PŘÍLOHA X

STANOVENÍ METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato příloha obsahuje pokyny pro stanovení volných a vázaných mastných kyselin v rostlinných tucích a olejích plynovou chromatografií po jejich přeměně na methylestery mastných kyselin (FAME).

Vázané mastné kyseliny triacylglycerolů (TAG) a v závislosti na metodě esterifikace volné mastné kyseliny (FFA) se přeměňují na methylestery mastných kyselin (FAME), které se stanoví kapilární plynovou chromatografií.

Metoda popsaná v této příloze umožňuje stanovovat methylestery mastných kyselin od C12 po C24, včetně methylesterů nasycených, cis- a trans-mononenasycených a cis- a trans-polynenasycených mastných kyselin.

2. PODSTATA

Pro kvantitativní analýzu FAME se používá plynová chromatografie (GC). Methylestery mastných kyselin se připraví podle části A. Poté se vstříknou do injektoru a uvnitř něj se odpaří. Separace methylesterů mastných kyselin se provádí v analytických kolonách se specifickou polaritou a délkou. Pro detekci FAME se používá plameno-ionizační detektor (FID). Podmínky analýzy jsou uvedeny v části B.

V plynové chromatografii methylesterů mastných kyselin s FID lze jako nosný plyn (mobilní fáze) použít vodík nebo helium. Vodík urychluje separaci a zajišťuje výraznější píky. Stacionární fáze je mikroskopickou vrstvou tenkého tekutého filmu na inertním pevném povrchu z taveného křemene.

Když analyzované odtěkané sloučeniny procházejí kapilární kolonou, reagují se stacionární fází, jež je pokrytím na vnitřním povrchu kolony. Vzhledem k tomuto různému působení rozdílných sloučenin dochází k eluaci v různou dobu, která se nazývá retenčním časem sloučenin pro daný soubor parametrů analýzy. Srovnání retenčních časů se používá stanovení jednotlivých sloučenin.

ČÁST A

PŘÍPRAVA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN Z OLIVOVÉHO OLEJE A OLIVOVÉHO OLEJE Z POKRUTIN

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato část upřesňuje přípravu methylesterů mastných kyselin. Zahrnuje metody pro přípravu methylesterů mastných kyselin z olivového oleje a olivového oleje z pokrutin.

2. OBLAST POUŽITÍ

Příprava methylesterů mastných kyselin z olivového oleje a olivového oleje z pokrutin se provádí transesterifikací pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného při pokojové teplotě. Nezbytnost čištění vzorku před transesterifikací vzorku závisí na obsahu volných mastných kyselin ve vzorku a analytickém parametru, který má být stanoven, přičemž rozhodnout se lze podle následující tabulky:

Kategorie oleje Metoda Panenský olivový olej s kyselostí ≤ 2,0 % 1. Mastné kyseliny 2. Trans-mastné kyseliny 3. ΔECN42 (po čištění pomocí silikagelu SPE) Rafinovaný olivový olej Olivový olej složený z rafinovaného a panenského olivového oleje Rafinovaný olivový olej z pokrutin Olivový olej z pokrutin Panenský olivový olej s kyselostí > 2,0 % Surový olivový olej z pokrutin 1. Mastné kyseliny (po čištění pomocí silikagelu SPE) 2. Trans-mastné kyseliny (po čištění pomocí silikagelu SPE) 3. ΔECN42 (po čištění pomocí silikagelu SPE)

3. METODIKA

3.1. Transesterifikace pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného při pokojové teplotě

3.1.1. Podstata

Methylestery se vytvářejí transesterifikací pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného jako mezistupeň před zmýdelněním.

3.1.2. Činidla

3.1.2.1. Methanol s obsahem maximálně 0,5 % (m/m) vody

3.1.2.2. Hexan pro chromatografii

3.1.2.3. Heptan pro chromatografii

3.1.2.4. Diethylether, stabilizovaný pro účely analýzy

3.1.2.5. Aceton pro chromatografii

3.1.2.6. Eluční rozpouštědlo pro čištění oleje směsí hexanu/diethyletheru 87/13 (v/v) pro sloupcovou chromatografii/chromatografii SPE)

3.1.2.7. Hydroxid draselný, přibližně 2M methanolový roztok: 11,2 g hydroxidu draselného se rozpustí ve 100 ml methanolu.

