1991R2568 — CS — 01.11.2003 — 020.001

Tento dokument je třeba brát jako dokumentační nástroj a instituce nenesou jakoukoli odpovědnost za jeho obsah

Ve znění:







(*) Tento akt nebyl nikdy publikován v češtině.









▼B

NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91

ze dne 11. července 1991

o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy







KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ, s ohledem na Smlouvu o založení Evropského hospodářského společenství, s ohledem na nařízení Rady č. 136/66/EHS ze dne 22. září 1966 o zřízení společné organizace trhu s oleji a tuky ( 1 ), naposledy pozměněné nařízením (EHS) č. 3577/90 ( 2 ), a zejména na článek 35a uvedeného nařízení, vzhledem k tomu, že příloha nařízení č. 136/66/EHS obsahuje označení a definice olivového oleje a olivového oleje z pokrutin, které jsou uváděny na trh v jednotlivých členských státech, v rámci obchodu uvnitř Společenství a v rámci obchodu s třetími zeměmi; vzhledem k tomu, že za účelem rozlišování mezi různými druhy olivového oleje je nutno definovat fyzikální a chemické vlastnosti každého z nich, jakož i organoleptické vlastnosti panenského olivového oleje, aby byla zaručena čistota a jakost daných výrobků, aniž jsou dotčena jiná existující ustanovení; vzhledem k tomu, že přítomnost charakteristik různých druhů olivového oleje je nutno stanovit v celém Společenství jednotně; že za tímto účelem je třeba vypracovat metody Společenství pro chemickou analýzu a organoleptické hodnocení; že v přechodném období je nutno povolit používání jiných metod analýzy v členských státech s podmínkou, že v případě rozdílných výsledků budou rozhodující výsledky získané metodou Společenství; vzhledem k tomu, že definice fyzikálních a chemických vlastností olivového oleje a metod analýzy způsobuje změnu doplňkových poznámek ke kapitole 15 kombinované nomenklatury; vzhledem k tomu, že metoda hodnocení organoleptických vlastností panenského olivového oleje zahrnuje sestavení zkušebních komisí z vybraných a vyškolených posuzovatelů; že období nezbytné pro vytvoření takové struktury je proto třeba pevně stanovit; že s ohledem na potíže, s nimiž se některé členské státy setkají při sestavování zkušebních komisí posuzovatelů, je nutno povolit využití zkušebních komisí sestavených v jiných členských státech; vzhledem k tomu, že v zájmu zajištění správného fungování režimu dávek na dovoz olivových pokrutin je nutno stanovit jednotnou metodu pro stanovení obsahu oleje v těchto produktech; vzhledem k tomu, že v zájmu hladkého fungování trhu je třeba přijmout opatření, aby bylo možné olivový olej stočený do obalů před vstupem tohoto nařízení v platnost umístit během omezeného časového období na trhu; vzhledem k tomu, že je nutné zrušit nařízení Komise (EHS) č. 1058/77 ( 3 ), naposledy pozměněné nařízením (EHS) č. 1858/88 ( 4 ); vzhledem k tomu, že Řídící výbor pro oleje a tuky nezaujal stanovisko ve lhůtě stanovené jeho předsedou, PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:







▼M20

Článek 1

1. Oleje s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodech 1 a 2 přílohy I tohoto nařízení, jsou považovány za panenské olivové oleje ve smyslu bodu 1 písm. a) a b) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

2. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 3 přílohy I tohoto nařízení, je považován za lampantový olivový olej ve smyslu bodu 1 písm. c) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

3. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 4 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej ve smyslu bodu 2 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

4. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 5 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej obsahující směs rafinovaného olivového oleje a panenského olivového oleje ve smyslu bodu 3 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

5. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 6 přílohy I tohoto nařízení, je považován za surový olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 4 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

6. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 7 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 5 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

7. Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 8 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 6 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

▼B

Článek 2

1. Charakteristiky olivových olejů uvedených v příloze I se stanoví v souladu s těmito metodami analýzy:

— stanovení volných mastných kyselin, vyjádřených v procentech kyseliny olejové, metodou uvedenou v příloze II,

— stanovení peroxidového čísla metodou uvedenou v příloze III,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— stanovení obsahu sterolů metodou uvedenou v příloze V,

— stanovení erythrodiolu a uvaolu metodou uvedenou vpříloze VI,

— stanovení nasycených mastných kyselin v triglyceridech vázaných v poloze 2 metodou uvedenou v příloze VII,

▼M20 —————

▼B

— spektrofotometrická analýza metodou uvedenou v příloze IX,

— stanovení složení mastných kyselin metodou uvedenou v přílohách XA a XB,

— stanovení těkavých halogenovaných rozpouštědel metodou uvedenou v příloze XI,

— hodnocení organoleptických vlastností panenského olivového oleje metodou uvedenou v příloze XII, používanou v souladu s odstavcem 2,

▼M20 —————

▼M11

— stanovení stigmastadienolů metodou uvedenou v příloze XVII,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Pro účely ověření podle odstavce 3 se analýzy uvedené v přílohách II, III, IX, X a XII, jakož i případné kontrolní analýzy stanovené vnitrostátními právními předpisy, provádějí před datem minimální trvanlivosti. Pokud se odběr vzorků provede více než čtyři měsíce před datem minimální trvanlivosti, analýzy se provedou nejpozději ve čtvrtém měsíci po odebrání vzorku. Pro ostatní analýzy tohoto nařízení neplatí žádné lhůty. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Článek 2a

Vnitrostátní orgány nebo jejich zástupci mohou ověřit, zda je vzorek v souladu s deklarovanou kategorií:

a) buď provedením analýz uvedených v příloze I v jakémkoli pořadí;

b) nebo v pořadí uvedeném v příloze Ib v rozhodovacím schématu, dokud není dosaženo jedno z rozhodnutí uvedených v rozhodovacím schématu.

▼M19 —————

▼M5

►M19 Článek 3 ◄

Pokud se zjistí rozdíly mezi zjištěnými organoleptickými vlastnostmi a těmi, které vyplývají z označení výrobku, uloží daný členský stát, aniž jsou dotčeny jakékoli další sankce, administrativní finanční sankce, jejich výše se stanoví podle závažnosti zjištěné nesrovnalosti.

Při posuzování nesrovnalostí se berou v úvahu přirozené změny vlastností olejů uchovávaných v běžných podmínkách.

Na začátku každého pololetí členské státy informují Komisi o počtu a druhu zjištěných nesrovnalostí a sankcí uložených v průběhu předešlého pololetí.

▼M5

Článek 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Pokud členský stát narazí na potíže při sestavování zkušebních komisí na svém území, může povolat zkušební komisi schválenou v jiném členském státě.

3. Každý členský stát vypracuje seznam zkušebních komisí sestavených profesionálními nebo mezioborovými organizacemi za podmínek stanovených v odstavci 1 a zajistí dodržování těchto podmínek.

▼M19 —————

▼B

Článek 6

1. Obsah oleje u pokrutin z oliv a jiných zbytků po extrakci olivového oleje (podpoložky 2306 90 11 a 2306 90 19) se stanoví metodou uvedenou v příloze XV.

2. Obsah oleje, na který odkazuje odstavec 1, se vyjadřuje v procentech hmotnosti oleje v sušině.

▼M20

Článek 7

Pokud jde o přítomnost kontaminujících látek, použijí se příslušné předpisy Společenství.

Pokud jde o halogenovaná rozpouštědla, zavádějí se pro všechny kategorie olivového oleje tyto limity:

— maximální obsah každého zjištěného halogenovaného rozpouštědla: 0,1 mg/kg,

— maximální celkový obsah zjištěných halogenovaných rozpouštědel: 0,2 mg/kg.

▼B

Článek 8

1. Členské státy sdělí Komisi opatření přijatá k provádění tohoto nařízení.

2. Členské státy předají Komisi na začátku každého pololetí souhrn analytických údajů, které se vztahují ke zkouškám provedeným během předchozího pololetí.

Výsledky budou přezkoumány Řídícím výborem pro oleje a tuky postupem podle článku 39 nařízení č. 136/66/EHS.

Článek 9

Nařízení (EHS) č. 1058/77 se zrušuje.

Článek 10

1. Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.

Metoda uvedená v příloze XII se však použije ode dne ►M1 1. listopadu 1992 ◄ , s výjimkou případů, kdy se jedná o intervenční opatření.

▼M5

Tato metoda se nepoužije u panenského olivového oleje stočeného před 1. listopadem 1992.

▼B

2. Toto nařízení se nepoužije na olivový olej a olivový olej z pokrutin stočený do obalů před vstupem tohoto nařízení v platnost a uvedený na trh do 31. října 1992.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.









PŘÍLOHA

Obsah







Příloha I: Charakteristiky olivového oleje ▼M17 Příloha I A: Odběr vzorků ze šarží olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin ve spotřebitelských obalech o objemu nejvýše 100 litrů ▼M20 Příloha I B: Rozhodovací schéma ▼B Příloha II: Stanovení volných mastných kyselin Příloha III: Stanovení peroxidového čísla Příloha IV: ►M6 Stanovení obsahu vosku kapilární plynovou chromatografií ◄ Příloha V: Stanovení obsahu a složení sterolů pomocí kapilární plynové chromatografie Příloha VI: Stanovení erythrodiolu a uvaolu Příloha VII: Stanovení nasycených mastných kyselin v triglyceridech vázaných v poloze 2 ▼M20 ————— ▼B Příloha IX: Spektrofotometrická analýza v ultrafialové oblasti spektra Příloha X A: Analýza methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil Příloha XI: Stanovení těkavých halogenovaných rozpouštědel v olivovém oleji Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Příloha XV: Stanovení obsahu oleje v olivových pokrutinách Příloha XVI: Stanovení jodového čísla ▼M11 Příloha XVII: Stanovení stigmastadienolů v rostlinných olejích ▼M13 Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with ECN42 ▼M19 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content

▼M20









PŘÍLOHA I

CHARAKTERISTIKY OLIVOVÉHO OLEJE







Kategorie Kyselost (%) * Peroxidové číslo (meq/O2/kg)* Vosky(mg/kg)* * Nasycené mastné kyse-liny v trigly-ceridech vázaných v poloze 2(%) Stigma-stadieny (mg/kg) (1) Rozdíl mezi hodnotou ECN42 zjištěnou z HLPC a teoretickým výpočtem K232 * K270 * Delta-K * Organoleptické hodnocení Medián závad(Md)* Organoleptické hodnocení Medián ovocnosti(Mf)* 1. Extra panenský olivový olej £ 0,8 £ 20 £ 250 £ 1,5 £ 0,15 £ 0,2 £ 2,50 £ 0,22 £ 0,01 Md = 0 Mf >0 2. Panenský olivový olej £ 2,0 £ 20 £ 250 £ 1,5 £ 0,15 £ 0,2 £ 2,60 £ 0,25 £ 0,01 Md £ 2,5 Mf >0 3. Lampantový olivový olej > 2,0 – £ 300 (3) £ 1,5 £ 0,50 £ 0,3 – – – Md > 2,5 (2) – 4. Rafinovaný olivový olej £ 0,3 £ 5 £ 350 £ 1,8 – £ 0,3 – £ 1,10 £ 0,16 – – 5. Olivový olej obsahující směs rafinovaného olivového oleje a panenského olivového oleje £ 1,0 £ 15 £ 350 £ 1,8 – £ 0,3 – £ 0,90 £ 0,15 – – 6. Surový olivový olej z pokrutin – – > 350 £ 2,2 – £ 0,6 – – – – – 7. Rafinovaný olivový olej z pokrutin £ 0,3 £ 5 350 (4) £ 2,2 – £ 0,5 – £ 2,00 £ 0,20 – – 8. Olivový olej z pokrutin £ 1,0 £ 15 > 350 £ 2,2 – £ 0,5 – £ 1,70 £ 0,18 – – (1) Úhrn izomerů, (ne)separovatelných prostřednictvím kapilární kolony. (2) Nebo pokud je medián závad nejvýše 2,5 a medián pro ovocnosti roven 0. (3) Oleje s obsahem vosku mezi 300 mg/kg a 350 mg/kg se zařazují do kategorie lampantového olivového oleje, pokud je celkový obsah alifatických alkoholů nejvýše 350 mg/kg, nebo pokud je obsah erythrodiolu a uvaolu nejvýše 3,5 %. (4) Oleje s obsahem vosku mezi 300 mg/kg a 350 mg/kg se zařazují do kategorie surového olivového oleje z pokrutin, pokud je celkový obsah alifatických alkoholů vyšší než 350 mg/kg, nebo pokud je obsah erythrodiolu a uvaolu vyšší než 3,5 %.







