15)

V části B se doplňují tyto kapitoly: „B.59 Senzibilizace kůže in chemico: zkouška přímé reaktivity peptidů (DPRA) ÚVOD Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 442C (2015). Jako látka senzibilizující kůži se označuje látka, která po styku s kůží vyvolává alergickou odpověď, jak ji definuje globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek Organizace spojených národů (GHS OSN) (1) a nařízení Evropské unie (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí (CLP) (18). Tato zkušební metoda popisuje postup in chemico (zkoušku přímé reaktivity peptidů – DPRA), který se má podpůrně použít k rozlišování mezi látkami senzibilizujícími kůži a látkami nesenzibilizujícími kůži v souladu s GHS OSN a CLP. Existuje všeobecná shoda, pokud jde o klíčové biologické procesy, jež zapříčiňují senzibilizaci kůže. Dosavadní znalosti o chemických a biologických mechanismech souvisejících se senzibilizací kůže byly shrnuty ve formě Dráhy nežádoucího účinku (AOP) (2) počínaje molekulární iniciační událostí přes průběžné události až po nepříznivý účinek, a sice alergickou kontaktní dermatitidu u lidí nebo kontaktní přecitlivělost u hlodavců. V rámci AOP pro senzibilizaci kůže je molekulární iniciační událostí kovalentní vazba elektrofilních látek na nukleofilní centra v kožních proteinech. Hodnocení senzibilizace kůže bylo obvykle prováděno na pokusných zvířatech. Klasické metody založené na morčatech, Magnussonova-Klingmannova maximalizační zkouška na morčatech (GPMT) a Bühlerova zkouška (zkušební metoda B.6 (3)), studují indukční i provokační fázi senzibilizace kůže. Uznána byla i zkouška na myších, a sice zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin (LLNA, zkušební metoda B.42 (4)) a její dvě neradioaktivní modifikace, LLNA: DA (zkušební metoda B.50 (5)) a LLNA: BrdU-ELISA (zkušební metoda B.51 (6)), které všechny posuzují výlučně odpověď na indukci; neboť ve srovnání se zkouškami na morčatech jsou vhodnější z hlediska dobrého zacházení se zvířaty a objektivního měření indukční fáze senzibilizace kůže. V poslední době jsou za vědecky platné metody pro hodnocení nebezpečnosti chemických látek pro senzibilizaci kůže považovány mechanisticky založené zkušební metody in chemico a in vitro. Protože však každá z těchto nyní dostupných zkušebních metod bez použití zvířat mechanisticky pokrývá AOP jen v omezeném rozsahu, bude pro úplné nahrazení nyní používaných zkoušek na zvířatech zapotřebí kombinace metod bez použití zvířat (in silico, in chemico, in vitro) v rámci integrovaného přístupu ke zkouškám a posuzování (IATA) (2) (7). Zkouška DPRA je navržena ke zkoumání molekulární iniciační události AOP pro senzibilizaci kůže, konkrétně reaktivity proteinů, pomocí kvantifikace reaktivity zkoušených chemických látek vůči modelovým syntetickým peptidům obsahujícím lysin nebo cystein (8). Na základě procentuálních hodnot úbytku cysteinových a lysinových peptidů se pak látka zařadí do jedné ze čtyř tříd reaktivity, což pomáhá rozlišovat mezi látkami senzibilizujícími kůži a látkami nesenzibilizujícími kůži (9). Zkušební metoda DPRA byla validována ve validační studii provedené pod vedením Referenční laboratoře Evropské unie pro alternativy ke zkouškám na zvířatech (EURL ECVAM), následně byla podrobena nezávislé odborné revizi, kterou provedl vědecký poradní výbor (ESAC) EURL ECVAM, a uznána za vědecky platnou (10) pro použití v rámci integrovaných přístupů IATA na podporu rozlišení mezi látkami senzibilizujícími a nesenzibilizujícími kůži pro účely klasifikace a označování nebezpečnosti. Příklady využití údajů DPRA v kombinaci s jinými informacemi jsou uvedeny v odborné literatuře (11) (12) (13) (14). Definice jsou uvedeny v dodatku 1. VÝCHOZÍ ÚVAHY, POUŽITELNOST A OMEZENÍ Korelace mezi reaktivitou proteinů a potenciálem senzibilizace kůže byla spolehlivě zjištěna (15) (16) (17). Ačkoli se jedná o molekulární iniciační události AOP pro senzibilizace kůže, vazba na proteiny představuje pouze jeden klíčový jev, takže informace o reaktivitě proteinů získané zkušebními i nezkušebními metodami nemusí samy o sobě stačit k vyvození závěru o neexistenci potenciálu chemických látek způsobovat senzibilizaci kůže. Údaje získané pomocí této zkušební metody by proto měly být zvažovány v kontextu integrovaných přístupů, jako je např. IATA, v kombinaci s jinými doplňujícími informacemi např. pocházejícími ze zkoušek in vitro zkoumajících jiné klíčové události v rámci metody AOP pro stanovení senzibilizace kůže, jakož i z nezkušebních metod včetně údajů odvozených z analogických chemických látek. Tuto zkušební metodu lze v kombinaci s jinými doplňujícími informacemi v rámci přístupu IATA použít na podporu rozlišení mezi látkami senzibilizujícími kůži (tj. kategorie 1 GHS OSN /CLP) a látkami nesenzibilizujícími kůži. Tuto zkušební metodu nelze používat samu o sobě ani k zařazení látek senzibilizujících kůži do podkategorií 1A a 1B, jak je definuje systém GHS OSN / CLP, ani k predikci účinnosti těchto látek při rozhodování v rámci posuzování bezpečnosti. V závislosti na regulačním rámci však kladný výsledek získaný zkušební metodou DPRA může být použit sám o sobě ke klasifikaci chemické látky v kategorii 1 GHS OSN / CLP. U zkušební metody DPRA se prokázalo, že ji lze přenést do laboratoří, které mají zkušenosti s analýzou pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Míra reprodukovatelnosti předpovědí, které lze od této zkušební metody očekávat, činí řádově 85 % v rámci laboratoří a 80 % mezi laboratořemi (10). Výsledky validační studie (18) a zveřejněných studií (19) celkově ukazují, že přesnost zkušební metody DPRA při odlišení senzibilizujících látek (tj. kategorie 1 GHS OSN / CLP) od nesenzibilizujících látek činí 80 % (N=157) při citlivosti 80 % (88/109) a specifičnosti 77 % (37/48) ve srovnání s výsledky zkušební metody LLNA. V případě DPRA je pravděpodobnější, že povede k příliš nízké předpovědi u chemických látek vykazujících nízkou až střední potenci způsobovat senzibilizaci kůže (tj. podkategorie 1B GHS OSN / CLP), než u chemických látek vykazujících vysokou potenci způsobovat senzibilizaci kůže (tj. podkategorie 1A GHS OSN / CLP (18) (19). Zde uvedené hodnoty přesnosti DPRA jako samostatné zkušební metody jsou však pouze orientační, protože tato zkušební metoda by měla být zvažována v kombinaci s jinými zdroji informací v rámci přístupu IATA a v souladu s ustanoveními odstavce 9 výše. Při hodnocení metod posuzování senzibilizace kůže bez použití zvířat by se dále mělo vést v patrnosti, že ani zkouška LLNA, ani jiné zkoušky na zvířatech nemusí plně odrážet situaci existující u druhu, který je předmětem zájmu, tj. u lidí. Na základě celkových dostupných údajů bylo prokázáno, že zkušební metodu DPRA lze použít v případě zkoušených chemických látek, jež obsahují různé organické funkční skupiny, mají různé reakční mechanismy, různou potenci způsobovat senzibilizaci kůže (jak bylo stanoveno ve studiích in vivo) a různé fyzikálně-chemické vlastnosti (8) (9) (10) (19). Celkově vzato z těchto informací vyplývá, že zkušební metoda DPRA je užitečná a může přispět ke zjištění nebezpečí senzibilizace kůže. Termín „zkoušená chemická látka“ se v této zkušební metodě používá k označení toho, co se zkouší, a nesouvisí s použitelností zkušební metody DPRA ke zkoušení látek a/nebo směsí. Tuto zkušební metodu nelze použít k testování sloučenin kovů, protože je o nich známo, že s proteiny reagují prostřednictvím jiných mechanismů, než je kovalentní vazba. Zkoušená chemická látka by měla být rozpustná ve vhodném rozpouštědle při konečné koncentraci 100 mM (viz odstavec 18). Chemické látky, které nejsou při této koncentraci rozpustné, je nicméně přesto možné testovat při koncentracích nižších, ve kterých jsou rozpustné. V takovém případě by přesto mohl být pozitivní výsledek použit na podporu identifikace zkoušené chemické látky jako látky senzibilizující kůži, avšak z negativního výsledku by se neměl vyvozovat závěr, že není dostatečné reaktivní. V současnosti jsou k dispozici jen omezené informace o použitelnosti zkušební metody DPRA ke zkoušení směsí se známým složením (18) (19). DPRA je nicméně považována za technicky použitelnou k testování vícesložkových látek a směsí se známým složením (viz odstavec 10). Před použitím této zkušební metody ke zkoušení směsi za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by mělo být zváženo, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové posouzení není nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi. Vzhledem k definovanému molárnímu poměru zkoušené chemické látky k peptidu není možné stávající predikční model použít ke zkoušení komplexních směsí s neznámým složením nebo látek s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexních reakčních produktů nebo biologického materiálu (tj. látek UVCB). Pro tento účel bude nutné vyvinout nový predikční model založený na gravimetrické metodě. V případech, kdy mohou být předloženy důkazy prokazující nepoužitelnost této zkušební metody ke zkoušení jiných specifických kategorií chemických látek, neměla by se tato zkušební metoda na tyto specifické kategorie chemických látek používat. Tato zkušební metoda je metodou in chemico, která nezahrnuje metabolický systém. Pomocí této zkušební metody není možné detekovat chemické látky, které pro prokázání svého potenciálu senzibilizace kůže potřebují enzymatickou bioaktivaci (tj. prohapteny). V literatuře se uvádí, že v některých případech byly za pomocí této zkušební metody správně detekovány chemické látky, které se stávají senzibilizujícími látkami po abiotické přeměně (tj. prehapteny) (18). Vzhledem k výše uvedenému by se měly negativní výsledky získané touto zkušební metodou interpretovat v kontextu stanovených omezení a ve spojení s jinými zdroji informací v rámci přístupu IATA. Při zkoušení chemických látek, které se na peptidy kovalentně neváží, ale podporují jejich oxidaci (dimerizaci cysteinů), by mohlo potenciálně dojít k příliš vysokému odhadu úbytku peptidů, což může vést k falešným pozitivním předpovědím a/nebo k zařazení do vyšší třídy reaktivity (viz odstavce 29 a 30). Jak bylo popsáno výše, zkušební metoda DPRA pomáhá rozlišovat mezi látkami senzibilizujícími kůži a látkami nesenzibilujícími kůži. Může však také potenciálně přispět k hodnocení senzibilizační potence (11), je-li používána v rámci integrovaných přístupů, například IATA. Pro určení toho, jak mohou výsledky DPRA potenciálně přispět k posuzování potence, však bude nutný další výzkum, přednostně založený na údajích o účincích na člověka. PODSTATA ZKOUŠKY DPRA je metoda in chemico, která kvantifikuje zbytkovou koncentraci peptidů obsahujících cystein nebo lysin po 24hodinové inkubaci se zkoušenou chemickou látkou při teplotě 25 ± 2,5 °C. K usnadnění detekce obsahují syntetické peptidy fenylalanin. Relativní koncentrace peptidů se měří pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s gradientovou elucí a UV detekcí při vlnové délce 220 nm. Poté se vypočítají procentuální hodnoty úbytku cysteinových a lysinových peptidů a použijí se v predikčním modelu (viz odstavec 29), což umožní zařadit zkoušenou chemickou látku do jedné ze čtyř tříd reaktivity, které se podpůrně používají k rozlišení mezi senzibilizujícími a nesenzibilizujícími látkami. Před rutinním používáním popsané metody, která se řídí touto zkušební metodou, by měly laboratoře prokázat odbornou způsobilost použitím deseti látek pro prokazování způsobilosti, které jsou uvedeny v dodatku 2. POSTUP Tato zkušební metoda je založena na protokolu DPRA DB-ALM č. 154 (20), což je protokol použitý při validační studii provedené za koordinace EURL ECVAM. Při provádění a používání této metody v laboratoři