Doplňují se nové přílohy, které znějí:

„

Dodatek

METODA PRO ZJIŠŤOVÁNÍ KRAVSKÉHO MLÉKA A KASEINÁTŮ V SÝRECH Z OVČÍHO MLÉKA, KOZÍHO MLÉKA NEBO BUVOLÍHO MLÉKA, NEBO SMĚSÍ OVČÍHO, KOZÍHO A BUVOLÍHO MLÉKA

1. PŘEDMĚT

Zjišťování kravského mléka a kaseinátů v sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka anebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka izoelektrickou fokusací γ-kaseinů po plasminolýze.

2. OBLAST POUŽITÍ

Metoda je vhodná pro citlivé a specifické zjišťování mléka a kaseinátu, též tepelně ošetřených, v čerstvých a zralých sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka nebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka. Není vhodná k odhalení falšování mléka a sýrů tepelně ošetřenými bílkovinnými koncentráty z hovězí syrovátky.

3. PODSTATA METODY

3.1. Izolace kaseinů ze sýra a referenčních standardů

3.2. Rozpuštění izolovaných kaseinů a proteolýza plasminem (EC.3.4.21.7)

3.3. Izoelektrická fokusace plasminem ošetřených kaseinů za přítomnosti močoviny a vybarvení bílkovin

3.4. Vyhodnocení vybarvených obrazců kaseinu γ3 a γ2 (důkaz přítomnosti kravského mléka) na základě porovnání obrazce získaného ze vzorku s obrazci získanými u téhož gelu z referenčních standardů obsahujících 0 % a 1 % kravského mléka.

4. CHEMIKÁLIE

Není-li stanoveno jinak, používají se pouze chemikálie čistoty p.a. Voda musí být redestilovaná nebo rovnocenné čistoty.

Poznámka: Následující údaje se vztahují na laboratorně připravované polyakrylamidové gely s obsahem močoviny o rozměrech 265 × 125 × 0,25 mm. Pokud se použijí jiné rozměry nebo druhy gelu, může být nutné upravit podmínky separace.

Izoelektrická fokusace

4.1. Chemikálie pro přípravu polyakrylamidových gelů s obsahem močoviny

4.1.1. Zásobní roztok gelu

Ve vodě rozpusťte:

4,85 g akrylamidu

0,15 g N, N′-methylen-bis-akrylamidu (BIS)

48,05 g močoviny

15,00 g glycerolu (87 % hm.),

doplňte na 100 ml a uložte do chladničky v hnědé skleněné lahvi.

Poznámka: Místo uvedených množství neurotoxického akrylamidu lze použít komerčně dostupný, předem namíchaný roztok akrylamidu a BIS. V případě, že koncentrace komerčního roztoku je 30 % hm./obj. akrylamidu a 0,8 % hm./obj. BIS, pak uvedená množství (4,85 g akrylamidu a 0,15 g BIS) musí být nahrazena komerčním roztokem o objemu 16,2 ml. Zásobní roztok lze skladovat nejdéle 10 dnů. Pokud je jeho vodivost vyšší než 5 μS, je nutné provést jeho deionizaci promícháváním s 2 g Amberlitu MB-3 po dobu 30 minut a poté jej přefiltrovat přes 0,45μm membránu.

4.1.2. Roztok gelu

Připravte roztok gelu smícháním přísad a amfolytů (*) se zásobním roztokem gelu (viz 4.1.1).

9,0 ml zásobního roztoku

24 mg β-alaninu

500 μl amfolytu pH 3,5–9,5

250 μl amfolytu pH 5–7

250 μl amfolytu pH 6–8

Gelový roztok promíchejte a odplyňujte po dobu dvou až tří minut v ultrazvukové lázni nebo ve vakuu.

Poznámka: Gelový roztok se musí připravit bezprostředně před naléváním (viz 6.2).

