opløselighed i n-octanol og vand ved lige ­
vægt (metode A.8), også betegnet K  ow . Logaritmen til P  ow benyttes 
som rettesnor for et kemisk stofs potentiale for biokoncentrering i vandorganismer.
 
Ved eksponeringsfasen  eller  optagelsesfasen  forstås det tidsrum, 
hvori fiskene udsættes for teststoffet.  
Ved hastighedskonstant for optagelse  (k 1 ) forstås den talværdi, der 
angiver hastigheden for koncentrationsforøgelsen af teststoffet i eller på fiskene (eller specificerede væv deraf), når fiskene udsættes for 
stoffet (k
 1 udtrykkes i dag  -1 ). 
Ved udskillelsesfasen  forstås det tidsrum efter overførsel af forsøgs ­
fiskene fra et medium med teststoffet i til et medium uden stoffet, hvor man undersøger udskillelsen (eller nettoafgivelsen) af stoffet fra 
forsøgsfiskene (eller specificerede væv deraf).
 
Ved hastighedskonstant for udskillelse  (k 2 ) forstås den talværdi, der 
angiver hastigheden for koncentrationsfaldet af teststoffet i forsøgs ­
fiskene (eller specificerede væv deraf), efter at de er overført fra et 
medium med teststoffet i til et medium uden dette stof (k  2 udtrykkes 
i dag  -1 ). 
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Testen falder i to faser, en eksponeringsfase (optagelsesfase) og en 
udskillelsesfase. I optagelsesfasen udsættes separate grupper af fisk af én art for mindst to koncentrationer af teststoffet. De overføres 
dernæst til et medium uden teststoffet, hvor udskillelsesfasen 
forløber. Der kræves altid en udskillelsesfase, undtagen hvis optagelsen af stoffet under eksponeringsfasen har været ubetydelig (f.eks.hvis BCF er mindre end 10). Under begge testens faser følges 
koncentrationen af stoffet i eller på fiskene (eller specificerede væv 
deraf). Der holdes samtidig en kontrolgruppe af fisk under samme betingelser, bortset fra at der ikke er noget teststof til stede, så man kan sammenholde eventuelle skadevirkninger i biokoncentrerings ­
testen med en tilsvarende kontrolgruppe og bestemme baggrundskon ­
centrationer af teststof.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Optagelsesfasen varer i 28 dage, medmindre det godtgøres, at der 
inden da er indtrådt ligevægt. Ud fra ligningerne i bilag 3 kan man 
forudsige, hvor lang tid optagelsesfasen vil vare, og hvor lang tid der vil gå, inden der er ligevægt. Udskillelsesperioden indledes dernæst ved, at fiskene overføres til en ren beholder med samme medium, 
men uden teststof. Når det er muligt, beregnes biokoncentrerings ­
faktoren både som forholdet (BCF
 SS ) mellem koncentrationen i 
fiskene (C  f ) og i vandet (C  W ) ved ligevægt, og som kinetisk biokon ­
centreringsfaktor (BCF  K ) som forholdet mellem hastighedskonstan ­
terne for optagelse (k  1 ) og udskillelse (k  2 ), idet kinetikken antages at 
være af første orden. Hvis det er åbenbart, at kinetikken ikke er af første orden, må der benyttes mere komplekse modeller (bilag 5).
 
Hvis der ikke nås ligevægt inden 28 dage, forlænges optagelsesfasen, 
indtil der er opnået ligevægt, dog højst 60 dage: Derefter påbegyndes udskillelsesfasen.
 
Hastighedskonstanten for optagelse, hastighedskonstanten for udskil ­
lelse (eller konstanterne, hvis der er tale om mere komplekse model ­
ler), biokoncentreringsfaktoren og så vidt muligt konfidensgrænser for hver af disse parametre beregnes ud fra den model, der bedst 
beskriver de målte koncentrationer af teststof i fisk og vand.
 
BCF udtrykkes som en funktion af fiskenes samlede vægt. I særlige 
tilfælde kan dog bestemte væv eller organer (f.eks. muskelvæv eller 
lever) anvendes, hvis fiskene er tilstrækkelig store, eller fiskene kan 
opdeles i en spiselig fraktion (filet) og en ikke-spiselig fraktion (indvolde). Da der for mange organiske stoffer er en tydelig sammenhæng mellem biokoncentreringspotentialet og stoffets lipofile 
karakter, er der en tilsvarende sammenhæng mellem forsøgsfiskenes 
fedtindhold og stoffernes observerede biokoncentrering. For at imødegå sådanne udsving i forsøgsresultater for stærkt lipofile stoffer (dvs. log P
 ow > 3) bør biokoncentreringen udtrykkes både i 
forhold til fedtindholdet og i forhold til den samlede legemsvægt.  
Fedtindholdet skal om muligt bestemmes på det samme biologiske 
materiale, som benyttes til bestemmelse af teststoffets koncentration.  
1.4. OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET  
Inden biokoncentreringstesten udføres, skal følgende oplysninger om 
teststoffet foreligge:  
— opløselighed i vand  
— octanol-vand fordelingskoefficient P  ow (betegnes også K  ow , 
bestemt ved en HPLC-metode i A.8)  
— hydrolyse  
— fotokemisk omdannelse i vand bestemt ved bestråling med sollys 
og simuleret sollys under samme bestrålingsforhold som ved 
testen for biokoncentrering (3)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— overfladespænding (dvs. for stoffer, hvis P  ow ikke kan bestem ­
mes)  
— damptryk  
— umiddelbar bionedbrydelighed (når det er relevant)  
Blandt andre nødvendige oplysninger er toksiciteten over for den 
fiskeart, der benyttes til testen, helst den asymptotiske (dvs. tidsuaf ­
hængige) LC  50 . Der skal foreligge en passende analysemetode med 
kendt nøjagtighed, præcision og følsomhed til kvantitativ bestem ­
melse af teststoffet i opløsninger og biologisk materiale og oplys ­
ninger om, hvordan prøver forberedes og opbevares. Hvis der bruges  
14 C-mærkede teststoffer, skal den procentdel af radioaktiviteten, der 
skyldes urenheder, være kendt.  
1.5. TESTENS GYLDIGHED  
Følgende betingelser skal være til stede, for at testen betragtes som 
gyldig:  
— temperaturudsving må ikke være større end ± 2  o C 
— koncentrationen af opløst oxygen må ikke komme under 60 % af 
mætning  
— koncentrationen af teststoffet i kamrene skal ligge inden for ± 
20 % af gennemsnittet af de målte værdier under eksponerings ­
fasen  
— dødeligheden og andre skadevirkninger/sygdomme må ved 
testens afslutning højst være 10 % både i kontrolgruppen og i de eksponerede fisk: Hvis testen strækker sig over flere uger eller 
måneder, må dødsfald og andre skadevirkninger i begge grupper 
højst være 5 % om måneden og højst 30 % i alt.
 
1.6. REFERENCESTOFFER  
Det kan være nyttigt at anvende referencestoffer med kendt biokon ­
centreringspotentiale til kontrol af forsøgsmetoden, hvis dette er påkrævet. Der kan dog endnu ikke anbefales nogen bestemte stoffer.
 
1.7. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.7.1.  Apparatur  
Det skal omhyggeligt undgås, at der i nogen dele af udstyret 
anvendes materialer, der kan opløses eller adsorbere, absorbere eller afgive stoffer og have en skadelig virkning på fiskene. Der kan benyttes rektangulære eller cylindriske standardkar af kemisk 
inert materiale og passende størrelse i forhold til mængden af fisk. 
Bløde plastslanger bør benyttes mindst muligt. Der skal helst bruges rør og slanger af teflon (R), rustfrit stål eller glas. Erfaringerne har vist, at det til stoffer med høj adsorptionskoefficient såsom syntetiske 
pyrethroider kan være nødvendigt at bruge silancoatet glas. I sådanne 
tilfælde må udstyret kasseres efter brug.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Vand  
Til testen benyttes sædvanligvis råvand, som skal være af ensartet 
kvalitet og komme fra en ikke-forurenet kilde. Vand til fortynding skal være af en sådan kvalitet, at den valgte fiskeart kan overleve 
akklimatiserings- og testperioden, uden at deres udseende eller 
adfærd bliver unormal. Allerhelst bør det godtgøres, at fiskearten kan overleve, vokse og formere sig i fortyndingsvandet (f.eks. i laboratoriekultur eller en toksicitetstest over en hel livscyklus). 
Vandet skal beskrives i hvert fald ved sit pH, hårdhed, tørstof i alt 
og organisk kulstof i alt, og gerne også indholdet af ammonium, nitrit og nitrat, samt for saltvandsfisk saltholdigheden. Selv om det 
er velkendt, hvilke parametre der er vigtige for fisks velfærd, er der i 
bilag 1 anført anbefalede maksimumkoncentrationer for en række parametre for fersk- og saltvand til forsøg.
 
Vandet skal være af konstant kvalitet under hele forsøget. Dets pH 
skal være mellem 6 og 8,5, men for en given test skal det ligge konstant inden for ± 0,5. For at sikre, at fortyndingsvandet ikke 
ubehørigt påvirker forsøgsresultatet (f.eks. ved kompleksdannelse 
med teststoffet) eller indvirker negativt på fiskebestanden, udtages der regelmæssigt prøver til analyse. Indholdet af tungmetaller (f.eks. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd og Ni), vigtige anioner og kationer (f.eks. Ca, 
Mg, Na, K, Cl og SO
 4 ) pesticider (f.eks. organiske phosphorforbin ­
delser i alt og organiske chlorforbindelser i alt), organisk kulstof i alt og opslæmmet tørstof bør bestemmes f.eks. hver tredje måned, når fortyndingsvandet vides at være af forholdsvis konstant kvalitet. Hvis 
vandkvaliteten kan påvises at have været konstant i mindst et år, kan 
hyppigheden sættes ned (til f.eks. hvert halve år).
 
Både det naturlige partikelindhold og indholdet af organisk kulstof i 
alt (TOC) i fortyndingsvandet skal være så lavt som muligt, så man undgår absorption af teststoffet ti! organisk materiale, hvilket kan nedsætte dets biotilgængelighed (4). Den højeste acceptable værdi 
er 5 mg/l for partikler (tørstof, der ikke passerer et 0,45 μm filter) 
og 2 mg/l for organisk kulstof i alt (se bilag 1). Om nødvendigt må vandet filtreres inden brugen. Bidraget til indholdet af organisk kulstof i vandet fra testfiskene (ekskrementer) og føderester skal 
holdes så lavt som muligt. Under hele testen må koncentrationen 
af organisk kulstof i testkarret ikke overstige koncentrationen af organisk kulstof hidrørende fra teststoffet og et eventuelt opløsende stof med mere end 10 mg/l (± 20 %).
 
1.7.3.  Testopløsninger  
Der fremstilles en stamopløsning af teststoffet med en passende 
koncentration. Den skal helst fremstilles ved simpel blanding eller omrystning af teststoffet med vand. Brug af opløsningsmidler eller 
dispergeringsmidler (opløsende stoffer) anbefales ikke, men det kan i 
visse tilfælde være nødvendigt for at opnå en passende koncentreret stamopløsning. Som opløsningsmiddel kan der benyttes ethanol, methanol, ethylenglycolmonomethylether, ethylenglycoldimethylet ­
her, dimethylformamid eller triethylenglycol. Som dispergerings ­
middel kan benyttes Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methyl ­
cellulose eller HCO-40. Der bør udvises forsigtighed med brug af let bionedbrydelige midler, da de kan skabe problemer med bakterie ­
vækst i test med gennemstrømning. Teststoffet kan være radioaktivt 
mærket og skal være af størst mulig renhed (f.eks. helst > 98 %).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Til forsøg med gennemstrømning kræves der er system, der konti ­
nuerligt leverer og fortynder en stamopløsning af teststoffet (f.eks. 
doseringspumpe, proportionalfortynder, mætningssystem), til tilførsel af teststoffet ti! kamrene. Der tilstræbes en udskiftning på mindst fem gange dagligt pr. testkammer. Gennemstrømningsmetoden bør 
foretrækkes, men kan det ikke lade sig gøre (f.eks. hvis testorganis ­
merne tager skade), kan der bruges en semistatisk teknik, forudsat at gyldighedskriterierne er opfyldt. Flowhastighederne for stamopløs ­
ning og fortyndingsvand kontrolleres 48 timer før testens begyndelse 
og derefter mindst dagligt under testen. Ved denne kontrol måles 
flowet i hvert testkammer, og det sikres, at det ikke varierer med mere end 20 %, hverken inden for hvert kammer eller mellem kamrene.
 
1.7.4.  Valg af fiskeart  
Blandt de vigtige kriterier ved valg af fiskearten er, at den skal være 
let at få fat i, kunne fås i passende størrelser og let kunne holdes i 
laboratoriet. Andre kriterier for valg af fiskeart kan være dens rekre ­
ative, kommercielle eller økologiske betydning, dens følsomhed i forhold til andre arter og gode erfaringer med den.
 
I bilag 2 er anført nogle fiskearter, som anbefales til test. Der kan 
anvendes andre arter, men testmetoden må i så fald tilpasses, så testbetingelserne bliver passende. Der skal da anføres en begrundelse 
for valg af art og testmetode.
 
1.7.5.  Opbevaring af fisk  
Stampopulationen af fisk akklimatiseres i mindst to uger i vand ved 
testtemperaturen og gives hele tiden tilstrækkeligt af det foder, som 
skal benyttes under testen.  
Efter en 48-timers tilpasningsperiode noteres dødeligheden, og der 
anvendes følgende kriterier:  
— dødelighed over 10 % efer syv dage: Hele partiet forkastes  
— dødelighed mellem 5 % og 10 % efter syv dage: Akklimatise ­
ringen fortsættes i endnu syv dage  
— dødelighed under 5 % efter syv dage: Partiet accepteres; hvis 
dødeligheden er over 5 % efter endnu syv dage, forkastes hele 
partiet.  
Det sikres, at ingen af fiskene til testen har synlige sygdomme eller 
misdannelser. Syge fisk kasseres. Fisk må ikke behandles mod 
sygdomme hverken under testen eller i to uger forud for testen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. TESTENS UDFØRELSE  
1.8.1.  Indledende test  
Det kan være nyttigt at gennemføre et indledende eksperiment med 
henblik på at optimere testbetingelserne for den endelige test, f.eks. 
valg af koncentration(er) af teststoffet og længden af eksponerings- 
og udskillelsesfasen.  
1.8.2.  Eksponeringsbetingelser  
1.8.2.1. O p t a g e l s e s f a s e n s l æ n g d e  
Forudsigelse af optagelsesfasens længde kan ske på grundlag af 
praktiske erfaringer (f.eks. fra en tidligere undersøgelse eller et andet kemisk stof, der akkumuleringsmæssigt ligner) eller ved 
hjælp af forskellige empiriske sammenhænge ud fra kendskab til 
stoffets opløselighed i vand eller dets octanol/vand fordelingskoeffi ­
cient (se bilag 3).
 
Optagelsesfasen bør vare 28 dage, medmindre det kan godtgøres, at 
der inden da er indtrådt ligevægt. Er der ikke opnået ligevægt efter 28 dage, forlænges optagelsesfasen, og målingerne fortsættes, indtil 
der er nået ligevægt, dog højst 60 dage.
 
1.8.2.2. U d s k i l l e l s e s f a s e n s l æ n g d e  
Normalt er en periode på halvdelen af optagelsesfasen tilstrækkeligt 
til at opnå et passende fald (f.eks. 95 %) i fiskenes belastning med 
stoffet (se redegørelsen for skønnet i bilag 3). Hvis der skal bruges 
urealistisk lang tid til at opnå et fald på 95 %, f.eks. dobbelt så lang tid som en normal optagelsesfase (dvs. mere end 56 dage), kan tidsrummet sættes ned (dvs. indtil koncentrationen af teststoffet er 
mindre end 10 % af ligevægtskoncentrationen). For stoffer med mere 
komplekse optagelses- og udskillelsesmønstre end det, hvor fisken betragtes som en helhed, og hvor der gælder førsteordenskinetik, må der dog benyttes en længere udskillelsesfase til bestemmelse af 
hastighedskonstanterne. Periodens længde kan f.eks. bestemmes af, 
hvor længe koncentrationen af teststoffet i fiskene er højere end påvisningsgrænsen.
 
1.8.2.3. A n t a l t e s t f i s k  
Der udvælges så mange fisk pr. testkoncentration, at der mindst er 
fire fisk til rådighed pr. prøve ved hver prøveudtagning. Ønskes der større statistisk styrke, må antallet af fisk pr. prøve øges.
 
Hvis der benyttes voksne fisk, anføres i rapporten, om der er brugt 
hanner, hunner eller begge køn i eksperimentet. Hvis begge køn er anvendt, skal det dokumenteres, at der inden eksponeringen ikke er 
nogen signifikant forskel i fedtindhold mellem kønnene; pooling af 
alle hanner og hunner kan være påkrævet.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Til en given test udvælges der fisk af samme vægt, således at den 
mindste ikke vejer mindre end to tredjedele af den største. Alle fisk 
skal være af samme årgang og komme fra samme kilde. Da fiskenes alder og vægt undertiden synes at indvirke signifikant på BCF-værdi ­
erne (1), skal disse oplysninger noteres nøjagtigt. Det anbefales, at 
man inden testen danner sig et skøn over gennemsnitsvægten ved at 
veje en delprøve af fiskebestanden.
 
1.8.2.4. B e l a s t n i n g  
Der benyttes et højt forhold mellem vand og fisk, så faldet i C  w som 
følge af overførsel af fiskene ved testens begyndelse bliver så lille som muligt, og for at undgå, at koncentrationen af opløst oxygen 
falder. Det er vigtigt, at belastningen afpasses efter den anvendte 
fiskeart. I alle tilfælde anbefales normalt en belastning på 0,1-1,0 g fisk (våd vægt) pr. liter vand pr. dag. Belastningen kan sættes op, hvis det godtgøres, at den nødvendige koncentration af teststof kan 
fastholdes inden for ± 20 %, og at koncentrationen af opløst oxygen 
ikke kommer under 60 % af mætning.
 
Der skal tages hensyn til fiskeartens normale levevilkår ved valget af 
belastning. Eksempelvis kan bundfisk kræve større bundareal i akva ­
riet for samme vandrumfang end pelagiske fiskearter.  
1.8.2.5. F o d r i n g  
Under akklimatisering og test gives fiskene passende foder med 
kendt fedt- og proteinindhold i en sådan mængde, at de forbliver sunde og bevarer deres legemsvægt. Fiskene fodres dagligt under akklimatisering og test med en mængde svarende til ca. 1-2 % af 
legemsvægten; på denne måde holdes fedtkoncentrationen i de fleste 
fiskearter nogenlunde konstant under testen. Fodermængden beregnes på ny f.eks. en gang om ugen, så legemsvægt og fedtind ­
hold holdes konstant. Til denne beregning kan man skønne vægten 
af fiskene i de enkelte kamre ud fra vægten af de fisk, der senest er 
taget op fra det pågældende kammer. De fisk, der bliver tilbage i kamrene, må ikke vejes.
 
Hver dag kort efter fodringen (30 min-l time) suges overskydende 
foder og ekskrementer op fra testkamrene. Kamrene holdes så rene 
som muligt under testen, så koncentrationen af organisk kulstof er så lav som mulig, eftersom tilstedeværende organisk kulstof kan nedsætte teststoffets biotilgængelighed (1).
 
Da meget foder er fremstillet af fiskemel, må det analyseres for 
teststoffet. Foderet bør tillige analyseres for pesticider og tungmetal ­
ler. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. L y s o g t e m p e r a t u r  
Lysperioden er normalt 12-16 timer, og temperaturen (± 2  o C) skal 
være afpasset efter testfiskearten (se bilag 2). Belysningens type og karakteristika skal være kendt. Man bør være opmærksom på en 
eventuel fotokemisk omdannelse af teststoffet ved belysningsforhol ­
dene under undersøgelsen. Der skal benyttes en passende belysning, hvor det undgås, at fiskene udsættes for kunstigt fremkaldte fotoke ­
miske omdannelsesprodukter. Det kan i nogle tilfælde være hensigts ­
mæssigt at afblænde UV-stråling under 290 nm med et filter.
 
1.8.2.7. T e s t k o n c e n t r a t i o n e r  
Fiskene udsættes under gennemstrømning for mindst to koncentra ­
tioner af teststoffet i vand. Normalt sættes den højeste koncentration 
af teststoffet til ca. 1 % af den akutte asymptotiske LC  50 og mindst ti 
gange højere end påvisningsgrænsen i vand ved den anvendte analysemetode.
 
De højeste testkoncentration kan også fastsættes ved division af den 
akutte 96 h LC  50 med et passende akut/kronisk-forhold (for nogle 
kemiske stoffer vil et passende forhold ligge fra ca 3 op til 100). Om 
muligt vælges den eller de andre testkoncentrationer, således at den 
(de) er en faktor ti lavere. Kan det ikke lade sig gøre på grund af 1 % af LC
 50 -kriteriet og analysegrænsen, kan der benyttes en 
mindre faktor, eller man kan overveje at benytte  14 C-mærket teststof. 
Der må ikke benyttes koncentrationer højere end teststoffets opløse ­
lighed.  
Hvis der benyttes et opløsende stof, må koncentrationen ikke være 
større end 0,1 ml/1, og den skal være den samme i alle testkar. Dette 
stofs og teststoffets bidrag til det samlede indhold af organisk kulstof i testvandet skal være kendt. Det skal dog så vidt muligt undgås at benytte sådanne materialer.
 
1.8.2.8. K o n t r o l g r u p p e r  
Der skal ud over testrækken være en kontrolgruppe med fortyndings ­
vand eller en kontrolgruppe med et eventuelt opløsende stof, forudsat at det er fastslået, at det opløsende stof ikke har nogen virkning på 
fisk. Er det ikke tilfældet, skal begge kontrolgrupper forefindes.
 
1.8.3.  Hyppighed af målinger af vandkvaliteten  
Under testen måles opløst oxygen, TOC, pH og temperatur i alle kar. 
I kontrolkarrene og karret med den højeste koncentration måles 
vandets samlede hårdhed og saltholdighed, hvis det er relevant. 
Som minimum måles opløst oxygen og eventuel saltholdighed tre gange — ved begyndelsen, midt i og ved slutningen af optagelses ­
perioden — og en gang ugentligt i udskillelsesperioden. TOC måles 
ved testens begyndelse (24 h og 48 h før optagelsesfasen begynder), 
før fiskene overføres, og mindst en gang ugentligt under både optagelses- og udskillelsesfasen. Temperaturen måles dagligt, pH ved begyndelsen og slutningen af hver periode, og hårdheden én 
gang ved hver test. Temperaturen skal helst følges kontinuerligt i 
mindst ét at karrene.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Prøveudtagning og analyse af fisk og vand  
1.8.4.1. P l a n f o r u d t a g n i n g a f p r ø v e r a f f i s k o g v a n d  
Der udtages prøver af vandet fra testkamrene med henblik på 
bestemmelse af teststofkoncentrationen, både inden fiskene overføres 
og under optagelses- og udskillelsesfasen. Som minimum udtages der 
prøver af vandet samtidig med prøver af fisk og før fodring. Under optagelsesfasen bestemmes teststofkoncentrationen til kontrol af, at gyldighedskriterierne er opfyldt.
 
Der udtages prøver af fisk mindst fem gange under optagelsesfasen 
og mindst fire gange under udskillelsesfasen. Da det i nogle tilfælde 
vil være vanskeligt at beregne et rimelig præcist skøn over BCF- værdien ud fra dette prøveantal, især hvis det formodes, at udskil ­
lelsen ikke følger en simpel førsteordenskinetik, kan det anbefales at 
øge prøveudtagningshyppigheden i begge perioder (se bilag 4). De 
ekstra prøver opbevares og analyseres kun, hvis resultaterne af den første analyserunde viser sig utilstrækkelig til beregning af BCF med den ønskede præcision.
 
I bilag 4 er der vist et eksempel på en acceptabel prøveudtagnings ­
plan. Der kan let opstilles andre planer efter beregning af ekspone ­
ringstider for 95 % optagelse ud fra andre antagne P  ow -værdier.  
Prøveudtagningen fortsættes under optagelsesfasen, indtil der er 
opnået ligevægt, dog højst 28 dage. Er der ikke nået ligevægt 
inden for 28 dage, fortsættes prøveudtagningen, indtil der er opnået ligevægt, dog højst 60 dage. Før udskillelsesfasen overføres fiskene til rene kar.
 
1.8.4.2. U d t a g n i n g o g f o r b e r e d e l s e a f p r ø v e r  
Vandprøver til analyse kan f.eks. udtages ved opsugning gennem et 
rør af inert materiale fra et sted midt i testkammeret. Da hverken 
filtrering eller centrifugering synes at kunne adskille den ikke-biotil ­
gængelige fraktion af teststoffet fra den biotilgængelige (især for ekstremt lipofile stoffer, dvs. stoffer med log P
 ow > 5) (1) (5) i 
alle tilfælde, må prøverne ikke behandles på denne måde.  
I stedet må man sørge for at holde karrene så rene som muligt, og 
indholdet af organisk kulstof i alt følges under såvel optagelses- som 
udskillelsesfasen.  
Der udtages et passende antal fisk (normalt mindst fire) fra testkar ­
rene ved hver prøveudtagning. De udtagne fisk skylles hurtigt med 
vand, duppes tørre og aflives med det samme på den mest velegnede og humane måde, hvorefter de vejes.
 
Fiske- og vandprøver skal helst analyseres umiddelbart efter udtag ­
ningen, så man undgår nedbrydning eller andre former for tab, og så der løbende under testen kan beregnes omtrentlige optagelses- og 
udskillelseshastigheder. Ved at foretage analyserne med det samme 
opdager man straks, når et plateau er nået.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Foretages analyserne ikke med det samme, opbevares prøverne 
hensigtsmæssigt. Inden undersøgelsen påbegyndes, indhentes der 
oplysninger om, hvordan det pågældende teststof bør opbevares, f.eks. dybfrysning, henstand ved 4
 o C, opbevaringstid og ekstraktion.  
1.8.4.3. A n a l y s e m e t o d e n s k v a l i t e t  
Da hele proceduren i vid udstrækning afhænger af analysemetodens 
nøjagtighed, præcision og følsomhed, kontrolleres det eksperimentelt, at den kemiske analyse giver tilfredsstillende præcision, reproducer ­
barhed og genfinding af teststoffet i både vand og fisk for den valgte 
metode. Det kontrolleres tillige, at teststoffet ikke kan påvises i det anvendte fortyndingsvand.
 
Om nødvendigt korrigeres de under testen funde C  w - og C  f -værdier 
for genfinding og baggrundsværdier i kontrolgrupperne. Fiske- og 
vandprøver håndteres hele tiden på en sådan måde, at kontaminering 
og tab (f.eks. ved adsorption i prøveudtagningsudstyret) er mindst mulige.
 
1.8.4.4. A n a l y s e a f f i s k e p r ø v e r  
Hvis der i testen anvendes radioaktivt mærket materiale, kan man 
analysere for det samlede indhold af radioaktivitet (dvs. det oprinde ­
lige stof og dets metabolitter), eller prøverne kan oprenses, så den 
oprindelige forbindelse kan analyseres særskilt. Også de vigtigste 
metabolitter kan karakteriseres ved ligevægtstilstanden eller ved afslutningen af optagelsesfasen, hvis den nås først. Hvis BCF udtrykt som samlet mængde radioaktivt mærket materiale er ≥ 
1 000 % tilrådes det — for visse stoffers, f.eks. pesticiders, vedkom ­
mende henstilles det kraftigt — at nedbrydningsprodukter, der udgør ≥ 10 % af restindholdet i alt i fiskevævet ved ligevægt, identificeres 
og bestemmes kvantitativt. Hvis nedbrydningsprodukter, der udgør ≥ 
10 % af radioaktivt mærket restindhold i alt i fiskevævet, identifi ­
ceres og bestemmes kvantitativt, anbefales det at gøre det samme for nedbrydningsprodukter i testvandet.
 
Normalt skal koncentrationen af teststoffet bestemmes i hver enkelt 
fisk efter vejning. Er det ikke muligt, kan prøverne fra hver prøveud ­
tagning pooles, men pooling indskrænker mulighederne for statistisk 
behandling af dataene. Hvis en bestemt statistisk metode og styrke er vigtige hensyn, bør testen omfatte tilstrækkeligt mange fisk til, at den ønskede pooling og styrke tilgodeses (6) (7).
 
BCF udtrykkes både som funktion af samlet våd vægt og — for 
stærkt lipofile stoffer — som funktion af fedtindholdet. Fiskenes 
fedtindhold bestemmes om muligt ved hver prøveudtagning. Bestem ­
melsen af fedtindholdet skal bestemmes ved hjælp af egnede metoder (henvisning (8) og (2) i bilag 3). Som standardmetode kan ekstrak ­
tion med chloroform/methanol anbefales (9). Da de forskellige 
metoder ikke giver identiske værdier (10), er det vigtigt at give nærmere oplysninger om, hvilken metode der er benyttet. Når det er muligt, skal lipidanalysen foretages på samme ekstrakt, som er 
benyttet til analyse for teststoffet, eftersom lipiderne ofte må fjernes 
fra ekstraktet, inden det kan analyseres ved gaskromatografi. Forskellen mellem fiskenes fedtindhold (i mg pr. kg våd vægt) ved begyndelsen af eksperimentet og ved slutningen må ikke være større 
end ± 25 %. Også vævets tørstofindhold skal oplyses, så lipidkon ­
centrationen kan omregnes fra våd basis til tørstofbasis.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Teststoffets optagelseskurve fås ved at afsætte koncentrationen i/på 
fiskene (eller bestemt væv) under optagelsesfasen mod tiden (lineære 
akser). Hvis kurven viser et plateau, dvs. at den er omtrent parallel 
med tidsaksen, beregnes ligevægtsværdien BCF  SS ved hjælp af 
udtrykket  
C f ligevægt ðgennemsnitÞ 
C w ligevægt ðgennemsnitÞ 
Hvis der ikke opnås ligevægt, kan der beregnes en BCF  SS -værdi, der 
er tilstrækkelig nøjagtig til risikovurderingsformål, ud fra en »sta ­
tionær tilstand« ved 80 % (1,6/k  2 ) eller 95 % (3,0/k  2 ) af ligevægt.  
Også biokoncentreringsfaktoren BCF  k beregnes som forholdet k  1 /k 2 , 
de to førsteordens hastighedskonstanter. Hastighedskonstanten for 
udskillelse (k  2 ) bestemmes normalt ud fra udskillelseskurven (dvs. 
en afbildning af faldet i teststoffets koncentration i fiskene mod tiden). Dernæst beregnes hastighedskonstanten for optagelse (k
 1 ) på 
grundlag af k  2 og en værdi af C  f , som udledes af optagelseskurven 
(se også bilag 5). Til at finde BCF  k og hastighedskonstanterne k  1 og 
k 2 foretrækkes ikke-lineære parameterestimeringsmetoder på 
computer (11). Ellers kan der benyttes grafiske metoder til beregning af k
 1 og k  2. Hvis udskillelseskurven tydeligvis ikke er af første 
orden, må der tages mere komplekse modeller i brug (se henvisnin ­
gerne i bilag 3) og søges biostatistisk bistand.  
2.2. FORTOLKNING AF RESULTATER  
Hvis der i prøveopløsninger måles koncentrationer nær analyseme ­
todens påvisningsgrænse, skal resultaterne fortolkes med forsigtig ­
hed. 
Skarpe optagelses- og udskillelseskurver er tegn på biokoncentre ­
ringsdata af høj kvalitet. Forskellen mellem optagelses- og udskillel ­
seskonstanterne ved to testkoncentrationer bør være mindre end 20 %, Hvis der iagttages signifikante forskelle i optagelses- og 
udskillelseskonstanter mellem de to anvendte testkoncentrationer, 
skal dette noteres og forsøges forklaret. Normalt ligger konfidens ­
grænserne for BCF-værdier i vel tilrettelagte undersøgelser omkring ± 20 %.
 
3. RAPPORTERING  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
3.1. TESTSTOF  
— dets fysiske tilstandsform og relevante fysiske og kemiske egen ­
skaber  
— data til kemisk identifikation (herunder et eventuelt indhold af 
organisk kulstof)  
— hvis stoffet er radioaktivt mærket, de mærkede atomers nøjagtige 
position og den procentdel af radioaktiviteten, der skyldes uren ­
heder.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. TESTART  
— dens videnskabelige navn, stamme, kilde, eventuel forbehandling, 
akklimatisering, alder, størrelse mv.  
3.3. TESTBETINGELSER  
— testprocedure (f.eks. gennemstrømning eller semistatisk)  
— belysningskildens art og karakteristika og belysningsperiodernes 
varighed  
— testens tilrettelægning (f.eks. testkamrenes antal og størrelse, 
vandudskiftningsrate, antal gentagelser, antal fisk pr. gentagelse, antal testkoncentrationer, optagelses- og udskillelsesfasens 
længde samt udtagningshyppighed for fiske- og vandprøver)
 
— metode til fremstilling af stamopløsninger og fornyelseshyp ­
pighed (hvis der er benyttet et opløsende stof, oplyses dets koncentration og dets bidrag til testvandets indhold af organisk 
kulstof)
 
— de nominelle testkoncentrationer, gennemsnittet af de målte 
værdier og deres standardafvigelser i testkarrene samt hvilken metode der er benyttet til bestemmelsen
 
— kilde til fortyndingsvand, beskrivelse af en eventuel forbehand ­
ling, resultater af forsøg til bekræftelse af, at fisk kan leve i vandet, samt vandets parametre: pH, hårdhed, temperatur, koncentration af opløst oxygen, restchlorindhold (hvis bestemt), 
organisk kulstof i alt, opslæmmet tørstof, testmediets salthol ­
dighed (hvis relevant) samt alle andre foretagne målinger
 
— kvaliteten af vandet i testkarrene, pH, hårdhed, TOC, temperatur 
og koncentration af opløst oxygen  
— detaljerede oplysninger om fodring (f.eks. foderets type, kilde og 
sammensætning (i hvert fald fedtog proteinindhold) samt foder ­
mængde og fodringshyppighed)  
— oplysninger om, hvordan fiske- og vandprøver er behandlet, 
herunder forberedelse, opbevaring, ekstraktion og analysemetoder 
(og præcision) for teststof og fedtindhold (hvis bestemt).  
3.4. RESULTATER  
— resultater af eventuelle indledende undersøgelser  
— dødelighed for kontrolfiskene og fiskene i de enkelte testkamre 
samt eventuelt iagttaget unormal adfærd  
— fiskenes fedtindhold (hvis bestemt i forbindelse med testen)  
— kurver (og alle måledata), der viser optagelse og udskillelse af 
teststoffet i fiskene, samt tiden til ligevægt  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f og C  w (med standardafvigelse og interval, hvis det er relevant) 
for alle udtagne prøver (C  f anføres i μg pr. g våd vægt (ppm), 
enten legemsvægt eller vægt af et bestemt væv, f.eks. fedtvæv, og C
 w μg/ml (ppm)); C  w -værdier for kontrolgruppen (også 
baggrundsværdier oplyses)  
— ligevægtsbiokoncentreringsfaktoren (BCF  SS ) og/eller den kine ­
tiske koncentreringsfaktor (BCF  k ) og i relevante tilfælde 95 % 
konfidensgrænser for hastighedskonstanter for optagelse og 
udskillelse (alle udtrykt i forhold til fiskenes legemsvægt eller 
fiskenes eller de specificerede vævs fedtindhold), konfidens ­
grænser og standardafvigelse (hvis de foreligger samt beregnings- og dataanalysemetoder for hver koncentration af teststof
 
— hvis der er benyttet radioaktivt mærkede stoffer, kan en eventuel 
akkumulering af påviste metabolitter anføres, hvis det er 
påkrævet  
— alle usædvanlige omstændigheder ved testen, eventuelle afvi ­
gelser fra proceduren samt alle andre relevante oplysninger.  
Resultater som »ikke påvist ved påvisningsgrænsen« bør ved 
forudgående metodeudvikling og god tilrettelæggelse af forsøget 
være indskrænket til et minimum, da sådanne resultater ikke kan 
benyttes til beregning af hastighedskonstanter.  
4. HENVISNINGER  
(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
Toxicol. 102, pp 117-156.  
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29-390.
 
(3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals No 3.  
(4) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the 
bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality 
Initiative Technical Support Doc. for the Procedure to Deter ­
mine Bioaccumulation Factors. July 1994.  
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 
20852, July 1975.  
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l) Analysis of Human Adipose 
Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Envi ­
ronmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
 
(8) Compaan H. (1980) in »The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation«, Ch. 
2.3, Part II. Government Publisching Office, The Hague, The 
Netherlands.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, 1099-1105.  
(10) Randall R.C, Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431- 1436.
 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method-Ring Test Programme, 1984- 
1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and 
N. Nyholm.  
(12) ASTME E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
Bilag 1  
Kemiske egenskaber af acceptabelt vand til fortynding  
Stof Koncentrationsgrænse  
1 Partikler 5 mg/l 
2 Organisk kulstof i alt 2 mg/l 3 Ikke-ioniseret ammoniak 1 μg/l 
4 Restchlor 10 μg/l 
5 Organophosphorpesticider i alt 50 ng/l 6 Organochlorpesticider i alt plus polychlorerede 
biphenyler 50 ng/l 
7 Organisk chlor i alt 25 ng/l 
8 Aluminium 1 μg/l 
9 Arsen 1 μg/l 
10 Chrom 1 μg/l 
11 Cobalt 1 μg/l 
12 Kobber 1 μg/l 
13 Jern 1 μg/l 
14 Bly l μg/l 
15 Nikkel 1 μg/l 
16 Zink 1 μg/l 
17 Cadmium 100 ng/l 18 Kviksølv 100 ng/l 19 Sølv 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
Bilag 2  
Anbefalede testfiskearter  
Anbefalet art Anbefalet test ­
temperaturin ­
terval (  o C) Anbefalet stør ­
relse af testfisk 
(længde i cm)  
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) zebrafisk 20-25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) Fathead minnow 20-25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 
Karpe 20-25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
and Schlegel) japansk risfisk 20-25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 
guppy 20-25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) 20-25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum) regnbueørred 13-17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) trepigget hundestejle 18-20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer, A., Orti G. (1993) Proc, Royal Society of London. Series B., Vol. 252, p. 231.  
I forskellige lande benyttes der en række brakvands- og saltvandsarter, f.eks. 
Trommefisk Leiostomus xanthurus 
Sheepshead minnow Cyprinodon variegatus 
Stribefisk Menidia beryllina Shiner perch Cymatogaster aggregata 
English sole Parophrys vetulus 
Staghjorn sculpin Leptocottus armatus Trepigget hundestejle Gasterosteus aculeatus Havaborre Dicentracus labrax 
Løje Alburnus alburnus
 
Samling  
De i ovenstående tabel opregnede ferskvandsfisk er lette at opdrætte og/eller fremskaffe hele året, 
mens saltvands- og brakvandsarterne til dels kun findes i bestemte lande. De kan opdrættes enten i 
fiskefarme eller i laboratoriet under kontrollerede forhold med hensyn til sygdomme og parasitter, så testdyrene er sunde og af kendt afstamning. Disse fisk kan fås over det meste af verden.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
Bilag 3  
Forudsigelse af længden af optagelsesfasen og udskillelsesfasen  
1. Forudsigelse af optagelsesfasens længde  
Før testen udføres, kan man ud fra en empirisk sammenhæng mellem k  2 og 
n-octanol/vand fordelingskoefficienten (P  ow ) eller k  2 og opløseligheden i 
vand (s) foretage et skøn over k  2 og dermed en procentdel af den tid, 
der vil være påkrævet til at nå ligevægt.  
Eksempelvis kan k  2 (dag  -1 ) skønnes ved hjælp af følgende empiriske 
udtryk (1): 
log 10 k 2 = – 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) [ligning 1]  
Andre udtryk, se henvisning (2).  
Hvis fordelingskoefficienten ikke er kendt, kan denne skønnes (3) ud fra 
stoffets opløselighed i vand (s) ifølge udtrykket: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) [ligning 2]  
hvor 
s = opløseligheden (mol/l) : (n = 36)  
Disse sammenhænge gælder kun for stoffer med log P  ow -værdier mellem 2 
og 6,5 (4).  
Den tid, der går til en bestemt procent af ligevægt, kan beregnes ud fra det 
generelle udtryk, der beskriver optagelses- og udskillelseskinetikken (før ­
steordenskinetik) ved at anvende k  2 -skønnet:  
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
eller hvis C  w er konstant:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ [ligning 3]  
Når der er næsten ligevægt (t → ∞), kan ligning 3 reduceres til (5) (6):  
C f ¼ k 1 
k 2: C w eller C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
Da er k  1 /k 2 . C w en tilnærmelse til koncentrationen i fiskene ved »lige ­
vægt« (C  f,s ). 
Ligning 3 kan omskrives til:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ eller  C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t [ligning 4]  
Ved at anvende ligning 4 kan man forudsige, hvor lang tid der går indtil en 
vis procent af ligevægt er nået, når k  2 allerede er skønnet ved hjælp af 
ligning 1 eller 2.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Som rettesnor kan anføres, at den statistisk optimale længde af optagelses ­
fasen, når der ønskes statistisk acceptable data (BCF  k ), er den tid, der går, 
indtil kurven over logaritmen til koncentrationen af teststoffet i fiskene mod tiden har nået sit midtpunkt, dvs. ved 1,6/k
 2 svarende til 80 % ligevægt, 
men ikke over 3,0/k  2 svarende til 95 % ligevægt (7).  
Den tid, der går indtil 80 % ligevægt, er (ligning 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 eller t  80 ¼ 1; 6 
k 2 [ligning 5]  
Tilsvarende for 95 % ligevægt:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 [ligning 6]  
For eksempel vil optagelsesfasens længde (up) for et teststof med P  ow = 4 
være (ligning 1, 5 og 6): 
log 10 k 2 = – 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 dag  -1 
up (80 %) = 1,6/0,652, i.e. 2,45 dag (59 timer)  
eller up (95 %) = 3,0/0,652, i.e. 4,60 dag (110 timer)  
Tilsvarende vil optagelsesfasens for et teststof med s = 10  -5 mol/l (log(s) = 
– 5,0) være (ligning 1, 2, 5 og 6)  
log 10 (P ow ) = 0,862 (– 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 k 2 = 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 dag  -1 
up (80 %) = 1,6/0,246, i.e. 6,5 dage (156 timer)  
eller up (95 %) = 3,0/0,246, i.e. 12,2 dage (293 timer)  
Alternativt kan undtrykket:  
t eq = 6,54 × 10  -3 P ow + 55,31 (timer)  
benyttes til beregning af, hvor lang tid der går til faktisk ligevægt (4).  
2. Forudsigelse af udskillelsesfasens længde  
Ud fra det generelle udtryk, der beskriver optagelses- og udskillelseskine ­
tikken (førsteordenskinetik), kan man ligeledes forudsige, hvor lang tid der 
kræves for, at legemsbelastningen falder til en vis procentdel af begyndel ­
seskoncentrationen (1) (8).  
I udskillelsesfasen antages C  w at være nul. Udtrykket kan da reduceres til:  
dC f 
dt ¼ Äk 2 C f eller C  f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
hvor C  f,o er koncentrationen ved udskillelsesperiodens begyndelse. 50 % 
udskillelse vil da være nået til tidspunktet (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 eller t  50 ¼ 0; 693 
k 2 
Tilsvarende vil 95 % udskillelse være nået ved:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Hvis der i den første periode benyttes 80 % optagelse (1,6/k  2 ), og der i 
udskillelsesfasen benyttes 95 % tab (3,0/k  2 ), bliver udskillelsesfasen 
omtrent dobbelt så lang som optagelsesfasen.  
Det er vigtigt at bemærke, at skønnene er baseret på antagelsen om første ­
ordenskinetik for optagelse og udskillelse. Er denne forudsætning tydeligvis 
ikke opfyldt, må der tages mere komplekse modeller i brug (f.eks. henvis ­
ning 1).  
Henvisning ( til bilag 3 ) 
(1) Spacie, A. and Hamelink, J.L. (1982) Alternative models for descri ­
bing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp 309-320.
 
(2) Kristensen, P, (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
 
(3) Chiou, C.T. and Schmedding, D.W. (1982) Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), 
pp. 4-10.  
(4) Hawker, D.W. and Connell, D.W. (1988) Influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp 701-707.
 
(5) Branson, D.R., Blau, G.E., Alexander, H.C. and Neely, W.B. (1975) 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp 785-792.  
(6) Ernst, W. (1985) Accumulation in aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Sheehman, P., Korte, F., Klein, W. and Bourdeau P.H. (red) Part 4.4, pp 243- 255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.
 
(7) Reilly, P.M., Bajramovic, R, Blau, G.E., Branson, D.R. and Sauerhof, 
f M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp 614-622.
 
(8) Könemann, H. and Van Leeuwen, K, (1980) Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. 
Chemosphere, 9, pp 3-19.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
Bilag 4  
Teoretisk eksempel på prøveudtagningsplan for biokoncentreringstest af stoffer med log P  ow = 4 
Fiskeprøve Tidspunkt for prøveudtagningen 
Antal vandprøver Antal fisk pr. prøve Mindste hyppighed 
(dage) Supplerende prøve  
Optagelsesfasen – 1 
0 2 (*) 
2 Tilførsel af 45-80 fisk 
1. 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2. 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3. 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4. 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5. 4,7 2 6 
Udskillelsesfasen Fiskene overføres til 
vand uden teststof 
6. 5,0 5,3 4 
(4) 
7. 5,9 7,0 4 
(4) 
8. 9,3 11,2 4 
(4) 
9. 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Der udtages vandprøve efter aftapning af mindst tre kammerrumfang vand. 
Tallene i parentes angiver, hvor mange prøver (vand, fisk) der skal udtages, hvis der foretages supplerende prøveudtagning.  
Anmærking : Forud for testen er k  2 for en log P  ow på 4,0 skønnet til 0,652 dag  -1 . Forsøgets samlede varighed sættes til 3 × up = 3 × 4,6 
dage, dvs. 14 dage. For skøn af »up« henvises der til bilag 3.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
Bilag 5  
Modelvalg  
De fleste biokoncentreringsdata antages at kunne beskrives »rimelig« godt ved en 
simpel model med to dele (»compartments«) og to parametre, hvilket fremgår af den bedste retlinede kurve gennem punkterne for koncentrationen i fisk under 
udskilielsesfasen, når de afsættes på semilogaritmisk papir. (Hvis punkterne ikke 
kan beskrives ved en ret linje, må der benyttes mere komplekse modeller, se f.eks. Spacie og Hamelinck, henvisning (1) til bilag 3).
 
Grafisk metode til bestemmelse af hastighedskonstanten for udskillelse, k  2 
Koncentrationen af teststoffet i hver fiskeprøve afbildes mod tiden på semiloga ­
ritmisk papir. Linjen har hældningen k  2 . 
k 2 ¼ lnðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Det skal bemærkes, at afvigelser fra en ret linje kan tyde på, at udskillelsens 
kinetik er mere kompleks end første orden. Der kan benyttes en grafisk metode 
til løsning af udskillelse, der ikke har af førsteordens kinetik.  
Grafisk metode til bestemmelse af hastighedskonstanten for optagelse, k  1 
På grundlag af k  2 beregnes k  1 efter udtrykket  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (ligning 1)  
Værdien af C  f aflæses ved midtpunktet af den glatte optagelseskurve fra afbild ­
ningen af logaritmen til koncentrationen mod tiden (lineært).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Computermetode til bestemmelse af hastighedskonstanterne for optagelse og 
udskillelse  
Til bestemmelse af biokoncentreringsfaktoren og hastighedskonstanterne k  1 og k  2 
foretrækkes det, at der benyttes ikke-lineære estimeringsmetoder på computer. 
Sådanne programmer finder værdier for k  1 og k  2 ud fra et sæt sekventielle data 
for koncentration og tid og følgende model:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ 0 < t < t  c (ligning 2)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü ðe Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Þ t > t  c (ligning 3)  
hvor t  c er tidspunktet for afslutningen af optagelsesfasen.  
Denne metode giver skøn over standardafvigelser for k  1 og k  2 . 
Eftersom k  2 i de fleste tilfælde kan skønnes ud fra udskillelseskurven med 
forholdsvis stor præcision, og der er en stærk korrelation mellem de to parametre 
k 1 og k  2 , hvis skønnet samtidigt, er det undertiden bedst først at beregne k  2 , ud 
fra udskillelsesdataene alene og derefter at beregne k  l ud fra optagelsesdataene 
ved hjælp af ikke-lineær regression.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  VÆKSTTEST PÅ FISKEYNGEL  
1. METODE  
Denne væksttoksicitetstestmetode svarer til OECD TG 215 (2000).  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med denne test er at vurdere virkningerne på væksten hos 
fiskeyngel, som gennem længere tid eksponeres for kemikalier. 
Testen er baseret på en metode, som er udviklet og ringtestet 
(1)(3) inden for den Europæiske Union med henblik på at vurdere virkningerne af kemikalier på væksten hos yngel af regnbueørred 
(Oncorhynchus mykiss) under gennemstrømningsbetingelser. Andre 
veldokumenterede aner kan anvendes. For eksempel har man erfaring fra væksttest med zebrafisk (Danio rerio) (
 1 ) (3)(4) og riskarpe 
(medaka, Oryzias latipes) (5)(6)(7).  
Der henvises også til den generelle indledning til del C.  
1.2. DEFINITIONER  
Laveste koncentration med observeret effekt (LOEC)  er den 
laveste koncentration af et testkemikalie, som i testen har vist sig 
at have en signifikant virkning (p < 0,05) i sammenligning med en kontrolgruppe. Dog skal alle testkoncentrationer over LOEC have en skadevirkning, som er lig med eller større end de virkninger, der er 
observeret ved LOEC.
 
Koncentration uden observeret effekt (NOEC)  er testkoncentra ­
tionen umiddelbart under LOEC.  
EC X er ved denne testmetode den koncentration af testkemikaliet, 
som forårsager en variation i fiskenes tilvækst på x % i sammen ­
ligning med kontrolgrupperne.  
Belastningsgraden  er fiskenes vådvægt pr. vandvolumen.  
Bestandtætheden  er antallet af fisk pr. vandvolumen.  
Enkeltfisk-specifik tilvækst  er et udtryk for en enkelt fisks tilvækst 
på grundlag af fiskens startvægt.  
Beholdergennemsnits-specifik tilvækst  er et udtryk for den 
gennemsnitlige tilvækst for en beholderpopulation ved én koncen ­
tration.  
Pseudo-specifik tilvækst  er et udtryk for den enkelte fisks tilvækst i 
sammenligning med beholderpopulationens gennemsnitlige startvægt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
 1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Fiskeyngel i den eskponentielle vækstfase vejes og anbringes 
derefter i testbeholdere og eksponeres for en række subletale koncen ­
trationer af testkemikaliet opløst i vand, fortrinsvis ved gennem ­
strømning eller, hvis dette ikke er muligt, under passende semis ­
tatiske betingelser (statisk-udskiftning). Testens varighed er 28 dage. Fiskene fodres dagligt. Foderrationen baseres på fiskenes start ­
vægt og kan genberegnes efter 14 dage. Ved testens afslutning vejes 
fiskene igen. Virkningerne på tilvæksten analyseres ved anvendelse 
af en regressionsmodel for at beregne den koncentration, som ville forårsage en variation i tilvæksten på x %, dvs. EC
 X (f.eks. EC  10 , 
EC 20 eller EC  30 ). Alternativt kan dataene sammenlignes med 
kontrolværdierne for at bestemme den laveste koncentration med observeret effekt (LOEC) og derudfra koncentrationen uden obser ­
veret effekt (NOEC).
 
1.4. INFORMATION OM TESTKEMIKALIET  
Der bør foreligge resultater fra en akut-toksidtetstest (se testmetode 
C.1), fortrinsvis udført på den art, som er valgt til denne test. Dette 
indebærer, at testkemikaliets vandopløselighed og damptryk er kendt, 
og at der foreligger en pålidelig analysemetode til kvantitativ bestem ­
melse af kemikaliet i testopløsningerne med kendt og rapporteret nøjagtighed, samt en detektionsgrænse.
 
Nyttige oplysninger omfatter strukturformlen, kemikaliets renhed, 
vand- og lysstabilitet, pK  a , P ow samt resultater fra en test for umid ­
delbar biologisk nedbrydelighed (se testmetode C.4).  
1.5. TESTENS VALIDITET  
Testens validitet forudsætter følgende:  
— mortaliteten i kontrolgruppen(-erne) må ikke overstige 10 % ved 
testens afslutning  
— den gennemsnitlige vægt af fiskene i kontrolgruppen(-erne) skal 
være øget tilstrækkeligt til, at detektion af den minimale variation i tilvæksten kan betragtes som signifikant. En ringtest (2) har vist, at for regnbueørreders vedkommende skal gennemsnits ­
vægten for fiskene i kontrolgrupperne i løbet af 28 dage være 
øget med mindst det halve (dvs. 50 %) af deres gennemsnitlige startvægt; f.eks. startvægt: 1 g/fisk (= 100 %), slutvægt efter 28 dage: ≥ 1,5 g/fisk ( ≥ 150 %)
 
— koncentrationen af opløst ilt skal gennem hele testperioden have 
været mindst 60 % af værdien for luftmætning (ASV)  
— vandtemperaturen må ikke på noget tidspunkt i løbet af testen 
variere med mere end 1  o C mellem testbeholdeme og skal holdes 
inden for 2  o C omkring de temperaturintervaller, der er specifi ­
ceret for de arter, der anvendes i testen (tillæg 1).  
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Apparatur  
Normalt laboratorieudstyr og i særdeleshed følgende:  
— ilt- og pH-måleudstyr  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— udstyr til bestemmelse af vandets hårdhed og alkalinitet  
— egnet apparatur til temperaturkontrol og fortrinsvis kontinuerlig 
overvågning  
— beholdere fremstillet af et kemisk inaktivt materiale og med 
passende kapacitet i forhold til den anbefalede belastningsgrad og bestandtæthed (se 1.8.5 og tillæg 1)
 
— vægt med tilstrækkelig nøjagtighed (dvs. nøjagtighed på 
± 0,5 %).  
1.6.2.  Vand  
Som testvand kan anvendes vand af enhver beskaffenhed, hvori den 
art, der anvendes i testen, udviser passende langtidsoverlevelse og 
vækst. Vandets kvalitet skal være ensartet i hele testperioden. 
Vandets pH skal ligge inden for området fra 6,5 til 8,5, men bør i løbet af en given test ligge inden for et område på ± 0,5 pH-enheder. En hårdhedsgrad på over 140 mg/l (som CaCO
 3 ) anbefales. For at 
sikre, at fortyndingsvandet ikke får urimelig indflydelse på testresul ­
tatet (f.eks. ved dannelse af et kompleks med testkemikaliet), skal der regelmæssigt udtages prøver til analyse. Målinger af tungmetaller (f.eks. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd og Ni), de vigtigste anioner og kationer 
(f.eks. Ca, Mg, Na, K, Cl og SO
 4 , pesticider (f.eks. samlet mængde 
phosphor- og chlorholdige organiske pesticider), samlet mængde organisk kulstof og opslæmmet tørstof skal foretages, f.eks. hver tredje måned, såfremt man ved, at fortyndingsvandet har en relativt 
konstant kvalitet. Hvis vandkvaliteten påviseligt har været konstant 
gennem mindst ét år, kan analyserne foretages mindre hyppigt og med længere intervaller (f.eks. hver sjette måned). I tillæg 2 er anført 
nogle kemiske karakteristika for acceptabelt fortyndingsvand.
 
1.6.3.  Testopløsninger  
Testopløsninger med de valgte koncentrationer fremstilles ved 
fortynding af en stamopløsning.  
Stamopløsningen bør fortrinsvis fremstilles ved mekanisk opblanding 
eller omrystning af testkemikaliet i fortyndingsvandet (f.eks. ved omrøring eller ultralydbehandling). Mætningssøjler (opløseligheds ­
søjler) kan anvendes for at opnå en passende koncentration i stamop ­
løsningen.
 
Anvendelse af opløsningsmidler eller dispergeringsmidler (opløselig ­
hedsfremmere) kan i nogle tilfælde være nødvendig for at fremstille en stamopløsning med en passende koncentration. Eksempler på egnede opløsningsmidler er acetone, ethanol, methanol, dimethylsul ­
foxid, dimethylformamid og triethylenglycol. Eksempler på egnede 
dispergeringsmidler er Cremophor RH40, Tween 80, methylcellulose 0,01 % og HCO-40. Man skal udvise forsigtighed ved anvendelse af stoffer, der er umiddelbart biologisk nedbrydelige (f.eks. acetone) 
og/eller meget flygtige, idet de ved gennemstrømnmgstest kan give 
anledning til problemer med bakteriebelægninger. Når der anvendes en opløselighedsfremmer, må dette ikke have nogen signifikant virk ­
ning på fiskenes vækst eller synlig negativ virkning på fiskeyngelen, 
hvilket kan afsløres ved en kontroltest, hvor kun opløsningsmidlet 
anvendes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Til gennemstrømningstest kræves et system, som kontinuerligt 
doserer og fortynder en stamopløsning af testkemikaliet (f.eks. udmå ­
lingspumpe, proportionalfortynder, mætningssystem), så der afgives en række forskellige koncentrationer til testbeholderne. Stamopløs ­
ningernes og fortyndingsvandets strømningshastigheder skal i løbet 
af testen kontrolleres regelmæssigt, fortrinsvis dagligt, og må ikke 
variere mere end 10 % gennem hele testforløbet. En ringtest (2) har vist, at en vandudskiftningshyppighed på 6 l pr. g fisk pr. døgn i løbet af testen er passende for regnbueørreds vedkommende (se 
1.8.2.2).
 
Til semistatiske (udskiftnings-) test vil medieudskiftningshyppig ­
heden være afhængig af testkemikaliets stabilitet; men det anbefales 
at udskifte vandet hver dag. Hvis det på baggrund af præliminære stabilitetstest (se 1.4) har vist sig, at testkemikaliets koncentration 
ikke er stabil (dvs. ligger uden for området på 80-120 % af den 
nominelle værdi, eller under 80 % af den målte startkoncentration) i udskiftningstidsrummet, bør man overveje at anvende en gennem ­
strømningstest.
 
1.6.4.  Valg af fiskeart  
Regnbueørred (Oncorhynchus mykiss) er den anbefalede art til denne 
test, idet man har mest erfaring fra ringtest med denne art (1)(2). 
Andre veldokumenterede arter kan dog anvendes; men testpro ­
ceduren må eventuelt tilpasses, så man opnår de bedst egnede test ­
betingelser. For eksempel har man også erfaring med zebrafisk (Danio rerio) (3)(4) og riskarpe (medaka, Oryzias latipes) (5)(6)(7). 
En begrundelse for valget af art og testmetode skal i så fald anføres.
 
1.6.5.  Opbevaring af fiskene  
Testfiskene skal udvælges fra en population af en enkelt bestand, 
fortrinsvis fra samme gydning, som i mindst to uger forud for testen 
holdes under vandkvalitets- og lysbetingelser, som svarer til de i testen anvendte. Fiskene skal fodres med en minimumsration på 2 % af kropsvægten pr. dag, og fortrinsvis 4 % af kropsvægten pr. 
dag, gennem hele opbevaringsperioden og under testen.
 
Efter en akklimatiseringsperiode på 48 timer registreres mortaliteten, 
og følgende kriterier bringes i anvendelse:  
— mortalitet på mere end 10 % af populationen på syv dage: Hele 
fiskegruppen kasseres  
— mortalitet på mellem 5 % og 10 % af populationen: akklimati ­
sering i yderligere syv dage, og hvis mortaliteten er over 5 % i 
løbet af de følgende syv dage, kasseres hele fiskegruppen  
— mortalitet på mindre end 5 % af populationen på syv dage: 
Fiskegruppen godkendes.  
I de to uger forud for testen eller under testen bør fiskene ikke 
behandles for sygdomme.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. TESTDESIGN  
»Testdesignet« vedrører valget af testkoncentrationernes antal og 
intervaller, antal beholdere med hvert koncentrationsniveau samt antal fisk pr. beholder. Optimalt bør testedesignet vælges under 
hensyntagen til:
 
— undersøgelsens formål  
— den anvendte statistiske analysemetode  
— forsøgsressourcernes tilgængelighed og pris.  
Beskrivelsen af formålet bør, om muligt, angive den statistiske 
opløsningsgrad, ved hvilken en given forskels-størrelse (f.eks. i tilvækst) skal detekteres, eller alternativt den nøjagtighed, hvormed 
EC
 x (f.eks. hvor x = 10, 20 eller 30, og fortrinsvis ikke mindre end 
10) skal beregnes. Dette er en forudsætning for, at undersøgelsens omfang kan fastlægges med sikkerhed.
 
Det er vigtigt at forstå, at et design, som er optimalt (giver den 
bedste udnyttelse af ressourcerne) til brug i forbindelse med én 
statistisk analysemetode, ikke nødvendigvis er optimalt ved en 
anden metode. Det design, der anbefales til vurdering af LOEC/ ­
NOEC, vil derfor ikke være det samme som det, der anbefales til brug ved regressionsanalyse.
 
I de fleste tilfælde foretrækkes regressionsanalyse frem for varians ­
analyse, af årsager, som Stephan og Rogers (8) har gjort rede for. 
Hvor der imidlertid ikke foreligger nogen egnet regressionsmodel, 
bør (r  2 < 0,9) NOEC/LOEC anvendes.  
1.7.1.  Design for regressionsanalyse  
Følgende punkter er vigtige at tage i betragtning, når en test skal 
designes til regressionsanalyse:  
— Testen må nødvendigvis omfatte et interval af koncentrationer, 
der ligger omkring den virksomme koncentration (f.eks. EC
 10,20,30  ) og det koncentrationsområde, hvor man er interesseret 
i testkemikaliets virkning. Beregningen af de virksomme koncen ­
trationer vil være mest nøjagtig, når den virksomme koncentra ­
tion befinder sig midt i testkoncentrationsområdet. En præli ­
minær test til bestemmelse af dette område kan være nyttig, når det skal afgøres, hvilke testkoncentrationer der er passende.
 
— For at man skal kunne opstille en fyldestgørende statistisk model, 
skal testen omfatte mindst én kontrolbeholder og fem yderligere 
beholdere med forskellige koncentrationer. Når der anvendes en 
opløselighedsfremmer, og hvor det er aktuelt, bør der i tillæg til testrækken udføres en test på én kontrolbeholder indeholdende opløselighedsfremmeren i den højeste testkoncentration (se 1.8.3 
og 1.8.4).
 
— En passende geometrisk eller logaritmisk progression (9) (se 
tillæg 3) kan anvendes. Logaritmiske progressioner mellem test ­
koncentrationerne er at foretrække.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— Hvis man har mere end seks beholdere til rådighed, bør de ekstra 
beholdere enten anvendes til replikation eller fordeles inden for 
koncentrationsområdet, så der bliver mulighed for mindre inter ­
valler mellem niveauerne. Disse to muligheder er lige ønskelige.  
1.7.2.  Design for vurdering af NOEC/LOEC ved anvendelse af varians ­
analyse (ANOVA)  
Fortrinsvis bør der være replikatbeholdere for hver enkelt koncen ­
tration, og statistiske analyser bør foretages på beholderniveau (10). 
Hvis man ikke har replikatbeholdere, kan man ikke tage højde for 
variabiliteten mellem beholdere, ud over hvad der må tilskrives enkeltfisk. Man har imidlertid erfaret (11), at variabiliteten mellem beholdere har været meget lille i sammenligning med variabiliteten 
inden for beholderen (dvs. mellem enkeltfisk) i det undersøgte 
tilfælde. Det er derfor et relativt acceptabelt alternativ at udføre statistisk analyse på enkeltfiskniveau.
 
Normalt anvendes mindst fem testkoncentrationer i en geometrisk 
progression med en faktor, som ikke overstiger 3.2.  
Når testene udføres med replikatbeholdere, bør antallet af replikat ­
kontrolbeholdere, og dermed antallet af fisk, almindeligvis være det 
dobbelte for hver af testkoncentrationerne, som bør omfatte samme 
antal (12)(13)(14). Hvis man derimod ikke har replikatbeholdere, bør der være lige så mange fisk i kontrolgruppen som i hver af rest ­
koncentrationerne.
 
Hvis ANOVA skal baseres på beholdere i stedet for enkeltfisk 
(hvilket vil indebære enten, at hver enkelt fisk skal mærkes, eller 
anvendelse af »pseudo«-specifik tilvækst (se 2.1.2)), vil det være nødvendigt med tilstrækkeligt mange replikatbeholdere til, at stan ­
dardafvigelsen for »beholdere inden for koncentrationerne« kan 
bestemmes. Dette betyder, at fejlfrihedsgraden i variansanalysen 
bør være mindst fem (10). Hvis kun kontrolgrupperne replikeres, vil der være en risiko for skævhed i fejlvariabiliteten, idet denne kan stige, når middelværdien for den pågældende tilvækst stiger. 
Eftersom det er sandsynligt, at tilvæksten vil falde, når koncentra ­
tionen øges, vil dette give en tilbøjelighed til overvurdering af varia ­
biliteten.
 
1.8. FREMGANGSMÅDE  
1.8.1.  Udvælgelse og vejning af testfisk  
Det er vigtig: a: minimere variationen i fiskenes vægt ved testens 
begyndelse. Egnede størrelser for de forskellige fiskearter, der anbe ­
fales til brug i denne test. er angivet i tillæg 1. For hele gruppen af 
fisk, der bruges i testen, gælder det, at området for individuel vægt ved testens begyndelse ideelt bør holdes inden for ± 10 % af gennemsnitsvægten og må under ingen omstændigheder overstige 
25 %. Det anbefales at veje en delprøve af fisk inden testen for at 
beregne gennemsnitsvægten.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Stampopulationen bør ikke fodres i 24 timer forud for testens begyn ­
delse. Derpå bør fiskene vælges tilfældigt. Ved anvendelse af et 
totalbedøvende middel (f.eks. en vandig opløsning af 100 mg/l tricainmethansulfonat (MS 222) neutraliseret ved tilsætning af to dele natriumbicarbonat pr. del MS 222) bør fiskene vejes enkeltvis 
som vådvægt (duppes tørre) med den nøjagtighed, som er anført i 
tillæg 1. De fisk, hvis vægt ligger inden for det ønskede område, tages fra og fordeles derpå tilfældigt mellem testbeholderne. Den samlede vådvægt af fisk i hver testbeholder registreres. Både anven ­
delsen af bedøvelsesmidlet og håndteringen af fiskene (herunder 
aftørring og vejning) kan give anledning til stress og beskadigelser af fiskeyngelen, i særdeleshed hvor det drejer sig om de arter, der er små af størrelse. Derfor skal håndteringen af fiskeyngelen foretages 
med den yderste forsigtighed for at undgå at stresse og beskadige 
testfiskene.
 
Fiskene vejes igen på testens 28. dag (se 1.8.6). Hvis det imidlertid 
skønnes nødvendigt at genberegne foderrationen, kan fiskene vejes 
igen på testens 14. dag (se 1.8.2.3). Andre metoder, som f.eks. en fotografisk metode, vil kunne anvendes for at bestemme ændringer i 
fiskenes størrelse, og foderrationerne vil så kunne justeres ud fra 
dette.
 
1.8.2.  Eksponeringsbetingelser  
1.8.2.1.  Varighed  
Testens varighed er ≥ 28 dage.  
1.8.2.2.  Belastningsgrad og bestandtæthed  
Det er vigtigt, at belastningsgraden og bestandtætheden er passende 
for den fiskeart, der bruges i testen (se tillæg 1). Hvis bestandtæt ­
heden er for stor, vil der opstå stress på grund af trængsel, hvilket vil 
føre til reduceret tilvækst og øget risiko for sygdomme. Hvis bestandtætheden er for lav, kan det medføre territorialadfærd, hvilket også vil kunne indvirke på væksten. Under alle omstændig ­
heder skal belastningsgraden være så lav, at der kan opretholdes en 
koncentration af opløst ilt på mindst 60 % ASV uden beluftning. For regnbueørreders vedkommende har man ved en ringtest (2) påvist, at en belastningsgrad på 16 ørreder a 3-5 g i et volumen på 40 liter er 
acceptabel. Den anbefalede hyppighed for udskiftning af vandet 
under testen er 6 l pr. g fisk pr. dag.
 
1.8.2.3.  Fodring  
Fiskene skal fodres med et passende foder (tillæg 1) og tilstrækkeligt 
ofte til at frembringe en acceptabel tilvækst. Man må udvise omhu 
for at undgå mikrobiel vækst og urenheder i vandet. For regnbue ­
ørreders vedkommende vil en fodertilførsel på 4 % af kropsvægten pr. dag som regel opfylde disse betingelser (2)(15)(16)(17). Den 
daglige foderration kan deles i to lige store portioner, som gives 
fiskene ved to daglige fodringer med mindst fem timers mellemrum. Rationen baseres på fiskenes samlede startvægt i hver enkelt testbe ­
holder. Hvis fiskene vejes igen på testens 14. dag, genberegnes 
rationen ud fra denne vægt. Fiskene bør ikke fodres i 24 timer 
inden vejningen.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Foderrester og fækalmateriale skal hver dag fjernes fra testbehol ­
derne ved omhyggelig rengøring af bunden i hver enkelt beholder 
ved hjælp af opsugning.  
1.8.2.4.  Lys og temperatur  
Lysperioderne og vandtemperaturen skal passe til den art, der bruges 
i testen (tillæg 1).  
1.8.3.  Testkoncentrationer  
Normalt kræves, uanset testens design, fem koncentrationer af test ­
kemikaliet (se 1.7.2). Forudgående kendskab til testkemikaliets toksi ­
citet (f.eks. fra akut-testning og eller fra »range finding tests«) vil 
være nyttigt ved udvælgelsen af passende testkoncentrationer. 
Begrundelse skal anføres, hvis der anvendes færre end fem koncen ­
trationer. Den højeste testkoncentration må ikke overstige kemika ­
liets opløselighedsgrænse i vand.  
Når der anvendes en opløselighedfremmer som hjælpemiddel ved 
fremstillingen af stamopløsninger, må dens slutkoncentration ikke 
være højere end 0,1 ml/l og bør fortrinsvis være den samme i alle testbeholdere (se 1.6.3). Anvendelse af sådanne stoffer skal imid ­
lertid så vidt muligt undgås.
 
1.8.4.  Kontrolprøver  
Antallet af fortyndingsvand-kontrolprøver afhænger af testens design 
(se 1.7-1.7.2). Hvis der anvendes en opløselighedsfremmer, skal der 
desuden foretages det samme antal opløselighedsfremmer-kontrol ­
prøver som fortyndingsvand-kontrolprøver.  
1.8.5.  Hyppighed af analyser og målinger  
Under testen måles koncentrationerne af testkemikaliet med regel ­
mæssige mellemrum (se nedenfor).  
Ved gennemstrørnningstest skal strømningshastighederne for fortyn ­
dingsmidlet og giftstofstamopløsningen kontrolleres regelmæssigt, 
fortrinsvis dagligt, og de må ikke udvise en variation på mere end 
10 % gennem hele testperioden. Hvis testkemikaliets koncentrationer forventes at ligge inden for ± 20 % af de nominelle værdier (dvs. inden for området fra 80 til 120 % — se 1.6.2 og 1.6.3), anbefales 
det som et minimum, at den højeste og den laveste testkoncentration 
analyseres ved testens begyndelse og hver uge derefter. Ved test, hvor testkemikaliets koncentration ikke forventes at holde sig inden for ± 20 % af de nominelle værdier (baseret på oplysninger 
om testkemikaliets stabilitet), vil det være nødvendigt at analysere 
samtlige testkoncentrationer, men efter samme retningslinjer.
 
Ved semistatiske (udskiftnings-) test, hvor testkemikaliets koncen ­
tration forventes at holde sig inden for ± 20 % af de nominelle værdier, anbefales det som et minimum, at den højeste og den 
laveste testkoncentration analyseres, når de lige er fremstillet og 
umiddelbart inden udskiftning, ved undersøgelsens begyndelse og hver uge derefter. Ved test, hvor testkemikaliets koncentration ikke forventes at holde sig inden for ± 20 % af de nominelle værdier, skal 
samtlige testkoncentrationer analyseres efter samme retningslinjer 
som for mere stabile kemikalier.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Det anbefales, at resultaterne baseres på målte koncentrationer. Hvis 
det imidlertid kan påvises, at testkemikaliets koncentration i tilstræk ­
kelig grad har holdt sig inden for ± 20 % af de nominelle værdier eller den målte startkoncentration gennem hele testen, kan resulta ­
terne baseres på de nominelle eller de målte værdier.
 
Det kan være nødvendigt at centrifugere eller filtrere prøverne (f.eks. 
med et filter med en porestørrelse på 0,45 μm). Det anbefales at 
centrifugere prøverne; men hvis testmaterialet ikke adsorberer på 
filteret, kan også filtrering accepteres.  
Under testen skal opløst ilt, pH og temperatur måles i samtlige 
testbeholdere. Samlet hårdhedsgrad, alkalinitet og saltindhold (hvis dette er aktuelt) skal måles i kontrolbeholderne og i én beholder med 
den højeste koncentration. Som et minimum skal opløst ilt og salt ­
indhold (hvis aktuelt) måles tre gange (ved testens begyndelse, midte og afslutning). Ved semistatiske test anbefales, at opløst ilt måles hyppigere, fortrinsvis før og efter hver vandudskiftning og mindst én 
gang om ugen. pH skal måles ved begyndelsen og afslutningen af 
hver vandudskiftning ved statiske udskiftningstest og mindst én gang ugentligt ved gennemstrømningstest. Hårdhedsgrad og alkalinitet skal måles én gang i hver test. Temperaturen skal fortrinsvis overvåges 
kontinuerligt i mindst én testbeholder.
 
1.8.6.  Observationer  
Vægt: Ved testens afslutning skal samtlige overlevende fisk vejes 
som vådvægt (duppes tørre), enten gruppevis pr. testbeholder eller 
enkeltvis. Vejning af fisk pr. testbeholder foretrækkes frem for indi ­
viduel vejning, som kræver, at hver enkelt fisk skal mærkes. Hvis fiskene skal vejes enkeltvis med henblik på bestemmelse af enkelt ­
fisk-specifik tilvækst, skal man vælge en mærkningsmåde, som 
undgår at stresse fiskene (der er egnede alternativer til frysemærk ­
ning, f.eks. anvendelse af tynd farvet fiskesnøre).
 
Fiskene skal i løbet af testperioden undersøges dagligt for eventuelle 
ydre abnormiteter (såsom blødninger eller misfarvning), og unormal 
adfærd registreres. Eventuelle mortaliteter skal registreres, og døde 
fisk skal fjernes hurtigst muligt. Døde fisk erstattes ikke. idet belast ­
ningsgraden og bestandtætheden er tilstrækkelige til. at indvirkninger på væksten som følge af ændringer i fiskeantallet pr. beholder 
undgås. Fodermængden skal imidlertid justeres.
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATERNE  
Det anbefales, at en statistiker inddrages i både design og analyse af 
testen, eftersom denne testmetode tillader betydelige variationer i forsøgets design, som f.eks. antal testbeholdere, antal testkoncentra ­
tioner, antal fisk osv. I betragtning af valgmulighederne med hensyn 
til testens design vil der ikke blive givet nogen vejledning i 
statistiske procedurer her.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Tilvæksten bør ikke beregnes for testbeholdere, hvor mortaliteten 
overstiger 10 %. Mortalitetsprocenten skal imidlertid anføres for 
samtlige testkoncentrationers vedkommende.  
Uanset hvilken metode, der anvendes til dataanalysen, er det centrale 
koncept den specifikke tilvækst r mellem tidspunktet t  1 og tids­
punktet t  2 . Denne kan defineres på flere måder afhængigt af, hvor ­
vidt fiskene er mærket individuelt, eller hvorvidt der ønskes et behol ­
dergennemsnit.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
hvor:  
r 1 = enkeltfisk-specifik tilvækst  
r 2 = beholdergennemsnitsspecifik tilvækst  
r 3 = »pseudo«-specifik tilvækst  
w 1 , w 2 = en bestemt fisks vægt på henholdsvis tidspunkt t  1 og t  2 
log e w 1 = logaritmen til en enkelt fisks vægt ved testperiodens 
begyndelse  
log e w 2 = logaritmen til en enkelt fisks vægt ved testperiodens 
afslutning  
log e W 1 = gennemsnit af logaritmerne til værdierne w  1 for fiskene 
i beholderen ved testperiodens begyndelse  
log e W 2 = gennemsnit af logaritmerne til værdierne w  2 for fiskene 
i beholderen ved testperiodens afslutning  
t 1 , t 2 = tidspunktet (dag) for testperiodens begyndelse og 
afslutning  
r 1 , r 2 , r 3 kan udregnes for tidsrummet mellem 0 og 28 dage og, hvor 
det er aktuelt (dvs. når der er foretaget måling på dag 14), for tids ­
rummene mellem 0 og 14 samt mellem 14 og 28 dage.  
2.1.1.  Resultatanalyse ved regression (koncentrationsrespons-model)  
Denne analysemetode fører frem til en passende matematisk 
sammenhæng mellem den specifikke tilvækst og koncentrationen 
og gør det således mulig: at beregne »EC  x «, dvs. en hvilken som 
helst ønsket EC-værdi. Ved anvendelse af denne metode er udreg ­
ningen af r for enkeltfisk (r  1 ) ikke nødvendig, og analysen kan i 
stedet baseres på r-beholdergennemsnitsværdien (r  2 ). Sidstnævnte 
metode foretrækkes. Den er også mest hensigtsmæssig, hvor den mindste fiskeart bruges.
 
Den beholdergennemsnitsspecifikke tilvækst (r  2 ) bør plottes grafisk 
som funktion af koncentrationen, for at forholdet mellem koncen ­
tration og respons kan undersøges.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Når forholdet mellem r  2 og koncentration skal vises, bør man vælge 
en passende model, og valget skal begrundes på hensigtsmæssig vis.  
Hvis der ikke er lige mange overlevende fisk i de enkelte beholdere, 
bør modeltilpasningsmetoden vægtes, hvad enten denne er simpel eller nonlineær, for at tage højde for grupper af uens størrelse.
 
Modeltilpasningsmetoden skal give mulighed for, at en beregning af 
f.eks. EC  20 og dennes fordeling (enten standardfejl eller konfidens ­
interval) kan udledes. Grafen for den tilpassede model bør vises i 
forhold til dataene, så modeltilpasningens tilstrækkelighed tydeligt fremgår (8)(18)(19)(20).
 
2.1.2.  Analyse af resultaterne for beregningen af LOEC  
Hvis testen har omfattet replikation af samtlige beholdere ved samt ­
lige koncentrationsniveauer, vil beregningen af LOEC kunne baseres 
på en variansanalyse (ANOVA) af den beholdergennemsnitsspeci ­
fikke tilvækst (se 2.1), efterfulgt af en egnet metode (f.eks. Dunnetts eller Williams' test (12)(13)(14){21)) til sammenligning af det gennemsnitlige r for hver enkelt koncentration med det gennemsnit ­
lige r for kontrolgrupperne, for at identificere den laveste koncen ­
tration, ved hvilken denne forskel er signifikant på et sandsynlig ­
hedsniveau på 0,05. Hvis de nødvendige forudsætninger for parame ­
triske metoder ikke er opfyldt — ikke-normal fordeling (f.eks. 
Shapiro-Wilks test) eller heterogen varians (Bartletts test) — bør man overveje at transformere dataene for at homogenisere varian ­
serne, inden ANOVA foretages, eller at foretage en vægtet ANOVA.
 
Hvis testen ikke har omfattet replikation af beholdere ved hver enkelt 
koncentration, vil en ANOVA, der baseres på beholdere, være ikke- 
udslagsgivende eller umulig. I denne situation vil det være et accep ­
tabelt kompromis at basere ANOVA på den »pseudo«-specifikke tilvækst r
 3 for enkeltfisk.  
Det gennemsnitlige r  3 for hver enkelt testkoncentration kan så 
sammenlignes med det gennemsnitlige r  3 for kontrolgrupperne. 
Derpå kan LOEC identificeres som tidligere beskrevet. Man må forstå, at denne metode hverken tager hensyn til eller yder beskyt ­
telse mod variabilitet mellem beholdere, ud over hvad der kan 
tilskrives variabiliteten mellem enkeltfisk. Erfaringerne har imidlertid vist (8), at variabilitet mellem beholdere har været meget lille sammenlignet med variabiliteten inden for de enkelte beholdere 
(dvs. mellem fisk). Hvis analysen ikke omfatter enkeltfisk, skal det 
med begrundelse anføres, hvilken metode der er benyttet til identi ­
fikation af ekstreme værdier.
 
2.2. TOLKNING AF RESULTATERNE  
Resultaterne skal tolkes med forsigtighed, hvor den målte koncen ­
tration af giftstof i testopløsningeme ligger nær analysemetodens 
detektionsgrænse, eller ved semistatiske test, hvor testkemikaliets 
koncentration i den nyligt fremstillede opløsning falder inden udskiftningen.
 
2.3. TESTRAPPORTEN  
Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Testkemikaliet:  
— fysisk beskaffenhed og relevante fysisk-kemiske egenskaber  
— kemiske identifikationsdata, herunder renhedsgrad og eventuelt 
analysemetode til kvantitativ bestemmelse af testkemikaliet.  
2.3.2.  Fiskeart(er), der indgår i testen:  
— videnskabeligt navn, og eventuelt  
— stamme, størrelse, leverandør, evt. forudgående behandling osv.  
2.3.3.  Testbetingelser:  
— anvendt testprocedure (f.eks. semistatisk/udskiftning. gennem ­
strømning, belastning, bestandtæthed osv.)  
— testdesign (f.eks. antal testbeholdere, testkoncentrationer og repli ­
kater, antal fisk pr. beholder)  
— metode til fremstilling af stamopløsmnger samt udskiftningshyp ­
pighed (eventuelt anvendt opløselighedsfremmer og dennes koncentration skal anføres)
 
— de nominelle testkoncentrationer, de målte værdiers gennemsnit 
og standardafvigelser i testbeholderne, metoden, hvorved de er 
opnået, samt dokumentation for, at målingerne refererer til test ­
kemikaliets faktiske koncentration i opløsning  
— fortyndingsvandets karakteristika: pH, hårdhedsgrad, alkalinitet, 
temperatur, koncentration af opløst ilt, restindhold af chlor (hvis målt), samlet mængde organisk kulstof, opslæmmet tørstof, 
testmediets saltindhold (hvis målt) og samtlige andre udførte 
målinger
 
— vandkvaliteten i testbeholderne: pH, hårdhedsgrad, temperatur og 
koncentration af opløst ilt  
— detaljerede oplysninger om fodring (f.eks. fodertype(r), -kilde, 
-mængde og fodringshyppighed).  
2.3.4.  Resultater:  
— dokumentation for, at kontrolgrupperne opfylder validitetskritenet 
for overlevelse, samt data vedrørende mortaliteten ved de enkelte testkoncentrationer
 
— anvendte statistiske analyseteknikker, statistikker baseret på repli ­
kater eller fisk, behandling af data og begrundelse for de 
anvendte teknikker  
— data i tabelform vedrørende fiskenes individuelle og gennemsnit ­
lige vægt på dag 0, 14 (hvis aktuelt) og 28, værdier for beholder ­
gennemsnits- eller pseudospecifik tilvækst (alt efter hvad der er aktuelt) i tidsrum met fra dag 0 til 28 eller eventuelt 0-14 og 14-28
 
— resultater af den statistiske analyse (dvs. regressionsanalyse eller 
ANOVA), fortrinsvis i tabelform og grafisk form, og LOEC (p = 
0,05) og NOEC eller EC  x , eventuelt med standardfejl, alt efter 
hvad der er aktuelt  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— forekomst af eventuelle usædvanlige reaktioner hos fiskene samt 
eventuelle synlige virkninger frembragt af testkemikaliet.  
3. HENVISNINGER  
(1) Solbe, J.F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. 
WRc Report No. PRD 1388-M/2.  
(2) Ashley, S., Mallett, M.J. and Grandy, N.J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on 
the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
(3) Crossland, N.O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp 1855-1870.  
(4) Nagel, R., Bresh, H., Caspers, N., Hansen, P.D., Market, M., 
Munk, R., Scholz, N. and Höfte, B.B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish  (Bra­
chydanio rerio):  results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, pp 157-164.
 
(5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biolo ­
gical field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
 
(6) Holcombe, G.W., Benoit, D.A., Hammermeister, D.E., 
Leonard, E.N. and Johnson, R.D. (1995). Acute and long- term effects of nine chemicals on the Japanese medaka  (Ory­
zias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp 287-297.
 
(7) Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka  (Oryzias latipes).  Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minesota.
 
(8) Stephan, C.E. and Rogers, J.W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Sympo ­
sium, ASTM STP 891, R.C. Bahner and D.J. Hansen, Eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp 328-338.
 
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 p.
 
(10) Cox, D.R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.  
(11) Pack, S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate offish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of 
Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10- 
12 December 1991.
 
(12) Dunnett, C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp 1096-1121.
 
(13) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp 482-491.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Williams, D.A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp 103-117.  
(15) Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville, N.T. (1994). A tech ­
nique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  Oncorhyn ­
chus mykiss:  effect of feeding level. Aquaculture 120, 123-133.
 
(16) Quinton, J. C. and Blake, R.W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss.  Journal of Fish 
Biology, 37, 33-41.
 
(17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 P.
 
(18) Bruce, R.D. and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. 
Chem. 11, 1485-1494.  
(19) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, 
J.H., Dean, Marcus, M.D. and McIntyre, D.O. (1989). Preci ­
sion of EPA seven-day fathead minnow larval survival and 
growth test; intra and interlaboratory study. report EA-6189 
(American Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power Research Institute, Palo alto, CA.
 
(20) Norbert-King, T.J. (1988). An interpolation estimate for 
chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protec ­
tion Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. 
Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.
 
(21) Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, pp 510-531.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
Tillæg 1  
FISKEARTER ANBEFALET TIL TESTNING, OG EGNEDE TESTBETINGELSER  
Arter Anbefalet område 
for testtemperatur 
( o C) Lysperiode 
(timer) Anbefalet område 
for fiskenes 
startvægt 
(g) Påkrævet 
målingsnøjagtighed Belastningsgrad 
(g/l) Bestandtæthed 
(pr. liter) Foder Testens varighed 
(dage)  
Anbefalet art:  
Oncorhynchuss mykiss  
Regnbueørred 12,5 - 16,0 12-16 1-5 Til nærmeste 
100 mg 1,2 - 2,0 4 Mærkevaretørfoder til laksefi ­
skeyngel ≥ 28 
Andre veldokumenterede 
arter:  
Danio rerio  
Zebrafisk 21-25 12-16 0,050 - 0,100 Til nærmeste 
1 mg 0,2 - 1,0 5-10 Levende foder ( Brachionus 
Artemia ) ≥ 28 
Oryzias latipes  
Riskarpe (Medaka) 21-25 12-16 0,050 - 0,100 Til nærmeste 
1 mg 0,2 - 1,0 5-20 Levende foder ( Brachionus 
Artemia ) ≥ 28
Tillæg 2  
NOGLE KEMISKE KARAKTERISTIKA FOR ACCEPTABELT 
FORTYNDINGSVAND  
Stof Koncentrationer  
Partikler < 20 mg/l 
Total organisk kulstof < 2 mg/l 
Ammoniak < 1 μg/l 
Restchlor < 10 μg/l 
Total phosphorholdige organiske pesticider < 50 ng/l Total chlorholdige organiske pesticider plus polychlore ­
rede biphenyler < 50 ng/1 
Total organisk chlor < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
Tillæg 3  
Logaritmiske rækker af koncentrationer, der er egnede til toksicitetstest (9)  
Søjle (antal koncentrationer mellem 100 og 10, eller mellem 10 og 1) (  1 ) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 
1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 
1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 
1,0
 
( 1 ) En række bestående af fem (eller flere) successive koncentrationer kan vælges fra en kolonne. Midterpunkterne mellem koncen ­
trationerne i kolonne (x) findes i kolonne (2x + 1), De anførte værdier kan repræsentere koncentrationer udtrykt i procent pr. 
volumen eller vægt (mg/l eller μg/l). Værdierne kan multipliceres eller divideres med en hvilken som helst potens af 10, alt efter 
hvad der er aktuelt. Kolonne 1 kan eventuelt anvendes, hvis der har været betydelig tvivl om toksicitetsniveauet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  FISK, KORTTIDSTOKSICITETSTEST UDFØRT PÅ 
FISKEEMBRYONER OG BLOMMESÆKYNGEL  
1. METODE  
Denne korttids toksicitetstestmetode svarer til OECD TG 212 (1998).  
1.1. INDLEDNING  
Denne korttidstoksicitetstest udført på fiskeembryoner og blomme ­
sækyngel er en korttidstest, i hvilken det nybefrugtede æg er udsat for giftstof indtil slutningen af blommesækstadiet. Der skal ikke fodres i denne test, og testen skal således afsluttes, medens 
yngelen stadig får sin næring fra blommesækken.
 
Testens formål er at finde letale og til en vis grad subletale virk ­
ninger af kemikalier på specielle stadier og arter. Denne test kunne 
skaffe nyttig viden, idet den kunne a) danne en bro mellem letale og 
subletale test, b) blive anvendt som en screeningtest enten for en test på alle tidlige livsstadier eller for en test for kronisk toksicitet og c) bruges til at teste arter, hvor dyrkningsteknikkerne ikke er tilstræk ­
keligt gode til at dække overgangsperioden mellem endogen og 
eksogen fodring.
 
Man bør erindre sig, at kun test, der omfatter alle stadier i fisks 
livscyklus, kan påregnes at give en præcis vurdering af kemikaliers 
kroniske toksicitet over for fisk, og at enhver begrænsning i påvirk ­
ning inden for livsstadierne kan reducere følsomheden og således undervurdere den kroniske toksicitet. Man må derfor forvente, at testen på fiske-embryoner og blommesækyngel har mindre 
følsomhed end en test, der omfatter alle tidlige livsstadier, specielt 
med hensyn til meget lipofile kemikalier (log P
 ow > 4) og til kemi ­
kalier med en særlig type toksisk virkning. Imidlertid må man forvente mindre forskelle i følsomhed mellem de to test med 
hensyn til kemikalier, der har en ikke-specifik, narkotisk virknings ­
måde (1).
 
Forud for offentliggørelsen af denne test udført på fiskeembryoner 
og blommesækyngel havde man størst erfaring med anvendelsen af 
ferskvandsfisken Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cypri ­
nidae — almindeligt navn: zebrafisk). Mere detaljerede retningslinjer for resultater med denne art er derfor anført i tillæg 1. Dette 
udelukker ikke brugen af andre arter, for hvilke der ligeledes fore ­
ligger erfaringer (tabel 1A og 1B).
 
1.2. DEFINITIONER  
Laveste koncentration med statistisk sikkert observeret effekt 
(LOEC)  er den laveste kemikaliekoncentration, der i testen har 
vist sig at resultere i en statistisk signifikant virkning (p < 0,05), 
sammenlignet med kontrollen. Alle testkoncentrationer over LOEC skal forårsage skadelige virkninger på samme eller højere niveau end observeret ved LOEC.
 
Koncentration uden statistisk sikkert observeret effekt (NOEC)  
er testkoncentrationen lige under LOEC.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. TESTPRINCIPPET  
Fiskeembryoner og blommesækyngel udsættes for en række koncen ­
trationer af testkemikaliet opløst i vand. Protokollen tillader valg mellem en semistatisk og en gennemstrømningsprocedure. Valget 
afhænger af testkemikaliets natur. Testen begynder med, at man 
anbringer befrugtede æg i forsøgsbeholderne, og den slutter, lige før blommesækken er blevet fuldstændig resorberet af en hvilken som helst af fiskelarverne i en hvilken som helst forsøgsbeholder, 
eller før dødsfald indtræffer i kontrolbeholderne på grund af sult. 
Letale og subletale virkninger måles og sammenlignes med kontrol ­
værdierne for at fastslå den laveste koncentration med statistisk 
observeret effekt og ud derfra den koncentration, der ikke giver 
nogen statistisk sikker virkning. Alternativt kan man analysere resul ­
taterne ved hjælp af en regressionsmodel for at finde frem til den koncentration, der ville give en bestemt procentisk effekt (dvs. 
LC/EC
 x , hvor x er en defineret procentisk virkning).  
1.4. KENDSKAB TIL TESTKEMIKALIET  
Resultater fra en akut toksicitetstest (se metode C.1), fortrinsvis 
udført på arten valgt til denne test. bør foreligge. De kan være nyttige med henblik på valg af passende område af testkoncentra ­
tioner i testen udført på tidlige livsstadier. Vandopløselighed, (inklu ­
sive opløseligheden i testvandet) og testkemikaliets damptryk bør 
kendes. En pålidelig analyse til kvantificering af kemikaliet i testop ­
løsningerne med kendt og publiceret »accuracy« og nederste måle ­
grænse bør foreligge.
 
Informationer om testkemikaliet, nyttige for testbetingelserne, inklu ­
derer strukturformel, renhedsgrad, lysstabilitet, stabilitet under testens betingelser, pKa, P
 ow og resultater fra en test for spontan biologisk 
nedbrydelighed (se metode C.4).  
1.5. TESTENS VALIDITET  
En tests validitet forudsætter:  
— den generelle overlevelse af befrugtede æg i kontrollerne, og, 
hvor relevant, i kar med rent opløsningsmiddel skal være større end eller lig med grænserne definerede i tillæg 2 og 3
 
— koncentrationen af opløst ilt skal være mellem 60 og 100 % af 
værdien for mætning med luft (ASV) i hele testperioden  
— vandtemperaturen må ikke variere mere end ± 1,5  o C imellem 
forsøgsbeholderne eller fra dag til dag på noget tidspunkt i testen, 
og den skal ligge i det temperaturområde, som gælder for den 
anvendte art. (tillæg 2 og 3).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Forsøgsbeholdeme  
Enhver type glas eller andet inaktivt materiale kan anvendes. 
Forsøgsbeholdernes dimensioner skal være store nok til at klare 
kravene til belastningsraten (se 1.7.1.2) Det anbefales at anbringe 
forsøgsbeholdeme randomiseret. Et randomiseret design med grupper af forsøgsbeholdere, hvor samme behandling forefindes i hver gruppe, bør foretrækkes frem for et helt randomiseret system, 
når der er systematiske virkninger i laboratoriet, som kan kontrol ­
leres ved gruppering. I den påfølgende dataanalyse bør der tages hensyn til en eventuel gruppering. Forsøgsbeholderne bør skånes 
for unødvendige forstyrrelser.
 
1.6.2.  Valg af fiskeart  
Anbefalede fiskearter ses i tabel 1A. Dette udelukker ikke anven ­
delsen af andre arter (eksempler ses i tabel 1B), men testproceduren må muligvis ændres for at opnå passende testbetingelser. Brug af andre arter og undersøgelsesmetode skal i så fald begrundes.
 
1.6.3.  Opbevaring af fisk til yngel  
Detaljer vedrørende pasning af fisk til yngel under tilfredsstillende 
omstændigheder kan findes i OECD TG 210 (  1 ) og i henvisning 
(2)(3)(4)(5)(6).  
1.6.4.  Håndtering af embryoner og fiskelarver  
Embryoner og fiskelarver kan, mens de udsættes for testkemikaliet, 
opholde sig i mindre kar med netvægge eller i rør med net for 
enderne med disse mindre kar placerede i forsøgskarret, således at testopløsningen kan flyde igennem. Man kan bevirke et ikke-turbu ­
lent flow gennem de mindre kar ved at lade dem hænge ned fra en 
arm, som bevæger karrene op og ned, dog altid med organismerne 
under overfladen; man kan også anvende et system med gennem ­
skylning ved hjælp af overtryk. Befrugtede lakseæg kan anbringes på stativer eller net med masker tilstrækkeligt store til at lade larverne 
falde igennem efter udklækning. Pasteurpipetter er anvendelige til at 
flytte embryoner og larver i de semistatiske test i forbindelse med den daglige totale udskiftning af testopløsningen (se 1.6.6).
 
I de tilfælde, hvor man har anvendt beholdere, riste eller netværk til 
at holde æg inde i forøgskarret, skal disse fjernes, når æggene klækkes (
 2 ), idet man dog beholder det netværk, som hindrer 
fiskene i at forsvinde. Hvis det er nødvendigt at flytte fiskelarver, 
må de ikke udsættes for luft, og net bør ikke bruges til at fjerne fisk 
fra beholdere (fra en sådan advarsel kan nok undtages mindre sarte arter, som f.eks. karpen). Tidspunktet for en sådan overførsel varierer med arten og behøves ikke i alle tilfælde. Ved brug af den semis ­
tatiske teknik kan man anvende bægerglas eller lave beholdere, even ­
tuelt, hvis nødvendigt, forsynet med et netværk løftet en smule op over bægerglassets bund. Hvis beholderne er store nok til at opfylde kravene til belastningsraten (se 1.7.1.2) kan overflytning af 
embryoner eller larver eventuelt undgås.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD. Paris, 1992, Test Guideline 210, »Fish, Early-life Stage Toxicity Test«. 
( 2 ) Ifølge resultaterne af sådanne ringtest og en teknisk berigtigelse af ISO 6341 ligger EC  50 
— 24 h for kaliumdichromat (K  2 Cr 2 O 7 ) mellem 0,6 mg/l og 1,7 mg/l.
 1.6.5.  Vand  
Til brug i testen kan anvendes vand, der er i overensstemmelse med 
de kemiske karakteristika for acceptabelt fortyndingsvand, som beskrevet i tillæg 4 og i hvilket fiskearten i kontrolbeholderne har 
en overlevelse mindst lige så god som beskrevet i tillæg 2 og 
3. Kvaliteten må ikke ændre sig i løbet af testperioden. pH skal holde sig inden for ± 0,5 pH-enheder. For at sikre, at vand til fortynding ikke får urimelig indflydelse på testresultaterne (f.eks. 
ved at danne kompleks med testkemikaliet) eller ved at indvirke 
uheldigt på de præstationer, man forventer af fisk til yngel, bør man regelmæssigt udtage prøver til analyse. Målinger af tungmetaller 
(f.eks. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd og Ni), væsentlige kationer og anioner 
(f.eks. Ca, Mg, Na, K, Cl og So
 4 ), pesticider (f.eks. totale organofos ­
for- og totale organochlorinopesticider), totalt organisk kulstof og opslæmmede faste stoffer bør f.eks. foretages hver tredje måned, 
hvis man ved, at fortyndingsvandet har en relativt konstant kvalitet. 
Hvis vandkvaliteten påviseligt har været konstant over mindst et år, kan analyserne foretages mindre hyppigt og med større intervaller (f.eks. hver sjette måned).
 
1.6.6.  Testopløsning  
Testopløsninger med den valgte koncentration fremstilles ved fortyn ­
ding af en stamopløsning.  
Stamopløsningen bør fortrinsvis fremstilles ved opblanding eller 
oprystning af testkemikaliet i opløsningsvandet ad mekanisk vej 
(f.eks. omrøring og ultralydbehandling). Saturation colums (solubility 
columns) kan anvendes til fremstilling af en passende koncentreret stamopløsning. Videst muligt bør brugen af opløsningsmidler eller dispergeringsmidler undgås; imidlertid kan den type stoffer være 
nødvendige til fremstilling af en passende koncentreret stamopløs ­
ning. Som eksempler på anvendelige opløsningsmidler kan nævnes acetone, ethanol, methanol, dimethylformamid og triethyleneglycol. Som eksempel på en anvendelige dispergenser kan nævnes Crem ­
ophor RH40, Tween 80, methylcellulose 0,01 % og HCO-40. Stor 
omhu bør udvises, når man anvender stoffer, der er let biologisk nedbrydelige (f.eks. acetone) og/eller let fordampelige, da de kan 
medføre problemer med bakterielle belægninger i gennemstrøm ­
ningstestene, Når et opløsningsmiddel anvendes, må det ikke have nogen signifikant virkning på overlevelsen eller synlig uheldig virk ­
ning på de tidlige livsstadier, som det kan kontrolleres i en test med 
kun opløsningsmiddel. Alle anstrengelser bør imidlertid gøres for at 
undgå brugen af sådanne stoffer.
 
I den semistatiske teknik kan man følge to forskellige procedurer ved 
udskiftning af testopløsningen; enten i) fremstilles nye testopløsninger i rene forsøgsbeholdere og overlevende æg og larver flyttes forsigtigt inde i små volumina af den gamle opløsning til det nye forsøgsbehol ­
dere, idet man undgår at udsætte dem for luft, eller ii) testorganismerne 
bibeholdes i forsøgsbeholderne, medens mindst tre fjerdedele af test ­
vandet udskiftes. Hvor hyppigt det skal gøres, afhænger af testkemi ­
kaliets stabilitet, men en daglig udskiftning anbefales. Hvis tidligere 
stabilitetsforsøg (se 1.4) har vist, at testkemikaliets koncentration ikke 
er stabil (dvs. falder uden for 80-120 % af de nominelle grænser eller under 80 % af den målte begyndelseskoncentration) i løbet af udskift ­
ningsperioden, bør man overveje at anvende en test med gennemstrøm ­
ning. Under alle omstændigheder skal man være omhyggelig med ikke 
at stresse larverne, når vandet fornyes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Til gennemstrømningstestene bruges et system, som kontinuerligt 
afmåler og fortynder en stamopløsning med test-kemikaliet (f.eks. 
peristaltpumper,  proportional diluter, saturator system ) for at yde 
en række forskellige koncentrationer til forsøgsbeholderne. Med mellemrum, fortrinsvis dagligt, kontrolleres flow-hastigheden fra 
stamopløsningen og vandfortyndingen, og de bør ikke variere mere 
end 10 % i testforløbet. En flow-hastighed svarende til volumenet af mindst fem målekamre pr. døgn er fundet passende (2).
 
1.7. FREMGANGSMÅDE  
Nyttig viden om, hvad testen med fiskeembryoner og blommesæ ­
kyngel kan præstere, kan findes i litteraturen, og eksempler herpå 
kan findes i henvisning (7)(8)(9).  
1.7.1.  Omstændigheder ved belastningen  
1.7.1.1.  Varighed  
Helst skal testen begynde mindre end 30 minutter efter befrugtnin ­
gen. Embryonerne sænkes ned i testopløsningen før eller så snart 
som muligt efter at blastocysten har delt sig. og i hvert fald for 
begyndelsen af gastrula-stadiet. Med æg, der leveres udefra, kar. man ikke altid begynde testen umiddelbart efter befrugtningen. Da testens følsomhed kan blive alvorligt påvirket af en forsinket test ­
start, bør testen påbegyndes senest otte timer efter befrugtningen. Da 
fiskelarverne ikke fodres i testperioden, afsluttes testen, lige før blommesækken er resorberet fuldstændigt i en hvilken som helst larve i en hvilken som helst forsøgsbeholder, og før sultedøden 
indtræffer i kontrollerne. Varigheden afhænger af den anvendte art. 
Nogle anbefalede tider ses i tillæg 2 og 3.
 
