(8)

V části B se doplňují tyto kapitoly: „B.63 SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA NA REPRODUKČNÍ/VÝVOJOVOU TOXICITU ÚVOD 1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 421 (2016). Pokyny OECD pro zkoušení chemických látek se pravidelně přezkoumávají s ohledem na vědecký pokrok. Pokyn č. 421 k původní screeningové zkoušce byl přijat v roce 1995 na základě protokolu pro „Předběžnou screeningovou zkoušku na reprodukční toxicitu“ projednaného na dvou zasedáních odborníků, a to v Londýně v roce 1990 (1) a v Tokiu v roce 1992 (2). 2. Tato zkušební metoda byla aktualizována o příslušné sledované vlastnosti pro endokrinní disruptory v návaznosti na činnost s vysokou prioritou, kterou organizace OECD zahájila v roce 1998 a která byla zaměřena na revizi stávajících pokynů ke zkoušení a vypracování nových pokynů pro zjišťování a zkoušení látek, které mohou narušovat činnost endokrinních žláz (3). Například do Pokynu OECD pro zkoušení č. 407 (Studie orální toxicity u hlodavců – 28denní opakovaná aplikace, kapitola B.7 této přílohy) byly v roce 2008 doplněny parametry vhodné k detekci endokrinního působení zkoušených chemických látek. Cílem aktualizace pokynu č. 421 bylo zahrnout do pokynu ke screeningové zkoušce některé relevantní sledované vlastnosti týkající se endokrinních disruptorů, pokud doby expozice zahrnují některá citlivá období v průběhu vývoje (prenatální nebo časně postnatální období). 3. Na základě studie proveditelnosti řešící vědecké a technické otázky spojené se zahrnutím relevantních sledovaných vlastností, jakož i možných úprav plánu zkoušky potřebných pro jejich zahrnutí (4) byly do pokynu č. 421 přidány vybrané další relevantní sledované vlastnosti související s endokrinními disruptory, které jsou rovněž součástí pokynu pro zkoušení č. 443 (Rozšířená jednogenerační studie toxicity pro reprodukci, kapitola B.56 této přílohy). 4. Tato zkušební metoda je určena pro získání omezeného množství informací týkajících se účinků zkoušené chemické látky na reprodukční výkonnost samců a samic, jako jsou funkce pohlavních žláz, chování při páření, početí, vývoj zárodku a vrh. Není alternativou pro stávající zkušební metody B.31, B.34, B.35 nebo B.56 a ani je nahrazuje. VÝCHOZÍ ÚVAHY 5. Tuto screeningovou zkušební metodu lze použít na získání prvních informací o možných účincích na reprodukci anebo vývoj, a to v rané fázi posuzování toxikologických vlastností chemických látek, nebo informací o chemických látkách, které jsou předmětem zájmu. Rovněž může být použita jako součást sady úvodních screeningových zkoušek u stávajících chemických látek, o nichž nejsou k dispozici žádné nebo jen omezené toxikologické informace, jako studie ke stanovení dávkování pro rozsáhlejší reprodukční/vývojové studie, nebo když je to jinak považováno za relevantní. Při realizaci studie by měly být respektovány hlavní zásady a aspekty stanovené v pokynu OECD č. 19 o uznávání, posuzování a používání klinických příznaků jako humánních sledovaných vlastností pro pokusná zvířata používaná při hodnocení bezpečnosti (5). 6. Tato zkušební metoda neposkytuje úplné informace o všech aspektech reprodukce a vývoje. Konkrétně nabízí jen omezené prostředky zjištění postnatálních projevů prenatální expozice nebo účinků, které mohou být vyvolány v průběhu postnatální expozice. Vzhledem (mimo jiné) k relativně malému počtu zvířat ve skupinách dávkování, selektivitě sledovaných vlastností a krátké době trvání studie neposkytuje tato metoda důkaz pro definitivní tvrzení, že nedochází k žádným účinkům. Navíc, pokud neexistují údaje z jiných zkoušek reprodukční/vývojové toxicity, jsou pozitivní výsledky užitečné pro první posouzení rizika a přispívají k rozhodnutím ohledně nezbytnosti a načasování dalších zkoušek. 7. Výsledky získané pro parametry související s endokrinním působením by se měly interpretovat v kontextu „koncepčního rámce OECD pro zkoušky a hodnocení chemických látek způsobujících endokrinní poruchy“ (6). V tomto koncepčním rámci je vylepšený Pokdyn OECD pro zkoušení č. 421 zařazena na úroveň 4 jako zkouška in vivo poskytující údaje o nežádoucích účincích na relevantní endokrinní sledované vlastnosti. Endokrinní signál sám o sobě však nemusí být považován za dostatečný důkaz, že zkoušená chemická látka je endokrinním disruptorem. 8. Tato zkušební metoda předpokládá orální aplikaci zkoušené chemické látky. Pokud jsou použity jiné cesty expozice, bude zřejmě nutné provést úpravy. 9. Před použitím této zkušební metody ke zkoušení směsi s cílem získat údaje pro zamýšlený regulační účel by mělo být zváženo, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout odpovídající výsledky, a pokud ano, proč tomu tak je. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi. 10. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1. PRINCIP ZKOUŠKY 11. Zkoušená chemická látka se podává v odstupňovaných dávkách několika skupinám samců a samic. Samcům se podává dávka minimálně čtyři týdny včetně dne před plánovaným usmrcením (zahrnuje to minimálně dva týdny před pářením, v průběhu období páření a přibližně dva týdny po páření). Vzhledem k omezené době podávání před pářením u samců nemusí být fertilita zvláště citlivým ukazatelem toxicity pro varlata. Proto je velmi důležité provést podrobné histologické vyšetření varlat. Kombinace dvoutýdenní doby podávání před pářením a následné pozorování páření/fertility s celkovou dobou podávání alespoň čtyři týdny, po níž následuje podrobná histopatologie samčích gonád, se považuje za dostatečnou ke zjištění většiny účinků na fertilitu a spermatogenezi u samců. 12. Samicím je třeba podávat zkoušenou chemickou látku po celou dobu studie. Zahrnuje to dva týdny před pářením (s cílem pokrýt alespoň dva celé estrální cykly), variabilní dobu do početí, dobu březosti a alespoň třináct dnů po porodu, a to včetně dne před plánovaným usmrcením. 13. Délka studie následující po aklimatizaci a zhodnocení estrálního cyklu před zahájením podávání závisí na výkonnosti samice a činí přibližně 63 dnů [alespoň 14 dnů před pářením, (maximálně) 14 dnů páření, 22 dnů gestace, 13 dnů laktace]. 14. V průběhu období podávání se zvířata každý den pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která v průběhu doby zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci zkoušky se přeživší zvířata utratí a rovněž pitvají. POPIS METODY Výběr zvířecích druhů 15. Tato zkušební metoda je určena k použití s potkany. Jestliže se parametry uvedené v této zkušební metodě zkoumají u jiných druhů hlodavců, mělo by se podat podrobné zdůvodnění. V mezinárodním validačním programu detekce endokrinních disruptorů pomocí Pokynu OECD pro zkoušení č. 407 (odpovídající kapitole B.7 této přílohy) byl jediným použitým druhem potkan. Není vhodné používat kmeny s nižší plodností nebo s typicky vysokým výskytem vývojových vad. Používají se zdravá, dosud nepřipuštěná zvířata ještě nepoužitá pro jiné experimenty. Pokusná zvířata by měla být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví, hmotnosti a věku. Na začátku studie by měly být odchylky hmotnosti zvířat minimální a neměly by překročit 20 % střední hodnoty pro každé pohlaví. Provádí-li se studie jako předběžná studie pro dlouhodobou nebo celogenerační studii, je vhodné použít v obou studiích nejlépe zvířata stejného kmene a stejného původu. Umístění a krmení zvířat 16. Všechny postupy by měly splňovat místní standardy péče o laboratorní zvířata. Teplota v experimentálních zvířecích místnostech by měla být 22 o C (± 3 o C). Ačkoli by relativní vlhkost vzduchu měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 %, kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody. Výběr potravy může být ovlivněn potřebou zajistit dostatečné promísení s testovanou látkou, je-li látka podávána touto cestou. 17. Zvířata by měla být chována v malých skupinách stejného pohlaví; je-li to z vědeckého hlediska důvodné, mohou být zvířata chována individuálně. Při chovu zvířat v klecích by v jedné kleci nemělo být umístěno více než pět zvířat. Páření by mělo probíhat v klecích, které jsou k tomuto účelu vhodné. Březí samice je třeba chovat v klecích jednotlivě a poskytnout jim materiál pro vytvoření hnízda. Samice v době laktace se chovají v klecích jednotlivě společně s potomky. 18. Krmivo by se mělo pravidelně analyzovat, aby se zjistila přítomnost kontaminantů. Vzorek stravy by se měl uchovávat až do dokončení zprávy. Příprava zvířat 19. Zdravá mladá dospělá zvířata se náhodným výběrem rozdělí na kontrolní skupinu a skupinu, která se exponuje. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Zvířata se jednoznačně identifikují a před započetím studie se nechají v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Příprava dávek 20. Není-li jiný způsob aplikace považován za vhodnější, doporučuje se orální podávání zkoušené chemické látky. Pokud je zvolena orální cesta, zkoušená chemická látka se obvykle podává žaludeční sondou; alternativně však lze zkoušené chemické látky podávat v potravě nebo v pitné vodě. 21. Je-li to nutné, je zkoušená chemická látka rozpuštěna nebo suspendována ve vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporučuje se zvážit jako první variantu použití vodného roztoku/suspenze, poté použití roztoku/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec eventuální použití roztoku jiného vehikula. U jiného typu vehikula, než je voda, je třeba znát jeho toxické charakteristiky. Měla by být určena stabilita a homogenita zkoušené chemické látky v daném vehikulu. POSTUP Počet a pohlaví zvířat 22. Doporučuje se, aby každá skupina měla zpočátku alespoň 10 samců a 12–13 samic. U samic se hodnotí před expozicí estrální cykly a zvířata, která nevykazují typické 4–5denní cykly, nebudou do studie zařazena; proto se doporučují náhradní samice, aby v každé skupině zůstalo 10 samic. S výjimkou případu výrazně toxických účinků se očekává, že v každé skupině bude alespoň 8 březích samic, což je obvykle minimální přijatelný počet březích samic na skupinu. Cílem je získat dostatečný počet březích samic a potomstva, a tím zajistit smysluplné hodnocení schopnosti zkoušené chemické látky ovlivnit plodnost, březost, chování samice a kojených mláďat a růst a vývoj potomstva generace F 1 od doby početí do 13. dne po porodu. Dávkování 23. Obecně by měly být použity nejméně tři zkušební skupiny a kontrolní skupina. Úrovně dávek mohou vycházet z údajů ze zkoušek akutní toxicity nebo z výsledků studií po opakované dávce. S výjimkou podávání zkoušené chemické látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako se zvířaty ve zkušební skupině. Používá-li se pro usnadnění aplikace zkoušené chemické látky vehikulum, podává se kontrolní skupině vehikulum v nejvyšším použitém objemu. 24. Při výběru úrovní dávek by se měly vzít v úvahu veškeré existující údaje o toxických a (toxiko)kinetických vlastnostech. Rovněž je třeba vzít v úvahu, že mohou existovat rozdíly v citlivosti mezi březími a nebřezími zvířaty. Nejvyšší úroveň dávky by se měla zvolit tak, aby vyvolala toxické účinky, ne však uhynutí nebo velké utrpení. Poté by se měla zvolit sestupná řada úrovní dávek, aby se prokázala odezva související s dávkou a nepřítomnost nepříznivých účinků (NOAEL) při nejnižší úrovni dávky. Pro nastavení sestupných úrovní dávek jsou obvykle optimální intervaly lišící se faktorem 2 až 4 a často je vhodnější přidání čtvrté zkušební skupiny než používání velkých intervalů mezi jednotlivými dávkami (např. lišících se faktorem vyšším než 10). 