1972L0199 — CS — 27.08.1999 — 005.001

Tento dokument je třeba brát jako dokumentační nástroj a instituce nenesou jakoukoli odpovědnost za jeho obsah

►B TŘETÍ SMĚRNICE KOMISE ze dne 27. dubna 1972, kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv (72/199/EHS) (Úř. věst. L 123, 29.5.1972, p.6)

Ve znění:









▼B

TŘETÍ SMĚRNICE KOMISE

ze dne 27. dubna 1972,

kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv

(72/199/EHS)







KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ, s ohledem na Smlouvu o založení Evropského hospodářského společenství, s ohledem na směrnici Rady ze dne 20. července 1970 o zavedení metod odběru vzorků a analytických metod Společenství pro úřední kontrolu krmiv ( 1 ), a zejména na článek 2 uvedené směrnice; vzhledem k tomu, že uvedená směrnice stanoví, že úřední kontroly krmiv, jejichž cílem je ověřit dodržování požadavků stanovených právními a správními předpisy a týkajících se jakosti a složení krmiv, se provádějí podle metod odběru vzorků a analytických metod Společenství; vzhledem k tomu, že směrnice Komise č. 71/250/EHS ze dne 15. června 1971 ( 2 ) a 71/393/EHS ze dne 18. listopadu 1971 ( 3 ) již stanovily řadu analytických metod Společenství; že s ohledem na stav doposud provedených prací je však nutné stanovit třetí sérii analytických metod; vzhledem k tomu, že opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Stálého výboru pro krmiva, PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:







Článek 1

Členské státy stanoví, že analýzy pro úřední kontroly krmiv, pokud jde o obsahy škrobu, hrubých proteinů, hrubých proteinů rozpustných působením pepsinu a kyseliny chlorovodíkové, volného a celkového gossypolu, jakož i o aktivitu pepsinu, se provádějí podle metod popsaných v příloze I této směrnice.

▼M1 —————

▼B

Článek 2

Členské státy stanoví, že analýzy pro úřední kontroly krmiv, pokud jde o ►M4 ————— ◄ o obsahy ►M4 ————— ◄ tylosinu a virginiamycinu v krmivech, se provádějí podle metod popsaných v příloze II této směrnice.

▼M1 —————

▼B

Článek 3

Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 1. července 1973. Neprodleně o nich informují Komisi.

Článek 4

Tato směrnice je určena členským státům.









PŘÍLOHA I

▼M5

1. STANOVENÍ ŠKROBU

POLARIMETRICKÁ METODA

1. Účel a oblast působnosti

Tato metoda umožňuje stanovit obsah škrobu a produktů odbourávání škrobu o vysoké molekulární hmotnosti v krmivech za účelem kontroly souladu s požadavky směrnice Komise 86/174/EHS a směrnice Rady 96/25/ES.

2. Princip

Metoda zahrnuje dvě stanovení. V prvním je vzorek ošetřen za horka zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Po vyčeření a filtraci je polarimetricky změřena optická otáčivost roztoku.

Ve druhém je vzorek extrahován 40 % etanolem. Po okyselení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčistění a filtraci je optická otáčivost změřena jako v prvním stanovení.

Rozdíl mezi dvěma měřeními, vynásobený známým faktorem, udává obsah škrobu ve vzorku.

3. Činidla

3.1. 25 % (hmotnostních) kyselina chlorovodíková, d: 1,126 g/ml.

3.2. 1,128 % (hmotnostních ve vztahu k objemu) kyselina chlorovodíková. Koncentrace musí být stanovena titračně za použití roztoku hydroxidu sodného 0,1 mol/litr za přítomnosti 0,1 % (hmotnostních ve vztahu k objemu) methyl červeně v 94 % (objemově) etanolu. 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 mol/litr.

3.3. Carrezovo činidlo I: rozpusťte 21,9 g octanu zinečnatého Zn(CH3COO)2·2H2O a 3 g ledové kyseliny octové ve vodě. Doplňte do 100 ml vodou.

3.4. Carrezovo činidlo II: rozpusťte 10,6 g hexakyanoželeznatanu draselného [K4(Fe(CN)6]·3H2O ve vodě. Doplňte do 100 ml vodou.

3.5. 40 % (objemově) etanol, d: 0,948 g/ml při 20 °C.

4. Přístroje a pomůcky

4.1. 250 ml Erlenmeyerova baňka se standardním zábrusem a zpětným chladičem.

4.2. Polarimetr nebo sacharimetr.

5. Postup

5.1. Příprava vzorku

Rozmělněte vzorek nadrobno tak, aby všechny jeho části prošly sítem s kulatými oky o průměru 0,5 mm.

5.2. Stanovení celkové optické otáčivosti (P nebo S) (viz poznámky 7.1.)

Odvažte 2,5 g rozmělněného vzorku s přesností na mg a vložte jej do 100 ml odměrné baňky. Přidejte 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2), protřepejte, aby bylo dosaženo rovnoměrného rozmístnění testovaného vzorku a přidejte dalších 25 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Ponořte baňku do vroucí vodní lázně za stálého a silného protřepávání po dobu prvních třech minut, aby se zabránilo tvorbě shluků. Množství vody ve vodní lázni musí být dostatečné, aby po vložení baňky zůstala lázeň na bodu varu. Baňka nesmí být vyjmuta z lázně během protřepávání. Po přesně 15 minutách vyjměte z lázně, přidejte 30 ml studené vody a ihned ochlaďte na 20 °C.

Přidejte 5 ml Carrezova činidla I (3.3) a protřepávejte po dobu jedné minuty. Potom přidejte 5 ml Carrezova činidla II (3.4) a protřepávejte opět po dobu jedné minuty. Doplňte do objemu vodou, promíchejte a filtrujte. Pokud není filtrát zcela čirý (což je zřídka), opakujte stanovení za použití většího množství Carrezova činidla I a II, například 10 ml.

Změřte optickou otáčivost roztoku ve 200 mm trubici polarimetrem nebo sacharimetrem.

5.3. Stanovení optické otáčivosti (Pnebo S) látek rozpustných ve 40 % etanolu

Odvažte 5 g vzorku s přesností na mg, vložte do 100 ml odměrné baňky a přidejte okolo 80 ml etanolu (3.5) (viz poznámky 7.2). Nechejte baňku stát jednu hodinu při pokojové teplotě; během této doby šestkrát silně protřepejte tak, aby se testovaný vzorek důkladně smísil s etanolem. Doplňte na objem etanolem (3.5.), promíchejte a filtrujte. Odpipetujte 50 ml filtrátu (= 2,5 g vzorku) do 250 ml Erlenmeyerovy baňky, přidejte 2,1 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1) a silně protřepejte. Osaďte baňku zpětným chladičem a ponořte ji do vroucí vodní lázně. Po přesně 15 minutách vyjměte Erlenmeyerovu baňku z vodní lázně, převeďte obsah do 100 ml odměrné baňky, vypláchněte chladnější vodou a ochlaďte na 20 °C. Vyčeřte použitím Carrezova činidla I (3.3) a II (3.4), doplňte do objemu vodou, promíchejte, přefiltrujte a změřte optickou otáčivost, jak je uvedeno ve druhém a třetím odstavci 5.2.

