A)

Provede se blokující nebo kompetitivní test ELISA podle následujícího protokolu: Provedením kompetitivního testu ELISA za použití monoklonové protilátky 3-17-A3 je možné zjistit protilátky proti všem známým sérotypům viru katarální horečky ovcí (VKHO). Podstatou tohoto testu je přerušení reakce mezi antigenem VKHO a skupinově specifickou monoklonální protilátkou (3-17-A3), způsobené přidáním testovaného séra. Protilátky proti VKHO přítomné v testovaném séru blokují reaktivitu monoklonálních protilátek (mab), což vede po přidání enzymaticky značené protimyší protilátky a chromogenu/substrátu k oslabení očekávané barevné reakce. Séra mohou být testována v jednom roztoku 1:5 (kapkový test – viz dodatek 1) nebo mohou být titrována (sérová titrace – viz dodatek 2) za účelem zjištění koncového bodu roztoku. Za pozitivní lze považovat hodnoty inhibice vyšší než 50 %. Materiál a reakční činidla: 1. vhodné mikrotitrační destičky ELISA; 2. antigen: dodávaný ve formě extrahovaného buněčného koncentrátu, připravený níže popsaným postupem a skladovaný při teplotě - 20 °C nebo - 70 °C; 3. blokující pufr: fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (PBS) obsahující 0,3 % VKHO negativního séra dospělého skotu, 0,1 % (v/v) Tween-20 (dodávaného ve formě polyoxyethylene sorbiton monolaurát syrupu) v PBS; 4. monoklonální protilátka: 3-17-A3 (dodávaná ve formě hybridomu supernatantu tkáňové kultury) zaměřená proti skupinově specifickému polypeptidu VP7, skladovaná při teplotě - 20 °C nebo lyofilizovaná, ředěná před použitím blokujícím pufrem v poměru 1:100; 5. konjugát: králičí protimyší globulin (adsorbovaný a eluovaný) konjugovaný na křenovou peroxidasu a uchovávaný v temnu při teplotě 4 °C; 6. chromogen a substrát: ortofenylen diamin (OPD chromogen) rozpuštěný ve sterilní destilované vodě s výslednou koncentrací 0,4 mg/ml; peroxid vodíku (30 % w/v substrátu) s koncentrací 0,05 % v/v přidaný těsně před použitím (5 μl H2 O2 na 10 ml OPD). (S OPD zacházejte opatrně – používejte gumové rukavice – možný mutagen); 7. jednomolární kyselina sírová: 26,6 ml kyseliny přidané do 473,4 ml destilované vody. (Pamatujte, že kyselina se musí přidávat do vody, nikdy voda do kyseliny); 8. kruhová třepačka; 9. Analyzátor destiček ELISA (odečet je možné provádět i vizuálně). Uspořádání testu Cc: kontrola konjugátu (žádné sérum / žádná monoklonální protilátka); C++: silná pozitivní kontrola séra; C+: slabá pozitivní kontrola séra; C–: negativní kontrola séra; Cm: kontrola monoklonální protilátky (žádné sérum).



DODATEK 1 Uspořádání při kapkovém ředění (1:5) formát (40 sér/destička) Kontroly Testované sérum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



DODATEK 2 Uspořádání při titraci séra (10 sér/destička) Kontroly Testované sérum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1:5 1:5 B Cc C– 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Protokol testu: Kontrola konjugátu (Cc) : jamky 1A a 1B jsou určené pro slepou zkoušku za použití antigenu VKHO a konjugátu. Je možno ji použít ke kalibraci snímače ELISA. Kontrola mab (Cm) : sloupce 1 a 2, řady G a H jsou jamky určené pro kontrolu monoklonální protilátky a obsahují antigen VKHO, monoklonální protilátku a konjugát. Tyto jamky představují maximální zabarvení. Průměr hodnot optické hustoty z této kontroly odpovídá inhibiční hodnotě 0 %. Pozitivní kontrola (C++, C+) : sloupce 1 a 2, řady C-D-E-F. Tyto jamky obsahují antigen VKHO, silné a slabé pozitivní antisérum VKHO, mab a konjugát. Negativní kontrola (C–) : jamky 2A a 2B obsahují negativní kontrolu, která sestává z VKHO antigenu, VKHO negativního antiséra, mab a