PŘÍLOHA III

PŘÍPRAVA VZORKŮ A POŽADAVKY NA ANALYTICKÉ METODY POUŽÍVANÉ PŘI KONTROLE OBSAHU DIOXINŮ (PCDD/PCDF) A PCB S DIOXINOVÝM EFEKTEM V NĚKTERÝCH POTRAVINÁCH

1. OBLAST POUŽITÍ

Požadavky stanovené v této příloze se vztahují na analýzu potravin pro úřední kontrolu obsahu polychlorovaných dibenzo-p-dioxinů substituovaných v polohách 2,3,7,8 a polychlorovaných dibenzofuranů (PCDD/PCDF) a polychlorovaných bifenylů s dioxinovým efektem (PCB s dioxinovým efektem) a pro další regulativní účely.

Sledování přítomnosti PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v potravinách může být provedeno dvěma různými druhy analytických metod:

2. SOUVISLOSTI

Pro výpočet koncentrací toxických ekvivalentů (TEQ) se koncentrace jednotlivých látek v daném vzorku vynásobí jejich příslušnými toxickými ekvivalenčními faktory (TEF), které jsou stanoveny Světovou zdravotnickou organizací a jsou uvedeny v dodatku k této příloze, sečtou se a výsledný součet je celkovou koncentrací sloučenin s dioxinovým efektem vyjádřenou v toxických ekvivalentech (TEQ).

Screeningové a konfirmační metody mohou být použity pouze pro kontrolu určité matrice, pokud jsou tyto metody dostatečně citlivé, aby spolehlivě zjistily hladiny na úrovni maximálního nebo akčního limitu.

3. POŽADAVKY NA ZABEZPEČENÍ KVALITY

4. POŽADAVKY NA LABORATOŘE

5. ZÁKLADNÍ POŽADAVKY, KTERÉ MUSÍ SPLŇOVAT ANALYTICKÝ POSTUP U DIOXINŮ (PCDD/PCDF) A PCB S DIOXINOVÝM EFEKTEM

5.1. Nízký pracovní rozsah a meze kvantifikace

5.2. Vysoká selektivita (specifičnost)

5.3. Vysoká správnost (pravdivost a přesnost, zjevná výtěžnost biologické zkoušky)

5.4. Validace v rozsahu maximálního limitu a obecná opatření pro kontrolu kvality

5.5. Mez kvantifikace

5.6. Analytická kritéria

5.7. Zvláštní požadavky na screeningové metody

Poté, co je k dispozici nejméně 20 potvrzených výsledků z kontroly kvality vyhovujících vzorků na matrici/matricovou skupinu, vyvodí se z těchto výsledků závěry ohledně míry falešně vyhovujících výsledků. Do minimálního počtu 20 výsledků pro hodnocení míry falešně vyhovujících výsledků se mohou zahrnout i výsledky ze vzorků analyzovaných pomocí okružních rozborů nebo při kontaminačních aférách, které pokrývají rozpětí koncentrace až např. do dvojnásobku maximálního limitu. Vzorky musí zahrnovat nejčastější zastoupení kongenerů, která představují různé zdroje.

6. ZVLÁŠTNÍ POŽADAVKY, KTERÉ MUSÍ SPLŇOVAT METODY GC-MS, ABY VYHOVOVALY PRO ÚČELY SCREENINGU NEBO KONFIRMACE

6.1. Přijatelné rozdíly mezi horním odhadem a dolním odhadem hladin WHO-TEQ

6.2. Kontrola výtěžnosti

6.3. Odstranění interferujících látek

6.4. Kalibrace pomocí standardní křivky

6.5. Zvláštní kritéria pro konfirmační metody

7. ZVLÁŠTNÍ POŽADAVKY NA BIOANALYTICKÉ METODY

Bioanalytické metody jsou metody založené na využití biologických principů, jako jsou buněčné testy, receptorové testy nebo imunologické testy. Tato část 7 stanoví obecné požadavky na bioanalytické metody.

