A.

Blokující nebo kompetitivní ELISA test se provádí podle tohoto protokolu: Kompetitivní ELISA test, využívající monoklonální protilátku 3-17-A3, je schopen detekovat protilátky proti všem známým sérotypům viru katarální horečky ovcí (VKHO). Podstatou tohoto testu je přerušení reakce mezi antigenem VKHO a skupinově specifickou monoklonální protilátkou (3-17-A3) přidáním testovaného séra. Protilátky proti VKHO přítomné v testovaném séru blokují reaktivitu monoklonální protilátky (Mab) a výsledkem je redukce očekávaného vzniku zbarvení po přidání enzymaticky značené proti-myší protilátky a chromogenu/substrátu. Sérum je možné testovat v jednom zředění 1:5 (bodová kontrola – dodatek 1) nebo může být titrováno (titrace séra – dodatek 2) za účelem dosažení bodu ekvivalence roztoku. Za pozitivní lze považovat hodnoty inhibice vyšší než 50 %. 1. vhodné mikrotitrační destičky ELISA; 2. antigen: dodaný jako extrahovaný buněčný koncentrát připravený podle níže uvedeného popisu a uložený buď při teplotě -20 °C nebo -70 °C; 3. blokující pufr: fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (PBS) obsahující 0,3 % VKHO negativního séra dospělého skotu, 0,1 % (objem/objem) Tween-20 (dodávaného jako polyoxyethylen sorbiton monolaurat sirup) v PBS; 4. monoklonální protilátka: 3-17-A3 (dodávaná jako hybridom supernatant tkáňové kultury) zaměřená proti skupinově specifickému polypeptidu p7, skladovaná při teplotě –20 °C nebo lyofilizovaná a ředěná 1/100 blokujícím pufrem před použitím; 5. konjugát: králičí proti-myší globulin (adsorbovaný a eluovaný) konjugovaný na křenovou peroxidasu a uchovávaný v temnu při teplotě 4 °C; 6. chromogen a substrát: orthofenylen diamin (OPD chromogen) rozpuštěný ve sterilní destilované vodě, s výslednou koncentrací 0,4 mg/ml, peroxid vodíku (30 % hmotnost/objem substrátu) s koncentrací 0,05 % objem/objem přidaný těsně před použitím (5 ml H2O2 na 10 ml OPD). (S OPD zacházejte opatrně – používejte gumové rukavice – možný mutagen;) 7. jednomolární kyselina sírová: 26,6 ml kyseliny přidané do 473,4 ml destilované vody. (Pamatujte: vždy přidávejte kyselinu do vody, nikdy vodu do kyseliny;) 8. kruhová třepačka; 9. zařízení k odečítání destiček ELISA (test lze vyhodnocovat vizuálně). Cc: kontrola konjugátu (žádné sérum/žádna monoklonální protilátka); C++: silná pozitivní kontrola séra; C+: slabá pozitivní kontrola séra; C-: negativní kontrola séra; Cm: kontrola monoklonální protilátky (žádné sérum).



Dodatek 1: uspořádání při jednom zředění (1:5) séra (40 sér/destička) Kontroly Testovaná séra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



Dodatek 2: uspoŕádání pŕi titraci séra (10 sér/destička) Kontroly Testovaná séra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Kontrola konjugátu (Cc) : jamky 1A a 1B odpovídají slepé kontrole sestávající z VKHO antigenu a konjugátu. Lze ji použít ke kalibraci přístroje pro odečítání ELISA. Kontrola Mab (Cm) : sloupce 1 a 2 a řádky G a H odpovídají kontrole monoklonální protilátky sestávající z VKHO antigenu, monoklonální protilátky a konjugátu. Tyto jamky jsou maximálně zbarveny. Průměrná hodnota optické denzity z této kontroly představuje 0 % inhibiční hodnotu. Pozitivní kontrola (C++, C-) : sloupce 1 a 2 a řádky C až F. Tyto jamky obsahují VKHO antigen, silné a slabé VHKO pozitivní antisérum v uvedeném pořadí, Mab a konjugát. Negativní kontrola (C-) : jamky 2A a 2B obsahují negativní kontrolu, která sestává z VHKO antigenu, VHKO negativního antiséra, Mab a konjugátu. Testovaná séra : pro sérologické průzkumy ve velkém měřítku a rychlý screening by bylo možné testovat séra v jednom zředění 1:5 (dodatek 1). Jinak lze testovat 10 sér v rozsahu zředění od 1:5 do 1:640 (dodatek 2). To nám poskytne určitou představu o titru protilátky v testovaných sérech. 