25. V přítomnosti pozorované obecné toxicity (např. snížená tělesná hmotnost, účinky na játra, srdce, plíce nebo ledviny atd.) nebo jiných změn, které nemusí být odezvou na toxicitu (např. snížený příjem krmiva, zvětšení jater), je třeba pozorované účinky na endokrinní citlivé sledované vlastnosti interpretovat obezřetně. Limitní zkouška 26. Pokud orální studie s jednou úrovní dávky v množství alespoň 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti a den nebo rovnocenné procento látky v potravě nebo pitné vodě při aplikaci dávky v potravě nebo pitné vodě pomocí postupů popsaných pro tuto studii nevyvolá žádnou zjistitelnou toxicitu, a pokud se neočekává ani toxicita na základě existujících údajů o strukturně příbuzných látkách, pak není nutné uvažovat o kompletní studii využívající několika úrovní dávek. Limitní zkouška se použije, pokud expozice u člověka nevyžaduje použít vyšší úroveň orální dávky. U dalších způsobů podávání látky, jako je inhalační nebo kožní aplikace, může být maximální dosažitelná úroveň koncentrace často dána fyzikálně-chemickými vlastnostmi zkoušených chemických látek. Podávání dávek 27. Zvířatům se denně podává zkoušená chemická látka po dobu sedmi dnů v rámci jednoho týdne. Pokud se zkoušená chemická látka podává nitrožaludečně, podává se zvířatům v jediné dávce za použití žaludeční sondy nebo vhodné intubační kanyly. Maximální objem tekutiny, kterou lze podat najednou, závisí na velikosti pokusného zvířete. Tento objem by neměl překročit 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. S výjimkou dráždivých a žíravých zkoušených chemických látek, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující konstantní objem při všech úrovních dávky. 28. U zkoušených chemických látek podávaných v potravě nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství použité zkoušené chemické látky neovlivňovalo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se zkoušená chemická látka v krmivu, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm), nebo konstantní dávkování vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete; použitá možnost by měla být specifikována. Zkoušená chemická látka podávaná žaludeční sondou se podává každý den přibližně ve stejnou dobu a alespoň jednou týdně se přizpůsobí tak, aby se udržela konstantní úroveň dávky vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete. Harmonogram zkoušky 29. Podávání oběma pohlavím by mělo být zahájeno alespoň 2 týdny před pářením po minimálně pětidenní aklimatizaci a po screeningu samic, zda mají normální estrální cykly (v dvoutýdenním období před expozicí). Studii je třeba naplánovat tak, aby hodnocení estrálních cyklů začalo brzy poté, co zvířata dosáhnou plné pohlavní zralosti. U různých kmenů potkana v různých laboratořích se to může mírně lišit, např. potkan Sprague Dawley stáří 10 týdnů, potkan Wistar stáří přibližně 12 týdnů. Samice s potomstvem by měly být utraceny 13. den po porodu nebo krátce poté. Den porodu (tj. ten, kdy je dokončen vrh) je definován jako 0. den po porodu. Samice, které nevykazují žádné známky kopulace, se utratí 24–26 dnů po posledním dni období páření. S dávkováním se u obou pohlaví pokračuje i během období páření. U samců se dále pokračuje s podáváním zkoušené chemické látky i po období páření alespoň do doby, kdy je dokončeno minimální období podávání 28 dnů. Poté se utratí, nebo se případně uchovají a dále je jim podávána zkoušená chemická látka pro případné provedení druhého páření, je-li to považováno za vhodné. 30. V denním podávání samicím rodičovské generace by se poté mělo pokračovat po celou březost a alespoň do 13. dne po porodu včetně nebo do dne před utracením. U studií, kde je zkoušená chemická látka podávána inhalací nebo dermální cestou, je třeba s dávkováním pokračovat alespoň do 19. dne gestace včetně, přičemž dávkování se obnoví co možná nejdříve, nejpozději však v PND 4. 31. Diagram časového sledu zkoušky je uveden v dodatku 2. Páření 32. Obvykle se v této studii používá párování 1:1 (jeden samec a jedna samice). V případě náhodného úmrtí samců mohou nastat výjimky. Samice se umístí se stejným samcem až do doby, kdy budou pozorovány důkazy o spáření, nebo do uplynutí dvou týdnů. Každé ráno se samice vyšetří na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 březosti je definován jako den, kdy je potvrzen důkaz o spáření (je nalezena vaginální zátka nebo sperma). V případě, že je páření neúspěšné, se zváží spáření se samci s osvědčenou plodností ze stejné skupiny. Velikost vrhu 33. Čtvrtý den po vrhu se velikost všech vrhů upraví náhodným vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby bylo pokud možno dosaženo počtu čtyř až pěti samců a čtyř až pěti samic z jednoho vrhu podle obvyklé početnosti vrhu u použitého kmene potkana. Od dvou nadbytečných mláďat se odeberou krevní vzorky, smíchají se a použijí pro stanovení sérových hladin T4. Selektivní eliminace jedinců, např. na základě tělesné hmotnosti nebo anogenitální vzdálenosti (AGD), není vhodná. Pokud počet mladých samců nebo samic neumožňuje ponechat čtyři až pět od každého pohlaví a vrhu, je možná částečná úprava (např. ponechat šest samců a čtyři samice). Jestliže velikost vrhu poklesne pod cílový počet pro utracení (8 nebo 10 mláďat/vrh), nevyřazují se žádná mláďata. Jestliže zbývá pouze jedno mládě nad cílový počet pro utracení, vyřadí se pouze jedno mládě, které se použije pro odběr krve pro případné vyšetření sérové hladiny T4. 34. Jestliže se velikost trhu neupravuje, 4. den po porodu se utratí dvě mláďata na vrh a odeberou se krevní vzorky pro stanovení sérové koncentrace hormonů štítné žlázy. Těmito dvěma mláďaty na vrh by měly být pokud možno samice, aby se uchovali samci pro hodnocení retenčních mléčných cyst, s výjimkou případu, že by po odstranění těchto mláďat nezbyly žádné samice pro vyšetření při ukončení zkoušky. Jestliže velikost vrhu poklesne pod 8 nebo 10 mláďat/vrh (podle normální velikosti vrhu u použitého kmene potkana), nevyřazují se žádná mláďata. Jestliže zbývá pouze jedno mládě nad normální velikost vrhu, vyřadí se pouze jedno mládě, které se použije pro odběr krve pro případné vyšetření sérové hladiny T4. Pozorování živých zvířat Poznatky z klinického pozorování 35. Po celou dobu zkoušky by se mělo provádět všeobecné klinické pozorování nejméně jednou denně a častěji, pokud jsou zpozorovány příznaky toxicity. Pozorování se provádí denně, pokud možno ve stejnou dobu a s přihlédnutím k době očekávaného maxima účinku po podání látky. Zaznamenávají se významné změny chování, příznaky ztíženého nebo prodlouženého vrhu a všechny příznaky toxicity, včetně mortality. Tyto záznamy by měly zahrnovat čas nástupu, stupeň a délku trvání známek toxicity. Tělesná hmotnost a spotřeba potravy a vody 36. Samci a samice se váží první den podávání, poté týdně a při ukončení zkoušky. V průběhu březosti se samice zváží 0., 7., 14. a 20. den a do 24 hodin po vrhu (0. den nebo 1. den po porodu) a alespoň 4. den a 13. den po porodu. Tato pozorování se zaznamenají individuálně u každého dospělého zvířete. 37. Před obdobím páření a během březosti a laktace se alespoň jednou týdně měří příjem potravy. Měření příjmu potravy v průběhu páření je volitelné. Pokud se zkoušená chemická látka podává v pitné vodě, měří se v průběhu těchto období také spotřeba vody. Estrální cykly 38. Estrální cykly je třeba sledovat před zahájením expozice, aby bylo možné vybrat pro studii samice s pravidelným cyklem (viz odstavec 22). Od začátku období expozice až do průkazu o páření je třeba také každý den sledovat vaginální stěry. V případě obav z účinků akutního stresu, které by při zahájení podávání zkoušené chemické látky mohly změnit estrální cykly, mohou laboratoře exponovat pokusná zvířata po dobu dvou týdnů, poté denně odebírat vaginální stěry za účelem sledování estrálního cyklu po dobu minimálně dvou týdnů před obdobím páření a dále je sledovat až do období páření, dokud prokazatelně nedojde k páření. Při získávání vaginálních/cervikálních buněk je třeba dávat pozor, aby se neporušila sliznice, což by mohlo vyvolat stav falešné březosti (7) (8). Parametry potomstva 39. Doba gestace se zaznamená a počítá se ode dne 0 březosti. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvě a živě narozených mláďat, počet zakrslých mláďat (mláďat, která jsou výrazně menší než odpovídající kontrolní mláďata) a přítomnost nápadných abnormalit. 40. Do 24 hodin po porodu (0. den nebo 1. den po porodu) a alespoň 4. den a 13. den po porodu se živá mláďata spočítají, stanoví se jejich pohlaví a zváží se. Kromě pozorování popsaných v odstavci 35 je třeba zaznamenat jakékoli abnormální chování potomstva. 41. U každého mláděte je třeba ve stejný den po porodu v době od PND 0 do PND 4 změřit anogenitální vzdálenost (AGD). V den měření AGD by měla být zjištěna tělesná hmotnost mláděte a AGD by měla být normalizována na nějakou míru velikosti mláďat, nejlépe třetí odmocninu tělesné hmotnosti (9). Podle doporučení pokynu OECD č. 151 se v PND 12 nebo 13 spočítá počet bradavek/prsních dvorců u mladých samců (10). Biochemické vyšetření 42. Krevní vzorky z určeného místa se odebírají podle tohoto rozvrhu: — od alespoň dvou mláďat na vrh 4. den po porodu, pokud to umožňuje počet mláďat (viz odstavce 33-34) — od všech samic a alespoň dvou mláďat na vrh při ukončení zkoušky 13. den a — od všech dospělých samců při ukončení zkoušky. Všechny krevní vzorky se uchovávají za vhodných podmínek. Krevní vzorky odebrané mláďatům 13. den a dospělým samcům se vyšetří na sérové hladiny hormonů štítné žlázy (T4). Ve vhodných případech se provede další vyšetření T4 v krevních vzorcích odebraných samicím a mláďatům 4. den. Je-li to vhodné, mohou být volitelně stanoveny také hladiny jiných hormonů: Krev mláďat z vrhu lze pro potřeby analýzy hormonů štítné žlázy smíchat. Hormony štítné žlázy (T4 a TSH) se měří nejlépe jako „celkové“. 43. Následující faktory mohou ovlivnit variabilitu a absolutní koncentrace stanovovaných hormonů: — doba utracení vzhledem k diurnálním odchylkám v koncentracích hormonů, — způsob utracení – mělo by se zabránit zbytečnému stresu zvířat, který může ovlivnit koncentrace hormonů, — testovací soupravy pro stanovení hormonů, jejichž standardní křivky se mohou lišit. 44. Vzorky plazmy určené speciálně k stanovení hormonů by se měly odebírat zhruba ve stejnou denní dobu. Číselné hodnoty získané při analýze koncentrací hormonů se u různých komerčních testovacích souprav liší. Patologie Celková pitva 45. Dospělá zvířata se v okamžiku usmrcení nebo úhynu během studie makroskopicky vyšetří na abnormality nebo patologické změny. Speciální pozornost je třeba věnovat orgánům rozmnožovací soustavy. Zaznamená se počet implantací. Ráno v den pitvy se vyšetří vaginální stěry s cílem určit stadium estrálního cyklu a umožnit korelaci s histopatologickým vyšetřením vaječníků. 46. Varlata, nadvarlata a prostata a semenné váčky s Cowperovými žlázami jako celek se u všech dospělých samců podle potřeby zbaví všech přirostlých tkání a co nejdříve po pitvě se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí. Kromě toho mohou být volitelně zváženy další orgány, jako jsou svaly m. levator ani a m. bulbocavernosus, Cowperovy žlázy a žalud penisu u samců a párové vaječníky (vlhká hmotnost) a děloha (včetně děložního hrdla) u samic; je-li toto vážení prováděno, mělo by k němu dojít co nejdříve po pitvě. 47. Mrtvá mláďata a mláďata utracená 13. den po porodu nebo krátce poté je třeba alespoň pečlivě externě vyšetřit na závažné abnormality. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vnějším rozmnožovacím orgánům, které se vyšetří na přítomnost známek změněného vývoje. 