PŘÍLOHA

Příloha nařízení (ES) č. 440/2008 se mění takto:

Vkládají se kapitoly B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 a B.58, které znějí:

„B.53. STUDIE VÝVOJOVÉ NEUROTOXICITY

ÚVOD

1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 426 (2007). Pracovní skupina OECD pro reprodukční a vývojovou toxicitu na svém zasedání v červnu 1995 v Kodani jednala o potřebě aktualizovat stávající pokyny OECD pro zkoušení reprodukční a vývojové toxicity a vypracovat nové pokyny pro účinky, pro které pokyny ještě neexistují (1). Pracovní skupina doporučila, aby pokyn pro zkoušení vývojové neurotoxicity byl vypracován na základě pokynu Úřadu pro ochranu životního prostředí USA (US EPA), který byl později revidován (2). V červnu 1996 se v Kodani konala druhá konzultační schůzka, která poskytla sekretariátu doporučení k nástinu nového pokynu pro zkoušení vývojové neurotoxicity, včetně jejich hlavních prvků, např. podrobností týkajících se volby druhu zvířat, období podávání dávek, doby zkoušky, výsledných parametrů, které mají být posuzovány, a kritérií pro hodnocení výsledků. V roce 1998 byl zveřejněn pokyn USA pro posuzování rizik neurotoxicity (3). V říjnu 2000 se konala konzultační schůzka odborníků OECD, na kterou bezprostředně navázal seminář vědeckého ústavu pro výzkum rizik ILSI, a v roce 2005 se uskutečnila konzultační schůzka odborníků v Tokiu. Cílem těchto zasedání bylo projednat vědecké a technické otázky související se stávajícím pokynem pro zkoušení a doporučení, jež z těchto zasedání vzešla (4)(5)(6)(7), byla zvážena při vývoji této zkušební metody. Další informace týkající se provádění, interpretace a použité terminologie této zkušební metody lze najít v Pokynu OECD č. 43 ‚Zkoušení a posuzování reprodukční toxicity‘ (8) a Pokynu OECD č. 20 ‚Zkoušení neurotoxicity‘ (9).

VÝCHOZÍ ÚVAHY

2. Je známo, že některé chemické látky mají vývojové neurotoxické účinky na člověka a další druhy (10)(11)(12)(13). Aby bylo možno posoudit a zhodnotit toxické vlastnosti určité chemické látky, může být nutné stanovit, jaká je její schopnost vývojové neurotoxicity. Studie vývojové neurotoxicity jsou koncipovány s cílem poskytnout údaje, včetně charakterizace vztahu dávka-odpověď, o možných funkčních a morfologických účincích na vývoj nervové soustavy potomstva, jež mohou vzniknout v důsledku expozice in utero a v časném postnatálním období života.

3. Studii vývojové neurotoxicity lze provádět jako samostatnou studii, začlenit ji do studie reprodukční toxicity a/nebo neurotoxicity dospělých zvířat (např. zkušební metody B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) nebo ji připojit ke studii prenatální vývojové toxicity (např. zkušební metoda B.31 (17)). Je-li studie vývojové neurotoxicity začleněna do jiné studie nebo připojena k jiné studii, musí být bezpodmínečně zachována integrita obou typů studií. Všechny zkoušky musí splňovat platné právní předpisy nebo státní a institucionální pokyny pro používání laboratorních zvířat ve výzkumu (např. (18)).

4. Zkušební laboratoř by před provedením studie měla vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce. Součástí těchto informací je totožnost a struktura chemické látky, její fyzické a chemické vlastnosti, výsledky jiných zkoušek toxicity dané chemické látky in vitro nebo in vivo, toxikologické údaje o strukturně příbuzných chemických látkách a očekávané použití chemické látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru vhodné výchozí dávky.

PODSTATA ZKOUŠKY

5. Zkoušená chemická látka se podává zvířatům v době březosti a laktace. Jsou testovány matky za účelem posouzení účinků na březí a kojící samice a zkouška může také poskytnout informace pro srovnání (mezi matkou a potomstvem). Z vrhů se náhodně vybere potomstvo pro hodnocení neurotoxicity. Hodnocení se skládá z pozorování za účelem zjištění závažných neurologických abnormalit a abnormalit v chování, včetně posouzení fyzického vývoje, behaviorální ontogeneze, motorické aktivity, motorických a smyslových funkcí a učení a paměti; a hodnocení hmotností mozku a neuropatologie během postnatálního vývoje a v dospělosti.

6. Pokud se zkušební metoda provádí jako samostatná studie, lze další dostupná zvířata z každé skupiny použít pro specifická neurobehaviorální, neuropatologická, neurochemická nebo elektrofyziologická vyšetření, která mohou doplnit údaje získané z vyšetření doporučených touto zkušební metodou (16)(19)(20)(21). Tyto doplňující postupy mohou být zvláště užitečné tehdy, pokud empirické pozorování, očekávané účinky nebo mechanismus účinku ukazují na specifický typ neurotoxicity. Tyto doplňující postupy lze použít na matkách i na mláďatech. Kromě toho lze použít také postupů ex vivo nebo in vitro, pokud tyto zkoušky nezmění integritu postupů in vivo.

PŘÍPRAVA NA ZKOUŠKU

Výběr druhu zvířat

7. Upřednostňovaným zkušebním druhem je potkan; případně lze použít i jiné druhy. Je však třeba mít na paměti, že období březosti a období postnatálního vývoje stanovené v této zkušební metodě jsou specifické pro běžně užívané kmeny potkanů, a pokud jsou použity jiné druhy nebo neobvyklé kmeny, měla by být zvolena srovnatelná období. Použití jiných druhů by mělo být zdůvodněno na základě toxikologických, farmakokinetických a/nebo jiných údajů. Zdůvodnění by mělo obsahovat dostupné postnatální neurobehaviorální a neuropatologické hodnocení specifické pro daný druh. Jestliže existuje dřívější zkouška, která vyvolala pozornost, mělo by být zváženo, na kterém druhu/kmenu byla provedena. Vzhledem k různým reakcím jednotlivých kmenů potkanů by měly existovat důkazy o tom, že kmen zvolený k použití má přiměřenou plodnost a citlivost. Spolehlivost a citlivost jiných druhů pro účely zjišťování vývojové neurotoxicity by měly být zdokumentovány.

Podmínky chovu a krmení

8. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost by měla být nejméně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 %, kromě doby úklidu místností; avšak cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Před pářením a po dobu trvání studie lze rovněž světelný cyklus obrátit, aby bylo možné posoudit sledované funkční a behaviorální vlastnosti za tmy (pod červeným světlem), tj. v době, kdy jsou zvířata za běžných podmínek aktivní (22). Veškeré změny v rytmu světla a tmy by měly zahrnovat přiměřenou dobu na aklimatizaci, aby se zvířatům umožnilo přizpůsobit se novému rytmu. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. Druhy krmiva a vody by měly být zaznamenány a měly by být analyzovány na přítomnost kontaminujících látek.

9. Zvířata lze chovat jednotlivě nebo je umístit do klecí v malých skupinkách zvířat stejného pohlaví. Páření by mělo probíhat v klecích, které jsou k tomuto účelu vhodné. Po spáření nebo nejpozději v 15. den březosti by oplodněné samice měly být umístěny individuálně do klecí určených k vrhu nebo chovu mláďat. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. S blížící se dobou vrhu by oplodněným samicím měl být poskytnut odpovídající a přesně stanovený materiál pro tvorbu hnízda. Je známo, že nevhodné zacházení nebo stres v době březosti může vést k nepříznivým následkům, včetně prenatální ztráty a změněného vývoje plodu a postnatálního vývoje. S cílem zabránit prenatálním ztrátám z důvodů, které nesouvisí s expozicí, by se mělo se zvířaty během březosti zacházet opatrně a zamezit stresu způsobenému zevními faktory, jako je např. nadměrný vnější hluk.

Příprava zvířat

10. Použijí se zdravá zvířata, která se aklimatizovala na laboratorní podmínky a která nebyla podrobena předcházejícím zkušebním postupům, pokud není studie začleněna do jiné studie (viz odstavec 3). Pokusná zvířata by měla být charakterizována podle druhu, kmenu, původu, pohlaví, hmotnosti a stáří. Každému zvířeti by mělo být přiděleno jedinečné identifikační číslo a zvíře by jím mělo být označeno. Je-li to možné, měla by mít zvířata ze všech zkušebních skupin stejnou hmotnost a věk a měla by být v rámci normálního rozpětí zkoumaného druhu a kmene. Pro každou úroveň dávek se použijí mladé dospělé samice, které musí být nulipary. Je třeba dbát na to, aby nedocházelo k páření sourozenců. Nultým dnem gestace je den, kdy je zpozorována vaginální zátka a/nebo sperma. Jsou-li od dodavatele nakupována stejně dlouho březí zvířata, měla by jim být poskytnuta přiměřená doba (např. 2–3 dny) na aklimatizaci. Oplodněné samice se náhodným výběrem přidělí do kontrolních a experimentálních skupin a měly by být do skupin rozděleny pokud možno rovnoměrně (pro zajištění rovnoměrného rozdělení do všech skupin se doporučuje např. postup stratifikovaného náhodného výběru, jako je postup založený na tělesné hmotnosti). Samice oplodněné stejným samcem by měly být rovnoměrně rozděleny do všech skupin.

POSTUP

Počet a pohlaví zvířat

11. V každé zkušební a kontrolní skupině by měl být dostatečný počet březích samic, které budou exponovány zkoušené chemické látce, aby se zajistilo, že se narodí dostatečný počet potomků pro hodnocení neurotoxicity. Pro každou úroveň dávky se doporučuje použít celkem 20 vrhů. Jsou povoleny režimy s opakovaným a stupňovitým podáváním, pokud je dosažen celkový počet vrhů v každé skupině a pokud jsou použity vhodné statistické metody zohledňující opakování.

12. Ve 4. postnatální den nebo dříve (postnatální den 0 je den vrhu) musí být velikost každého vrhu upravena odstraněním nadbytečných mláďat, aby byla dosažena stejná velikost všech vrhů (3). Velikost vrhu by neměla přesahovat průměrnou velikost vrhu u použitého kmene hlodavců (8–12 mláďat). Ve vrhu by měl být pokud možno stejný počet mladých samců a samic. Selektivní odstraňování mláďat, např. na základě tělesné hmotnosti, není vhodné. Po standardizaci velikosti vrhů (utracení) a před dalším zkoušením sledovaných funkčních ukazatelů by jednotlivá mláďata, která jsou určena pro zkoušky před odstavením a po odstavení, měla být jednoznačně identifikována pomocí jakékoli vhodné humánní metody pro identifikaci mláďat (např. (24)).

Přiřazení zvířat pro funkční a behaviorální zkoušky, hmotnost mozků a neuropatologická hodnocení

13. Tato zkušební metoda umožňuje různé způsoby přiřazení zvířat exponovaných in utero a prostřednictvím laktace pro funkční a behaviorální zkoušky, určení pohlavní zralosti, stanovení váhy mozku a neuropatologické hodnocení (25). V jednotlivých případech lze přidat i jiné zkoušky neurobehaviorálních funkcí (např. sociálního chování), neurochemie nebo neuropatologie, pokud nebude ohrožena integrita původně požadovaných zkoušek.