3.1.2.8. Silikagelové patrony 1 g (6 ml) pro extrakci na pevnou fázi.

3.1.3. Přístroje a pomůcky

3.1.3.1. Zkumavky se šroubovacím uzávěrem (o objemu 5 ml) opatřené spojem z PTFE

3.1.3.2. Dělené nebo automatické pipety, 2 ml a 0,2 ml

3.1.4. Čištění vzorků oleje

V případě potřeby budou vzorky oleje čištěny na silikagelových patronách pro extrakci na pevnou fázi. Silikagelová patrona (3.1.2.8) se vloží do vakuového elučního zařízení a promývá se s 6 ml hexanu (3.1.2.2), promývání se provádí mimo vakuum. Poté se do kolony vlije roztok oleje (přibližně 0,12 g) v 0,5 ml hexanu (3.1.2.2). Tento roztok se po průchodu kolonou eluuje s 10 ml hexanu/diethyletheru (87/13 v/v) (3.1.2.6). Kombinované eluáty se homogenizují a rozdělí na dva obdobné objemy. Alikvotní část se odpaří do sucha na rotační odparce za sníženého tlaku při pokojové teplotě. Residuum se rozpustí v 1 ml n-heptanu a roztok je připraven k analýze mastných kyselin plynovou chromatografií. Případně se odpaří druhá alikvotní část a residuum se rozpustí v 1 ml acetonu pro analýzu triglyceridů vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

3.1.5. Postup

Do 5ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem (3.1.3.1) se odváží přibližně 0,1 g vzorku oleje. Přidá se 2 ml heptanu (3.1.2.2) a vše se protřepe. Přidá se 0,2 ml roztoku hydroxidu draselného (3.1.2.7), přidá se uzávěr se spojem z PTFE, uzávěr se utěsní a důkladně protřepe po dobu 30 sekund. Nechá se odstát, dokud nebude svrchní vrstva roztoku čirá. Svrchní vrstva obsahující methylestery se slije. Roztok heptanu je připraven k nástřiku do plynového chromatografu. Do analýzy plynovou chromatografií je vhodné roztok uchovávat v ledničce. Nedoporučuje se skladovat roztok déle než 12 hodin.

ČÁST B

ANALÝZA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato metoda popisuje použití plynové chromatografie v kapilární koloně pro stanovení kvalitativního a kvantitativního složení směsi methylesterů mastných kyselin získaných podle metody uvedené v části A.

Tato část není použitelná pro polymerní mastné kyseliny.

2. ČINIDLA

2.1. Nosný plyn

Inertní plyn (helium nebo vodík), dokonale vysušený a s obsahem kyslíku menším než 10 mg/kg.

Poznámka 1: Vodík umožňuje dvakrát zvýšit rychlost analýzy, ale je nebezpečný. Dostupná jsou bezpečnostní zařízení.

2.2. Pomocné plyny

2.2.1. Vodík (čistota ≥ 99,9 %), neobsahující organické nečistoty.

2.2.2. Vzduch nebo kyslík, neobsahující organické nečistoty.

2.2.3. Dusík (čistota > 99 %).

2.3. Referenční standard

Směs methylesterů čistých mastných kyselin, nebo methylestery z tuku známého složení; výhodné je složení podobné analyzovanému tuku. Pro stanovení trans-isomerů nenasycených kyselin jsou užitečné cis- a trans-isomery methylesterů oktadecenové, oktadekadienové a oktadekatrienové kyseliny.

Pozornost je třeba věnovat ochraně polynenasycených mastných kyselin před oxidací.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Uvedené pokyny se vztahují na obvyklá zařízení používaná pro plynovou chromatografii, která používají kapilární kolony a plameno-ionizační detektor.

3.1. Plynový chromatograf

Plynový chromatograf obsahuje tyto části:

3.1.1. Injektor

Injektor se používá pro kapilární kolonu, kde by injektor měl být konstruován přímo pro použití s touto kolonou. V tomto případě může být prováděn buď nástřik pomocí děliče (split type), nebo bez dělení přímo na kolonu (splitless type) nástřik ‚on column‘.

3.1.2. Termostat

Termostat má mít schopnost vyhřát kolonu na teplotu nejméně 260 °C a udržovat žádanou teplotu s přesností na 0,1 °C. Poslední požadavek je zvlášť důležitý při použití trubice z taveného křemene.

Použití ohřevu s programovanou teplotou je doporučeno ve všech případech, zejména pro mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku.

3.1.3. Kapilární kolona

3.1.3.1. Trubice vyrobená z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (obvykle sklo nebo tavený křemen). Vnitřní průměr se pohybuje mezi 0,20 mm až 0,32 mm. Vnitřní povrch musí být před pokrytím stacionární fází přiměřeným způsobem upraven (např. příprava povrchu, inaktivace). Pro cis- a trans-isomery mastných kyselin je dostatečná délka 60 m.

3.1.3.2. U stacionární fáze jsou vhodné polární polysiloxany (kyanosilikony) vázané stacionární fáze (zesíťované).

Poznámka 2: Při použití polárních polysiloxanů je nebezpečí obtížné identifikace a separace kyseliny linolenové a kyselin C20.

