6)

Doplňují se následující kapitoly C.31 až C.46: „ C.31. ZKOUŠKA SUCHOZEMSKÝCH ROSTLIN: ZKOUŠKA VZCHÁZIVOSTI OSIVA A RŮSTU SEMENÁČKŮ ÚVOD 1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 208 (2006). Zkušební metody se pravidelně přezkoumávají s ohledem na vědecký pokrok a aplikovatelnost pro zákonné použití. Tato aktualizovaná zkušební metoda je určena pro hodnocení potenciálních účinků chemických látek na vzcházivost osiva a růst semenáčků. Jako taková nepokrývá chronické účinky nebo účinky na reprodukci (tj. množství semen, tvorba květů, zrání plodů). Je třeba brát v úvahu podmínky expozice a vlastnosti chemické látky určené ke zkoušení, aby se zajistilo, že budou použity příslušné zkušební metody (např. při zkoušení kovů/kovových sloučenin je třeba počítat s efekty pH a s tím spojených protiiontů) (1). Tato zkušební metoda se netýká rostlin vystavených parám chemických látek. Zkušební metoda je vhodná pro zkoušení obecných chemických látek, biocidů a přípravků na ochranu plodin (rovněž známých jako přípravky na ochranu rostlin nebo pesticidy). Metoda byla vyvinuta na základě stávajících metod (2, 3, 4, 5, 6, 7). Rovněž byly zohledněny další dokumenty vztahující se ke zkoušení rostlin (8, 9, 10). Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1. PODSTATA ZKOUŠKY 2. Zkouška hodnotí účinky na vzcházivost osiva a rané fáze růstu vyšších rostlin po expozici zkoušené chemické látce v půdě (nebo jiné vhodné půdní matrici). Semena se umístí do půdy vystavené působení zkoušené chemické látky a účinky se vyhodnotí obvykle 14 až 21 dnů poté, co vzejde 50 % osiva v kontrolní skupině. Cílovými ukazateli jsou vizuální hodnocení vzcházivosti osiva, hmotnost suchých výhonků (alternativně hmotnost čerstvých výhonků) a v určitých případech výška výhonků a rovněž hodnocení viditelných škodlivých účinků na různé části rostlin. Tato měření a pozorování se porovnají s neexponovanými kontrolními rostlinami. 3. V závislosti na očekávaném způsobu expozice se zkoušená chemická látka buď zapracuje do půdy (nebo případně do umělé půdní matrice) nebo se aplikuje na povrch půdy, což správně představuje potenciální způsob expozice chemické látce. Zapracování do půdy se provede zpracováním půdy v objemu. Po aplikaci se půda přemístí do květináčů a semena daného rostlinného druhu se vysejí do půdy. Povrchová aplikace se provádí na půdu v květináčích, do které již byla vsazena semena. Zkoušené jednotky (kontrolní a exponované půdy se semeny) se pak umístí do prostoru s vhodnými podmínkami pro podporu klíčení/růstu rostlin. 4. Zkoušku lze provádět tak, aby se stanovila křivka dávka-odezva nebo pro jednotlivou koncentraci/dávku jako limitní zkoušku podle účelu studie. Jestliže výsledky ze zkoušky s jednou koncentrací/dávkou překročí určitou úroveň toxicity (např. jsou-li pozorovány účinky vyšší než x %), provede se orientační zkouška pro stanovení horní a dolní meze toxicity; následuje zkouška s několika koncentracemi/dávkami pro stanovení křivky dávka-odezva. Použije se příslušná metoda statistické analýzy pro získání účinné koncentrace ECx nebo účinné dávky ERx vyvolávající účinek (např. EC25, ER25, EC50, ER50) pro nejcitlivější významný(é) parametr(y). Při této zkoušce je možno rovněž vypočítat koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC) a nejnižší koncentraci s pozorovaným účinkem (LOEC). INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE 5. Následující informace jsou užitečné pro identifikaci očekávaného způsobu expozice chemické látce a pro uspořádání zkoušky: strukturní vzorec, čistota, rozpustnost ve vodě, rozpustnost v organických rozpouštědlech, rozdělovací koeficient 1-oktanol/voda, sorpční chování půdy, tlak par, stabilita chemické látky ve vodě a na světle a biologická rozložitelnost. PLATNOST ZKOUŠKY 6. Aby byla zkouška uznána za platnou, musí být v kontrolních vzorcích splněna následující kritéria platnosti: — vzcházivost osiva je alespoň 70 %, — semenáčky nevykazují žádné viditelné fytotoxické účinky (např. chloróza, nekróza, vadnutí, deformace listů a stonků) a rostliny vykazují pouze normální odchylky v růstu a morfologii pro příslušný druh, — střední hodnota přežití vzešlých kontrolních semenáčků je alespoň 90 % po dobu trvání studie, — podmínky prostředí pro příslušný druh jsou identické a růstová média obsahují stejné množství půdní matrice, podpůrných médií nebo substrátu ze stejného zdroje. REFERENČNÍ CHEMICKÁ LÁTKA 7. Referenční chemická látka se může zkoušet v pravidelných intervalech pro ověření, zda se účinnost zkoušky a odezva příslušných zkoušených rostlin a zkušebních podmínek v průběhu zkoušky významně nezměnily. Alternativně je možné použít dřívější měření biomasy nebo růstu kontrolních vzorků pro vyhodnocení fungování zkušebního systému v příslušných laboratořích a výsledky mohou sloužit jako měřítko kontroly kvality pro danou laboratoř. POPIS METODY Přírodní půda – umělý substrát 8. Rostliny se mohou pěstovat v květináčích v půdě písčitohlinité, hlinitopísčité nebo písčitojílovitohlinité obsahující až 1,5 % organického uhlíku (přibližně 3 % organické hmoty). Rovněž se dá použít běžně prodávaný substrát nebo syntetická půdní směs, která obsahuje do 1,5 % organického uhlíku. Jílovité půdy by se neměly používat, jestliže je o zkoušené chemické látce známo, že vykazuje vysokou afinitu k jílu. Půda z pole se musí prosít na velikost částic 2 mm, aby se homogenizovala a odstranily se hrubé částice. V závěrečné zprávě se musí uvést typ a textura půdy, procentuální zastoupení organického uhlíku, pH a obsah solí měřením elektrické vodivosti konečné připravené půdy. Půda by měla být klasifikována podle standardního klasifikačního systému (11). Půdu je možné pasterizovat nebo tepelně ošetřit, aby se snížil účinek půdních patogenů. 9. Přírodní půda může komplikovat interpretaci výsledků a zvýšit variabilitu způsobenou měnícími se fyzikálně/chemickými vlastnostmi a mikrobiálními populacemi. Tyto proměnné zase mění schopnost zadržovat vlhkost, kapacitu vázat chemické látky, provzdušňování a obsah živin a stopových prvků. Kromě kolísání těchto fyzikálních faktorů se budou rovněž vyskytovat odchylky v chemických vlastnostech, jako je pH a oxidačně-redukční potenciál, což může ovlivnit biologickou dostupnost zkoušené chemické látky (12, 13, 14). 10. Umělé substráty se obvykle nepoužívají ke zkoušení přípravků na ochranu rostlin, lze je ale použít ke zkoušení běžných chemických látek nebo v případech, kdy je žádoucí minimalizovat variabilitu přírodních půd a zlepšit srovnatelnost výsledků zkoušek. Použité substráty by měly být složeny z inertních materiálů, které minimalizují interakce se zkoušenou chemickou látkou, nosným rozpouštědlem nebo s oběma. Jako vhodné inertní materiály se ukázaly křemenný písek vypraný kyselinou, minerální vlna a skleněné kuličky (např. o průměru 0,35 až 0,85 mm), které minimálně absorbují zkoušenou chemickou látku (15) a tím zajišťují, že chemická látka bude v maximální míře k dispozici pro sazenice příjmem kořeny. Nevhodnými substráty jsou vermikulit, perlit nebo jiné vysoce absorpční materiály. Rostlinám je třeba pro jejich růst poskytnout živiny, aby se předešlo strádání rostlin kvůli nedostatku živin, a tam, kde je to možné, je třeba stav vyhodnotit chemickou analýzou nebo vizuálním posouzením kontrolních rostlin. Kritéria pro výběr zkušebního druhu 11. Spektrum vybraných druhů by mělo být rozumně široké, např. s ohledem na taxonomickou rozmanitost v rostlinné říši, distribuci druhů, jejich hojnost, druhově specifické charakteristiky životního cyklu a oblast přírodního výskytu, aby bylo možno stanovit rozsah odezvy (8, 10, 16, 17, 18, 19, 20). Při výběru je třeba brát v úvahu následující charakteristiky možných zkušebních druhů: — druhy mají jednotná semena, která jsou přímo dostupná ze spolehlivých standardních zdrojů semen a která zajišťují konzistentní, spolehlivé a rovnoměrné klíčení, a rovněž jednotný růst semenáčků, — rostlina je vhodná pro zkoušení v laboratoři a může poskytnout spolehlivé a reprodukovatelné výsledky v rámci jedné zkušební laboratoře i mezi zkušebními laboratořemi navzájem, — citlivost zkoušených druhů by měla být konzistentní s odezvami rostlin v přírodním prostředí vystaveným účinku chemické látky, — byly použity v určitém rozsahu v dřívějších zkouškách toxicity a jejich použití, například při biologických zkouškách herbicidů, screeningu těžkých kovů, zátěžových testech vztahujících se ke slanosti nebo obsahu minerálů nebo alelopatických studiích, ukazuje citlivost na širokou škálu stresových faktorů, — jsou kompatibilní s růstovými podmínkami zkušební metody, — splňují kritéria platnosti zkoušky. Některé v minulosti nejčastěji používané zkušební druhy jsou uvedeny v dodatku 2 a možné neplodinové druhy v dodatku 3. 12. Počet druhů určených ke zkoušení závisí na příslušných právních požadavcích, proto není v této zkušební metodě specifikován. Aplikace zkoušené chemické látky 13. Chemická látka se aplikuje ve vhodném nosiči (např. voda, aceton, etanol, polyethylenglykol, arabská guma, písek). Zkoušeny mohou být rovněž směsi (upravené produkty nebo přípravky) obsahující účinné složky a různé pomocné látky. Zapracování do půdy/umělého substrátu 14. Chemické látky rozpustné ve vodě nebo suspendované ve vodě se mohou rozmíchat ve vodě a roztok se pak promíchá s půdou ve vhodném mísícím zařízení. Tento typ zkoušky může být vhodný, jestliže k expozici chemické látce dochází prostřednictvím půdy nebo vody v půdních pórech a jestliže je cílem sledovat příjem kořeny. Přidáním zkoušené chemické látky by neměla být překročena retenční vodní kapacita půdy. Objem přidané vody by měl být stejný pro každou zkušební koncentraci, ale měl by být omezen, aby se zabránilo hromadění shluků v půdě. 15. Chemické látky s nízkou rozpustností ve vodě se rozpustí ve vhodném těkavém rozpouštědle (např. aceton, ethanol) a promíchají s pískem. Rozpouštědlo se pak odstraní z písku pomocí proudu vzduchu za stálého promíchávání písku. Takto zpracovaný písek se pak promíchá s experimentální půdou. Připraví se druhý kontrolní vzorek, ve kterém bude pouze písek a rozpouštědlo. Do vzorků o všech expozičních úrovních a do druhého kontrolního vzorku se přidají stejná množství písku se zamíchaným a s odstraněným rozpouštědlem. V případě pevných, nerozpustných zkoušených chemických látek se suchá půda a chemická látka promíchají ve vhodném míchacím zařízení. Půda se pak přidá do květináčů a ihned se zasejí semena. 