01991R2568 — CS — 04.12.2016 — 031.005

Tento dokument slouží výhradně k informačním účelům a nemá žádný právní účinek. Orgány a instituce Evropské unie nenesou za jeho obsah žádnou odpovědnost. Závazná znění příslušných právních předpisů, včetně jejich právních východisek a odůvodnění, jsou zveřejněna v Úředním věstníku Evropské unie a jsou k dispozici v databázi EUR-Lex. Tato úřední znění jsou přímo dostupná přes odkazy uvedené v tomto dokumentu

Ve znění:





Opraveno:







(*) Tento akt nebyl nikdy publikován v češtině.









▼B

NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91

ze dne 11. července 1991

o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy







▼M20

Článek 1

1. Oleje s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodech 1 a 2 přílohy I tohoto nařízení, jsou považovány za panenské olivové oleje ve smyslu bodu 1 písm. a) a b) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

2. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 3 přílohy I tohoto nařízení, je považován za lampantový olivový olej ve smyslu bodu 1 písm. c) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

3. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 4 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej ve smyslu bodu 2 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

4. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 5 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej obsahující směs rafinovaného olivového oleje a panenského olivového oleje ve smyslu bodu 3 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

5. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 6 přílohy I tohoto nařízení, je považován za surový olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 4 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

6. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 7 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 5 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

7. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 8 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 6 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

▼M26

Článek 2

1. Charakteristiky olivových olejů uvedených v příloze I se stanoví v souladu s těmito metodami analýzy:

a) stanovení volných mastných kyselin, vyjádřených v procentech kyseliny olejové, metodou uvedenou v příloze II;

b) stanovení peroxidového čísla metodou uvedenou v příloze III;

c) stanovení obsahu vosků metodou uvedenou v příloze IV;

d) stanovení složení a obsahu sterolů a triterpenických dialkoholů kapilární plynovou chromatografií metodou uvedenou v příloze V;

e) stanovení procentního podílu 2-glyceril-monopalmitátu metodou uvedenou v příloze VII;

f) spektrofotometrická analýza metodou uvedenou v příloze IX;

▼M28

g) stanovení složení mastných kyselin metodou uvedenou v příloze X;

▼M26

h) stanovení těkavých halogenovaných rozpouštědel metodou uvedenou v příloze XI;

i) hodnocení organoleptických charakteristik panenského olivového oleje metodou uvedenou v příloze XII;

j) stanovení stigmastadienolů metodou uvedenou v příloze XVII;

k) stanovení obsahu triglyceridů s ECN 42 metodou uvedenou v příloze XVIII;

▼M28

l) stanovení obsahu alifatických a triterpenických alkoholů metodou uvedenou v příloze XIX;

▼M26

m) stanovení obsahu vosků, methylesterů mastných kyselin a ethylesterů mastných kyselin metodou uvedenou v příloze XX.

▼M28 —————

▼M26

2. Ověřování organoleptických charakteristik panenského oleje provádí vnitrostátní orgány nebo jejich zástupci v rámci zkušebních komisí schválených členskými státy.

Organoleptické vlastnosti oleje uvedeného v prvním pododstavci se považují za odpovídající deklarované kategorii v případě, že zkušební komise schválená členským státem potvrdí jeho zařazení.

V případě, že zkušební komise nepotvrdí deklarovanou kategorii oleje vzhledem k jeho organoleptickým vlastnostem, vnitrostátní orgány nebo jejich zástupci nechají bez odkladu provést, na žádost zainteresované strany, dvě oponentní hodnocení jinými schválenými zkušebními komisemi, z nichž alespoň jedna je schválena členským státem, z nějž pochází výrobce oleje. Dotčené vlastnosti se považují za odpovídající deklarovaným charakteristikám, pokud alespoň dvě oponentní hodnocení potvrdí deklarovanou kvalitu. Pokud tomu tak není, nese náklady na oponentní hodnocení zainteresovaná strana.

3. Pokud vnitrostátní orgány nebo jejich zástupci ověřují vlastnosti oleje postupem podle odstavce 1, provádí se odběr vzorků v souladu s mezinárodními normami EN ISO 661 o přípravě zkušebních vzorků a EN ISO 5555 o odběru vzorků. Pokud jsou však takové oleje ve spotřebitelských obalech baleny po šaržích, pak odchylně od bodu 6.8 normy EN ISO 5555 se odběr vzorků provádí v souladu s přílohou Ia tohoto nařízení. V případě, že odběr vzorků oleje ve velkém balení nemůže být proveden v souladu s normou EN ISO 5555, odeberou se vzorky podle pokynů příslušného orgánu členského státu.

Aniž by byla dotčena ustanovení normy EN ISO 5555 a kapitoly 6 normy EN ISO 661, odebrané vzorky se co nejrychleji umístí z dosahu světla a vysokých teplot a nejpozději pět pracovních dní po odběru se odešlou k analýze do laboratoře, jinak musí být uchovávány tak, aby se neznehodnotily nebo nepoškodily během přepravy nebo skladování, než budou do laboratoře zaslány.

4. Pro účely ověření podle odstavce 3 se analýzy uvedené v přílohách II, III, IX, XII a XX, jakož i případné kontrolní analýzy stanovené vnitrostátními právními předpisy, v případě balených výrobků provádějí před datem minimální trvanlivosti. V případě odběru vzorků olejů ve velkých baleních se tyto analýzy provádějí nejpozději šestý měsíc po měsíci, v kterém byl vzorek odebrán.

Pro ostatní analýzy uvedené v tomto nařízení neplatí žádné lhůty.

Jestliže výsledky analýz neodpovídají vlastnostem deklarované třídy olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin, dotčená strana je o tom informována nejpozději jeden měsíc před koncem lhůty stanovené v prvním odstavci, kromě případu, kdy byl vzorek odebrán méně než dva měsíce před datem minimální trvanlivosti.

5. Ke stanovení charakteristik olivového oleje metodami uvedenými v prvním pododstavci odstavce 1 se výsledky analýz porovnávají přímo s mezními hodnotami danými tímto nařízením.

▼M25

Článek 2a

1. Pro účely tohoto článku se pojmem „olivový olej uváděný na trh“ rozumí celkové množství olivového oleje a olivového oleje z pokrutin příslušného členského státu, které se v uvedeném členském státě spotřebuje nebo které se z uvedeného členského státu vyveze.

2. Členské státy zajistí, aby kontroly shody byly prováděny selektivně, na základě analýzy rizik a s přiměřenou četností s cílem zajistit, aby olivový olej uváděný na trh byl v souladu s deklarovanou kategorií.

3. Kritéria pro posouzení rizika mohou zahrnovat:

a) kategorii oleje, období produkce, cenu oleje v porovnání s jinými rostlinnými oleji, úkony mísení a balení, skladovací zařízení a podmínky, zemi původu, zemi určení, způsob přepravy nebo objem šarže;

b) postavení hospodářských subjektů v marketingovém řetězci, objem nebo hodnotu výrobků jimi uváděných na trh, sortiment olejů jimi uváděných na trh, druh vykonávané hospodářské činnosti jako např. lisování, skladování, rafinace, mísení, balení nebo maloobchodní prodej;

c) zjištění při předchozích kontrolách včetně počtu a druhu zjištěných nedostatků, obvyklou kvalitu olejů uváděných na trh, výkonnost používaného technického vybavení;

d) spolehlivost systému zajištění jakosti či systému vlastní kontroly hospodářských subjektů v souvislosti s dodržováním obchodních norem;

e) místo, kde se provádí kontrola, zejména, jde-li o první bod vstupu do Unie, poslední bod výstupu z Unie nebo o místo produkce, balení a naložení oleje či jeho prodeje konečnému spotřebiteli;

f) jakékoliv další informace, které by mohly poukazovat na riziko nedodržování norem.

4. Členské státy předem stanoví:

a) kritéria pro hodnocení rizika nedodržování norem u šarží;

b) na základě analýzy rizik pro každou kategorii rizik minimální počet hospodářských subjektů či šarží a/nebo množství, u nichž budou provedeny kontroly shody.

Ročně se provádí alespoň jedna kontrola shody na každých tisíc tun olivového oleje uváděného na trh v členském státě.

5. Členské státy ověří dodržování shody:

a) provedením analýz uvedených v příloze I v jakémkoli pořadí nebo

b) v pořadí uvedeném v rozhodovacím schématu v příloze Ib, dokud není dosaženo jednoho z rozhodnutí uvedených v rozhodovacím schématu.

▼M19 —————

▼M25

Článek 3

Pokud se zjistí, že určitý olej neodpovídá popisu kategorie, do níž patří, uloží daný členský stát, aniž jsou dotčeny jakékoli další sankce, účinné, přiměřené a odrazující sankce, jejichž výše se stanoví podle závažnosti zjištěné nesrovnalosti.

Pokud jsou při kontrolách zjištěny závažné nesrovnalosti, zvýší členské státy četnost kontrol ve vztahu k etapě uvádění na trh, kategorii oleje, původu nebo jiným kritériím.

▼M5

Článek 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Pokud členský stát narazí na potíže při sestavování zkušebních komisí na svém území, může povolat zkušební komisi schválenou v jiném členském státě.

3. Každý členský stát vypracuje seznam zkušebních komisí sestavených profesionálními nebo mezioborovými organizacemi za podmínek stanovených v odstavci 1 a zajistí dodržování těchto podmínek.

▼M19 —————

▼B

Článek 6

1. Obsah oleje u pokrutin z oliv a jiných zbytků po extrakci olivového oleje (podpoložky 2306 90 11 a 2306 90 19 ) se stanoví metodou uvedenou v příloze XV.

2. Obsah oleje, na který odkazuje odstavec 1, se vyjadřuje v procentech hmotnosti oleje v sušině.

▼M20

Článek 7

Pokud jde o přítomnost kontaminujících látek, použijí se příslušné předpisy Společenství.

Pokud jde o halogenovaná rozpouštědla, zavádějí se pro všechny kategorie olivového oleje tyto limity:

— maximální obsah každého zjištěného halogenovaného rozpouštědla: 0,1 mg/kg,

— maximální celkový obsah zjištěných halogenovaných rozpouštědel: 0,2 mg/kg.

▼M25

Článek 7a

Fyzické či právnické osoby a skupiny fyzických či právnických osob vlastnící z profesionálních či obchodních důvodů olivový olej a olivový olej z pokrutin od extrakce v lisovně až po fázi plnění, musí pro každou z kategorií těchto olejů vést evidenci vstupů a výstupů.

Členský stát zajistí, aby byla povinnost stanovená v prvním odstavci řádně dodržována.

▼M25

Článek 8

1. Členské státy sdělí Komisi opatření přijatá k provádění tohoto nařízení. Rovněž Komisi uvědomí o veškerých následných změnách.

2. Nejpozději 31. května každého roku předají členské státy Komisi zprávu o provádění tohoto nařízení v předchozím kalendářním roce. Zpráva musí obsahovat alespoň výsledky kontrol shody provedené u olivového oleje podle vzoru stanoveného v příloze XXI.

3. Oznámení uvedená v tomto nařízení se provádějí v souladu s nařízením Komise (ES) č. 792/2009 ( 1 ).

▼B

Článek 9

Nařízení (EHS) č. 1058/77 se zrušuje.

Článek 10

1. Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.

Metoda uvedená v příloze XII se však použije ode dne ►M1 1. listopadu 1992 ◄ , s výjimkou případů, kdy se jedná o intervenční opatření.

▼M5

Tato metoda se nepoužije u panenského olivového oleje stočeného před 1. listopadem 1992.

▼B

2. Toto nařízení se nepoužije na olivový olej a olivový olej z pokrutin stočený do obalů před vstupem tohoto nařízení v platnost a uvedený na trh do 31. října 1992.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.









PŘÍLOHA

Obsah







Příloha I: Charakteristiky olivového oleje Příloha I A: Odběr vzorků ze šarží olivového oleje a olivového oleje z pokrutin ve spotřebitelských obalech Příloha I B: Rozhodovací schéma pro ověření souladu vzorku olivového oleje s deklarovanou kategorií Příloha II: Stanovení volných mastných kyselin, metoda za studena Příloha III: Stanovení peroxidového čísla Příloha IV: Stanovení obsahu vosku pomocí kapilární plynové chromatografie Příloha V: Stanovení složení a obsahu sterolů a triterpenických dialkoholů kapilární plynovou chromatografií Příloha VII: ►M21 Stanovení procentuálního podílu 2-glyceril monopalmitátu ◄ ▼M20 ————— ▼B Příloha IX: Spektrofotometrická analýza v ultrafialové oblasti spektra ▼M28 Příloha X: Stanovení methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií ▼B Příloha XI: Stanovení těkavých halogenovaných rozpouštědel v olivovém oleji Annex XII: Metoda mezinárodní rady pro olivový olej pro organoleptické hodnocení panenského olivového oleje ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Příloha XV: Stanovení obsahu oleje v olivových pokrutinách Příloha XVI: Stanovení jodového čísla Příloha XVII: Metoda pro stanovení stigmastadienolů v rostlinných olejích Příloha XVIII: Stanovení rozdílu mezi skutečným a teoretickým obsahem triacylglycerolů s ekvivalentním počtem uhlíkových atomů 42 (ECN 42) Annex XIX: ►M28 Stanovení obsahu alifatických a triterpenických alkoholů kapilární plynovou chromatografií ◄ ▼M23 Příloha XX: Metoda stanovení obsahu vosků, methylesterů mastných kyselin a ethylesterů mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií ▼M28 ————— ▼M25 Příloha XXI: Výsledky kontroly shody prováděné v odvětví olivového oleje uvedené v čl. 8 odst. 2

▼M31









PŘÍLOHA I

CHARAKTERISTIKY OLIVOVÉHO OLEJE

Jakostní charakteristiky







Kategorie Kyselost (%) (*) Peroxidové číslo mEq O2/kg (*) K232 (*) K268 nebo K270 (*) Delta-K (*) Organoleptické hodnocení Ethylestery mastných kyselin mg/kg (*) Medián vad (Md) (*) Medián znaku ovocná chuť a vůně (Mf) (*) 1. Extra panenský olivový olej ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 35 2. Panenský olivový olej ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 — ►C2

3. Lampantový olivový olej ◄ > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Rafinovaný olivový olej ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — — 5. Olivový olej složený z rafinovaného a panenského olivového oleje ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — — 6. Surový olivový olej z pokrutin — — — — — — — — 7. Rafinovaný olivový olej z pokrutin ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — — 8. Olivový olej z pokrutin ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — — (1) Medián vad může být menší nebo roven 3,5, je-li medián znaku ovocná chuť a vůně je roven 0.

