2008R0273 — CS — 01.07.2013 — 001.001

Tento dokument je třeba brát jako dokumentační nástroj a instituce nenesou jakoukoli odpovědnost za jeho obsah

Ve znění:









▼B

NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 273/2008

ze dne 5. března 2008,

kterým se stanoví prováděcí pravidla k nařízení Rady (ES) č. 1255/1999, pokud jde o metody analýzy a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků







KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ, s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství, s ohledem na nařízení Rady (ES) č. 1255/1999 ze dne 17. května 1999 o společné organizaci trhu s mlékem a mléčnými výrobky ( 1 ), a zejména na články 10 a 15 a čl. 26 odst. 3, čl. 29 odst. 1 a čl. 31 odst. 4 uvedeného nařízení, vzhledem k těmto důvodům: (1) Nařízení Komise (ES) č. 213/2001 ( 2 ) stanoví prováděcí pravidla k nařízení Rady (ES) č. 1255/1999, pokud jde o metody analýzy a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků. V souvislosti s technickým vývojem v oblasti analytických metodik je třeba provést další výrazné změny. V zájmu jasnosti a účinnosti a s ohledem na počet a technickou povahu změn by nařízení (ES) č. 213/2001 mělo být zrušeno a nahrazeno novým nařízením. (2) Složení a jakostní znaky mléka a mléčných výrobků stanovené v rámci režimů zavedených nařízením (ES) č. 1255/1999 musí být validovány, neboť je nutné zajistit, aby plně odpovídaly stanoveným požadavkům. (3) Referenční metody, jež se mají pro uvedenou validaci používat, jsou metody, které zveřejňují mezinárodní organizace, jako jsou Evropský výbor pro normalizaci (CEN), Mezinárodní mlékárenská federace (IDF), Mezinárodní organizace pro normalizaci (ISO) a vědecké sdružení zabývající se odbornou způsobilostí v oblasti analýz (AOAC International), a které tyto organizace pravidelně aktualizují. V některých případech se stanoví referenční metoda Společenství, zatímco v jiných případech právní předpisy Společenství žádnou referenční metodu nestanoví. Má-li být zajištěno jednotné používání referenčních metod, je nezbytné vypracovat seznam referenčních metod a mělo by se stanovit, že Komise může tento seznam v případě potřeby přizpůsobit. (4) Používání rutinních metod by nemělo být vyloučeno, a proto by měly být stanoveny minimální podmínky pro jejich používání. (5) Rovněž by měly být stanoveny společné postupy s cílem zavést jednotnou praxi při hodnocení výsledků analýz. Totéž platí pro organoleptické hodnocení dotyčných produktů a pro přezkoumávání výsledků, které byly napadeny. (6) Pro některé analýzy v současnosti neexistují žádné mezinárodně uznávané referenční metody, jež byly validovány; z tohoto důvodu nejsou k dispozici žádné informace o tom, že by jednotlivé laboratoře dosahovaly při analýzách odlišných výsledků. Proto je třeba stanovit v rámci Společenství metody, které byly validovány podle pravidel stanovených na mezinárodní úrovni a které by se používaly jako metody referenční. (7) Nařízení Komise (ES) č. 1898/2005 ( 3 ) stanoví prováděcí pravidla k nařízení Rady (ES) č. 1255/1999, pokud jde o opatření pro odbyt smetany, másla a zahuštěného másla na trhu Společenství, a stanoví, že za určitých okolností se do smetany, másla a zahuštěného másla přidávají stopovací látky, aby bylo zajištěno správné konečné použití těchto produktů. Používání stopovacích látek je důležité pro řádné fungování režimu. V zájmu zajištění toho, aby se všem hospodářským subjektům, na které se tento režim vztahuje, dostalo rovného zacházení, měly by se zavést obecné metody pro zjišťování některých těchto stopovacích látek. (8) Podle článku 9 nařízení (ES) č. 1255/1999 může být poskytnuta podpora pro soukromé skladování sýrů vyráběných z ovčího mléka. Podle článku 31 téhož nařízení lze pro tyto produkty poskytnout zvláštní náhradu. Sýry vyráběné z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka a ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka mohou být do Společenství dováženy z některých třetích zemí za preferenčních podmínek. Vzhledem k výše uvedenému je třeba vhodnými kontrolními postupy ověřit, zda se do dotyčných produktů nepřidává kravské mléko. Z tohoto důvodu je nezbytné stanovit referenční metodu Společenství ke zjištění kravského mléka, aniž je dotčeno použití rutinních metod, pakliže splňují určitá kritéria. (9) Podle nařízení Komise (EHS) č. 2921/90 ze dne 10. října 1990 o podpoře výroby kaseinu a kaseinátů z odstředěného mléka ( 4 ) musí být stanovena nepřítomnost koliformních bakterií. Mezinárodně uznávanými referenčními metodami pro zjišťování koliformních bakterií v mléce a mléčných výrobcích je mezinárodní norma ISO 4831. Proto byla pro zjišťování koliformních bakterií stanovena referenční metoda Společenství založená na uvedené normě. (10) Nařízení Rady (EHS) č. 2658/87 ze dne 23. července 1987 o celní a statistické nomenklatuře a o společném celním sazebníku ( 5 ) stanoví různé celní sazby pro krmné směsi čísla 2309 celního sazebníku podle obsahu mléčných výrobků. Má-li být zajištěno jednotné používání příslušných pravidel, měla by se stanovit metoda analýzy ke zjištění obsahu laktosy, která bude povinná pro všechny členské státy, a za tímto účelem by se měla zvolit určitá obecně uznávaná metoda. (11) Nařízení (ES) č. 1255/1999 stanoví, že máslo a sušené odstředěné mléko určené k intervenci, jakož i sušené odstředěné mléko určené k použití jako krmivo, musí splňovat určité požadavky na jakost. Proto je třeba stanovit referenční metody, které umožní zjistit, zda jsou tyto požadavky plněny. (12) Některé metody v tomto nařízení se zavádějí poprvé. Od vstupu tohoto nařízení v platnost by měla být laboratořím poskytnuta dostatečná lhůta k tomu, aby tyto nové metody mohly správně zavést a používat. Kdykoli je referenční metoda uvedená v příloze I přezkoumána a zveřejněna Organizací pro vývoj norem, měly by mít laboratoře šest měsíců na to, aby své analytické postupy zaktualizovaly způsobem, který bude nové normě odpovídat. (13) Opatření tohoto nařízení jsou v souladu se stanoviskem Řídícího výboru pro mléko a mléčné výrobky, vzhledem k těmto důvodům: PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:







KAPITOLA I

OBECNÁ USTANOVENÍ

Článek 1

Předmět a oblast působnosti

1. Toto nařízení stanoví určité referenční metody pro chemickou, fyzikální a mikrobiologickou analýzu a organoleptické hodnocení mléka a mléčných výrobků v rámci režimů stanovených ve společné organizaci trhu s mlékem a mléčnými výrobky, kterou zavádí nařízení (ES) č. 1255/1999, a pravidla pro používání těchto metod.

2. Seznam referenčních metod použitelných pro analýzy uvedené v odstavci 1 je uveden v příloze I tohoto nařízení.

3. Komise aktualizuje uvedený seznam postupem podle článku 42 nařízení (ES) č. 1255/1999.

Článek 2

Rutinní metody

Pro analýzy stanovené právními předpisy Společenství lze používat rutinní metody za předpokladu, že jsou patřičně kalibrovány a pravidelně kontrolovány porovnáním s referenční metodou. Výsledky se srovnávají s přihlédnutím ke stálé odchylce, opakovatelnosti a reprodukovatelnosti.

V případě sporu je rozhodující výsledek získaný referenční metodou.

Členské státy informují Komisi o použití rutinních metod při analýze uvedené v článku 1.







KAPITOLA II

METODY ANALÝZY

Článek 3

Zhodnocení splnění zákonem stanovené mezní hodnoty s ohledem na šarži

K určení toho, zda byly splněny zákonem stanovené požadavky na složení, se kromě analýzy stopovacích látek použije příloha II tohoto nařízení.

Článek 4

Organoleptické hodnocení

1. Pokud jde o mléko a mléčné výrobky jiné než máslo určené k veřejnému skladování, členské státy použijí jako referenční metodu pro organoleptické hodnocení buď normu IDF 99C:1997 nebo jiné srovnatelné metody, které sdělí Komisi.

Práce posuzovatelů a spolehlivost výsledků organoleptických analýz se ověřují pomocí postupů uvedených v příloze III.

2. Pokud jde o máslo určené pro veřejné skladování, práce posuzovatelů a spolehlivost výsledků se ověřují pomocí postupů uvedených v příloze III.

Postup stanovený v příloze IV se použije jako referenční metoda pro organoleptické hodnocení.

Článek 5

Stopovací látky

1. Ke stanovení obsahu trigliceridu kyseliny enanthové v másle, máselném oleji a smetaně se jako referenční metoda použije metoda analýzy uvedená v příloze V.

2. Ke stanovení obsahu vanilinu v zahuštěném másle, másle a smetaně se jako referenční metoda použije metoda analýzy uvedená v příloze VI.

3. Ke stanovení obsahu ethylesteru beta-apo-8’karotenové kyseliny v zahuštěném másle a másle se jako referenční metoda použije metoda analýzy uvedená v příloze VII.

4. Ke stanovení obsahu β-sitosterolu nebo stigmasterolu v zahuštěném másle a másle se jako referenční metoda použije metoda analýzy uvedená v příloze VIII.

5. Pokud získané výsledky odpovídají technickým specifikacím bodu 10 a 11 přílohy V a bodu 8 příloh VI, VII a VII, má se za to, že stopovací látky byly do zahuštěného másla, másla a smetany přidány v souladu s příslušnými právními předpisy Společenství.

Článek 6

Zjišťování kaseinu z kravského mléka

1. Je nutné zaručit, že sýry vyráběné výhradně z ovčího mléka, kozího mléka či buvolího mléka, nebo ze směsi ovčího, kozího a buvolího mléka neobsahují kasein z kravského mléka, a za tímto účelem se použije referenční metoda analýzy uvedená v příloze IX.

Přítomnost kaseinu z kravského mléka se považuje za prokázanou, pokud obsah kaseinu z kravského mléka v analyzovaném vzorku je stejný nebo vyšší v porovnání s obsahem v referenčním vzorku obsahujícím 1 % kravského mléka, který je uveden v příloze IX.

2. Rutinní metody ke zjišťování kaseinu z kravského mléka v sýrech uvedených v odstavci 1 mohou být používány za těchto podmínek:

a) jejich detekční limit musí být nejvýše 0,5 %;

b) jejich výsledky nesmí být falešně pozitivní;

c) musí umožňovat detekci kaseinu z kravského mléka s požadovanou citlivostí i po dlouhé době zrání, k čemuž může za běžných obchodních podmínek docházet.

Není-li jeden z výše uvedených požadavků splněn, použijí se referenční metody uvedené v příloze IX.

Článek 7

Zjišťování koliformních bakterií

Koliformní bakterie v másle, sušeném odstředěném mléce, kaseinu a kaseinátech se zjišťují podle referenční metody uvedené v příloze X.

Článek 8

Stanovení obsahu laktózy

Obsah laktózy ve výrobcích kódu KN 2309 se stanoví podle referenční metody uvedené v příloze XI.

Článek 9

Zjišťování syřidlové syrovátky

1. Syřidlová syrovátka v sušeném odstředěném mléce určeném pro veřejné skladování se zjišťuje podle referenční metody uvedené v příloze XII.

2. Syřidlová syrovátka v sušeném odstředěném mléce a směsích určených k použití jako krmivo se zjišťuje podle referenční metody uvedené v příloze XII. V případě zjišťování syřidlové syrovátky by se měla použít příloha XIII.

Článek 10

Zjišťování podmáslí

Podmáslí v sušeném odstředěném mléce se zjišťuje podle referenční metody uvedené v příloze XIV.

Článek 11

Zjišťování antimikrobiálních reziduí

Antimikrobiální rezidua v sušeném odstředěném mléce se zjišťují podle referenční metody uvedené v příloze XV.

Článek 12

Stanovení obsahu sušeného odstředěného mléka

Obsah sušeného odstředěného mléka v krmných směsích se stanoví podle referenční metody uvedené v příloze XVI.

Článek 13

Zjišťování škrobu

Škrob v odstředěném mléce, denaturovaném sušeném mléce a krmných směsích se zjišťuje podle referenční metody uvedené v příloze XVII.

Článek 14

Stanovení obsahu vlhkosti v sušené smetaně

Obsah vlhkosti v sušené smetaně se stanoví podle referenční metody uvedené v příloze XVIII.

Článek 15

Stanovení obsahu vlhkosti v sušeném kysaném podmáslí

Obsah vlhkosti v sušeném kysaném podmáslí určeném pro použití v krmivech se stanoví podle referenční metody uvedené v příloze XIX.

Článek 16

Stanovení čistoty mléčného tuku

Čistota mléčného tuku se stanoví podle referenční metody uvedené v příloze XX.







KAPITOLA III

OBECNÁ A ZÁVĚREČNÁ USTANOVENÍ

Článek 17

Zajištění jakosti

Analýzy provádějí laboratoře se zavedeným systémem zajištění analytické jakosti a se zavedenými postupy vnitřní kontroly jakosti. Neakreditované laboratoře se účastní programů zkoušek odborné způsobilosti alespoň jednou ročně, přičemž se jejich výsledky neodchýlí o více než 2σR (směrodatná odchylka reprodukovatelnosti referenční metody) od dohodnuté hodnoty. V laboratoři je k dispozici k nahlédnutí podrobný popis použitých systémů.

Laboratoře akreditované podle norem uvedených v článku 12 nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 ze dne 29. dubna 2004 o úředních kontrolách za účelem ověření dodržování právních předpisů týkajících se krmiv a potravin a pravidel o zdraví zvířat a dobrých životních podmínkách zvířat ( 6 ) jsou od účasti ve zkouškách odborné způsobilosti osvobozeny.

Článek 18

Odběr vzorků a námitky proti výsledkům analýzy

1. Odběr vzorků se provádí v souladu s příslušným nařízením pro posuzovaný výrobek. Neexistují-li žádná ustanovení pro odběr vzorku, použije se ustanovení uvedené v normě ISO 707 IDF 50, Mléko a mléčné výrobky – Směrnice pro odběr vzorků.

2. Laboratorní zprávy o výsledcích analýz musí obsahovat dostatečné údaje, které umožní hodnocení výsledků podle přílohy II a přílohy XXI.

