Úřední věstník L 167 , 07/07/2000 S. 0022 - 0032



Rozhodnutí Komise ze dne 4. července 2000, kterým se stanoví diagnostické postupy, metody odběru vzorků a kritéria pro vyhodnocování výsledků laboratorních testů pro potvrzení a diferenciální diagnózu vezikulární choroby prasat (oznámeno pod číslem K(2000) 1805) (Text s významem pro EHP) (2000/428/ES) KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ, s ohledem na smlouvu o založení Evropského společenství, s ohledem na směrnici Rady 92/119/EHS ze dne 17. prosince 1992, kterou se zavádí všeobecná opatření Společenství pro tlumení některých chorob zvířat a zvláštní opatření týkající se vezikulární choroby prasat [1], naposledy pozměněnou aktem o přistoupení Rakouska, Finska a Švédska, a zejména na přílohu II odst. 3 uvedené směrnice, vzhledem k těmto důvodům: (1) Je nezbytné stanovit na úrovni Společenství diagnostické postupy, metody vzorkování a kritéria pro vyhodnocování výsledků laboratorních zkoušek pro potvrzení vezikulární choroby prasat a její rychlé odlišení od slintavky a kulhavky, aby bylo možno zajistit cílenější zdolávání obou nákaz. (2) Příloha III směrnice Rady 92/119/EHS stanoví úkoly a povinnosti referenční laboratoře Společenství pro vezikulární chorobu prasat tak, aby se koordinovaly, po konzultaci s Komisí, metody používané v členských státech pro diagnostiku nákazy. Tyto úkoly a povinnosti zahrnují organizování periodických porovnávacích testů a poskytování standardních reagencií na úrovni Společenství. (3) Byly nedávno vyvinuty laboratorní testy, které zajišťují, že vezikulární choroba prasat bude rychle diagnostikována a odlišena od slintavky a kulhavky. (4) Výsledky úplně posledních porovnávacích testů provedených na úrovni Společenství naznačují zejména, že byly vypracovány spolehlivé testy ke zjištění antigenu nebo genomu viru vezikulární choroby prasat a že tyto testy byly úspěšně doplněny testem izolace viru pro virologickou diagnózu vezikulární choroby prasat. (5) Výsledkem zkušeností získaných při tlumení vezikulární choroby prasat v nedávných letech bylo vykrystalizování nejvhodnějších vzorkovacích postupů a kritérií pro vyhodnocování výsledků laboratorních testů pro cílenou diagnózu této nákazy v různých situacích. (6) Bylo vzato v úvahu stanovisko a doporučení Vědeckého výboru pro zdraví a ochranu zvířat. (7) Opatření stanovená v tomto rozhodnutí jsou v souladu se stanoviskem Stálého veterinárního výboru, PŘIJALA TOTO ROZHODNUTÍ: Článek 1 1. Členské státy zajistí, aby potvrzení vezikulární choroby prasat a diferenční diagnóza vůči slintavce a kulhavce se zakládaly na: a) zjištění klinických příznaků choroby; b) zjištění viru, antigenu nebo genomu ve vzorcích epiteliálních tkání, vezikulární kapaliny a výkalů; c) demonstraci specifické reakce antilátky ve vzorcích séra, v souladu s postupy, metodami vzorkování a kritérii pro vyhodnocování výsledků laboratorních testů stanovených v manuálu, který je přílohou tohoto rozhodnutí. 2. Národní diagnostické laboratoře uváděné v příloze II odst. 5 směrnice 92/119/EHS ovšem mohou uplatňovat úpravy laboratorních testů uváděných v manuálu v příloze tohoto rozhodnutí nebo používat odlišné testy za předpokladu, že lze demonstrovat stejnou citlivost a specifičnost. Citlivost a specifičnost těchto upravených nebo odlišných testů musí být vyhodnocena v rámci periodických srovnávacích testů organizovaných Referenční laboratoří Společenství pro vezikulární chorobu prasat. Článek 2 Toto rozhodnutí se použije ode dne 1. října 2000. Článek 3 Toto rozhodnutí je určeno členským státům. V Bruselu dne 4. července 2000. Za Komisi David Byrne člen Komise [1] Úř. věst. L. 62, 15.3.1993, s. 69. -------------------------------------------------- PŘÍLOHA MANUÁL DIAGNOSTICKÝCH POSTUPŮ, VZORKOVACÍCH METOD A KRITÉRIÍ PRO VYHODNOCOVÁNÍ VÝSLEDKŮ LABORATORNÍCH TESTŮ PRO POTVRZENÍ A DIFERENČNÍ DIAGNÓZU VEZIKULÁRNÍ CHOROBY PRASAT KAPITOLA I Úvod, cíle a definice 1. Tento manuál: a) stanoví hlavní směry a minimální požadavky na diagnostické postupy, metody vzorkování a kritéria pro vyhodnocování výsledků laboratorních testů pro cílenou diagnózu vezikulární choroby prasat. Zvláštní důraz je ovšem také kladen na diferenční diagnózu za účelem odlišení od slintavky a kulhavky; b) integruje ustanovení přílohy II směrnice 92/119/EHS, a zejména odstavců 4, 7 a 8 uvedené přílohy; c) je zásadně určen pro orgány příslušné ke tlumení vezikulární choroby prasat. Proto je důraz kladen na zásady a uplatňování laboratorních testů a vyhodnocování jejich výsledků, a nikoli na podrobné laboratorní techniky. 