Vlastnosti týkající se čistoty







Kategorie Obsah mastných kyselin (1) Úhrn transizomerů kyseliny olejové (%) Úhrn transizomerů kyseliny linolové + linolenové (%) Stigmastadieny mg/kg (2) ►C2 Rozdíl: ECN42 (HPLC) a ECN42 (teoretický výpočet) ◄ 2-glyceryl monopalmitát (%) Myristová (%) Linolenová (%) Arachidová (%) Eikosanová (%) Behenová (%) Lignocerová (%) 1. Extra panenský olivový olej ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C2 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % ≤ 14 % ≤ 1,0, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % > 14 % 2. Panenský olivový olej ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C2 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % ≤ 14 % ≤ 1,0, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % > 14 % ►C2

3. Lampantový olivový olej ◄ ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % ≤ 14 % ≤ 1,1, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % > 14 % 4. Rafinovaný olivový olej ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % ≤ 14 % ≤ 1,1, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % > 14 % 5. Olivový olej složený z rafinovaného a panenského olivového oleje ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % ≤ 14 % ≤ 1,0, pokud celkové množství palmitové kyseliny v % > 14 % 6. Surový olivový olej z pokrutin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ►C2 ≤ |0,6| ◄ ≤ 1,4 7. Rafinovaný olivový olej z pokrutin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C2 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,4 8. Olivový olej z pokrutin ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C2 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,2







Kategorie Složení sterolů Steroly celkem (mg/kg) Erythrodiol a uvaol (%) (**) Vosky mg/kg (**) Cholesterol (%) Brasikasterol (%) Kampesterol (3) (%) Stigmasterol (%) App betasitosterol (%) (4) Delta-7-stigmastenol (3) (%) 1. Extra panenský olivový olej ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Panenský olivový olej ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ►C2

3. Lampantový olivový olej ◄ ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (5) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (5) 4. Rafinovaný olivový olej ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Olivový olej složený z rafinovaného a panenského olivového oleje ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Surový olivový olej z pokrutin ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (6) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (6) 7. Rafinovaný olivový olej z pokrutin ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Olivový olej z pokrutin ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350

Poznámky:

a) Výsledky zkoušek se uvádějí na stejný počet desetinných míst, jaký je předepsán pro každou charakteristiku. Poslední desetinné místo se přitom zaokrouhlí nahoru, pokud je číslice na dalším desetinném místě vyšší než 4.

b) Pokud jakákoli charakteristika neodpovídá předepsaným mezním hodnotám, může být olivový olej zařazen do jiné kategorie nebo označen jako nesplňující požadavky na čistotu pro účely tohoto nařízení.

▼C2

c) Jakostní charakteristiky olejů označené hvězdičkou (*) znamenají, že: — v případě lampantového olivového oleje nemusí být stanovené mezní hodnoty dodrženy současně, — v případě panenských olivových olejů je nedodržení jedné nebo více mezních hodnot důvodem pro změnu kategorie v rámci skupiny panenského olivového oleje.

▼M31

d) Charakteristiky olejů označené dvěma hvězdičkami (**) znamenají, že v případě všech olivových olejů z pokrutin nemusí být stanovené mezní hodnoty dodrženy současně.









Dodatek

ROZHODOVACÍ SCHÉMA

Kampesterol – rozhodovací schéma pro panenské a extra panenské olivové oleje:

Ostatní parametry musí být v souladu s limity stanovenými v tomto nařízení.

Delta-7-stigmastenol – rozhodovací schéma pro:

— extra panenské a panenské olivové oleje —

Ostatní parametry musí být v souladu s limity stanovenými v tomto nařízení.

— olivové oleje z pokrutin (surové a rafinované) —

▼M26









PŘÍLOHA Ia

ODBĚR VZORKŮ ZE ŠARŽÍ OLIVOVÉHO OLEJE A OLIVOVÉHO OLEJE Z POKRUTIN VE SPOTŘEBITELSKÝCH OBALECH

Tato metoda odběru vzorků se použije pro šarže olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin stočené do spotřebitelských obalů. Použijí se různé metody odběru vzorků v závislosti na tom, zda objem spotřebitelských obalů přesahuje 5 litrů či nikoli.

„Šarže“ se skládá z více prodejních jednotek, které jsou vyprodukovány, vyrobeny a zabaleny za takových okolností, že olej obsažený v každé prodejní jednotce se vzhledem ke všem svým analytickým charakteristikám považuje za homogenní. Individualizace šarže musí být provedena v souladu se směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2011/91/EU ( 8 ).

„Dílem“ se rozumí množství oleje obsažené ve spotřebitelském obalu a odebrané z namátkou vybraného místa v dané šarži.

1. OBSAH DÍLČÍHO VZORKU

1.1 Spotřebitelský obal o objemu nejvýše 5 litrů

„Dílčím vzorkem“ u spotřebitelského obalu o objemu nejvýše 5 litrů se rozumí počet dílů odebraných ze šarže v souladu s tabulkou 1.







Tabulka 1 Minimální velikost dílčího vzorku musí obsahovat V případě spotřebitelských obalů o objemu Dílčí vzorek musí obsahovat olej z (a) nejméně 1 litr (a) 1 spotřebitelského obalu; (b) méně než 1 litr (b) minimálního počtu obalů, jejichž celkový objem je nejméně 1 litr

Počet obalů uvedených v tabulce 1, které tvoří dílčí vzorek, může každý členský stát zvýšit podle vlastní potřeby (např. organoleptické hodnocení provedené jinou laboratoří než tou, která provedla chemické analýzy, kontrolní analýza atd.).

1.2 Spotřebitelský obal o objemu vyšším než 5 litrů

„Dílčím vzorkem“ u spotřebitelského obalu o objemu vyšším než 5 litrů se rozumí reprezentativní část všech dílů získaných redukcí jejich množství a v souladu s tabulkou 2. Dílčí vzorek se musí skládat z různých příkladů.

„Příkladem“ dílčího vzorku se rozumí každý obal, ze kterého se dílčí vzorek skládá.







Tabulka 2 Minimální počet dílů, které je nutno vybrat Počet balení v šarži Minimální počet dílů, které je nutno vybrat Do 10 1 11 až 150 2 151 až 500 3 501 až 1 500 4 1 501 až 2 500 5 > 2 500 na 1 000 obalů 1 díl navíc

Za účelem zmenšení objemu vzorků odebraných ze spotřebitelských obalů se obsah odebraných dílů pro přípravu dílčího vzorku homogenizuje. Části jednotlivých dílů se nalijí do společné nádoby pro homogenizaci mícháním tak, aby byly co nejlépe chráněny před přístupem vzduchu.

Obsah dílčího vzorku se musí nalít do série obalů s minimální kapacitou 1,0 litru, z nichž každý představuje příklad dílčího vzorku.

Počet dílčích vzorků může každý členský stát zvýšit podle vlastní potřeby (např. organoleptické hodnocení provedené jinou laboratoří, než která provedla chemické analýzy, kontrolní analýza atd.).

Každý obal musí být naplněn tak, aby byla vzduchová vrstva v jeho vrchní části co nejmenší, a pak se odpovídajícím způsobem uzavře a utěsní s cílem zabránit neoprávněné manipulaci s produktem.

Tyto příklady musí být označeny tak, aby byla zajištěna jejich správná identifikace.

2. ANALÝZY A VÝSLEDKY

2.1 Každý dílčí vzorek se musí dále rozdělit na laboratorní vzorky v souladu s bodem 2.5 normy EN ISO 5555 a podléhá těmto analýzám v pořadí uvedeném v rozhodovacím schématu v příloze Ib nebo v jakémkoli jiném náhodném pořadí.

2.2 Pokud všechny výsledky analýzy vyhovují charakteristikám deklarované kategorie olivového oleje, celá šarže se prohlásí za vyhovující.

Pokud jediný z výsledků analýzy nevyhovuje charakteristikám deklarované kategorie olivového oleje, celá šarže se prohlásí za nevyhovující.

3. OVĚŘENÍ KATEGORIE ŠARŽE

3.1 Příslušný orgán může za účelem ověření kategorie šarže zvýšit počet dílčích vzorků odebraných v různých bodech šarže podle následující tabulky:







Tabulka 3 Počet dílčích vzorků podle velikosti šarže Velikost šarže (v litrech) Počet dílčích vzorků Menší než 7 500 2 Od 7 500 do méně než 25 000 3 Od 25 000 do méně než 75 000 4 Od 75 000 do méně než 125 000 5 125 000 a více 6 + 1 na každých dalších 50 000 litrů

Každý díl představující dílčí vzorek musí být odebrán z průběžného místa v šarži; je třeba zaznamenat umístění každého dílčího vzorku a jednoznačně ho identifikovat.

Každý dílčí vzorek musí být vytvořen v souladu s postupy uvedenými v bodech 1.1 a 1.2.

Každý dílčí vzorek je pak podroben analýzám uvedeným v čl. 2 odst. 1.

3.2 Pokud některý z výsledků analýzy nejméně jednoho dílčího vzorku podle čl. 2 odst. 1 nevyhovuje charakteristikám deklarované kategorie olivového oleje, prohlásí se celá šarže, z níž byl vzorek odebrán, za nevyhovující.









PŘÍLOHA Ib

ROZHODOVACÍ SCHÉMA PRO OVĚŘENÍ SOULADU VZORKU OLIVOVÉHO OLEJE S DEKLAROVANOU KATEGORIÍ

Tabulka 1

Tabulka 2

Tabulka 3









Dodatek 1







Srovnávací tabulka mezi přílohami tohoto nařízení a analýzami uvedenými v rozhodovacím schématu — Kyselost Příloha II Stanovení volných mastných kyselin, metoda za studena — Peroxidové číslo Příloha III Stanovení peroxidového čísla — UV spektrometrie Příloha IX Spektrofotometrická analýza — Organoleptické hodnocení Příloha XII Organoleptické hodnocení panenského olivového oleje — Ethylestery Příloha XX Metoda stanovení obsahu vosků, methylesterů mastných kyselin a ethylesterů mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií — 3,5-Stigmastadieny Příloha XVII Metoda pro stanovení stigmastadienolů v rostlinných olejích ▼M28 — Trans-isomery mastných kyselin Příloha X Stanovení methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií — Obsah mastných kyselin Příloha X Stanovení methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií ▼M26 — delta-ECN42 Příloha XVIII Stanovení složení triglyceridů s ECN42 (rozdíl mezi výsledky HPLC a teoretickým obsahem) — Složení sterolů a celkový obsah sterolů — Erythrodiol a uvaol Příloha V Stanovení složení a obsahu sterolů a triterpenických dialkoholů pomocí kapilární plynové chromatografie — Vosky Příloha IV Stanovení obsahu vosku pomocí kapilární plynové chromatografie ▼M28 — Alifatické a triterpenické alkoholy Příloha XIX „Stanovení obsahu alifatických a triterpenických alkoholů kapilární plynovou chromatografií“ ▼M26 — Nasycené mastné kyseliny v poloze 2 Příloha VII Stanovení procentního podílu 2-glyceryl monopalmitátu

▼M29









PŘÍLOHA II

STANOVENÍ VOLNÝCH MASTNÝCH KYSELIN, METODA ZA STUDENA

1. PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje postup stanovování volných mastných kyselin v olivových olejích a olivových olejích z pokrutin. Obsah volných mastných kyselin je vyjádřen jako kyselost vypočtená v procentech kyseliny olejové.

2. PODSTATA METODY

Vzorek se rozpustí ve směsi rozpouštědel a přítomné volné mastné kyseliny se titrují roztokem hydroxidu draselného nebo hydroxidu sodného.

3. ČINIDLA

Všechna činidla by měla být čistoty p. a. a používaná voda by měla být destilovaná nebo odpovídající čistoty.

3.1 Směs diethyletheru a 95 % ethanolu 1:1 (V/V). Neutralizuje se těsně před použitím pomocí roztoku hydroxidu draselného (3.2) a přidá se 0,3 ml fenolftaleinového roztoku (3.3) na 100 ml směsi. Poznámka 1: Diethylether je vysoce hořlavý a může vytvářet výbušné peroxidy. Při jeho používání je třeba dbát zvýšené opatrnosti. Poznámka 2: Není-li možné použít diethylether, může se použít směsné rozpouštědlo obsahující ethanol a toluen. V případě potřeby může být ethanol nahrazen 2-propanolem.

