Tento dokument je t řeba brát jako dokumenta ční nástroj a instituce nenesou jakoukoli odpov ědnost za jeho obsah  
►B NA ŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008  
ze dne 30. kv ětna 2008,  
kterým se stanoví zkušební metody podle na řízení Evropského parlamentu a Rady (ES) 
č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek  
(Text s významem pro EHP)  
(Úř. věst. L 142, 31.5.2008, s. 1)  
Ve znění: 
Úřední věstník  
Č. Strana  Datum  
►M1 Nařízení Komise (ES) č. 761/2009 ze dne 23. července 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Nařízení Komise (EU) č. 1152/2010 ze dne 8. prosince 2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Nařízení Komise (EU) č. 640/2012 ze dne 6. července 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Nařízení Komise (EU) č. 260/2014 ze dne 24. ledna 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Nařízení Komise (EU) č. 900/2014 ze dne 15. července 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1
NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008  
ze dne 30. kv ětna 2008,  
kterým se stanoví zkušební metody podle na řízení Evropského 
parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, 
povolování a omezování chemických látek  
(Text s významem pro EHP)  
KOMISE EVROPSKÝCH SPOLE ČENSTVÍ,  
s ohledem na Smlouvu o založení Evropského spole čenství,  
s ohledem na na řízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 
ze dne 18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, o z řízení Evropské agentury pro 
chemické látky, o zm ěně směrnice 1999/45/ES a o zrušení na řízení 
Rady (EHS) č. 793/93, na řízení Komise (ES) č. 1488/94, sm ěrnice 
Rady 76/769/EHS a sm ěrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 
93/105/ES a 2000/21/ES (
 1 ), a zejména na čl. 13 odst. 3 uvedeného 
nařízení,  
vzhledem k t ěmto důvodům: 
(1) Podle na řízení (ES) č. 1907/2006 se na úrovni Spole čenství 
stanoví zkušební metody pro ú čely provád ění zkoušek látek, 
jsou-li tyto zkoušky vyžadovány pro získání informací o podstatných vlastnostech látek.
 
(2) Směrnice Rady 67/548/EHS ze dne 27. června 1967 o sbližování 
právních a správních p ředpisů týkajících se klasifikace, balení 
a označování nebezpe čných látek (  2 ) stanovila v p říloze 
V metody ur čení fyzikáln ě-chemických vlastností, toxicity 
a ekotoxicity látek a p řípravků. Příloha V sm ěrnice 67/548/EHS 
byla zrušena sm ěrnicí Evropského parlamentu a Rady 
2006/121/ES s ú činností ode dne 1. června 2008.  
(3) Zkušební metody obsažené v p říloze V sm ěrnice 67/548/EHS by 
měly být zahrnuty do tohoto na řízení.  
(4) Tímto na řízením není vylou čeno použití jiných zkušebních 
metod, pokud je ovšem jejich použití v souladu s čl. 13 odst. 3 
nařízení č. 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) Úř. věst. L 396, 30.12.2006, s. 1; opravené zn ění v Úř. věst. L 136, 
29.5.2007, s. 3. 
( 2 ) Úř. věst. L 196, 16.8.1967, s. 1. Sm ěrnice naposledy pozm ěněná směrnicí 
Evropského parlamentu a Rady 2006/121/ES (Ú ř. věst. L 396, 30.12.2006, 
s. 850; opravené zn ění v Úř. věst. L 136, 29.5.2007, s. 281) –  nutno aktu ­
alizovat s p říslušnými odkazy, jakmile bude zve řejněn dokument týkající se 
třicátého p řizpůsobení technickému pokroku.
 (5) Při stanovení zkušebních metod je t řeba vzít pln ě v úvahu zásadu 
nahrazovat, omezovat a zdokonalovat používání zví řat při 
provádění zkoušek, zejména pokud existují vhodné validované 
metody, které nahrazení, omezení nebo zdokonalení zkoušek prováděných na zví řatech umož ňují.
 
(6) Ustanovení tohoto na řízení jsou v souladu se stanoviskem výboru 
zřízeného podle článku 133 na řízení (ES) č. 1907/2006,  
PŘIJALA TOTO NA ŘÍZENÍ:  
Článek 1  
Zkušební metody k použití pro ú čely nařízení (ES) č. 1907/2006 jsou 
stanoveny v p říloze tohoto na řízení.  
Článek 2  
Komise podle pot řeby přezkoumá zkušební metody uvedené v tomto 
nařízení s cílem nahradit, omezit nebo zdokonalit zkoušky na obratlov ­
cích.  
Článek 3  
Všechny odkazy na p řílohu V sm ěrnice 67/548/EHS se považují za 
odkazy na toto na řízení.  
Článek 4  
Toto nařízení vstupuje v platnost prvním dnem po vyhlášení v  Úředním 
věstníku Evropské unie . 
Použije se ode dne 1. června 2008.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
PŘÍLOHA  
ČÁST A: METODY PRO STANOVENÍ FYZIKÁLN Ě-CHEMICKÝCH 
VLASTNOSTÍ  
OBSAH 
A.1 BOD TÁNÍ/BOD TUHNUTÍ 
A.2 BOD VARU 
A.3 RELATIVNÍ HUSTOTA A.4 TLAK PAR A.5 POVRCHOVÉ NAP ĚTÍ 
A.6 ROZPUSTNOST VE VOD Ě 
A.8 ROZD ĚLOVACÍ KOEFICIENT 
A.9 BOD VZPLANUTÍ 
A.10 HO ŘLAVOST (PEVNÉ LÁTKY) 
A.11 HO ŘLAVOST PLYN Ů 
A.12 HO ŘLAVOST (P ŘI STYKU S VODOU) 
A.13 PYROFORICKÉ VLASTNOSTI PEVNÝCH LÁTEK 
A KAPALIN 
A.14 VÝBUŠNÉ VLASTNOSTI 
A.15 BOD SAMOZÁPALU (KAPALINY A PLYNY) A.16 RELATIVNÍ TEPLOTA SAMOZÁPALU PEVNÝCH LÁTEK A.17 OXIDA ČNÍ VLASTNOSTI (PEVNÉ LÁTKY) 
A.18 PO ČETNĚ PRŮMĚRNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOST 
A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMER Ů 
A.19 OBSAH NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK 
V POLYMERECH 
A.20 CHOVÁNÍ POLYMER Ů PŘI ROZPOUŠT ĚNÍ NEBO 
EXTRAKCI VE VOD Ě 
A.21 OXIDA ČNÍ VLASTNOSTI (KAPALINY) 
A.22 DÉLKOV Ě VÁŽENÝ ST ŘEDNÍ GEOMETRICKÝ PR ŮMĚR 
VLÁKEN
 
▼M4 
A.23. ROZD ĚLOVACÍ KOEFICIENT (OKTAN-1-OL/VODA): 
METODA POMALÉHO MÍCHÁNÍ  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1 BOD TÁNÍ/BOD TUHNUTÍ  
1. METODA  
Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD 
pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny 
v literatu ře (2) a (3).  
1.1 ÚVOD  
Popsané metody a p řístroje jsou ur čeny ke stanovení bodu tání látek 
bez omezení z hlediska stupn ě jejich čistoty.  
Výběr metody závisí na povaze látky, která má být zkoumána. 
Omezením bude tedy skute čnost, zda lze danou látku rozm ělnit na 
prášek snadno, obtížn ě nebo zda ji nelze rozm ělnit. 
U některých látek je vhodn ější stanovení bodu tuhnutí nebo krysta ­
lizace a normalizované metody pro tato stanovení jsou v této metod ě 
rovněž uvedeny.  
Nelze-li vzhledem ke zvláštním vlastnostem látky dob ře stanovit 
žádný z uvedených parametr ů, může byt vhodné stanovit bod teku ­
tosti.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Bod tání je definován jako teplota, p ři níž dochází za atmosférického 
tlaku k p řechodu z pevného do kapalného skupenství a která za 
ideálních podmínek odpovídá bodu tuhnutí.  
Vzhledem k tomu, že u mnoha látek dochází k fázovému p řechodu 
v rozmezí teplot, je toto rozmezí často nazýváno rozmezím bodu 
tání. 
Přepočet jednotek (K na  o C) 
t = T – 273,15  
t: Celsiova teplota, stupn ě Celsia (  o C) 
T: termodynamická teplota, kelvin (K)  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Při zkoumání nové látky není nutné vždy používat referen ční látky. 
Měly by v první řadě sloužit k ob časné kontrole provedení metody 
a ke vzájemnému porovnávání výsledk ů získaných jinými metodami.  
Některé kalibra ční látky jsou uvedeny v literatu ře (4).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Stanovuje se teplota (teplotní rozmezí) fázového p řechodu z pevného 
do kapalného skupenství nebo z kapalného do pevného skupenství. V praxi se p ři zahřívání/ochlazování vzorku zkoušené látky za atmo ­
sférického tlaku stanoví teploty po čátku tání/tuhnutí a konce tání/ ­
tuhnutí. Je popsáno p ět typů metod, jmenovit ě kapilární metoda, 
metody používající zah řívací bloky, metody stanovení bodu tuhnutí, 
metody termické analýzy a stanovení bodu tekutosti (vyvinuto pro 
minerální oleje).
 
V některých p řípadech m ůže být vhodné m ěřit bod tuhnutí místo 
bodu tání.  
1.4.1  Kapilární metoda  
1.4.1.1  Zařízení pro stanovení bodu taní s kapalinovou lázní  
Malé množství jemn ě rozmělněné látky se vpraví do kapiláry 
a zhutní se. Kapilára se zah řívá spolu s teplom ěrem, přičemž se 
rychlost nár ůstu teploty b ěhem tání nastaví na mén ě než 1 K/min. 
Stanoví se teploty po čátku a konce tání.  
1.4.1.2  Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokem  
Provádí se podobn ě jako v bod ě 1.4.1.1 s tím rozdílem, že kapilára 
a teploměr jsou umíst ěny v kovovém vyh řívaném bloku a pozorují se 
otvory v bloku.  
1.4.1.3  Detekce foto článkem  
Vzorek v kapilá ře se automaticky zah řívá v kovovém válci. Otvorem 
ve válci prochází látkou sv ětelný paprsek na p řesně kalibrovaný 
fotočlánek. Při tání mění většina látek optické vlastnosti a z nepr ů­
hledných se m ění na průhledné. V tomto okamžiku vzroste intenzita 
světla dopadajícího na foto článek a do za řízení ode čítajícího teplotu 
platinového odporového teplom ěru umístěného v topné kom ůrce je 
vyslán signál k zastavení zaznamenávání. Tato metoda není vhodná pro některé siln ě zbarvené látky.
 
1.4.2  Zah řívací bloky  
1.4.2.1  Kofler ův zahřívací stolek  
Koflerův zahřívací stolek je tvo řen dvěma kovovými částmi s různou 
teplotní vodivostí, je vyh říván elektricky a je konstruován tak, že 
teplotní gradient je po jeho délce tém ěř lineární. Teplota stolku se 
může měnit od 283 do 573 K; stolek je vybaven speciálním 
zařízením pro ode čítání teploty, tvo řeným jezdcem s ukazatelem 
a stupnici navrženou pro daný stolek. Pro stanovení bodu tání se látka nanese v tenké vrstv ě přímo na povrch stolku. B ěhem několika 
sekund se vytvo ří ostrá dělicí linie mezi kapalnou a pevnou fázi. 
Teplota v míst ě dělicí linie se ode čte po nastavení ukazatele na 
tuto dělicí linii.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2  Tavící mikroskop  
Pro stanovení bodu tání velmi malých množství látek se používají 
různé typy mikroskop ů s ohřívacím stolkem. V ětšina ohřívacích 
stolků využívá k m ěření teploty citlivé termo články, používají se 
však i rtu ťové teplom ěry. Typický p řístroj pro stanovení bodu tání 
pomocí mikroskopu s oh řívacím stolkem má oh řívací komoru 
s kovovou deskou, na kterou se umístí vzorek na podložním sklí čku. 
Ve středu kovové desky je otvor, kterým m ůže procházet sv ětelný 
paprsek odražený osv ětlovacím zrcátkem mikroskopu. P ři měřeních 
se ohřívací komora p řikryje sklen ěnou desti čkou, aby se omezila 
cirkulace vzduchu v míst ě, kde se nachází vzorek.  
Ohřev vzorku se kontroluje regula čním odporem. Pro velmi p řesná 
měření opticky anisotropních látek lze používat polarizované sv ětlo. 
1.4.2.3  Menisková metoda  
Tato metoda se používá p ředevším pro polyamidy.  
Vizuálně se stanoví teplota, p ři které se z řetelně posune meniskus 
silikonového oleje uzav řeného mezi oh řívacím blokem a sklen ěnou 
krycí desti čkou umíst ěnou na vzorku zkoušeného polyamidu.  
1.4.3  Metoda stanovení bodu tuhnutí  
Vzorek se vloží do speciální zkumavky, která se umístí do p řístroje 
pro stanovení bodu tuhnutí. B ěhem ochlazování se vzorek nep řetržitě 
pomalu míchá a ve vhodných intervalech se ode čítá teplota. Jakmile 
je teplota po n ěkolik ode čtů konstantní (po odpovídající korekci 
teploměru), je zaznamenána jako bod tuhnutí.  
Podchlazení je nutno zabránit udržováním rovnováhy mezi pevnou 
a kapalnou fází.  
1.4.4  Termická analýza  
1.4.4.1  Diferen ční termická analýza (DTA)  
Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi látkou 
a referen čním materiálem, jež jsou podrobeny stejnému řízenému 
teplotnímu programu. Jestliže u vzorku dojde k fázovému p řechodu, 
který je spojen se zm ěnou enthalpie, je tato zm ěna zaznamenána jako 
endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní 
linie záznamu teploty.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2  Diferen ční skenovací kalorimetrie (DSC)  
Při této technice se látka a referen ční materiál podrobí stejnému 
řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie 
absorbované látkou a referen čním materiálem jako funkce teploty. 
Tato energie je energií pot řebnou k zachování nulového teplotního 
rozdílu mezi látkou a referen čním materiálem. Jestliže u vzorku 
dojde k fázovému p řechodu, který je spojen se zm ěnou enthalpie, 
je tato zm ěna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exoter ­
mická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu tepelného toku.  
1.4.5  Bod tekutosti  
Metoda byla vyvinuta pro minerální oleje a je vhodná pro m ěření 
olejovitých látek s nízkým bodem tání.  
Po počátečním zahřátí se vzorek ur čitou rychlostí ochlazuje a v 
intervalech po 3 K se stanovuje jeho tekutost. Nejnižší teplota, p ři 
níž je ješt ě pozorován pohyb látky, se zaznamená jako bod tekutosti.  
1.5 KRITERIA JAKOSTI  
Použitelnost a p řesnost různých metod stanovení bodu tání/rozmezí 
bodu tání jsou uvedeny v této tabulce.  
TABULKA: POUŽITELNOST METOD  
A. Kapilární metody  
Metoda m ěření Látky, které lze 
rozmělnit na 
prášek Látky, které nelze 
snadno rozm ělnit 
na prášek Rozsah teplot Odhadnutá 
přesnost (  1 ) Existující norma  
Zařízení pro 
stanovení bodu tání s kapalinovou 
lázní ano pouze pro 
několik látek 273 až 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Zařízení pro 
stanovení bodu 
tání s kovovým blokem ano pouze pro 
několik látek 293 až > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Detekce foto č­
lánkem ano pro n ěkteré 
látky 
s použitím 
přídavných 
zařízení 253 až 573 K ± 0,5 K
 
( 1 ) Závisí na typu za řízení a stupni čistoty látky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Zahřívací bloky a stanovení bodu tuhnutí  
Metoda m ěření Látky, které lze 
rozmělnit na 
prášek Látky, které nelze 
snadno rozm ělnit 
na prášek Rozsah teplot Odhadnutá 
přesnost (  1 ) Existující norma  
Koflerův zahřívací 
stolek ano ne 283 až > 573 K ± 1 K ANSI/ASTM 
D 3451-76 
Tavicí mikroskop ano pouze pro 
několik látek 273 až > 573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Meniskova 
metoda ne p ředevším pro 
polyamidy 293 až > 573 K ± 0,5 K ISO 1218(E) 
Metoda stanovení 
bodu tuhnutí ano ano 223 až 573 K ± 0,5 K nap ř. BS 4695  
( 1 ) Závisí na typu za řízení a stupni čistoty látky.  
C. Termická analýza  
Metoda m ěření Látky, které lze 
rozmělnit na 
prášek Látky, které nelze 
snadno rozm ělnit 
na prášek Rozsah teplot Odhadnutá 
přesnost (  1 ) Existující norma  
Diferenční 
termická analýza ano ano 173 až 1 273 K do 600 
K ± 0,5 K do 
1 273 K ± 
2,0 K ASTM E 537-76 
Diferenční skeno­
vací kalorimetrie ano ano 173 až 1 273 K do 600 
K ± 0,5 K do 
1 273 K ± 
2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Závisí na typu za řízení a stupni čistoty látky.  
D. Bod tekutosti  
Metoda m ěření Látky, které lze 
rozmělnit na 
prášek Látky, které nelze 
snadno rozm ělnit 
na prášek Rozsah teplot Odhadnutá 
přesnost (  1 ) Existující norma  
Teplota tekutosti pro minerální 
oleje 
a olejové 
látky pro minerální 
oleje a olejové 
látky 223 až 323 K ± 0,3 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Závisí na typu za řízení a stupni čistoty látky.  
1.6 POPIS METOD  
Postupy tém ěř všech t ěchto zkušebních metod jsou popsány 
v národních a mezinárodních normách (viz dopln ěk 1).  
1.6.1  Kapilární metody  
Při pomalém vzestupu teploty lze u jemn ě práškovitých látek 
obvykle rozlišit stupn ě tání znázorn ěné na obrázku 1.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Obrázek 1
  
Během stanovení bodu tání se zaznamenávají teploty po čátku tání 
a konečné fáze.  
1.6.1.1.  Zařízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní  
Na obrázku 2 je znázorn ěna normalizovaná sklen ěná aparatura pro 
stanovení bodu tání (JIS K 0064); všechny rozm ěry jsou uvedeny 
v milimetrech.  
Obrázek 2
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Kapalinová láze ň: 
Je třeba zvolit vhodnou kapalinu. Volba kapaliny závisí na bodu 
tání, který má být stanoven, nap ř. kapalný parafin pro stanovení 
bodu tání nižšího než 473 K, silikonový olej pro stanovení bodu tání nižšího než 573 K.
 
Pro stanovení bodu tání vyššího než 523 K lze použít sm ěs tří 
hmotnostních díl ů kyseliny sírové a dvou hmotnostních díl ů síranu 
draselného. S tímto typem sm ěsi je třeba pracovat s náležitou opatr ­
ností.  
Teploměr: 
Měly by se používat pouze teplom ěry, které spl ňují požadavky 
norem ASTM E 171, DIN 12770, JIS K 8001 nebo rovnocenných norem.
 
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Postup:  
Suchá látka se jemn ě rozetře v třecí misce a vpraví se do kapiláry 
zatavené na jednom konci, a to tak, aby po zhutn ění byla kapilára 
naplněna do výšky p řibližně 3 mm. Má-li se dosáhnout stejnom ěr­
ného zhutn ění, nechá se kapilára dopadnout z výšky p řibližně 
700 mm sklen ěnou trubicí na hodinové sklí čko. 
Naplněná kapilára se vloží do lázn ě tak, aby se st řední část rtuťové 
baňky teplom ěru dotýkala kapiláry v míst ě, kde se nachází vzorek. 
Kapilára se obvykle vkládá do lázn ě při teplotě asi o 10 K nižší, než 
je bod tání.  
Lázeň se zahřívá tak, aby vzestup teploty činil přibližně 3 K/min. 
Lázeň se míchá. Asi 10 K pod o čekávaným bodem tání se r ůst 
teploty upraví na nejvýše 1 K/min.  
Výpočet: 
Bod tání se vypo čte takto:  
T = T  D + 0,00016 (T  D – T  E )n 
kde: 
T = korigovaný bod tání v K  
T D = odečet teploty na teplom ěru D v K  
T E = odečet teploty na teplom ěru E v K  
n = po čet stupňů, o něž rtuťový sloupec teplom ěru D vyčnívá 
z kapaliny.  
1.6.1.2  Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokem  
Přístroj:  
Je tvořen: 
— válcovým kovovým blokem, jehož horní část je dutá a tvo ří 
komoru (viz obrázek 3),  
— kovovou krycí deskou se dv ěma nebo více otvory, kterými je 
možno do kovového bloku zavést trubi čky, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— ohřívacím systémem kovového bloku, nap říklad elektrickým 
topným odporem uzav řeným v kovovém bloku,  
— regula čním odporem pro regulaci p říkonu, je-li použit elektrický 
ohřev, 
— čtyřmi okénky ze žáruvzdorného skla v bo čních stěnách ohřívací 
komory, orientovanými v ůči sobě pod pravým úhlem. P řed 
jedním z t ěchto okének je umíst ěn okulár pro pozorování kapi ­
lární trubi čky. Ostatní t ři okénka slouží k osv ětlení vnit řního 
prostoru žárovkami,  
— kapilární trubi čkou z žáruvzdorného skla zatavenou na jednom 
konci (viz 1.6.1.1).  
Teploměr: 
Viz normy uvedené v 1.6.1.1. Je rovn ěž možné použít termoelek ­
trické měřicí přístroje srovnatelné p řesnosti.  
Obrázek 3
  
1.6.1.3  Detekce foto článkem  
Přístroj a postup:  
Přístroj se skládá z kovové komory s automatickým oh řívacím 
zařízením. T ři kapilární trubi čky se naplní podle bodu 1.6.1.1 
a umístí se do oh řívací komory.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Pro kalibraci p řístroje je k dispozici n ěkolik lineárních režim ů růstu 
teploty, p řičemž vhodný lineární r ůst teploty se elektricky nastaví 
předem zvolenou konstantou. Zaznamenávací za řízení ukazují teplotu 
v ohřívací komo ře a teplotu látky v kapilárách.  
1.6.2  Zah řívací bloky  
1.6.2.1  Kofler ův zahřívací stolek  
Viz dopln ěk. 
1.6.2.2  Tavící mikroskop  
Viz dopln ěk. 
1.6.2.3  Menisková metoda (pro polyamidy  
Viz dopln ěk. 
V oblasti bodu tání by m ěla být rychlost oh řevu menší než 1 K/min.  
1.6.3  Metody stanovení bodu tuhnutí  
Viz dopln ěk. 
1.6.4  Termická analýza  
1.6.4.1  Diferen ční termická analýza  
Viz dopln ěk. 
1.6.4.2  Diferen ční skenovací kalorimetrie  
Viz dopln ěk. 
1.6.5  Stanovení bodu tekutosti  
Viz dopln ěk. 
2. DATA  
V některých p řípadech je nutno provést korekci teplom ěru. 
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— použitá metoda,  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty) a pop ř. infor­
mace o provedeném p ředběžném čištění, 
— odhad p řesnosti.  
Jako bod tání se uvede st řední hodnota alespo ň dvou měření, jejichž 
výsledky leží v rozmezí odhadnuté p řesnosti (viz tabulky).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Leží-li rozdíl teplot po čáteční a kone čné fáze tání v mezích p řesnosti 
metody, uvede se jako bod tání kone čná teplota, v opa čném případě 
se uvedou ob ě teploty.  
Jestliže se látka p řed dosažením bodu tání rozkládá nebo sublimuje, 
uvede se teplota, p ři které dochází k pozorovanému jevu.  
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou d ůle­ 
žité pro interpretaci výsledk ů, zejména pokud jde o ne čistoty 
a fyzikální stav látky.  
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, rozhodnutí Rady C(81) 
30 v kone čném znění. 
2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803–834.  
3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.  
4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505–515.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Doplněk 
Další technické podrobnosti je možné zjistit nap říklad v těchto normách:  
1. Kapilární metody  
1.1 Za řízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapilarverfarehn 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products.
 
1.2 P řístroje pro stanovení bodu tání s kovovým blokem 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelz ­
temperatur von teilkristallinen Kunst ­
stoffen 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point“  
2. Zah řívací bloky  
2.1 Kofler ův zahřívací stolek 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2 Tavicí mikroskop 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelz ­
temperatur von teilkristallinen Kunst ­
stoffen  
2.3 Menisková metoda (pro polyamidy) 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point“  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion 
materials 
NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination 
du „point de fusion“ methode du menisque
 
3. Metody stanovení bodu tuhnutí  
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling 
Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de petrole: determination de la 
temperature de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsiiuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Methode de determination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Termická analýza  
4.1 Diferen ční termická analýza 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2 Diferen ční skenovací kalorimetrie 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
 
5. Stanovení bodu tekutosti  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des 
produits du petrole: Point de trouble et 
point ďecoulement limite – Monster ­
neming en ontleding van aardoliepro ­
ducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour 
point ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2 BOD VARU  
1. METODA  
Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD 
pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny 
v literatu ře (2) a (3).  
1.1 ÚVOD  
Popsané metody a za řízení lze použít pro kapaliny a látky s nízkým 
bodem tání, pokud nepodléhají chemickým reakcím pod bodem varu 
(např. autooxidaci, p řesmyku, rozkladu atd.). Metody lze použít jak 
pro čisté kapalné látky, tak pro kapalné látky obsahující ne čistoty.  
Přednost mají metody využívající detekci foto článkem a metody 
termické analýzy, protože umož ňují stanovení jak bodu tání, tak 
bodu varu. Tato m ěření mohou být navíc provád ěna automaticky.  
„Dynamická metoda“ má tu výhodu, že ji lze použít i ke stano ­
vení tlaku par a p řitom není t řeba korigovat bod varu na normální 
tlak (101,325 kPa), nebo ť tento tlak lze b ěhem měření nastavit 
manostatem.  
Poznámky:  
Vliv nečistot na stanovení bodu varu závisí ve velké mí ře na jejich 
povaze. Jestliže vzorek obsahuje t ěkavé nečistoty, které mohou 
ovlivnit výsledky, m ůže být látky p řečištěna. 
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Standardní bod varu je definován jako teplota, p ři které je tlak par 
dané kapaliny roven 101,325 kPa.  
Jestliže se m ěření bodu varu neprovádí za normálního tlaku, lze 
závislost tlaku par na teplot ě popsat Clausiovou-Clapeyronovou 
rovnicí:  
log P ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ konst : 
kde: 
P = tlak par látky v Pa,  
Δ H V = výparné teplo v Jmol  -1 
R = univerzální molární plynová konstanta = 8,314 Jmol  -1 K -1 
T = termodynamická teplota v K  
Bod varu se uvádí s ohledem na okolní tlak p ři měření. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Přepočty 
Tlak (jednotka: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 Mpa 
(jednotka „bar“ je nadále p řípustná, její používání se 
však nedoporu čuje) 
133 Pa = 1 mm Hg = 1 torr 
(jednotky „mm Hg“ a „torr“ nejsou povoleny)  
1 atm = standardní atmosféra = 101 325 Pa 
(jednotka „atm“ není povolena).  
Teplota (jednotka:K)  
t = T – 273,15  
t: Celsiova teplota, stupe ň Celsia (  o C) 
T: termodynamická teplota, kelvin (K)  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referen ční látky. 
Měly by v první řadě sloužit k ob časné kontrole provedení metody 
a ke vzájemnému porovnávání výsledk ů získaných jinými metodami.  
Některé kalibra ční látky jsou uvedeny v dopl ňku. 
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Pět metod stanovení bodu varu (teplotního rozmezí bodu varu) je 
založeno p římo na m ěření teploty varu, další dv ě využívají termální 
analýzy.  
1.4.1  Stanovení ebuliometrem  
Ebuliometry byly p ůvodně vyvinuty pro stanovení molekulové hmot ­
nosti na základ ě zvýšení teploty varu, jsou však vhodné také pro 
přesná měření bodu varu. Velmi jednoduchý p řístroj je popsán 
v normě ASTM D 112072 (viz dopln ěk). V tomto p řístroji se kapa ­
lina zahřívá za rovnovážných podmínek p ři atmosférickém tlaku, 
dokud neza čne vřít. 
1.4.2  Dynamická metoda  
Metoda zahrnuje m ěření teploty kondenzace páry vhodným teplo ­
měrem umíst ěným za varu ve zp ětném toku (refluxu). U této metody 
lze měnit tlak.  
1.4.3  Destila ční metoda pro stanovení bodu varu  
Metoda zahrnuje destilaci kapaliny a m ěření teploty kondenzace 
páry, přičemž se stanovuje také množství destilátu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4  Postup podle Siwoloboffa  
Vzorek se zah řívá ve zkumavce, která je pono řena do tepelné lázn ě. 
Do zkumavky se vzorkem je zasunuta zatavená kapilára, v jejíž spodní části se nachází vzduchová bublinka.
 
1.4.5  Detekce foto článkem  
Při použití principu unikajících bublinek podle Siwoloboffa se 
provádí automatické fotoelektrické m ěření. 
1.4.6  Diferen ční termická analýza  
Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi látkou 
a referen čním materiálem jako funkce teploty, p řičemž látka 
a referen ční materiál se podrobí témuž řízenému teplotnímu 
programu. Jestliže u studované látky dojde k fázovému p řechodu, 
který je spojen se zm ěnou enthalpie, je tato zm ěna indikována jako 
endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu teploty.  
1.4.7  Diferen ční skenovací kalorimetrie  
Při této technice se látka a referen ční materiál podrobí stejnému 
řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie 
absorbované látkou a referen čním materiálem jako funkce teploty. 
Tato energie je energií pot řebnou k zachování nulového teplotního 
rozdílu mezi látkou a referen čním materiálem. Jestliže u vzorku 
dojde k fázovému p řechodu, který je spojen se zm ěnou enthalpie, 
je tato zm ěna indikována jako endotermická odchylka (var) od 
základní linie záznamu tepelného toku.  
1.5 KRITERIA JAKOSTI  
Použitelnost a p řesnost různých metod používaných pro stanovení 
bodu/teplotního rozmezí bodu varu jsou uvedeny v tabulce 1.  
Tabulka 1  
Srovnání metod  
Metoda m ěření Odhadnutá p řesnost Existující norma  
Stanovení ebuliometrem ± 1,4 K (do 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (do 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Dynamická metoda ± 0,5 K (do 600 K) (  2 ) 
Destilační metoda (stanovení 
rozmezí bodu varu) ± 0,5 K (do 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Postup podle Siwoloboffa ±2 K (do 600 K) (  2 ) 
Detekce foto článkem ± 0,3 K (do 373 K) (  2 ) 
Diferenční termická analýza ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do 1 273 K) ASTM E 537-76 
Diferenční skenovací kalorimetrie ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Tato p řesnost platí pouze pro jednoduchý p řístroj, popsaný nap ř. v norm ě ASTM D 1120-72; m ůže být zlepšena 
užitím dokonalejšího ebuliometru. 
( 2 ) Platí pouze pro čisté látky. Užití za jiných okolností by m ělo být zd ůvodněno. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6 POPIS METOD  
Postupy n ěkterých zkušebních metod jsou popsány v mezinárodních 
a národních normách (viz dopln ěk). 
1.6.1  Ebuliometr  
Viz dopln ěk. 
1.6.2  Dynamická metoda  
Viz metoda A.4 pro stanovení tlaku par.  
Zaznamená se teplota varu nam ěřená při tlaku 101,325 kPa.  
1.6.3  Destila ční metoda (stanovení rozmezí bodu varu)  
Viz dopln ěk. 
1.6.4  Postup podle Siwoloboffa  
Vzorek se zah řívá ve zkumavce o pr ůměru přibližně 5 mm v p řístroji 
pro stanovení bodu tání (obrázek 1).  
Na obrázku 1 je znázorn ěn normalizovaný p řístroj pro stanovení 
bodu varu (JIS K 0064) (p řístroj je sklen ěný, všechny rozm ěry 
jsou uvedeny v milimetrech).  
Obrázek 1
  
Do zkumavky se vloží kapilára (varná kapilára) zatavená asi 1 cm 
nad spodním koncem. Zatavená část kapiláry musí ležet pod 
hladinou kapaliny. Zkumavka obsahující kapiláru se upevní bu ď 
pryžovou páskou k teplom ěru, nebo pomocí bo čního držáku (viz 
obrázek 2).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Obrázek 2  
Princíp podle Siwoloboffa  Obrázek 3  
Modifikovaný princíp
  
Kapalina pro láze ň se volí podle bodu varu. Pro teploty do 573 K lze 
použít silikonový olej. Parafinový olej lze použít pouze do 473 K. Kapalina v lázni se zah řívá tak, aby vzestup teploty byl zpo čátku asi 
3 K/min. Láze ň se míchá. Asi 10 K p řed očekávaným bodem tání se 
zahřívání sníží tak, aby nár ůst teploty byl nejvýše 1 K/min. Krátce 
před dosažením bodu varu za čnou z varné kapiláry rychle unikat 
bublinky.
 
Bodu varu je dosaženo, když p ři ochlazování náhle ustane unikáni 
bublinek a kapalina za čne v kapilá ře stoupat. P říslušný údaj na 
teploměru je bodem varu látky.  
Modifikovanou metodou (obrázek 3) se bod varu stanovuje 
v kapiláře pro stanovení bodu tání. Ta se vytáhne do tenké špi čky 
dlouhé asi 2 cm (a) a do ni se nasaje malé množství vzorku. Otevřený konec tenké části kapiláry se zataví tak, aby na konci 
byla malá vzduchová bublinka. P ři zahřívání v aparatu ře pro stano ­
veni bodu táni (b) se vzduchová bublinka rozpíná. Bod varu odpo ­
vídá teplot ě, při které sloupe ček látky dosáhne hladiny kapalinové 
lázně (c).
 
1.6.5  Detekce foto článkem  
Vzorek se zah řívá v kapilá ře ve vyhřívaném kovovém bloku.  
Otvory v bloku se vede sv ětelný paprsek tak, aby procházel látkou 
na přesně kalibrovaný foto článek.  
Při zvyšování teploty vzorku stoupají z kapiláry jednotlivé vzdu ­
chové bublinky. P ři dosažení bodu varu po čet bublinek zna čně 
vzroste. To vede ke zm ěně intenzity sv ětla zaznamenané foto č­
lánkem a vyvolá signál v m ěřicím přístroji, kterým se zastaví zazna ­
menávání teploty m ěřené platinovým odporovým teplom ěrem umís ­
těným v bloku.  
Tato metoda je zvlášt ě vhodná, protože umož ňuje stanovení teplot 
nižších než laboratorní teplota až do 253,15 K (–20  o C) bez jakékoli 
úpravy přístroje. Pouze je t řeba umístit p řístroj v chladicí lázni.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6  Termická analýza  
1.6.6.1  Diferen ční termická analýza  
Viz dopln ěk. 
1.6.6.2  Diferen ční skenovací kalorimetrie  
Viz dopln ěk. 
2. DATA  
Při malých odchylkách od normálního tlaku (nejvýše ± 5 kPa) se 
hodnoty teploty varu p řepočítávají na normalizovanou teplotu T  n 
pomocí Sidneyovy-Youngovy rovnice:  
T n = T + (f  T × Δp) 
kde: 
Δp = (101,325 – p) [pozor na znaménko]  
P = nam ěřený tlak v kPa  
f T = velikost zm ěny teploty varu v závislosti na zm ěně tlaku 
v K/kPa  
T = nam ěřená teploty varu v K  
T n = teplota varu korigovaná na normální tlak v K  
Teplotní korek ční faktory f  T a rovnice pro jejich aproximaci jsou 
uvedeny pro řadu látek ve zmín ěných mezinárodních a národních 
normách.  
Například metoda podle DIN 53171 uvádí p řibližné korekce pro 
rozpouštědla obsažená v nát ěrových hmotách:  
Tabulka 2  
Teplotní korek ční faktory f  T 
Teplota T (K) Korek ční faktor f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— použitá metoda,  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty) a pop ř. infor­
mace o provedeném p ředběžném čištění, 
— odhad p řesnosti.  
Jako bod varu se uvede st řední hodnota alespo ň dvou měření, jejichž 
výsledky leží v rozmezí odhadnuté p řesnosti (viz tabulka 1).  
Uvedou se nam ěřené teploty varu a jejich st řední hodnota a dále 
hodnota tlaku v kPa, p ři kterém byla m ěření provedena. Tlak by 
se měl pokud možno blížit normálnímu tlaku.  
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou d ůle­ 
žité pro interpretaci výsledk ů, zejména pokud jde o ne čistoty 
a fyzikální stav látky.  
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, rozhodnutí Rady C(81) 
30 v kone čném znění. 
2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London 1975, volume II.  
3) R. Weissberger (ed.): Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publi ­
cations, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Doplněk 
Další technické podrobnosti je možné zjistit nap říklad v těchto normách:  
1. Ebuliometr  
1.1 Za řízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Destila ční postupy (teplotní rozmezí bodu varu)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Diferen ční termická analýza a diferen ční skenovací kalorimetrie  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of 
differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3 RELATIVNÍ HUSTOTA  
1. METODA  
Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1). 
Základní principy jsou uvedeny v literatu ře (2).  
1.1 ÚVOD  
Popsané metody stanovení relativní hustoty jsou použitelné pro 
pevné a kapalné látky bez jakýchkoli omezení, pokud jde o jejich čistotu. Jednotlivé metody, které lze použít, jsou uvedeny 
v tabulce 1.
 
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Relativní hustota D  20 4 pevných látek nebo kapalin je pom ěr mezi 
hmotností ur čitého objemu zkoumané látky stanovenou p ři 20  o C 
a hmotností stejného objemu vody stanovenou p ři 4 o C. Relativní 
hustota nemá rozm ěr. 
Hustota látky P je podíl hmotnosti látky m a jejího objemu V.  
Jednotkou hustoty P, v soustav ě SI je kg/m  3 . 
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY (1, 3)  
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referen ční látky. 
Měly by v první řadě sloužit k ob časné kontrole provedení metody 
a ke vzájemnému porovnávání výsledk ů získaných jinými metodami.  
1.4 PODSTATA METOD  
Používají se čtyři skupiny metod.  
1.4.1  Vztlakové metody  
1.4.1.1  Hustom ěry (pro kapaliny)  
Dostatečně přesné a rychlé stanovení hustoty lze provést plovoucími 
hustoměry, které umožní stanovit hustotu kapaliny ode čtením 
hloubky jejich pono ření na kalibrované stupnici.  
1.4.1.2  Hydrostatické váhy  (pro kapaliny a pevné látky)  
Ke stanovení hustoty zkoušeného vzorku lze využít rozdíl mezi jeho 
hmotností stanovenou na vzduchu a ve vhodné kapalin ě (např. vodě). 
U pevných látek je nam ěřená hustota reprezentativní jen pro daný 
použitý vzorek. P ři stanovení hustoty kapalin se zváží t ěleso 
známého objemu nejd říve na vzduchu a poté v kapalin ě. 
1.4.1.3.  Metoda pono řené kuličky (pro kapaliny) (4)  
Touto metodou se stanoví hustota kapaliny z rozdílu mezi výsledky 
vážení kapaliny p řed ponořením kuli čky známého objemu do zkou ­ 
šené kapaliny a po n ěm. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2  Pyknometrické metody  
Pro pevné látky a kapaliny lze použít pyknometry r ůzných tvar ů 
o známém objemu. Hustota se vypo čte z rozdílu výsledk ů vážení 
plného a prázdného pyknometru a z jeho známého objemu.  
1.4.3.  Vzduchový srovnávací pyknometr  (pro pevné látky)  
Hustotu pevné látky v libovolné form ě je možné m ěřit při pokojové 
teplotě plynovým srovnávacím pyknometrem. Objem látky se m ěří 
ve vzduchu nebo v inertním plynu v kalibrovaném válci nastavitel ­
ného objemu. Pro výpo čet hustoty se po skon čení měření objemu 
provede vážení.  
1.4.4  Oscila ční densimetr  (5, 6, 7)  
Hustotu kapaliny lze m ěřit oscilačním densimetrem. Mechanický 
oscilátor konstruovaný ve tvaru U trubice se rozkmitá na rezonan ční 
kmitočet, který závisí na jeho hmotnosti. Po vložení vzorku se rezo ­
nanční kmito čet oscilátoru zm ění. Aparaturu je nutné kalibrovat 
dvěma kapalinami o známé hustot ě. Kapaliny by m ěly být voleny 
nejlépe tak, aby pokrývaly rozmezí, ve kterém leží hustota m ěřeného 
vzorku.  
1.5 KRITERIA JAKOSTI  
Použitelnost r ůzných metod pro stanovení relativní hustoty je 
uvedena v tabulce.  
1.6 POPIS METOD  
Normy uvedené jako p říklady, ve kterých je možno vyhledat tech ­
nické podrobnosti, jsou uvedeny v dopl ňku. 
Zkoušky musí být provedeny p ři 20  o C a provedou se nejmén ě dvě 
měření. 
2. DATA  
Viz normy.  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— použitá metoda,  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty) a pop ř. infor­
mace o provedeném p ředběžném čištění. 
Relativní hustota D  20 
4 se uvede podle definice v bod ě 1.2 spole čně se 
skupenstvím m ěřené látky.  
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou d ůle­ 
žité pro interpretaci výsledk ů, zejména pokud jde o ne čistoty 
a fyzikální stav látky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabulka  
Použitelnost metod  
Hustota Nejvyšší možná 
hodnota pevné látky kapaliny  
1.4.1.1 Hustom ěr ano 5 Pa s ISO 387 
ISO 649-2 
NF T 20-050 
1.4.1.2 Hydrostatické váhy a) pevné látky ano ISO 1183 (A) b) kapaliny ano 5 Pa s ISO 901 a 758 
1.4.1.3 Metoda pono řené kuličky ano 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2 Pyknometr ISO 3507 a) pevné látky ano ISO 1183 (B) 
NF T 20053 
b) kapaliny ano 500 Pa s ISO 758 
1.4.3 Vzduchový srovnávací 
pyknometr ano DIN 55990 Teil 3 
DIN 53243 
1.4.4 Oscila ční densimetr ano 5 Pa s
 
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, rozhodnutí Rady C(81) 
30 v kone čném znění. 
2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience 
Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.  
3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, 
vol. 48, 508.  
4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.11, 427–430.
 
5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 
1970, vol. 19, 297–302.  
6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726.
 
7) Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Doplněk 
Další technické podrobnosti je možné zjistit nap říklad v těchto normách:  
1. Vztlakové metody  
1.1 Hustom ěr 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardised 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydro ­
meters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – 
Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2 Hydrostatické váhy  
Pro pevné látky  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids 
other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Pro kapaliny  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method
 
1.3 Metoda pono řené kuličky 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of density; immersed body method
 
2. Pyknometrické metody  
2.1 Pro kapaliny 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 100 · 
10 -6 · m 2 · s -1 at 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 100 · 
10 -6 · m 2 · s -1 at 20  o C, applicable in 
particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids 
with higher vapour pressure, approxima ­
tely 1 bar at 90
 o C) ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high 
a vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by 
pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic 
compounds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer 
method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products 
by the capillary – stoppered pycnometer 
method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric 
method
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2 Pro pevné látky 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pyknometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Vzduchové srovnávací pyknometry  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4 TLAK PAR  
1. METODA  
Tato metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 104 (2004).  
1.1 ÚVOD  
Tato přepracovaná verze metody A.4 (1) zahrnuje jednu dopl ňkovou 
metodu, a to metodu efusní: isotermální termogravimetrii ur čenou 
pro látky s velmi nízkými tlaky (až 10  –10 Pa). Vzhledem k tomu, 
že je zapot řebí postup ů, zejména v souvislosti se stanovením tlaku 
par u látek s nízkou tenzí par, další postupy se p řehodnocující 
v rámci této metody s ohledem na další rozmezí použitelnosti.  
Při termodynamické rovnováze je tlak par čisté látky pouze funkcí 
teploty. Základní principy jsou popsány v literatu ře (2, 3).  
Neexistuje žádný postup vhodný pro celý rozsah tlaku par od mén ě 
než 10  –10 do 10  5 Pa. Do této metody spadá osm metod m ěření tlaku 
par, které lze používat v r ůzných rozmezích tlaku par. Jednotlivé 
metody jsou srovnány z hlediska použití a rozsahu m ěření 
v tabulce 1. Tyto metody lze použít pouze u slou čenin, které se za 
podmínek zkoušky nerozkládají. V p řípadě, kdy nelze experimentální 
metody z technických d ůvodů použít, lze tlak par rovn ěž odhadnout, 
přičemž doporu čená metoda odhadu je uvedena v dodatku.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Tlak par látky je definován jako tlak nasycené páry nad pevnou nebo 
kapalnou látkou.  
Měla by být používána jednotka tlaku v soustav ě SI, tj. pascal (Pa). 
Dále jsou uvedeny n ěkteré d říve používané jednotky 
s odpovídajícími p řepočítávacími faktory: 
1 torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 fyzikální atmosféra (atm) = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
Jednotkou termodynamické teploty v soustav ě SI je kelvin (K). 
Převod stup ňů Celsia na kelviny se provádí podle vzorce:  
T = t  + 273,15  
kde T je teplota v kelvinech, neboli termodynamická teplota, a  t je 
teplota ve stupních Celsia.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabulka 1  
Metoda m ěření Látky Odhad opakova ­
telnosti Odhad reprodu ­
kovatelnosti Doporučená oblast 
pevné kapalné  
Dynamická metoda s nízkým 
bodem tání ano do 25 % 
1 až 5 % do 25 % 
1 až 5 % 10 3 Pa až 2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa až 10  5 Pa 
Statická metoda ano ano 5 až 10 % 5 až 10 % 10 Pa až 10  5 Pa 
10 –2 Pa až 10  5 Pa (  1 ) 
Metoda za použití 
isoteniskopu ano ano 5 až 10 % 5 až 10 % 10  2 Pa až 10  5 Pa 
Efusní metoda: 
váhy pro m ěření 
tlaku par ano ano 5 až 20 % do 50 % 10  –3 Pa až 1 Pa 
Efusní metoda: 
Knudsenova komůrka ano ano 10 až 30 % — 10
 –10 Pa až 1 Pa 
Efusní metoda: 
isotermální termo ­
gravimetrie ano ano 5 až 30 % do 50 % 10  –10 Pa až 1 Pa 
Metoda sycení 
plynu ano ano 10 až 30 % do 50 % 10  –10 Pa až 10  3 Pa 
Metoda rotujícího 
tělíska ano ano 10 až 20 % — 10  –4 Pa až 0,5 Pa  
( 1 ) Při použití kapacitního manometru.  
1.3 PODSTATA ZKOUŠKY  
Obecně se tlak par stanovuje p ři různých teplotách. V omezeném 
rozsahu teplot je logaritmus tlaku par čisté látky nep římo úměrný 
termodynamické teplot ě podle zjednodušené Clapeyronovy-Clau ­
siovy rovnice:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ konst  
kde: 
p = tlak par v pascalech,  
ΔHv = výparné teplo v J mol  –1 , 
R = univerzální molární plynová konstanta (8,314 J mol  –1 K –1 ), 
T = termodynamická teplota v K.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Referenční látky není nutné vždy používat. Slouží v první řadě 
k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání 
výsledků získaných jinými metodami.  
1.5 POPIS METODY  
1.5.1  Dynamická metoda (Cottrellova metoda)  
1.5.1.1  Podstata  
Pro stanovení tlaku par látky se m ěří její teplota varu p ři různých 
specifikovaných tlacích mezi asi 10  3 a 10  5 Pa. Tato metoda se 
rovněž doporu čuje pro stanovení bodu varu. K tomuto ú čelu je 
metoda vhodná až do teploty 600 K. Teploty varu kapalin jsou 
v hloubce 3 až 4 cm p řibližně o 0,1 °C vyšší než na povrchu, 
a to kvůli hydrostatickému tlaku sloupce kapaliny. P ři Cottrellov ě 
metodě (4) je teplom ěr umístěn do páry nad povrch kapaliny 
a vroucí kapalina se nep řetržitě čerpá okolo ba ňky teplom ěru. 
Baňku teplom ěru pokrývá tenká vrstva kapaliny, která je 
v rovnováze s párou p ři atmosférickém tlaku. Teplom ěr tak ode čítá 
skutečnou teplotu varu bez chyb zp ůsobených p řehřátím nebo hydro ­
statickým tlakem. Výv ěva původně používaná Cottrellem je zachy ­
cena na obrázku 1. Vroucí kapalina se nachází ve zkumavce A. Platinový drátek B zatavený do dna usnad ňuje jednotný pr ůběh 
vření. Boční trubička C vede do kondenzátoru a pouzdro D brání 
styku studeného kondenzátu a teplom ěru E. Když kapalina v A v ře, 
bubliny a kapalina zachycená nálevkou se p řelévá přes baňku teplo­
měru prostř
ednictvím dvou ramen výv ěvy F.  
Obrázek 1
  Obrázek 2
  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrellova výv ěva (4)  
A: Termo článek  
B: Vyrovnávací prostor vakua  
C: Manometr  
D: Vakuum  
E: Měřicí bod  
F: Topný článek asi 150 W  
1.5.1.2  Aparatura  
Velmi přesná aparatura využívající Cottrell ův princip je zachycena 
na obrázku 2. Sestává se z trubice s varnou částí ve spodní části, 
chladiče ve střední části a výpusti a p říruby v horní části. Cottrellova 
vývěva je umíst ěna ve varné části, která je oh řívána elektrickou 
topnou vložkou. Teplota se m ěří plášťovým termo článkem nebo 
odporovým teplom ěrem zasunutým p řes přírubu v horní části. 
Výpusť je připojena na systém regulace tlaku. Systém pro regulaci 
tlaku se skládá z výv ěvy, vyrovnávacího objemu vakua, manostatu 
pro připouštění dusíku k ovládaní tlaku a manometru.  
1.5.1.3  Postup m ěření 
Látka se umístí do varné části. Při plnění pevných látek, které nejsou 
ve formě prášku, m ůže dojít k problém ům, kterým se však lze n ěkdy 
vyhnout zah řátím chladicího plášt ě. Aparatura se uzav ře přírubou 
a látka se odplyní. Touto metodou nelze m ěřit látky, které p ění. 
Poté se nastaví nejnižší požadovaný tlak a zapne se oh řev. Současně 
se teplotní čidlo připojí k zapisova či. 
Rovnováhy je dosaženo, je-li p ři konstantním tlaku zaznamenána 
konstantní teplota varu. Je t řeba věnovat zvláštní pozornost tomu, 
aby se zabránilo prudkému uvol ňování par b ěhem varu. Navíc musí 
dojít k úplné kondenzaci v chladi či. Při stanovování tlaku par 
u nízkotajících pevných látek je t řeba dbát na to, aby nedošlo 
k ucpání chladi če. 
Po zaznamenání nam ěřeného rovnovážného teplotního bodu se nastaví 
vyšší tlak. Takto se pokra čuje, dokud se nedosáhne tlaku 10  5 Pa 
(celkem asi 5 až 10 bod ů měření). Pro kontrolu se musí stanovení 
rovnovážných bod ů opakovat p ři klesajících hodnotách tlaku.  
1.5.2  Statická metoda  
1.5.2.1  Podstata  
Statickou metodou (5) se m ěří tlak par, který se ustaví p ři termody ­
namické rovnováze p ři dané teplot ě. Tato metoda je vhodná pro 
látky a vícesložkové kapaliny a pevné látky v rozsahu od 10  –1 do 
10 5 Pa a při potřebné pečlivosti lze tuto metodu použít také pro 
oblast od 1 do 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2  Aparatura  
Zařízení se skládá z lázn ě o konstantní teplot ě (preciznost ±0,2 K), 
zásobníku vzorku p řipojenému k podtlakovému potrubí, manometru 
a soustavy k regulaci tlaku. Ba ňka na vzorek (obrázek 3a) je p řipojena 
k podtlakovému potrubí p řes ventil a diferenciální manometr (U-trubice 
obsahující vhodnou manometrickou kapalinu), který slouží jako ukazatel nuly. V závislosti na rozsahu tlak ů a v závislosti na chemickém chování 
zkoušené látky jsou k použití v diferenciálním manometru vhodné rtu ť, 
silikonové oleje a ftaláty. Avšak s ohledem na životní prost ředí je třeba 
se vyvarovat použití rtuti, bude-li to možné. Zkoušená látka se nesmí znatelně rozpouštět ani nesmí reagovat s kapalinou v U-trubici. Namísto 
U-trubice lze použít manometr (obrázek 3b). V rozsahu od normálního 
tlaku do 10
 2 Pa lze v manometru používat rtu ť, zatímco silikonové oleje 
a ftaláty je vhodné používat pro tlaky pod 10  2 Pa až do 10 Pa. Existují též 
jiná měřidla tlaku, která lze použít pro tlak nižší než 10  2 Pa, a ohřívatelné 
membránové kapacitní manometry lze dokonce používat pro tlak nižší 
než 10  –1 Pa. Teplota se m ěří na vnější stěně baňky se vzorkem nebo 
v baňce samotné.  
1.5.2.3  Postup m ěření 
Při použití aparatury popsané na obrázku 3a se U-trubice naplní 
zvolenou kapalinou, která musí být p řed použitím odplyn ěna za zvýšené 
teploty. Zkoušená látka se vloží do aparatury a odplyní se za snížené 
teploty. V p řípadě vícesložkového vzorku musí být teplota dostate čně 
nízká, aby se zajistilo, že se složení materiálu nezm ění. Rovnováhy lze 
rychleji dosáhnout mícháním. Vzorek m ůže být podchlazen kapalným 
dusíkem nebo suchým ledem, je ale nutno zabránit kondenzaci vzduchu 
nebo kapaliny z výv ěvy. Při otevřeném ventilu nádoby se vzorkem se 
připojí na několik minut odsávání, aby se odstranil vzduch. Je-li to nutné, 
odplyňovací postup se n ěkolikrát opakuje.  
Obrázek 3a
  Obrázek 3b
  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Při zahřívání vzorku za uzav řeného ventilu roste tlak par. To m ění 
rovnováhu kapaliny v U-trubici. Aby se zm ěna kompenzovala, 
připouští se ventilem dusík nebo vzduch do té doby, dokud není 
indikátor rozdílu tlaku op ět na nule. Tlak pot řebný k ustavení nulové 
hodnoty m ůže být ode čten přesným manometrem nebo p řístrojem 
o vyšší preciznosti. Tento tlak odpovídá tenzi par látky p ři teplotě 
měření. Při použití aparatury popsané na obrázku 3b se tlak páry 
odečítá přímo. 
Tlak par se stanoví ve vhodných krátkých intervalech teplot (celkem 
asi 5 až 10 bod ů měření) až do požadovaného teplotního maxima.  
Odečty při nízkých teplotách se musí pro kontrolu opakovat. Neleží- 
li hodnoty zjišt ěné z opakovaných ode čtů na křivce zjišt ěné pro 
zvyšující se teplotu, m ůže to být zp ůsobeno jednou z t ěchto příčin: 
i) vzorek stále obsahuje vzduch (nap ř. u vysoce viskózních materi ­
álů) nebo obsahuje látky s nízkým bodem varu, které jsou p ři 
zahřátí uvolňovány,  
ii) v látce probíhá ve vyšet řovaném teplotní rozsahu chemická 
reakce (nap ř. rozklad, polymerace).  
1.5.3  Metoda za použití isoteniskopu  
1.5.3.1  Podstata  
Isoteniskop (6) vychází z podstaty statické metody. Metoda spo čívá 
v uložení vzorku do ba ňky udržované p ři konstantní teplot ě 
a připojené k manometru a výv ěvě. Odplyn ěním za sníženého 
tlaku se odstraní ne čistoty těkavější než vyšet řovaná látka. Tlak 
par vzorku p ři zvolených teplotách je vyrovnáván známým tlakem 
interního plynu. Isoteniskop byl vyvinut k m ěření tlaku par ur čitých 
kapalných uhlovodík ů, ale hodí se rovn ěž k vyšet řování pevných 
látek. Metoda obvykle není vhodná pro vícesložkové systémy. U vzorků obsahujících net ěkavé nečistoty jsou výsledky zatíženy 
pouze mírnými chybami. Doporu čený rozsah je od 10
 2 do 10  5 Pa. 
1.5.3.2  Aparatura  
Příklad měřicího zařízení je zachycen na obrázku 4. Úplný popis lze 
nalézt v ASTM D 2879–86 (6).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3  Postup m ěření 
V případě kapalin slouží látka samotná jako indika ční sloupec 
v diferenciálním manometru. Do isoteniskopu se odm ěří množství 
kapaliny posta čující k napln ění baňky a krátkého ramene manometru. 
Isoteniskop se p řipojí k vakuovému systému, evakuuje se a poté se 
naplní dusíkem. Evakuace a výplach systému se opakuje dvakrát, aby se odstranil veškerý zbytkový kyslík. Napln ěný isoteniskop se 
umístí do horizontální polohy, aby se vzorek rozprost řel v tenké 
vrstvě v baňce se vzorkem a v manometru. Tlak v systému se 
sníží na 133 Pa a vzorek se opatrn ě zahřeje právě k varu (odstran ění 
rozpuštěných plyn ů). Poté se isoteniskop vrátí do p ůvodní polohy 
tak, aby se vzorek vrátil do ba ňky a krátkého ramene manometru. 
Tlak se udržuje na 133 Pa. Špi čka baňky se vzorkem se oh řívá 
malým plamenem, dokud uvoln ěná pára vzorku neexpanduje natolik, 
že přetlačí část vzorku z horní části baňky a ramene manometru do 
manometru, p řičemž se vytvo ří prostor bez dusíku napln ěný 
výhradně parami. Isoteniskop se poté vloží do lázn ě se stálou 
teplotou a tlak dusíku se upraví tak, aby se rovnal tlaku vzorku. V rovnováze se rovná tlak dusíku tenzi par látky.
 
Obrázek 4
  
U pevných látek se v závislosti na oblasti tlaku a teploty používají 
manometrické kapaliny, jako jsou nap říklad silikonové kapaliny nebo 
ftaláty. Odplyn ěná manometrická kapalina se naplní do rozší řené 
části dlouhého ramene isoteniskopu. Poté se vyšet řovaná látka naplní 
do baňky a odplyní se p ři zvýšené teplot ě. Isoteniskop se poté 
nakloní, aby manometrická kapalina natekla do U-trubice.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4  Efusní metoda: váhy pro m ěření tlaku par  (7) 
1.5.4.1  Podstata  
Vzorek zkoušené látky se oh řeje v malé pícce a umístí se pod 
evakuovaný sklen ěný zvon. Pícka se zakryje víkem, které má malé 
otvory o známém pr ůměru. Pára látky unikající jedním z otvor ů je 
vedena na misku vysoce citlivých vah, která je rovn ěž umístěna pod 
evakuovaným sklen ěným zvonem. U n ěkterých konstrukcí je miska 
vah uzav řena v chladicím bloku, který zajiš ťuje rozptyl tepla do 
vnějšího okolí vedením tepla, a je ochlazována vyza řováním tak, 
aby unikající pára na ní kondenzovala. Hybnost proudu par p ůsobí 
jako síla proti misce vah. Tlak par lze odvodit dv ěma způsoby: 
přímo ze síly p ůsobící na misku vah a rovn ěž z rychlosti vypa řování 
s využitím Hertzovy-Knudsenovy rovnice (2):  
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
kde: 
G = rychlost vypa řování (kg s  –1 m –2 ), 
M = molární hmotnost (g mol  –1 ), 
T = termodynamická teplota (K),  
R = univerzální molární plynová konstanta, (J mol  –1 K –1 ), 
p = tlak páry (Pa).  
Doporučený rozsah je od 10  –3 do 1 Pa.  
1.5.4.2  Aparatura  
Obecný princip aparatury je znázorn ěn na obrázku 5.  
Obrázek 5
  
A: Základní deska F: Chladicí blok a chladicí ty č 
B: Přístroj s pohyblivou cívkou G: Odpa řovací pícka 
C: Sklen ěný zvon H: Dewarova nádoba s kapalným dusíkem 
D: Miska vah se stupnicí I: M ěření teploty vzorku 
E: Zařízení pro m ěření vakua J: Zkoušená látka  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5  Efusní metoda: Knudsenova kom ůrka 
1.5.5.1  Podstata  
Metoda je založena na odhadu hmotnosti par zkoušené látky unika ­
jící za jednotku času z Knudsenovy kom ůrky (8) mikrodýzou za 
podmínek vysokého vakua. Hmotnost difundujících par m ůže být 
zjištěna buď stanovením úbytku hmotnosti kom ůrky nebo konden ­
zací par p ři nízké teplot ě a stanovením jejich množství chromatogra ­
fickou analýzou. Tlak par se vypo čte za použití Hertzovy-Knudse ­
novy rovnice (viz bod 1.5.4.1) pomocí korek čních faktor ů, které 
závisí na parametrech p řístroje (9). Doporu čený rozsah je od 10  –10 
do 1 Pa (10, 11, 12, 13, 14).  
1.5.5.2  Aparatura  
Obecný princip aparatury je znázorn ěn na obrázku 6.  
Obrázek 6
  
1: Přípojka k vakuu 7: Šroubovací víko 
2: Otvory pro platinový odporový teplom ěr 
nebo pro systém m ěření a kontroly teploty 8: Křídlové matice 
3: Víko vakuového bloku 9: Šrouby 
4: O-kroužek 10: Efusní kom ůrky z korozivzdorné oceli 
5: Hliníkový vakuový blok 11: Topné t ěleso 
6: Zařízení pro zasouvání a vytahování 
efusních kom ůrek ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6  Efusní metoda: isotermální termogravimetrie  
1.5.6.1  Podstata  
Metoda je založena na stanovení zvýšených rychlostí vypa řování 
zkoušené látky p ři zvýšených teplotách a tlaku okolí s využitím 
termogravimetrie (10, 15, 16, 17, 18, 19, 20). Rychlosti vypa řování  
v T jsou výsledkem vystavení zvolené slou čeniny působení pomalu 
protékajícího inertního plynu, p řičemž se sleduje úbytek hmotnosti 
při definovaných isotermálních teplotách  T v kelvinech b ěhem 
příslušných časových období. Tlaky par  p T se vypočítají z hodnot  
v T s využitím lineární závislosti mezi logaritmem tlaku par 
a logaritmem rychlosti vypa řování. V p řípadě potřeby lze provést 
extrapolaci na teploty 20 °C a 25 °C regresní analýzou log  p T versus 
1/T. Tato metoda je vhodná pro látky s tlakem páry na úrovni 10  –10 
Pa (10  –12 mbar) při čistotě co nejvíce se blížící 100 %, aby se 
zabránilo chybné interpretaci nam ěřených hmotnostních úbytk ů. 
1.5.6.2  Aparatura  
Obecný princip m ěřicí soustavy je zachycen na obrázku 7.  
Obrázek 7
  
Destička nesoucí vzorek, zav ěšená na mikrováhách v kom ůrce 
s kontrolovanou teplotou, je vle čena proudem suchého plynného 
dusíku, který unáší molekuly par zkoušené látky. Po pr ůchodu 
komůrkou se proud plynu čistí v sorp ční jednotce.  
1.5.6.3  Postup m ěření 
Zkoušená látka se nanese na povrch zdrsn ěné skleněné destičky jako 
homogenní vrstva. U pevných látek se desti čka rovnom ěrně navlhčí 
roztokem látky ve vhodném rozpoušt ědle a vysuší se v inertní atmo ­
sféře. Pro měření se pokrytá desti čka zavěsí na termogravimetrický 
analyzátor a následn ě se průběžně měří úbytek hmotnosti jako 
funkce času. ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Rychlost vypa řování  v T při určité teplotě se vypočítá ze ztráty hmot ­
nosti Δm destičky se vzorkem pomocí rovnice  
v T ¼ Δm 
F Ö t ðgcm  –2 h –1 Ì 
kde F je plocha povrchu pokrytého zkoušenou látkou, obvykle je to 
povrchová plocha desti čky se vzorkem, a  t je čas, během něhož 
dojde k úbytku hmotnosti Δm. 
Tlak par  p T se vypočítá jako funkce rychlosti vypa řování  v T : 
Log p T = C + D log  v T 
kde C a D jsou konstanty specifické pro použité experimentální 
uspořádání v závislosti na pr ůměru měřicí komůrky a rychlosti 
toku plynu. Tyto konstanty se musí jednorázov ě stanovit m ěřením 
množiny slou čenin se známým tlakem par a ur čit pomocí lineární 
regrese ze závislosti log  p T na log  v T (11, 21, 22).  
Vztah mezi tlakem par  p T a teplotou  T v kelvinech popisuje rovnice  
Log p T = A + B 1/ T 
kde A a B jsou konstanty získané lineární regresí ze závislosti log  p T 
na 1/ T. Pomocí této rovnice lze vypo čítat tlak par extrapolací pro 
jakoukoliv teplotu.  
1.5.7  Metoda nasycení plynu  (23)  
1.5.7.1  Podstata  
Inertní plyn se vede p ři pokojové teplot ě a známém pr ůtoku přes 
vzorek zkoušené látky nebo nad ním, a to dostate čně pomalu, aby 
bylo zajišt ěno nasycení. Dosažení nasycení v plynné fázi je zásadn ě 
důležité. Transportovaná látka se zachytí, obvykle za použití 
sorbentu, a stanoví se její množství. Jako alternativní metody zachy ­
cení páry a následné analýzy mohou být ke stanovení množství hmoty transportovaného materiálu použity pr ůtokové analytické tech ­
niky, jako je plynová chromatografie. Tlak par se vypo čítá s tím, že 
se předpokládá platnost zákona o ideálním plynu a že celkový tlak 
směsi plynů je roven sou čtu tlaků plynných složek. Díl čí tlak zkou ­ 
šené látky, tj. tlak par, se vypo čítá ze známého celkového objemu 
plynu z hmotnosti transportovaného materiálu.
 
Metoda nasycení plynu je použitelná u pevných nebo kapalných 
látek. Lze ji použít pro tlaky par do 10  –10 Pa (10, 11, 12, 13, 14). 
Metoda je nejspolehliv ější pro tlaky par nižší než 10  3 Pa. Při tlaku 
nad 10  3 Pa jsou tlaky par všeobecn ě nadsazené, pravd ěpodobně kvůli 
tvorbě aerosolu. Protože se m ěření tlaku par provádí p ři pokojové 
teplotě, není nezbytné extrapolovat údaje získané za vysokých teplot 
a extrapolace vysokých teplot, která často způsobuje závažné chyby, 
se neprovádí.  
1.5.7.2  Aparatura  
Proces vyžaduje použití bloku s konstantní teplotou. Nákres na 
obrázku 8 ukazuje blok obsahující t ři držáky pevných vzork ů a tři 
držáky kapalných vzork ů, které umož ňují trojitou analýzu bu ď 
pevného, nebo kapalného vzorku. Teplota je regulována 
s precizností ±0,5 °C nebo lepší.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Obrázek 8
  
Obecně se jako inertní nosný plyn používá dusík, ale n ěkdy může 
být nutno použít jiný plyn (24). Nosný plyn musí být suchý. Proud 
plynu se rozd ělí do 6 proud ů ovládaných jehlovými ventily (otvor 
přibližně 0,79 mm) a protéká do bloku m ěděnou trubkou o vnit řním 
průměru 3,8 mm. Po vyrovnání teplot plyn protéká okolo vzorku 
a sorbentovým lapa čem a vychází z bloku.  
Pevné vzorky se umístí do trubice o vnit řním průměru 5 mm mezi 
zátky ze skelné vaty (viz obrázek 9). Obrázek 10 ukazuje držák 
kapalného vzorku a systém se sorbentem. Metoda pro m ěření tlaku 
par kapalin s nejvyšší reprodukovatelností spo čívá v nanesení kapa ­
liny na sklen ěné kuličky nebo na inertní sorbent, nap říklad na oxid 
křemičitý, a obalení držáku t ěmito kuli čkami. Druhou možností je 
nechat procházet nosný plyn hrubou fritou a probublávat sloupcem 
s kapalnou zkoušenou látkou.  
Obrázek 9
  Obrázek 10
  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Systém se sorbentem obsahuje p řední a zadní část se sorbentem. P ři 
velmi nízkých tlacích páry se na sorbentu zachytí pouze malá množ ­
ství a adsorpce na skelné vat ě a ve sklen ěném potrubí mezi vzorkem 
a sorbentem m ůže představovat závažný problém.  
Lapače chlazené pevným CO  2 jsou dalším ú činným zp ůsobem pro 
zachytávání materiálu v podob ě par. Nevyvolávají žádný protitlak 
v syticí kolon ě a rovněž lze snadno kvantitativn ě odstranit zachycený 
materiál.  
1.5.7.3  Postup m ěření 
Průtok vytékajícího nosného plynu se m ěří při pokojové teplot ě. 
Průtok se během experimentu často kontroluje, aby se zajistilo, že 
je přesně zjištěna hodnota celkového objemu nosného plynu. Dává 
se přednost nep řetržitému sledování hmotnostním pr ůtokoměrem. 
Nasycení plynné fáze m ůže vyžadovat zna čnou kontaktní dobu, 
a tím i dosti nízké pr ůtoky plynu (25).  
Po skončení experimentu se samostatn ě analyzují jak p řední, tak 
zadní část se sorbentem. Slou čenina v každé části se desorbuje 
přidáním rozpoušt ědla. Výsledné roztoky se analyzují kvantitativn ě, 
aby se stanovila hmotnost desorbovaná z každé části. Volba analy ­
tické metody (rovn ěž volba sorbentu a desorb čního rozpoušt ědla) je 
určována povahou zkoušeného materiálu. Ú činnost desorpce je 
stanovena vst říknutím známého množství vzorku do sorbentu, jeho 
desorpcí a analýzou zp ětně získaného množství. Je d ůležité kontro ­
lovat účinnost desorpce p ři koncentraci vzorku za podmínek zkou ­ 
šení nebo v její blízkosti.  
Aby bylo zajišt ěno nasycení nosného plynu zkoušenou látkou, použí ­
vají se tři odlišné pr ůtoky plynu. Jestliže vypo čítaný tlak par nevy ­
kazuje závislost na pr ůtoku, předpokládá se nasycení plynu.  
Tlak par se vypo čítá pomocí rovnice:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
kde: 
p = tlak páry (Pa),  
W = hmotnost odpa řené zkoušené látky (g),  
V = objem nasyceného plynu (m  3 ), 
R = univerzální molární plynová konstanta 8,314 (J mol  –1 K –1 ), 
T = termodynamická teplota (K),  
M = molární hmotnost zkoušené látky (g mol  –1 ). 
Naměřené objemy musí být korigovány v d ůsledku rozdíl ů tlaků 
a teplot mezi pr ůtokoměrem a syticí kolonou.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8  Metoda rotujícího t ělíska  
1.5.8.1  Podstata  
Tato metoda využívá m ěřiče viskozity s rotujícím t ělískem, kde je 
měřicím prvkem malá ocelová kuli čka zavěšená v magnetickém 
poli, která je uvád ěna do rota čního pohybu rotujícími magnetickými 
poli (26, 27, 28). Zvedací cívky umož ňují měření rotační rychlosti. 
Když kuli čka dosáhne stanovené rota ční rychlosti, obvykle p řibližně 
400 otáček za sekundu, zastaví se další napájení a zahájí se zpoma ­
lování vyvolané brzdicím ú činkem plynu. Pokles rota ční rychlosti je 
měřen jako funkce času. Tlak par je odvozen ze zpomalení rotující 
ocelové kuli čky v závislosti na tlaku. Doporu čený rozsah je od 10  –4 
do 0,5 Pa.  
1.5.8.2  Aparatura  
Schematický nákres m ěřicí soustavy je zachycen na obrázku 
11. Měřicí hlava je umíst ěna v prostoru s konstantní teplotou, 
v němž je teplota regulována s p řesností na 0,1 °C. Nádobka se 
vzorkem je umíst ěna do samostatného prostoru, v n ěmž je teplota 
rovněž regulována s p řesností na 0,1 °C. Všechny ostatní části 
soustavy jsou udržovány p ři vyšší teplot ě, aby nedocházelo ke 
kondenzaci. K za řízení se p řipojí vysokovakuová výv ěva. 
Obrázek 11
  
2. DATA A ZPRÁVY  
2.1 DATA  
Stanovení tlaku par kteroukoli z výše popsaných metod by se m ělo 
provést nejmén ě při dvou teplotách. Aby se ov ěřil lineární pr ůběh 
křivky tlaku par v oblasti teplot od 0 °C do 50 °C, doporu čuje se 
měření při třech nebo více teplotách. V p řípadě efusní metody 
(Knudsenova kom ůrka a isotermální termogravimetrie) a metody 
nasycení plynu se jako rozsah m ěřicích teplot doporu čuje 120 °C 
až 150 °C namísto 0 °C až 50 °C.  
2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:  
— použitá metoda,  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty) a pop ř. infor­
mace o provedeném p ředběžném čištění, 
— nejmén ě dvě hodnoty tlaku par a teploty – pokud možno t ři či 
více – v oblasti 0 °C až 50 °C (nebo 120 °C až 150 °C),  
— nejmén ě jedna z teplot by m ěla činit 25 °C nebo mén ě, bude-li to 
technicky proveditelné p ři zvolené metod ě, 
— všechny p ůvodní údaje,  
— křivka závislosti log  p na 1/ T, 
— odhadnutá hodnota tlaku par p ři 20 °C nebo 25 °C.  
Zjistí-li se zm ěna stavu (fázový p řechod, rozklad), m ěly by být 
uvedeny tyto skute čnosti:  
— druh zm ěny, 
— teplota p ři atmosférickém tlaku, p ři k které ke zm ěně dochází,  
— hodnoty tlaku par p ři 10 °C a 20 °C pod teplotou p řechodu a nad 
teplotou p řechodu (s výjimkou p řechodů z pevného do plynného 
skupenství).  
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou d ůle­ 
žité pro interpretaci výsledk ů, zejména pokud jde o ne čistoty 
a fyzikální stav látky.  
3. LITERATURA  
(1) Úřední věstník Evropských spole čenství  L 383 A, 26–47 
(1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., Vodar, B., ( eds.), Butterworths, London.  
(3) Weissberger R., ( ed.) (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.
 
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
(5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa – Static 
method.  
(6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909).  Ann. Phys. Lpz ., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975).  J. Chem. 
Thermodynamics  7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides;  Pest 
Management Science  56, 521–532.  
(11) Tomlin, C.D.S. ( ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000).  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides.  J. Chromatog . 16 (1964), 
22–28.  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A.,  Pesticide Science  16 (1982), 
269–278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins,  Thermochimia Acta  112 Issue 1 (1987), 117–122.  
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection;  Pesticide Science  4 (1973) 137–147.
 
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products;  Pesticide 
Science  5 (1974) 393–400.
 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., 
A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relati ­
onship between Vapour Pressure and Evaporation Rate;  Pesti­
cide Science  13 (1982) 161–168.  
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate;  Pesticide Science  
45 (1995) 27–31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME);  Pesticide Science , 53 (1998) 300–310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds;  Journal of Pharmaceutical Science  87­
(12) (1998) 1512–20.
 
(21) Lide, D.R. ( ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range – 25 °C to 150 °C.
 
(22) Meister, R.T. ( ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 
(2002).  
(23) 40 CFR, 796. (1993). s. 148–153, Office of the Federal Regis ­
ter, Washington DC.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985).  Thermochimica Acta  85, 435.  
(25) Westcott  et al . (1981).  Environ. Sci. Technol . 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., Jitschin W. (1987).  J. Vac. Sci. 
Technol . (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., Lindenau, B. (1980).  J. Vac. Sci. 
Technol . 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985).  J. Vac. Sci. Technol . (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Dodatek  
Metoda odhadu  
ÚVOD  
Odhadnuté hodnoty tlaku par lze využít:  
— k rozhodnutí, která z experimentálních metod je vhodná,  
— k provedení odhadu nebo ke stanovení mezní hodnoty v p řípadech, kdy nelze 
z technických d ůvodů použít experimentální metodu.  
METODA ODHADU  
Tlak par kapalin a pevných látek m ůže být odhadnut pomocí modifikovaného 
Watsonova korela čního vztahu (a). Požaduje se pouze jeden experimentální údaj, 
a to teplota varu za normálního tlaku. Metoda je použitelná pro tlaky od 10  5 do 
10 –5 Pa. 
Podrobné informace o metod ě jsou uvedeny v p říručce Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods  (b). Viz rovn ěž OECD Environmental Monograph 
No. 67 (c).  
POSTUP VÝPO ČTU 
Tlak par se vypo čte podle vzorce:  
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m–1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
kde: 
T = teplota, pro kterou je tlak par vypo čítáván,  
T b = teplota varu p ři normálním tlaku,  
P vp = tlak par p ři teplotě T, 
ΔH vb = výparné teplo,  
ΔZ b = faktor stla čitelnosti (použije se hodnota 0,97),  
m = empirický faktor, jehož hodnota závisí na fyzikálním stavu p ři teplotě, 
pro níž je provád ěn výpočet. 
Dále 
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8;75 þ R ln T b Þ 
kde K F je empirický sou činitel zohled ňující polaritu látky. V p říručce (b) jsou 
uvedeny hodnoty faktoru  K F pro několik typů sloučenin. ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Velmi často jsou k dispozici data o teplot ě varu při sníženém tlaku. V takovém 
případě se tlak par vypo čte podle tohoto vztahu:  
ln P vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 " 
1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m–1 
ln T 
T 1 # 
kde T 1 je teplota varu p ři sníženém tlaku  P 1 . 
ZPRÁVA  
Je-li použita metoda odhadu, musí zpráva obsahovat úplný postup výpo čtu. 
LITERATURA  
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem., 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph No. 67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5 POVRCHOVÉ NAP ĚTÍ 
1. METODA  
Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1). 
Základní principy jsou uvedeny v literatu ře (2).  
1.1 ÚVOD  
Popsané metody jsou ur čeny pro m ěření povrchového nap ětí 
vodných roztok ů. 
Před provedením t ěchto zkoušek je vhodné mít k dispozici p řed­
běžné informace o rozpustnosti látky ve vod ě, o její struktu ře, 
o hydrolýze a o kritické koncentraci pro tvorbu micel.  
Níže uvedené metody jsou použitelné pro v ětšinu chemických látek 
bez omezení z hlediska stupn ě jejich čistoty.  
Měření povrchového nap ětí metodou prstencového tenziometru je 
omezeno na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižší než 
přibližně 200 mPa/s.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Povrchová volná enthalpie vztažená na jednotku povrchu se nazývá 
povrchové nap ětí. 
Povrchové nap ětí se vyjad řuje těchto jednotkách:  
N/m (v soustav ě SI) nebo  
mN/m (odvozená jednotka v soustav ě SI) 
1 N/m= 103 dyn/cm  
1 mN/m = 1 dyn/cm ve staré soustav ě CGS  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referen ční látky. 
Měly by v první řadě sloužit k ob časné kontrole provedení metody 
a ke vzájemnému porovnávání výsledk ů získaných jinými metodami.  
Referenční látky, které pokrývají široké rozp ětí hodnot povrchového 
napětí, jsou uvedeny v literatu ře (1, 3).  
1.4 PODSTATA METOD  
Metody jsou založeny na m ěření největší síly, kterou je nutné 
působit ve svislém sm ěru na třmínek nebo prstenec, který se dotýká 
povrchu zkoumané kapaliny umíst ěné v měřicí nádob ě, aby se od 
tohoto povrchu odd ělil, nebo na desti čku, která se svým okrajem 
dotýká povrchu, aby se vzniklý film vytáhl nahoru.  
Látky, jejichž rozpustnost ve vod ě dosahuje hodnoty alespo ň 1 mg/1, 
se zkoušejí ve vodných roztocích p ři jedné koncentraci.  
1.5 KRITERIA JAKOSTI  
Přesnost těchto metod je pravd ěpodobně vyšší, než je požadováno 
pro účely hodnocení stavu životního prost ředí. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6 POPIS METOD  
Připraví se roztok látky v destilované vod ě. Koncentrace roztoku by 
měla být 90 % koncentrace nasyceného roztoku látky ve vod ě; 
pokud tato koncentrace p řesáhne 1 g/l, použije se k m ěření roztok 
o koncentraci 1 g/l. Látky, jejichž rozpustnost je menší než 1 mg/l, 
není nutné zkoušet.  
1.6.1  Desti čková metoda  
Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of 
surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.2  Třmínková metoda  
Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of 
surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.3  Prstencová metoda  
Viz ISO 304 a NF T 73060 (Surface active agents – determination of 
surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.4  Harmonizovaná prstencová metoda OECD  
1.6.4.1.  Aparatura  
Pro toto m ěření jsou vhodné komer ční tenziometry. Skládají se 
z těchto částí: 
— pohyblivý stolek pro vzorek,  
— systém m ěření síly,  
— měřicí tělísko,  
— měřicí nádoba.  
1.6.4.1.1 P o h y b l i v ý s t o l e k p r o v z o r e k  
Pohyblivý stolek pro vzorek slouží jako podložka pro termostato ­
vanou měřicí nádobu, ve které je kapalina, která má být zkoušena. 
Spolu se systémem m ěření síly je upevn ěn na stojanu.  
1.6.4.1.2 S y s t é m m ě ř e n í s í l y  
Systém m ěření síly je umíst ěn nad stolkem pro vzorek (viz obrázek). 
Chyba m ěření síly nemá p řekročit ± 10  –6 N, což odpovídá chyb ě 
± 0,1 mg p ři měřeni hmotnosti. Ve v ětšině případů je měřicí stupnice 
komerčních tenziometr ů dělena v mN/m, takže je možné povrchové 
napětí odečítat přímo v mN/m s p řesností na 0,1 mN/m.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3 M ě ř i c í t ě l í s k o ( p r s t e n e c )  
Prstenec je obvykle zhotoven z platino-iridiového drátu o pr ůměru 
asi 0,4 mm a st ředním obvodu 60 mm. Prstenec z drátu je zav ěšen 
vodorovn ě na upevňovací vidlici z drátu a na kovové ty čince, která 
tvoří spojení k systému m ěření síly (viz obrázek).  
Obrázek  
Měřicí tělísko  
(všechny rozm ěry jsou uvedeny v milimetrech)
  
1.6.4.1.4 M ě ř i c í n á d o b a  
Měřicí nádobou pro zkušební roztok je termostatovaná sklen ěná 
nádoba. Má být konstruována tak, aby teplota zkoumané kapaliny i plynné fáze nad jejím povrchem z ůstala během měření konstantní 
a aby se vzorek nemohl odpa řovat. Vhodná je válcová sklen ěná 
nádoba o vnit řním průměru nejmén ě 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2  Příprava aparatury  
1.6.4.2.1 Č i š t ě n í 
Skleněné nádoby je t řeba pečlivě vyčistit. Pokud je to nutné, m ěly 
by se vymýt horkou kyselinou chromsírovou a následn ě koncentro ­
vanou kyselinou fosfore čnou (83 až 98 % hmot. H  3 PO 4 ), pečlivě 
vypláchnout tekoucí vodou a nakonec omýt redestilovanou vodou 
do neutrální reakce a následn ě vysušit nebo vypláchnout vzorkem 
kapaliny, která má být m ěřena. 
Prstenec je t řeba nejprve pe člivě umýt vodou, aby se odstranily 
všechny látky rozpustné ve vod ě. Poté se krátce pono ří do kyseliny 
chromsírové, opláchne se v redestilované vod ě do neutrální reakce 
a nakonec se krátce oh řeje nad methanolovým plamenem.  
Poznámka:  
Znečištění látkami, které se nerozpoušt ějí ani nerozkládají kyselinou 
chromsírovou ani kyselinou fosfore čnou, jako nap říklad silikony, je 
nutné odstra ňovat vhodnými organickými rozpoušt ědly. 
1.6.4.2.2 K a l i b r o v á n í a p a r a t u r y  
Validace aparatury spo čívá v ověření nuly a v nastavení p řístroje tak, 
aby jeho data umož ňovala spolehlivé stanovení v mN/m.  
Poloha:  
Přístroj musí být nastaven do vodorovné polohy, nap ř. pomocí libely 
položené na základovou desku tenziometru a nastavením stav ěcích 
šroubů základnové desky.  
Nastavení nuly:  
Po upevn ění prstence na aparatu ře a před ponořením do kapaliny je 
třeba nastavit nulu ukazatele tenziometru a zkontrolovat rovnob ěž­
nost prstence s hladinou kapaliny. K tomu je možné použít hladiny kapaliny jako zrcadla.
 
Kalibrace:  
Vlastní kalibraci p řed měřením je možné provést dv ěma postupy:  
a) Použitím závaží: p ři tomto postupu se použijí jezdce o známé 
hmotnosti od 0,1 g do 1,0 g, které se umístí na prstenec. Kali ­
brační faktor Ф a , kterým je t řeba násobit všechny hodnoty 
odečtené na p řístroji, je možné ur čit podle rovnice (1): 
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
kde: 
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = hmotnost jezdce (g),  
g = tíhové zrychlení (981 cm s  –2 na úrovni hladiny mo ře), 
b = st řední obvod prstence (cm)  
σ a = odečtená hodnota na tenziometru po umíst ění jezdců na 
prstenec (mN/m).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) Použitím vody: p ři tomto postupu se použije čistá voda, jejíž 
povrchové nap ětí má při 23  o C hodnotu 72,3 mN/m. Tento 
postup lze provést rychleji než kalibraci se závažími, ale existuje vždy nebezpe čí, že povrchové nap ětí vody je zkresleno stopovým 
znečištěním povrchov ě aktivními látkami.
 
Kalibrační faktor Φ b , kterým je t řeba násobit všechny hodnoty 
odečtené na p řístroji, je možné ur čit podle rovnice (2): 
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
kde: 
σ o = hodnota povrchového nap ětí vody uvedená v literatu ře 
(mN/m),  
σ g = naměřená hodnota povrchového nap ětí vody (mN/m), ob ě 
při stejné teplot ě. 
1.6.4.3  Příprava vzork ů 
Připraví se vodné roztoky zkoušených látek o požadované koncen ­
traci, které nesm ějí obsahovat nerozpušt ěné složky.  
Roztoky musí být udržovány p ři konstantní teplot ě (± 0,5  o C). 
Protože se povrchové nap ětí roztoku v m ěřicí nádob ě v čase mění, 
provedou se m ěření v různých časech a sestrojí se k řivka závislosti 
povrchového nap ětí na čase. Nedochází-li k žádným dalším zm ěnám, 
bylo dosaženo rovnovážného stavu.  
Měření je ovliv ňováno zne čištěním prachem nebo plynnými látkami. 
Práce musí být tedy provád ěny pod ochranným krytem.  
1.6.5  Zkušební podmínky  
Měření se provádí p řibližně při 20  o C a udržuje se tolerance ± 0,5  o C. 
1.6.6  Postup zkoušky  
Roztoky, které mají být m ěřeny, se p řevedou do pe člivě vyčištěné 
měřicí nádoby, p řičemž je třeba dbát na to, aby nedošlo k p ěnění, 
a nádoba se poté postaví na stolek zkušební aparatury. Horní část 
stolku s m ěřicí nádobou se vysune tak vysoko, aby se prstenec 
ponořil pod povrch roztoku, který má být m ěřen. Horní část stolku 
se následn ě postupně a rovnom ěrně sníží (rychlostí p řibližně 0,5 cm/­
min), aby došlo k odd ělení prstence od povrchu, a to až do dosažení 
maximální hodnoty síly. Film kapaliny lpící na prstenci se od n ěho 
nesmí odtrhnout. Po ukon čení měření se prstenec op ět ponoří pod 
povrch a postup se opakuje až do dosažení konstantní hodnoty povrchového nap ětí. Při každém stanovení se za čne zaznamenávat 
čas v okamžiku pln ění roztoku do m ěřicí nádoby. Ode čty se 
provedou vždy v okamžiku, kdy je dosaženo maximální síly nutné 
pro oddělení prstence od povrchu kapaliny.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. DATA  
Za účelem výpo čtu povrchového nap ětí se hodnota ode čtená na 
přístroji v mN/m nejprve vynásobí kalibra čním faktorem Φ a nebo 
Φ b (podle použitého postupu kalibrace). Získá se tak hodnota, 
která však platí pouze p řibližně, a vyžaduje proto korekci.  
Harkins a Jordan (4) empiricky stanovili korek ční faktory pro 
hodnoty povrchového nap ětí měřeného prstencovou metodou, které 
závisí na rozm ěrech prstence, hustot ě kapaliny a jejím povrchovém 
napětí. 
Vzhledem k tomu, že je zdlouhavé stanovovat pro každé jednotlivé 
měření korek ční faktor z tabulek Harkinse a Jordana, lze pro výpo čet 
povrchového nap ětí vodných roztok ů použít zjednodušenou metodu, 
která spo čívá v ode čtu korigovaných hodnot povrchového nap ětí 
přímo z tabulky. (Pro ode čtené hodnoty, které leží mezi hodnotami 
uvedenými v tabulce, se provede interpolace.)  
Tabulka  
Korekce nam ěřených hodnot povrchového nap ětí 
Pouze pro vodné roztoky ρ = 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (st řední polom ěr prstence) 
r = 0,185 mm (polom ěr drátu prstence)  
Experimentální hodnota (mN/m) Korigovaná hodnota (mN/m) 
Kalibrace závažími (viz 1.6.4.2.2 písm. 
a)) Kalibrace vodou (viz 1.6.4.2.2 písm. 
b)) 
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,5 
39,5 42,3 
46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Experimentální hodnota (mN/m) Korigovaná hodnota (mN/m) 
Kalibrace závažími (viz 1.6.4.2.2 písm. 
a)) Kalibrace vodou (viz 1.6.4.2.2 písm. 
b)) 
58 53,2 57 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72 
74 69,2 — 
76 71,2 — 78 73,2 —
 
Tabulka byla sestavena na základ ě korekcí podle Harkinse a Jordana. 
Je obdobou tabulky podle normy DIN 53914 pro vodu a vodné roztoky (hustota p = 1 g/cm
 3 ); platí pro b ěžný komer ční prstenec 
o rozměrech R = 9,55 mm (st řední polom ěr prstence) a r = 
0,185 mm (polom ěr drátu prstence). Tabulka udává korigované 
hodnoty pro m ěření povrchového nap ětí získané po kalibraci 
závažími nebo vodou.  
Jiným řešením je vypo čítat povrchové bez p ředchozí kalibrace podle 
rovnice:  
σ ¼ fxF 
4πR 
kde: 
F = síla udaná m ěřicím systémem p ři oddělení filmu,  
R = polom ěr prstence,  
f = korek ční faktor (1).  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— použitá metoda,  
— druh vody nebo použitého roztoku,  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty),  
— výsledky m ěření: povrchové nap ětí (odečtené hodnoty) 
s uvedením jednotlivých ode čtených hodnot a jejich aritmetic ­
kého průměru a rovn ěž korigované st řední hodnoty (p řičemž se 
bere v úvahu kalibra ční faktor a tabulka korekcí),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— koncentrace roztoku,  
— zkušební teplota,  
— stáří použitého roztoku, zejména časový odstup mezi p řípravou 
roztoku a m ěřením,  
— znázorn ění časové závislosti povrchového nap ětí po převedení 
roztoku do m ěřicí nádoby,  
— uvedou se všechny informace a poznámky, které jsou d ůležité 
pro interpretaci výsledk ů, zejména pokud jde o ne čistoty 
a fyzikální stav látky.  
3.2 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Vzhledem k tomu, že povrchové nap ětí vody je 72,75 mN/m p ři 
20 o C, měly by být látky vykazující za podmínek této metody 
povrchové nap ětí menší než 60 mN/m považovány za povrchov ě 
aktivní materiály.  
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, rozhodnutí Rady C(81) 
30 v kone čném znění. 
2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.
 
3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 52, 
1751.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6 ROZPUSTNOST VE VOD Ě 
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) 105 
(1995). Tato zkušební metoda je revidovanou verzí p ůvodních pokyn ů TG 
105, které byly p řijaty v roce 1981. Sou časná verze se obsahov ě od verze 
z roku 1981 neliší. Zm ěnil se převážně formát textu. Revize vycházela ze 
zkušební metody EU „Rozpustnost ve vod ě“ ( 1 ). 
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
2. Rozpustnost látky ve vod ě může být zna čně ovlivněna přítomností ne čistot. 
Tato zkušební metoda se zabývá stanovením rozpustnosti ve vod ě 
u vícemén ě čistých látek, které jsou stabilní ve vod ě a nejsou t ěkavé. 
Před stanovením rozpustnosti ve vod ě je vhodné mít k dispozici p ředběžné 
informace o zkoušené chemické látce, nap říklad o strukturním vzorci, tlaku 
par, disocia ční konstant ě a hydrolýze jako funkci pH.  
3. V této zkušební metod ě jsou popsány dv ě metody, a sice sloupcová elu ční 
metoda pro rozpustnost nižší než 10  –2 g/l a baňková metoda pro rozpustnost 
vyšší. Rovn ěž je zde popsána jednoduchá p ředběžná zkouška. Ta umož ňuje 
přibližně stanovit vhodné množství vzorku, který se má použít v kone čné 
zkoušce, a rovn ěž dobu nezbytnou k dosažení saturace.  
DEFINICE A JEDNOTKY  
4. Rozpustnost látky ve vod ě je veličina udávající hmotnostní koncentraci 
jejího nasyceného vodného roztoku p ři dané teplot ě. 
5. Rozpustnost ve vod ě se vyjad řuje jako hmotnost rozpušt ěné látky v objemu 
roztoku. Jednotkou v soustav ě SI je kg/m  3 , ale může se používat také g/l.  
REFEREN ČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY  
6. Při vyšetřování zkoušené chemické látky není nutné používat referen ční 
chemické látky.  
POPIS METOD  
Zkušební podmínky  
7. Zkouška se provádí optimáln ě při teplotě 20 ± 0,5 °C. Zvolenou teplotu je 
třeba udržovat ve všech d ůležitých částech aparatury konstantní.  
Předběžná zkouška  
8. Ke vzorku o hmotnosti p řibližně 0,1 g (pevné zkoušené chemické látky 
musí být v práškové form ě) umístěnému do odm ěrného válce o objemu 
10 ml uzavíratelného sklen ěnou zátkou se p ři laboratorní teplot ě přidávají 
po krocích neustále nar ůstající objemy vody. Po každém p řidání dílčího 
objemu vody se sm ěsí intenzivn ě třepe po dobu 10 minut a vizuáln ě se 
kontroluje obsah nerozpušt ěných částic vzorku. Z ůstanou-li vzorek nebo 
jeho část po p řidání 10 ml vody nerozpušt ěny, pokra čuje se 
v experimentu v odm ěrném válci o objemu 100 ml. P řibližná rozpustnost  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
je uvedena v tabulce 1 pod objemem vody pot řebným k úplnému rozpušt ění 
vzorku. Je-li rozpustnost nízká, m ůže být doba pot řebná k rozpušt ění zkou­ 
šené chemické látky dlouhá a je t řeba vyčkat alespo ň 24 hodin. Není-li 
zkoušená chemická látka ani po 24 hodinách rozpušt ěna, je třeba vyčkat 
delší dobu (až 96 hodin) nebo se pokusit o další ředění, aby se zjistilo, zda 
by se měla použít sloupcová elu ční metoda nebo ba ňková metoda.  
Tabulka 1  
ml vody na 0,1 
g rozpoušt ěné látky 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
přibližná rozpustnost v g/l > 1 000 1 000–2 ­
00 200–100 100–50 50–10 10–1 < 1  
Sloupcová elu ční metoda  
Podstata  
9. Tato metoda je založena na vymývání zkoušené chemické látky vodou 
z mikrokolony napln ěné inertním nosi čem pokrytým p řebytkem zkoušené 
chemické látky (2). Rozpustnost ve vod ě udává hmotnostní koncentrace 
eluátu poté, co dosáhla rovnovážného nasycení v závislosti na čase. 
Aparatura  
10. Aparatura se skládá z mikrokolony (obrázek 1) udržované p ři konstantní 
teplotě. Je připojena bu ď k oběhovému čerpadlu (obrázek 2) nebo 
k vyrovnávací nádob ě (obrázek 3). Mikrokolona obsahuje inertní nosi č, 
který je fixován na míst ě pomocí malého smotku skelné vaty, který 
současně slouží k odfiltrování částeček. Materiály, které lze použít jako 
nosič, jsou sklen ěné kuličky, infuzoriová hlinka nebo jiné inertní materiály.  
11. Mikrokolona na obrázku 1 je vhodná pro konfiguraci s ob ěhovým čerpad­
lem. Prostor hlavy této mikrokolony pojme p ět objemů sloupce (které se na 
začátku pokusu vypustí) a objem p ěti vzorků (které se b ěhem experimentu 
odebírají k analýze). Velikost hlavy kolony m ůže být menší, pokud lze 
během experimentu p řidávat do systému vodu k nahrazení p ůvodních p ěti 
objemů sloupce eluovaných s ne čistotami. Kolona je p řipojena hadi čkami 
z inertního materiálu k ob ěhovému čerpadlu, které je schopno zajistit pr ůtok 
asi 25 ml/h. Ob ěhovým čerpadlem m ůže být nap říklad peristaltické nebo 
membránové čerpadlo. Je t řeba dbát na to, aby nedošlo ke kontaminaci 
materiálu hadi čky a/nebo adsorpci na n ěj. 
12. Obrázek 3 ukazuje schematické uspo řádání při použití vyrovnávací nádoby. 
V tomto uspo řádání je mikrokolona vybavena jednocestným uzavíracím 
kohoutem. Spojení s vyrovnávací nádobou se skládá ze zabroušeného skle ­
něného spoje a hadi čky z inertního materiálu. Pr ůtoková rychlost 
z vyrovnávací nádoby by m ěla být přibližně 25 ml/h.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Obrázek 1
  
Rozměry v mm  
A. připojení pro sklen ěný zabroušený spoj  
B. hlava kolony  
C. vnitřní průměr 5 
D. vnější průměr 19 
E. smotek skelné vaty  
F. uzavírací kohout  
Obrázek 2
  
A. vyrovnání atmosférického tlaku  
B. průtokoměr 
C. mikrokolona  
D. termostatované čerpadlo  
E. oběhové čerpadlo  
F. dvoucestný kohout pro odb ěr vzorků ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Obrázek 3
  
A. Vyrovnávací nádoba (nap ř. chemická ba ňka o objemu 2,5 l)  
B. Kolona  
C. Sběrač frakcí  
D. Termostat  
E. Teflonová hadi čka 
F. Sklen ěný zabroušený spoj  
G. Hadice na vodu (mezi termostatem a kolonou, s vnit řním průměrem asi 
8 mm)  
13. Přibližně 600 mg nosi če se převede do 50 ml ba ňky s kulatým dnem. 
Vhodné množství zkoušené chemické látky se rozpustí v t ěkavém rozpouš ­
tědle o jakosti analytického činidla a p říslušné množství tohoto roztoku se 
přidá k nosi či. Rozpoušt ědlo se zcela odpa ří, např. za použití rota ční 
odparky, jinak se nedosáhne úplného nasycení nosi če vodou b ěhem elučního 
kroku v d ůsledku rozd ělování na povrchu nosi če. Nosič s nanesenou látkou 
se nechá dv ě hodiny bobtnat v asi 5 ml vody a poté se suspenze nalije do 
mikrokolony. Je také možné naplnit mikrokolonu, která byla p ředtím napl ­
něna vodou, suchým nosi čem s nanesenou látkou a poté nechat b ěhem dvou 
hodin ustavit rovnováhu.  
14. Nanášení zkoušené chemické látky na nosi č může způsobit problémy a vést 
k chybným výsledk ům, např. usazuje-li se zkoušená chemická látka jako 
olej. Tyto problémy by se m ěly prozkoumat a zaznamenat p říslušné 
podrobné údaje.  
Postup s použitím ob ěhového čerpadla  
15. Zahájí se vymývání kolony. Doporu čená rychlost pr ůtoku je asi 25 ml/h, což 
odpovídá u popsané kolony desetinásobku objemu sloupce za hodinu. Nejméně prvních p ět objemů sloupce obsahujících ne čistoty rozpustné ve 
vodě se odstraní. Poté se nechá b ěžet oběhové čerpadlo až do ustavení 
rovnováhy, které je dosaženo, neliší-li se koncentrace p ěti po sobě následu­
jících vzork ů při náhodném výb ěru o více než ± 30 %, p řičemž rozdíly jsou 
nepravidelné. Tyto vzorky by se m ěly odebírat v intervalech, b ěhem kterých 
kolonou projde nejmén ě desetinásobek objemu sloupce. V závislosti na 
použité analytické metod ě může být vhodn ější stanovit k řivku závislosti 
koncentrace na čase, aby se prokázalo dosažení rovnováhy.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Postup s použitím vyrovnávací nádoby  
16. Po sob ě následující podíly eluátu se shromaž ďují a jejich koncentrace se 
analyzují zvolenou metodou. Pro stanovení rozpustnosti se použijí prost řední 
frakce eluátu, ve kterých z ůstávají koncentrace nejmén ě v pěti po sob ě 
jdoucích frakcích konstantní v rozmezí ± 30 %.  
17. Nejvhodn ějším eluentem je dvakrát destilovaná voda. Rovn ěž lze použít 
deionizovanou vodu s odporem vyšším než 10 ΜΩ/cm a s celkovým 
obsahem organického uhlíku nižším než 0,01 %.  
18. V obou postupech se druhé promytí provede p ři poloviční průtokové rych ­
losti. Shodují-li se výsledky obou pokus ů, považuje se výsledek zkoušky za 
uspokojivý. Je-li nam ěřená rozpustnost p ři nižší průtokové rychlosti vyšší, je 
nutno pokra čovat ve snižování pr ůtoku vždy na polovinu tak dlouho, dokud 
dvě po sobě následující m ěření nepovedou k stejné hodnot ě rozpustnosti.  
19. V obou postupech by se m ěly frakce otestovat na p řítomnost koloidních 
částic zkouškou Tyndallova jevu. P ři přítomnosti částic je výsledek zkoušky 
neplatný a zkouška by se m ěla zopakovat po zlepšení filtra ční funkce 
kolony.  
20. Mělo by se zm ěřit pH každého vzorku, pokud možno pomocí speciálních 
indikátorových papírk ů. 
Baňková metoda  
Podstata  
21. Zkoušená chemická látka (pevné látky musí být ve form ě prášku) se rozpustí 
ve vodě při teplotě, která je o n ěco vyšší než teplota m ěření. Po dosažení 
nasycení se sm ěs ochladí a udržuje se p ři zkušební teplot ě. Jinou možností 
je provést m ěření přímo při zkušební teplot ě, pokud je vhodným vzorko ­
váním prokázáno, že je dosaženo satura ční rovnováhy. Hmotnostní koncent ­
race zkoušené chemické látky ve vodném roztoku, který nesmí obsahovat žádné nerozpušt ěné částice, se následn ě stanoví vhodnou analytickou 
metodou (3).
 
Aparatura  
22. Je třeba toto vybavení:  
— běžné laboratorní sklen ěné nádoby a pom ůcky, 
— zařízení pro t řepání roztok ů při regulované konstantní teplot ě, 
— odstředivka (nejlépe termostatovaná), je-li nutná v p řípadě emulzí a  
— analytické vybavení.  
Postup  
23. Množství zkoušené chemické látky pot řebné pro nasycení požadovaného 
objemu vody se odhadne na základ ě předběžné zkoušky. Do každé ze t ří 
skleněných nádobek opat řených sklen ěnými zátkami (nap ř. centrifuga čních 
kyvet, ban ěk) se naváží asi p ětinásobek tohoto množství. Dále se do každé 
z nádobek p řidá množství vody zvolené v závislosti na analytické metod ě 
a rozmezí rozpustnosti. Nádobky se t ěsně uzavřou a poté se jimi t řepe při 
30 °C. K tomuto ú čelu by se m ěla použít t řepačka nebo mícha čka pracující 
při konstantní teplot ě, např. magnetické míchání v termostatované vodní 
lázni. Po jednom dni se jedna z nádobek uvede b ěhem 24 hodin p ři 
zkušební teplot ě za občasného prot řepání do rovnováhy. Poté se obsah 
nádobky odst ředí při zkušební teplot ě a v čiré vodné fázi se vhodnou  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
analytickou metodou stanoví koncentrace zkoušené chemické látky. Po 
dvou, resp. t řech dnech se zbylé dv ě baňky po po čátečním ustavení rovno ­
váhy při 30 °C zpracují podobným zp ůsobem. Pokud se koncentrace nam ě­ 
řené v nejmén ě dvou posledních nádobkách neliší o více než 15 %, pova ­ 
žuje se výsledek zkoušky za uspokojivý. Pokud hodnoty koncentrací pro 
nádobky 1, 2 a 3 vykazují stoupající tendenci, m ělo by se celé stanovení 
zopakovat s prodloužením doby pro ustavení rovnováhy.  
24. Zkoušku lze provést i bez p ředběžné inkubace p ři 30 °C. Aby se zjistila 
rychlost ustavení satura ční rovnováhy, odebírají se vzorky do té doby, 
dokud doba míchání ovliv ňuje měřené koncentrace.  
25. Mělo by se zm ěřit pH každého vzorku, pokud možno pomocí speciálních 
indikátorových papírk ů. 
Analytické stanovení  
26. Upřednostňuje se metoda specifická pro danou látku, protože malá množství 
rozpuštěných nečistot mohou zp ůsobit velké chyby p ři stanovení rozpust ­
nosti ve vod ě. Příklady takových metod jsou plynová nebo kapalinová 
chromatografie, titrace, fotometrie, voltametrie.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Údaje  
Sloupcová elu ční metoda  
27. Pro každý pokus by se m ěla vypočítat střední hodnota a sm ěrodatná 
odchylka z nejmén ě pěti po sob ě následujících vzork ů vybraných z oblasti 
po dosažení rovnovážného nasycení. St řední hodnoty získané ze dvou 
měření při různých průtokových rychlostech by se nem ěly lišit o více než 
30 %.  
Baňková metoda  
28. Zprůměrují se jednotlivé výsledky pro každou ze t ří baněk, které by se 
neměly lišit o více než 15 %.  
Protokol o zkoušce  
Sloupcová elu ční metoda  
29. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:  
— výsledky p ředběžné zkoušky,  
— chemickou identitu látky a ne čistoty (předběžný purifika ční krok, pokud 
se použije),  
— koncentrace, pr ůtokové rychlosti a pH každého vzorku,  
— střední hodnoty a sm ěrodatné odchylky nejmén ě pro pět vzorků 
z rovnovážné oblasti k řivky nasycení z každého pokusu,  
— průměrnou hodnotu nejmén ě dvou po sob ě jdoucích m ěření, 
— teplotu vody b ěhem procesu tvorby nasyceného roztoku,  
— analytickou metodu,  
— druh materiálu nosi če, 
— způsob nanesení zkoušené chemické látky na nosi č, 
— použité rozpoušt ědlo, 
— poznatky o jakékoli chemické nestálosti látky b ěhem zkoušky,  
— všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledk ů, zvláště 
s ohledem na ne čistoty a fyzikální stav zkoušené chemické látky.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Baňková metoda  
30. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:  
— výsledky p ředběžné zkoušky,  
— chemickou identitu látky a ne čistoty (předběžný purifika ční krok, pokud 
se použije),  
— výsledky jednotlivých analytických stanovení a pr ůměrné hodnoty, 
pokud byla pro každou nádobku stanovena více než jedna hodnota,  
— hodnotu pH každého vzorku,  
— průměrnou hodnotu pro r ůzné nádobky, jejichž výsledky jsou ve shod ě, 
— teplotu p ři zkoušce,  
— analytickou metodu,  
— poznatky o jakékoli chemické nestálosti látky b ěhem zkoušky,  
— všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledk ů, zvláště 
s ohledem na ne čistoty a fyzikální stav zkoušené chemické látky.  
LITERATURA:  
1) Směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po 
sedmnácté p řizpůsobuje technickému pokroku sm ěrnice Rady 67/548/EHS 
o sbližování právních a správních p ředpisů týkajících se klasifikace, balení 
a označování nebezpe čných látek, Ú ř. věst. L 383 A, 29.12.1992, s. 54.  
2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility – Column elution method.  
3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solu ­
bility – Flask method.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8 ROZD ĚLOVACÍ KOEFICIENT  
1. METODA  
Popsaná metoda „t řepací lahve“ je založena na Pokynech OECD pro 
zkoušení (1).  
1.1. ÚVOD  
Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici p ředběžné 
informace o strukturním vzorci látky, o disocia ční konstant ě, 
o rozpustnosti ve vod ě, o hydrolýze, o rozpustnosti v n-oktanolu 
a o povrchovém nap ětí. 
U disociujících látek by m ěla být m ěření provád ěna pouze 
s nedisociovanou formou (volná kyselina nebo volná báze), získanou 
při použití vhodného pufru o pH nejmén ě o 1 nižším (volná kyse ­
lina) nebo vyšším (volná báze) než pK.  
Tato zkušební metoda zahrnuje dva samostatné postupy: metodu 
třepací lahve a vysokoú činnou kapalinovou chromatografii (HPLC). 
První metodu lze použít, leží-li hodnota log P  ow (definice viz níže) 
v rozmezí – 2 až 4, a druhou metodu, leží-li hodnota log P  ow 
v rozmezí 0 až 6. P řed provedením kteréhokoli z experimentálních 
postupů by měl být nejd říve získán p ředběžný odhad rozd ělovacího 
koeficientu.  
Metoda třepací lahve je použitelná pouze pro v podstat ě čisté látky, 
které jsou rozpustné ve vod ě a v n-oktanolu. Nelze ji použít pro 
povrchov ě aktivní látky (pro které by m ěla být uvedena hodnota 
získaná výpo čtem nebo odhad založený na p říslušných rozpustnos ­
tech v n-oktanolu a ve vod ě). 
Metoda HPLC není použitelná pro silné kyseliny a zásady, 
komplexní slou čeniny kov ů, povrchov ě aktivní látky a látky, které 
reagují s eluentem. Pro tyto látky by m ěla být uvedena hodnota 
získaná výpo čtem nebo odhad založený na individuálních rozpust ­
nostech v n-oktanolu a vod ě. 
Metoda HPLC je mén ě citlivá na p řítomnost ne čistot ve zkoušené 
látce než metoda t řepací lahve. N ěkdy však mohou ne čistoty ztížit 
interpretaci výsledk ů, protože p řiřazení pík ů se stává nejistým. 
U směsí, které dávají nerozlišitelný pás, by m ěly být uvedeny spodní 
a horní mez hodnoty log P.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Rozdělovací koeficient (P) je definován jako pom ěr rovnovážných 
koncentrací (c  i ) rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému tvo řeném 
dvěma prakticky nemísitelnými rozpoušt ědly. V případě n-oktanolu 
a vody platí:  
p ow ¼ C OktanÄ1Äol 
C voda 
Rozdělovací koeficient (P) je tedy podílem dvou koncentrací a udává 
se obvykle ve form ě svého dekadického logaritmu (log P).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Metoda třepací lahve  
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referen ční látky. 
Měly by v první řadě sloužit k ob časné kontrole provedení metody 
a ke vzájemnému porovnávání výsledk ů získaných jinými metodami.  
Metoda HPLC  
Za účelem korelace hodnot nam ěřených pro danou slou čeninu 
metodou HPLC s její hodnotou P je nutné sestrojit kalibra ční graf 
závislosti log P na chromatografických datech tvo řený nejmén ě šesti 
referenčními body. Vhodné referen ční látky zvolí uživatel. Pokud je 
to možné, m ěla by mít alespo ň jedna referen ční látka P  ow vyšší než 
zkoušená látka a jiná referen ční látka P  ow nižší než zkoušená látka. 
U hodnot log P nižších než 4 m ůže být kalibrace založena na datech 
získaných metodou t řepací lahve. U hodnot log P vyšších než 
4 může být kalibrace založena na ov ěřených hodnotách 
z literatury, pokud jsou v souladu s vypo čtenými hodnotami. Za 
účelem dosažení vyšší p řesnosti je vhodn ější volit látky, které mají 
podobnou strukturu jako zkoušená látka.  
Rozsáhlé seznamy hodnot P  ow pro mnoho skupin chemických látek 
jsou dostupné v literatu ře (2, 3). Nejsou-li k dispozici údaje 
o rozdělovacích koeficientech látek s podobnou strukturou, lze použít 
obecnější kalibraci s jinými referen čními látkami.  
Seznam doporu čených referen čních látek a jejich hodnot P  ow je 
uveden v dopl ňku 2..  
1.4 PODSTATA METODY  
1.4.1  Metoda t řepací lahve  
Pro stanovení rozd ělovacího koeficientu musí být dosaženo rovno ­
váhy mezi všemi vzájemn ě působícími složkami systému a musí být 
stanoveny koncentrace látek rozpušt ěných v obou fázích. Ze studia 
literatury vztahující se k této otázce vyplývá, že k řešení tohoto 
problému lze použít n ěkolik různých postup ů, např. důkladné 
promíchání obou fází a jejich následné odd ělení za účelem stanovení 
rovnovážných koncentraci vyšet řované látky.  
1.4.2  Metoda HPLC  
HPLC se provádí na analytických kolonách pln ěných komer čně 
dostupnou pevnou fází obsahující dlouhé uhlovodíkové řetězce 
(např.. C  8 , C  18 ) chemicky vázané na oxid k řemičitý. Chemické 
látky nast říknuté do této kolony se v ní pohybují r ůznou rychlostí 
v důsledku r ůzných stup ňů rozdělení mezi mobilní fázi 
a uhlovodíkovou stacionární fázi. Sm ěsi chemikálií se eluují 
v pořadí své hydrofobnosti, p řičemž se látky rozpustné ve vod ě 
eluují jako první a látky rozpustné v olejích jako poslední, úm ěrně 
svému rozd ělovacímu koeficientu uhlovodíky-voda. To umož ňuje 
určit vztah mezi reten čním časem v této kolon ě (s reversními fázemi) 
a rozdělovacím koeficientem n-oktanol/voda. Rozd ělovací koeficient 
se odvodí z kapacitního faktoru k, daného výrazem:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
v němž, t  r = retenční čas zkoušené látky, t  o = průměrná doba, kterou 
molekula rozpoušt ědla potřebuje k pr ůchodu kolonou (mrtvá doba).  
Kvantitativní analytické metody nejsou zapot řebí, nezbytné je pouze 
stanovení elu čních dob.  
1.5 KRITERIA JAKOSTI  
1.5.1  Opakovatelnost  
Metoda třepací lahve  
S cílem zaru čit správnost hodnoty rozd ělovacího koeficientu se 
provedou opakovaná stanovení p ři třech různých zkušebních 
podmínkách, p řičemž lze m ěnit jak množství dané látky, tak pom ěr 
objemů obou rozpoušt ědel. Dekadické logaritmy stanovených hodnot 
rozdělovacího koeficientu by m ěly ležet v rozmezí ± 0,3.  
Metoda HPLC  
S cílem zvýšit d ůvěryhodnost m ěření musí být provedena opakovaná 
stanovení. Hodnoty log P získané z jednotlivých m ěření by m ěly 
ležet v rozmezí ± 0,1.  
1.5.2.  Citlivost  
Metoda třepací lahve  
Měřicí rozsah metody je ur čen mezí detekce analytické metody. Ta 
by měla umožnit stanovení hodnot log P  ow v oblasti od - 2 do 4 
(pokud to podmínky dovolí, lze tuto oblast rozší řit až do hodnoty log 
P ow do 5) není-li koncentrace rozpušt ěné látky v žádné z fází vyšší 
než 0,01 mol/l.  
Metoda HPLC  
Metoda HPLC umož ňuje stanovení rozd ělovacích koeficient ů 
v rozsahu log P  ow od 0 do 6.  
Obvykle je možné ur čit rozdělovací koeficient dané látky s p řesností 
± 1 řádu vzhledem k hodnot ě získané metodou t řepací lahve. 
Typické korelace lze nalézt v literatu ře (4, 5, 6, 7, 8). Vyšší p řesnosti 
lze obvykle dosáhnout, je-li korela ční závislost založena na referen ­ 
čních látkách podobné struktury (9).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3  Specifi čnost 
Metoda třepací lahve  
Nernstův rozdělovací zákon platí pro z ředěné roztoky jen p ři 
konstantní teplot ě, konstantním tlaku a pH. Platí pouze pro čistou 
látku rozd ělenou mezi dv ě čistá rozpoušt ědla. Je-li sou časně v jedné 
nebo obou fázích p řítomno více rozpušt ěných látek, m ůže tím být 
výsledek ovlivn ěn. 
Disociace nebo asociace rozpušt ěných molekul vede k odchylkám od 
Nernstova rozd ělovacího zákona. Tyto odchylky se projevují tím, že 
se rozdělovací koeficient stává závislým na koncentraci roztoku.  
V důsledku existujících mnohonásobných rozd ělovacích rovnovah by 
tato metoda nem ěla být použita bez korekcí na disociovatelné slou ­ 
čeniny. Pro tyto slou čeniny by m ělo být zváženo použití pufra čních 
roztoků namísto vody; pH pufra čního roztoku by se m ělo lišit od 
pK a látky nejmén ě o 1, přičemž se zohlední význam tohoto pH 
s ohledem na životní prost ředí. 
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Předběžný odhad rozd ělovacího koeficientu  
Hodnotu rozd ělovacího koeficientu lze nejlépe odhadnout na základ ě 
výpočtu (viz dopln ěk 1) nebo pop řípadě z poměru rozpustností zkou ­ 
šené látky v čistých rozpoušt ědlech (10).  
1.6.2  Metoda t řepací lahve  
1.6.2.1  Příprava  
n-oktanol: stanovení rozd ělovacího koeficientu by m ělo být 
provedeno s n-oktanolem čistoty p.a.  
Voda: měla by být použita destilovaná voda nebo redestilovaná voda 
ve skleněné nebo k řemenné aparatu ře. V případě potřeby by m ěly 
být u disociovatelných látek použity místo vody pufra ční roztoky.  
Poznámka:  
Neměla by být použita voda pocházející p římo z měniče iontů. 
1.6.2.1.1 P ř e d b ě ž n é n a s y c e n í r o z p o u š t ě d e l 
Před stanovením rozd ělovacího koeficientu se fáze rozpoušt ědlového 
systému vzájemn ě nasytí t řepáním p ři teplotě experimentu. 
K dosažení tohoto cíle je vhodné 24 hodin t řepat na mechanické 
třepačce ve dvou velkých zásobních lahvích vysoce čistý n-oktanol 
nebo vysoce čistou vodu, obojí s dostate čným množstvím druhého 
rozpouštědla, a poté nechat rozpoušt ědla stát tak dlouho, dokud se 
obě fáze neodd ělí a dokud není dosaženo nasycení.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2 P ř í p r a v a z k o u š k y  
Celkový objem dvoufázového systému by m ěl téměř naplňovat 
zkušební nádobu. Tím se zamezí ztrátám látek v d ůsledku odpa řo­
vání. Pom ěry objemů a množství látek, které mají být použity, jsou 
dány:  
— předběžným odhadem rozd ělovacího koeficientu (viz výše),  
— minimálním množstvím zkoušené látky nezbytným pro postup 
analýzy a  
— omezením maximální koncentrace v každé fázi na 0,01 mol/l.  
Provedou se t ři zkoušky. P ři první se použije vypo čtený pom ěr 
objemů n-oktanolu a vody; p ři druhé se tento pom ěr dělí dvěma 
a při třetí se tento pom ěr násobí dv ěma (např. 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3 Z k o u š e n á l á t k a  
Připraví se zásobní roztok v n-oktanolu p ředem nasyceném vodou. 
Koncentrace tohoto zásobního roztoku by m ěla být před jeho použ ­
itím ke stanovení rozd ělovacího koeficientu p řesně stanovena. Tento 
roztok by m ěl být uchováván za podmínek, které zajistí jeho stálost.  
1.6.2.2  Zkušební podmínky  
Zkušební teplota by m ěla být konstantní (±1  o C) a měla by ležet 
v rozmezí 20–25  o C. 
1.6.2.3  Postup m ěření 
1.6.2.3.1 U s t a v e n í r o v n o v á h y r o z d ě l e n í  
Pro každou ze zkušebních podmínek by m ěly být připraveny dv ě 
zkušební nádoby obsahující pot řebná přesně odměřená množství 
obou rozpoušt ědel spolu s nezbytným množstvím zásobního roztoku.  
Fáze n-oktanolu je nutné odm ěřit objemov ě. Zkušební nádoby by 
měly být umíst ěny do vhodné t řepačky, nebo by m ěly být třepány 
ručně. Při použití centrifuga ční kyvety spo čívá doporu čený postup 
v tom, že se kyveta rychle otá čí kolem své p říčné osy o 180  o , takže 
případný zachycený vzduch stoupá vzh ůru oběma fázemi. Ze zkuše ­
nosti vyplývá, že k ustavení rovnovážného rozd ělení obvykle sta čí 
50 takových oto čení. Pro jistotu se doporu čuje 100 oto čení během 
pěti minut.  
1.6.2.3.2 O d d ě l e n í f á z í  
V případě potřeby lze odd ělení fází provést odst ředěním směsi. 
Odstředění by mělo být provedeno laboratorní odst ředivkou udržo ­
vanou při laboratorní teplot ě, nebo, je-li použita odst ředivka bez 
regulace teploty, by m ěly být centrifuga ční kyvety za ú čelem usta ­
vení rovnováhy udržovány alespo ň jednu hodinu p řed analýzou p ři 
zkušební teplot ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4  Analýza  
Za účelem stanovení rozd ělovacího koeficientu je nutné stanovit 
koncentrace zkoušené látky v obou fázích. To lze provést odebráním alikvotního podílu každé z obou fází z každé kyvety a pro každou 
zkušební podmínku a jejich analýzou zvoleným postupem. Celkové 
množství látky p řítomné v obou fázích by m ělo být vypo čteno 
a porovnáno s p ůvodně dodaným množstvím látky.
 
Odběr vzorku z vodné fáze je nutné provést postupem minimalizu ­
jícím riziko zne čištění stopami n-oktanolu: k odb ěru vzorků vodné 
fáze lze použít sklen ěnou injek ční stříkačku s vym ěnitelnou jehlou. 
Stříkačka se nejprve částečně naplní vzduchem. Vzduch se p ři 
průchodu jehly vrstvou n-oktanolu opatrn ě vypudí. Do st říkačky se 
natáhne dostate čný objem vodné fáze. Obsah st říkačky lze poté 
použít jako vzorek vodné fáze. St říkačka se z roztoku rychle vytáhne 
a jehla se sejme. Koncentrace v obou od sebe odd ělených fázích by 
měla být stanovena nejlépe metodou, která je specifická pro danou 
látku. Příklady možných vhodných analytických metod jsou:  
— fotometrické metody,  
— plynová chromatografie,  
— vysokoú činná kapalinová chromatografie.  
1.6.3  Metoda HPLC  
1.6.3.1  Příprava  
Aparatura  
Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený 
bezpulzním čerpadlem a vhodným detek čním zařízením. Doporu čuje 
se používat nást řikový ventil se vst řikovacími smy čkami. Přítomnost 
polárních skupin ve stacionární fázi m ůže závažn ě zhoršit ú činnost 
kolony HPLC. Stacionární fáze by proto m ěla mít minimální podíl 
polárních skupin (11). Lze použít komer ční mikročásticové nápln ě 
s reversními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi nást řikem 
a analytickou kolonou m ůže být umíst ěna ochranná p ředkolona.  
Mobilní fáze  
K přípravě elučního rozpoušt ědla se použije methanol čistoty pro 
HPLC a voda čistoty pro HPLC, které se p řed použitím odplyní. 
Měla by být provedena isokratická eluce. Doporu čuje se použít 
směsi methanol-voda s minimálním obsahem vody 25 %. Obvykle 
vyhovuje pro eluci slou čenin o log P = 6 b ěhem jedné hodiny p ři 
průtokové rychlosti 1 ml/min sm ěs methanol-voda 3:1 (obj.). 
U sloučenin s vysokou hodnotou log P m ůže být nutné zkrátit elu ční 
dobu (stejn ě tak u referen čních látek) snížením polarity mobilní fáze 
nebo délky kolony.  
Látky s velmi nízkou rozpustností v n-oktanolu mají tendenci p ři 
použití metody HPLC vykazovat abnormáln ě nízké hodnoty P  ow ; 
píky těchto slou čenin někdy doprovázejí čelo rozpoušt ědla. Je to 
pravděpodobně způsobeno tím, že proces rozd ělení je příliš pomalý, 
než aby bylo dosaženo rovnováhy za dobu, po kterou obvykle trvá dělení metodou HPLC. Pro dosažení spolehlivé hodnoty m ůže být 
v takovém p řípadě účinné snížení pr ůtokové rychlosti nebo snížení 
poměru methanol-voda.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Zkoušená i referen ční látka by m ěly být rozpustné v mobilní fázi 
v dostatečných koncentracích umož ňujících jejich detekci. Pouze ve 
výjimečných případech mohou být u sm ěsi methanol-voda použita 
aditiva, nebo ť aditiva m ění vlastnosti kolony. V p řípadě chromato ­
gramů získaných p ři použití aditiv, musí být použita samostatná 
kolona téhož typu. Nevyhovuje-li sm ěs methanol-voda, lze použít 
směsi jiných organických rozpoušt ědel s vodou, nap ř. ethanol-voda 
nebo acetonitril-voda.  
Pro disociovatelné látky je kritické pH eluentu. M ělo by ležet 
v pracovní oblasti pH kolony, která je obvykle 2 až 8. Doporu čuje 
se použití pufra čních roztok ů. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke 
srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u n ěkterých sm ěsí 
organické fáze s pufra čním roztokem. M ěření pomocí HPLC se 
stacionárními fázemi na bázi oxidu k řemičitého při pH vyšším než 
8 se nedoporu čuje, nebo ť použití alkalické mobilní fáze m ůže 
způsobit rychlé narušení činnosti kolony.  
Rozpouštěné látky  
Referenční sloučeniny by m ěly mít nejvyšší dostupnou čistotu. Slou ­ 
čeniny, které se mají používat pro zkoušení nebo kalibraci, se pokud 
možno rozpustí v mobilní fázi.  
Zkušební podmínky  
Teplota by b ěhem měření neměla kolísat o více než ± 2 K.  
1.6.3.2  Měření 
Výpočet mrtvé doby t  o 
Mrtvou dobu  t o je možné stanovit bu ď pomocí homologické řady 
(např. nalkylmethylketon ů) nebo nezadržovaných organických slou ­ 
čenin (nap ř. thiomočoviny nebo formamidu). Pro výpo čet mrtvé 
doby  t o s použitím homologické řady se nast říkne sada alespo ň 
sedmi členů homologické řady a stanoví se p říslušné reten ční časy. 
Neupravené reten ční časy t  r (n c + 1) se vynesou jako funkce t  r (n c ) 
a stanoví se absolutní člen a a sm ěrnice b regresní rovnice:  
t rðn c þ lÞ = a + bt  rðn c Þ 
(n c = počet atomů uhlíku). Mrtvá doba t  o je dána vztahem:  
t o = a/(1 – b)  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Kalibrační křivka 
Následujícím krokem je sestrojení korela ční závislosti hodnot log 
k na log P pro p říslušné referen ční sloučeniny. V praxi se sou časně 
nastříkne soubor 5 až 10 standardních referen čních sloučenin, jejichž 
log P leží v o čekávané oblasti, a stanoví se reten ční časy, nejlépe 
zapisovacím integrátorem napojeným na detek ční systém. Vypo čtou 
se příslušné logaritmy kapacitních faktor ů, log k, a vynesou se jako 
funkce hodnot log P stanovených metodou t řepací lahve. Kalibrace 
se provádí v pravidelných intervalech nejmén ě jednou denn ě, aby 
bylo možné zohlednit p řípadné zm ěny činnosti kolony.  
Stanovení kapacitního faktoru zkoušen ě látky  
Zkoušená látka se nast říkne v co nejmenším množství mobilní fáze. 
Stanoví se reten ční čas (dvakrát), umož ňující výpo čet kapacitního 
faktoru k. Z korela ční křivky referen čních slou čenin je možné inter ­
polací získat rozd ělovací koeficient zkoušené látky. U velmi nízkých 
a velmi vysokých rozd ělovacích koeficient ů je nutná extrapolace. 
V těchto případech je nutno v ěnovat zvláštní pozornost interval ům 
spolehlivosti regresní k řivky.  
2. DATA  
Metoda třepací lahve  
Spolehlivost stanovených hodnot P je možné prov ěřit srovnáním st řed­
ních hodnot z opakovaných stanovení s celkovou st řední hodnotou.  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty)  
— nejsou-li metody použitelné (nap ř. u povrchov ě aktivní látky), 
měla by být uvedena vypo čtená hodnota nebo odhad založený 
na individuálních rozpustnostech látky v n-oktanolu a ve vod ě, 
— všechny informace a poznámky, které mají význam pro interpre ­
taci výsledk ů, zvláště s ohledem na ne čistoty a fyzikální stav 
látky.  
Pro metodu t řepací lahve:  
— výsledek p ředběžného odhadu, pokud existuje,  
— teplotu stanovení,  
— údaje o analytických postupech použitých ke stanovení koncen ­
trací,  
— dobu a rychlost odst řeďování, pokud se použilo,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— koncentrace nam ěřené při každém stanovení v obou fázích 
(tzn. uvede se celkem 12 koncentrací),  
— hmotnost zkoušené látky, objem každé fáze použité v každé 
zkušební nádob ě a vypočtené celkové množství zkoušené látky, 
obsažené v jednotlivých fázích po dosažení rovnováhy,  
— vypočtené hodnoty rozd ělovacího koeficientu (P) a st řední 
hodnotu je nutné uvést pro každý soubor zkušebních podmínek, 
stejně tak střední hodnotu ze všech stanovení. Pokud existují 
náznaky závislosti rozd ělovacího koeficientu na koncentraci, 
mělo by to být uvedeno ve zpráv ě, 
— měla by být uvedena sm ěrodatná odchylka jednotlivých hodnot 
P od střední hodnoty,  
— měl by být také uveden dekadický logaritmus st řední hodnoty 
P ze všech stanovení,  
— vypočtená teoretická hodnota P  ow byla-li stanovena nebo je-li 
naměřená hodnota > 10  4 , 
— pH použité vody a vodné fáze b ěhem experimentu,  
— pokud byly použity pufry, zd ůvodnění jejich použití místo vody, 
jejich složení, koncentrace a pH, pH vodné fáze p řed a po expe ­
rimentu.  
Pro metodu HPLC:  
— výsledek p ředběžného odhadu, pokud existuje,  
— zkoušená látka a referen ční látky, jejich čistota,  
— teplotní rozmezí p ři stanoveních,  
— pH, p ři kterém se provád ěla stanovení,  
— podrobnosti o analytické a ochranné kolon ě, o mobilní fázi a o 
způsobu detekce  
— retenční data a hodnoty log P z literatury pro referen ční slouče­
niny použité ke kalibraci,  
— podrobnosti o proložené regresní p římce (log k versus log P),  
— průměrná reten ční data a interpolovaná hodnota log P pro 
zkušební slou čeninu,  
— popis za řízení a pracovních podmínek,  
— eluční křivky,  
— množství zkoušené látky a referen čních látek zavedených do 
kolony,  
— mrtvý čas a způsob jeho m ěření. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, rozhodnutí Rady 
C(81) 30 v kone čném znění. 
2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.
 
3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) -Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemo ­
sphere, 1980, vol. 80, 683.  
5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 219 (1981).  
6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  
8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat, 1984, vol. 7, 
675. 
9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787.  
10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratori ­
umpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, 223–339.  
11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial 
use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.
 
15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
1459.  
16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
525. 
17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  
18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, 1113.  
19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual, 1981, vol. 10, 
382. 
20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und 
biologische Aktivität von WirkstofFen, Verlag Chemie, Wein ­
heim, New York 1979.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984,  
22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel 1978.  
23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Doplněk 1 
Metody výpo čtu nebo odhadu  
ÚVOD  
Obecný úvod do výpo čtových metod, data a p říklady jsou uvedeny v p říručce 
Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a).  
Vypočtené hodnoty P  o/v lze použít:  
— k rozhodnutí, která z experimentálních metod je vhodná (rozsah u t řepací 
lahve: log P  o/v : –2 až 4, rozsah u HPLC: log P  o/v : 0 až 6),  
— k volb ě vhodných zkušebních podmínek (nap ř. referenčních látek pro postupy 
HPLC, pom ěr objemů n-oktanol/voda pro metodu t řepací lahve),  
— jako vnit řní laboratorní kontrolu možných experimentálních chyb,  
— k získání odhadu P  o/v případech, kdy zkušební metody nelze z technických 
důvodů použít.  
METODA ODHADU  
Předběžný odhad rozd ělovacího koeficientu  
Hodnotu rozd ělovacího koeficientu je možné odhadnout s použitím rozpustnosti 
zkoušené látky v čistých rozpoušt ědlech:  
P odhad ¼ nasycení  oktanÄlÄol 
nasycení  voda 
VÝPOČTOVÉ METODY  
Podstata výpo čtových metod  
Všechny výpo čtové metody jsou založeny na formálním d ělení molekul do vhod ­
ných podstruktur, pro n ěž jsou známy spolehlivé hodnoty p řírůstků log P  o/­
v .Hodnota log P  o/v celé molekuly se poté vypo čte jako sou čet hodnot pro 
příslušné fragmenty plus sou čet korekčních členů pro intramolekulární interakce.  
Existují seznamy konstant fragment ů a korekčních členů (b, c, d, e). N ěkteré se 
pravideln ě aktualizují (b).  
Kritéria jakosti  
Spolehlivost výpo čtové metody obecn ě klesá s rostoucí složitostí zkoumané 
sloučeniny. V p řípadě jednoduchých molekul s nízkou molekulovou hmotností 
a jednou nebo dv ěma funkčními skupinami lze o čekávat, že odchylky hodnot log 
P o/v získaných r ůznými fragmenta čními metodami od nam ěřené hodnoty budou 
v rozmezí od 0,1 do 0,3. U složit ějších molekul m ůže být rozp ětí chyby v ětší. 
Závisí to na spolehlivosti a dostupnosti konstant pro fragmenty a rovn ěž na 
schopnosti zjistit intramolekulární interakce (nap ř. vodíkové vazby) a na 
správném používání korek čních členů (což není obtížné p ři použití po čítačového 
programu CLOGP-3) (b). V p řípadě disociujících látek je d ůležité správn ě 
zohlednit náboj nebo stupe ň disociace.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Postupy výpo čtu 
Hanschova π-metoda  
Původní konstanta hydrofobnosti substituentu  n, zavedená Fujitou et al. (f) je 
definována jako  
π x = log P  o/v (PhX) - log P  o/v (PhH)  
kde P  o/v (PhX) je rozd ělovací koeficient aromatického derivátu a P  o/v (PhH) 
rozdělovací koeficient výchozí slou čeniny  
(např. π Cl = log P  o/v (C 6 H 5 Cl) - log P  o/v (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71).  
rozdělovací koeficient výchozí slou čeniny Ze své definice je π-metoda použitelná 
především u aromatických substituent ů. Hodnoty  π byly pro velký po čet substi­
tuentů uspořádány do tabulek (b, c, d). Používají se k výpo čtu log P  o/v aroma­
tických molekul nebo substruktur.  
Rekkerova metoda  
Podle Rekkera (g) se hodnota log P  o/v vypočte takto:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j ðinterakčni členÞ 
kde f  i představuje konstanty r ůzných molekulárních fragment ů a a  i četnost 
jejich výskytu ve vyšet řované molekule. Korek ční členy je možné vyjád řit 
jako souhrnný násobek jediné konstanty C  m (tzv. „magické konstanty“). 
Konstanty pro molekulární fragmenty f  i a C  m byly stanoveny ze seznamu 
1 054 experimentálních hodnot P  o/v (pro 825 slou čenin) pomocí vícenásobné 
regresní analýzy (c, h). Interak ční členy se ur čí podle stanovených pravidel 
popsaných v literatu ře (e, h, i).  
Hanschova-Leova metoda  
Podle Hansche a Lea (c) se hodnota log P  o/v vypočte z výrazu:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
kde f  i představuje konstanty r ůzných molekulárních fragment ů, F j korekční členy 
a i , b j odpovídající četnosti výskyt ů. Na základ ě experimentálních hodnot P  o/v byl 
pokusně sestaven seznam hodnot pro atomové a skupinové fragmenty a seznam 
korekčních členů F j (tzv. „faktor ů“). Korek ční členy byly set říděny do několika 
různých tříd (a, c). Zohledn ění všech pravidel a korek čních členů je poměrně 
složité a časově náročné. Byly vyvinuty sady softwaru (b).  
Kombinovaná metoda  
Výpočet log P  o/v složitých molekul lze zna čně zdokonalit, jestliže se molekula 
rozdělí do větších podstruktur, pro n ěž existují spolehlivé hodnoty pocházející 
buď z tabulek (b, c), nebo z vlastních m ěření. Tyto fragmenty (nap ř. heterocykly, 
antrachinon, azobenzen) lze poté kombinovat s Hanschovými π-hodnotami nebo 
s Rekkerovými nebo Leovými konstantami pro fragmenty.  
Poznámky  
i) Výpočetní metody lze použít pro částečně nebo úpln ě disociované slou čeniny 
pouze tehdy, lze-li vzít v úvahu nezbytné korek ční faktory.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Pokud lze p ředpokládat p řítomnost intramolekulárních vodíkových vazeb, je 
nutné přičíst odpovídající korek ční členy (přibližně 0,6 až 1,0 logaritmu 
hodnot P  o/v ) (a). O p řítomnosti t ěchto vazeb lze usuzovat z prostorových 
modelů nebo ze spektroskopických dat molekuly.  
iii) Může-li existovat n ěkolik tautomerních forem, m ěla by být jako základ pro 
výpočet použita nejpravd ěpodobnější forma.  
iv) Pečlivě by měly být sledovány p řepracované seznamy konstant fragment ů. 
Protokol o zkoušce  
Při použití výpo čtové metody nebo metody odhadu by m ěl protokol o zkoušce 
pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— popis látky (sm ěs, nečistoty atd.),  
— známky p řítomnosti intramolekulárních vodíkových vazeb, disociace, náboj ů 
a dalších neobvyklých efekt ů (např. tautomerie),  
— popis výpo čtové metody,  
— označení nebo uvedení databáze,  
— zvláštnosti p ři volbě fragment ů, 
— vyčerpávající dokumentaci výpo čtů. 
LITERATURA  
a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14, 
479. 
f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175.  
g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977,vol 1.  
h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Doplněk 2 
Doporučené referen ční látky pro metodu HPLC  
Číslo referen ční látka log P  ow pKa 
1 butan2on 0,3 
2 4acetylpyridin 0,5 3 anilin 0,9 4 acetanilid 1,0 
5 benzylalkohol 1,1 
6 4-methoxyfenol 1,3 pKa = 10,26 7 kyselina fenoxyoctová 1,4 pKa = 3,12 8 fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 benzonitril 1,6 11 fenylacetonitril 1,6 12 4methylbenzylalkohol 1,6 13 acetofenon 1,7 14 2nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 kyselina 3nitrobenzoová 1,8 pKa = 3,47 
16 4chloranilin 1,8 pKa = 4,15 
17 nitroben 1,9 18 3fenylpropan2ol 1,9 19 kyselina benzoová 1,9 pKa = 4,19 20 pkresol 1,9 pKa = 10,17 21 kyselina sko řicová 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 
22 anisol 2,1 23 methylbenzoát 2,1 24 benzen 2,1 25 kyselina 3mehylbenzoová 2,4 pKa = 4,27 26 4chlorfenol 2,4 pKa = 9,1 27 trichlorethylen 2,4 
28 atrazin 2,6 
29 ethylbenzoát 2,6 30 2,6dichlorbenzonitril 2,6 31 kyselina 3chlorbenzoová 2,7 pKa = 3,82 32 toluen 2,7 33 naftalenlol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3dichloranilin 2,8 35 chlorbenzen 2,8 36 allyfenylether 2,9 37 brombenzen 3,0
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Číslo referen ční látka log P  ow pKa 
38 ethylbenzen 3,2 
39 benzofenon 3,2 
40 4fenylfenol 3,2 pKa = 9,54 
41 thymol 3,3 
42 l,4dichlorbenzen 3,4 43 difenylamin 3,4 pKa = 0,79 44 naftalen 3,6 45 fenylbenzoát 3,6 46 isopropylbenzen 3,7 47 2,4,6trichlorfenol 3,7 pKa = 6 48 bifenyl 4,0 49 benzylbenzoát 4,0 50 2,4dinitro6selebutylfenol 4,1 
51 l,2,4trichlorbenzen 4,2 
52 kyselina dodekanová 4,2 53 difenylether 4,2 54 nbutylbenzcn 4,5 55 fenanthren 4,5 56 fluoranthen 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6difenylpyrídin 4,9 59 trifenylamin 5,7 60 DDT 6,2 
Jiné referen ční látkys nízkou hodnotou log P
 ow 
1 kyselina nikotinová - 0,7  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9 BOD VZPLANUTÍ  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici p ředběžné 
informace o ho řlavosti látky. Zkušební postup je použitelný pro 
kapaliny, jejichž páry lze zapálit zdroji zapálení. Zkušební metody uvedené v tomto textu jsou spolehlivé pouze v rozsahu bodu vzpla ­
nutí, který je specifikován v jednotlivých metodách.
 
Při výběru metody, která má být použita, by m ělo být zváženo, zda 
nemůže dojít k chemických reakcím mezi látkou a zkušebním kelím ­
kem.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Bod vzplanutí je nejnižší teplota p řepočtená k tlaku 101,325 kPa, p ři 
které kapalina uvol ňuje za podmínek definovaných ve zkušební 
metodě páry v takovém množství, že se z nich ve zkušební nádobce 
vytvoří hořlavá směs se vzduchem.  
Jednotky teploty:  o C 
t = T – 273,15  
(t je ve  o Ca T je v K)  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referen ční látky. 
Měly by v první řadě sloužit k ob časné kontrole provedení metody 
a ke vzájemnému porovnávání výsledk ů získaných jinými metodami.  
1.4 PODSTATA METODY  
Látka se vpraví do zkušební nádobky, ve které je zah řívána nebo 
chlazena na zkušební teplotu podle postupu popsaného v dané zkušební metod ě. Zkoušky vzplanutí se provád ějí za účelem zjišt ění, 
zda vzorek vzplane či nevzplane p ři zkušební teplot ě.
 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
1.5.1  Opakovatelnost  
Opakovatelnost se m ění v závislosti na rozp ětí bodu vzplanutí 
a použité zkušební metod ě; maximální tolerance je 2  o C. 
1.5.2  Citlivost  
Citlivost závisí na použité zkušební metod ě. 
1.5.3  Specifi čnost 
Specifičnost některých metod je omezena na ur čitý rozsah bodu 
vzplanutí a závisí na vlastnostech látky (nap ř. na vysoké viskozit ě). ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Příprava  
Vzorek zkoušené látky se vloží do zkušebního za řízení podle bod ů 
1.6.3.1 a/nebo 1.6.3.2.  
Kvůli bezpečnosti se doporu čuje, aby byla v p řípadě toxických látek 
nebo látek s vysokým energetickým potenciálem použita metoda, p ři 
níž se pracuje s malým množství vzorku, p řibližně 2 cm.  
1.6.2  Zkušební podmínky  
Je-li to v souladu s podmínkami bezpe čnosti, umístí se zkušební 
zařízení na místo, kde nedochází k nadm ěrnému proud ění vzduchu.  
1.6.3  Provedení zkoušky  
1.6.3.1  Rovnovážná metoda  
Viz ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2  Nerovnovážná metoda  
Zkušební za řízení podle Abela:  
Viz BS 2000 – část 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Zkušební za řízení podle Abela-Penskyho:  
Viz EN 57, DIN 51755 – část 1 (pro teploty od 5 do 65  o C), DIN 
51755 – část 2 (pro teploty pod 5  o C), NF M07-036.  
Zkušební za řízení TAG:  
Viz ASTM D 56.  
Zkušební za řízení podle Penskyho-Martense:  
Viz ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 a NF 
M 07-019.  
Poznámky:  
Pokud se hodnota bodu vzplanutí stanovená nerovnovážnou metodou 
podle bodu 1.6.3.2 nachází v rozmezí 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C nebo 55 ± 
2 o C, měla by být potvrzena rovnovážnou metodou pomocí stejného 
zkušebního za řízení.  
Pro oznámení mohou být použity pouze ty metody, kterými lze bod 
vzplanutí stanovit.  
Ke stanovení bodu vzplanutí viskózních kapalin obsahujících 
rozpouštědla (barvy, lepidla apod.) mohou být použity pouze 
zkušební za řízení a zkušební metody vhodné pro stanovení bodu 
vzplanutí viskózních kapalin.  
Viz ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 a DIN 53213 – část 1.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. DATA  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty),  
— odkaz na použitou metodu a na všechny p řípadné odchylky,  
— výsledky a všechny další poznámky, které mají význam pro 
interpretaci výsledk ů. 
4. LITERATURA  
Není uvedena.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10  HOŘLAVOST (PEVNÉ LÁTKY)  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici p ředběžné 
informace o možných výbušných vlastnostech látky.  
Tato zkouška by m ěla být použita pouze pro práškové, zrnité nebo 
pastovité látky.  
Aby se mezi vysoce ho řlavé látky nezahrnovaly všechny látky, které 
lze zapálit, nýbrž pouze ty, které ho ří rychle nebo jejichž chování je 
při hoření nějakým zp ůsobem zvlášt ě nebezpe čné, jsou za vysoce 
hořlavé považovány jen ty látky, u nichž rychlost ho ření překročí 
určitou mezní hodnotu.  
Zvláště nebezpečné může být ho ření doutnáním, ší ří-li se kovovým 
prachem, a to pro jeho obtížné hašení. Kovové prachy se považují za vysoce ho řlavé, pokud podporují ší ření doutnáním celou hmotou za 
specifikovanou dobu.
 
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Doba hoření se vyjad řuje v sekundách.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Nejsou specifikovány.  
1.4 PODSTATA METODY  
Látka se zformuje do tvaru neporušeného pásku nebo prachové 
housenky o délce p řibližně 250 mm a provede se p ředběžná scre­
eningová zkouška s cílem stanovit, zda nastane po zapálení plamenem plynového ho řáku šíření plamenem nebo doutnáním. 
Pokud se ho ření za předepsanou dobu rozší ří na více než 200 mm 
délky prachové housenky, provede se úplná zkouška pro stanovení 
rychlosti ho ření.
 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Předběžná screeningová zkouška  
Látka se na neho řlavé, neporézní a málo tepeln ě vodivé podkladové 
desce zformuje do tvaru neporušeného pásku nebo prachové 
housenky o délce p řibližně 250 mm, ší řce 20 mm a výšce 10 mm. 
Na jeden konec prachové housenky se p ůsobí plamenem plynového 
hořáku (o minimálním pr ůměru 5 mm), dokud se prach nevznítí, 
nebo maximáln ě 2 minuty (5 minut u prach ů kovů nebo kovových 
slitin). Zjiš ťuje se, zda se ho ření rozšíří na 200 mm délky prachové 
housenky v pr ůběhu zkušební doby 4 minuty (nebo 40 minut 
u kovových prach ů). Jestliže se látka nevznítí a ho ření se buď plame­
nem, nebo doutnáním nerozší ří na 200 mm délky prachové housenky 
do zkušební doby 4 minuty (nebo 40 minut u kovových prach ů), 
nepovažuje se látka za vysoce ho řlavou a další zkouška se nepoža ­
duje. Jestliže se látka zapálí a ho ření se rozší ří plamenem na 200 mm 
délky prachové housenky za zkušební dobu mén ě než 4 minuty 
(nebo 40 minut u kovových prach ů), provede se postup uvedený 
níže (bod 1.6.2 dále).  
1.6.2  Zkouška rychlosti ho ření 
1.6.2.1  Příprava  
Práškovité nebo zrnité látky se voln ě nasypou do formy 
s trojúhelníkovým p říčným průřezem o délce 250 mm o vnit řní 
výšce 10 mm a ší řce 20 mm. Na ob ě podélné strany formy se upevní 
2 kovové desky se základnou jako bo čnice, které p řečnívají o 2 mm 
nad horní okraj trojúhelníkové formy (obrázek). Forma se poté t řikrát 
spustí z výšky 2 cm na pevný povrch. Podle pot řeby se forma 
doplní. Bo čnice se sejmou a p řebytek látky se seškrábne. Na horní 
část formy se položí neho řlavá, neporézní a málo tepeln ě vodivá 
deska, sestava se p řevrátí a forma se odstraní.  
Pastovité látky se rozet řou na neho řlavou, neporézní a málo tepeln ě 
vodivou desku do tvaru provazce o délce 250 mm a p říčném průřezu 
přibližně 1 cm.  
1.6.2.2  Zkušební podmínky  
V případě látky, která je citlivá na vlhkost, se zkouška provede co 
nejrychleji po vyjmutí látky z nádoby.  
1.6.2.3  Provedení zkoušky  
Zformovaný vzorek se umístí v digesto ři kolmo na sm ěr odtahu.  
Rychlost proud ění odsávaného vzduchu by m ěla stačit k zamezení 
úniku dýmu do laborato ře a neměla by se v pr ůběhu zkoušky m ěnit. 
Kolem zkušebního za řízení se postaví ochranné clony proti nadm ěr­
nému proud ění vzduchu.  
K zapálení zformovaného zkoušeného vzorku na jeho jednom konci 
se použije plamen plynového ho řáku o průměru minimáln ě 5 mm. 
Po vyhoření 80 mm délky zformovaného zkoušeného vzorku se m ěří 
rychlost ho ření na dalších 100 mm.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Zkouška se provede šestkrát, vždy s pomocí čisté a vychladlé desky, 
pokud není pozorován pozitivní výsledek d říve. 
2. DATA  
Pro vyhodnocení jsou d ůležité doba ho ření z předběžné screeningové 
zkoušky (1.6.1) a nejkratší doba ho ření ze šesti zkoušek (1.6.2.3).  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty),  
— popis zkoušené látky, její fyzikální stav, v četně obsahu vlhkosti,  
— výsledky p ředběžné screeningové zkoušky a zkoušky rychlosti 
hoření, je-li provedena,  
— všechny další poznámky, které mají význam pro interpretaci 
výsledků. 
3.2 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Práškovité, zrnité nebo pastovité látky se považují za vysoce ho řlavé, 
je-li doba ho ření v každé zkoušce provedené podle zkušebního 
postupu popsaného v bod ě 1.6.2 menší než 45 sekund. Prach kov ů 
nebo kovových slitin se považuje za vysoce ho řlavý, pokud jej lze 
zapálit a plamen nebo reak ční zóna se rozší ří po celém zkoušeném 
vzorku za 10 minut nebo za kratší dobu.  
4. LITERATURA  
NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Doplněk 
Obrázek  
Forma a p říslušenství pro p řípravu zkoušeného vzorku  
(Všechny rozm ěry jsou v milimetrech)
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11  HOŘLAVOST PLYN Ů 
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Tato metoda umož ňuje stanovit, zda jsou plyny ve sm ěsi se vzdu ­
chem při laboratorní teplot ě (přibližně 20 o C) a atmosférickém tlaku 
hořlavé, a jsou-li ho řlavé, v jakém rozmezí koncentrací. Sm ěsi se 
vzduchem, u nichž se postupn ě zvyšuje koncentrace zkušebního 
plynu, jsou zapalovány elektrickou jiskrou a sleduje se, zda dojde 
k zapálení.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Oblast ho řlavosti je rozp ětí koncentrace mezi dolní a horní mezí 
výbušnosti. Dolní a horní meze výbušnosti jsou takové mezní 
koncentrace ho řlavého plynu ve sm ěsi se vzduchem, za nimiž 
nedojde k ší ření plamene.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Nejsou specifikovány.  
1.4 PODSTATA METODY  
Koncentrace plynu ve vzduchu je postupn ě zvyšována a v každém 
stupni se sm ěs zapaluje elektrickou jiskrou.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6. POPIS METODY  
1.6.1  Aparatura  
Zkušební nádobu tvo ří svislý sklen ěný válec s vnit řním průměrem 
nejméně 50 mm a výškou nejmén ě 300 mm. Zapalovací elektrody 
jsou od sebe vzdáleny 3 až 5 mm a jsou umíst ěny ve výšce 60 mm 
nad dnem válce. Válec je opat řen přetlakovou bezpe čnostní pojist ­
kou. Aparatura musí být opat řena krytem, aby se zamezilo jakému ­
koli poškození výbuchem.  
Jako zdroj zapálení se používá statický induk ční výboj trvající 0,5 
sekundy generovaný vysokonap ěťovým transformátorem 
o výstupním nap ětí od 10 kV do 15 kV (maximální p říkon je 300 
W). Příklad vhodné aparatury je popsán v literatu ře (2).  
1.6.2  Zkušební podmínky  
Zkouška musí být provedena p ři laboratorní teplot ě (přibližně 20 o C). ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3  Provedení zkoušky  
Pomocí dávkovacích čerpadel se do sklen ěného válce vhání sm ěs 
plynu se vzduchem o známé koncentraci. Vyvolá se jiskra a sleduje se, zda se plamen odd ělí od zdroje zapálení a zda se 
samovoln ě šíří. Koncentrace plynu se postupn ě zvyšuje o 1 %, 
dokud nedojde k výše popsanému zapálení.
 
Jestliže z chemické struktury plynu vyplývá, že by mohl být neho ř­
lavý, a lze-li vypo čítat stechiometrické složení sm ěsi se vzduchem, 
postačuje zkoušet sm ěsi pouze v rozmezí od koncentrace o 10 % 
nižší, než je stechiometrické složení, do koncentrace o 10 % vyšší, než je stechiometrické složení, a to postupn ě po 1 %.
 
2. DATA  
Výskyt ší ření plamene je jediná relevantní informace pro stanovení 
této vlastnosti.  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty),  
— popis použité aparatury s rozm ěry, 
— teplota, p ři které byla zkouška provedena,  
— zkušební koncentrace a získané výsledky,  
— výsledek zkoušky: neho řlavý plyn nebo vysoce ho řlavý plyn,  
— jestliže byl u činěn závěr, že je plyn neho řlavý, uvede se koncen ­
trační rozpětí, které bylo zkoušeno v krocích po 1 %,  
— musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou 
důležité pro interpretaci výsledk ů. 
4. LITERATURA  
1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse- einer Standard- 
Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vol. 56, 2, 126–127. Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. 'Entwicklung.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12  HOŘLAVOST (P ŘI STYKU S VODOU)  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Tuto zkušební metodu lze použít pro zjišt ění, zda reakce látky 
s vodou nebo vzdušnou vlhkostí vede k vývinu nebezpe čného množ ­
ství plynu nebo plyn ů, které mohou být vysoce ho řlavé.  
Tuto zkušební metodu lze použít pro pevné látky a pro kapaliny. 
Nelze ji použít pro látky, které se spontánn ě vznítí ve styku se 
vzduchem.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Vysoce ho řlavé látky: látky, které p ři kontaktu s vodou nebo 
vzdušnou vlhkostí uvol ňují vysoce ho řlavé plyny v nebezpe čném 
množství rychlostí nejmén ě 1 litr na kg látky za hodinu.  
1.3 PODSTATA METODY  
Látka je zkoušena postupn ě, jak je uvedeno níže; dojde-li v n ěkterém 
stupni ke vznícení, není další zkoušení pot řebné. Je-li známo, že 
látka s vodou nereaguje prudce, pokra čuje se čtvrtým stupn ěm 
(bod 1.3.4).  
1.3.1  Stupe ň 1 
Zkoušená látka se vnese do vani čky s destilovanou vodou o teplot ě 
20 o C a sleduje se, zda se uvol ňovaný plyn vznítí, či nikoli.  
1.3.2  Stupe ň 2 
Zkoušená látka se položí na filtra ční papír plovoucí v misce 
s destilovanou vodou o teplot ě 20  o C na vodní hladin ě a sleduje 
se, zda se uvol ňovaný plyn vznítí, či nikoli. Filtra ční papír slouží 
pouze k tomu, aby byla látka položena na jedno místo a tím se zvýšila možnost vznícení.
 
1.3.3  Stupe ň 3 
Zkoušená látka se zformuje do tvaru hranice o výšce p řibližně 2 cm 
a průměru 3 cm. P řidá se do ní n ěkolik kapek vody a sleduje se, zda 
se uvolňovaný plyn vznítí, či nikoli.  
1.3.4  Stupe ň 4 
Zkoušená látka se smíchá s destilovanou vodou o teplot ě 20 o C a v 
jednohodinových intervalech se m ěří rychlost vývinu plynu po dobu 
7 hodin. Je-li po sedmi hodinách rychlost vývinu plynu nepravidelná nebo narůstá, doba m ěření by se m ěla prodloužit na maximáln ě pět 
dnů. Zkoušku lze p řerušit, jestliže rychlost vývinu plynu v pr ůběhu 
měření převýší 1 litr na kg látky za hodinu.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Nejsou specifikovány.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS METOD  
1.6.1  Stupe ň 1 
1.6.1.1  Zkušební podmínky  
Zkouška se provede p ři laboratorní teplot ě (přibližně 20 o C). 
1.6.1.2  Provedení zkoušky  
Malé množství zkoušené látky (p řibližně o průměru 2 mm) se vnese 
do misky s destilovanou vodou. Sleduje se, i) zda se uvol ňuje nějaký 
plyn a ii) zda dojde k jeho vznícení. Dojde-li ke vznícení, nejsou další zkoušky pot řebné, nebo ť látka je považována za nebezpe čnou.
 
1.6.2  Stupe ň 2 
1.6.2.1  Aparatura  
Ve vhodné nádob ě, např. v odpařovací misce o pr ůměru přibližně 
100 mm se na hladinu destilované vody umístí filtra ční papír.  
1.6.2.2  Zkušební podmínky  
Zkouška se provede p ři laboratorní teplot ě (přibližně 20 o C). 
1.6.2.3  Provedení zkoušky  
Malé množství zkoušené látky (p řibližně o průměru 2 mm) se umístí 
do středu filtra čního papíru. Sleduje se, i) zda se uvol ňuje nějaký 
plyn a ii) zda dojde k jeho vznícení. Dojde-li ke vznícení, nejsou 
další zkoušky pot řebné, nebo ť látka je považována za nebezpe čnou. 
1.6.3  Stupe ň 3 
1.6.3.1  Zkušební podmínky  
Zkouška se provede p ři laboratorní teplot ě (přibližně 20 o C). 
1.6.3.2  Provedení zkoušky  
Zkoušená látka se zformuje do tvaru hranice o výšce p řibližně 2 cm 
a průměru 3 cm s jamkou v horní části. Do jamky se p řidá několik 
kapek vody a sleduje se, i) zda se uvol ňuje nějaký plyn a ii) zda 
dojde k jeho vznícení. Dojde-li ke vznícení, nejsou další zkoušky 
potřebné, nebo ť látka je považována za nebezpe čnou. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4  Stupe ň 4 
1.6.4.1  Aparatura  
Aparatura se sestaví zp ůsobem uvedeným na obrázku.  
1.6.4.2  Zkušební podmínky  
Nádoba se zkoušenou látkou se prohlédne, zda neobsahuje prach 
o velikosti částic < 500 um. Tvo ří-li prach více než 1 % hmot. 
celkového množství nebo drobí-li se vzorek, veškerá látka se p řed 
zkoušením rozemele na prach, aby se zmenšila velikost částic během 
skladování a manipulace; v opa čném případě se látka zkouší 
v původním stavu. Zkouška by m ěla být provedena p ři laboratorní 
teplotě (přibližně 20 o C) a atmosférickém tlaku.  
1.6.4.3  Provedení zkoušky  
Přikapávací nálevka aparatury se naplní 10 až 20 ml vody a do 
Erlenmeyerovy ba ňky se vpraví 10 g látky. Objem uvol ňovaného 
plynu se m ěří jakýmkoli vhodným zp ůsobem. Kohout p řikapávací 
nálevky se otev ře, aby voda natekla do Erlenmeyerovy ba ňky, 
a současně se spustí stopky. Objem vzniklého plynu se m ěří každou 
hodinu po dobu sedmi hodin. Je-li vývin plynu b ěhem této doby 
nepravidelný nebo nar ůstá-li na konci této doby rychlost vývinu, 
prodlouží se doba m ěření na maximáln ě pět dnů. Překročí-li rychlost 
vývinu plynu v pr ůběhu měření 1 litr na kg látky za hodinu, m ůže 
být zkouška p řerušena. Zkouška se provede t řikrát.  
Není-li chemická identifikace plynu známa, m ěl by být analyzován. 
Obsahuje-li plyn vysoce ho řlavé složky a není-li známo, zda není 
celá směs vysoce ho řlavá, připraví se sm ěs stejného složení 
a provede se zkouška podle metody A.11.  
2. DATA  
Látka se považuje za nebezpe čnou, jestliže:  
— na kterémkoli stupni zkušebního postupu dojde k jejímu samo ­
volnému vznícení,  
nebo  
— dojde-li k vývinu ho řlavého plynu rychlostí vyšší než 1 litr na kg 
látky za hodinu.  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty),  
— podrobnosti o jakékoli po čáteční přípravě látky,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— výsledky zkoušek (stupn ě 1, 2, 3 a 4),  
— chemická identifikace uvol ňovaného plynu,  
— rychlost vývinu plynu, pokud se provádí stupe ň 4 (1.6.4),  
— všechny další poznámky, které mají význam pro interpretaci 
výsledků. 
4. LITERATURA  
1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York.  
2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the hydro ­
lysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Doplněk 
Obrázek  
Aparatura
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13  PYROFORICKÉ VLASTNOSTI PEVNÝCH LÁTEK 
A KAPALIN  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Zkušební postup je použitelný pro pevné látky nebo kapaliny, které 
se již v malých množstvích samovoln ě vznítí krátce poté, co p ři 
laboratorní teplot ě (přibližně 20  o C) přijdou do styku se vzduchem.  
Tato metoda se nevztahuje na látky, které se na vzduchu p ři labo­
ratorní teplot ě nebo při zvýšené teplot ě vznítí teprve po n ěkolika 
hodinách nebo dnech.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Látky mají pyroforické vlastnosti, pokud se samovoln ě vznítí nebo 
vykazují zuhelnat ění za podmínek, které jsou popsány v bod ě 1.6.  
Může být nezbytné provést zkoušku teploty samozápalu podle 
metody A.15. Bod samozápalu (kapaliny a plyny).  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Nejsou specifikovány.  
1.4 PODSTATA METODY  
Pevná nebo kapalná látka se nanese na inertní nosi č a uvede se p ři 
teplotě okolí na dobu p ěti minut do styku se vzduchem. Pokud se 
kapaliny nevznítí, jsou absorbovány do filtra čního papíru a vystaví 
se působení vzduchu po dobu p ěti minut p ři teplotě okolí (přibližně 
20 o C). Pokud se pevná látka nebo kapalina vznítí nebo pokud 
kapalina zapálí či zuhelnatí filtra ční papír, považuje se za pyroforic ­
kou. 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Opakovatelnost: vzhledem k závažnosti z hlediska bezpe čnosti stačí 
jediný pozitivní výsledek k tomu, aby byla látka považována za pyroforickou.
 
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Aparatura  
Porcelánový kelímek o pr ůměru přibližně 10 cm se p ři laboratorní 
teplotě (přibližně 20  o C) naplní do výšky asi 5 mm infuzoriovou 
hlinkou.  
Poznámka:  
Infuzoriová hlinka nebo jiná srovnatelná b ěžně dosažitelná inertní 
látka se považuje za reprezentativní materiál pro zeminu, do které může zkoušená látka proniknout v p řípadě havárie.
 
Pro zkoušení kapalin, které se p ři kontaktu se vzduchem na inertním 
nosiči samovoln ě nevznítí, se požaduje suchý filtra ční papír.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2  Provedení zkoušky  
a) Práškovité pevné látky  
1 až 2 cm  3 práškovité látky, která má být zkoušena, se sype z výšky 
přibližně 1 m na neho řlavý povrch a sleduje se, zda se látka p ři pádu 
nebo v pr ůběhu dalších p ěti minut po dopadu vznítí.  
Zkouška se provede šestkrát, pokud ke vznícení nedojde d říve. 
b) Kapaliny  
Přibližně 5 cm  3 kapaliny, která má být zkoušena, se nalije do p řipra­
veného porcelánového kelímku a sleduje se, zda se v pr ůběhu pěti 
minut vznítí.  
Pokud při šesti zkouškách nedojde ke vznícení, provede se tato 
zkouška:  
0,5 ml zkoušeného vzorku se vpraví pomocí injek ční stříkačky na 
zprohýbaný filtra ční papír a sleduje se, zda do 5 minut od p řidání 
kapaliny dojde ke vznícení nebo zuhelnat ění filtračního papíru. 
Zkouška se provede t řikrát, nedojde-li ke vznícení nebo zuhelnat ění 
dříve. 
2. DATA  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Zkoušky lze p řerušit, jakmile je dosaženo pozitivního výsledku 
v kterékoli zkoušce.  
2.2 VYHODNOCENÍ  
Jestliže se látka v pr ůběhu 5 minut po nanesení na inertní nosi č 
a vystavení p ůsobení vzduchu vznítí nebo pokud kapalná látka 
zuhelnatí či zapálí filtra ční papír do p ěti minut po nanesení 
a vystavení vzduchu, považuje se za pyroforickou.  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty),  
— výsledky zkoušek,  
— všechny další poznámky, které mají význam pro interpretaci 
výsledků. 
4. LITERATURA  
1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids.  
2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14  VÝBUŠNÉ VLASTNOSTI  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Tato metoda umož ňuje stanovit, zda u pevné nebo pastovité látky 
existuje nebezpe čí výbuchu, je-li podrobena p ůsobení plamene (cit ­
livost na p ůsobení tepla), nárazu nebo t ření (citlivost na mechanické 
podněty), a zda u kapalné látky existuje nebezpe čí výbuchu, je-li 
podrobena p ůsobení plamene nebo nárazu.  
Metoda sestává ze t ří částí: 
a) zkouška citlivosti na p ůsobení tepla (1);  
b) zkouška mechanické citlivosti na náraz (1);  
c) zkouška mechanické citlivosti na t ření (1).  
Metoda poskytuje data pro stanovení pravd ěpodobnosti vyvolání 
výbuchu ur čitými běžnými podn ěty. Metoda neslouží ke zjišt ění, 
zda je látka schopna vybuchnout za jakýchkoli podmínek.  
Metoda je vhodná pro zjišt ění, zda u látky existuje nebezpe čí 
výbuchu (citlivost na p ůsobení tepla a mechanická citlivost) za ur či­
tých podmínek specifikovaných ve sm ěrnici. Je založena na řadě 
typů zařízení, která jsou široce používána v mezinárodním m ěřítku 
(1) a která obvykle poskytují vypovídající výsledky. P řipouští se, že 
tato metoda není definitivní. Lze použít jiné než specifikované 
zařízení, za p ředpokladu, že je mezinárodn ě uznané a že lze výsledky 
vhodným zp ůsobem srovnat s výsledky poskytnutými specifiko ­
vaným za řízením.  
Zkouška nemusí být provedena, jestliže z dostupných termodynamic ­
kých informací (nap ř. ze slučovacího tepla nebo disocia čního tepla) 
a/nebo z nep řítomnosti ur čitých reak čních skupin (2) ve struktu ře 
s jistotou vyplývá, že látka nemá schopnost rychle se rozkládat za vývoje plyn ů nebo za uvol ňování tepla (tzn. materiál nep ředstavuje 
žádné riziko výbuchu). Zkouška mechanické citlivosti na t ření se 
nevyžaduje u kapalin.
 
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Výbušná látka:  
Látka, která m ůže vybuchnout p ůsobením plamene nebo která je 
citlivá na náraz nebo t ření ve specifikovaném za řízení (nebo je 
mechanicky citliv ější než 1,3-dinitrobenzen v alternativním za řízení).  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
1,3-dinitrobenzen, technický krystalický výrobek, prosetý na sítu 
o velikosti oka 0,5 mm, pro metody citlivosti na t ření a na náraz.  
Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (ozna čovaný jako RDX nebo 
hexogen nebo cyklonit – CAS 121-82-4) rekrystalizovaný z vodného cyklohexanonu, prosetý za mokra na sít ě 250 μm 
a zachycený na sít ě 150 μm, sušený 4 hodiny p ři 103 ± 2
 o C pro 
druhou sérii zkoušek citlivosti na t ření a na náraz.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4 PODSTATA METODY  
Pro zjištění bezpečných podmínek pro provedení t ří zkoušek citli ­
vosti jsou nezbytné p ředběžné zkoušky.  
1.4.1  Zkoušky bezpe čného zacházení (3)  
Z bezpečnostních d ůvodů se před provedením hlavních zkoušek 
podrobí velmi malé neuzav řené vzorky látky (p řibližně 10 mg) zah ří­
vání v plameni plynového ho řáku, nárazu v jakémkoli vhodném 
zařízení a tření za použití pali čky proti podložce nebo jiného za řízení 
pro zkoušení citlivosti nat ření. Účelem předběžných zkoušek je zjis ­
tit, zda je látka tak citlivá a výbušná, že by m ěly být předepsané 
zkoušky citlivosti, zvlášt ě zkouška citlivosti na p ůsobení tepla, 
prováděny za zvláštních bezpe čnostních opat ření, aby nedošlo 
k poranění osoby provád ějící zkoušky.  
1.4.2  Citlivost na p ůsobení tepla  
Metoda spo čívá v zah řívání látky v ocelové trubce uzav řené clonami 
s různými pr ůměry otvorů s cílem zjistit, zda m ůže za podmínek 
intenzivního zah řívání a p ři definovaném ut ěsnění vybuchnout.  
1.4.3  Mechanická citlivost (na náraz)  
Metoda spo čívá ve vystavení látky nárazu specifikovaným závažím 
puštěným ze specifikované výšky.  
1.4.4  Mechanická citlivost (na t ření) 
Metoda spo čívá ve vystavení pevných nebo pastovitých látek t ření 
mezi standardními povrchy za specifikovaných podmínek zatížení 
a vzájemného pohybu.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Citlivost na p ůsobení tepla (na p ůsobení plamene)  
1.6.1.1  Zařízení  
Zařízení je tvo řeno ocelovou trubkou na jedno použití s opakovan ě 
použitelným uzavíracím za řízením (obrázek 1), instalovanou 
v ohřívacím a ochranném za řízení. Každá trubka je hlubokotažená 
z ocelového plechu (viz dopln ěk) a má vnit řní průměr 24 mm, délku 
75 mm a tlouš ťku stěny 0,5 mm. Na otev řeném konci trubky je 
příruba sloužící k uzav ření trubky sestavou clony. Sestava je tvo řena 
clonou se st ředovým otvorem odolnou v ůči tlaku, p řipevněnou 
k trubce pomocí dvoudílného šroubového spoje (matice a závitové příruby). Matice a závitová p říruba jsou zhotoveny 
z chrommanganové oceli (viz dopln ěk), která je do 800
 o C nejisk­ 
řivá. Clony mají tlouš ťku 6 mm, jsou vyrobeny ze žáruvzdorné oceli 
a tvoří řadu podle velikosti otvor ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2  Zkušební podmínky  
Látka se obvykle zkouší ve stavu, v jakém byla obdržena, a čkoliv 
v některých p řípadech, nap ř. je-li lisovaná, litá nebo jiným zp ůsobem 
zhutněná, může být nezbytné ji p řed provedením zkoušky rozdrtit.  
U pevných látek se hmotnost látky, která má být použita v každé 
zkoušce, stanoví zkouškou ve dvou etapách. Zvážená trubka se naplní 9 cm látky a látka se po celém pr ůřezu trubky stla čí silou 
80 N. Z bezpe čnostních d ůvodů nebo v p řípadech, kdy m ůže stla­ 
čováním dojít ke zm ěně fyzikální formy vzorku, lze použít jiný 
způsob plnění, například je-li látka velmi citlivá na t ření, není 
vhodné ji stla čovat. Je-li látka stla čitelná, přidá se a stla čuje další 
množství látky, dokud není trubka zapln ěna do úrovn ě 55 mm od 
horního okraje. Stanoví se celkové množství látky použité pro napl ­
nění do úrovn ě 55 mm od horního okraje a p řidají se další dva 
podíly látky, p řičemž se každý stla čí silou 80 N. Látka se poté 
podle pot řeby buď přidá a stla čí, nebo se odebere tak, aby byla 
trubka napln ěna do úrovn ě 15 mm od horního okraje. Provede se 
druhá zkouška, p řičemž se za čne s třetinou hmotnosti po stla čení 
zjištěné v první etap ě. Přidají se další dva podíly, stla čí se silou 
80 N a podle pot ř
eby se látka p řidá nebo odebere do úrovn ě 
15 mm od horního okraje trubky. Množství pevné látky zjišt ěné ve 
druhé etap ě se použije pro každý pokus; napln ění se provede se 
třemi stejnými množstvími a každé z nich se stla čí na objem 9 cm 
bez ohledu na pot řebnou sílu (pro usnadn ění lze k tomuto ú čelu 
použít rozp ěrné kroužky).  
Kapaliny a gely se naplní do trubky do výšky 60 mm, p řičemž je 
třeba věnovat zvláštní pozornost gel ům, aby se v nich netvo řily 
dutiny. Na trubku se zdola navle če závitová p říruba, vloží se vhodná 
clona a po nanesení maziva na bázi disulfidu molybd ěničitého se 
matice utáhne. Je d ůležité se p řesvědčit, zda nějaká látka nez ůstala 
zachycena mezi p řírubou a clonou nebo v závitech.  
K zahřívání se použije propan odebíraný z pr ůmyslové tlakové lahve 
s regulátorem tlaku (60 až 70 mbar) p řes průtokoměr a rovnom ěrně 
rozdělený rozd ělovacím potrubím do čtyř hořáků (ověří se vizuáln ě 
pozorováním plamen ů hořáků). Hořáky se umístí kolem zkušební 
komory, jak je znázorn ěno na obrázku 1. Čtyři hořáky mají celkovou 
spotřebu přibližně asi 3,2 litru propanu za minutu. Lze použít jiné 
palivo a ho řáky, avšak rychlost oh řevu musí být taková, jak je 
uvedeno na obrázku 3. Rychlost oh řevu se musí u všech za řízení 
pravideln ě kontrolovat za použití trubek napln ěných dibutylftalátem, 
jak je znázorn ěno na obrázku 3.  
1.6.1.3  Provedení zkoušek  
Každá zkouška se provádí do roztržení trubky nebo dokud doba 
ohřevu nedosáhne 5 minut. Výsledek zkoušky, p ři níž došlo 
k roztržení trubky na t ři nebo více úlomk ů, z nichž n ěkteré mohou 
být vzájemn ě spojeny úzkými proužky kovu, jak je znázorn ěno na 
obrázku 2, se hodnotí jako výbuch. Výsledek zkoušky, p ři níž 
vzniklo mén ě úlomků nebo k roztržení nedošlo, se nehodnotí jako 
výbuch.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Nejprve se provede série t ří zkoušek s clonou o pr ůměru otvoru 
6,0 mm, a pokud nedojde k výbuchu, provede se druhá série t ří 
zkoušek s clonou o pr ůměru otvoru 2,0 mm. Dojde-li k výbuchu 
u kterékoli zkušební série, nevyžadují se další zkoušky.  
1.6.1.4  Hodnocení  
Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, dojde-li k výbuchu p ři 
jedné z výše uvedených zkušebních sérií.  
1.6.2  Mechanická citlivost (na náraz)  
1.6.2.1  Zařízení (obrázek 4)  
Základními částmi typických za řízení s padacím kladivem je blok 
z lité oceli s podstavcem, kovadlina, sloup, vodicí lišty, padací 
závaží, uvol ňovací zařízení a držák vzorku. Ocelová kovadlina 
o průměru 100 mm a výšce 70 mm je p řišroubována k horní 
straně bloku z lité oceli o délce 230 mm, ší řce 250 mm a výšce 
200 mm se základovou litinovou deskou o délce 450 mm, ší řce 
450 mm a výšce 60 mm. Sloup tvo řený bezešvou taženou 
ocelovou trubkou je p řipevněn držákem p řišroubovaným na 
zadní stranu bloku z lité oceli. Čtyři šrouby ukotvují za řízení 
k betonovému bloku o rozm ěrech 60 × 60 × 60 cm takovým 
způsobem, že jsou vodicí lišty dokonale svislé a padací závaží 
padá voln ě. Používá se závaží o hmotnosti 5 a 10 kg z pevné 
oceli. Úderová hlava každého záva ží je z tvrzené oceli HRC 60 
až 63 a má minimální pr ůměr 25 mm.  
Zkoušený vzorek se uzav ře do zkušebního za řízení tvořeného dvěma 
plnými souosými válci umíst ěnými nad sebou a vodicím pouzdrem 
tvořeným dutým ocelovým válcem. Plné ocelové válce o pr ůměru 10 
(–0,003, –0,005) mm a výšce 10 mm mají vylešt ěné plochy, zakula ­
cené hrany (s polom ěrem zakřivení 0,5 mm) a tvrdost HRC 58 až 
65. Dutý válec musí mít vn ější průměr 16 mm, vylešt ěný vyvrtaný 
otvor o pr ůměru 10 (+ 0,005, + 0,010) mm a výšku 13 mm. Sesta ­
vené zkušební za řízení se umístí na vým ěnnou ocelovou mezipod ­
ložku (o pr ůměru 26 mm a výšce 26 mm), která je vyst ředěna 
kroužkem s otvory pro odvod dým ů. 
1.6.2.2  Zkušební podmínky  
Objem vzorku by m ěl být 40 mm  3 nebo by m ěl být vhodný pro 
alternativní za řízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu 
a připravují se tímto zp ůsobem:  
a) práškové látky se prosejí sítem (o velikosti oka 0,5 mm); ke 
zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem;  
b) lisované, lité nebo jiným zp ůsobem zhutn ěné látky se rozdrtí na 
malé kousky a prosejí; ke zkoušení se použije prosetý podíl o velikosti částic od 0,5 do 1 mm, který by m ěl být reprezenta ­
tivní pro p ůvodní látku.
 