2. Pro účely tohoto manuálu se rozumí: a) "séropozitivním prasetem" prase, jehož sérum obsahuje titr antilátky, které se při neutralizačním testu používaném národní laboratoří rovná nebo je větší než je referenční sérum 4 vezikulární choroby prasat uváděné v kapitole X; b) "ojedinělým reaktorem" jedno séropozitivní prase v hospodářství, které poskytuje pozitivní výsledek sérologických testů na vezikulární chorobu prasat, které však nebylo v minulosti v kontaktu s virem vezikulární choroby prasat a u kterého nejsou důkazy o rozšíření infekce na prasata, se kterými bylo v kontaktu. Séropozitivní prase je prokazatelně ojedinělým reaktorem, jestliže jsou splněny podmínky uváděné v kapitole VIII písm. C); c) "prasaty v kontaktu" prasata, která mají a nebo měla přímý kontakt během posledních 28 dní s jedním nebo více séropozitivními prasaty nebo s jedním nebo více prasaty, která jsou podezřelá, že byla infikována virem vezikulární choroby prasat. Prasata v kontaktu mohou být nebo mohla být ve stejném chlévě nebo v sousedních chlévech, jestliže existuje možnost kontaktu prasat mezi chlévy. KAPITOLA II Pokyny pro kontrolu prasat, která vykazují klinické znaky vezikulární choroby prasat 1. Členské státy zajistí, aby v případě, že v hospodářství je podezření na přítomnost viru vezikulární choroby prasat, úřední veterinář co možná nejrychleji zkontroloval statisticky významný počet prasat, aby se odhalily klinické znaky choroby uváděné v kapitole IX. 2. Členské státy zajistí, aby jakmile prasata vykazují klinické znaky připomínající vezikulární chorobu prasat nebo slintavku a kulhavku, se co možná nejrychleji provedla diferenční diagnóza pomocí příslušného vzorkování a laboratorních vyšetření podle ustanovení uváděných v kapitolách IV, VII a VIII tohoto manuálu. KAPITOLA III Obecné postupy pro vzorkování a dopravu vzorků 1. Každá osoba, která vstupuje do prasečince nebo opouští prasečinec, ve kterém je podezření na vezikulární chorobu prasat, musí dodržovat nejpřísnější hygienická opatření, která jsou nezbytná ke snížení rizika kontaminace nebo rozšíření viru. 2. Všechna vzorkovaná prasata musí být jednoznačně označena takovým způsobem, aby mohla být identifikována pro případné nové vzorkování. Doporučuje se zapsat umístění každého vzorkovaného prasete v hospodářství společně s jeho jednoznačnou identifikační značkou, zejména tehdy, jestliže se vzorkují podezřelá prasata. 3. Vzorky se musí zasílat do laboratoře doprovázené příslušnými formuláři, které budou zahrnovat podrobnosti o vzorkovaných prasatech a eventuálních pozorovaných klinických znacích. 4. Protože každý vezikulární stav u prasat může být způsoben slintavkou a kulhavkou, musí se provádět zvláštní preventivní opatření pro bezpečné balení podezřelých vzorků. Tato preventivní opatření musí být hlavně určena k tomu, aby zabránila rozbití nebo netěsnosti kontejnerů a riziku kontaminace, ale také je důležité zajistit, aby vzorky dojely v uspokojivém stavu. Jestliže se dovnitř vkládá led, musí se zabránit úniku vody z obalu. Žádné nádobky se vzorky podezřelými, že obsahují virus vezikulární choroby prasat, se nesmí otevřít, jakmile opustí zamořené prostory, a to až do doby, než dorazí do laboratoře. 5. Pokud ještě nebyla vyloučena slintavka a kulhavka, vzorky, které jsou podezřelé, že obsahují virus vezikulární choroby prasat, smí být analyzovány pouze v laboratoři, která je oprávněná k manipulaci s virem slintavky a kulhavky pro diagnostické účely, podle právních předpisů Společenství týkajících se tlumení slintavky a kulhavky. 6. Jestliže předpokládaná doba dopravy do přijímající laboratoře není delší než 48 hodin, smí být veškeré vzorky přepravovány za teploty 4 °C, jinak se musí uchovávat při teplotě ne vyšší než minus 20 °C. 7. Pro vzorky, které jsou určené pro referenční laboratoř Společenství v Pirbrightu a pocházejí z jiných členských států než ze Spojeného království, je jedinou povolenou metodou dopravy letecká doprava na letiště Londýn (Heathrow) nebo Londýn (Gatwick). Před zásilkou musí být laboratoř informována faxem ((44-1483) 23 26 21) nebo e-mailem o letu, datu, předpokládané době příletu a číslu leteckého nákladního listu tak, aby se po příjezdu mohl balíček najít. Balíček se musí adresovat: Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory Community Reference Laboratory for swine vesicular disease Ash Road, Pirbright, Woking Surrey GU24 ONF United Kingdom,UK Na nálepce musí být také tato informace: "Zvířecí patologický materiál bez obchodní hodnoty. Podléhá zkáze. Křehké. Na letišti vyzvedne adresát. Neotevírat mimo laboratoř." Oprávněné vyzvednutí zásilek na letišti provádí personál referenční laboratoře Společenství podle zvláštního všeobecného dovozního povolení vystavovaného pro tento účel ministerstvem zemědělství, výživy a rybolovu Spojeného království. Jde o trvalé ujednání, pro každý případ dovozu se nevyžaduje zvláštní povolení. Převážení podezřelého vezikulárního materiálu do Spojeného království osobou, která k tomu není osobně oprávněna, se nepovoluje. Nesmí se používat kurýrní společnosti. 