6. Výpočet výsledků

Obsah škrobu ( %) se vypočítá následovně:

6.1. Měření polarimetrem

P = Celková optická otáčivost v úhlových stupních

P’ = Optická otáčivost látek rozpustných ve 40 % (objemově) etanolu v úhlových stupních.

= specifická optická otáčivost čistého škrobu. Číselné hodnoty konvenčně přijaté pro faktor jsou následující: + 185,9° : rýžový škrob + 185,4° : bramborový škrob + 184,6° : kukuřičný škrob + 182,7° : pšeničný škrob + 181,5° : ječný škrob + 181,3° : ovesný škrob + 184,0° : ostatní typy škrobu a směsi škrobu v krmných směsích

6.2. Měření sacharimetrem

S = Celková optická otáčivost ve stupních sacharimetru

S’ = Optická otáčivost látek rozpustných ve 40 % (objemově) etanolu ve stupních sacharimetru

N = Hmotnost (g) sacharózy ve 100 ml vody, dávající optickou otáčivost 100 stupňů sacharimetru při měření za použití 200 mm trubice 16,29 g pro francouzské sacharimetry 26,00 g pro německé sacharimetry 20,00 g pro smíšené sacharimetry

= specifická optická otáčivost čistého škrobu (viz 6.1)

6.3 Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 0,4 v absolutní hodnotě u obsahů škrobu nižších než 40 % a 1,1 % relativně u obsahů škrobu rovnajících se nebo vyšších než 40 %.

7. Poznámky

7.1. Pokud obsahuje vzorek více než 6 % uhličitanů, vyjádřených jako uhličitan vápenatý, musí být před stanovením optické otáčivosti rozloženy přesně odpovídajícím množstvím zředěné kyseliny sírové

7.2. V případě produktů s vyšším obsahem laktózy, jako je sušené mléčné sérum nebo odstředěné sušené mléko, postupujte následovně po přidání 80 ml etanolu (3.5) Osaďte baňku zpětným chladičem a ponořte ji do vodní lázně o teplotě 50 °C po dobu 30 minut. Nechejte vychladnout a pokračujte v analýze, jak je uvedeno v 5.3.

7.3. Následující krmné suroviny, v případě, že jsou přítomny ve významném množství v krmivech, jak známo způsobují interference při stanovení obsahu škrobu polarimetrickou metodou, a tím mohou být získány nesprávné výsledky: — výrobky z cukrové řepy, jako cukrová pulpa, cukrovková melasa, cukrovarské vyloužené řízky, cukrovková melasovaná pulpa, cukrovková vináza, řepa cukrová, — citrusová pulpa, — lněné semeno; lněné expelery; extrahované lněné semeno, — řepkové semeno; řepkové expelery; řepkové semeno extrahované; řepkové slupky, — slunečnicové semeno; slunečnicové semeno extrahované; slunečnicové semeno částečně loupané, extrahované, — kokosové expelery; kokosový extrahovaný šrot, — bramborová pulpa, — sušené kvasnice, — výrobky bohaté na inulín (např. řízky a moučka z topinambur); — škvarky.

▼M3

2. STANOVENÍ DUSÍKATÝCH LÁTEK

1. Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovit obsah dusíkatých látek v krmivu na základě obsahu dusíku, stanoveného podle Kjeldahlovy metody.

2. Princip

Vzorek je za přítomnost katalyzátoru mineralizován kyselinou sírovou. Kyselý roztok je alkalizován roztokem hydroxidu sodného. Čpavek je destilován a jímán v odměřeném množství kyseliny sírové, jejíž přebytek je titrován standardním roztokem hydroxidu sodného.

3. Činidla

3.1 Síran draselný.

3.2 Katalyzátor: oxid měďnatý (II) CuO nebo pentahydrát síranu měďnatého (II), CuSO4.5H2O.

3.3 Granulovaný zinek.

3.4 Kyselina sírová, p20 = 1,84 g/ml.

3.5 Kyselina sírová, c(½ H2SO4) = 0,5 mol/l.

3.6 Kyselina sírová, c(½ H2SO4) = 0,1 mol/l.

3.7 Indikátor methylová červeň: rozpusťte 300 mg methyl červeně ve 100 ml etanolu, δ = 95-96 % (objemově).

3.8 Roztok hydroxidu sodného (může být použit technický) δ = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.9 Roztok hydroxidu sodného c = 0,25 mol/l.

3.10 Roztok hydroxidu sodného c = 0,1 mol/l.

3.11 Granulovaná pemza, promytá v kyselině chlorovodíkové a zpopelněná.

3.12 Acetanilid (b.t. = 114 °C, N = 10,36 %)

3.13 Sacharóza (bez dusíku).

4. Přístroje a pomůcky

Přístroje vhodné pro provedení mineralizace, destilace a titrace podle Kjeldahlovy metody.

5. Postup

5.1 Mineralizace

Odvažte, s přesností na 0,001 g, 1 g vzorku a přeneste jej do mineralizační baňky. Přidejte 15 g síranu draselného (3.1), a přiměřené množství katalyzátoru (3.2) (0,3 až 0,4 g oxidu měďnatého (II) nebo 0,9 až 1,2 g pentahydrátu síranu měďnatého (II), 25 ml kyseliny sírové (3.4) a několik granulí pemzy (3.11) a promíchejte. Zahřívejte láhev nejprve mírně za občasného kroužení, pokud nutno, dokud hmota nezkarbonizuje a pěna nezmizí; potom zahřívejte intenzivněji, dokud kapalina nevře rovnoměrně. Ohřev je adekvátní, když vroucí kyselina kondenzuje na stěně baňky. Chraňte boky před přehřátím a před přilnutím organických částic k nim. Když se roztok stane čirým a světle zeleným, pokračujte ve varu po další dvě hodiny, potom nechejte vychladnout.

5.2 Destilace

Přidejte opatrně dostatek vody k zajištění úplného rozpuštění sulfátů. Nechejte vychladnout a potom přidejte několik granulí zinku (3.3).

Dejte do baňky destilačního přístroje přesně odměřené množství 25 ml kyseliny sírové (3.5) nebo (3.6) v závislosti na předpokládaném obsahu dusíku. Přidejte několik kapek indikátoru methyl červeně (3.7).

Spojte baňku s přestupníkem destilačního přístroje a ponořte konec přestupníku do kapaliny obsažené v titrační baňce do hloubky nejméně 1 cm (viz poznámky (8.3). Pomalu vlijte 100 ml roztoku hydroxidu sodného (3.8) do baňky bez ztráty čpavku (viz poznámky 8.1).

Zahřívejte láhev, dokud se čpavek nevydestiluje.