3.2 Hydroxid draselný nebo hydroxid sodný, titrační ethanolický nebo vodný roztok o koncentraci c(KOH) [nebo c(NaOH)] přibližně 0,1 mol/l, nebo v případě potřeby přibližně 0,5 mol/l. Dostupné jsou komerční roztoky. Přesná koncentrace roztoku hydroxidu draselného (nebo roztoku hydroxidu sodného) musí být známa a zkontrolována těsně před použitím. Použije se roztok připravený nejméně pět dnů před použitím a dekantovaný v láhvi z hnědého skla s gumovou zátkou. Roztok by měl být bezbarvý nebo pouze slabě zbarvený. Je-li při použití vodného roztoku hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) zpozorována separace fází, nahradí se vodný roztok roztokem ethanolickým. Poznámka 3: Stabilní bezbarvý roztok hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) je možné připravit takto: do varu se uvede 1 000 ml ethanolu nebo vody s 8 g hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) a 0,5 g hliníkových hoblin a nechá se jednu hodinu vařit pod zpětným chladičem. Okamžitě se destiluje. V destilátu se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného). Několik dnů se nechá stát a oddělí se čistá kapalina od usazeniny uhličitanu draselného (nebo uhličitanu sodného). Roztok je možné též připravit bez destilace takto: do 1 000 ml ethanolu (nebo vody) se přidají 4 ml aluminium-butylátu a směs se nechá několik dní stát. Odsazená kapalina se slije a v ní se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného). Roztok je připraven k použití.

3.3 Fenolftalein, roztok o koncentraci 10 g/l v 95–96 % ethanolu (V/V), nebo alkalická modř 6B nebo thymolftalein, roztok o koncentraci 20 g/l v 95–96 % ethanolu (V/V). V případě silně zbarvených olejů se použije alkalická modř nebo thymolftalein.

4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní přístroje a pomůcky, mj.:

4.1 analytická váha;

4.2 Erlenmeyerova baňka na 250 ml;

4.3 byreta třídy A na 10 ml s hodnotou dílku 0,05 ml nebo odpovídající automatická byreta.

5. POSTUP

5.1 Příprava zkušebního vzorku.

Je-li vzorek zakalený, měl by být přefiltrován.

5.2 Zkušební vzorek

Hmotnost vzorku se řídí podle očekávané kyselosti (podle údajů v níže uvedené tabulce):







Očekávaná kyselost (kyselina olejová g/100 g) Hmotnost vzorku (g) Přesnost vážení (g) 0 až 2 10 0,02 > 2 až 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Vzorek se naváží v Erlenmeyerově baňce (4.2).

5.3 Stanovení

Vzorek (5.2) se rozpustí v 50 až 100 ml předem neutralizované směsi diethyletheru a ethanolu (3.1).

Titruje se za současného míchání roztokem hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) o koncentraci 0,1 mol/l (3.2) (viz poznámka 4), dokud nedojde k barevné změně indikátoru (zbarvení indikátoru musí trvat nejméně 10 sekund).

Poznámka 4: Pokud je k titraci potřeba více než 10 ml roztoku hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) o koncentraci 0,1 mol/l, použije se roztok o koncentraci 0,5 mol/l nebo se změní hmotnost vzorku podle očekávaného obsahu volných mastných kyselin a uvedené tabulky.

Poznámka 5: Pokud se během titrace roztok zakalí, přidá se dostačující množství rozpouštědel (3.1), aby byl roztok opět čirý.

Druhé stanovení se provádí pouze tehdy, je-li první výsledek vyšší než limit určený pro danou kategorii oleje.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Kyselost vyjádřená jako podíl kyseliny olejové v % hmotnostních se vypočítá podle vzorce:

kde:

V = spotřeba titračního roztoku hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) v ml;

c = přesná koncentrace titračního roztoku hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) v mol/l;

M = 282 g/mol, molární hmotnost kyseliny olejové v g na mol;

m = hmotnost vzorku v g.

Obsah kyseliny olejové se udává takto:

a) na dvě desetinná místa u hodnot 0 až 1 včetně;

b) na jedno desetinné místo u hodnot 1 až 100 včetně.

▼M30









PŘÍLOHA III

STANOVENÍ PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1. Předmět

Tato příloha popisuje metodu pro stanovení peroxidového čísla živočišných a rostlinných olejů a tuků.

2. Definice

Peroxidové číslo je množství těchto látek ve vzorku, vyjádřené v miliekvivalentech aktivního kyslíku na kg, které oxidují jodid draselný za popsaných pracovních podmínek.

3. Podstata

Reakce vzorku s roztokem jodidu draselného v roztoku kyseliny octové a chloroformu. Titrace uvolněného jodu standardizovaným roztokem thiosíranu sodného.

4. Přístroje a pomůcky

Všechny použité předměty musí být zbaveny redukčních a oxidačních látek.

Poznámka 1: zábrusy nesmějí být mazány tukem.

4.1. Skleněná váženka o objemu 3 ml.

4.2. Baňky na 250 ml se zábrusy a zátkami, předem vysušené a naplněné čistým, suchým inertním plynem (dusíkem, nebo lépe oxidem uhličitým).

4.3. Byreta o objemu 5, 10 nebo 25 ml se stupnicí alespoň po 0,05 ml, pokud možno s automatickým seřízením na nulu, nebo rovnocenná automatická byreta.

4.4. Analytické váhy.

5. Reakční činidla

5.1. Chloroform čistoty p. a., zbavený kyslíku probubláváním proudem čistého suchého inertního plynu.

5.2. Ledová kyselina octová čistoty p. a., zbavená kyslíku probubláváním proudem čistého suchého inertního plynu.

5.3. Jodid draselný, nasycený vodný roztok, čerstvě připravený, zbavený jodu a jodičnanů. Přibližně 14 g jodidu draselného se nechá rozpustit v asi 10 ml vody při pokojové teplotě.

5.4. Thiosíran sodný, 0,01 mol/l (odpovídá 0,01 N), standardizovaný vodný roztok, připravený těsně před použitím.

Roztok thiosíranu sodného o koncentraci 0,01 mol/l se připraví denně před použitím ze standardního roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,1 mol/l, nebo se určí přesná molarita. Ze zkušeností vyplývá, že stabilita je omezená a závisí na hodnotě pH a obsahu volného oxidu uhličitého. Pro roztok se použije pouze čerstvě převařená voda, případně se propláchne dusíkem.

Pro určení přesné molarity roztoku thiosíranu sodného se doporučuje následující postup:

S přesností na 0,001 g se do odměrné baňky (250 nebo 500 ml) odváží 0,27 až 0,33 g jodičnanu draselného (mKIO3) a rozpustí se v po rysku doplněné čerstvě převařené vodě (V2), která se předtím nechá ochladit na pokojovou teplotu. Pomocí pipety se 5 nebo 10 ml tohoto roztoku jodičnanu draselného (V1) přenese do Erlenmeyerovy baňky na 250 ml. Přidá se 60 ml čerstvě převařené vody, 5 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 4 mol/l a 25 až 50 mg jodidu draselného nebo 0,5 ml nasyceného roztoku jodidu draselného. Tento roztok se titruje roztokem thiosíranu sodného (V3) za účelem stanovení přesné molarity roztoku thiosíranu sodného.

kde:

mKIO3 je hmotnost jodičnanu draselného v gramech

V1 je objem roztoku jodičnanu draselného v mililitrech (5 nebo 10 ml)

V2 je celkový objem roztoku jodičnanu draselného v mililitrech (250 nebo 500 ml)

V3 je objem roztoku thiosíranu sodného v mililitrech

wKIO3 je čistota jodičnanu draselného v g/100 g

MKIO3 je molekulová hmotnost jodičnanu draselného (214 g/mol)

T je přesná molarita roztoku thiosíranu sodného (mol/l).

5.5. Škrobový roztok, vodní disperze 10 g/l, čerstvě připravený z přírodního rozpustného škrobu. Lze použít i rovnocenná činidla.

6. Vzorek

Vzorek je nutno odebrat a skladovat v temnu a chladu ve zcela naplněných skleněných nádobách, hermeticky uzavřených zabroušenou skleněnou, nebo korkovou zátkou.

7. Postup

Stanovení musí být prováděno v rozptýleném denním světle, nebo při umělém osvětlení. Do skleněné váženky (4.1) nebo baňky (4.2) se s přesností na 0,001 g odváží vzorek o hmotnosti dle následující tabulky, podle předpokládaného peroxidového čísla:







Předpokládané peroxidové číslo (meq) Hmotnost zkušebního vzorku (g) 0 až 12 5,0 až 2,0 12 až 20 2,0 až 1,2 20 až 30 1,2 až 0,8 30 až 50 0,8 až 0,5 50 až 90 0,5 až 0,3

Z baňky (4.2) se vyjme zátka a vloží se do ní váženka obsahující vzorek. Přidá se 10 ml chloroformu (5.1). Vzorek se rychle rozpustí zamícháním. Přidá se 15 ml kyseliny octové (5.2) a potom 1 ml roztoku jodidu draselného (5.3). Baňka se ihned uzavře, protřepá se po dobu jedné minuty a nechá se stát přesně 5 minut v temnu při teplotě 15 až 25 °C.

Přidá se přibližně 75 ml destilované vody. Uvolněný jod se za použití škrobového roztoku (5.5) jako indikátoru za silného protřepávání titruje roztokem thiosíranu sodného (5.4).

Z jednoho zkušebního vzorku se provádějí dvě stanovení.

Spolu s vlastním stanovením se provádí slepý pokus. Jestliže výsledky slepého pokusu přesáhnou 0,05 ml roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,01 N (5.4), je nutno vyměnit znečištěná činidla.

8. Vyjádření výsledků

Peroxidové číslo (PV) vyjádřené v miliekvivalentech aktivního kyslíku na kilogram se vypočítá podle vzorce:

kde:

V = počet ml standardizovaného roztoku thiosíranu sodného (5.4) použitého pro stanovení, korigovaný s přihlédnutím k slepému pokusu.

T = přesná molarita použitého roztoku thiosíranu sodného (5.4) v mol/l.

m = hmotnost zkušebního vzorku v g.

Za výsledek se považuje aritmetický průměr dvou stanovení.

Výsledek se zaokrouhlí na jedno desetinné místo.

▼M21









PŘÍLOHA IV

STANOVENÍ OBSAHU VOSKU POMOCÍ KAPILÁRNÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE

1. PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu vosku v olivových olejích. Vosky se dělí podle počtu atomů uhlíku. Tuto metodu lze použít zejména k rozlišení mezi olivovým olejem získaným lisováním a extrakcí (olivový olej z pokrutin).

2. PODSTATA METODY

K tuku nebo oleji se přimísí vhodný vnitřní standard a poté se provádí chromatografická frakční destilace na hydratované silikagelové koloně. Získaná frakce eluovaná nejprve při testovacích podmínkách (jejíž polarita je menší než polarita triglyceridů) se přímo analyzuje pomocí kapilární plynové chromatografie.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1 Kónická 25ml baňka.

3.2 Skleněná chromatografická plynová kolona o vnitřním průměru 15 mm a délce 30 až 40 cm vybavená ventilem.

3.3 Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a vybavený přímým vstřikováním, obsahující: 3.3.1 Termostatickou komoru pro kolony vybavenou programátorem teploty. 3.3.2 Studené nástřikové zařízení pro přímé zavádění do kolony. 3.3.3 Plameno-ionizační detekční čidlo a konverzní zesilovač. 3.3.4 Integrátor se zapisovačem, vhodný pro provoz s konverzním zesilovačem (3.3.3), s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru. (Lze též použít informační systémy, které umožňují získávání dat z plynové chromatografie pomocí PC.) 3.3.5 Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 8 až 12 m s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi, o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm. (Kapalné fáze SE 52 nebo SE 54 vhodné k použití v obchodu.)

3.4 Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou.

3.5 Elektrický vibrátor.

3.6 Rotační odpařovač.

3.7 Muflová pec.

3.8 Analytické váhy s přesností měření ± 0,1 mg.

3.9 Běžné laboratorní skleněné nádoby.

4. REAKČNÍ ČINIDLA

4.1 Silikagel s velikostí zrna od 60 do 200 μm. Silikagel se umístí alespoň na čtyři hodiny do pece o teplotě 500 °C. Nechá se ochladit a přidají se 2 % vody v poměru k odebranému množství silikagelu. Řádným protřepáním se směs homogenizuje. Před použitím se ponechá nejméně 12 hodin ve tmě.

4.2 n-hexan pro chromatografii.

4.3 Diethylether pro chromatografii.

4.4 n-heptan pro chromatografii.

4.5 Standardní roztok 0,1 % (m/V) laurylarachidátu v hexanu (vnitřní standard). (Lze též použít palmityl palmitát a myristyl stearát.) 4.5.1 Sudan 1 (1-fenyl-azo-2-naftol).

4.6 Nosný plyn: vodík nebo čisté helium pro plynovou chromatografii.

4.7 Pomocné plyny: — vodík, čistý pro plynovou chromatografii, — vzduch, čistý pro plynovou chromatografii.

5. POSTUP

5.1 Příprava chromatografické kolony

Provede se suspenze 15 g silikagelu (4.1) v n-hexanu (4.2) a zavede se do kolony (3.2). Po spontánní sedimentaci se tato dokončí pomocí elektrického vibrátoru (3.5), aby byla chromatografická vrstva co nejhomogennější. Provede se perkolace 30 ml n-hexanu za účelem odstranění případných nečistot. Pomocí vah (3.8) se naváží přesně 500 mg vzorku do baňky (3.1) a přidá se vhodné množství vnitřního standardu (4.5) v závislosti na předpokládaném obsahu vosku. Např. 0,1 mg laurylu arachidátu v případě olivového oleje a 0,25 až 0,5 mg v případě olivového oleje z pokrutin. Získaný vzorek se za pomoci dvou dávek 2 ml n-hexanu (4.2) převede do chromatografické kolony.

Umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 mm nad horní úrovní absorbentu, a poté se provede perkolace 70 ml doplňkového n-hexanu za účelem odstranění n-alkanů, které jsou přirozeně přítomny. Poté se zahájí chromatografické eluování, odejme se 180 ml směsi n-hexanu/diethyletheru v poměru 99:1 při průtoku přibližně 15 kapek za 10 sekund. Eluování vzorku se musí provést při teplotě okolí 22 °C ± 4.

Poznámky:

— Směs n-hexanu s diethyletherem v poměru 99:1 se musí připravovat každý den.

— Aby bylo možno vizuálně kontrolovat správné eluování vosků, je možno do roztoku vzorku přidat 100 μl 1 % Sudanu v eluovací směsi. Jelikož má barvivo přechodnou vazbu mezi vosky a triglyceridy, je třeba eluci přerušit, jakmile zabarvení dosáhne spodní části chromatografické kolony, neboť všechny vosky byly eluovány.

Získaná frakce se usuší v rotačním odpařovači (3.6), až je téměř všechno rozpouštědlo odstraněno. Poslední 2 ml rozpouštědla se odstraní za pomoci slabého proudu dusíku; poté se přidá 2–4 ml n-heptanu.

5.2 Analýza plynovou chromatografií

5.2.1 Přípravné práce

Kolona se spojí s plynovým chromatografem (3.3), vstupní port se připojí ke kolonovému systému (on-column system) a výstupní port k detekčnímu činidlu. Poté se plynový chromatograf překontroluje (těsnost plynových vedení, funkce detekčního činidla a záznamníku atd.).

Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat. Postupně se zahřívá, dokud není zhruba po 4 hodinách dosaženo teploty 350 °C. Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se provede regulace pracovních podmínek (regulace průtoku plynu, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače (3.3.4), nastavení teploty kolonové komory, detekčního činidla atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů.

Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony.

5.2.2 Výběr pracovních podmínek

Pracovní podmínky, které je třeba všeobecně dodržovat, jsou tyto:

— teplota kolony: —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min nejdříve 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— teplota detekčního činidla: 350 °C,

— množství nastříknuté látky: 1 μl roztoku n-heptanu (2–4 ml),

— nosný plyn: optimální lineární rychlost helia nebo vodíku u vybraného plynu (viz dodatek),

— citlivost přístroje: má odpovídat níže uvedeným podmínkám:

Tyto podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem oddělit všechny vosky, dosáhnout dostatečného rozpuštění píků (viz obrázek) a retenčního času vnitřního standardu C32, který musí být 18 ± 3 minuty. Nejreprezentativnější pík vosku musí dosáhnout nejméně 60 % z plného rozsahu.

Parametry pro integraci píků se nastaví tak, aby došlo ke správnému vyhodnocení ploch uvažovaných píků.

Poznámka:Vzhledem k tomu, že konečná teplota je vysoká, připouští se kladný drift, který nesmí přesáhnout 10 % z plného rozsahu.

5.3 Provedení analýzy

Do mikrostříkačky na 10 μl se natáhne 1 μl roztoku; píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok; přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne.

Zaznamenávání je prováděno, dokud vosky nejsou zcela eluovány.

Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům.

5.4 Identifikace píků

Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsmi vosků, jejichž retenční časy jsou známé a které byly analyzovány za stejných podmínek.

Chromatogram vosků panenského olivového oleje je znázorněn na obrázku.

5.5 Kvantitativní vyhodnocení

Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu a alifatickým esterům C40 až C46.

Obsah vosku jednotlivých esterů vyjádřený v mg/kg tukové látky se vypočítá podle vzorce:

kde:

Ax = plocha píku každého esteru v milimetrech čtverečních;

As = plocha píku vnitřního standardu v milimetrech čtverečních;

ms = hmotnost přidaného vnitřního standardu v miligramech;

m = hmotnost vzorku použitého pro stanovení v gramech.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Uvádí se souhrn obsahů jednotlivých vosků C40 až C46v mg/kg tukové látky (ppm).

Poznámka:Sloučeniny, které je třeba kvantifikovat, se stanoví vzhledem k píkům esterů s počtem uhlíků mezi C40 a C46 podle příkladu chromatogramu vosků olivového oleje uvedeného na následujícím obrázku. Pokud se ester C46 objeví dvakrát, doporučuje se pro jeho identifikaci provést analýzu frakce vosků olivového oleje z pokrutin, v níž je pík C46 snadno rozpoznatelný, jelikož jasně převažuje.

Výsledky se vyjádří s přesností na jedno desetinné místo.

Obrázek

Chromatogram vosků olivového oleje ( 9 )

Vysvětlivky:

I.S. = Lauryl arachidátu;

1 = Estery diterpenu;

2 + 2′ = Estery C40;

3 + 3′ = Estery C42;

4 + 4′ = Estery C44;

5 = Estery C46;

6 = Estery sterolů a triterpenický alkohol.









DODATEK

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se vstříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu. Změří se doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku eluce píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas změřený v sekundách.

▼M26









PŘÍLOHA V

STANOVENÍ SLOŽENÍ A OBSAHU STEROLŮ A TRITERPENICKÝCH DIALKOHOLŮ KAPILÁRNÍ PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu a složení sterolů a triterpenických dialkoholů v olivových olejích a olivových olejích z pokrutin.

2. PODSTATA ZKOUŠKY

Zmýdelnění oleje, k němuž je přidán α-cholestanol jako vnitřní standard, pomocí ethanolického roztoku hydroxidu draselného a extrakce nezmýdelnitelných látek pomocí diethyletheru.

Pomocí tenkovrstvé chromatografie na bazické silikagelové desce se z nezmýdelnitelné látky oddělí sterolová frakce a frakce triterpenických dialkoholů. Frakce oddělené ze silikagelu se převedou na trimethylsilylether a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení a zejména:

3.1 Baňka na 250 ml vybavená zpětným chladičem se zábrusem.

3.2 Dělicí nálevka na 500 ml.

3.3 Baňky na 250 ml.

3.4 Kompletní zařízení pro tenkovrstvou chromatografii se skleněnými deskami o rozměrech 20 × 20 cm.

3.5 Ultrafialová lampa s vlnovou délkou 254 nebo 366 nm.

3.6 Mikrostříkačky na 100 μl a 500 μl.

3.7 Filtrační nálevka ze sintrovaného skla s pórovitou fritou G3 (pórovitost 15 až 40 μm) o průměru přibližně 2 cm a výšce 5 cm, vybavená uzávěrem pro vakuovou filtraci a s vnějším zábrusem.

3.8 Odsávací baňka na 50 ml s vnitřním zábrusem pro použití s filtrační nálevkou (3.7).

3.9 Zkumavka na 10 ml s kónickým dnem a skleněnou zátkou.

3.10 Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou, opatřený systémem děleného nástřikového zařízení složený z:

3.10.1 termostatické kolonové komory nastavitelné na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C;

3.10.2 vstřikovací jednotky s termostatem (vstřikové komory) s povlakem ze silanizovaného skla a s dělicím systémem;

3.10.3 plamenoionizačního detektoru (FID);

3.10.4 systému pro sběr dat vhodného pro provoz s detektorem FID (bod 3.10.3) s možností manuální integrace.

3.11 Kapilární kolona z taveného křemene dlouhá 20 až 30 m, s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, potažená 5% difenyl – 95% dimethylpolysiloxanem (stacionární fáze SE-52 nebo SE-54 nebo ekvivalentní), o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm.

3.12 Mikrostříkačka na 10 μl pro plynovou chromatografii opatřená tvrzenou jehlou pro nástřik pomocí děliče.

3.13 Exsikátor s chloridem vápenatým.

4. CHEMIKÁLIE

4.1 Hydroxid draselný, minimální titr 85 %.

4.2 Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci přibližně 2 mol/l.

130 g hydroxidu draselného (bod 4.1) se za současného chlazení rozpustí ve 200 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem (bod 4.10). Tento roztok je nutno uchovávat v dobře uzavřené skleněné láhvi z tmavého skla a skladovat po dobu maximálně dvou dnů.

4.3 Diethylether čistoty p.a.

4.4 Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci přibližně 0,2 mol/l.

13 g hydroxidu draselného (bod 4.1) se rozpustí ve 20 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem (bod 4.10).

4.5 Bezvodý síran sodný čistoty p.a.

4.6 Silikagelem potažené skleněné desky (20 x 20 cm) bez fluorescenčního indikátoru o tloušťce 0,25 mm (obchodně dostupné).

4.7 Toluen čistoty pro chromatografii.

4.8 Aceton čistoty pro chromatografii.

4.9 N-hexan čistoty pro chromatografii.

4.10 Diethylether čistoty pro chromatografii.

4.11 Ethanol čistoty p.a.

4.12 Ethylacetát čistoty p.a.

4.13 Referenční roztok pro tenkovrstvou chromatografii: 5% roztok cholesterolu nebo fytosterolu a erythrodiolu v ethylacetátu (bod 4.11).

4.14 0,2% ethanolický roztok 2,7-dichlor-fluoresceinu, mírně zásaditý přidáním několika kapek alkoholového roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l (bod 4.2).

4.15 Bezvodý pyridin čistoty pro chromatografii (viz poznámka 5).

4.16 Hexamethyl disilazan čistoty p.a.

4.17 Trimethyl-chlorsilan čistoty p.a.

4.18 Zkušební roztoky sterol(trimethylsilyl)etherů.

Připraví se ze sterolů nebo z erythrodiolu získaných z olejů, které je obsahují, těsně před použitím.

4.19 α-cholestanol o čistotě vyšší než! 99% (čistota musí být kontrolována pomocí analýzy plynovou chromatografií).

4.20 0,2% vnitřní standardní roztok α-cholestanolu, roztok (m/V) v ethylacetátu (bod 4.11).

4.21 Roztok fenolftaleinu 10 g/L v ethanolu (bod 4.10).

4.22 Nosné plyny: vodík nebo helium, čisté pro plynovou chromatografii.

4.23 Pomocné plyny: vodík, helium, dusík a vzduch, čisté pro plynovou chromatografii.

4.24 N-hexan (bod 4.9)/diethylether (bod 4.10) směs 65:35 (V/V).

4.25 Činidlo pro silylaci tvořené směsí pyridinu, hexamethyl-disilazanu a trimethyl-chlorsilanu v poměru 9:3:1 (V/V/V).

5. POSTUP

5.1 Příprava nezmýdelnitelných látek 5.1.1 Pomocí mikrostříkačky na 500 μl (bod 3.6) se do baňky na 250 ml dá (bod 3.1) vnitřní standardní roztok α-cholestanolu (bod 4.20) obsahující množství cholestanolu rovnající se přibližně 10 % obsahu sterolu ve vzorku. Například při analýze olivového oleje se na 5 g vzorku olivového oleje přidá 500 μl roztoku α-cholestanolu (bod 4.20) a 1 500 μl při analýze olivového oleje z pokrutin. V mírném proudu dusíku v teplé vodní lázni se vzorek odpaří do sucha a po vychladnutí baňky se do stejné baňky naváží 5±0,01 g vysušeného přefiltrovaného vzorku. Poznámka 1: Živočišné nebo rostlinné oleje obsahující větší množství cholesterolu mohou vykazovat pík s retenčním časem blízkým cholestanolu. Pokud k tomu dojde, musí být sterolová frakce analyzována jednou s vnitřním standardem a jednou bez něj. 5.1.2 Přidá se 50 ml ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l (bod 4.2) a malé množství pemzy, připojí se zpětný chladič a zahřeje se do mírného varu, dokud nedojde ke zmýdelnění (roztok se vyčeří). V zahřívání se pokračuje dalších 20 minut a poté se přes chladič přidá 50 ml destilované vody, chladič se následně odpojí a baňka se vychladí na teplotu přibližně 30 °C. 5.1.3 Obsah baňky se kvantitativně převede do dělicí nálevky na 500 ml (bod 3.2) a propláchne se několika dávkami destilované vody (50 ml). Přidá se přibližně 80 ml diethyletheru (bod 4.10), vše se protřepe po dobu přibližně 60 sekund a pravidelně se uvolňuje tlak obracením dělicí nálevky a otevíráním kohoutku. Nechá se odstát až do úplného oddělení obou fází (viz poznámka 2). Poté se co nejvíce mýdlového roztoku odčerpá do druhé dělicí nálevky. Stejným způsobem se provedou další dvě extrakce vodně-alkoholové fáze, vždy s použitím 60 až 70 ml diethyletheru (bod 4.10). Poznámka 2: Emulze je možné odstranit přidáním malých množství ethanolu (bod 4.11). 5.1.4 Všechny tři etherové extrakty se smíchají v jedné dělicí nálevce obsahující 50 ml vody. Dále se promývá vodou (50 ml), dokud se promývací voda při přidání kapky roztoku fenolftaleinu nepřestane zbarvovat růžově (bod 4.21). Odstraní se vodná fáze, etherová fáze se přefiltruje na bezvodém síranu sodném (bod 4.5) do předem zvážené baňky na 250 ml, přičemž nálevka a filtr se promyjí malými množstvími diethyletheru (bod 4.10). 5.1.5 Rozpouštědlo se nechá odpařit destilací ve vakuu v rotačním odpařovači při 30 °C. Přidá se 5 ml acetonu a těkavé rozpouštědlo se zcela odstraní mírným proudem vzduchu. Zbytek se suší v sušárně při 103±2 °C po dobu 15 min. Po vychlazení v exsikátorech se zváží s přesností na 0,1 mg.

