2009L0156 — CS — 18.10.2016 — 002.001

Tento dokument slouží výhradně k informačním účelům a nemá žádný právní účinek. Orgány a instituce Evropské unie nenesou za jeho obsah žádnou odpovědnost. Závazná znění příslušných právních předpisů, včetně jejich právních východisek a odůvodnění, jsou zveřejněna v Úředním věstníku Evropské unie a jsou k dispozici v databázi EUR-Lex. Tato úřední znění jsou přímo dostupná přes odkazy uvedené v tomto dokumentu

Ve znění:

▼B

SMĚRNICE RADY 2009/156/ES

ze dne 30. listopadu 2009

o veterinárních pravidlech pro přesun koňovitých a jejich dovoz ze třetích zemí

(kodifikované znění)

(Text s významem pro EHP)

KAPITOLA I

OBECNÁ USTANOVENÍ

Článek 1

Tato směrnice stanoví veterinární předpisy pro přesun živých koňovitých mezi členskými státy a pro dovoz koňovitých ze třetích zemí.

Článek 2

Pro účely této směrnice se rozumí:

c) „evidovanými koňovitými“ koňovití evidovaní podle směrnice Rady 90/427/EHS ze dne 26. června 1990 o zootechnických a genealogických podmínkách pro obchod s koňovitými uvnitř Společenství ( 1 ) a identifikovaní pomocí identifikačního dokladu vydaného:

d) „jatečnými koňovitými“ koňovití určení k porážce na jatkách, a to buď přímo po přepravě, nebo po tranzitu přes schválené sběrné středisko uvedené v článku 7;

e) „plemennými a užitkovými koňovitými“ koňovití jiní než uvedení v písmenech c) a d);

KAPITOLA II

PRAVIDLA PRO PŘESUN KOŇOVITÝCH MEZI ČLENSKÝMI STÁTY

Článek 3

Členské státy povolí přesun evidovaných koňovitých na svém území nebo odeslání koňovitých do jiného členského státu pouze v případě, že jsou splněny podmínky stanovené v článcích 4 a 5.

Příslušné orgány členských států určení však mohou udělit obecnou nebo omezenou výjimku pro přesun koňovitých, kteří:

Členské státy, které tyto možnosti využijí, sdělí Komisi rozsah udělených výjimek.

Článek 4

1. Koňovití nesmějí při prohlídce vykazovat žádný klinický příznak nákazy. Prohlídka musí být provedena během 48 hodin před jejich naložením. V případě evidovaných koňovitých je však tato prohlídka, aniž je dotčen článek 6, vyžadována pouze pro obchod uvnitř Společenství.

2. Aniž jsou dotčeny požadavky odstavce 5, jež se týkají chorob povinných hlášením, musí být úřední veterinární lékař v době prohlídky přesvědčen o tom, že neexistují žádné důvody – zejména na základě prohlášení majitele nebo chovatele – pro učinění závěru, že dotyční koňovití byli ve styku s koňovitými postiženými nákazou během patnácti dnů bezprostředně předcházejících prohlídce.

3. Koňovití nesmějí být určeni k utracení v rámci národního programu eradikace nákazy.

4. Koňovití musí být identifikováni takto:

5. Vedle požadavků stanovených v článku 5 nesmějí koňovití pocházet z hospodářství, které podléhá některé z následujících karantén:

iii) do dne, kdy po zneškodnění nakažených zvířat vykázala zbývající zvířata negativní reakci při dvou vyšetřeních testem podle Cogginse provedených v rozmezí tří měsíců v případě nakažlivé chudokrevnosti koní,

i) šest měsíců ode dne posledního skutečného nebo možného styku s nakaženým zvířetem v případě koňovitých podezřelých z hřebčí nákazy. V případě hřebce však karanténa platí až do jeho kastrace,

Příslušné orgány mohou udělit výjimky z těchto karantén hipodromům a závodištím, přičemž povahu každé udělené výjimky sdělí Komisi.