5.3 Titrace

Titrujte přebytek kyseliny sírové v titrační baňce roztokem hydroxidu sodného (3.9) nebo (3.10) v závislosti na koncentraci použité kyseliny sírové, dokud není dosažen konečný bod.

5.4 Slepý pokus

Pro ověření, že reagencie neobsahují dusík, proveďte slepý pokus (mineralizaci, destilaci a titraci) za použití sacharózy (3.13) místo vzorku.

6. Výpočet výsledků

Obsah dusíkatých látek se vypočítá podle následující rovnice:

kde:

V0 = Objem NaOH (3.9 nebo 3.10) použitého ve slepém pokusu (ml).

V1 = Objem NaOH (3.9 nebo 3.10) použitého při titraci vzorku (ml).

c = Koncentrace (mol/l) hydroxidu sodného (3.9 nebo 3.10).

m = Hmotnost vzorku (g).

7. Ověření metody

7.1 Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

0,2 % v absolutní hodnotě u obsahů dusíkatých látek nižších než 20 %;

1,0 % vzhledem k vyšší hodnotě, pro obsahy dusíkatých látek od 20 % do 40 %;

0,4 % v absolutní hodnotě u obsahů dusíkatých látek vyšších než 40 %.

7.2 Přesnost

Proveďte analýzu (mineralizaci, destilaci a titraci) u 1,5 až 2,0 g acetanilidu (3.12) za přítomnosti 1 g sacharózy (3.13); 1 g acetanilidu spotřebuje 14,80 ml kyseliny sírové (3.5). Výtěžek musí být nejméně 99 %.

8. Poznámky

8.1 Přístroje mohou být manuální, poloautomatické nebo automatické. Pokud přístroj vyžaduje přenos mezi kroky mineralizace a destilace, musí být tento přenos proveden beze ztrát. Pokud není baňka destilačního přístroje vybavena dávkovací nálevkou, přidejte hydroxid sodný ihned před spojením baňky s přestupníkem, pomalým nalitím po stěně.

8.2 Pokud výluh ztuhne, začněte stanovení za použití většího množství kyseliny sírové (3.4), než jaké je uvedeno dříve.

8.3 U produktů s nízkým obsahem dusíku, může být objem kyseliny sírové (3.6), přidaný do baňky, pokud je to nutné, snížen na 10 až 15 ml a doplněn na 25 ml vodou.

▼B

3. STANOVENÍ HRUBÝCH PROTEINŮ ROZPUSTNÝCH PEPSINEM A KYSELINOU CHLOROVODÍKOVOU

1. Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovit frakci hrubých proteinů rozpustných pepsinem a kyselinou chlorovodíkovou za stanovených podmínek. Metoda je použitelná pro všechna krmiva.

2. Princip

Vzorek se ošetřuje 48 hodin při 40 °C roztokem pepsinu v kyselině chlorovodíkové. Suspenze se filtruje a obsah dusíku ve filtrátu se stanoví metodou pro stanovení obsahu hrubých proteinů.

3. Činidla

3.1 Kyselina chlorovodíková, d: 1,125.

3.2 Kyselina chlorovodíková 0,075 N.

3.3 2,0 j/mg pepsinu; aktivita pepsinu je definována v metodě popsané v části 4 této přílohy a musí být kontrolována v souladu s touto metodou.

3.4 Asi 0,02 % (m/V), čerstvě připravený roztok pepsinu v kyselině chlorovodíkové (3.2); aktivita: 400 j/l.

3.5 Odpěňovací emulze (např. silikon).

3.6 Všechna činidla uvedená v bodě 3 metody pro stanovení obsahu hrubých proteinů.

4. Přístroje

4.1 Vodní lázeň nebo inkubátor nastavený na 40 °C ± 1 °C.

4.2 Mineralizační a destilační aparatura podle Kjeldahlovy metody.

5. Postup

5.1 Příprava roztoku (viz poznámky 7.2)

Navážit 2 g vzorku s přesností na 1 mg a dát ho do odměrné baňky o objemu 500 ml. Přidat 450 ml roztoku pepsinu v kyselině chlorovodíkové (3.4) předehřátého na 40 °C. Protřepat, aby se zabránilo tvorbě hrudek. Ověřit, že je pH suspenze nižší než 1,7. Vložit baňku do vodní lázně nebo inkubátoru (4.1) a nechat ji tam 48 hodin. Protřepat po 8, 24 a 32 hodinách. Po 48 hodinách přidat 15 ml kyseliny chlorovodíkové (3.1), zchladit na 20 °C, doplnit po rysku vodou a filtrovat.

5.2 Mineralizace

Odebrat 250 ml filtrátu s přesností na 1 mg a dát ho do baňky destilační aparatury (4.2). Přidat činidla nezbytná pro mineralizaci, jak je uvedeno v metodě pro stanovení hrubých proteinů, ve druhé větě bodu 5.1. Homogenizovat a uvést do varu. Pokud se vytvoří pěna, přidat několik kapek odpěňovací emulse (3.5). Pokračovat v silném varu, dokud se voda téměř zcela nevypaří. Snížit ohřev a opatrně odstranit poslední stopy vody.

Když je roztok čirý a bezbarvý (světlezelený, pokud se použije katalyzátor na bázi mědi), udržovat var ještě další hodinu. Nechat vychladnout.

5.3 Destilace a titrace

Postupovat, jak je uvedeno v metodě pro stanovení hrubých proteinů v bodech 5.2 a 5.3.

5.4 Slepý pokus

Provést slepý pokus za použití stejného postupu, ale bez vzorku, který má být analyzován.

6. Výpočet výsledků

Odečíst objem kyseliny sírové spotřebované během slepého pokusu od objemu spotřebovaného zkušebním vzorkem. 1 ml kyseliny sírové 0,1 N odpovídá 1,4 mg dusíku.

Vynásobit množství dusíku faktorem 6,25. Výsledek vyjádřit jako procento vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u jednoho vzorku nesmí překročit:

— 0,4 absolutní hodnoty pro obsah nižší než 20 %,

— 2,0 % relativní hodnoty pro obsah vyšší než 20 % a nižší než 40 %,

— 0,8 absolutní hodnoty pro obsah vyšší než 40 %.

7. Poznámky

7.1 Hodnoty získané touto metodou nemají přímou souvislost se stravitelností in vivo.

7.2 Výrobky o obsahu tuku vyšším než 10 % musí být odtučněny extrakcí petrolétheru (b.v. 40 až 60 °C).

4. STANOVENÍ AKTIVITY PEPSINU

1. Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovit aktivitu pepsinu použitého při stanovení hrubých proteinů rozpustných pepsinem a kyselinou chlorovodíkovou.

2. Princip

Hemoglobin se ošetří za stanovených podmínek pepsinem v prostředí kyseliny chlorovodíkové. Nehydrolyzovaná frakce proteinů se vysráží kyselinou trichloroctovou. Do filtrátu se přidá hydroxid sodný a činidlo Folin-Ciocalteu. Optická hustota tohoto roztoku se měří při 750 nm a odpovídající množství tyrosinu se odečte z kalibrační křivky.