13. den se uchová štítná žláza od 1 mladého samce a 1 mladé samice z každého vrhu. 48. Vaječníky a varlata, přídatné pohlavní orgány (děloha a děložní hrdlo, nadvarlata, prostata, semenné váčky s Cowperovými žlázami), štítná žláza a všechny orgány od všech dospělých zvířat vykazující makroskopické léze se uchovají. Pro rutinní vyšetření varlat a nadvarlat se nedoporučuje fixace ve formalínu. Přípustnou metodou pro tyto tkáně je použití Bouinova fixačního roztoku nebo modifikovaného Davidsonova fixačního roztoku (11). Tunica albuginea se může jemně a mělce propíchnout jehlou na obou koncích orgánu, aby se umožnilo rychlé proniknutí fixativa. Histopatologie 49. Podrobné histologické vyšetření je třeba provést u vaječníků, varlat a nadvarlat (se zvláštním důrazem na stádia spermatogeneze a histopatologii struktury intersticiálních buněk varlat) zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a v kontrolní skupině. V případě potřeby mohou být vyšetřeny i další uchované orgány včetně štítné žlázy od mláďat a dospělých zvířat. Hmotnost štítné žlázy lze stanovit po fixaci. Odříznutí by se mělo rovněž provádět velmi opatrně a teprve po fixaci, aby se zamezilo poškození tkáně. Poškození tkáně by mohlo narušit histopatologickou analýzu. Vyšetření by měla být provedena také u zvířat ostatních dávkových skupin, pokud jsou u skupiny s nejvyšší dávkou pozorovány změny. Pokyny k histopatologickému vyšetření (11) podrobně popisují pitvu, fixaci, tvorbu řezů a histopatologické vyšetření endokrinních tkání. ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV Údaje 50. Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Dále se všechny údaje shrnou do tabulek tak, aby byl u každé experimentální skupiny uveden počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat uhynulých během zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba úhynu nebo humánního utracení, počet plodných samic, počet březích samic, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis pozorovaných příznaků toxicity včetně doby nástupu, trvání a závažnosti veškerých toxických účinků, druhy histopatologických změn a všechny významné údaje o vrhu. Souhrnná zpráva ve formě tabulky, která se ukázala jako velmi užitečná pro hodnocení reprodukčního/vývojového účinku, je uvedena v dodatku 3. 51. Vzhledem k omezené velikosti studie mají statistické analýzy ve formě testů „významnosti“ pro mnoho sledovaných vlastností, zejména pro reprodukční sledované vlastnosti, omezenou hodnotu. Pokud se používají statistické analýzy, pak by měla být zvolená metoda vhodná pro distribuci zkoumané proměnné a měla by být zvolena před zahájením studie. Statistická analýza AGD a retenčních mléčných cyst by měla vycházet z údajů o jednotlivých mláďatech se zohledněním účinků na vrh. Ve vhodných případech je jednotkou analýzy vrh. Statistická analýza tělesné hmotnosti mláďat by měla vycházet z údajů o jednotlivých mláďatech se zohledněním velikosti vrhu. Vzhledem k malé velikosti skupin může být jako pomůcka pro interpretaci studie také užitečné použití historických kontrolních údajů (např. o velikosti vrhu), pokud jsou tyto údaje k dispozici. Vyhodnocení výsledků 52. Výsledky této studie reprodukční toxicity se vyhodnotí z hlediska pozorovaných účinků, pitvy a mikroskopických nálezů. V hodnocení musí být uveden vztah mezi dávkou zkoušené chemické látky a přítomností nebo nepřítomností, výskytem a závažností abnormalit včetně makroskopických lézí, stanovených cílových orgánů, neplodnosti, klinických abnormalit, vlivu na reprodukční výkonnost a schopnost vrhu, změny tělesné hmotnosti, vlivu na úmrtnost a další toxické účinky. 53. Vzhledem ke krátké době expozice samců je třeba histopatologii varlat a nadvarlat zvažovat při posuzování reprodukčních účinků u samců společně s údaji o fertilitě. Jako pomůcka pro interpretaci studie může být také užitečné použití historických kontrolních údajů o reprodukci/vývoji (např. o velikosti vrhu, AGD, retenčních mléčných cystách, sérových hladinách T4), pokud jsou tyto údaje k dispozici. 54. Za účelem kontroly jakosti se navrhuje, aby se shromáždily historické kontrolní údaje a vypočítaly se koeficienty rozptylu pro číselné údaje, zejména pro parametry spojené s detekcí endokrinních disruptorů. Tyto údaje pak lze použít pro účely srovnání při hodnocení stávajících studií. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA 55. Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace: Zkoušená chemická látka: — zdroj, číslo šarže a je-li k dispozici, datum použitelnosti, — stabilita zkoušené chemické látky, je-li známa. Jednosložková látka: — fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti, — chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd. Vícesložkové látky, UVCB a směsi: — charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek. Vehikulum (je-li použito): — zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda. Pokusná zvířata: — použitý druh/kmen, — počet, věk a pohlaví zvířat, — původ, podmínky chovu, strava atd., — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky. — zdůvodnění použití druhu, pokud je jiný než potkan. Zkušební podmínky: — zdůvodnění zvolených úrovní dávek, — podrobnosti o složení zkoušené chemické látky/úpravě potravy, o použitých koncentracích, stálosti a homogenitě přípravku, — podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky, — popřípadě přepočet koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vodě (ppm) na skutečnou denní dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den), — podrobnosti o jakosti krmení a vody, — podrobný popis postupů randomizace při výběru mláďat pro třídění, jsou-li tříděna. Výsledky: — tělesná hmotnost/změny tělesné hmotnosti, — spotřeba potravy a popřípadě spotřeba vody, je-li údaj k dispozici, — údaje o toxických reakcích podle pohlaví a dávky, včetně ukazatelů plodnosti, gestace a všech dalších známek toxicity, — délka gestace, — toxické nebo jiné účinky na reprodukci, potomstvo, postnatální růst atd., — povaha, závažnost a trvání klinických projevů (ať vratných, či nevratných), — počet dospělých samic s normálním nebo abnormálním estrálním cyklem a trváním cyklu, — počet živě narozených mláďat a postimplantačních ztrát, — údaje o tělesné hmotnosti mláďat, — AGD všech mláďat (a tělesná hmotnost v den měření AGD), — retenční mléčné cysty u mláďat samců, — hladiny hormonů štítné žlázy u 13denních mláďat a dospělých samců (a u samic a 4denních mláďat, jsou-li tyto hodnoty měřeny), — počet mláďat s makroskopicky viditelnými abnormalitami, orientační hodnocení vnějších genitálií, počet zakrslých mláďat, — den úhynu během studie nebo údaj, že zvířata přežila až do dne utracení, — počet implantovaných plodů, velikost vrhu a hmotnost vrhu v době pořízení záznamu, — tělesná hmotnost při utracení a údaje o hmotnosti orgánů u rodičovských zvířat, — pitevní nálezy, — podrobný popis histopatologických nálezů, — údaje o absorpci (jsou-li k dispozici), — statistické vyhodnocení výsledků, je-li to možné. Rozbor výsledků. Závěry. Interpretace výsledků 56. Studie poskytne hodnocení reprodukční/vývojové toxicity spojené s podáváním opakovaných dávek (viz odstavce 5 a 6). Mohla by naznačit nutnost provést další výzkum a poskytnout vodítko pro návrh dalších studií. Jako pomůcka při interpretaci výsledků v oblasti reprodukce a vývoje by měl posloužit pokyn OECD č. 43 (12). Pokyn OECD č. 106 týkající se histologického hodnocení endokrinních a reprodukčních zkoušek u hlodavců (11) poskytuje informace o přípravě a hodnocení (endokrinních) orgánů a vaginálních stěrů, což může být pro tento pokyn užitečné. LITERATURA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. K dispozici na vyžádání u Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj, Paříž. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. K dispozici na vyžádání u Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj, Paříž. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. K dispozici na vyžádání u Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj, Paříž. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 217) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development,.Paris. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Dodatek 1 DEFINICE (VIZ TAKÉ POKYNY OECD Č. 150 (6)) Androgenicita je schopnost chemické látky působit v organismu savců jako přirozený androgenní hormon (např. testosteron). Antiandrogenicita je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného androgenního hormonu (např. testosteronu). Antiestrogenicita je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného estrogenního hormonu (např. estradiolu 17ß). Antityreoidální působení je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného hormonu štítné žlázy (např. T3). Chemická látka je látka nebo směs. Vývojová toxicita: projev reprodukční toxicity představující prenatální, perinatální, postnatální, strukturální nebo funkční poruchy u potomstva. Dávkováním se rozumí obecný termín zahrnující dávku, četnost a trvání doby, po kterou je látka podávána. Dávkou se rozumí množství podané zkoušené chemické látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené chemické látky na jednotku tělesné hmotnosti zvířete za den (např. mg/kg tělesné hmotnosti/den) nebo jako konstantní koncentrace v krmivu. Zřejmá toxicita je obecný termín popisující jasné příznaky toxicity po podání zkoušené chemické látky. Ty by měly být dostačující pro posouzení nebezpečnosti a měly by být takové, že při zvýšení podávané dávky lze očekávat rozvoj závažných toxických příznaků a pravděpodobnou mortalitu. Porucha plodnosti představuje poruchy samčích nebo samičích reprodukčních funkcí nebo schopnosti. Mateřská toxicita: nežádoucí účinky na březí samice vyskytující se buď specificky (přímý účinek), nebo nespecificky (nepřímý účinek). NOAEL je zkratka pro angl. „no-observed-adverse-effect level“. Je to nejvyšší úroveň dávky, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky spojené se zkouškou. Estrogenicita je schopnost chemické látky působit v organismu savců jako přirozený estrogenní hormon (např. estradiol 17ß). Reprodukční toxicita představuje škodlivé účinky na potomstvo a/nebo poruchy samčích nebo samičích reprodukčních funkcí nebo schopnosti. Zkoušená chemická látka je jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou. Tyreoidální působení je schopnost chemické látky působit jako přirozený hormon štítné žlázy (např. T3) v savčím organismu. Validace je vědecký proces, jehož cílem je charakterizovat provozní požadavky a provozní omezení zkušební metody a prokázat její spolehlivost a relevantnost pro určitý konkrétní účel. Dodatek 2 DIAGRAM ČASOVÉHO PLÁNU EXPERIMENTU SE ZNÁZORNĚNÍM MAXIMÁLNÍ DÉLKY STUDIE, NA ZÁKLADĚ CELÉHO ČTRNÁCTIDENNÍHO OBDOBÍ PÁŘENÍ Dodatek 3 SOUHRNNÁ ZPRÁVA O ÚČINCÍCH NA REPRODUKCI/VÝVOJ VE FORMĚ TABULKY POZOROVÁNÍ HODNOTY Dávka (jednotky) 0 (kontrola) ... ... ... ... Páry na začátku (N) Estrální cyklus (alespoň střední délka a frekvence nepravidelných cyklů) Samice vykazující známky kopulace (N) Zabřezlé samice (N) Dny zabřeznutí 1–5 (N) Dny zabřeznutí 6–... (21) (N) Březost ≤ 21 dnů (N) Březost = 22 dnů (N) Březost ≥ 23 dnů (N) Samice s živými novorozenými mláďaty (N) Samice s živými novorozenými mláďaty 4. den po porodu (N) Implantace/samice (průměr) Živá mláďata/samice při narození (průměr) Živá mláďata/samice 4. den (průměr) Poměr pohlaví (samec/samice) při narození (průměr) Poměr pohlaví (samec/samice) 4. den (průměr) Hmotnost vrhu při narození (průměr) Hmotnost vrhu 4. den (průměr) Hmotnost mláďat při narození (průměr) Hmotnost mláďat v době měření AGD (průměr samců, průměr samic) AGD mláďat ve stejný postnatální den, při narození – 4. den (průměr samců, průměr samic, uvést PND) Hmotnost mláďat 4. den (průměr) Retenční mléčné cysty u mladých samců 13. den (průměr) Hmotnost mláďat 13. den (průměr) ABNORMÁLNÍ MLÁĎATA Samice s 0 Samice s 1 Samice s ≥ 2 ZTRÁTA POTOMSTVA Prenatální/postimplantační (implantace minus živě narozená mláďata) Samice s 0 Samice s 1 Samice s 2 Samice s ≥ 3 Postnatální (živě narozená mláďata minus živá mláďata 13. den po porodu) Samice s 0 Samice s 1 Samice s 2 Samice s ≥ 3 B.64 KOMBINOVANÁ STUDIE TOXICITY PO OPAKOVANÝCH DÁVKÁCH SE SCREENINGOVOU ZKOUŠKOU NA REPRODUKČNÍ/VÝVOJOVOU TOXICITU ÚVOD 1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení č. 422 (2016). Pokyny OECD pro zkoušení chemických látek se pravidelně přezkoumávají s ohledem na vědecký pokrok. Pokyn č. 422 k původní screeningové zkoušce byl přijat v roce 1996 na základě protokolu pro „Kombinovanou screeningovou zkoušku na reprodukční/vývojovou toxicitu po opakovaných dávkách“ projednaného na dvou zasedáních odborníků, a to v Londýně v roce 1990 (1) a v Tokiu v roce 1992 (2). 