14. Z každé exponované skupiny se ve 4. postnatální den nebo později vyberou mláďata a přiřadí se pro posouzení sledovaných vlastností. Výběr mláďat by měl být prováděn tak, aby při všech zkouškách byla v každé exponované skupině v největším možném rozsahu rovnoměrně zastoupena obě pohlaví z každého vrhu. Pro zkoušky motorické aktivity by měla být použita stejná dvojice mláďat samec-samice v každém zkoumaném věku před odstavením (viz odstavec 35). Pro všechny ostatní zkoušky lze pro různé behaviorální zkoušky použít tytéž páry mláďat nebo páry různé pro každou zkoušku. Pro zkoušky poznávacích funkcí odstavených mláďat v porovnání s dospělými zvířaty bude možná nutné přiřadit odlišná mláďata, aby se zamezilo zkreslujícím účinkům věku a předchozího návyku na tato měření (26)(27). Při odstavení (21. postnatální den) lze mláďata, která nebyla vybrána ke zkouškám, humánně usmrtit. Veškeré změny v přiřazení mláďat musí být zaznamenány. Statistickou jednotkou pro vyhodnocování výsledků by měl být vrh (nebo samice), a nikoli mládě.

15. Existují různé způsoby přiřazování mláďat k vyšetřením před odstavením a po odstavení, zkouškám poznávacích schopností, patologickým vyšetřením atd. (o obecném konceptu viz obrázek 1 a příklady přiřazení viz dodatek 1). Doporučené minimální počty zvířat v každé exponované skupině pro vyšetření před odstavením a po odstavení jsou tyto:

Klinická pozorování a tělesná hmotnost Všechna zvířata Podrobná klinická pozorování 20 od každého pohlaví (1 od každého pohlaví a vrhu) Hmotnost mozku (po fixaci) 11.–22. postnatální den 10 od každého pohlaví (1 z každého vrhu) Hmotnost mozku (nefixovaného) ~ 70. postnatální den 10 od každého pohlaví (1 z každého vrhu) Neuropatologie (fixace ponořením do fixačního roztoku nebo perfuzí) 11.–22. postnatální den 10 od každého pohlaví (1 z každého vrhu) Neuropatologie (fixace perfuzí) ~ 70. postnatální den 10 od každého pohlaví (1 z každého vrhu) Pohlavní zralost 20 od každého pohlaví (1 od každého pohlaví a vrhu) Jiné vývojové znaky (není povinné) Všechna zvířata Behaviorální ontogeneze 20 od každého pohlaví (1 od každého pohlaví a vrhu) Motorická aktivita 20 od každého pohlaví (1 od každého pohlaví a vrhu) Motorické a smyslové funkce 20 od každého pohlaví (1 od každého pohlaví a vrhu) Učení a paměť 10 od každého pohlaví (1) (1 z každého vrhu)

Dávkování

16. Použijí se alespoň tři dávky a souběžná kontrolní skupina. Úrovně dávek se rozloží tak, aby byly toxické účinky odstupňovány. Pokud neexistuje žádné omezení vyplývající z fyzikálně-chemické podstaty nebo biologických vlastností chemické látky, zvolí se nejvyšší dávka s cílem vyvolat určitou toxicitu u březí samice (např. klinické znaky, snížení přírůstku tělesné hmotnosti (ne více než o 10 %) a/nebo projevy limitní toxické dávky pro cílový orgán). Nejvyšší dávku lze s určitými výjimkami omezit na 1 000 mg na 1 kg tělesné hmotnosti za den. Avšak například velikost očekávané expozice člověka může vyvolat potřebu použití vyšší dávky. Jinak by měly být provedeny předběžné studie nebo předběžné orientační zkoušky s cílem určit, jaké nejvyšší dávkování má být použito, aby způsobilo minimální stupeň toxicity pro matku. Pokud se ve standardní studii vývojové toxicity nebo v předběžné studii ukázalo, že zkoušená chemická látka je vývojově toxická, měla by nejvyšší úrovní dávky být maximální dávka, která nevyvolá nadměrnou toxicitu pro potomstvo, nebo toxicitu in utero nebo neonatální toxicitu, popřípadě malformace v míře znemožňující provést smysluplné hodnocení neurotoxicity. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné známky toxicity pro matku ani žádné známky vývojové toxicity, včetně neurotoxicity. Měla by být zvolena sestupná řada úrovní dávek s cílem prokázat účinky související s dávkou a nepřítomnost nepříznivých účinků při nejnižší úrovni dávky (NOAEL) nebo by měly být použity dávky blížící se mezi detekovatelnosti, které by umožnily stanovení referenční dávky. Často je pro stanovení sestupných úrovní dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný interval mezi dávkami a je vhodnější přidat čtvrtou exponovanou skupinu než použít velmi velké intervaly (odpovídající např. faktoru většímu než 10) mezi dávkami.

17. Při výběru dávek je třeba brát v úvahu veškeré existující údaje o toxicitě a také další informace o metabolismu a toxikokinetice zkoušené chemické látky nebo látek příbuzných. Tyto informace mohou rovněž pomoci při prokazování přiměřenosti dávkovacího režimu. Přímé podávání mláďatům by mělo být zváženo na základě informací o expozici a farmakokinetických informací (28)(29). Před prováděním studií s přímým dávkováním by měly být pečlivě zváženy přínosy a nevýhody (30).

18. Souběžnou kontrolní skupinou by měla být kontrolní skupina s napodobeným podáváním nebo kontrolní skupina s vehikulem, pokud se vehikulum při podávání zkoušené chemické látky používá. Normálně by měl být všem zvířatům podáván stejný objem zkoušené chemické látky nebo vehikula na základě tělesné hmotnosti. Pokud se pro usnadnění dávkování používá vehikulum nebo jiná přísada, je třeba vzít v úvahu následující možnosti: vliv na absorpci, distribuci, metabolismus nebo retenci zkoušené chemické látky; vliv na chemické vlastnosti zkoušené chemické látky, které mohou ovlivnit její toxický účinek, a vliv na spotřebu potravy nebo vody anebo na nutriční stav zvířat. Vehikulum by nemělo vyvolávat účinky, které by mohly ovlivnit interpretaci studie, nemělo by být neurobehaviorálně toxické a nemělo by mít vliv na rozmnožování nebo vývoj. V případě nových vehikul by kromě kontrolní skupiny s vehikulem měla být zařazena také kontrolní skupina s napodobeným podáváním. Se zvířaty v kontrolní skupině (skupinách) se zachází stejně jako se zvířaty ve zkušební skupině.

Podávání dávek

19. Zkoušená chemická látka nebo vehikulum by měly být podávány cestami nejvhodnějšími z hlediska potenciální expozice člověka a na základě dostupných informací o metabolismu a distribuci u zkušebních zvířat. Podávány budou zpravidla orální cestou (např. sondou nebo v potravě či v pitné vodě), ale lze použít i jiné cesty (např. dermální expozici, inhalaci) v závislosti na vlastnostech a očekávaných nebo známých způsobech expozice člověka (další pokyny jsou uvedeny v Pokynu OECD č. 43 (8)). Zvolený způsob podávání je třeba zdůvodnit. Zkoušená chemická látka se podává každý den přibližně ve stejnou dobu.

20. Obvykle by dávka podávaná jednotlivým zvířatům měla vycházet z aktuálně zjištěné tělesné hmotnosti. Velkou pozornost je však třeba věnovat úpravě dávek během posledního trimestru březosti. Pokud je u experimentálních samic zaznamenána nadměrná toxicita, tato zvířata se humánně utratí.

21. Zkoušená chemická látka nebo vehikulum by měly být podávány oplodněným samicím nejméně jednou denně od doby implantace (6. den gestace) po celé období laktace (21. postnatální den), takže mláďata jsou zkoušené chemické látce exponována během prenatálního i postnatálního neurologického vývoje. Věk, ve kterém se začne dávka podávat, a trvání a frekvenci podávání dávky lze upravit, pokud existují poznatky, že jiné experimentální uspořádání je vhodnější z hlediska expozice člověka. Pro jiné druhy je podávání dávek nutno přizpůsobit tak, aby se zajistila expozice během všech raných období vývoje mozku (tj. odpovídajících prenatálnímu a raně postnatálnímu růstu lidského mozku). Podávání dávek může začít od vyvolání březosti (nultý den gestace), avšak měla by být zvážena schopnost zkoušené chemické látky způsobit preimplantační ztráty. Podávání od 6. dne gestace by toto riziko vyloučilo, ale nebyla by podchycena stadia vývoje mezi nultým a 6. dnem gestace. Jestliže laboratoř nakupuje zvířata spářená ve stejnou dobu, začínat podávání dávky v nultý den gestace je nepraktické, a vhodným počátečním dnem by proto byl 6. den gestace. Zkušební laboratoř by měla stanovit režim dávkování na základě příslušných informací o účincích zkoušené chemické látky, předchozích zkušeností a s ohledem na logistické zajištění; to může zahrnovat prodloužení podávání dávek po odstavení. Dávky by neměly být podávány v den vrhu těm zvířatům, která nevrhla celé své potomstvo. Obecně se předpokládá, že k expozici mláďat dojde prostřednictvím mateřského mléka; v případech, kdy není dostatek důkazů o kontinuální expozici potomstva, by však mělo být zváženo přímé dávkování potomstvu. Důkazy o kontinuální expozici lze čerpat např. z farmakokinetických informací, toxicity potomstva nebo změn v biologických markerech (28).

POZOROVÁNÍ

Pozorování samic

22. U všech samic se alespoň jednou denně pečlivě zkontroluje jejich zdravotní stav, včetně nemocnosti a úmrtnosti.

23. V období aplikace a pozorování by mělo být periodicky (nejméně dvakrát za období podávání látky za březosti a dvakrát za období podávání látky v době laktace) prováděno podrobnější klinické pozorování nejméně deseti samic na každé úrovni dávky. Zvířata by měla být pozorována mimo chovnou klec kvalifikovanými laboranty, kteří nejsou informováni o tom, do jaké experimentální skupiny zvíře patří, a s použitím standardizovaných postupů, které mají minimalizovat stres u zvířat a neobjektivnost pozorovatele a maximalizovat spolehlivost jednotlivých pozorovatelů. Je žádoucí, aby pozorování v rámci dané studie prováděl pokud možno stejný laborant.

24. Přítomnost zpozorovaných příznaků se zaznamená. Je-li to možné, zaznamená se rovněž závažnost zpozorovaných příznaků. Klinická pozorování by se měla mimo jiné zaměřit na změny kůže, srsti, očí a sliznic, výskyt sekretů a autonomní funkce (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklý průběh dýchání a/nebo dýchání ústy, nezvyklé příznaky močení nebo defekace).

