Seznam a popis metod rozboru podle čl. 120g prvního pododstavce nařízení Rady (ES) č. 1234/2007 (1)

(zveřejněný v souladu s čl. 15 odst. 2 nařízení Komise (ES) č. 606/2009 ze dne 10. července 2009 (2) )

2010/C 43/01

Níže uvedená tabulka obsahuje seznam metod rozboru, které se použijí na kontrolu limitů a požadavků stanovených v předpisech Společenství pro produkci vinařských produktů. Ve třetím sloupci naleznete pro každý dotyčný parametr odkaz na odpovídající metodu rozboru popsanou ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty (Recueil des méthodes internationales d’analyse des vins et des moûts) Mezinárodní organizace pro révu a víno (OIV) v posledním vydání (2009), které je k datu tohoto zveřejnění dostupné. Pro každý parametr jsou popsány pouze referenční metody („Typ I“ nebo „Typ II“ podle klasifikace OIV) s výjimkou parametrů, pro něž v současné době neexistuje validovaná metoda typu I nebo II. Popis metod se nachází v příloze sdělení.

Poznámka:

Příloha A oddíl I Sborníku OIV stanoví definici různých typů metod rozboru, a zejména typu I (Kriteriální referenční metoda), typu II (Referenční metoda) a typu IV (Předběžná metoda).

Metody rozboru pro olovo a kadmium jsou nyní popsány v nařízení Komise (ES) č. 333/2007 ze dne 28. března 2007 (příloha C-3) (3). Příloha II bod 4 nařízení (ES) č. 401/2006 ze dne 23. února 2006 (4) stanoví obecná kritéria pro metody rozboru pro ochratoxin A, a není tedy nezbytné pro tuto látku popisovat zvláštní metodu pro vinařské produkty.

SEZNAM METOD ROZBORU

Popis některých metod rozboru je předmětem aktualizace orgány OIV. Tyto popisy budou zveřejněny v příštím sdělení Komise, jakmile OIV zveřejní aktualizované znění ve vydání Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty na rok 2010.

(1) Úř. věst. L 299, 16.11.2007.

(2) Úř. věst. L 193, 24.7.2009, s. 1.

(3) Úř. věst. L 88, 29.3.2007, s. 29.

(4) Úř. věst. L 70, 9.3.2006, s. 12.

PŘÍLOHA

OBSAH

1. HUSTOTA PŘI 20 °C A RELATIVNÍ HUSTOTA PŘI 20 °C (OIV - AS2 - 01- MASVOL) – Metoda typ I

2. REFRAKTOMETRICKÉ STANOVENÍ OBSAHU CUKRU V HROZNOVÝCH MOŠTECH, ZAHUŠTĚNÝCH HROZNOVÝCH MOŠTECH A REKTIFIKOVANÝCH MOŠTOVÝCH KONCENTRÁTECH (OIV - AS2 - 02- SUCREF) – Metoda typ I

3. CELKOVÝ SUCHÝ EXTRAKT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) CELKOVÁ SUCHÁ HMOTA – Metoda typ I

4. STANOVENÍ IZOTOPOVÉHO POMĚRU 18 O/ 16 O VODY VE VÍNECH (OIV-AS-2-09-MOUO18) – Metoda typ II

5. INDEX FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) – Metoda typ IV

6. GLUKÓZA A FRUKTÓZA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – Metoda typ II

7. STANOVENÍ CUKRŮ METODOU HPLC (SACHARÓZA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – Metoda typ II

8. ZJIŠŤOVÁNÍ OBOHACENÍ HROZNOVÝCH MOŠTŮ, ZAHUŠTĚNÝCH HROZNOVÝCH MOŠTŮ, REKTIFIKOVANÝCH MOŠTOVÝCH KONCENTRÁTŮ A VÍN MĚŘENÍM NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÉ REZONANCE DEUTÉRIA (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – Metoda typ I

9. OBJEMOVÝ OBSAH ALKOHOLU (OIV-AS-312-01-TALVOL) – Metoda typ I

10. STANOVENÍ IZOTOPOVÉHO POMĚRU 13 C/ 12 C V ETHANOLU VE VÍNĚ NEBO ETHANOLU ZÍSKANÉM ZKVAŠENÍM MOŠTŮ, ZAHUŠTĚNÝCH HROZNOVÝCH MOŠTŮ NEBO REKTIFIKOVANÝCH MOŠTOVÝCH KONCENTRÁTŮ IZOTOPOVOU HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (OIV-AS-312-06-ETHANO) – Metoda typ II

11. CELKOVÝ OBSAH KYSELIN (OIV - AS-313-01-ACITOT) – Metoda typ I

12. STANOVENÍ OBSAHU TĚKAVÝCH KYSELIN (OIV - AS-313-02-ACIVOL) – Metoda typ I

13. KYSELINA CITRONOVÁ (OIV -AS-313-09-ACIENZ) – Metoda typ II

14. KYSELINA SORBOVÁ (OIV - AS-313-14-ACISOR) – Metoda typ IV

15. pH (OIV - AS-313-15-PH) – Metoda typ I

16. SOUČASNÉ STANOVENÍ KYSELINY L-ASKORBOVÉ A KYSELINY D-ISO-ASKORBOVÉ METODOU HPLC A UV DETEKCÍ (OIV-AS-313-22-ACASCO) – Metoda typ II

17. OXID UHLIČITÝ (OIV - AS-314-01-DIOCAR) – Metoda typ II

18. STANOVENÍ OXIDU UHLIČITÉHO VE VÍNĚ MANOMETRICKOU METODOU (OIV – AS314-04-CO2MAN) – Metoda typ II

19. MĚŘENÍ PŘETLAKU ŠUMIVÝCH A PERLIVÝCH VÍN (OIV - AS-314-02-SURPRES) – Metoda typ I

20. STANOVENÍ LYSOZYMU VE VÍNĚ METODOU HPLC (OIV-AS-315-14) – Metoda typ IV

21. SÍRANY (OIV- AS-321-05-SULFAT) – Metoda typ II

22. ŽELEZO (OIV - AS-322-05-FER) – Metoda typ IV

23. MĚĎ (OIV – AS 322-06) – Metoda typ IV

24. OXID SIŘIČITÝ (OIV - AS-323-04-DIOSU) – Metoda typ II

1 HUSTOTA PŘI 20 °C A RELATIVNÍ HUSTOTA PŘI 20 °C (OIV - AS2 - 01- MASVOL) – METODA TYP I

1. DEFINICE

Hustota je hmotnost jednotkového objemu vína nebo moštu při teplotě 20 °C. Vyjadřuje se v gramech na mililitr a jejím symbolem je ρ20 °C.

Relativní hustota při teplotě 20 °C nebo hustota 20 °C/20 °C je poměr hustoty určitého objemu vína nebo moštu při 20 °C k hustotě stejného objemu vody při stejné teplotě, vyjádřený desetinným číslem. Označuje se symbolem .

2. PRINCIP METOD

Hustota a relativní hustota při 20 °C se měří na zkušebním vzorku:

buď referenční metodou: pyknometrem,

nebo hustoměrem pomocí hydrostatických vah, nebo elektronickým hustoměrem.

Poznámka

Pro velmi přesná stanovení se hustota musí upravit kvůli účinku oxidu siřičitého.

ρ20 °C = ρ′20 °C – 0,0006 × S ρ20 °C = korigovaná hustota ρ′20 °C = zjištěná hustota S = celkové množství oxidu siřičitého v g/l

3. PŘEDBĚŽNÁ ÚPRAVA VZORKU

Pokud víno nebo mošt obsahuje nezanedbatelná množství oxidu uhličitého, odstraňte jeho většinu mícháním 250 ml vína v jednolitrové baňce nebo filtrací při sníženém tlaku přes 2 g vaty vložené do prodlužovací trubice.

4. REFERENČNÍ METODA

4.1. Vybavení

Běžné laboratorní vybavení, zejména:

4.1.1. Pyknometr (1) z ohnivzdorného skla (Pyrex) o kapacitě přibližně 100 ml s odnímatelným teploměrem se zábrusem, kalibrovaným v desetinách stupně od 10 do 30 °C. Teploměr musí být odzkoušen (obr. 1).

Pyknometr má postranní trubici o délce 25 mm a vnitřním průměru nejvýše 1 mm, zakončenou kuželovým zabroušeným spojem. Tato postranní trubice může být uzavřena „zátkou se zásobníkem“, která se skládá z kuželové trubice se zabroušeným spojem a končí vytaženou sekcí. Tato zátka slouží jako expanzní komora.

Oba zabroušené spoje aparatury musí být provedeny velmi pečlivě.

4.1.2. Tárovací láhev, která se skládá z nádobky se stejným vnějším objemem (s přesností na 1 ml) jako pyknometr a hmotností rovnou hmotnosti pyknometru naplněného kapalinou o hustotě 1,01 (2 % roztok chloridu sodného (hmotnost/objem)).

Tepelně izolovaná nádobka přesně odpovídající tělesu pyknometru.

4.1.3. Dvoumiskové váhy s rozsahem alespoň 300 g a citlivostí 0,1 mg,

nebo

jednomiskové váhy s rozsahem alespoň 200 g a citlivostí 0,1 mg.

4.2. Kalibrace pyknometru

Kalibrace pyknometru zahrnuje stanovení následujících veličin:

— hmotnost prázdného pyknometru,

— objem pyknometru při 20 °C,

— hmotnost pyknometru naplněného vodou při 20 °C.

4.2.1. Metoda s použitím dvoumiskové váhy

Položte tárovací láhev na levou misku vah a čistý a suchý pyknometr opatřený „zátkou se zásobníkem“ na pravou misku. Na misku s pyknometrem přidávejte závaží a zaznamenejte hmotnost závaží nutnou k ustavení rovnováhy: nechť je to p gramů.

Pyknometr opatrně naplňte destilovanou vodou o teplotě okolí a nasaďte teploměr. Pyknometr pečlivě otřete do sucha a vložte do tepelně izolované nádoby. Promíchejte ho otáčením nádobky, dokud nebude odečet teploty na teploměru konstantní. Hladinu nastavte přesně k hornímu okraji postranní trubice. Postranní trubici otřete do sucha a nasaďte zátku se zásobníkem; pečlivě odečtěte teplotu t °C, případně ji upravte s ohledem na nepřesnost na teplotní stupnici. Zvažte pyknometr naplněný vodou proti tárovací baňce a zaznamenejte hmotnost p' v gramech požadovanou k vytvoření rovnováhy.

Výpočet:

Tárování prázdného pyknometru: Tára prázdného pyknometru= p + m kde m= hmotnost vzduchu obsaženého v pyknometru m= 0,0012 (p – p′).

Objem při 20 °C: V20 °C= (p + m – p′) × Ft kde Ft= faktor převzatý z tabulky I pro teplotu t °C Hodnota objemu V20 °C by měla být známa v rozmezí na ± 0,001 ml.

Hmotnost vody při 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 0,998203= hustota vody při 20 °C.

4.2.2. Metoda s použitím jednomiskových vah

Stanovte:

— hmotnost čistého a suchého pyknometru: nechť tato hmotnost je P

— hmotnost pyknometru naplněného vodou při t °C podle postupu popsaného v bodu 4.2.1: nechť tato hmotnost je P 1

— hmotnost táry: T0

Výpočet:

Tárování prázdného pyknometru:

Tára prázdného pyknometru= P – m kde m= hmotnost vzduchu obsaženého v pyknometru m= 0,0012 (P1 – P).

Objem při 20 °C: V20 °C= [P1 – (P – m)] × Ft kde Ft= faktor převzatý z tabulky I pro teplotu t °C.

Hodnota objemu V20 °C by měla být známa v rozmezí ± 0,001 ml.

Hmotnost vody při 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 0,998203= hustota vody při 20 °C

4.3. Metoda měření

4.3.1. Metoda s použitím dvoumiskových vah

Zvažte pyknometr naplněný zkušebním vzorkem připraveným pro stanovení (bod 3) postupem podle bodu 4.2.1.

Nechť p″ je hmotnost v gramech požadovaná k zavedení rovnováhy při teplotě t °C.

Hmotnost kapaliny obsažené v pyknometru = p + m – p″

Zdánlivá hustota při t °C:

ρt °C = (p + m – p″)/V20 °C

Pomocí jedné z dále uvedených korekčních tabulek vypočítejte hustotu při 20 °C v souladu s povahou měřené kapaliny: suché víno (tabulka II), přírodní nebo zahuštěný mošt (tabulka III), sladké víno (tabulka IV).

Relativní hustota vína 20 °C/20 °C se vyjádří dělením jeho hustoty při 20 °C číslem 0,998203.

4.3.2. Metoda s použitím jednomiskových vah

Zvažte tárovací láhev, její hmotnost nechť je T 1.

Vypočítejte dT = T 1 – T o

Hmotnost prázdného pyknometru v okamžiku měření = P – m + dT

Zvažte pyknometr naplněný zkušebním vzorkem připraveným pro stanovení (bod 3) postupem podle bodu 4.2.1. Nechť jeho hmotnost při t °C je P 2.

Hmotnost kapaliny obsažené v pyknometru při teplotě t °C = P 2 – (P – m + dT)

Zdánlivá hustota při t °C:

ρ t °C = (P2 – (P – m + dT)/V 20 °C

Hustotu zkoušené kapaliny (suchého vína, přírodního nebo zahuštěného moštu nebo sladkého vína) při 20 °C vypočítejte podle bodu 4.3.1.

Relativní hustota vína 20 °C/20 °C se vypočítá dělením jeho hustoty při 20 °C číslem 0,998203.

4.3.3. Opakovatelnost měření hustoty:

pro suchá a polosladká vína: r = 0,00010

a pro sladká vína: r = 0,00018

4.3.4. Reprodukovatelnost měření hustoty:

pro suchá a polosladká vína: R = 0,00037

a pro sladká vína: R = 0,00045

TABULKA I

Faktory F,

kterými je třeba vynásobit hmotnost vody obsažené v pyknometru ze skla pyrex při teplotě t °C pro výpočet objemu pyknometru při 20 °C

[Viz tabulka I přílohy II metody AS2 - 01 popsané ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty organizace OIV]

TABULKA II

Teplotní korekce c k hustotě suchých vín a suchých vín bez alkoholu, měřené pyknometrem ze skla pyrex při teplotě t °C k úpravě výsledku na 20 °C.

[Viz tabulka II přílohy II metody AS2 - 01 popsané ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty organizace OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – je-li t °C nižší než 20 °C + je-li t °C vyšší než 20 °C

TABULKA III

Teplotní korekce c k hustotě přírodních moštů a zahuštěných moštů, měřené při t °C pyknometrem ze skla pyrex k úpravě výsledku na 20 °C.

[Viz tabulka III přílohy II metody AS2 - 01 popsané ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty organizace OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – je-li t °C nižší než 20 °C + je-li t °C vyšší než 20 °C

TABULKA IV

Teplotní korekce c k hustotě vín o obsahu alkoholu nejméně 13 % obj. a obsahujících zbytkový cukr, měřené při t °C pyknometrem ze skla pyrex k úpravě výsledku na 20 °C.

[Viz tabulka IV přílohy II metody AS2 - 01 popsané ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty organizace OIV]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – je-li t °C nižší než 20 °C + je-li t °C vyšší než 20 °C

2 REFRAKTOMETRICKÉ STANOVENÍ OBSAHU CUKRU V HROZNOVÝCH MOŠTECH, ZAHUŠTĚNÝCH HROZNOVÝCH MOŠTECH A REKTIFIKOVANÝCH MOŠTOVÝCH KONCENTRÁTECH (OIV - AS2 - 02- SUCREF) – METODA TYP I

1. PRINCIP METODY

Obsah cukru v gramech na litr a v gramech na kilogram pro hroznové mošty, zahuštěné hroznové mošty a rektifikované moštové koncentráty se stanoví na základě indexu lomu při 20 °C vyjádřeném buď jako absolutní hodnota, nebo jako hmotnostní procento sacharózy, který je uveden v příslušné tabulce.