Látky dodávané obvykle ve form ě pasty se zkoušejí pokud možno 
v suchém stavu nebo po odstran ění maximálního možného množství 
ředidla. Kapalné látky se zkoušejí p ři mezeře 1 mm mezi horním 
a dolním ocelovým válcem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3  Provedení zkoušek  
Provede se série šesti zkoušek spušt ěním závaží o hmotnosti 10 kg 
z výšky 0,40 m (40 J). Dojde-li b ěhem těchto šesti zkoušek p ři 40 
J k výbuchu, musí se provést další série šesti zkoušek spušt ěním 
závaží o hmotnosti 5 kg z výšky 0,15 m (7,5 J). U jiných za řízení 
se vzorek porovnává se zvolenou referen ční látkou za použití stano ­
veného postupu (nap ř. technikou up-and-down atd).  
1.6.2.4  Hodnocení  
Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, jestliže dojde k výbuchu 
(vzplanutí nebo t řesk jsou rovnocenné výbuchu) alespo ň jednou p ři 
kterékoli zkoušce se specifikovaným za řízením nebo je-li vzorek 
citlivější než 1,3-dinitrobenzen nebo RDX v alternativní zkoušce 
citlivosti na náraz.  
1.6.3  Mechanická citlivost (na t ření) 
1.6.3.1  Zařízení (obrázek 5)  
Třecí zařízení je tvo řeno základovou deskou z lité oceli, na které je 
upevněno třecí zařízení. To je tvo řeno nepohyblivým porcelánovým 
kolíkem a pohyblivou porcelánovou desti čkou. Porcelánová desti čka 
je upevněna na saních vedených dv ěma vodicími lištami. San ě jsou 
připojeny k elektromotoru ojnicí, excentrickou va čkou a vhodným 
ozubeným p řevodem tak, že porcelánová desti čka vykonává pod 
porcelánovým kolíkem pohyb tam a zp ět na dráze o délce 10 mm. 
Porcelánový kolík lze zatížit silou bu ď 120 N, nebo 360 N.  
Rovné porcelánové desti čky jsou vyrobeny z bílého technického 
porcelánu (o drsnosti 9 až 32 um) a mají délku 25 mm, ší řku 
25 mm a výšku 5 mm. Válcový porcelánový kolík je rovn ěž vyroben 
z bílého technického porcelánu, má délku 15 mm, pr ůměr 10 mm 
a zdrsněné kulové plochy s polom ěrem zakřivení 10 mm.  
1.6.3.2  Zkušební podmínky  
Objem vzorku by m ěl být 10 mm  3 nebo by m ěl být vhodný pro 
alternativní za řízení.  
Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a p řipravují se tímto zp ůso­
bem:  
a) práškové látky se prosejí sítem (o velikosti oka 0,5 mm); ke 
zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem;  
b) lisované, lité nebo jiným zp ůsobem zhutn ěné látky se rozdrtí na 
malé kousky a prosejí; ke zkoušení se použije prosetý podíl 
o velikosti částic < 0,5 mm.  
Látky dodávané obvykle ve form ě pasty se zkoušejí pokud možno 
v suchém stavu. Nelze-li látku p řipravit v suchém stavu, zkouší se 
pasta (po odstran ění maximálního možného množství ředidla) ve 
formě proužku o tlouš ťce 0,5 mm, ší řce 2 mm a délce 10 mm 
připraveného v tvarovací form ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3  Provedení zkoušek  
Porcelánový kolík se p řiloží na zkoušený vzorek a zatíží se. P ři 
provádění zkoušky musí být rýhy v porcelánové desti čce orientovány 
příčně ke směru pohybu. Je nutné dbát na to, aby kolík spo číval na 
vzorku, aby pod kolíkem leželo dostate čné množství zkoušeného 
materiálu a také aby se desti čka pohybovala pod kolíkem správn ě. 
U pastovitých látek se pro nanesení látky na desti čku používá m ěrka 
o tloušťce 0,5 mm s otvorem 2 × 10 mm. Porcelánová desti čka se 
musí pohybovat pod porcelánovým kolíkem po dráze 10 mm tam 
a zpět za 0,44 s. Každá část povrchu desti čky a kolíku se smí použít 
pouze jednou; dva konce každého kolíku slouží pro dva pokusy 
a každá ze dvou stran desti čky slouží pro t ři pokusy.  
Série šesti zkoušek se provede se zatížením 360 N. Získá-li se b ěhem 
těchto šesti zkoušek pozitivní výsledek, musí se provést další série 
šesti zkoušek se zatížením 120 N. U jiných za řízení se vzorek porov ­
nává se zvolenou referen ční látkou za použití stanoveného postupu 
(např. technikou up-and-down atd).  
1.6.3.4  Hodnocení  
Výsledek zkoušky se považuje za pozitivní, jestliže dojde k výbuchu 
(praskání, t řesk nebo vzplanutí jsou rovnocenné výbuchu) alespo ň 
jednou při kterékoli zkoušce se specifikovaným za řízením pro stano ­
vení citlivosti na t ření nebo spl ňuje-li ekvivalentní kritéria alterna ­
tivní zkoušky citlivosti na t ření. 
2. DATA  
Látka se v zásad ě považuje ve smyslu této sm ěrnice za nebezpe čnou 
z hlediska výbuchu, jestliže jsou získány pozitivní výsledky ve zkoušce citlivosti na p ůsobení tepla, ve zkoušce citlivosti na náraz 
nebo na t ření.
 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— identifikace zkoušené látky, její složení, čistota, obsah vlhkosti 
atd., 
— fyzikální forma vzorku, zda se vzorek drtil, mlel nebo proséval,  
— údaje zjišt ěné při zkoušce citlivosti na p ůsobení tepla (nap ř. 
hmotnost vzorku a po čet úlomků atd.),  
— pozorované jevy p ři zkoušce mechanické citlivosti (nap ř. tvorba 
značného množství dýmu nebo úplný rozklad bez t řesku, 
plameny, jiskry, t řesk, praskání atd.),  
— výsledky každého typu zkoušky,  
— bylo-li použito alternativní za řízení, musí být uvedeno v ědecké 
zdůvodnění použití a d ůkaz srovnatelnosti výsledk ů získaných se 
specifikovaným za řízením a výsledk ů získaných s rovnocenným 
zařízením,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— všechny užite čné poznámky, nap říklad odkaz na zkoušky podob ­
ných látek, které by mohly mít význam pro správné hodnocení 
výsledků, 
— všechny další poznámky, které mají význam pro interpretaci 
výsledků. 
3.2 INTERPRETACE A VYHODNOCENÍ VÝSLEDK Ů 
V protokolu o zkoušce by m ěly být uvedeny všechny výsledky, které 
jsou považovány za chybné, anomální nebo nereprezentativní. Má-li 
být kterýkoli z t ěchto výsledk ů vyloučen, mělo by být uvedeno 
vysvětlení a výsledky jakéhokoli alternativního nebo dopl ňkového 
zkoušení. Pokud nelze anomální výsledek vysv ětlit, musí být p řijat 
tak, jak byl dosažen, a musí být použit k odpovídající klasifikaci 
látky.  
4. LITERATURA  
1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol.3, 6–13 and 30–42.  
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use 
-Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Doplněk 
příklad materiálové specifikace pro zkoušku citlivosti na p ůsobení tepla (viz 
DIN 1623)  
1) Trubka: materiálová specifikace č. 1.0336.505 g  
2) Clona s otvorem: materiálová specifikace č. 1.4873  
3) Závitová p říruba a matice: materiálová specifikace č. 1.3817  
Obrázek 1  
Zařízení pro zkoušku citlivosti na p ůsobení tepla  
(všechny rozm ěry v mm)
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Obrázek 2  
Zkouška citlivosti na p ůsobení tepla  
(příklady roztržení trubky)
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Obrázek 3  
Kalibrace rychlosti oh řevu pro zkoušku citlivosti na p ůsobení tepla
  
Křivka závislosti teploty na čase získaná p ři zahřívání dibutyl-ftalátu (27 cm  3 ) v uzavřené 
trubce (s clonou 1,5 mm) p ři průtoku propanu 3,2 litry za minutu. Teplota byla m ěřena 
chromel/alumelovým termo článkem o pr ůměru 1 mm, zapouzd řeným v korozivzdorné oceli 
a umístěným 43 mm pod okrajem trubky. Rychlost zah řívání mezi 135  o C a 285  o C by měla 
být 185 až 215 K/min.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Obrázek 4  
Zařízení pro zkoušku citlivosti na mráz  
(všechny rozm ěry v mm)
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Obrázek 4  
Pokračování
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Obrázek 5  
Zařízení pro zkoušku citlivosti na t ření
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15  BOD SAMOZÁPALU (KAPALINY A PLYNY)  
METODA  
1.1 ÚVOD  
Výbušné látky a látky, které se spontánn ě vznítí při styku se vzdu ­
chem při teplotě okolí, by nem ěly být předmětem této zkoušky. 
Zkušební postup je použitelný pro plyny, kapaliny a páry, které se mohou za p řítomnosti vzduchu vznítit na horkém povrchu.
 
Bod samozápalu m ůže být zna čně snížen vlivem katalytických ne čis­
tot, materiálu povrchu nebo v ětšího objemu zkušební nádoby.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Míra schopnosti látky samovoln ě se vznítit se vyjad řuje teplotou 
samozápalu. Bod samozápalu je nejnižší teplota, p ři které se zkou ­ 
šená látka smíchaná se vzduchem za podmínek stanovených v této 
zkušební metod ě vznítí.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Referenční látky jsou uvedeny v normách (viz 1.6.3). M ěly by 
především sloužit k ob časné kontrole provedení metody a ke vzájem ­
nému porovnávání výsledk ů získaných jinými metodami.  
1.4 PODSTATA METODY  
Metodou se stanoví minimální teplota vnit řního povrchu uzav řeného 
prostoru, která zp ůsobí vznícení plynu, páry nebo kapaliny vprave ­
ných do tohoto prostoru.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Opakovatelnost se m ění v závislosti na rozp ětí bodů samozápalu a na 
použité zkušební metod ě. 
Citlivost a specifi čnost závisejí na použité zkušební metod ě. 
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Aparatura  
Aparatura je popsána v metod ě uvedené v bod ě 1.6.3.  
1.6.2  Zkušební podmínky  
Vzorek zkoušené látky se zkouší metodou uvedenou v bod ě 1.6.3.  
1.6.3  Provedení zkoušky  
Viz IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. DATA  
Zaznamená se zkušební teplota, atmosférický tlak, množství použ ­
itého zkoušeného vzorku a časová prodleva p řed vznícením.  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— přesná specifikace látky (identifikace a ne čistoty),  
— použité množství vzorku, atmosférický tlak,  
— použitá aparatura,  
— výsledky m ěření (zkušební teploty, výsledky týkající se vznícení, 
příslušná časová prodleva),  
— všechny další poznámky, které mají význam pro interpretaci 
výsledků. 
4. LITERATURA  
Není uvedena.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16  RELATIVNÍ TEPLOTA SAMOZÁPALU PEVNÝCH LÁTEK  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Výbušné látky a látky, které se spontánn ě vznítí při styku se vzdu ­
chem při teplotě okolí, by nem ěly být předmětem této zkoušky.  
Účelem této zkoušky je poskytnout p ředběžnou informaci 
o schopnosti pevných látek samovoln ě se vznítit za zvýšených teplot.  
Pokud teplo uvol ňované bu ď reakcí látky s kyslíkem, nebo 
exotermním rozkladem není dostate čně rychle odvád ěno do okolí, 
nastává samovolné zah řívání látky, které m ůže vést až k jejímu 
samozápalu. K samozápalu tedy dojde, je-li rychlost vývinu tepla 
vyšší než rychlost odvád ění tepla.  
Zkušební postup je užite čný jako p ředběžná screeningová zkouška 
pro pevné látky. Z hlediska složité povahy vznícení a ho ření 
pevných látek by m ěl být bod samozápalu stanovený touto metodou 
použit pouze ke srovnávacím ú čelům. 
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Bod samozápalu získaný touto metodou je minimální teplota okolí 
látky vyjád řená ve  o C, při které se ur čité množství látky za defino ­
vaných podmínek vznítí.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKA  
Žádná.  
1.4 PODSTATA METODY  
Určité množství vzorku zkoušené látky se za teploty okolí vloží do 
pece; zatímco se teplota pece zvyšuje rychlostí 0,5  o C/min na 400  o C 
nebo do bodu tání vzorku, je-li nižší, zaznamenává se k řivka 
závislosti teploty ve st ředu zkoušeného vzorku na čase. Pro ú čely 
této zkoušky se za bod samozápalu látky považuje teplota pece, p ři 
které dosáhne teplota zkoušeného vzorku samovolným zah říváním 
400  o C. 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Žádná.  
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Aparatura  
1.6.1.1  Pec  
Laboratorní pec (o obsahu p řibližně 2 litry) vybavená programova ­
telnou regulací teploty, p řirozenou cirkulací vzduchu a pojistným 
přetlakovým za řízením. Aby se p ředešlo možnému riziku výbuchu, 
nesmí přijít rozkladné plyny do styku s elektrickými topnými 
elementy.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2  Krychle z drát ěného pletiva  
Podle šablony na obrázku 1 se vyst řihne kus z drát ěného korozi 
vzdorného pletiva o velikosti otvor ů 0,045 mm. Vyst řižený kus se 
složí do formy naho ře otevřené krychle a zajistí se drátkem.  
1.6.1.3  Termo články  
Vhodné termo články.  
1.6.1.4  Zapisova č 
Jakýkoli dvoukanálový zapisova č kalibrovaný pro teploty od 0  o C do 
600  o C nebo jim odpovídající nap ětí. 
1.6.2  Zkušební podmínky  
Látky se zkouší ve stavu, v jakém byly obdrženy.  
1.6.3  Provedení zkoušky  
Drátěná krychle se naplní zkoušenou látkou, jemn ě se poklepe 
a přidá se tolik látky, aby byla krychle zcela napln ěna. Krychle se 
poté při laboratorní teplot ě zavěsí do středu pece. Jeden termo článek 
se umístí do st ředu krychle a druhý mezi krychli a st ěnu pece pro 
záznam teploty pece.  
Teploty pece a vzorku se nep řetržitě zaznamenávají, zatímco se 
teplota pece plynule zvyšuje rychlostí 0,5  o C/min až do teploty 
400  o C nebo do bodu tání vzorku, je-li nižší.  
Když se látka vznítí, termo články zaznamenají velmi prudký nár ůst 
teploty nad teplotou pece.  
2. DATA  
Pro hodnocení je d ůležitá teplota pece, p ři které dosáhla teplota 
vzorku samovolným zah říváním 400  o C (viz obrázek 2).  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— popis zkoušené látky,  
— výsledky m ěřeni včetně křivky závislosti teploty na čase, 
— všechny další poznámky, které mají význam pro interpretaci 
výsledků. 
4. LITERATURA  
NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Obrázek 1  
Šablona krychle o délce strany 20 mm
  
Obrázek 2  
Typická k řivka závislosti teploty na čase
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17  OXIDA ČNÍ VLASTNOSTI (PEVNÉ LÁTKY)  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Před provedením této zkoušky je vhodné mít p ředběžné informace 
o možných výbušných vlastnostech látky.  
Tato zkouška není použitelná pro kapaliny, plyny, výbušné nebo 
vysoce ho řlavé látky nebo pro organické peroxidy.  
Zkouška se neprovádí, jestliže ze strukturního vzorce bez pochyby 
vyplývá, že tato látka nemá schopnost exotermn ě reagovat 
s hořlavým materiálem.  
Ke zjištění, zda by se zkouška nem ěla provád ět za speciálních 
bezpečnostních opat ření, je třeba provést p ředběžnou zkoušku.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Doba hoření: doba reakce v sekundách pot řebná k pr ůchodu reak ční 
zóny prachovou housenkou podle postupu popsaného v bod ě 1.6.  
Rychlost ho ření: vyjad řuje se v mm/s.  
Maximální rychlost ho ření: nejvyšší hodnota rychlosti ho ření, která 
byla nam ěřena pro sm ěsi obsahující 10 až 90 % hmot. oxidující 
látky.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKA  
Pro zkoušku a pro p ředběžnou zkoušku se jako referen ční látka 
používá dusi čnan barnatý čistoty p.a.  
Referenční směsí je směs dusičnanu barnatého a práškové celulosy 
připravená podle bodu 1.6, která má maximální rychlost ho ření 
(obvykle jde o sm ěs obsahující 60 % hmot. dusi čnanu barnatého).  
1.4 PODSTATA METODY  
V zájmu bezpe čnosti se provede p ředběžná zkouška. Jestliže p řed­
běžná zkouška jasn ě prokáže, že látka má oxida ční vlastnosti, žádné 
další zkoušky se nevyžadují. Není-li tomu tak, podrobí se látka úplné 
zkoušce.  
Při úplné zkoušce se látka, která má být zkoušena, a definovaná 
hořlavá látka smísí v r ůzných pom ěrech. Každá sm ěs je poté upra ­
vena do tvaru prachové housenky a ta se na jednom konci zapálí. 
Stanovená maximální rychlost ho ření se porovná s maximální rych ­
lostí hoření referen ční směsi. 
1.5 KRITERIA JAKOSTI  
Vhodná je každá technika mletí a mísení, pro niž se neliší maximální 
rychlosti ho ření v šesti samostatných zkouškách od aritmetického 
průměru o více než 10 %.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Příprava  
1.6.1.1  Zkoušená látka  
Velikost částic zkoušeného vzorku se sníží na < 0,125 mm následu ­
jícím postupem: zkoušená látka se proseje, podíl zachycený na sít ě 
se drtí a celý postup se opakuje, dokud celá zkoušená dávka neprojde sítem.
 
Lze použít jakoukoli techniku mletí a prosévání, která vyhoví krité ­
riím jakosti.  
Před přípravou sm ěsi se látka suší p ři 105  o C do konstantní hmot ­
nosti. Pokud se zkoušená látka rozkládá p ři teplotě nižší než 105  o C, 
musí se látka sušit p ři vhodné nižší teplot ě. 
1.6.1.2  Hořlavá látka  
Jako hořlavá látka se používá prášková celulosa. Doporu čuje se typ 
celulosy používaný pro chromatografii na tenké vrstv ě nebo pro 
sloupcovou chromatografii. Jako vhodný se prokázal typ, který má délku více než 85 % vláken od 0,020 mm a 0,075 mm. Celulosový 
prášek se proseje sítem o velikosti oka 0,125 mm. V pr ůběhu 
zkoušky se používá tatáž šarže celulosy.
 
Před přípravou sm ěsi se prášková celulosa suší p ři 105  o C do 
konstantní hmotnosti.  
Pokud se p ři předběžné zkoušce použije d řevitá mou čka, připraví se 
z měkkého d řeva shromážd ěním podílu, který projde sítem 
o velikosti oka 1,6 mm, d ůkladným promícháním a následným 
sušením čtyři hodiny p ři teplotě 105  o C ve vrstv ě o tloušťce nepře­
sahující 25 mm. Ochladí se a do okamžiku použití, ke kterému by 
mělo dojít nejlépe do 24 hodin, se uchovává v co nejvíce napln ěné 
vzduchotěsné nádob ě. 
1.6.1.3  Zdroj zapálení  
Jako zdroj zapálení se použije plamen plynového ho řáku (o mini ­
málním pr ůměru 5 mm). Použije-li se jiný zdroj zapálení (nap ř. při 
zkoušce v inertní atmosfé ře), uvede se popis a zd ůvodnění. 
1.6.2  Provedení zkoušky  
Poznámka:  
Směsi oxidant ů a celulosy nebo d řevité mou čky se musí považovat 
za potenciáln ě výbušné a musí se s nimi zacházet s náležitou opatr ­
ností.  
1.6.2.1  Předběžná zkouška  
Vysušená látka se d ůkladně promíchá s vysušenou celulosou nebo 
dřevitou mou čkou v pom ěru 2 hmotnostní díly zkoušené látky a 1 
hmotnostní díl celulosy nebo d řevité mou čky a směs se upraví do 
tvaru malého kužele o rozm ěrech 3,5 cm (pr ůměr základny) × 
2,5 cm (výška) napln ěním bez p ěchování do kuželové formy (nap ř. 
do laboratorní sklen ěné nálevky s ut ěsněným stonkem).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Zkoušený vzorek se položí na chladnou, neho řlavou, neporézní 
a málo tepeln ě vodivou podkladovou desku. Zkouška se provede 
v digesto ři podle bodu 1.6.2.2.  
Zdroj zapálení se p řiloží ke kuželu. Sleduje se a zaznamená se 
prudkost a doba trvání výsledné reakce.  
Látka se považuje za oxidující, je-li reakce prudká.  
V případě, že výsledek vzbuzuje pochybnosti, je nezbytné vykonat 
úplnou níže popsanou zkoušku s prachovou housenkou.  
1.6.2.2  Zkouška s prachovou housenkou  
Připraví se sm ěsi oxidantu s celulosou obsahující 10 až 90 % hmot. 
oxidantu, po 10 % p řírůstcích. Přesnější hodnota maximální rychlosti 
hoření se v mezních p řípadech získá použitím mezilehlé sm ěsi 
oxidantu s celulosou.  
Zkoušený vzorek se upraví pomocí formy. Kovová forma je 250 mm 
dlouhá a má trojúhelníkový p říčný průřez o vnit řní výšce 10 mm 
a šířce 20 mm. Na ob ě podélné strany formy se upevní dv ě kovové 
desky se základnou jako bo čnice, které p řečnívají o 2 mm nad horní 
okraj trojúhelníkové formy (obrázek). Forma se bez zhutn ění naplní 
mírným p řebytkem sm ěsi. Po spušt ění formy z výšky 2 cm na pevný 
povrch se p řebytek látky seškrábne st ěrkou. Bo čnice se odstraní 
a zbývající prášek se uhladí vále čkem. Na horní část formy se položí 
nehořlavá, neporézní a málo tepeln ě vodivá deska, sestava se p řevrátí 
a forma odstraní.  
Zkoušený vzorek se umístí v digesto ři kolmo na sm ěr odtahu.  
Rychlost proud ění odsávaného vzduchu by m ěla stačit k zamezení 
úniku dýmu do laborato ře a neměla by se v pr ůběhu zkoušky m ěnit. 
Kolem zkušebního za řízení by se m ěly postavit ochranné clony proti 
nadměrnému proud ění vzduchu.  
Zkouška se provede co nejrychleji s ohledem na hygroskopi čnost 
celulosy a n ěkterých zkoušených látek.  
Jeden konec prachové housenky se zapálí plamenem ho řáku. 
Poté, co reak ční zóna dosáhne vzdálenosti 30 mm, m ěří se doba, za 
kterou se reakce rozší ří na vzdálenost 200 mm.  
Zkouška se provede s referen ční látkou a alespo ň jednou s každou 
z řady směsí zkoušené látky s celulosou.  
Pokud se zjistí, že maximální rychlost ho ření je zna čně vyšší, než 
rychlost ho ření referen ční směsi, lze zkoušku ukon čit; v opa čném 
případě se zkouška opakuje p ětkrát s každou ze t ří směsí 
s nejvyššími rychlostmi ho ření. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Existuje-li podez ření, že je výsledek falešn ě pozitivní, opakuje se 
zkouška s inertní látkou se stejnou velikostí částic, nap ř. 
s křemelinou, namísto celulosy. Sm ěs zkoušené látky s celulosou 
s nejvyšší rychlostí ho ření by m ěla být eventuáln ě znovu zkoušena 
v inertní atmosfé ře (s obsahem kyslíku < 2 % obj.).  
2. DATA  
Z bezpečnostních d ůvodů se považuje za charakteristickou oxida ční 
vlastnost zkoušené látky maximální rychlost ho ření, nikoli pr ůměrná 
hodnota.  
Pro vyhodnocení je d ůležitá nejvyšší hodnota rychlosti ho ření zjiš­
těná v šesti zkouškách dané sm ěsi. 
Do grafu se vynesou nejvyšší hodnoty rychlosti ho ření pro každou 
směs proti koncentraci oxidantu. Z grafu se ode čte nejvyšší rychlost 
hoření. 
Šest hodnot rychlosti ho ření naměřených pro sm ěs s maximální rych ­
lostí hoření se nesmí lišit od aritmetického pr ůměru o více než 10 %; 
v opačném případě se musí zlepšit technika drcení a mísení.  
Naměřená maximální rychlost ho ření se porovná s maximální rych ­
lostí hoření referen ční směsi (viz 1.3).  
Provedou-li se zkoušky v inertní atmosfé ře, porovná se maximální 
rychlost reakce s rychlostí nam ěřenou pro referen ční směs v inertní 
atmosféře. 
3. ZPRÁVA  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— identifikace zkoušené látky, její složení, čistota, vlhkost atd.,  
— jakákoli úprava zkoušeného vzorku (nap ř. drcení, sušení),  
— zdroj zapálení použitý p ři zkouškách,  
— výsledky m ěření, 
— charakter reakce (nap ř. vzplanutí na povrchu, ho ření v celé 
hmotě, jakékoli informace o produktech ho ření atd.),  
— všechny další poznámky, které mají význam pro interpretaci 
výsledků, včetně popisu prudkosti reakce (ho ření plamenem, 
jiskření, uvol ňování dýmu, pomalé doutnání atd.) a p řibližné 
doby trvání p ředběžné bezpe čnostní/screeningové zkoušky jak 
pro zkoušenou, tak pro referen ční látku,  
— výsledky ze zkoušek s inertní látkou, pokud byly provád ěny, 
— výsledky ze zkoušek v inertní atmosfé ře, pokud byly provád ěny. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Látka je považována za oxidující, je-li:  
a) při předběžné zkoušce zjišt ěna prudká reakce;  
b) při úplné zkoušce maximální rychlost ho ření zkoušených sm ěsí 
vyšší nebo stejná jako maximální rychlost ho ření referen ční směsi 
celulosy a dusi čnanu barnatého.  
S cílem vylou čit falešně pozitivní výsledky by m ěly být vzaty 
v úvahu také výsledky získané p ři zkoušení látky ve sm ěsi 
s inertním materiálem a/nebo p ři zkoušce v inertní atmosfé ře. 
4. LITERATURA  
NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Doplněk 
Obrázek  
Forma a p říslušenství pro p řípravu zkoušeného vzorku ve tvaru prachové housenky  
(všechny rozm ěry jsou v milimetrech)
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18  POČETNĚ PRŮMĚRNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOST 
A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMER Ů 
1. METODA  
Tato gelov ě permeační chromatografická metoda je replikou metody 
OECD TG 118 (1996). Základní principy a další technické infor ­
mace jsou uvedeny v odkaze (1).  
1.1 ÚVOD  
Vlastnosti polymer ů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou 
metodu a p řesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by 
pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se p ři separaci 
polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelov ě 
permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použ ­
itelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami 
(viz příloha). V takových p řípadech by m ěly být uvedeny veškeré 
podrobnosti a zd ůvodnění použité metody.  
Popsaná metoda je založena na norm ě DIN 55672 (1). Podrobné 
informace o provád ění experiment ů a o hodnocení údaj ů lze nalézt 
v uvedené norm ě DIN. V p řípadě, že jsou nezbytné úpravy experi ­
mentálních podmínek, musí být zm ěny zdůvodněny. Mohou být 
použity jiné normy, jsou-li na n ě uvedeny úplné odkazy. 
V popsané metod ě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu 
o známé polydisperzit ě a metoda m ůže být upravena tak, aby byla 
vhodná pro ur čité polymery, nap ř. ve vod ě rozpustné polymery 
a polymery s dlouhými v ětvemi.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Početně průměrná molekulová hmotnost M  n a hmotnostn ě průměrná 
molekulová hmotnost M  w se stanoví pomocí t ěchto rovnic: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i xM  i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
kde: 
H i je výška signálu detektoru nad základní čarou pro reten ční objem V  i , 
M i je molekulová hmotnost frakce polymeru s reten čním 
objemem V  i a 
n je počet údajů. 
Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity 
systému, je dána pom ěrem M  w /M n . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena 
kalibrace. k tomuto ú čelu se obvykle používá lineární polystyrenový 
standard s úzkou distribucí se známými pr ůměrnými molekulovými 
hmotnostmi M  n a M  w a se známou distribucí molekulové hmotnosti. 
Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti 
neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standard ů identické.
 
Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elu čním objemem je 
platný pouze za specifických podmínek ur čitého experimentu. 
Podmínky zahrnují p ředevším teplotu, rozpoušt ědlo (nebo sm ěs 
rozpouštědel), chromatografické podmínky a separa ční kolonu nebo 
systém kolon.  
Molekulové hmotnosti stanovené tímto zp ůsobem jsou relativními 
hodnotami a ozna čují se jako „molekulové hmotnosti ekvivalentní 
polystyrenu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem 
a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se 
jiné standardy, nap ř. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), 
poly(methyl-methakrylát), poly(akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno.
 
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Distribuce molekulové hmotnosti vzorku i pr ůměrné molekulové 
hmotnosti (M  n , M  w ) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální 
typ kapalinové chromatografie, p ři němž se vzorek d ělí podle hydro ­
dynamických objem ů jednotlivých složek (2).  
Separace probíhá p ři průchodu vzorku kolonou napln ěnou porézním 
materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou 
do pórů, zatímco velké molekuly nikoli. Pr ůchod velkých molekul je 
tedy kratší a jsou eluovány nejd říve. Středně velké molekuly 
pronikají do n ěkterých pór ů a jsou eluovány pozd ěji. Nejmenší mole ­
kuly se st ředním hydrodynamickým polom ěrem menším než velikost 
pórů gelu pronikají do všech pór ů. Tyto molekuly jsou eluovány 
nakonec.  
V ideálním p řípadě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale 
v praxi je obtížné vyhnout se alespo ň některým rušivým adsorp čním 
jevům. Nestejnom ěrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci 
zhoršit (2).  
Detekce se provádí nap říklad měřením indexu lomu nebo UV 
absorpce a výsledkem je jednoduchá distribu ční křivka. Má-li být 
však křivce přiřazena skute čná molekulová hmotnost, je nezbytné 
kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v 
ideálním p řípadě v podstat ě podobnou strukturou, nap ř. různými 
polystyrenovými standardy. K řivka má zpravidla gaussovský tvar, 
někdy deformovaný prodloužením na stran ě nízké molekulové hmot ­
nosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek r ůzných moleku ­
lových hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus mole ­
kulové hmotnosti.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Opakovatelnost (relativní sm ěrodatná odchylka: RSD) elu čního 
objemu by m ěla být lepší než 0,3 %. Je-li chromatogram hodnocen 
v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí 
být požadovaná opakovatelnost zajišt ěna korekcí vnit řním standar ­
dem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech stan ­
dardů. V případě polystyrenových standard ů jsou typickými hodno ­
tami: 
M p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku)  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1  Příprava standardních roztok ů polystyrenu  
Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve 
zvoleném eluentu. P ři přípravě roztoků se musí zohlednit doporu čení 
výrobce.  
Koncentrace zvolených standard ů závisí na r ůzných faktorech, nap ř. 
na vstřikovaném objemu, viskozit ě roztoku a citlivosti analytického 
detektoru. Maximální vst řikovaný objem musí být p řizpůsoben délce 
kolony, aby nedošlo k p řesycení. Typické vst řikované objemy pro 
analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozm ěrech 30 cm × 
7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale 
neměly by překročit 250 μl. Optimální pom ěr mezi vst řikovaným 
objemem a koncentrací musí být stanoven p řed vlastní kalibrací 
kolony.  
1.6.2  Příprava roztoku vzorku  
Stejné požadavky platí v zásad ě pro přípravu roztok ů vzorku. Vzorek 
se opatrným t řepáním rozpustí ve vhodném rozpoušt ědle, např. 
v tetrahydrofuranu (THF). V žádném p řípadě by neměl být rozpušt ěn 
pomocí ultrazvukové lázn ě. Je-li to nezbytné, p řečistí se roztok 
vzorku filtrací p řes membránový filtr o velikosti pór ů 0,2 až 2 um.  
Přítomnost nerozpušt ěných částic musí být zaznamenána 
v závěrečném protokolu, nebo ť mohou pocházet z frakcí 
s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpušt ěných částic vyjád řené v procentech by m ěla 
být použita vhodná metoda. Roztoky by m ěly být použity do 24 
hodin.
 
1.6.3  Přístroje a pom ůcky 
— zásobník rozpoušt ědla, 
— odplynovací za řízení (podle pot řeby),  
— dávkovací čerpadlo,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— tlumič rázů (podle pot řeby),  
— vstřikovací systém,  
— chromatografické kolony,  
— detektor,  
— průtokoměr (podle pot řeby),  
— zapisova č, 
— nádoba na odpad.  
Musí být zajišt ěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouš ­
tědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).  
1.6.4  Vst řikování a systém dávkování rozpoušt ědla 
Určený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu bu ď dávkova čem, 
nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad 
nebo vpřed (při ručním vnesení) m ůže způsobit změny v pozorované 
distribuci molekulové hmotnosti. Dávkova č rozpoušt ědla by pokud 
možno nem ěl působit rázy a v ideálním p řípadě by měl být opat řen 
tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.  
1.6.5  Kolona  
Podle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá 
kolona nebo n ěkolik za sebou řazených kolon. Komer čně je dostupná 
řada porézních materiál ů definovaných vlastností (nap ř. velikost pór ů, 
vylučovací meze). Výb ěr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak 
na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou 
rozpouštědlo, teplota a pr ůtok (1, 2, 3).
 
1.6.6  Teoretická patra  
Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována 
počtem teoretických pater. P ři použití THF jako eluentu to zahrnuje 
vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpušt ěné 
látky na kolonu známé délky. Po čet teoretických pater je dán touto 
rovnicí: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 
2 
nebo N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 
2 
kde, 
N = je po čet pater v maximu,  
V e = je eluční objem píku,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = ší řka píku na základní čáře, 
W 1/2 = šířka píku v polovin ě výšky.  
1.6.7  Separa ční účinnost  
Vedle počtu teoretických pater, který je veli činou určující šířku pásu, 
hraje roh také separa ční účinnost, která se stanoví ze strmosti kali ­
brační křivky. Separa ční účinnost kolony se získá z tohoto vztahu  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
plocha pr ůřezu kolony ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
kde, 
V e, M x = je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmot ­
ností M  x , 
V e,(10.M x) = je eluční objem pro polystyren s 10krát v ětší moleku ­
lovou hmotností.  
Rozlišení systému je obecn ě definováno tímto vztahem:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
kde, 
V e1 , V e2 = Jsou elu ční objemy dvou standard ů polystyrenu 
v maximu píku,  
W 1 , W  2 = jsou ší řky píků na základní čáře, 
M 1 , M  2 = jsou molekulové hmotnosti odpovídající maximu pík ů 
(měly by se lišit faktorem 10).  
Hodnota R pro kolonový systém by m ěla být větší než 1,7 (4).  
1.6.8  Rozpoušt ědla 
Všechna rozpoušt ědla musí mít vysokou čistotu (v p řípadě THF 
99,5 % čistotu). Zásobník rozpoušt ědla (v p řípadě potřeby pod 
inertní atmosférou) musí být dostate čně velký pro kalibraci kolony 
a pro několik analýz vzorku. Z rozpoušt ědla musí být p řed jeho 
dopravou čerpadlem na kolonu odstran ěny plyny.  
1.6.9  Kontrola teploty  
Teplota kritických vnit řních součástí (vstřikovací smy čky, kolon, 
detektoru a veden) by m ěla být konstantní a m ěla by být 
v souladu s volbou rozpoušt ědla. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10  Detektor  
Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace 
vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbyte čnému rozší ření 
píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Nem ěl by být 
větší než 10 μl, s výjimkou detektor ů k měření rozptylu sv ětla 
a viskozity. k detekci se obvykle používá diferenciálního refrakto ­
metru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elu čního 
rozpouštědla, lze použít jiné typy detektor ů, např. UV/vis, IR detek ­
tory a viskozitní detektory atd.  
2. ÚDAJE A P ŘEDKLÁDANÍ ZPRAV  
2.1 ÚDAJE  
Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se 
registrace a zpracování údaj ů, měla by být použita norma DIN (1).  
Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. 
Analýzy musí být provedeny samostatn ě. 
Pro každé m ěření musí být uvedeny hodnoty M  n , M  w , M  w /M n a M  p . 
Je nezbytné výslovn ě uvést, že nam ěřené hodnoty jsou relativními 
hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého stan ­
dardu.  
Po stanovení reten čních objem ů nebo reten čních časů (případně kori­
govaných za použití vnit řního standardu) se proti t ěmto veličinám 
vynesou do grafu hodnoty log M  p (přičemž M  p je výška maxima 
píku kalibra čního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové 
hmotnosti jsou nezbytné alespo ň dva kalibra ční body a pro celou 
křivku, která by m ěla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost 
vzorku, se požaduje alespo ň pět naměřených bod ů. Poslední bod 
kalibrační křivky na stran ě nízkých molekulových hmotností se 
určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpoušt ěd­
lem. Početně a hmotnostn ě průměrné molekulové hmotnosti se 
obecně určí elektronickým zpracováním údaj ů založeným na rovni ­
cích v bod ě 1.2. Při manuálním zpracování údaj ů do číselné formy 
lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).  
Distribuční křivka musí být znázorn ěna ve form ě tabulky nebo 
graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost 
v procentech proti log M). V grafickém znázorn ění by měl mít 
jeden řád molekulové hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku 
by měla být asi 8 cm. U integrálních distribu čních křivek by m ěla 
být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose p řibližně 10 cm.  
2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
2.2.1  Zkoušená látka:  
— dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, p řísady, nečis­
toty),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— popis zpracování vzorku, pozorované skute čnosti, problémy.  
2.2.2  Přístrojové vybavení:  
— zásobník eluentu, inertní plyn, odplyn ění eluentu, složení eluentu, 
nečistoty,  
— dávkovací čerpadlo, tlumi č rázů, vstřikovací systém,  
— separa ční kolony (výrobce, všechny informace 
o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pór ů, druh separa č­
ního materiálu atd., po čet, délka a po řadí použitých kolon),  
— počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), 
separační účinnost (rozlišení systému),  
— informace o symetrii pík,  
— teplota kolony, zp ůsob řízení teploty,  
— detektor (princip m ěření, typ, objem kyvety),  
— průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip m ěření), 
— systém pro záznam a zpracování údaj ů (hardware a software).  
2.2.3  Kalibrace systému:  
— podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibra ční křivky,  
— informace o kritériích jakosti této metody (nap ř. korelační koefi­
cient, sou čet čtverců chyb atd.),  
— informace o všech extrapolacích, p ředpokladech a aproximacích 
provedených b ěhem experimentálního postupu a p ři hodnocení 
a zpracování údaj ů, 
— všechny nam ěřené hodnoty použité p ři konstrukci kalibra ční 
křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro 
každý kalibra ční bod obsahovat tyto informace:  
— název vzorku,  
— výrobce vzorku,  
— charakteristické hodnoty standard ů M p , M  n , M  w , M  w /M n , jak 
jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjišt ěny 
z následných m ěření, spole čně s podrobnostmi o metod ě 
stanovení,  
— vstříknutý objem a vst říknutá koncentrace,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— hodnota M  p použitá po kalibraci  
— eluční objem nebo korigovaný reten ční čas měřený v maximu 
píku,  
— hodnota M  p vypočtená pro maximum píku,  
— chyba vypo čtené hodnoty M  p a kalibrační hodnoty M  p vyjád­ 
řená v procentech.  
2.2.4  Hodnocení:  
— hodnocení vlivu času: metody použité pro zajišt ění požadované 
reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnit řní standard atd.),  
— informace o tom, zda bylo hodnocení provedeno na základ ě 
elučního objemu nebo reten čního času. 
— informace o mezích hodnocení v p řípadě, že pík nebyl úpln ě 
analyzován,  
— popis metody vyrovnávání k řivek, bylo-li použito,  
— příprava a postupy p ředúpravy vzorku,  
— popřípadě přítomnost nerozpušt ěných částic,  
— vstříknutý objem ( μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),  
— pozorované skute čnosti, které vedou k odchylkám od ideálních 
charakteristik metody GPC,  
— podrobný popis všech zm ěn zkušebních postup ů, 
— podrobnosti o rozsahu chyb,  
— jakékoli další informace a pozorování relevantní pro interpretaci 
výsledků. 
3. LITERATURA  
1) DIN 55672 (1995) GelpermeationsChromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.
 
4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Doplněk 
Příklady jiných metod stanovení po četně průměrné molekulové hmotnosti 
(M n ) polymer ů 
Gelově permeační chromatografie (GPC) je preferovanou metodou stanovení M  n , 
zejména tehdy, je-li k dispozici sada standard ů, jejichž struktura je srovnatelná se 
strukturou polymeru. Vyskytnou-li se praktické obtíže p ři použití GPC nebo 
očekává-li se, že látka nevyhoví regulativním kritériím na M  n , (což je t řeba 
potvrdit), jsou k dispozici alternativní metody, jako jsou:  
1. Využití koligativních vlastností  
1.1 Ebulioskopie/kryoskopie:  
spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu 
tuhnutí (kryoskopie) rozpoušt ědla po p řidání polymeru. Metoda je 
založena na skute čnosti, že vliv rozpušt ěného polymeru na bod varu 
nebo bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1, 2).  
Použitelnost: M  n < 20 000.  
1.2 Snížení tlaku par:  
spočívá v m ěření tlaku par zvolené referen ční kapaliny p řed 
přidáním a po p řidání známého množství polymeru (1, 2).  
Použitelnost: M  n < 20 000 (teoretická; v praxi však má omezený 
význam).  
1.3 Membránová osmometrie:  
spočívá na principu osmózy, tj. p řirozené snahy molekul rozpouš ­
tědla proniknout polopropustnou membránou ze z ředěného do 
koncentrovaného roztoku a dosáhnout rovnováhy. P ři zkoušce je 
koncentrace z ředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný 
roztok obsahuje polymer. Pronikáním rozpoušt ědla membránou 
dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti polymeru (1, 3, 4).
 
Použitelnost: M  n od 20 000 do 200 000.  
1.4 Osmometrie v parní fázi:  
spočívá ve srovnání rychlosti vypa řování aerosolu čistého rozpouš ­
tědla s alespo ň třemi aerosoly obsahujícími polymer v r ůzných 
koncentracích (1, 5, 6).  
Použitelnost: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Analýza koncových skupin  
Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, 
tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od 
hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací nebo deriva ­
tizací). Stanovení po čtu koncových skupin polymeru m ůže vést 
k hodnotě molekulové hmotnosti (7, 8, 9).  
Použitelnost: M  n až do 50 000 (s klesající spolehlivostí).  
3. Literatura  
1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York.  
2) Glover, CA., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, 
Jr. ed., Marcel Dekker, New York.  
3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by 
Membrane Osmometry. American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania.  
4) Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25–52.
 
5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 
6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Deter ­
minationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley 
and Sons.  
7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: 
Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel 
Dekker, New York.  
9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139- 
2146.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19  OBSAH NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK V POLYMERECH  
1. METODA  
Tato gelov ě permeační chromatografická metoda je replikou metody 
OECD TG 119 (1996). Základní principy a další technické infor ­
mace jsou uvedeny v odkazech.  
1.1 ÚVOD  
Vlastnosti polymer ů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou 
metodu a p řesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by 
pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se p ři separaci 
polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelov ě 
permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použ ­
itelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami 
(viz příloha). V takových p řípadech by m ěly být uvedeny veškeré 
podrobnosti a zd ůvodnění použité metody.  
Popsaná metoda je založena na norm ě DIN 55672 (1). Podrobné 
informace o provád ění experiment ů a o hodnocení údaj ů lze nalézt 
v uvedené norm ě DIN. V p řípadě, že jsou nezbytné úpravy experi ­
mentálních podmínek, musí být zm ěny zdůvodněny. Mohou být 
použity jiné normy, jsou-li na n ě uvedeny úplné odkazy. 
V popsané metod ě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu 
o známé polydisperzit ě a metoda m ůže být upravena tak, aby byla 
vhodná pro ur čité polymery, nap ř. ve vod ě rozpustné polymery 
a polymery s dlouhými v ětvemi.  
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Nízká molekulová hmotnost je konven čně definována jako moleku ­
lová hmotnost pod 1 000.  
Početně průměrná molekulová hmotnost M  n a hmotnostn ě průměrná 
molekulová hmotnost M  w se stanoví pomocí t ěchto rovnic: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i xM  i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
kde, 
H i = je výška signálu detektoru nad základní čarou pro reten ční 
objem V  i , 
M i = je molekulová hmotnost frakce polymeru pro reten ční objem 
V i a n je po čet údajů. 
Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity 
systému, je dána pom ěrem M  w /M n . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena 
kalibrace. K tomuto ú čelu se obvykle používá lineární polystyrenový 
standard s úzkou distribucí se známými pr ůměrnými molekulovými 
hmotnostmi M  n a M  w a se známou distribucí molekulové hmotnosti. 
Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti 
neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standard ů identické.
 
Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elu čním objemem je 
platný pouze za specifických podmínek ur čitého experimentu. 
Podmínky zahrnují p ředevším teplotu, rozpoušt ědlo (nebo sm ěs 
rozpouštědel), chromatografické podmínky a separa ční kolonu nebo 
systém kolon.  
Molekulové hmotnosti stanovené tímto zp ůsobem jsou relativními 
hodnotami a ozna čují se jako „molekulové hmotnosti ekvivalentní 
polystyrenu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem 
a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se 
jiné standardy, nap ř. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), 
poly(methyl-methakrylát), poly (akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno.
 
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Distribuce molekulové hmotnosti vzorku i pr ůměrné molekulové 
hmotnosti (M  n , M  w ) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální 
typ kapalinové chromatografie, p ři němž se vzorek d ělí podle hydro ­
dynamických objem ů jednotlivých složek (2).  
Separace probíhá p ři průchodu vzorku kolonou napln ěnou porézním 
materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou 
do pórů, zatímco velké molekuly nikoliv. Pr ůchod velkých molekul 
je tedy kratší a jsou eluovány nejd říve. Středně velké molekuly 
pronikají do n ěkterých pór ů a jsou eluovány pozd ěji. Nejmenší mole ­
kuly se st ředním hydrodynamickým polom ěrem menším než velikost 
pórů gelu pronikají do všech pór ů. Tyto molekuly jsou eluovány 
nakonec.  
V ideálním p řípadě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale 
v praxi je obtížné vyhnout se alespo ň některým rušivým adsorp čním 
jevům. Nestejnom ěrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci 
zhoršit (2).  
Detekce se provádí nap říklad měřením indexu lomu nebo UV 
absorpce a výsledkem je jednoduchá distribu ční křivka. Má-li být 
však křivce přiřazena skute čná molekulová hmotnost, je nezbytné 
kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v 
ideálním p řípadě v podstat ě podobnou strukturou, nap ř. různé polys ­
tyrenové standardy. K řivka má zpravidla gaussovský tvar, n ěkdy 
deformovaný prodloužením na stran ě nízké molekulové hmotnosti, 
přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek r ůzných molekulových 
hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus molekulové 
hmotnosti.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Obsah molekul o nízké hmotnosti se ode čte z této kalibra ční křivky. 
Výpočet může být správný pouze tehdy, je-li odezva nízkomoleku ­
lárních látek hmotnostn ě ekvivalentní polymeru jako celku.  
1.5 KRITERIA JAKOSTI  
Opakovatelnost (relativní sm ěrodatná odchylka: RSD) elu čního 
objemu by m ěla být lepší než 0,3 %. Je-li chromatogram hodnocen 
v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí 
být požadovaná opakovatelnost zajišt ěna korekcí vnit řním standar ­
dem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech stan ­
dardů. V případě polystyrenových standard ů jsou typickými hodno ­
tami: 
M p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p < 10  6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku)  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1  Příprava standardních roztok ů polystyrenu  
Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve 
zvoleném eluentu. P ři přípravě roztoků se musí zohlednit doporu čení 
výrobce.  
Koncentrace zvolených standard ů závisí na r ůzných faktorech, nap ř. 
na vstřikovaném objemu, viskozit ě roztoku a citlivosti analytického 
detektoru. Maximální vst řikovaný objem musí být p řizpůsoben délce 
kolony, aby nedošlo k p řesycení. Typické vst řikované objemy pro 
analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozm ěrech 30 × 
7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale 
neměly by překročit 250 μl. Optimální pom ěr mezi vst řikovaným 
objemem a koncentrací musí být stanoven p řed vlastní kalibrací 
kolony.  
1.6.2  Příprava roztoku vzorku  
Stejné požadavky platí v zásad ě pro přípravu roztok ů vzorku. Vzorek 
se opatrným t řepáním rozpustí ve vhodném rozpoušt ědle, např. 
v tetrahydrofuranu (THF). V žádném p řípadě by neměl být rozpušt ěn 
pomocí ultrazvukové lázn ě. Je-li to nezbytné, p řečistí se roztok 
vzorku filtrací p řes membránový filtr o velikosti pór ů 0,2 až 2 um.  
Přítomnost nerozpušt ěných částic musí být zaznamenána 
v závěrečném protokolu, nebo ť mohou pocházet z frakcí 
s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpušt ěných částic vyjád řené v procentech by m ěla 
být použita vhodná metoda. Roztoky by m ěly být použity do 24 
hodin.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3  Korekce na obsah ne čistot a přísad 
Korekce obsahu frakce s M < 1 000 v d ůsledku příspěvku od přítom­
ných nepolymerních specifických složek (nap ř. nečistot a/nebo 
přísad) je obvykle nezbytná, není-li nam ěřený obsah < 1 %. Dosáhne 
se toho p římou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC.  
V případech, kdy je eluát po pr ůchodu kolonou pro další analýzu 
příliš zředěný, musí být zkoncentrován. M ůže být nezbytné odpa řit 
eluát do sucha a op ět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být 
provedeno za podmínek, p ři nichž je zajišt ěno, že nedojde ke 
změnám v eluátu. Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické 
metodě použité ke kvantitativnímu stanovení.  
1.6.4  Přístroje a pom ůcky 
Aparatura pro GPC sestává z t ěchto částí: 
— zásobník rozpoušt ědla, 
— odplynovací za řízení (podle pot řeby),  
— dávkovací čerpadlo,  
— tlumič rázů (podle pot řeby),  
— vstřikovací systém,  
— chromatografické kolony,  
— detektor,  
— průtokoměr (podle pot řeby),  
— zapisova č, 
— nádoba na odpad.  
Musí být zajišt ěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouš ­
tědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).  
1.6.5  Vst řikování a systém dávkování rozpoušt ědla 
Určený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu bu ď dávkova čem 
nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad 
nebo vpřed (při ručním vnesení) m ůže způsobit změny v pozorované 
distribuci molekulové hmotnosti. Dávkova č rozpoušt ědla by pokud 
možno nem ěl působit rázy a v ideálním p řípadě by měl být opat řen 
tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.  
1.6.6  Kolona  
Podle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá 
kolona nebo n ěkolik za sebou řazených kolon. Komer čně je dostupná 
řada porézních materiál ů definovaných vlastností (nap ř. velikost pór ů, 
vylučovací meze). Výb ěr separačního gelu nebo délky kolony závisí 
jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce mole ­
kulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako 
jsou rozpoušt ědlo, teplota a pr ůtok (1, 2, 3).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7  Teoretická patra  
Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována 
počtem teoretických pater. P ři použití THF jako eluentu to zahrnuje 
vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpušt ěné 
látky na kolonu známé délky. Po čet teoretických pater je dán touto 
rovnicí: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 
2 nebo N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 
2 
kde, 
N = je po čet pater v maximu,  
V e = je eluční objem píku,  
W = ší řka píku na základní čáře, 
W 1/2 = šířka píku v polovin ě výšky.  
1.6.8  Separa ční účinnost  
Vedle počtu teoretických pater, který je veli činou určující šířku pásu, 
hraje roh také separa ční účinnost, která se stanoví ze strmosti kali ­
brační křivky. Separa ční účinnost kolony se získá z tohoto vztahu:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
plocha pr ůřezu kolony ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
kde, 
V e, M x = je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmot ­
ností M  x 
Ve ,(10.M x) = je eluční objem pro polystyren s 10krát v ětší moleku ­
lovou hmotností. Rozlišení systému je obecn ě defino­
váno tímto vztahem:  
kde, 
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
kde, 
V e1 , V e2 = jsou elu ční objemy dvou standard ů polystyrenu 
v maximu píku,  
W 1 , W  2 = jsou ší řky píků na základní čáře, 
M 1 , M  2 = jsou molekulové hmotnosti odpovídající maximu pík ů 
(měly by se lišit faktorem 10).  
Hodnota R pro kolonový systém by m ěla být větší než 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9  Rozpoušt ědla 
Všechna rozpoušt ědla musí mít vysokou čistotu (v p řípadě THF 
99,5 % čistotu). Zásobník rozpoušt ědla (v p řípadě potřeby pod 
inertní atmosférou) musí být dostate čně velký pro kalibraci kolony 
a pro několik analýz vzorku. Z rozpoušt ědla musí být p řed jeho 
dopravou čerpadlem na kolonu odstran ěny plyny.  
1.6.10  Kontrola teploty  
Teplota kritických vnit řních součástí (vstřikovací smy čky, kolon, 
detektoru a vedení) by m ěla být konstantní a m ěla by být 
v souladu s volbou rozpoušt ědla. 
1.6.11  Detektor  
Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace 
vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbyte čnému rozší ření 
píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Nem ěl by být 
větší než 10 μl, s výjimkou detektor ů k měření rozptylu sv ětla 
a viskozity. K detekci se obvykle používá diferenciálního refrakto ­
metru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elu čního 
rozpouštědla, lze použít jiné typy detektor ů, např. UV/vis, IR detek ­
tory a viskozitní detektory atd.  
2. ÚDAJE A P ŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV  
2.1 ÚDAJE  
Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se 
registrace a zpracování údaj ů, měla by být použita norma DIN (1).  
Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. 
Analýzy musí být provedeny samostatn ě. Ve všech p řípadech je 
důležité stanovit také údaje ze slepých pokus ů zpracovaných za stej ­
ných podmínek jako vzorek.  
Je nezbytné výslovn ě uvést, že nam ěřené hodnoty jsou relativními 
hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého stan ­
dardu.  
Po stanovení reten čních objem ů nebo reten čních časů (případně kori­
govaných za použití vnit řního standardu) se proti t ěmto veličinám 
vynesou do grafu hodnoty log M  p (přičemž M  p je výška maxima 
píku kalibra čního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové 
hmotnosti jsou nezbytné alespo ň dva kalibra ční body a pro celou 
křivku, která by m ěla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost 
vzorku, se požaduje alespo ň pět naměřených bod ů. Poslední bod 
kalibrační křivky na stran ě nízkých molekulových hmotností se 
určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpoušt ěd­
lem. Při stanovení se část křivky odpovídající molekulovým hmot ­
nostem nižším než 1 000 podle pot řeby koriguje na ne čistoty 
a přísady. Elu ční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického 
zpracování údaj ů. Při manuálním zpracování údaj ů do číselné formy 
lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Jestliže je v kolon ě zachycen nerozpustný polymer, je jeho moleku ­
lová hmotnost pravd ěpodobně vyšší než molekulová hmotnost 
rozpuštěné frakce, a pokud by tato skute čnost nebyla zohledn ěna, 
došlo by k nadhodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah 
nerozpušt ěného polymeru je uveden v p říloze.
 
Distribuční křivka musí být znázorn ěna ve form ě tabulky nebo 
graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost 
v procentech proti log M). V grafickém znázorn ění by měl mít 
jeden řád molekulové hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku 
by měla být asi 8 cm. U integrálních distribu čních křivek by m ěla 
být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose p řibližně 10 cm.  
2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
2.2.1  Zkoušená látka:  
— dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, p řísady, nečis­
toty),  
— popis zpracování vzorku, pozorované skute čnosti, problémy.  
2.2.2  Přístrojové vybavení:  
— zásobník eluentu, inertní plyn, odplyn ění eluentu, složení eluentu, 
nečistoty,  
— dávkovací čerpadlo, tlumi č rázů, vstřikovací systém,  
— separa ční kolony (výrobce, všechny informace 
o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pór ů, druh separa č­
ního materiálu atd., po čet, délka a po řadí použitých kolon),  
— počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), 
separační účinnost (rozlišení systému),  
— informace o symetrii pík ů, 
— teplota kolony, zp ůsob řízení teploty,  
— detektor (princip m ěření, typ, objem kyvety),  
— průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip m ěření), 
— systém pro záznam a zpracování údaj ů (hardware a software).  
2.2.3  Kalibrace systému:  
— podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibra ční křivky, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— informace o kritériích jakosti této metody (nap ř. korelační koefi­
cient, sou čet čtverců chyb atd.),  
— informace o všech extrapolacích, p ředpokladech a aproximacích 
provedených b ěhem experimentálního postupu a p ři hodnocení 
a zpracování údaj ů, 
— všechny nam ěřené hodnoty použité p ři konstrukci kalibra ční 
křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro 
každý kalibra ční bod obsahovat tyto informace:  
— název vzorku,  
— výrobce vzorku,  
— charakteristické hodnoty standard ů M p , M  n , M  w , M  w /M n , jak 
jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjišt ěny 
z následných m ěření, spole čně s podrobnostmi o metod ě 
stanovení,  
— vstříknutý objem a vst říknutá koncentrace,  
— hodnota M  p použitá po kalibraci  
— eluční objem nebo korigovaný reten ční čas měřený v maximu 
píku,  
— hodnota M  p vypočtená pro maximum píku,  
— chyba vypo čtené hodnoty M  p a kalibrační hodnoty M  p vyjád­ 
řená v procentech.  
2.2.4  Informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností 
v polymeru:  
— popis metod použitých v analýze a zp ůsobu, jakým byly experi ­
menty provedeny,  
— informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností 
vyjádřeném v hmotnostních procentech celkového vzorku,  
— informace o ne čistotách, p řísadách a jiných nepolymerních podí ­
lech vyjád řených v hmotnostních procentech celkového vzorku.  
2.2.5  Hodnocení:  
— hodnocení vlivu času: metody použité pro zajišt ění požadované 
reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnit řní standard atd.),  
— informace o tom, zda bylo hodnocení provedeno na základ ě 
elučního objemu nebo reten čního času, 
— informace o mezích hodnocení v p řípadě, že pík nebyl úpln ě 
analyzován,  
— popis metody vyrovnávání k řivek, bylo-li použito,  
— příprava a postupy p ředúpravy vzorku,  
— popřípadě přítomnost nerozpušt ěných částic, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— vstříknutý objem ( μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),  
— pozorované skute čnosti, které vedou k odchylkám od ideálních 
charakteristik metody GPC,  
— podrobný popis všech zm ěn zkušebních postup ů, 
— podrobnosti o rozsahu chyb,  
— jakékoli další informace a pozorování relevantní pro interpretaci 
výsledků. 
3. LITERATURA  
1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.
 
4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Doplněk 
Korekce obsahu nízkomolekulárních látek na p řítomnost nerozpušt ěného 
polymeru  
Je-li ve vzorku p řítomen nerozpušt ěný polymer, dochází ke ztrát ě hmotnosti 
během analýzy GPC. Nerozpušt ěné polymery jsou nevratn ě zachyceny 
v koloně nebo na filtru p ři filtraci vzorku, zatímco rozpustný podíl vzorku 
kolonou projde. V p řípadě, že lze odhadnout nebo zm ěřit přírůstek indexu 
lomu (dn/dc) polymeru, lze odhadnout ztrátu hmotnosti vzorku na kolon ě. 
V takovém p řípadě se korekce provede pomocí externí kalibrace standardními 
materiály o známé koncentraci a známé hodnot ě dn/dc, čímž se kalibruje refrak ­
tometr. V p říkladě uvedeném dále je jako standard použit poly(methyl-metha ­
krylát) (PMMA).  
Při externí kalibraci pro analýzu polyakrylát ů se analyzuje metodou GPC stan ­
dard PMMA známé koncentrace v tetrahydrofuranu a výsledné údaje se použijí 
pro nalezení konstanty refraktometru podle rovnice:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
kde: 
K = je konstanta refraktometru ( μV/s/ml),  
R = je ode čet pro standard PMMA ( μV/s),  
C = je koncentrace standardu PMMA (mg/ml),  
V = je vst říknutý objem (ml) a  
dn/dc = je p řírůstek indexu lomu pro PMMA v tetrahydrofuranu (ml/mg).  
Pro standard PMMA jsou typické tyto údaje:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  –5 ml/mg  
Výsledná hodnota K = 3,05 × 10  11 se poté použije pro výpo čet teoretické odezvy 
detektoru v p řípadě, že detektorem prošlo 100 % vst říknutého polymeru.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20  CHOVÁNÍ POLYMER Ů PŘI ROZPOUŠT ĚNÍ NEBO 
EXTRAKCI VE VOD Ě 
1. METODA  
Popsaná metoda je replikou revidované verze metody OECD TG 120 
(1997). Další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1).  
1.1 ÚVOD  
U určitých polymer ů, např. emulzních polymer ů, může být p řed 
použitím dále popsané metody nezbytná p ředúprava. Tato metoda 
není použitelná pro kapalné polymery a pro polymery, které za 
zkušebních podmínek reagují s vodou.  
Není-li metoda použitelná nebo proveditelná, je možné zkoumat 
chování polymer ů při rozpoušt ění a extrakci jinými metodami. 
V takových p řípadech by m ěly být uvedeny všechny podrobnosti 
použité metody a její zd ůvodnění. 
1.2 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Nejsou.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Chování polymer ů při rozpoušt ění nebo extrakci ve vodném 
prostředí se zjiš ťuje baňkovou metodou (viz A.6 Rozpustnost ve 
vodě, baňková metoda) s úpravou uvedenou dále.  
1.4 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou.  
1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.5.1  Přístroje a pom ůcky 
Pro provedení metody je nezbytné toto za řízení:  
— drticí za řízení, nap ř. mlýnek pro p řípravu částic o známé veli ­
kosti,  
— třepačka s možností řízení teploty,  
— membránový filtra ční systém,  
— vhodné analytické vybavení,  
— normalizovaná síta.  
1.5.2  Příprava vzorku  
Reprezentativní vzorek musí být nejd říve omezen za použití vhod ­
ného síta na velikost částic 0,125 až 0,25 mm. Kv ůli stálosti vzorku 
nebo kvůli procesu drcení m ůže být nezbytné chlazení. Kau čukovité 
materiály mohou být drceny p ři teplotě kapalného dusíku (1).  
Pokud není možné dosáhnout požadované velikosti částic, je t řeba 
přijmout taková opat ření, aby byla velikost částic zmenšena co 
nejvíce; výsledky by m ěly být zaznamenány. Ve zpráv ě je nezbytné 
uvést, jak byl rozdrcený vzorek uchován do provedení zkoušky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3  Postup  
Do každé ze t ří nádob opat řených sklen ěnými zátkami se naváží po 
10 g zkoušené látky a p řidá se po 1 000 ml vody. Ukáže-li se 
zpracování 10 g polymeru nesch ůdným, m ělo by být použito 
nejbližší vyšší množství, které lze zpracovat, a objem vody by m ěl 
být podle toho upraven.  
Nádoby se t ěsně zazátkují a poté se t řepou při 20  o C. Měla by být 
použita t řepačka nebo mícha čka schopná pracovat p ři konstantní 
teplotě. Po 24 hodinách se obsah každé nádoby odst ředí nebo zfil ­
truje a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví 
koncentrace polymeru. Nejsou-li k dispozici vhodné analytické metody pro vodnou fázi, lze celkovou rozpustnost nebo extrahova ­
telnost zhodnotit z hmotnosti sušiny na filtru nebo odst ředěné sraže­
niny.
 
Obvykle je nezbytné kvantitativn ě rozlišit ne čistoty a p řísady na 
jedné stran ě a nízkomolekulární podíly na druhé stran ě. V případě 
gravimetrického stanovení je také d ůležité provést slepý pokus bez 
použití zkoušené látky s cílem zohlednit zbytky pocházející z experimentálního postupu.
 
Chování p ři rozpoušt ění nebo extrakci polymer ů ve vodě při 37  o C 
a pH 2 a 9 m ůže být stanoveno zp ůsobem popsaným v p řípadě 
provádění experimentu p ři 20  o C. Hodnot pH lze dosáhnout p řidáním 
buď vhodných pufr ů, nebo vhodných kyselin nebo zásad, nap ř. kyse­
liny chlorovodíkové, kyseliny octové, hydroxidu sodného nebo 
draselného analytické čistoty nebo NH  3 . 
V závislosti na použité metod ě by měla být provedena jedna nebo 
dvě zkoušky. Jsou-li k dispozici dostate čně specifické metody pro 
přímou analýzu vodné fáze na obsah polymeru, m ěla by stačit jedna 
zkouška, jak je uvedena výše. Nejsou-li však takové metody 
k dispozici a zjišt ění chování polymeru p ři rozpoušt ění nebo extrakci 
je omezeno na nep římou analýzu stanovením celkového obsahu 
organického uhlíku (TOC) ve vodném extraktu, m ěla by být 
provedena dodate čná zkouška. Tato dodate čná zkouška by m ěla 
být rovněž provedena t řikrát, přičemž se použije 10krát menší množ ­
ství vzork ů polymeru a stejné množství vody jako v první zkoušce.  
1.5.4  Analýza  
1.5.4.1  Zkouška s jednou velikostí vzorku  
Metody pro p římou analýzu složek polymeru ve vodné fázi mohou 
být k dispozici. V opa čném případě lze také zvážit nep římou analýzu 
rozpuštěných nebo extrahovaných složek polymeru stanovením 
celkového obsahu rozpustných složek a provedením korekce na 
obsah nepolymerních složek.  
Analýza vodné fáze na obsah celkového polymerního podílu je 
možná:  
buď dostatečně citlivou metodou, nap ř. 
— stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) 
rozkladem persíranem nebo dichromanem za vzniku CO  2 
a následnou IR analýzou nebo chemickou analýzou,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— atomovou absorp ční spektrometrií (AAS) nebo jejím prot ějškem 
spektrometrií s induk čně vázaným plazmatem (ICP) pro siliko ­
nové polymery nebo polymery obsahující kov,  
— UV absorpcí nebo spektrofluorimetrií pro aromatické polymery,  
— kapalinovou chromatografií s hmotovým spektrometrem (LC- 
MS) pro nízkomolekulární vzorky,  
nebo vakuovým odpa řením vodného extraktu do sucha 
a spektroskopickou (IR nebo UV atd.) nebo AAS/ICP analýzou 
zbytku.  
Není-li analýza vodné fáze jako takové možná, m ěl by být vodný 
extrakt extrahován organickým rozpoušt ědlem nemísitelným 
s vodou, nap ř. chlorovaným uhlovodíkem. Rozpoušt ědlo se poté 
odpaří a zbytek se analyzuje zp ůsobem popsaným výše pro obsah 
polymeru. Jakékoli složky, které jsou identifikovány jako ne čistoty 
nebo přísady, se ode čtou, aby byl stanoven stupe ň rozpustnosti 
samotného polymeru.  
Jsou-li přítomna relativn ě velká množství takových materiál ů, může 
být nezbytné analyzovat zbytek nap říklad HPLC nebo GC, aby se 
odlišily ne čistoty z p řítomného monomeru nebo deriváty monomeru 
a aby tak mohl být stanoven skute čný obsah monomeru nebo jeho 
derivátů. 
V některých p řípadech m ůže být posta čující pouhé odpa ření orga­
nického rozpoušt ědla do sucha a zvážení suchého zbytku.  
1.5.4.2  Zkouška se dv ěma různými velikostmi vzorku  
Všechny vodné extrakty se analyzují na celkový obsah organického 
uhlíku (TOC).  
Provede se gravimetrické stanovení nerozpušt ěného nebo ne extra ­
hovaného podílu vzorku. Z ůstávají-li po odst ředění nebo filtraci 
obsahu každé nádoby usazeny na st ěnách nádoby zbytky polymeru, 
měla by být nádoba oplachována filtrátem, dokud není vy čištěna od 
všech viditelných zbytk ů. Poté se filtrát op ět odstředí nebo zfiltruje. 
Zbytky, které z ůstanou na filtru nebo v centrifuga ční kyvetě, se 
vysuší ve vakuu p ři 40  o C a zváží. Sušení se provádí do konstantní 
hmotnosti.  
2. ÚDAJE  
2.1 ZKOUŠKA S JEDNOU VELIKOSTÍ VZORKU  
Pro každou ze t ří nádob by m ěly být uvedeny jednotlivé výsledky 
a průměrné hodnoty vyjád řené v jednotkách hmotnosti vztažené na 
objem roztoku (obvykle mg/l) nebo v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost vzorku polymeru (obvykle mg/g). Krom ě toho by m ěla 
být uvedena ztráta hmotnosti vzorku (vypo čtená jako hmotnost 
rozpuštěné látky d ělená hmotností výchozího vzorku). M ěly by být 
vypočteny relativní sm ěrodatné odchylky (RSD). M ěly by být 
uvedeny jednotlivé hodnoty pro celkovou látku (polymer + hlavní 
přísady atd.) a pro samotný polymer (tj. po ode čtení příspěvku od 
těchto přísad).
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2 ZKOUŠKA SE DV ĚMA RŮZNÝMI VELIKOSTMI VZORKU  
Pro každý experiment by m ěly být uvedeny jednotlivé hodnoty TOC 
ve vodných extraktech obou trojích experiment ů a průměrné hodnoty 
vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku 
(obvykle mg C/l) a rovn ěž v jednotkách hmotnosti vztažené na 
hmotnost výchozího vzorku (obvykle mg C/g).  
Není-li mezi výsledky pro vysoké a nízké pom ěry vzorek/voda 
rozdíl, m ůže to znamenat, že všechny extrahovatelné složky byly 
skutečně vyextrahovány. V takovém p řípadě obvykle nebývá p římá 
analýza nezbytná.  
Měly by být uvedeny jednotlivé hmotnosti zbytk ů vyjádřené 
v procentech po čátečních hmotností vzork ů. Měly by být vypo čteny 
průměrné hodnoty za celý experiment. Rozdíly mezi 100 % 
a zjištěnými hodnotami v procentech p ředstavují množství rozpust ­
ného a extrahovatelného materiálu v p ůvodním vzorku vyjád řené 
v procentech.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
3.1.1  Zkoušená látka:  
— dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, p řísady, nečis­
toty, obsah podílu o nízké molekulové hmotnosti).  
3.1.2  Experimentální podmínky:  
— popis použitých postup ů a experimentálních podmínek,  
— popis analytických a detek čních metod.  
3.1.3  Výsledky:  
— výsledky rozpustnosti nebo extrahovatelnosti v mg/l; jednotlivé 
a střední hodnoty pro extrak ční zkoušky v r ůzných roztocích, 
rozepsané podle obsahu polymeru, ne čistot, přísad atd.,  
— výsledky rozpustnosti nebo extrahovatelnosti v mg/g polymeru,  
— hodnoty TOC ve vodných extraktech, hmotnost rozpušt ěné látky 
a vypočtené procentuální hodnoty (pokud byly stanoveny),  
— hodnota pH každého vzorku,  
— informace o hodnotách získaných p ři slepém pokusu,  
— podle pot řeby upozorn ění na chemickou nestálost zkoušené látky 
během zkušebních postup ů a analytických postup ů, 
— všechny informace, které jsou d ůležité pro interpretaci výsledk ů. 
4. LITERATURA  
1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für 
Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21  OXIDA ČNÍ VLASTNOSTI (KAPALINY)  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Tato zkušební metoda slouží ke stanovení schopnosti kapalné látky 
zvyšovat rychlost ho ření nebo intenzitu ho ření hořlavé látky nebo 
vytvářet směs s hořlavou látkou, která se po d ůkladném promísení 
samovoln ě vznítí. Je založena na zkoušce OSN pro kapaliny 
podporující ho ření (1) a je jí rovnocenná. Vzhledem k tomu, že 
tato metoda A.21 byla v prvé řadě zavedena s ohledem na poža ­
davky sm ěrnice nařízení (ES) č. 1907/2006, vyžaduje se srovnání 
pouze s jednou referen ční látkou. Další zkoušení a srovnávání 
s dalšími referen čními látkami bude nutné, mají-li být výsledky 
zkoušky použity pro jiné ú čely (  1 ). 
Tato zkouška nemusí být provád ěna, pokud je z rozboru strukturního 
vzorce zcela nepochybné, že látka nem ůže s jiným ho řlavým mate ­
riálem reagovat exotermicky.  
Před provád ěním zkoušky je užite čné mít p ředběžné informace 
o možných výbušných vlastnostech látky.  
Tato zkouška není použitelná pro pevné látky, plyny, výbušné nebo 
vysoce ho řlavé látky nebo organické peroxidy.  
Tato zkouška nemusí být provád ěna, pokud jsou pro danou látku již 
k dispozici výsledky zkoušky OSN pro kapaliny podporující hoření (1).
 
1.2 DEFINICE A JEDNOTKY  
Průměrnou dobou nár ůstu tlaku se rozumí pr ůměr naměřených časo­
vých hodnot, v jejichž pr ůběhu dojde v testované sm ěsi k nárůstu 
tlaku z 690 kPa na 2 070 kPa nad atmosférický tlak.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKA  
Jako referen ční látka se použije 65 % (hmot.) vodný roztok kyseliny 
dusičné p.a. (  2 ). ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Např. pro účely předpisů OSN pro p řepravu. 
( 2 ) Koncentrace kyseliny by m ěla být před zkoušením stanovena titrací.
 Pokud experimentátor p ředpokládá, že výsledky zkoušky mohou být 
případně použity pro jiné ú čely (  1 ), je vhodné použít více referen ­ 
čních látek (  1 ). 
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená kapalina se smísí v pom ěru 1:1 (hmot.) s vláknitou 
celulosou a vpraví se do tlakové nádoby. Pokud dojde p ři 
mísení nebo pln ění k samovolnému vznícení, není t řeba ve 
zkoušce pokra čovat.  
Pokud k samovolnému vznícení nedojde, provede se celá zkou ­ 
ška. Směs se zah řívá v tlakové nádob ě a měří se průměrná 
doba, za kterou dojde k nár ůstu tlaku z 690 kPa na 2 070 
kPa nad atmosférický tlak. Tato hodnota se porovná 
s průměrnou dobou pro sm ěs referenční látky (referen čních látek) 
a celulosy v pom ěru 1:1.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
V sérii p ěti zkoušek jedné látky by nem ěl být rozdíl jednotlivých 
výsledků a aritmetického pr ůměru větší než 30 %. Výsledky, které se 
liší od aritmetického pr ůměru o více než 30 % se nepoužijí, proces 
mísení a pln ění se zlepší a zkoušení zopakuje.  
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Příprava  
1.6.1.1  Hořlavá látka  
Jako ho řlavý materiál se použije usušená vláknitá celulosa 
s délkou vlákna od 50 do 250 μm a středním pr ůměrem 
25 μm (  2 ). Suší se ve vrstv ě o tlouš ťce nejvýše 25 mm 4 
hodiny p ři 105  o C do konstantní hmotnosti a uchovává se 
v exsikátoru nad vysoušedlem až do vychladnutí 
a samotného použití. Obsah vlhkosti ve vysušené celulose by měl být nižší než 0,5 %, vztaženo na suchou látku (
 3 ). 
Aby bylo této hodnoty dosaženo, doba sušení se podle 
potřeby prodlouží (  4 ). Pro celou zkoušku se použije tatáž 
šarže celulosy.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Např. v odkazu 1 se používají 50 % (hmot.) kyselina chloristá a 40 % (hmot.) chlore čnan 
sodný 
( 2 ) Např. prášková celulosa Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, 
katalogové číslo 4021 050. 
( 3 ) Potvrzeno nap ř. titrací podle Karla Fishera 
( 4 ) Tohoto obsahu vlhkosti lze také dosáhnout nap ř. zahříváním p ři 105  o C za vakua po 
dobu 24 hodin.
 1.6.1.2  Zkušební za řízení  
1.6.1.2.1 T l a k o v á n á d o b a  
Zkouška vyžaduje použití tlakové nádoby. Nádobou je ocelový 
tlakový válec o délce 89 mm a vn ějším průměru 60 mm (viz obrázek 
1). Válec je na dvou protilehlých stranách opracován do plochy (v těchto místech je pr ůměr nádobky 50 mm), aby byla usnadn ěna 
manipulace p ři nasazování zažehovací a ventila ční zátky. Nádoba 
má vrtání o sv ětlosti 20 mm a na obou koncích je do hloubky 
19 mm rozší řena a opat řena závitem, aby do ní mohla být zavedena 
trubka odpovídající 1'' British Standard Pipe (BSP) nebo jejímu 
metrickému ekvivalentu. Ve vzdálenosti 35 mm od jednoho konce 
a v úhlu 90
 o k nezplošt ělým stěnám je do válcové st ěny tlakové 
nádoby našroubováno bo ční rameno pro odvod tlaku. Otvor pro 
toto rameno je vyvrtán do hloubky 12 mm a opat řen závitem tak, 
aby vyhovoval závitu 1/2'' BSP (nebo metrickému ekvivalentu) na 
konci bo čního ramene. V p řípadě potřeby se inertním t ěsněním 
zajistí plynot ěsnost. Bo ční rameno p řesahuje t ěleso nádoby 
o 55 mm a je v n ěm vyvrtaný kanál o pr ůměru 6 mm. Konec 
bočního ramene je uvnit ř rozšířen a opat řen závitem pro membrá ­
nové čidlo tlaku. Lze použít jakékoli m ěřidlo tlaku, které je odolné 
proti horkým plyn ům a produkt ům rozkladu a na nár ůst tlaku z 690 
na 2 070 kPa reaguje nejpozd ěji do 5 ms.  
Konec tlakové nádobky vzdálen ější od bo čního ramene je opat řen 
zažehovací zátkou se dv ěma elektrodami, p řičemž jedna je od zátky 
izolovaná a druhá je p řes zátku uzemn ěná. Druhý konec tlakové 
nádoby je uzav řen průtržným diskem (pr ůtržný tlak p řibližně 2 200 
kPa), který je p řidržován zátkou s vrtáním o sv ětlosti 20 mm. 
V případě potřeby se inertním t ěsněním zajistí plynot ěsnost zažeho ­
vací zátky. Podstavec (obrázek 2) drží sestavu b ěhem používání ve 
správné poloze. Skládá se obvykle ze základny z m ěkké oceli 
o rozměrech 235 mm × 184 mm × 6 mm a ze 185 mm dlouhého 
dutého hranolu o rozm ěrech 70 mm × 70 mm × 4 mm.  
Dvě protilehlé strany t ělesa jsou vy říznuty tak, aby vznikl podstavec 
ve tvaru 86 mm dlouhého hranolu na dvou plochých noži čkách. 
Konce t ěchto plochých noži ček jsou se říznuty v úhlu 
60 o vzhledem k horizontální rovin ě a jsou p řivařeny k podstavci. 
Na horním konci hranolu je vykrojení o ší řce 22 mm a hloubce 
46 mm, do n ěhož zapadne bo ční rameno tlakové nádoby, poté co 
je do držáku – zažehovací zátkou nap řed – zasazena tlaková 
nádobka. Na vnit řní nižší stranu hranolového držáku je p řivařen 
distanční ocelový kus o ší řce 30 mm a tlouš ťce 6 mm. Tlakovou 
nádobu na míst ě zajišťují dva 7 mm postranní k řídlové šrouby umís ­
těné v otvorech na prot ější straně. Na boční díl dna hranolového 
držáku jsou nava řeny dva 12 mm široké a 6 mm silné ocelové pásky, 
které podepírají tlakovou nádobu zespodu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2 Z á ž e h o v ý s y s t é m  
Zážehový systém se skládá z Ni/Cr drátu o délce 25 m, pr ůměru 
0,6 mm a odporu 3,85 Ω/m. Drát se pomocí ty činky o pr ůměru 
5 mm navine do tvaru cívky a p řipojí k elektrodám v zážehové zátce. 
Dvě možné podoby cívky jsou uvedeny na obrázku 3. Vzdálenost 
spodní strany nádoby a zážehové cívky by m ěla být 20 mm. Pokud 
nelze elektrody nastavit, m ěly by být konce zážehového drátu mezi 
cívkou a dnem tlakové nádoby izolovány keramickým plášt ěm. Drát 
se zahřívá konstantním stejnosm ěrným proudem nejmén ě 10 A.  
1.6.2  Provedení zkoušky  ( 1 ) 
Zařízení vybavené sníma čem tlaku a zah řívacím systémem, avšak 
bez průtržného disku, se vloží do stojanu zážehovou zátkou dol ů. 
Ve sklen ěné kádince se pomocí sklen ěného míchadla smíchá 2,5 
g kapaliny, která má být zkoušena, s 2,5 g usušené celulosy (  2 ). 
Z bezpečnostních d ůvodů by měl stát experimentátor p ři mísení za 
ochranným štítem. Pokud se sm ěs při mísení nebo pln ění vznítí, není 
třeba ve zkoušce pokra čovat. Směs se přidává do tlakové nádoby po 
malých dávkách a je p ěchována poklepem, p řičemž je třeba zajistit, 
aby směs obklopovala zážehovou cívku a byla s ní v t ěsném 
kontaktu. Je d ůležité, aby p ři plnění nedošlo k deformaci cívky, 
neboť by to vedlo k chybným výsledk ům (  3 ). Do tlakové nádoby 
se vloží pr ůtržný disk a zašroubuje se p řidržovací zátka. Napln ěná 
nádoba se vloží do stojanu pro provedení zkoušky pr ůtlakovým 
diskem nahoru a sestava se umístí do vhodné pancé řované digesto ře 
nebo spalovací komory. Vn ější svorky zážehové zátky se p řipojí ke 
zdroji napájení o proudu 10 A. Od zahájení mísení do vpušt ění 
proudu do cívky by nem ělo uplynout více než 10 minut.  
Signál sníma če tlaku se zaznamenává vhodným systémem, který 
umožňuje jak hodnocení, tak trvalý záznam časového pr ůběhu 
tlaku (nap ř. zapisova č přechodových d ějů). Směs se zah řívá do 
doby, než se roztrhne pr ůtržný disk, nebo po dobu 60 sekund. 
Pokud se pr ůtržný disk neroztrhne, je t řeba před opatrným roze ­
bráním za řízení nechat sm ěs vychladnout, p řičemž je t řeba dávat 
pozor na p řípadné zvyšování tlaku. Provede se p ět pokusů se zkou­ 
šenou a referen ční látkou (referen čními látkami). Zaznamená se 
doba, za kterou dojde k nár ůstu tlaku z 690 kPa na 2 070 kPa nad 
atmosférický tlak. Vypo čte se průměrná doba vzestupu tlaku.  
V některých p řípadech m ůže látka vykazovat nár ůst tlaku (p říliš 
vysoký nebo p říliš nízký), který necharakterizuje oxida ční vlastnosti 
látky, a to v d ůsledku chemické reakce. V takových p řípadech m ůže 
být nezbytné opakovat zkoušku s inertní látkou, nap ř. s křemelinou 
(infuzoriovou hlinkou), namísto celulosy, aby se vyjasnil typ reakce.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Směsi oxidujících látek musí být považovány za látky s možným nebezpe čím výbuchu 
a musí s nimi být nakládáno opatrn ě. 
( 2 ) V praxi toho lze dosáhnout p řípravou sm ěsi látky a celulosy v pom ěru 1:1 v množství 
větším než je nezbytné pro pokus; 5 ± 0,1 g takové sm ěsi se poté vpraví do tlakové 
nádoby. Sm ěs se připravuje čerstvá pro každý pokus. 
( 3 ) Zejména se nesm ějí dotýkat sousední závity cívky.
 2. ÚDAJE  
Doba nár ůstu tlaku u zkoušené látky a u referen ční látky (referen ­ 
čních látek). Doba nár ůstu tlaku p ři zkoušce s inertní látkou, provádí- 
li se.  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Vypočte se průměrná doba nár ůstu tlaku u zkoušené látky a u refe ­
renční látky (referen čních látek).  
Vypočte se průměrná doba nár ůstu tlaku p ři zkoušce s inertní látkou, 
provádí-li se.  
Příklady výsledk ů jsou uvedeny v tabulce 1.  
Tabulka 1  
Příklady výsledk ů ( a ) 
Látka (  b ) Průměrná doba nár ůstu tlaku pro sm ěs s celulosou 
v poměru 1:1 
(ms) 
Dichroman amonný, nasycený vodný roztok 20 800 
Dusičnan vápenatý, nasycený vodný roztok 6 700 
Dusičnan železitý, nasycený vodný roztok 4 133 
Chloristan lithný, nasycený vodný roztok 1 686 
Chloristan hore čnatý, nasycený vodný roztok 777 
Dusičnan nikelnatý, nasycený vodný roztok 6 250 
Kyselina dusi čná, 65 % 4 767 (  c ) 
Kyselina chloristá, 50 % 121 (  c ) 
Kyselina chloristá, 55 % 59 Dusičnan draselný, 30 % vodný roztok 26 690 
Dusičnan stříbrný, nasycený vodný roztok (
 d ) 
Chlorečnan sodný, 40 % vodný roztok 2 555 (  c ) 
Dusičnan sodný, 45 % vodný roztok 4 133  
Inertní látka  
Voda: celulosa (  d ) 
( a ) Klasifikace pro p řepravu podle ustanovení OSN je uvedena v literatu ře (1). 
( b ) Nasycený roztok se p řipraví při 20  o C. 
( c ) Střední hodnota z mezilaboratorních porovnávacích pokus ů. 
( d ) Maximální tlak 2 070 kPa nebyl dosažen.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. ZPRÁVA  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat tyto údaje:  
— druh, složení, čistotu atd. zkoušené látky,  
— koncentraci zkoušené látky,  
— postup sušení použité celulosy,  
— vlhkost použité celulosy,  
— výsledky m ěření, 
— výsledky zkoušek s inertní látkou, byly-li provedeny,  
— vypočtené průměrné doby nár ůstu tlaku,  
— jakékoli odchylky od této metody s uvedením d ůvodů, 
— všechny další dopl ňující informace nebo poznámky d ůležité pro 
interpretaci výsledk ů. 
3.2 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů ( 1 ) 
Hodnocení výsledk ů se zakládá na t ěchto skute čnostech:  
a) na tom, zda došlo k samovolnému vznícení sm ěsi zkoušené látky 
a celulosy,  
b) a na porovnání pr ůměrné doby nár ůstu tlaku z 690 kPa na 2 070 
kPa s dobou, kterou vykazuje referen ční látka (referen ční látky).  
Kapalina se považuje za oxidující, pokud:  
a) se směs látky a celulosy v pom ěru 1:1 (hmot.) samovoln ě vznítí, nebo  
b) je průměrná doba nár ůstu tlaku sm ěsi látky a celulosy v pom ěru 
1:1 (hmot.) rovna pr ůměrné době nárůstu tlaku sm ěsi 65 % 
(hmot.) vodného roztoku kyseliny dusi čné a celulosy nebo kratší.  
S cílem vyhnout se falešn ě pozitivnímu výsledku je p ři analýze 
výsledků potřeba zohlednit také výsledky zkoušení látky s inertním 
materiálem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Interpretace výsledk ů získaných za použití více referne čních látek podle p ředpisů OSN je 
popsána v literatu ře (1).
 4. LITERATURA  
1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3  rd revised edition. UN Publication 
No: ST/SG/AC. 10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for 
oxidizing liquids.  
Obrázek 1  
Tlaková nádoba
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Obrázek 2  
Podstavec
  
Obrázek 3  
Zážehový systém
  
Poznámka: m ůže být použito kterékoli z t ěchto dvou uspo řádání.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22  DÉLKOV Ě VÁŽENÝ ST ŘEDNÍ GEOMETRICKÝ PR ŮMĚR 
VLÁKEN  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Tato metoda popisuje postup m ěření délkov ě váženého st ředního 
geometrického pr ůměru (DVGSP) um ělých minerálních vláken 
(UMV). Jelikož DVGSP statistického souboru bude s pravděpodobností 95 % mezi hladinami významnosti 95 % 
(DVGSP ± dv ě střední směrodatné chyby) vzorku, ohlášená hodnota 
(testová hodnota) bude nižší hladina významnosti 95 % vzorku (tj. 
DVGSP – 2 dv ě střední směrodatné chyby). Metoda je založena na 
aktualizaci ( červen 1994) návrhu pr ůmyslového postupu HSE 
(Výkonný výbor pro zdraví a bezpe čnost) dohodnutého na sch ůzce 
HSE a ECFIA (Evropská asociace odv ětví keramických vláken) 
v Chesteru dne 26. zá ří 1993 a vyvinutého druhou mezilaboratorní 
zkouškou (1, 2). Tato m ěřicí metoda m ůže být použita pro charakte ­
rizaci průměru vláken sypkých látek či výrobků obsahujících UMV, 
včetně vysokotavných keramických vláken (VKV), um ělých skel ­
ných vláken (USV), krystalických a polykrystalických vláken.
 
Délkové vážení je zp ůsobem kompenzace vlivu rozlomení dlouhých 
vláken při odběru vzorků či při manipulaci s vlákny na rozložení 
jejich průměru. Pro m ěření rozložení velikosti pr ůměrů UMV jsou 
použita geometrická statistická data (geometrický pr ůměr), jelikož 
tyto průměry obvykle mají rozložení velikosti blížící se normálnímu.  
Měření délky a pr ůměru je jak únavné, tak dlouhé, ovšem pokud se 
měří pouze ta vlákna, která se dotýkají nekone čně tenké čáry na 
zorném poli rastrovacího elektronového mikroskopu, pak je pravd ě­
podobnost výb ěru daného vlákna p římo úměrná jeho délce. Jelikož 
tím se zohled ňuje délka p ři délkově vážených výpo čtech, jediné 
vyžadované m ěření je m ěření průměru a DVGSP-2SE m ůže být 
vypočten uvedeným zp ůsobem.  
1.2 DEFINICE  
Částice : objekt s pom ěrem délky k ší řce menším než 3:1.  
Vlákno : objekt s pom ěrem délky k ší řce (charakteristický pom ěr) 
nejméně 3:1.  
1.3 PLATNOST A OMEZENÍ  
Metoda je ur čena pro pohled na rozd ělení průměrů o středním 
průměru mezi 0,5 μm a 6 μm. Větší průměry mohou být m ěřeny 
pomocí menších zv ětšení rastrového elektronového mikroskopu, ale 
tato metoda bude stále více limitována vzhledem k rozd ělení 
jemných vláken a je-li st řední průměr menší než 0,5 μm, doporu ču­
jeme měření transmisním elektronovým mikroskopem (TEM).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4 Princip m ěřicí metody  
Z vláknové pokrývky či z volných sypkých vláken se odebere 
několik reprezentativních jádrových vzork ů. Sypká vlákna jsou 
délkově omezena pomocí procesu drcení a reprezentativní podíl 
vzorku se rozpustí ve vod ě. Poměrné podíly se vylou čí a přefiltrují 
přes polykarbonátový filtr o rozm ěrech pórů 0,2 μm a připraví se na 
pozorování pomocí technik rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM). Pr ůměry vláken se m ěří při zvětšení obrazovky × 10 000 
nebo vyšším (
 1 ) pomocí čárové zadržovací metody, aby se získal 
nezaujatý odhad st ředního pr ůměru. Vypo čte se nižší hladina 
významnosti 95 % (na základ ě jednostranného testu), a tím se 
získá odhad nejnižších hodnot geometrického st ředního pr ůměru 
vláken materiálu.  
1.5 Popis m ěřicí metody  
1.5.1  Bezpe čnostní opat ření 
Je nutno minimalizovat vystavení osob zví řeným vlákn ům a při 
manipulaci se suchými vlákny je nutno používat digesto ř či suchou 
skříň. Je nutno periodicky provád ět monitoring osobní expozice pro 
určení efektivity kontrolních metod. P ři manipulaci s UMV je nutno 
nosit jednorázové rukavice pro omezení podrážd ění kůže a pro 
zabránění křížové kontaminaci.  
1.5.2  Přístroje/za řízení  
— lis a lisovadla (schopná vyvinout tlak 10 MPa),  
— polykarbonátové filtry s kapilárními póry o velikosti 0,2 μm 
(průměr 25 mm),  
— membránový filtr z esteru buni činy o rozm ěru pórů 5 μm jako 
filtr záložní,  
— skleněný filtrační přístroj (či použitelné filtra ční systémy) pro 
filtry o pr ůměru 25 cm (nap ř. skleněná mikroanalytická sada 
Millipore typ XX10 025 00),  
— čerstvá voda destilovaná p řes filtr o rozm ěru pórů 0,2 μm pro 
odstranění mikroorganism ů, 
— katodový rozprašova č s anodou ze zlata či ze zlata/palladia,  
— rastrovací elektronový mikroskop schopný rozlišení až 10 nm 
a pracující p ři zvětšení × 10 000,  
— různé: stěrky, skalpel typu 24, pinzeta, tubusy SEM, uhlíkové 
lepidlo či uhlíková lepící páska, st říbrná tyčinka,  
— ultrazvuková sonda či ultrazvuková láze ň na desce laboratorního 
stolu,  
— odběrač vzorků sedimentu či korkovrt pro odebírání jádrových 
vzorků z pokrývky UMV.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Tato hodnota zv ětšení je uvedena pro vlákna o pr ůměru 3 μm, pro vlákna o pr ůměru 6 
μm je vhodn ější zvětšení × 5 000.
 1.5.3  Postup m ěření 
1.5.3.1  Odb ěr vzorků 
U pokrývek a roun se používá odb ěrač vzorků velikosti 25 mm či 
korkovrt pro odebírání vzork ů z řezu. Vzorky by m ěly být rovno ­
měrně rozprostřeny po ší řce a z malé délky pokrývky, nebo by m ěly 
být odebrány z náhodných ploch, je-li k dispozici pokrývka o velké délce. Stejné za řízení může být použito pro odb ěr náhodných vzork ů 
z volných vláken. Je-li to možné, m ělo by být odebráno šest vzork ů 
tak, aby byly zohledn ěny prostorové odchylky v sypkém materiálu.
 
Těchto šest jádrových vzork ů je nutno rozdrtit v lisovadle o pr ůměru 
50 mm tlakem 10 MPa. Materiál se rozmíchá st ěrkou a znovu se 
stlačí tlakem 10 MPa. Poté se materiál vyjme z lisovadla a umístí 
v utěsněné skleněné láhvi.  
1.5.3.2  Příprava vzorku  
Je-li to nutné, organické pojivo m ůže být odstran ěno umíst ěním 
vláken do pece o teplot ě 450 °C po dobu jedné hodiny.  
Vytvarujte vzorek do kužele a roz čtvrťte jej (to by m ělo být 
provedeno uvnit ř prachové sk říně). 
Přidejte stěrkou malé množství vzorku (< 0,5 g) do 100 ml čerstvé 
destilované vody, která byla p řefiltrována p řes membránový filtr 
0,2 μm (je možno použít jiný zdroj velmi čisté vody, ukáže-li se 
být uspokojivý). Řádně rozmíchejte vzorek pomocí ultrazvukové 
sondy provozované s výkonem 100 W a vylad ěné tak, aby se obje ­
vila kavitace (není-li sonda k dispozici, postupujte takto: opakovan ě 
vzorek prot řepte a oto čte jej na dobu 30 sekund; po dobu p ěti minut 
vystavte vzorek ultrazvuku v ultrazvukové lázni; poté op ět několikrát 
protřepte a oto čte vzorek po dobu dalších 30 sekund).  
Ihned po promíchání vláken odeberte n ěkolik pom ěrných dílů (např. 
tři poměrné části o 3, 6 a 10 ml) pomocí široké pipety (o objemu 
2–5 ml).  
Vakuově přefiltrujte každý pom ěrný díl p řes polykarbonátový filtr 
0,2 μm s pomocí podp ůrného filtru MEC o velikosti pór ů 5 μm 
pomocí sklen ěného filtra čního tunelu 25 mm s válcovou nádrží. 
Přibližně 5 ml filtrované destilované vody by m ělo být umíst ěno 
do tunelu a pom ěrný díl by m ěl být pomalu pipetován do vody, 
okraj pipety se drží pod prohnutou čočkou. Po pipetování musí být 
pipeta a nádrž řádně propláchnuta, jelikož tenká vlákna mají snahu 
ulpívat dále na povrchu.  
Opatrně odstraňte filtr a odd ělte jej od podp ůrného filtru p řed jeho 
umístěním do obalu za ú čelem jeho vysušení.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Uřízněte čtvrtinu či polovinu filtrované části filtrovaného depozitu 
pomocí skalpelu typu 24 trhnutím. Opatrn ě připojte odříznutou část 
k bloku SEM pomocí lepící uhlíkové pásky či uhlíkového lepidla. Je 
nutno použít alespo ň na třech místech st říbrnou tyčinku pro zlepšení 
elektrického kontaktu na okrajích filtru a bloku. Je-li lepidlo/st říbrná 
tyčinka suchá, katodov ě rozprašte cca 50 nm zlata či zlata/palladia na 
povrch depozitu.  
1.5.3.3  Kalibrace a provoz SEM  
1.5.3.3.1 K a l i b r a c e  
Kalibrace SEM by m ěla být zkontrolována minimáln ě jednou za 
týden (ideáln ě jednou denn ě) pomocí certifikované kalibra ční 
mřížky. Kalibrace musí být kontrolována v ůči certifikovanému stan ­
dardu a není-li nam ěřená hodnota (SEM) v rozsahu ±2 % hodnoty 
certifikované, potom musí být kalibrace SEM se řízena a znovu zkon ­
trolována.  
SEM by m ěl být schopen rozlišit alespo ň minimální viditelný pr ůměr 
0,2 μm pomocí reálné vzorkovací matice p ři zvětšení × 2 000.  
1.5.3.3.2 P r o v o z  
SEM by m ěl být provozován p ři zvětšení 10 000 (  1 ) za podmínek, 
které dávají dobré rozlišení p ři přijatelném snímku p ři pomalých 
snímacích rychlostech nap ř. 5 sekund na rámec. I když se provozní 
požadavky r ůzných SEM mohou lišit, obecn ě by mělo být použito 
urychlovací nap ětí 5–10 keV s nastavením malé velikosti bodu 
a krátkou pracovní vzdáleností; tím se získá nejlepší viditelnost a rozlišení s materiály o relativn ě nízkých atomových hmotnostech. 
Při provádění lineárního p říčného pohybu musí být použit sklon 0° 
pro minimalizaci p řeostření, nebo má-li SEM eucentrickou fázi, musí 
být použita eucentrická pracovní vzdálenost. Menší zv ětšení může 
být použito, neobsahuje-li materiál vlákna o malých pr ůměrech 
a průměry vláken jsou velké (> 5 μm)
 
1.5.3.4  Třídění dle rozm ěrů 
1.5.3.4.1 P o z o r o v á n í p ř i m a l é m z v ě t š e n í p r o v y h o d n o c e n í 
v z o r k u  
Zpočátku by m ěl být vzorek pozorován p ři malém zv ětšení pro 
ujištění se o rozdrcení velkých vláken a pro vyhodnocení hustoty 
vláken. V p řípadě velkého rozdrcení je doporu čeno připravit nový 
vzorek.  
Kvůli statistické p řesnosti je nezbytné zm ěřit minimální po čet vláken 
a může se zdát být výhodná vysoká hustota vláken, jelikož pozoro ­
váním prázdných polí ztrácíme čas a nijak k analýze nep řispíváme. 
Ovšem při přetížení filtru je obtížné zm ěřit všechna m ěřitelná vlákna 
a jelikož malá vlákna mohou být zakryta vlákny v ětšími, mohou být 
vynechána.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) U vláken 3 μm viz předchozí poznámka.
 Je-li hustota vláken v ětší než 150 vláken na milimetr lineárního 
příčného posuvu, m ůže dojít k nežádoucímu vlivu nadhodnocení 
DVGSP. Na druhé stran ě malá koncentrace vláken zvyšuje dobu 
analýzy a často je nákladov ě efektivní p řipravit vzorek v hustotou 
vlákna blíže hodnot ě optimální, než z ůstat u po čítání vláken 
o menších koncentracích. optimální hustota vláken by m ěla dávat 
průměrně jedno či dvě počítatelná vlákna na pole z záb ěru 
o zvětšení 5 000. Nicmén ě optimální hustota bude záviset na veli ­
kosti (průměru) vláken, takže je nezbytné, aby obsluha používala 
odborný úsudek za ú čelem rozhodnutí, zda je hustota vláken blízko 
hodnotě optimální či nikoliv.  
1.5.3.4.2 D é l k o v é v á ž e n í p r ů m ě r ů v l á k e n  
Pouze ta vlákna, která se dotýkají (nebo k říží) (nekone čně) tenkou 
čáru nakreslenou na obrazovce SEM, se zapo čítávají. Z tohoto 
důvodu je p řes střed obrazovky nakreslena horizontální ( či vertikální) 
čára. 
Alternativn ě může být ve st ředu obrazovky umíst ěn jediný bod 
a zahájí se spojité snímání v jednom sm ěru přes filtr. Každé vlákno 
o charakteristickém pom ěru větším než 3:1 dotýkající se p ři prochá­
zející tímto bodem má zm ěřený a zaznamenaný pr ůměr. 
1.5.3.4.3 T ř í d ě n í v l á k e n  
Doporučuje se m ěření minimáln ě 300 vláken. Každé vlákno je 
měřeno pouze jednou v bod ě průsečíku s čárou či bodem nakres ­
leným na snímku (nebo blízko pr ůsečíku, jsou-li okraje vlákna 
zakrytá). Jestliže se objeví vlákna s nerovnom ěrným průřezem, je 
nutno použít m ěření reprezentující st řední průměr vlákna. Je nutno 
dbát na definování okraje a m ěřit nejkratší vzdálenost mezi okraji 
vlákna. T řídění může být provád ěno on-line, nebo off-line na ulože ­
ných snímcích či fotografiích. Doporu čeny jsou poloautomatické 
snímkovací m ěřicí systémy, které stahují data p římo do tabulky, 
jelikož šet ří čas, eliminují chyby v p řepisech a mohou být zautoma ­
tizovány výpo čty. 
Konce dlouhých vláken by m ěla být zkontrolovány p ři malém zv ět­ 
šení, aby bylo zajišt ěno, že se nep řesunou zp ět do měřicího zorného 
pole a že budou m ěřeny pouze jednou.  
2. DATA  
2.1 NAKLÁDÁNÍ S VÝSLEDKY  
Průměry vláken obvykle nemají normální rozd ělení. Ovšem 
provedením logaritmické transformace je možno získat rozd ělení, 
které se blíží normálnímu.  
Vypočtěte aritmetický pr ůměr (střední (mean) lnD) a standardní 
odchylku (SD  lnD ) logaritmem o základu e hodnoty (lnD) pr ůměrů 
vláken (D). 
mean lnD ¼ ΣlnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
ΣðlnD – mean lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
Standardní odchylka je d ělena druhou odmocninou po čtu měření (n), 
čímž získáme st řední směrodatnou chybu (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Odečtěte od pr ůměrné hodnoty dvojnásobek st řední směrodatné 
chyby a vypo čtěte exponenciál této hodnoty (pr ůměr mínus dv ě 
střední směrodatné chyby), což dává st řední geometrickou hodnotu 
mínus dv ě geometrické sm ěrodatné chyby. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmean lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. ZPRÁVY  
ZPRÁVA O M ĚŘENÍ 
Zpráva o m ěření by m ěla obsahovat minimáln ě tyto informace:  
— hodnotu DVGSP-2SE,  
— veškeré odchylky a zejména ty, které mohou mít vliv na p řesnost 
výsledků, s patřičným odůvodněním. 
4. LITERATURA  
(1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. Únor 1999.  
(2) G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Projekt 
R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Labora ­
tory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23  ROZDĚLOVACÍ KOEFICIENT (OKTAN-1-OL/VODA): METODA 
POMALÉHO MÍCHÁNÍ  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) č. 123 
(2006). Metodou pomalého míchání byly p řesně stanoveny hodnoty rozd ě­
lovacího koeficientu oktan-1-ol/voda (P  ow ) až po hodnotu log P  ow = 8,2 (1). 
Proto je vhodným experimentálním postupem pro p římé stanovení P  ow 
vysoce hydrofobních látek.  
2. Dalšími metodami stanovení rozd ělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda 
(P ow ) jsou metoda „t řepací lahve“ (2) a stanovení P  ow z retenčního chování 
při reverzní fázi HPLC (3). P ři metodě „třepací lahve“ m ůže dojít 
k artefakt ům v důsledku přenosu mikrokapi ček oktanolu do vodné fáze. 
Při vzrůstajících hodnotách P  ow vede přítomnost t ěchto kapi ček ve vodné 
fázi k zvyšujícímu se nadhodnocení odhadu koncentrace zkoušené chemické látky ve vod ě. Proto je její použití omezeno na látky s log P
 ow < 4. Druhá 
metoda závisí na spolehlivosti údaj ů přímo stanovených hodnot P  ow , které 
se používají ke kalibraci vztahu mezi reten čním chováním p ři HPLC 
a naměřenými hodnotami P  ow . Pro stanovení rozd ělovacích koeficient ů 
oktan-1-ol/voda u ionizovatelných látek byla k dispozici pracovní verze 
pokynů OECD (4), ta se však již nemá nadále používat.  
3. Tato zkušební metoda byla vyvinuta v Nizozemsku. P řesnost zde popisova ­
ných metod byla validována a optimalizována ve valida ční studii mezilabo ­
ratorních test ů, které se zú častnilo 15 laborato ří (5).  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
Význam a použití  
4. U inertních organických látek byl zjišt ěn velmi významný vztah mezi rozd ě­
lovacími koeficienty oktan-1-ol/voda (P  ow ) a jejich bioakumulací v rybách. 
Dále bylo prokázáno, že P  ow koreluje s toxicitou pro ryby a rovn ěž se sorpcí 
chemických látek na pevné látky, nap ř. půdu a sedimenty. V literatu ře je 
uveden rozsáhlý p řehled těchto vztah ů (6). 
5. Byla stanovena široká škála vztah ů mezi rozd ělovacím koeficientem 
oktan-1-ol/voda a dalšími vlastnostmi látek s významem pro environmen ­
tální toxikologii a chemii. V d ůsledku toho se stal rozd ělovací koeficient 
oktan-1-ol/voda klí čovým parametrem p ři posuzování rizik chemických 
látek pro životní prost ředí a rovn ěž při odhadu osudu chemických látek 
v životním prost ředí. 
Oblast použití  
6. Má se za to, že experiment používající pomalé míchání omezuje tvorbu 
mikrokapi ček z kapi ček oktan-1-olu ve vodné fázi. Proto nedochází 
k nadhodnocení odhadu koncentrace zkoušené chemické látky ve vodné fázi v důsledku molekul zkoušené chemické látky asociovaných na tyto 
kapičky. Metoda pomalého míchání je proto vhodná zejména k stanovení 
P
 ow u látek s p ředpokládanou hodnotou log P  ow = 5 a vyšší, u nichž má 
metoda třepací lahve (2) tendenci vést k chybným výsledk ům. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINICE A JEDNOTKY  
7. Rozd ělovací koeficient látky pro rozd ělení mezi vodu a lipofilní rozpouš ­
tědlo (oktan-1-ol) charakterizuje rovnovážný stav distribuce chemické látky 
mezi těmito dvěma fázemi. Rozd ělovací koeficient oktan-1-ol/voda (P  ow ) je 
definován jako pom ěr rovnovážných koncentrací zkoušené chemické látky 
v oktan-1-olu nasyceném vodou (C  o ) a ve vod ě nasycené oktan-1-olem 
(C w ). 
P OW ¼ C O=C W 
Protože se jedná o podíl dvou koncentrací, je bezrozm ěrný. Nejčastěji se 
udává jako dekadický logaritmus (log P  ow ). Hodnota P  ow závisí na teplot ě 
a vykazované údaje by m ěly zahrnovat i teplotu m ěření. 
PODSTATA METODY  
8. Pro stanovení rozd ělovacího koeficientu se musí vzájemn ě ekvilibrovat 
voda, oktan-1-ol a zkoušená chemická látka p ři konstantní teplot ě. Poté se 
stanoví koncentrace zkoušené chemické látky v obou fázích.  
9. Potíže p ři provádění experimentu spojené s tvorbou mikrokapi ček během 
experimentu používajícího metodu t řepací lahve lze omezit zde navrhovanou 
metodou pomalého míchání. P ři experimentu používajícím metodu poma ­
lého míchání se rovnováhy mezi vodou, oktan-1-olem a zkoušenou chemickou látkou dosáhne v termostatovaném míchaném reaktoru. Vým ěna 
mezi fázemi je urychlena mícháním. P ři míchání dochází jen k omezeným 
turbulencím, což zlepšuje vým ěnu mezi oktan-1-olem a vodou bez sou časné 
tvorby mikrokapi ček (1).
 
POUŽITELNOST ZKOUŠKY  
10. Protože p řítomnost jiných látek než zkoušené chemické látky m ůže ovlivnit 
aktivitní koeficient zkoušené chemické látky, m ěla by se ov ěřit čistota zkou ­ 
šené chemické látky. Pro stanovení rozd ělovacího koeficientu oktan-1- 
ol/voda by se m ěla použít látka o nejvyšší čistotě, která je komer čně 
dostupná.  
11. Tato metoda se používá u čistých látek, které nedisociují ani neasociují 
a nejsou výrazn ě povrchov ě aktivní. U takových látek a sm ěsí je možné 
metodu použít ke stanovení rozd ělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda. 
Pokud se tato metoda používá u sm ěsí, jsou stanovené rozd ělovací koefici ­
enty oktan-1-ol/voda podmín ěné a závisejí na chemickém složení zkoušené 
směsi a na složení elektrolytu použitého jako vodná fáze. Pokud se 
podniknou dopl ňující kroky, lze tuto metodu použít rovn ěž pro disociující 
nebo asociující slou čeniny (odstavec 12).  
12. Vzhledem k mnohonásobným rovnovážným stav ům ve vod ě a oktan-1-olu 
při rozdělování disociujících látek, jako jsou organické kyseliny a fenoly, 
organické báze a látky na organokovové slou čeniny, je rozd ělovací koefi ­
cient oktan-1-ol/voda podmín ěnou konstantou, která výrazn ě závisí na 
složení elektrolytu (7)(8). Stanovení rozd ělovacího koeficientu oktan-1- 
ol/voda proto vyžaduje, aby bylo pH a složení elektrolytu v experimentu 
regulované a aby se zaznamenalo. P ři hodnocení t ěchto rozd ělovacích koefi ­
cientů je třeba vycházet z odborného posudku. S pomocí hodnoty disocia č­
ní(ch) konstant(y) se musí zvolit vhodné hodnoty pH, aby se stanovil rozd ě­
lovací koeficient pro každý ioniza ční stav. P ři zkoušení organokovových 
sloučenin se musí použít nekomplexující pufry (8). Vezmou-li se v úvahu 
stávající znalosti z oblasti chemie vodných roztok ů (konstanty stability 
komplexu, disocia ční konstanty), m ěly by se zvolit experimentální 
podmínky takovým zp ůsobem, aby bylo možno odhadnout, jaké formy 
vytvoří zkoušená chemická látka ve vodné fázi. Iontová síla by m ěla být 
ve všech experimentech identická díky použití základního elektrolytu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Provád ění této zkoušky m ůže být problemetické v p řípadě látek s nízkou 
rozpustností ve vod ě nebo vysokým P  ow , protože jejich koncentrace ve vod ě 
je tak nízká, že je obtížné ji p řesně stanovit. Tato zkušební metoda uvádí 
pokyny, jak tento problém řešit. 
INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE  
14. Chemická činidla by m ěla mít analytickou nebo vyšší čistotu. Doporu čuje se 
použít nezna čené zkoušené chemické látky se známým chemickým složením 
a pokud možno o čistotě alespoň 99 % nebo radioizotopov ě značené zkou­ 
šené chemické látky se známým chemickým složením a radiochemickou 
čistotou. V p řípadě značek s krátkým elimina čním polo časem by se m ěly 
provést korekce na rozpad. V p řípadě radioizotopov ě značených zkoušených 
látek by se m ěla použít chemická specifická analytická metoda k zajišt ění 
toho, aby nam ěřená radioaktivita p římo souvisela se zkoušenou chemickou 
látkou.  
15. Odhad hodnoty log P  ow lze vypočítat pomocí komer čně dostupného soft ­
waru pro odhad hodnoty log P  ow nebo použitím podílu rozpustností v obou 
rozpouštědlech.  
16. Před provedením experimentu používajícím pomalé míchání k stanovení 
hodnoty P  ow je třeba mít k dispozici následující informace o zkoušené 
chemické látce:  
a) strukturní vzorec;  
b) vhodné analytické metody k stanovení koncentrace látky ve vod ě 
a oktan-1-olu;  
c) disocia ční konstanta (konstanty) ionizovatelných látek (Pokyny OECD 
112 (9));  
d) rozpustnost ve vod ě (10);  
e) abiotická hydrolýza (11);  
f) snadná biologická rozložitelnost (12);  
g) tlak par (13).  
POPIS METODY  
Vybavení a aparatura  
17. Je třeba standardní laboratorní vybavení, zejména:  
— magnetické mícha čky a magnetické míchací ty činky s teflonovým 
povlakem k míchání vodné fáze,  
— analytické p řístroje vhodné k stanovení koncentrace zkoušené chemické 
látky v p ředpokládaném rozmezí koncentrací,  
— míchací nádoba s kohoutem v dolní části. V závislosti na odhadované 
hodnotě log P  ow a mezi stanovitelnosti (LOD) zkoušené slou čeniny se 
musí zvážit použití reak ční nádoby stejného tvaru o objemu v ětším než 
jeden litr, aby bylo možno získat dostate čný objem vody pro chemickou 
extrakci a analýzu. Koncentrace ve vodném extraktu tak budou vyšší 
a tím bude i k analytické stanovení spolehliv ější. V příloze 1 naleznete 
tabulku, v níž jsou uvedeny odhady minimálního pot řebného objemu, 
LOD slou čeniny, její odhadované hodnoty log P  ow a její rozpustnost ve 
vodě. Tabulka je založena na vztahu mezi hodnotou log P  ow a poměrem 
rozpustností v oktanolu a ve vod ě, jak jej uvádí Pinsuwan et al.  (14):  
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
kde 
SR ¼ S oct=S w (v jednotkách molární koncentrace),  
a na vztahu pro odhad rozpustnosti ve vod ě, jak jej uvádí Lyman (15). 
Hodnoty rozpustnosti ve vod ě vypočítané podle rovnice uvedené 
v příloze 1 se musí považovat za první odhad. Je t řeba poznamenat, 
že uživatel m ůže k získání odhadu rozpustnosti ve vod ě použít bez 
omezení jakýkoli vztah, o n ěmž se má za to, že lépe vyjad řuje vztah 
mezi hydrofobicitou a rozpustností. Nap říklad u slou čenin v pevném 
skupenství se doporu čuje zahrnout do odhadu rozpustnosti bod tání. 
V případě, že se použije pozm ěněný vzorec, je t řeba se ujistit, že vzorec 
pro výpo čet rozpustnosti v oktanolu i nadále platí. V dodatku 2 je 
uveden schematický nákres míchací nádoby se sklen ěným plášt ěm 
o objemu asi jeden litr. Proporce nádoby uvedené v dodatku 2 se osvědčily jako vhodné a m ěly by se zachovat i p ři použití aparatury 
jiné velikosti,
 
— během experimentu používajícího pomalé míchání je nezbytné udržovat 
konstantní teplotu.  
18. Nádoby by m ěly být vyrobeny z inertního materiálu, aby byla adsorpce na 
povrch nádoby zanedbatelná.  
Příprava roztok ů ke zkoušce  
19. Stanovení hodnoty P  ow by se mělo provád ět s oktan-1-olem o nejvyšší 
čistotě, který je komer čně dostupný (nejmén ě 99 %). Doporu čuje se přečiš­
tění oktan-1-olu extrakcí kyselinou, zásadou a vodou s následným vysuše ­
ním. Krom ě toho se m ůže oktan-1-ol p řečistit destilací. Purifikovaný 
oktan-1-ol se použije k p řípravě standardních roztok ů zkoušené chemické 
látky. Při stanovení hodnoty P  ow by se měla používat voda destilovaná ve 
skleněné nebo k řemenné aparatu ře nebo získaná z purifika čního systému 
nebo se m ůže použít voda v čistotě pro HPLC. U destilované vody je 
nutná filtrace p řes 0,22μm filtr a m ěly by se zahrnout slepé pokusy za 
účelem ověření, že koncentrované extrakty neobsahují žádné ne čistoty, 
které by mohly interferovat se zkoušenou chemickou látkou. Používá-li se 
filtr ze sklen ěných vláken, m ěl by se vy čistit vystavením teplot ě 400 °C po 
dobu nejmén ě tří hodin.  
20. Obě rozpoušt ědla se před experimentem vzájemn ě nasytí tím, že uvedením 
do rovnovážného stavu v dostate čně velké nádob ě. Dosáhne se toho 
pomalým mícháním tohoto dvoufázového systému po dobu dvou dn ů. 
21. Zvolí se vhodná koncentrace zkoušené chemické látky a látka se rozpustí 
v oktan-1-olu (nasyceném vodou). Rozd ělovací koeficient oktan-1-ol/voda 
se musí stanovit v ředěných roztocích látky v oktan-1-olu a vod ě. Proto by 
koncentrace zkoušené chemické látky nem ěla přesáhnout 70 % její rozpust ­
nosti, přičemž maximální koncentrace v každé fázi by m ěla být 0,1 M (1). 
Roztoky oktan-1-olu použité v experimentu nesm ějí obsahovat suspendo ­
vané pevné částečky zkoušené chemické látky.  
22. Vhodné množství zkoušené chemické látky se rozpustí v oktan-1-olu (nasy ­
ceném vodou). Pokud je odhadovaná hodnota log P  ow větší než pět, je třeba 
pečlivě zajistit, aby roztoky oktan-1-olu používané v experimentu neobsa ­
hovaly suspendované pevné částečky zkoušené chemické látky. K tomu je 
třeba použít u chemických látek s odhadovanou hodnotou log P  ow > 5 tento 
postup:  
— zkoušená chemická látka se rozpustí v oktan-1-olu (nasyceném vodou),  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— roztok se nechá po dostate čně dlouhou dobu ustálit, aby se suspendo ­
vaná pevná látka usadila. V pr ůběhu usazování se sleduje koncentrace 
zkoušené chemické látky,  
— poté, co nam ěřené koncentrace látky v roztoku oktan-1-olu dosáhnou 
stálých hodnot, na ředí se zásobní roztok vhodným objemem oktan-1-olu,  
— koncentrace ředěného zásobního roztoku se zm ěří. Jestliže nam ěřená 
koncentrace odpovídá ředění, může se naředěný zásobní roztok použít 
v experimentu s pomalým mícháním.  
Extrakce a analýza vzork ů 
23. Stanovení zkoušené chemické látky by se m ělo provád ět validovanou analy ­
tickou metodou. Experimentáto ři musí podat d ůkaz o tom, že se koncentrace 
látky v oktan-1-olové fázi nasycené vodou a rovn ěž ve vodné fázi nasycené 
oktan-1-olem b ěhem experimentu nacházejí nad mezí stanovitelnosti použ ­
itých analytických postup ů. V případě, že jsou nutné extrak ční metody, musí 
se před experimentem stanovit analyticky výt ěžky zkoušené chemické látky 
z vodné fáze a z oktan-1-olové fáze. Analytický signál se musí korigovat 
s ohledem na slepé vzorky a je t řeba zajistit, aby se jeden vzorek nemohl 
kontaminovat analytem z jiného vzorku.  
24. Před analýzou bude pravd ěpodobně nutné provést extrakci vodné fáze orga ­
nickým rozpoušt ědlem a zakoncentrování extraktu, protože koncentrace 
hydrofobních zkoušených látek ve vodné fázi je pom ěrně nízká. Ze stejného 
důvodu je nezbytné snížit p řípadné koncentrace slepých vzork ů. Proto je 
třeba použít rozpoušt ědla o vysoké čistotě, nejlépe rozpoušt ědla pro analýzu 
reziduí. Krom ě toho může použití p ředem pečlivě vyčištěného(např. umytím 
v rozpoušt ědle nebo pe čením při zvýšené teplot ě) skla pomoci zabránit 
křížové kontaminaci.  
25. Odhad hodnoty log P  ow lze získat pomocí programu pro odhady nebo na 
základě odborného posudku. Je-li tato hodnota vyšší než šest, je t řeba 
pečlivě sledovat korekce na slepé vzorky a p řípadnou kontaminaci analytu. 
Podobně, přesáhne-li odhadovaná hodnota log P  ow šest, je povinné použití 
náhradního standardu pro korekci na výt ěžnost, aby bylo možné dosáhnout 
vysokých faktor ů zakoncentrování. K odhadu hodnoty log P  ow je komerčně 
dostupná řada počítačových program ů ( 1 ), např. Clog P (16), KOWWIN 
(17), ProLogP (18) a ACD log P (19). V literatu ře (20–22) jsou uvedeny 
popisy metod odhadu.  
26. Pomocí schválených metod se ur čí meze stanovitelnosti (LOQ) zkoušené 
chemické látky v oktan-1-olu a vod ě. Na základ ě empirie lze mezní hodnotu 
kvantitativní stanovitelnosti dané metody ur čit jako koncentraci látky ve 
vodě nebo oktan-1-olu, p ři které je pom ěr signálu k šumu deset. M ěla by 
se zvolit vhodná metoda extrakce a p ředběžného zakoncentrování a také by 
se měly specifikovat analyticky výt ěžky. Zvolí se vhodný faktor zakoncen ­
trování, aby se p ři analytickém stanovení získal signál požadované velikosti.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Tyto informace jsou poskytovány pouze pro pot řebu uživatel ů. Mohou se použít i jiné 
rovnocenné po čítačové programy, pokud lze prokázat, že vedou ke stejným výsledk ům.
 27. Na základ ě parametr ů analytické metody a o čekávaných hodnot koncentrace 
se určí přibližná velikost vzorku nezbytného pro p řesné stanovení koncent ­
race sloučeniny. Vodné vzorky by nem ěly být příliš malé, protože by analy ­
tický signál nemusel být dostate čný. Zárove ň by neměly být vodné vzorky 
příliš velké, aby celkové množství vody sta čilo na minimální po čet požado ­
vaných analýz (n = 5). V dodatku 1 je uvedeno, že minimální objem vzorku 
závisí na objemu nádoby, mezi stanovitelnosti zkoušené chemické látky (LOD) a na rozpustnosti zkoušené chemické látky.
 
28. Kvantifikace zkoušené chemické látky se provádí porovnáním s kalibra čními 
křivkami příslušné slou čeniny. Koncentrace v analyzovaných vzorcích musí 
být dopln ěny koncentracemi standard ů v závorkách.  
29. U zkoušených látek s odhadovanou hodnotou log P  ow větší než šest je t řeba 
přidat k vodnému vzorku p řed extrakcí náhradní standard za ú čelem regis ­
trace ztrát b ěhem extrakce a zakoncentrování vodných vzork ů. Pro přesnou 
korekci na výt ěžnost musí mít náhradní standardy vlastnosti velmi podobné 
vlastnostem zkoušené chemické látky nebo identické vlastnosti. K tomuto účelu se přednostně používají (stabilní) izotopov ě značené analogy dot če­
ných látek (nap říklad zna čené deuteriem nebo izotopy
 13 C). Není-li možno 
použít zna čení stabilními izotopy, tj.  13 C nebo  2 H, mělo by se prokázat 
pomocí spolehlivých údaj ů z literatury, že jsou fyzikáln ě-chemické vlast ­
nosti náhradního standardu velmi podobné vlastnostem zkoušené chemické látky. Během extrakce typu kapalina-kapalina v p řípadě vodné fáze mohou 
vznikat emulze. Lze je omezit p řidáním soli a ponecháním emulze, aby se 
přes noc usadila. Je t řeba uvést metody použité pro extrakci a p ředběžné 
zakoncentrování vzork ů.
 
30. Vzorky odebrané z oktan-1-olové fáze se mohou p řed analýzou v p řípadě 
potřeby naředit vhodným rozpoušt ědlem. Dále se použití náhradních stan ­
dardů pro korekci na výt ěžnost doporu čuje u látek, u nichž experimenty 
stanovující výt ěžnost prokázaly vysoký stupe ň rozptylu v t ěchto experimen ­
tech (relativní sm ěrodatná odchylka > 10 %).  
31. Je t řeba uvést podrobnosti o analytické metod ě. To zahrnuje metodu 
extrakce, faktory zakoncentrování a ředění, parametry p řístrojů, kalibrační 
postup, kalibra ční rozpětí, analytický výt ěžek zkoušené chemické látky 
z vody, p řidání náhradních standard ů pro korekci na výt ěžnost, hodnoty 
slepých vzork ů, meze stanovitelnosti a meze kvantitativní stanovitelnosti.  
Provedení zkoušky  
Optimální pom ěry objemu oktan-1-olu/vody  
32. Při volbě objemu vody a oktan-1-olu je t řeba vzít v potaz mez 
stanovitelnosti (LOQ) v oktan-1-olu a vod ě, koncentra ční faktory použité 
u vodných vzork ů, objemy vzork ů odebíraných z oktan-1-olu a vody 
a očekávané koncentrace. Z experimentálních d ůvodů by se m ěl zvolit 
takový objem oktan-1-olu v systému pomalého míchání, aby byla vrstva 
oktan-1-olu dostate čně silná (> 0,5 cm), a umožnila tak odb ěr vzorků 
z oktan-1-olové fáze bez jejího porušení.  
33. Obvyklé pom ěry mezi fázemi používané pro stanovení slou čenin s hodnotou 
log P  ow = 4,5 a vyšší činí 20–50 ml oktan-1-olu a 950–980 ml vody 
v nádobě o objemu jeden litr.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Zkušební podmínky  
34. Reak ční nádoba se v pr ůběhu zkoušky termostatuje, aby nedocházelo ke 
kolísání teploty o více než 1 °C. Stanovení by se m ělo provád ět při teplotě 
25 °C.  
35. Experimentální systém by m ěl být chrán ěn před denním sv ětlem buď 
prováděním experimentu v tmavé komo ře, nebo zakrytím reak ční nádoby 
hliníkovou fólií.  
36. Experiment by se m ěl provádět v (co možná nejvíce) bezprašném prost ředí. 
37. Systém oktan-1-ol–voda se míchá až do dosažení rovnovážného stavu. 
V zkušebním experimentu se stanoví doba, za jakou dojde k ustavení rovno ­
váhy, provedením experimentu s pomalým mícháním a odebíráním vzork ů 
vody a oktan-1-olu v pravidelných intervalech. Časy odběru jednotlivých 
vzorků by měly být navzájem odd ěleny intervalem alespo ň pěti hodin.  
38. Každé stanovení P  ow se musí provést pomocí nejmén ě tří nezávislých expe ­
rimentů s pomalým mícháním.  
Stanovení doby ustavení rovnováhy  
39. Předpokládá se, že rovnovážného stavu je dosaženo, když regrese podílu 
koncentrací v oktan-1-olu/vod ě v závislosti na čase v časovém rozmezí čtyř 
časových bod ů vede ke sm ěrnici, která se p ři hladině p = 0,05 výrazn ě neliší 
od nuly. Minimální doba nutná k ustavení rovnováhy, než lze zahájit odb ěr 
vzorků, je jeden den. Dle empirického pravidla lze u látek s odhadovanou 
hodnotou log P  ow menší než p ět zahájit odb ěr vzorků během druhého 
a třetího dne. U hydrofobn ějších látek m ůže být nutné tuto dobu ekvilibrace 
prodloužit. Slou čenina s hodnotou log P  ow 8,23 (dekachlorobifenyl) sta čilo 
k dosažení rovnováhy 144 hodin. Rovnováha se stanoví pomocí opakova ­
ného odb ěru vzorků z jedné nádoby.  
Zahájení experimentu  
40. Na za čátku experimentu se reak ční nádoby naplní oktan-1-olem nasyceným 
vodou. Je t řeba vyčkat dostate čnou dobu, aby se dosáhlo teploty termosta ­
tování.  
41. Požadované množství zkoušené chemické látky (rozpušt ěné v pot řebném 
objemu oktan-1-olu nasyceného vodou) se opatrn ě přidá do reak ční nádoby. 
Tento krok je kritický, nebo ť je nutno zabránit turbulentnímu promíchání 
obou fází. Proto se oktan-1-olová fáze se pipetuje pomalu proti st ěně expe­
rimentální nádoby v blízkosti povrchu vody. oktan-1-olová fáze poté ste če 
po skleněné stěně a vytvoří vrstvičku nad vodnou fází. Vždy by se m ělo 
zabránit p římé dekantaci oktan-1-olu do nádoby, kapi čky oktan-1-olu by 
neměly padat p římo do vody.  
42. Po zahájení míchání by se m ěla pomalu zvyšovat rychlost míchání. Nelze-li 
míchací motory vhodn ě nastavit, m ělo by se zvážit použití transformátoru. 
Rychlost míchání by se m ěla nastavit tak, aby se v míst ě fázového rozhraní 
vody a oktan-1-olu vytvo řil vír o hloubce 0,5 až maximáln ě 2,5 cm. Rychlost 
míchání by se m ěla snížit, jestliže hloubka víru p řekročí 2,5 cm. Jinak se 
mohou z kapi ček oktan-1-olu ve vod ě vytvořit mikrokapi čky, což vede 
k přecenění odhadu koncentrace zkoušené chemické látky ve vod ě. Tato 
maximální rychlost míchání 2,5 cm se doporu čuje na základ ě výsledků vali­
dační studie mezilaboratorních test ů (5). Jedná se o kompromis mezi rychlým 
dosažením rovnováhy a omezením tvorby mikrokapi ček oktan-1-olu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Odběr a zpracování vzork ů 
43. Před odběrem vzork ů by se m ěla míchačka vypnout a vy čkat, až ustane 
pohyb kapaliny. Po dokon čení odběru vzorků se mícha čka opět pomalu 
spustí způsobem popsaným výše a rychlost míchání se postupn ě zvýší.  
44. Vzorky vodné fáze se odebírají z uzavíracího kohoutu ve spodní části 
reakční nádoby. Vždy je t řeba vylít mrtvý objem vody, který z ůstává 
v kohoutcích (p řibližně 5 ml u nádoby vyobrazené v dodatku 2). Voda 
v kohoutcích se nemíchá, a proto není v rovnováze s hlavním objemem vody v nádob ě. Zaznamená se objem vodných vzork ů. Při stanovování 
látkové bilance je nutné vzít v úvahu množství zkoušené chemické látky 
obsažené ve vylité vod ě. Ztráty odparem by se m ěly minimalizovat tím, že 
se voda nechá pomalu vtékat do d ělící nálevky tak, aby se p ři tom nenaru ­ 
šila vrstva voda/oktan-1-ol.
 
45. Oktan-1-olové vzorky se získají odebráním malého množství (asi 100 μl) 
oktan-1-olové vrstvy pomocí 100mikrolitrové sklo-kovové st říkačky. Je 
třeba dát pozor, aby se nenarušila hranice mezi fázemi. Objem odebraného 
vzorku se zaznamená. Malé množství sta čí, neboť oktan-1-klový vzorek se 
bude ředit. 
46. Vzorky není vhodné zbyte čně převádět. Proto by se m ěl objem vzorku 
stanovit gravimetricky. V p řípadě vodných vzork ů toho lze dosáhnout 
soustředěním vodného vzorku do d ělící nálevky, která již obsahuje požado ­
vaný objem rozpoušt ědla. 
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
47. V souladu se stávající zkušební metodou se P  ow stanoví provedením t ří 
experiment ů používajících pomalé míchání (t ři experimentální jednotky) se 
studovanou slou čeninou za identických podmínek. Regrese použitá 
k prokázání dosažení rovnovážného stavu by m ěla vycházet z výsledk ů 
alespoň čtyř stanovení C  o /C w po sobě jdoucích časových bodech. To 
umožňuje vypo čítat rozptyl jako m ěřítko neur čitosti průměrné hodnoty 
získané u každé experimentální jednotky.  
48. P  ow lze charakterizovat rozptylem údaj ů získaných pro každou experimen ­
tální jednotku. Tato informace se použije k výpo čtu P  ow jako váženého 
průměru výsledk ů jednotlivých experimentálních jednotek. Provede se to 
tak, že se p řevrácená hodnota rozptylu výsledk ů experimentálních jednotek 
použije jako váha. Údaje s velkou variabilitou (vyjád řenou jako rozptyl), 
a tedy s nižší spolehlivostí, pak budou mít menší vliv na výsledek než údaje s nízkou variabilitou.
 
49. Analogicky se vypo čítá vážená sm ěrodatná odchylka. Ta charakterizuje 
opakovatelnost m ěření P  ow . Nízká hodnota vážené sm ěrodatné odchylky 
naznačuje, že stanovení P  ow bylo v rámci jedné laborato ře vysoce opako ­
vatelné. Formální statistické zpracování údaj ů je uvedeno níže.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Zpracování výsledk ů 
Prokázání dosažení rovnovážného stavu  
50. Pro každý čas odběru vzorku se vypo čítá logaritmus podílu koncentrace 
zkoušené chemické látky v oktan-1-olu a vod ě (log (C  o /C w )). Dosažení 
chemické rovnováhy se prokáže z grafu závislosti tohoto podílu na čase. 
Plato v grafu, které prochází alespo ň čtyřmi po sob ě jdoucími časovými 
body, dokazuje, že bylo dosaženo rovnovážného stavu a že slou čenina je 
skutečně rozpuštěna v oktan-1-olu. Pokud tomu tak není, je t řeba ve zkoušce 
pokračovat, dokud se sm ěrnice čtyř po sobě jdoucích bod ů nebude jen málo 
odlišovat od nuly p ři hladině p = 0,05, což dokazuje, že hodnota log C  o /C w 
nezávisí na čase. 
Výpočet log P  ow 
51. Hodnota log P  ow experimentální jednotky se vypo čítá jako vážený pr ůměr 
log C  o /C w pro tu část křivky závislosti log C  o /C w na čase, pro niž bylo 
prokázáno dosažení rovnovážného stavu. Vážený pr ůměr se vypo čítá tak, že 
se jako váha údaj ů použije p řevrácená hodnota rozptylu, takže vliv údaj ů na 
konečný výsledek je nep římo úměrný neurčitosti údaj ů. 
Průměrná hodnota log P  ow 
52. Průměrná hodnota log P  ow různých experimentálních jednotek se vypo čítá 
jako průměr výsledk ů jednotlivých experimentálních jednotek vážený jejich 
příslušnými rozptyly.  
Výpočet se provádí takto:  
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
kde: 
log P  ow,i = hodnota log P  ow jednotlivé experimentální jednotky i;  
log P  ow,Av  = hodnota váženého pr ůměru jednotlivých stanovení log P  ow ; 
w i = statistická váha p řidělená hodnot ě log P  ow experimentální 
jednotky i.  
Jako w  i se použije reciproká hodnota rozptylu log P  ow,i 
w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 
53. Chyba pr ůměru log P  ow se odhadne jako opakovatelnost log C  o /C w stano­
veného během rovnovážné fáze v jednotlivých experimentálních jednotkách. 
Vyjadřuje se jako vážená sm ěrodatná odchylka log P  ow,Av  (σ log Pow,Av  ), která 
je zase m ěřítkem chyby spojené s log P  ow,Av  . Váženou sm ěrodatnou 
odchylku σσlze vypočítat z váženého rozptylu (var  log P ow,Av  ) (var  log Pow,Av  ) 
takto:  
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Písmeno „n“ ozna čuje počet experimentálních jednotek.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Protokol o zkoušce  
54. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená chemická látka:  
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (ur čující 
polohu zna čky, pokud se používá radioizotopov ě značkovaná látka) 
a příslušné fyzikáln ě-chemické vlastnosti (viz odstavec 17),  
— čistota (ne čistoty) zkoušené chemické látky,  
— čistota zna čky u značených chemických látek a molární aktivitu (je-li to 
vhodné),  
— předběžný odhad hodnoty log P  ow a rovněž metodu použitou k jejímu 
odvození.  
Zkušební podmínky:  
— data provedení studií,  
— teplota b ěhem experimentu,  
— objemy oktan-1-olu a vody na za čátku zkoušky,  
— objemy odebraných vzork ů oktan-1-olu a vody,  
— zbylé objemy oktan-1-olu a vody ve zkušebních nádobách,  
— popis použitého laboratorního nádobí a podmínek míchání (rozm ěry 
míchací ty činky a zkušební nádoby, výška víru v mm a rychlost 
míchání, je-li k dispozici),  
— analytické metody použité k stanovení zkoušené chemické látky a mez 
kvantitativní stanovitelnosti dané metody,  
— časy odběru vzorků, 
— pH vodné fáze a použité pufry, jestliže je pH upraveno s ohledem na 
ionizovatelné molekuly,  
— počet opakování.  
Výsledky:  
— opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod,  
— stanovené koncentrace zkoušené chemické látky v oktan-1-olu a vod ě 
v závislosti na čase, 
— vyjádření látkové bilance,  
— teplota a sm ěrodatná odchylka teplotního rozmezí b ěhem experimentu,  
— regrese podílu koncentrací v závislosti na čase, 
— průměrná hodnota log P  ow,Av  a její směrodatná odchylka,  
— diskuse a interpretace výsledk ů, ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— příklady nam ěřených údaj ů z reprezentativní analýzy (všechny nam ěřené 
údaje musí být uloženy v souladu se zásadami správné laboratorní 
praxe), v četně výtěžků náhrad a po čtu ředění použitých p ři kalibraci 
(spolu s kritérii pro korela ční koeficient kalibra ční křivky) a výsledky 
zajištění kvality/kontroly kvality (QA/QC),  
— případně validační zpráva o postupu zkoušky (uvede se v literatu ře). 
LITERATURA:  
1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring‘ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
 
2) Kapitola A.8 této p řílohy, Rozd ělovací koeficient.  
3) Kapitola A.8 této p řílohy, Rozd ělovací koeficient.  
4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
 
5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
 
6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596-2602.  
9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Paris.  
10) Kapitola A.6 této p řílohy, Rozpustnost ve vod ě. 
11) Kapitola C.7 této p řílohy, Rozklad – Abiotický rozklad – hydrolýza jako 
funkce pH.  
12) Kapitola C.4 – část II–VII (metoda A až F) této p řílohy, Stanovení „snadné“ 
biologické rozložitelnosti.  
13) Kapitola A.4 této p řílohy, Tlak par.  
14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623-626.  
15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, 
Washington, DC, 2-1 to 2-52.
 
16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA.  
17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl 
WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, D.C.  
21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479-488.  
22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen 
Chemie : 386-390.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Dodatek 1  
Tabulka pro výpo čet minimálních objem ů vody nutných k detekci 
zkoušených látek o r ůzných hodnotách log P  ow ve vodné fázi  
Předpoklady:  
— Maximální objem jednotlivých podíl ů = 10 % celkového objemu; 5 podíl ů = 
50 % celkového objemu.  
— Koncentrace zkoušen»ch látek  ¼ 0; 7 Ü rozpustnost vkaždé zfází. V p řípadě 
nižších koncentrací budou pot řeba větší objemy.  
— Objem použitý ke stanovení meze stanovitelnosti (LOD) = 100 ml.  
— log P  ow oproti log S  w a log P  ow oproti SR (S  o /S w ) vhodně vyjadřují vztahy 
zkoušených chemických látek.  
Odhad S  w 
log P  ow rovnice log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Odhad S  o 
log P  ow rovnice S  o (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Celková hmotnost 
m zkoušené 
chemické látky 
(mg) m o /m w m w 
(mg) C w 
(mg/l) m o 
(mg) C o 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 
2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 
7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 
9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Výpočet objemů 
Minimální požadovaný objem vodné fáze p ři jednotlivých koncentracich LOD  
log P  ow LOD (mikrogramy/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Objem použitý 
pro LOD (l) 0,1 
Legenda k výpo čtům: 
Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibra ční nádoba o objemu 
1 litr.  
Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibra ční nádoba o objemu 
2 litry.  
Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibra ční nádoba o objemu 
5 litrů. 
Představuje < 10 % celkového objemu vodné fáze, ekvilibra ční nádoba o objemu 
10 litrů. 
Přesahuje 10 % objemu, a to i u ekvilibra ční nádoby o objemu 10 litr ů. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Přehled požadovaných objem ů v závislosti na rozpustnosti ve vod ě a log P  ow 
Minimální požadovaný objem fáze H  2 O při každé koncentraci LOD (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogramy/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogramy/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Objem použitý pro LOD 
(l) 0,1 
Dodatek 2  
Příklad nádoby se sklen ěným plášt ěm pro experiment používající metodu 
pomalého míchání k stanovení P  ow
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
ČÁST B: METODY STANOVENÍ TOXICITY A JINÝCH Ú ČINKŮ NA 
ZDRAVÍ  
OBSAH 
OBECNÝ ÚVOD 
B.1.a AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA – METODA FIXNÍ DÁVKY B.1.b AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA – METODA STANOVENÍ 
TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY 
B.2 AKUTNÍ INHALA ČNÍ TOXICITA 
B.3 AKUTNÍ TOXICITA (DERMÁLNÍ) B.4 AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ Ú ČINKY NA 
KŮŽI 
B.5 AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ/LEPTAVÉ Ú ČINKY NA O ČI 
B.6 SENZIBILIZACE K ŮŽE 
B.7 STUDIE ORÁLNÍ TOXICITY U HLODAVC Ů – 28DENNÍ 
OPAKOVANÁ APLIKACE 
B.8 SUBAKUTNÍ INHALA ČNÍ TOXICITA: 28DENNÍ STUDIE 
B.9 DERMÁLNÍ TOXICITA (28DENNÍ OPAKOVANÁ APLI ­
KACE) 
B.10 MUTAGENITA – ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ 
ABERACE U SAVC Ů IN VITRO  
B.11 MUTAGENITA – ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ 
ABERACE V BU ŇKÁCH KOSTNÍ D ŘENĚ SAVCŮ IN VIVO  
B.12 MUTAGENITA – TEST SAV ČÍCH ERYTROCYTÁRNÍCH 
MIKROJADER  IN VIVO  
B.13/14 MUTAGENITA – ZKOUŠKA NA REVERZNÍ MUTACE 
S BAKTERIEMI 
B.15 ZKOUŠENÍ MUTAGENITY A SCREENING KARCINOGE ­
NITY – ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE 
U SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
B.16 ZKOUŠKA NA MITOTICKOU REKOMBINACI 
U SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
B.17 MUTAGENITA – ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE 
V BUŇKÁCH SAVC Ů IN VITRO  
B.18 ZKOUŠKA NA POŠKOZENÍ A REPARACI DNA – NEPLÁ ­
NOVANOU SYNTÉZU DNA – V SAV ČÍCH BUŇKÁCH  IN 
VITRO  
B.19 ZKOUŠKA NA VÝM ĚNU SESTERSKÝCH CHROMATID  IN 
VITRO  
B.20 ZKOUŠKA NA RECESIVNÍ LETÁLNÍ MUTACE VÁZANÉ 
NA POHLAVÍ U
 DROSOPHILA MELANOGASTER  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21 ZKOUŠKY NA TRANSFORMACE SAV ČÍCH BUN ĚK IN 
VITRO  
B.22 DOMINANTNÍ LETÁLNÍ ZKOUŠKA NA HLODAVCÍCH B.23 ZKOUŠKA NA CHROMOSOMOVÉ ABERACE VE SPERMA ­
TOGONIÍCH SAVC Ů 
B.24 SPOT TEST NA MYŠÍCH B.25 ZKOUŠKA NA D ĚDIČNOU TRANSLOKACI U MYŠÍ 
B.26 ZKOUŠKA SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ STUDIE ORÁLNÍ 
TOXICITY NA HLODAVCÍCH (90DENNÍ OPAKOVANÁ 
INHALA ČNÍ EXPOZICE NA HLODAVCÍCH) 
B.27 ZKOUŠKA SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ TOXICITY STUDIE 
ORÁLNÍ TOXICITY NA NEHLODAVCÍCH (90DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE) 
B.28 STUDIE SUBCHRONICKÉ DERMÁLNÍ TOXICITY (90DENNÍ 
OPAKOVANÁ KOŽNÍ APLIKACE NA HLODAVCÍCH) 
B.29 SUBCHRONICKÁ INHALA ČNÍ TOXICITA: 90DENNÍ 
STUDIE 
B.30 STUDIE CHRONICKÉ TOXICITY B.31 STUDIE PRENATÁLNÍ VÝVOJOVÉ TOXICITY B.32 STUDIE KARCINOGENITY B.33 KOMBINOVANÉ STUDIE CHRONICKÉ TOXICITY 
A KARCINOGENITY 
B.34 JEDNOGENERA ČNÍ ZKOUŠKA TOXICITY PRO REPRO ­
DUKCI 
B.35 DVOUGENERA ČNÍ STUDIE REPRODUK ČNÍ TOXICITY 
B.36 TOXIKOKINETIKA B.37 POZDNÍ NEUROTOXICITA ORGANICKÝCH SLOU ČENIN 
FOSFORU PO AKUTNÍ EXPOZICI 
B.38 POZDNÍ NEUROTOXICITA ORGANICKÝCH SLOU ČENIN 
FOSFORU – 28DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE 
B.39 ZKOUŠKA NA NEPLÁNOVANOU SYNTÉZU DNA 
(UDS) V JATERNÍCH BU ŇKÁCH SAVC Ů IN VIVO  
B.40 LEPTAVÉ Ú ČINKY NA K ŮŽI IN VITRO : ZKOUŠKA 
TRANSKUTÁNNÍHO ELEKTRICKÉHO ODPORU (TER) 
B.40.a LEPTAVÉ Ú ČINKY NA K ŮŽI IN VITRO : ZKOUŠKA POMOCÍ 
MODELU LIDSKÉ K ŮŽE
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41 ZKOUŠKA FOTOTOXICITY 3T3 NRU  IN VITRO  
B.42 SENZIBILIZACE K ŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠET ŘENÍM 
LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN 
B.43 ZKOUŠKA NEUROTOXICITY NA HLODAVCÍCH B.44 ABSORPCE K ŮŽÍ: METODA  IN VIVO  
B.45 ABSORPCE K ŮŽÍ: METODA  IN VITRO  
B.46 DRÁŽD ĚNÍ KŮŽE IN VITRO : ZKUŠEBNÍ METODA ZA 
POUŽITÍ REKONSTRUOVANÉ LIDSKÉ EPIDERMIS 
B.47 ZKUŠEBNÍ METODA PRO ZÁKAL A PROPUSTNOST 
ROHOVKY U SKOTU PRO ZJIŠ ŤOVÁNÍ LÁTEK 
S LEPTAVÝMI A SILN Ě DRÁŽDIVÝMI Ú ČINKY NA O ČI 
B.48 ZKUŠEBNÍ METODA ODD ĚLENÉHO KU ŘECÍHO OKA PRO 
ZJIŠŤOVÁNÍ LÁTEK S LEPTAVÝMI A SILN Ě DRÁŽDIVÝMI 
ÚČINKY NA O ČI 
B.49 ZKOUŠKA  IN VITRO  NA PŘÍTOMNOST MIKROJADER 
V BUŇKÁCH SAVC Ů 
B.50 SENZIBILIZACE K ŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠET ŘENÍM 
LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN: DA 
B.51 SENZIBILIZACE K ŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠET ŘENÍM 
LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN: BRDU-ELISA
 
▼M4 
B.52. AKUTNÍ INHALA ČNÍ TOXICITA – METODA STANOVENÍ 
TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY  
▼M5 
B.53. STUDIE VÝVOJOVÉ NEUROTOXICITY 
B.54. UTEROTROFNÍ BIOLOGICKÁ ZKOUŠKA NA HLODAV ­
CÍCH: KRÁTKODOBÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA ESTROGENNÍCH VLASTNOSTÍ 
B.55. HERSHBERGEROVA BIOLOGICKÁ ZKOUŠKA NA POTKA ­
NECH: KRÁTKODOBÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA ANDROGENNÍCH/ANTIANDROGENNÍCH VLASTNOSTÍ 
B.56. ROZŠÍ ŘENÁ JEDNOGENERA ČNÍ STUDIE TOXICITY PRO 
REPRODUKCI 
B.57. ZKOUŠKA STEROIDOGENEZE H295R B.58. ZKOUŠKY GENOVÝCH MUTACÍ U SOMATICKÝCH 
A ZÁRODE ČNÝCH BUN ĚK TRANSGENNÍCH HLODAVC Ů
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
OBECNÝ ÚVOD  
A. CHARAKTERIZACE ZKOUŠENÉ LÁTKY  
Složení zkoušené látky, v četně hlavních ne čistot, a její relevantní 
fyzikálně-chemické vlastnosti, v četně stálosti, by m ěly být známy 
před zahájením jakékoli studie toxicity.  
Fyzikálně-chemické vlastnosti zkoušené látky poskytují d ůležité 
informace pro výb ěr způsobu podávání, pro návrh každé jednotlivé 
studie a pro manipulaci se zkoušenou látkou a její uchovávání.  
Zahájení studie by m ěl předcházet vývoj analytické metody pro 
kvalitativní a kvantitativní stanovení zkoušené látky (pokud možno včetně hlavních ne čistot) v dávkovacím médiu a v biologickém 
materiálu.
 
Veškeré informace týkající se identifikace, fyzikáln ě-chemických 
vlastností, čistoty a chování zkoušené látky by m ěly být obsaženy 
v protokolu o zkoušce.  
B. PÉ ČE O ZVÍ ŘATA  
Při zkoušení toxicity jsou d ůležité přísná kontrola podmínek 
prostředí a správná pé če o zvířata. 
i) Podmínky chovu  
Podmínky chovu v prostorech nebo klecích pro pokusná zví řata by 
měly vyhovovat testovacím druh ům. Pro potkany, myši a mor čata 
jsou vhodnými podmínkami teplota místnosti 22 ± 3  o C a relativní 
vlhkost 30 až 70 %; pro králíky se doporu čuje teplota 20 ± 3  o C 
a relativní vlhkost 30 až 70 %.  
Některé experimentální techniky jsou zvlášt ě citlivé na vliv teploty 
a v takových p řípadech jsou v popisu zkušební metody uvedeny 
podrobnosti o vhodných podmínkách. P ři všech sledováních toxic ­
kých účinků by měly být zaznamenávány údaje o teplot ě a vlhkosti 
a měly by být zahrnuty do záv ěrečné zprávy o studii.  
Osvětlení by m ělo být um ělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla 
a 12 hodin tmy. Podrobnosti o sv ětelném režimu by m ěly zazname ­
nány a uvedeny v kone čné zprávě studie.  
Není-li v metod ě uvedeno jinak, m ěla by být zví řata chována jedno ­
tlivě nebo umíst ěna v klecích po malých skupinách stejného pohlaví; 
jsou-li zví řata v klecích po skupinách, nem ělo by být chováno 
v jedné kleci více než p ět zvířat. 
Ve zprávách o experimentech na zví řatech je d ůležité uvést typ 
použité klece a po čet zvířat chovaných v každé kleci jak b ěhem 
expozice chemické látce, tak b ěhem kterékoli další doby pozorování.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Podmínky krmení  
Strava by m ěla splňovat veškeré požadavky výživy pro p říslušný 
testovací druh. Pokud jsou zkoušené látky podávány v potrav ě, 
může být nutri ční hodnota snížena interakcí látky s n ěkterou složkou 
potravy. Možnost takové reakce by m ěla být zohledn ěna při inter­
pretaci výsledk ů zkoušky. M ůže být použita konven ční laboratorní 
strava s neomezeným p řístupem k pitné vod ě. Výběr potravy se 
může řídit potřebou zajistit vhodné p řimíchání zkoušené látky, 
pokud je podávána touto metodou.  
Příměsi v potrav ě, jejichž vliv na toxicitu je znám, nesmí být 
přítomny v koncentracích, ve kterých by se vliv projevil.  
C. ALTERNATIVNÍ ZKOUŠKY  
Vědeckým cílem Evropské unie je vývoj a validace alternativních 
metod, které mohou poskytnout stejnou úrove ň informací jako 
současné zkoušky na zví řatech, při nichž se však použije mén ě 
zvířat, způsobí mén ě utrpení nebo se v nich použití zví řat zcela 
vypouští.  
Hned po svém uvedení do praxe musí být tyto metody použity, 
kdykoli je to možné, pro charakterizaci nebezpe čnosti a následnou 
klasifikaci a ozna čování látek z hlediska jejich nebezpe čnosti.  
D. HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Při hodnocení a interpretaci zkoušek musí být vzaty v úvahu ur čité 
meze, nakolik lze výsledky studií na zví řatech a  in vitro  extrapolovat 
na člověka, a proto lze pro potvrzení výsledk ů zkoušení použít 
poznatky o nep říznivých ú čincích na člověka, pokud jsou 
k dispozici.  
E. LITERATURA  
Tyto metody jsou v ětšinou vyvinuty v rámci programu OECD pro 
zkušební pokyny a m ěly by být provád ěny v souladu s principy 
správné laboratorní praxe, aby bylo zajišt ěno co nejširší „vzájemné 
uznávání údaj ů“. 
Další podobn ější informace lze získat v pokynech OECD a v 
příslušné literatu ře publikované jinde.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1.a  AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA – METODA FIXNÍ DÁVKY  
1. METODA  
Tato zkušební metoda je rovnocenná metod ě OECD TG 420 (2001).  
1.1 ÚVOD  
Tradiční metody hodnocení akutní toxicity používají jako koncový 
bod uhynutí zví řat. V roce 1984 navrhla Britská toxikologická 
společnost nový p řístup k testování akutní toxicity založený na podá ­
vání řady fixních dávek (1). Tento p řístup jako koncový bod nepo ­
užíval uhynutí zví řat, nýbrž se opíral o pozorování jasných p říznaků 
toxicity u jedné z řady fixních dávek. Po provedení britských (2) 
a mezinárodních (3) valida čních studií  in vivo  byl tento postup 
v roce 1992 p řijat jako zkušební metoda. Následn ě byly pomocí 
matematických model ů v řadě studií (4, 5, 6) vyhodnoceny statis ­
tické vlastnosti metody fixní dávky. Studie  in vivo  a modelové studie 
společně prokázaly, že metoda je reprodukovatelná, vyžaduje mén ě 
zvířat, působí menší utrpení než tradi ční metody a dokáže látky 
zařadit podobn ě jako jiné zkušební metody akutní toxicity.  
Poučení týkající se výb ěru nejvhodn ější zkušební metody k danému 
účelu obsahuje text Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing (7). V tomto dokumentu jsou také uvedeny dopl ňující infor ­
mace o provád ění a analýze zkušební metody B.1.a.  
Podstatou metody je použití pouze st ředně toxických dávek v hlavní 
studii, dávky, u nichž se o čekává, že budou letální, by nem ěly být 
podávány. Také není nutné podávat dávky, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazn ě dráždivých ú činků vyvolávají 
značnou bolest a utrpení. Umírající zví řata nebo zví řata, která zjevn ě 
projevují p říznaky bolesti nebo zna čného a p řetrvávajícího utrpení, 
se humánn ě utratí a p ři analýze výsledk ů se hodnotí jako zví řata 
uhynulá p ři zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umírajících 
nebo značně trpících zví řat a poučení týkající se rozpoznání p ředví­
datelného nebo blížícího se uhynutí jsou p ředmětem samostatného 
dokumentu (8).
 
Metoda poskytuje informace o nebezpe čných vlastnostech 
a umožňuje zařazení a klasifikaci látky podle globáln ě harmonizova ­
ného systému (GHS) klasifikace chemických látek, které zp ůsobují 
akutní toxicitu (9).  
Zkušební laborato ř by před provedením studie m ěla vzít v úvahu 
veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Sou částí těchto infor ­
mací je totožnost a chemická struktura látky, výsledky jiných 
zkoušek toxicity dané látky,  in vitro  nebo  in vivo , toxikologické 
údaje o strukturn ě příbuzných látkách a o čekávané použití látky. 
Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zaintereso ­
vaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského 
zdraví a pom ůže při výběru vhodné výchozí dávky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2 DEFINICE  
Akutní orální toxicita:  nepříznivé účinky, které se projeví po 
orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky b ěhem 24 hodin.  
Opožděný úhyn:  znamená, že zví ře během 48 hodin neuhyne ani 
nejeví známky umírání, ale uhyne pozd ěji během čtrnáctidenní doby 
pozorování.  
Dávka:  množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjad řuje jako 
hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zví řete 
(např. mg/kg).  
Zjevná toxicita:  obecný pojem popisující z řetelné příznaky toxicity, 
které se projeví po podání zkoušené látky (p říklady viz (3)), kdy p ři 
podání další vyšší fixní dávky lze u v ětšiny pokusných zví řat 
očekávat zna čné bolesti a p řetrvávající známky zna čného utrpení, 
stavu agónie (kritéria uvádí dokument Humane Endpoints Guidance 
(8)) nebo pravd ěpodobné uhynutí.  
GHS:  Globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek 
a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodá řskou spolupráci 
a rozvoj (lidské zdraví a životní prost ředí), Odborného výboru OSN 
pro přepravu nebezpe čného zboží (fyzikáln ě-chemické vlastnosti) 
a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpe čnosti) koor ­
dinovaný Meziorganiza čním programem pro řádné nakládání 
s chemikáliemi (IOMC).  
Blížící se uhynutí:  stav agónie nebo uhynutí je o čekáván před další 
plánovanou dobou pozorování. P říznaky sv ědčící o tomto stavu 
u hlodavc ů mohou zahrnovat k řeče, polohu na boku, polohu vleže 
a třes (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance 
Document (8)).  
LD 50 (střední letální dávka):  statisticky vypo čtená jednotlivá dávka 
látky, u níž lze o čekávat, že zp ůsobí uhynutí 50 % zví řat, jimž byla 
podána orální cestou. Hodnota LD  50 se vyjadřuje v hmotnosti zkou ­ 
šené látky na jednotku hmotnosti pokusného zví řete (mg/kg).  
Limitní dávka:  označuje nejvyšší p řípustnou dávku (2 000 nebo 
5 000 mg/kg).  
Stav agónie:  označuje stav úhynu nebo neschopnost p řežít, ani když 
je zvíře léčeno (více podrobností viz text Humane Endpoint 
Guidance Document (8)).  
Předvídatelný úhyn:  přítomnost klinických p říznaků svědčících 
o smrti, p řičemž doba úhynu je známá a p ředchází plánovanému 
ukončení zkoušky v budoucnosti, nap ř. neschopnost dojít k vod ě 
nebo potrav ě (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance 
Document (8)).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Skupinám zví řat stejného pohlaví se postupn ě podá fixní dávka 5, 
50, 300 a 2 000 mg/kg (výjime čně lze uvažovat o další fixní dávce 
5 000 mg/kg, viz část 1.6.2). Výchozí úrove ň dávky se zvolí na 
základě orientační studie jako dávka, u níž se o čekává, že vyvolá 
některé příznaky toxicity, aniž zp ůsobí závažné toxické ú činky nebo 
úhyn. Klinické p říznaky a stavy spojené s bolestí, utrpením 
a blížícím se úhynem jsou podrobn ě popsány v samostatném 
dokumentu OECD (8). Dalším skupinám zví řat mohou být podány 
vyšší nebo nižší fixní dávky podle p řítomnosti nebo nep řítomnosti 
příznaků toxicity nebo uhynutí. Podle tohoto postupu se pokra čuje, 
dokud nebude zjišt ěna dávka vyvolávající z řejmou toxicitu nebo není 
pozorováno více než jedno uhynutí, anebo pokud nejsou ani p ři 
nejvyšší dávce zjišt ěny žádné ú činky nebo pokud dochází 
k úhynům při nejnižší dávce.  
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Výb ěr druhu zví řat 
Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít 
i jiné druhy hlodavc ů. Obvykle se používají samice (7). Je to proto, 
že přehled literatury o konven čních zkouškách LD  50 ukazuje, že 
mezi pohlavími je obvykle malý rozdíl, pokud jde o citlivost, ale v případech, v nichž jsou rozdíly pozorovány, jsou samice obecn ě 
nepatrně citlivější (10). Pokud však poznatky o toxikologických nebo 
toxikokinetických vlastnostech strukturn ě příbuzných chemických 
látek nazna čují, že citliv ější jsou pravd ěpodobně samci, použije se 
toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat 
náležité od ůvodnění.
 
Použijí se mladá zdravá dosp ělá zvířata běžně užívaných laborator ­
ních kmen ů. Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. Každé 
zvíře musí být na za čátku podávání látky 8 až 12 m ěsíců staré a jeho 
hmotnost by se m ěla pohybovat v intervalu ± 20 % st řední hmotnosti 
zvířat, kterým byla podána p ředchozí dávka.  
1.4.2  Podmínky chovu a krmení  
Teplota v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22  o C (± 3  o C). 
Relativní vlhkost vzduchu by m ěla být minimáln ě 30 % a pokud 
možno nep řesáhnout 70 %, krom ě doby úklidu místnosti, cílem by 
měla být hodnota 50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé a mělo by 
se střídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít 
konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. 
Zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky, 
ale počet zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého 
zvířete. 
1.4.3  Příprava zví řat 
Zvířata se náhodn ě vyberou, pro usnadn ění individuální identifikace 
se označí, a chovají se v klecích minimáln ě pět dnů před začátkem 
podávání látky, aby se mohla p řizpůsobit laboratorním podmínkám.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4  Příprava dávek  
Zkoušená látka by obecn ě měla být při všech úrovních zkoušených 
dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného p řípravku. V p řípadech, kdy má být zkoušen kapalný 
koncový produkt nebo sm ěs, může však být použití nez ředěné zkou­ 
šené látky, tj. s konstantní koncentrací, pro hodnocení následného rizika této látky užite čnější a je vyžadováno n ěkterými kontrolními 
orgány. Ani v jednom p řípadě nesmí být p řekročen maximální objem 
dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, 
závisí na velikosti pokusného zví řete. U hlodavc ů by objem obvykle 
neměl přesáhnout 1 ml na 100 g t ělesné hmotnosti, avšak u vodních 
roztoků připadá v úvahu i dávka 2 ml na 100 g t ělesné hmotnosti. 
S ohledem na složení dávkovaného p řípravku se ve všech p řípadech, 
kde je to možné, doporu čuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, 
potom v po řadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji 
(např. v kukuřičném oleji) a nakonec p řípadně roztoku v jiných vehiku ­
lech. U vehikul jiných než voda musí být známy toxikologické chara ­
kteristiky. Dávky musí být p řipraveny krátce p řed podáním, pokud není 
stálost přípravku b ěhem doby, kdy bude používán, známa a neukáže se 
jako přijatelná.
 
1.5 POSTUP  
1.5.1  Podávání dávek  
Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žalude ční 
sondy nebo vhodné intuba ční kanyly. Pokud výjime čně není možné 
podat dávku najednou, lze ji podat po menších množstvích b ěhem 
nejvýše 24 hodin.  
Před podáním zkoušené látky nemají zví řata dostávat potravu (nap ř. 
potkanům by se nem ěla podávat p řes noc, myším 3–4 hodiny), voda 
se však ponechává. Po uplynutí doby hladov ění se zví řata zváží 
a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí p řístupu 
k potravě na dalších 3–4 hodin u potkan ů nebo 1–2 hodiny u myší. 
Podává-li se látka po částech v pr ůběhu určité doby, m ůže být podle 
délky období nezbytné poskytnout zví řatům potravu a vodu.  
1.5.2  Orienta ční studie  
Cílem orienta ční studie je umožnit výb ěr vhodné výchozí dávky pro 
hlavní studii. Zkoušená látka se podává jednotlivým zví řatům 
postupně podle vývojového diagramu v p říloze 1. Orienta ční studie 
je ukončena, jakmile lze stanovit výchozí dávku pro hlavní studii 
(nebo pokud je p ři nejnižší fixní dávce pozorován úhyn).  
Výchozí dávka orienta ční studie se zvolí z fixních dávek ve výši 5, 
50, 300 a 2 000 mg/kg jako dávka, u níž se o čekává, že vyvolá 
zřejmou toxicitu, p řičemž toto o čekávání je pokud možno založeno 
na důkazech z údaj ů získaných  in vivo  a in vitro  ze stejné chemické 
látky a strukturn ě příbuzných látek. Pokud takové informace neexis ­
tují, výchozí dávka činí 300 mg/kg.  
Mezi podáním dávky každému zví řeti se ponechá doba minimáln ě 
24 hodin. Všechna zví řata se pozorují minimáln ě 14 dnů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Ve výjime čných případech a pouze je-li to od ůvodněno specifickými 
konkrétními p ředpisy, lze zvážit použití další nejvyšší úrovn ě dávky 
5 000 mg/kg (viz dodatek 3). S ohledem na dobré zacházení se zvířaty se pokusy na zví řatech v rámci kategorie 5 GHS 
(2 000–5 000 mg/kg) nedoporu čují a měly by se zvažovat pouze 
tehdy, pokud existuje velká pravd ěpodobnost, že výsledky takového 
pokusu mají p římý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví 
zvířat nebo životního prost ředí.
 
V případech, kdy zví ře, u něhož je látka zkoušena v nejnižší fixní 
úrovni dávky (5 mg/kg), v orienta ční studii uhyne, obvykle se studie 
ukončí a látka p řiřadí do kategorie 1 GHS (jak je uvedeno 
v příloze 1). Pokud je však vyžadováno další potvrzení klasifikace, 
může být proveden tento volitelný dopl ňkový postup: druhému 
zvířeti se podá dávka 5 mg/kg. Pokud toto druhé zví ře uhyne, 
bude kategorie 1 GHS potvrzena a studie okamžit ě ukončena. 
Pokud druhé zví ře přežije, dávka 5 mg/kg se podá maximáln ě 
třem dalším zví řatům. Jelikož riziko úhynu bude vysoké, m ěla by 
být látka zví řatům podávána postupn ě, aby bylo zajišt ěno dobré 
zacházení se zví řaty. Časový interval mezi dávkami podanými jedno ­
tlivým zví řatům by měl být dostate čný na to, aby bylo možné stano ­
vit, zda zví ře, jemuž byla látka podána d říve, pravd ěpodobně přežije. 
Pokud dojde k úhynu druhého zví řete, posloupnost podávání se 
okamžitě ukončí a látka nebude podána žádnému dalšímu zví řeti. 
Vzhledem k tomu, že výskyt druhého úhynu (bez ohledu na po čet 
zvířat, na nichž byla látka v dob ě ukončení zkoušena) spadá do 
výsledku A (2 anebo více úhyn ů), postupuje se podle pravidla klasi ­
fikace v p říloze 2 s fixní dávkou 5 mg/kg (kategorie 1, pokud se 
vyskytnou dva a více úhyn ů nebo kategorie 2, pokud se nevyskytne 
více než 1 úhyn). Navíc je v p říloze 4 uvedeno pou čení týkající se 
klasifikace v rámci systému EU, dokud nebude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS).
 
1.5.3  Hlavní studie  
1.5.3.1  Počet zvířat a úrovn ě dávek  
Kroky, podle kterých se má postupovat po provedení zkoušek 
s výchozí úrovní dávky, jsou uvedeny ve vývojovém diagramu v příloze 2. Bude nutné zvolit jeden ze t ří postupů: buď zkoušení 
ukončit a stanovit odpovídající klasifika ční třídu nebezpe čnosti, nebo 
provést zkoušky s vyšší fixní dávkou, nebo zkoušky s nižší fixní dávkou. S ohledem na ochranu zví řat se v hlavní studii znovu 
nepoužije úrove ň dávky, která v orienta ční studii vedla k uhynutí 
(viz dodatek 2). Zkušenosti ukázaly, že nejpravd ěpodobnějším 
výsledkem u výchozí úrovn ě dávky bude, že látku lze klasifikovat 
bez nutnosti dalších zkoušek.
 
Obvykle se pro každou zkoumanou úrove ň dávky použije celkem p ět 
zvířat stejného pohlaví. Mezi t ěmito pěti zvířaty bude jedno zví ře 
z orientační studie, jemuž byla podána zvolená úrove ň dávky, a další 
čtyři zvířata (krom ě výjimečných případů, kdy úrove ň dávky použité 
v hlavní studii nebyla sou částí orienta ční studie).  
Časový interval mezi podáváním jednotlivé výše dávky závisí na 
době nástupu, trvání a závažnosti p říznaků toxicity. Expozice zví řat 
další dávce bude odložena, dokud nebude jisté, že zví řata, jimž byla 
podána p ředchozí dávka, p řežila. Mezi jednotlivými dávkami se 
v případě potřeby doporu čuje ponechat dobu 3 nebo 4 dn ů, aby 
bylo umožn ěno pozorování zpožd ěné toxicity. Časový interval lze 
podle pot řeby upravit, nap ř. v případě neprůkazné reakce.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Při zvažování použití nejvyšší fixní dávky 5 000 mg/kg se postupuje 
podle metody popsané v p říloze 3 (viz také 1.6.2).  
1.5.3.2  Limitní zkouška  
Limitní zkouška se používá p ředevším tehdy, má-li osoba provád ějící 
zkoušku informace sv ědčící o tom, že zkoušený materiál je pravd ě­
podobně netoxický, tj. je toxický pouze nad rámec regula čních limit ­
ních dávek. Informace o toxicit ě zkoušeného materiálu lze získat ze 
znalostí o podobných zkoušených slou čeninách, sm ěsích nebo 
produktech s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen 
málo informací nebo v ůbec žádné informace o toxicit ě nebo kdy se 
očekává, že zkoušený materiál bude toxický, bude provedena hlavní 
zkouška.
 
Podle obvyklého postupu slouží jako limitní zkouška pro tyto 
pokyny výchozí dávka orienta ční studie 2 000 mg/kg (nebo 
výjimečně 5 000 mg/kg), po níž následuje podání této výše dávky 
dalším čtyřem zvířatům. 
1.6 POZOROVÁNÍ  
Po podání dávky se zví řata pozorují individuáln ě minimáln ě jednou 
během prvních 30 minut, pravideln ě během prvních 24 hodin, 
přičemž zvláštní pozornost se v ěnuje prvním 4 hodinám, a poté 
denně po dobu 14 dn ů kromě případů, kdy je nutné zví řata ze studie 
vyjmout a humánn ě utratit z d ůvodu dodržování pravidla dobrého 
zacházení se zví řaty, nebo je zjišt ěn jejich úhyn. Doba pozorování by 
však nem ěla být stanovena pevn ě. Bude stanovena podle toxických 
reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a m ůže tedy být 
podle pot řeby prodloužena. Doba, kdy se p říznaky toxicity objeví 
a vymizí, je d ůležitá zejména v p řípadě tendence ke zpožd ěným 
příznakům toxicity (11). Veškerá pozorování se systematicky zazna ­
menávají, p řičemž záznamy se vedou jednotliv ě, pro každé zví ře. 
Další pozorování budou nutná, jestliže zví řata dále vykazují p říznaky 
toxicity. Pozorování zahrnují zm ěny na kůži, na srsti, na o čích, na 
sliznicích, a rovn ěž změny dýchání, krevního ob ěhu, změny funkce 
autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je t řeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, 
letargii, spánku a kómatu. Vezmou se v úvahu principy a kritéria 
shrnuté v textu Humane Endpoints Guidance Document (8). Zví řata 
ve stavu agónie a zví řata se známkami prudkých bolestí nebo 
s přetrvávajícími p říznaky zna čného utrpení se humánn ě utratí. 
Pokud jsou zví řata z humánních d ůvodů utracena nebo je zjišt ěn 
jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejp řesněji.
 
1.6.1  Tělesná hmotnost  
Hmotnost jednotlivých zví řat se stanoví krátce p řed podáním zkou ­ 
šené látky a nejmén ě jednou týdn ě poté. Vypo čítají se zm ěny hmot­
nosti a zaznamenají se. Na konci zkoušky se zví řata, která p řežila, 
zváží a poté humánn ě utratí.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2  Patologie  
Všechna pokusná zví řata (včetně těch, která v pr ůběhu zkoušky 
uhynula nebo byla utracena z d ůvodu dodržování pravidla dobrého 
zacházení se zví řaty) se pitvají. U každého zví řete se zaznamenají 
všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikros ­
kopické vyšet ření orgán ů, u nichž jsou patrné makroskopické pato ­
logie, u zví řat, která p řežila 24 nebo více hodin po prvním podání 
dávky, protože mohou poskytnout užite čné informace.  
2. ÚDAJE  
Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zví ře. Navíc by 
měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, p řičemž se u každé 
zkušební skupiny uvede po čet použitých zví řat, počet zvířat vykazu ­
jících příznaky toxicity, po čet zvířat uhynulých v pr ůběhu zkoušky 
nebo utracených z humánních d ůvodů, doba uhynutí jednotlivých 
zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických ú činků a pitevní 
nálezy.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikáln ě- 
chemické vlastnosti (v četně izomerizace),  
— identifika ční údaje, v četně čísla CAS.  
Vehikulum (je-li použito):  
— zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— mikrobiologický stav zví řat, je-li znám,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat (případně včetně zdůvodnění použití 
samců místo samic),  
— původ, podmínky chovu, strava atd.  
Zkušební podmínky:  
— podrobné údaje o složení zkoušené látky, v četně podrobností 
o fyzikální form ě podávaného materiálu,  
— podrobné údaje o zp ůsobu podání zkoušené látky, v četně objemu 
dávek a dob ě podávání,  
— podrobné údaje o strav ě a kvalit ě vody (v četně druhu/zdroje 
stravy, zdroje vody),  
— zdůvodnění výběru výchozí dávky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Výsledky:  
— údaje o reakcích každého zví řete a o výši jeho dávky (tj. po čet 
zvířat vykazujících p říznaky toxicity, v četně uhynutí, povahy, 
závažnosti a trvání ú činků), ve form ě tabulky,  
— údaje o t ělesné hmotnosti a jejích zm ěnách ve form ě tabulky,  
— hmotnosti jednotlivých zví řat v den podání dávky, poté 
v týdenních intervalech a v čase úhynu nebo utracení,  
— datum a doba úhynu, pokud p ředchází plánovanému usmrcení,  
— časový průběh nástupu p říznaků toxicity u každého zví řete, a zda 
byly vratné,  
— pitevní a histopatologické nálezy pro každé zví ře, pokud jsou 
k dispozici.  
Diskuse a interpretace výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of 
substances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, 85–92.  
2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). 
Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol.‚ 6, 
279–291.
 
3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose 
procedure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. 
Chem. Toxicol. 28, 469–482.  
4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313–324.  
5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 
315–323. Human Exptl. Toxicol.  
6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical 
evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196.
 
7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment N. 24. Paris  
8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 
24-no-0,FF.html].
 
10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, 
Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. 
Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231.  
11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3
 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, 
USA.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
DODATEK 1  
VÝVOJOVÝ DIAGRAM PRO ORIENTA ČNÍ STUDII

 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
DODATEK 2  
VÝVOJOVÝ DIAGRAM PRO HLAVNÍ STUDII

 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
DODATEK 3  
KRITÉRIA KLASIFIKACE ZKOUŠENÝCH LÁTEK S O ČEKÁVANÝMI 
HODNOTAMI LD  50 PŘESAHUJÍCÍMI 2 000 MG/KG BEZ NUTNOSTI 
ZKOUŠENÍ  
Kritéria pro kategorii nebezpe čnosti 5 mají umožnit identifikaci zkoušených 
látek, u nichž je nebezpe čí akutní toxicity nízké, avšak které mohou za ur čitých 
okolností pro citlivé jedince p ředstavovat nebezpe čí. U těchto látek se p ředpo­
kládá, že se jejich orální nebo dermální LD  50 nebo LD  50 ekvivalentních dávek 
podávaných jinými cestami pohybuje v rozmezí od 2 000 do 5 000 mg/kg. 
Zkoušené látky lze klasifikovat v kategorii nebezpe čnosti definované jako 
2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (v GHS kategorie 5) v t ěchto případech:  
a) pokud je do této kategorie za řazena podle n ěkterého ze zp ůsobů zkoušení 
uvedeného v p říloze 2, a to v závislosti na výskytech uhynutí;  
b) pokud jsou již k dispozici spolehlivé d ůkazy nazna čující, že LD  50 se pohybuje 
v rozmezí hodnot kategorie 5, nebo pokud z jiných studií na zví řatech nebo 
z toxických ú činků na člověka vyplývají akutní obavy o lidské zdraví;  
c) pokud extrapolací, odhadem nebo m ěřením údaj ů není přiřazení do vyšší t řídy 
nebezpečnosti odůvodněno a 
— pokud jsou k dispozici spolehlivé informace nazna čující významné 
toxické ú činky na člověka, nebo  
— pokud je b ěhem zkoušení orální cestou s dávkami nejvýše kategorie 4 
pozorováno uhynutí, nebo  
— v případech, kdy odborný posudek potvrdí závažné klinické p říznaky 
toxicity p ři testování s dávkami nejvýše kategorie 4 s výjimkou pr ůjmu, 
zježení srsti nebo rozcuchané srsti, nebo  
— v případech, kdy odborný posudek potvrdí spolehlivé informace, které 
naznačují možnost závažných akutních ú činků vyplývajících z jiných 
studií na zví řatech.  
ZKOUŠENÍ V DÁVKÁCH P ŘESAHUJÍCÍCH 2 000 MG/KG  
Ve výjime čných případech, a pouze je-li to od ůvodněno specifickými regula č­
ními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovn ě fixní dávky 5 000 mg/kg. 
S ohledem na zásadu dobrého zacházení se zví řaty se zkoušení s dávkami 
5 000 mg/kg nedoporu čuje, mělo by se zvažovat pouze v p řípadě, že existuje 
velká pravd ěpodobnost, že výsledky takové zkoušky by m ěly přímý význam pro 
ochranu zví řat nebo lidského zdraví (9).  
Orientační studie  
Pravidla pro rozhodování, jimiž se řídí metoda postupného podávání dávek 
uvedená v p říloze 1, se rozší ří tak, aby zahrnovala úrove ň dávky 5 000 mg/kg. 
Pokud se v orienta ční studii použije výchozí dávka 5 000 mg/kg, výsledek 
A (úhyn) povede k nutnosti zkoušet na druhém zví řeti dávku 2 000 mg/kg. 
Výsledky B a C (z řejmá toxicita nebo žádná toxicita) umožní zvolit dávku 
5 000 mg/kg za výchozí dávku hlavní studie. Podobn ě pokud se použije výchozí 
dávka jiná než 5 000 mg/kg, zkoušení pokra čuje na úrove ň 5 000 mg/kg 
v případě, že se při 2 000 mg/kg zjistí výsledky B nebo C. Následný výsledek 
A při 5 000 mg/kg bude vyžadovat výchozí dávku hlavní studie 2 000 mg/kg 
a výsledky B a C budou vyžadovat výchozí dávku v hlavní studii 5 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Hlavní studie  
Pravidla pro rozhodování, jimiž se řídí metoda postupného podávání dávek 
uvedená v p říloze 2, se rozší ří tak, aby zahrnovala úrove ň dávky 5 000 mg/kg. 
Pokud se tedy v hlavní studii použije výchozí dávka 5 000 mg/kg, bude výsledek A (≥ 2 úhyny) vyžadovat zkoušení dávky 2 000 mg/kg na druhé skupin ě. 
Výsledek B (z řejmá toxicita a/nebo ≤ 1 úhyn) nebo C (žádná toxicita) povedou 
k tomu, že látka nebude podle GHS klasifikována. Podobn ě pokud se použije 
výchozí dávka jiná než 5 000 mg/kg, zkoušení pokra čuje na úrove ň 5 000 mg/kg 
v případě, že se p ři 2 000 mg/kg zjistí výsledek C. Následný výsledek A p ři 
5 000 mg/kg povede k tomu, že se látka p řiřadí do kategorie 5 GHS a na základ ě 
výsledku B nebo C látka nebude klasifikována.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
DODATEK 4  
ZKUŠEBNÍ METODA B.1.a  
Pokyny ke klasifikaci podle systému EU pro p řechodné období do plného zavedení globáln ě harmonizovaného systému 
klasifikace (GHS) (p řevzato z literatury (8))

 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1.b  AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITA – METODA STANOVENÍ 
TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY  
1. METODA  
Tato zkušební metoda odpovídá metod ě OECD TG 423 (2001).  
1.1 ÚVOD  
Metoda stanovení t řídy akutní toxicity (1) stanovená v této zkoušce 
je metodou po krocích, p řičemž u každého kroku se používají t ři 
zvířata stejného pohlaví. V závislosti na úmrtnosti a/nebo stavu 
agónie zví řat lze o akutní toxicit ě zkoušené látky rozhodnout 
průměrně na základ ě 2 až 4 krok ů. Tato metoda je reprodukovatelná, 
vyžaduje mén ě zvířat a dokáže látky za řadit podobn ě jako jiné 
zkušební metody akutní toxicity. Metoda stanovení t řídy akutní toxi ­
city je založena na biometrickém hodnocení (2)(3)(4)(5) s fixními 
dávkami, p řiměřeně oddělenými tak, aby umožnila za řazení látky pro 
účely klasifikace a posouzení nebezpe čnosti. Metoda p řijatá v roce 
1996 byla podrobena rozsáhlým národním (6) mezinárodním (7) validačním studií  in vivo  pro srovnání s hodnotami LD
 50 získanými 
z literatury.  
Obecný návod týkající se výb ěru nejvhodn ější zkušební metody 
k danému ú čelu obsahuje text Guidance Document on Acute Oral 
Toxicity Testing (8). V tomto dokumentu jsou také uvedeny dopl ňu­
jící informace o provád ění a analýze zkušební metody B.1.b.  
Není nutné podávat zkoušené látky v dávkách, o nichž je známo, že 
v důsledku leptavých nebo výrazn ě dráždivých ú činků vyvolávají 
značnou bolest a utrpení. Umírající zví řata nebo zví řata, která zjevn ě 
projevují p říznaky bolesti nebo zna čného a p řetrvávajícího utrpení, 
se humánn ě utratí a p ři interpretaci výsledk ů jsou hodnocena jako 
zvířata uhynulá p ři zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umíra ­
jících nebo zna čně trpících zví řat a poučení týkající se rozpoznání 
předvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou p ředmětem samostat ­
ného dokumentu (9).  
Metoda využívá p ředem stanovených dávek a její výsledky umož ňují 
látku zařadit a klasifikovat podle globáln ě harmonizovaného systému 
klasifikace chemických látek, které zp ůsobují akutní toxicitu (10).  
V zásadě tato metoda neslouží k vypo čtení přesné hodnoty LD  50 , ale 
umožňuje určit definované rozp ětí expozice, p ři které se p ředpokládá 
letalita, nebo ť hlavním koncovým vyhodnocením této zkoušky 
zůstává uhynutí části zvířat. Metoda umož ňuje stanovit hodnotu 
LD 50 , pouze pokud alespo ň dvě dávky vedou k mortalit ě vyšší než 
0 % a nižší než 100 %. Použití výb ěru předem stanovených dávek, 
bez ohledu na zkoušenou látku, u n ěhož se klasifikace explicitn ě 
váže k po čtu zvířat pozorovaných v r ůzných stavech, zvyšuje 
možnost konzistentního a opakovaného p ředávání zpráv mezi labo ­
ratořemi. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Zkušební laborato ř vezme p řed provedením studie v úvahu veškeré 
dostupné informace o zkoušené látce. Sou částí těchto informací je 
totožnost a chemická struktura látky, její fyzikáln ě-chemické vlast ­
nosti, výsledek jiných zkoušek toxicity dané látky  in vitro  nebo  in 
vivo, toxikologické údaje o strukturn ě příbuzných látkách 
a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, 
aby byli všichni zainteresovaní p řesvědčeni, že zkouška má význam 
pro ochranu lidského zdraví a pom ůže při výběru nejvhodn ější 
výchozí dávky.  
1.2 DEFINICE  
Akutní orální toxicita:  se vztahuje na nep říznivé účinky, které se 
projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky b ěhem 
24 hodin.  
Opožděný úhyn:  znamená, že zví ře během 48 hodin neuhyne ani 
nejeví známky umírání, ale uhyne pozd ěji během čtrnáctidenní doby 
pozorování.  
Dávka:  množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjad řuje jako 
hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zví řete 
(např. mg/kg).  
GHS:  globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek 
a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodá řskou spolupráci 
a rozvoj (lidské zdraví a životní prost ředí), Odborného výboru OSN 
pro přepravu nebezpe čného zboží (fyzikáln ě-chemické vlastnosti) 
a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpe čnosti) koor ­
dinovaný Meziorganiza čním programem pro řádné nakládání 
s chemikáliemi (IOMC).  
Blížící se uhynutí:  stav agónie nebo uhynutí je o čekáván před další 
plánovanou dobou pozorování. P říznaky sv ědčící o tomto stavu 
mohou u hlodavc ů zahrnovat k řeče, polohu na boku, polohu vleže 
a třes (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance 
Document (9)).  
LD 50 (střední letální orální dávka):  statisticky vypo čtená jednotlivá 
dávka látky, u níž lze o čekávat, že zp ůsobí uhynutí 50 % zví řat, jimž 
byla podána orální cestou. Hodnota LD  50 se vyjadřuje jako hmotnost 
zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zví řete (mg/kg).  
Limitní dávka:  označuje nejvyšší p řípustnou dávku (2 000 nebo 
5 000 mg/kg).  
Stav agónie:  označuje stav úhynu nebo neschopnost p řežít, ani když 
je zvíře léčeno (více podrobností viz text Humane Endpoint 
Guidance Document (9)).  
Předvídatelný úhyn:  přítomnost klinických p říznaků svědčících 
o smrti, p řičemž doba úhynu je známa a p ředchází plánovanému 
ukončení zkoušky v budoucnosti, nap ř. neschopnost dojít k vod ě 
nebo potrav ě (více podrobností viz text Humane Endpoint Guidance 
Document (9)).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3 PODSTATA ZKOUŠKY  
Podstatou zkoušky je, že se pomocí metody po krocích, využívající 
minimálního po čtu zvířat u každého kroku, získají informace 
o akutní toxicit ě zkoušené látky, které umožní její klasifikaci. 
Látka se skupin ě pokusných zví řat podává oráln ě v jedné ze stano ­
vených dávek. Látka se zkouší metodou po krocích, p řičemž 
u každého kroku se používají t ři zvířata stejného pohlaví (obvykle 
samice). P řítomnost nebo nep řítomnost mortality vyvolané látkou 
u zvířat, jimž byla látka podána v jednom kroku, rozhodne 
o dalším kroku, tj.:  
— není t řeba žádné další zkoušení,  
— podá se stejná dávka dalším t řem zvířatům, 
— látka se podá dalším t řem zvířatům v nejbližší vyšší nebo 
nejbližší nižší úrovni dávky.  
Podrobnosti postupu zkoušení jsou uvedeny v p říloze 1. Metoda 
umožní rozhodnout s ohledem na za řazení zkoušené látky do jedné 
z řady tříd toxicity definovaných fixními hrani čními hodnotami 
LD 50 . 
1.4 POPIS METODY  
1.4.1  Výb ěr druhu zví řat 
Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít 
i jiné druhy hlodavc ů. Obvykle se používají samice (9). Je to proto, 
že přehled literatury o konven čních zkouškách LD  50 ukazuje, že 
ačkoliv je mezi pohlavími obvykle malý rozdíl, pokud jde 
o citlivost, jsou samice v p řípadech, ve kterých jsou rozdíly pozo ­
rovány, obecn ě nepatrn ě citlivější (11). Pokud však poznatky 
o toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturn ě 
příbuzných chemických látek nazna čují, že citliv ější jsou pravd ěpo­
dobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na 
samcích, je nutné podat náležité od ůvodnění. 
Použijí se mladá zdravá dosp ělá zvířata běžně užívaných laborator ­
ních kmen ů. Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. Každé 
zvíře musí být na za čátku podávání látky 8 až 12 m ěsíců staré a jeho 
hmotnost by se m ěla pohybovat v intervalu ±20 % st řední hmotnosti 
zvířat, kterým byla podána p ředchozí dávka.  
1.4.2  Podmínky chovu a krmení  
Teplota v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22  o C (± 3  o C), 
relativní vlhkost vzduchu by m ěla být minimáln ě 30 % a pokud 
možno nep řesáhnout 70 %, krom ě doby úklidu místnosti, cílem by 
měla být hodnota 50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé a mělo by 
se střídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít 
konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. 
Zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky, 
ale počet zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého 
zvířete. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3  Příprava zví řat 
Zvířata se náhodn ě vyberou, pro usnadn ění individuální identifikace 
se označí a chovají se v klecích minimáln ě pět dnů před podáním 
látky, aby se mohla p řizpůsobit laboratorním podmínkám.  
1.4.4  Příprava dávek  
Zkoušená látka by obecn ě měla být při všech úrovních zkoušených 
dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace 
dávkovaného p řípravku. V p řípadech, kdy má být zkoušen kapalný 
koncový produkt nebo sm ěs, může však být použití nez ředěné zkoušené 
látky, tj. s konstantní koncentrací, pro hodnocení následného rizika této 
látky užite čnější a je vyžadováno n ěkterými kontrolními orgány. Ani 
v jednom p řípadě nesmí být p řekročen maximální objem dávky. Maxi ­
mální objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, závisí na velikosti 
pokusného zví řete. U hlodavc ů by objem obvykle nem ěl přesáhnout 
1 ml na 100 g t ělesné hmotnosti, avšak u vodních roztok ů připadá 
v úvahu i dávka 2 ml na 100 g t ělesné hmotnosti. S ohledem na složení 
dávkovaného p řípravku se ve všech p řípadech, kde je to možné, doporu ­ 
čuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v po řadí podle 
preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (nap ř. v kukuřičném 
oleji) a nakonec p řípadně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných 
než voda musí být známy toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce p řed podáním, pokud není stálost p řípravku b ěhem 
doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako p řijatelná.
 