25. Zaznamenají se rovněž nezvyklé projevy, pokud jde o polohu těla, úroveň aktivity (např. snížené nebo zvýšené zkoumání standardního prostoru) a koordinaci pohybu. Zaznamenají se také změny chůze (např. kolébání, ataxie), polohy (nahrbení hřbetu) a reakce na manipulaci, umístění a další stimuly související s prostředím, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, křečí, třesu, stereotypů v chování (např. nadměrného čištění, nezvyklých pohybů hlavy nebo opakovaného kroužení) nebo zvláštního chování (např. kousání nebo nadměrného olizování, sebepoškozování, pohybu pozpátku, vydávání zvuků) anebo agresivity.

26. Zaznamenají se příznaky toxicity, včetně dne jejich nástupu, denní doby, stupně a trvání.

27. Zvířata by se měla v době podávání dávek vážit nejméně jednou týdně po celou dobu studie, v den vrhu nebo jeho blízkosti a v 21. postnatální den (odstavení). Ve studiích podávání látky žaludeční sondou by měly být samice váženy nejméně dvakrát týdně. Při každém stanovení tělesné hmotnosti by měly být upraveny dávky podle potřeby. Během gestačního a laktačního období se spotřeba potravy měří minimálně každý týden. Pokud je expozice prováděna pomocí pitné vody, měří se spotřeba vody nejméně jednou týdně.

Pozorování potomstva

28. Veškeré potomstvo se nejméně jednou denně bedlivě pozoruje, aby se zjistily příznaky toxicity, nemocnost a úmrtnost.

29. Během doby aplikace a pozorování by mělo být prováděno podrobnější klinické pozorování potomstva. Pozorování potomstva (nejméně jedno mládě od každého pohlaví a vrhu) by měli provádět kvalifikovaní laboranti, kteří nejsou informováni o tom, do které experimentální skupiny zvířata patří, a s použitím standardizovaných postupů s cílem minimalizovat neobjektivnost pozorovatele a maximalizovat spolehlivost jednotlivých pozorovatelů. Je žádoucí, aby pozorování prováděl pokud možno stejný laborant. Sledují se přinejmenším sledované vlastnosti popsané v odstavci 24 a 25 podle potřeby vývojového stadia, které je pozorováno.

30. Zaznamenají se veškeré příznaky toxicity u potomstva, včetně dne nástupu, denní doby, stupně a trvání.

Fyzické a vývojové znaky

31. Změny ve vývojových znacích v období před odstavením (např. otevření uší a očí, prořezávání řezáků) úzce souvisejí s tělesnou hmotností (30)(31). Tělesná hmotnost může být nejlepším ukazatelem fyzického vývoje. Měření vývojových znaků se proto doporučuje provádět pouze tehdy, jestliže existují dřívější poznatky, že tyto sledované vlastnosti poskytnou doplňující informace. Časový rozvrh pro posuzování těchto parametrů je uveden v tabulce 1. Lze doporučit, aby v závislosti na očekávaných účincích a na výsledcích počátečních měření byly doplněny další časové body nebo byla prováděna měření v jiných vývojových stadiích.

32. Při posuzování fyzického vývoje se doporučuje použít postkoitální věk, a nikoli postnatální věk (33). Jsou-li mláďata testována v den odstavení, doporučuje se, aby byly tyto zkoušky prováděny před skutečným odstavením, aby se vyloučil zkreslující účinek stresu spojeného s odstavením. V období po odstavení by kromě toho neměly být prováděny žádné zkoušky během dvou dnů po odstavení.

Tabulka 1

Časový rozvrh posuzování fyzických a vývojových znaků a sledovaných funkčních/behaviorálních vlastností (2)

Období věku Sledované vlastnosti Před odstavením (3) Dospívání (3) Mladá dospělost (3) Fyzické a vývojové znaky Tělesná hmotnost a klinická pozorování týdně (4) nejméně jednou za dva týdny nejméně jednou za dva týdny Hmotnost mozku 22. postnatální den (5) při ukončení studie Neuropatologie 22. postnatální den (5) při ukončení studie Pohlavní zralost — podle vhodnosti — Další vývojové znaky (6) podle vhodnosti — — Sledované funkční/behaviorální vlastnosti Behaviorální ontogeneze nejméně dvě měření Motorická aktivita (včetně přivykání) 1–3krát (7) — jednou Motorické a smyslové funkce — jednou jednou Učení a paměť — jednou jednou

33. Živá mláďata se spočítají a rozdělí podle pohlaví, např. vizuální prohlídkou nebo měřením vzdálenosti od konečníku ke genitálu (34)(35) a každé mládě ve vrhu se jednotlivě zváží při narození nebo krátce po něm, nejméně jednou týdně během laktace a poté nejméně jednou za dva týdny. Při hodnocení pohlavní zralosti by mělo být stanoveno stáří a tělesná hmotnost zvířete při vaginálním otevření (36) nebo odpojení předkožky (37) nejméně u jednoho samce a jedné samice z každého vrhu.

Behaviorální ontogeneze

34. Ontogeneze vybraných chování by měla být měřena ve vhodném věku nejméně u jednoho mláděte od každého pohlaví a vrhu, přičemž ve všech zkušebních dnech by se pro všechna posuzovaná chování měla použít stejná mláďata. Dny měření by v tomto období měly být rozvrženy stejnoměrně, aby bylo možno stanovit běžnou změnu v ontogenezi uvedeného chování nebo změnu v souvislosti s aplikací (38). Dále jsou uvedeny některé příklady chování, u kterých by mohla být posuzována ontogeneze: reflex rovnováhy, negativní geotaxe a motorická aktivita (38)(39)(40).

Motorická aktivita

35. Motorická aktivita by měla být sledována (41)(42)(43)(44)(45) v období před odstavením a v dospělosti. Ke zkoušení v době odstavení viz odstavec 32. Zkušební sezení by mělo být dostatečně dlouhé, aby bylo možno prokázat přivykání neexponovaných kontrolních skupin v průběhu sezení. Behaviorální ontogenezi se důrazně doporučuje posuzovat pomocí motorické aktivity. Je-li prováděna zkouška behaviorální ontogeneze, měla by být při všech sezeních v období před odstavením použita stejná zvířata. Zkoušky by měly být prováděny dostatečně často, aby bylo možno posoudit ontogenezi přivykání v průběhu sezení (44). To může vyžadovat tři nebo více časových období před odstavením včetně dne odstavení (např. 13., 17. a 21. postnatální den). Testování stejných zvířat nebo sourozenců z vrhu by mělo být prováděno také v dospělosti nedlouho před ukončením studie (např. 60.–70. postnatální den). Podle potřeby lze provádět zkoušky i v dalších dnech. Motorická aktivita by měla být sledována přístrojem s automatizovaným zaznamenáváním aktivity, který by měl být schopen zjistit zvýšení i poklesy aktivity (tj. výchozí aktivita naměřená tímto zařízením by neměla být tak nízká, aby bránila zjištění zvýšení, ani tak vysoká, aby bránila zjištění poklesu aktivity. Každý přístroj by měl být odzkoušen standardními postupy, aby se zajistila co největší spolehlivost měření všemi přístroji a v různých dnech. Experimentální skupiny by měly být mezi přístroje rozděleny pokud možno vyváženě. Každé zvíře se testuje jednotlivě. Experimentální skupiny by měly být testovány vyváženě v různou denní dobu s cílem vyloučit zkreslení denními rytmy aktivity. Je třeba dbát na to, aby byly rozdíly ve zkušebních podmínkách co nejmenší a nesouvisely automaticky s aplikací. Mnohá měření chování včetně měření motorické aktivity mohou ovlivnit takové proměnné, jako je úroveň zvuku, velikost a tvar zkušební klece, teplota, relativní vlhkost, světelné podmínky, zápachy, použití chovné klece nebo nové, zkušební klece a odchylky v prostředí.

Motorické a smyslové funkce

36. Motorické a smyslové funkce se podrobně vyšetřují nejméně jednou za období dospívání a jednou v období mladé dospělosti (např. 60.–70. postnatální den). O testování v době odstavení pojednává odstavec 32. Zkoušení by se mělo provádět v dostatečném rozsahu, aby zajistilo dostatečný kvantitativní odběr vzorků smyslových podnětů (např. somatosenzorických, vestibulárních) a motorických aktivit (např. síla, koordinace). Jako několik příkladů zkoušek motorických a smyslových funkcí lze uvést vzpěrnou reakci extenzorů (46), reflex rovnováhy (47)(48), přivykání úlekové reakci na zvukový podnět (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) a evokované potenciály (55).

Zkoušky učení a paměti

37. Zkouška asociativního učení a paměti se provádí po odstavení (např. 25. postnatální den ± 2 dny) a u mladých dospělých (60. postnatální den a starší). K testování v době odstavení viz odstavec 32. V obou těchto vývojových stadiích lze použít stejnou nebo odlišnou zkoušku (zkoušky). Při volbě zkoušky (zkoušek) učení a paměti u odstavených mláďat a dospělých potkanů je povolena určitá pružnost. Zkoušky by však měly být koncipovány tak, aby splňovaly dvě kritéria. Zaprvé, učení by mělo být posuzováno buď jako změna mezi několika opakovanými pokusy nebo sezeními zabývajícími se učením, nebo při zkouškách sestávajících z jediného pokusu s odkazem na určitou podmínku, která kontroluje neasociativní účinky zkušeností získaných výcvikem. Zadruhé, zkoušky by kromě počátečního učení (nabytí) měly zahrnovat určité měření paměti (krátkodobé nebo dlouhodobé), ale toto měření paměti nelze zaznamenat bez měření osvojených prvků získaných při stejné zkoušce. Jestliže zkouška (zkoušky) učení a paměti zjistí účinek zkoušené chemické látky, lze zvážit další zkoušky za účelem vyloučení jiné interpretace založené na změnách smyslových, motivačních a/nebo motorických schopností. Kromě obou výše uvedených kritérií se doporučuje, aby byla zkouška učení a paměti zvolena na základě prokázané citlivosti na třídu zkoumaných chemických látek, pokud jsou takové informace v literatuře dostupné. Pokud takové informace neexistují, lze pro splnění výše uvedených kritérií provést například tyto zkoušky: pasivní vyhýbání (43)(56)(57), test pracovní paměti (DMP) pro dospělé potkany (58) a mláďata potkanů (59), čichové podmiňování (43)(60), Morrisovo vodní bludiště (61)(62)(63), Bielovo bludiště nebo bludiště Cincinnati (64)(65), radiální bludiště (66), ‚T‘ bludiště (43) a osvojení a uchovávání pravidelných návyků (26)(67)(68). V literatuře jsou popsány další zkoušky pro odstavená mláďata (26)(27) a dospělé potkany (19) (20).

Pitva

38. Matky lze po odstavení potomstva utratit.

39. Neuropatologické hodnocení potomstva se provede vyšetřením tkání zvířat humánně usmrcených v 22. postnatální den nebo v dřívějším časovém bodě mezi 11. a 22. postnatálním dnem, jakož i při ukončení studie. U potomstva usmrceného do 22. postnatálního dne se hodnotí mozkové tkáně, u zvířat usmrcených při ukončení se hodnotí tkáně centrální nervové soustavy (CNS) a tkáně periferní nervové soustavy (PNS). Zvířata usmrcená v 22. postnatální den nebo dříve lze fixovat ponořením do fixačního roztoku nebo perfuzí. Zvířata usmrcená při ukončení studie by měla být fixována perfuzí. Všechny aspekty přípravy tkáňových vzorků, od perfuze zvířat, přes odebrání tkáňových vzorků, zpracování tkání a barvení preparátů by měly být vyváženě koncipovány tak, aby každá sada obsahovala reprezentativní vzorky z každé exponované skupiny. Další pokyny týkající se neuropatologie lze nalézt v Pokynu OECD č. 20 (9), viz také (103).