2. VYBAVENÍ

2.1. Abbé refraktometr

Použitý refraktometr musí být vybaven stupnicí měřící:

— s přesností 0,1 % hmotnostního sacharózy,

— nebo index lomu na čtyři desetinná místa.

Refraktometr musí být vybaven teploměrem, který má stupnici v rozsahu alespoň od +15 °C do +25 °C, a zařízením pro cirkulující vodu, která umožňuje provádět měření při teplotě 20 °C ± 5 °C.

Provozní pokyny pro tento přístroj je třeba přísně dodržovat, zejména pokud jde o kalibraci a zdroj světla.

3. PŘÍPRAVA VZORKU

3.1 Mošt a zahuštěný mošt

Mošt případně přefiltrujte přes suchou gázu čtyřikrát přeloženou, odstraňte první podíly filtrátu a proveďte stanovení na filtrovaném vzorku.

3.2 Rektifikovaný moštový koncentrát

V závislosti na koncentraci použijte buď rektifikovaný moštový koncentrát samotný, nebo roztok získaný doplněním 200 g rektifikovaného moštového koncentrátu na 500 g vodou, přičemž veškerá odvažování musí být přesná.

4. POSTUP

Vzorek temperujeme na teplotu přibližně 20 °C. Na spodní hranol refraktometru dejte malý zkušební vzorek a dejte pozor, aby tento zkušební vzorek pokrýval skleněný povrch stejnoměrně (hranoly jsou stisknuty pevně k sobě). Proveďte měření podle provozních pokynů pro použitý přístroj.

Odečtěte hmotnostní procento sacharózy s přesností na 0,1 %, nebo odečtěte index lomu na čtyři desetinná místa.

Na stejném připraveném vzorku proveďte alespoň dvě stanovení. Poznamenejte si teplotu t °C.

5. VÝPOČET

5.1. Korekce teploty

5.1.1. Přístroje se stupnicí v hmotnostních procentech sacharózy: k získání korekce teploty použijte tabulku I.

5.1.2. Přístroje se stupnicí v indexu lomu: v tabulce II najděte index změřený při teplotě t °C, abyste získali odpovídající hodnotu hmotnostního procenta sacharózy při t °C (sloupec 1). Tuto hodnotu upravte pomocí tabulky I na teplotu 20 °C.

5.2. Obsah cukru v moštu a zahuštěném moštu

V tabulce II najděte hmotnostní procento sacharózy při 20 °C a zjistěte obsah cukru v gramech na litr a v gramech na kilogram. Obsah cukru se vyjadřuje jako invertní cukr s přesností na jedno desetinné místo.

5.3. Obsah cukru v rektifikovaném moštovém koncentrátu

V tabulce III najděte hmotnostní procento sacharózy při 20 °C a zjistěte obsah cukru v gramech na litr a v gramech na kilogram. Obsah cukru se vyjadřuje jako invertní cukr s přesností na jedno desetinné místo.

Pokud bylo měření provedeno na zředěném rektifikovaném moštovém koncentrátu, výsledek vynásobte faktorem zředění.

5.4 Index lomu moštu, zahuštěného moštu a rektifikovaného moštového koncentrátu

V tabulce II najděte hmotnostní procento sacharózy při 20 °C a zjistěte indexu lomu při 20 °C. Index lomu se vyjadřuje s přesností na čtyři desetinná místa.

Poznámka: Obsah alkoholu v moštu, zahuštěném moštu a rektifikovaném moštovém koncentrátu může být určen pomocí korelační tabulky uvedené v příloze I nařízení Komise (ES) č. 1623/2000 ze dne 25. července 2000 (Úř. věst. L 194, 31.7.2000).

TABULKA I

Korekce pro případ, že hmotnostní procento sacharózy bylo stanoveno při teplotě jiné než 20 °C

[Viz tabulka I přílohy metody AS2 - 02 popsané ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty organizace OIV]

TABULKA II

Tabulka udávající obsah cukru v moštu a zahuštěném moštu v gramech na litr a gramech na kilogram stanovený pomocí refraktometru v hmotnostním procentu sacharózy při 20 °C nebo v indexu lomu při 20 °C. Rovněž je uvedena hustota při 20 °C.

[Viz tabulka II přílohy metody AS2 - 02 popsané ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty organizace OIV]

TABULKA III

Tabulka udávající obsah cukru v rektifikovaném moštovém koncentrátu v gramech na litr a gramech na kilogram stanovený pomocí refraktometru v hmotnostním procentu sacharózy při 20 °C nebo v indexu lomu při 20 °C. Rovněž je uvedena hustota při 20 °C.

[Viz tabulka III přílohy metody AS2 - 02 popsané ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty organizace OIV]

3 CELKOVÝ SUCHÝ EXTRAKT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) CELKOVÁ SUCHÁ HMOTA – METODA TYP I

1. DEFINICE

Celkový suchý extrakt neboli celková suchá hmota zahrnuje veškerou hmotu, která je za daných fyzikálních podmínek netěkavého charakteru. Tyto fyzikální podmínky musejí být takové, aby hmota, která tvoří veškerý suchý extrakt, procházela během provádění zkoušky co nejmenšími změnami.

Bezcukerný extrakt je rozdíl mezi celkovým suchým extraktem a celkovým obsahem cukrů.

Redukovaný extrakt je rozdíl mezi celkovým suchým extraktem a celkovým obsahem cukrů s přebytkem 1 g/l, síranem draselným s přebytkem 1 g/l, případně přítomného mannitolu a veškerých dalších chemických látek, které mohly být do vína přidány.

Zbytkový extrakt je rozdíl mezi bezcukerným extraktem a obsahem netěkavých kyselin vyjádřených jako kyselina vinná.

Extrakt se vyjadřuje v g/l a musí být stanoven s přesností na 0,5 g.

2. PRINCIP METODY

[Popis této metody rozboru je předmětem aktualizace orgány OIV. Bude zveřejněn v příštím sdělení Komise, jakmile OIV zveřejní aktualizované znění ve vydání Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty na rok 2010. Orientačně lze do uvedeného zveřejnění vycházet z kapitoly 4 přílohy nařízení Komise (EHS) č. 2676/90.]

4 STANOVENÍ IZOTOPOVÉHO POMĚRU 18O/16O VODY VE VÍNECH (OIV-AS-2-09-MOUO18) – METODA TYP II

(p.m.)

[Popis této metody rozboru je předmětem aktualizace orgány OIV. Bude zveřejněn v příštím sdělení Komise, jakmile OIV zveřejní aktualizované znění ve vydání Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty na rok 2010. Orientačně lze do uvedeného zveřejnění vycházet z kapitoly 43 přílohy nařízení Komise (EHS) č. 2676/90.]

5 INDEX FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) – METODA TYP IV

1. DEFINICE

Index Folin-Ciocalteu je výsledek získaný použitím níže popsané metody.

2. PRINCIP

Veškeré fenolické sloučeniny obsažené ve víně se oxidují činidlem Folin – Ciocalteu. Toto činidlo se skládá ze směsi kyseliny fosfowolframové (H3PW12O40) a kyseliny fosfomolybdenové (H3PMo12O40), která se během oxidace fenolů redukuje na směs modrých oxidů wolframu (W8O23) a molybdenu (Mo8O23).

Vytvořené modré zabarvení má maximální absorpci v oblasti vlnové délky asi 750 nm. Je úměrné celkovému množství původně přítomných fenolických sloučenin.

3. ČINIDLA

Činidla musí mít analytickou kvalitu. Použitá voda musí být destilovaná nebo odpovídající čistoty.

3.1. Činidlo Folin-Ciocalteu

Toto činidlo je k dostání v obchodní síti ve formě připravené k použití. Může být připraveno následujícím způsobem: rozpusťte 100 g wolframanu sodného (Na2WO4 · 2H2O) a 25 g molybdenanu sodného (Na2MoO4 · 2H2O) v 700 ml destilované vody. Přidejte 50 ml 85 % kyseliny fosforečné (ρ20 = 1,71 g/ml) a 100 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (ρ20 = 1,19 g/ml). Uveďte do varu a vařte pod zpětným chladičem po dobu 10 hodin, poté přidejte 150 g síranu lithného (Li2SO4 · H2O), několik kapek bromu a vařte ještě jednou po dobu 15 minut. Ponechte zchladnout a doplňte destilovanou vodou na 1 litr.

3.2. Bezvodý uhličitan sodný (Na2CO3) doplněný na 20 % (hmotnost/objem) roztok vodou.

4. VYBAVENÍ

Běžné laboratorní vybavení, zejména:

4.1. Odměrné baňky o objemu 100 ml.

4.2. Spektrofotometr umožňující měření při 750 nm.

5. POSTUP

5.1. Červené víno

Do odměrné baňky o objemu 100 ml (bod 4.1) nalijte přesně v následujícím pořadí:

1 ml vína předem zředěného 1:5

50 ml destilované vody

5 ml činidla Folin-Ciocalteu (3.1)

20 ml roztoku uhličitanu sodného (3.2)

Doplňte na 100 ml destilovanou vodou.

Zamícháním homogenizujte. Počkejte 30 minut, než se reakce stabilizuje. Stanovte absorbanci při 750 nm v kyvetě o optické délce 1 cm proti slepému vzorku připravenému z vody místo vína.

Pokud absorbance není kolem 0,3, je třeba provést přiměřené zředění.

5.2. Bílé víno

Proveďte stejný postup s 1 ml nezředěného vína.

5.3. Rektifikovaný moštový koncentrát

5.3.1. Příprava vzorku

Použijte roztok s obsahem cukru 25 % hmotnostních (25 °Brix) připravený podle kapitoly „pH“, bodu 4.1.2.

5.3.2. Měření

Postupujte podle popisu pro případ červeného vína (bod 5.1) s použitím vzorku o objemu 5 ml připraveného podle popisu v bodě 5.3.1 a změřte absorbanci proti slepému vzorku připravenému s 5 ml 25 % (hmotn.) roztoku invertního cukru.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1. Metoda výpočtu

Výsledek se vyjadřuje ve formě indexu získaného vynásobením absorbance číslem 100 pro červená vína zředěná 1:5 (nebo odpovídajícím koeficientem pro jiná ředění) a číslem 20 pro bílá vína. Pro rektifikované moštové koncentráty násobte číslem 16.

6.2. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených současně nebo velmi rychle po sobě stejným analytikem nesmí být větší než 1.

Dobré opakovatelnosti výsledků se dosáhne používáním velmi čistého vybavení (odměrné baňky a kyvety spektrofotometru).

6 GLUKÓZA A FRUKTÓZA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – METODA TYP II

1. DEFINICE

Glukóza a fruktóza mohou být stanoveny individuálně enzymatickou metodou, s cílem pouze vypočítat poměr glukóza /fruktóza.

2. PRINCIP

Glukóza a fruktóza jsou fosforylovány enzymem hexokinázou (HK) v přítomnosti adenosintrifosfátu (ATP) na glukóza-6-fosfát (G6P) a fruktóza-6-fosfát (F6P):

glukóza + ATP←→G6P + ADP

fruktóza + ATP←→F6P + ADP

Glukóza-6-fosfát (G6P) je katalyticky oxidována enzymem glukóza-6-fosfátdehydrogenázou (G6PDH) na glukonát-6-fosfát v přítomnosti nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADP+). Množství redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH), které vzniká, odpovídá množství glukóza-6-fosfátu, a tedy i množství glukózy.

G6P + NADP+←→Glukonát-6-fosfát + NADPH + H +

Množství redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu je stanoveno podle své absorpce na vlnové délce 340 nm.

Po ukončení této reakce je fruktóza-6-fosfát přeměněna působením fosfoglukoizomerázy (PGI) na glukózu-6-fosfát:

F6P←→G6P

Glukóza-6-fosfát reaguje znovu s nikotinamidadenindinukleotidfosfátem za vzniku glukonát-6-fosfátu a redukovaného nikotinamidadenindinukleotidfosfátu, který je následně stanoven.

3. VYBAVENÍ

— Spektrofotometr umožňující měření při vlnové délce 340 nm, při které je absorpce NADPH na maximální hodnotě. Protože se jedná o absolutní měření (nepoužívá se kalibrační křivka, ale odkaz na extinkční koeficient NADPH), je třeba zkontrolovat stupnice vlnových délek a hodnot absorbance u přístroje. Pokud není k dispozici, použijte spektrofotometr s diskontinuálním spektrem, umožňující provádět měření při vlnových délkách 334 nm nebo 365 nm.

— Skleněné kyvety s délkou optické dráhy 1 cm, nebo kyvety na jedno použití.

— 0,02 — 0,05 — 0,1 — 0,2 ml pipety pro enzymatické zkušební roztoky

4. ČINIDLA

4.1. Roztok 1: tlumivý roztok (triethanolamin 0,3 M; pH = 7,6; 4 × 10-3M v Mg2+): rozpusťte 11,2 g triethanolamin hydrochloridu (C2H5)3N · HCl) a 0,2 g MgSO4 · 7H2O ve 150 ml redestilované vody, přidejte asi 4 ml roztoku 5 M hydroxidu sodného (NaOH), abyste získali hodnotu pH = 7,6, a doplňte na 200 ml.

Tento tlumivý roztok se uchovává po 4 týdny při + 4 °C.

4.2. Roztok 2: roztok nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (přibližně 11,5 × 10-3 M): rozpusťte 50 mg nikotinamidadenindinukleotidfosfátu sodného v 5 ml redestilované vody.

Tento roztok se uchovává po 4 týdny při + 4 °C.

4.3. Roztok 3: roztok adenosin-5′-trifosfátu (asi 81 × 10-3 M): rozpusťte 250 mg adenosin-5′-trifosfátu sodného a 250 mg hydrogenuhličitanu sodného NaHCO3 v 5 ml redestilované vody.

Tento roztok se uchovává po 4 týdny při + 4 °C.

4.4. Roztok 4: Hexokináza/glukóza-6-fosfátdehydrogenáza: smíchejte 0,5 ml hexokinázy (2 mg proteinu/ml, tj. 280 U/ml) a 0,5 ml glukózy-6-fosfátdehydrogenázy (1 mg proteinu na ml).

Tento roztok se uchovává po dobu jednoho roku při + 4 °C.

4.5. Roztok 5: Fosfoglukoizomeráza (2 mg proteinu na ml, tj. 700 U/ml). Suspenze se používá neředěná.

Tento roztok se uchovává po dobu jednoho roku při + 4 °C.

Poznámka:

Všechna výše uvedená činidla jsou k dostání v obchodní síti.

5. POSTUP

5.1. Příprava vzorku

V závislosti na odhadovaném množství glukózy a fruktózy na litr nařeďte vzorek takto:

Měření při 340 a 334 nm Měření při 365 nm Zředění vodou Faktor zředění F do 0,4 g/l do 0,8 g/l — — do 4,0 g/l do 8,0 g/l 1 + 9 10 do 10,0 g/l do 20,0 g/l 1 + 24 25 do 20,0 g/l do 40,0 g/l 1 + 49 50 do 40,0 g/l do 80,0 g/l 1 + 99 100 nad 40,0 g/l nad 80,0 g/l 1 + 999 1 000

5.2. Stanovení

Spektrofotometrem nastaveným na vlnovou délku 340 nm proveďte měření pomocí vzduchu (bez kyvety v optické dráze) nebo vody jako reference.

Teplota 20 až 25 °C.

Do dvou kyvet s optickými dráhami o délce 1 cm vložte:

Referenční kyveta Kyveta se vzorkem Roztok 1 (4.1) (při 20 °C) 2,50 ml 2,50 ml Roztok 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Roztok 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Měřený vzorek 0,20 ml Redestilovaná voda 0,20 ml

Zamíchejte a asi po 3 minutách odečtěte absorbanci roztoků (A1). Spusťte reakci přidáním:

Roztok 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Zamíchejte, počkejte 15 minut, proveďte měření absorbance a po dalších dvou minutách zkontrolujte, zda se reakce zastavila (A2).

