PŘÍLOHA III

Příprava vzorků a požadavky na analytické metody používané při úřední kontrole obsahu dioxinů (PCDD/PCDF) a PCB s dioxinovým efektem v některých potravinách

1. OBLAST POUŽITÍ

Požadavky stanovené v této příloze se vztahují na analýzu potravin pro úřední kontrolu obsahu polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů substituovaných v polohách 2,3,7,8 a polychlorovaných dibenzofuranů (PCDD/PCDF) a polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem (PCB s dioxinovým efektem) a pro další regulativní účely.

Sledování přítomnosti PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v potravinách může mít dva různé cíle:

2. KLASIFIKACE METOD PODLE STUPNĚ KVANTIFIKACE (1)

„Kvalitativní metody“ dávají jednoznačnou odpověď (ano/ne), co se týče přítomnosti sledovaných analytů, avšak bez kvantitativních údajů o koncentraci domnělého analytu. Tyto metody mohou mít potenciál pro poskytování semikvantitativních výsledků, avšak používají se výhradně pro vydání rozhodnutí, zda úrovně překračují či nikoliv určitá rozpětí, např. mez detekce, mez kvantifikace nebo mezní hodnoty.

Pro kontrolu maximálních a akčních limitů PCDD/PCDF a sloučenin s dioxinovým efektem v potravinách mohou být použity screeningové metody založené na porovnání výsledku analýzy s mezní hodnotou, které dávají odpověď ano/ne, pokud jde o možné překročení sledovaného limitu. Za tímto účelem byly zavedeny bioanalytické metody. V zásadě by bylo možné vyvinout také fyzikálně-chemické metody; pokud však jde o maximální a akční limity vycházející z TEQ a o komplexní analýzu s požadovaným stanovením příslušných jednotlivých kongenerů, neexistují žádné konkrétní příklady.

„Semikvantitativní metody“ poskytují přibližné údaje o koncentraci, které mohou být přínosné jakožto informace o rozpětí koncentrace analytu a rovněž užitečné pro osobu provádějící analýzu při rozhodování o kalibračním rozsahu pro následně prováděnou konfirmační zkoušku a pro účely kontroly kvality. Pro příklad lze uvést:

„Kvantitativní metody“ splňují stejné požadavky na správnost, dynamický rozsah a přesnost jako konfirmační zkoušky. Pokud je zapotřebí kvantifikace, je třeba, aby tyto metody byly validovány jako konfirmační metody, jak je podrobně vysvětleno v tomto dokumentu pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

3. SOUVISLOSTI

Pro výpočet koncentrací toxických ekvivalentů (TEQ) se koncentrace jednotlivých látek v daném vzorku vynásobí jejich příslušnými toxickými ekvivalenčními faktory (TEF), které jsou stanoveny Světovou zdravotnickou organizací a jsou uvedeny v dodatku k této příloze, sečtou se a výsledný součet je celkovou koncentrací sloučenin s dioxinovým efektem vyjádřenou v toxických ekvivalentech (TEQ).

Screeningové a konfirmační metody mohou být použity pouze pro kontrolu určité matrice, pokud jsou tyto metody dostatečně citlivé, aby spolehlivě zjistily hladiny na sledované úrovni (akční nebo maximální limit).

4. POŽADAVKY NA ZABEZPEČENÍ KVALITY

5. POŽADAVKY NA LABORATOŘE

6. ZÁKLADNÍ POŽADAVKY, KTERÉ MUSÍ SPLŇOVAT ANALYTICKÝ POSTUP U DIOXINŮ (PCDD/PCDF) A PCB S DIOXINOVÝM EFEKTEM

6.1 Nízký pracovní rozsah a meze kvantifikace

6.2 Vysoká selektivita (specifičnost)

6.3 Vysoká správnost (pravdivost a přesnost, zjevná výtěžnost biologické zkoušky)

6.4 Validace v rozsahu sledované úrovně a obecná opatření pro kontrolu kvality

6.5 Mez kvantifikace

6.6 Analytická kritéria

6.7 Zvláštní požadavky na screeningové metody

Poté, co je k dispozici nejméně 20 potvrzených výsledků z kontroly kvality vyhovujících vzorků na matrici / matricovou skupinu, vyvodí se z těchto výsledků závěry ohledně míry falešně vyhovujících výsledků. Do minimálního počtu 20 výsledků pro hodnocení míry falešně vyhovujících výsledků se mohou zahrnout i výsledky ze vzorků analyzovaných pomocí okružních rozborů nebo při kontaminačních aférách, které pokrývají rozpětí koncentrace až např. do dvojnásobku maximálního limitu. Vzorky musí zahrnovat nejčastější zastoupení kongenerů, která představují různé zdroje.