Zpracování tkáňových vzorků

40. Všechny závažné abnormality zjevné v průběhu pitvy se zaznamenají. Odebrané tkáňové vzorky by měly reprezentovat všechny hlavní oblasti nervové soustavy. Vzorky tkání by měly být ponechány ve vhodném fixativu a zpracovány podle standardizovaných zveřejněných histologických protokolů (69)(70)(71)(103). U tkání centrální nervové soustavy a periferní nervové soustavy je přípustné zalití do parafinu, avšak je-li požadován větší stupeň rozlišení (např. u periferních nervů, pokud existuje podezření na periferální neuropatii a/nebo při morfometrické analýze periferních nervů), může být vhodná postfixace osmiem spolu se zalitím do pryskyřice. Mozkové tkáně získané pro morfometrickou analýzu by měly být zality do vhodného média na všech úrovních dávky ve stejnou dobu, aby se zamezilo artefaktům vzniklým smrštěním, ke kterému může dojít v souvislosti s dlouhým uchováváním ve fixativu.

Neuropatologické vyšetření

41. Účelem kvalitativního vyšetření je:

i) zjistit oblasti nervové soustavy vykazující známky neuropatologických změn;

ii) zjistit typy neuropatologických změn vyplývajících z expozice zkoušené chemické látce; a

iii) stanovit míru závažnosti těchto neuropatologických změn.

Reprezentativní histologické řezy tkáňových vzorků se mikroskopicky zkoumají za účelem prokázání neuropatologických změn, vyšetření provádí patolog s odpovídající kvalifikací. Všem neuropatologickým změnám se přiřadí subjektivní stupeň vyjadřující jejich závažnost. Pro hodnocení řezů mozku zvířat, jež byla humánně usmrcena v 22. postnatální den nebo dříve, může být dostatečné barvení pomocí hematoxylinu a eosinu. U řezů tkání centrální nervové soustavy a periferní nervové soustavy zvířat usmrcených při ukončení studie se však doporučuje použít barviva na myelin (např. luxolová modř/kresylová violeť) a barvení stříbrem (např. podle Bielschowského nebo Bodiana). Na základě odborného úsudku patologa a druhu pozorovaných změn lze zvážit jiná barvení vhodná pro zjištění a charakterizaci konkrétních typů změn (např. gliální fibrilární acidický protein (GFAP) nebo lektinová histochemie pro posouzení gliálních a mikrogliálních změn (72), fluoro-jade pro zjišťování nekrózy (73)(74) nebo stříbrná barvení používaná při degeneraci nervové soustavy (75)).

42. Mělo by být prováděno morfometrické (kvantitativní) hodnocení, jelikož tyto údaje mohou pomoci při zjišťování účinků souvisejících s expozicí a jsou cenné pro interpretaci rozdílů v hmotnosti mozku nebo v morfologii souvisejících s expozicí. K tomu, aby bylo možno provést morfometrické hodnocení, je třeba odebrat a připravit nervovou tkáň. Morfometrická hodnocení mohou zahrnovat např. lineární nebo plošné měření konkrétních oblastí mozku (78). Lineární nebo plošná měření vyžadují použití homologických řezů pečlivě vybraných na základě spolehlivých mikroskopických znaků (6). Ke zjištění účinků expozice na parametry, jako je objem konkrétních neuroanatomických oblastí nebo počet buněk v těchto oblastech lze použít stereologii (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. Vyšetření mozků by se mělo zaměřit na veškeré příznaky neuropatologických změn souvisejících s expozicí a měly by být odebrány dostatečné vzorky ze všech hlavních oblastí mozku (např. čichové laloky, mozková kůra, hippocampus, bazální ganglia, thalamus, hypothalamus, střední mozek (tektum, tegmentum a pedunculi cerebrales), Varolův most, prodloužená mícha, mozeček), což umožní důkladné vyšetření. Je důležité, aby řezy byly u všech zvířat prováděny ve stejné rovině. Z dospělých zvířat humánně usmrcených při ukončení studie se odeberou reprezentativní řezy páteřní míchy a periferní nervové soustavy. Zkoumané oblasti by měly zahrnovat oko s očním nervem a sítnicí, míchu v oblasti cervikálního a lumbálního zesílení, dorzální a ventrální kořenová vlákna, n. ischiadicus – proximální část a n. tibialis – proximální část (v oblasti kolena) a n. tibialis z oblasti lýtkového svalu. Řezy míchy a periferních nervů by měly zahrnovat jak příčné, tak i podélné řezy.

44. Neuropatologické hodnocení by mělo zahrnovat vyšetření na příznaky vývojových poškození nervové soustavy (6)(85)(86)(87)(88)(89), dále na buněčné změny (např. vakuolizace, degenerace a nekróza neuronů) a tkáňové změny (např. glióza, infiltrace leukocytů, tvorba cyst). V této souvislosti je důležité odlišit účinky související s expozicí od běžných vývojových jevů, ke kterým, jak známo, dochází ve stadiu vývoje odpovídajícím době usmrcení (90). Významnými změnami, jež ukazují na vývojovou poruchu, jsou mimo jiné tyto:

— změny v absolutní velikosti nebo tvaru čichových laloků, mozku nebo mozečku,

— změny v relativní velikosti různých oblastí mozku, včetně zvětšené nebo zmenšené velikosti oblastí vyplývající ze ztráty nebo přetrvávání normálně přechodných populací buněk nebo z axonálních projekcí (např. vnější zárodečná vrstva mozečku, kalózní těleso),

— změny v proliferaci, migraci a diferenciaci ověřené podle oblastí nadměrné apoptózy nebo nekrózy, klastrů nebo rozptýlených populací ektopických, dezorientovaných nebo malformovaných neuronů, nebo změny v relativní velikosti různých vrstev kortikálních struktur,

— změny v myelinaci, včetně snížení celkové velikosti nebo odlišného zbarvení myelinových struktur,

— příznaky hydrocefalu, zejména zvětšení komor, stenóza cerebrálního akvaduktu a zúžení cerebrálních hemisfér.

Analýza neuropatologických změn z hlediska vztahu dávka-odpověď

45. Pro kvalitativní a kvantitativní neuropatologické analýzy se doporučuje následující postup sestávající z postupných kroků. Zaprvé, řezy ze skupiny, které byla podávána vysoká dávka, se porovnají s řezy z kontrolní skupiny. Jestliže se u zvířat ze skupiny s vysokou dávkou nenajdou žádné příznaky neuropatologických změn, není žádná další analýza nutná. Jestliže se ve skupině s vysokou dávkou najdou příznaky neuropatologických změn, vyšetří se zvířata ze skupin, kterým byla podávána střední a nízká dávka. Jestliže je skupina s vysokou dávkou ukončena v důsledku úhynu nebo jiné zkreslující toxicity, měly by se analyzovat neuropatologické změny ve skupinách s vysokou a střední dávkou. Existují-li jakékoli příznaky neurotoxicity ve skupinách s nižší dávkou, měla by být provedena neuropatologická analýza těchto skupin. Jestliže se při kvalitativním nebo kvantitativním vyšetření naleznou neuropatologické změny související s expozicí, měla by být stanovena závislost výskytu, četnost a stupeň závažnosti lézí nebo morfometrických změn na velikosti dávky, a to na základě hodnocení všech zvířat ze všech exponovaných skupin. Do tohoto hodnocení by měly být zařazeny všechny oblasti mozku, které vykazují příznaky neuropatologické změny. U každého typu lézí by měly být popsány typické znaky, podle nichž byl stanoven každý stupeň závažnosti, a uvedou se prvky sloužící k odlišení každého stupně od ostatních stupňů. Zaznamená se četnost a stupeň závažnosti každého typu lézí a provede se statistická analýza za účelem zhodnocení vztahu dávka-odpověď. Doporučuje se použít kódované preparáty (91).

ÚDAJE A ZPRÁVy

Údaje

46. Výsledky se zaznamenávají individuálně a shrnou se do tabulek tak, aby byly u každé experimentální skupiny uvedeny typy změn a počet samic, potomstvo podle pohlaví a vrhy vykazující každý typ změny. Pokud byla prováděna přímá postnatální expozice potomstva, uvede se způsob, trvání a doba expozice.

Hodnocení a interpretace výsledků

47. Studie vývojové neurotoxicity bude obsahovat informace o účincích opakované expozice určité chemické látce během vývoje in utero a raně postnatálního vývoje. Vzhledem k tomu, že důraz je kladen na ukazatele všeobecné toxicity i na ukazatele vývojové neurotoxicity, umožní výsledky této studie rozlišení mezi účinky na vývoj nervové soustavy vyskytujícími se za nepřítomnosti všeobecné toxicity u matek a mezi účinky vyvolanými pouze na úrovních, které jsou toxické i pro březí samice. V důsledku složitých vzájemných souvislostí mezi koncepcí studie, statistickou analýzou a biologickým významem údajů, bude odpovídající interpretace údajů o vývojové neurotoxicitě zahrnovat odborný posudek (107)(109). Při interpretaci výsledků zkoušek by měl být uplatněn přístup založený na existujících průkazných faktech (20)(92)(93)(94). Uvede se charakteristika behaviorálních nebo morfologických nálezů, pokud jsou přítomny, a poznatky o vztahu dávka-reakce. Tato charakterizace by měla zahrnovat údaje ze všech studií, které mají význam pro hodnocení vývojové neurotoxicity, včetně epidemiologických studií nebo případových studií u lidí a studií na pokusných zvířatech (např. toxikokinetické údaje, informace o vztahu struktura-účinek, údaje z jiných studií toxicity). Patří sem i vztah mezi dávkami zkoušené chemické látky a přítomností či nepřítomností, četností a rozsahem jakýchkoli neurotoxických účinků na každé pohlaví (20)(95).

48. Hodnocení údajů by mělo zahrnovat rozbor výsledků z hlediska jejich biologického i statistického významu. Na statistickou analýzu je nutno pohlížet jako nástroj k řízení, a nikoli nástroj předurčující interpretaci údajů. Nedostatečná statistická významnost by neměla být jediným odůvodněním pro učinění závěru o neexistenci účinku souvisejícího s expozicí, stejně tak jako statistická významnost by neměla být jediným odůvodněním pro vyvození závěru o existenci účinku souvisejícího s expozicí. Aby se zamezilo případným falešně negativním výsledkům a přirozeným potížím při ‚prokazování negativního‘, měly by být podrobeny rozboru dostupné pozitivní a historické kontrolní údaje, zejména pokud neexistují žádné účinky související s expozicí (102)(106). Pravděpodobnost falešně pozitivních výsledků by měla být analyzována s ohledem na celkové statistické hodnocení údajů (96). Hodnocení by mělo zahrnovat vztah mezi pozorovanými neuropatologickými a behaviorálními změnami, pokud takový vztah existuje.