8. Doprava vzorků do národních laboratoří musí být v souladu s pokyny stanovenými příslušným orgánem členských států. KAPITOLA IV Vzorkovací postupy v hospodářství s klinicky podezřelými prasaty 1. Je-li v hospodářství podezření na přítomnost viru vezikulární choroby prasat, protože byly pozorované klinické znaky choroby, musí se pro potvrzení choroby a diferenciální diagnózu slintavky a kulhavky odebrat příslušné vzorky reprezentativních skupin prasat, která vykazují uvedené znaky. 2. V uvedených hospodářstvích jsou nejlepšími vzorky pro diagnózu epiteliální a vezikulární kapalina z neporušených nebo čerstvě prasklých puchýřů odebraná od prasat vykazujících typické znaky choroby, ze kterých lze zjistit virus vezikulární choroby prasat, jeho antigeny nebo genom. Doporučuje se, aby se odebraly vzorky asi od pěti nebo šesti těchto prasat. 3. I tehdy, když jsou epiteliální tkáně a vezikulární kapalina k dispozici v dostatečném množství (1 g nebo více), musí se rovněž odebrat tyto vzorky: a) vzorky krve podezřelých prasat a prasat v kontaktu pro sérologické testování; b) vzorky výkalů podezřelých prasat a z podlahy jejich chléva a sousedních chlévů pro virologické testování. 4. Vzorky se musí odebrat a dopravovat podle těchto postupů: a) pro vzorky epitelu a vezikulární kapaliny: - je-li to možné, pak se musí odebrat minimálně 1 g epiteliální tkáně z neprasklého nebo právě prasklého puchýře. Doporučuje se, aby byla prasata před odběrem vzorků uklidněna sedativy, aby se zabránilo poranění personálu i za účelem ochrany zvířat, - jestliže se doprava vzorků do národní laboratoře provádí okamžitě (v době kratší než tři hodiny), epiteliální vzorky se mohou dopravovat suché a udržovat chlazené. Ovšem, jestliže potřebná doba pravděpodobně překročí tři hodiny, musí se vzorky uložit do malého objemu transportního média obsahujícího stejné množství glycerolu a 0,04 M fosfátového pufru nebo jiného rovnocenného pufru (hepes), takže se pH udrží v optimálním rozsahu pro přežití viru slintavky a kulhavky (pH od 7,2 do 7,6). Transportní médium musí obsahovat antibiotika pro další antimikrobiální aktivitu. Vhodná antibiotika a jejich koncentrace v mililitru konečného objemu jsou: i) penicilin 1000 IU; ii) neomycin sulfát 100 IU; iii) polymyxin B sulfát 50 IU; iv) mykostatin 100 IU, - jestliže lze odebrat vezikulární kapalinu z neporušeného puchýře, tato se musí ukládat neředěná ve zvláštním kontejneru; b) pro vzorky krve: - pro sérologické nebo virologické testy se mohou odebírat vzorky krve. Obecně ovšem platí, že se odebírají pouze od prasat, která jsou podezřelá, že se zotavila z klinické nebo subklinické infekce za účelem zjištění protilátky, protože epitel, vezikulární kapalina a vzorky výkalů od prasat vykazujících klinické znaky choroby jsou pro zjištění viru vhodnější než vzorky krve. Doporučuje se, aby se všechny vzorky krve odebíraly za použití vakutejnerů bez antikoagulantu a aby se vakutejnery dopravovaly neotevřené; c) pro vzorky výkalů: - vzorky výkalů z podlahy prostorů, které jsou podezřelé, že obsahují nebo měly obsahovat prasata infikovaná vezikulární nemocí prasat nebo fekální výtěry a fekální vzorky od podezřelých živých prasat, se musí umisťovat do pevných, těsných kontejnerů. Kontejnery s podezřelými vzorky se musí před dopravou do laboratoře dezinfikovat zvenčí. Vhodné dezinfekční látky jsou: - hydroxid sodný (roztok 1:100), - formalín (roztok 1:9 roztoku formalínu obsahující minimálně 34 % formaldehydu) a - chlornan sodný (2 % disponibilního chlóru). S těmito dezinfekčními prostředky je třeba zacházet opatrně. KAPITOLA V Vzorkovací postupy pro sérologický dozor nad vezikulární chorobou prasat 1. Když se provádí sérologický dozor za těmito účely: a) pro dozor v hospodářstvích, kde nejsou důkazy ani podezření, že by mohla být choroba přítomná; b) pro dozor v jatkách, na trhu, sběrných střediscích nebo podobných místech rutinním sérologickým vzorkováním; c) jako nediskriminační dozor u prasat obdržených z jiných členských států v dovozním hospodářství, vzorky krve pro sérologické testy se musí odebírat od prasat buď podle ustanovení určeného v programech dozoru a eradikace nebo v plánech schválených v rámci rozhodnutí 90/424/EHS [1] nebo směrnice 90/425/EHS [2] nebo při neexistenci těchto ustanovení postupy stanovenými příslušným orgánem členského státu. 