3. Pro analýzy stanovené v právních předpisech Společenství se musí odebírat duplicitní vzorky.

4. V případě, že hospodářský subjekt nesouhlasí s výsledky určité analýzy, použije se postup popsaný v příloze XXI.

5. Jestliže výrobce do pěti pracovních dnů po odběru vzorků prokáže, že postup při odběru vzorků nebyl správný, odběr vzorků se musí v rámci možností zopakovat. Pokud odběr vzorků zopakovat nelze, musí být šarže přijata.

▼M1 —————

▼M1

Článek 19a

Oznamování

Oznámení uvedená v článku 2, čl. 4 odst. 1 a příloze III C se provádějí v souladu s nařízením Komise (ES) č. 792/2009 ( 7 ).

▼B

Článek 20

Zrušující ustanovení

Nařízení (ES) č. 213/2001 se zrušuje.

Odkazy na zrušené nařízení se považují za odkazy na toto nařízení v souladu se srovnávací tabulkou v příloze XXII.

Článek 21

Vstup v platnost

Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.

Použije se ode dne 31. března 2008.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.









PŘÍLOHA I

(Článek 1)

SEZNAM REFERENČNÍCH METOD

Seznam zkratek min. = minimum, max. = maximum, příloha = příloha citovaného nařízení, TPS = tukoprostá sušina, PČ = peroxidové číslo, V = vzhled, CH = chuť, K = konzistence, CPB = celkový počet bakterií, term. = počet termofilních bakterií, ČS = členský stát, IDF = Mezinárodní mlékárenská federace, ISO = Mezinárodní organizace pro normalizaci, IUPAC = Mezinárodní unie čisté a aplikované chemie, ADPI = Americký ústav mléčných výrobků, SKM = slazené kondenzované mléko, ZMS = zahuštěné mléko nebo smetana.







ČÁST A Nařízení Komise Produkt Parametr Mezní hodnota (1) Referenční metoda Poznámka Nařízení (ES) č. 2771/1999 – Veřejné skladování Nesolené máslo Tuk Min. 82 % hm. ISO 17189:2003IDF 194:2003 Voda Až 16 % hm. ISO 3727–1:2001IDF 80–1:2001 TPS Až 2 % hm. ISO 3727–2:2001IDF 80–2:2001 Kyselost tuku 1,2 mmol/100 g tuku ISO 1740:2004IDF 6:2004 PČ (max.) 0,3 mekv. O2/1 000 g tuku ISO 3976:2006IDF 74:2006 Poznámka 1 Koliformní bakterie Nezjistitelné v 1 g Příloha X Poznámka 3 Nemléčný tuk Nezjistitelný analýzou triglyceridů Příloha XX Stopovací látky: steroly Nezjistitelné, β-sitosterol ≤ 40 mg/kg Příloha VIII Jiné stopovací látky — vanilin Nezjistitelný Příloha VI — ethylester kyseliny karotenové ≤ 6 mg/kg Příloha VII — triglyceridy kyseliny enanthové Nezjistitelné Příloha V Organoleptické vlastnosti Nejméně 4 body z 5 pro A, F a C Příloha IV Vodní disperze Nejméně 4 body ISO 7586:1985 – IDF 112A:1989 Nařízení (ES) č. 2771/1999 – Soukromé skladování Nesolené máslo Tuk Min. 82 % hm. ISO 17189:2003IDF 194:2003 Voda Až 16 % hm. ISO 3727–1:2001IDF 80–1:2001 TPS Až 2 % hm. ISO 3727–2:2001IDF 80–2:2001 Nařízení (ES) č. 2771/1999 – Soukromé skladování Solené máslo Tuk Min. 80 % hm. ISO 17189:2003IDF 194:2003 Voda Až 16 % hm. ISO 3727–1:2001IDF 80–1:2001 TPS (s výjimkou soli) Až 2 % hm. ISO 3727–2:2001IDF 80–2:2001 Sůl Až 2 % hm. ISO 15648:2004IDF 179:2004 Kapitola II nařízení (ES) č. 1898/2005 Nesolené máslo Tuk Min. 82 % hm. ISO 17189:2003IDF 194:2003 Nemléčný tuk Příloha XX Voda Až 16 % hm. ISO 3727–1:2001IDF 80–1:2001 TPS Až 2 % hm. ISO 3727–2:2001IDF 80–2:2001 Stopovací látky: — steroly Viz příloha VIII Příloha VIII — vanilin Viz příloha VI Příloha VI — ethylester kyseliny karotenové Viz příloha VII Příloha VII — triglyceridy kyseliny enanthové Viz příloha V Příloha V Kapitola II nařízení (ES) č. 1898/2005 Solené máslo Tuk Min. 80 % hm. ISO 17189:2003IDF 194:2003 Nemléčný tuk Příloha XX Voda Až 16 % hm. ISO 3727–1:2001IDF 80–1:2001 TPS (s výjimkou soli) Až 2 % hm. ISO 3727–2:2001IDF 80–2:2001 Sůl Až 2 % hm. ISO 15648:2004IDF 179:2004 Stopovací látky: — steroly Viz příloha VIII Příloha VIII — vanilin Viz příloha VI Příloha VI — ethylester kyseliny karotenové Viz příloha VII Příloha VII — triglyceridy kyseliny enanthové Viz příloha V Příloha V Kapitola II nařízení (ES) č. 1898/2005 Zahuštěné máslo Tuk Min. 99,8 % hm. IDF 24:1964 Voda a TPS Až 0,2 % hm. ISO 5536:2002IDF 23:2002 (vlhkost) IDF 24:1964 (TPS) Kyselost tuku 1,2 mmol/100 g tuku ISO 1740:2004IDF 6:2004 PČ (max.) 0,5 mekv. O2/1 000 g tuku ISO 3976:2006IDF 74:2006 Poznámka 1 Nemléčný tuk Nepřítomnost Příloha XX Chuť Čistá Vůně Nepřítomnost cizích vůní Jiné Nepřítomnost neutralizačních činidel, antioxidantů a konzervačních činidel Stopovací látky: — steroly Viz příloha VIII Příloha VIII — vanilin Viz příloha VI Příloha VI — ethylester kyseliny karotenové Viz příloha VII Příloha VII — triglyceridy kyseliny enanthové Viz příloha V Příloha V Kapitola II nařízení (ES) č. 1898/2005 Smetana Tuk Minimálně 35 % hm. ISO 2450:1999 – IDF 16 C:1987 Nemléčný tuk Příloha XX Stopovací látky: — steroly Viz příloha VIII Poznámka 2 — vanilin Viz příloha VI Příloha VI — ethylester kyseliny karotenové Viz příloha VII Poznámka 2 — triglyceridy kyseliny enanthové Viz příloha V Příloha V Kapitola III nařízení (ES) č. 1898/2005 Zahuštěné máslo Tuk Min. 96 % hm. Poznámka 2 Nemléčný tuk Příloha XX TPS Až 2 % hm. Poznámka 2 Stopovací látky: — stigmasterol (95 % hm.) 15 g/100 g zahuštěného másla Příloha VIII — stigmasterol (85 % hm.) 17 g/100 g zahuštěného másla Příloha VIII — triglyceridy kyseliny enanthové 10,34 kg/t zahuštěného másla Příloha V — ethylester kyseliny máselné a stigmasterol — ethylester kyseliny máselné — stigmasterol: Příloha VIII Poznámka 2 — ethylester kyseliny máselné a triglyceridy kyseliny enanthové — ethylester kyseliny máselné — triglyceridy kyseliny enanthové: Příloha V Poznámka 2 lecitin (E 322) Až 0,5 % hm. Poznámka 2 NaC1 Až 0,75 % hm. ISO 15648:2004IDF 179:2004 Kyselost tuku 1,2 mmol/100 g tuku ISO 1740:2004IDF 6:2004 PČ (max.) Až 0,5 mekv. O2/1 000 g tuku ISO 3976:2006IDF 74:2006 Poznámka 1 Chuť Čistá Vůně Nepřítomnost cizích vůní Jiné Nepřítomnost neutralizačních činidel, antioxidantů a konzervačních činidel Kapitola IV nařízení (ES) č. 1898/2005 Nesolené máslo Tuk Min. 82 % hm. ISO 17189:2003IDF 194:2003 Voda Až 16 % hm. ISO 3727–1:2001IDF 80–1:2001 TPS Až 2 % hm. ISO 3727–2:2001IDF 80–2:2001 Kapitola IV nařízení (ES) č. 1898/2005 Solené máslo Tuk Min. 80 % hm. ISO 17189:2003IDF 194:2003 Voda Až 16 % hm. ISO 3727–1:2001IDF 80–1:2001 TPS (s výjimkou soli) Až 2 % hm. ISO 3727–2:2001IDF 80–2:2001 Sůl Až 2 % hm. ISO 15648:2004IDF 179:2004 Článek 9 a hlava II nařízení (ES) č. 1255/1999 Sýry vyráběné z ovčího a/nebo kozího mléka Kravské mléko < 1 % hm. Příloha IX Nařízení (EHS) č. 2921/90 Příloha I – Kyselý kasein Voda Až 12,00 % hm. ISO 5550:2006IDF 78:2006 Tuk Až 1,75 % hm. ISO 5543:2004IDF 127:2004 Volné kyseliny Až 0,30 ml 0,1 N roztoku NaOH/g ISO 5547:1978 – IDF 91:1979 Nařízení (EHS) č. 2921/90 Příloha I – Sladký kasein Voda Až 12,00 % hm. ISO 5550:2006IDF 78:2006 Tuk Až 1,00 % hm. ISO 5543:2004IDF 127:2004 Popeloviny Min. 7,50 % hm. ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 Nařízení (EHS) č. 2921/90 Příloha I – Kaseináty Voda Až 6,00 % hm. ISO 5550:2006IDF 78:2006 Mléčná bílkovina Min. 88,00 % hm. ISO 5549:1978 – IDF 92:1979 Tuk a popeloviny Až 6,00 % hm. ISO 5543:2004IDF 127:2004 Vázané popeloviny ISO 5544:1978 – IDF 89:1979 Popeloviny ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 Nařízení (EHS) č. 2921/90 Příloha II – Kyselý kasein Voda Až 10,00 % hm. ISO 5550:2006IDF 78:2006 Tuk Až 1,50 % hm. ISO 5543:2004IDF 127:2004 Volné kyseliny Až 0,20 ml 0,1 N roztoku NaOH/g ISO 5547:1978 – IDF 91:1979 CPB (max.) 30 000/g ISO 4833:2003 Poznámka 3 Koliformní bakterie Nepřítomnost v 0,1 g Příloha X Poznámka 3 Term. (max.) 5 000/g ISO 4833:2003 Poznámky 3 a 4 Nařízení (EHS) č. 2921/90 Příloha II – Sladký kasein Voda Až 8,00 % hm. ISO 5550:2006IDF 78:2006 Tuk Až 1,00 % hm. ISO 5543:2004IDF 127:2004 Popeloviny Min. 7,50 % hm. ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 CPB (max.) 30 000/g ISO 4833:2003 Poznámka 3 Koliformní bakterie Nepřítomnost v 0,1 g Příloha X Poznámka 3 Term. (max.) 5 000/g ISO 4833:2003 Poznámky 3 a 4 Nařízení (EHS) č. 2921/90 Příloha II – Kaseináty Voda Až 6,00 % hm. ISO 5550:2006IDF 78:2006 Mléčná bílkovina Min. 88,00 % hm. ISO 5549:1978 – IDF 92:1979 Tuk a popeloviny Až 6,00 % hm. ISO 5543:2004IDF 127:2004 ISO 5544:1978 – IDF 89:1979 nebo ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 CPB (max.) 30 000/g ISO 4833:2003 Poznámka 3 Koliformní bakterie Nepřítomnost v 0,1 g Příloha X Poznámka 3 Term. (max.) 5 000/g ISO 4833:2003 Poznámky 3 a 4 Nařízení (EHS) č. 2921/90 Příloha III – Kaseináty Voda Až 6,00 % hm. ISO 5550:2006IDF 78:2006 Mléčná bílkovina Min. 85,00 % hm. ISO 5549:1978 – IDF 92:1979 Tuk Až 1,50 % hm. ISO 5543:2004IDF 127:2004 Laktóza Až 1,00 % hm. ISO 5548:2004IDF 106:2004 Popeloviny Až 6,50 % hm. ISO 5544:1978 – IDF 89:1979 nebo ISO 5545:1978 – IDF 90:1979 CPB (max.) 30 000/g ISO 4833:2003 Poznámka 3 Koliformní bakterie Nepřítomnost v 0,1 g Příloha X Poznámka 3 Term. (max.) 5 000/g ISO 4833:2003 Poznámky 3 a 4 Nařízení (ES) č. 2799/1999 Krmné směsi a sušené odstředěné mléko (SOM) (pro použití v krmivech) Voda (sušené kysané podmáslí) Až 5 % hm. Příloha XIX Bílkoviny 31,4 % hm. (min.) v tukoprosté sušině ISO 8968–123:2001IDF 20–123:2001 Voda (SOM) Až 5 % hm. ISO 5537:2004IDF 26:2004 Tuky (SOM) Až 11 % hm. ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 Syřidlová syrovátka (SOM) Nepřítomnost Příloha XIII Poznámka 6 Škrob (SOM) Nepřítomnost Příloha XVII Voda (směsi) Až 5 % v tukoprosté sušině ISO 5537:2004IDF 26:2004 Tuk (směsi) Směrnice Komise 84/4/EHS (Úř. věst. L 15, 18.1.1984, s. 29) Syřidlová syrovátka (směsi) Nepřítomnost Příloha XIII Obsah SOM (v konečném výrobku) Min. 50 % hm. Příloha XVI Tuk (v konečném výrobku) Min. 2,5 % hm. nebo 5 % hm. Směrnice Komise 84/4/EHS (Úř. věst. L 15, 18.1.1984, s. 29) Poznámka 7 Škrob (v konečném výrobku) Min. 2 % hm. Příloha XVII Poznámka 8 Měď (v konečném výrobku) 25 ppm Směrnice Komise 78/633/EHS (Úř. věst. L 206, 26.7.1987, s. 43) Nařízení (ES) č. 214/2001 SOM (sušené rozprašováním) Tuk Až 1,0 % hm. ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 Bílkoviny 31,4 % (2)hm. (min.) v tukoprosté sušině ISO 8968–1/2:2001IDF 20–1/2:2001 Voda Až 3,5 % hm. ISO 5537:2004IDF 26:2004 Kyselost Až 19,5 ml, 0,1 N NaOH, 10 g tukoprosté sušiny ISO 6091:1980 – IDF 86:1981 Mléčnany Až 150 mg/100 g tukoprosté sušiny ISO 8069:2005IDF 69:2005 Fosfatáza Negativní ISO 11816–1:2006IDF 155–1:2006 Index nerozpustnosti Až 0,5 ml při 24 °C ISO 8156:2005IDF 129:2005 Připálené částice Filtr A nebo B (15,0 mg) ADPI (1990) CPB 40 000/g ISO 4833:2003 Poznámka 3 Koliformní bakterie Negativní/0,1 g Příloha X Poznámka 3 Podmáslí Negativní Příloha XIV Syřidlová syrovátka Negativní Příloha XII Kyselá syrovátka Negativní Poznámka 2 Antimikrobiální látky Příloha XV (1) Aniž jsou dotčeny požadavky v příslušném nařízení. (2) Minimální obsah bílkovin bude od 1. září 2009 činit 34 %.