16. Je-li namísto půdy použit umělý substrát, chemické látky rozpustné ve vodě se mohou rozpustit v živném roztoku bezprostředně před začátkem zkoušky. Chemické látky, které jsou nerozpustné ve vodě, ale které se dají ve vodě suspendovat použitím nosného rozpouštědla, se přidají s nosičem do živného roztoku. Ve vodě nerozpustné chemické látky, pro které není k dispozici žádný netoxický nosič rozpustný ve vodě, se rozpustí ve vhodném těkavém rozpouštědle. Roztok se promíchá s pískem nebo skleněnými kuličkami a odpaří v rotační vakuové odparce, přičemž vznikne jednotný povlak chemické látky na písku nebo kuličkách. Zvážený podíl kuliček se extrahuje stejným organickým rozpouštědlem a chemická látka se stanoví před naplněním květináčů. Povrchová aplikace 17. V případě přípravků na ochranu rostlin se pro aplikaci zkoušené chemické látky často používá postřik povrchu půdy zkoušeným roztokem. Veškeré zařízení použité při provádění zkoušek, včetně vybavení použitého k přípravě a dávkování zkoušené chemické látky, by mělo mít takovou konstrukci a kapacitu, aby zkoušky zahrnující toto zařízení mohly být provedeny přesně a poskytly reprodukovatelné pokrytí. Pokrytí by mělo být jednotné po celém půdním povrchu. Pozornost je třeba věnovat tomu, aby se předešlo možnosti, že by chemická látka byla adsorbována nebo reagovala s vybavením (např. s plastovými trubkami a lipofilními chemikáliemi nebo ocelovými částmi a elementy). Zkoušená chemická látka se nastříkne na půdní povrch, čímž se simuluje typický postřik aplikovaný v nádržích. Obecně by objemy postřiku měly být v rozmezí normální zemědělské praxe a objemů (množství vody atd. je třeba uvést v závěrečné zprávě). Typ trysky se zvolí tak, aby umožnil jednotné pokrytí půdního povrchu. Jestliže se používají rozpouštědla a nosiče, připraví se druhá skupina kontrolních rostlin, na kterou se aplikuje pouze rozpouštědlo/nosič. To není nezbytné u přípravků na ochranu rostlin, u nichž se testuje složení. Ověření koncentrace/dávky zkoušené chemické látky 18. Koncentrace/aplikační dávky se musí ověřit vhodnou analytickou metodou. U rozpustných chemických látek se ověření všech zkušebních koncentrací/dávek může provést analýzou nejvyšší koncentrace zkoušeného roztoku použitého při zkoušce; zaznamená se následné zředění a použití kalibrovaných pomůcek (např. kalibrovaného analytického laboratorního skladu, kalibrovaného vybavení pro aplikaci postřiku). V případě nerozpustných chemikálií musí být spolu s ověřením materiálu složek uvedeny hmotnosti zkoušené chemické látky přidané do půdy. Jestliže je nutné prokázat homogenitu, může být nutné provést analýzu půdy. POSTUP Uspořádání zkoušky 19. Semena stejného druhu se vysejí do květináčů. Počet semen vysetých v květináči závisí na druhu, velikosti květináče a době trvání zkoušky. Počet rostlin v květináči by měl poskytovat adekvátní podmínky růstu a předejít přeplnění během trvání zkoušky. Maximální hustota rostlin je okolo 3–10 semen na 100 cm2 v závislosti na velikosti semen. Například se doporučuje jedna až dvě rostliny kukuřice, sóji, rajčete, okurky nebo cukrové řepy v 15cm květináči; tři rostliny řepky nebo hrachu v 15cm květináči; a 5 až 10 cibulových, pšeničných nebo jiných malých semen v 15cm květináči. Počet semen a paralelních květináčů (paralelní vzorek je definován jako květináč, proto rostliny ve stejném květináči nejsou považovány za paralelní vzorek) by měl být dostatečný pro optimální statistickou analýzu (21). Je třeba poznamenat, že variabilita bude větší u zkušebních druhů s velkými semeny, kterých se dává méně na květináč (opakování) ve srovnání se zkušebním druhem s malými semeny, jichž je možné použít větší počet na jeden květináč. Vysetím stejného počtu semen do každého květináče lze tuto variabilitu minimalizovat. 20. Kontrolní skupiny se používají, aby bylo jisté, že pozorované účinky jsou spojeny pouze s expozicí zkoušené chemické látce, nebo je lze této expozici přisoudit. Příslušná kontrolní skupina by měla být v každém ohledu identická se zkoušenou skupinou s výjimkou expozice zkoušené chemické látce. Během dané zkoušky by všechny zkušební rostliny, včetně kontrolních, měly být ze stejného zdroje. Aby se zabránilo systematickým chybám, je vyžadováno náhodné přiřazení zkušebních a kontrolních květináčů. 21. Semena pokrytá insekticidy nebo fungicidy (tzv. ‚oblečená‘ semena) se musí vyloučit. Avšak některé regulační orgány použití určitých nesystemických kontaktních fungicidů (např. kaptan, thiram) povolují (22). Jestliže je obava z patogenů vnesených semeny, mohou se semena nechat krátce nasáknout ve slabém 5 % roztoku chlornanu, pak důkladně opláchnout pod tekoucí vodou a osušit. Není povoleno žádné léčivé ošetření jiným přípravkem na ochranu rostlin. Zkušební podmínky 22. Zkušební podmínky by měly napodobit podmínky nezbytné pro normální růst zkoušených druhů a odrůd (v dodatku 4 jsou uvedeny příklady zkušebních podmínek). Vyvíjející se rostliny je třeba udržovat v podmínkách správné zahradnické praxe v řízeném prostředí komor, fytotronů nebo skleníků. Při použití růstových zařízení tato praxe obvykle zahrnuje regulaci a dostatečně časté (např. jednou za den) zaznamenávání teploty, vlhkosti, koncentrace oxidu uhličitého, světelných podmínek (intenzity, vlnové délky, fotosynteticky aktivního záření), doby osvětlení, prostředků zavlažování atd.; tím se zajistí dobrý růst rostlin, což se posuzuje pomocí kontrolních rostlin zvoleného druhu. Teplota ve skleníku by se měla regulovat pomocí systémů ventilace, vytápění anebo chlazení. Pro zkoušení ve sklenících jsou obecně doporučeny následující podmínky: — teplota: 22 °C ± 10 °C, — relativní vlhkost: 70 % ± 25 %, — fotoperioda: minimálně 16 hodin osvětlení, — intenzita záření dopadajícího na povrch (ozářenost): 350 ± 50 μE · m– 2 · s– 1. Dodatečné osvětlení může být nezbytné, jestliže se intenzita sníží pod 200 μE · m– 2 · s– 1, vlnová délka 400–700 nm s výjimkou určitých druhů, jejichž požadavky na osvětlení jsou menší. V průběhu studie se podmínky prostředí monitorují a zaznamenávají. Rostliny se pěstují v neporézních plastových nebo glazovaných květináčích s táckem nebo miskou pod nimi. Květináče se mohou pravidelně přemísťovat, aby se minimalizovala variabilita v růstu rostlin (v důsledku rozdílů ve zkušebních podmínkách v růstovém zařízení). Květináče musí být dostatečně velké, aby umožnily normální růst. 23. Půdní živiny je možné dodávat podle potřeby pro zachování dobré vitality rostlin. Potřeba a načasování dodatečných živin se mohou určit pozorováním kontrolních rostlin. Doporučuje se spodní zavlažování zkušebních květináčů (např. použitím knotů ze skelných vláken). Počáteční vrchní zavlažení se však může použít pro stimulaci klíčení semen; při aplikaci zkoušené chemické látky na půdní povrch se takto usnadní její průnik do půdy. 24. Specifické růstové podmínky by měly být vhodné pro zkušební druh a zkoušenou chemickou látku, které jsou předmětem zkoumání. Kontrolní a exponované rostliny se musí držet za stejných podmínek okolního prostředí; je však třeba přijmout adekvátní opatření, aby se zabránilo křížné expozici zkoušené chemické látce (např. těkavé látce) mezi různými exponovanými a kontrolními vzorky. Zkoušení jediné koncentrace/dávky 25. Pro stanovení vhodné koncentrace/dávky chemické látky při provádění zkoušky (provokační/mezní) s jedinou koncentrací nebo dávkou je třeba zvážit řadu faktorů. U běžných chemikálií k takovým faktorům patří fyzikální a chemické vlastnosti chemické látky, u přípravků na ochranu rostlin je třeba brát v úvahu fyzikální a chemické vlastnosti a způsob použití zkoušené chemické látky, její maximální koncentraci nebo aplikační dávku, počet aplikací za sezónu anebo stálost zkoušené látky. Pro stanovení, zda běžná chemikálie vykazuje fytotoxické vlastnosti, může být vhodné provést zkoušku při maximální dávce 1 000 mg/kg suché půdy. Orientační zkouška 26. Podle potřeby je možné provádět orientační zkoušku pro určení rozsahu koncentrací/dávek, které mají být zkoušeny v hlavní studii zjišťující vztah dávka-odezva. Při orientační zkoušce by zkušební koncentrace/dávky měly být zvoleny s velkými intervaly (např. 0,1, 1,0, 10, 100 a 1 000 mg/kg suché půdy). U přípravků na ochranu rostlin mohou koncentrace/dávky vycházet z doporučených nebo maximálních hodnot koncentrací nebo aplikačních dávek, např. 1/100, 1/10, 1/1 doporučené/maximální koncentrace nebo aplikační dávky. Zkouška s několika koncentracemi/dávkami 27. Účelem zkoušky s několika koncentracemi/dávkami je určit vztah dávka-odezva a stanovit hodnotu ECx nebo ERx pro vzcházivost, biomasu anebo viditelné účinky ve srovnání s neexponovanými kontrolními vzorky podle požadavků regulačních orgánů. 28. Počet a rozložení koncentrací nebo dávek by mělo být dostatečné, aby poskytly spolehlivý vztah dávka-odezva a regresní rovnici a umožnily odhad ECx. nebo ERx. Zvolené koncentrace/dávky by měly zahrnovat hodnoty ECx nebo ERx, které mají být stanoveny. Například, jestliže je požadována hodnota EC50, bude žádoucí provést zkoušku při dávkách vyvolávajících 20–80 % účinek. Doporučený počet zkoušených koncentrací/dávek, kterými se toho dosáhne, je alespoň pět v geometrické posloupnosti plus neexponovaný kontrolní vzorek, rozložených s faktorem nepřekračujícím tři. Pro každou exponovanou a kontrolní skupinu by počet opakování měl být alespoň čtyři a celkový počet semen alespoň 20. Pro zvýšení statistické síly zkoušky může být zapotřebí více opakování s určitými rostlinami vykazujícími nízkou rychlost klíčení nebo proměnné růstové průběhy. Jestliže se použije větší počet zkušebních koncentrací/dávek, může se počet opakování snížit. Jestliže je třeba odhadnout hodnotu NOEC, může být potřeba více opakování pro dosažení požadované statistické síly (23). Pozorování 29. Během doby pozorování, tj. 14 až 21 dní poté, co vzešlo 50 % kontrolních rostlin (rovněž případně kontrolních vzorků s rozpouštědly), jsou rostliny často pozorovány (alespoň jednou za týden a, je-li to možné, denně) z hlediska vzcházivosti a viditelné fytotoxicity a mortality. Na konci zkoušky se zaznamená změřený procentní podíl vzcházivosti a biomasy přeživších rostlin a rovněž viditelné škodlivé účinky na různých částech rostlin. Škodlivými účinky jsou abnormální vzhled vzešlých semenáčků, zakrslý růst, chloróza, odbarvení, odumření a účinky na vývoj rostlin. Konečnou biomasu lze měřit prostřednictvím konečné průměrné hmotnosti suchých výhonků přeživších rostlin, kdy se požnou výhonky při povrchu půdy a usuší do konstantní hmotnosti při 60 °C. Alternativně se může konečná biomasa měřit prostřednictvím hmotnosti čerstvých výhonků. Výška výhonku může představovat další cílový ukazatel, jestliže je požadován regulačními orgány. Pro vyhodnocení pozorovatelných toxických účinků je třeba použít jednotný systém vyhodnocování viditelného poškození. Příklady provádění kvalitativního a kvantitativního vizuálního hodnocení jsou uvedeny v odkazech (23, 24). ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV Statistická analýza Zkouška s jedinou koncentrací/dávkou 30. Údaje pro každý druh rostlin se analyzují použitím vhodné statistické metody (21). V závěrečné zprávě by se měla uvést úroveň účinku při zkušební koncentraci/dávce nebo nedosažení daného účinku při zkušební koncentraci/dávce (např. < x % účinek pozorovaný při koncentraci nebo dávce y). Zkouška s několika koncentracemi/dávkami 31. Vztah dávka-odezva se stanoví ve formě regresní rovnice. Je možné použít rozdílné modely: například pro odhad hodnoty ECx nebo ERx (např. EC25, ER25, EC50, ER50) a jejího intervalu spolehlivosti pro vzcházivost v binárním tvaru mohou být vhodné metody logitová, probitová, Weibullova, Spearman-Karberova, upravená Spearman-Karberova atp. Pro růst semenáčků – tj. jejich hmotnost a výšku jako průběžné ukazatele – se mohou hodnoty ECx nebo ERx a jejich intervaly spolehlivosti odhadnout použitím vhodné regresní analýzy (např. Bruce-Versteegova nelineární regresní analýza (25)). Tam, kde je to možné, by hodnota R2 měla být 0,7 nebo vyšší pro většinu citlivých druhů a použité zkušební koncentrace/dávky by měly zahrnovat 20 % až 80 % účinky. Jestliže má být odhadnuta hodnota NOEC, dává se přednost použití silných statistických testů zvolených na základě rozdělení dat (21, 26). Závěrečná zpráva 32. Závěrečná zpráva by měla obsahovat výsledky studií a rovněž podrobný popis zkušebních podmínek, důkladnou diskusi výsledků, analýzu dat a závěry získané na základě analýz. Rovněž by měl být obsažen tabelární souhrn a abstrakt výsledků. Závěrečná zpráva musí zahrnovat následující: Zkoušená chemická látka: — identifikační údaje chemické látky, relevantní vlastnosti zkoušené chemické látky (např. log Pow, rozpustnost ve vodě, tlak par a informace o osudu a chování v životním prostředí, jsou-li k dispozici); — podrobnosti o přípravě zkušebního roztoku a ověření zkušebních koncentrací, jak je specifikováno v odstavci 18. Zkušební druh: — podrobnosti o zkušebním organismu: druh/odrůda, čeledi rostliny, vědecký a obecný název, zdroj a historie semen co nejpodrobnější (tj. jméno dodavatele, procentuální klíčivost, třída velikosti semen, číslo várky nebo dávky, rok setí nebo sezóna pěstování shromážděných vzorků, datum hodnocení klíčení), životaschopnost atd., — počet zkoušených jedno- a dvouděložných druhů, — odůvodnění výběru druhu, — popis skladování, zpracování a udržování semen. Zkušební podmínky: — zkušební zařízení (např. růstová komora, fytotron a skleník), — popis zkušebního systému (např. rozměry květináčů, materiál květináčů a množství půdy), — charakteristiky půdy (textura nebo typ půdy: distribuce půdních částic a klasifikace, fyzikální a chemické vlastnosti, včetně podílu organické hmoty, podílu organického uhlíku a pH), — příprava půdy/substrátu (např. půda, umělá půda, písek a jiné) před zkouškou, — popis živného média, jestliže se používá, — aplikace zkoušené chemické látky: popis metody aplikace, popis vybavení, stupně a objemy expozice včetně ověření chemické látky, popis kalibrační metody a popis podmínek během aplikace, — podmínky růstu: ozářenost (např. PAR (parabolický hliníkový reflektor), fotosynteticky aktivní záření), fotoperioda, maximální/minimální teplota, harmonogram a způsob zavlažování, hnojení, — počet semen v květináči, počet rostlin na dávku, počet opakování (květináčů) na stupeň expozice, — typ a počet kontrolních vzorků (negativní anebo pozitivní kontrolní vzorky, kontrolní vzorky s rozpouštědlem, jestliže se použije), — doba trvání zkoušky. Výsledky: — tabulka všech cílových ukazatelů pro každé opakování, zkušební koncentrace/dávka a druh, — počet a procentuální vzcházivost ve srovnání s kontrolními vzorky, — měření biomasy (hmotnost suchých výhonků nebo čerstvých výhonků) rostlin vyjádřená jako procentuální podíl kontrolního vzorku, — výška výhonků rostlin jako procentuální podíl kontrolního vzorku, jestliže se měří, — procentuální podíl viditelně poškozených rostlin a kvalitativní a kvantitativní popis viditelného poškození (chloróza, nekróza, vadnutí, deformace listů a stonků, jakýkoli nedostatečný účinek) zkoušenou chemickou látkou ve srovnání s kontrolními rostlinami, — popis stupnice hodnocení použité k posouzení viditelného poškození, jestliže se vizuální hodnocení provádí, — u studií s jedinou dávkou je třeba uvést procentuální podíl poškození, — hodnoty ECx nebo ERx (např. EC50, ER50, EC25, ER25) a příslušné intervaly spolehlivosti. Když se provádí regresní analýza, uvede se standardní odchylka pro regresní rovnici a standardní odchylka pro jednotlivý odhadnutý parametr (např. směrnice, úsek), — hodnoty NOEC (a LOEC), jestliže byly vypočítány, — popis použitých statistických postupů a předpokladů, — grafické zobrazení těchto dat a vztah dávka-odezva zkoušeného druhu. Odchylky od postupů popsaných v této zkušební metodě a jakékoli neobvyklé skutečnosti během zkoušky. LITERATURA 1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. 2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. 3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. 4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. 5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. 6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. 7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. 8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. 9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. 10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. 11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). 12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. 13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. 14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. 15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. 16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. 18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. 19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. 20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. 21) OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. 22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. 23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. 24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. 25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. 26) Kapitola C.33 této přílohy: Zkouška toxicity pro reprodukci žížal (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Dodatek 1 Definice Účinná složka (ú.s.) (nebo účinná látka (ú.l.)) je látka určená k vyvolání specifického biologického účinku (např. hubení hmyzu, likvidace nákazy rostlin, hubení plevele na ošetřených plochách), rovněž je známá jako technická účinná složka, účinná látka. Chemická látka je látka nebo směs. Přípravky na ochranu plodin (CPP) nebo přípravky na ochranu rostlin (PPP) nebo pesticidy jsou látky se specifickou biologickou aktivitou záměrně používané k ochraně plodin před škůdci (např. plísňové choroby, hmyz a konkurenční rostliny). ECx – účinná koncentrace s x % účinkem nebo ERx – účinná dávka s x % účinkem je koncentrace nebo dávka, jejímž výsledkem je nežádoucí změna u x % ve zkoušeném cílovém ukazateli v porovnání s kontrolou (např. 25 % nebo 50 % snížení vzcházivosti osiva, hmotnosti výhonku či konečného počtu přítomných rostlin nebo nárůst viditelného poškození by představovaly EC25/ER25 nebo EC50/ER50). Vzklíčení je objevení se koleoptile nebo děložního lístku nad půdním povrchem. Přípravek je komerčně upravený výrobek obsahující účinnou látku (účinnou složku), rovněž znám jako konečný přípravek (8) nebo typický výrobek pro konečné použití (TEP). Nejnižší koncentrace s pozorovaným účinkem (LOEC) je nejnižší koncentrace zkoušené chemické látky, u níž byl účinek pozorován. Při této zkoušce vykazuje koncentrace odpovídající LOEC statisticky významný účinek (p < 0,05) během dané expoziční doby ve srovnání s kontrolou a je vyšší než hodnota NOEC. Necílové rostliny: Rostliny, které jsou mimo cílovou pěstební plochu. U přípravků na ochranu rostlin to obvykle znamená rostliny mimo plochu, na které se provádí expozice. Koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) je nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky, při které nebyl pozorován žádný účinek. Při této zkoušce nevykazuje koncentrace odpovídající NOEC žádný statisticky významný účinek (p < 0,05) během dané expoziční doby ve srovnání s kontrolou. Fytotoxicita: Škodlivé odchylky (zjištěné měřením a vizuálním hodnocením) od normálního vzhledu a růstu rostlin v odezvě na danou chemickou látku. Opakování je experimentální jednotka, která představuje kontrolní skupinu anebo exponovanou skupinu. V těchto studiích je jako opakování definován květináč. Vizuální hodnocení: Hodnocení viditelného poškození na základě pozorování postoje rostlin, jejich vitality, znetvoření, chlorózy, nekrózy a celkového vzhledu ve srovnání s kontrolní skupinou. Zkoušená chemická látka: Jakákoli látka nebo směs zkoušená touto metodou. Dodatek 2 Seznam druhů v minulosti použitých při zkoušení rostlin Čeleď Druh Obecné názvy DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota mrkev obecná Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus slunečnice roční Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa salát hlávkový Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba hořčice setá Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis brukev zelí (čínské) Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus brukev řepka (olejka) Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata brukev zelná (hlávkové zelí) Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa brukev řepák (vodnice) Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum řeřicha setá Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus ředkev setá Chenopodiaceae Beta vulgaris řepa obecná Cucurbitaceae Cucumis sativus okurka setá Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Sója luštinatá Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus fazol zlatý (mungo) Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris fazol obecný Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum hrách setý Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum- graecum pískavice řecké seno Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus štírovník růžkatý Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense jetel luční Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa vikev setá Linaceae Linum usitatissimum len setý Polygonaceae Fagopyrum esculentum pohanka obecná Solanaceae Solanum lycopersicum rajče jedlé MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa cibule kuchyňská Poaceae (Gramineae) Avena sativa oves setý Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare ječmen setý Poaceae (Gramineae) Lolium perenne jílek vytrvalý Poaceae (Gramineae) Oryza sativa rýže setá Poaceae (Gramineae) Secale cereale žito seté Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor čirok obecný Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum pšenice setá Poaceae (Gramineae) Zea mays kukuřice setá Dodatek 3 Seznam potenciálních neplodinových druhů Potenciální druhy pro zkoušení toxicity na rostlinách podle OECD. Poznámka: Následující tabulka poskytuje informace o 52 neplodinových druzích (odkazy jsou uvedeny v závorkách u každé položky). Uvedené vzcházivosti pocházejí z publikované literatury a slouží pouze jako obecné vodítko. Individuální zkušenost se může lišit v závislosti na zdroji semen a dalších faktorech. ČELEĎ Botanický název druhu (český obecný název) Délka života (9) a přirozené prostředí Hmotnost semene (mg) Fotoperioda pro klíčení nebo růst (10) Hloubka setí (mm) (11) Doba do vzklíčení (dny) (12) Speciální zpracování (13) Zkouška toxicity (14) Dodavatelé semen (15) Další odkazy (16) APIACEAE Torilis japónica (tařice skalní) А, В narušené oblasti, živé ploty, pastviny (16, 19) 1,7–1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) studená stratifikace (7, 14, 18, 19) zrání může být nezbytné (19) klíčení tlumeno tmou (1, 19) žádné speciální zpracování (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (sedmikráska chudobka) Ρ louky, orná pole, trávníky (16, 19) 0,09–0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) klíčení neovlivněno ozářeností (18, 