4.1.3. Roztoky katalyzátorů

4.1.3.1. N, N, N′, N′-tetramethylendiamin (Temed)

4.1.3.2. 40 % hm./obj. roztoku persíranu amonného (PER)

800 mg PER se rozpustí ve vodě a doplní se do 2 ml.

Poznámka: Vždy používejte čerstvě připravený roztok PER.

4.2. Kontaktní tekutina

Kerosin nebo kapalný parafin

4.3. Anodový roztok

Rozpusťte 5,77 g kyseliny fosforečné (85 % hm.) ve vodě a zřeďte na 100 ml.

4.4. Katodový roztok

Rozpusťte 2,00 g hydroxidu sodného ve vodě a zřeďte vodou na 100 ml.

Příprava vzorku

4.5. Chemikálie určené k izolaci bílkovin

4.5.1. Zředěná kyselina octová (25,0 ml ledové kyseliny octové doplněné vodou do 100 ml).

4.5.2. Dichlormethan

4.5.3. Aceton

4.6. Tlumivý roztok pro rozpuštění bílkovin

Ve vodě rozpusťte:

5,75 g glycerolu (87 % hm.)

24,03 g močoviny

250 mg dithiothreitolu

a doplňte na 50 ml vodou.

Poznámka: Skladujte v chladničce; maximální doba uskladnění je jeden týden.

4.7. Chemikálie určené k plasminovému štěpení kaseinů

4.7.1. Tlumivý roztok uhličitanu amonného

Titrujte molární roztok hydrogenuhličitanu amonného 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml vody) obsahující 0,05 mol/l kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA, 1,46 g/100 ml) roztokem uhličitanu amonného 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml vody) obsahujícího 0,05 mol/l EDTA na pH 8.

4.7.2. Hovězí plasmin (EC. 3.4.21.7), s aktivitou nejméně 5 U/ml.

4.7.3. Roztok kyseliny ε-aminokapronové určené k inhibici enzymu

Rozpusťte 2, 624 g kyseliny ε-aminokapronové (6-amino-n-hexankyseliny) ve 100 ml 40 % obj. ethanolu.

4.8. Referenční standardy

4.8.1. Certifikované referenční standardy směsi ovčího a kozího odstředěného mléka vysráženého pomocí syřidla a s obsahem 0 % a 1 % kravského mléka lze získat od Ústavu pro referenční materiály a měření působícího při Komisi, B-2440, Geel, Belgie.

4.8.2. Příprava laboratorních prozatímních standardů buvolího mléka vysráženého pomocí syřidla a s obsahem 0 % a 1 % kravského mléka

Odstředěné mléko se připraví odstředěním syrového buvolího nebo kravského mléka při teplotě 37 °C (2 500 g, 20 minut). Po rychlém ochlazení zkumavky a jejího obsahu na 6 až 8 °C se úplně odstraní horní tuková vrstva. Pro přípravu 1 % standardu přidejte 5,00 ml odstředěného kravského mléka do 495 ml odstředěného buvolího mléka v kádince o obsahu 1 l. Hodnotu pH upravte na 6,4 přídavkem zředěné kyseliny mléčné (10 %, hm./obj.). Teplotu upravte na 35 °C, přidejte 100 μl telecího syřidla (aktivita syřidla 1: 10 000, cca 3 000 U/ml) a míchejte po dobu 1 minuty. Poté kádinku zakryjte hliníkovou fólií a nechte hodinu stát při teplotě 35 °C k utvoření sýřeniny. Po utvoření sýřeniny se veškeré mléko vysrážené pomocí syřidla lyofilizuje, aniž by předtím byla provedena homogenizace nebo odebrání syrovátky. Lyofilizované mléko se jemně rozemele na homogenní prášek. K přípravě referenčního standardu 0 % použijte stejný postup u čistého odstředěného buvolího mléka. Referenční standardy musí být skladovány při teplotě – 20 °C.

Poznámka: Před přípravou referenčních standardů se doporučuje zkontrolovat čistotu buvolího mléka izoelektrickou fokusací kaseinů vystavených působení plasminu.