1.7.1.2.  Belastning  
Antallet af befrugtede æg ved testens begyndelse skal kunne opfylde 
de statistiske krav. Æggene skal fordeles tilfældigt mellem de 
forskellige behandlinger og mindst 30 befrugtede æg, ligeligt fordelt, 
til mindst tre replikate testbeholdere pr. koncentration af testkemika ­
lium (så vidt gørligt, det kan være vanskeligt med nogle arter at opnå lige store mængder). Belastningsraten (biomasse per volumen af 
testopløsningen) bør være så lav, så den opløste iltkoncentration på 
mindst 60 % ASV kan vedligeholdes uden beluftning. Til gennem ­
strømningstest anbefales en belastningsrate på ikke over 0,5 g/l per døgn og ikke over 5 g/l opløsning på noget tidspunkt (2).
 
1.7.1.3.  Lys og temperatur  
Perioderne med lys og testvandets temperatur skal passe til den 
valgte art (tillæg 2 og 3). For at holde temperaturen konstant kan 
det være nødvendigt med endnu et forsøgskar.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Testkoncentrationer  
Normalt kræves fem koncentrationer af testkemikaliet med en 
afstandsfaktor, som ikke overstiger 3,2. Kurven fra de akutte toksici ­
tetstest, som knytter LC  50 til testperioden, bør tages i betragtning, når 
man vælger området for testkoncentrationerne. Brug af færre end 
fem koncentrationer, for eksempel i en grænsetest, og et snævrere interval mellem koncentrationerne kan være rimeligt under nogle omstændigheder. Begrundelse skal anføres, hvis færre end fem 
koncentrationer anvendes. Det er ikke nødvendigt at teste koncen ­
trationer højere end svarende til 96 timer LC
 50 eller 100 mg/l, afhæn ­
gigt af hvilken af disse, der er lavest. Kemikalier bør ikke testes i 
koncentrationer, der overstiger deres opløselighed i testvandet.  
Når der anvendes et opløsningsmiddel som hjælp ved fremstillingen 
af testopløsninger (se 1.6,6), bør dets endelige koncentration i forsøgsbeholderen ikke overstige 0,1 ml/l og den skal være den 
samme i alle forsøgsbeholdere.
 
1.7.3.  Kontroller  
Sammen med testserien skal udføres en kontrol af fortyndingsvandet 
(replikate bestemmelser, hvis nødvendigt) og ligeledes, hvis relevant, en kontrol, som indeholder opløsningsmiddel (replikate bestemmel ­
ser, hvis nødvendigt).
 
1.7.4.  Hyppighed af analyser og målinger  
I testperioden måles koncentrationen af testkemikaliet med regel ­
mæssige mellemrum.  
I semistatiske test, hvor koncentrationen af testkemikaliet forventes at 
holdes inden for 20 % af det nominelle (dvs. inden for 80-120 %; se 1.4 og 1.6.6), anbefales det, som et minimum, at den højeste og laveste testkoncentration måles, når den er frisk fremstillet og umiddelbart før 
udskiftning ved mindst tre lejligheder jævnt fordelt over test-perioden 
(dvs. analyserne skal udføres på en prøve fra den samme opløsning, når den er frisk fremstillet og ved dens anvendelse ved udskiftning).
 
I test, hvor koncentrationen af testkemikaliet ikke forventes at holde sig 
inden for 20 % af den nominelle (baseret på kemikaliets stabilitetsdata), er det nødvendig; at analysere alle testkoncentrationer, når de er frisk fremstillede og ved udskiftning, efter samme system (dvs. ved mindst tre 
lejligheder jævnt fordelt over testperioden). Målingen af koncentrationen 
af testkemikaliet før udskiftning er kun nødvendigt på en af beholderne i replikate bestemmelser for hver testkoncentration. Målingerne skal fore ­
tages mindst hver uge. Det anbefales, at resultaterne baseres på målte 
koncentrationer. Hvis det imidlertid kan vises, at testkemikaliets koncen ­
tration testen igennem i tilstrækkelig grad har været holdt inden for ± 20 % af den nominelle eller målte begyndelseskoncentration, kan resul ­
taterne baseres på nominelle eller målte begyndelsesværdier.
 
Hvad angår gennemstrømningstest er det passende med et prøvetag ­
ningsregime som for de semistatiske test (men måling af udskiftede opløsninger er ikke mulig i disse tilfælde). Hvis imidlertid testen varer mere end en uge. er det tilrådeligt at øge antallet af prøve ­
tagninger i den første uge (f.eks. til tre) for at sikre, at test-koncen ­
trationcme holder sig stabile.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Det kan være nødvendigt at centrifugere eller filtrere (f.eks. med et 
filter med 0,45 μm porestørrelse). Da imidlertid hverken centrifuge ­
ring eller filtrering altid synes at skille den biotilgængelige fra den ikke-biotilgængelige del af testkemikaliet, behøver prøver ikke at gennemgå disse behandlinger.
 
1 løbet af testen skal opløst ilt, pH og temperatur måles i alle 
testbeholderne. Hårdhedsgrad og saltindhold (hvis relevant) bør 
måles i kontrollerne og i en beholder med den højeste koncentration. 
Som et minimum skal opløst ilt og saltindhold (hvis relevant) måles tre gange (i begyndelsen, midt i og ved afslutningen af testen). I de semistatiske test anbefales det at måle ilt hyppigere, fortrinsvis før og 
efter hver vandudskiftning og mindst en gang om ugen. pH skal 
måles før og efter vandudskiftning i de semistatiske test og mindst en gang ugentlig i gennemstrømningstestene. I hver test skal hård ­
hedsgraden måles en gang. Temperaturen skal måles daglig og helst 
være monitoreret kontinuerligt i mindst en test-beholder.
 
1.7.5.  Observationer  
1.7.5.1.  Fosterets udviklingstrin  
Fosterstadiet (dvs. gastrula-stadiet) bør fastslås så sikkert som muligt 
ved testens begyndelse, hvor fosteret udsættes for testkemikaliet. Dette kan gøres ved undersøgelse af en repræsentativ samling æg, som på passende vis præpareres og godkendes. I litteraturen kan man 
finde beskrivelser og illustrationer af fosterstadier (2)(5)(10)(11).
 
1.7.5.2.  Udklækning og overlevelse  
Udklækning og overlevelse observeres mindst en gang om dagen og 
noteres. I begyndelsen af testen kan det være ønskeligt at foretage 
hyppigere observationer (f.eks. hver halve time i løbet af de første tre timer), da overlevelsestid i nogle tilfælde kan være mere relevant end antallet af dødsfald alene (f.eks. når der er akutte toksiske virknin ­
ger). Døde embryoner og larver skal fjernes med det samme, 
eftersom de kan henfalde hurtigt. Meget stor omhu skal udvises, når døde individer fjernes, så nærtliggende æg eller larver ikke bliver ramt eller fysisk beskadigede, da de er meget sarte og 
følsomme. Kriterier for død varierer efter stadium:
 
— for æg : særligt i de tidlige stadier et tydeligt tab af gennem ­
sigtighed og ændring i farve forårsaget af koagulation og/eller bundfældelse af proteiner, hvilket medfører en hvid uklarhed
 
— for embryoner:  manglende bevægelighed og/eller hjerteslag 
og/eller uklar misfarvning i arter, hvor embryonerne alminde ­
ligvis er gennemskinnelige  
— for larver:  manglende bevægelighed og/eller manglende respira ­
tionsbevægelser og/eller manglende hjerteslag og/eller hvid uklar 
farvning af centralnervesystemet og/eller manglende reaktion på 
mekaniske stimuli.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Abnormt udseende  
Antallet af larver, der udviser abnorm kropsform og/eller pigmente ­
ring, og tidspunkt for resorption af blommesækken skal noteres med passende mellemrum afhængigt af testens varighed og den beskrevne 
abnormitet. Det skal bemærkes, at abnorme embryoner og larver 
optræder almindeligt og kan opgøres til adskillige procent i kontrol ­
lerne hos visse arter. Abnorme dyr skal kun fjernes fra beholderne, når de er døde.
 
1.7.5.4.  Abnorm opførsel  
Abnorm opførsel, f.eks. hyperventilation, ukoordineret svømning og 
atypisk ubevægelighed, skal noteres med passende intervaller afhæn ­
gigt af testens varighed. Disse virkninger kan, når de opdages, selvom de er vanskelige at kvantitere, hjælpe med til at tolke morta ­
litetsdata, dvs. skaffe viden om, hvorledes kemikaliets toksiske virk ­
ning udspiller sig.
 
1.7.5.5.  Længde  
Ved testens afslutning anbefales måling af individernes forskellige 
længde: Standard, fork eller totallængden kan anvendes. Hvis imid ­
lertid der forekommer finneråd (svamp) ved halefinnen eller erosion 
af finner, anvendes standardlængden. Almindeligvis vil i en 
vellykket testvariationskoefficient for længden i replikate bestem ­
melser ligge på ≤ 20 %.  
1.7.5.6.  Vægt  
Ved testens afslutning kan foretages vejning af dyrene: Tørvægt (24 
timer ved 60  o C) bør foretrækkes frem for vådvægt (aftørret). Almin ­
deligvis vil i en vellykket test variationskoefficienten på vægten i 
replikate bestemmelser ligge på ≤ 20 %.  
Disse observationer vil medføre, at nogle eller alle nedenstående data 
kan gøres til genstand for statistisk analyse:  
— kumulativ mortalitet  
— antal sunde larver ved afslutning af testen  
— begyndelses- og sluttidspunkt for klækning (dvs. 90 % klækning 
i hvert replikat)  
— det daglige antal larver, der klækkes  
— længde (og vægt) af overlevende dyr ved testens afslutning  
— antal larver, der er deforme eller har abnormt udseende  
— antal larver, der opfører sig abnormt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Det anbefales, at en statistiker involveres både i design og i analyse 
af testen, eftersom metoden tillader betragtelige variationer i tilrette ­
læggelse af eksperimentet, som f.eks. antallet af forsøgsbeholdere, 
antal testkoncentrationer, begyndelsesantal af befrugtede æg og de målte parametre. I betragtning af valgmulighederne i testdesign, vil her ikke blive vejledt i statistiske procedurer.
 
Hvis LOEC/NOECs skal beregnes, er det, for at beregne variationen 
inden for hvert sæt af replikater, nødvendigt at bruge variansanalyse (ANOVA) eller at anvende kontingenstabeller. Dunnets metode kan 
være nyttig til at foretage multiple sammenligninger mellem resul ­
tater fra individuelle koncentrationer og kontrollerne (12)(13). Andre nyttige eksempler kan også findes (14)(15). Størrelsen af den målbare effekt ved anvendelse af ANOVA eller andre procedurer 
(dvs. styrken af testen) bør udregnes og angives. Det bør bemærkes, 
at ikke alle observationer listet i 1.7.5.6 kan analyseres ved hjælp af ANOVA. F.eks. bør kumuleret død og antallet af sunde larver analyseres ved hjælp af probitmetoder.
 
Hvis LC/ECx'er skal beregnes, bør (en) passende kurve(r), f.eks. den 
logistiske kurve, fittes til de ønskede data ved hjælp af en statistisk metode som f.eks. mindste kvadraters metode eller ikke-lineære mindste kvadraters metode. Kurverne bør parametriseres, så den 
ønskede LC/ECx og dens standard error kan udregnes direkte. 
Dette vil gøre beregningen af sikkerhedsgrænserne for LC/ECx meget nemmere. Medmindre der er gode grunde til at foretrække andre sikkerhedsgrænser, bør tosidede 95 %-sikkerhedsgrænser angi ­
ves. Fitningsmetoden skulle helst give mulighed for beregning af en 
signifikans for mangel på fit. Grafiske metoder for fitning af kurver kan anvendes. Regressionsanalyse kan anvendes på alle observa ­
tioner listet i 1.7.5.6.
 
2.2. TOLKNING AF RESULTATER  
Hvor den målte koncentration af giftstoffet i testopløsningen ligger 
nær analysemetodens detektionsgrænse, skal resultaterne tolkes med 
forsigtighed. Tolkning af resultater, hvor koncentrationerne ligger over stoffets vandopløselighed. skal også gøres med forsigtighed.
 
2.3. TESTRAPPORTEN  
Testrapporten bør indeholde følgende information:  
2.3.1.  Test-kemikaliet:  
— dets fysiske natur og relevante fysisk-kemiske egenskaber  
— kemiske identitets-data, heri renhedsgrad og, hvor nødvendigt, 
den analytiske metode til kvantificering af stoffet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Arten, anvendt i testen:  
— dens videnskabelige navn, herkomst, antal forældrefisk (dvs. hvor 
mange hundyr blev brugt for at fremskaffe det ønskede antal æg til testen), kilde og metode til indsamling af befrugtede æg og 
behandlingen af dem.
 
2.3.3.  Forsøgsbetingelser:  
— anvendt fremgangsmåde (f.eks.. semistatisk eller gennemstrøms ­
forsøg, tidsforløb fra befrugtning til begyndelsen af testen, belast ­
ning osv.)  
— lysperiode(r)  
— testdesign (f.eks. antal forsøgsbeholdere og replikater, antal 
embryoner pr. replikat  
— fremstillingsmetode til stamopløsning og hyppighed af udskift ­
ning (hvis der er anvendt opløsningsmiddel, skal dets koncen ­
tration anføres)  
— den nominelle testkoncentration, de målte værdier, gennemsnit 
og standarddeviationer for forsøgskarrene og metoden, hvorved 
de er opnået, og, hvis testkemikaliet er opløseligt i vand i koncentrationer, der ligger under de undersøgte, skal der skaffes bevis for, at målingerne refererer til testkemikaliet i 
opløsning
 
— karakteristik af fortyndningsvandet: pH, hårdhedsgrad, tempera ­
tur, koncentration af opløst ilt, niveau for residual-chlor (hvis 
målt), total organisk kulstof, opslæmmede substanser, saltindhold i testmediet (hvis målt) og enhver anden ting, som er målt
 
— vandkvalitet i forsøgskarrene: pH. hårdhedsgrad, temperatur og 
koncentration af opløst ilt.  
2.3.4.  Resultater:  
— resultater fra ethvert præliminært forsøg med testkemikaliets 
stabilitet  
— bevis på, at testdyrene gennemsnitligt har overlevet i kontrollerne 
svarende til den accepterede standard (tillæg 2 og 3)  
— data vedrørende mortalitet/overlevelse på embryon- og larvesta ­
dierne og den totale mortalitet/overlevelse  
— antal dage til klækningen og antal klækninger  
— data vedrørende længde (og vægt)  
— morfologiske abnormiteter beskrives, hvis de forekommer  
— abnorm opførsel beskrives, hvis den forekommer  
— statistisk analyse og behandling af data  
— vedrørende test, hvor ANOVA er anvendt, anføres laveste obser ­
verede effekt-koncentration (LOEC) ved p = 0,05 og den koncentration, der var uden effekt (NOEC) ved hver måling, 
inklusive de statistiske procedurer og en angivelse af, hvilken 
størrelse effekt der kunne påvises
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— i forbindelse med test, hvor regressionsteknik er anvendt, anføres 
LC/ECx og sikkerhedsgrænser og en graf med den fitnings ­
metode, der blev brugt til beregningen  
— redegørelse for enhver afvigelse fra denne testmetode.  
3. HENVISNINGER  
(1) Kristensen P, (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS 
Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 pp. June 1990.
 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.
 
(3) Brauhn, J.L. and Schoettger, R.A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research 
Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.  
(4) Brungs, W.A. and Jones, B.R. (1977). Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures, p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
 
(5) Laale, H.W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  
(Brachydanio rerio)  in Fisheries Research. A Literature 
Review. J. Biol. 10, pp. 121-173.  
(6) Legault, R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Bmchy­
danio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328-330.  
(7) Dave, G., Damgaard, B., Grande, M., Martelin, J.E., Rosander, 
B. and Viktor, T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxi ­
city Test with Zebrafish  (Brachydanio rerio ) Using Chromium 
and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemis ­
try, 6, pp. 61-71.  
(8) Birge, J.W., Black, J.A. and Westerman, A.G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Esti ­
mating Chronic Values for Single Compounds and Complex 
Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 
807-821.
 
(9) Van Leeuwen, C.J., Espeldoom, A. and Mol, F, (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout  
{Salmo gairdneri),  J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129-145.
 
(10) Kirchen, R.V. and W.R. West (1969). Teleostean Devel ­
opment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply 
Company.  
(11) Kirchen, R.V. and W.R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply 
Company, North Carolina. 36 pp.  
(12) Dunnett, C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096-1121.
 
(13) Dunnett, C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(14) Mc Clave, J.T., Sullivan, J.H. and Pearson, J.G. (1980). 
Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Procee ­
dings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelp ­
hia. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen, C.J., Adema, D.M.M. and Henries, J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334.  
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 
l/RM/28, December 1992, 81 pp.
 
(17) Dave, G. and Xiu, R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, 
Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachy­
danio rerio.  Arch. of Environmental Contamination and Toxi ­
cology, 21. pp. 126-134.  
(18) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic 
position of the Zebrafish ( Danio rerio ), a model system in devel ­
opmental biology — an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 25 2: pp. 231-236.
 
(19) Ghillebaert, F., Chaillou, C., Deschamps, F. and Roubaud, P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference 
Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and 
Environmental Safety 32, pp. 19-28.  
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka,  Oryzias latipes.  EPA report EPA/600/3-91/064, 
Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka,  (Oryzias latipes ). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(22) De Graeve, G.M, Cooney, J.D., Mclntyre, D.O., Poccocic, T.L, 
Reichenbach, N.G., Dean, J.H. and Marcus, M.D. (1991). Vali ­
dity in the performance of the seven-day Fathead minnow  
(Pimephales promelas)  larval survival and growth test: an 
intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 1189-1203.
 
(23) Calow, P, (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish.  
(24) Balon, E. K. (198 5). Early life history of fishes: New devel ­
opmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, 280 pp.  
(25) Blaxter, J.H.S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W.S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1-58.
 
Tabel 1A  
Fiskearter, som er anbefalet til testning  
Ferskvand  
Oncorhynchus mykiss  
Regnbueørred (9) (16)  
Danio rerio  
Zebrafisk (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Alm. karpe (8) (19)  
Oryzias latipes  
Japanese ricefish/Medaka (20) (21)  
Pimephales promelas  
Fathead minnow (8) (22)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabel 1B  
Eksempler på andre veldokumenterede arter, som også har været anvendt  
Ferskvand Saltvand  
Carassius auralus  
Guldfisk (S)  Menidia peninsulae  
Tidewater silverside (23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  
Bluegill (8)  Clupea harengus  
Sild (24) (25)  
Gadus morhua  
Torsk (24) (25)  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
Tillæg 1  
VEJLEDNING I UDFØRELSE AF TOKSICITETSTEST PÅ 
EMBRYONER OG BLOMMESÆKYNGEL FRA ZEBRAFISK 
(BRACHYDANIO RERIO)  
INDLEDNING  
Zebrafisken kommer oprindeligt fra Coromandelkysten i Indien, hvor den 
opholder sig i hurtigtrindende strømme. Den er en almindelig akvariefisk af karpefamilien, og oplysninger om fremgangsmåde i behandlingen og dyrkningen af den kan findes i standardreferenceværker om tropiske fisk. Dens biologi og 
anvendelse i fiskeriundersøgelser findes i et review af Laale (1).
 
Fisken bliver sjældent længere end 45 cm. Kroppen er cylindrisk med 7- 
9 mørkeblå horisontale striber. Disse striber løber ud i de caudale og anale 
finner. Ryggen er olivengrøn. Hannerne er slankere end hunnerne. Hunnerne er mere sølvskinnende, og abdomen er udspilet, særligt lige før æglægning.
 
Voksne fisk tåler store svingninger i temperatur, pH og vandhårdhed. For at sikre 
sig sunde fisk, som lægger æg af god kvalitet, bør man sørge for optimale 
betingelser.  
Under æglægningen forfølger hannen hunnen og skubber til hende med snuden, 
og når æggene er kommet ud, bliver de befrugtede. Æggene, som er gennem ­
sigtige og ikke-klæbende, synker til bunds, hvor de kan ædes af forældrene. Lys har indflydelse på æglægningen. Hvis lyset om morgenen er tilstrækkeligt, vil 
fiskene almindeligvis lægge æg i de tidlige timer efter morgengry.
 
En hun kan producere adskillige hundrede af æg ad gangen med ugers mellem ­
rum. 
FORÆLDREFISK, REPRODUKTION OG TIDLIGE LIVSSTADIER  
Udvælg et passende antal sunde fisk og hold dem i passende vand (f.eks. tillæg 
4) i mindst to uger før den ønskede æglægning. Fiskene bør formere sig mindst 
en gang, før de producerer den samling æg, der skal bruges i testen. Fisketæt ­
heden bør ikke overstige 1 gram fisk pr liter. Regelmæssig fornyelse af vand eller anvendelse af rensningsanlæg kan tillade større fisketæthed. Temperaturen i 
tankene bør holdes på 25 ± 2
 o C. Fiskene bør fodres med en varieret kost 
f.eks. af passende kommercielt tørfoder, levende nyklækkede Arthemia, chirono ­
mider, dafnier, hvide orm (Enchytraeider).  
Nedenfor er skitseret to fremgangsmåder, der i praksis har ydet en tilstrækkelig 
mængde sunde, befrugtede æg til brug i en test:  
i) 8 hunner og 16 hanner placeres i et akvarium med 50 liter fortyndingsvand, 
skærmet mod direkte lys og holdt så uforstyrret som muligt i mindst 48 timer. 
En bakke til ægopsamling anbringes i bunden af akvariet om eftermiddagen, 
dagen før testen begynder. Ægopsamlingsbakken består af en ramme (plexi ­
glas eller andet passende materiale), 5-7 cm høj med et groft 2-5 mm net fæstnet til kanten og et 10-30 μm fint net på bunden. Et passende antal 
»æglægnings-træer«, lavet af optrevlet nylonreb, sættes fast på det grove 
net. Fiskene efterlades i mørke i 12 timer, hvorefter et svagt lys tændes, hvilket vil føre til æglægning. To til fire timer efter æglægningen fjernes bakken, og æggene samles. Bakken vil hindre fiskene i at æde æggene og 
letter samtidig indsamlingen af æggene. Disse fisk skal have lagt æg mindst 
en gang før den, hvorfra æggene anvendes til testning.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) Fra 5 til 10 han- og hunfisk holdes adskilt hver for sig i mindst to uger før 
den planlagte æglægning. Efter 5-10 dage vil hunnernes abdomen være 
udspilet og deres papillae genitales synlige. Sådanne har hanfisk ikke. Æglæg ­
ning foregår i et æglægningsakvarium, forsynet med en falsk netværksbund (som ovenfor). Akvariet fyldes med fortyndingsvand, så der står 5-10 cm 
vand over nettet. En hun og to hanner anbringes i akvariet dagen før den 
planlagte æglægning. Vandtemperaturen øges gradvist til en grad over akkli ­
matisationstemperaturen. Lyset slukkes, og akvariet holdes så uforstyrret som muligt. Næste morgen tændes et svagt lys, som får æglægningen til at gå i 
gang. 2-4 timer efter fjernes fiskene, og æggene indsamles. Hvis man har 
brug for flere æg, end en enkelt hun kan levere, opstilles flere akvarier parallelt. Ved at notere sig formeringens størrelse og kvalitet for hver hun før testen, kan man udvælge sig de bedste hunner til formering.
 
Æggene flyttes til forsøgsakvariet ved hjælp af glasrør med en indre diameter 
ikke mindre end 4 mm og forsynede med en sugeballon. Mængden af vand, der flyttes med æggene ved flytningen, skal være så ringe som muligt. Æggene er 
tungere end vand og synker selv ud af røret. Omhu skal udvises, så æg (og 
larver) ikke kommer i kontakt med luften. Ved hjælp af mikroskopiske under ­
søgelser af prøver fra æggene sikrer man sig, at de første stadier ikke udviser irregulære former. Det er ikke tilladt at desinficere æggene.
 
Mortaliteten blandt æggene er størst inden for de første 24 timer efter befrugt ­
ningen. Ofte ses en mortalitet på 5-40 %. Æg degenerer på grund af befrugtning, der ikke lykkes, eller udviklingsfejl. Æggenes kvalitet synes at bero på hunfisken, 
da nogle hunner hele tiden producerer gode ægkvaliteter, mens andre aldrig gør 
det. Udviklingshastigheden og klækningshastigheden varierer fra et kuld til et andet. Hvor befrugtningen lykkes, og hvor blommesækynglen klarer sig godt, overlever normalt over 90 %. Ved 25
 o C klækkes æggene 3-5 dage efter befrugt ­
ningen, og blommesækken resorberes ca. 13 dage efter befrugtningen.  
Fosterudviklingen er vel beskrevet af Hisaoka og Battle (2). På grund af æggenes 
og de udklækkede larvers gennemsigtighed kan fiskenes udvikling følges, og 
tilstedeværelsen af malformationer observeres. Omkring 4 timer efter æglæg ­
ningen kan de ikke-befrugtede æg skelnes fra de befrugtede (3). Til denne undersøgelse bliver æg og larver anbragt i små undersøgelseskar og set på under mikroskop.
 
Testbetingelserne, som vedrører de tidlige livsstadier, findes i tillæg 2. De opti ­
male værdier for pH og vandhårdhed er 7,8 og 250 mg CaCO  3 /l, respektive.  
BEREGNINGER OG STATISTIK  
Der foreslås beregninger i to tempi. Først foretages statistisk analyse af data 
vedrørende mortalitet, unormal udvikling og klækningstidspunkt. Derefter 
evalueres kropslængden statistisk for de koncentrationer, hvor ingen af oven ­
nævnte negative virkninger kunne ses. Denne fremgangsmåde tilrådes, eftersom giftstoffet kan tænkes selektivt at dræbe mindre fisk, forsinke klækningstids ­
punktet og forårsage grove malformationer og på den måde føre til længdemå ­
linger med bias. Ydermere vil der være stort set samme antal fisk at måle pr. 
undersøgelse, hvilket sikrer teststatistikkens validitet.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
LC 50 OG EC  50 -BESTEMMELSER  
Procentdelen af overlevende æg og larver beregnes og korrigeres for mortalitet i 
kontrollerne efter Abbotts formel (4):  
P ¼ 100 Ä Í 
C Ä P 0 
C Ü 100 Î 
hvor 
P = korrigeret % overlevelse  
P' = % observeret overlevelse i testkoncentrationen  
C = % overlevelse i kontrollen  
Hvis man ønsker at inkludere morfologiske abnormiteter i EC  50 -statistikken, kan 
man finde vejledning i Stephan (5).  
ESTIMERING AF LOEC OG NOEC  
Et af formålene med æg og blommesækyngelstestene er at sammenligne koncen ­
trationerne over nul med kontrolgruppens, dvs. at bestemme LOEC. Derfor bør multiple sammenligningsprocedurer anvendes (6)(7)(8)(9)(10).
 
HENVISNINGER  
(1) Laale, H.W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachydanio 
raid)  in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121- 
173. 
(2) Hisaoka, K.K. and Battle, H.I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
pp. 
(3) Nagel, R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabårbling  
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, pp. 173-181.  
(4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1-333.  
(5) Stephan, C.E. (198 2). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard ssessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69-81.
 
(6) Dunnett, C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096- 1121.
 
(7) Dunnett, C.W, (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a 
Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(8) Williams, D.A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103-117.
 
(9) Williams, D.A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.  
(10) Sokal, R.R. and Rohlf, F.J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
Tillæg 2  
TESTBETINGELSER, VARIGHED OG OVERLEVELSESKRITERIER FOR DE ANBEFALEDE ARTER  
Art Temperatur 
( 0 C) Saltindhold 
(0/00) Lysperiode 
(timer) Varighed af stadier 
(dage) 
Typisk testvarighed Overlevelseskontrol 
(minimum %) 
Embryoner Blommesæ ­
kyngel Klækningssucces Efter klækning  
FERSKVAND  
Brachydanio rerio  
Zebrafisk 25 ± 1 — 12-16 3-5 8-10 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-stadium) til 5 dage efter klækning (8-10 dage) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Regnbueørred 10 ± 1 (
 1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  3 ) 30-35 25-30 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-stadium) til 20 dage efter 
klækning (50-5 5 dage) 66 70  
Cyprinus carpio  
Alm. karpe 21-25 — 12-16 5 > 4 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-stadium) til 4 dage efter 
klækning (8-9 dage) 80 75  
Oryzias latipes  
Japanese ricefish/Medaka 24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12-16 8-11 4-8 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastruia-sta-dium) til 5 dage efter klækning (13-16 dage) 80 80  
Pimephales promelas  
Fathead minnow 25 ± 2 — 16 4-5 5 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-sta-dium) til 4 dage efter 
klækning (8-9 dage) 60 70
 
( 1 ) Gældende embryoner. 
( 2 ) Gældende for larver. 
( 3 ) Mørke for embryoner og larver op til en uge efter klækning, undtagen ved inspektion. Siden svagt lys i resten af testen.
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
TILLÆG 3  
Veldokumenterede testbetingelser, varighed og overlevelseskriterier for andre brugbare arter  
Art Temperatur (  o C) Saltindhold 
(0/00) Lysperiode 
(timer) Varighed af stadier (dage) 
Typisk testvarighed for embryoner og blommesæ ­
kyngel Overlevelse kontrol (minimum %) 
Embryoner Blommesæ ­
kyngel Klækningssucces Efter klækning  
FERSKVAND  
Carassius auratus  
Guldfisk 24 ± 1 — — 3-4 > 4 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-stadium) til 4 dage efter 
klækning (7 dage) — 80  
Leopomis macrochirus  
Blugill sunfish 21 ± 1 — 16 3 > 4 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-stadium) til 4 dage efter klækning (7 dage) — 75 
SALTVAND  
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside 22-25 15-22 12 1,5 10 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-stadium) til 5 dage efter 
klækning (6-7 dage) 80 60  
Clupea harengus  
Sild 10 ± 1 8-15 12 20-25 3-5 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-stadium) til 3 dage efter 
klækning (23-27 dage) 60 80  
Gadus morhua  
Torsk 5 ± 1 5-30 12 14-16 3-5 Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-stadium) til 3 dage efter klækning (18 dage) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow 25 ± 1 15-30 12 — — Så hurtigt som muligt efter befrugtning 
(tidl. gastrula-sta-dium) til 4-7 dage efter 
klækning (28 dage) > 75 80
TILLÆG 4  
NOGLE KEMISKE KARAKTERISTIKA FOR ACCEPTABELT 
FORTYNDINGSVAND  
Substans Koncentration  
Faste stoffer < 20 mg/l 
Totalt organisk kulstof < 2 mg/l 
Ikke-ioniseret ammonium < 1 μg/l 
Residualt chlor < 10 μg/l 
Total organophosphor-pesticider < 50 ng/l Total organochlorino-pcsticider + polychlor-biphenyler < 50 ng/l Total organisk chlor < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  HONNINGBIER — AKUT ORAL TOKSICITETSTEST  
1. METODE  
Denne korttids toksicitetstestmetode svarer til OECD TG 213 (1998).  
1.1. INDLEDNING  
Denne toksicitetstest er en laboratoriemetode beregnet til at fastlægge 
den orale akutte toksicitet af plantebeskyttelsesmidler og andre kemi ­
kalier på voksne arbejdsbier.  
I forbindelse med fastlæggelse og evaluering af stoffers toksiske 
egenskaber kan det være nødvendigt at fastslå den akutte orale toksi ­
citet over for honningbier, f.eks. når det er sandsynligt, at bier bliver 
udsat for stoffet. Den akutte orale toksicitetstest udføres for at fastslå 
den iboende toksicitet af pesticider og andre kemikalier over for bier. Resultaterne af testen bør anvendes for at fastslå en eventuel nødven ­
dighed af yderligere undersøgelser. Særligt kan metoden anvendes i 
programmer med henblik på at vurdere de risici, pesticider udgør for 
bier, baseret på en trinvis progression fra laboratorietoksicitetstest til tilnærmede feltforsøg og rene feltforsøg (l). Pesticider kan testes som aktive substanser (a.s.) eller som færdiggjorte produkter.
 
En toksisk standard bør medtages til at fastslå biernes følsomhed og 
testprocedurens præcision.  
1.2. DEFINITIONER  
Akut oral toksicitet:  er den skadelige effekt, som indtræffer inden 
for maksimum 96 timer efter en oral indtagelse af en enkelt dosis af testkemikaliet.
 
Dosis:  er den mængde af test-kemikaliet, som er indtaget. Dosis 
udtrykkes som masse (mg) af testkemikalium per test-dyr (mg/bi). Den reelle dosis, som hver bi får, kan ikke beregnes, da bierne 
fodres kollektivt, men en gennemsnitlig dosis kan skønnes (den 
totale mængde testkemikalium indtaget/antal test-bier i et bur).
 
LD 50 (Mediane letale dosis) oral:  er en statistisk beregnet enkelt ­
dosis af et kemikalium, der kan forårsage død af 50 % af dyrene, indtaget oralt. LD
 50 -værdien udtrykkes i mg testkemikalium pr. bi. 
Hvad pesticider angår, kan testkemikaliet være enten en aktiv 
substans (a.s.) eller et færdiggjort produkt, indeholdende et eller 
flere aktive kemikalier.  
Mortalitet:  et dyr regnes for dødt, når det er totalt immobilt.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Voksne arbejdshonningbier (Apis mellifera) udsættes for en række 
doser af testkemikaliet i en rørsukkeropløsning. Derefter får bierne samme føde, men uden testkemikaliet. Mortaliteten noteres daglig i 
mindst 48 timer og sammenlignes med kontrolværdierne. Hvis 
mortaliteten øges mellem 24 og 48 timer, mens kontrolværdierne holder sig på det accepterede niveau, dvs. ≤ 10 %, bør man forlænge 
testperioden til de maksimale 96 timer. Resultaterne analyseres for at 
beregne LD
 50 ved 24 timer og 48 timer og, hvis forsøget forlænges, 
ved 72 og 96 timer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. TESTENS VALIDITET  
For at testen skal være valid, gælder  
— at den gennemsnitlige mortalitet for alle kontroller skal være 
10 % eller mindre ved forsøgets afslutning  
— LD  50 for den toksiske standard falder inden for det forventede.  
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.5.1.  Indsamling af bier  
Unge. voksne bier af samme race bør anvendes, dvs. bier på samme 
alder, i samme foderstand osv. Bierne hentes fra tilstrækkeligt fodrede, sunde, så vidt muligt sygdomsfri kolonier, som er dronnin ­
gret. Deres fortid og fysiologiske status bør kendes. De kan 
indsamles om morgenen eller om aftenen før brugen og holdes under testbetingelserne til næste dag. Bier fra rammer uden yngel 
kan anvendes. Indsamling i det tidlige forår eller sene efterår bør 
undgås, da bierne har ændret fysiologi på den tid. Hvis testen skal udføres i det tidlige forår eller sene efterår, kan bierne holdes i en inkubator i en uge og fodres med »bi-brød« (pollen indsamlet fra 
vokskagen) og rørsukkeropløsning. Bier, der har været behandlet 
med kemiske stoffer, såsom antibiotika, anti-varroaprodukter osv., bør ikke bruges til toksicitetsundersøgelser før fire uger efter slut ­
ningen af behandlingen.
 
1.5.2.  Opbevaring og fodringsbetingelser  
Der anvendes bure, der er rene og godt ventilerede. Alt passende 
materiale kan anvendes, såsom rustfrit stål, metalnet, plastik eller 
engangstræbure, osv. Det er bedst med ti bier pr bur. Størrelsen af 
testburene skal passe til antallet af bier, dvs. der skal være for tilstrækkelig plads.
 
Bierne holdes i mørke i forsøgsrummet ved en temperatur på 25 ± 
2 o C. Den relative fugtighed, normalt omkring 50-70 %, skal regi ­
streres under hele forsøget. Håndtering, inklusive behandling og 
observation kan forgå ved (dags)lys. Som føde anvendes vandig 
rørsukkeropløsning med en slutkoncentration på 500 g/l (50 % w/v). Efter at testdosis er givet, forsynes bierne med føde ad libitum. Fordringssystemet bør tillade registrering af fødeindtagelse for hvert 
bur (se 1.6.3.1). Et glasrør, ca. 50 mm langt med 10 mm lysning, 
med den åbne ende indsnævret til 2 mm, kan anvendes.
 
1.5.3.  Forberedelse af bierne  
De indsamlede bier fordeles tilfældigt i burene, som placeres tilfæl ­
digt i forsøgsrummet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Bierne må sulte op til to timer før forsøgets begyndelse. Det anbe ­
fales, at bierne sulter før behandlingen, så at alle bier står lige med 
hensyn til tarmindhold ved forsøgets begyndelse. Moribunde bier skal kasseres og erstattes med sunde bier, før forsøget indledes.
 
1.5.4.  Fremstilling af doser  
Hvor testkemikaliet er kan blandes i vand. kan det dispenseres 
direkte i en 50 % rørsukkeropløsning. Der kan i forbindelse med 
tekniske produkter og stoffer med lav vandopløselighed anvendes hjælpestoffer såsom organiske opløsningsmidler, blødgøringsmidler eller dispergenser med lav toksicitet over for bier (f.eks. acetone, 
dimethylformamid, dimethylsulfoxid). Hjælpestoffets koncentration 
afhænger af teststoffets opløselighed og bør være den samme i alle koncentrationer, der undersøges. Imidlertid er en koncentration af hjælpestoffet på 1 % normalt passende og bør ikke overskrides.
 
Tilsvarende kontrolopløsninger bør fremstilles, dvs. hvor opløsnings ­
middel eller dispergens bliver anvendt til at gøre test-kemikaliet 
opløseligt, bør der anvendes to adskilte kontrolgrupper: en til opløs ­
ning i vand og en til rørsukkeropløsning med opløsningsmiddel/hjælpestof med samme koncentration som i forsøgsopløsningerne.
 
1.6. FREMGANGSMÅDE  
1.6.1.  Test- og kontrolgrupper  
Antallet af doser og replikater bør svare til de statistiske krav for 
bestemmelse af LD  50 med 95 % sikkerhedsgrænser. Normalt kræves 
dertil fem doser i en geometrisk serie med en faktor, der ikke over ­
stiger 2,2, og som dækker området for LD  50 . Fortyndingsfaktor og 
antal dosiskoncentrationer bør imidlertid beregnes ud fra toksicitetes ­
kurvens hældning (dosis over for mortalitet), idet man tager hensyn til den statistiske metode, hvormed man har valgt til at analysere 
resultaterne. En test til fastlæggelse af dosisområdet kan være til 
hjælp for fastlæggelse af dosiskoncentrationerne.
 
Mindst tre testgrupper, hver på ti bier, bør udsættes for hver test ­
koncentration. Mindst tre kontrolgrupper, hver på ti bier, deltager parallelt med testserien. Kontrolgrupper skal også inkluderes til belysning af de opløsningsmidler og hjælpestoffer, der anvendes 
(se 1.5.4).
 
1.6.2.  Toksisk standard  
En toksisk standard (dvs. et kendt toksisk stof) skal inkluderes i 
testserien. Af den bør udvælges mindst tre doser for at dække den forventede LD
 50 -værdi. Mindst tre bure. hver med ti bier. skal 
udsættes for hver testdosis. Den foretrukne toksiske standard er 
dimethoat, for hvilket det angives, at den orale LD  50 -24 timer 
befinder sig i størrelsesordenen 0,10-0,35 mg aktive substanser/bi (2). Andre toksiske standarder kan naturligvis anvendes, hvis 
tilstrækkelige data kan fremskaffes til belysning af forventet dosis ­
respons (f.eks. parathion).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Belastning  
1.6.3.1.  Administration af doser  
Hver test-gruppe bier skal forsynes med 100-200 ml 50 % vandig 
rørsukkeropløsning, indeholdende testkemikaliet i den rigtige 
koncentration. Større volumen kræves til kemikalier, der er tungt 
opløselige, har lav toksicitet eller lav koncentration i præparatet, da der skal bruges større mængder i rørsukkeropløsningen. Mængden af behandlet føde, der indtages, skal monitoreres. Når den er indtaget 
(almindeligvis efter 3-4 timer), skal fodringssystemet fjernes fra buret 
og udskiftes med et nyt, som kun indeholder rørsukkeropløsning, og som tilføres ad libitum. Nogle stoffer kan i højere doser medføre, at 
der indtages kun lidt eller ingen føde. Efter højst 6 timer skal resten 
af den behandlede føde fjernes og erstattes med ren rørsukkeropløs ­
ning. Mængden af behandlet føde, der er indtaget, skal beregnes (f.eks. via måling af volumen/vægt af resterende behandlet føde).
 
1.6.3.2.  Varighed  
Testen varer fortrinsvis til 48 timer efter at testopløsningen er blevet 
erstattet med ren rørsukkeropløsning. Hvis mortaliteten fortsætter 
med at stige med mere end 10 % efter de første 24 timer, bør 
testvarigheden udvides til maksimalt 96 timer, under forudsætning af, at mortaliteten blandt kontroldyrene ikke overstiger 10 %.
 
1.6.4.  Observationer  
Mortaliteten registreres 4 timer efter testens start og derefter 24 og 
48 timer efter (dvs. efter givet dosis). Hvis en længere observations ­
periode er nødvendig, registreres yderligere hver 24. time op til 96 
timer, under forudsætning af, at mortaliteten blandt kontroldyrene 
ikke overstiger 10 %.  
Den mængde føde, der indtages af hver gruppe, skal vurderes. 
Sammenligning af den hastighed, hvormed den behandlede og den ikke behandlede føde indtages inden for 6 timer, kan skaffe viden om den behandlede fødes smagskvalitet.
 
Enhver unormal opførsel observeret blandt bierne i forsøgsperioden 
skal registreres.  
1.6.5.  Grænsetest  
I visse tilfælde (f.eks. hvis et testkemikalium forventes at besidde lav 
toksicitet) kan man udføre en grænsetest, hvor man anvender 100 mg 
aktiv substans/bi, for at vise, at LD  50 er større end denne værdi. 
Samme fremgangsmåde skal anvendes, inklusive tre replikate test ­
grupper til testdosis, de relevante kontroller, vurderingen af indtaget behandlet føde og brugen af toksisk standard. Hvis dødsfald indtræ ­
der, skal der udføres et komplet forsøg. Hvis subletale virkninger 
observeres (se 1.6.4), skal de registreres.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. DATA  
Data skal opsummeres i tabelform, der viser, for hver behandlet 
gruppe, kontrolgrupper og grupper med toksisk standard, antallet af 
anvendte bier, mortaliteten for hvert observationstidspunkt og bier 
med usædvanlig opførsel. Analyser mortaliteten ved hjælp af passende statistiske metoder (f.eks. probitanalyser, vægtede gennem ­
snit, binominal sandsynlighed) (3)(4), Plot dosisresponskurver for 
hver tidspunkt, hvor observationer anbefales, og beregn kurvehæld ­
ninger og den mediane letale dosis, LD
 5o med 95 % sikkerheds ­
grænser. Korrektioner for kontrolleret mortalitet kan foretages 
v.h.a. Abbotts korrektion (4) (5). Hvis den behandlede føde ikke 
er totalt indtaget, skal dosis af testkemikalium indtaget pr. gruppe bestemmes. LD
 50 skal udtrykkes som mg testkemikalium pr. bi.  
2.2. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende informationer:  
2.2.1.  Test-kemikalium:  
— fysiske egenskaber og relevante fysisk-kermske egenskaber 
(f.eks. stabilitet i vand, damptryk)  
— data for kemisk identifikation, inklusive strukturformel, renheds ­
grad (dvs. for pesticider: identitet og koncentration af aktive 
substans(er)).  
2.2.2.  Testdyr  
— videnskabeligt navn, race, omtrentlige alder (i uger), indsam ­
lingsmetode, dato for indsamling  
— informationer om kolonier, der er anvendt til indsamlingen af 
testbier, inklusive sundhed, voksensygdomme, tidligere behand ­
ling osv.  
2.2.3.  Testomstændigheder  
— temperatur og forsøgsrummets relative fugtighedsgrad  
— opbevaringsbetingelser, inklusive burets type, størrelse og mate ­
riale 
— fremgangsmåde ved fremstilling af stamopløsning og testopløs ­
ning (eventuelt opløsningsmiddel og dets koncentration skal angives)
 
— testdesign, dvs. antal testkoncentrationer og deres størrelse, antal 
kontroller; for hver testkoncentration og kontrol angives antal 
replikater og antal bier pr. bur  
— dato for testen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Resultater:  
— resultater af eventuelle forsøg med koncentrationsområder  
— rådata: mortaliteten for hver koncentration ved hvert observa ­
tionstidspunkt  
— graf af dosisresponskurve ved forsøgets slutning  
— LD  50 -værdier med 95 %-sikkerhedsgrænser for hvert anbefalet 
observationstidspunkt, for testkemikalium og toksisk standard  
— statistisk procedure for fastlæggelse af LD  50 
— mortaliteten blandt kontroldyrene  
— andre biologiske effekter oberverede eller målte, f.eks. abnorm 
opførsel blandt bierne (inklusive manglende indtagelse af testdo ­
sis), konsumptionshastighed både hvad angår den behandlede og 
den ubehandlede gruppe  
— enhver fravigelse af testfremgangsmåden, som her er beskrevet, 
samt enhver anden relevant oplysning.  
3. HENVISNINGER  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products 
— Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1. pp. 151- 
165. March 1993.  
(2) Gough, H.J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, pp. 119-125.
 
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
 
(4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol, 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  HONNINGBIER — AKUT KONTAKTTOKSICITETSTEST  
1. METHODE  
Denne akut toksicitets-testmetode svarer til OECD TG 214 (1998).  
1.1. INDLEDNING  
Denne toksicitetstestmetode er en laboratoriemetode, beregnet til at 
vurdere den akutte toksicitet over for voksne arbejdshonningbier ved kontakt med plantebeskyttelsesmidler og andre kemikalier.
 
Ved vurderingen og evalueringen af kemikaliers toksiske karakteri ­
stika kan det være ønskværdigt at bestemme den akutte kontakttok ­
sicitet over for honningbier, f.eks. når det er sandsynligt, at bier kan 
blive udsat for de pågældende kemikalier. Den akutte toksicitetstest 
udføres for at bestemme pesticiders og andre kemikaliers naturlige toksicitet over for bier. Resultaterne af denne test er tænkt anvendt til at fastslå behovet for yderligere evaluering. Specielt kan metoden 
bruges i programmer, der evaluerer den fare, som pesticider 
betyder for bier, baseret på en trinvis progression fra laboratorietok ­
sicitetstest til tilnærmede feltforsøg og rene feltforsøg (1). Pesticider kan testes som aktive substanser (a.s.) eller som færdiggjorte 
produkter.
 
En toksisk standard bør medtages til at fastslå biernes følsomhed og 
testprocedurens præcision.  
1.2. DEFINITIONER  
Akut kontakt toksicitet:  er den skadelige effekt, som indtræffer 
inden for maksimum 96 timer efter en lokal applikation af en 
enkelt dosis af et kemikalium.  
Dosis:  er den mængde af test-kemikaliet, som er påført. Dosis 
udtrykkes som masse (mg) af testkemikalium per test-dyr (mg/bi). 
Den reelle dosis, som hver bi får, kan ikke beregnes, da bierne 
fodres kollektivt, men en gennemsnitlig dosis kan skønnes (den totale mængde test-kemikalium indtaget/antal test-bier i et bur).
 
LD 50 (Mediane letale dosis) kontakt:  er en statistisk beregnet 
enkeltdosis af et kemikalium, der kan forårsage død af 50 % af dyrene, når det administreres via kontakt. LD
 50 -værdien udtrykkes 
i mg testkemikalium pr. bi. Hvad pesticider angår, kan testkemikaliet 
være enten en aktiv substans (a.s.) eller et færdiggjort produkt, inde ­
holdende et eller flere aktive kemikalier.  
Mortalitet : et dyr regnes for dødt, når det er totalt immobilt.  
1.3. TESTMETODENS PRINCIP  
Voksne arbejdshonningbier (Apis mellifera) udsættes for en serie 
forskellige doser af testkemikaliet, opløst i et passende medie, 
gennem en direkte applikation på thorax (små dråber). Forsøget 
varer 48 timer. Hvis mortaliteten øges mellem 24 og 48 timer, mens kontrolværdierne holder sig på det accepterede niveau, dvs. < 10 %, bør man forlænge testperioden til de maksimale 96 timer. 
Resultaterne analyseres for at beregne LD
 50 ved 24 timer og 48 timer 
og, hvis forsøget forlænges, ved 72 og 96 timer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. TESTENS VALIDITET  
For at testen skal være valid, gælder  
— at den gennemsnitlige mortalitet for alle kontroller skal være 
10 % eller mindre ved forsøgets afslutning  
— LD  50 for den toksiske standard falder inden for det forventede.  
1.5. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.5.1.  Indsamling af bier  
Unge, voksne bier af samme race bør anvendes, dvs. bier på samme 
alder, i samme foderstand, race osv. Bierne hentes fra tilstrækkeligt fodrede, sunde, så vidt muligt sygdomsfri kolonier, som er dronnin ­
gret. Deres fortid og fysiologiske status bør kendes. De kan 
indsamles aftenen for brugen og holdes under testbetingelserne til 
næste dag. Bier fra rammer uden yngel kan anvendes. Indsamling i det tidlige forår eller sene efterår bør undgås, da bierne har ændret fysiologi på den tid. Hvis testen skal udføres i det tidlige forår eller 
sene efterår, kan bierne holdes i en inkubator i en uge og fodres med 
»bi-brød« (pollen indsamlet fra vokskagen) og rørsukkeropløsning. Bier, der har været behandlet med kemiske stoffer, såsom antibiotika, anti-varroaprodukter osv., bør ikke bruges til toksicitetsundersøgelser 
før fire uger efter slutningen af behandlingen.
 
1.5.2.  Opbevaring og fodringsbetingelser  
Der anvendes bure, der er rene og godt ventilerede. Alt passende 
materiale kan anvendes, såsom rustfrit stål, metalnet, plastik eller 
engangstræbure, osv. Størrelsen af testburene skal passe til antallet 
af bier, dvs. der skal være tilstrækkelig plads. Det er bedst med ti bier pr. bur.
 
Bierne holdes i mørke i forsøgsrummet ved en temperatur på 25 ± 2  o C. 
Den relative fugtighed, normalt omkring 50-70 %, skal registreres under hele forsøget. Håndtering, inklusive behandling og observation kan forgå ved (dags)lys. Som føde anvendes vandig rørsukkeropløsning med en 
slutkoncentration på 500 g/l (50 % w/v) og tilbydes ad libitum under 
forsøget, idet man anvender et fodringssystem, der kan være et glasrør (ca. 50 mm langt og med en lysning på 10 mm og med den åbne ende indsnævret til 2 mm i diameter).
 
1.5.3.  Forberedelse af bierne  
De indsamlede bier kan bedøves med carbondioxid eller nitrogen, 
når testkemikaliet skal appliceres. Mængden af anæstetikum og bedøvelsestiden bør være mindst mulig. Moribunde bier skal kasseres og erstattes af sunde bier, før testen påbegyndes.
 
1.5.4.  Fremstilling af doser  
Testkemikaliet skal appliceres som en opløsning i et medium, dvs. et 
organisk opløsningsmiddel eller en vandig opløsning med overflade ­
aktive stoffer. Som organisk opløsningsmiddel foretrækkes acetone, men andre organiske opløsningsmidler med lav toksicitet over for 
bier kan bruges (f.eks. dimethylformamid, dimethylsulfoxid). 
Vandopløselige færdiggjorte produkter og højpolære organiske substanser, som ikke er opløselige i organiske opløsningsmidler, kan være lettere at påføre, hvis de tilberedes i en svag opløsning 
af kommercielle overfladeaktive stoffer (f.eks.. Agral, Cittowet, 
Lubrol, Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Tilsvarende kontrolopløsninger bør fremstilles, dvs. hvor opløsnings ­
middel eller dispergens bliver anvendt til at gøre testkemikaliet 
opløseligt, bør der anvendes to adskilte kontrolgrupper, en behandlet med vand og en med opløsningsmiddel/dispergent.
 
1.6. FREMGANGSMÅDE  
1.6.1.  Test- og kontrolgrupper  
Antallet af doser og replikater bør svare til de statistiske krav for 
bestemmelse af LD  50 med 95 % sikkerhedsgrænser. Normalt kræves 
dertil fem doser i en geometrisk serie med en faktor, der ikke over ­
stiger 2,2, og som dækker området for LD  50 . Antallet af doser bør 
imidlertid beregnes ud fra toksiciteteskurvens hældning (dosis over 
for mortalitet), idet man tager hensyn til den statistiske metode, 
hvormed man har valgt til at analysere resultaterne. En test til fast ­
læggelse af dosisområdet kan være til hjælp for fastlæggelse af dosiskoncentrationerne.
 
Mindst tre testgrupper, hver på ti bier, bør udsættes for hver test ­
koncentration.  
Mindst tre kontrolgrupper, hver på ti bier, deltager parallelt med 
testserien. Hvis der er anvendt et organisk opløsningsmiddel eller et overfladeaktivt stof, skal der inkluderes yderligere tre kontrol ­
grupper på ti bier hver for opløsningsmidlet eller det overfladeaktive 
stof.
 
1.6.2.  Toksisk standard  
En toksisk standard skal inkluderes i testserien. Af den bør udvælges 
mindst tre doser for at dække den forventede LD  50 -værdi. Mindst tre 
bure, hver med ti bier, skal udsættes for hver testdosis. Den fore ­
trukne toksiske standard er dimethoat, for hvilket det angives, at 
kontakt-LD  50 -24 timer befinder sig i størrelsesordenen 0,10-0,30 
mg aktive substanser/bi (2). Andre toksiske standarder kan natur ­
ligvis anvendes, hvis tilstrækkelige data kan fremskaffes til belysning af forventet dosis-respons (f.eks. parathion).
 
1.6.3.  Belastning  
1.6.3.1.  Administration af doser  
Bedøvede bier behandles individuelt med lokal applikation. Bierne 
randomiseres til de forskellige testdoser og kontroller. 1 ml af opløs ­
ningen, der indeholder testkemikaliet i den passende koncentration, anbringes med en mikroapplikator på dorsalsiden af thorax af bien. 
Andre volumina kan anvendes, hvis der er grund til det. Efter appli ­
kationen anbringes bierne i testburene og forsynes med rørsukkerop ­
løsning.
 
1.6.3.2.  Varighed  
Forsøgets varighed er almindeligvis 48 timer. Hvis mortaliteten øger 
mere end 10 % mellem 24 og 48 timer, skal forsøgsvarigheden 
forøges til op til 96 timer, under forudsætning af, at mortaliteten 
blandt kontrollerne ikke overstiger 10 %.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Observationer  
Mortaliteten registreres 4, 24 og 48 timer efter applikationen. Hvis 
det er nødvendigt med en forlænget observationsperiode, skal obser ­
vationerne foretages med 24-timers intervaller, op til 96 timer, under 
forudsætning af, at kontrolmortaliteten ikke overstiger 10 %.  
Enhver unormal opførsel som observeres i testperioden skal registre ­
res. 
1.6.5.  Grænsetest  
I visse tilfælde (f.eks. hvis et testkemikalium forventes at besidde lav 
toksicitet) kan man udføre en grænsetest, hvor man anvender 100 mg 
aktiv substans/bi, for at vise, at LD  50 er større end denne værdi. 
Samme fremgangsmåde skal anvendes, inklusive tre replikate test ­
grupper til testdosis, de relevante kontroller og brugen af toksisk 
standard. Hvis dødsfald indtræder, skal der udføres et komplet 
forsøg. Hvis subletale virkninger observeres (se 1.6.4), skal de rapporteres.
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. DATA  
Data skal opsummeres i tabelform, der viser, for hver behandlet 
gruppe, kontrolgrupper og grupper med toksisk standard, antallet af 
anvendte bier, mortaliteten for hvert observationstidspunkt og bier med usædvanlig opførsel. Analyser mortaliteten ved hjælp af passende statistiske metoder (f.eks. probitanalyser, vægtede gennem ­
snit, binominal sandsynlighed) (3)(4). Plot dosisresponskurver for 
hver tidspunkt, hvor observationer anbefales, (dvs. efter 24, 48 og, hvis relevant. 72 og 96 timer) og beregn kurvehældninger og den mediane letale dosis, LD
 50 , med 95 %-sikkerhedsgrænser. Korrek ­
tioner for kontrolleret mortalitet kan foretages v.h.a. Abbotts korrek ­
tion (4)(5). LD  50 skal udtrykkes som mg testkemikalium pr. bi.  
2.2. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende informationer:  
2.2.1.  Testkemikalium:  
— fysiske egenskaber og relevante fysisk-kemiske egenskaber 
(f.eks. stabilitet i vand, damptryk)  
— data for kemisk identifikation, inklusive struktur-formel, renheds ­
grad (dvs. for pesticider: identitet og koncentration af aktive 
substans(er)).  
2.2.2.  Testdyr  
— videnskabeligt navn. race. omtrentlige alder (i uger), indsam ­
lingsmetode, dato for indsamling  
— informationer om kolonier, der er anvendt til indsamlingen af 
testbier, inklusive sundhed, voksensygdomme, tidligere behand ­
ling osv.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Testomstændigheder  
— temperatur og forsøgsrummets relative fugtighedsgrad  
— opbevaringsbetingelser, inklusive burets type, størrelse og mate ­
riale 
— fremgangsmåde ved administration af testkemikalium (det 
anvendte opløsningsmedium, volumen af testopløsning, det 
anvendte anæstetikum  
— testdesign, f.eks. antal og størrelse af testdoser, antal kontroller; 
for hver testdosis og kontrol angives antal replikater og antal bier 
pr. bur  
— dato for testen.  
2.2.4.  Resultater:  
— resultater af eventuelle forsøg med koncentrationsområder  
— rådata: mortaliteten for hver koncentration ved hvert observa ­
tionstidspunkt  
— graf af dosisresponskurve ved forsøgets slutning  
— LD  50 -værdier med 95 %-sikkerhedsgrænser for hvert anbefalet 
observationstidspunkt, for testkemikalium og toksisk standard  
— statistisk procedure for fastlæggelse af LD  50 
— mortaliteten blandt kontroldyrene  
— andre biologiske effekter, observerede eller målte, og abnorm 
opførsel blandt bierne  
— enhver fravigelse af testfremgangsmåden, som her er beskrevet, 
samt enhver anden relevant oplysning.  
3. HENVISNINGER  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products 
— Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.l, pp. 151-165. March 
1993.  
(2) Gough, H.J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees  (Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, pp. 119-125.  
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
 
(4) Finney, D.J. (1971), Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  ADSORPTION/DESORPTION MED EN BATCH- 
LIGEVÆGTSMETODE  
1. METODE  
Metoden er gengivet efter OECD TG 106: »Determination of Soil 
Adsorption/Desorption, using a Batch Equili-brium Method« (2000).  
1.1. INDLEDNING  
I metoden er taget hensyn til en ringtest og en workshop om udvæl ­
gelse af jord med henblik på udvikling af en adsorptionstest (1) (2) (3) (4) samt eksisterende guidelines på nationalt plan (5) (6) (7) (8) 
(9) (10) (11).
 
Adsorptions-/desorptionsundersøgelser kan skaffe vigtige oplysninger 
om kemiske stoffers mobilitet og fordeling i biosfærens jord-, vand- og luftcompartments (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). 
Sådanne oplysninger kan anvendes til opstilling af prognoser eller 
overslagsberegninger f.eks. vedrørende muligheden for kemisk nedbrydning (22) (23), omdannelse og optagelse i organismer (24), 
udvaskning gennem jordbundsprofilen (16) (18) (19) (21) (25) (26) 
(27) (28), fordampning fra jorden (21) (29) (30) og afstrømning fra jordoverfladen til naturlige vande (18) (31) (32). Adsorptionsdata kan anvendes til at drage sammenligninger og opstille modeller 
(19) (33) (34) (35).
 
Et kemisk stofs fordeling mellem jord- og vandfase er en kompleks 
proces, som bestemmes af en række forskellige faktorer: stoffets kemiske egenskaber (12) (36) (37) (38) (39) (40), jordens karakteri ­
stika (4) (12) (13), (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) 
samt klimatiske faktorer som nedbør, temperatur, sollys og vind. De mange fænomener og mekanismer, som medvirker ved adsorption af et kemisk stof til jord, kan således ikke fastlægges fuldt ud ved en 
forenklet laboratoriemodel som nærværende metode. Men uanset at 
denne tentativt opstillede metode ikke kan dække alle tilfælde, der kan forekomme i miljøet, giver den tilstrækkelige oplysninger om den miljømæssige relevans af adsorptionen af et kemisk stof.
 
Se også den generelle indledning.  
1.2. OMRÅDE  
Metodens formål er at gøre det muligt at foretage en skønsmæssig 
beregning af et stofs adsorption/desorption i jord. Målet er at nå frem til en sorptionsværdi, med hvilken fordelingen under forskellige 
miljøforhold kan forudsiges; til dette formål bestemmes ligevægts ­
adsorptionskoefficienter for et kemisk stof på forskellige jordtyper som funktion af jordens egenskaber (f.eks. dens indhold af organisk kulstof, lerindholdet samt jordens struktur og pH). Det er nødvendigt 
at anvende forskellige jordtyper for at få så bred dækning som 
muligt af vekselvirkningen mellem et givet stof og naturligt fore ­
kommende jordtyper.
 
I denne metode forstås ved adsorption den proces, hvorved et kemisk 
stof bindes til overfladen af forskellige jordtyper; der skelnes her 
ikke mellem forskellige adsorptionsprocesser (fysisk og kemisk adsorption) og processer som overfladekatalyseret nedbrydning, masseadsorption og kemiske reaktioner. Den adsorption, som 
finder sted på kolloide partikler (diameter < 0,2 μm) dannet af 
jordarterne, tages ikke i betragtning.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
De jordparametre, som anses for at have størst betydning for adsorp ­
tionen, er: organisk kulstofindhold (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) 
(44) (45) (46) (47) (48), lerindhold og jordstruktur (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) samt for ioniserbare forbindelser pH- værdien (3)(4)(42). Andre jordparametre, der kan have indflydelse på 
adsorptionen/desorptionen af et stof, er effektiv kationudvekslings ­
kapacitet (ECEC), indhold af amorfe jern- og aluminiumoxider, specielt for vulkanske og tropiske jordarter (4), samt virksom over ­
flade (49).
 
Testen er udviklet med henblik på vurdering af et kemisk stofs 
adsorption på forskellige jordtyper med varierende organisk kulstof ­
indhold, lerindhold og jordstruktur samt pH. Testen omfatter tre trin:  
Trin 1:  Indledende undersøgelse til bestemmelse af:  
— forholdet jord/opløsning  
— ligevægtstid for adsorptionsprocessen og mængde 
prøvestof adsorberet ved ligevægt  
— prøvestoffets adsorption på overfladen af prøvebehol ­
derne samt prøvestoffets stabilitet inden for prøveperio ­
den. 
Trin 2:  Screeningtest: adsorptionen i fem forskellige jordtyper 
undersøges adsorptionskinetisk ved én enkelt koncentration 
og bestemmelse af fordelingskoefficienterne K  d og K  oc . 
Trin 3:  Bestemmelse af Freundlich-adsorptionsisotermer til fastlæg ­
gelse af koncentrationens indflydelse på adsorptionen på jord.
 
Undersøgelse af desorption ved hjælp af desorptionskinetik/ 
Freundlich desorptionsisotermer (tillæg 1).  
1.3. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Symbol Definition Enhed  
A t i adsorptionsprocent til tiden t  i % 
A eq adsorptionsprocent ved adsorptionsligevægt %  
m s ads ðt i Þ masse prøvestof adsorberet til jorden til tiden t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ masse prøvestof adsorberet på jorden i løbet af tidsinter ­
vallet Δt i μg 
m s ads ðeqÞ masse prøvestof adsorberet på jorden ved adsorptionslige ­
vægt μg 
m 0 masse prøvestof i prøveglasset ved adsorptionstestens 
begyndelse μg 
m m ads ðt i Þ masse prøvestof målt i prøve ( v a A ) til tidspunktet t  i μg 
m aq ads ðeqÞ masse af stoffet i opløsningen ved adsorptionsligevægt μg 
m soil mængde jordfase, angivet som tør masse jord g  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Symbol Definition Enhed  
C st massekoncentration af stamopløsningen af stoffet μg cm  -3 
C 0 initial massekoncentration af prøveopløsning i berøring 
med jorden μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ massekoncentration af stoffet i den vandige fase til tids ­
punktet t  i for analysens udførelse μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ indhold af stof adsorberet på jorden ved adsoprtionslige ­
vægt μg g -1 
C aq ads ðeqÞ massekoncentration af stoffet i vandig fase ved adsorp ­
tionsligevægt μg cm  -1 
V o initialt volumen af vandig fase i kontakt med jorden under 
adsorptionstesten cm 3 
v a A volumen af den prøve, hvro prøvestoffet måles cm  3 
K d fordelingskoefficient for adsorption cm  3 g -1 
K oc normaliseret adsorptionskoefficient for organisk kulstof cm  3 g -1 
K um normaliseret adsorptionskoefficient for organisk kulstof cm  3 g -1 
K F ads Freudlich adsorptionskoefficient μg -1-l/n (cm  3 ) l/n g -1 
l/n Freudlich-eksponent  
D t i desorptionsprocent til tidspunktet t  i % 
D Δt i desorptionsprocent til tidsintervallet Δt i % 
K des tilsyneladende desorptionskoefficient cm  3 g -1 
K F des Freudlich desorptionskoefficient μg 1-l/n (cm  3 ) l/n g -1 
m aq des ðt i Þ masse af prøvestoffe desorbere fra jorden i lobet af tiden t  i μg 
m aq des ðΔt i Þ masse af prøvestoff desorberet fra jorden i lobet af tids ­
intervallet Δ ti μg 
m m des ðeqÞ masse af stof. som er bestemt analytisk i den vandige fase 
ved desorptionsligevægt μg 
m aq des ðeqÞ samlet masse af prøvestof desorberet ved desorptionslige ­
vægt μg 
m s des ðΔt i Þ masse af prøvestof. som stadig er adsorberet på jorden 
efter tidsintervallet Δ ti μg 
m aq A masse af stof. som er tilbage efter indtræden af adsorp ­
tionsligevægt som følge af ufuldstændig volumenudskift ­
ning μg 
C s des ðeqÞ indhold af prøvestof, som stadig er adsorberet til jorden 
ved desorptionsligevægt μg g -1 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Symbol Definition Enhed  
C aq des ðeqÞ massekoncentration af prøvestof i vandig fase ved 
desorptionsligevægt μg cm  -3 
V T samlet rumfang af vandig fase i kontakt med jorden under 
desorptionskinetikforsøget undført med den sekventielle metode cm
 3 
V R rumfang supermatant, som efter indtræden af adsorptions ­
ligevægt er fjernet fra prøveglasset og erstattet af samme 
rumfang 0,01 M CaCl  2 -opløsning cm 3 
v a D rumfang af prøve udtaget til analyse fra tidspunktet (i) 
under desorptionskinetikforsøget udført med den sekven ­
tielle metode cm 3 
V r r rumfang af opløsning udtaget af prøveglas (i) til bestem ­
melse af prøvestof i desorptionskinetkforsøget (parallelle metode) cm
 3 
V i F rumfang af opløsning udtaget af prøveglas (i) til bestem ­
melse af prøvestof, ved desorptionsligevægt cm 3 
MB massebalance % 
m E samlet masse prøvestof ekstraheret fra jord og prøveglas ­
sets vægge i to trin μg 
V rec rumfang af supermatant, som er opsamlet efter indtræden 
af adsorptionsligevægt cm 3 
P ow oktanol/vand fordelingskoefficient 
pKa dissociationskonstant 
S w vandopløselighed g l  -1 
1.4. TESTMETODENS PRINCIP  
Kendte rumfang af en opløsning af umærket eller radioaktivt mærket 
prøvestof med kendt koncentration i 0,01 M CaCl  2 tilsættes til jord ­
prøver, hvis tørre vægt kendes, og som i forvejen er ekvilibreret i 
0,01 M CaCl  2 . Blandingen omrystes et passende stykke tid. Jordsus ­
pensionerne adskilles derefter ved centrifugering og om ønsket filtre ­
ring, og den vandige fase analyseres. Den mængde prøvestof, som er adsorberet på jordprøven, beregnes som forskellen mellem den 
mængde prøvestof, som i begyndelsen er til stede i oplosningen og 
den mængde, der er tilbage ved forsøgets slutning (indirekte meto ­
de).
 
Om ønsket kan man vælge at bestemme den adsorberede mængde 
prøvestof direkte ved analyse af jorden (direkte metode). Denne 
metode, som indebærer trinvis ekstraktion af jorden med passende opløsningsmiddel, anbefales i tilfælde, hvor koncentrationsforskellen af stoffet i opløsningen ikke kan bestemmes nøjagtigt. Som eksempel 
på sådanne tilfælde kan nævnes: Prøvestoffet adsorberes på over ­
fladen af prøveglasset, prøvestoffet er ustabilt inden for forsøgets tidsramme, adsorptionen er enten så svag, at der kun fås lille koncen ­
trationsændring i stoffet, eller så stærk, at koncentrationen bliver for 
lille til at kunne bestemmes nøjagtigt. Anvendes radiomærket stof, 
kan ekstraktion af jorden undgås ved analyse af jordfasen ved forbrænding og væskescintillationstælling. Væskescintillationstælling er imidlertid en uspecifik teknik, som ikke gør det muligt at skelne 
mellem moderstof og omdannelsesprodukter; den bør derfor kun 
anvendes, hvis prøvestoffet er stabilt i hele undersøgelsens varighed.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. OPLYSNINGER OM PRØVESTOFFET  
Kemiske reagenser skal være af analytisk kvalitet. Det anbefales at 
anvende umærket prøvestof med kendt sammensætning og helst mindst 95 % renhed eller radioaktivt mærket prøvestof af kendt 
sammensætning og radioaktiv renhed. Anvendes radioaktive tracer ­
stoffer med kort halveringstid, skal der korrigeres for henfald.
 
Før man udfører en test for adsorption-desorption, skal der foreligge 
følgende oplysninger om prøvestoffet:  
a) vandopløselighed (A.6)  
b) damptryk (A.4) og/eller Henrys lovkonstant  
c) abiotisk nedbrydning: hydrolyse som funktion af pH (C.7)  
d) fordelingskoefficient (A.8)  
e) umiddelbar biologisk nedbrydelighed (C.4) eller aerob og anaerob 
omdannelse i jord  
f) pKa for ioniserbare stoffer  
g) direkte fotolyse i vand (dvs. UV-Vis absorptionsspektrum i vand, 
kvanteudbytte) og fotonedbrydning på jord.  
1.6. PRØVENS ANVENDELIGHED  
Prøven kan anvendes på kemiske stoffer, for hvilke en analyseme ­
tode med tilstrækkelig nøjagtighed er til rådighed. En vigtig parame ­
ter, som kan have betydning for resultaternes pålidelighed, navnlig 
ved anvendelse af den indirekte metode, er prøvestoffets stabilitet inden for det tidsrum, testen strækker sig over. Det er således en forudsætning, at stabiliteten efterprøves i en indledende undersø ­
gelse; iagttages der en omdannelse i løbet af den tid, testen strækker 
sig over, anbefales hovedundersøgelsen udført med analyse af både jord- og vandfase.
 
Man kan komme ud for vanskeligheder med at udføre testen for 
prøvestoffer med ringe vandopløselighed (S  w < 10  -4 g l -1 ), såvel 
som for stærkt ladede stoffer som følge af, at koncentrationen i den vandige fase ikke kan bestemmes analytisk med tilstrækkelig 
nøjagtighed. I sådanne tilfælde må der træffes supplerende foranstalt ­
ninger. Vejledning i, hvordan sådanne problemer gribes an. er givet i de pågældende afsnit i denne metode.
 
Ved testning af flygtige stoffer må der drages omsorg for at undgå 
tab under behandlingen.  
1.7. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.7.1.  Apparatur og kemiske reagenser  
Standardlaboratorieudstyr, navnlig følgende:  
a) Glas eller beholdere til udførelse af forsøgene. Det er vigtigt, at 
disse glas eller beholdere:  
— passer direkte i centrifugen, for at fejl ved håndtering og 
overførsel kan begrænses til det mindst mulige  
— er fremstillet af ikke-reaktive materialer, således at adsorp ­
tionen af prøvestoffet på overfladen nedsættes til det mindst 
mulige.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) Til omrystning anvendes overhead-rystebord eller tilsvarende; 
rystebordet skal holde jorden opslæmmet under omrystningen.  
c) Centrifuge: helst af højhastighedstypen, f.eks centrifugalkraft 
> 3 000 g, temperaturkontrolleret, skal kunne fjerne partikler med diameter over 0,2 μm fra vandige opløsninger. Beholderne 
skal være tilproppet under omrystning og centrifugering for at 
undgå tab ved fordampning og væskespild; for at mindske adsorptionen på propperne bør deaktiverede propper anvendes, f.eks. teflonbelagte skruepropper.
 
d) Valgfrit: filtreringsapparat, sterile engangsfiltre med 0,2 μm pore­
størrelse. Filtermaterialet bør udvælges særligt nøje med henblik på at undgå ethvert tab af prøvestof på filtrene; til tungtopløselige prøvestoffer kan filtre af organisk materiale ikke anbefales.
 
e) Analyseudstyr, som er velegnet til måling af prøvestoffets 
koncentration.  
f) Laboratorievarmeskab, som kan holde temperaturer fra 103  o C til 
110  o C. 
1.7.2.  Karakterisering og udvælgelse af jord  
Jorden bør være karakteriseret ved tre parametre, som i hovedsagen 
anses for bestemmende for adsorptionskapaciteten: organisk kulstof ­
indhold, lerindhold og jordstruktur, samt pH. Som allerede nævnt (jf. »Område«) kan andre fysisk-kemiske jordegenskaber have betydning 
for et givet stofs adsorption/desorption og bør i så fald tages i 
betragtning.
 
Det har meget stor betydning, hvilke metoder der anvendes til karak ­
terisering af jorden, og disse kan have stor indflydelse på resulta ­
terne. Det anbefales derfor, at jordens pH måles i en opløsning af 
0,01 M CaCl  2 (dvs. den opløsning, der benyttes ved undersøgelse af 
adsorption/desorption) i henhold til den pågældende ISO-metode (ISO-10390-1). Ligeledes anbefales, at de øvrige relevante jordegen ­
skaber bestemmes efter standardmetoder (ISO Handbook of soil 
analysis); derved kan analysen af sorptionsdata baseres på globalt standardiserede jordparametre. Nogen vejledning vedrørende forelig ­
gende standardmetoder til jordanalyse og -karakterisering er givet i 
henvisning (50-52). Til kalibrering af metoderne til jordbundsanalyse 
anbefales brug af referencejordtyper.
 
Vejledning i udvælgelse af jord til adsorptions-/desorptionsforsøgene 
er givet i tabel 1. De syv udvalgte jordtyper er dem, man finder i 
tempererede geografiske områder. For ioniserbare stoffer bør de 
udvalgte jordtyper dække et bredt pH-område for at give mulighed for vurdering af adsorptionen af stoffet, når dette er henholdsvis ioniseret og uioniseret. Vejledning i, hvor mange forskellige jord ­
typer der skal undersøges i de forskellige trin af testen, findes under 
1.9. »Testens præstationer«.
 
Foretrækker man andre jordtyper, bør de være karakteriseret ved de 
samme parametre og have tilsvarende variation i egenskaber som 
dem, der er beskrevet i tabel 1, også selv om de ikke modsvarer 
kriterierne nøjagtigt.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabel 1  
Vejledning i valg af jordprøver til adsorption-desorption  
Jordtype pH-område (i 0,01 M 
CaCl  2 ) Organisk kulstofind ­
hold ( %) Lerindhold ( %) Jordstruktur (  1 ) 
1 4,5-5,5 1,0-2,0 65-80 clay 
2 > 7,5 3,5-5,0 20-40 clay loam 
3 5,5-7,0 1,5-3,0 15-25 silt loam 4 4,0-5,5 3,0-4,0 15-30 loam 5 < 4,0-6,0 (
 2 ) < 0,5-1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) loamy sand 
6 > 7,0 < 0,5-1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 clay loam/clay 
7 |< 4,5 > 10 < 10 sand/loamy sand  
( 1 ) I henhold til FAO og US-systemet (85). 
( 2 ) Værdierne af de respektive variable bør fortrinsvis ligge i det anførte område. Hvis det imidlertid er vanskeligt at 
finde passende jordmateriale, kan værdier under den anførte mindsteværdi godtages. 
( 3 ) For jordtyper med mindre end 0,3 % organisk kulstof kan sammenhængen mellem organisk kulstofindhold og 
adsorption være forstyrret. Det anbefales således at anvende jord med et organisk kulstofindhold på mindst 0,3 %.  
1.7.3.  Indsamling og opbevaring af jordprøver  
1.7.3.1.  Indsamling  
Der anbefales ikke bestemte prøveudtagningsmetoder eller -redska ­
ber; prøveudtagningsmetoden afhænger af undersøgelsens formål 
(53)(54)(55)(56)(57){58).  
Følgende bør tages i betragtning:  
a) Udførlige oplysninger om områdets historie er nødvendige, 
herunder beliggenhed, plantedække, behandling med pesticider og/eller gødning, biologisk tilvækst eller tilfældig forurening. Anbe ­
falingerne i ISO-standarden for jordprøvetagning (ISO 10381-6) bør 
følges med hensyn til beskrivelse af prøvetagningsstedet.
 
b) Prøvetagningsstedet skal være fastlagt ved UTM (universel trans ­
versal Mercator-projektion/europæisk horisontal datum) eller geogra ­
fiske koordinater; dette skulle gøre det muligt at genfinde en bestemt jordtype i fremtiden og kan være en hjælp ved bestemmelse af jorden 
efter forskellige klassifikationssystemer, som anvendes i andre lande. 
Endvidere må kun indsamles A-horisont til en maksimal dybde af 20 cm. Specielt gælder for jordtype n.7, at hvis en O
 h -horisont indgår 
i jorden, bør den medtages ved prøveindsamlingen.  
Jordprøverne bør transporteres i sådanne beholdere og under sådanne 
temperaturforhold, at der med sikkerhed ikke sker nævneværdige 
ændringer i jordens oprindelige egenskaber.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Opbevaring  
Der bør fortrinsvis anvendes jord, som er frisk optaget fra marken. 
Kun når dette ikke er muligt, bør jorden opbevares ved rumtempe ­
ratur i lufttørret tilstand. Der anbefales ingen grænse for opbevarings ­
tiden, men har jorden været opbevaret i over tre år, bør den før 
anvendelse genanalyseres for organisk kulstofindhold, pH og kation ­
bytningskapacitet.  
1.7.3.3.  Håndtering og klargøring af jordprøver til testen  
Jordprøverne lufttørres ved rumtemperatur (fortrinsvis ved 20-25  o C). 
Disaggregering bør foretages med mindst mulig kraft, således at den oprindelige jordstruktur ændres mindst muligt. Jordens sigtes til en 
partikelstørrelse ≤ 2 mm; ved sigtningen følges anbefalingerne i ISO- 
standarden for jordprøvetagning (ISO 10381-6). Skånsom homoge ­
nisering anbefales, da reproducerbarheden af resultaterne derved øges. Fugtindholdet i hver jordtype bestemmes på tre prøver ved 
opvarmning til 105
 o C, indtil vægten ikke længere ændrer sig 
væsentligt (ca. 12 h). I alle beregninger forstås ved masse af jord den ovntørrede masse, dvs. jordens vægt korrigeret for fugtindhold.
 
1.7.4.  Klargøring af prøvestof, som skal tilføres jorden  
Prøvestoffet opløses i 0,01 M CaCl  2 i destilleret eller deioniseret 
vand; CaCl  2 -opløsningen anvendes som vandig fase for at forbedre 
centrifugeringen og nedsætte kationbytningen til det mindst mulige. Stamopløsningens koncentration bør fortrinsvis være tre størrelses ­
ordener over detektionsgrænsen for den anvendte analysemetode. 
Denne grænse garanterer nøjagtige målinger med hensyn til de her anviste metoder; endvidere bør stamopløsningens koncentration være lavere end prøvestoffets opløselighed i vand.
 
Stamopløsningen bør fortrinsvis fremstilles umiddelbart før stoffet 
tilføres jordprøverne og bør opbevares tillukket og mørkt ved 
4 o C. Opbevaringstiden afhænger af prøvestoffets stabilitet og dets 
koncentration i opløsningen.  
Kun ved tungtopløselige stoffer (S  w < 10  -4 g l -1 ) kan det være nødven ­
digt at anvende et passende opløsningsmiddel, når prøvestoffet er vanskeligt at bringe i opløsning. For dette opløsningsmiddel gælder; a) det bør være blandbart med vand, som f.eks. methanol eller acetoni ­
tril; b) dets koncentration bør ikke være større end svarende til 1 % af 
stamopløsningens samlede rumfang og bør være mindre i den opløs ­
ning af prøvestof, som kommer i kontakt med jorden (helst under 0,1 %), og c) det bør ikke være overfladeaktivt eller indgå i lyolytiske 
reaktioner med prøvestoffet. Brug af opløsningsmiddel bør være 
angivet og begrundet i rapporteringen af data.
 
Et andet alternativ ved tungtopløselige stoffer er at tilsætte prøve ­
stoffet til prøvesystemet ved spiking: Prøvestoffet opløses i et orga ­
nisk opløsningsmiddel, og en lille del heraf tilsættes systemet bestå ­
ende af jord og 0,01 molær opløsning af CaCl  2 i destilleret eller 
deioniseret vand. Indholdet af organisk opløsningsmiddel i den 
vandige fase skal holdes så lavt som muligt, normalt ikke over 0,1 %. Spiking fra en organisk opløsning kan være behæftet med manglende reproducerbarhed af volumen. Derved kan der indføres en 
ekstra fejlkilde i forsøget, da koncentrationen af prøvestof og hjæl ­
peopløsningsmiddel ikke vil være den samme i alle test.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. BETINGELSER FOR UDFØRELSE AF ADSORPTIONS- 
/DESORPTIONSTESTEN  
1.8.1.  Analysemetode  
De vigtigste parametre, som kan påvirke nøjagtigheden af sorptions ­
målingerne, er nøjagtigheden af analysemetoden anvendt til både 
opløsningsfase og adsorberet fase, prøvestoffets stabilitet og renhed, om sorptionsligevægt opnås, hvor meget opløsningens koncentration ændrer sig, forholdet jord/opløsning og ændringer i 
jordstrukturen under ekvilibreringen (35)(59-62). Nogle eksempler 
med relevans for nøjagtigbedsproblematikken er givet i tillæg 2.
 
Pålideligheden af den anvendte analysemetode skal være kontrolleret 
i det koncentrationsområde, som forventes at optræde under testen. 
Eksperimentatoren bør ikke afholde sig fra selv at udvikle en 
velegnet metode med passende nøjagtighed, præcision, reproducer ­
barhed, detektionsgrænser og genfindingsgrad. Nedenfor er givet en forsøgsvejledning, som viser udførelsen af en sådan test.
 
Et passende rumfang 0,01 M CaCl  2 , f.eks. 100 cm  3 , omrystes i 4 h 
med en afvejet mængde jord, f.eks. 20 g, med stor adsoptionsevne, dvs. stort organisk kulstofindhold; der kan afviges fra de angivne vægtmængder og rumfang afhængigt af, hvad hensynet til analysen 
kræver, men et forhold jord/opløsning på 1:5 vil være et passende 
udgangspunkt. Blandingen centrifugeres, og den vandige fase kan eventuelt filtreres. Til den vandige fase tilsættes et bestemt rumfang af stamopløsningen af prøvestof, således at den nominelle 
koncentration når inden for det koncentrationsområde, der forventes 
at optræde under testen. Dette rumfang bør højst udgøre 10 % af den vandige fases endelige rumfang, for at forekvilibreringsopløsningens beskaffenhed skal ændres mindst muligt. Opløsningen analyseres.
 
Én blindprøve bestående af systemets jord + CaCl  2 -opløsning (uden 
prøvestof) skal indgå i analysen, for at man kan kontrollere, om analysemetoden medfører artefakter, og om jorden giver matrixvirk ­
ninger.
 
Til sorptionsmåling kan anvendes gas-væskekromatografi (GLC), 
high-performance væskekromatografi (HPLC), spektrometri (f.eks. GC/massespektrometri, HPLC/massespektrometri) og væskescintil ­
lationstælling (ved radioaktivt mærket prøvestof). Uanset den 
anvendte analysemetode anses det for passende, hvis der genfindes 
mellem 90 % og 110 % af den nominelle værdi. For at give mulighed for detektion og evaluering efter at adskillelse af faserne har fundet sted, bør analysemetodens detektionsgrænser være mindst 
to størrelsesordener under den nominelle koncentration.
 
Karakteristika og detektionsgrænser for den analysemetode, der er til 
rådighed for adsorptionsundersøgelserne, spiller en vigtig rolle ved fastlæggelse af testbetingelserne og testens samlede præstationer. I denne metode angives en generel forsøgsgang, medens der gives 
anvisninger og vejledning for alternative løsninger, hvor analyseme ­
tode og laboratoriefaciliteter kan sætte begrænsninger.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Valg af optimalt jord/opløsning-forhold  
Et passende jord til opløsning forhold for sorptionsundersøgelser 
vælges ud fra fordelingskoefficienten K  d og den ønskede relative 
adsorptionsgrad. Den statistiske nøjagtighed, med hvilken stoffets 
koncentration i opløsningen lader sig bestemme, er givet ved koncen ­
trationsændringen for stoffet i opløsningen, afhængigt af adsorptions ­
ligningens form og analysemetodens grænseværdi. I praksis er det derfor sædvanligvis nyttigt at bestemme sig for nogle få faste forhold, 
som giver en adsorptionsprocent på over 20 %, helst også > 50 % (62), 
samtidig med at man sørger for, at prøvestoffets koncentration i den vandige fase er høj nok til at kunne måles nøjagtigt. Dette er særlig vigtigt ved høje adsorptionsprocenter.
 
En bekvem måde at vælge passende jord/vandforhold på er at basere 
det på en skønnet K  d -værdi, enten fra de indledende forsøg eller fra 
tilnærmet beregning med en anerkendt metode (tillæg 3). Derefter kan et passende forhold jord/opløsning vælges ved afsætte en kurve 
over dette forhold som funktion af K
 d for fastlagte adsorptionspro ­
center (figur1). Ved optegning af kurven antages adsorptionslig ­
ningen lineær (  1 ). Det pågældende forhold findes ved at omordne 
ligning 4 for K  d i samme form som ligning 1:  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
eller i logaritmisk form, idet det forudsættes, at R = m  soil /V 0 og 
A eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Figur 1.  Sammenhæng mellem forholdet jord/opløsning og K  d ved forskellige adsorp ­
tionsprocenter for prøvestof.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K  d · C aq ads ðeqÞ:
 Figur 1 viser det ønskede jord/opløsningsforhold som funktion af K  d 
ved forskellige adsorptionsgrader. F.eks. fås med et forhold 
jord/opløsning på 1:5 og K  d = 20 en adsorption på ca. 80 %. For 
at få 50 % adsorption ved samme K  d -værdi skal forholdet være 
1:25. Denne måde at vælge passende jord/opløsningsforhold på 
giver undersøgeren den fleksibilitet, som er nødvendig under 
forsøgsomstændigheder.  
Vanskeligere at håndtere er de områder, hvor det kemiske stof udviser 
enten meget høj eller meget lav adsorption. I tilfælde af lav adsorption 
anbefales et jord/opløsningsforhold på 1:1, dog kan det for visse meget 
organiske jordtyper være nødvendigt med et lavere forhold for at få en vællinglignende konsistens. Der må vises omhu med analysemetoden ved måling af små ændringer i opløsningens koncentration; ellers vil 
adsorptionsmålingen blive unøjagtig. Hvis fordelingskoefficienten K
 d 
på den anden side er meget høj, kan man gå op til et forhold 
jord/opløsning på 1:100 for at en væsentlig del af det kemiske stof skal forblive i opløsningen. Der må dog sørges omhyggeligt for god 
opblanding, og man må give systemet tilstrækkelig tid til at ekvili ­
breres, En alternativ fremgangsmåde er at forudsige K
 d -værdien med 
teknikker til skønsvis beregning, f.eks. baseret på P  ow -værdier (tillæg 
3), Især kan dette være nyttigt for lavt adsorberede/polære kemiske 
stoffer med P  ow < 20 og for lipofile/stærkt sorptive kemiske stoffer 
med P  ow > 10  4 . 
1.9. TESTENS PRÆSTATIONER  
1.9.1.  Testbetingelser  
Alle forsøg udføres ved rumtemperatur, og om muligt ved konstant 
temperatur mellem 20  o C og 25  o C. 
Centrifugeringsbetingelserne skal gøre det muligt at fjerne partikler 
større end 0,2 μm fra opløsningen. Denne værdi medtager den 
mindste partikel, der betragtes som en faststofpartikel, og danner overgangen mellem faste og kolloide partikler. Vejledning for fast ­
læggelse af centrifugeringsbetingelserne findes i tillæg 4.
 
Kan centrifugeringsfaciliteterne ikke garantere fjernelse af partikler 
over 0,2 μm, kan man eventuelt kombinere centrifugeringen med 
filtrering med filtre med 0,2 μm porestørrelse. Sådanne filtre skal 
være fremstillet af passende inaktivt materiale for at undgå tab af 
prøvestof på dem. Under alle omstændigheder skal det være godt ­
gjort, at filtreringen ikke medfører tab af prøvestof.  
1.9.2.  Trin 1 — Indledende undersøgelse  
Formålet med den indledende undersøgelse er beskrevet i afsnittet 
»Område«. Vejledning for opsætning af en sådan test gives i forbin ­
delse med det nedenfor foreslåede forsøg.  
1.9.2.1.  Valg af optimalt forhold jord/opløsning  
Der anvendes to jordtyper og tre forskellige jord/opløsningforhold 
(seks enkeltforsøg). Den ene jordtype har højt organisk kulstofind ­
hold og lavt lerindhold, medens den anden har lavt organisk kulstof ­
indhold og højt lerindhold. Der foreslås følgende forhold:  
— 50 g jord til 50 cm  3 vandig opløsning af prøvestoffet (forhold 
1:1) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g jord til 50 cm  3 vandig opløsning af prøvestoffet (forhold 
1:5) 
— 2 g jord til 50 cm  3 vandig opløsning af prøvestoffet (forhold 
1:25).  
Den mindste mængde jord, som forsøget kan gennemføres på, 
afhænger af laboratoriefaciliteterne og præstationerne af de anvendte analysemetoder. Dog anbefales det at anvende mindst 1 g, og helst 
2 g for at få pålidelige resultater af testen.
 
Én kontrolprøve, alene indeholdende prøvestof i 0,01 M CaCl  2 - 
opløsning (ingen jord), underkastes nøjagtig de samme procedurer som prøvesystemerne for at kontrollere prøvestoffets stabilitet i CaCl
 2 -opløsning og dets eventuelle adsorption på overfladen af 
prøvekarrene.  
For hver jordtype gennemføres samme testprocedure på en blind ­
prøve med samme jordmængde og et totalt rumfang på 50 cm
 3 0,01 M CaCl  2 -opløsning (uden prøvestof). Blindprøven 
tjener til baggrundskontrol under analysen med henblik på at 
opdage forstyrrende stoffer eller forurenet jord.  
Alle forsøgene, herunder kontrol- og blindforsøg, skal udføres mindst 
som dobbeltforsøg. Det samlede antal prøver, som skal fremstilles til forsøget, kan beregnes ud fra den metode, der skal anvendes.
 
Sædvanligvis benyttes samme metoder ved forundersøgelsen og 
hovedundersøgelsen; undtagelser herfra nævnes i givet fald.  
Dagen før forsøgsdagen ekvilibreres de lufttørrede jordprøver ved 
omrystning med et mindsterumfang på 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 natten 
over (12 h). Derefter tilsættes et bestemt rumfang af stamopløsningen af prøve-stoffet, således at det endelige rumfang justeres til 50 cm
 3 . 
Dette tilsatte rumfang stamopløsning: a) må ikke være over 10 % af 
det endelige rumfang på 50 cm  3 af den vandige fase for ikke at 
ændre beskaffenheden af forekvilibreringsopløsningen mere end nødvendigt, og b) bør fortrinsvis resultere i, at den prøveopløsning, 
som er i kontakt med jorden (C
 0 ), har en begyndelseskoncentration 
mindst to størrelsesordener over detektionsgrænsen for analysemeto ­
den; denne grænse sikrer, at der kan foretages nøjagtige målinger, selv når der optræder stærk adsorption (> 90 %), og giver mulighed 
for senere bestemmelse af adsorptionsisotermerne. Ligeledes anbe ­
fales det, at begyndelseskoncentrationen af det undersøgte stof (C
 0 ) 
ikke er større end halvdelen af dets opløselighed.  
Nedenfor er givet et eksempel på, hvordan stamopløsningens 
koncentration (C  st ) beregnes. Det antages, at detektionsgrænsen er 
0,01 μg cm  -3 , og at adsorptionen er 90 %; begyndelseskoncentra ­
tionen af prøvestoffet, som er i kontakt med jorden, bør derfor helst være 1 μg cm
 -3 (to størrelsesordener over detektionsgrænsen). Når 
det forudsættes, at der tilsættes det anbefalede maksimale rumfang 
stamopløsning, dvs. 5 cm  3 til 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 ekvilibrerings ­
opløsning (= 10 % stamopløsning i 50 cm  3 samlet vandigt rumfang), 
bør koncentrationen af stamopløsningen være 10 μg cm  -3 , altså tre 
størrelsesordener over detektionsgrænsen for analysemetoden.  
pH af den vandige fase bør måles før og efter kontakt med jorden, da 
den spiller en vigtig rolle i hele adsorptionsprocessen, navnlig for 
ioniserbare stoffer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Blandingen omrystes godt, indtil adsorptionsligevægt er nået. Lige ­
vægtstiden i jord er stærkt varierende og afhænger af det kemiske 
stof og af jorden; et tidsrum på 24 h er sædvanligvis tilstrækkeligt (77). I forundersøgelsen kan prøverne udtages sekventielt gennem en omrystningsperiode på 48 h (f.eks. 4. 8, 24, 48 h). Analysetidspunk ­
terne bør dog opfattes fleksibelt under hensyntagen til laboratoriets 
arbejdsplan.
 
For analyse af prøvestoffet i den vandige opløsning er der to valg ­
muligheder: a) den parallelle metode og b) den sekventielle metode. Det må understreges, at skønt den parallelle metode er forsøgsmæs ­
sigt mere langstrakt, er den matematiske behandling af resultaterne 
enklere (tillæg 5). Hvilken metode man vil vælge, er imidlertid op til 
eksperimentatoren, som må tage hensyn til de forhåndenværende laboratoriefaciliteter og ressourcer.
 
a) Den parallelle metode: Der fremstilles prøver med ens jordopløs ­
ningforhold, idet antal prøver skal være lig det antal tidsinter ­
valler, hvori adsorptionskinetikken ønskes undersøgt. Efter centri ­
fugering og (om ønsket) filtrering opsamles den vandige fase i 
første prøveglas så fuldstændig som muligt og måles efter f.eks. 4 h, væsken i det andet prøveglas efter 8 h, i det tredje prøveglas efter 24 h osv.
 
b) Den sekventielle metode: Der fremstilles kun en dobbeltprøve for 
hvert forhold jordopløsning. Ved fastlagte tidsintervaller centrifu ­
geres blandingen for at skille faserne. En lille prøve af den 
vandige fase analyseres straks for prøvestof; derefter fortsætter forsøget med den oprindelige blanding. Filtreres der efter centri ­
fugeringen, bør laboratoriet have de nødvendige faciliteter til 
filtrering af små vandige prøver. Det anbefales, at det samlede 
rumfang af de udtagne prøver ikke udgør over 1 % af opløsnin ­
gens samlede rumfang, således at man ikke ændrer forholdet jordopløsning væsentligt og nedsætter massen af opløst stof, 
som er til rådighed for adsorption under testen.
 
Adsorptionsprocenten  A  t i beregnes for hvert tidspunkt (t  i ) på 
grundlag af den nominelle begyndelseskoncentration og den målte 
koncentration på prøvetagningstidspunktet (t  i ), korrigeret for blind ­
værdien. Grafer over som  A t i -funktion af tiden (Figur 1, tillæg 5) 
optegnes for at vurdere, om der er nået et ligevægtsplateau (  1 ). K  d - 
værdien ved ligevægt beregnes ligeledes. På grundlag af denne 
K d -værdi vælges passende forhold jord/opløsning i figur 1, således 
at adsorptionsprocenten kommer over 20 %, og helst > 50 % (61). Alle de pågældende ligninger og principper for grafisk afbildning er 
givet i afsnittet om data og rapportering i tillæg 5.
 
1.9.2.2.  Bestemmelse af ekvilibreringstid for adsorptionen og mængde prøve ­
stof adsorberet ved ligevægt  
Som nævnt giver grafer over  A t i eller C aq ads som funktion af tiden 
mulighed for vurdere, om der er nået adsorptionsligevægt, samt den adsorberede mængde prøvestof ved ligevægt. Figur 1 og 2 i tillæg 5 viser eksempler på sådanne afbildninger. Ekvilibreringstiden er den 
tid, systemet behøver for at nå et plateau.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Kurver over koncentrationen af prøvestof i den vandige fase  C  aq ads Ê Ì  
som funktion af 
tiden kunne også anvendes til at vurdere, om der nås et ligevægtsplateau (se fig. 2 i 
tillæg 5).
 Hvis der med en given jord ikke nås et plateau, men fås en konstant 
stigende værdi, kan det skyldes komplicerende faktorer som biologisk 
nedbrydning eller langsom diffusion. Biologisk nedbrydning kan påvises ved, at forsøget gentages med en steriliseret prøve af jorden. Hvis der heller ikke i dette tilfælde nås et plateau, bør eksperimenta ­
toren søge efter andre fænomener, som kan tænkes at gøre sig 
gældende i netop hans undersøgelser; dette kan ske gennem passende ændringer af forsøgsbetingelserne (temperatur, omrystningstid, jord/opløsningforhold). Det er op til eksperimentatoren at afgøre, om 
testen skal fortsættes, uanset at det måske ikke lykkes at nå ligevægt.
 
1.9.2.3.  Adsorption af prøvestof på overfladen af prøvebeholderne og prøve ­
stoffets stabilitet  
Ved at analysere kontrolprøverne kan man skaffe sig en del oplys ­
ninger om prøvestoffets adsorption på overfladen af prøvebeholderne 
samt dets stabilitet. Hvis der iagttages en udtynding, som er større end svarende til middelfejlen på analysemetoden, kan der være tale om abiotisk nedbrydning og/eller adsorption på overfladen af prøve ­
glassene. Man vil kunne skelne mellem disse to fænomener ved at 
vaske prøveglassets vægge grundigt med et kendt volumen af et passende opløsningsmiddel og derefter analysere vaskeopløsningen for prøvestoffet. Hvis der ikke konstateres adsorption af prøvestof på 
overfladen af prøveglassene, er udtyndingen et bevis på abiotisk 
ustabilitet af prøvestoffet. Hvis der findes adsorption, må der anvendes prøveglas af andet materiale. De af dette forsøg afledte oplysninger om adsorption af prøvestof på overfladen af prøveglas ­
sene kan imidlertid ikke overføres direkte til jord/opløsningforsøget. 
Tilstedeværelsen af jord vil indvirke på denne adsorption.
 
Supplerende oplysninger om prøvestoffets stabilitet kan fås ved 
bestemmelse af massebalancen for moderstoffet i tid. Dette indebæ ­
rer, at den vandige fase, ekstrakterne af jord samt prøvekammerets vægge analyseres for prøvestof. Forskellen mellem massen af tilsat 
prøvestof og summen af masserne af prøvestof i den vandige fase, 
ekstrakterne fra jord og fra prøveglassets vægge er lig den masse, som er nedbrudt og/eller fordampet og/eller ikke ekstraheret. For at massebalancen kan beregnes, bør der være nået adsorptionsligevægt 
inden for forsøgsperioden.
 
Massebalancen beregnes for begge jordprøver og for ét 
jord/opløsningforhold for hver jordtype, som giver en udtynding over 
20 % og helst > 50 % ved ligevægt. Når forsøget til fastlæggelse at forholdet jord/opløsning er fuldført med analyse af den sidste prøve af den vandige fase efter 48 h, adskilles faserne ved centrifugering og, om 
ønsket, filtrering. Der opsamles så meget som muligt af den vandige fase, 
og til jorden tilsættes et passende ekstraktionsopløsningsmiddel (eks ­
traktionskoefficient mindst 95 %) for at ekstrahere prøvestoffet. Det anbefales at foretage mindst to på hinanden følgende ekstraktioner. 
Mængden af prøvestof i ekstrakterne fra jord og prøveglas bestemmes, 
og massebalancen beregnes (ligning 10, data og rapportering). Hvis den er mindre end 90 %, regnes prøvestoffet for ustabilt inden for testperio ­
den. Undersøgelserne kan dog i så tilfælde fortsættes, idet der tages 
hensyn til prøvestoffets ustabilitet; det anbefales da at analysere begge 
faser i hovedundersøgelsen.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4.  Trin 2 — Adsorptionskinetik ved én prøvestofkoncentration  
Der anvendes fem jordtyper, udvalgt fra tabel 1. Det vil være en fordel, 
hvis nogle af eller alle de anvendte jordtyper fra forundersøgelsen i givet fald er med blandt disse fem jordtyper. Derved undgår man at 
gentage trin 2 for de jordtyper, der er anvendt i forundersøgelsen.
 