Kategorie Obsah mastných kyselin (1) Úhrn trans-izomerů kyseliny olejové (%) Úhrn trans-izomerů kyseliny linolové a linolenové (%) Skladba sterolov Steroly celkem (mg/kg) Erythro-diol a uvaol (%) ** Myristová (%) Linolenová (%) Arachová (%) Eiko-sanová (%) Behenová (%) Ligno-cerová (%) Cholesterol (%) Brassika-sterol (%) Kampe-sterol (%) Stigma-sterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7-stigmastenol (%) 1. Extra panenský olivový olej £ 0,05 £ 1,0 £ 0,6 £ 0,4 £ 0,2 £ 0,2 £ 0,05 £ 0,05 £ 0,5 £ 0,1 £ 4,0 < kamp. ³ 93,0 £ 0,5 ³ 1000 £ 4,5 2. Panenský olivový olej £ 0,05 £ 1,0 £ 0,6 £ 0,4 £ 0,2 £ 0,2 £ 0,05 £ 0,05 £ 0,5 £ 0,1 £ 4,0 < kamp. ³ 93,0 £ 0,5 ³ 1000 £ 4,5 3. Lampantový olivový olej £ 0,05 £ 1,0 £ 0,6 £ 0,4 £ 0,2 £ 0,2 £ 0,10 £ 0,10 £ 0,5 £ 0,1 £ 4,0 – ³ 93,0 £ 0,5 ³ 1000 £ 4,5 (3) 4. Rafinovaný olivový olej £ 0,05 £ 1,0 £ 0,6 £ 0,4 £ 0,2 £ 0,2 £ 0,20 £ 0,30 £ 0,5 £ 0,1 £ 4,0 < kamp. ³ 93,0 £ 0,5 ³ 1000 £ 4,5 5. Olivový olej obsahující směs rafinovaného olivového oleje a panenského olivového oleje £ 0,05 £ 1,0 £ 0,6 £ 0,4 £ 0,2 £ 0,2 £ 0,20 £ 0,30 £ 0,5 £ 0,1 £ 4,0 < kamp. ³ 93,0 £ 0,5 ³ 1000 £ 4,5 6. Surový olivový olej z pokrutin £ 0,05 £ 1,0 £ 0,6 £ 0,4 £ 0,3 £ 0,2 £ 0,20 £ 0,10 £ 0,5 £ 0,2 £ 4,0 – ³ 93,0 £ 0,5 ³ 2500 > 4,5 (4) 7. Rafinovaný olivový olej z pokrutin £ 0,05 £ 1,0 £ 0,6 £ 0,4 £ 0,3 £ 0,2 £ 0,40 £ 0,35 £ 0,5 £ 0,2 £ 4,0 < kamp. ³ 93,0 £ 0,5 ³ 1800 > 4,5 8. Olivový olej z pokrutin £ 0,05 £ 1,0 £ 0,6 £ 0,4 £ 0,3 £ 0,2 £,40 £ 0,35 £,5 £,2 £,0 < kamp. ³ 93,0 £ 0,5 ³ 1600 > 4,5 (1) atních mastných kyselin (%): kyselina palmitová 7,5-20; palmitoolejová: 0,3 – 3,5; heptadekanová: £0,3; heptadecenová: £0,3; stearová 0,5-5,0; olejová: 55-83; linolová: 3,5-21,0. (2) Delta-5-23-stigmastadien + chlerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5-24-stigmastadien. (3) Oleje s obsahem vosku mezi 300 mg/kg a 350 mg/kg se zařazují do kategorie lampantového olivového oleje, pokud je celkový obsah alifatických alkoholů nejvýše 350 mg/kg, nebo pokud je obsah erythrodiolu a uvaolu nejvýše 3,5 %. (4) Oleje s obsahem vosku mezi 300 mg/kg a 350 mg/kg se zařazují do kategorie surového olivového oleje z pokrutin, pokud je celkový obsah alifatických alkoholů vyšší než 350 mg/kg, nebo pokud je obsah erythrodiolu a uvaolu vyšší než 3,5 %. Obsah ost Poznámky: a) Výsledky zkoušek se uvádí na stejný počet desetinných míst, jaký je předepsán pro každou charakteristiku. Poslední desetinné místo se přitom zaokrouhlí nahoru, pokud je číslice na dalším desetinném místě vyšší než 4. b) Pokud jakákoli charakteristika neodpovídá předepsaným mezním hodnotám, zařadí se olivový olej do jiné kategorie nebo se označí jako nesplňující požadavky na čistotu pro danou jakostní kategorii. c) Jakostní charakteristiky olejů označené hvězdičkou * znamenají, že: — v případě lampantového olivového oleje nemusí být stanovené mezní hodnoty dodrženy současně, — v případě panenských olivových olejů je nedodržení jedné nebo více mezních hodnot důvodem pro změnu kategorie v rámci skupiny panenského olivového oleje. d) Charakteristiky olejů označené dvěma hvězdičkami ** znamenají, že v případě všech olivových olejů z pokrutin nemusí být stanovené mezní hodnoty dodrženy současně.









PŘÍLOHA I A

ODBĚR VZORKŮ ZE ŠARŽÍ OLIVOVÉHO OLEJE NEBO OLIVOVÉHO OLEJE Z POKRUTIN VE SPOTŘEBITELSKÝCH OBALECH O OBJEMU NEJVÝŠE 100 LITRŮ

Tato metoda odběru vzorků se týká dodávek olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin nepřesahujících 125 000 litrů, stočených do spotřebitelských obalů o objemu nejvýše 100 litrů.

Pokud daná dodávka obsahuje více než 125 000 litrů, rozdělí se na přibližně stejně velké šarže o objemu nejvýše 125 000 litrů. Pokud dodávka obsahuje méně než 125 000 litrů, pak představuje jednu šarži. Metoda se pak použije u každé šarže.

Minimální počet odebraných dílčích vzorků závisí na velikosti šarže podle tabulky uvedené v bodu 1.

Velikost dílčího vzorku se určuje na základě objemu spotřebitelského obalu podle tabulky uvedené v bodu 2.1.

Dodávkou, dílčím vzorkem a laboratorním vzorkem se rozumějí definice uvedené v normě EN ISO 5555.

„Šarže“ se skládá z více prodejních jednotek, které jsou produkovány, vyrobeny a baleny za takových okolností, že olej obsažený v každé prodejní jednotce se považuje za homogenní vzhledem ke všem svým analytickým charakteristikám.

1. POČET DÍLČÍCH VZORKŮ, KTERÉ JE NUTNO ODEBRAT

Minimální počet odebraných dílčích vzorků závisí na velikosti šarže a odpovídá dále uvedené tabulce:







Velikost šarže (v litrech) menší než Minimální počet dílčích vzorků 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Spotřebitelské obaly daného dílčího vzorku musí pocházet s navzájem sousedících míst šarže.

V případě pochybností členské státy zvýší počet odebraných dílčích vzorků.

2. OBSAH DÍLČÍCH VZORKŮ

2.1 Každý dílčí vzorek se skládá:



V případě spotřebitelských obalů o objemu: Dílčí vzorek musí obsahovat olej: a) nejméně 5 litrů a) ze 3 spotřebitelských obalů b) nejméně 3 litrů, ale méně než 5 litrů b) ze 3 spotřebitelských obalů c) nejméně 2 litrů, ale méně než 3 litry c) ze 3 spotřebitelských obalů d) nejméně 1 litru, ale méně než 2 litrů d) z 6 spotřebitelských obalů e) nejméně 0,75 litru, ale méně než 1 litr e) z 6 spotřebitelských obalů f) méně než 0,75 litru f) z trojnásobného množství oleje z minimálního počtu obalů, jejichž celkový objem je větší než 1,5 litru

2.2 Dílčí vzorky musí být uchovány ve spotřebitelských obalech až do doby provedení analýzy. Olej z dílčích vzorků se pak rozdělí do tří laboratorních vzorků pro provedení: a) analýz uvedených v přílohách II, III, IX a X; b) analýz uvedených v příloze XII; c) ostatních analýz.

2.3 Obaly tvořící dílčí vzorek musí být rozděleny v souladu s kontrolními postupy, stanovenými vnitrostátními právními předpisy.

3. ANALÝZY A VÝSLEDKY

a) Každý z dílčích vzorků, uvedených v bodu 1, se dále rozdělí na laboratorní vzorky v souladu s bodem 2.5 normy EN ISO 5555 a podléhá těmto analýzám: — stanovení volných mastných kyselin podle čl. 2 odst. 1 první odrážky, — stanovení peroxidového čísla podle čl. 2 odst. 1 druhé odrážky, — spektrofotometrické analýze podle čl. 2 odst. 1 osmé odrážky, — stanovení složení mastných kyselin podle čl. 2 odst. 1 deváté odrážky.

b) Pokud výsledky analýzy podle písmene a) nevyhovují charakteristikám deklarované kategorie olivového oleje u alespoň jednoho z dílčích vzorků odebraných ze stejné šarže, celá daná šarže se prohlásí za nevyhovující. Pokud nejsou všechny výsledky analýzy podle písmene a) u každého z dílčích vzorků odebraných ze stejné šarže homogenní za předpokladu opakovatelnosti charakteristik daných metod, celá daná šarže se prohlásí za nehomogenní a každý dílčí vzorek musí být podroben ostatním předepsaným analýzám. V opačném případě se další předepsané analýze podrobí pouze jeden z dílčích vzorků z dané šarže.

c) Pokud jeden z výsledků analýzy podle písm. b) druhého odstavce nevyhovuje charakteristikám deklarované kategorie olivového oleje, celá daná šarže se prohlásí za nevyhovující. Pokud všechny výsledky analýzy podle písm. b) druhého odstavce vyhovují charakteristikám deklarované kategorie olivového oleje, celá šarže se prohlásí za vyhovující.

▼M20









PŘÍLOHA I B

ROZHODOVACÍ SCHÉMA PRO OVĚŘENÍ SOULADU VZORKU OLIVOVÉHO OLEJE S DEKLAROVANOU KATEGORIÍ

Soulad olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin je možné přezkoušet takto:

a) ověření splnění charakteristik uvedených v příloze I provedením analýz za tímto účelem stanovených v libovolném pořadí, nebo

b) provedením analýz uvedených v rozhodovacím schématu v něm stanoveném pořadí, dokud se nedospěje k jednomu ze stanovených rozhodnutí.

Nezávisle na tom se provádějí analýzy nutné pro ověření souladu s normami Společenství, pokud jde o případné kontaminující látky.

Rozhodovací schéma platí pro všechny kategorie olivového oleje a olivového oleje z pokrutin. Skládá se z tabulek, očíslovaných 1 až 11, které se použijí na základě deklarované kategorie daného oleje v pořadí, stanoveném ve všeobecné tabulce.

Klíč k všeobecné tabulce a k tabulkám 1 až 11:

— dvojitá čára (=) odkazuje na další krok, který je nutno provést, pokud jsou splněny podmínky předcházejícího ho pole. Tečkovaná čára (…) odkazuje na další krok, který nutno provést při negativním rozhodnutí,

— nadpisy v polích tabulek 1 až 11 odkazují na analýzy tohoto nařízení na základě srovnávací tabulky uvedené v dodatku 1 této přílohy,

— písmena v závorkách, nacházející se v kruzích a elipsách (negativní rozhodnutí) v tabulkách 1 až 11, odkazují na poznámky uvedené v dodatku 2 této přílohy. Písmena neznamenají automaticky, že je nutno provést další analýzy, ani nenaznačují pravdivost uvedených předpokladů.









DODATEK 1

Srovnávací tabulka mezi prílohami tohoto narízení a analýzami uvedenými v rozhodovacím schématu







– Kyselost příloha II Stanovení volných mastných kyselin – Peroxidové číslo příloha III Stanovení peroxidového čísla – UF spektrometrie příloha IX Spektrofotometrická analýza – Organoleptické hodnocení příloha XII Organoleptické hodnocení panenského olivového oleje – 3,5–stigmastadieny příloha XVII Metoda pro stanovení stigmastadienů v rostlinných olejích – Transizomery mastných kyselin příloha Xa a Analýza methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií příloha Xb Příprava methylesterů mastných kyselin – Obsah mastných kyselin příloha Xa i Analýza methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií příloha Xb Příprava methylesterů mastných kyselin – ΔECN42 příloha XVIII Metoda pro stanovení obsahu triglyceridů s ECN42 (rozdíl mezi hodnotou zjištěnou z HLPC a teoretickým výpočtem) – Složení a obsah sterolů příloha V Stanovení obsahu a složení sterolů pomocí kapilární plynové chromatografie – Erythrodiol a uvaol příloha VI Stanovení erythrodiolu a uvaolu – Vosky příloha IV Stanovení obsahu vosku pomocí kapilární plynové chromatografie – Alifatické alkoholy příloha XIX Stanovení obsahu a složení alifatických alkoholů pomocí kapilární plynové chromatografie – Nasycené mastné kyseliny v poloze 2 příloha VII Stanovení nasycených mastných kyselin v triglyceridech vázaných v poloze 2









DODATEK 2

Tabulka 1

a) Viz panenský nebo lampantový olivový olej (kritéria jakosti tabulka 2 nebo kritéria jakosti a čistoty tabulka 4).

b) Viz lampantový olivový olej (kritéria jakosti a čistoty tabulka 4).

Tabulka 2

a) Viz lampantový olivový olej (kritéria jakosti a čistoty tabulka 4).

b) Viz panenský olivový olej (kritéria jakosti tabulka 1).

Tabulka 3

a) Přítomnost rafinovaného oleje (olivového nebo jiného).

b) Přítomnost olivového oleje z pokrutin.

Tabulka 4

a) Viz panenský olivový olej extra a panenský olivový olej (kritéria jakosti tabulka 1 a tabulka 2).

b) Přítomnost rafinovaného oleje (olivového nebo jiného).

c) Přítomnost olivového oleje z pokrutin.

d) Přítomnost esterifikovaných olejů.

Tabulka 7

a) Přítomnost olivového oleje z pokrutin.

b) Přítomnost esterifikovaných olejů.

Tabulka 8

a) Přítomnost rafinovaného oleje (olivového nebo jiného).

b) Viz lampantový olivový olej (kritéria jakosti a čistoty tabulka 4).

c) Přítomnost esterifikovaných olejů.