konjugátu. Testovaná séra : pro rozsáhlé sérologické průzkumy a rychlý screening mohou být séra testována v jednom zředění 1:5 (dodatek 1). Případně může být 10 sér testováno v ředění od 1:5 do 1:640 (dodatek 2), což poskytne vodítko, pokud jde o titr protilátky v testovaných sérech. Postup: 1. Nařeďte antigen VKHO na předtitrovanou koncentraci v PBS, krátce protřepejte v ultrazvukové třepačce, aby se rozptýlil agregovaný virus (není-li tento přístroj k dispozici, důkladně protřepejte v pipetě) a přidejte 50 μl do všech jamek destičky ELISA. Oklepněte strany destičky, aby se antigen rozptýlil. 2. Inkubujte při 37 °C po dobu 60 minut na kruhové třepačce. Třikrát destičky promyjte, a to tak, že jamky propláchnete nesterilním PBS, a poté je osušíte pomocí savého papíru. 3. Kontrolní jamky: do jamek Cc přidejte 100 μl blokujícího pufru. Do příslušných jamek C–, C+ a C++ přidejte 50 μl pozitivního a negativního kontrolního séra ve zředění 1:5 (10 μl séra + 40 μl blokujícího pufru). Do kontrolních jamek přidejte k mab 50 μl blokujícího pufru. Metoda bodové titrace: do jamek ve sloupcích 3 až 12 přidejte zředění každého testovaného séra v tlumicím roztoku 1:5 (10 μl séra + 40 μl tlumicího roztoku), aby se jejich objem zdvojnásobil. nebo Metoda titrace séra: ve všech osmi jamkách jednotlivých sloupců 3 až 12 připravte dvojitou sérii roztoků každého testovaného vzorku (1:5 až 1:640) v blokujícím pufru. 4. Ihned po přidání testovaných sér nařeďte mab v blokujícím pufru v poměru 1:100 a přidejte 50 μl do všech jamek destičky kromě slepé kontroly. 5. Inkubujte při 37 °C po dobu 60 minut na kruhové třepačce. Promyjte destičky třikrát pomocí PBS, poté je osušte savým papírem. 6. Nařeďte králičí anti-myší koncentrát v blokujícím pufru v poměru 1:5 000 a přidejte 50 μl do všech jamek destičky. 7. Inkubujte při 37 °C po dobu 60 minut na kruhové třepačce. Promyjte destičky třikrát pomocí PBS, poté je osušte savým papírem. 8. Nechte roztát OPD a těsně před použitím přidejte 5 μl 30 % peroxidu vodíku ke každým 10 ml OPD. Do všech jamek destičky přidejte 50 μl. Vyčkejte asi 10 minut, než dojde k barevné reakci, a poté ji zastavte jednomolární kyselinou sírovou (50 μl na jamku). K barevné reakci by mělo dojít v kontrolních jamkách mab a v jamkách obsahujících séra bez protilátek proti VKHO. 9. Destičky odečítejte buď vizuálně, nebo pomocí spektrofotometrického analyzátoru. Analýza výsledků: Za použití příslušného softwarového nástroje se vytisknou hodnoty optické denzity (OD) a procentní inhibiční hodnoty (PI) testovaných a kontrolních sér vycházející ze střední hodnoty zaznamenané v kontrolních jamkách s antigenem. Údaje vyjádřené jako hodnoty OD a PI se použijí ke stanovení, zda byl test proveden v rámci přípustných mezí. Horní kontrolní meze (UCL) a dolní kontrolní meze (LCL) pro kontrolu mab (antigen plus mab bez testovaného séra) leží mezi hodnotami OD 0,4 a 1,4. Všechny destičky, které nevyhovují výše uvedeným kritériím, je nutné odmítnout. Není-li k dispozici softwarový nástroj, vytiskněte hodnoty OD za použití tiskárny ELISA. Vypočtěte střední hodnotu OD kontrolních jamek s antigenem, která představuje hodnotu 100 %. Určete 50 % hodnotu OD a ručně vypočtěte pozitivitu a negativitu každého vzorku. Procentní inhibiční hodnota (PI) = 100 – (OD každé testové kontroly / střední hodnota OD jamek Cm) × 100. Zdvojené jamky s negativním kontrolním sérem a zdvojené slepé jamky musí vykazovat hodnoty PI mezi + 25 % a - 25 %, resp. mezi + 95 % a + 105 %. Hodnoty mimo toto rozmezí destičku nevyřazují, ale svědčí o tom, že se vyvíjí barva pozadí. Silná a slabá pozitivní kontrolní séra musí vykazovat hodnoty PI