Ekvilibreringstiden, forholdet jord/opløsning, jordprøvens vægt, 
rumfanget af vandig fase i berøring med jorden og prøvestoffets koncen ­
tration i opløsningen vælges på grundlag af resultaterne af forundersø ­
gelsen. Analyse bør helst finde sted efter ca. 2, 4, 6, 8 (eventuelt også 10) og 24 h kontakttid: omrystningstiden kan strækkes til højst 48 h i tilfælde af, at prøvestoffet kræver længere ekvilibreringstid ud fra de resultater, 
der danner grundlag for fastlæggelse af opblandingsforholdet. Analyse ­
tidspunkterne bør dog opfattes fleksibelt.
 
Hvert forsøg (ét med jord og ét med opløsning) gennemføres mindst 
som dobbeltforsøg, for at resultaternes overensstemmelse kan vurde ­
res. I hvert forsøg skal indgå én blindprøve. Denne består af jord og 0,01 M CaCl
 2 opløsning uden stofprøve og med henholdsvis vægt 
og rumfang identisk med forsøgets. En kontrolprøve, alene indehol ­
dende prøvestof i 0,01 M CaCl  2 -opløsning (uden jord) underkastes 
samme testprocedure for at sikre mod det uventede.  
Adsorptionsprocenten beregnes for hvert tidspunkt  A t i og/eller tids ­
interval  A Δt i (afhængigt af behov) og afsættes mod tiden. Desuden 
beregnes fordelingskoefficienten K  d ved ligevægt og den normalise ­
rede adsorptionskoefficient K  oc for organisk kulstof (for upolære 
organiske stoffer).  
Resultaterne af adsorptionskinetikforsøget  
Den lineære K  d -værdi giver sædvanligvis en nøjagtig beskrivelse af 
sorptionsforholdene i jord (35)(78) og er et udtryk for den iboende 
mobilitet af kemiske stoffer i jord. For eksempel anses kemiske 
stoffer med K  d ≤ 1 cm  3 g –1 sædvanligvis for kvalitativt mobile. 
Tilsvarende har MacCall et al. (16) opstillet et system til opdeling efter mobilitet, baseret på K
 oc -værdier. Endvidere findes der klas ­
sifikationssystemer for udvaskning, baseret på sammenhængen 
mellem K  oc og DT-50 (  1 ) (32)(79).  
1 henhold til fejlanalyseundersøgelser (61) kan K  d -værdier under 
0,3 cm  3 g -1 desuden ikke beregnes nøjagtigt ud fra et fald i koncen ­
trationen i den vandige fase, selv når der anvendes det (fra en nøjagtighedssynsvinkel) gunstigste forhold jord/opløsning, dvs. 1:1. I så tilfælde anbefales det analysere begge faser — jord og 
opløsning.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: den tid, der forløber, til 50 % af prøvestoffer er nedbrudt.
 Vedrørende ovenstående bemærkninger anbefales det. at undersø ­
gelsen af adsorptionsforholdene for et kemisk stof i jord og dets 
potentielle mobilitet fortsættes med bestemmelse af Freundlich- adsorptionsisotermer for disse systemer, for hvilke K
 d kan 
bestemmes nøjagtigt ved brug af forsøgsprotokollen i denne testme ­
tode. Nøjagtig bestemmelse er mulig, såfremt multiplikation af K  d 
med forholdet jord/opløsning giver en værdi > 0,3, når målingerne 
baseres på koncentrationsfaldet i den vandige fase (indirekte meto ­
de), hhv. > 0,1 når begge faser analyseres (direkte metode) (61).  
1.9.2.5.  Trin 3 — Adsorptionsisotermer og desorptionskinetik/ 
desorptionsisotermer  
1.9.2.5.1. A d s o r p t i o n s i s o t e r m e r  
Der anvendes fem prøvestofkoncentrationer, helst således at de 
spænder over to størrelsesordener; valg af disse koncentrationer bør ske på grundlag af vandopløseligheden og den resulterende lige ­
vægtskoncentration i vand. For hver jordtype bør anvendes samme 
forhold jord/opløsning i hele undersøgelsen. Adsorptionstesten 
udføres som ovenfor beskrevet, blot med den forskel, at den vandige fase kun analyseres én gang efter forløb af den nødvendige tid til indtræden af ligevægt som tidligere bestemt i trin 
2. Ligevægtskoncentrationerne i opløsningen bestemmes, og den 
adsorberede mængde beregnes enten ud fra svindet af prøvestof i opløsningen eller ved hjælp af den direkte metode. Den adsorberede masse pr. masseenhed jord afsættes som funktion af ligevægtskon ­
centrationen af prøvestoffet (se »Data og rapportering«).
 
Resultater af bestemmelsen af adsorptionsisotermer  
Af de matematiske adsorptionsmodeller, som hidtil er foreslået, er 
Freundlich-isotermen den oftest anvendte til beskrivelse af adsorp ­
tionsprocesser. Mere udførlige oplysninger om fortolkning og betyd ­
ning af adsorptionsmodeller er givet i henvisning (41)(45)(S0)(81)(S2).  
Anmærkning:  Det skal nævnes, at man ikke kan sammenholde 
værdierne af K  F (Freundlich-adsorptionskoefficienten) for forskellige 
stoffer, medmindre de pågældende K  F -værdier udtrykkes i samme 
enheder (83).  
1.9.2.5.2. D e s o r p t i o n s k i n e t i k  
Formålet med dette forsøg er at undersøge, om et kemisk stof adsor ­
beres reversibelt eller irreversibelt til en jordtype. Denne oplysning er vigtig, da også desorptionsprocessen spiller en vigtig rolle for et kemisk stofs opførsel i jord på en given lokalitet. Desuden er desorp ­
tionsdata nyttige som inddata for computermodeller af et stofs 
udvaskning og afstrømning i opløst form. Ønskes en desorptions ­
undersøgelse, anbefales det at udføre nedenstående undersøgelse på hvert system, for hvilket det var muligt at bestemme K
 d nøjagtigt i 
det foregående adsorptionskinetikforsøg.  
Ligesom for adsorptionskinetikundersøgelsen kan der vælges: a) den 
parallelle metode og b) den sekventielle metode. Valg af metode er 
op til eksperimentatoren, som må tage hensyn til de forhåndenvæ ­
rende laboratoriefaciliteter og ressourcer.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Den parallelle metode: For hver jordtype, som udvælges til 
desorptionsundersøgelsen, fremstilles prøver med ens 
jord/opløsning forhold, således at antal prøver er lig det antal tidsintervaller, hvori adsorptionskinetikken ønskes undersøgt. Tidsintervallerne bør helst være de samme som i adsorptionskine ­
tikforsøget; dog kan den samlede tid om nødvendigt forlænges, 
for at systemet kan nå desorptionsligevægt. I hvert forsøg (én jordtype, én opløsning), køres én blindprøve. Blindprøven består af jord og 0,01 M CaCl
 2 -opløsning uden stofprøve og 
med henholdsvis vægt og volumen identisk med forsøgets. Som 
kontrolprøve underkastes prøvestof i 0,01 M CaCl  2 -opløsning 
(uden jord) samme testprocedure. Alle blandingerne af jord og opløsning omrystes, til adsorptionsligevægt er nået {som tidligere 
bestemt i trin 2). Derefter adskilles faserne ved centrifugering, og 
den vandige fase fjernes så fuldstændigt som muligt. Det fjernede rumfang væske erstattes af samme rumfang 0,01 M CaCl
 2 uden 
prøvestof, og de nye blandinger omrystes igen. Den vandige fase 
i første prøveglas opsamles så fuldstændig som muligt og måles 
efter f.eks. 2 h, væsken i det andet prøveglas efter 4 h, i det tredje prøveglas efter 6 h, osv., indtil desorptionsligevægt er nået.
 
b) Den sekventielle metode: Efter adsorptionskinetikforsøget centri ­
fugeres blandingen, og den vandige fase fjernes så fuldstændigt som muligt. Det fjernede rumfang væske erstattes af samme rumfang 0,01 M CaCl
 2 uden prøvestof. Den nye blanding omry ­
stes, indtil desorptionsligevægt er nået. I dette tidsrum centrifu ­
geres blandingen ved fastlagte tidsintervaller, så faserne adskilles. En lille prøve af den vandige fase analyseres straks for prøvestof; derefter fortsætter forsøget med den oprindelige blanding. 
Rumfanget af hver enkelt prøve skal være mindre end 1 % af 
det samlede rumfang. Der tilsættes samme mængde frisk frem ­
stillet 0,01 M CaCl
 2 -opløsning til blandingen for at bevare 
uændret forhold mellem jord og opløsning, og omrystningen fort ­
sætter indtil næste tidsinterval.  
Adsorptionsprocenten beregnes for hvert tidspunkt ( ðD t i Þ) og/eller 
tidsinterval (ðD Δt i Þ) (afhængigt af, hvad undersøgelsen kræver) og 
afsættes mod tiden. Desorptionskoefficienten K  des ved ligevægt 
beregnes ligeledes. Alle de ligninger, som skal anvendes, er givet i afsnittet »Data og rapportering« og i tillæg 5.
 
Resultater af desorptionskinetikforsøget  
Fælles afbildninger af desorptionsprocenten  D t i og adsorptionspro ­
centen  A t i som funktion af tiden giver mulighed for at at vurdere 
adsorptionsprocessens reversibilitet. Hvis desorptionsligevægt nås. 
selv om det tager dobbelt så lang tid som at nå adsorptionsligevægt, 
og hvis den samlede desorption udgør over 75 % af den adsorberede mængde, anses adsorptionen for reversibel.
 
1.9.2.5.3. D e s o r p t i o n s i s o t e r m e r  
Freundlich-desorptionsisotermer bestemmes for de jordtyper, som 
anvendes i forsøget til bestemmelse af adsorptionsisotermer. Desorp ­
tionstesten udføres som beskrevet i afsnittet »Desorptionskinetik«, 
blot med den forskel, at den vandige fase kun analyseres én gang, 
ved desorptionsligevægt. Den samlede masse desorberet prøvestof beregnes. Indholdet af prøvestof, som stadig er adsorberet til jorden ved desorptionsligevægt, afsættes som funktion af ligevægts ­
koncentrationen af prøvestoffet i opløsningen (se »Data og rappor ­
tering« samt tillæg 5).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
Analysedata fremlægges i tabelform (se tillæg 6). Enkeltmålinger og 
beregnede gennemsnit angives. Der gives grafiske fremstillinger af adsorptionsisotermerne. Beregningerne foretages som nedenfor 
beskrevet.
 
I forsøget sættes vægten af 1 cm  3 vandig opløsning til 1 g. Forholdet 
jord/opløsning kan angives i enheder w/w eller w/vol. med samme 
talværdi.  
2.1. ADSORPTION  
Adsorptionen ( A t i ) defineres som den procentdel af det fra forsøgets 
begyndelse tilstedeværende stof, som adsorberes på jorden under de 
givne forsøgsbetingelser. Såfremt prøvestoffet er stabilt og ikke i 
nævneværdig grad adsorberes til beholderens væg, beregnes adsorp ­
tionsprocenten  A t i til hvert af tidspunkterne t  i efter ligningen:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
hvor:  
A t i = adsorptionsprocent til tiden t  i ( %) 
m s ads ðt i Þ = masse af prøvestof adsorberet til jorden til tiden t  i (μg) 
m 0 = masse af prøvestof i prøveglasset ved prøvens begyn ­
delse (μg). 
Udførlige oplysninger om, hvordan den procentuelle adsorption  A t i beregnes ved brug af den parallelle og sekventielle metode, findes i 
tillæg 5.  
Fordelingskoefficienten K  d er forholdet mellem indholdet af stoffet i 
jordfasen og massekoncentrationen af stoffet i den vandige opløsning under testbetingelserne efter indtræden af ligevægt.
 
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
hvor:  
C s ads ðeqÞ = indhold af stof adsorberet på jorden ved adsorptions ­
ligevægt ( μg g  -1 ) 
C aq ads ðeqÞ = massekoncentration af stof i vandig fase ved adsorp ­
tionsligevægt ( μg cm  -3 ). Koncentrationen bestemmes 
ved analyse under hensyntagen til resultaterne af blindprøverne
 
m s ads ðeqÞ = masse af stof adsorberet på jorden ved adsorptions ­
ligevægt ( μg) 
m aq ads ðeqÞ = masse af stof i opløsningen ved adsorptionsligevægt 
(μg) 
m soil = mængde jordfase, angive; som tor masse af jord (g)  
V 0 = begyndelsesrumfang af vandig fase i kontakt med 
jorden (cm  3 ). 
Forholdet mellem A  eq og K  d er givet ved;  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
hvor:  
A eq = adsorptionsprocent ved adsorptionsligevægt, %.  
Den normaliserede adsorptionskoefficient for organisk kulstof K  oc 
angiver sammenhængen mellem fordelingskoefficienten K  d og jord­
prøvens organiske kulstofindhold:  
K oc ¼ K d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
hvor:  
% oc = procentdel organisk kulstof i jordprøven (g g  -1 ). 
K oc -koefficienten angiver ved én enkelt værdi fordelingen af hoved ­
sagelig ikke-polære organiske stoffer mellem organisk kulstof i jord 
eller slam og vand. Adsorptionen af sådanne kemiske stoffer er korreleret med det organiske indhold af det sorberende faste stof (7); således afhænger K
 oc -værdierae af de særlige karakteristika af 
humusfraktionerne, hvis sorptionsevne afviger betydeligt som følge 
af forskelle i oprindelse, tilblivelse osv.  
2.1.1.  Adsorptionsisotermer  
Freundlich-adsorptionsisotermligningen giver sammenhængen 
mellem den adsorberede mængde prøvestof og koncentrationen af 
opløst prøvestof ved ligevægt (ligning 8).  
Data behandles som angivet under »Adsorption«, og for hvert prøve ­
glas beregnes indholdet af prøvestof adsorberet på jorden efter 
adsorptionstesten  C s ads ðeqÞ) (andetsteds betegnet x/m). Det antages, 
at der er indtrådt ligevægt, og at  C s ads ðeqÞ udtrykker ligevægtsvær ­
dien:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i
: V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
Freundlich-adsorptionsligningen er vist i (8):  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
eller, på lineær form:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
hvor:  
K F ads = Freundlich-adsorptionskoefficient; den har kun 
dimensionen cm  3 g -1 , såfremt l/n = 1: i alle andre tilfælde 
indføres hældningen l/n i dimensionen af  K F ads (μg 1-1/n 
(cm  31/n g -1 ) 
n = regressionskonstant; l/n ligger sædvanligvis i intervallet 
0,7-1,0, hvilket viser, at sorptionsdata ofte er let ulineære.  
Ligning 8 og 9 afsættes, og værdierne af  K F ads og l/n beregnes ved 
regressionsanalyse ved anvendelse af ligning 9. Korrelat ­
ionskoefficienten r  2 for den logaritmiske ligning beregnes ligeledes. Et 
eksempel på sådanne afbildninger er givet i figur 2.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Fig. 2.  Freundlich adsoprtionskurve, normal og lineariseret.  
2.1.2.  Massebalance  
Massebalancen (MB) defineres som den procentdel af den nominelle 
mængde stof ved testens begyndelse, som kan genfindes analytisk efter en adsorptionstest.
 
Behandlingen af data vil afvige, hvis det opløste stof er fuldstændig 
blandbart med vand. For opløsningsmidler blandbare med vand kan man ved at behandle data som beskrevet under »Desorption« bestemme den mængde stof, som genfindes ved ekstraktion med 
opløsningsmiddel. Er opløsningsmidlet mindre blandbart med vand, 
må den genfundne mængde bestemmes.
 
Beregning af massebalancen MB for adsorption: leddet (m  E ) antages 
at svare til den samlede masse prøvestof ekstraheret af jorden og fra 
prøveglassets overflade med organisk opløsningsmiddel:  
MB ¼ V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
hvor:  
MB = massebalance ( %)  
m E = samlet masse prøvestof ekstraheret fra jord og prøveglas ­
sets vægge i to trin ( μg) 
C 0 = initial massekoncentration af prøveopløsning i berøring 
med jorden (ug cm  -3 ) 
V rec = rumfang supernatant, som er opsamlet efter indtræden af 
adsorptionsligevægt (cm  -3 ). 
2.2. DESORPTION  
Desorptionen (D) defineres som den procentdel af den tidligere 
adsorberede stofmængde, som desorberes under forsøgsbetingelserne:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ ·100ð%Þ (11) 
hvor:  
D t i = desorptionsprocent til tidspunktet t  i ( %) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = masse af prøvestof desorberet fra jorden til tiden t  i (μg) 
m s ads ðeqÞ = masse af prøvestof adsorberet til jorden ved adsorp ­
tionsligevægt ( μg). 
Udførlige oplysninger om, hvordan desorptionsprocenten  D  
t i 
beregnes ved brug af den parallelle og sekventielle metode, er 
givet i tillæg 5.  
Den tilsyneladende desorptionskoefficient (K  des ) er forholdet mellem 
indholdet af resterende stof i jordfasen og massekoncentrationen af 
desorberet stof i den vandige opløsning under testbetingelserne efter 
indtræden af desorptionsligevægt:  
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 ·g -1 ) (12) 
hvor:  
K des = desorptionskoefficient (cm  3 g -1 ) 
m aq des ðeqÞ = samlet masse af prøvestof desorberet fra jorden ved 
desorptionsligevægt ( μg) 
V T = samlet masse af vandig fase i kontakt med jorden 
under desorptionskinetikforsøget (cm  3 ). 
Vejledning tor beregning af  m aq des ðeqÞ (eq) findes i tillæg 5 under 
overskriften »Desorption«.  
Bemærkning:  
Hvis den efterfølgende adsorptionstest blev udført med den parallelle 
metode, sættes rumfanget V  T i ligning 12 lig V  0 . 
2.2.1.  Desorptionsisotermer  
Freundlich-ligningen for adsorptionsisotermer udtrykker sammen ­
hængen mellem den mængde prøvestof, som stadig er absorberet på jorden, og koncentrationen af prøvestof ved desorptionsligevægt 
(ligning 16).
 
For hvert prøveglas beregnes indholdet af prøvestof, som stadig er 
adsorberet til jorden ved desorptionsligevægt, på følgende måde:  
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞ defineres som:  
m aq des ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ · V 0 
V r F Ä m aq A (μg) (14) 
hvor:  
C s des ðeqÞ = indhold af prøvestof, som ved desorptionsligevægt 
stadig er adsorberet til jorden ( μg g -1 ) 
m m des ðeqÞ = masse af stof, som er bestemt analytisk i den vandige 
fase ved desorptionsligevægt ( μg) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = masse af prøvestof, som på grund af ufuldstændig 
volumenudskiftning er tilbage efter indtræden af 
adsorptionsligevægtt ( μg) 
m aq des ðeqÞ = masse af stof i opløsningen ved adsorptionsligevægt 
(μg) 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ·ð V 0 Ä V R 
V 0 Þ (15) 
V r F = rumfang opløsning, som ved desorptionsligevægt er udtaget 
af prøveglasset med henblik på bestemmelse af prøvestof 
(cm  3 ) 
V R = rumfang supernatant, som efter opnåelse af adsorptionslige ­
vægt er fjernet fra prøveglasset og erstattet af samme 
rumfang 0,01 M CaCl  2 -opløsning (cm  3 ). 
Freundlich-desorptionsligningen er vist i (16):  
C s des ðeqÞ ¼ K F des ·C aq des ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
eller, på lineær form:  
logC  s des ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n·logC  aq des ðeqÞ (17) 
hvor:  
K F des = Freundlich-desorptionskoefficient  
n = regressionskonstant  
C aq des ðeqÞ = massekoncentration af stof i vandig fase ved desorp ­
tionsligevægt ( μg cm  -3 ). 
Ligningerne 16 og 17 kan afsættes grafisk, og værdien af  K F des og l/n 
beregnes ved regressionsanalyse ved anvendelse af ligning 17.  
Bemærkning:  
Hvis Freundlich-adsorptions- eller desorptionseksponenten l/n er lig 
1, vil Freundlich-bindingskonstanten for adsorption eller desorption 
(K F ads og K F des ) være lig ligevægtskonstanterne (K  d og K  des ) for 
henholdsvis adsorption og desorption, og ved afbildning af C  s mod 
C aq fås en ret linje. Er eksponenterne forskellige fra 1, bliver en 
afbildning af C  s som funktion af C  aq ulineær, og adsorptions- og 
desorptionskonstanterne vil ændre sig langs isotermerne.  
2.2.2.  Testrapport  
Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:  
a) fuldstændig identifikation af de anvendte jordprøver, med angi ­
velse af:  
b) stedsbestemmelse for lokaliteten (bredde og længde)  
c) prøveindsamlingsdato  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
d) anvendelsesmønster (f.eks. landbrugsjord, skov osv.)  
e) dybde af prøvetagning  
f) sand-/silt-/lerindhold  
g) pH-værdi (i 0,01 M CaCl  2 ) 
h) organisk kulstofindhold  
i) indhold af organisk stof  
j) kvælstofindhold  
k) C/N-forhold  
l) kationbytningskapacitet (mmol/kg)  
m) udtømmende oplysninger om indsamling og opbevaring af jord ­
prøver  
n) når det er hensigtsmæssigt, alle relevante oplysninger til fortolk ­
ning af prøvestoffets adsorption/desorption  
o) henvisninger, som angiver de metoder, der er anvendt til bestem ­
melse af hver parameter  
p) oplysninger om prøvestoffet, hvis det er hensigtsmæssigt  
q) forsøgstemperaturen  
r) centrifugeringsbetingelser  
s) analysemetode anvendt til analyse af prøvestoffet  
t) begrundelse af enhver brug af opløsningsmiddel til fremstilling 
af stamopløsningen af prøvestoffet  
u) forklaring af eventuelle korrektioner foretaget i beregningerne  
v) data i henhold til formularbladet (tillæg 6) og grafiske fremstil ­
linger  
w) alle oplysninger og bemærkninger, som kan være til hjælp ved 
fortolkning af testresultaterne.  
3. HENVISNINGER  
(1) Kukowski H. and Brummer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part II.
 
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of 
Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.
 
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. januar 1995 (June 1995).
 
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate. Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/ Desorption Isotherm. EPA No: 71 2-C-96-048, April 1996.
 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
 
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.
 
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agric ­
ulture and Forestry, Braunschweig, Germany.  
(12) Calvet R., (1989), »Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils«, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour 
in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
 
(13) Calvet R., (1980), »Adsorption-Desorption Phenomena« in 
Interactions between herbicides and the soil, (R. . Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.
 
(14) Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments' in Reactions and 
Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science 
Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31-44.
 
(15) van Genuchten M.Th., Davidson J. M., and Wierenga P.J., 
(1974), »An evaluation of kinetic and equilibrium equations 
for the prediction of pesticide movement through porous 
media«. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), pp. 29-35.  
(16) McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger 
H.J., (1981), »Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate 
analysis«, in Test Protocols for Environmental Fate and Move ­
ment of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
 
(17) Lambert S.M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), 
»Movement and sorption of chemicals applied to the soil«. 
Weeds, 13, pp. 185-190.  
(18) Rhodes R.C, Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) »Determina ­
tion of mobility and adsorption of agrochemicals in soils«. J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524-528.
 
(19) Russell M.H., (1995), »Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil« in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney), John Wiley & 
Sons Ltd.  
(20) Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk 
J.W. and Holland P.T., (1988), »Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides«, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
pp. 901-932.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), »Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils«. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
 
(22) Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967), »Persistence of 
herbicides in soil«. J. Sci. Fd Agric, 18, pp. 269-273.  
(23) Burkhard N., and Guth J.A., (1981), »Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkyiamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption«, Pestic. 
Sci. 12, pp. 45-52.
 
(24) Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977), »Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological availa ­
bility of soil-applied pesticides«. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961-971.
 
(25) Osgerby J.M., (1973), »Process affecting herbicide action in 
soil«. Pestic. Sci., 4, pp. 247-258.  
(26) Guth J.A., (1972), »Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Boden«. Schr. Reihe Ver. Wass.- 
Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143-154.  
(27) Hamaker J.W., (1975), »The interpretation of soil leaching 
experiments«. in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.
 
(28) Helling C.S., (1971), »Pesticide mobility in soils«. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc., 35, pp. 732-210.  
(29) Hamaker J.W., (1972), »Diffusion and volatilization« in 
Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring 
and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49-143.  
(30) Burkhard N. and Guth J.A., (1981), »Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system«. Pestic. Sci. 12, pp. 37-44.
 
(31) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), »Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses«, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(32) Gustafson D.J., (1989), »Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability«. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339-357.
 
(33) Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). »Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils«. J. of Soil 
Sci., 28, pp. 340-3 50.  
(34) Bromilov R.H., and Leistra M., (1980), »Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils«. Pest. Sci., 11, pp. 389-395.
 
(35) Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), »Sorption estimates 
for modeling«, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80-101.
 
(36) Lambert S. M., (1967), »Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure«. J. Agri. Food Chem., 15, 
pp. 572-576.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R.J., (1969), »An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils«. J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667-668.  
(38) Briggs G.G. (1969), »Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils«. Nature, 223, 1288.  
(39) Briggs G.G. (1981). Theoretical and experimerital relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor'. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.
 
(40) Sabljic A., (1984), »Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology«. J. 
Agric. Food Chem., 32, pp. 243-246.  
(41) Bailey G. W., and White J.L., (1970), »Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil«. Residue Rev., 32, pp. 29-92.
 
(42) Bailey G.W., J.L White and Y. Rothberg., (1968), »Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate«. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32: pp. 222-234.
 
(43) Karickhoff S.W., (1981), »Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils«. Chemosphere 10, pp. 833-846.
 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), »Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners«. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, pp. 1-17.  
(45) Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972), »Adsorption in 
organic chemicals« in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49-143.
 
(46) Deli J., and Warren G.F., 1971, »Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils«. Weed Sci. 19; pp. 67-69.  
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, 
(1975), »Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils«. Weed Science, Vol. 23, pp. 454-457.
 
(48) Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), 
»Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions« in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
(49) Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980), »Methods for distri ­
buting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase«, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Manage ­
ment Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documenta ­
tion, USDA Conservation Research report.
 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality — 
General aspects; chemical and physical methods of analysis: 
biological methods of analysis. First Edition (1994).  
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
(52) Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark 
F.E., eds. »Methods of Soil Analysis«, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality — Sampling — Part 1: 
Guidance on the design of sampling programmes.  
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality — Sampling — Part 2: 
Guidance on sampling techniques.  
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality — Sampling — Part 3: 
Guidance on safety of sampling.  
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality — Sampling — Part 4: 
Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.  
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality — Sampling — Part 5: 
Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality — Sampling — Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(59) Green R.E., and Yamane V.K., (1970), »Precision in pesticide 
adsorption measurements«. Soil Sci. Am. Proc., 34, pp. 353- 
354. 
(60) Grover R., and Hance R.J. (1970), »Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine«. Soil Sci., pp. 109-138.
 
(61) Boesten, J.J.T.I, »Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system«. 
Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31-41.  
(62) Boesten, J.J.T.I. »Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106«. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
 
(63) Bastide J., Cantier J.M., et Coste C., (1980), »Comportement 
de substances herbicides dans le sol en fonction de leur struc ­
ture chimique«. Weed Res. 21, pp. 227-231.  
(64) Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), »Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments«, Envi ­
ron.Qual., 10(3), pp. 382-3S6.  
(65) Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), »Par ­
tition equilibria of non-ionic organic compounds between soil 
organic matter and water«. Environ. Sci. Technol., 17(4), 
pp. 227-231.  
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), »Sorption of organic 
substances by soils and sediments«. J. Environm. Sci. Health, Bl 9 (3), pp. 297-312.
 
(67) Vowles P.D., and Mantoura R.F.C, (1987), »Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons«. Chemosphere, 16(1), pp. 109-116.
 
(68) Lyman W.J., Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods. Environ ­
mental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
 
(69) Keniga E.E., and Goring, C.A. I. (1980). »Relationship 
between water solubility, soil sorption, octanol-water partitio ­
ning and concentration of chemicals in the biota« in Aquatic 
Toxicology (eds),G. Eaton, et al.), pp.78-115, ASTM STP 707, 
Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979), »A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds«. Science, Vol. 206, pp. 831-832.  
(71) Hassett J.J., Bamvart W. J., Wood S.G., and Means J.C, 
(1981), »Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption«. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 
pp. 38-42.
 
(72) Karickhoff S.W., (1981), »Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils«. Chemosphere. Vol. 10(8), pp. 833-846.
 
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), »Adsorption de 13 
herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilité-reacti ­
vité«. Revue de l'Agric. 34 (4), pp. 319-322.  
(74) Muller M., Kordel W. (1996), 'Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil. Chemosphere. 32(12), pp, 2493-2504.  
(75) Kordel W. Kotthoff G., Muller M. (1995), »HPLC — scre ­
ening method for the determination of the adsorption coeffi ­
cient on soil — results of a ring test«. Chemosphere 30 (7), pp. 1373-1384.
 
(76) Kordel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), »HPLC — screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil — comparison of different stationary phases«. Chemosp ­
here 27 (12), pp. 2341-2352.  
(77) Hance, R.J., (1967), »The Speed of Attamment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides«. Weed 
Research, Vol. 7, pp. 29-36.  
(78) Koskinen W.C, and Harper S.S., (1990), »The retention 
processes: mechanisms« in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. 
Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
(79) Cohen S.Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G. 
(1984), »Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses«, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(80) Giles C.H., (1970), »Interpretation and use of sorption isot ­
herms« in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14-32.
 
(81) Giles, C.H; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, 
(1960), »Studies in adsorption: XI. A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils«. J. Chem. Soc, pp. 3973-93.
 
(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C, (1980), »Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de l'adsorption«. Ann. Agron. 31: pp. 239-251.  
(83) Bedbur E., (1996). Anomalies in the Freundlich equation', 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.  
(84) Guth, J.A., (1985), »Adsorption/desorption«, in Joint inter ­
national Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canter ­
bury, UK.
 
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Arner. Proc. 26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
Tillæg 1  
Testplan
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
Tillæg 2  
BETYDNINGEN AF ANALYSEMETODENS NØJAGTIGHED OG 
KONCENTRATIONSÆNDRINGER FOR ADSORPTIONSRESULTA ­
TERNES NØJAGTIGHED  
Af følgende tabel (84) ses, at når der er meget lille forskel mellem prøvestoffets 
begyndelsesmasse (m  0 =110 μg) og ligevægtsmasse ( m aq ads ðeqÞ=100 μg) i opløs ­
ningen, vil en fejl på 5 % på ligevægtskoncentrationsmålingen føre til en fejl på 50 % på beregningen af den stofmængde, som er adsorberet på jorden (
m s ads ðeqÞ) 
og på 52,4 % på beregningen af K  d . 
Mængde jord mj  ord = 10 g 
Opløsningens rumfang V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm-  3 ) R m  s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g-  1 ) R‡ K  d * R‡  
FOR A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg 
eller C  0 ¼ 1; 100 μg=cm3 100 1,000 sand 
værdi 10 1,00 sand 
værdi 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
FOR A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg 
eller C  0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 sand 
værdi 60,0 6,00 sand 
værdi 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
FOR A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg 
eller C  0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 sand 
værdi 108,9 10,89 sand 
værdi 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
Hvor: 
äm s ads ðeqÞ = m 0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = masse af prøvestof i jordfasen ved ligevægt, μg 
m aq ads ðeqÞ = masse af prøvestof i vandfasen ved ligevægt, μg 
C s ads ðeqÞ = indhold af prøvestof i jordfasen ved ligevægt, μg g-  1 
C aq ads ðeqÞ = massekoncentration af prøvestoffet i vandig fase ved ligevægt, 
μg cm-3  
R = analysefejl på bestemmelse af  m aq ads ðeqÞ 
R‡ = beregnet fejl som følge af analysefejl R.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
Tillæg 3  
TEKNIKKER TIL SKØNSMÆSSIG BEREGNING AF K  d 
1. Ved hjælp af teknikker til skønsmæssig beregning kan størrelsen af K  d 
forudsiges på grundlag af korrelationer med f.eks. værdier af P  ow (12)(39)­
(63-68), vandopløselighedsdata (12)(19)(21)(39)(68-73) eller polaritetsdata 
afledt ved brug af omvendt fase HPLC (74-76). Som vist i tabel 1 og 2 
beregnes K  oc eller K  om og dermed indirekte K  d af ligningerne:  
K oc ¼ K d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Princippet om disse korrelationer hviler på to forudsætninger: (1) et stofs 
adsorption er hovedsagelig bestemt af jordens organiske stofindhold, og (2) de indgående vekselvirkninger er hovedsagelig af ikke-polær art. For disse 
korrelationer gælder følgelig: (1) de gælder ikke eller kun i nogen udstræk ­
ning for polære stoffer, og (2) de gælder ikkeved meget lille organisk stofindhold i jorden (12). Desuden gælder, at skønt der er fundet tilfreds ­
stillende korrelation mellem P
 ow og adsorptionen (19), kan det samme ikke 
siges om forholdet mellem vandopløselighed og adsorptionsgrad (19)(21); 
undersøgelser heraf har hidtil givet meget modstridende resultater.  
3. Nogle eksempler på korrelationen mellem adsorptionskoefficient og okta ­
nol-vand fordelingskoefficient samt vandopløselighed er givet henholdsvis i 
tabel 1 og 2.  
Tabel 1  
Eksempler på korrelation mellem adsorptionsfordelingskoefficienten og oktanol-vand 
fordelingskoefficienten; flere eksempler er givet i (12) og (68)  
Stoffer Korrelation Forfatter  
Substituerede urinstoffer log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Aromatiske klorerede log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou et al. (198 3) (65) 
Forskellige pesticider log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl og Mingelgrin (1984) (66) 
Aromatiske carbonhydrider log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow . Vowles og Mantoura (1987) (67)  
Tabel 2  
Eksempler på korrelationen mellem adsorptionsfordelingskoefficient og vandopløselighed; flere eksempler 
er givet i (68) og (69)  
Stoffer Korrelation Forfatter  
Forskellige pesticider log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl og Mingelgrin (1984) (66) 
Alifatiske og aromatiske 
klorerede forbindelser log K  om = (4,040 +/- 0,038) - (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou et al. (1979) (70) 
a-naphtol log K  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Cykliske, alifatiske og 
aromatiske stoffer log K  oc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Forskellige forbindelser log K  om = 2,75 - 0,45 log  Sw Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
Tillæg 4  
BEREGNINGER TIL FASTLÆGGELSE AF CENTRIFUGERINGS ­
BETINGELSER  
1. Centrifugeringstiden er givet ved følgende formel, idet partiklerne 
forudsættes at være kugleformede:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
For enkelhedens skyld er alle parametre angivet i ikke-SI-enheder (g, cm)  
hvor 
ω = rotationshastighed (=2 π rpm/60), rad s  -1 
rp = omdrejninger pr. minut  
η = opløsningens viskositet, g s-1  1 cm -1 
r p = partikelradius, cm  
ρ s = massefylde af jord, g cm-  3 
ρ aq = massefylde af opløsning, g cm-  3 
R t = afstand fra centrum af centrifugerotoren til overfladen af opløs ­
ningen i centrifugeglasset, cm  
R b = afstand fra centrum af centrifugerotoren til bunden i 
centrifugeglasset, cm  
R b -Rt = længde af jord/opløsning-blandingen i centrifugeglasset, cm.  
I praksis fordobler man sædvanligvis de beregnede tider for at sikre fuld ­
stændig separation.  
2. Ligning 1 kan forenkles yderligere, hvis opløsningens viskositet ( η) og 
massefylde ( ρ aq ) sættes lig viskositeten og massefylden afvand ved 
25 o C, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 og ρ aq = 1,0 g cm  -3 . 
Centrifugeringstiden er da givet ved ligning 2:  
t ¼ 3:7 
ðrpmÞ 2:r p 2 ðρ s Ä lÞ ln Rb 
Rt (2) 
3. Af ligning 2 ses, at to parametre er vigtige ved fastlæggelse af centrifuge ­
ringsbetingelseme, nemlig tid (t) og hastighed (rpm), når man vil udskille 
partikler med en given størrelse (i vort tilfælde radius 0,1 μm): (1) jordens 
massefylde og (2) længden af blandingen i centrifugeglasset (R  b -R t ), dvs. 
den distance, som en jordpartikel tilbagelægger fra overfladen af opløs ­
ningen til glassets bund; for et givet rumfang er det klart, at længden af 
blandingen i røret bestemmes af kvadratet på rørets radius.  
4. Figur 1 viser sammenhængen mellem centrifugeringstiden (t) og centrifu ­
geringshastigheden (rpm) for forskellige jordmassefylder (p  s (Figur la) og 
forskellige længder af blandingen i centrifugeglassene (Figur 2a). Af figur 
la ses betydningen af jordens massefylde tydeligt; for en typisk centrifuge ­
ringshastighed på 3000 rpm er centrifugeringstiden ca.240 min for jord med massefylde 1,2 g cm men kun 50 min., når massefylden er 2,0 g cm 
Tilsvarende ses af figur 1b, at for en typisk centrifugeringshastighed på 
3000 rpm er centrifugeringstiden ca. 50 min for en længde af blandingen på 10 cm men kun 7 min for en længde på 1 cm. Det er imidlertid vigtigt at finde et optimalt forhold mellem den centrifugering, som kræver mindst 
mulig længde, og den. som gør det let for eksperimentatoren at adskille 
faserne efter centrifugering.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Ved fastlæggelse af forsøgsbetingelserne med henblik på adskillelse af fast 
og flydende fase er det desuden vigtigt at tage hensyn til eventuel tilste ­
deværelse af en tredje »pseudo«-fase, kolloiderne. Disse partikler, der er under 0,2 μm, kan i væsentlig grad påvirke hele absorptionsmekanismen for 
et stof i en jordsuspension. Når der centrifugeres som ovenfor beskrevet, 
forbliver kolloiderne i den vandige fase og bliver analyseret sammen med 
den vandige fase. Derfor går oplysningerne om deres indflydelse tabt.
 
Hvis det laboratorium, som forestår undersøgelsen, har faciliteter til ultra ­
centrifugering eller ultrafiltrering, kan adsorption/desorption af et stof i jord undersøges mere tilbundsgående, herunder stoffets adsorption på kolloi ­
derne, I så tilfælde bør der anvendes ultracentrifugering ved 60 000 rpm 
eller ultrafiltrering med en filterporøsitet på 100 000 Dalton til at adskille de tre faser jord, kolloider og opløsning. Den forsøgsprotokol bør desuden ændres tilsvarende, således at alle tre faser analyseres for stoffet.
 
Figur 1a.
  
Sammenhængen mellem centrifugeringstid (t) og centrifugeringshastighed 
(rpm) ved forskellige jordmas-sefylder (p  s ). R  t = 10 cm, R  b -Rt = 10 cm, 
η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 og ρ aq = 1,0 g cm  -3 ved 25  o C. 
Fig, 1b.
  
Sammenhængen mellem centrifugeringstid (t) og centifugeringshastighed 
(rpm) for forskellige længder af blandingen i centrifugeglasset (R  b -R t ) = 
L; Rs = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 , ρ aq = 1,0 g cm  -3 ved 25  o C og 
ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
Tillæg 5  
BEREGNING AF ADSORPTION A ( %) OG DESORPTION D ( %)  
Tidsplanen for proceduren er følgende:
  
Ved alle beregninger er forudsat, at prøvestoffet er stabilt og ikke adsorberes 
nævneværdigt til beholderens vægge.  
ADSORPTION A (A %)  
a) Den parallelle metode  
Adsorptionsprocenten beregnes for hvert prøveglas (i) ved hvert tidspunkt 
(t i ) efter ligningen:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Leddene i denne ligning kan beregnes på følgende måde: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m  0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
hvor:  
A t i = adsorptionsprocent ( %) til tiden t  i 
m s ads ðt i Þ = masse af prøvestof adsorberet til jorden på det tidspunkt t  i , 
da analysen udføres ( μg); 
m 0 = masse af prøvestof i prøveglasset ved prøvens begyndelse 
(μg) 
C 0 = initial massekoncentration afprøveopløsning i berøring med 
jorden (μg cm  -3 ) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C aq ads ðt i Þ = massekoncentration af stof i vandig fase på det tidspunkt t  i, 
da analysen udføres ( μg cm  -3 ); denne koncentration 
bestemmes ved analyse med hensyntagen til blindværdierne  
V 0 = initialt rumfang af prøveopløsning i kontakt med jorden 
(cm  3 ). 
Værdierne af adsorptionsprocenten  A t i eller C aq ads ðt i Þ afsættes på en kurve 
mod tiden, og tiden til indtræden af sorptionsligevægt bestemmes. Eksem ­
pler på sådanne kurver er givet i hhv. figur 1 og figur 2.
  
Figur 1.  
Adsorptionsligevægtskurve.
  
Figur 2.  
Massekoncentration af prøvestoffet i vandfasen (C  aq ) som funk ­
tion af tiden.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Den sekventielle metode  
I de følgende ligninger er der taget hensyn til, at adsorptionsbestemmelsen 
sker ved måling af prøvestoffet i små prøver af vandig fase til bestemte tidsintervaller.
 
— Inden for hvert tidsinterval beregnes mængden af stof adsorberet på 
jorden på følgende måde:  
— for det første tidsinterval Δt 1 = t 1 - t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m  0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î (4) 
— for det andet tidsinterval Δt 2 = t 2 - t 1 
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— for det tredje tidsinterval Δt 3 = t 3 - t 2 
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î (6) 
— for det n'te tidsinterval Δt n = t n - t n - 1 
m s ads ðΔt n Þ ¼ m m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · Í 
ðV 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Þ 
v a A Î (7) 
— Adsorptionsprocenten i hvert tidsinterval,  A Δt i beregnes ved følgende 
ligning:  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) 
medens adsorptionsprocenten  A t i til tidspunktet t  i er givet ved lignin ­
gen: 
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Adsorptionsværdierne  A t i eller A Δt i (afhængigt af, hvad der er nødven ­
digt i undersøgelsen) afsættes som funktion af tiden, og tiden til indtræden af sorptionsligevægt bestemmes.
 
— Ved ligevægtstidspunktet t  eq : 
— er massen af prøvestof adsorberet på jorden:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— er massen af prøvestof i opløsningen:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— og er adsorptionsprocenten ved ligevægt:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12) 
De ovenfor anvendte parametre er defineret som følger:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = masse af prøvestof adsorberet til 
jorden henholdsvis i løbet af tids ­
intervallerne Δ t1 , Δ t2 ,..., Δ tn (μg); 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = masse af prøvestof målt i en prøve  
v a A henholdsvis til tiden t  1 , t 2 ,t n 
(μg); 
m s ads ðeqÞ = masse af stof adsorberet på jorden 
ved adsorptionsligevægt ( μg) 
m aq ads ðeqÞ = masse af stof i opløsningen ved 
adsorptionsligevægt ( μg) 
v a A = rumfang af den prøve, hvori 
prøvestoffet måles (cm  3 ) 
A Δt i = adsorptionsprocent svarende til et 
tidsinterval Δt i (%) 
A eq = adsorptionsprocent ved adsorp ­
tionsligevægt (%).  
DESORPTION D (%)  
Tidspunktet t  0 for start af desorptionskinetikforsøget regnes som det tidspunkt, 
hvor det maksimale opsamlede rumfang af prøvestofopløsningen (efter indtræden 
af adsorptionsligevægt) erstattes et tilsvarende rumfang 0,01 M CaCl  2 -opløsning.  
a) Den parallelle metode  
Til tiden t  i måles massen af prøvestof i den vandige fase udtaget af prøve ­
glas i ( V i 
r ).og den desorberede masse beregnes af ligningen:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Ved desorptionsligevægt er t  i = t eq og derfor  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
Massen af prøvestof desorberet i et tidsinterval ( Δt 1 ) er givet ved ligningen:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Desorptionsprocenten beregnes:  
til tidspunktet t  i af ligningen:  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
og i et tidsinterval ( Δt 1 ) af ligningen:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
hvor:  
D t i = desorptionsprocent til tidspunktet t  i ( %);  
D Δt i = desorprionsprocent svarende til et tidsinterval Δti 
( %)masse af prøvestof desorberet til tidspunktet t  i (μg) 
m aq des ðt 1 Þ = masse af prøvestof desorberet til tidspunktet t  i (μg) 
m aq des ðΔt 1 Þ = masse af prøvestof desorberet af jorden i løbet af et tids ­
interval Δt 1 (μg) 
m m des ðt i Þ = masse af prøvestof bestemt analytisk til et tidspunkt t  i i et 
rumfang opløsning  V r i , som udtages til analysen ( μg) 
m aq A = masse af prøvestof, som er til overs efter indtræden af 
adsorptionsligevægt som følge af ufuldstændig volumenud ­
skiftning ( μg) 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m aq ads ðeqÞ = masse af prøvestof i opløsningen ved adsorptionsligevægt 
(μg) 
V R = rumfang supernatant, som efter opnåelse af adsorptionslige ­
vægt er fjernet fra prøveglasset og erstattet af samme rumfang 0,01 M CaCl
 2 -opløsning (cm  3 ) 
V r i = rumfang af opløsning udtaget af prøveglas (i) til bestem ­
melse af prøvestof i desorptionskinetikforsøget (cm  3 ). 
Værdierne af desorptionen  D t i eller D Δt i (afhængigt af, hvad der er nødven ­
digt i undersøgelsen) afsættes mod tiden, og tidsrummet til indtræden af sorptionsligevægt bestemmes.
 
b) Den sekventielle metode  
I følgende ligninger er der taget hensyn til, at adsorptionsbestemmelsen 
sker ved måling af prøvestoffet i små prøver  ðv A 
a Þ af vandig fase (den 
sekventielle metode i 1.9. Testens præstationer). Forudsætninger: a) det rumfang supernatant, som er fjernet fra glasset efter adsorptionskinetikfor ­
søget er erstattet af samme rumfang 0,01 M CaCl
 2 -opløsning (V  R ), og b) 
det samlede rumfang vandig fase i kontakt med jorden (V  T ) under desorp ­
tionskinetikforsøget forbliver uændret og er givet ved ligningen:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Til tidspunktet t  i : 
— måles massen af prøvestof i en lille prøve  ðv a D Þ, og den desorberede 
masse beregnes af ligningen:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— ved desorptionsligevægt er t  i = t eq og derfor  m aq des ðt i Þ= m aq des ðeqÞ. 
— kan desorptionsprocenten  D t i beregnes af følgende ligning:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
I et tidsinterval ( Δt 1 ): 
beregnes mængden af stof desorberet i for hvert tidsinterval på følgende 
måde:  
— for det første tidsinterval Δt 1 = t i -t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— for det andet tidsinterval Δt 1 = t 2 -t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
og 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— for det n  'te tidsinterval Δt n = t n -t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D   ! 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
og m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Endelig beregnes desorptionsprocenten i hvert tidsinterval,  D Δt i ved hjælp 
af følgende ligning:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
medens desorptionsprocenten  D t i , til tidspunktet t  i er givet ved ligningen:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
hvor de ovenfor anvendte parametre er defineret således:  
m des 
s ðΔt 1 Þ, m des 
s ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = masse af prøvestof desorberet 
henholdsvis i løbet af tidsinter ­
vallet Δt 1 , Δt 2 , ..., Δt n (μg) 
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
aq ðΔt n Þ = masse af prøvestof målt i en 
prøve henholdsvis til tidspunktet 
t 1 , t 2 , ..., t  n (μg) 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = masse af prøvestof målt i en 
prøveðv D 
a Þ henholdsvis til tids ­
punktet t  1 , t 2 , ..., t  n (μg) 
V T = samlet rumfang af vandig fase i 
kontakt med jorden under desorp ­
tionskinetikforsøget udført med den sekventielle metode (cm
 3 ) 
m A 
aq = masse af prøvestof, som er til 
overs efter indtræden af adsorp ­
tionsligevægt som følge af ufuld ­
stændig volumenudskiftning ( μg) 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = rumfang supernatant, som efter 
indtræden af adsorptionsligevægt er fjernet fra prøveglasset og erstattet af samme rumfang 0,01 
M CaCl
 2 -opløsnmg (cm  3 ) 
v D 
a = rumfang af prøve udtaget af 
prøveglas (i) til analyseformål i desorptionskinetikforsøget udført 
med den sekventielle metode 
(cm
 3 ) 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
Tillæg 6  
ADSORPTION-DESORPTION I JORD: DATARAPPORTERINGSBLADE  
Afprøvet stof:  
Afprøvet jord:  
Jordens tørstofmasseindhold (105  o C, 12 h): %  
Temperatur:  o C 
Analysemetodens egnethed  
Afvejet jord g 
Jord: tør masse g 
Rumfang CaCl  2 -opløsning cm  3 
Nominel koncentreret endelig opløsning μg cm  -3 
Analytisk bestemt koncentreret endelig opløsning μg cm  -3 
Princip i anvendt analysemetode:  
Kalibrering af analysemetode:  
Afprøvet stof:  
Afprøvet jord:  
Jordens tørstofmasseindhold (105  o C, 12 h): %  
Temperatur:  o C 
Anvendt analysemetodik: Indirekte  □ Parallel  □ Sekventiel  □ 
Direkte  □ 
Adsorptionstest: udtagne prøver  
Symbol Enhed Ekvilibre­
ringstid Ekvilibre­
ringstid Ekvilibre­
ringstid Ekvilibre­
ringstid  
Prøveglas nr. 
Afvejet jord — g 
Jord: tør masse m  Soil g 
Rumfang vand i afvejet jord 
(beregnet) V WS cm 3 
Rumfang 0,01 M CaCl  2 -opløs­
ning til ekvilibrering af jord cm 3 
Rumfang stamopløsning cm  3 
Samlet rumfang vandig fase i 
kontakt med jord V 0 cm 3 
Begyndelseskoncentration af 
prøveopløsning C 0 μg cm  -3 
Masse af prøvestof ved testens 
begyndelse m 0 μg ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Symbol Enhed Ekvilibre­
ringstid Ekvilibre­
ringstid Ekvilibre­
ringstid Ekvilibre­
ringstid  
Efter omrøring og centrifugering  
INDIREKTE METODE 
Parallelle metode 
Koncentration af prøvestof i 
vandig fase inklusive korrektion for blindværdi
 C aq ads ðt i Þ μg cm-  3 
Sekventielle metode 
Målt masse af prøvestof i prøve 
V a A m m ads ðt i Þ μg 
DIREKTE METODE 
Masse af prøvestof adsorberet 
på jord  m s ads ðt i Þ μg 
Beregning af adsorption 
Adsorption A t i % 
A Δt i % 
Gennemsnitsværdier 
Adsorptionskoefficient K  d cm 3 g -1 
Gennemsnitsværdier 
Adsorptionskoefficient K  oc cm 3 g -1 
Gennemsnitsværdier  
Afprøvet stof:  
Afprøvet jord:  
Jordens tørstofmasseindhold (105  o C, 12 h): %  
Temperatur:  o C 
Adsorptionstest: blindprøver og kontrolprøver  
Symbol Enhed Blindprøve Blindprøve Kontrolprøve  
Glas nr. 
Afvejet jord g 0 0 Mængde vand i afvejet jord (beregnet) cm
 3 — — 
Tilsat rumfang 0,01 M CaCl  2 -opløs­
ning cm 3 
Tilsat rumfang stamopløsning af 
prøvestof cm 3 0 0 
Samlet rumfang vandig fase (beregnet) cm  3 — —  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Symbol Enhed Blindprøve Blindprøve Kontrolprøve  
Begyndelseskoncentration af prøvestof 
i vandig fase μg cm  -3 
Efter omrøring og centrifugering  
Koncentration i vandig fase μg cm  -3 
Bemærkning: Tilføj flere kolonner om nødvendigt.  
Afprøvet stof:  
Afprøvet jord:  
Jordens tørstofmasseindhold (105  o C, 12 h):  
Temperatur:  
Massebalance  
Symbol Enhed  
Prøveglas nr. 
Afvejet jord — g 
Jord: tør masse m  soil g 
Rumfang vand i afvejet jord (beregnet) V  WS ml 
Rumfang 0,01 M CaCl  2 -opløsning til 
ekvilibrering af jord ml 
Rumfang stamopløsning cm  3 
Samlet rumfang vandig fase i kontakt 
med jord V 0 cm 3 
Begyndelseskoncentration af prøveopløs ­
ning C 0 μg cm  -3 
Ekvilibreringstid — h  
Efter omrøring og centrifugering  
Koncentration af prøvestof i vandig fase 
ved adsorptionsligevægt inklusive blind ­
værdikorrektion  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Ekvilibreringstid t  eq h 
Første fortynding med opløsningsmiddel 
Fjernet rumfang vandig fase v  rec cm 3 
Tilsat rumfang opløsningsmiddel ΔV cm  3 
Første ekstraktion med opløsningsmiddel 
Signalstof i opløsningsmiddel S  E1 var. 
Koncentreret prøvestof i opløsnings ­
middel C E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Symbol Enhed  
Masse stof ekstraheret fra jord og 
beholdervægge m E1 μg 
Anden fortynding med opløsningsmiddel 
Fjernet rumfang opløsningsmiddel ΔV S cm 3 
Tilsat rumfang opløsningsmiddel ΔV cm  3 
Anden ekstraktion med opløsningsmiddel 
Signalstof i opløsningsmiddelfase S  E2 var. 
Koncentreret prøvestof i opløsnings ­
middel C E2 μg cm  -3 
Masse stof ekstraheret fra jord og 
beholdervægge m E2 μg 
Samlet masse prøvestof ekstraheret i to 
trin m E μg 
Massebalance MB %  
Afprøvet stof:  
Afprøvet jord:  
Jordens tørstofmasseindhold (105  o C, 12 h): %  
Temperatur:  o C 
Adsorptionsisotermer  
Symbol Enhed  
Prøveglas nr. 
Afvejet jord — g Jord: tør masse E g 
Rumfang vand i afvejet jord 
(beregnet) V
 WS cm 3 
Rumfang 0,01 M CaCl  2 -opløs­
ning til ekvilibrering af jord cm 3 
Tilsat rumfang stamopløsning cm  3 
Samlet rumfang vandig fase i 
kontakt med jorden (beregnet) V 0 cm 3 
Koncentration, opøsning C  0 μg cm  -3 
Ekvilibreringstid — h  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Symbol Enhed  
Efter omrøring og centrifugering  
Stofkoncentration, vandig fase, 
inklusive blindkorrektion  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatur  o C 
Adsorptionsmasse pr. enhed jord  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Regressionsanalyse:  
størrelse af K  F ads : 
størrelse af l/n:  
regressionskoefficient r  2 : 
Afprøvet stof:  
Afprøvet jord:  
Jordens tørstofmasseindhold (105  o C, 12 h): %  
Temperatur:  o C 
Anvendt analysemetodik: Indirekte  □ Parallel  □ Sekventiel  □ 
Desorptionstest  
Symbol Enhed Tidsin­
terval Tidsin­
terval Tidsin­
terval Tidsin­
terval  
Prøveglas ner. fra adsorptionstrin 
Masse af stof adsorberet til jord ved 
adsorptionsligevægt  m s ads ðeqÞ μg 
Fjernet rumfang vandig fase, erstattet med 
0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Samlet rumfang vandig 
fase i berøring med jorden PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Masse af prøvestof, som er til overs efter 
indtræden af adsorptionsligevægt som 
følge af ufuldstændig volumenudskiftning  m aq A μg 
Desorptionskinetik  
Målt mass stof desorberet fra jorden til 
tiden t  i m m des ðt i Þ μg 
Rumfang opløsning 
udtaget af prøveglas (i) til bestemmelse af prøvestof PM V
 f i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Masse stof desorberet fra jorden til tiden 
t i (beregnet)  m aq des ðt i Þ μg 
Masse stof desorberet fra jorden i tids ­
intervallet Δt i (beregnet)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Symbol Enhed Tidsin­
terval Tidsin­
terval Tidsin­
terval Tidsin­
terval  
Desorptionsprocent  
Desorption til tiden t  i D ti % 
Desorption til tidsintervallet Δt i D Δt i % 
Tilsyneladende desorptionskoefficent K  des 
PM: Parallelle metode.  
SM: Sekventielle metode.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  BESTEMMELSE AF ADSORPTIONSKOEFFICIENTEN ( K oc ) I 
JORD OG I KLOAKSLAM MED HPLC (HIGH 
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)  
1. METODE  
Metoden er gengivet efter OECD TG 121 (2000).  
1.1. INDLEDNING  
Stoffers sorptionsegenskaber i jord og kloakslam kan beskrives ved 
parametre, som bestemmes eksperimentelt med prøvemetode C.18. En vigtig parameter er adsorptionskoefficienten, der defineres 
som forholdet mellem stoffets koncentration i jord/slam og stoffets 
koncentration i den vandige fase ved adsorptionsligevægt. Adsorp ­
tionskoefficienten normaliseret efter jordens organiske kulstofind ­
hold. K
 oc er nyttig som indikator for et kemisk stofs bindingsevne 
til organisk materiale i jord og kloakslam og kan bruges til at 
sammenligne forskellige kemiske stoffer. Denne parameter kan bestemmes ved korrelering med vandopløseligheden og fordelings ­
koefficienten i n-oktanol/vand (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
 
I den her beskrevne forsøgsmetode anvendes HPLC til bestemmelse 
af adsorptionskoefficienten K  oc i jord og i kloakslam (8). De derved 
beregnede værdier er mere pålidelige end dem, der bygger på QSAR-beregninger (9). Som beregningsmetode kan den ikke helt erstatte batch-ligevægtsforsøgene i prøvemetode C.18. Den bereg ­
nede K
 oc -værdi kan imidlertid være nyttig ved valg af passende 
testparametre til adsorptions-/desorptionsundersøgelser med prøve ­
metode C.18 gennem beregning af K  d (fordelingskoefficient) eller 
K f (Freundlich-adsorptionskoefficient) efter ligning 3 (jf. 1.2).  
1.2. DEFINITIONER  
K d : Fordelingskoefficienten defineres som forholdet mellem lige ­
vægtskoncentrationerne C af et opløst prøvestof i et tofasesystem bestående af et sorptionsmiddel (jord eller kloakslam) og en vandig fase; den er dimensionsløs, når koncentrationerne i begge 
faser udtrykkes på w/w basis. Angives koncentrationen i den 
vandige fase på vægt/volumen basis, bliver enheden ml g
 -1 . K  d 
kan variere med absorptionsmidlets egenskaber og kan være koncen ­
trationsafhængig.  
K d ¼ C soil 
C aq eller  C sludge 
C aq (1) 
hvor:  
C soil = ligevægtskoncentration af prøvestof i jord ( μg g  -1 ) 
C siudge  = ligevægtskoncentration af prøvestof i slam ( μg g  -1 ) 
C aq = ligevægtskoncentration af prøvestof i vandig fase 
(μg g  -1 , μg ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Freundlich-adsorptionskoefficienten defineres som prøvestoffets 
koncentration i jord eller kloakslam (x/m), når ligevægtskoncentra ­
tionen C  aq den vandige fase er lig én; enheden er μg g -1 adsorptions ­
middel. Størrelsen kan afhænge af adsorptionsmidlets egenskaber.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
hvor:  
x/m = mængde prøvestof x ( μg) adsorberet på en mængde adsorp ­
tionsmiddel m (g) ved ligevægt  
l/n = Freundlich-adsorptionsisotermens hældning  
C aq = ligevægtskoncentration af prøvestof; vandig fase ( μg ml  -1 ) 
Ved C aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : Fordelingskoefficient (K  d ) eller Freundlich-adsorptionskoeffi ­
cient (K  f ) normaliseret efter adsorptionsmidlets organiske kulstofind ­
hold (f  oc ); denne er navnlig for uioniserede kemiske stoffer en vigtig 
indikator for størrelsen af adsorptionen mellem et stof og adsorp ­
tionsmidlet og kan bruges til at sammenligne forskellige kemiske 
stoffer. Alt efter dimensionen af K  d og K  f kan K  oc være dimen ­
sionsløs eller have enheden ml g  -1 eller μg g  -1 organisk stof.  
Koc ¼ Kd 
foc dimensionsløs eller ml ·g Ä1 Ê Ì  
eller Kf 
foc μg·g Ä1 Ê Ì  (3) 
Forholdet mellem K  oc og K  d er ikke altid lineært, således kan K  oc - 
værdierne variere fra jordtype til jordtype, dog med langt mindre variabilitet end K
 d eller K  f . 
Adsorptionskoefficienten (K  oc afledes af kapacitetsfaktoren (k') ved 
hjælp af en kalibreringskurve over log k' som funktion af log  oc for 
de valgte referencestoffer.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
hvor:  
t R : = HPLC-retentionstiden for prøve- og referencestof (minutter)  
t 0 : = HPLC-dødtid (minutter) (se 1.8.2).  
P ow : Oktanol-vand-fordelingskoefficienten defineres som forholdet 
mellem koncentrationerne af opløst stof i n-oktanol og vand; den 
er dimensionsløs.  
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ K  ow Þ (5) 
1.3. REFERENCESTOFFER  
Før metoden anvendes, bør man kende strukturformel, renhed og 
eventuel dissociationskonstant. Det er nyttigt at kende opløselighed 
i vand og organiske opløsningsmidler, oktanol-vand-fordelingskoef ­
ficient og hydrolyseegenskaber.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
For at korrelere de målte HPLC-retentionsdata for et prøvestof med 
dets adsorptionskoefficient K  oc må der opstilles en kalibreringskurve 
over log K  oc som funktion af log k'. Der kræves mindst seks refe ­
rencepunkter, heraf mindst ét over og ét under den forventede værdi for prøvestoffet. Metodens nøjagtighed kan forbedres væsentligt ved 
at anvende referencestoffer, som er strukturmæssigt beslægtet med 
prøvestoffet. Foreligger sådanne data ikke, er det op til brugeren at vælge passende kalibreringsstoffer. I så fald bør der vælges et mere generelt sæt strukturmæssigt forskelligartede stoffer. De stoffer og 
K
 oc -værdier, som kan anvendes, er i tillægget angivet i tabel 1 for 
kloakslam og tabel 3 for jord. Valg af andre kalibreringsstoffer bør begrundes.
 
1.4. PRØVEMETODENS PRINCIP  
Der udføres HPLC på analysekolonner pakket med en gængs cyano ­
propyl-faststoffase med både lipofile og polære grupper. Der anvendes en moderat polær stationær fase baseret på silicamatrix: 
— O — Si — CH
 2 — CH  2 — CH  2 — CN 
silica ikke polært fyldstof polær gruppe  
Prøvemetodens princip svarer til prøvemetode A.8 (fordelingskoeffi ­
cient, HPLC-metode). Når prøvestoffet føres gennem kolonnen sammen med den mobile fase, reagerer prøvestoffet med den statio ­
nære fase. Prøvestoffets fordeling mellem mobil og stationær fase 
bevirker, at det bliver forsinket. Den stationære fases dobbelte sammensætning med både polære og upolære bindingssteder giver mulighed for interaktion med de polære og ikke-polære grupper i et 
molekyle på samme måde som det er tilfældet for et organisk stof i 
en grundsubstans af jord eller kloakslam. Derved er det muligt at fastlægge forholdet mellem retentionstiden på søjlen og adsorptions ­
koefficienten på organisk materiale.
 
pH har væsentlig indflydelse på sorptionsegenskaberne, navnlig af 
polære stoffer. I landbrugsjord og i tanke i spildevandsbehandlings ­
anlæg ligger pH normalt mellem 5,5 og 7,5. For ioniserbare stoffer bør der udføres to forsøg med både den ioniserede og den ikke- ioniserede form i passende bufferopløsninger, dog kun når mindst 
10 % af prøvestoffet er dissocieret ved pH mellem 5,5 og 7,5.
 
Da vurderingen alene bygger på forholdet mellem retentionen på 
HPLC-kolonnen og adsorptionskoefficienten, er en kvantitativ 
analysemetode unødvendig, og kun retentionstiden behøver bestem ­
mes. Hvis man råder over et egnet sæt referencestoffer og kan anvende standardiserede forsøgsbetingelser, er dette en hurtig og 
effektiv metode til at få et skøn over adsorptionskoefficienten K
 oc . 
1.5. PRØVENS ANVENDELIGHED  
HPLC-metoden kan anvendes på kemiske stoffer (mærkede eller 
umærkede), til hvilke der findes et egnet detektionssystem (f.eks. 
spektrofotometer, strålingsdetektor), og som er tilstrækkeligt stabile inden for forsøgsvarigheden. Den kan især være nyttig for kemiske stoffer, som er vanskelige at undersøge i andre eksperimentelle 
systemer (f.eks. stoffer, som er flygtige, eller hvis vandopløselighed 
er for ringe til at give målelige koncentrationer, og stoffer med høj affinitet til inkuberingssystemernes overflade). Metoden er anven ­
delig til blandinger, som giver dårligt adskilte elueringsbånd. I så 
fald bør øvre og nedre grænse for log K
 oc -værdierne af stofferne i 
testblandingen angives.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Urenheder kan undertiden vanskeliggøre fortolkningen af HPLC- 
resultater, men er dog af underordnet betydning, når blot prøvestoffet 
kan identificeres sikkert ad analytisk vej og kan adskilles fra uren ­
hederne.  
Metoden er valideret for stofferne i tabel 1 i tillægget og er 
endvidere anvendt på en række andre kemiske stoffer i følgende grupper:
 
— aromatiske aminer (f.eks. trifluralin, 4-chloranilin, 3,5-dinitroani ­
lin, 4-methylanilin, N-methylanilin, 1-naphthylamin)  
— aromatiske carboxylsyreestere (f.eks. benzoesyremethylester, 3,5- 
dinitrobenzoesyreethylester)  
— aromatiske carbonhydrider (f.eks. toluen, xylen, ethylbenzen, 
nitrobenzen)  
— aryloxyphenoxypropionsyreestere (f.eks. diclofopmethyl, fenoxa ­
propethyl, fenoxaprop-P-ethyl)  
— benzimidazol- og imidazol-fungicider (f.eks. carbendazim. fube ­
ridazol, triazoxid)  
— carboxylsyreamider (f.eks. 2-chlorbenzamid, N.N-dimethylbenza ­
mid, 3,5-dinitrobenzamid, N-methylbenzamid, 2-nitrobenzamid, 
3-nitrobenzamid)  
— chlorerede carbonhydrider (f.eks. endosulfan, DDT. hexachlor ­
benzen, quintozen, 1.2,3-trichlorbenzen)  
— insekticider af typen organiske fosforforbindelser (f.eks. 
azinphosmethyl, disulfoton, fenamiphos, isofenphos, pyrazophos. sulprofos, triazophos)
 
— phenoler (f.eks. phenol, 2-nitrophenol. 4-nitrophenol, pentach ­
lorphenol, 2.4.6-trichlorphenol. 1-naphthol)  
— derivater af phenylurinstof (f.eks. 
isoproturon. monolinuron. pencycuron)  
— pigmentfarvestoffer (f.eks. Acid Yellow 219. Basic Blue 41, 
Direct Red SI)  
— polyaromatiske carbonhydrider (f.eks. acenaphthen, naphthalen)  
— 1,3,5-triazin-herbicider (f.eks. prometryn, propazin, simazin, 
terbutryn)  
— triazolderivater (f.eks. tebuconazol, triadimefon, tradimenol, tria ­
penthenol).  
Metoden er ikke anvendelig til stoffer, som reagerer enten med 
eluenten eller den stationære fase. Den er ligeledes ikke anvendelig til stoffer, som udviser specifik interaktion med uorganiske kompo ­
nenter (f.eks. kompleksdannelse med lermineraler). Metoden virker 
ikke nødvendigvis på overfladeaktive stoffer, uorganiske stoffer og 
middelstærke til stærke organiske syrer og baser. Log K
 oc -værdier 
mellem 1,5 og 5,0 kan bestemmes. Til bestemmelse af ioniserbare stoffer må anvendes en bufret mobil fase, men der må tages 
forholdsregler til undgåelse af udfældning af bufferkomponenter 
eller prøvestof.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. KVALITETSKRITERIER  
1.6.1.  Nøjagtighed  
Normalt kan adsorptionskoefficienten af et prøvestof bestemmes 
inden for +/- 0,5 logaritmeenhed af den tilsvarende værdi bestemt 
ved batch-ligevægtsmetoden (se tabel 1 i tillægget). Bedre 
nøjagtighed kan opnås, hvis de anvendte referencestoffer er struktu ­
relt beslægtet med prøvestoffet.  
1.6.2.  Repeterbarhed  
Bestemmelserne skal foretages mindst som dobbeltbestemmelser. 
Log K  oc -værdier baseret på enkeltmålinger bør højst afvige 0,25 
logaritmeenhed indbyrdes.  
1.6.3.  Reproducerbarhed  
De hidtidige erfaringer med anvendelsen af metoden underbygger 
dens validitet, En undersøgelse af HPLC-metoden på 48 stoffer 
(hovedsagelig pesticider), for hvilke der forelå pålidelige data vedrørende K
 oc i jord, resulterede i en korrelationskoefficient på 
R = 0,95 (10) (l1).  
Der er gennemført en sammenlignende laboratorieundersøgelse med 
11 deltagende laboratorier med henblik på at forbedre og validere 
metoden (12). Resultaterne er gengivet i tabel 2 i tillægget.  
1.7. BESKRIVELSE AF PRØVEMETODEN  
1.7.1.  Indledende skøn over adsorptionskoefficienten  
Oktanol-vand fordelingskoefficienten P  ow (= K  ow ) og, i nogen 
udstrækning, vandopløseligheden kan — navnlig for uioniserede stoffer — benyttes som indikatorer for adsorptionsgraden og 
således bruges til indledende afgrænsning af området. Der er 
udgivet en række nyttige korrelationer for forskellige grupper af kemiske stoffer (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
 
1.7.2.  Apparatur  
Der anvendes en væskekromatograf forsynet med en impulsfri 
pumpe og en egnet detektor. Det anbefales at bruge en injektions ­
ventil med injektionssløjfe. Der anvendes gængse kemisk bundne 
cyanopropyl-harpikser på silicabasis (f.eks. Hypersil og Zorbax 
CN). En forkolonne af samme materiale kan placeres mellem injek ­
tions-system og analysekolonne. Kolonner fra forskellige leveran ­
dører kan variere betydeligt i adskillelsesevne. Vejledende skal 
man opnå følgende kapacitetsfaktorer k'; log k' > 0,0 for log K  oc 
= 3,0 og log k' > 0,4 for log K  oc = 2,0 ved anvendelse af en 
mobil fase bestående af methanol/vand 55/45 %.  
1.7.3.  Mobile faser  
Der er afprøvet forskellige mobile faser, og følgende to anbefales:  
— methanol/vand (55/45 % v/v)  
— methanol/0,01 M citratbuffer pH 6,0 (55/45 % v/v).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Til fremstilling af elueringsvæsken anvendes methanol af HPLC- 
kvalitet og destilleret vand eller citratbuffer. Blandingen afgasses 
før brug. Elueringen skal være isokratisk (dvs. af ensartet styrke). Er methanol/vand-blandinger ikke egnede, kan andre blandinger af organiske opløsningsmidler og vand anvendes, f.eks. ethanol/vand 
eller acetonitril/vand. For ioniserbare stoffer anbefales, at pH stabili ­
seres med bufferopløsning. Der må træffes foranstaltninger til at undgå saltudfældning og tæring af kolonnen, som kan forekomme ved visse blandinger af organisk fase og buffer.
 
Der må ikke anvendes additiver som f.eks. ionparreagenser, da de 
kan påvirke sorptionsegenskaberne af den stationære fase. Sådanne ændringer af den stationære fase kan være irreversible. Af denne 
grund er det ubetinget nødvendigt, at eventuelle forsøg med additiver 
udføres på separate kolonner.
 
1.7.4.  Opløste stoffer  
Prøve- og referencestoffer opløses i den mobile fase.  
1.8. UDFØRELSE AF FORSØGET  
1.8.1.  Prøvningsbetingelser  
Temperaturen bør registreres under af målingerne. Det anbefales 
stærkt, at kolonnerummet er temperaturreguleret for at sikre konstante betingelser under kalibrerings- og overslagsforsøg og 
måling af prøvestoffet.
 
1.8.2.  Bestemmelse af dødtid t  0 
Til bestemmelse af dødtiden t  0 kan anvendes to forskellige metoder 
(se også 1.2).  
1.8.2.1.  Bestemmelse af dødtiden t  0 ved hjælp af en homolog serie  
Denne fremgangsmåde har vist sig give pålidelige og ensartede t  0 - 
værdier. Nærmere enkeltheder herom kan findes i prøvemetode A.8: 
Fordelingskoefficient (n-oktanol/vand), HPLC-metode.  
1.8.2.2.  Bestemmelse af dødtid t  0 ved hjælp af inaktive stoffer, som ikke 
tilbageholdes af kolonnen  
Teknikken bygger på, at der indsprøjtes en opløsning af formamid, 
urinstof eller natriumnitrat. Bestemmelserne skal udføres mindst som dobbeltbestemmelser.
 
1.8.3.  Bestemmelse af retentionstider t  R 
Referencestoffer vælges som beskrevet i 1.3. Til bestemmelse af 
disse stoffers retentionstid kan de indsprøjtes som en blandet stan ­
dard, forudsat at det er godtgjort, at retentionstiden for den enkelte referencestandard er upåvirket af tilstedeværelsen af de andre refe ­
rencestandarder. Kalibrering skal ske med regelmæssige intervaller 
mindst to gange dagligt for at tage højde for eventuelle uventede 
ændringer i kolonnens præstationer. Det bedste er at udføre kalibre ­
ringsindsprøjtningerne før og efter indsprøjtning af prøvestoffet for at bekræfte, at retentionstiderne er uændrede. Prøvestofferne indsprøjtes 
separat i mindst mulig mængde (undgå overbelastning af kolonnen), 
og deres retentionstider bestemmes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
For at gøre målingerne mere pålidelige bør de udføres mindst som 
dobbeltbestemmelser. Log K  oc -værdier afledt af enkeltmålinger bør 
højst afvige 0,25 logaritmeenhed fra hinanden.  
1.8.4.  Bedømmelse  
Kapacitetsfaktorerne k' beregnes af dødtiden t  0 og retentionstiderne 
t R for de valgte referencestoffer efter ligning 4 (se 1.2). Log k'- 
værdierne for referencestofferne afbildes derefter mod de tilhørende log K
 oc -værdier fra batchligevægtsforsøgene, som er givet i tabel 1 
og 3 i tillægget. Ved hjælp af denne kurve anvendes log k'-værdien 
for et prøvestof derefter til beregning af dets K  oc -værdi. Viser de 
faktiske resultater, at log K  oc for prøvestoffet er uden for kalibre ­
ringsområdet, bør forsøget gentages med et andet, mere velegnet referencestof.
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
Rapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
— identitet og renhed af prøve- og referencestof, samt pK  a -værdi 
hvis relevant  
— beskrivelse af apparatur og forsøgsbetingelser, f.eks. type og 
dimension af analysekolonne (og forkolonne), detektionsmåde, mobil fase (forholdet mellem komponenterne, samt pH), tempe ­
raturområde under målingerne
 
— dødtiden og metoden anvendt til bestemmelse heraf  
— mængdeprøve- og referencestof, som indføres i kolonnen  
— retentionstiderne for de referencestoffer, der anvendes til kalibre ­
ring 
— enkeltheder vedrørende den tilnærmede regressionslinje (log k' 
mod log Koc) og grafisk fremstilling af regressionslinjen  
— gennemsnitlig retention og beregnet d log K  oc -værdi for prøve ­
stoffet  
— kromatogrammer.  
HENVISNINGER  
(1) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). Hand ­
book of chemical property estimation methods, Chap. 4, 
McGraw-Hill, New York.  
(2) J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 167.  
(3) G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. 
J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.
 
(4) C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic 
matter and water. Environ. Sci. Technol., 1 7, pp. 227-231.  
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic 
substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, 
B19, pp. 297-312.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C.T. Chiou, L.J. Peters, V.H. Freed (1979). A physical concept 
of soil water equilibria for nonionic organic compounds, 
Science, 106, pp. 831-832.  
(7) S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils, Chemosphere, 10, pp. 833-846.
 
(8) W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Applica ­
tion of the HPLC-screening method for the determination 
of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128.
 
(9) M. Mueller, W. Kordel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.  
(10) W. Kordel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 
27(12), pp. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kordel, W. Klein (1991) Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304.  
(12) W. Kordel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test, Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
Tillæg  
Tabel 1  
Sammenligning af K  oc -værdier for jordarter og kloakslam, samt værdier beregnet ved HPLC- 
screeningsmetoden  ( 1 ) ( 2 ) 
Stof CAS nr. kloakslam Log K  oc ved 
HPLC Δ Log K  oc for 
jordtyper Log K  oc ved 
HPLC Δ 
Atrazin 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 
Fenthion 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 
Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Phenanthren 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 
Benzoesyrephenylester 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 
Benzamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-Nitrobenzamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 
Acetanilid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 
Anilin 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dichloroanilin 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), pp. 107-119.  
Tabel 2  
Resultater af det laboratoriesammenlignende forsøg (11 deltagende laboratorier), som er gennemført med henblik 
på at forbedre og validere HPLC-metoden  ( 1 ) 
Stof CAS nr. Log K  oc K oc Log K  oc 
(OECD 106) (HPLC metode)  
Atrazin 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 
Triapenthenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 
Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fenthion 55-38-9 3,31 2 062 + 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere. 30(7), pp. 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabel 3  
Anbefalede referencestoffer til HPLC-screeningsmetoden baseret på jordadsorptionsdata  
Referencestof CAS nr. Gennemsnitlige 
log K  oc -værdier 
fra batchligevægt Nummer på 
K oc -data Log S.D. Kilde  
Acetanilid 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Phenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N.N-dimethylbenzamid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Methylbenzamid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Methylbenzoat 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazin 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  C ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  C ) 
3-Nitrobenzamid 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilin 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  C ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  C ) 
Triazoxid 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  C ) 
Triazophos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  C ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  C ) 
Naphthalen 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  C ) 
Methiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  C ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Trichlorbenzen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fenthion 55-38-9 3,31 3 2,49 (  C ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyrazophos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  C ) 
α-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  C ) 
Diclofop-methyl 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  C ) 
Phenanthren 8 5-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 4] (mix) 26850-47-5 
12270-13- 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3-2 5,631— 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No 106 01 044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen. W. Kördel. W. Klein (1991). Chemosphere, 22. pp, 285-304. 
( c ) Data stillet til rådighed af industrien.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  DAPHNIA MAGNA FORMERINGSTEST  
1. METODE  
Denne testmetode, der undersøger kemikaliers toksiske indflydelse 
på formeringsevnen, svarer til OECD TG 211 (1998).  
1.1. INDLEDNING  
Det primære mål for testen er at vurdere kemikaliers indvirkning på 
Dafphnia magnas formeringsevne.  
1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER  
Forældregenerationen  er de hundafnier, som er til stede ved testens 
begyndelse, og hvis formeringsevne er genstand for undersøgelsen.  
Afkom  er de dafnier, der er født af forældregenerationen under 
testen.  
Laveste koncentration med observeret effekt  (LOEC) er den 
laveste kemikaliekoncentration, der i testen har vist sig at resultere i en statistisk signifikant indflydelse (p < 0,05) på formeringen og 
dødelighed for forældregenerationen inden for den fastlagte ekspone ­
ringstid, sammenlignet med kontrollen. Imidlertid skal alle under ­
søgte koncentrationer, der ligger over LOEC, have haft en skadelig virkning, som er større end eller lig med den, som er observeret ved 
LOEC. Hvis ikke disse to krav opfyldes, skal der gøres fuldstændigt 
rede for fastlæggelsen af LOEC (og dermed NOEC).
 
Koncentration uden observeret effekt (NOEC)  er den testkoncen ­
tration umiddelbart under LOEC, som ved sammenligning med kontrollen ikke har nogen statistisk signifikant effekt (p < 0,05) 
inden for en fastlagt eksponeringstid.
 
EC X er den koncentration af testkemikaliet opløst i vand, som resul ­
terer i en x procent reduktion i formeringen af Daphnia magna inden for en fastlagt eksponeringstid.
 
Den sande formeringshastighed  er det mål for vækst, der integrerer 
formering og den aldersbetingede dødelighed (20)(21)(22). I en 
»steady state« population vil den være lig nul. For populationer i 
vækst vil den være positiv, og for populationer, der mindskes, vil den være negativ. Det er klart, at den sidste situation er uholdbar og vil ende med udslettelse af populationen.
 
Den påviselige grænseværdi  er den laveste koncentration, der ses at 
have effekt, men som ikke kan kvantiteres.  
Den målelige grænseværdi  er den laveste koncentration, der kan 
kvantiteres.  
Mortalitet  et dyr anses for værende dødt, når det ikke kan bevæge 
sig, dvs. når det ikke er i stand til at svømme, eller hvis der ikke ses bevægelser af vedhæng eller postabdomen inden for 15 sekunder efter forsigtig omrystning af undersøgelsesbeholderen. (Hvis en 
anden definition anvendes, skal det meddeles sammen med dets 
reference).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. PRINCIPPET FOR TESTMETODEN  
Unge hundafnier (forældregenerationen), yngre end 24 timer ved 
testens begyndelse, udsættes for testkemikaliet opløst i vand i en række koncentrationer. Testens varighed er 21 dage. Ved testens 
afslutning vurderes det totale antal efterkommere efter den stadig 
levende forældregeneration. Det betyder, at afkom af dafnier, der er døde i løbet af testen, ikke inkluderes i beregningerne. Forældre ­
generationens formeringsevne kan udtrykkes på andre måder (f.eks. 
antal levende efterkommere pr moderdyr fra den første dag, afkom 
blev observeret), men skal rapporteres sammen med det totale antal afkom frembragt pr. levende moderdyr ved testens afslutning. 
Formeringsevnen for de dyr, der blev eksponeret for testkemikaliet, 
sammenlignes med formeringsevnen i kontrollen/kontrollerne for at fastlægge den laveste koncentration med observeret effekt (LOEC) og dermed koncentrationen uden observeret effekt (NOEC). Så vidt 
gørligt skal data desuden analyseres ved hjælp af en regressions ­
model for at vurdere de koncentrationer, der ville forårsage en x % reduktion i formeringsevnen (dvs. EC
 50 . EC  20 eller EC  10 ). 
Forældregenerationens overlevelse og tiden indtil den første yngel 
skal også meddeles. Andre effekter af kemikaliet på parametre såsom 
vækst (dvs. længde) og eventuelt den sande formeringshastighed kan tænkes undersøgt.
 
1.4. INFORMATION OM TESTKEMIKALIET  
Resultatet fra en akut toksicitetstest (se metode C.2, del I) udført 
med Daphnia magna bør være tilgængelig. Resultatet kan være 
nyttigt for valget af en passende række af testkoncentrationer i 
formeringstestene. Opløseligheden i vand og testkemikaliets damp ­
tryk bør være kendt ligesom en pålidelig analytisk metode til kvan ­
titering af kemikaliet i testopløsningerne med angivelse af effektivitet 
med hensyn til genfinding og den målelige grænseværdi.  
Data for testkemikaliet, som kan være nyttige for at fastslå testbe ­
tingelserne, inkluderer strukturformel, stoffets renhed, lysstabilitet, 
stabilitet i testforløbet, pKa, P  ow . og resultater af test for spontan 
nedbrydning (se metode C.4)  
1.5. TESTENS VALIDITET  
Hvis en test skal være valid skal følgende resultat-krav opfyldes af 
kontrollen/kontrollerne:  
— forældregenerationens mortalitet (hundafnier) må ikke overstige 
20 % ved afslutning af testen  
— det gennemsnitlige antal levende afkom pr overlevende forældre- 
hundafnie ved testens afslutning er ≥ 60. 
1.6. BESKRIVELSE AF TESTMETODEN  
1.6.1.  Apparatur  
Bægerglas og andet apparatur, der kommer i kontakt med testop ­
løsningerne, skal være fremstillet af rent glas eller andet kemisk inert materiale. Karrene til undersøgelsen vil almindeligvis være af glas.
 
Yderligere nødvendigt apparatur kan være følgende:  
— iltmålingsapparatur (med mikroelektrode eller andet passende 
udstyr til måling af ilt i små volumina)  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— fyldestgørende apparatur til temperaturkontrol  
— pH-meter  
— apparatur til måling af vands hårdhedsgrad  
— apparatur til måling af totalkoncentrationen af organisk kulstof 
(TOC) i vand eller apparatur til bestemmelse af det kemiske iltbehov (COD)
 
— fyldestgørende apparatur til kontrol af lys-regime og måling af 
lys-intensitet.  
1.6.2.  Testorganisme  
Den art, der skal benyttes i testen, er Daphnia magna Straus. Andre 
arter af dafnier kan anvendes, under forudsætning af at de på 
passende måde opfylder validitetskriterierne. (Det relevante validi ­
tetskriterium for dafniearten er formeringsevnen, som den ses i kontrollerne). Hvis der anvendes andre dafniearter, skal de klart 
defineres og brugen af dem begrundes.
 
En genotypebestemmelse som identifikation af arten vil være at 
foretrække. Undersøgelser (1) har vist, at formeringsevnen af Klon A (som stammer fra IRCHA i Frankrig) (3) er stabil med hensyn til 
det relevante validitetskriterium med sit gennemsnit på ≥ 60 stk. 
afkom pr. forældredafnie, der overlever ved de dyrkningsbetingelser, som nærværende metode beskriver. Andre kloner er imidlertid accep ­
table, hvis det kan påvises, at dafniekulturen opfylder validitetskri ­
terierne for en test.
 
Ved testens begyndelse skal dyrene være yngre end 24 timer og må 
ikke være først udrugede afkom. De skal være efterkommere af en sund population (dvs. uden tegn på stress, såsom høj mortalitet, 
tilstedeværelse af handyr og ephippier, forsinkelse i fremkomst at 
første udrugede afkom, misfarvning osv.) De dyr, der siden skal levere forsøgsdyr, skal dyrkes under betingelser (lys. temperatur, medium, fodring og antal dyr pr. volumenenhed), der svarer til 
dem, der anvendes i testen. Hvis dafnierne rutinemæssigt lever i et 
andet medium end det, der anvendes i testen, er det god praksis at inkludere en prætest-akklimatiseringsperiode på normalt tre uger (dvs. en generation) for at undgå at stresse forældregenerationen.
 
1.6.3.  Testmedium  
Det anbefales at anvende et veldefineret medium i denne test. 
Derved undgås brugen af additiver (f.eks. tang, udtræk af jord), 
som er vanskeligt at karakterisere, men derimod at forbedre mulig ­
heden for standardisering laboratorierne imellem. Elendt M4 (4) og M7 media (se tillæg 1) er fundet velegnede til dette formål. Andre 
medier kan imidlertid også bruges (f.eks. (5)(6)), forudsat at dafnie- 
kulturen opfylder testens validitetskriterier.
 
Hvis der anvendes medier, der indeholder udefinerede tilsætnings ­
stoffer, skal disse klart specificeres, og der skal fremskaffes oplys ­
ninger til testrapporten om sammensætning, særlig med hensyn til 
kulstofindholdet, da det kan optræde som tilskud til diæten. Det 
anbefales at fastlægge det totale organiske kulstof- (TOC) og/eller kemiske iltkrav (COD) til det organiske additiv i stamopløsningen, og at der foretages en vurdering af det medfølgende tilskud til 
TOC/COD i testmediet. Det anbefales, at niveauet af TOC i 
mediet (før tilsætning af alger) er under 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Det er vigtigt at gøre sig klart i forbindelse med undersøgelse af 
kemikalier, der indeholder metaller, at testmediets egenskaber (f.eks. 
hårdhed, cheleringskapacitet) kan have indflydelse på testkemikaliets toksicitet. Af den grund er et fuldt ud defineret medium ønskværdigt. For tiden er de eneste fuldt ud definerede medier, som er egnede til 
langtidskulturer med Daphnia magna Elendt M4 og M7. Begge inde ­
holder EDTA som cheleringsmiddel. Work har påvist (2), at cadmiums tilsyneladende toksicitet generelt er lavere, når formerings ­
testen udføres med M4 og M7 end med medier uden EDTA. Af den 
grund er M4 og M7 ikke at anbefale, når der skal undersøges kemi ­
kalier indeholdende metaller, ligesom andre medier kendt for at have chelerende stoffer ligeledes bør undgås. Til kemikalier, der inde ­
holder metaller, tilrådes brugen af andre medier som f.eks. hårdt 
ferskvand tilsat ASTM (7), som ikke indeholder EDTA, hvortil 
sættes ekstrakt af tang (8). Denne kombination af hårdt ferskvand tilsat ASTM med ekstrakt af tang er også velegnet til langtidskulturer og undersøgelse af Daphnia magna (2), endskønt den udøver en let 
chelerende effekt på grund af den organiske komponent i den tilsatte 
tangekstrakt.
 
Under hele testen bør koncentrationen af opløst ilt være over 3 mg/l. 
pH bør være inden for 6-9 og normalt ikke variere mere end 1,5 enheder. Hårdhed over 140 rng/l (målt som CaCO
 3 ) anbefales. Test 
på dette niveau og derover har vist formeringsevne i overensstem ­
melse med validitetskriterierne (9)(10).  
1.6.4.  Testopløsninger  
Testopløsninger med de valgte koncentrationer fremstilles alminde ­
ligvis ved fortynding af en stamopløsning. Stamopløsninger bør 
almindeligvis fremstilles ved opløsning af de relevante kemikalier i testmediet.
 
Brugen af organiske opløsningsmidler eller dispergenser er i nogle 
tilfælde nødvendige til fremstilling af en passende koncentreret 
stamopløsning, men alle anstrengelser bør tages i anvendelse for at 
undgå brugen af sådanne materialer. Eksempler på passende opløs ­
ningsmidler er acetone, ethanol, methanol, dimethylformamid og triethylene glycol. Eksempler på dispergenser er Cremophor RH40, 
methylcellulose 0,01 % og HCO-40. Under alle omstændigheder bør 
test-kemikaliet i testopløsningen ikke overskride graden af opløse ­
lighed i testmediet.
 
Opløsningsmidler anvendes til fremstilling af en stamopløsning, som 
kan doseres i vand med stor nøjagtighed. Med den anbefalede 
koncentration af opløsningsmiddel i det endelige testmedium (dvs. 
0,1 ml/l) vil de ovenfor nævnte opløsningsmidler ikke være toksiske, og de vil heller ikke øge et kemikaliums vandopløselighed.
 
Dispergensernes funktion er at hjælpe til med en nøjagtig dosering 
og dispersion. Med den anbefalede koncentration af dispergens i det endelige testmedium (dvs. 0,1 ml/l) vil de ovenfor nævnte disper ­
genser ikke være toksiske, og de vil heller ikke øge et kemikaliums 
vandopløselighed.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. TESTENS DESIGN  
Tilsætning til måleglassene og de påfølgende håndteringer af dem 
bør foretages på en randomiseret måde. Hvis dette ikke gøres, risi ­
kerer man bias, som kunne opfattes som resultatet af forskellige 
koncentrationer. Helt specielt kan dette ses, hvis undersøgelses ­
rækker håndteres systematisk efter behandling eller koncentrationer, at tidsrelaterede resultater, som f.eks. persontræthed eller anden fejl ­
mulighed, kan medføre større effekt ved de højere koncentrationer. 
Yderligere, hvis testresultaterne kan tænkes påvirkede af begiven ­
heder ved testens start eller af omgivelserne, som f.eks. karrenes placering i laboratoriet, bør man overveje at dele testen op i grupper.
 
1.8. FREMGANGSMÅDE  
1.8.1.  Omstændigheder ved ekspositionen  
1.8.1.1.  Varighed  
Testen varer 21 dage.  
1.8.1.2.  Påfyldning  
Moderdyrene holdes individuelt med ét dyr pr måleglas med 50- 
100 ml medium i hvert måleglas.  
Af hensyn til målinger af koncentrationen af testkemikaliet kan større 
volumina være nødvendige; det er dog tilladt at foretage den kemiske analyse på en pulje sammensat fra flergangsbestemmelser. 
Hvis der anvendes volumina større end 100 ml, kan det være 
nødvendigt at øge fødemængden for at sikre tilstrækkelig fødetilgang for dafnien og overensstemmelse med validitetskriterierne. Hvis der anvendes gennemstrømningstest, kan det af tekniske grunde være 
nødvendigt med alternative design (f.eks. fire grupper med 10 dyr 
i et større testvolumen), men enhver ændring i testdesign skal meddeles.
 
1.8.1.3.  Antal dyr  
Ved semistatiske test skal der være mindst 10 dyr, hver holdt sepa ­
rat, for hver testkoncentration og mindst 10 dyr, hver holdt separat, i kontrolserien.
 
Det har ved gennemstrømningstest vist sig passende med 40 dyr 
opdelt i grupper med 10 dyr for hver testkoncentration (1). Man 
kan anvende et mindre antal testorganismer, og der anbefales da et minimum på 20 dyr pr. koncentration opdelt i dobbelt- eller fler ­
gangsbestemmelser med et tilsvarende antal dyr (f.eks. fire bestem ­
melser med hver fem dafnier). Det bemærkes, at ved test, hvor 
dyrene holdes gruppevis, vil det ikke være muligt at udtrykke formeringsevnen som det totale antal levende efterkommere frem ­
bragt for hvert levende forældredyr, dersom forældredyr dør i løbet 
af forsøget. I de tilfælde bør man udtrykke formeringsevnen som det 
totale antal levende afkom pr. forældredyr, som var i live ved testens begyndelse.
 
1.8.1.4.  Fodring  
I semistatiske forsøg bør fordring foretages daglig eller i hvert fald 
tre gange ugentlig (dvs. i sammenhæng med udskiftning af medium). 
Afvigelser fra dette (f.eks. for gennemstrømningstest) skal meddeles.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Under forsøget bør diæten for forældredyr fortrinsvis være levende 
algeceller af en eller flere af følgende: Chlorella sp., Selenastrum 
capricornutum (nu Pseudokirchneriella subcapitata (11)) og Scene ­
desmus subspicatus. Den tilførte diæt skal baseres på mængden af organisk kulstof (C) for hvert forældredyr. Undersøgelser (12) har 
vist, at for Daphnia magna er det tilstrækkeligt med fodermængder af 
størrelsesordenen 0,1 til 0,2 mg C/Daphnia/døgn med henblik på det ifølge validitetskriterierne ønskede antal afkom. Fodermængden kan enten være konstant gennem hele forsøgsperioden eller, om det 
ønskes, kan der gives en lavere mængde til at begynde med og 
siden lade mængden forøges for at tage hensyn til forældredyrets vækst under forløbet. I sidstnævnte tilfælde bør fodermængden i hele perioden stadig være inden for de anbefalede mængder på 0,1 
til 0,2 mg C/Daphnia/døgn.
 
Måling af kulstofindhold er tidsrøvende, men hvis erstatningsmålin ­
ger, som f.eks. celletal af alger eller lysabsorption, anvendes for nemheds skyld for at afmåle den korrekte fødemængde, må hvert 
laboratorium fremstille et nomogram, som sammenholder erstatnings ­
målingen med kulstofindholdet i algekulturen (se tillæg 2 for rådgiv ­
ning om konstruktion af nomogram). Nomogrammer skal kontrol ­
leres mindst en gang årligt og hyppigere, hvis betingelserne for 
algerne er ændrede. Det er vist, at lysabsorption er en bedre erstat ­
ning end celletælling til beregning af kulstofindhold (13).
 
Man bør tilføre dafnierne algesuspensionen i koncentreret form, 
således at mindst muligt af algekulturmediet overføres til forsøgs ­
karret. Opkoncentrering af alger kan foretages ved centrifugering 
efterfulgt af resuspension i destilleret vand eller deioniseret vand eller dafniekulturmedium.
 
1.8.1.5.  Lys  
16 timers lys med en intensitet, der ikke overstiger 15-20 μE m  -2 s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatur  
Testmediets temperatur skal ligge mellem 18 og 22  o C. I det enkelte 
forsøg bør temperaturen, om muligt, ikke variere mere end 2  o C 
(f.eks. 18-20, 19-21 eller 20-22  o C). Det kan være på sin plads at 
anvende et forsøgskar yderligere til brug for temperaturmonitorerin ­
gen. 
1.8.1.7.  Gennemluftning  
Måleglassene må ikke gennemluftes under forsøget.  
1.8.2.  Testkoncentrationer  
Normalt bør der være mindst fem testkoncentrationer arrangeret i en 
geometrisk række med en adskillelsesfaktor, som helst ikke bør over ­
stige 3.2, og der skal udføres det passende antal af flergangsbestem ­
melser for hver testkoncentration (se 1.8.1.3). Begrundelse skal angi ­
ves, hvis færre end fem koncentrationer undersøges. Kemikalier bør 
ikke testes i koncentrationer, der overstiger opløseligheden i testme ­
diet. ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Når range for koncentrationerne skal fastlægges, bør følgende tages i 
betragtning:  
i) Hvis formålet er at opnå LOEC/NOEC, skal den laveste testkon ­
centration være så lav, at frugtbarheden ved denne koncentration 
ikke adskiller sig signifikant fra kontrollens. Hvis det ikke er tilfældet, skal testen gentages med formindsket laveste koncen ­
tration.
 
ii) Hvis formålet er at opnå LOEC/NOEC, bør den højeste testkon ­
centration være så høj, at frugtbarheden ved denne koncentration 
er signifikant lavere end i kontrollen. Hvis det ikke er tilfældet, skal testen gentages med forøget højeste koncentration.
 
iii) Hvis EC  X for indvirkning på formeringsevner, beregnes, er det 
tilrådeligt, at der anvendes tilstrækkeligt mange koncentrationer 
til, at EC  X kan defineres med passende sikkerhed. Hvis EC  50 for 
indvirkning på formeringsevnen beregnes, er det tilrådeligt, at den højeste testkoncentration er større end den ved EC
 50 . 
Ellers vil sikkerhedsgrænserne for EC  50 blive meget vide, og 
selvom man kan beregne EC  50 , er det ikke muligt i tilstrækkelig 
grad at vurdere, om forsøget har været fyldestgørende.  
iv) Range for testkoncentrationerne bør ikke inkludere koncentratio ­
ner, der har en statistisk signifikant indflydelse på forældredyrets overlevelse, da det vil ændre undersøgelsens natur fra en simpel 
formeringstest til en kombineret formerings- og overlevelsestest, 
som stiller krav om mere komplekse statistiske analyser.
 
Kendskab på forhånd til testkemikaliets toksicitet (f.eks. fra en hurtig 
test og/eller fra undersøgelser over range) kan hjælpe til at finde passende testkoncentrationer.
 
Når et opløsningsmiddel eller et dispergens er anvendt i præpara ­
tionen af testopløsningen (se 1.6.4), bør slutkoncentrationen i måle ­
glasset ikke være større end 0,1 ml/l og desuden være den samme i 
alle måleglassene.  
1.8.3.  Kontroller  
Sideløbende med testserien bør udføres en testmediumkontrol og 
ligeledes, hvis det er relevant, en kontrolserie, som indeholder opløs ­
ningsmiddel eller dispergens i koncentrationer som dem, der anvendes i forsøget. Der skal udføres et passende antal flergangs ­
bestemmelser (se 1.8.1.3).
 
Almindeligvis vil variationskoefficienten for det gennemsnitlige antal 
afkom pr forældredyr i kontrollen/kontrollerne i en vellykket test være ≤ 25, og dette skal meddeles fra testdesign, hvor dyrene har 
været holdt alene.
 
1.8.4.  Fornyelse af medium  
Hyppigheden for fornyelse af mediet afhænger af testkemikaliets 
stabilitet, men fornyelse bør foretages mindst tre gange om ugen. 
Hvis man ved fra forudgående stabilitetsundersøgelser, at testkemi ­
kaliet ikke er stabilt (dvs. uden for range 80-120 % af den nominelle koncentration eller falder under de 80 % af den målte begyndelses ­
koncentration) og ændrer sig i løbet af den maksimale fornyelses ­
periode (dvs. tre døgn), bør man overveje at skifte mediet hyppigere 
eller at gå over til en gennemstrømningstest.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Når mediet skal fornyes i semistatiske test, er der fremstillet en 
anden række af måleglas, og forældredyret flyttes over til dem 
f.eks. ved hjælp af en glaspipette med en passende diameter. Mindst muligt medium bør overflyttes sammen med dafnien.
 
1.8.5.  Observationer  
Resultatet af undersøgelser gjort under forsøget skal noteres på data- 
ark (se eksempler i tillæg 3 og 4). Hvis der ønskes andre målinger (se 1.3 og 1.8.8), kan det være nødvendigt med andre undersøgelser.
 
1.8.6.  Afkom  
Det er bedst dagligt at fjerne og tælle afkom fra hvert forældredyr fra 
første dag, der ses yngel, for at hindre ynglen i at indtage den føde, der var tiltænkt forældredyret. Undersøgelsens formål kræver kun, at 
man tæller antal levende afkom, men tilstedeværelsen af aborterede 
æg eller dødt afkom bør også noteres.
 
1.8.7.  Mortalitet  
Dødelighed blandt forældredyrene bør noteres dagligt og i hvert fald 
samtidigt med, at afkommet tælles.  
1.8.8.  Andre parametre  
Selvom metoden principielt er designet til at vurdere virkning på 
formeringsevnen, er det muligt, at andre virkninger kan kvantiteres, så der kan fortages statistiske beregninger. Målinger af vækst er særdeles ønskværdige, eftersom de giver informationer om mulige subletale virk ­
ninger, som kan tænkes at være mere nyttige end måling alene af 
formeringsevnen; det anbefales, at man ved forsøgets afslutning måler længden af forældredyrene (dvs. kropslængden minus den anale spina). Andre parametre kan måles eller beregnes såsom tiden til fremkomst af 
den første yngel (og den påfølgende yngel), antal og størrelse af yngel pr. 
dyr, antallet af aborteret yngel, tilstedeværelse af handyr eller ephippier, populationens egentlige formeringshastighed.
 
1.8.9.  Hyppighed af analyser og målinger  
Ilt-koncentration, temperatur, hårdhedsgrad og pH-værdier bør måles 
i hvert fald hver uge i nye og gamle medier, i kontroller og i opløs ­
ninger med den højeste koncentration af testkemikaliet.  
Mens forsøget løber, måles koncentrationen af testkemikaliet med 
regelmæssige intervaller.  
I semistatiske test, hvor koncentrationen af testkemikaliet forventes 
at forblive inden for ± 20 % af den nominelle koncentration (dvs. 
inden for range 80-120 % — se 1.4 og 1.8.4), anbefales det som et 
minimum at måle højeste og laveste testkoncentration ved fremstil ­
lingen og i forbindelse med udskiftning ved en lejlighed i den første uge af forsøget (dvs, analyser skal udføres på en prøve fra samme 
opløsning — frisk fremstillet og ved en fornyelse). Disse målinger 
bør gentages mindst ugentligt derefter.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
I forbindelse med test, hvor testkemikaliet ikke forventes at holde sig 
inden for ± 20 % af den nominelle koncentration, er det nødvendigt 
at analysere alle testkoncentrationer, når de er frisk fremstillede og ved udskiftning. I de test, imidlertid, hvor testkemikaliets målte begyndelseskoncentration ikke ligger inden for ± 20 % af den nomi ­
nelle koncentration, men hvor der er tilstrækkelig bevis for, at 
begyndelsesværdierne kan genfindes og er stabile (dvs. inden for range 80-120 % af begyndelseskoncentrationen), kan kemiske målinger reduceres i uge 2 og 3 til kun at omfatte den højeste og 
den laveste testkoncentration. I alle tilfælde behøver man før 
fornyelse kun at bestemme testkemikaliets koncentration i et af måle ­
glassene i en flergangsbestemmelse for hver af testkoncentrationerne.
 