49. Všechny výsledky by měly být analyzovány pomocí statistických modelů vhodných z hlediska koncepce daného experimentu (108). Volba parametrické nebo neparametrické analýzy by měla být zdůvodněna s přihlédnutím k takovým faktorům, jakými jsou povaha údajů (zda jsou transformovány, či nikoli) a jejich distribuce, jakož i relativní spolehlivost zvolené statistické analýzy. Záměr a koncepce studie by měly určovat volbu metod statistické analýzy, aby se minimalizovaly chyby typu I (falešně pozitivní) a typu II (falešně negativní) (96)(97)(104)(105). Vývojové studie, které používají druhy s vícečetnými vrhy, kdy je testováno více mláďat z každého vrhu, by měly mít ve statistickém modelu zahrnut i vrh, aby se zabránilo zvýšenému výskytu chyb I. typu (98)(99)(100)(101). Statistickou jednotkou pro hodnocení výsledků by měl být vrh, a nikoli mládě. Experimenty by měly být koncipovány tak, aby výsledky získané u sourozenců z vrhu nebyly považovány za nezávislá pozorování. Všechny sledované vlastnosti měřené opakovaně u stejného subjektu by měly být analyzovány pomocí statistických modelů, které zohledňují, že tato měření nejsou nezávislá.

Protokol o zkoušce

50. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

Zkoušená chemická látka:

— fyzikální povaha a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti,

— identifikační údaje, včetně zdroje,

— čistota přípravku a známé a/nebo předpokládané nečistoty.

Vehikulum (je-li použito):

— zdůvodnění volby jiného vehikula, pokud není použita voda nebo fyziologický solný roztok.

Pokusná zvířata:

— použitý druh a kmen a zdůvodnění použití jiných pokusných zvířat, není-li použit potkan,

— dodavatel pokusných zvířat,

— počet, věk na začátku a pohlaví zvířat;

— původ, podmínky chovu, strava, voda atd.,

— hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky.

Podmínky pro provádění zkoušky:

— zdůvodnění volby dávek,

— zdůvodnění způsobu podání a doby podávání dávek,

— specifikace aplikovaných dávek, včetně podrobností o vehikulu, objemu a fyzikální formě aplikovaného materiálu,

— podrobnosti o složení zkoušené chemické látky/úpravě potravy, o použité koncentraci, stálosti a homogenitě přípravku,

— metoda použitá pro jednoznačnou identifikaci samic a potomstva,

— podrobný popis postupu (postupů) náhodného výběru použitých pro přiřazení samic do experimentálních skupin, výběru mláďat pro utracení a zařazení mláďat do exponovaných skupin,

— podrobnosti o podávání zkoušené chemické látky,

— popřípadě přepočet koncentrace zkoušené látky v potravě/pitné vodě nebo inhalaci (ppm) na skutečnou denní dávku (mg na 1 kg tělesné hmotnosti),

— podmínky prostředí,

— podrobné údaje o stravě a kvalitě vody (např. vodovodní, destilovaná),

— datum zahájení a datum ukončení studie.

Pozorování a zkušební postupy:

— podrobný popis postupů použitých pro standardizaci pozorování a postupů, jakož i operativních definic pro pozorování s bodovacím systémem hodnocení účinků,

— seznam všech použitých zkušebních postupů a zdůvodnění jejich použití,

— podrobnosti o použitých behaviorálních/funkčních, patologických, neurochemických nebo elektrofyziologických postupech, včetně informací a podrobností o automatických zařízeních,

— postupy pro kalibrování a zajištění rovnocennosti zařízení a vyvážení experimentálních skupin v rámci zkušebních postupů,

— stručné zdůvodnění všech rozhodnutí obsahujících profesionální úsudky.

Výsledky (individuální i souhrnné, případně včetně střední hodnoty a rozptylu:

— počet zvířat na začátku studie a na konci studie,

— počet zvířat a vrhů použitých pro každou zkušební metodu,

— identifikační číslo každého zvířete a vrhu, z kterého pochází,

— velikost vrhu a střední hmotnost při narození podle pohlaví,

— údaje o tělesné hmotnosti a o změnách tělesné hmotnosti, včetně konečné tělesné hmotnosti samic a potomstva,

— údaje o spotřebě potravy a popřípadě o spotřebě vody (např. pokud je zkoušená látka podávána s pitnou vodou),

— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávky, včetně příznaků toxicity nebo úmrtnosti, popřípadě doba a příčina úmrtí,

— povaha, závažnost, trvání, den nástupu, denní doba a následný průběh podrobných klinických pozorování,

— bodové hodnocení každého vývojového znaku (hmotnost, pohlavní zralost a behaviorální ontogeneze) v každé době pozorování,

— podrobný popis všech behaviorálních, funkčních, neuropatologických, neurochemických, elektrofyziologických nálezů podle pohlaví, včetně nárůstů a poklesů v porovnání s kontrolními skupinami;

— pitevní nálezy,

— hmotnosti mozků,

— jakékoli diagnózy vyvozené z neurologických znaků a lézí, včetně přirozeně se vyskytujících chorob nebo stavů,

— zobrazení exemplárních nálezů,

— zobrazení s nízkým rozlišením pro posouzení homologie řezů použitých pro morfometrii,

— údaje o absorpci a metabolismu, včetně doplňujících údajů ze samostatné toxikokinetické studie, je-li k dispozici,

— statistické zpracování výsledků, včetně statistických modelů použitých pro analýzu údajů, a výsledky, bez ohledu na to, zda byly významné, či nikoli,

— seznam personálu studie, včetně jeho odborné kvalifikace.

Rozbor výsledků:

— informace o reakci na dávky podle pohlaví a skupin,

— význam veškerých dalších toxických účinků pro závěry týkající se neurotoxického potenciálu zkoušené chemické látky podle pohlaví a skupin,

— dopad toxikokinetických informací na závěry,

— podobnost účinků jakýmkoli známým látkám schopným vyvolat neurotoxicitu,

— údaje podporující spolehlivost a citlivost zkušební metody (tj. pozitivní a historické kontrolní údaje).

— souvislosti, existují-li, mezi neuropatologickými a funkčními účinky,

— NOAEL (hodnota dávky bez pozorovaného nepříznivého účinku) nebo referenční dávka pro samice a potomstvo podle pohlaví a skupiny.

Závěry:

— rozbor celkové interpretace údajů na základě výsledků, včetně závěru, zda zkoušená látka způsobila vývojovou neurotoxicitu či nikoli, a NOAEL.

LITERATURA

1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Kodaň, Dánsko, 13.–14. června 1995.

2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Dostupné na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Dostupné na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109, 79–91.

5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109, 101–111.

6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109, 93–100.

7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23–25 October 2000.

8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008. Dostupné na: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage=en].

9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Dostupné na: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12, 173–292.

11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8, 188–197.

13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

14) Kapitola B.34 této přílohy, Jednogenerační zkouška toxicity pro reprodukci.

15) Kapitola B.35 této přílohy, Dvougenerační studie reprodukční toxicity.

16) Kapitola B.43 této přílohy, Studie neurotoxicity na hlodavcích.

17) Kapitola B.31 této přílohy, Studie prenatální vývojové toxicity.

18) Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely. Úř. věst. L 276, 20.10.2010, s. 33.

19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Dostupné na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Dostupné na: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19, 499–509.

23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38, 2–6.

24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27, 110–112.

25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13, 118–136.

26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24, 87–94.

30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4.

31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5 A). Mezinárodní konference o harmonizaci technických požadavků na registraci humánních léčivých přípravků.

32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6, 433–439.

33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20, 449–457.

34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13, 383–390.

35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58, 350–365.

36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7, 579–586.

37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17, 298–303.

38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12, 489-495.

39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23, 896–920.

40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Raven Press, New York, s. 67–100.

41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1, 53–66.

42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Raven Press, New York, s. 37–82.

43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15, 117-129.

44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18, 247-260.

45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599–609.

46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19, 1997. 405–411.

47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64, 61–669.

48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40, 589–591.

49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, s. 287–351.

50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59, 107–128.

51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, s. 181–211.

52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8, 199–211.

53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80, 25–30.

54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6, 437–445.

55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. s. 125–145.

56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105, 321–332.

57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6, 247–296.

58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10, 237–244.

59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103, 98–105.

60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17, 465–479.

61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11, 47–60.

62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48, 29–69.

63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36, 60–90.

64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9, 235–241.

65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20, 387–399.

66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10, 327–332.

67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71, 342–352.

68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36, 338–341.

69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28, 122–131.

70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, s. 84–107.

71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24, 291–304.

73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874, 123–130.

74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53, 365–372.

75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.

76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19, 745–755.

77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20, 417–432.

78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1, 129–135.

79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57, 305–310.

81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609, 262–268.

82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26, 707–710.

83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22, 51–61.

84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130, 813–831.

85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49, 113–121.

86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84, 294–298.

87) Jensen, K.F., Catalano, S.M. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3–41.

88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283, 70–74.

89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287, 1056-1060.

90) Friede, R.L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63, 127–133.

92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104, 401–405.

93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644 A.

94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274–56322.

95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5, 113–126.

97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8, 21–27.

98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6, 329–335.

99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12, 165–172.

100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14, 221–228.

101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7, 587–590.

102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26, 345–352.

103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ‚best practices‘ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34, 296–313.

104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3), 205–210.

105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41, 295–301.

106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4), 266–287.

107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4), 288–325.

108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4), 326–348.

109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4), 349–381.

Obrázek 1

Obecný zkušební plán funkčních/behaviorálních zkoušek, neuropatologického hodnocení a stanovení hmotností mozku. Tento diagram vychází z popisu uvedeného v odstavci 13–15 (PND = postnatální den). Příklady rozdělení zvířat jsou uvedeny v dodatku 1

