„PŘÍLOHA V

STANOVENÍ SLOŽENÍ A OBSAHU STEROLŮ A TRITERPENICKÝCH DIALKOHOLŮ KAPILÁRNÍ PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu a složení sterolů a triterpenických dialkoholů v olivových olejích a olivových olejích z pokrutin.

2. PODSTATA ZKOUŠKY

Zmýdelnění oleje, k němuž je přidán α-cholestanol jako vnitřní standard, pomocí ethanolického roztoku hydroxidu draselného a extrakce nezmýdelnitelných látek pomocí diethyletheru.

Pomocí tenkovrstvé chromatografie na bazické silikagelové desce se z nezmýdelnitelné látky oddělí sterolová frakce a frakce triterpenických dialkoholů. Frakce oddělené ze silikagelu se převedou na trimethylsilylether a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení a zejména:

3.1 Baňka na 250 ml vybavená zpětným chladičem se zábrusem.

3.2 Dělicí nálevka na 500 ml.

3.3 Baňky na 250 ml.

3.4 Kompletní zařízení pro tenkovrstvou chromatografii se skleněnými deskami o rozměrech 20 × 20 cm.

3.5 Ultrafialová lampa s vlnovou délkou 254 nebo 366 nm.

3.6 Mikrostříkačky na 100 μl a 500 μl.

3.7 Filtrační nálevka ze sintrovaného skla s pórovitou fritou G3 (pórovitost 15 až 40 μm) o průměru přibližně 2 cm a výšce 5 cm, vybavená uzávěrem pro vakuovou filtraci a s vnějším zábrusem.

3.8 Odsávací baňka na 50 ml s vnitřním zábrusem pro použití s filtrační nálevkou (3.7).

3.9 Zkumavka na 10 ml s kónickým dnem a skleněnou zátkou.

3.10 Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou, opatřený systémem děleného nástřikového zařízení složený z: 3.10.1 termostatické kolonové komory nastavitelné na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C; 3.10.2 vstřikovací jednotky s termostatem (vstřikové komory) s povlakem ze silanizovaného skla a s dělicím systémem; 3.10.3 plamenoionizačního detektoru (FID); 3.10.4 systému pro sběr dat vhodného pro provoz s detektorem FID (bod 3.10.3) s možností manuální integrace.

3.11 Kapilární kolona z taveného křemene dlouhá 20 až 30 m, s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, potažená 5% difenyl – 95% dimethylpolysiloxanem (stacionární fáze SE-52 nebo SE-54 nebo ekvivalentní), o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm.

3.12 Mikrostříkačka na 10 μl pro plynovou chromatografii opatřená tvrzenou jehlou pro nástřik pomocí děliče.

3.13 Exsikátor s chloridem vápenatým.

4. CHEMIKÁLIE

4.1 Hydroxid draselný, minimální titr 85 %.

4.2 Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci přibližně 2 mol/l. 130 g hydroxidu draselného (bod 4.1) se za současného chlazení rozpustí ve 200 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem (bod 4.10). Tento roztok je nutno uchovávat v dobře uzavřené skleněné láhvi z tmavého skla a skladovat po dobu maximálně dvou dnů.

4.3 Diethylether čistoty p.a.

4.4 Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci přibližně 0,2 mol/l. 13 g hydroxidu draselného (bod 4.1) se rozpustí ve 20 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem (bod 4.10).

4.5 Bezvodý síran sodný čistoty p.a.

4.6 Silikagelem potažené skleněné desky (20 x 20 cm) bez fluorescenčního indikátoru o tloušťce 0,25 mm (obchodně dostupné).

4.7 Toluen čistoty pro chromatografii.

4.8 Aceton čistoty pro chromatografii.

4.9 N-hexan čistoty pro chromatografii.

4.10 Diethylether čistoty pro chromatografii.

4.11 Ethanol čistoty p.a.

4.12 Ethylacetát čistoty p.a.

4.13 Referenční roztok pro tenkovrstvou chromatografii: 5% roztok cholesterolu nebo fytosterolu a erythrodiolu v ethylacetátu (bod 4.11).

4.14 0,2% ethanolický roztok 2,7-dichlor-fluoresceinu, mírně zásaditý přidáním několika kapek alkoholového roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l (bod 4.2).

4.15 Bezvodý pyridin čistoty pro chromatografii (viz poznámka 5).

4.16 Hexamethyl disilazan čistoty p.a.

4.17 Trimethyl-chlorsilan čistoty p.a.

4.18 Zkušební roztoky sterol(trimethylsilyl)etherů. Připraví se ze sterolů nebo z erythrodiolu získaných z olejů, které je obsahují, těsně před použitím.

4.19 α-cholestanol o čistotě vyšší než! 99% (čistota musí být kontrolována pomocí analýzy plynovou chromatografií).