Tabulka 11

a) Přítomnost esterifkovaných ojejů“

▼B









PŘÍLOHA II

STANOVENÍ VOLNÝCH MASTNÝCH KYSELIN

1. STANOVENÍ KYSELOSTI

Stanovení volných mastných kyselin v olivových olejích. Obsah volných mastných kyselin je vyjádřen jako kyselost vypočtená obvyklým způsobem.

1.1. Podstata metody

Vzorek se rozpustí ve směsi rozpouštědel. Přítomné volné mastné kyseliny se potom titrují ethanolickým roztokem hydroxidu draselného.

1.2. Chemikálie

Všechna činidla musí mít čistotu p. a., voda destilovaná nebo odpovídající čistoty.

1.2.1 Směs diethyletheru a 95 % ethanolu 1:1 (V/V). Poznámka: diethylether je vysoce hořlavý a může vytvářet výbušné peroxidy. Při jeho používání je třeba dbát zvýšené opatrnosti. Neutralizuje se těsně před použitím pomocí roztoku hydroxidu draselného (1.2.2) a přidá se 0,3 ml fenolftaleinového roztoku (1.2.3) na 100 ml směsi. Poznámka: není-li možné použít diethylether, může se použít směsné rozpouštědlo obsahující ethanol a toluen. V případě potřeby může být ethanol nahrazen 2-propanolem.

1.2.2 Hydroxid draselný, titrační ethanolický roztok o koncentraci c(KOH) přibližně 0,1 mol/l, nebo v případě potřeby přibližně 0,5 mol/l. Přesná koncentrace ethanolického roztoku hydroxidu draselného musí být známa a zkontrolována těsně před použitím. Použije se roztok připravený nejméně pět dnů před použitím a dekantovaný v láhvi z hnědého skla s gumovou zátkou. Roztok musí být bezbarvý nebo pouze slabě zbarvený. Poznámka: stabilní bezbarvý roztok hydroxidu draselného je možné připravit takto: do varu se uvede 1 000 ml ethanolu s 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkových hoblin a nechá se jednu hodinu vařit pod zpětným chladičem. Okamžitě se destiluje. V destilátu se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného. Několik dnů se nechá stát a oddělí se čistá kapalina od usazeniny uhličitanu draselného. Tento roztok je též možné připravit bez destilace takto: do 1 000 ml ethanolu se přidá 4 ml aluminium-butylátu a směs se nechá několik dní stát. Odsazená kapalina se slije a v ní se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného. Roztok je připraven k použití.

1.2.3 Fenolftalein, roztok o koncentraci 10 g/l, v 95 % - 96 % ethanolu (V/V), nebo alkalická modř (v případě silně zbarvených tuků), roztok o koncentraci 20 g/l, v 95 % - 96 % ethanolu (V/V).

1.3 Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní přístroje a pomůcky, mj.:

1.3.1 analytické váhy,

1.3.2 Erlenmeyerova baňka na 250 ml,

1.3.3 byreta na 10 ml s hodnotou dílku 0,05 ml.

1.4 Postup

1.4.1 Příprava vzorku na testování (Testování se provádí s filtrovaným vzorkem. Pokud celkový obsah vody a nečistot činí méně než 1 %, provede se testování s nefiltrovaným vzorkem.)

1.4.2 Odběr vzorku Hmotnost vzorku se řídí podle očekávaného obsahu volných mastných kyselin (podle údajů v dále uvedené tabulce).



Očekávaný obsah volných mastných kyselin Hmotnost vzorku (g) Přesnost vážení na (g) < 1 20 0,05 1 až 4 10 0,02 4 až 15 2,5 0,01 15 až 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Vzorek se naváží v Erlenmeyerově baňce (1.3.2).

1.4.3 Stanovení Vzorek (1.4.2) se rozpustí v 50 až 150 ml předem neutralizované směsi diethyletheru a ethanolu (1.2.1). Titruje se za současného míchání roztokem hydroxidu draselného o koncentraci přibližně 0,1 mol/l (1.2.2) (viz poznámka 2), dokud nedojde k barevné změně indikátoru (růžová zbarvení fenolftaleinu musí trvat nejméně 10 sekund). Poznámky: 1. Pokud přidané množství vody nevyvolá rozložení fází, lze titrační ethanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) nahradit vodným roztokem hydroxidu draselného nebo sodného. Poznámky: 2. Pokud je k titraci potřeba více než 10 ml roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,1 mol/l, je nutno použít roztok o koncentraci 0,5 mol/l. Poznámky: 3. Pokud se během titrace roztok zakalí, je nutno přidat dostačující množství rozpouštědel (1.2.1), aby roztok byl opět čirý.

1.5 Výpočet obsahu volných mastných kyselin vyjádřených jako procento kyseliny olejové

Obsah volných mastných kyselin v % hmotnostních se vypočítá podle vzorce:

kde

V = spotřeba titračního roztoku hydroxidu draselného v ml;

c = přesná koncentrace roztoku hydroxidu draselného v mol/l;

M = molární hmotnost v g na mol kyseliny použité pro výpočet (= 282);

m = hmotnost vzorku v g.

Za výsledek se považuje aritmetický průměr ►M6 ze dvou stanovení ◄ .









PŘÍLOHA III

STANOVENÍ PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1. PŘEDMĚT

tato metoda popisuje postup stanovení peroxidového čísla v olejích a tucích.

2. OBLAST POUŽITÍ

tato metoda platí pro živočišné a rostlinné oleje a tuky.

3. DEFINICE

Peroxidové číslo je množství těchto látek ve vzorku, vyjádřené v milimolech aktivního kyslíku na kg, které oxidují jodid draselný za popsaných pracovních podmínek.

4. PODSTATA

Reakce vzorku s jodidem draselným v roztoku kyseliny octové a chloroformu. Titrace uvolněného jodu standardizovaným roztokem thiosíranu sodného.

5. PŘÍSTROJE

Všechna zařízení musí být zbavena redukčních a oxidačních látek.

Poznámka:zábrusy nesmí být mazány tukem.

5.1 Skleněná váženka na 3 ml.

5.2 Baňky na 250 ml se zábrusy, předem vysušené a naplněné čistým, suchým inertním plynem (dusík, nebo lépe oxid uhličitý).

5.3 Byreta na 25 nebo 50 ml, s hodnotou dílku 0,1 ml.

6. CHEMIKÁLIE

6.1 Chloroform čistoty p. a., zbavený kyslíku probubláváním proudem suchého inertního plynu.

6.2 Ledová kyselina octová čistoty p. a., zbavená kyslíku probubláváním proudem suchého inertního plynu.

6.3 Jodid draselný, nasycený vodný roztok, čerstvě připravený, zbavený jodu a jodičnanů.

6.4 Thiosíran sodný, vodný roztok o koncentraci přesně 0,01 nebo 0,002 mol/l, připravený těsně před použitím.

6.5 Škrobový roztok, vodní disperze 10 g/l, čerstvě připravený z přírodního rozpustného škrobu.

7. VZOREK

Vzorek je nutno odebrat a skladovat v temnu a chladu ve zcela naplněném skleněném obalu, hermeticky uzavřeném zabroušenou skleněnou, nebo korkovou zátkou.

8. POSTUP

Stanovení musí být prováděno v rozptýleném denním světle, nebo při umělém osvětlení. Vzorek se naváží ve skleněné vážence (5.1) nebo v baňce (5.2) s přesností na 0,001 g s ohledem na očekávaná peroxidové čísla podle dále uvedené tabulky:







Očekávané peroxidové číslo (meq O2/kg) Hmotnost zkušebního vzorku (g) 0 až 12 5,0 až 2,0 12 až 20 2,0 až 1,2 20 až 30 1,2 až 0,8 30 až 50 0,8 až 0,5 50 až 90 0,5 až 0,3

Z baňky (5.2) se vyjme zátka a vloží se do ní váženka obsahující vzorek. Přidá se 10 ml chloroformu (6.1). Vzorek se rychle rozpustí zamícháním. Přidá se 15 ml kyseliny octové (6.2) a potom 1 ml roztoku jodidu draselného (6.3). Baňka se ihned uzavře, 1 minutu protřepává a nechá se stát přesně 5 minut v temnu při teplotě 15 °C a 25 °C.

Přidá se přibližně 75 ml destilované vody. Uvolněný jod se po přídavku škrobového roztoku (6.5) jako indikátoru za silného protřepávání titruje roztokem thiosíranu sodného (6.4) při použití koncentrace 0,002 mol/l roztoku pro předpokládané peroxidové číslo do 12, nebo roztokem o koncentraci 0,01 mol/l pro předpokládané peroxidové číslo větší než 12.

Z jednoho analytického vzorku se provedou dvě stanovení.

Spolu s vlastním stanovením se provádí slepý pokus. Jestliže výsledky slepého pokusu přesáhnou 0,05 ml roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,01 mol/l (6.4), je nutno vyměnit znečištěná činidla.

9. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Peroxidové číslo (PV) vyjádřené v miliekvivalentech aktivního kyslíku na kg se vypočítá podle vzorce:

V = objem roztoku thiosíranu sodného (6.4), použitého pro stanovení, korigovaný s ohledem na slepý pokus;

T = přesná molarita použitého roztoku thiosíranu sodného (6.4);

m = hmotnost zkušebního vzorku v g.

Za výsledek se považuje aritmetický průměr dvou stanovení.

▼M6









PŘÍLOHA IV

STANOVENÍ OBSAHU VOSKU KAPILÁRNÍ PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu a složení vosku v různých olejích a tucích při testovacích podmínkách.

Tento postup lze použít zejména k rozlišení mezi olivovým olejem získaným lisováním a extrakcí (olivový olej z pokrutin).

2. PODSTATA METODY

K tuku nebo oleji se přimísí vhodný vnitřní standard a poté se provádí chromatografická frakční destilace na hydratované silikagelové koloně. Získaná frakce eluovaná nejprve při testovacích podmínkách (jejíž polarita je menší než polarita triglyceridů) se přímo analyzuje pomocí kapilární plynové chromatografie.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1. Kónická 25ml baňka.

3.2. Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 15 mm a délce 30 až 40 cm.

3.3. Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a vybavený přímým vstřikováním, obsahující následující části: 3.3.1 Termostaticky ovládatelná kolonová komora, nastavitelná na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C. 3.3.2. Studené nástřikové zařízení pro přímé zavádění do kolony. 3.3.3. Plameno-ionizační detektor a konverzní zesilovač. 3.3.4. Integrátor se zapisovačem, vhodný pro provoz s konverzním zesilovačem (3.3.3.), s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru. 3.3.5. Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 10 až 15 mm s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi SE-52 nebo SE-54 nebo ekvivalentní, o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm.

3.4. Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou.

4. CHEMIKÁLIE

4.1. Silikagel, 70/230 mesh, článek 7754 Merck. Silikagel se umístí na čtyři hodiny do pouzdrové (muflové) pece o teplotě 500 °C, nechá se ochladit a přidají se 2 % vody. Řádným protřepáním se směs homogenizuje. Před použitím se ponechá nejméně 12 hodin v temnotě.

4.2. n-hexan pro chromatografii.

4.3. Diethylether pro chromatografii.

4.4. n-heptan pro chromatografii.

4.5. Standardní roztok 0,1 % (m/V) laurylarachidátu v hexanu (vnitřní standard).

4.6. Nosný plyn: vodík, čistý pro plynovou chromatografii.

4.7. Pomocné plyny: — vodík, čistý pro plynovou chromatografii, — vzduch, čistý pro plynovou chromatografii.

5. POSTUP

5.1. Oddělení voskové frakce.

5.1.1 Příprava chromatografické kolony. 15 g silikagelu se doplní 2 % vody, suspenduje v bezvodém n-hexanu a zavede do kolony. Po spontánní sedimentaci se tato dokončí pomocí elektrického vibrátoru, aby byla chromatografická vrstva co nejhomogennější, a provede se perkolace 30 ml n-hexanu za účelem odstranění případných nečistot.

5.1.2. Kolonová chromatografie Do 25ml baňky se naváží přesně 500 mg vzorku a přidá se vhodné množství vnitřního standardu v závislosti na předpokládaném obsahu vosku, např. 0,1 mg laurylu arachidátu v případě olivového oleje a 0,25 až 0,5 mg v případě olivového oleje z pokrutin. Získaný vzorek se za pomoci dvou dávek 2 ml n-hexanu převede do chromatografické kolony připravené podle 5.1.1. Umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 mm nad horní úrovní absorbentu. Poté se zahájí chromatografické eluování; odejme se 140 ml směsi n-hexanu/éteru (99: 1) při průtoku přibližně 15 kapek za 10 sekund (2,1 ml/min). Získaná frakce se usuší v rotačním odpařovači, až je téměř všechno rozpouštědlo odstraněno. Poslední 2 nebo 3 ml rozpouštědla se odstraní za pomoci slabého proudu dusíku, poté se přidá 10 ml n-heptanu.

5.2. Plynová chromatografická analýza

5.2.1. Přípravné práce, kondicionace kolony. 5.2.1.1. Kolona se spojí s plynovým chromatografem, vstupní port se připojí ke kolonovému systému (on-column system) a výstupní port k detektoru. Poté se plynový chromatograf překontroluje (těsnost plynových vedení, funkce detektoru a záznamníku atd.). 5.2.1.2. Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20°C vyšší, než je provozní teplota (viz poznámka). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do předepsaných podmínek (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače, nastavení teploty kolonové komory, detektoru, injektoru atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony. Poznámka: Teplota kondicionace musí být nejméně o 20°C nižší než maximální teplota specifikovaná pro použité eluční činidlo.