ČÁST B Referenční metody uvedené v části B mohou být používány pro analýzu produktů, na které se vztahuje jakékoliv z nařízení uvedených ve sloupci 1. Nařízení Komise Produkt Kód KN Parametr Mezní hodnota Referenční metoda Poznámka Nařízení (EHS) č. 2658/87 Nařízení (ES) č. 2535/2001 Nařízení (ES) č. 1282/2006 Mléko a smetana, nezahuštěné, neobsahující přidaný cukr ani jiná sladidla 0401 Tuk (≤ 6 % hm.) Mezní hodnoty jsou hodnoty stanovené v popisu kódu KN pro konkrétní produkt a případně blíže určené v nařízení Komise (EHS) č. 3846/87 (Úř. věst. L 366, 24.12.1987, s. 1), části 9 vývozní nomenklatury, nebo nařízení (ES) č. 2535/2001 (Úř. věst. L 341, 22.12.2001, s. 29). ISO 1211:2001 – IDF 1D:1996 Tuk (> 6 % hm.) ISO 2450:1999 – IDF 16C:1987 Mléko a smetana, zahuštěné nebo obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla 0402 Tuk (v tekuté formě) ISO 1737:1999 – IDF 13C:1987 Tuk (v tuhé formě) ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 Bílkoviny ISO 8968–123:2001IDF 20–123:2001 Sacharóza (normální obsah) ISO 2911:2004IDF 35:2004 Sacharóza (nízký obsah) Poznámka 2 Sušina (SKM) ISO 6734:1989 – IDF 15B:1991 Sušina (ZMS) ISO 6731:1989 – IDF 21B:1987 Voda (sušené mléko) ISO 5537:2004/IDF 26:2004 Voda (sušená smetana) Příloha XVIII Podmáslí, fermentované (kysané) nebo acidofilní mléko a smetana, zahuštěné nebo nezahuštěné, obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla 0403 Tuk ISO 1211:2001 – IDF 1D:1996 ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 ISO 2450:1999 – IDF 16C:1987 ISO 7208:1999 – IDF 22B:1987 ISO 8262–3:2005 – IDF 124–3:2005 Bílkoviny ISO 8968–123:2001IDF 20–123:2001 Sacharóza (normální obsah) ISO 2911:2004IDF 35:2004 Sacharóza (nízký obsah) Poznámka 2 Voda (sušené kysané podmáslí) Příloha XIX Voda (sušené sladké podmáslí) ISO 5537:2004IDF 26:2004 Sušina (ostatní produkty) Metody schválené příslušným orgánem Syrovátka, též zahuštěná nebo obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla; výrobky sestávající z přírodních složek mléka 0404 Tuk ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 ISO 2450:1999 – IDF 16C:1987 ISO 7208:1999 – IDF 22B:1987 Bílkoviny ISO 8968–123:2001IDF 20–123:2001 Sacharóza (normální obsah) ISO 2911:2004IDF 35:2004 Sacharóza (nízký obsah) Poznámka 2 0404 90 Bílkoviny ISO 8968 1/2 2001IDF 20–1/2:2001 Voda IDF 21B:1987 Sušina ISO 6734:1989 – IDF 15B:1991 (Zahuštěné výrobky) ISO 6731:1989 – IDF 21B:1987 Máslo a jiné tuky získané z mléka; mléčné pomazánky 0405 Tuk (je-li ≤ 85 % hm.) ISO 17189:2003IDF 194:2003 Máslo Voda ISO 3727–1:2001IDF 80–1:2001 TPS ISO 3727–2:2001IDF 80–2:2001 NaCl ISO 15648:2004IDF 179:2004 Tuk (je-li > 99 % hm.) IDF 24:1964 Máselný olej Voda (je-li tuk < 99 % hm.) ISO 5536:2002IDF 23:2002 Sýry a tvaroh 0406 Tuk ISO 1735:2004IDF 5:2004 Sušina ISO 5534:2004IDF 4:2004 Sušina (Ricotta) ISO 2920:2004IDF 58:2004 NaCl ISO 5943:2006IDF 88:2006 Laktóza ISO 5765–1/2:2002IDF 79–1/2:2002 Nařízení (EHS) č. 2658/87 Krmné směsi 2309 Laktóza Příloha XI

Poznámky k seznamu referenčních metod Evropské unie:

Poznámka 1: Izolace mléčného tuku podle popisu v normě ISO 1740:1991 (ochrana před světlem).

Poznámka 2: Nebyla stanovena žádná referenční metoda. Metody schválené příslušným orgánem.

Poznámka 3: Vzorek je nutno připravit podle normy ISO 8261:2001IDF 122:2001.

Poznámka 4: Inkubace po dobu 48 hodin při teplotě 55 °C; je třeba zabránit vyschnutí živné půdy kultury.

Poznámka 5: % hm. TPS = % hm. sušiny – % hm. tuku.

Poznámka 6: Směrnice Komise 84/4/EHS.

Poznámka 7: Nařízení Komise (ES) č. 2799/1999 (Úř. věst. L 340, 31.12.1999, s. 3-27).

Poznámka 8: Směrnice Komise 78/633/EHS.









PŘÍLOHA II

(Článek 3)

ZHODNOCENÍ SPLNĚNÍ ZÁKONEM STANOVENÉ MEZNÍ HODNOTY S OHLEDEM NA ŠARŽI

1. PODSTATA METODY

V případech, kdy příslušné právní předpisy stanoví podrobné postupy pro odběr vzorků, dodržují se tyto postupy. Ve všech ostatních případech se používá vzorek nejméně ze 3 jednotek vzorku odebraných náhodně ze šarže odevzdané ke kontrole. Lze připravit i složený vzorek. Získaný výsledek se porovná se zákonem stanovenými mezními hodnotami na základě výpočtu 95 % intervalu spolehlivosti jakožto dvojnásobku směrodatné odchylky, kde příslušná směrodatná odchylka závisí buď na tom, 1) zda byla metoda validována na základě mezinárodní spolupráce s hodnotami pro σr a σR, nebo v případě vnitrolaboratorní validace na tom, 2) zda byla vypočítána vnitřní reprodukovatelnost. Tento interval spolehlivosti se potom rovná nejistotě měření výsledku.

2. METODA JE VALIDOVÁNA NA ZÁKLADĚ MEZINÁRODNÍ SPOLUPRÁCE

V tomto případě byla směrodatná odchylka opakovatelnosti σr a směrodatná odchylka reprodukovatelnosti σR stanovena a laboratoř může prokázat soulad s pracovními charakteristikami validované metody.

Vypočítá se aritmetický průměr

n

Vypočítá se rozšířená nejistota (k = 2) z

Je-li konečný výsledek měření x vypočítán ze vzorce ve tvaru x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 nebo x = y 1 / y 2, musí se v takových případech postupovat podle běžných postupů pro kombinování směrodatných odchylek.

Šarže se považuje za nevyhovující horní zákonem stanovené mezní hodnotě UL, jestliže

;

jinak se má za to, že hodnotě UL vyhovuje.

Šarže se považuje za nevyhovující dolní zákonem stanovené mezní hodnotě LL, jestliže

;

jinak se má za to, že hodnotě LL vyhovuje.

3. VNITROLABORATORNÍ VALIDACE S VÝPOČTEM SMĚRODATNÉ ODCHYLKY VNITŘNÍ REPRODUKOVATELNOSTI

V případech, kdy jsou použity metody, které nejsou stanoveny v tomto nařízení, a kdy nebyla stanovena opatření pro zajištění shodnosti, je třeba provést vnitrolaboratorní validaci. Namísto σr a σ R se musí ve vzorci pro výpočet rozšířené nejistoty U použít směrodatná odchylka vnitřní opakovatelnosti sir a směrodatná odchylka vnitřní reprodukovatelnosti siR.

Pravidla rozhodování jsou stejná jako v bodě 1. Považuje-li se však šarže za nesplňující zákonem stanovenou mezní hodnotu, musí se měření opakovat pomocí metody stanovené v tomto nařízení a rozhodnutí musí být dosaženo podle bodu 1.









PŘÍLOHA III

(Článek 4)

HODNOCENÍ POSUZOVATEL Ů A SPOLEHLIVOST VÝSLEDKŮ ORGANOLEPTICKÝCH ANALÝZ

V případě použití bodovacích metod (norma IDF 99C: 1997) se použijí tyto postupy:

A. STANOVENÍ „UKAZATELE OPAKOVATELNOSTI“

Jeden posuzovatel musí během 12 měsíců analyzovat nejméně deset vzorků jako slepé duplikáty. Jednotlivé analýzy obvykle provádí v odlišných termínech. Výsledky týkající se charakteristických znaků jednotlivých produktů se vyhodnotí pomocí tohoto vzorce:

kde:

w1 : ukazatel opakovatelnosti

xi1 : počet bodů pro první hodnocení vzorku xi

xi2 : počet bodů pro druhé hodnocení vzorku xi

n : počet vzorků

Hodnocené vzorky musí představovat široký rozsah jakosti. Hodnota w1 nesmí překročit 1,5 bodu (na pětibodové stupnici).

B. STANOVENÍ „UKAZATELE ODCHYLEK“

Tento ukazatel se musí používat pro kontrolu, zda posuzovatel používá pro hodnocení jakosti stejnou stupnici jako zkušená skupina posuzovatelů. Počet bodů přidělených posuzovatelem se porovnává s průměrným počtem bodů, které přidělila skupina posuzovatelů.

Pro hodnocení výsledků se použije tento vzorec:

kde:

xi1; xi2 : viz část A

; : průměrný počet bodů skupiny posuzovatelů pro první a druhé hodnocení vzorku xi

n : počet vzorků (nejméně deset za 12 měsíců).

Hodnocené vzorky musí představovat široký rozsah jakosti. Hodnota DI nesmí překročit 1,5 bodu (na pětibodové stupnici).

Členské státy musí informovat o všech potížích, s nimiž se při používání tohoto postupu setkají.

Jestliže se zjistí, že ukazatele odchylek a opakovatelnosti u jednotlivých posuzovatelů překročí hranici 1,5 bodu, musí odborník (odborníci) příslušného orgánu provést jednu nebo několik náhodných „opakovaných“ kontrol na vzorcích jakostně setříděných během několika následujících týdnů, anebo musí s těmito posuzovateli provést jednu nebo několik „doprovázených“ kontrol. Důkladné sledování je nutné k rozhodnutí, zda nadále využívat jejich služeb. Zjištění musí být zaznamenána a uchována jako důkaz pro následná opatření.

C. POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ ZÍSKANÝCH V RŮZNÝCH REGIONECH ČLENSKÉHO STÁTU A V RŮZNÝCH ČLENSKÝCH STÁTECH

V případě potřeby musí být nejméně jednou za rok zorganizována zkouška, která umožní porovnat výsledky získané posuzovateli z různých regionů. Pokud se zjistí významné rozdíly, je třeba přijmout nezbytná opatření, aby byly zjištěny důvody těchto rozdílů a dosaženy srovnatelné výsledky.

Členské státy mohou organizovat zkoušky, které umožní porovnat výsledky získané jejich vlastními posuzovateli a posuzovateli ze sousedních členských států. V případě zjištění významných rozdílů je nutné provést důkladné šetření, aby byly dosaženy srovnatelné výsledky.

Členské státy sdělí výsledky těchto porovnání Komisi.









PŘÍLOHA IV

(Článek 4)

ORGANOLEPTICKÉ HODNOCENÍ MÁSLA

1. OBLAST POUŽITÍ

Cílem tohoto postupu organoleptického hodnocení másla je stanovit jednotnou metodu použitelnou ve všech členských státech.

K bližším podrobnostem viz platná mezinárodní norma IDF pro mléko a mléčné výrobky, IDF 99 –části 1, 2, 3 o organoleptickém hodnocení.

2. DEFINICE

„Organoleptickým hodnocením“ se rozumí posuzování vlastností produktů smyslovými orgány.

„Porotou“ se rozumí skupina vybraných posuzovatelů, kteří během hodnocení pracují, aniž by mezi sebou komunikovali nebo se vzájemně ovlivňovali.

„Posuzovatel“ je osoba zvolená pro svou schopnost provést organoleptickou zkoušku. Tento posuzovatel může mít omezené zkušenosti.

„Odborný posuzovatel“ je osoba s vysokým stupněm organoleptické citlivosti a se zkušenostmi s organoleptickými metodami, jež je schopná provádět soustavná a spolehlivá organoleptická hodnocení různých produktů. Tento posuzovatel má dlouhodobou smyslovou paměť.

„Bodovým hodnocením“ se rozumí organoleptické hodnocení, které vypracuje porota za použití číselné řady. Musí být používána nomenklatura vad.

„Tříděním“ se rozumí třídění podle jakosti prováděné na základě bodového hodnocení.

„Kontrolními dokumenty“ se rozumí dokumenty používané k zaznamenávání bodového hodnocení každé vlastnosti a konečné jakostní třídy produktu (v těchto dokumentech může být rovněž zapsáno chemické složení).

3. ZKUŠEBNÍ MÍSTNOST

K bližším podrobnostem viz normy ISO 8589 a ISO/DIS 22935–2 IDF 99–2 odstavec 7.

Musí být přijata opatření, aby ve zkušební místnosti nepůsobily na posuzovatele vnější faktory.

Zkušební místnost musí být prosta cizích pachů a musí být snadné ji udržovat v čistotě. Stěny musí mít světlou a nereflexní barvu.

Zkušební místnost a její osvětlení nesmějí ovlivňovat vlastnosti bodově hodnocených produktů.

Místnost musí být vybavena vhodnou regulací teploty, aby bylo možno zachovat stálou teplotu másla. Máslo by mělo mít v době třídění teplotu 12 °C (± 2 °C).

4. VÝBĚR POSUZOVATELŮ

Posuzovatel musí být dobře obeznámen s výrobky z másla a musí být způsobilý provádět organoleptické jakostní třídění. Jeho způsobilost musí pravidelně (nejméně jednou ročně) posuzovat příslušný orgán.

4.1 Bližší informace o obecných požadavcích a screeningových zkouškách, které lze použít před oficiálním použitím nového posuzovatele, jsou uvedeny v normě ISO/DIS 22935–1 IDF 99–1 odstavec 4 (nábor) a odstavec 5.1. Je nezbytně nutné, aby probíhalo školení a aby se pravidelně konaly valné hromady. Informace o školení poroty jsou uvedeny v normě ISO 8586–1.