19) žádné speciální zpracování (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (chrpa modrá) A pole, okraje silnic, otevřená stanoviště (16) 4,1–4,9 (4, 14) L = D (14) 0–3 (2, 4, 14) 14–21 (100 %) (14) žádné speciální zpracování (2, 4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (chrpa černá) Ρ pole, okraje silnic, otevřená stanoviště (16, 19) 2,4–2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) zrání může být nezbytné (18, 19) klíčení tlumeno tmou (19) žádné speciální zpracování (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (oman pravý) Ρ vlhká, narušená místa (16) 1–1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) žádné speciální zpracování (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (máchelka srstnatá, pampeliška) Ρ pole, okraje silnic, narušené oblasti (16, 19) 0,85–1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) klíčení tlumeno tmou (17, 18, 19) žádné speciální zpracování (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (třapatka srstnatá) Β, Ρ narušené (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) žádné speciální zpracování (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (zlatobýl kanadský) Ρ pastviny, otevřená stanoviště (16) 0,06–0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14–21 (11) smíchat se stelným podílem písku a nasáknout v 500 ppm GA 24 hod. (11) žádné speciální zpracování (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum (řepeň pensylvánská) A pole, otevřená stanoviště (16) 25–61 (14, 29) 0(1) 5(29) klíčení může být tlumeno tmou (1 ), nasáknout v teplé vodě 12 hod. (29) PRE & POST (31) A Xanthium spinosum (řepeň trnitá) A otevřená stanoviště (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) skarifikace (14) žádné speciální zpracování (6) PRE & POST (6) A Xanthium strumarium (řepeň italská) A pole, otevřená stanoviště (16) 67,4 (14) L = D (14) 10–20 (6, 21) žádné speciální zpracování (6, 14, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (řeřišnice luční) Ρ pole, okraje silnic, trávníky (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) klíčení tlumeno tmou (18, 19) žádné speciální zpracování (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (kohoutek luční) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) zrání může být nezbytné (18) žádné speciální zpracování (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (merlík bílý) A okraje polí, narušené oblasti (16, 19) 0,7–1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) zpracování se liší v závislosti na barvě semen (19) suché skladování v době klidu (19) klíčení tlumeno tmou (1, 18, 19) studená stratifikace (18) žádné speciální zpracování (14, 34) PRE & POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (třezalka tečkovaná) Ρ pole, orná půda, otevřená stanoviště (16, 19) 0,1–0,23 (14, 19) L= D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) klíčení tlumeno tmou (1, 18, 19) žádné speciální zpracování (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (povijnice břečťanovitá, svlačec) A okraje silnic, otevřená stanoviště, obilná pole (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10–20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) klíčení neovlivněno ozářeností (1) žádné speciální zpracování (6, 21) PRE & POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (šáchor hlíznatý) Ρ orná půda, pastviny, okraje silnic (16, 30) 0,2 (14) L= D (14) 0 (1) 10–20 (6, 10) 12 (91 %) (10) klíčení tlumeno tmou (1) žádné speciální zpracování (6, 10, 14) PRE & POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (štírovník růžkatý) Ρ zatravněné plochy, okraje silnic, otevřená stanoviště (16, 19) 1–1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) skarifikace (14, 19) klíčení neovlivněno ozářeností (18, 19) žádné speciální zpracování (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (kasie tora) A vlhké lesy (16) 23–28 (9) L = D (14) L > D (9) 10–20 (6, 9) nasáknutí semen ve vodě 24 hodin (9) skarifikace (14) životaschopnost semen se liší v závislosti na barvě (1) žádné speciální zpracování (6) POST (6, 9) A Sesbania exaltata (sesbánie bylinná) A naplavená půda (16) 11–13 (9, 14) L > D (9) 10–20 (9, 21) nasáknutí semen ve vodě 24 hodin (9) klíčení neovlivněno ozářeností (1) žádné speciální zpracování (21) PRE & POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (jetel luční) Ρ pole, okraje silnic, orná půda (16, 19) 1,4–1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) skarifikace (14, 18) může vyžadovat zrání (19) klíčení neovlivněno ozářeností (1, 19) žádné speciální zpracování (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (buřina srdečník) Ρ otevřená stanoviště (16) 0,75–1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) žádné speciální zpracování (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (máta klasnatá) Ρ vlhké plochy (16) 2,21 (4) 0 (4) žádné speciální zpracování (4) POST (4) F Nepeta cataria (šanta kočičí) Ρ narušené oblasti (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) žádné speciální zpracování (2, 4, 14) POST (2, 4) F Prunella vulgaris (černohlávek obecný) Ρ orná pole, zatravněné plochy, narušené oblasti (16, 19) 0,58–1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) klíčení tlumeno tmou (18, 19) intenzivnější klíčení s většími semeny (1 ), žádné speciální zpracování (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (bukvice lékařská, čistec) Ρ louky, okraje polí (19) 14–18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) žádné speciální zpracování (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (mračňák Theophrastův) A pole, otevřená stanoviště (16) 8,8 (14) L = D (14) 10–20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) skarifikace (14) žádné speciální zpracování (5, 10, 21) PRE & POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (vlákeň ostnitá) A pole, okraje silnic (16) 3,8 (14) L = D (14) 10–20 (6, 21) skarifikace (14) klíčení neovlivněno ozářeností (1) žádné speciální zpracování (6, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (mák vlčí) A pole, orná půda, narušené oblasti (16, 19) 0,1–0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) studená stratifikace a skarifikace (1, 19, 32) žádné speciální zpracování (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (psineček obecný) trávníky, pastviny (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) klíčení tlumeno tmou (1, 17-19) žádné speciální zpracování (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (psárka polní) A pole, otevřená stanoviště (16) 0,9–1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) skarifikace (14) ošetřit 101 mg/l KNO3 (14) teplá stratifikace (1) klíčení tlumeno tmou (1) žádné speciální zpracování (34) PRE & POST (28, 34) A 32 Avena fatua (oves hluchý) A obdělávané plochy, otevřená stanoviště (16) 7–37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10–20 (6, 10) 3 (70 %) (18) skarifikace (7, 32) tma potlačuje klíčení (1) studená stratifikace (1, 18) žádné speciální zpracování (6, 10, 14) PRE & POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (sveřep střešní) A pole, okraje silnic, orná půda (16) 0,45–2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) období zrání (1, 7, 32) klíčení tlumeno světlem (1), žádné speciální zpracování (14) PRE & POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (poháňka hřebenitá) P pole, okraje silnic, otevřená stanoviště (16, 19) 0,5–0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) klíčení neovlivněno ozářeností (19) žádné speciální zpracování (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (rosička krvavá) A pole, trávník, otevřená stanoviště (16) 0,52–0,6 (14, 30) L = D (14) 10–20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) skarifikace, studená stratifikace, a zrání (1, 7, 14, 32) ošetřit 101 mg/l KNO3 (14) klíčení tlumeno tmou (1), žádné speciální zpracování (21) PRE & POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (ježatka kuří noha) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10–20 (7, 21) skarifikace (7, 32) klíčení neovlivněno ozářeností (1), žádné speciální zpracování (3, 14, 21) PRE & POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (pýrovník kanadský) P pobřeží, narušené oblasti (16) 4–5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14–28 (11) žádné speciální zpracování (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (kostřava luční) P pole, vlhké plochy (16, 19) 1,53–2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) žádné speciální zpracování (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (ječmen malý) A pastviny, okraje silnic, otevřená stanoviště (16) 3,28 (14) teplá stratifikace (1) klíčení neovlivněno ozářeností (1) PRE (31) 7 Phieum pratense (bojínek luční) P pastviny, orná pole, narušená místa (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0–10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) klíčení tlumeno tmou (19) klíčení neovlivněno ozářeností (17) žádné speciální zpracování (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (opletka svlačcovitá) A otevřená stanoviště, okraje silnic (16) 5–8 (4, 14, 29) L = D (20) 0–2 (4, 29) studená stratifikace 4–8 týdnů (1, 2, 4, 20, 29) klíčení neovlivněno ozářeností (1) PRE & POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (rdesno blešník) A vlhká půda (16) 1,8–2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) klíčení neovlivněno ozářeností (1) klíčení tlumeno tmou (18) studená stratifikace (1) žádné speciální zpracování (5) PRE & POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (rdesno pensylvánské) A pole, otevřená stanoviště (16) 3,6–7 (14, 29) 2 (29) studená stratifikace 4 týdny při 0–5 °C (1, 29) klíčení tlumeno tmou (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (rdesno červivec) A narušené oblasti, orná půda (16, 19) 2,1–2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) skarifikace, studená stratifikace, GA zpracování (14) studená stratifikace, zrání (17-19) klíčení tlumeno tmou (19) žádné speciální zpracování (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (šťovík kadeřavý) P orná pole, okraje silnic, otevřené plochy (16, 19) 1,3–1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) klíčení tlumeno tmou (18, 19) zrání může být nezbytné (18) žádné speciální zpracování (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (drchnička rolní) A orná pole, otevřené plochy, narušená místa (16, 19) 0,4–0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) studená stratifikace, GA zpracování (1,14, 18, 19, 32) klíčení vyžaduje světlo (1), žádné speciální zpracování (2, 4) POST (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (pryskyřičník prudký) Ρ orná pole, okraje silnic, otevřené plochy (16, 19) 1,5–2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41–56 (19, 29) žádné speciální zpracování (5, 14, 22, 24 -26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (kuklík městský) Ρ živý plot, vlhké plochy (16, 19) 0,8–1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) klíčení tlumeno tmou (18, 19) teplá stratifikace (1) žádné speciální zpracování (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (svízel přítula) A orná pole, vlhké plochy, narušené oblasti (16, 19) 7–9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) studená stratifikace (1, 18, 19) klíčení neovlivněno ozářeností (18, 19) klíčení tlumeno světlem (1) žádné speciální zpracování (6, 14) PRE & POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (svízel povázka) Ρ ohrady s živým plotem, otevřené plochy (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) žádné speciální zpracování (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (náprstník červený) Β, Ρ živý plot, otevřené plochy (16, 19) 0,1–0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) klíčení tlumeno tmou (1, 17-19) žádné speciální zpracování (4, 22-26) POST (4, 22–26) D, G, F Veronica persica (rozrazil perský) A orná pole, otevřené plochy, narušené oblasti(16, 19) 0,5–0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) klíčení tlumeno tmou (18, 19) studená stratifikace (18) žádné speciální zpracování (14) PRE & POST (28) A 32 Uvádění dodavatelé semen ID dodavatele Informace o dodavateli A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 – 4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 – 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 – 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 – 7333 www.thompson-morgan.com LITERATURA 1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto. 2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. 