4.20 0,2% vnitřní standardní roztok α-cholestanolu, roztok (m/V) v ethylacetátu (bod 4.11).

4.21 Roztok fenolftaleinu 10 g/L v ethanolu (bod 4.10).

4.22 Nosné plyny: vodík nebo helium, čisté pro plynovou chromatografii.

4.23 Pomocné plyny: vodík, helium, dusík a vzduch, čisté pro plynovou chromatografii.

4.24 N-hexan (bod 4.9)/diethylether (bod 4.10) směs 65:35 (V/V).

4.25 Činidlo pro silylaci tvořené směsí pyridinu, hexamethyl-disilazanu a trimethyl-chlorsilanu v poměru 9:3:1 (V/V/V).

5. POSTUP

5.1 Příprava nezmýdelnitelných látek

5.1.1 Pomocí mikrostříkačky na 500 μl (bod 3.6) se do baňky na 250 ml dá (bod 3.1) vnitřní standardní roztok α-cholestanolu (bod 4.20) obsahující množství cholestanolu rovnající se přibližně 10 % obsahu sterolu ve vzorku. Například při analýze olivového oleje se na 5 g vzorku olivového oleje přidá 500 μl roztoku α-cholestanolu (bod 4.20) a 1 500 μl při analýze olivového oleje z pokrutin. V mírném proudu dusíku v teplé vodní lázni se vzorek odpaří do sucha a po vychladnutí baňky se do stejné baňky naváží 5±0,01 g vysušeného přefiltrovaného vzorku.

Poznámka 1: Živočišné nebo rostlinné oleje obsahující větší množství cholesterolu mohou vykazovat pík s retenčním časem blízkým cholestanolu. Pokud k tomu dojde, musí být sterolová frakce analyzována jednou s vnitřním standardem a jednou bez něj.

5.1.2 Přidá se 50 ml ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l (bod 4.2) a malé množství pemzy, připojí se zpětný chladič a zahřeje se do mírného varu, dokud nedojde ke zmýdelnění (roztok se vyčeří). V zahřívání se pokračuje dalších 20 minut a poté se přes chladič přidá 50 ml destilované vody, chladič se následně odpojí a baňka se vychladí na teplotu přibližně 30 °C.

5.1.3 Obsah baňky se kvantitativně převede do dělicí nálevky na 500 ml (bod 3.2) a propláchne se několika dávkami destilované vody (50 ml). Přidá se přibližně 80 ml diethyletheru (bod 4.10), vše se protřepe po dobu přibližně 60 sekund a pravidelně se uvolňuje tlak obracením dělicí nálevky a otevíráním kohoutku. Nechá se odstát až do úplného oddělení obou fází (viz poznámka 2).

Poté se co nejvíce mýdlového roztoku odčerpá do druhé dělicí nálevky. Stejným způsobem se provedou další dvě extrakce vodně-alkoholové fáze, vždy s použitím 60 až 70 ml diethyletheru (bod 4.10).

Poznámka 2: Emulze je možné odstranit přidáním malých množství ethanolu (bod 4.11).

5.1.4 Všechny tři etherové extrakty se smíchají v jedné dělicí nálevce obsahující 50 ml vody. Dále se promývá vodou (50 ml), dokud se promývací voda při přidání kapky roztoku fenolftaleinu nepřestane zbarvovat růžově (bod 4.21).

Odstraní se vodná fáze, etherová fáze se přefiltruje na bezvodém síranu sodném (bod 4.5) do předem zvážené baňky na 250 ml, přičemž nálevka a filtr se promyjí malými množstvími diethyletheru (bod 4.10).

5.1.5 Rozpouštědlo se nechá odpařit destilací ve vakuu v rotačním odpařovači při 30 °C. Přidá se 5 ml acetonu a těkavé rozpouštědlo se zcela odstraní mírným proudem vzduchu. Zbytek se suší v sušárně při 103±2 °C po dobu 15 min. Po vychlazení v exsikátorech se zváží s přesností na 0,1 mg.

5.2. Separace sterolové frakce a frakce triterpenických dialkoholů (erythrodiol + uvaol)

5.2.1 Příprava bazických desek pro tenkovrstvou chromatografii. Silikagelové desky (bod 4.6) (cca 4 cm) se na 10 sekund zcela ponoří do ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,2 mol/l (bod 4.5), poté se nechají dvě hodiny sušit v digestoři a nakonec na jednu hodinu umístí do sušárny vyhřáté na 100 °C.

Desky se vyjmou ze sušárny a až do okamžiku použití uloží do exsikátoru s chloridem vápenatým (bod 3.13). Takto upravené desky musí být použity během 15 dnů.