Anvendes en gennemstrømningstest, er et analyseregime svarende til 
de semistatiske test passende (men i dette tilfælde er måling på 
»gamle« opløsninger ikke mulig). I den første uge kan det være 
tilrådeligt at øge antallet af prøvetagninger (f.eks. tre hold målinger) for at sikre, at testkoncentrationerne holder sig stabile. I den type test bør gennemstrømningshastigheden for fortyndingsvæske og testkemi ­
kalium kontrolleres daglig.
 
Hvis det viser sig, at koncentrationen af det undersøgte kemikalium 
på tilfredsstillende måde er holdt inden for ± 20 % af den nominelle eller målte begyndelseskoncentration gennem hele testforløbet, kan 
resultaterne baseres på de nominelle eller målte begyndelseskoncen ­
trationer. Hvis afvigelsen fra den nominelle eller målte begyndelses ­
koncentration er større end ± 20 %, skal resultaterne udtrykkes som tidsvægtet gennemsnit (se tillæg 5).
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Formålet med denne test er at bestemme virkningen af testkemikaliet 
på det totale antal levende afkom pr, forældredyr, som er i live ved forsøgets afslutning. Det totale antal afkom pr. forældredyr skal beregnes for hver beholder (dvs. hver enkeltbestemmelse). Viser det 
sig ved en enkeltbestemmelse, at forældredyret dør under forsøget, eller 
at det er af hankøn, ekskluderes denne enkeltbestemmelse fra analysen. Analysen vil så blive baseret på et reduceret antal enkeltbestemmelser.
 
Vurderingen af LOEC og dermed NOEC for virkningen af kemikaliet på 
det totale antal afkom forudsætter en beregning af det gennemsnitlige antal 
afkom på tværs af enkeltbestemmelserne for hver koncentration samt den samlede residuale standarddeviation. Dette kan gøres ved hjælp af en variansanalyse (ANOVA). Gennemsnittet for hver koncentration skal så 
sammenholdes med kontrolgennemsnittet ved hjælp af en passende 
metode til multiple sammenligninger. Dunnetts eller Williams test kan 
være anvendelige (14) (15) (16) (17). Det er nødvendigt at kontrollere, at ANOVA-forudsætningen om varianshomogenitet holder stik. Det anbe ­
fales, at dette gøres grafisk snarere en d ved en formel signifikanstest (18). 
Et passende alternativ er Bartletts test. Hvis den nævnte forudsætning ikke holder, bør man overveje at transformere data med henblik på sikring af homogenitet før udførelse af ANOVA eller at udføre en vægtet ANOVA. 
Størrelsen af den virkning, der kan påvises med ANOVA (dvs. mindste 
signifikante forskel), skal beregnes og meddeles.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Til vurdering af den koncentration, som medfører en 50 % reduktion 
af det totale antal afkom (dvs. EC  50 ), konstrueres en passende kurve, 
f.eks. en logistisk kurve, som er tilpasset data ved hjælp af en statistisk metode, f.eks. de mindste kvadraters metode. Kurven skal parameteriseres, således at EC
 50 og standardfejlen på denne kan 
aflæses direkte. Dette vil lette beregningen af sikkerhedsgrænserne 
for EC  50 . Medmindre der er gode grunde ti! at foretrække andre 
sikkerhedsgrænser, skal tosidede 95 %-sikkerhedsgrænser meddeles. Tilpasningsproceduren skal helst tillade en vurdering af signifikansen 
af den manglende overensstemmelse. Man kan gøre dette grafisk, 
eller man kan inddele den residuale kvadratsum i to komponenter: manglende overensstemmelse og tilfældig variation, hvorefter man udfører en signifikanstest for den manglende overensstemmelse. 
Eftersom behandlinger, der medfører højere frugtbarhed, må 
formodes at udvise større varians i antallet af afkom end behandlin ­
ger, der medfører lav frugtbarhed, bør man overveje at vægte de observerede data, så de afspejler de forskellige varianser i de forskel ­
lige behandlingsgrupper (se baggrundsinformation i henvisning (18)).
 
Ved analysen af data fra den endelige »ringtest« (2) tilpassedes en 
logistisk kurve ved hjælp af følgende model, selvom andre passende 
modeller kan anvendes:  
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
hvor:  
Y = totale antal afkom pr. forældredyr, som var i live ved forsøgets 
afslutning (beregnet for hver beholder)  
x = substanskoncentrationen  
c = det forventede antal afkom, når x = 0  
x 0 = EC  50 i populationen  
b = hældningen.  
Denne model vil formentlig være passende i et stort antal tilfælde, 
men der vil være forsøg, hvor den ikke er adækvat. Man bør vurdere 
modellens validitet som foreslået ovenfor. I nogle tilfælde vil det være passende at anvende en hormese-model, hvor lave koncentra ­
tioner giver en øget virkning (19).
 
Andre virkningskoncentrationer, såsom EC  10 eller EC  20 kan også 
estimeres. men de! kan i så fald være formålstjenligt at anvende 
en parameterisering af modellen, som er forskellig fra den, der 
anvendtes til at estimere EC  50 . 
2.2. TESTRAPPORT  
Test-rapporten skal indeholde:  
2.2.1.  For test-kemikaliet:  
— fysiske natur og relevante fysisk-kemiske egenskaber  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— data vedrørende den kemiske identifikation inklusive renhedsgrad.  
2.2.2.  For dyrearten:  
— klonen (om den er blevet genotypebestemt), leverandør eller 
kilde (hvis kendt) og dyrkningsbetingelserne. Hvis en anden art end Daphnia magna anvendes, skal det meddeles og begrundes.
 
2.2.3.  Testomstændigheder:  
— den anvendte test-procedure (f.eks. semistatisk eller gennem ­
strømning, volumen, antal dafnier pr liter ved påfyldning  
— lysperiode og lysintensitet  
— testdesign (f.eks. antal flergangsbestemmelser, antal forældredyr 
pr måleglas)  
— detaljer vedrørende kulturmediet  
— eventuel tilsætning af organisk materiale, inkluderende sammen ­
sætning, kilde, fremstillingsmetode, stamopløsningens TOC/COD, vurdering af resulterende TOC/COD i testmediet
 
— detaljeret information angående fodring, inklusive mængde (i mg 
C/Dafnia/døgn) og liste (f.eks. fodertype(r)) inklusive algernes 
specifikke navn (arten) og, hvis kendt, herkomst og dyrknings ­
betingelserne  
— måde til fremstilling af stamopløsninger og hyppighed af 
fornyelse (evt. opløsningsmidler eller dispergenser og deres koncentrationer skal opgives).
 
2.2.4.  Resultater  
— resultater af ethvert forudgående studium af test-kemikaliets 
stabilitet  
— de nominelle testkoncentrationer og resultaterne af alle analyser 
til bestemmelse af koncentrationen af testkemikaliet i måleglasset 
(se eksempler på dataark i tillæg 4); metodens genfindingsevne 
og dens grænser skal også meddeles  
— vandets kvalitet i måleglasset (dvs. pH, temperatur, koncentra ­
tionen af opløst ilt og TOC og/eller COD og hårdhedsgrad, hvor dette er relevant) (se eksempler på data-ark i tillæg 3)
 
— fuld fortegnelse over levende afkom efter hvert moderdyr (se 
eksempler på data-ark i tillæg 3)  
— antal døde moderdyr og dagen for hændelsen (se eksempler på 
data-ark i tillæg 3)  
— variationskoefficiemen for frugtbarhed i kontrollerne (baseret på 
det totale antal afkom pr forældredyr, som er i live ved testens 
afslutning)  
— det totale antal af levende afkom pr. forældredyr (for hver af 
flergangsbestemmelserne), som er i live ved testens afslutning 
plottet over for koncentrationen af testkemikaliet  
— laveste koncentration med observeret effekt (LOEC) med hensyn 
til frugtbarhed, inklusive en beskrivelse af den anvendte statistiske fremgangsmåde og en angivelse af, hvilken virknings ­
størrelse der kunne måles og koncentration uden observeret 
effekt (NOEC) med hensyn til frugtbarhed: hvor relevant 
opgives ligeledes LOEC/NOEC-mortaliteten for forældredyrene
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— hvor relevant ECx med hensyn til frugtbarhed og sikkerheds ­
grænser og en graf af den model, der var anvendt til beregnin ­
gen, hældningen på dosis-responskurven og standardfejlen  
— andre observerede biologiske virkninger eller målinger: der skal 
rapporteres enhver biologisk virkning, som blev observeret eller målt (f.eks. forældredyrenes vækst) inklusive relevante begrun ­
delser
 
— forklaringer for enhver afvigelse fra testmetoden.  
HENVISNINGER  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK. 
20-21 March 1993.  
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
(3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C, Soares A.M.V.M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265.
 
(4) Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.  
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber 
(ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
 
(6) Vigano L, (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna.  Bull. 
Environ. Contam. Toxicol, 47, pp. 775-782.  
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macromvertebrates and Amphibians. E729- 
88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. 20 pp.  
(8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; 
problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European 
Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148.
 
(9) Parkhurst B.R., Forte J.L and Wright G.P. (1981). Reproduci ­
bility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna.  Bull. 
Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8.  
(10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196.
 
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
(12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a stan ­
dard Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims i. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459-466.
 
(14) Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. j. Amer. Statist. 
Assoc, 50, pp. 1096-1121.  
(15) Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 4S2-491.  
(16) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(17) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.  
(18) Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, pp. 93-96.  
(20) Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population 
Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biolog}', New York, pp. 
532. 
(22) Meyer). S., Ingersoll C.G., McDonald L.L and Boyce M.S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67. pp. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
Tillæg 1  
KOMPLET FREMSTILLING AF MEDIERNE M7 OG M4  
Akklimatisering til Medierne Elendt M7 og M4  
Nogle laboratorier har haft problemer med at overflytte datnier direkte til M4- (1) 
og M7-medierne. Imidlertid har en gradvis akklimatisering givet nogen succes; 
man flytter dafnierne fra deres eget medium til et 30 % Elendt, siden til et 60 % 
Elendt og så til et 100 % Elendt. Akklimatiseringsperioden kan være på op til en måned.
 
FREMSTILLING  
Sporelementer  
Separate stamopløsninger (I) med de forskellige sporstoffer fremstilles primært i 
vand af passende renhedsgrad, f.eks. de-ioniseret, destilleret vand eller vand renset ved omvendt osmose. Ud fra disse forskellige stamopløsninger (I) frem ­
stilles en sekundær stamopløsning (II), som indeholder alle sporstofferne (kom ­
binationsopløsningen), som følger:
 
Stamopløsning I 
(enkelt stof) Antal mg sat 
til 1 liter vand Koncentrationer 
(refererende til M4) 
(fold) For at fremstille stamopløsning Il 
tilsættes nedennævnte antal ml af 
stamopløsning i 
til 1 liter vand 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 0 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 Mo0  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 0 1 991 2 000 _ _ 
Na 2 EDTA- og FeSO  4 -opløsningerne fremstilles hver for sig. hældes sammen og autoklaveres straks. Dette giver: 
21 Fe-EDTA-opløsning 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
M4- og M7-medierne  
M4- og M7-medierne fremstilles ved hjælp af stamopløsning II, makronærings ­
stofferne og vitaminerne som følger:  
Antal mg sat 
til 1 liter vand Koncentrationer 
(relateret til 
medium M4) 
(fold) Antal ml af stamopløsning, der sættes til 
1 liter for at fremstille mediet 
M4 M7  
Stamopløsning II samlede sporstoffer 20 50 50 
Stamopløsning med makro-næringsstoffer (enkelte stoffer) 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Kombineret vitaminopløsning — 10 000 0,1 0,1 Den kombinerede vitaminopløsning fremstilles ved at sætte de 3 vitaminer til 1 liter vand som vist nedenfor: Thiaminhydrochlorid 750 10 000 — — 
Cyanocobalamin (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotin 7,5 10 000 — —  
Den kombinerede vitaminopløsning opbevares i små mængder i frossen tilstand. Vitaminerne sættes til mediet kort før brugen.  
NB For at undgå udfældning af salte, når det fuldstændige medium fremstilles, skal man tilsætte de enkelte opløsninger til 500-80 0 ml 
deioniseret vand og derefter fylde op til 1 liter.  
NNB  Den første publicerede beskrivelse af M4-mediet kan findes i Elendt, B.P. (1990) Selenium deficiency in Crustacea; an ultra ­
structural approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
Tillæg 2  
ANALYSE FOR DET TOTALE ORGANISKE KULSTOF (TOC) OG 
FREMSTILLING AF NOMOGRAM TIL TOC-INDHOLDET I 
ALGEFODERET  
Det erkendes, at kulstofindholdet i algefoderet almindeligvis ikke vil blive målt 
direkte, men ud fra korrelationer (dvs. nomogrammer med erstatningsmålinger, 
såsom antallet af algeceller eller lysabsorbans).  
TOC bør måles ved oxidation ved høje temperaturer snarere end ved UV eller 
persulphate metoder. (Se: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
 
Med henblik på fremstilling af nomogrammer skal algerne adskilles fra dyrk ­
ningsmediet ved centrifugering med påfølgende resuspension i destilleret vand. Mål erstatningsparameteren og TOC-koncentrationen i hver prøve som en tredob ­
belt bestemmelse. Blindværdier måles i destilleret vand, og TOC-koncentrationen 
trækkes fra TOC-værdien i algeprøven.
 
Nomogrammet skal være lineært i hele området over kulkoncentrationer. Eksem ­
pler ses nedenfor:  
NB: Værdierne fra det her viste nomogram må ikke anvendes; det er essentielt at 
laboratorierne selv fremstiller deres egne nomogrammer.
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
Tillæg 3  
EKSEMPEL PÅ DATAARK TIL NOTATER OM FORNYELSE AF MEDIUM, FYSISK/KEMISK MONITORERING, FODRING, FORMERING OG MORTALITET BLANDT 
VOKSNE DAFNIER  
Eksperiment nr. Startdato: Klon: Medium: Fodertype: Testkemikalium: Nominel koncentration: 
Dag 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Fornyelse af medium 
(sæt kryds) 
pH (  1 ) ny 
gammel 
O 2 mg/l (  1 ) ny 
gammel 
Temperatur (  o C) (  1 ) ny 
gammel 
Fodring (sæt kryds) 
Antal levende 
afkom (  2 ) Total 
Måleglas 1 
2 
3 4 5
 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Eksperiment nr. Startdato: Klon: Medium: Fodertype: Testkemikalium: Nominel koncentration: 
Dag 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Total 
Kumulativ 
voksenmortalitet (
 3 ) 
( 1 ) Angiv hvilket glas, der blev anvendt til undersøgelsen. 
( 2 ) Anfør aborteret afkom som AB i det relevante felt. 
( 3 ) Anfør mortalitet for ethvert voksent dyr som M i det relevante felt.
 Tillæg 4  
EKSEMPEL PÅ DATAARK MED RESULTATER AF KEMISKE ANALYSER  
a) Målte koncentrationer  
Nominel 
koncentration Prøver i uge 1 Prøver i uge 2 Prøver i uge 3 
ny gammel ny gammel ny gammel  
b) Målte koncentrationer i procent af nominelle  
Nominel 
koncentration Prøver i uge 1 Prøver i uge 2 Prøver i uge 3 
ny gammel ny gammel ny gammel  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
Tillæg 5  
BEREGNING AF TIDSVÆGTET GENNEMSNIT  
Tidsvægtet gennemsnit  
Idet koncentrationen af testkemikaliet kan falde i perioden mellem fornyelsen af 
medierne, er det nødvendigt at overveje, hvilken koncentration der skal vælges 
som repræsentant for variationen af koncentrationer, som den voksne dafnie 
bliver udsat for. Valget skal baseres på såvel biologiske som statistiske betragt ­
ninger. Hvis for eksempel formeringen formodes mest påvirket af den højeste koncentration, så skal den anvendes. Hvis imidlertid den akkumulerede effekt 
eller langtidseffekten fra det toksiske stof regnes for mere vigtigt, så er gennem ­
snitskoncentrationen mere relevant. I dette tilfælde er den tidsvægtede gennem ­
snitskoncentration det passende at anvende, eftersom den tager hensyn til varia ­
tionen af hvert øjebliks koncentration i tidsforløbet.
 
Figur 1  
Eksempel på tidsvægtet gennemsnit
  
Figur 1 viser som eksempel et (forenklet) forsøg over syv dage med en fornyelse 
af mediet på dag 0, 2 og 4.  
Zigzaglinjen repræsenterer koncentrationen på ethvert tidspunkt. Faldet i 
koncentration formodes at følge en eksponential henfaldsproces.  
De seks angivne punkter repræsenterer de målte koncentrationer ved begyn ­
delsen og slutningen af hver fornyelsesperiode.  
Den tykke, solide linje angiver placeringen af det tidsvægtede gennemsnit.  
Det tidsvægtede gennemsnit er beregnet, så arealet under det tidsvægtede 
gennemsnit har samme størrelse som arealet under koncentrationskurven. Bereg ­
ningen af det ovenfor viste eksempel ses i tabel 1.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabel 1  
Beregning af tidsvægtet gennemsnit  
Fornyelse nr. Dage Konc0 Konc1 Ln(Konc0) Ln(Konc1) Areal  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Totale antal dage: 7 Totale areal 50,091 
TW gennem ­
snit 7,156
 
»Dage« er antallet af dage i fornyelsesperioden.  
»Konc0« er den målte koncentration ved begyndelsen af hver fornyelsesperiode.  
»Konc1« er den målte koncentration ved afslutningen af hver fornyelsesperiode.  
»Ln(Konc0)« er den naturlige logaritme til Konc0.  
»Ln(Konc1l)« er den naturlige logaritme til Konc1.  
»Arealet« er arealet under eksponentialkurven for hver fornyelsesperiode. Det beregnes 
således:  
Areal ¼ Konc 0 Ä Konc 1 
LnðKonc 0Þ Ä LnðKonc 1Þ Ü dage  
Det tidsvægtede gennemsnit (TW gennemsnit) er det »totale areal« divideret med 
de »totale antal dage«.  
Tabellen vil selvfølgelig strække sig over 21 dage i forbindelse med dafniefor ­
meringstesten.  
Det er klart, at når der kun foretages målinger ved begyndelsen og slutningen af 
hver fornyelsesperiode, kan man ikke bekræfte, at henfaldsprocessen er 
eksponentiel. En anderledes kurve ville resultere i en anderledes beregning for arealet. En eksponential henfaldsproces er dog ikke usandsynlig, og den er den bedste kurve at anvende, når der ikke foreligger andre informationer.
 
Stor omhu må udvises, hvis en kemisk analyse ikke kan påvise test-kemikaliet 
ved afslutningen af en fornyelsesperiode. Medmindre man kan påvise, med 
hvilken hastighed testkemikaliet forsvandt fra opløsningen, er det ikke muligt at finde frem til et realistisk areal under kurven, hvilket medfører, at det er umuligt at finde frem til et rimeligt tidsvægtet gennemsnit.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  JORDMIKROORGANISMER: KVÆLSTOFOMDANNELSESTEST  
1. METODE  
Metoden er gengivet efter OECD TG 216 (2000).  
1.1. INDLEDNING  
Den beskrevne metode er en laboratoriemetode til undersøgelse af 
langtidsvirkningerne på jordmikroorganismers kvælstofomdannende aktivitet af enkeltstående eksponering for kemiske stoffer. Metoden er hovedsagelig baseret på anbefalinger fra Plantebeskyttelsesorgani ­
sationen for Europa og Middelhavsområderne (1). Der er endvidere 
taget hensyn til guidelines fra den tyske Biologische Bundesanstalt (2), den amerikanske miljøstyrelse (3), SETAC (4) og Den Inter ­
nationale Standardiseringsorganisation (5). På en OECD-workshop 
om valg af jord-/sedimenttype, som blev holdt i Belgirate, Italien, 
i 1995 (6), enedes man om antal og art af de jordtyper, som skal anvendes i denne test. Anbefalingerne for indsamling, håndtering og opbevaring af jordprøver er baseret på en ISO-vejledning (7) og på 
anbefalingerne fra workshoppen i Belgirate, Ved vurdering af prøve ­
stoffers toksiske egenskaber kan det være nødvendigt at bestemme virkningerne på den mikrobielle aktivitet i jord, f.eks. når der kræves oplysninger om plantebeskyttelsesmidlers potentielle bivirkninger på 
mikrofloraen i jorden, eller når jordmikroorganismer forventes udsat 
for andre kemiske stoffer end plantebeskyttelsesmidler. Kvælstofom ­
dannelsesprøven udføres for at bestemme virkningerne af sådanne kemiske stoffer på mikrofloraen i jorden. Ved test af landbrugskemi ­
kalier (f.eks. plantebeskyttelsesmidler, kunstgødning og skovbrugs ­
kemikalier) udføres både kvælstofomdannelses- og kulstofomdannel ­
sestest. For andre kemiske stoffer end landbrugskemikalier er kvæl ­
stofomdannelsestesten tilstrækkelig. Viser sådanne kemiske stoffer 
sig imidlertid i kvælstofomdannelsestesten at have en EC
 50 -værdi i 
samme område som gængse nitrifikationsinhibitorer (f.eks. nitrapy ­
rin), kan en kulstofomdannelsestest udføres for at skaffe yderligere 
oplysninger.  
Jord består af levende og ikke levende komponenter, som er til stede 
i komplekse og heterogene blandinger. Mikroorganismer spiller en 
vigtig rolle i nedbrydning og omdannelse af det organiske stof i 
frugtbar jord, og mange arter bidrager til flere forskellige aspekter af jordens frugtbarhed. Hvis der gennem længere tid gribes ind i disse biokemiske processer, kan det gribe ind i næringsstofcyklussen, 
således at jordens frugtbarhed ændrer sig. Kulstof- og kvælstofom ­
dannelse finder sted i al frugtbar jord. Skønt det alt efter jordtypen er forskellige mikrobielle samfund, som er ansvarlige for disse proces ­
ser, følger omdannelsen i det væsentlige altid samme vej.
 
Den her beskrevne forsøgsmetode anvendes til bestemmelse af stof ­
fers langsigtede skadevirkning på kvælstofomdannelsesprocessen i jordens aerobe dæklag. Metoden giver desuden mulighed for at 
bedømme stoffernes indvirkning på den mikrobielle kulstofomdan ­
nelse i jorden. Efter nedbrydning af bindingerne mellem kulstof og kvælstof dannes nitrat. Finder man lige stor nitratproduktion i den behandlede jord og i kontroljord, er de vigtigste kulstotfnedbryd ­
ningsveje derfor højst sandsynligt intakte og funktionsdygtige. Det 
ved testen anvendte substrat (finmalet lucernemel) har et gunstigt kulstof-/kvælstofforhold (sædvanligvis mellem 12/1 og 16/1). Dette mindsker kulstofmanglen under testen, og hvis de mikrobielle 
samfund beskadiges af et kemikalie, kan de muligvis komme på 
fode inden for 100 dage.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
De test, som metoden oprindeligt er baseret på, er hovedsagelig 
udviklet til stoffer, for hvilke den til jorden tilførte mængde er 
kendt på forhånd. Det er f.eks. tilfældet for plantebeskyttelsesmidler, hvor spredemængden i marken kendes. For landbrugskemikalier er det tilstrækkeligt at teste to doser, som er relevante for den forven ­
tede eller forudsete spredemængde. Landbrugskemikalier kan enten 
testes som aktivt indholdsstof eller som færdigformuleret produkt. Testen er dog ikke begrænset til landbrugskemikalier. Ved at ændre dels den tilførte mængde teststof til jorden, dels metoden til 
vurdering af data kan man desuden anvende testen på kemiske stof ­
fer, hvor man ikke kender den mængde, som vil nå jorden. For andre kemiske stoffer end landbrugskemikalier bestemmes virkningen af en række koncentrationer på kvælstofomdannelsen. Data fra disse 
forsøg anvendes til at opstille en dosis-responskurve og beregne 
værdier af EC
 x hvor x er den definerede virkning i %.  
1.2. DEFINITIONER  
Kvælstofomdannelse : den fuldstændige mikrobielle nedbrydning af 
kvælstofholdigt organisk stof via ammonifikations- og nitrifikation ­
processer til det pågældende uorganiske nitrat som slutprodukt.  
EC x (effektiv koncentration) : den koncentration af prøvestoffet i 
jord, som medfører en hæmning på x procent af kvælstofomdan ­
nelsen til nitrat.  
EC 50 (effektiv mediankoncentration) : den koncentration af prøve ­
stoffet i jord, som medfører en 50 % hæmning af kvælstoffets omdannelse til nitrat.
 
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  
1.4. FORSØGSMETODENS PRINCIP  
Siet jord forbedres med finmalet plantemel og behandles enten med 
prøvestoffet eller lades ubehandlet (kontrol). Til test af landbrugs ­
kemikalier anbefales mindst to prøvekoncentrationer, som vælges i 
henhold til den højeste forventede koncentration i marken. Efter 0, 7, 
14 og 28 døgns inkubation ekstraheret prøver af behandlet jord og kontroljord med et passende opløsningsmiddel, og nitratmængden i ekstrakterne bestemmes. Nitratomdannelsen i de behandlede prøver 
sammenholdes med omdannelsen i kontrolprøverne, og den procen ­
tuelle afvigelse af de behandlede prøver fra kontrolprøverne bereg ­
nes. Alle forsøg løber over mindst 28 døgn. Er forskellen mellem behandlet og ubehandlet jord 25 % eller derover på dag 28, fort ­
sættes målingerne indtil højst 100 dage. Ved test af andre stoffer end 
landbrugskemikalier tilsættes en række koncentrationer af prøve ­
stoffet til jordprøverne, og den dannede mængde kvælstof i behand ­
lede prøver og kontrolprøver måles efter 28 døgns inkubation. Resul ­
taterne af forsøg med flere koncentrationer analyseres efter en regres ­
sionsmodel, og EC
 x -værdierne beregnes (dvs. EC  50 , EC  25 og/eller 
EC 10 ). Jf. definitionerne.  
1.5. FORSØGETS VALIDITET  
Vurdering af forsøgsresultater med landbrugskemikalier bygger på 
nogle forholdsvis små forskelle (gennemsnitligt ± 25 %) mellem nitratkoncentrationen i kontrolprøver og i behandlet jord, hvorfor store variationer i kontrolprøverne kan give forkerte resultater. 
Afvigelsen mellem gentagne kontrolprøver skal derfor være 
mindre end ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. BESKRIVELSE AF FORSØGSMETODEN  
1.6.1  Apparatur  
Prøvebeholderne skal være udført i kemisk inaktivt materiale. De 
skal have passende kapacitet svarende til den metode, der anvendes 
til inkubation af jordprøverne, dvs. inkubation af den samlede 
mængde eller som en række individuelle jordprøver (jf. 1.7.1.2), Der skal være draget omsorg både for at vandtabet minimeres og at gasser kan udveksles under prøven (f.eks. kan prøvebeholderne 
tildækkes med perforeret polyethylenfolie). Ved test af flygtige 
stoffer skal anvendes forseglede og gastætte beholdere. Beholderne skal have en størrelse, så deres rumfang er ca. en fjerdedel udfyldt af 
jordprøven.
 
Der anvendes standardlaboratorieudstyr, herunder følgende:  
— til omrystning: mekanisk rystebord eller tilsvarende  
— centrifuge (3 000 g) eller filtreringsanordning (med nitratfrit 
filterpapir)  
— instrument til nitratanalyse med tilstrækkelig følsomhed og repro ­
ducerbarhed.  
1.6.2.  Jordtyper og antal heraf  
Der anvendes én enkelt jordtype. Følgende jordkarakteristika anbe ­
fales:  
— sandindhold: mindst 50 % og ikke over 75 %  
— pH: 5,5-7,5  
— organisk kulstofindhold: 0,5-1,5 %  
— den mikrobielle biomasse skal måles (8)(9), og dens kulstofind ­
hold skal udgøre mindst 1 % af jordens samlede organiske kulstofindhold.
 
I de fleste tilfælde vil en jord med sådanne egenskaber repræsentere 
den værst tænkelige situation, da prøvestoffets adsorption er minimal 
og dets tilgængelighed for mikrofloraen maksimal. Sædvanligvis 
behøver man derfor ikke udføre forsøg med andre jordtyper. Under visse omstændigheder, f.eks. når prøvestoffet hovedsagelig forventes anvendt i bestemte jordtyper som sur skovbundsjord eller når der er 
tale om elektrostatisk ladede kemiske stoffer, kan det være nødven ­
digt at anvende en yderligere jordtype.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Indsamling og opbevaring af jordprøver  
1.6.3.1.  Indsamling  
Der skal foreligge detaljerede historiske oplysninger om det mark ­
areal, hvorfra prøvejorden er indsamlet. Disse oplysninger skal 
omfatte nøjagtig beliggenhed, plantedække, dato for behandlinger 
med plantebeskyttelsesmidler, behandlinger med organisk gødning og kunstgødning, tilførsler af biologisk materiale og uheldsbetingede forureningsepisoder. Til indsamling af jord skal vælges et areal, som 
kan anvendes gennem længere tid. Egnede er arealer med vedva ­
rende græs, marker med årlig kornhøst (bortset fra majs) eller tæt tilsået grøngødskning. De valgte prøvetagningsarealer må ikke have 
været behandlet med plantebeskyttelsesmidler i mindst ét år forud for 
prøvetagningen. Endvidere må der ikke have været anvendt organisk gødning inden for de sidste seks måneder. Anvendelse af mineralsk gødning er kun acceptabel, når det sker i overensstemmelse med 
afgrødens behov, og når jordprøverne tidligst udtages tre måneder 
efter udbringning af gødningen. Jord, som har været behandlet med kunstgødning med kendt biocid virkning (f.eks calciumeyanamid) bør ikke anvendes.
 
Prøvetagning bør undgås under eller umiddelbart efter lange perioder 
(mere end 30 dage) med tørke eller oversvømmelse. Af pløjet jord 
tages prøver fra en dybde af 0 ned til 20 cm. For græsningsarealer eller andre jordtyper, hvor der ikke pløjes i længere perioder (mindst én vækstsæson), kan den maksimale prøvetagningsdybde være en 
smule mere end 20 cm (f.eks. ned til 25 cm).
 
Jordprøverne skal transporteres i sådanne beholdere og under 
sådanne temperaturforhold, at jordens oprindelige egenskaber med sikkerhed ikke ændrer sig nævneværdigt.
 
1.6.3.2.  Opbevaring  
Der bør fortrinsvis anvendes jord, som er frisk optaget fra marken. 
Er opbevaring i laboratoriet ikke til at undgå, kan jorden opbevares i 
mørke ved 4 + 2  o C i indtil tre måneder. Under opbevaringen skal 
aerobe forhold være sikret. Er jorden indsamlet fra områder, hvor den er frossen mindst tre måneder årligt, kan opbevaring i seks måneder ved minus 18
 o C til minus 22  o C overvejes. Den mikrobi ­
elle biomasse af de opbevarede jordprøver måles før hvert forsøg, og 
biomassens kulstofindhold skal udgøre mindst 1 % af jordens samlede organiske kulstofindhold (se 1.6.2).
 
1.6.4.  Håndtering og klargøring af jordprøver til forsøget  
1.6.4.1.  Præinkubering  
Har jorden været opbevaret (jf. 1.6.3.2), anbefales præinkubering i et 
tidsrum på mellem 2 og 28 døgn. Under præinkuberingen skal 
jordens temperatur- og fugtindhold svare til forsøgsbetingelserne 
(se 1.6.4.2 og 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Fysisk-kemiske egenskaber  
Jorden befries manuelt for store genstande (f.eks. sten, plantedele 
osv.) og sies derefter våd uden for megen udtørring til en partikel ­
størrelse på højst 2 mm. Jordprøvens fugtindhold justeres ved hjælp 
af destilleret eller demineraliseret vand til en værdi mellem 40 % og 
60 % af den maksimale vandholdende evne.  
1.6.4.3.  Forbedring med organisk substrat  
Jorden skal forbedres med et passende organisk substrat, f.eks. 
finmalet lucernegræs-grønmel (hovedkomponent: Medicago saliva) med etC/N-forhold mellem 12/1 og 16/1. Det anbefalede lucerne- jord-forhold er 5 g lucerne pr. kilogram jord (tør vægt).
 
1.6.5.  Klargøring af prøvestoffet til tilføring til jorden  
Prøvestoffet tilføres normalt ved hjælp af et bærestof. Bærestoffet 
kan være vand (til vandopløselige stoffer) eller et inaktivt fast stof 
som finkornet kvartssand (partikelstørrelse: 0,1 - 0,5 mm). Man bør 
undgå andre flydende bærestoffer end vand (f.eks. organiske opløs ­
ningsmidler som acetone eller chloroform), da de kan skade mikrof ­
loraen. Anvendes sand som bærestof, kan det coates med prøvestof, 
som er opløst eller opslæmmet i et passende opløsningsmiddel. I så fald skal opløsningsmidlet fjernes ved fordampning før opblanding med jorden. For at få den bedst mulige fordeling af prøvestoffet i 
jorden anbefales et forhold på 10 g sand pr. kilogram jord (tør vægt). 
Kontrolprøver behandles kun med den tilsvarende mængde vand og/eller kvartssand.
 
Ved test af flygtige kemiske stoffer må tab under behandlingen så 
vidt muligt undgås, og det må tilstræbes at sikre ensartet fordeling i jorden (f.eks. bør prøvestoffet sprøjtes i jorden i flere punkter).
 
1.6.6.  Prøvekoncentrationer  
Af landbrugskemikalier skal anvendes mindst to koncentrationer. 
Den lave koncentration skal afspejle mindst den maksimale 
mængde, som under praktiske forhold forventes at nå jorden, og 
den høje koncentration skal være et multiplum af den lave koncen ­
tration. Ved beregning af den tilsatte prøvestofkoncentration til jorden forudsættes homogen tilsætning til en dybde af 5 cm og en 
bulkdensitet af jorden på 1,5. For landbrugskemikalier, som tilføres 
jorden direkte, og for kemiske stoffer, for hvilke det kan forudsiges, i hvilken mængde de når jorden, anbefales som prøvekoncentrationer den maksimale forventede eksponeringskoncentration (Predicted 
Environmental Concentration, PEC) samt fem gange denne koncen ­
tration. Stoffer, som forventes tilført jorden flere gange i løbet af én sæson, skal testes ved koncentrationer, som fås ved at gange eksponeringskoncentrationen med det maksimale forventede antal 
tilførsler. Den højeste testede koncentration må dog ikke svare til 
mere end ti gange den maksimale mængde ved én tilførsel. Afprøves andre stoffer end landbrugskemikalier, skal der anvendes mindst fem koncentrationer, som danner en kvotientrække. De afprøvede 
koncentrationer skal dække det område, der er nødvendigt tor at 
fastlægge EC
 x -værdierne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. UDFØRELSE AF FORSØGET  
1.7.1.  Eksponeringsbetingelser  
1.7.1.1.  Behandlingsprøver og kontrolprøver  
Ved test af landbrugskemikalier deles jorden i tre portioner med 
samme vægt. To portioner blandes med bærestof indeholdende 
produktet, den tredje med bærestof uden produkt (kontrol). Det anbe ­
fales at benytte mindst tre gentagelser for både behandlet og ubehandlet jord. Ved test af andre stoffer end landbrugskemikalier 
deles jorden i seks portioner med samme vægt. Fem af prøverne 
blandes med bærestof indeholdende prøvestof, og den sjette blandes med bærestof uden prøvestof. Der anbefales tre gentagelser 
for både behandlings- og kontrolgruppe. Der drages omsorg for at 
sikre ensartet fordeling af prøvestoffet i de behandlede jordprøver. Under blandingen bør komprimering og kugledannelse af jorden undgås.
 
1.7.1.2  Inkubering af jordprøver  
Inkubering af jordprøver kan ske på to måder: som bulkprøve af 
behandlet og ubehandlet jord eller som en række lige store delprøver af hver behandlet og ubehandlet jord. Ved test af flygtige prøve ­
stoffer må forsøget dog kun udføres med en række særskilte delprø ­
ver. Når jorden inkuberes som bulkprøve, tilberedes store mængder 
af hver behandlet og ubehandlet jord, og under forsøget udtages efter behov delprøver til analyse. Hvor stor en mængde, som fra begyn ­
delsen skal klargøres til hver behandlings-og kontrolprøve, afhænger 
af antal delprøver, antal gentagelser af analyserne og det forventede 
maksimale antal prøvetagningstidspunkter. Når jorden inkuberes som bulkprøve, skal den blandes grundigt før udtagning af delprøver. Når jorden inkuberes som en række særskilte jordprøver, skal hver 
behandlet og ubehandlet bulkjord deles i det nødvendige antal 
delprøver, og disse anvendes efter behov, Forventes flere end to prøvetagningstidspunkter i forsøget, tilberedes så mange delprøver, at de rækker til alle gentagelser og alle prøvetagningstidspunkter. 
Der inkuberes mindst tredobbelte prøver af prøvejorden under 
aerobe betingelser (se 1.7.1,1). Til alle forsøg skal anvendes passende beholdere med tilstrækkeligt headspace til at undgå opståen af anaerobe betingelser. Ved test af flygtige prøvestoffer 
udføres forsøget kun med en række særskilte delprøver.
 
1.7.1.3.  Prøvningsbetingelser og forsøgsvarighed  
Forsøget udføres i mørke ved en rumtemperatur på 20 ± 2  o C, Under 
forsøget holdes prøvens fugtindhold på en værdi svarende til mellem 
40 % og 60 % af jordens maksimale vandholdende evne (se 1.6.4.2) 
med en variation på = 5 %. Efter behov kan tilsættes destilleret, demineraliseret vand.
 
Forsøgenes mindste varighed er 28 døgn. Ved test af landbrugskemi ­
kalier sammenholdes nitratdannelsen i behandlede prøver og kontrol ­
prøver. Hvis forskellen mellem dem på dag 28 er over 25 %, fort ­
sættes forsøget, indtil forskellen mellem dem er 25 % eller derunder, dog højst i 100 dage. For andre stoffer end landbrugskemikalier 
ophører forsøget efter 28 dage. På dag 28 bestemmes nitratmængden 
i behandlede prøver og kontrolprøver, og EC
 x -værdierne beregnes.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Prøvetagningsplan for analyse af jord  
1.7.2.1.  Prøvetagningsplan for jordprøver  
Ved test af landbrugskemikalier analyseres jordprøverne for nitrat på 
dag 0, 7, 14 og 28. Er det nødvendigt at forlænge forsøget, fortsættes 
målingerne efter dag 28 med 14 dages mellemrum.  
Testes andre stoffer end landbrugskemikalier, skal der anvendes 
mindst fem koncentrationer, og jordprøverne analyseres for nitrat 
ved eksponeringsperiodens start (dag 0) og slutning (dag 28). En 
mellemliggende måling, f.eks. dag 7, kan foretages hvis det anses for nødvendigt. Data registreret på dag 28 anvendes til bestemmelse af stoffets EC
 x -værdi. Om ønsket kan værdierne for kontrolprøverne 
på dag 0 anvendes som jordens startindhold af nitrat.  
1.7.2.2.  Analyse af jordprøver  
Nitratmængden i hver gentagelse for behandlede prøver og kontrol ­
prøver bestemmes ved hvert prøvetagningstidspunkt, Nitratindholdet i jorden ekstraheres ved udrystning med en passende ekstraktions ­
væske, f.eks. en 0,1 M kaliumchloridopløsning. Det tilrådes at 
anvende en mængde KCl-opløsning på 5 ml pr. gram tør jord. For at optimere ekstraktionen bør beholderne med jord og ekstraktions ­
væske ikke være mere end halvt fyldte. Blandingerne omrystes ved 
150 o./min, i 60 minutter. Blandingerne centrifugeres eller filtreres, 
og væskefaserene analyseres for nitrat. Partikelfri væskeformige ekstrakter kan opbevares ved 20 ± 5
 o C i indtil seks måneder.  
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Ved test af landbrugskemikalier skal den dannede nitratmængde i 
hver gentagelse af jordprøven registreres, og gennemsnitsværdien for alle gentagelser angives i tabelform. Kvælstofomdannelsen 
bedømmes ved egnede og almindeligt anerkendte statistiske 
metoder (f.eks F-test, 5 % signifikansniveau). Den dannede mængde nitrat angives som mg nitrat/kg tør jord/døgn. Nitratdan ­
nelsen ved hver behandling sammenholdes med kontrolprøvens, og 
den procentuelle afvigelse fra kontrolprøven beregnes.
 
Ved test af andre stoffer end landbrugskemikalier bestemmes den 
dannede mængde nitrat for hver gentagelse, og der opstilles en 
dosis-responskurve til bestemmelse af EC  x -værdierne. Den nitrat ­
mængde (dvs. mg nitrat/kg tør jord), som er fundet i de behandlede prøver efter 28 døgn, sammenholdes med den, der er bestemt i kontrolprøverne. Af disse data beregnes for hver prøvestofkoncen ­
tration hæmningen i procent. Disse procentværdier afsættes mod 
koncentrationen, og EC
 x -værdierne beregnes. Desuden bestemmes 
konfidensgrænser (p = 0,95) for de beregnede EC  x -værdier ved 
hjælp af standardmetoder (10)(l 1)(12).  
Prøvestoffer med højt kvælstofindhold kan bidrage til den mængde 
nitrat, som dannes under forsøget. Hvis disse stoffer testes i høj koncentration (f.eks. stoffer som forventes anvendt til gentagen påførsel), skal passende kontrolprøver indgå i forsøget (dvs. jord 
med prøvestof, men uden plantemel). Data fra disse kontrolprøver 
skal indgå i beregningerne af EC
 x . ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. FORTOLKNING AF RESULTATER  
Når man ved test af landbrugskemikalier finder, at forskellen mellem 
kvælstofdannelsen i prøver, som er behandlet med den laveste mængde (dvs. den forventede maksimale koncentration), og i 
kontrolprøven ikke er over 25 % på noget prøvetagningstidspunkt 
efter dag 28. kan produktet anses for at være uden langtidsvirkning på kvælstofomdannelsen i jord. Ved vurdering af forsøg med andre stoffer end landbrugskemikalier anvendes EC
 50 , EC  25 og/eller EC  10 - 
værdier.  
3. RAPPORTERING  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Fuldstændig identifikation af den anvendte jord, med angivelse af:  
— stedsbestemmelse for lokaliteten (geografisk bredde og længde)  
— historiske oplysninger om arealet (dvs. plantedække, behandling 
med plantebeskyttelsesmidler, behandling med kunstgødning, 
uheldsbetinget forurening osv.)  
— anvendelsesmønster (f.eks. landbrugsjord, skov osv.)  
— prøvetagningsdybde (cm)  
— indhold af sand/silt/ler (tør vægt %)  
— pH (i vand)  
— organisk kulstofindhold (tør vægt %)  
— kvælstofindhold (tør vægt %)  
— startkoncentration af nitrat (mg nitrat/kg tør vægt)  
— kationbytningskapacitet (mmol/kg)  
— mikrobiel biomasse, angivet som procent af samlet mængde orga ­
nisk kulstof  
— henvisninger, som angiver de metoder, der er anvendt til bestem ­
melse af hver parameter  
— udtømmende oplysninger om indsamling og opbevaring af jord ­
prøver  
— nærmere oplysning om eventuel præinkubering af jorden.  
Prøvestof:  
— fysisk form og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber  
— når det er relevant, data til kemisk identifikation, herunder struk ­
turformel, renhed (dvs., for plantebeskyttelsesprodukter, 
procentdel aktivt indholdsstof), kvælstofindhold.  
Substrat:  
— substratets oprindelse  
— sammensætning (dvs. lucernemel, lucernegræs-grønmel)  
— kulstofindhold, kvælstofindhold (tør vægt %)  
— kornstørrelse (mm).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Forsøgsbetingelser:  
— Enkeltheder vedrørende forbedring af jorden med organisk 
substrat  
— det anvendte antal koncentrationer af prøvestoffet og, når det er 
hensigtsmæssigt, begrundelse for de valgte koncentrationer  
— enkeltheder vedrørende tilsætning af prøvestoffet til jorden  
— inkubationstemperatur  
— jordens vandindhold ved forsøgets start og under forsøget  
— metode anvendt ved inkubation af jorden (dvs. som bulk eller 
som en række særskilte delprøver)  
— antal gentagelser  
— prøvetagningstidspunkter  
— metode anvendt til ekstraktion af nitrat af jorden.  
Resultater:  
— anvendt analysemetode og udstyr til nitratanalyse  
— data i tabelform, bestående af enkeltværdier og gennemsnit for 
nitratmålingerne  
— variation mellem gentagelserne for behandlede prøver og kontrol ­
prøver  
— forklaring af eventuelle korrektioner foretaget i beregningerne  
— den procentuelle variation i kvælstofdannelsen ved hvert prøve ­
tagningstidspunkt eller, hvis det er hensigtsmæssigt, EC  50 -værdi 
med 95 % konfidensgrænse, anden EC-værdi (dvs. EC  25 eller 
EC 10 ) med konfidensintervaller, og grafisk fremstilling af 
dosis-responskurve  
— statistisk behandling af resultaterne  
— alle oplysninger og bemærkninger, som kan være til hjælp ved 
fortolkning af resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
(2) BBA (1990), Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2. udg., 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test, EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. 28. september 1987.  
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.
 
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influ ­
ence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality — Biological Methods.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italien, 18.-20. januar 1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1 (1997), Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(9) ISO 14240-2 (1997), Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour, Pharmacol, and 
Exper. Then, 96, 99-113.  
(11) Finney, D.J. (1971), Probit Analysis. 3. udg., Cambridge, 
London og New York.  
(12) Finney, D.J. (1978), Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  JORDMIKROORGANISMER: KULSTOFOMDANNELSESTEST  
1. METODE  
Metoden er gengivet efter OECD TG 217 (2000).  
1.1. INDLEDNING  
Den beskrevne metode er en laboratoriemetode til undersøgelse af 
langtidsvirkningerne på jordmikroorganismers kulstofomdannende 
aktivitet af enkeltstående eksponering for plantebeskyttelsesmidler 
og eventuelt også andre kemiske stoffer. Metoden er hovedsagelig baseret på anbefalinger fra Plantebeskyttelsesorganisationen for Europa og Middelhavsområderne (1). Der er endvidere taget 
hensyn til guidelines fra den tyske Biologische Bundesanstalt (2), 
den amerikanske miljøstyrelse (3), og SETAC (4). På en OECD- workshop om valg af jord-/sedimenttype, som blev holdt i Belgirate. Italien, i 1995 (5), enedes man om antal og art af de jordtyper, som 
skal anvendes i denne test, Anbefalingerne for indsamling, hånd ­
tering og opbevaring af jordprøver er baseret på en ISO-vejledning (6) og på anbefalingerne fra workshoppen i Belgirate.
 
Ved vurdering af prøvestoffers toksiske egenskaber kan det være 
nødvendigt at bestemme virkningerne på den mikrobielle aktivitet i 
jord, f.eks. når der kræves oplysninger om plantebeskyttelsesmidlers 
potentielle bivirkninger på mikrofloraen i jorden, eller når jordmi ­
kroorganismer forventes udsat for andre kemiske stoffer end plante ­
beskyttelsesmidler. Kulstofomdannelsestesten udføres for at 
bestemme virkningerne af sådanne kemiske stoffer på mikrofloraen 
i jorden. Ved test af landbrugskemikalier (f.eks. plantebeskyttelses ­
midler, kunstgødning og skovbrugskemikalier) udføres både kulsto ­
fomdannelses- og kvælstofomdannelsestest. For andre kemiske 
stoffer end landbrugskemikalier er kvælstofomdannelsestesten 
tilstrækkelig. Viser sådanne kemiske stoffer sig imidlertid i kvæl ­
stofomdannelsestesten at have en EC  50 -værdi i samme område som 
gængse nitrifikationsinhibitorer (f.eks. nitrapyrin), kan en kulstofom ­
dannelsestest udføres for at skaffe yderligere oplysninger.  
Jord består af levende og ikke levende komponenter, som er til stede 
i komplekse og heterogene blandinger. Mikroorganismer spiller en vigtig rolle i nedbrydning og omdannelse af det organiske stof i frugtbar jord, og mange arter bidrager til flere forskellige aspekter 
af jordens frugtbarhed. Hvis der gennem længere tid gribes ind i 
disse biokemiske processer, kan det gribe ind i næringsstofcyklussen, således at jordens frugtbarhed ændrer sig. Kulstof- og kvælstofom ­
dannelse finder sted i al frugtbar jord. Skønt det alt efter jordtypen er 
forskellige mikrobielle samfund, som er ansvarlige for disse proces ­
ser, følger omdannelsen i det væsentlige altid samme vej.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Den her beskrevne forsøgsmetode anvendes til bestemmelse af stof ­
fers langsigtede skadevirkning på kulstofomdannelsesprocessen i 
jordens aerobe dæklag. Metoden er følsom for ændringer i størrelse og aktivitet af de mikrobielle samfund, som er ansvarlige for kulsto ­
fomdannelsen, da den udsætter disse samfund for både kemisk stress 
og kulstofmangel. Der anvendes en sandet jord med lavt indhold af 
organisk stof. Jorden behandles med prøvestoffet og inkuberes under betingelser, som giver mulighed for et hurtigt mikrobielt stofskifte. Under disse betingelser udtømmes kilderne til umiddelbart tilgænge ­
ligt kulstof i jorden hurtigt. Derved opstår der kulstofmangel, som 
både forårsager celledød og inducerer dvaletilstand og/eller sporedan ­
nelse, Hvis forsøget løber over mere end 28 dage, kan man i kontrol ­
prøver (med ubehandlet jord) følge disse reaktioner som et gradvist 
tab i metabolisk aktiv mikrobiel biomasse (7). Hvis biomassen i jord, 
som er udsat for kulstofmangel, under prøvebetingelserne påvirkes af tilstedeværelse af et kemisk stof, vil den ikke nødvendigvis vende tilbage til samme niveau som kontrolprøvens. Forstyrrelser, som på 
et vilkårligt tidspunkt under prøven er fremkaldt af prøvestoffet, vil 
således ofte vare ved indtil forsøgets slutning.
 
De test, som metoden oprindeligt er baseret på, er hovedsagelig 
udviklet til stoffer, for hvilke den til jorden tilførte mængde er kendt på forhånd. Det er f.eks. tilfældet for plantebeskyttelsesmidler, 
hvor spredemængden i marken kendes. For landbrugskemikalier er 
det tilstrækkeligt at teste to doser, som er relevante for den forven ­
tede eller forudsete spredemængde. Landbrugskemikalier kan enten testes som aktivt indholdsstof eller som færdigformuleret produkt. 
Testen er dog ikke begrænset til kemiske stoffer med forudsigelig 
miljøkoncentration. Ved at fendre dels den tilførte mængde prøvestof til jorden, dels metoden til vurdering af data kan man desuden anvende testen på kemiske stoffer, hvor man ikke kender den 
mængde, som vil nå jorden. For andre kemiske stoffer end land ­
brugskemikalier bestemmes virkningen af en række koncentrationer på kulstofomdannelsen. Data fra disse forsøg anvendes til at opstille en dosis-responskurve og beregne værdier af EC
 x, hvor x er den 
definerede virkning i %.  
1.2. DEFINITIONER  
Kulstofomdannelse,  mikrobiel nedbrydning af organisk stof til 
kuldioxid som uorganisk slutprodukt.  
EC x (effektiv koncentration),  den koncentration af prøvestoffet i 
jord, som medfører en x % hæmning af kulstoffets omdannelse til kuldioxid.
 
EC 50 (effektiv mediankoncentration),  den koncentration af prøve ­
stoffet i jord, som medfører en 50 % hæmning af kulstoffets omdan ­
nelse til kuldioxid.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Ingen.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. FORSØGSMETODENS PRINCIP  
Siet jord behandles enten med prøvestoffet eller lades ubehandlet 
(kontrol). Til test af landbrugskemikalier anbefales mindst to prøve ­
koncentrationer, som vælges i henhold til den højeste forventede 
koncentration i marken. Efter inkubation i 0, 7, 14 og 28 døgn 
blandes prøver af behandlet jord og kontroljord med glucose, og den glucoseinducerede respiration måles gennem 12 timer uden afbrydelse, Respirationshastigheden angives enten som kuldioxidpro ­
duktionshastighed (mg kuldioxid/kg tør jord/h) eller som iltforbrugs ­
hastighed (mg ilt/kg jord/h). Den gennemsnitlige respirations ­
hastighed i de behandlede jordprøver sammenholdes med kontrol ­
prøvernes, og den procentuelle afvigelse af de behandlede prøver 
fra kontrolprøverne beregnes. Alle forsøg løber over mindst 28 døgn. Hvis der på dag 28 er mere end 25 % forskel mellem behandlet og ubehandlet jord, fortsættes målingerne med 14 dages 
intervaller indtil højst 100 dage. Ved test af andre stoffer end land ­
brugskemikalier tilsættes prøvestoffet i en række koncentrationer til jordprøverne, og den glucoseinducerede respirationshastighed (dvs. den gennemsnitlig kuldioxiddannelse eller det gennemsnitlige iltfor ­
brug) måles efter 28 døgn. Resultaterne af forsøg med flere koncen ­
trationer analyseres efter en regressionsmodel, og EC
 x -værdierne 
beregnes (dvs. EC.  50 , EC  25 og/eller EC  10 ). Jf. definitionerne.  
1.5. FORSØGETS VALIDITET  
Vurdering af forsøgsresultater med landbrugskemikalier bygger på 
nogle forholdsvis små forskelle (gennemsnitligt ± 25 %) mellem kuldioxidafgivelse eller iltforbrug i kontrolprøver og i behandlede 
jordprøver, hvorfor store variationer i kontrolprøverne kan give 
forkerte resultater. Afvigelsen mellem gentagne kontrolprøver skal derfor være mindre end ± 15 %.
 
1.6. BESKRIVELSE AF FORSØGSMETODEN  
1.6.1.  Apparatur  
Prøvebeholderne skal være udført i kemisk inaktivt materiale. De 
skal have passende kapacitet svarende til den metode, der anvendes 
til inkubation af jordprøverne, dvs. inkubation af den samlede 
mængde eller som en række særskilte jordprøver (jf. 1.7.1.2). Der skal være draget omsorg både for minimering af vandtabet og udveksling af gasser under forsøget (f.eks. kan prøvebeholderne 
tildækkes med perforeret polyethylenfolie). Ved test af flygtige 
stoffer skal anvendes forseglede og gastætte beholdere. Beholderne skal have en størrelse, så jordprøven udfylder ca. en fjerdedel af deres rumfang.
 
Til bestemmelse af glucoseinduceret respiration skal anvendes inku ­
bationssystemer og apparatur til måling af kuldioxidproduktion eller 
iltforbrug. Eksempler på sådanne systemer og apparatur findes i litteraturen (8) (9) (10) (11).
 
1.6.2.  Jordtyper og antal heraf  
Der anvendes én enkelt jordtype. Følgende jordkarakteristika anbe ­
fales:  
— sandindhold: mindst 50 % og ikke over 75 %  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5-7,5  
— organisk kulstofindhold: 0,5-1,5 %  
— den mikrobielle biomasse skal måles (12)(13), og dens kulstof 
indhold skal udgøre mindst 1 % af jordens samlede organiske 
kulstofindhold,  
I de fleste tilfælde vil en jord med sådanne egenskaber repræsentere 
den værst tænkelige situation, da prøvestoffets adsorption er mini ­
meret og dets tilgængelighed for mikrofloraen maksimal. Sædvan ­
ligvis behøver man derfor ikke udføre forsøg med andre jordtyper. 
Under visse omstændigheder, f.eks, når prøvestoffet hovedsagelig forventes anvendt i bestemte jordtyper som sur skovbundsjord eller når der er tale om elektrostatisk ladede kemiske stoffer, kan det være 
nødvendigt at anvende en yderligere jordtype.
 
1.6.3.  Indsamling og opbevaring af jordprøver  
1.6.3.1.  Indsamling  
Der skal foreligge detaljerede historiske oplysninger om det mark ­
areal, hvorfra prøvejorden er indsamlet, Disse oplysninger skal 
omfatte nøjagtig beliggenhed, plantedække, dato for behandlinger 
med plantebeskyttelsesmidler, behandlinger med organisk gødning og kunstgødning, tilførsler af biologisk materiale og uheldsbetingede forureningsepisoder. Til indsamling af jord skal vælges et areal, som 
kan anvendes gennem længere tid. Egnede er arealer med vedva ­
rende græs, marker med årlig kornhøst (bortset fra majs) eller tæt tilsået grøngødskning, De valgte prøvetagningsarealer må ikke have været behandlet med plantebeskyttelsesmidler i mindst ét år forud for 
prøvetagningen. Endvidere må der ikke have været anvendt organisk 
gødning inden for de sidste seks måneder. Anvendelse af mineralsk gødning er kun acceptabel, når det sker i overensstemmelse med 
afgrødens behov, og når jordprøverne tidligst udtages tre måneder 
efter udbringning af gødningen. Jord, som har været behandlet med kunstgødning med kendt biocid virkning (f.eks calciumcyanamid) bør ikke anvendes.
 
Prøvetagning bør undgås under eller umiddelbart efter lange perioder 
(mere end 30 dage) med tørke eller oversvømmelse. Af pløjet jord tages prøver fra en dybde af 0 ned til 20 cm. For græsningsarealer eller andre jordtyper, hvor der ikke pløjes i længere perioder (mindst 
én vækstsæson), kan den maksimale prøvetagningsdybde være en 
smule mere end 20 cm (f.eks. ned til 25 cm). Jordprøverne skal transporteres i sådanne beholdere og under sådanne temperaturfor ­
hold, at jordens oprindelige egenskaber med sikkerhed ikke ændrer 
sig nævneværdigt,
 
1.6.3.2.  Opbevaring  
Der bør fortrinsvis anvendes jord, som er frisk optaget fra marken. 
Er opbevaring i laboratoriet ikke til at undgå, kan jorden opbevares i mørke ved 4 ± 2
 o C i indtil tre måneder. Under opbevaringen skal 
aerobe forhold være sikret. Er jorden indsamlet fra områder, hvor 
den er frossen mindst tre måneder årligt, kan opbevaring i seks måneder ved minus 18
 o C overvejes. Den mikrobielle biomasse af 
de opbevarede jordprøver måles før hvert forsøg, og biomassens 
kulstofindhold skal udgøre mindst 1 % af jordens samlede organiske 
kulstofindhold (se 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Håndtering og klargøring af jordprøver til forsøget  
1.6.4.1.  Præinkubering  
Har jorden været opbevaret (jf. 1.6.4.2 og 1.7.1.3), anbefales præin ­
kubering i et tidsrum på mellem 2 og 28 døgn. Under præinkube ­
ringen skal jordens temperatur- og fugtindhold svare til forsøgsbetin ­
gelserne (se 1.6.4.2 og 1.7.1.3).  
1.6.4.2  Fysisk-kemiske egenskaber  
Jorden befries manuelt for store genstande (f.eks. sten, plantedele 
osv.) og sies derefter våd uden for megen udtørring til en partikel ­
størrelse på højst 2 mm. Jordprøvens fugtindhold justeres ved hjælp 
af destilleret eller demineraliseret vand til en værdi mellem 40 % og 
60 % af den maksimale vandholdende evne.  
1.6.5.  Klargøring af prøvestoffet til tilføring til jorden  
Prøvestoffet tilføres normalt ved hjælp af et bærestof. Bærestoffet 
kan være vand (til vandopløselige stoffer) eller et inaktivt fast stof som finkornet kvartssand (partikelstørrelse: 0,1-0,5 mm), Man bør 
undgå andre flydende bærestoffer end vand (f.eks. organiske opløs ­
ningsmidler som acetone eller chloroform), da de kan skade mikrof ­
loraen. Anvendes sand som bærestof, kan det coates med prøvestof, som er opløst eller opslæmmet i et passende opløsningsmiddel. I så 
fald skal opløsningsmidlet fjernes ved fordampning før opblanding 
med jorden. For at få den bedst mulige fordeling af prøvestoffet i jorden anbefales et forhold på 10 g sand pr. kilogram jord (tør vægt). Kontrolprøver behandles kun med den tilsvarende mængde 
vand og/eller kvartssand.
 
Ved test af flygtige kemiske stoffer må tab under behandlingen 
undgås, og det må tilstræbes at sikre ensartet fordeling i jorden (f.eks. bør prøvestoffet sprøjtes i jorden i flere punkter).
 
1.6.6.  Prøvekoncentrationer  
Af landbrugskemikalier og andre kemiske stoffer med forudsigelig 
eksponeringskoncentration testes mindst to koncentrationer. Den lave 
koncentration skal afspejle mindst den maksimale mængde, som 
under praktiske forhold forventes at nå jorden, og den høje koncen ­
tration skal være et multiplum af den lave koncentration, Ved bereg ­
ning af den tilsatte prøvestofkoncentration til jorden forudsættes 
homogen tilsætning til en dybde af 5 cm og en bulkdensitet af 
jorden på 1,5. For landbrugskemikalier, som tilføres jorden direkte, og for kemiske stoffer, for hvilke det kan forudsiges, i hvilken mængde de vil nå jorden, anbefales som prøvekoncentrationer den 
forventede eksponeringskoncentration (Predicted Environmental 
Concentration, PEC) samt fem gange denne koncentration. Stoffer, som forventes tilført jorden flere gange i løbet af én sæson, skal testes ved koncentrationer, som fås ved at gange eksponeringskon ­
centrationen med det maksimale forventede antal tilførsler, De 
højeste testede koncentration må dog ikke svare til mere end ti gange den maksimale mængde ved én tilførsel.
 
Afprøves andre stoffer end landbrugskemikalier, skal der anvendes 
mindst fem koncentrationer, som danner en kvotientrække, De afprø ­
vede koncentrationer skal dække det område, der er nødvendigt for 
at fastlægge EC  x -værdierne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. UDFØRELSE AF FORSØGET  
1.7.1.  Eksponeringsbetingelser  
1.7.1.1.  Behandlingsprøver og kontrolprøver  
Ved test af landbrugskemikalier deles jorden i tre portioner med 
samme vægt, To portioner blandes med bærestof indeholdende 
produktet, den tredje med bærestof uden produkt (kontrol), Det anbe ­
fales at benytte mindst tre gentagelser for både behandlet og ubehandlet jord. Ved test af andre stoffer end landbrugskemikalier 
deles jorden i seks portioner med samme vægt. Fem af prøverne 
blandes med bærestof indeholdende prøvestof, den sjette med bære ­
stof uden prøvestof. Der anbefales tre gentagelser for både behand ­
lings- og kontrolgruppe. Der drages omsorg for at sikre ensartet 
fordeling af prøvestoffet i de behandlede jordprøver. Under blan ­
dingen bør komprimering og kugledannelse af jorden undgås.
 
1.7.1.2.  Inkubering af jordprøver  
Inkubering af jordprøver kan ske på to måder: som bulkprøve af 
behandlet og ubehandlet jord eller som en række lige store delprøver 
af hver behandlet og ubehandlet jord. Ved test af flygtige prøve ­
stoffer må forsøget dog kun udføres med en række særskilte delprø ­
ver. Når jorden inkuberes som bulkprøve, tilberedes store mængder 
af hver behandlet og ubehandlet jord, og under forsøget udtages efter 
behov delprøver til analyse, Hvor stor en mængde, som fra begyn ­
delsen skal klargøres til hver behandlings-og kontrolprøve, afhænger af antal delprøver, antal gentagelser af analyserne og det forventede 
maksimale antal prøvetagningstidspunkter. Når jorden inkuberes som 
bulkprøve, skal den blandes grundigt før udtagning af delprøver. Når jorden inkuberes som en række særskilte jordprøver, skal hver behandlet og ubehandlet bulkjord deles i det nødvendige antal 
delprøver, og disse anvendes efter behov. Forventes flere end to 
prøvetagningstidspunkter i forsøget, tilberedes så mange delprøver, at de rækker til alle gentagelser og alle prøvetagningstidspunkter. Der inkuberes mindst tredobbelte prøver af prøvejorden under 
aerobe betingelser (se 1.7.1.1). Til alle forsøg skal anvendes 
passende beholdere med tilstrækkeligt headspace til at undgå opståen af anaerobe betingelser, Ved test af flygtige prøvestoffer udføres forsøget kun med en række særskilte delprøver.
 
1.7.1.3.  Prøvningsbetingelser og forsøgsvarighed  
Forsøget udføres i mørke ved en rumtemperatur på 20 ± 2  o C. Under 
forsøget holdes prøvens fugtindhold på en værdi svarende til mellem 40 % og 60 % af jordens maksimale vandholdende evne (se 1.6.4.2) 
med en variation på ± 5 %. Efter behov kan tilsættes destilleret, 
demineraliseret vand.
 
Forsøgenes mindste varighed er 28 døgn, Ved test af landbrugskemi ­
kalier sammenholdes kuldioxidafgivelse eller iltforbrug i behandlede 
prøver og kontrolprøver. Hvis forskellen mellem dem på dag 28 er 
over 25 %, fortsættes forsøget, indtil forskellen mellem dem er 25 % eller derunder, dog højst i i 100 dage. For andre stoffer end land ­
brugskemikalier ophører forsøget efter 28 dage. På dag 28 
bestemmes kuldioxidafgivelse eller iltforbrug i behandlede prøver 
og kontrolprøver, og EC
 x -værdierne beregnes.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Prøvetagning og analyse af jord  
1.7.2.1.  Prøvetagningsplan for jordprøver  
Ved test af landbrugskemikalier analyseres jordprøverne for gluco ­
seinduceret respirationshastighed på dag 0, 7, 14 og 28. Er det 
nødvendigt at forlænge forsøget, fortsættes målingerne efter dag 
28 med 14 dages mellemrum.  
Testes andre stoffer end landbrugskemikalier, skal der anvendes 
mindst fem koncentrationer, og jordprøverne analyseres for gluco ­
seinduceret respirationshastighed ved eksponeringsperiodens start 
(dag 0) og slutning (dag 28). En mellemliggende måling, f.eks. på dag 7, kan foretages, hvis det anses for nødvendigt. Data registreret på dag 28 anvendes til bestemmelse af stoffets EC
 x -værdi. Om 
ønsket kan dag 0-værdierne for kontrolprøveme anvendes som start ­
værdier for mængden af metabolisk aktiv biomasse i jorden (12).  
1.7.2.2.  Måling af glucoseinduceret respirationshastighed  
Den glucoseinducerede respirationshastighed i hver gentagelse for 
behandlede prøver og kontrolprøver bestemmes ved hvert prøvetag ­
ningstidspunkt. Jordprøverne blandes med en tilstrækkelig mængde glucose til at udløse øjeblikkelig maksimal respiratorisk respons. De 
nødvendige mængde glucose til fremkaldelse af maksimal respiratorisk 
respons fra en given jord kan bestemmes i en indledende test, hvor der bruges en række glucosekoncentrationer (14). For sandjord med 0,5- 1,5 % organisk kulstof er 2 000 mg til 4 000 mg glucose pr, kg tør jord 
dog sædvanligvis tilstrækkeligt. Glucosen kan finmales med rent 
kvartssand (10 g sand/kg tør jord) og iblandes homogent i jorden.
 
De glucoseforbedrede jordprøver inkuberes i et passende apparat 
med henblik på måling af respirationshastighed enten kontinuerligt, 
hver time eller hver anden time (se 1.6.1) ved 20 ± 2  o C. Den 
afgivne kuldioxid eller den forbrugte ilt måles i 12 timer uden afbry ­
delse, og målingen begynder snarest muligt, dvs. inden for en til to timer efter glucosetilsætningen. Den samlede kuldioxidproduktion 
eller det samlede iltforbrug i løbet af de 12 timer måles, og den 
gennemsnitlige respirationshastighed bestemmes.
 
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Ved test af landbrugskemikalier registreres kuldioxidafgivelse eller 
iltforbrug i hver gentagelse af jordprøven, og gennemsnitsværdien for alle gentagelser angives i tabelform. Resultaterne bedømmes 
ved egnede og almindeligt anerkendte statistiske metoder (f.eks F- 
test, 5 % signifikansniveau). Den glucoseinducerede respirations ­
hastighed angives i mg kuldioxid/kg tør jord/h eller mg ilt/kg tør jord/h. Den gennemsnitlige kuldioxidproduktionshastighed eller 
iltforbrugshastighed for hver behandling sammenholdes med kontrol ­
prøvens, og den procentuelle afvigelse fra kontrolprøven beregnes.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Ved test af andre stoffer end landbrugskemikalier bestemmes kuldio ­
xidproduktion eller iltforbrug for hver gentagelse, og der opstilles en 
dosis-responskurve til bestemmelse af EC  x -værdierne. Den gluco ­
seinducerede respirationshastighed (dvs. mg kuldioxid/kg tør jord/h eller mg ilt/kg tør jord/h), som findes i de behandlede prøver efter 28 
dage, sammenholdes med kontrolprøvernes. Af disse data beregnes 
hæmningen i procent for hver prøvestofkoncentration. Disse procent ­
værdier afsættes mod koncentrationen, og EC
 x -værdierne beregnes 
ved hjælp af statistiske metoder. Desuden bestemmes konfidens ­
grænser (p = 0,95) for de beregnede EC  x værdier ved hjælp af stan ­
dardmetoder (15)(16)(17).  
2.2. FORTOLKNING AF RESULTATER  
Når man ved test af landbrugskemikalier finder, at forskellen mellem 
respirationshastigheden i prøver behandlet med den laveste mængde 
(dvs. den forventede maksimale koncentration) og i kontrolprøve ikke er over 25 % på noget prøvetagningstidspunkt efter dag 28, kan produktet anses for at være uden langtidsvirkning på kulstofom ­
dannelsen i jord. Ved vurdering af forsøg med andre stoffer end 
landbrugskemikalier anvendes EC
 50 , EC  25 og/eller EC  10 -værdier.  
3. RAPPORTERING  
FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Fuldstændig identifikation af den anvendte jord, med angivelse af:  
— stedsbestemmelse for lokaliteten (geografisk bredde og længde)  
— historiske oplysninger om arealet (dvs. plantedække, behand ­
linger med plantebeskyttelsesmidler, behandlinger med kunstgød ­
ning, uheldsbetinget forurening osv.)  
— anvendelsesmønster (f.eks. landbrugsjord, skov osv.)  
— prøvetagningsdybde (cm)  
— indhold af sand/silt/ler (tør vægt %)  
— pH (i vand)  
— organisk kulstofindhold (tør vægt %)  
— kvælstofindhold (tør vægt %)  
— kationbytningskapacitet (mmol/kg)  
— mikrobiel biomasse, angivet som procent af samlet mængde orga ­
nisk kulstof  
— henvisninger, som angiver de metoder, der er anvendt til bestem ­
melse af hver parameter  
— udtømmende oplysninger om indsamling og opbevaring af jord ­
prøver  
— nærmere oplysning om eventuel præinkubering af jorden.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Prøvestof:  
— fysisk form og. når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber  
— når det er relevant, data til kemisk identifikation, herunder struk ­
turformel, renhed (dvs, for plantebeskyttelsesprodukter procentdel 
aktivt indholdsstof), kvælstofindhold.  
Forsøgsbetingelser:  
— enkeltheder vedrørende forbedring af jorden med organisk 
substrat  
— det anvendte antal koncentrationer af prøvestoffet og, når, det er 
hensigtsmæssigt, begrundelse for de valgte koncentrationer  
— enkeltheder vedrørende tilsætning af prøvestoffet til jorden  
— inkubationstemperatur  
— jordens vandindhold ved forsøgets start og under forsøget  
— metode anvendt ved inkubation af jorden (dvs. som bulk eller 
som en række særskilte delprøver)  
— antal gentagelser  
— prøvetagningstidspunkter.  
Resultater:  
— metode og udstyr anvendt til måling af respiratiunshastighed  
— data opstillet som tabeller over enkeltværdier og gennemsnit af 
kuldioxid- eller oxygenmængden  
— variation mellem gentagelserne for behandlede prøver og kontrol ­
prøver  
— forklaring af eventuelle korrektioner foretaget i beregningerne  
— den procentuelle variation i den glucoseinducerede respira ­
tionshastighed ved hvert prøvetagningstidspunkt eller, i 
givet fald, EC  50 -værdi med 95 % konfidensgrænse, anden 
EC x -værdi (dvs. EC  25 eller EC  10 ) med konfidensintervaller, 
og grafisk fremstilling af dosis-responskurve  
— når det er hensigtsmæssigt, statistisk behandling af resulta ­
terne  
— alle oplysninger og bemærkninger, som kan være til hjælp 
ved fortolkning af resultaterne.  
4. HENVISNINGER  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2. udg., 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule, 28. september 1987.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italien, 18-20. januar 1995.  
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment 
of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(7) Anderson. J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in »Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra«. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Kap. 3: 45-60.  
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in »Methods of Soil 
Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Properties«. 
Agronomy Monograph N  o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41: 831-871.  
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality — Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G, 
(1989), Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant 
and Soil, 116: 77-81.  
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass —Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(14) Malkomes, H.-P, (1986), Einflu β von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflan ­
zenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide, 
(Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzensch ­
utzd., Braunschweig, 38: 113-120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949), A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments, Jour, Pharmacol, and Exper.Ther., 96, 99-113.
 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3. udg., Cambridge, 
London og New York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  AEROB OG ANAEROB OMDANNELSE I JORD  
1. METODE  
Metoden er gengivet efter OECD TG 307 (2002)  
1.1. INDLEDNING  
Denne forsøgsmetode er baseret på eksisterende guidelines (1)(2)(3) ­
(4)(5)(6)(7)(8)(9). Den her beskrevne metode er til brug ved under ­
søgelse af kemiske stoffers aerobe og anaerobe omdannelse i jord. 
Ved forsøgene bestemmes i) prøvestoffets omdannelseshastighed og ii) art, dannelseshastighed og nedbrydningshastighed af de omdan ­
nelsesprodukter, som planter og jordorganismer kan blive udsat for. 
Sådanne undersøgelser er nødvendige for kemiske stoffer, som 
tilføres jorden direkte eller må forventes at nå frem til jordmiljøet. Resultaterne af sådanne laboratorieforsøg kan desuden anvendes til at opstille protokoller for prøvetagning og analyse i tilknyttede mark ­
undersøgelser.
 
Til vurdering af omdannelsesveje er aerobe og anaerobe forsøg med 
én jordtype sædvanligvis tilstrækkelige (8)(10)(11). Omdannelses ­
hastigheden skal bestemmes i mindst tre yderligere jordtyper (8)(10).  
På en OECD-workshop om valg af jord-/sedimenttype i Belgirate, 
Italien, i 1995 (10) enedes man specielt om antal og art af de jord ­
typer, som skal anvendes i dette forsøg. De testede jordtyper skal 
være repræsentative for de miljøforhold, hvor stoffet skal anvendes eller vil blive udledt. For eksempel skal kemiske stoffer, som kan blive udledt i subtropisk til tropisk klima, testes med Ferrasoler eller 
Nitosoler (FAO-systemet). Workshoppen resulterede desuden i anbe ­
falinger for indsamling, håndtering og opbevaring af jordprøver, baseret på ISO-vejledningen (15). Anvendelse af overrislet jord (til risdyrkning) er ligeledes tilgodeset i metoden.
 
1.2. DEFINITIONER  
Prøvestof : et vilkårligt stof, som enten er moderstof eller et relevant 
omdannelsesprodukt.  
Omdannelsesprodukter:  alle stoffer, som dannes ved biotisk eller 
abiotisk omdannelse af prøvestoffet, herunder CO  3 og stoffer, som er 
til stede i bundne rester.  
Bundne rester: »Bundne rester« repræsenterer de stoffer i jord, 
planter eller dyr, som efter ekstraktion bliver tilbage i den pågæl ­
dende matrix, enten som moderstof eller som 
metabolitter/omdannelsesprodukter. Ekstraktionsmetoden må ikke 
bevirke væsentlige ændringer af selve stofferne eller af matrixens struktur. Bindingens art kan delvis klarlægges gennem matrixomdan ­
nende ekstraktionsmetoder og avancerede analyseteknikker. Indtil nu 
har man på denne måde identificeret kovalente bindinger, ionbin ­
dinger og sorptionsbindinger foruden indlejring. Sædvanligvis vil dannelse af bundne rester indebære væsentligt nedsat fysiologisk 
opløselighed (bioaccessibility) og biotilgængelighed (bioavailability) 
(12) (ændret efter IUPAC 1984 (13)).
 
Aerob omdannelse:  reaktioner, som finder sted i tilstedeværelse af 
molekylært oxygen (14).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaerob omdannelse:  reaktioner, som finder sted i fravær af mole ­
kylært oxygen (14).  
Jord:  en blanding af mineralske og organisk-kemiske bestanddele, 
hvoraf sidstnævnte indeholder højmolekylære forbindelser med stort 
kulstof- og kvælstofindhold og bebos af små organismer (hovedsa ­
gelig mikroskopiske). Jord kan håndteres i to tilstande:  
a) uforstyrret, som den har udviklet sig med tiden, i karakteristiske 
lag af forskellige jordtyper  
b) forstyrret, således som den sædvanligvis findes i agerjord eller når 
der opgraves prøver til anvendelse i denne forsøgsmetode (14).  
Mineralisering:  fuldstændig nedbrydning af en organisk forbindelse 
til CO  2 og H  2 O under aerobe betingelser, og til CH  4 , CO  2 og H  2 O 
under anaerobe betingelser. Når der i denne forsøgsmetode anvendes  
14 C-mærkede forbindelser, forstås ved mineralisering en omfattende 
nedbrydning, hvorunder et mærket kulstof atom oxideres under frigi ­
velse af den pågældende mængde  14 CO 2 (14).  
Halveringstid:  t 0,5 er den tid, der forløber, til et prøvestof er 50 % 
omdannet, når omdannelsen kan beskrives ved første ordens kinetik; 
den er koncentrationsuafhængig.  
DT 50 (Disappearance Time 50):  den tid, der forløber, til koncen ­
trationen af prøvestoffet er aftaget med 50 %: følger omdannelsen 
ikke første ordens kinetik, er DT  50 forskellig fra halveringstiden t  0,5 . 
DT 75 (Disappearance Time 75):  den tid, der forløber, til koncen ­
trationen af prøvestoffet er aftaget med 75 %.  
DT 90 (Disappearance Time 90):  den tid, der forløber, til koncen ­
trationen af prøvestoffet er aftaget med 90 %.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Der skal anvendes referencestoffer til karakterisering og/eller identi ­
fikation af omdannelsesprodukter med spektroskopiske og/eller 
kromatografiske metoder.  
1.4. FORSØGSMETODENS ANVENDELIGHED  
Forsøgsmetoden kan anvendes på alle kemiske stoffer (umærkede 
eller radioaktivt mærkede), for hvilke man råder over en tilstrækkelig 
nøjagtig og følsom analysemetode. Metoden er anvendelig på tung ­
flygtige, ikke-flygtige, vandopløselige og vanduopløselige forbindel ­
ser. Metoden bør ikke anvendes på kemikalier, som er letflygtige fra jord (f.eks. rygningsmidler eller organiske opløsningsmidler) og 
således ikke vil forblive i jorden under de her beskrevne forsøgs ­
betingelser.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. OPLYSNINGER OM PRØVESTOFFET  
Til måling af omdannelseshastigheden kan anvendes mærket eller 
umærket prøvestof. Til undersøgelse af omdannelsesveje og opstil ­
ling af massebalance skal anvendes mærket stof.  14 C-mærkning 
anbefales, men andre isotoper, f.eks.  13 C, 15 N, 3 H og  32 P kan også 
anvendes. Mærket skal så vidt muligt placeres i molekylets mest stabile del(e) (
 1 ). Prøvestoffets renhed skal være mindst 95 %.  
Før man foretager forsøg med aerob og anaerob omdannelse i jord, 
skal der foreligge følgende oplysninger om prøvestoffet:  
a) vandopløselighed (metode A.6)  
b) opløselighed i organiske opløsningsmidler  
c) damptryk (metode A.4) og Henrys konstant  
d) n-oktanol/vand fordelingskoefficient (metode A.8)  
e) kemisk stabilitet i mørke (hydrolyse) (metode C.7)  
f) pK  a , hvis molekylet er tilbøjeligt til at protoneres eller depro ­
toneres (OECD Guideline 112) (16).  
Af andre nyttige oplysninger kan nævnes data vedrørende prøve ­
stoffet toksicitet over for jordmikroorganismer (prøvemetode C.21 og C.22) (16).
 
Der skal foreligge analysemetoder (herunder metoder til ekstraktion 
og oprensning) til kvantificering og identifikation af prøvestoffet og 
dets omdannelsesprodukter.  
1.6. METODENS PRINCIP  
Jordprøverne behandles med prøvestoffet og inkuberes i mørke i 
biometerkolber eller i gennemstrømningssystemer under kontrolle ­
rede laboratoriebetingelser (ved konstant temperatur og jordfugtig ­
hed). Efter passende tidsintervaller ekstraheres jordprøverne og 
analyseres for moderstof og omdannelsesprodukter. Flygtige produkter indsamles ligeledes til analyse ved hjælp af passende 
adsorptionsanordninger. Ved at benytte
 14 C-mærket stof kan de 
forskellige mineraliseringshastigheder af prøvestoffet måles gennem opsamling af den udviklede
 14 CO 2 og opstilling af en massebalance 
indbefattende dannelse af jordbundne rester.  
1.7. KVALITETSKRITERIER  
1.7.1.  Genfindingsgrad  
Ved ekstraktion og analyse af i det mindste dobbelte jordprøver 
umiddelbart efter tilsætning af prøvestoffet fås et første fingerpeg om analysemetodens repeterbarhed og om, hvor homogent prøve ­
stoffet er blevet tilført. Genfindingsgraden for senere forsøgsstadier 
fås af de respektive massebalancer, Genfindingsgraden skal være 
mellem 90 % og 110 % for mærkede kemiske stoffer (8) og mellem 70 % og 110 % for umærkede stoffer (3).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Indeholder prøvestoffet f.eks. én ring, skal denne ring være mærket; indeholder prøve ­
stoffet to eller flere ringe, kan separate forsøg være påkrævet for at undersøge, hvad der 
sker med de enkelte mærkede ringe, og for at skaffe anvendelige oplysninger om 
dannelse af omdannelsesprodukter.
 1.7.2.  Analysemetodens repeterbarhed og følsomhed  
Repeterbarheden af analysemetoden (heri ikke medregnet udvin ­
dingsgraden ved den indledende ekstraktion) til kvantitativ bestem ­
melse af prøvestof og omdannelsesprodukter kan kontrolleres ved 
dobbelt analyse på den samme ekstrakt af jord, som er inkuberet 
tilstrækkelig længe til at dannelse af omdannelsesprodukter har fundet sted.
 
Analysemetodens detektionsgrænse for prøvestoffet og for omdan ­
nelsesprodukteme må ikke være over 0,01 mg-kg  -1 jord (som prøve ­
stof), og ikke over 1 % af den tilsatte mængde. Grænsen for kvan ­
titativ bestemmelse skal ligeledes angives.  
1.7.3.  Nøjagtighed af omdannelsesdata  
Gennem regressionsanalyse på bestemmelserne af prøvestoffets 
koncentration som funktion af tiden fås de nødvendige oplysninger om omdannelseskurvens pålidelighed og mulighed for at bestemme 
konfidensgrænser for halveringstiderne (for pseudo første ordens 
kinetik) eller DT
 50 -værdier og, i givet fald, DT  75 - og DT  90 -værdier.  
1.8. BESKRIVELSE AF PRØVEMETODEN  
1.8.1.  Udstyr og kemiske reagenser  
Som inkuberingssystem anvendes statiske lukkede systemer eller 
egnede gennemstrømningssystemer (7)(17). Eksempler på egnede gennemstrømningsapparater til jordinkubering og biometerkolber er 
vist i hhv. figur 1 og 2. Hver type inkuberingssystem har sine fordele 
og begrænsninger (7)(17).
 
Der kræves standardlaboratorieudstyr, specielt følgende:  
— Apparater til GLC, HPLC og TLC med passende detektions ­
systemer til analyse af radioaktivt mærkede eller umærkede stoffer eller til omvendt isotopfortyndingsmetode
 
— Instrumenter til identifikation (f.eks. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR osv.)  
— Væskescintillationstæller  
— Ovn til forbrænding af radioaktivt materiale  
— Centrifuge  
— Ekstraktionsapparat (f.eks, centrifugeglas til kold ekstraktion og 
Soxhlet-apparat til kontinuerlig ekstraktion med recirkulation);  
— Udstyr til koncentrering af opløsninger og ekstrakter (f.eks. rota ­
tionsfordamper)  
— Vandbad  
— Mekanisk blandemaskine (f.eks, æltemaskine, rotationsmixer).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Anvendte kemiske reagenser kan f.eks. omfatte:  
— NaOH, analytisk kvalitet. 2 mol.dm  -3 , eller anden egnet base 
(f.eks. KOH, ethanolamin)  
— H  2 SO 4 , analytisk kvalitet, 0,05 mol.dm  -3 
— Ethylenglycol, analytisk kvalitet  
— Faste absorbenter som natronkalk og polyurethancylindre  
— Organiske opløsningsmidler af analytisk kvalitet, f.eks. acetone, 
methanol osv.  
— Scintillationsvæske.  
1.8.2.  Tilsætning af prøvestof  
Med henblik på tilsætning til jorden og fordeling heri kan prøve ­
stoffet opløses i vand (demineraliseret eller destilleret) eller, når det 
er nødvendigt, i mindst mulige mængder acetone eller andre orga ­
niske opløsningsmidler (6), hvori prøvestoffet er tilstrækkelig opløse ­
ligt og stabilt. Det valgte opløsningsmiddel må imidlertid i den anvendte mængde ikke have væsentlig indflydelse på den mikrobi ­
elle aktivitet i jorden (jf. 1.5 og 1.9.2-1.9.3). Man bør undgå opløs ­
ningsmidler som virker hæmmende på den mikrobiologiske aktivitet, således chloroform, dichlormethan og andre halogenerede opløs ­
ningsmidler.
 
Prøvestoffet kan også tilsættes i fast form. f.eks. blandet i kvartssand 
(6) eller i en lille delprøve af prøvejorden, som er lufttørret og 
steriliseret. Tilsættes prøvestoffet ved hjælp af et opløsningsmiddel, 
skal man lade opløsningsmidlet fordampe før tilsætning af den spikede delprøve til den oprindelige usterile jordprøve.
 
For sædvanlige kemikalier, hvis hovedtilførselsvej til jord er gennem 
kloakslam/landbrug, tilsætter man først prøvestoffet til slammet, som derefter tilsættes til jordprøven. (jf. 1.9.2 og 1.9.3).
 
Det kan ikke anbefales at bruge formulerede produkter rutinemæs ­
sigt, For prøvestoffer med ringe opløselighed kan anvendelse af det 
formulerede stof dog være et hensigtsmæssigt alternativ.  
1.8.3.  Jordtyper  
1.8.3.1.  Valg af jordtype  
Til fastlæggelse af omdannelsesvejen kan anvendes en repræsentativ 
jordtype; en sandblandet lerjord (sandy loam), siltblandet lerjord (silty 
loam), lerjord (loam) eller en lerblandet sandjord (loamy sand) (i henhold til FAO's og USDA's klassifikation (18)) med pH 5,5 - 8,0, organisk kulstofindhold 0,5 - 2,5 % og en mikrobiel biomasse på 
mindst 1 % af det totale organiske kulstofindhold anbefales (10).
 
Til undersøgelser af omdannelseshastigheden skal anvendes mindst 
tre yderligere jordtyper, som repræsenterer et udsnit af relevante 
jordtyper. Jordtyperne skal være forskellige hvad angår organisk 
kulstofindhold, pH, lerindhold og mikrobiel biomasse (10).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Alle jordtyper skal i det mindste være karakteriseret med hensyn til 
tekstur ( % sand, % silt, % ler) (i henhold til FAO's og USDA's 
klassifikation (18)), pH, kationbytterkapacitet, organisk kulstofind ­
hold, bulkdensitet og vandretentionsegenskaber (  1 ) og mikrobiel 
biomasse (kun ved aerobe undersøgelser). Til fortolkning af resulta ­
terne kan nærmere oplysninger om jordens egenskaber være nyttige, 
Til bestemmelse af jordegenskaber kan anvendes de metoder, som anbefales i henvisning (19)(20)(21)(22)(23). Til bestemmelse af mikrobiel biomasse anvendes SIR-metoden (substratinduceret respi ­
ration) (25)(26) eller alternative metoder (20).
 
1.8.3.2.  Indsamling, håndtering og opbevaring af jord  
Der skal foreligge detaljerede historiske oplysninger om det mark ­
areal, hvorfra prøvejorden er indsamlet. Disse oplysninger skal 
omfatte nøjagtig beliggenhed, plantedække, behandling med kemiske stoffer, behandling med organisk gødning og kunstgødning, tilførsel af biologisk materiale og anden forurening. Har jorden inden 
for de foregående fire år været behandlet med prøvestoffet eller 
stoffer strukturelt beslægtet hermed, må den ikke anvendes til omdannelsesundersøgelserne (10)(15).
 
Jorden skal være frisk indsamlet fra marken (fra A-horisonten eller 
det øverste 20 cm lag) med et indhold af jordvand, som letter sigt ­
ning. For andre jordtyper end jord fra overrislede marker bør man 
undgå prøvetagning under eller umiddelbart efter lange perioder (> 30 dage) med tørke, frysning eller oversvømmelse (14). Prøverne skal transporteres på en måde, som bevirker mindst mulig ændring i 
vandindholdet og skal opbevares mørkt med så fri adgang for luften 
som muligt. Hertil er en løst snøret polyethylenpose sædvanligvis velegnet.
 
Jorden skal behandles snarest muligt efter prøveindsamlingen. Vege ­
tation, større jordfaunadele og sten fjernes, før jorden sigtes gennem 
en 2 mm si, som fjerner småsten, fauna- og planterester. Omfattende 
tørring og formaling af jorden før sigtning bør undgås (15).  
Når prøvetagning i marken er vanskelig (jorden frossen eller snedæk ­
ket), kan prøven tages fra jord, som opbevares i drivhus under plan ­
tedække (f.eks. græs eller græs/kløver). Undersøgelser med frisk 
indsamlet jord fra marken må stærkt foretrækkes, men skal den indsamlede og behandlede jord opbevares, før forsøget påbegyndes, må det ske under passende betingelser og i begrænset tidsrum 
(4-2
 o C i højst 3 måneder) for at bevare den mikrobielle aktivitet (  2 ). 
Detaljerede anvisninger for indsamling, håndtering og opbevaring af jord til anvendelse i bioomdannelsesforsøg kan findes i (8)(10)(15) ­
(26)(27).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) En jordtypes vandretentionsegenskaber kan måles som markkapacitet, vandkapacitet eller 
vandets sugetension (pF-værdi). Forklaringer findes i bilag 1. I prøverapporten angives, 
om jordtypernes vandretentionsegenskaber og bulkdensitet er bestemt i uforstyrrede 
markprøver eller i forstyrrede (behandlede) prøver. 
( 2 ) Nyere forskningsresultater viser, at jord fra tempererede zoner ligeledes kan opbevares 
ved - 20  o C i over tre måneder (28)(29) uden nævneværdigt tab i mikrobiel aktivitet.
 Før den behandlede jord anvendes til dette forsøg, skal den præin ­
kuberes for at kimene kan bringes til spiring og fjernes, og for at 
ligevægten i den mikrobielle metabolisme kan genetableres efter skiftet fra prøvetagnings- eller opbevaringsbetingelser til inkubations ­
betingelser. Sædvanligvis vil en præinkubationseriode på mellem 2 
og 28 døgn under tilnærmelsesvis samme temperatur- og fugtigheds ­
betingelser som under det faktiske forsøg være tilstrækkelig (15). Opbevarings- og præinkubationsperioden må tilsammen ikke være over tre måneder.
 
1.9. UDFØRELSE AF FORSØGET  
1.9.1.  Forsøgsbetingelser  
1.9.1.1.  Forsøgstemperatur  
I hele forsøgsperioden skal jordprøverne inkuberes i mørke ved en 
konstant temperatur, som er repræsentativ for de klimabetingelser, hvorunder benyttelse eller udledning vil finde sted. En temperatur på 20 ± 2
 o C anbefales for alle prøvestoffer, som kan tilføres jorden i 
tempereret klima. Temperaturen skal kontrolleres.  
For kemikalier, som tilføres eller udledes under koldere klima ­
forhold (f.eks. i nordlige lande og i efterårs- og vinterperioden) bør yderligere jordprøver desuden inkuberes ved lavere tempe ­
ratur (f.eks. 10 ± 2
 o C). 
1.9.1.2.  Fugtindhold  
Ved omdannelsesforsøg under aerobe forhold skal jordens 
fugtindhold (  1 ) justeres til og holdes på en pF-værdi mellem 2,0 
og 2,5 (3). Jordens fugtindhold angives som masseenheder vand pr. masseenhed tør jord og bør regelmæssigt kontrolleres (f.eks. 
med 2 ugers mellemrum) ved vejning af inkubationskolberne, og 
vandtabet kompenseres ved tilsætning af vand (helst sterilfiltreret ledningsvand). Ved tilsætning af vand bør vises omhu, så man undgår eller minimerer tab af prøvestof og/eller omdannelsespro ­
dukter ved fordampning og/eller eventuel fotodegradering.
 
Til omdannelsesforsøg under anaerobe forhold og under betingelser 
svarende til overrislet mark skal jorden vandmættes ved overrisling.  
1.9.1.3.  Aerobe inkubationsbetingelser  
I gennemstrømningssystemer opretholdes aerobe betingelser ved 
periodisk skylning eller ved kontinuerlig ventilation med befugtet luft. I biometerkolber opretholdes luftskiftet ved diffusion.
 
1.9.1.4.  Sterile aerobe betingelser  
For at skaffe viden om eventuel abiotisk omdannelse af prøvestoffet 
kan jordprøverne steriliseres (vedr. sterilisationsmetoder henvises til 
henvisning (16) og (29)), behandles med sterilt prøvestof (f.eks. med 
en opløsning tilsat gennem et sterilfilter) og beluftes med befugtet steril luft som beskrevet i 1.9.1.3. For jord fra overrislet mark skal jord og vand steriliseres, og inkubation skal finde sted som beskrevet 
i 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Jorden må hverken være for våd eller for tør til at opretholde tilstrækkelig luft- og 
næringsstoftilførsel til jordens mikroflora. Til optimal mikrobiel vækst anbefales et fugt ­
indhold på mellem 40 og 60 % vandholdende evne (WHC) eller fra 0,1 til 0,33 bar (6). 
Sidstnævnte område svarer til et pF-område på 2,0-2,5. Det typiske fugtindhold i forskel ­
lige jordtyper er angivet i bilag 2.
 1.9.1.5.  Anaerobe inkubationsbetingelser  
For at etablere og opretholde anaerobe betingelser skal jorden — 
efter behandling med prøvestoffet og inkubation under aerobe betin ­
gelser i 30 døgn, dog højst én halveringstid eller DT  50 — vand­
mættes (et vandlag på 1-3 cm), og inkubationssystemet skylles 
med en inaktiv gas (f.eks. kvælstof eller argon) (  1 ). Forsøgsopstil ­
lingen skal gøre det muligt at måle f.eks. pH, oxygenkoncentration og redoxpotentiale og skal omfatte anordninger til indsamling af 
flygtige produkter. Systemer af biometertypen skal være lukkede 
for at undgå luftindtrængen ved diffusion.
 
1.9.1.6.  lnkubationsbetingelser svarende til overrislet mark  
For at undersøge omdannelsen i overrislede rismarker oversvømmes 
jorden med et vandlag på 1-5 cm, og prøvestoffet tilsættes vandfasen 
(9). En jorddybde på mindst 5 cm anbefales. Systemet ventileres med luft under aerobe betingelser. Den vandige fases pH, oxygenkoncen ­
tration og redoxpotentiale overvåges og registreres. Der kræves en 
præ-inkubationsperiode på mindst to uger, før omdannelsesundersø ­
gelserne påbegyndes (se 1.8.3.2).
 
1.9.1.7.  Forsøgets varighed  
Undersøgelserne af omdannelseshastighed og -vej bør normalt ikke 
strække sig over mere end 120 dage (  2 ) (3)(6)(8), da der herefter må 
forventes at indtræffe et fald i den mikrobiologiske aktivitet med tiden i et kunstigt laboratoriesystem, som er afskåret fra naturlig fornyelse. Forsøgene kan fortsætte i længere perioder (f.eks. 6 eller 
12 måneder), når det er nødvendigt for at beskrive nedbrydning af 
prøvestof og dannelse og nedbrydning af hovedomdannelsespro ­
dukter (8), Eventuelle længere inkubationsperioder skal begrundes i forsøgsrapporten og skal være ledsaget af målinger af biomasse 
under og ved slutningen af sådanne perioder.
 
1.9.2.  Forsøgets udførelse  
50 til 200 g jord (på tør vægtbasis) anbringes i hver inkubations ­
kolbe (se, figur 1 og 2 i bilag 3), og jorden behandles med prøve ­
stoffet efter en af de i 1.8.2 beskrevne metoder. Når der anvendes 
organiske opløsningsmidler til påføring af prøvestoffet, fjernes disse fra jorden ved fordampning. Jorden blandes derefter grundigt med spatel og/eller ved omrystning af kolben. Finder forsøget sted under 
betingelser svarende til overrislet mark, skal jord og vand blandes 
grundigt efter tilsætning af prøvestoffet. Små alikvoter (f.eks. 1 g) af den behandlede jord analyseres for prøvestoffet til kontrol af, at 
fordelingen er ensartet. En alternativ metode er beskrevet nedenfor.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Aerobe betingelser er fremherskende i overjord og endda i den underliggende jord, som 
påvist i et EU-finansieret forskningsprojekt (K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity 
and activity in subsoils; Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures 
and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 
270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sverige). Anaerobe betingelser kan lejlighedsvis 
optræde, når jorden er oversvømmet efter kraftig nedbør eller når rismarker overrisles. 
( 2 ) Aerobe undersøgelser kan afsluttes længe inden 120 døgn, forudsat at omdannelse og 
mineralisering er løbet fuldstændig til ende på det pågældende tidspunkt. Afslutning af 
forsøget er mulig efter 120 dage eller når mindst 90 % af prøvestoffet er omdannet, men 
kun hvis der er dannet mindst 5 % CO  2.
 Behandlingsmængden skal svare til den højeste i brugsanvisningen 
anbefalede spredemængde af et planteskyttelsesmiddel, idet dette 
iblandes homogent til en passende dybde i marken (f.eks. de øverste 10 cm (
 1 ) jord). For kemiske stoffer, der tilføres ved blad ­
gødskning eller påføres jorden uden iblanding, vil den mest passende 
dybde til beregning af den mængde kemisk stof, der skal tilsættes 
hver kolbe, være 2,5 cm. For kemiske stoffer, som iblandes jorden, er den mest passende dybde den iblandingsdybde, som foreskrives i brugsanvisningen. Generelt gælder, at den den mængde, der skal 
tilføres af et kemisk stof, bestemmes på grundlag af den mest rele ­
vante tilførselsvej; er den vigtigste tilførselsvej således gennem kloakslam, skal stoffet tilsættes slammet i en koncentration, som afspejler den forventede koncentration i slammet, og den til jorden 
tilsatte mængde slam skal afspejle den normale mængde slam, som 
landbrugsjord belastes med. Er denne koncentration ikke høj nok til, at hovedomdannelsesprodukterne kan identificeres, kan inkubation af separate jordprøver med en større tilsætningsmængde være nyttig, 
men man bør undgå mængder så store, at de påvirker jordens mikro ­
bielle funktioner (jf. 1.5 og 1.8.2).
 
Alternativt kan en større portion (dvs. 1 til 2 kg) jord behandles med 
prøvestoffet, blandes grundigt i en passende blandemaskine og derefter overføres til inkubationskolberne i små portioner på 50 til 200 g (f.eks. ved hjælp af prøvedelere). Små alikvoter (f.eks. 1 g) af 
den behandlede jordportion analyseres for prøvestoffet til kontrol af, 
at fordelingen er ensartet. Denne fremgangsmåde må foretrækkes, da den giver en mere ensartet fordeling af prøvestoffet i jorden.
 
Desuden skal der inkuberes ubehandlede jordprøver ved samme 
betingelser (aerobe) som prøver behandlet med prøvestof. Disse prøver anvendes til måling af biomasse under og efter afslutning 
af forsøgene.
 
Når prøvestoffet tilføres jorden opløst i et eller flere organiske opløs ­
ningsmidler, skal jordprøverne inkuberes med samme mængde opløs ­
ningsmiddel (-midler) og ved samme betingelser (aerobe) som prøver behandlet med prøvestof. Disse prøver anvendes til måling af 
biomasse før, under og efter afslutning af forsøgene for at kontrol ­
lere, om opløsningsmidlerne har indvirkning på den mikrobielle biomasse.
 
Kolberne med behandlet jord tilsluttes enten det i figur 1 beskrevne 
gennemstrømningssystem eller lukkes med den i figur 2 viste absorp ­
tionskolonne (se bilag 3).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Begyndelseskoncentrationen på arealbasis beregnes af følgende udtryk:  
C soil mg =kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d kg  soil=m 3 h i  
C soil = Begyndelseskoncentrationen i jord (mg.kg  -1 ) 
A = Spredemængde (kg.ha  -1) ; 1 = tykkelse af markjordlaget (m): 
d = tør bulkdensitet af jorden (kg.m  -3 ). 
Som tommelfingerregel resulterer en spredemængde på 1 kg.ha  -1 i en jordkoncentration 
på ca. 1 mg.kg  -1 i et 10 cm tykt lag (idet bulkdensiteten er sat til 1 g.cm  -3 ).
 1.9.3.  Prøvetagning og måling  
Ved de respektive tidsintervaller udtages et par inkubationskolber, og 
jordprøverne ekstraheres med passende opløsningsmidler af forskellig polaritet og analyseres for prøvestof og/eller omdannelses ­
produkter. I en veltilrettelagt undersøgelse er der tilstrækkeligt med 
kolber til, at der kan bruges to kolber ved hver prøvetagning. Endvidere udtages absorptionsopløsninger eller faste absorbenter med forskellige tidsintervaller (i den første måned med 7-døgns 
intervaller, efter én måned med 17-døgns intervaller) under og 
efter inkubationen af hver jordprøve og analyseres for flygtige produkter. Derudover skal der indgå jordprøver udtaget direkte 
efter tilsætning (0-dages prøve) i mindst 5 forskellige prøvetagnings ­
punkter. Tidsintervallerne vælges sådan, at mønsteret for nedbryd ­
ning af prøvestoffet og for omdannelsesprodukternes dannelse og nedbrydning kan fastlægges (f.eks. ved 0. 1, 3, 7 dage; 2, 3 uger; 
1, 2, 3 måneder osv.).
 