1.5 POSTUP  
1.5.1  Podávání dávek  
Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žalude ční 
sondy nebo vhodné intuba ční kanyly. Pokud výjime čně není možné 
podat dávku najednou, lze ji podat po menších množstvích b ěhem 
nejvýše 24 hodin.  
Před podáním zkoušené látky nemají zví řata dostávat potravu (nap ř. 
potkanům by se nem ěla podávat p řes noc, myším 3–4 hodiny), voda 
se však ponechává. Po uplynutí doby hladov ění se zví řata zváží 
a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí p řístupu 
k potravě na další 3–4 hodiny u potkan ů nebo 1–2 hodiny u myší. 
Podává-li se látka po částech v pr ůběhu určité doby, m ůže být podle 
délky období nezbytné poskytnout zví řatům potravu a vodu.  
1.5.2  Po čet zvířat a úrovn ě dávek  
V každém kroku se používají t ři zvířata. Dávka, která bude použita 
jako výchozí, se zvolí z jedné ze čtyř fixních úrovní: 5, 50, 300 
a 2 000 mg/kg t ělesné hmotnosti. Výchozí dávka by m ěla být taková, 
která nejpravd ěpodobněji vyvolá uhynutí n ěkterých zví řat, jimž bude 
podána. Postup, který je nutno u každé výchozí dávky dodržet, je popsán ve vývojových diagramech v p říloze 1. V p říloze 4 jsou 
uvedeny pokyny týkající se klasifikace v rámci systému EU do 
doby, než bude zaveden nový globáln ě harmonizovaný systém 
(GHS).
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Pokud dostupné informace nazna čují, že při nejvyšší úrovni výchozí 
dávky (2 000 mg/kg t ělesné hmotnosti) je úmrtnost nepravd ěpo­
dobná, je nutné provést limitní zkoušku. Pokud nejsou o látce, která má být zkoušena, k dispozici žádné informace, doporu čuje 
se, z důvodů dodržování pravidla dobrého zacházení se zví řaty, 
použít výchozí dávku 300 mg/kg t ělesné hmotnosti.
 
Časový interval mezi experimentálními skupinami závisí na dob ě 
nástupu, trvání a závažnosti p říznaků toxicity. Podání další dávky 
bude odloženo, dokud nebude jisté, že zví řata, jimž byla podána 
předchozí dávka, p řežila.  
Ve výjime čných případech a pouze je-li to od ůvodněno specifickými 
konkrétními p ředpisy, lze zvážit použití další nejvyšší úrovn ě dávky 
5 000 mg/kg t ělesné hmotnosti (viz dodatek 2). S ohledem na zásadu 
dobrého zacházení se zví řaty se pokusy na zví řatech v rámci kate ­
gorie 5 GHS (2 000–5 000 mg/kg) nedoporu čují a měly by se 
zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravd ěpodobnost, že 
výsledky takové zkoušky budou mít p římý význam pro ochranu 
lidského zdraví, zdraví zví řat nebo životního prost ředí. 
1.5.3  Limitní zkouška  
Limitní zkouška se používá p ředevším tehdy, má-li osoba provád ějící 
zkoušku informace sv ědčící o tom, že zkoušený materiál je pravd ě­
podobně netoxický, tj. je toxický pouze nad rámec regula čních limit ­
ních dávek. Informace o toxicit ě zkoušeného materiálu lze získat ze 
znalostí o podobných zkoušených slou čeninách, sm ěsích nebo 
produktech s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se 
ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen 
málo informací nebo v ůbec žádné informace o toxicit ě nebo kdy se 
očekává, že zkoušený materiál bude toxický, bude provedena hlavní 
zkouška.  
Limitní zkoušku s jednou úrovní dávky 2 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti lze provést na šesti zví řatech (tři zvířata na jeden krok). 
Výjimečně lze na třech zvířatech provést limitní zkoušku s jednou 
úrovní dávky 5 000 mg/kg (viz dodatek 2). Projeví-li se úmrtnost 
vyvolaná zkoušenou látkou, budou další zkoušky uskute čněny 
s nejbližší nižší úrovní dávky.  
1.6 POZOROVÁNÍ  
Po podání dávky se zví řata pozorují individuáln ě minimáln ě jednou 
během prvních 30 minut, pravideln ě během prvních 24 hodin, 
přičemž zvláštní pozornost se v ěnuje prvním 4 hodinám, a poté 
denně po dobu 14 dn ů kromě případů, kdy je nutné zví řata ze studie 
vyjmout a humánn ě utratit z d ůvodu dodržování pravidla dobrého 
zacházení se zví řaty, nebo je zjišt ěn jejich úhyn. Doba pozorování by 
však nem ěla být stanovena pevn ě. Bude stanovena podle toxických 
reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a m ůže tedy být 
podle pot řeby prodloužena. Doba, kdy se p říznaky toxicity objeví 
a vymizí, je d ůležitá zejména v p řípadě tendence ke zpožd ěným 
příznakům toxicity (12). Veškerá pozorování se systematicky zazna ­
menávají, p řičemž záznamy se vedou pro každé zví ře jednotliv ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Další pozorování budou nutná, jestliže zví řata dále vykazují p říznaky 
toxicity. Pozorování zahrnují zm ěny na kůži, na srsti, na o čích, na 
sliznicích, a rovn ěž změny dýchání, krevního ob ěhu, změny funkce 
autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je t řeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, 
letargii, spánku a kómatu. Vezmou se v úvahu principy a kritéria 
shrnuté v textu Humane Endpoints Guidance Document (9). Zví řata 
ve stavu agónie a zví řata se známkami prudkých bolestí nebo 
s přetrvávajícími p říznaky zna čného utrpení se humánn ě utratí. 
Pokud jsou zví řata z humánních d ůvodů utracena nebo je zjišt ěn 
jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejp řesněji.
 
1.6.1  Tělesná hmotnost  
Hmotnost jednotlivých zví řat se stanoví krátce p řed podáním zkou ­ 
šené látky a nejmén ě jednou týdn ě poté. Vypo čítají se zm ěny hmot­
nosti a zaznamenají se. Na konci zkoušky se zví řata, která p řežila, 
zváží a humánn ě utratí.  
1.6.2  Patologie  
Všechna pokusná zví řata (včetně těch, která v pr ůběhu zkoušky 
uhynula nebo byla utracena z d ůvodu dodržování pravidla dobrého 
zacházení se zví řaty) se pitvají. U každého zví řete se zaznamenají 
všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikros ­
kopické vyšet ření orgán ů, u nichž jsou patrné makroskopické pato ­
logie, u zví řat, která p řežila 24 nebo více hodin, protože mohou 
poskytnout užite čné informace.  
2. DATA  
Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zví ře. Navíc by 
měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, p řičemž se u každé 
zkušební skupiny uvede po čet použitých zví řat, počet zvířat vykazu ­
jících příznaky toxicity, po čet zvířat uhynulých v pr ůběhu zkoušky 
nebo utracených z humánních d ůvodů, doba uhynutí jednotlivých 
zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických ú činků a pitevní 
nálezy.  
3. ZPRÁVY  
3.1 Protokol o zkoušce  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat následující infor ­
mace:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikáln ě- 
chemické vlastnosti (v četně izomerizace),  
— identifika ční údaje, v četně čísla CAS.  
Vehikulum (je-li použito):  
— zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— mikrobiologický stav zví řat, je-li znám,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat (případně včetně zdůvodnění použití 
samců místo samic),  
— původ, podmínky chovu, strava atd.  
Zkušební podmínky:  
— podrobné údaje o složení zkoušené látky, v četně podrobností 
o fyzikální form ě podávaného materiálu,  
— podrobné údaje o zp ůsobu podání zkoušené látky, v četně objemu 
dávek a dob ě podávání,  
— podrobné údaje o strav ě a kvalit ě vody (v četně druhu/zdroje 
stravy, zdroje vody),  
— zdůvodnění výběru výchozí dávky.  
Výsledky:  
— údaje ve form ě tabulky o reakcích každého zví řete a o výši jeho 
dávky (tj. po čet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, v četně 
uhynutí, povahy, závažnosti a trvání ú činků), 
— údaje o t ělesné hmotnosti a jejích zm ěnách ve form ě tabulky,  
— hmotnosti jednotlivých zví řat v den podání dávky, poté 
v týdenních intervalech a v čase úhynu nebo utracení,  
— datum a doba úhynu, pokud p ředchází plánovanému usmrcení,  
— časový průběh nástupu p říznaků toxicity u každého zví řete, a zda 
byly vratné,  
— pitevní a histopatologické nálezy pro každé zví ře, pokud jsou 
k dispozici.  
Diskuse a interpretace výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspec ­
tives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86
 
2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341.  
3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610
 
4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734.
 
5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129–134  
6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). 
A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method 
– An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method 
(Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670.  
8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment N 19.
 
10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28
 th Joint Meeting 
of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/ 
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14- no-24-no-0,FF.html].
 
11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel k A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, 223–231.  
12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
DODATEK 1  
POSTUP, KTERÝ MÁ BÝT U KAŽDÉ Z VÝCHOZÍCH DÁVEK 
DODRŽEN  
OBECNÉ POZNÁMKY  
Systém zkoušení u každé výchozí dávky obsažený v této p říloze nasti ňuje 
postup, který je t řeba sledovat.  
— Dodatek 1A: výchozí dávka je 5 mg na kg t ělesné hmotnosti.  
— Dodatek 1B: výchozí dávka je 50 mg na kg t ělesné hmotnosti.  
— Dodatek 1C: výchozí dávka je: 300 mg na kg t ělesné hmotnosti.  
— Dodatek 1D: výchozí dávka je: 2 000 mg na kg t ělesné hmotnosti.  
Postup zkoušení se řídí nazna čenými šipkami v závislosti na po čtu humánn ě 
utracených nebo uhynulých zví řat. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
Dodatek 1A  
POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 5 MG NA KG T ĚLESNÉ HMOTNOSTI

 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
Dodatek 1B  
POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 50 MG NA KG T ĚLESNÉ HMOTNOSTI

 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
Dodatek 1C  
POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 300 MG NA KG T ĚLESNÉ HMOTNOSTI

 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
Dodatek 1D  
POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 2 000 MG NA KG T ĚLESNÉ HMOTNOSTI

 DODATEK 2  
KRITÉRIA KLASIFIKACE ZKOUŠENÝCH LÁTEK S O ČEKÁVANÝMI 
HODNOTAMI LD  50 PŘESAHUJÍCÍMI 2 000 MG/KG BEZ NUTNOSTI 
ZKOUŠENÍ  
Kritéria pro kategorii nebezpe čnosti 5 mají umožnit identifikaci zkoušených 
látek, u nichž je nebezpe čí akutní toxicity relativn ě nízké, avšak které mohou 
za určitých okolností pro citlivé jedince p ředstavovat nebezpe čí. U těchto látek se 
předpokládá, že se jejich orální nebo dermální LD  50 nebo LD  50 ekvivalentních 
dávek podávaných jinými cestami pohybuje v rozmezí od 2 000 do 5 000 mg/kg. 
Zkoušenou látku lze klasifikovat v kategorii nebezpe čnosti definované jako 
2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg v t ěchto případech (v GHS kategorie 5):  
a) pokud je do této kategorie za řazena podle n ěkterého ze systém ů zkoušení 
uvedeného v p říloze 1a–1d, v závislosti na výskytech uhynutí;  
b) pokud jsou již k dispozici spolehlivé d ůkazy nazna čující, že LD  50 se pohybuje 
v rozmezí hodnot kategorie 5, nebo pokud z jiných studií na zví řatech nebo 
toxických ú činků na člověka vyplývají akutní obavy o lidské zdraví;  
c) pokud extrapolací, odhadem nebo m ěřením údaj ů není přiřazení do vyšší t řídy 
nebezpečnosti odůvodněno a 
— pokud jsou k dispozici spolehlivé informace nazna čující závažné toxické 
účinky na člověka, nebo  
— pokud je b ěhem zkoušení orální cestou do hodnot kategorie 4 pozorováno 
uhynutí, nebo  
— v případech, kdy odborný posudek potvrdí závažné klinické p říznaky 
toxicity p ři testování do hodnot kategorie 4 s výjimkou pr ůjmu, zježení 
srsti nebo rozcuchané srsti, nebo  
— v případech, kdy odborný posudek potvrdí spolehlivé informace, které 
naznačují možnost závažných akutních ú činků vyplývajících z jiných 
studií na zví řatech.  
ZKOUŠENÍ V DÁVKÁCH P ŘESAHUJÍCÍCH 2 000 MG/KG  
S ohledem na nutnost dodržování zásady dobrého zacházení se zví řaty se zkou ­ 
šení na zví řatech v kategorii 5 (5 000 mg/kg) nedoporu čuje a mělo by se 
zvažovat pouze v p řípadě, že existuje velká pravd ěpodobnost, že výsledky takové 
zkoušky mají p římý význam pro ochranu lidského zdraví nebo zdraví zví řat (10). 
S vyššími úrovn ěmi dávek se žádné další zkoušky neprovedou.  
Pokud je vyžadováno zkoušení s dávkou 5 000 mg/kg, vyžaduje se pouze jeden 
krok (tj. t ři zvířata). Pokud první zví ře, jemuž byla podána dávka, uhyne, pokra ­ 
čuje podávání s úrovní 2 000 mg/kg podle vývojového diagramu v p říloze 
1. Pokud první zví ře přežije, podá se dávka dalším dv ěma zvířatům. Pokud 
uhyne pouze jedno zví ře ze tří, očekává se, že hodnota LD  50 přesáhne 
5 000 mg/kg. Pokud uhynou ob ě zvířata, pokra čuje se podáním dávky 
2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
DODATEK 3  
METODA ZKOUŠENÍ B.1.b: Pokyny ke klasifikaci podle systému EU pro p řechodné období 
do plného zavedení globáln ě harmonizovaného systému klasifikace (GHS) (p řevzato 
z literatury (8))
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2 AKUTNÍ INHALA ČNÍ TOXICITA  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) 403 
(2009) (1). P ůvodní Pokyny pro zkoušení 403 (TG 403) akutní inhala ční 
toxicity byly schváleny v roce 1981. Revidovaná verze zkušební metody B.2 
(odpovídá revidované verzi TG 403) popisovaná v této kapitole byla navr ­ 
žena tak, aby byla flexibiln ější, omezila použití zví řat a splňovala regula ční 
potřeby. Revidovaná verze zkušební metody uvádí dva typy studií: tradi ční 
protokol LC  50 a protokol koncentrace krát čas (C × t). Hlavními vlastnostmi 
této zkušební metody jsou schopnost poskytnout vztah mezi koncentrací 
a odezvou v rozmezí od neletálních až po letální výsledky, který umož ňuje 
odvodit medián letální koncentrace (LC  50 ), prahovou hodnotu neletální 
koncentrace (nap ř. LC01) a sm ěrnici a ur čit možnou citlivost pohlaví. 
Protokol C × t by se m ěl použít v p řípadě specifické regula ční nebo v ědecké 
potřeby, která vyžaduje zkoušky na zví řatech po n ěkolik časových období, 
např. pro účely plánování reakcí na nouzové situace [nap ř. odvození hodnot 
směrodatných úrovní akutní expozice (AEGL), pokyn ů pro plánování reakce 
na nouzové situace (ERPG;) nebo prahových úrovní akutní 
expozice (AETL) nebo pro plánování využití p ůdy. 
2. Pokyny k provád ění a interpretaci studií používajících tuto zkušební metodu 
naleznete v Pokynech k zkouškám akutní inhala ční toxicity (GD 39) (2).  
3. Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této 
kapitoly a v GD 39 (2).  
4. Tato zkušební metoda umož ňuje chemickou charakterizaci a kvantitativní 
posouzení rizik a umož ňuje rozdělit a klasifikovat zkoušené chemické 
látky podle na řízení (ES) č. 1272/2008 (3). Dokument GD 39 (2) uvádí 
pokyny pro výb ěr vhodné zkušební metody pro akutní zkoušky. Požadují- 
li se pouze informace o klasifikaci a ozna čení, doporu čuje se obvykle kapi ­
tola B.52 této p řílohy (4) [viz GD 39 (2)]. Zkušební metoda B.2 není 
výslovně určena pro zkoušky speciálních materiál ů, jako jsou špatn ě 
rozpustné kompozitní vláknové nebo izometrické částicové materiály či 
průmyslově vyráběné nanomateriály.  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
5. Zkušební laborato ř by měla dříve, než za čne uvažovat o provedení zkoušek 
v souladu s touto zkušební metodou, vzít v úvahu veškeré dostupné infor ­
mace o zkoušené chemické látce, v četně stávajících studií (nap ř. kapitola 
B.52 této p řílohy (4)), jejichž výsledky by podpo řily neprovád ění dalších 
zkoušek, aby se minimalizovalo použití zví řat. Při výběru nejvhodn ějších 
druhů, kmenů, pohlaví, zp ůsobu expozice a vhodných zkušebních koncen ­
trací mohou pomoci informace o identit ě, chemické struktu ře a fyzikáln ě- 
chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, výsledcích jakýchkoli testů toxicity  in vitro  nebo  in vivo , předpokládaných použitích 
a potenciální expozici u člověka, jakož i dostupné údaje (Q)SAR 
a toxikologické údaje o strukturn ě příbuzných látkách [viz GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Zkouškám žíravých a/nebo dráždivých chemických látek p ři koncentracích, 
které podle o čekávání zp ůsobí intenzivní bolest a/nebo utrpení, by se m ělo 
v co možná nejvyšší mí ře zabránit. Potenciál žíravosti/dráždivosti by se m ěl 
vyhodnotit na základ ě odborného posouzení informací získaných na základ ě 
zkušeností s ú činky na člověka a zvířata (např. údaje ze studií s opakovanou 
dávkou provedených p ři nežíravých/dráždivých koncentracích), stávající 
údaje  in vitro  (např. z kapitol B.40, (5), B.40 BIS (6) této p řílohy nebo 
OECD TG 435 (7)), hodnoty pH, informace o podobných látkách nebo jakékoli další relevantní údaje, za ú čelem prozkoumání, zda je možno od 
dalších zkoušek upustit. Pro specifické regula ční potřeby (např. pro účely 
plánování reakce na nouzové situace) lze tuto zkušební metodu použít k expozici zví řat těmto materiál ům, poněvadž vedoucímu studie nebo 
vedoucímu výzkumného týmu zajiš ťuje kontrolu nad výb ěrem cílových 
koncentrací. Cílové koncentrace by však nem ěly vyvolat intenzivní dráždi ­
vé/žíravé ú činky, zárove ň by však m ěly být dosta čující k prodloužení k řivky 
závislosti odezvy na koncentraci k hodnotám, které umožní splnit regula ční 
a vědecký účel této zkoušky. Tyto koncentrace by se m ěly volit p řípad od 
případu a m ělo by se poskytnout zd ů
vodnění zvolené koncentrace [viz GD 
39 (2)].  
PODSTATA ZKOUŠKY  
7. Tato revidovaná zkušební metoda B.2 byla navržena tak, aby umožnila 
získat dostate čné informace o akutní toxicit ě zkoušené chemické látky pro 
její klasifikaci a poskytovala údaje o letalit ě (např. LC  50, LC 01 a směrnici) 
pro obě pohlaví, které jsou pot řebné pro kvantitativní posouzení rizik. Tato 
zkušební metoda nabízí dva zp ůsoby, jak informace získat. Prvním je 
tradiční protokol, v n ěmž jsou skupiny zví řat vystaveny mezní koncentraci 
(limitní zkouška) nebo sérii koncentrací v postupu provád ěném po krocích 
po předem stanovenou dobu, obvykle 4 hodiny. Pro specifické regula ční 
účely mohou být použity i jiné doby trvání expozice. Druhým je protokol (C 
× t), v n ěmž jsou skupiny zví řat vystaveny jedné koncentraci (mezní 
koncentrace) nebo sérii n ěkolika koncentrací po r ůzně dlouhou dobu.  
8. Umírající zví řata nebo zví řata, která zjevn ě projevují p říznaky bolesti nebo 
značného a přetrvávajícího utrpení, by se m ěla humánn ě utratit a p ři analýze 
výsledků se hodnotí jako zví řata uhynulá p ři zkoušce. Kritéria rozhodování 
o utracení umírajících nebo zna čně trpících zví řat a pokyny týkající se 
rozpoznání p ředvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou p ředmětem 
pokynů OECD č. 19 o humánních parametrech (8).  
POPIS METODY  
Výběr zvířecích druh ů 
9. Měla by se použít mladá zdravá dosp ělá zvířata běžně používaných labora ­
torních plemen. Up řednostňovaným druhem je potkan, a pokud se použijí 
jiné druhy, m ělo by se uvést od ůvodnění. 
Příprava zví řat 
10. Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. V den expozice by m ělo jít 
o mladé dosp ělé jedince ve stá ří 8 až 12 týdn ů a jejich t ělesná hmotnost by 
se u obou pohlaví m ěla pohybovat v rozmezí ± 20 % pr ůměrné hmotnosti 
dříve exponovaných zví řat stejného stá ří. Zvířata jsou náhodn ě vybrána 
a označena pro pot řeby individuální identifikace. Zví řata se umístí do 
klecí nejmén ě 5 dnů před začátkem studie, aby si mohla zvyknout na 
laboratorní podmínky. Zví řata by se také m ěla nechat po krátkou dobu 
před zahájením zkoušky zvyknout na zkušební za řízení, nebo ť to sníží 
stres způsobený novým prost ředím.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Zvířecí chov  
11. Teplota v experimentální místnosti, v níž se zví řata chovají, by m ěla být 22 
± 3 °C. Relativní vlhkost by se m ěla ideálně udržovat v rozmezí 30 až 
70 %, což nemusí být proveditelné, používá-li se jako nosi č voda. P řed 
expozicí a po ní by se m ěla zvířata držet v klecích rozd ělena do skupin 
podle pohlaví a koncentrace, avšak po čet zvířat v jedné kleci by nem ěl 
bránit jasnému pozorování každého zví řete a měl by minimalizovat ztráty 
v důsledku kanibalismu nebo boj ů. Jsou-li zví řata vystavena látce pouze 
nazální cestou, m ůže být nutné je nechat zvyknout si na omezující trubi čky. 
Zkumavky omezující pohyb by nem ěly zvířatům způsobovat p řílišný 
fyzický, termální nebo imobiliza ční stres. Omezení m ůže ovlivnit fyziolo ­
gické cílové parametry, jako je t ělesná teplota (hypertermie) a/nebo respi ­
rační objem za minutu. Jsou-li k dispozici obecné údaje, které prokazují, že 
k takovým zm ěnám nedochází ve zna čné míře, není předběžná adaptace na 
omezující trubi čky nutná. Zví řata, jež jsou vystavena aerosolu celým t ělem, 
by se měla držet b ěhem expozice odd ěleně, aby se zabránilo pronikání 
zkoušeného aerosolu z jejich t ěla do srsti ostatních zví řat v kleci. Mohou 
se používat konven ční a certifikovaná laboratorní krmiva, vyjma období 
expozice, spolu s neomezeným množstvím pitné vody z vodovodu. Osv ět­
lení by m ělo být um ělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy.  
Inhalační komory  
12. Při výběru inhalační komory by se m ěla zvážit povaha zkoušené chemické 
látky a cíl zkoušky. Up řednostňuje se expozice pouze nazální cestou (p ři­ 
čemž pod pojmem nazální se rozumí i expozice hlavy, nosu nebo tlamy) 
Expozice pouze nazální cestou se obvykle up řednostňuje ve studiích kapal ­
ných nebo pevných aerosol ů a par, které mohou kondenzací vytvá řet aero­
soly. Speciálních cíl ů studie lze snáze dosáhnout, použije-li se celot ělová 
expozice, avšak tato skute čnost by se m ěla zdůvodnit ve zpráv ě o studii. Pro 
zajištění stability atmosféry v komo ře pro celot ělovou expozici by nem ěl 
celkový objem zapln ěný pokusnými zví řaty přesáhnout 5 % objemu 
komory. Principy techniky expozice pouze nazální cestou a celot ělové expo ­
zice a jejich konkrétní výhody a nevýhody jsou popsány v dokumentu GD 39 (2).
 
PODMÍNKY EXPOZICE  
Podání koncentrací  
13. Expozice pouze nazální cestou mohou u potkan ů trvat jakoukoli dobu až po 
6 hodin. U myší by expozice pouze nazální cestou nem ěla obvykle p řesáh­
nout 4 hodiny. Jsou-li nutné studie s delší dobou expozice, m ělo by se uvést 
zdůvodnění [viz GD 39 (2)]. Zví řata vystavená aerosol ům v komorách pro 
celotělovou expozici by se m ěla držet odd ěleně, aby se zabránilo poz ření 
zkoušené chemické látky p ři vzájemné pé či o srst s ostatními zví řaty v kleci. 
Během expozice by se m ělo pozastavit krmení zví řat. Během celot ělové 
expozice je možno zví řatům podávat vodu.  
14. Zvířata jsou vystavena zkoušené chemické látce ve form ě plynu, páry, aero ­
solu nebo jejich sm ěsi. Skupenství látky, které se má zkoušet, závisí na 
fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, zvolené 
koncentraci a/nebo fyzické form ě, v níž se bude zkoušená chemická látka 
s největší pravděpodobností nacházet p ři manipulaci a používání. Hygros ­
kopické a chemicky reaktivní zkoušené chemické látky by se m ěly zkoušet 
v podmínkách suchého vzduchu. Je t řeba dbát na to, aby nevznikly explo ­
zivní koncentrace.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Distribuce velikosti částic  
15. U všech aerosol ů a par, které mohou kondenzací vytvo řit aerosoly by se 
měla stanovit velikost částic. Aby byla možná expozice všech d ůležitých 
částí dýchací soustavy, doporu čují se aerosoly s hodnotami hmotnostního 
mediánu aerodynamických pr ůměrů (MMAD) v rozmezí od 1 do 4 μm a s 
geometrickou sm ěrodatnou odchylkou ( σ g ) v intervalu 1,5 až 3,0 (2) (9) 
(10). Přestože by se m ělo vynaložit dostate čné úsilí k spln ění tohoto stan ­
dardu, není-li to možné, je t řeba poskytnout odborný posudek. Nap říklad 
kovové výpary mohou být menší než je tento standard a nabité částice, 
vlákna a hygroskopické materiály (které ve vlhkém prost ředí dýchacích 
cest nabývají na velikosti) mohou být naopak v ětší. 
Příprava zkoušené chemické látky na nosi či 
16. K dosažení vhodné koncentrace a velikosti částic zkoušené chemické látky 
v ovzduší lze použít nosi č. Zpravidla by se m ěla dávat p řednost vod ě. 
Částicový materiál se m ůže zpracovat mechanickými postupy, aby se 
dosáhlo požadované distribuce velikosti částic, avšak m ělo by se zajistit, 
aby nedošlo k rozkladu nebo p řeměně zkoušené chemické látky. Pokud lze 
předpokládat, že by mechanické postupy mohly zm ěnit chemické složení 
zkoušené chemické látky (nap ř. intenzivní mletí spojené s t řením extrémn ě 
zvyšuje teplotu), m ělo by se složení zkoušené chemické látky analyticky 
ověřit. Je třeba dostate čně dbát na to, aby se zkoušená chemická látka 
nekontaminovala. Nedrolivé zrnité materiály, které jsou zám ěrně zformulo ­
vány tak, aby je nebylo možno vdechnout, není t řeba zkoušet. K prokázání 
skutečnosti, že p ři manipulaci se zrnitým materiálem nevznikají vdechova ­
telné částice, by se m ěla použít zkouška ot ěru. Pokud p ři zkoušce ot ěru 
vzniknou vdechovatelné částice, měla by se provést zkouška inhala ční toxi­
city. 
Kontrolní zví řata 
17. Soub ěžná negativní kontrolní skupina (vystavená pouze vzduchu) není 
nutná. Používá-li se k vytvo ření zkušební atmosféry jiný nosi č než voda, 
měla by se kontrolní skupina s nosi čem použít pouze tehdy, nejsou-li 
k dispozici d řívější údaje o inhala ční toxicitě nosiče. Jestliže studie toxicity 
zkoušené chemické látky formulované na nosi či neodhalí žádnou toxicitu, 
vyplývá z toho, že nosi č je při zkoušené koncentraci netoxický, a kontrola 
s nosičem tudíž není nutná.  
MONITOROVÁNÍ PODMÍNEK EXPOZICE  
Proudění vzduchu komorou  
18. Proud ění vzduchu komorou by se m ělo pečlivě řídit, neustále sledovat 
a zaznamenávat alespo ň v hodinových intervalech p ři každé expozici. Moni ­
torování koncentrace (nebo stability) látky ve zkušební atmosfé ře je 
nedílnou sou částí měření všech dynamických parametr ů a poskytuje 
nepřímý prost ředek k řízení všech d ůležitých parametr ů generování dyna ­
mické atmosféry. V komorách ur čených k expozici pouze nazální cestou by 
se měl brát zvláštní ohled na to, aby se zamezilo op ětovnému vdechování, 
v případech, kdy proud ění vzduchu expozi čním systémem není dosta čující 
k zajištění dynamického proud ění zkušební chemické atmosféry. Existují 
předepsané metodiky, které lze použít k prokázání skute čnosti, že za vybra ­
ných provozních podmínek nedochází k op ětovnému vdechování (2) (11). 
Koncentrace kyslíku by m ěla být alespo ň 19 % a koncentrace oxidu uhli ­ 
čitého by nem ěla přesáhnout 1 %. Pokud se p ředpokládá, že se takový 
standard nedodrží, m ěly by se koncentrace kyslíku a oxidu uhli čitého měřit. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Teplota a relativní vlhkost v komo ře 
19. Teplota v komo ře by se m ěla udržovat na 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost 
v zóně, kde zví řata dýchají, jak p ři expozici pouze nazální cestou, tak p ři 
celotělové expozici, by se m ěla sledovat a zaznamenat alespo ň třikrát při 
době expozice až 4 hodiny a každou hodinu p ři kratších expozicích. Rela ­
tivní vlhkost by se m ěla v ideálním p řípadě udržovat v rozmezí 30 až 70 %, 
ale může se stát, že se nepoda ří takovou hodnotu dosáhnout (nap ř. při 
zkoušení sm ěsí na bázi vody) nebo nebude m ěřitelná v d ůsledku interference 
zkoušené chemické látky se zkušební metodou.  
Zkoušená chemická látka: Nominální koncentrace  
20. Pokud to je proveditelné, m ěla by se vypo čítat a zaznamenat nominální 
koncentrace zkoušené chemické látky v expozi ční komo ře. Nominální 
koncentrace je hmotnost generované zkoušené chemické látky vyd ělená 
celkovým objemem vzduchu procházejícím komorovým systémem. Nomi ­
nální koncentrace se nepoužívá k charakterizaci expozice zví řat, avšak 
porovnání nominální koncentrace a skute čné koncentrace je ukazatelem 
výkonnosti zkušebního systému p ři generování zkušební atmosféry, 
a tudíž ji lze použít k odhalení problém ů při generování.  
Zkoušená chemická látka: Skute čná koncentrace  
21. Skute čná koncentrace je koncentrace zkoušené chemické látky v inhala ční 
komoře v zóně, kde zvířata dýchají. Skute čné koncentrace lze zm ěřit speci­
fickými metodami (nap ř. přímý odběr vzorků, adsorpční metody nebo 
metody založené na chemické reakci a následná analytická charakterizace) 
nebo nespecifickými metodami, jako je vážková analýza (gravimetrie). 
Použití gravimetrie je p řípustné pouze u práškových aerosol ů obsahujících 
jedinou složku nebo u aerosol ů z kapalin s nízkou t ěkavostí a m ělo by se 
podložit p říslušnou specifickou charakterizací zkoušené chemické látky p řed 
provedením studie. Koncentraci práškového aerosolu sestávajícího z více 
složek lze rovn ěž stanovit gravimetricky. Vyžaduje to však analytické údaje, 
které prokazují, že složení materiálu ve vzduchu je podobné složení výcho ­
zího materiálu. Nejsou-li tyto informace k dispozici, m ůže být nutné 
provádět během studie v pravidelných intervalech opakovanou analýzu 
zkoušené chemické látky (ideáln ě ve form ě, v níž se ší ří vzduchem). 
U látek ve form ě aerosolu, které se mohou vypa řovat nebo sublimovat, 
by se mělo prokázat, že byly vybranou metodou zachyceny všechny fáze. 
Ve zpráv ě o studii by se m ěly uvést cílové, nominální a skute čné koncent ­
race, avšak k výpo čtu hodnot letální koncentrace ve statistických analýzách 
se použijí pouze skute čné koncentrace.  
22. Měla by se použít pokud možno jedna šarže zkoušené chemické látky 
a zkoušený vzorek by se m ěl skladovat za takových podmínek, aby se 
uchoval čistý, homogenní a stabilní. P řed zahájením studie by se m ěla 
provést charakterizace zkoušené chemické látky, v četně určení její čistoty 
a, je-li to technicky proveditelné, identity a množství identifikovaných příměsí a nečistot. Je možné to prokázat mimo jiné t ěmito údaji: reten ční 
čas a relativní plocha píku, molekulová hmotnost ur čená hmotnostní spek ­
troskopií nebo plynovou chromatografií nebo jiné odhady. P řestože ur čení 
identity zkoušeného vzorku není povinností laborato ře provádějící zkoušku, 
je vhodné alespo ň do jisté míry ov ěřit popis látky poskytnutý zadavatelem 
(např. pokud jde o barvu, fyzikální povahu apod.).
 
23. Expozi ční atmosféra by se m ěla udržovat co nejstálejší a m ěla by se moni ­
torovat bu ď nepřetržitě, nebo v pravidelných intervalech v závislosti na 
analytické metod ě. Používá-li se odb ěr vzorků v pravidelných intervalech, 
měly by se vzorky atmosféry v komo ře odebrat ve čtyřhodinové studii 
alespoň dvakrát. Není-li to v d ůsledku omezené rychlosti proud ění vzduchu 
nebo nízké koncentrace možné, m ůže se během celého období expozice 
odebrat jeden vzorek. Objeví-li se výrazné výkyvy mezi jednotlivými  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
vzorky, m ěly by se u dalších zkoušených koncentrací použít čtyři vzorky na 
každou expozici. Koncentrace stanovená v jednotlivých vzorcích atmosféry 
v komoře by se nem ěla lišit od pr ůměrné koncentrace o více než ± 10 % 
u plynů a par či o více než ± 20 % u kapalných nebo pevných aerosol ů. 
Měla by se vypo čítat a zaznamenat doba pot řebná k dosažení rovnovážného 
stavu v komo ře (t 95 ). Doba expozice zahrnuje i dobu, b ěhem níž je zkoušená 
chemická látka generována, a ta bere v úvahu dobu nutnou k dosažení t  95 . 
Pokyny k výpo čtu t  95 jsou uvedeny v dokumentu GD 39 (2).  
24. U vysoce komplexních sm ěsí složených z plyn ů/par a aerosol ů (např. atmo­
sféry obsahující produkty spalování a zkoušené chemické látky vyst řikované 
z účelových výrobk ů/zařízení pro koncové použití) se m ůže každá fáze 
chovat v inhala ční komoře odlišně, proto by se pro každou fázi (plyn/pára 
a aerosol) m ěla zvolit alespo ň jedna indika ční látka (analyt), obvykle hlavní 
účinná látka ve sm ěsi. Je-li zkoušenou chemickou látkou sm ěs, měla by se 
uvést i analytická koncentrace sm ěsi, nikoliv pouze ú činné látky nebo 
složky (analytu). Další informace týkající se skute čných koncentrací nale ­
znete v dokumentu GD 39 (2).  
Zkoušená chemická látka: Distribuce velikosti částic  
25. Distribuce velikosti částic aerosol ů by se měla během čtyřhodinové expozice 
stanovit alespo ň dvakrát pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného 
přístroje, nap ř. aerodynamického spektrometru částic. Je-li možno prokázat 
shodu výsledk ů získaných pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného 
přístroje, m ůže se tento jiný p řístroj používat v pr ůběhu celé studie. Vedle 
primárního p řístroje by se m ěl použít ješt ě druhý p řístroj, nap ř. gravime ­
trický filtr nebo impinger/promýva čka plynu, k ov ěření účinnosti záchytu 
primárním p řístrojem. Hmotnostní koncentrace získaná analýzou velikosti 
částic by m ěla ležet v p řiměřeném rozmezí hmotnostní koncentrace získané 
vážkovou analýzou [viz dokument GD 39 (2)]. Je-li možné v časné fázi 
studie prokázat jejich rovnocennost, lze od dalších potvrzujících m ěření 
upustit. Z d ůvodu zajišt ění dobrých životních podmínek zví řat by se m ěly 
podniknout kroky k minimalizaci nepr ůkazných údaj ů, které mohou vést 
k nutnosti opakovat expozici. U par by se m ělo provést m ěření velikosti 
částic, pokud existuje možnost, že kondenzace páry povede ke vzniku aero ­
solu nebo pokud jsou v parách detekovány částice s potenciálem pro tvorbu 
smíšených fází (viz odstavec 15).  
POSTUP  
26. Níže jsou popsány dva typy studie: tradi ční protokol a protokol C × t. Oba 
protokoly mohou zahrnovat orienta ční studii, hlavní studii a/nebo limitní 
zkoušku (tradi ční protokol) nebo zkoušku p ři mezní koncentraci (C × t). 
Je-li známo, že jedno pohlaví je citliv ější, může se vedoucí studie rozhod ­
nout provést tyto studie pouze u citlivého pohlaví. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavc ů než potkani, je možno upravit 
maximální doby expozice za ú čelem minimalizace druhov ě specifického 
utrpení. P řed zahájením zkoušky je t řeba zvážit veškeré dostupné údaje, 
aby se minimalizovalo použití zví řat. Například použitím údaj ů získaných 
podle kapitoly B.52 této p řílohy (4) je možné se provád ění orienta ční studie 
vyhnout a m ůže se jimi rovn ěž prokázat, zda je jedno pohlaví citliv ější [viz 
GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
TRADIČNÍ PROTOKOL  
Obecné úvahy: Tradi ční protokol  
27. V tradi ční studii se skupiny zví řat vystaví zkoušené chemické látce po fixn ě 
dané časové období (obvykle 4 hodiny) bu ď v komoře pro expozici pouze 
nazální cestou nebo v komo ře pro celot ělovou expozici. Zví řata jsou vysta ­
vena buď mezní koncentraci (limitní zkouška) nebo alespo ň třem koncen ­
tracím v postupných krocích (hlavní studie). Hlavní studii m ůže předcházet 
studie orienta ční, pokud již nejsou o zkoušené chemické látce k dispozici 
nějaké informace, nap ř. údaje z d říve provedené studie B.52 [viz dokument 
GD 39 (2)].  
Orientační studie: Tradi ční protokol  
28. Orienta ční studie se používá k odhadu ú činnosti zkoušené chemické látky, 
zjištění rozdílů v citlivosti jednotlivých pohlaví a k výb ěru úrovně expoziční 
koncentrace pro hlavní studii nebo limitní zkoušku. P ři výběru úrovní 
koncentrací pro orienta ční studii by se m ěly použít veškeré dostupné infor ­
mace, včetně dostupných údaj ů (Q)SAR a údaj ů o podobných chemických 
látkách. Každé koncentraci by se m ěli vystavit maximáln ě tři samci a t ři 
samice (k stanovení rozdílu mezi pohlavími se obvykle používají od každého pohlaví 3 jedinci). Orienta ční studie m ůže používat pouze jedinou 
koncentraci, avšak v p řípadě potřeby je možné vyzkoušet více koncentrací. 
Orientační studie by nem ěla zkoušet tolik zví řat a koncentrací, aby p řipo­
mínala hlavní studii. Namísto orienta ční studie je možné použít d říve 
provedenou studii B.52 (4) [viz dokument GD 39 (2)].
 
Limitní zkouška: Tradi ční protokol  
29. Limitní zkouška se používá v p řípadě, že je o zkoušené chemické látce 
známo, že je prakticky netoxická, tj. vyvolává toxickou reakci pouze p ři 
koncentraci vyšší, než je regula ční mezní koncentrace, nebo se to o ní 
předpokládá. P ři limitní zkoušce se vystavuje jedna skupina t ří samců 
a tří samic zkoušené chemické látce o mezní koncentraci. Informace 
o toxicitě zkoušené chemické látky lze získat ze znalostí o podobných 
zkoušených chemických látkách, vezme-li se v úvahu identita a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo v ůbec žádné informace o toxicit ě nebo kdy 
se očekává, že zkoušená chemická látka bude toxická, by se m ěla provést 
hlavní zkouška.
 
30. Volba mezních koncentrací obvykle závisí na regula čních požadavcích. 
Používá-li se na řízení (ES) č. 1272/2008, činí mezní koncentrace pro 
plyny 20 000 ppm, pro páry 20 mg/l a pro aerosoly 5 mg/l (nebo maximální 
dosažitelná koncentrace) (3). Generovat mezní koncentrace n ěkterých zkou ­ 
šených chemických látek m ůže být technicky náro čné, zejména ve form ě par 
nebo aerosol ů. Při zkoušení aerosol ů by mělo být primárním cílem dosažení 
vdechovatelné velikosti částic (MMAD = 1–4 μm). U většiny zkoušených 
chemických látek je toho možno dosáhnout p ři koncentraci 2 mg/l. Zkoušení 
aerosolů při koncentracích v ětších než 2 mg/l by se m ělo provád ět pouze, 
pokud je možné dosáhnout vdechovatelné velikosti částic [viz dokument GD 
39 (2)]. Na řízení (ES) č. 1272/2008 nedoporu čuje zkoušky p ři koncentracích 
přesahujících mezní koncentraci z d ůvodů zajištění šetrného zacházení se 
zvířaty. O mezní koncentraci by se m ělo uvažovat pouze v p řípadě, že 
existuje velká pravd ěpodobnost, že výsledky takové zkoušky budou mít 
přímý význam pro ochranu lidského zdraví (3) a že se ve zpráv ě o studii 
uvede zd ůvodnění. V případě potenciáln ě výbušných zkoušených chemic ­
kých látek je t řeba zajistit, aby nedošlo k explozi. Aby se zamezilo zbyte č­
nému použití zví řat, měla by se p řed limitní zkouškou provést jedna zkouška 
bez zvířat, kterou se zjistí, zda lze v komo ře dosáhnout podmínek pro 
limitní zkoušku.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Pokud je p ři mezní koncentraci pozorována mortalita či umírání, mohou 
výsledky limitní zkoušky sloužit jako orienta ční studie pro další zkoušky 
při jiných koncentracích (viz hlavní studie). Jestliže fyzikální nebo chemické 
vlastnosti zkoušené chemické látky znemož ňují dosažení mezní koncentrace, 
měla by se zkoušet maximální dosažitelná koncentrace. Pokud p ři maxi­
mální dosažitelné koncentraci dojde k letalit ě menší než 50 %, nejsou 
nutné žádné další zkoušky. Nelze-li dosáhnout mezní koncentrace, m ěly 
by se ve zpráv ě o studii uvést vysv ětlující a podp ůrné údaje. Jestliže maxi ­
mální dosažitelná koncentrace páry nevyvolává toxicitu, m ůže být zapot řebí 
generovat zkoušenou chemickou látku ve form ě kapalného aerosolu.  
Hlavní studie: Tradi ční protokol  
32. Hlavní studie se obvykle provádí s použitím p ěti samců a pěti samic (nebo 5 
zvířat citlivého pohlaví, je-li známo) pro každou koncentraci s tím, že se 
zkouší nejmén ě tři různé koncentrace. Zvolené koncentrace by m ěly být 
dostatečné, aby statistická analýza byla pr ůkazná. Časový interval mezi 
exponovanými skupinami závisí na dob ě nástupu, trvání a závažnosti 
příznaků toxicity. S expozicí zví řat další úrovni koncentrace by se m ělo 
vyčkat, dokud není dostate čná jistota, že d říve zkoušená zví řata přežila. 
To vedoucímu studie umožní upravit cílovou koncentraci pro další expono ­
vanou skupinu. U inhala čních studií to však nemusí být vždy praktické, 
v důsledku závislosti na sofistikovaných technologiích, a tak by expozice 
zvířat na další úrovni koncentrace m ěla vycházet z p ředchozích zkušeností 
a vědeckého úsudku. P ři zkouškách sm ěsí je třeba nahlédnout do dokumentu 
GD 39 (2).  
PROTOKOL KONCENTRACE × ČAS (C × T)  
Obecné úvahy: Protokol C × t  
33. Při hodnocení inhala ční toxicity se jako alternativa k tradi čnímu protokolu 
může zvážit stup ňovaná studie C × t (12) (13) (14). Tento p řístup umož ňuje 
vystavit zví řata zkoušené chemické látce na r ůzných úrovních koncentrace 
a po několik časových období. Zkouška se provádí v komo ře pro expozici 
pouze nazální cestou (celot ělové komory nejsou pro tento protokol vhodné). 
Schéma postupu v dodatku 1 objas ňuje tento protokol. Simula ční analýzy 
prokázaly, že tradi ční protokol i protokol C × t jsou oba schopny vést 
k průkazným hodnotám LC  50 , avšak protokol C × t je obecn ě lepší pro 
získání pr ůkazných hodnot LC  01 a LC  10 (15).  
34. Simula ční analýza prokázala, že použití dvou zví řat na každý interval C × 
t (jedno od každého pohlaví p ři použití obou pohlaví nebo dva jedinci 
citlivějšího pohlaví) m ůže být obvykle dosta čující při zkoušení 4 koncen ­
trací a 5 dob expozice v hlavní studii. Za ur čitých okolností se m ůže 
vedoucí studie rozhodnout použít dva potkany od každého pohlaví na každý interval C × t (15). Použití 2 zví řat od každého pohlaví pro každou 
koncentraci a časový bod m ůže snížit zkreslení a variabilitu odhad ů, zvýšit 
míru úsp ěšnosti odhadu a zlepšit pokrytí intervalu spolehlivosti. Nicmén ě 
v případě, kdy jsou údaje pro odhad nedostate čné (při použití jednoho 
zvířete od každého pohlaví nebo dvou zví řat citlivějšího pohlaví) m ůže 
stačit rovněž 5. expozi ční koncentrace. Další pokyny ohledn ě počtu zvířat 
a koncentrací, které se mají použít ve studii C × t, naleznete v dokumentu 
GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Orientační studie: Protokol C × t  
35. Orienta ční studie se používá k odhadu ú činnosti zkoušené chemické látky 
a k pomoci p ři výběru úrovní expozi ční koncentrace pro hlavní studii. 
K výběru vhodné výchozí koncentrace pro hlavní studii a k minimalizaci 
počtu použitých zví řat může být zapot řebí provést orienta ční studii 
s použitím až t ří zvířat/pohlaví/koncentrací [podrobnosti viz dodatek III 
dokumentu GD 39 (2)]. K stanovení rozdílu mezi pohlavími m ůže být 
třeba použití t ří zvířat od každého pohlaví. Tato zví řata by se m ěla vystavit 
látce po jedinou dobu trvání, obvykle 240 min. Schopnost generovat 
příslušnou zkušební atmosféru by se m ěla posoudit b ěhem předběžných 
technických zkoušek bez zví řat. Jsou-li k dispozici údaje o mortalit ě ze 
studie B.52, není obvykle nutné provád ět orientační studii. P ři výběru 
první cílové koncentrace ve studii B.2 by m ěl vedoucí studie vzít 
v úvahu vzorce mortality pozorované v dostupných studiích B.52 (4) u obou pohlaví a p ři všech zkoušených koncentracích [viz dokument GD 
39 (2)].
 
Počáteční koncentrace: Protokol C × t  
36. Počáteční koncentrace (expozi ční cyklus I) (dodatek 1) bude bu ď mezní 
koncentrace, nebo koncentrace zvolená vedoucím studie na základ ě orien­
tační studie. Skupiny s jedním zví řetem od každého pohlaví jsou vystaveny 
této koncentraci po r ůzně dlouhou dobu (nap ř. 15, 30, 60, 120, nebo 240 
minut), takže celkový po čet zvířat je 10 (tomu se říká expozi ční cyklus I) 
(dodatek 1).  
37. Volba mezních koncentrací obvykle závisí na regula čních požadavcích. 
Používá-li se na řízení (ES) č. 1272/2008, činí mezní koncentrace pro 
plyny 20 000 ppm, pro páry 20 mg/l a pro aerosoly 5 mg/l (nebo maximální dosažitelná koncentrace) (3). Generovat mezní koncentrace n ěkterých zkou ­ 
šených chemických látek m ůže být technicky náro čné, zejména ve form ě par 
nebo aerosol ů. Při zkoušení aerosol ů by mělo být cílem dosažení vdecho ­
vatelné velikosti částic (tj. MMAD = 1–4 μm) při mezní koncentraci 2 mg/l. 
Toho je možné dosáhnout u v ětšiny zkoušených chemických látek. Zkoušení 
aerosolů při koncentracích v ětších než 2 mg/l by se m ělo provád ět pouze, 
pokud je možné dosáhnout vdechovatelné velikosti částic [viz dokument GD 
39 (2)]. Na řízení (ES) č. 1272/2008 odrazuje od zkoušek p ři koncentracích 
přesahujících mezní koncentraci z d ůvodů zajištění dobrých životních 
podmínek zví řat. O zkoušce p ři koncentraci p řevyšující mezní koncentraci 
by se mělo uvažovat pouze v p řípadě, že existuje velká pravd ěpodobnost, že 
výsledky takové zkoušky budou mít p římý význam pro ochranu lidského 
zdraví (3) a že se ve zpráv ě o studii uvede zd ůvodnění. V případ
ě poten­
ciálně výbušných zkoušených chemických látek je t řeba dbát na to, aby 
nedošlo k explozi. Aby se zamezilo zbyte čnému použití zví řat, měla by 
se před zkouškou p ři počáteční koncentraci provést jedna zkouška bez 
zvířat, aby se zajistilo, že lze v komo ře dosáhnout podmínek pro tuto 
koncentraci.  
38. Pokud se p ři počáteční koncentraci pozoruje mortalita či agonie, mohou 
výsledky p ři této koncentraci sloužit jako výchozí bod pro další zkoušky 
při jiných koncentracích (viz hlavní studie). Jestliže fyzikální nebo chemické 
vlastnosti zkoušené chemické látky znemož ňují dosažení mezní koncentrace, 
měla by se testovat maximální dosažitelná koncentrace. Pokud p ři maxi­
mální dosažitelné koncentraci dojde k letalit ě menší než 50 %, nejsou 
nutné žádné další zkoušky. Nelze-li dosáhnout mezní koncentrace, m ěly 
by se ve zpráv ě o studii uvést vysv ětlující a podp ůrné údaje. Jestliže maxi ­
mální dosažitelná koncentrace páry nemá toxické ú činky, může být 
zapotřebí generovat zkoušenou chemickou látku ve form ě kapalného aero ­
solu. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Hlavní studie: Protokol C × t  
39. Počáteční koncentrace (Expozi ční cyklus I) (Dodatek 1) zkoušená v hlavní 
studii bude bu ď mezní koncentrace, nebo koncentrace zvolená vedoucím 
studie na základ ě orientační studie. Jestliže byla b ěhem expozi čního cyklu 
I nebo po ní pozorována mortalita, bude minimální expozice (C × t), která 
vede k mortalit ě, použita jako vodítko k ur čení koncentrace a délek expozice 
pro expozi ční cyklus II. Každý následující expozi ční cyklus bude záviset na 
předcházejícím expozi čním cyklu (viz dodatek 1).  
40. U mnoha zkoušených chemických látek budou výsledky získané p ři počá­
teční koncentraci spolu s t řemi dalšími expozi čními cykly se sou řadnicovou 
sítí o menším časovém kroku (tj. geometrické odstup ňování dob expozice 
určené násobkem, jímž se liší po sob ě jdoucí periody, obvykle √2) dosta­ 
čující k stanovení vztahu mezi C × t a mortalitou (15), avšak m ůže být 
užitečné použít i 5. expozi ční koncentraci [viz dodatek 1 a dokument GD 39 
(2)]. Matematické zpracování výsledk ů protokolu C × t naleznete 
v dodatku 1.  
POZOROVÁNÍ  
41. Během období expozice by se m ěla zvířata často klinicky sledovat. Po 
expozici by se m ěla provést klinická pozorování alespo ň dvakrát v den 
expozice nebo častěji, pokud to nazna čuje reakci zví řat na expozici, 
a poté alespo ň jednou denn ě po dobu celkem 14 dní. Délka období sledo ­
vání není stanovená pevn ě, ale měla by se ur čit na základ ě povahy a doby 
nástupu klinických p říznaků a délky období zotavení. Doba, kdy se p říznaky 
toxicity objeví a vymizí, je d ůležitá zejména v p řípadě tendence ke zpož ­
děným příznakům toxicity. Veškerá pozorování se systematicky zaznamená ­
vají, přičemž záznamy se vedou pro každé zví ře jednotliv ě. Umírající zví řata 
a zvířata se známkami prudkých bolestí nebo s p řetrvávajícími p říznaky 
značného utrpení by se m ěla humánn ě utratit z d ůvodu zajišt ění dobrých 
životních podmínek zví řat. Při vyšetřování klinických p říznaků toxicity je 
třeba dbát na to, aby se po čáteční špatný stav a p řechodné respira ční změny 
v důsledku postupu expozice neinterpretovaly myln ě jako toxicita spojená se 
zkoušenou chemickou látkou, která by vyžadovala p ředčasné utracení zví řat. 
Měly by se vzít v úvahu principy a kritéria shrnuté v pokynech o humánních 
parametrech (GD 19) (7). Pokud jsou zví řata z humánních d ůvodů utracena 
nebo je zjišt ěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejp řes­
něji. 
42. Pozorování v kleci se soust řeďují na zm ěny na kůži, na srsti, na o čích, na 
sliznicích a rovn ěž změny dýchání, krevního ob ěhu, změny funkce auto ­
nomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. 
Je-li to možné, m ěly by se zaznamenat jakékoli rozdíly mezi místními 
a systémovými ú činky. Pozornost je t řeba věnovat třesu, křečím, slinění, 
průjmu, letargii, spánku a kómatu. M ěření rektální teploty m ůže poskytnout 
podpůrné důkazy pro reflexní bradypnoe nebo hypo/hypertermii spojenou 
s expozicí nebo držením v kleci.  
Tělesné hmotnosti  
43. Hmotnosti jednotlivých zví řat by se m ěly zaznamenat jednou b ěhem období 
aklimatizace, v den expozice p řed expozicí (den 0), a minimáln ě v den 1, 3 
a 7 (a poté jednou týdn ě) a v dob ě uhynutí nebo utracení, pokud k n ěmu 
dojde po dni 1. T ělesná hmotnost je uznávána jako zásadní ukazatel toxicity, 
a proto by se m ěla zvířata vykazující p řetrvávající úbytek hmotnosti ≥ 20 % 
v porovnání s hodnotami p řed studií pe člivě sledovat. Na konci období po 
expozici se zví řata, která p řežila, zváží a humánn ě utratí.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologie  
44. Všechna pokusná zví řata, včetně těch, která v pr ůběhu zkoušky uhynula 
nebo byla utracena z d ůvodu zajišt ění dobrého zacházení se zví řaty, by se 
měla podrobit pitv ě. Není-li možné pitvu provést ihned po objevení uhynu ­
lého zvířete, mělo by se zví ře uchovávat v chladicím boxu (nikoli zmrazené) 
při teplotách dostate čně nízkých k minimalizaci autolýzy. Pitvy by se m ěly 
provést co možná nejd říve, obvykle b ěhem jednoho nebo dvou dn ů. 
U každého zví řete by se m ěly zaznamenat všechny makroskopické patolo ­
gické nálezy, p řičemž se v ěnuje zvláštní pozornost jakýmkoli nález ům 
v dýchacích cestách.  
45. Je možné zvážit další vyšet ření zahrnutá a priori v návrhu za ú čelem zvět­ 
šení interpreta ční hodnoty studie, nap ř. měření hmotnosti plic p řeživších 
potkanů a/nebo poskytnutí d ůkazů o podrážd ění pomocí mikroskopického 
vyšetření dýchacích cest. Mezi vyšet řované orgány mohou pat řit také ty, 
které vykazují makroskopické patologické známky u zví řat přežívajících po 
24 či více hodin a orgány, o nichž je známo nebo se o čekává, že budou 
postiženy. Mikroskopické vyšet ření celých dýchacích cest m ůže poskytnout 
užitečné informace u zkoušených chemických látek, které reagují s vodou, 
například u kyselin a hygroskopických zkoušených látek.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Údaje  
46. Měly by se uvést údaje o t ělesné hmotnosti a pitevních nálezech pro každé 
jednotlivé zví ře. Údaje z klinického sledování by se m ěly shrnout do 
tabulky, p řičemž se u každé zkušební skupiny uvede po čet použitých zví řat, 
počet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, po čet zvířat uhynulých 
v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních d ůvodů, doba uhynutí 
jednotlivých zví řat, popis, časový pr ůběh a vratnost toxických ú činků 
a pitevní nálezy.  
Protokol o zkoušce  
47. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat následující informace:  
Pokusná zví řata a podmínky chovu  
— popis podmínek v klecích uvád ějící: počet (nebo zm ěnu počtu) zvířat 
v každé kleci, materiál podestýlky, teplotu a relativní vlhkost prost ředí, 
světelné období a druh stravy,  
— použitý druh/kmen a od ůvodnění použití jiného druhu než potkan,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— metoda randomizace,  
— podrobné údaje o kvalit ě krmení a vody (v četně druhu/zdroje stravy, 
zdroje vody),  
— popis jakékoliv p řípravy p řed zkouškou v četně krmení, karantény 
a léčby onemocn ění. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Zkoušená chemická látka  
— fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikáln ě-chemické 
vlastnosti (v četně izomerizace),  
— identifika ční údaje a číslo v registru Chemical Abstract Services (CAS), 
je-li známo.  
Nosič 
— zdůvodnění použití nosi če a zdůvodnění výběru nosiče (pokud se nepou ­ 
žije voda),  
— historické nebo sou časné údaje prokazující, že nosi č neovliv ňuje 
výsledek studie.  
Inhalační komora  
— popis inhala ční komory v četně jejích rozm ěrů a objemu,  
— zdroj a popis za řízení použitého pro expozici zví řat a rovn ěž pro gene ­
rování atmosféry,  
— zařízení pro m ěření teploty, vlhkosti, velikosti částic a skute čné koncent ­
race,  
— zdroj vzduchu a úprava dodávaného/odsávaného vzduchu a systém 
použitý pro klimatizaci,  
— metody použité ke kalibraci za řízení k zajišt ění homogenní zkušební 
atmosféry,  
— rozdíl tlak ů (kladný nebo záporný),  
— počet expozi čních otvor ů v každé komo ře (nazální expozice), umíst ění 
zvířat v systému (celot ělová expozice),  
— homogenita/stabilita zkušební atmosféry v čase, 
— umístění teplotních čidel, čidel vlhkosti a odb ěr vzorků zkušební atmo ­
sféry z komory,  
— průtokové rychlosti vzduchu, pr ůtoková rychlost vzduchu/expozi ční 
otvor (nazální expozice) nebo množství zví řat/komora (celot ělová expo ­
zice),  
— informace o za řízení použitém k m ěření kyslíku a oxidu uhli čitého, 
používá-li se,  
— doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v inhala ční komoře (t  95 ) 
— počet výměn objemu vzduchu za hodinu,  
— měřicí přístroje (používají-li se).  
Údaje o expozici  
— zdůvodnění volby cílové koncentrace v hlavní studii,  
— nominální koncentrace (celková hmotnost zkoušené chemické látky 
generované do inhala ční komory vyd ělená objemem vzduchu prošlým 
komorou),  
— skutečné koncentrace zkoušené chemické látky nam ěřené v dýchací zón ě 
zvířat. U směsí, které vytvá řejí heterogenní fyzikální formy (plyny, páry, 
aerosoly), je možné analyzovat každou zvláš ť, ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— veškeré koncentrace látky ve vzduchu by se m ěly uvádět v hmotnostních 
jednotkách (nap ř. mg/l, mg/m  3 , atd.), v závorce je možné uvést také 
hodnotu v objemových jednotkách (nap ř. ppm, ppb, atd.),  
— distribuce velikosti částic, hmotnostní medián aerodynamického 
průměru (MMAD) a geometrická sm ěrodatná odchylka ( σ g ), včetně 
metod jejich výpo čtu. Měly by se uvést jednotlivé analýzy velikosti 
částic.  
Zkušební podmínky  
— podrobné údaje o p řípravě zkoušené chemické látky v četně postupů 
použitých k snížení velikosti částic pevných látek nebo k p řípravě 
roztoků zkoušené chemické látky. V p řípadě, kdy mohly mechanické 
postupy zm ěnit chemické složení zkoušené chemické látky, uve ďte 
také výsledky analýz ov ěřujících složení zkoušené chemické látky,  
— popis (nejlépe v četně nákresu) za řízení použitého ke generování 
zkušební atmosféry k expozici zví řat zkušební atmosfé ře, 
— podrobné údaje o použité chemické analytické metod ě a validaci metody 
(včetně účinnosti výt ěžnosti zkoušené chemické látky ze vzorkovaného 
média),  
— zdůvodnění výběru zkoušených koncentrací.  
Výsledky  
— tabulka s údaji o teplot ě, vlhkosti a pr ůtoku vzduchu v komo ře, 
— tabulka s údaji o nominální a skute čné koncentraci v komo ře, 
— tabulka s údaji o velikosti částic včetně údajů o odběru analytických 
vzorků, distribuce velikosti částic a výpo čtů MMAD a σ g , 
— tabulka s údaji o odezv ě a úrovni koncentrace u každého zví řete (tj. 
zvířata vykazující p říznaky toxicity v četně mortality, charakter, závaž ­
nost, doba nástupu a trvání ú činků), 
— hmotnosti jednotlivých zví řat ve studii, datum a čas uhynutí, pokud 
k němu došlo p řed plánovaným utracením, časový pr ůběh nástupu 
příznaků toxicity a zda byly vratné u každého zví řete, 
— pitevní a histopatologické nálezy pro každé zví ře, pokud jsou 
k dispozici,  
— odhady letality (nap ř. LC  50 , LD  01 ) včetně 95 % interval ů spolehlivosti 
a směrnice (pokud ji lze metodou hodnocení získat),  
— statistická závislost v četně odhadu exponentu n (protokol C × t). M ěl by 
se uvést název použitého statistického softwaru.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Diskuse a interpretace výsledk ů 
— Měl by se klást zvláštní d ůraz na popis metod použitých ke spln ění 
kritérií této zkušební metody, nap ř. mezní koncentrace nebo velikost 
částic.  
— Je třeba zabývat se vdechovatelností částic s ohledem na celkové nálezy, 
zejména pokud nebylo možno splnit kritéria pro velikost částic.  
— Mělo by se uvést vysv ětlení, pokud bylo nutno humánn ě utratit zví řata 
trpící bolestí nebo vykazující známky intenzivního a p řetrvávajícího 
utrpení na základ ě kritérií uvedených v pokynech OECD o humánních 
parametrech (8).  
— Bylo-li ve prosp ěch této zkušební metody B.2 p řerušeno provád ění 
zkoušky podle kapitoly B.52 této p řílohy (4), m ělo by se uvést zd ůvod­
nění. 
— V celkovém hodnocení studie by se m ěla popsat konzistentnost metod 
použitých k stanovení nominálních a skute čných koncentrací a vztah 
mezi aktuální a skute čnou koncentrací.  
— Měla by se uvést pravd ěpodobná p říčina úhynu a p řevládající mecha ­
nismus účinku (systémový nebo místní).  
LITERATURA:  
1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Dostupné na: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testgu ­
idelines]  
3) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 
16. prosince 2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek a sm ěsí, 
o změně a zrušení sm ěrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zm ěně 
nařízení (ES) č. 1907/2006, Ú ř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.  
4) Kapitola B.52 této p řílohy, Akutní inhala ční toxicita – metoda stanovení 
třídy akutní toxicity (ATC).  
5) Kapitola B.40 této p řílohy, Leptavé ú činky na k ůži in vitro: Zkouška trans ­
kutánního elektrického odporu (TER).  
6) Kapitola B.40bis této p řílohy, Leptavé ú činky na k ůži in vitro: Zkouška 
pomocí modelu lidské k ůže. 
7) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosi ­
on.. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 425, OECD, Paris. 
Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs a. s. Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Dostupné na: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of 
Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.  
10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160- 
167. 
12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with 
Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
 
13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
 
14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.  
15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × 
t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
DEFINICE  
Zkoušená chemická látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Dodatek 1  
Protokol C × t  
1. Při hodnocení inhala ční toxicity se jako alternativa k tradi čnímu protokolu 
může použít vícestup ňová studie C × t (12) (13) (14). P řednostně by se měla 
provádět v případě, kdy je pro specifické regula ční nebo v ědecké účely třeba 
provést zkoušky na zví řatech po n ěkolik časových období nap ř. pro účely 
plánování reakce na nouzové situace nebo plánování využití p ůdy. Tento 
postup obvykle za číná zkouškou p ři mezní koncentraci (expozi ční cyklus I), 
při níž se zví řata vystaví zkoušené chemické látce po p ět různě dlouhých 
časových období (nap ř. 15, 30, 60, 120 a 240 min.), takže se v rámci 
jediného expozi čního cyklu získají údaje z n ěkolika různých časových 
období (viz obrázek 1). Používá-li se na řízení (ES) č. 1272/2008, činí 
mezní koncentrace pro plyny 20 000 ppm, pro páry 20 mg/l a pro aerosoly 5 mg/l. Tyto úrovn ě se smí p řekročit, pouze pokud je pro specifické regu ­
lační nebo v ědecké účely t
řeba provést zkoušky na t ěchto úrovních (viz 
odstavec 37 v hlavním textu kapitoly B.2).  
2. V situacích, kdy je k dispozici pouze málo informací o toxicit ě zkoušené 
chemické látky nebo informace zcela chybí, m ěla by se provést orienta ční 
studie, v níž se obvykle po dobu 240 minut vystaví maximáln ě 3 zvířata od 
každého pohlaví cílovým koncentracím, které vybral vedoucí studie.  
3. Jestliže se b ěhem expozi čního cyklu I zkouší mezní koncentrace a je pozo ­
rována mortalita menší než 50 %, není t řeba provád ět žádné další zkoušky. 
Existuje-li regula ční nebo v ědecká pot řeba stanovit vztah mezi koncentrací/ 
časem/odezvou p ři vyšších úrovních, než je uvedená mezní koncentrace, 
měla by se další expozice provést p ři vyšší úrovni, nap říklad při dvojná­
sobku mezní koncentrace (tj. 2L na obrázku 1).  
4. Jestliže je p ři mezní koncentraci pozorována toxicita, je t řeba provést další 
zkoušky (hlavní studii). Tyto další expozice se provád ějí buď při nižších 
koncentracích (na obrázku 1: expozi ční cykly II, III nebo IV), nebo p ři 
vyšších koncentracích po kratší časová období (na obrázku 1: expozi ční 
cyklus IV), p řičemž tato časová období jsou upravena a není mezi nimi 
velký časový odstup.  
5. Zkouška (po čáteční koncentrace a dalších koncentrací) se provádí za použití 
1 zvířete od každého pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod nebo se 2 
zvířaty citlivějšího pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod. Za ur čitých 
okolností se m ůže vedoucí studie rozhodnout použít 2 potkany od každého 
pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod (nebo 4 zví řata citliv ějšího 
pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod) (15). Použití 2 zví řat od 
každého pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod v ětšinou sníží zkreslení 
a variabilitu odhad ů, zvýší míru úsp ěšnosti odhadu a zlepší pokrytí intervalu 
spolehlivosti týkajícího se zde popsaného protokolu. Další podrobnosti jsou 
uvedeny v dokumentu GD 39 (2).  
6. V ideálním p řípadě se každý expozi ční cyklus provede b ěhem jednoho dne. 
To dává možnost vy čkat s další expozicí, dokud není dostate čná jistota, že 
zvířata přežila, a vedoucímu studie to umož ňuje upravit cílové koncentrace 
a doby expozice pro další expozi ční cyklus. Doporu čuje se zahájit každý 
expoziční cyklus skupinou, která bude látce vystavena po nejdelší dobu, 
např. se začne skupinou s 240minutovou expozicí, po ní následuje skupina 
s 120minutovou expozicí atd. Jestliže nap říklad zví řata v 240 minutové 
skupině po 90 minutách umírají nebo vykazují závažné p říznaky toxicity 
(např. extrémní zm ěny v dechovém vzorci jako t řeba namáhavé dýchání), 
nemělo by smysl vystavovat další skupinu 120 minutové expozici, nebo ť 
mortalita by pravd ěpodobně činila 100 %. Vedoucí studie by m ěl proto pro 
takovou koncentraci zvolit kratší dobu expozice (nap ř. 90, 65, 45, 33 a 25 
minut).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Koncentrace látky v komo ře by se m ěla často měřit, aby se stanovil časem 
vážený pr ůměr koncentrace pro každé trvání expozice. Kdykoli je to možné, 
měl by se v statistické analýze použít čas uhynutí každého zví řete (místo 
trvání expozice).  
8. Výsledky prvních čtyř expozičních cykl ů by se m ěly přezkoumat, aby se 
zjistily chyb ějící údaje na k řivce závislosti koncentrace na čase (viz obrázek 
1). V případě, že není dostatek údaj ů, lze provést další expozici (5. koncent ­
race). Koncentrace a doba expozice pro 5. expozici by se m ěly zvolit tak, 
aby pokryly tyto chyb ějící údaje.  
9. Všechny expozi ční cykly (v četně prvního expozi čního cyklu) se použijí 
k výpočtu vztahu mezi koncentrací, časem a odezvou pomocí statistické 
analýzy (16). Je-li to možné, m ěly by se pro každý interval C × t použít 
časem vážené pr ůměrné hodnoty koncentrace a doby expozice do uhynutí 
(dojde-li b ěhem expozice k uhynutí).  
Obrázek 1  
Hypotetické znázorn ění vztahu mezi koncentrací– časem–mortalitou 
u potkan ů
 
Prázdné zna čky = zvířata, která p řežila; plné zna čky = uhynulá zví řata 
Trojúhelní čky = samice; kroužky = samci  
Plná čára = hodnoty LC  50 (rozmezí 7,5–240 min) pro samce, pokud n = 1  
Přerušovaná čára = hodnoty LC  50 (rozmezí 7,5–240 min) pro samice, pokud 
n = 1  
Čerchované čáry = hypotetické hodnoty LC  50 pro samce a samice, pokud n = 2 
(12).  
Slovníček pojmů 
Koncentrace:  
Doba expozice:  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Níže je uveden p říklad postupu provád ěného po krocích:  
Expoziční cyklus I – zkouška p ři mezní koncentraci (viz obrázek 1)  
— Jedno zví ře od každého pohlaví pro každou koncentraci / časový bod, 
celkem deset zví řat (  a ) 
— Cílová koncentrace (  b ) = mezní koncentrace.  
— Vystavte p ět skupin zví řat této cílové koncentraci po dobu 15, 30, 60, 
120 a 240 minut.  
↓ 
Expoziční cyklus II  ( c ) – hlavní studie  
— Jedno zví ře od každého pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod, 
celkem deset zví řat. 
— Pět skupin zví řat vystavte nižší koncentraci (  d ) (1/2L) po dobu expozice 
o něco delší (koeficient odstup ňování √2, viz obrázek 1).  
↓ 
Expoziční cyklus III – hlavní studie  
— Jedno zví ře od každého pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod, 
celkem deset zví řat. 
— Pět skupin zví řat vystavte nižší koncentraci (  4 ) (1/4L) po dobu expozice 
o něco delší (koeficient odstup ňování √2, viz obrázek 1).  
↓ 
Expoziční cyklus IV‘ – hlavní studie  
— Jedno zví ře od každého pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod, 
celkem deset zví řat. 
— Pět skupin zví řat vystavte nižší koncentraci (  4 ) (1/8L) po dobu expozice 
o něco delší (koeficient odstup ňování √2, viz obrázek 1).  
↓ nebo  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Nejsou-li k dispozici žádné informace o citlivosti jednotlivých pohlaví, použijí se potkani 
obou pohlaví,  tj. 1 zvíře od každého pohlaví pro každou koncentraci. Pokud ze stáva ­
jících informací vyplývá, nebo pokud vyjde najevo b ěhem tohoto expozi čního cyklu, že 
je jedno pohlaví citliv ější, použije se b ěhem následujících zkoušek deset zví řat citlivěj­ 
šího pohlaví (dv ě zvířata pro každou koncentraci / časový bod) na každé úrovni koncent ­
race.. 
( b ) Používá-li se na řízení (ES) č. 1272/2008, činí mezní koncentrace pro plyny 20 000 ppm, 
pro páry 20 mg/l a pro aerosoly 5 mg/l. V p řípadě očekávané toxicity nebo na základ ě 
výsledků orientační studie by se m ěly zvolit nižší po čáteční koncentrace. Pro regula ční 
nebo vědecké účely se mohou použít vyšší koncentrace. 
( c ) V ideálním p řípadě by se mělo s expozicí zví řat další úrovni koncentrace vy čkat, dokud 
není dostate čná jistota, že d říve exponovaná zví řata přežila. To umožní vedoucímu studie 
upravit cílovou koncentraci a doby expozice pro další expozi ční cyklus. 
( d ) Minimální dávka (koncentrace × čas), která vedla k mortalit ě v průběhu zkoušky p ři 
počáteční koncentraci (první expozi ční cyklus) se použije jako vodítko pro stanovení 
další kombinace koncentrace a dob expozice. Koncentrace se obvykle sníží na polovinu 
(1/2L) a zví řata se vystaví koncentraci v novém časovém rozmezí s kratším krokem 
s použitím geometrického d ělení dob expozice faktorem 1,4 ( √2; viz odkaz 11), které 
je rozloženo kolem doby odpovídající minimální úrovni letální dávky ( čas × koncentrace) 
pozorované b ěhem první expozice. Na tomto obrázku (obrázek 1) byla mortalita p ři 
expozičním cyklu I poprvé pozorována p ři 15 minutách; doby expozice b ěhem expozi č­
ního cyklu II jsou proto rozmíst ěny okolo 30 minut a činí 15, 21 30, 42 a 60 min. Po 
prvních dvou expozicích se d ůrazně doporučuje vynést údaje do grafu podobn ě jako na 
výše uvedeném obrázku a zkontrolovat, zda má vztah mezi koncentrací a časem úhel 45 
stupňů (n = 1) nebo zda je vztah mezi koncentrací– časem–odezvou mén ě strmý (nap ř. 
n = 2) nebo strm ější (např. n = 0,8). V posledn ě jmenovaném p řípadě se důrazně 
doporučuje upravit p říslušným zp ůsobem další koncentrace a doby trvání expozice.
 Expoziční cyklus IV – hlavní studie  
— Jedno zví ře od každého pohlaví pro každou koncentraci/ časový bod, 
celkem deset zví řat. 
— Pět skupin zví řat vystavte vyšší koncentraci (  e ) (2L) po dobu expozice 
o něco kratší (koeficient odstup ňování √2, viz obrázek 1).  
Matematické zpracování výsledk ů protokolu C × t  
11. Postupem C × t provedeným se 4 nebo 5 expozi čními koncentracemi a p ěti 
různými dobami expozice se získá 20 nebo 25 bod ů. Z těchto bodů lze 
pomocí statistické analýzy vypo čítat vztah C × t (16):  
Rovnice 1:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
kde C = koncentrace, t = doba expozice nebo  
Rovnice 2:  
Odezva ¼ ƒðC n tÞ 
kde n ¼ b 1=b 2: 
Pomocí rovnice 1 lze vypo čítat hodnotu LC  50 pro dané časové období (nap ř. 
4 hodiny, 1 hodina, 30 minut nebo jakékoli časové období v rozmezí zkou ­ 
šených časových období) za použití P = 5 (50 % odezva). Haber ův zákon 
však lze použít, pouze pokud n = 1. Hodnotu LC  01 lze vypočítat za použití 
P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) V určitých případech m ůže být nutné zvýšit koncentraci (2L) v novém časovém rozmezí 
s ještě kratším krokem s použitím geometrického d ělení dob expozice faktorem 1,4 ( √2), 
které je rozloženo kolem doby odpovídající minimální úrovni letální koncentrace pozo ­
rované během první expozice. Minimální doba expozice by m ěla být pokud možno delší 
než 5 minut, maximální doba expozice by nem ěla přesáhnout 8 hodin.
 B.3 AKUTNÍ TOXICITA (DERMÁLNÍ)  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B (A).  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B (B).  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená látka se nanáší na k ůži v odstup ňovaných dávkách n ěko­
lika skupinám pokusných zví řat, a to každé skupin ě jedna úrove ň 
dávky. Následn ě se pozorují a zaznamenávají ú činky a p řípady 
uhynutí. Zví řata, která v pr ůběhu zkoušky uhynula, i zví řata, která 
do konce zkoušky p řežila, se pitvají.  
Je třeba humánn ě utratit zví řata vykazující závažné a p řetrvávající 
známky utrpení; nesm ějí se podávat zkoušené látky, o nichž je 
známo, že zp ůsobují zřetelnou bolest a utrpení v d ůsledku žíravých 
a dráždivých vlastností látky.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Příprava  
Nejméně pět dnů před zkouškou jsou zví řata chována v takových 
podmínkách chovu a krmení, v jakých budou b ěhem zkoušky. P řed 
zkouškou se provede náhodný výb ěr zdravých mladých dosp ělých 
zvířat, která se p řiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Asi 
24 hodin p řed zahájením zkoušky se zví řatům ostříhá nebo oholí srst 
na zádech. P ři stříhání nebo holení srsti je t řeba dbát na to, aby se 
neporanila k ůže, což by mohlo zm ěnit její prostupnost. Pro aplikaci 
zkoušené látky se p řipraví nejmén ě 10 % povrchu t ěla. Při zkou­ 
škách pevných látek, které mohou být podle pot řeby rozet řeny na 
prach, se zkoušená látka dostate čně navlhčí vodou nebo podle 
potřeby vhodným vehikulem, aby se zajistil dobrý styk s k ůží. Při 
výběru vehikula se bere v úvahu jeho vliv na pr ůnik zkoušené látky 
kůží. Kapalné zkoušené látky se zpravidla aplikují ne ředěné. 
1.6.2  Zkušební podmínky  
1.6.2.1  Pokusná zví řata 
Mohou být použiti dosp ělí potkani nebo králíci. Lze použít i jiné 
živočišné druhy, ale jejich použití musí být zd ůvodněno. Použijí se 
běžně používané laboratorní kmeny. Na za čátku zkoušky by nem ělo 
rozpětí odchylek hmotností použitých zví řat u obou pohlaví (pro 
každé pohlaví zvláš ť) překročit ± 20 % p říslušné st řední hodnoty.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2  Počet a pohlaví  
Pro každou úrove ň dávky se použije nejmén ě pět zvířat. Mají být 
stejného pohlaví. Použijí-li se samice, musí být nullipary a nesmí být březí. Jsou-li k dispozici informace, že jedno z pohlaví je výrazn ě 
citlivější, použijí se zví řata tohoto pohlaví.
 
Poznámka:  Používají-li se v akutních zkouškách toxicity zví řata 
vyšších druh ů, než jsou hlodavci, m ěl by se použít menší po čet 
zvířat. Dávky je t řeba pečlivě volit a je t řeba zajistit, aby nebyla 
překročena úrove ň středně toxických dávek. V takových zkouškách 
by neměly být podávány letální dávky zkoušené látky.  
1.6.2.3  Úrovn ě dávek  
Počet úrovní dávek má být dostate čný, nejmén ě tři, a mají být 
vhodně odstupňovány, aby vznikly zkušební skupiny se z řetelným 
rozsahem toxických ú činků a mortality. P ři rozhodování o úrovních 
dávek by m ěly být vzaty v úvahu všechny dráždivé nebo žíravé 
účinky zkoušené látky. Získaná data by m ěla být dostate čná pro 
sestrojení závislosti dávka-odezva, a pokud je to možné, m ěla by 
umožnit p řijatelné stanovení LD  50 . 
1.6.2.4  Limitní zkouška  
Lze provést limitní zkoušku s jednou dávkou nejmén ě 2 000 mg/kg 
tělesné hmotnosti na skupinách p ěti samců a pěti samic, a to za 
použití výše popsaných postup ů. Pokud podaná látka zp ůsobí 
uhynutí, je t řeba uvážit provedení úplné studie.  
1.6.2.5  Doba pozorování  
Doba pozorování by m ěla být nejmén ě 14 dní. Doba pozorování by 
však nem ěla být stanovena pevn ě. Měla by být stanovena podle 
toxických reakcí, jejich rychlosti vývoje a délky fáze zotavení; 
může tedy být podle pot řeby prodloužena. Doba, kdy se p říznaky 
toxicity objeví a vymizí, a doba uhynutí jsou d ůležité zejména 
v případě tendence ke zpožd ěné mortalit ě. 
1.6.3  Postup  
Zvířata se chovají jednotliv ě v klecích. Zkoušená látka se nanese 
rovnoměrně na plochu, která činí asi 10 % celkového povrchu 
těla. V případě vysoce toxických látek m ůže být tato plocha menší; 
co největší část této plochy by se však m ěla pokrýt co nejslabší 
a nejstejnom ěrnější vrstvou.  
Zkoušená látka se po expozi ční dobu 24 hodin udržuje ve styku 
s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. 
Zkušební plocha se dále vhodným zp ůsobem p řekryje, aby se 
mulový obvaz a zkoušená látka fixovaly a aby zví řata zkoušenou 
látku nepožila. K zamezení požití látky je možno použít 
i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplné znehybn ění 
však nelze doporu čit. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky zkoušené látky, pokud 
možno vodou nebo jiným vhodným zp ůsobem očištění kůže. 
Pozorování by se m ěla současně systematicky zaznamenávat. 
Záznamy se vedou pro každé jednotlivé zví ře. Během prvního dne 
se provád ějí pozorování často. Nejmén ě jednou každý pracovní den 
se provád ějí pečlivá klinická vyšet ření, další pozorování se provád ějí 
denně, přičemž se u činí odpovídající opat ření pro minimalizaci ztrát 
zvířat ve studii, nap ř. pitvou nebo zmrazením uhynulých zví řat nebo 
izolací či utracením slabých nebo umírajících zví řat. 
Pozorování zahrnují zm ěny na kůži, na srsti, na o čích, na sliznicích, 
a rovněž změny dýchání, krevního ob ěhu, změny funkce autonomní 
a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je t řeba věnovat tremoru, k řečím, slinění, průjmu, 
letargii, spánku a kómatu. Doba uhynutí se zaznamená co nejp řes­
něji. Zvířata, která v pr ůběhu zkoušky uhynula, i zví řata, která do 
konce zkoušky p řežila, se pitvají. Zaznamenají se všechny makros ­
kopické patologické nálezy. V p řípadě potřeby se odeberou tkán ě pro 
histopatologické vyšet ření.
 
Posouzení toxicity u druhého pohlaví  
Po dokon čení zkoušky na jednom pohlaví se látka podá nejmén ě 
jedné skupin ě o pěti zvířatech druhého pohlaví s cílem zjistit, zda 
nejsou zví řata druhého pohlaví na zkoušenou látku výrazn ě citlivější. 
V jednotlivých p řípadech m ůže být od ůvodněno použití menšího 
počtu zvířat. Pokud je k dispozici spolehlivá informace, že zví řata 
pohlaví, které je zkoušeno, jsou výrazn ě citlivější, je možno zkoušení 
na zvířatech druhého pohlaví vynechat.  
2. ÚDAJE  
Data se shrnou do tabulky, p řičemž se pro každou zkušební skupinu 
uvede po čet zvířat na počátku zkoušky, doba uhynutí jednotlivých 
zvířat, počet zvířat s jinými p říznaky toxicity, popis toxických 
účinků a pitevní nálezy. Hmotnost jednotlivých zví řat se stanoví 
a zaznamená krátce p řed aplikací zkoušené látky, poté v týdenních 
intervalech a v dob ě uhynutí. Zm ěny hmotnosti je t řeba stanovit 
a zaznamenat, p řežívají-li zví řata déle než jeden den. Zví řata, která 
byla humánním zp ůsobem utracena s ohledem na utrpení a bolest 
vyvolané podanou látkou, se zaznamenávají jako uhynutí vyvolaná 
látkou. LD  50 se vypočte pomocí uznávané metody.  
Vyhodnocení dat by m ělo zahrnovat také vztah, pokud existuje, mezi 
expozicí zví řat zkoušené látce a výskytem a závažností všech abnor ­
malit, včetně změn chování, klinických symptom ů, makroskopických 
lézí, změn tělesné hmotnosti, mortality a ostatních toxikologických 
účinků. 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— živočišný druh, kmen, p ůvod, podmínky chovu, strava atd.,  
— zkušební podmínky (v četně způsobu očištění kůže a typu obvazu: 
okluzivní nebo neokluzivní),  
— úrovn ě dávek (v četně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,  
— pohlaví zví řat, jimž byla látka podána,  
— údaje o odezv ě podle pohlaví a podle úrovn ě dávky, a to ve 
formě tabulky (tj. po čet uhynulých zví řat nebo po čet zvířat, 
která byla v pr ůběhu zkoušky utracena, po čet zvířat s příznaky 
toxicity, po čet exponovaných zví řat), 
— doba uhynutí po podání zkoušené látky, d ůvody a kritéria pro 
humánní utracení zví řat, 
— všechna pozorování,  
— hodnota LD  50 pro pohlaví, u n ěhož byla provedena úplná studie, 
a to pro 14denní pozorování (s uvedením metody stanovení),  
— 95 % interval spolehlivosti pro LC  50 (lze-li jej vypo čítat), 
— křivka závislosti mortality na dávce a její sm ěrnice, pokud to 
metoda stanovení umož ňuje, 
— pitevní nálezy,  
— všechny histopatologické nálezy,  
— výsledky všech zkoušek na druhém pohlaví,  
— rozbor výsledk ů (zvláštní pozornost je t řeba věnovat vlivu, který 
by mohlo mít humánní utracení zví řat během zkoušky na vypo č­
tenou hodnotu LC  50 ), 
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B (D).  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B (E).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4 AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ Ú ČINKY NA 
KŮŽI 
1. METODA  
Tato metoda je rovnocenná metod ě OECD TG 404 (2002).  
1.1 ÚVOD  
Při přípravě této modernizované metody byla zvláštní pozornost 
věnována možným zlepšením v oblasti dobrého zacházení se zví řaty 
a vyhodnocování veškerých existujících informací o zkoušené látce 
s cílem vyhnout se zkouškám na laboratorních zví řatech, které 
nejsou nutné. Sou částí této metody je doporu čení, aby byla p řed 
provedením popsané zkoušky dráždivých a leptavých ú činků látky 
na kůži in vivo  vypracována analýza pr ůkaznosti stávajících relevant ­
ních údaj ů. Pokud jsou k dispozici nedostate čné údaje, lze je 
s využitím metody postupného zkoušení rozpracovat (1). Strategie 
zkoušení zahrnuje provedení validovaných a uznaných zkoušek  in 
vitro  a je popsána v p říloze k této metod ě. Navíc se v p řípadě 
potřeby v počáteční zkoušce  in vivo  doporučuje namísto sou časného 
aplikování postupná aplikace t ří testovacích náplastí.  
V zájmu spolehlivého v ědeckého p řístupu a dobrého zacházení se 
zvířaty by se zkoušky  in vivo  neměly provád ět, dokud nebyly 
všechny dostupné údaje, významné pro potenciální leptavé nebo 
dráždivé ú činky látky, vyhodnoceny na základ ě analýzy pr ůkaznosti 
výsledků. Takové údaje budou zahrnovat d ůkazy ze stávajících studií 
na lidech a/nebo laboratorních zví řatech, důkazy leptavých nebo 
dráždivých ú činků jedné nebo více strukturn ě příbuzných látek 
nebo směsí takových látek, údaje dokládající silnou kyselost nebo 
zásaditost látky (2, 3) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek  
in vitro  nebo  ex vivo  (4, 5, 5a). Tato analýza by m ěla snížit pot řebu 
zkoušek leptavých nebo dráždivých ú činků na kůži metodou  in vivo  
u látek, u nichž již existují d ůkazy z jiných studiích, pokud jde o tyto 
dva ukazatele.  
V příloze k této metod ě je uvedena up řednostňovaná strategie 
postupného zkoušení, jejíž sou částí je provedení validovaných 
a uznaných zkoušek leptavých/dráždivých ú činků in vitro  nebo  ex 
vivo. Tato strategie byla vypracována na seminá ři OECD (6), jeho 
účastníky jednohlasn ě doporučena a přijata jako doporu čená strategie 
zkoušení v globáln ě harmonizovaném systému klasifikace chemic ­
kých látek (GHS) (7). Doporu čuje se, aby se podle této strategie 
zkoušení postupovalo p řed provád ěním zkoušek  in vivo . U nových 
látek se doporu čuje metoda zkoušení po krocích, díky které lze 
dosáhnout v ědecky spolehlivých údaj ů o leptavých/dráždivých ú čin­
cích látky. U existujících látek, o jejichž leptavých/dráždivých ú čin­
cích na kůži není k dispozici dostatek údaj ů, by se m ěla tato strategie 
využít pro dopln ění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo 
postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu po krocích musí 
být odůvodněno. 
Pokud pomocí analýzy pr ůkaznosti výsledk ů nelze o leptavých nebo 
dráždivých ú čincích rozhodnout, m ěla by se v souladu se strategií 
postupného zkoušení uvážit zkouška  in vivo  (viz dodatek).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2 DEFINICE  
Dráždivé ú činky na k ůži: vyvolání vratných zm ěn na kůži do 4 
hodin po aplikaci zkoušené látky.  
Leptavé ú činky na k ůži: vyvolání nevratného poškození k ůže, 
zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky, do čtyř 
hodin po aplikaci zkoušené látky. Reakce po poleptání se projevují 
vředy, krvácením, krvavými strupy a v záv ěru čtrnáctidenního pozo ­
rování ztrátou barvy v d ůsledku vyblednutí k ůže, úplnými ložisky 
alopecie a jizvami. K vyhodnocení sporných lézí by se m ěla uvážit 
histopatologie.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Látka, která má být zkoušena, se v jedné dávce nanese na k ůži 
pokusného zví řete, přičemž oblasti neexponované k ůže pokusného 
zvířete slouží jako kontrola. Ve stanovených intervalech se ur čí, 
vyhodnotí a následn ě popíše stupe ň dráždivých/leptavých ú činků, 
aby bylo možno provést úplné posouzení ú činků. Doba studie by 
měla být dostate čně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo 
nevratnost pozorovaných ú činků. 
Zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují p řetrvávající p říznaky 
značného utrpení a/nebo bolesti, se humánn ě utratí a látka se odpo ­
vídajícím zp ůsobem vyhodnotí. Kritéria pro rozhodování o utracení 
umírajících a zna čně trpících zví řat lze nalézt v literatu ře (8).  
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Příprava na zkoušku  in vivo  
1.4.1.1  Výb ěr druhu zví řat 
Upřednostňovaným laboratorním zví řetem je albín králíka, používají 
se mladá dosp ělá zvířata. Použití jiného druhu by m ělo být zd ůvod­
něno. 
1.4.1.2  Příprava zví řat 
Asi 24 hodin p řed zahájením zkoušky se zví řatům ostříhá srst na 
zádech. Je t řeba dbát na to, aby se k ůže neporanila. Sm ějí se použít 
pouze zví řata se zdravou, neporan ěnou kůží. 
Některé kmeny králíka mají plošky husté srsti, které jsou v n ěkterých 
obdobích roku výrazn ější. Na takových oblastech husté srsti by se 
zkouška provád ět neměla. 
1.4.1.3  Podmínky chovu a krmení  
Zvířata by m ěla být chována samostatn ě. Teplota v místnosti pro 
pokusná zví řata by m ěla u králík ů být 20  o C (± 3  o C), relativní 
vlhkost vzduchu by m ěla být minimáln ě 30 % a pokud možno 
nepřesáhnout 70 %, krom ě doby úklidu místnosti, cílem by m ěla 
být hodnota 50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé a mělo by se 
střídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít 
konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2  Postup zkoušky  
1.4.2.1  Aplikace zkoušené látky  
Zkoušená látka se nanese na malou plochu k ůže (asi 6 cm  2 ) 
a pokryje se plátkem mulu s nedráždivou náplastí. V p řípadech, 
kdy přímá aplikace není možná (nap ř. kapaliny nebo n ěkteré pasty), 
by se měla zkoušená látka nejprve nanést na plátek mulu, který se 
následně přiloží na k ůži. Po dobu trvání expozice je t řeba přidržovat 
plátek voln ě na kůži vhodným semiokluzivním obvazem. Pokud se 
zkoušená látka nanáší na mul, m ěl by být na k ůži připevněn tak, aby 
se zajistil dobrý kontakt s k ůží a rovnom ěrné rozložení látky na k ůži. 
Je třeba zabránit tomu, aby se zví ře dostalo k mulu a zkoušenou 
látku požilo nebo vdechlo.  
Zkoušené kapaliny se zpravidla aplikují ne ředěné. Při zkouškách 
pevných látek (které mohou být p řípadně rozetřeny na prach) se 
zkoušená látka navlh čí co nejmenším množstvím vody (v p řípadě 
potřeby jiným vhodným vehikulem), aby se zajistil dostate čný 
kontakt s k ůží. Pokud se používají jiná vehikula než voda, m ěl by 
být potenciální vliv vehikula na dráždivé ú činky zkoušené látky na 
kůži pouze minimální.  
Po uplynutí doby expozice, která je obvykle 4 hodiny, se odstraní 
zbytky zkoušené látky, pokud možno vodou nebo vhodným rozpouš ­
tědlem, aniž by došlo k ovlivn ění odezvy nebo celistvosti k ůže. 
1.4.2.2  Úrove ň dávek  
Na testovací místo se nanese 0,5 ml kapaliny nebo 0,5 g pevné látky 
nebo pasty.  
1.4.2.3  Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých ú činků na kůži in 
vivo s použitím jednoho zví řete) 
Důrazně se doporu čuje, aby byla zkouška  in vivo  provedena nejprve 
na jednom zví řeti, zejména pokud existuje podez ření, že látka má 
potenciální leptavé ú činky. Tento postup je v souladu se strategií 
postupného zkoušení (viz dodatek 1).  
Pokud byla na základ ě analýzy pr ůkaznosti výsledk ů látka posou ­
zena jako leptavá, není žádné další zkoušení na zví řatech nutné. 
U většiny látek, u nichž je podez ření, že jsou leptavé, nejsou obvykle 
další zkoušky  in vivo  nutné. Avšak v t ěch případech, kdy je kv ůli 
nedostatku d ůkazů považováno za nezbytné zjistit další údaje, 
mohou být v omezené mí ře provedeny zkoušky na zví řatech podle 
tohoto postupu: zví řeti se postupn ě přiloží nejvýše t ři testovací 
náplasti. První náplast se odstraní po t řech minutách. Pokud není 
pozorována závažná kožní reakce, odstraní se druhá náplast po 
jedné hodin ě. Pokud pozorování v této fázi nazna čují, že expozici 
lze bez porušení zásady humánního zacházení prodloužit na čtyři 
hodiny, p řiloží se třetí náplast, která se po čtyřech hodinách odstraní, 
a vyhodnotí se odezva.  
Pokud je po n ěkteré ze t ří následných expozic pozorován leptavý 
účinek, zkouška se okamžit ě ukončí. Pokud po odstran ění třetí 
náplasti není leptavý ú činek pozorován, zví ře se pozoruje po dobu 
14 dnů, pokud se u n ěj poleptání k ůže neprojeví d říve. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
V takových p řípadech, kdy se u zkoušené látky nep ředpokládá, že 
vyvolá leptavé ú činky, ale m ůže být dráždivá, by se m ěla jednomu 
zvířeti přiložit jedna náplast na čtyři hodiny.  
1.4.2.4  Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých ú činků na kůži in vivo 
s dalšími zví řaty) 
Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý ú činek, 
měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na dvou dalších 
zvířatech, u každého s jednou náplastí a dobou expozice 4 hodiny. 
Pokud je b ěhem počáteční zkoušky pozorován dráždivý ú činek, lze 
potvrzující zkoušku provést postupn ě, nebo exponováním dvou 
dalších zví řat současně. Ve výjime čném případě, kdy se po čáteční 
zkouška neprovádí, lze dv ěma nebo t řem zvířatům přiložit jednu 
náplast, která se po čtyřech hodinách odstraní. Jestliže se použijí 
dvě zvířata a u obou se projeví stejná reakce, není žádné další 
zkoušení nutné. Jinak se zkouší také t řetí zvíře. Sporné reakce je 
možné zhodnotit na dalších zví řatech.  
1.4.2.5  Doba pozorování  
Doba studie by m ěla být dostate čně dlouhá, aby bylo možné pln ě 
zhodnotit vratnost pozorovaných ú činků. Zkouška by však m ěla být 
ukončena kdykoliv v okamžiku, kdy zví ře vykazuje p řetrvávající 
příznaky zna čné bolesti nebo utrpení. Za ú čelem určení vratnosti 
účinků by se zví řata měla pozorovat 14 dn ů po odstran ění náplastí. 
Pokud je vratnost pozorována p řed uplynutím 14 dn ů, zkouška se 
v tomto okamžiku ukon čí. 
1.4.2.6  Klinická pozorování a hodnocení reakcí k ůže 
Všechna zví řata se pozorují na p říznaky erytému a edému, reakce 
kůže se hodnotí po 60 min a dále po 24, 48 a 72 hodinách po 
odstranění náplasti. V po čáteční zkoušce na jednom zví řeti se po 
odstranění náplasti okamžit ě vyšetří také testované místo. Kožní 
reakce se vyhodnotí a zaznamenají podle stupnice v níže uvedené 
tabulce. Pokud se objeví poškození k ůže, které po 72 hodinách nelze 
označit za dráždivé nebo leptavé ú činky, může být nezbytné pozo ­
rování až do 14. dne kv ůli stanovení vratnosti ú činků. Vedle pozo ­
rování dráždivých ú činků by m ěly být d ůkladně popsány 
a zaznamenány veškeré místní toxické ú činky, jako je odtu čnění 
kůže a jakékoli systémové nežádoucí ú činky (nap ř. vliv na klinické 
příznaky toxicity a t ělesnou hmotnost). K objasn ění sporných reakcí 
se zváží histopatologické vyšet ření. 
Hodnocení reakcí k ůže je nevyhnuteln ě subjektivní. S cílem podporovat 
harmonizaci hodnocení reakcí k ůže a napomáhat zkušebním laborato řím 
a těm, kdo provád ějí a interpretují pozorování, musí být zam ěstnanci 
provádějící pozorování odpovídajícím zp ůsobem kvalifikováni pro práci 
s používaným systémem vyhodnocování (viz níže uvedená tabulka). Jako pom ůcku lze použít ilustrované pokyny pro hodnocení dráždivých 
účinků na kůži a jiných lézí (9).
 
2. ÚDAJE  
2.1 P ŘEDKLÁDÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Výsledky studie se shrnou do tabulky uvedené v záv ěrečném 
protokolu o zkoušce. M ěly by zpracovávat všechny položky uvedené 
v části 3.1.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2 HODNOCENÍ VÝSLEDK Ů 
Stupně dráždivých ú činků na kůži se zhodnotí ve spojení s povahou 
a závažností lézí a jejich vratností nebo nevratností. Jednotlivé stupně nepředstavují absolutní m ěřítko dráždivých vlastností látky, 
neboť se hodnotí také jiné ú činky zkoušené látky. Jednotlivé stupn ě 
by spíše m ěly být považovány za referen ční hodnoty, které je nutno 
zhodnotit spole čně s dalšími pozorováními vyplývajícími ze studie.
 
Při hodnocení dráždivých reakcí se zohlední vratnost kožních lézí. 
Pokud do ukon čení čtrnáctidenní doby pozorování p řetrvávají reakce 
jako alopecie (na omezené ploše), hyperkeratóza, hyperplazie a šupinatění, považuje se zkoušená látka za dráždivou.
 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Zdůvodnění zkoušení  in vivo : analýza pr ůkaznosti výsledk ů předcho­
zích pokus ů, včetně výsledků strategie postupného zkoušení:  
— popis relevantních údaj ů z předchozích zkoušek,  
— údaje získané v každé fázi strategie zkoušení,  
— popis provedených zkoušek  in vitro , včetně podrobných údaj ů 
o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referen čními 
látkami,  
— analýza pr ůkaznosti výsledk ů odůvodňující provedení studie  in 
vivo. 
Zkoušená látka:  
— identifika ční údaje (nap ř. číslo CAS, zdroj, čistota, známé ne čis­
toty, šarže),  
— fyzikální povaha a fyzikáln ě-chemické vlastnosti (nap ř. pH, těka­
vost, rozpustnost, stabilita),  
— pokud jde o sm ěs, její složení a relativní podíl složek vyjád řený 
v procentech.  
Vehikulum:  
— identifikace, koncentrace (podle pot řeby), použitý objem,  
— zdůvodnění výběru vehikula.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen, zd ůvodnění použití jiných zví řat, není-li 
použit albín králíka,  
— počet zvířat každého pohlaví,  
— hmotnosti jednotlivých zví řat na začátku a v záv ěru zkoušky,  
— stáří na začátku studie,  
— původ zvířat, podmínky chovu, strava atd.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Zkušební podmínky:  
— technika p řípravy oblasti k ůže, na kterou se nanese náplast,  
— podrobné údaje o materiálech použitých na náplasti a technice 
aplikování náplastí,  
— podrobné údaje o p řípravě zkoušené látky, jejím nanesení 
a odstran ění. 
Výsledky:  
— údaje o stupni odezvy na dráždivé nebo leptavé ú činky 
u každého zví řete v každém okamžiku m ěření, 
— popis všech pozorovaných lézí,  
— podrobný popis povahy a stupn ě pozorovaných dráždivých nebo 
leptavých ú činků a případné histopatologické nálezy,  
— popis jiných místních (nap ř. odtučnění kůže) a systémových 
účinků vedle dráždivých nebo leptavých ú činků na kůži. 
Rozbor výsledk ů. 
4. LITERATURA  
1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.
 
2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19–26.
 
3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720.
 
4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation“, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brus ­
sels. 
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. 
(1998) The ECVAM international validation study on in vitro 
tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524.
 
5a) Zkušební metoda B.40 Leptavé ú činky na k ůži. 
6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological 
Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 
(http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).  
7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting 
of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm).
 
9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides 
and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.  
[Available from OECD Secretariat upon request].  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabulka 1  
HODNOCENÍ KOŽNÍCH REAKCÍ  
Tvorba erytému a p říškvaru  
Žádný erytém 0 
Velmi slabý erytém (sotva patrný) 1 Zřetelně viditelný erytém 2 
Mírný až výrazný erytém 3 Těžký erytém (silné zrudnutí) nebo tvorba p říškvaru znemož ňující 
posouzení erytému 4
 
Maximáln ě možné: 4  
Tvorba edému  
Žádný edém 0 
Velmi lehký edém (sotva patrný) 1 
Lehký edém (okraje jsou patrné, plocha je ohrani čena zřetelným 
vyvýšením) 2 
Mírný edém (okraje vyvýšeny asi o 1 mm) 3 
Výrazný edém (zdu ření více než 1 mm a otok p řesahující hranice 
exponované plochy) 4  
Maximáln ě možné: 4  
Pro objasn ění sporných reakcí lze provést histopatologické vyšet ření. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
DODATEK  
Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých ú činků na kůži 
OBECNÉ ÚVAHY  
V zájmu spolehlivého v ědeckého p řístupu a dobrého zacházení se zví řaty je 
důležité vyhýbat se zbyte čnému používání zví řat a minimalizovat jakékoli zkou ­ 
šky, které u zví řat pravděpodobně vyvolají závažné reakce. Veškeré informace 
týkající se potenciálních leptavých/dráždivých ú činků látky na k ůži by se m ěly 
zhodnotit p řed zvažováním zkoušení  in vivo . Je možné, že již existuje dostatek 
důkazů pro klasifikaci zkoušené látky podle její schopnosti vyvolávat leptavé 
nebo dráždivé ú činky na k ůži, aniž by bylo nutné provád ět zkoušky na labora ­
torních zví řatech. Proto využití analýzy pr ůkaznosti výsledk ů a strategie postup ­
ného zkoušení sníží pot řebu provád ět zkoušení  in vivo , zejména pokud látka 
pravděpodobně vyvolá závažné reakce.  
Doporučuje se, aby se stávající informace týkající se dráždivých nebo leptavých 
účinků látky na k ůži zhodnotily pomocí analýzy pr ůkaznosti výsledk ů, na jejímž 
základě se rozhodne o tom, zda by se k lepší charakteristice tohoto potenciálu 
měly provést další studie jiné než kožní studie  in vivo . Jsou-li nutné další studie, 
doporučuje se využít strategie postupného zkoušení a pomocí ní získat relevantní 
experimentální údaje. U látek, které doposud nebyly zkoušeny, by m ěla být 
strategie postupného zkoušení využita k získání souboru údaj ů, které jsou 
nezbytné k vyhodnocení jejich možných leptavých nebo dráždivých ú činků. 
Strategie zkoušení popsaná v této p říloze byla vypracována na seminá ři OECD 
(1) a pozd ěji potvrzena a rozpracována v Harmonizovaném integrovaném 
systému klasifikace nebezpe čí chemických látek pro lidské zdraví a jejich vlivu 
na životní prost ředí, který schválilo 28. spole čné zasedání Výboru pro chemické 
látky a Pracovní skupiny pro chemické látky v listopadu 1998 (2).  
Ačkoliv tato strategie postupného zkoušení není nedílnou sou částí zkušební 
metody B.4, vyjad řuje doporu čovaný postup stanovení dráždivých/leptavých 
účinků na kůži. Tento postup p ředstavuje nejlepší praktický i etický standard 
pro zkoušení dráždivých/leptavých ú činků na kůži in vivo.  Metoda zkoušení 
poskytuje návod pro provád ění zkoušky  in vivo  a shrnuje faktory, které by 
před zahájením takové zkoušky m ěly být zváženy. Tato strategie p ředstavuje 
přístup posuzování existujících údaj ů o dráždivých/leptavých ú čincích zkouše ­
ných látek a odstup ňovaný přístup k vytvá ření relevantních údaj ů o látkách, 
u kterých je nutné provést další studie, nebo u nichž žádné studie nebyly 
doposud provedeny. Doporu čuje se také za ur čitých okolností provést validované 
a uznané zkoušky  in vitro  nebo  ex vivo  na zjištění dráždivých/leptavých ú činků 
na kůži. 
POPIS STRATEGIE VYHODNOCOVÁNÍ A ZKOUŠENÍ  
Před zahájením zkoušek v rámci strategie postupného zkoušení (obrázek) se 
vyhodnotí veškeré dostupné informace, aby se mohlo rozhodnout o nutnosti 
provést zkoušení  in vivo . Ačkoliv lze významné informace získat 
z vyhodnocení jednotlivých parametr ů (např. extrémní hodnoty pH), stávající 
informace by se m ěly vzít v úvahu jako celek. Všechny relevantní údaje 
o účincích doty čné látky nebo jejích obdob se vyhodnotí na základ ě rozhodnutí 
založeném na pr ůkaznosti výsledk ů. Mělo by se podat zd ůvodnění tohoto 
rozhodnutí. Hlavní d ůraz by se m ěl klást na již existující údaje o ú čincích 
látky na člověka a zvířata a dále na výsledky zkoušení  in vitro  nebo  ex vivo . 
Studie leptavých látek  in vivo  by se m ěly provád ět co nejmén ě. Mezi faktory 
uvedené ve strategii zkoušení pat ří: ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Hodnocení existujících údaj ů o účincích látky na člověka a zvířata (krok 1).  
Nejprve je nutné vzít v úvahu existující údaje o ú čincích na člověka, např. 
klinické studie nebo studie nemocí z povolání, záznamy subjekt ů hodnocení 
a/nebo údaje o zkouškách na zví řatech, nap ř. z jednorázových nebo opakovaných 
studií dermální toxicity, protože z t ěchto údaj ů lze získat informace p římo se 
vztahující k ú činkům na kůži. Látky, jejichž dráždivé nebo leptavé ú činky jsou 
známy, a látky, o nichž existují jednozna čné důkazy, že leptavé nebo dráždivé 
účinky nemají, není nutné zkoušet ve studiích  in vivo . 
Analýza vztah ů mezi strukturou a biologickou aktivitou (SAR) (krok 2).  Vezmou 
se v úvahu výsledky zkoušek strukturn ě příbuzných látek, jsou-li k dispozici. 
Pokud jsou k dispozici dostate čné údaje o ú čincích strukturn ě příbuzných látek 
nebo jejich sm ěsí na člověka a/nebo zví řata nazna čující, že mají schopnost 
leptavých/dráždivých ú činků, lze předpokládat, že hodnocená zkoušená látka 
vyvolá stejné reakce. V takových p řípadech není nutné tuto látku zkoušet. Nega ­
tivní údaje získané ze studií strukturn ě příbuzných látek nebo jejich sm ěsí 
nepředstavují podle strategie postupného zkoušení dostate čný důkaz 
o neexistenci leptavých/dráždivých ú činků látky. Ke stanovení potenciálních 
leptavých a dráždivých ú činků na kůži by m ěly být použity validované 
a uznané postupy vycházející z analýzy SAR.  
Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (krok 3).  Látky vykazující 
extrémní hodnoty pH jako ≤ 2,0 a ≥ 11,5 mohou mít silné místní ú činky. Pokud 
se leptavé ú činky látky na k ůži stanoví na základ ě extrémních hodnot pH, lze 
také vzít v úvahu kyselou/alkalickou rezervu (pufra ční kapacitu) (3, 4). Pokud lze 
podle pufra ční kapacity soudit, že látka možná nemá leptavé ú činky na k ůži, 
musí tento p ředpoklad potvrdit další zkoušky, pokud možno s využitím valido ­
vané a uznané zkoušky  in vitro  nebo  ex vivo  (viz kroky 5 a 6).  
Dermální toxicita (krok 4).  Pokud se ukáže, že chemická látka je p ři podání 
dermální cestou vysoce toxická, nebude se provád ět studie dráždivých/leptavých 
účinků na kůži in vivo , neboť množství zkoušené látky, které se obvykle nanáší, 
by mohlo p řesáhnout vysoce toxickou dávku a mít za následek uhynutí nebo 
značné utrpení zví řat. Navíc pokud byly studie dermální toxicity využívající 
albíny králíka již provedeny do limitní úrovn ě dávky 2 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti nebo vyšší a nebyly zjišt ěny žádné dráždivé nebo leptavé ú činky, nebudou 
další zkoušky dráždivých/leptavých ú činků na kůži zřejmě nutné. P ři hodnocení 
akutní dermální toxicity v p ředchozích studiích je t řeba mít na pam ěti několik 
aspektů. Např. zaznamenané informace o dermálních lézích nemusí být úplné. 
Zkoušení a pozorování mohlo být provád ěno na jiných druzích než králík 
a citlivost reakcí jednotlivých druh ů se může do zna čné míry lišit. Také forma 
zkoušené látky, která byla zví řatům podávána, možná nebyla vhodná pro hodno ­
cení dráždivých/leptavých ú činků na kůži (např. ředění látek ur čených ke zkou ­ 
šení dermální toxicity) (5). Avšak v takových p řípadech, kdy byly na králících 
provedeny dob ře navržené a realizované studie dermální toxicity, lze negativní 
nálezy považovat za dostate čné důkazy, že látka není žíravá nebo dráždivá.  
Výsledky ze zkoušek in vitro nebo ex vivo (kroky 5 a 6).  Látky, které vykazovaly 
leptavé nebo výrazn ě dráždivé ú činky ve validované a uznané zkoušce  in vitro  
nebo  ex vivo  (6, 7), jejímž cílem bylo hodnocení specifických ú činků, není nutné 
zkoušet na zví řatech. Lze p ředpokládat, že takové látky vyvolají ve zkoušce  in 
vivo podobné závažné ú činky. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
Zkouška in vivo na králících (kroky 7 a 8).  Pokud je k provedení zkoušení  in 
vivo nutné rozhodnutí založené na pr ůkaznosti výsledku, m ělo by toto zkoušení 
začínat s po čáteční zkouškou na jednom zví řeti. Pokud výsledky této zkoušky 
naznačují, že látka má leptavé ú činky na k ůži, nemělo by se další zkoušení 
provádět. Pokud b ěhem počáteční zkoušky není pozorován leptavý ú činek, 
měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit maximáln ě na dvou dalších 
zvířatech po dobu expozice 4 hodiny. Pokud je b ěhem počáteční zkoušky pozo ­
rován dráždivý ú činek, lze potvrzující zkoušku provést postupn ě, nebo expono ­
váním dvou dalších zví řat současně. 
LITERATURA  
1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 
22–24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).  
3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709–720.
 
4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) s. 19–26.
 
5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and 
Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 
1-56032-356-6, Chapter 31, 411–436.  
6) Zkušební metoda B.40.  
7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results 
and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Obrázek  
STRATEGIE ZKOUŠENÍ A HODNOCENÍ DRÁŽDIVÝCH/LEPTAVÝCH Ú ČINKŮ NA 
KŮŽI
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5 AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ/LEPTAVÉ Ú ČINKY NA O ČI 
1. METODA  
Tato metoda je rovnocenná metod ě OECD TG 405 (2002).  
1.1 ÚVOD  
Při přípravě této modernizované metody byla zvláštní pozornost 
věnována možným zlepšením, jichž lze dosáhnout vyhodnocováním 
veškerých existujících informací o zkoušené látce s cílem vyhnout se nadbytečným zkouškám na laboratorních zví řatech a zohlednit tak 
zásadu dobrého zacházení se zví řaty. Sou částí této metody je 
doporučení, aby p řed provedením popsané zkoušky akutních 
dráždivých/leptavých ú činků na oči in vivo  byla vypracována analýza 
průkaznosti (1) stávajících relevantních údaj ů. Pokud nejsou 
k dispozici dostate čné údaje, doporu čuje se získat je pomocí metody 
postupného zkoušení (2, 3). Strategie zkoušení zahrnuje provedení 
validovaných a schválených zkoušek  in vitro  a je popsána v p říloze 
k této metod ě zkoušení. Navíc se p řed zvažováním o čního testu  in 
vivo doporučuje provést zkoušku dráždivých/leptavých ú činků na 
kůži in vivo , na jejímž základ ě se předpoví možné leptavé ú činky 
na oči.
 
V zájmu spolehlivého v ědeckého p řístupu a dobrého zacházení se 
zvířaty by se ke zkouškám  in vivo  nemělo přistupovat, dokud nebyly 
všechny dostupné údaje významné pro možné leptavé/dráždivé 
účinky látky na o či vyhodnoceny na základ ě analýzy pr ůkaznosti 
výsledků. Takové údaje budou zahrnovat d ůkazy ze stávajících studií 
na lidech a/nebo laboratorních zví řatech, d ůkazy leptavých/ ­
dráždivých ú činků jedné nebo více strukturn ě příbuzných látek 
nebo směsí těchto látek, údaje dokládající vysokou kyselost nebo 
zásaditost látky (4, 5) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek leptavých a dráždivých ú činků na kůži in vitro  nebo  ex vivo  (6, 6a). 
Tyto studie mohly být vypracovány p řed analýzou pr ůkaznosti 
výsledků nebo na základ ě zjištění této analýzy.
 
U některých látek m ůže taková analýza nazna čovat nutnost 
provedení studií možných leptavých/dráždivých ú činků látky na o či 
in vivo . Ve všech takových p řípadech se p řed zvážením použití o ční 
zkoušky  in vivo  nejprve provede studie ú činků látky na k ůži in vivo  
a zhodnotí se v souladu s metodou zkoušení B.4 (7). Použití analýzy průkaznosti výsledk ů a strategie postupného zkoušení by m ělo 
omezit pot řebu zkoušení leptavých/dráždivých ú činků na oči u těch 
látek, u nichž tyto ú činky byly již dostate čně doloženy v jiných 
studiích. Pokud pomocí strategie postupného zkoušení nelze o možnosti leptavých nebo dráždivých ú činků na oči rozhodnout 
ani po provedení studie leptavých a dráždivých ú činků na kůži in 
vivo, lze provést zkoušku leptavých/dráždivých ú činků na oči in 
vivo.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Upřednostňovaná strategie postupného zkoušení, jejíž sou částí je 
provedení validovaných zkoušek leptavých/dráždivých ú činků in 
vitro  nebo  ex vivo,  je uvedena v p říloze k této metod ě zkoušení. 
Tato strategie byla vypracována na seminá ři OECD (8), jeho ú čast­
níky jednohlasn ě doporučena a přijata jako doporu čená strategie 
zkoušení v globáln ě harmonizovaném systému klasifikace chemic ­
kých látek (GHS) (9). Doporu čuje se, aby se podle této strategie 
zkoušení postupovalo p řed provád ěním zkoušek  in vivo . U nových 
látek se doporu čuje metoda zkoušení po krocích, díky níž lze dosáh ­
nout vědecky spolehlivých poznatk ů o leptavých/dráždivých ú čincích 
látky. U existujících látek, o jejichž leptavých/dráždivých ú čincích na 
kůži a oči není k dispozici dostatek údaj ů, by se m ěla tato strategie 
využít pro dopln ění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo 
postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu po krocích musí 
být odůvodněno. 
1.2 DEFINICE  
Dráždivé ú činky na o či: vyvolání zm ěn v oku po aplikaci zkoušené 
látky na p řední povrch oka. Tyto zm ěny jsou pln ě vratné do 21 dn ů 
po aplikaci.  
Leptavé ú činky na o či: vyvolání poškození o ční tkáně nebo 
závažné fyzické zhoršení vid ění po aplikaci zkoušené látky na p řední 
povrch oka. Toto poškození není pln ě vratné do 21 dn ů po aplikaci.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Látka, která má být zkoušena, se nanese v jedné dávce na jedno oko 
pokusného zví řete, přičemž neexponované oko slouží jako kontrola. 
V předem určených intervalech se na základ ě lézí spojivky, rohovky 
a duhovky vyhodnotí stupe ň dráždivých/leptavých ú činků na oči. 
Popíší se také jiné ú činky na oko a nežádoucí systémové ú činky, 
aby bylo možno provést úplné posouzení ú činků. Doba studie by 
měla být dostate čně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo 
nevratnost ú činků. 
Zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují p řetrvávající p říznaky 
značného utrpení a/nebo bolesti, se humánn ě utratí a látka se odpo ­
vídajícím zp ůsobem vyhodnotí. Kritéria rozhodování o utracení 
umírajících a zna čně trpících zví řat lze nalézt v literatu ře (10).  
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Příprava na zkoušku  in vivo  
1.4.1.1  Výb ěr živočišných druh ů 
Upřednostňovaným laboratorním zví řetem je albín králíka, používají 
se zdravá mladá dosp ělá zvířata. Použití jiných kmen ů nebo druh ů je 
třeba zdůvodnit.  
1.4.1.2  Příprava zví řat 
24 hodin p řed zkouškou se u každého z p ředběžně vybraných pokus ­
ných zvířat provede vyšet ření obou o čí. Zvířata, u kterých se zjistí 
podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky, se nepoužijí.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3  Podmínky chovu a krmení  
Zvířata se chovají samostatn ě. Teplota v místnosti pro pokusná 
zvířata by m ěla být u králík ů 20  o C (±3  o C), relativní vlhkost 
vzduchu minimáln ě 30 % a pokud možno nep řesáhnout 70 %, 
kromě doby úklidu místnosti, cílem však je hodnota 50–60 %. 
Osvětlení by m ělo být um ělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla 
a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konven ční laboratorní stravu 
s neomezenou dodávkou pitné vody.  
1.4.2  Postup zkoušky  
1.4.2.1  Aplikace zkoušené látky  
Zkoušená látka se aplikuje každému zví řeti do spojivkového vaku 
jednoho oka tak, že se spodní ví čko lehce odchlípne od o ční bulvy. 
Víčka se pak asi na jednu sekundu lehce p řidrží u sebe, aby nedošlo 
ke ztrátě látky. Druhé oko, do kterého se látka neaplikuje, slouží 
jako kontrola.  
1.4.2.2  Výplach  
Oči pokusných zví řat se do 24 hodin po instilaci zkoušené látky 
nevyplachují, s výjimkou pevných látek (viz část 1.4.2.3.2) 
a okamžitých leptavých nebo dráždivých ú činků. Po 24 hodinách 
je možné v p řípadě potřeby oči vypláchnout.  
Použití satelitní skupiny zví řat k vyšet ření vlivu výplachu o čí se 
nedoporu čuje, pokud to není v ědecky od ůvodněno. Je-li satelitní 
skupina nezbytná, použijí se dva králíci. Podmínky výplachu se podrobně zdokumentují, nap ř. doba výplachu, složení a teplota 
promývacího roztoku, trvání, objem a rychlost aplikace.
 
1.4.2.3  Úrove ň dávek  
1.4.2.3.1  Zkoušení kapalin  
Při zkoušení kapalin se použije dávka 0,1 ml. K instilaci látky p římo 
do oka by se nem ěly používat aerosolové rozst řikovače s čerpadlem. 
Před instilací 0,1 ml do oka by se m ěla tekutina z rozst řikovače 
vypudit a shromáždit do nádobky.  
1.4.2.3.2  Zkoušení pevných látek  
Při zkoušení pevných látek, past a látek obsahujících částice se 
použije objem 0,1 ml nebo hmotnost nejvýše 100 mg. Zkoušená 
látka se rozemele na jemný prášek. Objem pevného materiálu se 
stanoví až po opatrném zhutn ění, např. poklepáním odm ěrnou 
nádobkou. Pokud nebyla zkoušená pevná látka odstran ěna z oka 
pokusného zví řete pomocí fyziologických mechanism ů do doby 
prvního pozorování po 1 hodin ě po aplikaci, lze oko vypláchnout 
fyziologickým roztokem nebo destilovanou vodou.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3  Zkoušení aerosol ů 
Před instilací látek do oka se doporu čuje zachytit látky obsažené 
v rozstřikovačích nebo aerosolech do nádobky. Jedinou výjimkou 
jsou látky obsažené v aerosolové nádobce pod tlakem, které z důvodu odpa řování zachytit nelze. V takových p řípadech se oko 
podrží otev řené a látka se do oka aplikuje p římým vst říknutím trva ­
jícím jednu sekundu ze vzdálenosti 10 cm. Vzdálenost se m ůže lišit 
podle tlaku v rozprašova či a jeho obsahu. Je t řeba dbát na to, aby 
nedošlo k poškození oka tlakem z rozprašova če. Případně bude nutné 
vyhodnotit možnost „mechanického“ poškození oka v d ůsledku 
rozprašovacího tlaku.
 
Dávku aerosolu lze odhadnout na základ ě této simulované zkoušky: 
látka se nast říká na odvažovací papír otvorem o velikosti králi čího 
oka, který se nachází bezprost ředně před papírem. Na základ ě 
zvýšení hmotnosti papíru se odhadne množství látky, která se 
vstříkne do oka. U t ěkavých látek lze dávku odhadnout pomocí 
zvážení odb ěrové nádobky p řed odstran ěním zkoušené látky a po 
jejím odstran ění. 
1.4.2.4  Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých ú činků na oči in 
vivo na jednom zví řeti) 
Jak je uvedeno ve strategii postupného zkoušení (viz dodatek 1), 
důrazně se doporu čuje, aby byla zkouška  in vivo  provedena nejprve 
na jednom zví řeti. 
Pokud výsledky této zkoušky nazna čují, že látka má leptavé nebo 
vysoce dráždivé ú činky na o či při použití popsaného postupu, další 
zkoušení dráždivých ú činků na oči se neprovádí.  
1.4.2.5  Lokální anestetika  
V jednotlivých p řípadech lze použít lokální anestetika. Pokud 
analýza pr ůkaznosti výsledk ů naznačuje, že látka m ůže způsobit 
bolest, nebo pokud po čáteční zkoušky ukazují, že se objeví bolestivá 
reakce, lze p řed instilací zkoušené látky použít lokální anestetika. 
Typ, koncentraci a dávku lokálního anestetika je t řeba pečlivě zvolit, 
aby bylo zajišt ěno, že v d ůsledku jeho použití nedojde k odlišné 
reakci na zkoušenou látku. Podobn ě se musí znecitliv ět i kontrolní 
oko. 
1.4.2.6  Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých ú činků na oči in vivo na 
dalších zví řatech)  
Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý ú činek, 
měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na maximáln ě 
dalších dvou zví řatech. Pokud je b ěhem počáteční zkoušky pozo ­
rován zna čný dráždivý ú činek, který nazna čuje možný silný 
(nevratný) ú činek v potvrzující zkoušce, doporu čuje se provést 
potvrzující zkoušku metodou postupného zkoušení na jednom zví řeti 
spíše než exponováním dalších dvou zví řat současně. Pokud se 
u druhého zví řete projeví leptavé nebo vysoce dráždivé ú činky, ve 
zkoušce se nepokra čuje. K potvrzení slabých nebo mírných dráždi ­
vých reakcí bude p řípadně nutné použít další zví řata. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7  Doba pozorování  
Doba pozorování by m ěla být dostate čně dlouhá, aby bylo možné 
plně zhodnotit míru a vratnost pozorovaných ú činků. Zkouška by 
však měla být ukon čena vždy, pokud zví ře vykazuje p řetrvávající 
příznaky zna čné bolesti nebo utrpení (9). Za ú čelem určení vratnosti 
účinků by se zví řata měla obvykle pozorovat 21 dn ů po podání 
zkoušené látky. Pokud je vratnost pozorována p řed uplynutím 21 
dnů, zkouška by se m ěla v tomto okamžiku ukon čit. 
1.4.2.7.1  Klinická pozorování a hodnocení o čních reakcí  
Oči se vyšet ří po 1, 24, 48 a 72 hodinách po podání zkoušené látky. 
Jakmile se získají kone čné informace, nem ělo by zkoušení na zví řa­
tech probíhat déle, než je nezbytné. Zví řata se známkami p řetrváva­
jícího utrpení nebo zna čných bolestí se neprodlen ě humánně utratí 
a látka se odpovídajícím zp ůsobem vyhodnotí. Humánn ě se utratí ta 
zvířata, u nichž došlo po instilaci k t ěmto očním lézím: perforace 
rohovky nebo výrazné zv ředovatění rohovky v četně stafylomu; krev 
v přední komo ře oční; zákal rohovky stupn ě 4 přetrvávající 48 h; 
absence reakce na osvit (reakce duhovky stupn ě 2) přetrvávající 72 
hodin; zv ředovatění spojivkové membrány; nekróza spojivek nebo 
slzné žlázy; nebo odlupování nekrotické hmoty. Tento postup je 
dán nevratností takových lézí.  
Zvířata, u nichž o ční léze nevzniknou, nelze utratit d říve než 3 dny 
po instilaci. Zví řata s mírnými až st ředními lézemi se pozorují, 
dokud léze nevymizí, nebo po 21 dn ů, po jejichž uplynutí se studie 
ukončí. Po 7, 14 a 21 dnech se provádí pozorování, aby se ur čil stav 
lézí a jejich vratnost nebo nevratnost.  
Stupeň reakce oka (spojivek, rohovky a duhovky) je t řeba zazna ­
menat při každém vyšet ření (tabulka 1). Uvedou se také jakékoli jiné 
oční léze (nap ř. panus, zbarvení) nebo nežádoucí systémové ú činky.  
Vyšetřování reakcí lze usnadnit použitím binokulární lupy, ru ční 
štěrbinové lampy, o čního mikroskopu nebo jiných vhodných 
zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 hodin mohou být o či 
zvířat dále vyšet řeny fluoresceinem.  
Hodnocení o čních reakcí je nutn ě subjektivní. s cílem podporovat 
harmonizaci hodnocení o čních reakcí a napomáhat zkušebním labo ­
ratořím a těm, kteří provádějí a interpretují pozorování, musí být 
zaměstnanci provád ějící pozorování odpovídajícím zp ůsobem kvali ­
fikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování.  
2. ÚDAJE  
2.2 HODNOCENÍ VÝSLEDK Ů 
Stupně dráždivých ú činků na oči se zhodnotí ve spojení s povahou 
a stupněm závažnosti lézí a jejich vratností nebo nevratností. Jedno ­
tlivé stupn ě nepředstavují absolutní m ěřítko dráždivých vlastností 
látky, nebo ť se hodnotí také jiné ú činky zkoušené látky. Jednotlivé 
stupně by spíše m ěly být považovány za referen ční hodnoty, které 
jsou smysluplné, pouze pokud se opírají o úplný popis a hodnocení 
veškerých pozorování.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:  
Zdůvodnění zkoušení  in vivo : analýza pr ůkaznosti výsledk ů předcho­
zích pokus ů, včetně výsledků strategie postupného zkoušení:  
— popis relevantních údaj ů z předchozích zkoušek,  
— údaje získané v každém kroku strategie zkoušení,  
— popis provedených zkoušek  in vitro , včetně podrobných údaj ů 
o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referen čními 
látkami,  
— popis provedené studie dráždivých/leptavých ú činků na kůži in 
vivo, včetně získaných výsledk ů, 
— analýza pr ůkaznosti výsledk ů odůvodňující provedení studie  in 
vivo.  
Zkoušená látka:  
— identifika ční údaje (nap ř. číslo CAS, zdroj, čistota, známé ne čis­
toty, číslo šarže),  
— fyzikální povaha a fyzikáln ě-chemické vlastnosti (nap ř. hodnota 
pH, těkavost, rozpustnost, stabilita, reaktivita s vodou),  
— v případě směsi její složení a relativní podíl složek vyjád řený 
v procentech,  
— je-li použito lokální anestetikum, jeho identifikace, čistota, typ, 
dávka a možná interakce se zkoušenou látkou.  
Vehikulum:  
— identifikace, koncentrace (podle pot řeby), použitý objem,  
— zdůvodnění výběru vehikula.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen, zd ůvodnění použití jiných zví řat, není-li 
použit albín králíka,  
— stáří každého zví řete na za čátku studie,  
— počet zvířat každého pohlaví ve zkušebních a kontrolních skupi ­
nách (je-li to nutné),  
— hmotnosti jednotlivých zví řat na začátku a na konci zkoušky,  
— původ, podmínky chovu, strava atd.  
Výsledky:  
— popis metody vyhodnocení dráždivosti p ři každém pozorování 
(např. ruční štěrbinová lampa, biomikroskop, fluorescein),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— údaje ve form ě tabulky o reakcích na dráždivé nebo leptavé 
účinky u jednotlivých zví řat při každém pozorování až do 
vyjmutí každého zví řete ze zkoušky,  
— podrobný popis stupn ě a charakteru pozorovaných dráždivých 
nebo leptavých ú činků, 
— popis všech dalších pozorovaných o čních lézí (nap ř. vaskulari ­
zace, tvorba zán ětu rohovky, sr ůst sousedních tkání, zbarvení),  
— popis místních a systémových nep říznivých ú činků mimo o či 
a případné histopatologické nálezy.  
Diskuse a interpretace výsledk ů. 
3.2 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Extrapolace výsledk ů studií dráždivých ú činků na oči laboratorních 
zvířat na člověka je platná jen v omezené mí ře. Albín králíka je ve 
většině případů na dráždivé a leptavé látky citliv ější než člověk. 
Je třeba dbát na to, aby byla p ři interpretaci údaj ů vyloučena dráž­
divost pramenící ze sekundární infekce.  
4. LITERATURA  
1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.
 
2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159–164.
 
3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.  
4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19–26.  
5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.
 
6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by 
the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524.
 
6a) Zkušební metoda B.40 Leptavé ú činky na k ůži. 
7) Zkušební metoda B.4. Akutní toxicita: dráždivé/leptavé ú činky 
na kůži. 
8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological 
Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, as endorsed by the 28  th Joint Meeting 
of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).  
10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications. Series on Testing and 
Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabulka 1  
STUPNICE O ČNÍCH LÉZÍ  
Rohovka  
Zákal: stupe ň hustoty (vyšet ří se nejvíce zakalené oblasti) (*) 
Žádné zv ředovatění ani zákal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Rozptýlené nebo difúzní oblasti zákalu (jiné než slabé zast ření 
normálního lesku), detaily duhovky jasn ě viditelné . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Snadno identifikovatelná pr ůhledná oblast, detaily duhovky lehce 
zastřené . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Přítomnost zóny opalescence, detaily duhovky nejsou viditelné, velikost 
zornice st ěží rozeznatelná . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Úplná nepr ůhlednost rohovky, duhovka je zcela neviditelná . . . . . . . . . 4  
Maximáln ě možné: 4  
POZNAMKY 
(*) Zaznamená se oblast zákalu rohovky.  
Duhovka  
Normální . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Výrazně prohloubené řasy, městnání, otoky, st řední překrvení kolem 
rohovky nebo p řekrvení p ři zánětu; rohovka reaguje na sv ětlo (zpožd ěná 
reakce je považována za ú činek) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Krvácení, makroskopické poškození nebo bez reakce na sv ětlo . . . . . . 2  
Maximáln ě možné: 2  
Spojivky  
Zčervenání (podle nejzávažn ější změny pozorované na ví čkové nebo bulbární 
spojivce, krom ě rohovky a duhovky) 
Normální . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Některé krevní cévy hyperemické (p řekrvené) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Difúzní, rudá barva, jednotlivé cévy nesnadno rozeznatelné . . . . . . . . . . 2 Difúzní temn ě rudá barva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
 
Maximáln ě možné: 3  
Chemóza  
Otoky (týká se ví ček a/nebo slzných žláz) 
Normální . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Slabě abnormální otok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Patrný otok, s částečným obrácením ví ček . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Otok způsobující uzav ření víček zhruba na polovinu . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Otok způsobující uzav ření víček více než na polovinu . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Maximáln ě možné: 4  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
Dodatek  
Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých ú činků na oči 
OBECNÉ ÚVAHY  
V zájmu spolehlivého v ědeckého p řístupu a dobrého zacházení se zví řaty je 
důležité vyhýbat se zbyte čnému používání zví řat a minimalizovat jakékoli zkou ­ 
šky, které u zví řat pravděpodobně vyvolají závažné reakce. Veškeré informace 
týkající se potenciálních dráždivých/leptavých ú činků látky na o či by se m ěly 
zhodnotit p řed zvažováním zkoušení  in vivo . Může již existovat dostatek d ůkazů 
pro klasifikaci zkoušené látky podle jejích potenciálních dráždivých nebo lepta ­
vých účinků na oči, aniž by bylo nutné provád ět zkoušky na laboratorních 
zvířatech. Proto využití analýzy pr ůkaznosti výsledk ů a strategie postupného 
zkoušení sníží pot řebu provád ět zkoušení  in vivo , zejména pokud látka pravd ě­
podobně vyvolá závažné reakce.  
Doporučuje se, aby se stávající informace týkající se dráždivých a leptavých 
účinků látky na o či zhodnotily pomocí analýzy pr ůkaznosti výsledk ů, na jejímž 
základě se rozhodne o tom, zda by se k lepší charakteristice tohoto potenciálu 
měly provést další studie, jiné než o ční studie  in vivo . Jsou-li nutné další studie, 
doporučuje se využít strategie postupného zkoušení a jejím prost řednictvím získat 
relevantní experimentální údaje. U látek, které doposud nebyly zkoušeny, by se měla strategie postupného zkoušení využít k získání údaj ů, které jsou nezbytné 
k vyhodnocení jejich leptavých nebo dráždivých ú činků na oči. Strategie zkou ­ 
šení popsaná v této p říloze byla vypracována na seminá ři OECD (1). Následn ě 
byla tato strategie potvrzena a rozpracována v Harmonizovaném integrovaném systému klasifikace nebezpe čí chemických látek pro lidské zdraví a jejich vlivu 
na životní prost ředí, který schválilo 28. spole čné zasedání Výboru pro chemické 
látky a Pracovní skupiny pro chemické látky v listopadu 1998 (2).
 
Ačkoliv tato strategie postupného zkoušení není nedílnou sou částí zkušební 
metody B.5, vyjad řuje doporu čovaný postup stanovení dráždivých/leptavých 
účinků na oči. Tento postup p ředstavuje nejlepší praktický i etický standard 
pro zkoušení dráždivých/leptavých ú činků na oči in vivo.  Metoda zkoušení 
obsahuje pokyny pro provád ění zkoušky  in vivo  a shrnuje faktory, kterým 
je nutno p řed zvažováním takové zkoušky v ěnovat pozornost. Strategie postup ­
ného zkoušení p ředstavuje p řístup posuzování existujících údaj ů o dráždivých 
a leptavých ú čincích látek na o či a odstup ňovaný přístup k získávání relevant ­
ních údaj ů o látkách, u kterých je nutné provést další studie, nebo u nichž 
žádné studie nebyly doposud provedeny. Sou částí této strategie je provedení 
nejprve validovaných a uznaných zkoušek  in vitro  nebo  ex vivo  a poté za 
určitých okolností provedení studií dráždivých/leptavých ú činků na kůži 
metodou zkoušení B.4 (3, 4).  
POPIS STRATEGIE ZKOUŠENÍ PO KROCÍCH  
Před zahájením zkoušek v rámci strategie postupného zkoušení (obrázek) se 
vyhodnotí veškeré dostupné informace, aby se mohlo rozhodnout o nutnosti provést zkoušení  in vivo . Ačkoliv lze podstatné informace získat 
z vyhodnocení jednotlivých parametr ů (např. extrémní hodnota pH), stávající 
informace by se m ěly hodnotit jako celek. Všechny relevantní údaje o ú čincích 
zkoušené látky a jejích strukturních obdob se vyhodnotí na základ ě rozhodnutí 
založeném na pr ůkaznosti výsledk ů, toto rozhodnutí se zd ůvodní. Zvláštní d ůraz 
bude kladen na již existující údaje o ú čincích látky na člověka a zvířata a dále na 
výsledky zkoušení  in vitro  nebo  ex vivo . Studie žíravých látek  in vivo  by se měly 
provádět co nejmén ě. Mezi faktory uvedené ve strategii zkoušení pat ří:
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Hodnocení existujících údaj ů o účincích látky na člověka a zvířata (krok 1) . 
Nejprve je nutné vzít v úvahu existující údaje o ú čincích na člověka, např. 
klinické studie nebo studie nemocí z povolání, záznamy subjekt ů hodnocení 
a/nebo údaje o zkouškách na zví řatech získaná z o čních studií, protože 
z těchto dat lze získat informace p římo se vztahující k ú činkům na oči. Poté 
se zhodnotí dostupné údaje ze studií na lidech a/nebo na zví řatech zabývajících 
se leptavými/dráždivými ú činky na k ůži. Látky, jejichž leptavé nebo vysoce 
dráždivé ú činky na o či jsou známy, se do o čí zvířat neaplikují. To platí rovn ěž 
pro látky vykazující leptavé nebo dráždivé ú činky na k ůži; takové látky se 
považují za látky s leptavými a/nebo dráždivými ú činky rovn ěž na oči. Látky, 
o nichž byly v p ředchozích o čních studiích získány dostate čné důkazy, že jsou 
nežíravé a nedráždivé, se v o čních studiích  in vivo  také nezkoušejí.  
Analýza vztah ů mezi strukturou a biologickou aktivitou (SAR) (krok 2) . Vezmou 
se v úvahu výsledky zkoušek strukturn ě příbuzných chemických látek, jsou-li 
k dispozici. Pokud jsou k dispozici dostate čné údaje o ú čincích strukturn ě příbu­
zných látek nebo jejich sm ěsí na člověka a/nebo zví řata nazna čující, že mají 
potenciál leptavých/dráždivých ú činků na oči, lze předpokládat, že zkoušená 
látka vyvolá stejné reakce. V takových p řípadech není nutné tuto látku zkoušet. 
Negativní údaje získané ze studií strukturn ě příbuzných látek nebo jejich sm ěsí 
nezakládají podle strategie postupného zkoušení dostate čný důkaz nežíravosti/ 
nedráždivosti látky. Ke stanovení potenciálu leptavých/dráždivých ú činků na 
kůži i oči by měly být použity validované a uznané postupy vycházející 
z analýzy SAR.  
Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (krok 3) . Látky vykazující 
extrémní hodnoty pH jako ≤ 2,0 nebo ≥ 11,5 mohou mít silné místní ú činky. 
Pokud se leptavé nebo dráždivé ú činky látky na o či stanoví na základ ě extrém­
ních hodnot pH, lze také vzít v úvahu kyselou/alkalickou rezervu (pufra ční 
kapacitu) (5, 6). Pokud lze podle pufra ční kapacity soudit, že látka z řejmě 
nemá leptavé ú činky na o či, musí tento p ředpoklad potvrdit další zkoušky, 
pokud možno s využitím validované a uznané zkoušky  in vitro  nebo  ex vivo  
(viz kroky 5 a 6).  
Zvážení dalších existujících informací (krok 4) . V této fázi se vyhodnotí veškeré 
dostupné informace o systémové toxicit ě dermální cestou. Vezme se v úvahu 
také akutní dermální toxicita zkoušené látky. Pokud se u zkoušené látky ukázalo, 
že je při podání dermální cestou vysoce toxická, není nutné zkoušet ji na oku. 
Ačkoliv mezi akutní dermální toxicitou a dráždivými/leptavými ú činky na o či 
nemusí nezbytn ě existovat souvislost, lze se domnívat, že pokud je látka p ři 
podání dermální cestou vysoce toxická, bude vysokou toxicitu vykazovat také 
při instilaci do oka. Takové údaje lze také vzít v úvahu mezi kroky 2 a 3.  
Výsledky ze zkoušek in vitro nebo ex vivo (kroky 5 a 6) . Látky, které vykazovaly 
leptavé nebo výrazn ě dráždivé vlastnosti ve zkoušce  in vitro  nebo  ex vivo  (7, 8), 
která byla validována a uznána pro hodnocení výlu čně leptavých/dráždivých 
účinků na oči nebo na k ůži, není nutné zkoušet na zví řatech. Lze p ředpokládat, 
že takové látky vyvolají ve zkoušce  in vivo  podobné závažné ú činky. Nejsou-li 
validované a uznané zkoušky  in vitro  nebo  ex vivo k  dispozici, kroky 5 a 6 se 
přeskočí a přejde se p římo ke kroku 7.  
Posouzení dráždivých nebo leptavých ú činků na kůži in vivo (krok 7) . Pokud 
stávající d ůkazy k provedení p řesvědčivé analýzy pr ůkaznosti výsledk ů potenci­
álních dráždivých/leptavých ú činků látky na o či opírající se o údaje z výše 
uvedených studií neposta čují, nejprve se s využitím metody B.4 (4) a pr ůvodní 
přílohy (9) vyhodnotí potenciál dráždivých/leptavých ú činků na kůži in vivo . 
Jestliže se u látky prokáží leptavé nebo siln ě dráždivé ú činky na k ůži, považuje 
se za látku s leptavými a dráždivými ú činky na o či, pokud jiné informace 
nesvědčí o odlišném záv ěru. Oční zkoušku  in vivo  by tak nebylo nutné provád ět. 
Pokud látka leptavé nebo výrazn ě dráždivé ú činky na k ůži nemá, o ční zkouška  in 
vivo se provede.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
Zkouška  in vivo  na králících (kroky 8 a 9). O ční zkoušení  in vivo  se zahájí 
počáteční zkouškou na jednom zví řeti. Pokud výsledky této zkoušky nazna čují, 
že látka má siln ě dráždivé nebo leptavé ú činky na o či, další zkoušení se nepro ­
vádí. Pokud zkouška žádné leptavé nebo siln ě dráždivé ú činky neodhalí, provede 
se potvrzující zkouška na dvou dalších zví řatech.  
LITERATURA  
1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 
22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).  
3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161–177.  
4) Zkušební metoda B.4. Akutní toxicita: dráždivé/leptavé ú činky na k ůži. 
5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19–26.  
6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.
 
7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524.
 
8) Zkušební metoda B.40 Leptavé ú činky na k ůži. 
9) Dodatek zkušební metody B.4: Strategie postupného zkoušení dráždivých 
a leptavých ú činků na kůži. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Obrázek  
Strategie zkoušení a hodnocení dráždivých/leptavých ú činků na oči
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6 SENZIBILIZACE K ŮŽE 
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Poznámky:  
Citlivost zkoušek a jejich schopnost zjistit látky s možným senzibi ­
lizačním účinkem na lidskou k ůži mají v systému klasifikace toxicity 
v oblasti ve řejného zdraví velký význam.  
Neexistuje jediná zkušební metoda, která by vhodným zp ůsobem 
identifikovala všechny látky s potenciálním senzibiliza čním účinkem 
na lidskou k ůži a která by byla relevantní pro všechny látky.  
Při výběru zkoušky musí být zváženy faktory, jako jsou fyzikální 
vlastnosti látky, v četně schopnosti pronikat k ůží. 
Byly vyvinuty dva typy zkoušek na mor čatech: zkoušky s adjuvanty, 
ve kterých je alergický stav umocn ěn rozpušt ěním nebo suspendo ­
váním zkoušené látky ve Freundov ě kompletním adjuvantu (FCA), 
a zkoušky bez adjuvant ů. 
Zkoušky s adjuvantem jsou pravd ěpodobně přesnější v předpovědi 
pravděpodobného senzibiliza čního účinku na lidskou k ůži než 
metody bez použití Freundova kompletního adjuvantu, a proto se jim dává p řednost.
 
Maximaliza ční zkouška na mor čatech (Guinea Pig Maximisation 
Test – GPMT) je velmi rozší řená zkouška s adjuvantem. A čkoli 
lze použít n ěkolik dalších metod pro zjišt ění schopnosti látky vyvolat 
senzibiliza ční reakci k ůže, je zkouška GMPT up řednostňovanou 
technikou s adjuvantem.  
U mnoha skupin chemických látek jsou zkoušky bez adjuvantu (dává 
se přednost Bühlerov ě zkoušce) považovány za mén ě citlivé.  
V určitých p řípadech lze zd ůvodnit Bühlerovu zkoušku 
s povrchovou aplikací spíše než intradermální injekci používanou v maximaliza ční zkoušce na mor čatech. Pro použití Bühlerovy 
zkoušky by m ělo být uvedeno v ědecké zdůvodnění.
 
V této metod ě jsou popsány maximaliza ční zkoušky na mor čatech 
(GPMT) a Bühlerova zkouška. Jiné metody lze použít za p ředpo­
kladu, že jsou spolehliv ě validované a odborn ě odůvodněné. 
Pokud je z uznávané screeningové zkoušky získán pozitivní výsle ­
dek, může být zkoušená látka ozna čena za potenciální senzibilizátor 
a nemusí být nezbytné provést další zkoušku na mor čatech. Jestliže 
však má taková zkouška negativní výsledek, musí být zkouška na morčatech provedena za použití postupu popsaného v této zkušební 
metodě.
 
Viz také obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2 DEFINICE  
Senzibilizace k ůže: (alergická kontaktní dermatitida) je imunologicky 
zprostředkovaná kožní reakce na látku. U člověka mohou být reakce 
charakterizovány sv ěděním, zarudnutím k ůže, otoky, pupenci, 
puchýřky, bulami nebo jejich kombinací. U jiných živo čišných 
druhů se mohou reakce lišit a m ůže být zjišt ěno pouze zarudnutí 
kůže nebo otok.  
Indukční expozice: experimentální expozice subjektu zkoušené látce 
se záměrem navodit stav p řecitlivělosti.  
Indukční období: období nejmén ě jednoho týdne po induk ční expo­
zici, během něhož se m ůže rozvinout stav p řecitlivělosti.  
Provokační expozice: experimentální expozice subjektu d říve vysta­
veného zkoušené látce po induk čním období s cílem stanovit, zda je 
reakce subjektu p řecitlivělá. 
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Citlivost a spolehlivost použité zkušební metody by m ěla být posou ­
zena každých šest m ěsíců za použití látek, o kterých je známo, že 
mají mírné až st ředně silné senzibiliza ční účinky na k ůži. 
U správn ě provedené zkoušky vyvolávají mírné/st řední senzibilizá ­
tory zpravidla nejmén ě 30 % reakci p ři metodě s adjuvanty 
a nejmén ě 15 % reakci p ři metodě bez adjuvant ů. 
Přednostně jsou používány tyto látky:  
Čísla CAS Čísla EINECS Názvy podle EINECS Obecné názvy  
101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldehyd α-hexylcinnamaldehyd 
149-30-4 205-736-8 2sulfanylbenzothiazol kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzokain nordkain  
Za určitých okolností mohou být p ři dostate čném zdůvodnění 
použity jiné kontrolní látky spl ňující výše uvedená kritéria.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Pokusným zví řatům je nejd říve aplikována zkoušená látka intrader ­
málními injekcemi a/nebo epidermální aplikací (induk ční expozice). 
Po období klidu 10 až 14 dn ů (indukční období), v pr ůběhu kterého 
se může rozvinout imunitní reakce, je zví řatům aplikována 
provokační dávka. Rozsah a stupe ň kožní reakce pokusných zví řat 
na provoka ční expozici je porovnáván s rozsahem a stupn ěm reakce 
u kontrolních zví řat, která podstoupí negativní expozici v pr ůběhu 
indukce a je jim aplikována provoka ční dávka.  
1.5 POPIS ZKUŠEBNÍCH METOD  
Pokud je považováno za nezbytné odstranit zkoušenou látku, použije 
se voda nebo vhodné rozpoušt ědlo, aniž by se zm ěnila stávající 
reakce nebo integrita pokožky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1  Maximaliza ční zkouška na mor čatech (GPMT)  
1.5.1.1 P ř í p r a v a  
Zdravá mladá dosp ělá albinotická mor čata se aklimatizují na labora ­
torní podmínky nejmén ě 5 dnů před zahájením zkoušky. P řed zkou­ 
škou se provede náhodný výb ěr zvířat a zvířata se přiřadí do expe ­
rimentálních a kontrolních skupin. Srst se odstraní st říháním, 
holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité zkušební metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození k ůže. Zvířata 
se zváží p řed zahájením zkoušky a na konci zkoušky.
 
1.5.1.2 Z k u š e b n í p o d m í n k y  
1.5.1.2.1 Pokusná zví řata: 
Použijí se b ěžně používané laboratorní kmeny albinotických mor čat. 
1.5.1.2.2 Po čet a pohlaví  
Použít lze samce i samice. Použité samice musí být nullipary a nesmí 
být březí. 
Experimentální skupina se skládá nejmén ě z 10 zví řat a kontrolní 
skupina nejmén ě z 5 zvířat. Použije-li se mén ě než 20 experimen ­
tálních a 10 kontrolních mor čat a není možné dojít k záv ěru, že je 
zkoušená látka senzibilizující, doporu čuje se zkoušení na dalších 
zvířatech, aby byl celkový po čet nejmén ě 20 experimentálních 
a 10 kontrolních zví řat. 
1.5.1.2.3 Úrovn ě dávek  
Koncentrace zkoušené látky použitá pro každou induk ční expozici 
by měla být taková, aby ji zví řata systémov ě dobře snášela, a m ěla 
by být nejvyšší koncentrací vyvolávající mírné až st řední podrážd ění 
kůže. Koncentrace použitá p ři provoka ční expozici by m ěla odpo­
vídat nejvyšší dávce, která nevyvolává podrážd ění. V p řípadě 
potřeby mohou být vhodné koncentrace stanoveny p ředběžnou studií 
na dvou nebo t řech zvířatech. Pro tento ú čel by mělo být zváženo 
použití zví řat, kterým bylo podáno Freundovo kompletní adjuvans 
(FCA).  
1.5.1.3 P o s t u p  
1.5.1.3.1 Indukce  
Den 0 – experimentální skupina  
Tři dvojice intradermálních injekcí o objemu 0,1 ml se podají syme ­
tricky podle st řední linie do lopatkové oblasti zbavené srsti.  
Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smísené s vodou 
nebo fyziologickým roztokem v pom ěru 1: 1 obj.  
Injekce 2: zkoušená látka ve vhodném vehikulu ve zvolené koncen ­
traci.  
Injekce 3: zkoušená látka ve zvolené koncentraci p řipravené ve 
směsi s FCA a vodou nebo fyziologickým roztokem v pom ěru 1: 
1 obj.  
Pro injekci 3 se látky rozpustné ve vod ě rozpustí p řed smísením 
s FCA ve vodné fázi. Látky rozpustné v lipidech nebo nerozpustné látky se p řed smísením s vodnou fází suspendují v FCA. Kone čná 
koncentrace zkoušené látky musí být stejná jako koncentrace použitá 
v injekci 2.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Injekce 1 a 2 se aplikují blízko sebe a co nejblíže hlav ě, zatímco 
injekce 3 se podává sm ěrem ke kaudální části zkušební plochy.  
Den 0 – kontrolní skupina  
Tři dvojice subkutánních injekcí o objemu 0,1 ml se podají na stejná 
místa jako u experimentálních zví řat. 
Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smísené s vodou 
nebo fyziologickým roztokem v pom ěru 1: 1 obj.  
Injekce 2: ne ředěné vehikulum.  
Injekce 3: 50 % (m/V) sm ěs vehikula se sm ěsí FCA a vody nebo 
fyziologickém roztoku v pom ěru 1: 1 obj.  
5.–7. den – experimentální a kontrolní skupiny  
Přibližně dvacet čtyři hodin p řed povrchovou induk ční aplikací, jest ­
liže látka není dráždivá pro k ůži, se po d ůkladném ost říhání a/nebo 
oholení nanese na zkušební plochu 0,5 ml 10 % natriumdodecylsul ­
fátu ve vazelín ě za účelem vyvolání místního podrážd ění. 
6.–8. den – experimentální skupina  
Zkušební plocha se op ět zbaví srsti. Filtra ční papír (2 × 4 cm) se 
plně napustí zkoušenou látkou ve vhodném vehikulu, p řiloží se na 
zkušební plochu a udržuje se ve styku s k ůží pomocí okluzivního 
obvazu po dobu 48 hodin. Výb ěr vehikula by m ěl být zdůvodněn. 
Pevné látky se jemn ě rozetřou a vpraví do vhodného vehikula. Kapa ­
liny lze aplikovat p římo, je-li to vhodné.  
6.–8. den – kontrolní skupina  
Zkušební plocha se op ět zbaví srsti. Na zkušební plochu se 
podobným zp ůsobem nanese samotné vehikulum a udržuje se ve 
styku s k ůží pomocí okluzivního plátku po dobu 48 hodin.  
1.5.1.3.2 Provokace  
20.–22. den – experimentální a kontrolní skupiny  
Boky pokusných i kontrolních zví řat se zbaví srsti. Na jeden bok 
zvířete se aplikuje zkoušená látka v plátku nebo v kom ůrce a na 
druhý bok se m ůže popřípadě umístit plátek nebo kom ůrka obsahu ­
jící pouze vehikulum. Plátky se fixují ve styku s k ůží pomocí oklu ­
zivního obvazu po dobu 24 hodin.  
Pozorování a hodnocení: experimentální a kontrolní skupiny  
— Přibližně 21 hodin po odstran ění plátku se provoka ční plocha 
očistí, důkladně ostříhá a/nebo oholí a v p řípadě potřeby depiluje,  
— přibližně po 3 hodinách (p řibližně 48 hodin od za čátku aplikace 
provokační dávky) se pozoruje kožní reakce a zaznamená se 
podle stupnice uvedené v dodatku,  
— přibližně 24 hodin po tomto pozorování se provede druhé pozo ­
rování (72 hodin) a op ět se zaznamená reakce k ůže. 
Doporučuje se provád ět pozorování „naslepo“ u pokusných 
i kontrolních zví řat. 
Pokud je to nezbytné pro objasn ění výsledk ů získaných p ři první 
provokaci, m ěla by být p řibližně jeden týden po první provokaci 
zvážena druhá provokace (tj. opakovaná provokace), v p řípadě 
potřeby s novou kontrolní skupinou. Opakovaná provokace m ůže 
být provedena také na p ůvodní kontrolní skupin ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Pozorování a zaznamenávání všech kožních reakcí a neobvyklých 
nálezů, včetně systémových reakcí, které jsou d ůsledkem induk čních 
a provoka čních postup ů, by měla být provád ěna podle stupnice 
Magnussona/Kligmana (viz dodatek). Pro objasn ění nejasných reakcí 
mohou být provedeny jiné postupy, nap ř. histopatologické vyšet ření 
nebo měření tloušťky kožní řasy. 
1.5.2  Bühlerova zkouška  
1.5.2.1 P ř í p r a v a  
Zdravá mladá dosp ělá albinotická mor čata se aklimatizují na labora ­
torní podmínky nejmén ě 5 dnů před zahájením zkoušky. P řed zkou­ 
škou se provede náhodný výb ěr zvířat a zvířata se přiřadí do expe ­
rimentálních a kontrolních skupin. Srst se odstraní st říháním, 
holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité zkušební metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození k ůže. Zvířata 
se zváží p řed zahájením zkoušky a na konci zkoušky.
 
1.5.2.2 Z k u š e b n í p o d m í n k y  
1.5.2.2.1 Pokusná zví řata 
Používají se b ěžně používané laboratorní kmeny albinotických 
morčat. 
1.5.2.2.2 Po čet a pohlaví  
Použít lze samce i samice. Použité samice musí být nullipary a nesmí 
být březí. 
Experimentální skupina se skládá nejmén ě z 20 zví řat a kontrolní 
skupina nejmén ě z 10 zví řat. 
1.5.2.2.3 Úrovn ě dávek  
Koncentrace zkoušené látky použitá pro každou induk ční expozici 
by měla být tou nejvyšší koncentrací, která vyvolá mírné, ne však 
silné podrážd ění kůže. Koncentrace použitá p ři provoka ční expozici 
by měla odpovídat nejvyšší koncentraci, která nevyvolává podráž ­
dění. V případě potřeby mohou být vhodné koncentrace stanoveny 
předběžným pokusem na dvou nebo t řech zvířatech.  
Pro zkoušené látky rozpustné ve vod ě je vhodné používat jako vehi ­
kulum vodu nebo nedráždivé z ředěné roztoky povrchov ě aktivní 
látky. Pro ostatní zkoušené látky se up řednostňuje roztok 80 % alko ­
holu ve vod ě pro indukci a aceton pro provokaci.  
1.5.2.3 P o s t u p  
1.5.2.3.1 Indukce  
Den 0 – experimentální skupina  
Jeden bok se zbaví srsti (d ůkladně se ostříhá). Zkušební plátek by 
měl být důkladně napuštěn zkoušenou látkou ve vhodném vehikulu 
(výběr vehikula musí být zd ůvodněn; tekuté zkoušené látky mohou 
být podle pot řeby aplikovány ne ředěné). 
Zkušební plátek se p řiloží na zkušební plochu a po dobu 6 hodin se 
udržuje ve styku s k ůží okluzivním plátkem nebo kom ůrkou 
a vhodným obvazem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Systém s plátkem musí být okluzivní. Vhodný je bavln ěný polštářek, 
může být kruhový nebo čtvercový, ale m ěl by mít velikost p řibližně 
4–6 cm  2 . Pro zajišt ění okluze je vhodné použít vhodnou fixaci. Jsou- 
li použity obvazy, mohou být nezbytné dodate čné expozice.  
Den 0 – kontrolní skupina  
Jeden bok se zbaví srsti (d ůkladně se ostříhá). Na zkušební plochu se 
nanese vehikulum podobným zp ůsobem jako u experimentální 
skupiny. Zkušební plátek se po dobu 6 hodin udržuje ve styku s kůží pomocí okluzivního plátku nebo kom ůrky a vhodného 
obvazu. Pokud je možné prokázat, že kontrolní skupina podrobená 
negativní expozici není nezbytná, lze použít neexponovanou kontrolní skupinu.
 
6.–8. a 13.–15. den – experimentální a kontrolní skupina  
Provede se stejná aplikace jako v den 0 na stejnou zkušební plochu 
(v případě potřeby zbavenou srsti) na tentýž bok, a to 6.–8. den 
a opět 13.–15. den.  
1.5.2.3.2 Provokace  
27.–29. den – experimentální a kontrolní skupina  
Neošetřený bok pokusných a kontrolních zví řat se zbaví srsti 
(důkladně se ostříhá). Okluzivní plátek nebo kom ůrka obsahující 
příslušné množství zkoušené látky v nejvyšší nedráždivé koncentraci 
se aplikuje na zadní část neošet řeného boku pokusných a kontrolních 
zvířat. 
Na přední část neošet řeného boku pokusných a kontrolních zví řat se 
popřípadě aplikuje okluzivní plátek nebo kom ůrka jen s vehikulem. 
Plátky nebo kom ůrky se po dobu 6 hodin fixují ve styku s k ůží 
pomocí vhodného obvazu.  
1.5.2.3.3 Pozorování a hodnocení  
— Přibližně 21 hodin po odstran ění plátku se provoka ční plocha 
zbaví srsti,  
— přibližně po třech hodinách (p řibližně 30 hodin po aplikaci 
provokačního plátku) se pozorují kožní reakce a zaznamenají 
se podle stupnice uvedené v dodatku,  
— přibližně 24 hodin po 30hodinovém pozorování (p řibližně 54 
hodin po aplikaci provoka čního plátku) se op ět pozorují kožní 
reakce a zaznamenají se.  
Doporučuje se provád ět pozorování „naslepo“ u pokusných 
i kontrolních zví řat. 
Pokud je to nezbytné pro objasn ění výsledk ů získaných p ři první 
provokaci, m ěla by být p řibližně jeden týden po první provokaci 
zvážena druhá provokace (tj. opakovaná provokace), v p řípadě 
potřeby s novou kontrolní skupinou. Opakovaná provokace m ůže 
být provedena také na p ůvodní kontrolní skupin ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Pozorování a zaznamenávání všech kožních reakcí a neobvyklých 
nálezů, včetně systémových reakcí, které jsou d ůsledkem induk čních 
a provoka čních postup ů, by měla být provád ěna podle stupnice 
Magnussona/Kligmana (viz dodatek). Pro objasn ění nejasných reakcí 
mohou být provedeny jiné postupy, nap ř. histopatologické vyšet ření 
nebo měření tloušťky kožní řasy. 
2. ÚDAJE (GPMT A BÜHLEROVA ZKOUŠKA)  
Údaje se shrnou do tabulky, p řičemž se pro každé zví ře uvedou 
kožní reakce p ři každém pozorování.  
3. ZPRÁVY (GPMT A BÜHLEROVA ZKOUŠKA)  
Pokud byla p řed zkouškou na mor čatech provedena screeningová 
zkouška (nap ř. zkouška ztlušt ění ucha u myší (MEST)), musí být 
s výsledky získanými se zkoušenými a referen čními látkami uveden 
popis této zkoušky nebo odkaz na tuto zkoušku, v četně podrobných 
informací o postupu.  
Protokol o zkoušce (GMPT a Bühlerova zkouška)  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
Pokusná zví řata: 
— použitý kmen mor čat, 
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— původ, podmínky chovu, strava atd.,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku zkoušky.  
Zkušební podmínky:  
— technika p řípravy oblasti k ůže, na kterou se nanese náplast,  
— podrobné údaje o materiálech použitých na náplasti a technice 
aplikování náplastí,  
— výsledek p ředběžné studie a záv ěr týkající se induk čních 
a provoka čních koncentrací, které byly p ři zkoušce použity,  
— podrobné údaje o p řípravě, aplikaci a odstran ění zkoušené látky,  
— zdůvodnění volby vehikula,  
— koncentrace vehikula a zkoušené látky použité pro induk ční 
a provoka ční expozice a celkové množství látky použité pro 
indukci a provokaci.  
Výsledky:  
— souhrn výsledk ů poslední kontroly citlivosti a spolehlivosti (viz 
1.3), včetně informací o použité látce, koncentraci a vehikulu,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— posuzování jednotlivých zví řat, včetně systému klasifikace,  
— podrobný popis charakteru a stupn ě pozorovaných ú činků, 
— všechny histopatologické nálezy.  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
Metoda je analogická metod ě OECD TG 406.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Dodatek  
TABULKA  
Stupnice Magnussona/Kligmana pro hodnocení kožních reakcí na 
provokační expozici  
0 = žádná viditelná zm ěna 
1 = slabé nebo skvrnité zarudnutí k ůže 
2 = mírné a splývající zarudnutí k ůže 
3 = intenzivní zarudnutí a zdu ření kůže ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7 STUDIE ORÁLNÍ TOXICITY U HLODAVC Ů – 28DENNÍ 
OPAKOVANÁ APLIKACE  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) 407 
(2008). P ůvodní Pokyny pro provád ění testů 407 byly schváleny v roce 
1981. V roce 1995 byla schválena revidovaná verze obsahující pokyny 
k získání dalších informací o zví řeti používaném ve studii, zejména 
o neurotoxicit ě a imunotoxicit ě. 
2. V roce 1998 zahájila OECD činnost s vysokou prioritou, a sice revizi 
stávajících Pokyn ů pro provád ění testů a vývoj nových Pokyn ů pro zkoušení 
určených ke screeningu a zkouškám potenciálních endokrinních 
disruptorů (8). Sou částí této činnosti byla aktualizace stávajících pokyn ů 
OECD pro „studii orální toxicity u hlodavc ů – 28denní opakovaná aplikace“ 
(TG 407) dopln ěním parametr ů vhodných k detekci endokrinního p ůsobení 
zkoušených chemických látek. Tento postup prošel rozsáhlým mezinárodním 
programem, p ři němž se zkoušela relevance a prakti čnost těchto dopl ňují­
cích parametr ů, funkčnost těchto parametr ů u chemických látek 
s (anti)estrogenním, (anti)androgenním a (anti)tyreoidálním p ůsobením, 
vnitrolaboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnost a interference nových 
parametrů s parametry požadovanými p ředchozími pokyny TG 407. Získá se 
velké množství údaj ů, které jsou shrnuty a podrobn ě vyhodnoceny 
v souhrnné zpráv ě OECD (9). Tato aktualizovaná zkušební metoda B.7 
(odpovídající TG 407) je výsledkem zkušeností a výsledk ů shromážd ěných 
v rámci mezinárodního zkušebního programu. Tato zkušební metoda umožňuje zkoumat souvislosti mezi ur čitými endokrinními ú činky 
a jinými toxikologickými ú činky.
 
VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ  
3. Při posuzování a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze po 
získání prvních informací o toxicit ě ze zkoušek akutní toxicity pomocí 
opakované aplikace dávek stanovit orální toxicitu. Tato zkušební metoda 
je určena ke zkoumání ú činků toxicity u velmi širokého spektra potenciál ­
ních cílových míst. Poskytuje informace o možných rizicích pro zdraví, které mohou pravd ěpodobně vzniknout p ři opakované expozici v relativn ě 
omezeném časovém období, v četně účinků na nervový, imunitní 
a endokrinní systém. S ohledem na tyto konkrétní cílové parametry by 
tato metoda m ěla identifikovat chemické látky s neurotoxickým potenciálem, 
které mohou vyžadovat jeho další d ůkladné prozkoumání, a chemické látky 
působící na štítnou žlázu. Rovn ěž může poskytnout údaje o chemických 
látkách, které p ůsobí na sam čí a/nebo sami čí pohlavní orgány u mladých 
dospělých zvířat, a mohou se pomocí ní zjistit imunologické ú činky látek.
 
4. Výsledky této zkušební metody B.7 by se m ěly použít k identifikaci nebez ­
pečnosti a posouzení rizik. Výsledky získané pro parametry související 
s endokrinním p ůsobením by se m ěly interpretovat v kontextu „koncep čního 
rámce OECD pro zkoušky a hodnocení chemických látek zp ůsobujících 
endokrinní poruchy“ (11). Tato metoda se skládá ze základní studie toxicity po opakovaných dávkách, kterou lze použít u chemických látek, u nichž není důvod pro 90denní studii (nap ř. když objem výroby nep řekračuje určité 
limity) nebo jako p ředběžnou studii k dlouhodobé studii. Expozice by m ěla 
trvat 28 dní.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Mezinárodní program validace parametr ů vhodných k potenciální detekci 
endokrinního p ůsobení zkoušené chemické látky ukázal, že kvalita údaj ů 
získaných touto zkušební metodou B.7 bude velmi záviset na zkušenostech laboratoře provád ějící zkoušku. Týká se to konkrétn ě histopatologického 
určení cyklických zm ěn v samičích pohlavních orgánech a stanovení hmot ­
nosti malých orgán ů závislých na hormonech, které se obtížn ě pitvají. Byly 
vyvinuty pokyny k histopatologickému vyšet ření (19). K dispozici jsou na 
veřejných webových stránkách OECD v ěnovaných pokyn ům pro zkoušení 
(Test Guidelines). Mají za cíl pomoci patolog ům při vyšetřování a pomoci 
zvýšit citlivost rozbor ů. Byla nalezena řada různých parametr ů svědčících 
o toxicitě pro endokrinní systém a tyto parametry byly za členěny do 
zkušební metody. Parametry, u nichž nebyl k dispozici dostatek údaj ů 
k ověření jejich použitelnosti nebo které vykazovaly pouze slabou pr ůkaz­
nost ve valida čním programu hodnotícím jejich schopnost pomoci detekovat 
endokrinní disruptory, jsou navrženy jako volitelné cílové parametry (viz dodatek 2).
 
6. Na základ ě údajů získaných ve valida čním postupu je nutné zd ůraznit, že 
citlivost tohoto stanovení není dostate čná pro identifikaci všech látek 
s (anti)androgenními nebo (anti)estrogenními ú činky (9). Tato zkušební 
metoda se neprovádí ve fázi života, v které je endokrinní systém nejcitliv ější 
na poškození. Nicmén ě během valida čního postupu tato metoda identifiko ­
vala látky, které slab ě nebo siln ě ovlivňují funkci štítné žlázy a látky, které 
vykazují silný nebo st ředně silný endokrinní ú činek prost řednictvím estro ­
genových nebo adrogenových receptor ů, ve většině případů však byla 
neúspěšná při identifikaci endokrinn ě působících látek, které ú činkují 
slabě na estrogenové nebo androgenové receptory. Nelze ji tudíž ozna čit 
za screeningové stanovení endokrinního p ůsobení.  
7. Nepřítomnost ú činků souvisejících s t ěmito mechanismy p ůsobení proto 
nelze pokládat za d ůkaz nepřítomnosti ú činků na endokrinní systém. Co 
se týká ú činků zprostředkovaných endokrinní cestou, nem ěla by se tedy 
charakterizace látky zakládat pouze na výsledcích této zkušební metody, nýbrž by se m ěly tyto výsledky použít v rámci p řístupu zvažování závaž ­
nosti důkazů, který používá všechny stávající údaje o chemické látce 
k charakterizaci jejího potenciálního endokrinního p ůsobení. Z tohoto 
důvodu by m ělo regulační rozhodování o endokrinním p ůsobení (charakte ­
rizaci látky) vycházet z široké škály údaj ů, a nemělo by se opírat pouze 
o výsledky získané touto zkušební metodou.
 