2. Tato zkušební metoda kombinuje screeningovou část na reprodukční/vývojovou toxicitu, která vychází ze zkušeností získaných v členských zemích při používání původní metody u stávajících chemických látek vyráběných ve velkém objemu a při průzkumném testování látek pozitivní kontroly (3) (4), a část zkoušení toxicity po opakovaných dávkách v souladu s Pokynem OECD pro zkoušení č. 407 (Studie orální toxicity u hlodavců s opakovaným podáváním dávky v 28denním cyklu, odpovídající kapitole B.7 této přílohy). 3. Tato zkušební metoda byla aktualizována o příslušné sledované vlastnosti endokrinnch disruptorů v návaznosti na činnost s vysokou prioritou, kterou organizace OECD zahájila v roce 1998 a která byla zaměřena na revizi stávajících pokynů pro zkoušení a vypracování nových pokynů pro zjišťování a zkoušení látek, které mohou narušovat činnost endokrinních žláz (5). V této souvislosti byly do pokynu č. 407 (odpovídajícího kapitole B.7 této přílohy) v roce 2008 doplněny parametry vhodné k detekci endokrinního působení zkoušených chemických látek. Cílem aktualizace pokynu č. 422 bylo zahrnout do pokynu ke screeningové zkoušce některé relevantní sledované vlastnosti endokrinních disruptorů, pokud doby expozice zahrnují některá citlivá období v průběhu vývoje (prenatální nebo časně postnatální období). 4. Na základě studie proveditelnosti řešící vědecké a technické otázky spojené se zahrnutím relevantních sledovaných vlastností, jakož i možných úprav plánu zkoušky potřebných pro jejich zahrnutí (6) byly do pokynu č. 422 přidány vybrané další relevantní sledované vlastnosti související s endokrinními disruptory, které jsou rovněž součástí pokynu pro zkoušení č. 443 (Rozšířená jednogenerační studie toxicity pro reprodukci, odpovídající kapitole B.56 této přílohy). 5. Tato zkušební metoda je určena pro získání omezeného množství informací týkajících se účinků zkoušené chemické látky na reprodukční výkonnost samců a samic, jako je funkce pohlavních žláz, chování při páření, početí, vývoj zárodku a vrh. Není alternativou pro stávající zkušební metody B.31, B.34, B.35 nebo B.56 a ani je nahrazuje. VÝCHOZÍ ÚVAHY 6. Při posuzování a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze po získání prvních informací o toxicitě z akutních zkoušek stanovit orální toxicitu pomocí opakované aplikace dávek. Tato studie poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by se mohlo projevit na základě opakované expozice během relativně omezeného časového období. Tato metoda se skládá ze základní studie toxicity po opakovaných dávkách, kterou lze použít u chemických látek, u nichž není důvod pro 90denní studii (např. když objem výroby nepřekračuje určité limity), nebo jako předběžnou studii k dlouhodobé studii. Při realizaci studie by měly být respektovány hlavní zásady a aspekty stanovené v pokynu OECD č. 19 o uznávání, posuzování a používání klinických příznaků jako humánních sledovaných vlastností pro pokusná zvířata používaná při hodnoceních bezpečnosti (7). 7. Dále zahrnuje screeningovou zkoušku na reprodukční/vývojovou toxicitu, a proto může být použita také na získání prvních informací o možných účincích na reprodukční výkonnost samců a samic, jako je funkce pohlavních žláz, chování při páření, početí, vývoj zárodku a vrh, a to v rané fázi posuzování toxikologických vlastností zkoušených chemických látek, nebo informací o chemických látkách, které jsou předmětem zájmu. Tato zkušební metoda neposkytuje úplné informace o všech aspektech reprodukce a vývoje. Konkrétně nabízí jen omezené prostředky zjištění postnatálních projevů prenatální expozice nebo účinků, které mohou být vyvolány v průběhu postnatální expozice. Vzhledem (mimo jiné) k selektivitě sledovaných vlastností a krátké době trvání studie neposkytuje tato metoda důkaz pro definitivní tvrzení, že nedochází k žádným reprodukčním/vývojovým účinkům. Navíc, pokud neexistují údaje z jiných zkoušek reprodukční/vývojové toxicity, jsou pozitivní výsledky užitečné pro první posouzení rizika a přispívají k rozhodnutím ohledně nezbytnosti a načasování dalších zkoušek. 8. Výsledky získané pro parametry související s endokrinním působením by se měly interpretovat v kontextu „koncepčního rámce OECD pro zkoušky a hodnocení chemických látek způsobujících endokrinní poruchy“ (8). V tomto koncepčním rámci je vylepšený Pokyn OECD pro zkoušení č. 422 zařazen na úroveň 4 jako zkouška in vivo poskytující údaje o nežádoucích účincích na relevantní endokrinní sledované vlastnosti. Endokrinní signál sám o sobě však nemusí být považován za dostatečný důkaz, že zkoušená chemická látka je endokrinním disruptorem. 9. Tato zkušební metoda klade rovněž větší důraz na neurologické účinky jako na specifické sledované vlastnosti; důraz je kladen na potřebu pečlivého klinického pozorování zvířat, aby bylo získáno co nejvíce informací. Metoda by měla odhalit chemické látky s neurotoxickým potenciálem, u nichž může být nezbytné další hlubší zkoumání tohoto aspektu. Dále může tato metoda poskytnout základní indikaci imunologických účinků. 10. Pokud neexistují údaje z jiných studií systémové toxicity, reprodukční/vývojové toxicity, neurotoxicity anebo imunotoxicity, jsou pozitivní výsledky užitečné pro první posouzení rizika a přispívají k rozhodnutím ohledně nezbytnosti a načasování dalších zkoušek. Zkouška však může být zvláště užitečná jako součást souboru údajů pro hodnocení OECD (SIDS) pro posouzení stávajících chemických látek, o nichž nejsou k dispozici žádné nebo jen omezené toxikologické informace, a může sloužit jako alternativa k provedení dvou samostatných zkoušek toxicity po opakovaných dávkách (Pokyn OECD pro zkoušení č. 407, odpovídající kapitole B.7 této přílohy), respektive reprodukční/vývojové toxicity (Pokyn OECD pro zkoušení č. 421, odpovídající kapitole B.63 této přílohy). Rovněž může být použita jako studie ke stanovení dávkování pro rozsáhlejší reprodukční/vývojové studie, nebo když je to jinak považováno za relevantní. 11. Obecně se předpokládá, že existují rozdíly v citlivosti mezi březími a nebřezími zvířaty. Proto může být složitější stanovit úroveň dávek v této kombinované zkoušce, která bude adekvátní pro posouzení jak obecné systémové toxicity, tak i specifické reprodukční/vývojové toxicity, než když se jednotlivé zkoušky provádějí zvlášť. Navíc může být obtížnější interpretovat výsledky zkoušek s ohledem na obecnou systémovou toxicitu, než když se provádí samostatná studie s opakovanými dávkami, zejména když se sérové a histopatologické parametry nehodnotí ve studii současně. Vzhledem k uvedeným technickým problémům jsou pro provádění této kombinované screeningové zkoušky nutné značné zkušenosti v oblasti zkoušení toxicity. Na druhé straně může kombinovaná zkouška nabídnout kromě menšího počtu použitých zvířat lepší prostředky pro rozlišení přímých účinků na reprodukci/vývoj od účinků, které jsou sekundární k jiným (systémovým) účinkům. 12. V této zkoušce je období podávání zkoušené chemické látky delší než v klasické 28denní studii s opakovanou dávkou. V porovnání se stavem, kdy se provádí klasická 28denní studie s opakovanou dávkou kromě screeningové zkoušky reprodukční/vývojové toxicity, se však používá méně zvířat každého pohlaví na skupinu. 13. Tato zkušební metoda předpokládá orální aplikaci zkoušené chemické látky. Pokud jsou použity jiné cesty expozice, bude zřejmě nutné provést úpravy. 14. Před použitím této zkušební metody ke zkoušení směsi s cílem získat údaje pro zamýšlený regulační účel by mělo být zváženo, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout odpovídající výsledky, a pokud ano, proč tomu tak je. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi. 15. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1. PRINCIP ZKOUŠKY 16. Zkoušená chemická látka se podává v odstupňovaných dávkách několika skupinám samců a samic. Samcům se podává dávka minimálně čtyři týdny včetně dne před plánovaným usmrcením (zahrnuje to minimálně dva týdny před pářením, v průběhu období páření a přibližně dva týdny po páření). Vzhledem k omezené době podávání před pářením u samců nemusí být fertilita zvláště citlivým ukazatelem toxicity pro varlata. Proto je velmi důležité provést podrobné histologické vyšetření varlat. Kombinace dvoutýdenní doby podávání před pářením a následné pozorování páření/fertility s celkovou dobou podávání alespoň čtyři týdny, po níž následuje podrobná histopatologie samčích gonád, se považuje za dostatečnou ke zjištění většiny účinků na fertilitu a spermatogenezi u samců. 17. Samicím je třeba podávat zkoušenou chemickou látku po celou dobu studie. Zahrnuje to dva týdny před pářením (s cílem pokrýt alespoň dva celé estrální cykly), variabilní dobu do početí, dobu březosti a alespoň třináct dnů po porodu, a to včetně dne před plánovaným usmrcením. 18. Délka studie následující po aklimatizaci a zhodnocení estrálního cyklu před zahájením podávání závisí na výkonnosti samice a činí přibližně 63 dnů [alespoň 14 dnů před pářením, (maximálně) 14 dnů páření, 22 dnů gestace, 13 dnů laktace]. 19. V průběhu období podávání se zvířata každý den pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci zkoušky se přeživší zvířata utratí a rovněž pitvají. POPIS METODY Výběr zvířecích druhů 20. Tato zkušební metoda je určena k použití s potkany. Jestliže se parametry uvedené v tomto pokynu pro zkoušení č. 422 zkoumají u jiných druhů hlodavců, mělo by se podat podrobné zdůvodnění. V mezinárodním validačním programu detekce endokrinních disruptorů pomocí pokynu pro zkoušení č. 407 byl jediným použitým druhem potkan. Není vhodné používat kmeny s nízkou plodností nebo s typicky vysokým výskytem vývojových vad. Používají se zdravá, dosud nepřipuštěná zvířata ještě nepoužitá pro jiné experimenty. Pokusná zvířata by měla být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví, hmotnosti a věku. Na začátku studie by měly být odchylky hmotnosti zvířat minimální a neměly by překročit ± 20 % střední hodnoty pro každé pohlaví. Provádí-li se studie jako předběžná studie pro dlouhodobou nebo celogenerační studii, je vhodné použít v obou studiích nejlépe zvířata stejného kmene a stejného původu. Umístění a krmení zvířat 21. Všechny postupy by měly splňovat místní standardy péče o laboratorní zvířata. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 o C (± 3 o ). Relativní vlhkost vzduchu by měla být alespoň 30 % a neměla by pokud možno přesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody. Výběr potravy může být ovlivněn potřebou zajistit dostatečné promísení s testovanou látkou, je-li látka podávána touto cestou. 