Screeningové metody v zásadě klasifikují vzorky jako vyhovující nebo vzorky podezřelé jako nevyhovující. Za tímto účelem se vypočtená hladina BEQ porovnává s mezní hodnotou (viz bod 7.3). Vzorky nižší než mezní hodnota se považují za vyhovující, vzorky rovnající se mezní hodnotě nebo vyšší se považují za podezřelé jako nevyhovující a je nutné provést jejich analýzu pomocí konfirmační metody. Prakticky může jako mezní hodnota sloužit množství BEQ odpovídající 2/3 maximálního obsahu za předpokladu, že taková mezní hodnota zajišťuje míru falešně vyhovujících vzorků nižší než 5 % a přijatelnou míru falešně nevyhovujících vzorků. Při různých maximálních limitech pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem vyžaduje kontrola souladu vzorků bez frakcionace vhodné mezní hodnoty pro biologickou zkoušku pro PCDD/PCDF. Pro kontrolu vzorků překračujících akční limity je vhodnou mezní hodnotou přiměřené procento příslušného akčního limitu.

V případě některých bioanalytických metod může být navíc stanovena orientační úroveň vyjádřená v BEQ pro vzorky v pracovním rozsahu, které přesahují oznamovací mez (viz 7.1.1. a 7.1.6.).

7.1. Hodnocení odezvy

7.1.1. Obecné požadavky

7.1.2. Kalibrace

7.1.2.1. Kalibrace pomocí standardní křivky

7.1.2.2. Kalibrace pomocí referenčních vzorků

Případně lze použít kalibrační křivku zhotovenou alespoň ze čtyř referenčních vzorků (viz bod 7.2): jednoho matričního slepého vzorku plus tří referenčních vzorků na polovině, jednonásobku a dvojnásobku maximálního nebo akčního limitu, čímž odpadne nutnost odečtu hodnoty slepého stanovení a korekce na výtěžnost. V tomto případě lze odezvu odpovídající 2/3 maximálního limitu (viz 7.3) vypočítat přímo z těchto vzorků a použít ji jako mezní hodnotu. Pro kontrolu vzorků překračujících akční limity je vhodnou mezní hodnotou přiměřené procento těchto akčních limitů.

7.1.3. Samostatné stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem

Extrakty lze rozdělit do frakcí obsahujících PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, což umožňuje získání oddělených údajů o hladinách TEQ pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem (v BEQ). Pro hodnocení výsledků pro frakci obsahující PCB s dioxinovým efektem se přednostně použije kalibrační křivka standardu PCB 126.

7.1.4. Zjevná výtěžnost biologické zkoušky

„Zjevná výtěžnost biologické zkoušky“ se vypočte z vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem maximálního nebo akčního limitu a vyjádří se jako procento hladiny BEQ v porovnání s hladinou TEQ. V závislosti na použitém typu zkoušky a použitých TEF (3) mohou rozdíly mezi faktory TEF a REP pro PCB s dioxinovým efektem způsobit nízkou zjevnou výtěžnost u PCB s dioxinovým efektem v porovnání s PCDD/PCDF. Proto při samostatném stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem musí být zjevná výtěžnost biologických zkoušek následující: u PCB s dioxinovým efektem 20 až 60 %, u PCDD/PCDF 50 až 130 % (rozmezí platná pro kalibrační křivku TCDD). Jelikož podíl PCB s dioxinovým efektem na sumě PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se může u různých matric a vzorků lišit, odráží se tyto rozdíly i ve zjevné výtěžnosti biologických zkoušek pro tento souhrnný parametr, která se musí pohybovat v rozmezí 30 až 130 %.

7.1.5. Kontrola výtěžnosti o ztráty při čištění

Při validaci je nutné zkontrolovat ztrátu sloučenin během čištění. Slepý vzorek obohacený směsí různých kongenerů se podrobí čištění (alespoň n = 3) a výtěžnost a variabilita se ověří konfirmační metodou. Výtěžnost musí být v rozmezí 60 až 120 %, zejména u kongenerů s podílem na množství TEQ v různých směsích, který je vyšší než 10 %.

7.1.6. Oznamovací mez

Při vydávání úrovní BEQ se stanoví oznamovací mez z příslušných matričních vzorků zahrnujících typická zastoupení kongenerů, avšak vzhledem k nízké přesnosti v dolním rozsahu křivky nikoli z kalibrační křivky standardů. Je třeba vzít v úvahu účinky extrakce a čištění. Oznamovací mez musí být stanovena významně (nejméně trojnásobně) vyšší než hodnoty slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup.