Definice: Jednotka pepsinu je definována jako množství enzymu, které za podmínek metody uvolní za minutu takové množství hydroxyarylových skupin, jejichž zbarvení činidlem Folin-Ciocalteu má optickou hustotu odpovídající optické hustotě jednoho μmolu tyrosinu zbarveného stejným způsobem.

3. Činidla

3.1 Kyselina chlorovodíková 0,2 N.

3.2 Kyselina chlorovodíková 0,06 N.

3.3 Kyselina chlorovodíková 0,025 N.

3.4 5 % roztok (m/V) kyseliny trichloroctové.

3.5 Roztok hydroxidu sodného 0,5 N.

3.6 Činidlo Folin-Ciocalteu. Dát 100 g wolframanu sodného (Na2WO4 · 2H2O), 25 g molybdenanu sodného (Na2MoO4 · 2H2O) a 700 ml vody do dvoulitrové baňky s kulatým dnem a normalizovaným zábrusem. Přidat 50 ml kyseliny fosforečné (d: 1,71) a 100 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (d: 1,19), připojit baňku na zpětný chladič, uvést do varu a udržovat roztok v mírném varu po dobu 10 hodin. Nechat vychladnout, odpojit zpětný chladič, přidat 175 g síranu lithného (Li2SO4 · 2H2O), 50 ml vody a 1 ml brómu. Vařit po dobu 15 minut, aby se odstranil přebytek brómu. Nechat vychladnout. Přelít roztok do odměrné baňky o objemu 1 l, doplnit po rysku vodou, homogenizovat a filtrovat. Nesmí zůstat nazelenalé zbarvení. Před použitím rozředit 1 objem činidla 2 objemy vody.

3.7 Roztok hemoglobinu: Navážit množství hemoglobinu, asi 2 g proteinového substrátu podle Ansonovy metody odpovídajícího 354 mg dusíku ( 4 ) a dát do baňky o objemu 200 ml s normalizovaným zábrusem. Přidat několik ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Spojit baňku s vakuovou pumpou a protřepávat, dokud se hemoglobin zcela nerozpustí. Uvolnit vakuum a za protřepávání doplnit kyselinu chlorovodíkovou (3.2) až na 100 ml. Připravit bezprostředně před použitím.

3.8 Standardní roztok tyrosinu: rozpustit 181,2 mg tyrosinu v kyselině chlorovodíkové (3.1) a doplnit do jednoho litru stejnou kyselinou (zásobní roztok). Odebrat 20 ml tohoto roztoku a rozředit kyselinou chlorovodíkovou (3.1) ve 100 ml. 1 ml tohoto roztoku obsahuje 0,2 μmol tyrosinu.

4. Přístroje

4.1 Vodní lázeň nastavená ultratermostatem na 25 °C + 0,1 °C.

4.2 Spektrofotometr.

4.3 Stopky, přesnost: 1 sekunda.

4.4 pH metr.

5. Postup

5.1 Příprava roztoku (viz poznámky 7.1.)

Rozpustit 150 mg pepsinu ve 100 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2). Odpipetovat 2 ml roztoku a dát ho do odměrné baňky o objemu 50 ml a doplnit po rysku kyselinou chlorovodíkovou (3.3). pH kontrolované pH metrem musí být 1,6+0,1. Ponořit baňku do vodní lázně (4.1).

5.2 Hydrolýza

Odpipetovat 5,0 ml roztoku hemoglobinu (3.7) do zkumavky, zahřát ve vodní lázni (4.1) na 25 °C, přidat 1,0 ml roztoku pepsinu získaného podle bodu 5.1 a promíchat asi deseti pohyby tam a zpět skleněnou tyčinkou zesílenou na jednom konci. Nechat zkumavku ve vodní lázni při 25 °C přesně po dobu 10 minut, počítáno od přidání roztoku pepsinu (doba a teplota musí být přesně dodrženy). Poté přidat 10,0 ml roztoku kyseliny trichloroctové (3.4) předehřátého na 25 °C, homogenizovat a filtrovat přes suchý filtr.

5.3 Vývoj zbarvení a měření optické hustoty

Odpipetovat 5,0 ml filtrátu, dát ho do Erlenmeyerovy baňky o objemu 50 ml, přidat 10,0 ml roztoku hydroxidu sodného (3.5) a za stálého protřepávání 3,0 ml zředěného činidla Folin-Ciocalteu (3.6). Po 5 až 10 minutách stanovit optickou hustotu roztoku spektrofotometrem při 750 nm v kyvetách o tloušťce 1 cm v porovnání s vodou.

5.4 Slepý pokus

Pro každé stanovení provést tento slepý pokus:

Odpipetovat 5,0 ml roztoku hemoglobinu (3.7) do zkumavky, zahřát ve vodní lázni (4.1) na 25 °C, přidat 10,0 ml roztoku kyseliny trichloroctové (3.4) předehřáté na 25 °C, homogenizovat a poté přidat 1,0 ml roztoku pepsinu získaného podle bodu 5.1. Promíchat skleněnou tyčinkou a nechat zkumavku přesně 10 minut ve vodní lázni (4.1) při 25 °C. Homogenizovat a filtrovat přes suchý filtr. Pokračovat v postupu uvedeném v bodě 5.3.

5.5 Kalibrační křivka

Do Erlenmeyerovy baňky o objemu 50 ml dát 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, a 5,0 ml alikvotního standardního roztoku tyrosinu, který odpovídá 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, a 1,0 μmolu množství tyrosinu. Doplnit sérii referenčním roztokem bez tyrosinu. Doplnit objemy kyselinou chlorovodíkovou (3.1) na 5,0 ml. Přidat 10,0 ml roztoku hydroxidu sodného (3.5) a za stálého protřepávání 3,0 ml zředěného činidla Folin-Ciocalteu (3.6). Změřit optickou hustotu jak je uvedeno v poslední větě bodu 5.3. Načrtnout kalibrační křivku uvedením optických hustot proti množstvím tyrosinu.

6. Výpočet výsledků

Odečíst z kalibrační křivky množství tyrosinu v μmolech, které odpovídá optické hustotě zbarveného roztoku a které bylo opraveno slepým pokusem.

Aktivita pepsinu v μmolech tyrosinu na 1 mg a za jednu minutu při 25 °C se vypočítá podle vzorce:

kde:

a = množství tyrosinu v μmol odečtené z kalibrační křivky;

p = množství pepsinu v mg přidané podle bodu 5.2.

7. Poznámky

7.1 Množství pepsinu, které má být rozpuštěno, musí být takové, aby byla při konečném fotometrickém měření získána optická hustota 0,35 + 0,035.