5.2.2. Výběr pracovních podmínek. 5.2.2.1. Všeobecné pracovní podmínky jsou tyto: — teplota kolony: počáteční teplota 80 °C, nárůst po 30 °C/min do teploty 120 °C a pak se naprogramuje růst o 5 °C/min do teploty 340 °C, — teplota detektoru: 350 °C, — lineární rychlost nosného plynu: vodík, 20 až 35 cm/s, — citlivost přístroje: 4 až 16násobek minimálního útlumu, — citlivost detektoru: 1 až 2 mV z plného rozsahu, — rychlost posunu papíru: 30 cm/hod, — množství nastříknuté látky: 0,5 až 1 μl roztoku. Výše uvedené podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto podmínky: retenční čas vnitřního standardu C32 musí být 25 ± 2 minuty a nejreprezentativnější pík vosku musí dosáhnout 60 až 100 % z plného rozsahu. 5.2.2.2. Parametry pro integraci píků se nastaví tak, aby došlo ke správnému vyhodnocení ploch uvažovaných píků.

5.2.3. Provedení analýzy 5.2.3.1. Do 10μl mikrostříkačky se natáhne 1 μl roztoku; píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. 5.2.3.2. Zaznamenávání je prováděno, dokud vosky nejsou zcela eluovány. Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům odstavce (5.2.1.2).

5.2.4. Identifikace píků Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsmi vosků, jejichž retenční časy jsou známé a které byly analyzované za stejných podmínek. Chromatogram vosků panenského olivového oleje je znázorněn na obrázku 1.

5.2.5. Kvantitativní vyhodnocení 5.2.5.1. Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu a alifatickým esterům C40 až C46. 5.2.5.2. Obsah vosku jednotlivých esterů vyjádřený v mg/kg tukové látky se vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku příslušného esteru, As = plocha píku laurylu arachidátu, ms = hmotnost přidaného laurylu arachidátu v mg, m = hmotnost vzorku použitého pro stanovení v g.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Uvádí se obsahy jednotlivých vosků a souhrn těchto obsahů v mg/kg tukové látky.









DODATEK

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se nastříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu a pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku vzniku píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas v sekundách, změřený stopkami.

▼B









PŘÍLOHA V

STANOVENÍ SLOŽENÍ A OBSAHU STEROLŮ POMOCÍ KAPILÁRNÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE

1. PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu a složení sterolů v tukové látce.

2. PODSTATA METODY

Zmýdelnění tukové látky, k níž je přidán β-cholestanol jako vnitřní standard, pomocí ethanolického roztoku hydroxidu draselného a extrakce nezmýdelnitelných látek pomocí diethyletheru.

Pomocí chromatografie na bazické silikagelové desce se z nezmýdelnitelného extraktu oddělí sterolová frakce. Steroly oddělené ze silikagelu se převedou na trimethylsilylether a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1 Baňka na 250 ml vybavená zpětným chladičem se zábrusem.

3.2 Dělicí nálevky na 500 ml.

3.3 Baňky na 250 ml.

3.4 Kompletní zařízení pro tenkovrstvou chromatografii se skleněnými deskami o rozměrech 20 × 20 cm.

3.5 Ultrafialová lampa s vlnovou délkou 366 nebo 254 nm.

3.6 Mikrostříkačky na 100 μl a 500 μl.

3.7 Filtrační nálevka ze sintrovaného skla pórovitou fritou G3 (pórovitost 15 až 40 μm) o průměru přibližně 2 cm a výšce přibližně 5 cm, vybavená uzávěrem pro vakuovou filtraci a s vnějším zábrusem 12/21.

3.8 Odsávací baňka na 50 ml s vnitřním zábrusem 12/21 pro použití s filtrační nálevkou (3.7).

3.9 Zkumavka na 10 ml s kónickým dnem a zátkou.

3.10 Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a opatřený dělicím systémem složeným: 3.10.1 z termostatické kolonové komory, nastavitelné na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C; 3.10.2 z odpařovací jednotky s termostatem (vstřikové komory) s povlakem ze silanizovaného skla, 3.10.3 z plameno-ionizačního detektoru se zesilovačem, 3.10.4 z integrátoru se zapisovačem vhodného pro provoz se zesilovačem (3.10.3), s dobou odezvy nejvýše jednu sekundu a s proměnnou rychlostí papíru.

3.11 Kapilární kolona ze skla nebo taveného křemene dlouhá 20 až 30 m, s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi SE-52 nebo SE-54 nebo ekvivalentní, o tloušťce filmu 0,10 až 0,30 μm.

3.12 Mikrostříkačka pro plynovou chromatografii na 10 μl s tvrzenou jehlou.

4. CHEMIKÁLIE

4.1 Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci přibližně 2 mol/l: 130 g přibližně 85 % hydroxidu draselného se za současného chlazení rozpustí ve 200 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem. Tento roztok je nutno uchovávat v dobře uzavřené skleněné láhvi z tmavého skla.

4.2 Diethylether čistoty p. a.

4.3 Bezvodý síran sodný čistoty p. a.

4.4 Silikagelem potažené skleněné desky bez fluorescenčního indikátoru o tloušťce 0,25 mm (obchodně dostupné).

4.5 Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci 0,2 mol/l: 13 g hydroxidu draselného se rozpustí ve 20 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem.

4.6 Benzen pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.7 Aceton pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.8 Hexan pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.9 Diethylether pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.10 Chloroform čistoty p. a.

4.11 Referenční roztok pro tenkovrstvou chromatografii: ►M6 2 % ◄ roztok cholesterolu nebo fytosterolu v chloroformu.

4.12 0,2 % ethanolický roztok 2,7-dichlor-fluoresceinu, mírně zásaditý přidáním několika kapek alkoholového roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l.

4.13 Bezvodý pyridin pro chromatografii.

4.14 Hexamethyl-disilazan.

4.15 Trimethyl-chlorsilan.

4.16 Referenční roztoky sterol(trimethylsilyl)etherů. Připraví se z čistých sterolů nebo ze směsí sterolů získaných z olejů, které je obsahují, těsně před použitím.

4.17 0,2 % roztok α-cholestanolu v chloroformu (m/V) (vnitřní standard).

4.18 Nosné plyny: vodík nebo helium, čisté pro plynovou chromatografii.

4.19 Pomocné plyny: vodík a vzduch, čisté pro plynovou chromatografii.

5. POSTUP

5.1 Příprava nezmýdelnitelných látek 5.1.1 Pomocí mikrostříkačky na 500 μl se do baňky na 250 ml dá pro účely analýzy 0,2 % roztok α-cholestanolu v chloroformu (4.17), obsahující množství cholestanolu rovnající se přibližně 10 % obsahu sterolu v části vzorku, která má být odebrána za účelem analýzy. Například při analýze oleje se na 5 g vzorku přidá 500 μl 0,2 % roztoku α-cholestanolu, a 1 500 μl při analýze ►M6 ————— ◄ olivového oleje z pokrutin. V dusíku se vzorek odpaří do sucha a do stejné baňky se naváží přesně 5 g vysušeného přefiltrovaného vzorku. ►M6 Oleje ◄ obsahující větší množství cholesterolu mohou vykazovat pík s retenčním časem shodným s cholestanolem. Pokud k tomu dojde, musí být sterolová frakce analyzována jednou s vnitřním standardem, a jednou bez něj. ►M6 Namísto cholestanolu je možné použít také betulinol. ◄ 5.1.2 Přidá se 50 ml ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l, připojí se zpětný chladič a zahřeje se do mírného varu na parní lázni za nepřetržitého míchání během zahřívání, dokud nedojde ke zmýdelnění (roztok se vyčeří). V zahřívání se pokračuje dalších 20 minut a poté se přes chladič přidá 50 ml destilované vody. Chladič se pak odpojí a baňka se vychladí na teplotu přibližně 30 °C. 5.1.3 Obsah baňky se kvantitativně převede do dělicí nálevky na 500ml a propláchne 2 x 25 ml destilované vody. Přidá se přibližně 80 ml diethyletheru, vše se protřepe po dobu 30 sekund a nechá se odstát (poznámka 1). Spodní vodná fáze se převede do druhé nálevky. Stejným způsobem se provedou další dvě extrakce vodné fáze vždy s použitím 60 až 70 ml diethyletheru. Poznámka 1 Emulze je možné odstranit přidáním malých množství ethanolu nebo methanolu formou postřiku. 5.1.4 Diethyletherové extrakty se smíchají v dělicí nálevce a promyjí destilovanou vodou (50 ml v jedné dávce), dokud promývací voda nevykáže neutrální reakci. Odstraní se vodná fáze, etherová fáze se vysuší bezvodým síranem sodným a přefiltruje se do předem zvážené baňky na 250 ml, přičemž nálevka a filtr se promyjí malými množstvími diethyletheru, které se přidá k celkovému množství. 5.1.5 Ether se pozvolným zahříváním odpařuje, až jej zbude jen několik ml, a zbytek se vysuší v mírném vakuu nebo pod proudem dusíku. Vysušení se dokončí v sušárně při teplotě 100 °C po dobu přibližně 15 minut a zbytek po se zváží po vychlazení v exsikátoru.

5.2 Separace sterolové frakce 5.2.1 Příprava bazických desek. Silikagelové desky (4.4) se na 10 sekund zcela ponoří do ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l (4.5), poté se nechají dvě hodiny sušit v digestoři a nakonec na jednu hodinu umístí do sušárny vyhřáté na 100 °C. Desky se vyjmou ze sušárny a až do okamžiku použití uloží do exsikátoru s chloridem vápenatým. Takto upravené desky musí být použity během 15 dnů. Poznámka 2 Jsou-li pro separaci alkoholové frakce použity bazické silikagelové desky, není nutné upravovat nezmýdelnitelné látky pomocí AlO (oxidu hlinitého). Dojde tak k zadržení všech kyselých sloučenin (mastných kyselin apod.) na počátku, a tím se zřetelně oddělí pásmo sterolů od pásma alifatických a triterpenických alkoholů. 5.2.2 Vyvíjecí komora se naplní roztokem benzenu a acetonu v poměru 95: 5 (V/V) do výšky přibližně 1 cm. Jinak je možné použít směs hexanu a diethyletheru 65:35 (V/V). Vyvíjecí komora se uzavře a nejméně půl hodiny ponechá v klidu, aby se mohla vytvořit rovnováha mezi parami a kapalinou. Na vnitřní povrch vyvíjecí komory je možné připojit proužky filtračního papíru namočené v eluční směsi za účelem zkrácení doby vyvolávání přibližně o jednu třetinu a dosílení stejnoměrnější, pravidelní eluce složek. Poznámka 3 Vyvíjecí roztok musí být pro každou analýzu vyměněn, aby bylo dosaženo reprodukovatelných podmínek vyvíjení. 5.2.3 Připraví se 5 % roztok nezmýdelnitelných látek (5.1.5) v chloroformu a 300 μl tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 100 μl nastříkne jako co nejrovnoměrnější a co nejtenčí pruh na tenkovrstvou desku přibližně 2 cm od dolního okraje desky. Ve stejné úrovni se nanese 2 až 3 μl referenčního roztoku sterolů (4.11) za účelem stanovení sterolového pásma po dokončení vyvíjení. 5.2.4 Deska se umístí do vyvíjecí komory uvedené v odstavci 5.2.2. Teplota se udržuje mezi 15 a 20 °C. Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu nebo se deska na chvíli nechá v digestoři. 5.2.5 Deska se lehce a rovnoměrně postříká roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu a pozoruje se pod ultrafialovým zářením. Sterolové pásmo se stanoví porovnáním skvrn vytvořených referenčním roztokem. Obrysy pásma podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem. 5.2.6 Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové špachtle. Odebraná hmota se rozmělní na malé části a převede do filtrační nálevky (3.7). Přidá se 10 ml horkého chloroformu. Obsah se důkladně promíchá kovovou stěrkou a vakuově přefiltruje. Filtrát se shromáždí v baňce, připojené na filtrační nálevku. Zbytek v nálevce se propláchne 3 × 10 ml diethyletheru. Filtrát se přitom sbírá do stejné baňky připojené k nálevce. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do předem zvážené zkumavky na 10 ml (3.9). Zkumavka se vysuší lampou pod mírným proudem dusíku. Zbytek se znovu rozpustí několika kapkami acetonu, opět vysuší a na deset minut vloží do sušárny vyhřáté na 105 °C, vyjme, vychladí v exsikátoru a zváží. Zbytek ve zkumavce je tvořen sterolovou frakcí.

5.3 Příprava trimethylsilyletherů 5.3.1 Do zkumavky obsahující sterolovou frakci se přidá činidlo pro silylaci tvořené směsí pyridinu, hexamethyl-disilazanu a trimethyl-chlorsilanu v poměru 9:3:1 (V/V/V) (poznámka 4) v množství 50 μl na každý mg sterolů. Přitom je nutné zabránit jakékoli absorpci vlhkosti (poznámka 5). Poznámka 4 Roztoky připravené k použití jsou obchodně dostupné: silanizační činidla, jako například N, O-bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethyl-chlor-silan pro smíchání se stejným objemem bezvodého pyridinu. 5.3.2 Zkumavka se uzavře a pečlivě protřepe bez převracení, dokud se steroly nerozpustí. Poté se nechá v klidu nejméně 15 minut při laboratorní teplotě a potom několik minut odstřeďuje. Čirý roztok je připraven pro plynovou chromatografickou analýzu. Poznámka 5 Vznik slabé opalescence je normální a není nijak rušivý. Tvorba bílých vloček nebo existence růžového zabarvení jsou známkami přítomné vlhkosti nebo degradace činidla. V tomto případě je třeba zkoušku opakovat.