se doporučuje použít tento protokol. Dále je uveden popis hlavních složek a postupů zkušební metody DPRA. Použije-li se jiné nastavení vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), měla by být prokázána jeho rovnocennost validovanému nastavení, které je popsáno v protokolu DB-ALM (např. testováním vhodných látek uvedených v dodatku 2). Příprava peptidů obsahujících cystein nebo lysin Zásobní roztoky cysteinu (Ac-RFAACAA-COOH) a lysinu (Ac-RFAAKAA-COOH) obsahující syntetické peptidy o čistotě vyšší než 85 % a přednostně v rozmezí 90–95 % by se měly připravovat čerstvé bezprostředně před jejich inkubací se zkoušenou chemickou látkou. Konečná koncentrace cysteinových peptidů ve fosfátovém pufru s pH 7,5 by měla být 0,667 mM a konečná koncentrace lysinových peptidů v pufru octanu amonného s pH 10,2 by měla být 0,667 mM. Série provedení HPLC by se měla nastavit tak, aby trvání analýzy HPLC bylo kratší než 30 hodin. Při nastavení HPLC použitém ve validační studii a popsaném v této zkušební metodě je možné v rámci jednoho provedení HPLC zpracovat až 26 analytických vzorků (jež zahrnují vzorky se zkoušenou chemickou látkou, pozitivní kontrolu a přiměřený počet kontrol s rozpouštědlem na základě počtu jednotlivých rozpouštědel použitých ve zkoušce, přičemž každý z nich se testuje třikrát). U všech replik analyzovaných v rámci jednoho provedení by měly být použity totožné zásobní roztoky cysteinových a lysinových peptidů. U jednotlivých šarží peptidů se před použitím doporučuje ověřit správnou rozpustnost. Příprava zkoušené chemické látky Před provedením zkoušky by měla být posouzena rozpustnost zkoušené chemické látky ve vhodném rozpouštědle za dodržení postupu rozpouštění popsaného v protokolu DPRA DB-ALM (20). Ve vhodném rozpouštědle se zkoušená chemická látka rozpustí beze zbytku. Jelikož při zkoušce DPRA se zkoušená chemická látka inkubuje ve velkém přebytku s cysteinovými nebo lysinovými peptidy, stačí k ověření toho, že se zkoušená chemická látka (a všechny její složky v případě zkoušení vícesložkové látky nebo směsi) rozpustila, vizuální kontrola tvorby čirého roztoku. Vhodnými rozpouštědly jsou acetonitril, voda, směs voda/acetonitril v poměru 1:1, izopropanol, aceton nebo směs aceton/acetonitril v poměru 1:1. Lze použít i jiná rozpouštědla, pokud nemají vliv na stabilitu peptidů, sledovanou pomocí referenční kontroly C (tj. vzorky sestávající pouze z peptidů rozpuštěných ve vhodném rozpouštědle; viz dodatek 3). Poslední možností, není-li zkoušená chemická látka rozpustná v žádném z těchto rozpouštědel, je pokusit se ji rozpustit ve 300 μl DMSO a výsledný roztok zředit přidáním 2 700 μl acetonitrilu, a pokud zkoušená chemická látka není v této směsi rozpustná, pokusit se rozpustit stejné množství zkoušené chemické látky v 1 500 μl DMSO a výsledný roztok zředit přidáním 1 500 μl acetonitrilu. Zkoušená chemická látka by měla být předem odměřena do skleněných zkumavek a bezprostředně před zkoušením rozpuštěna ve vhodném rozpouštědle k získání 100 mM roztoku. U směsí a vícesložkových látek se známým složením by se měla stanovit jediná čistota součtem podílů jejich složek (s výjimkou vody) a měla by se stanovit celková molekulová hmotnost na základě jednotlivých molekulových hmotností každé složky směsi (s výjimkou vody) a jejich jednotlivých podílů. Výsledná čistota a molekulová hmotnost by poté měly být použity k výpočtu hmotnosti zkoušené chemické látky nezbytné pro přípravu 100 mM roztoku. U polymerů, u kterých není možné stanovit dominantní molekulovou hmotnost, lze pro přípravu 100 mM roztoku posoudit molekulovou hmotnost monomeru (nebo zdánlivou molekulovou hmotnost různých monomerů tvořících polymer). Při zkoušení směsí, vícesložkových látek nebo polymerů se známým složením by však mělo být zváženo také zkoušení chemické látky v neředěném stavu. V případě kapalin by měla být zkoušena čistá chemická látka jako taková bez předchozího ředění prostřednictvím inkubace s cysteinovými peptidy v molárním poměru 1:10 a s lysinovými peptidy v molárním poměru 1:50. V případě pevných látek by měla být zkoušená chemická látka rozpuštěna v maximální rozpustné koncentraci ve stejném rozpouštědle, které bylo použito na přípravu roztoku se zdánlivou molekulovou hmotností 100 mM. Poté by měla zbýt zkoušena jako taková bez dalšího ředění tak, že se inkubuje s cysteinovými peptidy v molárním poměru 1:10 a s lysinovými peptidy v molárním poměru 1:50. Souhlasné výsledky (reaktivita nebo nereaktivita) mezi roztokem se zdánlivou molekulovou hmotností 100 mM a roztokem čisté chemické látky by měly umožnit vyvodit na základě tohoto výsledku spolehlivý závěr. Příprava pozitivní kontroly, referenčních kontrol a kontrol koelucí Jako pozitivní kontrola by měl být použit cinnamaldehyd (č. CAS 104-55-2, potravinářské čistoty ≥95 %) v roztoku o koncentraci 100 mM v acetonitrilu. Lze použít i jiné vhodné pozitivní kontroly přednostně poskytující hodnoty úbytku středního rozsahu, pokud jsou k dispozici dosavadní údaje umožňující odvodit srovnatelná kritéria přijatelnosti daného provedení zkoušky. Do série provedení HPLC by navíc měly být zařazeny referenční kontroly (tj. vzorky obsahující pouze peptidy rozpuštěné ve vhodném rozpouštědle), které se používají k ověření vhodnosti systému HPLC před analýzou (referenční kontroly A), k ověření stability referenčních kontrol v časovém průběhu (referenční kontroly B) a k ověření toho, že rozpouštědlo použité k rozpuštění zkoušené chemické látky nemá vliv na procentuální úbytek peptidů (referenční kontroly C) (viz dodatek 3). Pro každou chemickou látku se použije vhodná referenční kontrola k výpočtu procentuálního úbytku peptidů vyvolaného touto chemickou látkou (viz odstavec 26). Do série provedení by rovněž měla být pro každou zkoušenou chemickou látku, která se analyzuje, zařazena kontrola koeluce sestávající pouze ze zkoušené chemické látky, s cílem detekovat případnou koeluci zkoušené chemické látky s lysinovými nebo cysteinovými peptidy. Inkubace zkoušené chemické látky s roztoky cysteinových a lysinových peptidů Roztoky cysteinových a lysinových peptidů by se měly inkubovat ve skleněných zkumavkách s automatickým dávkovačem se zkoušenou chemickou látkou v poměru 1:10 pro cysteinové a 1:50 pro lysinové peptidy. Je-li ihned po přidání roztoku zkoušené chemické látky do roztoku peptidů zpozorována sraženina v důsledku nízké rozpustnosti zkoušené chemické látky ve vodě, nelze si v tomto případě být jistý, jaké množství zkoušené chemické látky zůstalo v roztoku a bude moci reagovat s peptidy. Proto by v takovém případě pozitivní výsledek mohl být i přesto použit, ale negativní výsledek je nejistý a měl by být interpretován s velkou opatrností (viz též ustanovení odstavce 11 o zkoušení chemických látek, které nejsou rozpustné až do koncentrace 100 mM). Před provedením analýzy HPLS by reakční roztok měl být ponechán v temnu při teplotě 25 ± 2,5 °C po dobu 24 ± 2 hodin. Každá zkoušená chemická látka by se měla analyzovat třikrát s každým z obou druhů peptidů. Před analýzou HPLC se musí vzorky vizuálně zkontrolovat. Je-li zjištěna sraženina nebo fázová separace, lze vzorky odstředit při nízké rychlosti (100–400xg), aby se sraženina z preventivních důvodů vytlačila ke dnu zkumavky, neboť velké množství sraženiny může ucpat trubice nebo kolony HPLC. Je-li sraženina nebo fázová separace zjištěna po inkubační době, může v případě negativního výsledku dojít k podhodnocenému odhadu a závěr o nedostatečné reaktivitě nelze učinit s dostatečnou jistotou. Příprava kalibrační křivky standardů pro HPLC Kalibrační křivka standardů by měla být stanovena pro cysteinové i pro lysinové peptidy. Standardy peptidů by měly být připraveny ve 20 % nebo 25 % pufračním roztoku acetonitrilu za použití fosfátového pufru (pH 7,5) pro cysteinové peptidy a pufru octanu sodného (pH 10,2) pro lysinové peptidy. S použitím standardu sériového ředění pro zásobní roztok s peptidy (0,667 mM) by se mělo připravit 6 kalibračních roztoků pokrývajících rozsah od 0,534 do 0,0167 mM. Do kalibrační křivky standardů by měla být rovněž zanesena slepá zkouška s ředicím pufrem. Vhodné kalibrační křivky by měly mít r2 > 0,99. Příprava a analýza HPLC Před provedením analýzy by se měla ověřit vhodnost systému HPLC. Úbytek peptidů se sleduje pomocí HPLC s připojeným UV detektorem (fotodiodový detektor nebo absorpční detektor s fixní vlnovou délkou se signálem 220 nm). Do systému HPLC se nainstaluje vhodná kolona. Nastavení HPLC popsané ve validační studii používá přednostně kolonu Zorbax SB-C-18 o rozměrech 2,1 mm × 100 mm × 3,5 micronu. S touto kolonou HPLC na reverzní fázi by se celý systém měl nechat před provedením analýzy nejméně po dobu 2 hodin ustálit při teplotě 30 °C s 50 % fází A (0,1 % obj. roztok kyseliny trifluoroctové ve vodě) a 50 % fází B (0,085 % obj. roztok kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu). Analýza HPLC by se měla provádět za průtoku 0,35 ml/min a s lineárním gradientem od 10 % do 25 % acetonitrilu za 10 minut, s následným prudkým zvýšením na 90 % acetonitrilu za účelem odstranění jiných materiálů. Injekcí by měly být nastříknuty stejné objemy každého standardu, vzorku a kontroly. Kolona by se mezi injekcemi měla znovu nechat ustálit za původních podmínek po dobu 7 minut. Použije-li se jiná kolona HPLC na reverzní fázi, bude možná nutné upravit výše popsané nastavení parametrů, aby se zajistila přiměřená eluce a integrace cysteinových a lysinových peptidů, včetně vstřikovaného objemu, který se může lišit (obvykle v rozmezí od 3 do 10 μl) podle použitého systému. Důležité je, že při použití jiného nastavení HPLC by měla být prokázána jeho rovnocennost s validovaným nastavením, které je popsáno výše (např. testováním vhodných látek uvedených v dodatku 2). Absorbance se měří při 220 nm. Je-li použit fotodiodový detektor, měla by se rovněž zaznamenávat absorbance při 258 nm. Je třeba poznamenat, že některé dodávky acetonitrilu by mohly mít negativní dopad na stabilitu peptidů, a toto se musí posoudit při použití nové šarže acetonitrilu. Jako ukazatel koeluce lze použít poměr plochy píků při 220 nm k ploše píků při 258 nm. Poměr v rozmezí 90 % < střední hodnota (19) poměru plochy u kontrolních vzorků < 100 % u každého vzorku by znamenal přesvědčivou známku toho, že ke koeluci nedošlo. Mohou se vyskytnout zkoušené chemické látky, které by mohly podporovat oxidaci cysteinových peptidů. Pík dimerizovaného cysteinového peptidu je možné sledovat vizuálně. Pokud se zdá, že došlo k dimerizaci, mělo by to být zaznamenáno, neboť může dojít k příliš vysokému odhadu procentuálního úbytku peptidů, což vede k falešným pozitivním předpovědím a/nebo k zařazení do vyšší třídy reaktivity (viz odstavce 29 a 30) Analýzu cysteinových a lysinových peptidů pomocí metody HPLC lze provádět souběžně (jsou-li k dispozici dva systémy HPLC), nebo v různých dnech. Provádí-li se analýza v různých dnech, pak by se všechny roztoky zkušebních chemických látek měly čerstvě připravit pro obě analýzy v každý příslušný den. Analýza by měla být načasována tak, aby se zajistilo, že vstříknutí prvního vzorku začne po uplynutí 22 až 26 hodin od okamžiku, kdy byla zkoušená chemická látka smíchána s roztokem peptidu. Série provedení HPLC by se měla nastavit tak, aby trvání analýzy HPLC bylo kratší než 30 hodin. Při nastavení HPLC, které bylo použito ve validační studii a je popsáno v této zkušební metodě, lze v jedné sérii provedení HPLC zpracovat až 26 analytických vzorků (viz též odstavec 17). Příklad série provedení analýzy HPLC je uveden v dodatku 3. ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV Vyhodnocení údajů Koncentrace cysteinových nebo lysinových peptidů se stanoví v každém vzorku fotometricky při 220 nm změřením plochy píku (plocha pod křivkou) vhodných píků a výpočtem koncentrace peptidů pomocí lineární kalibrační křivky odvozené od standardů. Procentuální úbytek peptidů se stanoví v každém vzorku změřením plochy píku, která se vydělí střední hodnotou plochy píku příslušných referenčních kontrol C (viz dodatek 3) podle níže uvedeného vzorce. Kritéria přijatelnosti Aby se provedení mohlo považovat za platné, měla by být splněna tato kritéria: a) kalibrační křivka standardů by měla mít r2 > 0,99; b) střední hodnota procentuálního úbytku peptidů ze tří replik pozitivní kontroly v cinnamaldehydu by měla být mezi 60,8 % a 100 % u cysteinového peptidu a mezi 40,2 % and 69,0 % u lysinového peptidu a maximální směrodatná odchylka (SD) replik pozitivní kontroly by měla být < 14,9 % pro procentuální úbytek cysteinových peptidů a < 11,6 % pro procentuální úbytek lysinových peptidů; a c) střední hodnota koncentrace peptidů z referenčních kontrol A by měla být 0,50 ± 0,05 mM a varianční koeficient (CV) píkových ploch peptidů u devíti referenčních kontrol B a C v acetonitrilu by měl být < 15,0 %. Není-li jedno nebo více těchto kritérií splněno, mělo by se provedení opakovat. Aby se výsledky zkoušení zkoušené chemické látky mohly považovat za platné, měla by být splněna tato kritéria: a) maximální směrodatná odchylka u replik se zkoušenou chemickou látkou by měla být < 14,9 % u procentuálního úbytku cysteinu a < 11,6 % u procentuálního úbytku lysinu; b) střední hodnota koncentrace peptidů ze tří referenčních kontrol C ve vhodném rozpouštědle by měla být 0,50 ± 0,05 mM. Nejsou-li tato kritéria splněna, měly by se údaje zamítnout a provedení s touto konkrétní zkoušenou chemickou látkou by se mělo opakovat. Predikční model Pro každou zkoušenou chemickou látku se vypočítá střední hodnota procentuálního úbytku cysteinu a procentuálního úbytku lysinu. Záporný úbytek se při výpočtu střední hodnoty považuje za „0“. S použitím predikčního modelu cystein 1:10 / lysin 1:50, jak je uvedeno v tabulce 1, by rozlišení mezi látkami senzibilizujícímu kůži a látkami nesenzibilizujícími kůži v rámci přístupu IATA mělo umožnit použití prahové hodnoty průměrného úbytku peptidů ve výši 6,38 %. Uplatnění tohoto predikčního modelu pro zařazení zkoušené chemické látky do příslušné třídy reaktivity (tj. nízká, střední a vysoká reaktivita) se snad může osvědčit jako užitečný zdroj informací pro posouzení potence v rámci přístupu IATA. Tabulka 1 Predikční model cystein 1:10 / lysin 1:50 (20) Střední hodnota procentuálního úbytku cysteinu a lysinu Třída reaktivity Předpověď DPRA (21) 0 % ≤ střední hodnota procentuálního úbytku ≤ 6,38 % Žádná nebo minimální reaktivita Negativní 6,38 % < střední hodnota procentuálního úbytku ≤ 22,62 % Nízká reaktivita Pozitivní 22,62 % < střední hodnota procentuálního úbytku ≤ 42,47 % Střední reaktivita 42,47 % < střední hodnota procentuálního úbytku ≤ 100 % Vysoká reaktivita Mohly by se vyskytnout případy, kdy zkoušená chemická látka (látka nebo jedna nebo několik složek vícesložkové látky nebo směsi) při 220 nm značně absorbuje a má stejný retenční čas jako peptid (koeluce). Koeluci lze vyřešit mírnou úpravou nastavení HPLC, aby se více oddělil eluční čas zkoušené chemické látky a eluční čas peptidu. Při použití jiného nastavení HPLC ve snaze vyřešit koeluci by měla být prokázána jeho rovnocennost s validovaným nastavením (např. testováním vhodných látek uvedených v dodatku 2). Dojde-li ke koeluci, pík peptidu nelze integrovat a výpočet procentuálního úbytku peptidu není možný. Jestliže dojde ke koeluci takových zkoušených chemických látek s cysteinovými i lysinovými peptidy, měla by být analýza označena za „neprůkaznou“. V případech, kdy dojde ke koeluci pouze s lysinovým peptidem, lze použít predikční model cystein 1:10 uvedený v tabulce Tabulka 2 Predikční model cystein 1:10 (22) Procentuální úbytek cysteinu (Cys) Třída reaktivity Předpověď DPRA (23) 0 % ≤ procentuální úbytek Cys ≤ 13,89 % Žádná nebo minimální reaktivita Negativní 13,89 % < procentuální úbytek Cys ≤ 23,09 % Nízká reaktivita Pozitivní 23,09 % < procentuální úbytek Cys ≤ 98,24 % Střední reaktivita 98,24 % < procentuální úbytek Cys ≤ 100 % Vysoká reaktivita Mohly by se vyskytnout jiné případy, kdy se retenční čas zkoušené chemické látky a retenční čas některého z peptidů zcela nepřekrývá. V takových případech lze hodnoty procentuálního úbytku peptidu odhadnout a použít je v predikčním modelu cystein 1:10 / lysin 1:50, avšak zařazení zkoušené chemické látky do třídy reaktivity nelze provést s přesností. Jediná analýza HPLC pro hodnocení cysteinových i lysinových peptidů by měla být pro zkoušenou chemickou látku dostačující, pokud je výsledek jednoznačný. Avšak v případě výsledků přibližujících se prahové hodnotě použité pro rozlišení mezi pozitivními a negativními výsledky (tj. hraničních výsledků) může být nezbytné další zkoušení. V situacích, kdy se střední hodnota procentuálního úbytku nachází v rozmezí 3 % až 10 % v predikčním modelu cystein 1:10 / lysin 1:50 nebo kdy se procentuální úbytek cysteinu nachází v rozmezí 9 % až 17 % v predikčním modelu cystein 1:10, by mělo být zváženo druhé provedení a v případě nesouhlasných výsledků prvního a druhého provedení by mělo být zváženo třetí provedení. Závěrečná zpráva Závěrečná zpráva by měla obsahovat následující informace: Zkoušená chemická látka — Jednosložková látka — chemická identifikace, např. název (názvy) IUPAC nebo CAS, číslo (čísla) CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec a/nebo jiné identifikátory, — fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě, molekulová hmotnost a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné, atd., — případné ošetření před zkoušením (např. zahřívání, mletí), — zkušební koncentrace, — podmínky skladování a stabilita, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné. — Vícesložková látka, UVCB a směs — charakterizovaná v co možná největší míře např. chemickou identitou (viz výše), čistotou, kvantitativním výskytem a důležitými fyzikálně-chemickými vlastnostmi (viz výše) složek, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — molekulová hmotnost nebo zdánlivá molekulová hmotnost v případě směsí/polymerů se známým složením nebo jiné informace důležité pro provedení studie, — případné ošetření před zkoušením (např. zahřívání, mletí), — zkušební koncentrace, — podmínky skladování a stabilita, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné. Kontroly — Pozitivní kontrola — chemická identifikace, např. název (názvy) IUPAC nebo CAS, číslo (čísla) CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec a/nebo jiné identifikátory, — fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě, molekulová hmotnost a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné, atd., — případné ošetření před zkoušením (např. zahřívání, mletí), — zkušební koncentrace, — podmínky skladování a stabilita, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — odkaz na případné dosavadní výsledky pozitivních kontrol prokazující vhodnost kritérií přijatelnosti provedení. — Rozpouštědlo/vehikulum — použité rozpouštědlo/vehikulum a případně poměr jeho složek, — chemická identifikace, např. název (názvy) IUPAC nebo CAS, číslo (čísla) CAS a/nebo jiné identifikátory, — čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné, atd., — fyzický vzhled, molekulová hmotnost a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti v případě použití jiných rozpouštědel/vehikul než rozpouštědel/vehikul uvedených v této zkušební metodě, a to v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — podmínky skladování a stabilita, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné. — zdůvodnění volby rozpouštědla pro každou zkoušenou chemickou látku, — u acetonitrilu výsledky zkoušky dopadu na stabilitu peptidů. Příprava peptidů, pozitivní kontroly a zkoušené chemické látky — charakterizace roztoku peptidů (dodavatel, šarže, přesná hmotnost peptidu, objem přidaný do zásobního roztoku), — charakterizace roztoku pozitivní kontroly (přesná hmotnost pozitivní kontrolní látky, objem přidaný do zkušebního roztoku), — charakterizace roztoků zkoušené chemické látky (přesná hmotnost zkoušené chemické látky, objem přidaný do zkušebního roztoku). HPLC – nastavení přístrojů a analýza — druh analyzátoru HPLC, kolon HPLC a předkolon, detektoru, automatického dávkovače, — důležité parametry pro analýzu HPLC, jako např. teplota v kolonách, objem nástřiku, průtok a gradient. Vhodnost systému — plocha píku peptidů při 220 nm v každém standardu a v každé replice referenční kontroly A, — lineární kalibrační křivka v grafickém vyjádření a udaná hodnota r2, — koncentrace peptidů v každé replice referenční kontroly A, — střední hodnota koncentrace peptidu (v mM) ve třech referenčních kontrolách A, směrodatná odchylka a variační koeficient, — koncentrace peptidu v referenčních kontrolách A a C. Série analýzy — U referenčních kontrol: — plocha píku peptidů při 220 nm v každé replice B a C, — střední hodnota plochy píku peptidů při 220 nm v devíti referenčních kontrolách B a C v acetonitrilu, směrodatná odchylka a variační koeficient (pro zajištění stability referenčních kontrol po celou dobu analýzy), — pro každé použité rozpouštědlo střední hodnota plochy píku peptidů při 220 nm ve třech vhodných referenčních kontrolách C (pro výpočet procentuálního úbytku peptidů), — u každého použitého rozpouštědla koncentrace peptidů (v mM) ve třech vhodných referenčních kontrolách C, — u každého použitého rozpouštědla střední hodnota koncentrace peptidů (v mM) ve třech vhodných referenčních kontrolách C, směrodatná odchylka a variační koeficient. — Ohledně pozitivní kontroly: — plocha píku peptidů při 220 nm v každé replice, — procentuální úbytek peptidů v každé replice, — střední hodnota procentuálního úbytku peptidů ve třech replikách, směrodatná odchylka a variační koeficient. — U každé zkoušené chemické látky: — vzhled sraženiny v reakční směsi na konci inkubační doby, byla-li zjištěna; zda byla sraženina rozpuštěna nebo odstředěna, — přítomnost koeluce, — případně popis jakýchkoli jiných důležitých zjištění z pozorování, — plocha píku peptidů při 220 nm v každé replice, — procentuální úbytek peptidů v každé replice, — střední hodnota procentuálního úbytku peptidů ve třech replikách, směrodatná odchylka a variační koeficient, — střední hodnota procentuálního úbytku cysteinu a procentuálního úbytku lysinu, — použitý predikční model a předpověď DPRA. Zkoušení způsobilosti — Případný postup použitý k prokázání způsobilosti laboratoře k provádění této zkušební metody (např. zkoušením látek pro prokázání způsobilosti) nebo k prokázání reprodukovatelného provedení této zkušební metody v průběhu doby. Diskuse o výsledcích — diskuse o výsledcích získaných pomocí zkušební metody DPRA, — diskuse o výsledcích zkušební metody v rámci IATA, jsou-li k dispozici jiné příslušné informace. Závěr LITERATURA 1) United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Dostupné na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html 2) OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris. 3) Kapitola B.6 této přílohy: Senzibilizace kůže. 4) Kapitola B.42 této přílohy: Zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin. 5) Kapitola B.50 této přílohy: Senzibilizace kůže: zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin: DA. 6) Kapitola B.51 této přílohy: Senzibilizace kůže: zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin: BrdU-ELISA. 7) Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85:367-485. 8) Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81:332-343. 9) Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97:417-427. 