4.2 Počáteční školení by mělo zahrnovat: — obecnou teorii a praktickou důležitost organoleptického hodnocení, — metody, stupnice a popis organoleptických dojmů, — zjištění a rozpoznání organoleptických vlastností a zvláštní organoleptické termíny, — základní školení o výrobě másla, — ověřené reference a vzorky, které posuzovateli pomohou stanovit určité chutě a jejich intenzitu v produktu.

5. POŽADAVKY KLADENÉ NA POROTU

Porota se musí skládat z lichého počtu posuzovatelů, a to nejméně tří. Většinu z nich musí tvořit zaměstnanci příslušného orgánu nebo schválené osoby, které nejsou zaměstnány v mlékárenském průmyslu.

Předseda poroty odpovídá za celkový postup a může být součástí poroty.

Před hodnocením je třeba vzít v úvahu řadu faktorů, aby členové poroty podali optimální výkon:

— členové poroty nesmějí trpět žádnou chorobou, která by ovlivnila jejich výkon. Pokud taková okolnost nastane, je třeba dotčeného posuzovatele nahradit v porotě jiným,

— členové poroty se k hodnocení musí dostavit včas a vyhradit si na provedení hodnocení dostatek času,

— členové poroty nesmějí používat silně vonící látky jako parfém, vodu po holení, deodorant atd., ani jíst silně aromatizovaná (např. silně kořeněná) jídla atd.,

— členové poroty nesmějí poslední půl hodinu před hodnocením kouřit, jíst ani pít nic jiného než vodu.

6. VÝKONNOST

Všichni posuzovatelé se musí účastnit pravidelných organoleptických porot, aby si udrželi svou kvalifikaci. Častost zasedání porot závisí na objemu a množství másla; je-li to možné, měla by každý měsíc zasednout alespoň jedna porota.

Několika zasedání porot by se každý rok měli účastnit i zkušení posuzovatelé, a to alespoň jednou za čtvrt roku, je-li to možné.

7. ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ

Je nezbytné, aby během hodnocení nebyla známa totožnost vzorků a aby se tak zabránilo případné zaujatosti. Vzorky by měly být označeny kódy.

Odběr a přípravu vzorků je nutno zorganizovat před začátkem hodnocení. Musí se stanovit požadavek na teplotu másla během přepravy do zkušební místnosti (6 °C ± 2 °C).

Pokud se organoleptické hodnocení provádí v chladírenském skladu, vzorek se odebírá pomocí máslové sondy. Pokud se organoleptické hodnocení provádí na jiném místě než v chladírenském skladu, je třeba odebrat vzorek nejméně o hmotnosti 500g. Během hodnocení by máslo mělo mít teplotu 12 °C (± 2 °C) (viz teplota pro hodnocení másla, jež je v normě ISO/DIS 22935–2 IDF 99–2 stanovená na 14 °C ± 2 °C). Větším odchylkám od této teploty je nutno za každou cenu zabránit.

8. POSOUZENÍ HODNOTY KAŽDÉ VLASTNOSTI

8.1 Organoleptické hodnocení musí být provedeno u třech následujících vlastností: vzhledu, konzistence a chuti. „Vzhled“ se týká těchto znaků: barvy, zjevné čistoty, nepřítomnosti fyzického znečištění, nepřítomnosti tvorby plísní a stejnoměrnosti vodní disperze. Vodní disperze se testuje podle normy IDF 112A/1989. „Konzistence“ se týká těchto znaků: struktury, textury a tuhosti. Pokud si tak členský stát přeje v zájmu uspokojení požadavků zákazníků, může pomocí fyzikálních prostředků sledovat roztíratelnost. Komise může rozhodnout, že tyto metody v budoucnu harmonizuje. „Struktura“ je termín, kterým se označuje soudržnost produktu při konzumaci. Obvykle se spojuje s tuhostí a roztíratelností, přičemž by měla být v celém produktu stejnoměrná. Úzce souvisí s texturou a označuje schopnost produktu držet tvar pod vlastní vahou. Projevuje se odolností při krájení a lze ji měřit mechanicky a pocitem v ústech a mezi prsty. „Chuť“ je vlastnost, kterou vnímáme v ústech, a to zejména chuťovými pohárky na jazyku. „Vůně“ je vlastnost, kterou vnímáme nosem a čichem. Významná odchylka od doporučené teploty brání tomu, aby konzistence a chuť byly spolehlivě ohodnoceny. Teplota má klíčový význam. Jestliže je teplota mimo doporučené rozmezí, musí být třídění másla odloženo.

8.2 Organoleptické hodnocení každé vlastnosti musí být prováděno samostatně. Bodové hodnocení se musí provádět podle tabulky 1.

8.3 Může být žádoucí, aby v zájmu jednotnosti posuzovatelé před zahájením hodnocení společně přidělili body jednomu nebo více referenčním vzorkům za vzhled, konzistenci a chuť.

8.4 Počet bodů nutných pro přijetí je stanoven takto: Viz část 7 – Nomenklatura a popis kritérií týkajících se bodů při bodování.



Maximum Požadavek Vzhled 5 4 Konzistence 5 4 Chuť/vůně 5 4 — Pokud není dosažen požadovaný počet bodů, musí být uveden popis vady. — Počet bodů od každého posuzovatele pro každou vlastnost musí být zapsán do kontrolního dokumentu. — Produkt je přijat, nebo zamítnut na základě rozhodnutí většiny. — Případy, kdy jsou rozdíly mezi jednotlivými bodovými hodnoceními každé vlastnosti větší než jeden bod, by se neměly vyskytovat často (nejvýše jednou u každých 20 vzorků). V opačném případě musí předseda poroty prověřit způsobilost poroty.

9. DOZOR

Předseda poroty, jenž musí být řádným zaměstnancem příslušného orgánu a může být členem poroty, musí nést obecnou odpovědnost za celý postup. Je povinen zapisovat bodové hodnocení každé vlastnosti do kontrolního dokumentu a potvrdit, zda je produkt přijat, nebo zamítnut.

10. NOMENKLATURA

Viz tabulka 2 uvedená v příloze.

11. NORMATIVNÍ ODKAZY

FIL-IDF 99C:1997 Senzorické hodnocení mléčných výrobků bodovým hodnocením – Referenční metoda

ISO/DIS 22935 IDF 99 Mezinárodní norma pro mléko a mléčné výrobky – Senzorická analýza – Části 1–3

ISO 8586–1 Senzorická analýza – Obecná směrnice pro výběr, výcvik a sledování činnosti posuzovatelů – Část 1

ISO 8589 Senzorická analýza – Obecná směrnice pro uspořádání senzorického pracoviště

FIL-IDF 112A:1989 Máslo – Stanovení hodnoty vodní disperze







Tabulka 1 Bodové hodnocení másla Vzhled Konzistence Chuť + vůně Body Č. (1) Poznámky Body (jakostní třída) Č. (1) Poznámky Body (jakostní třída) Č. (1) Poznámky 5 Velmi dobrý ideální druh nejvyšší jakost (rovnoměrný suchý) 5 Velmi dobrá ideální druh nejvyšší jakost (dobře roztíratelné) 5 Velmi dobré ideální druh nejvyšší jakost (absolutně čisté nejjemnější aroma) 4 Dobrý (2) bez zjevných vad 4 17 18 Dobrá (2) tvrdá měkká 4 Dobré (2) bez zjevných vad 3 1 2 3 4 5 6 7 8 Uspokojivý (drobné vady) vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody nejednotné barvy, dvojbarevný pruhovaný žilkovaný, mramorovaný skvrnitý oddělování oleje nadměrné vybarvení porézní textura 3 14 15 16 17 18 Uspokojivá (drobné vady) drobivá, křehká, hrudky pastovitá, těstovitá, mazlavá lepivá tvrdá měkká 3 21 22 25 27 33 34 35 Uspokojivé (drobné vady) nevýrazné cizí chuť kyselé chuť po vaření, připálená chuť chuť krmiva trpké, hořké přesolené 2 1 3 4 5 6 10 11 12 Špatný (zjevné vady) vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody pruhovaný žilkovaný, mramorovaný skvrnitý oddělování oleje cizí látky plesnivý nerozpuštěná sůl 2 14 15 16 17 18 Špatná (zjevné vady) drobivá, křehká, hrudky pastovitá, těstovitá, mazlavá lepivá tvrdá měkká 2 21 22 23 25 32 33 34 35 36 38 Špatné (zjevné vady) nevýrazné cizí chuť zvětralé kyselé oxidovaná, kovová chuť chuť krmiva trpké, hořké přesolené zatuchlé, hnilobné po chemikáliích 1 1 3 4 5 6 7 9 10 11 12 Velmi špatný (závažné vady) vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody pruhovaný žilkovaný, mramorovaný skvrnitý oddělování oleje nadměrné vybarvení zrnitý cizí látky plesnivý nerozpuštěná sůl 1 14 15 16 17 18 Velmi špatná (závažné vady) drobivá, křehká, hrudky pastovitá, těstovitá, mazlavá lepivá tvrdá měkká 1 22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38 Velmi špatné (závažné vady) cizí chuť sýrovité, mléčně sýrové kyselé po kvasnicích po plísni žluklé olejovité, rybina lojovité oxidovaná, kovová chuť trpké, hořké přesolené zatuchlé, hnilobné po sladu po chemikáliích (1) Tabulka 2. (2) Vady uvedené pod hodnocením „dobrý“ představují pouze velmi malé odchylky od ideálního druhu.







Tabulka 2 Tabulka vad másla I. Vzhled 1. vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody 2. nejednotné barvy, dvojbarevný 3. pruhovaný 4. žilkovaný, mramorovaný 5. skvrnitý 6. oddělování oleje 7. nadměrné vybarvení 8. porézní textura 9. zrnitý 10. cizí látky 11. plesnivý 12. nerozpuštěná sůl II. Konzistence 14. drobivá, křehká, hrudky 15. pastovitá, těstovitá, mazlavá 16. lepivá 17. tvrdá 18. měkká III. Chuť a vůně 20. bez chuti 21. nevýrazné (1) 22. cizí chuť 23. zvětralé 24. sýrovité, mléčně sýrové 25. kyselé 26. po kvasnicích 27. a) chuť po vaření b) připálená chuť 28. po plísni 29. žluklé 30. olejovité, rybina 31. lojovité 32. a) oxidovaná chuť b) kovová chuť 33. chuť krmiva 34. trpké, hořké 35. přesolené 36. zatuchlé, hnilobné 37. po sladu 38. po chemikáliích (1) Toto označení je třeba používat co nejméně a jen tehdy, nelze-li vadu popsat přesněji.









PŘÍLOHA V

(Článek 5)

STANOVENÍ OBSAHU TRIGLYCERIDU KYSELINY ENANTHOVÉ V MÁSLE, MÁSELNÉM OLEJI A SMETANĚ PLYNOVOU CHROMATOGRAFICKOU ANALÝZOU TRIGLYCERIDŮ

1. OBLAST POUŽITÍ

Tento postup vymezuje metodu stanovení obsahu triglyceridu kyseliny enanthové v máselném oleji, másle a smetaně.

2. TERMÍNY A DEFINICE

Obsah kyseliny enanthové: obsah triglyceridu kyseliny enanthové stanovený postupem uvedeným v této metodě.

Poznámka: Obsah kyseliny enanthové se vyjadřuje v kilogramech na tunu výrobku v případě máselného oleje a másla a v kilogramech na tunu mléčného tuku v případě smetany.

3. PODSTATA METODY

V souladu s normou ISO 14156 IDF 172:2001 se z různých výrobků extrahuje mléčný tuk. Kvantitativní stanovení obsahu trigliceridu kyseliny enanthové v extrahovaném tuku se určí pomocí kapilární plynové chromatografie (GC). Výsledek získaný ze vzorku se vyhodnotí porovnáním s triglyceridem kyseliny kapronové jako vnitřním standardem.

Poznámka: Bylo zjištěno, že vhodným vnitřním standardem je také tributyrin.

4. CHEMIKÁLIE

Použijte pouze chemická činidla uznávané analytické čistoty.

4.1 n-hexan

4.2 Běžný triglycerid kyseliny kapronové, čistota nejméně 99 %

4.3 Běžný triglycerid kyseliny enanthové, čistota nejméně 99 %

4.4 Bezvodý síran sodný (Na2SO4)

5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení, a zejména:

5.1 Analytické váhy s přesností na 1 mg

5.2 Odměrné baňky o objemu 10 ml a 20 ml

5.3 Odstředivkové zkumavky o objemu 30 ml

5.4 Rotační odparka

5.5 Pec, kterou lze udržovat na teplotě 50 °C ± 5 °C

5.6 Filtrační papír střední pórovitosti o průměru asi 15 cm

5.7 Plynové chromatografické zařízení 5.7.1 Plynový chromatograf s děleným/neděleným (tzv. split/splitless) nebo kolonovým (tzv. on-column) nástřikovým zařízením a plamenově ionizačním detektorem (FID) 5.7.2 GC kolona se stacionární fází, která se ukázala být vhodnou při provádění separace triglyceridů (100 % dimethylpolysiloxan, nebo 5 % fenyl – 95 % methylpolysiloxan). Zvolte stacionární fázi, délku kolony (od 4 m do 15 m), vnitřní průměr (od 0,22 mm do 0,50 mm) a tloušťku filmu (0,12 μm nebo více) s přihlédnutím k laboratorním zkušenostem a použitému nástřikovému sytému. Zvolená kolona by v každém případě měla umožnit sledovat jak úplné rozdělení mezi píkem rozpouštědla a triglyceridem kyseliny kapronové, tak rozlišení základní linie mezi píky triglyceridu kyseliny kapronové a enanthové. Příklady použitelných podmínek jsou uvedeny níže. 5.7.2.1 Příklad použitelných podmínek s využitím děleného nástřikového zařízení: — nosný plyn: helium, — tlak na koloně: 100 kPa, — kolona: kolona z křemenného skla o délce 12 m, vnitřním průměru 0,5 mm, tloušťce filmu 0,1 μm, — stacionární fáze: 100 % dimethylpolysiloxan, nebo 5 % fenyl – 95 % dimethylpolysiloxan (např. HT5), — teplota kolony: počáteční teplota 130 °C udržovaná po dobu 1 minuty, zvýšená rychlostí 20 °C/min na 260 °C a poté zvýšená rychlostí 30 °C/min na 360 °C; udržujte při teplotě 360 °C po dobu 10 min, — teplota detektoru: 370 °C, — teplota nástřikového zařízení: 350 °C, — poměr rozdělení 1:30, — množství nastříknutého vzorku: 1 μl. 5.7.2.2 Příklad použitelných podmínek s využitím kolonového nástřikového zařízení: — nosný plyn: vodík (systém s konstantním průtokem), — tlak na koloně: 89 kPa, — kolona: kolona z křemenného skla o délce 4 m, vnitřním průměru 0,32 mm, tloušťce filmu 0,25 μm, — stacionární fáze: 5 % fenyl, 95 % dimethylpolysiloxan, — teplota kolony: počáteční teplota 60 °C udržovaná po dobu 2 minut, zvýšená rychlostí 35 °C/min na 340 °C a udržovaná při této teplotě po dobu 5 min, — teplota detektoru: 350 °C, — množství nastříknutého vzorku: 1 μl.