5.4 Analýza plynovou chromatografií 5.4.1 Přípravné operace a kondicionace kapilární kolony 5.4.1.1 Kapilární kolona se připojí k plynovému chromatografu tak, že začátek kolony se připojí k odpařovací jednotce, která je spojena s oddělovacím systémem. Konec kolony se připojí k detektoru. Provede se kompletní kontrola plynového chromatografu (těsnost plynových spojovacích prvků, účinnost detektoru, účinnost oddělovacího a zapisovacího systému atd.). 5.4.1.2 Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20 °C vyšší, než je laboratorní teplota (viz poznámka 6). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do pracovních podmínek (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače, nastavení teploty kolonové komory, detektoru, injektoru atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony. Poznámka 6 Teplota kondicionace musí být nejméně o 20 °C nižší než maximální teplota použitelná pro uvažovanou stacionární fázi. 5.4.2 Výběr pracovních podmínek 5.4.2.1 Všeobecné pracovní podmínky jsou tyto: — teplota kolony: 260 ± 5 °C, — teplota odpařovací jednotky: 280 °C, — teplota detektoru: 290 °C, — lineární rychlost nosného plynu: helium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — oddělovací poměr: 1:50 až 1:100, — citlivost přístroje: 4 až 16násobek minimálního útlumu, — citlivost záznamu: 1 až 2 mV f.s., — rychlost posunu papíru, nastavitelná na hodnoty mezi 30 až 60 cm/hod, — množství nastříknuté látky: 0,5 až 1 μl trimethylsilyletherového roztoku. Výše uvedené podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto podmínky: — retenční čas betasitosterolu musí být 20 ± 5 minut, — pík kampesterolu musí být u olivového oleje (střední obsah 3 %) 0 ± 20 % plného rozsahu a u sojového oleje (střední obsah 20 %) 40 ± 20 % plného rozsahu; — všechny přítomné steroly musí být odděleny. Kromě separace musí být píky též zcela rozlišeny, tj. dráha záznamu píku se musí vrátit na základní linii dříve, než se zvedne do dalšího píku. Neúplné rozlišení je však tolerováno za předpokladu, že pík s relativním retenčním časem 1,02 je možné kvantifikovat pomocí kolmé úsečky. 5.4.3 Provedení analýzy 5.4.3.1 Do mikrostříkačky na 10 μl se natáhne 1 μl hexanu, poté 0,5 μl vzduchu a nakonec 0,5 až 1 μl zkušebního roztoku. Píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle vstříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. 5.4.3.2 Zaznamenávání je prováděno, dokud přítomná trimethylsilyletherová směs sterolů není zcela eluována. Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům odstavce 5.4.1.2. 5.4.4 Identifikace píků Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se standardní směsí trimethylsilyletherů analyzovanou za stejných podmínek. Steroly jsou eluovány v tomto pořadí: cholesterol, brassikasterol, 24-methyl-en-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, delta-7-kampesterol, delta-5, 23-stigmastadienol, chlerosterol, betasitosterol, sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5, 24-stigmastadienol, delta-7-stigmastenol a delta-7-avenasterol. Retenční časy sitosterolu v případě kolon SE-52 a SE-54 jsou uvedeny v tabulce 1. Chromatogram typický pro některé oleje je vidět na obrázku 1 a 2. 5.4.5 Kvantitativní vyhodnocení 5.4.5.1 Pomocí integrátoru se vypočítá plocha píků α-cholestanolu a sterolů. Píky jakýchkoli sloučenin, které nejsou mezi sloučeninami uvedenými v tabulce 1. Koeficient odezvy β-cholestanolu musí být roven 1. 5.4.5.2 Obsah jednotlivých sterolů vyjádřený v mg/100 g tuku se vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku sterolu x ►M6 ————— ◄ , As = plocha β-cholestanolu ►M6 ————— ◄ , ms = množství přidaného β-cholestanolu v mg,, m = množství vzorku použitého pro stanovení v g.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1 Uvádí se obsah jednotlivých sterolů v mg/100 g tuku a souhrn „obsah sterolů celkem“.

6.2 Procentní podíl jednotlivých sterolů z poměru plochy příslušného píku k celkové ploše píků sterolůse vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku sterolu x, ΣA = celková plocha píků sterolů.









DODATEK

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se vstříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu a pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku eluce píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas v sekundách, změřený stopkami.







Tabulka 1 Relativní retenční časy sterolů Pík Identifikace Relativní retenční čas kolona SE 54 kolona SE 52 1 cholesterol Δ-5-cholesten-3β-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α-cholestan-3β-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]- 24-methyl-Δ-5,22-cholestadien-3β-ol 0,73 0,71 4 24-methyl-en-cholesterol 24-methyl-en-Δ-5,24-cholesten-3β-ol 0,82 0,80 5 kampesterol [24R]- 24-methyl-Δ-5-cholesten-3β-ol 0,83 0,81 6 kampestanol [24R]- 24-methyl-cholestan-3β-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol [24R]- 24-methyl-Δ-5,22-cholestadien-3β-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol [24R]- 24-methyl-Δ-7-cholesten-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R, S]- 24-ethyl-Δ-5,23-cholestadien-3β-ol 0,95 0,95 10 chlerosterol [24S]- 24-ethyl-Δ-5,25-cholestadien-3β-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]- 24-ethyl-Δ-5-cholestan-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-ethylcholestan-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]- 24-ethyliden-Δ-5-cholesten-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R,S]- 24-ethyl-Δ-5,24-cholestadien-3β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R, S]- 24-ethyl-Δ-7,24-cholestadien-3β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol [24Z]- 24-ethyliden-Δ-7-cholesten-3β-ol 1,16 1,16

Obrázek 1

Plynový chromatogram sterolové frakce surového olivového oleje

Obrázek 2

Plynový chromatogram sterolové frakce rafinovaného olivového oleje









PŘÍLOHA VI

STANOVENÍ ERYTHRODIOLU A UVAOLU

ÚVOD

Erythrodiol (obvykle chápaní jako úhrn glykolů erythrodiol a uvaolu) je složkou nezmýdelnitelného podílu, charakteristického pro některé typy tukových látek. V olivovém oleji extrahovaném pomocí rozpouštědel se nachází ve významně vyšších koncentracích než v ostatních olejích, jako například lisovaném olivovém oleji a v hroznovém oleji, které erythrodiol také obsahují, a tak jeho přítomnost může prokázat existenci olivového oleje extrahovaného pomocí rozpouštědel.

1. PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení přítomnosti erythrodiolu v tukové látce.

2. PODSTATA METODY

Zmýdelnění tukové látky pomocí ethanolického roztoku hydroxidu draselného. Extrakce nezmýdelnitelných látek pomocí diethyletheru. Vyčištění průchodem kolonou s oxidem hlinitým.

Nezmýdelnitelné látky se podrobují tenkovrstvé chromatografii na silikagelové desce, dokud nejsou oddělena pásma odpovídající sterolové a erythrodiolové frakce. Steroly a erythrodiol oddělené ze silikagelu se převedou na trimethylsilylether a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie.

Výsledek je vyjádřen jako procentní podíl erythrodiolu ve směsi erythrodiolu a sterolů.

3. PŘÍSTROJE APOMŮCKY

3.1 Přístroje a pomůcky uvedené v příloze V (Stanovení obsahu a složení sterolů).

4. CHEMIKÁLIE

4.1 Chemikálie uvedené v příloze V (Stanovení obsahu a složení sterolů).

4.2 Referenční 0,5 % roztok erythrodiolu v chloroformu.

5. POSTUP

5.1 Příprava nezmýdelnitelných látek

Viz přílohu V odst. 5.1.2.

5.2 Separace erythrodiolu a sterolů

5.2.1 Viz přílohu V odst. 5.2.1.

5.2.2 Viz přílohu V odst. 5.2.2.

5.2.3 Připravte 5 % roztok nezmýdelnitelných látek v chloroformu. 300 μl tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 0,1 ml nastříkne jako co nejrovnoměrnější a co nejtenčí pruh na tenkovrstvou desku přibližně 1,5 cm od dolního okraje desky Na jeden konec desky se nanese několik mikrolitrů roztoků cholesterolu a erythrodiolu, které budou sloužit jako referenční látka.

5.2.4 Deska se umístí do vyvíjecí komory uvedené v odstavci 5.2.1. Teplota se udržuje kolem 20 °C. Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu.

5.2.5 Deska se lehce a rovnoměrně postříká alkoholovým roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu a pozoruje se pod ultrafialovým zářením. Erythrodiolová pásma je možno stanovit porovnáním s referenčním roztokem. Obrysy pásma podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem.

5.2.6 Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové špachtle. Odebraná hmota se převede do baňky na 50 ml. Přidá se 15 ml horkého chloroformu, dobře protřepe a přefiltruje přes nálevku s diskem ze sintrovaného skla tak, aby se silikagel převedl do filtru. Třikrát se propere horkým chloroformem (vždy 10 ml) a filtrát se shromáždí v baňce na 100 ml. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do kalibrované kónické vakuové baňky na 10 ml, vysuší pod mírným proudem dusíku a zváží.

5.3 Příprava trimethylsilyletherů

Viz odst. 5.3 přílohy V.

5.4 Analýza plynovou chromatografií

Viz popis v odstavci 5.4 předchozí metody. Pracovní podmínky plynového chromatografu při analýze musí být takové, aby umožnily provedení analýzy sterolů a separace trimethylsilyletheru od erythrodiolu a uvaolu.

Po nastříknutí vzorku je prováděno zaznamenávání, dokud přítomná směs sterolů, erythrodiolu a uvaolu není zcela eluována. Pak určete píky (relativní retenční časy vzhledem k betasitosterolu jsou u erythrodiolu přibližně 1,45 a u uvaolu 1,55) a vypočtěte obsahy ploch jako v případě sterolů.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

kde

A1 = plocha píku erythrodiolu ►M6 ————— ◄

A2 = plocha píku uvaolu ►M6 ————— ◄

∑ Asterolů = celková plocha píků sterolů ►M6 ————— ◄ .

Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo.









PŘÍLOHA VII

STANOVENÍ NASYCENÝCH MASTNÝCH KYSELIN V TRIGLYCERIDECH VÁZANÝCH V POLOZE 2

1. PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení složení frakce mastných kyselin v oleji nebo tuku, které jsou esterifikovány v poloze 2 (nebo ve vnitřní poloze) glyceridu.

2. OBLAST POUZITÍ

Tato norma platí pro oleje a tuky s bodem tání nižším než 45 °C a využívá specifického účinku pankreatické lipázy.

Není bezvýhradně použitelná pro oleje a tuky obsahující větší množství mastných kyselin s 12 nebo méně atomy uhlíku (kokosového a palmojádrového oleje, máselný tuk), nebo vysoce nenasycených mastných kyselin (s více než čtyřmi dvojnými vazbami) s 20 nebo více atomy uhlíku (rybí tuky a oleje z mořských živočichů), nebo mastných kyselin s kyslíkatými skupinami jinými než kyselinovými.

3. PODSTATA

Případná neutralizace kyselých olejů a tuků v rozpouštědle. Čištění průchodem kolonou s oxidem hlinitým. Parciální hydrolýza pomocí pankreatické lipázy během stanovené doby. Separace vzniklých monoglyceridů pomocí tenkovrstvé chromatografie a methanolýza těchto monoglyceridů. Analýza získaných methylesterů plynovou chromatografií.

4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1 Baňka na 100 ml.

4.2 Baňka na 25 ml a se zábrusem.

4.3 1 m dlouhý vzduchový chladič, vhodný k připojení k baňce 4.2.

4.4 Baňka na 250 ml.

4.5 Kádinka na 50 ml.

4.6 Dělicí nálevka na 500 ml.

4.7 Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 13 mm a délce 400 mm s vložkou ze sintrovaného skla a kohoutem.

4.8 Odstředivková zkumavka na 10 ml se zabroušenou skleněnou zátkou.

4.9 Byreta na 5 ml, s hodnotou dílku 0,05 ml.

4.10 Stříkačka na 1 ml s tenkou jehlou.

4.11 Mikrostříkačka pro dávkování po 3 až 4μl kapkách.

4.12 Nástroj na rozprostírání vrstev pro tenkovrstvou chromatografii.

4.13 Skleněné desky pro tenkovrstvou chromatografii, 20 × 20 cm.

4.14 Skleněná vyvíjecí komora pro tenkovrstvou chromatografii s víkem ze zabroušeného skla, pro desky 20 × 20.

4.15 Rozprašovač pro tenkovrstvou chromatografii.

4.16. Sušárna nastavitelná na teplotu 103 ± 2 °C.

4.17 Termostat nastavitelný na 30 až 45 °C s přesností na 0,5 °C.

4.18 Rotační odpařovač.

4.19 Vibrační elektrická třepací zařízení pro silné promíchávání odstředivkových zkumavek.

4.20 Ultrafialová lampa ke zkoumání desek pro tenkovrstvou chromatografii.

4.21 pH metr. 4.22 Spirálovité míchadlo. 4.23 Byreta na 5 ml. 4.24 Stopky.

4.25 Laboratorní míchadlo vhodné pro disperze a směsi heterogenních materiálů.

5. CHEMIKÁLIE

5.1 n — hexan nebo, není-li k dispozici, petrolether (bod varu 30 až 50 °C), pro chromatografii.