10) EC EURL-ECVAM (2013). Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing. Dostupné na: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra 11) Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. Journal of Applied Toxicology, published online, 14 May 2013, DOI: 10.1002/jat.2869. 12) Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489-504. 13) Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618. 14) Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389-400. 15) Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625-639. 16) Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc. 17) Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin. 18) EC EURL-ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 74pp. Dostupné na: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra 19) Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI:10.1002/jat.2868. 20) DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Dostupné na: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/ 21) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France. 22) FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Dostupné na: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf – 138 23) ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87). Dodatek 1 DEFINICE Přesnost : Přesnost shody mezi výsledky zkušební metody a přijatými referenčními hodnotami. Je to měření výsledku zkušební metody a jednoho aspektu „důležitosti“. Tento výraz se často používá namísto výrazu „soulad“ a rozumí se jím podíl správných výsledků zkušební metody (21). AOP (Dráha nežádoucího účinku) : Sled událostí od chemické struktury cílové chemické látky nebo skupiny podobných chemických látek přes molekulární iniciační událost po účinek in vivo, který je předmětem zájmu (2). Kalibrační křivka : Vztah mezi hodnotou experimentální odpovědi a analytickou koncentrací (rovněž nazývaná standardní křivka) známé látky. Chemická látka : Látka nebo směs. Variační koeficient : Míra variability, která se vypočítává pro skupinu údajů z replik tak, že se směrodatná odchylka vydělí průměrem. Lze ho vynásobit 100 za účelem vyjádření v procentech. Nebezpečnost : Základní charakteristika látky nebo situace, která má potenciál vyvolat nepříznivé účinky, jsou-li organismus, systém nebo (sub)populace vystaveny této látce. IATA (integrovaný přístup ke zkoušení a posuzování) : Strukturovaný přístup používaný pro zjišťování nebezpečnosti (potenciál), charakterizaci rizik (potence) a/nebo posouzení bezpečnosti (potenciál/potence a expozice) chemické látky nebo skupiny chemických látek, jenž strategicky integruje a váží všechny důležité údaje s cílem poskytnout informace pro přijetí regulačního rozhodnutí, které se týká potenciální nebezpečnosti a/nebo rizika a/nebo potřeby dalšího cíleného, a tudíž minimálního zkoušení. Molekulární iniciační událost : Narušení biologického systému na molekulární úrovni vyvolané chemickou látkou, jež bylo identifikováno jako počáteční událost v mechanismu nepříznivých účinků. Směs : Směs nebo roztok tvořený dvěma nebo více látkami, které v něm nereagují (1). Jednosložková látka : Látka definovaná svým kvantitativním složením, v níž je přítomna jedna hlavní složka v míře alespoň 80 % hmot. Vícesložková látka : Látka definovaná svým kvantitativním složením, v níž je přítomna více než jedna hlavní složka v koncentraci ≥ 10 % hmot. a < 80 % hmot. Vícesložková látka je výsledkem výrobního procesu. Rozdíl mezi směsí a vícesložkovou látkou spočívá v tom, že směs se získá smísením dvou nebo více látek bez chemické reakce. Vícesložková látka je výsledkem chemické reakce. Pozitivní kontrola : Replika obsahující všechny složky zkušebního systému s přidáním látky, o níž je známo, že způsobuje pozitivní reakci. Aby se zajistilo, že proměnlivost v reakci na pozitivní kontrolu bude možné časem vyhodnotit, rozsah pozitivní reakce by neměl být nadměrný. Referenční kontrola : Neexponovaný vzorek obsahující všechny složky zkušebního systému, včetně rozpouštědla nebo vehikula, který se zpracovává s exponovanými zkoušenými chemickými látkami a jinými kontrolními vzorky, aby se zjistila základní reakce vzorků zkoušených se zkoušenou chemickou látkou rozpuštěnou ve stejném rozpouštědle nebo vehikulu. Když se použije souběžně s negativní kontrolou, ukazuje také, zda rozpouštědlo nebo vehikul vzájemně reaguje se zkušebním systémem. Relevantnost : Popis vztahu zkoušky k účinku, který je předmětem zájmu, a také toho, zda je zkouška smysluplná a použitelná pro konkrétní účel. Vyjadřuje, do jaké míry zkouška správně měří nebo predikuje biologický účinek, který je předmětem zájmu. Relevantnost zahrnuje také posouzení přesnosti (shody) zkušební metody (21). Spolehlivost : Měření rozsahu, v jakém může být zkušební metoda časem reprodukovatelná v laboratořích a mezi laboratořemi, když se provádí s použitím stejného protokolu. Hodnotí se to výpočtem laboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti a laboratorní opakovatelnosti (21). Reprodukovatelnost : Shoda mezi výsledky získanými při zkoušení téže chemické látky za použití stejného zkušebního protokolu (viz spolehlivost) (21). Citlivost : Podíl všech pozitivních/aktivních chemických látek, které jsou na základě zkušební metody správně zatříděny. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která poskytuje kategorické výsledky, a je důležitým prvkem při hodnocení relevantnosti zkušební metody (21). Specifičnost : Podíl všech negativních/neaktivních chemických látek, které jsou na základě zkušební metody správně zatříděny. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která poskytuje kategorické výsledky, a je důležitým prvkem při hodnocení relevantnosti zkušební metody (21). Látka : Chemické prvky nebo jejich sloučeniny v přírodním stavu nebo získané výrobním procesem včetně všech přídatných látek nutných k uchování stability výrobku a všech nečistot vznikajících v použitém procesu, ale s vyloučením všech rozpouštědel, která je možno oddělit bez ovlivnění stability látky nebo změny jejího složení (1). Vhodnost systému : Určení výkonnosti (např. citlivosti) přístrojů pomocí analýzy referenčního standardu před zavedením analytické sady (22). Zkoušená chemická látka : Termín „zkoušená chemická látka“ se používá k označení toho, co se podrobuje zkoušení. Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek Organizace spojených národů (GHS OSN) : Systém navrhující klasifikaci látek a směsí podle standardizovaných typů a úrovní fyzikálních, zdravotních a environmentálních nebezpečí a řešící příslušné komunikační prvky, jako jsou piktogramy, signální slova, výroky o nebezpečí, výroky o bezpečnostních opatřeních a bezpečnostní datové listy, které obsahují informace o jejich nežádoucích účincích s ohledem na ochranu lidí (včetně zaměstnavatelů, dělníků, přepravců, spotřebitelů a osob reagujících na havárie) a životního prostředí (1). UVCB : Látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkty nebo biologický materiál. Validovaná zkušební metoda : Zkušební metoda, u níž se má za to, že je dostatečně relevantní a spolehlivá pro určitý účel, a která je založena na vědecky spolehlivých zásadách. Zkušební metoda není nikdy validovaná v absolutním smyslu, ale pouze pro určitý konkrétní účel (21). Dodatek 2 LÁTKY PRO PROKÁZÁNÍ ZPŮSOBILOSTI Senzibilizace kůže in chemico: zkouška přímé reaktivity peptidů Dříve než začnou laboratoře běžně používat tuto zkušební metodu, měly by prokázat odbornou způsobilost správným získáním předpokládané předpovědi DPRA u 10 vhodných látek doporučených v tabulce 1 a získáním hodnot úbytku cysteinu a lysinu, které spadají do příslušného referenčního rozpětí, u 8 z 10 vhodných látek pro každý peptid. Tyto vhodné látky byly vybrány tak, aby představovaly rozpětí účinků z hlediska nebezpečí senzibilizace kůže. Dalšími kritérii výběru bylo, aby byly komerčně dostupné, aby k nim byly k dispozici vysoce kvalitní referenční údaje získané in vivo a vysoce kvalitní údaje získané zkouškou DPRA in vitro a aby byly použity ve validační studii provedené za koordinace EURL ECVAM k prokázání úspěšného provedení této zkušební metody v laboratořích, které se na studii podílely. Tabulka 1 Doporučené látky k prokázání odborné způsobilosti k provádění zkoušky přímé reaktivity peptidů Látky pro zkoušení způsobilosti Registrační číslo CAS Skupenství Předpověď in vivo (24) Předpověď DPRA (25) Rozpětí (26) procentuálního úbytku cysteinových peptidů Rozpětí (26) procentuálního úbytku lysinových peptidů 2,4-dinitrochlorbenzen 97-00-7 Pevné Senzibilizující (extrémně) Pozitivní 90–100 15–45 Oxazolon 15646-46-5 Pevné Senzibilizující (extrémně) Pozitivní 60–80 10–55 Formaldehyd 50-00-0 Kapalné Senzibilizující (silně) Pozitivní 30–60 0–24 Benzylidenaceton 122-57-6 Pevné Senzibilizující (středně silně) Pozitivní 80–100 0–7 Farnesal 19317-11-4 Kapalné Senzibilizující (slabě) Pozitivní 15–55 0–25 Butanedion 431-03-8 Kapalné Senzibilizující (slabě) Pozitivní 60–100 10–45 Butan-1-ol 71-36-3 Kapalné Nesenzibilizující Negativní 0–7 0–5,5 6-methylkumarin 92-48-8 Pevné Nesenzibilizující Negativní 0–7 0–5,5 Kyselina mléčná 50-21-5 Kapalné Nesenzibilizující Negativní 0–7 0–5,5 4-methoxyacetofenon 100-06-1 Pevné Nesenzibilizující Negativní 0–7 0–5,5 Dodatek 3 PŘÍKLADY ANALYTICKÉ SÉRIE Kalibrační standardy a referenční kontroly STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 Ředicí pufr Referenční kontrola A, replika 1 Referenční kontrola A, replika 2 Referenční kontrola A, replika 3 Kontroly koeluce Kontrola koeluce 1 pro zkoušenou chemickou látku 1 Kontrola koeluce 2 pro zkoušenou chemickou látku 2 Referenční kontroly Referenční kontrola B, replika 1 Referenční kontrola B, replika 2 Referenční kontrola B, replika 3 První sada replik Referenční kontrola C, replika 1 Cinnamaldehyd, replika 1 Vzorek 1, replika 1 Vzorek 2, replika 1 Druhá sada replik Referenční kontrola C, replika 2 Cinnamaldehyd, replika 2 Vzorek 1, replika 2 Vzorek 2, replika 2 Třetí sada replik Referenční kontrola C, replika 3 Cinnamaldehyd, replika 3 Vzorek 1, replika 3 Vzorek 2, replika 3 Referenční kontroly Referenční kontrola B, replika 4 Referenční kontrola B, replika 5 Referenční kontrola B, replika 6 Do analytické série by měly být zařazeny tři sady referenčních kontrol (tj. vzorků sestávajících pouze z peptidu rozpuštěného ve vhodném rozpouštědle): Referenční kontrola A: používá se k ověření vhodnosti systému HPLC. Referenční kontrola B: zařadí se na začátku a na konci analytické série k ověření stability referenčních kontrol po dobu analýzy. Referenční kontrola C: zařadí se do analytické série k ověření, že rozpouštědlo použité k rozpuštění zkoušené chemické látky neovlivňuje procentuální úbytek peptidů. B.60 Senzibilizace kůže in vitro: zkušební metoda s vyšetřením luciferázy ARE-Nrf2 ÚVOD Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 442D (2015). Jako látka senzibilizující kůži se označuje látka, která po styku s kůží vyvolává alergickou odpověď, jak ji definuje globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek Organizace spojených národů (GHS OSN) (1) a nařízení Evropské unie (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí (CLP) (27). Tato zkušební metoda popisuje postup in vitro (zkoušku luciferázy ARE-Nrf2), který má být podpůrně použit k rozlišování mezi látkami senzibilizujícími kůži a látkami nesenzibilizujícími kůži v souladu s GHS OSN a s nařízením CLP. Existuje všeobecná shoda, pokud jde o klíčové biologické procesy, jež zapříčiňují senzibilizaci kůže. Dosavadní znalosti o chemických a biologických mechanismech spojených se senzibilizací kůže byly shrnuty ve formě Dráhy nežádoucích účinků (AOP) (2), která se odvíjí od