5.2. Separace sterolové frakce a frakce triterpenických dialkoholů (erythrodiol + uvaol) 5.2.1 Příprava bazických desek pro tenkovrstvou chromatografii. Silikagelové desky (bod 4.6) (cca 4 cm) se na 10 sekund zcela ponoří do ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,2 mol/l (bod 4.5), poté se nechají dvě hodiny sušit v digestoři a nakonec na jednu hodinu umístí do sušárny vyhřáté na 100 °C. Desky se vyjmou ze sušárny a až do okamžiku použití uloží do exsikátoru s chloridem vápenatým (bod 3.13). Takto upravené desky musí být použity během 15 dnů. Poznámka 3: Jsou-li pro separaci sterolové frakce použity bazické silikagelové desky, není nutné upravovat nezmýdelnitelnou frakci pomocí Al2O3 (oxidu hlinitého). Dojde tak k zadržení všech kyselých sloučenin (mastných kyselin apod.) na počátku, a tím se zřetelně oddělí pásmo sterolů od pásma alifatických a triterpenických alkoholů. 5.2.2 Vyvíjecí komora se naplní směsí hexanu a diethyletheru (bod 4.24) (viz poznámka 4) do výšky přibližně 1 cm. Vyvíjecí komora se uzavře a nejméně půl hodiny ponechá v klidu a chladnu, aby se mohla vytvořit rovnováha mezi parami a kapalinou. Na vnitřní povrch vyvíjecí komory je možné připojit proužky filtračního papíru namočené v eluční směsi za účelem zkrácení doby vyvolávání přibližně o jednu třetinu a docílení stejnoměrnější, pravidelné eluce složek. Poznámka 4: Vyvíjecí roztok musí být pro každou analýzu vyměněn, aby bylo dosaženo reprodukovatelných podmínek vyvíjení; lze použít alternativní rozpouštědlo 50:50 (V/V) n-hexanu a diethyletheru. 5.2.3 Připraví se přibližně 5% roztok nezmýdelnitelné látky (bod 5.1.5) v ethylacetátu (bod 4.12) a 0,3 ml tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 100 μl nastříkne jako úzký a rovnoměrný pruh k dolnímu okraji (2 cm) chromatografické desky (bod 5.2.1). Ve stejné úrovni se nanese 2 až 3 μl referenčního roztoku materiálu (bod 4.13) za účelem stanovení sterolového pásma a pásma triterpenických dialkoholů po dokončení vyvíjení. 5.2.4 Deska se umístí do vyvíjecí komory uvedené v bodě 5.2.2. Teplota se udržuje mezi 15 a 20 °C (viz poznámka 5). Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu nebo se deska na chvíli nechá v digestoři. Poznámka 5: Vyšší teplota může zhoršit oddělování. 5.2.5 Deska se lehce a rovnoměrně postříká roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu (bod 4.14), nechá se uschnout a pozoruje se pod ultrafialovým zářením. Sterolové pásmo a pásmo triterpenických dialkoholů se stanoví porovnáním skvrn vytvořených referenčním roztokem (bod 4.13). Obrysy pásem podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem (viz obrázek tenkovrstvé desky č. 3). 5.2.6 Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové špachtle. Odebraná hmota se rozmělní na malé části a převede do filtrační nálevky (bod 3.7). Přidá se 10 ml horkého ethylacetátu (bod 4.12). Obsah se důkladně promíchá kovovou stěrkou a vakuově přefiltruje. Filtrát se shromáždí v baňce připojené na filtrační nálevku (bod 3.8.). Zbytek v baňce se propláchne 3 x 10 ml diethyletheru (bod 4.3). Filtrát se přitom sbírá do stejné baňky připojené k nálevce. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do předem zvážené zkumavky na 10 ml (bod 3.9). Zkumavka se vysuší lampou pod mírným proudem dusíku. Zbytek se znovu rozpustí několika kapkami acetonu (bod 4.8) a opět vysuší. Zbytek ve zkumavce musí být tvořen sterolovou frakcí a frakcí triterpenických dialkoholů.

5.3 Příprava trimethylsilyletherů 5.3.1 Do zkumavky obsahující sterolovou a triterpenickou frakci se přidá činidlo pro silylaci (bod 4.25) (viz poznámka 6), v množství 50 μl na každý mg sterolů a triterpenických dialkoholů Přitom je nutné zabránit jakékoli absorpci vlhkosti (viz poznámka 7). Poznámka 6: Roztoky připravené k použití jsou obchodně dostupné. Dostupná jsou rovněž další silylační činidla, jako například N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethyl-chlor-silan pro smíchání se stejným objemem bezvodého pyridinu. Pyridin lze nahradit stejným množstvím acetonitrilu. 5.3.2 Zkumavka se uzavře a pečlivě protřepe bez převracení, dokud se sloučeniny nerozpustí. Poté se nechá v klidu nejméně 15 minut při laboratorní teplotě a následně několik minut odstřeďuje. Čirý roztok je připraven pro plynovou chromatografickou analýzu. Poznámka 7: Vznik slabé opalescence je normální a nezpůsobuje žádnou anomálii. Tvorba bílých vloček nebo existence růžového zabarvení jsou známkami přítomné vlhkosti nebo degradace činidla. V tomto případě je třeba zkoušku opakovat (pouze v případě, že byl použit hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan).

5.4 Analýza plynovou chromatografií 5.4.1 Přípravné operace a kondicionace kapilární kolony. 5.4.1.1 Kapilární kolona se připojí (bod 3.11) k plynovému chromatografu tak, že začátek kolony se připojí k dělenému nástřikovému zařízení a konec kolony se připojí k detektoru. Provede se kompletní kontrola plynového chromatografu (těsnost plynových spojovacích prvků, účinnost detektoru, účinnost oddělovacího a zapisovacího systému atd.). 5.4.1.2 Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat; samotnou kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20 °C vyšší, než je laboratorní teplota (viz poznámka 8). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do pracovních podmínek (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení výpočetního systému, nastavení teploty kolony, detektoru, injektoru atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony. Poznámka 8: Teplota kondicionace musí být nejméně o 20 °C nižší než maximální teplota použitelná pro uvažovanou stacionární fázi. 5.4.2 Výběr pracovních podmínek 5.4.2.1 Pracovní podmínky jsou tyto: — teplota kolony: 260 ± 5 °C, — teplota injektoru: 280–300 °C, — teplota detektoru: 280–300 °C, — lineární rychlost nosného plynu: helium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — oddělovací poměr: 1:50 až 1:100, — citlivost přístroje: 4 až 16násobek minimálního útlumu, — citlivost záznamu: 1 až 2 mV f.s., — množství nastříknuté látky: 0,5 až 1 μl trimethylsilyletherového roztoku. Tyto podmínky se mohou měnit podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto podmínky: — retenční čas betasitosterolu musí být 20 ± 5 minut; — pík kampesterolu musí být u olivového oleje (střední obsah 3 %) 20 ± 5 % plného rozsahu a u sójového oleje (střední obsah 20 %) 80 ± 10 % plného rozsahu; — všechny přítomné steroly musí být odděleny. Kromě separace musí být píky též zcela rozlišeny, tj. dráha záznamu píku se musí vrátit na základní linii dříve, než se zvedne do dalšího píku. Neúplné rozlišení je však tolerováno za předpokladu, že pík s relativním retenčním časem 1,02 (sitostanol) je možné kvantifikovat pomocí kolmé úsečky. 5.4.3 Analytický postup 5.4.3.1 Do mikrostříkačky na 10 μl se natáhne 1 μl hexanu, poté 0,5 μl vzduchu a nakonec 0,5 až 1 μl zkušebního roztoku. Píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum injektoru a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. Lze užít rovněž automatický injektor. 5.4.3.2 Zaznamenávání je prováděno, dokud přítomná trimethylsilyletherová směs triterpenických dialkoholů není zcela eluována. Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům bodu 5.4.1.2. 5.4.4 Identifikace píků Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se standardní trimethylsilyletherovou směsí sterolu a triterpenických dialkoholů analyzovanou za stejných podmínek (viz dodatek). Steroly a triterpenické dialkoholy jsou eluovány v tomto pořadí: cholesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-methylen-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, delta-7-kampesterol, delta-5,23-stigmastadienol, chlerosterol, betasitosterol, sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5,24-stigmastadienol, delta-7-stigmastenol, delta-7-avenasterol, erythrodiol a uvaol. Retenční časy betasistosterolu v případě kolon SE-52 a SE-54 jsou uvedeny v tabulce 1. Chromatogram typický pro některé oleje je vidět na obrázku 1 a 2. 5.4.5 Kvantitativní vyhodnocení 5.4.5.1 Pomocí výpočetního systému se vypočítá plocha píků α-cholestanolu, sterolů a triterpenických dialkoholů. Píky jakýchkoli sloučenin, které nejsou mezi sloučeninami uvedenými v tabulce 1 (výpočet pro ergosterol se provádět nesmí) se ignorují. Faktor odezvy α-cholestanolu musí být roven 1. 5.4.5.2 Obsah jednotlivých sterolů vyjádřený v mg/kg tuku se vypočítá podle vzorce: kde: Ax = plocha píku sterolu x vypočtená dle výpočetního systému; As = plocha píku α-cholestanolu vypočtená dle výpočetního systému; ms = množství přidaného α-cholestanolu v mg; m = hmotnost vzorku použitého pro stanovení v g.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1 Uvádí se obsah jednotlivých sterolů v mg/kg tuku a souhrn „obsah sterolů celkem“.

Složení jednotlivých sterolů, erythrodiolu a uvaolu by se mělo vyjadřovat s přesností na jedno desetinné místo.

Celkové složení sterolů musí být vyjádřeno v celých číslech.

▼M28

6.2 Procentní podíl jednotlivých sterolů z poměru plochy příslušného píku k celkové ploše píků sterolů se vypočítá podle vzorce:

kde:

Ax = plocha píku sterolu x;

ΣA = celková plocha píků sterolů.

▼M26

6.3 Zjevný betasitosterol: delta-5-23-stigmastadienol + chlerosterol + betasitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-55-24-stigmastadienol.

6.4 Vypočítá se procentní podíl erythrodiolu a uvaolu:

kde:

ΣA = součet ploch sterolu vypočtený dle výpočetního systému;

Er = plocha erythrodiolu vypočtená dle výpočetního systému;

Uv = plocha uvaolu vypočtená dle výpočetního systému;









Dodatek

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se vstříkne 1 až 3 μl methanu (nebo propanu) a pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od doby vstřiku do doby eluce píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je naměřený čas v sekundách.







Tabulka 1 Relativní retenční časy sterolů Pík Identifikace Relativní retenční čas Kolona SE 54 Kolona SE 52 1 cholesterol Δ-5-cholesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α-cholestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]-24-methyl-Δ-5,22-cholestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * ergosterol [24S] 24 methyl-Δ-5-7-22 cholestatrien 3b-ol 0,78 0,76 4 24-methylen-cholesterol 24-methylen-Δ-5,24-cholestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 kampesterol (24R)-24-methyl-Δ-5-cholesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 kampestanol (24R)-24-methyl-cholestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol (24S)-24-ethyl-Δ-5,22-cholestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol (24R)-24-methyl-Δ-7-cholesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-ethyl-Δ-5,23-choIestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 chlerosterol (24S)-24-ethyl-Δ-5,25-cholestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-ethyl-Δ-5-cholesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-ethyl-cholestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol (24Z)-24-ethyliden-Δ-cholesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-ethyl-Δ-5,24-cholestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-ethyl-Δ-7-cholesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-ethyliden-Δ-7-cholesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Erythrodiol 5α olean-12en-3ß28 diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-ursen-3ßb28 diol 1,52 1,52

Obrázek 1

Plynový chromatogram sterolové a triterpenicko dialkoholické frakce lampantového olivového oleje (s vnitřním standardem)

Obrázek 2

Plynový chromatogram sterolové a triterpenicko dialkoholické frakce rafinovaného olivového oleje (s vnitřním standardem)

Obrázek 3

Olivový olej z pokrutin nanesený na tenkovrstvé silikagelové desce s oblastí, která se musí seškrábat pro stanovení sterolů a triterpenických dialkoholů

1 – skvalen

2 – triterpenické a alifatické alkoholy

3 – steroly a triterpenické dialkoholy

4 – začátek a volné mastné kyseliny

▼M26 —————

▼M21









PŘÍLOHA VII

STANOVENÍ PROCENTUÁLNÍHO PODÍLU 2-GLYCERIL MONOPALMITÁTU

1. PŘEDMĚT A ROZSAH POUŽITÍ

Tato metoda popisuje analytický postup stanovení procentuálního podílu kyseliny palmitové ve 2. pozici triglyceridů hodnocením 2-glyceril monopalmitátu.

Tato metoda se použije na tekuté rostlinné oleje při teplotě okolí (20 °C).

2. PODSTATA METODY

Po přípravě se vzorek oleje podrobí účinku pankreatické lipázy. Parciální a specifická hydrolýza v pozici 1 a 3 molekuly triglyceridu způsobuje, že monoglyceridy se objeví na 2. pozici. Procentuální podíl 2-glyceril monopalmitátu v monoglycerické frakci se stanoví po silylaci pomocí kapilární plynové chromatografie.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1 Kónická 25ml baňka.

3.2 Kádinky na 100, 250 a 300 ml.

3.3 Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 21–23 mm a délce 400 mm s vložkou ze sintrovaného skla a kohoutem.