7.2 Dvě jednotky na mg získané touto metodou odpovídají: 3,64 Ansonovovým milijednotkám/mg (μmolů tyrosinu/mg min. při 35,5 °C) nebo 36 400 komerčních jednotek/g (μmolů tyrosinu/g za 10 min. při 35,5 °C).

5. STANOVENÍ VOLNÉHO A CELKOVÉHO GOSSYPOLU

1. Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovit volný gossypolu, celkový gossypolu a chemicky příbuzné látky v bavlníkových semenech, bavlníkové mouce a bavlníkových pokrutinách a krmných směsích, které tyto látky obsahují. Spodní hranice pro stanovení obsahu je 20 ppm.

2. Princip

Gossypol je extrahován za přítomnosti 3-amino-1-propanolu, a to buď směsí isopropanolu a hexanu pro stanovení volného gossypolu, nebo dimethylformamidem pro stanovení celkového gossypolu. Gossypol je prostřednictvím anilinu přeměněn na gossypol-dianilin, jehož optická hustota je měřena při 440 nm.

3. Činidla

3.1 Směs isopropanolu a hexanu: smíchat 60 objemových částí isopropanolu p.a. se 40 objemovými částmi n-hexanu.

3.2 Rozpouštědlo A: do odměrné baňky o objemu 1 l nalít asi 500 ml směsi isopropanolu a hexanu (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanolu, 8 ml ledové kyseliny octové a 50 ml vody. Doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Trvanlivost tohoto činidla je jeden týden.

3.3 Rozpouštědlo B: odpipetovat do odměrné baňky o objemu 100 ml 2 ml 3-amino-1-propanolu a 10 ml ledové kyseliny octové. Zchladit na pokojovou teplotu a doplnit po rysku N,N-dimethylformamidem. Trvanlivost tohoto činidla je jeden týden.

3.4 Anilin p.a.: pokud optická hustota slepého pokusu překročí 0,022, destilovat anilin přes zinkový prach s vyloučením prvních a posledních frakcí 10 % destilátu. Toto činidlo se skladuje v chladničce několik měsíců v zazátkované lahvi z hnědého skla.

3.5 Standardní roztok gossypolu A: do odměrné baňky o objemu 250 ml dát 27,9 mg octanu gossypolu. Rozpustit a doplnit po rysku rozpouštědlem A (3.2). Odpipetovat do odměrné baňky o objemu 250 ml 50 ml tohoto roztoku a doplnit po rysku rozpouštědlem A. Koncentrace gossypolu v tomto roztoku je 0,02 mg/ml. Před použitím nechat stát po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě.

3.6 Standardní roztok gossypolu B: do odměrné baňky o objemu 50 ml dát 27,9 mg octanu gossypolu. Rozpustit a doplnit po rysku rozpouštědlem B (3.3). Koncentrace gossypolu v tomto roztoku je 0,5 mg/ml.

Pokud jsou standardní roztoky gossypolu A a B chráněny před světlem, jejich trvanlivost je 24 hodin.

4. Přístroje

4.1 Mixér (třepačka): přibližně 35 ot./mim.

4.2 Spektrofotometr.

5. Postup

5.1 Zkušební vzorek

Množství zkušebního vzorku závisí na předpokládaném obsahu gossypolu ve vzorku. Je výhodné pracovat s malým množstvím zkušebního vzorku a relativně velkou alikvotní částí filtrátu, aby bylo možné získat dostatečné množství gossypolu pro přesné fotometrické měření. Pro stanovení volného gossypolu v bavlníkových semenech, bavlníkové mouce a bavlníkových pokrutinách by zkušební vzorek neměl překročit 1 g; pro krmné směsi to může být 5 g. Ve většině případů je použitelná alikvotní část 10 ml filtrátu; měla by obsahovat 50 až 100 μg gossypolu. Pro stanovení celkového gossypolu by množství zkušebního vzorku mělo být mezi 0,5 a 5 g, aby alikvotní část 2 ml filtrátu obsahovala 40 až 200 μg gossypolu.

Analýza by se měla provádět při pokojové teplotě kolem 20 °C.

5.2 Stanovení volného gossypolu

Dát zkušební vzorek do odměrné baňky se zábrusovým hrdlem o objemu 250 ml, jejíž dno je pokryto skleněnými střepy. Pomocí pipety přidat 50 ml rozpouštědla A (3.2), zazátkovat baňku a jednu hodinu promíchávat v mixéru. Filtrovat přes suchý filtr a zachytit filtrát v malé baňce se zábrusovým hrdlem. Během filtrace zakrýt nálevku s kohoutem hodinovým sklíčkem. Pomocí pipety přidat do dvou odměrných baněk (A a B) o objemu 25 ml stejné alikvotní části filtrátu obsahujícího 50 až 100 μg gossypolu. Případně doplnit objem rozpouštědlem A (3.2) na 10 ml. Poté doplnit po rysku baňku (A) směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Tento roztok se použije jako referenční roztok pro měření roztoku pro slepý pokus.

Pomocí pipety přidat 10 ml rozpouštědla A (3.2) do dvou jiných odměrných baněk (C a D) o objemu 25 ml. Doplnit po rysku baňku (C) směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Tento roztok se použije jako referenční roztok pro měření roztoku pro slepý pokus.

Přidat 2 ml anilinu (3.4) do baněk (D) a (B). Zahřívat 30 minut nad vroucí vodní lázní, aby se vytvořilo zbarvení. Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu (3.1), homogenizovat a nechat stát jednu hodinu.

Stanovit spektrofotometrem při 440 nm a ve skleněných kyvetách o tloušťce 1 cm optickou hustotu roztoku pro slepý pokus (D) porovnáním s referenčním roztokem (C) a optickou hustotu roztoku vzorku (B) porovnáním s referenčním roztokem (A).

Odečíst optickou hustotu roztoku pro slepý pokus od optické hustoty roztoku vzorku (= upravená optická hustota). Z této hodnoty vypočítat obsah volného gossypolu, jak je uvedeno v bodě 6.

5.3 Stanovení celkového gossypolu

Dát zkušební vzorek obsahující 1 až 5 mg gossypolu do odměrné baňky o objemu 50 ml a přidat 10 ml rozpouštědla B (3.3). Současně připravit slepý pokus a dát 10 ml rozpouštědla B (3.3) do jiné odměrné baňky o objemu 50 ml. Zahřívat obě baňky 30 minut nad vroucí vodní lázní. Zchladit na pokojovou teplotu a doplnit po rysku obě baňky směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Homogenizovat a nechat stát 10 až 15 minut, poté filtrovat a zachytit filtráty v baňce se zábrusovým hrdlem.

Pomocí pipety přidat 2 ml filtrátu ze vzorku do dvou odměrných baněk o objemu 25 ml a 2 ml filtrátu slepého pokusu do dvou jiných odměrných baněk o objemu 25 ml. Doplnit na 25 ml obsah jedné baňky z každé série směsí isopropanolu a hexanu (3.1). Tyto roztoky se použijí jako referenční roztoky.