Når der bruges  14 C-mærket prøvestof, bliver den ikke-ekstraherbare 
radioaktivitet kvantificeret ved forbrænding, og der opstilles en massebalance for hvert prøvetagningsinterval.
 
Ved inkubation under anaerobe forhold og med overrisling af jorden 
kan jord- og vandfasen enten sammen analyseres for prøvestof og 
omdannelsesprodukter, eller faserne kan adskilles ved filtrering eller centrifugering før ekstraktion og analyse.
 
1.9.4.  Frivillige prøver  
Det kan være nyttigt at foretage yderligere forsøg under aerobe, 
ikke-sterile betingelser ved andre temperaturer og jordfugtigheder 
for at belyse temperaturens og jordfugtighedens indflydelse på 
omdannelseshastigheden af et prøvestof og/eller dets omdannelses ­
produkter i jord.  
Yderligere karakterisering af ikke-ekstraherbar radioaktivitet kan 
søges foretaget f.eks. med superkritisk væskeekstraktion.  
2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
Mængden af prøvestof, omdannelsesprodukter, flygtige stoffer (kun 
i %) og ikke ekstraherbart stof angives i % af den tilførte begyn ­
delseskoncentration og, i givet fald, i mg.kg  -1 jord (på tør vægtbasis) 
for hvert prøvetagningsinterval. For hvert prøvetagningsinterval 
opstilles en massebalance i procent af den tilførte begyndelseskon ­
centration. En grafisk fremstilling af prøvestoffets koncentration mod tiden giver mulighed for bestemmelse af dets omdannelseshalve ­
ringstid eller DT
 50. De vigtigste omdannelsesprodukter skal identifi ­
ceres og deres koncentration ligeledes afbildes grafisk mod tiden for at vise deres dannelses- og nedbrydningshastighed. Ved »vigtigste omdannelsesprodukter« forstås dem, der på noget tidspunkt i løbet af 
undersøgelsen repræsenterer ≥ 10 % af den tilførte mængde.
 
De opsamlede flygtige produkter giver et vist fingerpeg om prøve ­
stoffets og omdannelsesprodukterne potentielle flygtighed fra jord.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Der foretages en mere præcis bestemmelse af halveringstider eller 
DT 50 -værdier og, i givet fald. DT  75 - og DT  90 -værdier, ved beregning 
med passende kinetiske modeller. I rapporten angives værdierne af halveringstider og DT
 50 sammen med beskrivelsen af den anvendte 
model, reaktionsordenen og determinationskoefficienten (r  2 ). Første 
ordens kinetik antages at være gældende, medmindre r  2 < 0,7. Når 
det er hensigtsmæssigt, anvendes beregningerne også på hoved ­
omdannelsesprodukterne. Eksempler på passende modeller er beskrevet i henvisning (31) til (35).
 
For kinetikforsøg ved forskellige temperaturer beskrives omdannel ­
seshastighederne som funktion af temperaturen inden for det eksperi ­
mentelle temperaturområde med brug af Arrhenius' ligning i formen:  
k ¼ A·e ÄB=T or lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
hvor ln A og B er regressionskonstanter givet ved henholdsvis 
skæringspunkt og hældning af den bedst tilnærmede linje dannet 
ved lineær regression af ln k mod 1/T, idet k er hastighedskonstanten og T temperaturen i Kelvin. Man må være opmærksom på, at Arrchenius-ligningen kun er gyldig inden for et begrænset tempera ­
turområde, når omdannelsen sker ved mikrobiel aktivitet.
 
2.2. EVALUERING OG FORTOLKNING AF RESULTATER  
Skønt forsøgene finder sted i et kunstigt laboratoriesystem, kan man 
ved hjælp af resultaterne bestemme både prøvestoffets omdannelses ­
hastighed og den hastighed, hvormed omdannelsesprodukterne dannes og nedbrydes under feltbetingelser (36)(37).
 
Ved at undersøge omdannelsesvejen for et prøvestof får man oplys ­
ninger om, hvordan det tilførte stof undergår strukturændringer i jorden gennem kemiske og mikrobielle reaktioner.
 
3. RAPPORTERING  
FORSØGSRAPPORT  
Forsøgsrapporten skal indeholde følgende:  
Prøvestof:  
— generisk navn, kemisk navn, CAS-nummer, strukturformel (med 
angivelse af placeringen af det mærkede atom, når radioaktivt 
mærket stof anvendes) og relevante fysisk-kemiske egenskaber (se 1.5)
 
— renhed (urenheder) af prøvestoffet  
— det mærkede kemiske slofs radiokemiske renhed og, når del er 
hensigtsmæssigt, specifikke aktivitet  
Referencestoffer:  
— kemisk navn og struktur for de referencestoffer, som er anvendt 
til karakterisering og/eller identifikation af omdannelsesprodukter  
Prøvejordtyper:  
— enkeltheder vedrørende indsamlingsstedet  
— dato og fremgangsmåde for udtagelse af jordprøven  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— jordtypernes egenskaber, således pH, organisk kulstofindhold, 
tekstur, ( % sand, % silt, % ler), kationbytterkapacitet bulkden ­
sitet, vandretentionsegenskaber og mikrobiel biomasse  
— opbevaringsvarighed og -betingelser (hvis jorden har været opbe ­
varet)  
Omstændigheder ved forsøget:  
— dato for forsøgenes udførelse  
— mængde prøvestof tilført  
— anvendte opløsningsmidler og metoden, med hvilken prøvestoffet 
er tilført  
— vægtmængde jord, som indledende er behandlet og hvoraf der er 
udtaget prøver til analyse med de fastlagte intervaller  
— beskrivelse af det anvendte inkubationssystem  
— luftgennemstrømningshastigheder (kun for gennemstrømnings ­
systemer)  
— temperatur af forsøgsopstillingen  
— jordens fugtindhold under inkuberingen  
— mikrobiel biomasse før, under og efter aerobe forsøg  
— pH, oxygenkoncentration og redoxpotentiale før, under og efter 
forsøg under anaerobe forhold og med overrislet jord  
— ekstraktionsmetode(r)  
— metoder til kvantificering og identifikation af prøvestoffet og dets 
hovedomdannelsesprodukter i jord og absorbenter  
— antal gentagelser og antal kontroller  
Resultater  
— resultat af bestemmelse af mikrobiel aktivitet  
— repeterbarhed og følsomhed af de anvendte analysemetoder  
— genfindingsgrad ( % værdier for en gyldig undersøgelse er 
angivet i 1.7.1)  
— tabeller over resultater, angivet som % af den tilførte begyndel ­
sesdosis, og, i givet fald, som mg. kg  -1 jord (på tør vægtbasis)  
— massebalance før, under og efter forsøgene  
— beskrivelse af ikke-ekstraherbar (bunden) radioaktivitet eller 
rester i jord  
— kvantificering af udledt CO  2 og andre flygtige forbindelser  
— kurver over koncentrationen i jord som funktion af tiden, dels for 
prøvestoffet, dels, i givet fald, for de vigtigste omdannelsespro ­
dukter  
— halveringstid eller DT  50 , DT  75 og DT  90 , dels for prøvestoffet, 
dels, i givet fald, for de vigtigste omdannelsesprodukter, med 
angivelse af konfidensgrænser  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— bestemmelse af den abiotiske nedbrydningshastighed under 
sterile betingelser  
— en vurdering af omdannelseskinetikken for prøvestoffet og, i 
givet fald, hovedomdannelsesprodukterne  
— formodede omdannelsesveje, når det er relevant  
— diskussion og fortolkning af resultaterne  
— rådata (dvs. eksempler på kromatogrammer, eksempler på bereg ­
ning af omdannelseshastigheder, og anvendte metoder til identi ­
fikation af omdannelsesprodukter).  
4. HENVISNINGER  
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide 
Assessment Guidelines. Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex III. Part A: Fate and 
Behaviour in the Environment.
 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflan ­
zenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutz ­
mitteln im Boden — Abbau, Umwandlung und Metabolismus.  
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil — Part 1: Aerobic conditions.
 
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(9) MAFF — Japan 2000 — Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil — Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded).  
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
 
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley — VCH 
(1998).  
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality — Sampling . Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(16) Annex V to Dir. 67/548/EEC.  
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85- 114.
 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mine ­
ralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
— General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
 
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologis ­
chen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologis ­
chen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
(23) Scheffer, F., Schaehtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological 
method for the quantitative measurement of microbial 
biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.  
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality — Determination of 
soil microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method. Part 2: fumigation-extraction method.  
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments, In Pesticide Effects on Soil Microflora, 
L. Somerville. M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.  
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment; Aerobic and bio-transformation of pesti ­
cides in aqueous environment. Proceedings of the 16  th Sympo­
sium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.  
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality. 59-63 (SETAC-Europe).  
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996), Effect of freeze and 
cold storage of soil on microbial activities and biomass. In 
Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R, (1987). Effects of 
ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.
 
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im 
Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
 
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, DA, Hamaker, J.W., Mcikle, R.W. 
(1975). Principles of pesticide degradation in soil. In »Envi ­
ronmental Dynamics of Pesticides«. R. Haque and V.H. Freed, 
Eds., 135-172.  
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V, (1986). Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues. II, Pflanzenschutz — Nachrichten 
Bayer 39, 188-204.  
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. 1. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer 33, 47- 
60. 
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide 
dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci.Technol. 24. 1032-1041.
 
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83-122.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
Bilag 1  
VANDTENSION, MARKKAPACITET OG VANDHOLDENDE EVNE  ( 1 ) 
Højde af vandsøjle 
[cm] pF (  a ) bar (  b ) Bemærkninger  
10 7 7 10  4 Tør jord 
1,6 · 10 4 4,2 16 Visnegrænse 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6 · 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Område for 
Markkapacitet (  d ) 10 2 2 0,1 
19 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 Vandholdende evne (tilnær ­
met) 
1 0 0,001 Vandmættet jord
 
( a ) pF = logaritmisk angivelse af cm vandsøjle. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Svarende til et omtrentligt vandindhold på 10 % i sand, 35 % i lerjord og 45 % i ler. 
( d ) Markkapaciteten er ikke konstant, men varierer alt efter jordtypen mellem pF 1,5 og 2,5.  
Vandpotentialet  måles i cm vandsøjle eller i bar. På grund af sugetensionens store variationsområde 
angives denne simpelthen som pF-værdien, som svarer til logaritmen til værdien i cm vandsøjle.  
Markkapaciteten  er den mængde vand. som en naturlig jord kan tilbageholde mod tyngdekraften 2 
døgn efter længerevarende regn eller efter tilstrækkelig kunstvanding. Den bestemmes i uforstyrret jord in situ i marken. Målingen er således ikke anvendelig på laboratorieprøver af forstyrret jord. Markkapaciteten bestemt i forstyrret jord kan udvise store systematiske afvigelser.
 
Den vandholdende evne  (WHC) bestemmes i laboratoriet med uforstyrret og forstyrret jord ved at 
mætte en jordsøjle med vand ved kapillartransport. Den er specielt nyttig til forstyrret jord og kan være indtil 30 % større end markkapaciteten (1). Den er endvidere lettere al bestemme eksperi ­
mentelt end pålidelige værdier af markkapaciteten.
 
Noter  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
Bilag 2  
FUGTINDHOLD I JORD (G VAND PR. 100 G TØR JORD) FOR FORSKELLIGE 
JORDTYPER FRA FORSKELLIGE LANDE  
Jordtype Land Fugtindhold i jord ved 
Vandholdende 
evne (WHC) (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Sand Tyskland 28,7 8,8 3,9 
Lerblandet sand Tyskland 50,4 17,9 12,1 Lerblandet sand Schweiz 44,0 35,3 9,2 Siltler Schweiz 72,8 56,6 28,4 Lerjord Brasilien 69,7 38,4 27,3 Lerjord Japan 74,4 57,8 31,4 Sandblandet lerjord Japan 82,4 59,2 36,0 
Siltler USA 47,2 33,2 18,8 
Sandblandet lerjord USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Vandholdende evne.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
Bilag 3  
Figur 1  
Eksempel på gennemstrømningsapparat til undersøgelser af omdannelsen af 
kemikalier i jord  ( 1 ) ( 2 )
 
Figur 2  
Eksempel på kolbe af biometertypen til undersøgelse af omdannelsen af 
kemiske stoffer i jord  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and 
the Soil (RJ. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In 
Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. 
Vol 1, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau 
und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 C.24.  AEROB OG ANAEROB OMDANNELSE I AKVATISKE 
SEDIMENTSYSTEMER  
1. METODE  
Metoden er gengivet efter OECD TG 308 (2002).  
1.1. INDLEDNING  
Kemiske stoffer kan blive tilført lave eller dybe overfladevande 
gennem direkte tilledning, spredning af aerosoler, afstrømning, 
afløb, affaldsbortskaffelse, spildevand fra industri, husholdning eller 
landbrug samt atmosfærisk deposition. Den her beskrevne laborato ­
riemetode er bestemt til vurdering af aerob og anaerob omdannelse af organisk-kemiske stoffer i akvatiske sedimentsystemer. Den er 
baseret på eksisterende Guidelines (1)(2)(3)(4)(5)(6). På en OECD- 
workshop om valg af jord-/sedimenttype i Belgirate, Italien, i 1995 (7) enedes man specielt om antal og art af de sedimenter, som skal anvendes i dette forsøg. Workshoppen udsendte desuden anbefa ­
linger for indsamling, håndtering og opbevaring af sedimentprøver, 
baseret på ISO-vejledningen (8). Sådanne undersøgelser er nødven ­
dige for kemiske stoffer, som anvendes direkte i vandmiljøet eller som må påregnes at nå frem til vandmiljøet ad ovennævnte veje.
 
I naturlige akvatiske sedimentsystemer hersker der ofte aerobe 
forhold i den øvre vandfase. Det overfladiske sedimentlag kan 
enten være aerobt eller anaerobt, mens den dybere del af sedimentet 
sædvanligvis er anaerob. For at tage alle disse muligheder i betragt ­
ning beskrives i dette dokument både aerobe og anaerobe forsøg. Det aerobe forsøg simulerer en aerob vandsøjle over et aerobt sediment ­
lag, som befinder sig over en anaerob gradient. Det anaerobe forsøg 
simulerer et fuldstændig anaerobt vandsedimentsystem. Hvis omstændighederne gør det nødvendigt at afvige væsentligt fra disse anbefalinger, f.eks. ved at bruge intakte sedimentkerner eller sedi ­
menter, som kan have været udsat for prøvestoffet, foreligger der 
andre metoder til dette formål (9).
 
1.2. DEFINITIONER  
Der skal i alle tilfælde anvendes SI-enheder.  
Prøvestof:  et vilkårligt stof, hvad enten det er moderstof eller et 
relevant orndannelsesprodukt.  
Omdannelsesprodukter:  alle stoffer, som dannes ved biotisk eller 
abiotisk omdannelse af prøvestoffer, herunder CO  2 og bundne rester.  
Bundne rester:  »Bundne rester« repræsenterer de stoffer i jord, 
planter eller dyr, som efter ekstraktion persisterer i den pågældende 
matrix, enten som moderstof eller som 
metabolitter/omdannelsesprodukter. Ekstraktionsmetoden må ikke bevirke væsentlige ændringer af selve stofferne eller af matrixens struktur. Bindingens art kan delvis klarlægges gennem matrixomdan ­
nende ekstraktionsmetoder og avancerede analyseteknikker. Indtil nu 
er der på denne måde identificeret kovalente bindinger, ionbindinger og sorptionsbindinger foruden indlejring. Sædvanligvis vil dannelse af bundne rester medføre væsentligt nedsat fysiologisk opløselighed 
(bioaccessibility) og biotilgængetighed (bioavailability) (10) (ændret 
efter IUPAC 1984 (11)).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aerob omdannelse:  (oxiderende): reaktioner, som finder sted i 
tilstedeværelse af molekylært oxygen (12).  
Anaerob omdannelse:  reaktioner, som finder sted i fravær af mole ­
kylært oxygen (12).  
Naturligt vand:  overfladevande udtaget fra damme, floder, vandløb 
osv. 
Sediment:  en blanding af mineralske og organisk-kemiske bestand ­
dele, hvoraf sidstnævnte indeholder højmolekylære forbindelser med stort kulstof- og kvælstofindhold, Det afsættes af naturligt vand og danner grænseflade til dette vand.
 
Mineralisering;  fuldstændig nedbrydning af en organisk forbindelse 
til CO  2 og H  2 O under aerobe betingelser, og til CH  4 , CO  2 og H  2 O 
under anaerobe betingelser. Når der i forbindelse med denne forsøgs ­
metode anvendes radioaktivt mærkede forbindelser, forstås ved mine ­
ralisering en vidtgående nedbrydning af molekylet, hvorunder et 
mærket kulstofatom oxideres eller reduceres under frigivelse af den pågældende mængde af henholdsvis
 14 CO 2 og 14 CH 4 . 
Halveringstid:  t 0,5 er den tid, der forløber, til et prøvestof er 50 % 
omdannet, når omdannelsen kan beskrives ved første ordens kinetik; 
den er uafhængig af begyndelseskoncentrationen.  
DT 50 (Disappearance Time  50): den tid, der forløber, til koncen ­
trationen af prøvestoffet er aftaget med 50 %.  
DT 75 (Disappearance Time 75):  den tid, der forløber, til koncen ­
trationen af prøvestoffet er aftaget med 75 %.  
DT 90 (Disappearance Time  90): den tid, der forløber, til koncen ­
trationen af prøvestoffet er aftaget med 90 %.  
1.3. REFERENCESTOFFER  
Til identifikation og kvantitativ bestemmelse af omdannelsespro ­
dukter med spektroskopiske og kromatografiske metoder skal anvendes referencestoffer.
 
1.4. OPLYSNINGER OM PRØVESTOFFET  
Til måling af omdannelseshastigheden kan anvendes umærket eller 
isotopmærket prøvestof, men radioaktivt mærket stof må foretræk ­
kes. Til undersøgelse af omdannelsesveje og opstilling af masseba ­
lance skal anvendes mærket stof.  14 C-mærkning anbefales, men 
andre isotoper, f.eks.  13 C, 15 N, H og "P, kan også anvendes. 
Mærket skal så vidt muligt placeres i molekylets mest stabile del(e) ­
( 1 ). Prøvestoffets kemiske og/eller radiokemiske renhed skal være 
mindst 95 %.  
Før man udfører et forsøg, skal der foreligge følgende oplysninger 
om prøvestoffet:  
a) vandopløselighed (metode A.6)  
b) opløselighed i organiske opløsningsmidler  
c) damptryk (metode A.4) og Henrys konstant  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Indeholder prøvestoffet f.eks. én ring, skal denne ring være mærket; indeholder prøve ­
stoffet to eller flere ringe, kan separate forsøg være nødvendige for at undersøge de 
enkelte mærkede ringes skæbne og for at få anvendelige oplysninger om dannelse af 
omdannelsesprodukter.
 d) n-oktanol/vand fordelingskoefficient (metode A.8)  
e) adsorptionskoefficient (K  d , K f eller, i givet fald, K  oc (metode C. 18)  
f) hydrolyse (metode C.7)  
g) syredissociationskonstant (pK  a ) (OECD Guideline 112) (13)  
h) prøvestoffets kemiske struktur og placeringen af eventuel isotop ­
mærkning.  
Bemærkning;  Den temperatur, ved hvilken disse målinger har fundet 
sted, skal angives.  
Af andre nyttige oplysninger kan nævnes data vedrørende prøve ­
stoffet toksicitet over for mikroorganismer, data vedrørende umid ­
delbar og/eller naturlig bionedbrydelighed og data vedrørende aerob 
og anaerob omdannelse i jord.  
Der skal foreligge analysemetoder (herunder metoder til ekstraktion 
og oprensning) til identifikation og kvantitativ bestemmelse af prøve ­
stoffet og dets omdannelsesprodukter i vand og i sediment (se 1.7.2).  
1.5. FORSØGSMETODENS PRINCIP  
I den her beskrevne forsøgsmetode anvendes et aerobt og et anaerobt 
akvatisk sedimentsystem (se bilag 1), som giver mulighed for:  
i) måling af prøvestoffets omdannelseshastighed i et vand-sediment 
system  
ii) måling af prøvestoffets omdannelseshastighed i sedimentet  
iii) måling af mineraliseringshastigheden for prøvestoffet og/eller 
dets omdannelsesprodukter (når der anvendes  14 C-mærket prøve ­
stof) 
iv) identifikation og kvantitativ bestemmelse af omdannelsespro ­
dufeter i vand- og sedimentfaser, herunder massebalance (når 
der anvendes mærket prøvestof)  
v) måling af fordelingen af prøvestoffet og dets omdannelsespro ­
dukter mellem de to faser under inkubation i mørke (for at undgå f.eks. algevækst) ved konstant temperatur, Halveringstid. DT
 50 , 
DT 75 og DT  90 bestemmes, når data berettiger det, men bør ikke 
ekstrapoleres ud over forsøgsperioden (se 1.2).  
Til både aerobe og anaerobe forsøg kræves mindst to sedimenter og 
de tilhørende vande (7). I visse tilfælde kan det dog være nødvendigt 
at anvende flere end to akvatiske sedimenter, f.eks. når det kemiske 
stof kan optræde i ferskvands- og/eller marint miljø.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. FORSØGSMETODENS ANVENDELIGHED  
Forsøgsmetoden kan anvendes på alle kemiske stoffer (umærkede 
eller mærkede), til hvilke man råder over en tilstrækkelig nøjagtig og følsom analysemetode. Metoden kan anvendes på tungflygtige, 
ikke-flygtige, vandopløselige og tungtopløselige forbindelser. 
Metoden bør ikke anvendes på kemiske stoffer, som er letflygtige fra vand (f.eks. rygningsmidler eller organiske opløsningsmidler) og således ikke vil forblive i vand og/eller sediment under de her 
beskrevne forsøgsbetingelser.
 
Metoden er hidtil anvendt til undersøgelse af omdannelsen af 
kemiske stoffer i ferske vande og sedimenter, men kan i princippet 
også anvendes på flodmundingssystemer/marine systemer. Den er ikke egnet til simulering af betingelserne i strømmende vand (f.eks floder) eller i det åbne hav.
 
1.7. KVALITETSKRITERIER  
1.7.1.  Genfindingsgrad  
Ved ekstraktion og analyse af i det mindste dobbelte vand- og sedi ­
mentprøver umiddelbart efter tilsætning af prøvestoffet fås et første 
fingerpeg om analysemetodens repeterbarhed og om, hvor homogent 
prøvestoffet er blevet tilført. Genfindingsgraden for senere forsøgs ­
stadier fås af de respektive massebalancer (når der bruges mærket stof). Genfindingsgraden skal være mellem 90 % og 110 % for 
mærkede kemiske stoffer (6) og mellem 70 % og 110 % for umær ­
kede stoffer.
 
1.7.2.  Analysemetodens repeterbarhed og følsomhed  
Repeterbarheden af analysemetoden (heri ikke medregnet udvin ­
dingsgraden ved den indledende ekstraktion) til kvantitativ bestem ­
melse af prøvestof og omdannelsesprodukter kan kontrolleres ved 
dobbelt analyse på den samme ekstrakt af vand- eller sedimentprø ­
verne, efter at disse er inkuberet tilstrækkelig længe til, at dannelse 
af omdannelsesprodukter har fundet sted.  
Analysemetodens detektionsgrænse for prøvestoffet og for omdan ­
nelsesprodukterne må ikke være over 0,01 mg kg  -1 i vand eller 
sediment (som prøvestof) og ikke over 1 % af den startmængde, 
der er tilsat prøvesystemet. Grænsen for kvantitativ bestemmelse skal angives.
 
1.7.3.  Nøjagtighed af omdannelesdata  
Gennem regressionsanalyse på bestemmelserne af prøvestoffets 
koncentration som funktion af tiden fås relevante oplysninger om omdannelseskurvens nøjagtighed samt mulighed for at fastlægge konfidensgrænser for halveringstiderne (når der gælder pseudo 
første ordens kinetik) eller DT
 50 -værdier, og i givet fald DT  75 - og 
DT 90 -værdier.  
1.8. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.8.1.  Prøvesystem og apparatur  
Til forsøget skal anvendes glasbeholdere (f.eks. flasker, centrifuge ­
glas), medmindre de indledende data (således n-oktanol-vand 
fordelingskoefficient, sorptionsdata osv.) viser, at prøvestoffet kan adhærere til glas, i hvilket tilfælde det kan blive nødvendigt at benytte et alternativt materiale (som Teflon). Når prøvestoffet vides 
at adhærere til glas, kan problemet afhjælpes ved hjælp af eneller 
flere af følgende metoder:
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— bestemmelser a fden masse prøvestof og omdannelsesprodukter, 
som sorberes på glas  
— vask af alt glasapparatur med opløsningsmiddel ved forsøgets 
afslutning  
— anvendelse af formulerede produkter (se også 1.9.2)  
— brug af øget mængde co-solvent ved tilsætning af prøvestof til 
systemet; anvendes co-solvent, må det ikke bevirke solvolyse af prøvestoffet.
 
Eksempler på typiske prøveopstillinger, dvs. gennemstrømnings ­
systemer og biometersystemer, er vist i hhv, bilag 2 og 3 (14). 
Andre anvendelige inkubationssystemer er beskrevet i henvisning 
(15). Forsøgsopstillingen skal give mulighed for udskiftning af luft eller kvælstof og indsamling af flygtige produkter, Forsøgsopstil ­
lingen skal være dimensioneret således, at den opfylder de krav, 
der stilles af forsøget (jf. 1.9.1). Udluftning kan enten ske ved let gennembobling eller ved at der ledes luft eller kvælstof hen over vandoverfladen. I sidstnævnte tilfælde kan forsigtig omrøring ovenfra 
være nødvendig for at opnå bedre fordeling af ilt eller kvælstof i 
vandet, Der må ikke anvendes CO
 2 -fri luft, da det kan medføre 
stigning i vandets pH. I begge tilfælde bør forstyrrelse af sedimentet så vidt muligt undgås. Tungflygtige kemiske stoffer skal testes i et 
biometer-system med forsigtig omrøring af vandoverfladen. Lukkede 
kar med headspace af enten atmosfærisk luft eller kvælstof og indvendige glas til opsamling af flygtige produkter kan ligeledes anvendes (16). Ved den aerobe prøve kræves regelmæssig udskift ­
ning af headspace-gassen for at kompensere for biomassens iltfor ­
brug.
 
Egnede udskillere til flygtige opsamlingsprodukter kan være, men er 
ikke begrænset til en 1 M opløsning af kaliumhydroxid eller natriumhydroxid til udskillelse af kuldioxid (
 1 ) og ethylenglycol, 
ethanolamtn eller 2 % paraffin i xylen til organiske forbindelser. 
Flygtige stoffer, som dannes under anaerobe forhold, således methan, kan f.eks, opsamles med molekylsi, Sådanne flygtige stoffer kan f.eks, forbrændes til CO
 2 ved, at gassen ledes gennem 
et kvartsrør fyldt med CuO ved en temperatur på 900  o C, og den 
dannede CO  2 opsamles i en absorber med alkali (17).  
Der kræves laboratorieudstyr til kemisk analyse af prøvestoffet og 
omdannelsesprodukter (f.eks. ved gasvæskekromatografi (GLC), high performance væskekromatografi (HPLC), tyndtlagskromatografi 
(TLC), massespektroskopi (MS), gaskromatografi-massespektroskopi 
(GC-MS), væskekromatografi-massespektroskopi (LC-MS), kerne ­
magnetisk resonans (NMR) mv.), herunder detektionssystemer for radioaktivt mærkede eller umærkede kemiske stoffer. Når radioaktivt 
mærket stof anvendes, skal der desuden bruges en væskescintil ­
lationstæller og en forbrændingsovn (til forbrænding af sediment ­
prøve før analyse af radioaktivitet).
 
Herudover skal der efter behov bruges øvrigt standardlaboratoneud ­
styr til fysisk-kemisk og biologisk bestemmelse (se tabel 1, 1.8.2.2), 
glasapparatur, kemikalier og reagenser.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Da sådanne alkaliske absorptionsvæsker også optager kuldioxiden i ventilationsluften og 
den, der er dannet ved respiration i aerobe forsøg, må de udskiftes regelmæssigt for at de 
ikke skal blive mættet og tabe absorptionsevnen.
 1.8.2.  Type og antal akvatiske sedimenter  
Prøvetagningsstedet skal vælges i henhold til formålet med det 
pågældende forsøg. Ved valg af prøvetagningssted må der tages hensyn til oplysninger om eventuel tidligere tilførsel fra landbrug, 
industri eller husholdninger til vandene opstrøms for prøvearealet. 
Har sedimenterne inden for de foregående fire år været forurenet med prøvestoffet eller stoffer strukturelt beslægtet hermed, bør de ikke anvendes.
 
1.8.2.1.  Valg af sediment  
Til aerobe forsøg anvendes normalt to sedimenter (7). De to valgte 
sedimenter skal være forskellige med hensyn til organisk kulstofind ­
hold og tekstur. Det ene sediment skal have højt organisk kulstof ­
indhold (2,5-7,5 %) og fin tekstur, det andet skal have lavt organisk 
kulstofindhold (0,5-2,5 %) og grov tekstur. Forskellen i organisk kulstofindhold skal normalt være mindst 2 %. Ved »fin tekstur« forstås, at indholdet af [ler + silt] (
 1 ) > 50 %, og ved »grov tekstur« 
forstås, at indholdet af [ler + silt| < 50 %. Forskellen i indholdet af 
[ler + silt] i de to sedimenter bør normalt være mindst 20 %. I tilfælde, hvor et kemisk stof også kan blive ført til marine vande, skal mindst det ene vandsedimentsystem være af marin oprindelse.
 
Til det rent anaerobe forsøg tages to sedimentprøver (sammen med 
de tilhørende vande) fra det anaerobe område af overfladevandom ­
råderne (7). Der drages omsorg for, at ilten ikke får adgang til 
sediment- eller vandfasen under håndtering og transport.  
Også andre parametre kan være vigtige ved valg af sedimenter og 
må tages i betragtning i de enkelte tilfælde. For eksempel vil sedi ­
menternes pH-område være vigtig ved testning af stoffer, hvis 
omdannelse og/eller sorption kan være pH-afhængig. pH-afhængig 
sorption kan afspejle sig i prøvestoffets pK  a -værdi.  
1.8.2.2.  Karakterisering af vand-sediment prøver  
I nedenstående tabel er angivet de nøgleparametre, der skat måles og 
rapporteres (med henvisning til den anvendte metode) for både vand 
og sediment, samt på hvilket trin i forsøget disse parametre skal bestemmes. Til orientering er metoder til bestemmelse af de pågæl ­
dende parametre givet i henvisning (18)(19)(20)(21).
 
Derudover kan der i det enkelte tilfælde være behov for måling og af 
andre parametre (f.eks, for ferskvand; partikler, alkalinitet, hårdhed, ledningsevne, NO
 3 /PO  4 (forhold og enkeltværdier); for sedimenter: 
kationbytrerkapacitet, vandholdende evne, karbonat, total kvælstof 
og fosfor; og for marine systemer: salinitet). Analyse af sedimenter og vand for nitrat, sulfat, biotilgængeligt jern og eventuelle andre elektronacceptorer kan desuden være nyttig til vurdering af redox ­
forholdene, specielt i forbindelse med anaerob omdannelse.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) [Ler + silt] er den mineralfraktion af sedimentet, hvis partikelstørrelse er < 50 μm.
 Måling af parametre til karakterisering af vand-sediment prøver(7)(22)(23)  
Parameter Forsøgsfase 
mark prøve ­
tagning efter hånd ­
teri ng start på 
akklimatise 
ring start på 
forsøg under 
forsøg forsøgets 
slutning  
Vand  
Oprindelse/kilde X Temperatur X pH X X X X X totalt organisk kulstof (TOC) X X X O
 2 -koncentration* X X X X X 
Redoxpotentiale* X X X X  
Sediment  
Oprindelse/kilde X Lagdybde X pH X X X X X Partikelstørrelsesfordeling X totalt organisk kulstof (TOC) X X X X 
Mikrobiel biomasse (*) X X X 
Redoxpotentiale (**) Observa ­
tion (farve/ lugt) X X X X
 
(*) Nyere forskning har vist, at målinger af vandets iltindhold og redoxpotentiale hverken har mekanistisk eller prædiktiv 
værdi med hensyn til mikrobielle populationers vækst og udvikling i overfladevande (24)(25). Bestemmelse af 
biokemisk iltforbrug (BOD, ved prøvetagning i marken, ved forsøgets start og slutning) og koncentrationen af 
mikro- og makronæringsstofferne Ca, Mg og Mn (ved forsøgets start og slutning) i vand samt måling af totalt 
kvælstof og totalt fosfor i sedimenter (ved prøvetagning i marken, ved forsøgets start og slutning) kan være mere 
velegnede som værktøjer til forståelse og vurdering aerobe biomdannelseshastigheder og -veje. 
(**) Metoder baseret på mikrobiel respirationshastighed (26), rygning (27) eller kolonitælling (f.eks. bakterier, aktinomy ­
ceter, svampe og totalkolonier) til aerobe forsøg; methandannelseshastigheden ved anaerobe forsøg.  
1.8.3.  Indsamling, håndtering og opbevaring  
1.8.3.1.  Indsamling  
Udtagning af prøver af sediment skal ske i overensstemmelse med 
udkastet til ISO-vejledningen for prøvetagning af bundsediment (8). 
Sedimentprøver skal tages fra hele den øverste 5 til 10 cm dybe del 
af sedimentlaget. Det tilhørende vand skal indsamles fra samme areal eller lokalitet og på samme tidspunkt som sedimentet. Til det anae ­
robe forsøg skal prøven af sedimentet og det tilhørende vand udtages 
og transporteres uden adgang af ilt (28) (jf. 1.8.2.1). I litteraturen 
beskrives nogle prøvetagningsanordninger(8)(23).
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2.  Håndtering  
Sedimentet adskilles fra vandet ved filtrering og vådsigtes gennem 
en 2 mm sigte med overskud af vand fra indsamlingsstedet, og det overskydende vand herfra kasseres. Derefter blandes kendte 
mængder sedimenter og vand i det ønskede forhold (jf, 1.9.1) i 
inkubationsflasker og forberedes til akklimatiseringsperioden (jf. 1.8.4). Til det anaerobe forsøg skal al håndtering ske under udeluk ­
kelse af ilt (29)(30)(31)(32)(33).
 
1.8.3.3.  Opbevaring  
Brug af frisk udtagede prøver af sediment og vand må stærkt anbe ­
fales, men er opbevaring nødvendig, skal sediment og vand sigtes 
som beskrevet ovenfor og opbevares sammen under vand (et 6- 
10 cm vandlag), i mørke ved 4 ± 2  o C (  1 ) i højst 4 uger (7)(8)(23). 
Prøver, som skal anvendes til aerobe forsøg, skal opbevares med fri luftadgang (f.eks i åbne beholdere), hvorimod prøver til anaerobe 
forsøg opbevares under udelukkelse af ilt. Under transport og opbe ­
varing må ikke forekomme frysning af sediment og vand eller udtør ­
ring af sedimentet.
 
1.8.4.  Klargøring af prøverne af sediment/vand til forsøget  
Før prøvestoffet tilsættes, skal der hengå en akkltmatiseringsperiode, 
hvor hver sediment/vandprøve er anbragt i den inkubationsbeholder, som skal bruges i hovedforsøget, og akklimatiseringen skal finde 
sted under nøjagtig samme betingelser som ved inkubationen under 
forsøget (se 1.9.1). Akklimatiseringsperioden skal svare til den tid, systemet er om at nå en rimelig stabilitet, således som det ses af pH, oxygenkoncentrationen i vandet, redoxpotentiale af sediment og 
vand, og den makroskopiske adskillelse af faserne, Akklimatise ­
ringen skal normalt vare mellem en og to uger og bør ikke overstige fire uger. Resultaterne af de bestemmelser, der er foretaget i denne 
periode, skal angives i rapporten.
 
1.9. UDFØRELSE AF FORSØGET  
1.9.1.  Forsøgsbetingelser  
Forsøget udføres i inkubationsapparat (se 1.8.1) med et vand:sedi ­
ment volumenforhold mellem 3:1 og 4:1 og et sedimentslag 2,5 cm 
(± 0,5 cm). Det anbefales at bruge mindst 50 g sediment (på tørvogtsbasis) per inkubationsbeholder.
 
Forsøget udføres i mørke ved konstant temperatur mellem 10 og 
30 o C, En temperatur på (20 ± 2)  o C er passende. Når det er 
hensigtsmæssigt, kan man i de enkelte tilfælde overveje en yderligere 
lav temperatur (f.eks. 10  o C), alt efter hvilke oplysninger forsøget 
skal give. Inkubationstemperaturen skal overvåges og rapporteres.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Nyere undersøgelser har vist. at der ved opbevaring ved 4  o C kan indtræde et fald i sedimen ­
tets organiske kulstofindhold, muligvis med nedsat mikrobiel aktivitet til følge (34).
 1.9.2.  Behandling og tilsætning af prøvestoffet  
Der anvendes én prøvekoncentration af det kemiske stof (  1 ). For 
plantebeskyttelsesmidler, som tilføres vandområderne direkte, anvendes som maksimal spredemængde den på mærkaten angivne 
maksimumsdosering, beregnet på grundlag af overfladearealet af 
vandet i prøvekarret. I alle andre tilfælde beregnes den anvendte koncentration på grundlag af prognoser baseret på de udledte mæng ­
der. Der skal drages omsorg for at sikre, at den tilførte mængde 
prøvestof er tilstrækkelig til at give mulighed for at karakterisere 
dets omdannelsesvej og omdannelsesprodukternes dannelse og nedbrydning. Det kan være nødvendigt at tilsætte højere doser 
(f.eks. 10 gange) i tilfælde, hvor stoffets koncentrationer ved 
forsøgets begyndelse er nær detektionsgrænsen og/eller hvis de vigtigste omdannelsesprodukter ikke let kan detekteres, når de optræder i en mængde på 10 % af den af prøvestoffet tilførte 
mængde. Anvendes højere testkoncentrationer, må disse dog ikke 
have nævneværdig ugunstig virkning på den mikrobielle aktivitet af vand-sediment systemet. For at opnå konstant prøvestofkoncen ­
tration i prøvekar af forskellige dimensioner vil det eventuelt blive 
fundet hensigtsmæssigt at korrigere den tilførte stofmængde på 
grundlag af dybden af vandsøjlen i karret i forhold til vanddybden i marken (som sættes til 100 cm, men andre dybder kan anvendes). Et eksempel på beregningsmåden er givet i bilag 4.
 
Ideelt skal prøvestoffet tilsættes prøvesystemets vandfase som vandig 
opløsning. Når det er uomgængelig nødvendigt, kan der bruges små 
mængder vandblandbare opløsningsmidler (som f.eks, acetone eller 
ethanol) til at tilføre og fordele prøvestoffet, men den tilsatte mængde må ikke udgøre over 1 % v/v eller have ugunstig virkning på den mikrobielle aktivitet af prøvesystemet. Den vandige opløsning 
af prøvestoffet skal fremstilles med omhu — det kan være hensigts ­
mæssigt at anvende en generatorsøjle og forblanding for at sikre fuldstændig homogenitet. Efter tilsætning af den vandige opløsning til prøvesystemet anbefales, at vandfasen blandes forsigtigt, så sedi ­
mentet forstyrres mindst muligt.
 
Det kan normalt ikke anbefales at anvende det færdigformulerede 
produkt, da indholdsstofferne i formuleringen kan påvirke prøvestof ­
fets og/eller omdannelsesprodukternes fordeling mellem vand- og sedimentfase. For prøvestoffer med ringe opløselighed i vand kan 
anvendelse af det formulerede stof dog være et hensigtsmæssigt 
alternativ.
 
Antallet af inkubationsbeholdere afhænger af antal prøvetagnings ­
tidspunkter (se 1.9.3). Der skal indgå tilstrækkeligt mange prøvesy ­
stemer til, at der kan ofres to systemer for hvert prøvetagningstids ­
punkt. Anvendes der kontrolenheder med hvert akvatisk sedimentsy ­
stem, skal disse ikke behandles med prøvestof. Kontrolenhederne 
kan benyttes til at bestemme sedimentets mikrobielle biomasse og det totale organiske kulstofindhold i vand og sediment ved forsøgets slutning. To af kontrolenhederne (dvs. én kontrolenhed af hvert 
akvatisk sediment) kan anvendes til at overvåge de ønskede para ­
metre i sediment og vand i akklimatiseringsperioden (se tabellen i 1.8.2.2). Når prøvestoffet tilføres ved hjælp af et opløsningsmiddel, skal der indgå to ekstra kontrolenheder til bestemmelse af ugunstig 
påvirkning af den mikrobielle aktivitet i prøvesystemet,
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Prøvning med endnu en koncentration kan være nyttig for stoffer, som tilføres overflade ­
vandene ad forskellige veje med deraf følgende forskelle i koncentration, når blot den 
laveste koncentration kan analyseres med tilstrækkelig nøjagtighed.
 1.9.3.  Forsøgsvarighed og prøvetagning  
Forsøget bør normalt ikke strække sig over mere 100 dage (6) og 
skal løbe, indtil nedbrydningsvej og vand/sediment fordelingsmøn ­
ster er klarlagt, eller indtil 90 % af prøvestoffet er spredt ved omdan ­
nelse og/eller fordampning. Antal prøvetagningstidspunkter skal være 
mindst seks (inklusive tidspunktet nul), idet en hensigtsmæssig prøvetagningsplan og forsøgets varighed fastlægges i en frivillig indledende undersøgelse (se 1.9.4), medmindre der fra tidligere 
undersøgelser foreligger tilstrækkelige data om prøvestoffet. For 
hydrofobe prøvestoffer kan ekstra prøvetagningspunkter være nødvendige i den indledende del af forsøgsperioden for at bestemme 
fordelingsforholdet mellem vand- og sedimentfase.
 
På passende prøvetagningstidspunkter udtages komplette (ens) inku ­
bationsbeholdere til analyse. Sedimentet og det overliggende vand 
analyseres hver for sig (  1 ). Overfladevandet fjernes forsigtigt med 
mindst mulig forstyrrelse af sedimentet. Til ekstraktion og karakte ­
risering af prøvestof og omdannelsesprodukter skal anvendes egnede analysemetoder. Der drages omsorg for at fjerne materiale, som kan 
være adsorberet til inkubationsbeholderen eller til de forbindelses ­
slanger, der anvendes til opsamling af flygtige stoffer.
 
1.9.4.  Frivillig forundersøgelse  
Kan forsøgsvarighed og prøvetagningsfrekvens ikke skønsmæssigt 
fastlægges ud fra andre relevante undersøgelser af prøvestoffet, vil en frivillig forundersøgelse eventuelt blive fundet hensigtsmæssig og skal i så fald udføres under de forsøgsbetingelser, som påtænkes for 
den endelige undersøgelse. Hvis en sådan forundersøgelse gennem ­
føres, skal relevante forsøgsomstændigheder og resultater for denne kortfattet rapporteres.
 
1.9.5.  Målinger og analyse  
For hvert prøvetagningstidspunkt måles og rapporteres koncentra ­
tionen af prøvestof og omdannelsesprodukter i vand og sediment (som koncentration og som procent af tilført mængde). Normalt skal omdannelsesprodukter, som på noget prøvetagningstidspunkt 
er detekteret som ≥10 % af den mængde radioaktivitet, der er 
tilført det samlede vand-sediment-system, identificeres, medmindre undladelse heraf med rimelighed kan begrundes. Også for omdan ­
nelsesprodukter med konstant stigende koncentration hen gennem 
forsøget må identifikation overvejes selv om deres koncentrationen 
ikke er over de nævnte grænser, da dette tyder på, at de er persi ­
stente. Der må ske en konkret vurdering heraf i det enkelte tilfælde, og begrundelser gives i rapporten.
 
Resultater fra opsamlingen af gasser/flygtige stoffer (CO  2 og andet, 
dvs. flygtige organiske forbindelser), rapporteres for hvert prøvetag ­
ningstidspunkt. Mineraliseringshastigheder skal ligeledes rapporteres. 
Ikke-ekstraherbare (bundne) rester i sediment rapporteres for hvert prøvetagningspunkt.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) Hvis anaerobe omdannelsesprodukter let kan blive reoxideret, skal der opretholdes anae ­
robe betingelser under prøvetagning og analyse.
 2. DATA  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
For hvert prøvetagningstidspunkt beregnes en total massebalance 
eller genfindingsgrad (se 1.7.1) for den tilsatte radioaktivitet. Resul ­
taterne angives i procent af tilsat mængde radioaktivitet. For hvert 
prøvetagningstidspunkt skal fordelingen af radioaktivitet mellem vand og sediment angives som koncentration og som procentdel.
 
Halveringstiden, DT  50 og, i givet fald, DT  75 og DT  90 for prøvestoffet 
beregnes med tilhørende konfidensgrænser (jf. 1.7.3). Oplysninger om prøvestoffets spredning i vand og sediment kan opnås ved hjælp af passende evalueringsværktøjer. Disse kan række fra anven ­
delse af pseudo første ordens kinetik og empirisk kurvetilpasning 
med grafisk eller numerisk løsning til mere komplekse analyser, f.eks. baseret på en- eller flerkompartmentmodeller. Nærmere detaljer kan hentes i litteraturen (35)(36)(37).
 
Alle metoderne har stærke og svage sider og er meget forskellige i 
kompleksitet, Antagelse af første ordens kinetik kan være en over ­
simplificering af nedbrydnings- og fordelingsprocesserne, men når 
den er er mulig, resulterer den i et letforståeligt begreb (hastigheds ­
konstanten eller halveringstiden), som er værdifuldt i simulerings ­
modeller og beregninger af forventede koncentrationer i miljøet. Empiriske metoder eller lineær transformation kan give bedre tilpas ­
ning af kurver til data og dermed mulighed for bedre skøn over 
halveringstider, DT
 50 - og, i givet fald. DT  75 - og DT  90 -værdier. De 
afledte konstanter har imidlertid begrænset anvendelse. Af kompart ­
mentmodeller kan uddrages en række nyttige konstanter, som har 
værdi ved risikovurderinger og beskriver nedbrydningshastigheden 
i forskellige kompartments og det kemiske stofs fordeling. Desuden bør de anvendes ved bestemmelse af hastighedskonstanter for dannelse og nedbrydning af hovedomdannelsesprodukterne. I alle 
tilfælde skal valget af den anvendte metode begrundes, og eksperi ­
mentatoren skal grafisk og/eller statistisk påvise tilpasningsgraden.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. FORSØGSRAPPORT  
Rapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Prøvestof;  
— generisk navn, kemisk navn. CAS-nummer, strukturformel (med 
angivelse af placeringen af det mærkede atom, når radioaktivt 
mærket stof anvendes) og relevante fysisk-kemiske egenskaber  
— renhed (urenheder) af prøvestoffet  
— i givet fald, det mærkede kemiske stofs radiokemiske renhed og 
molære aktivitet.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Referencestoffer:  
— kemisk navn og struktur for de referencestoffer, som er anvendt 
til karakterisering og/eller identifikation af omdannelsesprodukter  
Testsedimenter og -vande:  
— beliggenhed og beskrivelse af det eller de steder, hvor der er 
udtaget prøver af akvatisk sediment, herunder så vidt muligt oplysninger om tidligere forurening
 
— udtømmende oplysninger om indsamling, eventuel opbevaring og 
akklimatisering af vand-sediment systemer  
— vand-sediment prøvernes karakteristika som angivet i tabellen i 
1.8.2.2.  
Forsøgsbetingelser:  
— det anvendte forsøgssystem (f.eks. gennemstrømning, biometer, 
ventilationsmåde, omrøringsmåde, vandvolumen, sedimentmasse, 
tykkelsen af både sediment- og vandlag, prøvekarrenes dimen ­
sion osv.)  
— tilførsel af prøvestoffet til systemet: anvendt testkoncentration, 
antal gentagelser og kontrolprøver, måden, hvorpå prøvestoffet 
tilføres (f.eks. brug af eventuelt opløsningsmiddel) osv.  
— inkubationstemperatur  
— prøvetagningstidspunkter  
— ekstraktionsmetoder og -udbytte samt analysemetoder og detek ­
tionsgrænser  
— metoder til karakterisering/identifikation af omdannelsesprodukter  
— afvigelser fra forsøgsprotokollen eller forsøgsbetingelserne under 
forsøget.  
Resultater:  
— rådata (talværdier) for repræsentative analyser (samtlige rådata 
skal opbevares i GLP-arkivet)  
— repeterbarhed og følsomhed af de anvendte analysemetoder  
— genfindingsgrad ( %-værdier for en gyldig undersøgelse er 
angivet i 1.7.1)  
— tabeller med resultater, angivet i % af den tilførte begyndelses ­
dosis og i rng.kg  -1 i vand, sediment og det samlede system (kun 
som %) for prøvestoffet og, i givet fald, for omdannelsespro ­
dukter og ikke- ekstraherbar radioaktivitet  
— massebalance før, under og efter forsøgene  
— grafisk fremstilling af omdannelsen i vand- og sedimentfrak ­
tionen og det samlede system (inklusive mineralisering)  
— mineraliseringshastigheder  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— halveringstid, DT  50 og, i givet fald, DT  75 and DT  90 for prøve ­
stoffet og for eventuelle hovedomdannelsesprodukter i vand, 
sediment og det samlede system  
— en vurdering af omdannelseskinetikken af prøvestoffet og, i givet 
fald, hovedomdannelsesprodukterne  
— formodet omdannelsesvej. når det er relevant  
— diskussion af resultater.  
4. HENVISNINGER  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. 
Germany.
 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for regi ­
stration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product 
and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United 
Kingdom.
 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic 
(Laboratory) — Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.  
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (19S2). Section 162-3, Anae ­
robic aquatic metabolism.  
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
 
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, 
Italy, 18-20 January 1995.  
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality — Sampling — Part 
12: Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080.  
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 3O4A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC — Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R, Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114, J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.
 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987), The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  l4 C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.  
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17  th edition). American Public Health 
Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
 
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop »A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests«, 3-4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxi ­
city Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. 
Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of 
environmental factors at field sites. Water Research 3 1, 
2858-2868.  
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.  
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
 
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.  
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber. J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.
 
(31) Pagga, U. and Beimborn. D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986), A batch test for asses ­
sing the mineralisation of  14 C- radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597- 3603.
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). 
EPA 712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffici ­
ents of organic contaminants, Bulletin Environ. Contam, Toxi ­
col, 58, 961-968.  
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II, Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 39, 187-203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 33, 47- 60.
 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference — Pest and Diseases, pp 1349-1354.
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
Bilag 1  
VEJLEDNING I AEROBE OG ANAEROBE TESTSYSTEMER  
Aerobt testsystem  
Det her beskrevne aerobe testsystem består af et aerobt vandlag (typisk iltkoncen ­
tration fra 7 til 10 mg.l  -1 ) og et sedimentlag, som er aerobt ved overfladen og 
anaerobt under overfladen (typisk gennemsnitligt redoxpotentiale (E  h ) i sediment ­
lagets anaerobe zone: - 80 til - 190 mV). Der ledes befugtet luft hen over vandoverfladen i hver inkubationsenhed for at opretholde tilstrækkelig iltkoncen ­
tration i head space.
 
Anaerobt testsystem  
Forsøgsmetoden med det anaerobe testsystem er i hovedsagen den samme som 
for det aerobe system, bortset fra at der ledes befugtet kvælstof over vandover ­
fladen for at opretholde et nitrogenfyldt headspace. Sediment og vand anses for 
anaerobt, når redoxpotentialet (E  h ) er under - 100 mV.  
I det anaerobe forsøg omfatter bestemmelsen af mineraliseringen måling af den 
udviklede kuldioxid og methan.  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
Bilag 2  
EKSEMPEL PÅ GENNEMSTRØMNINGSAPPARAT
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
Bilag 3  
EKSEMPEL PÅ APPARAT AF BIOMETERTYPEN
  ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
Bilag 4  
EKSEMPEL PÅ BEREGNING AF MÆNGDE TILSAT 
PRØVEBEHOLDERNE  
Flankens indvendige diameter: = 8 cm 
Dybde af vandsøjle, eksklusive sediment: = 12 cm Overfladeareal: 3,142 × 4
 2 = 50,3 cm  2 
Spredemængde: 500 g prøvestof/ha svarer til 5 
μg/cm  2 
Total μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Mængden korrigeres til en dybde på 100 cm: 
12 × 251,5 : 100 = 30,18 μg 
Vandsøjlens rumfang: 50,3 × 12 = 603 ml Koncentrationen i vand: 30,18 : 603 = 0,050 μg/ml eller 50 μg/l
 ▼B 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AEROB MINERALISERING I OVERFLADEVAND — 
SIMULERET BIONEDBRYDNINGSFORSØG  
1. METODE  
Metoden er ækvivalent med OECD TG 309 (2004) (1).  
1.1. INDLEDNING  
Formålet med forsøget er at bestemme det tidsmæssige forløb af 
bionedbrydningen af et prøvestof med lav koncentration i aerobt 
naturligt vand og at kvantificere iagttagelserne i form af kinetiske 
hastighedsudtryk. Dette simuleringsforsøg er et shake-flask batch ­
forsøg i laboratoriet og har til formål at bestemme hastigheden af aerob bionedbrydning af organiske stoffer i prøver af naturligt vand 
(ferskvand, brakvand eller søvand). Det bygger på ISO/DIS 14592- 
1 (2) og indeholder desuden elementer fra prøvemetode C.23 og C.24 (3)(4). Langvarige forsøg kan valgfrit udføres som semikon ­
tinuerte forsøg i stedet for batchforsøg for at undgå ældning af 
mikromiljøet i forsøget. Hovedformålet med simuleringsforsøget er 
at bestemme mineraliseringen af prøvestoffet i overfladevand, og mineraliseringen danner grundlaget for de udtryk, der formulerer nedbrydningskinetikken. Et sekundært, valgfrit formål med forsøget 
er imidlertid at skaffe oplysninger om den primære nedbrydning og 
dannelsen af de vigtigste omdannelsesprodukter. Identifikation af omdannelsesprodukter og, om muligt, kvantitativ bestemmelse af disse er særligt vigtig for stoffer, der mineraliseres meget langsomt 
(f.eks. med en halveringstid for total residual
 –14 C på over 60 dage). 
Pga. begrænsningerne i analyseteknikken bør der normalt anvendes højere prøvestofkoncentration (f.eks. > 100 μg/l) til identifikation og 
kvantificering af vigtige omdannelsesprodukter.
 
I dette forsøg forstås ved »lav koncentration« en koncentration, der 
er så lav (f.eks. mindre end 1 μg/l til 100 μg/l), at den i forsøget 
iagttagne bionedbrydningskinetik med sikkerhed afspejler den, der 
forventes at gælde i miljøet. I forhold til den samlede masse bioned ­
brydeligt kulstofsubstrat, der er til rådighed i det i forsøget anvendte naturlige vand, vil prøvestoffet, der er til stede i lav koncentration, kun være et sekundært substrat. Dette forudsætter, at den forventede 
bionedbrydningskinetik er af første orden (»non-growth« kinetik), og 
at prøvestoffet kan nedbrydes ved »co-metabolisme«. Ved første ordens kinetik er nedbrydningshastigheden (mg/l/dag) proportional med substratkoncentrationen, der aftager med tiden. Ved ægte 
første ordens kinetik er den specifikke nedbrydningshastighedskon ­
stant, k, uafhængig af tiden og af koncentrationen. Det vil sige, at k ikke ændrer sig nævneværdigt i samme forsøg og ikke ændrer sig med den tilsatte koncentration mellem forskellige forsøg. Ved den 
specifikke nedbrydningshastighedskonstant forstås den relative 
koncentrationsændring pr. tidsenhed: k. Ved første ordens kinetik er nedbrydningshastigheden (mg/l/dag) proportional med substrat ­
koncentrationen, der aftager med tiden. Ved ægte første ordens 
kinetik er den specifikke nedbrydningshastighedskonstant, k, 
uafhængig af tiden og af koncentrationen. Det vil sige, at k ikke ændrer sig nævneværdigt i samme forsøg og ikke ændrer sig med den tilsatte koncentration mellem forskellige forsøg. Ved den speci ­
fikke nedbrydningshastighedskonstant forstås den relative koncentra ­
tionsændring pr. tidsenhed: k = (1/C) · (dC/dt). Skønt der under de foreskrevne betingelser normalt forventes første ordens kinetik, kan der være omstændigheder, hvor andre kinetiske love giver bedre 
overensstemmelse. Afvigelser fra første ordens kinetik ses f.eks., 
hvis det er massetransportfænomener, f.eks. diffusionshastigheden, snarere end den biologiske reaktionshastighed, der er hastigheds ­
begrænsende for den biologiske omdannelse. Data kan imidlertid 
næsten altid beskrives ved pseudo første ordens kinetik, når det 
accepteres, at hastighedskonstanten er koncentrationsafhængig.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Inden forsøget bør der foreligge oplysninger om biologisk nedbryd ­
ning af prøvestoffet ved højere koncentrationer (f.eks. fra rutinemæs ­
sige screeningstest) og oplysninger om abiotisk nedbrydning, omdan ­
nelsesprodukter og relevante fysisk-kemiske egenskaber, hvilket vil lette planlægning af forsøget og fortolkning af resultaterne. Ved at 
anvende
 14 C-mærket prøvestof og bestemme fasefordelingen af  14 C 
ved forsøgets afslutning kan den endelige bionedbrydelighed bestem ­
mes. Er prøvestoffet umærket, kan den endelige bionedbrydning kun bestemmes, hvis der testes en højere koncentration, og alle vigtige 
omdannelsesprodukter kendes.
 
1.2. DEFINITIONER  
Primær bionedbrydning : Den strukturændring (omdannelse) af et 
kemisk stof, der frembringes af mikroorganismer og medfører, at stoffet mister sin kemiske identitet.
 
Funktionel bionedbrydning : Den strukturændring (omdannelse) af 
et kemisk stof, som frembringes af mikroorganismer og medfører tab 
af en bestemt egenskab.  
Endelig aerob bionedbrydning : Den af mikroorganismer i tilstede ­
værelse af oxygen frembragte nedbrydning af et kemisk stof til carbondioxid, vand og uorganiske salte af eventuelle andre grund ­
stoffer, der er til stede (mineralisering) og produktion af ny biomasse 
og organiske mikrobielle biosynteseprodukter.
 
Mineralisering : Den af mikroorganismer i tilstedeværelse af oxygen 
frembragte nedbrydning af et kemisk stof eller organisk materiale til carbondioxid, vand og uorganiske salte af eventuelle andre grund ­
stoffer, der er til stede.
 
Lag-fase : Den tid, der går fra et forsøg begynder, indtil de nedbry ­
dende mikroorganismer har tilpasset sig, og nedbrydningsgraden for et kemisk stof eller organisk materiale har nået et detekterbart 
omfang (f.eks. 10 % af den teoretiske maksimale bionedbrydning, 
evt. mindre, afhængigt af måleteknikkens nøjagtighed).
 
Maksimal bionedbrydningsgrad : Den grad af bionedbrydning af et 
kemisk stof eller organisk materiale, angivet i procent, der finder sted i et forsøg, og over hvilken der ikke sker yderligere bionedbrydning 
under forsøget.
 
Primært substrat : En række naturlige kulstof- og energikilder, der 
tjener til vækst og opretholdelse af den mikrobielle biomasse.  
Sekundært substrat : En substratkomponent, der er til stede i så lav 
koncentration, at dens nedbrydning kun tilfører ubetydelige mængder 
kulstof og energi til de kompetente mikroorganismer i forhold til den 
mængde kulstof og energi, der tilføres ved nedbrydning af hovedsub ­
stratets komponenter (de primære substrater).  
Nedbrydningshastighedskonstant : En første ordens eller pseudo 
første ordens hastighedskonstant k (d  –1 ), der angiver nedbrydnings ­
processers hastighed. For et batch-forsøg beregnes k af den første del 
af nedbrydningskurven efter slutningen af lag-fasen.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Halveringstid, t  1/2 (d): En betegnelse til karakterisering af hastig ­
heden af en første ordens reaktion. Halveringstiden er tidsrummet 
svarende til en formindskelse af koncentrationen med en faktor 2. Sammenhængen mellem halveringstiden og hastighedskonstanten er givet ved udtrykket t
 1/2 = ln2/k.  
Nedbrydningshalveringstid, DT  50 (d): En betegnelse, der anvendes 
til kvantitativ angivelse af resultatet af bionedbrydningsforsøg. Det er det tidsrum, inklusive lag-fasen, der er nødvendigt for at nå 50 % 
bionedbrydning.
 
Detektionsgrænse (limit of detection (LOD)) og kvantificerings ­
grænse (limit of quantification (LOQ)) : Detektionsgrænsen er den 
koncentration af et stof, under hvilken stoffets identitet ikke kan skelnes fra analysebetingede artefakter. Kvantificeringsgrænsen er den koncentration af et stof, under hvilken koncentrationen ikke 
kan bestemmes med acceptabel nøjagtighed.
 
Opløst organisk kulstof (dissolved organic carbon (DOC)) : Den 
del af det organiske kulstofindhold i en prøve af vand, som ikke kan 
fjernes ved den foreskrevne faseadskillelse som f.eks. ved centrifu ­
gering ved 40 000 ms  –2 i 15 min. eller ved membranfiltrering med 
porestørrelse 0,2 μm-0,45 μm i diameter.  
Total organisk  14 C-aktivitet (total organic  14 C activity (TOA)) : 
Den totale  14 C-aktivitet, der er knyttet til organisk kulstof.  
Opløst organisk  14 C-aktivitet (dissolved organic  14 C activity 
(DOA)) : Den totale  14 C-aktivitet, der er knyttet til opløst organisk 
kulstof.  
Partikelbåren organisk  14 C-aktivitet (particulate organic  14 C 
activity (POA)) : Den totale  14 C-aktivitet, der er knyttet til partikel ­
formigt organisk kulstof.  
1.3. PRØVEMETODENS ANVENDELIGHED  
Denne simuleringsmetode er anvendelig til ikke-flygtige eller svagt 
flygtige organiske stoffer, der testes ved lave koncentrationer. Når 
der bruges kolber med åben forbindelse til atmosfæren (f.eks. med 
vatprop), kan stoffer med Henrys lov konstant mindre end omkring 1 Pa·m
 3 /mol (ca. 10  –5 atm·m  3 /mol) i praksis regnes for ikke-flygtige. 
Ved at anvende lukkede kolber med headspace kan man teste svagt 
flygtige stoffer (med Henrys lov konstant < 100 Pa·m  3 /mol 
eller < 10  –3 atm·m  3 /mol) uden tab fra prøvesystemet. Tab af  
14 C-mærkede stoffer kan forekomme, hvis der ikke er truffet 
passende forholdsregler, når CO  2 fjernes. I sådanne tilfælde kan 
det være nødvendigt at opfange CO  2 i en intern absorber med 
alkali eller i et eksternt CO  2 -absorbersystem (direkte  14 CO 2 -bestem­
melse, jf. tillæg 3). Til fastlæggelse af bionedbrydningens kinetik skal prøvestofkoncentrationen være lavere end stoffets opløselighed 
i vand. Det skal dog bemærkes, at man i litteraturen kan finde 
væsentligt højere værdier for vandopløseligheden end prøvestoffets opløselighed i naturlige vande. Om ønsket kan opløseligheden af prøvestoffer med ringe vandopløselighed bestemmes ved brug af 
de naturlige vande, som forsøget omfatter.
 
Metoden kan dels anvendes til simulering af bionedbrydning i over ­
fladevand fri for grove partikler (»pelagisk forsøg«), dels i uklart 
vand som f.eks. nær grænsefladen mellem vand og sediment 
(»forsøg med opslæmmet sediment«).  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. FORSØGETS PRINCIP  
Forsøget udføres som batchforsøg med inkubering af prøvestoffet 
enten med overfladevand alene (»pelagisk forsøg«) eller overflade ­
vand modificeret med en opslæmmet mængde faststof/sediment på 
0,01 til 1 g tør vægt pr. liter (»forsøg med opslæmmet sediment«) til 
simulering af en vandmasse med opslæmmede faststoffer eller genopslæmmet sediment. I de fleste overfladevande vil koncentra ­
tionen af opslæmmet faststof/sediment typisk ligge i den nedre ende 
af dette interval. Prøvekolberne inkuberes i mørke ved rumtempe ­
ratur under aerobe forhold og med omrystning. Prøvestoffet skal anvendes i mindst to forskellige koncentrationer til fastlæggelse af 
nedbrydningskinetikken. De anvendte koncentrationer skal indbyrdes 
afvige med en faktor 5 til 10 og skal være repræsentative for det forventede koncentrationsområde i miljøet. Den maksimale prøve ­
stofkoncentration må ikke være over 100 μg/l, dog må en maksimal 
prøvekoncentration på 10 μg/l eller derunder foretrækkes for at sikre, 
at bionedbrydningen følger første ordens kinetik. Den laveste koncentration må ikke være over 10 μg/l, men en laveste prøvekon ­
centration på 1-2 μg/l eller under 1 μg/l må foretrækkes. En så lav 
koncentration kan normalt analyseres tilfredsstillende ved hjælp af 
gængse
 14 C-mærkede stoffer. Analyseteknikkens begrænsninger gør 
det ofte umuligt at måle prøvestoffets koncentration med den krævede nøjagtighed, hvis prøvestoffet tilsættes i en koncentration 
≤ 100 μg/l (jf. andet afsnit i punkt 1.7.2). Til identifikation og 
kvantitativ bestemmelse af de vigtigste omdannelsesprodukter kan anvendes højere prøvestofkoncentration (> 100 μg/l, undertiden 
> 1 mg/l), hvis man ikke råder over en specifik analysemetode 
med lav detektionsgrænse. Anvendes en høj prøvestofkoncentration, 
kan resultaterne muligvis ikke anvendes til at beregne første ordens nedbrydningskonstant og halveringstid, da nedbrydningen antagelig ikke vil følge første ordens kinetik.
 
Nedbrydningen følges med passende tidsintervaller ved måling enten 
af residual  –14 C eller, hvis en specifik kemisk analyse anvendes, resi ­
dualkoncentration af prøvestoffet.  14 C-mærkning af den mest stabile 
del af molekylet giver mulighed for bestemmelse af den totale mine ­
ralisering, mens  14 C-mærkning af en mindre stabil del af molekylet i 
lighed med en specifik analysemetode kun gør det muligt at 
bestemme den primære bionedbrydning. Den mest stabile del omfatter dog ikke nødvendigvis molekylets relevante funktionelle enhed (dvs. den enhed, der kan være knyttet til en specifik egenskab 
som toksicitet, bioakkumulering osv.). I så fald kan det være 
hensigtsmæssigt at
 14 C-mærke prøvestoffet i den funktionelle 
gruppe for at følge eliminationen af den specifikke egenskab.  
1.5. OPLYSNINGER OM PRØVESTOFFET  
Både radioaktivt mærket og umærket prøvestof kan anvendes i 
forsøget.  14 C-mærkning anbefales, og mærkning bør normalt finde 
sted i molekylets mest stabile del(e) (jf. også punkt 1.4). I stoffer 
indeholdende mere end én aromatisk ring skal helst et eller flere kulstofatomer i hver ring være
 14 C-mærket. I bindinger, der let 
brydes, skal desuden et eller flere kulstofatomer på begge sider af 
bindingen helst være  14 C-mærket. Prøvestoffets kemiske og/eller 
radiokemiske renhed skal være > 95 %. For radioaktivt mærkede stoffer skal den specifikke aktivitet helst være ca. 50 μCi/mg 
(1,85 MBq) eller derover for at lette
 14 C-målingerne i forsøg med 
lav initialkoncentration. Følgende oplysninger om prøvestoffet skal 
foreligge:  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— vandopløselighed [metode A.6]  
— opløselighed i organiske(e) opløsningsmiddel (-midler) (stoffer, 
der tilføres med opløsningsmiddel eller er tungtopløselige i vand)  
— for stoffer, som kan protoniseres eller deprotoniseres, dissocia ­
tionskonstant (pKa) [OECD TG 112] (5)  
— damptryk [metode A.4] og Henrys konstant  
— kemisk stabilitet i vand og i mørke (hydrolyse) [metode C.7].  
Når tungtopløselige stoffer testes i søvand, kan det desuden være 
nyttigt at kende udsaltningskonstanten (eller »Setschenows 
konstant«) K  s , der er defineret ved udtrykket: log (S/S') = K  s C m , 
where S and S' er stoffets opløselighed i henholdsvis ferskvand og søvand, og C
 m er den molære saltkoncentration.  
Udføres forsøget som »forsøg med opslæmmet sediment«, skal der 
foreligge følgende oplysninger:  
— fordelingskoefficient n-octanol/vand [metode A.8]  
— adsorptionskoefficient [metode C.18].  
Desuden kan følgende oplysninger være nyttige:  
— stoffets koncentration i miljøet, hvis den kendes eller er beregnet  
— prøvestoffets toksicitet over for mikroorganismer [metode C.11]  
— umiddelbar og/eller naturlig bionedbrydelighed [metode C.4 A-F, 
C.12, C.9, OECD TG 302 (5)]  
— aerob eller anaerob bionedbrydelighed i omdannelsesforsøg i jord 
og sediment/vand [metode C.23 og C.24].  
1.6. REFERENCESTOF  
Som referencestof anvendes et stof, der normalt er let nedbrydeligt 
under aerobe forhold (f.eks. anilin eller natriumbenzoat). Anilin og natriumbenzoat nedbrydes sædvanligvis på mindre end to uger. Formålet med referencestofferne er at sikre, at prøvevandets mikro ­
bielle aktivitet er inden for visse grænser, dvs. at vandet indeholder 
en aktiv mikrobiel population.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. KVALITETSKRITERIER  
1.7.1.  Genfinding  
Umiddelbart efter tilsætning af prøvestoffet skal hver begyndelses ­
koncentration verificeres ved måling af  14 C-aktiviteten eller, for 
umærkede stoffer, ved kemisk analyse, idet der mindst anvendes 
dobbelte prøver. Dette vil give oplysninger om analysemetodens anvendelighed og repeterbarhed og om, hvor homogent prøvestoffet er fordelt. Ved den efterfølgende dataanalyse anvendes normalt den 
målte initiale
 14 C-aktivitet eller prøvestofkoncentration i stedet for 
den nominelle koncentration, så der tages højde for sorptionstab og doseringsfejl. For
 14 C-mærket prøvestof fås genfindingsgraden ved 
forsøgets slutning af en massebalance (jf. sidste afsnit i 
punkt 1.8.9.4). Ideelt skal massebalancen for radioaktivt mærket stof ligge mellem 90 % og 110 %, mens der for umærkede prøve ­
stoffer bør opnås en analysenøjagtighed svarende til en genfinding af 
initialmængden på mellem 70 % og 110 %. De nævnte områder må 
opfattes som mål, ikke som acceptkriterier for forsøget. Hvis det ønskes, kan analysenøjagtigheden for prøvestoffet bestemmes ved en lavere koncentration end initialkoncentrationen samt for de 
vigtigste omdannelsesprodukter.
 
1.7.2.  Analysemetodens repeterbarhed og følsomhed  
Repeterbarheden af analysemetoden (herunder udvindingsgraden for 
den indledende ekstraktion) ved kvantitativ bestemmelse af prøvestof og, hvis relevant, omdannelsesprodukter kontrolleres ved fem repli ­
kate analyser på hver enkelt ekstrakt af overfladevand.
 
Analysemetodens detektionsgrænse for prøvestoffet og for omdan ­
nelsesprodukterne skal så vidt muligt udgøre mindst 1 % af den 
initiale mængde, der tilføres prøvesystemet. Kvantificeringsgrænsen skal være højst 10 % af den tilsatte koncentration. Til kemisk analyse af mange organiske stoffer og omdannelsesprodukter heraf 
må prøvestoffet ofte tilsættes i forholdsvis høj koncentration, dvs. 
> 100 μg/l.
 
1.8. BESKRIVELSE AF PRØVEMETODEN  
1.8.1.  Udstyr  
Forsøget kan udføres i koniske eller cylindriske kolber af passende 
kapacitet (f.eks. 0,5 eller 1,0 liter), lukket med silicone- eller gummi ­
prop, eller i serumflasker med CO  2 -tæt låg (f.eks. med butylgummi- 
septum). En anden mulighed er at udføre forsøget med flere kolber og høste hele kolbens indhold, mindst som dobbeltprøver, ved hvert 
prøvetagningstidspunkt (jf. sidste afsnit i punkt 1.8.9.1). For ikke- 
flygtige prøvestoffer, der ikke er radioaktivt mærkede, kræves ikke gastætte propper eller låg. Velegnede er løse vatpropper, der forhin ­
drer kontaminering fra luften (jf. andet afsnit i punkt 1.8.9.1). Svagt 
flygtige kemiske stoffer bør testes i et system af biometertypen med 
let omrøring af vandoverfladen. For at sikre mod bakteriel kontami ­
nering kan beholderne valgfrit steriliseres ved opvarmning eller auto ­
klavering inden brug. Desuden anvendes følgende standardlaborato ­
rieudstyr:
 
— rystebord eller magnetomrørere til konstant omrøring af prøve ­
kolberne  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— centrifuge  
— pH-meter  
— turbidimeter til nephelometrisk turbiditetsmåling  
— ovn eller mikroovn til bestemmelse af tør vægt  
— apparatur til membranfiltrering  
— autoklave eller ovn til varmesterilisering af glasapparatur  
— udstyr til håndtering af  14 C-mærkede stoffer  
— udstyr til kvantitativ bestemmelse af  14 C-aktivitet i prøver fra 
CO 2 -opsamlingsvæsker og, om nødvendigt, fra sedimentprøver  
— analyseudstyr til bestemmelse af prøvestof (og referencestof), 
hvis der anvendes specifik kemisk analyse (f.eks. gaskromatograf 
eller højtryksvæskekromatograf).  
1.8.2.  Stamopløsninger af prøvestoffet  
Til fremstilling af stamopløsningerne af prøve- og referencestof skal 
anvendes deioniseret vand (jf. første afsnit i punkt 1.8.7). Det deioni ­
serede vand skal være frit for stoffer, der kan være toksiske for 
mikroorganismer, og indholdet af opløst organisk kulstof (dissolved 
organic carbon (DOC)) må ikke være over 1 mg/l (6).  
1.8.3.  Indsamling og transport af overfladevand  
Prøvetagningsstedet, hvor overfladevandet indsamles, skal vælges i 
henhold til formålet med forsøget i den givne situation. Ved valg af 
prøvetagningssted må der tages hensyn til oplysninger om eventuel tidligere udledning fra landbrug, industri eller husholdninger. Hvis det akvatiske miljø vides at have været forurenet med prøvestoffet 
eller andre stoffer med analog struktur inden for de foregående fire 
år, bør det ikke anvendes til indsamling af vandprøver, medmindre undersøgeren udtrykkelig har ønsket at undersøge nedbrydnings ­
hastigheden på tidligere eksponerede steder. Vandets pH og tempe ­
ratur skal måles på indsamlingsstedet. Desuden skal indsamlings ­
dybden og vandets udseende (f.eks. farve og turbiditet) noteres (jf. punkt 3). Oxygenkoncentrationen og/eller redoxpotentialet i vand og i sedimentets overfladelag skal måles for at påvise, at der er 
aerobe betingelser, medmindre dette er åbenbart, bedømt ud fra 
prøvens udseende og tidligere erfaringer med det pågældende sted. Overfladevandet skal transporteres i en omhyggeligt rengjort behol ­
der. Under transporten må prøvens temperatur ikke være nævnevær ­
digt højere end forsøgstemperaturen. Ved længere transporttid end 2- 
3 timer anbefales afkøling til 4 °C. Vandprøven må ikke fryses.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Opbevaring og klargøring af overfladevand  
Forsøget bør fortrinsvis igangsættes inden for ét døgn efter prøveind ­
samlingen. Er opbevaring af vandet nødvendig, bør dette begrænses til kortest mulig tid og må i intet tilfælde overstige fire uger. Vand ­
prøven skal opbevares ved 4 °C med beluftning, indtil den skal 
bruges. Før brug skal grove partikler fjernes, f.eks. ved filtrering med nylonfilter med maskevidde ca. 100 μm, med et groft papirfilter 
eller ved bundfældning.
 
1.8.5.  Klargøring af vand modificeret med sediment (valgfrit)  
Anvendes opslæmmet sediment, tilsættes sedimentet til kolberne 
indeholdende naturligt vand (som er filtreret for at fjerne grove 
partikler som beskrevet i punkt 1.8.4), så der dannes en opslæmning 
med en faststofkoncentration mellem 0,01 og 1 g/l. Overfladesedi ­
mentet skal være fra samme indsamlingssted som vandprøven. Afhængigt af det pågældende akvatiske miljø kan overfladesedi ­
mentet enten karakteriseres som sediment med højt organisk kulstof ­
indhold (2,5-7,5 %) og fin tekstur eller med lavt organisk kulstof ­
indhold (0,5-2,5 %) og grov tekstur (3). Overfladesedimentet kan klargøres således: Ved hjælp af et transparent plastrør udtages adskil ­
lige sedimentkerner, de øverste aerobe lag skæres af (fra overfladen 
til en dybde af maks. 5 mm) straks efter prøvetagningen, hvorefter de hældes sammen. Den resulterende sedimentprøve transporteres i en beholder med stort luft-headspace for at opretholde aerobe betin ­
gelser (prøven afkøles til 4 °C, hvis transporttiden er over 2-3 timer). 
Sedimentprøven opslæmmes i prøvevandet i forholdet 1:10 og opbe ­
vares ved 4 °C med beluftning, indtil den skal bruges. Opbevarings ­
tiden for sedimentet bør begrænses mest muligt og må i intet tilfælde 
overstige fire uger.
 
1.8.6.  Semikontinuert metode (valgfri)  
Det kan være nødvendigt med langvarig inkubering (flere måneder), 
hvis der optræder en lang lag-fase, før nævneværdig nedbrydning af 
prøvestoffet kan måles. Vides dette i forvejen fra tidligere forsøg 
med stoffet, kan forsøget indledes med den semikontinuerte metode, hvor en del af prøvevandet eller -opslæmningen udskiftes med mellemrum (jf. tillæg 2). I stedet kan det normale batchforsøg 
ændres til et semikontinuert forsøg, hvis der ikke er sket nogen 
nedbrydning af prøvestoffet efter ca. 60 dages testning med batch ­
metoden (jf. andet afsnit i punkt 1.8.8.3).
 
1.8.7.  Tilsætning af prøvestoffet (eller referencestoffet)  
For stoffer med stor vandopløselighed (> 1 mg/l) og lav flygtighed 
(Henrys konstant < 1 Pa·m  3 /mol eller < 10  –5 atm·m  3 /mol) kan der 
fremstilles en stamopløsning i deioniseret vand (jf. punkt 1.8.2); en passende mængde stamopløsning tilsættes prøvebeholderne, så den 
ønskede koncentration opnås. Volumenet af den tilsatte stamopløs ­
ning bør holdes så lavt, som det er praktisk muligt (< 10 % af volumenet af den endelige opløsning, om muligt). En anden mulighed er at bruge et større volumen prøvevand til at opløse 
prøvestoffet, hvilket kan betragtes som et alternativ til brug af orga ­
niske opløsningsmidler.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Hvis det ikke kan undgås, må stamopløsninger af ikke-flygtige 
stoffer med ringe vandopløselighed fremstilles ved hjælp af et flyg ­
tigt organisk opløsningsmiddel, men opløsningsmidlet må ikke tilsættes systemet i en mængde på over 1 % v/v og må ikke have negativ indvirkning på den mikrobielle aktivitet. Opløsningsmidlet 
må ikke påvirke prøvestoffets stabilitet i vand. Opløsningsmidlet 
skal fjernes, så der kun er en yderst ringe mængde tilbage, som ikke nævneværdigt øger DOC-indholdet i prøvevandet eller -suspen ­
sionen. Dette skal efterprøves ved stofspecifik analyse eller om 
muligt ved analyse for DOC (6). Det skal tilstræbes at begrænse 
den overførte mængde opløsningsmiddel til det absolut nødvendige og sikre, at den tilsatte mængde prøvestof er opløselig i det endelige volumen prøvevand. Tilsætning af prøvestoffet til prøvebeholderne 
kan ske ved hjælp af andre teknikker som beskrevet i (7) og (8). Når 
der bruges et organisk opløsningsmiddel til tilsætning af prøvestoffet, skal der køres opløsningsmiddelkontrolprøver, som indeholder prøvevandet (uden tilsætning) samt prøvevand tilsat referencestof, 
og som behandles på samme måde som aktive prøvebeholdere modi ­
ficeret med prøvestof i stabiliserende opløsningsmiddel. Formålet med opløsningsmiddelkontrolprøverne er at undersøge eventuel negativ indvirkning af opløsningsmidlet på den mikrobielle popula ­
tion, således som dette kan konstateres ved nedbrydningen af refe ­
rencestoffet.
 
1.8.8.  Forsøgsbetingelser  
1.8.8.1.  Forsøgstemperatur  
Inkubering skal enten ske i mørke (hvilket bør foretrækkes) eller i 
diffust lys ved kontrolleret temperatur (± 2 °C), som kan være felt ­
temperaturen eller en standardtemperatur på 20-25 °C. Felttempera ­
turen kan enten være prøvens faktiske temperatur på prøvetagnings ­
tidspunktet eller en gennemsnitlig felttemperatur på prøvetagnings ­
stedet.  
1.8.8.2.  Omrøring  
Der skal sørges for konstant omrystning eller omrøring, så partikler 
og mikroorganismer holdes opslæmmet. Omrøringen fremmer desuden overførslen af oxygen fra prøvebeholderens headspace til 
væsken, så aerobe betingelser kan opretholdes. Kolberne anbringes 
i rystebord (ca. 100 omdrejninger/min.) eller forsynes med magne ­
tomrører. Omrystning eller omrøring skal være kontinuerlig. Omryst ­
ning eller omrøring skal dog være så svag som muligt og samtidig 
opretholde en homogen opslæmning.
 
1.8.8.3.  Forsøgets varighed  
Forsøget bør normalt ikke strække sig over mere end 60 døgn, 
medmindre den semikontinuerte metode med periodisk udskiftning af prøvesuspensionen anvendes (jf. punkt 1.8.6 og tillæg 2). Er 
nedbrydningen af prøvestoffet begyndt i løbet af de første 60 dage, 
kan batchforsøget dog forlænges til maksimalt 90 dage. Nedbryd ­
ningen overvåges med passende tidsintervaller ved bestemmelse af
 
14 C-residualaktivitet eller den udviklede  14 CO 2 (jf. punkt 1.8.9.4) 
og/eller ved kemisk analyse (punkt 1.8.9.5). Inkubationstiden skal 
være tilstrækkeligt lang til, at nedbrydningsprocessen kan bedøm ­
mes. Nedbrydningsgraden skal helst være over 50 %. For langsomt nedbrydelige stoffer skal nedbrydningsgraden være tilstrækkelig 
(normalt mere end 20 % nedbrydning) til, at nedbrydningshastig ­
hedskonstanten kan bestemmes.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Testsystemets pH og oxygenkoncentration skal måles periodisk, 
medmindre erfaringer fra tilsvarende tidligere forsøg med vand- og 
sedimentprøver indsamlet på samme sted gør sådanne målinger unødvendige. Under visse betingelser kan metaboliseringen af det primære substrat ved langt større koncentration i vand eller sediment 
muligvis medføre CO
 2 -udvikling og oxygenforbrug i et omfang, der 
ændrer forsøgsbetingelserne væsentligt.  
1.8.9.  Fremgangsmåde  
1.8.9.1.  Klargøring af kolber til pelagisk forsøg  
Overfør en passende mængde af prøvevandet til prøvekolberne, 
højst en tredjedel af kolbens volumen og mindst ca. 100 ml. 
Også hvis der anvendes flere kolber (for at kunne høste en hel 
kolbe ved hvert prøvetagningstidspunkt), vil den mest hensigts ­
mæssige mængde prøvevand være ca. 100 ml, da små prøvevolu ­
mener kan påvirke lag-fasens varighed. Prøvestoffet tilsættes fra en 
stamopløsning som beskrevet i punkt 1.8.2 og 1.8.7. Der skal 
anvendes mindst to forskellige prøvestofkoncentrationer, der afviger indbyrdes med en faktor 5 til 10, for at nedbrydnings ­
kinetikken kan fastlægges og nedbrydningshastighedskonstanten 
beregnes. Begge de valgte koncentrationer skal være under 
100 μg/l og helst i området < 1-10 μg/l.
 
Kolberne lukkes med propper eller låg, der er uigennemtrængelige 
for luft og CO  2 . Til ikke  –14 C-mærkede, ikke-flygtige prøvestoffer 
kan anvendes løse vatpropper, der beskytter mod kontaminering fra 
luften (jf. punkt 1.8.1), forudsat at alle vigtige nedbrydningspro ­
dukter vides at være ikke-flygtige, og at der anvendes indirekte CO
 2 -bestemmelse (se tillæg 3).  
Kolberne inkuberes ved den valgte temperatur (se punkt 1.8.8.1). 
Prøver til kemisk analyse eller  14 C-måling udtages ved forsøgets 
begyndelse (dvs. før bionedbrydningen begynder, se punkt 1.7.1) og derefter med passende tidsintervaller i løbet af forsøget. Prøverne kan udtages som delprøver (f.eks. 5 ml aliquoter) fra hver replikat, 
eller ved at høste en hel kolbe på hvert prøvetagningstidspunkt. 
Mineraliseringen af prøvestoffet kan bestemmes enten indirekte eller direkte (se tillæg 3). Til pålidelig bestemmelse af hastigheds ­
konstanten kræves sædvanligvis mindst fem prøvetagningspunkter i 
nedbrydningsfasen (dvs. efter at lag-fasen er slut), medmindre det for 
hurtigt nedbrydelige stoffer kan godtgøres, at tre prøvetagnings ­
punkter er tilstrækkeligt. For ikke hurtigt nedbrydelige stoffer kan der let foretages flere målinger i nedbrydningsfasen, og der skal i så 
fald anvendes flere datapunkter til bestemmelse af k. En fast tidsplan 
for prøvetagningen kan ikke angives, da bionedbrydningshastigheden varierer. Ved langsom nedbrydning anbefales dog ugentlig prøveud ­
tagning. Er prøvestoffet hurtigt nedbrydeligt, udtages prøver dagligt 
de første tre dage, derefter hver anden eller hver tredje dag. Under 
visse omstændigheder, således ved stoffer, der hydrolyseres meget hurtigt, kan det være nødvendigt at tage prøver en gang i timen. Inden forsøget gennemføres, anbefales det at udføre et indledende 
forsøg til bestemmelse af passende prøvetagningsintervaller. Hvis der 
skal være prøver til rådighed til nærmere specifik analyse, tilrådes det at tage ekstra prøver og derefter vælge dem, der skal analyseres, ved forsøgets slutning i henhold til en bagudrettet strategi, dvs. de 
sidste prøver analyseres først (se vejledningen i andet afsnit i 
punkt 1.8.9.5 vedrørende prøvernes stabilitet ved opbevaring).
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Antal kolber og prøver  
Kør et tilstrækkeligt antal prøvekolber til, at der er:  
— prøvekolber: mindst to kolber for hver prøvestofkoncentration 
(helst mindst tre), dog flere kolber for hver koncentration hvis 
der høstes hele prøvekolber (betegnet F  T ) ved hvert prøvetag ­
ningstidspunkt  
— prøvekolber til beregning af massebalance: mindst to kolber 
(betegnet F  M ) for hver prøvekoncentration  
— blindkontrol, intet prøvestof: mindst én blindprøvekolbe 
(betegnet F  B ), kun indeholdende prøvevand  
— referencekontrol: to kolber (betegnet F  C ) med referencestof 
(f.eks. anilin eller natriumbenzoat i en koncentration af 10 μg/l). 
Formålet med referencekontrollen er at bekræfte et minimum af mikrobiel aktivitet. Hvis det er hensigtsmæssigt, kan der anvendes et radioaktivt mærket referencestof, også når nedbryd ­
ningen af prøvestoffet overvåges ved kemiske analyser
 
— steril kontrol: en eller to kolber (betegnet F  S ) indeholdende steri ­
liseret prøvevand, til undersøgelse af eventuel abiotisk nedbryd ­
ning eller anden ikke-biologisk bortfjernelse af prøvestoffet. Den 
biologiske aktivitet kan enten standses ved autoklavering (121 °C; 20 min.) af prøvevandet, ved tilsætning af et giftstof (f.eks. natriumazid (NaN
 3 ) i en koncentration af 10-20 g/l, kvik ­
sølvchlorid (HgCl  2 ) i en koncentration af 100 mg/l eller formalin 
i en koncentration af 100 mg/l) eller ved gammabestråling. Anvendes HgCl
 2 , skal dette bortskaffes som giftigt affald. For 
vand med sediment tilsat i store mængder er det ikke let at opnå 
sterile forhold; i så fald anbefales gentagne autoklaveringer 
(f.eks. tre gange). Der må tages højde for, at autoklaveringen kan ændre sedimentets sorptionsegenskaber
 
— opløsningsmiddelkontroller indeholdende prøvevand og prøve ­
vand med referencestof: dobbelt sæt kolber behandlet med 
samme mængde opløsningsmiddel og efter samme fremgangs ­
måde som ved tilsætning af prøvestoffet. Formålet hermed er at afsløre eventuelle skadelige virkninger af opløsningsmidlet 
ved bestemmelse af nedbrydningen af referencestoffet.
 
Ved forsøgets tilrettelæggelse må forsøgslederen veje betydningen af 
et øget antal forsøg op mod et øget antal prøvetagningstidspunkter. Det nøjagtige antal kolber, der er nødvendigt, afhænger af den 
anvendte metode til bestemmelse af nedbrydningen (se tredje 
afsnit i punkt 1.8.9.1, punkt 1.8.9.4 og tillæg 3).
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
Der skal udtages to delprøver (f.eks. på 5 ml aliquoter) fra hver 
prøvekolbe på hvert prøvetagningstidspunkt. Anvendes mange 
kolber for at kunne høste hele kolber, skal der høstes mindst to kolber ved hvert prøvetagningstidspunkt (se første afsnit i punkt 1.8.9.1).
 
1.8.9.3.  Klargøring af kolber til forsøg med opslæmmet sediment (valgfrit)  
Der tilsættes det nødvendige volumen prøvevand og, i givet fald, 
sediment, til prøvekarrene (se punkt 1.8.5). Klargøring af kolber til forsøg med opslæmmet sediment foretages som ved det pelagiske 
forsøg (se punkt 1.8.9.1 og 1.8.9.2). Der bør fortrinsvis anvendes 
serumflasker eller kolber af tilsvarende form. De lukkede kolber anbringes vandret på rystebord. Åbne kolber til ikke
 –14 C-mærkede, 
ikke-flygtige stoffer skal selvfølgelig anbringes stående; i så fald 
anbefales brug af magnetomrører og magneter overtrukket med 
glas. Om nødvendigt beluftes kolberne for at opretholde aerobe betingelser.
 
1.8.9.4.  Radiokemiske bestemmelser  
Den udviklede  14 CO 2 bestemmes indirekte og direkte (se tillæg 3).  
14 CO 2 bestemmes indirekte ved forskellen mellem den initiale  14 C- 
aktivitet i prøvevand eller -opslæmning og den totale residualaktivitet på prøvetagningstidspunktet, målt efter forudgående forsuring af 
prøven til pH 2-3 og fjernelse af CO
 2 . Derved er uorganisk kulstof 
fjernet, og den målte resterende aktivitet kommer fra organisk mate ­
riale. Indirekte  14 CO 2 -betemmelse bør ikke benyttes, hvis der dannes 
vigtige flygtige omdannelsesprodukter ved omdannelse af prøve ­
stoffet (se tillæg 3). Om muligt bør  14 CO 2 -udviklingen måles 
direkte (se tillæg 3) i mindst én prøvekolbe ved hvert prøvetagnings ­
tidspunkt. Derved kan både massebalance og bionedbrydning kontrolleres, men dette kan kun lade sig gøre ved forsøg i lukkede 
kolber.
 
Måles den udviklede  14 CO 2 direkte under forsøget, skal der ved 
forsøgets start opsættes ekstra kolber hertil. Direkte  14 CO 2 -bestem­
melse anbefales, hvis der dannes vigtige omdannelsesprodukter ved 
prøvestoffets omdannelse. Ved hvert målepunkt skal de ekstra flasker forsures til pH 2-3, og
 14 CO 2 opsamles i en intern eller ekstern 
absorber (se tillæg 3).  
I stedet kan koncentrationen af  14 C-mærket prøvestof og vigtige 
omdannelsesprodukter bestemmes ved radiokromatografi (f.eks. 
tyndtlagskromatografi, RAD-TLC) eller ved HPLC med radiokemisk 
detektion.  
Det kan frit vælges, om man vil bestemme fasefordelingen af den 
resterende radioaktivitet (se tillæg 1) og resterende prøvestof og 
omdannelsesprodukter.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Ved forsøgets slutning bestemmes massebalancen ved direkte  14 CO 2 - 
måling med separate prøvekolber, fra hvilke der ikke er udtaget 
nogen prøver under forsøget (se tillæg 3).  
1.8.9.5.  Specifik kemisk analyse  
Er en følsom specifik analysemetode til rådighed, kan den primære 
bionedbrydning bestemmes ved måling af den totale residualkoncen ­
tration af prøvestoffet i stedet for ved brug af radioaktiv mærkning. Anvendes et radioaktivt mærket prøvestof (til måling af total mine ­
ralisering), kan der ved sideløbende specifikke kemiske analyser fås 
værdifulde supplerende oplysninger og efterprøvning af metoden. 
Specifik kemisk analyse kan desuden anvendes til bestemmelse af omdannelsesprodukter, der dannes ved nedbrydning af prøvestoffet; dette anbefales for stoffer, der mineraliseres med en halveringstid på 
over 60 dage. For hvert prøvetagningstidspunkt måles og rapporteres 
koncentrationen af prøvestof og omdannelsesprodukter (som koncen ­
tration og som procent af tilført mængde). Generelt kræves et 
omdannelsesprodukt identificeret, hvis det på noget prøvetagnings ­
tidspunkt forefindes i en koncentration ≥ 10 % af den tilførte 
koncentration, medmindre andet med rimelighed kan begrundes. Ligeledes må det overvejes at identificere omdannelsesprodukter, 
hvis koncentration stiger konstant under forsøget, også selv om 
koncentrationen ikke overstiger den nævnte grænse, da dette kan være et tegn på, at de persisterer. Hvis prøvestoffet kan tænkes at være genstand for hurtig abiotisk omdannelses (f.eks. hydrolyse), må 
det overvejes at analysere for omdannelsesprodukterne i sterile 
kontroller. Nødvendigheden af kvantificering og identifikation af omdannelsesprodukter må vurderes konkret i det enkelte tilfælde, og begrundelser gives i rapporten. Ekstraktion med organisk opløs ­
ningsmiddel skal anvendes i henhold til anvisningerne i den pågæl ­
dende analysemetode.
 
Alle prøver skal opbevares ved 2 til 4 °C i lufttæt emballage, hvis 
analysen foretages inden for 24 timer (hvilket må foretrækkes). Ved længere opbevaring skal prøverne fryses ved en temperatur under –18 °C eller konserveres kemisk. Forsuring kan ikke anbefales 
som konserveringsmetode, da forsurede prøver kan være ustabile. 
Hvis prøverne ikke analyseres inden for 24 timer, men skal opbe ­
vares længere, skal der udføres et forsøg, der godtgør stabiliteten af de betragtede stoffer ved opbevaring under –18 °C eller i konserveret 
tilstand. Omfatter analysemetoden enten ekstraktion med opløsnings ­
middel eller fastfase-ekstraktion (SPE), skal ekstraktionen finde sted straks efter prøvetagning eller efter højst 24 timers opbevaring af prøven i nedkølet tilstand.
 
Afhængigt af analysemetodens følsomhed kan større prøvevolumener 
end angivet i punkt 1.8.1 være nødvendige. Forsøget kan let udføres 
med et prøvevolumen på én liter i kolber med et volumen på 2- 
3 liter, hvorved der kan udtages prøver på ca. 100 ml.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. BEHANDLING AF RESULTATER  
2.1.1.  Grafisk fremstilling af data  
Alle prøvetagningstidspunkter afrundes til hele timer (medmindre 
stoffet nedbrydes væsentligt inden for minutter til timer), men ikke 
til hele døgn. Der optegnes en kurve over prøvestoffets beregnede residualaktivitet (for
 14 C-mærkede prøvestoffer) eller residualkoncen ­
tration (for umærkede stoffer) som funktion af tiden i både lineær og 
semilogaritmisk afbildning (se figur 1a og 1b). Har nedbrydning 
fundet sted, sammenholdes resultaterne for kolber F  T med resulta ­
terne for kolber F  S . Hvis der er mindre end 10 % forskel mellem 
gennemsnitsresultaterne for kolberne med prøvestof (F  T ) og de sterile 
kolber (F  S ), kan den iagttagne nedbrydning antages at være over ­
vejende abiotisk. Hvis nedbrydningen i kolberne F  S er mindre, kan 
disse tal benyttes til at korrigere tallene for kolberne F  T (ved fratræk ­
ning) for at beregne omfanget af bionedbrydningen. Når der fore ­
tages valgfrie analyser for vigtige nedbrydningsprodukter, skal der forelægges grafiske kurver over deres dannelse og aftagen foruden en kurve over faldet i prøvestofindholdet.
 
Lag-fasens varighed t  L beregnes af nedbrydningskurven (semiloga ­
ritmisk afbildning) ved at ekstrapolere kurvens lineære del til et punkt svarende til en nedbrydning lig nul eller i stedet ved at bestemme tiden svarende til en nedbrydning på ca. 10 % (se 
figur 1a og 1b). Af den semilogaritmiske afbildning bestemmes 
første ordens hastighedskonstanten k og middelfejlen på denne ved lineær regression på kurven over ln (
 14 C-residualaktivitet eller prøve ­
stofkoncentration) som funktion af tiden. Navnlig for  14 C-målinger 
må der kun anvendes data hørende til kurvens første lineære del, der 
følger efter lag-fasens slutning, og der må gives præference til nogle få udvalgte, repræsentative data frem for et større antal mere usikre data. Usikkerheden indbefatter her de naturlige fejl i den anbefalede 
direkte brug af målt
 14 C residualaktivitet (se nedenfor). Hvis 
nedbrydningen følger et bifasisk mønster, kan det undertiden være relevant at beregne to forskellige hastighedskonstanter. Hertil defi ­
neres to forskellige faser af nedbrydningskurven. Hastighedskon ­
stanten k og halveringstiden t
 ½ = ln2/k beregnes for hver enkelt af 
de replikate kolber, når der er udtaget delprøver fra samme kolbe, eller ved hjælp af gennemsnitsværdier, når der høstes hele kolber på hvert prøvetagningstidspunkt (se sidste afsnit i punkt 1.8.9.2). Ved 
førstnævnte fremgangsmåde skal hastighedskonstant og halveringstid 
rapporteres for hver enkelt replikat kolbe og som gennemsnitsværdi med middelfejl. Er der anvendt høje koncentrationer af prøvestoffet, kan nedbrydningskurven afvige betydeligt fra den rette linje (i semi ­
logaritmisk afbildning), og der gælder ikke nødvendigvis første 
ordens kinetik. Det har derfor ingen mening at fastlægge en halve ­
ringstid. For et begrænset dataområde kan man dog anvende pseudo første ordens kinetik og beregne halveringstiden DT
 50 for nedbryd ­
ningen (den tid, der medgår til 50 % nedbrydning). Man må dog 
være opmærksom på, at nedbrydningens tidsforløb uden for det valgte dataområde ikke kan forudsiges ved hjælp af DT
 50 , der blot 
er en deskriptor for et givet datasæt. Der findes let tilgængelige 
analyseredskaber, som letter statistiske beregninger og kurvefitting, 
og brug af sådan software anbefales.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Foretages der specifikke kemiske analyser, beregnes hastighedskon ­
stanter og halveringstider for primær nedbrydning som beskrevet 
ovenfor for total mineralisering. Hvis den primære nedbrydning udgør den hastighedsbegrænsende proces, kan der undertiden anvendes datapunkter fra hele nedbrydningsforløbet. Dette skyldes, 
at målingerne er direkte, i modsætning til målingerne af
 14 C-aktivitet.  
Anvendes  14 C-mærkede stoffer, skal der opstilles en massebalance i 
procent af den tilsatte startkoncentration, i det mindste ved forsøgets slutning.
 
2.1.2.  Residualaktivitet  
Ved bionedbrydning af den  14 C-mærkede del af et organisk stof 
omdannes størstedelen af  14 C til  14 CO 2 , mens en anden del udnyttes 
til vækst af biomasse og/eller syntese af ekstracellulære metabolitter. 
»Fuldstændig« biologisk nedbrydning af et stof medfører derfor ikke 
100 % omdannelse af kulstofindholdet til  14 CO 2 . Den  14 C, der 
indbygges i produkter dannet ved biosyntese, frigives efterfølgende langsomt som
 14 CO 2 ved »sekundær mineralisering«. Kurver, der 
viser residualaktiviteten af organisk  14 C (målt efter fjernelse af 
CO 2 ) eller den producerede  14 CO 2 som funktion af tiden, har 
derfor en »hale«, efter at nedbrydningen er løbet til ende. Dette komplicerer den kinetiske fortolkning af data, og til dette formål 
bør kun den initiale del af kurven (efter lag-fasens afslutning, og 
inden ca. 50 % nedbrydning er nået) normalt anvendes til beregning af en hastighedskonstant for nedbrydningen. Hvis prøvestoffet nedbrydes, er den totale organiske
 14 C-residualaktivitet altid større 
end den  14 C-aktivitet, der skyldes tilbageværende intakt prøvestof. 
Hvis prøvestoffet nedbrydes ved en første ordens reaktion, og en konstant brøkdel α mineraliseres til CO
 2 , vil den initiale hældning 
af 14 C-depletionskurven (total organisk  14 C som funktion af tiden) 
være α gange hældningen af den tilsvarende kurve over koncentra ­
tionen af prøvestoffet (eller, mere præcist, den del af prøvestoffet, der er mærket med
 14 C). Hvis målingerne af den totale organiske  
14 C-aktivitet bruges uden korrektion, vil hastighedskonstanten for 
nedbrydningen derfor være lavt regnet. I litteraturen er beskrevet 
metoder til bestemmelse af prøvestofkoncentrationen ud fra den målte radiokemiske aktivitet ved brug af nogle forenklede forudsæt ­
ninger (2)(9)(10)(11). Sådanne metoder kan lettest anvendes på 
hurtigt nedbrydelige stoffer.
 