Ihned přidejte:

Roztok 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Zamíchejte, po 10 minutách odečtěte, po dalších dvou minutách zkontrolujte, zda se reakce zastavila (A3).

Vypočítejte rozdíly absorbancí pro referenční roztok a vzorek:

A2 – A1 odpovídající glukóze,

A3 – A2 odpovídající fruktóze.

Vypočítejte rozdíl absorbance referenčního roztoku (ΔAR) a měřeného vzorku (ΔAS) a určete:

pro glukózu: ΔAG = ΔAS – ΔAR

pro fruktózu: ΔAF = ΔAS – ΔAR

Poznámka:

Doba potřebná k dokončení enzymové aktivity se může měnit od dávky k dávce. Výše uvedená hodnota je pouze pro informaci. Doporučuje se stanovit ji pro každou dávku.

5.3. Vyjádření výsledků

5.3.1. Výpočet

Obecný vzorec pro výpočet koncentrací je následující:

C= ((V × MW)/(ε × d × v × 1 000)) × ΔA (g/l)

V= celkový objem (ml)

v= objem vzorku (ml)

MW= molekulová hmotnost stanovované látky

d= délka optické dráhy kyvety (cm)

ε= absorpční koeficient NADPH při 340 nm = 6,3 (mmol–1 × l × cm–1)

V= 2,92 ml pro stanovení glukózy

V= 2,94 ml pro stanovení fruktózy

v= 0,20 ml

MW= 180

d= 1.

Výsledek:

pro glukózu: C (g/l) = 0,417 × ΔAG

pro fruktózu: C (g/l) = 0,420 × ΔAF

Pokud byl během přípravy vzorek zředěn, vynásobte výsledek faktorem F.

Poznámka:

Jestliže byla měření provedena při vlnových délkách 334 nebo 365 nm, pak budou získány následující výrazy:

— měření při 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1) pro glukózu: C (g/l) = 0,425 × ΔAG pro fruktózu: C (g/l) = 0,428 × ΔAF

— měření při 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1) pro glukózu: C (g/l) = 0,773 × ΔAG pro fruktózu: C (g/l) = 0,778 × ΔAF

5.3.2. Opakovatelnost (r)

r= 0,056 xi

5.3.3. Reprodukovatelnost (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= koncentrace glukózy nebo fruktózy v g/l.

7 STANOVENÍ CUKRŮ METODOU HPLC (SACHARÓZA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) – METODA TYP II

(p.m.)

[Popis této metody rozboru je předmětem aktualizace orgány OIV. Bude zveřejněn v příštím sdělení Komise, jakmile OIV zveřejní aktualizované znění ve vydání Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty na rok 2010. Orientačně lze do uvedeného zveřejnění vycházet z kapitoly 6 bodu 3 přílohy nařízení Komise (EHS) č. 2676/90.]

8 ZJIŠŤOVÁNÍ OBOHACENÍ HROZNOVÝCH MOŠTŮ, ZAHUŠTĚNÝCH HROZNOVÝCH MOŠTŮ, REKTIFIKOVANÝCH MOŠTOVÝCH KONCENTRÁTŮ A VÍN MĚŘENÍM NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÉ REZONANCE DEUTÉRIA (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – METODA TYP I

(p.m.)

[Popis této metody rozboru je předmětem přezkoušení vědeckými orgány OIV. Bude zveřejněn ve sdělení Komise, jakmile Valné shromáždění OIV přijme definitivní znění. Orientačně lze do uvedeného zveřejnění vycházet z kapitoly 8 přílohy nařízení Komise (EHS) č. 2676/90.]

9 OBJEMOVÝ OBSAH ALKOHOLU (OIV-AS-312-01-TALVOL) – METODA TYP I

(p.m.)

[Popis těchto metod rozboru je předmětem aktualizace orgány OIV. Bude zveřejněn v příštím sdělení Komise, jakmile OIV zveřejní aktualizované znění ve vydání Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty na rok 2010. Orientačně lze do uvedeného zveřejnění vycházet z kapitoly 3 přílohy nařízení Komise (EHS) č. 2676/90.]

10 STANOVENÍ IZOTOPOVÉHO POMĚRU 13C/12C V ETHANOLU VE VÍNĚ NEBO ETHANOLU ZÍSKANÉM ZKVAŠENÍM MOŠTŮ, ZAHUŠTĚNÝCH HROZNOVÝCH MOŠTŮ NEBO REKTIFIKOVANÝCH MOŠTOVÝCH KONCENTRÁTŮ IZOTOPOVOU HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ (OIV-AS-312-06-ETHANO) – METODA TYP II

1. OBLAST POUŽITÍ

Metoda umožňuje měření poměru izotopů 13C/12C v ethanolu ve víně a ethanolu získaném kvašením vinařských produktů (moštů, zahuštěných hroznových moštů, rektifikovaných moštových koncentrátů).

2. REFERENČNÍ NORMY

ISO: 5725:1994 „Přesnost (správnost a preciznost) zkušebních metod a výsledků – Stanovení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti normalizované zkušební metody mezilaboratorními stanoveními“. V-PDB: Vídeňský belemnit Pee-Dee (RPDB = 0,0112372). Metoda OIV AS-311-O5-ENRRMN „Zjišťování obohacení hroznových moštů, zahuštěných hroznových moštů, rektifikovaných moštových koncentrátů a vín měřením nukleární magnetické rezonance deuteria (SNIF-NMR)“.

3. TERMÍNY A DEFINICE

13C/12C : Poměr izotopů uhlíku 13 (13C) k uhlíku 12 (12C) v daném vzorku. δ13 C : Obsah uhlíku 13 (13C) vyjádřený v promile (‰). SNIF-NMR : Stanovení podílů jednotlivého přirozeného izotopu nukleární magnetickou rezonancí. V-PDB : Vídeňský belemnit Pee-Dee. PDB je primární referenční materiál pro měření přirozených změn obsahu izotopu uhlíku 13, sestávající z uhličitanu vápenatého z lomu na křídový belemnit z útvaru Pee Dee v Jižní Karolině (USA). Jeho poměr izotopů 13C/12C, neboli RPDB, je 0,0112372. Zásoby PDB jsou už dlouho vyčerpány, ale zůstal primárním referenčním materiálem pro vyjádření přirozených změn obsahu izotopu 13C, na který je kalibrován referenční materiál, dostupný u Mezinárodní agentury pro atomovou energii (MAAE) ve Vídni (Rakousko). Izotopové údaje pro přirozeně se vyskytující uhlík 13 se dohodou vyjadřují v poměru k V-PDB. m/z : Poměr hmotnosti k náboji.

4. PRINCIP

Při fotosyntéze probíhá asimilace oxidu uhličitého rostlinami dvěma základními formami metabolismu, metabolismem C3 (Calvinovým cyklem) a metabolismem C4 (podle Hatche a Slacka). Tyto dva mechanismy fotosyntézy představují odlišný typ frakcionace izotopů. Produkty rostlin C4, jako jsou cukry a alkohol získaný kvašením, mají vyšší podíl uhlíku C než podobné produkty rostlin C3. Většina rostlin, včetně révy vinné a řepy cukrovky, náleží ke skupině C3. Cukrová třtina a kukuřice náležejí do skupiny C4. Měření obsahu uhlíku 13 umožňuje detekci a vyhodnocení cukrů původem z C4 (z cukrové třtiny nebo isoglukosy z kukuřice), přidaných do produktů pocházejících z hroznů (hroznového moštu, vína atd.). Informace o obsahu uhlíku 13 ve spojení s obsahem získaným ze SNIF-NMR umožňuje stanovit přidaná množství směsí cukrů či alkoholů odvozených z rostlin C3 a C4.

Obsah uhlíku 13 se stanoví v oxidu uhličitém získaném dokonalým spálením vzorku. Relativní zastoupení hlavních izotopomerů s molekulovými hmotnostmi 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 a 12C17O16O) a 46 (12C16O18O), které vznikají z různých možných kombinací izotopů 18O, 17O, 16O, 13C a 12C, se stanoví z iontových proudů, měřených na třech různých kolektorech izotopového hmotnostního spektrometru. Příspěvek izotopomerů 13C17O16O a 12C17O2 může být zanedbán vzhledem k jejich velmi nízkému výskytu. Iontový proud pro m/z = 45 se koriguje na příspěvek 12C17O16O, který se vypočte podle proudové intenzity, naměřené pro m/z = 46, přičemž se vezme v úvahu relativní zastoupení 18O a 17O (Craigova korekce). Porovnání s referenčním vzorkem kalibrovaným na mezinárodní referenční materiál V-PDB umožňuje výpočet obsahu uhlíku 13 v relativní stupnici δ13C.

5. ČINIDLA

Materiál a spotřební materiál závisí na přístroji (bod 6), který laboratoř používá. Obecně používaný systém je založen na přístrojích na elementární analýzu. Tyto systémy mohou být vybaveny tak, aby umožňovaly vnášení vzorků uložených v uzavřených kovových kapslích nebo vstřikování kapalných vzorků přes septum pomocí injekční stříkačky.

Podle druhu používaného přístroje mohou být používány tyto referenční materiály, činidla a spotřební materiály:

— referenční materiály

— dostupné z MAAE: Název Materiál δ13C v poměru k V-PDB (9) — IAEA-CH-6 sacharóza –10,4 ‰ — IAEA-CH-7 polyethylen –31,8 ‰ — NBS22 olej –29,7 ‰ — USGS24 grafit –16,1 ‰

— dostupné z Ústavu pro referenční materiály a měření (IRMM) v Geelu (Belgie): Název Materiál δ13C vzhledem k V-PDB (9) — CRM/BCR 656 vinný alkohol –26,93 ‰ — CRM/BCR 657 glukóza –10,75 ‰ — CRM/BCR 660 vodný roztok alkoholu (12 % obj.) –26,72 ‰

— standardní pracovní vzorek o známém poměru 13C/12C, kalibrovaný na mezinárodní referenční standard,

— toto je informativní seznam spotřebních materiálů pro systémy s kontinuálním průtokem: — hélium pro analýzu (CAS 07440-59-7), — kyslík pro analýzu (CAS 07782-44-7), — oxid uhličitý pro analýzu, používaný jako sekundární referenční plyn pro obsah uhlíku 13 (CAS 00124-38-9), — oxidační činidlo pro pec spalovacího systému, například oxid měďnatý (ΙΙ) pro elementární analýzu (CAS 1317-38-0), — desikant pro odstranění vody vznikající spalováním, například anhydron pro elementární analýzu (chloristan hořečnatý) (CAS 10034-81-8) (není nezbytný pro přístroje vybavené zařízením pro odstraňování vody, např. vymrazovací odlučovače nebo selektivně propustné kapiláry).

6. PŘÍSTROJE A ZAŘÍZENÍ

6.1. Hmotnostní spektrometr izotopových poměrů (IRMS)

Hmotnostní spektrometr izotopových poměrů (IRMS), schopný stanovit relativní obsah 13C v přirozeně se vyskytujícím plynném CO2 s vnitřní přesností 0,05 ‰ nebo lepší, vyjádřený jako poměrná hodnota (bod 9). Vnitřní přesnost je tu definována jako rozdíl dvou měření téhož vzorku CO2. Hmotnostní spektrometr izotopových poměrů je obecně vybaven trojitým kolektorem pro souběžné měření intenzit pro m/z = 44, 45 a 46. Hmotnostní spektrometr izotopových poměrů musí být vybaven buď dvojím vstupem pro střídavé měření neznámého vzorku a referenčního vzorku, nebo používat integrovaný systém, který provádí kvantitativní spalování vzorků a odděluje oxid uhličitý od ostatních produktů spalování před měřením na hmotnostním spektrometru.

6.2. Spalovací přístroj

Spalovací přístroj schopný kvantitativně přeměnit ethanol na oxid uhličitý a eliminovat všechny ostatní produkty spalování, včetně vody, bez jakékoli frakcionace izotopů. Tento přístroj může být buď systém s nepřetržitým průtokem spojený s hmotnostním spektrometrem (bod 6.2.1), nebo samostatný spalovací systém (bod 6.2.2). Přístroj musí umožňovat přesnost nejméně takovou, jaká je uvedena v bodu 11.

6.2.1. Systémy s nepřetržitým průtokem

Jedná se buď o přístroj na elementární analýzu nebo o plynový chromatograf s napojeným spalovacím systémem.

Pro systémy, vybavené pro vnášení vzorků v kovových kapslích je potřebné toto laboratorní zařízení:

— kalibrovaná mikrostříkačka nebo mikropipeta s vhodnými hroty (jehlami),

— váha s přesností na 1 μg nebo vyšší,

— kleště pro uzavírání vzorků v kapslích,

— cínové kapsle pro kapalné vzorky,

— cínové kapsle pro pevné vzorky.

Poznámka:

Pro snížení rizika odpaření ethanolových vzorků může být do kapslí vložen absorpční materiál (například Chromosorb W 45-60 mesh). Je však třeba nejdříve ověřit měřením slepého vzorku, zda neobsahuje významné množství uhlíku, které by mohlo ovlivnit výsledek.

Používá-li se přístroj na elementární analýzu vybavený vstřikovacím zařízením na kapaliny, nebo v případě přípravného systému pro spalovací chromatografii, je potřebné toto laboratorní vybavení:

— injekční stříkačka na kapaliny,

— baňky opatřené vzduchotěsným uzávěrem a inertní přepážkou.

Laboratorní vybavení ve výše uvedených seznamech slouží jako příklad a může být nahrazeno jiným vybavením rovnocenných užitkových vlastností podle druhu spalovacího zařízení a hmotnostního spektrometru, které laboratoř používá.

6.2.2. Samostatný přípravný systém

Vzorky oxidu uhličitého vzniklé spálením vzorků, které mají být analyzovány, a referenční vzorek se zachytí do baněk, které se pak umístí do dvojitého vstupu spektrometru k izotopovému rozboru. Může se používat několik spalovacích přístrojů popsaných v literatuře:

— uzavřený spalovací systém naplněný cirkulujícím kyslíkem,

— přístroj na elementární analýzu s proudem hélia a kyslíku,

— těsně uzavřená (zatavená) skleněná baňka naplněná oxidem měďnatým (II) jako oxidačním činidlem.

7. PŘÍPRAVA VZORKŮ KE STANOVENÍ

Před izotopovým rozborem analýzou musí být z vína získán ethanol. To se provádí destilací vína, popsanou v bodu 3.1 metody SNIF-NMR (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

V případě hroznového moštu, zahuštěného hroznového moštu a rektifikovaného moštového koncentrátu musí být cukry nejdříve zkvašeny na ethanol podle bodu 3.2 metody SNIF-NMR (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8. POSTUP

Všechny kroky přípravy musí být provedeny bez jakékoli významné ztráty ethanolu odpařením, která by mohla způsobit změnu izotopového složení vzorku.

Následující popis se týká postupů, které se obecně používají pro spalování ethanolových vzorků pomocí komerčních automatických spalovacích systémů. Pro přípravu oxidu uhličitého pro izotopový rozbor mohou být používány i všechny ostatní metody, které zajišťují, že se veškerý vzorek ethanolu přemění na oxid uhličitý beze ztrát ethanolu odpařováním.