5.2 2-propanol nebo 95 % ethanol (V/V), čistoty p. a.

5.3 2-propanol nebo ethanol, vodný roztok 1:1.

5.4 Diethylether, bez peroxidů.

5.5 Aceton.

5.6 Nejméně 98 % kyselina mravenčí (m/m).

5.7 Vyvíjecí roztok: směs n — hexanu (5.1), diethyletheru (5.4) a kyseliny mravenčí (5.6) v poměru 70:30:1 (V/V/V).

5.8 Aktivovaný oxid hlinitý pro chromatografii, neutrální, stupeň jakosti Brockmann I.

5.9 Křemenný prach s pojivem, odpovídající jakosti pro tenkovrstvou chromatografii.

5.10 Pankreatická lipáza vhodné kvality (poznámky 1 a 2).

5.11 Hydroxid sodný, vodný roztok o koncentraci 120 g/l.

5.12 Kyselina chlorovodíková, vodný roztok o koncentraci 6 mol/l.

5.13 Chlorid vápenatý (CaCl2), vodný roztok o koncentraci 220 g/l.

5.14 Cholát sodný (enzymatické kvality), vodný roztok o koncentraci 1 g/l.

5.15 Tlumivý roztok: 1M vodný roztok trihydroxy-methyl-aminomethanu upravený na pH 8 přidáním kyseliny chlorovodíkové (5.12) (zkontrolujte potenciometrem).

5.16 Fenolftalein, roztok 10 g/l v 95 % ethanolu (V/V).

5.17 2′, 7′-dichlor-fluorescein, roztok 2 g/l v 95 % ethanolu (V/V), upravený na mírně zásaditou reakci přidáním jedné kapky 1N roztoku hydroxidu sodného na 100 ml.

5.18 Neutralizovaný olej. 5.19 Hydroxid sodný, vodný roztok o koncentraci 0,1 mol/l. 5.20 Cholát sodný (enzymatické jakosti), vodný roztok o koncentraci 200 g/l. 5.21 Arabská guma, vodný roztok o koncentraci 100 g/l.

6. PŘÍPRAVA VZORKU

Pokud je hodnota kyselosti vzorku, stanovená podle přílohy II, nižší než 3 %, vyčistí se přímo průchodem přes oxid hlinitý podle odstavce 6.2.

Pokud je hodnota kyselosti vzorku, stanovená podle přílohy II, vyšší než 3 %, neutralizuje se zásadou za přítomnosti rozpouštědla podle odstavce 6.1 a poté se nechá projít oxidem hlinitým podle odstavce 6.2.

6.1 Neutralizace zásadou za přítomnosti rozpouštědla Do dělicí nálevky (4.6) se převede přibližně 10 g surového olivového oleje a přidá se 100 ml hexanu (5.1), 50 ml 2-propanolu (5.2), několik kapek roztoku fenolftaleinu (5.16) a množství roztoku hydroxidu sodného (5.11) odpovídající hodnotě volné kyselosti oleje, plus 0,3 % navíc. Jednu minutu se důkladně protřepá, přidá se 50 ml destilované vody, znovu protřepá a nechá se usadit. Po separaci se odstraní spodní mýdlová vrstva. Odstraní se také jakékoli mezilehlé vrstvy (sliz, nerozpustnou hmotu). Hexanový roztok neutralizovaného oleje se promyje následnými dávkami 25 až 30ml roztoku 2-propanolu (5.3), dokud růžové zabarvení fenolftaleinu nezmizí. Odstraní se většina hexanu destilací ve vakuu v rotačním odpařovači (4.18), olivový olej se vysuší ve vakuu při teplotě 30 až 40 °C pomocí proudu čistého dusíku, dokud nebude hexan zcela odstraněn.

6.2 Čištění průchodem oxidem hlinitým Připraví se suspenze 15 g aktivovaného oxidu hlinitého (5.8) v 50 ml hexanu (5.1) a za současného míchání se nalije do chromatografické kolony (4.7). Oxid hlinitý se nechá rovnoměrně usadit a umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 až 2 mm nad absorbentem. Do kolony se opatrně nalije roztok 5 g oleje ve 25 ml hexanu (5.1) a celý výtok z kolony se shromáždí v baňce (4.1).

7. PŘÍPRAVA CHROMATOGRAFICKÝCH DESEK Skleněné desky (4.13) se důkladně vyčistí ethanolem, petroletherem a acetonem, aby se odstranila jakákoli stopa tuku. Do Erlenmeyerovy baňky (4.4) se nasype 30 g křemenného prachu (5.9). Přidá se 60 ml destilované vody. Uzavře se a jednu minutu důkladně protřepe. Kaše se okamžitě přenese do nanášecího zařízení (4.12) a desky se pokryjí vrstvou silnou 0,25 mm. Desky se suší 15 minut na vzduchu a poté jednu hodinu v sušárně (4.16) při teplotě 103 ± 2 °C. Desky se před použitím vychladí v exsikátoru na laboratorní teplotu. Hotové desky jsou obchodně dostupné.

8. POSTUP 8.1 Hydrolýza za přítomnosti pankreatické lipázy Do odstředivkové zkumavky (4.8) se naváží přibližně 0,1 g připraveného vzorku; pokud je vzorkem kapalný olej, postupujte přímo níže uvedeným způsobem. Přidá se 20 mg lipázy (5.10) a 2 ml tlumivého roztoku (5.15). Dobře, ale opatrně se protřepe a pak se přidá 0,5 ml roztoku cholátu sodného (5.14) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého (5.13). Zkumavka se uzavře zátkou se zábrusem, opatrně se protřepe (nelze dopustit zvlhčení zátky), okamžitě se vloží do termostatu (4.17) udržovaného na teplotě 40 ± 0, 5 °C a ručně se přesně jednu minutu protřepá. Zkumavka se vyjme z termostatu a důkladně se přesně dvě minuty protřepe pomocí elektrického třepacího zařízení (4.19). Okamžitě se vychladí pod tekoucí vodou, přidá se do ní 1 ml kyseliny chlorovodíkové (5.12) a 1 ml diethyletheru (5.4). Uzavře se a důkladně promíchá na elektrickém třepacím zařízení. Nechá se ustát, v případě potřeby odstředí, a pomocí stříkačky (4,10) se odebere organická vrstva. 8.2 Separace monoglyceridů pomocí tenkovrstvé chromatografie Extrakt se pomocí mikrostříkačky (4.11) nastříkne jako co nejrovnoměrnější a co nejtenčí pruh na tenkovrstvou desku přibližně 1,5 cm od dolního okraje chromatografické desky. Deska se vloží do dobře nasycené vývojové komory (4.14) a nechá se vyvíjet ve vyvíjecím roztoku (5.7) přibližně při 20 °C, dokud čelo roztoku nebude přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se usuší na vzduchu při stejné teplotě, jakou má vyvíjecí komora a postříká se roztokem 2′, 7′-dichlor-fluoresceinu (5.17). Pod ultrafialovým světlem (4.20) se označí pásmo monoglyceridů (Rf přibližně 0,035). 8.3 Analýza monoglyceridů plynovou chromatografií Pomocí špachtle se odstraní pásmo získané v odstavci 8.2 (je nutno se vyvarovat odstranění složek, které zůstaly na základní linii) a převeďte je do methylační baňky (4.2). Získaný oxid křemičitý se upraví přímo metodami uvedenými v příloze XB, s cílem převedení monoglyceridů na methylestery; potom se estery analyzují pomocí plynové chromatografie, jak je popsáno v příloze XA.

9. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ Složení mastných kyselin vázaných v poloze 2 se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo (poznámka 3).

10. POZNÁMKY Poznámka 1 Kontrola aktivity lipázy Připraví se olejová emulze promícháním směsi 165 ml roztoku arabské gumy (5.21), 15 g drceného ledu a 20 ml neutralizovaného oleje (5.18) vhodným třepacím zařízením. Do kádinky (4.5) se převede 10 ml olejové emulze, poté se postupně přidá 0,3 ml roztoku cholátu sodného (5.20) a 20 ml destilované vody. Kádinka se vloží do termostatu udržovaného na teplotě 37 ± 0, 5 °C (poznámka 4); vloží se elektrody pH metru (4.21) a spirálovité míchadlo (4.22). Pomocí byrety (4.23) se po kapkách přidává roztok hydroxidu sodného (5.19), dokud hodnota pH nedosáhne 8,5. Přidá se dostatečné množství vodní suspenze lipázy (viz níže). Jakmile pH metr začne ukazovat pH 8,3, zapnou se stopky (4.24) a přikapává se roztok hydroxidu sodného (5.19) takovou rychlostí, aby se udržovala hodnota pH 8,3. Zaznamená se objem spotřebovaného zásaditého roztoku za minutu. Pozorování se zaznamená ve formě grafu, jehož nezávisle proměnnou je čas a závisle proměnnou objem zásaditého roztoku v ml potřebný pro udržení konstantní hodnoty pH. Výsledný graf musí být lineární. Výše zmíněná suspenze lipázy je vodní suspenzí 1:1000 (m/m). Při každé zkoušce se použije takové množství této suspenze, aby se během čtyř až pěti minut spotřeboval přibližně 1 ml zásaditého roztoku. Obvykle je zapotřebí přibližně 1 až 5 mg prášku. Lipázovou jednotkou se rozumí množství enzymu, které uvolní 10 mikroekvivalentů kyseliny za minutu. Aktivita A použitého prášku vyjádřená v lipázových jednotkách na 1 mg je pak dána vzorcem: kde V je objem v ml roztoku hydroxidu sodného (5.19) spotřebovaného za minutu, vypočítaný z grafu, a m je hmotnost použitého zkušebního vzorku prášku v mg. Poznámka 2 Příprava lipázy Lipázy s dostatečnou aktivitou jsou obchodně dostupné. Je ale rovněž možné je připravit v laboratoři takto: 5 kg čerstvé vepřové slinivky břišní se vychladí na 0 °C; okolní sádlo a vazivová tkáň se oddělí a v míchadle se rozmělní, dokud nevznikne tekutá mazlavá pasta. Tato pasta se v míchadle (4.25) smíchá s 2,5 l bezvodého acetonu a poté odstředí. Zbytek se extrahuje třikrát pomocí stejného množství acetonu, potom dvakrát pomocí směsi acetonu a diethyletheru 1:1 (V/V) a dvakrát pomocí diethyletheru. Zbytek se po 48 hodin suší ve vakuu za účelem získání stabilního prášku, který je možné skladovat v ledničce. Poznámka 3 V každém případě se doporučuje stanovit složení veškerých mastných kyselin ve stejném vzorku, neboť porovnání se složením kyselin vázaných v poloze 2 pomůže při vyhodnocení získaných čísel. Poznámka 4 Teplota hydrolýzy je 37 °C, je-li použit kapalný olej. V případě zkušebního vzorku se však nastaví na 40 °C, aby se umožnila analýza tuků s bodem tání až do 45 °C.

▼M20 —————

▼B









PŘÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÁ ANALÝZA V ULTRAFIALOVÉ OBLASTI SPEKTRA

PŘEDMLUVA

Spektrofotometrická analýza v ultrafialové oblasti spektra může poskytnout informace o jakosti tuku, stavu jeho zachovalosti a změnách způsobených technologickými procesy.

Absorpce na vlnových délkách specifikovaných v metodě je způsobena přítomností konjugovaných dienových a trienových systémů. Tyto absorpce jsou vyjádřeny jako specifické extinkce E1 % 1 cm (extinkce vyvolaná 1 % roztokem tuku v předepsaném rozpouštědle při tloušťce vrstvy 1 cm) obvykle označované písmenem K (též zmiňované jako „extinkční koeficienty“).

1. PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup při spektrofotometrické analýze olivového oleje v ultrafialové oblasti spektra.

2. PODSTATA METODY

Zkoumaný tuk se rozpustí v požadovaném rozpouštědle a poté se určí extinkce roztoku při určitých vlnových délkách proti čistému rozpouštědlu. Z výsledků spektrofotometrických měření se vypočtou specifické extinkce.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1 Spektrofotometr pro měření extinkce v ultrafialové oblasti spektra mezi 220 a 360 nm s možností odečítání jednotlivých nanometrických jednotek.

3.2 Pravoúhlé křemenné kyvety s víčky a optickou délkou 1 cm. Jsou-li naplněny vodou nebo jiným vhodným rozpouštědlem, nesmí vykazovat rozdíly větší než 0,01 jednotky extinkce.

3.3 Odměrné baňky na 25 ml.

▼M6

3.4 Chromatografická kolona s horní částí o délce 270 mm a průměru 35 mm a dolní částí o délce 270 mm a průměru 10 mm.

▼B

4. CHEMIKÁLIE

4.1 Spektrofotometricky čistý isooktan (2,2,4-trimethyl-pentan). Proti destilované vodě musí mít transmitanci nejméně 60 % při 220 nm a nejméně 95 % při 250 nm, nebo — spektrofotometricky čistý cyklohexan: proti destilované vodě musí mít transmitanci nejméně 40 % při 220 nm a nejméně 95 % při 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2 Bazický oxid hlinitý pro kolonovou chromatografii připravený a zkontrolovaný v souladu s postupem uvedeným v příloze I.

4.3 n — hexan pro chromatografii.