Přidat 2 ml anilinu (3.4) do dvou jiných baněk. Zahřívat 30 minut nad vroucí vodní lázní, aby se vytvořilo zbarvení. Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit na 25 ml směsí isopropanolu a hexanu (3.1), homogenizovat a nechat stát jednu hodinu.

Stanovit optickou hustotu volného gossypolu, jak je uvedeno v bodě 5.2. Z této hodnoty vypočítat obsah celkového gossypolu, jak je uvedeno v bodě 6.

6. Výpočet výsledků

Výpočet výsledků se může provést buď na základě specifické optické hustoty (6.1), nebo na základě kalibrační křivky (6.2).

6.1 Na základě specifické optické hustoty

Za stanovených podmínek je specifická optická hustota tato:







volný gossypol: celkový gossypol:

Obsah volného nebo celkový obsah gossypolu ve vzorku se vypočítá takto:

kde:

E = opravená optická hustota, stanovená jak je uvedeno v bodě 5.2

p = zkušební vzorek v g

a = alikvotní část filtrátu v ml

6.2 Na základě kalibrační křivky

6.2.1 Volný gossypol

Připravit dvě série po pěti odměrných baňkách o objemu 25 ml. V každé série přidat pipetou 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 a 10,0 ml standardního roztoku gossypolu A (3.5). Doplnit objemy rozpouštědlem A (3.2) na 10 ml.

Doplnit baňky první série, včetně slepého pokusu, směsí isopropanolu a hexanu (3.1) na 25 ml.

Přidat do každé baňky druhé série 2 ml anilinu (3.4). Zahřívat 30 minut nad vroucí vodní lázní, aby se vytvořilo zbarvení. Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu (3.1), homogenizovat a nechat stát jednu hodinu.

Za podmínek uvedených v bodě 5.2 stanovit optickou hustotu standardní série roztoků porovnáním s odpovídajícími roztoky referenční série. Načrtnout kalibrační křivku uvedením hodnot optické hustoty proti množství gossypolu (v μg).

6.2.2 Celkový gossypol

Připravit 6 odměrných baněk o objemu 50 ml. Do první baňky přidat pipetou 10 ml rozpouštědla B (3.3) a do ostatních 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 a 10,0 ml standardního roztoku gossypolu B (3.6). Doplnit obsah každé baňky na 10 ml rozpouštědlem B (3.3). Zahřívat 30 minut nad vroucí vodní lázní. Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu a promíchat.

Přidat pipetou 2 ml těchto roztoků do dvou sérií o 6 odměrných baňkách o objemu 25 ml. Doplnit obsah baněk první série na 25 ml směsí i isopropanolu a hexanu (3.1) (referenční série).

Přidat do každé baňky druhé série 2 ml anilinu (3.4). Zchladit na pokojovou teplotu, doplnit po rysku směsí isopropanolu a hexanu (3.1), homogenizovat a nechat stát jednu hodinu (standardní série).

Za podmínek uvedených v bodě 5.2 stanovit optickou hustotu standardní série roztoků porovnáním s odpovídajícími roztoky referenční série. Načrtnout kalibrační křivku uvedením hodnot optické hustoty proti množství gossypolu (v μg).

6.3 Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit:

— 15 % relativní hodnoty pro obsah gossypolu nižší než 50 ppm,

— 75 ppm absolutní hodnoty pro obsah od 500 do 750 ppm,

— 10 % relativní hodnoty pro obsah vyšší než 750 ppm.









PŘÍLOHA II

▼M4 —————

▼B

4. STANOVENÍ TYLOSINU

- difúzí na agaru -

1. Účel a rozsah

Tato metoda umožňuje stanovit tylosin v krmivech, koncentrátech a premixech. Spodní hranice pro stanovení je 2 ppm.

2. Princip

Vzorek se ošetří fosfátovým pufračním roztokem o pH 8, předehřátým na 80 °C, a poté se extrahuje methanolem. Po odstředění se extrakt zředí a jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze tylosinu na agarovém médiu naočkovaném Sarcina lutea. Difúze se projeví vytvořením inhibičních zón za přítomnosti mikroorganismu. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika.

3. Mikroorganismus: Sarcina lutea ATCC č. 9341

3.1 Udržování rodičovského kmene

Naočkovat Sarcina lutea do zkumavky se šikmým agarem odebraným z kultivačního média (4.1) upraveného na pH 7,0. Inkubovat přes noc při asi 35 °C. Skladovat kulturu v chladničce a přeočkovat každý měsíc na šikmý agar.

3.2 Příprava bakteriální suspenze

Smýt bakterie ze zkumavky se šikmým agarem (3.1) za použití 2 až 3 ml fyziologického roztoku (4.4). Naočkovat tuto suspenzi do Rouxovy baňky obsahující 250 ml kultivačního média (4.1), upravit na pH 7,0. Inkubovat 24 hodin při 35 °C, poté smýt bakterie za pomoci 25 ml fyziologického roztoku (4.4). Homogenizovat a zředit tuto suspenzi s cílem získat 75 % světelnou propustnost při 650 nm.

Pokud se tato suspenze skladuje v chladničce, její trvanlivost je jeden týden.

Předběžnými testy na deskách s bazálním médiem pro stanovení (4.1) určit množství očkovací látky, které umožní získat pro použité koncentrace tylosinu největší možné, ale ještě zřetelné inhibiční zóny. Očkování kultivačního média se provádí při 48 až 50 °C.

4. Kultivační média a činidla

4.1 Bazální médium pro stanovení ( 5 )







Glukosa 1 g Tryptický pepton 10 g Masový extrakt 1,5 g Kvasnicový extrakt 3 g Agar, podle jakosti 10 až 20 g Destilovaná voda ad 1 000 ml

Za účelem udržování rodičovského kmene a přípravy bakteriální suspenze upravit pH na7,0 a za účelem stanovení na 8,0.

4.2 Fosfátový pufr, pH 8







Dihydrogenfosforečnan draselný KH2PO4 p.a. 0,523 g Hydrogenfosforečnan draselný K2HPO4 p.a. 16,730 g Destilovaná voda ad 1 000 ml

4.3 Fosfátový pufr, pH 7







Dihydrogenfosforečnan draselný KH2PO4 p.a. 5,5 g Hydrogenfosforečnan draselný K2HPO4 p.a. 13,6 g Destilovaná voda ad 1 000 ml

4.4 Sterilní fyziologický roztok.

4.5 Čistý methanol.

4.6 40 % (V/V) methanol.

4.7 Směs fosfátového pufru (4.2)/čistý methanol: 60/40 objemově.

4.8 Standardní látka: tylosin o známé aktivitě.

5. Standardní roztoky

Sušit standardní látku (4.8) 3 hodiny při 60 °C ve vakuové sušárně (5 mm rtuti). Navážit 10 až 50 mg do odměrné baňky, rozpustit v 5 ml methanolu (4.5) a zředit roztok fosfátovým pufrem, pH 7 (4.3) s cílem získat koncentraci základního tylosinu 1 000 μg/ml.