8. Uznává se, že veškeré postupy používající zví řata musí spl ňovat místní 
normy pé če o zvířata. Popisy pé če a zacházení uvedené níže jsou minimál ­
ními standardy a budou nahrazeny místními p ředpisy, pokud ty jsou p řís­
nější. Další pokyny o humánním zacházení se zví řaty poskytuje OECD (14).  
9. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.  
PODSTATA ZKOUŠKY  
10. Zkoušená chemická látka se denn ě orálně podává v odstup ňovaných 
dávkách n ěkolika skupinám pokusných zví řat; každé skupin ě se podává 
jedna úrove ň dávky po dobu 28 dn ů. V průběhu období podávání se zví řata 
každý den pe člivě pozorují, aby se zjistily p říznaky toxicity. Zví řata, která 
v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci 
zkoušky se utratí zví řata, která p řežila, a rovn ěž se pitvají. 28denní studie 
poskytuje informace o ú čincích opakované orální expozice a m ůže se 
ukázat, že jsou t řeba další dlouhodobé studie. Také m ůže poskytnout  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
informace o výb ěru koncentrací pro dlouhodobé studie. Údaje získané použ ­
itím této zkušební metody by m ěly umožnit charakterizaci toxicity zkoušené 
chemické látky, ur čení vztahu mezi dávkou a odezvou a stanovení hladiny 
bez pozorovaného nep říznivého ú činku ((NOAEL).  
POPIS METODY  
Výběr zvířecích druh ů 
11. Dává se p řednost potkan ům, ale lze použít i jiný druh hlodavc ů. Jestliže se 
parametry uvedené v této zkušební metod ě B.7 zkoumají u jiných druh ů 
hlodavců, mělo by se podat podrobné zd ůvodnění. Přestože je biologicky 
možné, že jiné druhy budou reagovat na toxické látky podobným zp ůsobem 
jako potkan, použití menších druh ů může vést ke zvýšené variabilit ě 
v důsledku technické obtížnosti pitvy menších orgán ů. V mezinárodním 
validačním programu detekce endokrinních disruptor ů byl jediným použitým 
druhem potkan. M ěla by se použít mladá zdravá dosp ělá zvířata běžně 
používaných laboratorních kmen ů. Samice musí být nullipary a nesmí být 
březí. Podávání látky by m ělo začít co nejd říve po odstavení a v každém 
případě dříve, než zví řata dosáhnou stá ří devíti týdn ů. Na začátku studie by 
měly být odchylky hmotnosti zví řat minimální a nem ěly by překročit 
± 20 % pr ůměrné hmotnosti pro každé pohlaví. Provádí-li se studie opako ­
vaného orálního podávání látky jako p ředběžná studie pro dlouhodobou 
studii, měla by se v obou studiích použít nejlépe zví řata stejného kmene 
a stejného p ůvodu.  
Umístění a krmení zví řat 
12. Všechny postupy by m ěly splňovat místní standardy pé če o laboratorní 
zvířata. Teplota v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22 °C (± 3 °C). 
Relativní vlhkost vzduchu by m ěla být minimáln ě 30 % a pokud možno 
nepřesáhnout 70 % krom ě doby čištění místnosti. Cílem by m ěla být 
hodnota 50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé a mělo by se st řídat 12 
hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konven ční laboratorní 
krmivo s neomezenou dodávkou pitné vody. Výb ěr krmiva m ůže být 
ovlivněn potřebou zajistit vhodnou p řísadu zkoušené chemické látky, 
podává-li se látka tímto zp ůsobem. Zví řata by m ěla být chována v malých 
skupinkách stejného pohlaví. Je-li to v ědecky od ůvodněné, mohou být 
zvířata umíst ěna jednotliv ě. Při chovu zví řat v klecích by v jedné kleci 
nemělo být umíst ěno více než p ět zvířat. 
13. Krmivo by se m ělo pravideln ě analyzovat, aby se zjistila p řítomnost konta ­
minantů. Vzorek stravy by se m ěl uchovávat až do dokon čení zprávy.  
Příprava zví řat 
14. Zdravá mladá dosp ělá zvířata se náhodn ě přiřadí do kontrolních 
a experimentálních skupin. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby byl 
případný vliv jejich polohy minimalizován. Zví řata se jednozna čně identifi­
kují a před započetím studie se nechají v laboratorních podmínkách alespo ň 
pět dní aklimatizovat.  
Příprava dávek  
15. Zkoušená chemická látka se podává žalude ční sondou nebo v krmivu či 
v pitné vod ě. Metoda orálního podání závisí na ú čelu studie a na fyzikál ­
ních/chemických/toxikokinetických vlastnostech zkoušeného materiálu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Zkoušená chemická látka se v p řípadě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve 
vhodném nosi či. Kdykoli je to možné, doporu čuje se zvážit nejprve použití 
vodného roztoku/suspenze, poté použití olejového roztoku/emulze (nap ř. 
kukuřičného oleje) a nakonec roztoku v jiných nosi čích. U nosi čů jiných 
než voda je nutné znát jejich toxické vlastnosti. M ěla by se stanovit stabilita 
zkoušené chemické látky v daném nosi či. 
POSTUP  
Počet a pohlaví zví řat 
17. Pro každou úrove ň dávky by se m ělo použít nejmén ě deset zví řat (pět samic 
a pět samců). Pokud se budou zví řata utrácet v pr ůběhu studie, je nutno 
zvýšit celkový po čet zvířat o počet zvířat, která budou utracena p řed ukon­ 
čením studie. M ělo by se zvážit p řidání další satelitní skupiny deseti zví řat 
(pět zvířat od každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší 
dávkou, aby se po dobu nejmén ě 14 dní po ukon čení aplikace mohla 
sledovat vratnost, p řetrvávání nebo opožd ěný nástup toxických ú činků. 
Dávkování  
18. Obecn ě by se m ěly použít nejmén ě tři experimentální a jedna kontrolní 
skupina, ale pokud se na základ ě vyhodnocení jiných údaj ů neočekávají 
žádné účinky při dávce 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti na den, m ůže se 
provést limitní zkouška. Nejsou-li dostupné žádné vhodné údaje, m ůže se 
provést p ředběžná studie (na zví řatech stejného kmene a p ůvodu) pro stano ­
vení rozmezí dávek, které mají být použity. S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je t řeba se zví řaty v kontrolní skupin ě zacházet stejným 
způsobem jako se zví řaty v experimentální skupin ě. Používá-li se pro usnad ­
nění aplikace zkoušené chemické látky nosi č, podává se kontrolní skupin ě 
nosič v nejvyšším použitém objemu.
 
19. Při výběru úrovní dávek by se m ěly vzít v úvahu veškeré existující údaje 
o toxických a (toxiko)kinetických vlastnostech, které jsou pro zkoušenou chemickou látku nebo p říbuzné chemické látky dostupné. Nejvyšší úrove ň 
dávky by se m ěla zvolit tak, aby vyvolala toxické ú činky, ne však uhynutí 
nebo velké utrpení. Poté by se m ěla zvolit sestupná řada úrovní dávek, aby 
se prokázaly ú činky související s dávkou a nep řítomnost nep říznivých 
účinků při nejnižší úrovni dávky (NOAEL). Pro nastavení sestupných úrovní 
dávek bývá optimální dvoj- až čtyřnásobný interval mezi dávkami a často je 
vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu než použít velmi velké 
intervaly (odpovídající nap ř. koeficientu v ětšímu než 10).
 
20. V přítomnosti pozorované obecné toxicity (nap ř. snížená t ělesná hmotnost, 
účinky na játra, srdce, plíce nebo ledviny atd.) nebo jiných zm ěn, které 
nemusí být odezvou na toxicitu (nap ř. snížený p říjem krmiva, zv ětšení jater), 
je třeba pozorované ú činky na imunitní, neurologické nebo endokrinní 
citlivé cílové parametry interpretovat obez řetně. 
Limitní zkouška  
21. Pokud zkouška provedená podle postup ů popsaných v této studii p ři jedné 
dávce nejmén ě 1 000 mg na kg t ělesné hmotnosti na den nebo v p řípadě 
podávání v krmivu nebo v pitné vod ě v odpovídající koncentraci (na základ ě 
stanovení t ělesné hmotnosti) nevyvolá pozorovatelné toxické ú činky 
a pokud se na základ ě údajů o chemických látkách s podobnou strukturou 
nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití t ří úrovní dávek nutná. 
Limitní zkouška se použije s výjimkou p řípadu, kdy údaje o expozici 
člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovn ě dávek.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Podávání dávek  
22. Zkoušená chemická látka se zví řatům podává denn ě 7 dní v týdnu po dobu 
28 dnů. Pokud se zkoušená chemická látka podává nitrožalude čně, podává 
se zvířatům v jediné dávce za použití žalude ční sondy nebo vhodné intu ­
bační kanyly. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, 
závisí na velikosti pokusného zví řete. Toto množství by nem ělo překročit 
1 ml/100 g t ělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztok ů, kde lze použít 2 
ml/100 g t ělesné hmotnosti. Krom ě dráždivých nebo žíravých chemických 
látek, u kterých se ve vyšších koncentracích stup ňují účinky, by m ěly být 
rozdíly ve zkušebním objemu minimalizovány úpravou koncentrace tak, aby byl při všech úrovních dávek podáván konstantní objem.
 
23. U látek podávaných v krmivu nebo v pitné vod ě je důležité zajistit, aby 
množství použité zkoušené chemické látky neovliv ňovalo normální výživu 
nebo vodní rovnováhu. Podává-li se zkoušená chemická látka v krmivu, 
může se použít bu ď konstantní koncentrace (v ppm), nebo konstantní dávko ­
vání vzhledem k t ělesné hmotnosti zví řete; použitá možnost musí být speci ­
fikována. U látky podávané prost řednictvím žalude ční sondy je t řeba dávku 
podávat každý den p řibližně ve stejnou dobu a alespo ň jednou týdn ě ji 
přizpůsobit tak, aby se udržela konstantní úrove ň dávky vzhledem 
k tělesné hmotnosti zví řete. Pokud se studie s opakovaným podáváním 
provádí jako p ředběžná studie k dlouhodobé studii, m ěla by se v obou 
studiích použít stejná krmivo.  
Pozorování  
24. Doba pozorování by m ěla být 28 dn ů. Zvířata v satelitní skupin ě určená pro 
následná pozorování by m ěla být po dalších nejmén ě 14 dnů bez aplikace, 
aby se zachytil opožd ěný nástup, p řetrvávání nebo zotavení se z toxických 
účinků. 
25. Všeobecné klinické pozorování by se m ělo provád ět nejméně jednou denn ě, 
nejlépe ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby o čekávaného 
maxima ú činku po podání látky. M ěl by se zaznamenat zdravotní stav 
zvířat. Nejmén ě dvakrát denn ě se provede prohlídka všech zví řat za účelem 
zjištění morbidity a mortality.  
26. Před expozicí látce a dále nejmén ě jednou týdn ě by se mělo provést d ůkladné 
klinické vyšet ření všech zví řat (za účelem intraindividuálního porovnání). 
Toto pozorování by se m ělo provád ět mimo chovnou klec ve standardním 
pozorovacím prostoru a nejlépe pokaždé ve stejnou dobu. Pozorování by se 
měla pečlivě zaznamenávat, nejlépe za použití systému bodování explicitn ě 
definovaného ve zkušební laborato ři. Mělo by se usilovat o to, aby rozdíly ve 
zkušebních podmínkách byly co nejmenší a aby vyšet ření provád ěly nejlépe 
osoby, které nev ědí, jakým testem zví řata procházejí. Vyšet ření by m ělo 
mimo jiné zahrnovat zm ěny kůže, srsti, o čí a sliznic, výskyt sekret ů 
a exkretů a vegetativní funkce (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé 
dýchání). Zaznamenávat by se m ěly změny chůze, držení t ěla a reakce na 
manipulaci, dále p řítomnost klonických a tonických pohyb ů, stereotyp ů 
v chování (nap ř. nadměrného čištění nebo opakovaného kroužení) nebo bizar ­
ního chování (nap ř. sebepoškozování, ch ůze pozpátku) (2).  
27. Ve čtvrtém týdnu expozice látce by se m ěly vyšetřit reakce na r ůzné smys ­
lové podn ěty (2) (nap ř. sluchové, zrakové, proprioceptivní), (3), (4), (5), síla 
úchopu (6) a motorická aktivita (7). Další informace o postupech, které lze 
použít, jsou uvedeny v p říslušné literatu ře. Místo postup ů popsaných v této 
literatuře však lze použít také alternativní postupy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Pozorování funk čních poruch ve čtvrtém týdnu expozice látce lze p řípadně 
vynechat, pokud je studie provád ěna jako p ředběžná pro následnou subchro ­
nickou (90denní) studii. V takovém p řípadě by se m ělo pozorování funk č­
ních poruch zahrnout do této dlouhodobé studie. Dostupnost údaj ů 
o pozorovaných funk čních poruchách ze studie opakovaného podávání 
dávky může na druhé stran ě usnadnit výb ěr úrovní dávek pro následnou 
subchronickou studii.  
29. Pozorování funk čních poruch lze výjime čně vynechat u skupin, které 
vykazují p říznaky toxicity v takové mí ře, že by p ři posuzování funk čního 
stavu vadily.  
30. Při pitvě lze určit estrální cyklus všech samic (volitelné) odebráním vagi ­
nálních st ěrů. Tato pozorování poskytnou informace ohledn ě fáze estrálního 
cyklu v čase utracení zví řete a pomohou p ři histologickém vyšet ření tkání 
citlivých na estrogen [viz pokyny k histopatologickému vyšet ření (19)].  
Tělesná hmotnost a spot řeba krmiva/vody  
31. Všechna zví řata by se m ěla nejmén ě jednou týdn ě zvážit. M ěření spotřeby 
krmiva by se m ělo provád ět nejméně jednou týdn ě. Pokud se látka podává 
v pitné vod ě, měla by se nejmén ě jednou týdn ě měřit také spot řeba vody.  
Hematologická vyšet ření 
32. Na konci zkoušky by se m ěla provést tato hematologická vyšet ření: stano ­
vení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, po čtu erytrocyt ů, retikulocyt ů, 
celkového po čtu a diferenciálního rozpo čtu leukocyt ů a trombocyt ů 
a stanoví se protrombinový čas. Jestliže zkoušená chemická látka nebo 
její domn ělé metabolity mají oxida ční vlastnosti nebo existuje podez ření, 
že je mají, m ěly by se stanovit také koncentrace methemoglobinu 
a Heinzových t ělísek.  
33. Krevní vzorky by se m ěly odebírat z ur čeného místa t ěsně před utracením 
zvířat nebo v jeho pr ůběhu a měly by se skladovat za vhodných podmínek. 
Zvířata by se m ěla před utracením ponechat p řes noc nala čno (  1 ). 
Biochemické vyšet ření 
34. Klinické biochemické analýzy za ú čelem vyšet ření hlavních toxických 
účinků na tkáně, a zejména ú činků na játra a ledviny, by se m ěly provést 
na krevních vzorcích odebraných všem zví řatům těsně před utracením nebo 
v jeho pr ůběhu (krom ě zvířat nalezených v agónii a/nebo utracených p řed 
dokončením studie). Vyšet ření plazmy a séra obsahuje stanovení sodíku, 
draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, mo čoviny, kreatininu, celkových 
bílkovin a albuminu, nejmén ě dvou enzym ů indikujících ú činky na jaterní 
buňky (jako je alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická 
fosfatáza, gama-glutamyltranspeptidáza a glutamátdehydrogenáza) 
a žlučových kyselin. Stanovení dalších enzym ů (jaterního nebo jiného 
původu) a bilirubinu m ůže za určitých okolností poskytnout užite čné infor­
mace.  
35. Dále je možné v pr ůběhu posledního týdne studie provést následující 
analýzy mo či za použití časově definovaného sb ěru: vzhled, objem, osmo ­
lalita nebo specifická hmotnost, pH, bílkoviny, glukóza a krev/krvinky.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Pro řadu vyšet ření séra a plazmy, zejména na glukózu, by bylo vhodné ponechat zví řata 
nalačno přes noc. Hlavním d ůvodem je, že u nehladov ějících zví řat je vyšší variabilita 
výsledků, která by mohla maskovat jemné zm ěny a ztížit interpretaci. Na druhé stran ě 
může mít hladov ění přes noc vliv na celkový metabolismus zví řat a může narušit 
každodenní expozici zkoušené chemické látce, zejména ve studiích s podáváním látky 
v krmivu. Pokud se krev odebírá nala čno, měla by se klinická biochemická vyšet ření 
provést až po pozorování funk čních poruch ve 4. týdnu studie.
 36. Dále by se m ělo zvážit vyšet ření sérových marker ů celkového poškození 
tkání. Další vyšet ření by se m ělo provést, jestliže známé vlastnosti zkoušené 
chemické látky mohou (nebo existuje podez ření, že mohou) ovlivnit souvi ­
sející metabolické profily, v četně vápníku, fosfát ů, triglycerid ů, specifických 
hormonů a cholinesterázy. Tyto profily je t řeba identifikovat pro chemické 
látky patřící do určitých tříd nebo p řípad od p řípadu.  
37. Přestože v mezinárodním hodnocení cílových parametr ů týkajících se endo ­
krinního p ůsobení nebylo možno prokázat jasnou výhodu stanovení tyreoid ­
ních hormon ů (T3, T4) a TSH, m ůže být užite čné uchovat vzorky plazmy či 
séra k zm ěření T3, T4 a TSH (volitelné), existuje-li náznak p ůsobení na osu 
hypofýza–štítná žláza. Tyto vzorky je možno uchovat zmrazené na – 20 °C. Následující faktory mohou ovlivnit variabilitu a absolutní koncentrace stano ­
vovaných hormon ů:
 
— doba utracení vzhledem k diurnálním odchylkám v koncentracích 
hormonů, 
— způsob utracení – m ělo by se zabránit zbyte čnému stresu zví řat, který 
může ovlivnit koncentrace hormon ů, 
— testovací soupravy pro stanovení hormon ů, jejichž standardní k řivky se 
mohou lišit.  
Definitivní identifikace chemických látek p ůsobících na štítnou žlázu je 
spolehlivější, pokud se provede pomocí histopatologické analýzy spíše než 
stanovením hladin hormon ů. 
38. Vzorky plazmy ur čené speciáln ě k stanovení hormon ů by se m ěly odebírat 
zhruba ve stejnou denní dobu. Doporu čuje se, aby se zvážilo stanovení T3, 
T4 a TSH p ři nálezu histopatologických zm ěn štítné žlázy. Číselné hodnoty 
získané p ři analýze koncentrací hormon ů se u různých komer čních testova ­
cích souprav liší. V d ůsledku toho nemusí být možné poskytnout kritéria 
účinnosti vycházející z jednotných historických údaj ů. Laborato ře by se 
měly snažit udržovat kontrolní koeficienty odchylky pod hodnotou 25 pro 
T3 a T4 a pod hodnotou 35 pro TSH. Všechny koncentrace je nutno uvád ět 
v jednotkách ng/ml.  
39. Pokud nejsou údaje o výchozích hodnotách z d řívějších pozorování dosta ­
tečné, mělo by se zvážit stanovení hematologických a klinických bioche ­
mických parametr ů před začátkem podávání dávky nebo p řednostně 
u skupiny zví řat nezahrnutých do experimentálních skupin.  
PATOLOGIE  
Makroskopická pitva  
40. U všech zví řat zařazených do studie se provede celková, podrobná pitva, 
zahrnující pe člivé vyšet ření vnějšího povrchu t ěla, všech otvor ů a lebeční, 
hrudní a b řišní dutiny a jejich obsahu.  Játra, ledviny, nadledvinky, varlata,  
nadvarlata, prostata + semenné vá čky s Cowperovými žlázami jako celek,  
brzlík, slezina, mozek a srdce všech zví řat (kromě zvířat nalezených umíra ­
jících a/nebo zví řat utracených p řed ukončením studie) by m ěly být zbaveny 
všech přirostlých tkání a co nejd říve po pitv ě se ve vlhkém stavu zváží, aby 
nedošlo k vyschnutí. P ři ořezávání p řirostlých tkání z komplexu prostaty je 
třeba postupovat opatrn ě, aby se zabránilo propíchnutí semenných vá čků 
naplněných tekutinou. Nebo je možné semenné vá čky a prostatu od říznout 
a zvážit po fixaci.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Krom ě toho lze voliteln ě zvážit hned po sekci další dv ě tkáně, aby se 
zabránilo jejich vyschnutí, a to párové vaje čníky (vlhká hmotnost) 
a dělohu, včetně děložního hrdla (pokyny k odb ěru a přípravě děložních 
tkání k m ěření hmotnosti jsou uvedeny v OECD TG 440 (18)).  
42. Hmotnost štítné žlázy (volitelné) lze stanovit po fixaci. Od říznutí by se m ělo 
rovněž provádět velmi opatrn ě a teprve po fixaci, aby se zamezilo poškození 
tkáně. Poškození tkán ě by mohlo narušit histopatologickou analýzu.  
43. Následující tkán ě by se měly konzervovat v nejvhodn ějším fixačním médiu 
pro daný typ tkán ě a zamýšlené následné histopatologické vyšet ření (viz 
odstavec 47): všechny  makroskopicky viditelné léze, mozek (reprezentativní 
oblasti zahrnující hemisféry, moze ček a most),  mícha, oko, žaludek, tenké  
a tlusté st řevo (včetně Peyerových plát ů), játra, ledviny, nadledvinky,  
slezina, srdce, brzlík, štítná žláza, pr ůdušnice a plíce (konzervované napl ­
něním fixa čním roztokem a následným pono řením),  gonády (varlata  
a vaječníky), přídatné pohlavní orgány (d ěloha a hrdlo d ěložní, nadvarlata, 
prostata + semenné vá čky s Cowperovými žlázami),  vagina, mo čový 
měchýř, lymfatické uzliny (krom ě nejproximáln ější svodné uzliny by se 
měla odebrat ješt ě jedna uzlina dle laboratorních zkušeností (15)),  periferní  
nerv ( n. ischiadicus  nebo  n. tibialis ) přednostně v blízkosti svalu,  kosterní  
sval a kost, s  kostní dření (řez nebo čerstvý nát ěr z aspirované kostní d řeně). 
Doporučuje se fixovat varlata pono řením do Bouinova nebo modifikovaného 
Davidsonova fixa čního média (16), (17).  Tunica albuginea  se musí jemn ě 
a mělce propíchnout jehlou na obou koncích orgánu, aby se umožnilo rychlé 
proniknutí fixativa. Na základ ě klinických nebo jiných nález ů může být 
nezbytné zkoumat i další tkán ě. Konzervovat by se m ěly také všechny 
orgány považované na základ ě známých vlastností zkoušené chemické 
látky za možné cílové orgány.  
44. Následující tkán ě mohou poskytnout cenné sv ědectví o endokrinních ú čin­
cích: gonády (vaje čníky a varlata), p řídatné pohlavní orgány (d ěloha včetně 
děložního hrdla, nadvarlata, semenné vá čky s Cowperovými žlázami, dorzo ­
laterální a ventrální prostata), vagina, hypofýza, sam čí prsní žláza, štítná 
žláza a nadledvinka. Zm ěny na sam čích prsních žlázách nebyly dostate čně 
zdokumentovány, avšak tento parametr m ůže být velmi citlivý na látky 
s estrogenním p ůsobením. Pozorování orgán ů/tkání, které nejsou uvedeny 
v odstavci 43, jsou volitelná (viz dodatek 2).  
45. Pokyny k histopatologickému vyšet ření (19) podrobn ě popisují pitvu, fixaci, 
tvorbu řezů a histopatologické vyšet ření endokrinních tkání.  
46. V mezinárodním zkušebním programu byly získány ur čité důkazy, že mírné 
endokrinní ú činky chemických látek s nízkou ú činností ovliv ňující homeos ­
tázu pohlavních hormon ů lze identifikovat podle poruch synchronizace 
estrálního cyklu v r ůzných tkáních a v menší mí ře tolik na základ ě klinicky 
zřejmých histopatologických zm ěn samičích pohlavních orgán ů. Přestože 
pro tyto ú činky nebyl získán definitivní d ůkaz, doporu čuje se, aby se 
důkazy možné asynchronie estrálního cyklu vzaly v úvahu p ři interpretaci 
histopatologických nález ů na vaječnících (folikulární, thekální a granulózní 
buňky), děloze, hrdle d ěložním a vagin ě. Pokud se pomocí poševních st ěrů 
vyhodnotí také fáze cyklu, m ůže se do tohoto srovnání za řadit. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatologické vyšet ření 
47. U všech zví řat kontrolní skupiny a skupiny, které byla podána vysoká 
dávka, by se m ělo provést celkové histopatologické vyšet ření uchovaných 
orgánů a tkání. Toto vyšet ření by se m ělo rozšířit i na zví řata všech ostat ­
ních dávkových skupin, pokud jsou u skupiny s vysokou dávkou pozoro ­
vány změny orgánů vyvolané zkoušenou dávkou.  
48. Vyšet ří se všechny makroskopické léze.  
49. V p řípadě použití satelitní skupiny by se m ělo provést histopatologické 
vyšetření tkání a orgán ů, na kterých byly pozorovány ú činky 
u exponovaných skupin.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Údaje  
50. Měly by se uvést údaje pro každé jednotlivé zví ře. Navíc by m ěly být 
všechny údaje shrnuty do tabulky, p řičemž se uvede u každé experimentální 
skupiny po čet zvířat na začátku zkoušky, po čet zvířat nalezených uhynulých 
v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních d ůvodů a dobu úmrtí 
nebo utracení, po čet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, popis pozorova ­
ných toxických p říznaků, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého 
toxického ú činku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí, jejich závažnost 
a procento zví řat vykazujících jednotlivé typy léze.  
51. Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a obecně uznávanou statistickou metodou. Srovnáním ú činků v celém 
rozpětí dávkování by se m ělo zamezit použití mnohonásobných t-test ů. 
Statistické metody by se m ěly vybrat již p ři plánování studie.  
52. Za ú čelem kontroly jakosti se navrhuje, aby se shromáždily d řívější 
kontrolní údaje a vypo čítaly se koeficienty rozptylu pro číselné údaje, 
zejména pro parametry spojené s detekcí endokrinních disruptor ů. Tyto 
údaje pak lze použít pro ú čely srovnání p ři hodnocení stávajících studií.  
Protokol o zkoušce  
53. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená chemická látka:  
— fyzikální povaha, čistota a fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— identifika ční údaje.  
Nosič (je-li použit):  
— zdůvodnění výběru nosiče, pokud je jiný než voda.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— zdroj, podmínky chovu, krmivo atd.,  
— hmotnosti jednotlivých zví řat na začátku zkoušky,  
— zdůvodnění použití druhu, pokud je jiný než potkan.  
Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění výběru úrovně dávky,  
— podrobné údaje o použité form ě zkoušené chemické látky/úprav ě 
krmiva, o dosažené koncentraci, stabilit ě a homogenit ě přípravku,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,  
— popřípadě přepočet koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné 
vodě (ppm) na skute čnou denní dávku (mg/kg t ělesné hmotnosti/den),  
— podrobné údaje o kvalit ě krmiva a vody.  
Volitelné zkoumané cílové parametry  
— seznam volitelných zkoumaných cílových parametr ů. 
Výsledky:  
— tělesná hmotnost a zm ěny tělesné hmotnosti,  
— spotřeba krmiva, pop řípadě spotřeba vody,  
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovn ě dávky, v četně 
příznaků toxicity,  
— povaha, závažnost a trvání klinických projev ů (ať vratných, či nevrat­
ných),  
— posouzení reaktivity na smyslové podn ěty, úchopové síly a motorické 
aktivity,  
— hematologická vyšet ření s příslušnými základními hodnotami (normami),  
— klinická biochemická vyšet ření s příslušnými výchozími hodnotami (nor ­
mami),  
— tělesná hmotnost p ři utracení a údaje o hmotnosti orgán ů, 
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— údaje o absorpci, jsou-li dostupné,  
— popřípadě statistické zpracování výsledk ů. 
Diskuse o výsledcích.  
Závěry. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Androgenicita  je schopnost chemické látky p ůsobit v organismu savc ů jako 
přirozený androgenní hormon (nap ř. testosteron).  
Antiandrogenicita  je schopnost chemické látky potla čit v organismu savc ů půso­
bení přirozeného androgenního hormonu (nap ř. testosteronu).  
Antiestrogenicita  je schopnost chemické látky potla čit v organismu savc ů půso­
bení přirozeného estrogenního hormonu (nap ř. estradiolu 17ß).  
Antityreoidální p ůsobení  je schopnost chemické látky potla čit v organismu 
savců působení přirozeného hormonu štítné žlázy (nap ř. T 3 ). 
Dávkování  je obecný termín zahrnující dávku, její četnost a trvání podávání 
látky.  
Dávka  je podávané množství zkoušené chemické látky. Dávka se vyjad řuje jako 
hmotnost zkoušené chemické látky na jednotku t ělesné hmotnosti zví řete za den 
(např. mg/kg t ělesné hmotnosti/den) nebo jako konstantní koncentrace v krmivu.  
Zřejmá toxicita  je obecný termín popisující jasné p říznaky toxicity po podání 
zkoušené chemické látky. Ty by m ěly být dosta čující pro posouzení nebezpe č­
nosti a m ěly by být takové, že p ři zvýšení podávané dávky lze o čekávat rozvoj 
závažných toxických p říznaků a pravděpodobnou mortalitu.  
NOAEL  je zkratka pro angl. „no-observed-adverse-effect level“. Je to nejvyšší 
úroveň dávky, p ři které nejsou pozorovány žádné nep říznivé účinky spojené se 
zkouškou.  
Estrogenicita  je schopnost chemické látky p ůsobit v organismu savc ů jako 
přirozený estrogenní hormon (nap ř. estradiolu 17ß).  
Zkoušená chemická látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  
Tyreoidální p ůsobení  je schopnost chemické látky p ůsobit jako p řirozený 
hormon štítné žlázy (nap ř. T 3 ) v savčím organismu.  
Validace  je vědecký postup ur čený k charakterizaci provozních požadavk ů 
a omezení zkušební metody a k prokázání její spolehlivosti a relevantnosti pro 
konkrétní ú čel. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Dodatek 2  
Cílové parametry doporu čené k detekci endokrinních disruptor ů (ED) v této 
zkušební metod ě B.7  
Povinné cílové parametry Volitelné cílové parametry 
Hmotnost  
— varlata 
— nadvarlata 
— nadledvinky 
— prostata a semenné vá čky 
s Cowperovými žlázami — vaječníky 
— děloha včetně hrdla děložního 
— štítná žláza  
Histopatologické vyšet ření 
— gonády: 
— varlata a — vaječníky 
— přídatné pohlavní orgány: 
— nadvarlata — prostata a semenné vá čky 
s Cowperovými žlázami 
— děloha včetně hrdla děložního 
— nadledvinky — štítná žláza 
— pochva — poševní st ěry 
— samčí prsní žlázy 
— hypofýza
 
Měření hormon ů 
— hladiny cirkulujícího T3 a T4 
— hladina cirkulujícího TSH  
LITERATURA:  
1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuroto ­
xicity.  
2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.  
5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
 
8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
11) OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_ 1_1_1_37407,00.html
 
12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endoc ­
rine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7.  
15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404-407.  
16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
 
17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of 
testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
 
18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endoc ­
rine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8 SUBAKUTNÍ INHALA ČNÍ TOXICITA: 28DENNÍ STUDIE  
SHRNUTÍ  
Tato revidovaná zkušební metoda B.8 byla navržena s cílem pln ě charakterizovat 
inhalační toxicitu zkoušené chemické látky po opakované expozici po omezené 
časové období (28 dn ů) a získat údaje pro kvantitativní posouzení rizik inhalace. 
Skupiny alespo ň 5 samců a 5 samic hlodavc ů se vystaví 6 hodin denn ě po dobu 
28 dnů a) zkoušené chemické látce na t řech nebo více úrovních koncentrace, b) 
filtrovanému vzduchu (negativní kontrola) a/nebo c) nosi či (kontrola s nosi čem). 
Zvířata jsou obvykle exponována 5 dn ů v týdnu, avšak expozice po 7 dn ů 
v týdnu je rovn ěž povolena. Zkouška se vždy provádí se samci i samicemi, 
avšak jednotlivá pohlaví mohou být vystavena odlišným úrovním koncentrace, pokud je známo, že je jedno pohlaví citliv ější vůči dané zkušební chemické látce. 
Tato metoda poskytuje vedoucímu studie možnost za řadit do zkoušky satelitní 
skupiny (k sledování vratnosti), bronchoalveolární laváž (BAL), neurologické testy a další klinická patologická a histopatologická vyšet ření za účelem lepší 
charakterizace toxicity zkoušené chemické látky.
 
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení 412 (2009). 
Původní Pokyny pro zkoušení 412 (TG 412) pro subakutní inhala ční toxi­
citu byly schváleny v roce 1981 (1). Tato zkušební metoda B.8 (odpovída ­
jící revidovaným pokyn ům TG 412) byla aktualizována tak, aby odrážela 
stav vědeckého poznání a napl ňovala stávající a budoucí regula ční potřeby. 
2. Tato metoda umož ňuje charakterizaci nep říznivých ú činků po opakované 
denní inhala ční expozici zkoušené chemické látce po dobu 28 dn ů. Údaje 
získané z 28denních studií subakutní inhala ční toxicity lze použít ke kvan ­
titativnímu posouzení rizik (pokud se po ní neprovádí 90denní studie 
subchronické inhala ční toxicity (Kapitola B.29 této p řílohy)). Tyto údaje 
mohou rovn ěž poskytovat informace pro výb ěr koncentrací pro dlouhodo ­
bější studie, jako je 90denní studie subchronické inhala ční toxicity. Tato 
zkušební metoda není speciáln ě určena pro zkoušky nanomateriál ů. Definice 
použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této 
kapitoly a v Pokynech GD 39 (2).  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
3. Před zahájením této studie by m ěla laborato ř provádějící zkoušky vzít 
v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby se zvýšila kvalita studie a minimalizovalo použití zví řat. Mezi informace, 
které usnad ňují výběr vhodných zkušebních koncentrací, pat ří identita zkou ­ 
šené chemické látky, její chemická struktura a fyzikáln ě-chemické vlastnosti, 
výsledky jakýchkoli test ů toxicity in vitro nebo in vivo, p ředpokládaná 
použití a možnost expozice lidí, dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o strukturn ě příbuzných látkách a údaje odvozené ze zkoušek akutní 
inhalační toxicity. O čekává-li se nebo je-li v pr ůběhu studie pozorována 
neurotoxicita, m ůže se vedoucí studie rozhodnout za řadit vhodná vyšet ření, 
například funk ční pozorovací baterii (functional observational battery, FOB) 
a měření motorické aktivity. P řestože na časování expozic s ohledem na 
konkrétní vyšet ření může být velmi d ůležité, nem ělo by provád ění těchto 
doplňkových činností narušovat základní plán studie.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Roztoky žíravých nebo dráždivých zkoušených chemických látek lze 
testovat p ři koncentracích, které povedou k požadovanému stupni toxicity 
[viz GD 39 (2)]. P ři vystavování zví řat těmto materiál ům by však m ěly být 
cílové koncentrace dostate čně nízké, aby nezp ůsobily výraznou bolest 
a utrpení, zárove ň by však m ěly být dosta čující k prodloužení k řivky 
závislosti odezvy na koncentraci k hodnotám, které umožní splnit regula ční 
a vědecký účel této zkoušky. Tyto koncentrace by se m ěly volit individuáln ě 
případ od p řípadu, nejlépe na základ ě výsledků vhodně navržené studie ke 
stanovení dávkování, která poskytuje informace o kritickém cílovém para ­
metru, prahu dráždivosti a dob ě nástupu ú činků (viz odstavce 11–13). M ělo 
by se uvést zd ůvodnění výběru dané koncentrace.  
5. Umírající zví řata nebo zví řata, která o čividně trpí bolestí nebo vykazují 
známky závažného a p řetrvávajícího stresu by se m ěla humánním zp ůsobem 
utratit. Umírající zví řata se posuzují stejným zp ůsobem jako zví řata, která 
při zkoušce uhynou. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo 
značně trpících zví řat a pokyny týkající se rozpoznání p ředvídatelného 
nebo blížícího se uhynutí jsou p ředmětem Pokyn ů OECD o humánních 
cílových parametrech (3).  
POPIS METODY  
Výběr zvířecích druh ů 
6. Měli by se použít mladí zdraví dosp ělí hlodavci b ěžně používaných 
laboratorních kmen ů. Nejvhodn ějším druhem je potkan. Pokud se použijí 
jiné druhy, m ělo by se uvést od ůvodnění. 
Příprava zví řat 
7. Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. V den randomizace by m ělo jít 
o mladé dosp ělé jedince staré 7 až 9 týdn ů. Tělesná hmotnost by se m ěla 
pohybovat v rozmezí ± 20 % pr ůměrné hmotnosti u každého pohlaví. 
Zvířata se náhodn ě vyberou, ozna čí pro pot řeby individuální identifikace 
a umístí do klecí nejmén ě 5 dnů před začátkem zkoušky, aby si mohla 
zvyknout na laboratorní podmínky.  
Zvířecí chov  
8. Zvířata by m ěla být individuáln ě označena, nejlépe pomocí subkutánních 
transpondér ů, aby se usnadnila pozorování a zamezilo zám ěně. Teplota 
zkušební místnosti, v níž se uchovávají zví řata, by m ěla být 22 ± 3 °C. 
Relativní vlhkost by se m ěla udržovat optimáln ě v rozmezí 30 až 70 %, 
ačkoliv to nemusí být proveditelné, používá-li se jako nosi č voda. P řed 
expozicí a po ní by se m ěla zvířata držet v klecích rozd ělena do skupin 
podle pohlaví a koncentrace, avšak po čet zvířat v jedné kleci by nem ěl 
bránit jasnému pozorování každého zví řete a měl by minimalizovat ztráty 
v důsledku kanibalismu nebo boj ů. Jsou-li zví řata vystavena látce pouze 
nazální cestou, m ůže být nutné nechat je zvyknout si na zkumavky omezu ­
jící pohyb. Zkumavky by nem ěly zvířatům způsobovat p řílišný fyzický, 
termální nebo imobiliza ční stres. Omezení m ůže ovlivnit fyziologické cílové 
parametry, jako je t ělesná teplota (hypertermie) a/nebo respira ční objem za 
minutu. Jsou-li k dispozici obecné údaje, které prokazují, že k takovým změnám nedochází ve zna čné míře, není předběžná adaptace na zkumavky 
omezující pohyb nutná. Zví řata, jež jsou vystavena aerosolu celým t ělem, by 
se měla držet b ěhem expozice odd ěleně, aby se zabránilo pronikání zkou ­ 
šeného aerosolu z jejich t ěla do srsti ostatních zví řat v kleci. Mohou se 
používat konven ční a certifikovaná laboratorní krmiva, krom ě období expo ­
zice, podávaná s neomezeným množstvím pitné vody z vodovodu. Osv ětlení 
by mělo být um ělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalační komory  
9. Při výběru inhalační komory by se m ěla zvážit povaha zkoušené chemické 
látky a cíl zkoušky. Up řednostňuje se expozice pouze nazální cestou (p ři­ 
čemž tento termín zahrnuje i expozici hlavy, nosu a tlamy) Expozice pouze 
nazální cestou se obecn ě upřednostňuje u studií kapalných nebo pevných 
aerosolů a par, které mohou kondenzací vytvá řet aerosoly. Speciálních cíl ů 
studie lze snáze dosáhnout, použije-li se celot ělová expozice, avšak tato 
skutečnost by se m ěla zdůvodnit ve zpráv ě o studii. Pro zajišt ění stability 
atmosféry v komo ře pro celot ělovou expozici by nem ěl celkový objem 
zaplněný pokusnými zví řaty přesáhnout 5 % objemu komory. Principy tech ­
niky expozice pouze nazální cestou a celot ělové expozice a jejich konkrétní 
výhody a nevýhody jsou popsány v dokumentu GD 39 (2).  
STUDIE TOXICITY  
Mezní koncentrace  
10. Na rozdíl od akutních studií nejsou v 28denních studiích subakutní inhala ční 
toxicity žádné definované mezní koncentrace. Maximální zkoušená koncent ­
race by m ěla zohledňovat: 1) maximální dosažitelnou koncentraci, 2) úrove ň 
expozice člověka v „nejhorším p řípadě“, 3) potřebu udržet dostate čný přívod 
kyslíku a/nebo 4) dobré životní podmínky zví řat. Chybí-li mezní hodnoty 
založené na skute čných údajích, mohou se použít akutní limity 
z nařízení (ES) č. 1272/2008 (13) (tj. maximáln ě 5 mg/l pro aerosoly, 20 
mg/l pro páry a 20 000 ppm pro plyny), viz GD 39 (2). Pokud je p ři 
zkouškách plyn ů nebo vysoce t ěkavých chemických látek (nap ř. chladicí 
prostředky) pot řeba tyto limity p řekročit, mělo by se uvést zd ůvodnění. 
Z mezní koncentrace by m ělo být možné odvodit jednozna čnou toxicitu 
bez toho, aby byly zví řata vystavena nadm ěrnému stresu nebo aby byla 
ovlivněna délka jejich života.  
Studie k stanovení rozsahu  
11. Před zahájením hlavní studie m ůže být nutné provést studii k stanovení 
rozsahu. Studie k stanovení rozsahu je komplexn ější než orienta ční studie, 
protože není omezená na výb ěr koncentrace. Poznatky získané ve studii 
k stanovení rozsahu mohou vést k úsp ěšné hlavní studii. Studie 
k stanovení rozsahu m ůže například poskytnout technické informace týkající 
se analytických metod, velikosti částic, odhalení toxických mechanism ů, 
klinické patologie a histopatologických údaj ů a odhady koncentrací 
NOAEL a MTC v hlavní studii. Vedoucí studie se m ůže rozhodnout použít 
studii ke stanovení rozsahu pro ur čení prahové hodnoty pro podrážd ění 
dýchacích cest (nap ř. pomocí histopatologického vyšet ření dýchacích cest, 
zkoušení plicních funkcí nebo bronchoalveolární laváže), horní hranice 
koncentrace, kterou zví řata snáší bez nadm ěrného stresu, a parametr ů, 
které budou nejlépe charakterizovat toxicitu zkoušené chemické látky.  
12. Studie ke stanovení rozsahu m ůže obsahovat jednu nebo více úrovní 
koncentrace. Každé úrovni koncentrace by se m ěli vystavit maximáln ě tři 
samci a t ři samice. Studie ke stanovení rozsahu by m ěla trvat minimáln ě 5 
dní a obvykle ne déle než 14 dní. Ve zpráv ě o studii by se m ělo uvést 
zdůvodnění výběru koncentrací pro hlavní studii. Cílem hlavní studie je 
ukázat vztah mezi koncentrací a odezvou založený na p ředpokládaném 
nejcitlivějším cílovém parametru. Nízká koncentrace by m ěla být 
v ideálním p řípadě koncentrace, p ři níž nejsou pozorovány nep říznivé 
účinky, zatímco z vysoké koncentrace by m ělo být možné odvodit jedno ­
značnou toxicitu, aniž by se zví řatům způsobil nadm ěrný stres nebo se 
ovlivnila délka jejich života (3).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Při výběru úrovní koncentrace pro studii k stanovení rozsahu by se m ěly 
zvážit veškeré dostupné informace, v četně vztahů mezi strukturou 
a aktivitou a údaj ů o podobných chemických látkách (viz odstavec 3). 
Studie ke stanovení rozsahu m ůže potvrdit/vyvrátit cílové parametry, které 
se považují z mechanistického hlediska za nejvíce citlivé, nap ř. inhibice 
cholinesterázy organickými fosfáty, tvorba methemoglobinu v d ůsledku 
erytrocytotoxických látek, hormony štítné žlázy (T  3 , T 4 ) u tyreotoxických 
látek, bílkoviny, LDH nebo neutrofily v bronchoalveolární laváži u neškodných špatn ě rozpustných částic nebo aerosol ů dráždících plíce.
 
Hlavní studie  
14. Hlavní studie subakutní toxicity se obvykle skládá ze t ří úrovní koncentrace 
a rovněž zahrnuje soub ěžné negativní kontroly (se vzduchem) a/nebo dle 
potřeby kontroly s nosi čem (viz odstavec 17). P ři výběru vhodných úrovní 
expozice je t řeba použít veškeré dostupné údaje, v četně výsledků studií 
systémové toxicity, metabolismu a kinetiky (zvláštní d ůraz by se m ěl 
klást na vylou čení vysokých úrovní koncentrace, které saturují kinetické 
procesy). Každá experimentální skupina obsahuje alespo ň 10 hlodavc ů (5 
samců a 5 samic), kte ří jsou vystaveni zkoušené chemické látce každý den 6 
hodin 5 dn ů v týdnu po dobu 4 týdn ů (celková doba trvání studie je 28 dní). 
Zvířata lze rovn ěž vystavit látce 7 dní v týdnu (nap ř. při zkouškách inha ­
lačních farmaceutik). Je-li známo, že je jedno pohlaví v ůči dané zkoušené 
chemické látce citliv ější, je možné vystavit jednotlivá pohlaví odlišným 
úrovním koncentrace, aby se optimalizoval vztah mezi koncentrací a odezvou, jak popisuje odstavec 15. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou 
použity jiné druhy hlodavc ů než potkani, je možno upravit maximální doby 
expozice za ú čelem minimalizace druhov ě specifického utrpení. Použije-li se 
doba expozice kratší než 6 hodin/den nebo pokud je t řeba provést studii 
celotělové expozice s dlouhou dobou expozice (nap ř. 22 hodin/den), m ělo 
by se uvést zd ůvodnění [viz GD 39 (2)]. B ěhem expozice by se m ělo 
pozastavit krmení zví řat, jestliže doba expozice nep řesahuje 6 hodin. 
Během celot ělové expozice je možno zví řatům podávat vodu.  
15. Zvolené cílové koncentrace by m ěly vést k identifikaci cílového orgánu 
(cílových orgán ů) a ukázat jasný vztah mezi koncentrací a odezvou:  
— Vysoká úrove ň koncentrace by m ěla mít toxické ú činky, avšak nem ěla 
by způsobovat trvalé následky či letalitu, které by zabránily smyslu ­
plnému vyhodnocení.  
— Střední úrovn ě koncentrací mezi mezními hodnotami by m ěly odstup ­ 
ňovány, aby se toxické ú činky zvyšovaly od nízké po vysokou koncen ­
traci.  
— Nízká úrove ň koncentrace by m ěla vyvolat malé nebo žádné p říznaky 
toxicity.  
Satelitní studie (k sledování vratnosti)  
16. Satelitní studii (ke sledování vratnosti) je možné použít k pozorování vrat ­
nosti, přetrvávání nebo opožd ěného nástupu toxicity b ěhem dostate čně dlou­
hého období po expozici, nejmén ě však po 14 dn ů. Skupiny v satelitní studii 
(ke sledování vratnosti) jsou složeny z p ěti samců a pěti samic a jsou látce 
vystaveny sou časně s pokusnými zví řaty v hlavní studii. Skupiny v satelitní 
studii (ke sledování vratnosti) by se m ěly vystavit nejvyšší úrovni koncent ­
race zkoušené chemické látky a m ěly by se použít soub ěžné kontroly se 
vzduchem a/nebo s nosi čem, dle pot řeby (viz odstavec 17).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Kontrolní zví řata 
17. Se zví řaty v soub ěžné negativní (vzduch) kontrolní skupin ě by se m ělo 
zacházet stejným zp ůsobem jako se zví řaty v experimentální skupin ě až 
na to, že se namísto zkoušené chemické látce vystaví filtrovanému vzduchu. 
Pokud se ke generování zkušební atmosféry používá také voda nebo jiná 
látka, měla by se do studie namísto negativní kontroly se vzduchem za řadit 
kontrolní skupina s nosi čem. Kdykoli je to možné, m ěla by se jako nosi č 
použít voda. Použije-li se jako nosi č voda, m ěla by se kontrolní zví řata 
vystavit vzduchu o stejné relativní vlhkosti jako experimentální skupiny. 
Výběr vhodného nosi če by se m ěl zakládat na vhodn ě provedené p ředběžné 
studii nebo na historických údajích. Není-li toxicita nosi če dobře známa, 
může se vedoucí studie rozhodnout použít jak negativní kontrolu (vzduch), 
tak kontrolu s nosi čem, ale takový postup se rozhodn ě nedoporu čuje. Jest­
liže historické údaje ukážou, že nosi č není toxický, není t řeba používat 
negativní (vzduch) kontrolní skupinu a m ěla by se použít pouze kontrolní 
skupina s nosi čem. Jestliže p ředběžná studie zkoušené chemické látky 
formulované na nosi či neodhalí žádnou toxicitu, vyplývá z toho, že nosi č 
je při zkoušené koncentraci netoxický a m ěla by se použít tato kontrola 
s nosičem. 
PODMÍNKY EXPOZICE  
Podávání koncentrací  
18. Zvířata jsou vystavena zkoušené chemické látce ve form ě plynu, páry, aero ­
solu nebo jejich sm ěsi. Skupenství látky, které se má zkoušet, závisí na 
fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, zvolené 
koncentraci a/nebo fyzické form ě, v níž se bude zkoušená chemická látka 
s největší pravděpodobností nacházet p ři manipulaci a používání. Hygros ­
kopické a chemicky reaktivní zkoušené chemické látky by se m ěly zkoušet 
v podmínkách suchého vzduchu. Je t řeba pečlivě zabránit vzniku exploziv ­
ních koncentrací. Materiál složený z částic je možno podrobit mechanickým 
postupům na snížení velikosti částic. Další pokyny jsou uvedeny 
v dokumentu GD 39 (2).  
Distribuce velikosti částic  
19. U všech aerosol ů a par, které mohou kondenzací vytvo řit aerosoly, by se 
mělo provést stanovení rozm ěrů částic. Aby byla možná expozice všech 
důležitých částí dýchací soustavy, doporu čují se aerosoly s hodnotami hmot ­
nostního mediánu aerodynamického pr ůměru (MMAD) v rozmezí 1 až 3 μm 
a s geometrickou sm ěrodatnou odchylkou ( σ g ) v rozmezí 1,5 až 3,0 (4). 
Přestože by se m ělo vynaložit dostate čné úsilí k spln ění této normy, není-li 
to možné, je t řeba předložit odborný posudek. Nap říklad částice kovových 
výparů mohou být menší, než je tato norma, a nabité částice a vlákna ji 
mohou překračovat.  
Příprava zkoušené chemické látky na nosi či 
20. V ideálním p řípadě by se měla zkoušená chemická látka testovat bez nosi če. 
Jestliže je nutno použít nosi č k získání vhodné koncentrace a velikosti částic 
zkoušené chemické látky, m ěla by se p řednostně použít voda. Kdykoli je 
zkoušená chemická látka v tomto nosi či rozpuštěna, měla by se prokázat její 
stabilita.  
MONITOROVÁNÍ PODMÍNEK EXPOZICE  
Proudění vzduchu komorou  
21. Proud ění vzduchu expozi ční komorou by se m ělo při každé expozici pe člivě 
kontrolovat, neustále monitorovat a zaznamenávat alespo ň v hodinových 
intervalech. Monitorování koncentrace (nebo stability) látky ve zkušební atmosféře je nedílnou sou částí měření všech dynamických parametr ů 
a poskytuje nep římý prost ředek ke kontrole všech d ůležitých dynamických 
inhalačních parametr ů. Monitoruje-li se koncentrace v reálném čase, je
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
možno snížit frekvenci m ěření průtoku vzduchu komorou na jediné m ěření 
pro každou expozici za den. Zvláštní pozornost je t řeba věnovat tomu, aby 
se zamezilo op ětovnému vdechování látky v komorách s nazální cestou 
expozice. Koncentrace kyslíku by m ěla být alespo ň 19 % a koncentrace 
oxidu uhli čitého by nem ěla přesáhnout 1 %. Existuje-li d ůvod se domnívat, 
že tyto normy nelze splnit, m ěly by se koncentrace kyslíku a oxidu uhli či­
tého měřit. Jestliže m ěření v první den expozice ukážou, že jsou úrovn ě 
těchto plyn ů správné, není t řeba další m ěření provád ět. 
Teplota a relativní vlhkost v komo ře 
22. Teplota v komo ře by se m ěla udržovat na 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost 
v dýchací zón ě zvířat, jak při expozici pouze nazální cestou, tak p ři celo­
tělové expozici, by se m ěla nepřetržitě sledovat a zaznamenávat pokud 
možno nejmén ě v hodinových intervalech b ěhem každé expozice. Relativní 
vlhkost by se m ěla udržovat nejlépe v rozmezí 30 až 70 %, to však m ůže 
být neproveditelné (nap ř. při zkoušení sm ěsí na bázi vody) nebo obtížn ě 
měřitelné v d ůsledku interference zkoušené chemické látky se zkušební 
metodou.  
Zkoušená chemická látka: Nominální koncentrace  
23. Je-li to možné, m ěla by se vypo čítat a zaznamenat nominální koncentrace 
zkoušené chemické látky v expozi ční komoře. Nominální koncentrace je 
hmotnost generované zkoušené chemické látky vyd ělená celkovým 
objemem vzduchu procházejícím systémem inhala ční komory. Nominální 
koncentrace se nepoužívá k charakterizaci expozice zví řat, avšak porovnání 
nominální koncentrace a skute čné koncentrace je ukazatelem výkonnosti 
zkušebního systému p ři generování zkušební atmosféry, a tudíž ji lze použít 
k odhalení problém ů při generování.  
Zkoušená chemická látka: Skute čná koncentrace  
24. Skute čná koncentrace je koncentrace zkoušené chemické látky ve vzorcích 
odebraných v dýchací zón ě zvířat v inhala ční komoře. Skutečné koncentrace 
lze změřit specifickými metodami (nap ř. přímý odběr vzorků, adsorpční 
metody nebo metody založené na chemické reakci a následná analytická charakterizace) nebo nespecifickými metodami, jako je vážková analýza (gravimetrie). Použití gravimetrie je p řípustné pouze u práškových aerosol ů 
obsahujících jedinou složku nebo u aerosol ů z kapalin s nízkou t ěkavostí 
a mělo by se podložit p říslušnou specifickou charakterizací zkoušené 
chemické látky p řed provedením studie. Koncentraci práškového aerosolu 
sestávajícího z více složek lze rovn ěž stanovit gravimetricky. Vyžaduje to 
však analytické údaje, které prokazují, že složení materiálu rozptýleného ve 
vzduchu je podobné složení výchozího materiálu. Nejsou-li tyto informace k dispozici, je b ěhem studie nutné provád ět v pravidelných intervalech 
opakovanou analýzu zkoušené chemické látky (ideáln ě ve vzdušné form ě). 
U látek v aerosolové form ě, které se mohou vypa řovat nebo sublimovat, by 
se mělo prokázat, že byly vybranou metodou zachyceny všechny fáze.
 
25. Během celé studie by se m ěla používat pokud možno jedna šarže zkoušené 
chemické látky a zkoušený vzorek by se m ěl uchovávat za takových 
podmínek, aby z ůstal čistý, homogenní a stabilní. P řed zahájením studie 
by se měla provést charakterizace zkoušené chemické látky, v četně určení 
její čistoty a je-li to technicky proveditelné, její identity a množství identi ­
fikovaných p říměsí a nečistot. Prokázat to lze mimo jiné t ěmito údaji: 
retenční čas a relativní plocha píku, molekulová hmotnost z hmotnostní 
spektroskopie nebo plynové chromatografie nebo jiné odhady. P řestože 
určení identity zkoušeného vzorku není povinností laborato ře provád ějící 
zkoušku, je vhodné alespo ň do určité míry ov ěřit popis látky poskytnutý 
zadavatelem (nap ř. barvu, fyzikální vlastnosti atp.).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Dle možností by se m ěla udržovat konstantní expozi ční atmosféra. 
K prokázání stability podmínek expozice lze použít p řístroj pro sledování 
v reálném čase, například fotometr pro aerosoly nebo analyzátor celkových 
uhlovodík ů pro páry. Skute čné koncentrace v komo ře by se m ěly měřit 
alespoň třikrát během každého dne expozice a pro každou úrove ň expozice. 
Není-li to v d ůsledku omezené rychlosti proud ění vzduchu nebo nízké 
koncentrace možné, je p řípustné použít jeden vzorek pro každé období 
expozice. V ideálním p řípadě by se m ěl tento vzorek odebírat po celou 
dobu expozice. Jednotlivé vzorky k stanovení koncentrace v komo ře by 
se neměly lišit od pr ůměrné hodnoty koncentrace v komo ře o více než 
± 10 % u plyn ů a par a o více než ± 20 % u kapalných nebo pevných 
aerosolů. Měla by se vypo čítat a zaznamenat doba pot řebná k dosažení 
rovnovážného stavu v komo ře (t  95 ). Doba expozice zahrnuje i dobu, 
během níž je zkoušená chemická látka generována. Bere se p ři tom 
v úvahu doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v komo ře (t  95 ) 
a doba rozpadu. Pokyny k výpo čtu t  95 naleznete v dokumentu GD 39 (2).  
27. U vysoce komplexních sm ěsí složených z plyn ů/par a aerosol ů (např. atmo­
sféry obsahující produkty spalování a zkoušené chemické látky vyst řikované 
z účelových výrobk ů/zařízení pro koncové použití) se m ůže každá fáze 
chovat v inhala ční komoře jinak. Proto by se pro každou fázi (plyn/pára 
a aerosol) m ěla zvolit alespo ň jedna indika ční látka (analyt), obvykle hlavní 
účinná látka ve sm ěsi. Je-li zkoušená chemická látka sm ěsí, měla by se 
uvést analytická koncentrace celkové sm ěsi, a nikoliv pouze ú činné látky 
nebo indika ční látky (analytu). Další informace týkající se skute čných 
koncentrací naleznete v dokumentu GD 39 (2).  
Zkoušená chemická látka: Distribuce velikosti částic  
28. Distribuce velikosti částic aerosol ů by se měla stanovit alespo ň jednou týdn ě 
pro každou úrove ň koncentrace pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného 
přístroje, nap ř. aerodynamického spektrometru částic (APS). Je-li možno 
prokázat shodu výsledk ů získaných pomocí kaskádového impaktoru 
a jiného p řístroje, m ůže se tento jiný p řístroj používat v pr ůběhu celé studie.  
29. Krom ě primárního p řístroje by se m ěl použít ješt ě druhý p řístroj, nap ř. 
gravimetrický filtr nebo impinger/plynová promýva čka, k ověření účinnosti 
záchytu primárním p řístrojem. Hmotnostní koncentrace získaná analýzou 
velikosti částic by m ěla ležet v p řiměřeném rozmezí hmotnostní koncentrace 
získané vážkovou analýzou [viz dokument GD 39 (2)]. Je-li možno v časné 
fázi studie prokázat u veškerých zkoušených koncentrací jejich rovnocen ­
nost, lze od dalších potvrzujících m ěření upustit. Z d ůvodu zajišt ění dobrých 
životních podmínek zví řat by se m ěly podniknout kroky k minimalizaci 
neprůkazných údaj ů, které mohou vést k nutnosti opakovat studii.  
30. U par by se m ělo provést m ěření velikosti částic, pokud existuje možnost, že 
kondenzace páry povede ke vzniku aerosolu nebo pokud jsou v parách detekovány částice s potenciálem pro tvorbu smíšených fází.
 
POZOROVÁNÍ  
31. Zvířata by se m ěla klinicky sledovat p řed expozicí, b ěhem expozice i po 
expozici. Mohou být nutná častější pozorování v závislosti na reakci zví řat 
během expozice. Je-li pozorování zví řat znemožn ěno použitím zkumavek 
omezujících pohyb zví řat, špatným osv ětlením v komorách pro celot ělovou 
expozici nebo nepr ůhlednou atmosférou, m ěla by se zví řata pečlivě pozo­
rovat po expozici. Pozorování p řed následujícím dnem expozice mohou vést 
k vyhodnocení p řípadné reverzibility nebo exacerbace toxických ú činků. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Všechna sledování se zaznamenávají, p řičemž záznamy se vedou pro každé 
zvíře zvlášť. Pokud jsou zví řata z humánních d ůvodů utracena nebo je 
zjištěn jejich úhyn, je t řeba dobu uhynutí zaznamenat co nejp řesněji. 
33. Pozorování v kleci by se m ěla zaměřit na změny kůže, srsti, o čí, sliznic, 
a rovněž na zm ěny dýchání, krevního ob ěhu, změny funkce nervové 
soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Je t řeba pozorn ě sledovat, 
zde se neobjeví tremor, k řeče, slinění, průjmy, letargie, spánek a kóma. 
Měření rektální teploty m ůže poskytnout podp ůrné důkazy pro reflexní 
bradypnoe nebo hypo/hypertermii spojenou s expozicí nebo držením 
v kleci. Do protokolu studie je možno zahrnout dopl ňující vyšet ření, napří­
klad kinetiku, biomonitoring, plicní funkce, zadržování špatn ě rozpustných 
materiálů, které se hromadí v plicní tkáni a zm ěny v chování.  
TĚLESNÉ HMOTNOSTI  
34. Tělesná hmotnost jednotlivých zví řat by se m ěla zaznamenat krátce p řed 
první expozicí (den 0), poté dvakrát týdn ě (například každý pátek a pond ělí, 
aby se prokázalo zotavení po víkendu bez expozice, nebo v takovém časovém intervalu, který umož ňuje posouzení systémové toxicity) a v čase 
uhynutí nebo utracení. Pokud se b ěhem prvních 2 týdn ů neobjeví žádné 
účinky na t ělesnou hmotnost, lze ji po zbytek studie m ěřit pouze jednou 
týdně. Zvířata v satelitní skupin ě (sledování reverzibility) (jsou-li použita) 
by se měla nadále vážit jednou týdn ě po celé období zotavování. Na konci 
studie by se m ěla všechna zví řata krátce p řed utracením zvážit, aby bylo 
možno provést nezkreslený výpo čet podílů hmotnosti orgán ů vůči tělesné 
hmotnosti.
 
SPOTŘEBA KRMIVA A VODY  
35. Spot řeba krmiva by se m ěla měřit jednou týdn ě. Rovněž by se m ěla měřit 
spotřeba vody.  
KLINICKÁ PATOLOGIE  
36. Klinická patologická vyšet ření by se m ěla provést u všech zví řat, včetně 
zvířat v kontrolní a satelitní (sledování reverzibility) skupin ě, když jsou 
utracena. M ěl by se zaznamenat časový interval mezi koncem expozice 
a odběrem krve, zejména pokud je obnova p říslušného cílového parametru 
rychlá. Odb ěr vzorků po ukon čení expozice je indikován pro parametry 
s krátkým elimina čním poločasem v plazm ě (např. COHb, CHE a MetHb).  
37. Tabulka 1 uvádí klinické patologické parametry, které jsou obvykle vyžado ­
vány ve všech toxikologických studiích. Analýza mo či se běžně nevyžaduje, 
může se však provést, pokud se to považuje za vhodné na základ ě očeká­
vané nebo pozorované toxicity. Vedoucí studie se m ůže rozhodnout vyšet řit 
další parametry k lepší charakterizaci toxicity zkoušené chemické látky (např. cholinesteráza, lipidy, hormony, acidobazická rovnováha, methemo ­
globin nebo Heinzova t ělíska, kreatinkináza, pom ěr myeloidní/erythroidní 
buňky, troponiny, vyšet ření krevních plyn ů, laktátdehydrogenáza, sorbitol ­
dehydrogenáza, glutamátdehydrogenáza a gamaglutamyltranspeptidáza).
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabulka 1  
Standardní klinické patologické parametry  
Hematologická vyšet ření 
počet erytrocyt ů 
hematokrit 
koncentrace hemoglobinu 
průměrné množství hemoglobinu 
v erytrocytu 
střední objem erytrocytu 
průměrná koncentrace hemoglobinu 
v erytrocytu 
retikulocyty celkový po čet leukocyt ů 
diferenciální rozpo čet leukocyt ů 
počet trombocyt ů 
srážlivost (vyberte jednu 
z možností): 
— protrombinový čas 
— koagula ční čas 
— parciální tromboplastinový 
čas 
Klinická biochemická vyšet ření 
glukóza (*) 
celkový cholesterol 
triglyceridy 
močovinový dusík v krvi 
celkový bilirubin 
kreatinin 
celkový obsah protein ů 
albuminy globuliny alaninaminotransferáza 
aspartátaminotransferáza 
alkalická fosfatáza 
draslík sodík 
vápník 
fosfor chloridy
 
Rozbor mo či (volitelný)  
vzhled (barva a zákal) 
objem 
relativní hustota nebo osmolalita pH celkový obsah protein ů 
glukóza 
krev/krvinky
 
(*) Dlouhé období la čnění může zkreslit výsledky m ěření glukózy u exponovaných 
zvířat oproti zví řatům kontrolním. Vedoucí studie by proto m ěl určit, zda je 
vhodné, aby zví řata lačnila. Používá-li se období la čnění, mělo by být vhodné 
pro daný použitý druh. U potkana to m ůže být 16 h (la čnění přes noc). Stanovení 
glukózy nala čno lze provést po la čnění přes noc během posledního týdne expozice 
nebo po la čnění přes noc před pitvou (v tomto p řípadě se provede spole čně se 
všemi ostatními klinickými patologickými parametry).  
38. Existují-li d ůkazy o tom, že hlavním místem depozice a retence jsou dolní 
cesty dýchací (tj. alveoly), jako technika pro kvantitativní analýzu hypote ­
tických parametr ů závislosti ú činku na dávce zam ěřená na alveolitidu, plicní 
zánět a fosfolipidózu, m ůže být zvolena bronchoalveolární laváž (BAL). 
Umožňuje vhodn ě vyšetřit změny ve vztazích dávka–odezva a čas–průběh 
při poškození plicních sklípk ů. V tekutin ě z BAL lze stanovit diferenciální 
rozpočet leukocyt ů, celkový obsah protein ů a laktátdehydrogenázu. Další 
parametry, jejichž analýzu je možno zvážit, jsou ty, které sv ědčí 
o lysozomálním poškození, fosfolipidóze, fibróze, zán ětu z podrážd ění 
nebo alergickém zán ětu, což m ůže zahrnovat stanovení prozán ětlivých cyto ­
kinů/chemokin ů. Měření v tekutin ě BAL obecn ě doplňují výsledky histopa ­
tologických vyšet ření, avšak nemohou je nahradit. Pokyny, jak provád ět 
laváž plic, jsou uvedeny v dokumentu GD 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
PITVA A HMOTNOSTI ORGÁN Ů 
39. Všechna pokusná zví řata, včetně těch, která v pr ůběhu zkoušky uhynula 
nebo byla utracena z d ůvodu ohleduplného zacházení se zví řaty, by se 
měla podrobit úplnému vykrvení (je-li proveditelné) a pitv ě. Měla by se 
zaznamenat doba mezi koncem poslední expozice zví řete a jeho utracením. 
Není-li možno pitvu provést ihned po objevení uhynulého zví řete, mělo by 
se zvíře uchovávat v chladicím boxu (nikoli zmrazené) p ři teplotě dostatečně 
nízké k minimalizaci autolýzy. Pitvy by se m ěly provést co možná nejd říve, 
obvykle b ěhem jednoho nebo dvou dn ů. U každého zví řete by se m ěly 
zaznamenat všechny makroskopické patologické nálezy, p řičemž se v ěnuje 
zvláštní pozornost jakýmkoli nález ům v dýchacích cestách.  
40. Tabulka 2 uvádí orgány a tkán ě, které by se m ěly během pitvy konzervovat 
ve vhodném médiu pro histopatologické vyšet ření. Uchovávání orgán ů 
a tkání [uvedených v závorkách] a jakýchkoli dalších orgán ů a tkání závisí 
na rozhodnutí vedoucího studie. Orgány uvedené  tučným  písmem by se 
měly co nejd říve po vyjmutí z t ěla zbavit p řirostlých tkání a zvážit, než 
začnou vysychat. Štítná žláza a nadvarlata by se m ěly vážit pouze v p řípadě 
potřeby, nebo ť artefakty z o řezávání p řirostlých tkání mohou bránit histo ­
patologickému vyšet ření. Tkán ě a orgány by se m ěly fixovat v 10 % pufro ­
vaném formalínu nebo jiném vhodném fixativu ihned po provedení pitvy 
a ne pozd ěji než 24–48 hodin p řed ořezáváním p řirostlých tkání v závislosti 
na použitém fixativu.  
Tabulka 2  
Orgány a tkán ě, které se b ěhem pitvy konzervují  
Nadledvinky  
Kostní dřeň (a/nebo čerstvý aspirát)  
Mozek  (zahrnující řezy mozkových hemisfér, 
mozečku a prodloužené míchy/Varolova 
mostu)  
[Oči (sítnice, o ční nerv) a o ční víčka] 
Srdce  
Ledviny  
Hrtan (3 úrovn ě, 1 úroveň by měla zahrnovat 
bázi epiglottis ) 
Játra  
Plíce  (všechny laloky v jedné úrovni v četně 
hlavních bronch ů) 
Lymfatické uzliny z oblasti plicního hilu, 
zejména v p řípadě špatně rozpustných parti ­
kulárních zkoušených chemických látek. Pro 
podrobnější vyšet ření a/nebo studie 
s imunologickým zam ěřením lze uvažovat 
i o dalších lymfatických uzlinách, nap ř. 
z oblasti mediastina, oblasti cervikální, 
submandibulární a aurikulární.  
Nosohltanové tkán ě (alespoň 4 úrovn ě, 1 
úroveň by měla zahrnovat  ductus nasopha ­
ryngeus  a lymfatickou tká ň nosní 
sliznice (NALT))  
Jícen  
[Bulbus olfactorius ] 
Vaječníky Semenné vá čky 
Mícha (kr ční, střední hrudní a bederní)  
Slezina  
Žaludek  
Varlata  
Brzlík  
Štítná žláza  
Průdušnice (alespo ň dvě úrovně zahrnující 1 
podélný řez skrz  carinu tracheae  a 1 příčný 
řez) 
[Močový měchýř] 
Děloha 
Všechny makroskopicky viditelné léze  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Plíce je t řeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným médiem p ři 
tlaku 20–30 cm vodního sloupce, aby se zachovala struktura plic (5). 
U všech lalok ů by se m ěly řezy odebrat na jedné úrovni, v četně hlavních 
bronchů, avšak provádí-li se plicní laváž, m ěly by se u nevyplachovaného 
laloku provést řezy na třech úrovních (nikoli sériové řezy).  
42. Měly by se vyšet řit alespoň 4 úrovn ě tkání nosohltanu, z nichž jedna by 
měla zahrnovat  ductus nasopharyngeus  (5, 6, 7, 8, 9), aby bylo možno 
dostatečně vyšetřit dlaždicový, p řechodný (respira ční bez řasinek), respira ční 
(řasinkový respira ční) a čichový epitel a svodnou lymfatickou tká ň (NALT; 
10, 11). M ěly by se vyšet řit tři úrovně hrtanu a jedna z t ěchto úrovní by 
měla zahrnovat bázi p říklopky hrtanové (12). M ěly by se vyšet řit alespoň 
dvě úrovně průdušnice, a to tak, že jeden podélný řez se povede skrz  carina 
tracheae  v místě bifurkace a jeden p říčný řez. 
HISTOPATOLOGICKÉ VYŠET ŘENÍ 
43. Mělo by se provést histopatologické vyšet ření všech orgán ů a tkání uvede ­
ných v tabulce 2 u kontrolní skupiny a skupiny vystavené vysoké koncen ­
traci látky a u všech zví řat, která uhynou nebo jsou utracena b ěhem studie. 
Zvláštní pozornost je t řeba věnovat dýchacím cestám, cílovým orgán ům 
a makroskopicky viditelným lézím. Orgány a tkán ě, u nichž se objeví 
léze u skupiny zví řat vystavené vysoké koncentraci látky, by se m ěly 
vyšetřit ve všech skupinách. Vedoucí studie se m ůže rozhodnout provést 
histopatologická vyšet ření v dalších skupinách, aby se prokázala jasná 
odezva na koncentraci. V p řípadě použití satelitní skupiny (sledování rever ­
zibility) by se m ělo provést histopatologické vyšet ření všech tkání a orgán ů, 
na kterých byly pozorovány ú činky u exponovaných skupin. Pokud ve 
skupině s expozicí vysoké koncentraci látky p říliš brzy uhyne velký po čet 
zvířat nebo vzniknou jiné problémy, které by mohly zpochybnit významnost 
údajů, měla by se histopatologicky vyšet řit nejbližší nižší koncentrace. M ěl 
by se u činit pokus porovnat makroskopicky viditelné zm ěny 
s mikroskopickými nálezy.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Údaje  
44. U každého zví řete by se m ěly uvést údaje o t ělesné hmotnosti, spot řebě 
krmiva, klinické patologické údaje, údaje z pitvy, hmotnosti orgán ů 
a histopatologické nálezy. Údaje z klinického sledování by se m ěly shrnout 
do tabulky, p řičemž se u každé zkušební skupiny uvede po čet použitých 
zvířat, počet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, po čet zvířat uhynulých 
v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních d ůvodů, čas uhynutí 
jednotlivých zví řat, popis, časový pr ůběh a vratnost toxických ú činků 
a pitevní nálezy. Všechny výsledky, kvantitativní a incidentální, by se měly vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Lze použít všeobecn ě uzná­
vanou statistickou metodu. Statistické metody by se m ěly zvolit b ěhem 
vypracovávání návrhu studie.
 
Protokol o zkoušce  
45. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat následující informace:  
Pokusná zví řata a podmínky chovu  
— popis podmínek v klecích uvád ějící počet (nebo zm ěnu počtu) zvířat 
v každé kleci, materiál podestýlky, teplotu a relativní vlhkost prost ředí, 
délku světelné fáze a druh krmiva,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— použitý druh/kmen a od ůvodnění, pokud se použil jiný druh než potkan. 
Je možné uvést údaje ze zdroje a historické údaje, pokud se týkají zví řat, 
která byla exponována za podobných podmínek expozice, chovu a lačnění,
 
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— metoda randomizace,  
— popis jakékoliv p řípravy p řed zkouškou v četně krmiva, karantény 
a léčby onemocn ění. 
Zkoušená chemická látka  
— fyzikální povaha, čistota a v p řípadě potřeby fyzikáln ě-chemické vlast ­
nosti (včetně izomerizace),  
— identifika ční údaje a registra ční číslo CAS (Chemical Abstract Services), 
je-li známo.  
Nosič 
— zdůvodnění použití nosi če a zdůvodnění výběru nosiče (pokud je jiný 
než voda),  
— historické nebo sou časné údaje prokazující, že nosi č neovliv ňuje 
výsledek studie.  
Inhalační komora  
— popis inhala ční komory v četně objemu a nákresu,  
— zdroj a popis za řízení použitého k expozici zví řat a rovn ěž pro genero ­
vání atmosféry,  
— zařízení k m ěření teploty, vlhkosti, velikosti částic a skute čné koncent ­
race,  
— zdroj vzduchu a použitý klimatiza ční systém,  
— metody použité ke kalibraci za řízení k zajišt ění homogenní zkušební 
atmosféry,  
— rozdíl tlak ů (kladný nebo záporný),  
— počet expozi čních otvor ů v každé komo ře (v případě nazální expozice), 
umístění zvířat v komo ře (v případě celotělové expozice),  
— stabilita zkušební atmosféry,  
— umístění čidel ke snímání teploty a vlhkosti a odb ěr vzorků zkušební 
atmosféry v komo ře, 
— úprava dodávaného/odsávaného vzduchu,  
— průtokové rychlosti vzduchu, pr ůtoková rychlost vzduchu/expozi ční 
otvor (nazální expozice) nebo množství zví řat/komora (celot ělová expo ­
zice),  
— doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v inhala ční komoře (t95),  
— počet výměn objemu vzduchu za hodinu,  
— měřicí přístroje (používají-li se).  
Údaje o expozici  
— zdůvodnění volby cílové koncentrace v hlavní studii,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— nominální koncentrace (celková hmotnost zkoušené chemické látky 
generované do inhala ční komory vyd ělená objemem vzduchu prošlým 
komorou),  
— skutečné koncentrace zkoušené chemické látky nam ěřené v dýchací zón ě 
zvířat. U směsí, které vytvá řejí heterogenní fyzikální formy (plyny, páry, 
aerosoly), je možné analyzovat každou zvláš ť, 
— veškeré koncentrace látky ve vzduchu by se m ěly uvádět raději 
v hmotnostních jednotkách (mg/l, mg/m  3 , atd.) než v objemových jedno ­
tkách (ppm, ppb atd.),  
— distribuce velikosti částic, hmotnostní medián aerodynamického 
průměru (MMAD) a geometrická sm ěrodatná odchylka ( σ g ), včetně 
metod jejich výpo čtu. Měly by se uvést jednotlivé analýzy velikosti 
částic.  
Zkušební podmínky  
— podrobné údaje o p řípravě zkoušené chemické látky v četně postupů 
použitých ke snížení velikosti částic pevných látek nebo k p řípravě 
roztoků zkoušené chemické látky,  
— popis (pokud možno s nákresem) za řízení použitého ke generování 
zkušební atmosféry k expozici zví řat zkušební atmosfé ře, 
— podrobné údaje o za řízení použitém k monitorování teploty a vlhkosti 
v komoře a proud ění vzduchu komorou (tj. vývoj kalibra ční křivky),  
— podrobné údaje o za řízení použitém k odb ěru vzorků ke stanovení 
koncentrace látky v komo ře a distribuce velikosti částic,  
— podrobné údaje o použité chemické analytické metod ě a validaci metody 
(včetně účinnosti výt ěžnosti zkoušené chemické látky ze vzorkovaného 
média),  
— metoda randomizace použitá k rozd ělení zvířat do zkoušených 
a kontrolních skupin,  
— podrobnosti o jakosti vody a krmiva (v četně druhu/zdroje krmiva, zdroje 
vody),  
— zdůvodnění výběru zkoušených koncentrací.  
Výsledky  
— tabulka s údaji o teplot ě, vlhkosti a pr ůtoku vzduchu v komo ře, 
— tabulka s údaji o nominální a skute čné koncentraci v komo ře, 
— tabulka s údaji o velikosti částic včetně údajů o odběru analytických 
vzorků, distribuce velikosti částic a výpo čtů MMAD a σ g , 
— tabulka s údaji o odezv ě a úrovni koncentrace u každého zví řete (tj. 
zvířata vykazující p říznaky toxicity v četně mortality, charakter, závaž ­
nost, doba nástupu a trvání ú činků), ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— tabulka s údaji o t ělesné hmotnosti jednotlivých zví řat, 
— tabulka s údaji o spot řebě krmiva,  
— tabulka s klinickými patologickými údaji,  
— pitevní a histopatologické nálezy pro každé zví ře, pokud jsou 
k dispozici,  
— tabulka se všemi dalšími m ěřenými parametry.  
Diskuse a interpretace výsledk ů 
— zvláštní d ůraz by se m ěl klást na popis metod použitých ke spln ění 
kritérií této zkušební metody, nap ř. mezní koncentrace nebo velikost 
částic,  
— je třeba zabývat se vdechovatelností částic s ohledem na celkové nálezy, 
zejména pokud nebylo možné splnit kritéria pro velikost částic,  
— v celkovém hodnocení studie by se m ěla uvést konzistentnost metod 
použitých ke stanovení nominálních a skute čných koncentrací a vztahu 
mezi aktuální a skute čnou koncentrací,  
— měla by se uvést pravd ěpodobná p říčina úhynu a p řevládající mecha ­
nismus účinku (systémový nebo lokální),  
— mělo by se uvést vysv ětlení, pokud bylo nutné humánn ě utratit zví řata 
trpící bolestí nebo vykazující známky intenzivního a p řetrvávajícího 
utrpení, na základ ě kritérií uvedených v pokynech OECD 
o humánních parametrech (3),  
— měl(y) by se ur čit cílový (cílové) orgán(y),  
— měla by se stanovit hodnota NOAEL a LOAEL.  
LITERATURA:  
1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guide ­
line No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency.  
5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
 
6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyn ­
geal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
13) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 
16. prosince 2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek a sm ěsí, 
o změně a zrušení sm ěrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zm ěně 
nařízení (ES) č. 1907/2006, Ú ř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Zkoušená chemická látka:  jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9 DERMÁLNÍ TOXICITA (28DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B (A).  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B (B).  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená látka se denn ě po dobu 28 dní nanáší na k ůži 
v odstup ňovaných dávkách n ěkolika skupinám pokusných zví řat, 
a to každé skupin ě jedna úrove ň dávky. B ěhem doby aplikace se 
zvířata denně pozorují s cílem zjistit p říznaky toxicity. Zví řata, která 
v průběhu zkoušky uhynula, i zví řata, která do konce zkoušky 
přežila, se pitvají.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS METODY  
1.6.1  Příprava  
Nejméně pět dní před zkouškou jsou zví řata chována v takových 
podmínkách chovu a krmení, v jakých budou b ěhem zkoušky. 
Před zkouškou se provede náhodný výb ěr zdravých mladých dosp ě­
lých zvířat, která se p řiřadí do experimentálních a kontrolních 
skupin. Krátce p řed zahájením zkoušky se zví řatům ostříhá srst na 
zádech. Vyholení srsti je rovn ěž možné, m ělo by se však provést asi 
24 hodin p řed zkouškou. Ost říhání nebo oholení je pot řeba obvykle 
opakovat p řibližně v týdenních intervalech. P ři stříhání nebo holení 
srsti je třeba dbát na to, aby se neporanila k ůže. Pro aplikaci zkou ­ 
šené látky se p řipraví nejmén ě 10 % povrchu t ěla. Při rozhodování 
o velikosti p řipravované plochy k ůže, která má být zbavena srsti, a o 
velikosti krycího obvazu je t řeba vzít v úvahu hmotnost zví řat. Při 
zkouškách pevných látek, které mohou být podle pot řeby rozet řeny 
na prach, se zkoušená látka dostate čně navlhčí vodou nebo podle 
potřeby vhodným vehikulem, aby se zajistil dobrý styk s k ůží. 
Kapalné zkoušené látky se zpravidla aplikují ne ředěné. Aplikace se 
provádí p ět až sedm dn ů v týdnu.  
1.6.2  Zkušební podmínky  
1.6.2.1  Pokusná zví řata 
Mohou být použiti dosp ělí potkani, králíci nebo mor čata. Lze použít 
i jiné živo čišné druhy, ale jejich použití musí být zd ůvodněno. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Na začátku zkoušky by nem ělo rozpětí odchylek hmotností použ ­
itých zvířat u obou pohlaví (pro každé pohlaví zvláš ť) překročit ± 
20 % příslušné st řední hodnoty.  
1.6.2.2  Počet a pohlaví  
Pro každou úrove ň dávek se použije nejmén ě 10 zvířat (pět samic 
a pět samců). Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. Pokud se 
plánuje usmrcování zví řat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový 
počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena p řed koncem 
studie. Mimoto je možné exponovat po dobu 28 dn ů satelitní 
skupinu 10 zví řat (pět zvířat každého pohlaví) vysokou dávkou 
a během následujících 14 dn ů po podávání sledovat vratnost, trvání 
nebo zpožd ěný výskyt toxických ú činků. Používá se také satelitní 
skupina 10 kontrolních zví řat (pět zvířat každého pohlaví).  
1.6.2.3  Úrovn ě dávek  
Použijí se nejmén ě tři úrovně dávek a kontrolní skupina nebo, je-li 
použito vehikulum, kontrolní skupina s vehikulem. Doba expozice 
by měla být nejmén ě šest hodin denn ě. Zkoušená látka by m ěla být 
aplikována každý den p řibližně ve stejnou dobu a dávkování by 
mělo být pravideln ě (týdně nebo každých čtrnáct dnů) přizpůsobeno, 
aby bylo konstantní vzhledem k t ělesné hmotnosti zví řete. 
S výjimkou aplikace zkoušené látky se se zví řaty v kontrolní skupin ě 
zachází stejn ě jako se zví řaty v exponované skupin ě. Použije-li se 
pro usnadn ění aplikace vehikulum, aplikuje se na kontrolní skupinu 
stejným zp ůsobem a ve stejném množství, jako ve skupin ě, které se 
aplikuje nejvyšší dávka. Nejvyšší úrove ň dávky by m ěla mít za 
následek toxické ú činky, ale nem ěla by zp ůsobit žádná uhynutí, 
nebo by m ěla mít za následek malý po čet uhynutí. Nejnižší dávka 
by neměla vyvolat žádné známky toxicity. Je-li k dispozici použ ­
itelný odhad expozice člověka, měla by jej nejnižší úrove ň překra­ 
čovat. V ideálním p řípadě by měla střední úrove ň dávky vyvolat 
minimální pozorovatelné toxické ú činky. Použije-li se více než 
jedna střední úrove ň dávky, m ěly by se úrovn ě lišit tak, aby vyvolaly 
odstupňované toxické ú činky. Ve skupinách s nízkou a st řední 
úrovní dávky a v kontrolní skupin ě by měla být četnost uhynutí 
nízká, aby bylo možné provést smysluplné hodnocení výsledk ů. 
Vede-li aplikace zkoušené látky k závažnému podrážd ění kůže, je 
třeba snížit koncentraci, což u vysoké úrovn ě dávky m ůže vést 
k omezení nebo vylou čení ostatních toxických ú činků. Došlo-li 
navíc k závažnému poškození k ůže, je nutné zkoušku ukon čit 
a provést ji znovu s nižšími koncentracemi.  
1.6.2.4  Limitní zkouška  
Nevyvolá-li p ři předběžné studii aplikace dávky 1 000 mg/kg nebo 
vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, je-li známa, 
žádné toxické ú činky, není další zkoušení pot řebné.  
1.6.2.5  Doba pozorování  
Zvířata se pozorují denn ě s cílem zaznamenat p říznaky toxicity. 
Zaznamená se doba uhynutí a doba, kdy se známky toxicity objeví 
a vymizí.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3  Postup  
Zvířata se chovají jednotliv ě v klecích. Zví řatům se aplikuje zkou ­ 
šená látka denn ě nejlépe 7 dní v týdnu po dobu 28 dn ů. Zvířata ve 
všech satelitních skupinách ur čených pro následná pozorování by 
neměla být dalších 14 dn ů exponována, aby se posoudilo zotavení 
z toxických ú činků, nebo jejich p řetrvávání. Doba expozice by m ěla 
být nejmén ě šest hodin denn ě. 
Zkoušená látka se nanese rovnom ěrně na plochu, která činí asi 10 % 
celkového povrchu t ěla. V případě vysoce toxických látek m ůže být 
tato plocha menší; co nejv ětší část této plochy by se však m ěla 
pokrýt co nejslabší a nejstejnom ěrnější vrstvou.  
Během expozice se zkoušená látka udržuje ve styku s k ůží pomocí 
porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Zkušební plocha 
se dále vhodným zp ůsobem p řekryje, aby se mulový obvaz 
a zkoušená látka fixovaly a aby zví řata zkoušenou látku nepožila. 
K zamezení požití látky je možno použít i prost ředků pro omezení 
volnosti pohybu, úplné znehybn ění však nelze doporu čit. Jako alter ­
nativní metody je možno použít „ochranného límce“.  
Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky zkoušené látky, pokud 
možno vodou nebo jiným vhodným zp ůsobem očištění kůže. 
Všechna zví řata se pozorují denn ě a zaznamenávají se p říznaky 
toxicity, v četně doby jejich nástupu, stupn ě a trvání. Pozorování 
zahrnují zm ěny na kůži, na srsti, na o čích, na sliznicích, a rovn ěž 
změny dýchání, krevního ob ěhu, změny funkce autonomní 
a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Každý týden se zví řata váží. Doporu čuje se také, aby byla každý 
týden zjišt ěna spotřeba potravy. Pravidelné pozorování zví řat je 
nezbytné k tomu, aby se zajistilo, že u zví řat nedochází ke ztrátám, 
např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného 
zařazení. Po ukon čení studie se všechna p řeživší zví řata z jiných 
než satelitních skupin pitvají. Zví řata v agónii a zví řata, která se 
trápí nebo trpí bolestí, se ihned vy řadí, humánn ě utratí a pitvají.
 
Na konci zkušebního období se u všech zví řat, včetně kontrolních, 
provedou tato vyšet ření: 
1) hematologické vyšet ření: stanovit alespo ň hematokrit, koncentraci 
hemoglobinu, po čet erytrocyt ů, celkový a diferenciální po čet 
leukocytů a srážlivost krve;  
2) klinické biochemické vyšet ření krve: stanovení alespo ň jednoho 
parametru funkce jater a ledvin: alaninaminotransferasa v séru 
(dříve známá jako glutamátpyruváttransaminasa), aspartátamino ­
transferasa séra (d říve známá jako glutamátoxalacetáttransamina ­
sa), močovinový dusík, albumin, kreatinin, celkový bilirubin 
a celkové bílkoviny v séru.  
Mezi jiná stanovení, která mohou být pot řebná pro úplné toxikolo ­
gické hodnocení, pat ří stanovení vápníku, fosforu, chlorid ů, sodíku, 
draslíku, glukosy na la čno, analýza lipid ů, hormon ů, acidobasické 
rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Další biochemické analýzy mohou být v p řípadě potřeby použity pro 
širší vyšet ření pozorovaných ú činků. 
1.6.4  Pitva  
U všech zví řat použitých ve studii se provede celková pitva. Alespo ň 
játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejd říve po sekci 
zváží ve vlhkém stavu, aby se p ředešlo vysychání. Orgány 
a tkáně, tj. normální a exponovaná k ůže, játra, ledviny, slezina, 
varlata, nadledviny, srdce a cílové orgány (orgány s lézemi nebo 
změnami velikosti), je t řeba uchovávat ve vhodném médiu 
s ohledem na pozd ější histopatologická vyšet ření. 
1.6.5  Histopatologické vyšet ření 
U skupiny, které byla aplikována vysoká dávka, a u kontrolní 
skupiny se provede histologické vyšet ření uchovaných orgán ů 
a tkání. Orgány a tkán ě, u nichž se ve skupin ě s nejvyšší koncentrací 
objeví poškození zp ůsobená zkoušenou látkou, se podrobí histolo ­
gickému vyšet ření i u všech skupin s nižšími dávkami. U zví řat ze 
satelitní skupiny se provede histologické vyšet ření se zvláštním 
důrazem na orgány a tkán ě, na kterých byly pozorovány ú činky 
u ostatních exponovaných skupin.  
2. ÚDAJE  
Data se shrnou do tabulky, p řičemž se pro každou exponovanou 
skupinu uvede po čet zvířat na za čátku zkoušky a po čet zvířat, 
která vykazují jednotlivé typy léze.  
Všechny výsledky se zhodnotí vhodnou statistickou metodou. Lze 
použít jakoukoli uznanou statistickou metodu.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— údaje o zví řatech (druh, kmen, p ůvod, podmínky chovu, strava 
atd.),  
— zkušební podmínky (v četně typu obvazu: okluzivní nebo neoklu ­
zivní),  
— úrovn ě dávek (v četně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,  
— dávka, p ři které nedochází k ú činkům, pokud je to možné,  
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovn ě dávky,  
— doba uhynutí b ěhem studie, nebo zda zví řata přežila do konce 
zkoušky,  
— toxické a jiné ú činky,  
— doba pozorování každého neobvyklého p říznaku a jeho další 
vývoj,  
— údaje o spot řebě potravy a o t ělesné hmotnosti,  
— provedená hematologická vyšet ření a výsledky,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— provedená klinická biochemická vyšet ření a výsledky,  
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— statistické zpracování výsledk ů, kde je to možné,  
— diskuse a výsledky,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B (D).  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B (E).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10  Mutagenita – zkouška na chromozomové aberace u savc ů in vitro  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 473 – Zkouška na chro ­
mozomové aberace u savc ů in vitro  (1997).  
1.1 ÚVOD  
Zkouška na chromozomové aberace u savc ů in vitro  má identifikovat 
činitele, které zp ůsobují strukturní chromozomové aberace 
v kultivovaných bu ňkách savc ů (1, 2, 3). Rozlišují se dva typy 
strukturních aberací: chromozomové a chromatidové. U v ětšiny 
chemických mutagen ů jsou indukované aberace chromatidového 
typu, avšak chromozomové aberace se rovn ěž vyskytují. Nár ůst 
polyploidie m ůže znamenat, že chemická látka má schopnost indu ­
kovat numerické aberace. Tato metoda však není ur čena ke stanovení 
numerických aberací a není k tomuto ú čelu rutinn ě používána. Chro ­
mozomové mutace a podobné jevy jsou p říčinou mnoha geneticky 
podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho d ůkazů o tom, že 
chromozomové mutace a s nimi související jevy zp ůsobující zm ěny 
v onkogenech a v genech somatických bun ěk tlumících nádory, mají 
podíl na indukci rakoviny u člověka a u pokusných zví řat. 
Ke zkoušce na chromozomové aberace  in vitro  mohou být použity 
stabilizované bun ěčné linie, bun ěčné kmeny nebo primární bun ěčné 
kultury. Použité bu ňky jsou vybrány na základ ě schopnosti r ůstu 
v kultuře, stálosti karyotypu, po čtu chromozom ů, rozmanitosti chro ­
mozomů a spontánní četnosti chromozomových aberací.  
Zkoušky provád ěné in vitro  obecně vyžadují použití vn ějšího zdroje 
metabolické aktivace. Tento metabolický aktiva ční systém nem ůže 
zcela napodobit podmínky  in vivo  u savců. Je třeba se zcela 
vyvarovat podmínek, které by vedly k pozitivním výsledk ům, jež 
neodrážejí vlastní mutagenitu a m ůže k nim dojít zm ěnou pH, osmo ­
lality nebo vysokých úrovní cytotoxicity (4, 5).  
Tato zkouška se používá ke zjišt ění možných mutagen ů 
a karcinogen ů pro savce. Mnoho slou čenin, které jsou v této zkoušce 
pozitivní, jsou pro savce karcinogenní, avšak mezi touto zkouškou 
a karcinogenitou však není absolutní korelace. Korelace závisí na 
chemické t řídě a přibývají d ůkazy o tom, že existují karcinogeny, 
které nejsou zjišt ěny touto zkouškou, nebo ť zřejmě působí jinými 
mechanismy než p římým poškozením DNA.  
Viz také obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Chromatidová aberace:  strukturní poškození chromozomu 
v podobě zlomu jednotlivých chromatid nebo zlomu a op ětného 
spojení chromatid.  
Chromozomová aberace:  strukturní poškození chromozomu 
v podobě zlomu nebo zlomu a spojení obou chromatid v tomtéž 
místě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikace:  proces, p ři kterém v jád ře po S-fázi replikace 
DNA nedojde k mitóze, nýbrž následuje další S-fáze. Výsledkem 
jsou chromozomy se 4, 8, 16 … chromatidami.  
Gap:  achromatická léze menší než ší řka jedné chromatidy a s mini ­
mální odchylkou chromatid.  
Mitotický index:  podíl bun ěk, které se nacházejí v metafázi, 
z celkového po čtu buněk v populaci; udává stupe ň proliferace této 
populace.  
Numerická aberace:  odchylka po čtu chromozom ů od normálního 
počtu obvyklého u použitého typu bun ěk. 
Polyploidie:  násobek haploidního po čtu chromozomových sad ( n) 
jiný než diploidní (tj. 3 n, 4n atd.).  
Strukturní aberace:  mikroskopicky pozorovatelné zm ěny struktury 
chromozom ů při buněčném dělení ve stadiu metafáze; jeví se jako 
delece a fragmenty, intrachromozomální nebo interchromozomální změny.
 
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Buněčné kultury jsou vystaveny zkoušené látce, a to s metabolickou 
aktivací a bez ní. V p ředem stanovených intervalech po zkoušené 
látce se do bun ěčných kultur p řidá látka zastavující metafázi (nap ř. 
Colcemid nebo kolchicin), kultury se sklidí, obarví a p řítomnost 
chromozomových aberací se zjistí mikroskopickým pozorováním buněk.
 
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Příprava  
1.4.1.1  Buňky 
Mohou být použity r ůzné buněčné linie, kmeny nebo primární 
buněčné kultury, v četně lidských bun ěčných linií (nap ř. fibroblasty 
křečka čínského, lymfocyty periferní krve člověka nebo jiných 
savců). 
1.4.1.2  Média a kultiva ční podmínky  
Pro udržování kultur by m ěla být použita vhodná kultiva ční média 
a inkubační podmínky (kultiva ční nádoby, koncentrace CO  2 teplota 
a vlhkost). U stabilizovaných bun ěčných linií a kmen ů by měla být 
rutinně kontrolována stabilita modální hodnoty po čtu chromozom ů 
a mělo by být kontrolováno, zda nejsou kontaminovány mykoplas ­
maty; v p řípadě kontaminace by nem ěly být použity. Pro použité 
buňky a inkuba ční podmínky by m ěla být známa normální délka 
buněčného cyklu.  
1.4.1.3  Příprava kultur  
Stabilizované bun ěčné linie a kmeny: bu ňky se pomnoží 
z kmenových kultur, nasadí se do kultiva čního média v takové 
hustotě, aby nedosáhly konfluence p řed sklizením, a inkubují se 
při 37  o C. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Lymfocyty: krev ošet řená antikoagulantem (nap ř. heparinem) nebo 
oddělené lymfocyty zdravých proband ů se přidají do kultiva čního 
média obsahujícího mitogen (nap ř. fytohemaglutinin) a inkubují se 
při 37  o C. 
1.4.1.4  Metabolická aktivace  
Buňky by měly být vystaveny zkoušené látce, a to s vhodnou meta ­
bolickou aktivací a bez ní. Nej častěji používaným systémem je 
kofaktorem dotovaná postmitochondriální frakce (S9) p řipravená 
z jater hlodavc ů zpracovaná činidlem indukujícím enzymy, jako je 
Aroclor 1254 (6, 7, 8 a 9), nebo sm ěs fenobarbitonu a β-naftoflavonu 
(10, 11 a 12).  
Postmitochondriální frakce je v kone čném testovacím médiu obvykle 
používána v koncentracích 1–10 % obj. Stav metabolického aktiva č­
ního systému m ůže záviset na t řídě chemické látky, která je zkou ­ 
šena. V n ěkterých p řípadech m ůže být vhodné použít více než jednu 
koncentraci postmitochondriální frakce.  
Řada výsledk ů vývoje, v četně přípravy geneticky modifikovaných 
buněčných linií exprimujících specifické aktiva ční enzymy, posky ­
tuje možnosti pro endogenní aktivaci. Volba použitých bun ěčných 
linií by m ěla být vědecky zd ůvodněna (např. důležitostí isoenzymu 
cytochromu P450 pro metabolismus zkoušené látky).  
1.4.1.5  Zkoušená látka/p říprava  
Pevné zkoušené látky by m ěly být před aplikací na bu ňky rozpuš ­
těny nebo suspendovány ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehiku ­
lech a pop řípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být 
přidány přímo k testovacím systém ům a/nebo mohou být p řed apli­
kací zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené látky, 
pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.  
1.4.2  Zkušební podmínky  
1.4.2.1  Rozpoušt ědlo/vehikulum  
Rozpoušt ědlo/vehikulum by m ělo být mimo podez ření, že reaguje se 
zkoušenou látkou, a m ělo by být slu čitelné s p řežitím bun ěk a s 
aktivitou S9. Jsou-li použita jiná než známá rozpoušt ědla/vehikula, 
mělo by být jejich za řazení podloženo údaji o jejich kompatibilit ě. 
Doporučuje se pokud možno nejd říve zvážit použití vodných 
rozpouštědel/vehikul. P ři zkoušení látek nestálých ve vod ě by měla 
být použita organická rozpoušt ědla neobsahující vodu. Vodu lze 
odstranit p řidáním molekulového síta.  
1.4.2.2  Expozi ční koncentrace  
Mezi kritéria, která mají být zohledn ěna při stanovení nejvyšší 
koncentrace, pat ří cytotoxicita, rozpustnost v testovacím systému 
a změny pH nebo osmolality.  
Cytotoxicita by m ěla být stanovena s metabolickou aktivací a bez ní 
v hlavním experimentu za použití vhodných indikátor ů buněčné inte­
grity a růstu, jako jsou stupe ň konfluence, po čet životaschopných 
buněk nebo mitotický index. M ůže být výhodné stanovit cytotoxicitu 
a rozpustnost v p ředběžném experimentu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Měly by být použity alespo ň tři analyzovatelné koncentrace. 
V případě cytotoxicity by m ěly tyto koncentrace pokrývat rozmezí 
dané maximální až minimální toxicitou, p řípadně žádnou toxicitou, 
což obvykle znamená, že by se koncentrace nem ěly lišit více nežli 
faktorem 2 až 10. V okamžiku sklizn ě by měla nejvyšší koncentrace 
vykazovat významné snížení stupn ě konfluence, po čtu buněk nebo 
mitotického indexu (vše o více než 50 %). Mitotický index je pouze nepřímým m ěřítkem cytotoxických nebo cytostatických ú činků 
a závisí na dob ě, která uplynula od expozice. Mitotický index je 
však přijatelný u suspenzních kultur, u nichž mohou být jiné metody 
stanovení toxicity obtížné a nepraktické. Informace o kinetice bun ěč­
ného cyklu, nap říklad průměrná genera ční doba (AGT), mohou být 
použity jako dodatkové informace. V p řípadě AGT však jde 
o celkovou pr ůměrnou hodnotu, z níž nelze usoudit na existenci 
zpožděných subpopulací, a i malý p řírůstek průměrné genera ční 
doby může mít za následek velmi podstatné oddálení okamžiku 
optimálního výt ěžku aberací.
 
V případě relativně necytotoxických látek by m ěla být maximální 
zkušební koncentrace 5 μl/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M, podle toho, 
která z nich je nejnižší.  
V případě relativně nerozpustných látek, které nejsou toxické p ři 
koncentracích nižších, než je jejich rozpustnost, by m ěla být použita 
nejvyšší dávka v koncentraci, jež je nad mezí rozpustnosti v konečném kultiva čním médiu na konci doby aplikace. 
V určitých případech (nap ř. projeví-li se toxicita pouze p ři vyšších 
koncentracích, než je rozpustnost) se doporu čuje vyzkoušet více 
koncentrací, p ři nichž dochází ke srážení. M ůže být užite čné stanovit 
rozpustnost na za čátku a na konci expozice, nebo ť koncentrace 
v testovacím systému se m ůže v pr ůběhu expozice m ěnit 
v důsledku přítomnosti bun ěk, séra S9 atd. Nerozpustnost lze zjistit 
vizuálně. Sraženina by nem ěla vadit p ři vyšetřování.
 
1.4.2.3  Negativní a pozitivní kontroly  
Součástí každého experimentu by m ěly být pozitivní a negativní 
kontroly (kontroly rozpoušt ědla nebo vehikula). P ři použití metabo ­
lické aktivace by m ěla být pro pozitivní kontrolu použita chemická 
látka, která k mutagenní reakci vyžaduje aktivaci.  
K pozitivní kontrole by m ěl být použit známý elastogen 
v expozičních koncentracích, které nejspíše poskytnou reprodukova ­
telný a detekovatelný nár ůst nad pozadí, čímž se prokáže citlivost 
testovacího systému.  
Koncentrace pozitivních kontrol by m ěly být zvoleny tak, aby byl 
účinek zřetelný, ale aby p ři odečtu nevyšla ihned najevo kódovaná 
identifikace preparátu. P říklady pozitivních a negativních kontrol:  
Stav metabolické aktivace Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS  
Bez vnější metabolické aktivace methyl-methansulfonát 66-27-3 200-625-0 
ethyl-methansulfonát 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Stav metabolické aktivace Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS  
1-ethyl-1-nitrosomo čovina 759-73-9 212-072-2 
mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
4-nitrochinolin-1-oxid 56-57-5 200-281-1 
S vnější metabolickou aktivací benzo[ a]pyren 50-32-8 200-028-5 
cyklofosfamid 
cyklofosfamid monohydrát 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Pro pozitivní kontrolu mohou být použity i jiné vhodné látky. Pro 
pozitivní kontrolu by m ělo být pokud možno vzato v úvahu použití 
chemických látek ze stejné chemické t řídy. 
V okamžiku sklizení by m ěly být použity negativní kontroly skláda ­
jící se ze samotného rozpoušt ědla nebo vehikula v kultiva čním 
médiu a zpracované stejným zp ůsobem jako kultury. Krom ě toho 
by měly být neexponované kontroly použity také tehdy, neexistují- 
li dosud žádné kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpoušt ědlo 
nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní ú činky.  
1.4.3  Postup  
1.4.3.1  Expozice zkoušené látce  
Proliferující bu ňky se vystaví zkoušené látce jak za p řítomnosti 
metabolického aktiva čního systému, tak bez n ěho. Expozice lymfo ­
cytů by měla být zahájena asi 48 hodin po mitogenní stimulaci.  
1.4.3.2 Pro každou koncentraci by m ěly být obvykle použity duplicitní 
kultury, a totéž se d ůrazně doporučuje u kultur pro negativní 
kontrolu nebo kontrolu rozpoušt ědla. Jestliže lze na základ ě dosavad­
ních údaj ů prokázat (13, 14), že mezi duplicitními kulturami je 
minimální rozdíl, m ůže být přípustné použití jediné kultury.  
Plynné nebo t ěkavé látky by m ěly být zkoušeny vhodnými meto ­
dami, nap ř. v těsně uzavřených kultiva čních nádobách (15, 16).  
1.4.3.3  Doba sklizn ě kultur  
V prvním experimentu by m ěly být buňky vystaveny zkoušené látce, 
jak s metabolickou aktivací, tak bez ní, na dobu 3–6 hodin, a m ěly 
by být odebrány po takové dob ě od zahájení aplikace, která odpo ­
vídá 1,5 násobku normální délky bun ěčného cyklu (12). Jestliže 
tento postup dává negativní výsledky jak s aktivací, tak bez aktivace, měl by být proveden dodate čný experiment bez aktivace 
s nepřetržitou expozicí až do odb ěru v dob ě, která odpovídá 1,5 
násobku normální délky bun ěčného cyklu. Ur čité chemické látky 
lze snáze detekovat p ři dobách aplikace nebo odb ěru delších než 
1,5násobek délky cyklu. Negativní výsledky p ři metabolické aktivaci 
musí být potvrzeny p řípad od p řípadu. V p řípadech, kdy se nepova ­ 
žuje potvrzení negativních výsledk ů za nezbytné, by m ělo být 
podáno zd ůvodnění.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4  Příprava preparát ů pro analýzu chromozom ů 
Do buněčné kultury se obvykle 1–3 hodiny p řed sklizením p řidá 
Colcemid nebo kolchicin. Pro p řípravu preparát ů pro analýzu chro ­
mozomů se každá bun ěčná kultura sklízí a zpracovává zvláš ť. 
Příprava preparát ů pro analýzu chromozom ů zahrnuje hypotonizaci 
buněk, fixaci a obarvení bun ěk. 
1.4.3.5  Analýza  
Všechny preparáty, v četně preparát ů pozitivních a negativních 
kontrol, by m ěly být p řed analýzou pod mikroskopem nezávisle 
kódovány. Pon ěvadž při fixaci často dochází ke zlomu části buněk 
v metafázi a ke ztrát ě chromozom ů, měly by vyšet řované bu ňky 
obsahovat centromery v po čtu rovném modální hodnot ě ± 2 pro 
všechny typy bun ěk. Na každou koncentraci a kontrolu by m ělo 
být hodnoceno alespo ň 200 dob ře rozprost řených metafází, p řípadně 
rovnoměrně rozdělených mezi duplicitní kultury. Tento po čet lze 
snížit, je-li pozorován velký po čet aberací.  
Ačkoli je ú čelem zkoušky detekovat strukturní chromozomové 
aberace, je d ůležité zaznamenat polyploidii a endoreduplikace, 
jsou-li pozorovány.  
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Experimentální jednotkou je bu ňka a mělo by tedy být vyhodnoceno 
množství bun ěk se strukturní chromozomovou aberací (aberacemi) 
vyjádřené v procentech. Pro kontrolní a experimentální kultury by 
měly být uvedeny r ůzné typy strukturních chromozomových aberací 
s jejich po čtem a četností. Gapy se zaznamenávají odd ěleně 
a uvádějí se, ale nezahrnují se do celkové četnosti aberací.  
Měla by být také zaznamenána opat ření, která byla provedena pro 
stanovení cytotoxicity u všech exponovaných kultur a negativních kultur v hlavních experimentech s aberacemi.
 
Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé kultury. Dále by m ěly být 
všechny údaje shrnuty ve form ě tabulky.  
Ověření jasně pozitivní odpov ědi se nepožaduje. Dvojzna čné 
výsledky by m ěly být vyjasn ěny dalším zkoušením, nejlépe 
s úpravami experimentálních podmínek. Nezbytnost potvrdit nega ­
tivní výsledky byla diskutována v bodu 1.4.3.3. Zm ěna parametr ů 
studie s cílem rozší řit rozsah posuzovaných podmínek by m ěla být 
zvážena v následných experimentech. K parametr ům studie, které by 
mohly být zm ěněny, patří rozmezí koncentrací a podmínky metabo ­
lické aktivace.  
2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Pro stanovení pozitivního výsledku existuje n ěkolik kritérií, nap ř. 
nárůst počtu buněk s chromozomovými aberacemi v závislosti na 
koncentraci, nebo reprodukovatelný nár ůst tohoto po čtu. Nejdříve 
by měla být uvážena biologická relevance výsledk ů. Při hodnocení 
výsledků zkoušky mohou být použity jako pomocný prost ředek 
statistické metody (3, 13). Statistická významnost by nem ěla být 
jediným ur čujícím faktorem pro pozitivní odpov ěď. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Nárůst počtu polyploidie bun ěk může znamenat, že zkoušená látka 
má schopnost potla čit mitotické procesy a indukovat numerické 
chromozomové aberace. Nár ůst počtu buněk s endoreduplikovanými 
chromozomy m ůže znamenat, že zkoušená látka má schopnost 
potlačit progresi bun ěčného cyklu (17, 18).  
Zkoušená látka, jejíž výsledky nespl ňují výše uvedená kritéria, se 
v tomto systému považuje za nemutagenní.  
Ačkoli většina experiment ů poskytne jasn ě pozitivní nebo negativní 
výsledky, v ojedin ělých případech neumožní soubor údaj ů vyslovit 
konečný výrok o aktivit ě zkoušené látky. Výsledky mohou z ůstat 
dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment 
opakován.  
Pozitivní výsledky ze zkoušky na chromozomové aberace  in vitro  
znamenají, že zkoušená látka indukuje v kultivovaných somatických 
buňkách savc ů strukturní chromozomové aberace. Negativní 
výsledky znamenají, že zkoušená látka za podmínek zkoušky nein ­
dukuje v kultivovaných somatických bu ňkách savc ů strukturní chro ­
mozomové aberace.  
3. ZPRÁVY  
3.1. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— zdůvodnění volby vehikula,  
— rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpoušt ědle/vehikulu, je-li 
známa.  
Buňky: 
— typ a zdroj bun ěk, 
— vlastnosti karyotypu a vhodnost použitého typu bun ěk, 
— popřípadě nepřítomnost mykoplasmat,  
— informace o délce bun ěčného cyklu,  
— pohlaví dárce krve, zda byla použita plná krev nebo separované 
lymfocyty, použitý mitogen,  
— případně počet pasáží,  
— případně metody udržování bun ěčné kultury,  
— modální hodnota po čtu chromozom ů. 
Zkušební podmínky:  
— identifikace látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka 
expozice bun ěk, 
— odůvodnění výběru koncentrací a po čtu kultur, v četně např. 
údajů o cytotoxicit ě a mezích rozpustnosti, jsou-li k dispozici,  
— složení média, p řípadně koncentrace CO  2 , ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— koncentraci zkoušené látky,  
— objem vehikula a p řidané zkoušené látky,  
— inkuba ční teplota,  
— inkuba ční doba,  
— délka expozice,  
— případně hustota bun ěk při nasazení,  
— typ a složení použitého metabolického aktiva čního systému, 
včetně kritérií p řijatelnosti,  
— pozitivní a negativní kontroly,  
— metody p řípravy preparát ů, 
— kritéria hodnocení aberací,  
— počet analyzovaných metafází,  
— metody stanovení toxicity,  
— kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo 
dvojznačnou. 
Výsledky:  
— známky toxicity, nap ř. stupeň konfluence, údaje o bun ěčném 
cyklu, po čty buněk, mitotický index,  
— známky srážení,  
— údaje o pH a osmolalit ě expozičního média, pokud byly stano ­
veny,  
— definice aberací, v četně gapů, 
— počet buněk s chromozomovými aberacemi a typy aberací zvláš ť 
pro každou exponovanou a kontrolní kulturu,  
— změny ploidie, pokud byly pozorovány,  
— podle možnosti závislost odpov ědi na dávce,  
— případné statistické analýzy,  
— údaje o soub ěžné negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) a pozitivní 
kontrole,  
— dosavadní údaje o negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) a pozitivní 
kontrole s rozp ětími, středními hodnotami a sm ěrodatnými 
odchylkami.  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and 
Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum 
Press, New York and London, s. 1–29.  
2) Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T. (1985). The  in Vitro  Chromo ­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford, 427–432.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Ander ­
son, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 
(suppl.10), 1–175.
 
4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res,. 257, 147–204.
 
5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells. Mutation Res., 268, 297–305.  
6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347–364.
 
7) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173–215.  
8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and 
de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcino ­
gens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosa ­
mine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Micro ­
somes. Mutation Res., 37, 83–90.
 
9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro . Mutation Res., 66, 277–290.
 
10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of 
UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, 175–177.  
11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., 
Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds)  In Vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North- Holland, s. 85–88.
 
12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., 
Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations. Mutation Res., 312, 241–261.  
13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., 
Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from  
In Vitro  Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University 
Press, Cambridge, s. 141–154.  
14) Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994). replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells. Mutation Res., 312, 139–149.  
15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/ ­
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Geno ­
toxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 
s. 91–103.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 795–801.
 
17) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, 403–413.
 
18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer 
Res., 43, 1362–1364.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11  MUTAGENITA – ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ 
ABERACE V BU ŇKÁCH KOSTNÍ D ŘENĚ SAVCŮ IN VIVO  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 475 – Zkouška na chro ­
mozomové aberace v bu ňkách kostní d řeně savců (1997).  
1.1 ÚVOD  
Zkouška na chromozomové aberace u savc ů in vivo  je používána pro 
detekci strukturních chromozomových aberací indukovaných zkou ­ 
šenou látkou v bu ňkách kostní d řeně savců, obvykle hlodavc ů (1, 2, 
3, 4). Rozlišují se dva typy strukturních aberací – chromozomové 
a chromatidové. Nár ůst polyploidie m ůže znamenat, že chemická 
látka má schopnost indukovat numerické aberace. v p řípadě většiny 
chemických mutagen ů jsou indukované aberace chromatidového 
typu, avšak chromozomové aberace se rovn ěž vyskytují. Chromozo ­
mové mutace a související jevy jsou p říčinou mnoha geneticky 
podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho d ůkazů o tom, 
že chromozomové mutace a související jevy zp ůsobující zm ěny 
v onkogenech a v genech somatických bun ěk tlumících nádory, 
mají podíl na indukci rakoviny u člověka a v experimentálních 
systémech.  
Při této zkoušce jsou rutinn ě používáni hlodavci. Cílovou tkání je 
v této zkoušce kostní d řeň, poněvadž je vysoce vaskularizovanou 
tkání a obsahuje populaci bun ěk s rychlým cyklem, které se snadno 
izolují a zpracovávají. Jiné druhy a cílové tkán ě nejsou p ředmětem 
této metody.  
Tato zkouška na chromozomové aberace je zvlášt ě určená 
k posouzení nebezpe čí mutagenese, nebo ť umožňuje zohlednit 
faktory metabolismu  in vivo , farmakokinetiku a procesy reparace 
DNA, třebaže se mohou u r ůzných druh ů a tkání m ěnit. Zkouška  
in vivo  je rovněž užitečná pro další výzkum mutagenních ú činků 
zjištěných zkouškou  in vitro . 
Jestliže existuje d ůkaz o tom, že se zkoušená látka nebo reaktivní 
metabolity nedostanou do cílové tkán ě, není vhodné tuto zkoušku 
použít.  
Viz také obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Chromatidová aberace:  strukturní poškození chromozomu 
v podobě zlomu jednotlivých chromatid nebo zlomu a op ětného 
spojení chromatid.  
Chromozomová aberace:  strukturní poškození chromozomu 
v podobě zlomu nebo zlomu a spojení obou chromatid v tomtéž 
místě. 
Endoreduplikace:  proces, p ři kterém v jád ře po S-fázi replikace 
DNA nedojde k mitóze, nýbrž následuje další S-fáze. Výsledkem 
jsou chromozomy se 4, 8, 16… chromatidami.  
Gap:  achromatická léze menší než ší řka jednoho chromatidu a s 
minimální odchylkou chromatid.  
Numerická aberace:  odchylka po čtu chromozom ů od normálního 
počtu obvyklého u použitého typu bun ěk. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Polyploidie:  násobek haploidního po čtu chromozomových sad ( n) 
jiný než diploidní (tj. 3 n, 4n atd.).  
Strukturní aberace:  mikroskopicky pozorovatelné zm ěny struktury 
chromozom ů při buněčném dělení ve stadiu metafáze; jeví se jako 
delece a fragmenty, intrachromozomální nebo interchromozomální 
změny. 
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zvířata jsou vystavena zkoušené látce vhodným zp ůsobem a ve 
vhodném okamžiku po aplikaci se usmrtí. P řed usmrcením se 
zvířatům podá látka zastavující metafázi (nap ř. kolchicin nebo Colce ­
mide  ® ). Z buněk kostní d řeně se poté p řipraví preparáty chromo ­
zomů, obarví se a analyzují se chromozomové aberace bun ěk 
v metafázi.  
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Přípravky  
1.4.1.1  Výb ěr druhu zví řat 
Běžně je používán potkan, myš a k řeček čínský, ačkoli lze použít 
jakýkoli vhodný sav čí druh. Použity by m ěly být běžně používané 
kmeny mladých zdravých dosp ělých zvířat. V okamžiku zahájení 
studie by m ěla být odchylka v hmotnosti zví řat minimální 
a neměla by u obou pohlaví p řekročit ± 20 % st řední hodnoty 
hmotnosti.  
1.4.1.2  Podmínky chovu a strava  
Platí obecné podmínky podle obecného úvodu k části B, přičemž by 
mělo být dosaženo vlhkosti vzduchu 50–60 %.  
1.4.1.3  Příprava zví řat 
Zdravá mladá dosp ělá zvířata se náhodn ě přiřadí do kontrolních 
a experimentálních skupin. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby 
byl vliv umíst ění klecí minimalizován. Zví řata se jednozna čně iden­
tifikují. Nechají se v laboratorních podmínkách alespo ň pět dní akli ­
matizovat.  
1.4.1.4  Příprava dávek  
Pevné zkoušené látky by m ěly být před aplikací zví řatům rozpušt ěny 
nebo suspendovány ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech 
a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být podávány 
přímo nebo mohou být p řed podáním z ředěny. Měly by být použity 
čerstvě připravené zkoušené látky, pokud údaje o stálosti neprokazují 
možnost skladování.  
1.4.2  Zkušební podmínky  
1.4.2.1  Rozpoušt ědlo/vehikulum  
Rozpoušt ědlo/vehikulum by nem ělo mít p ři použitých úrovních 
dávek toxické ú činky a mělo by být vylou čeno podez ření, že reaguje 
se zkoušenou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, m ělo by být jejich za řazení podloženo údaji 
o jejich kompatibilit ě. Doporu čuje se pokud možno nejd říve zvážit 
použití vodných rozpoušt ědel/vehikul.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2  Kontroly  
Součástí každého experimentu by m ěly být pozitivní a negativní 
(rozpoušt ědlo/vehikulum) kontroly pro ob ě pohlaví. S výjimkou apli ­
kace zkoušené látky by m ěla zvířata kontrolní skupiny podstoupit 
identický proces jako zví řata ve skupinách, v nichž dojde k expozici.  
Pozitivní kontroly by m ěly poskytovat strukturní aberace  in vivo  při 
expozičních úrovních, u nichž se o čekává, že poskytnou detekova ­
telný nár ůst nad pozadí. Dávky pozitivní kontroly by m ěly být 
zvoleny tak, aby byl ú činek zřetelný, ale aby p ři odečtu nevyšla 
ihned najevo kódovaná identifikace preparátu. Je p řijatelné, aby 
byla pozitivní kontrola podávána jiným zp ůsobem než zkoušená 
látka a aby byl odb ěr v jejím p řípadě prováděn jen jednou. Pro 
pozitivní kontrolu mohou být použity chemické látky ze stejné chemické t řídy, jsou-li k dispozici. P říklady pozitivních 
a negativních kontrol:
 
Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS  
ethyl-methansulfonát 62-50-0 200-536-7 
1-ethyl-1-nitrosomo čovina 759-73-9 212-072-2 
mitomycin C 50-07-7 200-008-6 cyklofosfamid 
cyklofosfamid monohydrát 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
2,4,6-tris(aziridin-1-yl)- 1,3,5-triazin 51-18-3 200-083-5
 
V okamžiku každého odb ěru by m ěl být proveden odb ěr 
u negativních kontrol, jimž je aplikováno pouze rozpoušt ědlo nebo 
vehikulum a jež jinak podstupují stejný proces jako exponované 
skupiny, pokud nejsou z dosavadních kontrolních údaj ů k dispozici 
přijatelné údaje o variabilit ě zvířat a četnosti bun ěk 
s chromozomovými aberacemi. Provádí-li se pro negativní kontrolu 
jeden odb ěr, je nejvhodn ějším okamžikem doba prvního odb ěru. 
Kromě toho by m ěly být neexponované kontroly použity také tehdy, 
neexistují-li dosud kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní 
účinky.
 
1.5 POSTUP  
1.5.1  Po čet a pohlaví zví řat 
Každá exponovaná a kontrolní skupina se skládá z alespo ň pěti 
analyzovatelných zví řat pro každé pohlaví. Jestliže jsou v dob ě 
studie k dispozici údaje ze studií se stejným druhem a za použití stejného zp ůsobu expozice, jež prokazují, že neexistuje mezi pohla ­
vími rozdíl v toxicit ě, bude posta čující zkoušení jednoho pohlaví. Je- 
li expozice člověka specifická pro ur čité pohlaví, jako je tomu nap ří­
klad u n ěkterých farmaceutických látek, m ěla by být zkouška 
provedena se zví řaty odpovídajícího pohlaví.
 
1.5.2  Plán expozice  
Zkoušené látky by m ěly být pokud možno podávány jednorázov ě. 
Zkoušené látky mohou být podávány také ve dvou dávkách, tzn. dv ě 
dávky v týž den v rozmezí ne více než n ěkolika hodin, aby bylo 
usnadněno podávání velkých objem ů materiálu. Jiné režimy podá ­
vání by m ěly být vědecky zd ůvodněny. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Vzorky by m ěly být odebrány ve dvou r ůzných intervalech od apli ­
kace podané v jednom dni. U hlodavc ů se odběr provádí po takové 
době od aplikace, která odpovídá 1,5 násobku normální délky bun ěč­
ného cyklu (jenž trvá obvykle 12–18 hodin). Pon ěvadž doba 
nezbytná pro p říjem a metabolismus zkoušené látky a rovn ěž pro 
účinky na kinetiku bun ěčného cyklu m ůže mít vliv na optimální 
okamžik pro stanovení chromozomových aberací, doporu čuje se 
provést další odb ěr po 24 hodinách od prvního odb ěru. Je-li aplikace 
rozložena do více než jednoho dne, m ěl by být odb ěr proveden po 
takové dob ě od poslední aplikace, která odpovídá 1,5 násobku 
normální délky bun ěčného cyklu.  
Před usmrcením se zví řatům intraperitoneáln ě podá vhodná dávka 
látky zastavující metafázi (nap ř. Colcemid  ® nebo kolchicin). Poté 
se po vhodné dob ě provede u zví řat odběr. U myši je tato doba 
přibližně 3–5 hodin; u k řečka čínského je tato doba p řibližně 4–5 
hodin. Z kostní d řeně se odeberou bu ňky a analyzují se na chromo ­
zomové aberace.  
1.5.3  Dávkování  
Provádí-li se kv ůli neexistenci vhodných dostupných údaj ů studie 
pro zjištění rozsahu dávek, m ěla by být provedena ve stejné labora ­
toři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu 
expozice, které se použijí v hlavní studii (5). V p řípadě toxicity se 
pro první odb ěr použijí t ři úrovně dávky. Tyto úrovn ě dávky by 
měly pokrývat rozp ětí dané maximální a minimální toxicitou, 
případně žádnou toxicitou. P ři pozdějším odběru stačí, když bude 
použita pouze nejvyšší dávka. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že vyšší dávky by vedly při stejném režimu dávkování podle o čekávání k letalit ě. 
Látky se specifickou biologickou aktivitou p ři nízkých netoxických 
dávkách (nap ř. hormony a mitogeny) nemusí kritériím stanovení 
dávky vyhovovat a m ěly by být hodnoceny p řípad od p řípadu. 
Nejvyšší dávka m ůže být také definována jako dávka vyvolávající 
v kostní d řeni některé známky toxicity (nap ř. více než 50 % snížení 
mitotického indexu).
 
1.5.4  Limitní zkouška  
Jestliže zkouška s jednou dávkou alespo ň 2 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti podanou jednorázov ě nebo ve dvou dávkách v jednom dni 
nevykazuje žádné pozorovatelné toxické ú činky a není-li na základ ě 
údajů o látkách, které mají podobnou strukturu, o čekávána genoto ­
xicita, nepovažuje se úplná studie se t řemi úrovn ěmi dávky za 
nezbytnou. U déle trvajících studií je limitní dávkou pro 14denní 
aplikaci 2 000 mg/kg t ělesné hmotnosti/den a pro delší než 14denní 
aplikaci je limitní dávkou 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti/den. 
Očekávaná expozice člověka může znamenat pot řebu použít 
v limitní zkoušce vyšší úrove ň dávky.  
1.5.5  Podávání dávek  
Zkoušená látka se obvykle podává nitrožalude čně, žaludeční sondou 
nebo vhodnou intuba ční kanylou, nebo intraperitoneální injekcí. Jiné 
způsoby podávání jsou v od ůvodněných případech p řijatelné. Maxi ­
mální objem kapaliny, který m ůže být najednou podán nitrožalu ­
dečně nebo injek čně, závisí na velikosti testovacího zví řete. Objem 
by neměl překročit 2 ml/100 g t ělesné hmotnosti. Použití vyšších 
objemů, než je uvedený objem, musí být zd ůvodněno. Až na dráž ­
divé a žíravé látky, které obvykle p ři vyšších koncentracích vykazují 
zesílené ú činky, by m ěla být variabilita zkušebního objemu minima ­
lizována nastavením koncentrace zajiš ťující konstantní objem p ři 
všech úrovních dávky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6  Příprava preparát ů pro analýzu chromozom ů 
Ihned po usmrcení se odebere kostní d řeň, hypotonizuje se a fixuje. 
Buňky se nanesou na podložní sklí čka a obarví se.  
1.5.7  Analýza  
Jako měřítko cytotoxicity by m ěl být u všech exponovaných zví řat 
(včetně pozitivních kontrol) a u neexponovaných zví řat pro negativní 
kontrolu stanoven mitotický index, a to alespo ň u 1 000 bun ěk na 
jedno zví ře. 
U každého zví řete by m ělo být analyzováno alespo ň 100 bun ěk. 
Tento počet lze snížit, je-li pozorován velký po čet aberací. Všechny 
preparáty, v četně preparát ů pozitivních a negativních kontrol, by 
měly být p řed analýzou pod mikroskopem nezávisle kódovány. 
Protože p ři fixaci často dochází ke chromozomálním zlom ům nebo 
ke ztrátě chromozom ů u části buněk v metafázi, m ěly by vyšet řované 
buňky obsahovat centromery v po čtu odpovídajícímu číslu 2n ± 2.  
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Údaje pro jednotlivá zví řata by m ěly být zpracovány ve form ě 
tabulky. Experimentální jednotkou je zví ře. Pro každé zví ře by měl 
být vyhodnocen po čet buněk, počet aberací na bu ňku a počet buněk 
s chromozomovou aberací (chromozomovými aberacemi) vyjád řený 
v procentech. Pro exponované a kontrolní skupiny by m ěly být 
uvedeny r ůzné typy strukturních chromozomových aberací s jejich 
počtem a četností. Gapy se zaznamenávají odd ěleně a uvádějí se, ale 
nezahrnují se do celkové četnosti aberací. Neexistuje-li d ůkaz 
o rozdílu v odpov ědi mezi pohlavími, mohou být pro statistickou 
analýzu údaje pro ob ě pohlaví zkombinovány.  
2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Pro stanovení pozitivního výsledku existuje n ěkolik kritérií, nap ř. 
nárůst relativního po čtu buněk s chromozomovými aberacemi 
v závislosti na dávce nebo jasný nár ůst počtu buněk s aberacemi 
pro skupinu s ur čitou dávkou a k ur čitému okamžiku odb ěru. 
Nejdříve by m ěla být uvážena biologická relevance výsledk ů. Při 
hodnocení výsledk ů zkoušky mohou být použity jako pomocný 
prostředek statistické metody (6). Statistická významnost by nem ěla 
být jediným ur čujícím faktorem pro pozitivní odpov ěď. Dvojzna čné 
výsledky by m ěly být vyjasn ěny dalším zkoušením, nejlépe 
s úpravami experimentálních podmínek.  
Nárůst polyploidie m ůže znamenat, že zkoušená látka má potenciál 
indukovat numerické chromozomové aberace. Nár ůst počtu buněk 
s endoreduplikovanými chromozomy m ůže znamenat, že zkoušená 
látka má schopnost potla čit progresi bun ěčného cyklu (7, 8).  
Zkoušená látka, jejíž výsledky nespl ňují výše uvedená kritéria, se 
v tomto systému považuje za nemutagenní.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Ačkoli většina experiment ů poskytne jasn ě pozitivní nebo negativní 
výsledky, v ojedin ělých případech neumožní soubor údaj ů vyslovit 
konečný výrok o aktivit ě zkoušené látky. Výsledky mohou z ůstat 
dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment 
opakován.  
Pozitivní výsledky zkoušky na chromozomové aberace  in vivo  
znamenají, že zkoušená látka indukuje v kostní d řeni testovacího 
druhu chromozomové aberace. Negativní výsledky znamenají, že 
zkoušená látka za podmínek zkoušky neindukuje v kostní d řeni 
testovacího druhu chromozomové aberace.  
Měla by být diskutována pravd ěpodobnost, s jakou se zkoušená látka 
nebo její metabolity dostanou do krevního ob ěhu, nebo specificky do 
cílové tkán ě (např. systémová toxicita).  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Rozpoušt ědlo/vehikulum  
— zdůvodnění volby vehikula,  
— rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpoušt ědle/vehikulu, je-li 
známa.  
Testovací zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— původ, podmínky chovu, strava atd.,  
— individuální hmotnost zví řat na počátku zkoušky, v četně rozpětí 
tělesné hmotnosti, st řední hodnoty a sm ěrodatné odchylky pro 
každou skupinu.  
Zkušební podmínky:  
— pozitivní a negativní (vehikulum/rozpoušt ědlo) kontroly,  
— údaje ze studie pro zjišt ění rozsahu, pokud byla provedena,  
— zdůvodnění zvolených úrovní dávek,  
— údaje o p řípravě zkoušené látky,  
— údaje o podávání zkoušené látky,  
— zdůvodnění způsobu podávání,  
— popřípadě metody ov ěření, zda se zkoušená látka dostala do 
krevního ob ěhu nebo do cílové tkán ě, 
— případně přepočet mezi koncentrací zkoušené látky v krmivu 
nebo vod ě (ppm) na odpovídající dávku (mg/kg t ělesné 
hmotnosti/den),  
— podrobné údaje o kvalit ě krmiva a vody,  
— podrobný popis rozvrhu expozice a odb ěru, 
— metody stanovení toxicity,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— identifikace látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka 
aplikace,  
— metody p řípravy preparát ů, 
— kritéria hodnocení aberací,  
— počet analyzovaných bun ěk na jedno zví ře, 
— kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojzna č­
nou. 
Výsledky:  
— známky toxicity,  
— mitotický index,  
— typ a po čet aberací uvedený samostatn ě pro každé zví ře, 
— celkový po čet aberací ve skupin ě se středními hodnotami 
a směrodatnými odchylkami,  
— celkový po čet aberací ve skupin ě se středními hodnotami 
a směrodatnými odchylkami,  
— změny ploidie, pokud byly pozorovány,  
— podle možnosti závislost odpov ědi na dávce,  
— případné statistické analýzy,  
— údaje o soub ěžné negativní kontrole,  
— dosavadní údaje o negativní kontrole s rozp ětími, středními 
hodnotami a sm ěrodatnými odchylkami,  
— údaje o soub ěžné pozitivní kontrole.  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry 
(Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., s. 275–306.  
2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. 
and Shelby, M. (1987). Mammalian  In Vivo  Cytogenetic Assays: 
Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, 157–165.
 
3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Boot ­
man, J. and Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetic Assays. 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141.
 
4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, 
D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, 
S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on 
the in Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration 
Test. Mutation Res., 312, 305–312.
 
5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, 313–319.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, 
G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, 
J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic 
Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutage ­
nicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University 
Press, Cambridge. s. 184–232.  
7) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 
119, 403–413.  
8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, 1362–1364.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12  MUTAGENITA – TEST SAV ČÍCH ERYTROCYTÁRNÍCH 
MIKROJADER  IN VIVO  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 474 – Test sav čích 
erytrocytárních mikrojader in vivo (1997).  
1.1 ÚVOD  
Test savčích erytrocytárních mikrojader  in vivo  je používán pro 
detekci poškození chromozom ů nebo mitotického aparátu erytro ­
blastu, které je indukováno zkoušenou látkou, a to pomocí analýzy erytrocytů odebraných z kostní d řeně a/nebo bun ěk periferní krve, 
obvykle hlodavc ů.
 
Účelem testu sav čích erytrocytárních mikrojader je identifikovat 
látky, které zp ůsobují cytogenetické poškození, jehož výsledkem je 
tvorba mikrojader obsahujících nereplikující se (lagging) chromozo ­
mové fragmenty nebo celé chromozomy.  
Když se erytroblast kostní d řeně mění na polychromatický erytrocyt, 
hlavní jádro je vypuzeno a mikrojádra, která p ři tom mohou vznik ­
nout, zůstávají v cytoplasm ě, která jinak jádra neobsahuje. Zviditel ­
nění mikrojader je v t ěchto buňkách usnadn ěno tím, že neobsahují 
hlavní jádro. Nár ůst výskytu polychromatických erytrocyt ů 
s mikrojádry v exponovaných zví řatech je známkou indukovaného 
chromozomového poškození.  
V tomto testu je rutinn ě používána kostní d řeň hlodavců, poněvadž 
tato tkáň produkuje polychromatické erytrocyty. Stanovení nezralých 
(polychromatických) erytrocyt ů s mikrojádry v periferní krvi je 
rovnocenn ě přijatelné u kteréhokoli druhu, u n ěhož byla prokázána 
neschopnost sleziny odstra ňovat erytrocyty s mikrojádry, nebo dosta ­
tečná citlivost detekovat činitele, které zp ůsobují strukturní nebo 
numerické chromozomové aberace. Mikrojádra lze rozlišit řadou 
kritérií. Ta zahrnují identifikaci p řítomnosti nebo nep řítomnosti 
centromerní (kinetochorní) DNA v mikrojád ře. Vyšetřuje se zejména 
četnost nezralých (polychromatických) erytrocyt ů s mikrojádry. 
Počet zralých (normochromatických) erytrocyt ů v periferní krvi, 
které obsahují mikrojádra, p řipadající na ur čitý počet zralých erytro ­
cytů lze rovn ěž použít jako kone čný výsledek zkoušky, jestliže jsou 
zvířata exponována čtyři týdny nebo déle.  
Tento test sav čích erytrocytárních mikrojade  in vivo  je zvlášt ě 
vhodný k posouzení nebezpe čí mutagenese, nebo ť umožňuje 
zohlednit faktory metabolismu  in vivo  farmakokinetiku a procesy 
reparace DNA, t řebaže se mohou lišit u r ůzných druh ů a tkání, 
jakož i z genetického hlediska. Zkouška  in vivo  je rovněž užitečná 
pro další výzkum mutagenních ú činků zjištěných v systémech  in 
vitro . 
Jestliže existuje d ůkaz o tom, že se zkoušená látka nebo reaktivní 
metabolity nedostanou do cílové tkán ě, není vhodné tuto zkoušku 
použít.  
Viz také obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2 DEFINICE  
Centromera (kinetochor):  oblast (oblasti) chromozomu, k níž (k 
nimž) se b ěhem dělení buněk připojí dělící vřeténko umož ňující 
uspořádaný pohyb dce řiných chromozom ů k pólům dceřiných bun ěk. 
Mikrojádra:  malá jádra existující odd ěleně od hlavních jader 
a vedle nich, vytvá řená během telofáze mitosy (meiosy) nereplikují ­
cími se (lagging) chromozomovými fragmenty nebo celými chromo ­
zomy.  
Normochromatický erytrocyt:  zralý erytrocyt neobsahující ribo ­
zomy, který lze rozlišit od nezralých polychromatických erytrocyt ů 
barvivem selektivním pro ribozomy.  
Polychromatický erytrocyt:  nezralý erytrocyt ve vývojovém mezi ­
stadiu, který ješt ě obsahuje ribozomy, a m ůže být tedy rozlišen od 
zralých normochromatických erytrocyt ů barvivem selektivním pro 
ribozomy.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zvířata se vhodným zp ůsobem vystaví zkoušené látce. P ři použití 
kostní dřeně se zvířata ve vhodném okamžiku po expozici usmrtí, 
odebere se kostní d řeň, připraví se preparáty a obarví se (1, 2, 3, 4, 
5, 6, 7). P ři použití periferní krve se krev ve vhodném okamžiku po 
expozici odebere, rozet řením se p řipraví preparát a obarví se (4, 8, 9, 
10). Při studiích s periferní krví by m ěla mezi poslední expozicí 
a sklizením bun ěk uplynout co nejkratší doba. Preparáty jsou analy ­
zovány na p řítomnost mikrojader.  
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Přípravky  
1.4.1.1  Výb ěr druhu zví řat 
Při použití kostní d řeně se jako testovací zví ře doporučuje myš nebo 
potkan, a čkoli lze použít jakýkoli vhodný sav čí druh. P ři použití 
periferní krve se doporu čuje myš. Lze však použít jakýkoli vhodný 
druh savce za p ředpokladu, že jde o druh, u n ěhož slezina neodstra ­ 
ňuje erytrocyty s mikrojádry, nebo druh vykazující dostate čnou citli­
vost detekovat činitele, které zp ůsobují strukturní nebo numerické 
chromozomové aberace. Použijí se mladá zdravá dosp ělá zvířata 
běžně užívaných laboratorních kmen ů. V okamžiku zahájení studie 
by měla být odchylka v hmotnosti zví řat minimální a nem ěla by 
u obou pohlaví p řekročit ± 20 % st řední hodnoty hmotnosti.  
1.4.1.2  Podmínky chovu a strava  
Platí obecné podmínky podle obecného úvodu k části B, přičemž by 
mělo být dosaženo vlhkosti vzduchu 50–60 %.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3  Příprava zví řat 
Zdravá mladá dosp ělá zvířata se náhodn ě přiřadí do kontrolních 
a experimentálních skupin. Zví řata se jednozna čně identifikují. 
Nechají se v laboratorních podmínkách alespo ň pět dní aklimatizo ­
vat. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby byl vliv umíst ění klecí 
minimalizován.  
1.4.1.4  Příprava dávek  
Pevné zkoušené látky by m ěly být před aplikací zví řatům rozpušt ěny 
nebo suspendovány ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech 
a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být podávány 
přímo nebo mohou být p řed podáním z ředěny. Měly by být použity 
čerstvě připravené zkoušené látky, pokud údaje o stálosti neprokazují 
možnost skladování.  
1.4.2  Zkušební podmínky  
1.4.2.1  Rozpoušt ědlo/vehikulum  
Rozpoušt ědlo/vehikulum by nem ělo mít p ři použitých úrovních 
dávek toxické ú činky a mělo by být vylou čeno podez ření, že reaguje 
se zkoušenou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, m ělo by být jejich za řazení podloženo údaji 
o jejich kompatibilit ě. Doporu čuje se pokud možno nejd říve zvážit 
použití vodných rozpoušt ědel/vehikul.
 
1.4.2.2  Kontroly  
Součástí každého experimentu by m ěly být pozitivní a negativní 
(rozpoušt ědlo/vehikulum) kontroly pro ob ě pohlaví. S výjimkou apli ­
kace zkoušené látky by m ěla zvířata kontrolní skupiny podstoupit 
identický proces jako zví řata ve skupinách, v nichž dojde k expozici.  
Pozitivní kontroly by m ěly produkovat mikrojádra  in vivo  při expo­
zičních úrovních, u nichž se o čekává, že poskytnou detekovatelný 
nárůst nad pozadí. Dávky pozitivní kontroly by m ěly být zvoleny 
tak, aby byl ú činek zřetelný, ale aby p ři odečtu nevyšla ihned najevo 
kódovaná identifikace preparátu. Je p řijatelné, aby pozitivní kontrola 
byla podávána jiným zp ůsobem než zkoušená látka a aby byl odb ěr 
v tomto p řípadě prováděn jen jednou. Pro pozitivní kontrolu navíc 
může být vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické 
třídy, jsou-li k dispozici. P říklady látek pro pozitivní kontrolu:  
Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS  
ethyl-methansulfonát 62-50-0 200-536-7 
1-ethyl-1-nitrosomo čovina 759-73-9 212-072-2 
mitomycin C 50-07-7 200-008-6 cyklofosfamid 
cyklofosfamid monohydrát 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
2,4,6-tris(aziridin-1-yl)- 1,3,5-triazin 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
V okamžiku odb ěru by měl být proveden odb ěr u skupiny negativní 
kontroly, které je aplikováno pouze rozpoušt ědlo nebo vehikulum 
a která jinak podstupuje stejný proces jako exponované skupiny, pokud nejsou z dosavadních kontrolních údaj ů k dispozici p řijatelné 
údaje o variabilit ě zvířat a četnosti bun ěk s mikrojádry. Provádí-li se 
pro negativní kontrolu jeden odb ěr, je nejvhodn ějším okamžikem 
doba prvního odb ěru. Krom ě toho by m ěly být neexponované 
kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpoušt ědlo/vehikulum nevyvolává žádné 
zhoubné nebo mutagenní ú činky.
 
Při použití periferní krve m ůže být jako negativní kontrola p řijatelný 
také vzorek krve odebraný p řed expozicí, pouze však u krátkých 
studií s periferní krví (nap ř. 1–3 aplikace) za p ředpokladu, že 
výsledné údaje budou v rozp ětí, které se na základ ě dosavadních 
kontrol o čekává.  
1.5 POSTUP  
1.5.1  Po čet a pohlaví zví řat 
Každá exponovaná a kontrolní skupina se musí skládat z alespo ň pěti 
analyzovatelných zví řat pro každé pohlaví (11). Jestliže jsou v dob ě 
studie k dispozici údaje ze studií se stejným druhem a za použití stejného zp ůsobu expozice, jež prokazují, že neexistuje mezi pohla ­
vími rozdíl v toxicit ě, bude posta čující zkoušení jednoho pohlaví. Je- 
li expozice člověka specifická pro ur čité pohlaví, jako je tomu nap ří­
klad u n ěkterých farmaceutických látek, m ěla by být zkouška 
provedena se zví řaty odpovídajícího pohlaví.
 
1.5.2  Plán aplikace  
Nelze doporu čit žádný standardní plán (tj. jednu, dv ě nebo tři apli­
kace v intervalu 24 hodin). Vzorky ze studií s prodlouženým 
režimem podávání jsou p řijatelné, pokud se u t ěchto studií prokáží 
pozitivní výsledky, nebo – v p řípadě negativních studií – pokud byla 
prokázána toxicita nebo byla uplatn ěna limitní dávka a podávání 
pokračuje až do okamžiku odb ěru. Zkoušené látky mohou být podá ­
vány také ve dvou dávkách, tzn. dv ě dávky v týž den v rozmezí ne 
více než n ěkolika hodin, aby bylo usnadn ěno podávání velkých 
objemů materiálu.  
Test může být proveden dv ěma způsoby:  
a) zkoušená látka se aplikuje zví řatům jednou. Vzorky kostní d řeně 
se odeberou alespo ň dvakrát, p řičemž první odb ěr se provede 
nejdříve 24 hodin po aplikaci a poslední nejpozd ěji 48 hodin 
po aplikaci a s p řiměřeným odstupem mezi odb ěry. Odběr dříve 
než 24 hodin po aplikaci musí být zd ůvodněn. Vzorky periferní 
krve se odeberou alespo ň dvakrát, p řičemž první odb ěr se 
provede nejd říve 36 hodin po aplikaci a poslední nejpozd ěji 72 
hodin po aplikaci a po prvním odb ěru se dodrží odpovídající 
odstup. Je-li po prvním odb ěru pozorována pozitivní odpov ěď, 
není další odb ěr nutný;  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) jsou-li podávány dv ě nebo více dávek denn ě (např. dvě nebo více 
dávek v intervalu 24 hodin), m ěly by být vzorky p ři použití 
kostní dřeně odebrány jednou po 18 až 24 hodinách po poslední 
aplikaci a p ři použití periferní krve jednou po 36 až 48 hodinách 
po poslední aplikaci (12).  
Podle pot řeby mohou být navíc použity jiné doby odb ěru. 
1.5.3  Dávkování  
Provádí-li se kv ůli neexistenci vhodných dostupných údaj ů studie 
pro zjištění rozsahu dávek, m ěla by být provedena ve stejné labora ­
toři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu 
expozice, jež se použijí v hlavní studii (13). V p řípadě toxicity se pro 
první odb ěr použijí t ři úrovně dávky. Tyto úrovn ě dávky by m ěly 
pokrývat rozp ětí dané maximální a minimální toxicitou, p řípadně 
žádnou toxicitou. P ři pozdějším odb ěru stačí, když bude použita 
pouze nejvyšší dávka. Nejvyšší dávka je definována jako dávka 
vyvolávající takové známky toxicity, že vyšší dávky by vedly p ři 
stejném režimu dávkování podle o čekávání k letalit ě. Látky se speci ­
fickou biologickou aktivitou p ři nízkých netoxických dávkách (nap ř. 
hormony a mitogeny) nemusí kritériím stanovení dávky vyhovovat 
a měly by být hodnoceny p řípad od p řípadu. Nejvyšší dávka m ůže 
být také definována jako dávka vyvolávající v kostní d řeni některé 
známky toxicity (nap ř. snížení podílu nezralých erytrocyt ů 
z celkového množství erytrocyt ů v kostní d řeni nebo v periferní 
krvi).  
1.5.4  Limitní zkouška  
Jestliže zkouška s jednou dávkou alespo ň 2 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti podanou jednorázov ě nebo ve dvou dávkách v jednom dni 
nevykazuje žádné pozorovatelné toxické ú činky a není-li na základ ě 
údajů o látkách, které mají podobnou strukturu, o čekávána genoto ­
xicita, nepovažuje se úplná studie se t řemi úrovn ěmi dávky za 
nezbytnou. U déle trvajících studií je limitní dávkou pro 14denní aplikaci 2 000 mg/kg t ělesné hmotnosti/den a pro delší než 14denní 
aplikaci je limitní dávkou 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti/den. 
Očekávaná expozice člověka může znamenat pot řebu použít 
v limitní zkoušce vyšší úrove ň dávky.
 
1.5.5  Podávání dávek  
Zkoušená látka se obvykle podává nitrožalude čně, žaludeční sondou 
nebo vhodnou intuba ční kanylou, nebo intraperitoneální injekcí. Jiné 
způsoby podávání jsou v od ůvodněných případech p řijatelné. Maxi ­
mální objem kapaliny, který m ůže být najednou podán nitrožalu ­
dečně nebo injek čně, závisí na velikosti testovacího zví řete. Objem 
by neměl překročit 2 ml/100 g t ělesné hmotnosti. Použití vyšších 
objemů, než je uvedený objem, musí být zd ůvodněno. Až na dráž ­
divé a žíravé látky, které obvykle p ři vyšších koncentracích vykazují 
zesílené ú činky, by m ěla být variabilita zkušebního objemu minima ­
lizována nastavením koncentrace zajiš ťující konstantní objem p ři 
všech úrovních dávky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6  Příprava kostní d řeně nebo krve  
Buňky kostní d řeně se obvykle získávají z femuru nebo tibie ihned 
po usmrcení. Bu ňky se odeberou z femuru nebo tibie a zavedenými 
metodami se preparují a obarví. Periferní krev se získává z ocasní 
žíly nebo jiné vhodné krevní cévy. Krevní bu ňky se ihned supravi ­
tálně obarví (8, 9, 10), nebo se p řipraví preparáty rozt ěrem a poté se 
obarví. Použitím barviva specifického pro DNA (nap ř. akridinová 
oranž (14) nebo Hoechst 33258 a pyronin-Y (15)) se lze vyhnout 
některým artefakt ům spojeným s použitím barviva nespecifického 
pro DNA. Tato výhoda nebrání použití konven čních barviv (nap ř. 
Giemsa). P řídavné systémy (nap ř. celulosová kolona k odstran ění 
buněk obsahujících jádra (16)) lze použít za p ředpokladu, že se 
prokázala odpovídající funk čnost těchto systém ů pro preparaci 
mikrojader v laborato ři. 
1.5.7  Analýza  
Pro každé zví ře se stanoví podíl nezralých erytrocyt ů z celkového 
(nezralé + zralé) množství erytrocyt ů, přičemž se v p řípadě kostní 
dřeně použije celkov ě alespoň 200 erytrocyt ů a v případě periferní 
krve alespo ň 1 000 erytrocyt ů (17). Všechny preparáty, v četně 
preparátů pozitivních a negativních kontrol, by m ěly být p řed 
analýzou pod mikroskopem nezávisle kódovány. U každého zví řete 
se vyšetří alespoň 2 000 nezralých erytrocyt ů na výskyt mikrojader 
v nezralých erytrocytech. Další informace mohou být získány vyšetřením zralých erytrocyt ů na výskyt mikrojader. P ři mikrosko ­
pické analýze by nem ěl být podíl nezralých erytrocyt ů z celkového 
množství erytrocyt ů menší než 20 % kontrolní hodnoty. Jestliže jsou 
zvířata exponována nep řetržitě čtyři týdny nebo déle, lze také 
vyšetřit na výskyt mikrojader alespo ň 2 000 zralých erytrocyt ů na 
jedno zví ře. Systémy pro automatickou analýzu (analýza obrazu 
a průtoková cytometrická analýza bun ěčné suspenze) jsou po odpo ­
vídajícím zd ůvodnění a validaci p řijatelnými alternativami manuál ­
ního hodnocení.  
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Údaje pro jednotlivá zví řata by m ěly být zpracovány ve form ě 
tabulky. Experimentální jednotkou je zví ře. Pro každé analyzované 
zvíře by měl být uveden po čet vyšetřených nezralých erytrocyt ů, 
počet nezralých erytrocyt ů s mikrojádry a po čet nezralých erytrocyt ů 
z celkového množství erytrocyt ů. Jestliže jsou zví řata exponována 
nepřetržitě čtyři týdny nebo déle, m ěly by být také uvedeny údaje 
o zralých erytrocytech, byly-li shromaž ďovány. Pro každé zví ře se 
uvede podíl nezralých erytrocyt ů z celkového množství erytrocyt ů 
a případně množství erytrocyt ů s mikrojádry vyjád řené v procentech. 
Neexistuje-li d ůkaz o rozdílu v odpov ědi mezi pohlavími, mohou být 
pro statistickou analýzu údaje pro ob ě pohlaví zkombinovány.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Pro stanovení pozitivního výsledku existuje n ěkolik kritérií, nap ř. 
nárůst počtu buněk s mikrojádry v závislosti na dávce nebo jasný 
nárůst počtu buněk s mikrojádry pro skupinu s ur čitou dávkou a k 
určitému okamžiku odb ěru. Nejdříve by měla být uvážena biologická 
relevance výsledk ů. Při hodnocení výsledk ů zkoušky mohou být 
použity jako pomocný prost ředek statistické metody (18, 19). Statis ­
tická významnost by nem ěla být jediným ur čujícím faktorem pro 
pozitivní odpov ěď. Dvojzna čné výsledky by m ěly být vyjasn ěny 
dalším zkoušením, nejlépe s úpravami experimentálních podmínek.  
Zkoušená látka, jejíž výsledky nespl ňují výše uvedená kritéria, se 
v tomto systému považuje za nemutagenní.  
Ačkoli většina experiment ů poskytne jasn ě pozitivní nebo negativní 
výsledky, v ojedin ělých případech neumožní soubor údaj ů vyslovit 
konečný výrok o aktivit ě zkoušené látky. Výsledky mohou z ůstat 
dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment 
opakován.  
Pozitivní výsledky testu na mikrojádra znamenají, že zkoušená látka 
indukuje mikrojádra, jež jsou d ůsledkem chromozomového poško ­
zení nebo poškození mitotického aparátu erytroblastu testovacího druhu. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za 
podmínek zkoušky neprodukuje mikrojádra v nezralých erytrocytech 
testovacího druhu.
 
Měla by být diskutována pravd ěpodobnost, s jakou se zkoušená látka 
nebo její metabolity dostanou do krevního ob ěhu, nebo specificky do 
cílové tkán ě (např. systémová toxicita).  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat tyto údaje:  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— zdůvodnění volby vehikula,  
— rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpoušt ědle/vehikulu, je-li 
známa.  
Testovací zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— zdroj, podmínky chovu, strava atd.,  
— individuální hmotnost zví řat na počátku zkoušky, v četně rozpětí 
tělesné hmotnosti, st řední hodnoty a sm ěrodatné odchylky pro 
každou skupinu.  
Zkušební podmínky:  
— údaje k pozitivní a negativní (vehikulum/rozpoušt ědlo) kontrole,  
— údaje ze studie pro zjišt ění rozsahu, pokud byla provedena,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— zdůvodnění zvolených úrovní dávek,  
— údaje o p řípravě zkoušené látky,  
— údaje o podání zkoušené látky,  
— zdůvodnění způsobu podávání,  
— popřípadě metody ov ěření, zda se zkoušená látka dostala do 
krevního ob ěhu nebo do cílové tkán ě, 
— případně přepočet mezi koncentrací zkoušené látky v krmivu 
nebo vod ě (ppm) na odpovídající dávku (mg/kg t ělesné 
hmotnosti/den),  
— podrobné údaje o kvalit ě krmiva a vody,  
— podrobný popis rozvrhu expozice a odb ěru, 
— metody p řípravy preparát ů, 
— metody stanovení toxicity,  
— kritéria hodnocení mikrojader v nezralých erytrocytech,  
— počet analyzovaných bun ěk na jedno zví ře, 
— kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojzna č­
nou. 
Výsledky:  
— známky toxicity,  
— podíl nezralých erytrocyt ů z celkového množství erytrocyt ů, 
— počet nezralých erytrocyt ů s mikrojádry uvedený samostatn ě pro 
každé zví ře, 
— střední hodnota ± sm ěrodatná odchylka po čtu nezralých erytro ­
cytů s mikrojádry ve skupin ě, 
— podle možnosti závislost odpov ědi na dávce,  
— případné statistické analýzy a metody,  
— údaje o soub ěžné a dosavadní negativní kontrole,  
— údaje o soub ěžné pozitivní kontrole.  
— Rozbor výsledk ů. 
— Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Heddle, J.A. (1973). A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, 187–190.  
2) Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
9–15.  
3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavour ­
nin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induc ­
tion of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation 
Res. 123: 61–118.  
4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. 
and Heddle, J.A. (1990). The  In Vivo  Micronucleus Assay in 
Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of 
the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, 
Mutation Res., 239, 29–80.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
5) MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. 
(1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: „Developments in Science and Practice of Toxicology“, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. 
Miya, Elsevier, Amsterdam, 555–558.
 
6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., 
Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mamma ­
lian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189: 103–112.
 
7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. 
(1990). The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14: 513–522.
 
8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, 245–249.
 
9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood 
Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, 83–98.
 
10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test ( ­
CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study 
Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, 153–159.
 
11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blac ­
key, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994).  In 
Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 
312, 293–304.
 
12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, 313–319.
 
13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, 
D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British 
Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, 313–319.
 
14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test. Mutation Res., 120, 241–247.  
15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). 
A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. 
Mutation Res., 120, 269–275.  
16) Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The automated bone 
marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, 91–104.  
17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 
347, 97–99.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D.G. and Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetics Assay. 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Ches ­
ter, Melbourne, Sydney, s. 115–141.
 
19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and 
Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines 
for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14  MUTAGENITA – ZKOUŠKA NA REVERZNÍ MUTACE 
S BAKTERIEMI  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 471 – Zkouška na 
reverzní mutace s bakteriemi (1997).  
1.1 ÚVOD  
Při zkoušce na reverzní mutace s bakteriemi se používají bakteriální 
kmeny závislé na aminokyselinách  Salmonella typhimurium  
a Escherichia coli , k detekci bodových mutací, které zahrnují substi ­
tuci, adici a deleci jednoho nebo n ěkolika pár ů bází DNA (1, 2, 3). 
Podstata této zkoušky na reverzní mutace s bakteriemi spo čívá 
v detekci mutací, které revertují mutace obsažené v testovacích 
kmenech, a obnovují tak funk ční schopnost bakterií syntetizovat 
esenciální aminokyseliny. Bakterie po reverzi jsou detekovány díky své schopnosti r ůst v nepřítomnosti aminokyselin, které jsou vyžado ­
vány mate řským testovacím kmenem.
 
Bodové mutace a podobné jevy jsou p říčinou mnoha geneticky 
podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho d ůkazů o tom, 
že bodové mutace v onkogenech a v genech somatických bun ěk 
tlumících nádory mají podíl na tvorb ě rakoviny u člověka a u pokus ­
ných zvířat. Zkouška na reverzní mutace s bakteriemi je rychlá, 
nenákladná a relativn ě snadná. Mnoho testovacích kmen ů má řadu 
vlastností, díky nimž jsou citliv ější na detekci mutací, v četně respon­
sivních sekvencí DNA na reverzních místech, zvýšené permeability 
buněk pro velké molekuly a eliminaci repara čních systém ů DNA 
nebo zlepšení repara čních proces ů DNA náchylných k chybám. 
Specifičnost testovacích kmen ů může poskytnout n ěkteré užite čné 
informace o typech mutací, jež jsou indukovány genotoxickými čini­
teli. Pro zkoušky na reverzní mutací s bakteriemi je k dispozici velmi 
rozsáhlá databáze výsledk ů pro širokou škálu struktur a dále byly 
vyvinuty dob ře vyzkoušené metody zkoušení chemických látek, 
včetně těkavých slou čenin, s různými fyzikáln ě-chemickými vlast ­
nostmi.  
Viz také obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Zkouška na reverzní mutace : s bakteriemi  Salmonella typhimurium  
nebo  Escherichia coli  slouží k detekci mutací v kmeni vyžadujícím 
aminokyseliny (histidin resp. tryptofan), p řičemž vzniká kmen nezá ­
vislý na vn ějším přísunu aminokyseliny.  
Mutageny substituce pár ů bází:  činitele, jež zp ůsobují zm ěny 
v bázích DNA. P ři zkoušce reverzních mutací se mohou tyto 
změny vyskytnout na míst ě původní mutace nebo jiném míst ě bakte­
riálního genomu.  
Posunové mutageny:  činitele, jež zp ůsobují adici nebo deleci 
jednoho nebo více pár ů bází DNA a posunují tak čtecí rámec RNA.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3 VÝCHOZÍ ÚVAHY  
Při zkouškách na reverzní mutace s bakteriemi se využívají 
prokaryotické bu ňky, které se liší od bun ěk savců faktory, jako 
jsou příjem, metabolismus, chromozomová struktura a repara ční 
procesy DNA. Zkoušky provád ěné in vitro  obecně vyžadují použití 
vnějšího zdroje metabolické aktivace. Metabolické aktiva ční systémy  
in vitro  nemohou zcela napodobit podmínky  in vivo  u savců. 
Zkouška tedy neposkytuje p římou informaci o mutagenním 
a karcinogenním potenciálu látky pro savce.  
Zkouška na reverzní mutace s bakteriemi je zpravidla využívána pro 
počáteční vyšetření genotoxické aktivity, a zejména aktivity vyvolá ­
vající bodové mutace. Z rozsáhlé databáze vyplývá, že mnoho 
chemických látek, které jsou v této zkoušce pozitivní, vykazuje 
mutagenní aktivitu i v jiných zkouškách. Existují p říklady mutagen ­
ních činitelů, které nejsou detekovány touto zkouškou. P říčiny těchto 
skutečností lze spat řovat ve specifické povaze detekovaného kone č­
ného jevu, v rozdílech v metabolické aktivaci nebo v rozdílech 
v biologické dostupnosti. Na druhé stran ě faktory, které zvyšují 
citlivost zkoušky na reverzní mutace na bakteriích, mohou vést k nadhodnocení mutagenní aktivity.
 
Zkouška na reverzní mutace s bakteriemi nemusí být vhodná pro 
určité třídy chemických látek, nap říklad vysoce baktericidní slou če­
niny (nap ř. určitá antibiotika) a pro chemické látky, o nichž se 
předpokládá (nebo o nichž se ví), že specificky zasahují do replika č­
ního systému bun ěk savců (např. některé inhibitory topoisomerasy 
a některé analogy nukleosid ů). V takových p řípadech mohou být 
vhodnější zkoušky mutagenity u savc ů. 
Přestože mnoho slou čenin, pro n ěž je tato zkouška pozitivní, je 
karcinogenní pro savce, není korelace absolutní. Závisí na chemické 
třídě a existuje mnoho karcinogen ů, jež nejsou detekovány touto 
zkouškou, nebo ť působí jinými, negenotoxickými mechanismy, 
nebo mechanismy, které v bakteriálních bu ňkách neexistují.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Suspenze bakteriálních bun ěk jsou vystaveny zkoušené látce, a to za 
přítomnosti vn ějšího metabolického aktiva čního systému a bez n ěho. 
Ve standardním miskovém testu se suspenze smíchají s vrchním 
agarem a ihned se nanesou na minimální p ůdu. V preinkuba ční 
metodě se zkoušená sm ěs inkubuje a poté se p řed nanesením na 
minimální p ůdu smíchá s vrchním agarem. P ři obou technikách se 
po dvou nebo t řech dnech inkubace spo čítají kolonie revertant ů 
a provede se srovnání s po čtem kolonií spontánních revertant ů na 
kontrolní misce s rozpoušt ědlem.  
Je popsáno n ěkolik postup ů provedení zkoušky na reverzní mutace 
s bakteriemi. Mezi b ěžně používané pat ří standardní miskový test (1, 
2, 3, 4), preinkuba ční metoda (2, 3, 5, 6, 7, 8), fluktua ční test (9, 10) 
a suspenzní metoda (11). Metody pro zkoušení plyn ů a par jsou 
popsány (12).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Zde popsané postupy se týkají hlavn ě standardního miskového testu 
a preinkuba čních metod. Každá z nich je p řijatelná pro provád ění 
experiment ů jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. N ěkteré látky 
lze účinněji detekovat za použití preinkuba ční metody. Tyto látky 
patří do chemických t říd, do nichž pat ří mezi jiným krátké alifatické 
nitrosaminy, dvojvazné kovy, aldehydy, azobarviva a diazoniové 
sloučeniny, pyrrolizidinové alkaloidy, allylové slou čeniny 
a nitroslou čeniny (3). P řitom se p řipouští, že ur čité třídy mutagen ů 
nelze vždy detekovat standardními postupy, jako je standardní 
miskový test nebo preinkuba ční metoda. M ěly by být považovány 
za „zvláštní p řípady“ a k jejich detekci se d ůrazně doporučuje použít 
alternativní postupy. Je možné identifikovat tyto „zvláštní p řípady“ 
(společně s příklady postup ů jejich detekce): azobarviva a diazoniové 
sloučeniny (3, 5, 6, 13), plyny a t ěkavé chemické látky (12, 14, 15, 
16) a glykosidy (17, 18). Odchylka od standardního postupu musí být vědecky zdůvodněna.
 
1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.5.1  Přípravky  
1.5.1.1  Bakterie  
Čerstvé kultury bakterií by m ěly být kultivovány do pozdní expo ­
nenciální fáze nebo do časné stacionární fáze r ůstu (přibližně 10  9 
buněk na ml). Bu ňky v pozdní stacionární fázi by nem ěly být použ ­
ity. Je důležité, aby m ěly použité bakterie vysoký titr životaschop ­
ných bakterií. Titr m ůže být prokázán bu ď na základ ě dosavadních 
kontrolních údaj ů o růstové křivce, nebo pro každou zkoušku stano ­
vením po čtu životaschopných bun ěk na miskách.  
Doporučená inkuba ční teplota je 37  o C. 
Mělo by být použito alespo ň pět kmenů bakterií. Mezi nimi by m ěly 
být čtyři kmeny  S. typhimurium  (TA 1535; TA 1537 nebo TA97a 
nebo TA97; TA98; TA100), jejichž odpov ěď se ukázala v r ůzných 
laboratořích jako spolehlivá a reprodukovatelná. Tyto čtyři kmeny  S. 
typhimurium  mají pár bází GC na primárním reverzním míst ě a je 
známo, že jejich prost řednictvím nelze detekovat ur čité oxida ční 
mutageny, činitele zp ůsobující p řekřížení vláken DNA a hydraziny. 
Tyto látky mohou být detekovány kmeny  E. coli  WP2 strains nebo  
S. typhimurium  TA102 (19), které mají na primárním reverzním 
místě pár bází AT. Doporu čená kombinace kmen ů je tedy tato:  
— S. typhimurium  TA1535,  
— S. typhimurium  TA1537 nebo TA97 nebo TA97a,  
— S. typhimurium  TA98,  
— S. typhimurium  TA100 a  
— E. coli  WP2 uvrA, nebo  E. coli  WP2 uvrA (pKM101), nebo  S. 
typhimurium  TA102.  
Pro detekci mutagen ů způsobujících p řekřížení vláken DNA m ůže 
být vhodn ější zařadit TA102 nebo p řidat kmen  E. coli  (např. E. coli  
WP2 nebo  E. coli  WP2 (pKM101)).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Měly by být použity zavedené postupy p řípravy kmenové kultury, 
verifikace markeru a skladování. Pot řeba aminokyseliny pro r ůst by 
měla být prokázána pro každou zmrazenou kmenovou kulturu (his ­
tidin pro kmeny  S. typhimurium  a tryptofan pro  E. coli ). Podobn ě by 
měly být kontrolovány jiné fenotypové charakteristiky, jmenovit ě 
podle pot řeby přítomnost nebo nep řítomnost R-faktoru plasmid ů 
(tj. ampicilinová rezistence u kmen ů TA98, TA100 a TA97a nebo 
TA97, WP2 uvrA a WP2 uvrA (pKM101) a ampicilinová a tetracyklinová rezistence u kmene TA102); p řítomnost charakteris ­
tických mutací (tj. rfa mutací u  S. typhimurium  citlivostí na krysta ­
lovou viole ť a uvrA mutace u  E. coli  nebo uvrB mutací u  S. typhi­
murium,  citlivostí na ultrafialové sv ětlo) (2)(3). Kmeny by m ěly 
rovněž dávat po čty kolonií spontánních revertant ů na misce 
v rozmezí četností očekávaných na základ ě dosavadních údaj ů labo­
ratorních kontrol a nejlépe v rozmezí uvedeném v literatu ře.
 
1.5.1.2  Médium  
Použije se vhodný minimální agar (nap ř. obsahující minimální p ůdu 
E (Vogel-Bonner) a glukosu) a vrchní agar obsahující histidin a biotin nebo tryptofan umož ňující několik bun ěčných dělení (1, 2, 9).
 
1.5.1.3  Metabolická aktivace  
Bakterie by m ěly být vystaveny zkoušené látce, a to s vhodným 
systémem metabolické aktivace a bez n ěho. Nejčastěji používaným 
systémem je kofaktorem dopln ěná postmitochondriální frakce (S9) 
připravená z jater hlodavc ů ošetřených prost ředkem indukujícím 
enzymy, jako je Aroclor 1254 (1, 2) nebo fenobarbitonu a β-nafto­
flavonu (18, 20, 21). Postmitochondriální frakce je obvykle použí ­
vána v koncentracích v rozmezí 5 až 30 % obj. ve sm ěsi S9. Volba 
a podmínky metabolického aktiva čního systému m ůže záviset na 
třídě zkoušené chemické látky. V n ěkterých p řípadech m ůže být 
vhodné použít více než jednu koncentraci postmitochondriální 
frakce. U azobarviv a diazoniových slou čenin může být vhodn ější 
použití reduk čního metabolického aktiva čního systému (6, 13).  
1.5.1.4  Zkoušená látka nebo p řípravek  
Pevné zkoušené látky by m ěly být před aplikací na bakterie rozpuš ­
těny nebo suspendovány ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehiku ­
lech a pop řípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být 
přidány přímo k testovacím systém ům a/nebo mohou být p řed apli­
kací zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené 
chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost sklado ­
vání.  
Rozpoušt ědlo/vehikulum by m ělo být mimo podez ření, že reaguje se 
zkoušenou látkou, a m ělo by být slu čitelné s p řežitím bakterií a s 
aktivitou S9 (22). Jsou-li použita jiná než známá 
rozpouštědla/vehikula, m ělo by být jejich za řazení podloženo údaji 
o jejich kompatibilit ě. Doporu čuje se pokud možno nejd říve zvážit 
použití vodných rozpoušt ědel/vehikul. P ři zkoušení látek nestálých 
ve vodě by měla být použita organická rozpoušt ědla neobsahující 
vodu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2  Zkušební podmínky  
1.5.2.1  Zkušební kmeny (viz 1.5.1.1)  
1.5.2.2  Expozi ční koncentrace  
Mezi kritéria, která mají být zohledn ěna při stanovení nejvyššího 
množství zkoušené látky pat ří cytotoxicita a rozpustnost v kone čné 
směsi pro aplikaci.  
Může být užite čné stanovit toxicitu a nerozpustnost v p ředběžných 
experimentech. Cytotoxicita m ůže být detekována snížením po čtu 
kolonií revertant ů, vymizením nebo zeslabením bakteriálního 
podkladu nebo snížením stupn ě přežití exponovaných kultur. Cyto ­
toxicita látky se m ůže změnit v přítomnosti metabolických aktiva č­
ních systém ů. Nerozpustnost by m ěla být posouzena na základ ě 
viditelného srážení v kone čné směsi za skute čných zkušebních 
podmínek.  
Doporučená maximální zkušební koncentrace pro rozpustné necyto ­
toxické látky je 5 mg/misku nebo 5 μl/misku. U necytotoxických 
látek nerozpustných p ři koncentracích 5 mg/misku nebo 5 μl/misku 
by měla být jedna nebo více zkušebních koncentrací takových, aby 
látky byly v kone čné směsi pro aplikaci nerozpustné. Zkoušené 
látky, které jsou cytotoxické již p ři koncentracích nižších než 5 mg/ ­
misku nebo 5 μl/misku, by m ěly být zkoušeny až do cytotoxické 
koncentrace. Sraženina by nem ěla vadit p ři vyšetřování.  
Mělo by být použito alespo ň pět různých analyzovatelných koncen ­
trací zkoušené látky, p řičemž při prvním experimentu by m ěly být 
intervaly mezi zkušebními body rovny p řibližně polovině dílku loga ­
ritmické stupnice (tj. √10). Menší intervaly jsou vhodné v p řípadě, 
kdy se vyšet řuje křivka závislosti odpov ědi na koncentraci. Zkoušení 
koncentrací vyšších než 5 mg/misku nebo 5 μl/misku m ůže být 
zváženo p ři hodnocení látek obsahujících významné množství poten ­
ciálně mutagenních ne čistot.  
1.5.2.3  Negativní a pozitivní kontroly  
Součástí každého stanovení by m ěly být kmenov ě specifické pozi ­
tivní a negativní (rozpoušt ědlo nebo vehikulum) kontroly 
s metabolickou aktivací a bez ní. Pro pozitivní kontrolu by m ěly 
být vybrány koncentrace dokládající ú činnost každé zkoušky.  
V případě zkoušek s použitím metabolického aktiva čního systému by 
měla být látka(látky) pro pozitivní kontrolu vybrána(vybrány) na 
základě typu použitého kmene bakterií.  
Příkladem vhodné pozitivní kontroly u zkoušky s metabolickou akti ­
vací jsou tyto látky:  
Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS  
9,10-dimethylanthracen 781-43-1 212-308-4 
7,12-dimethylbenzo[ a]anthracen 57-97-6 200-359-5 
benzo[ a]pyren 50-32-8 200-028-6 
2-aminoanthracen 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS  
cyklofosfamid 50-18-0 
cyklofosfamid monohydrát 6055-19-2 200-015-4  
Tato látka je vhodnou pozitivní kontrolou pro metodu reduk ční 
metabolické aktivace:  
Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS  
CI Direct Red 28 573-58-0 209-358-4  
2-aminoanthracen by nem ěl být použit jako jediný indikátor ú čin­
nosti směsi S9. Při použití 2-aminoanthracenu by m ěla být každá 
šarže S9 charakterizována mutagenem, který vyžaduje metabolickou aktivaci mikrosomálními enzymy, nap říklad benzo[a]pyren nebo 
7,12-dimethylbenzo[a]anthracen.
 
Příkladem kmenov ěspecifické pozitivní kontroly u zkoušky bez 
vnější metabolické aktivace jsou tyto látky:  
Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS Kmen  
azid sodný 26628-22-8 247-852-1 TA1535 a TA100 
2-nitrofluoren 607-57-8 210-138-5 TA98 
9-aminoakridin 90-45-9 201-995-6 TA1537, TA97 a TA97a 
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA1537, TA97 a TA97a 
kumenhydrope ­
roxid 80-15-9 201-254-7 TA102 
mitomycin C 50-07-7 200-008-6 WP2uvrA a TA102 
1-methyl-3-nitro- 
1-nitrosoguanidin 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA a WP2 uvrA 
(pKM101) 
4-nitrochinolin-1- 
oxid 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA a WP2 uvrA 
(pKM101) 
α[(5-nitro-2- 
furyl)methyli ­
den]furan-2- 
acetamid (AF2) 3688-53-7 kmeny obsahující plasmidy  
Pro pozitivní kontrolu mohou být použity jiné vhodné referen ční 
látky. Pro pozitivní kontrolu by m ělo být vzato v úvahu použití 
chemických látek ze stejné chemické t řídy, jsou-li k dispozici.  
Měly by být použity negativní kontroly skládající se ze samotného 
rozpouštědla nebo vehikula, bez zkoušené látky, zpracované jinak 
stejným zp ůsobem jako exponované skupiny. Krom ě toho by m ěly 
být neexponované kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud 
žádné kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpoušt ědlo nevyvo ­
lává žádné zhoubné nebo mutagenní ú činky. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3  Postup  
U standardní miskové metody (1, 2, 3, 4) bez metabolické aktivace 
se obvykle smíchá 0,05 ml nebo 0,1 ml zkušebních roztok ů, 0,1 ml 
čerstvé bakteriální kultury (obsahující p řibližně 10 8 životaschopných 
buněk) a 0,5 ml sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. V p řípadě 
zkoušky s metabolickou aktivací se obvykle smíchá 0,5 ml metabo ­
lické aktiva ční směsi obsahující p řiměřené množství postmitochon ­
driální frakce (v rozmezí 5 až 30 % obj. v metabolické aktiva ční 
směsi) s vrchním agarem (2,0 ml) a zárove ň s bakteriemi 
a zkoušenou látkou nebo zkušebním roztokem. Obsah každé zkumavky se promíchá a p řelije přes povrch minimálního agaru na 
misce. Před inkubací se nechá vrchní agar ztuhnout.
 
U preinkuba ční metody (2, 3, 5, 6) se zkoušená látka nebo zkoušený 
roztok před smícháním s vrchním agarem a p řelitím přes povrch 
minimálního agaru na misce obvykle 20 minut nebo déle preinku ­
buje s testovacím kmenem (obsahujícím p řibližně 10  8 životaschop ­
ných bun ěk) a sterilním pufrem nebo metabolickým aktiva čním 
systémem (0,5 ml) p ři 30–37  o C. Obvykle se smíchá 0,05 nebo 
0,1 ml zkoušené látky nebo zkušebního roztoku, 0,1 ml bakterií 
a 0,5 ml sm ěsi S9 nebo sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. 
Zkumavky by m ěly být b ěhem inkubace provzduš ňovány na 
třepačce. 
K dostate čnému odhadu odchylky by m ěly být při každé úrovni 
dávky použity 3 misky. Použití dvou misek je p řijatelné po 
vědeckém zd ůvodnění. Případná ztráta misky nemusí znamenat 
znehodnocení zkoušky.  
Plynné nebo t ěkavé látky by m ěly být zkoušeny vhodnými metodami, 
např. v těsně uzavřených kultiva čních nádobách (12, 14, 15, 16).  
1.5.4  Inkubace  
Všechny misky v dané zkoušce by m ěly být inkubovány p ři 37  o C 
po 48–72 hodinách. Po uplynutí inkuba ční doby se zjistí po čet 
kolonií revertant ů na misku.  
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Předloženými údaji by m ěly být po čty kolonií revertant ů připadající 
na misku. M ěl by být rovn ěž uveden po čet kolonií revertant ů jak na 
miskách s negativní kontrolou (kontrola rozpoušt ědla a případně 
neexponovaná kontrola), tak na miskách s pozitivní kontrolou. Počty na jednotlivých miskách, st řední hodnoty po čtu kolonií rever ­
tantů na misku a sm ěrodatná odchylka by m ěly být předloženy pro 
zkoušenou látku a pozitivní a negativní kontrolu (neexponovanou kontrolu a/nebo kontrolu rozpoušt ědla).
 
Ověření jasně pozitivní odpov ědi se nepožaduje. Dvojzna čné 
výsledky by m ěly být vyjasn ěny dalším zkoušením, nejlépe 
s úpravami experimentálních podmínek. Negativní výsledky musí být potvrzeny p řípad od p řípadu. V p řípadech, kdy se nepovažuje 
potvrzení negativních výsledk ů za nezbytné, by m ělo být podáno 
zdůvodnění. Změna parametr ů studie s cílem rozší řit rozsah posuzo ­
vaných podmínek by m ěla být zvážena v následných experimentech. 
K parametr ům studie, které by mohly být zm ěněny, patří rozmezí 
koncentrací, metoda zpracování (standardní misková metoda nebo 
preinkubace v kapalném médiu) a podmínky metabolické aktivace.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Pro stanovení pozitivního výsledku existuje n ěkolik kritérií, nap ř. 
nárůst počtu kolonií revertant ů na misku nad testovaný rozsah 
u alespoň jednoho kmene s metabolickým aktiva čním systémem 
nebo bez n ěho, a to v závislosti na koncentraci, nebo reprodukova ­
telný nár ůst tohoto po čtu pro jednu nebo více koncentrací (23). 
Nejdříve by m ěla být uvážena biologická relevance výsledk ů. Při 
hodnocení výsledk ů zkoušky mohou být použity jako pomocný 
prostředek statistické metody (24). Statistická významnost by nem ěla 
být jediným ur čujícím faktorem pro pozitivní odpov ěď. 
Zkoušená látka, jejíž výsledky nespl ňují výše uvedená kritéria, se 
v tomto systému považuje za nemutagenní.  
Ačkoli většina experiment ů poskytne jasn ě pozitivní nebo negativní 
výsledky, v ojedin ělých případech neumožní soubor údaj ů vyslovit 
konečný výrok o aktivit ě zkoušené látky. Výsledky mohou z ůstat 
dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment 
opakován.  
Pozitivní výsledky zkoušky na reverzní mutace s bakteriemi zname ­
nají, že zkoušená látka indukuje v genomu kmen ů Salmonella typhi ­
murium  a/nebo  Escherichia coli  bodové mutace substitucí bází nebo 
posunem čtecího rámce. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená 
látka není za podmínek zkoušky pro testovací druhy mutagenní.  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— zdůvodnění volby rozpoušt ědla/vehikula,  
— rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpoušt ědle/vehikulu, je-li 
známa.  
Kmeny:  
— použité kmeny,  
— počet buněk v kultu ře, 
— charakteristiky kmene.  
Zkušební podmínky:  
— množství zkoušené látky na misku (mg/misku nebo μl/misku) 
s odůvodněním výběru dávky a po čtu misek na koncentraci,  
— použitá média,  
— typ a složení použitého metabolického aktiva čního systému, 
včetně kritérií p řijatelnosti,  
— postup expozice.  
Výsledky:  
— známky toxicity,  
— známky srážení,  
— počty na jednotlivých miskách,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— střední hodnota po čtu kolonií revertant ů na misku a sm ěrodatná 
odchylka,  
— podle možnosti závislost odpov ědi na dávce,  
— případné statistické analýzy,  
— údaje o soub ěžné negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) a pozitivní 
kontrole s rozp ětími, středními hodnotami a sm ěrodatnými 
odchylkami,  
— dosavadní údaje o negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) a pozitivní 
kontrole s rozp ětími, středními hodnotami a sm ěrodatnými 
odchylkami.  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the 
Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Muta ­
tion Res., 31, 347–364.  
2) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173–215.  
3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays. Mutation Res., 312, 217–233.
 
4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, 
M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsomal Assay: A report of the 
U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, 69–240.
 
5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 91–96.
 
6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity 
Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. s. 273–285.
 
7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. 
and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic 
Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, s. 13–61.
 
8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, 
167–177.  
9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of 
a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. 
Mutation Res., 38, 33–42.  
10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges 
(1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., 
Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amster ­
dam-New York-Oxford, s. 141–161.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Examination of 
the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains 
of Salmonella typhimurium . Environmental Mutagenesis, 3, 
453–465.  
12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994). 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, 335–344.
 
13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and 
Vaughn, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzi ­
dine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in 
a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, 33–47.  
14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortel ­
mans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results 
from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 
19, 2–141.  
15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Muta ­
genic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In 
Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. 
Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, s. 249–258.  
16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. 
(1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity 
of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, 421–441.
 
17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and 
Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in  Salmonella typhimurium . Cancer Res., 39, 
3780–3782.
 
18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 
4961–4965.  
19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. 
(1990). Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, 285–291.  
20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an 
Inducer or Metabolic Activation Systems. In: „ In Vitro  meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing“ Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, s. 85–88.
 