Chemikálie určené k barvení bílkovin

4.9. Fixativ

Rozpusťte 150 g kyseliny trichloroctové ve vodě a doplňte na 1 000 ml.

4.10. Odbarvovací roztok

Zřeďte 500 ml methanolu a 200 ml ledové kyseliny octové destilovanou vodou na 2 000 ml.

Poznámka: Odbarvovací roztok se připravuje každý den čerstvý; lze jej připravit smícháním stejných objemů zásobního roztoku 50 % (obj.) methanolu a zásobního roztoku 20 % (obj.) ledové kyseliny octové.

4.11. Barvicí roztoky

4.11.1. Barvicí roztok (zásobní roztok 1)

V 1 000 ml 90 % obj. methanolu rozpusťte pomocí magnetické míchačky (asi 45 minut) 3,0 g brilantní modři Coomassie G-250 (C. I. 42655) a roztok přefiltrujte přes dva středně husté skládané filtry.

4.11.2. Barvicí roztok (zásobní roztok 2)

V 1 000 ml 20 % obj. kyseliny octové rozpusťte 5,0 g síranu měďnatého, pentahydrátu.

4.11.3. Barvicí roztok (pracovní roztok)

Bezprostředně před barvením smíchejte 125 ml obou zásobních roztoků (4.11.1 a 4.11.2).

Poznámka: Barvicí roztok je třeba použít v den přípravy.

5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

5.1. Skleněné desky (265 x 125 x 4 mm), pryžový váleček (o šířce 15 cm), nivelační stolek.

5.2. Nosná fólie gelu (265 × 125 mm)

5.3. Krycí fólie (280 × 125 mm). Na každý dlouhý okraj nalepte pruh lepicí pásky (280 × 6 × 0,25 mm) (viz obrázek 1).

5.4. Elektrofokusační komora s chladicí deskou (např. 265 × 125 mm) a vhodný napájecí zdroj (≥ 2,5 kV) nebo automatické elektroforetické zařízení