22. Zvířata by měla být chována v malých skupinách stejného pohlaví; je-li to z vědeckého hlediska důvodné, mohou být zvířata chována individuálně. Při chovu zvířat v klecích by v jedné kleci nemělo být umístěno více než pět zvířat. Páření by mělo probíhat v klecích, které jsou k tomuto účelu vhodné. Březí samice je třeba chovat v klecích jednotlivě a poskytnout jim materiál pro vytvoření hnízda. Samice v době laktace se chovají v klecích jednotlivě společně s potomky. 23. Krmivo by se mělo pravidelně analyzovat, aby se zjistila přítomnost kontaminantů. Vzorek stravy by se měl uchovávat až do dokončení zprávy. Příprava zvířat 24. Zdravá mladá dospělá zvířata se náhodně vyberou a rozdělí do experimentálních skupin a klecí. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Zvířata se jednoznačně identifikují a před započetím studie se nechají v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Příprava dávek 25. Není-li jiný způsob aplikace považován za vhodnější, doporučuje se orální podávání zkoušené chemické látky. Pokud je zvolena orální cesta, zkoušená chemická látka se obvykle podává žaludeční sondou; alternativně však lze zkoušené chemické látky podávat také v potravě nebo v pitné vodě. 26. Je-li to nutné, je zkoušená chemická látka rozpuštěna nebo suspendována ve vhodném vehikulu. Kdykoli je to možné, doporučuje se zvážit nejprve použití vodného roztoku/suspenze, poté použití olejového roztoku/emulze (např. kukuřičného oleje) a nakonec roztoku v jiných vehikulech. U jiného typu vehikula, než je voda, je třeba znát jeho toxické charakteristiky. Měla by být určena stabilita a homogenita zkoušené chemické látky v daném vehikulu. POSTUP Počet a pohlaví zvířat 27. Doporučuje se, aby každá skupina měla zpočátku alespoň 10 samců a 12–13 samic. U samic se hodnotí před expozicí estrální cykly a zvířata, která nevykazují typické 4–5denní cykly, nebudou do studie zařazena; proto se doporučují náhradní samice, aby v každé skupině zůstalo 10 samic. S výjimkou případu výrazně toxických účinků se očekává, že v každé skupině bude alespoň 8 březích samic, což je obvykle minimální přijatelný počet březích samic na skupinu. Cílem je získat dostatečný počet březích samic a potomstva, a tím zajistit smysluplné hodnocení schopnosti zkoušené chemické látky ovlivnit plodnost, březost, chování samice a kojených mláďat a růst a vývoj potomstva generace F 1 od doby početí do dne 13 po porodu. Pokud se budou zvířata usmrcovat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před ukončením studie. Mělo by se zvážit přidání další satelitní skupiny pěti zvířat od každého pohlaví do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po dobu nejméně 14 dní po ukončení aplikace mohla sledovat vratnost, přetrvávání nebo opožděný nástup systémových toxických účinků. Zvířata ze satelitních skupin se nepáří, a proto se nepoužívají pro posouzení reprodukční/vývojové toxicity. Dávkování 28. Obecně by měly být použity nejméně tři zkušební skupiny a kontrolní skupina. Nejsou-li dostupné žádné vhodné obecné údaje o toxicitě, může se provést předběžná studie (na zvířatech stejného kmene a původu) pro stanovení rozmezí dávek, které mají být použity. S výjimkou podávání zkoušené chemické látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako se zvířaty ve zkušební skupině. Používá-li se pro usnadnění aplikace zkoušené chemické látky vehikulum, podává se kontrolní skupině vehikulum v nejvyšším použitém objemu. 29. Při výběru úrovní dávek by se měly vzít v úvahu veškeré existující údaje o toxických a (toxiko)kinetických vlastnostech. Rovněž je třeba vzít v úvahu, že mohou existovat rozdíly v citlivosti mezi březími a nebřezími zvířaty. Nejvyšší úroveň dávky by se měla zvolit tak, aby vyvolala toxické účinky, nikoli však uhynutí ani velké utrpení. Dále by měla být zvolena sestupná řada dávek s cílem prokázat, že existuje odezva související s dávkou a že nejnižší dávka nevyvolává žádné nežádoucí účinky. Obvykle jsou optimální dvoj- až čtyřnásobné intervaly mezi dávkami a často je vhodnější přidání čtvrté zkušební skupiny než používání příliš velkých intervalů mezi jednotlivými dávkami (např. lišících se faktorem větším než 10). 30. V přítomnosti pozorované obecné toxicity (např. snížená tělesná hmotnost, účinky na játra, srdce, plíce nebo ledviny atd.) nebo jiných změn, které nemusí být odezvou na toxicitu (např. snížený příjem krmiva, zvětšení jater), je třeba pozorované účinky na endokrinní citlivé sledované vlastnosti interpretovat obezřetně. Limitní zkouška 31. Pokud orální studie provedená podle postupů popsaných pro tuto studii při jedné dávce nejméně 1 000 mg na kg tělesné hmotnosti na den nebo v případě podávání v potravě nebo v pitné vodě v rovnocenné koncentraci (na základě stanovení tělesné hmotnosti) nevyvolá pozorovatelné toxické účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití několika úrovní dávek nutná. Limitní zkouška se použije s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek. U dalších způsobů podávání látky, jako je inhalační nebo kožní aplikace, může být maximální dosažitelná expozice často dána fyzikálně-chemickými vlastnostmi zkoušených chemických látek. Podávání dávek 32. Zvířatům se denně podává zkoušená chemická látka po dobu sedmi dnů v rámci jednoho týdne. Pokud se zkoušená chemická látka podává nitrožaludečně, podává se zvířatům v jediné dávce za použití žaludeční sondy nebo vhodné intubační kanyly. Maximální objem tekutiny, kterou lze podat najednou, závisí na velikosti pokusného zvířete. Tento objem by neměl překročit 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. S výjimkou dráždivých a žíravých zkoušených chemických látek, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující konstantní objem při všech úrovních dávky. 33. U zkoušených chemických látek podávaných v potravě nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství použité zkoušené chemické látky neovlivňovalo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se zkoušená chemická látka v krmivu, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm), nebo konstantní dávkování vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete; použitá možnost by měla být specifikována. Zkoušená chemická látka podávaná žaludeční sondou se podává každý den přibližně ve stejnou dobu a alespoň jednou týdně se přizpůsobí tak, aby se udržela konstantní úroveň dávky vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete. Pokud je kombinovaná studie prováděna jako předběžná studie k dlouhodobé nebo úplné studii reprodukční toxicity, měla by být v obou studiích použita stejná potrava. Harmonogram zkoušky 34. Podávání oběma pohlavím by mělo být zahájeno 2 týdny před pářením po minimálně pětidenní aklimatizaci a po screeningu samic, zda mají normální estrální cykly (v dvoutýdenním období před expozicí). Studii je třeba naplánovat tak, aby hodnocení estrálních cyklů začalo brzy poté, co zvířata dosáhnou plné pohlavní zralosti. U různých kmenů potkana v různých laboratořích se to může mírně lišit, např. potkan Sprague Dawley stáří 10 týdnů, potkan Wistar stáří přibližně 12 týdnů. Samice s potomstvem by měly být utraceny 13. den po porodu nebo krátce poté. Aby bylo možné odebrat krev samicím nalačno (pokud je dávána přednost této možnosti), není nutné, aby byly samice a jejich potomstvo utraceny ve stejný den. Den porodu (tj. ten, kdy je dokončen vrh) je definován jako 0. den po porodu. Samice, které nevykazují žádné známky kopulace, se utratí 24–26 dnů po posledním dni období páření. S dávkováním se u obou pohlaví pokračuje i během období páření. U samců se dále pokračuje s podáváním zkoušené chemické látky i po období páření alespoň do doby, kdy je dokončeno minimální období podávání 28 dnů. Poté se utratí, nebo se případně uchovají a dále je jim podávána zkoušená chemická látka pro případné provedení druhého páření, je-li to považováno za vhodné. 35. V denním podávání samicím rodičovské generace by se poté mělo pokračovat po celou březost a alespoň do 13. dne po porodu včetně nebo do dne před utracením. U studií, kde je zkoušená chemická látka podávána inhalací nebo dermální cestou, je třeba s dávkováním pokračovat alespoň do 19. dne gestace včetně, přičemž dávkování se obnoví co možná nejdříve, nejpozději však 4. postnatální den (PND). 36. Pokud je zařazena satelitní skupina, pak zvířata v této skupině, která mají být podle plánu dále sledována, se nepáří. Měla by být po dalších nejméně 14 dnů po prvním naplánovaném utracení samic bez aplikace, aby se zachytil opožděný nástup či přetrvávání toxických účinků nebo zotavení se z nich. 37. Diagram časového sledu zkoušky je uveden v dodatku 2. Estrální cykly 38. Estrální cykly je třeba sledovat před zahájením expozice, aby bylo možné vybrat pro studii samice s pravidelným cyklem (viz odstavec 27). Od začátku období expozice až do průkazu o páření je třeba také každý den sledovat vaginální stěry. V případě obav z účinků akutního stresu, které by při zahájení podávání zkoušené chemické látky mohly změnit estrální cykly, mohou laboratoře exponovat pokusná zvířata po dobu dvou týdnů, poté denně odebírat vaginální stěry za účelem sledování estrálního cyklu po dobu minimálně dvou týdnů před obdobím páření a dále je sledovat až do období páření, dokud prokazatelně nedojde k páření. Při získávání vaginálních/cervikálních buněk je třeba neporušit sliznice, což by mohlo vyvolat stav falešné březosti (8) (9). Páření 39. Obvykle se v této studii používá párování 1:1 (jeden samec a jedna samice). V případě náhodného úmrtí samců mohou nastat výjimky. Samice se umístí se stejným samcem až do doby, kdy budou pozorovány důkazy o spáření, nebo do uplynutí dvou týdnů. Každé ráno se samice vyšetří na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 březosti je definován jako den, kdy je potvrzen důkaz o spáření (je nalezena vaginální zátka nebo sperma). V případě, že páření bylo neúspěšné, se zváží spáření se samci s osvědčenou plodností ze stejné skupiny. Velikost vrhu 40. Čtvrtý den po vrhu se velikost všech vrhů upraví náhodným vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby bylo pokud možno dosaženo počtu čtyř až pěti samců a čtyř až pěti samic z jednoho vrhu podle obvyklé početnosti vrhu u použitého kmene potkana. Od dvou nadbytečných mláďat se odeberou krevní vzorky, smíchají se a použijí pro stanovení sérových hladin T4. Selektivní eliminace jedinců, např. na základě tělesné hmotnosti nebo anogenitální vzdálenosti (AGD), není vhodná. Pokud počet mladých samců nebo samic neumožňuje ponechat čtyři až pět od každého pohlaví a vrhu, je možná částečná úprava (např. ponechat šest samců a čtyři samice). Jestliže velikost vrhu poklesne pod cílový počet pro utracení (8 nebo 10 mláďat/vrh), nevyřazují se žádná mláďata. Jestliže zbývá pouze jedno mládě nad cílový počet pro utracení, vyřadí se pouze jedno mládě, které se použije pro odběr krve pro případné vyšetření sérové hladiny T4. 41. Jestliže se velikost trhu neupravuje, 4. den po porodu se utratí dvě mláďata na vrh a odeberou se krevní vzorky pro stanovení sérové koncentrace hormonů štítné žlázy. Těmito dvěma mláďaty na vrh by měly být pokud možno samice, aby se uchovali samci pro hodnocení retenčních mléčných cyst, s výjimkou případu, že by po odstranění těchto mláďat nezbyly žádné samice pro vyšetření při ukončení zkoušky. Jestliže velikost vrhu poklesne pod 8 nebo 10 mláďat/vrh (podle normální velikosti vrhu u použitého kmene potkana), nevyřazují se žádná mláďata. Jestliže zbývá pouze jedno mládě nad normální velikost vrhu, vyřadí se pouze jedno mládě, které se použije pro odběr krve pro případné vyšetření sérové hladiny T4. Pozorování 42. Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, nejlépe ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maxima účinku po podání látky. Zaznamenává se zdravotní stav zvířat. Nejméně dvakrát denně se provede prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. 43. Před expozicí látce a dále nejméně jednou týdně by se mělo provést důkladné klinické vyšetření všech rodičovských zvířat (za účelem intraindividuálního porovnání). Toto pozorování by se mělo provádět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru a nejlépe každý den ve stejnou dobu. Pozorování je třeba pečlivě zaznamenat, nejlépe za použití systému bodování explicitně definovaného ve zkušební laboratoři. Mělo by se usilovat o to, aby rozdíly ve zkušebních podmínkách byly co nejmenší a aby vyšetření prováděly nejlépe osoby, které nevědí, jakým testem zvířata procházejí. Vyšetření by mělo mimo jiné zahrnovat změny kůže, srsti, očí a sliznic, výskyt sekretů a exkretů a vegetativních funkcí (např. slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé dýchání). Zaznamenávat by se měly také změny chůze, držení těla a reakce na manipulaci, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (např. nadměrného čištění nebo opakovaného kroužení), ztížený nebo prodlužovaný vrh nebo bizarní chování (např. sebepoškozování, chůze pozpátku) (10). 44. Jednou v průběhu studie by se měly u pěti samců a pěti samic náhodně vybraných z každé skupiny vyšetřit reakce na smyslové podněty různého druhu (např. sluchové, zrakové, proprioceptivní), (8), (9), (11), síla úchopu (12) a motorická aktivita (13). Další informace o postupech, které lze použít, jsou uvedeny v příslušné literatuře. Místo postupů popsaných v této literatuře však lze použít alternativní postupy. U samců by měla tato funkční pozorování proběhnout ke konci období, kdy je jim podávána zkoušená chemická látka, krátce před naplánovaným utracením, ale před odběrem krve pro hematologické vyšetření nebo stanovení klinických biochemických ukazatelů (viz odstavce 53–56, včetně poznámky pod čarou č. 1). Samice by měly být v průběhu těchto funkčních zkoušek ve fyziologicky podobném stavu a měly by být testovány nejlépe jednou v průběhu posledního týdne laktace (např. LD 6–13), krátce před plánovaným utracením. V maximálně možné míře minimalizujte dobu oddělení samic od mláďat. 45. Pozorování funkčních poruch provedené jednou ke konci studie lze případně vynechat, pokud je studie prováděna jako předběžná pro následnou subchronickou (90denní) nebo dlouhodobou studii. V takovém případě by se mělo pozorování funkčních poruch zahrnout do této dlouhodobé studie. Dostupnost údajů o pozorovaných funkčních poruchách z této studie opakovaného podávání dávky může na druhé straně usnadnit výběr úrovní dávek pro následnou subchronickou nebo dlouhodobou studii. 46. Pozorování funkčních poruch lze výjimečně vynechat u skupin, které vykazují příznaky toxicity v takové míře, že by při posuzování funkčního stavu vadily. 47. Doba gestace se zaznamená a počítá se ode dne 0 březosti. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvě a živě narozených mláďat, počet zakrslých mláďat (mláďat, která jsou výrazně menší než odpovídající kontrolní mláďata) a přítomnost nápadných abnormalit. 48. Do 24 hodin po porodu (0. den nebo 1. den po porodu) a alespoň 4. den a 13. den po porodu se živá mláďata spočítají, stanoví se jejich pohlaví a zváží se. Kromě pozorování zvířat rodičovské generace (viz odstavce 43 a 44) je třeba zaznamenat jakékoli abnormální chování potomstva. 49. U každého mláděte je třeba ve stejný den po porodu v době od PND 0 do PND 4 změřit anogenitální vzdálenost (AGD). V den měření AGD by měla být zjištěna tělesná hmotnost mláděte a AGD by měla být normalizována na nějakou míru velikosti mláďat, nejlépe třetí odmocninu tělesné hmotnosti (14). Podle doporučení pokynu OECD č. 151 se v PND 12 nebo 13 spočítá počet bradavek/prsních dvorců u mladých samců (15). Tělesná hmotnost a spotřeba potravy a vody 50. Samci a samice se váží první den podávání, poté týdně a při ukončení zkoušky. V průběhu březosti se samice zváží 0., 7., 14. a 20. den a do 24 hodin po vrhu (0. den nebo 1. den po porodu) a alespoň 4. den a 13. den po porodu. Tato pozorování se zaznamenají individuálně u každého dospělého zvířete. 51. Před obdobím páření a během březosti a laktace se alespoň jednou týdně měří příjem potravy. Měření příjmu potravy v průběhu páření je volitelné. Pokud se zkoušená chemická látka podává ve vodě, měří se v průběhu těchto období také spotřeba tohoto média. Hematologická vyšetření 52. Jednou v průběhu studie by se měla u pěti samců a pěti samic náhodně vybraných z každé skupiny tato hematologická provést vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, retikulocytů, celkového počtu a diferenciálního rozpočtu leukocytů a trombocytů a stanovení protrombinového času. Jestliže zkoušená chemická látka nebo její domnělé metabolity mají oxidační vlastnosti nebo existuje podezření, že je mají, měly by se stanovit také koncentrace methemoglobinu a Heinzových tělísek. 53. Krevní vzorky by se měly odebírat z určeného místa. Samice by měly být při odběru ve fyziologicky podobném stavu. Za účelem vyloučení praktických problémů spojených s variabilitou při nástupu gestace se může samicím odebírat krev na konci období před pářením jako alternativa k odběru těsně před utracením zvířat nebo jako součást tohoto postupu. U samců se krev odebírá nejlépe těsně před utracením zvířat nebo jako součást tohoto postupu. Alternativně lze samcům odebírat krev také na konci období před pářením, pokud byla tato doba vybrána pro samice. 54. Krevní vzorky je třeba skladovat za vhodných podmínek. Biochemické vyšetření 55. Klinické biochemické analýzy za účelem vyšetření hlavních toxických účinků na tkáně, a zejména na játra a ledviny, by se měly provést na krevních vzorcích od pěti vybraných samců a pěti vybraných samic z každé skupiny. Před odebráním krevních vzorků se doporučuje ponechat zvířata přes noc nalačno ( 22 ) . Vyšetření plazmy a séra by mělo obsahovat stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, kreatininu, celkových bílkovin a albuminu, nejméně dvou enzymů indikujících účinky na jaterní buňky (jako je alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, a sorbitoldehydrogenáza) a žlučových kyselin. Stanovení dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a bilirubinu může za určitých okolností poskytnout užitečné informace. 56. Krevní vzorky z určeného místa se odebírají podle tohoto rozvrhu: — od alespoň dvou mláďat na vrh 4. den po porodu, pokud to umožňuje počet mláďat (viz odstavce 40–41), — od všech samic a alespoň dvou mláďat na vrh při ukončení zkoušky 13. den a — od všech dospělých samců při ukončení zkoušky. Všechny krevní vzorky se uchovávají za vhodných podmínek. Krevní vzorky odebrané mláďatům 13. den a dospělým samcům se vyšetří na sérové hladiny hormonů štítné žlázy (T4). Ve vhodných případech se provede další vyšetření T4 v krevních vzorcích odebraných samicím a mláďatům 4. den. Je-li to vhodné, mohou být volitelně stanoveny také hladiny jiných hormonů. Krev mláďat z vrhu lze pro potřeby analýzy hormonů štítné žlázy smíchat. Hormony štítné žlázy (T4 a TSH) se měří nejlépe jako „celek“. 57. Volitelně mohou být provedena tato vyšetření moči u pěti náhodně vybraných samců z každé skupiny v průběhu posledního týdne studie za použití časově definovaného sběru moči; vyšetření se týkají vzhledu, objemu, osmolality nebo specifické hmotnosti, pH, bílkovin, glukózy a krve/krvinek. 58. Dále by se mělo uvážit vyšetření indikátorů celkového poškození tkání v séru. Další vyšetření by mělo být provedeno, pokud mohou známé vlastnosti zkoušené chemické látky ovlivnit odpovídající metabolické profily, včetně vápníku, fosforu, triglyceridů na lačno a glukózy na lačno, specifických hormonů, methemoglobinu a cholinesterázy. To je třeba stanovit individuálně. 59. Následující faktory mohou ovlivnit variabilitu a absolutní koncentrace stanovovaných hormonů: — doba utracení vzhledem k diurnálním odchylkám v koncentracích hormonů, — způsob utracení – mělo by se zabránit zbytečnému stresu zvířat, který může ovlivnit koncentrace hormonů, — testovací soupravy pro stanovení hormonů, jejichž standardní křivky se mohou lišit. 60. Vzorky plazmy určené speciálně k stanovení hormonů by se měly odebírat zhruba ve stejnou denní dobu. Číselné hodnoty získané při analýze koncentrací hormonů se u různých komerčních testovacích souprav liší. 61. Pokud nejsou údaje o výchozích hodnotách z dřívějších pozorování dostatečné, mělo by se zvážit stanovení hematologických a klinických biochemických parametrů před začátkem podávání dávky nebo přednostně u skupiny zvířat nezahrnutých do experimentálních skupin. U samic musí být údaje od zvířat v laktaci. PATOLOGIE Celková pitva 62. U všech dospělých zvířat zařazených do studie by měla být provedena celková, podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Speciální pozornost je třeba věnovat orgánům rozmnožovací soustavy. Zaznamená se počet implantací. V den pitvy se vyšetří vaginální stěry s cílem určit stadium estrálního cyklu a umožnit korelaci s histopatologickým vyšetřením samičích reprodukčních orgánů. 63. Varlata, nadvarlata a prostata a semenné váčky s Cowperovými žlázami jako celek se u všech dospělých samců podle potřeby zbaví všech přirostlých tkání a co nejdříve po pitvě se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí. Kromě toho mohou být volitelně zváženy další orgány, jako jsou svaly m. levator ani a m. bulbocavernosus, Cowperovy žlázy a žalud penisu u samců a párové vaječníky (vlhká hmotnost) a děloha (včetně děložního hrdla) u samic; je-li toto vážení prováděno, mělo by k němu dojít co nejdříve po pitvě. Vaječníky, varlata, nadvarlata, přídatné pohlavní orgány a všechny orgány od všech dospělých zvířat vykazující makroskopické léze se uchovají. 64. Pro účely následného histopatologického vyšetření se uchovají v nejvhodnějším fixačním médiu štítné žlázy od všech dospělých samců a samic a od jednoho 13denního samce a jedné 13denní samice z každého vrhu. Hmotnost štítné žlázy lze stanovit po fixaci. Odříznutí by se mělo rovněž provádět velmi opatrně a teprve po fixaci, aby se zamezilo poškození tkáně. Poškození tkáně by mohlo narušit histopatologickou analýzu. Krevní vzorky by se měly odebírat z určeného místa těsně před utracením zvířat nebo v jeho průběhu a měly by se skladovat za vhodných podmínek (viz odstavec 56). 65. Dále se játra, ledviny, nadledvinky, brzlík, slezina, mozek a srdce od alespoň pěti dospělých samců a samic náhodně vybraných z každé skupiny (kromě zvířat nalezených v agónii a/nebo zvířat utracených před ukončením studie) podle potřeby zbaví všech ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí. Následující tkáně by se měly konzervovat v nejvhodnějším fixačním médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny makroskopicky viditelné léze, mozek (reprezentativní oblasti zahrnující hemisféry, mozeček a most), mícha, oko, žaludek, tenké a tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, ledviny, nadledvinky, slezina, srdce, brzlík, průdušnice a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a následným ponořením), gonády (varlata a vaječníky), přídatné pohlavní orgány (děloha a hrdlo děložní, nadvarlata, prostata, semenné váčky s Cowperovými žlázami), vagina, močový měchýř, lymfatické uzliny (kromě nejproximálnější svodné uzliny by se měla odebrat ještě jedna uzlina dle laboratorních zkušeností (16)), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis) přednostně v blízkosti svalu, kosterní sval a kost, s kostní dření (řez nebo čerstvý nátěr z aspirované kostní dřeně). Doporučuje se fixovat varlata ponořením do Bouinova nebo modifikovaného Davidsonova fixačního média (16) (17) (18); pro tyto tkáně se nedoporučuje fixace ve formalínu. Tunica albuginea se může jemně a mělce propíchnout jehlou na obou koncích orgánu, aby se umožnilo rychlé proniknutí fixativa. Na základě klinických nebo jiných nálezů může být nezbytné zkoumat i další tkáně. Také by se měly uchovat všechny orgány považované na základě známých vlastností zkoušené chemické látky za možné cílové orgány. 