Pokrytí má být tenké, tj. 0,1 μm až 0,2 μm.

3.1.3.3. Montáž a kondicionace kolony

Při montáži kapilární kolony, např. úpravě kolony v termostatu (nosič), výběru a provedení spojů (netěsné spoje), polohy konce kolony v injektoru a detektoru (zmenšení mrtvých prostorů) je nutno zachovat běžnou opatrnost. Kolonou se nechá protékat nosný plyn (např. 0,3 bar (30 kPa) pro kolonu délky 25 m a vnitřním průměru 0,3 mm).

Kolona se ohřívá v termostatu za programované teploty rychlostí 3 °C/min od teploty okolí do teploty 10 °C pod limitní hodnotu, při které dochází k rozložení stacionární fáze. Termostat se udržuje při této teplotě po dobu jedné hodiny, dokud nedojde k ustálení základní linie. Potom se termostat ochladí na 180 °C a pracuje se za isotermních podmínek.

Poznámka 3: Vhodné kondiciované kolony jsou obchodně dostupné.

3.1.4. Plameno-ionizační detektor a konverzní zesilovač

3.2. Stříkačka

Stříkačka o maximálním objemu 10 μl, dělená po 0,1 μl.

3.3. Systém pro sběr dat

Systém pro sběr dat napojený online na detektory a používaný se softwarovým programem pro integraci píků a normalizaci.

4. POSTUP

Operace popsané v odstavcích 4.1 až 4.3 se týkají použití plameno-ionizačního detektoru.

4.1. Zkušební podmínky

4.1.1. Výběr optimálních pracovních podmínek u kapilárních kolon

Účinnost a permeabilita kapilárních kolon způsobují, že dělení složek a doba trvání analýzy jsou značně závislé na průtoku nosného plynu kolonou. Bude proto nezbytné optimalizovat pracovní podmínky působením na tyto parametry (nebo jednodušeji na tlakovou ztrátu na koloně) podle toho, zda je cílem zlepšit dělení, nebo zrychlit analýzu.

Tyto podmínky se ukázaly být vhodné pro separaci FAME (C4 až C26). Příklady chromatogramů jsou uvedeny v dodatku B:

Teplota injektoru: 250 °C Teplota detektoru: 250 °C Teplota termostatu: 165 °C (8 min) až 210 °C při 2 °C/min Nosný plyn – vodík: tlak na koloně: 179 kPa, Celkový průtok: 154,0 ml/min; Oddělovací poměr: 1:100 Objem nástřiku: 1 μl

4.1.2. Stanovení rozlišení (viz dodatek A)

Rozlišení R dvou sousedních píků I a II se vypočte podle vzorce:

R = 2 × ((dr(II) – dr(I) )/(ω(I) + ω(II))) nebo R = 2 × ((tr(II) – tr(I) )/(ω(I) + ω(II))) (USP) (lékopis USA)

nebo

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (JP (lékopis Japonska), EP (Evropský lékopis), BP (lékopis UK))

kde:

d r(I) je retenční vzdálenost píku I;

d r(I) je retenční vzdálenost píku II;

t r(I) je retenční čas píku I;

t r(II) je retenční čas píku II;

ω(I) je šířka základu píku I;

ω(I) je šířka základu píku II;

ω0,5 je šířka píku uvedené sloučeniny, při střední výšce píku;

Pokud ω(I) ≈ ω(II), R se vypočte podle těchto vzorců:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

kde

σ je směrodatná odchylka (viz Dodatek A, obrázek 1).

Pokud se vzdálenost dr mezi dvěma píky d r(II) – d r(I) rovná 4σ, faktor rozlišení R = 1.

Nejsou-li dva píky úplně separovány, tečny vedené inflexními body dvou píků se protnou v bodě C. Pro úplnou separaci dvou píků musí být vzdálenost mezi dvěma píky:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, odtud R = 1,5 (viz Dodatek A, obrázek 3).

5. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

5.1. Kvalitativní analýza

Provede se identifikace píků methylesterů pro vzorek z chromatogramu v dodatku B, obrázku 1, podle potřeby se interpoluje, nebo se porovná s píky referenčních směsí methylesterů (jak je uvedeno v bodě 2.3).

5.2. Kvantitativní analýza

5.2.1. Určení složení

Výpočet hmotnostního zlomku w i jednotlivých methylesterů mastných kyselin, vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů, se provede takto:

5.2.2. Metoda výpočtu

5.2.2.1. Obecný případ

Obsah složky i vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů se vypočítá určením plochy odpovídajícího píku vzhledem k součtu ploch všech píků podle vzorce:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kde

Ai je plocha píku jednotlivého methylethylesteru mastných kyselin i;

ΣA je součet ploch všech píků všech jednotlivých methylesterů mastných kyselin.