5.8 Injekční stříkačka o objemu 5 μl

6. ODBĚR VZORKŮ

Je důležité, aby laboratoř obdržela vzorek, který je skutečně reprezentativní a který nebyl během přepravy nebo skladování poškozen ani změněn.

Odběr vzorků není součástí metody uvedené v této mezinárodní normě. Doporučená metoda odběru vzorků je uvedena v normě IDF 50C:1995 nebo ISO 707–1997 – Mléko a mléčné výrobky – Směrnice pro odběr vzorků.

7. PRACOVNÍ POSTUP

7.1 Příprava zkušebního vzorku a zkušební dávky

Postupujte podle normy ISO 14156 IDF 172:2001.

7.1.1 Máselný olej, máslo

7.1.1.1 Rozpusťte 50 až 100 g zkušebního vzorku v peci (5.5).

7.1.1.2 Do složeného filtračního papíru vložte 0,5 g až 1,0 g bezvodého síranu sodného (5.4).

7.1.1.3 Přefiltrujte tuk přes filtrační papír obsahující bezvodý síran sodný a filtrát zachyťte do kádinky ponechané v peci (5.5). Při přelévání rozpuštěného másla na filtrační papír dávejte pozor na to, aby nedošlo k přenosu séra.

7.1.2 Smetana

7.1.2.1 Zahřejte zkušební vzorek na teplotu 20 °C ± 2 °C.

7.1.2.2 Důkladně vzorek promíchejte.

7.1.2.3 Rozpusťte vhodné množství zkušebního vzorku tak, abyste získali 10 ml zkušební dávky s hmotnostním zlomkem tuku asi 4 %.

7.1.2.4 Při extrahování tuku ze smetany postupujte jako v případě syrového a homogenizovaného mléka (viz ISO 14156 IDF 172:2001, §8.3).

7.1.2.5 V odměrné baňce na 10 ml (5.2) odměřte 1 g extrahovaného tuku s přesností na 1 mg. Přidejte 1 ml roztoku 7.2.2. Doplňte na 10 ml n-hexanem (4.1) a homogenizujte.

7.1.2.6 Přidejte 1 ml roztoku 7.1.1.2 do odměrné baňky na 10 ml (5.2) a nařeďte ho na 10 ml n-hexanem (4.1).

7.2 Příprava kalibračních standardů

7.2.1 Rozpusťte 10 mg triglyceridu kyseliny enanthové (4.3) v 10 ml n-hexanu (4.1).

7.2.2 Rozpusťte 10 mg triglyceridu kyseliny kapronové (4.2) v 10 ml n-hexanu (4.1).

7.2.3 Přidejte 1 ml roztoku 7.2.2 do odměrné baňky na 10 ml (5.2). Doplňte na 10 ml n-hexanem (4.1).

7.2.4 Přidejte 1 ml roztoku 7.2.1 a 1 ml roztoku 7.2.2 do odměrné baňky na 10 ml (5.2). Doplňte na 10 ml n-hexanem (4.1).

7.2.5 Přidejte 1 ml roztoku 7.2.4 do odměrné baňky na 10 ml (5.2) a doplňte na 10 ml n-hexanem (4.1).

7.3 Chromatografické stanovení

7.3.1 Nastříkněte dvakrát 1 μl standardního roztoku 7.2.5.

7.3.2 Nastříkněte 1 μl každého roztoku vzorku. Poznámka: Použije-li se kolonový nástřikový systém, měly by se jak standardní roztok, tak roztoky vzorků více naředit.

7.3.3 Opakujte operaci 7.3.1 u každého třetího vzorku tak, abyste na začátku a na konci skupiny vzorků provedli vždy dva standardní nástřiky. Výsledky jsou založeny na středním průměru odezvových faktorů ze standardních chromatogramů.

8. VÝPOČET VÝSLEDKŮ

U každého chromatogramu určete oblast píků souvisejících s triglyceridy kyseliny enanthové a kyseliny kapronové.

Řiďte se těmito pokyny u každé ohraničené řady, tj. u každé skupiny ohraničených vzorků je standardním roztokem nastříknutým dvakrát bezprostředně před ní STD1 a standardním roztokem nastříknutým dvakrát bezprostředně po ní STD2.

8.1 Kalibrace

8.1.1 Vypočítejte odezvový faktor Rf1(a) a Rf1(b) pro každý duplikát STD1 Rf1 (a) nebo (b) = (plocha píků triglyceridu kyseliny kapronové/plocha píků triglyceridu kyseliny enanthové) × 100 Vypočítejte střední průměr odezvového faktoru Rf1: Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(b)) / 2

8.1.2 Obdobným způsobem vypočítejte střední průměr odezvového faktoru Rf2 pro STD2

8.1.3 Vypočítejte střední průměr odezvového faktoru Rf Rf = (Rf1 + Rf2) /2

8.2 Zkušební vzorky

Pro každý chromatogram vzorků získaný mezi STD1 a STD2 vypočítejte obsah kyseliny enanthové C (kg/t):

C = (plocha píků triglyceridu kyseliny enanthové × Rf × 100)/(plocha píků triglyceridu kyseliny kapronové × Wt × 1 000)

kde:

— Wt = váha odebraného tuku (g),

— 100 = objem zředěného vzorku,

— 1 000 = převodní faktor (z μg/g na kg/t)

V případě vzorků másla přihlédněte k obsahu tuku v másle a vypočítejte upravenou hodnotu koncentrace Cmáslo (kg/t másla)

Cmáslo = Ctuk × F

kde F je obsah tuku v másle.

9. SHODNOST

Podrobnosti o mezilaboratorní zkoušce másla podle norem ISO 5725–1 a ISO 5725–2 týkající se přesné metody jsou uvedeny v bodě (12).

Mezní hodnoty opakovatelnosti a reprodukovatelnosti jsou vyjádřeny pro 95 % pravděpodobnost a nemusí být použitelné na jiné než uvedené rozsahy koncentrací a matrice.

9.1 Opakovatelnost

Absolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých zkoušek získaných s krátkým časovým odstupem stejnou metodou na stejném zkušebním materiálu ve stejné laboratoři a stejným pracovníkem používajícím stejné zařízení by ve více než 5 % případů neměl být větší než 0,35 kg/t.

9.2 Reprodukovatelnost

Absolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých zkoušek získaných stejnou metodou na stejném zkušebním materiálu v různých laboratořích a různými pracovníky používajícími odlišná zařízení by ve více než 5 % případů neměl být větší než 0,66 kg/t.

10. MEZE TOLERANCE: DOLNÍ MEZE (PŘÍPAD NEDOSTATEČNÝCH MNOŽSTVÍ)

10.1 Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.

10.2 Máslo a zahuštěné máslo 10.2.1 Dávkování je 11 kg triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 % na jednu tunu másla, tj. 10,45 kg/t. 10.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 9,51 kg/t (95 % minimálního dávkování triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 %, jednotlivé stanovení), — 6,89 kg/t (70 % minimálního dávkování triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 %, jednotlivé stanovení), — koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem s nejnižší hodnotou se použije interpolací mezi hodnotami 9,51 kg/t a 6,89 kg/t.

10.3 Smetana 10.3.1 Dávkování je 10 kg triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 % na jednu tunu mléčného tuku, tj. 9,50 kg/t mléčného tuku se stopovací látkou. 10.3.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 8,60 kg/t (95 % minimálního dávkování triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 %, jednotlivé stanovení), — 6,23 kg/t (70 % minimálního dávkování triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 %, jednotlivé stanovení), — koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem s nejnižší hodnotou se použije interpolací mezi hodnotami 8,60 kg/t a 6,23 kg/t.

11. MEZE TOLERANCE: HORNÍ MEZE (PŘÍPAD PŘEKROČENÍ MNOžSTVÍ O VÍCE NEŽ20 %)

11.1 Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.

11.2 Máslo a zahuštěné máslo 11.2.1 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a průměrný výsledek se porovná s následujícími mezními hodnotami: — horní mez činí 12,96 kg/t.

11.3 Smetana 11.3.1 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a průměrný výsledek se porovná s následujícími mezními hodnotami: — horní mez činí 11,82 kg/t.

12. DALŠÍ INFORMACE: STATISTICKÁ ANALÝZA VÝSLEDKŮ STANOVENÍ TRIENANTOÁTU V MÁSELNÉM TUKU ANALÝZOU TRIGLICERIDU

Pro stanovení obsahu trienantoátu v másle se stopovacími látkami byly provedeny čtyři společné pokusy.

První kruhové zkoušky se zúčastnilo devět laboratoří, přičemž nebyly poskytnuty žádné specifikace o analytických metodách, které se měly použít.

Druhé kruhové zkoušky se zúčastnilo deset laboratoří, přičemž byly použity 4 různé metody:

— kvantifikace methylheptanoátu použitím n-nonanu nebo methylnonanoátu jako vnitřního standardu,

— kvantifikace trienantoátu použitím trikaproátu jako vnitřního standardu,

— kvantifikace methylheptanoátu použitím kalibračního vzorku/kalibrační směsi,

— kvantifikace methylheptanoátu použitím kalibrační směsi.

Prováděla-li se kromě toho analýza methylesterů mastných kyselin (FAME), byly použity dva odlišné postupy methylace (De Francesco a Christopherson & Glass).

V důsledku získaných výsledků byly pro třetí kruhovou zkoušku zvoleny dvě metody:

— kvantifikace methylheptanoátu použitím n-nonanu nebo methylnonanoátu jako vnitřního standardu,

— kvantifikace trienantoátu použitím trikaproátu jako vnitřního standardu.

Výsledky sedmi laboratoří prokázaly, že metoda FAME vede k vyšší variabilitě, v důsledku čehož bylo rozhodnuto, že se použije pouze stanovení trienantoátu jako triglyceridu na základě postupu kvantifikace trienantoátu použitím trikaproátu jako vnitřního standardu. Analýza triglyceridu musí být navíc provedena pomocí kapilární kolony.

Ve čtvrté kruhové zkoušce kolovaly čtyři vzorky (A, B, C, D) a výsledky poskytlo devět laboratoří (tabulky 1–2).

Dvě laboratoře (DE a EU) analyzovaly vzorky pomocí metody FAME.

Z důvodu nižšího počtu laboratoří byl statistický výpočet proveden jak z celkového souboru údajů (obrázky 1–2) včetně výsledků analýz FAME, tak z údajů získaných z analýzy TG.

Zkoušky pro odlehlé hodnoty:

— Vzorek A. Dixonův, Cochranův a Grubbsův test na úrovni 1 a 5 % prokázaly jednu laboratorní odlehlou hodnotu.

— Vzorek B. Grubbsův test na úrovni 5 % prokázal jednu laboratorní odlehlou hodnotu.

— Vzorek C. Dixonův a Grubbsův test na úrovni 1 a 5 % prokázaly jednu laboratorní odlehlou hodnotu.

— Vzorek D. Dixonův a Grubbsův test na úrovni 1 a 5 % prokázaly jednu laboratorní odlehlou hodnotu.

Odlehlá hodnota byla z výpočtu vyloučena.

Hodí se poznamenat, že výsledky získané metodou FAME se v použitých zkouškách nikdy nepovažovaly za odlehlé hodnoty.

Parametry shodnosti

V tabulkách 1 a 2 jsou uvedeny výsledky všech laboratoří a parametry shodnosti, jež jsou vypočítané z přijatelného počtu (8) laboratoří, bohužel však nevycházejí ze stejné analytické metody.

V tabulkách 3 a 4 jsou uvedeny výsledky odvozené pouze z metody TG a odpovídající parametry shodnosti. Přijetí těchto parametrů závisí na přijetí nízkého počtu laboratoří (6).

Obrázky 2 a 3 ukazují trend hodnot Sr a SR vypočítaných ze 4 vzorků dvou souborů údajů popsaných výše.

V tabulce 5 jsou uvedeny hodnoty Sr a SR společně s odpovídajícími úhrnnými hodnotami a celkovými parametry r a R.

Nakonec byl vypočítán kritický rozdíl při 95 % pravděpodobnosti.