3.4 Nedělené pipety na 10, 50, 100 a 200 ml.

3.5 Baňky na 100 a 250 ml.

3.6 Rotační odpařovač.

3.7 Centrifugační zkumavky s konickým dnem na 10 ml se zabroušenou skleněnou zátkou.

3.8 Odstředivka pro zkumavky o obsahu 10 a 100 ml.

3.9 Termostat umožňující udržet teplotu na 40 °C s přesností na 0,5 °C.

3.10 Dělené pipety na 1 a 2 ml.

3.11 Hypodermická stříkačka na 1 ml.

3.12 Mikrostříkačka na 100 μl.

3.13 Nálevka na 1 000 ml.

3.14 Plynový chromatograf pro kapilární kolony se studeným nástřikovým zařízením on column pro přímé zavádění vzorku do kolony a s termostatem, který je schopen udržovat žádanou teplotu s přesností na 1 °C.

3.15 Studené nástřikové zařízení on column pro přímé zavádění vzorku do kolony.

3.16 Plameno-ionizační detektor a elektrometr.

3.17 Integrátor se zapisovačem, vhodný pro elektrometr, s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru.

3.18 Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 8 až 12 m s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující methylpolysiloxan nebo 5 %-fenyl-methylpolysiloxan, o tloušťce 0,10 až 0,30 μm, kterou je možno použít při 370 °C.

3.19 Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou o délce min. 7,5 cm.

4. CHEMIKÁLIE

4.1 Silikagel s velikostí zrna od 0,063 až po 0,200 mm (70/280 mesh), který se připraví takto: silikagel se položí do porcelánové misky, suší se v sušárně po dobu 4 hodin při teplotě 160 °C, pak se nechá ochladit v exsikátoru při pokojové teplotě. Přidá se voda o objemu shodném s 5 % váhy silikagelu takto: do 500 ml baňky se naváží 152 g silikagelu a přidá se 8 g destilované vody, baňka se zazátkuje a jemně protřepá, aby se voda rozložila rovnoměrně. Nechá se odstát na alespoň 12 hodin před použitím.

4.2 n-hexan pro chromatografii.

4.3 Isopropanol.

4.4 Isopropanol, vodný roztok 1/1 (V/V).

4.5 Pankreatická lipáza. Použitá lipáza musí mít aktivitu mezi 2,0 A 10 jednotkami lipázy na mg (v obchodě existují pankreatické lipázy s aktivitou mezi 2 a 10 jednotkami na mg enzymu).

4.6 Tlumivý roztok trihydroxy-methyl-aminomethanu: 1 M vodný roztok upravený na pH 8 (kontrola potenciometrem) přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové (1/1 V/V).

4.7 Cholát sodný (enzymatické kvality), vodný roztok o koncentraci 0,1 % (tento roztok se musí použít do 15 dnů po přípravě).

4.8 Chlorid vápenatý, vodný roztok o koncentraci 22 %.

4.9 Diethylether pro chromatografii.

4.10 Vyvíjecí rozpouštědlo: směs n-hexanu/diethyletheru (87/13) (V/V).

4.11 Hydroxid sodný, roztok o koncentraci 12 % hmotnostních.

4.12 Fenolftalein, 1 % roztok ethanolu.

4.13 Nosný plyn: vodík nebo helium, pro plynovou chromatografii.

4.14 Pomocné plyny: – vodík o minimální čistotě 99 %, bez vlhkosti a organických látek, a vzduch, pro plynovou chromatografii stejná čistota.

4.15 Silanizační činidla: směs pyridinu/hexametyldisilazanu, trimetylchlorosilanu 9/3/1 (V/V/V) (Roztoky připravené k použití jsou na trhu. Mohou se použít jiná silylační činidla, zejména bis-trimethylsilyl trifluoracetamid + 1 % trimetylchlorosilan, zředěná stejným objemem bezvodého pyridinu.)

4.16 Referenční vzorky: čisté monoglyceridy nebo směsi, které mají podobné procentuální složení jako vzorek.

5. POSTUP

5.1 Příprava vzorku

5.1.1 Oleje, které mají volnou kyselost nižší než 3 %, nemusí být neutralizovány před chromatografií na silikagelové koloně. Oleje, které mají volnou kyselost vyšší než 3 %, musí být neutralizovány podle bodu 5.1.1.1. 5.1.1.1 Do nálevky na 1 000 ml (3.13) se vleje 50 g oleje a 200 ml n-hexanu. Přidá se 100 ml isopropanolu a množství roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 12 % (4.11) odpovídající volné kyselosti oleje, plus 5 % navíc. Jednu minutu se důkladně protřepe. Přidá se 50 ml destilované vody, znovu se protřepe a nechá se usadit. Po dělení se odstraní spodní mýdlová vrstva. Odstraní se také jakékoli mezilehlé vrstvy (sliz, nerozpustné hmoty). Hexanový roztok neutralizovaného oleje se promyje následnými dávkami 50 až 60 ml roztoku isopropanolu/vody 1/1 (V/V) (4.4), dokud růžové zabarvení fenolftaleinu nezmizí. Většina hexanu se odstraní destilací ve vakuu (např. v rotačním odpařovači) a olej se přelije do baňky na 100 ml (3.5). Olej se suší ve vakuu, dokud nebude rozpouštědlo zcela odstraněno. K tomu musí být kyselost oleje nižší než 0,5 %.

5.1.2 Do kónické 25 ml baňky (3.1) se převede olej připravený podle výše uvedeného způsobu a rozpustí se ve vyvíjecím rozpouštědle (10 ml, 4.10). Roztok se nechá odstát na alespoň 15 minut před chromatografií na silikagelové koloně. Pokud je roztok kalný, odstředí se, aby byly zabezpečeny optimální podmínky pro chromatografii. (Mohou se použít kartony silikagelu SPE na 500 mg, které jsou připraveny k použití.)

5.1.3 Příprava chromatografické kolony Do kolony se vlije (3.3) zhruba 30 ml vyvíjecího rozpouštědla (4.10) a pomocí skleněné tyčinky se do spodní části kolony zavede kousek vaty. Stlačí se, aby se odstranil vzduch. V kádince se připraví suspenze 25 g silikagelu (4.1) ve zhruba 80 ml vyvíjecího rozpouštědla a naleje se do kolony za pomoci nálevky. Ověří se, zda je celý silikagel zaveden do kolony; vymyje se vyvíjecím rozpouštědlem (4.10), otevře se kohoutek a hladina kapaliny se nechá dostoupit zhruba 2 mm nad horní úroveň silikagelu.

5.1.4 Kolonová chromatografie Do 25 ml baňky (3.1) se naváží přesně 1,0 g připraveného vzorku podle bodu 5.1. Vzorek se rozpustí v 10 ml vyvíjecího rozpouštědla (4.10). Roztok se vlije do připravené chromatografické kolony podle bodu 5.1.3. Zabrání se tomu, aby se plocha kolony hýbala. Otevře se kohoutek a roztok vzorku se nechá odkapat, než dosáhne hladiny silikagelu. Rozpustí se pomocí 150 ml vyvíjecího rozpouštědla. Průtok se upraví na 2 ml/min (tak, aby 150 ml proteklo do kolony přibližně za 60–70 minut). Do baňky na 250 ml, která byla předtím zvážena, se odebere eluát. Rozpouštědlo se ve vakuu odpaří a jeho zbylé stopy se odstraní pod proudem dusíku. Baňka se zváží a vypočítá se množství získaného extraktu. (V případě použití už hotových silikagelových patron SPE se postupuje takto: zavede se 1 ml roztoku (5.1.2) do předem připravených patron s 3 ml n-hexanu. Po perkolování roztoku se vyvíjí 4 ml n-hexanu/dietyleteru v objemovém poměru 9/1 (V/V). Eluát se odebere do 10 ml zkumavky a odpařuje se pod proudem dusíku až do vysušení. Suché reziduum se podrobí pankreatické lipáze (5.2). Základem je ověřit složení mastných kyselin před a po přechodu patronou SPE.)

5.2 Hydrolýza pankreatickou lipázou

5.2.1 Do centrifugační zkumavky se odváže 0,1 g oleje připraveného podle bodu 5.1. Přidá se 2 ml tlumivého roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, přičemž po každém přidání se protřepe řádně směsí. Zkumavka se uzavře zábrusovou zátkou a umístí se do termostatu při teplotě 40 ± 0,5 °C.

5.2.2 Přidá se 20 mg lipázy, opatrně se protřepe (tak, aby se nenamočila zátka), a zkumavka se dá do termostatu přesně na 2 minuty, potom se vybere, během 1 minuty důkladně protřepává a nechá se vychladit.

5.2.3 Přidá se 1 ml dietyleteru, zazátkuje se a důkladně protřepe, potom se odstředí a pomocí mikrostříkačky se roztok etheru přenese do čisté a suché zkumavky.

5.3 Příprava silanizovaných derivátů a plynová chromatografie

5.3.1 Pomocí mikrostříkačky se 100 μl roztoku (5.2.3) zavede do 10 ml zkumavky s kónickým dnem.

5.3.2 Rozpouštědlo se odstraní pod slabým proudem dusíku, přidá se 200 μl silanizačního činidla (4.15), zkumavka se uzavře zátkou a nechá 20 minut odstát.

5.3.3 Po 20 minutách se přidá 1 až 5 ml n-hexanu (v závislosti na chromatografických podmínkách): výsledný roztok je připravený pro plynovou chromatografii.

5.4 Plynová chromatografie

Pracovní podmínky jsou tyto:

— teplota nástřikového zařízení (nástřikové zařízení on column) nižší než teplota varu rozpouštědla (68 °C),

— teplota detektoru: 350 °C,

— teplota kolony: nastavení teploty pece: 60 °C během 1 minuty, každou minutu se zvýší o 15 °C až do dosažení 180 °C, potom o 5 °C za minutu až do 340 °C, dále se udržuje 340 °C během 13 minut,

— nosný plyn: vodík nebo helium nastavené na lineární rychlost přiměřenou k dosažení rozlišení znázorněného na obrázku 1. Retenční čas triglyceridu C54 musí být 40 ± 5 minut (viz obrázek 2) (Výše uvedené podmínky postupu se uvádějí pouze orientačně. Každý subjekt je musí pro dosažení požadovaného rozlišení optimalizovat. Výška píku odpovídající 2-glyceril monopalmitátu musí dosáhnout alespoň 10 % rozsahu stupnice zapisovače.),

— množství nastříknuté látky: 0,5–1 μl roztoku (5 ml) n-hexanu (5.3.3).

5.4.1 Identifikace píků

Identifikace jednotlivých monoglyceridů se provádí podle retenčních časů a porovnáním se standardními směsmi monoglyceridů, které byly analyzovány za stejných podmínek.

5.4.2 Kvantitativní vyhodnocení

Plocha každého píku se vypočítá pomocí elektronického integrátoru.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Procentuální obsah glyceryl monopalmitátu se vypočítá na základě vztahu mezi plochou odpovídajícího píku a součtem ploch píků všech monoglyceridů (viz obrázek 2), podle vzorce:

Glycéril monopalmitate (%):

(Glycéril monopalmitate = glyceril monopalmitát)

kde:

Ax = plocha píku, který odpovídá glyceril monopalmitátu;

ΣA = součet ploch všech píků, které odpovídají monoglyceridům;

Výsledek se uvádí s přesností na jedno desetinné místo.

7. ZPRÁVA O ANALÝZE

Zpráva o analýze musí uvádět:

— odkaz na tuto metodu,

— všechny údaje potřebné k úplné identifikaci vzorku,

— výsledek analýzy,

— každý odklon od této metody, ať už pokud jde o rozhodnutí dotčených stran nebo z jiného důvodu,

— podrobné identifikační údaje o laboratoři, datum uskutečnění analýzy a podpis osob odpovědných za analýzu.

Obrázek 1

Chromatogram produktů z reakce silanizace, které byly získány lipázou na rafinovaném olivovém oleji s přidáním 20 % esterifikovaného oleje (100 %)

Vysvětlivky: „acides gras libres“ = volné mastné kyseliny; „Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée“ = rafinovaný olivový olej + 20 % esterifikovaný olej; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 monopalmitolein; „1-2 mono C18 insat.“ = nenasycený 1-2 mono C18; „squalene“ = squalen.

Obrázek 2

Chromatogram:

A) neesterifikovaného olivového oleje po lipáze; po silanizaci; za těchto podmínek (kapilární kolona 8–12 m) je vosková frakce eluovaná zároveň s frakcí diglyceridu nebo krátce poté. Po lipáze by obsah triglyceridů neměl překročit 15 % Vysvětlivky: 1 = Volné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

Chromatogram:

B) esterifikovaného olivového oleje po lipáze; po silanizaci; za těchto podmínek (kapilární kolona 8–12 m) je vosková frakce eluovaná zároveň s frakcí diglyceridu nebo krátce poté. Po lipáze by obsah triglyceridů neměl překročit 15 % Vysvětlivky: 1 = Volné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

8. POZNÁMKY

PŘÍPRAVA LIPÁZY

Lipázy s dostatečnou aktivitou jsou obchodně dostupné. Je ale rovněž možné je připravit v laboratoři takto:

5 kg čerstvé vepřové slinivky břišní se vychladí na 0 °C; okolní sádlo a vazivová tkáň se oddělí a v míchadle se rozmělní, dokud nevznikne tekutá mazlavá pasta. Tato pasta se protřepe po dobu 4 až 6 hodin s 2,5 l bezvodého acetonu a poté odstředí. Zbytek se extrahuje třikrát pomocí stejného množství bezvodého acetonu, potom dvakrát pomocí směsi acetonu a diethyletheru 1:1 (V/V) a dvakrát pomocí diethyletheru.