►M1

Jestliže členský stát vypracuje nebo vypracoval dobrovolný nebo povinný program tlumení nákazy, vůči níž jsou koňovití vnímaví, může jej předložit Komisi do šesti měsíců od 4. července 1990 v případě Belgie, Dánska, Německa, Irska, Řecka, Španělska, Francie, Itálie, Lucemburska, Nizozemska, Portugalska a Spojeného království, od 1. ledna 1995 v případě Rakouska, Finska a Švédska, od 1. května 2004 v případě České republiky, Estonska, Kypru, Lotyšska, Litvy, Maďarska, Malty, Polska, Slovinska a Slovenska, od 1. ledna 2007 v případě Bulharska a Rumunska a od 1. července 2013 v případě Chorvatska s tím, že uvede zejména:

◄

c) zeměpisnou oblast, ve které bude program proveden;

Komise posoudí programy předložené členskými státy. Podle potřeby je schválí postupem podle čl. 21 odst. 2. Týmž postupem lze určit doplňkové obecné nebo zvláštní záruky, které mohou být v obchodu uvnitř Společenství požadovány. Tyto záruky nesmějí být přísnější než záruky, které členský stát vyžaduje na vlastním území.

Programy předložené členskými státy mohou být změněny nebo doplněny postupem podle čl. 21 odst. 3. Týmž postupem mohou být schváleny změny nebo doplnění programů dříve schválených a záruk vymezených v souladu s druhým pododstavcem tohoto odstavce.

Článek 5

1. Členský stát, který není prostý moru koní, může odesílat koňovité z té části svého území, která je považována za infikovanou ve smyslu odstavce 2, pouze za podmínek stanovených v odstavci 5.

2. Část území členského státu se považuje za infikovanou morem koní, jestliže:

Část území považovaná za infikovanou morem koní zahrnuje alespoň:

3. Pravidla a opatření pro tlumení moru koní vztahující se k územím a pásmům uvedeným v odstavci 2 a odpovídající odchylky jsou blíže uvedeny ve směrnici Rady 92/35/EHS ze dne 29. dubna 1992, kterou se stanoví pravidla a opatření pro tlumení moru koní ( 2 ).

4. Všichni očkovaní koňovití nalézající se v ochranném pásmu musí být evidováni a označeni v souladu s čl. 6 odst. 1 písm. d) směrnice 92/35/EHS.

Identifikační doklad, případně veterinární osvědčení, musí obsahovat jasný odkaz na toto očkování.

5. Členský stát může odesílat z území uvedeného v odst. 2 druhém pododstavci pouze koňovité, kteří splňují tyto podmínky:

c) musí podstoupit vyšetření na mor koní popsané v příloze IV, a to dvakrát v rozmezí 21 až 30 dnů, přičemž druhé vyšetření musí být provedeno během deseti dnů před odesláním:

e) během období v karanténě a během přepravy z karanténní stanice do místa odeslání musí být chráněni proti vektorovému hmyzu.

Článek 6

Členské státy, které uplatňují alternativní systém kontroly poskytující záruky rovnocenné těm, jež jsou stanoveny v čl. 4 odst. 5, pokud se týká přesunu koňovitých na jejich území, mohou na základě vzájemnosti udělit další výjimky z čl. 4 odst. 1 druhé věty a čl. 8 odst. 1 písm. b).

Členské státy je oznámí Komisi.

Článek 7

1. Koňovití musí být dopraveni z hospodářství původu na místo určení co možná nejrychleji a buď přímo, nebo přes schválené sběrné středisko zvířat ve smyslu čl. 2 odst. 2 písm. o) směrnice Rady 64/432/EHS ze dne 26. června 1964 o veterinárních otázkách obchodu se skotem a prasaty uvnitř Společenství ( 3 ), a to ve vozidlech nebo kontejnerech, které jsou pravidelně čištěny a dezinfikovány dezinfekčním prostředkem v odstupech, které stanoví odesílající členský stát. Vozidla musí být vybavena tak, aby z nich v průběhu přepravy nemohly vytékat nebo vypadávat exkrementy, podestýlka nebo krmivo koňovitých. Aniž je dotčeno nařízení (ES) č. 1/2005, musí být přeprava prováděna tak, aby bylo účinně chráněno zdraví a dobré životní podmínky koňovitých.