3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. 4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. 5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. 6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. pp 197 – 208. 7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. 8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge. 9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. 10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. pp. 151 – 156. 11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Personal communication. (www.ernstseed.com) 12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. 13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. 14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid). 15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. 16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY. 17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. 18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. 19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London. 20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. 21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. 22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. 23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. 24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. 25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. 26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. 27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. pp. 1021-1028. 28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. 29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) 30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA. 31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. 32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. 33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Personal communication. 34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Dodatek 4 Příklady vhodných podmínek pro růst určitých druhů plodin Následující podmínky byly shledány vhodnými pro 10 druhů plodin a mohou se použít jako vodítko rovněž při zkouškách v růstových komorách s určitými dalšími druhy: Koncentrace oxidu uhličitého: 350 ± 50 ppm Relativní vlhkost: 70 ± 5 % během období světa a 90 ± 5 % během období tmy Teplota: 25 ± 3 °C během dne, 20 ± 3 °C během noci Fotoperioda: 16 hodin světla/8 hodin tma, předpokládá se průměrná vlnová délka 400 až 700 nm Světlo: svítivost 350 ± 50 μE/m2/s měřená na vrchu klenby. Plodinové druhy: — rajče jedlé (Solanum lycopersicum), — okurka setá (Cucumis sativus), — salát hlávkový (Lactuca sativa), — sója luštinatá (Glycine max), — hlávkové zelí (Brassica oleracea var. capitata), — mrkev obecná (Daucus carota), — oves setý (Avena sativa), — jílek vytrvalý (Lolium perenne), — kukuřice setá (Zea mays), — cibule kuchyňská (Allium cepa). C.32. ZKOUŠKA TOXICITY PRO REPRODUKCI ROUPICOVITÝCH ÚVOD 1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 220 (2004). Je určena pro použití v hodnocení účinků chemických látek na reprodukční schopnost roupice bělavé, Enchytraeus albidus Henle 1873, v půdě. V zásadě vychází z metody vyvinuté v německém spolkovém úřadu pro ochranu životního prostředí (Umweltbundesamt) (1), která byla podrobena okružnímu testu (2). Byly rovněž brány v úvahu další metody zkoušení toxicity chemických látek na roupicovité a žížaly (3, 4, 5, 6, 7, 8). VÝCHOZÍ ÚVAHY 2. V půdě žijící kroužkovci rodu roupice (Enchytraeus) jsou ekologicky vhodným druhem pro ekotoxikologické zkoušky. I když se roupicovití často vyskytují v půdách, kde žijí žížaly, rovněž je pravda, že se často nalézají v hojném množství i tam, kde žížaly nejsou. Roupicovití se dají použít v laboratorních zkouškách, stejně jako v poloterénních a terénních studiích. Z praktického hlediska je řada druhů Enchytraeus vhodných vzhledem k snadné manipulaci a snadnému chovu a jejich generační perioda je významně kratší než u žížal. Doba trvání zkoušky toxicity pro reprodukci s roupicovitými je proto pouze 4–6 týdnů, zatímco u žížal hnojních (Eisenia fetida) je to 8 týdnů. 3. Základní informace o ekologii a ekotoxikologii roupicovitých v suchozemském životním prostředí lze nalézt v literatuře (9, 10, 11, 12). PODSTATA ZKOUŠKY 4. Dospělí roupicovití červi jsou vystaveni celé řadě koncentrací zkoušené chemické látky zamíchané do umělé půdy. Zkoušku je možné rozdělit na dva kroky: a) v případě, že nejsou k dispozici dostatečné informace, orientační zkoušku pro nalezení rozmezí dávek, ve které je hlavním cílovým ukazatelem mortalita hodnocená po dvou týdnech expozice, a b) hlavní zkoušku toxicity pro reprodukci, ve které se hodnotí celkový počet mláďat zplozených rodičovskými jedinci a přežití rodičů. Doba trvání hlavní zkoušky je šest týdnů. Po prvních třech týdnech se dospělí jedinci vyjmou a zaznamenají se morfologické změny. Po dalších třech týdnech se zjistí počet potomků vylíhnutých ze zámotků vytvořených dospělými jedinci. Reprodukční schopnost živočichů vystavených zkoušené chemické látce se srovná s aktivitou kontrolní skupiny pro stanovení i) koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC), nebo ii) ECx (např. EC10, EC50) za použití regresního modelu pro odhad koncentrace, která způsobí x % snížení reprodukční schopnosti. Rozsah zkušebních koncentrací by měl zahrnovat ECx (např. EC10, EC50) tak, aby se pak hodnota ECx získala interpolací spíše než extrapolací. INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE 5. U zkoušené chemické látky by optimálně měly být známy rozpustnost ve vodě, log Kow, rozdělovací koeficient půda/voda (např. kapitola C.18 nebo C.19 této přílohy) a tlak par. Žádoucí jsou další informace o osudu zkoušené chemické látky v půdě, jako je rychlost fotolýzy a hydrolýzy. 6. Tato zkušební metoda se dá použít jak pro chemické látky ve vodě rozpustné, tak i nerozpustné. Režim aplikace zkoušené chemické látky se však bude příslušně lišit. Zkušební metoda se nedá aplikovat na těkavé chemické látky, tj. látky, jejichž Henryho konstanta nebo rozdělovací koeficient vzduch/voda je větší než jedna, nebo chemické látky, jejichž tlak par je vyšší než 0,0133 Pa při 25 °C. PLATNOST ZKOUŠKY 7. Má-li být zkouška platná, musí být u kontrolních skupin splněna tato kritéria reprodukční schopnosti: — na konci orientační zkoušky a po prvních třech týdnech zkoušky toxicity pro reprodukci by mortalita dospělých jedinců neměla překročit 20 %, — za předpokladu, že v uspořádání zkoušky bylo použito 10 dospělých jedinců na nádobu, mělo by být na konci zkoušky zplozeno průměrně alespoň 25 mláďat na nádobu, — variační koeficient okolo střední hodnoty počtu mláďat by na konci zkoušky toxicity pro reprodukci neměl být vyšší než 50 %. Tam, kde zkouška nesplní uvedená kritéria platnosti, musí být ukončena. Případné pokračování zkoušky musí být odůvodněno. Odůvodnění musí být uvedeno v závěrečné zprávě. REFERENČNÍ CHEMICKÁ LÁTKA 8. Referenční chemická látka by se měla zkoušet buď v pravidelných intervalech, nebo by případně měla být zahrnuta v každé zkoušce, aby se ověřilo, že reakce zkušebních organismů se během času významně nezměnila. Vhodnou referenční látkou je karbendazim, u kterého bylo zjištěno, že ovlivňuje přežití a reprodukci roupicovitých (13, 14), nebo je rovněž možné použít jiné chemické látky, u nichž jsou dobře známé údaje týkající se toxicity. Přípravek karbendazim známý pod obchodním názvem Derosal™, který dodává firma AgrEvo (Frankfurt, Německo) a který obsahuje 360 g/l (32,18 %) účinné složky, byl použit v okružním testu (2). Hodnota EC50 pro reprodukci stanovená okružním testem byla v rozsahu 1,2 ± 0,8 mg účinné složky na kg sušiny (2). Jestliže se do zkušební série zahrne pozitivní kontrolní látka, použije se jedna koncentrace a počet opakování by měl být stejný jako u kontrolních vzorků. V případě karbendazimu se doporučuje zkoušení 1,2 mg ú.s./kg hmotnosti sušiny (zkoušeno jako kapalný přípravek). POPIS ZKOUŠKY Vybavení 9. Zkušební nádoby by měly být vyrobeny ze skla nebo jiného chemicky inertního materiálu. Vhodné jsou skleněné nádoby (např. o objemu 0,20–0,25 litru; průměr: ≈ 6 cm). Nádoby by měly mít průhledná víka (např. skleněná nebo polyethylenová), která jsou navržena tak, aby snižovala odpařování vody a současně umožňovala výměnu plynů mezi půdou a atmosférou. Víka by měla být průhledná, aby umožňovala průchod světla. 10. Je požadováno běžné laboratorní vybavení, zejména následující: — sušárna, — stereomikroskop, — pH-metr a fotometr, — vhodné přesné váhy, — adekvátní zařízení pro regulaci teploty, — adekvátní zařízení pro regulaci vlhkosti (není podstatné, jestliže exponované nádoby mají víka), — inkubátor nebo malá místnost s klimatizací, — pinzeta, háčky nebo smyčky, — foto miska. Příprava umělé půdy 11. V této zkoušce se používá umělá půda (5, 7) s následujícím složením (vztaženo na hmotnost sušiny, sušeno do konstantní hmotnosti při 105 °C): — 10 % sfagnové rašeliny sušené na vzduchu a jemně mleté (přijatelná je velikost částic 2 ± 1 mm); před použitím ve zkoušce se doporučuje prověřit, zda je půda připravená s čerstvou várkou rašeliny vhodná pro kultivaci roupic, — 20 % kaolinitického jílu (obsah kaolinitu pokud možno vyšší než 30 %); — přibližně 0,3 až 1,0 % uhličitanu vápenatého (CaCO3, práškový, analyticky čistý) pro dosažení pH 6,0 ± 0,5; množství uhličitanu vápenatého, které je třeba doplnit, může v podstatě záviset na kvalitě/charakteru rašeliny; — přibližně 70 % na vzduchu vysušeného křemenného písku (v závislosti na potřebném množství CaCO3), převážně jemný písek s více než 50 % částic o velikosti 50 a 200 mikrometrů. Před použitím půdy v hlavní zkoušce se doporučuje prokázat vhodnost umělé půdy pro kultivaci roupic a pro splnění kritérií platnosti zkoušky. Zejména se doporučuje provést takové prověření, kterým se zjistí, zda se účinnost zkoušky nesníží, jestliže se obsah organického uhlíku v umělé půdě sníží, např. snížením obsahu rašeliny na 4–5 % a odpovídajícím zvýšením obsahu písku. Takovým snížením obsahu organického uhlíku se může snížit schopnost adsorpce zkoušené chemické látky (organický uhlík) v půdě a dostupnost zkoušené chemické látky pro živočichy se může zvýšit. Bylo prokázáno, že Enchytraeus albidus může splnit kritéria platnosti pro reprodukci při testování v polních půdách s nižším obsahem organického uhlíku, např. 2,7 % (15); dle zkušeností, i když omezených, toho lze dosáhnout i v umělé půdě s 5 % obsahem rašeliny. Poznámka: Při použití přírodní půdy v dodatečné zkoušce (např. vyššího stupně) je třeba rovněž prokázat vhodnost půdy a splnění kritérií platnosti zkoušky. 