2. Když se provádí sérologická kontrola za těmito účely: a) pro dozor v hospodářstvích ležících v pásmech dozoru a ochrany, které byly vytvořeny potom, co se potvrdilo vzplanutí nákazy podle přílohy II odst. 7 a 8 směrnice 92/119/EHS nebo b) pro dozor nad hospodářstvími uváděnými v článku 9 směrnice 92/119/EHS, se musí vzorky krve odebírat pro sérologické testování od prasat podle tohoto systému: - v případě chovných hospodářství se postup namátkového odběru vzorků musí provádět takovým způsobem, aby se odhalilo 5 % prevalence sérokonverze se spolehlivostí 95 %, - v případě výkrmových hospodářství, kde se chovají jen prasata na sádlo, vzorkovací postupy musí zajistit, že celkový počet odebraných vzorků je minimálně rovný počtu potřebnému pro odhalení prevalence 5 % se spolehlivostí 95 %. V každém případě se vzorky musí odebrat z tolika náhodně vybraných chlévů, z kolika je to možné, - v případě smíšených chovných a výkrmových hospodářství se musí ovzorkovat každá skupina prasat žijící v oddělených prostorách takovým způsobem, aby se odhalilo 5 % prevalence sérokonverze se spolehlivostí 95 %. KAPITOLA VI Další kroky a postupy nového odběru vzorků v případě zjištění séropozitivních prasat 1. V případě, že je v hospodářství po kontrole uváděné v kapitole V odst. 1 písm. a) nebo kapitole V odst. 2 zjištěno jedno séropozitivní prase, příslušný orgán musí zajistit, že se: a) na toto hospodářství aplikují opatření uváděná v článku 4 směrnice 92/119/EHS, pokud již nebyla aplikována; b) v hospodářství provede kontrola podle ustanovení uvedeného v kapitole II odst. 1; c) odebírají vzorky krve pro sérologické zkoušky od: - podezřelého prasete, - prasat, která žijí ve stejném chlévě a v sousedních chlévech jako podezřelé prase; u uvedených prasata se musí odebrat vzorky takovým způsobem, aby se v chlévě odhalilo 5 % prevalence sérokonverze se spolehlivostí 95 %. 2. Příslušný orgán ovšem může zrušit opatření uvedená v odst. 1 písm. a), jestliže: a) epidemiologický průzkum provedený podle článku 8 směrnice 92/119/EHS naznačuje, že do hospodářství nebyla zavlečena vezikulární choroba prasat; b) v hospodářství nebyly zjištěny žádné klinické znaky vezikulární choroby prasat a c) hospodářství se nenachází v pásmu dozoru nebo pásmu omezeného pohybu vytvořeném po potvrzeném vypuknutí choroby nebo nepodléhajícím jiným omezením uplatňovaným ve vztahu k potvrzenému vypuknutí nákazy, a za předpokladu, že: - žádná prasata nebyla odvezena z hospodářství pro obchod uvnitř Společenství a - prasata z příslušného hospodářství byla převezena pouze do jatek k okamžité porážce nebo do jiného statku, ze kterého se žádná prasata neodvážejí pro obchod uvnitř Společenství, a to až do doby, kdy výsledky dalších kontrol a sérologických testů ukáží, že vezikulární choroba prasat může být definitivně vyloučena. 3. Jestliže kontroly a sérologické zkoušky prováděné podle odst. 1 písm. b) a c): a) dávají negativní výsledky nebo se jako pozitivní potvrdí jen dříve pozitivní prase (ojedinělý reaktor), lze vezikulární chorobu prasat vyloučit. Opatření uváděná v odst. 1 písm. a) se zruší, pokud se hospodářství nachází v ochranném pásmu nebo v pásmu dozoru vytvořeném kolem ohniska nákazy, kde opatření ke zdolání nákazy musí zůstat v účinnosti podle přílohy II odst. 7 nebo 8 směrnice 92/119/EHS; b) naznačují, že v hospodářství je přítomno více než jedno séropozitivní prase, vezikulární choroba prasat se buď musí potvrdit nebo, pokud nejsou splněné podmínky stanovené v příloze II odst. 4 směrnice 92/119/EHS, by se musely pro potvrzení přítomnosti nákazy odebrat z hospodářství další vzorky podle postupů odběru vzorků uváděných v odstavci 4. 4. V případě, že v hospodářství je zjištěno více než jedno séropozitivní prase po vzorkování a sérologickém testování uváděném v kapitole V odst. 1 písm. a), odst. 1 písm. c) nebo odstavce 2, ale podmínky stanovené v příloze II odst. 4 ke směrnici 92/119/EHS nejsou splněné, aby se potvrdila vezikulární chorobu prasat, příslušný orgán musí zajistit, aby: a) ustanovení uváděná v článku 4 směrnice 92/119/EHS se uplatňovala a nebo se pokračovalo v jejich uplatňování; b) kontrola v hospodářství se provádí podle ustanovení uváděných v kapitole II odst. 1; c) od séropozitivních prasat a prasat v kontaktu jsou dále odebírané vzorky krve pro sérologické testování podle odst. 1 písm. c); d) od prasat v jiných budovách hospodářství se odebírají vzorky krve pro sérologické zkoušky podle postupu uváděného v kapitole V odst. 2; e) pro virologické testy se odebírá dostatečný počet fekálních vzorků: - od séropozitivních prasat, - z podlah chlévů obsahujících séropozitivní prasata a sousedních chlévů, - z náhodně vybraných chlévů z jiných budov statku. Fekální vzorky odebrané podle první a druhé odrážky výše se musí vyšetřit co možná nejdříve. V případě, že jsou tyto vzorky negativní, ale výsledky sérologických zkoušek naznačují, že virus vezikulární choroby prasat se mohl rozšířit na jiné budovy, musí se rovněž vyšetřit fekální vzorky odebrané podle třetí odrážky. Jestliže se po těchto dalších zkouškách a zkouškách stanovených v příloze II odst. 4 směrnice 92/119/EHS přítomnost vezikulární choroby prasat nepotvrdí, séropozitivní prasata se musí zabít nebo porazit podle ustanovení uváděných v příloze II odst. 4 písm. d) směrnice 92/119/EHS. Ovšem, jestliže byla zjištěna další séropozitivní prasata kromě těch, která již byla zjištěna jako séropozitivní po předchozím vzorkování, ustanovení a postupy stanovené v písmenech a), b), c), d) a e) se i nadále aplikují obdobně. 