2. Členský stát určení může udělit obecnou nebo omezenou odchylku od některého z požadavků čl. 4 odst. 5 pro jakékoliv zvíře, které nese zvláštní označení vyjadřující, že je určeno k porážce, za předpokladu, že ve veterinárním osvědčení podle přílohy III je tato odchylka uvedena.

V případě udělení této odchylky musí být jateční koňovití dopraveni přímo do určených jatek a musí být poraženi během pěti dnů po příjezdu na jatky.

3. Úřední veterinární lékař zaznamená v evidenci identifikační číslo nebo číslo identifikačního dokladu poraženého koňovitého zvířete a zašle příslušnému orgánu místa odeslání na jeho žádost potvrzení o tom, že zvíře bylo poraženo.

Článek 8

1. Členské státy zajistí, aby:

2. Veterinární osvědčení nebo v případě evidovaných koňovitých potvrzení o zdravotním stavu musí být, aniž je dotčen článek 6, vypracováno během 48 hodin před naložením nebo nejpozději poslední pracovní den před naložením, a to alespoň v jednom z úředních jazyků členských států odeslání a určení. Doba platnosti veterinárních osvědčení nebo potvrzení o zdravotním stavu je deset dnů. Veterinární osvědčení nebo potvrzení o zdravotním stavu sestává pouze z jednoho listu.

3. Pro přesun mezi členskými státy mohou být koňovití jiní než evidovaní namísto jednotlivých veterinárních osvědčení uvedených v odst. 1 písm. b) pokryti pouze jedním veterinárním osvědčením na zásilku.

Článek 9

Použijí se pravidla stanovená směrnicí 90/425/EHS, především pokud jde o kontroly původu, o organizaci kontrol v zemi určení, o další postup strany země určení v návaznosti na tyto kontroly a o ochranná opatření, která mají být učiněna.

Článek 10

Veterinární znalci Komise mohou v rozsahu nutném k zajištění jednotného uplatňování této směrnice a ve spolupráci s příslušnými vnitrostátními orgány provádět kontroly na místě. Komise sdělí členským státům závěry těchto kontrol.

Členské státy, na jejichž území se kontrola provádí, poskytují znalcům veškerou pomoc nutnou ke splnění jejich úkolu.

Prováděcí pravidla k tomuto článku se přijímají postupem podle čl. 21 odst. 2.

KAPITOLA III

PRAVIDLA PRO DOVOZ KOŇOVITÝCH ZE TŘETÍCH ZEMÍ

Článek 11

Koňovití dovážení do Společenství musí splňovat podmínky stanovené v článcích 12 až 16.

Článek 12

1. Dovoz koňovitých do Společenství se povolí jen ze třetích zemí uvedených na seznamu sestaveném nebo změněném postupem podle čl. 21 odst. 2.

Při zohlednění nákazové situace a záruk poskytnutých pro koňovité třetí zemí může být postupem podle čl. 21 odst. 2 rozhodnuto, že povolení poskytnuté podle prvního pododstavce tohoto odstavce se použije na celé území třetí země nebo pouze na jeho část.

Za tímto účelem a na základě příslušných mezinárodních norem se přihlédne k tomu, jak třetí země tyto normy, zejména zásadu regionalizace, používá a provádí na svém vlastním území a ve vztahu ke svým veterinárním požadavkům pro dovoz z ostatních třetích zemí a ze Společenství.