21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, 175–177.  
22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compa ­
tibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. 
Mutation Res., 88, 343–350.  
23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., 
Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity. Mutation Res. 189, 83–91.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., 
Cambridge University Press, s. 28–65.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15  ZKOUŠENÍ MUTAGENITY A SCREENING KARCINOGENITY 
– ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE U  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Není uvedena.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Různé haploidní a diploidní kmeny kvasinek  Saccharomyces cerevi ­
siae mohou být použity ke stanovení chemicky indukovaných geno ­
vých mutací za p řítomnosti metabolické aktivace nebo bez ní.  
Jsou využívány p římé muta ční systémy u haploidních kmen ů, jako 
měření mutací z červených mutant ů vyžadujících adenin ( ade-1, ade- 
2) na dvojité bílé mutanty vyžadující adenin, a selektivní systémy, 
jako je indukce rezistence v ůči kanavinu a cykloheximidu.  
V nejlépe ov ěřeném reverzním muta čním systému se využívá haplo ­
idního kmene XV 18514C s nonsense mutacemi (ochre)  ade 2-1,  arg 
4-17,  lys 1-1 and  trp 5-48, které jsou vratné p ůsobením mutagen ů 
vyvolávajících zám ěnu bází, indukujících mutace ve specifickém 
místě nebo ochre-supresorové mutace. XV 185-14C nese rovn ěž 
marker  his 1-7 missense mutaci, revertovanou p řevážně mutacemi 
v dalším míst ě, a marker  hom  3-10, který je revertován posunovými 
mutageny.  
U diploidních kmen ů S. cerevisiae  je jediným široce využívaným 
kmenem D  7 , který je homozygotní pro  ilv 1-92.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Příprava  
Roztoky zkoušených chemických látek a kontrol se p řipraví těsně 
před zkoušením za použití vhodného vehikula. U organických látek, 
které nejsou rozpustné ve vod ě, se použije nejvýše 2 % (obj.) roztok 
v organických rozpoušt ědlech, jako jsou ethanol, aceton nebo dime ­
thylsulfoxid (DMSO). Kone čná koncentrace vehikula nesmí 
významně ovlivnit životaschopnost bun ěk a charakteristiky r ůstu. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o l i c k á a k t i v a c e  
Buňky se exponují zkoušeným chemickým látkám jak v p řítomnosti, 
tak v nep řítomnosti vhodného vn ějšího metabolického aktiva čního 
systému.  
Nejčastěji používaným systémem je kofaktorem dotovaná postmito ­
chondriální frakce p řipravená z jater hlodavc ů, upravovaná činidly 
indukujícími enzymy. Použití jiných druh ů, tkání, postmitochondri ­
álních frakcí nebo postup ů může být rovn ěž vhodné pro metabo ­
lickou aktivaci.  
Zkušební podmínky  
Z k u š e b n í k m e n y  
Nejpoužívan ější kmeny pro studie genových mutací jsou haploidní 
kmen XV 185-14C a diploidní kmen D  7 . Jiné kmeny mohou být 
rovněž vhodné.  
M é d i a  
Pro určení počtu přežívajících a mutovaných bun ěk se použijí 
vhodná kultiva ční média.  
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Souběžně se nasadí pozitivní kontroly, neexponované kontroly 
a kontroly s rozpoušt ědlem. Pro každou specifickou muta ční 
změnu se použijí odpovídající pozitivní kontrolní chemické látky.  
E x p o z i č n í k o n c e n t r a c e  
Použije se nejmén ě pět dostate čně odstupňovaných koncentrací 
zkoušené chemické látky. U toxických látek nemá nejvyšší zkoušená koncentrace snižovat p řežití na mén ě než 5–10 %. Látky, které jsou 
relativně nerozpustné ve vod ě, se za použití vhodných postup ů 
zkouší až k mezi rozpustnosti. Nejvyšší koncentrace u netoxických látek dob ře rozpustných ve vod ě se určí případ od p řípadu.
 
P o d m í n k y i n k u b a c e  
Misky se inkubují v temnu čtyři až sedm dní p ři 28 až 30  o C. 
F r e k v e n c e s p o n t á n n í c h m u t a c í  
Použijí se subkultury s četností spontánních mutací v obvyklém 
přijatelném rozmezí.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
P o č e t m i s e k  
Pro stanovení po čtu prototrofních bun ěk vznikajících genovými 
mutacemi a pro stanovení životaschopnosti bun ěk se použijí nejmén ě 
tři misky na jednu koncentraci. U experiment ů s markery, jako je  
hom 3-10 s nízkou muta ční rychlostí, se po čet misek zvýší, aby byly 
získány statisticky relevantní údaje.  
Postup  
Expozice kmen ů S. cerevisiae  se obvykle provede v kapalném 
prostředí a zahrnuje bu ď buňky ve stacionární fázi, nebo rostoucí 
buňky. Výchozí experimenty se provedou na rostoucích bu ňkách: 1 
– 5 × 10  7 buněk/ml se za prot řepávání vystaví zkoušené látce na 
dobu až 18 hodin p ři 28 až 37  o C; podle pot řeby se v pr ůběhu 
expozice p řidá odpovídající množství metabolické aktiva ční směsi. 
Na konci expozi ční doby se bu ňky centrifugují, promyjí a nao čkují 
na vhodné kultiva ční médium. Po inkubaci se na miskách spo čítají 
přežívající bu ňky a buňky s indukovanými genovými mutacemi. 
Jestliže je první experiment negativní, provede se druhý experiment 
s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první experiment pozitivní, 
potvrdí se vhodným nezávislým experimentem.  
2. ÚDAJE  
Údaje se zpracují v tabulkové form ě a uvede se po čet kolonií, po čet 
mutací, četnost přežívajících bun ěk a četnost mutací. Všechny 
výsledky se potvrdí nezávislým experimentem. Údaje se vyhodnotí 
vhodnými statistickými metodami.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— použitý kmen,  
— zkušební podmínky: bu ňky ve stacionární fázi nebo rostoucí 
buňky, složení médií, teplota a délka inkubace, metabolický akti ­
vační systém,  
— podmínky expozice: úrovn ě expozice, postup a délka expozice, 
teplota při expozici, pozitivní a negativní kontroly,  
— počet kolonií, po čet mutant ů, četnost p řežívajících bun ěk 
a četnost mutací, podle možnosti vztah dávky a ú činku, statis ­
tické hodnocení údaj ů, 
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16  ZKOUŠKA NA MITOTICKOU REKOMBINACI 
U SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Mitotickou rekombinaci u  Saccharomyces cerevisiae  lze detekovat 
mezi geny (obecn ěji mezi genem a jeho centromerou) a uvnit ř genů. 
První případ je nazýván mitotické p řekřížení a vytvá ří reciproční 
produkty, zatímco druhý p řípad je v ětšinou nerecipro ční a nazývá 
se genová konverze. P řekřížení se obecn ě stanoví na základ ě tvorby 
recesivních homozygotních kolonií nebo sektor ů vzniklých 
u heterozygotních kmen ů, zatímco genová konverze se stanoví na 
základě tvorby prototrofních revertant vzniklých u auxotrofního hete ­
roalelického kmene, který nese dv ě různé defektní alely téhož genu. 
Nejčastěji používanými kmeny pro detekci mitotické genové 
konverze jsou D  4 (heteroalelický v  ade 2 a trp 5) D  7 (heteroalelický 
v trp 5) BZ  34 (heteroalelický v  arg 4) a JDl (heteroalelický v  his 4 
a trp 5). Mitotické p řekřížení produkující červené a r ůžové homozy ­
gotní sektory lze stanovit u D  5 nebo D  7 (který slouží rovn ěž 
k měření mitotické genové konverze a reverzních mutací v  ilv 1- 
92 oba kmeny jsou heteroalelické pro komplementární alely  ade 2. 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Příprava  
Roztoky zkoušených chemických látek a kontrol nebo referen čních 
sloučenin se p řipraví těsně před zkoušením za použití vhodného 
vehikula. U organických látek, které nejsou rozpustné ve vod ě, se 
použije nejvýše 2 % (obj.) roztok v organických rozpoušt ědlech, 
jako jsou ethanol, aceton nebo dimethylsulfoxid (DMSO). Kone čná 
koncentrace vehikula nesmí významn ě ovlivnit životaschopnost 
buněk a charakteristiky r ůstu. 
M e t a b o l i c k á a k t i v a c e  
Buňky se exponují zkoušeným chemickým látkám jak v p řítomnosti, 
tak v nep řítomnosti vhodného vn ějšího metabolického aktiva čního 
systému. Nej častěji používaným systémem je kofaktorem dotovaná 
postmitochondriální frakce p řipravená z jater hlodavc ů, upravovaná 
činidly indukujícími enzymy. Použití jiných druh ů, tkání, postmito ­
chondriálních frakcí nebo postup ů může být rovn ěž vhodné pro 
metabolickou aktivaci.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Zkušební podmínky  
Z k u š e b n í k m e n y  
Nejpoužívan ějšími kmeny jsou diploidní kmeny D  4 , D  5 , D  7 
a JD1. Jiné kmeny mohou být rovn ěž vhodné.  
M é d i a  
Pro určení počtu přežívajících bun ěk a četnosti mitotické rekombi ­
nace se použijí vhodná kultiva ční média.  
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Souběžně se nasadí pozitivní kontroly, neexponované kontroly 
a kontroly s rozpoušt ědlem. Pro každou specifickou rekombina ční 
změnu se použijí odpovídající pozitivní kontrolní chemické látky.  
E x p o z i č n í k o n c e n t r a c e  
Použije se nejmén ě pět dostate čně odstupňovaných koncentrací 
zkoušené chemické látky. Mezi faktory, které mají být zohledn ěny, 
patří cytotoxicita a rozpustnost. Nejnižší koncentrace nesmí mít vliv 
na životaschopnost bun ěk. U toxických látek nemá nejvyšší zkou ­ 
šená koncentrace snižovat p řežití na mén ě než 5–10 %. Látky, které 
jsou relativn ě nerozpustné ve vod ě, se za použití vhodných postup ů 
zkouší až k mezi rozpustnosti. Nejvyšší koncentrace u netoxických látek dob ře rozpustných ve vod ě se určí případ od p řípadu.
 
Buňky mohou exponovány zkoušené chemické látce bu ď ve staci­
onární fázi, nebo b ěhem růstu po dobu až 18 hodin. Dlouhodob ě 
exponované kultury však mají být mikroskopicky kontrolovány na 
tvorbu spor, jejichž p řítomnost zkoušku znehodnocuje.  
P o d m í n k y i n k u b a c e  
Misky se inkubují v temnu čtyři až sedm dní p ři 28 až 30  o C. Misky 
použité pro pr ůkaz červených a r ůžových homozygotních sektor ů 
tvořených mitotickým p řekřížením se p řed počítáním umístí 
v chladni čce (při přibližně 4 o C) na další 1–2 dny, aby se mohly 
utvořit odpovídající pigmentované kolonie.  
Č e t n o s t s p o n t á n n í m i t o t i c k é r e k o m b i n a c e  
Použijí se subkultury s četností spontánní mitotické rekombinace 
v obvyklém p řijatelném rozmezí.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
P o č e t m i s e k  
Pro stanovení po čtu prototrofních bun ěk vznikajících mitotickou 
genovou konverzí a pro stanovení životaschopnosti bun ěk se použijí 
nejméně tři misky na jednu koncentraci. Pro stanovení recesivní 
homozygocity tvo řené mitotickým p řekřížením se po čet misek zvýší, 
aby bylo dosaženo dostate čného počtu kolonií.  
Postup  
Expozice kmen ů S. cerevisiae  se obvykle provede v kapalném 
prostředí a zahrnuje bu ď buňky ve stacionární fázi, nebo rostoucí 
buňky. Výchozí experimenty se provedou na rostoucích bu ňkách. 1 
– 5 × 10  7 buněk/ml se za prot řepávání vystaví zkoušené látce na 
dobu až 18 hodin p ři 28 až 37  o C; podle pot řeby se v pr ůběhu 
expozice p řidá odpovídající množství metabolické aktiva ční směsi. 
Na konci expozi ční doby se bu ňky centrifugují, promyjí a nao čkují 
na vhodné kultiva ční médium. Po inkubaci se na miskách spo čítají 
přežívající bu ňky a počet indukcí mitotické rekombinace.  
Jestliže je první experiment negativní, provede se druhý experiment 
s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první experiment pozitivní, 
potvrdí se vhodným nezávislým experimentem.  
2. ÚDAJE  
Údaje se zpracují v tabulkové form ě a uvede se po čet kolonií, po čet 
rekombinací, četnost přežívajících bun ěk a četnost rekombinací.  
Výsledky se potvrdí nezávislým experimentem.  
Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— použitý kmen,  
— zkušební podmínky: bu ňky ve stacionární fázi nebo rostoucí 
buňky, složení médií, teplota a délka inkubace, metabolický akti ­
vační systém,  
— podmínky expozice: úrove ň expozice, postup a délka expozice, 
teplota při expozici, pozitivní a negativní kontroly,  
— počet kolonií, po čet rekombinací, četnost přežívajících bun ěk 
a četnost rekombinací, podle možnosti vztah dávky a ú činku, 
statistické vyhodnocení údaj ů, 
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17  MUTAGENITA – ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE 
V BUŇKÁCH SAVC Ů IN VITRO  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 476, Zkouška na genové 
mutace v bu ňkách savc ů in vitro  (1997).  
1.1 ÚVOD  
Zkoušku na genové mutace v bu ňkách savc ů in vitro  lze použít pro 
detekci genových mutací indukovaných chemickými látkami. Mezi vhodné bun ěčné linie pat ří buňky lymfomu L5178Y myší, bun ěčné 
linie CHO, CHOAS52 a V79 k řečka čínského a lymfoblastoidní 
buňky TK6 člověka (1). U t ěchto buněčných linií jsou nejpoužíva ­
nější mírou genetických ú činků mutace gen ů pro thymidinkinasu 
(TK) a hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasu (HPRT) 
a transgen xanthin-guaninfosforibosyltransferasy (XPRT). Zkoušky 
na mutace TK, HPRT a XPRT detekují r ůzné spektrum genetických 
událostí. Autosomální lokace TK a XPRT m ůže umožnit detekci 
genetických událostí (nap ř. rozsáhlé delece), které nelze detekovat 
v HPRT lokusu na X chromosomech (2, 3, 4, 5, 6).
 
Ve zkoušce na genové mutace v bu ňkách savc ů in vitro  lze použít 
kultury zavedených linií bun ěk nebo bun ěčné kmeny. Bu ňky se 
vybírají podle schopnosti r ůstu v kultu ře a stálosti četnosti spontán ­
ních mutací.  
Zkoušky provád ěné in vitro  obecně vyžadují použití vn ějšího zdroje 
metabolické aktivace. Tento metabolický aktiva ční systém nem ůže 
zcela napodobit podmínky  in vivo  u savců. Je třeba se zcela 
vyvarovat podmínek, které by vedly k pozitivním výsledk ům, jež 
neodrážejí vlastní mutagenitu. K pozitivním výsledk ům, jež neodrá ­ 
žejí vlastní mutagenitu, m ůže dojít zm ěnou pH, osmolality nebo 
vysokých úrovní cytotoxicity (7).  
Tato zkouška se používá ke zjišt ění možných mutagen ů 
a karcinogen ů pro savce. Mnoho slou čenin, pro n ěž je tato zkouška 
pozitivní, jsou karcinogeny savc ů; mezi touto zkouškou 
a karcinogenitou však není absolutní korelace. Korelace závisí na chemické t řídě a přibývají d ůkazy o tom, že existují karcinogeny, 
které nejsou zjišt ěny touto zkouškou, nebo ť zřejmě působí jinými, 
negenotoxickými mechanismy, nebo mechanismy, které 
v bakteriálních bu ňkách neexistují (6).
 
Viz také obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Přímá mutace:  genová mutace výchozího typu mutované formy, 
která způsobuje zm ěnu nebo ztrátu enzymatické aktivity kódovaných 
bílkovin.  
Mutageny substituce pár ů bází:  látky, které zp ůsobují substituci 
jednoho nebo více pár ů bází v DNA.  
Posunové mutageny:  látky, které zp ůsobují adici nebo deleci 
jednoho nebo více pár ů bází v molekule DNA.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Doba exprese fenotypu:  doba, během níž vymizí z nov ě mutova­
ných bun ěk nezměněné genové produkty.  
Četnost mutant ů: počet pozorovaných mutantních bun ěk dělený 
počtem životaschopných bun ěk. 
Relativní celkový r ůst: nárůst počtu buněk v čase ve srovnání 
s kontrolní populací bun ěk; vypočte se jako sou čin poměru rychlosti 
růstu v suspenzi a v negativní kontrole a relativní ú činnosti klono ­
vání vzhledem k negativní kontrole.  
Relativní r ůst v suspenzi:  nárůst počtu buněk v průběhu exprese 
vzhledem k negativní kontrole.  
Životaschopnost:  účinnost klonování bun ěk v okamžiku nasazení na 
misku za selektivních podmínek po expresi.  
Přežití:  účinnost klonování bun ěk při nasazení na misku na konci 
období expozice; p řežití je obvykle vyjád řeno v pom ěru k přežití 
kontrolní populace bun ěk. 
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Buňky, které v d ůsledku mutace TK  +/– → TK  –/– neobsahují thymi ­
dinkinasu (TK) jsou rezistentní k cytotoxickým ú činkům analogu 
pyrimidinu trifluorthymidinu (TFT). Bu ňky produkující thymidinki ­
nasu jsou citlivé na TFT, což zp ůsobuje inhibici bun ěčného metabo ­
lismu a zastavuje další bun ěčné dělení. Mutantní bu ňky jsou tedy 
schopny proliferace za p řítomnosti TFT, zatímco normální bu ňky, 
které obsahují thymidinkinasu tuto schopnost nemají. Podobn ě lze 
u buněk s deficientním HPRT nebo XPRT provést selekci prost řed­
nictvím rezistence k 6thioguaninu (TG) nebo 8azaguaninu (AG). 
Vlastnosti zkoušené látky by m ěly být pe člivě zváženy, jestliže je 
ve zkoušce na genové mutace v bu ňkách savc ů zkoušen analog báze 
nebo slou čenina podobná selek čnímu činidlu. M ělo by být nap říklad 
vyšetřeno jakékoli podez ření na selektivní toxicitu zkoušené látky 
pro mutantní nebo nemutantní bu ňky. Při zkoušení chemických látek, 
které mají podobnou strukturu jako selek ční činidlo, musí tedy být 
potvrzena ú činnost systému nebo činidla pro selekci (8).  
Buňky v suspenzní nebo jednovrstevné kultu ře jsou vhodnou dobu 
vystaveny zkoušené látce jak s metabolickou aktivací, tak bez ní, 
a subkultivovány za ú čelem stanovení cytotoxicity a za ú čelem 
exprese fenotypu p řed selekcí mutant ů (9, 10, 11, 12, 13). Cytoto ­
xicita se obvykle zjistí stanovením relativní ú činnosti klonování (p ře­ 
žití) nebo stanovením relativního celkového r ůstu kultur po uplynutí 
doby expozice. Exponované kultury se udržují v r ůstovém médiu po 
vhodnou dobu charakteristickou pro každý zvolený lokus a typ buněk, aby nastala p řibližně optimální fenotypová exprese induko ­
vaných mutací. Četnost mutant ů se stanoví tak, že se nasadí známý 
počet buněk do média obsahujícího selek ční činidlo pro detekci 
mutantních bun ěk a do média bez selek čního činidla, aby byla stano ­
vena účinnost klonování (životaschopnost). Po vhodné inkuba ční 
době se spočítají kolonie. Četnost mutant ů se vypo čte z počtu 
mutantních kolonií v selek čním médiu a po čtu kolonií v médiu 
bez selek čního činidla.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Přípravky  
1.4.1.1  Buňky 
Pro použití v této zkoušce jsou k dispozici r ůzné typy bun ěk, včetně 
subklonů buněk L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 nebo TK6. Typy 
buněk v této zkoušce by m ěly vykazovat citlivost k chemickým 
mutagenům, vysokou klonovací schopnost a stabilní frekvenci spon ­
tánních mutací. Bu ňky by měly být kontrolovány, zda nejsou konta ­
minovány mykoplasmaty, a v p řípadě kontaminace by nem ěly být 
použity.  
Zkoušky by m ěly být navrženy tak, aby m ěly předem stanovenou citli ­
vost a váhu. Po čet použitých bun ěk, kultur a koncentrací zkoušené látky 
by měl tyto definované parametry odrážet (14). Minimální po čet buněk, 
které přežijí expozici a které budou použity v každém stadiu zkoušky, by 
měl být založen na četnosti spontánních mutací. Obecným pravidlem je, 
aby byl použit po čet buněk, který je desetinásobkem p řevrácené hodnoty 
četnosti spontánních mutací. Je však doporu čeno, aby bylo použito 
alespoň 10  6 buněk. Měly by být k dispozici dostate čné dosavadní 
údaje o použitém bun ěčném systému, aby byla doložena konzistentní 
výpovědní hodnota zkoušky.  
1.4.1.2  Média a kultiva ční podmínky  
Pro udržování kultur by m ěla být použita vhodná kultiva ční média 
a inkubační podmínky (kultiva ční nádoby, koncentrace CO  2 teplota 
a vlhkost). Média by m ěla být zvolena podle selek čních systém ů 
a typů buněk použitých p ři zkoušce. Je zvlášt ě důležité, aby kulti ­
vační podmínky byly zvoleny tak, aby byly zajišt ěny optimální r ůst 
buněk během období exprese a schopnost jak mutovaných, tak 
nemutovaných bun ěk tvořit kolonie.  
1.4.1.3  Příprava kultur  
Buňky by m ěly být získávány z kmenových kultur, nasazeny do 
kultivačního média a inkubovány p ři 37  o C. Před použitím v této 
zkoušce m ůže být nezbytné odstranit z kultury již p řítomné mutantní 
buňky. 
1.4.1.4  Metabolická aktivace  
Buňky by m ěly být vystaveny zkoušené látce, a to s vhodným 
systémem metabolické aktivace a bez n ěho. Nejčastěji používaným 
systémem je kofaktorem dotovaná postmitochondriální frakce (S9) 
připravená z jater hlodavc ů zpracovaná činidlem indukujícím 
enzymy, jako je Aroclor 1254 (15, 16, 17 a 18), nebo sm ěs feno­
barbitonu a β-naftoflavonu (19, 20).  
Postmitochondriální frakce je v kone čném testovacím médiu obvykle 
používána v koncentracích 1–10 % obj. Volba a podmínky metabo ­
lického aktiva čního systému m ůže záviset na t řídě zkoušené 
chemické látky. V n ěkterých p řípadech m ůže být vhodné použít 
více než jednu koncentraci postmitochondriální frakce.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Řada výsledk ů vývoje, v četně přípravy geneticky modifikovaných 
buněčných linií exprimujících specifické aktiva ční enzymy, posky ­
tuje možnosti pro endogenní aktivaci. Volba použitých bun ěčných 
linií by m ěla být vědecky zd ůvodněna (např. důležitostí isoenzymu 
cytochromu P450 pro metabolismus zkoušené látky).  
1.4.1.5  Příprava zkoušené látky  
Pevné zkoušené látky by m ěly být před aplikací na bu ňky rozpuš ­
těny nebo suspendovány ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehiku ­
lech a pop řípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být 
přidány přímo k testovacím systém ům a/nebo mohou být p řed apli­
kací zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené látky, 
pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.  
1.4.2  Zkušební podmínky  
1.4.2.1  Rozpoušt ědlo/vehikulum  
Rozpoušt ědlo/vehikulum by m ělo být mimo podez ření, že reaguje se 
zkoušenou látkou, a m ělo by být slu čitelné s p řežitím bun ěk a s 
aktivitou S9. Jsou-li použita jiná než známá rozpoušt ědla/vehikula, 
mělo by být jejich za řazení podloženo údaji o jejich kompatibilit ě. 
Doporučuje se pokud možno nejd říve zvážit použití vodných 
rozpouštědel/vehikul. P ři zkoušení látek nestálých ve vod ě by měla 
být použita organická rozpoušt ědla neobsahující vodu. Vodu lze 
odstranit p řidáním molekulového síta.  
1.4.2.2  Expozi ční koncentrace  
Mezi kritéria, která mají být zohledn ěna při stanovení nejvyšší 
koncentrace, pat ří cytotoxicita, rozpustnost v testovacím systému 
a změny pH nebo osmolality.  
Cytotoxicita by m ěla být stanovena s metabolickou aktivací a bez ní 
v hlavním experimentu za použití vhodných indikátor ů buněčné inte­
grity a růstu, jako jsou relativní ú činnost klonování (p řežití) nebo 
relativní celkový r ůst. Může být výhodné stanovit cytotoxicitu 
a rozpustnost v p ředběžném experimentu.  
Měly by být použity alespo ň čtyři analyzovatelné koncentrace. 
V případě toxicity by m ěly tyto koncentrace pokrývat rozmezí 
dané maximální a minimální toxicitou, p řípadně žádnou toxicitou, 
což bude obvykle znamenat, že by se koncentrace m ěly lišit 
faktorem 2 až √10. Je-li maximální koncentrace odvozena od cyto ­
toxicity, m ělo by být výsledkem p řibližně 10–20 % (ale nejmén ě 
10 %) přežití (relativní ú činnost klonování) nebo relativní celkový 
růst. Vpřípadě relativně necytotoxických látek by m ěla být maxi ­
mální zkušební koncentrace 5 μl/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M, podle 
toho, která z nich je nejnižší.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Relativně nerozpustné látky by m ěly být zkoušeny až k mezi 
rozpustnosti za kultiva čních podmínek, nebo až za tuto mez. M ěla 
by být stanovena p řípadná nerozpustnost v kone čném médiu, ve 
kterému jsou bu ňky exponovány. M ůže být užite čné stanovit 
rozpustnost na za čátku a na konci expozice, nebo ť koncentrace 
v testovacím systému se m ůže v pr ůběhu expozice m ěnit 
v důsledku přítomnosti bun ěk, séra S9 atd. Nerozpustnost lze zjistit 
vizuálně. Sraženina by nem ěla vadit p ři vyšetřování.  
1.4.2.3  Kontroly  
Součástí každého experimentu by m ěly být pozitivní a negativní 
(rozpoušt ědlo nebo vehikulum) kontroly jak s metabolickou aktivací, 
tak bez ní. P ři použití metabolické aktivace by m ěla být pro pozitivní 
kontrolu použita chemická látka, která k mutagenní reakci vyžaduje aktivaci.
 
Příkladem pozitivní kontroly mohou být tyto látky:  
Stav metabolické 
aktivace Lokus Látka Číslo CAS Číslo podle 
EINECS  
Bez vnější meta­
bolické aktivace HPRT ethyl-methansulfonát 62-50-0 200-536-7 
1-ethyl-1-nitrosomo čovina 759-73-9 212-072-2 
TK (malé 
a velké kolo ­
nie) methyl-methansulfonát 66-27-3 200-625-0 
XPRT ethyl-methansulfonát 62-50-0 200-536-7 
1-ethyl-1-nitrosomo čovina 759-73-9 212-072-2 
S vnější metabo ­
lickou aktivací HPRT 3-methylcholanthren 56-49-5 200-276-4  
N-nitrosodimethylamin 62-75-9 200-549-8 
7,12-dimethylbenzoanthracen 57-97-6 200-359-5 
TK (malé 
a velké kolo ­
nie) cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
cyklofosfamid monohydrát 6055-19-2 benzo[ a]pyren 50-32-8 200-028-5 
3-methylcholanthren 56-49-5 200-276-5 
XPRT  N -nitrosodimethylamin (pro 
vysoké úrovn ě S9)) 62-75-9 200-549-8 
benzo[ a]pyren 50-32-8 200-028-5
 
Mohou být použity také jiné referen ční látky pro pozitivní kontrolu, 
např. má-li laborato ř databázi dosavadních údaj ů o 5-brom-2'- 
deoxyuridinu (CAS 59-14-3, EINECS 200-415-9), m ůže být tato 
referenční látka rovn ěž použita. Pro pozitivní kontrolu by m ělo být 
pokud možno vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné 
chemické t řídy. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Měly by být použity negativní kontroly tvo řené médiem obsahujícím 
samotné rozpoušt ědlo nebo vehikulum a zpracované jinak stejným 
způsobem jako exponované skupiny. Krom ě toho by m ěly být neex ­
ponované kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud žádné kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpoušt ědlo nevyvolává 
žádné zhoubné nebo mutagenní ú činky.
 
1.4.3  Postup  
1.4.3.1  Expozice zkoušené látce  
Proliferující bu ňky by m ěly být vystaveny zkoušené látce jak za 
přítomnosti metabolického aktiva čního systému, tak bez n ěho. Expo­
zice by m ěla trvat vhodnou dobu (obvykle je ú činná doba 3 až 6 
hodin). Expozi ční doba m ůže být prodloužena na jeden nebo více 
buněčných cykl ů. 
Pro každou zkušební koncentraci mohou být použity duplicitní 
kultury nebo jedna exponovaná kultura. Je-li použita jedna kultura, 
měl by být po čet koncentrací zvýšen tak, aby byl zajišt ěn odpoví­
dající počet kultur pro analýzu (nap ř. alespoň osm analyzovatelných 
koncentrací). M ěly by být použity duplicitní negativní kontrolní 
kultury (kontrola rozpoušt ědla). 
Plynné nebo t ěkavé látky by m ěly být zkoušeny vhodnými meto ­
dami, nap ř. v těsně uzavřených kultiva čních nádobách (21, 22).  
1.4.3.2  Stanovení p řežití, životaschopnosti a četnosti mutací  
Na konci expozi ční doby se bu ňky promyjí a kultivují za ú čelem 
stanovení p řežití a za ú čelem umožn ění exprese fenotypu mutantu. 
Se stanovením cytotoxicity prost řednictvím stanovení relativní ú čin­
nosti klonování (p řežití) nebo relativního celkového r ůstu kultur se 
započne obvykle po expozi ční době. 
Každý lokus má definované minimální časové nároky, aby umožnil 
přibližně optimální fenotypovou expresi nov ě indukovaných mutant ů 
(HPRT a XPRT vyžadují alespo ň 6 až 8 dn ů, TK alespo ň dva dny). 
Buňky jsou kultivovány v médiu se selek čním činidlem (selek čními 
činidly) a bez n ěho (bez nich) za ú čelem stanovení po čtu mutant ů 
a klonovací ú činnosti. Se stanovením životaschopnosti (použité pro 
výpočet četnosti mutant ů) se zapo čne na konci doby exprese nasa ­
zením na misku bez selek čního činidla.  
Je-li zkoušená látka pozitivní ve zkoušce L5178Y TK  +/– , mělo by 
být provedeno alespo ň na jedné ze zkušebních kultur (s nejvyšší 
pozitivní koncentrací) a na negativních a pozitivních kontrolách 
rozdělení kultury podle velikosti kolonií. Je-li zkoušená látka ve 
zkoušce L5178Y TK  +/– negativní, m ělo by být rozd ělení kultury 
podle velikosti kolonií provedeno na negativních a pozitivních 
kontrolách. P ři studiích za použití TK6TK  +/– může být také 
provedeno rozd ělení kultury podle velikosti kolonií.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Údaje by m ěly zahrnovat stanovení cytotoxicity a životaschopnosti, 
počtu kolonií a četnosti mutant ů pro exponované a kontrolní kultury. 
V případě pozitivní odpov ědi na zkoušku L5178Y TK  +/– se kolonie 
vyšetřují alespo ň u jedné koncentrace zkoušené látky (nejvyšší pozitivní 
koncentrace) a u negativní a pozitivní kontroly za použití kriteria malá kolonie – velká kolonie. Molekulární a cytogenetická povaha jak 
mutantů tvořících velké kolonie, tak mutant ů tvořících malé kolonie 
byla podrobn ě zkoumána (23, 24). Ve zkoušce TK
 +/– jsou kolonie 
vyšetřovány za použití kriteria kolonie s normálním r ůstem (velká) 
a kolonie s pomalým r ůstem (malá) (25). U mutantních bun ěk, které 
utrpěly nejrozsáhlejší genetické poškození, se prodloužily doby zdvo ­
jení, a tvo ří tedy malé kolonie. Poškození má obvykle rozsah od ztrát 
celého genu až po karyotypické viditelné chromosomové aberace. 
Indukce mutant ů tvořících malé kolonie se spojuje s chemickými 
látkami, které indukují silné chromosomové aberace (26). Mén ě závažně 
postižené bu ňky mutant ů rostou podobným tempem jako mate řské 
buňky a tvoří velké kolonie.  
Mělo by být udáno p řežití (relativní ú činnost klonování) nebo rela ­
tivní celkový r ůst. Četnost mutant ů by měla být vyjád řena jako po čet 
mutantů k počtu přeživších bun ěk. 
Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé kultury. Dále by m ěly být 
všechny údaje shrnuty ve form ě tabulky.  
Ověření jasně pozitivní odpov ědi se nepožaduje. Dvojzna čné 
výsledky by m ěly být vyjasn ěny dalším zkoušením, nejlépe 
s úpravami experimentálních podmínek. Negativní výsledky musí 
být potvrzeny p řípad od p řípadu. V p řípadech, kdy se nepovažuje 
potvrzení negativních výsledk ů za nezbytné, by m ělo být podáno 
zdůvodnění. Změna parametr ů studie s cílem rozší řit rozsah posuzo ­
vaných podmínek by m ěla být zvážena v následných experimentech 
jak pro dvojzna čné výsledky, tak pro negativní výsledky. 
K parametr ům studie, které by mohly být zm ěněny, patří rozmezí 
koncentrací a podmínky metabolické aktivace.  
2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Pro stanovení pozitivního výsledku existuje n ěkolik kritérií, nap ř. 
nárůst četností mutant ů v závislosti na koncentraci, nebo reproduko ­
vatelný nár ůst této četnosti. Nejd říve by měla být uvážena biologická 
relevance výsledk ů. Při hodnocení výsledk ů zkoušky mohou být 
použity jako pomocný prost ředek statistické metody. Statistická 
významnost by nem ěla být jediným ur čujícím faktorem pro pozitivní 
odpověď. 
Zkoušená látka, jejíž výsledky nespl ňují výše uvedená kritéria, se 
v tomto systému považuje za nemutagenní.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Ačkoli většina experiment ů poskytne jasn ě pozitivní nebo negativní 
výsledky, v ojedin ělých případech neumožní soubor údaj ů vyslovit 
konečný výrok o aktivit ě zkoušené látky. Výsledky mohou z ůstat 
dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment 
opakován.  
Pozitivní výsledky zkoušky na genové mutace v bu ňkách savc ů in 
vitro  znamenají, že zkoušená látka indukuje v použitých kultivova ­
ných buňkách savc ů genové mutace. Reprodukovatelná pozitivní 
závislost odpov ědi na koncentraci je velmi významná. Negativní 
výsledky znamenají, že zkoušená látka za podmínek zkoušky nein ­
dukuje v použitých kultivovaných bu ňkách savc ů genové mutace.  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— zdůvodnění volby rozpoušt ědla/vehikula,  
— rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpoušt ědle/vehikulu, je-li 
známa.  
Buňky: 
— typ a zdroj bun ěk, 
— počet buněčných kultur,  
— případně počet pasáží,  
— případně metody udržování bun ěčné kultury,  
— nepřítomnost mykoplasmat.  
Zkušební podmínky:  
— odůvodnění výběru koncentrací a po čtu kultur, v četně např. 
údajů o cytotoxicit ě a mezích rozpustnosti, jsou-li k dispozici,  
— složení média, p řípadně koncentrace CO  2 , 
— koncentraci zkoušené látky,  
— objem vehikula a p řidané zkoušené látky,  
— inkuba ční teplota,  
— inkuba ční doba,  
— délka expozice,  
— případně hustota bun ěk během expozice,  
— typ a složení použitého metabolického aktiva čního systému, 
včetně kritérií p řijatelnosti,  
— pozitivní a negativní kontroly,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— délka doby exprese (p řípadně včetně počtu nasazených bun ěk, 
subkultur a vým ěny média),  
— selekční činidla,  
— kritéria klasifikace zkoušky na pozitivní, negativní nebo dvoj ­
značnou, 
— metody použité k po čítání životaschopných a mutantních bun ěk, 
— definice kolonií podle velikosti a typu (p řípadně včetně kriterií 
pro malé a velké kolonie).  
Výsledky:  
— známky toxicity,  
— známky srážení,  
— údaje o pH a osmolalit ě během expozice zkoušené látce, pokud 
byly stanoveny,  
— velikost kolonií, byla-li vyšet řována, alespo ň pro negativní 
a pozitivní kontroly,  
— popřípadě předpoklady laborato ře detekovat mutanty tvo řící malé 
kolonie systémem L5178Y TK  +/– , 
— podle možnosti závislost odpov ědi na dávce,  
— případné statistické analýzy,  
— údaje o soub ěžné negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) a pozitivní 
kontrole,  
— dosavadní údaje o negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) a pozitivní 
kontrole s rozmezími, st ředními hodnotami a sm ěrodatnými 
odchylkami,  
— četnost mutant ů. 
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, 
K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Muta ­
genesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
2) Chu, E.H.Y. and Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Gene ­
tics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells  In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 
61, 1306–1312.
 
3) Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, 467–485.
 
4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, 
K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse 
Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, 
394–403.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the 
AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six 
Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121–128.  
6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group 
Report. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 235–239.
 
7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity 
under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147–204.
 
8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavour ­
nin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in 
Culture. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, 225–251.
 
9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/ 
Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program. Mutation Res., 196, 17–36.
 
10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., 
Loveday, K.S., O’Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the 
Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphori ­
bosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135–141.
 
11) Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). 
A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT 
Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences 
are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9–17.
 
12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133–147.
 
13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for 
the L5178Y/TK  +/- – TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Mutageni ­
city Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutage ­
nicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, 
s. 239–268.  
14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, 
J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: 
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, 
D.J., Ed., Cambridge University Press, s. 66–101.
 
15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365–373.
 
16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 
347–364.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and 
Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of 
the L5178Y/TK  +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. 
Mutat. Res., 59, 61–108.  
18) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173–215.  
19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, 175–177.  
20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an 
Inducer of Metabolic Activation Systems. In:  In Vitro  Metabolic 
Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, s. 85–88.
 
21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/ 
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile 
Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Geno ­
toxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91–103.
 
22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 
795–801.
 
23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and 
Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 51–55.
 
24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, 
A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Triflu ­
orothymidine-Resistant (TFT  r ) Mutants of L5178Y/TK  +/- 
Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, 161–174.  
25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, 89–102.
 
26) Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromo ­
some Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK
 +/- - 3.7.2C Mouse Lymp ­
homa Cells. Mutagenesis, 5, 609–614.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18  ZKOUŠKA NA POŠKOZENÍ A REPARACI DNA – 
NEPLÁNOVANOU SYNTÉZU DNA – V SAV ČÍCH BU ŇKÁCH  
IN VITRO  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Není uvedena.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkouška na neplánovanou syntézu DNA (UDS) umož ňuje měřit 
reparační syntézu DNA po vyšt ěpení a nahrazení části DNA obsa ­
hující oblast poškození indukovaného chemickými nebo fyzikálními faktory. Zkouška je založena na inkorporaci zna čeného thymidinu 
(
 3 H-TdR) do DNA sav čích buněk, které nejsou v S-fázi bun ěčného 
cyklu. Inkorporace  3 H-TdR je stanovena autoradiograficky nebo 
kapalinovou scintila ční spektrometrií (LSC) DNA exponovaných 
buněk. Savčí buněčné kultury, pokud ne p římo primární bun ěčné 
kultury hepatocyt ů potkana, se exponují zkoušené látce jak 
v přítomnosti, tak i v nep řítomnosti vn ějšího metabolického aktiva č­
ního systému. UDS m ůže být také stanovena  in vivo . 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Příprava  
Zkoušené chemické látky a kontroly nebo referen ční látky se p řipraví 
v kultivačním médiu nebo se rozpustí nebo suspendují ve vhodných 
vehikulech a poté se pro ú čely stanovení z ředí kultiva čním médiem. 
Konečná koncentrace vehikula v kultu ře nesmí ovliv ňovat života ­
schopnost bun ěk. 
Pro stanovení se použijí primární kultury hepatocyt ů potkana, 
lidských lymfocyt ů, nebo zavedených bun ěčných linií (lidských 
diploidních fibroblast ů). 
Buňky se exponují zkoušené chemické látce jak v p řítomnosti, tak 
v nepřítomnosti vhodného metabolického aktiva čního systému.  
Zkušební podmínky  
P o č e t k u l t u r  
Pro každý experimentální bod je pot řeba nejmén ě dvou bun ěčných 
kultur pro autoradiografii a šesti kultur (nebo mén ě, jeli to v ědecky 
zdůvodnitelné) pro metodu stanovení UDS pomocí LSC.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Do každého experimentu se nasadí soub ěžné pozitivní a negativní 
(neexponované a/nebo s vehikulem) kontroly v p řítomnosti i v nep ří­
tomnosti metabolického aktiva čního systému.  
Příkladem pozitivní kontroly pro stanovení s hepatocyty potkana je 
7,12-dimethylbenzoanthracen (7,12-DMBA) nebo N-(fluoren-2- 
yl)acetamid (2-AAF). P říkladem pozitivní kontroly pro zavedené 
buněčné linie jak pro autoradiografii, tak i pro LSC provád ěné bez 
metabolické aktivace je 4-nitrochinolin-N-oxid (4-NQO); N-nitroso ­
dimethylamin je p říkladem chemické látky pro pozitivní kontrolu p ři 
použití metabolického aktiva čního systému.  
E x p o z i č n í k o n c e n t r a c e  
Použije se n ěkolik koncentrací zkoušené látky v rozsahu p řiměřeném 
pro stanovení odezvy. Nejvyšší koncentrace musí vyvolávat cytoto ­
xické účinky. Látky, které jsou relativn ě nerozpustné ve vod ě, se 
zkouší až k mezi rozpustnosti. Nejvyšší koncentrace u netoxických 
látek dob ře rozpustných ve vod ě se určí případ od p řípadu.  
B u ň k y 
Pro udržování kultur se použijí vhodná kultiva ční média, koncent ­
race CO  2 , teplota a vlhkost. U zavedených bun ěčných linií musí být 
pravideln ě kontrolováno, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty.  
M e t a b o l i c k á a k t i v a c e  
U primárních kultur hepatocyt ů se nepoužívá metabolický aktiva ční 
systém. Zavedené bun ěčné linie a lymfocyty se exponují zkoušené 
látce za p řítomnosti i nep řítomnosti vhodného metabolického akti ­
vačního systému.  
Postup  
P ř í p r a v a k u l t u r  
Zavedené bun ěčné linie se pomnoží ze zásobních kultur (trypsinací 
nebo setřepáním bun ěk z povrchu kultiva ční nádoby), nao čkují se do 
kultivačních nádob ve vhodné hustot ě a inkubují se p ři teplotě 37 o C. 
Krátkodobé kultury hepatocyt ů potkana se p řipravují tak, že se 
umožní, aby se čerstvě izolované hepatocyty p řichytily ve vhodném 
médiu k povrchu kultiva ční nádoby.  
Kultury lidských lymfocyt ů se založí vhodnou metodou.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
E x p o z i c e k u l t u r z k o u š e n é l á t c e  
Primární hepatocyty potkana  
Čerstvě izolované hepatocyty potkana se vhodnou dobu exponují 
zkoušené látce v médiu obsahujícím  3 H-TdR. Po ukon čení expozice 
se médium z bun ěk odstraní, bu ňky se promyjí, fixují a vysuší. 
Preparáty se pono ří do autoradiografické emulze (m ůže být použita 
také sloupávací fólie), emulze se exponuje, vyvolá, obarví a vyhodnotí.
 
Zavedené bun ěčné linie a lymfocyty  
Autoradiografické techniky: Bun ěčné kultury se vhodnou dobu expo ­
nují zkoušené látce a poté se vystaví  3 H-TdR. Doba expozice je 
závislá na druhu zkoušené látky, na aktivit ě metabolického systému 
a na typu bun ěk. K zachycení vrcholu UDS je t řeba 3 H-TdR přidat 
současně se zkoušenou látkou nebo n ěkolik minut po expozici. 
Výběr mezi těmito postupy závisí na možné interakci mezi zkou ­ 
šenou látkou a  3 H-TdR. K rozlišení UDS od semikonzervativní repli ­
kace DNA se používá médium deficientní na arginin, nízký obsah séra nebo hydroxymo čovina v kultiva čním médiu, což p ůsobí inhi­
bici semikonzervativní replikace DNA.
 
Stanovení UDS pomocí LSC: P řed expozicí zkoušené látce se zablo ­
kuje vstup bun ěk do S-fáze, jak bylo uvedeno výše; bu ňky se poté 
exponují zkoušené látce zp ůsobem popsaným pro autoradiografii. Na 
konci kultivace se DNA extrahuje z bun ěk a stanoví se celkový 
obsah DNA a rozsah zabudování  3 H-TdR.  
Použijí-li se ve výše uvedených metodách lidské lymfocyty, je 
v nestimulovaných kulturách suprese semikonzervativní replikace DNA zbyte čná.
 
Analýza  
V y h o d n o c e n í a u t o r a d i o g r a f i e  
Při vyhodnocování UDS v bun ěčné kultuře se jádra v S-fázi nehod ­
notí. Pro každou koncentraci se hodnotí nejmén ě 50 bun ěk. 
Preparáty se p řed hodnocením opat ří kódem. V každém preparátu 
se hodnotí n ěkolik náhodn ě vybraných vzájemn ě vzdálených polí. 
Množství zabudovaného  3 H-TdR v cytoplazm ě se určí v zóně 
o velikosti t ří jader v cytoplazm ě každé hodnocené bu ňky. 
V y h o d n o c e n í L S C  
Pro stanovení UDS pomocí LSC se použije p řiměřený počet kultur 
pro každou koncentraci a pro kontroly.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Všechny výsledky se potvrdí nezávislým experimentem.  
2. ÚDAJE  
Údaje se zpracují v tabulkové form ě. 
2.1 VYHODNOCENÍ AUTORADIOGRAFIE  
Rozsah zabudování  3 H-TdR do cytoplazmy a po čet zrn nalezených 
mimo bun ěčné jádro se zaznamenají odd ěleně. 
Distribuci rozsahu zabudování  3 H-TdR do cytoplazmy a po čet zrn 
v jádře lze popsat st řední hodnotou, mediánem a modem.  
2.2 VYHODNOCENÍ LSC  
U LSC se rozsah zabudování  3 H-TdR zaznamená v dpm/ μg DNA. 
Distribuci zabudování lze popsat st řední hodnotou dpm/ μg DNA 
a směrodatnou odchylkou.  
Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— použité bu ňky, hustota a po čet pasáží v dob ě expozice kultury, 
počet buněčných kultur,  
— metody použité k udržování bun ěčné kultury, v četně média, 
teploty a koncentrace CO  2 , 
— zkoušená látka, vehikulum, koncentrace a zd ůvodnění výběru 
koncentrací pro zkoušku,  
— podrobné údaje o metabolickém aktiva čním systému,  
— plán expozice,  
— pozitivní a negativní kontroly,  
— použitá autoradiografická technika,  
— postupy použité k blokování vstupu bun ěk do S-fáze,  
— postupy použité k extrakci DNA a ke stanovení celkového 
obsahu DNA u metody LSC,  
— vztah dávka/odezva, jeli to možné,  
— statistické vyhodnocení,  
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19  ZKOUŠKA NA VÝM ĚNU SESTERSKÝCH CHROMATID  IN 
VITRO  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Stanovení vým ěny sesterských chromatid (SCE) je krátkodobou 
zkouškou zam ěřenou na detekci recipro ční výměny DNA mezi 
dvěma sesterskými chromatidami replikujícího se chromozomu. 
SCE představuje vzájemnou vým ěnu produkt ů replikace DNA 
v lokusech jevících se jako homogenní. Proces vým ěny pravd ěpo­
dobně zahrnuje zlom a op ětovné spojení DNA, a čkoliv zatím exis ­
tuje málo znalostí o molekulárním základu tohoto procesu. Detekce SCE vyžaduje rozdílné zna čení sesterských chromatid; toho se 
dosahuje zabudováním bromdeoxyuridinu (BrdU) do chromosomální 
DNA na dobu dvou bun ěčných cykl ů.
 
Savčí buňky in vitro  se exponují zkoušené látce podle pot řeby za 
přítomnosti i nep řítomnosti sav čího vnějšího metabolického aktiva č­
ního systému a kultivují se po dobu dvou replika čních cykl ů v médiu 
obsahujícím BrdU. Ke konci kultivace se bu ňky zpracují inhibitorem 
dělicího vřeténka (nap ř. kolchicinem), aby se akumulovaly bu ňky 
v C-metafázi mitózy; kultury se sklidí a p řipraví se preparáty pro 
analýzu chromozom ů. 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1  Příprava  
— Pro stanovení se mohou používat primární kultury (lidské lymfo ­
cyty) nebo zavedené bun ěčné linie (nap ř. ovariální bu ňky křečka 
čínského). U bun ěk musí být pravideln ě kontrolováno, zda 
nejsou kontaminovány mykoplasmaty.  
— Použijí se vhodná kultiva ční média a inkuba ční podmínky (tep ­
lota, kultiva ční nádoby, koncentrace CO  2 a vlhkost).  
— Před exponováním bun ěk se zkoušené látky rozpustí nebo 
suspendují v kultiva čním médiu nebo ve vhodných vehikulech. 
Konečná koncentrace vehikula v kultu ře nesmí ovlivnit života ­
schopnost bun ěk nebo rychlost r ůstu; vliv na četnost SCE se 
sleduje kontrolou s rozpoušt ědlem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Buňky se exponují zkoušené látce jak v p řítomnosti, tak 
v nepřítomnosti vn ějšího sav čího metabolického aktiva čního 
systému. Pokud se použijí bun ěčné typy s vnit řní metabolickou 
aktivitou, m ělo by být známo, že úrove ň a vlastnosti této aktivity 
jsou vhodné pro zkoušenou t řídu chemických látek.  
1.6.2  Zkušební podmínky  
P o č e t k u l t u r  
Pro každý experimentální bod se použijí nejmén ě dvě kultury.  
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Do každého experimentu se nasadí pozitivní kontroly využívající jak 
přímo působící chemickou látku, tak látku vyžadující metabolickou 
aktivaci; rovn ěž se použije kontrola s vehikulem.  
Příkladem pozitivní kontroly mohou být tyto látky:  
— přímo působící látky:  
— ethyl-methansulfonát,  
— nepřímo působící látky:  
— cyklofosfamid.  
Podle pot řeby se za řadí další pozitivní kontrola ze stejné t řídy 
chemických látek, jako je zkoušená látka.  
E x p o z i č n í k o n c e n t r a c e  
Zkoušejí se nejmén ě tři dostatečně odstupňované koncentrace zkou ­ 
šené látky. Nejvyšší koncentrace musí vyvolat významné toxické 
účinky, avšak zárove ň musí umožnit p řiměřenou replikaci bun ěk. 
Látky, které jsou relativn ě nerozpustné ve vod ě, se zkouší až 
k mezi rozpustnosti za použití vhodných postup ů. Nejvyšší koncent ­
race u netoxických látek dob ře rozpustných ve vod ě se určí případ 
od případu.  
1.6.3 e Postup  
P ř í p r a v a k u l t u r  
Zavedené bun ěčné linie se pomnoží ze zásobní kultury (nap ř. tryp­
sinací nebo set řepáním bun ěk z povrchu kultiva ční nádoby), nao čkují 
se do kultiva čních nádob ve vhodné hustot ě a inkubují se p ři teplotě 
37 o C. Pro jednovrstevné kultury se stanoví takový po čet buněk 
v kultivační nádobě, aby v dob ě sklizně nepřesáhly 50 % konfluenci. 
Lze také použít suspensní kultury. Lidské lymfocytární kultury se 
připraví vhodnými postupy z heparinizované krve a inkubují p ři 
teplotě 37 o C. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
E x p o z i c e  
Buňky v exponenciální fázi r ůstu se vhodnou dobu exponují zkou ­ 
šené látce; ve v ětšině případů stačí jedna až dv ě hodiny, avšak 
expozice m ůže být v ur čitých případech prodloužena až na dva 
úplné bun ěčné cykly. Bu ňky, které nemají dostate čnou vnitřní meta­
bolickou aktivitu, musí být exponovány zkoušené chemické látce za 
přítomnosti i za nep řítomnosti vhodného metabolického aktiva čního 
systému. Na konci expozi ční doby se z bun ěk vymyje zkoušená látka 
a buňky se kultivují v p řítomnosti BrdU po dva replika ční cykly. Je 
možné rovn ěž exponovat bu ňky současně zkoušené látce a BrdU po 
dobu dvou bun ěčných cykl ů. 
Lidské lymfocytární kultury se exponují, dokud jsou 
v semisynchronizovaném stavu.  
Buňky se analyzují v druhém mitotickém d ělení po expozici, 
přičemž se zajistí, aby expozice chemické látce prob ěhla 
v nejcitliv ějším stádiu bun ěčného cyklu. Všechny kultury 
s přidaným BrdU se udržují až do sklizn ě v temnu nebo za slabého 
osvětlení žárovkou, aby se minimalizovala fotolýza DNA, ve které je 
zabudován BrdU.  
S k l i z e ň b u n ě k 
Jednu až čtyři hodiny p řed sklizní bun ěk se kultury zpracují inhibi ­
torem dělicího vřeténka (nap ř. kolchicinem). Každá kultura se sklidí 
a samostatn ě zpracuje pro p řípravu preparát ů pro analýzu chromo ­
somů. 
P ř í p r a v a p r e p a r á t ů p r o a n a l ý z u c h r o m o s o m ů 
a b a r v e n í  
Preparáty pro analýzu chromosom ů se připraví standardními cytoge ­
netickými technikami. Barvení preparát ů ke znázorn ění SCE lze 
provést n ěkolika technikami (nap ř. fluorescen ční metodou plus 
Giemsa).  
A n a l ý z a  
Počet analyzovaných bun ěk závisí na spontánní četnosti SCE 
v kontrole. Obvykle se hodnotí nejmén ě 25 dobře rozprost řených 
metafází na kulturu. Preparáty se p řed analýzou opat ří kódem. 
V lidských lymfocytech se analyzují pouze metafáze s 46 centrome ­
rami. U zavedených linií se analyzují pouze metafáze, které se liší o ± 2 centromery od modálního po čtu centromer. Je t řeba stanovit, 
zda se za SCE považuje zm ěna v barvení v oblasti centromery. 
Všechny výsledky se potvrdí nezávislým experimentem.
 
2. ÚDAJE  
Údaje se zpracují v tabulkové form ě. Pro všechny exponované 
kultury a kontroly se samostatn ě zaznamená po čet SCE pro každou 
metafázi a po čet SCE/chromosom pro každou metafázi.  
Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— použité bu ňky, metody udržování bun ěčné kultury,  
— zkušební podmínky: složení média, koncentrace CO  2 , koncent ­
race zkoušené látky, použité vehikulum, inkuba ční teplota, inku ­
bační doba, délka expozice, použitý inhibitor mitózy, jeho 
koncentrace a délka jeho p ůsobení, typ použitého sav čího meta­
bolického aktiva čního systému, pozitivní a negativní kontroly,  
— počet kultur na každý experimentální bod,  
— podrobné údaje o zp ůsobu přípravy preparát ů, 
— počet analyzovaných metafází (odd ěleně pro každou kulturu),  
— střední hodnota po čtu SCE/bu ňku a SCE/chromosom (odd ěleně 
pro každou kulturu),  
— kritéria hodnocení SCE,  
— zdůvodnění výběru koncentrací,  
— vztah dávka/odezva, jeli to možné,  
— statistické vyhodnocení,  
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20  ZKOUŠKA NA RECESIVNÍ LETÁLNÍ MUTACE VÁZANÉ NA 
POHLAVÍ U  DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkouška na recesivní letální mutace vázané na pohlaví (SLRL) 
u Drosophila melanogaster  umožňuje detekci mutací, a to jak bodo ­
vých mutací, tak i malých delecí v zárode čných buňkách hmyzu. 
Tato zkouška je zkouškou na p římé mutace vhodnou pro screening 
v přibližně 800 lokusech chromosomu X; to p ředstavuje asi 80 % 
všech lokus ů chromosomu X. Chromosom X p ředstavuje p řibližně 
jednu pětinu celého haploidního genomu.  
Mutace v chromosomu X  Drosophila melanogaster  se fenotypicky 
projeví u samc ů nesoucích mutovaný gen. Když je mutace letální 
v hemizygotním stavu, lze na její p řítomnost usuzovat z absence 
jednoho ze dvou typ ů samčích potomk ů, kteří se obvykle rodí hete ­
rozygotní samici. Ve zkoušce na SLRL se tyto skute čnosti využívají 
prostřednictvím speciáln ě označených a uspo řádaných chromosom ů. 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Příprava  
Z d r o j e  
Mohou být použiti samci dob ře definované divoké linie a samice 
linie Muller-5. Mohou být použity i jiné vhodn ě značené linie 
samic s vícenásobnou inversí chromosomu X.  
Z k o u š e n á l á t k a  
Zkoušené látky se rozpustí ve vod ě. Látky, které jsou nerozpustné ve 
vodě, se mohou rozpustit nebo suspendovat ve vhodných vehikulech 
(např. ve směsi ethanolu a Tween-60 nebo 80) a p řed aplikací se 
dále ředí vodou nebo fyziologickým roztokem. Použití dimethylsul ­
foxidu (DMSO) jako vehikula je t řeba se vyhnout.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
P o č e t z v í ř a t 
Citlivost a síla zkoušky se stanoví p ředem. Četnost spontánních 
mutací pozorovaná v p říslušné kontrolní skupin ě významn ě ovlivní 
počet exponovaných chromosom ů, které je t řeba analyzovat.  
Z p ů s o b p o d á v á n í  
Expozice zkoušené látce m ůže být orální, injek ční nebo m ůže jít 
o expozici plyn ům nebo parám. P ři orální aplikaci (zkrmování) se 
zkoušená látka podává v cukerném roztoku. Podle pot řeby lze zkou ­ 
šenou látku rozpustit v 0,7 % roztoku NaCl a injek čně nastříknout do 
hrudní nebo b řišní dutiny.  
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Nasadí se negativní kontroly (s vehikulem) a pozitivní kontroly. 
Jsou-li k dispozici vhodné laboratorní údaje z d řívějších pokus ů 
s kontrolami, není t řeba nasazovat žádné soub ěžné kontroly.  
Ú r o v n ě e x p o z i c e  
Použijí se t ři úrovně expozice. Pro p ředběžný orienta ční odhad se 
použije jedna úrove ň expozice rovnající se bu ď maximální tolero ­
vané koncentraci, nebo úrovni vyvolávající známky toxicity. U netoxických látek se použije nejvyšší dosažitelná koncentrace.
 
P o s t u p  
Samci divokého typu (ve stá ří 3–5 dnů) se exponují zkoušené látce 
a jednotliv ě jsou připouštěni k více dosud nep řipuštěným samicím 
z linie Muller-5 nebo z jiné vhodn ě značené linie (s vícenásobnou 
inverzí chromosomu X). Samice se vym ění za čerstvé dosud nep ři­
puštěné samice každé dva až t ři dny, aby se pokryl celý bun ěčný 
cyklus zárode čných bun ěk. U potomk ů těchto samic se sleduje 
letální účinek odpovídající ú činkům na zralé spermie, na spermatidy 
ve středním nebo pozdním stadiu, na časné spermatidy, spermatocyty 
a spermatogonie v dob ě expozice.  
Heterozygotní samice generace F  1 narozené z tohoto k řížení se dále 
kříží jednotliv ě (tj. jedna samice/zkumavku) se svými bratry. 
V generaci F  2 se v každé kultu ře zaznamená absence samc ů divo­
kého typu. Jestliže se v kultu ře F 1 rodí samice nesoucí letální mutaci 
v rodičovském chromosomu X (tj. nejsou nalezeni žádní samci 
s ovlivněným chromosomem), testují se dcery t ěchto samic se 
stejným genotypem, aby se zjistilo, zda se letalita opakuje v p říští 
generaci.  
2. ÚDAJE  
Údaje se zpracují v tabulkové form ě; uvede se po čet hodnocených 
chromosom ů X, počet afertilních samc ů a počet chromosom ů 
s letální mutací pro každou koncentraci, pro každé období k řížení 
a pro každého exponovaného samce. Zaznamenává se po čet klastrů 
různých velikostí na každého samce. Výsledky se potvrdí nezávislým 
experimentem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Zkouška na recesivní letální mutace vázané na pohlaví se vyhodnotí 
vhodnými statistickými metodami. Nahromad ění recesivních letál ­
ních mutací vzniklých v jednom samci se zpracuje a zhodnotí vhodným statistickým zp ůsobem.
 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— zdroje: použité linie nebo kmeny druhu  Drosophila , věk hmyzu, 
počet exponovaných samc ů, počet sterilních samc ů, počet vznik­
lých kultur F  2 , počet kultur F  2 bez potomk ů, počet zjištěných 
chromosom ů nesoucích letální mutaci v každém stadiu zárode č­
ných bun ěk, 
— kritéria pro velikost exponovaných skupin,  
— podmínky zkoušky: podrobný popis plánu expozice a odb ěru 
vzorků, úrovně expozice, údaje o toxicit ě, podle pot řeby nega ­
tivní kontroly (s rozpoušt ědlem) a pozitivní kontroly,  
— kritéria hodnocení letálních mutací,  
— vztah expozice/ú činek, jeli to možné,  
— hodnocení údaj ů, 
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21  ZKOUŠKY NA TRANSFORMACE SAV ČÍCH BUN ĚK IN VITRO  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Kultury sav čích buněk lze použít pro detekci fenotypických zm ěn in 
vitro indukovaných chemickými látkami spojovanými s maligní transformací  in vivo . Často používanými bu ňkami jsou C3H10T
 1/2 , 
3T3, SHE, bu ňky potkan ů Fischer a zkouška se opírá o zm ěny 
buněčné morfologie, tvorbu ložisek nebo zm ěny v uchycení 
v polotuhém agaru. Mén ě často se používají systémy detekující 
ostatní fyziologické či morfologické zm ěny v buňkách po expozici 
karcinogenním chemickým látkám. Žádný výsledek zkoušky  in vitro  
není důkazem karcinogenity. N ěkteré systémy jsou schopny dete ­
kovat promotory tumor ů. Cytotoxicita se zjistí m ěřením účinku zkou ­ 
šeného materiálu na schopnost vytvá řet kolonie (ú činnosti klonování) 
nebo rychlosti r ůstu kultur. Stanovením cytotoxicity lze zjistit, zda 
byla expozice zkoušené látce toxikologicky relevantní, nelze ji však použít k ur čení četnosti transformace ve všech experimentech, 
protože u n ěkterých mohlo dojít k prodloužení inkubace nebo 
k replatingu.
 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Příprava  
B u ň k y 
Pro různé zkoušky transformace existuje řada použitelných bun ěč­
ných linií a primárních kultur. Experimentátor musí zajistit, že bu ňky 
použité v testu transformace vykazují p říslušné fenotypické zm ěny 
po expozici známým karcinogen ům a že zkouška používaná v jeho 
laboratoři je ov ěřena a že je dokumentována její validita 
a spolehlivost.  
M é d i u m  
Použitá média a experimentální podmínky musí být vhodné pro 
použitou zkoušku na transformace.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
Z k o u š e n á l á t k a  
Před exponováním bun ěk je možné zkoušené látky rozpustit nebo 
suspendovat v kultiva čním médiu nebo ve vhodných vehikulech. 
Konečná koncentrace vehikula v kultu ře nesmí ovlivnit životaschop ­
nost buněk, rychlost r ůstu nebo výskyt transformace.  
M e t a b o l i c k á a k t i v a c e  
Buňky by měly být vystaveny zkoušené látce, a to s vhodnou meta ­
bolickou aktivací a bez ní. Pokud se použijí bun ěčné typy s vnit řní 
metabolickou aktivitou, m ělo by být známo, že úrove ň a vlastnosti 
této aktivity jsou vhodné pro zkoušenou t řídu chemických látek.  
Zkušební podmínky  
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Do každého experimentu se nasadí pozitivní kontroly využívající jak 
přímo působící chemickou látku, tak látku vyžadující metabolickou 
aktivaci; rovn ěž se použije kontrola s vehikulem.  
Příkladem pozitivní kontroly mohou být tyto látky:  
— přímo působící látky:  
— ethyl-methansulfonát,  
— propano-3-lakton,  
— látky vyžadující metabolickou aktivaci:  
— N-(fluoren-2-yl)acetamid,  
— 4-dimethylaminoazobenzen,  
— 7,12-dimethylbenzoanthracen.  
Podle pot řeby se za řadí další pozitivní kontrola ze stejné t řídy 
chemických látek, jako je zkoušená látka.  
E x p o z i č n í k o n c e n t r a c e  
Použije se n ěkolik koncentrací zkoušené látky. Tyto koncentrace 
musí vyvolávat toxický ú činek závislý na koncentraci, p řičemž 
nejvyšší koncentrace má vést k nízké úrovni p řežití bun ěk 
a úroveň přežití bun ěk při nejnižší koncentraci má být p řibližně 
stejná jako u negativní kontroly. Látky, které jsou relativn ě neroz­
pustné ve vod ě, se zkouší až k mezi rozpustnosti za použití vhod ­
ných postup ů. Nejvyšší koncentrace u netoxických látek dob ře 
rozpustných ve vod ě se určí případ od p řípadu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Postup  
Buňky se exponují dostate čnou dobu v závislosti na použitém 
zkušebním systému; p ři delší expozici m ůže být nezbytná opakovaná 
expozice spojená s vým ěnou média (a podle pot řeby s vým ěnou 
čerstvé metabolické aktiva ční směsi). Buňky, které nemají dosta ­
tečnou vnitřní metabolickou aktivitu, musí být exponovány zkoušené 
chemické látce za p řítomnosti i za nep řítomnosti vhodného metabo ­
lického aktiva čního systému. Na konci expozi ční doby se z bun ěk 
vymyje zkoušená látka a bu ňky se kultivují za vhodných podmínek, 
aby se mohl projevit sledovaný transformovaný fenotyp; poté se 
zaznamená výskyt transformace. Všechny výsledky se potvrdí nezá ­
vislým experimentem.  
2. ÚDAJE  
Údaje se zpracují v tabulkové form ě; podle použité zkoušky jimi 
mohou být nap ř. počet misek, po čet misek s transformací nebo 
počet transformovaných bun ěk. Podle pot řeby se p řežití bun ěk 
vyjádří v procentech p řežití v kontrolní kultu ře a četnost transformací 
se vyjádří jako podíl transformovaných bun ěk a životaschopných 
buněk. Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— typ použitých bun ěk, počet buněčných kultur, metody udržování 
buněčných kultur,  
— zkušební podmínky: koncentrace zkoušené látky, použité vehiku ­
lum, doba inkubace, délka a frekvence expozice, hustota bun ěk 
během expozice, typ použitého vn ějšího metabolického aktiva č­
ního systému, pozitivní a negativní kontroly, specifikace sledo ­
vaného fenotypu, použitý selek ční systém (podle pot řeby), 
zdůvodnění výběru koncentrací,  
— metody po čítání životaschopných a transformovaných bun ěk, 
— statistické vyhodnocení,  
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22  DOMINANTNÍ LETÁLNÍ ZKOUŠKA NA HLODAVCÍCH  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Dominantní letální ú činky způsobují embryonální nebo fetální smrt. 
Indukce dominantních letálních mutací po expozici chemické látce dokazuje, že tato látka poškozuje zárode čné tkáně zkušebního druhu. 
Obecně se má za to, že dominantní letální mutace jsou zp ůsobeny 
poškozením chromosom ů (strukturní a numerické abnormality). Smrt 
embrya exponované samice m ůže být také výsledkem toxických 
účinků.
 
Samci jsou zpravidla exponováni zkoušené látce a pá řeni 
s neexponovanými, dosud nep řipuštěnými samicemi. R ůzná stadia 
zárodečných bun ěk mohou být testována odd ěleně použitím po 
sobě jdoucích interval ů páření. Nárůst mrtvých implantací na samici 
v exponované skupin ě nad počet mrtvých implantací na samici 
v kontrolní skupin ě odpovídá postimplanta čním ztrátám. Preimplan ­
tační ztráty se hodnotí na základ ě počtu žlutých t ělísek nebo porov ­
náním všech implantací na samici v exponované a kontrolní skupin ě. 
Celková dominantní letalita je sou čtem preimplanta čních 
a postimplanta čních ztrát. Výpo čet celkové dominantní letality je 
založen na porovnání po čtu živých implantací na samici 
v exponované skupin ě s počtem živých implantací na samici 
v kontrolní skupin ě. Snížení po čtu implantací v n ěkterých intervalech 
může být zp ůsobeno zánikem bun ěk (tj. spermatocyt ů a/nebo sper ­
matogonií).  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Příprava  
Zkoušená látka se pokud možno rozpustí nebo suspenduje 
v isotonickém fyziologickém roztoku. Látky, které jsou nerozpustné ve vodě, se mohou rozpustit nebo suspendovat ve vhodných vehi ­
kulech. Použité vehikulum nesmí interferovat se zkoušenou látkou 
ani vyvolávat toxické ú činky. Použijí se čerstvě připravené roztoky 
zkoušené látky.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Zkušební podmínky  
Z p ů s o b p o d á v á n í  
Zkoušená látka se obvykle podává pouze jednou. Na základ ě toxi­
kologických informací lze podávat látku opakovan ě. Obvyklými 
způsoby podávání jsou orální aplikace sondou nebo intraperitoneální 
injekce. Mohou být vhodné i jiné zp ůsoby aplikace.  
P o k u s n á z v í ř a t a 
Jako zkušební druh se doporu čuje potkan nebo myš. Provede se 
náhodný výb ěr zdravých, pohlavn ě dospělých zvířat, která se p řiřadí 
do experimentálních a kontrolních skupin.  
P o č e t a p o h l a v í  
Použije se dostate čný počet exponovaných samc ů s ohledem na 
spontánní variabilitu hodnocené biologické charakteristiky. Po čet se 
zvolí s ohledem na p ředem stanovenou citlivost detekce 
a statistickou významnost. V typické zkoušce se nap říklad volí 
takový po čet samců v každé exponované skupin ě, aby bylo dosaženo 
30–50 březích samic na dobu p řipouštění. 
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Do každého experimentu se nasadí soub ěžné pozitivní a negativní 
kontroly (neexponované s vehikulem). Jestliže jsou k dispozici p řija­
telné výsledky pozitivní kontroly z nedávných experiment ů provede­
ných v téže laborato ři, mohou být použity namísto soub ěžných pozi ­
tivních kontrol. Látky pro pozitivní kontroly se za ú čelem prokázání 
citlivosti zkoušky použijí ve vhodných nízkých dávkách (nap ř. 
MMS, intraperitoneáln ě, 10 mg/kg).  
Ú r o v n ě d á v e k  
Obvykle se použijí t ři úrovně dávek. Nejvyšší dávka má 
u exponovaných zví řat vyvolat známky toxicity nebo snížené ferti ­
lity. V n ěkterých p řípadech m ůže být posta čující jedna vysoká 
dávka.  
L i m i t n í z k o u š k a  
Netoxické látky se podávají v množství 5 g/kg p ři jednorázovém 
podávání nebo v dávce 1 g/kg na den p ři opakovaném podávání.  
Postup  
Existuje n ěkolik plán ů expozice. Nej častěji se používá jednorázové 
podávání. Mohou však být použity jiné plány expozice.  
Jeden samec je opakovan ě křížen s jednou nebo dv ěma neexpono ­
vanými, dosud nep řipuštěnými samicemi ve vhodných intervalech po 
expozici. Samice musí být u samc ů ponechány nejmén ě po dobu 
trvání jednoho estrálního cyklu, nebo dokud nedojde ke spá ření 
prokázanému spermiemi ve vagin ě nebo přítomností vaginální zátky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Počet páření po expozici je dán plánem expozice a musí být dosta ­
tečný, aby zahrnul všechna stádia zárode čných bun ěk po expozici.  
Samice se utratí v druhé polovin ě březosti a obsah d ělohy se vyšet ří 
za účelem určení počtu mrtvých a živých implantací. Vaje čníky 
mohou být vyšet řeny k určení počtu žlutých t ělísek.  
2. ÚDAJE  
Údaje se zpracují v tabulkové form ě a uvede se po čet samců, počet 
březích samic a po čet nezabřezlých samic. Samostatn ě se uvedou 
výsledky každého pá ření, včetně identifikace každého samce 
a samice. Pro každou samici se zaznamená týden pá ření, dávka, 
kterou obdržel samec, po čet živých a mrtvých implantací.  
Výpočet celkového dominantního letálního ú činku je založen na 
porovnání po čtu živých implantací na samici v exponované skupin ě 
s počtem živých implantací na samici v kontrolní skupin ě. Srovnání 
poměru mrtvých implantací k živým implantacím v exponované 
skupině a téhož pom ěru v kontrolní skupin ě vypovídá 
o postimplanta čních ztrátách.  
Zaznamenávají-li se údaje o časné a pozdní letalit ě, musí být 
v tabulkách jasn ě odlišeny. Odhadují-li se také preimplanta ční ztráty, 
uvedou se. Preimplanta ční ztráty mohou být vypo čítány jako rozdíl 
mezi počtem žlutých t ělísek a po čtem implantací nebo jako snížení 
průměrného počtu implantací na d ělohu ve srovnání s kontrolou.  
Údaje se vyhodnotí vhodnými statistickými metodami.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— druh, kmen, v ěk a hmotnost zví řat, počet zvířat každého pohlaví 
v exponovaných a kontrolních skupinách,  
— zkoušená látka, vehikulum, zkoušené úrovn ě dávek a d ůvody 
jejich výb ěru, negativní a pozitivní kontroly, údaje o toxicit ě, 
— způsob podání a plán expozice,  
— plán pá ření, 
— metody pr ůkazu spáření, 
— doba usmrcení,  
— kritéria pro hodnocení dominantních letálních ú činků, 
— vztah dávka/odezva, jeli to možné,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— statistické vyhodnocení,  
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23  ZKOUŠKA NA CHROMOSOMOVÉ ABERACE VE 
SPERMATOGONIÍCH SAVC Ů 
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 483 – Zkouška na chro ­
mosomové aberace ve spermatogoniích savc ů (1997).  
1.1 ÚVOD  
Účelem zkoušky na chromosomové aberace ve spermatogoniích 
savců in vivo  je identifikovat takové látky, které zp ůsobují strukturní 
chromosomové aberace ve spermatogoniích savc ů (1, 2, 3, 4, 5). 
Rozlišují se dva typy strukturních aberací: chromosomové a chromatidové. U v ětšiny chemických mutagen ů jsou indukované 
aberace chromatidového typu, avšak chromosomové aberace se 
rovněž vyskytují. Tato metoda však není ur čena ke stanovení nume ­
rických aberací a není k tomuto ú čelu rutinn ě používána. Chromo ­
somové mutace a podobné jevy jsou p říčinou mnoha geneticky 
podmíněných chorob u člověka.
 
Touto zkouškou se stanovují chromosomové zm ěny ve spermatogo ­
niích a p ředpokládá se tedy, že tato zkouška poskytne p ředpověď 
indukce d ědičných mutací v germinálních bu ňkách.  
Při této zkoušce jsou rutinn ě používáni hlodavci. Touto cytogene ­
tickou zkouškou  in vivo  se detekují chromosomové aberace p ři 
mitose spermatogonií. Jiné cílové bu ňky nejsou p ředmětem této 
zkoušky.  
Pro detekci aberací chromatidového typu ve spermatogoniích by 
mělo být – d říve než dojde ke ztrát ě léze – vyšet řeno první mitotické 
buněčné dělení, které následuje po aplikaci. Další informace 
z exponovaných spermatogoniálních kmenových bun ěk lze získat 
meiotickou chromosomovou analýzou aberací chromosomového typu v diakinese-metafázi I, kdy se exponované bu ňky stávají sper ­
matocyty.
 
Tato zkouška  in vivo  je navržena pro vyšet ření, zda jsou mutageny 
somatických bun ěk aktivní také v germinálních bu ňkách. Navíc je 
tato zkouška se spermatogoniemi významná pro posouzení nebezpe čí 
mutagenese, nebo ť umožňuje zohlednit faktory metabolismu  in vivo  
farmakokinetiku a procesy reparace DNA.  
Ve varlatech je p řítomna řada generací spermatogonií s r ůznou citli ­
vostí na expozici chemické látce. Detekované aberace tedy p ředsta­
vují souhrnnou odpov ěď exponované populace spermatogonií 
s převládajícími diferencovanými spermatogoniemi. V závislosti na 
své poloze ve varlatech mohou nebo nemusí být r ůzné generace 
spermatogonií exponovány celkovému krevnímu ob ěhu v důsledku 
fyzikální a fyziologické bariéry Sertoliho bun ěk a bariéry mezi 
krevním ob ěhem a varlaty.  
Jestliže existuje d ůkaz o tom, že se zkoušená látka nebo reaktivní 
metabolity nedostanou do cílové tkán ě, není vhodné tuto zkoušku 
použít.  
Viz také obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2 DEFINICE  
Chromatidová aberace:  strukturní poškození chromozomu 
v podobě zlomu jednotlivých chromatid nebo zlomu a op ětného 
spojení chromatid.  
Chromozomová aberace:  strukturní poškození chromozomu 
v podobě zlomu nebo zlomu a spojení obou chromatid v tomtéž 
místě. 
Gap:  achromatická léze menší než ší řka jedné chromatidy a s mini ­
mální odchylkou chromatid.  
Numerická aberace:  odchylka po čtu chromosom ů od normální 
hodnoty u použitého typu bun ěk. 
Polyploidie:  násobek haploidního po čtu chromosomových sad ( n) 
jiný než diploidní (tj. 3 n, 4n atd.).  
Strukturní aberace:  mikroskopicky pozorovatelné zm ěny struktury 
chromosom ů při buněčném dělení ve stadiu metafáze; jeví se jako 
delece a fragmenty, intrachromosomální nebo interchromosomální změny.
 
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zvířata jsou vhodným zp ůsobem exponována zkoušené látce a po 
vhodné dob ě po expozici usmrcena. P řed usmrcením se zví řatům 
podá látka zastavující metafázi (nap ř. kolchicin nebo Colcemid  ® ). 
Z germinálních bun ěk se poté p řipraví preparáty chromosom ů, obarví 
se a analyzují se chromosomové aberace metafázujících bun ěk. 
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Přípravky  
1.4.1.1  Výb ěr druhu zví řete 
Běžně jsou používáni samci k řečka čínského a myši; lze však použít 
samce jakéhokoli jiného vhodného druhu savce. Použity by m ěly být 
běžně používané laboratorní kmeny mladých zdravých pohlavn ě 
dospělých zvířat. V okamžiku zahájení studie by m ěla být odchylka 
v hmotnosti zví řat minimální a nem ěla by překročit ± 20 % st řední 
hodnoty hmotnosti.  
1.4.1.2  Podmínky chovu a strava  
Platí obecné podmínky podle obecného úvodu k části B, přičemž by 
mělo být dosaženo vlhkosti vzduchu 50–60 %.  
1.4.1.3  Příprava zví řat 
Zdraví mladí pohlavn ě dospělí samci se náhodným výb ěrem rozdělí 
na kontrolní skupinu a skupinu, která se exponuje. Klece by m ěly 
být uspo řádány tak, aby byl vliv jejich polohy minimalizován. 
Zvířata se jednozna čně identifikují. P řed započetím studie se nechají 
v laboratorních podmínkách alespo ň pět dní aklimatizovat.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4  Příprava dávek  
Pevné zkoušené látky by m ěly být před aplikací zví řatům rozpušt ěny 
nebo suspendovány ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech 
a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být podávány 
přímo nebo mohou být p řed podáním z ředěny. Měly by být použity 
čerstvě připravené zkoušené látky, pokud údaje o stálosti neprokazují 
možnost skladování.  
1.4.2  Zkušební podmínky  
1.4.2.1  Rozpoušt ědlo/vehikulum  
Rozpoušt ědlo/vehikulum by nem ělo mít p ři použitých hladinách 
dávek toxické ú činky a mělo by být vylou čeno podez ření, že reaguje 
se zkoušenou látkou. Jsou-li použita jiná než známá 
rozpouštědla/vehikula, m ělo by být jejich za řazení podloženo údaji 
o jejich kompatibilit ě. Doporu čuje se pokud možno nejd říve zvážit 
použití vodných rozpoušt ědel/vehikul.  
1.4.2.2  Kontroly  
Součástí každého experimentu by m ěly být pozitivní a negativní 
(rozpoušt ědlo/vehikulum) kontroly. S výjimkou aplikace zkoušené 
látky by m ěla zvířata kontrolní skupiny podstoupit identický proces 
jako zvířata ve skupinách, v nichž dojde k expozici.  
Pozitivní kontroly by m ěly poskytovat strukturní aberace ve sperma ­
togoniích  in vivo  při expozičních úrovních, u nichž se p ředpokládá, 
že poskytnou detekovatelný nár ůst nad pozadí.  
Dávky pozitivní kontroly by m ěly být zvoleny tak, aby byl ú činek 
zřetelný, ale aby p ři odečtu nevyšla ihned najevo kódovaná identifi ­
kace preparátu. Je p řijatelné, aby byla pozitivní kontrola podávána 
jiným způsobem než zkoušená látka a aby byl odb ěr v jejím p řípadě 
prováděn jen jednou. Pro pozitivní kontrolu navíc m ůže být vzato 
v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické t řídy, jsou-li 
k dispozici. P říklady látek pro pozitivní kontrolu:  
Látka Číslo CAS Číslo podle EINECS  
cyklofosfamid 
cyklofosfamid monohydrát 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
cyklohexylamin 108-91-8 203-629-0 
mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
akrylamid (monomer) 79-06-1 201-173-7 2,4,6-tris(aziridin-1-yl)- 1,3,5-triazin 51-18-3 200-083-5
 
V okamžiku každého odb ěru by měl být proveden odb ěr u skupiny 
negativní kontroly, které je aplikováno pouze rozpoušt ědlo nebo 
vehikulum a která jinak podstupuje stejný proces jako exponované 
skupiny, pokud nejsou z dosavadních kontrolních údaj ů k dispozici 
přijatelné údaje o variabilit ě zvířat a četnosti bun ěk 
s chromosomovými aberacemi. Krom ě toho by m ěly být neexpono ­
vané kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud kontrolní údaje 
prokazující, že zvolené rozpoušt ědlo/vehikulum nevyvolává žádné 
zhoubné nebo mutagenní ú činky. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5 POSTUP  
1.5.1  Po čet zvířat 
Každá exponovaná i kontrolní skupina musí zahrnovat alespo ň pět 
analyzovatelných samc ů. 
1.5.2  Plán expozice  
Zkoušené látky by m ěly být pokud možno podávány jednorázov ě 
nebo nadvakrát (tj. p ři jedné expozici nebo dvou expozicích). Zkou ­ 
šené látky mohou být podávány také ve dvou dávkách, tzn. dv ě 
dávky v týž den v rozmezí ne více než n ěkolika hodin, aby bylo 
usnadněno podávání velkých objem ů materiálu. Jiné režimy podá ­
vání by m ěly být vědecky zd ůvodněny. 
Ve skupin ě s nejvyšší dávkou by m ěly být po expozici provedeny 
dva odběry. Poněvadž kinetika bun ěčného cyklu m ůže být zkou ­ 
šenou látkou ovlivn ěna, provede se jeden časný odb ěr a jeden 
pozdější odběr přibližně 24 hodin a 48 hodin po expozici. 
V případě jiné než nejvyšší dávky by m ěl být odb ěr proveden po 
24 hodinách nebo po takové dob ě expozice, která odpovídá 1,5 
násobku délky bun ěčného cyklu, pokud není známa jiná vhodn ější 
doba pro detekci ú činku (6).  
Navíc mohou být odb ěry provedeny také v jiné dob ě. Například 
v případě chemických látek, které mohou indukovat opožd ění repli­
kace (lagging) chromosom ů nebo mohou zp ůsobovat S-nezávislé 
účinky, může být vhodn ější časnější odběr (1).  
Vhodnost plánu opakované expozice musí být ur čena případ od 
případu. V p řípadě plánu s opakovanou expozicí by m ěla být zví řata 
usmrcena 24 hodin (1,5násobek délky cyklu) po poslední expozici. Podle pot řeby mohou být provád ěny další odb ěry v jiné dob ě.
 
Před usmrcením se zví řatům intraperitoneáln ě podá vhodná dávka 
látky zastavující metafázi (nap ř. Colcemid  ® nebo kolchicin). Poté 
se po vhodné dob ě provede u zví řat odběr. U myši je tato doba 
přibližně 3–5 hodin; u k řečka čínského je tato doba p řibližně 4–5 
hodin.  
1.5.3  Dávkování  
Provádí-li se kv ůli neexistenci vhodných dostupných údaj ů studie 
pro zjištění rozsahu, m ěla by být provedena ve stejné laborato ři, se 
stejným druhem a kmenem a za stejného režimu expozice, který se použije v hlavní studii (7). V p řípadě toxicity se pro první odb ěr 
použijí tři úrovně dávky. Tyto úrovn ě dávky by m ěly pokrývat 
rozpětí dané maximální a minimální toxicitou, p řípadně žádnou toxi ­
citou. Při pozdějším odběru stačí, když bude použita pouze nejvyšší 
dávka. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové 
známky toxicity, že vyšší dávky by vedly p ři stejném režimu dávko ­
vání podle o čekávání k letalit ě.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Látky se specifickou biologickou aktivitou p ři nízkých netoxických 
dávkách (nap ř. hormony a mitogeny) nemusí kritériím stanovení 
dávky vyhovovat a m ěly by být hodnoceny p řípad od p řípadu. 
Nejvyšší dávka m ůže být také definována jako dávka vyvolávající 
ve spermatogoniích n ěkteré známky toxicity (nap ř. snížení po čtu 
spermatogonií v mitose vzhledem k první a druhé meiotické meta ­
fázi; toto snížení by nem ělo překročit 50 %).  
1.5.4  Limitní zkouška  
Jestliže zkouška s jednou dávkou alespo ň 2 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti podanou jednorázov ě nebo ve dvou dávkách v jednom dni 
nevykazuje žádné pozorovatelné toxické ú činky a není-li na základ ě 
údajů o látkách, které mají podobnou strukturu, o čekávána genoto ­
xicita, nepovažuje se úplná studie se t řemi úrovn ěmi dávky za 
nezbytnou. O čekávaná expozice člověka může znamenat pot řebu 
použít v limitní zkoušce vyšší úrove ň dávky.  
1.5.5  Podávání dávek  
Zkoušená látka se obvykle podává nitrožalude čně, žaludeční sondou 
nebo vhodnou intuba ční kanylou, nebo intraperitoneální injekcí. Jiné 
způsoby podávání jsou v od ůvodněných případech p řijatelné. Maxi ­
mální objem kapaliny, který m ůže být najednou podán nitrožalu ­
dečně nebo injek čně, závisí na velikosti testovacího zví řete. Objem 
by neměl překročit 2 ml/100 g t ělesné hmotnosti. Použití vyšších 
objemů, než je uvedený objem, musí být zd ůvodněno. S výjimkou 
dráždivých nebo žíravých látek, u kterých se ve vyšších koncentra ­
cích stup ňují účinky, by m ěly být rozdíly ve zkušebním objemu 
minimalizovány úpravou koncentrace tak, aby byl p ři všech úrovních 
dávek podáván konstantní objem.  
1.5.6  Příprava preparát ů pro analýzu chromosom ů 
Ihned po usmrcení se z jednoho nebo obou varlat získá bun ěčná 
suspenze, hypotonizuje se a fixuje. Poté se nanese na podložní 
sklíčka a obarví se.  
1.5.7  Analýza  
U každého zví řete by m ělo být analyzováno alespo ň 100 bun ěk 
v dobře rozprost řené metafázi (tj. minimáln ě 500 metafází na 
skupinu). Tento po čet lze snížit, je-li pozorován velký po čet 
aberací. Všechny preparáty, v četně preparát ů pozitivních 
a negativních kontrol, by m ěly být p řed analýzou pod mikros ­
kopem nezávisle kódovány. Pon ěvadž při fixaci často dochází ke 
chromosomálním zlom ům nebo ztrát ě chromosom ů u části meta ­
fází, měly by vyšet řované bu ňky obsahovat centromery v po čtu 
odpovídajícímu číslu 2n ± 2.  
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Údaje pro jednotlivá zví řata by m ěly být zpracovány ve form ě 
tabulky. Experimentální jednotkou je zví ře. Pro každé zví ře by měl 
být vyhodnocen po čet buněk se strukturními chromosomovými 
aberacemi a po čet chromosomových aberací na bu ňku. Pro expono ­
vané a kontrolní skupiny by m ěly být uvedeny r ůzné typy struktur ­
ních chromozomových aberací s jejich po čtem a četností. Gapy se 
zaznamenávají odd ěleně a uvádějí se, ale nezahrnují se do celkové 
četnosti aberací.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Je-li pozorována mitosa a také meiosa, m ěl by být pro stanovení 
možných cytotoxických ú činků jako míra cytotoxicity stanoven 
u všech exponovaných zví řat a zvířat sloužících jako negativní 
kontrola pom ěr spermatogonií v mitose vzhledem k první a druhé 
meiotické metafázi, a to v celkovém vzorku 100 d ělících se bun ěk na 
jedno zví ře. Pokud je sledována pouze mitosa, nejmén ě v 1 000 
buňkách na zví ře by měl být stanoven mitotický index.  
2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Pro stanovení pozitivního výsledku existuje n ěkolik kritérií, nap ř. 
nárůst relativního po čtu buněk s chromozomovými aberacemi 
v závislosti na dávce nebo jasný nár ůst počtu buněk s aberacemi 
pro skupinu s ur čitou dávkou a k ur čitému okamžiku odb ěru. 
Nejdříve by m ěla být uvážena biologická relevance výsledk ů. Při 
hodnocení výsledk ů zkoušky mohou být použity jako pomocný 
prostředek statistické metody (8). Statistická významnost by nem ěla 
být jediným ur čujícím faktorem pro pozitivní odpov ěď. Dvojzna čné 
výsledky by m ěly být vyjasn ěny dalším zkoušením, nejlépe 
s úpravami experimentálních podmínek.  
Zkoušená látka, jejíž výsledky nespl ňují výše uvedená kritéria, se 
v tomto systému považuje za nemutagenní.  
Ačkoli většina experiment ů poskytne jasn ě pozitivní nebo negativní 
výsledky, v ojedin ělých případech neumožní soubor údaj ů vyslovit 
konečný výrok o aktivit ě zkoušené látky. Výsledky mohou z ůstat 
dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment 
opakován.  
Pozitivní výsledky zkoušky na chromosomové aberace ve spermato ­
goniích savc ů in vivo  znamenají, že zkoušená látka indukuje 
v germinálních bu ňkách testovacího druhu strukturní chromosomové 
aberace. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za 
podmínek zkoušky neindukuje v germinálních bu ňkách testovacího 
druhu chromosomové aberace.  
Měla by být diskutována pravd ěpodobnost, s jakou se zkoušená látka 
nebo její metabolity dostanou do cílové tkán ě. 
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— zdůvodnění volby vehikula,  
— rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpoušt ědle/vehikulu, je-li 
známa.  
Testovací zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— počet a stáří zvířat, 
— zdroj, podmínky chovu, strava atd.,  
— individuální hmotnost zví řat na počátku zkoušky, v četně rozpětí 
tělesné hmotnosti, st řední hodnoty a sm ěrodatné odchylky pro 
každou skupinu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Zkušební podmínky:  
— údaje ze studie pro zjišt ění rozsahu, pokud byla provedena,  
— zdůvodnění zvolených úrovní dávek,  
— zdůvodnění způsobu podávání,  
— údaje o p řípravě zkoušené látky,  
— údaje o podávání zkoušené látky,  
— zdůvodnění dob usmrcení,  
— případně přepočet mezi koncentrací zkoušené látky v krmivu 
nebo vod ě (ppm) na odpovídající dávku (mg/kg t ělesné 
hmotnosti/den),  
— podrobné údaje o kvalit ě krmiva a vody,  
— podrobný popis rozvrhu expozice a odb ěru, 
— metody stanovení toxicity,  
— identifikace látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka 
aplikace,  
— metody p řípravy preparát ů, 
— kritéria hodnocení aberací,  
— počet analyzovaných bun ěk na jedno zví ře, 
— kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojzna č­
nou. 
Výsledky:  
— známky toxicity,  
— mitotický index,  
— poměr spermatogonií v mitose vzhledem k první a druhé meta ­
fázi meiosy,  
— typ a po čet aberací uvedený samostatn ě pro každé zví ře, 
— celkový po čet aberací ve skupin ě, 
— počet buněk s aberacemi ve skupin ě, 
— podle možnosti závislost odpov ědi na dávce,  
— případné statistické analýzy,  
— údaje o soub ěžné negativní kontrole,  
— dosavadní údaje o negativní kontrole s rozp ětími, středními 
hodnotami a sm ěrodatnými odchylkami,  
— údaje o soub ěžné pozitivní kontrole,  
— změny ploidie, pokud byly pozorovány.  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. LITERATURA  
1) Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., 
Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, s. 477–484.
 
2) Adler, I.D., (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, s. 275–306.
 
3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cyto ­
genetics and Cell Genetics, 3, 289–294.  
4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and 
Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetic Assays, In: D.J. Kirk ­
land (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutageni ­
city Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, 
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
s. 115–141.
 
5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Muta ­
tion Res., 52, 207–209.  
6) Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., 
Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. 
Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ 
Cell Tests. Mutation Res., 312, 313–318.
 
7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, 313–319.
 
8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, 
G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic Assays 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity 
Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24  SPOT TEST NA MYŠÍCH  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část E.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část E.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Jedná se o zkoušku na myších  in vivo , při níž jsou vyvíjející se 
embrya exponována chemickým látkám. Cílovými bu ňkami 
u vyvíjejících se embryí jsou melanoblasty a cílovými geny jsou 
geny kontrolující pigmentaci srsti. Vyvíjející se embrya jsou hetero ­
zygotní pro řadu genů ovlivňujících barvu srsti. Mutace nebo ztráta 
(při různých genetických událostech) dominantní alely v genu mela ­
noblastu je vyjád řena recesivním fenotypem v dce řiných bu ňkách 
vytvářejících skvrnu (spot) pozm ěněné barvy srsti narozené myši. 
Počet potomk ů s těmito skvrnami, mutacemi, se zaznamená 
a jejich četnost se porovná s četností u potomk ů exponovaných 
pouze rozpoušt ědlu. Spot test na myších detekuje p ředpokládané 
somatické mutace v embryonálních bu ňkách.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Příprava  
Zkoušené chemické látky se pokud možno rozpustí nebo suspendují 
v isotonickém fyziologickém roztoku. Látky, které jsou nerozpustné 
ve vodě, se rozpustí nebo suspendují ve vhodných vehikulech. 
Použité vehikulum nesmí interferovat se zkoušenou látkou ani vyvolávat toxické ú činky. Použijí se čerstvě připravené roztoky 
zkoušené látky.
 
P o k u s n á z v í ř a t a 
Myši kmene T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c  ch p/c ch p; 
brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) se zk říží 
buď s kmenem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; 
leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe), nebo s kmenem C57BL (nona ­
gouti, a/a). Mohou být použita i jiná k řížení za p ředpokladu, že 
budou vznikat nonagouti potomci, nap ř. křížení mezi kmenem 
NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) a DBA (nonagouti, a/a; brown, 
b/b; dilute d/d).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
P o č e t a p o h l a v í  
Použije se dostate čný počet březích samic, aby byl zajišt ěn dosta­
tečný počet živých potomk ů pro každou použitou úrove ň dávky. 
Vhodná velikost vzorku závisí na po čtu skvrn pozorovaných 
u exponovaných myší a na rozsahu kontrolních údaj ů. Negativní 
výsledky jsou p řijatelné pouze tehdy, bylo-li hodnoceno nejmén ě 
300 potomk ů samic exponovaných nejvyšší dávce.  
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Měly by být k dispozici soub ěžné kontrolní údaje od myší expono ­
vaných pouze vehikulu (negativní kontroly). Ke zvýšení citlivosti testu mohou být použity kontrolní údaje z d řívějších pokus ů 
provedených v téže laborato ři za předpokladu, že jsou homogenní. 
Není-li u zkoušené látky zjišt ěna mutagenita, m ěly by být k dispozici 
údaje z pozitivních kontrol, které byly tímto testem získány v poslední dob ě v téže laborato ři při expozici chemické látce se 
známou mutagenitou.
 
Z p ů s o b p o d á v á n í  
Obvyklými zp ůsoby podávání jsou orální aplikace sondou nebo 
intraperitoneální injekce b řezí myši. Podle pot řeby se expozice 
provede inhalací nebo jiným vhodným zp ůsobem.  
Ú r o v n ě d á v e k  
Použijí se alespo ň dvě úrovně dávek, z nichž jedna vyvolává známky 
toxicity nebo vede ke zmenšení velikosti vrhu. U netoxických látek se použije maximální dosažitelná koncentrace.
 
Postup  
Zvířata se obvykle exponují pouze jednou v 8., 9., nebo 10. dni 
březosti, přičemž se za 1. den b řezosti považuje den, kdy byla zjiš ­
těna vaginální zátka. Tyto dny odpovídají 7,25, 8,25 a 9,25 dne po 
koncepci. B ěhem těchto dnů lze provést postupné expozice.  
A n a l ý z a  
U mláďat se mezi t řetím a čtvrtým týdnem po vrhu spo čítá 
a zaznamená po čet skvrn. Rozlišují se t ři kategorie skvrn:  
a) bílé skvrny o pr ůměru 5 mm ve st řední ventrální linii, u nichž se 
předpokládá, že vznikly zánikem bun ěk (WMVS);  
b) žluté skvrny typu agouti vyskytující se v okolí mlé čných 
žláz, genitálií, hrdla, axil, oblasti slabin a uprost řed čela, 
u nichž se p ředpokládá, že vznikají v d ůsledku chybné dife ­
renciace (MDS), a  
c) pigmentované a bílé skvrny náhodn ě rozmístěné v srsti, u nichž 
se předpokládá, že jsou výsledkem somatických mutací (RS).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Všechny t ři kategorie se zaznamenají, avšak pouze poslední, RS, je 
geneticky relevantní. Obtíže s odlišením MDS od RS lze vy řešit 
pozorováním chlup ů ve fluorescen čním mikroskopu.  
Zaznamenávají se nápadné makroskopické morfologické malformace 
potomků. 
2. ÚDAJE  
Uvede se celkový po čet sledovaných potomk ů a počet mláďat 
s jednou nebo více skvrnami vyvolanými podle p ředpokladu soma ­
tickými mutacemi. Údaje získané u kontrolních a exponovaných skupin se porovnávají vhodnými metodami. Uvedou se rovn ěž 
údaje vztažené na velikost vrhu.
 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— kmen použitý ke k řížení,  
— počet březích samic v experimentálních a v kontrolních skupi ­
nách,  
— průměrná velikost vrhu v experimentálních a v kontrolních skupi ­
nách při vrhu a p ři odstavení,  
— úrove ň(úrovně) dávky zkoušené chemické látky,  
— použité rozpoušt ědlo, 
— den b řezosti, ve kterém byla podána zkoušená látka,  
— způsob podání,  
— celkový po čet sledovaných potomk ů a počet potomk ů 
s kategoriemi skvrn WMVS, MDS a RS v experimentálních 
a kontrolních skupinách,  
— makroskopické morfologické malformace,  
— vztah dávka/odezva u kategorie skvrn RS, je-li to možné,  
— statistické vyhodnocení,  
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25  ZKOUŠKA NA D ĚDIČNOU TRANSLOKACI U MYŠÍ  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkouška na d ědičnou translokaci u myší detekuje strukturní 
a numerické chromosomové zm ěny v savčích zárode čných buňkách 
zachycené v první generaci potomk ů. U pozorovaných chromosomo ­
vých změn se jedná o recipro ční translokace a u sami čích potomk ů 
o ztráty chromosomu X. Nositelé translokací a samice X0 vykazují 
sníženou fertilitu, která se využívá pro výb ěr potomstva F  1 pro 
cytogenetickou analýzu. Úplná sterilita je zp ůsobena n ěkterými 
typy translokací (autosomální translokací X a translokací typu 
centromera-telomera). Translokace se analyzují v meiotických 
buňkách samc ů ve stadiu diakinézy-metafáze I, tzn. bu ď u samců 
generace F  1 nebo sam čích potomk ů samic generace F  1 . Samice X0 
jsou cytogeneticky identifikovány p řítomností pouhých 39 chromo ­
somů v mitózách z kostní d řeně. 
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Příprava  
Zkoušené chemické látky se rozpustí v isotonickém fyziologickém 
roztoku. Látky nerozpustné ve vod ě se rozpustí nebo suspendují ve 
vhodných vehikulech. Použijí se čerstvě připravené roztoky zkoušené 
látky. Jestliže bylo pro usnadn ění dávkování látky použito rozpouš ­
tědlo, nesmí interferovat se zkoušenou látkou ani vyvolávat toxické 
účinky.  
Z p ů s o b p o d á v á n í  
Obvyklými zp ůsoby podávání jsou orální aplikace sondou nebo 
intraperitoneální injekce. Mohou být vhodné i jiné zp ůsoby aplikace.  
P o k u s n á z v í ř a t a 
Z důvodu snadn ějšího křížení a cytologické verifikace se tyto expe ­
rimenty provád ějí na myších. Nepožaduje se žádný specifický kmen 
myši. Průměrná velikost vrhu u kmene by však m ěla být větší než 
osm potomk ů a měla by být pom ěrně stálá.  
Používají se zdravá pohlavn ě dospělá zvířata. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
P o č e t z v í ř a t 
Nezbytný po čet zvířat závisí na četnosti spontánních translokací a na 
minimálním po čtu indukovaných translokací požadovaném pro pozi ­
tivní výsledek.  
Zkouška se obvykle provádí analýzou samc ů generace F  1 . Zkouší se 
nejméně 500 samc ů generace F  1 na každou exponovanou skupinu. 
Jestliže se zahrnou také samice generace F  1 , je potřeba 300 samc ů 
a 300 samic.  
P o u ž i t í n e g a t i v n í c h a p o z i t i v n í c h k o n t r o l  
Měly by být k dispozici vhodné kontrolní údaje ze soub ěžné 
kontroly a z d řívějších pokus ů. Jestliže jsou k dispozici p řijatelné 
výsledky pozitivní kontroly z nedávných experiment ů provedených 
v téže laborato ři, mohou být použity namísto soub ěžných pozitivních 
kontrol.  
Ú r o v n ě d á v e k  
Zkouší se jedna úrove ň dávky, obvykle nejvyšší dávka vyvolávající 
minimální toxické ú činky, avšak bez vlivu na reproduk ční chování 
nebo přežití. Pro stanovení vztahu dávka/odezva je t řeba dvou 
dalších, nižších dávek. U netoxických látek se použije maximální 
dosažitelná koncentrace.  
Postup  
E x p o z i c e a p á ř e n í 
Používají se dva plány expozice. Nej častěji se volí jedno podání 
zkoušené látky. Je rovn ěž možné podávat zkoušenou látku sedm 
dní v týdnu po 35 dn ů. Počet oplodn ění po expozici se řídí plánem 
expozice a je t řeba zajistit, aby byla analyzována všechna expono ­
vaná bun ěčná stádia zárode čných bun ěk. Na konci období pá ření se 
samice umístí do odd ělených klecí. U každého vrhu se zaznamená 
datum, velikost vrhu a pohlaví mlá ďat. Všichni sam čí potomci se 
odstaví a sami čí potomci se vylou čí, pokud se nepoužijí 
v experimentu.  
Z j i š ť o v á n í t r a n s l o k a č n í c h h e t e r o z y g o t ů 
Používá se jedna ze dvou možných metod:  
— test fertility potomk ů F 1 a následná verifikace možných nositel ů 
translokací cytogenetickou analýzou,  
— cytogenetická analýza všech samc ů generace F  1 bez předchozího 
výběru testem fertility.  
a) Test fertility  
Sníženou fertilitu zví řat v generaci F  l lze stanovit z velikosti vrhu 
a/nebo analýzou obsahu d ělohy samic.  
Kritéria ur čení běžné a snížené fertility musí být stanovena pro 
každý použitý kmen myší.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Pozorování velikosti vrhu: samci generace F  1 určení k testování 
jsou umíst ěni samostatn ě do klecí se samicemi bu ď ze stejného 
experimentu, nebo ze stejné kolonie. Klece jsou kontrolovány denně počínaje 18. dnem po spá ření. Velikost vrhu a pohlaví 
generace F
 2 se při vrhu zaznamenají a vrh se poté vylou čí. Jest­
liže jsou testovány samice generace F  1 , ponechá se generace F  2 
malých vrh ů pro další zkoušení. Samice, nositelky translokací, se 
zjistí cytogenetickou analýzou translokací u jakéhokoliv jejich samčího potomka. Samice X0 se rozpoznají ze zm ěny poměru 
samců a samic u jejich potomk ů z 1:1 na 1:2. V následném 
kroku se normální zví řata generace F
 l vyřadí z dalšího testování, 
jestliže první vrh generace F  2 dosahuje p ředem určené normální 
hodnoty nebo ji p řekračuje; v opa čném případě se pozoruje 
druhý nebo t řetí vrh generace F  2 . 
Zvířata generace F  1 , která po vyhodnocení t ří vrhů generace F  2 
nemohou být klasifikována jako normální, se dále testují bu ď 
analýzou obsahu d ělohy, nebo se p římo podrobí cytogenetické 
analýze.  
Analýzy obsahu d ělohy: Snížení velikosti vrhu u nositel ů trans­
lokací je zp ůsobena smrtí embryí, takže vysoký po čet mrtvých 
implantací nazna čuje přítomnost translokací u testovaných zví řat. 
Samci generace F  1 kteří mají být testováni, jsou p řipouštěni 
každý ke 2–3 samicím. Oplodn ění se zjiš ťuje denní ranní 
kontrolou vaginální zátky. Samice se usmrtí po 14–16 dnech a zaznamenají se živé a mrtvé zárodky v jejich d ěloze.
 
b) Cytogenetická analýza  
Zhotoví se mikroskopické preparáty z varlat usušené na vzduchu. 
Nosiči translokací se identifikují na základ ě přítomnosti multiva ­
lentních konfigurací ve stádiu diakinézy – metafáze I v primár ­
ních spermatocytech. Nález nejmén ě dvou bun ěk 
s multivalentními asociacemi je požadovaným d ůkazem, že testo ­
vané zvíře je nositelem translokace.  
Jestliže nebyl proveden výb ěr testem fertility, vyšet ří se všichni 
samci generace F  1 cytogeneticky. U každého samce se mikros ­
kopicky vyšet ří nejméně 25 buněk ve stadiu diakinézy – meta ­
fáze I. Analýza mitotických metafází ve spermatogoniích nebo 
v kostní d řeni je nezbytná u samc ů generace F  1 s malými varlaty 
a potlačením meiózy p řed diakinézí, nebo u samic generace F  1 
s podezřením na X0. P řítomnost neobvykle dlouhého a/nebo 
krátkého chromosomu v každé z 10 bun ěk je důkazem existence 
částečné samčí transloka ční sterility (typu centromera-telomera). 
Některé translokace mezi autosomálními chromosomy 
a chromozomem X zp ůsobující sam čí sterilitu mohou být iden ­
tifikovány pouze proužkovacími technikami analýzy mitotických 
chromosom ů. Přítomnost 39 chromosom ů ve všech 10 mitózách 
je důkazem, že se jedná o samice X0.  
2. ÚDAJE  
Údaje se zpracují v tabulkové form ě. 
Pro každý interval pá ření se zaznamená pr ůměrná velikost vrhu 
a poměr pohlaví p ři narození a p ři odstavení.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Údaje o fertilit ě zvířat generace F  1 musí zahrnovat pr ůměrnou veli­
kost vrhu u všech normálních pá ření a individuální velikosti vrh ů 
u nositelů translokací generace F  1 . U analýzy obsahu d ělohy se 
uvede pr ůměrný počet živých a mrtvých zárodk ů u normálních 
páření a individuální po čty živých a mrtvých zárodk ů pro každé 
páření nositel ů translokací generace F  1 . 
U cytogenetické analýzy diakinéze-metafáze I se pro každého nosi ­
tele translokací uvede po čet typů multivalentních konfigurací 
a celkový po čet buněk. 
U sterilních jedinc ů generace F  1 se uvede po čet páření a jejich délka. 
Uvede se hmotnost varlat a podrobné údaje o cytogenetické analýze.  
U samic X0 se uvede pr ůměrná velikost vrhu, pom ěr pohlaví 
u generace F  2 a výsledky cytogenetické analýzy.  
Pokud byli testem fertility p ředběžně vybráni možní nositelé trans ­
lokací generaceF  1 , uvede se v tabulkách informace o tom, kolik 
z nich bylo potvrzeno jako transloka ční heterozygoti.  
Uvedou se údaje z experiment ů s negativními a pozitivními kontro ­
lami.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— kmen myši, stá ří a hmotnost exponovaných zví řat, 
— počet rodičovských zví řat každého pohlaví v exponovaných 
a kontrolních skupinách,  
— zkušební podmínky, podrobný popis expozice, úrovn ě dávek, 
rozpouštědla, použité schéma pá ření, 
— počet a pohlaví mlá ďat na samici, po čet a pohlaví potomk ů 
určených pro analýzu translokací,  
— doba a kritéria analýzy translokací,  
— počet a podrobný popis nositel ů translokací, v četně údajů 
o březosti a pop řípadě o obsahu d ělohy,  
— popis cytogenetické metody a mikroskopické analýzy, pokud 
možno s obrázky,  
— statistické vyhodnocení,  
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26  ZKOUŠKA SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ STUDIE ORÁLNÍ 
TOXICITY NA HLODAVCÍCH (90DENNÍ OPAKOVANÁ 
APLIKACE)  
1. METODA  
Popisovaná metoda zkoušení subchronické orální toxicity se řídí 
hlavními zásadami metody OECD TG 408 (1998).  
1.1 ÚVOD  
Při posouzení a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze 
stanovení subchronické orální toxicity s opakovanou aplikací provést až po získání prvních informací o toxicit ě ze zkoušek akutní toxicity 
a toxicity p ři 28denní opakované aplikaci. 90denní studie poskytuje 
informace o možném nebezpe čí pro zdraví, které by mohlo vznik ­
nout vlivem opakované expozice v pr ůběhu delšího období, zahrnu ­
jící vývoj po odstavení až do dosp ělosti. Studie poskytne informace 
o hlavních toxických ú čincích, ur čí cílové orgány a možnou kumu ­
laci a může poskytnout odhad hladiny bez pozorovatelného nep ří­
znivého ú činku, kterou lze použít p ři výběru úrovní dávek pro chro ­
nické studie a pro stanovení bezpe čnostních kritérií pro expozici 
člověka.
 
Metoda klade dále d ůraz na neurologické p říznaky a nazna čuje 
možné imunologické ú činky a ú činky na reprodukci. D ůraz se 
klade také na pe člivé klinické pozorování zví řat s cílem získat co 
nejvíce informací. Tato studie by m ěla umožnit identifikaci chemic ­
kých látek, které by mohly vyvolat neurotoxické nebo imunologické účinky nebo mít nep říznivý vliv na reproduk ční orgány, a m ůže 
odůvodnit další hlubší zkoumání.
 
Viz také obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Dávka:  množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjad řuje jako 
hmotnost (v g, mg) nebo jako hmotnost zkoušené látky na jednotku 
hmotnosti pokusného zví řete (např. v mg na kg) nebo jako 
konstantní koncentrace v potrav ě (v ppm).  
Dávkování:  obecný termín zahrnující dávku, četnost a trvání podá ­
vání látky.  
NOAEL:  anglická zkratka pro termín „no observed adverse effect 
level“ (hladina bez pozorovaného nep říznivého ú činku) a odpovídá 
nejvyšší úrovni dávky nebo expozice, p ři které nejsou pozorovány 
žádné nep říznivé účinky související s podáním látky.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená látka se denn ě orálně podává v odstup ňovaných dávkách 
několika skupinám pokusných zví řat; každé skupin ě se podává jedna 
úroveň dávky 90 dn ů. Vprůběhu období podávání se zví řata každý 
den pečlivě pozorují, aby se zjistily p říznaky toxicity. Zví řata, která 
v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, i zví řata, která do 
konce zkoušky p řežila, se pitvají.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Příprava zví řat 
Použijí se zdravá zví řata, která se aklimatizovala na laboratorní 
podmínky nejmén ě 5 dnů před zahájením zkoušky a nebyla vysta ­
vena žádným experimentálním zásah ům. Musí být popsán druh, 
kmen, původ, pohlaví a hmotnost a/nebo v ěk pokusných zví řat. 
Zvířata by m ěla být náhodn ě přiřazena do kontrolních 
a experimentálních skupin. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby 
byl vliv umíst ění klecí minimalizován. Každému zví řeti by mělo být 
přiřazeno samostatné identifika ční číslo. 
1.4.2  Příprava dávek  
Zkoušená látka se podává sondou nebo v potrav ě či v pitné vod ě. 
Metoda orálního podání závisí na ú čelu studie a na fyzikáln ě- 
chemických vlastnostech zkoušené látky.  
Zkoušená látka se v p řípadě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve 
vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporu čuje se zvážit použití 
vodného roztoku/suspense, potom použití roztoku/emulse v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku v jiných vehikulech. 
U nevodných vehikul by m ěla být známa jejich toxická charakteris ­
tika. Měla by být stanovena stálost zkoušené látky v podmínkách 
podávání.
 
1.4.3  Zkušební podmínky  
1.4.3.1  Pokusná zví řata 
Dává se p řednost potkan ům, ale lze použít i jiný druh hlodavc ů, 
např. myši. Použity by m ěly být běžně používané kmeny mladých 
zdravých zví řat. Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. Podá ­
vání látky by m ělo začít co nejd říve po odstavení a v každém 
případě dříve, než zví řata dosáhnou stá ří devíti týdn ů. Na začátku 
studie by m ěly být odchylky hmotnosti zví řat minimální a nem ěly by 
překročit ± 20 % st řední hodnoty pro každé pohlaví. Provádí-li se 
studie jako p ředběžná studie pro dlouhodobou studii chronické toxi ­
city, měla by být v obou studiích použita zví řata stejného kmene 
a stejného p ůvodu.  
1.4.3.2  Počet a pohlaví  
Pro každou úrove ň dávek se použije nejmén ě 20 zvířat (10 samic 
a 10 samc ů). Pokud se budou zví řata usmrcovat v pr ůběhu studie, je 
nutno zvýšit celkový po čet zvířat o počet zvířat, která budou usmr ­
cena před ukon čením studie. Na základ ě dřívějších poznatk ů 
o chemické látce nebo jí blízce p říbuzné látce by se m ělo zvážit 
i přidání další satelitní skupiny 10 zví řat (5 zvířat každého pohlaví) 
do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po ukončení aplikace mohlo posoudit, zda jsou p řípadné účinky vratné 
nebo trvalé. Trvání tohoto období po expozici by m ělo být vhodn ě 
stanoveno s ohledem na pozorované ú činky.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3  Úrovn ě dávek  
S výjimkou p řípadů, kdy se provede limitní zkouška (viz bod 
1.4.3.4), by m ěly být použity nejmén ě tři úrovně dávek 
a souběžná kontrola. Úrovn ě dávek je možno stanovit na základ ě 
výsledků studií p ři opakované aplikaci nebo orienta čních studií 
a měly by zohlednit jakékoli existující dostupné toxikologické 
a toxikokinetické údaje o zkoušené látce nebo o p říbuzné látce. 
Nebrání-li tomu fyzikáln ě-chemická povaha nebo biologické ú činky 
zkoušené látky, m ěla by být nejvyšší úrove ň dávky zvolena s cílem 
vyvolat toxicitu, ne však uhynutí nebo velké utrpení. M ěla by být 
zvolena sestupná řada úrovní dávek s cílem prokázat ú činky souvi ­
sející s dávkou a nep řítomnost nep říznivých ú činků při nejnižší 
úrovni dávky (NOAEL). Často je pro stanovení sestupných úrovní 
dávek optimální dvoj až čtyřnásobný interval mezi dávkami a je 
vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu než použít velmi 
velké intervaly (odpovídající nap ř. faktoru v ětšímu než p řibližně 6 
až 10).  
Kontrolní skupin ě se nepodává žádná látka, nebo se jí podává vehi ­
kulum, jestliže se p ři podávání zkoušené látky vehikulum používá. 
S výjimkou podávání zkoušené látky se se zví řaty v kontrolní 
skupině zachází stejn ě jako se zví řaty v experimentální skupin ě. 
Jestliže je použito vehikulum, podává se kontrolní skupin ě 
v nejvyšším použitém objemu. Jestliže se zkoušená látka podává 
v potravě a způsobuje-li omezení p říjmu potravy, doporu čuje se 
použít paraleln ě skupinu se stejným omezením potravy, aby se 
odlišil vliv snížení p říjmu potravy nechutenstvím od toxikologických 
změn 
V případě potřeby by m ěly být vzaty v úvahu následující charakte ­
ristiky vehikula a ostatních p řísad: účinky na vst řebávání, distribuci, 
metabolismus nebo retenci zkoušené látky; dále vlivu na chemické vlastnosti zkoušené látky, které mohou zm ěnit její toxické vlastnosti, 
a vliv na spot řebu potravy nebo vody nebo na nutri ční stav zví řat.
 
1.4.3.4  Limitní zkouška  
Pokud zkouška provedená podle postup ů popsaných v této studii p ři 
jedné dávce nejmén ě 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti a den nevyvolá 
pozorovatelné nep říznivé účinky a pokud se na základ ě údajů 
o látkách s podobnou strukturou nep ředpokládá toxicita, není úplná 
studie za použití t ří dávek nezbytná. Limitní zkouška se provádí 
s výjimkou p řípadu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je 
nezbytné použití vyšší úrovn ě dávek.  
1.5 POSTUP  
1.5.1  Podání dávek  
Zkoušená látka se zví řatům podává 7 dní v týdnu po dobu 90 dn ů. 
Jakýkoli jiný režim podávání, nap ř. 5 dní v týdnu, musí být zd ůvod­
něn. Pokud se zkoušená látka podává sondou, aplikuje se zví řatům 
jen v jediné dávce sondou nebo kanylou. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, závisí na velikosti pokusného zví řete. 
Objem by nem ěl překročit 1 ml na 100 g t ělesné hmotnosti, 
s výjimkou vodných roztok ů, kdy lze použít 2 ml na 100 
g tělesné hmotnosti. s výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, 
u kterých se ve vyšších koncentracích zhoršují ú činky, by m ěly 
být rozdíly ve zkušebním objemu minimalizovány úpravou koncent ­
race tak, aby byl p ři všech úrovních dávek podáván konstantní 
objem.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
U látek podávaných v potrav ě nebo v pitné vod ě je důležité zajistit, 
aby množství použité zkoušené látky neovliv ňovalo normální výživu 
nebo vodní rovnováhu. Podává-li se zkoušená látka v potrav ě, může 
se použít bu ď konstantní koncentrace (v ppm), nebo konstantní 
dávkování ve vztahu k t ělesné hmotnosti zví řete; použitá možnost 
musí být specifikována. U látky podávané prost řednictvím žalude ční 
sondy je t řeba dávku podávat každý den p řibližně ve stejnou dobu 
a alespoň jednou týdn ě ji přizpůsobit tak, aby se udržela konstantní 
úroveň dávky vzhledem k t ělesné hmotnosti zví řete. Pokud je 
90denní studie provád ěna jako p ředběžná studie k dlouhodobé studii 
chronické toxicity, m ěla by být v obou studiích použita stejná dieta.  
1.5.2  Pozorování  
Doba pozorování by m ěla být nejmén ě 90 dní. Zví řata v satelitní 
skupině určená pro následná pozorování by m ěla být po vhodnou 
dobu bez expozice, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení, nebo 
toxické ú činky přetrvávají.  
Všeobecné klinické pozorování by se m ělo provád ět nejméně jednou 
denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby 
očekávaného maximálního ú činku po podání látky. Zaznamenává se 
klinický stav zví řat. Nejmén ě dvakrát denn ě, obvykle na za čátku 
a na konci každého dne, se provede prohlídka všech zví řat za účelem 
zjištění morbidity a mortality.  
Nejméně jednou p řed prvním podáním látky a dále jednou týdn ě se 
provede d ůkladné klinické vyšet ření všech zví řat (za účelem intrain ­
dividuálního srovnání). Toto pozorování by se m ělo provád ět mimo 
chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru a p řednostně 
pokaždé ve stejnou dobu. Pozorování by m ěla být pečlivě zazname ­
návána, nejlépe za použití systému bodování explicitn ě definovaného 
ve zkušební laborato ři. Je třeba se pokusit zajistit, aby byly rozdíly 
mezi podmínkami pozorování minimální. Vyšet ření by m ělo mimo 
jiné zahrnovat zm ěny kůže, srsti, o čí a sliznic, p řítomnost sekret ů 
a exkretů a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic, 
poruchy dýchání). Zaznamenávat by se m ěly změny chůze, držení 
těla a reakce na manipulaci, dále p řítomnost klonických a tonických 
pohybů, stereotyp ů v chování (nap ř. nadměrného čištění nebo opako ­
vaného kroužení) nebo bizarního chování (nap ř. sebepoškozování, 
chůze pozpátku) (1).  
Před podáním zkoušené látky a p ři zakončení studie by m ělo být 
provedeno vyšet ření oftalmoskopem nebo rovnocenným p řístrojem 
nejlépe u všech zví řat, alespo ň však ve skupin ě s vysokou dávkou 
a v kontrolní skupin ě. Jsou-li zjišt ěny změny na očích, měla by být 
vyšetřena všechna zví řata. 
Ke konci doby expozice, a v každém p řípadě ne dříve než 
v jedenáctém týdnu, by m ělo být provedeno posouzení reakce na 
smyslové podn ěty různého typu (1) (nap ř. sluchové, zrakové 
a proprioceptivní podn ěty) (2, 3, 4), zm ěří se síla úchopu (5) 
a motorická aktivita (6). Další informace o postupech, které lze použít, jsou uvedeny v p říslušné literatu ře. Místo postup ů popsaných 
v této literatu ře však lze použít alternativní postupy.
 
Pozorování funk čních poruch provád ěná ke konci studie lze 
vynechat, pokud jsou údaje o pozorování funk čních poruch dostupná 
z jiných studií a pokud denní klinická pozorování neprokáží žádné 
funkční poruchy.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Pozorování funk čních poruch lze výjime čně vynechat u skupin, které 
vykazují p říznaky toxicity v takové mí ře, že by p ři posuzování 
funkčního stavu vadily.  
1.5.2.1  Tělesná hmotnost a spot řeba potravy/vody  
Všechna zví řata by se m ěla nejmén ě jednou týdn ě zvážit. P říjem 
potravy by se m ěl provádět nejméně jednou týdn ě. Pokud se látka 
podává v pitné vod ě, měla by se nejmén ě jednou týdn ě zaznamenat 
spotřeba vody. Spot řeba vody by m ěla být vzata v úvahu také 
v případě studií s podáváním v potrav ě nebo sondou, v jejichž 
průběhu může dojít ke zm ěně příjmu tekutin.  
1.5.2.2  Hematologická a klinická biochemická vyšet ření 
Krevní vzorky by se m ěly odebírat z ur čeného místa a v p řípadě 
potřeby by se m ěly skladovat za vhodných podmínek. Na konci 
zkušebního období se vzorky odeberou t ěsně před utracením zví řat 
nebo v jeho pr ůběhu. 
Na konci zkušebního období a p ři případném odb ěru krevních 
vzorků v průběhu zkoušky by m ěla být provedena následující hema ­
tologická vyšet ření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglo ­
binu, počtu erytrocyt ů, celkového a diferenciálního po čtu leukocyt ů, 
počtu trombocyt ů a stanoví se protrombinový čas. 
Klinické biochemické analýzy za ú čelem vyšet ření hlavních toxických 
účinků na tkáně a zejména na játra a ledviny se provedou na krevních 
vzorcích odebraných každému zví řeti před utracením nebo v jeho 
průběhu (krom ě zvířat nalezených v agónii a/nebo zví řat utracených 
v průběhu zkoušky). Podobn ě jako hematologická vyšet ření může být 
v průběhu zkoušky provád ěn odběr vzorků pro klinické biochemické 
zkoušky. P řed odebráním krevních vzork ů se doporu čuje ponechat 
zvířata přes noc nala čno (  1 ). Vyšetření plazmy a séra zahrnuje stanovení 
sodíku, draslíku, glukosy, celkového cholesterolu, mo čoviny, dusíku 
močoviny, kreatininu, celkových protein ů a albuminu, nejmén ě dvou 
enzymů indikujících ú činky na jaterní bu ňky (jako alaninaminotrans ­
ferasa, aspartátaminotransferasa, alkalická fosfatasa, gamaglutamyltran ­
speptidasa a sorbitoldehydrogenasa). Zahrnout lze také stanovení dalších enzymů (jaterního nebo jiného p ůvodu) a žlu čových kyselin, které m ůže 
za určitých okolností poskytnout užite čné informace.
 
Dále je možné v pr ůběhu posledního týdne studie provést následující 
analýzy mo či za použití časově definovaného sb ěru: vzhled, objem, 
osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, bílkoviny, glukosa 
a krev/krvinky.  
Dále by se m ělo uvážit vyšet ření indikátor ů celkového poškození 
tkání v séru. Další vyšet ření by m ělo být provedeno, pokud 
mohou známé vlastnosti zkoušené látky ovlivnit ur čité metabolické 
funkce, v četně vápníku, fosforu, triglycerid ů nalačno, specifických 
hormonů, methemoglobinu a cholinesterasy. Ú čelnost těchto 
vyšetření se posuzuje podle p říslušnosti chemické látky do ur čitých 
skupin nebo p řípad od p řípadu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Pro řadu stanovení v séru a plazm ě, zejména pro glukosu, by bylo vhodné ponechat 
zvířata nalačno přes noc. Hlavním d ůvodem je, že u nehladov ějících zví řat je vyšší 
variabilita výsledk ů, která by mohla maskovat jemné zm ěny a ztížit interpretaci. Na 
druhé stran ě by hladov ění přes noc mohlo mít vliv na celkový metabolismus a p ři 
podávání v potrav ě by zasáhlo do pravidelnosti expozice zkoušené látce. Pokud se 
odebírá krev nala čno, měla by být klinická biochemická vyšet ření provedena až po 
pozorování funk čních poruch v rámci studie.
 Obecně je třeba postupovat pružn ě v závislosti na druhu a na pozo ­
rovaných a/nebo p ředpokládaných ú čincích dané látky.  
Pokud nejsou údaje o dosavadních výchozích hodnotách dostate čné, 
mělo by se zvážit stanovení hematologických a klinických bioche ­
mických parametr ů před začátkem zkoušky; obecn ě se nedoporu čuje 
tyto údaje získávat p řed expozicí (7).  
1.5.2.3  Pitva  
U všech pokusných zví řat zařazených do studie by m ěla být 
provedena celková, podrobná pitva, zahrnující pe člivé vyšet ření vněj­ 
šího povrchu t ěla, všech otvor ů a lebeční, hrudní a b řišní dutiny 
a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledvinky, varlata, nadvarlata, děloha, vaje čníky, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zví řat (kromě 
zvířat nalezených v agónii a/nebo zví řat utracených v pr ůběhu zkou­ 
šky) by m ěly být zbaveny všech ulp ělých tkání a co nejd říve po 
sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.
 
Následující tkán ě by měly být přechovány v nejvhodn ějším fixačním 
médiu s ohledem na typ tkán ě a plánovaná následná histopatologická 
vyšetření: všechny tkán ě s lézemi, mozek (reprezentativní oblasti, 
včetně předního mozku, moze čku a prodloužené míchy), mícha (ve 
třech úrovních: kr ční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, štítná 
žláza, příštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, tenké 
i tlusté st řevo (včetně Peyerových plát ů), játra, slinivka b řišní, 
ledviny, nadledvinky, slezina, srdce, pr ůdušnice a plíce (konzervo ­
vané napln ěním fixačním roztokem a pono řením), aorta, gonády, 
děloha, přídatné pohlavní orgány, sami čí mléčná žláza, prostata, 
močový měchýř, žlučník (myší), lymfatické uzliny (p řednostně 
jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv ( n. ischiadicus  nebo  n. tibialis ), přednostně 
v blízkosti svalu, řez kostní d
řeně (a/nebo čerstvý nát ěr z nasáklé 
kostní dřeně), kůže a oči (jestliže byly p ři oftalmologických vyšet ře­
ních pozorovány zm ěny). Podle klinických nebo jiných nález ů může 
být nezbytné zkoumat i další tkán ě. Všechny orgány považované za 
možné cílové orgány pro p ůsobení zkoušené látky by m ěly být 
uchovány.  
1.5.2.4  Histopatologická vyšet ření 
U všech zví řat kontrolní skupiny a skupiny s vysokou dávkou by 
mělo být provedeno celkové histologické vyšet ření uchovaných 
orgánů a tkání. Toto vyšet ření by m ělo být rozší řeno na zví řata 
všech ostatních dávkových skupin, pokud jsou u skupiny s vysokou dávkou pozorovány zm ěny orgán ů vyvolané zkoušenou 
dávkou.
 
1.5.2.5  Vyšet ření všech makroskopických lézí  
V případě použití satelitní skupiny by m ělo být provedeno histopa ­
tologické vyšet ření tkání a orgán ů, na kterých byly pozorovány 
účinky u exponovaných skupin.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
2.1 ÚDAJE  
Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zví ře. Kromě toho 
by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, p řičemž se uvede 
u každé experimentální skupiny po čet zvířat na začátku zkoušky, 
počet zvířat nalezených uhynulých v pr ůběhu zkoušky nebo utrace ­
ných z humánních d ůvodů a doba úmrtí nebo humánního utracení, 
počet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, popis toxických 
příznaků, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého toxic ­
kého účinku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zví řat 
vykazujících každý typ léze.  
Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by 
měla být zvolena již p ři plánování studie.  
2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
2.2.1  Zkoušená látka  
— fyzikální povaha, čistota a fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— identifika ční údaje,  
— vehikulum (je-li pot řeba): zdůvodnění volby vehikula, není-li 
použita voda.  
2.2.2  Testovací druh:  
— použitý druh a kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— původ, podmínky chovu, strava atd.,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku zkoušky.  
2.2.3  Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění výběru úrovní dávek,  
— podrobné údaje o složení látky nebo úprav ě potravy, o dosažené 
koncentraci, stálosti a homogenit ě přípravku,  
— podrobné údaje o zp ůsobu aplikace zkoušené látky,  
— skutečné denní dávky (mg/kg t ělesné hmotnosti) a pop řípadě 
přepočet koncentrace zkoušené látky v potrav ě/pitné vod ě 
(ppm) na skute čnou dávku,  
— podrobné údaje o kvalit ě stravy a vody.  
2.2.4  Výsledky:  
— tělesná hmotnost/zm ěny tělesné hmotnosti,  
— spotřeba potravy a pop řípadě spotřeba vody,  
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovn ě dávky, v četně 
příznaků toxicity,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— charakter, závažnost a trvání klinických projev ů (zda byly vratné 
nebo nevratné),  
— výsledky oftalmologického vyšet ření, 
— posouzení reaktivity na smyslové podn ěty, úchopové síly 
a motorické aktivity (je-li dostupné),  
— hematologické vyšet ření s příslušnými výchozími (normálními) 
hodnotami,  
— klinická biochemická vyšet ření s příslušnými výchozími normál ­
ními hodnotami,  
— konečná tělesná hmotnost, hmotnost orgán ů a poměry hmotnosti 
orgánů a tělesné hmotnosti,  
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— údaje o absorpci, pokud jsou dostupné,  
— statistické zpracování číselných výsledk ů, kde je to možné.  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
3. LITERATURA  
1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No. 60.  
2) Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999–1003.  
3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704.  
4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain 
and Stock Comparisons Using a Functional Observational 
Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267–283.
 
5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). 
A Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 
233–236.
 
6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter 
L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599–609.
 
7) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al . (1996). „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studi ­
es“, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198–201.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27  ZKOUŠKA SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ TOXICITY STUDIE 
ORÁLNÍ TOXICITY NA NEHLODAVCÍCH (90DENNÍ 
OPAKOVANÁ APLIKACE)  
1. METODA  
Popisovaná metoda zkoušení subchronické orální toxicity se řídí 
hlavními zásadami metody OECD TG 409 (1998).  
1.1 ÚVOD  
Při posouzení a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze 
stanovení subchronické orální toxicity s opakovanou aplikací provést až po získání prvních informací o toxicit ě ze zkoušek akutní toxicity 
a toxicity p ři 28denní opakované aplikaci. 90denní studie poskytuje 
informace o možném nebezpe čí pro zdraví, které by mohlo vznik ­
nout vlivem opakované expozice v pr ůběhu období rychlého r ůstu 
a mladé dosp ělosti. Studie poskytne informace o hlavních toxických 
účincích, ur čí cílové orgány a možnost akumulace a m ůže posky ­
tnout odhad hladiny bez pozorovatelného nep říznivého ú činku, 
kterou lze použít p ři výběru úrovní dávek pro chronické studie 
a pro stanovení bezpe čnostních kritérií pro expozici člověka.
 
Tato zkušební metoda umož ňuje zjistit nep říznivé účinky vyvolané 
chemickou látkou na nehlodavcích a m ěla by být použita pouze 
tehdy, pokud:  
— účinky pozorované v jiných studiích nazna čují potřebu je 
objasnit nebo charakterizovat na dalším druhu, a to na nehlodav ­
cích, nebo  
— toxikokinetické studie nazna čují, že použití specifického druhu 
nehlodavce je nejvhodn ější volbou laboratorního zví řete, nebo  
— existují jiné specifické d ůvody, které zd ůvodňují použití nehlo ­
davce.  
Viz také obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Dávka:  množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjad řuje jako 
hmotnost (v g, mg) nebo jako hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zví řete (např. v mg/kg) nebo jako konstantní 
koncentrace v potrav ě (v ppm).
 
Dávkování:  obecný termín zahrnující dávku, četnost a trvání podá ­
vání látky.  
NOAEL:  anglická zkratka pro termín „no observed adverse effect 
level“ (hladina bez pozorovaného nep říznivého ú činku) a odpovídá 
nejvyšší úrovni dávky nebo expozice, p ři které nejsou pozorovány 
žádné nep říznivé účinky související s podáním látky.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená látka se denn ě orálně podává v odstup ňovaných dávkách 
několika skupinám pokusných zví řat; každé skupin ě se podává jedna 
úroveň dávky 90 dn ů. V průběhu období podávání se zví řata každý 
den pečlivě pozorují, aby se zjistily p říznaky toxicity. Zví řata, která 
v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, i zví řata, která do 
konce zkoušky p řežila, se pitvají.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Výb ěr druhu zví řat 
Obvykle používaným druhem nehlodavce je pes, musí jít 
o definované plemeno, často se používá beagle. Dále lze použít 
jiné druhy, nap ř. prase nebo miniprase. Primáti se nedoporu čují 
a jejich použití musí být od ůvodněno. Použita by m ěla být mladá 
zdravá zví řata a v p řípadě psů by podávání m ělo začít nejlépe ve 
věku 4 až 6 m ěsíců, nejpozději v devíti m ěsících. Provádí-li se studie 
jako předběžná studie pro dlouhodobou studii chronické toxicity, m ěl 
by být v obou studiích použit tentýž živo čišný druh a plemeno.  
1.4.2  Příprava zví řat 
Použijí se mladá zdravá zví řata, která se aklimatizovala na labora ­
torní podmínky a která nebyla podrobena p ředchozím experimen ­
tálním postup ům. Trvání aklimatizace závisí na vybraném testovacím 
druhu a p ůvodu zvířat. Doporu čuje se nejmén ě 5 dnů pro psy nebo 
pro prasata chovaná pro tento ú čel ve vlastním chovu a nejmén ě 2 
týdny pro zví řata z externích chovných za řízení. Musí být popsán 
druh, kmen, p ůvod, pohlaví a hmotnost a/nebo v ěk pokusných zví řat. 
Zvířata by m ěla být náhodn ě přiřazena do kontrolních 
a experimentálních skupin. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby 
byl vliv umíst ění klecí minimalizován. Každému zví řeti by mělo být 
přiřazeno samostatné identifika ční číslo. 
1.4.3  Příprava dávek  
Zkoušenou látku lze podávat v potrav ě nebo v pitné vod ě, sondou 
nebo v kapslích. Metoda orálního podání závisí na ú čelu studie a na 
fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušeného materiálu.  
Zkoušená látka se v p řípadě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve 
vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporu čuje se zvážit použití 
vodného roztoku/suspense, potom použití roztoku/emulse v oleji 
(např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku v jiných vehikulech. 
Pro nevodná vehikula by m ěla být známa jejich toxická charakteris ­
tika. Měla by být stanovena stálost zkoušené látky v podmínkách 
podávání.  
1.5 POSTUP  
1.5.1  Po čet a pohlaví zví řat 
Pro každou úrove ň dávek se použije nejmén ě 8 zvířat (4 samice a 4 
samci). Pokud se budou zví řata usmrcovat v pr ůběhu studie, je nutno 
zvýšit celkový po čet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena 
před ukončením studie. Po čet zvířat při zakončení studie musí být 
dostatečný pro smysluplné vyhodnocení toxických ú činků. Na 
základě dřívějších poznatk ů o zkoušené chemické látce nebo jí blízce 
příbuzné látce by m ělo být vzato v úvahu za řazení dodate čné sate­
litní skupiny 8 zví řat (4 zví řata každého pohlaví) do kontrolní 
skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou pro ú čely pozorování vrat ­
nosti nebo p řetrvávání jakýchkoli toxických ú činků v období po 
expozici. Trvání tohoto období po expozici by m ělo být vhodn ě 
stanoveno s ohledem na pozorované ú činky. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2  Dávkování  
S výjimkou p řípadů, kdy se provede limitní zkouška (viz bod 1.5.3), 
by měly být použity nejmén ě tři úrovně dávek a soub ěžná kontrola. 
Úrovně dávek je možno stanovit na základ ě výsledků studií p ři 
opakované aplikaci nebo orienta čních studií a m ěly by zohlednit 
jakékoli existující toxikologické a toxikokinetické údaje dostupné pro zkoušenou slou čeninu nebo p říbuzné materiály. Nebrání-li 
tomu fyzikáln ě-chemická povaha nebo biologické ú činky zkoušené 
látky, měla by být nejvyšší úrove ň dávky zvolena s cílem vyvolat 
toxicitu, ne však uhynutí nebo velké utrpení. M ěla by být zvolena 
sestupná řada úrovní dávek s cílem prokázat ú činky související 
s dávkou a nep řítomnost nep říznivých ú činků při nejnižší úrovni 
dávky (NOAEL). Často je pro stanovení sestupných úrovní dávek 
optimální dvoj- až čtyřnásobný interval mezi dávkami a je vhodn ější 
přidat čtvrtou experimentální skupinu než použít velmi velké inter ­
valy (odpovídající nap ř. faktoru v ětšímu než 6 až 10).
 
Kontrolní skupin ě se nepodává žádná látka, nebo se jí podává vehi ­
kulum, jestliže se p ři podávání zkoušené látky vehikulum používá. 
S výjimkou podávání zkoušené látky se se zví řaty v kontrolní 
skupině zachází stejn ě jako se zví řaty v experimentální skupin ě. 
Jestliže je použito vehikulum, podává se kontrolní skupin ě 
v nejvyšším použitém objemu. Jestliže se zkoušená látka podává 
v potravě a způsobuje-li omezení p říjmu potravy, doporu čuje se 
použít paraleln ě skupinu se stejným omezením potravy, aby se 
odlišil vliv snížení p říjmu potravy nechutenstvím od toxikologických 
změn 
V případě potřeby by m ěly být vzaty v úvahu následující charakte ­
ristiky vehikula a ostatních p řísad: účinky na absorpci, distribuci, 
metabolismus nebo vylu čování zkoušené látky; dále vlivu na 
chemické vlastnosti zkoušené látky, které mohou zm ěnit její toxické 
vlastnosti, a ú činky na spot řebu potravy nebo vody nebo na nutri ční 
stav zvířat. 
1.5.3  Limitní zkouška  
Pokud zkouška provedená podle postup ů popsaných v této studii p ři 
jedné dávce nejmén ě 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti a den nevyvolá 
pozorovatelné nep říznivé účinky a pokud se na základ ě údajů 
o látkách s podobnou strukturou nep ředpokládá toxicita, není úplná 
studie za použití t ří dávek nezbytná. Limitní zkouška se provádí 
s výjimkou p řípadu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je 
nezbytné použití vyšší úrovn ě dávek.  
1.5.4  Podání dávek  
Zkoušená látka se zví řatům podává 7 dní v týdnu po dobu 90 dn ů. 
Jakýkoli jiný režim podávání, nap ř. 5 dní v týdnu, musí být zd ůvod­
něn. Pokud se zkoušená látka podává sondou, podává se zví řatům 
v jediné dávce za použití žalude ční sondy nebo vhodné intuba ční 
kanyly. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, 
závisí na velikosti pokusného zví řete. Zpravidla se udržuje co 
nejnižší objem. Až na dráždivé a žíravé látky, které obvykle p ři 
vyšších koncentracích vykazují zesílené ú činky, by m ěla být variabi ­
lita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace 
zajišťující konstantní objem p ři všech úrovních dávky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
U látek podávaných v potrav ě nebo v pitné vod ě je důležité zajistit, 
aby množství použité zkoušené látky neovliv ňovalo normální výživu 
nebo vodní rovnováhu. Podává-li se zkoušená látka v potrav ě, může 
se použít bu ď konstantní koncentrace (v ppm), nebo konstantní 
dávkování ve vztahu k t ělesné hmotnosti zví řete; použitá možnost 
musí být specifikována. Aplikuje-li se látka sondou nebo v kapslích, 
mělo by se tak stát každý den p řibližně ve stejnou dobu a dávkování 
by mělo být podle pot řeby upraveno tak, aby bylo konstantní 
vzhledem k t ělesné hmotnosti zví řete. Pokud je 90denní studie 
prováděna jako p ředběžná studie k dlouhodobé studii chronické toxi ­
city, měla by být v obou studiích použita stejná potrava.  
1.5.5  Pozorování  
Doba pozorování by m ěla být nejmén ě 90 dní. Zví řata v satelitní 
skupině určená pro následná pozorování by m ěla být po vhodnou 
dobu bez expozice, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení, nebo toxické ú činky přetrvávají.
 
Všeobecné klinické pozorování by se m ělo provád ět nejméně jednou 
denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby 
očekávaného maximálního ú činku po podání látky. Zaznamenává se 
klinický stav zví řat. Nejmén ě dvakrát denn ě, obvykle na za čátku 
a na konci každého dne, se provede prohlídka všech zví řat za účelem 
zjištění morbidity a mortality.  
Nejméně jednou p řed prvním podáním látky a dále jednou týdn ě se 
provede d ůkladné klinické vyšet ření všech zví řat (za účelem intrain ­
dividuálního srovnání). Toto pozorování by se m ělo, pokud je to 
možné, provád ět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím 
prostoru a p řednostně pokaždé ve stejnou dobu. Je t řeba se pokusit 
zajistit, aby byly rozdíly mezi podmínkami pozorování minimální. 
Příznaky toxicity by m ěly být pe člivě zaznamenány, v četně doby 
nástupu, stupn ě a trvání. Pozorování by m ělo mimo jiné zahrnovat 
změny kůže, srsti, o čí a sliznic, výskyt sekret ů a exkret ů 
a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé 
dýchání). Zaznamenávat by se m ěly změny chůze, polohy a reakce 
na manipulaci, dále p řítomnost klonických a tonických pohyb ů, 
stereotypů v chování (nap ř. nadměrného čistění nebo opakovaného 
kroužení) nebo jakékoli zvláštní chování.  
Před podáním zkoušené látky a p ři zakončení studie by m ělo být 
provedeno vyšet ření oftalmoskopem nebo rovnocenným p řístrojem 
nejlépe u všech zví řat, alespo ň však ve skupin ě s vysokou dávkou 
a v kontrolní skupin ě. Jsou-li zjišt ěny změny na očích související 
s podáním látky, m ěla by být vyšet řena všechna zví řata. 
1.5.5.1  Tělesná hmotnost a spot řeba potravy/vody  
Všechna zví řata by se m ěla nejmén ě jednou týdn ě zvážit. M ěření 
spotřeby potravy by se m ělo provád ět nejméně jednou týdn ě. Pokud 
se látka podává v pitné vod ě, měla by se nejmén ě jednou týdn ě měřit 
spotřeba vody. Spot řeba vody by m ěla být vzata v úvahu také 
v případě studií s podáváním v potrav ě nebo sondou, v jejichž 
průběhu může dojít ke zm ěně příjmu tekutin.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2  Hematologická a klinická biochemická vyšet ření 
Krevní vzorky by se m ěly odebírat z ur čeného místa a v p řípadě 
potřeby by se m ěly skladovat za vhodných podmínek. Na konci 
zkušebního období se vzorky odeberou t ěsně před utracením zví řat 
nebo v jeho pr ůběhu. 
Na začátku studie a poté v m ěsíčních intervalech nebo uprost řed 
zkušebního období a na konci zkušebního období se provede hema ­
tologické vyšet ření, včetně stanovení hematokritu, koncentrace 
hemoglobinu, po čtu erytrocyt ů, celkového a diferenciálního po čtu 
leukocytů, počtu trombocyt ů a srážlivosti krve, stanoví se protrom ­
binový a trombinový čas. 
Klinické biochemické analýzy za ú čelem vyšet ření hlavních toxic ­
kých účinků na tkáně a zejména na játra a ledviny se provedou na 
krevních vzorcích odebraných všem zví řatům na začátku zkušebního 
období a poté v m ěsíčních intervalech nebo uprost řed a na konci 
zkušebního období. Zkušební oblasti, které je vhodné stanovit jsou koncentrace elektrolyt ů, metabolismus cukr ů a funkce jater a ledvin. 
Výběr specifických zkoušek ovlivní pozorování mechanismu ú činku 
zkoušené látky. P řed odběrem vzork ů by měla být zví řata ponechána 
nalačno po dobu vhodnou pro daný druh. Navrhovaná vyšet ření 
zahrnují stanovení vápníku, fosforu, chlorid ů, sodíku, draslíku, 
glykémie nala čno, alaninaminotransferasy, aspartátaminotransferasy, 
ornitindekarboxylasy, gama-glutamyltranspeptidasy, dusíku mo čo­
viny, albuminu, kreatininu, celkového bilirubinu a celkových bílkovin v séru.
 
Analýzy mo či za použití časově definovaného sb ěru by se m ěly 
provést alespo ň na začátku, uprost řed a na konci studie. Analýzy 
moči zahrnují vyšet ření vzhledu, objemu, osmolality nebo specifické 
hmotnosti, pH, bílkovin, glukosy a krve/krvinek. Zkoumání pozoro ­
vaného ú činku (pozorovaných ú činků) lze v případě potřeby rozší řit 
o další analýzy.  
Dále by se m ělo uvážit vyšet ření indikátor ů celkového poškození 
tkání. Mezi jiná stanovení, která mohou být pot řebná pro úplné 
toxikologické hodnocení, pat ří analýza lipid ů, hormonů, acidobasické 
rovnováhy, methemoglobinu a aktivity cholinesterasy. Další bioche ­
mické analýzy mohou být v p řípadě potřeby použity pro širší 
vyšetření pozorovaných ú činků. Tyto profily je t řeba identifikovat 
pro chemické látky ur čitých skupin nebo p řípad od p řípadu.  
Obecně je třeba postupovat pružn ě v závislosti na druhu a na pozo ­
rovaných a/nebo p ředpokládaných ú čincích dané látky.  
1.5.5.3  Pitva  
U všech pokusných zví řat zařazených do studie by m ěla být 
provedena celková, podrobná pitva, zahrnující pe člivé vyšet ření vněj­ 
šího povrchu t ěla, všech otvor ů a lebeční, hrudní a b řišní dutiny 
a jejich obsahu. Játra se žlu čníkem, ledviny, nadledvinky, varlata, 
nadvarlata, vaje čníky, děloha, štítná žláza (s p říštítnými t ělísky), 
brzlík, slezina, mozek a srdce všech zví řat (kromě zvířat nalezených 
v agónii a/nebo zví řat utracených v pr ůběhu zkoušky) by m ěly být 
zbaveny všech ulp ělých tkání a co nejd říve po sekci se ve vlhkém 
stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Následující tkán ě by měly být přechovány v nejvhodn ějším fixačním 
médiu s ohledem na typ tkán ě a plánovaná následná histopatologická 
vyšetření: všechny tkán ě s lézemi, mozek (reprezentativní oblasti, 
včetně předního mozku, moze čku a prodloužené míchy), mícha (ve 
třech úrovních: kr ční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, o či, 
štítná žláza, p říštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, 
tenké i tlusté st řevo (včetně Peyerových plát ů), játra, žlu čník, 
slinivka b řišní, ledviny, nadledvinky, slezina, srdce, pr ůdušnice 
a plíce, aorta, gonády, d ěloha, přídatné pohlavní orgány, sami čí 
mléčná žláza, prostata, mo čový měchýř, žlučník (myší), lymfatické 
uzliny (p řednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro 
pokrytí systémových ú činků), periferní nerv ( n. ischiadicus  nebo  
n. tibialis ), přednostně v blízkosti svalu, řez kostní d řeně (a/nebo 
čerstvý nát ěr z nasáklé kostní d řeně) a kůže. Podle klinických 
nebo jiných nález ů může být nezbytné zkoumat i další tkán ě. 
Všechny orgány považované za možné cílové orgány pro p ůsobení 
zkoušené látky by m ěly být uchovány.  
1.5.5.4  Histopatologická vyšet ření 
Celkové histologické vyšet ření uchovaných orgán ů a tkání by m ělo 
být provedeno nejmén ě u všech zví řat kontrolní skupiny a skupiny 
s vysokou dávkou. Toto vyšet ření by m ělo být rozší řeno na zví řata 
všech ostatních dávkových skupin, pokud jsou u skupiny s vysokou 
dávkou pozorovány zm ěny orgánů vyvolané zkoušenou dávkou.  
Měly by být zkoumány všechny makroskopické léze.  
V případě použití satelitní skupiny by m ělo být provedeno histopa ­
tologické vyšet ření tkání a orgán ů, na kterých byly pozorovány 
účinky u exponovaných skupin.  
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
2.1 ÚDAJE  
Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zví ře. Navíc by 
měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, p řičemž se uvede 
u každé experimentální skupiny po čet zvířat na začátku zkoušky, 
počet zvířat nalezených uhynulých v pr ůběhu zkoušky nebo utrace ­
ných z humánních d ůvodů a dobu úmrtí nebo humánního utracení, 
počet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, popis toxických 
příznaků, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého toxic ­
kého účinku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zví řat 
vykazujících každý typ léze.  
Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by 
měla být zvolena již p ři plánování studie.  
2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1  Zkoušená látka  
— fyzikální povaha, čistota a fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— identifika ční údaje,  
— vehikulum (je-li pot řeba): zdůvodnění volby vehikula, není-li 
použita voda.  
2.2.2  Testovací druh:  
— použitý druh a kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— původ, podmínky chovu, strava atd.,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku zkoušky.  
2.2.3  Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění výběru úrovní dávek,  
— podrobné údaje o složení látky nebo úprav ě potravy, o dosažené 
koncentraci, stálosti a homogenit ě přípravku,  
— podrobné údaje o zp ůsobu podání zkoušené látky,  
— přepočet z koncentrace látky v potrav ě nebo ve vod ě (ppm) na 
skutečnou denní dávku v mg/kg t ělesné hmotnosti (pokud jde 
o aplikaci v potrav ě nebo ve vod ě), 
— podrobné údaje o potrav ě a kvalitě vody.  
2.2.4  Výsledky  
— tělesná hmotnost/zm ěny tělesné hmotnosti,  
— spotřeba potravy a pop řípadě spotřeba vody,  
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovn ě dávky, v četně 
příznaků toxicity,  
— charakter, závažnost a trvání klinických projev ů (zda byly vratné 
nebo nevratné),  
— oftalmologické vyšet ření, 
— hematologické vyšet ření s příslušnými výchozími hodnotami 
(normami),  
— klinická biochemická vyšet ření s příslušnými výchozími hodno ­
tami,  
— konečná tělesná hmotnost, hmotnost orgán ů a poměry hmotnosti 
orgánů k tělesné hmotnosti,  
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— údaje o absorpci, pokud jsou dostupné,  
— popřípadě statistické vyhodnocení výsledk ů. 
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28  STUDIE SUBCHRONICKÉ DERMÁLNÍ TOXICITY (90DENNÍ 
OPAKOVANÁ KOŽNÍ APLIKACE NA HLODAVCÍCH)  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená látka se denn ě po dobu 90 dní nanáší na k ůži 
v odstup ňovaných dávkách n ěkolika skupinám pokusných zví řat, 
každé skupin ě jedna úrove ň dávky. V pr ůběhu období aplikace se 
zvířata každý den pozorují, aby se zjistily p říznaky toxicity. Zví řata, 
která v pr ůběhu zkoušky uhynula, i zví řata, která do konce zkoušky 
přežila, se pitvají.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1.  Příprava  
Nejméně pět dní před zkouškou jsou zví řata chována v podmínkách 
chovu a krmení, v jakých budou b ěhem experimentu. P řed zkouškou 
se provede náhodný výb ěr zdravých mladých dosp ělých zvířat, která 
se přiřadí do experimentálních a kontrolních skupin. Krátce p řed 
zahájením zkoušky se zví řatům ostříhá srst na zádech. Vyholení 
srsti je rovn ěž možné, m ělo by se však provést asi 24 hodin p řed 
zkouškou. Ost říhání nebo oholení je obvykle t řeba opakovat 
přibližně v týdenních intervalech. P ři stříhání nebo holení srsti je 
třeba dbát na to, aby se neporanila k ůže. Pro aplikaci zkoušené 
látky se p řipraví nejmén ě 10 % povrchu t ěla. Při rozhodování 
o velikosti p řipravované plochy k ůže, která má být zbavena srsti, 
a o velikosti krycího obvazu je t řeba vzít v úvahu hmotnost zví řat. 
Při zkouškách pevných látek, které mohou být podle pot řeby roze­
třeny na prach, se zkoušená látka dostate čně navlhčí vodou, pop ří­
padě vhodným vehikulem, aby se zajistil dobrý styk s k ůží. Kapalné 
zkoušené látky se zpravidla aplikují ne ředěné. Aplikace se provádí 
pět až sedm dn ů v týdnu.  
1.6.2  Zkušební podmínky  
1.6.2.1. P o k u s n á z v í ř a t a 
Může být použit dosp ělý potkan, králík nebo mor če. Lze použít 
i jiné živo čišné druhy, ale jejich použití musí být zd ůvodněno. Na 
začátku zkoušky by nem ělo rozpětí odchylek hmotností p řekročit ± 
20 % příslušné st řední hodnoty. Provádíli se subchronická dermální 
studie jako p ředběžná studie p řed dlouhodobou studií, m ěl by být 
v obou studiích použit stejný živo čišný druh a kmen.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
1.6.2.2. P o č e t a p o h l a v í  
Pro každou úrove ň dávek se použije nejmén ě 20 zvířat (10 samic 
a 10 samc ů) se zdravou k ůží. Samice musí být nullipary a nesm ějí 
být březí. Pokud se budou zví řata usmrcovat v pr ůběhu studie, zvýší 
se celkový po čet o počet zvířat, která budou usmrcena p řed ukon­ 
čením studie. Krom ě toho může být satelitní skupin ě 20 zvířat (10 
zvířat každého pohlaví) podávána vysoká úrove ň dávky po dobu 90 
dnů a 28 dn ů po podávání se pozoruje vratnost, p řetrvávání nebo 
zpožděný výskyt toxických ú činků. 
1.6.2.3. Ú r o v n ě d á v e k  
Použijí se nejmén ě tři úrovně dávek a kontrolní skupina nebo, jeli 
použito vehikulum, kontrolní skupina s vehikulem. Doba expozice 
by měla být nejmén ě šest hodin denn ě. Zkoušená látka by m ěla být 
aplikována každý den p řibližně ve stejnou dobu a dávkování by 
mělo být pravideln ě (týdně nebo každých čtrnáct dnů) přizpůsobeno, 
aby bylo konstantní vzhledem k t ělesné hmotnosti zví řete. 
S výjimkou aplikace zkoušené látky se se zví řaty v kontrolní skupin ě 
zachází stejn ě jako se zví řaty v experimentální skupin ě. Používáli se 
pro usnadn ění aplikace vehikulum, aplikuje se kontrolní skupin ě 
stejným zp ůsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množ ­
ství, jaké obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka. Nejvyšší 
úroveň dávky by m ěla mít za následek toxické ú činky, ale nem ěla by 
způsobit žádná uhynutí nebo by m ěla mít za následek malý po čet 
uhynutí. Nejnižší úrove ň dávky by nem ěla vyvolat žádné p říznaky 
toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší 
dávka tuto hodnotu p řekračovat. V ideálním p řípadě by střední 
úroveň dávky m ěla vyvolat minimální pozorovatelné toxické ú činky. 
Použijeli se více než jedna mezilehlá úrove ň dávky, m ěly by se 
úrovně lišit tak, aby vyvolaly odstup ňované toxické ú činky. Ve 
skupinách s nízkou a st řední úrovní dávky a v kontrolních skupinách 
by měla být četnost uhynutí nízká, aby bylo možné provést smys ­
luplné hodnocení výsledk ů. 
Vede-li aplikace zkoušené látky k závažnému podrážd ění kůže, je 
třeba snížit koncentraci, což u vysoké úrovn ě dávky m ůže vést 
k omezení nebo vylou čení ostatních toxických ú činků. Došloli 
k závažnému poškození k ůže, je nutné zkoušku ukon čit a provést 
ji znovu s nižšími koncentracemi.  
1.6.3. L i m i t n í z k o u š k a  
Nevyvolá-li p ři předběžné studii aplikace dávky 1 000 mg/kg nebo 
vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, jeli známa, 
žádné toxické ú činky, není další zkoušení pot řebné.  
1.6.4. D o b a p o z o r o v á n í  
Zvířata se pozorují denn ě s cílem zaznamenat p říznaky toxicity. 
Zaznamenají se doba uhynutí a čas, ve kterém se objevily a op ět 
odezněly toxické ú činky. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
1.6.5.  Postup  
Zvířata se chovají jednotliv ě v klecích. Zví řatům se aplikuje zkou ­ 
šená látka denn ě nejlépe 7 dní v týdnu po dobu 90 dn ů. 
Zvířata v satelitních skupinách, která jsou ur čena k následnému 
pozorování, se pozorují dalších 28 dn ů bez aplikace, aby se posou ­
dilo zotavení z otravy nebo p řetrvávání toxických ú činků. Doba 
expozice by m ěla být nejmén ě šest hodin denn ě. 
Zkoušená látka se nanese rovnom ěrně na plochu, která činí asi 10 % 
celkového povrchu t ěla. V případě vysoce toxických látek m ůže být 
tato plocha menší; m ěla by se však porýt co nejv ětší část této plochy 
co nejslabší a nejstejnom ěrnější vrstvou.  
Během expozice se zkoušená látka udržuje ve styku s k ůží pomocí 
porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Zkušební plocha se dále vhodným zp ůsobem p řekryje, aby se mulový obvaz 
a zkoušená látka fixovaly a aby zví řata zkoušenou látku nepožila. 
K zamezení požití látky je možno použít i prost ředky pro omezení 
volnosti pohybu, úplné znehybn ění se však nedoporu čuje.
 
Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky zkoušené látky pokud 
možno vodou nebo jiným vhodným zp ůsobem očištění kůže. 
Všechna zví řata se pozorují denn ě a zaznamenávají se známky toxi ­
city včetně doby nástupu, závažnosti a trvání. Pozorování v kleci 
zahrnuje zm ěny kůže, srsti, o čí, sliznic, dýchání a krevního ob ěhu, 
změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomo ­
torické aktivity a chování. M ěření spotřeby potravy a hmotnosti 
zvířat se provád ějí týdně. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zví řat, 
aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zví řat, např. v důsledku 
kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného za řazení. Na konci 
zkoušky se všechna zví řata, která p řežila, s výjimkou satelitních 
skupin, pitvají. Zví řata nalezená v agónii se vy řadí, humánn ě utratí 
a pitvají.  
U všech zví řat včetně kontrolních se obvykle provád ějí následující 
vyšetření: 
a) oftalmologické vyšet ření oftalmoskopem nebo rovnocenným 
vhodným p řístrojem se provede p řed podáním zkoušené látky 
a na konci studie nejlépe u všech zví řat, alespo ň však 
u skupiny s nejvyšší dávkou a u kontrolních skupin. Jsou-li zjiš ­
těny oční změny, vyšet ří se všechna zví řata; 
b) na konci zkoušky se provede hematologické vyšet ření, které má 
zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erythrocyt ů, celkového a diferenciálního po čtu leukocyt ů 
a testy srážlivosti krve, zm ěří se nap říklad doba srážlivosti, 
prothrombinový čas, thrombinový čas nebo po čet trombocyt ů;
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) na konci zkoušky se provede biochemická analýza krve. Pro tyto 
studie je vhodné analyzovat koncentraci elektrolyt ů, metabo ­
lismus glycid ů, funkci jater a ledvin. Výb ěr specifických zkoušek 
bude určen pozorováním zp ůsobu účinku látky. Navrhovaná 
vyšetření zahrnují stanovení vápníku, fosforu, chlorid ů, sodíku, 
draslíku, glukózy na la čno (délka doby hladov ění se volí podle 
živočišného druhu), hladiny sérové glutamát-pyruvát 
transaminasy (  1 ), glutamát-oxalacetát transaminasy (  2 ), ornitinde ­
karboxylasy, gama-glutamyltranspeptidasy, dusíku mo čoviny, 
albuminu, kreatininu, celkového bilirubinu a celkových bílkovin 
v séru. Mezi další stanovení, která mohou být nezbytná pro správné toxikologické hodnocení, pat ří stanovení lipid ů, 
hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu a aktivity 
cholinesterasy. Další biochemické analýzy mohou být použity, 
je-li nezbytné provést širší vyšet ření pozorovaných ú činků;
 
d) analýza mo či se běžně nevyžaduje, provádí se pouze na základ ě 
očekávané nebo pozorované toxicity.  
Pokud nejsou kontrolní údaje z d řívějších pozorování vhodné, zváží 
se stanovení hematologických a biochemických parametr ů ještě před 
začátkem aplikace.  
P i t v a  
U všech zví řat se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu 
těla, všech t ělních otvor ů, lební, hrudní a b řišní dutiny v četně jejich 
obsahu. Játra, ledviny, nadledviny a varlata se co nejd říve po sekci 
zváží, aby nedošlo k vysychání. Následující orgány a tkán ě je třeba 
přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozd ější histo­
patologická vyšet ření: všechny tkán ě s makroskopickými lézemi, 
mozek – v řezech medula/pons, k ůra mozku a moze čku, podvěsek 
mozkový, štítná žláza/p říštítná tělíska, všechny thymické tkán ě, 
průdušnice a plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, 
nadledviny, slinivka b řišní, gonády, d ěloha (přídatné pohlavní orgá ­
ny), (kůže), jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, caecum, 
tračník, kone čník, močový měchýř, reprezentativní lymfatické uzliny, 
(samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, hrudní kost 
s kostní d ření, (oči), (kost stehenní v četně kloubních ploch), (mícha 
ve třech úrovních – kr ční, střední hrudní a bederní) a (slzné žlázy). 
Tkáně v závorkách se vyšet řují pouze v p řípadě, že lze na jejich 
postižení usuzovat z p říznaků toxicity nebo pokud souvisejí 
s cílovým orgánem.  
H i s t o p a t o l o g i c k á v y š e t ř e n í 
a) Úplné histopatologické vyšet ření normální a exponované k ůže, 
orgánů a tkání se provede u všech zví řat kontrolní skupiny a u 
zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka.  
b) Vyšetří se všechny makroskopické léze.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Nyní známá jako alaninaminotransferasa. 
( 2 ) Nyní známá jako aspartátaminotransferasa.
 c) Vyšetří se cílové orgány v jiných dávkových skupinách.  
d) Použijí-li se potkani, plíce zví řat ve skupinách s nízkou a st řední 
dávkou se histopatologicky vyšet ří k zjištění příznaků infekce, 
neboť to umož ňuje vhodné posouzení zdravotního stavu zví řat. 
Další histopatologická vyšet ření se u zví řat těchto skupin nemusí 
provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na 
kterých byly zjišt ěny léze ve skupin ě s vysokou dávkou.  
e) V případě použití satelitní skupiny se provede histopatologické 
vyšetření tkání a orgán ů, na kterých byly pozorovány ú činky 
u exponovaných skupin.  
2. ÚDAJE  
Údaje se shrnou do tabulky, p řičemž se uvede u každé experimen ­
tální skupiny po čet zvířat na začátku zkoušky, po čet zvířat vykazu ­
jících léze a procento zví řat vykazujících jednotlivé typy lézí. 
Výsledky se vyhodnotí vhodnou statistickou metodou. M ůže být 
použita jakákoli uznávaná statistická metoda.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— živočišný druh, kmen, p ůvod, podmínky chovu, strava,  
— zkušební podmínky,  
— úrovn ě dávek (v četně vehikula, pokud je použito) a koncentrace,  
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a dávky,  
— úrove ň bez účinku, pokud ji lze stanovit,  
— doba uhynutí b ěhem experimentu, p řípadně údaj o p řežití zvířat 
do konce sledování,  
— popis toxických nebo jiných ú činků, 
— doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální p říznaky, 
a jejich další vývoj,  
— údaje o spot řebě potravy a o t ělesné hmotnosti,  
— oftalmologické nálezy,  
— provedená hematologická vyšet ření a jejich výsledky,  
— provedená biochemická vyšet ření a jejich výsledky (v četně 
výsledků případných analýz mo či), 
— pitevní nálezy,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— statistické vyhodnocení výsledk ů, kde je to možné,  
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29  SUBCHRONICKÁ INHALA ČNÍ TOXICITA: 90DENNÍ STUDIE  
SHRNUTÍ  
Tato revidovaná zkušební metoda B.29 byla navržena s cílem pln ě charakteri ­
zovat toxicitu zkoušené chemické látky podávané inhala ční cestou p ři subchro ­
nické expozici (90 dn ů) a získat pr ůkazné údaje pro kvantitativní posouzení rizik 
inhalace. Skupiny 10 samc ů a 10 samic hlodavc ů se vystaví 6 hodin denn ě po 
dobu 90 dn ů (13 týdn ů) a) zkoušené chemické látce na t řech nebo více úrovních 
koncentrace, b) filtrovanému vzduchu (negativní kontrola) a/nebo c) nosi či (kon­
trola s nosi čem). Zvířata jsou obvykle exponována 5 dn ů týdně, avšak expozice 
po 7 dnů v týdnu je rovn ěž povolena. Zkouška se vždy provádí se samci 
i samicemi, avšak mohou být vystaveni odlišným úrovním koncentrace, pokud je známo, že je jedno pohlaví citliv ější vůči dané zkušební chemické látce. Tato 
metoda poskytuje vedoucímu studie možnost za řadit do zkoušky satelitní (rever ­
zibilní) skupiny, p ředběžná utracení, bronchoalveolární laváž (BAL), neuro ­
logické testy a další klinická patologická a histopatologická vyšet ření za účelem 
lepší charakterizace toxicity zkoušené chemické látky.
 
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení 413 (2009). 
Původní Pokyny pro zkoušení 413 (TG 413) subchronické inhala ční toxicity 
byly schváleny v roce 1981 (1). Tato zkušební metoda B.29 (odpovídající revidovaným pokyn ům TG 413 (2009)) byla aktualizována tak, aby odrážela 
stav vědeckého poznání a napl ňovala stávající a budoucí regula ční potřeby.
 
2. Studie subchronické inhala ční toxicity se používají p ředevším k odvození 
regulačních koncentrací pro posouzení rizika pro pracovníky v pracovním 
prostředí. Také se používají k posouzení rizika pro člověka v obytných 
prostorách, v doprav ě a rizika pro životní prost ředí. Tato metoda umož ňuje 
charakterizaci nep říznivých ú činků po opakované denní inhala ční expozici 
zkoušené chemické látce po dobu 90 dn ů (přibližně 10 % délky života 
potkana). Údaje získané ve studiích subchronické inhala ční toxicity lze 
použít ke kvantitativnímu posouzení rizik a k výb ěru koncentrací pro chro ­
nické studie. Tato zkušební metoda není speciáln ě určena pro zkoušky 
nanomateriál ů. Definice použité v kontextu této zkušební metody jsou 
uvedeny na konci této kapitoly a v Pokynech GD 39 (2).  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
3. Před zahájením této studie by m ěla laborato ř provádějící zkoušky vzít 
v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby se 
zvýšila kvalita studie a minimalizovalo použití zví řat. Mezi informace, 
které usnad ňují výběr vhodných zkušebních koncentrací, pat ří identita zkou ­ 
šené chemické látky, její chemická struktura a fyzikáln ě-chemické vlastnosti, 
výsledky jakýchkoli test ů toxicity  in vitro  nebo  in vivo , předpokládaná 
použití a potenciální expozice člověka, dostupné údaje (Q)SAR 
a toxikologické údaje o strukturn ě příbuzných látkách a údaje získané p ři 
jiných zkouškách toxicity po opakované expozici. O čekává-li se nebo je-li 
v průběhu studie pozorována neurotoxicita, m ůže se vedoucí studie rozhod ­
nout zahrnout vhodná vyšet ření, například funk ční pozorovací baterii (func ­
tional observational battery, FOB) a m ěření motorické aktivity. P řestože 
načasování expozic s ohledem na konkrétní vyšet ření může být velmi d ůle­ 
žité, nem ělo by provád ění těchto dopl ňkových činností narušovat základní 
plán studie.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Roztoky žíravých nebo dráždivých zkoušených chemických látek lze 
testovat p ři koncentracích, které povedou k požadovanému stupni toxicity. 
Další informace naleznete v dokumentu GD 39 (2). P ři vystavování zví řat 
těmto materiál ům by však m ěly být cílové koncentrace dostate čně nízké, aby 
nezpůsobily výraznou bolest a utrpení, zárove ň by však m ěly být dosta čující 
k prodloužení k řivky závislosti odezvy na koncentraci k hodnotám, které 
umožní splnit regula ční a vědecký účel této zkoušky. Tyto koncentrace by 
se měly volit p řípad od p řípadu, nejlépe na základ ě výsledků vhodně navr­ 
žené studie ke stanovení dávkování, která poskytuje informace o kritickém 
cílovém parametru, prahu dráždivosti a dob ě nástupu ú činků (viz odstavce 
11–13). M ělo by se uvést zd ůvodnění výběru dané koncentrace.  
5. Umírající zví řata nebo zví řata, která o čividně trpí bolestí nebo vykazují 
známky závažného a p řetrvávajícího stresu, by se m ěla humánním 
způsobem utratit. Umírající zví řata se posuzují stejným zp ůsobem jako 
zvířata, která p ři zkoušce uhynou. Kritéria rozhodování o utracení umírají ­
cích nebo zna čně trpících zví řat a pokyny týkající se rozpoznání p ředvída­
telného nebo blížícího se uhynutí jsou p ředmětem Pokyn ů OECD 
o humánních cílových parametrech (3).  
POPIS METODY  
Výběr zvířecích druh ů 
6. Měli by se použít mladí zdraví dosp ělí hlodavci b ěžně používaných 
laboratorních kmen ů. Nejvhodn ějším druhem je potkan. Pokud se použijí 
jiné druhy, m ělo by se uvést od ůvodnění. 
Příprava zví řat 
7. Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. V den randomizace by m ělo jít 
o mladé dosp ělé jedince staré 7 až 9 týdn ů. Tělesná hmotnost by se m ěla 
pohybovat v rozmezí ± 20 % pr ůměrné hmotnosti u každého pohlaví. 
Zvířata se náhodn ě vyberou, ozna čí pro pot řeby individuální identifikace 
a umístí se do klecí nejmén ě 5 dnů před začátkem zkoušky, aby si mohla 
zvyknout na laboratorní podmínky.  
Zvířecí chov  
8. Zvířata by m ěla být individuáln ě označena, nejlépe pomocí subkutánních 
transpondér ů, aby se usnadnila pozorování a zamezilo zám ěně. Teplota 
zkušební místnosti, v níž se zví řata uchovávají, by m ěla být 22 ± 3 °C. 
Relativní vlhkost by se m ěla ideálně udržovat v rozmezí 30 až 70 %, 
ačkoliv to nemusí být proveditelné, používá-li se jako nosi č voda. P řed 
expozicí a po ní by se m ěla zvířata držet v klecích rozd ělena do skupin 
podle pohlaví a koncentrace, avšak po čet zvířat v jedné kleci by nem ěl 
bránit jasnému pozorování každého zví řete a měl by minimalizovat ztráty 
v důsledku kanibalismu nebo boj ů. Jsou-li zví řata vystavena látce pouze 
nazální cestou, m ůže být nutné nechat je zvyknout si na zkumavky omezu ­
jící pohyb. Zkumavky by nem ěly zvířatům způsobovat p řílišný fyzický, 
termální nebo imobiliza ční stres. Omezení m ůže ovlivnit fyziologické cílové 
parametry, jako je t ělesná teplota (hypertermie) a/nebo minutový dechový 
objem. Jsou-li k dispozici obecné údaje, které prokazují, že k takovým změnám nedochází ve zna čné míře, není p ředběžná adaptace na omezující 
trubičky nutná. Zví řata, jež jsou vystavena aerosolu celým t ělem, by se m
ěla 
držet během expozice odd ěleně, aby se zabránilo pronikání zkoušeného 
aerosolu z jejich t ěla do srsti ostatních zví řat v kleci. Mohou se používat 
konvenční a certifikovaná laboratorní krmiva, krom ě období expozice, podá ­
vaná s neomezeným množstvím pitné vody z vodovodu. Osv ětlení by m ělo 
být umělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalační komory  
9. Při výběru inhalační komory by se m ěla zvážit povaha zkoušené chemické 
látky a cíl zkoušky. Up řednostňuje se expozice pouze nazální cestou (p ři­ 
čemž tento termín zahrnuje i expozici hlavy, nosu nebo tlamy) Expozice 
pouze nazální cestou se obecn ě upřednostňuje u studií kapalných nebo 
pevných aerosol ů a par, které mohou kondenzací vytvá řet aerosoly. Speci ­
álních cíl ů studie lze snáze dosáhnout, použije-li se celot ělová expozice, 
avšak tato skute čnost by se m ěla zdůvodnit ve zpráv ě o studii. Pro zajišt ění 
stability atmosféry v komo ře pro celot ělovou expozici by nem ěl celkový 
objem zapln ěný pokusnými zví řaty přesáhnout 5 % objemu komory. Prin ­
cipy techniky expozice pouze nazální cestou a celot ělové expozice a jejich 
konkrétní výhody a nevýhody jsou popsány v dokumentu GD 39 (2).  
STUDIE TOXICITY  
Mezní koncentrace  
10. Na rozdíl od akutních studií nejsou ve studiích subchronické inhala ční toxi­
city žádné definované mezní koncentrace. Maximální zkoušená koncentrace 
by měla zohled ňovat: 1) maximální dosažitelnou koncentraci, 2) úrove ň 
expozice člověka v „nejhorším p řípadě“, 3) potřebu udržet dostate čný přívod 
kyslíku, a/nebo 4) dobré životní podmínky zví řat. Chybí-li mezní hodnoty 
založené na skute čných údajích, mohou se použít akutní limity 
z nařízení (ES) č. 1272/2008 (13) (tj. maximáln ě 5 mg/l pro aerosoly, 20 
mg/l pro páry a 20 000 ppm pro plyny), viz GD 39 (2). Pokud je p ři 
zkouškách plyn ů nebo vysoce t ěkavých chemických látek (nap ř. chladicí 
prostředky) pot řeba tyto limity p řekročit, mělo by se uvést zd ůvodnění. 
Z mezní koncentrace by m ělo být možné odvodit jednozna čnou toxicitu 
bez toho, aby byly zví řata vystavena nadm ěrnému stresu nebo aby byla 
ovlivněna délka jejich života.  
Studie ke stanovení rozsahu  
11. Před zahájením hlavní studie je obvykle nutno provést studii ke stanovení 
rozsahu. Studie ke stanovení rozsahu je komplexn ější než orienta ční studie, 
protože není omezená na výb ěr koncentrace. Poznatky získané ve studii ke 
stanovení rozsahu mohou vést k úsp ěšné hlavní studii. Studie k stanovení 
rozsahu m ůže například poskytnout technické informace týkající se analy ­
tických metod, stanovení velikosti částic, odhalení toxických mechanism ů, 
klinické patologie a histopatologických údaj ů a odhady koncentrací NOAEL 
a MTC v hlavní studii. Vedoucí studie se m ůže rozhodnout použít studii ke 
stanovení rozsahu pro ur čení prahové hodnoty pro podrážd ění dýchacích 
cest (nap ř. pomocí histopatologického vyšet ření dýchacích cest, zkoušení 
plicních funkcí nebo bronchoalveolární laváže), horní hranice koncentrace, 
kterou zví řata snášejí bez nadm ěrného stresu, a parametry, které budou 
nejlépe charakterizovat toxicitu zkoušené chemické látky.  
12. Studie ke stanovení rozsahu se m ůže skládat z jedné nebo více úrovní 
koncentrace. V závislosti na zvolených cílových parametrech by se m ělo 
každé úrovni koncentrace vystavit t ři až šest samc ů a tři až šest samic. 
Studie ke stanovení rozsahu by m ěla trvat minimáln ě 5 dní a obvykle ne 
déle než 28 dní. Ve zpráv ě o studii by se m ělo uvést zd ůvodnění výběru 
koncentrací pro hlavní studii. Cílem hlavní studie je ukázat vztah mezi 
koncentrací a odezvou založený na p ředpokládaném nejcitliv ějším cílovém 
parametru. Nízká koncentrace by m ěla být v ideálním p řípadě koncentrace, 
při níž nejsou pozorovány nep říznivé účinky, zatímco z vysoké by m ělo být 
možné odvodit jednozna čnou toxicitu, aniž by se zví řatům způsobil 
nadměrný stres nebo se ovlivnila délka jejich života (3).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Při výběru úrovní koncentrace pro studii ke stanovení rozsahu by se m ěly 
zvážit veškeré dostupné informace, v četně vztahů mezi strukturou 
a aktivitou a údaj ů o podobných chemických látkách (viz odstavec 3). 
Studie ke stanovení rozsahu m ůže potvrdit/vyvrátit cílové parametry, které 
se považují z mechanistického hlediska za nejvíce citlivé, nap ř. inhibice 
cholinesterázy organickými fosfáty, tvorba methemoglobinu v d ůsledku 
erytrocytotoxických látek, hormony štítné žlázy (T  3 , T 4 ) u tyreotoxických 
látek, bílkoviny, LDH nebo neutrofily v bronchoalveolární laváži u neškodných špatn ě rozpustných částic nebo aerosol ů dráždících plíce.
 