molekulární iniciační události přes průběžné události až k výslednému nepříznivému účinku na zdraví, tj. alergickou kontaktní dermatitidu u lidí nebo kontaktní přecitlivělost u hlodavců (2) (3). Molekulární iniciační událostí je kovalentní navázání elektrofilních látek na nukleofilní centra v kožních proteinech. Druhá klíčová událost v této metodě AOP se odehrává v keratinocytech a zahrnuje zánětlivé odpovědi, jakož i expresi genů spojenou se specifickými dráhami buněčné signalizace, např. dráhami závislými na antioxidačním/elektrofilním responsním elementu (ARE). Třetí klíčovou událostí je aktivace dendritických buněk, typicky hodnocená podle exprese specifických buněčných povrchových markerů, chemokinů a cytokinů. Čtvrtou klíčovou událostí je proliferace T buněk, která se nepřímo hodnotí ve zkoušce s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin na myších (4). Hodnocení senzibilizace kůže bylo obvykle prováděno na pokusných zvířatech. Klasické metody založené na morčatech, Magnussonova-Klingmannova maximalizační zkouška na morčatech (GPMT) a Bühlerova zkouška (zkušební metoda B.6 (5)), studují indukční i provokační fázi senzibilizace kůže. Uznána byla i zkouška na myších, a sice zkouška vyšetřením lokálních místních uzlin (LLNA, zkušební metoda B.42 (4)) a její dvě neradioaktivní modifikace, LLNA: DA (zkušební metoda B.50 (6)) a LLNA: BrdU-ELISA (zkušební metoda B.51 (7)), které všechny posuzují výlučně odpověď na indukci; neboť oproti zkouškám na morčatech poskytují výhody z hlediska dobrého zacházení se zvířaty, i pokud jde o objektivní měření indukční fáze senzibilizace kůže. V poslední době jsou za vědecky platné metody pro hodnocení nebezpečnosti chemických látek pro senzibilizaci kůže považovány mechanisticky založené zkušební metody in chemico a in vitro. Protože však každá z těchto nyní dostupných zkušebních metod bez použití zvířat mechanisticky pokrývá AOP jen v omezeném rozsahu, bude pro úplné nahrazení nyní používaných zkoušek na zvířatech zapotřebí kombinace metod bez použití zvířat (in silico, in chemico, in vitro) v rámci integrovaného přístupu ke zkouškám a posuzování (IATA) (2) (3). Tato zkušební metoda (zkouška luciferázy ARE-Nrf2) se se navrhuje ke zkoumání druhé klíčové události, jak je vysvětleno v odstavci 2. V literatuře se uvádí, že látky senzibilizující kůži indukují geny, které jsou regulovány antioxidačním responsním elementem (ARE) (8) (9). Slabé elektrofilní látky, jako jsou látky senzibilizující kůži, mohou působit na senzorový protein Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) například kovalentní modifikací jeho zbytkového cysteinu, což vede k jeho disociaci od trankripčního faktoru Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2). Disociovaný Nrf2 může pak aktivovat geny závislé na ARE, např. ty, které kódují detoxifi kační enzymy fáze II (8) (10) (11). V současnosti je k dispozici jediná zkouška, která vyhovuje zde popsané zkušební metodě in vitro s vyšetřením luciferázy ARE-Nrf2, a to zkouška KeratinoSensTM, u které již byly dokončeny validační studie (9) (12) (13) s následnou nezávislou odbornou revizí, kterou provedla Referenční laboratoř Evropské unie pro alternativy ke zkouškám na zvířatech (EURL ECVAM) (14). Zkouška KeratinoSensTM byla uznána za vědecky platnou při použití v rámci přístupu IATA na podporu rozlišování mezi látkami senzibilizujícími kůži a látkami nesenzibilizujícími kůži za účelem klasifikace nebezpečnosti a označování (14). Laboratoře, které chtějí tuto zkušební metodu provádět, mohou získat rekombinantní buněčnou linii použitou ve zkoušce KeratinoSensTM po uzavření licenční dohody se subjektem, který tuto zkušební metodu vyvinul (15). Definice jsou uvedeny v dodatku 1. VÝCHOZÍ ÚVAHY, POUŽITELNOST A OMEZENÍ Jelikož se aktivace dráhy Keap1-Nrf2-ARE vztahuje pouze ke druhé klíčové události AOP pro senzibilizaci kůže, není pravděpodobné, že informace získané touto zkušební metodou na základě aktivace této dráhy, jsou-li použity samy o sobě, by byly dostatečné pro vyvození závěru o potenciálu chemických látek senzibilizovat kůži. Údaje získané pomocí této zkušební metody by proto měly posuzovány v kontextu integrovaných přístupů, např. IATA, v kombinaci s jinými doplňujícími informacemi získanými např. ze zkoušek in vitro, které zkoumají jiné klíčové události AOP pro senzibilizaci kůže, a také nezkušebními metodami včetně údajů odvozených z analogických chemických látek. Příklady využití údajů zkušební metody s vyšetřením luciferázy ARE-Nrf2 v kombinaci s jinými informacemi jsou uvedeny v literatuře (13) (16) (17) (18) (19). Tuto zkušební metodu je možné v rámci IATA podpůrně použít k rozlišování mezi látkami senzibilizujícími kůži (tj. kategorie 1 GHS OSN / CLP) a látkami nesenzibilizujícími kůži. Tuto zkušební metodu nelze používat samu o sobě, a to ani k zařazení látek senzibilizujících kůži do podkategorií 1A a 1B, jak je definuje systém GHS OSN / CLP, ani k predikci účinnosti těchto látek při rozhodování v rámci posuzování bezpečnosti. V závislosti na regulačním rámci však pozitivní výsledek může být sám o sobě použit ke klasifikaci chemické látky v kategorii 1 GHS OSN / CLP. Na základě souboru údajů z validační studie a z interního laboratorního testování použitého pro nezávislou odbornou revizi této zkušební metody bylo prokázáno, že zkoušku KeratinoSensTM lze přenést do laboratoří, které mají zkušenosti s kultivací buněk. Míra reprodukovatelnosti předpovědí, které lze od této zkušební metody očekávat, činí řádově 85 % v rámci laboratoří a 80 % mezi laboratořemi (14). Přesnost (77 % – 155/201), citlivost (78 % – 71/91) a specifičnost (76 % – 84/110) zkoušky KeratinoSensTM pro rozlišení mezi látkami senzibilizujícími kůži (tj. kategorie 1 UN GHS/CLP) a látkami nesenzibilizujícími kůži ve srovnání s výsledky zkoušky LLNA byly vypočteny na základě všech údajů, které byly předloženy EURL ECVAM za účelem vyhodnocení a odborné revize této zkušební metody. Tyto údaje jsou obdobné jako nedávno zveřejněné údaje založené na výsledcích interního testování asi 145 látek (přesnost 77 %, citlivost 79 %, specifičnost 72 %) (13). V případě zkoušky KeratinoSensTM je pravděpodobnější, že povede k příliš nízké předpovědi u chemických látek vykazujících nízkou až střední potenci způsobovat senzibilizaci kůže (tj. podkategorie 1B GHS OSN / CLP), než u chemických látek vykazujících vysokou potenci způsobovat senzibilizaci kůže (tj. podkategorie 1A GHS OSN / CLP) (13) (14). Celkově vzato tyto informace naznačují, že zkouška KeratinoSensTM může být užitečná a může přispět k zjištění nebezpečí senzibilizace kůže. Zde uvedené hodnoty přesnosti zkoušky KeratinoSensTM jako samostatné zkušební metody jsou však pouze orientační, neboť tato zkušební metoda by měla být posuzována v kombinaci s jinými zdroji informací v rámci IATA a v souladu s ustanoveními odstavce 9 výše. Při hodnocení metod posuzování senzibilizace kůže bez použití zvířat by se dále mělo vést v patrnosti, že ani LLNA a ani jiné zkoušky na zvířatech nemusí plně odrážet situaci existující u druhu, který je předmětem zájmu, tj. u lidí. Termín „zkoušená chemická látka“ se v této zkušební metodě používá k označení toho, co se zkouší, a netýká se použitelnosti zkušební metody luciferázy ARE-Nrf2 ke zkoušení látek a/nebo směsí. Na základě nyní dostupných údajů bylo prokázáno, že zkoušku KeratinoSensTM lze použít ke zkoušení chemických látek, které obsahují různé organické funkční skupiny, mají různé reakční mechanismy, různou potenci způsobovat senzibilizaci kůže (jak byla stanovena ve studiích in vivo) a různé fyzikálně-chemické vlastnosti (9) (12) (13) (14). Zkoušeny byly hlavně jednosložkové látky, ačkoli určité omezené množství údajů existuje i o zkoušení směsí (20). Zkušební metoda je nicméně technicky použitelná i na zkoušení vícesložkových látek a směsí. Před použitím této zkušební metody ke zkoušení směsi za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by však mělo být zváženo, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi. Při zkoušení vícesložkových látek nebo směsí by se mimoto měly uvážit možné rušivé vlivy cytotoxických složek na pozorované odpovědi. Zkušební metodu lze použít ke zkoušení rozpustných chemických látek nebo látek, jež tvoří stabilní disperzi (tj. koloid nebo suspenzi, ve které se zkoušená chemická látka neusazuje ani se neodděluje od rozpouštědla do různých fází) buď ve vodě, nebo v DMSO (včetně všech složek zkoušených chemických látek v případě zkoušení vícesložkové látky nebo směsi). Zkoušené chemické látky, které nesplňují tyto podmínky při nejvyšší požadované konečné koncentraci 2 000 μM (viz odstavec 22), lze přesto zkoušet při nižších koncentracích. V takovém případě by výsledky splňující kritéria pro pozitivitu popsaná v odstavci 39 i přesto mohly být použity na podporu identifikace zkoušené chemické látky jako látky senzibilizující kůži, ale negativní výsledek získaný při koncentracích < 1 000 μM by měl být považován za nepřesvědčivý (viz predikční model v odstavci 39). Obecně byly úspěšně zkoušeny látky s hodnotou LogP do 5, zatímco na extrémně hydrofobní látky s hodnotou LogP vyšší než 7 se podle současných poznatků použitelnost této zkušení metody nevztahuje (14). O látkách, u nichž hodnota LogP leží mezi 5 a 7, jsou k dispozici jen omezené informace. Negativní výsledky by se měly interpretovat obezřetně, protože látky s výlučnou reaktivitou vůči reziduím lysinů může tato zkušební metoda detekovat jako negativní. Z důvodu omezené metabolické schopnosti použité buněčné linie (21) a vzhledem k experimentálním podmínkám mohou prohapteny (tj. chemické látky vyžadující enzymatickou aktivaci, například prostřednictvím enzymů P450) a prehapteny (tj. chemické látky aktivované autooxidací) zejména při nízké míře oxidace rovněž vykazovat negativní výsledky. Na druhé straně zkoušené chemické látky, které nepůsobí jako senzibilizující látka, ale jsou nicméně chemickými stresory, mohou vést k falešně pozitivním výsledkům (14). Ne vždy je též možné spolehlivě posuzovat vysoce cytotoxické zkoušené chemické látky. Rovněž tak zkoušené chemické látky, jež ovlivňují enzym luciferázu, mohou zkreslit aktivitu luciferázy ve zkouškách založených na zkoušení buněk, neboť způsobují buď očividnou inhibici, nebo zvýšenou luminiscenci (22). Uvádí se například, že koncentrace fytoestrogenu vyšší než 1 μM ovlivnila luminiscenční signály v jiných zkouškách reporterových genů založených na luciferáze v důsledku nadměrné aktivace reporterového genu luciferázy (23). V důsledku toho je nutné pečlivě zkoumat exprese luciferázy získané při vysoké koncentraci fytoestrogenů nebo podobných chemických látek, u nichž existuje podezření, že vyvolávají nadměrnou aktivaci reporterového genu luciferázy podobně jako fytoestrogeny (23). V případech, kdy mohou být předloženy důkazy prokazující nepoužitelnost této zkušební metody na jiné specifické kategorie chemických látek, neměla by se tato zkušební metoda ke zkoušení těchto specifických kategorií používat. Kromě podpory rozlišování mezi látkami senzibilizujícími kůži a látkami nesenzibilizujícími kůži zkouška KeratinoSensTM rovněž poskytuje informace o vztahu koncentrace a účinku, které při použití v rámci integrovaných přístupů jako IATA mohou potenciálně přispět k hodnocení senzibilizační potence (19). Ke stanovení toho, jak mohou výsledky zkoušky KeratinoSensTM přispět k hodnocení potence (24) a k zařazování senzibilizujících látek do podkategorií GHS OSN / CLP, však bude zapotřebí další výzkum, přednostně založeny na spolehlivých údajích o účincích na člověka. PODSTATA ZKOUŠKY Zkušební metoda s vyšetřením luciferázy ARE-Nrf2 používá permanentní adherentní buněčné linie odvozené z lidských