2.2. FORTOLKNING AF RESULTATER  
Hvis k findes at være uafhængig af den tilsatte koncentration (dvs. 
den beregnede k-værdi er omtrent ens ved forskellige prøvestofkon ­
centrationer), kan første ordens hastighedskonstanten antages at være 
repræsentativ for de anvendte prøvebetingelser, dvs. prøvestoffet, 
vandprøven og forsøgstemperaturen. I hvilket omfang resultaterne kan generaliseres eller ekstrapoleres til andre systemer, kræver det ekspertviden at vurdere. Anvendes en høj prøvestofkoncentration, så 
nedbrydningen ikke følger første ordens kinetik, kan data ikke 
benyttes til direkte beregning af en første ordens hastighedskonstant eller en tilsvarende halveringstid. Dog vil data fra forsøg med høj prøvestofkoncentration stadig være nyttige til beregning af den totale 
mineraliseringsgrad og/eller detektion og kvantificering af omdannel ­
sesprodukter.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Hvis man kender tabsprocenten fra andre tabsprocesser end bioned ­
brydning (f.eks. hydrolyse eller fordampning), kan de trækkes fra de 
nettotab, der iagttages under forsøget, hvorved man kan få en tilnærmet bestemmelse af bionedbrydningshastigheden. Data for hydrolyse vil kunne fås fra f.eks. den sterile kontrol eller fra side ­
løbende forsøg med højere prøvestofkoncentration.
 
Indirekte og direkte bestemmelse af  14 CO 2 (punkt 1.8.9.4 og 
tillæg 3) kan kun bruges til at bestemme graden af prøvestoffets 
mineralisering til CO  2 . Koncentrationen af  14 C-mærket prøvestof 
og dannelsen af vigtige omdannelsesprodukter (tredje afsnit i punkt 1.8.9.4) kan analyseres ved radiokromatografi (RAD-TLC) eller HPLC. For at halveringstiden kan bestemmes direkte, må der 
ikke være vigtige omdannelsesprodukter (defineret som ≥ 10 % af 
den tilsatte mængde prøvestof) til stede. Hvis der er vigtige omdan ­
nelsesprodukter, som her defineret, til stede, er en detaljeret vurde ­
ring af data nødvendig. En sådan vurdering kan bestå i yderligere 
undersøgelser og/eller identifikation af omdannelsesprodukterne (se 
første afsnit i punkt 1.8.9.5), medmindre disses skæbne med rimelig sikkerhed kan vurderes ud fra tidligere erfaringer (f.eks. oplysninger om nedbrydningsvej). Da den andel af prøvestoffets kulstofindhold, 
der omdannes til CO
 2 , er forskellig (hovedsagelig afhængig af 
koncentrationen af prøvestoffet og øvrige tilgængelige substrater, prøvebetingelserne og det mikrobielle miljø), giver forsøget ikke umiddelbar mulighed for beregning af den endelige bionedbrydning 
som i et DOC die-away forsøg, men resultatet svarer til det, der fås 
af et respirometrisk forsøg. Mineraliseringsgraden vil således højst være lig med minimumsniveauet af fuldstændig bionedbrydning. For at få et mere fyldestgørende billede af den fuldstændige bionedbryd ­
ning (mineralisering og inkorporation i biomasse) bør analysen af 
fasefordelingen af
 14 C foretages ved forsøgets slutning (se 
tillæg 1).  14 C-indholdet i den samlede partikelmængde vil dels bestå 
af 14 C indbygget i bakteriel biomasse, dels  14 C sorberet til organiske 
partikler.  
2.3. FORSØGETS VALIDITET  
Hvis referencestoffet ikke nedbrydes inden for det forventede 
tidsrum (for anilin og natriumbenzoat sædvanligvis mindre end to uger), er forsøgets validitet tvivlsom og må nærmere efterprøves, 
eller forsøget må i stedet gentages med en ny vandprøve. I en ISO 
ringtest af metoden med deltagelse af syv laboratorier beliggende forskellige steder i Europa lå hastighedskonstanten for nedbrydning af anilin efter tilpasning mellem 0,3 og 1,7 dag
 –1 med et gennemsnit 
på 0,8 d  –1 ved 20  o C og en middelfejl på ± 0,4 d  –1 (t ½ = 0,9 dag). 
Typiske lag-tider var 1 til 7 dage. De undersøgte vande rapporteredes at have en bakteriel biomasse svarende til 10
 3 -10 4 kolonidannende 
enheder (CFU) pr. ml. Nedbrydningshastigheden i næringsstofrige 
mellemeuropæiske vande var større end i oligotrofe nordiske vande, hvilket kan skyldes forskelle i trofisk status eller tidligere eksponering for kemiske stoffer.
 
Den totale genfinding (ved massebalance) ved forsøgets slutning bør 
være mellem 90 % og 110 % for radioaktivt mærkede stoffer, mens den initiale genfinding ved forsøgets begyndelse bør være mellem 70 % og 110 % for umærkede stoffer. De angivne områder må 
imidlertid kun opfattes som mål og bør ikke anvendes som accept ­
kriterier for testen.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. FORSØGSRAPPORT  
Undersøgelsens art, dvs. pelagisk eller med opslæmmet sediment, 
skal klart angives i forsøgsrapporten, som desuden skal indeholde i det mindste følgende oplysninger:
 
For prøvestof og referencestof(fer):  
— generisk navn, kemisk navn, (anbefalet IUPAC og/eller CAS 
navn), CAS-nummer, strukturformel (med angivelse af place ­
ringen af  14 C, når radioaktivt mærket stof anvendes) og relevante 
fysisk-kemiske egenskaber (se punkt 1.5 og 1.6)  
— kemisk navn, CAS-nummer, strukturformel (med angivelse af 
placeringen af  14 C, når radioaktivt mærket stof anvendes) og 
relevante fysisk-kemiske egenskaber for stoffer anvendt som standarder til identifikation og kvantificering af omdannelsespro ­
dukter
 
— renhed (urenheder) af prøve- og referencestof  
— for mærkede stoffer, radiokemisk renhed og specifik aktivitet 
(når det er relevant).  
For overfladevand:  
Der skal som minimum gives følgende oplysninger om den udtagne 
vandprøve:  
— beliggenhed og beskrivelse af prøvetagningsstedet, herunder så 
vidt muligt oplysninger om tidligere forurening  
— dato og klokkeslæt for indsamling af prøven  
— næringsstofindhold (total N, ammonium, nitrit, nitrat, total P, 
opløst orthophosphat)  
— prøvetagningsdybde  
— prøvens udseende (f.eks. farve og turbiditet)  
— DOC og TOC  
— BOD  
— temperatur og pH på prøvetagningsstedet og -tidspunktet  
— oxygen- eller redoxpotentiale (kun nødvendigt, hvis der ikke 
tydeligt ses at være aerobe betingelser)  
— saltindhold eller ledeevne (for søvand og brakvand)  
— opslæmmet faststof (for uklare prøver)  
— eventuelle andre relevante oplysninger om prøvetagningsstedet på 
prøvetagningstidspunktet (f.eks. aktuelle eller historiske oplys ­
ninger om strømhastigheden i vandløb eller havstrømme, nærlig ­
gende større udledninger og udledningernes art, vejrforholdene i tiden forud for prøvetagningen)
 
og, valgfrit:  
— mikrobiel biomasse (f.eks. direkte tælling med acridinorange- 
farvning, eller kolonidannende enheder)  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— uorganisk kulstof  
— koncentration af chlorophyll-a som specifik bestemmelse af alge ­
biomasse.  
Hvis forsøget udføres med opslæmmet sediment, skal der desuden 
gives følgende oplysninger om sedimentet:  
— prøvetagningsdybde for sedimentet  
— sedimentets fremtræden (som f.eks. farvet, mudret, siltholdig eller 
sandholdig)  
— tekstur (f.eks. angivet som % groft sand, fint sand, silt og ler)  
— tør vægt af opslæmmet faststof i g/l, TOC-koncentration eller 
vægttab ved forbrænding som mål for indholdet af organisk stof  
— pH  
— oxygen- eller redoxpotentiale (kun nødvendigt, hvis der ikke 
tydeligt ses at være aerobe betingelser).  
Forsøgsbetingelser:  
— forsinkelse mellem indsamling og anvendelse i laboratoriefor ­
søget, opbevaring og forbehandling af prøven, dato for undersø ­
gelserne  
— mængde prøvestof tilført, koncentration under forsøget og refe ­
rencestof  
— tilsætningsmetode for prøvestoffet, herunder brug af eventuelt 
opløsningsmiddel  
— anvendt volumen overfladevand og sediment (hvis anvendt), og 
volumen udtaget til analyse ved hvert prøvetagningstidspunkt  
— beskrivelse af det anvendte prøvesystem.  
Hvis forsøget ikke udføres i mørke, oplysninger om betingelserne 
»diffus belysning«:  
— oplysninger om den eller de anvendte metoder til sterilisering af 
kontrolprøver (f.eks. autoklaveringstemperatur og -tid samt antal 
autoklaveringer)  
— inkubationstemperatur  
— oplysninger om analyseteknik og metode(r) anvendt til radio ­
kemiske målinger samt til kontrol af massebalance og målinger 
af fasefordeling (hvis sådanne er udført)  
— antal gentagelser.  
Resultater:  
— genfindingsprocenter (se punkt 1.7.1)  
— reproducerbarhed og følsomhed af de anvendte analysemetoder, 
herunder detektionsgrænse (LOD) og kvantificeringsgrænse 
(LOQ) (se punkt 1.7.2)  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— alle målte data (herunder prøvetagningstidspunkter) og beregnede 
værdier i tabelform og nedbrydningskurver; for hver prøvekon ­
centration og for hver replikat kolbe angives den lineære korre ­
lationskoefficient for kurvehældningen i logaritmisk afbildning, den beregnede lag-fase og en første ordens eller pseudo første 
ordens hastighedskonstant (hvis dette er muligt) samt den tilsva ­
rende nedbrydningshalveringstid (t
 50 ) 
— relevante værdier angives som gennemsnit af de værdier, der er 
iagttaget i de enkelte replikater, f.eks. lag-fasens varighed, 
nedbrydningshastighedskonstanten og nedbrydningshalverings ­
tiden (t  50 ) 
— systemet rubriceres enten som ikke tilpasset eller tilpasset, 
bedømt ud fra nedbrydningskurvens udseende og ud fra den 
mulige indvirkning af prøvekoncentrationen  
— resultaterne af den endelige massebalancekontrol og resultaterne 
af eventuelle fasefordelingsmålinger  
— den andel af  14 C, der er mineraliseret, og, når specifikke analyser 
anvendes, den endelige primære nedbrydningsgrad  
— identifikation, molær koncentration og procentdel tilsat stof og, 
når det er relevant, vigtige omdannelsesprodukter (se første 
afsnit i punkt 1.8.9.5)  
— formodet omdannelsesvej, når det er relevant  
— diskussion af resultater.  
4. LITTERATUR  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
— Simulation Biodegradation Test.  
2. ISO/DIS 14592-1 (1999) Water quality — Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations — Part 1: Shake flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions.
 
3. Prøvemetode C.23. Aerob og anaerob omdannelse i jord.  
4. Prøvemetode C.24. Aerob og anaerob omdannelse i akvatiske 
sedimentsystemer.  
5. OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
6. ISO 8245 (1999). Water quality — Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic 
carbon (DOC).  
7. ISO 10634 (1995). Water quality — Guidance for the prepara ­
tion and treatment of poorly water-soluble organic compounds 
for the subsequent evaluation of their biodegradability in an 
aqueous medium.  
8. OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and 
Assessment. No 22.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394-401.  
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274-283.  
11. ISO/CD 14592-1 (1999). Ring test report: Water Quality — 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 — report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface 
water/sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Tillæg 1  
Fasefordeling af  14 C 
Til kontrol af metoden skal rutinemålingerne af total organisk  14 C-residualakti ­
vitet (TOA) suppleres med massebalancemålinger, hvor den udviklede  14 CO 2 
bestemmes direkte efter opsamling i absorber (se tillæg 3). Positiv  14 CO 2 - 
dannelse er i sig selv et direkte tegn på bionedbrydning i modsætning til abiotisk 
nedbrydning eller andre tabsmekanismer som fordampning og sorption. Andre nyttige oplysninger til karakterisering af bionedbrydningsegenskaberne kan fås af målinger af fordelingen af TOA på opløst tilstand (opløst organisk
 14 C-aktivitet, 
DOA) og fast partikelform (POA) efter separation af partiklerne ved membranfil ­
trering eller centrifugering. POA består af prøvestof, der er sorberet på den mikrobielle biomasse og på andre partikler samt af kulstof fra prøvestoffet, der er anvendt til syntese af nyt cellemateriale og derved indbygget i den partikel ­
formige biomassefraktion. Dannelsen af opløst organisk
 14 C kan bestemmes som 
DOA, når bionedbrydningen er slut (svarende til plateauet af kurven over nedbrydningen som funktion af tiden).
 
Fasefordelingen af residual  –14 C i udvalgte prøver bestemmes ved filtrering af 
prøven på et 0,22 μm eller 0,45 μm membranfilter af et materiale, der ikke 
adsorberer nævneværdige mængder prøvestof (polycarbonatfiltre kan være egne ­
de). Er sorptionen af prøvestoffet på filteret for stor til at kunne ignoreres (dette skal verificeres inden forsøget), kan højhastighedscentrifugering (2 000 g; 10 min.) anvendes i stedet for filtrering.
 
Derefter behandles filtratet eller centrifugatet som beskrevet i tillæg 3 for ufil ­
trerede prøver. Membranfiltratet opløses i en egnet scintillationsvæske og tælles på sædvanlig måde, idet korrektion for quenching normalt kun foretages ved hjælp af kanalforholdet for ekstern standard eller behandling af prøverne med 
et blegemiddel. Er der anvendt centrifugering, skal den pellet, der er dannet af 
partikelfraktionen, genopslæmmes i 1-2 ml destilleret vand og overføres til et scintillationsglas. Derefter vaskes to gange med 1 ml destilleret vand, og vaske ­
vandet overføres til scintillationsglasset. Opslæmningen kan om nødvendigt 
indlejres i en gel til væskescintillationstælling.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Tillæg 2  
Semikontinuert metode  
Vanskelige stoffer kan kræve inkubation i indtil flere måneder for at opnå 
tilstrækkelig nedbrydning. Forsøget bør normalt ikke vare over 60 dage, medmindre den normale vandprøves egenskaber opretholdes ved udskiftning af 
prøveopslæmningen. Er nedbrydningen af prøvestoffet begyndt inden for de 
første 60 dage, kan forsøget dog forlænges til maksimalt 90 dage, uden at forsøgsopslæmningen udskiftes.
 
Ved langvarig inkubation kan mangfoldigheden af det mikrobielle samfund blive 
nedsat som følge af forskellige tabsmekanismer og muligvis opbrugning af essen ­
tielle næringsstoffer og primære kulstofsubstrater i vandprøven. Derfor anbefales 
det at anvende en semikontinuert metode for at få tilfredsstillende bestemmelse af nedbrydningshastigheden for langsomt nedbrydelige stoffer. Den semikontinuerte metode bør anvendes fra forsøgets start, hvis tidligere erfaring viser, at der 
kræves en inkubationsperiode på tre måneder for at opnå 20 % nedbrydning af 
stoffet. En anden mulighed er, at det normale batchforsøg ændres til et semikon ­
tinuert forsøg, hvis der ikke er sket nogen nedbrydning af prøvestoffet, efter at forsøget har kørt i ca. 60 dage med batchmetoden. Den semikontinuerte udførelse 
af forsøget kan standses og forsøget fortsættes som et batchforsøg, når der er 
konstateret en væsentlig nedbrydning (f.eks. > 20 %).
 
I det semikontinuerte forsøg udskiftes ca. en tredjedel af forsøgsopslæmningens 
volumen hver anden uge med friskindsamlet vand, som er tilsat prøvestof 
svarende til initialkoncentrationen. Anvendes den valgfrie metode med 
opslæmmet sediment, skal udskiftningsvandet desuden tilsættes sediment svarende til initialkoncentration (mellem 0,01 og 1 g/l). Udføres forsøget med opslæmmet sediment, er det vigtigt, at systemet holdes fuldstændig opslæmmet, 
også mens vandet skiftes, og at der er samme opholdstid for faste stoffer og for 
vand, da man ellers ikke opnår den tilsigtede overensstemmelse med et homogent vandigt system uden fastliggende faser. Af disse grunde bør initialkoncentra ­
tionen af opslæmmet sediment helst være i den nedre del af det foreskrevne 
interval, når den semikontinuerte metode anvendes.
 
Den angivne tilsætning af prøvestof forudsætter, at den delvise udskiftning af 
prøveopslæmningen ikke medfører overskridelse af den initiale prøvestofkoncen ­
tration, for at man skal undgå den tilpasning, der ofte ses ved høje prøvestof ­
koncentrationer. Da metoden både indebærer re-inokulering og kompensation for 
opbrugte næringsstoffer og primære substrater, genetableres den oprindelige 
mikrobielle mangfoldighed, og forsøget kan i princippet forlænges ubegrænset. Når den semikontinuerte metode anvendes, at det vigtigt at bemærke, at residu ­
alkoncentrationen af prøvestoffet skal korrigeres for de mængder prøvestof, der 
tilsættes og fjernes ved hver udskiftningsgang. For stoffer, der kun udviser ringe 
sorption, kan man frit vælge, om man vil bruge totalkoncentrationen eller den opløste koncentration af prøvestoffet. Sorptionen er uden betydning (< 5 %) ved de foreskrevne betingelser (0,1-1 g faststof/l) for stoffer med log K
 ow < 3 (gælder 
for neutrale, lipofile forbindelser). Dette illustreres af følgende beregningseksem ­
pel. 0,1 g faststof /l svarer til ca. 10 mg kulstof pr. liter (ved en vægtbrøk kulstof, f
 C = 0,01). Idet det forudsættes, at  
Log K  ow (for prøvestoffet) = 3  
K oc = 0,42 × K  ow 
Fordelingskoefficient, K  d = f C × K  oc 
Vil den opløste andel af totalkoncentrationen (C-water (C  w )/C-total (C  t ) være:  
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 0,1 × 
10 –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Tillæg 3  
Bestemmelse af  14 CO  2 
Indirekte  14 CO  2 -bestemmelse  
Til rutinemæssige målinger er indirekte bestemmelse normalt den mindst tids ­
krævende og mest nøjagtige metode, når prøvestoffet er ikke-flygtigt og ikke 
omdannes til flygtige omdannelsesprodukter. De ufiltrerede prøver overføres 
simpelthen til scintillationsglas, f.eks. i en mængde af 5 ml. En passende initial aktivitet i prøverne er 5 000 dpm-10 000 dpm (80-170 Bq), og en mindste initial aktivitet er ca. 1 000 dpm. CO
 2 -indholdet fjernes efter forsuring 
til pH 2-3 med 1-2 dråber koncentreret H  3 PO 4 eller HCl. CO  2 -fjernelse kan ske 
ved gennembobling med luft i ½-1 time. I stedet kan glassene omrystes kraftigt i 1-2 timer (f.eks. på en mikropladeryster) eller med svagere omrystning natten over. Effektiviteten af CO
 2 -fjernelsen skal kontrolleres (ved forlængelse af beluft ­
nings- eller omrystningsperioden). Der tilsættes derefter en scintillationsvæske 
egnet til tælling af vandige prøver, prøven homogeniseres i en omrører, og radioaktiviteten måles med væskescintillationstælling, idet man fratrækker den baggrundsaktivitet, der er fundet i blindprøverne (F
 B ). Medmindre prøvevandet 
er stærkt farvet eller har et højt partikelindhold, vil prøverne normalt udvise 
ensartet quenching, og det vil være tilstrækkeligt at korrigere for quenching ved hjælp af en ekstern standard. Hvis prøvevandet er stærkt farvet, kan det være nødvendigt at tilsætte en intern standard til at korrigere for quenching. Er 
partikelkoncentrationen høj, kan det være umuligt at få en homogen opløsning 
eller gel, eller prøverne vil udvise store forskelle i quenching. I så fald kan man benytte den tællemetode, der er beskrevet nedenfor for prøveslam. Udføres forsøget med opslæmmet sediment, kan
 14 CO 2 måles indirekte ved udtagning 
af en homogen 10 ml prøve af prøvevand/prøveopslæmning og adskillelse af 
faserne ved centrifugering med passende hastighed (f.eks. 40 000 m/s  2 i 
15 min.). Den vandige fase behandles derefter som ovenfor beskrevet.  14 C-akti­
viteten i partikelfasen (POA) bestemmes ved genopslæmning af sedimentet i et 
lille volumen destilleret vand, overførsel til scintillationsglas og tilsætning af 
scintillationsvæske, så der dannes en gel (særlige scintillationsvæsker fås hertil). Alt efter partiklernes beskaffenhed (f.eks. indholdet af organisk stof) kan det være en fordel at behandle prøven natten over med et vævsopløsende middel 
og derefter homogenisere den i en omrører, før scintillationsvæsken tilsættes. I 
stedet kan POA bestemmes ved forbrænding i overskud af oxygen ved hjælp af en oxidiser. Ved tællingen skal der altid medtages interne standarder, og det kan være nødvendigt at korrigere hver enkelt prøve for quenching ved tilsætning af 
intern standard.
 
Direkte  14 CO  2 -bestemmelse  
Hvis den udviklede  14 CO 2 måles direkte, skal det ske ved at opsætte ekstra 
kolber ved forsøgets begyndelse og høste prøvekolberne i hvert målepunkt ved 
forsuring af kolberne til pH 2-3 og indsamling af  14 CO 2 i en intern (anbragt i 
hver prøvekolbe ved forsøgets begyndelse) eller ekstern absorber. Som absorp ­
tionsmiddel kan enten anvendes alkali (f.eks. 1 N NaOH-opløsning eller en NaOH-pellet), ethanolamin eller en ethanolamin-baseret absorber, eller andre 
gængse absorbere. Til direkte måling af
 14 CO 2 skal kolberne lukkes med septa 
f.eks. af butylgummi.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Figur 1a  
Eksempel på aritmetisk kurve over data (residualaktiviteten som funktion af tiden)
  
Figur 1b  
Eksempel på semilogaritmisk kurve over data (ln til residualaktiviteten som funktion af tiden)
  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  LEMNA  SP. VÆKSTHÆMNINGSTEST  
1. METODE  
Metoden er ækvivalent med OECD TG 221 (2006) (1). Der er 
opnået bred tilslutning blandt EU's myndigheder til, at Lemna- 
testen er et velegnet alternativ til en algetest for stærkt farvede stoffer (2)(3).
 
1.1. INDLEDNING  
Formålet med nærværende testmetode er at vurdere stoffers toksicitet 
over for akvatiske ferskvandsplanter af slægten  Lemna  (andemad). 
Den er baseret på eksisterende retningslinjer (4)(5)(6)(7)(8)(9), men 
der er foretaget ændringer, som afspejler den senere tids forskning og drøftelser vedrørende en række vigtige punkter. Den foreslåede metode er blevet valideret ved en international ringtest (10).
 
I denne testmetode beskrives toksicitetstestning med  Lemna gibba  og 
Lemna minor , der begge har været genstand for omfattende under ­
søgelser og er omhandlet i ovennævnte standarder. Taksonomien for  
Lemna  spp. er vanskelig, idet den kompliceres af, at der findes en 
bred vifte af fænotyper. Genetisk variation i responsen på giftstoffer 
hos Lemna  kan forekomme, men de aktuelt foreliggende oplysninger 
om denne kilde til variation er utilstrækkelige som grundlag for at anbefale en bestemt klon til brug i nærværende testmetode. Det skal bemærkes, at testen ikke udføres axenisk, men nogle af testproces ­
sens trin er foranstaltninger, der skal holde kontamineringen med 
andre organismer nede på et minimum.
 
Der gives en nærmere beskrivelse af testning med udskiftning af 
substratet (semistatisk forsøg og gennemstrømningsforsøg) og uden udskiftning (statisk). Afhængigt af målsætningen for testen og myndig ­
hedernes krav anbefales det at overveje brug af den semistatiske 
metode og gennemstrømningsmetoden f.eks. til stoffer, der hurtigt forlader opløsningen ved fordampning, fotonedbrydning, udfældning 
eller bionedbrydning. Nærmere anvisninger er givet i (11).
 
1.2. DEFINITIONER  
Følgende definitioner og forkortelser anvendes i denne testmetode:  
Biomasse : den tørre vægt af det levende materiale, som er til stede i 
en population. I denne test måles typisk surrogater for biomasse, 
f.eks. bladantal eller bladareal, og betegnelsen »biomasse« benyttes således også for sådanne surrogater.
 
Chlorose : gulning af bladvæv.  
Klon : en organisme eller celle, der er opstået af en enkelt celle ved 
vegetativ formering. Individer fra samme klon er derfor genetisk 
identiske.  
Koloni : en samling af moder- og datterblade (sædvanligvis 2 til 4), 
der sidder fast på hinanden. Betegnes undertiden en plante.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : den koncentration af teststof opløst i testsubstratet, der 
medfører en væksthæmning på x % (f.eks. 50 %) af  Lemna  i løbet 
af en nærmere bestemt eksponeringsperiode (som udtrykkeligt skal angives, hvis den er forskellig fra den fulde eller normale testperio ­
de). For klart at skelne mellem EC-værdier afledt af henholdsvis 
væksthastighed og udbytte anvendes betegnelsen »E
 r C« for vækst ­
hastighed (rate) og »E  y C« for udbytte (yield), efterfulgt af den 
anvendte målevariabel, f.eks. »E  r C (bladantal)«.  
Gennemstrømningstest : en test, hvor testopløsningen udskiftes 
kontinuerligt.  
Blad : en individuel/enkelt »bladlignende« struktur hos andemadplan ­
ten. Det er den mindste enhed, dvs. det mindste individ, der kan 
formere sig.  
Opsvulmethed : blade, der fremtræder udbulede eller opsvulmede.  
Vækst : en stigning i en målevariabel i løbet af testperioden, f.eks. 
bladantal, tør vægt, våd vægt eller bladareal.  
Væksthastighed (gennemsnitlig specifik væksthastighed) : den 
logaritmiske biomasseforøgelse i eksponeringsperioden.  
Laveste koncentration med observeret effekt (Lowest Observed 
Effect Concentration, LOEC) : den laveste testede koncentration, 
ved hvilken stoffet har vist statistisk signifikant (p < 0,05) vækst ­
nedsættende virkning i forhold til kontrolprøverne inden for en given eksponeringsperiode. Alle testkoncentrationer over LOEC skal dog 
have en skadelig virkning mindst svarende til den, der iagttages ved 
LOEC. Kan disse to betingelser ikke opfyldes, skal der fyldestgø ­
rende redegøres for, hvordan den pågældende LOEC (og dermed NOEC) er valgt.
 
Målevariabler : enhver type variabel, der måles for at udtrykke ende ­
punktet for en test ved hjælp af en eller flere forskellige respons ­
variabler. I denne metode er bladantal, bladareal, frisk vægt og tør vægt målevariabler.
 
Monokultur : en kultur med én planteart.  
Nekrose : dødt (dvs. hvidt eller gennemblødt) bladvæv.  
Nuleffekt-koncentration (No Observed Effect Concentration, 
NOEC) : testkoncentrationen umiddelbart under LOEC.  
Fænotype : de observerbare kendetegn for en organisme, som er 
bestemt af samspillet mellem dens gener og dens omgivelser.  
Responsvariabler : variabler, som anvendes til vurdering af den 
toksiske virkning og er afledt af målte parametre, der beskriver 
biomassen ved forskellige beregningsmetoder. I nærværende metode er væksthastighed og udbytte responsvariabler, der er afledt af målevariabler som bladantal, bladareal, frisk vægt eller tør vægt.
 
Semistatisk test (udskiftningstest) : en test, hvor testopløsningen 
udskiftes med bestemte intervaller i løbet af testen.  
Statisk test : en testmetode, hvor testopløsningen ikke udskiftes 
under testen.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Endepunkt for en test : den generelle faktor, som teststoffet frem ­
kalder en ændring af i forhold til kontrollen som mål for testen. I 
denne testmetode er endepunktet væksthæmning, som kan udtrykkes ved forskellige responsvariabler, der er baseret på en eller flere målevariabler.
 
Testsubstrat : det komplette, syntetiske næringssubstrat, hvorpå test ­
planterne vokser, når de eksponeres for teststoffet. Normalt er test ­
stoffet opløst i testsubstratet.  
Udbytte : værdien af en målevariabel for biomasse ved eksponerings ­
periodens slutning minus værdien af samme variabel ved ekspone ­
ringsperiodens start.  
1.3. TESTENS PRINCIP  
Eksponentielt voksende plantekulturer af slægten  Lemna  dyrkes som 
monokultur ved forskellige koncentrationer af teststoffet i syv dage. Testens formål er at kvantificere stofrelaterede virkninger på den 
vegetative vækst i dette tidsrum, baseret på vurdering af udvalgte 
målevariabler. Bladantallet er den primære målevariabel. Der måles desuden mindst én anden målevariabel, (totalt bladareal, tør vægt eller frisk vægt), da nogle stoffer kan påvirke andre målevariabler 
langt mere end bladantallet. De stofrelaterede virkninger kvantifi ­
ceres ved, at væksten i testopløsningerne sammenholdes med væksten i kontrolprøverne, hvorudfra man bestemmer den koncen ­
tration, som frembringer en bestemt hæmning x % (f.eks. 50 %) af 
væksthastigheden, og som betegnes EC
 x (f.eks. EC  50 ). 
Testens endepunkt er hæmning af væksten, der er udtrykt som den 
logaritmiske stigning i målevariablen (den gennemsnitlige specifikke væksthastighed) i eksponeringsperioden. Ud fra de gennemsnitlige specifikke væksthastigheder, der er registreret i en række testopløs ­
ninger, bestemmes den koncentration, der frembringer en bestemt 
hæmning x % (f.eks. 50 %) af væksthastigheden, og denne betegnes E
 r C x (f.eks. E  r C 50 ). 
I denne metode anvendes udbytte som en supplerende responsvaria ­
bel, der kan være nødvendig for at efterkomme myndighedsbestem ­
melserne i visse stater. Udbyttet defineres som værdien af målevari ­
ablerne ved eksponeringsperiodens slutning minus værdien af vari ­
ablerne ved eksponeringsperiodens start. Ud fra det udbytte, der er registreret i en række testopløsninger, bestemmes den koncentration, 
der frembringer en bestemt hæmning x % (f.eks. 50 %) af udbyttet, 
og denne betegnes E
 y C x (f.eks. E  y C 50 ). 
Derudover kan den laveste koncentration med observeret effekt 
(LOEC) og nuleffekt-koncentrationen (NOEC) bestemmes statistisk.  
1.4. OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET  
Der skal foreligge en tilstrækkeligt følsom analysemetode til kvanti ­
tativ bestemmelse af stoffet i testsubstratet.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Af oplysninger om teststoffet, der kan være nyttige ved fastsættelse 
af testbetingelserne, kan nævnes strukturformel, renhed, vandopløse ­
lighed, stabilitet i vand, lysstabilitet, pK  a , K ow , damptryk og bioned ­
brydelighed. Vandopløseligheden og damptrykket kan bruges til at beregne Henrys konstant, som angiver, om der kan forventes væsent ­
ligt tab af teststof i løbet af testperioden. Derved fås en indikation af, 
om der skal træffes særlige skridt til at kontrollere sådanne tab. Er oplysningerne om teststoffets opløselighed og stabilitet usikre, anbe ­
fales det at vurdere disse ved testbetingelserne, dvs. med samme 
næringssubstrat, temperatur og belysning som i testen.
 
Når regulering af testsubstratets pH er særlig vigtig, f.eks. ved test ­
ning af metaller eller hydrolytisk ustabile stoffer, anbefales det at tilsætte en buffer til næringssubstratet (se første afsnit i punkt 1.7.4). I (11) er der givet vejledning for testning af stoffer, hvis fysisk- 
kemisk egenskaber vanskeliggør testning.
 
1.5. REFERENCESTOF  
Til kontrol af testmetoden kan der testes et eller flere referencestof ­
fer, f.eks. 3,5-dichlorphenol, som er anvendt i den internationale 
ringtest (10). Det tilrådes, at testning af et referencestof finder sted mindst to gange årligt eller, hvis testningsfrekvensen er lavere, side ­
løbende med toksicitetsbestemmelsen af et teststof.
 
1.6. TESTENS VALIDITET  
For at testen skal være valid, skal fordoblingstiden for bladantallet i 
kontrollen være mindre end 2,5 dage (60 h), tilnærmelsesvis 
svarende til en syvdobling på syv dage og en gennemsnitlig specifik væksthastighed på 0,275 d
 –1 . Med de testsubstrater og testbetingel ­
ser, der er beskrevet i denne testmetode, kan dette kriterium opfyldes 
ved at gennemføre testen under statiske betingelser (8). Kriteriet 
forventes desuden at kunne opfyldes under semistatiske forhold og med gennemstrømning. Beregningen af fordoblingstiden er vist i punkt 2.1.
 
1.7. BESKRIVELSE AF METODEN  
1.7.1.  Apparatur  
Alt udstyr, der kommer i berøring med testsubstraterne, skal være 
udført helt i glas eller andet kemisk inaktivt materiale. Glasapparatur, 
der anvendes til dyrkning og testning, skal være renset for kemiske kontaminanter, der kan udvaskes i testsubstratet, og skal være sterilt. Testbeholderne skal være tilstrækkeligt vide til, at blade fra forskel ­
lige kolonier i kontrolbeholderne kan vokse uden at overlappe 
hinanden ved testens slutning. Rødderne må gerne røre bunden af testbeholderen, men en mindste dybde på 20 mm og et mindste rumfang på 100 ml i hver testbeholder tilrådes. Valget af testbe ­
holder er ikke afgørende, når blot disse krav er opfyldt. Bægerglas, 
krystallisationsskåle eller petriskåle af glas med passende mål har alle vist sig velegnede. Testbeholderne skal have låg, der nedsætter fordampning og utilsigtet kontaminering til et minimum og samtidig 
tillader det nødvendige luftskifte. Testbeholderne, og især disses låg, 
må ikke skygge eller ændre lysets spektrale sammensætning.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Kulturerne og testbeholderne må ikke opbevares sammen. Dette 
opnås bedst ved, at klimakamre, inkubatorer eller lokaler er separate. 
Belysning og temperatur skal kunne reguleres og holdes på et konstant niveau (se punkt 1.7.8).
 
1.7.2.  Testorganisme  
Som testorganisme anvendes i denne test enten  Lemna gibba  eller  
Lemna minor . Tillæg 1 indeholder en kort beskrivelse af de arter af 
andemad, der er blevet anvendt til toksicitetstestning. Plantemateriale kan fås fra en kultursamling, fra et andet laboratorium eller i felten. 
Er planterne indsamlet i felten, skal de opbevares i mindst otte uger i 
kultur i samme substrat, som benyttes til testningen, før de anvendes. Indsamlingssteder for startkulturer i felten skal være fri for åbenbare forureningskilder. Hvis de leveres fra et andet laboratorium eller fra 
en kultursamling, skal de opbevares på tilsvarende måde i mindst tre 
uger. Kilden til plantematerialet og den testede art og klon (hvis denne kendes) skal altid rapporteres.
 
Der skal anvendes monokulturer, som er fri for synlig kontaminering 
med andre organismer såsom alger og protozoer. Sunde planter af  L. 
minor  består af kolonier på mellem to og fem blade, mens sunde 
kolonier af  L. gibba  kan bestå af op til syv blade.  
De testede planters kvalitet og ensartethed har stor indflydelse på 
testresultatet, hvorfor de bør udvælges nøje. Der skal anvendes unge, 
hurtigtvoksende planter uden synlige forandringer eller misfarvning (chlorose). Kulturer af god kvalitet er kendetegnet af en høj andel af kolonier med mindst to blade. Et stort antal enkeltblade er tegn på 
miljøbelastning som f.eks. begrænset adgang til næringsstoffer, og 
plantemateriale fra sådanne kulturer bør ikke anvendes til testning.
 
1.7.3.  Dyrkning  
For at undgå at skulle vedligeholde kulturerne så ofte (f.eks. når  
Lemna -test ikke påtænkes anvendt i en periode) kan kulturerne opbe ­
vares ved reduceret belysning og temperatur (4-10 °C). En nærmere beskrivelse af dyrkningen er givet i tillæg 2. Hvis der er tydelige 
tegn på kontaminering med alger eller andre organismer, udtages en 
delprøve af  Lemna -blade, som overfladesteriliseres og derefter over ­
føres til friskt substrat (se tillæg 2). I så fald kasseres resten af den kontaminerede kultur.
 
Mindst syv dage før testning overføres et tilstrækkeligt antal kolonier 
aseptisk til friskt, sterilt substrat og dyrkes i 7-10 dage under test ­
betingelserne.  
1.7.4.  Testsubstrat  
Der anbefales forskellige substrater til  Lemna minor  og Lemna gibba  
som beskrevet nedenfor. Det må nøje overvejes, om der skal 
anvendes pH-buffer i testsubstratet (MOPS (4-morpholinpropan 
sulfonsyre, CAS-nr.: 1132-61-2, Einecs-nr.: 214-478-5) i  L. minor - 
substrat og NaHCO  3 i L. gibba -substrat), hvis det mistænkes for at 
kunne reagere med teststoffet og påvirke tegnene på dets toksicitet. 
Steinberg-substrat (12) er ligeledes acceptabelt, når blot validitets ­
kriterierne er opfyldt.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Til dyrkning af og testning med  L. minor  anbefales en modificeret 
version af  Lemna -næringssubstratet efter svensk standard (SIS). 
Sammensætningen af dette substrat er givet i tillæg 3.  
Til dyrkning af og testning med  L. gibba  anbefales næringssubstratet 
20X AAP, som er beskrevet i tillæg 3.  
Steinberg-substratet, som beskrives i tillæg 3, er også velegnet til  L. 
minor  og kan desuden bruges til  L. gibba , når blot validitetskriteri ­
erne er opfyldt.  
1.7.5.  Testopløsninger  
Testopløsninger fremstilles sædvanligvis ved fortynding af en 
stamopløsning. Stamopløsningerne af teststoffet fremstilles normalt 
ved opløsning af stoffet i næringssubstrat.  
Den højeste testede koncentration af teststoffet skal sædvanligvis 
ikke være større end stoffets vandopløselighed under testbetingel ­
serne. Det skal dog bemærkes, at  Lemna  spp. flyder ovenpå og 
kan blive eksponeret for stoffer, som samler sig i vand-luft-grænse ­
fladen (f.eks. stoffer, der er tungtopløselige i vand, hydrofobe eller 
overfladeaktive). Under sådanne omstændigheder vil eksponeringen 
skyldes andet materiale end det opløste materiale, og alt efter test ­
stoffets egenskaber kan testkoncentrationerne være større end opløse ­
ligheden i vand. For teststoffer med lav vandopløselighed kan det 
være nødvendigt at fremstille en koncentreret stamopløsning eller 
-dispersion af stoffet ved hjælp af et organisk opløsnings- eller dispergeringsmiddel for at lette tilsætning af nøjagtige mængder test ­
stof til testsubstratet og medvirke til, at det dispergeres eller opløses. 
Brug af sådanne midler bør på enhver måde søges undgået. Brug af sådanne hjælpeopløsnings- og dispergeringsmidler må ikke medføre fytotoksisk virkning. Som eksempler på almindeligt anvendte opløs ­
ningsmidler, der er uden fytotoksisk virkning i koncentrationer op til 
100 μl·l
 –1 , kan nævnes acetone og dimethylformamid. Hvis der 
anvendes et opløsnings- eller dispergeringsmiddel, skal dets slutkon ­
centration rapporteres og skal holdes så lav som muligt 
(≤ 100 μl·l –1 ), og der skal være samme koncentration af opløsnings- 
eller dispergeringsmiddel i alle behandlings- og kontrolgrupper. Nærmere anvisninger kan findes i (11).
 
1.7.6.  Behandlings- og kontrolgrupper  
Det vil lette valget af passende teststofkoncentrationer, hvis man på 
forhånd kender til teststoffets toksicitet over for  Lemna , f.eks. fra et 
indledende forsøg. I den endelige toksicitetstest skal der normalt være 
mindst fem teststofkoncentrationer, der danner en geometrisk række. 
Kvotienten mellem testkoncentrationerne skal helst ikke være over 3,2, men kan dog være større, når koncentrations-responskurven er flad. Anvendes færre end fem koncentrationer, skal dette begrundes. Der 
skal anvendes mindst tre replikater for hver testkoncentration.
 
Ved fastsættelse af området for testkoncentrationerne (i det indle ­
dende forsøg og/eller i den endelige toksicitetstest) skal følgende 
tages i betragtning:  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Ved bestemmelse af en EC  x -værdi skal denne ligge i det område, 
testkoncentrationerne dækker, for at den skal blive bestemt med 
et tilstrækkeligt konfidensniveau. Ved beregning af en EC  50 - 
værdi skal den højeste testkoncentration således være større end EC
 50 -værdien. Ligger EC  50 -værdien uden for testkoncentra ­
tionernes område, bliver de tilhørende konfidensintervaller store, 
så det kan blive umuligt at foretage en pålidelig vurdering af modellens statistiske fit.
 
— Hvis målet er at bestemme en LOEC/NOEC-værdi, skal den 
laveste testkoncentration være så lav, at væksten ikke er væsent ­
ligt lavere end i kontrolprøven. Desuden skal den højeste test ­
koncentration være så høj, at væksten er væsentligt mindre end i kontrolprøven. Er det ikke tilfældet, må testen gentages med et 
andet koncentrationsområde (medmindre den højeste koncentra ­
tion svarer til opløselighedsgrænsen eller til den maksimalt krævede grænsekoncentration, f.eks. 100 mg·l
 –1 ). 
Hver test skal omfatte kontroller med samme næringssubstrat, 
samme antal blade og kolonier og samme miljøbetingelser og 
procedurer som testbeholderne, men uden teststof. Hvis der anvendes et opløsnings- eller dispergeringsmiddel, skal der indgå en ekstra kontrolbehandling med samme koncentration af opløsnings/ ­
dispergeringsmiddel som i testbeholderne med teststof. Antallet af 
replikate kontrolprøver (og, i givet fald, prøver med opløsningsmid ­
del) skal mindst være lig antallet af beholdere for hver testkoncen ­
tration, og ideelt skal der være dobbelt så mange.
 
Hvis der ikke kræves bestemmelse af NOEC, kan testens design 
ændres, så der er flere forskellige koncentrationer og færre replikater for hver koncentration. Der skal dog være mindst tre replikater af kontrolprøverne.
 
1.7.7.  Eksponering  
Kolonier bestående af 2 til 4 synlige blade overføres fra podekul ­
turen i tilfældig orden til testbeholderne under aseptiske betingelser. Hver testbeholder skal indeholde i alt 9 til 12 blade. Der skal være samme antal blade og kolonier i hver testbeholder. Erfaringerne med 
brugen af metoden og oplysninger fra ringtest har vist, at tre repli ­
kater pr. behandling med 9 til 12 blade som startværdi i hver replikat er tilstrækkeligt til at påvise vækstforskelle mellem behandlingerne svarende til en hæmning på 4 til 7 %, beregnet som væksthastighed 
(10 til 15 %, beregnet som udbytte) (10).
 
Testbeholdernes placering i inkubatoren skal være randomiseret for 
at minimere indflydelsen af rumlige forskelle i lysintensitet eller temperatur. Desuden skal testen enten have blokdesign, eller også 
skal testbeholderne omplaceres tilfældigt ved hver observation (eller 
hyppigere).
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Hvis en indledende stabilitetstest viser, at teststofkoncentrationen 
ikke kan opretholdes (dvs. den målte koncentration kommer ned 
under 80 % af den målte initialkoncentration) gennem hele testpe ­
rioden (7 dage), anbefales et semistatisk testregime. Dette gennem ­
føres ved, at kolonierne eksponeres for friskfremstillede test- og 
kontrolopløsninger mindst to gange i løbet af testen (f.eks. på dag 
3 og 5). Hyppigheden af eksponeringen for friskt substrat afhænger af teststoffets stabilitet. Meget ustabile eller flygtige stoffer kan kræve hyppigere eksponering, for at koncentrationerne kan holdes 
tilnærmelsesvis konstante. I visse tilfælde kan det være nødvendigt at 
bruge en gennemstrømningsmetode (11)(13).
 
Eksponeringsscenariet ved påføring på bladene (spray) er ikke 
omhandlet i denne metode. Der henvises i stedet til (14).  
1.7.8.  Inkubationsbetingelser  
Belysningen skal være konstant og komme fra lysstofrør med 
»warm« eller »cool white« lys med en styrke, der vælges i 
området 85-135 μE·m  –2 ·s –1 , målt i det fotosyntetisk aktive spektrum 
(400-700 nm) i punkter med samme afstand fra lyskilden som bladene af  Lemna  (svarende til 6 500-10 000 lux). Lysstyrken over 
testområdet må ikke afvige mere end ± 15 % fra den valgte 
lysstyrke. Den anvendte metode til lysdetektion og -måling, specielt den anvendte type sensor, vil påvirke måleværdien. Sfæriske sensorer (som reagerer på lys fra alle vinkler over og under måle ­
planet) og cosinus-sensorer (som reagerer på lys fra alle vinkler over 
måleplanet) må foretrækkes frem for retningsbestemte sensorer og vil give højere aflæsninger fra en lyskilde bestående af mange punkter som den her beskrevne.
 
Temperaturen i testbeholderne skal være 24 ± 2 °C. Kontrolsubstra ­
tets pH må højst stige med 1,5 enheder under testen. Dog vil en afvigelse på mere end 1,5 enhed ikke gøre testen ugyldig, når det kan vises, at validitetskriterierne er opfyldt. I særlige tilfælde, f.eks. 
testning af ustabile stoffer eller metaller, må der udvises ekstra 
opmærksomhed over for pH-afvigelse. Nærmere vejledning er givet i (11).
 
1.7.9.  Varighed  
Testen afsluttes 7 dage efter, at planterne er overført til testbehol ­
derne.  
1.7.10.  Målinger og analytiske bestemmelser  
Ved testens begyndelse tælles og registreres antallet af blade i test ­
karrene, idet der sørges for, at fremstående, klart synlige blade 
medtages. Antal blade med normalt og unormalt udseende 
bestemmes ved testens begyndelse, mindst hvert tredje døgn i løbet af eksponeringsperioden (dvs. mindst to gange i løbet af test ­
perioden på syv dage) samt ved testens slutning. Ændringer i plan ­
ternes udvikling, f.eks. i bladstørrelse, udseende, tegn på nekrose, 
chlorose eller opsvulmethed, opbrydning af kolonierne eller tab af disses flydeevne, samt i røddernes længde og udseende, skal regi ­
streres. Særlige kendetegn ved testsubstratet (f.eks. ikke-opløst mate ­
riale i testbeholderen eller algevækst på denne) skal ligeledes regi ­
streres.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Foruden at bladantallet registreres under testen, vurderes teststoffets 
virkninger på en (eller flere) af følgende målevariabler:  
i) totalt bladareal  
ii) tør vægt  
iii) frisk vægt.  
Bestemmelse af det totale bladareal har den fordel, at det kan 
bestemmes for hver testbeholder og kontrolbeholder både ved 
testens start, under testen og ved dens slutning. Den tørre og friske vægt bestemmes ved testens start på en prøve af podekulturen, der er repræsentativ for den, der anvendes til at begynde testen, samt 
ved testens slutning med plantemateriale fra hver test- og kontrolbe ­
holder. Hvis der ikke måles bladareal, er tør vægt at foretrække frem for frisk vægt.
 
Bestemmelse af totalt bladareal, tør vægt og frisk vægt kan foretages 
således:  
i) Totalt bladareal: Det totale bladareal af alle kolonier kan 
bestemmes ved billedanalyse: Der kan afbildes en silhuet af testbeholder og planter med et videokamera (idet beholderen 
anbringes på en lyskasse), og det resulterende billede digitalise ­
res. Derefter kan det totale bladareal i testbeholderen bestemmes ved kalibrering med flade former med kendt areal. Der skal sørges for at udelukke interferens fra testbeholderens rand. En 
alternativ, men mere omstændelig metode er at fotokopiere test ­
beholdere og planter, klippe den resulterende silhuet af koloni ­
erne ud og bestemme arealet med en bladareal-analysator eller ved hjælp af millimeterpapir. Også andre teknikker kan anvendes 
(f.eks. vejning af papiret svarende til silhuetten og sammenhol ­
delse med et enhedsareal).
 
ii) Tør vægt: Alle kolonier indsamles fra hver testbeholder og 
skylles med destilleret eller deioniseret vand. De duppes fri for overskydende vand og tørres derefter ved 60 °C, til vægten er konstant. Eventuelle rodstumper skal medtages. Den tørre vægt 
skal angives med en nøjagtighed mindst svarende til 0,1 mg.
 
iii) Frisk vægt: Alle kolonier overføres til på forhånd vejede rør af 
polystyren (eller andet inert materiale), hvis afrundede bund er 
forsynet med et lille hul (1 mm). Rørene centrifugeres derefter ved 3 000 o./min. i 10 minutter ved rumtemperatur. Rørene, der indeholder de nu tørrede kolonier, vejes igen, og den friske vægt 
beregnes ved fratrækning af vægten af de tomme rør.
 
1.7.10.1.  Hyppighed af målinger og analytiske bestemmelser  
Hvis testen udføres statisk, skal pH for hver behandling måles ved 
testens start og slutning. Udføres testen semistatisk, foretages pH- 
måling på hver portion »frisk« testopløsning før hver udskiftning 
foruden på de tilsvarende »brugte« opløsninger.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Lysintensiteten skal måles i vækstkammeret, inkubatoren eller lokalet 
i punkter med samme afstand til lyskilden som bladene af  Lemna . 
Målingerne foretages mindst én gang i løbet af testen. Mindst én gang dagligt måles temperaturen af substratet i en surrogatbeholder, der opbevares ved samme betingelser i klimakammeret, inkubatoren 
eller lokalet.
 
Under testen bestemmes teststofkoncentrationerne med passende 
intervaller. Mindstekravet i statiske test er bestemmelse af koncen ­
trationerne ved testens start og slutning.  
I semistatiske test, hvor teststofkoncentrationen ikke forventes at 
forblive inden for ± 20 % af den nominelle koncentration, er det 
nødvendigt at analysere alle frisk fremstillede testopløsninger, og de 
samme opløsninger analyseres ved hver udskiftning (se tredje afsnit i punkt 1.7.7). For de test, hvor den målte startkoncentration af test ­
stoffet ikke er inden for ± 20 % af den nominelle værdi, men hvor 
der kan fremlægges tilstrækkelig dokumentation for, at startkoncen ­
trationerne er repeterbare og stabile (dvs. inden for området 80- 120 % af startkoncentrationen), kan det godtages, at der kun fore ­
tages kemisk bestemmelse af den højeste og laveste testkoncentra ­
tion. I alle tilfælde behøver teststofkoncentrationen før udskiftning 
kun bestemmes på én replikat testbeholder ved hver testkoncentration (eller på indholdet af de poolede beholdere for hver replikat).
 
For gennemstrømningstest vil det være hensigtsmæssigt med en 
prøvetagningsplan svarende til den, der er beskrevet for semistatiske 
test, herunder analyse ved testens start, midtpunkt og slutning, men 
måling af »brugt« testopløsning er ikke hensigtsmæssig i dette tilfælde. I sådanne test skal flowhastigheden af fortyndingsmiddel og teststofopløsning eller teststof-stamopløsning kontrolleres dagligt.
 
Hvis det kan konstateres, at prøvestofkoncentrationen har været holdt 
tilfredsstillende inden for ± 20 % af den nominelle eller målte start ­
koncentration under hele testen, kan analysen af resultaterne baseres på nominelle eller målte startværdier. Er afvigelsen fra den nominelle 
eller målte startkoncentration større end ± 20 %, skal analysen af 
resultaterne baseres på den geometriske middelkoncentration under eksponeringen eller på modeller, der beskriver faldet i teststofkon ­
centrationen (11).
 
1.7.11.  Grænsetest  
Under visse omstændigheder, f.eks. når en indledende test viser, at 
teststoffet er uden toksiske virkninger i koncentrationer på op til 
100 mg·l  –1 , dog ikke over stoffets opløselighed i testsubstratet, kan 
der udføres en grænsetest, hvor reaktionen i en kontrolgruppe sammenholdes med reaktionen i én behandlingsgruppe (100 mg·l
 –1 
eller en koncentration lig med opløselighedsgrænsen). Det anbefales 
kraftigt, at dette understøttes ved analyse af eksponeringskoncentra ­
tionen. Alle de beskrevne testbetingelser og validitetskriterier finder anvendelse på en grænsetest bortset fra, at antallet af behandlings ­
replikater skal fordobles. Væksten i kontrol- og behandlingsgruppen 
kan analyseres med en statistisk test til sammenligning af middel ­
værdier, f.eks. Students t-test.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. DATA OG RAPPORTERING  
2.1. FORDOBLINGSTID  
Til bestemmelse af fordoblingstiden (T  d ) for bladantallet og forsøgets 
overensstemmelse med dette validitetskriterium (punkt 1.6) anvendes 
følgende formel på de data, der er indsamlet for kontrolbeholderne:  
T d = ln 2/μ 
hvor μ er den gennemsnitlige specifikke væksthastighed, der 
bestemmes som beskrevet i første og andet afsnit i punkt 2.2.1.  
2.2. RESPONSVARIABLER  
Testens formål er at bestemme teststoffets virkninger på den vege ­
tative vækst af  Lemna . I nærværende testmetode beskrives to 
responsvariabler, da præferencer og myndighedskrav er forskellige i medlemsstaterne. For at testresultaterne skal kunne godtages i alle medlemsstater, skal virkningerne vurderes ved hjælp af begge de 
nedenfor beskrevne responsvariabler a) og b).
 
a) Gennemsnitlig specifik væksthastighed: Denne responsvariabel 
beregnes på grundlag af den logaritmiske ændring i bladantallet 
samt den logaritmiske ændring i en anden måleparameter (totalt bladareal, tør vægt eller frisk vægt) med tiden (udtrykt pr. dag) i kontrollerne og i hver behandlingsgruppe. Den kaldes undertiden 
relativ væksthastighed (15).
 
b) Udbytte: Denne responsvariabel beregnes på grundlag af 
ændringen i bladantallet og desuden ændringen i en anden måle ­
parameter (totalt bladareal, tør vægt eller frisk vægt) i kontrol ­
lerne og i hver behandlingsgruppe indtil testens slutning.  
Det skal bemærkes, at toksicitetsværdier beregnet ved hjælp af disse 
to responsvariabler ikke er sammenlignelige, og at forskellen mellem dem må holdes for øje ved anvendelse af testens resultater. EC
 x - 
værdier baseret på gennemsnitlig specifik væksthastighed (E  r C x ) vil 
sædvanligvis være højere end resultater baseret på udbytte (E  y C x ), 
når testbetingelserne i denne metode er overholdt, hvilket følger af det matematiske grundlag for de to beregningsmåder. Dette må ikke opfattes som en forskel i følsomhed mellem de to responsvariabler, 
men kun, at der er tale om to matematisk forskellige størrelser. 
Begrebet gennemsnitlig specifik væksthastighed bygger på det gene ­
relle eksponentielle vækstmønster for andemad i ikke-begrænsede kulturer, idet toksiciteten vurderes på grundlag af virkningerne på 
væksthastigheden og ikke afhænger af den absolutte størrelse af den 
specifikke væksthastighed af kontrollen, koncentrations-responskur ­
vens hældning eller testens varighed. Resultater, der er baseret på responsvariablen udbytte, afhænger derimod af alle disse øvrige vari ­
abler. E
 y C x afhænger af den specifikke væksthastighed af de arter af 
andemad, der anvendes i hver test, og af den maksimale specifikke væksthastighed, som kan variere mellem de forskellige arter og endda kloner. Denne responsvariabel bør ikke anvendes til at 
sammenligne følsomheden over for giftstoffer mellem forskellige 
arter af andemad, endsige forskellige kloner. Skønt det videnskabe ­
ligt foretrukne grundlag til vurdering af toksicitet er den gennemsnit ­
lige specifikke væksthastighed, indeholder nærværende testmetode 
også toksicitetsvurderinger baseret på udbytte for at imødekomme 
de aktuelle myndighedskrav i visse stater.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Beregningen af toksicitet skal baseres på bladantal og på mindst én 
anden målevariabel (totalt bladareal, tør vægt eller frisk vægt), da 
visse stoffer kan påvirke andre målevariabler langt mere end bladan ­
tallet. Denne virkning ville ikke blive opdaget ved beregning af bladantallet alene.
 
Bladantallet og eventuelle andre registrerede målevariabler, dvs. 
totalt bladareal, tør vægt eller frisk vægt, samles i en tabel 
sammen med teststofkoncentrationerne for hvert målepunkt. Den 
efterfølgende dataanalyse, f.eks. beregning af estimater for LOEC, NOEC eller EC
 x , skal baseres på værdierne for de enkelte replikater 
og ikke beregnede gennemsnit for hver behandlingsgruppe.  
2.2.1.  Gennemsnitlig specifik væksthastighed  
Den gennemsnitlige specifikke væksthastighed for en given periode 
beregnes som den logaritmiske stigning i vækstvariablerne — 
bladantal og en anden målevariabel (totalt bladareal, tør vægt eller 
frisk vægt) — ved hjælp af nedenstående udtryk for hver replikat af kontrol og behandlingsprøve:
 
μ iÄj ¼ lnX j – lnX i 
t j Ä t i , (dag  -1 ) 
hvor:  
— μ i-j : er den gennemsnitlige specifikke væksthastighed i tids ­
rummet fra i til j  
— N  i : er værdien af målevariablen i test- eller kontrolbehol ­
deren til tiden i  
— N  j : er værdien af målevariablen i test- eller kontrolbehol ­
deren til tiden j  
— t: er tidsrummet fra i til j  
For hver behandlings- og kontrolgruppe beregnes en gennemsnitlig 
væksthastighed samt estimater for variansen.  
Den gennemsnitlige specifikke væksthastighed skal beregnes for hele 
testperioden (tiden »i« i ovenstående formel er testens starttid, og tiden »j« er testens sluttid). For hver testkoncentration og kontrol beregnes en gennemsnitsværdi af den specifikke væksthastighed samt 
estimater for variansen. Derudover foretages en trinvis beregning af 
væksthastigheden for at vurdere teststoffets virkninger i ekspone ­
ringsperioden (f.eks. ved betragtning af logaritmisk transformerede vækstkurver). Væsentlige forskelle mellem den trinvist beregnede 
væksthastighed og den gennemsnitlige væksthastighed tyder på en 
afvigelse fra konstant eksponentiel vækst, og nøje granskning af vækstkurverne er da nødvendig. I så fald kan et forsigtigt skøn opstilles ved at sammenholde de specifikke væksthastigheder fra 
behandlede kulturer i det tidsrum, hvor hæmningen er maksimal, 
med de tilsvarende værdier for kontrolprøver i samme tidsrum.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Hæmningen i procent af væksthastigheden (I  r ) kan derefter beregnes 
for hver testkoncentration (behandlingsgruppe) af følgende udtryk:  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
hvor:  
— % I  r : er hæmningen i procent af den gennemsnitlige specifikke 
væksthastighed  
— μ C : er gennemsnitsværdien af μ i kontrolgruppen  
— μ T : er gennemsnitsværdien af μ i behandlingsgruppen  
2.2.2.  Udbytte  
Virkningerne på udbyttet bestemmes på grundlag af to målevariabler, 
bladantallet og en anden målevariabel (totalt bladareal, tør vægt eller frisk vægt) i hver testbeholder ved testens start og slutning. For tør vægt og frisk vægt bestemmes start-biomassen på grundlag af en 
prøve af blade, der tages fra samme batch som den, der er 
anvendt til at pode testbeholderne (se andet afsnit i punkt 1.7.3). For hver testkoncentration og kontrol beregnes en gennemsnitsværdi af udbyttet samt estimater for variansen. Udbyttehæmningen i 
procent (% I
 y ) kan beregnes for hver behandlingsgruppe som følger:  
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
hvor:  
— % I  y : er udbyttereduktionen i procent  
— b  C : er slut-biomasse minus start-biomasse for kontrol ­
gruppen  
— b  T : er slut-biomasse minus start-biomasse for behandlings ­
gruppen  
2.2.3.  Optegning af koncentrations-responskurver  
Der afsættes koncentrations-responskurver over sammenhængen 
mellem den gennemsnitlige hæmningsprocent for responsvariablerne (I
 r eller I  y , beregnet som vist i sidste afsnit i punkt 2.2.1 eller i 
punkt 2.2.2) og logaritmen til teststofkoncentrationen.  
2.2.4.  Beregning af EC  x 
Estimaterne for EC  x (f.eks. EC  50 ) baseres på gennemsnitsværdien 
dels af specifik væksthastighed (E  r C x ), dels af udbytte (E  y C x ), der 
hver især er baseret på bladantal og endnu en målevariabel (totalt 
bladareal, tør vægt eller frisk vægt). Dette skyldes, at der findes 
teststoffer med forskellig virkning på bladantallet og på de øvrige målevariabler. Som parametre for toksicitet er der derfor fire EC
 x - 
værdier for hvert beregnet hæmningsniveau x: E  r C x (bladantal), E  r C x 
(totalt bladareal, tør vægt eller frisk vægt), E  y C x (bladantal) og E  y C x 
(totalt bladareal, tør vægt eller frisk vægt).  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. STATISTISKE METODER  
Målet er at formulere den kvantitative koncentrations-responssam ­
menhæng ved hjælp af regressionsanalyse. Der kan anvendes vægtet lineær regression efter forudgående lineariserende transfor ­
mation af responsdataene — til f.eks. probit-, logit- eller Weibull- 
enheder (16), men det må foretrækkes at benytte ikke-lineære regres ­
sionsmetoder, da de bedre håndterer de uundgåelige uregelmæssig ­
heder i data og afvigelser fra jævne fordelinger. I området tæt på 
enten ingen hæmning eller total hæmning kan sådanne uregelmæs ­
sigheder blive forstørret ved transformation og derved gribe forstyr ­
rende ind i analysen (16). Det må bemærkes, at standardanalyseme ­
toder, hvor der bruges probit-, logit- eller Weibull-transformerede 
variabler, er bestemt til brug på binære data (f.eks. død eller over ­
levelse) og må modificeres for at kunne benyttes til data for vækst ­
hastighed eller udbytte. Særlige metoder til bestemmelse af EC
 x - 
værdier ud fra kontinuerte data findes i henvisning (17)(18) og (19).  
For hver responsvariabel, der skal analyseres, anvendes koncentra ­
tions-responsrelationen til at beregne punktestimater for EC  x -værdier. 
Når det er muligt, skal der bestemmes 95 % konfidensgrænser for 
hvert estimat. Responsdataenes tilpasningsgrad til regressions ­
modellen vurderes enten grafisk eller statistisk. Regressionsanalysen skal foretages på responsværdierne for de enkelte replikater, ikke på gruppegennemsnit.
 
Hvis de tilgængelige regressionsmodeller eller -metoder er uegnede 
til dataene, kan estimater og konfidensgrænser for EC  50 desuden fås 
ved lineær interpolation med bootstrapping (20).  
Til beregning af et estimat for LOEC og dermed NOEC må middel ­
værdierne for behandlingerne sammenholdes ved hjælp af varians ­
analyse. Gennemsnittet for hver koncentration sammenholdes derefter med gennemsnittet for kontrollerne ved hjælp af en egnet 
multisammenlignings- eller trend test-metode. Dunnetts eller Willi ­
ams’ test kan være nyttig (21)(22)(23)(24). Det må vurderes, om variansanalysens forudsætning om varianshomogenitet er opfyldt. Denne vurdering kan foretages grafisk eller ved en formel test 
(25). Hertil kan Levenes eller Bartletts test anvendes. Manglende 
opfyldelse af forudsætningen om varianshomogenitet kan undertiden afhjælpes ved logaritmisk transformation af dataene. Hvis variansen er ekstremt heterogen og ikke kan korrigeres ved transformation, må 
analyse med step-down Jonkheere trend test overvejes. Supplerende 
vejledning for bestemmelse af NOEC er givet i (19).
 
Den senere tids videnskabelige udvikling har ført til en anbefaling 
om, at NOEC-begrebet afskaffes og erstattes med regressionsbase ­
rede punktestimater EC  x . Der er ikke fastlagt en passende værdi af x 
til denne  Lemna -test. Et område på 10 til 20 % synes imidlertid at 
være passende (afhængigt af den valgte responsvariabel), og det må 
foretrækkes at rapportere både EC  10 og EC  20 . 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT  
Testrapporten skal indeholde følgende:  
Teststoffet:  
— fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber, herunder vandop ­
løselighed  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— kemiske identifikationsdata (f.eks. CAS-nr.), herunder renhed.  
Testede arter:  
— videnskabeligt navn, klon (hvis den kendes) og kilde.  
Testbetingelser:  
— den anvendte testmetode (statisk, semistatisk eller gennemstrøm ­
ningstest)  
— startdato og varighed for testen  
— testsubstrat  
— beskrivelse af testens design: testbeholdere og låg, opløsnings ­
volumener, antal kolonier og blade pr. testbeholder ved testens 
start 
— testkoncentrationer (nominelle eller målte) og antal replikater for 
hver koncentration  
— metoder til fremstilling af stam- og testopløsninger, herunder 
eventuelle opløsnings- og dispergeringsmidler  
— testtemperaturen  
— lyskilde, lysintensitet og -homogenitet  
— pH-værdierne af test- og kontrolsubstraterne  
— teststofkoncentrationer og analysemetoder med fyldestgørende 
oplysninger om kvalitetsvurdering (valideringsundersøgelser, 
standardafvigelser eller konfidensgrænser for analyserne)  
— metoder til bestemmelse af bladantal og andre målevariabler, 
f.eks. tør vægt, frisk vægt og bladareal  
— alle fravigelser af nærværende testmetode.  
Resultater:  
— rådata: antal blade og andre målevariabler i hver test- og kontrol ­
beholder ved hver observation og hver analyse  
— gennemsnit og standardafvigelse for hver målevariabel  
— vækstkurver for hver koncentration (brug af logaritmisk transfor ­
merede målevariabler anbefales, se andet afsnit i punkt 2.2.1)  
— fordoblingstid/væksthastighed i kontrolprøven, baseret på 
bladantal  
— beregnede responsvariabler for hver behandlingsreplikat, med 
gennemsnitsværdier og variationskoefficient for replikaterne  
— grafisk fremstilling af sammenhængen mellem koncentration og 
virkning  
— estimater for toksicitetsendepunkter for responsvariablerne, f.eks. 
EC 50 , EC  10 , EC  20 , med tilhørende konfidensintervaller; LOEC 
og/eller NOEC (hvis disse er beregnet) og de statistiske metoder, 
der anvendt til at beregne dem  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— hvis variansanalyse er anvendt, størrelsen af den virkning, det er 
muligt at påvise (f.eks. mindste signifikante forskel)  
— enhver vækststimulation, der er fundet ved nogen behandling  
— ethvert visuelt tegn på fytotoksicitet samt observationer af testop ­
løsningerne  
— diskussion af resultaterne, herunder den eventuelle betydning af 
fravigelser fra nærværende testmetode.  
4. LITTERATUR  
(1) OECD TG 221 (2006)  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test.  
(2) Der redegøres nærmere for brugen af  Lemna -undersøgelser for 
farvede stoffer i afsnit 13.5.3 i EU's Manual of Decisions fra juli 2006, se: http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals
 
(3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; 
Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, avai ­
lable at  
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ 
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.
 
(5) USEPA — United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  
Lemna  spp., »Public draft«. EPA 712-C-96-156. 8pp.  
(6) AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). 
XP T 90-337: Détermination de l’inhibition de la croissance 
de Lemna minor . 10pp.  
(7) SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , 
duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (på svensk).  
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater 
Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37-120 pp.  
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and 
Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.
 
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.
 
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and 
Assessment No.23.  
(12) ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) — Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor  L.). Environmental Research Labora ­
tory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3-77 108. September 1977.
 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). 
Bioassays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of 
sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 
353-359.  
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, 481-483.  
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.
 
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.
 
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.
 
(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
 
(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482-491.  
(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
 
(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93-96.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Tillæg 1  
Beskrivelse af Lemna spp.  
Vandplanten med trivialnavnet andemad,  Lemna  spp., tilhører familien  Lemna­
ceae, der omfatter en række arter, som er udbredt over hele verden og består af 
fire slægter. Deres respektive udseende og taksonomi er beskrevet udtømmende 
(1)(2).  Lemna gibba  og L. minor  er repræsentative arter fra tempererede områder 
og finder almindelig anvendelse i toksicitetstest. Begge arter har flydende eller nedsænket skiveformet stilk (blad) og en meget tynd rod, der udgår fra midten af undersiden på hvert blad.  Lemna  spp. danner sjældent blomster, og planterne 
formerer sig vegetativt ved at skyde nye blade (3). De unge planter er blegere 
og har kortere rødder end de ældre planter og består af to-tre blade af forskellig størrelse.  Lemnas  enkle struktur, ukønnede formering og korte generationstid gør 
planten meget velegnet til laboratorietest (4)(5).
 
På grund af artsbetingede forskelle i følsomhed er sammenligning af følsomhed 
kun gyldig inden for samme art.  
Eksempler på arter af Lemna, der er blevet anvendt til testning: Henvis ­
ninger vedrørende de forskellige arter  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.
 
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., »Public draft«. 
EPA 712-C-96-156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of 
growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (på svensk).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 
733-742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., »Public draft«. EPA 
712-C-96-156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 
483. ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Kilder til Lemna-arter  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2  
Tlf. +1 4169783641  
Fax +1 4169785878  
E-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
USA  
Tlf. +1 9195157572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 STOCKHOLM  
SVERIGE  
Tlf. +46 86747240  
Fax: +46 86747636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
TYSKLAND  
E-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Litteratur  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agric ­
ultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Tillæg 2  
Vedligeholdelse af stamkultur  
Ved lavere temperatur (4-10 °C) kan stamkulturer vedligeholdes i længere tid 
uden at skulle gendannes. Næringssubstratet til  Lemna  kan være det samme som 
det, der anvendes ved testning, men andre næringsrige substrater kan anvendes til 
stamkulturer.  
Med jævne mellemrum udtages et antal unge, lysegrønne planter og overføres 
aseptisk til nye dyrkningsbeholdere med friskt substrat. Under de her foreslåede køligere forhold kan dyrkning af subkulturer ske med op til tre måneders mellem ­
rum.
 
Der skal anvendes kemisk rene (syrevaskede) og sterile dyrkningsbeholdere af 
glas samt aseptisk håndtering. Hvis en stamkultur bliver kontamineret med. f.eks. 
alger eller svampe, må der foretages indgreb til at eliminere kontaminanten. For algers og de fleste andre kontaminanters vedkommende kan dette opnås ved overfladesterilisation. Der udtages en prøve af det kontaminerede plantemateriale, 
og rødderne klippes bort. Materialet omrystes derefter kraftigt med rent vand, 
efterfulgt af nedsænkning i en 0,5 % (v/v) opløsning af natriumhypochlorit i mellem 30 sekunder og 5 minutter. Plantematerialet skylles derefter med sterilt 
vand og overføres i et par portioner til dyrkningsbeholdere indeholdende friskt 
næringssubstrat. Mange af bladene vil dø som følge af denne behandling, specielt hvis der anvendes længere eksponeringsperioder, men nogle af de overlevende vil sædvanligvis være fri for kontaminering. Disse kan derefter bruges til podning 
af nye kulturer.
 ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Tillæg 3  
Substrater  
Der anbefales forskellige næringssubstrater til  L. minor  og L. gibba . Til L. minor  
anbefales et modificeret substrat efter Swedish Standard (SIS), mens substratet 20X AAP anbefales til  L. gibba . Nedenfor er sammensætningen af de to 
substrater angivet. Til fremstilling af sådanne substrater skal anvendes kemikalier 
af reagens- eller analysekvalitet og deioniseret vand.
 
Lemna -næringssubstrat efter Swedish Standard (SIS)  
— Stamopløsning I-V steriliseres ved autoklavering (120 °C, 15 min.) eller ved 
membranfiltrering (porediameter ca. 0,2 μm). 
— Stamopløsning VI (og valgfrit VII) steriliseres kun ved membranfiltrering og 
må ikke autoklaveres.  
— Sterile stamopløsninger skal opbevares køligt og mørkt. Stamopløsning I-V 
skal kasseres efter seks måneder, mens holdbarheden for stamopløsning VI 
(og valgfrit VII) er én måned.  
Stam opløsning 
nr. Stof Koncentration i 
stamopløsningen 
(g· l  –1 ) Koncentration i 
færdigt substrat 
(mg·l  –1 ) Færdigt substrat 
Grundstof Koncentration 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na, N 
K, P 32, 14 
6,0, 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg, S 7,4, 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca, Cl 9,8, 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010 1,00 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010 B 
Mn 
Mo 
Zn Cu Co 0,17 
0,056 
0,0040 
0,011 0,0013 0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (buffer) 490 490 — —  
— Til fremstilling af én liter SIS-substrat tilsættes følgende til 900 ml deioni ­
seret vand:  
— 10 ml stamopløsning I  
— 5 ml stamopløsning II  
— 5 ml stamopløsning III  
— 5 ml stamopløsning IV  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml stamopløsning V  
— 5 ml stamopløsning VI  
— 1 ml stamopløsning VII (valgfrit)  
Bemærkning:  Til visse teststoffer kan der yderligere være brug for en stamopløsning VII 
(MOPS-buffer) (se sidste afsnit i punkt 1.4).  
— pH justeres til 6,5 ± 0,2 med enten 0,1 M eller 1 M HCl eller NaOH, og der 
fyldes op til én liter med deioniseret vand.  
20X AAP-næringssubstrat  
Stamopløsninger fremstilles i sterilt, destilleret eller deioniseret vand.  
Sterile stamopløsninger skal opbevares køligt og mørkt. Under disse betingelser 
vil stamopløsningerne have en holdbarhed på mindst 6-8 uger.  
Der fremstilles fem næringssubstrat-stamopløsninger (A1, A2, A3, B og C) til 
20X AAP-substrat, idet der anvendes kemikalier af reagenskvalitet. Næringssub ­
stratet fremstilles ved, at der tilsættes 20 ml af hver næringssubstrat-stamopløs ­
ning til ca. 850 ml deioniseret vand. pH justeres til 7,5 ± 0,1 med enten 0,1 M 
eller 1 M HCl eller NaOH, og der fyldes op til én liter med deioniseret vand. 
Substratet filtreres gennem et membranfilter med en porediameter på ca. 0,2 μm 
over i en steril beholder.  
Det næringssubstrat, der skal bruges til testningen, skal fremstilles 1-2 dage før 
brug, for at pH kan stabiliseres. Næringssubstratets pH skal kontrolleres før brug 
og om nødvendigt justeres igen med 0,1 M eller 1 M NaOH eller HCl som 
beskrevet ovenfor.  
Stamopløsning 
nr. Stof Koncentration i 
stamopløsningen 
(g·l –1 ) (*) Koncentration i 
færdigt substrat 
(mg·l  –1 ) (*) Færdigt substrat 
Grundstof Koncentration 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 
4,4 510 
240 
90 Na, N 
Mg 
Ca 190, 84 
58,08 
24,04 
A2 MgSO  4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K, P 9,4, 3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 0,16 0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 3,2 6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn Fe — Zn Co Mo 
Cu 0,65 
2,3 0,66 — 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na, C 220, 43  
(*) Medmindre noteret.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Fodnote: Den teoretisk mest passende endelige bicarbonatkoncentration (som vil overflødig ­
gøre nævneværdig pH-justering) er 15 mg/l, ikke 300 mg/l. Den traditionelle brug 
af 20X AAP-substratet og ringtesten af metoden er imidlertid baseret på 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse og R. Lacey. (1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition 
Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Tech ­
nical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.
 
STEINBERG-substrat (efter ISO 20079)  
Koncentrationer og stamopløsninger  
— Det modificerede Steinberg-substrat anvendes i ISO 20079 til  Lemna minor  
alene (da der deri kun tillades brug af  Lemna minor ), men også med  Lemna 
gibba  er der opnået gode testresultater.  
— Til fremstilling af substratet skal der anvendes kemikalier af reagens- eller 
analysekvalitet og deioniseret vand.  
— Næringssubstratet fremstilles af stamopløsninger eller af det 10-dobbelt 
koncentrerede substrat, som har den maksimale substratkoncentration uden udfældning.
 
Tabel 1  
pH-stabiliseret STEINBERG-substrat (modificeret efter Altenburger)  
Stof Næringssubstrat  
Makronæringsstoffer  molvægt mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikronæringsstoffer  molvægt μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA-dinatrium-dihydrat 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabel 2  
Stamopløsninger (makronæringsstoffer)  
1. Makronæringsstoffer (50 gange koncentreret)  g/l  
Stamopløsning 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Stamopløsning 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Stamopløsning 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabel 3  
Stamopløsninger (mikronæringsstoffer)  
2. Mikronæringsstoffer (1 000 gange koncentreret)  mg/l  
Stamopløsning 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Stamopløsning 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Stamopløsning 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Stamopløsning 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Stamopløsning 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA-dinatrium-dihydrat 1 500,00  
— Stamopløsning 2 og 3 og 4 til 7 kan pooles hver for sig (idet de nødvendige 
koncentrationer tages i betragtning).  
— For at få opnå længere holdbarhed autoklaveres stamopløsningerne ved 
121 °C i 20 min., eller sterilfiltreres (0,2 μm) som alternativ. Brug af sterilfil ­
trering (0,2 μm) tilrådes kraftigt til stamopløsning 8.  
Fremstilling af den endelige koncentration af STEINBERG-substratet (modi ­
ficeret)  
— Der tilsættes 20 ml stamopløsning 1, 2 og 3 (se tabel 2) til ca. 900 ml 
deioniseret vand for at undgå udfældning.  
— Der tilsættes 1,0 ml stamopløsning 4, 5, 6, 7 og 8 (se tabel 3).  
— pH skal være 5,5 ± 0,2 (justeres ved tilsætning af mindst mulig NaOH- 
opløsning eller HCl).  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Der fyldes op med vand til 1 000 ml.  
— Hvis stamopløsningerne er steriliseret, og det anvendte vand er af den 
korrekte kvalitet, kræves ingen yderligere sterilisering. Hvis steriliseringen 
finder sted på det endelige substrat, skal stamopløsning 8 tilsættes efter auto ­
klavering (ved 121 °C i 20 min.).  
Fremstilling af det 10-dobbelt koncentrerede STEINBERG-substrat (modifi ­
ceret) til midlertidig opbevaring  
— Der tilsættes 20 ml stamopløsning 1, 2 og 3 (se tabel 2) til ca. 30 ml vand for 
at undgå udfældning.  
— Der tilsættes 1,0 ml stamopløsning 4, 5, 6, 7 og 8 (se tabel 3). Der fyldes op 
med vand til 100 ml.  
— Hvis stamopløsningerne er steriliseret, og det anvendte vand er af den 
korrekte kvalitet, kræves ingen yderligere sterilisering. Hvis steriliseringen finder sted på det endelige substrat, skal stamopløsning 8 tilsættes efter auto ­
klavering (ved 121 °C i 20 min.).
 
— pH af substratet (i den endelige koncentration) skal være 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27.  TOKSICITETSTEST SEDIMENT/VAND PÅ CHIRONOMIDER 
MED FORURENET SEDIMENT  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 218 (2004). 
Formålet med denne test er at vurdere virkningerne på larver af ferskvands ­
dipteraen Chironomus sp., der lever i sediment, af forlænget eksponering for 
kemikalier. Den er baseret på de eksisterende toksicitetstestprotokoller for Chironomus riparius og Chironomus tentans, der er blevet udviklet i Europa (1) (2) (3) og Nordamerika (4) (5) (6) (7) (8) og ringtestet (1) (6) (9). Andre 
veldokumenterede chironomidarter kan også benyttes, f.eks. Chironomus 
yoshimatsui (10) (11).
 
2. Eksponeringsscenariet i denne testmetode er spiking (forurening) af sedi ­
ment med teststoffet. Valget af det mest velegnede eksponeringsscenario 
afhænger af, hvad testen skal anvendes til. Scenariet med sedimentspiking har til formål at simulere akkumulerede niveauer af kemikalier i sedimentet. Dette eksponeringssystem omfatter spiking af sediment i et sediment/vand- 
testsystem.
 
3. Stoffer, der skal testes i forbindelse med organismer, der lever i sediment, 
forefindes normalt i dette rum over længere tid. Organismer, der lever i 
sediment, kan eksponeres ad forskellige veje. Den relative vigtighed af 
den enkelte eksponeringsvej og den tid, der tager for hver enkelt at bidrage til de generelle toksiske virkninger, afhænger af de fysisk-kemiske egenskaber af det pågældende kemikalie. Ved stærkt adsorberende stoffer 
(f.eks. med log K
 ow > 5) eller ved stoffer, der kovalent bindes til sediment, 
kan indtagelse af kontamineret føde være en væsentlig eksponeringsvej. For ikke at undervurdere toksiciteten af højt lipofile stoffer kan det overvejes at 
tilsætte foder til sedimentet før tilsætning af teststoffet. For at tage alle 
potentielle eksponeringsveje i betragtning fokuserer denne testmetode på langtidseksponering. Testens varighed er 20-28 dage for C. riparius og C. yoshimatsui og 28-65 dage for C. tentans. Hvis der kræves korttidsdata til 
særlige formål, f.eks. for at undersøge virkningerne af et ustabilt kemikalie, 
kan yderligere replikater fjernes efter en periode på 10 dage.
 
4. De målte effektparametre er det samlede antal voksne, der har udviklet sig, 
og tiden, der er gået med udvikling. Det anbefales, at målinger af larvers 
overlevelse og vækst kun udføres efter en periode på 10 dage, hvis der kræves yderligere korttidsdata, ved hjælp af eventuelle yderligere replikater.
 
5. Det anbefales at anvende formuleret sediment. Der er flere fordele ved 
formuleret sediment i forhold til naturlige sedimenter:  
— udsvingene i forsøgene reduceres, idet der dannes en reproducerbar 
»standardiseret matrix«, og der er ikke brug for at finde ikke-kontaminerede og rene sedimentkilder
 
— testene kan indledes på ethvert tidspunkt, uden at der opstår sæsonbe ­
tingede udsving i testsedimentet, og der er ikke behov for at forbehandle sedimentet med henblik på at fjerne hjemmehørende fauna; brugen af formuleret sediment reducerer også omkostningerne i forbindelse med 
opsamling af tilstrækkelige mængder sediment i felten til rutinetest
 
— anvendelsen af formuleret sediment gør det muligt at sammenligne toksi ­
citet og rangordne stoffer i overensstemmelse hermed.  
6. De anvendte definitioner er anført i tillæg 1.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
TESTENS PRINCIP  
7. Æglarver af chironomider eksponeres for et koncentrationsinterval af testke ­
mikaliet i sediment/vand-systemer. Teststoffet tilsættes sedimentet, og æglar ­
verne overføres derefter til bægerglas, hvor sediment- og vandkoncentratio ­
nerne er blevet stabiliseret. Emergens- og udviklingstiden for chironomider 
måles ved afslutningen af testen. Larvernes overlevelse og vægt kan om nødvendigt også måles efter 10 dage (ved brug af yderligere replikater). Disse data analyseres ved hjælp af en regressionsmodel for at anslå den 
koncentration, der vil forårsage en reduktion på × % i emergens, larveover ­
levelse eller larvevækst (f.eks. EC
 15 , EC  50 osv.), eller ved hjælp af statistisk 
hypotesetest med henblik på at bestemme en NOEC/LOEC. Sidstnævnte 
kræver sammenligning af effektværdier med kontrolværdier ved hjælp af 
statistiske test.  
OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET  
8. Teststoffets vandopløselighed, damptryk, målt eller beregnet, fordeling i 
sediment samt stabilitet i vand og sediment bør kendes. En pålidelig analysemetode til kvantificering af teststoffet i overliggende vand, porevand og sediment med kendt og publiceret nøjagtighed og nedre målegrænse bør 
foreligge. Nyttige oplysninger omfatter teststoffets strukturformel og renhed. 
Teststoffets kemiske skæbne (f.eks. spredning, abiotisk og biotisk nedbryd ­
ning osv.) er også nyttige oplysninger. For stoffer, der er vanskelige at teste som følge af deres fysisk-kemiske egenskaber, findes der yderligere vejled ­
ning i (12).
 
REFERENCEKEMIKALIER  
9. Referencekemikalier kan testes periodisk for at sikre, at testprotokollen og 
-betingelserne er pålidelige. Eksempler på referencetoksikanter, der er 
anvendt med godt resultat i ringtest og valideringsforsøg, omfatter lindan, trifluralin, pentachlorphenol, cadmiumchlorid og kaliumchlorid (1) (2) (5) (6) (13).
 
TESTENS VALIDITET  
10. Testens validitet forudsætter følgende:  
— emergensen i kontrolbeholderne skal være mindst 70 % ved testens 
afslutning (1) (6)  
— emergensen af C. riparius og C. yoshimatsui til voksne fra kontrolglas ­
sene skal ske mellem 12 og 23 dage efter deres overførsel til testglas ­
sene; for C. tentans kræves der en periode på 20-65 dage  
— ved testens afslutning måles pH og koncentrationen af opløst ilt i hvert 
bægerglas. Koncentrationen af opløst ilt skal være mindst 60 % af 
værdien for mætning med luft (ASV) ved den anvendte temperatur, og pH i det overliggende vand skal være i intervallet 6-9 i alle bæger ­
glas
 
— vandtemperaturen må højst variere med ± 1,0 °C. Vandtemperatur kan 
styres ved at anvende et isotermisk rum, og i det tilfælde bekræftes 
rumtemperaturen med passende tidsintervaller.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Testglas  
11. Forsøget udføres i 600 ml bægerglas med en diameter på 8 cm. Andre 
beholdere kan anvendes, men de skal kunne sikre en passende dybde for det overliggende vand og sediment. Sedimentoverfladen skal være tilstræk ­
kelig (2 til 3 cm
 2 pr. larve). Forholdet mellem dybden af sedimentlaget og 
dybden af det overliggende vand skal være 1:4. Testglas og andet udstyr, 
der kommer i berøring med testsystemet, skal være udført helt i glas eller andet kemisk inaktivt materiale (f.eks. Teflon).
 
Valg af fiskeart  
12. Den art, der skal benyttes i testen, er fortrinsvis Chironomus riparius. Chiro ­
nomus tentans kan også anvendes, men er vanskeligere at håndtere og kræver en længere testperiode. Chironomus yohimatsui kan også anvendes. 
Detaljer om dyrkningsmetoder findes i tillæg 2 vedrørende Chironomus 
riparius. Oplysninger om dyrkningsbetingelser findes også for andre arter, dvs. Chironomus tentans (4) og Chironomus yoshimatsui (11). Identifikation af arten skal bekræftes inden testning, men kræves ikke før hver test, hvis 
organismer kommer fra en intern bestand.
 
Sediment  
13. Formuleret sediment (også kaldet rekonstitueret, kunstigt eller syntetisk sedi ­
ment) bør fortrinsvis anvendes. Hvis naturligt sediment anvendes, skal det 
karakteriseres (som minimum ved hjælp af pH og organisk kulstofindhold, 
men andre parametre anbefales også, f.eks. C/N-forhold og kornstørrelse), og det bør være uden forurening og andre organismer, der kan konkurrere med eller æde chironomiderne. Inden naturligt sediment anvendes i en 
toksicitetstest på chironomider, bør det desuden konditioneres i syv dage 
under de betingelser, der anvendes i den efterfølgende test. Det anbefales at bruge følgende formulerede sediment, som er baseret på den syntetiske jord, der anvendes i testmetode C.8 (14), i denne test (1) (15) (16):
 
a) 4-5 % (tørvægt) tørv: så tæt på pH 5,5 til 6,0 som muligt; det er vigtigt 
at bruge pulveriseret tørv, findelt (partikelstørrelse ≤ 1 mm) og kun 
lufttørret  
b) 20 % (tørvægt) kaolinholdigt ler, helst med over 30 % kaolinit  
c) 75-76 % (tørvægt) kvartssand (overvejende finsand med over 50 % af en 
partikelstørrelse på 50 til 200 μm) 
d) deioniseret vand tilsættes for at få et fugtindhold i den færdige blanding 
på 30-50 %  
e) kemisk rent calciumcarbonat (CaCO  3 ) tilsættes for at få en pH-værdi i 
den færdige sedimentblanding på 7,0 ± 0,5. Det organiske kulstofindhold i den færdige blanding skal være 2 % (± 0,5 %), og det justeres ved brug af passende mængder tørv og sand som anført i litra a) og c).
 
14. Oprindelsen af tørv, kaolinler og sand skal være kendt. Det kontrolleres, at 
sedimentkomponenterne ikke indeholder kemisk forurening (f.eks. tungme ­
taller, organiske chlorforbindelser, organiske phosphorforbindelser osv.). Et 
eksempel på fremstilling af formuleret sediment er beskrevet i tillæg 3. Blanding af tørre bestanddele accepteres også, hvis det påvises, at der ikke sker en separation af sedimentets bestanddele efter tilsætning af over ­
liggende vand (f.eks. at tørvepartikler flyder ovenpå), og at tørven eller 
sedimentet er tilstrækkeligt konditioneret.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Vand  
15. Til brug i testen kan anvendes vand, der er i overensstemmelse med de 
kemiske karakteristika for acceptabelt fortyndingsvand, som beskrevet i tillæg 2 og 4. Som dyrknings- og fortyndingsvand kan accepteres råvand 
(overflade- eller grundvand), rekonstitueret vand (se tillæg 2) eller afkloret 
ledningsvand, såfremt chironomider kan overleve i vandet i et tidsrum svarende til dyrknings- og testperioden uden at vise tegn på stress. Ved testens begyndelse skal testvandet have en pH-værdi på 6-9 og en hårdheds ­
grad på højst 400 mg/l som CaCO
 3 . Hvis der er formodning om en inter ­
aktion mellem hårdhedsioner og teststoffet, anvendes vand med lavere hårdhed (og dermed må Elendt-medium M4 ikke anvendes i denne situa ­
tion). Den samme type vand skal anvendes i hele forsøget. De karakteristika 
for vandkvalitet, der er anført i tillæg 4, måles to gange årligt, samt hver gang der er formodning om, at de kan have ændret sig væsentligt.
 
Stamopløsninger — forurenet sediment  
16. Forurenet sediment af den valgte koncentration fremstilles sædvanligvis ved, 
at en stamopløsning af teststoffet tilsættes sedimentet direkte. En stamop ­
løsning af teststoffet opløst i deioniseret vand blandes med det formulerede 
sediment ved brug af valsning, en foderblander eller manuel blanding. Hvis teststoffet er tungtopløseligt i vand, kan det opløses i den mindst mulige mængde af et passende organisk opløsningsmiddel (f.eks. hexan, acetone 
eller chloroform). Denne opløsning blandes derefter med 10 g fint kvarts ­
sand til et testglas. Vent, indtil opløsningsmidlet er fordampet, og fjern det helt fra sandet. Derefter blandes sandet med den passende mængde sediment 
pr. testglas. Kun midler, der let fordamper, kan bruges til at opløse, disper ­
gere eller emulgere teststoffet. Det sand, der findes i teststoffet og sand ­
blandingen, skal tages i betragtning, når sedimentet fremstilles (dvs. sedi ­
ment skal således fremstilles med mindre sand). Det skal sikres, at det 
teststof, der tilsættes sediment, fordeles grundigt og jævnt i sedimentet. 
Om nødvendigt kan delprøver analyseres for at bestemme homogeniteten.
 
TESTDESIGN  
17. Testdesignet vedrører valget af testkoncentrationernes antal og intervaller, 
antal testglas med hvert koncentrationsniveau samt antal larver pr. testglas. 
Design til beregning af EC-punkter, beregning af NOEC og gennemførelse 
af en grænsetest beskrives.  
Design til regressionsanalyse  
18. Testen skal omfatte et interval af koncentrationer, der ligger omkring den 
virksomme koncentration (f.eks. EC  15 , EC  50 ) og det koncentrationsområde, 
hvor man er interesseret i testkemikaliets virkning. Beregningen af de virk ­
somme koncentrationer (EC  x ) vil være mest nøjagtig og gyldig, når den 
virksomme koncentration befinder sig midt i testkoncentrationsområdet. Ekstrapolering langt under den laveste positive koncentration eller over den højeste koncentration bør undgås. En præliminær test til bestemmelse 
af koncentrationsområdet kan være nyttig, når det skal afgøres, hvilke test ­
koncentrationer der er passende (se afsnit 27).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Hvis EC  x skal bestemmes, skal der testes mindst fem koncentrationer og tre 
replikater for hver koncentration. Under alle omstændigheder bør der 
anvendes et tilstrækkeligt antal testkoncentrationer til at sikre god modele ­
stimering. Faktoren mellem koncentrationer bør ikke overstige to (med ­
mindre dosiskurven har en lav hældning). Antallet af replikater i hver 
behandling kan reduceres, hvis antallet af testkoncentrationer med forskel ­
lige reaktioner forøges. Hvis antallet af replikater forøges, eller størrelsen af testkoncentrationsintervallerne reduceres, opnås der ofte snævrere konfidens ­
intervaller for testen. Der kræves yderligere replikater, hvis larveoverlevelse 
og -vækst skal anslås for en periode på 10 dage.
 
Design til beregning af NOEC/LOEC  
20. Hvis LOEC eller NOEC skal beregnes, anvendes fem testkoncentrationer 
med mindst fire replikater, og faktoren mellem koncentrationerne bør højst 
være to. Antallet af replikater bør være højt nok til at sikre en tilstrækkelig 
statistisk styrke til at detektere en forskel på 20 % i forhold til kontrollen på signifikansniveauet 5 % (p = 0,05). I forbindelse med udviklingshastigheden er en ANOVA-analyse normalt velegnet, f.eks. Dunnett-testen eller 
Williams-testen (17) (18) (19) (20). I forbindelse med emergensforholdet 
kan Cochran-Armitage-testen, Fishers eksakte test (med Bonferroni-korrektion) eller Mantel-Haenszel-testen anvendes.
 
Grænsetest  
21. En grænsetest kan udføres (med en testkoncentration og kontrol), hvis der 
ikke blev observeret virkninger i den præliminære test til bestemmelse af koncentrationsområdet. Formålet med grænsetesten er at udføre en test ved 
en koncentration, der er høj nok til, at beslutningstagere kan udelukke 
mulige toksiske virkninger af teststoffet, og grænsen fastsættes til en koncentration, der ikke forventes at forekomme under nogen omstændighe ­
der. 1 000 mg/kg (tørvægt) anbefales. Der anbefales normalt seks replikater 
for både behandlings- og kontrolgruppen. Statistisk styrke til at detektere en 
forskel på 20 % i forhold til kontrollen på signifikansniveauet 5 % (p = 0,05) skal påvises. Med hensyn til metrisk respons (udviklingshastighed og vægt) er t-testen en egnet statistisk metode, hvis dataene opfylder kravene i 
forbindelse med denne test (normalitet og homogen varians). T-testen 
justeret for forskel i varians eller en ikke-parametrisk test, f.eks. Wilcoxon-Mann-Whithey-testen, kan bruges, hvis disse krav ikke opfyldes. Med hensyn til emergensforholdet kan Fishers eksakte test anvendes.
 
FREMGANGSMÅDE  
Eksponeringsbetingelser  
Klargøring af forurenet sediment/vand-system  
22. Den spiking-metode, der er beskrevet i testmetode C.8, Toksicitet for 
regnorme, anbefales til tilsætning af teststoffet (14). De »spikede« (forure ­
nede) sedimenter anbringes i bægerglas, og overliggende vand tilsættes for at frembringe et volumenforhold mellem sediment og vand på 1:4 (se afsnit 11 og 15). Sedimentlaget skal have en dybde på 1,5-3 cm. For at undgå 
separering af sedimentets bestanddele og resuspension af fint materiale 
under tilsætningen af testvand i vandsøjlen, kan sedimentet overdækkes med en plastplade, mens vandet hældes i. Plastpladen fjernes derefter straks. Der kan også anvendes andre løsninger.
 
23. Testglassene skal være overdækket (f.eks. af glasplader). I løbet af forsøget 
påfyldes der yderligere vand for at bevare det oprindelige volumen og 
kompensere for vandfordampning. Dette vand skal være destilleret eller 
deioniseret vand for at forhindre opbygning af salte.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilisering  
24. Når det forurenede sediment med overliggende vand er blevet fremstillet, 
afventes det, at teststoffet fordeler sig fra den vandige fase til sedimentet (3) (4) (6) (13). Dette bør ske under de temperatur- og beluftningsforhold, der 
anvendes i testen. Tiden til opnåelse af ligevægt (ækvilibrering) afhænger af 
det pågældende sediment og kemikalie og kan være fra timer til dage og i sjældne tilfælde flere uger (4-5 uger). Da mange kemikalier i dette tidsrum ville blive nedbrudt, afventes ligevægt ikke, men en ækvilibreringstid på 48 
timer anbefales. Efter denne yderligere ækvilibreringstid måles koncentra ­
tionen af teststoffet i det overliggende vand, porevandet og sedimentet, som minimum ved den højeste koncentration og en lavere (se afsnit 38). Disse 
analyser af teststoffet gør det muligt at beregne massebalance og angive 
resultater baseret på målte koncentrationer.
 
Tilsætning af testorganismer  
25. Fire til fem dage inden tilsætningen af testorganismer til testglassene udtages 
ægmasse fra bestandene og anbringes i små glas i dyrkningsmedium. Ældet 
dyrkningsmedium fra stamkulturen eller frisk medium kan anvendes. Hvis 
sidstnævnte anvendes, tilsættes dyrkningsmediet en lille mængde foder, f.eks. grønalger og/eller et par dråber filtrat fra en fintmalet suspension af fiskefoder i flager (se tillæg 2). Kun frisklagte ægmasser bør anvendes. 
Normalt begynder larverne at blive udklækket et par dage efter æglægningen 
(2-3 dage for Chironomus riparius ved 20 °C og 1-4 dage for Chironomus tentans ved 23 °C og Chironomus yoshimatui ved 25 °C), og larvevækst sker i fire stadier, som hver er af 4-8 dages varighed. Larver i første stadium 
(2-3 eller 1-4 dage efter udklækning) bør anvendes i testen. Larver af 
dansemyg kan muligvis kontrolleres ved hjælp af hovedkapselbredde (6).
 
26. 20 æglarver fordeles vilkårligt til hvert testglas med forurenet sediment og 
vand ved hjælp af en stump pipette. Beluftningen af vandet skal standses, 
mens larverne overføres til testglassene, og den skal være standset i endnu 24 timer efter tilsætningen af larver (se afsnit 25 og 32). Afhængigt af det 
anvendte testdesign (se afsnit 19 og 20) anvendes der mindst 60 larver pr. 
koncentration i forbindelse med bestemmelse af EC-punkter og 80 til bestemmelse af NOEC.
 
Testkoncentrationer  
27. En test til bestemmelse af koncentrationsområde kan være nyttig, når 
koncentrationsområdet skal vælges til den endelige test. Til det formål 
anvendes en række spredte koncentrationer af teststoffet. For at opnå den overfladedensitet pr. chironomide, der anvendes i den endelige test, eksponeres chironomider for hver koncentration af teststoffet i en periode, 
der gør det muligt at anslå de omtrentlige testkoncentrationer, og der kræves 
ingen replikater.
 
28. Testkoncentrationerne i den endelige test fastlægges ud fra testen til bestem ­
melse af koncentrationsområde. Mindst fem koncentrationer anvendes og 
vælges som beskrevet i afsnit 18-20.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontroller  
29. Kontrolglas uden teststof, men med sediment, inkluderes i testen med et 
hensigtsmæssigt antal replikater (se afsnit 19-20). Hvis der er anvendt et opløsningsmiddel til tilsætning af teststoffet (se afsnit 16), anvendes også en 
opløsningsmiddelkontrol.
 
Testsystem  
30. Der anvendes statiske systemer. Semistatiske systemer eller gennemstrøm ­
ningssystemer med intermitterende eller kontinuerlig udskiftning af overlig ­
gende vand kan undtagelsesvis bruges, hvis specifikationerne for vandkva ­
litet bliver uhensigtsmæssige for testorganismen eller påvirker den kemiske ligevægt (hvis f.eks. koncentrationen af opløst ilt bliver for lav, koncen ­
trationen af ekskretionsprodukter bliver for høj, eller mineraler udvaskes fra 
sedimentet og påvirker pH og/eller vandets hårdhed). Andre metoder til 
forbedring af det overliggende vands kvalitet, f.eks. beluftning, er normalt tilstrækkelige og bør foretrækkes.
 
Foder  
31. Larverne skal fodres, helst dagligt eller mindst tre gange om ugen. Fiske ­
foder (en suspension i vand eller fintmalet foder, f.eks. Tetra-Min eller Tetra-Phyll; se detaljer i tillæg 2) i en mængde på 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg for C. yoshimatui) pr. larve pr. dag er tilstrækkelig til unge larver i de 
første 10 dage. Ældre larver skal have lidt mere foder: 0,5-1 mg pr. larve pr. 
dag er passende i resten af testen. Foderrationen skal reduceres i alle behandlingsprøver og reguleres, hvis der konstateres svampevækst, eller hvis mortalitet observeres i kontrolglassene. Hvis svampevæksten ikke kan 
stoppes, gentages testen. Ved test af stærkt adsorberende stoffer (f.eks. med 
log K
 ow > 5) eller ved stoffer, der kovalent bindes til sediment, skal den 
mængde foder, der er nødvendig for at sikre organismernes overlevelse og naturlige vækst, muligvis tilsættes det formulerede sediment inden stabilise ­
ringsperioden. Til det formål anvendes der plantemateriale i stedet for fiske ­
foder, f.eks. tilsætning af 0,5 % (tørvægt) fintmalede blade af brændenælde (Urtica dioica), morbærtræ (Morus alba), hvidkløver (Trifolium repens) eller spinat (Spinacia oleracea). Andet plantemateriale (Cerophyl eller 
alfa-cellulose) kan også anvendes.
 