5.5. Cirkulační kryostat s regulací teploty ve výši 12 ± 0,5 °C

5.6. Odstředivka nastavitelná na 3 000 g

5.7. Elektrodové proužky (o délce ≥ 265 mm)

5.8. Plastové kapací nádobky na anodový a katodový roztok

5.9. Aplikátory vzorku (10 × 5 mm, z viskózy nebo filtračního papíru s nízkou adsorpcí bílkovin)

5.10. Odbarvovací a barvicí misky (např. misky na nástroje 280 × 150 mm) z nerezové oceli nebo skleněné

5.12. Nastavitelný tyčový homogenizátor s průměrem tyče 10 mm a rychlostí 8 000 až 20 000 ot/min

5.13. Magnetická míchačka

5.14. Ultrazvuková lázeň

5.15. Svářečka fólií

5.16. Mikropipety na 25 μl

5.17. Vakuová odstředivka nebo lyofilizátor

5.18. Termostatem řízená vodní lázeň, nastavitelná na 35 a 40 ± 1 °C s třepačkou

5.19. Densitometrické zařízení umožňující měření na vlnové délce λ = 634 nm

6. PRACOVNÍ POSTUP

6.1. Příprava vzorku

6.1.1. Izolace kaseinů

Do odstředivkové kyvety na 100 ml navažte množství sýra nebo referenčního standardu odpovídající 5 g sušiny, přidejte 60 ml destilované vody a obsah homogenizujte tyčovým homogenizátorem (8 000 až 10 000 ot/min). Upravte pH na 4,6 zředěnou kyselinou octovou (4.5.1) a odstřeďujte (5 minut, 3 000 g). Dekantujte tuk a syrovátku a zbytek homogenizujte při 20 000 ot/min se 40 ml destilované vody s hodnotou pH upravenou na 4,5 zředěnou kyselinou octovou (4.5.1). Přidejte 20 ml dichlormethanu (4.5.2) a znovu homogenizujte a odstřeďuje (5 minut, 3 000 g). Špachtlí vyjměte kaseinovou vrstvu, která se nachází mezi vodnou a organickou fází (viz obrázek 2), a obě fáze dekantujte. Kasein se znovu homogenizuje se 40 ml destilované vody (viz výše) a 20 ml dichlormethanu (4.5.2) a odstředí se. Tento postup opakujte, dokud obě extrakční fáze nejsou bezbarvé (dvakrát až třikrát). Bílkovinný zbytek homogenizujte s 50 ml acetonu (4.5.3) a přefiltrujte přes středně hustý skládaný papírový filtr. Zbytek promyjte dvěma samostatnými 25 ml dávkami acetonu a nechte vysušit na vzduchu nebo v proudu dusíku. Potom jemně rozmělněte v třecí misce.

Poznámka: Suché bílkovinné extrakty se musí uchovávat při teplotě – 20 °C.

6.1.2. Přeměna β-kaseinů na γ-kaseiny působením plasminu

Rozptylte 25 mg izolovaných kaseinů (6.1.1) v 0,5 ml tlumivého roztoku uhličitanu amonného (4.7.1) a směs 20 minut homogenizujte, např. ultrazvukem. Směs zahřejte na 40 °C a přidejte 10 μl plasminu (4.7.2), promíchejte a inkubujte 1 hodinu při teplotě 40 °C za stálého třepání. Pro inhibici enzymu přidejte 20 μl roztoku kyseliny ε-aminokapronové (4.7.3). Poté přidejte 200 mg pevné močoviny a 2 mg dithiothreitolu.

Poznámka: Pro získání lepší symetrie fokusovaných kaseinových pásů se doporučuje po přidání kyseliny ε-aminokapronové roztok lyofilizovat a poté zbytky rozpustit v 0,5 ml tlumivého roztoku pro rozpouštění bílkovin (4.6).

6.2. Příprava polyakrylamidových gelů s obsahem močoviny

Na skleněnou desku (5.1) válečkem naneste nosnou fólii gelu (5.2) s pomocí několika kapek vody a přebytečnou vodu odsajte papírovým ubrouskem nebo kapesníčkem. Stejným způsobem válečkem naneste druhou, krycí fólii (5.3) s distančními vložkami (0,25 mm) na jinou skleněnou desku. Tuto druhou desku uložte vodorovně na nivelační stolek.

K připravenému odplyněnému roztoku gelu (4.1.2) přidejte 10 μl Temedu (4.1.3.1), protřepejte a přidejte 10 μl roztoku PER (4.1.3.2); důkladně promíchejte a okamžitě nalijte rovnoměrně na střed krycí fólie. Jeden okraj nosné desky gelu (stranou s fólií směrem dolů) přiložte k desce s krycí fólií a pomalu pokládejte tak, aby se mezi fóliemi vytvořila pravidelně rozprostřená tenká vrstva gelu bez bublin (obrázek 3). Pomocí tenké špachtle nosnou desku gelu opatrně přitiskněte po celé délce a položte na ni tři další skleněné desky, aby ji zatížily. Po skončení polymerace (asi po 60 minutách) spolu s krycí fólií sejměte gel zpolymerovaný na nosné fólii gelu tak, že skleněné desky nakloníte. Zadní stranu nosné fólie pečlivě očistěte, aby se odstranily zbytky gelu a močoviny. „Gelový sendvič“ zavařte do tenké fólie a uložte do chladničky (nejdéle na šest týdnů).

Poznámka: Krycí fólii s distančními vložkami lze použít znovu. Polyakrylamidový gel může být rozřezán na menší části; je to vhodné v případě omezeného počtu vzorků nebo v případě použití automatického elektroforetického zařízení (dva gely o rozměrech 4,5 × 5 cm).