5. POSTUP

5.1 Zkoumaný vzorek musí být dokonale homogenní a bez podezřelých nečistot. Oleje, které jsou při normální teplotě kapalné, mají být přefiltrovány přes papír při teplotě přibližně 30 °C, pevné tuky je třeba homogenizovat a přefiltrovat při teplotě nejvýše 10 °C nad jejich bodem tání.

5.2 Naváží se přibližně 0,25 g takto připraveného vzorku do odměrné baňky na 25 ml, doplní se až ke značce předepsaným rozpouštědlem a homogenizuje. Výsledný roztok musí být dokonale čirý. Je-li roztok zakalený nebo obsahuje nečistoty, je nutno jej rychle přefiltrovat přes papír.

5.3 Kyveta se naplní získaným roztokem a změří se extinkce v oblasti vlnových délek 232 až 276 nm, jako referenční roztok slouží použité rozpouštědlo. Zaznamenané hodnoty extinkce musí ležet v rozsahu 0,1 až 0,8. Pokud tomu tak není, musí být měření zopakována s použitím roztoků o vhodně upravené koncentraci.

5.4 Je-li nutné stanovit specifické extinkce po průchodu oxidem hlinitým, postupuje se takto: Do chromatografické kolony se nalije suspenze 30 g bazického oxidu hlinitého v hexanu. Po usazení adsorbentu se odstraní přebytečný hexan tak, aby převyšoval horní okraj oxidu hlinitého přibližně o 1 cm. Rozpustí se 10 g tuku, homogenizovaného a filtrovaného podle popisu v odstavci 5.1, ve 100 ml hexanu a roztok se nalije do kolony. Shromáždí se eluát a odpaří se veškeré rozpouštědlo ve vakuu při teplotě nižší než 25 °C. Takto získaný vzorek tuku se neprodleně zpracuje podle popisu v odstavci 5.2.

6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1 Zaznamenávají se specifické extinkce (extinkční koeficienty) při různých vlnových délkách vypočtené takto kde Kλ = specifická extinkce při vlnové délce λ, Eλ = extinkce při vlnové délce λ, c = koncentrace analytického roztoku v g/100 ml zkušebního roztoku, s = tloušťka kyvety v cm. Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo.

6.2 Spektrofotometrická analýza olivového oleje v souladu s úřední metodou definovanou v nařízeních EHS předepisuje stanovení charakteristických extinkcí v roztoku isooktanu při vlnových délkách 232 a 270 nm a stanovení hodnoty ΔK, která je definována takto kde Km je charakteristická extinkce při vlnové délce m, vlnová délka v blízkosti 270 nm, při níž dochází k maximální absorpci.









DODATEK I

Příprava oxidu hlinitého a zkouška jeho aktivity

A.1.1 Příprava oxidu hlinitého

Oxid hlinitý, který byl nejprve tři hodiny sušen v laboratorní pícce při teplotě 380 až 400 °C, se vloží do hermeticky uzavřené nádoby, přidá se destilovaná voda v poměru 5 ml na 100 g oxidu hlinitého, nádoba se ihned uzavře, opakovaně protřepe a poté před použitím nechá nejméně 12 hodin v klidu.

A.1.2 Kontrolaaktivity oxiduhlinitého

Připraví se chromatografická kolona s 30 g oxidu hlinitého. Postupem podle odstavce 5.4. se kolonou nechá projít směs tvořená:

— 95 % panenského olivového oleje se specifickou extinkcí menší než 0,18 při 268 nm,

— 5 % podzemnicového oleje, upravovaného za pomoci zeminy v procesu rafinace, s hodnotou specifické extinkce nejméně 4 při vlnové délce 268 nm.

Jestliže po průchodu kolonou má směs charakteristickou extinkci při 268 nm větší než 0,11, je oxid hlinitý přijatelný, pokud ne, úroveň dehydratace musí být zvýšena.









DODATEK II

Kalibrace spektrofotometru

A.2 Zařízení musí být v pravidelných intervalech (nejméně jednou za šest měsíců) kontrolováno, pokud jde o vlnovou délku a přesnost odezvy.

A.2.1 Vlnovou délku je možné kontrolovat pomocí rtuťové výbojky nebo pomocí vhodných filtrů.

A.2.2 Při kontrole odezvy fotočlánku a fotonásobiče se postupuje takto: naváží se 0,2000 g čistého chromanu draselného pro spektrofotometrii a rozpustí se v roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,05 mol/l v 1 000 ml odměrné baňce a doplní po značku. Odebere se přesně 25 ml získaného roztoku, převede do odměrné baňky na 500 ml a doplní po značku stejným roztokem hydroxidu draselného. Extinkce takto získaného roztoku se změří při vlnové délce 275 nm proti roztoku hydroxidu draselného. Extinkce naměřená pomocí jednocentimetrové kyvety musí být 0,200 ± 0,005.









PŘÍLOHA X A

ANALÝZA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. PODSTATA

Tato metoda popisuje použití plynové chromatografie s náplňovými nebo kapilárními kolonami pro stanovení kvalitativního a kvantitativního složení směsi methylesterů mastných kyselin, získaných podle metody uvedené v příloze X B.

Metoda není použitelná pro polymerní mastné kyseliny.

2. CHEMIKÁLIE

2.1 Nosný plyn

Inertní plyn (dusík, helium, argon, vodík atd.), dokonale vysušený a s obsahem kyslíku menším než 10 mg/kg.

Poznámka 1

Vodík, který je používán pouze na kapilárních kolonách, umožňuje dvakrát zvýšit rychlost analýzy, ale je nebezpečný. Bezpečnostní zařízení jsou dostupná.

2.2 Pomocné plyny

2.2.1 Vodík (čistoty vyšší než 99,9 %), neobsahující organické nečistoty.

2.2.2 Vzduch nebo kyslík, neobsahující organické nečistoty.

2.3 Referenční standard

Směs methylesterů čistých mastných kyselin, nebo methylestery z oleje známého složení; výhodné je složení podobné analyzovanému vzorku.

Pozornost je nutno věnovat ochraně polynenasycených mastných kyselin před oxidací.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Uvedené pokyny se vztahují na obvyklá zařízení používaná pro plynovou chromatografii, používající náplňové, nebo kapilární kolony a plameno-ionizační detektor. Vhodné jsou přístroje dosahující účinnosti a rozlišení uvedené v odstavci 4.1.2.

3.1 Plynový chromatograf

Plynový chromatograf, obsahující následující části:

3.1.1 Injektor

Používá se injektor buď

a) pro náplňovou kolonu, který by měl mít pokud možno nejmenší mrtvý prostor (v tomto případě by měl být injektor schopen ohřátí na teplotu o 20 až 50 °C vyšší než je teplota kolony), nebo

b) pro kapilární kolonu, kde by injektor měl být konstruován přímo pro použití s touto kolonou. V tomto případě může být prováděn buď nástřik pomocí děliče (split type), nebo bez dělení přímo na kolonu (splitless type) nástřik „on column“.

Poznámka 2

Pokud nejsou přítomny mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku, může být použit injektor s pohyblivou jehlou.

3.1.2 Termostat

Termostat má mít schopnost vyhřát kolonu na teplotu nejméně 260 °C a udržovat žádanou teplotu s přesností na 1 °C v případě náplňové kolony a na 0,1 °C v případě kapilární kolony. Poslední požadavek je důležitý při použití křemenných kolon.

Použití ohřevu s programovanou teplotou je doporučeno ve všech případech, zejména pro mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku.

3.1.3 Náplňové kolony

3.1.3.1 Kolona má být vyrobena z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (např. sklo nebo korozivzdorná ocel), a má mít následující rozměry: a) délka: 1 m až 3 m. Relativně kratší kolony by mohly být použity za přítomnosti mastných kyselin s dlouhým řetězcem (nad C20). Při analýzách kyselin se 4 nebo 6 uhlíkovými atomy se doporučuje použít kolonu o délce 2 m; b) vnitřní průměr: 2 až 4 mm. Poznámka 3 Jestliže jsou analyzovány polyenové kyseliny s více než třemi dvojnými vazbami, může na koloně z korozivzdorné oceli docházet k jejich rozložení. Poznámka 4 Může být použit systém s dvěma náplňovými kolonami.

3.1.3.2 Náplň zahrnuje tyto části: a) nosič: kyselinou praná a silanizovaná křemelina, nebo jiný vhodný inertní nosič s úzkým rozsahem velikosti částic (25 μm v rozmezí mezi 125 μm až 200 μm), přičemž průměrná velikost částic má vztah k vnitřními průměru a délce kolony; b) stacionární fáze: polární fáze polyesterového typu (např. diethylenglykoljantarát polyester, butandioljantarát polyester, ethylenglykoladipat polyester atd.), kyanosilikony nebo jiné kapaliny splňující požadavky na chromatografickou separaci (viz bod 4). Stacionární fáze by měla tvořit 5 % až 20 % (m/m) z náplně. Pro určitá dělení může být použita nepolární stacionární fáze.

3.1.3.3 Kondicionace kolony Připravená kolona odpojená od detektoru, je-li to možné, se postupně ohřeje v termostatu na teplotu 185 °C za průtoku inertního plynu rychlostí 20 ml/min až 60 ml/min, nechá se nejméně 16 hodin při této teplotě a další dvě hodiny při 195 °C.

3.1.4 Kapilární kolona

3.1.4.1 Trubice má být vyrobena z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (např. sklo nebo tavený křemen). Vnitřní průměr by se měl pohybovat mezi 0,2 mm až 0,8 mm. Vnitřní povrch by měl být přiměřeným způsobem upraven (např. příprava povrchu, inaktivace). Délka 25 m je ve většině případů dostatečná.

3.1.4.2 Stacionární fáze, obvykle polyethylenglykolového typu (polyethylenglykol 20 000), polyestery (butandioljantarát polyester) nebo polární polysiloxany (kyanosilikony). Vhodné jsou vázané stacionární fáze (zesíťované). Poznámka 5 Při použití polárních polysiloxanů je nebezpečí obtížné identifikace a separace kyseliny linolenové a kyselin C20. Pokrytí by mělo být tenké, např. 0,1 μm až 0,2 μm.

3.1.4.3 Montáž a kondicionace kolony Je nutno zachovat běžnou opatrnost při montáži kapilární kolony, např. úprava kolony v termostatu (nosič), výběr a provedení spojů (netěsné spoje), poloha konce kolony v injektoru a detektoru (zmenšení mrtvých prostorů). Kolono se nechá protékat nosný plyn (např. 0 kPa pro kolonu délky 25 mm a vnitřním průměru 0,3 mm). Kolona se ohřívá v termostatu za programované teploty rychlostí 3 °C/min od teploty okolí do teploty 10 °C pod limitní hodnotu, při které dochází k rozložení stacionární fáze. Termostat se udržuje při této teplotě po dobu jedné hodiny, dokud nedojde k ustálení základní linie. Potom se termostat ochladí na 180 °C a pracuje se za isotermních podmínek. Poznámka 6 Vhodné kondiciované kolony jsou obchodně dostupné.

3.1.5 Detektor; vhodnější je detektor vyhřívaný na teplotu vyšší, než je teplota kolony.

3.2 Stříkačka

Stříkačka o maximálním objemu 10 μl, dělená po 0,1 μl.

3.3 Zapisovač

Jestliže je pro výpočet složení analyzované směsi použit záznam zapisovače, je nutno použit elektronický zapisovač s vysokou přesností, slučitelný s přístrojem. Zapisovač by měl mít následující charakteristiky:

a) rychlost odezvy nižší než 1,5 s, výhodnější je 1 s (rychlost odezvy je doba nutná pro přeběh pera zapisovače z 0 % na 90 % při náhlém zavedení signálu 100 %),

b) šířka papíru nejméně 20 cm,

c) rychlost posunu papíru, nastavitelná na hodnoty mezi 0,4 cm/min až 2,5 cm/min.

3.4 Integrátor nebo kalkulátor (volitelný)

Rychlý a přesný výpočet může být proveden pomocí elektronického integrátoru nebo kalkulátoru. Ten má poskytovat lineární odezvu s odpovídající citlivostí a uspokojivou korekcí na opravu základní linie.

4. POSTUP

Postup popsaný v odstavcích 4.1 až 4.3 se týká použití plameno-ionizačního detektoru.

Může být použít plynový chromatograf vybavený detektorem pracujícím na principu tepelné vodivosti (katarometrem), který pracuje na principu změn tepelné vodivosti. Pracovní podmínky je třeba v tomto případě upravit tak, jak je uvedeno v bodu 6.

4.1 Zkušební podmínky

4.1.1 Výběr optimálních pracovních podmínek 4.1.1.1 Náplňové kolony Při výběru pracovních podmínek je nutno přihlížet k následujícím proměnným: a) délka a průměr kolony; b) povaha a množství stacionární fáze; c) teplota kolony; d) průtok nosného plynu; e) požadované rozlišení; f) velikost nástřiku zvolená tak, aby sestava detektoru a elektrometru dávala lineární odezvu; g) trvání analýzy. Obecně hodnoty uvedené v tabulkách 1 a 2 povedou k požadovaným výsledkům, tj. nejméně 2 000 teoretických pater na metr délky kolony pro methylstearát a jeho eluci v průběhu přibližně 15 minut. Jestliže to přístrojové vybavení dovolí, měla by být teplota injektoru přibližně 200 °C a detektoru stejná nebo vyšší než je teplota kolony. Platí pravidlo, že poměr průtoku vodíku přiváděného do plameno-ionizačního detektoru k průtoku nosného plynu by se měl pohybovat v rozmezí 1:2 až 1:1 v závislosti na průměru kolony. Průtok kyslíku by měl být 5krát až 10krát vyšší než průtok vodíku.