Experimentální postup, založený na použití přístroje pro elementární analýzu:

a) uložení vzorků do kapslí: — použijte kapsle, kleště a přípravnou misku, vše musí být čisté, — vezměte kleštěmi kapsli vhodné velikosti, — vneste mikropipetou do kapsle patřičné množství kapaliny, — Poznámka: Pro získání 2 mg uhlíku je nutné množství 3,84 mg absolutního ethanolu nebo 4,17 mg destilátu s obsahem alkoholu 92 % m/m. Patřičné množství destilátu musí být vypočteno na tomto základě podle množství uhlíku, které je nutné s ohledem na citlivost hmotnostního pektrometru. — kapsli zavřete kleštěmi, — každá kapsle musí být dokonale těsně uzavřena. Pokud není, musí být vyřazena a připravena nová , — pro každý vzorek musí být připraveny dvě kapsle, — vložte kapsle na patřičné místo na misce automatického dávkovače vzorků přístroje na elementární analýzu. Každá kapsle musí být jednoznačně identifikována pořadovým číslem, — na začátek a na konec série vzorků systematicky vkládejte kapsle obsahující pracovní referenční vzorky, — do řady vzorků pravidelně vkládejte kontrolní vzorky.

b) kontrola a seřízení přístroje na elementární analýzu a hmotnostní spektrometrii: — seřiďte teplotu pecí přístroje na elementární analýzu a průtoky hélia a kyslíku pro optimální spálení vzorku, — zkontrolujte systém elementární analýzy a hmotnostní spektrometrie na netěsnosti (například kontrolou iontového proudu, kde m/z = 28 pro N2), — seřiďte hmotnostní spektrometr pro měření intenzity iontových proudů, kde m/z = 44, 45 a 46, — před vlastním měřením vzorků zkontrolujte systém pomocí známých kontrolních vzorků.

c) provádění řady měření: Vzorky uložené na automatickém dávkovači vzorků přístroje na elementární analýzu (nebo chromatografu) jsou vkládány postupně. Oxid uhličitý ze spálení každého vzorku se vymývá do hmotnostního spektrometru, který měří iontové proudy. Počítač připojený k zařízení zaznamenává intenzitu iontových proudů a vypočítává hodnotu δ pro každý vzorek (bod 9).

9. VÝPOČET

Cílem této metody je změřit poměr izotopů 13C/12C ethanolu získaného z vína nebo z produktů získaných z hroznů kvašením. Poměr izotopů 13C/12C lze vyjádřit jeho odchylkou od pracovního referenčního vzorku. Potom se vypočítá izotopická odchylka uhlíku 13 (δ13C) na stupnici delta v promile (δ/1 000) porovnáním výsledků měřeného vzorku s výsledky pracovního referenčního vzorku, předem kalibrovaného na základě primárního mezinárodního standardu (V-PDB). Hodnoty δ13C se vyjádří v poměru k pracovnímu referenčnímu vzorku takto:

δ13Cech/ref ‰ = 1 000 × (Rech-Rref)/Rref

kde Rech a Rref jsou příslušné poměry izotopů 13C/12C ve vzorku a v oxidu uhličitém, použitém jako referenční plyn.

Hodnoty δ 13C se ve vztahu k V-PDB vyjadřují takto:

δ13Cech/V-PDB ‰ = δ13Cech/ref + δ13Cref/V-PDB + (δ13Cech/ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000,

kde δ13Cref/V-PDB je předem stanovená izotopická odchylka pracovního referenčního vzorku od V-PDB.

Při měření mohou vzniknout malé odchylky, způsobené změnami podmínek přístrojového vybavení. V tomto případě musí být hodnoty δ13C vzorků opraveny podle rozdílu mezi hodnotou δ13C naměřenou pro referenční pracovní vzorek a jeho skutečnou hodnotou předem zkalibrovanou na V-PDB porovnáním s jedním z mezinárodních referenčních materiálů. Může se předpokládat, že mezi dvěma měřeními referenčního pracovního vzorku bude změna a tudíž i oprava, kterou je nutno použít na výsledky získané od vzorků, lineární. Referenční pracovní vzorek musí být měřen vždy na začátku a konci každé série vzorků. Opravu lze potom pro každý vzorek vypočítat lineární interpolací.

10. ZABEZPEČOVÁNÍ KVALITY A KONTROLA

Zkontrolujte, zda se hodnota 13C pro pracovní referenční vzorek neliší od přípustné hodnoty o více než 0,5 ‰. Jestliže se liší, je třeba zkontrolovat nastavení spektrometru, a případně je seřídit.

Pro každý vzorek zkontrolujte, že rozdíl výsledku dvou kapslí měřených po sobě je menší než 0,3 ‰. Konečný výsledek pro určitý vzorek je průměrná hodnota z obou kapslí. Je-li odchylka větší než 0,3 ‰, měření se musí opakovat.

Kontrola správné funkce měření může být založena na intenzitě iontového proudu, kde m/z = 44, který je přímo úměrný množství uhlíku vstříknutého do přístroje na elementární analýzu. Za normalizovaných podmínek má být intenzita iontového proudu pro analyzované vzorky téměř konstantní. Významná odchylka může ukazovat na odpaření ethanolu (například kvůli nedokonalému utěsnění kapsle) nebo nestabilitu přístroje na elementární analýzu či hmotnostního spektrometru.

11. PRACOVNÍ CHARAKTERISTIKY METODY (PŘESNOST)

První kolaborativní studie (bod 11.1) byla realizována na destilátech obsahujících alkohol vinného původu a alkohol z cukrové třtiny a řepy, jakož i různé směsi alkoholů z těchto tří zdrojů. Protože tato studie nebrala v úvahu proces destilace, byly dále zváženy informace pocházející z jiných mezilaboratorních studií vína (bod 11.2) a především byly vzaty v úvahu také testy způsobilosti pro izotopová měření. Výsledky ukazují, že různé systémy destilace, použité ve vyhovujících podmínkách, a především ty, které jsou použitelné pro měření SNIF-NMR, nepřinášejí významné odchylky δ13C v ethanolu ve víně. Parametry správnosti (preciznosti) sledované u vína jsou téměř totožné s parametry získanými v kolaborativní studii (bod 11.1) na destilátech.

11.1. Kolaborativní studie provedená na destilátech

Rok mezilaboratorních zkoušek: 1996 Počet laboratoří: 20 Počet vzorků: 6 vzorků dvakrát ve slepém porovnání Analyt: δ13C v ethanolu





Kód vzorků Alkohol vinného původu Alkohol z řepy Alkohol ze třtiny A & G 80 % 10 % 10 % B & C 90 % 10 % 0 % D & F 0 % 100 % 0 % E & I 90 % 0 % 10 % H & K 100 % 0 % 0 % J & L 0 % 0 % 100 %





Vzorky A/G B/C D/F E/I H/K J/l Počet laboratoří po vyloučení odchylných výsledků 19 18 17 19 19 19 Počet zahrnutých výsledků 38 36 34 38 38 38 Střední hodnota (δ13C) ‰ –25,32 –26,75 –27,79 –25,26 –26,63 –12,54 Sr 2 0,0064 0,0077 0,0031 0,0127 0,0069 0,0041 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) ‰ 0,08 0,09 0,06 0,11 0,08 0,06 Mez opakovatelnosti r (2,8 × Sr) ‰ 0,22 0,25 0,16 0,32 0,23 0,18 SR 2 0,0389 0,0309 0,0382 0,0459 0,0316 0,0584 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) ‰ 0,20 0,18 0,20 0,21 0,18 0,24 Mez reprodukovatelnosti R (2,8 × SR) ‰ 0,55 0,49 0,55 0,60 0,50 0,68

11.2. Mezilaboratorní studie provedená na dvou vínech a jednom alkoholu

Rok mezilaboratorních zkoušek: 1996 Počet laboratoří: 14 pro destilaci vín, z nich 7 také pro měření δ 13C ethanolu ve víně, 8 pro měření δ13C ve vzorku alkoholu Počet vzorků: 3 (bílé víno o obsahu alkoholu 9,3 % obj., bílé víno o obsahu alkoholu 9,6 % obj. a alkohol v koncentraci 93 % hmotnostních) Analyt: δ13C z ethanolu





Vzorky Červené víno Bílé víno Alkohol Počet laboratoří 7 7 8 Počet zahrnutých výsledků 7 7 8 Střední hodnota (δ13C) ‰ –26,20 –26,20 –25,08 Druhá mocnina směrodatné odchylky reprodukovatelnosti SR 2 0,0525 0,0740 0,0962 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) ‰ 0,23 0,27 0,31 Mez reprodukovatelnosti R (2,8 × SR) ‰ 0,64 0,76 0,87

Zúčastněné laboratoře použily různé systémy destilace. Izotopová stanovení δ13C provedená v jediné laboratoři na všech destilátech vrácených účastníky nevykazují žádnou abnormální hodnotu, ani hodnotu významně odchylnou od středních hodnot. Odchylka výsledků (S2 = 0,0059) je srovnatelná s druhou mocninou směrodatné odchylky opakovatelnosti Sr 2 z kolaborativní studie na destilátech (bod 11.1).

11.3. Výsledky testování způsobilosti pro izotopové rozbory

Od prosince 1994 se pravidelně organizuje mezinárodní testování způsobilosti pro stanovení izotopů ve vínech a alkoholech (destiláty s obsahem alkoholu 96 % obj.). Výsledky umožňují zúčastněným laboratořím kontrolovat kvalitu jejich analýz. Statistické využití výsledků umožňuje posoudit odchylky měření v podmínkách reprodukovatelnosti, a tedy odhadnout parametry odchylky a mez reprodukovatelnosti. Výsledky získané při stanovení δ13C pro ethanol z vína a destilátů jsou shrnuty v následující tabulce:

Datum Vína Destiláty N SR SR 2 R N SR SR 2 R Prosinec 1994 6 0,210 0,044 0,59 6 0,151 0,023 0,42 Červen 1995 8 0,133 0,018 0,37 8 0,147 0,021 0,41 Prosinec 1995 7 0,075 0,006 0,21 8 0,115 0,013 0,32 Březen 1996 9 0,249 0,062 0,70 11 0,278 0,077 0,78 Červen 1996 8 0,127 0,016 0,36 8 0,189 0,036 0,53 Září 1996 10 0,147 0,022 0,41 11 0,224 0,050 0,63 Prosinec 1996 10 0,330 0,109 0,92 9 0,057 0,003 0,16 Březen 1997 10 0,069 0,005 0,19 8 0,059 0,003 0,16 Červen 1997 11 0,280 0,079 0,78 11 0,175 0,031 0,49 Září 1997 12 0,237 0,056 0,66 11 0,203 0,041 0,57 Prosinec 1997 11 0,127 0,016 0,36 12 0,156 0,024 0,44 Březen 1998 12 0,285 0,081 0,80 13 0,245 0,060 0,69 Červen 1998 12 0,182 0,033 0,51 12 0,263 0,069 0,74 Září 1998 11 0,264 0,070 0,74 12 0,327 0,107 0,91 Vážený průměr 0,215 0,046 0,60 0,209 0,044 0,59 N : počet zúčastněných laboratoří.

11.4. Meze opakovatelnosti a reprodukovatelnosti

Údaje různých mezilaboratorních zkoušek uvedené v předchozích tabulkách tedy umožňují pro tuto metodu stanovit následující meze opakovatelnosti a reprodukovatelnosti včetně fáze destilace:

Mez opakovatelnosti r: 0,24

Mez reprodukovatelnosti R: 0,6.

11 CELKOVÝ OBSAH KYSELIN (OIV - AS-313-01-ACITOT) – METODA TYP I

1. DEFINICE

Celkový obsah kyselin je součet titrovatelných kyselin, titrovaných do pH 7 odměrným alkalickým roztokem.

V celkovém obsahu kyselin není zahrnut oxid uhličitý.

2. PRINCIP METODY

Potenciometrická titrace nebo titrace za přítomnosti bromthymolové modři jako indikátoru konce reakce porovnáním s barevným standardem koncového bodu.

3. ČINIDLA

3.1. Tlumivý roztok pH 7,0:

Dihydrogenfosforečnan draselný KH2PO4: 107,3 g

Roztok 500 ml 1 M hydroxidu sodného (NaOH)

Voda do 1 000 ml.

Rovněž mohou být použity tlumivé roztoky běžné v obchodní síti.

3.2. Roztok 0,1 M hydroxidu sodného (NaOH):

3.3. Roztok bromthymolové modři 4 g/l.

Bromthymolová modř (C27H28Br2O5S) … 4 g Neutrální alkohol 96 % obj … 200 ml Po rozpuštění přidejte: Vodu bez CO2 … 200 ml Roztok 1 M hydroxidu sodného až do vzniku modrozeleného zbarvení (pH 7) … cca 7,5 ml Voda do … 1 000 ml

4. VYBAVENÍ

4.1. Vodní vývěva.

4.2. Odsávací baňka o objemu 500 ml.

4.3. Potenciometr se stupnicí se stupnicí v pH hodnotách a elektrody. Skleněná elektroda musí být uchovávána v destilované vodě. Kalomelová elektroda s nasyceným chloridem draselným musí být uchovávána v nasyceném roztoku chloridu draselného. Nejčastěji se používá kombinovaná elektroda; je třeba ji uchovávat v destilované vodě.

4.4. Odměrné válce o objemu 50 ml (v případě vína) a 100 ml (v případě rektifikovaného moštového koncentrátu).

5. POSTUP

5.1. Příprava vzorku

5.1.1. Vína

Odstranění oxidu uhličitého. Nalijte asi 50 ml vína do odsávací baňky a vodní vývěvou udržujte v baňce za neustálého protřepávání vakuum. Protřepávání musí trvat 1 až 2 minuty.

5.1.2. Rektifikované moštové koncentráty

Nalijte 200 g přesně zváženého rektifikovaného moštového koncentrátu do odměrné baňky o objemu 500 ml. Dolijte vodou po rysku. Zamíchejte.

5.2. Potenciometrická titrace

5.2.1. Kalibrace pH-metru

Podle pokynů výrobce se pH-metr nyní kalibruje pro použití při 20 °C tlumivým roztokem pH 7,00 při 20 °C.

5.2.2. Metoda měření

Do odměrného válce (4.4) dejte vzorek připravený podle popisu v 5.1 o objemu 10 ml v případě vína a 50 ml v případě rektifikovaného moštového koncentrátu. Přidejte asi 10 ml destilované vody a pak přidávejte z byrety 0,1M roztok hydroxidu sodného, dokud se pH při 20 °C nerovná 7. Hydroxid sodný se musí přidávat pomalu a roztok se musí neustále míchat. Nechť n je objem přidaného 0,1 M NaOH v ml.

5.3. Titrace na indikátor (bromthymolová modř)

5.3.1. Předběžná zkouška: stanovení barvy koncového bodu

Do odměrného válce (bod 4.4) dejte 25 ml převařené destilované vody, 1 ml roztoku bromthymolové modři (bod 3.3) a vzorek připravený podle pokynů v bodu 5.1 o objemu 10 ml v případě vína a 50 ml v případě rektifikovaného moštového koncentrátu. Přidávejte 0,1M roztok hydroxidu sodného (3.2), dokud se barva nezmění na modrozelenou. Pak přidejte 5 ml tlumivého roztoku pH 7 (3.7).

5.3.2. Stanovení

Do odměrného válce (bod 4.4) dejte 30 ml převařené destilované vody, 1 ml roztoku bromthymolové modři (bod 3.3) a vzorek připravený podle pokynů v bodu 5.1 o objemu 10 ml v případě vína a 50 ml v případě rektifikovaného moštového koncentrátu. Přidávejte 0,1M roztok hydroxidu sodného (3.2), dokud není dosaženo stejné barvy jako v předběžné zkoušce (5.3.1). Nechť n je objem přidaného 0,1M hydroxidu sodného v ml.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1. Metoda výpočtu

6.1.1. Vína

Celkový obsah kyselin vyjádřený v miliekvivalentech na litr je dán vztahem:

A = 10 n

Zaznamenává se na jedno desetinné místo.

Celkový obsah kyselin vyjádřený v gramech kyseliny vinné na litr je dán vztahem:

A′ = 0,075 ×A

Zaznamenává se na jedno desetinné místo.

6.1.2. Rektifikované moštové koncentráty

— Celkový obsah kyselin vyjádřený v miliekvivalentech na kilogram rektifikovaného moštového koncentrátu je dán vztahem: a = 5 × n

— Celkový obsah kyselin vyjádřený v miliekvivalentech na kilogram celkových cukrů je dán vztahem: — A = (500 × n)/P — P = celkový obsah cukrů v % (hmotnostních)

Zaznamenává se na jedno desetinné místo.