66. Následující tkáně mohou poskytnout cenné svědectví o endokrinních účincích: gonády (vaječníky a varlata), přídatné pohlavní orgány (děloha včetně děložního hrdla, nadvarlata, semenné váčky s Cowperovými žlázami, dorzolaterální a ventrální prostata), vagina, hypofýza, samčí prsní žláza a nadledvinka. Změny na samčích prsních žlázách nebyly dostatečně zdokumentovány, avšak tento parametr může být velmi citlivý na látky s estrogenním působením. Pozorování orgánů/tkání, které nejsou uvedeny v odstavci 65, jsou volitelná. 67. Mrtvá mláďata a mláďata utracená 13. den po porodu nebo krátce poté je třeba alespoň pečlivě externě vyšetřit na závažné abnormality. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vnějším rozmnožovacím orgánům, které se vyšetří na přítomnost známek změněného vývoje. Histopatologie 68. U vybraných zvířat z kontrolní skupiny a skupiny s vysokou dávkou by mělo být provedeno celkové histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání (se zvláštním důrazem na stádia spermatogeneze samčích gonád a histopatologii struktury intersticiálních buněk varlat). V případě potřeby může být vyšetřena štítná žláza od mláďat a zbývajících dospělých zvířat. Toto vyšetření by mělo být rozšířeno na zvířata z ostatních dávkových skupin, pokud jsou u skupiny s vysokou dávkou pozorovány změny orgánů vyvolané zkoušenou dávkou. Pokyny k histopatologickému vyšetření (10) podrobně popisují pitvu, fixaci, tvorbu řezů a histopatologické vyšetření endokrinních tkání. 69. Měly by být zkoumány všechny makroskopické léze. Za účelem objasnění hodnot dávky bez pozorovaného nepříznivého účinku (NOAEL) je třeba vyšetřit cílové orgány v jiných dávkových skupinách, zejména ve skupinách, které údajně vykazují hodnotu dávky bez pozorovaného nepříznivého účinku. 70. V případě použití satelitní skupiny by mělo být provedeno histopatologické vyšetření tkání a orgánů, na kterých byly pozorovány účinky u exponovaných skupin. ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV Údaje 71. Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Dále se všechny údaje shrnou do tabulek tak, aby byl u každé experimentální skupiny uveden počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat uhynulých během zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba úhynu nebo utracení, počet plodných samic, počet březích samic, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis pozorovaných příznaků toxicity včetně doby nástupu, trvání a závažnosti veškerých toxických účinků, druhy histopatologických změn a všechny významné údaje o vrhu. Souhrnná zpráva ve formě tabulky, která se ukázala jako velmi užitečná pro hodnocení reprodukčního/vývojového účinku, je uvedena v dodatku 3. 72. Je-li to možné, je třeba vyhodnotit číselné výsledky vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Srovnáním účinků v celém rozpětí dávkování by se mělo zamezit použití mnohonásobných t-testů. Statistické metody je třeba zvolit během plánování studie. Statistická analýza AGD a retenčních mléčných cyst by měla vycházet z údajů o jednotlivých mláďatech se zohledněním účinků na vrh. Ve vhodných případech je jednotkou analýzy vrh. Statistická analýza tělesné hmotnosti mláďat by měla vycházet z údajů o jednotlivých mláďatech se zohledněním velikosti vrhu. Vzhledem k omezené velikosti studie mají statistické analýzy ve formě testů „významnosti“ pro mnoho sledovaných vlastností, zejména pro reprodukční sledované vlastnosti, omezenou hodnotu. Některé nejčastěji používané metody, zejména parametrické testy na měření středního trendu, jsou nevhodné. Pokud se používají statistické analýzy, pak by měla být zvolená metoda vhodná pro distribuci zkoumané proměnné a měla by být zvolena před zahájením studie. Vyhodnocení výsledků 73. Výsledky této studie reprodukční toxicity se vyhodnotí z hlediska pozorovaných účinků, pitvy a mikroskopických nálezů. V hodnocení musí být uveden vztah mezi dávkou zkoušené chemické látky a přítomností nebo nepřítomností, výskytem a závažností abnormalit včetně makroskopických lézí, stanovených cílových orgánů, neplodnosti, klinických abnormalit, vlivu na reprodukční výkonnost a schopnost vrhu, změny tělesné hmotnosti, vlivu na úmrtnost a další toxické účinky. 74. Vzhledem ke krátké době expozice samců je třeba histopatologii varlat a nadvarlat zvažovat při posuzování reprodukčních účinků u samců společně s údaji o fertilitě. Jako pomůcka pro interpretaci studie může být také užitečné použití historických kontrolních údajů o reprodukci/vývoji (např. o velikosti vrhu, AGD, retenčních mléčných cystách, sérových hladinách T4), pokud jsou tyto údaje k dispozici. 75. Za účelem kontroly jakosti se navrhuje, aby se shromáždily historické kontrolní údaje a vypočítaly se koeficienty rozptylu pro číselné údaje, zejména pro parametry spojené s detekcí endokrinních disruptorů. Tyto údaje pak lze použít pro účely srovnání při hodnocení stávajících studií. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA 76. Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace: Zkoušená chemická látka: — zdroj, číslo šarže a, je-li k dispozici, datum použitelnosti, — stabilita zkoušené chemické látky, je-li známa. Jednosložková látka: — fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti, — chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd. Vícesložkové látky, UVCB a směsi: — charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek . Vehikulum (je-li použito): — zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda. Pokusná zvířata: — použitý druh/kmen, — počet, věk a pohlaví zvířat, — původ, podmínky chovu, strava atd., — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky, — zdůvodnění použití druhu, pokud je jiný než potkan. Zkušební podmínky: — zdůvodnění zvolených úrovní dávek, — podrobnosti o složení zkoušené chemické látky/úpravě potravy, o použité koncentraci, stálosti a homogenitě přípravku, — podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky, — popřípadě přepočet koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vodě (ppm) na skutečnou denní dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den), — podrobnosti o jakosti krmení a vody, — podrobný popis postupů randomizace při výběru mláďat pro třídění, jsou-li tříděna. Výsledky: — tělesná hmotnost/změny tělesné hmotnosti, — spotřeba krmiva, popřípadě spotřeba vody, — údaje o toxických reakcích podle pohlaví a dávky, včetně ukazatelů plodnosti, gestace a všech dalších známek toxicity, — délka gestace, — toxické nebo jiné účinky na reprodukci, potomstvo, postnatální růst atd., — povaha, závažnost a trvání klinických projevů (ať vratných, či nevratných), — posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity, — hematologická vyšetření s příslušnými základními hodnotami (normami), — klinická biochemická vyšetření s příslušnými výchozími hodnotami (normami), — počet dospělých samic s normálním nebo abnormálním estrálním cyklem a trváním cyklu, — počet živě narozených mláďat a postimplantačních ztrát, — počet mláďat s nápadnými strukturálními abnormalitami, orientační hodnocení vnějších genitálií, počet zakrslých mláďat, — den úhynu během studie nebo údaj, že zvířata přežila až do dne utracení, — počet implantovaných plodů, velikost vrhu a hmotnost vrhu v době pořízení záznamu, — údaje o tělesné hmotnosti mláďat, — AGD všech mláďat (a tělesná hmotnost v den měření AGD), — retenční mléčné cysty u mláďat samců, — hladiny hormonů štítné žlázy u 13denních mláďat a dospělých samců (a u samic a 4denních mláďat, jsou-li tyto hodnoty měřeny), — tělesná hmotnost při utracení a údaje o hmotnosti orgánů u rodičovských zvířat, — pitevní nálezy, — podrobný popis histopatologických nálezů, — údaje o absorpci (jsou-li k dispozici), — statistické vyhodnocení výsledků, je-li to možné. Rozbor výsledků. Závěry. Interpretace výsledků 77. Studie poskytne hodnocení reprodukční/vývojové toxicity spojené s podáváním opakovaných dávek. Vzhledem k tomu, že důraz je kladen na sledované vlastnosti všeobecné toxicity i na sledované vlastnosti reprodukční/vývojové toxicity, umožní výsledky této studie rozlišení mezi reprodukčními/vývojovými účinky vyskytujícími se za nepřítomnosti všeobecné toxicity a účinky projevujícími se pouze při úrovních, které jsou toxické i pro rodičovská zvířata (viz odstavce 7–11). Mohla by naznačit nutnost provést další výzkum a poskytnout vodítko pro návrh dalších studií. Jako pomůcka při interpretaci výsledků v oblasti reprodukce a vývoje by měl posloužit pokyn OECD č. 43 (19). Pokyn OECD č. 106 týkající se histologického hodnocení endokrinních a reprodukčních zkoušek u hlodavců (16) poskytuje informace o přípravě a hodnocení (endokrinních) orgánů a vaginálních stěrů, což může být pro tuto zkušební metodu užitečné. LITERATURA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. K dispozici na vyžádání u Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj, Paříž. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. K dispozici na vyžádání u Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj, Paříž. (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141-149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Environ. Toxicol ., 18, 89-95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Part B, 80 (2), 84-97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60). (11) Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267-283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233-236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). „Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights“, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (16) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (17) Hess RA and Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. V: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. (18) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol . Pathol . 