Hlavní studie  
14. Hlavní studie subchronické toxicity se obvykle skládá ze t ří úrovní koncent ­
race a rovn ěž zahrnuje soub ěžné negativní kontroly (se vzduchem) a/nebo 
dle potřeby kontroly s nosi čem (viz odstavec 18). P ři výběru vhodných 
úrovní expozice je t řeba použít veškeré dostupné údaje, v četně výsledků 
studií systémové toxicity, metabolismu a kinetiky (zvláštní d ůraz by se 
měl klást na vylou čení vysokých úrovní koncentrace, které saturují kinetické 
procesy). Každá experimentální skupina obsahuje alespo ň 10 samc ů a 10 
samic hlodavc ů, kteří jsou vystaveni zkoušené chemické látce 6 hodin denn ě 
5 dnů v týdnu po dobu 13 týdn ů (celková doba trvání studie je alespo ň 90 
dní). Zvířata lze rovn ěž vystavit látce 7 dní v týdnu (nap ř. při zkouškách 
inhalačních farmaceutik). Je-li známo, že je jedno pohlaví v ůči dané zkou ­ 
šené chemické látce citliv ější, je možné vystavit jednotlivá pohlaví odlišným 
úrovním koncentrace, aby se optimalizoval vztah mezi koncentrací a odezvou, jak popisuje odstavec 15. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy hlodavc ů než potkani, je možné upravit maximální doby 
expozice za ú čelem minimalizace druhov ě specifického utrpení. Použije-li se 
doba expozice kratší než 6 hodin/den, nebo pokud je nutné provést studii celotělové expozice s dlouhou dobou expozice (nap ř. 22 hodin/den), m ělo 
by se uvést zd ůvodnění (viz GD 39) (2). B ěhem expozice by se m ělo 
pozastavit krmení zví řat, jestliže doba expozice nep
řesahuje 6 hodin. 
Během celot ělové expozice je možné zví řatům podávat vodu.  
15. Zvolené cílové koncentrace by m ěly vést k identifikaci cílového orgánu 
(cílových orgán ů) a ukázat jasný vztah mezi koncentrací a odezvou:  
— Vysoká úrove ň koncentrace by m ěla mít toxické ú činky, avšak nem ěla 
by způsobovat trvalé následky či letalitu, které by zabránily smyslu ­
plnému vyhodnocení.  
— Střední úrovn ě koncentrací mezi mezními hodnotami by m ěly odstup ­ 
ňovány, aby se toxické ú činky zvyšovaly od nízké po vysokou koncen ­
traci.  
— Nízká úrove ň koncentrace by m ěla vyvolat malé nebo žádné p říznaky 
toxicity.  
Předběžná utracení  
16. Je-li plánováno utracení n ěkterých zví řat před ukončením studie, m ěl by se 
počet zvířat na každé úrovni expozice zvýšit o po čet zvířat určených 
k utracení p řed koncem studie. P ředběžná utracení by se m ěla zdůvodnit 
a náležitě zohlednit ve statistických analýzách.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Satelitní studie (reverzibility)  
17. Satelitní studii (reverzibility) je možné použít k pozorování reverzibility, 
přetrvávání nebo opožd ěného nástupu toxicity b ěhem dostate čně dlouhého 
období po expozici, nejmén ě však po 14 dn ů. Skupiny v satelitní studii 
(studii reverzibility) tvo řené deseti samci a deseti samicemi se látce vystaví 
současně s pokusnými zví řaty v hlavní studii. Skupiny v satelitní studii 
(studii reverzibility) by se m ěly vystavit nejvyšší úrovni koncentrace zkou ­ 
šené chemické látky a m ěly by se použít soub ěžné kontroly se vzduchem 
a/nebo s nosi čem, dle pot řeby (viz odstavec 18).  
Kontrolní zví řata 
18. Se zví řaty v soub ěžné negativní kontrolní skupin ě (se vzduchem) by se m ělo 
zacházet stejným zp ůsobem jako se zví řaty v experimentální skupin ě, místo 
zkoušené chemické látce se však vystaví filtrovanému vzduchu. Pokud se ke 
generování zkušební atmosféry používá také voda nebo jiná látka, m ěla by 
se do studie místo negativní kontroly se vzduchem za řadit kontrolní skupina 
s nosičem. Kdykoli je to možné, m ěla by se jako nosi č použít voda. Použije- 
li se jako nosi č voda, měla by se kontrolní zví řata vystavit vzduchu o stejné 
relativní vlhkosti jako experimentální skupiny. Výb ěr vhodného nosi če by 
měl vycházet z vhodn ě provedené p ředběžné studie nebo d říve získaných 
údajů. Není-li toxicita nosi če dostate čně známá, m ůže se vedoucí studie 
rozhodnout použít jak negativní kontrolu (se vzduchem), tak kontrolu 
s nosičem, ale takový postup se rozhodn ě nedoporu čuje. Jestliže historické 
údaje ukážou, že nosi č není toxický, není t řeba používat negativní kontrolní 
skupinu (se vzduchem) a m ěla by se použít pouze kontrolní skupina 
s nosičem. Jestliže p ředběžná studie zkoušené chemické látky formulované 
na nosiči neodhalí žádnou toxicitu, vyplývá z toho, že nosi č je při zkoušené 
koncentraci netoxický a m ěla by se použít tato kontrola s nosi čem. 
PODMÍNKY EXPOZICE  
Podání koncentrací  
19. Zvířata jsou vystavena zkoušené chemické látce ve form ě plynu, páry, aero ­
solu nebo jejich sm ěsi. Skupenství látky, které se má zkoušet, závisí na 
fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, zvolených 
koncentracích a/nebo fyzické form ě, v níž se bude zkoušená chemická 
látka s nejv ětší pravd ěpodobností nacházet p ři manipulaci a používání. 
Hygroskopické a chemicky reaktivní zkoušené chemické látky by se m ěly 
zkoušet v podmínkách suchého vzduchu. Je t řeba pečlivě zabránit vzniku 
explozivních koncentrací. Partikulární materiály je možné podrobit mecha ­
nickým postup ům ke snížení velikosti částic. Další pokyny jsou uvedeny 
v dokumentu GD 39 (2).  
Distribuce velikosti částic  
20. U všech aerosol ů a par, které mohou kondenzací vytvo řit aerosoly, by se 
mělo provést stanovení velikosti částic. Aby byla možná expozice všech 
důležitých částí dýchací soustavy, doporu čují se aerosoly s hodnotami hmot ­
nostního mediánu aerodynamického pr ůměru (MMAD) v rozmezí 1 až 3 μm 
a s geometrickou sm ěrodatnou odchylkou ( σ g ) v rozmezí 1,5 až 3,0 (4). 
Přestože by se m ělo vynaložit dostate čné úsilí k spln ění této normy, není-li 
to možné, je t řeba předložit odborný posudek. Nap říklad částice kovových 
výparů mohou být menší, než je tato norma, a nabité částice a vlákna ji 
mohou překračovat. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Příprava zkoušené chemické látky na nosi či 
21. V ideálním p řípadě by se měla zkoušená chemická látka testovat bez nosi če. 
Jestliže je nutné použít nosi č k získání vhodné koncentrace a velikosti částic 
zkoušené chemické látky, m ěla by se p řednostně použít voda. Kdykoli je 
zkoušená chemická látka v tomto nosi či rozpuštěna, měla by se prokázat její 
stabilita.  
MONITOROVÁNÍ PODMÍNEK EXPOZICE  
Proudění vzduchu komorou  
22. Proud ění vzduchu expozi ční komorou by se m ělo při každé expozici pe člivě 
kontrolovat, neustále monitorovat a zaznamenávat nejmén ě v hodinových 
intervalech. Aktuální monitorování koncentrace látky ve zkušební atmosfé ře 
(nebo stability v čase) je nedílnou sou částí měření všech dynamických 
parametrů a poskytuje nep římý prost ředek ke kontrole všech d ůležitých 
dynamických inhala čních parametr ů. Monitoruje-li se koncentrace 
v reálném čase, je možné snížit frekvenci m ěření průtoku vzduchu komorou 
na jediné m ěření pro každou expozici za den. Zvláštní pozornost je t řeba 
věnovat tomu, aby se zamezilo op ětovnému vdechování látky v komorách 
s nazální cestou expozice. Koncentrace kyslíku by m ěla být alespo ň 19 % 
a koncentrace oxidu uhli čitého by nem ěla přesáhnout 1 %. Existuje-li d ůvod 
se domnívat, že tyto normy nelze splnit, m ěly by se koncentrace kyslíku 
a oxidu uhli čitého měřit. Jestliže m ěření v první den expozice ukážou, že 
jsou úrovn ě těchto plyn ů správné, není t řeba provád ět další měření. 
Teplota a relativní vlhkost v komo ře 
23. Teplota v komo ře by se m ěla udržovat na 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost 
v dýchací zón ě zvířat, jak při expozici pouze nazální cestou, tak p ři celo­
tělové expozici, by se m ěla nepřetržitě sledovat a zaznamenávat pokud 
možno alespo ň v hodinových intervalech b ěhem každé expozice. Relativní 
vlhkost by se m ěla udržovat nejlépe v rozmezí 30 až 70 %, to však m ůže 
být neproveditelné (nap ř. při zkoušení sm ěsí na bázi vody) nebo nem ěřitelné 
v důsledku interference zkoušené chemické látky se zkušební metodou.  
Zkoušená chemická látka: Nominální koncentrace  
24. Je-li to možné, m ěla by se vypo čítat a zaznamenat nominální koncentrace 
zkoušené chemické látky v expozi ční komoře. Nominální koncentrace je 
hmotnost generované zkoušené chemické látky vyd ělená celkovým 
objemem vzduchu, který prošel systémem inhala ční komory. Nominální 
koncentrace se nepoužívá k charakterizaci expozice zví řat, ale porovnání 
nominální koncentrace a skute čné koncentrace je ukazatelem výkonnosti 
zkušebního systému p ři generování zkušební atmosféry, a tudíž ji lze použít 
ke zjištění problém ů při generování.  
Zkoušená chemická látka: Skute čná koncentrace  
25. Skute čná koncentrace je koncentrace zkoušené chemické látky ve vzorcích 
odebraných v dýchací zón ě zvířat v inhala ční komoře. Skutečné koncentrace 
lze změřit specifickými metodami (nap ř. přímý odběr vzorků, adsorpční 
metody nebo metody založené na chemické reakci a následná analytická 
charakterizace) nebo nespecifickými metodami, jako je vážková analýza 
(gravimetrie). Použití gravimetrie je p řípustné pouze u práškových aerosol ů 
obsahujících jedinou složky nebo u aerosol ů z kapalin s nízkou t ěkavostí 
a mělo by se podložit p říslušnou specifickou charakterizací zkoušené 
chemické látky p řed provedením studie. Koncentraci práškového aerosolu 
sestávajícího z více složek lze rovn ěž stanovit gravimetricky. Vyžaduje to  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
však analytické údaje, které prokazují, že složení materiálu ve vzduchu je 
podobné složení výchozího materiálu. Nejsou-li tyto informace k dispozici, 
může být nutné provád ět během studie v pravidelných intervalech opako ­
vanou analýzu zkoušené chemické látky (ideáln ě ve vzdušné form ě). U látek 
v aerosolové form ě, které se mohou vypa řovat nebo sublimovat, by se m ělo 
prokázat, že byly vybranou metodou zachyceny všechny fáze.  
26. Během celé studie by se m ěla použít pokud možno jedna šarže zkoušené 
chemické látky a zkoušený vzorek by se m ěl uchovávat za takových 
podmínek, aby z ůstal čistý, homogenní a stabilní. P řed zahájením studie 
by se měla provést charakterizace zkoušené chemické látky, v četně určení 
její čistoty a, je-li to technicky proveditelné, identity a množství identifiko ­
vaných kontaminujících látek a ne čistot. Je možné to prokázat mimo jiné 
těmito údaji: reten ční čas a relativní plocha píku, molekulová hmotnost 
z hmotnostní spektroskopie nebo plynové chromatografie, nebo jiné odhady. Přestože ur čení identity zkoušeného vzorku není povinností laborato ře 
provádějící zkoušku, je vhodné alespo ň do jisté míry ov ěřit popis látky 
poskytnutý zadavatelem (nap ř. barvu, fyzikální vlastnosti atp.).
 
27. Podle možností je t řeba udržovat expozi ční atmosféru konstantní. 
K prokázání stability podmínek expozice lze použít p řístroj pro sledování 
v reálném čase, například fotometr pro aerosoly nebo analyzátor celkových 
uhlovodík ů pro páry. Skute čné koncentrace v komo ře by se m ěly měřit 
alespoň třikrát během každého dne expozice a pro každou úrove ň expozice. 
Není-li to v d ůsledku omezené rychlosti proud ění vzduchu nebo nízké 
koncentrace možné, je p řípustné použít jeden vzorek pro každé období 
expozice. V ideálním p řípadě by se m ěl tento vzorek odebírat po celou 
dobu expozice. Jednotlivé vzorky k stanovení koncentrace v komo ře by 
se neměly lišit od pr ůměrné hodnoty koncentrace v komo ře o více než 
± 10 % u plyn ů a par a o více než ± 20 % u kapalných nebo pevných 
aerosolů. Měla by se vypo čítat a zaznamenat doba pot řebná k dosažení 
rovnovážného stavu v komo ře (t  95 ). Doba expozice zahrnuje i dobu, 
během níž je zkoušená chemická látka generována. Bere se p ři tom 
v úvahu doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v komo ře (t  95 ) 
a doba rozpadu. Pokyny k výpo čtu t  95 naleznete v dokumentu GD 39 (2).  
28. U vysoce komplexních sm ěsí složených z plyn ů/par a aerosol ů (např. atmo­
sféry obsahující produkty spalování a zkoušené chemické látky vyst řikované 
z účelových výrobk ů/zařízení pro koncové použití) se m ůže každá fáze 
chovat v inhala ční komoře jinak. Proto by se pro každou fázi (plyn/pára 
a aerosol) m ěla zvolit alespo ň jedna indika ční látka (analyt), obvykle hlavní 
účinná složka ve sm ěsi. Je-li zkoušená chemická látka sm ěsí, měla by se 
uvést analytická koncentrace celkové sm ěsi, a nikoliv pouze ú činné látky 
nebo indika ční látky (analytu). Další informace týkající se skute čných 
koncentrací naleznete v dokumentu GD 39 (2).  
Zkoušená chemická látka: Distribuce velikosti částic  
29. Distribuce velikosti částic aerosol ů by se měla stanovit alespo ň jednou týdn ě 
pro každou úrove ň koncentrace pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného 
přístroje, nap ř. aerodynamického spektrometru částic (APS). Je-li možné 
prokázat shodu výsledk ů získaných pomocí kaskádového impaktoru 
a jiného p řístroje, m ůže se tento jiný p řístroj používat v pr ůběhu celé studie.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Krom ě primárního p řístroje by se m ěl použít ješt ě druhý p řístroj, nap ř. 
gravimetrický filtr nebo impinger / plynová promýva čka, k ověření účinnosti 
záchytu primárním p řístrojem. Hmotnostní koncentrace získaná analýzou 
velikosti částic by m ěla ležet v p řiměřeném rozmezí hmotnostní koncentrace 
získané vážkovou analýzou [viz dokument GD 39 (2)]. Je-li možné v časné 
fázi studie prokázat u veškerých zkoušených koncentrací jejich rovnocen ­
nost, lze od dalších potvrzujících m ěření upustit. Z d ůvodu zajišt ění dobrých 
životních podmínek zví řat by se m ěly podniknout kroky k minimalizaci 
neprůkazných údaj ů, které mohou vést k nutnosti opakovat studii.  
31. U par by se m ělo provést m ěření velikosti částic, pokud existuje možnost, že 
kondenzace páry povede ke vzniku aerosolu nebo pokud jsou v parách detekovány částice s potenciálem pro tvorbu smíšených fází.
 
POZOROVÁNÍ  
32. Zvířata by se m ěla klinicky sledovat p řed expozicí, b ěhem expozice i po 
expozici. Mohou být nutná častější pozorování v závislosti na reakci zví řat 
během expozice. Je-li pozorování zví řat znemožn ěno použitím zkumavek 
omezujících pohyb zví řat, špatným osv ětlením v komorách pro celot ělovou 
expozici nebo nepr ůhlednou atmosférou, m ěla by se zví řata pečlivě pozo­
rovat po expozici. Pozorováním p řed expozicí následující den je možné 
zhodnotit p řípadnou reverzibilitu nebo exacerbaci toxických ú činků. 
33. Všechna sledování se zaznamenávají, p řičemž záznamy se vedou pro každé 
zvíře zvlášť. Pokud jsou zví řata z humánních d ůvodů utracena nebo je 
zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejp řesněji. 
34. Pozorování v kleci by m ěla zaznamenat zm ěny kůže, srsti, o čí, sliznic, 
a rovněž změny dýchání, krevního ob ěhu, změny funkce nervové soustavy, 
somatomotorické aktivity a chování. Je t řeba pozorn ě sledovat, zde se neob ­
jeví tremor, k řeče, slinění, průjmy, letargie, spánek a kóma. M ěření rektální 
teploty m ůže poskytnout podp ůrné důkazy pro reflexní bradypnoe nebo 
hypo/hypertermii spojenou s expozicí nebo držením v kleci. Do protokolu studie je možné zahrnout dopl ňující vyšet ření, například kinetiku, biomoni ­
toring, plicní funkce, zadržování špatn ě rozpustných materiál ů, které se 
hromadí v plicní tkáni a zm ěny v chování.
 
TĚLESNÉ HMOTNOSTI  
35. Tělesná hmotnost jednotlivých zví řat by se m ěla zaznamenat krátce p řed 
první expozicí (den 0), poté dvakrát týdn ě (například každý pátek a pond ělí, 
aby se prokázalo zotavení po víkendu bez expozice, nebo v takovém 
časovém intervalu, který umož ňuje posouzení systémové toxicity) a v čase 
uhynutí nebo utracení. Pokud se b ěhem prvních 4 týdn ů neobjeví žádné 
účinky na t ělesnou hmotnost, lze ji po zbytek studie m ěřit pouze jednou 
týdně. Zvířata v satelitní skupin ě (sledování reverzibility) (jsou-li použita) 
by se měla nadále vážit jednou týdn ě po celé období zotavování. Na konci 
studie by se m ěla všechna zví řata krátce p řed utracením zvážit, aby bylo 
možné provést nezkreslený výpo čet podílů hmotnosti orgán ů vůči tělesné 
hmotnosti.  
SPOTŘEBA KRMIVA A VODY  
36. Spot řeba krmiva by se m ěla měřit jednou týdn ě. Rovněž by se m ěla měřit 
spotřeba vody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLINICKÁ PATOLOGIE  
37. Klinická patologická vyšet ření by se m ěla provést u všech zví řat, včetně 
zvířat v kontrolní a satelitní (sledování reverzibility) skupin ě, když jsou 
utracena. M ěl by se zaznamenat časový interval mezi koncem expozice 
a odběrem krve, zejména pokud je obnova p říslušného cílového parametru 
rychlá. Odb ěr vzorků po ukon čení expozice je indikován pro parametry 
s krátkým elimina čním poločasem v plazm ě (např. COHb, CHE a MetHb).  
38. Tabulka 1 uvádí klinické patologické parametry, které jsou obvykle vyžado ­
vány ve všech toxikologických studiích. Analýza mo či se běžně nevyžaduje, 
může se však provést, pokud se to považuje za vhodné na základ ě očeká­
vané nebo pozorované toxicity. Vedoucí studie se m ůže rozhodnout vyšet řit 
další parametry k lepší charakterizaci toxicity zkoušené chemické látky (např. cholinesteráza, lipidy, hormony, acidobazická rovnováha, methemo ­
globin nebo Heinzova t ělíska, kreatinkináza, pom ěr myeloidní/erythroidní 
buňky, troponiny, vyšet ření krevních plyn ů, laktátdehydrogenáza, sorbitol ­
dehydrogenáza, glutamátdehydrogenáza a gamaglutamyltranspeptidáza).
 
Tabulka 1  
Standardní klinické patologické parametry  
Hematologická vyšet ření 
Počet erytrocyt ů 
Hematokrit Koncentrace hemoglobinu 
Průměrné množství hemoglobinu 
v erytrocytu (MHC) 
Střední objem erytrocytu (MCV) 
Průměrná koncentrace hemoglobinu 
v erytrocytu 
Retikulocyty Celkový po čet leukocyt ů 
Diferenciální rozpo čet leukocyt ů 
Počet trombocyt ů 
Srážlivost (vyber jednu 
z možností): 
— protrombinový čas 
— koagula ční čas 
— parciální tromboplastinový 
čas
 
Klinická biochemická vyšet ření 
Glukóza (*) 
Celkový cholesterol Triglyceridy 
Dusík mo čoviny v krvi 
Celkový bilirubin Kreatinin Celkový obsah protein ů 
Albuminy 
Globuliny Alaninaminotransferáza 
Aspartátaminotransferáza Alkalická fosfatáza 
Draslík 
Sodík Vápník Fosfor 
Chloridy
 
Rozbor mo či (volitelný)  
Vzhled (barva a zákal) 
Objem 
Relativní hustota nebo osmolalita pH Celkový obsah protein ů 
Glukóza 
Krev/krvinky
 
(*) Protože dlouhé období la čnění může zkreslit výsledky m ěření glukózy 
u exponovaných zví řat oproti zví řatům kontrolním, m ěl by vedoucí studie ur čit, 
zda je vhodné, aby zví řata lačnila. Používá-li se období la čnění, mělo by být 
vhodné pro daný použitý druh. U potkana to m ůže být 16 h (la čnění přes noc). 
Stanovení glukózy nala čno lze provést po la čnění přes noc b ěhem posledního 
týdne expozice nebo po la čnění přes noc před pitvou (v tomto p řípadě se provede 
společně se všemi ostatními klinickými patologickými parametry).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Existují-li d ůkazy o tom, že hlavním místem depozice a retence jsou dolní 
cesty dýchací (tj. alveoly), jako technika pro kvantitativní analýzu hypote ­
tických parametr ů závislosti ú činku na dávce zam ěřená na alveolitidu, plicní 
zánět a fosfolipidózu, m ůže být zvolena bronchoalveolární laváž (BAL). 
Umožňuje to vhodn ě vyšetřit změny ve vztahu dávka–odezva 
a čas–průběh při poškození plicních sklípk ů. V tekutin ě z BAL lze stanovit 
diferenciální rozpo čet leukocyt ů, celkový obsah protein ů 
a laktátdehydrogenázu. Další parametry, které je možno zvážit, jsou ty, které svědčí o lysozomálním poškození, fosfolipidóze, fibróze, zán ětu 
z podrážd ění nebo alergickém zán ětu, což m ůže zahrnovat stanovení 
prozánětlivých cytokin ů/chemokin ů. Měření v tekutin ě BAL obecn ě 
doplňují výsledky histopatologických vyšet ření, avšak nemohou je nahradit. 
Pokyny, jak provád ět laváž plic je možné nalézt v dokumentu GD 39 (2).
 
OFTALMOLOGICKÉ VYŠET ŘENÍ 
40. Pomocí oftalmoskopu nebo obdobného p řístroje by se m ělo provést oftal ­
mologické vyšet ření fundu, lomivých prost ředí oka, duhovky a spojivek 
u všech zví řat před podáním zkoušené chemické látky a u všech skupin 
s vysokou koncentrací látky a u kontrolních skupin také p ři ukončení studie. 
Zjistí-li se na o čích změny, měla by se vyšet řit také všechna zví řata 
v ostatních skupinách, v četně satelitní skupiny (sledování reverzibility).  
PITVA A HMOTNOSTI ORGÁN Ů 
41. Všechna pokusná zví řata, včetně těch, která v pr ůběhu zkoušky uhynula 
nebo byla utracena z d ůvodu ohleduplného zacházení se zví řaty, by se 
měla podrobit úplnému vykrvení (je-li proveditelné) a pitv ě. Měl by se 
zaznamenat doba mezi koncem poslední expozice zví řete a jeho utracením. 
Není-li možné pitvu provést ihned po objevení uhynulého zví řete, mělo by 
se zvíře uchovávat v chladicím boxu (nikoli zmrazené) p ři teplotě dostatečně 
nízké k minimalizaci autolýzy. Pitva by se m ěla provést co možná nejd říve, 
obvykle b ěhem jednoho nebo dvou dn ů. U každého zví řete by se m ěly 
zaznamenat všechny makroskopické patologické nálezy, p řičemž se v ěnuje 
zvláštní pozornost jakýmkoli nález ům v dýchacích cestách.  
42. Tabulka 2 uvádí orgány a tkán ě, které by se m ěly během pitvy konzervovat 
ve vhodném médiu pro histopatologické vyšet ření. Uchovávání orgán ů 
a tkání uvedených  [v závorkách ] a jakýchkoli dalších orgán ů a tkání závisí 
na rozhodnutí vedoucího studie. Orgány uvedené  tučným  písmem by se 
měly co nejd říve po vyjmutí z t ěla zbavit p řirostlých tkání a zvážit, d říve 
než vyschnou. Štítná žláza a nadvarlata by se m ěly vážit pouze v p řípadě 
potřeby, nebo ť artefakty z o řezávání p řirostlých tkání mohou bránit histo ­
patologickému vyšet ření. Tkán ě a orgány by se m ěly fixovat v 10 % pufro ­
vaném formalínu nebo jiném vhodném fixativu ihned po provedení pitvy, 
a ne pozd ěji než 24–48 hodin p řed ořezáváním p řirostlých tkání v závislosti 
na použitém fixativu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 431
 
Tabulka 2  
Orgány a tkán ě, které se b ěhem pitvy konzervují  
Nadledvinky  
Aorta  
Kostní dřeň (a/nebo čerstvý aspirát)  
Mozek  (zahrnující řezy mozkových hemisfér, 
mozečku a prodloužené míchy/mostu)  
Slepé střevo 
Tlusté střevo 
Dvanáctník  
[Nadvarlata ] 
[Oči (sítnice, o ční nerv) a o ční víčka] 
Femur  a kolenní kloub  
Žlučník (je-li p řítomen)  
[Harderova žláza]  
Srdce  
Ileum  
Jejunum  
Ledviny  
[Slzné žlázy (extraorbitální)]  
Hrtan (3 úrovn ě včetně báze  epiglottis ) 
Játra  
Plíce  (všechny laloky v jedné úrovni v četně 
hlavních bronch ů) 
Lymfatické uzliny z oblasti plicního hilu, 
zejména v p řípadě špatně rozpustných parti ­
kulárních zkoušených chemických látek. Pro 
podrobnější vyšet ření a/nebo studie 
s imunologickým zam ěřením lze uvažovat 
i o dalších lymfatických uzlinách, nap ř. 
z oblasti mediastina, oblasti cervikální, 
submandibulární a aurikulární.  
Lymfatické uzliny (distáln ě od místa vstupu)  
Prsní žlázy (sami čí) 
Sval (stehenní)  
Nosohltanové tkán ě (alespoň 4 úrovn ě, 1 
úroveň by m ěla zahrnovat  ductus 
naso-pharyngeus  a lymfatickou tká ň nosní 
sliznice (NALT))  Jícen  
[Bulbus olfactorius ] 
Vaječníky  
Slinivka b řišní 
Příštítná tělíska  
Periferní nerv ( nervus ischiadicus  nebo  
nervus tibialis , nejlépe blízko svalu)  
Hypofýza  
Prostata  
Rectum  
Slinné žlázy  
Semenné vá čky 
Kůže 
Mícha (kr ční, střední hrudní a bederní)  
Slezina  
Sternum  
Žaludek  
Zuby  
Varlata  
Brzlík  
Štítná žláza  
[Jazyk]  
Průdušnice (alespo ň 2 úrovn ě zahrnující 1 
podélný řez skrz  carinu tracheae  a 1 příčný 
řez) 
[Močovod]  
[Močová trubice]  
Močový měchýř 
Děloha 
Cílové orgány  
Veškeré makroskopicky viditelné léze 
a masy  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Plíce je t řeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným médiem p ři 
tlaku 20–30 cm vody, aby se zachovala struktura plic (5). U všech lalok ů by 
se měly odebrat řezy na jedné úrovni, v četně hlavních bronch ů, avšak 
provádí-li se plicní laváž, m ěly by se u nevyplachovaného laloku provést 
řezy na třech úrovních (nikoli sériové řezy).  
44. Měly by se vyšet řit alespoň 4 úrovn ě tkání nosohltanu, z nichž jedna by 
měla zahrnovat  ductus nasopharyngeus  (5), (6), (7), (8), (9), aby bylo 
možné dostate čně vyšetřit epitel dlaždicový, p řechodný (respira ční bez řasi­
nek), respira ční (řasinkový respira ční) a čichový a svodnou lymfatickou 
tkáň (NALT) (10), (11). M ěly by se vyšet řit tři úrovně hrtanu a jedna 
z těchto úrovní by m ěla zahrnovat bázi epiglottis (12). M ěly by se vyšet řit 
alespoň dvě úrovně průdušnice zahrnující jeden podélný řez skrz  carinu 
tracheae  v místě bifurkace a jeden p říčný řez. 
HISTOPATOLOGICKÉ VYŠET ŘENÍ 
45. Mělo by se provést histopatologické vyšet ření všech orgán ů a tkání uvede ­
ných v tabulce 2 u kontrolní skupiny a skupiny vystavené vysoké koncen ­
traci látky a u všech zví řat, která uhynou nebo jsou utracena b ěhem studie. 
Zvláštní pozornost je t řeba věnovat dýchacím cestám, cílovým orgán ům 
a makroskopicky viditelným lézím. Orgány a tkán ě, na nichž se objevily 
léze u skupiny zví řat vystavené vysoké koncentraci látky, by se m ěly 
vyšetřit ve všech skupinách. Vedoucí studie se m ůže rozhodnout provést 
histopatologická vyšet ření v dalších skupinách, aby se prokázala jasná 
odezva na koncentraci. V p řípadě použití satelitní skupiny (sledování rever ­
zibility) by se m ělo provést histopatologické vyšet ření všech tkání a orgán ů, 
na kterých byly pozorovány ú činky u exponovaných skupin. Pokud ve 
skupině s expozicí vysoké koncentraci látky p říliš brzy uhyne velký po čet 
zvířat nebo vzniknou jiné problémy, které by mohly zpochybnit významnost 
údajů, měla by se histopatologicky vyšet řit nejbližší nižší koncentrace. M ěl 
by se u činit pokus porovnat makroskopicky viditelné zm ěny 
s mikroskopickými nálezy.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Údaje  
46. U každého zví řete by se m ěly uvést údaje o t ělesné hmotnosti, spot řebě 
krmiva, klinické patologické údaje, údaje z pitvy, hmotnosti orgán ů 
a histopatologické nálezy. Údaje z klinického sledování by se m ěly shrnout 
do tabulky, p řičemž se u každé zkušební skupiny uvede po čet použitých 
zvířat, počet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, po čet zvířat uhynulých 
v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních d ůvodů, doba uhynutí 
jednotlivých zví řat, popis, časový pr ůběh a vratnost toxických ú činků 
a pitevní nálezy. Všechny výsledky, kvantitativní a incidentální, by se 
měly vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Lze použít všeobecn ě uzná­
vanou statistickou metodu. Statistické metody by se m ěly zvolit b ěhem 
vypracovávání návrhu studie.  
Protokol o zkoušce  
47. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat následující informace:  
Pokusná zví řata a podmínky chovu  
— popis podmínek v klecích uvád ějící: počet (nebo zm ěnu počtu) zvířat 
v každé kleci, materiál podestýlky, teplotu a relativní vlhkost prost ředí, 
délku světelné fáze a druh stravy,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— použitý druh/kmen a od ůvodnění, pokud se použije jiný druh než 
potkan. Je možné uvést údaje ze zdroje a historické údaje, pokud se 
týkají zví řat, která byla exponována za podobných podmínek expozice, 
chovu a la čnění, 
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— metoda randomizace,  
— popis jakékoliv p řípravy před zkouškou v četně stravy, karantény a lé čby 
onemocnění. 
Zkoušená chemická látka  
— fyzikální povaha, čistota a v p řípadě potřeby fyzikáln ě-chemické vlast ­
nosti (včetně izomerizace),  
— identifika ční údaje a registra ční číslo CAS (Chemical Abstract Services), 
je-li známo.  
Nosič 
— zdůvodnění použití nosi če a zdůvodnění výběru nosiče (pokud je jiný 
než voda),  
— historické nebo sou časné údaje prokazující, že nosi č neovliv ňuje 
výsledek studie.  
Inhalační komora  
— popis inhala ční komory, v četně objemu a nákresu,  
— zdroj a popis za řízení použitého pro expozici zví řat a rovn ěž pro gene ­
rování atmosféry,  
— zařízení k m ěření teploty, vlhkosti, velikosti částic a skute čné koncent ­
race,  
— zdroj vzduchu a použitý klimatiza ční systém,  
— metody použité ke kalibraci za řízení k zajišt ění homogenní zkušební 
atmosféry,  
— rozdíl tlak ů (kladný nebo záporný),  
— počet expozi čních otvor ů v každé komo ře (v případě nazální expozice), 
umístění zvířat v komo ře (v případě celotělová expozice),  
— stabilita zkušební atmosféry,  
— umístění čidel ke snímání teploty a vlhkosti a odb ěr vzorků zkušební 
atmosféry v komo ře, 
— úprava dodávaného/odsávaného vzduchu,  
— průtokové rychlosti vzduchu, pr ůtoková rychlost vzduchu na jeden expo ­
ziční otvor (v p řípadě nazální expozice) nebo množství zví řat na jednu 
komoru (v p řípadě celotělové expozice),  
— doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v inhala ční komoře (t  95 ), 
— počet výměn objemu vzduchu za hodinu,  
— měřicí přístroje (používají-li se).  
Údaje o expozici  
— zdůvodnění volby cílové koncentrace v hlavní studii,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— nominální koncentrace (celková hmotnost zkoušené chemické látky 
generované do inhala ční komory vyd ělená objemem vzduchu prošlým 
komorou),  
— skutečné koncentrace zkoušené chemické látky nam ěřené v dýchací zón ě 
zvířat. U směsí, které vytvá řejí heterogenní fyzikální formy (plyny, páry, 
aerosoly), je možné analyzovat každou zvláš ť, 
— veškeré koncentrace látky ve vzduchu by se m ěly uvádět raději 
v hmotnostních jednotkách (mg/l, mg/m  3 , atd.), než v objemových 
jednotkách (ppm, ppb atd.),  
— distribuce velikosti částic, hmotnostní medián aerodynamického 
průměru (MMAD) a geometrická sm ěrodatná odchylka ( σ g ), včetně 
metod jejich výpo čtu. Měly by se uvést jednotlivé analýzy velikosti 
částic.  
Zkušební podmínky  
— podrobné údaje o p řípravě zkoušené chemické látky v četně postupů 
použitých k snížení velikosti částic pevných látek nebo k p řípravě 
roztoků zkoušené chemické látky,  
— popis (pokud možno s nákresem) za řízení použitého ke generování 
zkušební atmosféry k expozici zví řat zkušební atmosfé ře, 
— podrobné údaje o za řízení použitém k monitorování teploty a vlhkosti 
v komoře a proud ění vzduchu komorou (tj. vývoj kalibra ční křivky),  
— podrobné údaje o za řízení použitém k odb ěru vzork ů k stanovení 
koncentrace látky v komo ře a distribuce velikosti částic,  
— podrobné údaje o použité chemické analytické metod ě a validaci metody 
(včetně účinnosti výt ěžnosti zkoušené chemické látky ze vzorkovaného 
média),  
— metoda randomizace použitá k rozd ělení zvířat do zkoušených 
a kontrolních skupin,  
— podrobnosti o jakosti vody a krmiva (v četně druhu/zdroje stravy, zdroje 
vody),  
— zdůvodnění výběru zkoušených koncentrací.  
Výsledky  
— tabulka s údaji o teplot ě, vlhkosti a pr ůtoku vzduchu v komo ře, 
— tabulka s údaji o nominální a skute čné koncentraci v komo ře, 
— tabulka s údaji o velikosti částic včetně údajů o odběru analytických 
vzorků, distribuce velikosti částic a výpo čtů MMAD a σ g , 
— tabulka s údaji o odezv ě a úrovni koncentrace u každého zví řete (tj. 
zvířata vykazující p říznaky toxicity v četně mortality, charakter, závaž ­
nost, doba nástupu a trvání ú činků), ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— tabulka s údaji o t ělesné hmotnosti jednotlivých zví řat, 
— tabulka s údaji o spot řebě krmiva,  
— tabulka s klinickými patologickými údaji,  
— pitevní a histopatologické nálezy pro každé zví ře, pokud jsou 
k dispozici.  
Diskuse a interpretace výsledk ů 
— zvláštní d ůraz by se m ěl klást na popis metod použitých ke spln ění 
kritérií této zkušební metody, nap ř. mezní koncentrace nebo velikost 
částic,  
— je třeba zabývat se vdechovatelností částic s ohledem na celkové nálezy, 
zejména pokud nebylo možné splnit kritéria pro velikost částic,  
— v celkovém hodnocení studie by se m ěla uvést konzistentnost metod 
použitých ke stanovení nominálních a skute čných koncentrací a vztah 
mezi aktuální a skute čnou koncentrací,  
— měla by se uvést pravd ěpodobná p říčina úhynu a p řevládající mecha ­
nismus účinku (systémový nebo lokální),  
— mělo by se uvést vysv ětlení, pokud bylo nutno humánn ě utratit zví řata 
trpící bolestí nebo vykazující známky intenzivního a p řetrvávajícího 
utrpení, na základ ě kritérií uvedených v pokynech OECD 
o humánních parametrech (3),  
— měl(y) by se ur čit cílový (cílové) orgán(y),  
— měla by se stanovit hodnota NOAEL a LOAEL.  
LITERATURA:  
1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Guide ­
line No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency.  
5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material,  Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyn ­
geal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
13) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 
16. prosince 2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek a sm ěsí, 
o změně a zrušení sm ěrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zm ěně 
nařízení (ES) č. 1907/2006, Ú ř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Zkoušená chemická látka:  jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30  STUDIE CHRONICKÉ TOXICITY  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) 452 
(2009). P ůvodní Pokyny pro zkoušení 452 byly schváleny v roce 1981. 
Revize zkušební metody B.30 byla považována za nezbytnou 
k zohledn ění nejnov ějšího vývoje v oblasti zajišt ění dobrých životních 
podmínek zví řat a regula čních požadavk ů (1) (2) (3) (4). Aktualizace této 
zkušební metody B.30 se provád ěla paraleln ě s revizemi kapitoly B.32 této 
přílohy, Studie karcinogenity, a kapitoly B.33 této p řílohy, Kombinovaná 
studie chronické toxicity/karcinogenity, aby se získaly další informace o zvířatech použitých ve studii a poskytnout další podrobnosti o výb ěru 
dávky. Tato zkušební metoda je ur čena ke zkouškám široké škály chemic ­
kých látek, v četně pesticidů a průmyslových chemikálií.
 
2. Většina studií chronické toxicity se provádí na hlodavcích, a tato zkušební 
metoda je proto primárn ě určena k použití pro studie provád ěné na nich. 
Je-li potřeba provést studie na nehlodavcích, lze rovn ěž použít principy 
a postupy uvedené v této zkušební metod ě spolu s t ěmi, které jsou uvedeny 
v kapitole B.27 této p řílohy, Studie orální toxicity na nehlodavcích – 
90denní opakovaná aplikace (5), p říslušně pozměněné, jak je uvedeno 
v pokynech OECD, Pokyny č. 116 o p řípravě a provád ění studií chronické 
toxicity a karcinogenity (6).  
3. Třemi hlavními zp ůsoby podávání používanými ve studiích chronické toxi ­
city jsou orální podávání, dermální aplikace a inhala ční podávání. Výb ěr 
cesty podání závisí na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené chemické látky a na p řevládající cest ě expozice u lidí. Další informace 
o výběru cesty expozice jsou uvedeny v pokynech OECD č. 116 (6).
 
4. Tato zkušební metoda se zam ěřuje na expozici orální cestou, což je cesta, 
která se ve studiích chronické toxicity používá nejb ěžněji. Přestože dlouho ­
dobé studie chronické toxicity zahrnující expozici dermální nebo inhala ční 
cestou mohou být k posouzení rizik pro lidské zdraví rovn ěž nezbytné 
a/nebo mohou být vyžadovány v rámci ur čitých regula čních režim ů, jsou 
studie používající tyto cesty expozice zna čně technicky složité. Zde uvedená 
zkušební metoda posouzení a vyhodnocení chronické toxicity p ři orálním 
podávání m ůže sloužit jako základ protokolu pro inhala ční a/nebo dermální 
studie pokud jde o doporu čení pro období expozice, klinické a patologické 
parametry atd., studie je však t řeba navrhovat individuáln ě případ od 
případu. K dispozici jsou pokyny OECD týkající se podávání zkoušených 
chemických látek inhala ční (6), (7) a dermální cestou (6). P ři navrhování 
dlouhodobých studií zahrnujících expozici inhala ční cestou by se m ěla 
konkrétně použít kapitola B.8 této p řílohy (8) a kapitoly B.29 této p řílohy 
(9) a rovn ěž pokyny OECD ke zkouškám akutní inhala ční toxicity (7). 
V případě, že se zkoušky provádí dermální cestou, je t řeba použít kapitolu 
B.9 této p řílohy (10).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Studie chronické toxicity poskytuje informace o možných rizicích pro 
zdraví, která m ůže opakovaná expozice po zna čnou část života použitých 
druhů představovat. Studie rovn ěž poskytne informace o toxických ú čincích 
zkoušené chemické látky, ur čí cílové orgány a možnost akumulace. M ůže 
také poskytnout odhad hodnoty dávky bez pozorovaných nep říznivých 
účinků, což lze použít p ři stanovení kritérií pro bezpe čnou expozici člověka. 
Důraz se klade také na pe člivé klinické pozorování zví řat s cílem získat co 
nejvíce informací.  
6. Cíle studií zahrnutých v této zkušební metod ě jsou:  
— identifikace chronické toxicity zkoušené chemické látky,  
— identifikace cílových orgán ů, 
— charakterizace vztahu mezi dávkou a odezvou,  
— určení hodnoty dávky bez pozorovaného nep říznivého ú činku (NOAEL) 
nebo výchozího bodu pro stanovení referen ční dávky (BMD),  
— předpověď chronických toxických ú činků na úrovních expozice člověka, 
— získání údaj ů ke zkoušení hypotéz ohledn ě způsobu účinku (6).  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
7. Zkušební laborato ř by měla před provedením studie vzít v úvahu p ři posu­
zování a hodnocení toxikologických vlastností zkoušené chemické látky 
veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby zam ěřila uspo­ 
řádání studie sm ěrem k účinnějšímu zkoušení potenciálu chronické toxicity 
a minimalizovala použití zví řat. Mezi informace, které usnadní vytvá ření 
plánu studie, pat ří identita zkoušené chemické látky, její chemická struktura 
a fyzikáln ě-chemické vlastnosti, všechny informace o zp ůsobu účinku, 
výsledky jakýchkoli test ů toxicity  in vitro  nebo  in vivo , předpokládaná 
použití a potenciální expozici u člověka, dostupné údaje (Q)SAR 
a toxikologické údaje o strukturn ě příbuzných chemických látkách, dostupné 
toxikokinetické údaje (kinetika p ři jednorázové dávce a rovn ěž při opako­
vaných dávkách, je-li k dispozici) a údaje získané v jiných studiích toxicity po opakované expozici. Stanovení chronické toxicity by se m ělo provád ět 
pouze poté, co byly získány úvodní informace o toxicit ě z 28denních a/nebo 
90denních zkoušek toxicity po opakované dávce. Jako sou část celkového 
zhodnocení potenciálních nep říznivých ú činků konkrétní zkoušené chemické 
látky na zdraví by se m ěl zvážit postup zkoušení provád ěný po fázích p ři 
zkouškách chronické toxicity (11), (12), (13), (14).
 
8. Nejvhodn ější statistické metody pro analýzu výsledk ů s ohledem na uspo ­ 
řádání a cíle experimentu by se m ěly stanovit p řed zahájením studie. Je 
třeba zvážit, zda by m ěla statistika zahrnovat korekci vztahující se 
k přežití zvířat a analýzu v p řípadě předčasného ukon čení zkoušky 
u jedné nebo více skupin. Pokyny ohledn ě vhodných statistických analýz 
a klíčové odkazy na mezinárodn ě uznávané statistické metody jsou uvedeny 
v Pokynech č. 116 (6) a rovn ěž v Pokynech č. 35 o analýze a hodnocení 
studií chronické toxicity a karcinogenity (15).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Při provádění studie chronické toxicity je nutné řídit se vždy v ůdčími prin­
cipy a úvahami uvedenými v Pokynech OECD č. 19 o rozpoznání, vyšet ření 
a použití klinických p říznaků jako lidských cílových parametr ů u pokusných 
zvířat používaných p ři hodnocení bezpe čnosti (16), zejména v odstavci 62 
těchto pokyn ů. Tento odstavec uvádí, že „ Ve studiích zahrnujících opako ­
vané podávání dávky by se m ělo v případě, kdy zví ře vykazuje klinické 
příznaky, které jsou progresivní a vedou k dalšímu zhoršení jeho stavu, 
učinit informované rozhodnutí, zda zví ře humánn ě utratit, či ne. Toto 
rozhodnutí by m ělo obsahovat posouzení hodnoty informací, které se získají, 
bude-li se zví ře i nadále udržovat ve studii, oproti jeho celkovému stavu. 
Dospěje-li se k rozhodnutí pokra čovat ve zkoušce na zví řeti, měla by se dle 
potřeby zvýšit četnost pozorování. Rovn ěž je možné, aniž by to nep říznivě 
ovlivnilo ú čel zkoušky, do časně pozastavit podávání dávky, jestliže to zmírní 
bolest či utrpení, nebo snížit zkoušenou dávku. “ 
10. Podrobné pokyny a diskuse o principech výb ěru dávky pro studie chronické 
toxicity a karcinogenity uvádí Pokyny č. 116 (6) a rovn ěž dvě publikace 
ústavu International Life Sciences Institute (17), (18). Hlavní strategie 
výběru dávky závisí na primárním cíli nebo cílech studie (odstavec 6). P ři 
výběru vhodných úrovní dávky by se m ělo dosáhnout rovnováhy mezi 
screeningem nebezpe čnosti na jedné stran ě a charakterizací odezev na 
nízkou dávku a jejich významu na stran ě druhé. To je d ůležité zejména 
v situaci, kdy je nutno provést kombinovanou studii chronické toxicity 
a karcinogenity (kapitola B.33 této p řílohy) (odstavec 11).  
11. Mělo by se uvážit, zda neprovést rad ěji kombinovanou studii chronické 
toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této p řílohy) nežli jen dv ě samostatné 
studie – chronické toxicity (tato zkušební metoda B.30) a karcinogenity (kapitola B.32 této p řílohy). Kombinovaná zkouška zajiš ťuje větší efektivitu 
ve smyslu času a náklad ů v porovnání s provád ěním dvou samostatných 
studií, a zárove ň nezhoršuje kvalitu údaj ů ani ve fázi zkoušení chronické 
toxicity, ani ve fázi zkoušení karcinogenity. P ři provádění kombinované 
studie chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této p řílohy) však 
je třeba pečlivě zvážit zásady výb ěru dávky (odstavce 9 a 20–25) a rovn ěž 
se uznává, že v ur čitých regula čních rámcích mohou být vyžadovány samo ­
statné studie.
 
12. Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této 
kapitoly a v Pokynech č. 116 (6).  
PODSTATA ZKOUŠKY  
13. Zkoušená chemická látka se podává denn ě v postupn ě rostoucích dávkách 
několika skupinám pokusných zví řat po dobu 12 m ěsíců, avšak je možné 
zvolit i delší nebo kratší dobu expozice v závislosti na regula čních poža ­
davcích (viz odstavec 33). Tato doba trvání by se m ěla zvolit dostate čně 
dlouhá na to, aby umožnila manifestaci jakýchkoli ú činků kumulativní toxi ­
city, bez zkreslujících p říznaků geriatrických zm ěn. Odchylky od doby 
expozice 12 m ěsíců by měly být od ůvodněny, zejména v p řípadě kratších 
expozic. Zkoušená chemická látka se obvykle podává orální cestou, avšak zkoušky provád ěné inhalační nebo dermální cestou mohou být také vhodné. 
Plán studie m ůže rovněž zahrnovat jedno nebo více p ředběžných utracení, 
např. za 3 a 6 m ěsíců, a je možné p řidat další skupiny zví řat, aby se tato 
skutečnost kompenzovala (viz odstavec 19). V pr ůběhu období podávání se 
zvířata každý den pe člivě pozorují, aby se zjistily p říznaky toxicity. Zví řata, 
která v pr ůbě
hu zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci 
zkoušky se p řeživší zví řata utratí a rovn ěž pitvají.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
POPIS METODY  
Výběr zvířecích druh ů 
14. Tato zkušební metoda primárn ě zahrnuje posouzení a vyhodnocení chro ­
nické toxicity u hlodavc ů (viz odstavec 2), avšak uznává se, že v ur čitých 
regulačních rámcích mohou být vyžadovány podobné studie u nehlodavc ů. 
Výběr druhu by m ěl být zdůvodněn. Plán a provedení studií chronické 
toxicity u nehlodavc ů, jsou-li požadovány, by m ěl vycházet z princip ů 
uvedených v této zkušební metod ě spolu s principy v kapitole B.27 této 
přílohy, 90denní studie orální toxicity po opakované aplikaci na nehlodav ­
cích (5). Další informace o výb ěru druhu a kmene jsou uvedeny v Pokynech 
č. 116 (6).  
15. V této zkušební metod ě se dává p řednost potkan ům, ale lze použít i jiný 
druh hlodavc ů, např. myš. Krysy a myši jsou up řednostňovanými experi ­
mentálními modelovými organismy díky své relativn ě krátké dob ě života, 
široce rozší řenému použití ve farmakologických a toxikologických studiích, 
citlivosti k indukci nádoru a dostupnosti dostate čně 
charakterizovaných kmen ů. V důsledku těchto vlastností je k dispozici 
velké množství informací o jejich fyziologii a patologii. M ěla by se použít 
mladá zdravá dosp ělá zvířata běžně používaných laboratorních kmen ů. 
Studie chronické toxicity by se m ěla provád ět na zví řatech ze 
stejného kmene a zdroje, jako byla zví řata použitá v p ředběžných studiích 
toxicity s kratší dobou trvání. Samice musí být nullipary a nesm ějí být březí. 
Podmínky chovu a krmení  
16. Zvířata lze chovat jednotliv ě nebo v klecích po malých skupinkách jedinc ů 
stejného pohlaví. Individuální chov by se m ěl použít pouze tehdy, je-li to 
vědecky od ůvodněné (19), (20), (21). Klece by m ěly být uspo řádány tak, 
aby byl p řípadný vliv jejich polohy minimalizován. Teplota v místnosti pro 
pokusná zví řata by měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by 
měla být minimáln ě 30 % a pokud možno nep řesáhnout 70 % krom ě doby 
úklidu místnosti. Cílem by m ěla být hodnota 50–60 %. Osv ětlení by m ělo 
být umělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Ke krmení 
lze použít konven ční laboratorní krmivo s neomezenou dodávkou pitné 
vody. Strava by m ěla splňovat všechny nutri ční požadavky zkoušených 
druhů a obsah p říměsí ve strav ě zahrnující mimo jiné zbytky pesticid ů, 
perzistentní organopolutanty, fytoestrogeny, t ěžké kovy a mykotoxiny, 
které mohou ovlivnit výsledek zkoušky, by m ěl být co možná nejnižší. 
Pravideln ě by se měly získávat analytické informace o nutri čních hodnotách 
stravy a množství p říměsí ve strav ě, alespoň na začátku studie a pokaždé, 
když se zm ění používaná šarže, a m ěly by se za členit do záv ěrečné zprávy. 
Obdobně by se měla poskytnout analýza pitné vody. Výb ěr stravy m ůže být 
ovlivněn nutností zajistit vhodnou p řísadu zkoušené chemické látky, 
podává-li se látka v krmivu, a splnit nutri ční potřeby zvířat. 
Příprava zví řat 
17. Použijí se zdravá zví řata, která se alespo ň 7 dnů aklimatizovala na labora ­
torní podmínky a která nebyla d říve podrobena žádným experimentálním 
postupům. V případě hlodavců by se mělo podávání látky zahájit co možná 
nejdříve po jejich odstavení a aklimatizaci, nejlépe p řed dosažením stá ří 8 
týdnů. Pokusná zví řata by m ěla být charakterizována podle druhu, kmenu, 
původu, pohlaví, hmotnosti a stá ří. Na začátku studie by m ěly být odchylky 
hmotnosti zví řat u každého pohlaví minimální a nem ěly by překročit ± 20 % 
průměrné hmotnosti pro všechna zví řata ve studii, pro každé pohlaví zvláš ť. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
Zvířata by m ěla být rozd ělena náhodným výb ěrem do kontrolních 
a experimentálních skupin. Po randomizaci by nem ěly být výrazné rozdíly 
v průměrných hodnotách t ělesné hmotnosti mezi skupinami v rámci každého 
pohlaví. Existují-li statisticky významné rozdíly, m ěla by se randomizace 
pokud možno zopakovat. Každému zví řeti by se m ělo přidělit jedine čné 
identifika ční číslo a mělo by se tímto číslem trvale ozna čit pomocí tetování, 
implantací mikro čipu nebo jinou vhodnou metodou.  
POSTUP  
Počet a pohlaví zví řat 
18. Měla by se použít ob ě pohlaví. M ělo by se použít dostate čné množství 
zvířat, aby bylo na konci studie v každé skupin ě dost zvířat pro podrobné 
biologické a statistické vyhodnocení. U hlodavc ů by se mělo obvykle použít 
alespoň 20 zvířat od každého pohlaví pro každou skupinu p ři každé úrovni 
dávky, oproti tomu u nehlodavc ů se doporu čuje použít minimáln ě 4 jedince 
od každého pohlaví pro každou skupinu. Ve studiích používajících myši 
může být nutné p řidat další zví řata do každé skupiny s p říslušnou dávkou, 
aby se mohla provést všechna požadovaná hematologická vyšet ření. 
Zajištění předběžných utracení, satelitních skupin a ov ěřovacích zví řat 
19. Studie m ůže zajistit zví řata pro p ředběžná utracení (alespo ň 10 zvířat/po­
hlaví/skupinu) nap ř. v 6. měsíci, aby se získaly informace o progresi toxi ­
kologických zm ěn a mechanistické informace, je-li to v ědecky od ůvodněné. 
Jsou-li tyto informace již k dispozici z p ředchozích studií toxicity zkoušené 
chemické látky po opakovaných dávkách, nemusí být p ředběžná utracení 
vědecky od ůvodněná. Rovn ěž je možné za řadit do studie satelitní skupiny 
k monitorování reverzibility toxikologických zm ěn vyvolaných zkoumanou 
chemickou látkou; ty budou obvykle omezeny na nejvyšší úrove ň dávky ve 
studii plus kontrolu. Také je možné za řadit do studie další skupinu ov ěřo­
vacích zví řat (obvykle 5 zví řat od každého pohlaví) k monitorování stavu 
onemocnění v průběhu studie, je-li to nutné (22). Pokud se plánují p řed­
běžná utracení zví řat nebo za členění satelitní nebo ov ěřovací skupiny, je 
nutno zvýšit po čet zvířat zařazených do studie o po čet zvířat, která budou 
utracena p řed ukončením studie. U t ěchto zvířat by se m ěly obvykle 
sledovat stejné parametry, zahrnující t ělesnou hmotnost, spot řebu krmiva/ 
vody, hematologická a klinická biochemická m ěření a patologická vyšet ření, 
jako u zví řat ve fázi chronické toxicity v hlavní studii, avšak m ěření se také 
mohou omezit (ve skupinách ur čených k p ředběžnému utracení) na 
konkrétní klí čové parametry, jako je neurotoxicita a imunotoxicita.  
Dávkové skupiny a dávkování  
20. Pokyny ohledn ě veškerých aspekt ů výběru dávky a odstup ňování úrovní 
dávek jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (6). S výjimkou p řípadů, kdy se 
provede limitní zkouška (viz odstavec 27), by se m ěly použít nejmén ě tři 
úrovně dávek a soub ěžná kontrola. Úrovn ě dávek budou obecn ě vycházet 
z výsledk ů krátkodobých studií p ři opakované aplikaci nebo ze studií 
k stanovení rozsahu dávkování a m ěly by zohlednit jakékoli existující toxi ­
kologické a toxikokinetické údaje dostupné pro zkoušenou slou čeninu nebo 
příbuzné materiály.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Nebrání-li tomu fyzikáln ě-chemická povaha nebo biologické ú činky zkou ­ 
šené chemické látky, m ěla by se obvykle zvolit nejvyšší úrove ň dávky za 
účelem identifikace hlavních cílových orgán ů a toxických ú činků, která by 
však zárove ň neměla vést k utrpení, závažné toxicit ě, morbidit ě nebo 
uhynutí. Za sou časného zohledn ění faktorů uvedených v odstavci 22 níže 
by se měla vybrat taková nejvyšší dávka, aby vyvolala p říznaky toxicity, 
např. pokles p řírůstku tělesné hmotnosti (p řibližně 10 %).  
22. Nicmén ě v závislosti na cílech studie (viz odstavec 6) je možné zvolit 
nejvyšší dávku nižší, než je dávka prokazující toxicitu, nap ř. jestliže 
dávka vyvolává nep říznivý účinek, který však má jen malý dopad na 
délku života nebo t ělesnou hmotnost. Nejvyšší dávka by nem ěla přesáhnout 
1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti/den (mezní dávka, viz odstavec 27).  
23. Je možné zvolit úrovn ě dávek a jejich odstup ňování ke stanovení vztahu 
mezi dávkou a odezvou a NOAEL nebo jiných plánovaných výsledk ů 
studie, nap ř. BMD (viz odstavec 25) na nejnižší úrovni dávky. Faktory, 
které by se m ěly zvážit p ři určování nižších dávek, zahrnují p ředpokládanou 
směrnici křivky závislosti odezvy na dávce, dávky, p ři kterých mohou nastat 
důležité zm ěny v metabolismu nebo zp ůsobu toxického ú činku, kde se 
předpokládá prahová hodnota nebo kde se p ředpokládá výchozí bod pro 
extrapolaci do oblasti nízkých dávek.  
24. Odstup ňování úrovní dávek bude záviset na vlastnostech zkoušené chemické 
látky a není možné je v této zkušební metod ě předepsat, avšak dvou až 
čtyřnásobné intervaly obvykle vedou k dobré funk čnosti zkoušky, použijí-li 
se k nastavení sestupných úrovní dávek a často se up řednostňuje zařazení 
čtvrté zkušební skupiny p řed použitím velmi dlouhých interval ů (např. více 
než faktor p řibližně 6–10) mezi dávkami. Obecn ě je třeba vyhnout se použití 
faktorů větších než 10 a jejich p řípadné použití by se m ělo zdůvodnit.  
25. Jak je dále uvedeno v Pokynech č. 116 (6), je t řeba při výběru dávky zvážit 
tyto body:  
— známá nebo p ředpokládaná nelinearita či inflexní body na k řivce 
závislosti odezvy na dávce,  
— toxikokinetika a rozsahy dávkování, p ři kterých dochází nebo nedochází 
k metabolické indukci, saturaci nebo nelinearit ě mezi vn ějšími 
a vnitřními dávkami,  
— prekurzorové léze, známky ú činku nebo indikátory probíhajících klí čo­
vých základních biologických proces ů, 
— klíčové (nebo p ředpokládané) aspekty zp ůsobu účinku, nap říklad dávky, 
při kterých za číná vzrůstat cytotoxicita, narušují se hladiny hormon ů, 
homeostatické mechanismy jsou ochromeny atd.,  
— oblasti k řivky závislosti odezvy na dávce, kde je nutný obzvláš ť robustní 
odhad, nap ř. v rozsahu p ředpokládané BMD nebo prahové hodnoty,  
— zvážení p ředpokládaných úrovní expozice člověka. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Kontrolní skupina je neexponovaná skupina nebo kontrolní skupina 
s nosičem, pokud se nosi č při podávání zkoušené chemické látky používá. 
S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je t řeba se zví řaty v kontrolní 
skupině zacházet stejným zp ůsobem jako se zví řaty v experimentálních 
skupinách. Používá-li se nosi č, podá se kontrolní skupin ě v nejvyšším 
používaném objemu v rámci skupin. Jestliže se zkoušená chemická látka 
podává v krmivu a zp ůsobuje podstatné snížení p říjmu potravy v d ůsledku 
snížené chutnosti krmiva, m ůže být užite čné použít další kontrolní skupinu 
krmenou tak, aby m ěla stejně snížený p říjem potravy a posloužila jako 
vhodnější kontrola.  
27. Pokud je možné na základ ě informací z p ředběžných studií p ředpokládat, že 
zkouška provedená podle postup ů popsaných pro tuto studii p ři jedné úrovni 
dávky nejmén ě 1 000 mg na kg t ělesné hmotnosti na den pravd ěpodobně 
nevyvolá nep říznivé účinky a pokud se na základ ě údajů o strukturn ě příbu­
zných chemických látkách nep ředpokládá toxicita, nemusí být úplná studie 
s použitím t ří úrovní dávek nutná. Mezní dávka 1 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti/den se m ůže použít s výjimkou p řípadu, kdy údaje o expozici člověka 
naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovn ě dávek.  
Příprava dávek a podávání zkoušené chemické látky  
28. Zkoušená chemická látka se obvykle podává oráln ě, v krmivu či v pitné 
vodě nebo žalude ční sondou. Další informace o cestách a zp ůsobech podání 
jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (6). Cesta a zp ůsob podání závisí na ú čelu 
studie, fyzikáln ě-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, její 
biologické dostupnosti a p řevládající cest ě a způsobu expozice člověka. 
Mělo by se uvést zd ůvodnění zvolené cesty a zp ůsobu podání. V zájmu 
zajištění dobrých životních podmínek zví řat by se m ělo podávání žalude ční 
sondou zvolit pouze u t ěch látek, u nichž tato cesta a zp ůsob podání náležit ě 
reprezentují potenciální expozici člověka (např. farmaceutika). Chemické 
látky, které se nacházejí v potrav ě nebo životním prost ředí, včetně pesticidů, 
se obvykle podávají v krmivu nebo pitné vod ě. Nicmén ě u některých 
scénářů expozice, nap ř. expozice na pracovišti, mohou být vhodn ější jiné 
cesty podání.  
29. Zkoušená chemická látka se v p řípadě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve 
vhodném nosi či. Je třeba podle pot řeby zvážit následující vlastnosti nosi če 
nebo jiných p řídatných látek: ú činky na absorpci, distribuci, metabolismus 
nebo retenci zkoušené chemické látky, ú činky na chemické vlastnosti zkou ­ 
šené chemické látky, které mohou zm ěnit její toxické vlastnosti a ú činky na 
konzumaci krmiva nebo vody či na nutri ční stav zví řat. Je-li to možné, 
doporučuje se zvážit nejprve použití vodného roztoku/suspenze, poté použití 
roztoku/emulze v oleji (nap ř. v kuku řičném oleji) a nakonec roztoku 
v jiných nosi čích. U nosi čů jiných než voda je nutné znát jejich toxické 
vlastnosti. M ěly by být k dispozici informace o stabilit ě zkoušené chemické 
látky a homogenit ě podávaných roztok ů nebo krmiva (dle pot řeby) za 
podmínek podávání (nap ř. v krmivu).  
30. U látek podávaných v krmivu nebo v pitné vod ě je důležité zajistit, aby 
množství použité zkoušené chemické látky neovliv ňovalo normální výživu 
nebo vodní rovnováhu. V dlouhodobých studiích toxicity s podáváním látky v krmivu by koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu obvykle 
neměla přesáhnout horní mez 5 % celkového množství krmiva, aby se 
zabránilo nutri ční nerovnováze. Podává-li se zkoušená chemická látka 
v krmivu, m ůže se použít bu ď konstantní koncentrace v krmivu (mg/kg 
krmiva nebo ppm), nebo konstantní dávkování vzhledem k t ělesné hmot ­
nosti zvířete (mg/kg t ělesné hmotnosti) vypo čítané jednou týdn ě. Použitá 
možnost by se m ěla specifikovat.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. V případě orálního podávání se zví řatům podává zkoušená chemická látka 
denně (sedm dn ů v každém týdnu), obvykle po dobu 12 m ěsíců (viz také 
odstavec 33), avšak m ůže být nutná i delší doba v závislosti na regula čních 
požadavcích. Jakýkoli jiný režim podávání, nap ř. pět dní v týdnu, musí být 
zdůvodněn. V případě dermální aplikace se zví řata vystavují zkoušené 
chemické látce alespo ň po dobu 6 hodin denn ě, 7 dnů v týdnu, jak je 
specifikováno v kapitole B.9 této p řílohy (10) po dobu 12 m ěsíců. Expozice 
inhalační cestou se provádí 6 hodin denn ě, 7 dnů v týdnu, avšak je možné 
použít i expozici 5 dn ů v týdnu, je-li zd ůvodněna. Období expozice obvykle 
trvá 12 m ěsíců. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy 
hlodavců než potkani, je možné upravit maximální doby expozice za ú čelem 
minimalizace druhov ě specifického utrpení. Používá-li se expozice kratší 
než 6 hodin denn ě, je třeba uvést zd ůvodnění. Viz také kapitola B.8 této 
přílohy (8).  
32. Pokud se zkoušená chemická látka podává zví řatům nitrožalude čně, mělo by 
se to provád ět žaludeční sondou nebo vhodnou intuba ční kanylou, vždy 
v přibližně stejnou denní dobu. Obvykle se podává jedna dávka jednou 
denně. Pokud je nap ř. chemická látka lokáln ě dráždící, je možné denní 
dávku podávat rozd ělenou na dv ě dávky (dvakrát denn ě). Maximální 
objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, závisí na velikosti pokusného 
zvířete. Objem by se m ěl udržovat co možná nejnižší a u hlodavc ů by 
obvykle nem ěl přesáhnout 1 ml/100 g t ělesné hmotnosti (22). Kolísání 
objemu zkoušené chemické látky by se m ělo omezit nastavením koncentrace 
tak, aby se zajistil konstantní objem na všech úrovních dávek. Potenciáln ě 
žíravé nebo dráždivé chemické látky jsou výjimkou a je nutné je na ředit, 
aby se zamezilo závažným lokálním ú činkům. Zkoušky p ři koncentracích, 
které by pravd ěpodobně vedly k poleptání nebo podrážd ění gastrointestinál ­
ního traktu, by se nem ěly provád ět. 
Délka studie  
33. Přestože je tato zkušební metoda primárn ě navržena jako 12m ěsíční studie 
chronické toxicity, uspo řádání studie dovoluje i jiné intervaly, a lze je tedy 
použít rovn ěž u kratších (nap ř. 6 nebo 9 m ěsíců) nebo delších (nap ř. 18 
nebo 24 m ěsíců) studií v závislosti na požadavcích konkrétních regula čních 
rámců nebo pro specifické mechanistické ú čely. Odchylky od doby expozice 
12 měsíců by měly být od ůvodněny, zejména v p řípadě kratších expozic. 
Satelitní skupiny zahrnuté pro monitorování reverzibility toxikologických změn vyvolaných zkoušenou chemickou látkou by se m ěly udržovat bez 
podávání látky po dobu nep řekračující 4 týdny a ne delší než jedna t řetina 
celkové délky studie po skon čení expozice. Další pokyny, v četně posouzení 
přežití ve studii, jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (6).
 
POZOROVÁNÍ  
34. Všechna zví řata by se m ěla kontrolovat s ohledem na morbiditu nebo morta ­
litu, obvykle na za čátku a na konci každého dne, v četně víkendů a svátků. 
Všeobecné klinické pozorování by se m ělo provád ět nejméně jednou denn ě, 
přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby o čekávaných 
maximálních ú činků po podání látky v p řípadě podání sondou.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Před první expozicí látce (za ú čelem intraindividuálního porovnání), na 
konci prvního týdne studie a dále jednou m ěsíčně se by se m ělo provést 
důkladné klinické vyšet ření všech zví řat. Protokol pozorování by se m ěl 
uspořádat tak, aby byly odchylky mezi jednotlivými pozorovateli minimali ­
zovány a byly nezávislé na experimentální skupin ě. Toto pozorování by se 
mělo provád ět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru 
a přednostně pokaždé ve stejnou dobu. Pozorování by se m ěla pečlivě 
zaznamenávat, nejlépe za použití systému bodování explicitn ě definovaného 
ve zkušební laborato ři. Je třeba se pokusit zajistit, aby byly rozdíly mezi 
podmínkami pozorování minimální. Vyšet ření by se m ělo mimo jiné 
soustředit na zm ěny kůže, srsti, o čí a sliznic, výskyt sekret ů a exkret ů 
a vegetativní funkce (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé dýchání). Zaznamenávat by se m ěly také zm ěny chůze, držení t ěla a reakce na mani ­
pulaci, dále p řítomnost klonických a tonických pohyb ů, stereotyp ů 
v chování (nap ř. nadměrného čištění nebo opakovaného kroužení) nebo 
bizarního chování (nap ř
. sebepoškozování, ch ůze pozpátku) (24).  
36. Před prvním podáním zkoušené chemické látky by se m ělo u všech zví řat 
provést oftalmologické vyšet ření s použitím oftalmoskopu nebo jiného 
vhodného p řístroje. Na konci studie by se toto vyšet ření mělo provést 
nejlépe u všech zví řat, avšak minimáln ě ve skupinách s vysokou dávkou 
a kontrolních skupinách. Zjistí-li se na o čích změny související s podáním 
látky, měla by se vyšet řit všechna zví řata. Pokud analýza struktury nebo jiné 
informace nazna čují toxicitu pro oko, m ěla by se četnost provád ění očního 
vyšetření zvýšit.  
37. V případě chemických látek, které p ři předchozích 28denních a/nebo 90den ­
ních zkouškách toxicity po opakované dávce vyvolaly neurotoxické ú činky, 
je možné voliteln ě vyšetřit senzorickou reaktivitu na r ůzné druhy stimul ů 
(24) (nap ř. sluchové, zrakové a proprioceptivní stimuly) (25), (26), (27), sílu 
úchopu (28) a motorickou aktivitu (29) p řed zahájením studie a v t říměsíč­
ních intervalech po za čátku studie až do 12 m ěsíců včetně a rovněž při 
ukončení studie (je-li delší než 12 m ěsíců). Další informace o postupech, 
které lze použít, jsou uvedeny v p říslušné literatu ře. Místo postup ů popsa­
ných v této literatu ře však lze použít alternativní postupy.  
38. V případě chemických látek, které p ři předchozích 28denních a/nebo 90den ­
ních zkouškách toxicity po opakované dávce vyvolaly imunotoxické ú činky, 
je možno na konci studie voliteln ě provést další vyšet ření tohoto cílového 
parametru.  
Tělesná hmotnost, spot řeba krmiva/vody a využitelnost krmiva  
39. Všechna zví řata by se m ěla zvážit na za čátku expozice, alespo ň jednou 
týdně během prvních 13 týdn ů a poté alespo ň jednou m ěsíčně. Měření 
spotřeby krmiva a využitelnosti krmiva by se m ěla provád ět alespoň jednou 
týdně během prvních 13 týdn ů a poté alespo ň jednou m ěsíčně. Spotřeba 
vody by se m ěla měřit alespoň jednou týdn ě během prvních 13 týdn ů a poté 
alespoň jednou m ěsíčně, podává-li se chemická látka v pitné vod ě. Měření 
spotřeby vody by se m ělo zvážit také v p řípadě studií, p ři kterých m ůže 
dojít ke zm ěně příjmu tekutin.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematologická a klinická biochemická vyšet ření 
40. Ve studiích na hlodavcích by se m ěla hematologická vyšet ření provád ět 
alespoň u 10 samc ů a 10 samic v každé skupin ě, 3., 6. a 12. m ěsíc 
a rovněž na konci studie (trvá-li déle než 12 m ěsíců), vždy u stejných zví řat. 
U myší mohou být zapot řebí satelitní zví řata, aby se mohla provést všechna 
požadovaná hematologická stanovení (viz odstavec 18). Ve studiích na nehlodavcích se budou vzorky odebírat menšímu po čtu zvířat (např. 4 
zvířatům od každého pohlaví v každé skupin ě ve studiích na psech) 
v průběžných odb ěrových časech a na konci studie, jak je popsáno 
u hlodavc ů. Měření po třech měsících, jak u hlodavc ů, tak u nehlodavc ů, 
se nemusí provád ět, pokud nebyl v p ředchozí 90denní studii provedené p ři 
srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný ú činek na hematologické 
parametry. Krevní vzorky by se m ěly odebírat z ur čeného místa, nap říklad 
srdeční punkcí nebo z retroorbitálního sinu, v anestezii.
 
41. Měly by se vyšet řit následující parametry (30): Celkový po čet leukocyt ů, 
diferenciální rozpo čet leukocyt ů, počet erytrocyt ů, trombocyt ů, koncentrace 
hemoglobinu, hematokrit (objem erytrocyt ů), střední objem 
erytrocytu (MCV), pr ůměrné množství hemoglobinu v erytrocytu (MCH), 
průměrná koncentrace hemoglobinu v erytrocytu (MCHC), protrombinový 
čas a aktivovaný parciální tromboplastinový čas. Dle pot řeby lze zm ěřit také 
další hematologické parametry, jako jsou Heinzova t ělíska či jiné atypické 
morfologické formy erytrocytu nebo methemoglobin, v závislosti na toxicit ě 
zkoušené chemické látky. Celkov ě by se m ělo postupovat flexibiln ě, podle 
pozorovaného a/nebo o čekávaného ú činku dané zkoušené chemické látky. 
Jestliže má zkoušená chemická látka ú činek na systém krvetvorby, m ůže být 
indikováno také vyšet ření počtu retikulocyt ů a cytologie kostní d řeni, přes­
tože se tato vyšet ření nemusí provád ět rutinně. 
42. Klinické biochemické analýzy za ú čelem vyšet ření hlavních toxických 
účinků na tkán ě, a zejména na játra a ledviny, by se m ěly provést na 
krevních vzorcích odebraných alespo ň 10 samc ům a 10 samicím v každé 
skupině ve stejných časových intervalech stanovených pro hematologická 
vyšetření a s použitím vždy stejných zví řat. U myší mohou být zapot řebí 
satelitní zví řata, aby se mohla provést všechna požadovaná biochemická 
vyšetření. Ve studiích na nehlodavcích se budou vzorky odebírat menšímu 
počtu zvířat (např. ve studiích na psech 4 zví řatům od každého pohlaví 
v každé skupin ě) v průběžných odb ěrových časech a na konci studie tak, 
jak je popsáno u hlodavc ů. Měření po třech měsících, jak u hlodavc ů, tak 
u nehlodavc ů, se nemusí provád ět, pokud nebyl v p ředchozí 90denní studii 
provedené p ři srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný ú činek na 
klinické biochemické parametry. P řed odebráním krevních vzork ů se 
doporučuje ponechat zví řata (s výjimkou myší) p řes noc la čnit. Měly by 
se vyšetřit následující parametry (30): glukóza, mo čovina (mo čovinový 
dusík), kreatinin, celkový obsah protein ů, albuminy, vápník, sodík, draslík, 
celkový cholesterol, alespo ň dva vhodné testy pro hepatocelulární vyšet ření 
(alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, glutamátdehydrogenáza, celkové kyseliny žlu čové) (31) a alespo ň dva vhodné testy pro hepatobili ­
ární vyšet ření (alkalická fosfatáza, gamaglutamyltransferáza, 5’-nukleoti ­
dáza, celkový bilirubin, celkový obsah žlu čových kyselin) (31). Dle pot řeby 
je možné zm ěřit také další klinické biochemické parametry, nap ř. triglyce­
ridy nalačno, specifické hormony a cholinesterázu, v závislosti na toxicit ě 
zkoušené chemické látky. Celkov ě je třeba postup p řizpůsobit pozorova ­
nému a/nebo o čekávanému ú činku zkoušené chemické látky.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Rozbor mo či by se m ěl provést alespo ň u 10 samc ů a 10 samic v každé 
skupině, s použitím vzork ů odebraných ve stejných intervalech, jako 
u hematologických a klinických biochemických vyšet ření. Měření v 3. 
měsíci se nemusí provád ět, pokud nebyl v p ředchozí 90denní studii 
provedené p ři srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný ú činek na 
složení mo či. Odborné doporu čení pro klinické patologické studie zahrno ­
valo následující parametry (30): vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, celkový obsah protein ů a glukóza. Další stanovení zahrnují 
ketony, urobilinogen, bilirubin, a okultní krvácení. Zkoumání pozorovaného 
účinku (pozorovaných ú činků) lze v p řípadě potřeby rozší řit o další para ­
metry.
 
44. Obecn ě se má za to, že ve studiích na psech je t řeba před expozicí zm ěřit 
výchozí hematologické a klinické biochemické parametry, avšak ve studiích 
na hlodavcích se stanovovat nemusí (30). Pokud jsou však historické 
výchozí údaje (viz odstavec 50) nedostate čné, je třeba zvážit získání t ěchto 
údajů. 
Patologie  
Pitva  
45. U všech zví řat zařazených do studie se obvykle provede celková podrobná 
pitva zahrnující pe člivé vyšet ření povrchu t ěla, všech otvor ů a lebeční, 
hrudní a b řišní dutiny a jejich obsahu. Nicmén ě je také možno m ěření 
omezit na konkrétní klí čové parametry (ve skupin ě pro předběžná utracení 
nebo v satelitní skupin ě), jako je neurotoxicita či imunotoxicita (viz 
odstavec 19). Zví řata se nemusí pitvat ani se u nich neprovádí postupy 
popsané v následujících odstavcích. V jednotlivých p řípadech a dle uvážení 
vedoucího studie m ůže být třeba provést pitvu u ov ěřovacích zví řat. 
46. U všech ostatních zví řat, kromě zvířat vyloučených v druhé části odstavce 
45, by se m ěly zvážit orgány. Nadledvinky, mozek, nadvarlata, srdce, 
ledviny, játra, vaje čníky, slezina, varlata, štítná žláza (vážená po fixaci, 
včetně příštítných t ělísek) a d ěloha všech zví řat (kromě zvířat nalezených 
umírajících a/nebo zví řat utracených v pr ůběhu zkoušky) by se m ěly zbavit 
všech přirostlých tkání a co nejd říve po vyjmutí z t ěla ve vlhkém stavu 
zvážit, než vyschnou. Ve studii používající myši je vážení nadledvinek 
volitelné.  
47. Následující tkán ě by se měly konzervovat v nejvhodn ějším fixačním médiu 
s ohledem na typ tkán ě a plánovaná následná histopatologická vyšet ření (32) 
(tkáně v hranatých závorkách jsou volitelné): 
všechny makroskopicky 
viditelné léze srdce slinivka b řišní žaludek (p ředžaludek, 
žláznatý žaludek) 
nadledvinka  ileum  p říštítná tělíska [zuby] 
aorta  jejunum  periferní nerv varlata 
mozek (zahrnující řezy 
mozkových hemisfér, 
mozečku a prodloužené 
míchy/Varolova mostu) ledviny hypofýza brzlík 
slepé střevo slzní žláza (extraorbi ­
tální) prostata štítná žláza 
cervix játra rektum [jazyk]  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
koagulační žláza plíce slinná žláza pr ůdušnice 
tlusté střevo lymfatické uzliny 
(povrchové i hluboké) semenný vá ček mo čový měchýř 
dvanáctník prsní žláza (povinné 
u samic a, je-li o čividně 
možné ji vypreparovat, i u samců) kosterní sval d ěloha (včetně hrdla dělo­ 
žního) 
nadvarle [horní cesty dýchací, 
včetně nosu, nosních 
skořep a vedlejších dutin 
nosních] kůže [mo čovod] 
oko (včetně sítnice) jícen mícha (ve t řech úrov­
ních: krční, střední 
hrudní a bederní) [močová trubice] 
[femur  s kloubem] [ Bulbus olfactorius ] slezina pochva 
žlučník (u jiných druh ů než 
potkan) vaječníky [ sternum ], řez kostní d ření a/nebo 
čerstvý aspirát kostní d řeni 
Harderova žláza
 
V případě párových orgán ů, např. ledvin, nadledvinek, by se m ěly ucho­
vávat oba orgány. Na základ ě klinických nebo jiných nález ů může být 
nezbytné zkoumat i další tkán ě. Také by se m ěly uchovat všechny orgány 
považované na základ ě známých vlastností zkoušené chemické látky za 
možné cílové orgány. Ve studiích s dermální cestou aplikace by se m ěl 
zachovat seznam orgán ů stanovený pro orální cestu, a navíc je nezbytné 
odebrat a konzervovat vzorky k ůže z místa aplikace. V inhala čních studiích 
by se m ěl seznam tkání z dýchacích cest ur čených ke konzervaci 
a vyšetření, řídit doporu čeními uvedenými v kapitole B.8 této p řílohy (8) 
a kapitole B.29 této p řílohy (9). Co se týká ostatních orgán ů/tkání (krom ě 
specificky konzervovaných tkání z dýchacích cest) by se m ěly vyšetřit 
orgány uvedené na seznamu orgán ů určeném pro orální cestu.  
Histopatologické vyšet ření 
48. Jsou k dispozici pokyny ohledn ě osvědčených postup ů při provádění toxi­
kologických patologických studií (32). Histopatologická vyšet ření by m ěla 
minimáln ě obsahovat:  
— všechny tkán ě ve skupinách s vysokou dávkou zkoušené chemické látky 
a kontrolních skupinách,  
— všechny tkán ě ze zvířat uhynulých nebo utracených b ěhem studie,  
— všechny tkán ě vykazující makroskopické abnormality,  
— cílové tkán ě nebo tkán ě, které vykazují zm ěny v souvislosti s expozicí 
ve skupin ě s vysokou dávkou, u všech zví řat ve všech ostatních expe ­
rimentálních skupinách,  
— v případě párových orgán ů, např. ledvin, nadledvinek, by se m ěly 
vyšetřit oba orgány.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Údaje  
49. Měly by se uvést údaje o všech hodnocených parametrech u každého jedno ­
tlivého zví řete. Krom ě toho by se m ěly všechny údaje shrnout do tabulky, 
přičemž se uvede u každé experimentální skupiny po čet zvířat na začátku 
zkoušky, po čet zvířat nalezených uhynulých v pr ůběhu zkoušky nebo utra ­
cených z humánních d ůvodů a doba úmrtí nebo humánního utracení, po čet 
zvířat vykazujících p říznaky toxicity, popis p říznaků toxicity, v četně doby 
nástupu, trvání a závažnosti každého toxického ú činku, počet zvířat vykazu ­
jících léze, typ lézí a procento zví řat vykazujících každý typ léze. Tabulky 
se souhrnnými údaji by m ěly uvádět průměrné hodnoty a sm ěrodatné 
odchylky (u spojitých dat ze zkoušky) u zví řat vykazujících toxické ú činky 
nebo léze a také klasifikaci lézí.  
50. Pro interpretaci výsledk ů studie mohou být cenné historické kontrolní údaje, 
např. v případě, kdy existují známky toho, že se sou časné kontroly zna čně 
odchylují od posledních údaj ů získaných od kontrolních zví řat ze stejného 
zkušebního za řízení/kolonie. Historické kontrolní údaje, pokud se hodnotí, 
by měly být ze stejné laborato ře a měly by pocházet od zví řat stejného v ěku 
a ze stejného kmene b ěhem pěti let předcházejících p říslušné studii.  
51. Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody a údaje, 
které se mají analyzovat, by se m ěly zvolit již p ři plánování studie (odstavec 
8). Tento výb ěr by měl zahrnovat rezervu pro p řípadné úpravy v závislosti 
na přežití.  
Protokol o zkoušce  
52. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená chemická látka:  
— fyzikální vlastnosti, čistota a fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— identifika ční údaje,  
— zdroj chemické látky,  
— číslo šarže,  
— certifikát o chemické analýze.  
Nosič (je-li použit):  
— zdůvodnění výběru nosiče (pokud není použita voda).  
Pokusná zví řata: 
— použité druhy/kmen a zd ůvodnění výběru, 
— počet, věk a pohlaví zví řat na začátku zkoušky,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— zdroj, podmínky chovu, krmivo atd.,  
— hmotnosti jednotlivých zví řat na začátku zkoušky.  
Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění způsobu podávání a výb ěru dávky,  
— případně statistické metody použité k analýze dat,  
— podrobnosti o použité form ě zkoušené chemické látky/úprav ě krmiva,  
— analytické údaje o dosažené koncentraci, stabilit ě a homogenit ě 
přípravku,  
— cesta podání a podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,  
— u inhala čních studií informace o tom, zda byla expozice pouze nazální 
cestou, nebo celot ělová,  
— skutečné dávky (mg/kg t ělesné hmotnosti/den) a p řípadně koeficient 
přepočtu koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vod ě 
(mg/kg nebo ppm) na skute čnou dávku (mg/kg t ělesné hmotnosti/den),  
— podrobné údaje o kvalit ě stravy a vody.  
Výsledky (m ěly by se p ředložit souhrnné tabulky údaj ů a údaje pro jedno ­
tlivá zvířata):  
— údaje o p řežití,  
— tělesná hmotnost/zm ěny tělesné hmotnosti,  
— spotřeba krmiva, výpo čty využitelnosti krmiva, pokud byly provedeny 
a případně spotřeba vody,  
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovn ě dávky, v četně 
příznaků toxicity,  
— povaha, výskyt (plus závažnost, je-li hodnocena) a trvání pozorovaných 
klinických p říznaků (zda byly p řechodné, nebo trvalé),  
— oftalmologické vyšet ření, 
— hematologické testy,  
— klinické biochemické testy,  
— rozbor mo či, 
— výsledky všech vyšet ření neurotoxicity nebo imunotoxicity,  
— konečná tělesná hmotnost,  
— hmotnosti orgán ů (a jejich pom ěry, pokud se stanovují),  
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů souvisejících 
s expozicí,  
— údaje o absorpci, pokud jsou dostupné.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Statistické zpracování výsledk ů dle potřeby 
Diskuse o výsledcích zahrnující:  
— vztahy mezi dávkou a odezvou,  
— posouzení všech informací o zp ůsobu účinku,  
— diskuse o všech modelovacích p řístupech,  
— stanovení BMD, NOAEL nebo LOAEL,  
— historické kontrolní údaje,  
— význam pro člověka. 
Závěry 
LITERATURA:  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208.  
3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.  
4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  
5) Kapitola B.27 této p řílohy, Zkouška subchronické orální toxicity studie 
orální toxicity na nehlodavcích (90denní opakovaná aplikace).  
6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ env/testguidelines.
 
7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
8) Kapitola B.8 této p řílohy, Subakutní inhala ční toxicita: 28denní studie.  
9) Kapitola B.29 této p řílohy, Studie subchronické inhala ční toxicity: 90denní 
studie.  
10) Kapitola B.9 této p řílohy, Dermální toxicita (28denní opakovaná aplikace).  
11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
 
12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69-98.  
15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approa ­
ches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
 
18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
19) Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 
o ochran ě zvířat používaných pro v ědecké účely, Úř. věst. L 276, 
20.10.2010, s. 33.  
20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
 
22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals 
in various housing systems.  
23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.  
24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  
29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. 
Teratol. 13: 599-609.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
30) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
31) Dokument (návrh) agentury EMEA „Non-clinical guideline on drug-induced 
hepatotoxicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 
131. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Zkoušená chemická látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31  STUDIE PRENATÁLNÍ VÝVOJOVÉ TOXICITY  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 414 (2001).  
1.1 ÚVOD  
Tato metoda zkoušení vývojové toxicity je ur čena k získání všeobec ­
ných informací týkajících se ú činku prenatální expozice na b řezí 
pokusné zví ře a na organismus vyvíjející se v d ěloze; tyto informace 
mohou zahrnovat jak hodnocení ú činku na matku, tak i vliv na 
uhynutí, strukturální odchylky nebo zm ěněný růst plodu. I když 
funkční poruchy tvo ří významnou část vývoje, nejsou sou částí této 
metody. Zkoušky na tyto poruchy mohou být provád ěny 
v samostatné studii nebo jako dopln ěk této studie pomocí zkušební 
metody vývojové neurotoxicity. Informace o zkoušení funk čních 
poruch a jiných postnatálních ú činků lze v případě potřeby získat 
z dvougenera ční zkoušky toxicity pro reprodukci a zkoušky 
vývojové neurotoxicity.  
Tato zkušební metoda m ůže ve specifických p řípadech vyžadovat 
určitou úpravu na základ ě specifických znalostí, nap ř. fyzikáln ě- 
chemických nebo toxikologických vlastností zkoušené látky. Tato úprava je p řijatelná, jestliže p řesvědčivé vědecké důkazy svědčí 
o tom, že díky ní bude mít zkouška vyšší vypovídací hodnotou. 
V takovém p řípadě je třeba tyto v ědecké důkazy pečlivě zdokumen ­
tovat ve zpráv ě o studii.
 
1.2 DEFINICE  
Vývojová toxikologie:  studie nep říznivých ú činků na vyvíjející se 
organismus, které mohou vyplývat z expozice p řed početím, během 
prenatálního vývoje nebo v postnatálním období až do doby pohlavní zralosti. Hlavní projevy vývojové toxicity zahrnují: 1) úhyn organismu, 2) strukturální odchylky, 3) zm ěněný růst a 4) 
funkční poruchu. Vývojová toxikologie se p ůvodně nazývala terato ­
logie.
 
Nepříznivý účinek:  jakákoliv odchylka od normálního stavu spojená 
se zkouškou, která snižuje schopnost organismu p řežít, rozmnožovat 
se nebo se p řizpůsobit prost ředí. Pokud jde o vývojovou toxikologii 
v nejširším slova smyslu, zahrnuje tento pojem jakýkoliv ú činek, 
který brání normálnímu vývoji plodu, a to jak p řed narozením, tak 
i po něm. 
Změněný růst: změna hmotnosti nebo velikosti orgánu nebo t ěla 
u potomstva.  
Odchylky (anomálie):  strukturální zm ěny ve vývoji, které zahrnují 
jak malformace, tak i odchylky (28).  
Malformace/velká odchylka:  strukturální zm ěna považovaná za 
škodlivou pro zví ře (může být i letální); obvykle je vzácná.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Malformace/malá odchylka:  strukturální zm ěna, která nemá žádný 
nebo má jen malý škodlivý ú činek na zví ře; může být přechodná a u 
kontrolní populace se m ůže vyskytovat pom ěrně často. 
Zárodek:  celkové množství derivát ů oplodn ěného vají čka 
v jakékoliv fázi vývoje od oplodn ění až do narození, v četně dalších 
zárodečných membrán, embrya nebo plodu.  
Implantace (nidace):  přichycení blastocytu k epitelové výstelce 
dělohy, včetně její penetrace do d ěložního epitelu a zahnízd ění 
v děložní sliznici.  
Embryo:  raná nebo vývojová fáze organismu, a to zvlášt ě plod 
vyvíjející se po oplodn ění vajíčka poté, co se objeví dlouhá osa 
a dokud nejsou p řítomné všechny hlavní struktury.  
Embryotoxicita:  toxicita škodlivá pro normální strukturu, vývoj, 
růst a/nebo životaschopnost embrya.  
Zárodek:  nenarozený potomek v post-embryonálním období.  
Fetotoxicita:  toxicita škodlivá pro normální strukturu, vývoj, r ůst 
a/nebo životaschopnost plodu.  
Potrat:  předčasné vylou čení produkt ů oplodnění – embrya nebo 
plodu neschopného života – z d ělohy.  
Resorpce:  zárodek, který po implantaci do d ělohy pozd ěji odumřel 
a vstřebává se nebo se již vst řebal.  
Raná resorpce:  důkaz o zahnízd ění (implantaci) bez rozeznatelného 
embrya/plodu.  
Pozdní resorpce:  mrtvé embryo nebo plod se 
zevními degenerativními zm ěnami.  
NOAEL:  zkratka pro hladinu bez pozorovaného nep říznivého 
účinku; odpovídá nejvyšší úrovni dávky nebo expozice, p ři které 
nejsou pozorovány žádné nep říznivé nálezy související s podáním 
látky.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKA  
Žádná.  
1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY  
Obvykle se zkoušená látka podává b řezím zvířatům nejpozd ěji od 
implantace až do dne p řed plánovaným usmrcením, který by se m ěl 
co nejvíce p řiblížit očekávanému dni vrhu, aniž se riskuje ztráta 
údajů v důsledku předčasného vrhu. Zkušební metoda není ur čena 
výhradně ke zkoumání období organogeneze (nap ř. 5.–15. den 
u hlodavce a 6.–18. den u králíka), ale pop řípadě rovněž ke zkou ­
mání účinků před implantací, pro celé období gestace a až do dne 
před císařským řezem. Krátce p řed císařským řezem se samice 
usmrtí, prozkoumá se d ěložní obsah a u plod ů se vyhodnotí zevní 
viditelné anomálie, zm ěny měkkých tkání a skeletu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.5.1  Výb ěr živočišných druh ů 
Doporučuje se provád ět zkoušení s nejvhodn ějšími druhy a využívat 
laboratorní druhy a kmeny, které se b ěžně používají p ři zkoušení 
prenatální vývojové toxicity. Up řednostňovaným druhem hlodavce 
je potkan a up řednostňovaným druhem nehlodavce je králík. Použití 
jiného druhu je t řeba odůvodnit.  
1.5.2  Podmínky chovu a krmení  
Teplota v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22  o C (± 3  o ) pro 
hlodavce 18  o C (± 3  o ) pro králíky, relativní vlhkost vzduchu by m ěla 
být minimáln ě 30 % a pokud možno nep řesáhnout 70 %, krom ě 
doby úklidu místnosti, cílem by m ěla být hodnota 50–60 %. Osv ět­
lení by m ělo být um ělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 
hodin tmy. Ke krmení lze použít konven ční laboratorní stravu 
s neomezenou dodávkou pitné vody.  
Páření by mělo probíhat v klecích vhodných k tomuto ú čelu. I když 
se dává p řednost individuálnímu chovu spá řených zví řat, přípustný je 
rovněž chov v malých skupinkách.  
1.5.3  Příprava zví řat 
Použijí se zdravá zví řata, která se alespo ň 5 dnů aklimatizovala na 
laboratorní podmínky a která nebyla podrobena p ředcházejícím 
zkušebním postup ům. Pokusná zví řata by měla být charakterizována 
podle druhu, kmenu, p ůvodu, pohlaví, hmotnosti a/nebo stá ří. Je-li to 
možné, m ěla by mít zví řata ze všech testovaných skupin stejnou 
hmotnost a v ěk. Pro každou úrove ň dávek se použijí mladé dosp ělé 
samice, které by m ěly být nullipary. Samice se spá ří se samci stej ­
ného druhu a kmene a nem ělo by docházet k pá ření sourozenc ů. 
U hlodavc ů je nultým dnem gestace den, kdy se pozoruje vaginální 
zátka a/nebo sperma; u králík ů je dnem 0 obvykle den pá ření nebo 
umělé inseminace, pokud se tato metoda používá. Oplodn ěné samice 
se náhodným výb ěrem rozd ělí do kontrolních a experimentálních 
skupin. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby byl vliv umíst ění 
klecí minimalizován. Každému zví řeti se přidělí vlastní identifika ční 
číslo. Náhodným výb ěrem se oplodn ěné samice rozd ělí do kontrol ­
ních a experimentálních skupin, a jsou-li samice pá řeny v sadách, 
rozdělí se zvířata z jednotlivých sad rovnom ěrně do všech skupin. 
Stejně tak se do všech skupin rozd ělí samice oplodn ěné stejným 
samcem.  
1.6 POSTUP  
1.6.1  Po čet a pohlaví zví řat 
Každá experimentální a kontrolní skupina by m ěla obsahovat dosta ­
tečný počet samic, abych se p ři pitvě získalo p řibližně 20 samic 
s implantací plodu. Skupiny s mén ě než 16 zví řaty s implantací 
plodu nejsou vhodné. Mortalita samic nemusí nutn ě znamenat 
znehodnocení studie za p ředpokladu, že nep řekročí přibližně 10 %.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2  Příprava dávek  
Pokud se pro usnadn ění dávkování používá vehikulum nebo jiná 
přísada, je t řeba vzít v úvahu následující typické znaky: vliv na 
absorpci, distribuci, metabolismus a retenci nebo vylu čování zkou ­ 
šené látky; vliv na chemické vlastnosti zkoušené látky, která m ůže 
pozměnit svoje toxické znaky, a vliv na spot řebu potravy nebo vody 
anebo nutri čního stavu zví řat. Vehikulum by nem ělo být ani 
vývojově toxické, ani by nem ělo mít vliv na rozmnožování.  
1.6.3  Dávkování  
Zkoušená látka se obvykle podává denn ě od implantace (nap ř. pátý 
den po spá ření) až do dne p řed plánovaným císa řským řezem. Pokud 
z případných p ředběžných studií nevyplývá vysoký potenciál 
předimplanta ční ztráty, lze aplikaci prodloužit tak, aby zahrnovala 
celé období gestace, od spá ření až do dne p řed plánovaným usmr ­
cením. Je známo, že nevhodné zacházení nebo stres b ěhem březosti 
může vést k prenatální ztrát ě. S cílem zabránit prenatálním ztrátám 
z důvodů, které nejsou spojeny s expozicí, je nutné zamezit jak 
nadbytečné manipulaci se zví řaty, tak i stresu zp ůsobenému zevními 
faktory, jako je nap ř. hluk.  
Použijí se alespo ň tři úrovně dávek a soub ěžná kontrola. Zdravá 
zvířata se náhodným výb ěrem rozd ělí do kontrolních 
a experimentálních skupin. Úrovn ě dávek se rozloží tak, aby byly 
toxické ú činky odstup ňovány. Pokud neexistuje žádné omezení 
fyzickou/chemickou podstatou nebo biologickými vlastnostmi zkou ­ 
šené látky, zvolí se nejvyšší dávka s cílem vyvolat ur čitou vývojovou 
toxicitu a/nebo toxicitu pro matku (klinické znaky nebo snížení t ělesné 
hmotnosti), ale nikoliv uhynutí nebo zna čné utrpení. Alespo ň jedna 
střední úrove ň dávky by m ěla vyvolat minimální zjistitelné toxické 
účinky. Nejnižší úrove ň dávky by nem ěla vyvolat žádnou prokaza ­
telnou toxicitu pro matku ani vývojovou toxicitu. S ohledem na prokázání jakékoli reakce související s dávkováním a s úrovní 
dávky bez pozorovaného nep říznivého ú činku (NOAEL) by se m ěla 
zvolit sestupná posloupnost úrovní dávek. Pro nastavení sestupných úrovní dávek jsou obvykle optimální dvoj- až čtyřnásobné intervaly 
a často je vhodn ější přidání čtvrté exponované skupiny než používání 
velkých interval ů mezi dávkami (nap ř. lišících se faktorem 10). 
Ačkoliv je cílem stanovit hodnotu NOAEL pro samici, p řijatelné 
jsou rovn ěž studie, které tuto hodnotu nestanoví (1).
 
Při výběru úrovní dávek je t řeba brát v úvahu jakékoliv existující 
údaje o toxicit ě a také jako další informace o metabolismu 
a toxikokinetice zkoušené látky nebo látek p říbuzných. Tyto infor ­
mace pomohou rovn ěž při prokazování p řiměřenosti dávkovacího 
režimu.  
Použije se soub ěžná kontrolní skupina. Tato skupina by m ěla tvořit 
zdánlivě léčenou kontrolní skupinu nebo kontrolní skupinu 
s vehikulem, pokud se vehikulum p ři podávání zkoušené látky 
používá. Všem skupinám se podává stejné množství zkoušené 
látky nebo vehikula. Se zví řaty v kontrolní skupin ě (kontrolních 
skupinách) se zachází stejn ě jako se zví řaty v experimentální 
skupině. Kontrolní skupina s vehikulem by m ěla dostat vehikulum 
v nejvyšším používaném množství (jako u experimentální skupiny 
s nejnižší dávkou).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4  Limitní zkouška  
Pokud zkouška na jedné úrovni dávky v množství alespo ň 
1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti na den p ři orálním podávání nevy ­
volá při použití postup ů předepsaných pro tuto studii žádnou zjisti ­
telnou toxicitu ani u b řezích zví řat, ani u jejich plod ů, a pokud se 
neočekává ú činek ani na základ ě existujících údaj ů (např. 
o sloučeninách s podobnou strukturou a/nebo metabolismem), není 
nutné uvažovat o kompletní studii využívající t ří úrovní dávek. Je 
možné, že p ředpokládaná expozice u člověka si vyžádá použití vyšší 
orální dávky v limitní zkoušce. U dalších zp ůsobů podávání látky, 
jako je inhala ční nebo kožní aplikace, m ůže být maximální dosaži ­
telná úrove ň expozice dána fyzikáln ě-chemickými vlastnostmi zkou ­ 
šené látky (nap ř. kožní aplikace by nem ěla způsobit závažnou lokální 
toxicitu).  
1.6.5  Aplikace dávek  
Zkoušená látka nebo vehikulum se obvykle podává oráln ě intubací. 
Pokud se používá jiný zp ůsob aplikace látky, m ěl by experimentátor 
volbu zdůvodnit a objasnit, p řičemž možná bude nutné provést odpo ­
vídající zm ěny (2, 3, 4). Zkoušená látka se podává každý den 
přibližně ve stejnou dobu.  
Dávka pro jednotlivá zví řata obvykle vychází z aktuální zjišt ěné 
tělesné hmotnosti. Je však nutné v ěnovat velkou pozornost úprav ě 
dávky během posledního trimestru b řezosti. Dávka by se m ěla zvolit 
na základ ě existujících údaj ů, aby se zabránilo nadm ěrné toxicit ě 
u samic. Pokud je však u ošet řovaných samic zaznamenána 
nadměrná toxicita, tato zví řata se humánn ě utratí. Pokud n ěkolik 
březích zvířat vykazuje známky nadm ěrné toxicity, m ělo by se zvážit 
utracení této skupiny. Je-li látka podávána prost řednictvím žalude ční 
sondy, m ěla by se zví řatům podávat ve form ě jediné dávky pomocí 
hadičky k výplachu žaludku nebo vhodné intuba ční kanyly. Maxi ­
mální objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, závisí na veli ­
kosti pokusného zví řete. Toto množství by nem ělo překročit 1 ml/100 
g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztok ů, kde lze použít 
2 ml/100 g t ělesné hmotnosti. Pokud se jako vehikulum používá 
kukuřičný olej, nem ělo by množství p řekročit 0,4 ml/100 g t ělesné 
hmotnosti. Kolísání v množství zkoušené látky by se m ěla omezit 
nastavením koncentrací tak, aby se zajistilo konstantní množství na všech úrovních dávek.
 
1.6.6  Sledování samic  
Klinická pozorování se provád ějí a zaznamenávají minimáln ě jednou 
denně, a to každý den nejlépe ve stejnou dobu, a p řihlédne se k dob ě 
vrcholícího p ředpokládaného ú činku po dávkování. Zaznamená se 
stav zvířat včetně mortality, agónie, relevantních zm ěn chování 
a všech p říznaků zjevné toxicity.  
1.6.7  Tělesná hmotnost a spot řeba potravy  
Zvířata se zváží b ěhem nultého dne gestace anebo nejpozd ěji třetí 
den gestace, pokud externí chovatel dodává zví řata spářená ve 
stejnou dobu, první den podávání látky a minimáln ě každý t řetí 
den v období podávání látky a dále v den plánovaného usmrcení.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Spotřeba potravy se zaznamená v t řídenním intervalu a m ěla by se 
shodovat se dny zjiš ťování tělesné hmotnosti.  
1.6.8  Pitva  
Samice se usmrtí jeden den p řed očekávaným dnem vrhu. Samice 
vykazující známky potratu nebo p ředčasného vrhu p ředcházejícího 
plánovanému usmrcení se usmrtí a podrobí d ůkladnému makrosko ­
pickému vyšet ření. 
Samice se v okamžiku usmrcení nebo úhynu b ěhem studie makros ­
kopicky vyšet ří na strukturní odchylky nebo patologické zm ěny. 
S cílem minimalizovat neobjektivnost se posuzování samic b ěhem 
císařského řezu a následná fetální analýza provedou pokud možno 
bez znalosti experimentální skupiny.  
1.6.9  Vyšet ření děložního obsahu  
Okamžitě po usmrcení nebo co nejd říve po uhynutí se samicím 
vyjme děloha a zjistí se stav b řezosti. D ělohy, které nesv ědčí 
o gravidit ě, se dále vyšet ří (např. pomocí barvení sulfidem amonným 
u hlodavc ů a pomocí Salewského barvení nebo vhodnou alternativní 
metodou u králík ů) a potvrdí se negravidní stav (5).  
Gravidní d ěloha včetně děložního hrdla se zváží. Hmotnost gravidní 
dělohy by se nem ěla zjišťovat u zví řat, která b ěhem studie uhynula.  
U březích zvířat se zjistí po čet žlutých t ělísek.  
U děložního obsahu se vyšet ří počet úhynů embrya nebo plodu 
a počet životaschopných plod ů. Popíše se stupe ň resorpce, aby 
bylo možné odhadnout relativní dobu uhynutí zárodku (viz část 1.2).  
1.6.10  Vyšet ření plodů 
Zjistí se pohlaví a t ělesná hmotnost každého plodu.  
U každého plodu se vyšet ří zevní odchylky (6).  
U plodů se vyšet ří změny kostry a m ěkkých tkání (nap ř. odchylky 
a malformace nebo anomálie) (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24). Kategorizace fetálních zm ěn je vhodná, 
ale nikoli nezbytná. Pokud se kategorizace provede, m ěla by se jasn ě 
stanovit kritéria definování jednotlivých kategorií. Zvláštní pozornost 
je třeba věnovat rozmnožovací soustav ě, která se vyšet ří na přítom­
nost známek zm ěněného vývoje.
 
U hlodavc ů se pitvá p řibližně polovina každého vrhu, u n ěhož se 
vyšetří změny skeletu. Zbytek se pitvá a vyšet ří na přítomnost zm ěn 
měkkých tkání pomocí uznaných nebo vhodných metod postupných 
histologických řezů nebo důkladné pitvy.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
U nehlodavc ů, např. králíků, se prozkoumají jak zm ěny měkkých 
tkání, tak zm ěny skeletu všech plod ů. Opatrným odd ělením tkání 
se u těchto plod ů vyšetří změny měkkých tkání, p řičemž pitva 
může zahrnovat i postupy pro další vyhodnocení vnit řní stavby 
srdce (25). Hlavy poloviny plod ů zkoumaných tímto zp ůsobem se 
oddělí a použijí se k vyhodnocení zm ěn měkkých tkání (v četně očí, 
mozku, nosních dutin a jazyka), a to pomocí standardních metod postupného segmentování (26) nebo stejn ě citlivých metod. T ěla 
těchto i zbývajících neporušených plod ů se pitvají a vyšet ří na 
přítomnost zm ěn skeletu za použití stejných metod popsaných pro 
hlodavce.
 
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Výsledky se zaznamenají do tabulky samostatn ě pro samice a pro 
jejich potomky a u každé pokusné skupiny a každé generace se 
uvede po čet zvířat na za čátku zkoušky, po čet zvířat uhynulých 
během zkoušky nebo utracených z humánních d ůvodů, doba úhynu 
nebo humánního utracení, po čet březích samic, po čet zvířat vykazu ­
jících příznaky toxicity, popis p říznaků zjištěné toxicity v četně 
nástupu, trvání a závažnosti p řípadných toxických ú činků, typy 
pozorování embryí/plod ů a všechny d ůležité údaje o vrhu.  
Numerické výsledky se vyhodnotí vhodnou statistickou metodou, 
přičemž jako jednotka analýzy dat se použije vrh. Použije se 
všeobecně uznávaná statistická metoda; zvolí se jako sou část návrhu 
studie a musí být zd ůvodněna. Rovn ěž se uvedou údaje získané 
u zvířat, která nep řežila až do plánovaného usmrcení. Tyto údaje 
lze v případě potřeby zahrnout do skupinového pr ůměru. Význam 
údajů získaných od t ěchto zvířat i jejich zahrnutí nebo nezahrnutí do 
průměru skupiny by m ěly být odůvodněny a individuáln ě posouzeny.  
2.2 HODNOCENÍ VÝSLEDK Ů 
Výsledky studie prenatální vývojové toxicity se vyhodnotí na 
základě zjištěných účinků.Vyhodnocení bude obsahovat následující 
informace:  
— výsledky zkoušky u samic a embrya/plodu, v četně hodnocení 
vazeb nebo jejich absence mezi expozicí zví řat zkoušené látce 
a výskytem a závažností všech nález ů, 
— kritéria používaná pro kategorizaci zevních zm ěn, změn měkkých 
tkání a skeletu u plodu, pokud byla tato kategorizace provedena,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— případně předchozí kontrolní údaje ke snazšímu objasn ění 
výsledků studie,  
— číselné hodnoty používané p ři výpočtu všech procentuálních 
hodnot nebo koeficient ů, 
— případně odpovídající statistickou analýzu výsledk ů studie, která 
by měla zahrnovat dostate čné informace o metod ě analýzy, aby 
nezávislý posuzovatel/statistik mohl tuto analýzu p řehodnotit 
a zrekonstruovat.  
U studií, které prokazují nep řítomnost toxických ú činků, je třeba 
zvážit další zkoušky pro zjišt ění absorpce a biologické dostupnosti 
zkoušené látky.  
2.3 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Studie prenatální vývojové toxicity poskytuje informace o ú činku 
opakované expozice látce na b řezí samice a na nitrod ěložní vývoj 
jejich potomstva. Výsledky studie by m ěly být objasn ěny 
v souvislosti s výsledky ze subchronických, reproduk čních, toxiko ­
kinetických a dalších studií. Vzhledem k tomu, že se klade d ůraz jak 
na výslednou všeobecnou toxicitu z hlediska matky, tak i na 
vývojovou toxicitu, umožní výsledky této studie do ur čité míry 
rozlišit mezi vývojovými ú činky vyskytujícími se v nep řítomnosti 
všeobecné toxicity a mezi ú činky vyvolanými pouze na úrovních, 
které jsou toxické i pro b řezí zvířata (27).  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující specifické informace:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha, a je-li to podstatné, fyzikáln ě-chemické vlast ­
nosti,  
— identifika ční údaje, v četně čísla CAS, je-li známo nebo p řiděleno,  
— čistota.  
Vehikulum (je-li použito):  
— zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— počet a stáří zvířat; 
— původ, podmínky chovu, strava atd.,  
— individuální hmotnosti zví řat na začátku zkoušky.  
Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění výběru úrovně dávky,  
— podrobné údaje o p řípravě složení zkoušené látky/stravy, 
dosažené koncentraci, stabilit ě a homogenit ě přípravku,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— podrobné údaje o podávání zkoušené látky,  
— v případě potřeby přepočet koncentrace zkoušené látky (ppm) ve 
stravě/pitné vod ě na skute čnou dávku (mg na kg t ělesné hmot ­
nosti na den), je-li to možné,  
— podmínky prost ředí, 
— podrobné údaje o kvalit ě stravy a vody.  
Výsledky:  
Údaje o toxických reakcích matky podle dávky, nap ř.: 
— počet zvířat na začátku zkoušky, po čet zvířat, která p řežila, počet 
březích zví řat, počet zvířat, která potratila, a po čet zvířat, která 
předčasně vrhla,  
— den úhynu b ěhem studie anebo zda zví řata přežila až do dne 
usmrcení,  
— uvedou se údaje o zví řatech, která nep řežila do plánovaného 
usmrcení, nezahrnou se však do statistických srovnání dat pro skupiny,
 
— den zjišt ění každého abnormálního klinického p říznaku a jeho 
následný pr ůběh, 
— tělesná hmotnost, zm ěna tělesné hmotnosti a hmotnost gravidní 
dělohy, včetně případných údaj ů o změně tělesné hmotnosti kori ­
gované o hmotnost gravidní d ělohy,  
— spotřeba potravy, a m ěří-li se, spot řeba vody,  
— pitevní nálezy v četně děložní hmotnosti,  
— zaznamenají se hodnoty NOAEL ú činků na matku a vývojové 
účinky.  
Ukazatele vývojové toxicity podle dávky pro vrhy s implantáty, 
včetně: 
— počtu žlutých t ělísek,  
— počtu zahnízd ění, počtu a procenta živých a mrtvých plod ů 
a resorpcí,  
— počtu procentuálního podílu pre- a postimplanta čních ztrát.  
Ukazatele vývojové toxicity podle dávky pro vrhy s živými plody, 
včetně: 
— počtu a procentuálního podílu živých potomk ů, 
— poměru pohlaví,  
— fetální t ělesné hmotnosti, pokud možno podle pohlaví a pro ob ě 
pohlaví dohromady,  
— zevních malformací, malformací m ěkkých tkání a skeletu 
a jiných významných odchylek,  
— případně kritérií kategorizace,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— celkového po čtu a procentuálního podílu plod ů a vrhů 
s jakýmikoli zevními a kosterními odchylkami, odchylkami 
měkkých tkání a rovn ěž typů a výskyt ů individuálních anomálií 
a jiných významných odchylek.  
Diskuse o výsledcích.  
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399–410.  
2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386–398.
 
3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1–8.  
4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E- 
Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation 
Developmental Toxicity Study.  
5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experi ­
mentelle Pathologie  247; 367.  
6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology . D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171–173.  
8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32; 381–391.  
9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47; 229–242.  
10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476.
 
11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127; 291–306.  
12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of 
Foetal Maturity.  Teratology  11; 313–320.  
13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9; 398–408.  
14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309–316.  
15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169–181.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera.  Supplement to Teratology 
Workshop Manual , s. 163–173.  
17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind 
Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible 
Influence of the Sex Factor.  American Journal of Anatomy  41; 
411–445.  
18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red s Method for 
Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61–63.  
19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313–355.
 
20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
181–188.
 
21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton . Thomas, Springfield, IL.  
22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principles and Techniques,  Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, 
s. 251–277.  
23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of Tera ­
tology , Vol. 4. Plenum, NY.  
24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung . 28; 233–239.  
25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses.  Teratology  9; 37–38.  
26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal 
Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., Merker, 
H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, s. 126–144.
 
27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798–63826.  
28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnor ­
malities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Terato ­
logy 55; 249–292.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32  STUDIE KARCINOGENITY  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) 451 
(2009). P ůvodní pokyny TG 451 ke studiím karcinogenity byly schváleny 
v roce 1981. Revize zkušební metody B.32 byla považována za nezbytnou 
k zohledn ění nejnov ějšího vývoje v oblasti zajišt ění dobrých životních 
podmínek zví řat a regula čních požadavk ů (2), (3), (4), (5), (6). Aktualizace 
této zkušební metody B.32 se provád ěla paraleln ě s revizemi kapitoly B.30 
této přílohy, Studie chronické toxicity, a kapitoly B.33 této p řílohy, Kombi ­
novaná studie chronické toxicity/karcinogenity, s cílem získat další infor ­
mace o zví řatech použitých ve studii a poskytnout další podrobnosti 
o výběru dávky. Tato zkušební metoda B.32 je ur čena ke zkouškám široké 
škály chemických látek, v četně pesticid ů a průmyslových chemikálií. 
V případě farmaceutik se však n ěkteré detaily a požadavky mohou lišit 
(viz pokyny S1B Mezinárodní konference o harmonizaci (ICH) testování karcinogenity lék ů).
 
2. Většina studií karcinogenity se provádí na hlodavcích, a tato zkušební 
metoda je proto primárn ě určena k použití ve studiích provád ěných na 
těchto druzích. Je-li t řeba provést studie na jiných druzích nežli z řádu 
hlodavců, lze rovn ěž použít p říslušně pozměněné principy a postupy 
uvedené v této zkušební metod ě spolu s t ěmi, které jsou uvedeny 
v kapitole B.27 této p řílohy, Studie orální toxicity na nehlodavcích – 
90denní opakovaná aplikace (6). Další pokyny jsou k dispozici 
v pokynech OECD č. 116 o p řípravě a provád ění studií chronické toxicity 
a karcinogenity (7).  
3. Třemi hlavními zp ůsoby podávání používanými ve studiích karcinogenity 
jsou orální podávání, dermální aplikace a inhala ční podávání. Výb ěr cesty 
podání závisí na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené chemické 
látky a na p řevládající cest ě expozice u lidí. Další informace o výb ěru cesty 
expozice jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).  
4. Tato zkušební metoda se zam ěřuje na expozici orální cestou, což je cesta, 
která se ve studiích karcinogenity používá nejb ěžněji. Přestože studie karci ­
nogenity zahrnující expozici dermální nebo inhala ční cestou mohou být pro 
posouzení rizik pro lidské zdraví rovn ěž nezbytné a/nebo mohou být 
vyžadovány v rámci ur čitých regula čních režim ů, jsou studie používající 
tyto cesty expozice zna čně technicky složité. Takové studie je t řeba navr­
hovat individuáln ě pro daný p řípad, přestože zde uvedená zkušební metoda 
pro posouzení a vyhodnocení karcinogenity p ři orálním podávání by mohla 
tvořit základ protokolu pro studie inhala ční a/nebo dermální, pokud jde 
o doporu čení pro období expozice, klinické a patologické parametry atd. 
Jsou k dispozici pokyny OECD týkající se podávání zkoušených chemic ­
kých látek dermální (7) a inhala ční cestou (7), (8). P ři navrhování dlouho ­
dobých studií zahrnujících expozici inhala ční cestou by se m ělo konkrétn ě 
nahlédnout do kapitoly B.8 této p řílohy (9) a kapitoly B.29 této p řílohy (10) 
a rovněž do pokyn ů OECD pro zkoušení akutní inhala ční toxicity (8). 
V případě, že se zkoušky provád ějí dermální cestou, je t řeba nahlédnout 
do kapitoly B.9 této p řílohy (11).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Studie karcinogenity poskytuje informace o možných rizikách pro zdraví, 
která mohou pravd ěpodobně vzniknout p ři opakované expozici trvající až 
celou dobu života použitých druh ů. Studie rovn ěž poskytne informace 
o toxických ú čincích zkoušené chemické látky, v četně potenciální karcino ­
genity, a m ůže určit cílové orgány a možnost akumulace. M ůže také pro 
toxické ú činky poskytnout odhad hodnoty dávky nevyvolávající pozorova ­
telné nepříznivé účinky a v p řípadě negenotoxických karcinogen ů pro nádo ­
rové odpov ědi, což lze použít p ři stanovení kritérií pro bezpe čnou expozici 
člověka. Důraz se klade také na pe člivé klinické pozorování zví řat s cílem 
získat co nejvíce informací.  
6. Cíle studií karcinogenity zahrnutých v této zkušební metod ě jsou:  
— identifikace karcinogenních vlastností zkoušené chemické látky vedou ­
cích ke zvýšenému výskytu novotvar ů, zvýšenému podílu maligních 
novotvarů nebo snížení doby do vzniku novotvar ů ve srovnání se soub ě­ 
žnými kontrolními skupinami,  
— identifikace cílového orgánu (cílových orgán ů) karcinogenity,  
— identifikace doby do vzniku novotvar ů, 
— charakterizace vztahu mezi dávkou a nádorovou odezvou,  
— určení hodnoty dávky bez pozorovaného nep říznivého ú činku (NOAEL) 
nebo výchozího bodu pro stanovení referen ční dávky (BMD),  
— extrapolace karcinogenních ú činků na nízké úrovn ě expozice člověka, 
— získání údaj ů k ověření hypotéz o zp ůsobu účinku (2), (7), (12), (13), 
(14), (15).  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
7. Zkušební laborato ř by měla před provedením studie vzít v úvahu p ři posu­
zování a hodnocení potenciální karcinogenity zkoušené chemické látky veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, aby zam ěřila uspo­ 
řádání studie sm ěrem k účinnějšímu zkoušení karcinogenního potenciálu 
a minimalizovala použití zví řat. Obzvláš ť důležité jsou informace 
o způsobu účinku potenciálního karcinogenu a jeho posouzení (2), (7), 
(12), (13), (14), (15), nebo ť optimální uspo řádání studie se m ůže lišit 
podle toho, zda je zkoušená chemická látka známým genotoxickým karci ­
nogenem nebo je u ní pouze podez ření na genotoxickou karcinogenitu. Další 
pokyny k rozvahám o zp ůsobu účinku jsou uvedeny v pokynech č. 116 (7).
 
8. Mezi informace, které usnadní vytvá ření plánu studie, pat ří identita zkou ­ 
šené chemické látky, její chemická struktura a fyzikáln ě-chemické vlastnosti, 
výsledky všech test ů toxicity  in vitro  nebo  in vivo  včetně testů genotoxicity, 
předpokládaná použití a potenciální expozice u člověka, dostupné 
údaje (Q)SAR, údaje o mutagenit ě/genotoxicit ě, karcinogenita a další toxi ­
kologické údaje o strukturn ě příbuzných chemických látek, dostupné toxi ­
kokinetické údaje (kinetika p ři jednorázové dávce a rovn ěž při opakovaných 
dávkách, je-li k dispozici) a údaje získané v jiných studiích s opakovanou 
expozicí. Zhodnocení karcinogenity by se m ělo provád ět po získání prvot ­
ních informací o toxicit ě z 28denních a/nebo 90denních zkoušek toxicity  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
v opakovaných dávkách. Krátkodobé zkoušky iniciace–propagace nádoru 
mohou rovn ěž poskytnout užite čné informace. Jako sou část celkového zhod ­
nocení potenciálních nep říznivých ú činků konkrétní zkoušené chemické 
látky na zdraví by se m ěl zvážit postup zkoušení provád ěný po fázích p ři 
zkouškách karcinogenity (16), (17), (18), (19).  
9. Nejvhodn ější statistické metody pro analýzu výsledk ů s ohledem na uspo ­ 
řádání a cíle experimentu by se m ěly stanovit p řed zahájením studie. Je 
třeba zvážit, zda by m ěla statistika zahrnovat korekci na p řežití, analýzu 
kumulativních nádorových rizik ve vztahu k dob ě přežití, analýzu doby do 
vzniku nádoru a analýzu v p řípadě předčasného ukon čení zkoušky u jedné 
nebo více skupin. Pokyny ohledn ě vhodných statistických analýz a klí čové 
odkazy na mezinárodn ě uznávané statistické metody jsou uvedeny 
v Pokynech č. 116 (7) a rovn ěž v Pokynech č. 35 o analýze a hodnocení 
studií chronické toxicity a karcinogenity (20).  
10. Při provád ění studie karcinogenity je nutné řídit se vždy zásadami 
a úvahami uvedenými v Pokynech OECD č. 19 k rozpoznání, vyšet ření 
a použití klinických p říznaků jako lidských cílových parametr ů 
u pokusných zví řat používaných p ři hodnocení bezpe čnosti (21), zejména 
v odstavci 62 t ěchto pokyn ů. Tento odstavec uvádí, že „ Ve studiích zahrnu ­
jících opakované podávání dávky by se m ělo v případě, kdy zvíře vykazuje 
klinické p říznaky, které jsou progresivní a vedou k dalšímu zhoršení jeho 
stavu, učinit informované rozhodnutí, zda zví ře humánn ě utratit, či ne. Toto 
rozhodnutí by m ělo obsahovat posouzení hodnoty informací, které se získají, 
bude-li se zví ře i nadále udržovat ve studii, oproti jeho celkovému stavu. 
Dospěje-li se k rozhodnutí pokra čovat u zví řete ve zkoušce, m ěla by se dle 
potřeby zvýšit četnost pozorování. Rovn ěž je možné, aniž by to nep říznivě 
ovlivnilo ú čel zkoušky, do časně pozastavit podávání dávky, jestliže to zmírní 
bolest či utrpení, nebo snížit zkoušenou dávku. “ 
11. Podrobné pokyny a diskuse o principech výb ěru dávky pro studie chronické 
toxicity a karcinogenity naleznete v Pokynech č. 116 (7) a rovn ěž ve dvou 
publikacích ústavu International Life Sciences Institute (22) (23). Hlavní 
strategie výb ěru dávky závisí na primárním cíli nebo cílech studie 
(odstavec 6). P ři výběru vhodných úrovní dávky by se m ělo dosáhnout 
rovnováhy mezi screeningem nebezpe čnosti na stran ě jedné 
a charakterizací odezvy na nízkou dávku a jejich významu na stran ě druhé. 
To je důležité zejména v situaci, kdy je nutné provést kombinovanou studii 
chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této p řílohy) (odstavec 12).  
12. Mělo by se zvážit, zda rad ěji neprovést kombinovanou studii chronické 
toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této p řílohy), a ne samostatné 
provedení studie chronické toxicity (tato zkušební metoda B.30) a studie karcinogenity (kapitola B.32 této p řílohy). Kombinovaná zkouška zajiš ťuje 
větší efektivitu ve smyslu času a náklad ů v porovnání s provád ěním dvou 
samostatných studií a zárove ň nezhoršuje kvalitu údaj ů ani ve fázi zkoušení 
chronické toxicity, ani ve fázi zkoušení karcinogenity. P ři provádění kombi­
nované studie chronické toxicity a karcinogenity (kapitola B.33 této p řílohy) 
však je t řeba pečlivě zvážit zásady výb ěru dávky (odstavce 11 a 22–25) 
a rovněž se uznává, že v ur čitých regula čních rámcích mohou být vyžado ­
vány samostatné studie.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této 
kapitoly a v Pokynech č. 116 (7).  
PODSTATA ZKOUŠKY  
14. Zkoušená chemická látka se podává denn ě v odstup ňovaných dávkách n ěko­
lika skupinám pokusných zví řat po většinu jejich života, obvykle orální 
cestou. Expozice inhala ční nebo dermální cestou m ůže být rovn ěž vhodná. 
Zvířata se pečlivě sledují s ohledem na p říznaky toxicity a rozvoj neoplas ­
tických lézí. Zví řata, která v pr ůběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, 
se pitvají a na konci zkoušky se p řeživší zví řata utratí a rovn ěž pitvají.  
POPIS METODY  
Výběr zvířecích druh ů 
15. Tato zkušební metoda se primárn ě zabývá posouzením a vyhodnocením 
karcinogenity u hlodavc ů (odstavec 2). Použití nehlodavc ů je možné zvážit, 
pokud dostupné údaje nazna čují, že jsou pro p ředpověď účinků na lidské 
zdraví vhodn ější. Výběr druhu by m ěl být zdůvodněn. Upřednostňovaným 
druhem hlodavc ů je potkan, ale lze použít i jiný druh hlodavc ů, např. myš. 
Přestože použití myší ve zkouškách karcinogenity m ůže mít omezený užitek 
(24), (25), (26), jsou v n ěkterých stávajících regula čních programech 
zkoušky karcinogenity na myších ješt ě stále vyžadovány, pokud se nepro ­
káže, že taková studie není z v ědeckého hlediska nezbytná. Krysy a myši 
jsou upřednostňovanými experimentálními modelovými organismy díky své 
relativně krátké dob ě života, široce rozší řenému použití ve farmakologic ­
kých a toxikologických studiích, citlivosti k indukci nádoru a dostupnosti 
dostatečně charakterizovaných kmen ů. V důsledku těchto vlastností je 
k dispozici velké množství informací o jejich fyziologii a patologii. Další informace o výb ěru druhu a kmene jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).
 
16. Měla by se použít mladá zdravá dosp ělá zvířata běžně používaných 
laboratorních kmen ů. Studie karcinogenity by se m ěla provád ět nejlépe na 
zvířatech ze stejného kmene a zdroje, jako byla zví řata použitá v kratších 
předběžných studiích toxicity, i když je-li známo, že zví řata z tohoto kmene 
a zdroje nedosahují b ěžně uznávaných kritérií p řežití v dlouhodobých 
studiích [viz Pokyny č. 116 (7)], m ěla by se zvážit možnost použít 
takový kmen zví řat, který má p řijatelnou míru p řežití v dlouhodobé studii. 
Samice musí být nullipary a nesm ějí být březí. 
Umístění a krmení zví řat 
17. Zvířata lze chovat jednotliv ě nebo v klecích po malých skupinkách jedinc ů 
stejného pohlaví. Individuální chov by se m ěl použít pouze, je-li to v ědecky 
odůvodněné (27), (28), (29). Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby byl 
případný vliv jejich polohy minimalizován. Teplota v místnosti pro pokusná 
zvířata by měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by m ěla být 
minimáln ě 30 % a pokud možno nep řesáhnout 70 % krom ě doby čištění 
místnosti, cílem by m ěla být hodnota 50–60 %. Osv ětlení by m ělo být 
umělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Ke krmení 
lze použít konven ční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. 
Strava by m ěla splňovat všechny nutri ční požadavky zkoušených druh ů 
a obsah p říměsí v krmivu zahrnující mimo jiné zbytky pesticid ů, perzistentní  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
organopolutanty, fytoestrogeny, t ěžké kovy a mykotoxiny, které mohou 
ovlivnit výsledek zkoušky, by m ěl být co možná nejnižší. Pravideln ě by 
se měly získávat analytické informace o nutri čních hodnotách stravy 
a množství p říměsí ve strav ě, alespoň na začátku studie a pokaždé, když 
se změní používaná šarže, a m ěly by se za členit do záv ěrečné zprávy. 
Obdobně by se m ěla poskytnout analýza pitné vody. Výb ěr krmiva m ůže 
být ovlivn ěn nutností zajistit vhodnou p řísadu zkoušené chemické látky, 
podává-li se látka v krmivu, a splnit nutri ční potřeby zvířat. 
Příprava zví řat 
18. Použijí se zdravá zví řata, která se alespo ň 7 dnů aklimatizovala na labora ­
torní podmínky a která nebyla d říve podrobena žádným experimentálním 
postupům. V případě hlodavců by se mělo podávání látky zahájit co možná 
nejdříve po jejich odstavení a aklimatizaci, nejlépe p řed dosažením stá ří 8 
týdnů. Pokusná zví řata by m ěla být charakterizována podle druhu, kmenu, 
původu, pohlaví, hmotnosti a stá ří. Na začátku studie by m ěly být odchylky 
hmotnosti zví řat u každého pohlaví minimální a nem ěly by překročit ± 20 % 
průměrné hmotnosti pro všechna zví řata ve studii, pro každé pohlaví zvláš ť. 
Zvířata by m ěla být rozd ělena náhodným výb ěrem do kontrolních 
a experimentálních skupin. Po randomizaci by nem ěly být výrazné rozdíly 
v průměrných hodnotách t ělesné hmotnosti mezi skupinami v rámci každého 
pohlaví. Existují-li statisticky významné rozdíly, m ěla by se randomizace 
pokud možno zopakovat. Každému zví řeti by se m ělo přidělit jedine čné 
identifika ční číslo a mělo by se tímto číslem trvale ozna čit pomocí tetování, 
implantací mikro čipu nebo jinou vhodnou metodou.  
POSTUP  
Počet a pohlaví zví řat 
19. Měla by se použít ob ě pohlaví. M ěl by se použít dostate čný počet zvířat 
umožňující důkladné biologické a statistické vyhodnocení. Každá expono ­
vaná skupina a soub ěžná kontrolní skupina by proto m ěla obsahovat alespo ň 
50 zvířat od každého pohlaví. V závislosti na cíli studie m ůže být možné 
zvýšit statistickou sílu klí čových odhad ů rozdělením zví řat nerovnom ěrně do 
skupin s r ůznými dávkami, p řičemž do skupin s nízkou dávkou se za řadí 
více než 50 zví řat, např. aby se odhadl karcinogenní potenciál p ři nízkých 
dávkách. Mírným zvýšením velikosti skupiny však statistická síla studie 
vzroste jen relativn ě málo. Další informace o statistickém uspo řádání studie 
a výběru úrovní dávek k maximalizaci statistické síly jsou uvedeny 
v Pokynech č. 116 (7).  
Zajištění předběžných utracení a satelitních (ov ěřovacích) skupin  
20. Studie m ůže zajistit zví řata pro předběžná utracení nap ř. v 12. měsíci, aby se 
získaly informace o progresi neoplastických zm ěn a mechanistické infor ­
mace, je-li to v ědecky od ůvodněné. Jsou-li tyto informace již k dispozici 
z předchozích studií toxicity zkoušené chemické látky po opakovaných 
dávkách, nemusí být p ředběžná utracení v ědecky od ůvodněná. Pokud jsou 
v plánu studie zahrnuta p ředběžná utracení zví řat, v každé exponované 
skupině určených k p ředběžnému utracení je obvykle 10 zví řat od každého 
pohlaví a celkový po čet zvířat zařazených do studie je nutno zvýšit o po čet 
zvířat, která budou usmrcena p řed ukončením studie. Také je možné za řadit 
do studie další skupinu ov ěřovacích zví řat (obvykle 5 zví řat od každého 
pohlaví) k monitorování stavu onemocn ění v průběhu studie, je-li to nutné 
(30). Další pokyny jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Dávkové skupiny a dávkování  
21. Pokyny ohledn ě veškerých aspekt ů výběru dávky a odstup ňování úrovní 
dávek jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). M ěly by se použít alespo ň tři 
úrovně dávek a soub ěžná kontrola. Úrovn ě dávek budou obecn ě vycházet 
z výsledk ů krátkodobých studií p ři opakované aplikaci nebo ze studií 
k stanovení rozsahu dávkování a m ěly by zohlednit jakékoli existující toxi ­
kologické a toxikokinetické údaje dostupné pro zkoušenou slou čeninu nebo 
příbuzné materiály.  
22. Nebrání-li tomu fyzikáln ě-chemická povaha nebo biologické ú činky zkou ­ 
šené chemické látky, m ěla by se zvolit nejvyšší úrove ň dávky za ú čelem 
identifikace hlavních cílových orgán ů a toxických ú činků, která by však 
zároveň neměla vést k utrpení, závažné toxicit ě, morbidit ě nebo uhynutí. 
Za současného zohledn ění faktorů uvedených v odstavci 23 níže by se m ěla 
vybrat taková nejvyšší dávka, aby vyvolala p říznaky toxicity, nap ř. pokles 
přírůstku tělesné hmotnosti (p řibližně 10 %). Nicmén ě v závislosti na cílech 
studie (viz odstavec 6) je možné zvolit nejvyšší dávku nižší, než je dávka dokazující toxicitu, nap ř. jestliže dávka vyvolává nep říznivý účinek, který 
však má jen malý dopad na délku života nebo t ělesnou hmotnost.
 
23. Je možné zvolit úrovn ě dávek a odstup ňování úrovní dávek ke stanovení 
vztahu mezi dávkou a odezvou a NOAEL nebo jiných plánovaných výsledků studie, nap ř. BMD (viz odstavec 25) na nejnižší úrovni dávky, 
a to v závislosti na zp ůsobu účinku zkoušené chemické látky. Mezi faktory, 
které by se m ěly zvážit p ři určování nižších dávek, pat ří předpokládaná 
směrnici křivky závislosti odezvy na dávce, dávky, p ři kterých mohou nastat 
důležité zm ěny v metabolismu nebo zp ůsobu toxického ú činku, kde se 
předpokládá prahová hodnota nebo kde se p ředpokládá výchozí bod pro 
extrapolaci do oblasti nízkých dávek.
 
24. Interval mezi jednotlivými úrovn ěmi dávek bude záviset na vlastnostech 
zkoušené chemické látky a není možno jej v této zkušební metod ě přede­
psat, avšak dvou až čtyřnásobné intervaly obvykle vedou k dobré funk čnosti 
zkoušky, použijí-li se k nastavení klesajících úrovní dávek; často se up řed­
nostňuje zařazení čtvrté zkušební skupiny p řed použitím velmi velkých 
intervalů (např. více než p řibližně 6–10násobek) mezi dávkami. Obecn ě je 
třeba vyhnout se použití koeficient ů větších než 10 a jejich p řípadné použití 
by se mělo zdůvodnit.  
25. Jak je dále probráno v Pokynech č. 116 (7), je t řeba při výběru dávky zvážit 
tyto body:  
— známá nebo p ředpokládaná nelinearita či inflexní body na k řivce 
závislosti odezvy na dávce,  
— toxikokinetika a rozsahy dávkování, p ři kterých dochází nebo nedochází 
k metabolické indukci, saturaci nebo nelinearit ě mezi vn ějšími 
a vnitřními dávkami,  
— prekurzorové léze, známky ú činku nebo indikátory probíhajících klí čo­
vých základních biologických proces ů, 
— klíčové (nebo p ředpokládané) aspekty zp ůsobu účinku, nap říklad dávky, 
při kterých za číná vzrůstat cytotoxicita, narušují se hladiny hormon ů, 
homeostatické mechanismy jsou ochromeny atd.,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— oblasti k řivky závislosti odezvy na dávce, kde je nutný obzvláš ť robustní 
odhad, nap ř. v rozsahu p ředpokládané BMD nebo prahové hodnoty,  
— zvážení p ředpokládaných úrovní expozice člověka. 
26. Kontrolní skupina je neexponovaná skupina nebo kontrolní skupina 
s nosičem, pokud se nosi č při podávání zkoušené chemické látky používá. 
S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je t řeba se zví řaty v kontrolní 
skupině zacházet stejným zp ůsobem jako se zví řaty v experimentálních 
skupinách. Používá-li se nosi č, podá se kontrolní skupin ě v nejvyšším 
používaném objemu v rámci skupin. Jestliže se zkoušená chemická látka 
podává v krmivu a zp ůsobuje podstatné snížení p říjmu potravy v d ůsledku 
snížené chutnosti krmiva, m ůže být užite čné použít další kontrolní skupinu 
krmenou tak, aby m ěla stejně snížený p říjem potravy, která poslouží jako 
vhodnější kontrola.  
Příprava dávek a podávání zkoušené chemické látky  
27. Zkoušená chemická látka se obvykle podává oráln ě, v krmivu či v pitné 
vodě nebo sondou. Další informace o cestách a zp ůsobech podání jsou 
uvedeny v Pokynech č. 116 (7). Cesta a zp ůsob podání závisí na ú čelu 
studie, fyzikáln ě-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, její 
biologické dostupnosti a p řevládající cest ě a způsobu expozice člověka. 
Mělo by se uvést zd ůvodnění zvolené cesty a zp ůsobu podání. V zájmu 
zajištění dobrých životních podmínek zví řat by se m ělo podávání žalude ční 
sondou zvolit pouze u t ěch látek, u nichž tato cesta a zp ůsob podání náležit ě 
reprezentují potenciální expozici člověka (např. farmaceutika). Chemické 
látky, které se nacházejí v potrav ě nebo životním prost ředí, včetně pesticidů, 
se obvykle podávají v krmivu nebo pitné vod ě. Nicmén ě u některých 
scénářů expozice, nap ř. expozice na pracovišti, mohou být vhodn ější jiné 
cesty podání.  
28. Zkoušená chemická látka se v p řípadě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve 
vhodném nosi či. Případně je třeba zvážit následující vlastnosti nosi če nebo 
jiných přídatných látek: ú činky na absorpci, distribuci, metabolismus nebo 
retenci zkoušené chemické látky, ú činky na chemické vlastnosti zkoušené 
chemické látky, které mohou zm ěnit její toxické vlastnosti a ú činky na 
konzumaci krmiva nebo vody či na nutri ční stav zví řat. Je-li to možné, 
doporučuje se zvážit nejprve použití vodného roztoku/suspenze, poté použití 
roztoku/emulze v oleji (nap ř. v kuku řičném oleji) a nakonec roztoku 
v jiných nosi čích. U nosi čů jiných než voda je nutné znát jejich toxické 
vlastnosti. M ěly by být k dispozici informace o stabilit ě zkoušené chemické 
látky a homogenit ě podávaných roztok ů nebo krmiva (dle pot řeby) za 
podmínek podávání (nap ř. v krmivu).  
29. U látek podávaných v krmivu nebo v pitné vod ě je důležité zajistit, aby 
množství použité zkoušené chemické látky neovliv ňovalo normální výživu 
nebo vodní rovnováhu. V dlouhodobých studiích toxicity s podáváním látky v krmivu by koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu obvykle horní 
mez nem ěla přesáhnout 5 % celkového množství krmiva, aby se zabránilo 
nutriční nerovnováze. Podává-li se zkoušená chemická látka v krmivu, m ůže 
se použít bu ď konstantní koncentrace v krmivu (mg/kg krmiva nebo ppm) 
nebo konstantní dávkování v pom ěru k tělesné hmotnosti zví řete (mg/kg 
tělesné hmotnosti), která se vypo čítá jednou týdn ě. Použitá možnost by se 
měla specifikovat.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. V případě orálního podávání se zví řatům podává zkoušená chemická látka 
denně (sedm dn ů v každém týdnu), u hlodavc ů obvykle po dobu 24 m ěsíců 
(viz také odstavec 32). Jakýkoli jiný režim podávání, nap ř. pět dní v týdnu, 
musí být zd ůvodněn. V případě dermální aplikace se zví řata vystavují zkou ­ 
šené chemické látce alespo ň po dobu 6 hodin denn ě, 7 dnů v týdnu, jak je 
specifikováno v kapitole B.9 této p řílohy (11) po dobu 24 m ěsíců. Expozice 
inhalační cestou se provádí 6 hodin denn ě, 7 dnů v týdnu, avšak je možné 
použít i expozici 5 dn ů v týdnu, je-li zd ůvodněna. Období expozice obvykle 
trvá 24 m ěsíců. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné druhy 
hlodavců než potkani, je možné upravit maximální doby expozice za ú čelem 
minimalizace druhov ě specifického utrpení. Používá-li se expozice kratší 
než 6 hodin denn ě, je třeba uvést zd ůvodnění. Viz také kapitola B.8 této 
přílohy (9).  
31. Pokud se zkoušená chemická látka podává zví řatům nitrožalude čně, mělo by 
se to provád ět žaludeční sondou nebo vhodnou intuba ční kanylou, vždy 
v přibližně stejnou denní dobu. Obvykle se podává jedna dávka jednou 
denně. Pokud je nap ř. chemická látka lokáln ě dráždící, je možné denní 
dávku podávat rozd ělenou na dv ě dávky (dvakrát denn ě). Maximální 
objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, závisí na velikosti pokusného 
zvířete. Objem by se m ěl udržovat co možná nejnižší a u hlodavc ů by 
obvykle nem ěl přesáhnout 1 ml/100 g t ělesné hmotnosti (31). Kolísání 
objemu zkoušené chemické látky by se m ělo omezit nastavením koncentrace 
tak, aby se zajistil konstantní objem na všech úrovních dávek. Potenciáln ě 
žíravé nebo dráždivé chemické látky jsou výjimkou a je nutné je na ředit, 
aby se zamezilo závažným lokálním ú činkům. Zkoušky p ři koncentracích, 
které by pravd ěpodobně vedly k poleptání nebo podrážd ění gastrointestinál ­
ního traktu, by se nem ěly provád ět. 
Délka studie  
32. Délka studie u hlodavc ů je obvykle 24 m ěsíců, což představuje v ětší část 
normální délky života používaných zví řat. Trvání studie je možné zkrátit 
nebo prodloužit podle délky života kmene zví řecího druhu použitého ve 
studii, mělo by se však uvést zd ůvodnění. U určitých kmen ů myší, nap ř. 
AKR/J, C3H/J nebo C57BL/6J, m ůže být vhodn ější délka studie 18 m ěsíců. 
Dále jsou uvedeny pokyny ohledn ě délky a ukon čení studie a p řežití. Další 
pokyny v četně posouzení p řijatelnosti negativní karcinogenity vzhledem 
k přežití ve studii jsou uvedeny v pokynech OECD č. 116 o Uspo řádání 
a provádění studií chronické toxicity a karcinogenity (7).  
— O ukon čení studie by se m ělo uvažovat v p řípadě, kdy počet přeživších 
zvířat ve skupinách s nižší dávkou nebo v kontrolní skupin ě poklesne 
pod 25 %.  
— V případě, kdy v d ůsledku toxicity p ředčasně uhynou zví řata pouze ve 
skupině s vysokou dávkou, by se studie ukon čit neměla. 
— Přežití každého pohlaví by se m ělo posuzovat odd ěleně. 
— Studie by se nem ěla dosáhnout míry, p ři které již údaje ze studie nepo ­
stačují k provedení statisticky platného zhodnocení.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
POZOROVÁNÍ  
33. Měla by se kontrolovat morbidita nebo mortalita u všech zví řat, obvykle na 
začátku a na konci každého dne, v četně víkendů a svátků. Dále by se m ělo 
jednou denn ě kontrolovat, zda zví řata nevykazují konkrétní p říznaky toxi ­
kologického významu a v p řípadě podání nitrožalude čně by se m ěla vzít 
v úvahu doba o čekávaných maximálních ú činků po podání látky. Zvláštní 
pozornost je t řeba věnovat rozvoji nádor ů a mělo by se zaznamenat, kdy se 
nádor objeví, kde, jeho rozm ěry, vzhled a progrese každého viditelného 
nebo hmatného tumoru.  
Tělesná hmotnost, spot řeba krmiva/vody a využitelnost krmiva  
34. Všechna zví řata by se m ěla zvážit na za čátku expozice, alespo ň jednou 
týdně během prvních 13 týdn ů a poté alespo ň jednou m ěsíčně. Měření 
spotřeby krmiva a využitelnosti krmiva by se m ěla provád ět alespoň jednou 
týdně během prvních 13 týdn ů a poté alespo ň jednou m ěsíčně. Spotřeba 
vody by se m ěla měřit alespoň jednou týdn ě během prvních 13 týdn ů a poté 
alespoň jednou m ěsíčně, podává-li se chemická látka v pitné vod ě. Měření 
spotřeby vody by se m ělo zvážit také v p řípadě studií, p ři kterých m ůže 
dojít ke zm ěně příjmu tekutin.  
Hematologická, klinická biochemická vyšet ření a další m ěření 
35. Aby se ze studie získalo co nejvíce informací, zejména pro úvahy o zp ůsobu 
účinku, je možno dle uvážení vedoucího studie odebrat vzorky krve pro 
hematologická a klinická biochemická vyšet ření. Rovn ěž může být vhodné 
provést rozbor mo či. Další pokyny k významu odb ěru těchto vzork ů v rámci 
studie karcinogenity jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). Považuje-li se to 
za vhodné, je možno provést odb ěry vzorků pro hematologická a klinická 
biochemická vyšet ření a rozbor mo či jako sou část předběžného utracení 
(odstavec 20) a na konci studie u nejmén ě 10 zvířat od každého pohlaví 
v každé skupin ě. Krevní vzorky by se m ěly odebírat v anestezii z ur čeného 
místa, nap říklad srde ční punkcí nebo z retroorbitálního sinu, a m ěly by se 
případně uchovávat ve vhodných podmínkách. Také je možno p řipravit 
k vyšetření krevní nát ěry, zejména pokud se zdá, že je cílovým orgánem 
kostní dřeň, přestože hodnota takového vyšet ření k zhodnocení karcinogen ­
ního/onkogenního potenciálu se zpochyb ňuje (32).  
PATOLOGIE  
Pitva  
36. U všech zví řat zařazených do studie (krom ě ověřovacích zví řat a ostatních 
satelitních zví řat, viz odstavec 20) se provede celková podrobná pitva 
zahrnující pe člivé vyšet ření povrchu t ěla, všech otvor ů a lebeční, hrudní 
a břišní dutiny a jejich obsahu. V jednotlivých p řípadech a dle uvážení 
vedoucího studie m ůže být třeba provést pitvu ov ěřovacích a ostatních sate ­
litních zví řat. Měření hmotnosti orgán ů obvykle nebývá sou částí studie 
karcinogeneze, nebo ť geriatrické zm ěny a v pozd ějších stádiích rozvoj 
nádorů maří použitelnost údaj ů o hmotnosti orgán ů. Mohou však být 
velmi důležité pro hodnocení pr ůkaznosti d ůkazů, a zejména pro úvahy 
o způsobu účinku. Jsou-li sou částí satelitní studie, m ěly by se získat nejpoz ­
ději jeden rok po zahájení studie.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Následující tkán ě by se měly konzervovat v nejvhodn ějším fixačním médiu 
s ohledem na typ tkán ě a plánovaná následná histopatologická vyšet ření (33) 
(tkáně v hranatých závorkách jsou volitelné): 
všechny makroskopicky 
viditelné léze srdce slinivka b řišní žaludek (p ředžaludek, 
žláznatý žaludek) 
nadledvinka  ileum  p říštítná tělíska [zuby] 
aorta  jejunum  periferní nerv varlata 
mozek (zahrnující řezy 
mozkových hemisfér, 
mozečku a prodloužené 
míchy/Varolova mostu) ledviny hypofýza brzlík 
slepé střevo slzní žláza (extraorbi ­
tální) prostata štítná žláza 
cervix játra rektum [jazyk] 
koagulační žláza plíce slinná žláza pr ůdušnice 
tlusté střevo lymfatické uzliny 
(povrchové i hluboké) semenný vá ček mo čový měchýř 
dvanáctník prsní žláza (povinné 
u samic a, je-li z řejmé, 
že je možné ji vyprepa ­
rovat, i u samc ů) kosterní sval d ěloha (včetně hrdla dělo­ 
žního) 
nadvarle [horní cesty dýchací, 
včetně nosu, nosních 
skořep a vedlejších dutin 
nosních] kůže [mo čovod] 
oko (včetně sítnice) jícen mícha (ve t řech úrov­
ních: krční, střední 
hrudní a bederní) [močová trubice] 
[femur  s kloubem] [ Bulbus olfactorius ] slezina pochva 
žlučník (u jiných druh ů než 
potkan) vaječníky [ sternum ], řez kostní d ření a/nebo 
čerstvý aspirát kostní d řeni 
Harderova žláza  
V případě párových orgán ů, např. ledvin či nadledvinek, by se m ěly ucho­
vávat oba orgány. Na základ ě klinických nebo jiných nález ů může být 
nezbytné zkoumat i další tkán ě. Také by se m ěly uchovat všechny orgány 
považované na základ ě známých vlastností zkoušené chemické látky za 
možné cílové orgány. Ve studiích s dermální cestou aplikace by se m ěl 
zachovat seznam orgán ů stanovený pro orální cestu, a navíc je nezbytné 
odebrat a konzervovat vzorky k ůže z místa aplikace. V inhala čních studiích 
by se měl seznam tkání z dýchacích cest ur čených ke konzervaci a vyšet ření 
řídit doporu čeními v kapitole B.8 a B.29 této p řílohy. Co se týká ostatních 
orgánů/tkání (krom ě specificky konzervovaných tkání z dýchacích cest) by 
se měly vyšetřit orgány uvedené na seznamu orgán ů určeném pro orální 
cestu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatologické vyšet ření 
38. Jsou k dispozici pokyny ohledn ě osvědčených postup ů při provádění toxi­
kologických patologických studií (33). M ěly by se vyšet řit minimáln ě tyto 
tkáně: 
— všechny tkán ě ve skupinách s vysokou dávkou zkoušené chemické látky 
a kontrolních skupinách,  
— všechny tkán ě zvířat uhynulých nebo utracených b ěhem studie,  
— všechny tkán ě vykazující makroskopické abnormality v četně nádorů, 
— pokud jsou ve skupin ě s vysokou dávkou pozorovány histopatologické 
změny související s expozicí, m ěly by se stejné tkán ě vyšetřit u všech 
zvířat ve všech ostatních exponovaných skupinách,  
— v případě párových orgán ů, např. ledvin, nadledvinek, by se m ěly 
vyšetřit oba orgány.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Údaje  
39. Měly by se uvést údaje o všech hodnocených parametrech u každého jedno ­
tlivého zví řete. Krom ě toho by se m ěly všechny údaje shrnout do tabulky, 
přičemž se uvede u každé experimentální skupiny po čet zvířat na začátku 
zkoušky, po čet zvířat nalezených uhynulých v pr ůběhu zkoušky nebo utra ­
cených z humánních d ůvodů a doba úmrtí nebo utracení, po čet zvířat 
vykazujících p říznaky toxicity, popis p říznaků toxicity, v četně doby 
nástupu, trvání a závažnosti každého toxického ú činku, počet zvířat vykazu ­
jících léze, typ lézí a procento zví řat vykazujících p říslušný typ léze. 
Tabulky se souhrnnými údaji by m ěly uvádět průměrné hodnoty 
a směrodatné odchylky (u pr ůběžných dat ze zkoušky) u zví řat vykazujících 
toxické ú činky nebo léze a také klasifikaci lézí.  
40. Pro interpretaci výsledk ů studie mohou být cenná historická kontrolní data, 
např. v případě, kdy existují známky toho, že soub ěžné kontroly se zna čně 
liší od posledních údaj ů získaných u kontrolních zví řat ze stejného zkušeb ­
ního zařízení/kolonie. Historická kontrolní data, pokud se hodnotí, by m ěla 
být ze stejné laborato ře a měla by pocházet ze studie používající zví řata 
stejného v ěku a stejného kmene a m ěla by být z období p ěti let předchá­
zejících p říslušné studii.  
41. Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody a data, která 
se mají analyzovat, by se m ěly zvolit již p ři plánování studie (odstavec 9). 
Tento výb ěr by měl zahrnovat rezervu pro p řípadné úpravy v závislosti na 
přežití.  
Protokol o zkoušce  
42. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená chemická látka:  
— fyzikální povaha, čistota a fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— identifika ční údaje,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— zdroj chemické látky,  
— číslo šarže,  
— certifikát o chemické analýze.  
Nosič (je-li použit):  
— zdůvodnění výběru nosiče (pokud je jiný než voda).  
Pokusná zví řata: 
— použité druhy/kmen a zd ůvodnění výběru, 
— počet, věk, a pohlaví zví řat na začátku zkoušky,  
— zdroj, podmínky chovu, strava atd.,  
— individuální hmotnosti zví řat na začátku zkoušky.  
Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění způsobu podávání a výb ěru dávky,  
— případně statistické metody použité k analýze dat,  
— podrobnosti o použité form ě zkoušené chemické látky/úprav ě krmiva,  
— analytické údaje o dosažené koncentraci, stabilit ě a homogenit ě 
přípravku,  
— cesta podání a podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,  
— u inhala čních studií informace o tom, zda byla expozice pouze nazální 
cestou, nebo celot ělová,  
— skutečné dávky (mg/kg t ělesné hmotnosti/den) a p řípadně koeficient 
přepočtu koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vod ě 
(mg/kg nebo ppm) na skute čnou dávku (mg/kg t ělesné hmotnosti/den),  
— podrobné údaje o kvalit ě krmiva a vody.  
Výsledky (m ěly by se p ředložit souhrnné tabulky údaj ů a údaje pro jedno ­
tlivá zvířata) 
Obecné  
— údaje o p řežití,  
— tělesná hmotnost/zm ěny tělesné hmotnosti,  
— spotřeba krmiva, výpo čty využitelnosti krmiva, pokud byly provedeny, 
a případně spotřeba vody, pokud se uplat ňuje, 
— toxikokinetické údaje, jsou-li k dispozici,  
— oftalmoskopické vyšet ření (je-li k dispozici),  
— hematologická vyšet ření (jsou-li k dispozici),  
— klinická biochemická vyšet ření (jsou-li k dispozici).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Klinické nálezy  
— známky toxicity,  
— incidence (plus závažnost, je-li hodnocena) jakékoli abnormality,  
— povaha, závažnost a trvání pozorovaných klinických p říznaků (zda byly 
přechodné, nebo trvalé).  
Pitevní údaje  
— konečná tělesná hmotnost,  
— hmotnosti orgán ů a jejich pom ěry, pokud se stanovují,  
— pitevní nálezy; incidence a závažnost abnormalit.  
Histopatologické vyšet ření 
— histopatologické nálezy, které nejsou neoplastické,  
— neoplastické histopatologické nálezy,  
— vzájemný vztah mezi makroskopickými a mikroskopickými nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů souvisejících 
s expozicí, v četně klasifikace závažnosti,  
— zprávy o všech odborných revizích vzork ů. 
Statistické zpracování výsledk ů dle potřeby 
Diskuse o výsledcích zahrnující  
— diskuse o jakýchkoli modelovacích p řístupech,  
— vztahy mezi dávkou a odezvou,  
— historické kontrolní údaje,  
— posouzení jakýchkoli informací o zp ůsobu účinku,  
— stanovení BMD, NOAEL nebo LOAEL,  
— význam pro člověka. 
Závěry 
LITERATURA:  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3) Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32:
 
4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.  
5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
6) Kapitola B.27 této p řílohy, Zkouška subchronické orální toxicity studie 
orální toxicity na nehlodavcích (90denní opakovaná aplikace).  
7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
k dispozici na ve řejných webových stránkách OECD s pokyny ke zkoušení 
na adrese www.oecd.org/env/testguidelines.  
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9) Kapitola B.8 této p řílohy, Subakutní inhala ční toxicita: 28denní opakovaná 
aplikace.  
10) Kapitola B.29 této p řílohy, Subchronická inhala ční toxicita: 90denní studie.  
11) Kapitola B.9 této p řílohy, Dermální toxicita (28denní opakovaná aplikace).  
12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
 
14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.  
15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE 
(2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
 
17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  
19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
 
20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approa ­
ches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
 
23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC.  
24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.  
26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
 
27) Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 
o ochran ě zvířat používaných pro v ědecké účely, Úř. věst. L 276, 
20.10.2010, s. 33.  
28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services.
 
29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
 
30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
 
32) Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices Guide ­
line: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Zkoušená chemická látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33  KOMBINOVANÉ STUDIE CHRONICKÉ TOXICITY 
A KARCINOGENITY  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) 453 
(2009). P ůvodní Pokyny pro zkoušení 453 byly schváleny v roce 1981. 
Revize zkušební metody B.33 byla považována za nezbytnou k zohledn ění nejnov ějšího vývoje v oblasti zajišt ění dobrých životních 
podmínek zví řat a regula čních požadavk ů (1), (2), (3), (4), (5). Aktualizace 
této zkušební metody B.33 se provád ěla paraleln ě s revizemi kapitoly B.32 
této přílohy, Studie karcinogenity, a kapitoly B.30 této p řílohy, Studie chro ­
nické toxicity, s cílem získat další informace o zví řatech použitých ve studii 
a poskytnout další podrobnosti o výb ěru dávky. Tato zkušební metoda je 
určena ke zkouškám širokého spektra chemických látek, v četně pesticidů 
a průmyslových chemikálií. V p řípadě farmaceutik se však n ěkteré detaily 
a požadavky mohou lišit (viz pokyny S1B Mezinárodní konference o harmonizaci (ICH) testování karcinogenity lék ů).
 
2. Většina studií chronické toxicity a karcinogenity se provádí na r ůzných 
druzích hlodavc ů a tato zkušební metoda je proto primárn ě určena 
k použití ve studiích provád ěných práv ě na těchto druzích. Je-li t řeba tyto 
studie provést na nehlodavcích, lze rovn ěž použít principy a postupy 
uvedené v této zkušební metod ě spolu s t ěmi, které jsou uvedeny 
v kapitole B.27 této p řílohy, Studie orální toxicity na nehlodavcích – 
90denní opakovaná aplikace (6), jak je uvedeno v pokynech OECD Pokyny 
č. 116 o p řípravě a provád ění studií chronické toxicity a karcinogenity (7).  
3. Třemi hlavními zp ůsoby podávání používanými ve studiích chronické toxi ­
city/karcinogenity jsou orální podávání, dermální aplikace a inhala ční podá­
vání. Výb ěr cesty podání závisí na fyzikálních a chemických vlastnostech 
zkoušené chemické látky a na p řevládající cest ě expozice u lidí. Další 
informace o výb ěru cesty expozice jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).  
4. Tato zkušební metoda se zam ěřuje na expozici orální cestou, což je cesta, 
která se ve studiích chronické toxicity a karcinogenity používá nejb ěžněji. 
Přestože dlouhodobé studie zahrnující expozici dermální nebo inhala ční 
cestou mohou být pro posouzení rizik pro lidské zdraví rovn ěž nezbytné 
a/nebo mohou být vyžadovány v rámci ur čitých regula čních režim ů, jsou 
studie používající tyto cesty expozice zna čně technicky složité. Takové 
studie je t řeba navrhovat individuáln ě pro daný p řípad, přestože zde uvedená 
zkušební metoda pro posouzení a vyhodnocení chronické toxicity 
a karcinogenity p ři orálním podávání by mohla tvo řit základ protokolu 
pro studie inhala ční a/nebo dermální, pokud jde o doporu čení pro období 
expozice, klinické a patologické parametry atd. Jsou k dispozici pokyny OECD týkající se podávání zkoušených chemických látek inhala ční (7), 
(8) a dermální cestou (7). P ři navrhování dlouhodobých studií zahrnujících 
expozici inhala ční cestou by se m ělo konkrétn ě nahlédnout do kapitoly B.8 
této přílohy (9) a kapitoly B.29 této p řílohy (10) a rovn ěž do pokyn ů OECD 
ke zkouškám akutní inhala ční toxicity (8). V p řípadě, že se zkoušky 
provádějí dermální cestou, je t řeba nahlédnout do kapitoly B.9 této p řílohy 
(11).
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Kombinovaná studie chronické toxicity/karcinogenity poskytuje informace 
o možných rizicích pro zdraví, která mohou pravd ěpodobně vzniknout p ři 
opakované expozici trvající až po celou dobu života použitého druhu. Studie rovněž poskytne informace o toxických ú čincích zkoušené chemické látky 
včetně potenciální karcinogenity a ur čí cílové orgány a možnost akumulace. 
Může také poskytnout odhad hodnoty dávky bez pozorovaných nep řízni­
vých účinků pro toxické ú činky a v p řípadě negenotoxických karcinogen ů 
pro nádorové odezvy, což lze použít p ři stanovení kritérií pro bezpe čnou 
expozici člověka. Důraz se klade také na pe člivé klinické pozorování zví řat 
s cílem získat co nejvíce informací.
 
6. Cíle studií chronické toxicity/karcinogenity zahrnutých v této zkušební 
metodě jsou:  
— identifikace karcinogenních vlastností zkoušené chemické látky vedou ­
cích ke zvýšenému výskytu novotvar ů, zvýšenému podílu maligních 
novotvarů nebo snížení doby do vzniku novotvar ů ve srovnání se soub ě­ 
žnými kontrolními skupinami,  
— identifikace doby do vzniku novotvar ů, 
— identifikace chronické toxicity zkoušené chemické látky,  
— identifikace cílového orgánu (cílových orgán ů) chronické toxicity 
a karcinogenity,  
— charakterizace vztahu mezi dávkou a odezvou,  
— určení hodnoty dávky bez pozorovaného nep říznivého ú činku (NOAEL) 
nebo výchozího bodu pro stanovení referen ční dávky (BMD),  
— extrapolace karcinogenních ú činků na nízké úrovn ě expozice člověka, 
— předpověď chronických toxických ú činků na úrovních expozice člověka, 
— získání údaj ů ke zkoušení hypotéz ohledn ě způsobu účinku (2), (7), (12), 
(13), (14), (15).  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
7. Před zahájením studie by m ěla laborato ř provádějící zkoušky vzít v úvahu 
při posuzování a hodnocení potenciální karcinogenity a chronické toxicity 
zkoušené chemické látky všechny dostupné informace o zkoušené chemické 
látce, aby zam ěřila uspořádání studie sm ěrem k účinnějšímu zkoušení jejích 
toxikologických vlastností a minimalizovala použití zví řat. Obzvláš ť důležité 
jsou informace o zp ůsobu účinku potenciálního karcinogenu a jeho posou ­
zení (2), (7), (12), (13), (14), (15), nebo ť optimální uspo řádání studie se 
může lišit podle toho, zda je zkoušená chemická látka známý genotoxický 
karcinogen nebo je u ní pouze podez ření na genotoxickou karcinogenitu. 
Další pokyny k rozvahám o zp ůsobu účinku jsou uvedeny v pokynech 
č. 116 (7).  
8. Informace, které pom ůžou při utváření plánu studie, zahrnují identitu, 
chemickou strukturu a fyzikáln ě-chemické vlastnosti zkoušené chemické 
látky, všechny informace o zp ůsobu účinku, výsledky jakýchkoli test ů toxi­
city včetně testů genotoxicity  in vitro  nebo  in vivo , předpokládaná použití 
a potenciální expozici u člověka, dostupné údaje (Q)SAR, údaje 
o mutagenit ě/genotoxicit ě, karcinogenit ě a další toxikologické údaje 
o strukturn ě příbuzných chemických látkách, dostupné toxikokinetické 
údaje (kinetika p ři jednorázové dávce a rovn ěž při opakovaných dávkách, 
je-li k dispozici) a údaje získané v jiných studiích s opakovanou expozicí. 
Stanovení chronické toxicity/karcinogenity by se m ělo provád ět pouze poté,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
co byly získány úvodní informace o toxicit ě z 28denních a/nebo 90denních 
zkoušek toxicity po opakované dávce. Krátkodobé zkoušky iniciace – 
propagace mohou rovn ěž poskytnout užite čné informace. Jako sou část 
celkového zhodnocení potenciálních nep říznivých ú činků konkrétní zkou ­ 
šené chemické látky na zdraví by se m ěl zvážit postup zkoušení provád ěný 
po fázích p ři zkouškách karcinogenity (16), (17), (18), (19).  
9. Nejvhodn ější statistické metody pro analýzu výsledk ů s ohledem na uspo ­ 
řádání a cíle experimentu by se m ěly stanovit p řed zahájením studie. Je 
třeba zvážit, zda by m ěla statistika zahrnovat korekci na p řežití, analýzu 
kumulativních nádorových rizik ve vztahu k dob ě přežití, analýzu doby do 
vzniku nádoru a analýzu v p řípadě předčasného ukon čení zkoušky u jedné 
nebo více skupin. Pokyny ohledn ě vhodných statistických analýz a klí čové 
odkazy na mezinárodn ě uznávané statistické metody jsou uvedeny 
v Pokynech č. 116 (7) a rovn ěž v Pokynech č. 35 o analýze a hodnocení 
studií chronické toxicity a karcinogenity (20).  
10. Při provádění studie karcinogenity je nutné řídit se vždy v ůdčími principy 
a úvahami uvedenými v Pokynech OECD o rozpoznání, vyšet ření a použití 
klinických p říznaků jako lidských cílových parametr ů u pokusných zví řat 
používaných p ři hodnocení bezpe čnosti (21), zejména v odstavci 62 t ěchto 
pokynů. Tento odstavec uvádí, že „ Ve studiích zahrnujících opakované 
podávání dávky by se m ělo v případě, kdy zvíře vykazuje klinické p říznaky, 
které jsou progresivní a vedou k dalšímu zhoršení jeho stavu, u činit infor­
mované rozhodnutí, zda zví ře humánn ě utratit, či ne. Toto rozhodnutí by 
mělo obsahovat posouzení hodnoty informací, které se získají, bude-li se 
zvíře i nadále udržovat ve studii, oproti jeho celkovému stavu. Dosp ěje-li 
se k rozhodnutí, pokra čovat u zví řete ve zkoušce, m ěla by se dle pot řeby 
zvýšit četnost pozorování. Rovn ěž je možné, aniž by to nep říznivě ovlivnilo 
účel zkoušky, do časně pozastavit podávání dávky, jestliže to zmírní bolest či 
utrpení, nebo snížit zkoušenou dávku. “ 
11. Podrobné pokyny a diskuse o principech výb ěru dávky pro studie chronické 
toxicity a karcinogenity naleznete v Pokynech č. 116 (7) a rovn ěž ve dvou 
publikacích ústavu International Life Sciences Institute (22), (23). Hlavní strategie výb ěru dávky závisí na primárním cíli nebo cílech studie (odstavec 
6). Při výběru vhodných úrovní dávky by se m ělo dosáhnout rovnováhy 
mezi screeningem nebezpe čnosti na stran ě jedné a charakterizací odezvy na 
nízkou dávku a jejich významu na stran ě druhé. To je d ůležité zejména 
v případě kombinované studie chronické toxicity a karcinogenity.
 
12. Je třeba zvážit možnost provedení této kombinované studie chronické toxi ­
city a karcinogenity, namísto odd ěleného provád ění studie chronické toxicity 
(kapitola B.30 této p řílohy) a studie karcinogenity (kapitola B.32 této p řílo­
hy). Kombinovaná zkouška zajiš ťuje větší efektivitu ve smyslu času 
a nákladů a určité omezení použití zví řat v porovnání s provád ěním dvou 
samostatných studií a zárove ň nezhoršuje kvalitu údaj ů ani ve fázi zkoušení 
chronické toxicity, ani ve fázi zkoušení karcinogenity. P ři provádění kombi­
nované studie chronické toxicity a karcinogenity však je t řeba pečlivě zvážit 
zásady výb ěru dávky (odstavce 11 a 22–26) a rovn ěž se uznává, že 
v určitých regula čních rámcích mohou být vyžadovány samostatné studie. 
Další pokyny o uspo řádání kombinované studie chronické toxicity 
a karcinogenity s cílem dosáhnout maximální efektivity studie ve smyslu 
možností snížení po čtu použitých zví řat a rovn ěž úpravou r ůzných experi ­
mentálních postup ů naleznete v Pokynech č. 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete na konci této 
kapitoly a v Pokynech č. 116 (7).  
PODSTATA ZKOUŠKY  
14. Plán studie se skládá ze dvou paralelních fází, chronické fáze a fáze karci ­
nogenity (jejich délka viz odstavec 34 a 35). Zkoušená chemická látka se 
obvykle podává orální cestou, avšak zkoušky inhala ční nebo dermální 
cestou mohou být také vhodné. V chronické fázi se zkoušená chemická látka podává denn ě v odstup ňovaných dávkách n ěkolika skupinám pokus ­
ných zvířat, jedna úrove ň dávky na každou skupinu, obvykle po dobu 12 
měsíců, avšak je možné zvolit i delší nebo kratší dobu expozice v závislosti 
na regula čních požadavcích (viz odstavec 34). Tato doba trvání by se m ěla 
zvolit dostate čně dlouhá na to, aby umožnila manifestaci jakýchkoli ú činků 
kumulativní toxicity bez zkreslujících p říznaků geriatrických zm ěn. Plán 
studie může rovněž zahrnovat jedno nebo více p ředběžných utracení, nap ř. 
za 3 a 6 m ěsíců, a je možné p řidat další skupiny zví řat, aby se tato skute č­
nost kompenzovala (viz odstavec 20. Ve fázi karcinogenity se zkoušená 
chemická látka se podává denn ě několika skupinám pokusných zví řat po 
většinu jejich života. Zví řata se v obou fázích pe člivě sledují s ohledem na 
příznaky toxicity a rozvoj neoplastických lézí. Zví řata, která v pr ůběhu 
zkoušky uhynula nebo byla utracena, se pitvají a na konci zkoušky se 
přeživší zví řata utratí a rovn ěž pitvají.
 
POPIS METODY  
Výběr zvířecích druh ů 
15. Tato zkušební metoda se primárn ě zabývá posouzením a vyhodnocením 
toxicity a karcinogenity u hlodavc ů (odstavec 2). Použití nehlodavc ů lze 
zvážit, pokud dostupné údaje nazna čují, že jsou pro p ředpověď účinků na 
lidské zdraví vhodn ější. Výběr druhu by m ěl být zdůvodněn. Upřednostňo­
vaným druhem hlodavc ů je potkan, ale lze použít i jiný druh hlodavc ů, např. 
myš. Přestože použití myší ve zkouškách karcinogenity m ůže mít omezený 
užitek (24), (25), (26), jsou v n ěkterých stávajících regula čních programech 
zkoušky karcinogenity na myších ješt ě stále vyžadovány, pokud se nepro ­
káže, že taková studie není z v ědeckého hlediska nezbytná. Krysy a myši 
jsou upřednostňovanými experimentálními modelovými organismy díky své 
relativně krátké dob ě života, široce rozší řenému použití ve farmakologic ­
kých a toxikologických studiích, citlivosti k indukci nádoru a dostupnosti dostatečně charakterizovaných kmen ů. V důsledku těchto vlastností je 
k dispozici velké množství informací o jejich fyziologii a patologii. Plán 
a provedení studií chronické toxicity/karcinogenity u nehlodavc ů, jsou-li 
požadovány, by m ěly vycházet z princip ů uvedených v této zkušební 
metodě spolu s principy v kapitole B.27 této p řílohy, 90denní studie orální 
toxicity po opakované aplikaci na nehlodavcích (6). Další informace 
o výbě
ru druhu a kmene jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).  
16. Měla by se použít mladá zdravá dosp ělá zvířata běžně používaných 
laboratorních kmen ů. Kombinovaná studie chronické toxicity/karcinogenity 
by se měla provád ět na zvířatech ze stejného kmene a zdroje, jako byla 
zvířata použitá v kratších p ředběžných studiích toxicity, p řestože je-li 
známo, že zví řata z tohoto kmene a zdroje mívají potíže dosáhnout b ěžně 
uznávaných kritérií p řežití v dlouhodobých studiích [viz Pokyny č. 116 (7)], 
měla by se zvážit možnost použít takový kmen zví řat, který má p řijatelnou 
míru přežití v dlouhodobé studii. Samice musí být nullipary a nesm ějí být 
březí. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Podmínky chovu a krmení  
17. Zvířata lze chovat jednotliv ě nebo v klecích po malých skupinkách jedinc ů 
stejného pohlaví. Individuální chov by se m ěl použít pouze, pokud je to 
vědecky od ůvodněné (27), (28), (29). Klece by m ěly být uspo řádány tak, 
aby byl p řípadný vliv jejich polohy minimalizován. Teplota v místnosti pro 
pokusná zví řata by měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by 
měla být minimáln ě 30 % a pokud možno nep řesáhnout 70 % krom ě doby 
úklidu místnosti, cílem by m ěla být hodnota 50–60 %. Osv ětlení by m ělo 
být umělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Ke krmení 
lze použít konven ční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. 
Strava by m ěla splňovat všechny nutri ční požadavky zkoušených druh ů 
a obsah p říměsí ve strav ě zahrnující mimo jiné zbytky pesticid ů, perzistentní 
organopolutanty, fytoestrogeny, t ěžké kovy a mykotoxiny, které mohou 
ovlivnit výsledek zkoušky, by m ěl být co možná nejnižší. Pravideln ě by 
se měly získávat analytické informace o nutri čních hodnotách stravy 
a množství p říměsí ve strav ě, alespoň na začátku studie a pokaždé, když 
se změní používaná šarže, a m ěly by se za členit do záv ěrečné zprávy. 
Obdobně by se m ěly poskytnout analytické informace o pitné vod ě. 
Výběr stravy m ůže být ovlivn ěn nutností zajistit vhodnou p řísadu zkoušené 
chemické látky, podává-li se látka v krmivu, a splnit nutri ční potřeby zvířat. 
Příprava zví řat 
18. Použijí se zdravá zví řata, která se alespo ň 7 dnů aklimatizovala na labora ­
torní podmínky a která nebyla d říve podrobena žádným experimentálním 
postupům. V případě hlodavců by se mělo podávání látky zahájit co možná 
nejdříve po jejich odstavení a aklimatizaci, nejlépe p řed dosažením stá ří 8 
týdnů. Pokusná zví řata by m ěla být charakterizována podle druhu, kmenu, 
původu, pohlaví, hmotnosti a stá ří. Na začátku studie by m ěly být odchylky 
hmotnosti zví řat u každého pohlaví minimální a nem ěly by překročit ± 20 % 
průměrné hmotnosti pro všechna zví řata ve studii, pro každé pohlaví zvláš ť. 
Zvířata by m ěla náhodným výb ěrem rozd ělit do kontrolních 
a experimentálních skupin. Po randomizaci by nem ěly být výrazné rozdíly 
v průměrných hodnotách t ělesné hmotnosti mezi skupinami v rámci každého 
pohlaví. Existují-li statisticky významné rozdíly, m ěla by se randomizace 
pokud možno zopakovat. Každému zví řeti by se m ělo přidělit jedine čné 
identifika ční číslo a mělo by se tímto číslem trvale ozna čit pomocí tetování, 
implantací mikro čipu nebo jinou vhodnou metodou.  
POSTUP  
Počet a pohlaví zví řat 
19. Měla by se použít ob ě pohlaví. M ěl by se použít dostate čný počet zvířat 
umožňující důkladné biologické a statistické vyhodnocení. U hlodavc ů by 
proto každá exponovaná skupina (jak je uvedeno v odstavci 22) a soub ěžná 
kontrolní skupina ur čená k fázi karcinogenity m ěla obsahovat alespo ň 50 
zvířat od každého pohlaví. V závislosti na cíli studie m ůže být možné zvýšit 
statistickou sílu klí čových odhad ů rozdělením zví řat nerovnom ěrně do 
skupin s r ůznou dávkou, p řičemž do skupin s nízkou dávkou se za řadí 
více než 50 zví řat, např. aby se odhadl karcinogenní potenciál p ři nízkých 
dávkách. Je však t řeba přiznat, že mírné zvýšení velikosti skupiny povede 
pouze k relativn ě malému zvýšení statistické síly studie. V p řípadě hlodavců 
by každá exponovaná skupina (jak je uvedeno v odstavci 22) a soub ěžná 
kontrolní skupina ur čená k fázi chronické toxicity m ěla obsahovat alespo ň 
10 zvířat od každého pohlaví. Je t řeba upozornit, že je tento po čet nižší než 
ve studii chronické toxicity (kapitola 30 této p řílohy). Interpretace údaj ů ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
pocházejících od omezeného po čtu zvířat v každé skupin ě ve fázi chronické 
toxicity této kombinované studie však bude podep řena také údaji od v ětšího 
počtu zvířat z fáze karcinogenity této studie. Ve studiích používajících myši 
může být nutné p řidat další zví řata do každé exponované skupiny ve fázi 
chronické toxicity, aby se mohla provést všechna požadovaná hematologická 
vyšetření. Další informace o statistickém uspo řádání studie a výb ěru úrovní 
dávek k maximalizaci statistické síly jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7).  
Zajištění předběžných utracení, satelitní skupiny a ov ěřovacích zví řat 
20. Studie m ůže zajistit zví řata pro p ředběžná utracení nap ř. v 6. měsíci fáze 
chronické toxicity, aby se získaly informace o progresi non-neoplastických 
změn a mechanistické informace, je-li to v ědecky od ůvodněné. Jsou-li tyto 
informace již k dispozici z p ředchozích studií toxicity zkoušené chemické 
látky po opakovaných dávkách, nemusí být p ředběžná utracení v ědecky 
odůvodněná. Zvířata použitá ve fázi chronické toxicity této studie trvající 
obvykle 12 m ěsíců (odstavec 34) poskytnou údaje z p ředběžného utracení 
pro fázi karcinogenity této studie, čímž se dosáhne snížení celkového po čtu 
použitých zví řat. Do fáze chronické toxicity studie lze rovn ěž zařadit sate­
litní skupiny za ú čelem sledování reverzibility jakýchkoli toxikologických 
změn vyvolaných zkoušenou chemickou látkou, která se zkoumá. Tyto 
skupiny mohou být omezeny pouze na nejvyšší úrove ň dávky ve studii 
a kontrolu. Také je možno za řadit do studie další skupinu ov ěřovacích zví řat 
(obvykle 5 zví řat od každého pohlaví) k monitorování stavu onemocn ění 
v průběhu studie, je-li to nutné (30). Další pokyny o uspo řádání studie tak, 
aby zahrnovalo p ředběžná utracení, satelitní a ov ěřovací zvířata a zárove ň se 
minimalizoval celkový po čet použitých zví řat, jsou uvedeny v Pokynech 
č. 116 (7).  
21. Pokud jsou v plánu studie zahrnuta satelitní zví řata a/nebo p ředběžná utra­
cení zvířat, činí počet zvířat v každé exponované skupin ě určených k tomuto 
účelu obvykle 10 zví řat od každého pohlaví a celkový po čet zvířat zařaze­
ných do studie je nutno zvýšit o po čet zvířat, která budou usmrcena p řed 
ukončením studie. U p ředběžně utracených a satelitních zví řat by se m ěly 
obvykle sledovat stejné parametry, jako u zví řat ve fázi chronické toxicity 
v hlavní studii, mezi n ěž patří tělesná hmotnost, spot řeba krmiva/vody, 
hematologická a klinická biochemická m ěření a patologická vyšet ření, 
nicméně měření se mohou také omezit (ve skupinách ur čených 
k předběžnému utracení) na konkrétní klí čové parametry, jakými jsou 
neurotoxicita a imunotoxicita.  
Dávkové skupiny a dávkování  
22. Pokyny ohledn ě veškerých aspekt ů výběru dávky a odstup ňování úrovní 
dávek jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). V chronické fázi i ve fázi 
karcinogenity by se m ěly použít alespo ň tři úrovně dávek a soub ěžná 
kontrola. Úrovn ě dávek budou obecn ě vycházet z výsledk ů krátkodobých 
studií při opakované aplikaci nebo ze studií k stanovení rozsahu dávkování 
a měly by zohlednit jakékoli existující toxikologické a toxikokinetické údaje 
dostupné pro zkoušenou slou čeninu nebo p říbuzné materiály.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. V p řípadě studie pro fázi chronické toxicity nemusí být úplná studie 
s použitím t ří úrovní dávek nutná, pokud lze p ředpokládat, že zkouška 
provedená p ři jedné úrovni dávky nejmén ě 1 000 mg na kg t ělesné hmot ­
nosti na den pravd ěpodobně nevyvolá nep říznivé účinky. Tato úvaha by se 
měla zakládat na informacích z p ředběžných studií a p ředpoklad, že 
k toxicitě nedojde, by m ěl vycházet z údaj ů od strukturn ě příbuzných 
chemických látek. Mezní dávka 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti/den se 
může použít s výjimkou p řípadu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, 
že je nezbytné použití vyšší úrovn ě dávek.  
24. Nebrání-li tomu fyzikáln ě-chemická povaha nebo biologické ú činky zkou ­ 
šené chemické látky, m ěla by se zvolit nejvyšší úrove ň dávky za ú čelem 
identifikace hlavních cílových orgán ů a toxických ú činků, která by však 
zároveň neměla vést k utrpení, závažné toxicit ě, morbidit ě nebo uhynutí. 
Obvykle by se m ěla vybrat taková nejvyšší dávka, aby vyvolala p říznaky 
toxicity, nap ř. pokles p řírůstku tělesné hmotnosti (p řibližně 10 %). Nicmén ě 
v závislosti na cílech studie (viz odstavec 6) je možno zvolit nejvyšší dávku nižší, než je dávka podávající d ůkaz o toxicit ě, např. jestliže dávka vyvolává 
nepříznivý účinek, který však má jen malý dopad na délku života nebo 
tělesnou hmotnost.
 