Tabulka 1: Statistické výsledky metod TG a FAME* Vzorek A R1 R2 Střed Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot 8 RENNES FR1 11,0 11.1 11.1 Počet odlehlých hodnot 1 RIKILT NL 11,2 11,2 11,2 Odlehlé hodnoty DК ZPLA DE* 11,6 11,8 11,7 Střední hodnota 11,3 ADAS GB 11,4 11,2 11,3 Skutečná hodnota 11,0 CNEVA FR2 11,4 11,4 11,4 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) 0,09 LODI IT 11,1 11,3 11,2 Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %) 0,80 EELA FI 11,3 11,2 11,3 Opakovatelnost r (95 %) 0,26 ISPRA EU* 11,0 11,0 11,0 Relativní opakovatelnost r % 2,24 D.V.F.A. DK 13,3 11,8 12,6 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) 0,23 Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %) 2,04 Reprodukovatelnost R (95 %) 0,84 Relativní reprodukovatelnost R % 5,71 Vzorek B R1 R2 Střed Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot 8 RENNES FR1 12,7 12,8 12,8 Počet odlehlých hodnot 1 RIKILT NL 13,5 13,3 13,4 Odlehlé hodnoty DK ZPLA DE* 14,0 13,8 13,9 Střední hodnota 13,4 ADAS GB 13,4 13,5 13,5 Skutečná hodnota 13,5 CNEVA FR2 13,3 13,4 13,4 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) 0,14 LODI IT 13,9 13,5 13,7 Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %) 1,04 EELA FI 13,4 13,2 13,3 Opakovatelnost r (95 %) 0,40 ISPRA EU* 13,2 13,3 13,3 Relativní opakovatelnost r % 2,91 D.V.F.A. DK 14,1 14,8 14,5 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) 0,35 Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %) 2,61 Reprodukovatelnost R (95 %) 0,99 Relativní reprodukovatelnost R % 7,31







Tabulka 2: Statistické výsledky metod TG a FAME* Vzorek C R1 R2 STŘED Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot 8 RENNES FR1 8,9 9,2 9,1 Počet odlehlých hodnot 1 RIKILT NL 9,2 9,3 9,3 Odlehlé hodnoty DK ZPLA DE* 9,2 9,4 9,3 Střední hodnota 9,3 ADAS GB 9,5 9,3 9,4 Skutečná hodnota 9,3 CNEVA FR2 9,4 9,4 9,4 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) 0,14 LODI IT 9,2 9,5 9,4 Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %) 1,50 EELA FI 9,4 9,6 9,5 Opakovatelnost r (95 %) 0,40 ISPRA EU* 9,4 9,3 9,4 Relativní opakovatelnost r % 4,20 D.V.F.A. DK 10,7 10,9 10,8 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) 0,17 Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %) 1,82 Reprodukovatelnost R (95 %) 0,47 Relativní reprodukovatelnost R % 5,10 Vzorek D R1 R2 Střed Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot 8 RENNES R1 1,6 1,6 1,6 Počet odlehlých hodnot 1 RIKILT NL 2,1 2,1 2,1 Odlehlé hodnoty DK ZPLA DE* 2,3 2,3 2,3 Střední hodnota 2,1 ADAS GB 2,1 2,2 2,2 Skutečná hodnota 2,1 CNEVA FR2 2,1 2,1 2,1 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) 0,08 LODI IT 2,2 1,9 2,1 Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %) 3,81 EELA FI 2,3 2,3 2,3 Opakovatelnost r (95 %) 0,22 ISPRA UE* 2,3 2,3 2,3 Relativní opakovatelnost r % 10,67 D.V.F.A. DK 3,4 2,9 3,2 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) 0,24 Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %) 11,43 Reprodukovatelnost R (95 %) 0,67 Relativní reprodukovatelnost R % 32,00







Tabulka 3: Statistické výsledky metod TG a FAME* Vzorek A R1 R2 Střed Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot 6 RENNES FR1 11,0 11,1 11,1 Počet odlehlých hodnot 1 RIKILT NL 11,2 11,2 11,2 Odlehlé hodnoty DК ADAS GB 11,4 11,2 11,3 Střední hodnota 11,2 CNEVA FR2 11,4 11,4 11,4 Skutečná hodnota 11,0 LODI IT 11,1 11,3 11,2 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) 0,09 EELA FI 11,3 11,2 11,3 Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %) 0,80 D.V.F.A. DK 13,3 11,8 12,6 Opakovatelnost r (95 %) 0,25 Relativní opakovatelnost r % 2,24 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) 0,13 Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %) 1,16 Reprodukovatelnost R (95 %) 0,36 Relativní reprodukovatelnost R % 3,25 Vzorek B R1 R2 Střed Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot 6 RENNES FR1 12,7 12,8 12,8 Počet odlehlých hodnot 1 RIKILT NL 13,5 13,3 13,4 Odlehlé hodnoty DК ADAS GB 13,4 13,5 13,5 Střední hodnota 13,3 CNEVA FR2 13,3 13,4 13,4 Skutečná hodnota 13,5 LODI IT 13,9 13,5 13,7 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) 0,15 EELA FI 13,4 13,2 13,3 Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %) 1,13 D.V.F.A. DK 14,1 14,8 14,5 Opakovatelnost r (95 %) 0,42 Relativní opakovatelnost r % 3,16 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) 0,33 Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %) 2,48 Reprodukovatelnost R (95 %) 0,93 Relativní reprodukovatelnost R % 6,94







Tabulka 4: Statistické výsledky metody TG Vzorek C R1 R2 Střed Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot 6 RENNES FR1 8,9 9,2 9,1 Počet odlehlých hodnot 1 RIKILT NL 9,2 9,3 9,3 Odlehlé hodnoty DК ADAS GB 9,5 9,3 9,4 Střední hodnota 9,3 CNEVA FR2 9,4 9,4 9,4 Skutečná hodnota 9,3 LODI IT 9,2 9,5 9,4 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) 0,15 EELA FI 9,4 9,6 9,5 Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %) 1,61 D.V.F.A. DK 10,7 10,9 10,8 Opakovatelnost r (95 %) 0,42 Relativní opakovatelnost r % 4,51 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) 0,19 Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %) 2,04 Reprodukovatelnost R (95 %) 0,53 Relativní reprodukovatelnost R % 5.71 Vzorek D R1 R2 Střed Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot 6 RENNES FR1 1,6 1,6 1,6 Počet odlehlých hodnot 1 RIKILT NL 2,1 2,1 2,1 Odlehlé hodnoty DK Střední hodnota 2,1 ADAS GB 2,1 2,2 2,2 Skutečná hodnota 2,1 CNEVA FR2 2,1 2,1 2,1 Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr) 0,09 LODI IT 2,2 1,9 2,1 Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %) 4,29 EELA FI 2,3 2,3 2,3 Opakovatelnost r (95 %) 0,26 D.V.F.A. DK 3,4 2,9 3,2 Relativní opakovatelnost r % 12,01 Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) 0,25 Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %) 11,90 Reprodukovatelnost R (95 %) 0,69 Relativní reprodukovatelnost R % 33,32







Tabulka 5 Opakovatelnost a reprodukovatelnost (s analýzou FAME*) Počet laboratoří Odlehlá hodnota Opakovatelnost Sr (95 %) Reprodukovatelnost SR (95 %) Vzorek A 8 1 0,09 0,23 Vzorek B 8 1 0,14 0,35 Vzorek C 8 1 0,14 0,17 Vzorek D 8 1 0,08 0,24 Úhrnná hodnota 0,116 0,256 R R Úhrnná hodnota* 2,8 0,324 0,716 CrD95 = 0,40 Minimální čistota stanovená pro trienantoát = 95 % Minimální mez stanovená pro trienantoát v mléčném tuku = 11 kg/t Přihlédneme-li ke kritickému rozdílu při 95 % pravděpodobnosti, nesmí být průměr obou výsledků menší než: 10,05 kg/t v případě přidání trienantoátu o čistotě 95 %.







Opakovatelnost a reprodukovatelnost (bez analýzy FAME) Počet laboratoří Odlehlá hodnota Opakovatelnost Sr (95 %) Reprodukovatelnost SR (95 %) Vzorek A 6 1 0,09 0,13 Vzorek B 6 1 0,15 0,33 Vzorek C 6 1 0,15 0,19 Vzorek D 6 1 0,09 0,25 Úhrnná hodnota 0,124 0,237 r R Úhrnná hodnota * 2,8 0,347 0,663 CrD95 = 0,36 Minimální čistota stanovená pro trienantoát = 95 % Minimální mez stanovená pro trienantoát v mléčném tuku = 11 kg/t Přihlédneme-li ke kritickému rozdílu při 95 % pravděpodobnosti, nesmí být průměr obou výsledků menší než: 10,09 kg/t v případě přidání trienantoátu o čistotě 95 %.

Obrázek 1 ( 8 )

Výsledky zkoušek: vzorek A

Výsledky zkoušek: vzorek B

Výsledky zkoušek: vzorek C

Výsledky zkoušek: vzorek D

Obrázek 2

Směrodatná odchylka opakovatelnosti a reprodukovatelnosti na různých stupních (TG + FAME)

Obrázek 3

Směrodatná odchylka opakovatelnosti a reprodukovatelnosti na různých stupních (TG)

Obrázek 4

Příklad použití kolonového nástřikového zařízení









PŘÍLOHA VI

(Článek 5)

STANOVENÍ OBSAHU VANILINU V ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE, MÁSLE NEBO SMETANĚ VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení vanilinu v zahuštěném másle, másle nebo smetaně.

2. PODSTATA METODY

Extrakce známého množství vzorku směsí isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2). Vysrážení většiny tuku ochlazením na teplotu mezi – 15 °C a – 20 °C a následným odstředěním.

Po zředění vodou se stanoví obsah vanilinu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení, a zejména:

3.1 Mrazicí box určený pro teploty v rozmezí od – 15 °C do – 20 °C

3.2 Injekční stříkačky na jedno použití o objemu 2 ml

3.3 Membránové mikrofiltry o velikosti pórů 0,45 μm, odolné roztoku obsahujícímu 5 % extrakčního roztoku (4.4)

3.4 Systém pro kapalinovou chromatografii sestávající z čerpadla (s průtokem 1,0 ml/min), nástřikového zařízení (automatického nebo manuálního, objem nástřiku 20 μl) a UV detektoru (fungujícího při 306 nm, 0,01 Å rozsahu stupnice), zapisovače nebo integrátoru a termostatu kolony fungujícího při 25 °C

3.5 Analytická kolona (250 mm × 4,6 mm/vnitřní průměr/), naplněná fází LiChrosper RP 18 (Merck, 5 μm) nebo jinou rovnocennou fází

3.6 Ochranná kolona (cca 20 mm × 3 mm/vnitřní průměr/), naplněná za sucha fází LiChrospher RP 18 (5 až 10 μm) nebo jinou rovnocennou fází

3.7 Odstředivka fungující při 2 000 ot/min

4. CHEMIKÁLIE

Používají se pouze chemikálie čistoty p.a.

4.1 Isopropanol

4.2 Ethanol, 96 % obj.

4.3 Acetonitril

4.4 Extrakční roztok Isopropanol (4.1), ethanol (4.2) a acetonitril (4.3) se smíchají v poměru 1:1:2 (obj.).

4.5 Vanilin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd) ≥ 98 % 4.5.1 Zásobní roztok vanilinu (500 μg/ml) S přesností na 0,1 mg navažte asi 50 mg (CM mg) vanilinu (4.5) do odměrné baňky na 100 ml, přidejte 25 ml extrakčního roztoku (4.4) a doplňte po značku vodou. 4.5.2 Standardní roztok vanilinu (10 μg/ml) Do odměrné baňky na 250 ml pipetou přeneste 5 ml zásobního roztoku vanilinu (4.5.1) a doplňte po značku vodou. 4.5.3 Methanol čistoty pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) 4.5.4 Kyselina octová, ledová 4.5.5 Voda čistoty pro HPLC 4.5.6 Mobilní fáze HPLC V odměrné baňce na 1 000 ml smíchejte 300 ml methanolu (4.5.3), cca 500 ml vody (4.5.5) a 20 ml kyseliny octové (4.5.4) a doplňte po značku vodou (4.5.5). Přefiltrujte přes filtr 0,45 μm (3.3).

5. PRACOVNÍ POSTUP

5.1 Příprava zkušebního vzorku

5.1.1 Máslo

Vzorek zahřívejte, dokud nezačne tát. Je nutné zabránit místnímu přehřátí nad 30 °C. Máslo se v žádném případě nesmí oddělit ve dvou fázích. Jakmile je vzorek dostatečně plastický, homogenizujte jej protřepáním. Před odběrem vzorku máslo po dobu 15 sekund míchejte. Do odměrné baňky na 100 ml navažte s přesností na 1 mg asi 5 g (SM g) másla.

5.1.2 Zahuštěné máslo

Bezprostředně před odběrem vzorku vložte nádobu se zahuštěným máslem do sušárny o teplotě 40 °C až 50 °C, aby máslo zcela roztálo. Vzorek promíchejte protřepáním nebo mícháním, které však nesmí být tak silné, aby se vytvářely vzduchové bubliny. Do odměrné baňky na 100 ml navažte s přesností na 1 mg asi 4 g (SM g) zahuštěného másla.

5.1.3 Smetana

Vzorek zahřejte ve vodní lázni nebo termostatu na teplotu 35 °C až 40 °C. Tuk rovnoměrně rozprostřete třepáním, a je-li to nutné, také promícháním. Vzorek rychle ochlaďte na 20 ± 2 °C. Vzorek musí být na pohled homogenní, v opačném případě je třeba postup opakovat. Do odměrné baňky na 100 ml navažte s přesností na 1 mg asi 10 g (SM g) smetany.

5.2 Příprava zkušebního roztoku

Přidejte asi 75 ml extrakčního roztoku (4.4) ke zkušebnímu vzorku (5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3), důkladně promíchávejte nebo protřepávejte po dobu asi 15 minut a doplňte po značku extrakčním roztokem (4.4). Asi 10 ml tohoto extraktu převeďte do zkumavky opatřené zátkou. Zkumavku uložte do mrazicího boxu (3.1) a nechte ji v něm stát asi 30 minut. Vychlazený extrakt odstřeďujte po dobu 5 minut asi při 2 000 otáčkách za minutu a okamžitě dekantujte. Dekantovaný roztok nechte přizpůsobit laboratorní teplotě. Do odměrné baňky na 100 ml pipetou přeneste 5 ml dekantovaného roztoku a doplňte vodou. Alikvotní díl přefiltrujte přes membránový mikrofiltr (3.3) pomocí stříkačky (3.2). Filtrát je připraven ke stanovení pomocí HPLC.

5.3 Kalibrace

Do odměrné baňky na 100 ml pipetou přeneste 5 ml standardního roztoku vanilinu (4.5.2). Přidejte 5 ml extrakčního roztoku (4.4) a doplňte po značku vodou. Tento roztok obsahuje 0,5 μg/ml vanilinu.

5.4 Stanovení pomocí HPLC

Chromatografický systém nechte asi 30 minut stabilizovat. Nastříkněte standardní roztok (5.3). Tento postup opakujte, dokud rozdíl v ploše píků nebo výšce píků mezi dvěma po sobě jdoucími nástřiky nebude menší než 2 %. Za popsaných podmínek je retenční čas vanilinu asi 9 minut. Standardní roztok (5.3) paralelně analyzujte nastříknutím 20 μl. Nastříkněte 20 μl zkušebních roztoků (5.2). Stanovte plochu nebo výšku získaného píku vanilinu. Po provedení 10 nástřiků zkušebních vzorků (5.2) opakujte duplicitní nástřik standardního roztoku (5.3).

6. VÝPOČET VÝSLEDKŮ

Vypočítejte průměrnou plochu (nebo výšku) (AC) píků vanilinu odpovídajících duplicitním nástřikům u každé šarže zkušebních roztoků (čtyři plochy nebo výšky).

Vypočítejte odezvový faktor (R):

kde CM je hmotnost vanilinu v mg (4.5.1).

Obsah (mg/kg) vanilinu (C) ve zkušebním vzorku je dán vzorcem:

kde:

AS = plocha nebo výška píku vanilinu zkušebního vzorku

SM = hmotnost zkušebního vzorku v g (5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3).

Poznámka: Pokud se za účelem stanovení vanilinu analyzuje smetana, koncentrace stopovací látky musí být vyjádřena v miligramech stopovací látky na kilogram mléčného tuku. Tento výpočet se provede vynásobením hodnoty C výrazem 100/f, kde f je obsah tuku ve smetaně v hmotnostních procentech.

20 = koeficient, kterým se berou v úvahu zředění srovnávacího a zkušebního vzorku

0,96 = opravný faktor pro obsah tuku v prvním zředění zkušebního vzorku

Poznámka: Místo plochy píků lze použít výšku píků (viz 8.3).