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

Poznámka 4: U tuků a olejů se hmotnostní zlomek methylesterů mastných kyselin rovná hmotnostnímu zlomku triacylglycerolů v gramech na 100 g. V případech, že tento předpoklad neplatí, viz 5.2.2.2.

5.2.2.2. Použití korekčních faktorů

V některých případech, zvláště za přítomnosti mastných kyselin s méně než osmi atomy uhlíku, nebo kyselin se sekundární skupinou se plochy opraví pomocí specifických korekčních faktorů (Fci). Tyto faktory se stanoví pro každý jednotlivý nástroj. Pro tento účel se použijí vhodné referenční materiály s certifikovaným složením mastných kyselin v odpovídajícím rozsahu.

Poznámka 5: Tyto korekční faktory nejsou shodné se teoretickými korekčními faktory FID, které jsou uvedeny v dodatku A, jelikož zahrnují rovněž výkonnost systému ve vztahu k injektoru atd. V případě větších rozdílů by měla být zkontrolována výkonnost celého systému.

Pro tyto referenční směsi se hmotnostní procenta FAME i vypočtou podle vzorce:

wi = (mi /Σm) × 100

kde

m i je hmotnost FAME i v referenční směsi,

Σm je celková hmotnost různých složek jako FAME v referenční směsi.

Z chromatogramu referenční směsi se vypočítá procentní podíl plochy pro FAME i takto:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kde

Ai je plocha FAME i v referenční směsi,

ΣA součet všech ploch všech FAMW v referenční směsi.

Korekční faktor Fc je následně:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Pro vzorek činí hmotnostní procenta každého FAME i:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

Poznámka 6: Vypočtená hodnota odpovídá procentním procentům jednotlivých mastných kyselin vypočítaným jako triacylglyceroly na 100 g tuku.

5.2.2.3. Použití vnitřního standardu

V některých případech (např. když nejsou kvantifikovány všechny mastné kyseliny, k čemuž dochází, jsou-li přítomny kyseliny se čtyřmi a šesti atomy uhlíku současně s kyselinami s 16 a 18 atomy uhlíku, nebo když je třeba určit absolutní množství mastných kyselin ve vzorku) by měl být použit vnitřní standard. Jako vnitřní standard se používají nejčastěji methylestery mastných kyselin s 5, 15 nebo 17 atomy uhlíku. Pro vnitřní standard by měl být stanoven korekční faktor (pokud se použije).

Hmotnostní procenta složky i vyjádřená jako methylester lze vypočítat podle vzorce:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

kde:

A i je plocha FAME i,

A IS je plocha vnitřního standardu;

F i je korekční faktor mastné kyseliny i, vyjádřený jako FAME;

F IS je korekční faktor vnitřního standardu;

m je hmotnost zkušebního vzorku v miligramech,

m IS je hmotnost vnitřního standardu v miligramech.

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

6. PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol musí obsahovat odkaz na použitou metodu pro přípravu methylesterů a jejich stanovení plynovou chromatografií. Dále zahrnuje všechny pracovní podrobnosti nespecifikované v této standardní metodě nebo považované za volitelné, jakož i další okolnosti, které mohou ovlivnit výsledek.

Protokol musí obsahovat všechny informace nutné pro kompletní identifikaci vzorku.

7. PŘESNOST

7.1. Výsledky mezilaboratorní zkoušky

Podrobnosti k mezilaboratorní zkoušce týkající se přesnosti metody jsou uvedeny v příloze C normy IOC/T.20/Doc. No 33. Hodnoty odvozené z této mezilaboratorní zkoušky nelze použít na jiné než uvedené rozsahy koncentrace a matrice.

7.2. Opakovatelnost

Absolutní rozdíl mezi výsledky dvou samostatných jednotlivých zkoušek získanými stejnou metodou na stejném zkušebním materiálu v téže laboratoři týmž pracovníkem používajícím stejné zařízení krátce po sobě není u více než 5 % případů vyšší než R uvedené v tabulkách 1 až 14 přílohy C normy IOC/T.20/Doc. No 33.

7.3. Reprodukovatelnost

Absolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých zkoušek získanými stejnou metodou na stejném zkušebním materiálu v různých laboratořích a různými pracovníky používajícími odlišná zařízení není u více než 5 % případů vyšší než R uvedené v tabulkách 1 až 14 přílohy C normy IOC/T.20/Doc. No 33.

Dodatek A Obrázek 1 Šířka ω0,5 v poloviční výšce trojúhelníku (ABC) a šířka b v poloviční výšce trojúhelníku (NPM). Obrázek 2 Obrázek 3