7. ZVLÁŠTNÍ POŽADAVKY, KTERÉ MUSÍ SPLŇOVAT METODY GC/HRMS, ABY VYHOVOVALY PRO ÚČELY SCREENINGU NEBO KONFIRMACE

7.1 Obecné požadavky

7.2 Kontrola výtěžnosti

7.3 Odstranění interferujících látek

7.4 Kalibrace pomocí standardní křivky

8. ZVLÁŠTNÍ POŽADAVKY NA BIOANALYTICKÉ METODY

Bioanalytické metody jsou metody založené na využití biologických principů, jako jsou buněčné testy, receptorové testy nebo imunologické testy. Tato část 8 stanoví obecné požadavky na bioanalytické metody.

Screeningové metody v zásadě klasifikují vzorky jako vyhovující nebo vzorky podezřelé jako nevyhovující. Za tímto účelem se vypočtená hladina BEQ porovnává s mezní hodnotou (viz 8.3). Vzorky nižší než mezní hodnota se považují za vyhovující, vzorky rovnající se mezní hodnotě nebo vyšší se považují za podezřelé jako nevyhovující a je nutné provést jejich analýzu pomocí konfirmační metody. Prakticky může jako nejvhodnější mezní hodnota sloužit množství BEQ odpovídající 2/3 maximálního limitu, přičemž taková mezní hodnota zajišťuje míru falešně vyhovujících vzorků nižší než 5 % a přijatelnou míru falešně nevyhovujících vzorků. Při různých maximálních limitech pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem vyžaduje kontrola souladu vzorků bez frakcionace vhodné mezní hodnoty pro biologickou zkoušku pro PCDD/PCDF. Pro kontrolu vzorků překračujících akční limity je vhodnou mezní hodnotou přiměřené procento příslušné sledované úrovně.

V případě některých bioanalytických metod může být navíc stanovena orientační úroveň vyjádřená v BEQ pro vzorky v pracovním rozsahu, které přesahují oznamovací mez (viz 8.1.1. a 8.1.6.).

8.1 Hodnocení odezvy

8.1.1 Obecné požadavky

8.1.2 Kalibrace

8.1.2.1 Kalibrace pomocí standardní křivky

8.1.2.2 Kalibrace pomocí referenčních vzorků

Případně lze použít kalibrační křivku zhotovenou alespoň ze čtyř referenčních vzorků (viz bod 8.2: jednoho matričního slepého vzorku plus tří referenčních vzorků na polovině, jednonásobku a dvojnásobku sledované úrovně) kolem sledované úrovně, čímž odpadne nutnost odečtu hodnoty slepého stanovení a korekce na výtěžnost. V tomto případě lze odezvu odpovídající 2/3 maximální úrovně (viz 8.3) vypočítat přímo z těchto vzorků a použít ji jako mezní hodnotu. Pro kontrolu vzorků překračujících akční limity je vhodnou mezní hodnotou přiměřené procento těchto akčních limitů.

8.1.3 Samostatné stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem

Extrakty lze rozdělit do frakcí obsahujících PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, což umožňuje získání oddělených údajů o hladinách TEQ pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem (v BEQ). Pro hodnocení výsledků pro frakci obsahující PCB s dioxinovým efektem se přednostně použije kalibrační křivka standardu PCB 126.

8.1.4 Zjevná výtěžnost biologické zkoušky

„Zjevná výtěžnost biologické zkoušky“ se vypočte z vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem sledované úrovně a vyjádří se jako procento hladiny BEQ v porovnání s hladinou TEQ. V závislosti na použitém typu zkoušky a použitých TEF (3) mohou rozdíly mezi faktory TEF a REP pro PCB s dioxinovým efektem způsobit nízkou zjevnou výtěžnost u PCB s dioxinovým efektem v porovnání s PCDD/PCDF. Proto při samostatném stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem musí být zjevná výtěžnost biologických zkoušek následující: u PCB s dioxinovým efektem 25 % až 60 %, u PCDD/PCDF 50 % až 130 % (rozmezí platná pro kalibrační křivku TCDD). Jelikož podíl PCB s dioxinovým efektem na sumě PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se může u různých matric a vzorků lišit, odráží se tyto rozdíly i ve zjevné výtěžnosti biologických zkoušek pro tento souhrnný parametr, která se musí pohybovat v rozmezí 30 % až 130 %.