Zbytek se po 48 hodin suší ve vakuu za účelem získání stabilního prášku, který je možné dlouho skladovat v ledničce chráněný před vlhkostí.

KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY

Emulze olivového oleje se připraví takto:

V míchadle se po 10 minut protřepává směs složená ze 165 ml roztoku arabské gumy o koncentraci 100 g/l, 15 g drceného ledu a 20 ml předem neutralizovaného oleje.

Do 50 ml kádinky se zavede 10 ml této emulze, poté se postupně přidá 0,3 ml roztoku cholátu sodného o koncentraci 0,2 g/ml a 20 ml destilované vody.

Kádinka se vloží do termostatu udržovaného na teplotě 37 °C; vloží se elektrody pH metru a spirálovité míchadlo.

Pomocí byrety se po kapkách přidává roztok hydroxidu sodného 0,1 N, dokud hodnota pH nedosáhne 8,3.

Přidá se objem vodní suspenze lipázy (0,1 g/ml lipázy). Jakmile pH metr začne ukazovat pH 8,3, zapnou se stopky a po kapkách se přikapává roztok hydroxidu sodného takovou rychlostí, aby se udržovala hodnota pH 8,3. Zaznamená se objem spotřebovaného roztoku za minutu.

Údaje se zaznamenávají do grafového systému souřadnic tak, že osa nezávisle proměnných (x-ová osa) ponese časové údaje a na ose závisle proměnných se uvede počet mililitrů alkalického roztoku 0,1 N spotřebovaného na udržení konstantního pH. Výsledný graf musí být lineární.

Aktivita lipázy vyjádřená v lipázových jednotkách na 1 mg je pak dána tímto vzorcem:

kde:

A je aktivita vyjádřená v jednotkách lipázy/mg;

V je počet ml roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za minutu (vypočítaný z grafu);

N je molarita roztoku hydroxidu sodného;

m je hmotnost zkušební lipázy v mg.

Jednotka lipázy je definovaná jako množství enzymu, které uvolní 10 mikro-ekvivalentů kyseliny za minutu.

▼M20 —————

▼M28









PŘÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÁ ANALÝZA V ULTRAFIALOVÉ OBLASTI SPEKTRA

ÚVOD

Spektrofotometrická analýza v ultrafialové oblasti spektra může poskytnout informace o jakosti tuku, stavu jeho zachovalosti a změnách způsobených technologickými procesy. Absorpce při vlnových délkách specifikovaných v metodě je dána přítomností systémů konjugovaných dienů a trienů, které jsou výsledkem procesů oxidace a/nebo rafinace. Tyto absorpce jsou vyjádřeny jako specifické extinkce

(extinkce vyvolaná 1 % roztokem tuku v předepsaném rozpouštědle, v 10mm kyvetě) obvykle označované písmenem K (též zmiňované jako „extinkční koeficient“).

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato příloha popisuje postup spektrofotometrické analýzy olivového oleje v ultrafialové oblasti spektra.

2. PODSTATA METODY

Vzorek se rozpustí v požadovaném rozpouštědle a změří se absorbance roztoku při určitých vlnových délkách proti čistému rozpouštědlu.

Vypočítá se specifická extinkce při 232 nm a 268 nm v isooktanu nebo při 232 nm a 270 nm v cyklohexanu pro 1 % hmotnostní koncentrace v 10mm kyvetě.

3. VYBAVENÍ

3.1. Spektrofotometr vhodný pro měření v ultrafialových vlnových délkách (mezi 220 nm a 360 nm) s možností odečítání jednotlivých nanometrických jednotek. Doporučuje se provádět pravidelné kontroly přesnosti a reprodukovatelnosti rozsahu absorbance a vlnových délek, jakož i rozptýleného světla. 3.1.1. Rozsah vlnových délek: rozsah vlnových délek se může ověřit pomocí referenčního materiálu tvořeného optickým skleněným filtrem obsahujícím oxid holmia nebo roztok oxidu holmia (uzavřený či neuzavřený), který má různá absorpční pásma. Referenční materiály slouží k ověřování a kalibraci stupnice vlnových délek spektrofotometrů ve viditelné a ultrafialové oblasti spektra s nominální spektrální šířkou pásma 5 nm nebo méně. Podle pokynů přiložených k referenčním materiálům se měření provádějí proti vzdušnému slepému vzorku v rozsahu vlnových délek od 640 do 240 nm. Při každé změně štěrbiny se provede korekce základní linie bez kyvety v optické dráze. Vlnové délky normy jsou uvedeny v osvědčení referenčního materiálu. 3.1.2. Stupnice absorbance: ověřit ji lze pomocí obchodně dostupného uzavřeného referenčního materiálu tvořeného roztoky dichromanu draselného v určitých koncentracích a certifikovaných hodnotách absorbance při jejich λmax (čtyřmi roztoky dichromanu draselného v kyselině chloristé uzavřenými ve čtyřech křemenných kyvetách pro UV k měření linearity a referenční fotometrické přesnosti v UV oblasti spektra). Roztoky dichromanu draselného se měří proti slepému vzorku kyseliny použité po základní korekci podle pokynů přiložených k referenčnímu materiálu. Hodnoty absorbance jsou uvedeny v osvědčení referenčního materiálu. Při kontrole odezvy fotočlánku a fotonásobiče lze rovněž postupovat takto: naváží se 0,2000 g čistého chromanu draselného pro spektrofotometrii a rozpustí se v roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,05 N v 1 000 ml odměrné baňce a doplní po značku. Odebere se přesně 25 ml získaného roztoku, převede do odměrné baňky na 500 ml a doplní po značku stejným roztokem hydroxidu draselného. Extinkce takto získaného roztoku se změří při vlnové délce 275 nm s použitím roztoku hydroxidu draselného jako reference. Extinkce naměřená pomocí jednocentimetrové kyvety by měla být 0,200 ± 0,005.

3.2. Obdélníkové křemenné kyvety s víčky, vhodné pro měření v ultrafialových vlnových délkách (mezi 220 a 360 nm) o délce optické dráhy 10 mm. Naplněné vodou nebo jiným vhodným rozpouštědlem by se neměly vzájemně lišit o více než 0,01 jednotky extinkce.

3.3. Odměrné baňky s jednou značkou o objemu 25 ml třídy A.

3.4. Analytické váhy, které lze odečítat s přesností na 0,0001 g.

4. ČINIDLA

Není-li uvedeno jinak, používají se během analýzy pouze činidla uznané analytické kvality a destilovaná nebo demineralizovaná voda nebo voda rovnocenné čistoty.

Rozpouštědlo: isooktan (2,2,4-trimethylpentan) pro měření při 232 nm a 268 nm a cyklohexan pro měření při 232 nm a 270 nm, s absorbancí nižší než 0,12 při 232 nm a nižší než 0,05 při 270 nm proti destilované vodě, měřeno v 10mm kyvetě.

5. POSTUP

5.1. Zkoumaný vzorek musí být dokonale homogenní a bez suspendovaných nečistot. Není-li tomu tak, musí být přefiltrován přes papír při teplotě přibližně 30 °C.

5.2. Takto připraveného vzorku se odváží přibližně 0,25 g (s přesností na 1 mg) do odměrné baňky o objemu 25 ml, doplní se po rysku předepsaným rozpouštědlem a homogenizuje se. Výsledný roztok musí být dokonale čirý. Je-li roztok zakalený nebo obsahuje nečistoty, je nutno jej rychle přefiltrovat přes papír. POZNÁMKA: Pro měření absorbance panenských a extra panenských olivových olejů při při 232 nm a 268 nm zpravidla stačí hmotnost 0,25–0,30 g. Pro měření při 232 nm se obvykle požaduje vzorek o váze 0,05 g, takže se obvykle připraví dva různé roztoky. Pro měření absorbance olivového oleje z pokrutin, rafinovaného olivového oleje nebo kontaminovaného olivového oleje je vzhledem k jeho vyšší absorbanci zapotřebí menší část vzorku, např. 0,1 g.

5.3. Je-li to třeba, proveďte korekci základní linie (220–290 nm) rozpouštědlem v obou křemenných kyvetách (ve vzorku i v referenční kyvetě), potom naplňte vzorkovou křemennou kyvetu zkušebním roztokem a změřte extinkce při 232, 268 nebo 270 nm proti rozpouštědlu, které bylo použito jako reference. Zaznamenané hodnoty extinkce musí být v rozmezí 0,1 až 0,8 nebo v rozsahu linearity spektrofotometru, kterou je nutno ověřit. Pokud tomu tak není, musí se měření zopakovat s koncentrovanějšími nebo případně zředěnějšími roztoky.

5.4. Po měření absorbance při 268 nebo 270 nm, změřte absorbanci při λmax, λmax + 4 a λmax – 4. Tyto hodnoty absorbance se používají ke stanovení změny specifické extinkce (ΔΚ). POZNÁMKA: Má se za to, že λmax činí 268 nm pro isooktan použitý jako rozpouštědlo a 270 nm pro cyklohexan.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1. Zaznamenávají se specifické extinkce (extinkční koeficienty) při různých vlnových délkách vypočtené ze vzorce: kde: Kλ = specifická extinkce při vlnové délce λ, Eλ = extinkce měřená při vlnové délce λ; c = koncentrace roztoku v g/100 ml; s = délka dráhy křemenné kyvety v cm; vyjádřeno s přesností na dvě desetinná místa.

6.2. Změna specifické extinkce (ΔΚ) Změny absolutní hodnoty extinkce (ΔΚ) je dána vzorcem: kde Km je specifická extinkce při vlnové délce pro maximální absorpce ve výši 270 nm a 268 nm v závislosti na použitém rozpouštědle, vyjádřeno s přesností na dvě desetinná místa.









PŘÍLOHA X

STANOVENÍ METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato příloha obsahuje pokyny pro stanovení volných a vázaných mastných kyselin v rostlinných tucích a olejích plynovou chromatografií po jejich přeměně na methylestery mastných kyselin (FAME).

Vázané mastné kyseliny triacylglycerolů (TAG) a v závislosti na metodě esterifikace volné mastné kyseliny (FFA) se přeměňují na methylestery mastných kyselin (FAME), které se stanoví kapilární plynovou chromatografií.

Metoda popsaná v této příloze umožňuje stanovovat methylestery mastných kyselin od C12 po C24, včetně methylesterů nasycených, cis- a trans-mononenasycených a cis- a trans-polynenasycených mastných kyselin.

2. PODSTATA

Pro kvantitativní analýzu FAME se používá plynová chromatografie (GC). Methylestery mastných kyselin se připraví podle části A. Poté se vstříknou do injektoru a uvnitř něj se odpaří. Separace methylesterů mastných kyselin se provádí v analytických kolonách se specifickou polaritou a délkou. Pro detekci FAME se používá plameno-ionizační detektor (FID). Podmínky analýzy jsou uvedeny v části B.

V plynové chromatografii methylesterů mastných kyselin s FID lze jako nosný plyn (mobilní fáze) použít vodík nebo helium. Vodík urychluje separaci a zajišťuje výraznější píky. Stacionární fáze je mikroskopickou vrstvou tenkého tekutého filmu na inertním pevném povrchu z taveného křemene.

Když analyzované odtěkané sloučeniny procházejí kapilární kolonou, reagují se stacionární fází, jež je pokrytím na vnitřním povrchu kolony. Vzhledem k tomuto různému působení rozdílných sloučenin dochází k eluaci v různou dobu, která se nazývá retenčním časem sloučenin pro daný soubor parametrů analýzy. Srovnání retenčních časů se používá stanovení jednotlivých sloučenin.

ČÁST A

PŘÍPRAVA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN Z OLIVOVÉHO OLEJE A OLIVOVÉHO OLEJE Z POKRUTIN

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato část upřesňuje přípravu methylesterů mastných kyselin. Zahrnuje metody pro přípravu methylesterů mastných kyselin z olivového oleje a olivového oleje z pokrutin.

2. OBLAST POUŽITÍ

Příprava methylesterů mastných kyselin z olivového oleje a olivového oleje z pokrutin se provádí transesterifikací pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného při pokojové teplotě. Nezbytnost čištění vzorku před transesterifikací vzorku závisí na obsahu volných mastných kyselin ve vzorku a analytickém parametru, který má být stanoven, přičemž rozhodnout se lze podle následující tabulky:







Kategorie oleje Metoda Panenský olivový olej s kyselostí ≤ 2,0 % 1. Mastné kyseliny 2. Trans-mastné kyseliny 3. ΔECN42 (po čištění pomocí silikagelu SPE) Rafinovaný olivový olej Olivový olej složený z rafinovaného a panenského olivového oleje Rafinovaný olivový olej z pokrutin Olivový olej z pokrutin Panenský olivový olej s kyselostí > 2,0 % Surový olivový olej z pokrutin 1. Mastné kyseliny (po čištění pomocí silikagelu SPE) 2. Trans-mastné kyseliny (po čištění pomocí silikagelu SPE) 3. ΔECN42 (po čištění pomocí silikagelu SPE)

3. METODIKA

3.1. Transesterifikace pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného při pokojové teplotě

3.1.1. Podstata

Methylestery se vytvářejí transesterifikací pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného jako mezistupeň před zmýdelněním.