Dodatek 1 1. Příklady možného rozdělení jsou popsány a uvedeny v tabulce níže. Tyto příklady mají ukázat, že rozdělení zvířat v rámci studie podle různých zkušebních paradigmat může být provedeno několika různými způsoby. Příklad č. 1 2. Pro zkoušky behaviorální ontogeneze před odstavením se použije jedna sada 20 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu). Z těchto zvířat se v 22. postnatální den humánně usmrtí 10 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu). Mozky se vyjmou, zváží a zpracují pro histopatologické hodnocení. Kromě toho se shromáždí údaje o hmotnosti mozku s použitím nefixovaných mozků ostatních 10 samců a 10 samic z každé úrovně dávky. 3. Další sada 20 zvířat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu) se použije pro funkčně/behaviorální zkoušky po odstavení (podrobná klinická pozorování, motorická aktivita, úleková reakce na zvukový podnět a zkoušení poznávacích funkcí u dospívajících) a pro posouzení věku pohlavní zralosti. Z těchto zvířat se 10 zvířat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) anestetizuje a fixuje perfuzí při ukončení studie (přibližně 70. postnatální den). Po další fixaci in situ se vyjme mozek a zpracuje se pro neuropatologické hodnocení. 4. Pro zkoušky poznávacích funkcí u mladých dospělých (např. 60.–70. postnatální den) se použije třetí sada 20 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu). Z těchto zvířat se 10 zvířat od každého pohlaví a každé skupiny (1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) při ukončení studie usmrtí a mozek se vyjme a zváží. 5. Zbývajících 20 zvířat od každého pohlaví a každé skupiny se ponechá v záloze pro případné další zkoušky. Tabulka 1 Mládě č. (8) Počet mláďat zařazených do zkoušky Vyšetření/zkouška ♂ ♀ 1 5 20 ♂ + 20 ♀ Behaviorální ontogeneze 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfometrie mozku, 22. postnatální den 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost mozku, 22. postnatální den 2 6 20 ♂ + 20 ♀ Podrobná klinická pozorování 20 ♂ + 20 ♀ Motorická aktivita 20 ♂ + 20 ♀ Pohlavní zralost 20 ♂ + 20 ♀ Motorické a smyslové funkce 20 ♂ + 20 ♀ Učení a paměť (25. postnatální den) 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfometrie mozku mladých dospělých ~ 70. postnatální den) 3 7 20 ♂ + 20 ♀ Učení a paměť (mladí dospělí) 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost mozku mladých dospělých ~ 70. postnatální den) 4 8 — Zvířata v rezervě pro nahrazení nebo další zkoušky Příklad č. 2 6. Pro zkoušky behaviorální ontogeneze před odstavením se použije jedna sada 20 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu). Z těchto zvířat se v 11. postnatální den 10 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) humánně usmrtí. Mozky se vyjmou, zváží a zpracují pro histopatologické hodnocení. 7. Další sada 20 zvířat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (1 samec a 1 samice z každého vrhu) se použije pro vyšetření po odstavení (podrobná klinická pozorování, motorická aktivita, posouzení věku pohlavní zralosti a motorické a smyslové funkce). Z těchto zvířat se 10 zvířat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) anestetizuje a fixuje perfuzí při ukončení studie (přibližně v 70. postnatální den). Po další fixaci in situ se vyjme mozek, zváží se a zpracuje pro neuropatologické hodnocení. 8. Pro testování poznávacích funkcí u dospívajících a mladých dospělých se použije 10 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu). Pro zkoušky poznávacích funkcí v 23. postnatální den a u mladých dospělých se použijí odlišná zvířata. Při ukončení se 10 zvířat od každého pohlaví a každé skupiny, která byla testována jako dospělá, usmrtí, mozek se vyjme a zváží. 9. Zbývajících 20 zvířat od každého pohlaví a každé skupiny, která nebyla vybrána pro zkoušky, se při odstavení usmrtí a vyloučí. Tabulka 2 Mládě č. (9) Počet mláďat zařazených do zkoušky Vyšetření/zkouška ♂ ♀ 1 5 20 ♂ + 20 ♀ Behaviorální ontogeneze 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfometrie mozku, 11. postnatální den 2 6 20 ♂ + 20 ♀ Podrobná klinická pozorování 20 ♂ + 20 ♀ Motorická aktivita 20 ♂ + 20 ♀ Pohlavní zralost 20 ♂ + 20 ♀ Motorické a smyslové funkce 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfometrie mozku mladých dospělých ~ 70. postnatální den) 3 7 10 ♂ + 10 ♀ (10) Učení a paměť (23. postnatální den) 3 7 10 ♂ + 10 ♀ (10) Učení a paměť (mladí dospělí) Hmotnost mozku mladých dospělých 4 8 — Zvířata usmrcená a vyloučená, 21. postnatální den Příklad č. 3 10. Pro posouzení hmotnosti mozku a neuropatologie v 11. postnatální den se použije jedna sada 20 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu). Z těchto zvířat se v 11. postnatální den 10 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) humánně usmrtí, mozky se vyjmou, zváží a zpracují pro histopatologické hodnocení. Kromě toho se shromáždí údaje o hmotnosti mozku s použitím nefixovaných mozků ostatních 10 samců a 10 samic z každé úrovně dávky. 11. Další sada 20 zvířat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu) se použije pro testování behaviorální ontogeneze (motorická aktivita), vyšetření po odstavení (motorická aktivita a posouzení věku pohlavní zralosti) a testování poznávacích funkcí u dospívajících. 12. Další sada 20 zvířat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu) se použije pro zkoušky motorických a smyslových funkcí (úleková reakce na zvukový podnět) a pro podrobná klinická pozorování. Z těchto zvířat se 10 zvířat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) anestetizuje a fixuje perfuzí při ukončení studie (přibližně v 70. postnatální den). Po další fixaci in situ se vyjme mozek, zváží se a zpracuje pro neuropatologické hodnocení. 13. Další sada 20 mláďat od každého pohlaví a každé úrovně dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu) se použije pro zkoušení poznávacích funkcí u mladých dospělých. Z těchto zvířat se 10 zvířat od každého pohlaví a každé skupiny (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) usmrtí při ukončení studie, mozek se vyjme a zváží. Tabulka 3 Mládě č. (11) Počet mláďat zařazených do zkoušky Vyšetření/zkouška ♂ ♀ 1 5 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfometrie mozku v 11. postnatální den 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost mozku v 11. postnatální den 2 6 20 ♂ + 20 ♀ Behaviorální ontogeneze (motorická aktivita) 20 ♂ + 20 ♀ Motorická aktivita 20 ♂ + 20 ♀ Pohlavní zralost 20 ♂ + 20 ♀ Učení a paměť (27. postnatální den) 3 7 20 ♂ + 20 ♀ Úleková reakce (dospívající a mladí dospělí) 20 ♂ + 20 ♀ Podrobná klinická pozorování 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfometrie mozku mladých dospělých ~ 70. postnatální den 4 8 20 ♂ + 20 ♀ Učení a paměť (mladí dospělí) 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost mozku mladých dospělých

Dodatek 2 Definice Chemická látka: látka nebo směs. Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou.

B.54. UTEROTROFNÍ BIOLOGICKÁ ZKOUŠKA NA HLODAVCÍCH: KRÁTKODOBÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA ESTROGENNÍCH VLASTNOSTÍ

ÚVOD

1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 440 (2007). Organizace OECD v roce 1998 zahájila činnost s vysokou prioritou zaměřenou na revizi stávajících pokynů a vypracování nových pokynů pro screening a zkoušení potenciálních endokrinních disruptorů (1). Jedním z prvků této činnosti bylo vypracovat metodický návod pro provádění uterotrofní biologické zkoušky u hlodavců. Uterotrofní biologická zkouška u hlodavců poté prošla rozsáhlým validačním programem, který mimo jiné zahrnoval sestavení podrobného podkladového dokumentu (2)(3) a provedení rozsáhlých vnitrolaboratorních a mezilaboratorních studií, aby se prokázal význam a reprodukovatelnost biologické zkoušky s účinným referenčním estrogenem, slabými agonisty estrogenního receptoru, silným antagonistou estrogenního receptoru a negativní referenční chemickou látkou (4)(5)(6)(7)(8)(9). Tato zkušební metoda B.54 vychází ze zkušeností získaných během programu validačních zkoušek a z výsledků těchto zkoušek s agonisty estrogenů.

2. Uterotrofní biologická zkouška je krátkodobá screeningová zkouška, která pochází z 30. let 20. století (27)(28) a standardizovanou screeningovou metodou se stala na základě rozhodnutí expertního výboru v roce 1962 (32)(35). Je založena na zvýšení hmotnosti dělohy neboli uterotrofní reakce (přehled viz 29). Hodnotí schopnost chemické látky vyvolávat biologické aktivity odpovídající agonistům nebo antagonistům přírodních estrogenů (např. 17-beta-estradiolu), avšak její použití pro zjištění antagonistních látek je mnohem méně obvyklé než pro zjištění agonistních látek. Děloha reaguje na estrogeny dvojím způsobem: Počáteční reakcí je zvýšení hmotnosti v důsledku nasáknutí vodou. Po této reakci následuje nárůst hmotnosti v důsledku růstu tkáně (30). Reakce dělohy u potkanů a u myší jsou kvalitativně srovnatelné.

3. Tato biologická zkouška slouží jako screeningová zkouška in vivo a na její provedení je třeba pohlížet v kontextu ‚Koncepčního rámce OECD pro zkoušky a posuzování chemických látek narušujících činnost endokrinních žláz‘ (dodatek 2). V tomto koncepčním rámci je uterotrofní biologická zkouška zařazena na úroveň 3 jako zkouška in vivo poskytující údaje o jediném endokrinním mechanismu, tj. estrogenitě.

4. Předpokládá se zařazení uterotrofní biologické zkoušky do baterie zkoušek in vitro a in vivo za účelem zjištění chemických látek schopných interakce s endokrinním systémem, která nakonec bude sloužit k posouzení rizik pro lidské zdraví nebo životní prostředí. V rámci validačního programu OECD byli používáni silní a slabí agonisté estrogenu s cílem zhodnotit schopnost zkoušky identifikovat estrogenní chemické látky (4)(5)(6)(7)(8). Tímto způsobem byla jasně prokázána citlivost tohoto zkušebního postupu z hlediska agonistů estrogenu, jakož i dobrá vnitrolaboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnost.

5. Pokud jde o negativní chemické látky, byla do validačního programu zařazena pouze jedna ‚negativní‘ referenční chemická látka, u které byly známy negativní výsledky z uterotrofní zkoušky a dalších zkoušek in vitro s využitím receptorů a vazby na receptory. Avšak byly zhodnoceny i další zkušební údaje nesouvisející s validačním programem OECD, jež dále podpořily specifičnost uterofrofní biologické zkoušky pro screening agonistů estrogenů (16).

VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ

6. Agonisté a anatagonisté estrogenů působí jako ligandy pro alfa a beta receptory estrogenů a mohou aktivovat nebo potlačovat transkripční aktivitu receptorů. To může potenciálně vést k nepříznivým zdravotním důsledkům, včetně účinků na reprodukci a vývoj. Proto existuje potřeba rychlého posouzení a zhodnocení chemické látky jakožto možného agonisty nebo antagonisty estrogenů. Afinita ligandu k estrogenovému receptoru nebo aktivace transkripce reporterových genů in vitro, byť informativní, je pouze jedním z několika určujících faktorů možného nebezpečí. Jiné určující faktory mohou zahrnovat aktivaci a deaktivaci metabolismu po vstupu do organismu, distribuci do cílových tkání a odstranění z těla, což přinejmenším zčásti závisí na způsobu podávání a na zkoušené chemické látce. Z toho vyplývá potřeba zjištění možné aktivity chemické látky in vivo za určitých podmínek, pokud dostatečné informace neposkytují již vlastnosti ADME (absorpce – distribuce – metabolismus – eliminace) dané chemické látky. Děložní tkáně reagují na stimulaci estrogeny rychlým a mohutným růstem, zejména u laboratorních hlodavců, kde estrální cyklus trvá přibližně čtyři dny. Druhy hlodavců, zejména potkan, se rovněž široce používají ve studiích toxicity za účelem charakterizace nebezpečí. Děloha hlodavců je proto vhodným cílovým orgánem pro zjišťování estrogenních agonistů a antagonistů in vivo.