2. Při sestavování nebo změně seznamu stanoveného v odstavci 1 se bere ohled zejména na:

a) nákazový status koňovitých a jiných domácích zvířat a volně žijících živočichů ve třetí zemi, se zvláštním zřetelem k exotickým nákazám zvířat, a na všechna obecná zdravotní hlediska a situaci životního prostředí ve třetí zemi, které by mohly představovat riziko pro nákazový status a životní prostředí ve Společenství;

c) organizaci příslušného veterinárního orgánu a jeho kontrolních útvarů, pravomoci těchto útvarů, dohled, jemuž podléhají, a prostředky, jimiž disponují, včetně personálu a laboratorních kapacit, pro účinné uplatňování vnitrostátních právních předpisů;

e) to, zda je třetí země členem Světové organizace pro zdraví zvířat (OIE), a na pravidelnost a rychlost informací poskytovaných třetí zemí o výskytu nákaz zvířat na jejím území, zejména nákaz uvedených na seznamu OIE a v příloze I;

i) o potvrzení výskytu nákaz koňovitých uvedených v příloze I, a to během 24 hodin, a o všech změnách přístupu k očkování proti těmto nákazám,

h) výsledky kontrol nebo auditů Společenství provedených v dané třetí zemi, zejména na výsledky posouzení příslušných orgánů, nebo požádá-li o to Komise, na zprávu předloženou příslušnými orgány o kontrolách, které provedly;

3. Komise zajistí, aby byly aktualizované verze sestaveného nebo změněného seznamu, jak je stanoveno v odstavci 1, dostupné veřejnosti.

Tento seznam lze kombinovat s ostatními seznamy sestavenými pro účely zdraví zvířat a veřejného zdraví a může rovněž obsahovat vzory veterinárních osvědčení.

4. Postupem podle čl. 21 odst. 2 se pro každou třetí zemi nebo skupinu třetích zemí stanoví zvláštní dovozní podmínky s ohledem na nákazovou situaci koňovitých v dotyčné třetí zemi nebo zemích.

5. Postupem podle čl. 21 odst. 2 mohou být přijata prováděcí pravidla k odstavcům 1 až 4, včetně kritérií pro zařazení třetích zemí nebo částí třetích zemí na seznam podle odstavce 1.

Článek 13

1. Koňovití musí pocházet ze třetích zemí:

c) šest měsíců prostých hřebčí nákazy a vozhřivky.

2. Postupem podle čl. 21 odst. 2 může být rozhodnuto:

Článek 14

Přede dnem naložení k přepravě do členského státu určení musí koňovití zůstat bez přerušení na území nebo části území třetí země nebo, v případě regionalizace, v části území definované podle čl. 13 odst. 2 písm. a) po dobu, která bude určena v rozhodnutích přijatých podle článku 15.

Koňovití musí pocházet z hospodářství, které je pod veterinárním dozorem.

Článek 15

Dovoz koňovitých z území třetí země nebo z jeho části definované v souladu s čl. 13 odst. 2 písm. a), které je na seznamu sestaveném v souladu s čl. 12 odst. 1, je povolen pouze tehdy, pokud koňovití kromě požadavků článku 13:

Článek 16

1. Koňovití musí být identifikováni v souladu s čl. 4 odst. 4 a doprovázeni veterinárním osvědčením vystaveným úředním veterinárním lékařem vyvážející třetí země. Toto veterinární osvědčení musí:

a) být vydáno v den nakládky zvířat k odeslání do členského státu určení nebo, v případě evidovaných koní, v poslední pracovní den před naložením;

c) doprovázet zvířata v prvopise;

2. Veterinární osvědčení se vyhotovuje na formuláři, který odpovídá vzoru stanovenému postupem podle čl. 21 odst. 2.

Článek 17

1. Jateční koňovití musí být neprodleně po vstupu do členského státu určení dáni na jatky, a to buď přímo, nebo po tranzitu přes schválené sběrné středisko uvedené v článku 7, a musí být v souladu s veterinárními požadavky poraženi ve lhůtě určené v rozhodnutích, která budou přijata podle článku 15.

2. Aniž jsou dotčeny zvláštní podmínky, které mohou být přijaty postupem podle čl. 21 odst. 2, může příslušný orgán členského státu určení na základě zdravotního stavu zvířat určit jatky, do kterých musí být takoví koňovití dopraveni.