7. PŘESNOST METODY

7.1 Opakovatelnost (r)

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 16 mg/kg.

7.2 Reprodukovatelnost (R)

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 27 mg/kg.

8. MEZE TOLERANCE

8.1 Pro účely posouzení homogenity musí být z produktu obsahujícího stopovací látku odebrány tři vzorky.

8.2 Stopovací látka získaná z vanilky nebo ze syntetického vanilinu 8.2.1 Dávkování 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehydu je 250 g na jednu tunu zahuštěného másla nebo másla. Jsou-li stopovací látky přidávány do smetany, pak je dávkování 250 g látky na tunu mléčného tuku. 8.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 220,8 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky), — 158,3 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky). Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 220,8 mg/kg a 158,3 mg/kg.

8.3 Stopovací látka získaná výhradně z vanilkových bobů nebo z jejich komplexních extraktů 8.3.1 Dávkování 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehydu je 100 g na jednu tunu zahuštěného másla nebo másla. Jsou-li stopovací látky přidávány do smetany, pak je dávkování 100 g látky na tunu mléčného tuku. 8.3.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 78,3 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky), — 53,3 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky). Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 78,3 mg/kg a 53,3 mg/kg.

9. POZNÁMKY

9.1 Rekuperace přidaného vanilinu na úrovni 250 mg/kg máselného oleje kolísá v rozmezí od 97,0 do 103,8. Průměrný zjištěný obsah byl 99,9 % se směrodatnou odchylkou 2,7 %.

9.2 Standardní roztok obsahuje 5 % extrakčního roztoku z důvodu kompenzace rozšiřování píků způsobeného přítomností 5 % extrakčního roztoku ve zkušebních vzorcích. To umožňuje kvantifikaci na základě výšky píků.

9.3 Analýza je založena na lineární kalibrační křivce (intercept nula).

9.4 Linearitu je třeba ověřit nejprve při prvním provedení analýzy pomocí vhodných ředění standardního roztoku (4.5.2) a poté v pravidelných intervalech a po každé změně či opravě zařízení na HPLC. Vanilin lze působením vnitřních enzymů v nepasterizované smetaně nebo ve výrobcích z nepasterizované smetany rozložit na kyselinu vanilinovou, divanilin a jiné sloučeniny.









PŘÍLOHA VII

(Článek 5)

SPEKTROMETRICKÉ KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ETHYLESTERU BETA-APO-8'-KAROTENOVÉ KYSELINY V ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE A MÁSLE

1. PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení ethylesteru beta-apo-8'-karotenové kyseliny (apokarotenového esteru) v zahuštěném másle a másle. Apokarotenový ester je souhrn všech látek přítomných v extraktu vzorků získaném za podmínek popsaných v této metodě, které absorbují světlo při 440 nm.

2. PODSTATA METODY

Máselný tuk se rozpustí v petroletheru a změří se jeho absorbance při 440 nm. Obsah apokarotenového esteru se stanoví porovnáním s vnějším standardem.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1 Pipety – dělené, o objemu 0,25, 0,50, 0,75 a 1,0 ml

3.2 Spektrofotometr – vhodný pro používání při 440 nm (a 447–449 nm) a vybavený kyvetami s délkou optické dráhy 1 cm

3.3 Odměrné baňky na 20 ml a 100 ml

3.4 Analytické váhy s citlivostí 0,1 mg, vážící s přesností na 1 mg a s možností odečtu po 0,1 mg

3.5 Pec, 45 °C ± 1 °C

3.6 Rychlofiltrační bezpopelné filtry

4. CHEMIKÁLIE

Používají se pouze chemikálie čistoty p.a.

4.1 Suspenze apokarotenového esteru (přibližně 20 %) 4.1.1 Obsah látky v suspenzi se stanoví takto: Suspenzi zahřejte na teplotu 45 °C až 50 °C a homogenizujte v neotevřené původní nádobě. Do odměrné baňky na 100 ml navažte 400 mg, rozpusťte ve 20 ml chloroformu (4.4) a doplňte po značku cyklohexanem (4.5). Zřeďte 5 ml tohoto roztoku cyklohexanem na 100 ml (roztok A). Zřeďte 5 ml roztoku A cyklohexanem na 100 ml. Změřte absorbanci při 447–449 nm (měří se maximum vztažené k cyklohexanu jako referenční hodnotě pomocí kyvet s délkou optické dráhy 1 cm). Obsah apokarotenového esteru P (%) = (Abs max × 40 000)/(Msusp × 2 550) nebo se odvodí: (Absmax /2 550) × (100/5) × (100/5) × (100/Msusp) Absmax = absorbance měrného roztoku při maximu Msusp = hmotnost suspenze (g) 2 550 = referenční hodnota Abs (1 %, 1 cm) P = Čistota (obsah) suspenze (%) Poznámka: Suspenze apokarotenového esteru je citlivá na vzduch, teplo a světlo. V neotevřené původní nádobě (těsně uzavřené v dusíkové atmosféře) a v chladu ji lze skladovat po dobu asi 12 měsíců. Po otevření je třeba obsah v krátké době spotřebovat. 4.1.2 Standardní roztok apokarotenového esteru, přibližně 0,2 mg/ml S přesností na 0,1 mg navažte asi 0,100 g suspenze apokarotenového esteru (4.1.1) (W), rozpusťte v petroletheru (4.2), kvantitativně převeďte do odměrné baňky o objemu 100 ml a doplňte po značku petroletherem. Tento roztok obsahuje (W × P) / 10 mg/ml apokarotenového esteru. Poznámka: Roztok musí být uložen na chladném a tmavém místě. Nepoužitý roztok po měsíci vyřaďte.

4.2 Petrolether (40–60 °C)

4.3 Síran sodný bezvodý, granulovaný, předem sušený dvě hodiny při teplotě 102 °C

4.4 Chloroform

4.5 Cyklohexan

5. PRACOVNÍ POSTUP

5.1 Příprava zkušebního vzorku

5.1.1 Zahuštěné máslo

Vzorek roztavte v sušárně při teplotě asi 45 °C.

5.1.2 Máslo

Vzorek roztavte v sušárně při teplotě asi 45 °C a reprezentativní část přefiltrujte přes filtr obsahující asi 10 g bezvodého síranu sodného (4.3) v prostředí, které je chráněné před silným přirozeným nebo umělým světlem a udržované při teplotě 45 °C. Odeberte patřičné množství máselného tuku.

5.2 Stanovení

S přesností na 1 mg navažte asi 1 g zahuštěného másla (nebo extrahovaného máselného tuku (5.1.2)) (M). Kvantitativně převeďte do odměrné baňky na 20 ml (V) petroletherem (4.2), doplňte po značku a důkladně promíchejte.

Alikvotní díl této směsi převeďte do kyvety 1 cm dlouhé a změřte absorbanci při 440 nm ve vztahu k petroletheru jako referenční hodnotě. Pomocí získané standardní křivky (C μ/ml) zjistěte koncentraci apokarotenového esteru v roztoku.

5.3 Kalibrace

Do pěti odměrných baněk na 100 ml pipetou přeneste 0, 0,25, 0,5, 0,75 a 1,0 ml standardního roztoku apokarotenového esteru (4.1.2). Zřeďte petroletherem (4.2) doplněním ke značce a promíchejte.

Přibližné koncentrace roztoků se pohybují od 0 do 2 μg/ml a přesně se vypočítají ve vztahu ke koncentraci standardního roztoku (4.1.2) (W × P)/10 mg/ml. Změřte absorbanci při 440 nm vztaženou k petroletheru (4.2) jako referenční hodnotě.

Hodnoty absorbance vyneste do grafu na osu pořadnic („y“) a koncentrace apokarotenového esteru na osu úseček („x“). Vypočítejte rovnici standardní křivky.

6. VÝPOČET VÝSLEDKŮ

6.1 Obsah apokarotenového esteru vyjádřený v mg/kg produktu je dán: u zahuštěného másla výrazem: (C × V)/M u másla výrazem: 0,82 (C × V)M kde: C = obsah apokarotenového esteru v μg/ml odečtený z kalibračního grafu (5.3) V = objem zkušebního roztoku v ml (5.2) M = hmotnost dílčího zkušebního vzorku v g (5.2) 0,82 = opravný koeficient pro obsah máselného tuku v másle

7. PŘESNOST METODY

7.1 Opakovatelnost

7.1.1 Analýza másla

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 1,4 mg/kg.

7.1.2 Analýza zahuštěného másla

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 1,6 mg/kg.

7.2 Reprodukovatelnost

7.2.1 Analýza másla

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 4,7 mg/kg.

7.3. Analýza zahuštěného másla

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 5,3 mg/kg.

7.4. Zdroj údajů o shodnosti

Údaje o shodnosti byly získány na základě pokusu z roku 1995, kterého se zúčastnilo jedenáct laboratoří a ve kterém bylo v případě másla použito dvanáct vzorků obsahujících stopovací látku (šest slepých duplikátů) a v případě zahuštěného másla dvanáct vzorků obsahujících stopovací látku (šest slepých duplikátů).

8. MEZE TOLERANCE

8.1 Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.

8.2 Máslo 8.2.1 S přihlédnutím k absorbanci pozadí se stopovací látka přidává do másla v poměru 22 mg/kg. 8.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 17,7 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky), — 12,2 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky). Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 17,7 mg/kg a 12,2 mg/kg.

8.3 Zahuštěné máslo 8.3.1 S přihlédnutím k absorbanci pozadí se stopovací látka přidává do zahuštěného másla v poměru 24 mg/kg. Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 19,2 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky), — 13,2 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky). Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 19,2 mg/kg a 13,2 mg/kg.









PŘÍLOHA VIII

(Článek 5)

STANOVENÍ OBSAHU SITOSTEROLU NEBO STIGMASTEROLU V MÁSLE NEBO ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ V KAPILÁRNÍ KOLONĚ

1. PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení sitosterolu nebo stigmasterolu v másle nebo zahuštěném másle. Sitosterol je považován za látku složenou zejména z β-sitosterolu a 22-dihydro-β-sitosterolu, zatímco ostatní sitosteroly jsou považovány za bezvýznamné.

2. PODSTATA METODY

Máslo nebo zahuštěné máslo se zmýdelní hydroxidem draselným v ethanolovém roztoku a nezmýdelnitelný podíl se extrahuje diethyletherem.

Steroly se přemění na trimethylsilylethery a analyzují se plynovou chromatografií v kapilární koloně za použití betulinu jako vnitřního standardu.

3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1 Saponifikační baňka na 150 ml opatřená zpětným chladičem se zabroušenými spoji

3.2 Dělicí nálevky na 500 ml

3.3 Baňky na 250 ml

3.4 Nálevky o objemu přibližně 250 ml s vyrovnáváním tlaku pro zachycování odpadního diethyletheru

3.5 Skleněná kolona, 350 mm × 20 mm, opatřená zátkou se skleněným sintrem

3.6 Vodní lázeň nebo izotermní plášť

3.7 Reakční nádobky na 2 ml

3.8 Plynový chromatograf, který lze používat s kapilární kolonou, opatřený dělicím systémem, který tvoří: 3.8.1 termostatická komora pro kolony schopná udržovat požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C 3.8.2 nástřikový systém s nastavitelnou teplotou 3.8.3 plamenově ionizační detektor a převodník/zesilovač 3.8.4 integrátor/zapisovač, který lze použít s převodníkem/zesilovačem (3.8.3)

3.9 Kapilární kolona z křemenného skla zcela potažená BP1 nebo rovnocenným materiálem (nebo jiná kolona alespoň stejného rozkladu) ve stejnoměrné tloušťce 0,25 μm; kolona musí být schopna rozložit trimethylsilylderiváty lanosterolu a sitosterolu. Vhodná je kolona o délce 12 m a vnitřním průměru 0,2 mm.

3.10 Injekční mikrostříkačka pro plynovou chromatografii o objemu 1 μl s tvrzenou jehlou

4. CHEMIKÁLIE

Používají se pouze chemikálie čistoty p.a. Použitá voda musí být voda destilovaná nebo voda nejméně rovnocenné čistoty.

4.1 Ethanol o čistotě nejméně 95 %

4.2 Hydroxid draselný, 60 % roztok. Rozpusťte 600 g hydroxidu draselného (nejméně 85 %) ve vodě a doplňte vodou do 1 litru.

4.3 Betulin o čistotě nejméně 99 % 4.3.1 Roztoky betulinu v diethyletheru (4.4) 4.3.1.1 Koncentrace roztoku betulinu pro stanovení sitosterolu musí být 1,0 mg/ml. 4.3.1.2 Koncentrace roztoku betulinu pro stanovení stigmasterolu musí být 0,4 mg/ml.

4.4 Diethylether o čistotě p.a. (zbavený peroxidů s zbytků)

4.5 Síran sodný, bezvodý, granulovaný, předem sušený dvě hodiny při teplotě 102 °C

4.6 Silylační činidlo, např. TRI-SIL (dodávané firmou Pierce Chemical Co., katalogové číslo 49001) nebo rovnocenné. (Důležité: TRI-SIL je hořlavý, toxický, korozivní a pravděpodobně karcinogenní. Laboratorní personál musí být seznámen se zásadami bezpečnosti práce s TRI-SILem a přijmout nezbytná bezpečnostní opatření).

4.7 Lanosterol

4.8 Sitosterol o známé čistotě nejméně 90 % (P) Poznámka 1: Čistota standardních materiálů používaných pro kalibraci musí být zjištěna standardizační metodou. Vychází se z předpokladu, že všechny steroly ve vzorku jsou znázorněny na chromatogramu, že celková plocha píků představuje 100 % sterolových složek a že steroly reagují na detektor stejně. Linearita systému musí být ověřena v celém dotčeném rozsahu koncentrací. 4.8.1 Standardní roztok sitosterolu – s přesností na 0,001 mg/ml připravte roztok obsahující přibližně 0,5 mg/ml (W1) sitosterolu (4.8) v diethyletheru (4.4).

4.9 Stigmasterol o známé čistotě nejméně 90 % (P) 4.9.1 Standardní roztok stigmasterolu – s přesností na 0,001 mg/ml připravte roztok obsahující přibližně 0,2 mg/ml (W1) stigmasterolu (4.9) v diethyletheru (4.4).

4.10 Směs pro rozlišovací zkoušku. Připravte roztok obsahující 0,05 mg/ml lanosterolu (4.7) a 0,5 mg/ml sitosterolu (4.8) v diethyletheru (4.4).

5. PRACOVNÍ POSTUP

5.1 Příprava standardních roztoků pro chromatografii

Roztok vnitřního standardu (4.3.1) musí být přidán současně do odpovídajícího standardního roztoku sterolu a do zmýdelněného vzorku (viz 5.2.2).