5. Aniž jsou dotčena opatření uváděná v článku 9 směrnice 92/119/EHS, v případě, že po kontrolních aktivitách uváděných v kapitole V odst. 1 písm. b) nebo téže kapitole V odst. 1 písm. c) je zjištěno jedno nebo více séropozitivních prasat, příslušný orgán musí zajistit, že se: a) tam, kde je to nezbytné a únosné, provádějí další vhodné kontroly včetně odběru vzorků, aby se potvrdila nebo vyloučila vezikulární chorobu prasat na místě, kde byla tato prasata zjištěna, přičemž se bere v úvahu místní situace; b) v hospodářství, ze kterého tato prasata pocházejí, uplatňují opatření uváděná v článku 4 směrnice 92/119/EHS; c) v hospodářství, ze kterého tato prasata pocházejí, provádí kontrola podle ustanovení uváděných v kapitole II odst. 1 a d) pro sérologické zkoušky odebírají od prasat v hospodářství, ze kterého pocházejí séropozitivní prasata, vzorky krve podle ustanovení uváděných v kapitole V odst. 2. 6. Příslušný orgán ovšem může rozhodnout, že zruší opatření uváděná v odst. 5 písm. b), jestliže: a) epidemiologický průzkum provedený podle článků 4 a 8 směrnice Rady 92/119/EHS naznačuje, že do hospodářství nebyla zavlečena vezikulární choroba prasat; b) v hospodářství nebyly zjištěny klinické znaky vezikulární choroby prasat; c) hospodářství se nenachází v pásmu dozoru nebo v pásmu omezeného pohybu vytvořeném po potvrzeném vypuknutí choroby nebo podle jiných omezení uplatňovaných s ohledem na potvrzené vypuknutí choroby, a za předpokladu, že: - žádná prasata nebyla z hospodářství převezena pro obchod uvnitř Společenství a - prasata se převážejí z hospodářství jen do jatek na okamžitou porážku nebo do jiného hospodářství, ze kterého se žádné prase nepřeváží pro obchod uvnitř Společenství, až do doby, dokud výsledky dalších kontrol a sérologických testů prováděných na místě, kde bylo zjištěno séropozitivní prase a v hospodářství, ze kterého pochází, neukazují, že vezikulární chorobu prasat lze s konečnou platností vyloučit. KAPITOLA VII Zásady a uplatňování virologických testů a vyhodnocování jejich výsledků A. Zjištění antigenu viru 1. Doplňkovou fixační zkoušku nahradil nepřímý sendvičový test ELISA jako metoda výběru pro zjišťování antigenu viru vezikulární choroby prasat. Zkouška je stejná jako zkouška, která se používá pro diagnózu slintavky a kulhavky. Pokud již nebyla slintavka a kulhavka vyloučena, musí se provádět zkoušky pro obě choroby současně. Doporučuje se zejména na vzorcích epitelu nebo kapaliny z vezikulárních lézí, ve kterých mohou být u akutně infikovaných prasat viry vezikulární choroby prasat i slintavky a kulhavky ve vysokých titrech a zjištěny za několik málo hodin [3]. Duplicitní řady na mnohobodových (multiwell) deskách ELISA se pokryjí králičím antisérem pro virus vezikulární choroby prasat a pro každý ze sedmi sérotypů viru slintavky a kulhavky. Ke každé z řad se přidají suspenze zkušebního vzorku. Zahrnují se i příslušné kontroly. Do příslušných řad se v dalším stadiu přidává homologické detekční sérum morčat a za ním králičí sérum morčat konjugované na enzym, jako je křenová peroxidáza. Mezi každým stádiem se provádí důkladné promývání pro odstranění nenavázaných reakčních činidel. Pozitivní reakce je indikována, jestliže při připojení chromogenu a substrátu dojde k barevné reakci. Silné pozitivní reakce takto budou zřejmé prostým okem, avšak výsledky lze rovněž odečítat spektrofotometricky a v takovém případě absorbance v hodnotě 0,1 nad pozadím naznačuje pozitivní reakci. 2. Pro zjištění antigenu vezikulární choroby prasat a pro diferenční diagnózu slintavky a kulhavky ve vzorcích epitelu, vezikulární kapaliny nebo infikované tkáňové kultuře se může používat alternativní monoklonální systém ELISA na bázi protilátky, používající vybrané monoklonální protilátky jako vychytávací protilátky a s peroxidázou konjugované monoklonální protilátky jako zjišťovací protilátky 3. Monoklonální ELISA na bázi protilátky se může používat ke studiu antigenových variací mezi kmeny viru vezikulární choroby prasat. Virové antigeny vypěstované na tkáňové kultuře se vychytávají králičím hyperimunním antisérem pro vezikulární chorobu adsorbovaným na pevnou fázi. Vhodné panely monoklonálních protilátek jsou potom reagované a vázací monoklonální protilátky k terénním kmenům se porovnávají s vázacími monoklonálními protilátkami parentálních kmenů. Podobné