1. Nařeďte VKHO antigen na předtitrovanou koncentraci v PBS, krátce podrobte ultrazvukovým vibracím, aby se rozptýlil agregovaný virus (pokud sonikátor není k dispozici, silně pipetujte), přidejte 50 ml do všech jamek destičky ELISA. Oklepněte strany destičky, aby se antigen rozptýlil. 2. Inkubujte při teplotě 37 °C po dobu 60 minut na kruhové třepačce. Promyjte destičky třikrát tak, že jamky zalijete nesterilním PBS, vyprázdníte je a vysajte savým papírem. 3. Kontrolní jamky: do jamek Cc přidejte 100 ml blokujícího pufru. Do odpovídajících jamek C-, C+ a C++ přidejte 50 ml pozitivního a negativního kontrolního séra ve zředění 1:5 (10 ml séra + 40 ml blokujícího pufru) a do kontrolních jamek přidejte k Mab 50 ml blokujícího pufru. Metoda bodové titrace: přidejte zředění 1:5 každého testovaného séra v blokovacím pufru, abyste zdvojili jamky ve sloupcích 3 až 12 (10 ml séra + 40 ml blokujícího pufru) nebo Metoda titrace séra: ve všech osmi jamkách jednotlivých sloupců 3 až 12 připravte dvojnásobně zředěné řady každého testovaného vzorku (1:5 až 1:640) v blokujícím pufru. 4. Ihned po přidání testovaných sér zřeďte Mab 1:1000 v blokujícím pufru a přidejte 50 ml do všech jamek destičky kromě slepé kontroly. 5. Inkubujte při 37 °C po dobu 60 minut na kruhové třepačce. Promyjte třikrát pomocí PBS a vysajte savým papírem. 6. Nařeďte králičí anti-myší koncentrát na 1/5 000 v blokujícím pufru a přidejte 50 ml do všech jamek destičky. 7. Inkubujte při 37 °C po dobu 60 minut na kruhové třepačce. Promyjte třikrát pomocí PBS a vysajte savým papírem. 8. Nechte roztát OPD a těsně před použitím přidejte 5 ml 30 % peroxidu vodíku do každých 10 ml OPD. Přidejte 50 ml do všech jamek destičky. Asi 10 minut počkejte, dokud se nevyvine zbarvení, a zastavte reakci 1M kyselinou sírovou (50 ml na jamku). Zbarvení by se mělo objevit v kontrolních jamkách s Mab a v těch jamkách, které obsahují séra bez protilátky proti VKHO. 9. Vyšetřete a vyhodnoťte destičky buď vizuálně, nebo pomocí spektrofotometru. Pomocí softwarového balíku vytiskněte hodnoty optické denzity (OD) a procentní inhibiční hodnoty (PI) testovaného a kontrolního séra vycházející ze střední hodnoty zaznamenané v kontrolních jamkách s antigenem. Údaje vyjádřené jako hodnoty OD a PI se používají ke zjištění, zda byl test proveden v rámci přípustných mezí. Horní kontrolní meze (UCL) a dolní kontrolní meze (LCL) pro kontrolu Mab (antigen pus Mab v nepřítomnosti tetovaného séra) leží mezi hodnotami 0,4 a 1,4. Každou destičku, která nevyhovuje výše uvedeným kritériím, je nutné odmítnout. Pokud softwarový balík není k dispozici, vytiskněte hodnoty OD pomocí tiskárny ELISA. Vypočtěte střední hodnotu OD kontrolních jamek s antigenem, která představuje 100 % hodnotu. Určete 50 % hodnotu OD a ručně vypočítejte pozitivitu a negativitu každého vzorku. Procentní inhibiční hodnota (PI) = 100 – (OD každé testové kontroly/střední hodnota OD jamek Cm) × 100. Zdvojené jamky s negativním kontrolním sérem a zdvojené slepé jamky by měly vykázat hodnoty PI mezi +25 % a -25 % a mezi +95 % a +105 % v uvedeném pořadí. Překročení těchto mezních hodnot jamku nezpochybňuje, ale svědčí o tom, že se vyvíjí barva pozadí. Silně a slabě pozitivní séra by měla vykázat hodnoty PI mezi +81 % a +100 % a mezi +51 % a +80 % v uvedeném pořadí. Diagnostický práh pro testované sérum je 50 % (PI 50 % nebo OD 50 %). Vzorky vykazující hodnoty PI >50 % se považují za negativní. Vzorky, které vykazují hodnoty nad prahem a pod prahem pro zdvojené jamky, se považují za pochybné; takové vzorky lze opakovaně otestovat bodovým testem a/nebo titrací. Pozitivní vzorky lze rovněž titrovat za účelem zjištění stupně pozitivity. Vizuální vyhodnocení: pozitivní a negativní vzorky jsou snadno rozeznatelné zrakem; slabě pozitivní nebo silně negativní vzorky lze zrakem interpretovat obtížněji. 1. Promyjte 40-60 Roux lahví se souvislým porostem buněk BHK-21 třikrát Eagleho médiem bez séra a infikujte sérotypem 1 viru katarální horečky ovcí v Eagleho médiu bez séra. 2. Inkubujte při teplotě 37 °C a denně vyšetřujte na cytopatický efekt (CPE). 3. Jakmile je CPE zřejmý u 90 až 100 % buněk v každé Roux láhvi, skliďte virus pomocí třepání tak, aby se dosud ulpívající buňky uvolnily od skla. 4. Odstřeďujte při 2 000 až 3 000 otáčkách za minutu, aby buňky vytvořily peletu. 5. Odstraňte supernatant a resuspendujte buňky přibližně ve 30 ml PBS obsahujícím 1 % Sarkosylu a 2 ml fenolmethylsulfonylfluoridu (lysis pufr). Toto může způsobit tvorbu gelu z buněk a může se přidat více lysis pufru, aby se tento efekt potlačil. (Pozor: fenylmethylsulfonylfluorid je zhoubný – zacházejte s ním s velkou opatrností!) 6. 60 sekund rozrušujte buňky ultrazvukovou sondou při amplitudě 30 mikronů. 7. 10 minut odstřeďujte při 10 000 otáčkách za minutu. 8. Supernatant uchovávejte při +4 °C a zbývající buněčnou peletu resuspendujte v 10 až 20 ml lysis pufru. 9. Podrobte ultrazvukovým vibracím a projasněte celkem třikrát, supernatant každého stadia uchovávejte. 10. Shromážděte supernatanty a odstřeďujte při 24 000 otáčkách za minutu (100 000 g) po dobu 120 minut při teplotě +4 °C pomocí 5ml polštáře 40 % sacharosy (hmotnost/objem v PBS) s použitím 30 ml Beckmannových odstředivkových zkumavek a rotoru SW 28. 11. Odstraňte supernatant, důkladně vyprázdněte zkumavky a resuspendujte peletu v PBS působením ultrazvukových vibrací. Antigen skladujte rozdělený na poměrné části při teplotě -20 °C. ELISA antigen katarální horečky ovcí se titruje nepřímým testem ELISA. Dvojnásobná zředění antigenu se titrují proti konstantnímu zředění (1/100) monoklonální protilátky 3-17-A3. Protokol je tento: 1. VKHO antigen zředěný pomocí PBS v poměru 1:20 titrujte v mikrotitrační destičce v sériích dvojnásobných zředění (50 ml/jamka) pomocí mnohokanálové pipety. 2. Inkubujte po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C na kruhové třepačce. 3. Destičky třikrát promyjte pomocí PBS. 4. Přidejte 50 ml monoklonální protilátky 3-17-A3 (zředěné 1/100) do každé jamky mikrotitrační destičky. 5. Inkubujte po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C na kruhové třepačce. 6. Destičky třikrát promyjte pomocí PBS. 7. Do každé jamky mikrotitrační destičky přidejte 50 ml králičího anti-myšího globulinu konjugovaného na křenovou peroxidasu, ředěného na optimální koncentraci podle předtitrace. 8. Inkubujte po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C na kruhové třepačce. 9. Přidejte substrát a chromogen jak bylo popsáno výše. Zastavte reakci po 10 minutách přidáním jednomolární kyseliny sírové (50 ml/jamka). Při kompetitivním testu musí být nadbytek monoklonální protilátky, proto se volí takové zředění antigenu, které leží na titrační křivce (ne v oblasti základny), což dává asi 0,8 OD po 10 minutách.