3.1.2. Činidla

3.1.2.1. Methanol s obsahem maximálně 0,5 % (m/m) vody

3.1.2.2. Hexan pro chromatografii

3.1.2.3. Heptan pro chromatografii

3.1.2.4. Diethylether, stabilizovaný pro účely analýzy

3.1.2.5. Aceton pro chromatografii

3.1.2.6. Eluční rozpouštědlo pro čištění oleje směsí hexanu/diethyletheru 87/13 (v/v) pro sloupcovou chromatografii/chromatografii SPE)

3.1.2.7. Hydroxid draselný, přibližně 2M methanolový roztok: 11,2 g hydroxidu draselného se rozpustí ve 100 ml methanolu.

3.1.2.8. Silikagelové patrony 1 g (6 ml) pro extrakci na pevnou fázi.

3.1.3. Přístroje a pomůcky

3.1.3.1. Zkumavky se šroubovacím uzávěrem (o objemu 5 ml) opatřené spojem z PTFE

3.1.3.2. Dělené nebo automatické pipety, 2 ml a 0,2 ml

3.1.4. Čištění vzorků oleje

V případě potřeby budou vzorky oleje čištěny na silikagelových patronách pro extrakci na pevnou fázi. Silikagelová patrona (3.1.2.8) se vloží do vakuového elučního zařízení a promývá se s 6 ml hexanu (3.1.2.2), promývání se provádí mimo vakuum. Poté se do kolony vlije roztok oleje (přibližně 0,12 g) v 0,5 ml hexanu (3.1.2.2). Tento roztok se po průchodu kolonou eluuje s 10 ml hexanu/diethyletheru (87/13 v/v) (3.1.2.6). Kombinované eluáty se homogenizují a rozdělí na dva obdobné objemy. Alikvotní část se odpaří do sucha na rotační odparce za sníženého tlaku při pokojové teplotě. Residuum se rozpustí v 1 ml n-heptanu a roztok je připraven k analýze mastných kyselin plynovou chromatografií. Případně se odpaří druhá alikvotní část a residuum se rozpustí v 1 ml acetonu pro analýzu triglyceridů vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

3.1.5. Postup

Do 5ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem (3.1.3.1) se odváží přibližně 0,1 g vzorku oleje. Přidá se 2 ml heptanu (3.1.2.2) a vše se protřepe. Přidá se 0,2 ml roztoku hydroxidu draselného (3.1.2.7), přidá se uzávěr se spojem z PTFE, uzávěr se utěsní a důkladně protřepe po dobu 30 sekund. Nechá se odstát, dokud nebude svrchní vrstva roztoku čirá. Svrchní vrstva obsahující methylestery se slije. Roztok heptanu je připraven k nástřiku do plynového chromatografu. Do analýzy plynovou chromatografií je vhodné roztok uchovávat v ledničce. Nedoporučuje se skladovat roztok déle než 12 hodin.

ČÁST B

ANALÝZA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato metoda popisuje použití plynové chromatografie v kapilární koloně pro stanovení kvalitativního a kvantitativního složení směsi methylesterů mastných kyselin získaných podle metody uvedené v části A.

Tato část není použitelná pro polymerní mastné kyseliny.

2. ČINIDLA

2.1. Nosný plyn

Inertní plyn (helium nebo vodík), dokonale vysušený a s obsahem kyslíku menším než 10 mg/kg.

Poznámka 1: Vodík umožňuje dvakrát zvýšit rychlost analýzy, ale je nebezpečný. Dostupná jsou bezpečnostní zařízení.

2.2. Pomocné plyny

2.2.1. Vodík (čistota ≥ 99,9 %), neobsahující organické nečistoty.

2.2.2. Vzduch nebo kyslík, neobsahující organické nečistoty.

2.2.3. Dusík (čistota > 99 %).

2.3. Referenční standard

Směs methylesterů čistých mastných kyselin, nebo methylestery z tuku známého složení; výhodné je složení podobné analyzovanému tuku. Pro stanovení trans-isomerů nenasycených kyselin jsou užitečné cis- a trans-isomery methylesterů oktadecenové, oktadekadienové a oktadekatrienové kyseliny.

Pozornost je třeba věnovat ochraně polynenasycených mastných kyselin před oxidací.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Uvedené pokyny se vztahují na obvyklá zařízení používaná pro plynovou chromatografii, která používají kapilární kolony a plameno-ionizační detektor.

3.1. Plynový chromatograf

Plynový chromatograf obsahuje tyto části:

3.1.1. Injektor

Injektor se používá pro kapilární kolonu, kde by injektor měl být konstruován přímo pro použití s touto kolonou. V tomto případě může být prováděn buď nástřik pomocí děliče (split type), nebo bez dělení přímo na kolonu (splitless type) nástřik „on column“.

3.1.2. Termostat

Termostat má mít schopnost vyhřát kolonu na teplotu nejméně 260 °C a udržovat žádanou teplotu s přesností na 0,1 °C. Poslední požadavek je zvlášť důležitý při použití trubice z taveného křemene.

Použití ohřevu s programovanou teplotou je doporučeno ve všech případech, zejména pro mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku.

3.1.3. Kapilární kolona

3.1.3.1. Trubice vyrobená z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (obvykle sklo nebo tavený křemen). Vnitřní průměr se pohybuje mezi 0,20 mm až 0,32 mm. Vnitřní povrch musí být před pokrytím stacionární fází přiměřeným způsobem upraven (např. příprava povrchu, inaktivace). Pro cis- a trans-isomery mastných kyselin je dostatečná délka 60 m.

3.1.3.2. U stacionární fáze jsou vhodné polární polysiloxany (kyanosilikony) vázané stacionární fáze (zesíťované). Poznámka 2: Při použití polárních polysiloxanů je nebezpečí obtížné identifikace a separace kyseliny linolenové a kyselin C20. Pokrytí má být tenké, tj. 0,1 μm až 0,2 μm.

3.1.3.3. Montáž a kondicionace kolony Při montáži kapilární kolony, např. úpravě kolony v termostatu (nosič), výběru a provedení spojů (netěsné spoje), polohy konce kolony v injektoru a detektoru (zmenšení mrtvých prostorů) je nutno zachovat běžnou opatrnost. Kolonou se nechá protékat nosný plyn (např. 0,3 bar (30 kPa) pro kolonu délky 25 m a vnitřním průměru 0,3 mm). Kolona se ohřívá v termostatu za programované teploty rychlostí 3 °C/min od teploty okolí do teploty 10 °C pod limitní hodnotu, při které dochází k rozložení stacionární fáze. Termostat se udržuje při této teplotě po dobu jedné hodiny, dokud nedojde k ustálení základní linie. Potom se termostat ochladí na 180 °C a pracuje se za isotermních podmínek. Poznámka 3: Vhodné kondiciované kolony jsou obchodně dostupné.

3.1.4. Plameno-ionizační detektor a konverzní zesilovač

3.2. Stříkačka

Stříkačka o maximálním objemu 10 μl, dělená po 0,1 μl.

3.3. Systém pro sběr dat

Systém pro sběr dat napojený online na detektory a používaný se softwarovým programem pro integraci píků a normalizaci.

4. POSTUP

Operace popsané v odstavcích 4.1 až 4.3 se týkají použití plameno-ionizačního detektoru.

4.1. Zkušební podmínky

4.1.1. Výběr optimálních pracovních podmínek u kapilárních kolon

Účinnost a permeabilita kapilárních kolon způsobují, že dělení složek a doba trvání analýzy jsou značně závislé na průtoku nosného plynu kolonou. Bude proto nezbytné optimalizovat pracovní podmínky působením na tyto parametry (nebo jednodušeji na tlakovou ztrátu na koloně) podle toho, zda je cílem zlepšit dělení, nebo zrychlit analýzu.

Tyto podmínky se ukázaly být vhodné pro separaci FAME (C4 až C26). Příklady chromatogramů jsou uvedeny v dodatku B:







Teplota injektoru: 250 °C Teplota detektoru: 250 °C Teplota termostatu: 165 °C (8 min) až 210 °C při 2 °C/min Nosný plyn – vodík: tlak na koloně: 179 kPa, Celkový průtok: 154,0 ml/min; Oddělovací poměr: 1:100 Objem nástřiku: 1 μl

4.1.2. Stanovení rozlišení (viz dodatek A)

Rozlišení R dvou sousedních píků I a II se vypočte podle vzorce:

R = 2 × ((dr(II) – dr(I) )/(ω(I) + ω(II))) nebo R = 2 × ((tr(II) – tr(I) )/(ω(I) + ω(II))) (USP) (lékopis USA)

nebo

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (JP (lékopis Japonska), EP (Evropský lékopis), BP (lékopis UK))

kde:

d r(I) je retenční vzdálenost píku I;

d r(I) je retenční vzdálenost píku II;

t r(I) je retenční čas píku I;

t r(II) je retenční čas píku II;

ω(I) je šířka základu píku I;

ω(I) je šířka základu píku II;

ω0,5 je šířka píku uvedené sloučeniny, při střední výšce píku;

Pokud ω(I) ≈ ω(II), R se vypočte podle těchto vzorců:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

kde

σ je směrodatná odchylka (viz Dodatek A, obrázek 1).

Pokud se vzdálenost dr mezi dvěma píky d r(II) – d r(I) rovná 4σ, faktor rozlišení R = 1.

Nejsou-li dva píky úplně separovány, tečny vedené inflexními body dvou píků se protnou v bodě C. Pro úplnou separaci dvou píků musí být vzdálenost mezi dvěma píky:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, odtud R = 1,5 (viz Dodatek A, obrázek 3).

5. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

5.1. Kvalitativní analýza

Provede se identifikace píků methylesterů pro vzorek z chromatogramu v dodatku B, obrázku 1, podle potřeby se interpoluje, nebo se porovná s píky referenčních směsí methylesterů (jak je uvedeno v bodě 2.3).

5.2. Kvantitativní analýza

5.2.1. Určení složení

Výpočet hmotnostního zlomku w i jednotlivých methylesterů mastných kyselin, vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů, se provede takto:

5.2.2. Metoda výpočtu

5.2.2.1. Obecný případ

Obsah složky i vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů se vypočítá určením plochy odpovídajícího píku vzhledem k součtu ploch všech píků podle vzorce:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kde

Ai je plocha píku jednotlivého methylethylesteru mastných kyselin i;

ΣA je součet ploch všech píků všech jednotlivých methylesterů mastných kyselin.

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

Poznámka 4: U tuků a olejů se hmotnostní zlomek methylesterů mastných kyselin rovná hmotnostnímu zlomku triacylglycerolů v gramech na 100 g. V případech, že tento předpoklad neplatí, viz 5.2.2.2.

5.2.2.2. Použití korekčních faktorů

V některých případech, zvláště za přítomnosti mastných kyselin s méně než osmi atomy uhlíku, nebo kyselin se sekundární skupinou se plochy opraví pomocí specifických korekčních faktorů (Fci). Tyto faktory se stanoví pro každý jednotlivý nástroj. Pro tento účel se použijí vhodné referenční materiály s certifikovaným složením mastných kyselin v odpovídajícím rozsahu.

Poznámka 5: Tyto korekční faktory nejsou shodné se teoretickými korekčními faktory FID, které jsou uvedeny v dodatku A, jelikož zahrnují rovněž výkonnost systému ve vztahu k injektoru atd. V případě větších rozdílů by měla být zkontrolována výkonnost celého systému.

Pro tyto referenční směsi se hmotnostní procenta FAME i vypočtou podle vzorce:

wi = (mi /Σm) × 100

kde

m i je hmotnost FAME i v referenční směsi,

Σm je celková hmotnost různých složek jako FAME v referenční směsi.

Z chromatogramu referenční směsi se vypočítá procentní podíl plochy pro FAME i takto:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kde

Ai je plocha FAME i v referenční směsi,

ΣA součet všech ploch všech FAMW v referenční směsi.

Korekční faktor Fc je následně:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Pro vzorek činí hmotnostní procenta každého FAME i:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

Poznámka 6: Vypočtená hodnota odpovídá procentním procentům jednotlivých mastných kyselin vypočítaným jako triacylglyceroly na 100 g tuku.

5.2.2.3. Použití vnitřního standardu

V některých případech (např. když nejsou kvantifikovány všechny mastné kyseliny, k čemuž dochází, jsou-li přítomny kyseliny se čtyřmi a šesti atomy uhlíku současně s kyselinami s 16 a 18 atomy uhlíku, nebo když je třeba určit absolutní množství mastných kyselin ve vzorku) by měl být použit vnitřní standard. Jako vnitřní standard se používají nejčastěji methylestery mastných kyselin s 5, 15 nebo 17 atomy uhlíku. Pro vnitřní standard by měl být stanoven korekční faktor (pokud se použije).

Hmotnostní procenta složky i vyjádřená jako methylester lze vypočítat podle vzorce:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

kde:

A i je plocha FAME i,

A IS je plocha vnitřního standardu;

F i je korekční faktor mastné kyseliny i, vyjádřený jako FAME;

F IS je korekční faktor vnitřního standardu;

m je hmotnost zkušebního vzorku v miligramech,

m IS je hmotnost vnitřního standardu v miligramech.

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

6. PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol musí obsahovat odkaz na použitou metodu pro přípravu methylesterů a jejich stanovení plynovou chromatografií. Dále zahrnuje všechny pracovní podrobnosti nespecifikované v této standardní metodě nebo považované za volitelné, jakož i další okolnosti, které mohou ovlivnit výsledek.

Protokol musí obsahovat všechny informace nutné pro kompletní identifikaci vzorku.

7. PŘESNOST

7.1. Výsledky mezilaboratorní zkoušky

Podrobnosti k mezilaboratorní zkoušce týkající se přesnosti metody jsou uvedeny v příloze C normy IOC/T.20/Doc. No 3