5.1.1 Standardní chromatografický roztok sistosterolu: Převeďte 1 ml standardního roztoku sitosterolu (4.8.1) do každé ze dvou reakčních nádobek (3.7) a proudem dusíku odstraňte diethylether. Přidejte 1 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.1) a proudem dusíku odstraňte diethylether.

5.1.2 Standardní chromatografický roztok stigmasterolu: Převeďte 1 ml standardního roztoku stigmasterolu (4.9.1) do každé ze dvou reakčních nádobek (3.7) a proudem dusíku odstraňte diethylether. Přidejte 1 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.2) a proudem dusíku odstraňte diethylether.

5.2 Příprava nezmýdelnitelného podílu

5.2.1 Vzorek másla roztavte při teplotě nepřesahující 35 °C; vzorek důkladně promíchejte mícháním. S přesností na 1 mg navažte přibližně 1 g másla (W2) nebo zahuštěného másla (W2) do baňky na 150 ml (3.1). Přidejte 50 ml ethanolu (4.1) a 10 ml roztoku hydroxidu draselného (4.2). Nasaďte zpětný chladič a obsah zahřívejte asi na 75 °C po dobu 30 minut. Sejměte chladič a ochlaďte baňku přibližně na laboratorní teplotu.

5.2.2 Přidejte do baňky 1,0 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.1, má-li být stanoven sitosterol, a 4.3.1.2, má-li být stanoven stigmasterol). Důkladně promíchejte. Obsah baňky kvantitativně převeďte do dělicí nálevky na 500 ml (3.2). Baňku postupně vypláchněte 50 ml vody a 250 ml diethyletheru (4.4). Obsah dělicí nálevky důkladně protřepávejte po dobu 2 minut a počkejte, dokud se neoddělí jednotlivé fáze. Spodní vodnou vrstvu vypusťte a etherovou vrstvu čtyřikrát po sobě promyjte alikvotními, 100 ml díly vody. Poznámka 2: Má-li se zabránit tvorbě emulze, je nezbytně nutné provést první dvě promytí vodou jemně (deset převrácení nálevky). Třetí promytí lze provést důkladným protřepáváním po dobu 30 vteřin. Pokud se vytvoří emulze, je možné ji rozpustit přidáním 5–10 ml ethanolu. V případě, že se ethanol přidá, je nutné provést další dvě důkladná promytí vodou.

5.2.3 Čirou, mýdla zbavenou etherovou vrstvu nechte projít přes skleněnou kolonu (3.5) naplněnou 30 g bezvodého síranu sodného (4.5). Ether odeberte do baňky na 250 ml (3.3). Přidejte jeden varný kamínek a obsah nechte odpařit téměř do sucha ve vodní lázni nebo v izotermním plášti. Dbejte přitom na to, abyste zachytili odpadní rozpouštědla. Poznámka 3: Jestliže se extrakty vzorků odpařují do sucha při příliš vysoké teplotě, může dojít ke ztrátám na sterolu.

5.3 Příprava trimethylsilyletherů

5.3.1 Převeďte etherový roztok zbývající v baňce do reakční nádobky na 2 ml (3.7) se 2 ml diethyletheru a odstraňte ether proudem dusíku. Promyjte baňku dvěma dalšími 2 ml alikvotními dávkami diethyletheru s tím, že tekutinu pokaždé převedete do reakční nádobky a ether odstraníte proudem dusíku.

5.3.2 Proveďte silylaci vzorku přidáním 1 ml TRI-SILu (4.6). Uzavřete nádobku a důkladně ji protřepejte, aby se obsah rozpustil. Nerozpustí-li se úplně, zahřejte nádobku na 65–70 °C. Nechte ji nejméně 5 minut odstát a teprve poté její obsah nastříknete do plynového chromatografu. Silylaci standardů proveďte stejným způsobem jako silylaci vzorků. Silylaci směsi pro rozlišovací zkoušku (4.10) proveďte stejným způsobem jako silylaci vzorků. Poznámka 4: Silylace musí být provedena v bezvodém prostředí. Neúplná silylace betulinu je indikována druhým píkem v blízkosti píku betulinu. Pokud je během silylace přítomen ethanol, pak tuto sylilaci ruší. Ethanol může být přítomen v důsledku nedostatečného promývání ve fázi extrakce. Pokud tento problém přetrvává, může být během fáze extrakce provedeno páté promytí s důkladným protřepáváním po dobu 30 vteřin.

5.4 Analýza plynovou chromatografií

5.4.1 Volba provozních podmínek

Připravte plynový chromatograf podle návodu výrobce.

Směrné provozní podmínky jsou tyto:

— teplota kolony: 265 °C

— teplota nástřikového zařízení: 265 °C

— teplota detektoru: 300 °C

— průtok nosného plynu: 0,6 ml/min

— tlak vodíku: 84 kPa

— tlak vzduchu: 155 kPa

— rozdělení nástřiku: 10:1 až 50:1; poměr rozdělení musí být optimalizován podle návodu výrobce a linearity odezvy detektoru a poté ověřen v rozmezí dotčených koncentrací. — Poznámka 5: Je nesmírně důležité pravidelně čistit vložku do nástřikového prostoru (tzv. liner).

— množství nastříknuté látky: 1 μl roztoku TMSE.

Počkejte, dokud systém nedosáhne rovnováhy, a teprve po dostatečně stabilní reakci zahajte analýzu.

Tyto podmínky je třeba měnit podle charakteristických vlastností kolony a plynového chromatografu tak, aby získané chromatogramy splňovaly tyto požadavky:

— pík sitosterolu musí být dostatečně odlišen od píku lanosterolu. Obrázek 1 znázorňuje typický chromatogram, který je třeba získat ze silylované směsi pro rozlišovací zkoušku (4.10),

— relativní retenční časy následujících sterolů se musí blížit těmto hodnotám: — cholesterol: 1,0 stigmasterol: 1,3 sitosterol: 1,5 betulin: 2,5,

— retenční čas betulinu musí být přibližně 24 minut.

5.4.2 Analytický postup

Nastříkněte 1 μl roztoku silylovaného standardu (stigmasterolu nebo sitosterolu) a upravte kalibrační parametry integrátoru.

Nastříkněte další 1 μl roztoku silylovaného standardu, aby bylo možné stanovit odezvové faktory ve vztahu k betulinu.

Nastříkněte 1 μl roztoku silylovaného vzorku a změřte plochy píků. Nástřik standardů musí být proveden před každým chromatografickým cyklem a po každém takovém cyklu.

Za normálních okolností by měl každý takto ohraničený cyklus zahrnovat šest nástřiků vzorku.

Poznámka 6: Do integrace píku stigmasterolu je třeba zahrnout chvosty uvedené v bodech 1, 2 a 3 na obrázku 2b.

Integrace píku sitosterolu by měla zahrnovat plochu píku 22-dihydro-β-sitosterolu (stigmastanolu), který se vymývá okamžitě po sitosterolu (viz obrázek 3b) při vyhodnocování celkového sitosterolu.

6. VÝPOČET VÝSLEDKŮ

6.1 Stanoví se plocha píků sterolu a píků betulinu v obou standardech na začátku a na konci každého pokusu a vypočte se R1: R1 = (průměrná plocha píku sterolu ve standardu)/(průměrná plocha píku betulinu ve standardu) Stanoví se plocha píku sterolu (stigmasterolu a sitosterolu) a píku betulinu ve vzorku a vypočte seR2: R2 = (plocha píku sterolu ve vzorku)/(plocha píku betulinu ve vzorku) W1 = obsah sterolu ve standardu (mg), obsažený v 1 ml standardního roztoku (4.8.1 nebo 4.9.1) W2 = hmotnost vzorku (g) (5.2.1) P = čistota standardního sterolu (4.8 nebo 4.9) Obsah sterolu ve vzorku (mg/kg) = ((R 2) / (R 1)) × ((W 1) / (W 2)) × P × 10

7. PŘESNOST METODY

7.1 Máslo

7.1.1 Opakovatelnost

7.1.1.1 Stigmasterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 19,3 mg/kg.

7.1.1.2 Sitosterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 23,0 mg/kg.

7.1.2 Reprodukovatelnost

7.1.2.1 Stigmasterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 31,9 mg/kg.

7.1.2.2 Sitosterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 8,7 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.

7.1.3 Zdroj údajů o shodnosti

Údaje o shodnosti byly získány na základě pokusu z roku 1992, kterého se zúčastnilo osm laboratoří a ve kterém bylo v případě stigmasterolu použito šest vzorků (tří slepých duplikátů) a v případě sitosterolu šest vzorků (tří slepých duplikátů).

7.2 Zahuštěné máslo

7.2.1 Opakovatelnost

7.2.1.1 Stigmasterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 10,2 mg/kg.

7.2.1.2 Sitosterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 3,6 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.

7.2.2 Reprodukovatelnost

7.2.2.1 Stigmasterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 25,3 mg/kg.

7.2.2.2 Sitosterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 8,9 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.

7.2.3 Zdroj údajů o shodnosti

Údaje o shodnosti byly získány na základě pokusu z roku 1991, kterého se zúčastnilo devět laboratoří a ve kterém bylo v případě stigmasterolu použito šest vzorků (tří slepých duplikátů) a v případě sitosterolu šest vzorků (tří slepých duplikátů).

8. MEZE TOLERANCE

8.1 Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.

8.2 Máslo 8.2.1 Stigmasterol 8.2.1.1 Dávkování stigmasterolu je 150 g stigmasterolu o čistotě nejméně 95 % na tunu másla, tj. 142,5 mg/kg, nebo 170 g stigmasterolu o čistotě nejméně 85 % na tunu másla, tj. 144,5 mg/kg. 8.2.1.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 115,8 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 95 %), — 117,7 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 85 %), — 80,1 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 95 %), — 81,5 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 85 %). Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 115,8 mg/kg a 80,1 mg/kg nebo 117,7 mg/kg a 81,5 mg/kg. 8.2.2 Sitosterol 8.2.2.1 Dávkování sitosterolu je 600 g sitosterolu o čistotě nejméně 90 % na tunu másla, tj. 540 mg/kg. 8.2.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 482,6 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 90 %), — 347,6 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 90 %). Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 482,6 mg/kg a 347,6 mg/kg.

8.3 Zahuštěné máslo 8.3.1 Stigmasterol 8.3.1.1 Dávkování stigmasterolu je 150 g stigmasterolu o čistotě nejméně 95 % na tunu zahuštěného másla, tj. 142,5 mg/kg, nebo 170 g stigmasterolu o čistotě nejméně 85 % na tunu zahuštěného másla, tj. 144,5 mg/kg. 8.3.1.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 118,5 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 95 %), — 120,4 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 85 %), — 82,9 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 95 %), — 84,3 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 85 %). Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 118,5 mg/kg a 82,9 mg/kg nebo 120,4 mg/kg a 84,3 mg/kg. 8.3.2. Sitosterol 8.3.2.1 Dávkování sitosterolu je 600 g sitosterolu o čistotě nejméně 90 % na tunu zahuštěného másla, tj. 540 mg/kg. 8.3.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami: — 480,9 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 90 %), — 345,9 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 90 %). Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 480,9 mg/kg a 345,9 mg/kg. Vhodnějši je úplné rozlišení, tj. zápis píku lanosterolu se musí vrátit na základní linii dříve než začne růst pík sitosrerolu. Neúplné rozlišení se však toleruje.



Obrázek 2a Obrázek 2b Standard stigmasterolu Vzorek másla denaturovaného stigmasterolem Poznámka: Integrace píku.stigmasterolu musi zahrnout všechny chvosty uvedené v bodech 1, 2 a 3.



Obrázek 3a Obrázek 3a Standard β-sitosterolu Vzorek másla denaturovaného β-sitosterolem Poznámka: β-sitosterol často obsahuje nečistotu (identifikovanou jako stigmastanol), která se vymývá okamžitě po β-sitosterolu. Plochy těchto dvou píků musí být při vyhodnocování celkového přítomného β-sitosterolu sečteny.









PŘÍLOHA IX

(Článek 6)

REFERENČNÍ METODA PRO ZJIŠŤOVÁNÍ KRAVSKÉHO MLÉKA A KASEINÁTŮ V SÝRECH Z OVČÍHO MLÉKA, KOZÍHO MLÉKA NEBO BUVOLÍHO MLÉKA, NEBO SMĚSÍ OVČÍHO, KOZÍHO A BUVOLÍHO MLÉKA

1. PŘEDMĚT

Zjišťování kravského mléka a kaseinátů v sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka anebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka izoelektrickou fokusací γ-kaseinů po plasminolýze.

2. OBLAST POUŽITÍ

Metoda je vhodná pro citlivé a specifické zjišťování mléka a kaseinátu, též tepelně ošetřených, v čerstvých a zralých sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka nebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka. Není vhodná k odhalení falšování mléka a sýrů tepelně ošetřenými bílkovinnými koncentráty z hovězí syrovátky.

3. PODSTATA METODY

3.1 Izolace kaseinů ze sýra a referenčních standardů

3.2 Rozpuštění izolovaných kaseinů a proteolýza plasminem (EC.3.4.21.7)

3.3 Izoelektrická fokusace plasminem ošetřených kaseinů za přítomnosti močoviny a vybarvení bílkovin

3.4 Vyhodnocení vybarvených obrazců kaseinu γ3 a γ2 (důkaz přítomnosti kravského mléka) na základě porovnání obrazce získaného ze vzorku s obrazci získanými u téhož gelu z referenčních standardů obsahujících 0 % a 1 % kravského mléka

4. CHEMIKÁLIE

Není-li stanoveno jinak, používají se pouze chemikálie čistoty p.a. Voda musí být redestilovaná nebo rovnocenné čistoty.

Poznámka: Následující údaje se vztahují na laboratorně připravované polyakrylamidové gely s obsahem močoviny o rozměrech 265 × 125 × 0,25 mm. Pokud se použijí jiné rozměry nebo druhy gelu, může být nutné upravit podmínky separace.

Isoelektrická fokusace

4.1 Chemikálie pro přípravu polyakrylamidových gelů s obsahem močoviny

4.1.1 Zásobní roztok gelu

Ve vodě rozpusťte:

4,85g akrylamidu

0,15g N, N'-methylen-bis-akrylamidu (BIS)

48,05g močoviny

15,00g glycerolu (87 % hm.),

doplňte na 100 ml a uložte do chladničky v hnědé skleněné lahvi.

Poznámka: Místo uvedených množství neurotoxického akrylamidu lze použít komerčně dostupný, předem namíchaný roztok akrylamidu a BIS. V případě, že koncentrace komerčního roztoku je 30 % hm./obj. akrylamidu a 0,8 % hm./obj. BIS, pak uvedená množství (4,85g akryla