vazby naznačují přítomnost epitopů sdílených mezi parentálními a terénními kmeny. B. Izolace a pěstování viru 1. Jako běžný postup se vyčištěné suspenze vzorku epitelia, vezikulární kapaliny nebo výkalů, které jsou podezřelé, že obsahují virus vezikulární choroby prasat, musí inokulovat do senzitivních buněčných kultur. Jestliže množství a kvalita vzorků z vezikulárních lézí předložených k vyšetření je nedostačující pro okamžité vyšetření testem ELISA, bude nezbytné pěstovat virus na tkáňové kultuře, aby se rozmnožil antigen viru. 2. Pro izolaci a růst viru se vyčištěná epiteliální suspenze inokuluje na jednovrstvé kultury buněk IB-RS-2. Aby se zabránilo interferenci růstu viru interferonem, jehož uvolnění by zasahovalo do růstu viru vezikulární choroby prasat, měla by se používat dvojí zředění epiteliální suspenze, jedno vysoké (1/500) a jedno nízké (1/10). Pro izolaci viru se pro udržování média přidávají pouze antibiotika. Pro diferenční diagnózu od viru slintavky a kulhavky se musí také inokulovat primární tyreoidní hovězí buňky, nebo buňky ledvin malých křečků (BHK-21). 3. Jestliže se dostaví cytopatický efekt (CPE), musí se, když je účinek kompletní, stáhnout z pozitivních kultur supernatantní kapalina a použije se v testu ELISA pro identifikaci viru. Negativní kultury se musí inokulovat na čerstvé tkáňové kultury při 48 nebo 72 hodinách a slepé pasáže se zkoumají nejpozději po 72 hodinách. Když se cytopatický účinek po další slepé pasáži nedostaví, lze vzorek z hlediska přítomnosti živého viru prohlásit za negativní. 4. Suspenze výkalových vzorků se může zpracovat jak je popsáno v bodě 1. Protože ve výkalech je obecně méně viru než v epitelu, je klíčové, aby se za nepřítomnosti cytopatického účinku v prvních dvou pasážích ještě použilo třetí slepé pasáže. 5. Současné inokulování linie prasečích buněk a jednoho výše uvedeného systému tkáňové kultury (nejlépe primární tyreoidní hovězí buňky) je užitečným vodítkem ke zjištění, zda vezikulární vzorky obsahují virus vezikulární choroby prasat nebo virus slintavky a kulhavky, protože ten první se bude množit pouze v buňkách prasečího původu. Ovšem v buněčných systémech prasečích kultur mohou také přednostně růst izoláty viru slintavky a kulhavky s prodlouženou historií přenosu mezi prasaty. C. Reakce polymerázového řetězce (PCR) pro zjištění genomu 1. Metody rozpoznávání nukleové kyseliny za použití PCR se hodí u klinického materiálu ke zjištění virového genomu vezikulární choroby prasat a ke stanovení vztahů mezi izoláty viru vezikulární choroby prasat určením nukleotidové sekvence části genomu. Techniky používající PCR byly vypracovány za účelem zvýšení citlivosti diagnózy. Byly popsány mírně odlišné postupy reverzní transkriptázy-PCR za použití primerů odpovídajících silně konzervovaným regionům v genech 1C a 1D. 2. Technika PCR je rychlá (výsledky jsou obvykle k dispozici během 24 hodin), stanoví všechny genotypy viru vezikulární choroby prasat a je dostatečně citlivá, aby se mohla použít na vzorcích odebraných z případů podezření na klinickou chorobu. 3. Při podezření na subklinickou infekci, nebo když se vzorky odebírají v okamžiku, kdy se již nevyskytují klinické symptomy choroby, nebo při přípravě výkalových vzorků ukazují se vyspělé techniky RT-PCR, jako je hnízdová RT-PCR, imunní-PCR, ELISA-PCR a mnohem pracnější metody extrakce RNA, jako detekční systém, který je minimálně stejně senzitivní, avšak mnohem rychlejší než násobné pasáže na tkáňové kultuře. 4. Sekvencováním přibližně 200 nukleotidů v genu 1D, který kóduje hlavní strukturální protein VP1, je možné seskupit kmeny viru vezikulární choroby prasat podle jejich sekvenční homologie a epidemiologicky zjistit vzájemnou souvislost kmenů způsobujících chorobu v různých regionech nebo v různé době. D. Vyhodnocování výsledků virologických testů Zjištění antigenů nebo genomu viru vezikulární choroby prasat pomocí testů ELISA a PCR má stejnou diagnostickou hodnotu jako izolace viru. Izolace viru ovšem musí být považována za referenční test a musí se používat jako potvrzovací test tam, kde je to nezbytné, zejména jestliže pozitivní výsledky ELISA nebo PCR nejsou spojené se: a) zjištěním klinických znaků choroby; b) zjištěním séropozitivních prasat nebo c) přímou epidemiologickou vazbou na potvrzené vypuknutí choroby ve stádu. KAPITOLA VIII Zásady a oblasti aplikace sérologických testů a vyhodnocování jejich výsledků A. Test neutralizace viru (VN) 1. Kvantitativní mikrotest VN pro detekci protilátky viru vezikulární choroby prasat se provádí s buňkami IB-RS-2 nebo s ekvivalentním buněčným systémem na deskách s plochým dnem tkáňové kultury mikrotitrového stupně. 