Článek 18

Veterinární znalci členských států a Komise provádějí kontroly na místě za účelem ověření, zda jsou ustanovení této směrnice, a zejména čl. 12 odst. 2, skutečně uplatňována.

Jestliže se při kontrolách prováděných podle tohoto článku zjistí závažné skutečnosti proti schválenému hospodářství, Komise neprodleně vyrozumí členské státy a ihned přijme rozhodnutí, kterým schválení prozatímně pozastaví. Konečné rozhodnutí se přijme postupem podle čl. 21 odst. 3.

Znalce z členských států pověřené kontrolami jmenuje Komise na návrh členských států.

Kontroly jsou prováděny jménem Společenství, které hradí náklady s nimi spojené.

Četnost a průběh kontrol se stanoví postupem podle čl. 21 odst. 2.

Článek 19

Postupem podle čl. 21 odst. 2:

b) aniž je dotčen článek 15, stanoví se zvláštní podmínky pro dočasný vstup na území Společenství evidovaných koňovitých nebo koňovitých určených pro zvláštní využití nebo pro jejich opětovný vstup na území Společenství poté, co byli dočasně vyvezeni;

c) určí se podmínky pro změnu dočasného vstupu na trvalý;

KAPITOLA IV

ZÁVĚREČNÁ USTANOVENÍ

Článek 20

Přílohy I až IV se mění postupem podle čl. 21 odst. 3.

Článek 21

1. Komisi je nápomocen Stálý výbor pro potravinový řetězec a zdraví zvířat, zřízený článkem 58 nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 178/2002 ze dne 28. ledna 2002, kterým se stanoví obecné zásady a požadavky potravinového práva, zřizuje se Evropský úřad pro bezpečnost potravin a stanoví postupy týkající se bezpečnosti potravin ( 4 ).

2. Odkazuje-li se na tento odstavec, použijí se články 5 a 7 rozhodnutí 1999/468/ES.

Doba uvedená v čl. 5 odst. 6 rozhodnutí 1999/468/ES je tři měsíce.

3. Odkazuje-li se na tento odstavec, použijí se články 5 a 7 rozhodnutí 1999/468/ES.

Doba uvedená v čl. 5 odst. 6 rozhodnutí 1999/468/ES je patnáct dní.

Článek 22

Směrnice 90/426/EHS ve znění aktů uvedených v části A přílohy V se zrušuje, aniž jsou dotčeny povinnosti členských států týkající se lhůt pro provedení zmíněných směrnic ve vnitrostátním právu uvedených v části B přílohy V.

Odkazy na zrušenou směrnici se považují za odkazy na tuto směrnici v souladu se srovnávací tabulkou obsaženou v příloze VI.

Článek 23

Tato směrnice vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.

Článek 24

Tato směrnice je určena členským státům.

PŘÍLOHA I

CHOROBY POVINNÉ HLÁŠENÍM

Následující choroby jsou povinné hlášením:

PŘÍLOHA II

VZOR

POTVRZENÍ O ZDRAVOTNÍM STAVU ( 5 )

Pas číslo …

Já, níže podepsaný, potvrzuji ( 6 ), že výše popsaný koňovitý splňuje tyto požadavky:

— pochází z území nebo části území členského státu, které podléhá karanténě z veterinárních důvodů, a prošel s uspokojujícími výsledky vyšetřením stanoveným v čl. 5 odst. 5 směrnice 2009/156/ES, a to v karanténní stanici…… v době mezi … a … ( 7 );

c)

— v případě nakažlivé chudokrevnosti koní až do dne, kdy po utracení nakažených zvířat vykázala zbývající zvířata při dvou vyšetřeních testem podle Cogginse provedených v rozmezí tří měsíců, negativní reakci,