8.1.5 Kontrola výtěžnosti o ztráty při čištění

8.1.6 Oznamovací mez

8.2 Použití referenčních vzorků

8.3 Stanovení mezních hodnot

Je nutné určit vztah mezi výsledky biologické zkoušky v BEQ a výsledky GC/HRMS v TEQ (např. pomocí kalibračních pokusů, které zohledňují vliv matrice, s referenčními vzorky obohacenými na nule, polovině, jednonásobku a dvojnásobku maximálního limitu s šesti opakováními na každé úrovni (n = 24)). Na základě tohoto vztahu lze odhadnout korekční faktory (odečtení blanku a korekce na výtěžnost), je však nutno je v každé sérii zkoušek ověřit zahrnutím slepých vzorků / matričních slepých vzorků a vzorků výtěžnosti (8.2).

Je nutné stanovit mezní hodnoty pro účely rozhodnutí ohledně souladu vzorku s maximálními limity nebo pro kontrolu akčních limitů, jsou-li sledovanou hodnotou, s příslušnými sledovanými úrovněmi buď zvlášť pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, nebo pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem. Tyto hodnoty jsou zastoupeny nižším cílovým bodem distribuce výsledků biologické zkoušky (upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) odpovídajícím rozhodovací mezi u GC/HRMS na základě 95% spolehlivosti, z čehož vyplývá míra falešně vyhovujících výsledků < 5 %, a na základě RSDR < 25 %. Rozhodovací mezí u GC/HRMS je maximální limit při zohlednění nejistoty měření.

V praxi lze mezní hodnotu (v BEQ) vypočítat těmito způsoby (viz graf č. 1):

8.3.1 S použitím nižší části 95% predikčního intervalu na úrovni rozhodovací meze GC/HRMS

kde:

je parametr sumy čtverců, i = index pro kalibrační bod i

8.3.2 Z výsledků biologické zkoušky (upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) získaných z vícenásobných analýz vzorků (n ≥ 6) kontaminovaných na úrovni rozhodovací meze GC/HRMS, jakožto nižší část rozdělení výsledků na odpovídající průměrné hodnotě BEQ:

Mezní hodnota = BEQDL – 1,64 × SDR

kde

8.3.3 Výpočet jako střední hodnota výsledků biologické zkoušky (v BEQ, upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) z vícenásobné analýzy vzorků (n ≥ 6) kontaminovaných na 2/3 sledované úrovně. To vychází z poznatku, že tato úroveň se bude pohybovat kolem mezní hodnoty určené podle 8.3.1 nebo 8.3.2.

Graf č. 1

Výpočet mezních hodnot vycházející z 95% míry spolehlivosti, z níž vyplývá míra falešně vyhovujících výsledků < 5 %, a z RSDR < 25 %: 1. z nižší části 95 % predikčního intervalu na úrovni rozhodovací meze HRGC/HRMS, 2. z vícenásobné analýzy vzorků (n ≥ 6) kontaminovaných na úrovni rozhodovací meze HRGC/HRMS jakožto nižší část distribuce údajů (v grafu je znázorňuje křivka ve tvaru zvonu) na odpovídající průměrné hodnotě BEQ.

8.3.4 Omezení mezních hodnot:

Mezní hodnoty vycházející z BEQ a vypočtené z RSDR dosažené při validaci s použitím omezeného počtu vzorků s různým zastoupením matrice/kongenerů mohou být vyšší než sledované úrovně vycházející z TEQ, vzhledem k větší přesnosti, než je přesnost, jíž lze běžně dosáhnout s neznámým spektrem zastoupení kongenerů. V takových případech se mezní hodnoty vypočtou z RSDR = 25 % nebo se dá přednost dvěma třetinám sledované úrovně.

8.4 Kritéria výkonnosti

9. VYDÁVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Konfirmační metody

Bioanalytické screeningové metody

(1) Přizpůsobeno PCDD/PCDF a sloučeninám s dioxinovým efektem z „Pokynů pro validaci screeningových metod pro rezidua veterinárních léčivých přípravků“ referenčních laboratoří EU pro rezidua veterinárních léčivých přípravků ve Fougeres, Berlíně a Bilthovenu, 20.1.2010, http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/lab_analysis_en.htm

(2) s ohledem na maximální limity

(3) Současné požadavky vycházejí z TEF vydaných v: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

Dodatek k PŘÍLOZE III

WHO-TEF (toxické ekvivalenční faktory Světové zdravotnické organizace) pro hodnocení nebezpečnosti pro člověka vycházející ze závěrů zasedání odborníků Světové zdravotnické organizace (WHO) – Mezinárodní program chemické bezpečnosti (IPCS), které se konalo v Ženevě v červnu 2005 (Martin Van den Berg et al., 2005. The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).