30, 524-533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (20) OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Dodatek 1 DEFINICE (VIZ TAKÉ (20) POKYN OECD Č. 150) Androgenicita je schopnost chemické látky působit v organismu savců jako přirozený androgenní hormon (např. testosteron). Antiandrogenicita je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného androgenního hormonu (např. testosteronu). Antiestrogenicita je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného estrogenního hormonu (např. estradiolu 17ß). Antityreoidální působení je schopnost chemické látky potlačit v organismu savců působení přirozeného hormonu štítné žlázy (např. T3). Chemická látka je látka nebo směs. Vývojová toxicita projev reprodukční toxicity představující prenatální, perinatální, postnatální, strukturální nebo funkční poruchy u potomstva. Dávkou se rozumí množství podané zkoušené chemické látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené chemické látky na jednotku tělesné hmotnosti zvířete za den (např. mg/kg tělesné hmotnosti/den) nebo jako konstantní koncentrace v krmivu. Dávkováním se rozumí obecný termín zahrnující dávku, četnost a trvání doby, po kterou je látka podávána. Zřejmá toxicita je obecný termín popisující jasné příznaky toxicity po podání zkoušené chemické látky. Ty by měly být dostačující pro posouzení nebezpečnosti a měly by být takové, že při zvýšení podávané dávky lze očekávat rozvoj závažných toxických příznaků a pravděpodobnou mortalitu. Porucha plodnosti představuje poruchy samčích nebo samičích reprodukčních funkcí nebo schopnosti. Mateřská toxicita nežádoucí účinky na březí samice vyskytující se buď specificky (přímý účinek), nebo nespecificky (nepřímý účinek), které souvisí s graviditou. NOAEL je zkratka pro angl. „no-observed-adverse-effect level“. Je to nejvyšší úroveň dávky, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky spojené se zkouškou. Estrogenicita je schopnost chemické látky působit v organismu savců jako přirozený estrogenní hormon (např. estradiol 17ß). Reprodukční toxicita představuje škodlivé účinky na potomstvo a/nebo poruchy samčích nebo samičích reprodukčních funkcí nebo schopnosti. Zkoušená chemická látka je jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou. Tyreoidální působení je schopnost chemické látky působit jako přirozený hormon štítné žlázy (např. T3) v organismu savců. Validace je vědecký proces, jehož cílem je charakterizovat provozní požadavky a provozní omezení zkušební metody a prokázat její spolehlivost a relevantnost pro určitý konkrétní účel. Dodatek 2 DIAGRAM ČASOVÉHO PLÁNU EXPERIMENTU SE ZNÁZORNĚNÍM MAXIMÁLNÍ DÉLKY STUDIE NA ZÁKLADĚ CELÉHO ČTRNÁCTIDENNÍHO OBDOBÍ PÁŘENÍ Dodatek 3 SOUHRNNÁ ZPRÁVA O ÚČINCÍCH NA REPRODUKCI/VÝVOJ VE FORMĚ TABULKY POZOROVÁNÍ HODNOTY Dávka (jednotky)....... 0 (kontrola) ... ... ... ... Páry na začátku (N) Estrální cyklus (alespoň střední délka a frekvence nepravidelných cyklů) Samice vykazující známky kopulace (N) Zabřezlé samice (N) Dny zabřeznutí 1–5 (N) Dny zabřeznutí 6–...( (23) ) (N) Březost≤21 dnů (N) Březost = 22 dnů (N) Březost ≥ 23 dnů (N) Samice s živými novorozenými mláďaty (N) Samice s živými novorozenými mláďaty 4. den po porodu (N) Implantace/samice (průměr) Živá mláďata/samice při narození (průměr) Živá mláďata/samice 4. den (průměr) Poměr pohlaví (samec/samice) při narození (průměr) Poměr pohlaví (samec/samice) 4. den (průměr) Hmotnost vrhu při narození (průměr) Hmotnost vrhu 4. den (průměr) Hmotnost mláďat při narození (průměr) Hmotnost mláďat v době měření AGD (průměr samců, průměr samic) AGD mláďat ve stejný postnatální den, při narození – 4. den (průměr samců, průměr samic, uvést PND) Hmotnost mláďat 4. den (průměr) Hmotnost mláďat 13. den (průměr) Retenční mléčné cysty u mladých samců 13. den (průměr) ABNORMÁLNÍ MLÁĎATA Samice s 0 Samice s 1 Samice s ≥ 2 ZTRÁTA POTOMSTVA Prenatální (implantace minus živě narozená mláďata) Samice s 0 Samice s 1 Samice s 2 Samice s ≥ 3 Postnatální (živě narozená mláďata minus živá mláďata 13. den po porodu) Samice s 0 Samice s 1 Samice s 2 Samice s ≥ 3 B.65 ZKUŠEBNÍ METODA S VYUŽITÍM MEMBRÁNOVÉ BARIÉRY IN VITRO PRO LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI ÚVOD 1. in vitro , kterou lze použít na určení žíravých chemických látek. Zkušební metoda využívá umělou membránu navrženou tak, aby reagovala na žíravé chemické látky podobně jako zvířecí kůže in situ . Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení č. 435 (2015). Leptavými účinky na kůži se označuje vyvolání nevratného poškození kůže, které se projevuje jako viditelná, do koria zasahující nekróza pokožky, po aplikaci zkoušené chemické látky, jak ji definuje globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek Organizace spojených národů (GHS OSN) (1) a nařízení Evropské unie (EU) č. 1272/2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí (dále jen „nařízení CLP“) ( 24 ) . Tato zkušební metoda, rovnocenná aktualizovanému Pokynu OECD pro zkoušení č. 435, představuje zkušební metodu s využitím membránové bariéry, kterou lze použít na určení žíravých chemických látek. Zkušební metoda využívá umělou membránu navrženou tak, aby reagovala na žíravé chemické látky podobně jako zvířecí kůže 2. Leptavé účinky na kůži se tradičně posuzují aplikací zkoušené chemické látky na kůži živých zvířat, kdy se vyhodnotí rozsah poškození tkáně po stanoveném časovém období (2). Kromě této zkušební metody byla přijata řada jiných zkušebních metod in vitro jako alternativy (3) (4) ke standardnímu postupu zkoušení na kůži králíka in vivo (kapitola B.4 této přílohy, rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení č. 104), který se používá na určení žíravých chemických látek (2). Strategie odstupňovaného zkoušení a hodnocení podle systému GHS OSN pro hodnocení a klasifikaci leptavých účinků na kůži a dokument OECD k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování (IATA) látek dráždivých/leptavých pro kůži doporučuje použití validovaných a uznávaných zkušebních metod in vitro podle modulů 3 a 4 (1) (5). Integrované přístupy ke zkouškám a posuzování popisují několik modulů, které seskupují informační zdroje a analytické nástroje, a i) poskytují návod na integraci a používání stávajících údajů ze zkoušek i jiných údajů pro posouzení potenciálu dráždivých a leptavých účinků chemických látek na kůži a ii) navrhují přístup, když je nutné další zkoušení, včetně případů, kdy jsou zjištěny negativní výsledky (5). V tomto modulárním přístupu mohou být pozitivní výsledky zkušebních metod in vitro použity pro klasifikaci chemické látky jako žíravé bez nutnosti zkoušek na zvířatech, čímž se snižuje a kultivuje použití zvířat a vyloučí se bolest a stres, k nimž může dojít, když jsou pro tento účel používána zvířata. 3. Byly dokončeny validační studie pro model s membránovou bariérou in vitro , které jsou komerčně dostupné jako Corrositex ® (6)(7)(8), vykazující celkovou přesnost predikce leptavých účinků na kůži 79 % (128/163), citlivost 85 % (76/89) a specifičnost 70 % (52/74) u databáze 163 látek a směsí (7). Na základě uznávané validity byla tato validovaná referenční metoda (VRM) doporučena pro použití jako součást strategie odstupňovaného zkoušení pro hodnocení potenciálního rizika leptavých účinků chemických látek na kůži (5) (7). Před použitím použít modelu s membránovou bariérou in vitro pro leptavé účinky na kůži pro regulační účely, je zapotřebí stanovit jeho spolehlivost, relevantnost (přesnost) a omezení týkající se jeho navrhovaného použití, aby se zajistila jeho podobnost s VRM (9) v souladu se stanovenými požadavky standardů funkčnosti (10). Vzájemné uznávání údajů bude v rámci OECD zaručeno až poté, co bude každá navrhovaná nebo aktualizovaná metoda podle standardů funkčnosti podrobena revizi a zahrnuta do rovnocenného pokynu OECD pro zkoušení. V současnosti se Pokyn OECD pro zkoušení č. 435 a tato zkušební metoda týká pouze jedné metody in vitro , a to komerčně dostupného modelu Corrositex ® . 4. Jiné zkušební metody pro zkoušení leptavých účinků na kůži vycházejí z použití rekonstruované lidské kůže (Pokyn OECD pro zkoušení č. 431) (3) a izolované kůže potkana (Pokyn OECD pro zkoušení č. 430) (4). Tento pokyn také stanoví podrobnější klasifikaci žíravých chemických látek do tří podkategorií žíravých látek podle systému GHS OSN a tří přepravních obalových skupin podle systému OSN pro nebezpečí žíravé látky. Tento pokyn byl původně přijat v roce 2006 a v roce 2015 byl aktualizován o odkazy na pokyny IATA a aktualizaci seznamu vhodných látek. DEFINICE 5. Použité definice jsou uvedeny v dodatku. VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ 6. in vitro (13). Pro úplné vyhodnocení lokálních účinků na kůži po jednotlivých kožních expozicích je třeba postupovat podle pokynů OECD k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování (5). Zkouška popsaná v této zkušební metodě umožňuje určení žíravých zkoušených látek a dále umožňuje podrobnou klasifikaci žíravých zkoušených chemických látek podle systému GHS OSN/CLP (tabulka 1). Kromě toho může být taková zkušební metoda použita pro rozhodnutí o žíravosti a nežíravosti konkrétních tříd chemických látek, např. organických a anorganických kyselin, derivátů kyselin ( 25 ) a zásad pro některé účely zkoušení v oblasti přepravy (7)(11)(12). Tato zkušební metoda popisuje obecný postup podobný validované referenční zkušební metodě (7). I když tato zkušební metoda neposkytuje odpovídající informace o dráždivosti pro kůži, je třeba poznamenat, že zkušební metoda B.46 (rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení č. 439) řeší konkrétně zdravotní účinky dráždivosti pro kůži(13). Pro úplné vyhodnocení lokálních účinků na kůži po jednotlivých kožních expozicích je třeba postupovat podle pokynů OECD k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování (5). Tabulka 1 Kategorie a podkategorie leptavých účinků na kůži podle systému GHS OSN (26) Kategorie žíravých látek (kategorie 1) (pro orgány nepoužívající podkategorie) Podkategorie potenciálně žíravých látek (26) (pro orgány používající podkategorie, včetně nařízení CLP) Žíravá u ≥ 1 ze 3 zvířat Expozice Pozorované příznaky Žíravá Podkategorie žíravosti 1A ≤ 3 minuty ≤ 1 hodina Podkategorie žíravosti 1B > 3 minuty / ≤ 1 hodina ≤ 14 dnů Podkategorie žíravosti 1C > 1 hodina / ≤ 4 hodiny ≤ 14 dnů 7. Omezení této validované referenční metody (7) spočívá v tom, že mnoho nežíravých chemických látek a některé žíravé chemické látky nemusí být vhodné pro zkoušení na základě výsledků úvodního testu kompatibility (viz odstavec 13). Vodné chemické látky s pH v rozsahu 4,5 až 8,5 často nejsou pro zkoušení vhodné; 85 % chemických látek zkoušených v tomto rozmezí pH však nemělo ve zkouškách na zvířatech leptavé účinky (7). Metoda s membránovou bariérou in vitro může být použita na zkoušení pevných látek (rozpustných nebo nerozpustných ve vodě), kapalin (vodných a nevodných) a emulzí. Zkoušené chemické látky nevyvolávající zjistitelnou změnu při testu kompatibility (tj. barevná změna v chemickém detekčním systému (CDS) validované referenční zkušební metody) však nemohou být testovány metodou s membránovou bariérou a je třeba je testovat pomocí jiných zkušebních metod. PRINCIP ZKOUŠKY 8. Zkušební systém sestává ze dvou komponentů: syntetické makromolekulární biobariéry a chemického detekčního systému (CDS); tato zkušební metoda detekuje přes CDS poškození membránové bariéry způsobené žíravými zkoušenými chemickými látkami po aplikaci zkoušené chemické látky na povrch syntetické makromolekulární membránové bariéry (7), pravděpodobně stejným mechanismem (mechanismy) žíravosti, který působí na živou kůži. 9. Penetraci membránové bariéry (neboli proniknutí) lze měřit podle počtu zákroků nebo pomocí chemického detekčního systému, včetně změny barvy pH indikačního barviva či některé jiné vlastnosti indikačního roztoku pod bariérou. 10. Membránová bariéra by měla být stanovena jako validní, tj. relevantní a spolehlivá, pro zamýšlené použití. Zahrnuje to zajištění, aby byly různé přípravky shodné, pokud jde o bariérové vlastnosti, např. aby dokázaly zachovat bariéru proti nežíravým chemickým látkám a aby umožňovaly klasifikaci leptavých vlastností chemických látek do různých podkategorií žíravosti podle systému GHS OSN (1). Klasifikace vychází z doby, která je potřebná k tomu, aby chemická látka pronikla přes membránovou bariéru do indikačního roztoku. PROKÁZÁNÍ ZPŮSOBILOSTI 11. Dříve než začnou laboratoře rutinně používat metodu s membránovou bariérou in vitro , která dodržuje tuto zkušební metodu, měly by prokázat svou odbornou způsobilost správným určením klasifikace dvanácti vhodných látek doporučených v tabulce 2. V situacích, kdy některá z uvedených látek není k dispozici, lze v odůvodněných případech použít jinou látku, u níž jsou k dispozici odpovídající referenční údaje