25. Úrovn ě dávek a odstup ňování úrovní dávek lze vybrat tak, aby mohly být 
stanoveny vztah mezi dávkou a odezvou a v závislosti na zp ůsobu účinku 
zkoušené chemické látky také NOAEL nebo jiné plánované výsledky studie, 
např. BMD (viz odstavec 27). Mezi faktory, které by se m ěly zvážit p ři 
určování nižších dávek, pat ří předpokládaná sm ěrnice křivky závislosti 
odezvy na dávce, dávky, p ři nichž mohou nastat d ůležité zm ěny 
v metabolismu nebo ve zp ůsobu toxického ú činku, u n ějž se předpokládá 
prahová hodnota, nebo dávky, u nichž p ředpokládá výchozí bod pro extra ­
polaci do oblasti nízkých dávek. P ři provádění kombinované studie karci ­
nogenity/chronické toxicity je hlavním cílem získat informace pro ú čely 
posouzení rizika karcinogenity a informace o chronické toxicit ě jsou 
obvykle vedlejším cílem. Tuto skute čnost je třeba mít ve studii na pam ěti 
při výběru úrovní dávek a jejich odstup ňováním.  
26. Interval mezi jednotlivými úrovn ěmi dávek bude záviset na cílech studie 
a vlastnostech zkoušené chemické látky a není možné je v této zkušební 
metodě předepsat, avšak dvou až čtyřnásobné intervaly obvykle vedou 
k dobré funk čnosti zkoušky, použijí-li se k nastavení sestupných úrovní 
dávek, a často se up řednostňuje zařazení čtvrté zkušební skupiny p řed použ­
itím velmi velkých interval ů (např. více než faktor p řibližně 6–10) mezi 
dávkami. Obecn ě je třeba vyhnout se použití faktor ů větších než 10 
a jejich p řípadné použití by se m ělo zdůvodnit.  
27. Jak je dále uvedeno v Pokynech č. 116 (7), je t řeba při výběru dávky zvážit 
tyto body:  
— známá nebo p ředpokládaná nelinearita či inflexní body na k řivce 
závislosti odezvy na dávce,  
— toxikokinetika a rozsahy dávkování, p ři kterých dochází nebo nedochází 
k metabolické indukci, saturaci nebo nelinearit ě mezi vn ějšími 
a vnitřními dávkami,  
— prekurzorové léze, známky ú činku nebo indikátory probíhajících klí čo­
vých základních biologických proces ů, ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— klíčové (nebo p ředpokládané) aspekty zp ůsobu účinku, nap říklad dávky, 
při kterých za číná vzrůstat cytotoxicita, narušují se hladiny hormon ů, 
homeostatické mechanismy jsou ochromeny atd.,  
— oblasti k řivky závislosti odezvy na dávce, kde je nutný obzvláš ť robustní 
odhad, nap ř. v rozsahu p ředpokládané BMD nebo prahové hodnoty,  
— zvážení p ředpokládaných úrovní expozice člověka, zejména p ři výběru 
středních a nízkých dávek.  
28. Kontrolní skupina je neexponovaná skupina nebo kontrolní skupina 
s nosičem, pokud se nosi č při podávání zkoušené chemické látky používá. 
S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je t řeba se zví řaty v kontrolní 
skupině zacházet stejným zp ůsobem jako se zví řaty v experimentálních 
skupinách. Používá-li se nosi č, podá se kontrolní skupin ě v nejvyšším 
používaném objemu v rámci skupin. Jestliže se zkoušená chemická látka podává v krmivu a zp ůsobuje podstatné snížení p říjmu potravy v d ůsledku 
snížené chutnosti krmiva, m ůže být užite čné použít další kontrolní skupinu 
krmenou tak, aby m ěla stejně snížený p říjem potravy, která poslouží jako 
vhodnější kontrola.
 
Příprava dávek a podávání zkoušené chemické látky  
29. Zkoušená chemická látka se obvykle podává oráln ě, v krmivu či v pitné 
vodě, nebo žalude ční sondou. Další informace o cestách a zp ůsobech podání 
jsou uvedeny v Pokynech č. 116 (7). Cesta a zp ůsob podání závisí na ú čelu 
studie, fyzikáln ě-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, její 
biologické dostupnosti a p řevládající cest ě a způsobu expozice člověka. 
Mělo by se uvést zd ůvodnění zvolené cesty a zp ůsobu podání. V zájmu 
zajištění dobrých životních podmínek zví řat by se m ělo podávání žalude ční 
sondou zvolit pouze u t ěch látek, u nichž tato cesta a zp ůsob podání náležit ě 
reprezentují potenciální expozici člověka (např. farmaceutika). Chemické 
látky, které se nacházejí v potrav ě nebo v životním prost ředí, včetně pesti­
cidů, se obvykle podávají v krmivu nebo pitné vod ě. Nicmén ě u některých 
scénářů expozice, nap ř. expozice na pracovišti, mohou být vhodn ější jiné 
cesty podání.  
30. Zkoušená chemická látka se v p řípadě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve 
vhodném nosi či. Je třeba podle pot řeby zvážit následující vlastnosti nosi če 
nebo jiných p řídatných látek: ú činky na absorpci, distribuci, metabolismus 
nebo retenci zkoušené chemické látky, ú činky na chemické vlastnosti zkou ­ 
šené chemické látky, které mohou zm ěnit její toxické vlastnosti a ú činky na 
konzumaci krmiva nebo vody či na nutri ční stav zví řat. Je-li to možné, 
doporučuje se zvážit nejprve použití vodného roztoku/suspenze, poté použití 
roztoku/emulze v oleji (nap ř. v kuku řičném oleji) a nakonec roztoku 
v jiných nosi čích. U nosi čů jiných než voda je nutné znát jejich toxické 
vlastnosti. M ěly by být k dispozici informace o stabilit ě zkoušené chemické 
látky a homogenit ě podávaných roztok ů nebo krmiva (dle pot řeby) za 
podmínek podávání (nap ř. v krmivu).  
31. U látek podávaných v krmivu nebo v pitné vod ě je důležité zajistit, aby 
množství použité zkoušené chemické látky neovliv ňovalo normální výživu 
nebo vodní rovnováhu. V dlouhodobých studiích toxicity s podáváním látky v krmivu by koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu obvykle 
neměla přesáhnout horní mez 5 % celkového množství krmiva, aby se 
zabránilo nutri ční nerovnováze. Podává-li se zkoušená chemická látka 
v krmivu, m ůže se použít bu ď konstantní koncentrace v krmivu (mg/kg 
krmiva nebo ppm), nebo konstantní dávkování vzhledem k t ělesné hmot ­
nosti zvířete (mg/kg t ělesné hmotnosti) vypo čítané jednou týdn ě. Použitá 
možnost by se m ěla specifikovat.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. V případě orálního podávání se zví řatům podává zkoušená chemická látka 
denně (sedm dn ů v každém týdnu) po dobu 12 m ěsíců (chronická fáze) nebo 
24 měsíců (fáze karcinogenity), viz také odstavec 33 a 34. Jakýkoli jiný 
režim dávkování, nap ř. pět dní v týdnu, musí být zd ůvodněn. V případě 
dermální aplikace se zví řata vystavují zkoušené chemické látce alespo ň po 
dobu 6 hodin denn ě, 7 dnů v týdnu, jak je specifikováno v kapitole B.9 této 
přílohy (11), po dobu 12 m ěsíců (chronická fáze) nebo 24 m ěsíců (fáze 
karcinogenity). Expozice inhala ční cestou se provádí 6 hodin denn ě, 7 
dnů v týdnu, avšak je možné použít i expozici 5 dn ů v týdnu, je-li zd ůvod­
něna. Období expozice obvykle trvá 12 m ěsíců (chronická fáze) nebo 24 
měsíců (fáze karcinogenity). Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity 
jiné druhy hlodavc ů než potkani, je možné upravit maximální doby expozice 
za účelem minimalizace druhov ě specifického utrpení. Používá-li se expo ­
zice kratší než 6 hodin denn ě, je třeba uvést zd ůvodnění. Viz také kapitola 
B.8 této p řílohy (9).  
33. Pokud se zkoušená chemická látka podává zví řatům nitrožalulude čně, mělo 
by se to provád ět žaludeční sondou nebo vhodnou intuba ční kanylou, vždy 
v přibližně stejnou denní dobu. Obvykle se podává jedna dávka jednou 
denně. Pokud je nap ř. chemická látka lokáln ě dráždící, je možno denní 
dávku podávat rozd ělenou na dv ě dávky (dvakrát denn ě). Maximální 
objem kapaliny, kterou lze jednorázov ě podat, závisí na velikosti pokusného 
zvířete. Objem by se m ěl udržovat co možná nejnižší a u hlodavc ů by 
obvykle nem ěl přesáhnout 1 ml/100 g t ělesné hmotnosti (31). Kolísání 
objemu zkoušené chemické látky by se m ělo omezit nastavením koncentrace 
tak, aby se zajistil konstantní objem na všech úrovních dávek. Potenciáln ě 
žíravé nebo dráždivé chemické látky jsou výjimkou a je nutné je na ředit, 
aby se zamezilo závažným lokálním ú činkům. Zkoušky p ři koncentracích, 
které by pravd ěpodobně vedly k poleptání nebo podrážd ění gastrointestinál ­
ního traktu, by se nem ěly provád ět. 
Délka studie  
34. Období podávání dávky a délka chronické fáze této studie je obvykle 12 
měsíců, avšak uspo řádání studie umož ňuje a lze jej použít rovn ěž ke kratším 
(např. 6 nebo 9 m ěsíců) nebo delším (nap ř. 18 nebo 24 m ěsíců) studiím, 
v závislosti na požadavcích konkrétních regula čních rámc ů nebo 
k specifickým mechanistickým ú čelům. Odchylky od doby expozice 12 
měsíců by měly být od ůvodněny, zejména v p řípadě kratších expozic. 
Všechny exponované skupiny za řazené do této fáze budou v ur čenou 
dobu ukon čeny ke zhodnocení chronické toxicity a non-neoplastické pato ­
logie. Satelitní skupiny zahrnuté pro monitorování reverzibility toxikologic ­
kých změn vyvolaných zkoušenou chemickou látkou by se m ěly udržovat 
bez podávání látky po dobu ne kratší než 4 týdny a ne delší než jedna 
třetina celkové délky studie po skon čení expozice.  
35. Délka fáze karcinogenity této studie bude u hlodavc ů obvykle 24 m ěsíců, 
což představuje v ětšinu normální délky života používaných zví řat. Je možné 
použít kratší nebo delší dobu trvání studie, v závislosti na délce 
života kmene zví řecího druhu použitého ve studii, avšak m ělo by to být 
zdůvodněno. U určitých kmen ů myší, nap ř. AKR/J, C3H/J nebo C57BL/6J, 
může být vhodn ější délka studie 18 m ěsíců. Dále jsou uvedeny pokyny 
ohledně délky a ukon čení studie a p řežití, další pokyny v četně posouzení 
přijatelnosti negativní karcinogenity vzhledem k p řežití ve studii jsou 
uvedeny v Pokynech č. 116 (7):  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— O ukon čení studie by se m ělo uvažovat v p řípadě, kdy počet přeživších 
zvířat ve skupinách s nižší dávkou nebo v kontrolní skupin ě poklesne 
pod 25 %.  
— K ukon čení studie by nem ěla vést situace, kdy v d ůsledku toxicity 
předčasně uhynou zví řata pouze ve skupin ě s vysokou dávkou.  
— Přežití každého pohlaví by se m ělo posuzovat odd ěleně. 
— Studie by se nem ěla rozšiřovat do takové míry, kdy údaje ze studie již 
nestačí k provedení statisticky platného zhodnocení.  
POZOROVÁNÍ (FÁZE CHRONICKÉ TOXICITY)  
36. Všechna zví řata by se m ěla kontrolovat s ohledem na morbiditu nebo morta ­
litu, obvykle na za čátku a na konci každého dne, v četně víkendů a svátků. 
Všeobecné klinické pozorování by se m ělo provád ět nejméně jednou denn ě, 
přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby o čekávaných 
maximálních ú činků po podání látky v p řípadě podání žalude ční sondou.  
37. Před první expozicí látce (za ú čelem intraindividuálního porovnání), na 
konci prvního týdne studie a dále jednou m ěsíčně se by se m ělo provést 
důkladné klinické vyšet ření všech zví řat. Protokol pozorování by se m ěl 
uspořádat tak, aby byly odchylky mezi jednotlivými pozorovateli minimali ­
zovány a byly nezávislé na experimentální skupin ě. Toto pozorování by se 
mělo provád ět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru 
a přednostně pokaždé ve stejnou dobu. Pozorování by se m ěla pečlivě 
zaznamenávat, nejlépe za použití systému bodování explicitn ě definovaného 
ve zkušební laborato ři. Je třeba se pokusit zajistit, aby byly rozdíly mezi 
podmínkami pozorování minimální. Vyšet ření by m ělo mimo jiné zazna ­
menat zm ěny kůže, srsti, o čí a sliznic, výskyt sekret ů a exkret ů 
a vegetativní funkce (nap ř. slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé 
dýchání). Zaznamenávat by se m ěly také zm ěny chůze, držení t ěla a reakce 
na manipulaci, dále p řítomnost klonických a tonických pohyb ů, stereotyp ů 
v chování (nap ř. nadměrného čištění nebo opakovaného kroužení) nebo 
bizarního chování (nap ř. sebepoškozování, ch ůze pozpátku) (32).  
38. Před prvním podáním zkoušené chemické látky by se m ělo u všech zví řat 
provést oftalmologické vyšet ření s použitím oftalmoskopu nebo jiného 
vhodného p řístroje. Na konci studie by se toto vyšet ření mělo provést 
nejlépe u všech zví řat, avšak minimáln ě ve skupinách s vysokou dávkou 
a kontrolních skupinách. Zjistí-li se zm ěny na očích související s podáním 
látky, měla by se vyšet řit všechna zví řata. Pokud analýza struktury nebo jiné 
informace nazna čují toxicitu pro oko, m ěla by se četnost provád ění očního 
vyšetření zvýšit.  
39. U chemických látek, kde p ředchozí 28denní a/nebo 90denní zkoušky toxi ­
city po opakované dávce ukázaly schopnost vyvolat neurotoxické ú činky, je 
možné voliteln ě vyšetřit senzorickou reaktivitu na r ůzné druhy stimul ů (32) 
(např. sluchové, zrakové a proprioceptivní stimuly) (33), (34), (35), sílu 
úchopu (36) a motorickou aktivitu (37) p řed zahájením studie a v t říměsíč­
ních intervalech po za čátku studie až do 12 m ěsíců včetně a rovněž při 
ukončení studie (je-li delší než 12 m ěsíců). Další informace o postupech, 
které lze použít, jsou uvedeny v p říslušné literatu ře. Místo postup ů popsa­
ných v této literatu ře však lze použít alternativní postupy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. U chemických látek, kde p ředchozí 28denní a/nebo 90denní zkoušky toxi ­
city po opakované dávce ukázaly schopnost vyvolat imunotoxické ú činky, je 
možné na konci studie voliteln ě provést další vyšet ření tohoto cílového 
parametru.  
Tělesná hmotnost, spot řeba krmiva/vody a využitelnost krmiva  
41. Všechna zví řata by se m ěla zvážit na za čátku expozice, alespo ň jednou 
týdně během prvních 13 týdn ů a poté alespo ň jednou m ěsíčně. Měření 
spotřeby krmiva a využitelnosti krmiva by se m ěla provád ět alespoň jednou 
týdně během prvních 13 týdn ů a poté alespo ň jednou m ěsíčně. Spotřeba 
vody by se m ěla měřit alespoň jednou týdn ě během prvních 13 týdn ů a poté 
alespoň jednou m ěsíčně, podává-li se chemická látka v pitné vod ě. Měření 
spotřeby vody by se m ělo zvážit také v p řípadě studií, p ři kterých m ůže 
dojít ke zm ěně příjmu tekutin.  
Hematologická a klinická biochemická vyšet ření 
42. Ve studiích na hlodavcích by se m ěla hematologická vyšet ření provád ět 
u všech zví řat ve studii (10 samc ů a 10 samic v každé skupin ě), 3., 6. 
a 12. m ěsíc a rovn ěž na konci studie (trvá-li déle než 12 m ěsíců). 
V případě myší mohou být zapot řebí satelitní zví řata, aby se mohla provést 
všechna požadovaná hematologická m ěření (viz odstavec 19). Ve studiích 
na nehlodavcích se budou vzorky odebírat menšímu po čtu zvířat (např. 4 
zvířatům od každého pohlaví v každé skupin ě ve studiích na psech) 
v průběžných odb ěrových časech a na konci studie, jak je popsáno 
u hlodavc ů. Měření v 3. m ěsíci jak u hlodavc ů, tak u nehlodavc ů, se nemusí 
provádět, pokud nebyl v p ředchozí 90denní studii provedené p ři srovnatel ­
ných úrovních dávky pozorován žádný ú činek na hematologické parametry. 
Krevní vzorky by se m ěly odebírat z ur čeného místa, nap říklad srde ční 
punkcí nebo z retroorbitálního sinu, v anestezii.  
43. Měly by se vyšet řit následující parametry (38): celkový po čet leukocyt ů 
a diferenciální rozpo čet leukocyt ů, počet erytrocyt ů, počet trombocyt ů, 
koncentrace hemoglobinu, hematokrit (objem erytrocyt ů), střední objem 
erytrocytu (MCV), pr ůměrné množství hemoglobinu v erytrocytu (MCH), 
průměrná koncentrace hemoglobinu v erytrocytu (MCHC), protrombinový 
čas a aktivovaný parciální tromboplastinový čas. Dle pot řeby lze zm ěřit také 
další hematologické parametry, jako jsou Heinzova t ělíska či jiné atypické 
morfologické formy erytrocytu nebo methemoglobin, v závislosti na toxicit ě 
zkoušené chemické látky. Celkov ě by se m ělo postupovat flexibiln ě, podle 
pozorovaného a/nebo o čekávaného ú činku dané zkoušené chemické látky. 
Jestliže má zkoušená chemická látka ú činek na hematopoetický systém, 
může být indikováno také vyšet ření počtu retikulocyt ů a cytologie kostní 
dřeni, přestože se tato vyšet ření nemusí provád ět rutinně. 
44. Klinické biochemické analýzy za ú čelem vyšet ření hlavních toxických 
účinků na tkán ě, a zejména na játra a ledviny, by se m ěly provést na 
krevních vzorcích odebraných všem zví řatům ve studii (10 samc ům a 10 
samicím v každé skupin ě) ve stejných časových intervalech stanovených pro 
hematologická vyšet ření. U myší mohou být zapot řebí satelitní zví řata, aby 
se mohla provést všechna požadovaná biochemická vyšet ření. Ve studiích 
na nehlodavcích se budou vzorky odebírat menšímu po čtu zvířat (např. 4 
zvířatům od každého pohlaví v každé skupin ě ve studiích na psech) 
v průběžných odb ěrových časech a na konci studie, jak je popsáno 
u hlodavc ů. Měření v 3. m ěsíci, jak u hlodavc ů, tak u nehlodavc ů, se 
nemusí provád ět, pokud nebyl v p ředchozí 90denní studii provedené p ři 
srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný ú činek na klinické bioche ­
mické parametry. P řed odebráním krevních vzork ů se doporu čuje ponechat  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
zvířata (s výjimkou myší) p řes noc nala čno (  1 ). Měly by se vyšet řit násle­
dující parametry (38): glukóza, mo čovina (mo čovinový dusík), kreatinin, 
celkový protein, albumin, vápník, sodík, draslík, celkový cholesterol, alespoň dva vhodné testy pro hepatocelulární vyšet ření (alaninaminotrans ­
feráza, aspartátaminotransferáza, glutamátdehydrogenáza, celkové kyseliny 
žlučové) (39) a alespo ň dva vhodné testy pro hepatobiliární vyšet ření (alka­
lická fosfatáza, gamaglutamyltransferáza, 5’-nukleotidáza, celkový bilirubin, celkové kyseliny žlu čové) (39). Dle pot řeby je možné zm ěřit také další 
klinické biochemické parametry, nap ř. triglyceridy nala čno, specifické 
hormony a cholinesterázu, v závislosti na toxicit ě zkoušené chemické látky. 
Celkově je třeba postupovat flexibiln ě, podle pozorovaného a/nebo o čeká­
vaného ú činku dané zkoušené chemické látky.
 
45. Rozbor mo či by se m ěl provést u všech zví řat ve studii (10 samc ů a 10 
samic v každé skupin ě) s použitím vzork ů odebraných ve stejných interva ­
lech jako u hematologických a klinických biochemických vyšet ření. Měření 
v 3. měsíci se nemusí provád ět, pokud nebyl v p ředchozí 90denní studii 
provedené p ři srovnatelných úrovních dávky pozorován žádný ú činek na 
složení mo či. Odborné doporu čení pro klinické patologické studie zahrno ­
valo následující parametry (38): vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, celkový protein a glukóza. Další stanovení zahrnují ketony, urobilinogen, bilirubin, a okultní krev. Zkoumání pozorovaného ú činku 
(pozorovaných ú činků) lze v případě potřeby rozší řit o další parametry.
 
46. Obecn ě se má za to, že ve studiích na psech je t řeba před expozicí zm ěřit 
výchozí hematologické a klinické biochemické parametry, avšak ve studiích na hlodavcích se stanovovat nemusí (38). Pokud jsou však historické 
výchozí údaje (viz odstavec 58) nedostate čné, je třeba zvážit získání t ěchto 
údajů.
 
PATOLOGIE  
Pitva  
47. U všech zví řat zařazených do studie se obvykle provede celková podrobná 
pitva, zahrnující pe člivé vyšet ření vnějšího povrchu t ěla, všech otvor ů 
a lebeční, hrudní a b řišní dutiny a jejich obsahu. Nicmén ě je také možno 
zajistit (ve skupin ě pro předběžná utracení nebo v satelitní skupin ě), aby se 
měření omezila na konkrétní klí čové parametry, jako je neurotoxicita či 
imunotoxicita (viz odstavec 21). Tato zví řata se nemusí pitvat ani se 
u nich neprovádí postupy popsané v následujících odstavcích. U ověřovacích zví řat může být třeba provést pitvu v jednotlivých p řípadech 
a dle uvážení vedoucího studie.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Pro řadu stanovení v séru a plazm ě, zejména pro glukózu, je vhodné ponechat zví řata 
nalačno přes noc. Hlavním d ůvodem je, že u nehladov ějících zví řat je vyšší variabilita 
výsledků, která by mohla maskovat jemné zm ěny a ztížit interpretaci. Je však nutno 
upozornit, že hladov ění přes noc m ůže mít vliv na celkový metabolismus zví řat a může 
narušit každodenní expozici zkoušené chemické látce, zejména ve studiích s podáváním 
látky v krmivu. Všechna zví řata by se m ěla vyšetřovat ve stejném fyziologickém stavu, 
a proto by se m ěla podrobná nebo neurologická vyšet ření raději naplánovat na jiný den 
než odběr vzorků pro klinická biochemická vyšet ření.
 48. U všech zví řat, kromě zvířat vyloučených v druhé části odstavce 47 by se 
měly zvážit orgány. Nadledvinky, mozek, nadvarlata, srdce, ledviny, játra, 
vaječníky, slezina, varlata, štítná žláza (vážená po fixaci, s p říštítnými 
tělísky) a d ěloha všech zví řat (kromě zvířat nalezených umírajících a/nebo 
zvířat utracených v pr ůběhu zkoušky) by se m ěly zbavit všech p řirostlých 
tkání a co nejd říve po vyjmutí ve vlhkém stavu zvážit, aby nedošlo 
k vyschnutí.  
49. Následující tkán ě by se měly konzervovat v nejvhodn ějším fixačním médiu 
s ohledem na typ tkán ě a plánovaná následná histopatologická vyšet ření (40) 
(tkáně v hranatých závorkách jsou volitelné): 
všechny makroskopicky 
viditelné léze srdce slinivka b řišní žaludek (p ředžaludek, 
žláznatý žaludek) 
nadledvinka  ileum  p říštítná tělíska [zuby] 
aorta  jejunum  periferní nerv varlata 
mozek (zahrnující řezy 
mozkových hemisfér, 
mozečku a prodloužené 
míchy/Varolova mostu) ledviny hypofýza brzlík 
slepé střevo slzní žláza (extraorbi ­
tální) prostata štítná žláza  
cervix  játra  rektum  [jazyk] 
koagulační žláza plíce slinná žláza pr ůdušnice 
tlusté střevo lymfatické uzliny 
(povrchové i hluboké) semenný vá ček mo čový měchýř 
dvanáctník prsní žláza (povinné 
u samic a, je-li o čividně 
možné ji vypreparovat, i u samců) kosterní sval d ěloha (včetně hrdla dělo­ 
žního) 
nadvarle [horní cesty dýchací, 
včetně nosu, nosních 
skořep a vedlejších dutin 
nosních] kůže [mo čovod] 
oko (včetně sítnice) jícen mícha (ve t řech úrov­
ních: krční, střední 
hrudní a bederní) [močová trubice] 
[femur  s kloubem] [ Bulbus olfactorius ] slezina pochva 
žlučník (u jiných druh ů než 
potkan) vaječníky [sternum], řez kostní d ření a/nebo 
čerstvý aspirát kostní d řeni 
Harderova žláza  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
V případě párových orgán ů, např. ledvin, nadledvinek, by se m ěly ucho­
vávat oba orgány. Na základ ě klinických nebo jiných nález ů může být 
nezbytné zkoumat i další tkán ě. Také by se m ěly uchovat všechny orgány 
považované na základ ě známých vlastností zkoušené chemické látky za 
možné cílové orgány. Ve studiích s dermální cestou podání by se m ěl 
vyšetřit stejný seznam orgán ů, jako byl stanovený pro orální cestu, 
a navíc je nezbytné odebrat a konzervovat vzorky k ůže z místa aplikace. 
V inhalačních studiích by se m ěl seznam tkání z dýchacích cest ur čených ke 
konzervaci a vyšet ření, řídit doporu čeními v kapitole B.8 této p řílohy (9) 
a kapitole B.29 této p řílohy (10). Co se týká ostatních orgán ů/tkání (krom ě 
specificky konzervovaných tkání z dýchacích cest) by se m ěly vyšetřit 
orgány uvedené na seznamu orgán ů určeném pro orální cestu.  
Histopatologické vyšet ření 
50. Jsou k dispozici pokyny ohledn ě osvědčených postup ů při provádění toxi­
kologických patologických studií (40). Histopatologická vyšet ření by m ěla 
minimáln ě zahrnovat:  
— všechny tkán ě ve skupinách s vysokou dávkou zkoušené chemické látky 
a kontrolních skupinách,  
— všechny tkán ě ze zvířat uhynulých nebo utracených b ěhem studie,  
— všechny tkán ě vykazující makroskopické abnormality,  
— cílové tkán ě nebo tkán ě, které vykazují zm ěny v souvislosti s expozicí 
ve skupin ě s vysokou dávkou, u všech zví řat ve všech ostatních expe ­
rimentálních skupinách,  
— v případě párových orgán ů, např. ledvin, nadledvinek, by se m ěly 
vyšetřit oba orgány.  
POZOROVÁNÍ (FÁZE KARCINOGENITY)  
51. Všechna zví řata by se m ěla kontrolovat s ohledem na morbiditu nebo morta ­
litu, obvykle na za čátku a na konci každého dne, v četně víkendů a svátků. 
Zvířata by se m ěla navíc jednou denn ě kontrolovat s ohledem na specifické 
příznaky, které mají toxikologický význam. V p řípadě studií s podáváním 
látky žalude ční sondou by se m ěla zvířata kontrolovat v dob ě těsně po 
podání dávky. Zvláštní pozornost je t řeba věnovat rozvoji nádor ů a měla 
by se zaznamenat doba objevení se nádoru, umíst ění, rozměry, vzhled 
a progrese každého viditelného nebo hmatného tumoru.  
52. Všechna zví řata by se m ěla zvážit na za čátku expozice, alespo ň jednou 
týdně během prvních 13 týdn ů a poté alespo ň jednou m ěsíčně. Měření 
spotřeby krmiva a využitelnosti krmiva by se m ěla provád ět alespoň jednou 
týdně během prvních 13 týdn ů a poté alespo ň jednou m ěsíčně. Spotřeba 
vody by se m ěla měřit alespoň jednou týdn ě během prvních 13 týdn ů a poté 
alespoň jednou m ěsíčně, podává-li se chemická látka v pitné vod ě. Měření 
spotřeby vody by se m ělo zvážit také v p řípadě studií, p ři kterých m ůže 
dojít ke zm ěně příjmu tekutin.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematologická, klinická biochemická vyšet ření a další m ěření 
53. Aby se ze studie získalo co nejvíce informací, zejména pro úvahy o zp ůsobu 
účinku, je možné odebrat vzorky krve pro hematologická a klinická bioche ­
mická vyšet ření, přestože to závisí na uvážení vedoucího studie. Rovn ěž 
může být vhodné provést rozbor mo či. Údaje o zví řatech použitých ve 
fázi chronické toxicity studie, která obvykle trvá 12 m ěsíců (odstavec 34), 
poskytnou informace o t ěchto parametrech. Další pokyny o hodnot ě odběru 
těchto vzork ů v rámci studie karcinogenity jsou uvedeny v Pokynech č. 116 
(7). Jestliže se odebírají vzorky krve, m ěly by se odebrat na konci zkušeb ­
ního období t ěsně před utracením zví řat nebo v jeho pr ůběhu. Měly by se 
odebírat z ur čeného místa, nap říklad srde ční punkcí nebo z retroorbitálního 
sinu, v anestezii. Také je možné p řipravit k vyšet ření krevní nát ěry, zejména 
pokud se zdá, že je cílovým orgánem kostní d řeň, přestože hodnota tako ­
vého vyšet ření krevních nát ěrů k zhodnocení karcinogenního/onkogenního 
potenciálu ve fázi studie zkoumající karcinogenitu byla zpochyb ňována (38).  
PATOLOGIE  
Pitva  
54. U všech zví řat zařazených do studie, krom ě ověřovacích zví řat a ostatních 
satelitních zví řat (viz odstavec 20), se provede celková, podrobná pitva, 
zahrnující pe člivé vyšet ření vnějšího povrchu t ěla, všech otvor ů a lebeční, 
hrudní a b řišní dutiny a jejich obsahu. U ov ěřovacích a ostatních satelitních 
zvířat může být třeba provést pitvu v jednotlivých p řípadech a dle uvážení 
vedoucího studie. M ěření hmotnosti orgán ů obvykle nebývá sou částí studie 
karcinogeneze, nebo ť geriatrické zm ěny a, v pozd ějších stádiích, rozvoj 
nádorů maří použitelnost údaj ů o hmotnosti orgán ů. Mohou však být 
velmi důležité pro hodnocení pr ůkaznosti d ůkazů a zejména pro úvahy 
o způsobu účinku. Jsou-li sou částí satelitní studie, m ěly by se získat nejpoz ­
ději jeden rok po zahájení studie.  
55. Následující tkán ě by se měly konzervovat v nejvhodn ějším fixačním médiu 
s ohledem na typ tkán ě a plánovaná následná histopatologická vyšet ření (40) 
(tkáně v hranatých závorkách jsou volitelné): 
všechny makroskopicky 
viditelné léze srdce slinivka b řišní žaludek (p ředžaludek, 
žláznatý žaludek) 
nadledvinka  ileum  p říštítná tělíska [zuby] 
aorta  jejunum  periferní nerv varlata 
mozek (zahrnující řezy 
mozkových hemisfér, mozečku a prodloužené 
míchy/Varolova mostu) ledviny hypofýza brzlík 
slepé střevo slzní žláza (extraorbi ­
tální) prostata štítná žláza  
cervix  játra  rektum  [jazyk] 
koagulační žláza plíce slinná žláza pr ůdušnice 
tlusté střevo lymfatické uzliny 
(povrchové i hluboké) semenný vá ček mo čový měchýř
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
dvanáctník prsní žláza (povinné 
u samic a, je-li o čividně 
možné ji vypreparovat, i u samců) kosterní sval d ěloha (včetně hrdla dělo­ 
žního) 
nadvarle [horní cesty dýchací, 
včetně nosu, nosních 
skořep a vedlejších dutin 
nosních] kůže [mo čovod] 
oko (včetně sítnice) jícen mícha (ve t řech úrov­
ních: krční, střední 
hrudní a bederní) [močová trubice] 
[femur  s kloubem] [ Bulbus olfactorius ] slezina pochva 
žlučník (u jiných druh ů než 
potkan) vaječníky [ sternum ], řez kostní d ření a/nebo 
čerstvý aspirát kostní d řeni 
Harderova žláza
 
V případě párových orgán ů, např. ledvin, nadledvinek, by se m ěly ucho­
vávat oba orgány. Na základ ě klinických nebo jiných nález ů může být 
nezbytné zkoumat i další tkán ě. Také by se m ěly uchovat všechny orgány 
považované na základ ě známých vlastností zkoušené chemické látky za 
možné cílové orgány. Ve studiích s dermální cestou podání by se m ěl 
vyšetřit stejný seznam orgán ů, jako byl stanovený pro orální cestu, 
a navíc je nezbytné odebrat a konzervovat vzorky k ůže z místa aplikace. 
V inhalačních studiích by se m ěl seznam tkání z dýchacích cest ur čených ke 
konzervaci a vyšet ření, řídit doporu čeními v kapitole B.8 této p řílohy (8) 
a kapitole B.29 této p řílohy (9). Co se týká ostatních orgán ů/tkání (krom ě 
specificky konzervovaných tkání z dýchacích cest) by se m ěly vyšetřit 
orgány uvedené na seznamu orgán ů určeném pro orální cestu.  
Histopatologické vyšet ření 
56. Jsou k dispozici pokyny ohledn ě osvědčených postup ů při provádění toxi­
kologických patologických studií (40). M ěly by se vyšet řit minimáln ě tyto 
tkáně: 
— všechny tkán ě ve skupinách s vysokou dávkou zkoušené chemické látky 
a kontrolních skupinách,  
— všechny tkán ě zvířat uhynulých nebo utracených b ěhem studie,  
— všechny tkán ě vykazující makroskopické abnormality v četně nádorů, 
— pokud jsou ve skupin ě s vysokou dávkou pozorovány histopatologické 
změny související s expozicí, m ěly by se stejné tkán ě vyšetřit u všech 
zvířat ve všech ostatních exponovaných skupinách,  
— v případě párových orgán ů, např. ledvin, nadledvinek, by se m ěly 
vyšetřit oba orgány.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ (KARCINOGENITA A CHRONICKÁ 
TOXICITA)  
Údaje  
57. Měly by se uvést údaje o všech hodnocených parametrech u každého jedno ­
tlivého zví řete. Krom ě toho by se m ěly všechny údaje shrnout do tabulky, 
přičemž se uvede u každé experimentální skupiny po čet zvířat na začátku 
zkoušky, po čet zvířat nalezených uhynulých v pr ůběhu zkoušky nebo utra ­
cených z humánních d ůvodů a doba úmrtí nebo humánního utracení, po čet 
zvířat vykazujících p říznaky toxicity, popis p říznaků toxicity, v četně doby 
nástupu, trvání a závažnosti každého toxického ú činku, počet zvířat vykazu ­
jících léze, typ lézí a procento zví řat vykazujících každý typ léze. Tabulky 
se souhrnnými údaji by m ěly uvádět průměrné hodnoty a sm ěrodatné 
odchylky (u spojitých dat ze zkoušky) u zví řat vykazujících toxické ú činky 
nebo léze a také klasifikaci lézí.  
58. Pro interpretaci výsledk ů studie mohou být cenná historická kontrolní data, 
např. v případě, kdy existují známky toho, že soub ěžné kontroly se zna čně 
vymykají ve srovnání s posledními údaji získanými u kontrolních zví řat ze 
stejného zkušebního za řízení/kolonie. Historická kontrolní data, pokud se 
hodnotí, by m ěla být ze stejné laborato ře a měla by pocházet od zví řat 
stejného v ěku a ze stejného kmene b ěhem pěti let předcházejících p říslušné 
studii.  
59. Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody a data, která 
se mají analyzovat, by se m ěly zvolit již p ři plánování studie (odstavec 9). 
Tento výb ěr by měl zahrnovat rezervu pro p řípadné úpravy v závislosti na 
přežití.  
60. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená chemická látka:  
— fyzikální povaha, čistota a fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— identifika ční údaje,  
— zdroj chemické látky,  
— číslo šarže,  
— certifikát o chemické analýze.  
Nosič (je-li použit):  
— zdůvodnění výběru nosiče, (pokud není použita voda).  
Pokusná zví řata: 
— použité druhy/kmen a zd ůvodnění výběru, 
— počet, věk, a pohlaví zví řat na začátku zkoušky,  
— zdroj, podmínky chovu, strava atd.,  
— individuální hmotnosti zví řat na začátku zkoušky.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění způsobu podávání a výb ěru dávky,  
— případně statistické metody použité k analýze dat,  
— podrobnosti o použité form ě zkoušené chemické látky/úprav ě krmiva,  
— analytické údaje o dosažené koncentraci, stabilit ě a homogenit ě 
přípravku,  
— cesta podání a podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,  
— u inhala čních studií informace o tom, zda byla expozice pouze nazální 
cestou, nebo celot ělová,  
— skutečné dávky (mg/kg t ělesné hmotnosti/den) a p řípadně koeficient 
přepočtu koncentrace zkoušené chemické látky v krmivu/pitné vod ě 
(mg/kg nebo ppm) na skute čnou dávku (mg/kg t ělesné hmotnosti/den),  
— podrobné údaje o kvalit ě stravy a vody.  
Výsledky (m ěly by se p ředložit souhrnné tabulky údaj ů a údaje pro jedno ­
tlivá zvířata):  
Obecné  
— údaje o p řežití,  
— tělesná hmotnost/zm ěny tělesné hmotnosti,  
— spotřeba krmiva, výpo čty využitelnosti krmiva, pokud byly provedeny 
a případně spotřeba vody,  
— toxikokinetické údaje, jsou-li k dispozici,  
— oftalmoskopické vyšet ření (je-li k dispozici),  
— hematologická vyšet ření (jsou-li k dispozici),  
— klinická biochemická vyšet ření (jsou-li k dispozici).  
Klinické nálezy  
— známky toxicity,  
— incidence (plus závažnost, je-li hodnocena) jakékoli abnormality,  
— povaha, závažnost a trvání pozorovaných klinických p říznaků (zda byly 
přechodné, nebo trvalé).  
Pitevní údaje  
— konečná tělesná hmotnost,  
— hmotnosti orgán ů a jejich pom ěry, pokud se stanovují,  
— pitevní nálezy; incidence a závažnost abnormalit.  
Histopatologické vyšet ření 
— histopatologické nálezy, které nejsou neoplastické,  
— neoplastické histopatologické nálezy,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— vzájemný vztah mezi makroskopickými a mikroskopickými nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů souvisejících 
s expozicí, v četně klasifikace závažnosti,  
— zprávy o všech odborných revizích vzork ů. 
Statistické zpracování výsledk ů dle potřeby 
Diskuse o výsledcích zahrnující:  
— diskuse o jakýchkoli modelovacích p řístupech,  
— vztahy mezi dávkou a odezvou,  
— historické kontrolní údaje,  
— posouzení jakýchkoli informací o zp ůsobu účinku,  
— stanovení BMD, NOAEL nebo LOAEL,  
— význam pro člověka. 
Závěry 
LITERATURA:  
1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208
 
4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191  
5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445
 
6) Kapitola B.27 této p řílohy, Zkouška subchronické orální toxicity studie 
orální toxicity na nehlodavcích (90denní opakovaná aplikace).  
7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
dostupné na ve řejných webových stránkách OECD pro pokyny ke zkoušení 
na adrese www.oecd.org/env/testguidelines.
 
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9) Kapitola B.8 této p řílohy, Subakutní inhala ční toxicita: 28denní studie.  
10) Kapitola B.29 této p řílohy, Subchronická inhala ční toxicita: 90denní studie.  
11) Kapitola B.9 této p řílohy, Dermální toxicita (28denní opakovaná aplikace).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.  
14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
 
15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.
 
17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.  
18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al . (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.  
19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
 
20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  
22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approa ­
ches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
 
23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.  
26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
27) Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 
o ochran ě zvířat používaných pro v ědecké účely, Úř. věst. L 276, 
20.10.2010, s. 33.  
28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health 
and Human Services.  
29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and 
Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9.
 
30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
 
32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
 
33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  
37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
 
38) Weingand K, Brown G, Hall R  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
 
39) (Návrh) dokumentu agentury EMEA ‘Non-clinical guideline on 
drug-induced hepatotoxicity‘ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Zkoušená chemická látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34  JEDNOGENERA ČNÍ ZKOUŠKA TOXICITY PRO REPRO ­
DUKCI  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Viz obecný úvod, část B.  
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená látka se podává n ěkolika skupinám samic a samc ů 
v odstup ňovaných dávkách. Samc ům se podává zkoušená látka 
v době růstu a v pr ůběhu alespo ň jednoho úplného spermatogenního 
cyklu (přibližně 56 dnů u myši a 70 dn ů u potkana), aby byl 
zachycen jakýkoli nep říznivý účinek zkoušené látky na spermatoge ­
nezi.  
Samicím rodi čovské generace (P) se podává látka po dobu alespo ň 
dvou estrálních cykl ů, aby byl zachycen jakýkoli nep říznivý účinek 
zkoušené látky na strus. Zví řata jsou poté p řipuštěna. V dob ě připuš­
tění se zkušební látka podává zví řatům obou pohlaví, v dob ě březosti 
a laktace pouze samicím. Pro inhala ční aplikaci je t řeba metodu 
modifikovat.  
1.5 KRITÉRIA JAKOSTI  
Nejsou stanovena.  
1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1  Příprava  
Před zkouškou se provede náhodný výb ěr zdravých mladých dosp ě­
lých zvířat, která se p řiřadí do experimentálních a kontrolních 
skupin. Nejmén ě pět dní před zkouškou jsou zví řata chována 
v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou b ěhem experimentu. 
Doporučuje se podávat zkoušenou látku v potrav ě nebo v pitné vod ě. 
Jiné způsoby podání jsou také p řijatelné. Všem zví řatům se zkoušená 
látka podává po celou dobu zkoušky stejnou metodou. Používá-li se 
pro usnadn ění aplikace vehikulum nebo jiná p řísada, musí být o nich 
známo, že nemají toxické ú činky. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
L á t k a s e p o d á v á s e d m d n í v t ý d n u .  
1.6.2 Pokusná zví řata 
Výběr druhu  
Upřednostňovanými druhy jsou potkan nebo myš. Používají se 
zdravá zví řata, dosud nepoužitá pro jiné experimenty. Používaný 
kmen by nem ěl mít nízkou plodnost. Pokusná zví řata musí být 
plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví, hmotnosti 
a/nebo věku. 
Plodnost musí být ov ěřena vhodným zp ůsobem u obou pohlaví. 
Zvířata v experimentální i kontrolní skupin ě musí být odstavena 
před zahájením aplikace.  
Počet a pohlaví  
Každá experimentální i kontrolní skupina by m ěla obsahovat dosta ­
tečný počet zvířat, aby bylo možné získat minimáln ě 20 březích 
samic s p řibližně stejným termínem vrhu.  
Cílem je získat dostate čný počet březích samic a dostate čné potom ­
stvo, a tím zajistit spolehlivé hodnocení vlivu látky na plodnost, 
průběh březosti a mate řské chování v generaci P a laktaci, r ůst 
a vývoj potomstva generace F  1 od početí do odstavení.  
1 . 6 . 3 Z k u š e b n í p o d m í n k y  
Vodu a potravu dostávají zví řata ad libitum . Před vrhem se b řezí 
samice přemístí do odd ělených vrhních nebo mate řských klecí a je 
jim poskytnut materiál pro vytvo ření hnízda.  
1 . 6 . 3 . 1 Ú r o v n ě d á v e k  
Použijí se alespo ň tři exponované skupiny a jedna kontrolní. 
Používá-li se pro usnadn ění aplikace zkoušené látky vehikulum, 
podává se kontrolní skupin ě v nejvyšším použitém objemu. 
Snižuje-li zkoušená látka p říjem a využití potravy, m ůže být 
nezbytné použít párov ě krmenou kontrolní skupinu. Pokud to 
dovolují fyzikáln ě-chemické vlastnosti nebo biologické ú činky zkou ­ 
šené látky, má nejvyšší dávka v ideálním p řípadě vyvolávat toxicitu, 
avšak nikoli uhynutí v rodi čovské populaci zví řat (P). Střední dávka 
(dávky) by m ěla vyvolávat minimální toxické ú činky, které by 
mohly být p řipisovány zkoušené látce, a nejnižší dávka by nem ěla 
vyvolávat žádné pozorovatelné nep říznivé účinky ani u rodi čů ani 
u potomstva. P ři podání sondou nebo v kapslích se dávka stanoví 
individuáln ě na základ ě hmotnosti zví řete a každý týden se p řizpů­
sobuje podle zm ěny hmotnosti. U b řezích samic mohou být dávky 
popřípadě určeny na základ ě tělesné hmotnosti v 0. nebo 6. dni 
březosti.  
1 . 6 . 3 . 2 L i m i t n í z k o u š k a  
Pokud látka o nízké toxicit ě neposkytne p ři úrovni dávky 
1 000 mg/kg žádné d ůkazy o vlivu na reproduk ční schopnost, není 
zkoušení p ři dalších úrovních dávky pot řebné. Pokud p ředběžná 
studie prokáže, že vysoká dávka vyvolávající u matek jasné p říznaky 
toxicity nemá nep říznivé účinky na plodnost, není zkoušení p ři 
dalších úrovních dávky pot řebné.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3  Provedení zkoušky  
P l á n p o k u s u  
Denní podávání samc ům rodičovské generace (P) se zahájí ve v ěku 
pěti až devíti týdn ů po nejmén ě pětidenní aklimatizaci po odstavení. 
U potkana se v podávání pokra čuje po 10 týdn ů do období p řipouš­
tění (u myši osm týdn ů). Samci se bu ď utratí a vyšet ří na konci 
období p řipouštění, nebo se pokra čuje v podávání a samci mohou 
být použiti pro produkci druhého vrhu a utratí se a vyšet ří ještě před 
koncem studie. U samic rodi čovské generace (P) se podávání zahájí 
po nejmén ě pětidenní aklimatizaci a pokra čuje se v n ěm alespoň do 
doby dvou týdn ů před obdobím p řipouštění. V denním podávání se 
poté pokra čuje po celé t ři týdny období p řipouštění, v dob ě březosti 
a poté až do odstavení generace F  1 . Může být nezbytné zm ěnit plán 
dávkování podle dostupných znalostí o vlastnostech zkoušené látky, 
např. o indukci metabolismu a/nebo bioakumulaci.  
P o s t u p p ř i p ř i p o u š t ě n í 
Ve studiích toxicity pro reprodukci je možné použít párování 1:1 
(jeden samec a jedna samice) anebo 1:2 (jeden samec a dv ě samice).  
V případě párování 1:1 se samice ponechá s týmž samcem do zab ře­
znutí nebo po dobu t ří týdnů. Každé ráno se samice vyšet ří na 
přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Dnem 0 b řezosti je den, 
kdy je pozorována vaginální zátka a/nebo spermie.  
Páry, u kterých nedojde k oplodn ění, se vyšet ří s cílem zjistit d ůvod 
neplodnosti.  
Tento postup m ůže zahrnovat umožn ění další p říležitosti k oplodn ění 
se zvířetem s osv ědčenou plodností, mikroskopické vyšet ření repro­
dukčních orgán ů anebo vyšet ření estrálního cyklu a spermatogeneze.  
V e l i k o s t v r h ů 
Zvířatům exponovaným ve studii fertility se ponechá možnost vrhit 
normálně a pečovat o své potomstvo do okamžiku odstavení bez 
standardizace velikosti vrh ů. 
Při standardizaci vrh ů se doporu čuje následující postup. Mezi 1. a 4. 
dnem po vrhu se velikost všech vrh ů upraví vy řazením nadbyte čných 
jedinců tak, aby bylo pokud možno dosaženo po čtu 4 samc ů a 4 
samic na vrh.  
Pokud po čet mladých samc ů nebo samic neumož ňuje ponechat čtyři 
z každého pohlaví, je možné se tomu částečně přizpůsobit (nap ř. 
ponechat p ět samců a tři samice). Vrhy s mén ě než osmi potomky 
nelze standardizovat.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1 . 6 . 4 P o z o r o v á n í  
Po dobu zkoušky se každé zví ře pozoruje alespo ň jednou denn ě. 
Zaznamenávají se významné zm ěny chování, p říznaky ztíženého 
nebo prodlouženého vrhu a všechny p říznaky toxicity, v četně morta­
lity. Před obdobím p řipouštění i během něho se denn ě měří příjem 
potravy. Po vrhu a v pr ůběhu laktace se m ěří příjem potravy (a vody, 
pokud se látka podává v pitné vod ě) ve stejný den, kdy se váží 
potomstvo. Samci a samice rodi čovské generace (P) se váží první 
den podávání a poté týdn ě. Všechna pozorování se zaznamenávají 
individuáln ě pro každé dosp ělé zvíře. 
Doba gestace se po čítá ode dne 0 b řezosti. Každý vrh se co nejd říve 
po vrhu vyšet ří a stanoví se po čty a pohlaví mlá ďat, počet mrtvě 
a živě narozených mlá ďat a přítomnost nápadných anomálií.  
Mrtvá mlá ďata a mlá ďata utracená ve 4. dnu se uchovají pro 
vyšetření na možné defekty. Živá mlá ďata se spo čítají a celé vrhy 
se zváží ráno po vrhu, ve 4. a 7. dnu a poté každý týden do ukon čení 
studie, kdy se zví řata zváží jednotliv ě. 
Zaznamenávají se všechny pozorované abnormality v chování 
a fyzickém stavu matek nebo potomstva.  
1.6.5  Patologie  
1 . 6 . 5 . 1 P i t v a  
Po utracení nebo úmrtí b ěhem studie se všechna zví řata generace 
P makroskopicky vyšet ří na strukturní abnormality anebo patologické 
změny, přičemž se zvláštní pozornost v ěnuje orgán ům reproduk čního 
systému. Uhynulá mlá ďata nebo mlá ďata v agónii se vyšet ří na 
defekty.  
1 . 6 . 5 . 2 H i s t o p a t o l o g i c k á v y š e t ř e n í 
Vaječníky, děloha, děložní hrdlo, vagina, varlata, epididymis, 
semenné vá čky, prostata, koagula ční žláza, hypofysa a cílový 
orgán (cílové orgány) všech zví řat generace P se uchovají pro 
mikroskopické vyšet ření. V případě, že tyto orgány dosud nebyly 
vyšetřeny v jiných studiích s více dávkami, provede se podle 
možnosti mikroskopické vyšet ření u všech zví řat ze skupiny 
s nejvyšší dávkou a u kontrolní skupiny a dále u zví řat, která 
uhynula v pr ůběhu studie.  
Orgány, které u t ěchto skupin zví řat vykazovaly abnormality, se 
vyšetří i u zvířat generace P ostatních dávkových skupin. V t ěchto 
případech se mikroskopicky vyšet ří všechny tkán ě vykazující 
makroskopické zm ěny. Jak již bylo doporu čeno v oddíle 
o připouštění, mohou být reproduk ční orgány zví řat podezřelých 
z neplodnosti podrobeny mikroskopické analýze.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. ÚDAJE  
Údaje se shrnou do tabulky, p řičemž se u každé experimentální 
skupiny uvede po čet zvířat na začátku zkoušky, po čet plodných 
samců, počet březích samic, typ zm ěn a procento zví řat vykazujících 
jednotlivé typy zm ěn. 
Podle možnosti se numerické výsledky vyhodnotí vhodnou statis ­
tickou metodou. M ůže být použita jakákoli všeobecn ě uznávaná 
statistická metoda.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto informace:  
— druh/kmen použitých zví řat, 
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a dávky, v četně ukaza­
telů plodnosti, gestace a životaschopnosti,  
— doba uhynutí b ěhem studie, nebo zda zví řata přežila do pláno ­
vaného utracení nebo do konce studie,  
— tabulka s údaji o hmotnosti každého vrhu, pr ůměrné hmotnosti 
mláďat a individuální hmotnosti potomk ů při ukončení studie,  
— toxické a další ú činky pro reprodukci, potomstvo a postnatální 
růst, 
— den, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální p říznaky, 
a jejich další vývoj,  
— údaje o t ělesné hmotnosti zví řat generace P,  
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— statistické vyhodnocení výsledk ů, kde je to možné,  
— diskuse o výsledcích,  
— interpretace výsledk ů. 
3.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE  
Viz obecný úvod, část B.  
4. LITERATURA  
Viz obecný úvod, část B.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35  DVOUGENERA ČNÍ STUDIE REPRODUK ČNÍ TOXICITY  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 416 (2001).  
1.1 ÚVOD  
Tato metoda zkoušení dvougenera ční reprodukce je ur čena k získání 
všeobecných informací týkajících se ú činků zkoušené látky na inte ­
gritu a výkonnost sam čí a samičí rozmnožovací soustavy, v četně 
funkcí pohlavních žláz, estrálního cyklu, zp ůsobu chování p ři páření, 
plození, gestaci, vrhu, laktaci, odstavení, r ůstu a vývoje potomstva. 
Studie m ůže rovněž poskytnout informace o ú činku zkoušené látky 
na neonatální nemocnost a úmrtnost a p ředběžné informace 
o prenatální a postnatální vývojové toxicit ě a může sloužit jako 
návod pro další zkoušky. Mimo zkoumání r ůstu a vývoje generace 
F 1 je tato zkušební metoda ur čena rovn ěž k hodnocení integrity 
a výkonnosti sam čí a samičí rozmnožovací soustavy a rovn ěž růstu 
a vývoje generace F  2 . S cílem získat další informace o vývojové 
toxicitě a funkčních poruchách lze do tohoto protokolu za členit 
další prvky studie, p řičemž jako vhodné se jeví metody vývojové 
toxicity a/nebo vývojové neurotoxicity, anebo lze tyto kone čné 
výsledky zkoumat v samostatných studiích pomocí vhodných 
metod zkoušení.  
1.2 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená látka se podává v odstup ňovaných dávkách n ěkolika 
skupinám samc ů a samic. Samc ům z generace P se látka podává 
během růstu a během minimáln ě jednoho dokon čeného spermatoge ­
netického cyklu (p řibližně 56 dnů u myši a 70 dn ů u potkana), aby 
bylo možné zachytit jakékoliv nep říznivé účinky na spermatogenezi. 
Účinky na spermie se stanoví pomocí parametr ů pro spermie (nap ř. 
morfologie a motilita spermií), z pitvy tkání a podrobné histopato ­
logie. Jsou-li k dispozici informace o spermatogenezi z p ředešlých 
dostatečně dlouhých studií opakovaného dávkování, nap ř. 90denní 
studie, není do hodnocení nutné zahrnovat samce z generace P. 
Tyto vzorky nebo digitální záznamy o spermiích z generace P je však vhodné uchovat pro možnost pozd ějšího vyhodnocení. Samicím 
z generace P se látka podá b ěhem růstu a během několika dokon če­
ných estrálních cykl ů, aby bylo možné odhalit jakékoliv nep říznivé 
účinky zkoušené látky na normální pr ůběh estrálního cyklu. Zkou ­ 
šená látka se podává rodi čovské (P) generaci zví řat během jejich 
páření, následné b řezosti a až do doby odstavení jejich potomstva 
F
 1 . Po odstavení se u generace F  1 v podávání látky pokra čuje během 
růstu až do dosp ělosti, v pr ůběhu páření a produkce generace F  2 a až 
do doby, kdy dojde k odstavení generace F  2 . 
U všech zví řat se provád ějí klinická sledování a patologická 
vyšetření příznaků toxicity, a to se zvláštním d ůrazem na její vliv 
na integritu a výkonnost sam čí a samičí rozmnožovací soustavy a na 
růst a vývoj jejich potomstva.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.3.1  Výb ěr živočišných druh ů 
Nejvhodn ějším druhem pro testování je potkan. Použití jiných druh ů 
je třeba zdůvodnit a provést odpovídající úpravy. Není vhodné 
používat kmeny s nižší plodností nebo s typicky vysokým výskytem 
vývojových vad. Na za čátku studie by m ěly být u používaných zví řat 
jen minimální odchylky hmotnosti, které by nem ěly překročit 20 % 
průměrné hmotnosti u každého pohlaví.  
1.3.2  Podmínky chovu a krmení  
Teplota v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22  o C (± 3  o C). 
Relativní vlhkost vzduchu by m ěla být minimáln ě 30 % a pokud 
možno nep řesáhnout 70 %, krom ě doby úklidu místnosti, cílem by 
měla být hodnota 50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé a mělo by 
se střídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít 
konvenční laboratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. 
Výběr stravy m ůže být ovlivn ěn nutností zajistit vhodnou p řísadu 
zkoušené látky, je-li látka podávána tímto zp ůsobem.  
Zvířata lze chovat jednotliv ě, anebo je umístit v klecích v malých 
skupinkách zví řat stejného pohlaví. Pá ření by m ělo probíhat 
v klecích, které jsou k tomuto ú čelu vhodné. Po spá ření je třeba 
umístit oplodn ěné samice individuáln ě do klecí ur čených k vrhu 
nebo chovu mlá ďat. Oplodn ěné potkany lze rovn ěž chovat 
v malých skupinách a odd ělit jeden až dva dny p řed vrhem. Když 
se blíží doba vrhu, je nutné oplodn ěným zvířatům poskytnout odpo ­
vídající a p řesně stanovený materiál pro tvorbu hnízda.  
1.3.3  Příprava zví řat 
Použijí se zdravá zví řata, která se alespo ň 5 dnů aklimatizovala na 
laboratorní podmínky a která nebyla podrobena p ředcházejícím 
zkušebním postup ům. Pokusná zví řata by měla být charakterizována 
podle druhu, kmenu, p ůvodu, pohlaví, hmotnosti a/nebo stá ří. 
K dispozici by m ěly být veškeré informace o sourozeneckých vzta ­
zích, aby se nepá řili sourozenci. Zví řata se náhodným výb ěrem 
rozdělí do kontrolních a experimentálních skupin (doporu čuje se 
rozdělení podle t ělesné hmotnosti). Klece by m ěly být uspo řádány 
tak, aby byl vliv umíst ění klecí minimalizován. Každému zví řeti se 
přiřadí vlastní identifika ční číslo. U generace P se tato čísla přiřadí 
před zahájením podávání dávek. U generace F  1 je nutné p řidělit tato 
čísla po odstavení zví řat vybraných k pá ření. U všech vybraných 
zvířat generace F  1 se vedou záznamy ozna čující původ vrhu. 
Kromě toho se doporu čuje individuální identifikace mlá ďat co 
nejdříve po narození, kdy se provádí individuální vážení mlá ďat 
nebo jakékoliv funk ční zkoušky.  
Na začátku podávání dávek musí být rodi čovská (P) generace zví řat 
stará přibližně 5 až 9 týdn ů. Je-li to možné, m ěla by mít zví řata ze 
všech zkušebních skupin stejnou hmotnost a v ěk. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4 POSTUP  
1.4.1  Po čet a pohlaví zví řat 
Každá experimentální i kontrolní skupina by m ěla obsahovat dosta ­
tečný počet zvířat, aby bylo možné získat minimáln ě 20 březích 
samic s p řibližně stejným termínem vrhu. To pravd ěpodobně nebude 
možné u látek, které vyvolávají nežádoucí ú činky spojené s aplikací 
(např. sterilitu, nadm ěrnou toxicitu p ři vysoké dávce). Cílem je získat 
dostatečný počet březích samic, a tím zajistit smysluplné hodnocení 
potenciálu dané látky na plodnost, b řezost, chování samice 
a kojených mlá ďat, růst a vývoje potomstva generace F  1 od doby 
početí až do doby dosp ělosti a vývoj jejich potomstva (F  2 ) až do 
odstavení. Nepoda ří-li se však dosáhnout požadovaného po čtu 
březích zví řat (tj. 20), nemusí to nutn ě znamenat znehodnocení 
studie, a proto by hodnocení m ělo vždy probíhat individuáln ě případ 
od případu.  
1.4.2  Příprava dávek  
Není-li jiný vhodn ější způsob aplikace (nap ř. kožní nebo inhala ční), 
doporučuje se orální podávání zkoušené látky (ve strav ě, pitné vod ě 
nebo pomocí žalude ční sondy).  
Zkoušená látka se v p řípadě potřeby rozpustí nebo suspenduje ve 
vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporu čuje se zvážit použití 
vodného roztoku/suspenze, poté použití roztoku/emulze v oleji (nap ř. 
v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku jiného vehikula. U jiného 
typu vehikula, než je voda, je t řeba znát jeho toxické charakteristiky. 
Stanoví se stálost zkoušené látky v daném vehikulu.  
1.4.3  Dávkování  
Použijí se alespo ň tři úrovně dávek a soub ěžná kontrola. Není-li 
dávka limitována fyzikáln ě-chemickou podstatou nebo biologickými 
účinky zkoušené látky, zvolí se nejvyšší úrove ň dávky tak, aby 
vyvolala toxicitu, ale nezp ůsobila úhyn nebo zna čné utrpení. 
V případě neočekávané úmrtnosti jsou obvykle ješt ě přijatelné studie 
s úmrtností rodi čovských (P) zví řat nižší než p řibližně 10 %. Ve 
snaze prokázat jakoukoli reakci související s dávkováním a s hodnotou dávky bez pozorovatelného nep říznivého ú činku (NOAEL) 
se zvolí sestupná posloupnost úrovní dávek. Pro nastavení sestup ­
ných úrovní dávek jsou obvykle optimální intervaly lišící se 
faktorem 2 až 4 a často je vhodn ější přidání čtvrté zkušební skupiny 
než používání velkých interval ů mezi jednotlivými dávkami (nap ř. 
lišících se faktorem 10). U studií stravy by dávky nem ěly být více 
než trojnásobné. P ři výběru úrovně dávek je t řeba vzít v úvahu 
jakékoliv existující údaje o toxicit ě, a to zvlášt ě v případě výsledků 
studií po opakované dávce. Rovn ěž je třeba vzít v úvahu jakékoliv 
existující informace o metabolismu a kinetice zkoušené slou čeniny 
nebo příbuzných látek. Tyto informace navíc napomohou rovn ěž p
ři 
prokazování p řiměřenosti dávkovacího režimu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Kontrolní skupina je neexponovaná skupina nebo kontrolní skupina 
s vehikulem, pokud se vehikulum pro aplikaci zkoušené látky 
používá. S výjimkou aplikace zkoušené látky je t řeba se zví řaty 
v kontrolní skupin ě zacházet stejným zp ůsobem jako se zví řaty 
v experimentální skupin ě. Používá-li se vehikulum, podá se kontrolní 
skupině v nejvyšším používaném objemu. Podává-li se zkoušená 
látka ve strav ě a způsobuje-li snížený p říjem nebo využití potravy, 
pak je třeba zvážit nutnost použití párov ě krmené kontrolní skupiny. 
Jinak lze místo soub ěžné párov ě krmené kontrolní skupiny použít 
údaje získané z kontrolovaných studií ur čených k hodnocení ú činků 
snížené spot řeby potravy na reproduk ční parametry.  
Pozornost je t řeba věnovat následujícím typickým znak ům vehikula 
a jiných p řísad: účinku na absorpci, distribuci, metabolismus, a/nebo 
retenci zkoušené látky, dále vlivu na chemické vlastnosti zkoušené 
látky, které mohou zm ěnit její toxické vlastnosti, a vlivu na spot řebu 
potravy, vody nebo nutri ční stav zví řat. 
1.4.4  Limitní zkouška  
Pokud orální studie s jednou úrovní dávky v množství alespo ň 
1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti a den a/nebo rovnocenné procento 
látky v potrav ě nebo pitné vod ě při aplikaci dávky v potrav ě nebo 
pitné vod ě pomocí postup ů předepsaných pro tuto studii nevyvolá 
žádnou zjistitelnou toxicitu ani u rodi čovských zví řat, ani u jejich 
potomstva a pokud se neo čekává ani toxicita na základ ě existujících 
údajů o strukturn ě/metabolicky p říbuzných slou čeninách, pak není 
nutné uvažovat o kompletní studii využívající n ěkolika úrovní dávek. 
Limitní zkouška se použije, pokud expozice u člověka nevyžaduje 
použít vyšší úrove ň orální dávky. U dalších zp ůsobů podávání látky, 
jako je inhala ční nebo kožní aplikace, m ůže být maximální dosaži ­
telná úrove ň expozice dána fyzikáln ě-chemickými vlastnostmi zkou ­ 
šené látky.  
1.4.5  Aplikace dávek  
Zkoušená látka se podává zví řatům 7 dnů v týdnu. Up řednostňuje se 
orální zp ůsob podávání (ve strav ě, pitné vod ě nebo žalude ční 
sondou). Pokud se používá jiný zp ůsob podávání, je t řeba podat 
zdůvodnění a provést odpovídající modifikace. Všem zví řatům by 
měla být látka b ěhem odpovídajícího experimentálního období podá ­
vána stejným zp ůsobem. Je-li látka podávána žalude ční sondou, 
podává se hadi čkou určenou k výplachu žaludku. Množství jednorá ­
zově podávané tekutiny by nem ělo překročit 1 ml/100 g t ělesné 
hmotnosti (u kuku řičného oleje maximum p ředstavuje dávka 
0,4 ml/100 g t ělesné hmotnosti), výjimkou jsou vodní roztoky, kde 
lze použít 2 ml/100 g t ělesné hmotnosti. S výjimkou dráždivých 
nebo žíravých látek, které ve vyšších koncentracích obvykle odhalí 
další zhoršení ú činků, se prom ěnlivost množství zkoušené látky sníží 
nastavením takové koncentrace, která zajistí konstantní množství na všech úrovních dávek. Ve studiích zam ěřených na podávání látky 
žaludeční sondou budou mlá ďata dostávat zkoušenou látku obvykle 
nepřímo prost řednictvím mléka, dokud neza čne přímé dávkování po 
jejich odstavení. Ve studiích zam ěřených na podávání látky ve strav ě 
nebo pitné vod ě budou mlá ďata navíc dostávat zkoušenou látku 
přímo, jakmile za čnou během posledního týdne lakta čního období 
sama žrát.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
U látky podávané ve strav ě nebo pitné vod ě je velmi d ůležité zajistit, 
aby množství použité zkoušené látky nebránilo vyváženosti b ěžné 
stravy nebo vody. Je-li zkoušená látka podávána ve strav ě, je třeba 
používat bu ď konstantní koncentrace (ppm) ve strav ě, nebo 
konstantní úrovn ě dávky ve vztahu k t ělesné hmotnosti zví řete. 
Použití jiného zp ůsobu je třeba zdůvodnit. Látka podávaná žalude ční 
sondou se podává každý den p řibližně ve stejnou dobu a alespo ň 
jednou týdn ě se přizpůsobí tak, aby se udržela konstantní úrove ň 
dávky vzhledem k t ělesné hmotnosti zví řete. Při přizpůsobování 
dávky podle hmotnosti u podávání látky sondou je t řeba vzít 
v úvahu informace týkající se placentární distribuce.  
1.4.6  Plán zkoušky  
S každodenním podáváním zkoušené látky se u rodi čovské generace 
(P) samců a samic zahájí od 5. do 9. týdne v ěku. Denní podávání 
látky u samc ů a samic generace F  1 je třeba zahájit po jejich odsta ­
vení; stále je t řeba mít na pam ěti, že v p řípadě, kdy se zkoušená 
látka podává prost řednictvím stravy nebo pitné vody, m ůže docházet 
k přímé expozici mlá ďat F  1 zkoušené látce již b ěhem lakta čního 
období. U obou pohlaví (P i F  1 ) by se m ělo s podáváním látky 
pokračovat alespo ň 10 týdn ů před obdobím pá ření. S dávkováním 
se u obou pohlaví pokra čuje i během dvoutýdenního období pá ření. 
Nejsou-li samci již pot řební k hodnocení reproduk čních účinků, měli 
by být humánním zp ůsobem utraceni a vyšet řeni. U rodi čovské gene ­
race (P) samic dávkování pokra čuje i během březosti a až do odsta ­
vení potomstva generace F  1 . Pozornost je t řeba věnovat modifikacím 
dávkovacího programu na základ ě dostupných informací o zkoušené 
látce, včetně existujících údaj ů o toxicit ě, indukci metabolismu nebo 
bioakumulaci. Obvykle by dávka pro jednotlivá zví řata měla 
vycházet z aktuáln ě zjištěné tělesné hmotnosti. Velkou pozornost 
je však t řeba věnovat úprav ě dávek b ěhem posledního trimestru 
březosti.  
Podávání látky samc ům a samicím generací P a F  1 pokračuje až do 
doby jejich utracení. Všichni dosp ělí samci a samice generace P a F  1 
se humánním zp ůsobem utratí, pokud již nejsou pot řební 
k hodnocení reproduk čních účinků. Potomstvo generace F  1 , které 
není vybráno k pá ření, a celé potomstvo generace F  2 se po odstavení 
humánním zp ůsobem utratí.  
1.4.7  Pá ření 
1.4.7.1  Připouštění rodičovské generace (P)  
U každého pá ření se samice umístí s jedním samcem se stejnou 
úrovní dávek (pá ření 1:1), dokud nedojde ke spá ření, nebo po 
dobu alespo ň 2 týdnů. Každý den se samice vyšet ří na přítomnost 
spermatu nebo vaginální zátky. Nultým dnem b řezosti je den, kdy je 
pozorována vaginální zátka a/nebo spermie. V p řípadě, že je pá ření 
neúspěšné, se zváží spá ření se samci s osv ědčenou plodností ze 
stejné skupiny. Spá řené páry se v záznamech jasn ě označí. Je 
třeba se vyvarovat pá ření sourozenc ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2  Páření generace F  1 
U páření zvířat generace F  1 se za účelem produkce generace F  2 po 
odstavení vybere z každého vrhu alespo ň jeden samec a samice pro 
spáření s jinými zví řaty ze stejné dávkové skupiny, ale z odlišného 
vrhu. Výb ěr zvířat z každého vrhu se provede náhodn ě, pokud 
nejsou mezi zví řaty z daného vrhu pozorovány žádné výrazné odliš ­
nosti v tělesné hmotnosti nebo vzhledu. V p řípadě zjištěných odliš ­
ností se z každého vrhu vyberou nejkvalitn ější jedinci. Z hlediska 
pragmatického by bylo nejlepší tento výb ěr provádět na základ ě 
tělesné hmotnosti, vhodn ějším se však m ůže jevit výb ěr na základ ě 
vzhledu. Potomstvo generace F  1 by se nem ělo pářit před dosažením 
plné pohlavní zralosti.  
Páry bez potomstva je t řeba vyšet řit za účelem zjišt ění skutečné 
příčiny neplodnosti. Tento postup m ůže zahrnovat umožn ění další 
příležitosti k oplodn ění se zvířetem s osv ědčenou plodností, mikros ­
kopické vyšet ření reproduk čních orgán ů anebo vyšet ření estrálního 
cyklu a spermatogeneze.  
1.4.7.3  Druhé pá ření 
V určitých případech, nap ř. u odchylek velikosti vrhu spojených 
s aplikací nebo p ři zjištění nejednozna čného účinku po prvním 
páření, se doporu čuje opětovné p řipuštění dospělých zví řat 
z generace P a F  1 za účelem produkce druhého vrhu. Rovn ěž se 
doporučuje znovu p řipustit samice nebo samce, u kterých nedošlo 
k produkci mlá ďat s osvědčeným zví řaty. Pokud je u jakékoliv gene ­
race nezbytná produkce druhého vrhu, zví řata budou opakovan ě 
připuštěna přibližně jeden týden po odstavení posledního vrhu.  
1.4.7.4  Velikost vrhu  
Zvířatům se ponechá možnost normáln ě vrhnout a pe čovat o svoje 
potomstvo až do jeho odstavení. Standardizace velikosti vrh ů je 
dobrovolná. Pokud se standardizace provádí, je nutné používanou 
metodu detailn ě popsat.  
1.5 POZOROVÁNÍ  
1.5.1  Klinická pozorování  
Všeobecné klinické pozorování se provádí denn ě a v případě podá­
vání látky žalude ční sondou časový rozvrh zohlední o čekávané doby 
nejvyšších ú činků po podání látky. Zaznamenají se významné zm ěny 
chování, známky ztíženého nebo prodlužovaného vrhu a všechny příznaky toxicity. Alespo ň jednou týdn ě se u každého zví řete 
provede další podrobn ější vyšetření, nejlépe v dob ě vážení zví řete. 
Dvakrát denn ě, během víkendu p řípadně jednou denn ě, se provádí 
pozorování nemocnosti a úmrtnosti všech zví řat.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2  Tělesná hmotnost a spot řeba potravy/vody u rodi čovských zví řat 
Rodičovská zví řata (generace P a F  1 ) se zváží v první den podávání 
látky a poté alespo ň jednou týdn ě. Samice rodi čovské generace (P 
a F 1 ) se zváží 0., 7., 14. a 20. nebo 21. den gestace, b ěhem stejných 
dnů v průběhu laktace, p ři vážení vrh ů a poté v den utracení zví řat. 
Tato pozorování se zaznamenají individuáln ě u každého dosp ělého 
zvířete. V období p řed pářením a b ěhem gesta čního období se 
spotřeba potravy m ěří minimáln ě každý týden. Pokud se látka 
podává ve vod ě, měří se spotřeba vody alespo ň jednou týdn ě. 
1.5.3  Estrální cyklus  
Před pářením a pop řípadě i během páření se u samic generace P a F  1 
hodnotí délka a normálnost estrálního cyklu pomocí vaginálních 
stěrů, dokud se nezíská d ůkaz o zab řeznutí. P ři získávání 
vaginálních/cervikálních bun ěk je t řeba neporušit sliznice 
a následn ě také nevyvolat stav falešné b řezosti (1).  
1.5.4  Parametry spermatu  
U všech samc ů generace P a F  1 se po utracení zaznamená hmotnost 
varlat a nadvarlat a jeden z každého orgánu se ponechá pro histo ­
patologické vyšet ření (viz body 1.5.7, 1.5.8.1). Zbylá varlata 
a nadvarlata z podskupiny alespo ň deseti samc ů z každé generace 
P a F  1 se použijí pro výpo čet homogeniza čně odolných spermatid 
a kaudálních epididymálních rezerv spermií. Od stejné podskupiny 
samců se shromáždí spermie z kaudálních částí nadvarlat nebo 
spermie z chámovod ů za účelem vyhodnocení jejich motility 
a morfologie. Pokud se zjistí ú činky spojené s aplikací látky anebo 
jsou z jiných studií k dispozici d ůkazy o možném ú činku na sper ­
matogenezi, provede se hodnocení spermatu u všech samc ů z každé 
skupiny podle dávky; jinak se výpo čet omezí pouze na samce 
z kontrolní skupiny a ze skupiny generace P a F  1 s vysokou dávkou.  
Vypočítá se celkový po čet homogeniza čně odolných testikulárních 
spermatid a spermií z kaudální části nadvarlat (2, 3). Kaudální 
rezervy spermií lze odvodit z koncentrace a objemu spermií v suspenzi používané k dopln ění kvalitativních hodnocení a po čtu 
spermií získaných pomocí následného roz řezání a/nebo homogenizo ­
vání zbylé kaudální tkán ě. Pokud nejsou zhotoveny digitální 
záznamy nebo videozáznamy anebo nejsou-li vzorky zmraženy a analýza provedena pozd ěji, je nutné výpo čet u vybrané podskupiny 
samců ze všech dávkových skupin provést okamžit ě po utracení 
zvířat. v těchto případech se nejprve provádí analýza u kontrolní 
skupiny a u skupiny s vysokou dávkou. Pokud se nezjistí žádné účinky spojené s aplikací (nap ř. vliv na po čet, motilitu nebo morfo ­
logii spermií), není nutné provád ět analýzu u ostatních dávkových 
skupin. Pokud se zjistí ú činky spojené s aplikací u skupiny 
s vysokou dávkou, je nutné zhodnotit i skupiny s nižšími dávkami.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Motilita epididymálních spermií (nebo spermií z chámovodu) se 
vyhodnotí nebo zaznamená na video okamžit ě po utracení. 
V takovém p řípadě je nutné vyhodnotit rovn ěž skupiny s nižší 
úrovní dávek. Spermie se odeberou tak, aby došlo k minimálnímu poškození, a pomocí vhodných metod se z ředí pro analýzu motility 
(4). Procento progresivn ě pohyblivých spermií se stanoví subjek ­
tivně, nebo objektivn ě. Pokud se provádí po čítačová analýza pohyb ­
livosti (5, 6, 7, 8, 9, 10), spo čívá odvození progresivní motility 
v mezních uživatelsky nastavených hodnotách pr ůměrné rychlosti 
dráhy a p římosti nebo lineárního koeficientu. Pokud se po řídí video­
záznam vzork ů (11) anebo jsou zobrazení b ěhem pitvy zaznamenána 
jiným způsobem, sta čí provést následnou analýzu pouze u kontrolní 
skupiny a u skupiny s vysokou dávkou u samc ů z generací P a F
 1 , 
pokud nedojde ke zjišt ění účinků spojených s aplikací. Pokud nejsou 
k dispozici žádné digitální záznamy ani videozáznam, analyzují se pitvou všechny vzorky od všech experimentálních skupin.
 
Provede se morfologické hodnocení vzork ů epididymálních spermií 
(nebo spermií z chámovod ů). Spermie (minimáln ě 200 na vzorek) se 
vyšetří jako stabilní, mokré preparáty (12) a klasifikují se jako 
normální nebo abnormální. P říklady morfologických odchylek 
spermií by m ěly zahrnovat syntézu, izolované a zdeformované 
hlavičky a/nebo ocásky. Hodnocení se provádí u vybraných 
podskupin samc ů ze všech skupin podle úrovní dávek bezprost ředně 
po utracení zví řat, nebo pozd ěji na základ ě digitálních záznam ů nebo 
videozáznam ů. Jsou-li st ěry zakonzervované, lze je rovn ěž vyhod­
notit pozd ěji. V takovém p řípadě se analyzuje nejprve kontrolní 
skupina a skupiny s vysokou dávkou. Pokud se nezjistí žádné ú činky 
spojené s aplikací (nap ř. účinek na morfologii spermií), není nutné 
analyzovat ostatní dávkové skupiny. Pokud se zjistí ú činky spojené 
s aplikací u skupiny s vysokou dávkou, je nutné zhodnotit i skupiny s nižšími dávkami.
 
Pokud již byly kterékoliv výše zmín ěné parametry spermií zkoumány 
v rámci nejmén ě 90 dnů trvající studie systémové toxicity, není 
nutné je v rámci dvougenera ční studie opakovat. Doporu čuje se 
však veškeré vzorky nebo digitální záznamy spermií z generace 
P uchovat pro pozd ější hodnocení.  
1.5.5  Potomstvo  
Vrhy se vyšet ří co nejdříve po vrhu (v nultý den laktace), aby bylo 
možné stanovit po čet a pohlaví mlá ďat, počet mrtvě a živě naroze­
ných mlá ďat a přítomnost nápadných anomálií. Mlá ďata, která byla 
nalezena mrtvá v den 0, se vyšet ří na možné defekty a p říčinu smrti 
(nejsou-li rozložená) a posléze se uchovají. Živá mlá ďata se spo čí­
tají, každé se ihned po narození zváží (v nultý den laktace) nebo během 1. dne a poté v pravidelných intervalech, nap ř. v 4., 7., 14., 
a 21. den laktace. Zaznamenají se fyzické nebo behaviorální abnor ­
mality zjišt ěné u samic nebo jejich potomstva.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Fyzický vývoj u potomstva se zaznamenává hlavn ě podle přírůstku 
tělesné hmotnosti. Další fyzické parametry (nap ř. otevření uší a o čí, 
prořezávání zub ů, růst srsti) mohou poskytnout dopl ňkové infor ­
mace, ale u t ěchto údaj ů se dává p řednost hodnocení v kontextu 
údajů o pohlavní zralosti (nap ř. stáří a tělesná hmotnost p ři vagi­
nálním otev ření nebo odpojení p ředkožky) (13). Doporu čuje se 
provést funk ční vyšetření (např. pohybová aktivita, smyslové funkce, 
reflexní ontogeneze) potomstva generace F  1 před a/nebo po odsta ­
vení, a to zvlášt ě vyšetření týkající se pohlavní zralosti, nejsou-li 
taková vyšet ření součástí samostatných studií. U odstavených 
potomků generace F  1 vybraných k p řipuštění je třeba stanovit stá ří, 
ve kterém došlo k vaginálnímu otev ření a odlou čení předkožky. 
U mláďat generace F  2 je třeba změřit anogenitální vzdálenost 
během postnatálního dne 0, je-li vyvolána zm ěnami v pom ěru 
pohlaví u generace F  1 nebo načasováním pohlavní zralosti.  
Funkční sledování lze vynechat u skupin, které jinak vykazují jasné 
známky nep říznivých ú činků (např. významné snížení p řírůstku 
hmotnosti atd.). Pokud se provádí funk ční vyšetření, nemělo by se 
provádět u mláďat vybraných k pá ření. 
1.5.6  Celková pitva  
Po utracení nebo uhynutí b ěhem studie se všechna zví řata rodičovské 
generace (P a F  1 ), všechna mlá ďata se zevními odchylkami nebo 
klinickými známkami a rovn ěž jedno náhodn ě vybrané mlád ě 
z každého pohlaví a vrhu z obou generací F  1 a F  2 makroskopicky 
vyšetří na jakékoliv strukturální abnormality anebo patologické 
změny. Speciální pozornost je t řeba věnovat orgán ům rozmnožovací 
soustavy. U mlá ďat, která jsou humánním zp ůsobem utracena ve 
stavu agónie, a u mrtvých mlá ďat, která nejsou rozložena, se provede 
vyšetření za účelem zjišt ění možných defekt ů a/nebo p říčiny uhynutí. 
Mláďata se uchovají.  
Děloha všech samic prvorodi ček se vyšet ří na přítomnost a po čet 
zachycených vají ček v děloze způsobem, který nebude mít vliv na 
histopatologické hodnocení.  
1.5.7  Hmotnost orgán ů 
V okamžiku utracení se u všech rodi čovských zví řat generace P a F  1 
stanoví tělesná hmotnost a hmotnost t ěchto orgán ů (párové orgány je 
třeba vážit jednotliv ě): 
— děloha, vaje čníky,  
— varlata, nadvarlata (celkem a kaudální),  
— prostata,  
— semenné vá čky s koagula čními žlázami a jejich tekutinami a s 
prostatou (jako jedna jednotka),  
— mozek, játra, ledviny, slezina, hypofýza, štítná žláza 
a nadledvinky a známé cílové orgány.  
U mláďat generace F  1 a F  2 vybraných k pitv ě se stanoví t ělesná 
hmotnost v okamžiku utracení. U jednoho náhodn ě vybraného 
mláděte z každého pohlaví a vrhu (viz odstavec 1.5.6) se zváží 
tyto orgány: mozek, slezina a brzlík.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Je-li to proveditelné, zhodnotí se výsledky celkové pitvy a hmotnosti 
orgánů v souvislost s výsledky zjišt ěnými v jiných studiích opako ­
vaného dávkování.  
1.5.8  Histopatologie  
1.5.8.1  Rodi čovská zví řata 
Pro histopatologické vyšet ření se připraví a ve vhodném prost ředí 
uchovají tyto orgány a tkán ě rodičovských zví řat, nebo jejich repre ­
zentativní vzorky:  
— vagina, d ěloha s d ěložním hrdlem a vaje čníky (uložené ve 
vhodném konzerva čním prost ředku),  
— jedno varle (uložené v Bouinov ě roztoku nebo jiném srovna ­
telném prost ředku), jedno nadvarle, semenné vá čky, prostata 
a koagula ční žláza,  
— již dříve určený cílový orgán nebo orgány od všech zví řat gene­
race P a F  1 vybraných k pá ření. 
U všech zví řat generace P a F  1 ze skupiny s vysokou dávkou a z 
kontrolní skupiny vybraných k pá ření se provede kompletní histopa ­
tologické vyšet ření všech výše vyjmenovaných uchovaných orgán ů 
a tkání. Vyšet ření vaječníků u zvířat generace P není povinné. 
Provede se rovn ěž vyšetření orgán ů vykazujících zm ěny spojené 
s aplikací látky u zví řat ze skupiny s nízkou a st řední dávkou, 
které mohou napomoci stanovit dávku NOAEL. Histopatologické 
vyšetření se navíc provede u reproduk čních orgán ů zvířat ze skupiny 
s nízkou a st řední dávkou, u kterých je podez ření na sníženou plod ­
nost, např. u těch, u kterých nedošlo k pá ření, zabřeznutí, zplodn ění 
nebo k vrhu zdravého potomstva nebo u kterých byl ovlivn ěn 
estrální cyklus nebo po čet, motilita nebo morfologie spermií. Vyšet ří 
se všechny makroskopické léze, jako nap ř. atrofie nebo tumory.  
Za účelem zjišt ění účinků spojených s aplikací, jako jsou nap ř. 
nevyvinuté spermatidy, chyb ějící vrstva nebo typ zárode čných 
buněk, mnohojaderné ob ří buňky nebo rozrušení spermatických 
buněk v dutin ě, se provede podrobné histopatologické vyšet ření 
varlat (nap ř. pomocí Bouinova roztoku, zalití do parafínu 
a příčných řezů o tlouš ťce 4–5 μm) (14). Vyšet ření intaktního 
nadvarlete by m ělo zahrnovat vyšet ření hlavy, t ěla a kaudální části, 
čehož lze dosáhnout vyhodnocením podélného řezu. U nadvarlete se 
vyšetří leukocytová infiltrace, zm ěna v prevalenci typ ů buněk, 
aberantní typy bun ěk a fagocytóza spermií. k vyšet ření samčí 
rozmnožovací soustavy lze použít PAS a hematoxylin.  
Postlaktační vaječník by m ěl obsahovat p ůvodní a rostoucí folikuly 
a rovněž zvětšená žlutá t ělíska z období laktace. Histopatologické 
vyšetření by m ělo odhalit kvalitativní snížení celkového po čtu 
původních folikul ů. U samic generace F  1 se provede kvantitativní 
vyhodnocení p ůvodních folikul ů. K vyhodnocení použitého postupu 
je nutné mít statisticky odpovídající po čet zvířat, výběr řezů vaječ­
níků a velikost vzork ů řezů. S cílem umožnit srovnání vaje čníků 
u testované a kontrolní skupiny by m ělo vyšetření zahrnovat výpo čet 
počtu původních folikul ů, které lze zkombinovat s malými rostou ­
cími folikuly (15, 16, 17, 18, 19).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2  Odstavená mlá ďata 
Pro histopatologické vyšet ření se ve vhodném prost ředí připraví 
a uchová makroskopicky abnormální tká ň a cílové orgány od 
všech mlá ďat se zevními odchylkami nebo klinickými p říznaky 
a rovněž od jednoho náhodn ě vybraného mlád ěte z každého pohlaví 
a vrhu z obou generací F  1 a F  2 , které nebyly vybrány k pá ření. 
Kompletní histopatologická charakterizace uchovaných tkání se provede se speciálním d ůrazem na orgány rozmnožovací soustavy.
 
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Výsledky se zaznamenávají individuáln ě a shrnou se do tabulek tak, 
aby byl u každé experimentální skupiny a každé generace uveden počet zvířat na za čátku zkoušky, po čet zvířat uhynulých b ěhem 
zkoušky nebo utracených z humánních d ůvodů, doba úhynu nebo 
humánního utracení, po čet plodných samic, po čet březích samic, 
počet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, popis pozorovaných 
příznaků toxicity v četně doby nástupu, trvání a závažnosti veškerých 
toxických ú činků, typy pozorování rodi čovských zví řat a jejich 
potomstva a všechny významné údaje o vrhu.
 
Numerické výsledky se vyhodnotí pomocí vhodné, všeobecn ě uzná­
vané statistické metody; metody se zvolí v rámci návrhu studie a je třeba je zd ůvodnit. Pro analýzu dat je vhodné použít statistické 
modely dávka-odezva. Protokol by m ěl obsahovat dostate čné infor­
mace o použité metod ě analýzy a po čítačovém programu, aby mohl 
tuto analýzu znovu vyhodnotit a rekonstruovat nezávislý statistik.
 
2.2 HODNOCENÍ VÝSLEDK Ů 
Výsledky této dvougenera ční studie reproduk ční toxicity se vyhod ­
notí ve vztahu k pozorovaným ú činkům včetně pitvy 
a mikroskopických nález ů. V hodnocení musí být uvedeno, zda 
existuje nebo neexistuje souvislost mezi dávkou zkoušené látky a přítomností nebo nep řítomností, výskytem a závažností abnormalit 
včetně makroskopických lézí stanovených cílových orgán ů, vlivu na 
plodnost, klinických abnormalit, vlivu na reproduk ční výkonnost 
a schopnost vrhu, zm ěny tělesné hmotnosti, vlivu na úmrtnost 
a další toxické ú činky. Při hodnocení výsledk ů zkoušky se p řihlédne 
k fyzikáln ě-chemickým vlastnostem zkoušené látky 
a toxikokinetickým údaj ům, jsou-li k dispozici.
 
Správně provedená zkouška reproduk ční toxicity by m ěla zajistit 
dostačující odhad úrovn ě dávky bez ú činku a vysv ětlení nepřízni­
vých účinků na reprodukci, vrh, laktaci, postnatální vývoj v četně 
růstu a pohlavního vývoje.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Dvougenera ční studie reproduk ční toxicity poskytne informace 
o účinku opakované expozice látce b ěhem všech fází reproduk čního 
cyklu. Studie zejména poskytne informace o reproduk čních parame ­
trech a o vývoji, r ůstu, dozrávání a p řežívání potomstva. Výsledky 
studie se interpretují v souvislosti s výsledky ze subchronických, reprodukčních, toxikokinetických a dalších studií. Výsledky této 
studie lze použít k posouzení pot řeby dalšího zkoušení chemické 
látky. Extrapolace výsledk ů této studie na člověka platí pouze 
v omezené mí ře. Největší význam t ěchto výsledk ů spočívá v tom, 
že poskytují informace o úrovni dávky bez ú činků a o přípustné 
expozici člověka (20, 21, 22, 23).
 
3. ZPRÁVY  
3.1. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální vlastnosti, a je-li to podstatné, též fyzikáln ě-chemické 
vlastnosti,  
— identifika ční údaje,  
— čistota.  
Vehikulum (je-li použito):  
— zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— původ, podmínky chovu, strava, materiál na výrobu hnízda atd.,  
— individuální hmotnosti zví řat na začátku zkoušky.  
Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění výběru úrovně dávky,  
— podrobné údaje o složení zkoušené látky/krmiva, o dosažené 
koncentraci,  
— stabilita a homogenita p řípravku,  
— podrobné údaje o podávání zkoušené látky,  
— v případě potřeby přepočet koncentrace zkoušené látky (ppm) ve 
stravě/pitné vod ě na skute čnou dávku (mg na kg t ělesné hmot ­
nosti na den), je-li to možné,  
— podrobné údaje o kvalit ě stravy a vody.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Výsledky:  
— spotřeba stravy a vody, jsou-li k dispozici, využití stravy (p ří­
růstek tělesné hmotnosti na gram spot řebované potravy) 
a spotřeba zkoušené látky u zví řat generace P a F  1 s výjimkou 
období kohabitace a minimáln ě poslední t řetiny laktace,  
— údaje o absorpci (jsou-li k dispozici),  
— údaje o t ělesné hmotnosti zví řat z generace P a F  1 vybraných 
k páření, 
— údaje o hmotnosti vrhu a mlá ďat, 
— tělesná hmotnost p ři utracení a údaje o absolutní a relativní hmot ­
nosti orgán ů u rodičovských zví řat, 
— povaha, závažnost a trvání klinických pozorování (vratných 
i nevratných),  
— den úhynu b ěhem studie nebo údaj, že zví řata přežila až do dne 
utracení,  
— údaje o toxické reakci podle pohlaví a dávky, v četně koeficient ů 
páření, plodnosti, gestace, porodnosti, životaschopnosti a laktace; 
zpráva by m ěla uvádět údaje využité p ři výpočtu těchto koefici ­
entů, 
— toxické nebo jiné ú činky na reprodukci, potomstvo, postnatální 
růst atd.;  
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— počet samic s normálním cyklem z generace P a F  1 a délka 
cyklu,  
— celkový po čet kaudálních epididymálních spermií, procento 
progresivn ě pohyblivých spermií, procento morfologicky normál ­
ních spermií a procento spermií se všemi identifikovanými 
abnormalitami,  
— doba do pá ření včetně počtu dnů před pářením,  
— délka gestace,  
— počet implantát ů, žlutých t ělísek, velikost vrhu,  
— počet živě narozených mlá ďat a postimplanta čních ztrát,  
— počet mláďat s makroskopicky viditelnými abnormalitami a po čet 
zakrslých mlá ďat, pokud byl zjiš ťován,  
— údaje o fyzických vývojových znacích u mlá ďat a další údaje 
o postnatálním vývoji; hodnocené fyzické vývojové znaky je 
nutno zdůvodnit,  
— případně údaje o funk čním pozorování mlá ďat a dosp ělých 
zvířat, 
— statistické vyhodnocení výsledk ů, je-li to možné.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Rozbor výsledk ů. 
Závěry včetně hodnot NOAEL pro ú činky na samice a potomstvo.  
4. LITERATURA  
1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Reproduction 
in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and 
R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Metho ­
xychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  12; 
92–108.
 
3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54; 103–107.  
4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology  5; 39–44  
5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: 
a Consensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3); 237–244.  
6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6; 267–273  
7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dime ­
thanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13; 409–421.  
8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5; 449–458.  
9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using 
the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxico ­
logy,  Part A., Academic, Orlando, Florida; s. 319–333.  
10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm 
Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: 
Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andro ­
logy 10; 401–415.  
11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomic ­
rographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy 8; 330–337.  
12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive 
Toxicants. Reproductive Toxicology 6; 491–505.  
13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. 
Biological Reproduction 17; 298–303.  
14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, 
Florida.  
15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, 
Orlando, Florida.  
16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, 
New York, s. 421–426.  
17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5; 379–383.  
19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
 
20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull’s Toxicology, M.O. Amdur, J. 
Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.  
21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Repro ­
ductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, 
New York.
 
22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36  TOXIKOKINETIKA  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) 417 
(2010). Studie zkoumající toxikokinetiku (TK) zkoušené chemické látky se provádí za ú čelem získání náležitých informací o její absorpci, distribuci, 
biotransformaci (tj. metabolismu) a exkreci, které pomohou dát do souvi ­
slosti koncentraci či dávku s pozorovanou toxicitou a pomohou pochopit 
mechanismus její toxicity. Toxikokinetika m ůže pomoci porozum ět TK 
studiím tím, že prokáže, že jsou pokusná zví řata systémov ě vystavena zkou ­ 
šené chemické látce a odhalením identity cirkulujících složek (mate řská 
chemická látka/metabolity). Základní TK parametry stanovené v t ěchto 
studiích rovn ěž poskytnou informace o schopnosti zkoušené chemické 
látky hromadit se v tkáních a/nebo orgánech a o schopnosti vyvolat 
biotransformaci v d ůsledku expozice zkoušené chemické látce.
 
2. TK údaje mohou p řispět k posouzení p řijatelnosti a relevantnosti použití 
údajů o toxicit ě u zvířat k extrapolaci na nebezpe čnost pro člověka a/nebo 
posouzení rizik. Dále mohou toxikokinetické studie poskytnout užite čné 
informace pro stanovení úrovní dávek ve studiích toxicity (lineární vs. neli ­
neární kinetika), ú činků cesty podání, biologické dostupnosti a otázek souvi ­
sejících s uspo řádáním studie. Ur čité druhy TK údaj ů lze použít k vývoji 
modelu toxikokinetiky na fyziologické bázi (PBTK).  
3. Údaje o metabolitech/TK údaje jsou d ůležité nap ř. k navržení možných 
toxických ú činků a způsobů účinků a jejich vztahu k úrovni dávky a k 
cestě expozice. Dále mohou údaje o metabolismu poskytnout užite čné infor­
mace pro posouzení toxikologického významu expozic exogenn ě produko­
vaných metabolit ů zkoušené chemické látky.  
4. Náležité toxikokinetické údaje pomohou zajistit další p řijatelnost 
a uplatnitelnost kvantitativních vztah ů mezi strukturou a aktivitou, analogic ­
kých přístupů či přístupů založených na seskupování, p ři hodnocení bezpe č­
nosti chemických látek. Údaje o kinetice lze rovn ěž použít k zhodnocení 
toxikologické relevantnosti jiných studií (nap ř. in vivo /in vitro ). 
5. Není-li uvedena jiná cesta podání (viz zejména odstavce 74–78), používá se 
tato zkušební metoda p ři orálním podávání zkoušené chemické látky.  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
6. Regula ční systémy mají u r ůzných tříd chemických látek (nap ř. pesticidy, 
biocidy, pr ůmyslové chemikálie) r ůzné požadavky a pot řeby týkající se 
měření cílových parametr ů souvisejících s toxikokinetikou. Na rozdíl od 
většiny zkušebních metod tato zkušební metoda popisuje zkoušky toxikoki ­
netiky, což zahrnuje více m ěření a cílových parametr ů. V budoucnosti m ůže 
být vyvinuto nové zkušební metody a/nebo pokyny, které budou popisovat každý cílový parametr samostatn ě a podrobn ěji. V případě této zkušební 
metody jsou zkoušky či vyhodnocení, které se mají provést, ur čeny podle 
požadavk ů a/nebo pot řeb každého regula čního systému.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Existuje řada studií, které lze provést ke zhodnocení TK chování zkoušené 
chemické látky pro regula ční účely. Nicmén ě v závislosti na konkrétních 
regulačních potřebách nebo situacích nemusí být všechny tyto studie pro 
hodnocení zkoušené chemické látky nutné. P ři plánování toxikokinetických 
studií je nutná flexibilita a zohledn ění hodnocených vlastností zkoušené 
chemické látky. V n ěkterých p řípadech je t řeba prozkoumat pouze ur čitou 
sadu otázek, aby se zhodnotila nebezpe čnost a obavy z rizik související se 
zkoušenou chemickou látkou. V n ěkterých situacích se mohou TK údaje 
shromáždit jako sou část hodnocení v jiných toxikologických studiích. 
V jiných situacích m ůže být nutné provést dopl ňující a/nebo rozsáhlejší 
studie TK, v závislosti na regula čních potřebách a/nebo pokud se p ři hodno­
cení zkoušené chemické látky objeví nové otázky.  
8. Před zahájením této studie by m ěla laborato ř provádějící zkoušky vzít 
v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce a příslušných metabolitech a analozích, aby se zvýšila kvalita studie 
a předešlo se zbyte čnému použití zví řat. Tyto informace mohou obsahovat 
údaje z ostatních relevantních zkušebních metod (studie  in vivo , studie  in 
vitro  a/nebo hodnocení  in silico ). K plánování studie a interpretaci výsledk ů 
mohou být užite čné fyzikáln ě-chemické vlastnosti, jakými jsou rozd ělovací 
koeficient oktanol–voda (vyjád řený jako log P
 ow ), pKa, rozpustnost ve vod ě, 
tlak par a molekulová hmotnost chemické látky. Lze je stanovit pomocí vhodných metod, jak je popsáno v p říslušných zkušebních metodách.
 
OMEZENÍ  
9. Tato zkušební metoda není ur čena pro speciální okolnosti, nap ř. březí 
zvířata nebo zví řata v laktaci a mlá ďata, či k hodnocení potenciálních 
reziduí u exponovaných zví řat chovaných pro potraviná řské účely. Nicmén ě 
údaje získané ze studie B.36 mohou poskytnout podkladové informace, které mohou být vodítkem p ři plánování speciálních studií pro tyto 
výzkumy. Tato zkušební metoda není ur čena pro zkoušky nanomateriál ů. 
Ze zprávy o p ředběžném přezkoumání Pokyn ů OECD ke zkouškám 
s ohledem na jejich použitelnost u nanomateriál ů vyplývá, že pokyny TG 
417 (odpovídající této zkušební metod ě B.36) není možné v p řípadě nano­
materiálů použít (1).
 
DEFINICE  
10. Definice použité pro ú čely této zkušební metody jsou uvedeny v dodatku.  
ÚVAHY O ZAJIŠT ĚNÍ DOBRÝCH ŽIVOTNÍCH PODMÍNEK ZVÍ ŘAT 
11. Pokyny k humánnímu zacházení se zví řaty jsou k dispozici v Pokynech 
OECD (GD) 19 (2). U všech studií  in vivo  a in vitro  popsaných v této 
zkušební metod ě se doporu čuje postupovat podle dokumentu OECD GD 19.  
POPIS METOD  
Pilotní studie  
12. Při výběru experimentálních parametr ů pro studie toxikokinetiky (nap ř. 
metabolismu, látkové bilance, analytických postup ů, stanovení dávky, 
vydechovaného CO  2 atd.) se doporu čuje použít pilotní studie. 
K charakterizaci n ěkterých z t ěchto parametr ů nemusí být nutné používat 
radioizotopov ě značené chemické látky.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Výběr zvířat 
Druhy  
13. Zvířecí druh (a kmen) použitý pro zkoušky TK by m ěl být nejlépe stejný 
jako druh použitý v jiných toxikologických studiích provád ěných s danou 
zkoušenou chemickou látkou. Obvykle by se m ěl použít potkan, nebo ť se 
v toxikologických studiích široce používá. Použití jiných nebo dopl ňkových 
druhů může být oprávn ěné, pokud kritické toxikologické studie prokážou 
výskyt významné toxicity u t ěchto druh ů nebo pokud se ukáže, že toxicita/ 
toxikokinetika t ěchto druh ů je pro člověka relevantn ější. Výběr zvířecího 
druhu a kmene by se m ěl zdůvodnit.  
14. Není-li uvedeno jinak, týká se tato zkušební metoda potkana jakožto zkou ­ 
šeného druhu. Pokud jsou ke zkouškám použity jiné druhy, m ůže být nutné 
určité aspekty této metody upravit.  
Stáří a kmen  
15. Měla by se použít mladá dosp ělá zvířata (v dob ě podávání dávky obvykle 
6–12 týdn ů stará) (viz také odstavce 13 a 14). Použití zví řat, která nejsou 
mladá a dosp ělá, by se m ělo zdůvodnit. Všechna zví řata by m ěla být na 
počátku studie p řibližně stejného stá ří. Odchylky v hmotnosti jednotlivých 
zvířat by v dané experimentální skupin ě neměly překročit ± 20 % pr ůměrné 
hmotnosti. V ideálním p řípadě by se měl použít stejný kmen, jaký se použil 
při získávání toxikologických dat o dané zkoušené chemické látce.  
Počet a pohlaví zví řat 
16. Pro každou zkoumanou dávku by se m ěla použít alespo ň čtyři zvířata od 
každého pohlaví. M ělo by se uvést zd ůvodnění pro výb ěr pohlaví použitých 
zvířat. Jestliže existují d ůkazy, které sv ědčí o významných rozdílech 
v toxicitě v závislosti na pohlaví, m ělo by se použití obou pohlaví ( čtyř 
samců a čtyř samic) uvážit.  
Podmínky chovu a krmení  
17. Zvířata by se m ěla v průběhu zkoušky chovat jednotliv ě. Za speciálních 
podmínek m ůže být od ůvodněn skupinový chov. Osv ětlení by m ělo být 
umělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Teplota 
v místnosti pro pokusná zví řata by m ěla být 22 °C (± 3 °C) a relativní 
vlhkost 30–70 %. Ke krmení lze použít konven ční laboratorní krmivo 
s neomezeným p řísunem pitné vody.  
Zkoušená chemická látka  
18. Pro látkovou bilanci a identifikaci metabolit ů ve studii by se m ěla použít 
radioizotopov ě značená zkoušená chemická látka (pomocí  14 C), avšak je-li 
možné prokázat, že:  
— látkovou bilanci a identifikaci metabolit ů lze dostate čně vyhodnotit i p ři 
použití nezna čené zkoušené chemické látky,  
— analytická specifi čnost a citlivost metody použité s nezna čenou zkou ­ 
šenou chemickou látkou je shodná nebo v ětší, než jaké by bylo možné 
dosáhnout s radioizotopov ě značenou zkoušenou chemickou látkou,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
pak se radioizotopov ě značená chemická látka nemusí používat. Krom ě toho 
lze použít jiné radioaktivní a stabilní izotopy, zejména pokud je p říslušný 
prvek zodpov ědný za toxicitu nebo je sou částí toxické části zkoušené 
chemické látky. Je-li to možné, m ěla by být radioaktivní zna čka umístěna 
ve středové části molekuly, která je metabolicky stabilní (není zam ěnitelná, 
nelze ji metabolicky odbourat jako CO  2 a nestává se sou částí zásob jednou ­
hlíkových jednotek v organismu). N ěkdy může být nutné ozna čit více míst 
nebo specifických oblastí molekuly, aby bylo možné sledovat metabolický osud zkoušené chemické látky.
 
19. Pomocí vhodných metod by se m ěla stanovit čistota a identita radioizoto ­
pově značených a nezna čených zkoušených chemických látek. Radioche ­
mická čistota radioaktivní zkoušené chemické látky by m ěla být nejvyšší, 
jaké lze u dané zkoušené chemické látky dosáhnout (v ideálním p řípadě by 
měla být v ětší než 95 %) a m ělo by se vynaložit dostate čné úsilí 
k identifikaci ne čistot přítomných v množství 2 % a v ětším. Čistota spolu 
s identitou a procentuálním zastoupením jakýchkoli ne čistot, které byly 
identifikovány, by se m ěla zaznamenat. Další užite čné pokyny p ři defino­
vání a specifikacích zkoušených chemických látek, které jsou složeny ze směsí, a metody pro stanovení čistoty mohou být obsaženy v individuálních 
regulačních programech.
 
Výběr dávky  
Pilotní studie  
20. Pro pilotní studii je obvykle dosta čující jednorázová orální dávka. Dávka by 
měla být netoxická, avšak dostate čně vysoká na to, aby umožnila identifi ­
kaci metabolit ů v exkretech (a p řípadně v plazm ě) a rovněž aby spl ňovala 
uvedený ú čel pilotní studie, jak je uveden v odstavci 12 této zkušební 
metody.  
Hlavní studie  
21. Pro hlavní studie se up řednostňují minimáln ě dvě dávky, nebo ť informace 
získané alespo ň ze dvou exponovaných skupin mohou pomoci p ři nastavo­
vání dávek v jiných studiích toxicity a p ři hodnocení vztahu mezi dávkou 
a odezvou v již dostupných zkouškách toxicity.  
22. Pokud se podávají dv ě dávky, m ěly by být ob ě dostatečně vysoké, aby 
umožnily identifikaci metabolit ů v exkretech (a p řípadně v plazm ě). Při 
výběru dávky by se m ěly vzít v úvahu dostupné toxikologické údaje. 
Nejsou-li tyto informace k dispozici (nap ř. ze studií akutní orální toxicity 
zaznamenávajících p říznaky toxicity nebo ze studií toxicity po opakovaných 
dávkách), m ůže se zvážit použití vyšší dávky, která je menší než odhad 
LD 50 (orální a dermální cesta) nebo LC  50 (inhalační cesta) nebo menší než 
nižší hodnota odhadovaného rozmezí akutní toxicity. Nižší dávka by se m ěla 
stanovit vyd ělením vyšší dávky.  
23. Jestliže se zkoumá pouze jedna úrove ň dávky, m ěla by být dávka v ideálním 
případě dostatečně vysoká, aby umožnila identifikaci metabolit ů v exkretech 
(a případně v plazm ě), aniž by vedla ke zjevné toxicit ě. Mělo by se uvést 
zdůvodnění, proč nebyla za řazena druhá úrove ň dávky.  
24. Jestliže je t řeba stanovit ú činek dávky na kinetické procesy, nemusí být dv ě 
dávky dosta čující a alespo ň jedna dávka by m ěla být dostate čně vysoká, aby 
tyto procesy saturovala. Pokud se p ři dvou úrovních dávky použité v hlavní 
studii plocha pod k řivkou závislosti koncentrace v plazm ě na čase (AUC) 
nemění lineárn ě, svědčí to o tom, že k saturaci jednoho nebo více kinetic ­
kých proces ů dochází n ěkde mezi t ěmito dvěma úrovn ěmi dávek.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. U zkoušených chemických látek s nízkou toxicitou (podávaných oráln ě 
a dermáln ě) by se m ěla použít maximáln ě dávka 1 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti (pokud se látka podává inhala ční cestou, viz pokyny v kapitole B.2 
této přílohy; obvykle tato dávka nep řesahuje 2 mg/l). Úvahy specifické pro 
danou chemickou látku mohou vyžadovat vyšší dávku v závislosti na pot ře­
bách regula čních opat ření. Výběr dávky by m ěl být vždy zd ůvodněn. 
26. Údaje o toxikokinetice a distribuci látky v tkáních po jednorázové dávce 
mohou být dosta čující pro stanovení potenciálu akumulace a/nebo perzis ­
tence. Nicmén ě za určitých okolností m ůže být třeba podávat dávku opako ­
vaně i) aby bylo úpln ější zhodnocení potenciálu akumulace a/nebo perzis ­
tence či změny v TK (tj. nap říklad indukce a inhibice enzym ů) nebo ii) 
protože to vyžaduje p říslušný regula ční systém. Ve studiích s opakovaným 
podáváním dávky obvykle posta čí opakované podávání nízké dávky, avšak 
za jistých okolností m ůže být nutné podávat opakovan ě vysokou dávku (viz 
také odstavec 57).  
Podávání zkoušené chemické látky  
27. Pokud je známo, jaký nosi či byl použit pro studie orální toxicity s danou 
chemickou látkou podávanou nitrožalude čně, měla by se zkoušená chemická 
látka rozpustit nebo homogenn ě suspendovat ve stejném nosi či. Mělo by se 
uvést zdůvodnění výběru nosiče. Výběr nosiče a objemu dávkování by se 
měl zvážit v návrhu studie. Obvyklým zp ůsobem podání je žalude ční sonda, 
avšak ve speciálních p řípadech m ůže být výhodné podávat látku ve form ě 
želatinové tobolky nebo ve sm ěsi s potravou (v obou p řípadech je t řeba 
uvést zdůvodnění). Mělo by se uvést ov ěření skute čné dávky podané 
každému zví řeti. 
28. Maximální objem tekutiny, který se podává najednou žalude ční sondou, 
závisí na velikosti pokusného zví řete, druhu nosi če dávky a na skute čnosti, 
zda je před podáním zkoušené chemické látky pozastaveno krmení či nikoli. 
Mělo by se uvést zd ůvodnění pro podávání nebo omezení krmiva p řed 
podáním dávky. Objem dávky by m ěl být za b ěžných okolností co možná 
nejnižší, až už se použijí vodné nebo jiné nosi če. Objemy dávky by 
u hlodavc ů obvykle nem ěly přesáhnout 10 ml/kg t ělesné hmotnosti. Objemy 
nosičů použitých pro lipofiln ější zkoušené chemické látky mohou za čínat na 
4 ml/kg t ělesné hmotnosti. P ři opakovaném podávání dávky, kdy je la čnění 
přes den kontraindikováno, by se m ělo uvažovat o nižších objemech dávky 
(např. 2–4 ml/kg t ělesné hmotnosti). Kdykoli je to možné, m ůže se zvážit 
použití stejného objemu dávky, jaký byl podáván žalude ční sondou v jiných 
orálních studiích zkoušené chemické látky.  
29. K stanovení biologické dostupnosti nebo relativní orální absorpce je možné 
použít nitrožilní (intravenózní, IV) podání zkoušené chemické látky a měření hladiny zkoušené chemické látky v krvi a/nebo exkretech. 
V případě IV studie se podává jednorázová dávka (obvykle odpovídající 
nižší orální dávce, avšak ji nep řesahující – viz výb ěr dávky) zkoušené 
chemické látky s pomocí vhodného nosi če. Tento materiál by se m ěl 
podávat ve vhodném objemu (nap ř. 1 ml/kg t ělesné hmotnosti) na vybraném 
místě podání alespo ň čtyřem zvířatům vhodného pohlaví (je-li to pot řeba, 
mohou se použít ob ě pohlaví, viz odstavec 16). K podání zkoušené 
chemické látky intravenózn ě je nutné, aby byla dávka pln ě rozpuštěna 
nebo suspendována. Nosi č použitý p ři IV podání by nem ěl ovlivňovat inte­
gritu krve ani krevní tok. Jestliže se zkoušená chemická látka podává infuzí 
a používá-li se infuzní pumpa, m ěla by se uvést infuzní rychlost a m ěla by
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
být standardizována pro všechna zví řata. Je-li zavád ěna kanyla do  vena 
jugularis  (k podání zkoušené chemické látky a/nebo odb ěru krve) nebo 
podává-li se látka do  arteria femoralis , měla by se použít anestézie. Druh 
anestézie je t řeba náležit ě zvážit, nebo ť může ovlivnit toxikokinetiku. 
Zvířatům by se m ěl ponechat dostatek času na náležité zotavení p řed 
podáním zkoušené chemické látky a nosi če. 
30. Ostatní cesty podání, nap ř. dermální a inhala ční (viz odstavce 74–78), se 
mohou použít u ur čitých druh ů zkoušených chemických látek s ohledem na 
jejich fyzikáln ě-chemické vlastnosti a o čekávané použití nebo expozici 
u člověka. 
Měření 
Látková bilance  
31. Látková bilance se stanoví se čtením procentuálního zastoupení podané 
(radioaktivní) dávky, která se vylou čila močí, výkaly a vydechovaným vzdu ­
chem, a procentuálního zastoupení v tkáních, zbývajících částech mrtvého 
těla a ve zbytcích vymytých z klece (viz odstavec 46). Obvykle se považují 
celkové výt ěžky podané chemické látky (radioaktivní) nad 90 % za dosta ­
tečné. 
Absorpce  
32. Úvodní odhad absorpce lze stanovit tak, že se z látkové bilance ode čte 
procentuální zastoupení dávky v gastrointestinálním (GI) traktu a/nebo 
výkalech. Výpo čet procentuální absorpce uvádí odstavec 33. Vyšet ření 
exkretů uvádí odstavce 44–49. Nelze-li ze studií látkové bilance ur čit 
přesnou míru absorpce po orálním podání dávky (nap ř. když je více než 
20 % podané dávky p řítomno ve výkalech), m ůže být nezbytné provést další 
vyšetření. Tyto studie se mohou zahrnovat bu ď 1) orální podání zkoušené 
chemické látky a m ěření obsahu zkoušené chemické látky ve žlu či, nebo 2) 
orální a IV podání zkoušené chemické látky a m ěření čistého množství 
zkoušené chemické látky p řítomné v mo či a vydechovaném vzduchu a v 
mrtvém těle při každé z t ěchto dvou cest. V obou plánech studie se provádí 
měření radioaktivity jako náhradní metoda za chemicky specifickou analýzu 
zkoušené chemické látky a metabolit ů. 
33. Provádí-li se studie exkrece žlu čí, používá se obvykle orální cesta podání. 
V této studii by se m ěly kanylovat žlu čovody alespo ň čtyř zvířat vhodného 
pohlaví (nebo obou pohlaví, je-li to opodstatn ěné) a měla by se jim podat 
jednorázová dávka zkoušené chemické látky. Po podání zkoušené chemické 
látky by se m ěla sledovat exkrece radioaktivní/zkoušené chemické látky ve 
žluči tak dlouho, jak je pot řeba pro ur čení procentuálního podílu podané 
dávky, který se vylu čuje touto cestou a který lze použít k p římému výpo čtu 
míry orální absorpce takto:  
Procentuální absorpce  ¼ ðmnožství ve žlu či þ moči þ vydechovaném vzduchu  þ 
mrtvém těle bez obsahu GItraktu Þ=podané množství Ü 100 
34. U některých tříd zkoušených chemických látek m ůže dojít k p římé sekreci 
absorbované dávky p řes střevní stěnu. V takových p řípadech se m ěření % 
dávky ve výkalech po orálním podání dávky u potkana s kanylovanými žlučovody nepovažuje za odpovídající neabsorbované dávce. Doporu čuje 
se, aby se v p řípadě, kdy podle p ředpokladů dochází k sekreci látky ze 
střev, zakládalo stanovení % absorbované dávky na absorpci vypo čítané 
ze srovnání exkrece po orální a IV cest ě podání (potkan s kanylovanými 
žlučovody nebo intaktní) (viz odstavec 35). Rovn ěž se doporu čuje, aby se 
v případě, kdy se považuje za nutné kvantifikovat st řevní sekreci, m ěřila 
exkrece u potkana s kanylovanými žlu čovody po IV podání dávky.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biologická dostupnost  
35. Biologickou dostupnost lze stanovit z kinetiky látky v plazm ě/krvi u skupin 
s orálním a IV podáním, jak popisují odstavce 50–52, specifickou chemickou analýzou zkoušené chemické látky a/nebo p říslušného metabolitu 
(příslušných metabolit ů), a radioizotopov ě značená zkoušená chemická látka 
proto není nutná. Výpo čet biologické dostupnosti (F) zkoušené chemické 
látky nebo p říslušného metabolitu (p říslušných metabolit ů) lze provést násle ­
dovně:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDávka  IV=Dávka  exp Þ 
kde AUC je plocha pod k řivkou závislosti koncentrace v plazm ě na čase 
a exp je experimentální cesta podání (orální, dermální nebo inhala ční). 
36. K posouzení rizika systémových ú činků se obvykle up řednostňuje použití 
biologické dostupnosti toxické složky p řed procentuální absorpcí, když se 
porovnávají systémové koncentrace ze studií na zví řatech s analogickými 
údaji z biomonitorování ve studiích expozice pracovník ů. Situace se m ůže 
stát složit ější, pokud se dávky nacházejí v nelineárním rozmezí, proto je 
důležité, aby se p ři toxikokinetickém screeningu stanovily dávky v lineárním 
rozmezí.  
Distribuce v tkáních  
37. Poznatky o distribuci zkoušené chemické látky a/nebo jejích metabolit ů 
v tkáních jsou d ůležité pro identifikaci cílových tkání a pochopení základ ­
ních mechanism ů toxicity a pro získání informací o schopnosti akumulace 
a perzistence zkoušené chemické látky a jejích metabolit ů. Procentuální 
podíl celkové (radioaktivní) dávky v tkáních a rovn ěž ve zbylém mrtvém 
těle by se m ěl měřit alespoň při ukončení exkre čního experimentu (nap ř. 
obvykle do 7 dn ů či méně po podání dávky v závislosti na specifickém 
chování zkoušené chemické látky). Pokud p ři ukončení studie není v tkáních 
detekována žádná zkoušená chemická látka (nap ř. protože mohlo k její 
eliminaci dojít ješt ě před ukončením studie v d ůsledku krátkého elimina č­
ního polo času), je t řeba důsledně předcházet nesprávné interpretaci údaj ů. 
V takové situaci by se m ěla distribuce v tkáních vyšet řit v době maximální 
koncentrace zkoušené chemické látky (a/nebo metabolitu) v plazm ě/krvi 
(T max ) nebo v dob ě maximální míry exkrece látky mo čí dle vhodnosti 
(viz odstavec 38). Krom ě toho m ůže být pot řeba odebrat tká ň ještě 
v dalších časových bodech k stanovení distribuce zkoušené chemické 
látky a/nebo jejích metabolit ů v tkáních, zhodnocení závislosti na čase (je- 
li vhodné), pomoci p ři stanovení látkové bilance a/nebo na základ ě poža­
davků příslušného orgánu. Mezi tkán ě, které by se m ěly odebrat, pat ří játra, 
tuková tká ň, GI trakt, ledviny, slezina, krev jako celek, zbylé části mrtvého 
těla, tkáně cílových orgán ů a jakékoli další tkán ě (např. štítná žláza, erytro ­
cyty, reproduk ční orgány, k ůže, oči – zejména u zví řat s pigmentací), které 
mohou mít význam p ři toxikologickém hodnocení zkoušené chemické látky. 
Měla by se zvážit analýza dalších tkání ve stejných časových bodech za 
účelem maximálního využití zví řat a v případě, kdy je ve studiích subchro ­
nické a chronické toxicity pozorována toxicita v ůči cílovým orgán ům. Měly 
by se rovn ěž uvádět (radioaktivní) zbytkové koncentrace a pom ěr tkání 
a plazmy (krví).  
38. Zhodnocení distribuce v tkáních v dalších časových bodech, jako je čas 
maximální koncentrace látky v plazm ě/krvi (T  max ) nebo čas maximální 
míry exkrece látky mo čí, v příslušných experimentech zkoumajících kine ­
tiku látky v plazm ě/krvi nebo exkreci látky, m ůže být také pot řebné nebo jej 
může vyžadovat p říslušný orgán. Tyto informace mohou být užite čné 
k pochopení toxicity a schopnosti akumulace a perzistence zkoušené chemické látky a jejích metabolit ů. Mělo by se uvést zd ůvodnění výběru 
vzorků. Vzorky k analýze by m ěly být obvykle stejné jako výše zmi ňované 
(viz odstavec 37).
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Kvantifikaci radioaktivity ve studiích distribuce v tkáních lze provést 
preparací orgánu, homogenizací, spálením a/nebo solubilizací, po čemž 
následuje kapalinová scintila ční spektrometrie (LSC) zachycených reziduí. 
Při stanovování distribuce zkoušené chemické látky v orgánech a/nebo 
tkáních mohou být užite čné určité techniky, které jsou v sou časnosti 
v různých fázích vývoje, nap ř. kvantitativní celot ělová autoradiografie 
a receptorová mikroskopická autoradiografie (3), (4).  
40. U jiných cest expozice než orální by se m ěly odebrat a analyzovat speci ­
fické tkán ě, jako jsou plíce v inhala čních studiích a k ůže v dermálních 
studiích. Viz odstavce 74–78.  
Metabolismus  
41. Pro identifikaci a kvantifikaci nezm ěněné zkoušené chemické látky 
a metabolit ů by se m ěly odebrat exkrety (a plazma, je-li to vhodné), jak 
je popsáno v odstavcích 44–49. Slou čení exkret ů v rámci skupiny s danou 
dávkou k usnadn ění identifikace metabolit ů je přípustné. Doporu čuje se určit 
profil metabolit ů v každém časovém období. Pokud však množství vzork ů 
a/nebo výše radioaktivity nejsou dostate čné, je p řípustné slou čit moč 
a výkaly z n ěkolika časových bod ů. Slučování vzork ů odebraných r ůzným 
pohlavím nebo p ři různých dávkách však p řípustné není. K analýze mo či, 
výkalů, radioaktivity uvoln ěné z exponovaných zví řat a případně žluči by se 
měly použít vhodné kvalitativní a kvantitativní metody.  
42. Mělo by se vynaložit dostate čné úsilí k identifikaci všech metabolit ů, které 
představují 5 % množství podané dávky či větším a k vytvo ření metabolic ­
kého schématu zkoušené chemické látky. M ěly by se identifikovat zkoušené 
chemické látky, které byly zjišt ěny v exkretech v množství 5 % podané 
dávky a v ětším,. Identifikací se rozumí p řesné určení struktury složek. 
Obvykle se identifikace provádí simultánní chromatografií metabolitu se 
známými standardy s použitím dvou rozdílných systém ů nebo pomocí 
technik schopných provést pozitivní identifikaci struktury, jako je hmot ­
nostní spektrometrie, nukleární magnetická rezonance (NMR) atd. 
V případě simultánní chromatografie se chromatografické techniky použí ­
vající stejnou stacionární fázi se dv ěma různými systémy rozpoušt ědla nepo­
važují za dostate čnou verifikaci metabolitu dv ěma metodami, nebo ť tyto 
metody nejsou nezávislé. Identifikace pomocí simultánní chromatografie 
by se měla provést pomocí dvou rozdílných analyticky nezávislých systém ů, 
jako je nap říklad chromatografie na tenké vrstv ě (TLC) s reverzní 
a normální fází a vysoce ú činná kapalinová chromatografie (HPLC). Jestliže 
je chromatografická separace dostate čně kvalitní, není další potvrzení 
pomocí spektroskopických postup ů nutné. Jednozna čné identifikace lze 
dosáhnout také pomocí metod podávajících informace o struktu ře, jako je 
kapalinová chromatografie/hmotnostní spektrometrie (LC-MS) nebo kapali ­
nová chromatografie/tandemová hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS), 
plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie (GC-MS) a NMR spek ­
trometrie.  
43. Jestliže identifikace metabolit ů představujících 5 % množství podané dávky 
a větší není možná, m ělo by se v záv ěrečné zprávě uvést zd ůvodnění/vy­
světlení. Může být vhodné identifikovat metabolity p ředstavující mén ě než 
5 % podané dávky k lepšímu pochopení metabolické dráhy zkoušené chemické látky pro posouzení její nebezpe čnosti a/nebo rizik. Kdykoli je 
to možné, m ělo by se uvést potvrzení struktury. To m ůže zahrnovat ur čení 
jejího profilu v plazm ě, krvi nebo jiných tkáních.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Vylučování  
44. Rychlost a rozsah vylu čování podané dávky by se m ěly určit měřením 
procentuální výt ěžnosti (radioaktivní) dávky z mo či, výkal ů 
a vydechovaného vzduchu. Tyto údaje rovn ěž pomohou p ři stanovení 
látkové bilance. Množství zkoušené chemické látky (radioaktivita) vylou ­ 
čené v mo či, výkalech a vydechovaném vzduchu by se m ělo stanovovat 
ve vhodných časových intervalech (viz odstavce 47–49). Experimenty 
s opakovaným podáváním dávky by m ěly být správn ě navrženy tak, aby 
umožnily sb ěr údajů o exkreci ke spln ění cílů popsaných v odstavci 26. 
Umožní to srovnání s experimenty s jednorázovou dávkou.  
45. Jestliže pilotní studie prokázala, že se ve vydechovaném vzduchu nevylu ­ 
čuje žádné významné množství zkoušené chemické látky (radioaktivity) (dle 
odstavce 49), nemusí se v kone čné studii vydechovaný vzduch odebírat.  
46. Každé zví ře se musí umístit do odd ělené metabolické jednotky pro sb ěr 
exkretů (moč, výkaly a vydechovaný vzduch). Na konci každého období 
sběru (viz odstavce 47–49) by se m ěly metabolické jednotky vypláchnout 
vhodným rozpoušt ědlem (tomu se říká „vymytí klece“) aby se zajistil maxi ­
mální výt ěžek zkoušené chemické látky (radioaktivity). Sb ěr exkretů by se 
měl ukončit 7. den nebo poté, co bylo získáno alespo ň 90 % podané dávky, 
podle toho, co nastane d říve. 
47. Celková množství zkoušené chemické látky (radioaktivity) v mo či se musí 
stanovit v 1. den sb ěru alespoň ve dvou časových bodech, z nichž jeden by 
měl být 24 h po podání dávky, a poté se stanovují denn ě až do konce studie. 
První den se doporu čuje zvolit více než dva odb ěrové časy (např. po 6 h, 12 
h a 24 h). Výsledky pilotních studií by se m ěly analyzovat, aby se získaly 
informace k ur čení alternativních nebo dopl ňujících odb ěrových časů. Odbě­
rová schémata by m ěla být zd ůvodněna. 
48. Celková množství zkoušené chemické látky (radioaktivity) ve výkalech by 
se měla stanovovat denn ě, s prvním odb ěrem 24 h po podání dávky, až do 
konce studie, pokud pilotní studie nenavrhuje alternativní nebo dopl ňující 
odběrové časy. Alternativní odb ěrová schémata by m ěla být zd ůvodněna. 
49. Sběr vydechovaného CO  2 a dalších t ěkavých materiál ů lze v daném 
studijním experimentu ukon čit, jestliže se b ěhem 24hodinového období 
sběru ve vydechovaném vzduchu nalezne mén ě než 1 % podané dávky.  
Studie časového pr ůběhu 
Kinetika v plazm ě/krvi 
50. Cílem t ěchto studií je získat odhady základních TK parametr ů [např. C max , 
T max , eliminační poločas (t  1/2 ), AUC] zkoušené chemické látky. Tyto studie 
lze provád ět s jednou dávkou nebo – pravd ěpodobněji – se dv ěma a více 
dávkami. Nastavení dávek by se m ělo určit podle podstaty experimentu 
a/nebo příslušné tkán ě. Kinetické údaje mohou být zapot řebí k řešení otázek, 
jako je biologická dostupnost zkoušené chemické látky a/nebo k objasn ění 
účinku dávky na clearanci (nap ř. k objasn ění, zda je clearance saturována 
způsobem závisejícím na dávce).  
51. V těchto studiích by se m ěla použít nejmén ě čtyři zvířata jednoho pohlaví 
pro každou skupinu s p říslušnou dávkou. M ělo by se uvést zd ůvodnění pro 
výběr pohlaví použitých zví řat. Použití obou pohlaví ( čtyři samci a čtyři 
samice) by se m ělo zvážit, jestliže existují d ůkazy, které sv ědčí 
o významných rozdílech v toxicit ě v závislosti na pohlaví.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Po podání zkoušené chemické látky (radioizotopov ě značené) by se m ěly 
každému zví řeti ve vhodnou dobu odebrat krevní vzorky pomocí náležité 
metodiky odb ěru. Objem a množství krevních vzork ů, které lze získat od 
jednoho zví řete, může být limitován potenciálními ú činky opakovaného 
odběru na zdraví/fyziologii zví řete a/nebo citlivostí analytické metody. 
Vzorky by se m ěly analyzovat u každého jednotlivého zví řete zvlášť. Za 
určitých okolností (nap ř. charakterizace metabolit ů), může být nutné slou čit 
vzorky od více než jednoho zví řete. Sloučené vzorky by m ěly být jasn ě 
označené a mělo by se podat zd ůvodnění sloučení vzork ů. Používá-li se 
radioizotopov ě značená zkoušená chemická látka, m ůže být posta čující 
analýza celkové p řítomné radioaktivity. Je-li tomu tak, m ěla by se celková 
radioaktivita analyzovat v krvi a plazm ě nebo v plazm ě a červených krvin ­
kách, aby byl možný výpo čet podílu látky v krvi/plazm ě. V jiných p řípa­
dech mohou být nezbytná specifi čtější vyšetření vyžadující identifikaci 
mateřské slou čeniny a/nebo metabolit ů nebo vyhodnocení vazby na 
proteiny.  
Kinetika v dalších tkáních  
53. Cílem t ěchto studií je získat informace o časovém pr ůběhu, aby bylo možno 
zodpovědět otázky týkající se nap ř. způsobu toxického ú činku, bioakumu ­
lace a bioperzistence pomocí stanovení hladiny zkoušené chemické látky 
v různých tkáních. Výb ěr tkání a po čet hodnocených časových bod ů bude 
záviset na p říslušné tkáni a na databázi toxikologických údaj ů o zkoušené 
chemické látce. Plán t ěchto studií kinetiky v dalších tkáních by m ěl brát 
v úvahu také informace získané postupy popsanými v odstavcích 37–40. 
Tyto studie mohou používat jednorázové nebo opakované podání dávky. Mělo by se uvést podrobné zd ůvodnění použitého postupu.
 
54. Mezi d ůvody pro provád ění studií kinetiky v dalších tkáních m ůže patřit: 
— důkaz prodlouženého elimina čního polo času v krvi nazna čující možnou 
akumulaci zkoušené chemické látky v r ůzných tkáních nebo  
— zájem zjistit, zda bylo v konkrétních tkáních dosaženo ustáleného stavu 
(např. ve studiích s opakovanými dávkami m ůže být zájem zjistit, zda 
bylo dosaženo ustáleného stavu v cílových tkáních v okamžiku, kdy bylo zdánliv ě dosaženo ustáleného stavu zkoušené chemické látky 
v krvi).
 
55. V těchto typech studií sledujících časový průběh by se m ěla podat p říslušná 
orální dávka zkoušené chemické látky nejmén ě čtyřem zvířatům pro každou 
dávku a každý časový bod a ve vybraných tkáních se poté sleduje časový 
průběh distribuce. Je možno použít pouze jedno pohlaví, pokud nebyla 
pozorována toxicita specifická pro pohlaví. Zda se bude analyzovat celková 
radioaktivita nebo mate řská chemická látka a/nebo metabolity bude rovn ěž 
záviset na p říslušné tkáni. Vyhodnocení distribuce v tkáních by se m ělo 
provádět pomocí vhodných technik.  
Enzymová indukce/inhibice  
56. Studie sledující možné ú činky enzymové indukce/inhibice nebo biotransfor ­
mace studované zkoušené chemické látky mohou být zapot řebí v jednom 
nebo více z následujících p řípadů: 
1) dostupné d ůkazy nazna čují vztah mezi biotransformací zkoušené 
chemické látky a zvýšenou toxicitou;  
2) dostupné údaje o toxicit ě naznačují nelineární vztah mezi dávkou 
a metabolismem;  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3) výsledky studií identifikace metabolit ů prokázaly identifikaci potenciáln ě 
toxického metabolitu, který by mohl být produkován enzymovou drahou 
indukovanou zkoušenou chemickou látkou;  
4) při vysvětlování účinků, o nichž se tvrdí, že jsou spojeny s fenoménem 
enzymové indukce;  
5) jsou-li pozorovány toxikologicky významné zm ěny metabolického 
profilu zkoušené chemické látky bu ď v in vitro,  nebo v  in vivo  experi­
mentech s r ůznými druhy či za různých podmínek, m ůže být pot řebná 
charakterizace zú častněného enzymu (zú častněných enzym ů) (např. 
enzymy fáze I, jako jsou isoenzymy systému monooxygenázy závislém na cytochromu P450, enzymy fáze II, jako jsou isoenzymy sulfotrans ­
ferázy nebo uridin-difosfát-glukuronosyl-transferázy nebo jakékoli další 
relevantní enzymy). Tyto informace lze použít ke zhodnocení vhodnosti mezidruhových extrapolací.
 
57. Ke zhodnocení zm ěn TK souvisejících se zkoušenou chemickou látkou by 
se měly použít vhodné protokoly studie, náležit ě validované a zd ůvodněné. 
Ukázkové plány studie se skládají z opakovaného podávání dávky nezna ­ 
čené zkoušené chemické látky, po n ěmž následuje 14. den jednorázová 
radioizotopov ě značená dávka nebo opakované podávání dávek radioizoto ­
pově značené zkoušené chemické látky a odb ěry vzorků 1., 7. a 14. den ke 
stanovení profilu metabolit ů. Opakované podávání dávky radioizotopov ě 
značené zkoušené chemické látky m ůže rovněž poskytnout informace 
o bioakumulaci (viz odstavec 26).  
DOPLŇKOVÉ POSTUPY  
58. Dopl ňkové postupy nad rámec experiment ů in vivo  popsané v této zkušební 
metodě mohou poskytnout užite čné informace o absorpci, distribuci, meta ­
bolismu či eliminaci zkoušené chemické látky u ur čitých druh ů. 
Použití informací  in vitro  
59. Několik otázek týkajících se metabolismu zkoušené chemické látky lze 
vyřešit pomocí studií  in vitro  používajících vhodné zkušební systémy. 
Čerstvě izolované nebo kultivované hepatocyty a subcelulární frakce (nap ř. 
mikrozomy a cytosol nebo frakce S9) z jater lze použít ke studiu možných 
metabolit ů. Lokální metabolismus v cílovém orgánu, nap ř. plicích, m ůže být 
předmětem zájmu p ři posuzování rizik. K t ěmto účelům mohou být vhodné 
mikrozomální frakce cílových tkání. Studie na mikrozomech mohou být užitečné ke zkoumání potenciálních rozdíl ů mezi pohlavími a životními 
stadii a k charakterizaci enzymatických parametr ů (K
 m a V  max ), které 
mohou pomoci p ři hodnocení závislosti metabolismu na dávce 
v souvislosti s úrovn ěmi expozice. Dále mohou být mikrozomy užite čné 
k identifikaci specifických mikrozomálních enzym ů účastnících se metabo ­
lismu zkoušené chemické látky, které mohou být významné p ři mezidruhové 
extrapolaci (viz také odstavec 56). Schopnost indukce biotransformace lze rovněž zkoumat za použití subcelulárních frakcí z jater (nap ř. mikrozomy 
a cytosol) zví řat předběžně vystavených p říslušné zkoušené chemické látce,  
in vitro  prostřednictvím studií indukce hepatocyt ů nebo pomocí specifických 
buněčných linií exprimujících p říslušné enzymy. Za ur čitých okolností 
a vhodných podmínek lze uvažovat o použití subcelulárních frakcí z lidských tkání k stanovení potenciálních rozdíl ů v biotransformaci mezi 
druhy. Výsledky zkoumání  in vitro  mohou být rovn ěž užitečné při vývoji 
modelů PBTK (5).
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. In vitro  studie dermální absorpce mohou poskytnout dopl ňující informace 
k charakterizaci absorpce (6).  
61. Primární bun ěčné kultury z jaterních bun ěk a čerstvé tká ňové řezy lze použít 
k zodpov ězení podobných otázek jako u jaterních mikrozom ů. V určitých 
případech se m ůže podařit zodpov ědět konkrétní otázky za použití bun ěč­
ných linií s definovanou expresí p říslušného enzymu nebo bun ěčných linií 
připravených pomocí genetického inženýrství. V ur čitých případech m ůže 
být užitečné studovat inhibici a indukci specifických isoenzym ů cytochromu 
P450 (nap ř. CYP1A1, 2E1, 1A2 a dalších) a/nebo enzym ů fáze II mate řskou 
sloučeninou ve studiích  in vitro . Získané informace mohou být užite čné 
u sloučenin s podobnou strukturou.  
Použití toxikokinetických údaj ů ze studií toxicity jako dopl ňující infor ­
mace  
62. Analýza vzork ů krve, tkání a/nebo exkret ů získaných b ěhem jakýchkoli 
jiných studií toxicity m ůže poskytnout údaje o biologické dostupnosti, 
změnách v plazmatických koncentracích v čase (AUC, C  max ), schopnosti 
bioakumulace, rychlostech clearance a o zm ěnách v metabolismu 
a kinetice souvisejících s pohlavím nebo životním stadiem.  
63. Posouzení plánu studie lze použít k zodpov ězení otázek týkajících se satu ­
race absorpce, drah biotransformace nebo exkrece p ři vyšších úrovních 
dávek, působení nových metabolických drah p ři vyšších úrovních dávek 
a omezení toxických metabolit ů na vyšší dávky.  
64. Další úvahy p ři hodnocení nebezpe čnosti by se mohly týkat nap říklad těchto 
charakteristik:  
— citlivosti spojené s v ěkem v důsledku rozdíl ů ve stavu hematoencefa ­
lické bariéry, ledvin a/nebo detoxika čních schopností,  
— subpopula ční citlivosti v d ůsledku rozdíl ů v biotransforma čních schop ­
nostech nebo jiných TK rozdílech,  
— míry expozice plodu prost řednictvím transplacentárního p řenosu chemic ­
kých látek nebo novorozence prost řednictvím laktace.  
Použití toxikokinetického modelování  
65. Toxikokinetické modely mohou být užite čné pro různé aspekty posouzení 
nebezpečnosti a rizik, nap říklad při predikci systémové expozice a vnit řní 
dávky v tkáni. Dále je možno zabývat se v t ěchto modelech specifickými 
otázkami týkajícími se zp ůsobu účinku a tyto modely mohou p ředstavovat 
základ pro mezidruhovou extrapolaci, extrapolaci mezi cestami expozice, 
režimy dávkování a pro posouzení rizik pro člověka. Mezi údaje, které 
jsou užite čné pro vývoj model ů PBTK pro zkoušenou chemickou látku 
u jakéhokoliv druhu, pat ří 1) rozd ělovací koeficienty, 2) biochemické 
konstanty a fyziologické parametry, 3) absorp ční parametry specifické pro 
cestu podání a 4)  in vivo  kinetické údaje pro modelové hodnocení [nap ř. 
parametry clearance pro p říslušné (> 10 %) dráhy exkrece, K  m a V  max pro 
metabolismus]. Experimentální data používaná p ři vývoji modelu by m ěla 
být získána pomocí řádných v ědeckých metod a modelové výsledky by 
měly být validovány. K usnadn ění vývoje nekompartmentálních model ů 
nebo model ů na fyziologické bázi se často stanovují parametry specifické 
pro zkoušenou chemickou látku a živo čišný druh, jako jsou rychlosti 
absorpce, rozd ělení látky mezi krev a tkán ě a konstanty metabolické rych ­
losti. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
66. Doporu čuje se, aby ve zpráv ě o studii byl uveden i její obsah.  
Hlavní část zprávy  
67. Hlavní část zprávy by m ěla obsahovat informace získané v této zkušební 
metodě rozčleněné do oddíl ů a odstavc ů následujícím zp ůsobem:  
Shrnutí  
68. Tento oddíl zprávy o studii by m ěl obsahovat shrnutí plánu studie a popis 
použitých metod. M ěl by také zd ůraznit klíčové výsledky týkající se látkové 
bilance, povahy a významu metabolit ů, tkáňových reziduí, rychlosti 
clearance, bioakumula čního potenciálu, rozdíl ů mezi pohlavími atd. Souhrn 
by měl být dostate čně podrobný, aby umož ňoval zhodnocení výsledk ů. 
Úvod  
69. Tento oddíl zprávy by m ěl obsahovat cíle studie, zd ůvodnění a plán 
a rovněž příslušné odkazy na literaturu a jakékoli podkladové historické 
údaje.  
Materiál a metody  
70. Tento oddíl zprávy by m ěl obsahovat podrobné popisy všech relevantních 
informací, mezi n ěž patří: 
a) Zkoušená chemická látka  
Tento pododdíl by m ěl obsahovat identifikaci zkoušené chemické látky: 
chemický název, molekulární strukturu, kvalitativní a kvantitativní stano ­
vení jejího chemického složení, chemickou čistotu a – je-li to možné – 
druh a množství ne čistot. Rovn ěž by m ěl obsahovat informace 
o fyzikáln ě-chemických vlastnostech v četně skupenství, barvy, p řibližné 
rozpustnosti a/nebo rozd ělovacího koeficientu, stability a p řípadně žíra­
vosti. Případně by se m ěly uvést informace o izomerech. Je-li zkoušená 
chemická látka radioizotopov ě značená, měly by se do tohoto pododdílu 
zahrnout informace o typu radionuklidu, pozici zna čky, specifické akti ­
vitě a radiochemické čistotě. 
Měl by se uvést druh nebo popis jakéhokoliv nosi če, rozpoušt ědel, 
suspenzních a emulga čních činidel či jiných materiál ů použitých p ři 
podávání zkoušené chemické látky.  
b) Pokusná zví řata 
Tento pododdíl by m ěl obsahovat informace o pokusných zví řatech, 
včetně výběru druhu a zd ůvodnění výběru příslušného druhu, kmene 
a stáří na počátku studie, pohlaví a rovn ěž tělesné hmotnosti, zdravotního 
stavu a zví řecího chovu.  
c) Metody  
Tento pododdíl by m ěl obsahovat podrobnosti o plánu studie a použité 
metodice. M ěl by zahrnovat:  
1) zdůvodnění jakékoli úpravy cesty expozice a p řípadně podmínek 
expozice;  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2) zdůvodnění výběru úrovní dávek;  
3) popis pilotních studií použitých v experimentálním plánu následných 
studií, je-li to vhodné. M ěly by se p ředložit podp ůrné údaje pro 
pilotní studie;  
4) popis p řípravy podávaného roztoku a druh použitého rozpoušt ědla 
nebo nosi če, pokud se používaly;  
5) počet exponovaných skupin zví řat a počet zvířat v každé skupin ě; 
6) úrovně a objemy dávek (a specifická aktivita dávky, používá-li se 
radioaktivita);  
7) cestu (cesty) a zp ůsoby podání;  
8) četnost podávání dávky;  
9) období la čnění (pokud se použilo);  
10) celkovou radioaktivitu p ůsobící na každé zví ře; 
11) popis manipulace se zví řaty; 
12) odběr vzorků a manipulace s nimi;  
13) analytické metody použité k separaci, kvantifikaci a identifikaci 
metabolit ů; 
14) mez detekce použitých metod;  
15) další použitá experimentální m ěření a postupy (v četně validace 
metod pro analýzu metabolit ů). 
d) Statistická analýza  
Pokud se k analýze výsledk ů studie používá statistická analýza, m ěly by 
se uvést dostate čné informace o metod ě analýzy a použitý výpo četní 
program, aby mohl nezávislý recenzent/statistik analýzu znovu vyhod ­
notit a rekonstruovat.  
V případě studií modelujících systémy, nap říklad PBTK, by m ělo před­
stavení model ů obsahovat kompletní popis model ů umožňující nezá ­
vislou rekonstrukci a validaci modelu (viz odstavec 65 a dodatek: Defi ­
nice).  
Výsledky  
71. Veškeré údaje by se m ěly shrnout a uvést v tabulkách spolu s p říslušným 
statistickým vyhodnocením a popsat v textu tohoto oddílu. Nam ěřené údaje 
o radioaktivit ě by se m ěly shrnout a uvést zp ůsobem vhodným pro studii, 
obvykle jako po čet mikrogram ů nebo miligram ů na hmotnost vzorku, lze 
však použít i jiné jednotky. Tento oddíl by m ěl obsahovat grafická znázor ­
nění výsledk ů, reprodukci p říslušných chromatografických 
a spektrometrických údaj ů, identifikaci/kvantifikaci metabolit ů 
a navrhované metabolické dráhy, v četně molekulární struktury metabolit ů. 
Kromě toho by se m ěly v tomto oddíle uvést následující informace, je-li to 
možné:  
1) kvantita a procentuální výt ěžek radioaktivity v mo či, výkalech, vydecho ­
vaném vzduchu a v rozpoušt ědle po vymytí klece od mo či a výkal ů: 
— u dermálních studií rovn ěž uveďte údaje o výt ěžku zkoušené 
chemické látky z exponované k ůže, oplach ů kůže a zbytkovou radio ­
aktivitu v materiálu pokrývajícím k ůži a v metabolické jednotce 
a také výsledky studie oplach ů kůže. Další diskusi naleznete 
v odstavcích 74–77,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— u inhala čních studií rovn ěž uveďte údaje o výt ěžku zkoušené 
chemické látky z plic a nosních tkání (8). Další diskusi naleznete 
v odstavci 78;  
2) distribuce v tkáních uvedená jako procento podané dávky a koncentrace 
(počet mikrogram ů na gram tkán ě) a podíly množství látky v tkáni v ůči 
krvi nebo v tkáni v ůči plazmě; 
3) látková bilance z každé studie zahrnující rozbor t ělních tkání a exkret ů; 
4) plazmatické koncentrace a toxikokinetické parametry (biologická dostup ­
nost, AUC, Cmax, Tmax, clearance, elimina ční poločas) po podání látky 
příslušnou cestou (p říslušnými cestami) expozice;  
5) rychlost a míra absorpce zkoušené chemické látky po podání p říslušnou 
cestou (p říslušnými cestami) expozice;  
6) množství zkoušené chemické látky a metabolit ů (uvedená jako procento 
podané dávky) v exkretech;  
7) odkaz na údaje v dodatku, které obsahují všechny údaje týkající se 
měřených cílových parametr ů u jednotlivých zví řat (např. podání dávky, 
procentuální výt ěžek, koncentrace, TK parametry atd.);  
8) Obrázek s navrhovanými metabolickými drahami a molekulárními struk ­
turami metabolit ů. 
Diskuse a záv ěry 
72. V tomto oddíle by m ěl autor (by m ěli autoři): 
1) uvést navrhovanou metabolickou dráhu vycházející z výsledk ů týkajících 
se metabolismu a rozmíst ění zkoušené chemické látky;  
2) prodiskutovat jakékoli potenciální druhové a pohlavní rozdíly týkající se 
distribuce a/nebo biotransformace zkoušené chemické látky;  
3) uvést v tabulkách a prodiskutovat identifikaci a význam metabolit ů, 
rychlosti clearance, bioakumula ční potenciál a množství tká ňových 
reziduí mate řské sloučeniny a/nebo metabolitu (metabolit ů) a rovn ěž 
změny TK parametr ů v závislosti na dávce, je-li to vhodné;  
4) zahrnout do tohoto oddílu všechny relevantní TK údaje získané b ěhem 
provádění studií toxicity;  
5) uvést stru čný a výstižný záv ěr, který lze podložit výsledky studie;  
6) přidat další oddíly (dle pot řeby či vhodnosti).  
73. Další oddíly by m ěly sloužit k uvedení podp ůrných informací z literatury, 
tabulek, obrázk ů, dodatků atd. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATIVNÍ CESTY EXPOZICE  
Dermální  
Dermální aplikace  
74. Tento oddíl uvádí specifické informace ohledn ě zkoumání toxikokinetiky 
zkoušené chemické látky p ři aplikaci dermální cestou. Pro informace 
o dermální absorpci je t řeba nahlédnout do kapitoly B.44 této p řílohy 
[Absorpce k ůží: metoda  in vivo  (9)]. U ostatních cílových parametr ů, jako 
jsou distribuce a metabolismus, je možno použít tuto zkušební metodu B.36. 
Při dermální aplikaci by se m ěla použít jedna nebo více úrovní dávky 
zkoušené chemické látky. Zkoušená chemická látka (nap ř. čistý, zředěný, 
nebo formulovaný materiál obsahující zkoušenou chemickou látku, která je aplikována na k ůži) by měla být stejná jako ta, které mohou být lidé nebo 
jiné potenciální cílové druhy vystaveny (nebo by m ěla být její realistickou 
náhražkou). Úrove ň (úrovně) dávky by se m ěly vybrat v souladu s odstavci 
20–26 této zkušební metody. Mezi faktory, které by se m ěly vzít v úvahu 
při výběru dermální dávky, pat ří očekávaná expozice člověka a/nebo dávky, 
při nichž byla pozorována toxicita v jiných studiích dermální toxicity. 
Dermální dávka (dávky) by se m ěla v případě potřeby rozpustit ve vhodném 
nosiči a aplikovat v objemu dostate čném pro její dodání. Krátce p řed 
zahájením zkoušky by se m ěla zvířatům ostříhat srst na zádech. Vyholení 
srsti je rovn ěž možné, m ělo by se však provést asi 24 hodin p řed zkouškou. 
P
ři stříhání nebo holení srsti je t řeba dbát na to, aby se neporanila k ůže, což 
by mohlo zm ěnit její prostupnost. Pro aplikaci zkoušené chemické látky by 
se mělo obnažit p řibližně 10 % tělesného povrchu. U vysoce toxických 
chemických látek m ůže být tato plocha menší než p řibližně 10 %, avšak 
měla by se pokrýt co možná nejv ětší plocha tenkou a rovnom ěrnou 
vrstvičkou látky. U všech zkoušených skupin by se m ěla k aplikaci látky 
použít stejná plocha povrchu. Plochy s nanesenou dávkou by se m ěly 
chránit vhodným krytím, které se upevní v daném míst ě. Zvířata by se 
měla chovat odd ěleně. 
75. Měla by se provést studie mytí k ůže k stanovení množství aplikované dávky 
zkoušené chemické látky, které lze z k ůže odstranit mytím ošet řené oblasti 
kůže jemným mýdlem a vodou. Tato studie m ůže rovněž pomoci p ři stano­
vování látkové bilance, pokud je zkoušená chemická látka podávána 
dermální cestou. P ři této studii mytí k ůže by se m ěla aplikovat dv ěma 
zvířatům jedna dávka zkoušené chemické látky. Úrove ň dávky se zvolí 
v souladu s odstavcem 23 této zkušební metody (viz rovn ěž diskusi 
o době kontaktu s k ůží v odstavci 76). M ěla by se stanovit množství zkou ­ 
šené chemické látky získaná z t ěchto mytí, aby se zhodnotila ú činnost 
odstranění zkoušené chemické látky mytím.  
76. Pokud to není vylou čeno kvůli žíravosti, m ěla by se zkoušená chemická 
látka aplikovat a udržovat na k ůži alespoň 6 hodin. Po odstran ění krytí by se 
měla ošetřená oblast umýt postupem uvedeným ve studii mytí k ůže (viz 
odstavec 75). V krytí i v tekutin ě z mytí by se m ěla analyzovat zbytková 
zkoušená chemická látka. P ři ukončení studií by se m ěla všechna zví řata 
humánním zp ůsobem utratit v souladu s (2) a ošet řená kůže se odstraní. 
Měla by se analyzovat p říslušná část ošetřené kůže, aby se stanovila zbyt ­
ková zkoušená chemická látka (radioaktivita).  
77. Pro toxikokinetické hodnocení farmaceutik mohou být zapot řebí různé 
postupy, v souladu s p říslušným regula čním systémem.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalační 
78. Měla by se použít jedna koncentrace ( či více, je-li to t řeba) zkoušené 
chemické látky. Koncentrace by se m ěla (měly) vybrat v souladu 
s odstavci 20–26 této zkušební metody. Inhala ční expozice by se m ěly 
provést pomocí „nosního konusu“ nebo p řístroje typu „pouze hlava“, aby 
se zabránilo absorpci alternativními cestami expozice (8). Používají-li se jiné podmínky inhala ční expozice, m ělo by být zdokumentováno zd ůvodnění 
této změny. Měla by se definovat délka inhala ční expozice, obvykle expo ­
zice trvá 4–6 hodin.
 
LITERATURA:  
1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manu ­
factured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.  
2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series 
on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the 
pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regu ­
latory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.  
4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
 
5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt 
W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
 
6) Kapitola B.45 této p řílohy, Absorpce k ůží: Metoda in vitro.  
7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organiza ­
tion, International Programme on Chemical Safety.  
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9) Kapitola B.44 této p řílohy, Absorpce k ůží: Metoda in vivo.  
10) Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural 
Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Dodatek  
DEFINICE  
Absorpce:  Proces(y) p říjmu či prostupování chemických látek tkán ěmi. Absorpce 
se týká mate řské slou čeniny a všech jejích metabolit ů. Nezam ěňovat 
s „biologickou dostupností“.  
Akumulace (bioakumulace):  Zvýšení množství zkoušené chemické látky 
v tkáních (obvykle v tukových tkáních po opakované expozici) postupem času. 
Pokud je p řísun zkoušené chemické látky do t ěla větší než rychlost, kterou je 
vylučována, organismus zkoušenou chemickou látku akumuluje a je možno 
dosáhnout toxických koncentrací zkoušené chemické látky.  
ADME:  Akronym pro „absorpce, distribuce, metabolismus a exkrece“.  
AUC:  (Plocha pod k řivkou závislosti plazmatické koncentrace na čase): Plocha 
pod křivkou v grafu vyjad řujícím závislost koncentrace zkoušené chemické látky 
v plazmě na čase. Představuje celkové množství zkoušené chemické látky absor ­
bované tělem za p ředem stanovené časové období. Za lineárních podmínek je 
AUC (od času nula až do nekone čna) úměrná celkovému množství zkoušené 
chemické látky absorbované t ělem bez ohledu na rychlost absorpce.  
Autoradiografie:  (Celotělová autoradiografie): Používá se ke kvalitativnímu 
a/nebo kvantitativnímu ur čení lokalizace radioaktivní zkoušené chemické látky 
v tkáni. Tato technika používá radiografický film nebo v poslední dob ě skeno­
vání využívající fosforové záznamové desky k vizualizaci radioaktivn ě značených 
molekul nebo fragment ů molekul prost řednictvím záznamu zá ření vydávaného 
studovaným objektem. Kvantitativní celot ělová autoradiografie m ůže mít 
v porovnání s pitvou orgán ů různé výhody p ři hodnocení distribuce zkoušené 
chemické látky a stanovení celkové výt ěžnosti a rozlišení radioaktivního mate ­
riálu v tkáních. Jednou, velmi podstatnou výhodou je nap říklad to, že ji lze 
používat u pigmentovaného zví řecího modelu k stanovení možné vazby zkoušené 
chemické látky na melanin, který je schopen vázat ur čité molekuly. P řestože tato 
technika m ůže poskytovat vhodné celot ělové přehledy vazebných míst o vysoké 
kapacitě a nízké afinit ě, při rozeznávání specifických cílových míst, jako jsou 
receptorová vazebná místa, kde je k detekci zapot řebí poměrně vysoké rozlišení 
a vysoká citlivost, m ůže mít naopak svá omezení. Používá-li se autoradiografie, 
měly by se experimenty ur čené ke stanovení látkové bilance podané slou čeniny 
provádět jako samostatná skupina nebo v rámci samostatné studie odd ělené od 
experimentu stanovujícím tká ňovou distribuci, v n ěmž se všechny exkrety (které 
mohou zahrnovat rovn ěž vydechovaný vzduch) a celá mrtvá t ěla homogenizují 
a analyzují pomocí kapalinové scintila ční spektrometrie.  
Biliární exkrece:  Exkrece žlu čovody.  
Bioakumulace:  Viz „akumulace“.  
Biologická dostupnost (biodostupnost):  Frakce podané dávky, která se dostane 
do systémového ob ěhu nebo je k dispozici v míst ě fyziologického p ůsobení. 
Biologická dostupnost zkoušené chemické látky se obvykle týká mate řské slou­ 
čeniny, ale mohla by se vztahovat i na její metabolit. Bere v úvahu pouze jednu 
chemickou formu.  Poznámka:  biologická dostupnost a absorpce nejsou totéž. 
Rozdíl mezi nap ř. orální absorpcí (tj. p řítomností látky ve st řevní stěně 
a portálním ob ěhu) a biologickou dostupností (tj. p řítomností látky 
v systémovém ob ěhu a tkáních) m ůže vzniknout mimo jiné v d ůsledku rozkladu 
látky v rámci metabolismu st řevní stěny nebo transportu prost řednictvím eflux ­
ních pump zp ět do dutiny st řeva nebo presystémového metabolismu v játrech 
(10). Biologická dostupnost toxické složky (mate řské sloučeniny nebo metabo ­
litu) je rozhodujícím parametrem p ři posuzování rizika pro člověka (extrapolace 
z vysokých dávek do oblasti nízkých dávek, extrapolace mezi cestami) 
k odvození vnit řní hodnoty z externích hodnot NOAEL či BMD (aplikovaná 
dávka). Pro ú činky na játra po orálním podání je dosta čující znát orální absorpci. 
Nicméně pro všechny ostatní ú činky, krom ě účinků v místě vstupu, je obecn ě 
spolehlivějším parametrem pro další použití v posouzení rizika biologická 
dostupnost, nikoliv absorpce.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Bioperzistence:  Viz „perzistence“.  
Biotransformace:  (Obvykle enzymová) chemická konverze zkoušené chemické 
látky v těle na odlišnou chemickou látku. Synonymní s pojmem „metabolismus“.  
C max : Buď maximální (vrcholová) koncentrace v krvi (plazm ě/séru) po podání 
nebo maximální (vrcholová) exkrece (v mo či nebo výkalech) po podání.  
Rychlost clearance:  Kvantitativní míra rychlosti, jakou je zkoušená chemická 
látka odstra ňována z krve, plazmy nebo ur čité tkáně za jednotku času. 
Kompartment:  Strukturní nebo biochemická část (či jednotka) t ěla, tkáně nebo 
buňky, která je odd ělena od zbytku.  
Detoxika ční dráhy:  Série krok ů vedoucích k eliminaci toxických chemických 
látek z těla buď metabolickou p řeměnou, nebo exkrecí.  
Distribuce:  Rozšíření zkoušené chemické látky a jejích derivát ů v celém orga ­
nismu.  
Enzymy/isoenzymy:  Proteiny, které katalyzují chemické reakce. Isoenzymy jsou 
enzymy, které katalyzují podobné chemické reakce, avšak liší se ve svých amino ­
kyselinových sekvencích.  
Enzymové parametry:  K m : Michaelisova konstanta a V  max : maximální rychlost  
Exkrece:  Proces(y), kterým(i) se podaná zkoušená chemická látka a/nebo její 
metabolity odstra ňují z těla. 
Exogenně: Zavedený z vn ějšku nebo produkovaný mimo organismus nebo 
systém.  
Extrapolace:  Odvození jedné nebo více neznámých hodnot na základ ě známých 
nebo pozorovaných skute čností.  
Eliminační poločas (t  1/2 ): Doba nutná k poklesu koncentrace zkoušené chemické 
látky v kompartmentu o jednu polovinu. Obvykle se vztahuje k plazmatické koncentraci nebo množství zkoušené chemické látky v celém t ěle.
 
Indukce / enzymová indukce:  Enzymová syntéza v reakci na environmentální 
stimul nebo molekulu induktoru.  
Linearita / lineární kinetika:  Proces je ve smyslu kinetiky lineární, pokud 
všechny rychlosti p řenosu mezi kompartmenty jsou úm ěrné přítomným množ ­
stvím nebo koncentracím, tj. prvního řádu. V d ůsledku toho jsou clearance, 
distribuční objemy a rovn ěž elimina ční poločasy konstantní. Dosažené koncent ­
race jsou úm ěrné míře dávkování (expozice) a akumulaci lze snadn ěji předpoví­
dat. Linearitu/nelinearitu lze vyhodnotit porovnáním p říslušných parametr ů, např. 
AUC, po r ůzných dávkách nebo po jednorázové a opakovaných expozicích. 
Nepřítomnost závislosti na dávce m ůže nasvědčovat saturaci enzym ů účastnících 
se metabolismu dané slou čeniny, vzestup AUC po opakované expozici 
v porovnání s jednorázovou expozicí m ůže nazna čovat inhibici metabolismu 
a pokles AUC m ůže svědčit o indukci metabolismu [viz také (11)].  
Látková bilance:  Bilance zkoušené chemické látky vstupující do systému 
a opouštějící systém.  
Hmotnostní bilance:  Viz „látková bilance“.  
Mechanismus (zp ůsob) toxicity / mechanismus (zp ůsob) účinku:  Mecha­
nismus ú činku se vztahuje k specifickým biochemickým interakcím, pomocí 
nichž zkoušená chemická látka ú činkuje. Zp ůsob účinku se vztahuje 
k obecnějším drahám vedoucím k toxicit ě zkoušené chemické látky.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Metabolismus:  Synonymní s pojmem „biotransformace“.  
Metabolity:  Produkty metabolismu nebo metabolických proces ů. 
Orální absorpce:  Procento dávky zkoušené chemické látky absorbované z místa 
podání (tj. GI traktu). Tento kritický parametr lze použít k pochopení frakce 
podané chemické látky, která se dostane až do vrátnicové žíly a následn ě do 
jater.  
Rozdělovací koeficient:  Rovněž znám jako distribu ční koeficient, je m ěřítkem 
diferenciální rozpustnosti chemické látky ve dvou rozpoušt ědlech.  
Maximální hladiny v krvi (plazm ě/séru):  Maximální (vrcholová) koncentrace 
v krvi (plazm ě/séru) po podání (viz také „C  max “). 
Perzistence (bioperzistence):  Dlouhodobá p řítomnost chemické látky (v 
biologickém systému) v d ůsledku odolnosti v ůči degradaci/eliminaci.  
Analogický p řístup:  Informace o cílovém parametru u jedné nebo více chemic ­
kých látek se použijí k odhadu cílového parametru u cílové chemické látky.  
Receptorová mikroskopická autoradiografie (nebo receptorová mikroautora ­
diografie):  Tuto techniku lze použít k vyšet ření xenobiotických interakcí se 
specifickými místy v tkáních nebo bun ěčných populacích, nap říklad ve studiích 
vazeb na receptory či specifických zp ůsobů účinku, které mohou vyžadovat 
vysoké rozlišení a vysokou citlivost, jež nemusí být dosažitelná s pomocí jiných 
technik, jako je celot ělová autoradiografie.  
Cesta podání (orální, nitrožilní, dermální, inhala ční atd.):  Vztahuje se ke 
způsobu, jakým jsou chemické látky dopraveny do t ěla (např. orálně sodnou, 
orálně v krmivu, dermáln ě, inhalací, nitrožiln ě atd.).  
Saturace:  Stav, kdy jeden nebo více kinetických (nap ř. absorpce, metabolismus 
či clearance) proces( ů) dosáhne maxima (tzn. „je saturován“).  
Citlivost:  Schopnost metody nebo p řístroje rozlišit mezi nam ěřenými odezvami 
představujícími r ůzné hodnoty dot čené prom ěnné. 
Ustálené hladiny v krvi (plazm ě): Nerovnovážný stav otev řeného systému, kdy 
všechny síly p ůsobící na systém jsou p řesně vyrovnávány opa čnými silami, a to 
takovým zp ůsobem, že všechny složky systému mají nem ěnnou koncentraci, 
přestože systémem proudí hmota.  
Modelování systém ů (toxikokinetické založené na fyziologii, založené na 
farmakokinetice, farmakokinetické založené na fyziologii, založené na 
biologii atd.):  Abstraktní model, který používá k popisu chování systému mate ­
matický jazyk.  
Cílová tká ň: Tkáň, v níž se projevuje hlavní nep říznivý účinek toxické látky.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Zkoušená chemická látka:  Jakákoli chemická látka nebo sm ěs zkoušená pomocí 
této zkušební metody.  
Distribuce v tkáních:  Reverzibilní pohyb zkoušené chemické látky z jednoho 
místa v t ěle do jiného. Distribuci v tkáních lze studovat pomocí pitvy orgán ů, 
homogenizace, spálení a kapalinové scintila ční spektrometrie či pomocí kvalita ­
tivní a/nebo kvantitativní celot ělové autoradiografie. První zp ůsob je užite čný pro 
získání hodnoty koncentrace a procentuální výt ěžnosti z tkání a zbylého mrtvého 
těla stejných zví řat, avšak nemusí mít dostate čné rozlišení pro všechny tkán ě 
a může mít menší než ideální celkovou výt ěžnost (< 90 %). Definici druhého 
způsobu viz výše.  
T max : Doba pot řebná k dosažení C  max . 
Toxikokinetika (Farmakokinetika):  Studie absorpce, distribuce, metabolismu 
a vylučování chemických látek v pr ůběhu času. 
Validace model ů: Postup zhodnocení adekvátnosti modelu pro ú čely konzistent ­
ního popisu dostupných toxikokinetických údaj ů. Modely lze vyhodnotit pomocí 
statistického a vizuálního porovnání modelových p ředpovědí s experimentálními 
hodnotami oproti spole čné nezávislé prom ěnné (např. čas). Rozsah hodnocení by 
se měl odůvodnit vzhledem k ur čenému použití modelu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37  POZDNÍ NEUROTOXICITA ORGANICKÝCH SLOU ČENIN 
FOSFORU PO AKUTNÍ EXPOZICI  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Při posouzení a hodnocení toxických ú činků látek je d ůležité 
vzít v úvahu schopnost ur čitých skupin látek vyvolat specifické 
typy neurotoxicity, které nemohou být zjišt ěny jinými studiemi 
toxicity. U ur čitých organických slou čenin fosforu byla pozoro ­
vána pozdní neurotoxicita; tyto látky mají být podrobeny zkou ­
mání touto metodou.  
Screeningové zkoušky  in vitro  lze použít pro vyhledání látek, které 
mohou vyvolat pozdní polyneuropatii; negativní nález ze zkoušek  in 
vitro  však neposkytuje d ůkaz, že látka nemá schopnost vyvolat 
pozdní neurotoxicitu.  
Viz obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Mezi „organické slou čeniny fosforu“ pat ří neutrální organické estery, 
thioestery nebo anhydridy kyseliny fosfore čné, fosfonové nebo 
amidofosfore čné nebo p říslušných kyselin thiofosfore čných, thiofos ­
fonových nebo amidothiofosfore čných, nebo jiné látky, které mohou 
způsobit pozdní neurotoxicitu pozorovanou u n ěkterých látek této 
skupiny.  
Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se pozdním po čátkem 
ataxie, distální axonopatií v míše a periferním nervu a dále inhibicí a stárnutím specifické esterasy (NTE – neuropathy target esterase) v nervové tkáni.
 
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Referenční látka m ůže být zkoušena v pozitivní kontrolní skupin ě 
s cílem prokázat, že se v laboratorních podmínkách reakce pokus ­
ných druh ů podstatn ě nezměnila. 
Příkladem široce používané látky s pozdním toxickým ú činkem je 
tri-o-tolyl-fosfát (CAS 78308, EINECS 2011035, název podle CAS: 
tris(2methylfenyl)fosfát), známá také pod názvem triokresylfosfát (TOCP).
 
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená látka se podává oráln ě v jediné dávce slepicím domácím, 
chráněným před možnými akutními cholinergními ú činky. Zví řata se 
pozorují po dobu 21 dn ů, zaznamenává se abnormální chování, 
ataxie a peréza. Biochemická vyšet ření, zejména inhibice NTE (nero ­
pathy target esterase), se provád ějí u slepic náhodn ě vybraných 
z každé skupiny, obvykle 24 a 48 hodin po podání látky. Dvacet 
jedna dnů po podání látky se zbývající slepice usmrtí a provede se 
histopatologické vyšet ření vybraných nervových tkání.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.5.1  Příprava  
Provede se náhodný výb ěr mladých zdravých dosp ělých slepic, které 
nejsou ovlivn ěny virovými onemocn ěními a farmakologickou lé čbou 
a mají normální ch ůzi, přiřadí se do experimentální a kontrolní 
skupiny a nejmén ě 5 dnů před zahájením studie se aklimatizují na 
laboratorní podmínky.  
Používají se dostate čně velké klece nebo ohrady umož ňující volný 
pohyb slepic a snadné pozorování ch ůze. 
Zkoušená látka se obvykle podává oráln ě sondou, želatinovými 
tobolkami nebo srovnatelnou metodou. Kapaliny se podávají ne ře­
děné nebo rozpušt ěné ve vhodném vehikulu, jako je nap ř. kukuřičný 
olej, pevné látky by se m ěly nechat rozpustit, protože velké dávky 
pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostate čně 
vstřebat. Toxické vlastnosti nevodných vehikul by m ěly být známy 
před zkouškou, a pokud nejsou známy, m ěly by být p ředem určeny. 
1.5.2  Zkušební podmínky  
1.5.2.1  Pokusná zví řata 
Doporučuje se mladá nosnice kura domácího ( Gallus gallus domes ­
ticus ), stará 8–12 m ěsíců. Používají se plemena o standardní velikosti 
a slepice by m ěly být chovány za podmínek umož ňujících volný 
pohyb.  
1.5.2.2  Počet a pohlaví  
Kromě experimentální skupiny by m ěla být použita kontrolní 
skupina s vehikulem a pozitivní kontrolní skupina. S výjimkou 
podání zkoušené látky se s kontrolní skupinou zachází stejn ě jako 
s experimentální skupinou.  
V každé skupin ě by měl být použit dostate čný počet slepic, aby 
aspoň šest slepic mohlo být usmrceno pro biochemické vyšet ření 
(tři v první a t ři v druhý den po podání) a šest p řežilo 21denní 
pozorování patologických p říznaků. 
Pozitivní kontrolní skupina m ůže být zkoušena soub ěžně nebo 
mohou být použity údaje z nedávno použité kontrolní skupiny. Měla by zahrnovat nejmén ě šest slepic, kterým se podá látka, 
o níž je známo, že vyvolává pozdní neurotoxicitu, t ři slepice pro 
biochemické vyšet ření a tři slepice pro histopatologické vyšet ření. 
Doporučuje se periodicky dopl ňovat historické údaje. Nové pozitivní 
kontrolní údaje by m ěly být dopln ěny, pokud provád ějící laborato ř 
v průběhu testu zm ění některý základní prvek zkoušky (nap ř. 
plemeno, stravu, podmínky chovu).
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3  Úrovn ě dávek  
Měla by se provést p ředběžná studie za použití vhodného po čtu 
slepic a skupin s r ůznými úrovn ěmi dávek, aby bylo možné stanovit 
úroveň, která má být použita v hlavní studii. Pro stanovení p řiměřené 
dávky v hlavní studii je v této p ředběžné studii nezbytná ur čitá 
letalita. Aby se však zabránilo úhynu vlivem akutních cholinergních účinků, lze použít atropin nebo jiný ochranný p řípravek, o kterém je 
známo, že nemá vliv na pozdní neurotoxické reakce. Pro odhad 
nejvyšší neletální dávky zkoušených látek lze použít řadu metod 
(viz metoda B.1a). P ři výběru dávky mohou být užite čné také 
dosavadní údaje o slepicích nebo jiné toxikologické informace.
 
Úroveň dávky zkoušené látky v hlavní studii by m ěla být co 
nejvyšší, p řičemž se berou v úvahu výsledky p ředběžné studie 
výběru dávky a horní limit dávky 2 000 mg/kg t ělesné hmotnosti. 
Případný úhyn by nem ěl narušit dostate čný počet zvířat pro bioche ­
mická vyšet ření (šest) a pro histologická vyšet ření (šest) po 21 
dnech. Aby se zabránilo úmrtí vlivem akutních cholinergních ú činků, 
použije se atropin nebo jiný ochranný p řípravek, o kterém je známo, 
že nemá vliv na pozdní neurotoxické ú činky.  
1.5.2.4  Limitní zkouška  
Pokud zkouška provedená podle postup ů popsaných v této studii p ři 
jedné dávce nejmén ě 2 000 mg/kg t ělesné hmotnosti na den nevy ­
volá pozorovatelné toxické ú činky a pokud se na základ ě údajů 
o látkách s podobnou strukturou nep ředpokládá toxicita, není úplná 
studie za použití vyšší dávky nezbytná. Limitní zkouška se použije s výjimkou p řípadu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je 
nezbytné použití vyšší úrovn ě dávek.
 
1.5.3  Doba pozorování  
Doba pozorování by m ěla být 21 dn ů. 
1.5.4 Postup  
Po podání p řípravku chránícího p řed uhynutím na následky akutního 
cholinergního ú činku se podá zkoušená látka v jedné dávce.  
Obecná pozorování  
Pozorování by m ěla začít okamžit ě po podání. Všechny slepice se 
pečlivě několikrát denn ě pozorují v pr ůběhu prvních dvou dn ů a poté 
nejméně jednou denn ě po dobu 21 dn ů nebo do plánovaného usmr ­
cení. Veškeré p říznaky toxicity by m ěly být zaznamenány, v četně 
doby nástupu, typu, závažnosti a trvání abnormálního chování. Ataxie by m ěla být hodnocena podle nejmén ě čtyřstupňové pořadové 
stupnice a zaznamenává se paréza. Nejmén ě dvakrát týdn ě se slepice 
určené s patologickými p říznaky vyjmou z klecí a podrobí zkoušce 
nucené motorické aktivity, jako nap ř. stoupání po žeb říku, aby se 
usnadnilo posouzení sebemenších toxických ú činků. Zvířata v agónii 
a zvířata, která se trápí nebo trpí bolestí, se ihned vy řadí, humánn ě 
utratí a pitvají.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
Tělesná hmotnost  
Všechny slepice se zváží t ěsně před podáním zkoušené látky a poté 
nejméně jednou týdn ě. 
Biochemická vyšet ření 
Šest slepic náhodn ě vybraných z každé experimentální skupiny 
a kontrolní skupiny s vehikulem a t ři slepice z pozitivní kontrolní 
skupiny (pokud se zkouška soub ěžně provádí s touto skupinou) se 
usmrtí v prvních dnech po podání látky, mozek a lumbální mícha se 
vypreparují a vyšet ří se na inhibici NTE. Dále m ůže být rovn ěž 
vhodné vypreparovat  n. ischiadicus  a analyzovat jeho tká ň na inhi­
bici aktivity NTE. Zpravidla se usmrtí t ři slepice z kontrolní skupiny 
a z každé experimentální skupiny po 24 hodinách a další t ři po 48 
hodinách, zatímco t ři slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrtí 
po 24 hodinách. Pokud pozorování klinických p říznaků toxicity 
naznačuje, že se toxická látka v organismu vst řebává velmi pomalu 
(to lze často posoudit pozorováním doby nástupu cholinergních 
příznaků), může být vhodn ější odebrat vzorek tkán ě dvakrát ze t ří 
zvířat mezi 24 až 72 hodinami po podání látky.  
Na těchto vzorcích tkán ě mohou být provedeny také analýza acetyl ­
cholinesterasy (AChE), je-li to považováno za vhodné.  In vivo  však 
může nastat spontánní reaktivace AChE, což m ůže vést k podcen ění 
látky jako inhibitoru AChE.  
Pitva  
Pitva všech zví řat (usmrcených podle plánu a utracených v agónii) 
by měla zahrnovat posouzení stavu mozku a míchy.  
Histopatologická vyšet ření 
Nervová tká ň zvířat, která p řežila dobu pozorování a nebyla použita 
pro biochemické studie, by m ěla být mikroskopicky vyšet řena. 
Tkáně by měly být fixovány  in situ,  za použití perfúzních technik. 
Odebírá se moze ček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha 
a periferní nervy. Řezy míchy by m ěly být odebrány z horní kr ční 
části, střední hrudní a lumbosakrální oblasti. M ěly by být odebrány 
řezy distální části n. tibialis a jeho v ětví k m. gastrocnemius a z 
n. ischiadicus. Řezy se barví vhodnými barvivy na myelin a axony.  
2. ÚDAJE  
Negativní výsledky získané pro výsledné ú činky zvolené v této 
metodě (biochemická a histopatologická vyšet ření a vyšet ření změn 
chování) nevyžadují zpravidla další zkoušení pozdní neurotoxicity. 
Při dvojzna čných nebo nepr ůkazných výsledcích t ěchto vyšet ření 
může být nezbytné další sledování.  
Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zví ře. Navíc by 
měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, p řičemž se uvede 
u každé experimentální skupiny po čet zvířat na začátku zkoušky, 
počet zvířat vykazujících léze, ú činky na chování nebo biochemické 
účinky, typ a závažnost t ěchto lézí nebo ú činků a procento zví řat 
vykazující každý typ a závažnost léze nebo ú činku. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Údaje z této studie by m ěly být vyhodnoceny z hlediska výskytu, 
závažnosti a korelace ú činků na chování a biochemických 
a histopatologických nález ů a dále jakýchkoli dalších pozorovaných 
účinků na experimentální a kontrolní skupiny.  
Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by 
měla být zvolena již p ři plánování studie.  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
3.1 Pokusná zví řata: 
— použité plemeno,  
— počet a stáří zvířat, 
— původ, podmínky chovu atd.,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku zkoušky.  
3.2 Zkušební podmínky:  
— podrobné údaje o p řípravě zkoušené látky, pop řípadě o její 
stálosti a homogenit ě, 
— zdůvodnění volby vehikula,  
— podrobné údaje o podání zkoušené látky,  
— podrobné údaje o strav ě a o kvalit ě vody,  
— zdůvodnění výběru úrovní dávek,  
— specifikace podávaných dávek, v četně podrobných informací 
o vehikulu, objemu a fyzikální form ě podané látky,  
— identifikace jakéhokoli ochranného p řípravku a podrobné infor ­
mace o jeho podání.  
3.3 Výsledky:  
— údaje o t ělesné hmotnosti,  
— údaje o toxických reakcích podle skupin, v četně mortality,  
— charakter, závažnost a trvání klinických projev ů (zda byly vratné 
nebo nevratné),  
— podrobný popis biochemických vyšet ření a nález ů, 
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— popřípadě statistické vyhodnocení výsledk ů. 
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
Metoda je analogická metod ě OECD TG 418.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38  POZDNÍ NEUROTOXICITA ORGANICKÝCH SLOU ČENIN 
FOSFORU – 28DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE  
1. METODA  
1.1 ÚVOD  
Při posouzení a hodnocení toxických ú činků látek je d ůležité vzít 
v úvahu schopnost ur čitých skupin látek vyvolat specifické typy 
neurotoxicity, které nemohou být zjišt ěny jinými studiemi toxicity. 
U určitých organických slou čenin fosforu byla pozorována pozdní 
neurotoxicita; tyto látky mají být podrobeny zkoumání touto meto ­
dou. 
Screeningové zkoušky  in vitro  lze použít pro vyhledání látek, které 
mohou vyvolat pozdní polyneuropatii; negativní nález ze zkoušek  in 
vitro  však neposkytuje d ůkaz, že látka nemá schopnost vyvolat 
pozdní neurotoxicitu.  
28denní zkouška pozdní neurotoxicity poskytuje informace 
o možném nebezpe čí pro zdraví, které by se mohlo projevit 
z opakovaných expozic b ěhem omezeného časového období. 
Poskytne informace o reakci na dávku a m ůže poskytnout odhad 
úrovně bez pozorovatelných nep říznivých ú činků, což může být 
užitečné při stanovení kritérií pro bezpe čnou expozici člověka. 
Viz také obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Mezi „organické slou čeniny fosforu“ pat ří neutrální organické estery, 
thioestery nebo anhydridy kyseliny fosfore čné, fosfonové nebo 
amidofosfore čné nebo p říslušných kyselin thiofosfore čných, thiofos ­
fonových nebo amidothiofosfore čných, nebo jiné látky, které mohou 
způsobit pozdní neurotoxicitu pozorovanou u n ěkterých látek této 
skupiny.  
Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se pozdním po čátkem 
ataxie, distální axonopatií v míše a periferním nervu a dále inhibicí 
a stárnutím specifické esterasy (NTE – neuropathy target esterase) v nervové tkáni.
 