7. Tato zkušební metoda je založena na postupech použitých při validační studii OECD, u kterých byla při vnitrolaboratorních a mezilaboratorních studiích prokázána jejich spolehlivost a opakovatelnost. V současné době jsou k dispozici dvě metody, a sice metoda používající dospělé samice s odstraněnými vaječníky a metoda s použitím nezralých mláďat bez odstranění vaječníků. V rámci programu validačních zkoušek OECD bylo prokázáno, že obě metody mají srovnatelnou citlivost a reprodukovatelnost. Nezralé mládě, protože má intaktní hypothalamo-hypofýzo-gonadální (HPG) osu, je ovšem poněkud méně specifické, avšak umožňuje širší rozsah vyšetření než zvíře s odstraněnými vaječníky, jelikož může reagovat na chemické látky, které interagují s HPG osou, a nikoli pouze s estrogenním receptorem. HPG osa potkana je funkční přibližně ve věku 15 dnů. Předtím nelze pubertu urychlit, např. podáváním hormonu uvolňujícího gonadotropiny. Jak samice začínají dosahovat puberty, budou mít před otevřením vaginy několik tichých cyklů, které nevedou k vaginálnímu otevření nebo k ovulaci, ale v organismu probíhají určité hormonální výkyvy. Jestliže určitá chemická látka přímo či nepřímo stimuluje HPG osu, vede to k předčasné pubertě, časné ovulaci a urychlenému vaginálnímu otevření. Takové účinky mohou být vyvolány nejen chemickými látkami prostřednictvím působení na HPG osu, ale podobný účinek může mít i určitý typ potravy. Některé diety s vyšší úrovní metabolizovatelné energie mohou stimulovat růst a urychlovat vaginální otevření, aniž by byly přímo estrogenní. U dospělých zvířat s odstraněnými vaječníky by takové chemické látky nevyvolávaly uterotrofní reakci, jelikož jejich HPG osa nefunguje.

8. S ohledem na zásadu dobrého zacházení se zvířaty by měla být upřednostňována metoda používající nezralé potkany, kdy nedochází k chirurgické předúpravě zvířat a nedochází také k případnému nepoužití těch zvířat, která vykazují příznaky estru (říje) (viz odstavec 30).

9. Uterotrofní reakce není čistě estrogenního původu, tj. reakci mohou vyvolat i jiné chemické látky než agonisté nebo antagonisté estrogenů. Například ke stimulativní reakci mohou vést poměrně vysoké dávky progesteronu, testosteronu nebo různých syntetických progestinů (30). Jakoukoli reakci lze analyzovat histologicky z hlediska keratinizace a kornifikace vaginy (30). Bez ohledu na možný původ reakce by pozitivní výsledek uterotrofní biologické zkoušky měl běžně vyvolat kroky zaměřené na další vyjasnění. Další poznatky o estrogenitě by mohly přinést studie in vitro, jako jsou studie vazby na estrogenní receptory a studie transkripční aktivace, nebo jiné in vivo studie, jako např. studie puberty u samic.

10. Vzhledem k tomu, že uterotrofní biologická zkouška slouží jako screeningová zkouška in vivo, byla při validaci zaměřena pozornost hlavně na dobré zacházení se zvířaty a stupňovitou strategii zkoušení. Proto bylo úsilí zaměřeno na přísné ověření reprodukovatelnosti a citlivosti zkoušky na estrogenitu – což je hlavním zájmem u mnoha chemických látek – a složce antiestrogenity této zkoušky byla věnována malá pozornost. Zkoušen byl pouze jeden antiestrogen se silným působením, jelikož počet chemických látek s jasným antiestrogenním profilem (nezastíněným určitým estrogenním působením) je velmi omezený. Tato zkušební metoda je tudíž určena pro estrogenní protokol a protokol popisující antagonistní stránku zkoušky je obsažen v Pokynech (37). Reprodukovatelnost a citlivost zkoušky v případě chemických látek s čistě antiestrogenním působením bude přesněji stanovena později, až bude tento zkušební postup po nějakou dobu běžně používán a bude identifikováno více chemických látek s tímto druhem působení.

11. Má se za to, že veškeré postupy založené na zvířatech budou splňovat normy jednotlivých zemí v oblasti péče o zvířata. Popis péče a zacházení, který je stanoven níže, představuje minimální požadavky a bude nahrazen místními předpisy, např. směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely (38). Další pokyny týkající se humánního zacházení se zvířaty stanovila organizace OECD (25).

12. Stejně jako u všech zkoušek používajících živá zvířata je nezbytné před zahájením zkoušek zajistit, že údaje jsou skutečně nezbytné. Dvě podmínky, kdy mohou být údaje nutné, jsou například tyto:

— vysoký expoziční potenciál (úroveň 1 koncepčního rámce, dodatek 2) nebo příznaky estrogenity (úroveň 2), aby se zjistilo, zda takový účinek může nastat in vivo,

— účinky naznačující estrogenitu na úrovni 4 nebo 5 zkoušení in vivo, aby se potvrdilo, že tyto účinky souvisely s estrogenním mechanismem, který nelze objasnit použitím zkoušky in vitro.

13. Definice použité při této zkušební metodě jsou uvedeny v dodatku 1.

PODSTATA ZKOUŠKY

14. Uterotrofní biologická zkouška je z hlediska své citlivosti založena na systému testování zvířat, při kterém hypothalamo-hypofýzo-ovariální osa není funkční, což vede k nízkým endogenním úrovním cirkulujícího estrogenu. To zajistí nízkou výchozí hmotnost dělohy a maximální šíři reakce na podávané estrogeny. Tento požadavek splňují dva stavy samic hlodavců, kdy jsou citlivé na estrogeny:

i) nezralé samice po odstavení a před pubertou; a

ii) mladé dospělé samice po odstranění vaječníků s dostatečnou dobou na to, aby se děložní tkáně mohly vrátit do původního stavu.

15. Zkoušená chemická látka je podávána denně žaludeční sondou nebo subkutánní injekcí. Odstupňované dávky zkoušené chemické látky se podávají nejméně dvěma experimentálním skupinám (pro pokyny viz odstavec 33) pokusných zvířat s použitím jedné úrovně dávky na každou skupinu a dobou aplikace tři po sobě jdoucí dny v případě použití metody nezralých mláďat a nejméně tři po sobě jdoucí dny v případě metody dospělého zvířete s odstraněnými vaječníky. Přibližně 24 hodin po poslední dávce se zvířata podrobí pitvě. U agonistů estrogenu se posoudí střední hmotnost dělohy experimentálních skupin zvířat v porovnání se skupinou s vehikulem s cílem zjistit, zda došlo ke statisticky významnému zvýšení. Statisticky významné zvýšení střední hmotnosti dělohy experimentální skupiny ukazuje na pozitivní reakci v této biologické zkoušce.

POPIS METODY

Výběr druhu zvířat

16. Lze použít běžně užívané kmeny laboratorních hlodavců. Při validaci byly například použity kmeny potkanů Sprague-Dawley a Wistar. Neměly by se používat kmeny, o kterých se ví nebo předpokládá, že mají méně reaktivní dělohu. Laboratoř by měla prokázat citlivost použitého kmene, jak je popsáno v odstavcích 26 a 27.

17. Od 30. let 20. století jsou k uterotrofní biologické zkoušce běžně používáni potkani a myši. Validační studie OECD byly prováděny pouze na potkanech na základě toho, že existuje obecná shoda, jež předpokládá, že oba druhy jsou rovnocenné, a proto by v zájmu úspory zdrojů a zvířat měl pro celosvětové ověření postačovat jeden druh. Ve většině studií reprodukční a vývojové toxicity je zvoleným druhem potkan. Vzhledem k tomu, že u myší existuje rozsáhlá historická databáze a aby působnost zkušební metody pro provádění uterotrofní biologické zkoušky na hlodavcích byla rozšířena i na použití myší jako zkušebního druhu, byla provedena zkrácená následná validační studie na myších (16). V souladu s původním záměrem úspory zdrojů a zvířat byl vybrán překlenovací přístup s omezeným počtem zkoušených chemických látek, zúčastněných laboratoří a bez testování kódovaných vzorků. Tato překlenovací validační studie ukazuje, že v případě uterotrofní biologické zkoušky na mladých dospělých myších s odstraněnými vaječníky jsou údaje získané u potkanů a myší kvalitativně i kvantitativně v souladu. To umožňuje v případech, kdy výsledek uterotrofní biologické zkoušky může předcházet dlouhodobé studii, použít v obou studiích zvířata stejného kmene a původu. Překlenovací přístup byl omezen na myši s odstraněnými vaječníky a zpráva neposkytuje spolehlivý soubor údajů pro ověření modelu s nezralými mláďaty, a tudíž model s nezralými mláďaty u myší se do stávající zkušební metody nezahrnuje.

18. V některých případech tedy mohou být místo potkanů použity myši. Výběr tohoto druhu je třeba zdůvodnit na základě toxikologických, farmakokinetických a/nebo jiných kritérií. U myší mohou být nezbytné změny v testovacím postupu. Například spotřeba potravy na základě tělesné hmotnosti je u myší vyšší než u potkanů, a obsah fytoestrogenu v potravě by proto měl být u myší nižší než u potkanů (9)(20)(22).

Podmínky chovu a krmení

19. Veškeré postupy by měly vyhovovat místním normám péče o laboratorní zvířata. Zde uvedené popisy péče a zacházení představují minimální požadavky a budou nahrazeny místními právními předpisy, např. směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. září 2010 o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely (38). Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být 22 °C (s přibližným rozpětím ± 3 °C). Relativní vlhkost by měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 %, kromě doby úklidu místnosti. Cílem by měla být relativní vlhkost 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé. Mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy.

20. Laboratorní stravu a pitnou vodu dostávají zvířata ad libitum. Mladá dospělá zvířata lze chovat jednotlivě nebo v klecích po skupinách, maximálně tříčlenných. Vzhledem k nízkému věku nezralých zvířat se doporučuje chov v sociálních skupinách.

21. Je známo, že vysoká úroveň fytoestrogenů v laboratorní stravě zvyšuje hmotnost dělohy u hlodavců v míře, která může narušit uterotrofní biologickou zkoušku (13)(14)(15). Vysoká úroveň fytoestrogenů a metabolizovatelné energie v laboratorní stravě může mít rovněž za následek časný nástup puberty, jestliže se používají nezralá zvířata. Přítomnost fytoestrogenů vyplývá především ze zařazení produktů ze sóji a vojtěšky do laboratorní stravy a ukázalo se, že koncentrace fytoestrogenů v jednotlivých šaržích standardní laboratorní stravy je různá (23). Důležitou proměnnou je tělesná hmotnost, neboť množství spotřebované potravy souvisí s tělesnou hmotností. Skutečná dávka spotřebovaných fytoestrogenů ze stejné stravy se proto může lišit podle druhu a podle věku (9). U nezralých samic potkana může být spotřeba potravy na jednotku tělesné hmotnosti přibližně dvojnásobně vyšší než u mladých dospělých samic s odstraněnými vaječníky. U mladých dospělých myší může být spotřeba potravy na jednotku tělesné hmotnosti přibližně čtyřnásobně vyšší než u mladých dospělých samic potkana s odstraněnými vaječníky.