6.3. Izoelektrická fokusace

Nastavte kryostat na 12 °C. Zadní stranu nosné fólie gelu otřete kerosinem a poté na střed chladicího bloku kápněte několik kapek kerosinu (4.2). Opatrně přiložte „gelový sendvič“ nosnou fólií obrácený dolů, aby se vytlačily všechny vzduchové bubliny. Přebytečný kerosin otřete a sejměte krycí fólii. Elektrodové proužky napusťte elektrodovými roztoky (4.3, 4.4), seřízněte na délku gelu a uložte na místo (vzdálenost elektrod 9,5 cm).

Podmínky izoelektrické fokusace

6.3.1. Rozměry gelu 265 × 125 × 0,25 mm

Fáze Doba (min) Napětí (V) Proud (mA) Příkon (W) Volty/hodiny (Vh) 1. Předběžná fokusace 30 max. 2 500 max. 15 konstantní 4 cca 300 2. Fokusace vzorku (7) 60 max. 2 500 max. 15 konstantní 4 cca 1 000 3. Konečná fokusace 60 max. 2 500 max. 5 max. 20 cca 3 000 40 max. 2 500 max. 6 max. 20 cca 3 000 30 max. 2 500 max. 7 max. 25 cca 3 000

Poznámka: Jestliže se změní tloušťka nebo šířka gelů, hodnoty proudu a příkonu musí být odpovídajícím způsobem upraveny (např. hodnoty proudu a příkonu se zdvojnásobí, použije-li se gel o rozměrech 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Příklad programování napětí u automatického elektroforetického zařízení (2 gely 5,0 × 4,5 cm, elektrody bez proužků se přikládají přímo na gel.

Fáze Napětí Proud Příkon Teplota Volty/hodiny 1. Předběžná fokusace 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Fokusace vzorku 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusace 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusace 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

Aplikátor vzorku ve fázi 2 vložte při 0 Vh.

Aplikátor vzorku ve fázi 2 odstraňte při 30 Vh.

6.4. Barvení bílkovin

6.4.1. Fixace bílkovin

Okamžitě po vypnutí napájení se odstraní elektrodové proužky a gel se ihned vloží do barvicí/odbarvovací misky naplněné 200 ml fixatéru (4.9). Gel v ní ponechte 15 minut za stálého třepání.

6.4.2. Praní a barvení gelové desky

Fixatér beze zbytku dekantujte a gelovou desku dvakrát promývejte po dobu 30 sekund vždy ve 100 ml odbarvovacího roztoku (4.10) Odbarvovací roztok dekantujte, misku naplňte 250 ml barvicího roztoku (4.11.3) a gel nechte za mírného třepání po dobu 45 minut zbarvovat.

6.4.3. Odbarvení gelové desky

Barvicí roztok dekantujte a gelovou desku dvakrát promývejte po dobu 30 sekund vždy ve 100 ml odbarvovacího roztoku (4.10). Poté 15 minut protřepávejte s 200 ml odbarvovacího roztoku; fázi odbarvování opakujte nejméně dvakrát až třikrát, dokud není pozadí čiré a bezbarvé. Gelovou desku potom promyjte destilovanou vodou (2 × 2 minuty) a nechte uschnout na vzduchu (2 až 3 hodiny) nebo usušte vysoušečem vlasů (10 až 15 minut).

Poznámka 1: Fixaci, promývání, barvení a odbarvování provádějte při teplotě 20 °C. Vyšší teploty nepoužívejte.

Poznámka 2: Pokud upřednostňujete citlivější obarvení stříbrem (např. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, kód č. 17-1150-01), musí být kaseinové vzorky ošetřené plasminem zředěny v poměru 5 mg/ml.

7. HODNOCENÍ

Hodnocení se provádí porovnáním proteinových obrazců zkoumaného vzorku s obrazci referenčních standardů u stejného gelu. Zjišťování kravského mléka v sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka nebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka se provádí prostřednictvím γ3- a γ2-kaseinů, jejichž izoelektrické body se nacházejí v rozmezí mezi pH 6,5 a pH 7,5 (obrázky 4a, b, obrázek 5). Detekční mez je nižší než 0,5 %.