12. Suché složky půdy se důkladně promísí (např. ve velké laboratorní míchačce). To by se mělo provést alespoň týden před zahájením zkoušky. Promíchaná půda by se měla skladovat dva dny, aby se dosáhlo rovnováhy a stabilizovala se kyselost. Pro stanovení pH se použije směs půdy a roztoku 1 M chloridu draselného (KCl) nebo 0,01 M chloridu vápenatého (CaCl2) v poměru 1:5 (viz (16) a dodatek 3). Jestliže je kyselost půdy vyšší než požadovaný rozsah (viz odstavec 11), nastaví se pH přidáním vhodného množství CaCO3. Jestliže je půda příliš alkalická, nastaví se pH přidáním více směsi uvedené v odstavci 11, ale s vyloučením CaCO3. 13. Maximální retenční vodní kapacita (RVKmax, též WHCmax) umělé půdy se stanoví podle postupů popsaných v dodatku 2. Jeden až dva dny před začátkem zkoušky se suchá umělá půda předběžně zvlhčí přidáním dostatečného množství deionizované vody, aby se dosáhlo přibližně poloviny konečného obsahu vody, což představuje 40 až 60 % maximální retenční vodní kapacity. Na začátku zkoušky se předem zvlhčená půda rozdělí na díly odpovídající počtu zkušebních koncentrací (a referenční chemické látce, je-li použita) a kontrolních vzorků použitých při zkoušce. Obsah vlhkosti se nastaví na 40–60 % maximální RVK přidáním roztoku zkoušené chemické látky anebo přidáním destilované nebo deionizované vody (viz odstavce 19–21). Obsah vlhkosti se stanoví na začátku a na konci zkoušky (vysušením na konstantní hmotnost při 105 °C) a měl by spadat do optimálního rozsahu pro přežití živočichů. Hrubý odhad obsahu vlhkosti v půdě lze učinit tak, že mírně stisknete půdu v ruce; jestliže je obsah vlhkosti správný, měly by se mezi prsty objevit malé kapky vody. Výběr a příprava zkušebních živočichů 14. Doporučený zkušební druh je Enchytraeus albidus Henle 1837 (roupice bělavá) z čeledi Enchytraeidae (třída Oligochaeta, kmen Annelida). E. albidus je jedním z největších druhů roupicovitých, u nějž byli zaznamenáni jedinci o délce až 35 mm (17, 18). E. albidus je celosvětově rozšířen a nalézá se na mořských, sladkovodních i suchozemských stanovištích, zejména v tlející organické hmotě (chaluhy, kompost) a vzácně na lukách (9). Jeho široká ekologická tolerance a některé morfologické odchylky mohou ukazovat na existenci rozdílných poddruhů. 15. E. albidus je komerčně dostupný jako krmivo pro ryby. Mělo by se ověřit, zda není kultura kontaminována jinými, obvykle menšími druhy (1, 19). Pokud se znečištění objeví, omyjí se všechny roupice vodou v Petriho misce. Velcí dospělí jedinci E. albidus se pak vyberou (použitím stereomikroskopu) pro začátek nové kultury, ostatní jedinci se vyřadí. E. albidus lze snadno chovat v široké škále organických materiálů (viz dodatek 4). Životní cyklus E. albidus je krátký, jelikož dospělosti dosáhne mezi 33 dny (při 18 °C) a 74 dny (při 12 °C) (1). Pro zkoušku se použijí pouze kultury, které byly uchovávány bez problémů v laboratoři po dobu alespoň 5 týdnů (jednu generaci). 16. Ostatní druhy rodu Enchytraeus jsou rovněž vhodné, např. E. buchholzi Vejdovský 1879 nebo E. crypticus Westheide a Graefe 1992 (viz dodatek 5). Pokud se použijí jiné druhy rodu Enchytraeus, musí být jasně identifikovány a musí být logicky zdůvodněný výběr druhu. 17. Při zkouškách se používají dospělí jedinci. Měli by mít vajíčka (bílé skvrny) v oblasti clitella (střední kroužkové části) a mít přibližně stejnou velikost (přibližně 1 cm na délku). Synchronizace množících se kultur není nezbytná. 18. Jestliže roupicovití nejsou chováni ve stejném půdním typu a za podmínek (včetně výživy) použitých při konečné zkoušce, musí se aklimatizovat po dobu nejméně 24 hodin až tří dnů. Na počátku by se měl aklimatizovat větší počet dospělých jedinců, než bude zapotřebí pro provádění zkoušky, aby vznikla rezerva pro vyřazení poškozených nebo jinak nevyhovujících jedinců. Na konci doby aklimatizace se jako vhodní pro zkoušku vyberou pouze jedinci mající vajíčka a nevykazující žádné anomálie v chování (např. pokus o únik z půdy). Roupice se opatrně vyjmou použitím klenotnických pinzet, háčků nebo smyček a umístí do Petriho misek obsahujících malé množství čerstvé vody. Pro tento účel se přednostně použije rekonstituovaná sladká voda podle návrhu v kapitole C.20 této přílohy (Zkouška toxicity pro reprodukci druhu Daphnia magna), neboť voda deionizovaná, demineralizovaná nebo voda z vodovodu by pro roupice mohla být nebezpečná. Živočichové se prohlédnou pod stereomikroskopem a všichni, kteří neobsahují vajíčka, jsou vyřazeni. Je třeba dbát na to, aby byli vyjmuti a odstraněni všichni roztoči nebo chvostoskoci, kteří mohli infikovat kultury. Zdraví jedinci nepoužití pro zkoušku se vrátí do zásobní kultury. Příprava zkušebních koncentrací Zkoušená chemická látka rozpustná ve vodě 19. Připraví se roztok zkoušené chemické látky v deionizované vodě v množství dostatečném pro všechna opakování jedné zkušební koncentrace. Doporučuje se použít vhodné množství vody, aby byl dosažen požadovaný obsah vlhkosti, tj. 40 až 60 % maximální RVKmax (viz odstavec 13). Před vložením do zkušební nádoby se každý roztok zkoušené chemické látky důkladně promíchá s jednou várkou předem navlhčené půdy. Zkoušená chemická látka nerozpustná ve vodě 20. V případě chemických látek nerozpustných ve vodě, ale rozpustných v organických rozpouštědlech, se může zkoušená chemická látka rozpustit v co nejmenším objemu vhodného nosiče (např. acetonu). Měla by se použít pouze těkavá rozpouštědla. Nosič se nastříkne nebo promíchá s malým množstvím, například 2,5 g, jemného křemenného písku. Nosič se odstraní odpařením v digestoři po dobu alespoň jedné hodiny. Tato směs křemenného písku a zkoušené chemické látky se přidá do navlhčené půdy a důkladně se promíchá; předem se přidá příslušné množství deionizované vody, aby bylo dosaženo požadované vlhkosti. Konečná směs se přemístí do zkušebních nádob. 21. V případě chemických látek obtížně rozpustných ve vodě i v organických rozpouštědlech se ekvivalent 2,5 g jemně mletého křemenného písku na zkušební nádobu promíchá s příslušným množstvím zkoušené chemické látky, aby se získala požadovaná zkušební koncentrace. Tato směs křemenného písku a zkoušené chemické látky se přidá do navlhčené půdy a důkladně se promíchá; předem se přidá příslušné množství deionizované vody, aby se dosáhlo požadované vlhkosti. Konečná směs se rozdělí mezi zkušební nádoby. Tento postup se opakuje pro každou zkušební koncentraci a připraví se rovněž příslušné kontrolní vzorky. 22. Chemické látky by se obvykle neměly zkoušet při koncentracích vyšších než 1 000 mg/kg suché hmotnosti půdy. Zkoušení při vyšších koncentracích však může být požadováno podle cílů konkrétní zkoušky. ÚČINNOST ZKOUŠEK Zkoušené a kontrolní skupiny 23. Pro každou zkušební koncentraci se do zkušební nádoby umístí příslušné množství zkušební půdy odpovídající 20 g hmotnosti sušiny (viz odstavce 19–21). Připraví se rovněž kontrolní vzorky bez zkoušené chemické látky. Do každé nádoby se přidá krmivo podle postupů popsaných v odstavci 29. Do každé zkušební nádoby se náhodně rozmístí deset roupic. Roupice se opatrně přemístí do každé ze zkušebních nádob a položí na povrch půdy použitím například klenotnických pinzet, háčků nebo smyček. Počet opakování pro zkušební koncentrace a pro kontrolní vzorky závisí na použitém uspořádání zkoušky (viz odstavec 34). Zkušební nádoby se umístí náhodně do zkušebního inkubátoru a tyto polohy se jednou za týden náhodně obmění. 24. Jestliže se pro aplikaci zkoušené chemické látky použije nosič, je třeba kromě zkoušené série provést zkoušku s jednou kontrolní sérií obsahující křemenný písek postříknutý nebo promíchaný s rozpouštědlem. Koncentrace rozpouštědla nebo dispergátoru by měla být stejná jako v případě zkušebních nádob obsahujících zkoušenou chemickou látku. V případě chemické látky vyžadující administraci ve shodě s postupy popsanými v odstavci 21 by se měla provést zkouška s kontrolní sérií obsahující další křemenný písek (2,5 g na nádobu). Zkušební podmínky 25. Zkušební teplota je 20 ± 2 °C. Aby se roupicím zabránilo uniknout z půdy, provádí se zkouška v řízených cyklech světlo-tma (výhodně 16 hodin světla a 8 hodin tmy) s intenzitou osvětlení 400 až 800 luxů v místě zkušebních nádob. 26. Při prověřování vlhkosti půdy se nádoby váží na začátku zkoušky a pak jednou týdně. Ztráta hmotnosti se doplní přidáním příslušného množství deionizované vody. Je třeba poznamenat, že ztrátu vody je možné snížit tak, že se ve zkušebním inkubátoru udržuje vysoká vlhkost vzduchu (> 80 %). 27. Obsah vlhkosti a pH se měří na začátku a konci jak orientační zkoušky, tak hlavní zkoušky. Měření se provádí v kontrolních a exponovaných (všechny koncentrace) vzorcích půdy připravených a udržovaných stejným způsobem jako zkušební kultury, ale neobsahujících roupice. Krmivo se přidává pouze do těchto vzorků půdy na začátku zkoušky, aby byla usnadněna mikrobiální aktivita. Množství přidaného krmiva musí být stejné, jako se přidává do zkušebních kultur. Není nezbytné do těchto nádob během zkoušky přidávat další krmivo. Krmení 28. Je možné použít krmivo schopné uchovat populaci roupicovitých. Jako vhodný krmný materiál se ukázaly ovesné vločky, přednostně před použitím ošetřené v autoklávu, aby se předešlo mikrobiální kontaminaci (zahřátí je rovněž vhodné). 29. Krmivo se nejdříve podává promícháním 50 mg mletých vloček s půdou v každé nádobě před vložením roupic. Pak se krmivo dodává týdně až do 21. dne. Krmení se neprovádí 28. den neboť dospělí jedinci byli v této fázi vyjmuti a mladé roupice potřebují po tomto dni relativně málo dalšího krmiva. Krmení během zkoušky spočívá v 25 mg mletých ovesných vloček na nádobu umístěných opatrně na povrch půdy, aby se předešlo poranění živočichů. Aby se potlačil růst plísní, měly by se ovesné vločky zapracovat do půdy pokrytím malým množstvím půdy. Jestliže krmivo zůstane nesnědené, dávka se sníží. Uspořádání orientační zkoušky 30. Je-li to nezbytné, provede se orientační zkouška, například s pěti koncentracemi zkoušené chemické látky 0,1; 1,0; 10; 100 a 1 000 mg/kg (suchá hmotnost půdy). Dostatečné je jedno opakování pro každou koncentraci a kontrolu. 31. Doba trvání orientační zkoušky je dva týdny. Na konci zkoušky se vyhodnotí mortalita roupic. Živočich je zaznamenán jako mrtvý, jestliže nijak nereaguje na mechanické stimuly na ventrálním konci. Pro rozhodování o rozsahu koncentrací použitých v hlavní zkoušce mohou být užitečné i další informace o mortalitě. Proto je třeba zaznamenat změny v chování dospělých jedinců (např. neschopnost zavrtat se do půdy; ležení bez pohybu proti skleněné stěně zkušební nádoby) a v morfologii (např. přítomnost otevřených ran) spolu s přítomností jakýchkoli mláďat. Mláďata je možné identifikovat použitím barvící metody popsané v dodatku 6. 