Inkubationsbetingelser  
32. Forsigtig beluftning af det overliggende vand i testglassene foretages helst 
24 timer efter tilsætningen af larver og foretages gennem hele testen. Det 
skal sikres, at koncentrationen af opløst ilt ikke falder til mindre end 60 % 
af ASV. Beluftning sker gennem en Pasteur-glaspipette, der er fastgjort 2- 3 cm over sedimentlaget (dvs. en eller få bobler pr. sekund). Ved test af flygtige kemikalier kan det overvejes ikke at belufte sediment/vand-syste ­
met.
 
33. Testen udføres ved en konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). For C. tentans 
og C. yoshimatui anbefales en temperatur på henholdsvis 23 °C og 25 °C 
(± 2 °C). Der anvendes en lysperiode på 16 timer, og lysintensiteten skal 
være 500-1 000 lux.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Eksponeringsvarighed  
34. Eksponeringen begynder, når larver tilsættes de forurenede bægerglas og 
kontrolglassene. Den maksimale eksponeringsvarighed er 28 dage for C. riparius og C. yoshimatsui og 65 dage for C. tentans. Hvis dansemyg 
udvikles tidligere, kan testen afsluttes, når der er gået mindst fem dage 
efter emergensen af den sidste voksne i kontrolglasset.
 
Observationer  
Emergens  
35. Udviklingstiden og det samlede antal fuldt udviklede han- og hunindivider 
bestemmes. Hanner kan nemt identificeres ved deres fjerbuskede antenner.  
36. Testglassene observeres mindst tre gange ugentligt med henblik på visuelt at 
vurdere abnorm opførsel (hvis individer f.eks. forlader sediment eller svømmer på en usædvanlig måde) sammenlignet med kontrollen. I løbet 
af perioden for forventet emergens foretages en daglig tælling af de udvik ­
lede individer. Kønnet og antallet af fuldt udviklede individer registreres dagligt. Efter identifikation fjernes individerne fra bægerglassene. Ægmasse, der er afsat før afslutningen af testen, registreres og fjernes derefter for at 
forhindre gentaget tilførsel af larver til sedimentet. Antallet af synlige 
pupper, der ikke har udviklet sig, registreres også. Vejledning i måling af emergens findes i tillæg 5.
 
Vækst og overlevelse  
37. Hvis der skal fremlægges data om larveoverlevelse og -vækst efter 10 dage, 
skal yderligere testglas medtages fra begyndelsen, så de kan anvendes efter ­
følgende. Sedimentet fra disse yderligere glas sigtes gennem en 250 μm 
sigte for at tilbageholde larverne. Kriterier for død er immobilitet eller manglende reaktion på mekaniske stimuli. Larver, der ikke genfindes, regi ­
streres også som døde (larver, der er døde ved begyndelsen af testen, kan 
være blevet nedbrudt af mikrober). Tørvægten (askefri) af de overlevende larver pr. testglas bestemmes, og den individuelle gennemsnitlige tørvægt pr. glas beregnes. Det er nyttigt at bestemme det stadium, som de overlevende 
larver befinder sig på. Til det formål anvendes en måling af bredden på 
hvert individs hovedkapsel.
 
Analysemålinger  
Teststofkoncentration  
38. Inden testen påbegyndes (dvs. inden larver tilsættes), udtages prøver af 
bulksediment fra mindst ét glas pr. behandling til analytisk bestemmelse af teststofkoncentrationen i sedimentet. Det anbefales, at prøver af som 
minimum det overliggende vand, porevandet og sedimentet analyseres ved 
begyndelsen (se afsnit 24) og slutningen af testen ved den højeste koncen ­
tration og en lavere. Disse bestemmelser af teststofkoncentrationen giver oplysninger om teststoffets opførsel/fordeling i vand- og sedimentsystemet.
 
39. Når der foretages mellemliggende målinger (f.eks. på dag 7), og hvis der i 
analysen skal bruges større prøver, der ikke kan udtages fra testglas uden at påvirke testsystemet, udføres de analytiske bestemmelser på prøver fra yder ­
ligere testglas, der er behandlet på samme måde (herunder tilstedeværelse af 
testorganismer), men som ikke anvendes til biologiske observationer.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Centrifugering ved f.eks. 10 000 g og 4 °C i 30 minutter er den anbefalede 
fremgangsmåde til isolering af interstitielt vand. Hvis det påvises, at test ­
stoffet ikke adsorberer til filtre, kan filtrering dog accepteres. I nogle tilfælde er det ikke muligt at analysere koncentrationer i porevandet, da prøvestør ­
relsen er for lille.
 
Fysisk-kemiske parametre  
41. Testglassenes pH og temperatur måles på en hensigtsmæssig måde (se afsnit 
10). Hårdhed og ammoniak måles i kontrolglassene og et testglas ved den højeste koncentration ved begyndelsen og afslutningen af testen.
 
DATA OG RAPPORTERING  
Behandling af resultater  
42. Formålet med denne test er at bestemme virkningen af teststoffet på udvik ­
lingshastigheden og det samlede antal fuldt udviklede han- og hunindivider eller virkningen på larvernes overlevelse og vægt, hvis en 10-dages test udføres. Hvis der ikke er indikationer på statistisk forskellige sensitiviteter 
mellem kønnene, kan resultaterne for hanner og hunner samles med henblik 
på statistisk analyse. Kønsbetingede sensitivitetsforskelle kan vurderes statistisk ved hjælp af f.eks. en χ
 2 -r × 2-test. Larvernes overlevelse og 
den individuelle gennemsnitlige tørvægt pr. glas bestemmes om nødvendigt 
efter 10 dage.  
43. Effektkoncentrationer udtrykt og baseret på tørvægt beregnes fortrinsvis ud 
fra målte sedimentkoncentrationer ved begyndelsen af testen (se afsnit 38).  
44. For at beregne et punktestimat for EC  50 eller en anden EC  x -værdi bruges 
data pr. glas som ægte replikater. Når et konfidensinterval for en EC  x -værdi 
beregnes, skal variabiliteten mellem glassene tages i betragtning, eller det skal påvises, at denne variabilitet er så lille, at den kan ignoreres. Når 
modellen tilpasses ved hjælp af Least Squares, foretages en transformation 
af dataene pr. glas for at forbedre varianshomogeniteten. EC
 x -værdier 
beregnes dog, når resultatet er transformeret tilbage til den oprindelige værdi.
 
45. Når den statistiske analyse har til formål at bestemme NOEC/LOEC ved 
hjælp af hypotesetest, skal variabiliteten mellem glassene tages i betragtning, 
f.eks. ved hjælp af nested ANOVA. Alternativt kan mere robuste test (21) bruges i situationer, hvor de sædvanlige ANOVA-antagelser ikke kan anvendes.
 
Emergensforhold  
46. Emergensforhold er kvantale data og kan analyseres ved at anvende 
Cochran-Armitage-testen på en nedadgående måde, hvor et monotont dosis ­
respons forventes, og disse data er i overensstemmelse med denne forvent ­
ning. Hvis det ikke er tilfældet, kan Fishers eksakte test eller 
Mantel-Haenszel-testen med Bonferroni-Holm-korrigerede p-værdier anven ­
des. Hvis der er bevis for større variabilitet mellem replikater inden for samme koncentration, end en binominal fordeling indicerer (ofte betegnet 
som »ekstra-binominal« variation), anvendes en robust Cochran-Armitage- 
test eller Fishers eksakte test som foreslået i (21).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Summen af individer, der har udviklet sig pr. glas, n  e , bestemmes og 
divideres med antallet af tilførte larver, n  a : 
ER ¼ n e 
n a 
hvor:  
ER = emergensforhold  
n e = antal udviklede individer pr. glas  
n a = antal tilførte larver pr. glas  
47. Ved store prøvestørrelser, hvor der er ekstra-binominal varians, kan emer ­
gensforholdet behandles som et kontinuerligt respons, og der kan bruges fremgangsmåder, som f.eks. Williams test, når et monotont dosisrespons 
forventes og er i overensstemmelse med disse ER-data. Dunnetts test kan 
anvendes, hvis der ikke kan påvises monotoni. Et stor prøvestørrelse defi ­
neres her som prøver, hvor både antallet af udviklede individer og antallet af ikke-udviklede individer overstiger fem målt pr. replikat (glas).
 
48. Hvis ANOVA-metoder anvendes, skal ER-værdier først transformeres ved 
hjælp af arcsin-sqrt-transformation eller Freeman-Tukey-transformation for 
at få en omtrentlig normalfordeling og udligne varians. Cochran-Armitage- testen, Fishers eksakte test (med Bonferroni-korrektion) eller Mantel-Haenszel-testen kan anvendes, hvis absolutte hyppigheder anvendes. 
Arcsin-sqrt-transformation anvendes ved at tage invers sinus (sin
 –1 ) af 
kvadratroden af ER.  
49. I forbindelse med emergensforhold beregnes EC  x -værdier ved hjælp af 
regressionsanalyse (eller f.eks. probit (22), logit, Weibull, relevant software i handelen osv.). Hvis regressionsanalyse mislykkes (hvis der f.eks. er 
mindre end to delsvar), anvendes andre ikke-parametriske metoder, som 
f.eks. glidende gennemsnit eller simpel interpolation.
 
Udviklingshastighed  
50. Den gennemsnitlige udviklingstid repræsenterer det gennemsnitlige tidsrum 
mellem tilsætningen af larver (testens dag 0) og emergensen af testkohorten af dansemyg. (Ved beregning af den sande udviklingstid tages larvernes alder på tilsætningstidspunktet i betragtning). Udviklingshastigheden er det 
reciprokke tal til udviklingstiden (enhed: 1/dag) og angiver den del af 
larveudviklingen, der finder sted pr. dag. Udviklingshastigheden foretrækkes til evaluering af disse sedimenttoksicitetsforsøg, da dens varians er lavere, og da den er mere homogen og ligger tættere på normalfordelingen end 
udviklingstid. Testfremgangsmåder baseret på anvendelige parametre kan 
derfor bruges med udviklingshastighed i stedet for udviklingstid. For udvik ­
lingshastighed som et kontinuerligt respons kan EC
 x -værdier estimeres ved 
hjælp af regressionsanalyse (f.eks. (23) (24)).  
51. I forbindelse med følgende statistiske test antages det antal individer, der er 
observeret på kontroldagen, at være udviklet ved gennemsnittet af tidsinter ­
vallet mellem dag × og dag x-l (l = længde af inspektionsinterval, normalt 1 dag). Den gennemsnitlige udviklingshastighed pr. glas ( x) beregnes ved 
hjælp af følgende ligning:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
hvor:  
x: gennemsnitlig udviklingshastighed pr. glas  
i: indeks for inspektionsinterval  
m: maksimalt antal inspektionsintervaller  
ƒ i : antal individer, der er udviklet i inspektionsintervallet i  
n e : det samlede antal individer, der er udviklet ved slutningen af forsøget 
(= P ƒ i ) 
x i : udviklingshastighed for individer, der er udviklet i intervallet i  
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
hvor:  
day  i : inspektionsdag (siden behandling)  
l i : længde af inspektionsintervallet i (dage, normalt 1 dag)  
Testrapport  
52. Testrapporten skal mindst indeholde følgende oplysninger:  
Teststof:  
— fysiske egenskaber og relevante fysisk-kemiske egenskaber (vandopløse ­
lighed, damptryk, fordelingskoefficient i jord (eller sediment, hvis 
tilgængelig), stabilitet i vand osv.)  
— kemisk identifikation (generisk navn, kemisk navn, CAS-nummer, struk ­
turformel osv.), herunder renhed og analysemetode til kvantificering af teststof.
 
Testart:  
— anvendte testorganismer: art, videnskabeligt navn, herkomst af orga ­
nismer og dyrkningsbetingelser  
— information om håndtering af ægmasser og larver  
— testorganismernes alder ved tilsætning til testglas.  
Testbetingelser:  
— anvendt sediment, dvs. naturligt eller formuleret sediment  
— for naturligt sediment: beliggenhed og beskrivelse af prøvetagningsstedet 
for sediment, herunder så vidt muligt oplysninger om tidligere forure ­
ning; karakteristika: pH, organisk kulstofindhold, C/N-forhold og korn ­
størrelse (hvis relevant)  
— fremstilling af formuleret sediment: ingredienser og karakteristika (orga ­
nisk kulstofindhold, pH, fugt osv. ved begyndelsen af testen)  
— fremstilling af testvand (hvis rekonstitueret vand anvendes) og dets 
karakteristika (iltkoncentration, pH, ledningsevne, hårdhed osv. ved 
begyndelsen af testen)  
— dybde af sediment og overliggende vand  
— volumen af overliggende vand og porevand; vægt af vådt sediment med 
og uden porevand  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— testglas (materiale og størrelse)  
— metode til sedimentspiking: anvendte testkoncentrationer, antal replikater 
og brug af evt. opløsningsmiddel  
— stabiliserende ligevægtsfase for det spikede sediment/vand-system: 
varighed og betingelser  
— inkubationsbetingelser: temperatur, lysintensitet og -periodicitet, beluft ­
ning (hyppighed og intensitet)  
— detaljerede oplysninger om fodring, herunder fodertype, tilberedning, 
mængde og fodringshyppighed.  
Resultater:  
— nominelle testkoncentrationer, målte testkoncentrationer og resultater af 
alle analyser med henblik på at bestemme teststofkoncentrationen i test ­
glasset  
— kvaliteten af vandet i testglassene, dvs. pH, temperatur, opløst ilt, 
hårdhed og ammoniak  
— evt. udskiftning af fordampet vand  
— antal udviklede han- og hunindivider pr. glas og pr. dag  
— antal larver, der ikke udviklede sig til dansemyg, pr. glas  
— individuel gennemsnitlige tørvægt af larver pr. glas og pr. stadium, hvis 
relevant  
— procentvis emergens pr. replikat og testkoncentration (samlet for han- og 
hunindivider)  
— gennemsnitlig udviklingshastighed for fuldt udviklede individer pr. 
replikat og behandlingshastighed (samlet for han- og hunindivider)  
— estimater for toksicitetseffektparametre, f.eks. EC  x (og tilhørende konfi ­
densintervaller), NOEC og/eller LOEC og de statistiske metoder, der anvendt til at beregne dem
 
— diskussion af resultaterne, herunder den eventuelle betydning af fravi ­
gelser fra denne testmetode.  
LITTERATUR:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Devel ­
opment and validation of a new test system. Redigeret af M. Streloke og H. Köpp. Berlin 1995.
 
(2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Endelig rapport til Europa-Kommissionen. Rapport nr. EC 
3738. August 1994. WRc, Det Forenede Kongerige.  
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Fra WOSTA-workshop afholdt i Nederlandene.
 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebra ­
tes. s. 1125-1241. I ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
 
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. 
Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ og Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of 
Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
 
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference 
Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
(14) Kapitel C.8 i dette bilag, Toksicitet for regnorme.  
(15) Suedel BC og JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
(16) Naylor C og C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482-491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103-117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
(21) Rao JNK og Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered 
binary data. Biometrics 48: 577-585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
(23) Bruce og Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.  
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
I forbindelse med denne testmetode anvendes følgende definitioner:  
Formuleret sediment  eller rekonstitueret, kunstigt eller syntetisk sediment: en 
blanding af materialer, der bruges til at efterligne de fysiske bestanddele i natur ­
ligt sediment.  
Overliggende vand : det vand, der tilsættes over sedimentet i testglasset.  
Interstitielt vand  eller porevand: det vand, der optager pladsen mellem sediment 
og jordpartikler.  
Spiked sediment  eller forurenet sediment: sediment, som teststoffet er tilsat.  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Tillæg 2  
Anbefalinger vedrørende dyrkning af Chironomus riparius  
1. Chironomus-larver kan holdes i krystallisationsskåle eller større beholdere. 
Fint kvartssand spredes i et tyndt lag på ca. 5-10 mm på bunden af skålen. Kiselgur (f.eks. Merck, Art 8117) er også et egnet substrat (et tyndere lag på få mm er nok). En passende mængde vand tilsættes, så der fås en dybde på 
flere cm. Vandet fyldes op efter behov for at erstatte tab som følge af 
fordampning og undgå udtørring. Vandet kan udskiftes, hvis det er nødven ­
digt. Forsigtig beluftning skal foretages. Larvebeholderne opbevares i et bur, der er egnet til formålet, og som forhindrer udviklede voksne i at forsvinde. 
Buret skal være så stort, at udviklede voksne kan danne sværme. Ellers vil 
kopulation muligvis ikke forekomme (minimum er ca. 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Burene opbevares ved rumtemperatur eller i rum med konstant temperatur 
ved 20 ± 2 °C med belysning, der består af 16 timers lys (intensitet ca. 
1 000 lux) og 8 timers mørke. Det er rapporteret, at en luftfugtighed på 
mindre end 60 % RH kan hæmme reproduktionen.  
Fortyndingsvand  
3. Der kan anvendes egnet naturligt eller syntetisk vand. Brøndvand, afkloret 
ledningsvand eller kunstige medier (f.eks. Elendt M4 eller M7, se nedenfor) anvendes ofte. Vandet skal beluftes inden brug. Om nødvendigt kan vandet i beholderne udskiftes ved forsigtigt at hælde eller suge det brugte vand fra 
dyrkingsbeholderne uden at ødelægge larverørene.
 
Fodring af larver  
4. Chironomus-larver fodres med fiskefoder i flager (Tetra Min®, Tetra Phyll® 
eller et tilsvarende mærke af særligt fiskefoder) med ca. 250 mg pr. beholder 
pr. dag. Foderet kan gives som tørt malet pulver eller som en suspension i vand: 1,0 g foder i flager tilsættes 20 ml fortyndet vand og blandes for at få en homogen blanding. Denne præparat kan tilsættes med ca. 5 ml pr. 
beholder pr. dag (rystes inden brug). Ældre larver kan gives mere foder.
 
5. Fodringen tilpasses vandkvaliteten. Hvis dyrkningsmediet bliver uklart, 
reduceres fodermængden. Tilsætningen af foder overvåges nøje. For lidt foder vil få larverne til at vandre til vandsøjlen, og for meget foder vil forårsage øget mikrobiel aktivitet og lavere iltkoncentrationer. Begge 
forhold kan medføre lavere vækstrater.
 
6. Nogle grønalger (f.eks. Scenedesmus subspicatus og Chlorella vulgaris) kan 
også tilsættes ved etableringen af nye dyrkningsbeholdere.  
Fodring af udviklede voksne  
7. Nogle forskere har foreslået, at vat, der er opblødt i mættet rørsukkerop ­
løsning, kan bruges som foder til udviklede voksne.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Emergens  
8. Efter ca. 13-15 dage ved 20 ± 2 °C begynder voksne at udvikle sig 
fra larvebeholderne. Hanner kan nemt identificeres ved deres fjerbuskede antenner.
 
Ægmasser  
9. Når der findes voksne i buret, skal alle larvebeholdere kontrolleres tre gange 
om ugen for afsætning af geleagtige ægmasser. Evt. ægmasser skal fjernes forsigtigt. De overføres til en lille plade med en prøve af dyrkningsvandet. 
Ægmasser bruges til at starte et nyt dyrkningsglas (f.eks. 2-4 ægmasser pr. 
glas) eller til toksicitetstest.
 
10. Æglarver udklækkes efter 2-3 dage.  
Etablering af nye dyrkningsglas  
11. Når vækstbetingelser er etableret, kan et nyt larvedyrkningsglas etableres 
hver uge eller mindre hyppigt afhængigt af testkravene, således at de 
ældste glas kan fjernes, når voksne individer har udviklet sig. Ved hjælp 
af dette system fås der en regelmæssig forsyning af voksne med minimal håndtering.
 
Fremstilling af testopløsninger M4 og M7  
12. Elendt (1990) har beskrevet M4-mediet. M7-mediet fremstilles på samme 
måde som M4-mediet bortset fra de stoffer, der er anført i tabel 1, for hvilke koncentrationerne er fire gange lavere i M7 end i M4. En artikel om M7- mediet er under forberedelse (Elendt, personlig meddelelse). I henhold til 
Elendt og Bias (1990) bør testopløsningen ikke fremstilles for de nævnte 
koncentrationer af NaSiO
 3 5 H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 og K  2 HPO  4 , idet oplys ­
ningerne om fremstillingen af stamopløsninger ikke er fyldestgørende.  
Fremstilling af M7-mediet  
13. Hver stamopløsning (I) fremstilles individuelt, og en kombineret 
stamopløsning (II) fremstilles ud fra disse stamopløsninger (I) (se tabel 1). M7-mediet fremstilles ved at fortynde 50 ml af den kombinerede stamopløsning (II) og de mængder af hver stamopløsning med 
makro-næringsstoffer, der er anført i tabel 2, med 1 liter deioniseret vand. 
En vitaminopløsning fremstilles ved at tilsætte tre vitaminer til deioniseret vand som anført i tabel 3, og 0,1 ml af den kombinerede vitaminopløsning tilsættes det færdige M7-medium umiddelbart inden brug. Vitaminopløs ­
ningen opbevares i små aliquoter i frossen tilstand. Mediet beluftes og 
stabiliseres.
 
LITTERATUR  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Redigeret af M. Streloke og H. Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabel 1  
Stamopløsninger af sporstoffer til M4- og M7-medierne  
Stamopløsninger (I) Mængde (mg), 
der fortyndes 
med 1 l deioni ­
seret vand Fremstilling af den kombinerede 
stamopløsning (II): Bland følgende 
mængder (ml) af 
stamopløsninger (I), og fortynd med 
1 l deioniseret vand Endelige koncentrationer i testopløs ­
ninger (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
Kl 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Disse stoffer varierer i M4 og M7 som anført ovenfor. 
( 2 ) Disse opløsninger fremstilles hver for sig, hældes sammen og autoklaveres straks.  
Tabel 2  
Stamopløsninger med makro-næringsstoffer til M4- og M7-medierne  
Mængde, der fortyndes 
med 1 l deioniseret 
vand 
(mg) Mængde af stamopløs ­
ninger med 
makro-næringsstoffer, der 
tilsættes for at fremstille 
M4- og M7-medierne 
(ml/l) Endelige koncentra ­
tioner i testopløsninger 
M4 og M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabel 3  
Vitaminopløsninger til M4- og M7-medierne. Alle tre vitaminopløsninger samles for at 
fremstille én vitaminopløsning.  
Mængde, der fortyndes 
med 1 l deioniseret vand 
(mg) Mængde af vitaminopløsning, 
der tilsættes for at fremstille 
M4- og M7-medierne 
(ml/l) Endelige koncentrationer 
i testopløsninger M4 og 
M7 
(mg/l)  
Thiaminhydrochlorid 750 0,1 0,075 
Cyanocobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075
 
LITTERATUR  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25- 
33. 
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Tillæg 3  
FREMSTILLING AF FORMULERET SEDIMENT  
Sammensætning af sediment  
Det formulerede sediment skal have følgende sammensætning:  
Bestanddel Karakteristika % af sediment 
(tørvægt)  
Tørv Sphagnum så nær pH 5,5-6,0 
som muligt uden synlige planterester og findelt (parti ­
kelstørrelse ≤ 1 mm) og luft ­
tørret 4-5 
Kvartssand Kornstørrelse: > 50 % af 
partiklerne skal være fra 50- 200 μm 75-76 
Kaolinholdigt ler Kaolinindhold ≥ 30 % 20 
Organisk kulstof Justeres ved tilsætning af tørv 
og sand 2 (± 0,5) 
Calciumcarbonat CaCO
 3 , pulveriseret, kemisk 
rent 0,05-0,1 
Vand Ledeevne ≤ 10 μS/cm 30-50  
Fremstilling  
Tørven lufttørres og males til fint pulver. En suspension af den krævede mængde 
tørvepulver i ioniseret vand fremstilles ved brug af et højtydende homogenise ­
ringsapparat. pH-værdien af denne suspension justeres til 5,5 ± 0,5 med CaCO  3 . 
Suspensionen konditioneres i mindst to dage med forsigtig omrøring ved 20 
± 2 °C for at stabilisere pH og opnå en stabil mikrobiel komponent. pH måles 
igen og skal være 6,0 ± 0,5. Derefter blandes tørvesuspensionen med de andre bestanddele (sand og kaolinholdigt ler) og deioniseret vand for at få et homogent sediment med et vandindhold på 30-50 % af sedimentets tørvægt. Den færdige 
blandings pH måles igen og justeres om nødvendigt til 6,5 til 7,5 med CaCO
 3 . 
Der udtages prøver af sedimentet for at bestemme tørvægten og det organiske kulstofindhold. Inden det formulerede sediment anvendes i en toksicitetstest på chironomider, bør det konditioneres i syv dage under de betingelser, der 
anvendes i den efterfølgende test.
 
Opbevaring  
De tørre bestanddele til fremstilling af kunstigt sediment lagres tørt og køligt ved 
rumtemperatur. Det formulerede (våde) sediment må ikke opbevares inden brug. 
Det skal bruges umiddelbart efter konditioneringsperioden på de syv dage, som 
afslutter dets fremstilling.  
LITTERATUR  
Kapitel C.8 i dette bilag. Toksicitet for regnorme.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Tillæg 4  
Kemiske egenskaber af acceptabelt vand til fortynding  
Stof Koncentrationer  
Faste stoffer < 20 mg/l 
Totalt organisk kulstof < 2 mg/l Ikke-ioniseret ammoniak < 1 μg/l 
Hårdhed som CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Residualt chlor < 10 μg/l 
Total organiske phosphorpesticider < 50 ng/l Total chlorerede organiske pesticider + polychlorbip ­
henyler < 50 ng/l 
Total organisk chlor < 25 ng/l
 
(*) Hvis der er formodning om en interaktion mellem hårdhedsioner og teststoffet, anvendes 
vand med lavere hårdhed (og dermed må Elendt-medium M4 ikke anvendes i denne 
situation).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Tillæg 5  
Vejledning i overvågning af emergens af chironomidlarver  
Emergensfiltre anbringes på testbægerglassene. Disse filtre skal bruges fra dag 20 
til slutningen af testen. Et eksempel på et filter vises nedenfor:
  
A: Nylonvæv  
B: Omvendte plastbægre  
C: Eksponeringsbæger uden flange  D: Åbninger med væv til vandudskiftning  
E: Vand  
F: Sediment  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C. 28.  TOKSICITETSTEST SEDIMENT/VAND PÅ CHIRONOMIDER 
MED FORURENET VAND  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD TG 219 (2004). Formålet med denne test 
er at vurdere virkningerne på larver af ferskvandsdipteraen Chironomus sp., 
der lever i sediment, af forlænget eksponering for kemikalier. Den er primært baseret på BBA-vejledningen, der anvender et sediment- og vand ­
testsystem med syntetisk jord, og et vandsøjleeksponeringsscenario (1). Den 
inddrager også de eksisterende toksicitetstestprotokoller for Chironomus 
riparius og Chironomus tentans, der er blevet udviklet i Europa og Nord ­
amerika (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) og ringtestet (1) (6) (9). Andre veldoku ­
menterede chironomidarter kan også benyttes, f.eks. Chironomus 
yoshimatsui (10) (11).
 
2. Eksponeringsscenariet i denne testmetode er spiking (forurening) af vand. 
Valget af det mest velegnede eksponeringsscenario afhænger af, hvad testen 
skal anvendes til. Vandeksponeringsscenariet, hvor vandsøjlen spikes, har til 
formål at simulere et tilfælde af aerosolspredning af pesticider og dækker den første koncentrationstop i porevand. Det kan også anvendes i forbin ­
delse med andre typer eksponering (herunder kemiske udslip) med 
undtagelse af akkumuleringsprocesser, der varer længere end testperioden.
 
3. Stoffer, der skal testes i forbindelse med organismer, der lever i sediment, 
forefindes normalt i dette rum over længere tid. Organismer, der lever i 
sediment, kan eksponeres ad forskellige veje. Den relative vigtighed af 
den enkelte eksponeringsvej og den tid, der tager for hver enkelt at bidrage til de generelle toksiske virkninger, afhænger af de fysisk-kemiske egenskaber af det pågældende kemikalie. Ved stærkt adsorberende stoffer 
(f.eks. med log K
 ow > 5) eller ved stoffer, der kovalent bindes til sediment, 
kan indtagelse af kontamineret føde være en væsentlig eksponeringsvej. For ikke at undervurdere toksiciteten af højt lipofile stoffer kan det overvejes at tilsætte foder til sedimentet før tilsætning af teststoffet. For at tage alle 
potentielle eksponeringsveje i betragtning fokuserer denne testmetode på 
langtidseksponering. Testens varighed er 20-28 dage for C. riparius og C. yoshimatsui og 28-65 dage for C. tentans. Hvis der kræves korttidsdata til særlige formål, f.eks. for at undersøge virkningerne af et ustabilt kemikalie, 
kan yderligere replikater fjernes efter en periode på 10 dage.
 
4. De målte effektparametre er det samlede antal voksne, der har udviklet sig, 
og tiden, der er gået med udvikling. Det anbefales, at målinger af larvers 
overlevelse og vækst kun udføres efter en periode på 10 dage, hvis der 
kræves yderligere korttidsdata, ved hjælp af eventuelle yderligere replikater.  
5. Det anbefales at anvende formuleret sediment. Der er flere fordele ved 
formuleret sediment i forhold til naturlige sedimenter:  
— udsvingene i forsøgene reduceres, idet der dannes en reproducerbar 
»standardiseret matrix«, og der er ikke brug for at finde 
ikke-kontaminerede og rene sedimentkilder  
— testene kan indledes på ethvert tidspunkt, uden at der opstår sæsonbe ­
tingede udsving i testsedimentet, og der er ikke behov for at forbehandle sedimentet med henblik på at fjerne hjemmehørende fauna; brugen af 
formuleret sediment reducerer også omkostningerne i forbindelse med 
opsamling af tilstrækkelige mængder sediment i felten til rutinetest
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— anvendelsen af formuleret sediment gør det muligt at sammenligne toksi ­
citet og rangordne stoffer i overensstemmelse hermed toksicitetsdata fra 
test med naturlige og kunstige sedimenter var sammenlignelige for flere kemikalier (2).
 
6. De anvendte definitioner er anført i tillæg 1.  
TESTENS PRINCIP  
7. Æglarver af chironomider eksponeres for et koncentrationsinterval af test ­
stoffet i sediment/vand-systemer. Testen indledes med, at æglarver anbringes 
i testbægerglas, som indeholder sediment/vand-systemet, og derefter tilsættes teststoffet vandet. Emergens- og udviklingstiden for chironomider måles ved afslutningen af testen. Larvernes overlevelse og vægt kan om nødvendigt 
også måles efter 10 dage (ved brug af yderligere replikater). Disse data 
analyseres ved hjælp af en regressionsmodel for at anslå den koncentration, der vil forårsage en reduktion på × % i emergens, larveoverlevelse eller larvevækst (f.eks. EC
 15 , EC  50 osv.), eller ved hjælp af statistisk hypotesetest 
med henblik på at bestemme en NOEC/LOEC. Sidstnævnte kræver 
sammenligning af effektværdier med kontrolværdier ved hjælp af statistiske test.
 
OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET  
8. Teststoffets vandopløselighed, damptryk, målt eller beregnet, fordeling i 
sediment og stabilitet i vand og sediment bør kendes. En pålidelig analyse ­
metode til kvantificering af teststoffet i overliggende vand, porevand og 
sediment med kendt og publiceret nøjagtighed og nedre målegrænse bør foreligge. Nyttige oplysninger omfatter teststoffets strukturformel og renhed. Teststoffets kemiske skæbne (f.eks. spredning, abiotisk og biotisk 
nedbrydning osv.) er også nyttige oplysninger. For stoffer, der er vanskelige 
at teste som følge af deres fysisk-kemiske egenskaber, findes der yderligere vejledning i (12).
 
REFERENCEKEMIKALIER  
9. Referencekemikalier kan testes periodisk for at sikre, at testprotokollen og 
-betingelserne er pålidelige. Eksempler på referencetoksikanter, der er 
anvendt med godt resultat i ringtest og valideringsforsøg, omfatter lindan, 
trifluralin, pentachlorphenol, cadmiumchlorid og kaliumchlorid (1) (2) (5) (6) (13).
 
TESTENS VALIDITET  
10. Testens validitet forudsætter følgende:  
— emergensen i kontrolbeholderne skal være mindst 70 % ved testens 
afslutning (1) (6)  
— emergensen af C. riparius og C. yoshimatsui til voksne fra kontrolglas ­
sene skal ske mellem 12 og 23 dage efter deres overførsel til testglas ­
sene; for C. tentans kræves der en periode på 20-65 dage  
— ved testens afslutning måles pH og koncentrationen af opløst ilt i hvert 
bægerglas. Koncentrationen af opløst ilt skal være mindst 60 % af værdien for mætning med luft (ASV) ved den anvendte temperatur, 
og pH i det overliggende vand skal være i intervallet 6-9 i alle bæger ­
glas
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— vandtemperaturen må højst variere med ± 1,0 °C. Vandtemperatur kan 
styres ved at anvende et isotermisk rum, og i det tilfælde bekræftes 
rumtemperaturen med passende tidsintervaller.  
BESKRIVELSE AF METODEN  
Testglas  
11. Forsøget udføres i 600 ml bægerglas med en diameter på 8 cm. Andre 
beholdere kan anvendes, men de skal kunne sikre en passende dybde for 
det overliggende vand og sediment. Sedimentoverfladen skal være tilstræk ­
kelig (2 til 3 cm  2 pr. larve). Forholdet mellem dybden af sedimentlaget og 
dybden af det overliggende vand skal være 1:4. Testglas og andet udstyr, der kommer i berøring med testsystemet, skal være udført helt i glas eller 
andet kemisk inaktivt materiale (f.eks. Teflon).
 
Valg af fiskeart  
12. Den art, der skal benyttes i testen, er fortrinsvis Chironomus riparius. Chiro ­
nomus tentans kan også anvendes, men er vanskeligere at håndtere og 
kræver en længere testperiode. Chironomus yohimatsui kan også anvendes. Detaljer om dyrkningsmetoder findes i tillæg 2 vedrørende Chironomus riparius. Oplysninger om dyrkningsbetingelser findes også for andre arter, 
dvs. Chironomus tentans (4) og Chironomus yoshimatsui (11). Identifikation 
af arten skal bekræftes inden testning, men kræves ikke før hver test, hvis organismer kommer fra en intern bestand.
 
Sediment  
13. Formuleret sediment (også kaldet rekonstitueret, kunstigt eller syntetisk sedi ­
ment) bør fortrinsvis anvendes. Hvis naturligt sediment anvendes, skal det karakteriseres (som minimum ved hjælp af pH og organisk kulstofindhold, 
men andre parametre anbefales også, f.eks. C/N-forhold og kornstørrelse), 
og det bør være uden forurening og andre organismer, der kan konkurrere med eller æde chironomiderne. Inden naturligt sediment anvendes i en toksicitetstest på chironomider, bør det desuden konditioneres i syv dage 
under de betingelser, der anvendes i den efterfølgende test. Det anbefales at 
bruge følgende formulerede sediment, som er baseret på den syntetiske jord, der anvendes i testmetode C.8 (14), i denne test (1) (15) (16):
 
a) 4-5 % (tørvægt) tørv: så tæt på pH 5,5 til 6,0 som muligt; det er vigtigt 
at bruge pulveriseret tørv, findelt (partikelstørrelse ≤ 1 mm) og kun 
lufttørret  
b) 20 % (tørvægt) kaolinholdigt ler, helst med over 30 % kaolinit  
c) 75-76 % (tørvægt) kvartssand (overvejende finsand med over 50 % af en 
partikelstørrelse på 50 til 200 μm) 
d) deioniseret vand tilsættes for at få et fugtindhold i den færdige blanding 
på 30-50 %  
e) kemisk rent calciumcarbonat (CaCO  3 ) tilsættes for at få en pH-værdi i 
den færdige sedimentblanding på 7,0 ± 0,5  
f) det organiske kulstofindhold i den færdige blanding skal være 2 % (± 
0,5 %), og det justeres ved brug af passende mængder tørv og sand som 
anført i litra a) og c).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Oprindelsen af tørv, kaolinler og sand skal være kendt. Det kontrolleres, at 
sedimentkomponenterne ikke indeholder kemisk forurening (f.eks. tungme ­
taller, organiske chlorforbindelser, organiske phosphorforbindelser osv.). Et eksempel på fremstilling af formuleret sediment er beskrevet i tillæg 3. Blanding af tørre bestanddele accepteres også, hvis det påvises, at der 
ikke sker en separation af sedimentets bestanddele efter tilsætning af over ­
liggende vand (f.eks. at tørvepartikler flyder ovenpå), og at tørven eller sedimentet er tilstrækkeligt konditioneret.
 
Vand  
15. Til brug i testen kan anvendes vand, der er i overensstemmelse med de 
kemiske karakteristika for acceptabelt fortyndingsvand, som beskrevet i 
tillæg 2 og 4. Som dyrknings- og fortyndingsvand kan accepteres råvand 
(overflade- eller grundvand), rekonstitueret vand (se tillæg 2) eller afkloret ledningsvand, såfremt chironomider kan overleve i vandet i et tidsrum 
svarende til dyrknings- og testperioden uden at vise tegn på stress. Ved 
testens begyndelse skal testvandet have en pH-værdi på 6-9 og en hårdheds ­
grad på højst 400 mg/l som CaCO
 3 . Hvis der er formodning om en inter ­
aktion mellem hårdhedsioner og teststoffet, anvendes vand med lavere 
hårdhed (og dermed må Elendt-medium M4 ikke anvendes i denne situa ­
tion). Den samme type vand skal anvendes i hele forsøget. De karakteristika for vandkvalitet, der er anført i tillæg 4, måles to gange årligt, samt hver gang der er formodning om, at de kan have ændret sig væsentligt.
 
Stamopløsninger — forurenet vand  
16. Testkoncentrationer beregnes på grundlag af vandsøjlekoncentrationer, dvs. 
vandet over sedimentet. Testopløsninger med de valgte koncentrationer 
fremstilles almindeligvis ved fortynding af en stamopløsning. Stamopløs ­
ninger fremstilles fortrinsvis ved at opløse teststoffet i testmediet. Anven ­
delse af opløsningsmidler eller dispergeringsmidler kan i nogle tilfælde være 
nødvendig for at fremstille en stamopløsning med en passende koncentra ­
tion. Som opløsningsmiddel kan der benyttes acetone, ethanol, methanol, ethylenglycolmonomethylether, ethylenglycoldimethylether, dimethylfor ­
mamid eller triethylenglycol. Som dispergeringsmiddel kan benyttes Crem ­
ophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcellulose eller HCO-40. Koncen ­
trationen af opløselighedsfremmere i det færdige testmedium skal være så lille som muligt (dvs. ≤ 0,1 ml/l) og bør være den samme i alle behandlings ­
prøver. Når der anvendes en opløselighedsfremmer, må den ikke have nogen 
signifikant virkning på overlevelsen eller synlig negativ virkning på chiro ­
nomidlarven, hvilket kan afsløres ved en kontroltest, hvor kun opløsnings ­
midlet anvendes. Der skal ydes enhver indsats for at undgå brugen af 
sådanne materialer.
 
TESTDESIGN  
17. Testdesignet vedrører valget af testkoncentrationernes antal og intervaller, 
antal testglas med hvert koncentrationsniveau samt antal larver pr. testglas. Design til beregning af EC-punkter, beregning af NOEC og gennemførelse 
af en grænsetest beskrives. Regressionsanalyse foretrækkes frem for hypo ­
tesetest.
 
Design til regressionsanalyse  
18. Testen skal omfatte et interval af koncentrationer, der ligger omkring den 
virksomme koncentration (f.eks. EC  15 , EC  50 ) og det koncentrationsområde, 
hvor man er interesseret i testkemikaliets virkning. Beregningen af de virk ­
somme koncentrationer (EC  x ) vil være mest nøjagtig og gyldig, når den 
virksomme koncentration befinder sig midt i testkoncentrationsområdet.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
Ekstrapolering langt under den laveste positive koncentration eller over den 
højeste koncentration bør undgås. En præliminær test til bestemmelse af 
koncentrationsområdet kan være nyttig, når det skal afgøres, hvilke testkon ­
centrationer der er passende (se afsnit 27).  
19. Hvis EC  x skal bestemmes, skal der testes mindst fem koncentrationer og tre 
replikater for hver koncentration. Under alle omstændigheder bør der anvendes et tilstrækkeligt antal testkoncentrationer til at sikre god modele ­
stimering. Faktoren mellem koncentrationer bør ikke overstige to (med ­
mindre dosiskurven har en lav hældning). Antallet af replikater i hver 
behandling kan reduceres, hvis antallet af testkoncentrationer med forskel ­
lige reaktioner forøges. Hvis antallet af replikater forøges, eller størrelsen af testkoncentrationsintervallerne reduceres, opnås der ofte snævrere konfidens ­
intervaller for testen. Der kræves yderligere replikater, hvis larveoverlevelse 
og -vækst skal anslås for en periode på 10 dage.
 
Design til beregning af NOEC/LOEC  
20. Hvis LOEC eller NOEC skal beregnes, anvendes fem testkoncentrationer 
med mindst fire replikater, og faktoren mellem koncentrationerne bør højst 
være to. Antallet af replikater bør være højt nok til at sikre en tilstrækkelig 
statistisk styrke til at detektere en forskel på 20 % i forhold til kontrollen på signifikansniveauet 5 % (p = 0,05). I forbindelse med udviklingshastigheden er en ANOVA-analyse normalt velegnet, f.eks. Dunnett-testen eller 
Williams-testen (17) (18) (19) (20). I forbindelse med emergensforholdet 
kan Cochran-Armitage-testen, Fishers eksakte test (med Bonferroni-korrektion) eller Mantel-Haenszel-testen anvendes.
 
Grænsetest  
21. En grænsetest kan udføres (med en testkoncentration og kontrol), hvis der 
ikke blev observeret virkninger i den præliminære test til bestemmelse af 
koncentrationsområdet. Formålet med grænsetesten er at indicere, at test ­
stoffets toksiske værdi er større end den testede grænsekoncentration. En anbefalet koncentration kan ikke foreslås i forbindelse med denne testme ­
tode. Det overlades til myndighedernes vurdering. Der anbefales normalt 
seks replikater for både behandlings- og kontrolgruppen. Statistisk styrke til at detektere en forskel på 20 % i forhold til kontrollen på signifikans ­
niveauet 5 % (p = 0,05) skal påvises. Med hensyn til metrisk respons 
(udviklingshastighed og vægt) er t-testen en egnet statistisk metode, hvis 
dataene opfylder kravene i forbindelse med denne test (normalitet og homogen varians). T-testen justeret for forskel i varians eller en 
ikke-parametrisk test, f.eks. Wilcoxon-Mann-Whithey-testen, kan bruges, 
hvis disse krav ikke opfyldes. Med hensyn til emergensforholdet kan Fishers eksakte test anvendes.
 
FREMGANGSMÅDE  
Eksponeringsbetingelser  
Klargøring af forurenet vand- og sedimentsystem  
22. Passende mængder formuleret sediment (se afsnit 13-14 og tillæg 3) tilsættes 
testglasset, så der dannes et lag på mindst 1,5 cm. Vand tilsættes, så der fås en dybde på 6 cm (se afsnit 15). Forholdet mellem dybden af sedimentlaget og dybden af vandet må ikke overstige 1:4, og sedimentlaget må ikke være 
dybere end 3 cm. Sediment/vand-systemet hensættes til forsigtig beluftning i 
syv dage inden testorganismer tilsættes (se afsnit 14 og tillæg 3). For at undgå separering af sedimentets bestanddele og resuspension af fint mate ­
riale under tilsætningen af testvand i vandsøjlen, kan sedimentet overdækkes 
med en plastplade, mens vandet hældes i. Plastpladen fjernes derefter straks. 
Der kan også anvendes andre løsninger.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Testglassene skal være overdækket (f.eks. af glasplader). I løbet af forsøget 
påfyldes der yderligere vand for at bevare det oprindelige volumen og 
kompensere for vandfordampning. Dette vand skal være destilleret eller deioniseret vand for at forhindre opbygning af salte.
 
Tilsætning af testorganismer  
24. Fire til fem dage inden tilsætningen af testorganismer til testglassene udtages 
ægmasse fra bestandene og anbringes i små glas i dyrkningsmedium. Ældet dyrkningsmedium fra stamkulturen eller frisk medium kan anvendes. Hvis sidstnævnte anvendes, tilsættes dyrkningsmediet en lille mængde foder, 
f.eks. grønalger og/eller et par dråber filtrat fra en fintmalet suspension af 
fiskefoder i flager (se tillæg 2). Kun frisklagte ægmasser bør anvendes. Normalt begynder larverne at blive udklækket et par dage efter æglægningen (2-3 dage for Chironomus riparius ved 20 °C og 1-4 dage for Chironomus 
tentans ved 23 °C og Chironomus yoshimatui ved 25 °C), og larvevækst 
sker i fire stadier, som hver er af 4-8 dages varighed. Larver i første stadium (2-3 eller 1-4 dage efter udklækning) bør anvendes i testen. Larver af dansemyg kan muligvis kontrolleres ved hjælp af hovedkapselbredde (6).
 
25. 20 æglarver fordeles vilkårligt til hvert testglas med forurenet sediment og 
vand ved hjælp af en stump pipette. Beluftningen af vandet skal standses, 
mens larverne overføres til testglassene, og den skal være standset i endnu 24 timer efter tilsætningen af larver (se afsnit 24 og 32). Afhængigt af det anvendte testdesign (se afsnit 19 og 20) anvendes der mindst 60 larver pr. 
koncentration i forbindelse med bestemmelse af EC-punkter og 80 til 
bestemmelse af NOEC.
 
26. 24 timer efter tilsætning af larverne tilsættes teststoffet i den overliggende 
vandsøjle, og let beluftning tilføres igen. Små mængder af teststofopløs ­
ninger tilsættes under vandoverfladen ved hjælp af en pipette. Det overlig ­
gende vand blandes derefter forsigtigt, idet det undgås at forstyrre sedimen ­
tet. 
Testkoncentrationer  
27. En test til bestemmelse af koncentrationsområde kan være nyttig, når 
koncentrationsområdet skal vælges til den endelige test. Til det formål anvendes en række spredte koncentrationer af teststoffet. For at opnå den overfladedensitet pr. chironomide, der anvendes i den endelige test, 
eksponeres chironomider for hver koncentration af teststoffet i en periode, 
der gør det muligt at anslå de omtrentlige testkoncentrationer, og der kræves ingen replikater.
 
28. Testkoncentrationerne i den endelige test fastlægges ud fra testen til bestem ­
melse af koncentrationsområde. Mindst fem koncentrationer anvendes og 
vælges som beskrevet i afsnit 18-20.  
Kontroller  
29. Kontrolglas uden teststof, men med sediment, inkluderes i testen med et 
hensigtsmæssigt antal replikater (se afsnit 19-20). Hvis der er anvendt et 
opløsningsmiddel til tilsætning af teststoffet (se afsnit 16), anvendes også en 
opløsningsmiddelkontrol.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Testsystem  
30. Der anvendes statiske systemer. Semistatiske systemer eller gennemstrøm ­
ningssystemer med intermitterende eller kontinuerlig udskiftning af overlig ­
gende vand kan undtagelsesvis bruges, hvis specifikationerne for vandkva ­
litet bliver uhensigtsmæssige for testorganismen eller påvirker den kemiske 
ligevægt (hvis f.eks. koncentrationen af opløst ilt bliver for lav, koncen ­
trationen af ekskretionsprodukter bliver for høj, eller mineraler udvaskes fra sedimentet og påvirker pH og/eller vandets hårdhed). Andre metoder til 
forbedring af det overliggende vands kvalitet, f.eks. beluftning, er normalt 
tilstrækkelige og bør foretrækkes.
 
Foder  
31. Larverne skal fodres, helst dagligt eller mindst tre gange om ugen. Fiske ­
foder (en suspension i vand eller fintmalet foder, f.eks. Tetra-Min eller Tetra-Phyll; se detaljer i tillæg 2) i en mængde på 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 
mg for C. yoshimatui) pr. larve pr. dag er tilstrækkelig til unge larver i de 
første 10 dage. Ældre larver skal have lidt mere foder: 0,5-1 mg pr. larve pr. dag er passende i resten af testen. Foderrationen skal reduceres i alle behandlingsprøver og reguleres, hvis der konstateres svampevækst, eller 
hvis mortalitet observeres i kontrolglassene. Hvis svampevæksten ikke kan 
stoppes, gentages testen. Ved test af stærkt adsorberende stoffer (f.eks. med log K
 ow > 5) eller ved stoffer, der kovalent bindes til sediment, skal den 
mængde foder, der er nødvendig for at sikre organismernes overlevelse og 
naturlige vækst, muligvis tilsættes det formulerede sediment inden stabilise ­
ringsperioden. Til det formål anvendes der plantemateriale i stedet for fiske ­
foder, f.eks. tilsætning af 0,5 % (tørvægt) fintmalede blade af brændenælde (Urtica dioica), morbærtræ (Morus alba), hvidkløver (Trifolium repens) eller 
spinat (Spinacia oleracea). Andet plantemateriale (Cerophyl eller 
alfa-cellulose) kan også anvendes.
 
Inkubationsbetingelser  
32. Forsigtig beluftning af det overliggende vand i testglassene foretages helst 
24 timer efter tilsætningen af larver og foretages gennem hele testen. Det skal sikres, at koncentrationen af opløst ilt ikke falder til mindre end 60 % 
af ASV. Beluftning sker gennem en Pasteur-glaspipette, der er fastgjort 2- 
3 cm over sedimentlaget (dvs. en eller få bobler pr. sekund). Ved test af flygtige kemikalier kan det overvejes ikke at belufte sediment/vand-syste ­
met.
 
33. Testen udføres ved en konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). For C. tentans 
og C. yoshimatui anbefales en temperatur på henholdsvis 23 °C og 25 °C (± 2 °C). Der anvendes en lysperiode på 16 timer, og lysintensiteten skal være 500-1 000 lux.
 
Eksponeringsvarighed  
34. Eksponeringen begynder, når larver tilsættes de forurenede bægerglas og 
kontrolglassene. Den maksimale eksponeringsvarighed er 28 dage for C. 
riparius og C. yoshimatsui og 65 dage for C. tentans. Hvis dansemyg 
udvikles tidligere, kan testen afsluttes, når der er gået mindst fem dage efter emergensen af den sidste voksne i kontrolglasset.
 
OBSERVATIONER  
Emergens  
35. Udviklingstiden og det samlede antal fuldt udviklede han- og hunindivider 
bestemmes. Hanner kan nemt identificeres ved deres fjerbuskede antenner.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Testglassene observeres mindst tre gange ugentligt med henblik på visuelt at 
vurdere abnorm opførsel (hvis individer f.eks. forlader sediment eller 
svømmer på en usædvanlig måde) sammenlignet med kontrollen. I løbet af perioden for forventet emergens foretages en daglig tælling af de udvik ­
lede individer. Kønnet og antallet af fuldt udviklede individer registreres 
dagligt. Efter identifikation fjernes individerne fra bægerglassene. Ægmasse, 
der er afsat før afslutningen af testen, registreres og fjernes derefter for at forhindre gentaget tilførsel af larver til sedimentet. Antallet af synlige pupper, der ikke har udviklet sig, registreres også. Vejledning i måling af 
emergens findes i tillæg 5.
 
Vækst og overlevelse  
37. Hvis der skal fremlægges data om larveoverlevelse og -vækst efter 10 dage, 
skal yderligere testglas medtages fra begyndelsen, så de kan anvendes efter ­
følgende. Sedimentet fra disse yderligere glas sigtes gennem en 250 μm 
sigte for at tilbageholde larverne. Kriterier for død er immobilitet eller 
manglende reaktion på mekaniske stimuli. Larver, der ikke genfindes, regi ­
streres også som døde (larver, der er døde ved begyndelsen af testen, kan være blevet nedbrudt af mikrober). Tørvægten (askefri) af de overlevende 
larver pr. testglas bestemmes, og den individuelle gennemsnitlige tørvægt pr. 
glas beregnes. Det er nyttigt at bestemme det stadium, som de overlevende larver befinder sig på. Til det formål anvendes en måling af bredden på hvert individs hovedkapsel.
 
Analysemålinger  
Teststofkoncentration  
38. Som minimum analyseres prøver af det overliggende vand, porevandet og 
sedimentet ved begyndelsen (helst en time efter tilsætning af teststoffet) og slutningen af testen ved den højeste koncentration og en lavere. Disse bestemmelser af teststofkoncentrationen giver oplysninger om teststoffets 
opførsel/fordeling i vand- og sedimentsystemet. Prøvetagning af sediment 
ved begyndelsen af testen kan påvirke testsystemet (f.eks. fjerne testlarver), og derfor bør der anvendes yderligere testglas til udførelsen af analyse ­
bestemmelser ved begyndelsen af og i løbet af testen, hvis det er hensigts ­
mæssigt (se afsnit 39). Målinger i sediment er muligvis ikke nødvendige, 
hvis fordelingen af teststoffet mellem vand og sediment er blevet tydeligt bestemt i et vand- og sedimentforsøg under lignende betingelser (f.eks. forhold mellem vand og sediment, anvendelsestype og organisk kulstofind ­
hold i sediment).
 
39. Når der foretages mellemliggende målinger (f.eks. på dag 7), og hvis der i 
analysen skal bruges større prøver, der ikke kan udtages fra testglas uden at 
påvirke testsystemet, udføres de analytiske bestemmelser på prøver fra yder ­
ligere testglas, der er behandlet på samme måde (herunder tilstedeværelse af testorganismer), men som ikke anvendes til biologiske observationer.
 
40. Centrifugering ved f.eks. 10 000 g og 4 °C i 30 minutter er den anbefalede 
fremgangsmåde til isolering af interstitielt vand. Hvis det påvises, at test ­
stoffet ikke adsorberer til filtre, kan filtrering dog accepteres. I nogle tilfælde 
er det ikke muligt at analysere koncentrationer i porevandet, da prøvestør ­
relsen er for lille.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fysisk-kemiske parametre  
41. Testglassenes pH og temperatur samt opløst ilt i vandet måles på en 
hensigtsmæssig måde (se afsnit 10). Hårdhed og ammoniak måles i kontrol ­
glassene og et testglas ved den højeste koncentration ved begyndelsen og 
afslutningen af testen.  
DATA OG RAPPORTERING  
Behandling af resultater  
42. Formålet med denne test er at bestemme virkningen af teststoffet på udvik ­
lingshastigheden og det samlede antal fuldt udviklede han- og hunindivider 
eller virkningen på larvernes overlevelse og vægt, hvis en 10-dages test 
udføres. Hvis der ikke er indikationer på statistisk forskellige sensitiviteter mellem kønnene, kan resultaterne for hanner og hunner samles med henblik på statistisk analyse. Kønsbetingede sensitivitetsforskelle kan vurderes 
statistisk ved hjælp af f.eks. en χ
 2 -r × 2-test. Larvernes overlevelse og 
den individuelle gennemsnitlige tørvægt pr. glas bestemmes om nødvendigt efter 10 dage.
 
43. Effektkoncentrationer udtrykt som koncentrationer i det overliggende vand 
beregnes fortrinsvis ud fra målte sedimentkoncentrationer ved begyndelsen 
af testen (se afsnit 38).  
44. For at beregne et punktestimat for EC  50 eller en anden EC  x -værdi bruges 
data pr. glas som ægte replikater. Når et konfidensinterval for en EC  x -værdi 
beregnes, skal variabiliteten mellem glassene tages i betragtning, eller det 
skal påvises, at denne variabilitet er så lille, at den kan ignoreres. Når 
modellen tilpasses ved hjælp af Least Squares, foretages en transformation af dataene pr. glas for at forbedre varianshomogeniteten. EC
 x -værdier 
beregnes dog, når resultatet er transformeret tilbage til den oprindelige 
værdi.  
45. Når den statistiske analyse har til formål at bestemme NOEC/LOEC ved 
hjælp af hypotesetest, skal variabiliteten mellem glassene tages i betragtning, f.eks. ved hjælp af nested ANOVA. Alternativt kan mere robuste test (21) 
bruges i situationer, hvor de sædvanlige ANOVA-antagelser ikke kan 
anvendes.
 
Emergensforhold  
46. Emergensforhold er kvantale data og kan analyseres ved at anvende 
Cochran-Armitage-testen på en nedadgående måde, hvor et monotont dosis ­
respons forventes, og disse data er i overensstemmelse med denne forvent ­
ning. Hvis det ikke er tilfældet, kan Fishers eksakte test eller 
Mantel-Haenszel-testen med Bonferroni-Holm-korrigerede p-værdier anven ­
des. Hvis der er bevis for større variabilitet mellem replikater inden for samme koncentration, end en binominal fordeling indicerer (ofte betegnet som »ekstra-binominal« variation), anvendes en robust Cochran-Armitage- 
test eller Fishers eksakte test som foreslået i (21).
 
47. Summen af individer, der har udviklet sig pr. glas, n  e , bestemmes og 
divideres med antallet af tilførte larver, n  a : 
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
hvor:  
ER = emergensforhold  
n e = antal udviklede individer pr. glas  
n a = antal tilførte larver pr. glas  
48. Ved store prøvestørrelser, hvor der er ekstra-binominal varians, kan emer ­
gensforholdet behandles som et kontinuerligt respons, og der kan bruges 
fremgangsmåder, som f.eks. Williams test, når et monotont dosisrespons forventes og er i overensstemmelse med disse ER-data. Dunnetts test kan anvendes, hvis der ikke kan påvises monotoni. Et stor prøvestørrelse defi ­
neres her som prøver, hvor både antallet af udviklede individer og antallet af 
ikke-udviklede individer overstiger fem målt pr. replikat (glas).
 
49. Hvis ANOVA-metoder anvendes, skal ER-værdier først transformeres ved 
hjælp af arcsin-sqrt-transformation eller Freeman-Tukey-transformation for 
at få en omtrentlig normalfordeling og udligne varians. Cochran-Armitage- 
testen, Fishers eksakte test (med Bonferroni-korrektion) eller Mantel-Haenszel-testen kan anvendes, hvis absolutte hyppigheder anvendes. Arcsin-sqrt-transformation anvendes ved at tage invers sinus (sin
 –1 ) af 
kvadratroden af ER.  
50. I forbindelse med emergensforhold beregnes EC  x -værdier ved hjælp af 
regressionsanalyse (eller f.eks. probit (22), logit, Weibull, relevant software i handelen osv.). Hvis regressionsanalyse mislykkes (hvis der f.eks. er mindre end to delsvar), anvendes andre ikke-parametriske metoder, som 
f.eks. glidende gennemsnit eller simpel interpolation.
 
Udviklingshastighed  
51. Den gennemsnitlige udviklingstid repræsenterer det gennemsnitlige tidsrum 
mellem tilsætningen af larver (testens dag 0) og emergensen af testkohorten 
af dansemyg. (Ved beregning af den sande udviklingstid tages larvernes alder på tilsætningstidspunktet i betragtning.) Udviklingshastigheden er det reciprokke tal til udviklingstiden (enhed: 1/dag) og angiver den del af 
larveudviklingen, der finder sted pr. dag. Udviklingshastigheden foretrækkes 
til evaluering af disse sedimenttoksicitetsforsøg, da dens varians er lavere, og da den er mere homogen og ligger tættere på normalfordelingen end udviklingstid. Testfremgangsmåder baseret på anvendelige parametre kan 
derfor bruges med udviklingshastighed i stedet for udviklingstid. For udvik ­
lingshastighed som et kontinuerligt respons kan EC
 x -værdier estimeres ved 
hjælp af regressionsanalyse (f.eks. (23) (24)).  
52. I forbindelse med følgende statistiske test antages det antal individer, der er 
observeret på kontroldagen, at være udviklet ved gennemsnittet af tidsinter ­
vallet mellem dag × og dag x-l (l = længde af inspektionsinterval, normalt 1 dag). Den gennemsnitlige udviklingshastighed pr. glas ( x) beregnes ved 
hjælp af følgende ligning:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
hvor:  
x: gennemsnitlig udviklingshastighed pr. glas  
i: indeks for inspektionsinterval  
m: maksimalt antal inspektionsintervaller  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : antal individer, der er udviklet i inspektionsintervallet i  
n e : det samlede antal individer, der er udviklet ved slutningen af forsøget 
(= P ƒ i ) 
x i : udviklingshastighed for individer, der er udviklet i intervallet i  
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
hvor:  
day  i : inspektionsdag (siden behandling)  
l i : længde af inspektionsintervallet i (dage, normalt 1 dag)  
Testrapport  
53. Testrapporten skal mindst indeholde følgende oplysninger:  
Teststof:  
— fysiske egenskaber og relevante fysisk-kemiske egenskaber (vandopløse ­
lighed, damptryk, fordelingskoefficient i jord (eller sediment, hvis tilgængelig), stabilitet i vand osv.)
 
— kemisk identifikation (generisk navn, kemisk navn, CAS-nummer, struk ­
turformel osv.), herunder renhed og analysemetode til kvantificering af teststof.
 
Testart:  
— anvendte forsøgsdyr: art, videnskabeligt navn, herkomst af organismer 
og dyrkningsbetingelser  
— information om håndtering af ægmasser og larver  
— forsøgsdyrenes alder ved tilsætning til testglas.  
Testbetingelser:  
— anvendt sediment, dvs. naturligt eller formuleret sediment  
— for naturligt sediment: beliggenhed og beskrivelse af prøvetagningsstedet 
for sediment, herunder så vidt muligt oplysninger om tidligere forure ­
ning; karakteristika: pH, organisk kulstofindhold, C/N-forhold og korn ­
størrelse (hvis relevant)  
— fremstilling af formuleret sediment: ingredienser og karakteristika (orga ­
nisk kulstofindhold, pH, fugt osv. ved begyndelsen af testen)  
— fremstilling af testvand (hvis rekonstitueret vand anvendes) og dets 
karakteristika (iltkoncentration, pH, ledningsevne, hårdhed osv. ved 
begyndelsen af testen)  
— dybde af sediment og overliggende vand  
— volumen af overliggende vand og porevand; vægt af vådt sediment med 
og uden porevand  
— testglas (materiale og størrelse)  
— metode til fremstilling af stamopløsninger og testkoncentrationer  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— anvendelse af teststof: anvendte testkoncentrationer, antal replikater og 
brug af evt. opløsningsmiddel  
— inkubationsbetingelser: temperatur, lysintensitet og -periodicitet, beluft ­
ning (hyppighed og intensitet)  
— detaljerede oplysninger om fodring, herunder fodertype, tilberedning, 
mængde og fodringshyppighed.  
Resultater:  
— nominelle testkoncentrationer, målte testkoncentrationer og resultater af 
alle analyser med henblik på at bestemme teststofkoncentrationen i test ­
glasset  
— kvaliteten af vandet i testglassene, dvs. pH, temperatur, opløst ilt, 
hårdhed og ammoniak  
— evt. udskiftning af fordampet vand  
— antal udviklede han- og hunindivider pr. glas og pr. dag  
— antal larver, der ikke udviklede sig til dansemyg, pr. glas  
— individuel gennemsnitlige tørvægt af larver pr. glas og pr. stadium, hvis 
relevant  
— procentvis emergens pr. replikat og testkoncentration (samlet for han- og 
hunindivider)  
— gennemsnitlig udviklingshastighed for fuldt udviklede individer pr. 
replikat og behandlingshastighed (samlet for han- og hunindivider)  
— estimater for toksicitetseffektparametre, f.eks. EC  x (og tilhørende konfi ­
densintervaller), NOEC og/eller LOEC og de statistiske metoder, der 
anvendt til at beregne dem  
— diskussion af resultaterne, herunder den eventuelle betydning af fravi ­
gelser fra denne testmetode.  
LITTERATUR:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Devel ­
opment and validation of a new test system. Redigeret af M. Streloke og H. Köpp. Berlin 1995.
 
(2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Endelig rapport til Europa-Kommissionen. Rapport nr. EC 
3738. August 1994. WRc, Det Forenede Kongerige.  
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Fra 
WOSTA-workshop afholdt i Nederlandene.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebra ­
tes. s. 1125-1241. I ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
 
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. 
Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first 
edition dated June 1994.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850,1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ og Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of 
Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and 
Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.  
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
 
(14) Kapitel C.8 i dette bilag, Toksicitet for regnorme.  
(15) Suedel BC og Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
(16) Naylor C og Rodrigues C (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482-491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103-117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510-531.  
(21) Rao JNK og Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered 
binary data. Biometrics 48:577-585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
(23) Bruce og Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.  
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
I forbindelse med denne testmetode anvendes følgende definitioner:  
Formuleret sediment  eller rekonstitueret, kunstigt eller syntetisk sediment: en 
blanding af materialer, der bruges til at efterligne de fysiske bestanddele i natur ­
ligt sediment.  
Overliggende vand : det vand, der tilsættes over sedimentet i testglasset.  
Interstitielt vand  eller porevand: det vand, der optager pladsen mellem sediment 
og jordpartikler.  
Spiked vand  eller forurenet vand: vand, som teststoffet er tilsat.  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Tillæg 2  
Anbefalinger vedrørende dyrkning af  Chironomus riparius  
1. Chironomus-larver kan holdes i krystallisationsskåle eller større beholdere. 
Fint kvartssand spredes i et tyndt lag på ca. 5-10 mm på bunden af skålen. Kiselgur (f.eks. Merck, Art 8117) er også et egnet substrat (et tyndere lag på få mm er nok). En passende mængde vand tilsættes, så der fås en dybde på 
flere cm. Vandet fyldes op efter behov for at erstatte tab som følge af 
fordampning og undgå udtørring. Vandet kan udskiftes, hvis det er nødven ­
digt. Forsigtig beluftning skal foretages. Larvebeholderne opbevares i et bur, der er egnet til formålet, og som forhindrer udviklede voksne i at forsvinde. 
Buret skal være så stort, at udviklede voksne kan danne sværme. Ellers vil 
kopulation muligvis ikke forekomme (minimum er ca. 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Burene opbevares ved rumtemperatur eller i rum med konstant temperatur 
ved 20 ± 2 °C med belysning, der består af 16 timers lys (intensitet ca. 
1 000 lux) og 8 timers mørke. Det er rapporteret, at en luftfugtighed på 
mindre end 60 % RH kan hæmme reproduktionen.  
Fortyndingsvand  
3. Der kan anvendes egnet naturligt eller syntetisk vand. Brøndvand, afkloret 
ledningsvand eller kunstige medier (f.eks. Elendt M4 eller M7, se nedenfor) anvendes ofte. Vandet skal beluftes inden brug. Om nødvendigt kan vandet i beholderne udskiftes ved forsigtigt at hælde eller suge det brugte vand fra 
dyrkingsbeholderne uden at ødelægge larverørene.
 
Fodring af larver  
4. Chironomus-larver fodres med fiskefoder i flager (Tetra Min®, Tetra Phyll® 
eller et tilsvarende mærke af særligt fiskefoder) med ca. 250 mg pr. beholder 
pr. dag. Foderet kan gives som tørt malet pulver eller som en suspension i vand: 1,0 g foder i flager tilsættes 20 ml fortyndet vand og blandes for at få en homogen blanding. Denne præparat kan tilsættes med ca. 5 ml pr. 
beholder pr. dag (rystes inden brug). Ældre larver kan gives mere foder.
 
5. Fodringen tilpasses vandkvaliteten. Hvis dyrkningsmediet bliver uklart, 
reduceres fodermængden. Tilsætningen af foder overvåges nøje. For lidt foder vil få larverne til at vandre til vandsøjlen, og for meget foder vil forårsage øget mikrobiel aktivitet og lavere iltkoncentrationer. Begge 
forhold kan medføre lavere vækstrater.
 
6. Nogle grønalger (f.eks. Scenedesmus subspicatus og Chlorella vulgaris) kan 
også tilsættes ved etableringen af nye dyrkningsbeholdere.  
Fodring af udviklede voksne  
7. Nogle forskere har foreslået, at vat, der er opblødt i mættet rørsukkerop ­
løsning, kan bruges som foder til udviklede voksne.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Emergens  
8. Efter ca. 13-15 dage ved 20 ± 2 °C begynder voksne at udvikle sig fra 
larvebeholderne. Hanner kan nemt identificeres ved deres fjerbuskede anten ­
ner. 
Ægmasser  
9. Når der findes voksne i buret, skal alle larvebeholdere kontrolleres tre gange 
om ugen for afsætning af geleagtige ægmasser. Evt. ægmasser skal fjernes 
forsigtigt. De overføres til en lille plade med en prøve af dyrkningsvandet. 
Ægmasser bruges til at starte et nyt dyrkningsglas (f.eks. 2-4 ægmasser pr. glas) eller til toksicitetstest.
 
10. Æglarver udklækkes efter 2-3 dage.  
Etablering af nye dyrkningsglas  
11. Når vækstbetingelser er etableret, kan et nyt larvedyrkningsglas etableres 
hver uge eller mindre hyppigt afhængigt af testkravene, således at de ældste glas kan fjernes, når voksne individer har udviklet sig. Ved hjælp af dette system fås der er en regelmæssig forsyning af voksne med minimal 
håndtering.
 
Fremstilling af testopløsninger M4 og M7  
12. Elendt (1990) har beskrevet M4-mediet. M7-mediet fremstilles på samme 
måde som M4-mediet bortset fra de stoffer, der er anført i tabel 1, for hvilke 
koncentrationerne er fire gange lavere i M7 end i M4. En artikel om M7- 
mediet er under forberedelse (Elendt, personlig meddelelse). I henhold til Elendt og Bias (1990) bør testopløsningen ikke fremstilles for de nævnte koncentrationer af NaSiO
 3 5 H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 og K  2 HPO  4 , idet oplys ­
ningerne om fremstillingen af stamopløsninger ikke er fyldestgørende.  
Fremstilling af M7-mediet  
13. Hver stamopløsning (I) fremstilles individuelt, og en kombineret 
stamopløsning (II) fremstilles ud fra disse stamopløsninger (I) (se tabel 1). 
M7-mediet fremstilles ved at fortynde 50 ml af den kombinerede stamopløsning (II) og de mængder af hver stamopløsning med makro-næringsstoffer, der er anført i tabel 2, med 1 liter deioniseret vand. 
En vitaminopløsning fremstilles ved at tilsætte tre vitaminer til deioniseret 
vand som anført i tabel 3, og 0,1 ml af den kombinerede vitaminopløsning tilsættes det færdige M7-medium umiddelbart inden brug. Vitaminopløs ­
ningen opbevares i små aliquoter i frossen tilstand. Mediet beluftes og 
stabiliseres.
 
Tabel 1  
Stamopløsninger af sporstoffer til M4- og M7-medierne  
Stamopløsninger (I) Mængde (mg), 
der fortyndes 
med 1 l deioni ­
seret vand Fremstilling af den kombinerede 
stamopløsning (II): Bland følgende 
mængder (ml) af 
stamopløsninger (I), og fortynd med 
1 l deioniseret vand Endelige koncentrationer i testopløs ­
ninger (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Stamopløsninger (I) Mængde (mg), 
der fortyndes 
med 1 l deioni ­
seret vand Fremstilling af den kombinerede 
stamopløsning (II): Bland følgende 
mængder (ml) af 
stamopløsninger (I), og fortynd med 
1 l deioniseret vand Endelige koncentrationer i testopløs ­
ninger (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
Kl 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Disse stoffer varierer i M4 og M7 som anført ovenfor. 
( 2 ) Disse opløsninger fremstilles hver for sig, hældes sammen og autoklaveres straks.  
Tabel 2  
Stamopløsninger med makro-næringsstoffer til M4- og M7-medierne  
Mængde, der fortyndes 
med 1 l deioniseret 
vand 
(mg) Mængde af stamopløs ­
ninger med 
makro-næringsstoffer, der 
tilsættes for at fremstille 
M4- og M7-medierne 
(ml/l) Endelige koncentra ­
tioner i testopløsninger 
M4 og M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabel 3  
Vitaminopløsninger til M4- og M7-medierne  
Alle tre vitaminopløsninger samles for at fremstille én vitaminopløsning.  
Mængde, der fortyndes 
med 1 l deioniseret vand 
(mg) Mængde af vitaminopløsning, 
der tilsættes for at fremstille 
M4- og M7-medierne 
(ml/l) Endelige koncentrationer 
i testopløsninger M4 og 
M7 
(mg/l)  
Thiaminhydrochlorid 750 0,1 0,075 
Cyanocobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotin 7,5 0,1 0,00075  
LITTERATUR  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Redigeret af M. Streloke og H. Köpp. Berlin 
1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt BP og Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Tillæg 3  
FREMSTILLING AF FORMULERET SEDIMENT  
Sammensætning af sediment  
Det formulerede sediment skal have følgende sammensætning:  
Bestanddel Karakteristika % af sediment 
(tørvægt)  
Tørv Sphagnum så nær pH 5,5-6,0 
som muligt uden synlige planterester og findelt (parti ­
kelstørrelse ≤ 1 mm) og luft ­
tørret 4-5 
Kvartssand Kornstørrelse: > 50 % af 
partiklerne skal være fra 50- 200 μm 75-76 
Kaolinholdigt ler Kaolinindhold ≥ 30 % 20 
Organisk kulstof Justeres ved tilsætning af tørv 
og sand 2 (± 0,5) 
Calciumcarbonat CaCO
 3 , pulveriseret, kemisk 
rent 0,05-0,1 
Vand Ledeevne ≤ 10 μS/cm 30-50  
Fremstilling  
Tørven lufttørres og males til fint pulver. En suspension af den krævede mængde 
tørvepulver i ioniseret vand fremstilles ved brug af et højtydende homogenise ­
ringsapparat. pH-værdien af denne suspension justeres til 5,5 ± 0,5 med CaCO  3 . 
Suspensionen konditioneres i mindst to dage med forsigtig omrøring ved 20 
± 2 °C for at stabilisere pH og opnå en stabil mikrobiel komponent. pH måles 
igen og skal være 6,0 ± 0,5. Derefter blandes tørvesuspensionen med de andre bestanddele (sand og kaolinholdigt ler) og deioniseret vand for at få et homogent sediment med et vandindhold på 30-50 % af sedimentets tørvægt. Den færdige 
blandings pH måles igen og justeres om nødvendigt til 6,5 til 7,5 med CaCO
 3 . 
Der udtages prøver af sedimentet for at bestemme tørvægten og det organiske kulstofindhold. Inden det formulerede sediment anvendes i en toksicitetstest på chironomider, bør det konditioneres i syv dage under de betingelser, der 
anvendes i den efterfølgende test.
 
Opbevaring  
De tørre bestanddele til fremstilling af kunstigt sediment lagres tørt og køligt ved 
rumtemperatur. Det formulerede (våde) sediment må ikke opbevares inden brug. 
Det skal bruges umiddelbart efter konditioneringsperioden på de syv dage, som 
afslutter dets fremstilling.  
LITTERATUR:  
Kapitel C.8 i dette bilag. Toksicitet for regnorme.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Tillæg 4  
Kemiske egenskaber af acceptabelt vand til fortynding  
Stof Koncentrationer  
Faste stoffer < 20 mg/l 
Totalt organisk kulstof < 2 mg/l Ikke-ioniseret ammoniak < 1 μg/l 
Hårdhed som CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Residualt chlor < 10 μg/l 
Total organiske phosphorpesticider < 50 ng/l Total chlorerede organiske pesticider + polychlorbip ­
henyler < 50 ng/l 
Total organisk chlor < 25 ng/l
 
(*) Hvis der er formodning om en interaktion mellem hårdhedsioner og teststoffet, anvendes 
vand med lavere hårdhed (og dermed må Elendt-medium M4 ikke anvendes i denne 
situation).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Tillæg 5  
Vejledning i overvågning af emergens af chironomidlarver  
Emergensfiltre anbringes på testbægerglassene. Disse filtre skal bruges fra dag 20 
til slutningen af testen. Et eksempel på et filter vises nedenfor:
  
A: Nylonvæv  
B: Omvendte plastbægre  
C: Eksponeringsbæger uden flange  D: Åbninger med væv til vandudskiftning  
E: Vand  
F: Sediment  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  LET BIONEDBRYDELIGHED — CO  2 I LUKKEDE BEHOLDERE 
(HEADSPACE-TEST)  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 310 (2006). Denne 
testmetode er en screeningsmetode til evaluering af kemikaliers lette bioned ­
brydelighed og giver oplysninger, der svarer de oplysninger, der fås med de seks testmetoder, som er beskrevet i kapitel C.4 (A-F) i dette bilag. Et kemikalie, der giver positive resultater i forbindelse med denne testmetode, 
kan derfor betragtes som let bionedbrydeligt og derfor hurtigt nedbrydeligt i 
miljøet.
 
2. Den veletablerede kuldioxidmetode (CO  2 ) (1), der er baseret på Sturms 
originale test (2) til vurdering af organiske kemikaliers bionedbrydelighed, 
som måler den kuldioxid, der produceres ved mikrobiel aktivitet, har normalt været den foretrukne metode i forbindelse med test af tungtopløse ­
lige kemikalier og stærkt adsorberende kemikalier. Den er også blevet 
anvendt i forbindelse med opløselige (men ikke flygtige) kemikalier, da udviklingen af kuldioxid af mange betragtes som det eneste klare bevis for mikrobiel aktivitet. Eliminering af opløst organisk kulstof kan opnås 
ved hjælp af fysisk-kemiske processer — adsorption, fordampning, udfæld ­
ning, hydrolyse — og ved hjælp af mikrobiel aktivitet, og mange ikke-biologiske reaktioner forbruger ilt. CO
 2 produceres i sjældne tilfælde 
abiotisk fra organiske kemikalier. I den originale og tilpassede Sturm-test (1) 
(2) elimineres CO  2 fra væskefasen til de absorberende kar som følge »spar ­
ging« (dvs. luftbobler, der er behandlet til at eliminere CO  2 via det flydende 
substrat), mens CO  2 i Larsons version (3) (4) overføres fra reaktionsbehol ­
deren til absorberne ved at lade CO  2 -fri luft passere gennem headspace og 
ved også kontinuerligt at ryste testbeholderen. Kun i Larsons version rystes 
reaktionsbeholderen. Omrystning foreskrives kun for uopløselige stoffer i ISO 9439 (5) og i den originale amerikanske version (6), som begge fore ­
skriver sparging i stedet for headspace-udskiftning. I en anden officiel 
amerikansk EPA-metode (7), som er baseret på Gledhills metode (8), er 
den omrystede reaktionsbeholder lukket for atmosfæren, og det producerede CO
 2 opsamles i et indbygget alkalisk filter direkte fra gasfasen som i klas ­
siske Warburg/Barcroft-respirometerkolber.  
3. Det er påvist, at uorganisk kulstof akkumuleres i mediet ved anvendelse af 
den traditionelle tilpassede Sturm-test på en række kemikalier (9). En 
koncentration af uorganisk kulstof på så meget som 8 mg/l blev fundet 
under nedbrydningen af 20 mg C/l anilin. Opsamling af CO  2 i alkalifiltre 
gav derfor ikke et sandt billede af den mængde CO  2 , der produceres mikro ­
biologisk på forskellige tidspunkter i løbet af nedbrydningen. Som følge 
deraf opfyldes forskriften om, at en teoretisk maksimal CO  2 -produktion > 
60 % skal opsamles inden for et »10-dages-vindue« (de 10 dage umiddel ­
bart efter opnåelsen af 10 % bionedbrydning), for at et testkemikalie kan klassificeres som let bionedbrydeligt, ikke for visse kemikalier, der klas ­
sificeres som sådan ved hjælp af eliminering af opløst organisk 
kulstof (DOC).
 
4. Når den procentvise nedbrydning er en lavere værdi end forventet, akku ­
muleres uorganisk kulstof muligvis i testopløsningen. Bionedbrydelighed 
kan derefter vurderes med andre test for let bionedbrydelighed.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. På grund af andre ulemper ved Sturm-metoden (besværlig, tidskrævende, 
mere udsat for forsøgsfejl og ikke-anvendelig i forbindelse med flygtige 
kemikalier) har man tidligere forsøgt at finde en teknik med en lukket beholder — ud over Gledhills — i stedet for gasgennemstrømning (10) (11). Boatman et al. (12) gennemgik de tidligere metoder og anvendte et 
indesluttet headspace-system, hvor CO
 2 blev frigivet til headspace ved slut ­
ningen af inkubationen gennem forsuring af mediet. CO  2 blev målt ved 
hjælp af gaskromatografi (GC)/analyse af uorganisk kulstof i automatisk udtagne prøver fra headspace, men opløst uorganisk kulstof (DIC) i væske ­
fasen blev ikke taget i betragtning. De anvendte beholdere var desuden 
meget små (20 ml) og indeholdt kun 10 ml medium, hvilket gav problemer f.eks. ved tilsætning af de nødvendigvis meget små mængder uopløselige testkemikalier. Der kunne også være for få eller ingen mikroorganismer til 
stede i det inokulerede medium, som kan nedbryde testkemikalierne.
 
6. Disse vanskeligheder er blevet afhjulpet af de forsøg, som Struijs og Stol ­
tenkamp (13) samt Birch og Fletcher (14) hver for sig har udført, idet sidstnævnte har været inspireret af erfaringer med apparatur anvendt i den 
anaerobe bionedbrydningstest (15). I den førstnævnte metode (13) måles 
CO
 2 i headspace efter forsuring og ækvilibrering, mens DIC i sidstnævnte 
metode (14) måles i både gasfasen og væskefasen uden behandling. Over 90 % af det dannede uorganiske kulstof var til stede i væskefasen. Begge 
metoder har fordele i forhold til Sturm-testen, idet testsystemet var mere 
kompakt og håndterbart, flygtige kemikalier kan testes, og muligheden for forsinkelse i målingen af det producerede CO
 2 undgås.  
7. De to metoder blev kombineret i ISO Headspace CO  2 -standarden (16), som 
blev ringtestet (17), og det er denne standard, der er grundlaget for denne testmetode. De to metoder er ligeledes blevet anvendt i den amerikanske EPA-metode (18). Der anbefales to metoder til måling af CO
 2 , nemlig CO  2 i 
headspace efter forsuring (13) og uorganisk kulstof i væskefasen efter tilsæt ­
ning af yderligere alkali. Sidstnævnte metode blev introduceret af Peterson under CONCAWE-ringtesten (19) af denne headspace-metode med tilpas ­
ning til måling af iboende bionedbrydelighed. De ændringer, der blev fore ­
taget i revisionen af metoderne i kapitel C.4 Bestemmelse af let bioned ­
brydelighed i dette bilag i 1992 (20), er indarbejdet i denne testmetode, således at betingelserne (medium, varighed osv.) i øvrigt er de samme som i den reviderede Sturm-test (20). Birch og Fletcher (14) har påvist, at 
næsten samme resultater blev opnået med denne headspace-test som med de 
samme kemikalier i OECD-ringtesten (21) af de reviderede testmetoder.
 
TESTENS PRINCIP  
8. Som eneste kulstof- og energikilde inkuberes testkemikaliet, normalt ved 20 
mg C/l, i et medium af bufrede mineralsalte, som er inokuleret med en blandet population af mikroorganismer. Testen udføres i lukkede flasker 
med headspace af luft, som skaber et iltreservoir til aerob bionedbrydning. 
CO
 2 -udviklingen som følge af den fuldstændige aerobe bionedbrydning af 
testkemikaliet bestemmes ved at måle det uorganiske kulstof, der produceres i testflaskerne, ud over det, der produceres i blindprøver, som kun inde ­
holder inokuleret medium. Graden af bionedbrydning udtrykkes som en 
procentdel af den teoretiske maksimale produktion af uorganisk kulstof (ThIC) baseret på den mængde testkemikalie (som organisk kulstof), der oprindeligt blev tilsat.
 
9. DOC-eliminering og/eller graden af primær bionedbrydning af testkemikaliet 
kan også måles (20).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
OPLYSNINGER OM TESTKEMIKALIET  
10. Testkemikaliets organiske kulstofindhold (% w/w) skal kendes enten fra dets 
kemiske struktur eller ved måling, således at den procentvise nedbrydning kan beregnes. For flygtige testkemikalier kan en målt eller beregnet Henrys 
konstant bruges til at bestemme et hensigtsmæssigt forhold mellem heads ­
pace og væskevolumen. Information om testkemikaliets toksicitet over for mikroorganismer kan bruges til at vælge en hensigtsmæssig testkoncentra ­
tion og fortolke resultater, der påviser lav bionedbrydelighed. Kontrol for 
hæmning bør medtages, medmindre det er påvist, at testkemikaliet ikke 
hæmmer mikrobielle aktiviteter (se afsnit 24).
 
METODENS ANVENDELSESOMRÅDE  
11. Testen kan anvendes i forbindelse med vandopløselige og uopløselige test ­
kemikalier, men god dispergering af testkemikaliet skal sikres. Ved hjælp af 
det anbefalede forhold mellem headspace og væskevolumen på 1:2 kan flygtige kemikalier med en Henrys konstant på op til 50 Pa.m
 3 .mol  –1 
testes, da testkemikaliets andel af headspace ikke overstiger 1 % (13). Et 
mindre headspace-volumen kan anvendes ved test af kemikalier, der er mere 
flygtige, men hvis biotilgængelighed virker begrænsende, navnlig hvis de er tungtopløselige i vand. Brugerne skal dog sikre, at forholdet mellem heads ­
pace og væskevolumen og koncentrationen af testkemikaliet er af en sådan 
karakter, at der er ilt nok til stede til at muliggøre fuldstændig aerob bioned ­
brydning. Det skal f.eks. undgås at bruge en høj substratkoncentration og et lille headspace-volumen. Vejledning i dette findes i (13) (23).
 
REFERENCEKEMIKALIER  
12. For at kontrollere testfremgangsmåden testes et referencekemikalie med 
kendt bionedbrydelighed parallelt. Til det formål kan anilin, natriumbenzoat 
eller ethylenglycol anvendes i forbindelse med test af vandopløselige test ­
kemikalier og 1-octanol til tungtopløselige testkemikalier (13). Bionedbryd ­
ning af disse kemikalier skal nå op på > 60 % af den teoretiske maksimale 
produktion af uorganisk kulstof inden for 14 dage.  
REPRODUCERBARHED  
13. I ISO-ringtesten af metoden (17) blev følgende resultater opnået under de 
anbefalede betingelser, herunder 20 mg C testkemikalie pr. liter.  
Testkemikalie Gennemsnitlig 
bionedbrydning i % 
(28 d) Variationskoeffi ­
cient 
(%) Antal laboratorier  
Anilin 90 16 17 
1-octanol 85 12 14  
Variabiliteten inden for testen (replikabilitet), ved brug af anilin, var lav, 
idet variationskoefficienterne var mindre end 5 % i næsten alle testserier. I 
de to tilfælde, hvor replikabiliteten var ringere, skyldtes den større varia ­
bilitet sandsynligvis en høj produktion af uorganisk kulstof i blindprøverne. Replikabiliteten var ringere med 1-octanol, men stadig mindre end 10 % for 
79 % af testserierne. Denne større variabilitet inden for testen kan skyldes 
doseringsfejl, da en lille mængde (3-4 μl) 1-octanol skulle injiceres i 
lukkede testflasker. Der opnås højere variationskoefficienter, når der anvendes lavere koncentrationer af testkemikaliet, især ved koncentrationer 
under 10 mg C/l. Dette kan delvist afhjælpes ved at reducere koncentration 
af det totale kulstofindhold i inokulum.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. I en EU-ringtest (24) af fem overfladeaktive stoffer, som blev tilsat med 10 
mg C/l, blev der opnået følgende resultater:  
Testkemikalie Gennemsnitlig 
bionedbrydning i % 
(28 d) Variationskoef ­
ficient 
(%) Antal laborato ­
rier 
Tetrapropylen 
benzensulfonat 17 45 10 
Di-isooctylsulfo- 
succinat 
(anionisk) 72 22 9 
Hexadecyl-trimethyl- (*) 
ammoniumchlorid 
(kationisk) 75 13 10 
Isononylphenol-(etho ­
xylat)  9 
(nonionisk) 41 32 10 
Coco-amid-propyl- 
dimethylhydroxy- 
sulfobetain 
(amfoter) 60 23 11  
(*) SiO  2 blev tilsat for at neutralisere toksicitet.  
I henhold til resultaterne var variabiliteten generelt højere for de mindre 
velnedbrudte overfladeaktive stoffer. Variabiliteten inden for testen var 
mindre end 15 % for over 90 % af tilfældene, og den højeste nåede op på 30-40 %.
 
BEMÆRK: De fleste overfladeaktive stoffer er ikke enkeltmolekyler, men 
er blandinger af isomerer, homologer osv., der nedbrydes efter forskellige karakteristiske lag-perioder og ved forskellige kine ­
tiske hastigheder, så der fås »uklare« kurver, som betyder, at 
pass-værdien på 60 % måske ikke nås inden for 10-dages- 
vinduet, selv om hvert molekyle når op på > 60 % inden for 10 dage, hvis det testes alene. Dette kan også observeres i forbindelse med andre komplekse blandinger.
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Apparatur  
15. Sædvanligt laboratorieudstyr og:  
a) Glasserumflasker, lukket med propper af butylgummi og »crimp-on« 
aluminiumslåg. Den anbefalede størrelse er »125 ml«, som har et 
samlet volumen på ca. 160 ml. Volumen for hver flaske skal være angivet til 160 ± 1 ml. En mindre beholder kan bruges, hvis resultaterne opfylder betingelserne i afsnit 66 og 67.
 
b) Kulstofanalysator eller andet instrument (f.eks. gaskromatograf) til 
måling af uorganisk kulstof.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) Sprøjter med høj præcision til gasformige og flydende prøver.  
d) Orbitalryster i temperaturreguleret miljø.  
e) Tilførsel af CO  2 -fri luft — dette kan fremstilles ved at lade luft passere 
gennem natriumhydroxidperler eller ved hjælp af en gasblanding af 80 % N
 2 /20 % 0  2 (valgfrit) (se afsnit 28).  
f) Membranfiltreringsapparatur med porøsitet på 0,20-0,45 μm (valgfrit).  
g) Organisk kulstofanalysator (valgfri).  
Reagenser  
16. Anvend reagenser af analysekvalitet i hele testen.  
Vand  
17. Der anvendes destilleret eller deioniseret vand med ≤ 1 mg/l samlet organisk 
kulstof. Det repræsenterer ≤ 5 % af det indledende organiske kulstofindhold 
tilført ved den anbefalede dosis af testkemikaliet.  
Stamopløsninger til medium med mineralsalte  
18. Stamopløsningerne og mediet af mineralsalte ligner dem, der anvendes i ISO 
14593 (16) og testen for let bionedbrydelighed i kapitel C.4 i dette bilag 
(20). Der bør kun undtagelsesvis anvendes en højere koncentration af ammoniumchlorid (2,0 g/l i stedet for 0,5 g/l), f.eks. når koncentrationen af testkemikaliet er > 40 mg C/l. Stamopløsninger opbevares i køleskab og 
kasseres efter seks måneder eller tidligere, hvis der er tegn på udfældning 
eller mikrobiel vækst. Følgende stamopløsninger fremstilles:
 
a) Kaliumdihydrogenfosfat (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
Dikaliumhydrogenfosfat (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
Dinatriumhydrogenfosfatdihydrat (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g  
Ammoniumchlorid (NH  4 Cl) 0,50 g  
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter. Denne opløsnings pH skal være 
7,4 (± 0,2). Hvis det ikke opnås, fremstilles en ny opløsning.  
b) Calciumchloriddihydrat (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g  
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter.  
c) Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g  
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter.  
d) Jern(III)chloridhexahydrat (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g  
Opløses i vand og fortyndes til 1 liter. Tilsæt en dråbe koncentreret HCl.  
Fremstilling af mineralsk medium  
19. 10 ml af opløsning a) blandes med ca. 800 ml vand (afsnit 17), og af 
opløsning b), c) og d) tilsættes der 1 ml af hver, hvorefter der fyldes op 
til 1 liter med fortyndingsvand (afsnit 17).  
Andre reagenser  
20. Koncentreret orthophosphorsyre (H  3 PO 4 ) (> 85 % masse pr. volumenen ­
hed). ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
7 M natriumhydroxidopløsning  
21. 280 g natriumhydroxid (NaOH) opløses i 1 liter vand (afsnit 17). Bestem 
koncentrationen af opløst uorganisk kulstof (DIC) i denne opløsning, og anvend denne værdi ved beregningen af testresultatet (se afsnit 55 og 61), 
især på baggrund af validitetskriteriet i afsnit 66, litra b). Fremstil en frisk 
opløsning, hvis DIC-koncentrationen er for høj.
 
Testkemikalie  
22. Fremstil en stamopløsning af et tilstrækkeligt vandopløseligt testkemikalie i 
vand (afsnit 17) eller i testmediet (afsnit 19) ved en koncentration, der helst 
er 100 gange højere end den slutkoncentration, der skal anvendes i testen. Det kan være nødvendigt at justere stamopløsningens pH. Stamopløsningen tilsættes det mineralske medium for at opnå en endelig koncentration for 
organisk kulstof på 2-40 mg C/l, helst 20 mg C/l. Hvis der anvendes lavere 
koncentrationer end disse, kan det påvirke den opnåede præcision. Opløse ­
lige og uopløselige flydende kemikalier kan tilsættes beholderne direkte ved 
hjælp af højpræcisionssprøjter. Lavt opløselige og uopløselige testkemikalier 
kan kræve særlig behandling (25). Der findes følgende valgmuligheder:
 
a) direkte tilsætning af kendte vejede mængder  
b) ultralydsdispergering inden tilsætning  
c) dispergering med hjælp fra emulgeringsmidler, hvor det dog fastlægges, 
om de har hæmmende eller stimulerende virkning på den mikrobielle 
aktivitet, inden tilsætning  
d) adsorption af flydende testkemikalier eller en opløsning i et egnet flygtigt 
opløsningsmiddel til et inert medium eller underlag (f.eks. glasfiberfilter) 
efterfulgt af fordampning af det anvendte opløsningsmiddel og direkte tilsætning af kendte mængder
 
e) tilsætning af et kendt volumen af en opløsning af testkemikaliet i et 
meget flygtigt opløsningsmiddel til en tom testbeholder efterfulgt af fordampning af opløsningsmidlet.
 
Stoffer eller opløsningsmidler, der er anvendt i c), d) og e) skal testes for 
evt. stimulerende eller hæmmende virkning på den mikrobielle aktivitet (se 
afsnit 42, litra b)).  
Referencekemikalie  
23. Fremstil en stamopløsning af det opløselige referencekemikalie i vand 
(afsnit 17) ved en koncentration, der helst er 100 gange større end den 
slutkoncentration, der skal anvendes i testen (20 mg C/l).  
Test for hæmning  
24. Testkemikalier udviser ofte ingen signifikant nedbrydning under de betin ­
gelser, der anvendes i forbindelse med vurderinger af let bionedbrydelighed. 
Det kan skyldes, at testkemikaliet har hæmmende virkning på inokulum ved 
den koncentration, som det anvendes med i testen. En test for hæmning kan indgå i testdesignet for at gøre det lettere (efterfølgende) at udpege hæmning som en mulig årsag eller medvirkende faktor. Alternativt kan testen for 
hæmning udelukke en sådan påvirkning og vise, at ingen eller kun let 
nedbrydning kan tilskrives manglende mulighed for mikrobielt angreb under de anvendte testbetingelser. For at få oplysninger om testkemikaliets toksicitet for (aerobe) mikroorganismer fremstilles en opløsning af testme ­
diet, der indeholder testkemikaliet og referencekemikaliet (afsnit 19) ved de 
koncentrationer, som de er tilsat ved (se afsnit 22 og 23).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inokulum  
25. Inokulum kan stamme fra en række forskellige kilder: aktiveret slam, spilde ­
vandsafløb (ikke-chlorerede), overfladevand og -jord eller en blanding af disse (20). Kildens biologiske nedbrydningsaktivitet skal kontrolleres ved 
hjælp af et referencekemikalie. Uanset kilden må mikroorganismer, der 
tidligere er eksponeret for testkemikaliet, ikke anvendes, hvis fremgangs ­
måden skal bruges som en test for let bionedbrydelighed.
 
Advarsel: Aktiveret slam, spildevand og spildevandsafløb kan indeholde 
patogene organismer og skal håndteres med forsigtighed.  
26. Erfaringer har vist, at det optimale volumen for inokulum er det volumen, 
som:  
— er tilstrækkeligt til at skabe den nødvendige bionedbrydende aktivitet  
— nedbryder referencekemikaliet med den angivne procentdel (se afsnit 66)  
— giver 10  2 til 10  5 kolonidannende enheder pr. ml endelig blanding  
— normalt giver en koncentration på 4 mg/l suspenderede stoffer i den 
endelige blanding, når aktiveret slam anvendes; koncentrationer på op 
til 30 mg/l kan anvendes, men kan forøge blindprøvernes CO  2 -produk­
tion markant (26)  
— bidrager med under 10 % af det indledende organiske kulstofindhold 
tilført af testkemikaliet  
— generelt udgør 1-10 ml af inokulum til 1 liter testopløsning.  
Aktiveret slam  
27. Aktiveret slam udtages frisk fra beluftningstanken ved et rensningsanlæg 
eller et laboratorieanlæg, der fortrinsvis behandler husholdningsspildevand. Om nødvendigt fjernes grove partikler ved sigtning (f.eks. ved hjælp af en sigte med et net på 1 mm
 2 ), og slammet opbevares aerobisk indtil anven ­
delsen.  
28. Alternativt kan slammet henstå til bundfældning eller centrifugeres (f.eks. 
ved 1 100 × g i 10 min), efter at grove partikler er fjernet. Supernatanten kasseres. Slammet kan vaskes i den mineralske opløsning. Det koncentre ­
rede slam suspenderes til en koncentration på 3-5 g suspenderede stoffer pr. 
liter, hvorefter det beluftes indtil anvendelse.
 
29. Slammet skal tages fra et velfungerende konventionelt rensningsanlæg. 
Slammet vaskes, hvis det er nødvendigt at tage det fra et stærkt belastet 
rensningsanlæg, eller et rensningsanlæg, som menes at indeholde 
hæmmende stoffer. Det resuspenderede slam henstår til bundfældning eller centrifugeres efter grundig blanding, supernatanten fjernes, og det vaskede slam resuspenderes i mineralsk medium. Denne fremgangsmåde gentages, 
indtil slammet menes at være fri for overskud af substrat eller hæmmende 
stoffer.
 
30. Lige før brugen udtages der en prøve af det fuldstændigt resuspenderede 
slam eller af det ubehandlede slam med henblik på at bestemme mængden 
af suspenderede stoffer.  
31. Et andet alternativ er at homogenisere aktiveret slam (3-5 g suspenderede 
stoffer pr. liter). Slammet behandles i en Waring-blender i 2 minutter ved middel hastighed. Det homogeniserede slam henstår til bundfældning i 
mindst 30 minutter, og væsken dekanteres fra til brug som inokulum i en 
mængde på 10 ml pr. liter mineralsk medium.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Yderligere reduktion af den blinde CO  2 -udvikling kan opnås ved at belufte 
slammet natten over med CO  2 -fri luft. Brug 4 mg/l aktiverede slamfast ­
stoffer som inokulumkoncentration i denne test (13).  
Sekundært spildevand  
33. Inokulum kan også fremstilles af sekundært udløb fra et rensningsanlæg 
eller et laboratorieanlæg, der overvejende behandler husholdningsspildevand. 
Prøven opbevares under aerobe betingelser og anvendes på indsamlings ­
dagen. Hvis det ikke er muligt, skal den prækonditioneres. Udløbet filtreres gennem et groft filter for at fjerne grove partikler, og pH-værdien måles.
 
34. For at reducere indholdet af uorganisk kulstof tilføres filtratet CO  2 -fri luft 
(»såkaldt sparging«) (afsnit 15, litra e)), i 1 time, mens pH-værdien holdes på 6,5 ved hjælp af orthophosphorsyre (afsnit 20). pH-værdien genoprettes til den oprindelige værdi ved hjælp af natriumhydroxid (afsnit 21), og efter 
bundfældning i ca. 1 time udtages en passende mængde supernatant til 
inokulering. Denne »sparging« reducerer indholdet af uorganisk kulstof i inokulum. Når den anbefalede maksimumsmængde af filtreret »sparget« udløb (100 ml) pr. liter blev anvendt som inokulum, var mængden af 
uorganisk kulstof i blindkontrollerne i intervallet 0,4 til 1,3 mg/l (14), 
hvilket repræsenterede 2-6,5 % af testkemikaliet C ved 20 mg C/l og 4- 13 % ved 10 mg C/l.
 
Overfladevand  
35. En prøve udtages af egnet overfladevand. Den opbevares under aerobe 
betingelser og anvendes på indsamlingsdagen. Prøven koncentreres om nødvendigt ved filtrering eller centrifugering. Den mængde inokulum, der skal anvendes i hver testbeholder, skal opfylde kriterierne i afsnit 26.
 
Jord 
36. En prøve udtages af egnet jord i en dybde på op til 20 cm under jordover ­
fladen. Sten, planterester og hvirvelløse dyr fjernes fra jordprøven, inden den sigtes gennem et 2 mm net (hvis prøven er for våd til sigtning, lufttørres den inden sigtning). Den opbevares under aerobe betingelser og anvendes på 
indsamlingsdagen. Hvis prøven transporteres i en løst bundet sort plastpose, 
kan den opbevares i posen ved 2-4 °C i op til en måned).
 