Poznámka 3: Jsou-li pro separaci sterolové frakce použity bazické silikagelové desky, není nutné upravovat nezmýdelnitelnou frakci pomocí Al 2 O 3 (oxidu hlinitého). Dojde tak k zadržení všech kyselých sloučenin (mastných kyselin apod.) na počátku, a tím se zřetelně oddělí pásmo sterolů od pásma alifatických a triterpenických alkoholů.

5.2.2 Vyvíjecí komora se naplní směsí hexanu a diethyletheru (bod 4.24) (viz poznámka 4) do výšky přibližně 1 cm. Vyvíjecí komora se uzavře a nejméně půl hodiny ponechá v klidu a chladnu, aby se mohla vytvořit rovnováha mezi parami a kapalinou. Na vnitřní povrch vyvíjecí komory je možné připojit proužky filtračního papíru namočené v eluční směsi za účelem zkrácení doby vyvolávání přibližně o jednu třetinu a docílení stejnoměrnější, pravidelné eluce složek.

Poznámka 4: Vyvíjecí roztok musí být pro každou analýzu vyměněn, aby bylo dosaženo reprodukovatelných podmínek vyvíjení; lze použít alternativní rozpouštědlo 50:50 (V/V) n-hexanu a diethyletheru.

5.2.3 Připraví se přibližně 5% roztok nezmýdelnitelné látky (bod 5.1.5) v ethylacetátu (bod 4.12) a 0,3 ml tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 100 μl nastříkne jako úzký a rovnoměrný pruh k dolnímu okraji (2 cm) chromatografické desky (bod 5.2.1). Ve stejné úrovni se nanese 2 až 3 μl referenčního roztoku materiálu (bod 4.13) za účelem stanovení sterolového pásma a pásma triterpenických dialkoholů po dokončení vyvíjení.

5.2.4 Deska se umístí do vyvíjecí komory uvedené v bodě 5.2.2. Teplota se udržuje mezi 15 a 20 °C (viz poznámka 5). Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu nebo se deska na chvíli nechá v digestoři.

Poznámka 5: Vyšší teplota může zhoršit oddělování.

5.2.5 Deska se lehce a rovnoměrně postříká roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu (bod 4.14), nechá se uschnout a pozoruje se pod ultrafialovým zářením. Sterolové pásmo a pásmo triterpenických dialkoholů se stanoví porovnáním skvrn vytvořených referenčním roztokem (bod 4.13). Obrysy pásem podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem (viz obrázek tenkovrstvé desky č. 3).

5.2.6 Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové špachtle. Odebraná hmota se rozmělní na malé části a převede do filtrační nálevky (bod 3.7). Přidá se 10 ml horkého ethylacetátu (bod 4.12). Obsah se důkladně promíchá kovovou stěrkou a vakuově přefiltruje. Filtrát se shromáždí v baňce připojené na filtrační nálevku (bod 3.8.).

Zbytek v baňce se propláchne 3 x 10 ml diethyletheru (bod 4.3). Filtrát se přitom sbírá do stejné baňky připojené k nálevce. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do předem zvážené zkumavky na 10 ml (bod 3.9). Zkumavka se vysuší lampou pod mírným proudem dusíku. Zbytek se znovu rozpustí několika kapkami acetonu (bod 4.8) a opět vysuší.

Zbytek ve zkumavce musí být tvořen sterolovou frakcí a frakcí triterpenických dialkoholů.

5.3 Příprava trimethylsilyletherů

5.3.1 Do zkumavky obsahující sterolovou a triterpenickou frakci se přidá činidlo pro silylaci (bod 4.25) (viz poznámka 6), v množství 50 μl na každý mg sterolů a triterpenických dialkoholů Přitom je nutné zabránit jakékoli absorpci vlhkosti (viz poznámka 7).

Poznámka 6: Roztoky připravené k použití jsou obchodně dostupné. Dostupná jsou rovněž další silylační činidla, jako například N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethyl-chlor-silan pro smíchání se stejným objemem bezvodého pyridinu.

Pyridin lze nahradit stejným množstvím acetonitrilu.

5.3.2 Zkumavka se uzavře a pečlivě protřepe bez převracení, dokud se sloučeniny nerozpustí. Poté se nechá v klidu nejméně 15 minut při laboratorní teplotě a následně několik minut odstřeďuje. Čirý roztok je připraven pro plynovou chromatografickou analýzu.

Poznámka 7: Vznik slabé opalescence je normální a nezpůsobuje žádnou anomálii. Tvorba bílých vloček nebo existence růžového zabarvení jsou známkami přítomné vlhkosti nebo degradace činidla. V tomto případě je třeba zkoušku opakovat (pouze v případě, že byl použit hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan).