32. Hodnotu LC50 je možné přibližně stanovit výpočtem geometrického průměru z dat mortality. Při určování rozsahu koncentrací pro hlavní zkoušku se předpokládá, že účinky na reprodukci jsou nižší než LC50 s faktorem až 10. Jedná se však o empirický vztah a v každém specifickém případě může být tato hodnota jiná. Další pozorování prováděná během orientační zkoušky, jako je výskyt mláďat, mohou pomoci v přesnějším určení rozsahu koncentrací zkoušené chemické látky, který má být použit v hlavní zkoušce. 33. Pro přesné stanovení LC50 se doporučuje provádět zkoušku s použitím alespoň čtyř opakování pro každou koncentraci zkoušené chemické látky a adekvátní počet koncentrací, aby bylo dosaženo alespoň čtyř statisticky významně rozdílných středních hodnot odezvy při těchto koncentracích. Podobný počet koncentrací a opakování se použije pro kontrolní vzorky, když se používají. Uspořádání hlavní zkoušky toxicity pro reprodukci 34. Jsou navržena tři uspořádání na základě doporučení plynoucích z okružního testu (2) — Při stanovení NOEC by se mělo zkoušet alespoň pět koncentrací tvořících geometrickou posloupnost. Doporučují se čtyři opakování pro každou zkoušenou koncentraci plus osm kontrolních vzorků. Koncentrace by měly být rozloženy tak, že interval mezi nimi nepřekročí faktor 1,8. — Při stanovení ECx (např. EC10, EC50) je třeba zkoušet alespoň pět koncentrací a rozsah koncentrací by měl zahrnovat ECx, aby bylo možno hodnotu ECx interpolovat, a nebylo nutno extrapolovat. Doporučuje se použít alespoň čtyři opakování pro každou zkušební koncentraci a čtyři kontrolní opakování. Faktor pro interval se může měnit, tj. faktor může být nižší nebo roven 1,8 v očekávaném rozsahu účinku a větší než 1,8 při vyšších nebo nižších koncentracích. — Kombinovaný přístup umožňuje stanovení jak NOEC, tak ECx. Použije se osm koncentrací testované chemické látky v geometrické posloupnosti. Doporučena jsou čtyři opakování pro každou koncentraci plus osm kontrol. Koncentrace by měly být rozloženy tak, že faktor pro interval dávek nepřekračuje 1,8. 35. Na zkušební nádobu se použije deset dospělých jedinců (viz odstavec 23). Krmivo se přidá do zkušebních nádob na začátku zkoušky a pak jednou za týden (viz odstavec 29) až do 21. dne (včetně). 21. dne se vzorky půdy opatrně ručně prozkoumají; pozorují se a spočítají žijící dospělí jedinci; zaznamenají se změny v chování (např. neschopnost zavrtat se do půdy; ležení bez pohybu u skleněné stěny zkušební nádoby) a v morfologii (např. otevřené rány). Všichni dospělí jedinci se pak vyjmou ze zkušebních nádob a ze zkušební půdy. Zkušební půdy obsahující jakékoli zplozené zámotky se inkubují po další tři týdny za stejných zkušebních podmínek s tou výjimkou, že krmení se provádí pouze v 35. den (tj. 25 mg mletých ovesných vloček na nádobu). 36. Po šesti týdnech se spočítají nově vylíhlí jedinci. Doporučuje se metoda využívající barvení bengálskou červení (viz dodatek 6), ačkoli se jako vhodné ukázaly i jiné techniky používající mokrou (ale ne horkou) extrakci a flotaci (viz dodatek 6) (4, 10, 11, 20). Barvení bengálskou červení se doporučuje, protože mokrá extrakce z půdního substrátu může být brzděna turbiditou způsobenou suspendovanými jílovými částicemi. Limitní zkouška 37. Jestliže při nejvyšší koncentraci v orientační zkoušce (tj. 1 000 mg/kg) nejsou pozorovány žádné účinky, může se zkouška toxicity pro reprodukci provést jako limitní zkouška použitím koncentrace 1 000 mg/kg, aby se prokázalo, že hodnota NOEC pro reprodukci je vyšší než tato hodnota. Souhrn a harmonogram zkoušky 38. Jednotlivé kroky zkoušky je možné shrnout následovně: Čas Orientační zkouška Hlavní zkouška Den – 7 nebo dříve — Připraví se umělá půda (smísením suchých složek) — Připraví se umělá půda (smísením suchých složek) Den – 5 — Zjistí se pH umělé půdy — Změří se RVKmax půdy — Zjistí se pH umělé půdy — Změří se RVKmax půdy Den – 5 až – 3 — Vytřídí se roupice pro aklimatizaci — Vytřídí se roupice pro aklimatizaci Den – 3 až 0 — Roupice se aklimatizují alespoň 24 hodin — Roupice se aklimatizují alespoň 24 hodin Den – 1 — Umělá půda se zvlhčí a rozdělí do várek — Umělá půda se zvlhčí a rozdělí do várek Den 0 — Připraví se zásobní roztoky — Aplikuje se zkoušená chemická látka — Odváží se zkušební substrát do zkušebních nádob — Zamíchá se krmivo — Přidají se roupice — Změří se pH a obsah vlhkosti půdy — Připraví se zásobní roztoky — Aplikuje se zkoušená chemická látka — Odváží se zkušební substrát do zkušebních nádob — Zamíchá se krmivo — Přidají se roupice — Změří se pH a obsah vlhkosti půdy Den 7 — Zjistí se obsah vlhkosti půdy — Zjistí se obsah vlhkosti půdy — Krmivo Den 14 — Stanoví se mortalita dospělých jedinců — Odhadne se počet mláďat — Změří se pH a obsah vlhkosti půdy — Zjistí se obsah vlhkosti půdy — Krmivo Den 21 — Pozoruje se chování dospělých jedinců — Vyjmou se dospělí jedinci — Stanoví se mortalita dospělých jedinců — Zjistí se obsah vlhkosti půdy — Krmivo Den 28 — Zjistí se obsah vlhkosti půdy — Žádné krmení Den 35 — Zjistí se obsah vlhkosti půdy — Krmivo Den 42 — Spočítají se mladí jedinci — Změří se pH a obsah vlhkosti půdy ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV Zpracování výsledků 39. Ačkoli je přehled statistických metod uveden v dodatku 7, neexistují u této zkušební metody žádné závazné pokyny pro statistickou analýzu výsledků zkoušky. 40. Při orientační zkoušce je hlavním cílovým ukazatelem mortalita. Změny v chování (např. neschopnost zavrtat se do půdy; ležení bez pohybu proti skleněné stěně zkušební nádoby) a v morfologii (např. přítomnost otevřených ran) dospělých jedinců by však rovněž měly být zaznamenány spolu s přítomností jakýchkoli mláďat. Pro stanovení LC50 se obvykle užívá probitová analýza (21) nebo logistická regrese. Avšak v případech, kdy tato metoda analýzy není vhodná (např. jsou-li k dispozici méně než tři koncentrace s usmrcením pouze části zkušební skupiny), je možné použít alternativní metody. Mezi takové metody můžeme počítat klouzavé průměry (22), upravenou Spearman-Karberovu metodu (23) nebo jednoduchou interpolaci (např. geometrický průměr LC0 a LC100 vypočítaný jako druhá odmocnina ze součinu LC0 a LC100). 41. V hlavní zkoušce je cílovým ukazatelem plodnost (tj. počet zplozených mláďat). Avšak stejně jako v orientační zkoušce musí být i v závěrečné zprávě uvedeny všechny ostatní škodlivé účinky. Statistická analýza vyžaduje výpočet aritmetického průměru a směrodatné odchylky účinku na reprodukci u exponovaných a kontrolních souborů. 42. Jestliže byla provedena analýza rozptylu, mohou se směrodatná odchylka s a stupně volnosti df nahradit odhadnutým sloučeným rozptylem získaným z ANOVA a jeho stupni volnosti – za předpokladu, že rozptyl nezávisí na koncentraci. V tomto případě se použijí hodnoty jednotlivých rozptylů kontrolních a exponovaných souborů. Tyto hodnoty se obvykle vypočítají pomocí běžně dostupného statistického softwaru použitím výsledků pro jednu nádobu jako opakování. Jestliže se sloučení dat pro negativní a kontrolní vzorky s rozpouštědly ukáže jako rozumnější než statistické testování vůči jedné z variant, pak je třeba provést test, který prokáže, zda je mezi nimi významný rozdíl (vhodné statistické metody jsou uvedeny v odstavci 45 a dodatku 7). 43. Další statistické testy a závěry závisejí na tom, zda mají opakované hodnoty normální rozdělení a zda je jejich rozptyl homogenní. Odhad NOEC 44. Přednost by se měla dávat aplikaci výkonných testů. Měly by se použít informace, např. z předchozích zkušeností s okružním testem nebo jiné údaje z minulosti, o tom, zda data mají přibližně normální distribuci. Ještě důležitější je homogenita rozptylu (homoskedasticita). Zkušenost ukazuje, že rozptyl se často zvyšuje s rostoucí střední hodnotou. V těchto případech je možno homoskedasticity dosáhnout transformací dat. Avšak taková transformace by měla být založena spíše na zkušenostech s předchozími daty než na datech právě zkoumaných. S homogenními daty se provádějí vícenásobné t-testy, jako je Williamsův test (α = 0,05, jednostranný) (24, 25) nebo v určitých případech Dunnettův test (26, 27). Nutno poznamenat, že v případě nerovnoměrného opakování musí být tabulkové t-hodnoty korigovány podle návrhu Dunnetta a Williamse. Někdy v důsledku velké odchylky nerostou/neklesají odezvy pravidelně. V případě takto velké odchylky od monotónnosti je vhodnější Dunnettův test. Jestliže existují odchylky od homoskedasticity, může být rozumné zkoumat možné účinky na hodnoty rozptylu blíže, aby se rozhodlo, zda může být aplikován t-test, aniž by se podstatně snížila vypovídací schopnost testu (28). Alternativně může být aplikován vícenásobný U-test, např. Bonferroniho-U-test podle Holma (29), nebo když tato data vykazují heteroskedasticitu, ale jinak jsou konzistentní se základním monotónním vztahem dávka-odezva, jiný neparametrický test [např. Jonckheere-Terpstrův (30, 31) nebo Shirleyův (32, 33)], a byla by mu obecně dávána přednost před t-testy s nerovností rozptylů (viz rovněž schéma v dodatku 7). 45. Jestliže byla provedena limitní zkouška a podmínky pro použití parametrických testů jsou splněny (normálnost, homogenita), je možné použít párový Studentův t-test, v opačném případě pak neparametrický Mann-Whitneyův U-test (29). Odhad ECx 46. Při výpočtu jakékoli hodnoty ECx se pro regresní analýzu (lineární nebo nelineární) použijí střední hodnoty pro jednu expozici poté, co byla získána příslušná funkce dávka-odezva. Pro růst roupic jako kontinuální odezvu mohou být hodnoty ECx odhadnuty použitím vhodné regresní analýzy (35). Mezi vhodné funkce pro binární data (mortalita/přežití a počet zplozených potomků) patří normální sigmoidní, logistická nebo Weibullova funkce obsahující dva až čtyři parametry, z nichž některé mohou rovněž modelovat hormetické odezvy. Jestliže funkce dávka-odezva vyhovují lineární regresní analýze, tomu odpovídající r2 (koeficient determinace) a/nebo směrnice by měly být stanoveny prostřednictvím regresní analýzy před odhadem ECx, a to dosazením hodnoty odpovídající x % střední hodnoty kontroly do rovnice zjištěné regresní analýzou. Meze 95 % intervalu spolehlivosti se vypočítají podle Fiellera (citován ve Finney (21)) nebo jinými vhodnými moderními metodami. 47. Alternativně se odpověď modeluje jako procentní část modelového parametru, který je interpretován jako střední hodnota odpovědi kontroly. V těchto případech je často možné výsledky snadno proložit normální (logistickou, Weibullovou) sigmoidní křivkou za použití probitového regresního postupu (21). V těchto případech musejí být váhové funkce nastaveny pro metrické odezvy, jak uvádí Christensen (36). Avšak jestliže byla pozorována hormeze, měla by se probitová analýza nahradit čtyřparametrickou logistickou nebo Weibullovou funkcí za použití nelineární regrese (36). Jestliže není možné data proložit vhodnou funkcí dávka-odezva, je možné použít alternativní metody pro odhad hodnoty ECx a jejího intervalu spolehlivosti, jako je metoda klouzavých průměrů podle Thompsona (22) a očištěná Spearman-Karberova metoda (23). ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA 48. Závěrečná zpráva musí obsahovat následující informace: Zkoušená chemická látka: — fyzikální povaha a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (např. rozpustnost ve vodě, tlak par), — chemická identifikace zkoušené chemické látky podle nomenklatury IUPAC, číslo CAS, šarže, dávka, strukturní vzorec a čistota, — datum konce použitelnosti vzorku. Zkušební druh: — použití zkušební živočichové: druh, vědecký název, zdroj organismů a podmínky chovu. Zkušební podmínky: — složky umělé půdy a její příprava, — metoda aplikace zkoušené chemické látky, — popis zkušebních podmínek, včetně teploty, obsahu vlhkosti, pH atd., — úplný popis experimentálního uspořádání a postupů. Výsledky zkoušky: — mortalita dospělých roupic po dvou týdnech a počet mláďat na konci orientační zkoušky, — mortalita dospělých roupic po třech týdnech expozice a úplný záznam mláďat na konci hlavní zkoušky, — jakékoli pozorované fyzikální nebo patologické symptomy a změny chování zkušebních organismů, — hodnoty LC50, NOEC anebo ECx (např. EC50, EC10) pro reprodukci, jestliže některé z nich jsou použitelné pro intervaly spolehlivosti, a graf proložené modelové křivky použité při jeho výpočtu, všechny informace a pozorování užitečné pro interpretaci výsledků. Odchylky od postupů popsaných v této zkušební metodě a jakékoli neběžné jevy, které se vyskytly během zkoušky. LITERATURA 1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. 2) Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. 3) Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam. 4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. 5) Kapitola C.8 této přílohy, Zkouška akutní toxicity pro žížaly. 6) ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. 7) ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. 8) Rundgren, S. and A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. 9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. 10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. 11) Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. 12) Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. 13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. 14) Römbke, J. and Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. 15) Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. 16) ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. 17) Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. 18) Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. 19) Bouguenec, V. and Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. 20) Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Věstník Československé společnosti zoologické 32, 300-305. 21) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. 22) Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. 23) Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. 24) Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. 25) Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. 26) Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. 27) Dunnett, C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. 28) Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361. 29) Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. 30) Jonckheere, A. R. (1954); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. 31) Terpstra, T. J. (1952); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327-333. 32) Shirley, E. A. (1979); The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144-151. 33) Williams, D.A. (1986); A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183-186. 34) Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. 35) Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213-221. 36) Van Ewijk, P.H. and J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25-32. Dodatek 1 Definice Pro účel této zkušební metody jsou platné následující definice: Chemická látka je látka nebo směs. ECx (účinná koncentrace s x % účinkem) je koncentrace, která vyvolá x % účinek u zkušebních organismů během dané expoziční doby ve srovnání s kontrolou. Při této zkoušce jsou koncentrace vyvolávající účinek vyjádřeny jako hmotnost zkoušené chemické látky na hmotnost sušiny zkušební půdy. LC0 (koncentrace bez letálního účinku) je koncentrace zkoušené chemické látky, která neusmrtí žádné exponované zkušební organismy během daného časového období. Při této zkoušce je LC0 vyjádřena jako hmotnost zkoušené chemické látky na hmotnost sušiny zkušební půdy. LC50 (medián letální koncentrace) je koncentrace zkoušené chemické látky, která zahubí 50 % exponovaných zkušebních organismů během daného časového období. Při této zkoušce je LC50 vyjádřena jako hmotnost zkoušené chemické látky na hmotnost sušiny zkušební půdy. LC100 (letální koncentrace) je koncentrace zkoušené chemické látky, která zahubí 100 % exponovaných zkušebních organismů během daného časového období. Při této zkoušce je LC100 vyjádřena jako hmotnost zkoušené chemické látky na hmotnost sušiny zkušební půdy. Nejnižší koncentrace s pozorovaným účinkem (LOEC) je nejnižší koncentrace zkoušené chemické látky, která má statisticky významný účinek (p < 0,05). Při této zkoušce je LOEC vyjádřena jako hmotnost zkoušené chemické látky na hmotnost sušiny zkušební půdy. Všechny zkušební koncentrace vyšší než LOEC by obvykle měly vykazovat účinek, který je statisticky rozdílný od kontroly. Jakékoli odchylky z výše uvedeného v identifikaci LOEC musejí být zdůvodněny v závěrečné zprávě. Koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) je nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky bezprostředně nižší než LOEC, při které není pozorován žádný účinek. Při této zkoušce nemá koncentrace odpovídající NOEC žádný statisticky významný účinek (p < 0,05) během dané expoziční doby ve srovnání s kontrolou. Rychlost reprodukce je střední hodnota počtu mladých roupic zplozených daným počtem dospělých jedinců během zkušebního období. Zkoušená chemická látka je jakákoli látka nebo směs zkoušená použitím této zkušební metody. Dodatek 2 Stanovení maximální retenční vodní kapacity Stanovení retenční vodní kapacity umělé půdy Následující metoda byla shledána vhodnou. Je popsána v příloze C normy ISO DIS 11268-2. Odeberte stanovené množství (např. 5 g) zkušebního půdního substrátu použitím vhodného nástroje na odběr vzorku (spirálový trubkový vzorkovač atd.). Dno trubky se pokryje kusem filtračního papíru, trubka se naplní vodou a umístí na stojan ve vodní lázni. Trubka se postupně ponořuje, až je vodní hladina nad povrchem půdy. Pak se ponechá ve vodě přibližně tři hodiny. Jelikož ne všechna voda absorbovaná půdními kapilárami může být zadržena, měl by se vzorek půdy ponechat okapat dvě hodiny tak, že se trubka umístí na lůžko z velmi mokrého, jemně mletého křemenného písku v uzavřené nádobě (aby se zabránilo vysušení). Vzorek se pak zváží a vysuší do konstantní hmotnosti při 105 °C. Retenční vodní kapacita (RVK) se pak vypočítá podle následujícího vzorce: Kde: S = vodou nasycený substrát + hmotnost trubky + hmotnost filtračního papíru T = tára (hmotnost trubky + hmotnost filtračního papíru) D = hmotnost sušiny substrátu LITERATURA: ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality -Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. Dodatek 3 Stanovení pH půdy Následující metoda stanovení pH vzorku půdy vychází z popisu v ISO 10390 (Kvalita půdy – Stanovení pH). Definované množství půdy se vysuší při laboratorní teplotě po dobu alespoň 12 hodin. Suspenze půdy (obsahující alespoň 5 gramů půdy) se pak doplní do 5násobného objemu buď 1 M analyticky čistého chloridu draselného (KCl) nebo 0,01 M roztoku analyticky čistého chloridu vápenatého (CaCl2). Suspenze se pak důkladně třepe 5 minut. Po protřepání se suspenze ponechá usadit alespoň 2 hodiny, ale ne déle než 24 hodin. pH kapalné fáze se pak změří použitím pH-metru kalibrovaného před každým měřením pomocí vhodné řady roztoků pufrů (např. pH 4,0 a 7,0). LITERATURA: ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. Dodatek 4 Kultivační podmínky Enchytraeus sp. Roupicovití druhu Enchytraeus albidus (stejně jako jiné druhy Enchytraeus) mohou být kultivováni ve velkých plastových krabicích (např. 30 × 60 × 10 cm) naplněných 1:1 směsí umělé půdy a přírodní nekontaminované zahradní půdy. Nesmí se používat kompostovaný materiál, protože by mohl obsahovat toxické chemické látky, jakými jsou těžké kovy. Fauna se musí z půdy před použitím odstranit (např. hlubokozmrazením). Je rovněž možné použít substrát obsahující pouze umělou půdu, ale rychlost reprodukce může být nižší než v případě promíchaného půdního substrátu. Substrát použitý pro kultivaci by měl mít pH 6,0 ± 0,5. Kultura se udržuje v temnu při teplotě 15 až 20 °C ± 2 °C. Teplota nesmí překročit 23 °C. Půda se musí udržovat vlhká, ale ne mokrá. Správný obsah vlhkosti půdy je indikován malými kapkami vody, které se objeví mezi prsty po lehkém stisknutí půdy. Je třeba zabránit vytvoření anaerobních podmínek tak, že zajistíme, aby kryty kontejnerů s kulturou umožňovaly dostatečnou výměnu plynů s atmosférou. Každý týden se půda musí opatrně rozrušit, aby bylo umožněno provzdušňování. Roupice je možné krmit ovesnými vločkami. Ovesné vločky se uchovávají v utěsněných nádobách a před použitím by se měly zpracovat v autoklávu nebo zahřát, aby se zabránilo infikování moučnými roztoči (např. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) nebo dravými roztoči (např. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Po zahřátí se krmivo umele, aby se dalo snadno rozsypat na půdní povrch. Občas se mohou ovesné vločky obohatit přidáním vitamínů, mléka a oleje z tresčích jater. Dalšími vhodnými krmnými zdroji jsou pekařské droždí a rybí krmivo ‚Tetramin‘. Krmení se provádí přibližně dvakrát týdně. Vhodné množství ovesných vloček se rozsype na půdní povrch nebo opatrně zamíchá do substrátu při rozrušování půdy pro možné provzdušnění. Absolutní množství dodaného krmiva závisí na počtu roupic přítomných v substrátu. Jako vodítko, že množství krmiva je třeba zvýšit, může sloužit pozorování, že je všechno spotřebováno během jednoho dne od přidání. Naopak jestliže krmivo ještě zůstává na povrchu v čase druhého krmení (po týdnu), je třeba dávku snížit. Krmivo kontaminované plísněmi se musí odstranit a nahradit. Po třech měsících se červi přemístí do čerstvě připraveného substrátu. Kultivační podmínky se považují za vyhovující, jestliže roupice: a) se nepokoušejí opustit půdní substrát, b) se pohybují rychle půdou, c) vykazují lesklý vnější povrch bez ulpívajících půdních částic, d) jejich zbarvení je více méně bělavé, e) vykazují rozmanitost rozmezí stáří v kulturách a f) kontinuálně se reprodukují. Dodatek 5 Účinnost zkoušky s jinými druhy Enchytraeus Výběr druhu Je možné použít jiné druhy než E. albidus, ale postup zkoušky a kritéria platnosti se musí příslušně upravit. Mnoho druhů Enchytraeus je snadno k dispozici a mohou se vyhovujícím způsobem udržovat v laboratoři, proto je nejdůležitějším kritériem pro výběr druhu jiného než E. albidus ekologická významnost a srovnatelná citlivost. Pro výměnu druhů mohou rovněž exist