Na základě tohoto zásobního roztoku připravit rozředěním směsi (4.7) standardní pracovní roztok S8 obsahující 2 μg základního tylosinu na 1 ml.

Poté připravit postupným ředěním (1 + 1) za použití směsi (4.7) tyto koncentrace:







S4 1 μg/ml S2 0,5 μg/ml S1 0,25 μg/ml

6. Extrakce

Pro koncentráty použít 10 g zkušebního vzorku; pro premixy a krmiva 20 g zkušebního. Přidat 60 ml fosfátového pufru, pH 8 (4.2), předehřátého na 80 °C, a homogenizovat 2 minuty (kuchyňský mixer, Ultra-turrax atd.).

Nechat stát 10 minut, přidat 40 ml methanolu (4.5) a homogenizovat 5 minut. Odstředit extrakt a zředit alikvotní část směsi (4.7) s cílem získat předpokládanou koncentraci tylosinu 2 μg/ml (= U8). Poté připravit koncentrace U4, U2 a U1 postupným ředěním (1 + 1) za použití směsi (4.7).

Pro obsahy nižší než 10 ppm odpařit extrakt do sucha v rotačním odpařovači při 35 °C a rozpustit reziduum ve 40 % methanolu (4.6).

7. Metoda stanovení

7.1 Očkování kultivačního média

Naočkovat bazální médium pro stanovení (4.1) upravené na pH 8 při 48 až 50 °C suspenzí bakterií (3.2).

7.2 Příprava misek

Difúze na agaru se provádí v miskách za použití čtyř koncentrací standardního roztoku (S8, S4, S2, S1) a čtyř koncentrací extraktu (U8, U4,U2, U1). Každá miska musí obsahovat čtyři koncentrace standardního roztoku a extraktu.

Za tímto účelem vybrat misky o takové velikosti, aby bylo možné udělat v agarovém médiu nejméně 8 děr o průměru 10 až 13 mm. Vypočítat množství očkovaného kultivačního média (7.1), které se má použít pro získání stejnoměrné vrstvy o tloušťce 2 mm. Upřednostňuje se použití misek sestávajících se z plochých skleněných desek s dokonale rovným hliníkovým nebo plastovým kroužkem o průměru 200 mm a o výšce 20 mm.

Pipetovat do děr přesně odměřená množství roztoku antibiotika mezi 0,10 a 0,15 ml, v závislosti na průměru děr.

U každého vzorku opakovat difúzi nejméně čtyřikrát s každou koncentrací, aby každé stanovení zahrnovalo vyhodnocení 32 inhibičních zón.

7.3 Inkubace

Inkubovat misky přes noci při 35 až 37 °C.

8. Vyhodnocení

Změřit průměr inhibičních zón, přednostně projekcí. Zaznamenat měření na semilogaritmický papír zanesením logaritmu koncentrací proti průměru inhibičních zón. Načrtnout křivky standardního roztoku a extraktu. Pokud nedošlo k interferenci, obě křivky budou paralelní.

Logaritmus relativní aktivity se vypočítá pomocí této rovnice:

Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita x relativní aktivita.

9. Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u jednoho vzorku nesmí překročit 10 % relativní hodnoty.

▼M2

5. STANOVENÍ VIRGINIAMYCINU

— difúzí na agaru —

1. Účel a oblast použití

Metoda je určena pro stanovení obsahu virginyamicinu v krmivech a premixech. Dolní mez stanovitelnosti obsahu je 2 mg/kg (2 ppm) ( 6 ).

2. Princip

Vzorek se extrahuje methanolickým smáčedlem Tween 80. Extrakt se dekantuje nebo odstředí a rozředí. Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze virginiamycinu na agaru, na nějž byl naočkován Micrococcus luteus. Difúze se projevuje vytvořením inhibičních zón mikroorganismu. Průměr těchto zón je považován za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotik pro stupnici použitých koncentrací.

3. Mikroorganismus: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1 Uchovávání kultury

Kultivační médium (4.1) v šikmých zkumavkách se naočkuje mikroorganismem Micrococcus luteus a 24 hodin se nechá inkubovat při teplotě 30 oC. Kultura se skladuje v chladničce při teplotě okolo 4 oC. Očkování se obnovuje každé dva týdny.

3.2 Příprava bakteriální suspenze ( 7 )

Vytvořená čerstvá kultura z nedávno připraveného agarového média (3.1) v šikmých zkumavkách se sklidí za pomoci 2 až 3 ml roztoku chloridu sodného (4.3). Touto suspenzí se naočkuje 250 ml kultivačního média (4.1) umístěného do Rouxovy baňky a nechá se inkubovat po dobu 18 až 20 hodin při teplotě 30 oC. Porost se sklidí pomocí 25 ml roztoku chloridu sodného (4.3) a zamíchá se. Suspenze se rozředí v poměru 1/10 roztokem chloridu sodného (4.3). Průchod světla suspenze musí být okolo 75 %, měřeno při 650 nm a tloušťce 1 cm ve srovnání s roztokem chloridu sodného (4.3). Tato suspenze může být uchována po dobu jednoho týdne při teplotě okolo 4 oC,

4. Kultivační média a činidla

4.1 Kultivační a zkušební médium ( 8 )







Masový pepton 6,0 g Trypton 4,0 g Kvasnicový extrakt 3,0 g Masový extrakt 1,5 g Glukóza 1,0 g Agar 10,0 až 20,0 g Voda 1 000 ml pH 6,5 (po sterilizaci)

4.2 Fosfátový tlumivý roztok, pH 6







Hydrofosforečnan draselný, K2HPO4 2,0 g Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4 8,0 g Voda až do 1 000 ml

4.3 Roztok chloridu sodného 0,8 % (hmot./obj.): 8 g chloridu sodného se rozpustí ve vodě a rozředí se na 1 000 ml; sterilizuje se.

4.4 Methanol.

4.5. Směs fosfátového tlumivého roztoku (4.2) a methanolu (4.4): 80/20 (obj./obj.).

4.6 0,5 % (hmot./obj.) methanolické smáčedlo Tween 80: 5 g Tweenu 80 se rozpustí v methanolu (4.4) a doředí se methanolem na 1 000 ml.

4.7 Standardní substance: virginiamycin známé aktivity.

5. Standardní roztoky

Přesně navážené množství standardní substance (4.7) se rozpustí v methanolu (4.4) a methanolem (4.4) se doředí tak, aby se získal roztok obsahující 1 000 μg virginiamycinu na ml.

Je-li tento roztok uchován v uzátkované baňce při teplotě 4 oC, je stabilní po dobu 5 dní.