7.1. Vizuální hodnocení

Pro vizuální hodnocení množství kravského mléka se doporučuje upravit koncentraci vzorků a referenčních standardů s cílem dosáhnout u hovězích, kozích a/nebo buvolích γ2- a γ3-kaseinů (viz „γ2 E,G,B“ a „γ3 E,G,B“ na obrázcích 4a, b a obrázku 5) stejné úrovně intenzity. Pouze za těchto podmínek lze přímo posoudit množství kravského mléka (menší nebo větší než 1 % nebo ve výši 1 %) v analyzovaném vzorku porovnáním intenzity hovězích γ3- a γ2-kaseinů (viz „γ3 C“ a „γ2 C“ na obrázcích 4 a, b a obrázku 5) s intenzitami kaseinů v referenčních standardech s obsahy 0 % a 1 % (ovčích, kozích), nebo prozatímních laboratorních standardech (buvolích).

7.2. Denzitometrické hodnocení

Pokud je to možné, použijte pro stanovení poměru mezi plochami píků hovězích γ2- a γ3-kaseinů a plochami píků ovčích, kozích a/nebo buvolích γ2- a γ3-kaseinů (viz obrázek 5) denzitometrii (5.19). Tuto hodnotu porovnejte s poměrem ploch píků γ2- a γ3-kaseinů v 1 % referenčním standardu (ovčím, kozím) nebo prozatímním laboratorním standardu (buvolím) analyzovaných u téhož gelu.

Poznámka: Tato metoda funguje uspokojivě, pokud existuje jasný pozitivní signál obou hovězích γ2- a γ3-kaseinů v 1 % referenčním standardu, avšak nikoli v 0 % referenčním standardu. V opačném případě je nutné postup optimalizovat při přesném dodržení pokynů stanovených v dané metodě.

Vzorek je považován za pozitivní, jestliže hodnoty obou hovězích γ2- a γ3-kaseinů nebo příslušných poměrů ploch píků jsou stejné nebo větší než hodnoty odpovídající 1 % referenčnímu standardu.

8. LITERATURA

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708–711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83–85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195–199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43–56 (1980).

Obrázek 1

Schematický výkres krycí fólie

Obrázek 2

Kaseinová vrstva plovoucí mezi vodnou a organickou fází po odstředění

Obrázek 3

Sklápěcí technika pro odlévání ultratenkých polyakrylamidových gelů

a = distanční páska (0,25 mm); b = krycí fólie (5.3); c, e = skleněné desky (5.1); d = gelový roztok (4.1.2); f = nosná fólie gelu (5.2).

Obrázek 4a

Izoelektrická fokusace kaseinů ze sýrů z ovčího a kozího mléka, ošetřených plasminem, s různým obsahem kravského mléka

% CM = procento kravského mléka, C = kravské, E = ovčí, G = kozí

Na obrázku je znázorněna horní polovina gelu IEF.

Obrázek 4b

Izoelektrická fokusace kaseinů ze sýrů vyrobených ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka, ošetřených plasminem, s různým obsahem kravského mléka

% CM = procento kravského mléka; 1 + = vzorek s obsahem 1 % kravského mléka a s přídavkem čistého hovězího kaseinu ve středu dráhy. C = kravské, E = ovčí, G = kozí, B = buvolí

Na obrázku je znázorněna celá separační vzdálenost gelu IEF.

Obrázek 5

Superpozice denzitogramů referenčních standardů (STD) a vzorků sýra vyrobeného ze směsi ovčího a kozího mléka, po izoelektrické fokusaci

a, b = referenční standardy obsahující 0 a 1 % kravského mléka; c-g = vzorky sýra obsahujícího 0, 1, 2, 3 a 7 % kravského mléka; C = kravské, E = ovčí, G = kozí.

Byla snímána horní polovina gelu IEF při λ = 634 nm.