— během posledních šesti měsíců v případě koňovitých podezřelých nebo postižených hřebčí nákazou počínaje dnem posledního skutečného nebo možného styku s nemocným zvířetem. V případě hřebce platí karanténa až do jeho kastrace,

d) nepochází z hospodářství, které podléhá karanténě z veterinárních důvodů, a nepřišel do styku s koňovitými z hospodářství, které podléhá karanténě z veterinárních důvodů:

e) pokud vím, nepřišel během patnácti dnů před tímto prohlášením do styku s koňovitými postiženými nákazou;

PŘÍLOHA III

VZOR

VETERINÁRNÍ OSVĚDČENÍ

pro obchod mezi členskými státy

KOŇOVITÍ

▼M2

PŘÍLOHA IV

MOR KONÍ

DIAGNOSTIKA

ČÁST A

Sérologické testy

Na základě kapitoly 2.5.1 oddílu B bodu 2 Příručky norem pro diagnostické testy a očkovací látky pro suchozemská zvířata vydané v roce 2016 a přijaté Světovým shromážděním delegátů OIE v květnu 2012 využívá sérologická metoda zde popsaná enzymovou imunoanalýzu s enzymem vázaným na imunosorbent (enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA).

VP7 je hlavní imunodominantní antigenní virový protein viru moru koní (AHSV) a je obsažený ve všech devíti sérotypech AHSV. Bylo prokázáno, že rekombinantní proteiny AHSV-VP7 jsou stabilní, neškodné a vhodné pro použití jako antigeny v postupech využívajících ELISA pro stanovení protilátek proti AHSV a poskytují vysoký stupeň senzitivity a specificity (Laviada et al., 1992b ( 10 ); Maree and Paweska, 2005). Nepřímý test ELISA a blokující test ELISA jsou dva testy AHS-VP7 ELISA, které jsou vhodné pro sérologickou diagnózu moru koní.

1. Nepřímý test ELISA pro zjištění protilátek proti viru moru koní (AHSV)

Jako konjugát využívá tato metoda antikoňský gama-globulin konjugovaný s křenovou peroxidázou reagující se sérem koní, mezků a oslů. Metoda popsaná v publikaci Maree & Paweska (2005) ( 11 ) využívá jako konjugát protein G, který rovněž reaguje se sérem zeber.

Antigen lze získat ve středisku Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) ve lhůtě 4 až 6 měsíců od zaslání žádosti.

1.1. Postup testu

1.1.1. Pevná fáze

1.1.2. Testované vzorky

1.1.3. Konjugát

1.1.4. Chromogen/substrát

1.2. Interpretace výsledků

2. Blokující test ELISA pro zjištění protilátek proti viru moru koní (AHSV)

Kompetitivní blokující test ELISA je zaměřen na zjištění specifických protilátek proti AHSV v séru koňovitých, tj. koňů, oslů, zeber a jejich kříženců. Tento test předchází problému se specificitou, k němuž příležitostně dochází při použití nepřímých testů ELISA.

Podstatou testu je přerušení reakce mezi rekombinantním proteinem VP7 vázaným na destičku ELISA a konjugovanou monoklonální protilátkou (Mab) specifickou na AHS-VP7. Protilátka v testovaném séru blokuje reakci mezi antigenem a Mab a v důsledku toho dojde ke zmírnění zbarvení. Protože je Mab zaměřena proti VP7, poskytuje test vysokou úroveň senzitivity a specificity.

Kompetitivní blokující test ELISA je komerčně dostupný.

2.1. Postup testu

2.1.1. Pevná fáze

2.1.2. Testované vzorky a kontrolní vzorky

Pro titraci se připraví dvojitá série roztoků testovaných sér (100 μl/jamka) od 1 ku 10 do 1 ku 280 v osmi jamkách, jedno sérum na sloupec destičky. Stejný krok se provede i s pozitivním a negativním kontrolním sérem. Inkubuje se 1 hodinu při teplotě 37 °C.

2.1.3. Konjugát

2.1.3.1. Do každé jamky se přidá 100 μl roztoku Mab proti VP7 konjugovaného s křenovou peroxidázou. Tento roztok Mab byl předem naředěn v poměru 1/5 000 –1/15 000 v roztoku stabilizátoru StabiliZyme Select® (SurModics. Reference: SZ03) 1 ku 1 v destilované vodě. Inkubuje se 30 minut při teplotě 37 °C.