7.2. Použití referenčních vzorků

7.3. Stanovení mezních hodnot

Je nutné určit vztah mezi výsledky biologické zkoušky v BEQ a výsledky z konfirmačních metod v TEQ (např. pomocí kalibračních pokusů, které zohledňují vliv matrice, s referenčními vzorky obohacenými na nule, polovině, jednonásobku a dvojnásobku maximálního limitu s šesti opakováními na každé úrovni (n = 24)). Na základě tohoto vztahu lze odhadnout korekční faktory (odečtení blanku a korekce na výtěžnost), je však nutno je v každé sérii zkoušek ověřit zahrnutím slepých vzorků/matričních slepých vzorků a vzorků výtěžnosti (7.2).

Je nutné stanovit mezní hodnoty pro účely rozhodnutí ohledně souladu vzorku s maximálními limity nebo pro kontrolu akčních limitů, jsou-li sledovanou hodnotou, s příslušnými maximálními nebo akčními limity buď zvlášť pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem, nebo pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem. Tyto hodnoty jsou zastoupeny nižšímcílovým bodem distribuce výsledků biologické zkoušky (upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) odpovídajícím rozhodovací mezi u příslušné konfirmační metody na základě 95 % spolehlivosti, z čehož vyplývá míra falešně vyhovujících výsledků < 5 %, a na základě RSDR < 25 %. Rozhodovací mezí u dané konfirmační metody je maximální limit při zohlednění nejistoty měření.

V praxi lze mezní hodnotu (v BEQ) vypočítat těmito způsoby (viz graf č. 1):

7.3.1. S použitím nižší části 95 % predikčního intervalu ve výši rozhodovací meze konfirmační metody:

kde:

7.3.2. Z výsledků biologické zkoušky (upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) získaných z vícenásobných analýz vzorků (n > 6) kontaminovaných na úrovni rozhodovací meze konfirmační metody, jakožto nižší část rozdělení výsledků na odpovídající průměrné hodnotě BEQ:

kde

7.3.3. Výpočet jako střední hodnota výsledků biologické zkoušky (v BEQ, upravených o hodnoty slepého stanovení a korigovaných na výtěžnost) z vícenásobné analýzy vzorků (n ≥ 6) kontaminovaných na 2/3 maximálního nebo akčního limitu. To vychází z poznatku, že tato úroveň se bude pohybovat kolem mezní hodnoty určené podle 7.3.1 nebo 7.3.2.

Graf 1.:

výpočet mezních hodnot vycházející z 95 % míry spolehlivosti, z níž vyplývá míra falešně vyhovujících výsledků < 5 %, a z RSDR < 25 %:

7.3.4. Omezení mezních hodnot:

Mezní hodnoty vycházející z BEQ a vypočtené z RSDR dosažené při validaci s použitím omezeného počtu vzorků s různým zastoupením matrice/kongenerů mohou být vyšší než maximální nebo akční limity vycházející z TEQ, vzhledem k větší přesnosti, než je přesnost, jíž lze běžně dosáhnout s neznámým spektrem zastoupení kongenerů. V takových případech se mezní hodnoty vypočtou z RSDR = 25 % nebo se dá přednost dvěma třetinám maximálního nebo akčního limitu.

7.4. Kritéria výkonnosti

8. VYDÁVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Konfirmační metody

Bioanalytické screeningové metody

(1) Nařízení Evropského Parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 ze dne 29. dubna 2004 o úředních kontrolách za účelem ověření dodržování právních předpisů týkajících se krmiv a potravin a pravidel o zdraví zvířat a dobrých životních podmínkách zvířat (Úř. věst. L 165,30.4.2004, s. 1).

(2) S ohledem na maximální limity.

(3) Současné požadavky vycházejí z TEF vydaných v: M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

Dodatek k PŘÍLOZE III

WHO-TEF (toxické ekvivalenční faktory Světové zdravotnické organizace) pro hodnocení nebezpečnosti pro člověka vycházející ze závěrů zasedání odborníků Světové zdravotnické organizace (WHO) – Mezinárodní program chemické bezpečnosti (IPCS), které se konalo v Ženevě v červnu 2005 (Martin Van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006))