6.2. Opakovatelnost (r) pro titracií s indikátorem (5.3)

r = 0,9 meq/l r = 0,07 g kyseliny vinné/l

pro bílá, červená a růžová vína.

6.3. Reprodukovatelnost (R) pro titraci s indikátorem (5.3)

Pro bílá a růžová vína: R = 3,6 meq/l R = 0,3 g kyseliny vinné/l

pro červená vína: R = 5,1 meq/l R = 0,4 g kyseliny vinné/l

12 STANOVENÍ OBSAHU TĚKAVÝCH KYSELIN (OIV - AS-313-02-ACIVOL) – METODA TYP I

1. DEFINICE

Těkavé kyseliny jsou tvořeny přítomnými mastnými kyselinami, zejména kyselinou octovou, které se vyskytují ve víně volně nebo ve formě solí.

2. PRINCIP METODY

Titrace těkavých kyselin separovaných z vína destilací s vodní párou a rektifikací par.

Víno je předem zbaveno oxidu uhličitého.

Od obsahu těkavých kyselin je nutno odečíst obsah volné a vázané kyseliny siřičité destilované za těchto podmínek.

Obsah kyseliny sorbové případně přidávané do vína musí být rovněž odečten.

Poznámka:

V destilátu je částečně obsažena kyselina salicylová, používaná v některých zemích ke stabilizaci vín před analýzou. Je nezbytné ji stanovit a od obsahu kyselin odečíst. Metoda stanovení je uvedena v paragrafu 7 této kapitoly.

3. ČINIDLA

3.1. Krystalická kyselina vinná (C4H6O6)

3.2. Roztok 0,1M hydroxidu sodného (NaOH):

3.3. 1 % roztok fenolftaleinu v neutrálním 96 % obj. alkoholu

3.4. Kyselina chlorovodíková (ρ20 = 1,18 až 1,19 g/ml) zředěná 1:4 (objemově)

3.5. Roztok 0,005 M jódu (I2)

3.6. Krystalický jodid draselný (KI)

3.7. Roztok škrobu, 5 g/l:

Rozmíchejte 5 g škrobu v asi 500 ml vody. Za míchání přiveďte do varu a vařte po dobu 10 minut, pak přidejte 200 g chloridu sodného. Po ochlazení doplňte na litr.

3.8. Nasycený roztok tetraboritanu sodného (Na2B4O7. 10 H2O), tj. přibližně 55 g/l při 20 °C.

4. VYBAVENÍ

4.1. Aparatura na destilaci s vodní párou, která se skládá z:

1) generátoru vodní páry – vytvořená vodní pára musí být prostá oxidu uhličitého;

2) baňky s parní trubicí;

3) destilační kolony;

4) chladiče;

Toto zařízení musí projít třemi následujícími zkouškami:

a) Do baňky dejte 20 ml převařené vody; zachyťte 250 ml destilátu a přidejte k němu 0,1 ml 0,1 M roztoku hydroxidu sodného (bod 3.2) a dvě kapky roztoku fenolftaleinu (bod 3.3). Růžové zbarvení musí být stabilní alespoň po dobu 10 sekund (tj. vodní pára je bez oxidu uhličitého).

b) Do baňky dejte 20 ml 0,1 M roztoku kyseliny octové. Zachyťte 250 ml destilátu. Titrujte 0,1 M roztokem hydroxidu sodného (bod 3.2). Objem použitého roztoku musí být alespoň 19,9 ml. (tj. alespoň 99,5 % kyseliny octové zachycené v páře).

c) Do baňky dejte 20 ml 1 M roztoku kyseliny mléčné. Zachyťte 250 ml destilátu a kyselinu titrujte 0,1 M roztokem hydroxidu sodného (bod 3.2).

Objem použitého roztoku musí být menší nebo roven 1,0 ml (tj. destilovaná kyselina mléčná ≤ 0,5 %).

Jakékoli vybavení nebo postup, které vyhovuje těmto zkouškám, jsou uznány za úřední mezinárodní vybavení nebo úřední mezinárodní postup.

4.2. Vodní vývěva.

4.3. Odsávací baňka.

5. POSTUP

5.1. Příprava vzorku: odstranění oxidu uhličitého.

Do odsávací baňky dejte asi 50 ml vína. Vývěvou udržujte v baňce za neustálého protřepávání vakuum po dobu jedné nebo dvou minut.

5.2. Destilace s vodní párou.

Do baňky dejte 20 ml vína zbaveného oxidu uhličitého, jak je uvedeno v bodu 5.1. Přidejte asi 0,5 g kyseliny vinné (bod 3.1). Zachyťte alespoň 250 ml destilátu.

5.3. Titrace

Titrujte 0,1 M roztokem hydroxidu sodného (bod 3.2) se dvěma kapkami roztoku fenolftaleinu (3.3). Nechť n ml je použitý objem.

Přidejte čtyři kapky kyseliny chlorovodíkové zředěné 1:4 (3.4), 2 ml roztoku škrobu (bod 3.7) a několik krystalů jodidu draselného (bod 3.6). Titrujte volný oxid siřičitý 0,005 M roztokem jodu (bod 3.5). Nechť n' ml je použitý objem.

Přidávejte nasycený roztok tetraboritanu sodného (bod 3.8), dokud se znovu neobjeví růžové zbarvení. Titrujte vázaný oxid siřičitý 0,005 M roztokem jodu (bod 3.5). Nechť n" ml je použitý objem.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1. Metoda výpočtu

Obsah těkavých kyselin vyjádřený v miliekvivalentech na litr na 1 desetinné místo je dán vztahem:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

Obsah těkavých kyselin vyjádřený v gramech kyseliny octové na litr na 2 desetinná místa je dán vztahem:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

6.2. Opakovatelnost (r)

r = 0,7 meq/l r = 0,04 g kyseliny octové/l

6.3. Reprodukovatelnost (R)

R = 1,3 meq/l R = 0,08 g kyseliny octové/l

6.4. Víno s přídavkem kyseliny sorbové

Protože 96 % kyseliny sorbové se destiluje s vodní párou při objemu destilátu 250 ml, je nutné obsah kyseliny sorbové odečíst od obsahu těkavých kyselin s tím, že 100 mg kyseliny sorbové odpovídá obsahu kyselin 0,89 miliekvivalentů nebo 0,053 g kyseliny octové, přičemž obsah kyseliny sorbové v mg/l se stanoví jinými metodami.

7. STANOVENÍ KYSELINY SALICYLOVÉ V DESTILÁTU TĚKAVÝCH KYSELIN

7.1. Princip

Po stanovení obsahu těkavých kyselin a opravě s ohledem na oxid siřičitý je přítomnost kyseliny salicylové po okyselení indikována fialovým zbarvením, které se objeví po přidání železité soli (III).

Stanovení kyseliny salicylové v destilátu těkavých kyselin se provede na druhém destilátu stejného objemu jako má ten, na kterém bylo provedeno stanovení obsahu těkavých kyselin. V tomto destilátu se kyselina salicylová stanoví srovnávací kolorimetrickou metodou. Odečítá se od destilátu těkavých kyselin.

7.2. Činidla

7.2.1. Kyselina chlorovodíková (HCl) (ρ20 = 1,18 až 1,19 g/ml).

7.2.2. 0,1 M roztok thiosíranu sodného (Na2 S2 O3. 5 H2O).

7.2.3. 10 % roztok (hmotnost/objem) síranu železito-amonného [Fe2(SO4)3. (NH4)2SO4 · 24 H2O].

7.2.4. 0,01 M roztok salicylanu sodného. Roztok obsahuje 1,60 g/l salicylanu sodného (Na C7 H5 O3).

7.3. Postup

7.3.1. Zjištění kyseliny salicylové v destilátu těkavých kyselin.

Ihned po stanovení obsahu těkavých kyselin a opravě na volný a vázaný oxid siřičitý přidejte do Erlenmayerovy baňky 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 7.2.1), 3 ml 0,1 M roztoku thiosíranu sodného (bod 7.2.2) a 1 ml roztoku síranu železito-amonného (bod 7.2.3).

Je-li přítomna kyselina salicylová, objeví se fialové zabarvení.

7.3.2. Stanovení kyseliny salicylové

Na výše uvedené Erlenmayerově baňce označte referenční značkou objem destilátu. Baňku vyprázdněte a vypláchněte.

Nový zkušební vzorek 20 ml vína podrobte destilaci s vodní párou a zachycujte destilát v Erlenmayerově baňce až po referenční značku. Přidejte 0,3 ml čisté kyseliny chlorovodíkové (bod 7.2.1) a 1 ml roztoku síranu železito-amonného (bod 7.2.3). Obsah Erlenmayerovy baňky se zbarví do fialova.

Do stejné Erlenmayerovy baňky, jako je ta s referenční značkou, nalijte destilovanou vodu až do stejné úrovně, jako je úroveň destilátu. Přidejte 0,3 ml čisté kyseliny chlorovodíkové (bod 7.2.1), 1 ml roztoku síranu železito-amonného (bod 7.2.3). Z byrety přidávejte 0,01 M roztok salicylanu sodného (bod 7.2.4), až vznikne fialové zbarvení stejné intenzity jako je v Erlenmayerově baňce obsahující vinný destilát.

Nechť n′′′ je objem použitého roztoku v mililitrech.

7.4. Korekce obsahu těkavých kyselin

Odečtěte objem 0,1 ·n′′′ od objemu n ml 0,1 M roztoku hydroxidu sodného, použitého k titraci kyselin destilátu při stanovení obsahu těkavých kyselin.

13 KYSELINA CITRONOVÁ (OIV -AS-313-09-ACIENZ) – METODA TYP II

1. PRINCIP METODY

Kyselina citronová se v reakci katalyzované citrátlyázou (CL) převádí na oxalacetát a octan:

Citrát ←→ oxalacetát + octan

V přítomnosti malátdehydrogenázy (MDH) a laktátdehydrogenázy (LDH) se oxalacetát a jeho derivát dekarboxylace pyruvát redukují redukovaným nikotinamidadenindinukleotidem (NADH) na L-malát a L-laktát:

Oxalacetát + NADH + H+ ←→ L-malát + NAD+

Pyruvát + NADH + H+ ←→ L-laktát + NAD+

Množství NADH oxidovaného v těchto reakcích na NAD+ je úměrné množství přítomného citrátu. Oxidace NADH se měří poklesem jeho absorbance na vlnové délce 340 nm.

2. ČINIDLA

2.1. Tlumivý roztok pH 7,8

(0,51 M glycylglycin; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10- 3 M):

Rozpusťte 7,13 g glycylglycinu v přibližně 70 ml redestilované vody.

Upravte pH na 7,8 přibližně 13 ml 5 M roztoku hydroxidu sodného; přidejte 10 ml roztoku chloridu zinečnatého (ZnCl2, 80 mg ve 100 ml vody) a doplňte na 100 ml redestilovanou vodou.

Tento roztok zůstává stabilní při teplotě 4 °C alespoň po dobu čtyř týdnů.

2.2. Roztok redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu (NADH) (přibližně 6.10- 3 M): Rozpusťte 30 mg NADH a 60 mg NaHCO3 v 6 ml redestilované vody.

2.3. Roztok maládehydrogenázy/ laktátdehydrogenázy, (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml):

Smíchejte spolu 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml roztoku síranu amonného (3,2 M) a 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Tato suspenze zůstává stabilní při teplotě 4 °C alespoň po dobu jednoho roku.

2.4. Citrát-lyáza CL (5 mg proteinu/ml): Rozpusťte 168 mg lyofilizátu v 1 ml ledové vody. Tento roztok zůstává stabilní při teplotě 4 °C alespoň po dobu jednoho týdne a alespoň po dobu čtyř týdnů, je-li zmrazen.

Doporučuje se před stanovením zkontrolovat aktivitu enzymů.

2.5. Polyvinylpolypyrolidon (PVPP)

Poznámka: Veškerá činidla potřebná pro toto stanovení jsou k dostání v obchodní síti.

3. VYBAVENÍ

3.1. Spektrofotometr umožňující provádět měření při vlnové délce 340 nm, při které je absorpce NADH na maximální hodnotě.

Není-li to možné, lze použít spektrofotometr se zdrojem nespojitého spektra, umožňující provádět měření na vlnových délkách 334 nm nebo 365 nm. Protože se jedná o absolutní měření absorbance (tj. nepoužívají se kalibrační křivky, ale standardizace se provádí posouzením extinkčního koeficientu NADH), je nutné u přístroje zkontrolovat rozsahy vlnových délek a spektrální absorbanci.

3.2. Skleněné kyvety s délkou optické dráhy 1 cm nebo kyvety na jedno použití.

3.3. Mikropipety umožňující odebírat objemy od 0,02 do 2 ml.

4. PŘÍPRAVA VZORKU

Stanovení citrátu se obecně provádí přímo ve víně bez předchozího odbarvení a bez ředění, za podmínky, že obsah kyseliny citrónové je menší než 400 mg/l. Pokud ne, zřeďte víno tak, aby koncentrace citrátu byla mezi 20 a 400 mg/l (množství citrátu ve zkušebním vzorku je mezi 5 μg a 80 μg).

V případě červeného vína bohatého na fenolické sloučeniny se doporučuje víno předem ošetřit pomocí PVPP:

vytvořte suspenzi asi 0,2 g PVPP ve vodě a nechte stát 15 minut. Přefiltrujte přes skládaný filtr.

Do 10 ml vína nalitého do Erlenmayerovy baňky o objemu 50 ml přidejte vlhký PVPP odebraný stěrkou z filtru. Protřepávejte 2 až 3 minuty. Přefiltrujte.

5. POSTUP

Spektrofotometrem nastaveným na vlnovou délku 340 nm stanovte pomocí kyvet s délkou optické dráhy 1 cm absorbanci, přičemž použijte vzduch jako standard nulové absorbance (v optické trase není kyveta). Do kyvet o šířce 1 cm vložte:

Referenční kyveta Kyveta se vzorkem Roztok 2.1 1,00 ml 1,00 ml Roztok 2.2 0,10 ml 0,10 ml Vzorek — 0,20 ml Redestilovaná voda 2,00 ml 1,80 ml Roztok 2.3 0,02 ml 0,02 ml

Promíchejte a asi po 5 minutách odečtěte absorbanci roztoků v referenční kyvetě a kyvetě se vzorkem (A1).

Přidejte:

Roztok 2,4 0,02 ml 0,02 ml

Promíchejte, vyčkejte na konec reakce (asi 5 minut) a odečtěte absorbanci roztoků v referenční kyvetě a kyvetě se vzorkem (A2).

Vypočítejte rozdíl v absorbancích (A1-A2) pro referenční kyvetu a kyvetu se vzorkem, Δ AR a Δ AS.

Odvoďte rozdíl absorbancí pro referenční kyvetu od rozdílu absorbancí kyvety se vzorkem:

Δ A = ΔAS – ΔAR

Poznámka: Doba nezbytná pro činnost enzymů se může měnit od jedné dávky ke druhé. Výše uvedená hodnota je pouze orientační. Doporučuje se ji určit pro každou dávku.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Obsah kyseliny citrónové se uvádí v miligramech na litr (mg/l) se zaokrouhlením na nejbližší celé číslo.

6.1. Metoda výpočtu

Koncentrace v mg/l je dána obecným vzorcem:

C = ((V × MW)/(ε × d × v)) × Δ A

V = celkový objem v ml (zde 3,14 ml) v = objem testovaného vzorku v ml (zde 0,2 ml) PM = molekulová hmotnost stanovované látky (zde bezvodá kyselina citronová = 192,1) d = délka optické dráhy v kyvetě v cm (zde 1 cm) ε = absorpční koeficient NADH; při 340 nm, ε = 6,3 mmol– 1 × l × cm– 1.

Výsledek:

C = 479 × ΔA

Pokud byl během přípravy vzorek zředěn, vynásobte výsledek faktorem zředění.