2.1.4. Chromogen/substrát

Přidá se 100 μl/jamka roztoku chromogen/substrát, tj.1 ml ABTS (2,2′-azino-bis-[3-ethylbenzothiazolin-6-kyselina sulfonová]), 5 mg/ml + 9 ml substrátového pufru (0,1 M fosfáto-citrátový pufr pH 4 obsahující 0,03 % H2O2, a inkubuje se 10 minut při pokojové teplotě. Proces barvení se zastaví přidáním 100 μl/jamka 2 % (hmot./obj.) roztoku SDS (natriumdodecylsulfát).

2.1.5. Vyhodnocení

Vzorek se vyhodnotí při vlnové délce 405 nm pomocí odečítacího zařízení pro ELISA.

2.2. Interpretace výsledků

2.2.2. Vzorky s hodnotou BP vyšší než 50 % by měly být považovány za pozitivní na protilátky proti AHSV.

2.2.3. Vzorky s hodnotou BP nižší než 45 % by měly být považovány za negativní na protilátky proti AHSV.

2.2.4. Vzorky s hodnotou BP mezi 45 % a 50 % by měly být považovány za nejisté a testování je třeba provést znovu. V případě opakovaného nejistého výsledky by zvířata měla být znovu vyšetřena na základě vzorků odebraných nejdříve dva týdny po odběru vzorku, který se považoval za nejistý.

ČÁST B

Identifikace původce

Polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí v reálném čase (rRT-PCR)

Testy k identifikaci původce založené na metodách využívajících nukleovou kyselinu musí zjistit referenční kmeny u devíti virových sérotypů AHSV.

Metoda popsaná v bodě 2.1. vychází z kapitoly 2.5.1. oddílu B bodu 1.2 Příručky pro diagnostické testy a očkovací látky pro suchozemská zvířata, vydání z roku 2016 přijaté Světovým shromážděním delegátů OIE v květnu 2012.

Každá detekční metoda využívající RT-PCR používaná při testování vzorků krve nebo sleziny v souladu se směrnicí 2009/156/ES musí vykázat stejnou nebo vyšší senzitivitu jako metody popsané v bodě 2.

Inaktivovaný vir referenčních kmenů sérotypů 1 až 9 je možné získat v referenční laboratoři Evropské unie nebo referenční laboratoři OIE pro mor koní v Algete ve Španělsku.

1. Extrakce virové RNA

K zajištění dobré reakce je nezbytné ze vzorku AHSV extrahovat vysoce kvalitní RNA. Extrakci nukleových kyselin z klinických vzorků lze provést různými interními a komerčně dostupnými metodami.

Komerční sady využívají k izolaci RNA různé přístupy. Většina z nich je založena na jednom z následujících postupů:

— adsorpce nukleových kyselin do filtračního systému,

— adsorpce nukleových kyselin do systému magnetických kuliček.

Níže je uveden příklad interně provedené extrakce RNA:

1.2. Po odstředění se do supernatantu přidá 1 μg reagentu kvasinkové RNA, 0,1 ml 2 M octanu sodného pH 4, 1 ml fenolu a 0,2 ml směsi chloroformu a isoamylalkoholu (49/1).

2. Postup RT-PCR v reálném čase

2.1. Skupinově specifická RT-PCR v reálném čase dle Agüero a kol., 2008 ( 12 )

Tato skupinově specifická RT-PCR v reálném čase cílí na VP7 v AHSV a dokáže detekovat všechny známé a aktuálně cirkulující sérotypy a kmeny AHSV. Uplatnění této metody přineslo v účastnících se národních referenčních laboratořích členských států Evropské unie při zkouškách odborné způsobilosti každoročně organizovaných referenční laboratoří Evropské unie v období 2009–2015 velmi dobré výsledky. V mezinárodním kruhovém testu provedeném v roce 2015 v rámci sítě referenčních laboratoří OIE se tento protokol rovněž umístil na předních místech.