Tabulka 1 Vnitřní průměr kolony mm Průtok nosného plynu ml/min 2 15 až 25 3 20 až 40 4 40 až 60



Tabulka 2 Koncentrace stacionární fáze % (m/m) Teplota kolony °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2 Kapilární kolona Účinnost a permeabilita kapilární kolony způsobují, že dělení složek a doba trvání analýzy jsou značně závislé na průtoku nosného plynu kolonou. Je proto nezbytné optimalizovat pracovní podmínky působením na tyto parametry (nebo jednodušeji na tlakovou ztrátu na koloně) podle toho, zda je cílem zlepšit dělení, nebo zrychlit analýzu.

4.1.2 Stanovení počtu teoretických pater (účinnosti) a rozlišení (viz obrázek 1) Provede se analýza směsi přibližně stejného množství methylstearátu a methyloleátu (např. methylestery z kakaového másla). Teplota kolony a průtok nosného plynu se nastaví tak, aby maximum píku methylstearátu bylo zaznamenáno přibližně 15 minut po píku rozpouštědla. Použijte dostatečné množství směsi methylesterů, aby výška píku methylstearátu dosahovala přibližně tří čtvrtin rozsahu stupnice. Počet teoretických pater n (účinnost) se vypočítá podle vzorce: a rozlišení R podle vzorce: kde dr1 je vzdálenost v mm od počátku chromatogramu do maxima píku methylstearátu; ω1 a ω2 jsou šířky v mm píků methylstearátu a methyloleátu změřené mezi průsečíky tangent vedenými inflexními body na píku a základní linií; Δ je vzdálenost mezi maximy píků methylstearátu a methyloleátu v mm; ▼M2 a rozlišovací index Ir pomocí vzorce kde a = výška nejnižšího píku měřená od základní linie a b = výška nejnižšího bodu sedla mezi dvěma sousedními píky měřená od základní linie. ▼B Obrázek 1 Chromatogram pro stanovení počtu teoretických pater (účinnosti) a rozlišení Při stanovení by měly být nastaveny pracovní podmínky poskytující nejméně 2 000 teoretických pater na jeden metr délky kolony pro methylstearát a rozlišení nejméně 1,25.

4.2 Nástřik vzorku

Za použití stříkačky (3.2) se na kolonu chromatografu nastříkne 0,1 μl až 2 μl roztoku methylesterů připravených podle přílohy X B.

Pokud methylestery nejsou v roztoku, připraví se roztok přibližně 100 mg v 1 ml heptanu pro chromatografii a nastřikuje se 0,1 μl až 1 μl tohoto roztoku.

Jestliže jsou analyzovány složky přítomné pouze ve stopových množstvích, velikost nástřiku může být zvýšena (až desetinásobně).

4.3 Analýza

Pracovní podmínky by měly být nastaveny podle odstavce 4.1.1.

Pokud jsou analyzovány mastné kyseliny s méně než 12 atomy uhlíku, lze pracovat při nižší teplotě. Při analýzách mastných kyselin s více než 20 atomy uhlíku lze pracovat naopak při teplotě vyšší. Je také možno použít v obou těchto případech programové teploty. Např. při analýze vzorku, který obsahuje methylestery mastných kyselin s méně než 12 atomy uhlíku nastřikujeme vzorek při teplotě 100 °C (nebo 50 °C až 60 °C, je-li přítomna kyselina máselná) a okamžitě se zvyšuje teplota rychlostí 4 Co/min až 8 °C/min až na optimální hodnotu. V některých případech mohou být oba postupy kombinovány.

Po ukončení programovaném ohřevu pokračuje eluce při konstantní teplotě, dokud nejsou eluovány všechny složky. Jestliže přístroj není vybaven programováním teploty, je možno použít dvě teploty mezi 100 °C a 195 °C.

Jestliže je to nutné, je doporučeno provést analýzu na dvou zakotvených fázích o různé polaritě, aby byla ověřena nepřítomnost maskovaných píků, například v případě současného výskytu C18:3 a C20:0, nebo C18:3 a konjugovaných C18:2.

4.4 Příprava referenčního chromatogramu a referenčních grafů

Provádí se analýza referenční standardní směsi (2.3) za stejných pracovních podmínek, které byly použity při analýze vzorku, měřením retenčních časů nebo retenčních vzdáleností pro základní mastné kyseliny. Do semilografického grafu se vynesou logaritmy retenčních časů nebo vzdáleností pro jednotlivé stupně nasycenosti proti počtu atomů uhlíku. Za isotermních podmínek by měla být závislost pro kyseliny s rovným řetězcem stejného stupně nasycenosti lineární. Tyto přímky by měly být přibližně rovnoběžné.

Je nutné stanovit podmínky k vyvarování se přítomnosti „maskovaných píků“ v případě, že rozlišení je nedostatečné k rozdělení dvou složek.

5. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

5.1 Kvalitativní analýza

Provede se identifikace píků methylesterů pro vzorek z grafu podle 4.4; podle potřeby se interpoluje.

5.2 Kvantitativní analýza

5.2.1 Určení složení

Až na výjimečné případy lze použít metody vnitřní normalizace, tj. za předpokladu, že všechny složky vzorku jsou zaznamenány na chromatogramu, představuje celková plocha píků 100 % (celková eluce).

Jestliže je přístroj vybaven integrátorem, použijí se výsledky získané tímto způsobem. Není-li integrátor k dispozici, vypočte se plocha každého píku vynásobením výšky píku šířkou píku v poloviční výšce a podle potřeby se použije ve výpočtu změna zeslabení použitá při záznamu chromatogramu.

5.2.2 Výpočet

5.2.2.1 Obecný případ Obsah složky i vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů se vypočítá určením plochy odpovídajícího píku vzhledem k součtu ploch všech píků podle vzorce: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, ΣA je součet ploch všech píků. Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo. Poznámka 7 V tomto obecném případě je výsledek založen na předpokladu, že plocha píku představuje hmotnostní procenta. V případech, že tento předpoklad neplatí, viz 5.2.2.2.

5.2.2.2 Použití korekčních faktorů V některých případech, zvláště za přítomnosti mastných kyselin s méně než 8 atomy uhlíku, nebo kyselin se sekundární skupinou v případě použití detektoru pracujícího na principu tepelné vodivosti, nebo je-li požadována zvláště vysoká přesnost, by měly být použity korekční faktory k převedení plochy píku vyjádřené v procentech na hmotnostní procenta složek. Určení korekčních faktorů za pomoci chromatogramu referenční směsi methylesterů známého složení se provádí za stejných pracovních podmínek, jaké byly použity při analýze vzorku. Pro tyto referenční směsi se obsah v hmotnostních procentech vypočte podle vzorce: kde mi je hmotnost složky i v referenční směsi, Σm je celková hmotnost všech složek v referenční směsi. Z chromatogramu referenční směsi (4.4) se vypočítá procentní podíl ploch (plocha/plocha) pro složku i takto: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, ΣA součet ploch všech píků. Korekční faktor se vypočítá podle vzorce Obecně se korekční faktory vyjádří ve vztahu ke KC16 jako relativní faktor: Pro vzorek se vyjádří obsah každé složky i v hmotnostních procentech methylesteru jako: Výsledky se vypočítají s přesností na jedno desetinné místo.

5.2.2.3 Použití vnitřního standardu V některých případech (např. když nejsou kvantifikovány všechny mastné kyseliny, k čemuž dochází, jsou-li přítomny kyseliny se čtyřmi a šesti atomy uhlíku současně s kyselinami s 16 a 18 atomy uhlíku, nebo když je třeba určit absolutní množství mastných kyselin ve vzorku) by měl být použit vnitřní standard. Jako vnitřní standard se používají nejčastěji methylestery mastných kyselin s 5, 15 nebo 17 atomy uhlíku. Pro vnitřní standard by měl být stanoven korekční faktor (pokud se použije). Hmotnostní procenta složky i vyjádřená jako methylester lze vypočítat podle vzorce: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, As plocha píku odpovídající vnitřnímu standardu, K′i korekční faktor pro složku i (vztažený na KC16), K′s korekční faktor pro vnitřní standard (vztažený na KC16), m hmotnost zkušebního vzorku v mg, ms hmotnost vnitřního standardu v mg. Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo.

▼M2

6. ZVLÁŠTNÍ PŘÍPAD – STANOVENÍ TRANS-ISOMERŮ

Obsah trans-isomerů mastných kyselin s počtem atomů uhlíku mezi 10 až 24 je možné stanovit separací methylesterů pomocí kapilární plynové chromatografie s kolonami se specifickou polaritou.

6.1 Kapilární kolona z křemene o vnitřním průměru 0,25 až 0,32 mm a délce 50 m, potažená vrstvou kyanopropisilikonu o tloušťce 0,1 až 0,3 μm (typ SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 a podobné typy).

6.2 Methylestery se připravují postupem popsaném v příloze X B. Tukové látky s obsahem volných kyselin vyšším než 3 % musí být předem neutralizovány v souladu s bodem 6.1 přílohy VII.

6.3 Laboratorní podmínky pro plynovou chromatografii jsou tyto: — teplota kolony nastavitelná na teplotu od 150 do 230 °C (například 165 °C po dobu 15 minut a poté narůstající o 5 °C za minutu na 200 °C), — teplota vstřikovací jednotky: 250 °C při nástřiku pomocí děliče (split type), nebo počáteční teplota kolony při použití systému nástřiku bez dělení přímo na kolonu (on column), — teplota detektoru: 260 °C, — rychlost průtoku nosného plynu (helium a vodík): 1,2 ml za minutu. Vstříknuté množství musí být takové, aby za daných podmínek citlivosti byla výška píku odpovídajícího methylesteru kyseliny arachidové nejméně 20 % spodní části škály.

6.4 Stanovení jednotlivých methylesterů se provádí na základě retenčních časů, které jsou porovnány s retenčními časy referenčních směsí (viz bod 2.3.). Estery trans-mastných kyselin se eluují před odpovídajícími cis-isomery. Příklad chromatogramu je uveden na obrázku 2. Obrázek 2 Chromatogram pro stanovení trans-isomerů mastných kyselin pomocí kapilární plynové chromatografie

6.5 Účinnost kolony podle bodu 4.1.2. musí umožňovat separaci určitých kritických párů, například páru tvořeného masívem píků kyseliny trans-olejové a píkem kyseliny cis-olejové, trans- C18:1/cis- C18:1, s rozlišovacím indexem vyšším než 2.

6.6 Procentní podíl jednotlivých trans-mastných kyselin se vypočítá na základě vztahu mezi danými plochami píků a součtem ploch všech přítomných píků. Pro jednotlivé kyseliny se berou v úvahu tyto procentní podíly: — trans-oktadecenové kyseliny (T 18: 1) podle přílohy I k tomuto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny olejové, — cis-trans- a trans-cis-oktadekadienové kyseliny [(CT/TC) 18: 2] podle přílohy I tohoto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny linolové, — trans-cis-trans-, cis-cis-trans-, cis-trans-cis- a trans-cis-cis-oktadekatrienové kyseliny [(TCT + CCT + CTC + TCC)18: 3] podle přílohy I tohoto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny linolenové. Poznámka 8: S přihlédnutím ke zvláštním charakteristikám této metody je výsledky nutno uvádět na dvě desetinná místa.

▼B

►M2 7. ◄ SPECIÁLNÍ PŘÍPAD: POUŽITÍ KATAROMETRU (DETEKTORU PRACUJÍCÍHO NA PRINCIPU ZMĚN TEPELNÉ VODIVOSTI)

Plynový chromatograf vybavený detektorem pracujícím na principu změn tepelné vodivosti (katarometr) může být rovněž použit pro kvalitativní a kvantitativní stanovení složení směsi methylesterů mastných kyselin. Při jeho použití by podmínky uvedené v odstavcích 3 a 4 měly být upraveny podle tabulky 3.

Pro kvantitativní analýzu je definováno použití korekčních faktorů v 5.2.2.2.







Tabulka 3 Proměnná Hodnota/podmínka Kolona délka: 2 m až 4 m vnitřní průměr: 4 mm Nosič zrnění mezi 160 μm a 200 μm Koncentrace stacionární fáze 15 % až 25 % (m/m) Nosný plyn Helium, nebo při jeho nedostatku vodík s co nejnižším obsahem kyslíku Pomocné plyny žádné Teplota nástřiku 40 °C až 60 °C nad teplotu kolony Teplota kolony 180 °C až 200 °C Průtok nosného plynu obvykle 60 ml/min až 80 ml/min Nástřik vzorku obvykle mezi 0,5 μl až 2 μl

►M2 8. ◄ PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol musí obsahovat odkaz na použitou metodu pro přípravu methylesterů a jejich stanovení plynovou chromatografií a získané výsledky. Dále zahrnuje všechny pracovní podrobnosti nespecifikované v této mezinárodní normě nebo považované za volitelné, jakož i další okolnosti, které mohou ovlivnit výsledek.

Protokol musí obsahovat všechny informace nutné pro kompletní identifikaci vzorku.

▼M19









ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A : Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B : Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

(a) determination of difference between actual and theoretical content of triglycerides with ECN42 (ΔECN42): — method A will be applied to samples of all the oil categories after purification of the oil by passing it through a silica gel column;

(b) determination of the fatty acid composition: — method A will be applied directly to samples of the following oil categories: — — virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %, — refined olive oil, — olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil), — refined olive-pomace oil, — olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace oil); — method B will be