mezi + 81 % a + 100 %, resp. mezi + 51 % a + 80 %. Diagnostický práh pro testovaná séra je 50 % (PI 50 % nebo OD 50 %). Vzorky vykazující hodnoty PI > 50 % se zaznamenají jako negativní. Vzorky vykazující hodnoty PI mimo rozmezí pro zdvojené jamky (nad mezními hodnotami nebo pod nimi) se považují za nejisté. Takové vzorky mohou být znovu testovány bodovým testem a/nebo titrací. Pozitivní vzorky lze také titrovat za účelem zjištění stupně pozitivity. Vizuální vyhodnocení: pozitivní a negativní vzorky jsou snadno rozeznatelné zrakem; slabě pozitivní nebo silně negativní vzorky lze zrakem interpretovat obtížněji. Příprava VKHO ELISA antigenu: 1. Promyjte 40–60 Rouxových lahví se souvislým porostem buněk BHK-21 třikrát Eagleho médiem bez séra a infikujte sérotypem 1 viru katarální horečky ovcí v Eagleho médiu bez séra. 2. Inkubujte při teplotě 37 °C a denně vyšetřujte na cytopatický efekt (CPE). 3. Jakmile k CPE dojde u 90–100 % buněk v každé Roux láhvi, lze virus získat protřepáním, kterým se uvolní buňky ulpívající na skle. 4. Odstřeďte při 2 000 až 3 000 otáčkách za minutu, až buňky vytvoří peletu. 5. Odstraňte supernatant a resuspendujte buňky přibližně ve 30 ml PBS obsahujícího 1 % „Sarkosylu“ a 2 ml fenylmethylsulfonylfluoridu (lysis pufr). To může vést k tvorbě gelu a ke zmírnění tohoto efektu je možné přidat více lysis pufru. (Pozor: fenylmethylsulfonylfluorid má škodlivé účinky - je třeba s ním zacházet s maximální opatrností.) 6. Po dobu 60 sekund rozrušujte buňky ultrazvukovou sondou při amplitudě 30 mikronů. 7. Po dobu deseti minut odstřeďujte při 10 000 otáčkách za minutu. 8. Supernatant uchovávejte při teplotě + 4 °C a zbývající buněčnou peletu resuspendujte v 10 až 20 ml lysis pufru. 9. Třikrát protřepejte v ultrazvukové třepačce a vyčeřte, supernatant z každého stadia uchovejte. 10. Slijte supernatanty a odstřeďujte při 24 000 otáčkách za minutu (100,000 g) po dobu 120 minut při teplotě + 4 °C přes 5ml polštář 40 % sacharosy (w/v v PBS) s použitím 30ml Beckmannových odstřeďovacích zkumavek a rotoru SW 28. 11. Odstraňte supernatant, důkladně vyprázdněte zkumavky a resuspendujte peletu v PBS působením ultrazvukových vibrací. Antigen skladujte rozdělený na poměrné části při teplotě - 20 °C. Titrace VKHO ELISA antigenu: ELISA antigen katarální horečky ovcí se titruje nepřímou metodou ELISA. Dvojnásobná zředění antigenu se titrují proti konstantnímu zředění (1:100) monoklonální protilátky 3-17-A3. Protokol je tento: 1. VKHO antigen zředěný v PBS v poměru 1:20 titrujte na celé mikrotitrační destičce v sériích dvojnásobných zředění (50 μl na jamku) pomocí mnohokanálové pipety. 2. Inkubujte po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C na kruhové třepačce. 3. Destičky třikrát promyjte PBS. 4. Přidejte 50 μl monoklonální protilátky 3-17-A3 (zředěné v poměru 1:100) do každé jamky mikrotitrační destičky. 5. Inkubujte po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C na kruhové třepačce. 6. Destičky třikrát promyjte PBS. 7. Do každé jamky mikrotitrační destičky přidejte 50 μl králičího anti-myšího globulinu konjugovaného na křenovou peroxidasu, ředěného na optimální koncentraci na základě předtitrace. 8. Inkubujte po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C na kruhové třepačce. 9. Přidejte substrát a chromogen, jak je uvedeno výše. Po deseti minutách reakci zastavte přidáním jednomolární kyseliny sírové (50 μl na jamku). Při kompetitivním testu musí být nadbytek monoklonální protilátky, proto se volí takové zředění antigenu, které leží na titrační křivce (nikoli v oblasti základny), při kterém má OD hodnotu přibližně 0,8 po deseti minutách.