keratinocytů HaCaT stabilně transfektované volitelným plasmidem. Buněčná linie obsahuje gen luciferázy pod transkripční kontrolou konstitutivního promotoru sloučeného s elementem ARE z genu, o kterém je známo, že je up-regulován kontaktními senzibilizátory (25) (26). Signál luciferázy odráží aktivaci látek senzibilizujících endogenní Mrf2 závislé geny, a závislost signálu luciferázy na Nrf2 v rekombinantní buněčné linii byla prokázána (27). To umožňuje kvantitativní měření (pomocí lumuniscenční detekce) indukce genu luciferázy za použití dobře známých substrátů pro luciferázu produkujících světlo, jako ukazatele aktivity transkripčního faktoru Nrf2 v buňkách po expozici elektrofilním látkám. Zkoušené chemické látky se při zkoušce KeratinoSens™ považují za pozitivní, pokud vyvolávají statisticky významnou indukci aktivity luciferázy nad stanovenou prahovou hodnotou (tj. > 1,5násobný nebo 50 % růst) při menší než stanovené koncentraci, která významně neovlivňuje životaschopnost buněk (tj. nižší než 1 000 μM a při koncentraci, při které je životaschopnost buněk vyšší než 70 % (9) (12)). Za tímto účelem se stanoví maximální násobek indukce aktivity luciferázy oproti (negativní) kontrole s rozpouštědlem (Imax). Jelikož jsou buňky vystaveny řadě koncentrací zkoušených chemických látek, měly by se dále z křivky dávka-účinek interpolovat koncentrace potřebné pro vyvolání statisticky významné aktivity luciferázy nad prahovou hodnotou (tj. hodnota EC1,5) (výpočty viz odstavec 32). Měla by být rovněž prováděna paralelní měření cytotoxicity, aby bylo možné posoudit, zda úrovně indukce aktivity luciferázy nastávají při sub-cytotoxických koncentracích. Před rutinním použitím zkoušky se stanovením luciferázy ARE-Nrf2 by měly laboratoře prokázat odbornou způsobilost použitím deseti k tomu určených látek, které jsou uvedeny v dodatku 2. Jsou k dispozici technické parametry metody (Performance Standards) (28), které usnadní validaci nových nebo pozměněných zkušebních metod luciferázy ARE-Nrf2 in vitro obdobných zkoušce KeratinoSens™ a umožní včas provést změnu této zkušební metody, aby do ní mohly být zahrnuty. Vzájemné uznávání údajů bude podle postupu dohodnutého v rámci OECD zaručeno pouze u zkušebních metod validovaných podle těchto výkonnostních standardů, pokud tyto zkušební metody byly podrobeny revizi a pokud je OECD zahrnula do odpovídajícího pokynu ke zkoušení. POSTUP Jedinou zkouškou, kterou popsaná zkušební metoda v současnosti zahrnuje, je vědecky platná zkouška KeratinoSensTM (9) (12) (13) (14). Jsou k dispozici standardní pracovní postupy pro zkoušku KeratinoSensTM a měly by být používány pro provádění a využívání této zkušební metody v laboratoři (15). Laboratoře, jež chtějí tuto zkušební metodu provádět, mohou získat rekombinantní buněčnou linii použitou ve zkoušce KeratinoSensTM po uzavření licenční dohody se subjektem, který tuto zkušební metodu vyvinul. V následujících odstavcích je uveden popis hlavních složek a postupů zkušební metody se stanovením luciferázy ARE-Nrf2. Příprava kultur keratinocytů Měla by být použita transgenní buněčná linie, která má stabilní inzerci reporterového genu luciferázy řízeného elementem ARE (např. buněčná linie KeratinoSens™). Buňky se po obdržení pomnoží (např. 2 až 4 pasáže) a skladují se zmrazené jako homogenní kmen. Buňky z tohoto původního kmene se mohou pomnožit až do maximálního počtu pasáží (tj. 25 v případě KeratinoSensTM) a použijí se pro rutinní zkoušení s použitím vhodného udržovacího média (v případě KeratinoSensTM se jedná o DMEM (Dulbeccova modifikace Eagleova média, obsahující sérum a geneticin). Buňky by pro zkoušení měly být z 80 % až 90 % konfluentní a je třeba dbát na to, aby nikdy nevyrostly do úplné konfluence. Jeden den před zkoušením se buňky odeberou a rozdělí na destičky o 96 jamkách (10 000 buněk na každou jamku v případě KeratinoSensTM). Je třeba se vyvarovat sedimentace buněk během nasazování, aby se zajistila distribuce homogenního počtu buněk do jamek. Pokud by se tak nestalo, může z tohoto kroku vzejít vysoká variabilita mezi jednotlivými jamkami. V každém opakování se použijí tři repliky pro měření aktivity luciferázy a jedna souběžná replika se použije pro zkoušku životaschopnosti buněk. Příprava zkoušené chemické látky a kontrolních látek Zkoušená chemická látka a kontrolní látky se připraví v den zkoušení. Při zkoušce KeratinoSensTM se zkoušené chemické látky rozpustí v dimethylsulfoxidu (DMSO) na žádoucí konečnou koncentraci (např. 200 mM). Roztoky v DMSO lze považovat za samosterilizující, takže sterilní filtrace není nutná. Chemická látka, která není rozpustná v DMSO, se rozpustí v sterilní vodě nebo v kultivačním médiu a roztoky se sterilizují např. filtrací. V případě zkoušené chemické látky, která nemá definovanou molekulovou hmotnost (MW) se připraví zásobní roztok v standardní koncentraci (40 mg/ml nebo 4 % (m/V)) používané ve zkoušce KeratinoSensTM. V případě použití jiných rozpouštědel než DMSO, vody nebo kultivačního média by mělo být uvedeno dostatečné vědecké zdůvodnění. Na základě zásobních roztoků zkoušené chemické látky v DMSO se provádí sériové ředění pomocí DMSO k získání 12 základních koncentrací chemické látky, která má být zkoušena (od 0,098 do 200 mM ve zkoušce KeratinoSensTM). U chemických látek nerozpustných v DMSO se k získání základních koncentrací provádí ředění sterilní vodou nebo sterilním kultivačním médiem. Nezávisle na použitém rozpouštědle se poté základní koncentrace dále naředí v poměru 1:25 v kultivačním médiu obsahujícím sérum, a nakonec se použije k expozici buněk po dalším zředění ředicím faktorem 4, takže konečné koncentrace zkoušené chemické látky při zkoušce KeratinoSensTM jsou v rozsahu od 0,98 do 2 000 μM. V odůvodněných případech lze použít jiné koncentrace (např. v případě cytotoxicity nebo špatné rozpustnosti). Pro negativní kontrolu (s rozpouštědlem) se ve zkoušce KeratinoSensTM používá DMSO (č. CAS 67-68-5, v ≥ 99 % čistotě), pro tuto kontrolu se připraví šest jamek na každé destičce. Provede se stejné zředění, jak je popsáno u základních koncentrací v odstavci 22, takže konečná koncentrace negativní kontroly (s rozpouštědlem) je 1 %, což neovlivní životaschopnost buněk a odpovídá to stejné koncentraci DMSO, která je použita u zkoušené chemické látky a v pozitivní kontrole. U zkoušené chemické látky nerozpustné v DMSO, u které se ředění prováděla ve vodě, musí být úroveň DMSO ve všech jamkách konečného zkušebního roztoku upravena na 1 %, tj. na stejnou úroveň, která byla použita u ostatních zkoušených chemických látek a u kontrolních látek. Pozitivní kontrolou, která se používá v případě zkoušky KeratinoSensTM je cinnamaldehyd (č. CAS 14371-10-9, o čistotě ≥ 98 %), pro který se připraví řada základních koncentrací v rozsahu od 0,4 do 6,4 mM v DMSO (ze zásobního roztoku 6,4 mM) a rozpustí se tak, jak je uvedeno u základních koncentrací v odstavci 22, takže konečná koncentrace pozitivní kontroly je v rozsahu 4 až 64 μM. Lze použít jiné vhodné pozitivní kontroly, nejlépe poskytující hodnoty EC1,5 ve střední části rozsahu, pokud jsou k dispozici historické údaje k odvození srovnatelných kritérií přijatelnosti provedení. Aplikace zkoušené chemické látky a kontrolních látek U každé zkoušené chemické látky a pozitivní kontrolní látky je pro předpověď účinku (pozitivní nebo negativní) postačující jeden experiment, který sestává nejméně ze dvou nezávislých opakování, každé s třemi replikami (tj. n = 6). V případě neshodných výsledků mezi dvěma nezávislými opakováními by se mělo provést třetí opakování se třemi replikami (tj. n=9). Každé nezávislé opakování se provádí v různý den s čerstvým zásobním roztokem zkoušených chemických látek a s nezávisle sklizenými buňkami. Buňky však mohou pocházet ze stejné pasáže. Po nasazení buněk, jak je popsáno v odstavci 20, se buňky kultivují 24 hodin na mikrotitračních destičkách s 96 jamkami. Médium se poté odstraní a nahradí čerstvým kultivačním médiem (v případě zkoušky KeratinoSensTM je to 150 μl kultivačního média obsahujícího sérum, ale bez geneticinu, do něhož se přidá 50 μl 25násobně rozředěné zkoušené chemické látky a kontrolních látek. Nejméně jedna jamka na každé destičce by se měla ponechat prázdná (bez buněk a bez expozice), aby bylo možné posoudit hodnoty pozadí. Exponované destičky se poté ve zkoušce KeratinoSensTM inkubují asi 48 hodin při teplotě 37 ± 1 °C za přítomnosti 5 % CO2. Mělo by se dbát na to, aby nedošlo k vypařování těkavých zkoušených chemických látek a ke vzájemné kontaminaci zkoušenou chemickou látkou mezi jamkami, např. tak, že se destičky před inkubací se zkoušenými chemickými látkami přikryjí fólií. Měření aktivity luciferázy K zajištění odpovídajících údajů o luminiscenci jsou kriticky důležité tři faktory: — volba citlivého luminometru, — použití destiček o dostatečné výšce, aby se nedošlo k vzájemné světelné kontaminaci, a — použití substrátu pro luciferázu s dostatečným světelným výstupem, což zajistí dostatečnou citlivost a nízkou variabilitu. Před vlastním zkoušením by měl být proveden kontrolní experiment, jak je popsáno v dodatku 3, aby se zajistilo, že tyto tři body budou splněny. Po 48hodinové době expozice zkoušené chemické látce a kontrolním látkám ve zkoušce KeratinoSensTM se buňky opláchnou fosfátovým pufrem a do každé jamky se přidá na 20 minut za pokojové teploty příslušný lýzový pufr pro získání údajů o luminiscenci. Destičky s buněčným lyzátem se poté vloží do luminometru pro získání údajů, což je ve zkoušce KeratinoSensTM naprogramováno tak, že se i) přidá substrát pro luciferázu do každé jamky (tj. 50 μl), ii) počká 1 sekundu a iii) integruje aktivita luciferázy po 2 sekundy. V případě, že se použije jiné nastavení, např. v závislosti na použitém modelu luminometru, mělo by to být odůvodněno. Je možné rovněž použít luminiscenční substrát za předpokladu, že byl úspěšně splněn pokus na kontrolu kvality uvedený v dodatku 3. Posouzení cytotoxicity Při zkoušce životaschopnosti buněk KeratinoSensTM se médium po 48hodinové expoziční době nahradí čerstvým médiem obsahujícím MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromid, thiazolylová modř č. CAS 298-93-1) a buňky se inkubují 4 hodiny při teplotě 37 °C za přítomnosti 5 % CO2. Médium s MTT se poté odstraní a buňky se přes noc lýzují (např. přidáním 10 % roztoku SDS do každé jamky). Po protřepání se změří absorpce při 600 nm pomocí fotometru. ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV Vyhodnocení údajů Ve zkoušce KeratinoSensTM se vypočítávají tyto parametry: — maximální průměrný násobek hodnoty indukce aktivity luciferázy (Imax) pozorovaný při jakékoli koncentraci zkoušené chemické látky a pozitivní kontroly, — hodnota EC1,5, jež představuje koncentraci, při níž byla získána indukce aktivity luciferázy vyšší než 1,5násobek prahové hodnoty (tj. než 50 % zvýšení aktivity luciferázy), a — hodnoty koncentrací IC50 a IC30, při nichž došlo k 50 % a 30 % snížení životnosti buněk, — násobek indukce aktivity luciferázy se vypočítá pomocí rovnice 1 a celkový maximální násobek indukce (Imax) se vypočítá jako průměr jednotlivých opakování. Rovnice 1: kde Lsample je naměřená hodnota luminiscence v jamce se zkoušenou chemickou látkou, Lblank je naměřená hodnota luminiscence v jamce slepého pokusu, jež neobsahuje žádné buňky a nebyla nijak ošetřena, Lsolvent je průměrná naměřená hodnota luminiscence v jamkách obsahujících buňky a (negativní) kontrolu s rozpouštědlem. EC1,5 se vypočítá lineární interpolací podle rovnice2 a celková hodnota EC1,5 se vypočítá jako geometrický průměr z jednotlivých opakování. Rovnice 2: kde Ca je nejnižší koncentrace v μM s větší než 1,5násobnou indukcí, Cb je nejvyšší koncentrace v μM s menší než 1,5násobnou indukcí, Ia je násobek indukce naměřený při nejnižší koncentraci s větší než 1,5násobnou indukcí (střední hodnota tří jamek s replicitními vzorky), Ib je násobek indukce při nejvyšší koncentraci s menší než 1,5násobnou indukcí (střední hodnota tří jamek s replicitními vzorky). Životaschopnost se vypočítá podle rovnice 3: Rovnice 3: kde Vsample je naměřená hodnota absorbance MTT v jamce se zkoušenou chemickou látkou, Vblank je naměřená hodnota absorbance MTT v jamce slepého pokusu, jež neobsahuje žádné buňky a nebyla nijak ošetřena, Vsolvent je průměrná naměřená hodnota absorbance MTT v jamkách obsahujících buňky a (negativní) kontrolu s rozpouštědlem, IC50 a IC30 se vypočítají lineární interpolací podle rovnice 4 a celkové hodnoty IC50 a IC30 se vypočítají jako geometrický průměr z jednotlivých opakování. Rovnice 4: kde X je % snížení při koncentraci, jež má být vypočtena (50 pro IC50 a 30 pro IC30), Ca je nejnižší koncentrace v μM s větším než x % snížením životaschopnosti, Cb je nejvyšší koncentrace v μM s menším než x % snížením životaschopnosti, Va je % životaschopnosti při nejnižší koncentraci s větším než x % snížením životaschopnosti, Vb je % životaschopnosti při nejvyšší koncentraci s menším než x % snížením životaschopnosti. U každé koncentrace vykazující větší než 1,5násobnou indukci aktivity luciferázy se vypočte statistická významnost (např. pomocí dvouvýběrového Studentova t-testu), přičemž se hodnoty luminiscence u tří replicitních vzorků porovnají s hodnotami luminiscence zjištěné v jamkách (negativní) kontroly s rozpouštědlem, což umožní stanovit, zda je indukce aktivity luciferázy statisticky významná (p < 0,05). Nejnižší koncentrace s větší než 1,5násobnou indukcí aktivity luciferázy je hodnotou určující hodnotu EC1,5. V každém případě se zkontroluje, zda je tato hodnota nižší než hodnota IC30, což nasvědčuje tomu, že při koncentraci určující hodnotu EC1,5 je menší než 30 % snížení životaschopnosti buněk. Doporučuje se tyto údaje zkontrolovat vizuálně s použitím grafů. Není-li zjištěna jasná křivka dávka-účinek nebo pokud je získaná křivka dávka-účinek dvoufázová (tj. protíná prahovou hodnotu 1,5 dvakrát), měl by být experiment opakován, aby se ověřilo, zda je to specifické pro danou chemickou látku nebo zda je to důsledkem experimentálního artefaktu. V případě, že dvoufázová odezva je reprodukovatelná v nezávislém experimentu, měla by být zaznamenána nižší hodnota EC1,5 (koncentrace, kdy je prahová hodnota 1,5 protnuta poprvé). V ojedinělých případech, kdy je zjištěna statisticky nevýznamná indukce nad 1,5násobnou hodnotou, po níž následuje vyšší koncentrace se statisticky významnou indukcí, se výsledky získané z tohoto opakování považují za platné a pozitivní pouze v případě, že při koncentraci, jež není cytotoxická, byla získána statisticky významná indukce vyšší než prahová hodnota 1,5). A konečně, u chemických látek, jež vyvolávají 1,5násobnou nebo vyšší indukci při nejnižší koncentraci 0,98 μM, se na základě vizuální kontroly křivky dávka-účinek stanoví hodnota EC1,5 < 0,98. Kritéria přijatelnosti Při použití zkoušky KeratinoSensTM by měla být splněna tato kritéria přijatelnosti: Zaprvé, indukce aktivity luciferázy získaná s pozitivní kontrolou, cinnamaldehydem, by měla být statisticky významná nad prahovou hodnotou 1,5 (tj. s použitím T-testu) alespoň při jedné ze zkoušených koncentrací (od 4 do 64 μM). Zadruhé, hodnota EC1,5 by měla ležet mezi dvěma směrodatnými odchylkami od historické střední hodnoty zkušebního zařízení (např. mezi 7 μM a 30 μM na základě souboru údajů použitého pro validaci), která by měla být pravidelně aktualizována. Dále, průměrná indukce ve třech replikách s cinnamaldehydem při koncentraci 64 μM by měla být mezi 2 a 8. Není-li toto posledně uvedené kritérium splněno, měla by se pečlivě zkontrolovat křivka dávka-účinek cinnamaldehydu a zkoušky lze přijmout pouze v případě, že existuje jednoznačný vztah dávka-účinek s rostoucí indukcí aktivity luciferázy při rostoucích koncentracích v pozitivní kontrole. Průměrný variační koeficient u naměřených údajů luminiscence v negativní kontrole (s rozpouštědlem) s DMSO by pak měl být pod hodnotou 20 % při každém opakování, které se skládá z 6 jamek testovaných třikrát. Je-li variabilita vyšší, výsledky se nepoužijí. Interpretace výsledků a predikční model Předpověď získaná zkouškou KeratinoSensTM se považuje za pozitivní, jsou-li splněny všechny 4 následující podmínky ve 2 ze 2 opakování nebo v týchž 2 ze 3 opakování, jinak se předpověď získaná zkouškou KeratinoSensTM považuje za negativní (schéma č. 1): 1. hodnota Imax je větší než (>) 1,5násobek a statisticky významně se liší v porovnání s hodnotou (negativní) kontroly s rozpouštědlem (jak se stanoví pomocí dvouvýběrového, nepárového Studentova t-testu); 2. životaschopnost buněk je větší než (>) 70 % při nejnižší koncentraci, jež vede k indukci aktivity luciferázy vyšší než 1,5násobek (tj. při koncentraci určující hodnotu EC1,5); 3. hodnota EC1,5 je menší než (<) 1 000 μM (nebo < 200 μg/ml v případě zkoušené chemické látky bez definované molekulové hmotnosti; 4. existuje zjevný celkový vztah dávka-účinek při indukci luciferázy (nebo dvoufázová odezva, jak uvedeno v odstavci 33). Pokud v daném opakování jsou všechny tři první podmínky splněny, avšak nelze zjistit jasný vztah dávka-účinek při indukci luciferázy, pak by výsledek tohoto opakování měl být považován za nepřesvědčivý a může být nutné další zkoušení (schéma č. 1). Rovněž tak negativní výsledek získaný s koncentracemi < 1 000 μM (nebo < 200 μg/ml v případě zkoušených chemických látek bez definované molekulové hmotnosti) by také měl být považován za nepřesvědčivý (viz odstavec 11). Schéma č. 1 Predikční model používaný při zkoušce KeratinoSensTM. Předpověď KeratinoSensTM by měla být hodnocena v rámci přístupu IATA a v souladu s ustanoveními odstavců 9 a 11. V ojedinělých případech zkoušené chemické látky, jež indukují aktivitu luciferázy na úrovni velmi blízké cytotoxickým úrovním, mohou být při některých opakováních pozitivní na necytotoxických úrovních (tj. při koncentraci určující hodnotu EC1,5 menší než (<) koncentrace IC30), a při jiných opakováních mohou být pozitivní pouze na cytotoxických úrovních (tj. při koncentraci určující hodnotu EC1,5 větší než (>) koncentrace IC30). Takové zkoušené chemické látky musí být přezkoušeny s užší analýzou vztahu dávka-účinek a za použití nižšího ředicího faktoru (např. zředění 1:1,33 nebo √2 (= 1,41) mezi jamkami), aby bylo možné stanovit, zda došlo k indukci na cytotoxických úrovních, či nikoli (9). Závěrečná zpráva Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace: Zkoušená chemická látka — Jednosložková látka: — chemická identifikace, např. název (názvy) IUPAC nebo CAS, číslo (čísla) CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec a/nebo jiné identifikátory, — fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě, rozpustnost v DMSO, molekulová hmotnost a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné atd., — případné ošetření před zkoušením (např. zahřívání, mletí), — zkušební koncentrace, — podmínky skladování a stabilita, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné. — Vícesložková látka, UVCB a směs: — charakterizovaná v co možná největší míře např. chemickou identitou (viz výše), čistotou, kvantitativním výskytem a důležitými fyzikálně-chemickými vlastnostmi (viz výše) složek, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě, rozpustnost v DMSO, a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — molekulová hmotnost nebo zdánlivá molekulová hmotnost v případě směsí/polymerů se známým složením nebo jiné informace důležité pro provedení studie, — případné ošetření před zkoušením (např. zahřívání, mletí), — zkušební koncentrace, — podmínky skladování a stabilita, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné. Kontroly — Pozitivní kontrola: — chemická identifikace, např. název (názvy) IUPAC nebo CAS, číslo (čísla) CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec a/nebo jiné identifikátory, — případně fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě, rozpustnost v DMSO, molekulová hmotnost a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné atd., — případné ošetření před zkoušením (např. zahřívání, mletí), — zkušební koncentrace, — podmínky skladování a stabilita, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — odkaz na případné dosavadní výsledky pozitivních kontrol prokazující vhodnost kritérií přijatelnosti provedení. — Negativní kontrola (kontrola vehikula): — chemická identifikace, např. název (názvy) IUPAC nebo CAS, číslo (čísla) CAS a/nebo jiné identifikátory, — čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky proveditelné atd., — fyzický vzhled, molekulová hmotnost a další důležité fyzikálně-chemické vlastnosti v případě použití jiných negativních kontrol / vehikul, než které jsou uvedeny v této zkušební metodě, a to v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — podmínky skladování a stabilita, v rozsahu, v jakém jsou tyto informace dostupné, — zdůvodnění volby rozpouštědla pro každou zkoušenou chemickou látku. Podmínky zkušební metody — jméno a adresa zadavatele, zkušebního zařízení a vedoucího studie, — popis použité zkušební metody, — použité buněčné linie, podmínky skladování a zdroj (např. zařízení, z něhož byly získány), — počet pasáží a míra konfluence buněk použitých ke zkoušení, — metoda počítání buněk použitá při jejich nasazování před zkoušením a opatření přijatá k zajištění homogenní distribuce počtu buněk (viz odstavec 20), — použitý luminometr (např. model), včetně nastavení přístroje, použitý substrát pro luciferázu a prokázání přiměřeného měření luminiscence na základě kontrolního testu, který je popsán v dodatku 3, — postup použitý pro prokázání způsobilosti laboratoře k provádění této zkušební metody (např. zkoušením vhodných látek) nebo pro prokázání reprodukovatelného provedení této zkušební metody v průběhu doby. Postup zkoušky — počet opakování a použitých replik, — koncentrace zkoušených chemických látek, použitý postup aplikace a doba expozice (pokud se liší od doporučených), — popis použitých hodnotících kritérií a kritérií rozhodování, — popis použitých kritérií přijatelnosti studie, — popis jakýchkoli změn zkušebního postupu. Výsledky — Tabulka s uvedením hodnot Imax, EC1,5 a životaschopnosti (tj. IC50, IC30) získaných se zkoušenými chemickými látkami a v pozitivních kontrolách při každém opakování, a rovněž středních hodnot (Imax: průměr; hodnoty EC1,5 a životaschopnosti: geometrický průměr) a směrodatných odchylek vypočtených z údajů získaných při všech opakováních, s uvedením hodnocení zkoušené chemické látky podle predikčního modelu, — získaný variační koeficient s údaji o luminiscenci naměřenými v negativní kontrole při každém pokusu, — graf zobrazující křivky dávka- účinek pro indukci aktivity luciferázy a životaschopnost, — případně popis jakýchkoli jiných důležitých zjištění z pozorování. Diskuse o výsledcích — diskuse o výsledcích získaných za pomoci zkoušky KeratinoSensTM, — diskuse o výsledcích zkušební metody v rámci IATA, jsou-li k dispozici jiné příslušné informace. Závěr LITERATURA 1) United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Dostupné na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html. 2) OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paris. 3) Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85, 367–485. 4) Kapitola B.42 této přílohy: Senzibilizace kůže: zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin. 5) Kapitola B.6 této přílohy: Senzibilizace kůže. 6) Kapitola B.50 této přílohy: Senzibilizace kůže: zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin: DA. 7) Kapitola B.51 této přílohy: Senzibilizace kůže: zkouška s vyšetřením lokálních lymfatických uzlin: BrdU-ELISA. 