5.4 Analýza plynovou chromatografií

5.4.1 Přípravné operace a kondicionace kapilární kolony.

5.4.1.1 Kapilární kolona se připojí (bod 3.11) k plynovému chromatografu tak, že začátek kolony se připojí k dělenému nástřikovému zařízení a konec kolony se připojí k detektoru. Provede se kompletní kontrola plynového chromatografu (těsnost plynových spojovacích prvků, účinnost detektoru, účinnost oddělovacího a zapisovacího systému atd.).

5.4.1.2 Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat; samotnou kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20 °C vyšší, než je laboratorní teplota (viz poznámka 8). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do pracovních podmínek (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení výpočetního systému, nastavení teploty kolony, detektoru, injektoru atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony. Poznámka 8: Teplota kondicionace musí být nejméně o 20 °C nižší než maximální teplota použitelná pro uvažovanou stacionární fázi.

5.4.2 Výběr pracovních podmínek

5.4.2.1 Pracovní podmínky jsou tyto: — teplota kolony: 260 ± 5 °C, — teplota injektoru: 280–300 °C, — teplota detektoru: 280–300 °C, — lineární rychlost nosného plynu: helium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — oddělovací poměr: 1:50 až 1:100, — citlivost přístroje: 4 až 16násobek minimálního útlumu, — citlivost záznamu: 1 až 2 mV f.s., — množství nastříknuté látky: 0,5 až 1 μl trimethylsilyletherového roztoku. Tyto podmínky se mohou měnit podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto podmínky: — retenční čas betasitosterolu musí být 20 ± 5 minut; — pík kampesterolu musí být u olivového oleje (střední obsah 3 %) 20 ± 5 % plného rozsahu a u sójového oleje (střední obsah 20 %) 80 ± 10 % plného rozsahu; — všechny přítomné steroly musí být odděleny. Kromě separace musí být píky též zcela rozlišeny, tj. dráha záznamu píku se musí vrátit na základní linii dříve, než se zvedne do dalšího píku. Neúplné rozlišení je však tolerováno za předpokladu, že pík s relativním retenčním časem 1,02 (sitostanol) je možné kvantifikovat pomocí kolmé úsečky.

5.4.3 Analytický postup

5.4.3.1 Do mikrostříkačky na 10 μl se natáhne 1 μl hexanu, poté 0,5 μl vzduchu a nakonec 0,5 až 1 μl zkušebního roztoku. Píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum injektoru a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. Lze užít rovněž automatický injektor.

5.4.3.2 Zaznamenávání je prováděno, dokud přítomná trimethylsilyletherová směs triterpenických dialkoholů není zcela eluována. Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům bodu 5.4.1.2.

5.4.4 Identifikace píků

Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se standardní trimethylsilyletherovou směsí sterolu a triterpenických dialkoholů analyzovanou za stejných podmínek (viz dodatek).

Steroly a triterpenické dialkoholy jsou eluovány v tomto pořadí: cholesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-methylen-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, delta-7-kampesterol, delta-5,23-stigmastadienol, chlerosterol, betasitosterol, sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5,24-stigmastadienol, delta-7-stigmastenol, delta-7-avenasterol, erythrodiol a uvaol.

Retenční časy betasistosterolu v případě kolon SE-52 a SE-54 jsou uvedeny v tabulce 1.

Chromatogram typický pro některé oleje je vidět na obrázku 1 a 2.

5.4.5 Kvantitativní vyhodnocení

5.4.5.1 Pomocí výpočetního systému se vypočítá plocha píků α-cholestanolu, sterolů a triterpenických dialkoholů. Píky jakýchkoli sloučenin, které nejsou mezi sloučeninami uvedenými v tabulce 1 (výpočet pro ergosterol se provádět nesmí) se ignorují. Faktor odezvy α-cholestanolu musí být roven 1.

5.4.5.2 Obsah jednotlivých sterolů vyjádřený v mg/kg tuku se vypočítá podle vzorce: kde: Ax = plocha píku sterolu x vypočtená dle výpočetního systému; As = plocha píku α-cholestanolu vypočtená dle výpočetního systému; ms = množství přidaného α-cholestanolu v mg; m = hmotnost vzorku použitého pro stanovení v g.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1 Uvádí se obsah jednotlivých sterolů v mg/kg tuku a souhrn „obsah sterolů celkem“. Složení jednotlivých sterolů, erythrodiolu a uvaolu by se mělo vyjadřovat s přesností na jedno desetinné místo. Celkové složení sterolů musí být vyjádřeno v celých číslech.

6.2 Procentní podíl jednotlivých sterolů z poměru plochy příslušného píku k celkové ploše píků sterolů, erythrodiolu a uvaolu se vypočítá podle vzorce: kde: Ax = plocha píku sterolu x; ΣA = celková plocha píků sterolů;

6.3 Zjevný betasitosterol: delta-5-23-stigmastadienol + chlerosterol + betasitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-55-24-stigmastadienol.