Poznámka: při 334 nm: C = 488 × ΔA (ε = 6,2 mmol– 1 × l × cm– 1)

při 365 nm: C = 887 × ΔA (ε = 3,4 mmol– 1 × l × cm– 1)

6.2. Opakovatelnost (r)

Obsah kyseliny citronové menší než 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Obsah kyseliny citronové větší než 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3. Reprodukovatelnost (R)

Obsah kyseliny citronové menší než 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Obsah kyseliny citronové větší než 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14 KYSELINA SORBOVÁ (OIV - AS-313-14-ACISOR) – METODA TYP IV

1. PRINCIP METODY

1.1. Metoda stanovení absorpční spektrofotometrií v ultrafialové oblasti

Kyselina sorbová (kyselina trans, trans-2,4-hexadienová,) extrahovaná destilací s vodní párou je stanovena ve vinném destilátu UV absorpční spoektrofotometrií. Látky, které v UV oblasti interferují se odstraňují odpařováním do sucha pomocí lehce alkalizovaného roztoku hydroxidu vápenatého. Chromatografie na tenké vrstvě se používá na potvrzení hladin menších než 20 mg/l (citlivost: 1 mg/l).

1.2. Metoda stanovení plynovou chromatografií

Kyselina sorbová extrahovaná v ethyletheru se stanoví plynovou chromatografií pomocí vnitřního standardu.

1.3. Identifikace stop chromatografií na tenké vrstvě

Kyselina sorbová extrahovaná v ethyletheru se odděluje chromatografií na tenké vrstvě a její koncentrace je vyhodnocena semikvantitativně.

2. METODA STANOVENÍ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIÍ V ULTRAFIALOVÉ OBLASTI

2.1. Činidla

2.1.1. Krystalická kyselina vinná (C4H6O6).

2.1.2. Roztok hydroxidu vápenatého, Ca (OH)2 přibližně 0,02 M.

2.1.3. Referenční roztok kyseliny sorbové 20 mg na litr.

Rozpusťte 20 mg kyseliny sorbové C6H8O2 asi ve 2 ml roztoku 0,1 M hydroxidu sodného. Nalijte do odměrné baňky o objemu 1 000 ml, doplňte po rysku vodou. Lze také rozpustit 26,8 mg sorbanu draselného C6H7KO2 ve vodě a doplnit vodou na 1 000 ml.

2.2. Vybavení

2.2.1. Přístroj pro destilaci s vodní parou (viz „Obsah těkavých kyselin“).

2.2.2. Vodní lázeň při 100 °C.

2.2.3. Spektrofotometr umožňující měřit absorbance při vlnové délce 256 mm s křemennou kyvetou a optickou dráhou 1 cm.

2.3. Postup

2.3.1. Destilace

Do baňky aparatury na destilaci s vodní parou nalijte 10 ml vína, přidejte 1 až 2 g kyseliny vinné (2.1.1). Zachyťte 250 ml destilátu.

2.3.2. Kalibrační křivka

Zředěním referenčního roztoku vodou (bod 2.1.3) připravte čtyři zředěné referenční roztoky 0,5, 1,0, 2,5 a 5 mg kyseliny sorbové na litr. Změřte jejich absorbance spektrofotometrem při 256 nm pomocí destilované vody. Znázorněte závislost udávající hodnoty absorbance jako funkce koncentrace. Závislost je lineární.

2.3.3. Stanovení

Do odpařovací misky o průměru 55 mm nalijte 5 ml destilátu, přidejte 1 ml roztoku hydroxidu vápenatého (bod 2.1.2). Odpařujte do sucha v lázni s vroucí vodou.

Zbytek rozpusťte v několika ml destilované vody, převeďte kvantitativně do odměrné baňky o objemu 20 ml a doplňte po značku oplachovanou vodou. Změřte absorbanci při 256 nm pomocí spektrofotometru oproti slepému vzorku, který se skládá z roztoku získaného zředěním 1 ml roztoku hydroxidu vápenatého (2.1.2.) vodou na 20 ml.

Hodnotu změřené absorbance znázorněte na kalibrační křivce a odtud zjistěte obsah C kyseliny sorbové v roztoku.

Poznámka: V běžné praxi může být toto odpařování do sucha zanedbáno. Provádějte přímo měření absorbance na destilátu ředěném v poměru 1:4 s destilovanou vodou.

2.4. Vyjádření výsledků

2.4.1. Výpočet

Obsah kyseliny sorbové ve víně vyjádřený v mg na litr se udává součinem:

100 × C

kde C = obsah kyseliny sorbové v roztoku analyzovaném spektrofotometrií vyjádřený v mg/l.

3. METODA STANOVENÍ PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

3.1. Činidla

3.1.1. Ethylether (C2H5)2O destilovaný těsně před použitím.

3.1.2. Roztok vnitřního standardu: roztok kyseliny undekanové C11H22O2 v 95 % ethanolu (obj.), o koncentraci 1 g/l.

3.1.3. Vodný roztok kyseliny sírové H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml) zředěný 1:3 (objemově).

3.2. Vybavení

3.2.1. Plynový chromatograf vybavený plamenovým ionizačním detektorem a kolonou z nerezové oceli (4 m × 1/8 palce), předem ošetřenou dimetyldichlorosilanem a naplněnou stacionární fází, tvořenou směsí dietylénglykolsukcinátu (5 %) a kyseliny fosforečné (1 %) (DEGS- H3 PO4) nebo směsí dietylénglykoladipátu (7 %) a kyseliny fosforečné (1 %) (DEGA — H3 PO4) vázané na Gaschrom Q o zrnitosti 80 — 100 mesh.

Při ošetření kolony dimetyldichlorosilanem (DMDCS) nechte projít kolonou roztok obsahující 2 až 3 g DMDCS v toluenu. Ihned vymyjte kolonu methanolem; nechte projít proudem dusíku, pak hexanu a znovu dusíku. Pak ji naplňte.

Provozní podmínky:

Teplota pece: 175 °C.

Teplota nástřiku a detektoru: 230 °C.

Nosný plyn: dusík (průtok 20 ml/min.).

3.2.2. Mikrostříkačka s objemem 10 mikrolitrů odstupňovaná po 0,1 mikrolitru.

Poznámka: Jiné typy kolon mohou rovněž umožnit dobrou separaci, především kapilární kolona (například FFAP).

Níže uvedený postup je uveden jako příklad.

3.3. Postup

3.3.1. Příprava vzorku k rozboru

Do skleněné zkumavky o objemu asi 40 ml opatřené zabroušenou zátkou dejte 20 ml vína, přidejte 2 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.1.2) a 1 ml zředěného roztoku kyseliny sírové (bod 3.1.3).

Po promíchání opakovaným převracením přidejte k obsahu zkumavky 10 ml ethyletheru (bod 3.1.1). Protřepáváním zkumavky po dobu 5 minut extrahujte kyselinu sorbovou v organické fázi. Nechte usadit.

3.3.2. Příprava referenčního roztoku.

Vyberte víno, jehož chromatogram éterového extraktu nevykazuje žádný pík na úrovni kyseliny sorbové; přidejte k tomuto vínu kyselinu sorbovou v koncentraci 100 mg/l. Zpracujte 20 ml takto připraveného vzorku podle postupu popsaného v 3.3.1.

3.3.3. Chromatografie

Do chromatografu postupně vstříkněte pomocí mikrostříkačky 2 μl etherové fáze získané podle bodu 3.3.2 a 2 μl etherové fáze získané podle 3.3.1.

Zaznamenejte příslušné chromatogramy; ověřte shodnost příslušných retenčních časů kyseliny sorbové a vnitřního standardu. Změřte výšku (nebo plochu) každého zaznamenaného píku.

3.4. Vyjádření výsledků

3.4.1. Výpočet

Obsah kyseliny sorbové v analyzovaném víně vyjádřený v mg/l je dán vztahem:

100 × (h/H) × (l/i)

kde

H= výška píku kyseliny sorbové v referenčním roztoku

h= výška píku kyseliny sorbové v analyzovaném vzorku

l= výška píku vnitřního standardu v referenčním roztoku

i= výška píku vnitřního standardu v analyzovaném vzorku

Poznámka: Obsah kyseliny sorbové je možné stanovit stejným způsobem měřením plochy příslušných píků.

15 PH (OIV - AS-313-15-PH) – METODA TYP I

1. PRINCIP

Změří se rozdíl v potenciálu mezi elektrodami ponořenými do zkoumané kapaliny. Jedna z těchto dvou elektrod má potenciál, který je funkcí pH kapaliny, druhá má stabilní a známý potenciál a představuje referenční elektrodu.

2. VYBAVENÍ

2.1. pH-metr se stupnicí kalibrovanou v pH jednotkách a umožňující provádět měření s přesností alespoň ± 0, 05 jednotky pH.

2.2. Elektrody:

2.2.1. Skleněná elektroda uchovávaná v destilované vodě.

2.2.2. Kalomelová referenční elektroda s nasyceným chloridem draselným uchovávaná v nasyceném roztoku chloridu draselného.

2.2.3. Nebo kombinovaná elektroda uchovávaná v destilované vodě.

3. ČINIDLA

3.1. Tlumivé roztoky:

3.1.1. Nasycený roztok hydrogenvinanu draselného. Roztok obsahující nejméně 5,7 g/l hydrogenvinanu draselného (C4H5KO6), při 20 °C. Tento roztok se může uchovávat po 2 měsíce přidáním 0,1 g thymolu do 200 ml.

pH 3,57 při 20 °C 3,56 při 25 °C 3,55 při 30 °C

3.1.2. Roztok 0,05 M hydrogenftalátu draselného. Roztok obsahující 10,211 g/l hydrogenftalátu draselného (C8H5KO4) při 20 °C. (Maximální doba uchování: 2 měsíce).

pH 3,999 při 15 °C 4,003 při 20 °C 4,008 při 25 °C 4,015 při 30 °C

3.1.3. Roztok obsahující:

Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4 … 3,402 g Hydrogenfosforečnan draselný, K2H PO4 … 4,354 g Doplnit vodou na… 1 l

(Maximální doba uchování: 2 měsíce)

pH 6,90 při 15 °C 6,88 při 20 °C 6,86 při 25 °C 6,85 při 30 °C

Poznámka: Je také možné použít referenční tlumivé roztoky běžně dostupné v obchodní síti.

4. POSTUP

4.1 Příprava vzorku k rozboru

4.1.1. Mošt a víno

Použijte přímo mošt nebo víno.

4.1.2. Rektifikovaný moštový koncentrát

Zřeďte rektifikovaný moštový koncentrát vodou tak, abyste získali celkový obsah cukrů 25 ± 0,5 % hmotnostních (25 o Brix).

Je-li P celkový obsah cukrů v % hmotnostních v rektifikovaném moštovém koncentrátu, odvažte hmotnost 2 500/P

a doplňte vodou na 100 g. Použitá voda musí mít vodivost menší než 2 mikrosiemensy na centimetr.

4.2 Vynulování aparatury

Vynulování se provádí před provedením jakéhokoli měření podle pokynů daných pro používanou aparaturu.

4.3. Kalibrace pH-metru

Kalibrujte pH-metr při 20 °C pomocí tlumivého roztoku pH 6,88 a 3,57 při 20 °C podle pokynů daných pro použitý přístroj.

Pro kontrolu kalibrace stupnice použijte tlumivý roztok s pH 4,00 při 20 °C.

4.4. Stanovení

Ponořte elektrodu do zkoumaného vzorku, jehož teplota musí být mezi 20 a 25 °C, co nejblíže 20 °C. Hodnotu pH odečtěte přímo ze stupnice.

U stejného vzorku proveďte nejméně dvě stanovení.

Jako výsledek vezměte aritmetický průměr těchto stanovení.

5. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Hodnota pH moštu, vína nebo 25 % (hmotn.) roztoku rektifikovaného moštového koncentrátu (25 o Brix) se uvádí na 2 desetinná místa.

16 SOUČASNÉ STANOVENÍ KYSELINY L-ASKORBOVÉ A KYSELINY D-ISO-ASKORBOVÉ METODOU HPLC A UV DETEKCÍ (OIV-AS-313-22-ACASCO) – METODA TYP II

1. ÚVOD

Kyselina askorbová je antioxidant přirozeně přítomný v celé řadě potravin. Přirozené množství kyseliny askorbové v hroznech klesá během zpracování moštů a během výroby vína. Do moštů a vín se může přidávat v určitých mezích.

Popsaná metoda byla validována mezilaboratorní studií pomocí rozborů vzorků vín s přidaným množstvím kyseliny L-askorbové a kyseliny D-isoaskorbové v množství od 30 mg/l do 150 mg/l, resp. od 10 mg/l do 100 mg/l.

2. OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda je vhodná k současnému stanovení kyseliny L-askorbové a kyseliny D-isoaskorbové (kyselina erythorbová) ve víně vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s UV detekcí v rozsahu od 3 do 150 mg/l.

Pro obsahy přesahující 150 mg/l je nezbytné ředění vzorku.

3. PRINCIP

Vzorky jsou přímo vstřikovány do systému HPLC po filtraci na membráně. Analyzované látky jsou separovány na koloně s reverzní fází a jsou detekovány pomocí UV při 266 nm. Kvantifikace kyseliny L-askorbové a kyseliny D-isoaskorbové je prováděna vzhledem k vnějšímu standardu.

Poznámka: Kolony a podmínky fungování jsou uvedeny jako příklad. Jiné typy kolon mohou také zajišťovat dobrou separaci.

4. ČINIDLA A MATERIÁL

4.1 Činidla

4.1.1 n-oktylamin, čistota ≥ 99,0 %

4.1.2 Octan sodný × 3 H2O, čistota ≥ 99,0 %

4.1.3 Kyselina octová čistá, 100 %

4.1.4 Kyselina fosforečná, asi 25 %

4.1.5 Kyselina šťavelová, čistota ≥ 99,0 %

4.1.6 Askorbátoxydáza

4.1.7 Kyselina L-askorbová, ultra ≥ 99,5 %

4.1.8 Kyselina D-isoaskorbová, čistota ≥ 99,0 %

4.1.9 Redestilovaná voda

4.1.10 Methanol, p.a. 99,8 %

4.2 Příprava mobilní fáze

4.2.1 Roztoky pro mobilní fázi

Pro mobilní fázi připravte následující roztoky:

4.2.1.1 12,93 g n-oktylaminu ve 100 ml methanolu

4.2.1.2 68,05 g octanu sodného x 3 H2O v 500 ml redestilované vody

4.2.1.3 12,01 g čisté kyseliny octové ve 200 ml redestilované vody

4.2.1.4 Tlumivý roztok (pH 5,4): 430 ml roztoku octanu sodného (4.2.1.2.) a 70 ml roztoku kyseliny octové (4.2.1.3.)

4.2.2 Příprava mobilní fáze

Přidejte 5 ml roztoku n-oktylaminu (4.2.1.1.) do asi 400 ml redestilované vody v kádince. Upravte tento roztok na pH od 5,4 do 5,6 přidáváním 25 % kyseliny fosforečné po kapkách (4.1.4.). Přidejte 50 ml tlumivého roztoku (4.2.1.4.) a přelijte směs do 1 000 ml odměrné baňky a doplňte redestilovanou vodou. Před použitím musí být mobilní fáze přefiltrována pomocí membrány (regenerovaná celulóza, 0,2 μm) a pokud možno odplyněna héliem (po dobu asi 10 minut) podle potřeby použitého systému HPLC.

4.3 Příprava standardního roztoku

Poznámka:

Všechny standardní roztoky (zásobní roztok 4.3.1. a pracovní roztoky 4.3.2) musí být připraveny každý den a před nástřikem uloženy nejlépe v chladničce.

4.3.1 Příprava zásobního roztoku (1 mg/ml)

Připravte 2 % vodný roztok kyseliny šťavelové a odstraňte rozpuštěný kyslík probubláváním dusíkem.

Navažte přesně 100 mg kyseliny L-askorbové a 100 mg kyseliny D-isoaskorbové do 100 ml odměrné baňky a doplňte 2 % vodným roztokem kyseliny šťavelové.