Sekvenování primeru a sondy k detekci virů druhu AHSV:

2.1.1. Koncentrace primeru se naředí na pracovní koncentraci 8 μM (dále jen „pracovní primer 8 μM“) a sonda se naředí na pracovní koncentraci 50 μM (dále jen „pracovní roztok sondy 50 μM“). Navrhne se uspořádání testovací destičky a nahraje se do softwaru přístroje k provedení metody PCR v reálném čase. S využitím plánu uspořádání se přidá 2,5 μl každého pracovního primeru 8 μM do každé jamky, která bude obsahovat vzorky RNA, pozitivní a/nebo negativní kontrolní vzorky (konečná koncentrace primeru bude 1 μM v 20 μl roztoku RT-PCR mix). Destička se uchovává na ledu.

2.1.3. Podle pokynů výrobce se připraví roztok master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase v objemu dostatečném pro počet testovaných vzorků. 0,1 μl pracovního roztoku sondy o 50 μM se přidá do každé jamky obsahující vzorky RNA (konečná koncentrace sondy bude 0,25 μM v každé jamce obsahující vzorky RNA. 13 μl roztoku master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase se rozdělí do každé jamky na destičce PCR obsahující denaturované primery a RNA.

2.1.4. Destička se umístí do termocykleru v reálném čase naprogramovaného na reverzní transkripci a detekci amplifikace/fluorescence cDNA. Podmínky amplifikace zahrnují první krok reverzní transkripce při 48 °C po 25 minut, následovaný 10 minutami při 95 °C („horký start“) a 40 cykly po 15 sekundách při 95 °C, po 35 sekundách při 55 °C a po 30 sekundách při 72 °C (nebo 40 cyklů při 97 °C po 2 sekundách a při 55 °C po 30 sekundách při použití reakčních činidel a termocykleru určených pro rychlé reakce). Údaje o fluorescenci se získají na konci kroku při 55 °C.

2.2. Skupinově specifická RT-PCR v reálném čase dle Guthrie a kol., 2013 ( 13 )

RT-PCR v reálném čase využívající sondy fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET) k detekci nukleové kyseliny v AHSV.

Popsané stanovení obsahu AHSV RT-PCR bylo navrženo pomocí sekvencí ze širokého spektra v současnosti cirkulujících kmenů AHSV (Quan a kol., 2010 ( 14 )). Rovněž zahrnuje chráněnou syntetickou externí kontrolu stanovení obsahu k ověření řádného fungování komponent pro stanovení obsahu.

Soupravy pro jednokrokovou PCR v reálném čase jsou komerčně k dispozici. Níže jsou uvedeny některé základní kroky tak, jak je popsal Guthrie a kol. (2013), které lze upravit v závislosti podle místních specifik nebo specifik jednotlivých případů, použitých soupravách a dostupném vybavení.

Sekvenování primeru a sondy k detekci virů druhu AHSV:

2.2.1. Roztoky primeru a sondy se připraví v 25 × násobné koncentraci při 5 μΜ v případě přímého a reverzního primeru a 3 μΜ v případě sondy. Navrhne se uspořádání testovací destičky a nahraje se do softwaru přístroje k provedení metody PCR v reálném čase. S využitím plánu uspořádání se přidá 5 μl vzorků RNA, včetně testovacích vzorků a pozitivních i negativních kontrolních vzorků, do příslušných jamek na destičce.

2.2.3. Podle pokynů výrobce se připraví roztok master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase v objemu dostatečném pro počet testovaných vzorků. 1 μl 25 × násobného roztoku směsi primeru a sondy (viz bod 2.2.1 výše) se přidá do roztoku master mix k získání konečné koncentrace v každé jamce 200 nM pro každý primer a 120 nM pro sondu. 20 μl roztoku master mix se rozdělí do každé jamky na destičce PCR obsahující denaturovanou RNA.