2. Virus se pěstuje v monovrstvách buněk IB-RS-2 a skladuje se buď při –20 °C po přidání 50 % glycerolu nebo při –70 °C bez glycerolu. Séra jsou před testováním inaktivována po dobu 30 minut při teplotě 56 °C. B. Testy ELISA 1. ELISA pro detekci protilátek je monoklonální kompetiční ELISA na bázi protilátky. Jestliže sérový vzorek obsahuje protilátky viru vezikulární choroby prasat, vazba vybrané, peroxidázou konjugované monoklonální protilátky na antigen viru se bude inhibovat. V tomto testu ELISA je antigen viru vezikulární choroby prasat zachycen na pevné fázi za použití monoklonálních protilátek; v další fázi se sérové vzorky inkubují při příslušném zředění, následovaném přidáním peroxidázou konjugované monoklonální protilátky. Potom se měří inhibice vázání monoklonální protilátky pomocí substrátu a chromogenu. 2. Nepřímý zachycovací test ELISA používající izotypově-specifické monoklonální protilátky ke stanovení prasečího IgG nebo IgM specifického pro virus vezikulární choroby prasat je užitečný při stanovení doby infekce prasete a nebo infikovaného zařízení. U izotypově specifického testu ELISA se antigen viru zachycuje na pevné fázi za použití protilátky zachycující antigen. Jestliže sérový vzorek obsahuje protilátky viru vezikulární choroby prasat, jsou zjišťovány za použití antitělísek IgG z prasat nebo antitělísek IgM z prasat monoklonální protilátky konjugované s peroxidázou. Potom se tato vazba měří pomocí substrátu a chromogenu. Izotypově specifický test ELISA může rovněž pomoci při odlišení ojedinělých reaktorů od skutečně pozitivních prasat, jak se uvádí v bodě C. C. Aplikace sérologických testů a vyhodnocování výsledků 1. Přednostně doporučenými sérologickými testy jsou test VN a ELISA. V kapitole X jsou uváděna referenční séra, která jsou k dispozici z referenční laboratoře Společenství pro provádění uvedených standardizovaných sérologických testů ve Společenství. Test VN se musí považovat za referenční test, má však nevýhody v tom, že provedení trvá dva až tři dny a vyžaduje tkáňové kultury. ELISA je mnohem rychlejší a může se mnohem snadněji standardizovat. Monoklonálně protilátková kompetitivní ELISA je nejspolehlivější ELISOU protilátky vezikulární choroby prasat, jaká byla až dosud popsána. Doporučuje se jako vyšetřovací test na velkém počtu vzorků. Když je to nezbytné, musí se ovšem jako potvrzení použít test VN, zejména po prvním zjištění pozitivních vzorků ze statku. Pozitivní prasata podle ELISA, ale negativní při zkoušce VN se nemusí brát v úvahu. 2. Přítomnost ojedinělého reaktoru [4] může být podezřelá tam, kde se zjistí jedno séropozitivní prase a kde jsou splněna tato kritéria: a) v hospodářství neexistují klinické znaky choroby; b) v hospodářství se v minulosti nevyskytly významnější případy klinické choroby; c) v minulosti nedošlo nikdy ke kontaktu se známým nakaženým stádem. 3. Prase je potvrzeným ojedinělým reaktorem, když: a) další testování nezjistí jiná séropozitivní prasata; b) vzorkování prováděné na prasatech v kontaktu po prvním zjištění ojedinělého reaktoru neobjeví sérokonverzi; c) titr protilátky u opakovaných vzorků zůstává konstantní nebo klesá. 4. Pro potvrzení ojedinělého reaktoru se musí ovšem uvážit také následující dodatečná kritéria a zásady: a) ojedinělý reaktor se objevuje v množství přibližně 1 na 1000 prasat; b) séra z ojedinělých reaktorů mají obecně tento profil: - nízký titr protilátky testu VN, - pozitivní hraniční čáru v monoklonálním konkurenčním testu ELISA na bázi protilátky, - u izotypově specifického testu ELISA pro vezikulární chorobu prasat [5] je výlučně IgM a žádný IgG. KAPITOLA IX Klinické znaky a charakteristiky vezikulární choroby prasat Vezikulární choroba prasat je nakažlivá choroba prasat způsobovaná enterovirem rodu picornaviridae a může být v subklinickém, mírném nebo vážném vezikulárním stavu v závislosti na působícím kmenu viru, cestě a dávce infekce a pěstitelských podmínkách, ve kterých jsou prasata držena. Další stresové faktory, jako doprava, smíchání s jinými prasaty a extrémní teploty, mohou rovněž vytvořit predispozici k rozvoji klinických znaků. Charakterizuje ji mírná horečka a puchýřky na koronárním pásu, bulby na patě, kůži údů a méně častěji rypáku, pyscích, jazyku a strucích. Míra nemocnosti může dosahovat až 100 %, avšak úmrtnost je velmi nízká nebo nulová. Infekce se může rozvíjet v neviditelné nebo mírné formě s projevy jen postupného zhoršení zdravotního stavu prasat, avšak během několika málo dní [6] vede k vývoji protilátek neutralizujících virus. V důsledku subklinické a nebo mírné povahy choroby se první podezření objeví po sérologických testech při kontrole nemocí nebo osvědčení pro vývoz. Nedávná vzplanutí vezikulární choroby prasat v Evropě byla charakterizována méně závažnými nebo zcela neklinickými znaky, diagnóza často závisela na sérologii. Klinické znaky vezikulární choroby