22. Výsledky uterotrofní biologické zkoušky (9)(17)(18)(19) však ukazují, že omezené množství fytoestrogenů ve stravě je přijatelné a nesnižuje citlivost biologické zkoušky. Určitým vodítkem může být, že u nezralých samic potkana Sprague-Dawley a Wistar by úroveň fytoestrogenů ve stravě neměla přesáhnout 350 μg ekvivalentů genisteinu na gram laboratorní stravy (6)(9). Taková strava by měla být vhodná i při zkouškách na mladých dospělých potkanech s odstraněnými vaječníky, protože spotřeba potravy měřená na jednotku tělesné hmotnosti je u mladých dospělých nižší než u nezralých zvířat. Mají-li být použity dospělé myši s odstraněnými vaječníky nebo potkani citlivější na fytoestrogeny, musí být zváženo úměrné snížení úrovně fytoestrogenů v stravě (20). Rozdíly v dostupné metabolizovatelné energii z různé stravy navíc mohou vést k časovým posunům v nástupu puberty (21)(22).

23. Před studií je nutný pečlivý výběr stravy bez zvýšené úrovně fytoestrogenů (jako vodítko viz (6)(9)) nebo zvýšené úrovně metabolizovatelné energie, jež mohou zkreslit výsledky (15)(17)(19)(22)(36). Pro zajištění náležité výkonnosti zkušebního systému, který laboratoř použije, jak stanoví odstavec 26 a 27, je důležité zkontrolovat oba tyto faktory. Pro jistotu by v souladu se zásadami správné laboratorní praxe (SLP) měly být z každé sady stravy podávané během studie odebrány reprezentativní vzorky pro případnou analýzu obsahu fytoestrogenů (např. v případě vysoké kontrolní hmotnosti dělohy ve srovnání s historickými kontrolami nebo nepřiměřené reakce na referenční estrogen, 17-alfa-ethinylestradiol). Vzorky by měly být analyzovány během studie nebo zmrazené na –20 °C nebo ošetřené takovým způsobem, aby se zabránilo změně složení před analýzou.

24. Některá steliva mohou obsahovat přirozeně se vyskytující estrogenní nebo antiestrogenní chemické látky (např. je známo, že kukuřičný klas ovlivňuje cykličnost u potkanů a podle všeho je antiestrogenní). Zvolené stelivo by mělo obsahovat minimální úroveň fytoestrogenů.

Příprava zvířat

25. Pokusná zvířata bez příznaků jakékoli choroby nebo fyzických abnormalit se náhodným výběrem rozdělí do kontrolních a experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Zvířata se jednoznačně identifikují. Nezralá zvířata by během aklimatizace měla být pokud možno umístěna do klecí s matkami nebo adoptivními matkami až do odstavení. Doba aklimatizace před zahájením studie by u mladých dospělých zvířat a u nezralých zvířat dodaných spolu s matkami nebo adoptivními matkami měla trvat přibližně 5 dnů. Pokud jsou nezralá zvířata získána jako odstavená mláďata bez matek, může se stát, že dobu aklimatizace bude nutné zkrátit, jelikož podávání dávek by mělo začít bezprostředně po odstavení (viz odstavec 29).

POSTUP

Ověření odborné způsobilosti laboratoře

26. Odbornou způsobilost laboratoře lze ověřit dvěma různými způsoby:

— pravidelné ověřování založené na počáteční výchozí studii s pozitivní kontrolní látkou (viz odstavec 27). Nejméně každých 6 měsíců – a pokaždé, když dojde ke změně, která může ovlivnit provedení studie (např. nové složení stravy, změna personálu provádějícího sekce, změna kmene nebo dodavatele zvířat apod.) – by měla být ověřena reakční schopnost zkušebního systému (modelu zvířat) pomocí vhodné dávky (na základě výchozí studie s pozitivní kontrolní látkou popsané v odstavci 27) referenčního estrogenu: 17-alfa-ethinylestradiolu (číslo CAS 57-63-6)(EE).

— použití souběžných kontrol tak, že se do každé zkoušky zařadí skupina, které je podávána vhodná dávka referenčního estrogenu.

Jestliže systém nereaguje podle očekávání, měly by se zkušební podmínky přezkoumat a odpovídajícím způsobem upravit. Doporučuje se, aby dávka referenčního estrogenu, která má být použita při každém postupu, byla přibližně 70 až 80 ED.

27. Výchozí studie s pozitivní kontrolní látkou. Dříve, než laboratoř provede poprvé studii podle této zkušební metody, měla by být prokázána odborná způsobilost laboratoře zkouškou reakční schopnosti daného modelu zvířat, při které se vyvolá reakce na dávku referenčního estrogenu: 17-alfa-ethinylestradiolu (číslo CAS 57-63-6) (EE) s aplikací nejméně čtyř dávek. Odpověď hmotnosti dělohy bude porovnána se zjištěnými historickými údaji (viz odkaz (5)). Pokud tato výchozí studie s pozitivní kontrolní látkou nedá předpokládané výsledky, měly by se přezkoumat a upravit zkušební podmínky.

Počet a stav zvířat

28. Každá pokusná a kontrolní skupina by měla zahrnovat nejméně 6 zvířat (pro oba protokoly metody nezralých mláďat a metody dospělých s odstraněnými vaječníky).

Věk nezralých zvířat

29. U uterotrofní biologické zkoušky s nezralými zvířaty musí být uveden den narození. Podávání dávek by mělo začít dostatečně brzy, aby se zajistilo, že na konci podávání zkoušené chemické látky ještě nedojde k fyziologickému růstu endogenních estrogenů spojenému s pubertou. Na druhé straně existují poznatky, že velmi mladá zvířata mohou být méně citlivá. Pro stanovení optimálního věku by každá laboratoř měla vzít v úvahu své vlastní podkladové údaje o dozrávání.

Jako všeobecné vodítko lze uvést, že u potkanů lze začít s podáváním dávek ihned po časném odstavení v 18. postnatální den (přičemž den narození je postnatálním dnem 0). Podávání dávek u potkanů by mělo být ukončeno v 21. postnatální den, ale v každém případě před 25. postnatálním dnem, protože po dosažení tohoto věku se hypothalamo-hypofýzo-ovariální osa stává funkční a úroveň endogenního estrogenu může začít růst, což je doprovázeno růstem průměrné základní hmotnosti dělohy a nárůstem směrodatných odchylek ve skupinách (2)(3)(10)(11)(12).

Postup odstranění vaječníků

30. U samic potkana a myši (experimentální skupina a kontrolní skupina), kterým mají být odstraněny vaječníky, by k odstranění vaječníků mělo dojít mezi 6. a 8. týdnem věku. U potkanů by mezi odstraněním vaječníků a prvním dnem podávání mělo uplynout nejméně 14 dnů, aby se umožnil návrat dělohy do minimálního, stabilního výchozího stavu. U myší by mezi odstraněním vaječníků a prvním dnem podávání mělo uplynout nejméně 7 dnů. Jelikož pro vyvolání významné cirkulující úrovně estrogenů (3) postačí malé množství tkáně vaječníků, zvířata by před použitím měla být nejméně po pět po sobě jdoucích dnů (např. u potkanů v 10.–14. den po odstranění vaječníků) zkoušena pozorováním epiteliálních buněk získaných výtěrem z vaginy. Pokud zvířata vykazují jakékoli příznaky, že vstupují do estru, neměla by být použita. Dále by při pitvě měly být zkoumány zbytky vaječníků, zda neexistují příznaky přítomnosti vaječníkové tkáně. Pokud ano, dané zvíře by nemělo být použito pro výpočty (3).

31. Při zahájení postupu odstranění vaječníků je zvíře ve ventrální poloze poté, co bylo řádně anestetizováno. Řez otevírající dorzo-laterální stěnu břišní by měl být přibližně 1 cm dlouhý, od středu mezi spodním okrajem žeber a hřebenem kosti kyčelní a několik milimetrů vedle bočního okraje bederního svalu. Vaječník se vyjme z břišní dutiny a položí na aseptickou podložku. Vaječník se oddělí ve spojení vejcovodu s tělem dělohy. Po ujištění, že nedochází k masivnímu krvácení, by břišní stěna měla být uzavřena suturou a kůže klipsy nebo vhodným stehem. Místa podvazu jsou schematicky ukázány na obrázku 1. Mělo by být použito vhodné pooperační tišení bolesti v souladu s doporučením veterinárního lékaře se zkušenostmi v oblasti péče o hlodavce.

Tělesná hmotnost

32. Při metodě dospělých samic s odstraněnými vaječníky tělesná hmotnost a hmotnost dělohy spolu nekorelují, protože hmotnost dělohy je ovlivňována hormony, např. estrogeny, ale nikoli růstovými faktory, které regulují velikost těla. Naopak v modelu s nezralými zvířaty tělesná hmotnost s hmotností dělohy souvisí, dokud dospívají (34). V okamžiku zahájení studie by tak v modelu nezralých zvířat měla být odchylka v jejich hmotnosti minimální a neměla by překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti. To znamená, že velikost vrhu by měla být chovatelem standardizována, aby se zajistilo, že potomstvo různých mateřských zvířat bude krmeno přibližně stejně. Zvířata by měla být přiřazena ke skupinám (kontrolním a experimentálním) náhodným rozdělením z hlediska hmotnosti, takže střední tělesná hmotnost každé skupiny se nebude statisticky lišit od kterékoli jiné skupiny. Mělo by se dbát na to, aby nedošlo k přiřazení sourozenců z vrhu do stejné experimentální skupiny, pokud možno bez zvyšování počtu vrhů, jež mají být používány při vyšetřeních.

Dávkování

33. K tomu, aby se zjistilo, zda zkoušená chemická látka může mít estrogenní účinek in vivo, běžně postačí dvě exponované skupiny a jedna kontrolní skupina, a s ohledem na zásadu dobrého zacházení se zvířaty je proto upřednostňováno toto uspořádání. Je-li záměrem získat křivku dávka-odpověď nebo extrapolovat na nižší dávky, jsou zapotřebí nejméně tři exponované skupiny. Jsou-li požadovány informace vycházející za rámec zjištění estrogenního působení (např. odhad potence), měl by být zvážen odlišný režim dávkování. S výjimkou podávání zkoušené chemické látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako se zvířaty v experimentální skupině. Pokud se při podávání zkoušené chemické látky používá vehikulum, podává se kontrolní skupině ve stejném objemu, který byl použit v experimentálních skupinách (nebo v nejvyšším objemu použitém v exponovaných skupinách, pokud je u jednotlivých skupin rozdílný).

34. V případě uterotrofní biologické zkoušky je cílem vybrat dávky, které zaručují přežití zvířat a nezpůsobují významnou toxicitu nebo utrpení zvířat po uplynutí tří po sobě jdoucích dnů podávání chemické látky, až do maximální dávky 1 000 mg/kg/den. Při výběru všech úrovní dávek by měly být zohledněny veškeré existující údaje o toxických a toxikokinetických vlastnostech, které jsou pro zkoušenou chemickou látku nebo příbuzné materiály dostupné. Nejvyšší úroveň dávky by měla především zohlednit hodnotu LD50 a/nebo informace o akutní toxicitě, aby nedošlo k úmrtí, vážnému poškození nebo utrpení zvířat (24)(25)(2