8) Natsch A. (2010). The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers. Toxicological Sciences 113, 284–292. 9) Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281–290. 10) Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005). The role of Keap1 in cellular protective responses. Chem. Res. Toxicol. 18, 1779–1791. 11) Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013). The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol. 1(1), 45–49. 12) Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 25, 733–744. 13) Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, 33, 1337–1352. 14) EC EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing (Doporučení pro zkoušku KeratinoSensTM ke zkoušení senzibilizace kůže), 42 pp. Dostupné na: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation. 15) DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSensTM, 17 pp. Dostupné na: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index 16) Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009). Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing. Toxicol. Sci. 107, 106–121. 17) Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389–400. 18) Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potentials. Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489–504. 19) Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. J Appl Toxicol. 33, 1353–1364. 20) Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013). The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study. Toxicology In Vitro 27, 1220–1225. 21) Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1683–1969. 22) Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17, 646–657. 23) OECD (2012). BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457. OECD, Paris. 24) ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87). 25) Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006). Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing. J. Invest. Dermatol., 126, 1813–1822. 26) Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004). Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen. Toxicol. Lett. 150, 301–316. 27) Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013). Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events. Toxicol. in vitro 27, 2225–2232. 28) OECD (2015). Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment N0 213, OECD, Paris. 29) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No.34. OECD, Paris, France. 30) NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides – (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf Dodatek 1 DEFINICE Přesnost : Přesnost shody mezi výsledky zkušební metody a přijatými referenčními hodnotami. Je to měření výsledku zkušební metody a jednoho aspektu „důležitosti“. Tento výraz se často používá namísto výrazu „soulad“ a rozumí se jím podíl správných výsledků zkušební metody (29). AOP (mechanismy nežádoucích účinků) : Sled událostí od chemické struktury cílové chemické látky nebo skupiny podobných chemických látek přes molekulární iniciační událost po účinek in vivo, který je předmětem zájmu (2). ARE : Antioxidační responzivní element (též nazývaný EpRE, elektrofilní responzivní element), je responzivní element, který se nachází v oblasti protisměrných promotorů mnohých cytoprotektivních genů a genů kódujících enzymy II. fáze. Je-li aktivován prostřednictvím transkripčního faktoru Nfr2, zprostředkovává transkripční indukci těchto genů. Chemická látka : Chemická substance nebo směs. Variační koeficient : Míra variability, která se vypočítává pro skupinu údajů z replik tak, že se směrodatná odchylka vydělí průměrem. Lze ho vynásobit 100 za účelem vyjádření v procentech. EC1,5 : Interpolovaná koncentrace pro získání 1,5násobné indukce luciferázy. IC30 : Koncentrace vyvolávající snížení životaschopnosti buněk o 30 %. IC50 : Koncentrace vyvolávající snížení životaschopnosti buněk o 50 %. Nebezpečnost : Základní charakteristika látky nebo situace, která má potenciál vyvolat nepříznivé účinky, jsou-li organismus, systém nebo (sub)populace vystaveny této látce. IATA (integrovaný přístup ke zkoušení a posuzování) : Strukturovaný přístup používaný pro zjišťování nebezpečnosti (potenciál), charakterizaci rizik (potence) a/nebo posouzení bezpečnosti (potenciál/potence a expozice) chemické látky nebo skupiny chemických látek, jenž strategicky integruje a váží všechny důležité údaje s cílem poskytnout informace pro přijetí regulačního rozhodnutí, které se týká potenciální nebezpečnosti a/nebo rizika a/nebo potřeby dalšího cíleného, a tudíž minimálního zkoušení. Imax : Faktor maximální indukce aktivity luciferázy ve srovnání s (negativní) kontrolou s rozpouštědlem naměřený při jakékoli koncentraci zkoušené chemické látky. Keap1 : (Kelch-like ECH-associated protein 1) je senzorový protein, který dokáže regulovat aktivitu transkripčního faktoru Nrf2. Za neindukovaných podmínek senzorový protein Keap1 směruje transkripční faktor Nrf2 na ubikvitinylaci a proteolytickou degradaci v proteazomu. Kovalentní modifikace reaktivních reziduí cysteinu v Keap 1 prostřednictvím malých molekul může vést k disociaci Nrf2 z Keap1 (8) (10) (11). Směs : Směs nebo roztok tvořený dvěma nebo více látkami, které v něm nereagují (1). Jednosložková látka : Látka definovaná svým kvantitativním složením, v níž je přítomna jedna hlavní složka v míře alespoň 80 % hmot. Vícesložková látka : Látka definovaná svým kvantitativním složením, v níž je přítomna více než jedna hlavní složka v koncentraci ≥ 10 % hmot. a < 80 % hmot. Vícesložková látka je výsledkem výrobního procesu. Rozdíl mezi směsí a vícesložkovou látkou spočívá v tom, že směs se získá smísením dvou nebo více látek bez chemické reakce. Vícesložková látka je výsledkem chemické reakce. Nrf2 : Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, je transkripční faktor zapojený do mechanismu antioxidační odpovědi. Není-li Nrf2 ubikvitinylován, hromadí se se v cytoplasmě a přesouvá se do jádra, kde se spojuje s ARE v oblasti protisměrných promotorů mnohých cytoprotektivních genů a vyvolává jejich transkripci (8) (10) (11). Pozitivní kontrola : Replika obsahující všechny složky zkušebního systému a látku, o níž je známo, že způsobuje pozitivní reakci. Aby se zajistilo, že proměnlivost v reakci na pozitivní kontrolu bude možné časem vyhodnotit, rozsah pozitivní reakce by neměl být nadměrný. Relevantnost : Popis vztahu zkoušky k účinku, který je předmětem zájmu, a také toho, zda je zkouška smysluplná a použitelná pro konkrétní účel. Vyjadřuje, do jaké míry zkouška správně měří nebo predikuje biologický účinek, který je předmětem zájmu. Relevantnost zahrnuje také posouzení přesnosti (shody) zkušební metody (29). Spolehlivost : Měření rozsahu, v jakém může být zkušební metoda časem reprodukovatelná v laboratořích a mezi laboratořemi, když se provádí s použitím stejného protokolu. Hodnotí se to výpočtem laboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti a laboratorní opakovatelnosti. Hodnotí se na základě výpočtu laboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti a laboratorní opakovatelnosti (29). Reprodukovatelnost : Shoda mezi výsledky získanými při zkoušení téže chemické látky za použití stejného zkušebního protokolu (viz spolehlivost) (29). Citlivost : Podíl všech pozitivních/aktivních chemických látek, které jsou na základě zkušební metody správně zatříděny. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která poskytuje kategorické výsledky, a je důležitým prvkem při hodnocení relevantnosti zkušební metody (29). Kontrola s rozpouštědlem/vehikulem : Replika obsahující všechny složky zkušebního systému s výjimkou zkoušené chemické látky, ale včetně rozpouštědla, které se používá. Používá se ke stanovení účinku na pozadí u vzorků exponovaných zkoušené chemické látce, která je rozpuštěna ve stejném rozpouštědle. Specifičnost : Podíl všech negativních/neaktivních chemických látek, které jsou na základě zkušební metody správně zatříděny. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která poskytuje kategorické výsledky, a je důležitým prvkem při hodnocení relevantnosti zkušební metody (29). Látka : Chemické prvky nebo jejich sloučeniny v přírodním stavu nebo získané výrobním procesem včetně všech přídatných látek nutných k uchování stability výrobku a všech nečistot vznikajících v použitém procesu, ale s vyloučením všech rozpouštědel, která je možno oddělit bez ovlivnění stability látky nebo změny jejího složení (1). Zkoušená chemická látka : Termín „zkoušená chemická látka“ se používá k označení toho, co se podrobuje zkoušení. Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek Organizace spojených národů (GHS OSN) : Systém navrhující klasifikaci látek a směsí podle standardizovaných typů a úrovní fyzikálních, zdravotních a environmentálních nebezpečí a řešící příslušné komunikační prvky, jako jsou piktogramy, signální slova, výroky o nebezpečí, výroky o bezpečnostních opatřeních a bezpečnostní datové listy, které obsahují informace o jejich nežádoucích účincích s ohledem na ochranu lidí (včetně zaměstnavatelů, dělníků, přepravců, spotřebitelů a osob reagujících na havárie) a životního prostředí (1). UVCB : Látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkty nebo biologický materiál. Validovaná zkušební metoda : Zkušební metoda, u níž se má za to, že je dostatečně relevantní a spolehlivá pro určitý účel, a která je založena na vědecky spolehlivých zásadách. Zkušební metoda není nikdy validovaná v absolutním smyslu, ale pouze pro určitý konkrétní účel (29). Dodatek 2 LÁTKY PRO PROKÁZÁNÍ ZPŮSOBILOSTI Senzibilizace kůže in vitro: zkušební metoda se stanovením luciferázy ARE-Nrf2 Dříve než začnou laboratoře běžně používat tuto zkušební metodu, měly by prokázat odbornou způsobilost správným získáním předpokládané předpovědi KeratinoSensTM u 10 vhodných látek doporučených v tabulce 1 a získáním hodnot EC1,5 a IC50, které spadají do příslušného referenčního rozpětí, u nejméně 8 z 10 vhodných látek. Tyto látky pro prokázání způsobilosti byly vybrány tak, aby představovaly rozpětí účinků na nebezpečí senzibilizace kůže. Jinými kritérii výběru bylo, aby byly komerčně dostupné, aby k nim byly k dispozici vysoce kvalitní referenční údaje získané in vivo a vysoce kvalitní údaje získané in vitro zkouškou KeratinoSensTM. Tabulka 1 Doporučené látky pro prokázání odborné způsobilosti k provádění zkoušky KeratinoSens™. Vhodné látky Registrační číslo CAS Fyzikální forma Předpověď in vivo (28) KeratinoSens™ Předpověď (29) Referenční rozpětí EC1,5 (v μM) (30) Referenční rozpětí IC50 (v μM) (30) Propan-2-ol 67-63-0 Kapalná Látka nesenzibilizující kůži Negativní > 1 000 > 1 000 Kyselina salicylová 69-72-7 Pevná Látka nesenzibilizující kůži Negativní > 1 000 > 1 000 Kyselina mléčná 50-21-5 Kapalná Látka nesenzibilizující kůži Negativní > 1 000 > 1 000 glycerol 56-81-5 Kapalná Látka nesenzibilizující kůži Negativní > 1 000 > 1 000 Cinnamyl-alkohol 104-54-1 Pevná Látka senzibilizující kůži (slabě) Pozitivní 25–175 > 1 000 Ethylenglykol-dimethakrylát 97-90-5 Kapalná Látka senzibilizující kůži (slabě) Pozitivní 5–125 > 500 Benzothiazol-2-thiol 149-30-4 Pevná Látka senzibilizující kůži (středně silně) Pozitivní 25–250 > 500 2-brom-2-(brommethyl)pentadinitril 35691-65-7 Pevná Látka senzibilizující kůži (silně) Pozitivní < 20 20–100 4-(methylamino)fenol, hemisulfát 55-55-0 Pevná Látka senzibilizující kůži (silně) Pozitivní < 12,5 20–200 1-chlor-2,4-dinitrobenzen 97-00-7 Pevná Látka senzibilizující kůži (extrémně) Poz