Z tohoto zásobního roztoku se postupným ředěním za pomoci směsi (4.5) připraví následující roztoky:







s8 1 μg/ml s4 0,5 μg/ml s2 0,25 μg/ml s1 0,125 μg/ml

6. Příprava extraktu a extrahovaných roztoků

6.1 Extrakce

6.1.1 Produkty s obsahem virginiamycinu do 100 mg/kg

Odváží se 50 g vzorku se, přidá se 200 ml roztoku (4.6) a po dobu 30 minut se protřepává. Poté se nechá usadit nebo se odstředí. 20 ml roztoku se odebere z povrchu a odpařuje se na 5 ml v rotační odparce při teplotě nepřesahující 40 oC. Zbytek se rozředí směsí (4.5) tak, aby se získal předpokládaný obsah virginiamycinu 1 μg/ml (= u8).

6.1.2 Produkty s obsahem virginiamycinu nad 100 mg/kg

Odváží se množství vzorku nepřevyšující 10 g a obsahující mezi 1 a 50 mg virginiamycinu, přidá se 100 ml roztoku (4.6) a po dobu 30 minut se protřepává. Nechá se usadit nebo se odstředí, poté se rozředí směsí (4.5) tak, aby se získal předpokládaný obsah virginiamycinu 1 μg/ml (= u8).

6.2 Extrahované roztoky

Z roztoku u8 se připraví roztoky u4 (předpokládaný obsah: 0,5 μg/ml), u2 (předpokládaný obsah: 0,25 μg/ml) a u1 (předpokládaný obsah: 0,125 μg/ml) prostřednictvím postupného rozřeďování (1 + 1) se směsí (4.5).

7. Postup rozboru

7.1 Naočkování kultivačního média

Zkušební kultivační médium (4.1) se naočkuje bakteriální suspenzí (3.2) při teplotě přibližně 50 oC. Předběžnými testy na miskách s kultivačním médiem (4.1) se stanoví množství bakteriální substance umožňující získat nejrozsáhlejší a nejjasnější inhibiční zóny pro různé koncentrace virginiamycinu.

7.2 Příprava misek

Difúze na agaru se provádí na miskách se čtyřmi koncentracemi standardního roztoku (s8, s4, s2 a s1) a čtyřmi koncentracemi extrahovaného roztoku (u8, u4, u2 a u1). Na každé misce musí být nezbytně umístěny čtyři koncentrace standardu a čtyři koncentrace extraktu. Za tímto účelem se zvolí takový rozměr misek, který umožňuje vytvořit v prostředí agaru alespoň osm otvorů o průměru 10 až 13 mm, jejichž středy jsou od sebe vzdáleny alespoň 30 mm. Test by měl být prováděn především na miskách, které jsou vyrobeny ze skleněné desky, na kterou se umístí hliníkové nebo plastové kroužky o výšce 20 mm a průměru 200 mm.

Na misky se nalije kultivační médium (4.1) naočkované podle bodu 7.1. v takovém množství, které umožňuje získat přibližně 2 mm tlustou vrstvu (60 ml na misku o průměru 200 mm). Nechá se ztuhnout, vytvoří se otvory a do nich se umístí přesně naměřené objemy extrahovaných a standardních roztoků (mezi 0,10 a 0,15 ml na otvor v závislosti na průměru). Každá koncentrace se použije alespoň čtyřikrát tak, aby se při každém stanovení obsahu hodnotilo 32 inhibičních zón.

7.3 Inkubace

Misky se nechají inkubovat po dobu 16 až 18 hodin při teplotě 30 ± 2 oC.

8. Hodnocení

Průměr inhibičních zón se změří s přesností na 0,1 mm. Průměrné rozměry pro každou koncentraci se zaznamenají na semilogaritmický papír grafem znázorňujícím logaritmus koncentrací v závislosti na průměrech inhibičních zón. Nejlépe vyhovující přímky standardního a extrahovaného roztoku se zaznamenají např. následovně:

„Nejlépe vyhovující bod“ pro nejnižší úroveň standardního vzorku (SL) se stanoví za použití vzorce:

(a)

„Nejlépe vyhovující bod“ pro nejvyšší úroveň standardního vzorku (SH) se stanoví za použití vzorce:

(b)

Nahrazením u1, u2, u4 a u8, za s1, s2, s4 a s8 ve výše uvedených vzorcích se podobným způsobem vypočítají „nejlépe vyhovující body“ pro nejnižší úroveň extraktu (UL) a nejvyšší úroveň extraktu (UH).

Vypočítané hodnoty SL a SH se zaznamenají na stejný grafický papír a jejich spojením se získá „nejlépe vyhovující“ přímka standardního roztoku. Podobně se zaznamenají i hodnoty UL a UH a jejich spojením se získá „nejlépe vyhovující“ přímka extraktu.

Nejsou-li přímky ničím ovlivněny, měly by být rovnoběžné. Z praktických důvodů se přímky považují za rovnoběžné, pokud se hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) neliší o více než o 10 % od své průměrné hodnoty.

Jestliže přímky nejsou rovnoběžné, je možné eliminovat buď u1 a s1 nebo u8 a s8 a hodnoty SL, SH, UL a UH se poté vypočítají za pomocí následujících vzorců:







(a′) SL = nebo (b′) SH = nebo

a podobně pro hodnoty UL a UH. Při použití této alternativy by měla být dodržena stejná kritéria pro rovnoběžnost. Skutečnost, že byl výsledek vypočítán ze tří mezí, se poznamená v závěrečné zprávě.

Pokud jsou přímky považovány za rovnoběžné, vypočítá se logaritmus relativní aktivity (log A) pomocí jednoho z následujících vzorců podle toho, zda byly pro hodnocení rovnoběžnosti použity tři nebo čtyři úrovně.

Pro čtyři úrovně

(c)

Pro tři úrovně

(d)

nebo

(d ’)

Aktivita extraktu vzorku = aktivita odpovídajícího standardu x A

(u8 = s8 × A)

Jestliže se relativní aktivita nachází mimo rozmezí od 0,5 do 2,0, zkouška se zopakuje, přičemž se odpovídajícím způsobem upraví koncentrace extraktu nebo, jestliže to není možné, standardních roztoků. Jestliže není možné dostat relativní aktivitu do požadovaného rozmezí, je třeba považovat výsledek za přibližný a tato skutečnost by měla být uvedena v závěrečné zprávě.

Pokud přímky nejsou považovány za rovnoběžné, stanovení se opakuje. Není li dosaženo rovnoběžnosti, považuje se stanovení za nevyhovující.

Výsledek se vyjádří v miligramech virginiamycinu na kilogram krmiva.

9. Opakovatelnost

Rozdíl výsledků mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku stejným laborantem nesmí být vyšší než:

— 2 mg/kg, v absolutní hodnotě, u obsahů virginiamycinu nižších než 10 mg/kg,

— 20 % nevyššího výsledku pro obsahy od 10 do 25 mg/kg,

— 5 mg/kg, v absolutní hodnotě, u obsahů virginiamycinu od 25 do 50 mg/kg,

— 10 % nevyššího výsledku pro obsahy nad 50 mg/kg.