Prækonditionering af inokulum  
37. Inokulum kan prækonditioneres til forsøgsbetingelserne, men må ikke 
tilvænnes til testkemikaliet. Prækonditionering kan reducere den blinde 
CO 2 -udvikling. Prækonditioneringen består i beluftning af aktiveret slam 
efter fortynding i testmediet til 30 mg/l med fugtig CO  2 -fri luft i op til 5- 
7 dage ved testtemperatur.  
TESTPROCEDURE  
Antal flasker  
38. Det antal flasker (afsnit 15, litra a)), der skal bruges til en test, afhænger af 
analysehyppigheden og testvarigheden.  
39. Det anbefales, at et tredobbelt antal flasker analyseres efter et tilstrækkeligt 
antal tidsintervaller, således at 10-dages-vinduet kan påvises. Mindst fem testflasker (afsnit 15, litra a)) fra sæt a), b) og c) (se afsnit 42) analyseres 
ved testens afslutning for at gøre det muligt at beregne 95 %-konfidensinter ­
vallet for den gennemsnitlige bionedbrydning i procent.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Medium med inokulum  
40. Inokulum bruges ved en koncentration på 4 mg/l aktiveret slam med fast ­
stoffer. Umiddelbart inden anvendelse fremstilles en tilstrækkelig mængde inokuleret medium ved f.eks. at tilsætte 2 ml korrekt behandlet aktiveret 
slam (afsnit 27-32) ved 2 000 mg/l til 1 liter medium med mineralsalte 
(afsnit 19). Når sekundært spildevandsudløb bruges, tilsættes op til 100 ml udløb (afsnit 33) til 900 ml medium med mineralsalte (afsnit 19), som fortyndes til 1 liter med medium.
 
Klargøring af flasker  
41. Prøver af inokuleret medium dispenseres til replikatflasker, så der fås et 
forhold mellem headspace og væske på 1:2 (tilsæt f.eks. 107 ml til flasker med en kapacitet på 160 ml). Andre forhold kan anvendes, men 
se advarslen i afsnit 11. Uanset den anvendte type inokulum skal det 
sikres, at det inokulerede medium blandes tilstrækkeligt, så det fordeles ensartet til testflaskerne.
 
42. Sæt af flasker (afsnit 15, litra a)) klargøres til at indeholde følgende:  
a) testbeholdere (benævnt som F  T ), som indeholder testkemikaliet  
b) blindkontroller (benævnt F  B ), som kun indeholder testmediet plus inoku ­
lum; evt. kemikalier, opløsningsmidler, stoffer eller glasfiberfiltre, der 
anvendes til at tilsætte testkemikaliet til testbeholderen, skal også tilsættes
 
c) beholdere (benævnt F  C ) med referencekemikaliet til at kontrollere frem ­
gangsmåden  
d) om nødvendigt beholdere (benævnt F  I ) til at kontrollere, om testkemika ­
liet virker hæmmende; der tilsættes både test- og referencekemikalie ved samme koncentration (afsnit 24) som i de andre flasker (henholdsvis F
 T 
og F  C ) 
e) beholdere (benævnt F  S ) til at kontrollere evt. abiotisk nedbrydning som 
a) plus 50 mg/l HgCl  2 eller steriliseret på anden måde (f.eks. ved auto ­
klavering).  
43. Vandopløselige testkemikalier og referencekemikalier tilsættes som vandige 
stamopløsninger (afsnit 22, 23 og 24), så der fås en koncentration på 10 til 
20 mg C/l.  
44. Uopløselige testkemikalier og uopløselige referencekemikalier hældes på 
flasker på forskellige måder (se afsnit 22, litra a-e)) afhængigt af kemikaliets karakter enten før eller efter tilsætningen af mediet med inokulum og afhæn ­
gigt af metoden til behandling af testkemikaliet. Hvis en af de fremgangs ­
måder, der er beskrevet i afsnit 22, litra a-e), anvendes, behandles blindkon ­
trollerne F
 B (afsnit 42, litra b)) på en lignende måde, men uden at tilsætte 
testkemikaliet eller referencekemikaliet.  
45. Flygtige testkemikaliet injiceres i lukkede flasker (afsnit 47) ved brug af en 
mikrosprøjte. Dosis beregnes ud fra det injicerede volumen og testkemika ­
liets densitet.  
46. Vand tilsættes beholdere efter behov for at opnå samme væskevolumen i 
hver beholder. Det skal sikres, at forholdet mellem headspace og væskevo ­
lumen (normalt 1:2) og koncentrationen af testkemikaliet er af en sådan 
karakter, at der er ilt nok til stede til at muliggøre fuldstændig bionedbryd ­
ning. ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Alle flasker lukkes derefter med f.eks. propper af butylgummi og alumi ­
niumskapsler. Flygtige testkemikalier tilsættes på dette trin (afsnit 45). Hvis 
reduktionen i testopløsningens DOC-koncentration skal overvåges, og der skal udføres analyser fra nultid af den indledende koncentration af uorganisk kulstof (sterile kontroller, afsnit 42, litra e)) eller andre determinanter, 
udtages en passende prøve fra testbeholderen. Derefter kasseres testbehol ­
deren med indhold.
 
48. De lukkede flasker anbringes på en orbitalryster (afsnit 15, litra d)), og der 
anvendes en rystehastighed, så flaskens indhold forbliver velblandet og 
suspenderet (f.eks. 150-200 rpm). Flaskernes inkuberes i mørke ved 20 °C 
(± 1 °C).  
Prøvetagning  
49. Prøvetagningsmønstret afhænger af lag-perioden og den kinetiske hastighed 
af testkemikaliets bionedbrydning. Flasker bruges til analyse på dagen for 
prøvetagning, som skal ske mindst ugentligt eller hyppigere (f.eks. to gange 
om ugen), hvis der kræves en fyldestgørende kurve for nedbrydning. Det krævede antal replikatflasker, herunder F
 T , F B og F  C samt evt. F  I og F  S (se 
afsnit 42), udtages fra rysteren. Testen forløber normalt over 28 dage. Hvis 
kurven for bionedbrydning indicerer, at der er opnået et plateau inden dag 
28, kan testen afsluttes tidligere end efter 28 dage. Udtag prøver fra de fem flasker, der er reserveret til testens 28. dag, til analyse, og anvend resulta ­
terne til at beregne konfidensintervallet eller variationskoefficienten for den 
procentvise bionedbrydning. Der skal ikke tages prøver af flasker, der 
anvendes til test for hæmning og abiotisk nedbrydning, så ofte som af de øvrige flasker. Dag 1 og dag 28 er nok.
 
Analyse af uorganisk kulstof  
50. CO  2 -produktionen i flasker bestemmes ved at måle stigningen i koncen ­
trationen af uorganisk kulstof under inkubering. Der findes to anbefalede 
metoder til måling af den mængde uorganisk kulstof, der produceres i løbet af testen, og de er beskrevet nedenfor. Da metoderne kan give lidt forskel ­
lige resultater, bør den samme metode anvendes i hele testforløbet.
 
51. Metode a) anbefales, hvis mediet sandsynligvis indeholder rester af f.eks. 
glasfilterpapir og/eller uopløseligt testkemikalie. Denne analyse kan udføres ved hjælp af en gaskromatograf, hvis en kulstofanalysator ikke er til rådig ­
hed. Det er vigtigt, at flaskerne er ved eller tæt på testtemperaturen, når 
headspace-gassen analyseres. Metode b) kan være nemmere at anvende for laboratorier, der bruger en kulstofanalysator til at måle uorganisk kulstof. Det er vigtigt, at den natriumhydroxidopløsning (afsnit 21), der bruges til at 
omdanne CO
 2 til karbonat, er friskfremstillet, eller at dens indhold af 
uorganisk kulstof er kendt, således at den kan tages i betragtning ved beregningen af testresultaterne (se afsnit 66, litra b)).
 
Metode a): forsuring til pH < 3  
52. Inden hver analyseserie kalibreres kulstofanalysatoren ved hjælp af en 
hensigtsmæssig standard for uorganisk kulstof (f.eks. 1 % w/w CO  2 i N  2 ). 
Koncentreret orthophosphorsyre (afsnit 20) injiceres i låget på hver udtaget 
flaske for at reducere pH i mediet til < 3 (tilsæt f.eks. 1 ml til 107 ml testmedium). Flaskerne sættes tilbage på rysteren. Efter 1 times rysten ved testtemperaturen tages flaskerne af rysteren. Aliquoter (f.eks. 1 ml) af gas 
udtages fra headspace på hver flaske og overføres til kulstofanalysatoren. De 
målte koncentrationer af uorganisk kulstof registreres som mg C/l.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Efter forsuring til pH < 3 og ækvilibrering ved 20 °C er ligevægtskonstanten 
for fordelingen af CO  2 mellem væske- og gasfasen i testflaskerne ved denne 
metode 1,0, når den måles som en koncentration (13). Dette påvises mindst én gang for et testsystem på følgende måde:
 
Klargør flasker med 5 og 10 mg/l som inaktivt kulstof ved hjælp af en 
opløsning af vandfrit natriumcarbonat (Na  2 CO 3 ) i CO  2 -frit vand klargjort 
ved forsuring af vand til pH 6,5 med koncentreret orthophosphorsyre (afsnit 20), sparging natten over med CO
 2 -fri luft og forøgelse af pH til neutralitet 
med alkali. Sørg for, at forholdet mellem headspace og væskevolumen er det 
samme som i testene (f.eks. 1:2). Foretag forsuring og ækvilibrering som beskrevet i afsnit 52, og mål koncentrationerne af uorganisk kulstof i både headspace- og væskefasen. Kontroller, at de to koncentrationer er ens inden 
for margenen for forsøgsfejl. Hvis ikke, gennemgås fremgangsmåderne. Det 
er ikke nødvendigt at udføre denne kontrol af fordelingen af uorganisk kulstof mellem væske- og gasfasen, hver gang testen udføres. Den bør udføres i forbindelse med kalibreringen.
 
54. Hvis DOC-eliminering skal måles (kun vandopløselige testkemikalier), 
udtages prøver af væskefasen fra separate (ikke-forsurede) flasker. De 
filtreres gennem en membran og overføres til DOC-analysatoren. Disse 
flasker kan efter behov anvendes til andre analyser for at måle den primære bionedbrydning.
 
Metode b): omdannelse af CO  2 til karbonat  
55. Inden hver analyseserie kalibreres kulstofanalysatoren ved hjælp af en 
hensigtsmæssig standard for uorganisk kulstof, f.eks. en opløsning af 
natriumbicarbonat (NaHCO  3 ) i CO  2 -frit vand (se afsnit 53) i intervallet 0 
til 20 mg/l som uorganisk kulstof. 7 M natriumhydroxidopløsning (afsnit 21) (f.eks. 1 ml til 107 ml medium) injiceres i låget på hver udtaget flaske, og 
flaskerne rystes i 1 time ved testtemperatur. Brug den samme 
NaOH-opløsning til alle flasker, der bruges på en bestemt dag, men ikke nødvendigvis til alle prøvetagninger i løbet af en test. Hvis der kræves absolutte blindværdier for uorganisk kulstof ved alle prøvetagninger, skal 
uorganisk kulstof i NaOH-opløsningen bestemmes, hver gang den anvendes. 
Flaskerne tages af rysteren og henstilles til bundfældning. Passende mængder (f.eks. 50 til 1 000 μl) af væskefasen i hver flaske udtages ved 
hjælp af en sprøjte. Prøverne overføres til kulstofanalysatoren, og koncen ­
trationerne af uorganisk kulstof registreres. Det skal sikres, at analysatoren 
er udstyret til at håndtere alkaliske prøver, der er fremstillet ved hjælp af denne metode.
 
56. Efter tilsætning af alkali og omrysten er koncentrationen af uorganisk 
kulstof ved denne metode ubetydelig. For testsystemet bør dette kontrolleres mindst én gang ved hjælp af standarder for uorganisk kulstof, tilsætning af 
alkali og ækvilibrering samt måling af koncentrationen af uorganisk kulstof i 
både headspace- og væskefasen (se afsnit 53). Koncentrationen i headspace skal være nær nul. Det er ikke nødvendigt at udføre denne kontrol af næsten fuldstændig absorption af CO
 2 , hver gang testen udføres.  
57. Hvis DOC-eliminering skal måles (kun vandopløselige testkemikalier), 
udtages prøver af væskefasen fra separate flasker (uden tilsat alkali). De filtreres gennem en membran og overføres til DOC-analysatoren. Disse 
flasker kan efter behov anvendes til andre analyser for at måle den 
primære bionedbrydning.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
DATA OG RAPPORTERING  
Beregning af resultater  
58. Hvis 100 % mineralisering af testkemikaliet til CO  2 antages, er den teore ­
tiske maksimale produktion af uorganisk kulstof (ThIC) ud over det, der produceres i blindkontrollerne, lig med det opløste organiske kulstof (TOC), der tilsættes hver flaske ved begyndelsen af testen, dvs.:
 
ThIC ¼ TOC  
Den samlede masse (mg) af uorganisk kulstof (TIC) i hver flaske er: 
TIC ¼ ðmg C i væske þ mg C i headspaceÞ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Ligning [1]  
hvor:  
V L = volumen af væske i flasken (liter)  
C L = koncentration af organisk kulstof i væske (mg/l som kulstof)  
V H = volumen af headspace (liter)  
C H = koncentration af organisk kulstof i headspace (mg/l som kulstof).  
Beregningerne af TIC til de to analysemetoder, der anvendes til måling af 
uorganisk kulstof i denne test, er beskrevet nedenfor i afsnit 60 og 61. Den 
procentvise bionedbrydning ( %D) fås i hvert tilfælde ved: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Ligning [2]  
hvor:  
TIC  t = mg TIC i testflaske på tidspunktet t  
TIC  b = gennemsnitlig mg TIC i blindflasker på tidspunktet t  
TOC = mg TOC indledningsvis tilsat testbeholderen.  
Den procentvise bionedbrydning %D beregnes for testflasken (F  T ), referen ­
ceflasken (F  C ) og evt. flasken til kontrol for hæmning (F  I ) ud fra de respek ­
tive mængder TIC, der er produceret indtil prøvetagningstidspunktet.  
59. Hvis der er sket en signifikant stigning i TIC-indholdet i de sterile kontroller 
(F S ) i løbet af testperioden, kan det konkluderes, at der er sket abiotisk 
nedbrydning af testkemikaliet, og at dette skal tages i betragtning i bereg ­
ningen af D i ligning [2].  
Forsuring til pH < 3  
60. Eftersom forsuring til pH < 3 og ækvilibrering fører til udligning af 
koncentrationen af TIC i væske- og gasfasen, skal kun koncentrationen af organisk kulstof måles i gasfasen. I henhold til ligning [1]
 
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , hvor V  B = volumen i serumflaske.  
Omdannelse af CO  2 til karbonat  
61. I forbindelse med denne metode udføres beregningerne som i ligning [1], 
men den ubetydelige mængde af uorganisk kulstof i gasfasen ignoreres, dvs.  
V H Ü C H ¼ 0, og  TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Angivelse af resultater  
62. En bionedbrydningskurve fås ved at afsætte den procentvise bionedbryd ­
ning, D, i forhold til inkubationstiden. Hvis det er muligt, angives lag-fasen, bionedbrydningsfasen, 10-dages-vinduet og plateau-fasen, dvs. 
den fase, hvor den maksimale nedbrydning er nået, og bionedbrydnings ­
kurven har udjævnet sig. Hvis sammenlignelige resultater opnås for paral ­
lelle testflasker F
 T (forskel på < 20 %), afsættes en gennemsnitlig kurve (se 
tillæg 2, figur 1); hvis ikke, afsættes kurver for hver flaske. Gennemsnits ­
værdien for den procentvise bionedbrydning i plateaufasen bestemmes, eller 
den højeste værdi vurderes (f.eks. når kurven falder i plateaufasen), men det er i sidstnævnte tilfælde vigtigt at kontrollere, at værdien ikke er en ekstrem 
værdi. Dette maksimale niveau af bionedbrydning angives som »graden af 
bionedbrydningen af testkemikaliet« i testrapporten. Hvis antallet af testbe ­
holdere var utilstrækkeligt til at indicere en plateaufase, anvendes de data, der er målt for den sidste testdag, til at beregne en gennemsnitlig værdi. 
Denne sidste værdi, gennemsnittet af fem replikater, bruges til at indicere 
den præcision, hvormed den procentvise bionedbrydning er bestemt. Endvidere rapporteres den værdi, der blev indhentet ved afslutningen af 10-dages-vinduet.
 
63. På samme måde afsættes der en kurve for referencekemikaliet, F  C , samt 
kontrollen for abiotisk eliminering, F  S , og kontrollen for hæmning, F  I , 
hvis de er medtaget.  
64. De mængder af TIC, der er til stede i blindkontrollerne (F  B ), registreres, og 
det samme gælder mængderne i F  S -flaskerne (abiotisk kontrol), hvis de er 
medtaget i testen.  
65. Beregn D for F  I -flaskerne baseret på den teoretiske værdi for uorganisk 
kulstof, der fås fra blandingens referencekomponent alene. Hvis [(D  FC ( 1 ) 
— D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 % på dag 28, kan det antages, at testkemikaliet 
har hæmmet aktiviteten for inokulum, og at de lave værdier for D  FT , der 
blev opnået under testbetingelserne, kan tilskrives dette. I dette tilfælde 
gentages testen ved hjælp af en lavere testkoncentration og helst med reduk ­
tion af DIC i inokulum og TIC dannet i blindprøverne, da den lavere koncentration ellers vil reducere metodens præcision. Ellers kan der anvendes et andet inokulum. Hvis der i flasken F
 S (abiotisk) observeres 
en signifikant stigning (> 10 %) i mængden af TIC, kan abiotiske nedbryd ­
ningsprocesser være opstået.  
Resultaternes validitet  
66. En test anses for gyldig, hvis:  
a) den gennemsnitlige procentvise nedbrydning i F  C -flasker, som indeholder 
referencekemikaliet, er > 60 % på den 14. inkubationsdag, og  
b) den gennemsnitlige mængde af TIC i blindkontrollerne F  B ved slutningen 
af testen er > 3 mg C/l.  
Hvis disse grænser ikke overholdes, gentages testen med et inokulum fra en 
anden kilde, og/eller de anvendte fremgangsmåder kontrolleres. Hvis f.eks. 
en høj blindproduktion af uorganisk kulstof er et problem, følges fremgangs ­
måden i afsnit 27-32.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Den procentvise nedbrydning i F  C -flasker med referencestoffet. 
( 2 ) Den procentvise nedbrydning i F  I -flasker.
 67. Hvis testkemikaliet ikke når op på 60 % ThIC, og det er påvist, at det ikke 
er hæmmende (afsnit 65), kan testen gentages med en højere inokulumkon ­
centration (op til 30 mg/l aktiveret slam og 100 ml udløb/l) eller inokulum fra andre kilder, navnlig hvis nedbrydning var i intervallet 20-60 %.
 
Fortolkning af resultater  
68. Bionedbrydning > 60 % ThIC inden for 10-dages-vinduet i denne test viser, 
at testkemikaliet er let bionedbrydeligt under aerobe betingelser.  
69. Hvis pass-værdien på 60 % ThIC ikke opnås, bestemmes pH-værdien i 
medier i flasker, der ikke er blevet forsuret eller alkaliske. En værdi på 
mindre end 6,5 kunne indicere, at nitrificering er forekommet. I det tilfælde 
gentages testen med en bufferopløsning med en højere koncentration.  
Testrapport  
70. Opstil en tabel over % D for hver testflaske (F  T ), referenceflaske (F  C ) og 
evt. flaske til kontrol for hæmning (F  I ) for hver prøvetagningsdag. Hvis 
sammenlignelige resultater opnås for replikatflasker, afsættes en kurve over gennemsnitlig % D i forhold til tid. Registrer mængden af TIC i 
blindflasker (F
 B ) og i de sterile kontrolflasker (F  S ) samt DOC og/eller 
andre determinanter og deres procentvise eliminering.  
71. Bestem gennemsnitsværdien for % D i plateaufasen, eller anvend den 
højeste værdi, hvis kurven for bionedbrydning falder i plateaufasen, og 
rapporter dette som »graden af bionedbrydningen af testkemikaliet«. I sidst ­
nævnte tilfælde er det vigtigt at kontrollere, at værdien ikke er en ekstrem værdi.
 
72. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:  
Testkemikalie:  
— generisk navn, kemisk navn, CAS-nummer, strukturformel og relevante 
fysisk-kemiske egenskaber  
— renhed (urenheder) af teststoffet.  
Testbetingelser:  
— reference til denne testmetode  
— beskrivelse af det anvendte testsystem (f.eks. beholderens volumen, 
forhold mellem headspace og væske, omrøringsmetode osv.)  
— tilførsel af testkemikaliet og referencekemikaliet til testsystemet: anvendt 
testkoncentration, mængde af kulstof tilsat hver testflaske og anvendte 
opløsningsmidler  
— detaljer om det anvendte inokulum, evt. forbehandling og prækonditio ­
nering  
— inkubationstemperatur  
— validering af princippet for analyse af uorganisk kulstof  
— primære karakteristika for den anvendte kulstofanalysator (og andre 
anvendte analysemetoder)  
— antal replikater.  
Resultater:  
— rådata og beregnede værdier for bionedbrydelighed opstillet i tabelform  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— afbildning af den procentvise nedbrydning i forhold til tid for test- og 
referencekemikalier med angivelse af lag-periode, nedbrydningsfase, 10- 
dages-vindue og hældning  
— procentvis eliminering ved plateau, ved testens afslutning og efter 10- 
dages-vinduet  
— årsager til evt. afvisning af testresultaterne  
— andre fakta, der er relevante for den anvendte fremgangsmåde  
— diskussion af resultater.  
LITTERATUR:  
(1) Kapitel C.4 i dette bilag, Bestemmelse af let bionedbrydelighed — CO  2 - 
udvikling (metode C.4-C).  
(2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 
159-167.  
(3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.  
(4) Larson RJ, Hansmann MA og Bookland EA (1996). Carbon dioxide 
recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
 
(5) ISO 9439 (1990; revideret 1999). Water Quality — Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
 
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
(8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.  
(9) Weytjens D, Van Ginneken I og Painter HA (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
 
(10) Ennis DM og Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biode ­
gradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.  
(11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH og Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.  
(12) Boatman RJ, Cunningham SL og Ziegler DA (1986). A method for measu ­
ring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233- 243.
 
(13) Struijs J og Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
 
(14) Birch RR og Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosp ­
here 23: 507-524.  
(15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust 
H, og Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biode ­
gradation. Chemosphere 19: 1527-1550.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593, (1999) Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biode ­
gradability of organic compounds in an aerobic medium-method by 
analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test).  
(17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, 
Chemosphere 34: 1813-1822.  
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance, Washington, DC.  
(19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
og Starkey M (1999). An »inherent« biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219- 
3235.
 
(20) Kapitel C.4 i dette bilag, Bestemmelse af let bionedbrydelighed.  
(21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) og Final report (M. Kitano og M. Takatsuki; CITI). Paris.
 
(22) Kapitel C.11 i dette bilag, Biologisk nedbrydning — aktiveret slam — 
respirationshæmningstest.  
(23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ og Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
 
(24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research 
Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, Det Forenede Kongerige.  
(25) ISO 10634 (1996) Water Quality — Guidance for the preparation and 
treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Tillæg 1  
FORKORTELSER OG DEFINITIONER  
IC: uorganisk kulstof.  
ThCO  2 : teoretisk kuldioxid (mg) er den mængde kuldioxid, der ifølge bereg ­
ninger på grundlag af testkemikaliets kendte eller målte kulstofindhold skulle dannes ved fuldstændig nedbrydning af testkemikaliet; den udtrykkes også i 
mg udviklet kuldioxid pr. mg testkemikalie.
 
DOC:  opløst organisk kulstof er den mængde organisk kulstof, der er til stede i 
opløsning, passerer gennem et 0,45 μm filter eller forbliver i centrifugatet efter 
centrifugering ved 4 000 g (ca. 40 000 ms  -2 ) i 15 minutter.  
DIC:  opløst uorganisk kulstof.  
ThIC:  teoretisk uorganisk kulstof.  
TIC:  totalt uorganisk kulstof.  
Let bionedbrydelig:  en arbitrær klasse af kemikalier, der har bestået visse 
specifikke screeningstest for fuldstændig bionedbrydning; disse test er så 
krævende, at sådanne kemikalier i vandigt miljø under aerobe forhold hurtigt vil blive fuldstændigt nedbrudt.
 
10-dages-vindue:  den periode på 10 dage, der begynder, når nedbrydningen er 
nået op på 10 %.  
Iboende bionedbrydelighed:  en klasse af kemikalier, som ved enhver bioned ­
brydelighedstest klart har vist sig at kunne omdannes ved bionedbrydning (primær eller fuldstændig).
 
Endelig aerob bionedbrydning:  den nedbrydningsgrad, der er nået, når mikro ­
organismer har opbrugt et testkemikalie fuldstændigt under samtidig dannelse af 
kuldioxid, vand, mineralsalte og nye cellebestanddele (biomasse).  
Mineralisering:  fuldstændig nedbrydning af en organisk forbindelse til CO  2 og 
H 2 O under aerobe betingelser, og til CH  4 , CO  2 og H  2 O under anaerobe betin ­
gelser.  
Lag-fase:  den tid, der går fra et forsøg begynder, indtil de nedbrydende mikro ­
organismer har tilpasset sig, og nedbrydningsgraden for et testkemikalie eller 
organisk materiale har nået et detekterbart omfang (f.eks. 10 % af den teoretiske maksimale bionedbrydning, evt. mindre, afhængigt af måleteknikkens nøjagtig ­
hed).
 
Nedbrydningsfase:  tidsrummet mellem lag-periodens afslutning og det tids ­
punkt, hvor nedbrydningen har nået 90 % af sin maksimale værdi.  
Plateaufase:  den fase, hvor den maksimale nedbrydning er nået, og bionedbryd ­
ningskurven har udjævnet sig.  
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Tillæg 2  
Eksempel på kurve for bionedbrydning  
Figur 1  
Bionedbrydning af 1-octanol i test af CO  2 i headspace
  
Ordliste  
Bionedbrydning  
Nedbrydningsfase  
Maksimal bionedbrydningsgrad  
Plateaufase  
10-dages-vindue  
Testtid (i dage)  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30.  BIOAKKUMULERING I TERRESTRISKE OLIGOCHAETER  
INDLEDNING  
1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 317 (2010). Blandt 
testmetoderne vedrørende skæbne i miljøet blev Biokoncentrering: Gennem ­
strømningstest med fisk (kapitel C.13 i dette bilag (49)) og Bioakkumulering 
i bentiske oligochaeter, der lever i sediment (53), offentliggjort i henholdsvis 1996 og 2008. Ekstrapoleringen af data om akvatisk bioakkumulering til landorganismer, som f.eks. regnorm, er vanskelig, hvis overhovedet mulig. 
Modelberegninger baseret på et testkemikalies lipofile karakter, f.eks. (14) 
(37), anvendes i dag til at vurdere bioakkumulering af kemikalier i jord, som f.eks. EU's Technical Guidance Document (19). Behovet for en rumspecifik testmetode er allerede blevet imødekommet, f.eks. (55). En sådan metode er 
især vigtig for evalueringen af sekundær forgiftning i landbaserede føde ­
kæder (4). Flere nationale testmetoder omhandler spørgsmålet om bioakku ­
mulering i andre organismer end fisk, f.eks. (2) og (72). En metode vedrørende måling af bioakkumulering fra forurenet jord i regnorm (Eisenia 
fetida, Savigny) og kompostorm er udviklet af American Society for Testing 
and Materials (3). En internationalt anerkendt metode til bestemmelse af bioakkumulering i forurenet jord vil forbedre risikovurderingen af kemika ­
lier i terrestriske økosystemer, f.eks. (25) (29).
 
2. Invertebrater, der lever af jord, eksponeres for jordbundne kemikalier. 
Blandt disse dyr spiller terrestriske oligochaeter en vigtig rolle for jordbun ­
dens struktur og funktion (15) (20). Terrestriske oligochaeter lever i jord og 
delvist på jordoverfladen (især i strølaget). De repræsenterer i mange 
tilfælde den mest rigelige art med hensyn til biomasse (54). Ved bioturba ­
tion af jorden og som byttedyr kan disse dyr have en stærk indvirkning på biotilgængeligheden af kemikalier for andre organismer, herunder inverte ­
brater (såsom rovmider og biller; f.eks. (64)) eller vertebrate rovdyr (såsom 
ræve og måger) (18) (62). Nogle arter af terrestriske oligochaeter, som i øjeblikket anvendes i forbindelse med økotoksikologiske test, er beskrevet i tillæg 5.
 
3. ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccu ­
mulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchy ­
traeid Potworm Enchytraeus albidus (3) indeholder mange vigtige og nyttige 
oplysninger om udførelsen af denne testmetode vedrørende bioakkumulering i jord. Yderligere dokumenter, der henvises til i denne testmetode, er kapitel C.13 i dette bilag, Biokoncentrering: Gennemstrømningstest med fisk (49) 
og OECD TG 315: Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligo ­
chates (53). Praktisk erfaring med forsøg vedrørende bioakkumulering i jord og publikationer, f.eks. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) og (79), er andre vigtige kilder til oplysninger i forbindelse med denne 
testmetode.
 
4. Denne testmetode gælder primært for stabile, neutrale organiske kemikalier, 
der ofte adsorberes til jord. Test for bioakkumulering af jordtilknyttede, 
stabile organiske metalforbindelser kan også udføres ved hjælp af denne 
testmetode. Den kan også anvendes i forbindelse med metaller og andre sporstoffer.
 
FORUDSÆTNINGER  
5. Test, der har til formål at måle bioakkumuleringen af et kemikalie i 
terrestriske oligochaeter, er udført med tungmetaller (se f.eks. (63)) og 
persistente, organiske kemikalier med log K  ow -værdier mellem 3,0 og 6,0, 
f.eks. (40). Sådanne test kan også udføres i forbindelse med:  
— kemikalier, der har en log K  ow på mere end 6,0 (super-hydrofobe kemi ­
kalier)  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— kemikalier, der tilhører en klasse af organiske kemikalier, der vides at 
have potentialet til at bioakkumuleres i levende organismer, f.eks. over ­
fladeaktive kemikalier eller kemikalier med høj adsorptionsevne  
— kemikalier, hvis strukturelle karakteristika indicerer et potentiale for 
bioakkumulering, f.eks. analoger til kemikalier med kendt bioakkumule ­
ringspotentiale, og  
— metaller.  
6. Oplysninger om testkemikaliet, f.eks. generisk navn, kemisk navn (for ­
trinsvis IUPAC-navn), strukturformel, CAS-nummer, renhed, sikkerhedsfor ­
anstaltninger, korrekt opbevaring og analysemetoder, indhentes, inden forsøget påbegyndes. Derudover skal følgende oplysninger foreligge:
 
a) opløselighed i vand  
b) oktanol/vandfordelingskoefficient, K  ow 
c) jord/vandfordelingskoefficient, K  oc 
d) damptryk  
e) nedbrydelighed (f.eks. i jord eller vand)  
f) kendte metabolitter.  
7. Der kan anvendes testkemikalier med og uden radioaktiv mærkning. Af 
hensyn til analysen anbefales det dog at bruge et radioaktivt mærket test ­
kemikalie. Denne beslutning træffes ud fra detektionsgrænserne eller et krav om at måle et oprindeligt testkemikalie og metabolitter. Hvis et radioaktivt 
mærket testkemikalie anvendes, og den samlede mængde radioaktivt rest ­
materiale måles, er det vigtigt, at det radioaktive restmateriale i både jorden og testorganismerne karakteriseres med hensyn til procentdele af oprindeligt testkemikalie og mærkede ikke-oprindelige kemikalier, f.eks. i prøver 
udtaget ved steady state eller ved slutningen af optagelsesfasen, således at 
en bioakkumuleringsfaktor (BAF) kan beregnes for det oprindelige testke ­
mikalie og de undersøgte jordmetabolitter (se afsnit 50). Den metode, der beskrives her, skal evt. tilpasses, f.eks. for at opnå tilstrækkelig biomasse, 
ved måling af organiske testkemikalier eller metaller, der ikke er radioaktivt 
mærkede. Hvis den samlede mængde radioaktivt restmateriale måles (ved hjælp af væskescintillationstælling efter ekstraktion, forbrænding eller opløs ­
ning af væv), baseres bioakkumuleringsfaktoren på det oprindelige testke ­
mikalie og metabolitter. BAF-beregningen bør baseres på koncentrationen af 
det oprindelige testkemikalie i organismerne og den samlede mængde radio ­
aktivt restmateriale. Efterfølgende beregnes biota-jord- akkumuleringsfaktoren (BSAF), normaliseret til fedtindholdet i orm og det 
organiske kulstofindhold i jord, ud fra BAF for at kunne sammenligne 
resultaterne mellem forskellige bioakkumuleringstest.
 
8. Testkemikaliets toksicitet for de arter, der anvendes i testen, skal være 
kendt, f.eks. en effektkoncentration (ECx) eller letal koncentration (LCx) på tidspunktet for optagelsesfasen (f.eks. (19)). Den valgte koncentration 
af testkemikaliet bør være ca. 1 % af den akutte asymptotiske LC
 50 og 
mindst 10 gange højere end detektionsgrænsen i jord ved den anvendte analysemetode. Der anvendes fortrinsvis toksicitetsværdier fra langvarige forsøg vedrørende subletale effektparametre (51) (52), hvis de foreligger. 
Hvis sådanne data ikke er tilgængelige, vil en akut toksicitetstest give 
nyttige oplysninger (se f.eks. (23)).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Der skal foreligge en passende analysemetode med kendt nøjagtighed, 
præcision og sensitivitet til kvantitativ bestemmelse af kemikaliet i testop ­
løsninger, jord og biologisk materiale, oplysninger om, hvordan prøver forberedes og opbevares, samt sikkerhedsdatablade for materialer. Oplys ­
ninger om analytiske detektionsgrænser for testkemikaliet i jord og 
ormevæv skal også foreligge. Hvis der bruges et
 14 C-mærket testkemikalie, 
skal den specifikke radioaktivitet (dvs. Bq mol-1) og den procentdel af radioaktiviteten, der skyldes urenheder, være kendt. Testkemikaliets speci ­
fikke radioaktivitet skal være høj nok til at muliggøre analyse, og de 
anvendte testkoncentrationer må ikke fremkalde toksiske virkninger.
 
10. Testen kan udføres med syntetisk eller naturlig jord. Oplysninger om karak ­
teristika for den anvendte naturlige jord, f.eks. jordens oprindelse eller 
bestanddele, pH, organisk kulstofindhold, partikelstørrelsesfordeling (procent 
sand, silt og ler) og vandbindingsevne (WHC), skal foreligge, inden testen påbegyndes (3) (48).
 
TESTENS PRINCIP  
11. De parametre, der karakteriserer bioakkumuleringen af et testkemikalie, 
omfatter bioakkumuleringsfaktoren (BAF), hastighedskonstanten for 
optagelse (k  s ) og hastighedskonstanten for eliminering (k  e ). Definitioner 
findes i tillæg 1.  
12. Testen omfatter to faser: optagelsesfasen (eksponering) og elimineringsfasen 
(efter-eksponering). I optagelsesfasen eksponeres replikate grupper af orm 
for jord, der er »spiked« (forurenet) med testkemikaliet. Ud over testorganis ­
merne holdes grupper af kontrolorm under identiske betingelser, men uden testkemikaliet. Testorganismernes tørvægt og fedtindhold måles. Dette kan 
gøres ved hjælp af orm i kontrolgruppen. Analytiske baggrundsværdier 
(blinde) kan fås ved at analysere prøver af kontrolorm og jord. Ved elimi ­
neringsfasen overføres ormene til jord uden testkemikaliet. Der kræves altid en elimineringsfase, medmindre optagelsen af testkemikaliet i eksponerings ­
fasen har været ubetydelig. En elimineringsfase giver oplysninger om den 
hastighed, hvormed testkemikaliet udskilles af testorganismerne (f.eks. (27)). Hvis der ikke opnås steady state i optagelsesfasen, baseres bestemmelsen af de kinetiske parametre — kinetisk bioakkumuleringsfaktor (BAFk), hastig ­
hedskonstanter for optagelse og eliminering — fortrinsvis på samtidig tilpas ­
ning af resultaterne af optagelses- og elimineringsfaserne. Koncentrationen af testkemikaliet i/på ormene overvåges i løbet af begge faser i testen.
 
13. I løbet af optagelsesfasen foretages målinger på prøvetagningstidspunkter i 
op til 14 dage (enchytraeider) eller 21 dage (regnorm), indtil steady state er opnået (11) (12) (67). Steady state opnås, når en kurve over koncentrationen i orm i forhold til tid bliver parallel med tidsaksen, og tre på hinanden 
følgende koncentrationsanalyser af prøver, der er udtaget med mindst to 
dages mellemrum, ligger inden for ± 20 % af hinanden baseret på statistiske sammenligninger (f.eks. variansanalyse og regressionsanalyse).
 
14. I elimineringsfasen overføres testorganismerne til beholdere med samme 
substrat, men uden testkemikaliet. I løbet af elimineringsfasen foretages målinger på prøvetagningstidspunkter i 14 dage (enchytraeider) eller 21 dage (regnorm), medmindre tidligere analytisk bestemmelse har påvist en 
reduktion af reststoffer af testkemikaliet i orm på 90 %. Koncentrationen af 
testkemikaliet i ormene ved slutningen af elimineringsfasen rapporteres som
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
ikke-eliminerede reststoffer. Steady state-bioakkumuleringsfaktoren (BAFss) 
beregnes så vidt muligt både som forholdet mellem koncentrationen i orm 
(Ca) og i jorden (Cs) ved steady state og som en kinetisk bioakkumulerings ­
faktor (BAFk), som forholdet mellem hastighedskonstanten for optagelse fra jord (ks) og hastighedskonstanten for eliminering (ke) (definitioner findes i 
tillæg 1), idet kinetikken antages at være af første orden (beregninger findes 
i tillæg 2). Hvis det er åbenbart, at kinetikken ikke er af første orden, anvendes andre modeller.
 
15. Hastighedskonstanten for optagelse, hastighedskonstanten for eliminering 
(eller konstanterne, hvis andre modeller anvendes), den kinetiske bioakku ­
muleringsfaktor (BAFk) og så vidt muligt konfidensgrænserne for hver af disse parametre beregnes ud fra computerbaserede modelligninger (se 
vejledning i tillæg 2). En models tilpasningsgrad kan bestemmes ud fra 
f.eks. korrelationskoefficienten eller determinationskoefficienten (koeffici ­
enter tæt på én indicerer god tilpasning), eller den kan beregnes ved hjælp af chi i anden. Størrelsen af standardfejl eller konfidensinterval 
omkring de estimerede parametre kan også indicere modellens tilpasnings ­
grad.
 
16. For at reducere variabiliteten i testresultater for stærkt lipofile testkemikalier 
udtrykkes bioakkumuleringsfaktorer i forhold til fedtindholdet og det orga ­
niske kulstofindhold (kg organisk kulstof i jord kg-fedt i 1 orm). Denne tilgang er baseret på den kendsgerning, at der for nogle kemiske stofgrupper er en tydelig sammenhæng mellem kemikaliernes bioakkumuleringspoten ­
tiale og deres lipofile karakter. Dette er veldokumenteret for fisk (47). Der er 
en sammenhæng mellem fiskenes fedtindhold og sådanne kemikaliers bioakkumulering. For bentiske organismer er der konstateret lignende korre ­
lationer, f.eks. (30) (44). For terrestriske oligochaeter er denne korrelation 
også påvist, f.eks. (5) (6) (7) (14). Hvis tilstrækkeligt ormevæv er tilgæn ­
geligt, kan testorganismernes fedtindhold bestemmes på det samme biolo ­
giske materiale som det, der benyttes til bestemmelse af koncentrationen af testkemikaliet. Alternativt kan fedtindholdet måles på kontroldyr.
 
TESTENS VALIDITET  
17. Hvis en test skal være gyldig, skal følgende kriterier opfyldes af både 
kontroller og behandlingsprøver:  
— Ved slutningen af testen må den samlede mortalitet i optagelses- og 
elimineringsfasen ikke overstige 10 % (regnorm) eller 20 % (enchytraei ­
der) af det samlede antal tilførte orm.  
— For Eisenia fetida og Eisenia andrei må det gennemsnitlige tab målt ved 
slutningen af optagelsesfasen og slutningen af elimineringsfasen ikke overstige 20 % sammenlignet med den indledende frisk vægt ved begyn ­
delsen af hver fase.
 
BESKRIVELSE AF METODEN  
Forsøgsarter  
18. Der anbefales flere arter af terrestriske oligochaeter til test af bioakkumule ­
ring. De oftest anvendte arter, Eisenia fetida eller Eisenia andrei (Lumbri ­
cidae), Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus eller Enchytraeus luxu ­
riosus (Enchytraeidae), er beskrevet i tillæg 5.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Apparatur  
19. Det skal omhyggeligt undgås, at der i nogen dele af udstyret anvendes 
materialer, som kan opløses, adsorbere testkemikaliet eller afgive andre kemikalier og have en skadelig virkning på testorganismerne. Der kan 
benyttes rektangulære eller cylindriske standardbeholdere af kemisk inert 
materiale og passende størrelse i forhold til mængden af forsøgsorm. Udstyr, der kommer i kontakt med testmedierne, kan være fremstillet af rustfrit stål, plast eller glas. Testbeholderne skal overdækkes for at forhindre, 
at ormene slipper ud, men der skal være tilstrækkelig luftforsyning. For 
kemikalier med høj adsorptionskoefficient, såsom syntetiske pyrethroider, kan det være nødvendigt at bruge silancoatet glas. I sådanne tilfælde skal 
udstyret kasseres efter brug (49). Udslip af radioaktivt mærkede testkemi ­
kalier og flygtige kemikalier skal forhindres. Udskillere (f.eks. gasvaskefla ­
sker i glas) med egnede absorbenter anvendes til at tilbageholde reststoffer, der fordamper fra testbeholderne.
 
Jord  
20. Testjord skal være af en sådan kvalitet, at testorganismerne kan overleve og 
helst forplante sig i akklimatiserings- og testperioden, uden at deres udse ­
ende eller adfærd bliver unormal. Ormene skal kunne grave sig ned i jorden.  
21. Det anbefales at bruge den syntetiske jord, der er beskrevet i kapitel C.8 i 
dette bilag (48), som substrat i testene. Fremstilling af syntetisk jord til brug 
i bioakkumuleringstest og anbefalinger vedrørende opbevaring af syntetisk jord findes i tillæg 4. Lufttørret syntetisk jord kan opbevares ved rumtem ­
peratur indtil anvendelse.
 
22. Naturlig jord fra ikke-forurenede steder kan dog bruges som test- og/eller 
dyrkningsjord. Naturlig jord skal karakteriseres ved mindst oprindelse 
(opsamlingssted), pH, organisk kulstofindhold, partikelstørrelsesfordeling (procent sand, silt og ler) og maksimal vandbindingsevne (WHCmax) samt vandindhold i procent (3). En analyse af jorden eller dens bestanddele 
for mikroforurenere inden anvendelse kan give nyttige oplysninger. Hvis 
feltjord fra landbrugsarealer anvendes, må den ikke være blevet behandlet med plantebeskyttelsesmidler eller husdyrgødning fra behandlede dyr i mindst et år og med organisk gødning i mindst seks måneder inden prøve ­
tagning (50). Fremgangsmåderne til håndtering af naturlig jord inden 
økotoksikologiske test med oligochaeter i laboratoriet er beskrevet i (3). Naturlig jord opbevares så kort tid i laboratoriet som muligt.
 
Applikation af testkemikaliet  
23. Testkemikaliet indarbejdes i jorden. Testkemikaliets fysisk-kemiske egen ­
skaber tages i betragtning. Et vandopløseligt testkemikalie opløses fuldstæn ­
digt i vand, inden det blandes med jorden. Den anbefalede 
spiking-procedure i forbindelse med testkemikalier, der er tungtopløselige 
i vand, omfatter overfladebehandling af en eller flere af bestanddelene i den naturlige eller syntetiske jord med testkemikaliet. Kvartssand eller en del heraf kan f.eks. gennemblødes med en opløsning af testkemikaliet i et egnet 
organisk opløsningsmiddel, som derefter langsomt fordamper, indtil det er 
tørt. Den overfladebehandlede andel blandes derefter med den våde jord.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
Den vigtigste fordel ved denne fremgangsmåde er, at der ikke tilsættes 
opløsningsmidler til jorden. Når naturlig jord anvendes, kan testkemikaliet 
tilsættes ved at spike en lufttørret del af jorden som beskrevet ovenfor for syntetisk jord eller ved at røre testkemikaliet ind i den våde jord. Dette efterfølges af et fordampningstrin, hvis en opløselighedsfremmer er blevet 
anvendt. Generelt bør det undgås, at den våde jord kommer i kontakt med 
opløsningsmidler. Følgende bør tages i betragtning (3):
 
— Hvis et andet opløsningsmiddel end vand anvendes, skal det kunne 
blandes med vand og/eller fjernes (f.eks. ved fordampning), så kun testkemikaliet er tilbage i jorden.
 
— Hvis der anvendes en opløsningsmiddelkontrol, er der ikke brug for en 
negativ kontrol. Opløsningsmiddelkontrollen skal indeholde den højeste koncentration af det opløsningsmiddel, der er tilført jorden, og skal være 
fra samme batch, som det middel, der er anvendt i stamopløsningen. 
Opløsningsmidlets toksicitet og flygtighed samt opløseligheden af test ­
kemikaliet i det valgte opløsningsmiddel bør være de primære kriterier ved valget af en egnet opløselighedsfremmer.
 
24. I forbindelse med kemikalier, der er tungtopløselige i vand og organiske 
opløsningsmidler, kan 2,0-2,5 g finsand af formalet kvarts pr. testbeholder 
blandes med testkemikaliet, f.eks. ved hjælp af en morter og støder, for at 
opnå den ønskede testkoncentration. Denne blanding af kvartssand og test ­
kemikalie tilsættes den fugtede jord og blandes grundigt med en passende mængde deioniseret vand for at opnå det krævede fugtindhold. Den færdige 
blanding fordeles i testbeholderne. Fremgangsmåden gentages for hver test ­
koncentration, og der klargøres også en kontrol med 2,0-2,5 g finsand af formalet kvarts pr. testbeholder.
 
25. Koncentrationen af testkemikaliet i jorden bestemmes efter spiking. Inden 
testorganismerne tilsættes, kontrolleres det, at testkemikaliet er ensartet fordelt i jorden. Den anvendte spiking-metode og begrundelsen for valget 
af den pågældende metode anføres i rapporten (24).
 
26. Der etableres ideelt ligevægt mellem jord- og porevandfasen, inden testor ­
ganismerne tilsættes. En periode på fire dage ved 20 °C anbefales. For 
mange organiske kemikalier, der er tungtopløselige i vand, kan det tage flere dage eller måneder at opnå ægte ligevægt mellem adsorberede og opløste andele. Afhængigt af forsøgets formål, hvis f.eks. miljøforholdene 
skal efterlignes, kan den spikede jord »ældes« i længere tid. Hvis det drejer 
sig om metaller, kan det f.eks. være tre uger ved 20 °C (22).
 
Dyrkning af testorganismer  
27. Orm holdes fortrinsvis i permanente laboratoriesystemer. Vejledning om 
laboratoriedyrkningsmetoder findes i tillæg 5, for så vidt angår arterne 
Eisenia fetida, Eisenia andrei og Enchytraeid (se også (48) (51) (52)).  
28. De orm, der anvendes i test, må ikke have synlige sygdomme, misdannelser 
eller parasitter.  
UDFØRELSE AF TESTEN  
29. Testorganismerne eksponeres for testkemikaliet i løbet af optagelsesfasen. 
Optagelsesfasen bør vare 14 dage (enchytraeider) eller 21 dage (regnorm), 
medmindre det kan påvises, at steady state er indtrådt.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Ved elimineringsfasen overføres ormene til jord uden testkemikaliet. Den 
første prøve udtages 4-24 timer efter elimineringsfasens start. Eksempler på 
prøvetagningsplaner for en 21-dages optagelsesfase og en 21-dages elimine ­
ringsfase findes i tillæg 3.  
Testorganismer  
31. For mange arter af terrestriske enchytraeider er den individuelle vægt meget 
lav (f.eks. 5-10 mg vådvægt pr. individ for Enchytraeus albidus og mindre 
for Enchytraeus crypticus og Enchytraeus luxuriosus). For at kunne foretage 
vejningen og den kemiske analyse kan det være nødvendigt at samle ormene fra de replikate testbeholdere (dvs. alle orm i en replikat testbeholder bruges til at opnå et analyseresultat for væv). 20 individuelle enchytraeider tilsættes 
hver replikat, og der anvendes mindst tre replikater. Hvis den analytiske 
detektionsgrænse for testkemikaliet er meget høj, skal der muligvis bruges flere orm. For testarter med højere individuel vægt (Eisenia fetida og Eisenia andrei) kan der bruges replikate beholdere med ét individ.
 
32. De regnorm, der bruges i en test, bør være af ensartet vægt (Eisenia fetida 
og Eisenia andrei bør f.eks. have en individuel vægt på 250-600 mg). Enchytraeider (f.eks. Enchytraeus albidus) bør have en længde på ca. 1 cm. Alle orm i en bestemt test bør komme fra samme kilde og være 
voksne dyr med bælte (se tillæg 5). Da et dyrs vægt og alder kan have 
betydning for BAF-værdierne (f.eks. på grund af varierede fedtindhold og/eller tilstedeværelse af æg), registreres disse parametre nøjagtigt og under hensyntagen til fortolkningen af resultater. Desuden kan der i 
eksponeringsperioden være afsat kokoner, som også påvirker 
BAF-værdierne. Det anbefales, at man inden testen danner sig et skøn over gennemsnitsvægten (våd og tør) ved at veje en delprøve af testormene.
 
33. Der bør anvendes et højt jord-til-orm-forhold for at minimere reduktionen i 
koncentrationen af testkemikaliet i jorden i løbet af optagelsesfasen. Til Eisenia fetida og Eisenia andrei anbefales som minimum 50 g jord (tørvægt) pr. orm, og til enchytraeider anbefales som minimum 10-20 g jord (tørvægt) 
pr. testbeholder. Beholderne skal indeholde et jordlag på 2-3 cm (enchy ­
traeider) eller 4-5 cm (regnorm).
 
34. De orm, der anvendes i en test, udtages fra dyrkningssystemet (f.eks. enchy ­
traeider med pincet). Voksne dyr overføres fra ubehandlet testjord med 
henblik på akklimatisering og fodres (se afsnit 36). Hvis testbetingelserne 
adskiller sig fra dyrkningsbetingelserne, er en akklimatiseringsfase på 24-72 timer nok til at tilpasse ormene til testbetingelserne. Efter akklimatisering skylles ormene ved at overføre dem til glasplader (f.eks. petriglas) med rent 
vand. Efterfølgende vejes de, inden de tilsættes testjorden. Inden vejningen 
fjernes overskydende vand fra ormene ved forsigtigt at holde dem mod kanten af glaspladen eller duppe dem forsigtigt med et let fugtigt papirhånd ­
klæde.
 
35. Testorganismernes nedgravningsadfærd observeres og registreres. I test med 
regnorm vil dyrene (kontrol og behandlingsprøver) normalt grave sig ned i jorden inden for en periode på få timer. Dette kontrolleres senest 24 timer efter tilsætning af ormene til testbeholderne. Hvis regnormene ikke graver 
sig ned (f.eks. mere end 10 % i løbet af mere end halvdelen af optagelses ­
fasen), indicerer det, at testbetingelserne ikke er hensigtsmæssige, eller at
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
testorganismerne ikke er sunde. I det tilfælde afbrydes testen, hvorefter den 
gentages. Enchytraeider lever primært i de interstitielle porer i jorden, og 
deres integument er ofte kun i delvis kontakt med det omgivende substrat. Eksponering af gravende og ikke-gravende enchytraeider antages at være den samme, og en test skal ikke nødvendigvis gentages, selv om enchy ­
traeider ikke graver sig ned.
 
Fodring  
36. Fodring planlægges, hvis der anvendes jord med lavt samlet organisk 
kulstofindhold. Hvis der anvendes syntetisk jord, anbefales ugentlig fordring 
(dvs. ormene fodres én gang om ugen) bestående af 7 mg tørret møg pr. g 
jord (tørvægt) til regnorm, og en ugentlig fodring bestående af 2-2,5 mg malede havregryn pr. g jord (tørvægt) til enchytraeider (11). Den første foderration blandes i jorden umiddelbart inden tilsætningen af testorganis ­
merne. Der anvendes fortrinsvis samme type foder som i dyrkningssystemet 
(se tillæg 5).
 
Lys og temperatur  
37. Testene gennemføres under reguleret belysning med 16 timers lys og 8 
timers mørke, helst 400-800 lux, i det område, hvor testbeholderne opbe ­
vares (3). Testtemperaturen skal være 20 ± 2 °C i hele testen.  
Testkoncentrationer  
38. Der anvendes én koncentration. Situationer, hvor yderligere koncentrationer 
kræves, skal begrundes. Hvis testkemikaliets toksicitet (ECx) ligger tæt på den analytiske detektionsgrænse, bør et radioaktivt mærket testkemikalie med høj specifik radioaktivitet anvendes. For metaller bør koncentrationen 
ligge over baggrundsniveauet i væv og jord.
 
Replikater  
39. Til kinetiske målinger (optagelses- og elimineringsfasen) skal antallet af 
behandlede replikate beholdere som minimum være tre pr. prøvetagnings ­
tidspunkt. Der skal klargøres et tilstrækkeligt antal replikater til at dække alle prøvetagningstidspunkter i optagelses- og elimineringsfasen.
 
40. Til biologiske observationer og målinger (f.eks. forhold mellem tør- og 
vådvægt, fedtindhold osv.) og til analyse af baggrundskoncentrationer i orm og jord skal der bruges mindst 12 replikatbeholdere med en negativ 
kontrol (fire prøver ved start, fire ved afslutning af optagelse og fire ved 
afslutning af eliminering), hvis der ikke anvendes et andet opløsningsmiddel end vand. Hvis der anvendes en opløselighedsfremmer til tilsætning af testkemikaliet, skal der tilvejebringes en opløsningsmiddelkontrol (fire 
prøver ved start, fire ved afslutning af optagelse og fire ved afslutning af 
eliminering), som indeholder alle bestanddele med undtagelse af testkemi ­
kaliet, ud over de behandlede replikater. I dette tilfælde kan der også klar ­
gøres fire yderligere replikate beholdere til en negativ kontrol (intet opløs ­
ningsmiddel) til evt. prøvetagning ved afslutningen af optagelsesfasen. Disse 
replikater kan derefter sammenlignes biologisk med opløsningsmiddelkon ­
trollen for at få oplysninger om en mulig indvirkning af opløsningsmidlet på testorganismerne. Det anbefales, at der klargøres et tilstrækkeligt antal yder ­
ligere replikate reservebeholdere (f.eks. otte) til behandlingsprøver og 
kontrol.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Hyppighed af målinger af jordkvaliteten  
41. Jordens pH, jordens fugtindhold og temperaturen (kontinuerlig) i testrummet 
måles ved begyndelsen og slutningen af optagelses- og elimineringsfasen. En gang om ugen kontrolleres jordens fugtindhold ved at veje testbehol ­
derne og sammenligne de faktiske vægte med de indledende vægte ved 
testens begyndelse. Vandtab kompenseres ved tilsætning af deioniseret vand.
 
Prøvetagning og analyse af orm og jord  
42. Et eksempel på en tidsplan for optagelses- og elimineringsfasen i test af 
bioakkumulering i regnorm og enchytraeider findes i tillæg 3.  
43. Der udtages prøver af jorden fra testbeholderne med henblik på bestemmelse 
af testkemikaliekoncentrationen, både inden ormene tilsættes og i løbet af 
optagelses- og elimineringsfasen. I løbet af testen måles koncentrationerne af 
testkemikaliet i ormene og jorden. Generelt måles de samlede koncentra ­
tioner i jord. Koncentrationer i porevand kan også måles. I det tilfælde bør begrundelsen og metoderne fastlægges, inden forsøget indledes, og anføres i 
rapporten.
 
44. Der tages prøver af orm og jord mindst seks gange i løbet af optagelses- og 
elimineringsfasen. Hvis stabiliteten af et testkemikalie påvises, kan antallet 
af jordanalyser reduceres. Der bør analyseres mindst tre replikater ved 
begyndelsen af afslutningen af optagelsesfasen. Hvis den koncentration i jord, der måles ved afslutningen af optagelsesfasen, afviger fra den indle ­
dende koncentration med mere end 30 %, analyseres jordprøver udtaget på 
de andre datoer også.
 
45. Udtag ormene fra jorden i en replikatbeholder på hvert prøvetagningstids ­
punkt (f.eks. efter at have spredt jorden i beholderen ud på en bakke og 
samlet ormene op med en pincet), skyl dem hurtigt med vand i et lavt glas 
eller på en stålbakke. Fjern overskydende vand (se afsnit 34). Overfør forsigtigt ormene til en allerede vejet beholder, og vej dem straks med 
tarmindhold.
 
46. Regnormene (Eisenia sp.) placeres derefter på f.eks. fugtigt filterpapir i en 
overdækket petriskål (se afsnit 34) natten over, så de kan tømme deres 
tarme. Efter udtømning bestemmes ormenes vægt, så en evt. reduktion i 
biomasse i løbet af testen kan vurderes (se validitetskriterierne i afsnit 17). Vejning og vævsanalyse af enchytraeider udføres uden tømning af tarme, da det er teknisk vanskeligt på grund af disse ormes lille størrelse. 
Straks efter den endelige fastlæggelse af vægten aflives ormene på den mest 
hensigtsmæssige måde (f.eks. ved hjælp af flydende nitrogen eller nedfrys ­
ning ved temperaturer under – 18 °C).
 
47. I løbet af elimineringsfasen udskifter ormene forurenet tarmindhold med ren 
jord. Det betyder, at målinger i ikke-udtømte orm (enchytraeider i denne sammenhæng), der udtages umiddelbart inden elimineringsfasen, omfatter forurenet tarmjord. For akvatiske oligochaeters vedkommende antages det, 
at størstedelen af det forurenede tarmindhold er blevet erstattet af rent sedi ­
ment efter de første 4-24 timer af elimineringsfasen (se f.eks. (46)). Lignende resultater er rapporteret for regnorm i forsøg vedrørende akkumu ­
lering af radioaktivt mærket cadmium og zink (78). For så vidt angår 
ikke-udtømte enchytraeider, kan koncentration af denne første prøve i 
løbet af elimineringsfasen betragtes som koncentrationen i væv efter tarm ­
tømning. For at tage højde for den uforurenede jords fortynding af testke ­
mikaliekoncentrationen i løbet af elimineringsfasen kan vægten af tarmind ­
holdet estimeres ud fra forholdet mellem ormenes vådvægt/ormenes aske ­
vægt eller ormenes tørvægt/ormenes askevægt.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Jord- og ormeprøver bør analyseres umiddelbart efter udtagningen (dvs. 
inden for 1-2 dage), så man undgår nedbrydning eller andre former for 
tab, og så der løbende under testen kan beregnes omtrentlige optagelses- og elimineringshastigheder. Hvis analysen forsinkes, opbevares prøverne på en hensigtsmæssig måde, f.eks. ved dybfrysning ( ≤ – 18 °C).
 
49. Det kontrolleres, at den kemiske analyse giver tilfredsstillende præcision, 
reproducerbarhed og genfinding af testkemikaliet i både jord og orm for den 
valgte metode. Ekstraktionsgraden, detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ) rapporteres. Det kontrolleres ligeledes, at test ­
kemikaliet ikke kan detekteres i kontrolbeholderne i højere koncentrationer 
end baggrundskoncentrationerne. Hvis koncentrationen af testkemikaliet i 
testorganismen Ca er > 0 i kontrolormene, medtages dette i beregningen af de kinetiske parametre (se tillæg 2). Alle prøver håndteres i hele testen på en sådan måde, at kontaminering og tab (f.eks. som følge af adsorption af 
testkemikaliet til prøvetagningsudstyret) minimeres.
 
50. Når der anvendes radioaktivt mærkede testkemikalier, kan det oprindelige 
testkemikalie og metabolitter analyseres. Kvantificering af det oprindelige testkemikalie og metabolitter ved steady state eller ved afslutningen af 
optagelsesfasen giver vigtige oplysninger. Prøverne »oprenses« derefter, så 
det oprindelige testkemikalie kan kvantificeres separat. Hvis individuelle metabolitter overstiger 10 % af den samlede radioaktivitet i de analyserede prøver, bør disse metabolitter identificeres.
 
51. Den samlede genfinding og genfindingen af testkemikalie i orm, jord og evt. 
udskillere, der indeholder absorbenter for at fastholde fordampet testkemi ­
kalie, registreres og rapporteres.  
52. Individer udtaget fra en testbeholder kan samles i en pool, hvis det drejer sig 
om enchytraeider, som er mindre end regnorm. Hvis denne »pooling« redu ­
cerer antallet af replikater, indskrænkes mulighederne for statistisk behand ­
ling af dataene. Hvis der kræves en bestemt statistisk metode og styrke, bør testen omfatte tilstrækkeligt mange replikate testbeholdere til, at den ønskede pooling, metode og styrke tilgodeses.
 
53. BAF bør udtrykkes både som funktion af samlet tørvægt og som funktion af 
fedtindholdet, hvis det kræves (f.eks. for meget hydrofobe kemikalier). Fedt ­
indholdet bestemmes ved hjælp af egnede metoder. Eksisterende metoder, f.eks. (31) og (58), tilpasses til dette formål. Disse metoder anvender ekstraktion med chloroform/methanol. For at undgå brugen af chlorerede 
opløsningsmidler bør der anvendes en tilpasning af Bligh og 
Dyer-metoden (9) som beskrevet i (17). Da de forskellige metoder ikke giver identiske værdier, er det vigtigt at give nærmere oplysninger om den anvendte metode. Når det er muligt, dvs. når tilstrækkeligt ormevæv 
er tilgængeligt, skal lipidanalysen foretages på samme prøve eller ekstrakt 
som det, der blev anvendt til analyse for testkemikaliet, eftersom lipiderne ofte skal fjernes fra ekstraktet, inden det kan analyseres ved gaskromatografi (49). Alternativt kan fedtindholdet måles på kontroldyr og derefter anvendes 
til at normalisere BAF-værdier. Sidstnævnte tilgang reducerer forureningen 
af udstyr med testkemikaliet.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
DATA OG RAPPORTERING  
Behandling af resultater  
54. Testkemikaliets optagelseskurve fås ved at afsætte koncentrationen i/på 
ormene i løbet af optagelsesfasen i forhold til tiden (lineære akser). Når kurven når et plateau, eller steady state (se definitioner i tillæg 1), beregnes steady state-bioakkumuleringsfaktoren BAFss ved hjælp af:
 
C a ved steady state eller afslutning af optagelsesfase  ðgennemsnitÞ 
C s ved steady state eller afslutning af optagelsesfase  ðgennemsnitÞ 
C a er koncentrationen af testkemikalie i testorganisme  
C s er koncentrationen af testkemikalie i jord  
55. Hvis steady state ikke nås, bestemmes BAFk, baseret på hastighedskonstan ­
ter, i stedet for BAFss, som beskrevet nedenfor:  
— Bestem akkumuleringsfaktoren (BAF  K ) som forholdet k  s /k e . 
— Optagelses- og elimineringshastigheder beregnes helst samtidig (se 
ligning 11 i tillæg 2).  
— Hastighedskonstanten for eliminering (k  e ) bestemmes normalt ud fra 
elimineringskurven (dvs. en afbildning af koncentrationen af testkemi ­
kaliet i ormene i løbet af elimineringsfasen). Dernæst beregnes hastig ­
hedskonstanten for optagelse (k  s ) på grundlag af k  e og en værdi af C  a , 
som udledes af optagelseskurven (disse metoder er også beskrevet i 
tillæg 2). Til at finde BAF  K og hastighedskonstanterne, k  s og k  e fore­
trækkes computerbaserede ikke-lineære parameterestimeringsmetoder. Hvis det er åbenbart, at elimineringen ikke er af første orden, anvendes andre modeller.
 
Testrapport  
56. Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:  
Testkemikalie:  
— alle tilgængelige oplysninger om testkemikaliets akutte toksicitet eller 
langtidstoksicitet (f.eks. EC  x , LC  x og NOEC) over for terrestriske oligo ­
chaeter  
— renhed, fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber, f.eks. log K  ow og 
vandopløselighed  
— kemisk identifikation; testkemikaliets herkomst, identitet og koncentra ­
tion af evt. opløsningsmiddel  
— hvis et radioaktivt mærket testkemikalie anvendes: den præcise position 
af de mærkede atomer, den specifikke radioaktivitet og den radio ­
kemiske renhed.  
Testart:  
— videnskabeligt navn, stamme, herkomst, evt. forbehandling, akklimatise ­
ring, alder, størrelse osv.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Testbetingelser:  
— anvendt testfremgangsmåde  
— belysningskildens art og karakteristika og belysningsperiodernes 
varighed  
— testdesign (f.eks. testbeholdernes antal og størrelse, jordmasse og højde 
af jordlag, antal replikater, antal orm pr. replikat, antal testkoncentratio ­
ner, varighed af optagelses- og elimineringsfaser samt prøvetagnings ­
hyppighed)  
— begrundelse for valget af testbeholdermateriale  
— metode til klargøring og applikation af testkemikalie samt begrundelse 
for valg af specifik metode  
— de nominelle testkoncentrationer, gennemsnittet af de målte værdier og 
deres standardafvigelser i testbeholderne og den metode, der er benyttet 
til at bestemme disse værdier  
— oprindelsen af bestanddele i syntetisk jord eller — hvis naturlige medier 
er anvendt — oprindelsen af jorden, beskrivelse af evt. forbehandling, 
resultater af kontroller (overlevelse, biomasseudvikling og reproduktion), jordkarakteristika (pH, samlet organisk kulstofindhold, partikelstørrelses ­
fordeling (procent sand, silt og ler), WHC
 max , vandindhold i procent ved 
testens start og afslutning og evt. andre målinger)  
— detaljerede oplysninger om, hvordan jord- og ormeprøver er behandlet, 
herunder forberedelse, opbevaring, spiking, ekstraktion og analyseme ­
toder (og præcision) for testkemikalie i orm og jord og fedtindhold 
(hvis bestemt) samt genfinding af testkemikaliet.  
Resultater:  
— mortalitet for kontrolorm og orm i hver testbeholder samt evt. iagttaget 
unormal adfærd (f.eks. undvigelse af jord eller manglende reproduktion i 
bioakkumuleringstest med enchytraeider)  
— forholdet mellem tørvægt og vådvægt for jord og testorganismer 
(anvendes til normalisering)  
— ormenes vådvægt på hvert prøvetagningstidspunkt; for regnorm også 
vådvægten ved begyndelsen af testen og på hvert prøvetagningstidspunkt før og efter udtømning af tarme
 
— testorganismernes fedtindhold (hvis bestemt)  
— kurver, der viser optagelses- og elimineringskinetikken for testkemikaliet 
i ormene samt tiden til steady state  
— C  a og C  s (med standardafvigelse og interval, hvis det er relevant) på alle 
prøvetagningstidspunkter (C  a udtrykt i g kg  –1 våd- og tørvægt af 
legemsvægt, C  s udtrykt i g kg  –1 våd- og tørvægt af jord). Hvis en 
biota-jord-akkumuleringsfaktor (BSAF) kræves (f.eks. til sammenligning af resultaterne fra to eller flere test udført med dyr med forskelligt 
fedtindhold), kan C
 a også udtrykkes som g kg  –1 fedtindhold i organis ­
men, og C  s kan udtrykkes som g kg  –1 organisk kulstofindhold i jorden  
— BAF (udtrykt i kg jord ·kg –1 orm), hastighedskonstant for optagelse fra 
jord k  s (udtrykt i g jord kg  –1 orm dag  –1 ) og hastighedskonstant for 
eliminering k  e (udtrykt i dag  –1 ); BSAF (udtrykt i kg jord organisk 
kulstofindhold kg  –1 orm fedtindhold) kan også rapporteres  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— hvis målt: procentdele af oprindeligt kemikalie, metabolitter og bundne 
reststoffer, dvs. den procentdel af testkemikalie, der ikke kan ekstraheres 
med almindelige ekstraktionsmetoder, detekteret i jord og testorganismer  
— metoder, der er anvendt til statistisk analyse af data.  
Evaluering af resultater:  
— resultaternes overensstemmelse med validitetskriterierne i afsnit 17  
— uventede eller usædvanlige resultater, f.eks. ufuldstændig eliminering af 
testkemikaliet fra testorganismerne.  
LITTERATUR:  
(1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ- 
HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University 
Coimbra.  
(2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
 
(3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Inter ­
national, E1676-04: 26 s.  
(4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. I Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. 
Beek): Bioaccumulation — New Aspects and Developments. 
Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276.
 
(5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.  
(6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & 
Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earth ­
worms ( Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 
154-165.  
(7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms 
(Eisenia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.  
(8) Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.  
(9) Bligh EG og Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.  
(10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 s.  
(11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P 
(2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests 
mit terrestrischen Oligochaeten. Rapport til den tyske miljøstyrelse 
(Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.  
(12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccu ­
mulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchy­
traeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, 
Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196.  
(13) Conder JM og Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13-20.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell DW og Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.  
(15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2-29.  
(16) Didden W (2003). Oligochaeta, I: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., Nederlandene, s. 555-576.
 
(17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shell ­
fish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
 
(18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bach ­
mann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 29: 140-145.
 
(19) Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 
18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt 
begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et europæisk 
kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommissionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 76/769/EØF og Kommissionens direktiv 
91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF, EUT L 396 af 
30.12.2006, s. 1.
 
(20) Edwards CA og Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 s.  
(21) OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris  
(22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th og Römbke J (2009). 
Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumu ­
lation mit terrestrischen Oligochaeten. Rapport til den tyske miljøstyrelse 
(Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 s. Findes 
på: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.  
(23) Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and 
acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 s.
 
(24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
 
(25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
 
(26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.  
(27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501-1514.  
(28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6- 
Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbri ­
cidae). Dissertation University Mainz, 156 s.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF — Z. Umweltchem, 
Ökotox. 15: 78-84.  
(30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcen ­
tration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231.  
(31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods 
for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099- 1105.
 
(32) Hawker DW og Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 
701-707.  
(33) Hund-Rinke K og Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sedi ­
ments 1: 15-20.  
(34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. I: Toxiko ­
logische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.  
(35) ISO 11268-2 (1998) Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
(36) Jaenike J (1982). » Eisenia foetida « is two biological species. Megadrilo ­
gica 4: 6-8.  
(37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
 
(38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.  
(39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, 
DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligo­
chaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. 
Chem. 22: 767-775.
 
(40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.  
(41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Compa ­
rison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
 
(42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and 
function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.  
(43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, 137 s.  
(44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.  
(45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accu ­
mulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.  
(46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, I: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
(48) Kapitel C.8 i dette bilag, Toksicitet for regnorme.  
(49) Kapitel C.13 i dette bilag, Biokoncentrering: Gennemstrømningstest med 
fisk. 
(50) Kapitel C.21 i dette bilag, Jordmikroorganismer: Kvælstofomdannelsestest.  
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.  
(52) OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia 
Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris.  
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
 
(54) Petersen H og Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.  
(55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. I: Handbook of Ecotoxicology Vol. 
1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.  
(56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- 
Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.  
(57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
(58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.  
(59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 s.  
(60) Römbke J og Moser Th (1999). Organisation and performance of an inter ­
national ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 s.
 
(61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, I: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & 
Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.  
(62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, 
Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.
 
(63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
 
(64) Schlosser H-J og Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
 
(65) Schmelz R og Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Caro ­
linea 57: 93-100.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims R W og Gerard BM (1985). Earthworms, I: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) 
No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
(67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557-2563.
 
(68) Spacie A og Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.  
(69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scrog ­
gins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. I: Advances in earthworm ecotoxico ­
logy. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). 
Setac Press, Pensacola, 67-81.
 
(70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. Toxi ­
col. Chemistry 22: 1167-1171.
 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation — Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
(72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, 
Duluth, MN, marts 2000.  
(73) Van Brummelen TC og Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277-285.  
(74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, I: Ecotoxicology of Earth ­
worms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
(75) Van Gestel CA og Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. 
Chemosphere 21: 1023-1033.  
(76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.  
(77) Venter JM og Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.  
(78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated flood ­
plain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
 
(79) Widianarko B og Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Tillæg 1  
DEFINITIONER  
Bioakkumulering : en koncentrationsforøgelse af testkemikaliet i eller på en 
organisme i forhold til koncentrationen af testkemikaliet i det omgivende medium. Bioakkumulering er resultatet af både biokoncentrerings- og biomagni ­
fikationsprocesser (se nedenfor).
 
Biokoncentration : en koncentrationsforøgelse af testkemikaliet i eller på en 
organisme som følge af optagelsen af kemikaliet alene fra det omgivende 
medium (dvs. via legemsflade og fordøjet jord) i forhold til koncentrationen af testkemikaliet i det omgivende medium.
 
Biomagnifikation : en koncentrationsforøgelse af testkemikaliet i eller på en 
organisme primært som følge af optagelsen af forurenet foder eller bytte i forhold til koncentrationen af testkemikaliet i foder eller bytte. Biomagnifikation 
kan medføre overførsel eller akkumulering af testkemikaliet i fødekæder.
 
Eliminering  af testkemikalie: tabet af kemikaliet fra testorganismens væv ved 
aktive eller passive processer, der forekommer uafhængigt af tilstedeværelsen eller fraværet af testkemikaliet i det omgivende medium.
 
Bioakkumuleringsfaktoren  (BAF) på ethvert tidspunkt i denne bioakkumule ­
ringstests optagelsesfase: koncentrationen af testkemikaliet i eller på testor ­
ganismen (C  a i g·kg -1 tørvægt orm) divideret med koncentrationen af testkemi ­
kaliet i det omgivende medium (C  s som g·kg -1 tørvægt jord); BAF angives i 
enheder af kg jord ·kg -1 orm. 
Steady state-bioakkumuleringsfaktor  (BAF  ss ): er BAF ved steady state og 
ændres ikke signifikant over en længere periode, idet koncentrationen af testke ­
mikaliet i det omgivende medium (C  s som g.kg  -1 tørvægt jord) er konstant i 
denne tidsperiode.  
Bioakkumuleringsfaktorer  beregnet direkte ud fra forholdet mellem hastigheds ­
konstanten for optagelse fra jord og hastighedskonstanten for eliminering (k  s og 
k e , se nedenfor) betegnes  kinetisk bioakkumuleringsfaktor (BAF  K ). 
Biota-jord-akkumuleringsfaktoren  (BSAF): den fedtindholdsnormaliserede 
koncentration af testkemikaliet i eller på testorganismen divideret med den orga ­
nisk kulstofnormaliserede koncentration af testkemikaliet i jorden ved steady 
state. C  a udtrykkes da som g ·kg -1 fedtindhold i organismen, og C  s som g·kg -1 
organisk indhold i jorden; BSAF angives i enheder af kg organisk kulstof ·kg -1 
fedt. 
Plateau  eller  steady state : ligevægten mellem de optagelses- og eliminerings ­
processer, der forekommer samtidig i løbet af eksponeringsfasen. Man taler om 
steady state i afbildningen af BAF i forhold til tiden, når kurven bliver parallel 
med tidsaksen, når tre på hinanden følgende analyser af BAF i prøver, der er udtaget med mindst to dages mellemrum, ligger inden for 20 % af hinanden, og når der ikke er nogen signifikante forskelle mellem de tre prøvetagningsperioder. 
For testkemikalier, der optages langsomt, vil et interval på syv dage være mere 
passende (49).
 
Organisk kulstof/vandfordelingskoefficient  (K oc ): forholdet mellem et kemika ­
lies koncentration i eller på andelen af organisk kulstof i jord og kemikaliets koncentration i vand ved ligevægt.
 
Octanol-vandfordelingskoefficient  (K  ow ): forholdet mellem et kemikalies 
opløselighed i n-octanol og vand ved ligevægt, også betegnet P  ow . Logaritmen 
til K  ow (log K  ow ) benyttes som rettesnor for et kemikalies potentiale for bioakku ­
mulering i vandorganismer.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Optagelses- eller eksponeringsfasen:  det tidsrum, hvori testorganismerne 
udsættes for testkemikaliet.  
Hastighedskonstanten for optagelse fra jord  (k s ): den numeriske værdi, som 
definerer hastigheden for den forøgelse af koncentrationen af testkemikaliet i eller på testorganismen, der følger af fasen for optagelse fra jord. k
 s udtrykkes i g 
jord kg  -1 orm d  -1 . 
Elimineringsfasen : tidsrummet efter overførsel af testorganismerne fra et 
forurenet medium til et medium uden testkemikaliet, hvor elimineringen (eller 
nettotabet) af kemikaliet fra testorganismerne undersøges.  
Hastighedskonstanten for eliminering  (k e ): den numeriske værdi, som definerer 
hastigheden for den reduktion af koncentrationen af testkemikaliet i eller på 
testorganismen, efter at testorganismerne er overført fra et medium med testke ­
mikaliet til et medium uden dette stof; k  e udtrykkes i d  -1 . 
Testkemikalie:  ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne 
testmetode.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Tillæg 2  
Beregning af parametre for optagelse og eliminering  
Den primære effektparameter i en bioakkumuleringstest er bioakkumuleringsfak ­
toren, BAF. Den målte BAF beregnes ved at dividere koncentration i testor ­
ganismen, C  a , med koncentrationen i jord, C  s , ved steady state. Hvis steady 
state ikke nås i optagelsesfasen, beregnes BAF  K ud fra hastighedskonstanter i 
stedet for BAFss. Det skal angives, om BAF er baseret på steady 
state-koncentrationer.  
Den kinetiske bioakkumuleringsfaktor (BAF  K ), hastighedskonstanten for 
optagelse fra jord (k  s ) og hastighedskonstanten for eliminering (k  e ) fås sædvan ­
ligvis ved at bruge computerbaserede ikke-lineære parameterestimeringsmetoder, f.eks. baseret på de modeller, der er beskrevet i (68). Ud fra et sæt sekventielle 
data for koncentration og tid og modelligningerne: 
C
 a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ligning 1]  
eller 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [ligning 2]  
hvor:  
C a = koncentration af kemikalie i orm [g kg-1 våd- eller tørvægt]  
k s = hastighedskonstant for optagelse i væv [g jord kg-1 orm d-1]  
C s = koncentration af kemikalie i jord [g kg-1 våd- eller tørvægt]  
k e = hastighedskonstant for eliminering [d-1]  
t c = tid ved afslutningen af optagelsesfasen  
beregner disse computerprogrammer værdier for BAF  K , k s og k  e . 
Når baggrundskoncentration i ikke-eksponerede orm, f.eks. på dag 0, adskiller sig 
signifikant fra nul (det kan f.eks. være tilfældet for metaller), skal denne 
baggrundskoncentration (C  a,0 ) medtages i ligningerne, så de lyder: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ligning 3]  
og 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [ligning 4]  
Hvis der observeres et signifikant fald i koncentrationen af testkemikaliet i jord i 
løbet af optagelsesfasen, kan følgende model anvendes, f.eks. (67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ [ligning 5]  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
hvor:  
C s = koncentration af kemikalie i jord [g kg-1 våd- eller tørvægt]  
k 0 = hastighedskonstant for nedbrydning i jord [d-1]  
C 0 = indledende koncentration af kemikalie i jord [g kg-1 våd- eller tørvægt] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ligning 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [ligning 7]  
hvor:  
C a = koncentration af kemikalie i orm [g kg-1 våd- eller tørvægt]  
k s = hastighedskonstant for optagelse i væv [g jord kg-1 orm d-1]  
k 0 = hastighedskonstant for nedbrydning i jord [d-1]  
k e = hastighedskonstant for eliminering [d-1]  
t c = tid ved afslutningen af optagelsesfasen.  
Når steady state opnås i løbet af optagelsesfasen (dvs. t = ∞), kan ligning 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ligning 1]  
reduceres til:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
eller 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [ligning 8]  
I så fald er k  s /k e x C  s en tilgang til koncentrationen af testkemikaliet i ormevæv 
ved steady state (C  a,ss ). 
Biota-jord-akkumuleringsfaktoren (BSAF) beregnes på følgende måde: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [ligning 9]  
hvor f  oc er andelen af organisk kulstof i jord, f  lip er andelen af fedtindhold i orm, 
som begge fortrinsvis bestemmes på prøver udtaget fra testen og baseret på 
henholdsvis tørvægt eller vådvægt.  
Elimineringskinetikken kan modelleres ved hjælp af data fra elimineringsfasen og 
ved anvendelse af følgende modelligning og en computerbaseret ikke-lineær 
parameterestimeringsmetode. Hvis de datapunkter, der er afsat i forhold til tid, 
indicerer et konstant eksponentielt fald i koncentrationen af testkemikaliet i testorganismerne, kan en etrumsmodel (ligning 9) bruges til at beskrive tidsfor ­
løbet for eliminering. 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [ligning 10]  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Elimineringsprocesser kan være tofasede og udvise et hurtigt fald i C  a i begyn­
delsen, som ændres til et langsommere tab af testkemikalie i slutningen af elimi ­
neringsfasen, f.eks. (27) (68). De to faser kan fortolkes ud fra den antagelse, at der er to forskellige rum i organismen, hvorfra testkemikalie går tabt med forskellige hastigheder. I sådanne tilfælde henvises til specifik litteratur, f.eks. 
(38) (39) (40) (78).
 
Ved hjælp af modelligningerne ovenfor kan de kinetiske parametre (k  s og k  e ) 
også beregnes i ét trin ved at anvende modellen for førsteordenskinetik på alle data fra både optagelses- og elimineringsfasen samtidig. En beskrivelse af en metode, der understøtter en sådan kombineret beregning af hastighedskonstan ­
terne for optagelse og eliminering, findes i (41) (73) og (70). 
C
 a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[ligning 11]  
Bemærk:  Når optagelses- og elimineringsparametre estimeres samtidig fra de 
kombinerede optagelses- og elimineringsdata, er »m« som vist i ligning 11 en deskriptor, der sætter computerprogrammet i stand til 
at tildele ligningens underled til datasættene for den enkelte fase og 
udføre evalueringen korrekt (m = 1 for optagelsesfasen; m = 2 for elimineringsfasen).
 
Disse modelligninger skal dog bruges med forsigtighed, især når testkemikaliets 
biotilgængelighed eller (bio)nedbrydning ændres i løbet af testen (se f.eks. (79)).  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Tillæg 3  
EKSEMPLER PÅ TIDSPLANER FOR BIOAKKUMULERINGSTEST  
Test med regnorm  
a) Optagelsesfase med otte prøvetagningsdatoer til beregning af kinetik  
Dag Aktivitet  
– 6 Konditionering af fremstillet jord i 48 timer. 
– 4 Spiking af jordandel med opløsning af testkemikaliet. Fordamp ­
ning af opløsningsmiddel. Blanding af jordbestanddele. Fordeling af jord til testbeholdere. Ækvilibrering ved testbetingelser i fire dage (tre uger for jord spiked med metal). 
– 3 til – 1 Udtagning af testorganismer fra dyrkningssystem til akklimatise ­
ring. Fremstilling og befugtning af jordbestanddele. 
0 Måling af temperatur og pH i jord. Udtagning af jordprøver fra 
behandlede beholdere og opløsningsmiddelkontroller til bestem ­
melse af koncentration af testkemikalie. Tilsætning af foderration. 
Vejning og randomiseret fordeling af orme til testbeholdere. 
Opbevaring af tilstrækkeligt antal delprøver af orm til bestem ­
melse af analytiske baggrundsværdier, våd- og tørvægt og fedt ­
indhold. Vejning af alle testbeholdere for at kontrollere fugtind ­
hold i jord. Kontrol af luftforsyning ved anvendelse af lukket 
testsystem. 
1 Kontrol af luftforsyning. Registrering af ormenes opførsel og 
temperatur. Udtagning af jord- og ormeprøver med henblik på bestemmelse af koncentration af testkemikalie. 
2 Samme som dag 1. 
3 Kontrol af luftforsyning. Registrering af ormenes opførsel og 
temperatur. 
4 Samme som dag 1. 
5 til 6 Samme som dag 3. 
7 Samme som dag 1. Tilsætning af foderration. Kontrol af fugt ­
indhold i jord ved gentaget vejning af testbeholdere. Kompensa ­
tion for fordampet vand. 
8 til 9 Samme som dag 3. 
10 Samme som dag 1. 
11 til 13 Samme som dag 3. 
14 Samme som dag 1. Tilsætning af foderration. Kontrol af fugt ­
indhold i jord ved gentaget vejning af testbeholdere. Kompensa ­
tion for fordampet vand. 
15 til 16 Samme som dag 3. 
17 Samme som dag 1. 
18 til 20 Samme som dag 3.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Dag Aktivitet  
21 Samme som dag 1. Måling af temperatur og pH i jord. Kontrol af 
fugtindhold i jord ved gentaget vejning af testbeholdere. Afslut ­
ning af optagelsesfase. Overførsel af orm fra resterende ekspone ­
rede replikater til beholdere med ren jord til elimineringsfasen (ingen tarmudtømning). Prøvetagning af jord og orm fra opløs ­
ningsmiddelkontroller. 
Aktiviteter før eksponering (ækvilibreringsfase) planlægges under 
hensyntagen til testkemikaliets egenskaber. 
Aktiviteter beskrevet for dag 3 udføres dagligt (som minimum på 
hverdage).
 
b) Elimineringsfase  
Dag Aktivitet  
– 6 Fremstilling og befugtning af jordbestanddele. Konditionering af 
fremstillet jord i 48 timer. 
– 4 Blanding af jordbestanddele. Fordeling af jord til testbeholdere. 
Inkubation ved testbetingelser i fire dage. 
0 (afslutning af 
optagelsesfase) Måling af temperatur og pH i jord. Vejning og randomiseret 
fordeling af orme til testbeholdere. Tilsætning af foderration. Overførsel af orm fra resterende eksponerede replikater til behol ­
dere med ren jord. Udtagning af jord- og ormeprøver efter 4-6 
timer med henblik på bestemmelse af koncentrationen af testke ­
mikaliet. 
1 Kontrol af luftforsyning. Registrering af ormenes opførsel og 
temperatur. Udtagning af jord- og ormeprøver med henblik på bestemmelse af koncentration af testkemikalie. 
2 Samme som dag 1. 
3 Kontrol af luftforsyning. Registrering af ormenes opførsel og 
temperatur. 
4 Samme som dag 1. 
5 til 6 Samme som dag 3. 
7 Samme som dag 1. Tilsætning af foderration. Kontrol af fugt ­
indhold i jord ved gentaget vejning af testbeholdere. Kompensa ­
tion for fordampet vand. 
8 til 9 Samme som dag 3. 
10 Samme som dag 1. 
11 til 13 Samme som dag 3. 
14 Samme som dag 1. Tilsætning af foderration. Kontrol af fugt ­
indhold i jord ved gentaget vejning af testbeholdere. Kompensa ­
tion for fordampet vand. 
15 til 16 Samme som dag 3. 
17 Samme som dag 1.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Dag Aktivitet  
18 til 20 Samme som dag 3. 
21 Samme som dag 1. Måling af temperatur og pH i jord. Kontrol af 
fugtindhold i jord ved gentaget vejning af testbeholdere. Prøve ­
tagning af jord og orm fra opløsningsmiddelkontroller. 
Inden starten på elimineringsfasen skal jord fremstilles på samme 
måde som inden optagelsesfasen. 
Aktiviteter beskrevet for dag 3 udføres dagligt (som minimum på 
hverdage).  
Test med enchytraeider  
a) Optagelsesfase med otte prøvetagningsdatoer til beregning af kinetik  
Dag Aktivitet  
– 6 Konditionering af fremstillet jord i 48 timer. 
– 4 Spiking af jordandel med opløsning af testkemikaliet. Fordamp ­
ning af opløsningsmiddel. Blanding af jordbestanddele. Fordeling af jord til testbeholdere. Ækvilibrering ved testbetingelser i fire dage (tre uger for jord spiked med metal). 
– 3 til – 1 Udtagning af testorganismer fra dyrkningssystem til akklimatise ­
ring. Fremstilling og befugtning af jordbestanddele. 
0 Måling af temperatur og pH i jord. Udtagning af jordprøver fra 
behandlede beholdere og opløsningsmiddelkontroller til bestem ­
melse af koncentration af testkemikalie. Tilsætning af foderration. Vejning og randomiseret fordeling af orme til testbeholdere. Opbevaring af tilstrækkeligt antal delprøver af orm til bestem ­
melse af analytiske baggrundsværdier, våd- og tørvægt og fedt ­
indhold. Vejning af alle testbeholdere for at kontrollere fugtind ­
hold i jord. Kontrol af luftforsyning ved anvendelse af lukket testsystem. 
1 Kontrol af luftforsyning. Registrering af ormenes opførsel og 
temperatur. Udtagning af jord- og ormeprøver med henblik på 
bestemmelse af koncentration af teststof. 
2 Samme som dag 1. 3 Kontrol af luftforsyning. Registrering af ormenes opførsel og 
temperatur. 
4 Samme som dag 1. 
5 til 6 Samme som dag 3. 
7 Samme som dag 1. Tilsætning af foderration til jord. Kontrol af 
fugtindhold i jord ved gentaget vejning af testbeholdere. 
Kompensation for fordampet vand. 
9 Samme som dag 1. 
10 Samme som dag 3.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Dag Aktivitet  
11 Samme som dag 1. 
12 til 13 Samme som dag 3. 
14 Samme som dag 1. Tilsætning af foderration til jord. Måling af 
temperatur og pH i jord. Kontrol af fugtindhold i jord ved gentaget vejning af testbeholdere. Afslutning af optagelsesfase. 
Overførsel af orm fra resterende eksponerede replikater til behol ­
dere med ren jord til elimineringsfasen (ingen tarmudtømning). Prøvetagning af jord og orm fra opløsningsmiddelkontroller. 
Aktiviteter før eksponering (ækvilibreringsfase) planlægges under 
hensyntagen til testkemikaliets egenskaber. 
Aktiviteter beskrevet for dag 3 udføres dagligt (som minimum på 
hverdage).
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Tillæg 4  
Syntentisk jord — anbefalinger vedrørende fremstilling og opbevaring  
Da naturlig jord fra en bestemt kilde ikke er tilgængelig hele året, og da hjem ­
mehørende organismer og tilstedeværelsen af mikroforurenere kan påvirke testen, 
anbefales det at bruge et syntetisk substrat, den syntetiske jord i henhold til 
kapitel C.8 i dette bilag, Toksicitet for regnorme (48), i denne test. Flere forsøgs ­
arter kan overleve, vokse og forplante sig i denne jord, og der opnås maksimal standardisering samt sammenlignelighed af test- og dyrkningsbetingelser inden 
for og mellem laboratorier.
 
Jordbestanddele 
Tørv: 10 % Sphagnumtørv i overensstemmelse med 
OECD Guideline 207 no. (48) 
Kvartssand: 70 % Industrielt kvartssand (lufttørret); kornstør ­
relse: over 50 % af partiklerne skal være 
fra 50-200 μm, men alle partikler skal være 
≤ 2 mm 
Kaolinholdigt ler: 20 % Kaolinindhold ≥ 30 % 
Calciumcarbonat: ≤ 1 % CaCO  3 , pulveriseret, kemisk rent  
Det organiske kulstofindhold i den syntetiske jord kan evt. reduceres, f.eks. ved 
at reducere indholdet af tørv til 4-5 % af tørjorden og øge sandindholdet tilsva ­
rende. Ved en sådan reduktion af det organiske kulstofindhold kan mulighederne for, at testkemikaliet adsorberes til jorden (organisk kulstof), reduceres, og test ­
kemikaliets tilgængelighed for ormene forøges (74). Det er blevet påvist, at 
Enchytraeus albidus og Eisenia fetida kan opfylde validitetskriterierne for repro ­
duktion ved test i feltjord med lavere organisk kulstofindhold, f.eks. 2,7 % (33) 
(61), og erfaringer viser, at dette også kan opnås i syntetisk jord med 5 % tørv.
 
Fremstilling  
De tørre bestanddele i jorden blandes grundigt (f.eks. i stor laboratoriemixer). 
Dette gøres ca. en uge, inden testen påbegyndes. De blandede tørre jordbestand ­
dele fugtes med deioniseret vand mindst 48 timer inden tilsætning af testkemi ­
kaliet for at ækvilibrere/stabilisere surheden. Til bestemmelse af pH-værdien 
anvendes en blanding af jord og 1 M KCl-opløsning i forholdet 1:5. Hvis 
pH-værdien ikke er inden for det krævede interval (6,0 ± 0,5), tilsættes en passende mængde CaCO
 3 til jorden, eller en ny batch jord fremstilles.  
Den maksimale vandbindingsevne (WHC) for den syntetiske jord bestemmes i 
overensstemmelse med ISO 11268-2 (35). Mindst to dage inden påbegyndelsen 
af testen fugtes den tørre syntetiske jord ved at tilsætte så meget deioniseret eller 
rekonstitueret vand, at ca. halvdelen af det endelige vandindhold opnås. Det endelige vandindhold skal være 40-60 % af den maksimale WHC. Når testen påbegyndes, fordeles den fugtede jord i så mange batches som det anvendte antal 
testkoncentrationer og kontroller, og fugtindholdet justeres til 40-60 % af 
WHC
 max ved hjælp af en opløsning af testkemikaliet og/eller ved at tilsætte 
deioniseret eller rekonstitueret vand. Fugtindholdet bestemmes ved begyndelsen og slutningen af testen (ved 105 °C). Det skal være optimalt i forhold til artens 
behov. Fugtindholdet kan også kontrolleres på følgende måde: Når jorden presses 
forsigtigt i hånden, skal små dråber vand vise sig mellem fingrene.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Opbevaring  
De tørre bestanddele i syntetisk jord kan opbevares ved rumtemperatur indtil 
anvendelse. Den fremstillede og fugtede jord kan opbevares køligt i op til tre 
dage inden spiking. Fordampningen af vand skal minimeres. Jord, der er tilsat testkemikaliet, anvendes straks, medmindre information indicerer, at den pågæl ­
dende jord kan opbevares, uden at det påvirker testkemikaliets toksicitet og 
biotilgængelighed. Prøver af spiked jord opbevares i det tilfælde under de betin ­
gelser, der anbefales for det pågældende testkemikalie, indtil analyse.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Tillæg 5  
Arter af terrestriske oligochaeter, der anbefales til test af bioakkumulering 
fra jord  
Regnorm  
Den anbefalede testart er Eisenia fetida (Savigny 1826), som tilhører familien 
Lumbricidae. Siden 1972 har den været opdelt i to underarter (Eisenia fetida og 
Eisenia andrei (10)). I henhold til Jaenike (36) er de ægte særskilte arter. Eisenia fetida er letgenkendelig på sine lyse, gule striber mellem leddene, mens Eisenia andrei er ensartet mørkerød. De stammer sandsynligvis oprindeligt fra området 
omkring Sortehavet, men findes i dag i hele verden, især i menneskeskabte 
levesteder, som f.eks. kompostbunker. Begge kan bruges til økotoksikologiske test og bioakkumuleringstest.
 
Eisenia fetida og Eisenia andrei kan fås i handelen, f.eks. som fiskemadding. 
Sammenlignet med andre lumbricidregnorme har de en kort livscyklus på ca. 2-3 måneder (ved rumtemperatur). Deres optimale temperatur er ca. 20-24 °C. De foretrækker relativt fugtige substrater med næsten neutral pH og et højt indhold 
af organisk materiale. Da disse arter har været anvendt bredt i standardiserede 
økotoksikologiske test i omkring 25 år, er deres dyrkning veletableret (48) (77).
 
Begge arter kan opdrættes i forskellige dyreekskrementer. Som avlsmedium kan 
anbefales af ISO (35) en blanding af lige dele tørv og ko- eller hestegødning. 
Mediet skal have en pH-værdi på ca. 6-7 (justeret med calciumcarbonat) og en lav ionledningsevne (under 6 mmhos eller 0,5 % saltkoncentration), og det må ikke være uforholdsmæssigt forurenet med ammoniak eller dyreurin. Kommerciel 
havejord fri for additiver eller syntetisk jord i henhold til OECD (48) eller en lige 
blanding af de to kan anvendes. Substratet bør være fugtigt, men ikke for vådt. Avlekasser med et rumfang på 10-50 l er passende.
 
For at få orm af standardalder og -masse er det bedst at starte dyrkningen med 
kokoner. Voksne orm sættes derfor i en avlekasse, der indeholder frisk substrat, med henblik på producere kokoner. Praktiske erfaringer har vist, at en popula ­
tionstæthed på ca. 100 voksne orm pr. kg substrat (vådvægt) giver god repro ­
duktion. Efter 28 dage fjernes de voksne orm. De regnorme, der klækkes af kokonerne, anvendes til test, når de er kønsmodne efter mindst to måneder, men højst efter 12 måneder.
 
Orm af de arter, der er beskrevet ovenfor, betragtes som sunde, hvis de bevæger 
sig gennem substratet, ikke forsøger at forlade substratet og formerer sig løbende. Meget langsom bevægelse eller gul bagende (i Eisenia fetidas tilfælde) indicerer 
udtømmelse af substrat. I det tilfælde bør der gives frisk substrat, og/eller antallet 
af orm pr. beholder bør reduceres.
 
Yderligere udvalgte referencer  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J, Egele, P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
 
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims R W og Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London, 31: 1-171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. I: Earthworm 
Ecology — from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 s.
 
Enchytraeider  
Den anbefalede testart er Enchytraeus albidus Henle 1837 (hvid kompostorm). 
Enchytraeus albidus er en af de største (op til 15 mm) arter af Enchytraeidae-slægten af Oligochaeter (annelida), og den findes i hele verden, f.eks. (8). Enchytraeus albidus findes på marine, limniske og terrestriske leveste ­
der, primært i organiske materialer under nedbrydning (tang og kompost) og 
sjældent i engområder (42). Den brede økologiske tolerance og visse morfolo ­
giske variationer indicerer, at arten omfatter forskellige racer.
 
Enchytraeus albidus sælges som fiskefoder. Det bør undersøges, om bestanden er 
kontamineret af andre, normalt mindre arter (60). Hvis kontaminering forekom ­
mer, bør alle orm skylles med vand i en petriskål. Store voksne individer af Enchytraeus albidus udvælges derefter (ved hjælp af stereomikroskop) for at starte en ny bestand. Alle andre orm kasseres. Ormens livscyklus er kort, da 
den når sin modenhed mellem 33 dage (ved 18 °C) og 74 dage (ved 12 °C). Kun 
bestande, der har været i laboratoriet i mindst fem uger (en generation) uden problemer, bør anvendes i en test.
 
Andre arter af Enchytraeus-slægten kan også anvendes, navnlig Enchytraeus 
luxuriosus . Denne art er en ægte jordinhabitant, som er beskrevet for nylig i 
(65). Hvis andre arter af Enchytraeus anvendes, skal de identificeres klart, og begrundelsen for valget af art skal anføres i rapporten.
 
Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) er en art, der tilhører samme 
gruppe som Enchytraeus luxuriosus. Det er ikke med sikkerhed dokumenteret, at den findes i det fri, og er kun blevet beskrevet fra dyrkede regnormebestande og kompostbunker (Römbke 2003). Dens oprindelige økologiske behov kendes 
derfor ikke. Nylige laboratorieforsøg i forskellige feltjorde har dog bekræftet, 
at denne art udviser bred tolerance over for jordegenskaber, som f.eks. pH og tekstur (Jänsch et al. 2005). I de senere år er denne art ofte blevet anvendt i økotoksikologiske forsøg på grund af dens ukomplicerede formering og test, 
f.eks. Kuperman et al. 2003). Den er dog lille (3-12 mm; 7 mm i gennemsnit 
(Westheide & Müller 1996), og det gør den vanskeligere at håndtere end Enchy ­
traeus albidus. Hvis denne art bruges i stedet for Enchytraeus albidus, kan test ­
beholderen være mindre, men det er ikke nødvendigt. Det skal desuden tages i 
betragtning, at denne art reproduceres meget hurtigt og har en generationstid på 
mindre end 20 dage ved 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) og endda hurtigere ved højere temperaturer.
 
Enchytraeider af arten Enchytraeus albidus (og andre Enchytraeus-arter) kan 
avles i store plastikkasser (f.eks. 30 × 60 × 10 cm eller 20 × 12 × 8 cm, som 
er egnet til dyrkning af små orm) fyldt med en blanding af syntetisk jord og uforurenet havejord fri for additiver, som fås i handelen. Kompostmateriale bør undgås, da det kan indeholde toksiske kemikalier, som f.eks. tungmetaller. Fauna 
fjernes fra avlsjorden inden brug ved tredobbelt dybfrysning. Ren syntetisk jord 
kan også bruges, men reproduktionshastigheden kan være langsommere sammen ­
lignet med hastigheden i blandede substrater. Substratet skal have en pH på 6,0 ± 0,5. Bestanden holdes i en inkubator ved en temperatur på 15 ± 2 °C uden lys. 
Temperaturer over 23 °C skal undgås. Det syntetiske/naturlige jord bør være 
fugtigt, men ikke vådt. Når jorden presses forsigtigt i hånden, skal små dråber vand vise sig mellem fingrene. Iltfattige betingelser skal undgås. Hvis der f.eks. bruges et låg, skal der være så mange huller i låget, at der kan ske en tilstræk ­
kelig luftudskiftning. Jorden i avlekassen skal beluftes ved at blande den forsig ­
tigt en gang om ugen.
 ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Ormene fodres mindst en gang om ugen ad libitum med havregryn, der anbringes 
i en fordybning på jordoverfladen og dækkes med jord. Hvis der stadig er foder 
tilbage i beholderen fra den forrige fodringsdato, tilpasses mængden af foder i overensstemmelse hermed. Hvis der vokser svampe på den resterende foder, erstattes den med en ny portion havregryn. For at stimulere reproduktionen 
kan havregrynene hver anden uge suppleres med vitaminberiget proteinpulver, 
som fås i handelen. Efter tre måneder overføres ormene til friskfremstillet dyrknings- eller avlesubstrat. Havregrynene, som skal opbevares i lukkede behol ­
dere, autoklaveres eller opvarmes inden brug for at undgå infektion med 
melmider (f.eks. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) eller rovmider (f.eks. 
Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Efter desinfektion males foderet, så det nemt kan strøs ud på jordoverfladen. Gær eller fiskefoderet Tetra ­
Min
 ® kan også bruges som foder.  
Generelt er dyrkningsbetingelserne hensigtsmæssige, hvis ormene ikke forsøger 
at forlade substratet, bevæger sig hurtigt gennem jorden, har en blank overflade 
uden fastsiddende jordpartikler eller er mere eller mindre hvide, og hvis der ses orme i forskellige aldre. Orm betragtes faktisk som sunde, hvis de kontinuerligt formerer sig.
 
Yderligere udvalgte referencer  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
 
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. 
Reviews 13: 51-83.  
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the 
nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.  
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607-616.  
Westheide W og Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.  
Westheide W og Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.  ▼M4 2008R0440 — DA — 24.08.2014 — 005.001 — 1467