4.3.2 Příprava pracovních roztoků

Pro pracovní roztoky zřeďte zásobní roztok (4.3.1.) na požadované koncentrace 2 % roztokem kyseliny šťavelové. Jsou doporučeny koncentrace mezi 10 mg/l a 120 mg/l. Například 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl a 1 200 μl v 10 ml, což odpovídá 10, 20, 40, 80 a 120 mg/l.

5. VYBAVENÍ

Běžný laboratorní materiál, především následující vybavení:

5.1 Čerpadlo HPLC

5.2 Injektor se smyčkou, 20 μl

5.3 UV detektor

6. VZORKOVÁNÍ

Před nástřikem jsou vzorky vína filtrovány na membráně s průměrem pórů 0,2 μm.

Pro obsahy přesahující 150 mg/l je nezbytné vzorek zředit.

7. POSTUP

7.1 Podmínky použití systému HPLC

Do chromatografického přístroje dávkujte 20 μl vzorku zfiltrovaného na membráně.

Předkolona : například Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm) Kolona : například Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm) Objem nástřiku : 20 μl Mobilní fáze : viz 4.2.2, isokratická Průtok : 1 ml/min UV detekce : 266 nm Cyklus proplachování : nejméně 30 ml redestilované vody, následně 30 ml methanolu a 30 ml acetonitrilu

7.2 Identifikace / Potvrzení

Identifikace píků se provádí porovnáním retenčních časů standardních roztoků a vzorků. S chromatografickým systémem popsaným jako příklad jsou retenční časy 7,7 min pro kyselinu L-askorbovou a 8,3 min pro kyselinu D-isoaskorbovou (viz obr. 1, chromatogram A).

K potvrzení pozitivních výsledků je třeba tyto vzorky zpracovat se stěrkou askorbátoxidázy a znovu změřit (viz obr. 1, chromatogram B).

Vzhledem k poklesu hodnoty kyseliny L-askorbové a D-isoaskorbové vyvolanému askorbátoxydázou by neměl být nalezen žádný signál v retenčním času kyseliny L-askorbové a kyseliny D-isoaskorbové. V případu zjištění interferujících píků je třeba jejich plochu započítat do výpočtu koncentrace analyzovaných látek.

Poznámka: Doporučuje se analyzovat vzorky zpracované s askorbátoxidázou na konci sekvence, po níž následuje proplachovací cyklus, aby se odstranily zbytky askorbátoxidázy z kolony, jinak by kyselina L-askorbová a kyselina D-isoaskorbová mohly být v průběhu měření HPLC přeměněny zbývající askorbátoxidázou a výsledek by tím mohl být ovlivněn.

8. VÝPOČTY

Z pracovních výsledků (4.3.2) připravte kalibrační křivku. Podle metody vnějšího standardu se kvantifikace kyseliny L-askorbové a kyseliny D-isoaskorbové provádí měřením plochy píků a porovnáním s odpovídající koncentrací na kalibrační křivce.

Vyjádření výsledků

Výsledky jsou vyjádřeny na 1 desetinné místo v mg/l kyseliny L-askorbové a kyseliny D-isoaskorbové (například 51,3 mg/l).

Pro obsahy nad 150 mg/l je třeba vzít v úvahu naředění.

9. PŘESNOST

Metoda byla testována v rámci mezilaboratorních zkoušek organizovaných bývalým Spolkovým úřadem pro veřejnou hygienu (Bundesgesundheitsamt, Německo), kterého se zúčastnilo 27 laboratoří. Program mezilaboratorního testu se řídil podle § 35 německého zákona týkajícího se potravinářských výrobků, který byl akceptován OIV až do zavedení nového protokolu (OENO 6/2000).

Studie se prováděla na 4 různých vzorcích vína - 2 vína bílá a 2 vína červená - s požadavkem 5 opakování u každého vzorku. Vzhledem k tomu, že nebylo možné připravit vzorky s dostatečnou stabilitou analyzovaných látek (různé rychlosti degradace), bylo rozhodnuto rozeslat účastníkům definovaná množství čistých standardních látek, jakož i vzorky vín. Laboratoře dostaly pokyn přenést standardy kvantitativně do vzorků vín a ihned je analyzovat. Byly analyzovány obsahy od 30 do 150 mg/l kyseliny L-askorbové a od 10 do 100 mg/l kyseliny D-isoaskorbové. Detailní výsledky studie jsou uvedeny v příloze metody zveřejněné ve Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty organizace OIV. Vyhodnocení bylo provedeno podle DIN/ISO 5725 (verze 1988).

Směrodatné odchylky opakovatelnosti (sr) a reprodukovatelnosti (sR) odpovídaly koncentracím kyseliny L-askorbové a kyseliny D-isoaskorbové. Parametr reálné přesnosti může být vypočten podle následujících rovnic:

Kyselina L-askorbová sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 x: koncentrace kyseliny L-askorbové (mg/l)

Kyselina D-isoaskorbová sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 koncentrace kyseliny D-isoaskorbové (mg/l)

Příklad:

50 mg/l kyseliny D-isoaskorbové sr = 1,0 mg/l

sR = 5,2 mg/L

10. DALŠÍ CHARAKTERISTIKY ANALÝZY

10.1 Mez detekce

Mez detekce této metody byla odhadnuta na 3 mg/l pro kyselinu L-askorbovou a kyselinu D-isoaskorbovou.

10.2 Správnost

Průměrná výtěžnost vypočtená na základě mezilaboratorních zkoušek provedených na 4 vzorcích (viz příloha metody zveřejněná ve Sborníku OIV) byla:

— 100,6 % pro kyselinu L-askorbovou

— 103,3 %/l pro kyselinu D-isoaskorbovou

17 OXID UHLIČITÝ (OIV - AS-314-01-DIOCAR) – METODA TYP II

1. PRINCIP METODY

1.1. Tichá vína (přetlak CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa) (2)

Objem vína odebraného ze vzorku se ochladí asi na 0 °C a smíchá s dostatečným množstvím hydroxidu sodného tak, aby bylo dosaženo pH 10-11. Titrace se provádí roztokem kyseliny za přítomnosti karbonické anhydrázy. Obsah oxidu uhličitého je odečten ze spotřebovaného objemu potřebného ke změně pH z 8,6 (hydrogenuhličitanová forma) na pH 4,0 (kyselina uhličitá). Srovnávací titrace, provedená za stejných podmínek na víně s odstraněným oxidem uhličitým, umožňuje zohlednit objem roztoku hydroxidu sodného spotřebovaného kyselinami ve víně.

1.2. Šumivá a perlivá vína

Vzorek zkoumaného vína se ochladí na teplotu blízkou bodu mrazu. Po odebrání určitého objemu, který bude sloužit jako srovnávací vzorek po odstranění oxidu uhličitého, se zalkalizuje zbytek láhve, aby se veškerý CO2 vázal ve formě Na2CO3. Titruje se kyselým roztokem za přítomnosti enzymu karbonické anhydrázy. Obsah oxidu uhličitého je odečten ze spotřebovaného objemu kyselého roztoku potřebného ke změně pH z 8,6 (hydrogenuhličitanová forma) na pH 4,0 (kyselina uhličitá). Srovnávací titrace, provedená za stejných podmínek na víně s odstraněným oxidem uhličitým, umožňuje zohlednit objem roztoku hydroxidu sodného spotřebovaného kyselinami ve víně.

2. POPIS METODY

2.1. Tichá vína (přetlak CO2 ≤ 0,5 x 105 Pa)

2.1.1. Vybavení

2.1.1.1. Magnetické míchadlo

2.1.1.2. pH metr.

2.1.2. Činidla

2.1.2.1. Roztok 0,1 M hydroxidu sodného (NaOH)

2.1.2.2. Roztok 0,05 M kyseliny sírové (H2SO4)

2.1.2.3. Roztok enzymu karbonické anhydrázy, 1 g/l.

2.1.3. Postup

Vzorek vína ochlaďte přibližně na teplotu 0 °C spolu s 10 ml pipetou sloužící k odebrání vzorku.

Do kádinky o objemu 100 ml nalijte 25 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 2.1.2.1), přidejte 2 kapky vodného roztoku enzymu karbonické anhydrázy (bod 2.1.2.3). Pomocí pipety ochlazené na 0 °C přidejte 10 ml vína.

Kádinku umístěte na magnetické míchadlo, vložte elektrodu a magnetickou tyčinku a mírně promíchávejte.

Když se kapalina ohřeje zpět na teplotu okolí, titrujte pomalu roztokem kyseliny sírové (bod 2.1.2.2), dokud pH nedosáhne hodnoty 8,6.

Pokračujte v titraci kyselinou sírovou (bod 2.1.2.2), dokud pH nedosáhne hodnoty 4,0. Nechť je n ml je přidaný objem mezi pH 8,6 a 4,0.

Ze vzorku vína o objemu přibližně 50 ml odstraňte CO2 mícháním pod vakuem po dobu 3 minut, přičemž ohřívejte baňku ve vodní lázni na asi 25 °C.

Použijte výše uvedený postup na vzorek 10 ml vína s odstraněným oxidem uhličitým: Nechť n' ml je použitý objem.

2.1.4. Vyjádření výsledků

1 ml titračního 0,05 M roztoku kyseliny sírové odpovídá 4,4 mg CO2.

Množství CO2 v g/l vína je dáno vzorcem

0,44 (n – n′)

Udává se na 2 desetinná místa.

Poznámka: V případě vína s malým obsahem CO2 (CO2 < 1 g/l) není nezbytné přidání enzymu karbonické anhydrázy za účelem katalýzy hydratace CO2.

2.2. Šumivá a perlivá vína

2.2.1. Vybavení

2.2.1.1. Magnetické míchadlo

2.2.1.2. pH metr.

2.2.2. Činidla

2.2.2.1. Roztok hydroxidu sodného (NaOH) 50% (hmotnostních).

2.2.2.2. Roztok 0,05 M kyseliny sírové (H2SO4).

2.2.2.3. Roztok enzymu karbonické anhydrázy uhličité 1 g/l.

2.2.3. Postup

Na láhvi vína pro rozbor vyznačte rysku na úrovni hladiny a ochlazujte ji, dokud nezačne mrznout.

Nechte láhev mírně ohřát za protřepávání, až zmizí krystalky ledu.

Rychle odzátkujte a odlijte stranou do odměrného válce 45 až 50 ml vína, které bude sloužit ke srovnávací titraci. Přesný objem tohoto odebraného vzorku v ml bude stanoven odečtením na válci po jeho ohřátí zpět na teplotu okolí.

Ihned po odběru srovnávacího vzorku přidejte do láhve o objemu 750 ml 20 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 2.2.2.1).

Počkejte, až se víno ohřeje zpět na teplotu okolí.

Do kádinky o objemu 100 ml nalijte 30 ml převařené destilované vody a 2 kapky roztoku enzymu karbonické anhydrázy (bod 2.2.2.3). Přidejte 10 ml zalkalizovaného vína.

Kádinku umístěte na magnetické míchadlo, vložte elektrodu a magnetickou tyčinku a mírně promíchávejte.

Pomalu titrujte roztokem kyseliny sírové (bod 2.2.2.2), dokud pH nedosáhne hodnoty 8,6.

Pokračujte v titraci kyselinou sírovou (bod 2.2.2.2), dokud pH nedosáhne hodnoty 4,0. Nechť n ml je objem přidaný mezi pH 8,6 a 4,0.

Ze vzorku vína o objemu přibližně 50 ml odloženého stranou pro srovnávací titraci odstraňte CO2 mícháním pod vakuem po dobu 3 minut, přičemž se baňka ohřívá ve vodní lázni o teplotě asi 25 °C. Odeberte 10 ml vína zbaveného oxidu uhličitého, přidejte ke 30 ml převařené destilované vody, přidejte 2 až 3 kapky roztoku hydroxidu sodného (bod 2.2.2.1) tak, aby hodnota pH dosáhla 10-11. Pak aplikujte výše uvedený postup. Nechť n′ ml je přidaný objem 0,05 M kyseliny sírové.

2.2.4. Vyjádření výsledků

1 ml 0,05 M roztoku kyseliny sírové odpovídá 4,4 mg CO2.

Vyprázdněte láhev se zalkalizovaným vínem a určete s přesností na 1 ml počáteční objem vína doplněním láhve vodou až po značku, nechť V ml je zjištěný objem.

Množství CO2 v g/l vína je dáno následujícím vzorcem:

0,44(n – n′) × ((V – v + 20)/(V – v))

Výsledek se uvádí na 2 desetinná místa.

2.3. Výpočet teoretického přetlaku

Přetlak při 20 °C, Paph20, vyjádřený v pascalech, je dán následujícím vzorcem:

Paph20 = ((Q)/(1,951 × 10–5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S))) – Patm

kde:

Q : obsah CO2 v g na litr vína A : obsah alkoholu ve víně při 20 °C S : obsah cukrů ve víně v g/l Patm : atmosférický tlak vyjádřený v pascalech

18 STANOVENÍ OXIDU UHLIČITÉHO VE VÍNĚ MANOMETRICKOU METODOU (OIV – AS314-04-CO2MAN) – METODA TYP II

(p.m.)

[Popis této metody rozboru je předmětem aktualizace orgány OIV. Bude zveřejněn v příštím sdělení Komise, jakmile OIV zveřejní aktualizované znění ve vydání Sborníku mezinárodních analytických metod pro vína a mošty na rok 2010.]

19 MĚŘENÍ PŘETLAKU ŠUMIVÝCH A PERLIVÝCH VÍN (OIV - AS-314-02-SURPRES) – METODA TYP I

1. PRINCIP

Po tepelné stabilizaci a protřepání láhve je přetlak měřen pomocí afrometru (měřidlo tlaku). Je vyjádřen v pascalech (Pa) (metoda typu I). Metodu lze rovněž použít na šumivá a perlivá vína dosycená CO2.

2. VYBAVENÍ

Přístroj umožňující měření přetlaku v láhvích šumivých a perlivých vín se nazývá afrometr. Používají se různé afrometry podle uzávěru láhve (kovová kapsle, korunkový uzávěr, korková nebo plastová zátka).

2.1. Pro láhve opatřené kapslí nebo uzávěry

Afrometr se skládá ze 3 částí (obr. 1):

— horní část (držák jehly se závitem) se skládá z manometru, kroužku na ruční utažení, šnekového šroubu, který se vsouvá do střední části, a z jehly, která prochází kapslí. Jehla je opatřena bočním otvorem, kterým se přenáší tlak do manometru. Těsné usazení přístroje na kapsli lahve je zajištěno těsněním.

— střední část (hlava nebo matice) slouží k vycentrování horní části. Našroubuje se do spodní části tak, aby celek pevně držel na láhvi.

— spodní část (objímka) je opatřena výběžkem, který zasahuje pod obrubu láhve a drží celek pohromadě. Existují kroužky přizpůsobené pro každý typ láhve.

2.2. Pro láhve opatřené zátkou

Afrometr se skládá se ze 2 částí (obr. 2):

— Horní část je shodná s výše popsaným přístrojem, ale jehla je delší. Ta je tvořena dlouhou dutou trubičkou na konci opatřenou hrotem, který umožňuje proniknout zátkou. Tento hrot je odnímatelný a spadne do vína, jakmile projde zátkou.

— spodní část je tvořena maticí (hlavou) a podstavcem přiléhajícím k zátce. Podstavec je opatřen čtyřmi upevňovacími šrouby, sloužícími k udržení přístroje na zátce.

Poznámky týkající se manometrů, které jsou součástí těchto dvou typů přístroje:

— mohou být buď mechanické s Bourdonovou trubicí, nebo digitální s piezoelektrickým snímačem tlaku. V prvním případě musí být Bourdonova trubice vyrobena z nerezavějící oceli.

— mají stupnici v pascalech (zkratka Pa). Pro šumivá vína je praktičtější používat jako jednotku 105 pascalů (105 Pa) nebo kilopascaly (kPa).