prasat jsou však neodlišitelné od znaků slintavky a kulhavky. Každý vezikulární stav se musí zpočátku považovat za podezření na slintavku a kulhavku a co možná nejrychleji je třeba získat diferenční diagnózu. Inkubační doba vezikulární choroby prasat je obvykle dva až sedm dní, po kterých se může objevit přechodná horečka až 41 °C, avšak klinické znaky mohou začít být v hospodářství zřejmé až po delším období. Puchýřky se potom vyvíjejí na koronárním pásu, obvykle na spoji s patou. Ty mohou ovlivňovat celkový koronární pás mající za následek ztrátu paznehtu. Mnohem méně často se mohou puchýře rovněž objevit na rypáku, zvláště na dorzálním povrchu, na pyscích, jazyku a strucích a na kolenech je možno vidět mělké eroze. Postižená prasata mohou kulhat a několik dní nežrat. Mladší prasata jsou postihována mnohem vážněji, třebaže úmrtnost na vezikulární chorobu prasat je, na rozdíl od slintavky a kulhavky, u mladých zvířat velmi nízká. Byly hlášeny poruchy nervového systému, ale nejsou obvyklé. Zmetání není obvyklým charakteristickým rysem vezikulární choroby prasat. Selhání srdce v důsledku víceohniskové myokarditidy může být charakteristickým znakem slintavky a kulhavky a encefalomyokarditidy, zvláště u malých selat, u vezikulární choroby prasat se však neobjevuje. Zotavení je obvykle kompletní během dvou až tří týdnů s jediným znakem infekce, kterým jsou tmavé, horizontální čáry na paznehtech, kde byl růst dočasně přerušen. Postižená prasata mohou vylučovat virus z nozder a tlamy a ve výkalech již 48 hodin před začátkem objevení se klinických znaků. Většina viru je produkována v prvních sedmi dnech po infekci a vylučování viru z rypáku se obvykle zastavuje během dvou týdnů. Virus lze izolovat z výkalů až 20 dní po infekci, třebaže existují zprávy o tom, že se vyskytoval ještě po třech měsících. Značnou dobu může přetrvávat v nekrotických tkáních spojených s prasklými puchýřky a ve výkalech. KAPITOLA X Referenční séra vezikulární choroby prasat Referenční sérum | Původ | Poznámka | 1 | Běžné prasečí sérum (NPS) | Negativní kontrolní sérum | 2 | Sérum odebrané 21 dní po infekci (dpi) z prasete infikovaného virem vezikulární choroby prasat kmene UKG 27/72 (neředěné) | Silné pozitivní kontrolní sérum | 3 | Roztok 1:10 v NPS séra odebraného pět dpi z prasete nakaženého kmenem vezikulární choroby prasat Italy 8/94 | Nízkopozitivní sérum z prasete brzo po infekci s nedávným evropským izolátem viru vezikulární choroby prasat. Sérum bylo zředěno tak, aby poskytovalo nízký pozitivní výsledek v testech ELISA a VNT. | 4 | Ředění 1:40 séra odebraného 21 dpi z prasete infikovaného virovým kmenem vezikulární choroby prasat UKG 27/72 | Nízkopozitivní sérum definující nejnižší úroveň protilátek, které by měly národní referenční laboratoře EU považovat trvale za pozitivní podle testu ELISA a neutralizace viru. Ekvivalentní séru RS 01-04-94 | 5 | Sérum odebrané 4 dpi od prasete infikovaného virovým kmenem vezikulární choroby prasat UKG 27/72 (neředěné) | Nízkopozitivní sérum z prasete brzy po infekci | 6 | Sérum odebrané 5 dpi z prasete infikovaného virovým kmenem vezikulární choroby prasat UKG 27/72 (neředěné) | Nízkopozitivní sérum z prasete brzy po infekci | [1] Úř. věst. L 224, 18.8.1990, s. 19. [2] Úř. věst. L 224, 18.8.1990, s. 29. [3] Pozitivní výsledky testu ELISA jsou spojené s přítomností minimálně 105 TCID50 (infekční dávky tkáňové kultury) viru ve vzorku. [4] Malá část ojedinělých reaktorů se může zjistit kterýmkoli z běžných sérologických testů na vezikulární chorobu prasat. Faktory, které způsobují ojedinělé reaktory, nejsou známé. Sérologická křížová reaktivita s virem vezikulární choroby prasat může vznikat v důsledku infekce jiným, dosud neidentifikovaným pikornavirem nebo může být důsledkem jiných nespecifických faktorů přítomných v séru. [5] V sérových vzorcích prasat infikovaných virem vezikulární choroby prasat se obvykle zjišťuje jen specifický IgG a nebo obojí IgG a IgM, zatímco séra ojedinělých reaktorů obecně obsahují pouze IgM. Specifický IgG se nezjistí v sérových vzorcích prasat infikovaných virem vezikulární choroby prasat během předcházejících 10 až 14 dní, třebaže specifický IgG by měl být zjištěn v druhém vzorku krve. Ovšem, nedávno infikovaná prasata se nedají spolehlivě odlišit od ojedinělých reaktorů před tím, než jejich imunitní reakce přejde z produkce IgM na IgG. Viz rovněž kapitola IX a poznámka pod čarou 7. [6] V krvi odebrané dva až tři dni po infekci může být obvykle zjištěn specifický IgM, který zmizí asi po 30 až 50 dnech; specifický IgG se může obvykle zjistit v krvi v době od 10 do 14 dní po infekci a setrvává několik let. Isotyp IgG se může stanovit pomocí ELISA popisované v kapitole VIII písm. B odst. 2. --------------------------------------------------