— mohou být různých tříd. Třída manometru je dána přesností odečítání vzhledem k plnému rozsahu stupnice vyjádřené v % (např.: manometr 1 000 kPa třídy 1 znamená maximální provozní tlak 1 000 kPa, odečítání s přesností ± 10 kPa). Pro přesná měření se doporučuje třída 1.

3. POSTUP

Měření je nutné provádět na láhvích, jejichž teplota byla stabilizována nejméně po dobu 24 hodin. Po provrtání uzávěru, plastové nebo korkové zátky se musí před odečtením tlaku lahví silně třást tak dlouho, dokud není tlak konstantní.

3.1. Lahve s kapslí nebo uzávěrem

Zasuňte výběžek objímky pod obrubu láhve. Zašroubujte matici tak, aby byl přístroj upevněný na láhvi. Horní část je našroubovaná v matici. Aby se zabránilo ztrátě plynu, musí se provrtání uzávěru provést co možno nejrychleji, aby se těsnění dostalo do kontaktu s uzávěrem. Láhev poté silně protřepejte, až se tlak ustálí, a pak odečtěte hodnotu tlaku.

3.2. Láhve se zátkou

Na konec jehly nasaďte hrot. Nasaďte celé zařízení na láhev. Utáhněte všechny 4 šrouby. Našroubujte horní část (jehla projde zátkou). Hrot musí spadnout do láhve, aby se tlak mohl dostat do manometru. Po protřepání láhve a ustálení tlaku odečtěte hodnotu tlaku. Po odečtení hrot vyndejte.

4. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Přetlak při 20 °C (Paph20) je vyjádřený v pascalech (Pa) nebo v kilopascalech (kPa). Musí být v souladu s přesností manometru (například pro manometr třídy 1 s celým rozsahem stupnice 1 000 kPa to musí být 6,3 x 105 Pa nebo 630 kPa, nikoliv 6,33 x 105 Pa nebo 633 kPa ).

Pokud je teplota při měření odlišná od 20 °C, je třeba provést korekci vynásobením naměřeného tlaku příslušným koeficientem (viz tab. 1).

Tab. 1

Poměr přetlaku Paph20 v šumivém nebo perlivém víně při teplotě 20 °C k přetlaku Papht při teplotě t

°C 0 1,85 1 1,80 2 1,74 3 1,68 4 1,64 5 1,59 6 1,54 7 1,50 8 1,45 9 1,40 10 1,36 11 1,32 12 1,28 13 1,24 14 1,20 15 1,16 16 1,13 17 1,09 18 1,06 19 1,03 20 1,00 21 0,97 22 0,95 23 0,93 24 0,91 25 0,88

5. KONTROLA VÝSLEDKŮ

Metoda přímého stanovení fyzikálních parametrů (kriteriální metoda typu I).

Ověření afrometrů

Afrometry musí být pravidelně ověřovány (nejméně jednou ročně).

Ověření se provádí pomocí kalibračního přístroje. Umožňuje porovnat zkoušený manometr s paralelně zapojeným referenčním manometrem vyšší třídy, který odpovídá vnitrostátním normám. Kontrola slouží k porovnání hodnot udávaných oběma přístroji pro stoupající a klesající tlak. Je-li mezi hodnotami rozdíl, seřizovací šroub umožňuje provést nezbytné úpravy.

Takovými kalibračními přístroji jsou vybaveny všechny oprávněné laboratoře a úřady. Tyto přístroje jsou k dispozici také u výrobců manometrů.

20 STANOVENÍ LYSOZYMU VE VÍNĚ METODOU HPLC (OIV-AS-315-14) – METODA TYP IV

1. ÚVOD

Pro stanovení lysozymu je upřednostňována analytická metoda, která není založená na enzymatické aktivitě.

2. OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda umožňuje kvantifikaci lysozymu (mg proteinu/l) přítomného v bílých a červených vínech bez ohledu na enzymatickou činnost (která by mohla být inhibována částečnou denaturací nebo vznikem komplexů nebo koprecipitačními jevy) matrice.

3. DEFINICE

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) nabízí přístup založený na sterických, polárních nebo adsorpčních interakcích mezi stacionární fází a analyzovanou látkou nesouvisející s reálnou enzymatickou aktivitou proteinu.

4. PRINCIP

Rozbor se provádí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) se spektrofotometrickým a spektrofluorimetrickým detektorem. Neznámé množství látky ve vzorku vína je vypočítáno podle plochy chromatografického píku s použitím metodologie vnější kalibrace.

5. ČINIDLA

5.1. Rozpouštědla a roztoky

Acetonitril (CH3CN) pro analýzu HPLC

Kyselina trifluoroctová (TFA), čistá

Deionizovaná voda pro analýzu HPLC

Standardní roztok: kyselina vinná, 1 g/l, 10 % etylalkohol (objemově) nastavený na pH 3,2 neutrálním vinanem draselným.

5.2. Eluenty

A : 1 % CH3CN, 0,2 % TFA, H2O= 98,8 % B : 70 % CH3CN, 0,2 % TFA, H2O= 29,8 %

5.3. Referenční roztoky

Od 1 do 250 mg/l standardu lysozymu rozpuštěného ve standardním roztoku trvalým promícháváním po dobu min. 12 hodin.

6. MATERIÁL

6.1. Přístroj HPLC s čerpacím systémem vhodným pro eluční gradient.

6.2. Příslušenství pro termostatickou kolonu (pec).

6.3. Spektrofotometrický detektor spojený se spektrofluorimetrickým detektorem.

6.4. Injektor se smyčkou 20 μL.

6.5. Kolona: Polymer s reverzní fází s funkčními fenylovými skupinami (průměr pórů = 1 000 Å, vylučovací limit = 1 000 000 Da), například Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm ID.

6.6. Předkolona se stejným materiálem jako kolona, např. Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2 mm ID.

7. PŘÍPRAVA VZORKU

Vzorky vína jsou okyseleny HCl (10 M) zředěnou v poměru 1:10 a po 5 minutách filtrovány polyamidovým filtrem, jehož póry mají průměr 0,22 μm. Chromatografická analýza je provedena ihned po filtraci.

8. PROVOZNÍ PODMÍNKY

8.1. Průtok eluentu: 1 ml/min

8.2. Teplota kolony: 30 °C

8.3. Spektrofotometrická detekce: 280 nm

8.4. Spektrofluorimetrická detekce: λ ex = 276 nm ; λ em = 345 nm ; zisk = 10

8.5. Program elučního gradientu

Čas (min.) Rozpouštědlo A% Rozpouštědlo B% gradient 0 100 0 isokratický 3 100 0 lineární 10 65 35 isokratický 15 65 35 lineární 27 40,5 59,5 lineární 29 0 100 isokratický 34 0 100 lineární 36 100 0 isokratický 40 100 0

8.6. Průměrný retenční čas lysozymu: 25,50 minut

9. VÝPOČET

Referenční roztoky obsahující dále uvedeny koncentrace lysozymu jsou analyzovány trojmo: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. Z každého chromatogramu jsou plochy píků odpovídající pro lysozym přeneseny do diagramu závislostí na odpovídajících koncentracích za účelem získání lineárních regresních přímek vyjádřených vzorcem Y = a.x + b. Koeficient determinace r 2 musí být vyšší než 0,999.

10. VLASTNOSTI METODY

Za účelem vyhodnocení vhodnosti metody pro stanovený cíl byla provedena validační studie zohledňující linearitu, mez detekce a kvantifikace a přesnost metody. Tento poslední parametr byl stanoven definováním hladiny přesnosti a správnosti metody.

Rozsah linearity (mg/l) Sklonpřímky Koeficient determinace (r2) LD (mg/l) LQ (mg/l) Opakovatelnost (n=5) RSD% Reprodukovatelnost (n=5) RSD% Std1 Č.V.2 B.V.3 Std1 UV 5-250 3,786 0,9993 1,86 6,20 4,67 5,54 0,62 1,93 FLD 1-250 52,037 0,9990 0,18 0,59 2,61 2,37 0,68 2,30

Tab. 1: Veličiny vztahující se k vlastnostem metody: Std1 standardní roztok ; Č.V.2 červené víno ; B.V.3 bílé víno

10.1. Linearita metody

Na základě výsledků získaných analýzou lineární regrese se metoda jeví jako lineární v rozsazích uvedených v tab. 1.

10.2. Mez detekce a kvantifikace

Mez detekce (LD) a mez kvantifikace (LQ) byly vypočteny jako signál ekvivalentní troj a desetinásobku chromatografického šumu v pracovních podmínkách na aktuálním zkoumaném roztoku (tab. 1).

10.3. Preciznost metody

Rozhodujícími parametry, které jsou zohledňovány, je opakovatelnost a reprodukovatelnost. V tab. 1 jsou uvedeny hodnoty těchto parametrů (vyjádřené jako % standardní odchylky měření opakovaného při různých koncentracích), zjištěné pro standardní roztoky, červeného a bílého vína.

10.4. Přesnost metody

Procento výtěžnosti bylo vypočítáno pro standardní roztoky obsahující 5 a 50 mg/l lysozymu, doplněné přidaným množstvím lysozymu, jak je uvedeno v následující tabulce.

[C] výchozí nominální (mg/l) Přídavek (mg/l) [C] teoreticky (mg/l) [C] nalezeno (mg/l) Standardní odchylka Výtěžnost % UV 280 nm 50 13,1 63,1 62,3 3,86 99 FD 50 13,1 63,1 64,5 5,36 102 UV 280 nm 5 14,4 19,4 17,9 1,49 92,1 FD 5 14,4 19,4 19,0 1,61 97,7

21 SÍRANY (OIV- AS-321-05-SULFAT) – METODA TYP II

1. PRINCIP

1.1. Referenční metoda

Gravimetrické stanovení po vysrážení síranu barnatého. Vysrážený fosforečnan barnatý za stejných podmínek je eliminován promytím sraženiny kyselinou chlorovodíkovou.

V případě moštů nebo vín bohatých na oxid siřičitý je doporučeno předchozí odsíření varem ve vzduchotěsné nádobě.

1.2. Rychlá zkušební metoda

Třídění vín do několika kategorií tzv. limitní metodou založenou na vysrážení síranu barnatého pomocí titračního roztoku iontů barya.

2. REFERENČNÍ METODA

2.1. Činidla

2.1.1. 2 M roztok kyseliny chlorovodíkové.

2.1.2. Roztok chloridu barnatého BaCl2. 2H2O, 200 g/l.

2.2. Postup

2.2.1. Všeobecný postup

Do centrifugační zkumavky o objemu 50 ml dejte 40 ml analyzovaného vzorku. Přidejte 2 ml 2 M kyseliny chlorovodíkové a 2 ml roztoku chloridu barnatého v koncentraci 200 g/l. Zamíchejte skleněnou tyčinkou, opláchněte tyčinku trochou destilované vody a nechte 5 minut stát. Odstřeďujte po dobu 5 minut, pak opatrně slijte supernatant.

Poté promyjte sraženinu síranu barnatého následujícím způsobem: přidejte 10 ml 2 M kyseliny chlorovodíkové, rozmíchejte sraženinu na suspenzi a odstřeďujte po dobu 5 minut. Opatrně oddělte supernatant. Promývání sraženiny opakujte dvakrát za stejných podmínek, pokaždé s použitím 15 ml destilované vody.

Sraženinu kvantitativně převeďte pomocí destilované vody do tárované platinové kapsle a umístěte ji do vodní lázně o teplotě 100 °C, dokud se zcela neodpaří. Vysušená sraženina se několikrát krátce žíhá nad plamenem, dokud nezbělá. Nechte zchladit v exsikátoru a zvažte.

Nechť m mg je získaná hmotnost síranu barnatého.

2.2.2. Zvláštní případ: sířené mošty a víno se zvýšeným obsahem oxidu siřičitého

Předtím odstraňte oxid siřičitý.

Do 500 ml Erlemayerovy baňky opatřené přikapávací nálevkou a odvzdušňovací trubicí nalijte 25 ml vody a 1 ml čisté kyseliny chlorovodíkové (ρ 20 = 1,15 — 1,18 g/ml). Tento roztok povařte, aby byl odstraněn vzduch, přidejte přikapávací nálevkou 100 ml vína a stále jej udržujte ve varu. Pokračujte ve vaření, dokud se objem kapaliny obsažené v baňce nesníží asi na 75 ml a po ochlazení jej kvantitativně převeďte do odměrné baňky o objemu 100 ml. Doplňte vodou po rysku. Stanovte sírany ve 40 ml zkušebního vzorku postupem podle bodu 2.2.1.

2.3. Vyjádření výsledků

2.3.1. Výpočty

Obsah síranů vyjádřený v mg/l síranu draselného K2SO4 je:

18,67 × m

Obsah síranů v moštech nebo vínech se vyjadřuje v mg/l síranu draselného bez desetinných míst

2.3.2. Opakovatelnost

do 1 000 mg/l: r = 27 mg/l

při cca. 1 500 mg/l: r = 41 mg/l

2.3.3. Reprodukovatelnost

do 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

při cca. 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

22 ŽELEZO (OIV - AS-322-05-FER) – METODA TYP IV

1. PRINCIP METODY

REFERENČNÍ METODA

Po vhodném zředění vína a odstranění alkoholu se železo stanoví přímo atomovou absorpční spektrofotometrií.

OBVYKLÁ METODA

Po mineralizaci vína perhydrolem je železo, které se nachází ve trojmocném stavu (III), redukováno na dvojmocné železo (II). Je stanoveno díky červenému zbarvení, které vzniká po reakci s ortofenantrolinem.

2. REFERENČNÍ METODA

2.1. Činidla

2.1.1. Koncentrovaný standardní roztok železa (III) o koncentraci 1 g /l.

Použijte standardní komerční roztok o koncentraci 1 g/l. Tento roztok může být připraven rozpuštěním 8,6341 g síranu železitoamonného (FeNH4(SO4)2. 12 H2O) v destilované vodě mírně okyselené 1 M kyselinou chlorovodíkovou a doplněním objemu na 1 litr.

2.1.2. Standardní ředěný roztok železa o koncentraci 100 mg/l.

2.2. Vybavení

2.2.1. Rotační odparka s termostaticky řízenou vodní lázní.

2.2.2. Atomový absorpční spektrofotometr vybavený hořákem napájeným vzduchem a acetylénem.

2.2.3. Železná výbojka s dutou katodou.

2.3. Postup

2.3.1. Příprava vzorku

Pomocí rotační odparky (50-60 °C) odstraňte z vína alkohol zakoncentrováním vzorku na polovinu. Doplňte destilovanou vodou na původní objem.

V případě potřeby před stanovením nařeďte destilovanou vodou.

2.3.2. Kalibrace

Do 5 odměrných baněk o objemu 100 ml dejte 1 - 2 - 3 - 4 - 5 ml roztoku železa o koncentraci 100 mg/l (bod 2.1.2) a doplňte na 100 ml destilovanou vodou. Připravené roztoky obsahují 1 - 2 - 3 - 4 - 5 mg železa na litr.

Tyto roztoky by měly být uchovávány v polyethylenových nádobách.

2.3.3. Stanovení

Nastavte vlnovou délku na 248,3 nm. Stupnici absorbance vynulujte destilovanou vodou. Nasajte zředěný vzorek přímo do hořáku spektrofotometru, a pak postupně standardní roztoky připravené podle bodu 2.3.2. Odečtěte absorbance. Každé měření zopakujte.

2.4. Vyjádření výsledků

2.4.1. Metoda výpočtu

Nakreslete graf změny absorbance v závislosti na obsahu železa ve standardních roztocích. Na tento graf zaznamenejte střední hodnotu absorbance pro vzorek zředěného vína a stanovte obsah železa C.

Obsah železa vyjádřený v mg/l vína na 1 desetinné místo bude:

C × F

F = faktor zředění.

23 MĚĎ (OIV – AS 322-06) – METODA TYP IV

1. PRINCIP METODY

Použití atomové absorpční spektrofotometrie.

2. VYBAVENÍ

2.1. Platinová miska.

2.2. Atomový absorpční spektrofotometr.

2.3. Měděná výbojka s dutou katodou.

2