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušené látky se podávají denn ě orálně slepicím domácím po dobu 
28 dnů. Zvířata se pozorují nejmén ě jednou denn ě, zaznamenává se 
abnormální chování, ataxie a paréza ješt ě 14 dnů po poslední dávce. 
Biochemická vyšet ření, zejména inhibice NTE (neropathy target este ­
rase), se provád ějí u slepic náhodn ě vybraných z každé skupiny, 
obvykle 24 a 48 hodin po podání látky. Dva týdny po poslední 
dávce se zbývající slepice usmrtí a provede se histopatologické 
vyšetření vybraných nervových tkání.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Příprava  
Provede se náhodný výb ěr mladých zdravých dosp ělých slepic, které 
nejsou ovlivn ěny virovými onemocn ěními a farmakologickou lé čbou 
a mají normální ch ůzi, přiřadí se do experimentální a kontrolních 
skupin a nejmén ě 5 dnů před zahájením studie se aklimatizují na 
laboratorní podmínky.  
Používají se dostate čně velké klece nebo ohrady umož ňující volný 
pohyb slepic a snadné pozorování ch ůze. 
Zkoušená látka se podává každý den, 7 dn ů v týdnu, nejlépe oráln ě 
sondou nebo želatinovými tobolkami. Kapaliny se podávají ne ředěné 
nebo rozpušt ěné ve vhodném vehikulu, nap ř. kukuřičný olej, pevné 
látky by se m ěly nechat rozpustit, protože velké dávky pevných látek 
v želatinových tobolkách by se nemusely dostate čně vstřebat. 
Toxické vlastnosti nevodných vehikul by m ěly být známy p řed zkou­ 
škou, a pokud nejsou známy, m ěly by být p ředem určeny. 
1.4.2  Zkušební podmínky  
Pokusná zví řata 
Doporučuje se mladá nosnice kura domácího ( Gallus gallus domes ­
ticus ), stará 8–12 m ěsíců. Používají se plemena o standardní velikosti 
a slepice by m ěly být chovány za podmínek umož ňujících volný 
pohyb.  
Počet a pohlaví  
Obecně by měly být použity nejmén ě tři experimentální skupiny 
a kontrolní skupina s vehikulem. S výjimkou podání zkoušené látky se s kontrolní skupinou s vehikulem zachází stejn ě jako 
s experimentální skupinou.
 
V každé skupin ě by měl být použit dostate čný počet slepic, aby 
aspoň šest slepic mohlo být usmrceno pro biochemické vyšet ření 
(tři v první a t ři v druhý den po podání) a šest p řežilo 14denní 
pozorování patologických p říznaků. 
Úrovně dávek  
Při výběru úrovní dávek by m ěly být vzaty v úvahu t ři výsledky 
akutní zkoušky pozdní neurotoxicity a jakékoli další dostupné údaje 
o toxicitě a kinetice zkoušené slou čeniny. Nejvyšší úrove ň dávky by 
měla být vybrána s cílem vyvolat toxické ú činky, nejlépe pozdní 
neurotoxicitu, ne však uhynutí nebo zjevné utrpení. Dále by m ěla 
být zvolena sestupná řada dávek s cílem prokázat, že existuje 
závislost ú činku na dávce a že nejnižší dávka nevyvolává žádné 
projevy toxicity.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
Limitní zkouška  
Pokud zkouška provedená podle postup ů popsaných v této studii p ři 
jedné dávce nejmén ě 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti na den nevy ­
volá pozorovatelné toxické ú činky a pokud se na základ ě údajů 
o látkách s podobnou strukturou nep ředpokládá toxicita, není úplná 
studie za použití vyšší dávky nezbytná. Limitní zkouška se provádí 
s výjimkou p řípadu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je 
nezbytné použití vyšší úrovn ě dávek.  
Doba pozorování  
Všechna zví řata by m ěla být pozorována nejmén ě jednou denn ě po 
dobu expozice a 14 dn ů po ní až do provedení pitvy podle plánu.  
1.4.3  Postup  
Zvířatům se podává zkoušená látka sedm dn ů v týdnu po dobu 28 
dnů. 
Obecná pozorování  
Pozorování by m ěla začít okamžit ě po podání. Všechny slepice se 
pečlivě pozorují jednou denn ě každý den z 28 dn ů expozice a 14 
dnů po expozici nebo do plánovaného usmrcení. Veškeré p říznaky 
toxicity by m ěly být zaznamenány, v četně doby nástupu, typu, 
závažnosti a trvání. Pozorování má zahrnovat abnormality chování, ale nemá se na n ě omezovat. Ataxie by m ěla být hodnocena podle 
nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice a zaznamenává se paréza. 
Nejméně dvakrát týdn ě se slepice s patologickými p říznaky vyjmou 
z klecí a podrobí zkoušce nucené motorické aktivity, jako nap ř. 
stoupání po žeb říku, aby se usnadnilo posouzení sebemenších toxic ­
kých účinků. Zvířata v agónii a zví řata, která se trápí nebo trpí 
bolestí, se ihned vy řadí, humánn ě utratí a pitvají.
 
Tělesná hmotnost  
Všechny slepice se zváží t ěsně před podáním zkoušené látky a poté 
nejméně jednou týdn ě. 
Biochemická vyšet ření 
Šest slepic náhodn ě vybraných z každé experimentální skupiny 
a kontrolní skupiny s vehikulem a t ři slepice z pozitivní kontrolní 
skupiny se usmrtí v prvních dnech po podání poslední dávky, mozek 
a lumbální mícha se vypreparují a vyšet ří se na inhibici NTE. Dále 
může být vhodné vypreparovat  n. ischiadicus  a analyzovat jeho tká ň 
na inhibici aktivity NTE. Zpravidla se usmrtí t ři slepice z kontrolní 
skupiny a z každé experimentální skupiny po 24 hodinách a další t ři 
po 48 hodinách od poslední dávky. Pokud údaje z akutní studie nebo z jiných studií (nap ř. toxikokinetických) nazna čují, že jsou vhodné 
jiné doby usmrcení po poslední dávce než tyto doby, m ěly by být 
použity a zd ůvodnění by mělo být uvedeno v dokumentaci.
 
Na těchto vzorcích tkán ě mohou být provedeny také analýza acetyl ­
cholinesterasy (AChE), je-li to považováno za vhodné. In vivo však 
může nastat spontánní reaktivace AChE, což m ůže vést k podcen ění 
látky jako inhibitoru AChE.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
Pitva  
Pitva všech zví řat (usmrcených podle plánu a utracených v agónii) 
by měla zahrnovat posouzení stavu mozku a míchy.  
Histopatologická vyšet ření 
Nervová tká ň zvířat, která p řežila dobu pozorování a nebyla použita 
pro biochemické studie, by m ěla být mikroskopicky vyšet řena. 
Tkáně by měly být fixovány  in situ,  za použití perfúzních technik. 
Odebírá se moze ček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha 
a periferní nervy. Řez míchy by m ěl být proveden z horní kr ční části, 
střední hrudní a lumbosakrální oblasti. M ěly by být odebrány řezy 
distální části n. tibialis  a jeho v ětví k  m. gastrocnemius  a z  
n. ischiadicus . Řezy se barví vhodnými barvivy na myelin 
a axony. Nejprve by m ělo být provedeno mikroskopické vyšet ření 
fixované tkán ě všech zví řat kontrolní skupiny a skupiny s vysokou 
dávkou. Pokud se u skupiny s vysokou dávkou projeví ú činky, mělo 
by být mikroskopické vyšet ření provedeno také na slepicích ze 
skupiny se st řední a nízkou dávkou.  
2. ÚDAJE  
Negativní výsledky získané pro výsledné ú činky zvolené v této 
metodě (biochemická a histopatologická vyšet ření a vyšet ření změn 
chování) nevyžadují zpravidla další zkoušení pozdní neurotoxicity. Při dvojzna čných nebo nepr ůkazných výsledcích t ěchto vyšet ření 
může být nezbytné další sledování.
 
Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zví ře. Navíc by 
měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, p řičemž se uvede 
u každé experimentální skupiny po čet zvířat na začátku zkoušky, 
počet zvířat vykazujících léze, ú činky na chování nebo biochemické 
účinky, typ a závažnost t ěchto lézí nebo ú činků a procento zví řat 
vykazující každý typ a závažnost léze nebo ú činku.  
Údaje z této studie by m ěly být vyhodnoceny z hlediska výskytu, 
závažnosti a korelace ú činků na chování a biochemických 
a histopatologických nález ů a dále jakýchkoli dalších pozorovaných 
účinků na experimentální a kontrolní skupiny.  
Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by 
měla být zvolena již p ři plánování studie.  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce obsahuje pokud možno tyto informace:  
3.1 Pokusná zví řata: 
— použité plemeno,  
— počet a stáří zvířat, 
— původ, podmínky chovu atd.,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku zkoušky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
3.2 Zkušební podmínky:  
— podrobné údaje o p řípravě zkoušené látky, pop řípadě o její 
stálosti a homogenit ě, 
— zdůvodnění volby vehikula,  
— podrobné údaje o zp ůsobu podání zkoušené látky,  
— podrobné údaje o strav ě a o kvalit ě vody,  
— zdůvodnění výběru úrovní dávek,  
— specifikace podávaných dávek, v četně podrobných informací 
o vehikulu, objemu a fyzikální form ě podané látky,  
— zdůvodnění jiných časů odběru pro biochemické vyšet ření, není- 
li použito 24 a 48 hodin.  
3.3 Výsledky:  
— údaje o t ělesné hmotnosti,  
— údaje o toxických reakcích podle skupin, v četně mortality,  
— úrove ň bez pozorovatelných nep říznivých ú činků, 
— charakter, závažnost a trvání klinických projev ů (zda byly vratné 
nebo nevratné),  
— podrobný popis biochemických vyšet ření a nález ů, 
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— popřípadě statistické zpracování výsledk ů. 
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
Metoda je analogická metod ě OECD TG 419.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39  ZKOUŠKA NA NEPLÁNOVANOU SYNTÉZU DNA 
(UDS) V JATERNÍCH BU ŇKÁCH SAVC Ů IN VIVO  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 486. Zkouška na neplá ­
novanou syntézu DNA (UDS) v jaterních bu ňkách savc ů in vivo  
(1997).  
1.1 ÚVOD  
Účelem zkoušky na neplánovanou syntézu DNA (UDS) v jaterních 
buňkách savc ů in vivo  je identifikovat zkoušené látky, které indukují 
reparace DNA v jaterních bu ňkách exponovaných zví řat (1, 2, 3, 4).  
Tato zkouška  in vivo  poskytuje metodu vyšet ření genotoxických 
účinků chemických látek v játrech. Stanovovaný jev je ukazatelem 
poškození DNA a následné reparace v jaterních bu ňkách. Játra jsou 
obvykle hlavním místem, kde jsou absorbované slou čeniny metabo ­
lizovány. Jsou tedy vhodným místem pro hodnocení míry poškození DNA  in vivo .
 
Jestliže existuje d ůkaz o tom, že se zkoušená látka nedostane do 
cílové tkán ě, není vhodné tuto zkoušku použít.  
Rozsah neplánované syntézy DNA (UDS) se zhodnotí stanovením 
inkorporace zna čených nukleosid ů do buněk, které neprošly pláno ­
vanou syntézou DNA (S-fází). Nejrozší řenější technikou je auto ­
radiografické stanovení inkorporace thymidinu zna čeného tritiem 
( 3 H-TdR). Pro zkoušky na UDS  in vivo  se přednostně používají 
játra potkana. Jiné tkán ě než játra mohou být rovn ěž použity, nejsou 
však předmětem této metody.  
Detekce odpov ědi UDS závisí na po čtu bází DNA vyšt ěpených 
a nahrazených v míst ě poškození. Zkouška na UDS je tedy vhodná 
zvláště pro detekci dlouhých reparací („long-patch repair“) (20 až 30 
bází) indukovaných látkou. Krátké opravy („short-patch repair“) 
(jedna až t ři báze) jsou naproti tomu detekovány s daleko menší 
citlivostí. Navíc m ůže důsledkem neuskute čněné reparace, chybné 
reparace nebo chybné replikace lézí DNA dojít k mutagenním 
událostem. Rozsah odpov ědi UDS neposkytuje žádnou informaci 
o věrnosti repara čních proces ů. Navíc je možné, že mutagen reaguje 
s DNA, ale poškození DNA není opraveno vyšt ěpovací reparací. 
Nedostatek specifických informací, které tato zkouška poskytuje 
o mutagenní aktivit ě, je vyvážen potenciální citlivostí tohoto jevu, 
neboť je vyšetřován v celém genomu.  
Viz také obecný úvod, část B.  
1.2 DEFINICE  
Opravované bu ňky: čistý počet zrn odpovídajících bun ěčným 
jádrům (NNG) vyšší než p ředvolená hodnota stanovená laborato ří 
provádějící zkoušku.  
Čistý počet zrn odpovídajících bun ěčným jádr ům (NNG):  kvan­
titativní míra UDS aktivity bun ěk v autoradiografické zkoušce na 
UDS, vypo čtená ode čtením pr ůměrného po čtu zrn 
v cytoplasmatických oblastech (CG) odpovídajících jádr ům od 
počtu zrn odpovídajících bun ěčným jádr ům (NG): NNG = NG – 
CG. Hodnota NNG se vypo čte pro jednotlivé bu ňky, poté spole čně 
pro buňky v kultu ře, v paralelních kulturách atd.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Neplánovaná syntéza DNA (UDS):  syntéza reparací DNA po vyšt ě­
pení a odstran ění úseku DNA obsahujícího region s poškozením 
indukovaným chemickými látkami nebo fyzikálními činiteli.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkouška na UDS v jaterních bu ňkách savc ů in vivo  indikuje syntézu 
reparací DNA po vyšt ěpení a odstran ění úseku DNA obsahujícího 
region s poškozením indukovaným chemickými látkami nebo fyzi ­
kálními činiteli. Zkouška je obvykle založena na inkorporaci  3 H-TdR 
do DNA jaterních bun ěk, kde je malá četnost bun ěk v S-fázi bun ěč­
ného cyklu. Inkorporace  3 H-TdR je obvykle stanoveno autoradiogra ­
fií, jelikož tato technika není tak citlivá na vliv S-fáze bun ěk jako 
např. kapalná scintila ční spektrometrie.  
1.4 POPIS METODY  
1.4.1  Přípravky  
1.4.1.1  Výb ěr druhu zví řete 
Běžně je používán potkan, a čkoli lze použít jakýkoli vhodný druh 
savce. M ěly by být použity b ěžně používané laboratorní kmeny 
mladých zdravých pohlavn ě dospělých zvířat. V okamžiku zahájení 
studie by m ěla být odchylka v hmotnosti zví řat minimální a nem ěla 
by překročit ± 20 % st řední hodnoty hmotnosti pro ob ě pohlaví.  
1.4.1.2  Podmínky chovu a strava  
Platí obecné podmínky podle obecného úvodu k části B, přičemž by 
mělo být dosaženo vlhkosti vzduchu 50–60 %.  
1.4.1.3  Příprava zví řat 
Zdravá mladá dosp ělá zvířata se náhodným výb ěrem rozd ělí na 
kontrolní skupinu a skupinu, která se exponuje. Klece by m ěly být 
uspořádány tak, aby byl vliv jejich polohy minimalizován. Zví řata se 
jednoznačně identifikují a p řed zapo četím studie se nechají 
v laboratorních podmínkách alespo ň pět dní aklimatizovat.  
1.4.1.4  Příprava zkoušené látky  
Pevné zkoušené látky by m ěly být před aplikací zví řatům rozpušt ěny 
nebo suspendovány ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech 
a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být podávány 
přímo nebo mohou být p řed podáním z ředěny. Měly by být použity 
čerstvě připravené zkoušené látky, pokud údaje o stálosti neprokazují 
možnost skladování.  
1.4.2  Zkušební podmínky  
1.4.2.1  Rozpoušt ědlo/vehikulum  
Rozpoušt ědlo/vehikulum by nem ělo mít p ři použitých úrovních 
dávek toxické ú činky a mělo by být vylou čeno podez ření, že reaguje 
se zkoušenou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, m ělo by být jejich za řazení podloženo údaji 
o jejich kompatibilit ě. Doporu čuje se pokud možno nejd říve zvážit 
použití vodných rozpoušt ědel/vehikul.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2  Kontroly  
Součástí každé nezávisle provád ěné části experimentu by m ěly být 
souběžné pozitivní a negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) kontroly. 
s výjimkou aplikace zkoušené látky by m ěla zvířata kontrolní 
skupiny podstoupit stejný proces jako zví řata ve skupinách, 
v nichž dojde k expozici.  
Pozitivními kontrolami by m ěly být látky, o nichž je známo, že 
jejich podávání v o čekávaných expozi čních koncentracích vede 
k nárůstu UDS detekovatelnému nad pozadím. Pozitivní kontroly 
vyžadující metabolickou aktivaci by m ěly být použity v dávkách 
vyvolávající mírnou odpov ěď (4). Dávky mohou být zvoleny tak, 
aby byl ú činek zřetelný, ale aby p ři odečtu nevyšla ihned najevo  
kódovaná identifikace preparátu. P říklady látek pro pozitivní 
kontrolu:  
Doby odb ěru Látka Číslo CAS Číslo podle 
EINECS  
Časné doby odb ěru (2 až 4 hodiny) N-nitrosodimethylamin 62-75-9 200-249-8 
Pozdní doby odb ěru (12 až 16 
hodin) N-(fluoren-2-yl)acetamid (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Mohou být použity také jiné látky pro pozitivní kontrolu. Je 
přípustné, aby byla pozitivní kontrolní látka podávána jiným zp ůso­
bem, než zkoušená látka.  
1.5 POSTUP  
1.5.1  Po čet a pohlaví zví řat 
Měl by být použit dostate čný počet zvířat, aby bylo zohledn ěno 
přirozené biologické kolísání odpov ědi na zkoušku. Každá skupina 
by se měla skládat alespo ň ze tří analyzovatelných zví řat. Jestliže 
jsou shromážd ěny dostate čné dosavadní údaje, je pro negativní 
a pozitivní kontrolní skupiny nezbytné pouze jedno až dv ě zvířata. 
Jestliže jsou v dob ě studie k dispozici údaje ze studií se stejným 
druhem a za použití stejného zp ůsobu expozice, jež prokazují, že 
neexistuje mezi pohlavími rozdíl v toxicit ě, bude posta čující zkou ­ 
šení jednoho pohlaví, nejlépe samc ů. Je-li expozice člověka speci­
fická pro ur čité pohlaví, jako je tomu nap říklad u n ěkterých farma ­
ceutických látek, m ěla by být zkouška provedena se zví řaty odpoví ­
dajícího pohlaví.  
1.5.2  Plán expozice  
Zkoušené látky jsou zpravidla podávány jednorázov ě. 
1.5.3  Dávkování  
Za normálních podmínek se používají alespo ň dvě úrovně dávek. 
Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že vyšší dávky by vedly podle o čekávání p ři 
stejném režimu dávkování k letalit ě. Nižší dávka by m ěla být zpra ­
vidla 50 % až 25 % vyšší dávky.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Látky se specifickou biologickou aktivitou p ři nízkých netoxických 
dávkách (nap ř. hormony a mitogeny) nemusí kritériím stanovení 
dávky vyhovovat a m ěly by být hodnoceny p řípad od p řípadu. 
Provádí-li se kv ůli neexistenci vhodných dostupných údaj ů studie 
pro zjištění rozsahu, m ěla by být provedena ve stejné laborato ři, se 
stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, 
jež se použijí v hlavní studii.  
Nejvyšší dávka m ůže být definována také jako dávka vyvolávající 
známky toxicity v játrech (nap ř. pyknotická jádra).  
1.5.4  Limitní zkouška  
Jestliže zkouška s jednou dávkou o alespo ň 2 000 mg/kg t ělesné 
hmotnosti podanou jednorázov ě nebo ve dvou dávkách v jednom 
dni nevykazuje žádné pozorovatelné toxické ú činky a není-li na 
základě údajů o látkách, které mají podobnou strukturu, o čekávána 
genotoxicita, nemusí být úplná studie nezbytná. O čekávaná expozice 
člověka může znamenat pot řebu použít v limitní zkoušce vyšší 
úroveň dávky.  
1.5.5  Podávání dávek  
Zkoušená látka se obvykle podává nitrožalude čně, žaludeční sondou 
nebo vhodnou intuba ční kanylou. Jiné zp ůsoby podávání jsou 
možné, lze-li je zd ůvodnit. Podávání intraperitoneáln ě se však nedo ­
poručuje, neboť by játra mohla být exponována zkoušené látce p římo 
a nikoli prost řednictvím ob ěhového systému. Maximální objem kapa ­
liny, který m ůže být najednou podán žalude ční sondou nebo 
injekčně, závisí na velikosti testovacího zví řete. Objem by nem ěl 
překročit 2 ml/100 g t ělesné hmotnosti. Použití vyšších objem ů, 
než je uvedený objem, musí být zd ůvodněno. Až na dráždivé 
a žíravé látky, které obvykle p ři vyšších koncentracích vykazují 
zesílené ú činky, by m ěla být variabilita zkušebního objemu minima ­
lizována nastavením koncentrace zajiš ťující konstantní objem p ři 
všech úrovních dávky.  
1.5.6  Příprava jaterních bun ěk 
Jaterní bu ňky se připravují z exponovaných zví řat zpravidla 12 až 16 
hodin po podání dávky. Dopl ňující dřívější odebrání vzork ů (obecně 
dvě až čtyři hodiny po expozici) je nezbytné, není-li po 12 až 16 
hodinách jasná pozitivní odpov ěď. Mohou však být použity jiné 
doby odb ěru, jsou-li zd ůvodněny na základ ě toxikokinetických 
údajů. 
Krátkodobé kultury jaterních bun ěk savců se zpravidla zakládají 
perfuzí jater kolagenasou  in situ  a umožní se, aby se čerstvě disoci­
ované jaterní bu ňky zachytily na vhodném povrchu. Jaterní bu ňky 
z negativní kontroly by m ěly vykazovat životaschopnost (5) alespo ň 
50 %.  
1.5.7  Stanovení UDS  
Čerstvě izolované jaterní bu ňky savců se obvykle vhodnou dobu, 
např. tři až osm hodin, inkubují s médiem obsahujícím  3 H-TdR. 
Na konci inkuba ční doby by m ělo být médium z bun ěk odstran ěno 
a buňky poté mohou být inkubovány s médiem obsahujícím p řebytek 
neznačeného thymidinu, aby byla snížena neinkorporovaná radioakti ­
vita („cold chase“). Bu ňky se poté promyjí, fixují a vysuší. P ři delší 
inkubační době nemusí být snížení radioaktivity nezbytné. Preparáty 
se ponoří do autoradiografické emulse, exponují se v temnu (nap ř. 
v chladu 7 až 14 dn ů), vyvolají se, obarví a spo čítají se exponovaná 
zrna stříbra. Z každého zví řete se připraví dva až t ři preparáty.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8  Analýza  
Preparáty by m ěly obsahovat dostate čný počet morfologicky normál ­
ních buněk, aby mělo hodnocení UDS výpov ědní hodnotu. Preparáty 
se pod mikroskopem prohlédnou na známky zjevné cytotoxicity 
(např. na pyknosu, sníženou úrove ň značení radioaktivním izoto ­
pem).  
Před počítáním zrn by m ěly být preparáty kódovány. Zpravidla se 
vyšetřuje 100 bun ěk na každé zví ře alespoň ze dvou preparát ů; 
vyšetření méně než 100 bun ěk/zvíře by mělo být zd ůvodněno. Při 
počítání zrn se jádra v S-fázi nevyšet řují, ale podíl bun ěk v S-fázi 
může být zaznamenán.  
Množství  3 H-TdR inkorporovaného do jader a cytoplasmy morfolo ­
gicky normálních bun ěk doložené navrstvením zrn st říbra by m ělo 
být stanoveno vhodnou metodou.  
Počet buněk se stanoví z po čtu zrn odpovídajících bun ěčným jádrům 
(NG) a z pr ůměrného počtu zrn v cytoplasmatických oblastech (CG) 
odpovídajících jádr ům. Jako hodnota CG se použije bu ď počet 
buněk pro nejsiln ěji označenou oblast cytoplasmy, nebo pr ůměrná 
hodnota dvou až t ří náhodně vybraných oblastí v blízkosti doty čných 
buněčných jader. Po odpovídajícím zd ůvodnění mohou být použity 
i jiné postupy stanovení po čtu buněk (např. počítání celých 
buněk) (6).  
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé preparáty a zví řata. Údaje 
by měly být dále shrnuty ve form ě tabulky. Ode čtením hodnoty CG 
od hodnoty NG by m ěl být vypo čten pro každou bu ňku, pro každé 
zvíře a pro každou dávku a čas čistý počet zrn odpovídajících 
buněčným jádr ům (NNG). Jestliže jsou po čítány „opravované“ 
buňky, měla by být kritéria pro definování „opravovaných“ bun ěk 
odůvodněna a založena na dosavadních nebo soub ěžných údajích 
o negativních kontrolách. Numerické výsledky mohou být zhodno ­
ceny statistickými metodami. Mají-li být použity, m ěly by být statis ­
tické testy vybrány a od ůvodněny před provedením studie.  
2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Mezi příklady kritérií pro pozitivní nebo negativní odpov ěď patří: 
pozitivní i) hodnota NNG leží nad prahovou úrovní, která 
je zdůvodněna na základ ě dosavadních údaj ů 
laboratoře; nebo 
ii) hodnota NNG je významn ě vyšší než hodnota 
pro souběžnou kontrolu; 
negativní i) hodnota NNG leží na dosavadní prahové 
hodnotě nebo pod ní; nebo 
ii) hodnota NNG není významn ě vyšší než 
hodnota pro soub ěžnou kontrolu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Měla by být uvažována biologická relevance údaj ů, tj. měly by být 
vzaty v úvahu parametry, jako jsou variabilita zví řat, vztah dávky 
a odpovědi a cytotoxicita. P ři hodnocení výsledk ů zkoušky mohou 
být použity jako pomocný prost ředek statistické metody. Statistická 
významnost by nem ěla být jediným ur čujícím faktorem pro pozitivní 
odpověď. 
Ačkoli většina experiment ů poskytne jasn ě pozitivní nebo negativní 
výsledky, v ojedin ělých případech neumožní soubor údaj ů vyslovit 
konečný výrok o aktivit ě zkoušené látky. Výsledky mohou z ůstat 
dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment 
opakován.  
Pozitivní výsledky zkoušky na UDS v jaterních bu ňkách savc ů in 
vivo znamenají, že zkoušená látka indukuje v jaterních bu ňkách 
savců in vivo  poškození DNA, které lze opravit neplánovanou 
syntézou DNA  in vitro . Negativní výsledky znamenají, že zkoušená 
látka za podmínek zkoušky neindukuje poškození DNA, které lze detekovat touto zkouškou.
 
Měla by být diskutována pravd ěpodobnost, s jakou se zkoušená látka 
dostane do krevního ob ěhu popř. do cílové tkán ě (např. systémová 
toxicita).  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— zdůvodnění volby vehikula,  
— rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpoušt ědle/vehikulu, je-li 
známa.  
Testovací zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— zdroj, podmínky chovu, strava atd.,  
— individuální hmotnost zví řat na počátku zkoušky, v četně rozpětí 
tělesné hmotnosti, st řední hodnoty a sm ěrodatné odchylky pro 
každou skupinu.  
Zkušební podmínky:  
— pozitivní a negativní (vehikulum/rozpoušt ědlo) kontroly,  
— údaje ze studie pro zjišt ění rozsahu, pokud byla provedena,  
— zdůvodnění zvolených úrovní dávek,  
— údaje o p řípravě zkoušené látky,  
— údaje o podávání zkoušené látky,  
— zdůvodnění způsobu podávání,  
— popřípadě metody ov ěření, zda se zkoušená látka dostala do 
krevního ob ěhu nebo do cílové tkán ě, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— případně přepočet mezi koncentrací zkoušené látky v krmivu 
nebo vod ě (ppm) na odpovídající dávku (mg/kg t ělesné 
hmotnosti/den),  
— podrobné údaje o kvalit ě krmiva a vody,  
— podrobný popis rozvrhu expozice a odb ěru, 
— metody stanovení toxicity,  
— metody p řípravy a kultivace jaterních bun ěk, 
— použitá autoradiografická technika,  
— počet preparát ů a počet vyšetřených bun ěk, 
— kritéria hodnocení,  
— kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojzna č­
nou. 
Výsledky:  
— střední hodnoty po čtu zrn odpovídajících bun ěčným jádr ům 
a počtu zrn odpovídajících cytoplasm ě a čistý počet zrn, jedno ­
tlivě pro preparáty, zví řata a skupiny,  
— podle možnosti závislost odpov ědi na dávce,  
— případné statistické hodnocení,  
— známky toxicity,  
— údaje o soub ěžné negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) a pozitivní 
kontrole,  
— dosavadní údaje o negativní (rozpoušt ědlo/vehikulum) a pozitivní 
kontrole s rozmezími, st ředními hodnotami a sm ěrodatnými 
odchylkami,  
— počet buněk „opravovaných“ bun ěk, je-li stanoven,  
— počet buněk v S-fázi, je-li stanoven,  
— životaschopnost bun ěk. 
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G. 
(1985). An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay. Mutation Res., 156, 1–18.  
2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsa ­
lis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Protocol and Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mutation 
Res. 189, 123–133.
 
3) Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, 
B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G. (1993). 
In Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., 
(Eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, s. 52–77.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
4) Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., 
Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C.A. and 
Mori, H. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and In Vivo . Mutation Res., 312, 263–285.
 
5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993). Assessment of the Relation Between the Initial Viabi ­
lity and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes 
Used for the  In Vivo/In Vitro  DNA Repair Assay (UDS). Muta ­
tion Res., 291, 21–27.  
6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982). Detec ­
tion of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  Hepatocyte 
DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, 553–562.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40  LEPTAVÉ Ú ČINKY NA K ŮŽI IN VITRO : ZKOUŠKA 
TRANSKUTÁNNÍHO ELEKTRICKÉHO ODPORU (TER)  
1. METODA  
Tato zkušební metoda je rovnocenná metod ě OECD TG 430 (2004).  
1.1 ÚVOD  
Poleptáním k ůže se rozumí nevratné poškození tkán ě kůže po apli ­
kaci zkoušeného materiálu (definované globáln ě harmonizovaným 
systémem klasifikace a ozna čování látek a p řípravků (GHS)) (1). 
Tato metoda uvádí postup posouzení leptavých ú činků – žíravosti, 
který není provád ěn na živých zví řatech.  
Posuzování leptavých ú činků na kůži bylo obvykle provád ěno na 
pokusných zví řatech (2). Snaha o omezení bolesti a utrpení pokus ­
ných zví řat vedla k takové revizi zkušební metody B.4, která 
umožňuje stanovit leptavé ú činky na k ůži alternativními metodami  
in vitro,  vylučujícími bolest a utrpení zví řat. 
Prvním krokem k definování alternativních zkoušek, které by 
umožňovaly zkoušet leptavé ú činky na k ůži pro ú čely regulace, 
bylo provedení p ředvalidačních studií (3). Poté byla provedena 
řádná valida ční studie metod  in vitro  (6, 7, 8) pro posuzování lepta ­
vých účinků na kůži (4, 5). Záv ěr z těchto studií a z dalších publi ­
kací vedl k doporu čení, že pro posouzení leptavých ú činků na kůži 
in vivo  by mohly být použity tyto zkoušky (9, 10, 11): zkouška 
pomocí modelu lidské k ůže (viz zkušební metodu B.40a) 
a zkouška transkutánního elektrického odporu (tato metoda).  
Validační studie a další publikované studie uvád ějí, že stanovení 
transkutánního elektrického odporu (TER) k ůže potkana (12, 13) 
již umožňuje spolehliv ě rozlišovat mezi známými látkami k ůži lepta­
jícími (žíravými) a neleptajícími (nežíravými) (5, 9).  
Zkouška popsaná v této metod ě umožňuje identifikovat leptavé 
(žíravé) chemické látky a sm ěsi. Dále umož ňuje identifikaci nelep ­
tavých (nežíravých) látek a sm ěsí, pokud je doložena d ůkazními 
stanoveními založenými na dalších dostupných údajích (nap ř. pH, 
vztahy mezi strukturou a aktivitou, údaje o vlivu na lidi nebo na 
zvířata) (1, 2, 11, 14). Zkouška neskýtá údaje o dráždivých ú čincích 
na kůži ani neumož ňuje rozčleňovat žíravé látky na podskupiny, jak 
to umožňuje globáln ě harmonizovaný systém klasifikace (GHS) (1).  
Úplné vyhodnocení lokálních ú činků na kůži po jednotlivých 
kožních expozicích se doporu čuje provád ět strategií postupného 
zkoušení, jak je uvedeno ve zkušební metod ě B.4 (2) a jak je stano ­
veno globáln ě harmonizovaným systémem (1). Tato strategie zkou ­ 
šení zahrnuje provád ění zkoušek leptavých ú činků na kůži in vitro  
(jak je uvedeno v této metod ě) a dráždivých ú činků na kůži před 
uvážením zkoušek na živých zví řatech.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2 DEFINICE  
Leptavé ú činky na k ůži in vivo : vyvolání nevratného poškození 
kůže, zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky, do 
čtyř hodin po aplikaci zkoušené látky. Reakce po poleptání se 
projevují v ředy, krvácením, krvavými strupy a v záv ěru čtrnáctiden ­
ního pozorování ztrátou barvy v d ůsledku vyblednutí k ůže, úplnými 
ložisky alopecie a jizvami. K vyhodnocení sporných lézí by se m ěla 
uvážit histopatologie.  
Transkutánní elektrický odpor (TER):  je mírou elektrické impe ­
dance kůže, vyjádřenou hodnotou elektrického odporu v kiloohmech. 
Jednoduchá a robustní metoda posouzení bariérové funkce, která spočívá ve sledování pr ůchodu iont ů kůží užitím Wheatstoneova 
můstku.
 
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Tabulka 1  
Referenční chemické látky  
Název Č. EINECS Č. CAS  
propan-1,2-diamin 201-155-9 78-90-0 siln ě žíravý 
kyselina akrylová (kyselina prop-2- 
enová) 201-177-9 79-10-7 siln ě žíravá 
2-terc -butylfenol 201-807-2 88-18-6 žíravý 
hydroxid draselný (10 %) 215-181-3 1310-58-3 žíravý 
kyselina sírová (10 %) 231-639-5 7664-93-9 žíravá 
kyselina oktanová (kyselina kapry ­
lová) 204-677-5 124-07-02 žíravý 
4-amino-1 H-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 nežíravý 
eugenol 202-589-1 97-53-0 nežíravý 
fenethylbromid 203-130-8 103-63-9 nežíravý 
tetrachlorethen 204-825-9 27-18-4 nežíravý 
kyselina isostearová 250-178-0 30399-84-9 nežíravá 4-(methylsulfanyl)benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 nežíravý
 
Většina z uvedených látek je p řevzata ze seznamu látek vybraných 
pro mezinárodní valida ční studii ECVAM (4). Jejich výb ěr je 
založen na t ěchto kritériích:  
i) stejný po čet leptavých (žíravých) a neleptavých (nežíravých) 
látek,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) komer čně dostupné látky pokrývající v ětšinu relevantních t říd 
chemických látek,  
iii) zahrnutí siln ě leptavých (žíravých) látek i mén ě leptavých (žíra ­
vých) látek s cílem umožnit rozlišování založené na schopnosti 
leptat,  
iv) volba chemických látek, s nimiž lze manipulovat v laborato ři bez 
jiných vážných nebezpe čí, než je žíravost.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušený materiál je aplikován až 24 hodin na epidermální stranu 
terčíků kůže ve dvoukomorovém zkušebním systému, ve kterém 
terčíky kůže oddělují obě komory. Ter číky kůže jsou odebrány 
z humánn ě usmrcených potkan ů starých 28–30 dní. Materiály 
s leptavými ú činky jsou identifikovány schopností zp ůsobit ztrátu 
normální integrity a bariérové funkce rohovité vrstvy ( stratum 
corneum ), která je m ěřena jako snížení vlastního TER pod ur čitou 
prahovou úrove ň (12). Pro potkany byla vybrána jako hrani ční 
hodnota TER 5 k Ω a to na základ ě rozsáhlých údaj ů pro široké 
spektrum chemických látek, pro n ěž hodnota TER v p řevážné většině 
případů byla bu ď značně nad (často > 10 k Ω), nebo zna čně pod 
(často < 3 k Ω) touto hrani ční hodnotou (12). Všeobecn ě platí, že 
materiály, které nejsou žíravé pro zví řata, ale jsou dráždivé nebo 
nedráždivé, nesnižují TER pod tuto hrani ční hodnotu. Použití jiných 
kožních p řípravků nebo jiného p řístroje si m ůže vynutit zm ěnu volby 
hraniční hodnoty a její další validaci.  
Do zkušebního postupu je pro potvrzující zkoušku pozitivních výsledk ů 
včetně hodnot TER okolo 5 k Ω zařazen stupe ň pro stanovení vázání 
barviva. Tento stupe ň pro stanovení vázání barviva ur čuje, zda zvýšení 
permeability iont ů je důsledkem fyzikálního porušení rohovité vrstvy 
(stratum corneum ). Ukázalo se, že metoda TER s využitím k ůže potkana 
umožňuje předvídat výsledky zjiš ťování leptavých ú činků in vivo s  
králíky podle zkušební metody B.4 (2). M ělo by být uvedeno, že 
zkoušky  in vivo  na králících jsou vysoce konzervativní vzhledem 
k leptavým a dráždivým ú činkům na kůži v porovnání se zkouškou na 
lidské kůži pomocí náplastí (15).  
1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.5.1  Zví řata 
Vybraným druhem zví řat jsou potkani, protože citlivost jejich k ůže 
k chemickým látkám v této zkoušce již byla prokázána (10). Stá ří (v 
době odběru kůže) a kmen potkan ů je zvlášt ě důležitý pro zajišt ění 
toho, aby folikuly chlup ů byly v latentní fázi, p řed začátkem růstu 
zralé srsti.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Hřbetní a bo ční srst mladých, p řibližně 22denních samc ů nebo samic 
potkanů (z kmene p říbuzného Wistaru nebo srovnatelného kmene) se 
opatrně odstraní holicím strojkem. Zví řata se poté umyjí opatrným 
otíráním, p řičemž se oholená oblast pono ří do roztoku antibiotik 
(obsahujícího nap ř. streptomycin, penicilin, chloramfenikol 
a amfotericin o koncentracích zastavujících r ůst bakterií). Zví řata 
se třetí nebo čtvrtý den po prvním omytí znovu omyjí roztokem 
antibiotik a použijí se do 3 dn ů po druhém omytí, kdy se jejich  
stratum corneum  po odstran ění srsti zregeneruje.  
1.5.2  Příprava ter číků kůže 
Zvířata se humánn ě usmrtí ve stá ří 28–30 dní; toto stá ří je kritické. 
Z každého zví řete se poté odstraní h řbetní a bo ční kůže a nadbyte čný 
tuk se z k ůže opatrn ě seškrábne. Odeberou se ter číky kůže 
o průměru přibližně 20 mm. K ůže může být před použitím ter číků 
uchovávána, je-li prokázáno, že pozitivní a negativní kontrolní údaje jsou ekvivalentní údaj ům získaným s k ůží čerstvou.
 
Každý ter čík kůže se přeloží přes jeden z konc ů teflonové (PTFE) 
trubičky tak, aby epidermis byla v kontaktu s trubi čkou. Přes konec 
trubičky se těsně přetáhne pryžový O-kroužek, aby byla k ůže upev­
něna, a přebytek tkán ě se ořízne. Rozm ěry trubičky a O-kroužku 
jsou uvedeny na obrázku 2. Pryžový O-kroužek na teflonové trubi čce 
se poté pe člivě utěsní ke konci teflonové trubi čky vrstvou vazelíny. 
Trubička držená pomocí pružinové svorky se umístí do receptorové 
komory obsahující roztok síranu ho řečnatého (154 mM) (obrázek 1). 
Terčík kůže musí být úpln ě ponořen do roztoku MgSO  4 . Z jedné 
kůže potkana m ůže být získáno 10 až 15 ter číků kůže. 
Pro každou zví řecí kůži je před započetím zkoušky zm ěřen elek­
trický odpor dvou ter číků kůže jako postup kontroly jakosti. Pro 
oba terčíky by m ěla být nam ěřena hodnota odporu v ětší než 10 
kΩ, mají-li být pro tuto zkoušku použity ostatní ter číky. Pokud je 
hodnota odporu nižší než 10 k Ω, musí být ostatní ter číky z doty čné 
kůže ze zkoušek vy řazeny.  
1.5.3  Aplikace zkoušených a kontrolních látek  
Pro každou studii by m ěly být provedeny soub ěžné pozitivní 
a negativní kontroly k zajišt ění dostate čné účinnosti daného experi ­
mentálního modelu. M ěly by k tomu být použity ter číky kůže 
z téhož zví řete. Navrženými látkami pro pozitivní kontrolu je 10 
M kyselina chlorovodíková a pro negativní kontrolu destilovaná voda.
 
Kapalná zkoušená látka (150 μL) se aplikuje stejnom ěrně na 
epidermis uvnit ř trubičky. Při zkoušení pevných materiál ů se použije 
dostatečné množství tak, aby byla rovnom ěrně pokryta celá epider ­
mis. Poté se na povrch pevné látky p řidá deionizovaná voda (150 
μL) a trubi čka se lehce prot řepe. K zajišt ění maximálního styku látky 
s kůží může být nutné zah řát pevnou látku až na 30  o C, aby se 
zkoušená látka roztavila či změkla, nebo ji rozemlít na zrnitý mate ­
riál či prášek.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Pro každou zkoušenou a kontrolní látku se použijí t ři terčíky kůže. 
Zkoušená látka se aplikuje po dobu 24 hodin p ři 20–23  o C. Zkou­ 
šená látka se zcela odstraní proudem tekoucí vody o teplot ě nejvýše 
30 o C. 
1.5.4  M ěření TER  
Impedance k ůže se měří jako TER. TER se m ěří nízkonap ěťovým 
impedančním Wheatstoneovým m ůstkem pro st řídavý proud (13). 
Všeobecné specifikace m ůstku: provozní nap ětí 1 až 3 V, sinusový 
nebo pravoúhlý tvar kmit ů střídavého proudu frekvence 50–1 000 Hz 
a rozsah m ěření nejmén ě 0,1–30 k Ω. Můstek použitý ve valida ční 
studii měří induktanci, kapacitanci a odpor až do hodnot 2 000 H, 
2 000 μF, a 2 M Ω, při frekvencích 100 Hz nebo 1 kHz, za použití 
sériových nebo paralelních hodnot. Pro ú čely měření TER v rámci 
zkoušky leptavých ú činků se zaznamenávají hodnoty odporu p ři 
frekvenci 100 Hz a za použití sériových hodnot. P řed měřením elek ­
trického odporu se povrchové nap ětí kůže sníží p řidáním dostate č­
ného objemu 70 % ethanolu tak, aby byla epidermis zakryta. Po několika sekundách se ethanol z trubice vylije a tká ň se zvlhčí 
přidáním 3 ml roztoku síranu ho řečnatého (154 mM). Elektrody 
můstku se umístí na ob ě strany ter číku kůže za účelem ode čtu 
odporu v k Ω/terčík kůže (obrázek 1). Rozm ěry elektrod a délky 
exponovaných částí elektrod pod krokosvorkou jsou uvedeny na 
obrázku 2. Svorka vnit řní elektrody je b ěhem měření odporu op řena 
o horní konec teflonové trubi čky, aby bylo zajišt ěno, že se délka 
části elektrody pono řené v roztoku síranu ho řečnatého nem ění. 
Vnější elektroda je umíst ěna uvnitř receptorové komory tak, aby 
spočívala na dn ě komory. Vzdálenost mezi pružinovou svorkou 
a dnem teflonové trubi čky se udržuje konstantní (obrázek 2), 
neboť tato vzdálenost má vliv na nam ěřené hodnoty odporu. Proto 
by vzdálenost mezi vnit řní elektrodou a ter číkem kůže měla být 
konstantní a minimální (1–2 mm).  
Je-li nam ěřená hodnota vyšší než 20 k Ω, může to být zp ůsobeno 
zbytky vrstvy zkoušené látky na epidermální stran ě terčíku kůže. 
O odstran ění této vrstvy se lze pokusit nap ř. tím, že se teflonová 
trubička zakryje palcem v rukavici a 10 sekund se prot řepává. 
Roztok síranu ho řečnatého se odstraní a m ěření se opakuje 
s čerstvým síranem ho řečnatým.  
Vlastnosti a rozm ěry zkušebního p řístroje a použitý experimentální 
postup mohou ovlivnit nam ěřené hodnoty TER. Prahová hodnota 5 
kΩ pro leptavé ú činky byla odvozena na základ ě údajů zjištěných se 
specifickým p řístrojem a postupem popsanými v této metod ě. Pokud 
se změní podmínky zkoušky nebo je použit jiný p řístroj, mohou 
platit jiné prahové a kontrolní hodnoty. Proto je nutné kalibrovat 
metodu a prahové hodnoty odporu zkoušením řady referen čních stan­
dardních materiál ů vybraných z chemických látek použitých ve vali ­
dační studii (4, 5), nebo z t říd chemických látek podobných zkou ­ 
šeným látkám. Soubor vhodných referen čních chemických látek je 
uveden v tabulce 1.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5  Metody stanovení vázání barviva  
Expozice k ůže některým nežíravým materiál ům může snížit odpor 
pod hrani ční hodnotu 5 k Ω, v důsledku čehož je umožn ěn průnik 
iontů přes stratum corneum  a snižuje se elektrický odpor (5). Nap ř. 
neutrální organické látky a povrchov ě aktivní chemické látky (v četně 
detergentů, emulgátor ů a jiných povrchov ě aktivních látek) mohou 
vést k odstran ění kožních lipid ů, čímž se bariéra stane pro ionty 
průchodnější. Proto pokud jsou p ři absenci zjevného poškození 
hodnoty TER zkoušených látek okolo 5 k Ω nebo jsou nižší než 5 
kΩ, mělo by být provedeno posouzení pr ůniku barviva na kontrol ­
ních a upravených tkáních ke zjišt ění, zda jsou nam ěřené hodnoty 
TER výsledkem zvýšené permeability k ůže, nebo poleptání k ůže 
(3, 5). V p řípadě poleptání k ůže, kdy  stratum corneum  je porušeno, 
barvivo sulforhodamin B p ři aplikaci na k ůži rychle proniká 
a zbarvuje podložní tká ň. Toto konkrétní barvivo je stabilní 
v prostředí širokého rozsahu chemických látek a nemá na n ěj vliv 
níže popsaný extrak ční postup.  
1.5.5.1  Aplikace a odstran ění barviva sulforhodaminu B  
Po měření TER se roztok síranu ho řečnatého vylije z trubi čky 
a kůže se pečlivě přezkoumá, zda není zjevn ě poškozena. Pokud 
zjevné velké poškození není patrné, aplikuje se na epidermální stranu každého ter číku kůže po dobu 2 hodin 150 μL 10 % roztoku 
(m/V) barviva sulforhodaminu B (Acid Red 52; C.I. 45100; 
č. EINECS 222-529-8; č. CAS 3520-42-1) v destilované vod ě. 
Terčíky kůže se poté p řibližně 10 sekund omývají tekoucí vodou 
o nejvýše pokojové teplot ě, aby se odstranilo veškeré volné 
barvivo. Všechny ter číky kůže se opatrn ě sejmou z teflonové 
trubičky a umístí se do lahvi čky (např. 20mililitrové sklen ěné 
lahvičky pro scintila ční spektrometrii) obsahující deionizovanou 
vodu (8 ml). Lahvi čky se lehce 5 minut prot řepávají, aby se odstra ­
nilo další volné barvivo. Tato metoda oplachování se poté zopakuje 
a pak se ter číky kůže vyjmou a vloží do lahvi ček obsahujících 5 ml 
30 % roztoku (m/V) natrium-dodecyl-sulfátu (SDS) v destilované vodě a inkubují se p řes noc při 60
 o C. 
Po inkubaci se všechny ter číky kůže vyjmou a zlikvidují a zbylý 
roztok se odst ředí 8 minut p ři 21  o C (při relativní odst ředivé síle 
~175 × g). 1 ml vzorku supernatantu se poté z ředí 4 ml 30 % (m/V) 
roztoku SDS v destilované vod ě. Absorbance (A) roztoku se m ěří 
přibližně při 565 nm.  
1.5.5.2  Výpo čet obsahu barviva  
Obsah barviva sulforhodaminu B na ter čík kůže se vypo čte z hodnot 
absorbance A (5) (molární absorp ční koeficient sulforhodaminu B p ři 
565 nm = 8,7 × 10  4 ; molekulová hmotnost = 580). Obsah barviva 
sulforhodaminu B se vypo čte pro každý ter čík kůže využitím vhodné 
kalibrační křivky a poté se vypo čte jeho st řední hodnota.  
2. ÚDAJE  
Hodnoty odporu (k Ω) a případně hodnoty st ředního obsahu barviva 
(μg/terčík) pro zkoušený materiál a také pro pozitivní a negativní 
kontroly by m ěly být uvedeny ve form ě tabulky (údaje 
z jednotlivých pokus ů a jejich st řední hodnoty spolu s jejich ± 
směrodatnou odchylkou), v četně údajů o duplicitních nebo opakova ­
ných experimentech, a jejich jednotlivé a st řední hodnoty.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Střední hodnoty výsledk ů TER jsou p řijatelné, pokud hodnoty pro 
paralelní pozitivní a negativní kontroly spadají do p řijatelného 
rozmezí dané metody v doty čné zkušební laborato ři. Pro popsanou 
metodiku a p řístroje jsou p řijatelné hodnoty rozmezí odporu uvedeny 
v následující tabulce:  
Kontrola Látka Rozmezí 
odporu (k Ω) 
pozitivní 10M kyselina chlorovodíková 0,5–1,0 
negativní destilovaná voda 10–25  
Střední hodnoty výsledk ů vázání barviva jsou p řijatelné, pokud 
hodnoty pro paralelní kontroly spadají do p řijatelného rozmezí 
metody. Pro popsanou metodiku a p řístroje jsou pro uvedení  
kontrolní látky doporu čeny tyto p řijatelné hodnoty rozmezí obsahu 
barviva:  
Kontrola Látka Rozmezí 
obsahu barviva 
(μg/terčík kůže) 
pozitivní 10M kyselina chlorovodíková 40–100 
negativní destilovaná voda 15–35  
Zkoušená látka je pokládána za neleptající k ůži (nežíravou):  
i) je-li st řední hodnota TER zm ěřená pro doty čnou zkoušenou 
látku větší než 5 k Ω, nebo  
ii) je-li st řední hodnota TER menší nebo rovna 5 k Ω a 
— terčík kůže nevykazuje žádné zjevné poškození a  
— střední obsah barviva v ter číku kůže je podstatn ě nižší než 
střední obsah barviva v ter číku kůže získaný soub ěžně při 
použití 10M HCl jako pozitivní kontroly.  
Zkoušená látka je pokládána za leptající k ůži (žíravou):  
i) je-li st řední hodnota TER menší nebo rovna 5 k Ω a terčík kůže 
je zjevně poškozen, nebo  
ii) je-li st řední hodnota TER menší nebo rovna 5 k Ω a 
— terčík kůže není zjevn ě poškozen, ale  
— střední obsah barviva v ter číku kůže je větší nebo roven 
střednímu obsahu barviva v ter číku kůže získanému 
souběžně při použití 10M HCl jakožto pozitivní kontroly.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Zkoušené a kontrolní látky:  
— chemický název (názvy), nap ř. název podle IUPAC nebo CAS 
a číslo CAS, je-li známo,  
— čistota a složení látky nebo p řípravku (v hmotnostních procen ­
tech) a fyzikální vlastnosti,  
— fyzikáln ě-chemické vlastnosti, nap ř. fyzikální stav, pH, stabilita, 
rozpustnost ve vod ě, které jsou relevantní pro provedení studie,  
— případná úprava zkoušených/kontrolních látek p řed zkouškou 
(např. zahřátí, rozemletí),  
— stabilita, je-li známa.  
Pokusná zví řata: 
— použitý kmen a pohlaví,  
— stáří zvířat použitých jako dárcovská zví řata, 
— zdroj, podmínky p řechovávání, výživa atd.,  
— podrobnosti p řípravy kůže. 
Zkušební podmínky:  
— kalibra ční křivky zkušebního p řístroje,  
— kalibra ční křivky pro zkoušku ú činnosti vázání barviva,  
— podrobnosti zkušebního postupu pro m ěření TER,  
— případně podrobnosti zkušebního postupu pro stanovení vázání 
barviva,  
— popis p řípadných modifikací zkušebních postup ů, 
— popis použitých kritérií vyhodnocení.  
Výsledky:  
— údaje zm ěřených hodnot TER a p řípadně obsahu vázaného 
barviva pro jednotlivá zví řata a jednotlivé vzorky k ůže, zpraco ­
vané ve form ě tabulky,  
— popis jakýchkoli pozorovaných ú činků. 
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 
33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/ 
2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2) Zkušební metoda B.4 Akutní toxicita: dráždivé a leptavé ú činky 
na kůži. 
3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219–255.
 
4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471–482.
 
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483–524.
 
6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62pp.  
7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147.
 
8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Accep ­
tance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97- 
3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Rese ­
arch Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/ guidelines/validate.pdf.
 
9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.  
10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm
 TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Transcuta ­
neous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for 
assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publica ­
tion No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, 
National Institute of Environmental Health Sciences, Research 
Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ epiddocs/epis_brd.pdf.
 
11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st -2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat.  
12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  in 
vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507–512.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic. in Vitro 6, 191–194.  
14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: 709–720.
 
15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., 
Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845–852.
 
16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7–17.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Obrázek 1  
Přístroj pro zkoušku TER na k ůži potkana
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Obrázek 2  
Rozměry teflonové a receptorové trubi čky a použitých elektrod
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Kritické faktory p řístroje uvedeného výše:  
— vnitřní průměr teflonové trubi čky, 
— taková délka elektrod vzhledem k teflonové trubi čce 
a receptorové trubi čce, aby se elektrody nedotýkaly ter číku 
kůže a aby standardní délka elektrody byla ve styku 
s roztokem MgSO  4 , 
— objem roztoku MgSO  4 v receptorové trubi čce musí vzhledem 
k hladině v teflonové trubi čce dávat takovou výšku kapaliny, 
jak je znázorn ěno na obrázku 1,  
— terčík kůže musí být k teflonové trubi čce připevněn tak, aby 
elektrický odpor p ředstavoval skute čnou míru vlastností k ůže. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40a  LEPTAVÉ Ú ČINKY NA K ŮŽI IN VITRO : ZKOUŠKA POMOCÍ 
MODELU LIDSKÉ K ŮŽE 
1. METODA  
Tato zkušební metoda je rovnocenná metod ě OECD TG 431 (2004).  
1.1 ÚVOD  
Poleptáním k ůže se rozumí nevratné poškození tkán ě kůže po apli ­
kaci zkoušeného materiálu (definované globáln ě harmonizovaným 
systémem klasifikace a ozna čování látek a p řípravků (GHS)) (1). 
Tato zkušební metoda nevyžaduje použití živých zví řat ani zví řecí 
tkáně pro stanovení leptavých ú činků na kůži. 
Posuzování leptavých ú činků na kůži bylo obvykle provád ěno na 
pokusných zví řatech (2). Snaha o omezení bolesti a utrpení pokus ­
ných zvířat spojené s tímto postupem vedla k takové revizi zkušební 
metody B.4, která umož ňuje stanovit poleptání k ůže alternativními 
metodami  in vitro , vylučujícími bolest a utrpení zví řat. 
Prvním krokem k definování alternativních zkoušek, které by 
umožňovaly zkoušet leptavé ú činky na k ůži pro ú čely regulace, 
bylo provedení p ředvalidačních studií (3). Poté byla provedena 
řádná valida ční studie metod  in vitro  (6, 7, 8) pro posuzování lepta ­
vých účinků na kůži (4, 5). Záv ěr z těchto studií a z dalších publi ­
kací (9) vedl k doporu čení, že pro posouzení leptavých ú činků na 
kůži in vivo  by mohly být použity tyto zkoušky (9, 10, 11, 12, 13): 
zkouška pomocí modelu lidské k ůže (tato metoda) a zkouška trans ­
kutánního elektrického odporu (viz zkušební metoda B.40).  
Validační studie uvád ějí, že zkoušky s využitím model ů lidské kůže 
(3, 4, 5, 9) již umož ňují spolehliv ě rozlišovat mezi známými látkami 
kůži leptajícími (žíravými) a neleptajícími (nežíravými). Zkušební 
postup m ůže rovněž umožnit rozlišení mezi látkami zp ůsobujícími 
vážné a mén ě vážné poleptání k ůže. 
Zkouška popsaná v této metod ě umožňuje identifikovat leptavé 
(žíravé) chemické látky a sm ěsi. Dále umož ňuje identifikaci nelep ­
tavých (nežíravých) látek a sm ěsí, pokud je doložena d ůkazními 
stanoveními založenými na dalších dostupných údajích (nap ř. pH, 
vztahy mezi strukturou a aktivitou, údaje o vlivu na lidi nebo na zvířata) (1, 2, 13, 14). Zkouška obvykle neskýtá odpovídající údaje 
o dráždivých ú čincích na k ůži ani neumož ňuje rozčleňovat žíravé 
látky na podskupiny, jak to umož ňuje globáln ě harmonizovaný 
systém klasifikace (GHS) (1).
 
Úplné vyhodnocení lokálních ú činků na kůži po jednotlivých 
kožních expozicích se doporu čuje provád ět strategií postupného 
zkoušení, jak je uvedeno ve zkušební metod ě B.4 (2) a jak je stano ­
veno globáln ě harmonizovaným systémem (GHS) (1). Tato strategie 
zkoušení zahrnuje provád ění zkoušek leptavých ú činků na kůži in 
vitro  (jak je uvedeno v této metod ě) a dráždivých ú činků na kůži 
před uvážením zkoušek na živých zví řatech.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2 DEFINICE  
Leptavé ú činky na k ůži in vivo : vyvolání nevratného poškození 
kůže, zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky, do 
čtyř hodin po aplikaci zkoušené látky. Reakce po poleptání se 
projevují v ředy, krvácením, krvavými strupy a v záv ěru čtrnáctiden ­
ního pozorování ztrátou barvy v d ůsledku vyblednutí k ůže, úplnými 
ložisky alopecie a jizvami. K vyhodnocení sporných lézí by se m ěla 
uvážit histopatologie.  
Životaschopnost bun ěk: parametr, kterým se m ěří celková aktivita 
buněčné populace (nap ř. schopnost bun ěčných mitochondriálních 
dehydrogenas redukovat vitální barvivo MMT) a který v závislosti na měřeném jevu a na použitém uspo řádání zkoušky koreluje 
s celkovým po čtem a/nebo životaschopností bun ěk.
 
1.3 REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Tabulka 1  
Referenční chemické látky  
Název Č. EINECS Č. CAS  
propan-1,2-diamin 201-155-9 78-90-0 siln ě žíravý 
kyselina akrylová (kyselina prop-2- 
enová) 201-177-9 79-10-7 siln ě žíravá 
2-terc-butylfenol 201-807-2 88-18-6 žíravý 
hydroxid draselný (10 %) 215-181-3 1310-58-3 žíravý 
kyselina sírová (10 %) 231-639-5 7664-93-9 žíravý kyselina oktanová (kyselina kapry ­
lová) 204-677-5 124-07-02 žíravá 
4-amino-1H-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 nežíravý 
eugenol 202-589-1 97-53-0 nežíravý fenethylbromid 203-130-8 103-63-9 nežíravý tetrachlorethen 204-825-9 27-18-4 nežíravý 
kyselina isostearová 250-178-0 30399-84-9 nežíravá 
4-(methylsulfanyl)benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 nežíravý
 
Většina z uvedených látek je p řevzata ze seznamu látek vybraných 
pro mezinárodní valida ční studii ECVAM (4). Jejich výb ěr je 
založen na t ěchto kritériích:  
i) stejný po čet leptavých (žíravých) a neleptavých (nežíravých) 
látek,  
ii) komer čně dostupné látky pokrývající v ětšinu relevantních t říd 
chemických látek,  
iii) zahrnutí siln ě leptavých (žíravých) látek i mén ě leptavých (žíra ­
vých) látek s cílem umožnit rozlišování založené na schopnosti 
leptat,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) volba chemických látek, s nimiž lze manipulovat v laborato ři bez 
jiných vážných nebezpe čí, než je žíravost.  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušený materiál je aplikován na trojrozm ěrný model lidské k ůže 
sestávající se p řinejmenším z rekonstruované epidermis a funk ční 
rohovité vrstvy ( stratum corneum ). Materiály s leptavými ú činky 
jsou identifikovány schopností zp ůsobit při specifikované expozi ční 
době pokles životaschopnosti bun ěk (stanovený nap ř. použitím 
zkoušky redukce MTT) pod definovanou prahovou úrove ň. Podstata 
stanovení pomocí modelu lidské k ůže je založena na hypotéze, že 
chemické látky s leptavými ú činky jsou ty, jež jsou schopny pronik ­
nout rohovitou vrstvou ( stratum corneum ) difuzí nebo erozí a jsou 
cytotoxické pro bu ňky v hlubších bun ěčných vrstvách.  
1.4.1  Postup  
1.4.1.1  Modely lidské k ůže 
Modely lidské k ůže lze vyrobit nebo získat komer čně (např. modely 
EpiDerm  TM a EPISKIN  TM ) (16, 17, 18, 19) nebo je lze p řipravit či 
vyrobit ve zkušební laborato ři (20, 21). Uznává se, že využití lidské 
kůže podléhá vnitrostátním a mezinárodním etickým ohled ům 
a podmínkám. Jakýkoli nový model by m ěl být validován (p řinej­
menším v rozsahu uvedeném v bodu 1.4.1.1.2). Modely lidské k ůže 
použité pro tuto zkoušku musí spl ňovat následující podmínky:  
1.4.1.1.1 V š e o b e c n é p o d m í n k y m o d e l u  
K sestavení epitelu se musí použít lidské keratinocyty. Pod funk ční 
rohovitou vrstvou ( stratum corneum ) musí být více vrstev života ­
schopných epitelových bun ěk. Model k ůže může mít také jako 
složku stromální vrstvu.  Stratum corneum  musí být vícevrstvé 
s nezbytným profilem lipid ů, umožňující funkci robustní p řekážky 
odolávající rychlému pronikání cytotoxických zna čkovacích látek. 
Izolační vlastnosti modelu musí p ředcházet pronikání materiálu 
okolo  stratum corneum  do životaschopných tkání. Proniknutí zkou ­ 
šených chemických látek okolo  stratum corneum  by vedlo 
k chybnému modelování expozice k ůže. Model k ůže nesmí být 
kontaminován bakteriáln ě (mj. mykoplasmaty) ani houbami 
a plísněmi. 
1.4.1.1.2 P o d m í n k y f u n k č n í h o m o d e l u  
Rozsah životaschopnosti je obvykle kvantifikován pomocí MTT 
nebo jiných metabolicky p řeměněných vitálních barviv. V t ěchto 
případech by absorbance (A) extrahovaného (solubilizovaného) 
barviva negativní kontrolní tkán ě měla být nejmén ě 20násobn ě 
vyšší než absorbance extrak čního rozpoušt ědla samotného (22). 
Negativní kontrolní tká ň musí být stabilní v kultu ře (musí vést 
k podobným výsledk ům měření životachopnosti) po dobu trvání 
expoziční doby zkoušky.  Stratum corneum  musí být dostate čně 
odolné, aby odolalo rychlému proniknutí n ěkterých cytotoxických 
značkovacích chemických látek (nap ř. 1 % Triton X-100). Tuto 
vlastnost lze odhadnout pomocí expozi ční doby nutné ke snížení 
životaschopnosti bun ěk o 50 % (ET  50 ) (např. pro modely 
EpiDerm  TM a EPISKIN  TM je tato doba > 2 hodiny). Pro tká ň by 
měla být prokázána reprodukovatelnost v čase a p řednostně 
i mezilaboratorn ě. Kromě toho musí umožnit predikci leptavých 
účinků referenčních chemických látek (viz tabulka 1), pokud je 
vybrána ve zvoleném zkušebním postupu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2  Aplikace zkoušených a kontrolních látek  
Pro každý experiment (expozi ční dobu), v četně kontrolních, se 
použijí dv ě repliky tkán ě. U kapalných materiál ů musí být apliko ­
váno dostate čné množství zkoušené látky, aby rovnom ěrně pokrylo 
povrch k ůže: musí být použito nejmén ě 25 μL/cm  2 . U pevných 
materiálů musí být aplikováno dostate čné množství zkoušené látky, 
aby rovnom ěrně pokrylo k ůži, a zkoušená látka by m ěla být ovlh ­ 
čena deionizovanou nebo destilovanou vodou, aby byl zajišt ěn dobrý 
styk s kůží; pevné látky by m ěly být podle pot řeby před aplikací 
rozemlety na prášek. Aplika ční metoda musí být pro zkoušenou látku 
vhodná (5). Po uplynutí expozi ční doby musí být zkoušený materiál 
z povrchu k ůže pečlivě spláchnut vhodným pufrem, nebo 0,9 % 
roztokem NaCl.  
Pro každou studii by m ěly být provedeny soub ěžné pozitivní 
a negativní kontroly k zajišt ění dostate čné účinnosti daného experi ­
mentálního modelu. Navrženými látkami pro pozitivní kontrolu jsou ledová kyselina octová nebo 8N KOH. Navrženými látkami pro 
negativní kontrolu jsou 0,9 % roztok NaCl nebo voda.
 
1.4.1.3  Měření životaschopnosti bun ěk 
K měření životaschopnosti bun ěk lze používat pouze validované kvan ­
titativní metody. Míra životaschopnosti musí být slu čitelná s využíváním 
v třírozměrném modelu tkán ě. Nespecifické vázání barviva nesmí rušit 
měření životaschopnosti. Proto nejsou vhodná barviva vážící proteiny 
a barviva nepodléhající metabolické konverzi (nap ř. neutrální červeň). 
Nejčastěji se používá stanovení redukce MTT (2-(4,5-dimethylthiazol-2- 
yl)-3,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid, thiazolylová mod ř: č. EINECS 
206-069-5, č. CAS 298-93-1)), pro niž bylo prokázáno, že poskytuje 
správné a reprodukovatelné výsledky (5), ale lze používat i jiné. Vzorek 
kůže se umístí do roztoku MTT o vhodné koncentraci (nap ř. 0,3 až 
1,0 mg/ml) p ři vhodné inkuba ční teplotě na dobu 3 hodin. Vzniklá 
sraženina modrého formazanu se poté extrahuje rozpoušt ědlem (isopro ­
pylalkoholem) a koncentrace formazanu se stanoví m ěřením absorbance 
A při vlnové délce 545 až 595 nm.  
Chemický ú činek zkoušeného materiálu na vitální barvivo m ůže 
imitovat ú činek bun ěčného metabolismu, čímž může dojít 
k nesprávnému odhadu životaschopnosti. Bylo pozorováno, že k tomu dochází, nebyl-li zkoušený materiál z k ůže úplně odstraněn oplacho ­
váním (9). Jestliže zkoušený materiál p ůsobí přímo na vitální barvivo, 
musí být dodate čně zkontrolováno, zda zkoušené látky neruší stanovení 
životaschopnosti, a p řípadně výsledky korigovat (9, 23).
 
2. ÚDAJE  
Hodnoty absorbance A pro každou tká ň a vypočtené hodnoty života ­
schopnosti bun ěk v procentech pro zkoušený materiál a pro pozitivní 
a negativní kontroly by m ěly být uvedeny ve form ě tabulky, v četně 
údajů o duplicitních nebo opakovaných experimentech, st ředních 
a jednotlivých hodnot.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Hodnoty absorbance A dosažené pro každý zkoušený vzorek lze 
použít k výpo čtu relativní životaschopnosti v procentech vzhledem 
k negativní kontrole, která je dohodou stanovena na úrove ň 100 %. 
Hraniční procentuální podíl životaschopnosti bun ěk, kterým se rozli ­ 
šují žíravé zkoušené materiály od nežíravých (nebo kterým se rozli ­ 
šují různé třídy leptavých ú činků), nebo statistické postupy použité 
k vyhodnocení výsledk ů a k identifikaci žíravých materiál ů musí být 
jasně definovány a zdokumentovány, a musí být prokázána jejich 
vhodnost. Obecn ě jsou tyto hrani ční hodnoty stanoveny b ěhem opti­
malizace zkoušky, testovány b ěhem předvalidační fáze a potvrzeny 
validační studií. Predikce leptavých ú činků (žíravosti) je ve spojení 
s modelem EpiDerm  TM například dána takto (9):  
Zkoušená látka je pokládána za leptající k ůži (žíravou):  
i) jestliže po 3 minutách expozice je životaschopnost nižší než 
50 %, nebo  
ii) jestliže po 3 minutách expozice je životaschopnost vyšší nebo 
rovna 50 % a životaschopnost po 1 hodin ě expozice je nižší 
než 15 %.  
Zkoušená látka je pokládána za neleptající k ůži (nežíravou):  
i) jestliže po 3 minutách expozice je životaschopnost vyšší nebo 
rovna 50 % a životaschopnost po 1 hodin ě expozice je vyšší 
nebo rovna 15 %.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat alespo ň tyto informace:  
Zkoušené a kontrolní látky:  
— chemický název (názvy), nap ř. název podle IUPAC nebo CAS 
a číslo CAS, je-li známo,  
— čistota a složení látky nebo p řípravku (v hmotnostních procen ­
tech),  
— fyzikáln ě-chemické vlastnosti, nap ř. fyzikální stav, pH, stabilita, 
rozpustnost ve vod ě, které jsou relevantní pro provedení studie,  
— případná úprava zkoušených/kontrolních látek p řed zkouškou 
(např. zahřátí, rozemletí),  
— stabilita, je-li známa.  
Zdůvodnění modelu k ůže a použitého postupu.  
Zkušební podmínky:  
— použitý bun ěčný systém,  
— kalibra ční údaje pro m ěřicí zařízení použité pro m ěření života ­
schopnosti bun ěk (např. spektrofotometr),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— úplné podkladové údaje pro konkrétní použitý model k ůže včetně 
jeho validity,  
— podrobnosti použitého zkušebního postupu,  
— použité zkušební dávky,  
— popis p řípadných modifikací zkušebního postupu,  
— odkazy na minulé údaje o použitém modelu,  
— popis použitých kritérií pro vyhodnocení.  
Výsledky:  
— údaje z jednotlivých zkoušených vzork ů, zpracované ve form ě 
tabulky,  
— popis dalších pozorovaných ú činků. 
Rozbor výsledk ů. 
Závěr. 
4. LITERATURA  
1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances 
and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 
33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/ 2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
 
2) Zkušební metoda B.4 Akutní toxicita: dráždivé a leptavé ú činky 
na kůži. 
3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., 
Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 
6 ATLA 23, 219–255.
 
4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471–482.
 
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. In Vitro 12, 483–524.
 
6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62pp.  
7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147.
 
8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Accep ­
tance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97- 3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Rese ­
arch Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/ 
guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, s. 371–401.
 
10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.  
11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365–67.  
12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDerm  TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Transcuta ­
neous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publica ­
tion No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency 
Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
epiddocs/epis_brd.pdf.
 
13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat.  
14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26; 709–720.
 
15) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55–63.  
16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy 
testing. Toxic. In Vitro 8, 889–891.  
17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural charac ­
terization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211–225.
 
18) Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Poura ­
dier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach; 133–140.
 
19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, 
Thivolet J (1991). In vitro and post – transplantation differen ­
tiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental 
Cell Research 193; 310-319.
 
20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosen ­
berg, H. (1992). The organotypic culture of human skin kera ­
tinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cyto ­
technology 9, 163–171.  
21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, 747–756.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical 
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to 
measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69–84.  
23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne’, C., Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. InVItro 15, 57–93.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41  ZKOUŠKA FOTOTOXICITY 3T3 NRU  IN VITRO  
1. METODA  
Tato zkušební metoda je rovnocenná metod ě OECD TG 432 (2004).  
1.1 ÚVOD  
Fototoxicita je definována jako toxická odezva na látku aplikovanou 
na tělo, která je vyvolána nebo zvýšena (a je zjevná p ři nižších 
úrovních dávek) po následné expozici sv ětlu nebo která je vyvolána 
ozářením kůže po systémovém podání látky.  
Zkouška fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  slouží k identifikaci fototo ­
xického potenciálu zkoušené látky, který je vyvolán chemickou 
látkou excitovanou po expozici sv ětlem. Zkouška vyhodnocuje foto ­
cytotoxicitu z relativního snížení životaschopnosti bun ěk exponova ­
ných zkoušené chemické látce v p řítomnosti sv ětla versus p ři jeho 
absenci. Látky identifikované touto zkouškou jsou pravd ěpodobně 
fototoxické  in vivo  po systémovém podání a po nanesení na k ůži, 
nebo po nanesení na pokožku.  
Fototoxické ú činky byly zaznamenány u mnoha typ ů chemických 
látek (1, 2, 3, 4). Jejich spole čným rysem je schopnost absorbovat 
světelnou energii v oblasti slune čního světla. Podle prvního zákona 
fotochemie (Grotthaus-Draper ův zákon) vyžaduje fotoreakce dosta ­
tečnou absorpci sv ětelných kvant. P řed zvážením biologického zkou ­ 
šení musí být stanoveno UV/VIS absorp ční spektrum zkoušené 
chemické látky podle Metodiky OECD TG 101. Vychází se 
z toho, že pokud je molární absorp ční koeficient nižší než 
10 l/mol/cm doty čná chemická látka pravd ěpodobně není fotoreak ­
tivní. Takové látky nemusí být zkouškou fototoxicity 3T3 NRU in 
vitro ani jinými biologickými zkouškami zkoušeny na nep říznivé 
fotochemické ú činky (1, 5). Viz též p řílohu 1.  
V poslední dob ě byla vyhodnocena spolehlivost a význam zkoušky 
fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  (6, 7, 8, 9). Bylo prokázáno, že 
zkouška fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  umožňuje předpovídat akutní 
fototoxické ú činky u zví řat a u člověka in vivo . Zkouška není ur čena 
pro předpověď jiných nep říznivých ú činků, které mohou plynout 
z kombinovaného p ůsobení chemické látky a sv ětla, např. neumo­ 
žňuje zkoumat fotogenotoxicitu, fotoalergii nebo fotokarcinogenitu 
ani neumož ňuje posuzovat fototoxický potenciál. Tato zkouška 
dále není ur čena ke zkoumání nep římých mechanism ů fototoxicity 
ani účinků metabolit ů zkoušené látky nebo ú činků směsí. 
Zatímco použití metabolizujícího systému je obecným požadavkem 
při všech zkouškách  in vitro  určených pro posouzení genotoxického 
a karcinogenního potenciálu, ve fototoxikologii je dosud známo pouze málo p říkladů, kdy je metabolická transformace nutná pro 
působení chemické látky jako fototoxinu  in vivo  nebo  in vitro . Nepo­
važuje se tedy ani za nezbytné ani za v ědecky zdůvodněné, aby byla 
předložená zkouška provedena se systémem aktivace metabolismu.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2 DEFINICE  
Intenzita ozá ření: intenzita ultrafialového (UV) nebo viditelného 
světla dopadajícího na povrch, m ěřená ve W/m  2 nebo mW/cm  2 . 
Dávka sv ětelného zá ření: množství (intenzita × čas) ultrafialového 
(UV) nebo viditelného zá ření dopadajícího na povrch, vyjád řená 
v joulech (W × s) na plochu povrchu, nap ř. J/m  2 nebo J/cm  2 . 
Vlnová pásma UV sv ětla: označení doporu čená komisí CIE (Mezi ­
národní komise pro osv ětlení): UVA (315–400 nm), UVB 
(280–315 nm) a UVC (100–280 nm). Používají se rovn ěž jiná ozna ­ 
čení; jako hranice mezi UVB a UVA je často používána hodnota 
320 nm a pásmo UVA m ůže být rozd ěleno na UV-A1 a UV-A2 
s hranicí kolem 340 nm.  
Životaschopnost bun ěk: parametr, kterým se m ěří celková aktivita 
buněčné populace (nap ř. příjem vitálního barviva neutrální červeně 
do buněčných lysosom ů) a který v závislosti na m ěřeném jevu a na 
použitém uspo řádání zkoušky koreluje s celkovým po čtem a/nebo 
životaschopností bun ěk. 
Relativní životaschopnost bun ěk: životaschopnost v pom ěru ke 
kontrolám s rozpoušt ědlem (negativní kontroly), které prošly celým 
postupem zkoušky (s ozá řením i bez n ěj), ale nebyly exponovány 
zkoušeným chemickým látkám.  
PIF (Photo-Irritation-Factor – fotoirita ční faktor):  faktor získaný 
srovnáním dvou stejn ě účinných cytotoxických koncentrací (IC  50 ) 
zkoušené látky, a to p ři necytotoxickém ozá ření UVA/VIS sv ětlem 
a bez ozá ření. 
IC 50 : koncentrace zkoušené látky, p ři níž se životaschopnost bun ěk 
sníží o 50 %.  
MPE (Mean-Photo-Effect – st řední světelný účinek):  veličina 
odvozená z matematické analýzy pr ůběhu křivek závislosti ú činku 
na koncentraci získaných p ři necytotoxickém ozá ření UVA/VIS 
světlem v přítomnosti ozá ření a bez n ěho. 
Fototoxicita:  akutní toxická reakce vyvolaná po první expozici k ůže 
určitým chemickým látkám a následné expozici sv ětlu nebo podobn ě 
vyvolaná ozá řením kůže po systémovém podání chemické látky.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkouška fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  je založena na srovnání 
cytotoxicity chemické látky p ři zkoušení s expozicí necytotoxické 
dávce simulovaného slune čního světla a bez této expozice. Cytoto ­
xicita je v této zkoušce vyjád řena jako koncentra čně závislé snížení 
příjmu vitálního barviva neutrální červeně (NR) 24 hodin po p ůso­
bení zkoušené chemické látky a ozá ření (10). NR je slabé kationické 
barvivo, které nedifusn ě snadno proniká bun ěčnými membránami 
a akumuluje se mezibun ěčně v lysosomech. Zm ěny povrchu citli ­
vých lysosomálních membrán zp ůsobují ztrátu pevnosti lysosom ů 
a další zm ěny, které se postupn ě stávají nevratnými. Tyto zm ěny 
vyvolané p ůsobením xenobiotik vedou ke snížení p říjmu a vázání 
neutrální červeně. Je proto možné rozlišovat mezi životaschopnými, 
poškozenými nebo mrtvými bu ňkami, což je základem této zkoušky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Buňky Balb/c 3T3 se 24 hodin kultivují, aby vytvo řily monovrstvu. 
Dvě 96jamkové desti čky na jednu zkoušenou chemickou látku se 
poté 1 hodinu preinkubují osmi r ůznými koncentracemi zkoušených 
chemických látek. Poté je jedna ze dvou desti ček exponována 
nejvyšší necytotoxickou dávkou ozá ření, zatímco druhá desti čka se 
udržuje v temnu. U obou desti ček se poté expozi ční médium nahradí 
kultivačním médiem a po dalších 24 hodinách inkubace je života ­
schopnost bun ěk stanovena pomocí p říjmu neutrální červeně (NRU). 
Životaschopnost bun ěk je vyjád řena v procentech vzhledem 
k neexponované kontrole s rozpoušt ědlem a vypo čte se pro každou 
zkušební koncentraci. Pro p ředpověď fototoxického potenciálu se 
porovnají koncentra čně závislé odezvy získané p ři ozáření a bez 
ozáření, obvykle p ři hodnotě IC  50 , tj. při koncentraci zp ůsobující 
50 % úbytek životaschopnosti bun ěk ve srovnání 
s neexponovanými kontrolami.  
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Příprava  
1.4.1.1  Buňky 
Při validační studii byla použita permanentní myší linie bun ěk fibro­
plastů – Balb/c 3T3, klon 31 – bu ď z banky ATCC (American Type 
Culture Collection) v Manassasu ve Virginii (USA) nebo z banky 
ECACC (European Collection of Cell Cultures) v Salisbury v hrabství Wiltshire (Spojené království), a je tudíž doporu čeno 
získat bu ňky z dob ře kvalifikovaných zdroj ů buněk. Jiné bu ňky 
nebo bun ěčné linie mohou být p ři stejném zkušebním postupu 
použity za p ředpokladu, že jsou kultiva ční podmínky p řizpůsobeny 
specifickým pot řebám bun ěk, ale musí být prokázána jejich rovno ­
cennost.
 
Buňky by měly být pravideln ě kontrolovány, zda nejsou kontamino ­
vány mykoplasmaty, a m ěly by být použity, pouze pokud kontami ­
novány nejsou (11).  
Je důležité, aby byla citlivost bun ěk na UV pravideln ě kontrolována 
postupem kontroly jakosti popsaným v této metod ě. Vzhledem 
k tomu, že citlivost bun ěk na UVA m ůže růst s počtem pasáží, 
měly by být použity bu ňky Balb/c 3T3 z pasáže s nejnižším dosaži ­
telným po čtem pasáží, nejlépe z nižší než sté pasáže (viz bod 
1.4.2.2.2 a p říloha 2).  
1.4.1.2  Média a kultiva ční podmínky  
Pro rutinní bun ěčné pasážování a b ěhem zkušebního postupu by 
měla být použita vhodná kultiva ční média a inkuba ční podmínky, 
např. u buněk Balb/c 3T3 se jedná o DMEM (Dulbeccova modifi ­
kace Eagleova média) obohacenou 10 % novorozeneckým telecím sérem, 4mM glutaminem, penicilinem (100 IU) a streptomycinem 
(100 μg/ml) a o inkubaci ve vlh čené atmosfé ře při 37
 o C, 5–7,5 % 
CO 2 v závislosti na použitém pufru (viz druhý odstavec bod 1.4.1.4). 
Zvlášť důležité je, aby kultiva ční podmínky zajistily, aby byl 
buněčný cyklus uvnit ř dosavadního rozp ětí pro použité bu ňky nebo 
buněčné linie.  
1.4.1.3  Příprava kultur  
Buňky ze zmrazených kmenových kultur se nasadí do kultiva čního 
média ve vhodné hustot ě a alespoň jednou se pasážují p řed použitím 
ve zkoušce fototoxicity 3T3 NRU  in vitro . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Při zkoušce fototoxicity se bu ňky nasazují do kultiva čního média 
v takové hustot ě, aby nedosáhly konfluence do konce zkoušky, tj. 
do okamžiku, kdy je po 48 hodin od nasazení stanovována života ­
schopnost. Pro bu ňky Balb/c 3T3 kultivované v 96jamkových desti č­
kách je doporu čeno inokulum 1 × 10  4 buněk na jamku.  
Pro každou chemickou látku se bu ňky nasadí stejným zp ůsobem do 
dvou odd ělených 96jamkových desti ček, které jsou poté soub ěžně 
podrobeny celému postupu zkoušky za stejných podmínek krom ě 
doby, kdy je jedna z desti ček ozářena (+ Irr) a druhá je udržována 
v temnu (– Irr).  
1.4.1.4  Příprava zkoušené látky  
Zkoušené látky musí být čerstvě připraveny vždy bezprost ředně před 
použitím, pokud údaje neprokáží jejich stabilitu p ři skladování. 
Doporučuje se veškeré chemické kroky a po čáteční úpravy bun ěk 
provádět při světelných podmínkách vylu čujících fotoaktivaci 
nebo degradaci zkoušené látky p řed ozářením.  
Zkoušené chemické látky se rozpustí ve fyziologickém roztoku, nap ř. 
v Earlově fyziologickém roztoku (EBSS), nebo v jiných fyziologicky 
vyvážených pufrovaných roztocích, které nesmí obsahovat protei ­
nové složky a složky absorbující sv ětlo (např. pH indikátory 
a vitaminy), aby nerušily p ři ozařování. Protože b ěhem ozařování 
jsou buňky drženy p řibližně 50 minut mimo inkubátor s CO  2 , je 
nutno dbát na vylou čení alkalizace. Je-li použit slabý pufr jako 
např. EBSS, lze toho dosáhnout inkubováním bun ěk v prost ředí se 
7,5 % CO  2 . Jsou-li bu ňky inkubovány pouze p ři 5 % CO  2 , je nutno 
použít siln ější pufr.  
Zkoušené chemické látky s omezenou rozpustností ve vod ě by měly 
být rozpušt ěny ve vhodném rozpoušt ědle. Použije-li se rozpoušt ědlo, 
musí být p řítomné v konstantní koncentraci ve všech kulturách, tj. 
v negativní (rozpoušt ědlové) kontrole i ve všech koncentracích zkou ­ 
šené chemické látky, a nesmí být p ři této koncentraci cytotoxické. 
Koncentrace zkoušené chemické látky musí být voleny tak, aby bylo vyloučeno srážení nebo zakalení roztoku.
 
Doporučenými rozpoušt ědly jsou dimethylsulfoxid (DMSO) 
a ethanol (EtOH). Vhodná mohou být i jiná málo cytotoxická 
rozpouštědla. Před použitím by m ěly být pro všechna rozpoušt ědla 
posouzeny jejich specifické vlastnosti, nap ř. reakce se zkoušenou 
chemickou látku, potla čení fototoxických ú činků, záchyt radikál ů 
a/nebo chemická stabilita v rozpoušt ědle. 
Rozpoušt ění může být usnadn ěno mícháním a/nebo ultrazvukem 
a/nebo zah řátím na vhodnou teplotu, pokud tím není dot čena stabilita 
zkoušené chemické látky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5  Podmínky oza řování  
1.4.1.5.1 Z d r o j s v ě t l a 
Volba vhodného zdroje sv ětla a filtrů je kritickým faktorem zkoušení 
fototoxicity. Zá ření v pásmu UVA a ve viditelném pásmu je obvykle 
spojováno s fototoxickými reakcemi  in vivo  (3, 12), zatímco zá ření 
v pásmu UVB je mén ě relevantní a je vysoce cytotoxické; cytotoxi ­
cita vzrůstá mezi 313 nm a 280 nm tisíckrát (13). Kritéria pro volbu 
vhodného sv ětelného zdroje musí zahrnovat požadavek, aby zdroj 
světla vyzařoval světlo o vlnových délkách, které zkoušená chemická 
látka absorbuje (absorp ční spektrum), a aby dávka sv ětelného zá ření 
(dosažitelná po p řijatelnou dobu expozice) byla dostate čná pro 
detekci známých fotocytotoxických chemických látek. Použité vlnové délky a dávky by dále nem ěly nadměrně poškozovat zkušební 
systém, nap ř. emisí tepla (infra červená oblast).
 
Simulace slune čního světla solárními simulátory se považuje za opti ­
mální zdroj um ělého světla. Distribuce zá řivého výkonu filtrovaného 
solárního simulátoru by m ěla být blízká dennímu venkovnímu sv ětlu 
uvedenému v literatu ře (14). V solárních simulátorech se používá jak 
xenonová výbojka, tak vysokotlaká rtu ťová halogenová výbojka 
(15). Druhá z nich má tu výhodu, že emituje mén ě tepla a je levn ější, 
avšak slune ční světlo napodobuje mén ě dokonale než výbojka xeno ­
nová. Pon ěvadž všechny solární simulátory vyza řují významné 
množství UVB zá ření, měly by být vhodn ě filtrovány, aby byly 
vysoce cytotoxické vlnové délky UVB zeslabeny. Protože plastové 
materiály pro bun ěčné kultury obsahují UV stabilizátory, spektrum 
by mělo být měřeno po pr ůchodu stejným typem ví čka 96jamkové 
destičky, jaké se použije v daném stanovení. Nehled ě na opatření 
přijatá k potla čení částí spektra filtrováním nebo na nevyhnutelné 
filtrační vlivy za řízení, spektrum zaznamenané za t ěmito filtry by 
se nemělo lišit od normalizovaného denního sv ětla ve vn ějším 
prostředí (14). P říklad spektrální distribuce filtrovaného zá ření solár­
ního simulátoru použitého ve valida ční studii zkoušky fototoxicity 
3T3 NRU  in vitro  je uveden v literatu ře (8, 16). Viz též dodatek 2 
obrázek 1.  
1.4.1.5.2 D o z i m e t r i e  
Intenzita sv ětla (intenzita ozá ření) se musí pravideln ě před každou 
zkouškou fototoxicity kontrolovat za použití vhodného širokopásmo ­
vého UV-metru. Intenzita by m ěla být měřena po pr ůchodu stejným 
typem víčka 96jamkové desti čky, jaké se použije v daném stanovení. 
UV-metr musí být pro daný zdroj kalibrován. Funk čnost UV-metru 
by měla být kontrolována a za tímto ú čelem se doporu čuje použít 
druhý referen ční UV-metr stejného typu, stejným zp ůsobem kalibro ­
vaný. V ideálním p řípadě by měl být v delších časových odstupech 
použit k m ěření spektrální intenzity zá ření filtrovaného zdroje sv ětla 
a ke kontrole kalibrace širokopásmového UV-metru spektroradi ­
ometr.  
Dávka 5 J/cm  2 (změřená v pásmu UVA) byla shledána jako necy ­
totoxická pro bu ňky Balb/c 3T3 a dostate čně silná k excitaci chemic ­
kých látek pro vyvolání fototoxických reakcí (6, 17), nap ř. pro 
dosažení 5 J/cm  2 po dobu 50 minut byla intenzita ozá ření nastavena 
na 1,7 mW/cm  2 . Viz dodatek 2 obrázek 2. Jestliže je použita jiná 
buněčná linie nebo jiný sv ětelný zdroj, musí být dávka ozá ření 
případně kalibrována, aby mohl být režim dávkování volen tak, 
aby nepoškozoval bu ňky a byl dostate čný k excitaci standardních 
fototoxinů. Doba sv ětelné expozice se vypo čte tímto zp ůsobem:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ dávka ozá ření ðJ=cm 2 Þ Ü 1 000 
intenzita ozá ření ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Ws)  
1.4.2  Zkušební podmínky  
1.4.2.1  Koncentrace zkoušené látky  
Rozmezí koncentrací chemických látek zkoušených se sv ětlem (+ Irr) 
a bez světla (– Irr) by m ěly být náležit ě stanoveny v experimentech 
pro zjištění rozmezí. M ůže být užite čné zjistit rozpustnost na po čátku 
a po 60 minutách (nebo po dob ě odpovídající dob ě expozice), nebo ť 
rozpustnost se m ůže měnit s časem nebo v pr ůběhu expozice. pH 
buněčných kultur s p řídavkem zkoušených látek by m ěla být 
v rozmezí 6,5–7,8, aby byla vylou čena toxicita zp ůsobená nevhod ­
nými kultiva čními podmínkami nebo vysoce kyselými či zásaditými 
chemickými látkami.  
Nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky by se m ěla nacházet 
v mezích fyziologických zkušebních podmínek, nap ř. by měl být 
vyloučen osmotický stres či stres z pH. V závislosti na zkoušené 
chemické látce m ůže být nutné brát v úvahu další fyzikáln ě- 
chemické vlastnosti jako faktory omezující nejvyšší zkušební 
koncentraci. U relativn ě nerozpustných látek, které nejsou toxické 
až do koncentrace nasycení, by m ěla být testována nejvyšší dosaži ­
telná koncentrace. Obecn ě by mělo být vylou čeno srážení zkoušené 
látky při jakýchkoli zkušebních koncentracích. Maximální koncent ­
race zkoušené látky by nem ěla překročit 1 000 μg/ml; osmolarita by 
neměla překročit 10 mM. M ěla by být použita geometrická řada 
ředění 8 koncentrací zkoušené látky s konstantním faktorem ředění 
(viz druhý odstavec bodu 2.1).  
Pokud existují údaje (z experiment ů pro zjištění rozmezí koncentrací) 
o tom, že zkoušená chemická látka není cytotoxická až do mezní koncentrace ur čené pro experiment v temnu (– Irr), ale je vysoce 
cytotoxická po ozá ření (+ Irr), rozmezí koncentrací, které má být 
zvoleno pro experimenty s ozá řením (+ Irr), se m ůže lišit od rozmezí 
zvoleného pro experimenty v temnu (– Irr), má-li být spln ěn poža­
davek uspokojivé kvality údaj ů.
 
1.4.2.2  Kontroly  
1.4.2.2.1 C i t l i v o s t b u n ě k n a z á ř e n í , z j i š t ě n í d o s a v a d n í c h 
ú d a j ů : 
Citlivost bun ěk na zdroj sv ětla by měla být pravideln ě kontrolována 
(přibližně každá pátá pasáž) posouzením jejich životaschopnosti po 
expozici rostoucími dávkami ozá ření. Při tomto posouzení by m ělo 
být použito n ěkolik dávek ozá ření, včetně úrovní podstatn ě vyšších, 
než jsou úrovn ě při zkoušce fototoxicity 3T3 NRU. Tyto dávky se 
nejsnáze kvantifikují m ěřením UV složek sv ětelného zdroje. Bu ňky 
se nasadí p ři intenzitě použité ke zkoušce fototoxicity 3T3 NRU  in 
vitro  a příští den se ozá ří. Životaschopnost bun ěk se poté stanoví 
o den pozd ěji využitím p říjmu neutrální červeně. Mělo by být 
prokázáno, že výsledná nejvyšší necytotoxická dávka (nap ř. dávka 
ve valida ční studii 5 J/cm  2 (UVA)) byla dostate čná ke korektní 
klasifikaci referen čních chemických látek (tabulka 1).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2 C i t l i v o s t n a z á ř e n í , k o n t r o l a s o u č a s n é z k o u š k y :  
Zkouška spl ňuje kritéria jakosti, pokud ozá řené negativní/ ­
rozpouštědlové kontroly vykazují životaschopnost více než 80 % 
v porovnání s neozá řenými negativními/rozpoušt ědlovými kontro ­
lami.  
1.4.2.2.3 Ž i v o t a s c h o p n o s t r o z p o u š t ě d l o v é k o n t r o l y  
Absolutní absorbance (A  540 NRU  ) neutrální červeně extrahované 
z rozpoušt ědlových kontrol nazna čí, zda 1 × 10  4 buněk nasazených 
na jednu jamku zachovalo p ři růstu během dvou dn ů zkoušky 
obvyklou dobu zdvojnásobení (doubling time). Zkouška spl ňuje 
kritérium p řijatelnosti, jestliže st řední hodnota A  540 NRU  neexpono ­
vaných kontrol je ≥ 0,4 (tj. p řibližně dvacetinásobek absorbance 
rozpouštědlového pozadí).  
1.4.2.2.4 P o z i t i v n í k o n t r o l a  
Při každé zkoušce fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  musí být soub ěžně 
zkoušena známá fototoxická chemická látka. Doporu čen je chlorpro ­
mazin (CPZ). Pro CPZ zkoušený podle standardního postupu p ři 
zkoušce fototoxicity 3T3 NRU  in vitro  byla definována tato kritéria 
přijatelnosti zkoušky: CPZ ozá řený (+ Irr): IC  50 = 0,1 až 2,0 μg/ml, 
pro CPZ neozá řený (– Irr): IC  50 = 7,0 až 90,0 μg/ml. Fotoirita ční 
faktor (PIF) by m ěl být > 6. M ěla by být sledována p ředcházející 
funkčnost této pozitivní kontroly.  
Namísto chlorpromazinu mohou být použity jako soub ěžné pozitivní 
kontroly jiné fototoxické chemické látky vhodné z hlediska typu 
nebo rozpustnosti hodnocené chemické látky.  
1.4.3  Zkušební postup (6, 7, 8, 16, 17)  
1.4.3.1  První den  
Do obvodových jamek 96jamkové mikrotitra ční destičky pro tká ňové 
kultury se odpipetuje po 100 μl kultivačního média (slepý pokus). Do 
zbývajících jamek se dávkuje po 100 μl buněčné suspenze s 1 × 10  5 
buněk/ml v kultiva čním médiu (= 1 × 10  4 buněk na jamku). Pro každou 
řadu koncentrací jednotlivých zkou šených chemických látek a pro 
rozpouštědlovou a pro pozitivní kontrolu se p řipraví dvě destičky. 
Buňky se inkubují 24 hodin (viz bod 1.4.1.2), dokud nedosáhnou 
semikonfluentní monovrstvy. Tato inkuba ční doba umožní regeneraci 
buněk, jejich p řichycení a exponenciální r ůst. 
1.4.3.2  Druhý den  
Po inkubaci se kultiva ční médium z bun ěk dekantuje a d ůkladně 
promyje 150 μl pufrovaného roztoku použitého k inkubaci. P řidá 
se 100 μl pufru obsahujícího vhodnou koncentraci zkoušené 
chemické látky, nebo pouze rozpoušt ědlo (rozpoušt ědlová kontrola). 
Aplikuje se 8 r ůzných koncentrací zkoušené chemické látky. Bu ňky 
se zkoušenou chemickou látkou se inkubují v temnu po dobu 
60 minut (viz bod 1.4.1.2 a druhý odstavec bodu 1.4.1.4).  
Jedna ze dvou desti ček připravených pro každou z řady koncentrací 
zkoušené chemické látky a kontroly se zvolí, obvykle náhodn ě, pro 
stanovení cytotoxicity (– Irr) (tj. kontrolní desti čka) a jedna (tj. 
expoziční destička) pro stanovení fotocytotoxicity (+ Irr).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
K provedení části zkoušky s ozá řením (+ Irr) se bu ňky při pokojové 
teplotě po dobu 50 minut oza řují přes víčko 96jamkové desti čky 
nejvyšší dávkou zá ření, která je necytotoxická (viz též dodatek 2). 
Neozářené destičky (– Irr) se ponechají 50 minut (= doba expozice 
světlem) v temnu p ři pokojové teplot ě. 
Zkušební roztok se odstraní a každá jamka se promyje dvakrát 150 
μl pufrovaného roztoku použitého k inkubaci, ale neobsahujícího 
zkoušený materiál. Pufrovaný roztok se poté nahradí kultiva čním 
médiem a inkubuje se (viz bod 1.4.1.2) p řes noc (18–22 hodin).  
1.4.3.3  Třetí den  
1.4.3.3.1 M i k r o s k o p i c k é h o d n o c e n í  
Buňky se prohlédnou pod mikroskopem s fázovým kontrastem 
vzhledem k jejich r ůstu, morfologii a neporušenosti monovrstvy. 
Zaznamenají se zm ěny morfologie bun ěk a účinky na r ůst buněk. 
1.4.3.3.2 Z k o u š k a p ř í j m u n e u t r á l n í č e r v e n ě 
Buňky se promyjí 150 μl předehřátého roztoku pufru. Promývací 
roztok se opatrn ě odstraní poklepem. P řidá se 100 μl média bez 
séra (16) s koncentrací 50 μg/ml neutrální červeně (NR) (3-amino- 
7-dimethylamino-2-methylphenazin hydrochlorid; N  8 ,N 8 ,3-trimethyl ­
fenazin-2,8-diamin-hydrochlorid; č. EINECS 209-035-8; č. CAS 
553-24-2; C.I. 50040) a inkubuje se 3 hodiny dle popisu v bod 1.4.1.2. Po inkubaci se médium NR odstraní a bu ňky se promyjí 
150 μl pufru. Ten se dekantuje a zcela odstraní odsátím nebo odst ře­
děním.
 
Přidá se p řesně 150 μl čerstvě připraveného roztoku (49 díl ů 
vody + 50 díl ů ethanolu + 1 díl kyseliny octové) k odstran ění NR.  
Mikrotitra ční destička se jemn ě 10 minut t řepe na třepačce, dokud se 
NR z bun ěk nevylouží a nevytvo ří homogenní roztok.  
Spektrometrem se zm ěří absorbance extraktu NR p ři 540 nm, 
přičemž se pro srovnání použije slepý pokus. Údaje se uloží ve 
vhodném formátu elektronického souboru pro následnou analýzu.  
2. ÚDAJE  
2.1 KVALITA A MNOŽSTVÍ ÚDAJ Ů 
Údaje ze zkoušky by m ěly umožnit smysluplnou analýzu závislosti 
odezvy na koncentraci získané p ři ozáření a bez n ěho, a je-li to 
možné, koncentraci zkoušené látky, p ři níž je životaschopnost 
buněk snížena na 50 % (IC  50 ). Je-li zjišt ěna cytotoxicita, m ěl by 
být rozsah koncentrací a interval mezi nimi nastaven tak, aby bylo možné proložit experimentálními údaji k řivku.
 
Pro jasně pozitivní a jasn ě negativní výsledky (viz první odstavec 
bodu 2.3) m ůže dostačovat primární experiment podpo řený jedním 
nebo více p ředběžnými experimenty pro stanovení rozsahu dávek.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Neprůkazné, hrani ční nebo nejasné výsledky by m ěly být vyjasn ěny 
dalším zkoušením (viz též druhý odstavec bodu 2.4). V t ěchto přípa­
dech by m ěla být uvážena zm ěna experimentálních podmínek. 
Změněné experimentální podmínky se mohou týkat rozmezí koncen ­
trací nebo rozestup ů mezi jednotlivými koncentracemi, preinkuba ční 
doby a doby expozice ozá řením. Kratší doba expozice m ůže být 
vhodná u chemických látek nestálých ve vod ě. 
2.2 VYHODNOCENÍ VÝSLEDK Ů 
S cílem umožnit vyhodnocení údaj ů může být vypo čten fotoirita ční 
faktor (PIF) a st řední světelný účinek (MPE).  
Pro výpo čet parametr ů fotocytotoxicity (viz níže) musí být soubor 
diskrétních hodnot závislosti odezvy na koncentraci aproximován vhodnou spojitou k řivkou závislosti odezvy na koncentraci 
(vhodným modelem). Prokládání dat k řivkou je b ěžně prováděno 
metodou nelineární regrese (18). Pro posouzení vlivu variability údajů na proloženou k řivku se doporu čuje postup  bootstrap .
 
Fotoiritační faktor (PIF) se vypo čte ze vzorce:  
PIF ¼ IC 50 ð Ä IrrÞ 
IC 50 ð þ IrrÞ 
Pokud nelze vypo číst IC  50 v přítomnosti a p ři absenci ozá ření, nelze 
pro zkoušený materiál fotoirita ční faktor PIF stanovit.  
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Střední světelný účinek (MPE) je založen na srovnání úplné k řivky 
závislosti odezvy na koncentraci (19). MPE je definován jako vážený průměr reprezentativního souboru hodnot sv ětelného ú činku:
 
Světelný účinek při koncentraci C (PE  c ) je definován jako sou čin 
účinku odezvy RE  c a účinku dávky DE  c tj. PE  c = RE  c × DE  c . 
Účinek odezvy RE  c je rozdíl mezi odezvou pozorovanou p ři absenci 
a v přítomnosti sv ětla, tj. RE  c = R  c (– Irr) – R  c (+ Irr). Ú činek dávky 
je dán vzorcem:  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
kde C* p ředstavuje ekvivalentní koncentraci, tj. koncentraci, p ři 
které se odezva v p řítomnosti sv ětla + Irr rovná odezv ě při absenci 
světla – Irr p ři koncentraci C. Pokud nelze ekvivalentní koncentraci 
C* určit, protože hodnoty odezvy R  C (+ Irr) křivky jsou soustavn ě 
vyšší nebo nižší než hodnoty R  C (– Irr)), je ú činek dávky stanoven na 
hodnotu 1. Váhové faktory w  i jsou dány nejvyšší hodnotou odezvy, 
tj. w  i = MAX {R  i (+ Irr), R  i (– Irr) }. Koncentra ční síť C i je volena 
tak, aby v každém koncentra čním intervalu definovaném hodnotami 
koncentrací použitými v experimentu byl stejný po čet bodů. Výpočet 
středního sv ětelného ú činku je omezen na nejvyšší hodnoty koncen ­
trací, při nichž alespo ň jedna z obou k řivek stále ješt ě vykazuje 
odezvu nejmén ě 10 %. Pokud je tato maximální koncentrace vyšší 
než nejvyšší koncentrace použitá v + Irr experimentu, je na zbývající části + Irr k řivky odezva kladena jako rovná nule (= 0). V závislosti 
na tom, zda je, či není hodnota MPE v ětší než vhodn ě zvolená 
hraniční hodnota (MPE
 c = 0,15), zkoušená chemická látka je, či 
není klasifikována jako fototoxická.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Program pro výpo čet parametr ů PIF a MPE je dostupný v (20).  
2.3 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Na základ ě validační studie (8) lze p ředpovědět, že zkoušená látka 
s PIF < 2 či MPE < 0,1„není fototoxická“. Hodnoty PIF > 2 a < 5 či 
MPE > 0,1 a < 0,15 p ředpovídají: „pravd ěpodobně fototoxická“; 
a PIF > 5 či MPE > 0,15 p ředpovídají: „fototoxická“.  
V laborato ři zavádějící prvně toto stanovení by referen ční materiály 
uvedené v tabulce 1 m ěly být odzkoušeny p řed zkoušením zkušeb ­
ních látek ke stanovení fototoxicity. Nam ěřené hodnoty PIF a MPE 
by měly být blízké hodnotám uvedeným v tabulce 1.  
Tabulka 1  
Chemický název č. EINECS č. CAS PIF MPE Absorp ční pík Rozpoušt ědlo (  1 ) 
amiodaron- 
hydrochlorid 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27–0,54 242 nm 
300 nm 
(rameno) ethanol 
chlorpromazin- 
hydrochlorid 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33–0,63 309 nm ethanol 
norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34–0,90 316 nm acetonitril 
anthracen 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19–0,81 356 nm acetonitril protoporfyrin 
IX, disodná s ůl 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54–0,74 402 nm ethanol 
L-histidin [7006-35-1] žádný PIF 0,05–0,10 211 nm voda 
2,2'-methylen ­
bis(3,4,6-trich ­
lorfenol); hexachlorofen 200-733-8 [70-30-4] 1,1–1,7 0,00–0,05 299 nm 
317 nm (rameno) ethanol 
natrium- 
dodecyl-sulfát 205-788-1 [151-21-3] 1,0–1,9 0,00–0,05 neabsorbuje voda
 
( 1 ) Rozpoušt ědlo použité pro m ěření absorpce.  
2.4 INTERPRETACE ÚDAJ Ů 
Jsou-li fototoxické ú činky pozorovány pouze p ři nejvyšších zkouše ­
ných koncentracích (zvlášt ě v případě zkoušených chemických látek 
rozpustných ve vod ě), mohou být pro posouzení nebezpe čnosti 
nezbytné další úvahy. Ty se mohou týkat údaj ů o absorpci k ůží 
a akumulaci chemické látky v k ůži a/nebo údaj ů z jiných zkoušek, 
např. ze zkoušek doty čné chemické látky  in vitro  za použití zví řecí 
nebo lidské k ůže či jejich model ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Není-li toxicita prokázána (+ Irr a – Irr) a jsou-li koncentrace, které 
by mohly být zkoušeny, omezeny malou rozpustností, není patrn ě 
zkouška pro zkoušenou látku vhodná a m ělo by být zváženo 
potvrzující zkoušení za použití nap ř. jiného modelu.  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat p řinejmenším tyto informace:  
Zkoušená látka:  
— identifika ční údaje, obecné generické názvy a čísla podle IUPAC 
a CAS, jsou-li známa,  
— fyzikální vlastnosti a čistota,  
— fyzikáln ě-chemické vlastnosti d ůležité pro provedení studie,  
— UV/VIS absorp ční spektrum,  
— stálost a fotostabilita, jsou-li známy.  
Rozpoušt ědlo: 
— zdůvodnění volby rozpoušt ědla, 
— rozpustnost zkoušené chemické látky v rozpoušt ědle, 
— procentuální koncentrace rozpoušt ědla v aplika čním médiu.  
Buňky: 
— typ a zdroj bun ěk, 
— nepřítomnost mykoplasmat,  
— číslo buněčné pasáže, je-li známo,  
— citlivost bun ěk na záření stanovená oza řovacím za řízením použ ­
itým ve zkoušce fototoxicity 3T3 NRU  in vitro . 
Zkušební podmínky (1);  inkubace p řed aplikací a po ní : 
— typ a složení kultiva čního média,  
— inkuba ční podmínky (koncentrace CO  2 ; teplota; vlhkost),  
— délka inkubace (zpracování p řed inkubací a po ní).  
Zkušební podmínky (2);  aplikace chemické látky : 
— zdůvodnění výběru koncentrací zkoušené chemické látky použ ­
itých jak p ři ozáření, tak bez n ěj, 
— v případě, že zkoušená chemická látka vykazuje omezenou 
rozpustnost a není cytotoxická: zd ůvodnění nejvyšší zkušební 
koncentrace,  
— typ a složení aplika čního média (pufrovaný fyziologický roztok),  
— délka aplikace chemické látky.  
Zkušební podmínky (3);  ozáření: 
— zdůvodnění výběru použitého zdroje sv ětla, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— výrobce a typ zdroje sv ětla a radiometru,  
— spektrální charakteristiky ozá ření ze zdroje sv ětla, 
— charakteristiky propustnosti a absorpce použitého filtru (použ ­
itých filtr ů), 
— charakteristiky radiometru a podrobnosti o jeho kalibraci,  
— vzdálenost zdroje sv ětla od zkoušeného systému,  
— intenzita ozá ření UVA v této vzdálenosti, vyjád řená v mW/cm  2 , 
— délka expozice UV/VIS sv ětlu, 
— dávka UVA zá ření (intenzita × čas), vyjád řená v J/cm  2 , 
— teplota bun ěčných kultur b ěhem ozařování a teplota bun ěčných 
kultur soub ěžně udržovaných v temnu.  
Zkušební podmínky (4);  zkouška životaschopnosti p říjmem neutrální 
červeně: 
— složení aplika čního média neutrální červeně, 
— doba inkubace neutrální červeně, 
— inkuba ční podmínky (koncentrace CO  2 ; teplota; vlhkost),  
— podmínky extrakce neutrální červeně (extrakční činidlo; délka 
extrakce),  
— vlnová délka použitá pro spektrofotometrický ode čet absorbance 
neutrální červeně, 
— druhá (referen ční) vlnová délka, je-li použita,  
— složení slepého roztoku pro spektrometrii, je-li použit.  
Výsledky:  
— životaschopnost bun ěk získaná p ři každé koncentraci zkoušené 
chemické látky vyjád řená v procentech st řední životaschopnosti 
souběžných rozpoušt ědlových kontrol,  
— křivky koncentra ční závislosti odezvy (koncentrace zkoušené 
chemické látky versus relativní životaschopnost bun ěk) získané 
při souběžných experimentech + Irr a – Irr,  
— analýza k řivek koncentra ční závislosti odezvy; je-li to možné, 
výpočet hodnot / IC  50 (+ Irr) a IC  50 (– Irr),  
— srovnání obou k řivek koncentra ční závislosti odezvy získaných 
s ozářením a bez n ěho, a to bu ď výpočtem fotoirita čního faktoru 
(PIF), nebo výpo čtem středního sv ětelného ú činku (MPE),  
— kritéria p řijatelnosti zkoušky; soub ěžná rozpoušt ědlová kontrola:  
— absolutní životaschopnost (absorbance extraktu NR) ozá řených 
a neozářených bun ěk, 
— dosavadní údaje pro negativní a rozpoušt ědlovou kontrolu; 
střední hodnoty a sm ěrodatné odchylky,  
— kritéria p řijatelnosti zkoušky; soub ěžná pozitivní kontrola:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— IC  50 (+ Irr) a IC  50 (– Irr) a PIF/MPE pozitivní kontrolní chemické 
látky,  
— dosavadní údaje pozitivní kontrolní chemické látky: IC  50 (+ Irr) 
a IC  50 (– Irr) a PIF/MPE; st řední hodnoty a sm ěrodatné odchylky.  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of 
substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 95–102.
 
2) Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry“ Vol. 3 part 1. North Holland Publishing 
Co. Amsterdam. p XI–XXXV.  
3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 
314–348.
 
4) Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology“ Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, s. 79–110.
 
5) OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document 
On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water“ Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.  
6) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L’Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, 
W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., 
Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell 
phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793–796.
 
7) Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7–8.
 
8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., 
Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannen ­
becker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA  In 
vitro  phototoxicity validation study: results of phase II (blind 
trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, 305–327.
 
9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 
30 th -31 th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
15 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat.  
10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119–124.  
11) Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225–237.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology“, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, s. 515–530.
 
13) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829.  
14) ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic 
colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
 
15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, 
Vienna, 1993, ISBN 3900734275.  
16) ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 
1998. 18 stran.  
17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union  Directive 76/768/EEC,  
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679–708.
 
18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical mode ­
ling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127–138.
 
19) Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
445–462.  
20) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_23 
49687_1_1_1_1,00.html.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
DODATEK 2  
Role zkoušky fototoxicity 3T3 NRU v postupném zkoušení fototoxicity 
chemických látek
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
DODATEK 2  
Obrázek 1  
Spektrální distribuce výkonu filtrovaného solárního simulátoru
  
(viz druhý odstavec bodu 1.4.1.5)  
Obrázek 1 uvádí p říklad přijatelné spektrální distribuce intenzity ozá ření filtrovaného solárního 
simulátoru. Pochází ze zdroje dopovaného halidy kov ů, použitého ve valida čním experimentu 
zkoušky fototoxicity 3T3 NRU (6, 8, 17). Je ukázán ú činek dvou r ůzných filtr ů a dodate čný 
filtrační účinek víčka 96jamkové desti čky pro kultivaci bun ěk. Filtr H2 byl použit pouze ve 
zkušebních systémech tolerantních k vyšší dávce UVB (zkouška modelu k ůže a fotohemolytická 
zkouška červených krvinek). Pro zkoušku fototoxicity 3T3 NRU byl použit filtr H1. Obrázek 
ukazuje, že dodate čný filtrační účinek víčka destičky je pozorován hlavn ě v oblasti UVB, p řičemž 
víčkem proniká stále ješt ě dostatečné množství UVB ze spektra intenzity ozá ření k excitování 
chemických látek obvykle absorbujících v UVB oblasti, jako amiodaron (viz tabulka 1).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Obrázek 2  
Citlivost bun ěk Balb/c 3T3 k ozá ření (měřená v oblasti UVA)  
Životaschopnost bun ěk (v % úrovn ě příjmu neutrální červeně v kontrole v temnu)
  
(viz bod 1.4.1.5.2 druhý odstavec; 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)  
Citlivost bun ěk Balb/c 3T3 k ozá ření solárním simulátorem použitým ve valida čním experimentu 
zkoušky fototoxicity 3T3 NRU, nam ěřená v UVA oblasti. Obrázek znázor ňuje výsledky zm ěřené 
v sedmi r ůzných laborato řích v předvalidační studii (1). Zatímco dv ě křivky ozna čené neplnými 
symboly byly získány se staršími bu ňkami (s vyšším po čtem pasáží), které musely být nahrazeny 
novými bu ňkami, křivky s plnými symboly p ředstavují bu ňku s přijatelnou tolerancí k ozá ření. 
Z těchto údaj ů byla odvozena nejvyšší necytotoxická dávka ozá ření 5 J/cm  2 (svislá čárkovaná 
čára). Vodorovná čárkovaná čára představuje navíc maximální p řijatelný ú činek ozáření uvedený 
v bodu 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42  SENZIBILIZACE K ŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠET ŘENÍM 
LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN  
ÚVOD  
1. Metodiky OECD pro testování chemických látek a na nich založené 
zkušební metody EU jsou pravideln ě přezkoumávány s ohledem na v ědecký 
pokrok, zm ěny regula čních potřeb a dobré životní podmínky zví řat. Již 
dříve byla p řijata původní zkušební metoda (ZM) pro stanovení senzibili ­
zace kůže u myší, tzv. zkouška s vyšet řením lokálních lymfatických uzlin 
(LLNA; zkušební metodika OECD č. 429; kapitola B.42 této p řílohy) (1). 
Podrobnosti o validaci metody LLNA a p řehled souvisejících prací byly 
publikovány (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Aktualizovaná metoda LLNA je založena na posouzení zkušeností a v ědeckých údaj ů (12). Jedná 
se o druhou ZM, která je ur čena k hodnocení potenciálu chemikálií (látek 
a směsí) způsobovat senzibilizaci k ůže u zvířat. Druhá zkušební metoda 
(tzn. podle zkušební metodiky OECD č. 406 nebo kapitoly B.6 této p řílohy) 
využívá zkoušky na mor čatech, a to zvlášt ě maximaliza ční zkoušku na 
morčatech a Bühler ův test (13). Metoda LLNA poskytuje oproti metod ě 
uvedené v kapitole B.6 a zkušební metodice OECD č. 406 (13) ur čité 
výhody, pokud jde o dobré životní podmínky zví řat. Tato aktualizovaná 
zkušební metoda LLNA obsahuje sadu standard ů funkčnosti (dodatek 1), 
které lze používat k posouzení stavu validace nových a/nebo modifikova ­
ných zkušebních metod, které jsou funk čně a mechanicky podobné metod ě 
LLNA, v souladu se zásadami uvedenými v Pokynu OECD č. 34 (14).
 
2. Metoda LLNA zkoumá induk ční fázi senzibilizace k ůže a poskytuje kvan ­
titativní údaje, které jsou vhodné pro hodnocení závislosti odezvy na dávce. 
Je třeba poznamenat, že mírn ě nebo středně silně senzibilizující látky, které 
se doporu čují jako vhodné pozitivní kontrolní látky pro zkoušky na mor ča­
tech (tzn. podle kapitoly B.6 této p řílohy nebo zkušební metodiky OECD 
č. 406) (13) jsou vhodné také pro metodu LLNA (6) (8) (15). V této ZM je 
jako alternativa popsána také redukovaná metoda LLNA (rLLNA), p ři které 
by se mohlo používat až o 40 % mén ě zvířat (16) (17) (18). Metodu rLLNA 
lze použít, když právní p ředpisy vyžadují potvrzení negativní predikce 
potenciálu ur čité chemické látky senzibilizovat k ůži, pokud se dodrží 
všechny ostatní specifikace protokolu metody LLNA popsané v této ZM. Predikce negativního výsledku by m ěla být založena na všech dostupných 
informacích popsaných v odstavci 4. P řed použitím metody rLLNA je nutno 
poskytnout jednozna čné obecné a v ědecké zdůvodnění jejího použití. Pokud 
jsou v rozporu s p ůvodním o čekáváním získány p ři použití metody rLLNA 
pozitivní nebo nejednozna čné výsledky, m ůže být k interpretaci nebo objas ­
nění výsledku nezbytné provést další zkoušky. Metoda rLLNA by se 
neměla používat k zjiš ťování nebezpe čnosti látek, které se používají p ři 
zkouškách senzibilizace k ůže, pokud jsou zapot řebí informace ohledn ě 
závislosti odezvy na dávce, nap říklad při podrobném díl čím tř
ídění látek 
pro účely nařízení (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek 
a směsí nebo pro ú čely globáln ě harmonizovaného systému klasifikace 
a označování chemických látek OSN.  
DEFINICE  
3. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 2.  
VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ  
4. Metoda LLNA p ředstavuje alternativní metodu pro identifikaci chemických 
látek způsobujících senzibilizaci k ůže. To však nutn ě neznamená, že by se 
metoda LLNA m ěla používat ve všech p řípadech namísto zkoušek na 
morčatech (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD 
č. 406) (13); znamená to spíše, že tato metoda má stejnou hodnotu a že 
ji lze použít jako alternativní metodu, jejíž pozitivní ani negativní výsledky 
obvykle již nevyžadují žádné další potvrzování. Zkušební laborato ř by měla 
před provedením studie zohlednit všechny dostupné informace o zkoušené  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
látce. Mezi tyto informace pat ří totožnost a chemická struktura zkoušené 
látky, její fyzikáln ě-chemické vlastnosti, výsledky jakýchkoli jiných 
zkoušek toxicity  in vitro  a in vivo  za použití zkoušené látky 
a toxikologické údaje o strukturn ě příbuzných látkách. Tyto informace by 
se měly posoudit, aby se zjistilo, zda je metoda LLNA vhodná pro danou 
látku (s ohledem na neslu čitelnost n ěkterých druh ů chemických látek 
s metodou LLNA – viz odstavec 5), a také aby se usnadnila volba dávkování.
 
5. Zkušební metoda LLNA je metodou  in vivo , a tudíž taková neeliminuje 
používání zví řat při hodnocení alergického kontaktního senzibilizujícího 
působení. Tato metoda však umož ňuje snížit po čet zvířat, která jsou 
k tomuto ú čelu nezbytná. Krom ě toho metoda LLNA nabízí podstatné 
zlepšení zp ůsobu zacházení se zví řaty (mén ě bolesti a utrpení), která se 
využívají ke zkoušení kontaktní alergické senzibilizace. Metoda LLNA je 
založena na posouzení imunologických jev ů navozených chemickými 
látkami b ěhem induk ční fáze senzibilizace. Na rozdíl od zkoušek na 
morčatech (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD 
č. 406) (13) metoda LLNA nevyžaduje um ělé vyvolání kožní p řecitlivě­
losti. Krom ě toho metoda LLNA nevyžaduje ani používání adjuvantu, jak 
je tomu v p řípadě maximaliza ční zkoušky na mor čatech (13). Díky tomu 
metoda LLNA snižuje bolest a utrpení zví řat. Ale i p řes výhody, které 
má metoda LLNA ve srovnání s metodou popsanou v kapitole B.6 
a zkušební metodice OECD č. 406, je t řeba si uv ědomit, že existují 
určitá omezení, která si mohou vyžádat použití metody popsané 
v kapitole B.6 nebo zkušební metodice OECD č. 406 (13) (nap ř. falešně 
negativní výsledky p ři použití metody LLNA pro ur čité kovy, falešn ě 
pozitivní výsledky u ur čitých látek zp ůsobujících podrážd ění kůže [jako 
jsou například některé chemikálie typu povrchov ě aktivních látek] (19) 
(20) nebo rozpustnost zkoušené látky). Krom ě toho si použití zkoušek na 
morčatech (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD 
č. 406) (13) mohou vyžádat také n ěkteré třídy chemických látek nebo 
látky obsahující funk ční skupiny, u nichž je prokázáno, že mohou zp ůso­
bovat zkreslení výsledk ů (21). Na základ ě omezené valida ční databáze, 
která se skládala p řevážně z pesticidních p řípravků, je pravd ěpodobnější, 
že u těchto druh ů zkoušených látek poskytne pozitivní výsledek metoda 
LLNA nežli zkouška na mor čatech (22). Avšak p ři testování p řípravků by 
se dalo uvažovat o možnosti použít podobné látky se známými výsledky 
jakožto srovnávací látky, které prokáží, že metoda LLNA funguje správn ě 
(viz odstavec 16). S výjimkou t ěchto známých omezení by m ěla být 
metoda LLNA použitelná k testování jakýchkoli látek, nejsou-li s těmito látkami spojeny vlastnosti, které mohou nep říznivě ovlivnit p řes­
nost metody LLNA.
 
PODSTATA ZKOUŠKY  
6. Základní podstata metody LLNA spo čívá v tom, že senzibilizující látky 
vyvolávají proliferaci lymfocyt ů v lymfatických uzlinách drenujících 
místo aplikace zkoušené látky. Tato proliferace je úm ěrná dávce 
a účinnosti aplikovaného alergenu a p ředstavuje jednoduchý prost ředek 
k získání kvantitativního údaje o mí ře senzibilizace. Proliferace se m ěří 
porovnáním st řední proliferace u každé zkušební skupiny se st řední 
proliferací u kontrolní skupiny s vehikulem. Ur čí se pom ěr střední 
proliferace u každé z exponovaných skupin ke st řední proliferaci 
u souběžně testované kontrolní skupiny s vehikulem, nazývaný index 
stimulace (SI), p řičemž jeho hodnota by m ěla být v ětší nebo rovna 
třem, aby bylo za řazení zkoušené látky mezi potenciální senzibilizátory 
kůže oprávn ěné. Zde popsané postupy jsou založeny na použití radio ­
aktivního zna čení in vivo  k měření zvýšeného po čtu proliferujících 
buněk v lymfatických uzlinách drenujících aurikulární oblast. 
K posouzení po čtu proliferujících bun ěk však lze použít i jiné ukazatele 
za předpokladu, že jsou zcela spln ěny požadavky standard ů funkčnosti 
(viz dodatek 1).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
POPIS ZKOUŠKY  
Volba druhu zví řat 
7. Vhodným druhem pro tuto zkoušku je myš. Používají se mladé dosp ělé 
samice myší z kmene CBA/Ca nebo CBA/J, které musí být nullipary 
a nesmějí být březí. Při zahájení studie by zví řata měla být přibližně 8 až 
12 týdnů stará, přičemž odchylky v hmotnosti zví řat by měly být pouze 
minimální a nem ěly by překročit 20 % st řední hmotnosti. P řípadně lze 
používat i jiné kmeny a samce, pokud je k dispozici dostatek údaj ů, které 
dokazují, že v rámci reakcí neexistují u metody LLNA významné specifické odlišnosti mezi kmeny a/nebo pohlavími.
 
Podmínky chovu a krmení  
8. Myši by m ěly být chovány ve skupinách (23), není-li p ředloženo dostate čné 
vědecké zd ůvodnění, proč by měly být chovány jednotliv ě. Teplota 
v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22 ± 3 °C. A čkoli by relativní 
vlhkost vzduchu m ěla být minimáln ě 30 % a pokud možno by krom ě doby 
úklidu místnosti nem ěla přesáhnout 70 %, cílem by m ěla být hodnota 
50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé se střídáním 12 hodin sv ětla a 12 
hodin tmy. Ke krmení lze používat b ěžnou laboratorní stravu a k pití by 
měly mít myši k dispozici neomezené množství vody.  
Příprava zví řat 
9. Zvířata se náhodn ě vyberou, pro usnadn ění individuální identifikace se 
označí (nesmí se však použít žádná forma zna čení uší) a chovají se 
v klecích minimáln ě pět dnů před začátkem aplikování zkoušené látky, 
aby se mohla p řizpůsobit laboratorním podmínkám. P řed začátkem aplikace 
látky se všechna zví řata vyšetří, aby se ov ěřilo, že nemají žádné pozorova ­
telné kožní léze.  
Příprava dávkovacích roztok ů 
10. Pevné chemické látky by se m ěly před nanesením na ucho myši rozpustit 
nebo suspendovat ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech a pop řípadě 
zředit. Kapalné látky lze aplikovat bez p řísad nebo je lze p řed dávkováním 
rozpustit. Nerozpustné látky, jaké se nej častěji používají k výrob ě zdravot­
nických prost ředků, by měly být vystaveny intenzívní extrakci ve vhodném 
rozpouštědle, aby se p řed nanesením na ucho myši odhalily všechny extra ­
hovatelné složky, které je nutno testovat. Zkoušené látky by se m ěly připra­
vovat každý den čerstvé, pokud údaje o stálosti neprokazují p řijatelnost 
jejich skladování.  
Kontrola spolehlivosti  
11. K prokázání řádné funk čnosti zkoušky slouží pozitivní kontrolní chemikálie, 
a to tak, že reagují s dostate čnou a reprodukovatelnou citlivostí na zkou ­ 
šenou senzibilizující látku, u níž je dob ře popsána síla odezvy. Za řazení 
souběžné pozitivní kontroly se doporu čuje proto, že prokazuje zp ůsobilost 
laboratoře úspěšně provést každou zkoušku a umož ňuje posoudit vnitrola ­
boratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnost a srovnatelnost. Pozitivní 
kontrolu p ři každé studii také vyžadují n ěkteré regula ční orgány, a proto 
se uživatel ům doporu čuje před provedením zkoušky LLNA p říslušné 
orgány konzultovat. Doporu čuje se tudíž b ěžně používat soub ěžnou pozi ­
tivní kontrolu, aby nebylo nutné další zkoušení na zví řatech ke spln ění 
požadavk ů, které by mohly vzniknout p ři používání periodické pozitivní 
kontroly (viz odstavec 12). Pozitivní kontrola by m ěla v rámci metody 
LLNA vyvolat pozitivní odezvu p ři úrovni expozice, u které se o čekává 
zvýšení indexu stimulace (SI) > 3 ve srovnání s negativní kontrolní skupi ­
nou. Dávka pozitivní kontroly by m ěla být zvolena tak, aby nevyvolala 
nadměrné podrážd ění kůže nebo systémovou toxicitu a p řitom aby indukce  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
byla reprodukovatelná, avšak nikoli nadm ěrná (tzn. že hodnota SI > 20 by 
byla příliš velká). K up řednostňovaným látkám, které se používají jako 
pozitivní kontrola, pat ří 25 % roztok 2-benzylidenoktanalu 
(reg. č. Chemical Abstracts Service [CAS] 101-86-0) v acetonu s olivovým 
olejem (v objemovém pom ěru 4:1) a 5 % roztok 2-sulfanylbenzothiazolu 
(CAS 149-30-4) v  N,N -dimethylformamidu (viz dodatek 1, tabulka 1). 
Mohou existovat ur čité okolnosti, za nichž lze p ři řádném zd ůvodnění použít 
i jiné pozitivní kontrolní látky, které spl ňují výše uvedená kritéria.  
12. I když se za řazení skupiny soub ěžných pozitivních kontrol doporu čuje, 
mohou existovat situace, kdy m ůže být periodické testování (tzn. 
v intervalech ≤ 6 měsíců) pozitivních kontrol vhodné u laborato ří, které 
provádějí zkoušky LLNA pravideln ě (tzn. nejmén ě jednou m ěsíčně) a mají 
k dispozici databázi d řívějších údaj ů pozitivních kontrol, která prokazuje 
schopnost laborato ře získat p ři použití pozitivních kontrol reprodukovatelné 
a přesné výsledky. Odpovídající zb ěhlost v používání metody LLNA lze 
úspěšně prokázat dosažením shodných pozitivních výsledk ů při použití 
pozitivní kontroly alespo ň v 10 nezávislých zkouškách provedených 
během přiměřené doby (tzn. b ěhem mén ě než jednoho roku).  
13. Skupina soub ěžných pozitivních kontrol by se m ěla zařadit vždy, když 
dojde k procedurální zm ěně metody LLNA (nap ř. při změně složení vyško ­
leného personálu, p ři změně materiálů a/nebo činidel či vybavení, jež se 
používají v rámci zkušební metody, nebo p ři změně zdroje pokusných 
zvířat), přičemž takové zm ěny by se m ěly vždy zdokumentovat 
v laboratorních zprávách. P ři určování nezbytnosti vytvo řit novou databázi 
ke zdokumentování shodnosti výsledk ů pozitivních kontrol by se m ěl zvážit 
dopad těchto změn na přiměřenost dosavadní databáze.  
14. Zkoušející by si m ěli uvědomit, že rozhodnutí používat pozitivní kontroly peri ­
odicky namísto soub ěžně má závažné dopady na p řiměřenost a p řijatelnost 
negativních výsledk ů studie získaných bez soub ěžných pozitivních kontrol 
během intervalu mezi jednotlivými periodickými použitími pozitivních kontrol. 
Například obdržení falešn ě negativního výsledku p ři periodickém používání 
pozitivních kontrol m ůže zpochybnit negativní výsledky zkoušené látky získané 
v období mezi poslední p řijatelnou periodickou studií pozitivních kontrol 
a nepřijatelnou periodickou studií pozitivních kontrol. D ůsledky, jež z toho 
vyplývají, je t řeba pečlivě zvážit při rozhodování, zda do zkoumání za řadit 
souběžné pozitivní kontroly, nebo používat pouze periodické pozitivní kontroly. 
Je také nutno vzít v úvahu možnost použít v rámci skupiny soub ěžných pozi ­
tivních kontrol mén ě zvířat, jestliže je to v ědecky opodstatn ěné a jestliže labo ­
ratoř na základ ě svých vlastních dosavadních údaj ů prokáže, že lze používat 
méně myší (12).  
15. Ačkoli by se pozitivní kontroly m ěly zkoušet ve vehikulu, o n ěmž je 
známo, že vždy vyvolává shodnou reakci (nap ř. aceton s olivovým olejem 
v objemovém pom ěru 4:1), mohou nastat ur čité situace, kdy je z d ůvodů 
požadovaných v právních p ředpisech nezbytné provést zkoušku s použitím 
nestandardního vehikula (klinicky/chemicky relevantní složení) (24). Pokud se souběžná pozitivní kontrola zkouší v jiném vehikulu než zkoušená látka, 
měla by být sou částí zkoušky se soub ěžnou pozitivní kontrolou také samo ­
statná kontrola s vehikulem.
 
16. V p řípadech, kdy se hodnotí zkoušené látky, které pat ří do určité třídy 
chemických látek nebo vykazují ur čitou škálu odezev, mohou být užite čné 
také srovnávací látky, jelikož mohou prokázat, že zkušební metoda je 
schopna správn ě zjistit potenciál t ěchto druh ů zkoušených látek vyvolávat 
senzibilizaci k ůže. Vhodné srovnávací látky by m ěly mít tyto vlastnosti:  
— strukturální a funk ční podobnost s t řídou, do níž pat ří zkoušená látka,  
— známé fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— podklady ze zkoušky LLNA,  
— podklady získané p ři použití jiných zví řecích model ů a/nebo lidí.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
ZKUŠEBNÍ POSTUP  
Počet zvířat a dávkování  
17. Na každou dávkovou skupinu se použijí alespo ň čtyři zvířata, přičemž se 
použijí minimáln ě tři koncentrace zkoušené látky, dále se použije soub ěžná 
negativní kontrolní skupina, k jejíž expozici se použije pouze vehikulum zkoušené látky, a pozitivní kontrola (soub ěžná nebo z nedávné jiné zkoušky 
– v závislosti na postupech dané laborato ře při zohledn ění odstavc ů 11–14). 
Mělo by se zvážit zkoušení v ětšího počtu dávek pozitivní kontroly, a to 
zejména v p řípadě, že se pozitivní kontrola nepoužívá soustavn ě. Se zvířaty 
v kontrolních skupinách by se s výjimkou aplikace zkoušené látky m ělo 
zacházet stejn ě jako se zví řaty v exponovaných skupinách.
 
18. Volba dávkování a vehikula by m ěla být založena na doporu čeních uvede ­
ných v literatu ře – (3) a (5). Po sob ě jdoucí dávky se b ěžně vybírají 
z vhodné řady koncentrací, nap říklad 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 
2,5 %, 1 %, 0,5 % atd. Volba této řady koncentrací by m ěla být dostate čně 
vědecky zd ůvodněna. Při výběru tří po sobě jdoucích koncentrací je t řeba 
zvážit veškeré existující toxikologické informace (nap ř. o akutní toxicit ě 
a kožní dráždivosti) a informace o struktu ře a fyzikáln ě-chemických vlast ­
nostech zkoušené látky (a/nebo strukturn ě příbuzných látek), jsou-li 
k dispozici, aby nejvyšší koncentrace maximalizovala expozici, aniž by současně vyvolala systémovou toxicitu a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění 
kůže (3) (25). Nejsou-li takové informace k dispozici, m ůže být nezbytné 
provést úvodní p ředběžnou screeningovou zkoušku (viz odstavce 21–24).
 
19. Vehikulum by nem ělo nepříznivě ovlivňovat ani jinak zkreslovat výsledky 
zkoušky a m ělo by být vybráno tak, aby se maximalizovala rozpustnost 
umožňující dosáhnout nejvyšší možné koncentrace a zárove ň připravit 
roztok nebo suspenzi, jež jsou vhodné pro aplikaci zkoušené látky. K doporu čeným vehikul ům patří aceton s olivovým olejem (v objemovém 
poměru 4:1),  N,N -dimethylformamid, ethyl(methyl)keton, propan-1,2-diol 
a dimethylsulfoxid (19), avšak p ři dostatečném vědeckém zd ůvodnění lze 
použít i jiná vehikula. V ur čitých situacích m ůže být nezbytné použít jako 
doplňující kontrolu klinicky relevantní rozpoušt ědlo nebo komer ční 
přípravek obsahující zkoušenou látku. Zvlášt ě je třeba dbát na to, aby 
byly hydrofilní zkoušené látky zapracovány do takového vehikula, které 
zvlhčí kůži a neste če ihned z pokožky. Toho lze dosáhnout použitím vhod ­
ných solubilizér ů (jako je nap ř. 1 % Pluronic® L92). Není tudíž vhodné 
používat zcela vodná vehikula.
 
20. Zpracování lymfatických uzlin z jednotlivých myší umož ňuje posoudit vari ­
abilitu mezi jednotlivými zví řaty a provést statistické porovnání rozdílu 
mezi hodnotami zkoušené látky a hodnotami nam ěřenými u kontrolní 
skupiny se samotným vehikulem (viz odstavec 35). Krom ě toho je vhodné 
posoudit možnost snížit po čet myší v pozitivní kontrolní skupin ě, když se 
zaznamenávají údaje od jednotlivých zví řat (12). Sb ěr údajů od jednotlivých 
zvířat navíc vyžadují i n ěkteré regula ční orgány. Souhrnné údaje za všechna 
zvířata mohou být nicmén ě některými regula čními orgány považovány za 
přijatelné, p řičemž v takových situacích se mohou uživatelé rozhodnout, zda 
zvolí individuální nebo souhrnné údaje.  
Předběžná screeningová zkouška  
21. Nejsou-li k dispozici informace pro stanovení nejvyšší dávky, která má být 
předmětem zkoušky (viz odstavec 18), m ěla by se provést p ředběžná scre­
eningová zkouška umož ňující vymezit vhodné dávkování, které se bude 
metodou LLNA zkoušet. Ú čelem předběžné screeningové zkoušky je 
poskytnout vodítko pro volbu maximálního dávkování, které se má použít 
v hlavní studii LLNA, pokud nejsou k dispozici informace o koncentraci, která vyvolává systémovou toxicitu (viz odstavec 24) a/nebo nadm ěrné 
lokální podrážd ění kůže (viz odstavec 23). Maximální zkoušenou dávkou 
by mělo být 100 % zkoušené látky v p řípadě kapalin, respektive maximální 
možná koncentrace v p řípadě pevných látek nebo suspenzí.
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Předběžná screeningová zkouška se provádí za stejných podmínek jako 
hlavní studie LLNA až na to, že se nehodnotí proliferace bun ěk 
z lymfatických uzlin a lze použít mén ě zvířat na dávkovou skupinu. 
Navrhuje se po čet jednoho až dvou zví řat na dávkovou skupinu. Všechny 
myši se denn ě pozorují, zda nevykazují klinické p říznaky systémové 
toxicity nebo lokálního podrážd ění v míst ě aplikace. P řed zahájením 
zkoušky a p řed jejím ukon čením (den 6) se zaznamenají hodnoty t ělesné 
hmotnosti zví řat. Na obou uších každé myši se sleduje výskyt erytému, 
který se vyhodnotí podle tabulky 1 (25). Tlouš ťka ucha se zm ěří tloušť­
koměrem (nap ř. digitálním mikrometrem nebo tlouš ťkoměrem s kruhovou 
stupnicí) v den 1 (p řed aplikací první dávky), v den 3 (p řibl. 48 hodin 
po první dávce) a v den 6. Krom ě toho lze v den 6 ur čit tloušťku ucha 
na základ ě stanovení hmotnosti části ucha vyseknuté speciálními klešt ěmi, 
což by se m ělo provád ět až poté, co se zví řata humánn ě usmrtí. 
Známkou nadm ěrného lokálního podrážd ění kůže je zarudnutí ohodnocené 
3 nebo více body a/nebo zvýšení tlouš ťky ucha o 25 % nebo více 
v kterýkoli den m ěření (26) (27). Jako nejvyšší dávka se pro hlavní 
studii LLNA v rámci řady koncentrací zjišt ěných při předběžné screenin ­
gové zkoušce (viz odstavec 18) zvolí nejbližší nižší dávka, která nevy ­
volává systémovou toxicitu a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění kůže. 
Tabulka 1  
Bodové hodnocení erytému  
Pozorované p říznaky Bodové 
ohodnocení  
Žádný erytém 0 
Velmi slabý erytém (sotva patrný) 1 Zřetelně viditelný erytém 2 
Mírný až výrazný erytém 3 Těžký erytém (silné zarudnutí) nebo tvorba p říškvaru 
znemožňující posouzení erytému 4
 
23. Krom ě 25 % zvýšení tlouš ťky ucha (26) (27) se k identifikaci dráždivých 
látek při zkoušce LLNA používá také statisticky významné zvýšení tlou ­ 
šťky ucha u myší ze zkušební skupiny ve srovnání s kontrolními zví řaty 
(28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). A čkoli mohou nastat p řípady statis ­
ticky významného zvýšení, i když se tlouš ťka ucha zvýší o mén ě než 
25 %, nebyly tyto p řípady spojeny výhradn ě s nadměrným podrážd ěním 
(30))32) (33) (34).  
24. O systémové toxicit ě (35) (36) mohou p ři použití v rámci integrovaného 
hodnocení sv ědčit tyto poznatky z klinického pozorování, a tudíž mohou 
indikovat maximální dávku, která by se m ěla použít v hlavní studii LLNA: 
změny fungování nervového systému (nap ř. piloerekce, ataxie, t řes a křeče), 
změny chování (nap ř. agresivita, zm ěna činností týkajících se pé če o srst, 
výrazná zm ěna úrovn ě aktivity), zm ěny způsobů dýchání (tj. zm ěny 
frekvence a intenzity dýchání, nap ř. dušnost, lapání po dechu a chropy) 
a změny v přijímání potravy a vody. P ři hodnocení je navíc nutno brát 
v úvahu známky letargie a/nebo absence reagování, veškeré klinické příznaky více než mírné nebo momentální bolesti či utrpení nebo snížení 
tělesné hmotnosti ode dne 1 do dne 6 o více než 5 % a také úmrtnost. 
Umírající zví řata nebo zví řata, která o čividně trpí bolestí nebo jeví známky 
silného a trvalého utrpení, by se m ěla humánn ě usmrtit 37).
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Harmonogram zkoušek v rámci hlavní studie  
25. Harmonogram zkoušky je následující:  
— Den 1:  Každé zví ře se zváží a zaznamená se jeho hmotnost a jakékoli 
poznatky z klinického pozorování. Na h řbet každého ucha se aplikuje 
25 μl vhodně zředěného roztoku zkoušené látky, samotné vehikulum 
nebo pozitivní kontrola (tu lze provád ět buď souběžně, nebo lze použít 
pozitivní kontrolu z nedávné jiné zkoušky – v závislosti na postupech dané laborato ře při zohledn ění odstavc ů 11–15).
 
— Den 2 a den 3:  Zopakuje se postup aplikace provedený v den 1.  
— Den 4 a den 5:  Žádná aplikace.  
— Den 6:  Zaznamená se hmotnost každého zví řete. Přes ocasní žílu se 
všem pokusným i kontrolním myším vpíchne 250 μl fyziologického 
roztoku ve fosfátovém pufru (PBS) obsahujícího 20 μCi (7,4×10  5 Bq) 
[ 3 H]thymidinu (tritiovaného na methylu). Jinou možností je všem 
myším p řes ocasní žílu vpíchnout 250 μl PBS obsahujícího 2 μCi 
(7,4×10  4 Bq) [  125 I]joddeoxyuridinu a 10  –5 M fluordeoxyuridinu. 
O pět hodin (5 hod.) pozd ěji se zvířata humánn ě usmrtí. U každého 
zvířete se vyjmou lymfatické uzliny drenující aurikulární oblast obou 
uší a zpracují se v PBS (individuální p řístup) nebo se lymfatické uzliny 
vyjmou na obou stranách u všech myší z celé zkušební skupiny a společně se uloží do PBS (p řístup založený na sdružení exponované 
skupiny). Podrobnosti a grafické znázorn ění vyhledání uzlin a jejich 
disekce lze nalézt v literatu ře (12). Pro ú čely dalšího sledování lokální 
kožní reakce v rámci hlavní studie lze do protokolu studie za řadit i další 
parametry, jako je bodové ohodnocení erytému ucha nebo údaje 
o tloušťce ucha (získané bu ď pomocí tlouš ťkoměru, nebo na základ ě 
stanovení hmotnosti části ucha vyseknuté speciálními klešt ěmi při 
pitvě).
 
Příprava bun ěčných suspenzí  
26. Jednobun ěčná suspenze obsahující bu ňky vyňatých lymfatických uzlin 
drenujících oblast obou uší a pocházejících od jednotlivých zví řat nebo 
od celé exponované skupiny se p řipraví jemnou mechanickou deagregací 
přes 200 μm sítko z korozivzdorné oceli nebo jiným p řijatelným postupem 
vytvoření jednobun ěčné suspenze. Bu ňky lymfatických uzlin se dvakrát 
propláchnou v dostate čném množství PBS a jejich DNA se nechá vysrážet 
s 5 % kyselinou trichloroctovou p ři 4 °C po dobu 18 hod. (3). Sediment se 
buď resuspenduje v 1 ml kyseliny trichloroctové a p řemístí do scintila čních 
kyvet obsahujících 10 ml kapalného scintilátoru pro m ěření aktivity  3 H, 
nebo se p řenese přímo do zkumavek pro m ěření aktivity  125 I. 
Stanovení bun ěčné proliferace (inkorporované radioaktivity)  
27. Inkorporace [  3 H]thymidinu se m ěří β-scintilační metodou a vyjad řuje se 
počtem rozpad ů za minutu (DPM). Inkorporace [  125 I]joddeoxyuridinu se 
měří prostřednictvím aktivity  125 I a rovn ěž se vyjad řuje v DPM. 
V závislosti na použitém p řístupu se inkorporace vyjád ří v DPM na zví ře 
(individuální p řístup) nebo v DPM na zkušební skupinu (sdružený p řístup).  
Redukovaná metoda LLNA  
28. V ur čitých situacích, kdy právní p ředpisy vyžadují potvrzení negativní 
predikce potenciálu ur čité chemické látky senzibilizovat k ůži, lze použít 
volitelný protokol zkoušky rLLNA (16) (17) (18) vyžadující menší po čet 
zvířat, pokud se dodrží všechny ostatní specifikace protokolu LLNA 
popsané v této ZM. P řed použitím metody rLLNA je nutno poskytnout 
jednoznačné obecné a v ědecké zd ůvodnění jejího použití. Pokud jsou 
získány pozitivní nebo nejednozna čné výsledky, m ůže být k interpretaci 
nebo objasn ění výsledku nezbytné provést další zkoušky.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Snížení po čtu dávkových skupin je jediný rozdíl mezi protokoly zkušebních 
metod LLNA a rLLNA, a proto zkouška rLLNA neposkytuje informace 
o závislosti odezvy na dávce. Proto by se metoda rLLNA nem ěla používat, 
když je nutno získat informace o závislosti odezvy na dávce. Stejn ě jako při 
vícedávkové zkoušce LLNA by m ěla hodnocená koncentrace látky zkou ­ 
šené metodou rLLNA být maximální koncentrací, která nevyvolává zjevnou 
systémovou toxicitu a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění kůže u myší (viz 
odstavec 18).  
ZÍSKANÉ POZNATKY  
Poznatky z klinického pozorování  
30. Každá myš se jednou denn ě pečlivě vyšetří, zda nevykazuje jakékoli 
klinické p říznaky lokálního podrážd ění v míst ě aplikace nebo p říznaky 
systémové toxicity. Všechny získané poznatky se systematicky zaznamenají, 
přičemž záznamy se vedou zvláš ť za každou myš. Plány sledování by m ěly 
obsahovat kritéria umož ňující rychle identifikovat myši, jež vykazují 
známky systémové toxicity, nadm ěrného lokálního podrážd ění pokožky 
nebo poleptání k ůže, aby mohly být usmrceny (37).  
Hodnoty t ělesné hmotnosti  
31. Jak je uvedeno v odstavci 25, t ělesnou hmotnost jednotlivých zví řat je 
nutno zjistit na za čátku zkoušky a v dob ě plánovaného humánního usmrcení 
zvířete. 
VÝPOČET VÝSLEDK Ů 
32. Výsledky za každou exponovanou skupinu se vyjád ří jako index 
stimulace (SI). P ři individuálním p řístupu se SI stanoví jako podíl pr ůměrné 
hodnoty DPM na zví ře jak u každé exponované skupiny, tak u pozitivní 
kontrolní skupiny, a pr ůměrné hodnoty DPM na zví ře u kontrolní skupiny 
s rozpoušt ědlem/vehikulem. Pr ůměrná hodnota SI u kontrolních skupin 
s vehikulem je pak rovna 1. P ři sdruženém p řístupu se SI stanoví jako 
podíl sdružené inkorporované radioaktivity u jednotlivých exponovaných skupin a sdružené radioaktivity kontrolní skupiny s vehikulem; získá se tak průměrná hodnota SI.
 
33. Výsledek se považuje za pozitivní, když SI ≥ 3. Avšak p ři rozhodování, zda 
prohlásit hrani ční výsledek za pozitivní, lze použít rovn ěž intenzitu odezvy 
na dávku, statistickou významnost a shodnost odezvy p ři použití rozpouš ­
tědla/vehikula a p ři použití pozitivní kontroly (4) (5) (6).  
34. Je-li nezbytné objasnit získané výsledky, m ěla by se v ěnovat pozornost 
různým vlastnostem zkoušené látky v četně toho, zda se její struktura 
podobá struktu ře známých senzibilizátor ů kůže, zda u myší zp ůsobuje 
nadměrné lokální podrážd ění kůže, a také povaze zjišt ěné závislosti odezvy 
na dávce. T ěmito faktory a dalšími a. s.pekty, které je t řeba zvážit, se 
podrobně zabývá literatura (7).  
35. Shromaž ďování údaj ů o radioaktivit ě na úrovni jednotlivých myší umožní 
provést statistickou analýzu, kterou se na základ ě těchto údaj ů zjistí exis ­
tence a míra závislosti odezvy na dávce. P řípadné statistické hodnocení by 
mohlo obsahovat posouzení závislosti odezvy na dávce, jakož i vhodn ě 
upravená srovnání zkušebních skupin (nap ř. skupiny s párov ě srovnávaným 
dávkováním oproti soub ěžné kontrolní skupin ě s vehikulem). Statistické 
analýzy mohou zahrnovat nap ř. lineární regresi nebo Williamsovu zkoušku 
k posouzení trend ů závislosti odezvy na dávce a Dunnettovu zkoušku pro 
párová srovnání. P ři výběru vhodné metody pro statistickou analýzu by si 
měl být zkoušející v ědom možných nestejných odchylek a jiných souvise ­
jících problém ů, které si mohou vyžádat transformaci údaj ů nebo nepara ­
metrickou statistickou analýzu. V každém p řípadě může být nezbytné, aby 
zkoušející provedl výpo čty SI a statistické analýzy jednak za použití ur či­
tých hodnot (n ěkdy ozna čovaných výrazem „odlehlé hodnoty“) a jednak 
bez nich.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
ÚDAJE A VYKAZOVÁNÍ  
Údaje  
36. Údaje by se m ěly shrnout do tabulky. P ři použití individuálního p řístupu se 
uvedou hodnoty DPM získané za jednotlivá zví řata, průměrná hodnota 
DPM na zví ře za celou skupinu, p říslušný chybový výraz (nap ř. směrodatná 
odchylka – SD, sm ěrodatná odchylka pr ůměrných hodnot – SEM) 
a průměrná hodnota SI za každou dávkovou skupinu oproti soub ěžné 
kontrolní skupin ě s vehikulem. P ři použití sdruženého p řístupu se uvedou 
průměrné/mediánové hodnoty DPM a pr ůměrná hodnota SI za každou 
dávkovou skupinu ve srovnání oproti soub ěžné kontrolní skupin ě 
s vehikulem.  
Protokol o zkoušce  
37. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Zkoušené a kontrolní látky:  
— identifika ční údaje (nap ř. číslo CAS a číslo ES, jsou-li k dispozici, 
zdroj, čistota, známé ne čistoty, číslo šarže),  
— skupenství a fyzikáln ě-chemické vlastnosti (nap ř. prchavost, stálost, 
rozpustnost),  
— jedná-li se o sm ěs, je nutno uvést její složení a pom ěrné procentuální 
zastoupení složek.  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— identifika ční údaje ( čistota, pop řípadě koncentrace, použitý objem),  
— zdůvodnění volby vehikula.  
Pokusná zví řata: 
— zdroj myší z kmene CBA,  
— mikrobiologický stav zví řat, je-li znám,  
— počet a věk zvířat, 
— původ zvířat, podmínky chovu, strava atd.  
Zkušební podmínky:  
— podrobnosti o p řípravě a aplikaci zkoušené látky,  
— zdůvodnění volby dávkování (v četně výsledků předběžné screeningové 
zkoušky, pokud byla provedena),  
— použité koncentrace vehikula a zkoušené látky a celkové aplikované 
množství zkoušené látky,  
— podrobnosti o jakosti vody a potravy (v četně druhu/zdroje stravy, zdroje 
vody),  
— podrobnosti o harmonogramech expozice a odb ěru vzorků, 
— metody m ěření toxicity,  
— kritéria pro ozna čení studie za pozitivní nebo negativní,  
— údaje o p řípadných odchylkách od protokolu a vysv ětlení, jakým 
způsobem taková odchylka ovliv ňuje koncepci studie a její výsledky.  
Kontrola spolehlivosti:  
— souhrn výsledk ů nejnovější kontroly spolehlivosti v četně informací 
o použité zkoušené látce, koncentraci a vehikulu,  
— údaje ze soub ěžných a/nebo d řívějších pozitivních nebo negativních 
kontrolních skupin zkoušených v doty čné laborato ři, ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— pokud soub ěžná pozitivní kontrola nebyla sou částí studie, je nutno uvést 
datum a laboratorní zprávu nejnov ější periodické pozitivní kontroly 
a podrobnou zprávu s údaji z d řívějších pozitivních kontrol zkoušených 
v dotyčné laborato ři, které od ůvodňují rozhodnutí neprovád ět souběžné 
pozitivní kontroly.  
Výsledky:  
— hmotnost jednotlivých myší na po čátku aplikace a v dob ě plánovaného 
usmrcení, jakož i pr ůměrná hodnota a p říslušný chybový výraz (nap ř. 
SD, SEM) za každou exponovanou skupinu,  
— u každého zví řete časový pr ůběh nástupu p říznaků toxicity, v četně 
podráždění kůže v míst ě aplikace, pokud k n ěmu dojde,  
— tabulka hodnot DPM a hodnot SI od jednotlivých myší (individuální 
přístup) nebo pr ůměrných/mediánových hodnot (sdružený p řístup) za 
každou exponovanou skupinu,  
— průměrná hodnota DPM na zví ře a příslušný chybový výraz (nap ř. SD, 
SEM) za každou exponovanou skupinu a výsledky analýzy odlehlých 
hodnot za každou exponovanou skupinu p ři použití individuálního 
přístupu,  
— vypočtená hodnota SI a p říslušná míra variability, která zohled ňuje 
variabilitu mezi jednotlivými zví řaty jak z testování zkoušené látky, 
tak z kontrolních skupin p ři použití individuálního p řístupu,  
— závislost odezvy na dávce,  
— případné statistické analýzy.  
Rozbor výsledk ů: 
— stručný komentá ř k výsledk ům, k analýze závislosti odezvy na dávce 
a k případným statistickým analýzám a dále záv ěr, zda se má zkoušená 
látka považovat za senzibilizátor k ůže. 
LITERATURA  
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node a. 
s.say; collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. 
Toxicol ., 30, 165–169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node a. s.say: developments and applications,  Toxicol ., 93, 
13–31.  
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node a. s.say: An interlaboratory exercise,  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53, 563–79.  
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node a. 
s.say: status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999–1002.  
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node a. s.say: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985–997.
 
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327–33.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for a. s.sessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node a. s.say: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins,  Toxicol ., 146, 49–59.
 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node a. s.say: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258–273.
 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node a. s.say: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274–286.
 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node a. s.say: I. The ICCVAM review 
process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249–257.  
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici 
na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna- ps/LLNAPerfStds.pdf].
 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemi ­
cals No 406, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/ env/testguidelines].
 
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. K dispozici na adrese: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281–284.
 
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181–185.
 
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research 
Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre 
for the Validation of Alternative Methods, April 2007. K dispozici na adrese: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525- 1.pdf].
 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis 
Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/].
 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordi ­
nated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ 
llna/llnarep.pdf].
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96.
 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication 
Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, K dispozici na adrese: [http://iccvam. niehs.nih.gov/].
 
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71–89.  
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. K dispozici na adrese: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1 _1,00.html].
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam. 
niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  Toxi­
col. Appl. Pharmacol ., 153, 83–94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245–256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and 
Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60–68.  
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028.  
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing 
of Chemicals No 402, Paris, France. K dispozici na adrese: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, K dispozici na adrese: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acute ­
tox/Tox_workshop.htm].
 
(37) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Dodatek 1  
Standardy funk čnosti k posouzení navrhovaných podobných nebo modifiko ­
vaných zkušebních metod LLNA pro zjiš ťování senzibilizace k ůže 
ÚVOD  
1. Účelem standard ů funkčnosti je stanovit základ, podle n ěhož lze ur čit, zda 
nové zkušební metody, a to jak chrán ěné (chrán ěné autorskými právy, 
chráněné ochrannými známkami, registrované), tak nechrán ěné, mají dosta ­
tečnou přesnost a spolehlivost pro konkrétní zkušební ú čely. Tyto standardy 
funkčnosti, založené na validovaných a uznávaných zkušebních metodách, 
lze používat k hodnocení spolehlivosti a p řesnosti jiných podobných metod 
(hovorově označovaných jako zkoušky typu „me-too“), které jsou založeny 
na podobných v ědeckých zásadách a m ěří nebo predikují tentýž biologický 
nebo toxický ú činek (14).  
2. Před přijetím modifikovaných metod (tzn. navrhovaných možných vylep ­ 
šení schválené zkušební metody) je t řeba provést posouzení, které ur čí 
dopad navrhovaných zm ěn na funk čnost zkoušky a také míru, v jaké tyto 
změny ovlivňují údaje, jež jsou k dispozici pro další složky procesu vali ­
dace. V závislosti na po čtu a povaze navrhovaných zm ěn, na výsledných 
údajích a podkladech pro tyto zm ěny by m ěly být navrhované metody 
podrobeny bu ď témuž procesu validace, jaký je stanoven pro novou 
zkušební metodu, nebo p řípadně omezenému posouzení spolehlivosti 
a relevantnosti za použití stávajících standard ů funkčnosti (14).  
3. Podobné nebo modifikované metody navržené k použití v rámci této ZM by 
měly být za ú čelem zjišt ění jejich spolehlivosti a p řesnosti vyhodnoceny za 
použití chemických látek, které zastupují celou škálu výsledk ů zkoušky 
LLNA. Aby se zabránilo neoprávn ěnému využívání zví řat, důrazně se 
doporučuje, aby vývojoví pracovníci, kte ří model koncipují, konzultovali 
příslušné orgány p řed zahájením valida čních studií v souladu se standardy 
funkčnosti a pokyny uvedenými v této ZM.  
4. Tyto standardy funk čnosti jsou založeny na harmonizovaných standardech 
funkčnosti vypracovaných výborem US-ICCVAM (USA), st řediskem 
EC-ECVAM (EU) a st řediskem JaCVAM (Japonsko) (12) pro posuzování 
validity podobných nebo modifikovaných verzí metody LLNA. Standardy funkčnosti jsou tvo řeny zásadními složkami zkušební metody, doporu če­
nými srovnávacími látkami a požadavky na p řesnost a spolehlivost, jež 
by navrhovaná metoda m ěla splňovat nebo p řevyšovat.
 
I. Zásadní složky zkušební metody  
5. Aby se zajistilo, že podobná nebo modifikovaná metoda LLNA je funk čně 
a mechanicky analogická s metodou LLNA a m ěří tentýž biologický ú činek, 
měl by protokol zkušební metody obsahovat tyto složky:  
— zkoušená látka se myši aplikuje lokáln ě na obě uši, 
— proliferace lymfocyt ů by se m ěla měřit v lymfatických uzlinách drenu ­
jících místo aplikace zkoušené látky,  
— proliferace lymfocyt ů by se m ěla měřit během induk ční fáze senzibili ­
zace kůže, ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— u zkoušených látek by se m ěla nejvyšší zvolená dávka rovnat maximální 
koncentraci, která nevyvolává systémovou toxicitu a/nebo nadm ěrné 
lokální podrážd ění kůže u myší. U pozitivních srovnávacích látek by 
měla být nejvyšší dávka alespo ň tak vysoká jako hodnoty EC3 odpoví ­
dající srovnávací látky pro metodu LLNA (viz tabulka 1), aniž by 
vyvolala systémovou toxicitu a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění 
kůže u myší,  
— v každé studii by m ěly být zahrnuty soub ěžné kontroly s vehikulem 
a případně by se m ěla použít také soub ěžná pozitivní kontrola,  
— na každou dávkovou skupinu by se m ěla použít alespo ň čtyři zvířata, 
— lze shromaž ďovat údaje za jednotlivá zví řata nebo souhrnné údaje.  
Není-li některé z těchto kritérií spln ěno, potom nelze tyto standardy funk č­
nosti k validaci podobné nebo modifikované metody použít.  
II. Minimální seznam srovnávacích látek  
6. Harmonizované standardy funk čnosti vypracované výborem 
US-ICCVAM (USA), st řediskem EC-ECVAM (EU) a st řediskem JaCVAM 
(Japonsko) (12) uvád ějí 18 minimálních srovnávacích látek, které by se 
měly používat, a čtyři volitelné srovnávací látky (tzn. látky, které v rámci 
metody LLNA poskytují bu ď falešně pozitivní nebo falešn ě negativní 
výsledky ve srovnání s výsledky zkoušek na lidech a na mor čatech (podle 
kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD č. 406) (13), a proto umož ňují 
prokázat stejnou nebo lepší funk čnost než metoda LLNA) uvedené ve stan ­
dardech funk čnosti pro metodu LLNA. Kritéria výb ěru pro ur čení těchto 
chemických látek byla následující:  
— srovnávací látky uvedené v seznamu zastupovaly druhy látek, u nichž se 
zpravidla zjiš ťuje jejich potenciál zp ůsobovat senzibilizaci k ůže a řadu 
reakcí, které lze m ěřit nebo predikovat pomocí metody LLNA,  
— látky m ěly jasně definovanou chemickou strukturu,  
— pro každou látku byly k dispozici údaje ze zkoušek na mor čatech za 
použití metody LLNA (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky 
OECD č. 406) (13) a (pokud možno) údaje ze zkoušek na lidech a  
— látky byly snadno dostupné z komer čního zdroje.  
Doporučené srovnávací látky jsou uvedeny v tabulce 1. Studie za použití 
navrhovaných srovnávacích látek by se m ěly hodnotit ve vehikulu, s nímž 
jsou uvedeny v tabulce 1. V situacích, kdy n ěkterá uvedená látka nemusí 
být k dispozici, lze p ři odpovídající zd ůvodnění použít jiné látky, které 
splňují uvedená kritéria výb ěru. ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabulka 1  
Doporučené Srovnávací látky pro standardy FUNK čnosti k metod ě LLNA  
Číslo Chemické látky (  1 ) Číslo CAS Skup. Veh. (  2 ) EC3 (v %) (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Skut. rozsah 
EC3 LLNA vs. M LLNA vs. L  
1 5-chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on (CMI)/2- 
methyl-4-isothiazolin-3-on (MI) (  5 ) 26172-55- 
4/2682-20-4 kap. DMF 0,009 1 0,0045–0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 pev. AOO 0,049 15 0,025–0,099 0,02–0,09 ­
4 +/+ +/+ 
3 benzen-1,4-diamin 106-50-3 pev. AOO 0,11 6 0,055–0,22 0,07–0,16 +/+ +/+ 
4 chlorid kobaltnatý 7646-79-9 pev. DMSO 0,6 2 0,3–1,2 0,4–0,8 +/+ +/+ 
5 isoeugenol 97-54-1 kap. AOO 1,5 47 0,77–3,1 0,5–3,3 +/+ +/+ 
6 2-sulfanylbenzothiazol 149-30-4 pev. DMF 1,7 1 0,85–3,4 NC +/+ +/+ 7 citral 5392-40-5 kap. AOO 9,2 6 4,6–18,3 5,1–13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 kap. AOO 9,7 21 4,8–19,5 4,4–14,7 +/+ +/+ 9 eugenol 97-53-0 kap. AOO 10,1 11 5,05–20,2 4,9–15 +/+ +/+ 
10 fenyl-benzoát 93-99-2 pev. AOO 13,6 3 6,8–27,2 1,2–20 +/+ +/+ 
11 3-fenyl-propan-2-ol 104-54-1 pev. AOO 21 1 10,5–42 NC +/+ +/+ 
12 imidazolidinyl mo čovina 39236-46-9 pev. DMF 24 1 12–48 NC +/+ +/+ 
13 methyl-methakrylát 80-62-6 kap. AOO 90 1 45–100 NC +/+ +/+ 14 chlorbenzen 108-90-7 kap. AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15 propan-2-ol 67-63-0 kap. AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Číslo Chemické látky (  1 ) Číslo CAS Skup. Veh. (  2 ) EC3 (v %) (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Skut. rozsah 
EC3 LLNA vs. M LLNA vs. L  
16 kyselina mlé čná 50-21-5 kap. DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 methyl-salicylát 119-36-8 kap. AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 kyselina salicylová 69-72-7 pev. AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Volitelné látky k prokázání lepší funk čnosti oproti metod ě LLNA 
19 dodecyl sulfát sodný 151-21-3 pev. DMF 8,1 5 4,05–16,2 1.5–17.1 +/– +/– 20 ethylenglykol-dimethakrylát 97-90-5 kap. MEK 28 1 14–56 NC +/– +/+ 21 xylen 1330-20-7 kap. AOO 95,8 1 47,9–100 NC +/ (**) +/– 22 chlorid nikelnatý 7718-54-9 pev. DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Zkratky: AOO = aceton s olivovým olejem (v objemovém pom ěru 4:1); Číslo CAS = Registra ční číslo Chemical Abstracts Service; DMF =  N,N -dimethylformamid; DMSO = dimethylsulfoxid; DNCB = 2,4-dinitrochlorbenzen; 
EC3 = odhadovaná koncentrace pot řebná k dosažení hodnoty 3 indexu stimulace; HCA = 2-benzylidenoktanal; kap. = kapalina; LLNA = výsledek zkoušky s vyšet řením lokálních lymfatických uzlin myší (tzn. podle kapitoly B.6 
nebo zkušební metodiky OECD č. 429) (2); M = výsledek zkoušky na mor čatech (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD č. 406) (13); MEK = ethyl(methyl)keton; NA = nelze použít, nebo ť index stimulace je 
menší než 3; NC = nevypo čítává se, protože údaje byly získány z jediné studie; pev. = pevná látka; Skup. = skupenství; Veh. = zkušební vehikulum. 
(*) Předpokládá se, že nezp ůsobuje senzibilizaci u lidí, protože nebyly zjišt ěny žádné klinické výsledky náplas ťového testu, není obsažen v sad ě zkoušených náplas ťových alergen ů a nebyly zjišt ěny žádné p řípadové zprávy 
o senzibilizaci u lidí. 
(**)Výsledky zkoušek na mor čatech nejsou k dispozici. 
( 1 ) Chemické látky by se m ěly připravovat každý den čerstvé, pokud údaje o stálosti neprokazují p řijatelnost jejich skladování. 
( 2 ) Vzhledem k tomu, že r ůzná vehikula mohou nep říznivě ovlivňovat funk čnost metody LLNA, by se m ělo pro každou srovnávací látku používat doporu čené vehikulum (24) (32). 
( 3 ) Průměrná hodnota, pokud byla k dispozici více než jedna hodnota EC3. U látek s negativním výsledkem (tzn. jejichž hodnota indexu sti mulace je menší než 3; je uvedena nejvyšší zkoušená koncentrace). 
( 4 ) Počet studií LLNA, ze kterých byly získány p říslušné údaje. 
( 5 ) Dostupný na trhu pod názvem Kathon CG ( číslo CAS 55965-84-9), což je sm ěs CMI a MI v pom ěru 3:1. Relativní koncentrace každé složky se pohybují v rozsahu od 1,1 % do 1,25 % (CMI), respektive od 0,3 % do 
0,45 % (MI). Neaktivními složkami jsou ho řečnaté soli (21,5 % až 24 %) a dusi čnan měďnatý (0,15 % až 0,17 %), p řičemž zbytek je tvo řen 74 % až 77 % vody. P řípravek Kathon CG je snadno dostupný od spole čností 
Sigma-Aldrich a Rohm & Haas (nyní Dow Chemical Corporation).
 III. Definované požadavky na spolehlivost a p řesnost  
7. Přesnost podobné nebo modifikované metody LLNA by p ři vyhodnocení za 
pomoci 18 minimálních srovnávacích látek, které se mají používat, m ěla být 
stejná nebo vyšší, než je uvedeno ve standardech funk čnosti metody LLNA. 
Nová nebo modifikovaná metoda by m ěla vést ke správnému zat řídění 
zkoušené látky na základ ě rozhodnutí typu „ano/ne“. Je však možné, že 
za použití nové nebo modifikované metody nebudou správn ě zatříděny 
všechny minimální srovnávací látky, které by se m ěly používat. Pokud by 
byla například chybn ě zatříděna jedna ze slab ě senzibilizujících látek, je 
možno zvážit zd ůvodnění chybného zat řídění a vhodné dopl ňující údaje 
(např. výsledky zkoušek, které zajiš ťují správné zat řídění jiných látek 
s fyzikálními, chemickými a senzibilizujícími vlastnostmi podobnými vlast ­
nostem chybn ě zatříděné srovnávací látky) k prokázání odpovídající funk č­
nosti doty čné metody. Za takových okolností by se stav validace nové nebo 
modifikované zkušební metody LLNA posuzoval p řípad od p řípadu.  
Vnitrolaboratorní reprodukovatelnost  
8. Za ú čelem zjišt ění vnitrolaboratorní reprodukovatelnosti by se m ěla nová 
nebo modifikovaná metoda LLNA posoudit za použití senzibilizující látky, jejíž charakteristiky p ři zkoušce LLNA jsou dob ře popsány. Proto jsou 
standardy funk čnosti metody LLNA založeny na variabilit ě výsledk ů 
z opakovaných zkoušek 2-benzylidenoktanalu (HCA). Pro posouzení vnitro ­
laboratorní spolehlivosti je nutno odvodit hodnoty odhadované prahové koncentrace (ECt) pro HCA p ři čtyřech různých p říležitostech 
s prodlevou alespo ň jednoho týdne mezi jednotlivými zkouškami. P řija­
telnou vnitrolaboratorní reprodukovatelnost indikuje schopnost laborato ře 
získat v každé zkoušce HCA hodnoty ECt v rozmezí od 5 % do 20 %, což představuje rozsah poloviny až dvojnásobku pr ůměrné hodnoty EC3 
stanovené pro HCA (10 %) p ři použití metody LLNA (viz tabulka 1).
 
Mezilaboratorní reprodukovatelnost  
9. Mezilaboratorní reprodukovatelnost nové nebo modifikované metody LLNA by 
se měla posoudit za použití dvou senzibilizujících látek, jejichž charakteristiky 
při zkoušce LLNA jsou dob ře popsány. Standardy funk čnosti metody LLNA 
jsou založeny na variabilit ě výsledk ů zkoušek HCA a 1-chlor-2,4- 
dinitrochlorbenzenu (DNCB) v r ůzných laborato řích. Hodnoty ECt by m ěly 
být odvozeny nezávisle na základ ě jedné studie provedené nejmén ě ve třech 
různých laborato řích. Aby byla prokázána p řijatelná mezilaboratorní reprodu ­
kovatelnost, m ěla by každá laborato ř získat hodnoty ECt v rozsahu od 5 % do 
20 % pro HCA a v rozsahu od 0,025 % do 0,1 % pro DNCB, což p ředstavuje 
rozsah poloviny až dvojnásobku pr ůměrné hodnoty koncentrací EC3 stanovené 
pro HCA (10 %) a DNCB (0,05 %), p ři použití metody LLNA (viz tabulka 1).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
Dodatek 2  
Definice  
Přesnost:  Blízkost shody mezi výsledky zkušební metody a uznávanými referen ­ 
čními hodnotami. Je to míra funk čnosti zkušební metody a jeden z aspekt ů její 
relevantnosti. Tento výraz se často používá namísto výrazu „soulad“ a rozumí se 
jím podíl správných výsledk ů zkušební metody (14).  
Srovnávací látka:  Senzibilizující nebo nesenzibilizující látka použitá jako stan ­
dard pro srovnání se zkoušenou látkou. Srovnávací látka by m ěla mít tyto vlast ­
nosti: i) konzistentní a spolehlivý zdroj (konzistentní a spolehlivé zdroje); ii) 
strukturální a funk ční podobnost s t řídou zkoušených látek; iii) známé fyzi ­
kálně-chemické vlastnosti; iv) podklady o známých ú čincích a v) známá ú činnost 
v rozsahu žádoucí odezvy.  
Odhadovaná prahová koncentrace (ECt):  Odhadovaná koncentrace zkoušené 
látky pot řebná pro dosažení takové hodnoty indexu stimulace, která sv ědčí 
o pozitivní odezv ě. 
Odhadovaná koncentrace t ři (EC3):  Odhadovaná koncentrace zkoušené látky 
potřebné pro dosažení hodnoty t ři indexu stimulace.  
Falešně negativní:  Zkoušená látka je zkušební metodou nesprávn ě označena za 
negativní nebo neaktivní, a čkoli ve skute čnosti je pozitivní nebo aktivní.  
Falešně pozitivní:  Zkoušená látka je zkušební metodou nesprávn ě označena za 
pozitivní nebo aktivní, a čkoli ve skute čnosti je negativní nebo neaktivní.  
Nebezpečnost:  Potenciál látky p ůsobit nep říznivě na zdraví nebo životní 
prostředí. Nepříznivý účinek se projevuje pouze p ři dostatečné úrovni expozice.  
Mezilaboratorní reprodukovatelnost:  Míra, v jaké mohou r ůzné kvalifikované 
laboratoře za použití stejného protokolu a p ři testování stejných zkoušených 
látek získat kvalitativn ě a kvantitativn ě podobné výsledky. Mezilaboratorní repro ­
dukovatelnost se ur čuje během předvalidačních a valida čních postup ů a ukazuje, 
do jaké míry lze zkoušku úsp ěšně přenášet mezi r ůznými laborato řemi (14).  
Vnitrolaboratorní reprodukovatelnost:  Určení míry, v jaké m ůže kvalifikovaný 
personál ve stejné laborato ři jindy úsp ěšně dosáhnout stejných výsledk ů za 
použití ur čitého protokolu.  
Zkouška typu „me-too“:  Hovorový výraz pro zkušební metodu, která je struktu ­
rálně a funkčně podobná validované a uznávané referen ční zkušební metod ě. 
Taková zkušební metoda by byla kandidátem pro dodate čnou validaci. Používá 
se namísto podobné zkušební metody (14).  
Odlehlá hodnota:  Odlehlá hodnota je poznatek, který se výrazn ě liší od ostatních 
hodnot v náhodném vzorku od celé populace.  
Standardy funk čnosti:  Standardy založené na validované referen ční metod ě, 
které slouží jako základ pro hodnocení srovnatelnosti navrhované zkušební 
metody, která je funk čně a mechanicky podobná. Pat ří mezi n ě i) zásadní 
složky zkušební metody, i) minimální seznam srovnávacích látek vybraných z chemických látek používaných k prokázání p řijatelné funk čnosti validované 
referenční metody a iii) srovnatelné hladiny p řesnosti a spolehlivosti založené 
na hodnotách získaných u validované referen ční metody, jež by navrhovaná 
zkušební metoda m ěla prokázat p ři vyhodnocení za použití minimálního 
seznamu srovnávacích látek (14).
 
Chráněná zkušební metoda:  Zkušební metoda, u níž je výroba a distribuce 
omezena patenty, autorskými právy, ochrannými známkami apod.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Prokazování kvality:  Řídicí proces, v jehož rámci se hodnotí dodržování zkušeb ­
ních norem a standard ů laborato ře, příslušných požadavk ů a postup ů vedení 
záznamů, jakož i p řesnost přenosu údaj ů, přičemž tyto prvky jsou hodnoceny 
osobami, které jsou nezávislé na pracovnících, kte ří zkoušky provád ějí. 
Srovnávací látky:  Chemické látky zvolené k použití p ři procesu validace, pro n ěž 
jsou již známy odezvy v rámci zkušebního systému  in vitro  nebo  in vivo  nebo 
odezvy u biologického druhu, který je p ředmětem zájmu daného zkoumání. Tyto 
chemické látky by m ěly být reprezentativními zástupci t říd chemických látek, 
u nichž se p ředpokládá používání doty čné zkušební metody, a m ěly by před­
stavovat celou škálu reakcí, jež lze o čekávat u chemických látek, pro n ěž se 
může zkušební metoda používat, od silné p řes slabou až po negativní odezvu. 
Pro jednotlivé fáze procesu validace a pro r ůzné zkušební metody a r ůzná použití 
zkoušek mohou být pot řebné rozdílné sady srovnávacích látek (14).  
Relevantnost:  Popis vztahu zkoušky k ú činku, který je p ředmětem zájmu, a také 
toho, zda je zkouška smysluplná a použitelná pro konkrétní ú čel. Vyjad řuje, do 
jaké míry zkouška správn ě měří nebo predikuje biologický ú činek, který je 
předmětem zájmu. Relevantnost zahrnuje také posouzení p řesnosti (shody) 
zkušební metody (14).  
Spolehlivost:  Míra, v jaké lze zkušební metodu provád ět reprodukovateln ě 
v rámci téže laborato ře i v rámci r ůzných laborato ří v průběhu doby, jestliže 
se provádí za použití stejného protokolu. Hodnotí se na základ ě výpočtu vnitro­
laboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti (14).  
Senzibilizace k ůže: Imunologický proces, který nastává, když je vnímavá osoba 
vystavena místn ě aplikovanému chemickému alergenu, který vyvolává kožní 
imunitní odezvu, jež m ůže vést ke vzniku kontaktní senzibilizace.  
Index stimulace (SI):  Hodnota vypo čtená za ú čelem posouzení potenciálu zkou ­ 
šené látky vyvolat senzibilizaci k ůže. Vyjad řuje poměr hodnoty proliferace 
u exponovaných skupin k hodnot ě proliferace u soub ěžné kontrolní skupiny 
s vehikulem.  
Zkoušená látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs, která se zkouší za použití této 
zkušební metody.  
Validovaná zkušební metoda:  Zkušební metoda, u níž byly provedeny valida ční 
studie k ur čení její relevantnosti (v četně přesnosti) a spolehlivosti pro konkrétní 
účel. Je důležité si uv ědomit, že validovaná zkušební metoda nemusí mít dosta ­
tečnou funk čnost, pokud jde o p řesnost a spolehlivost, aby mohla být shledána 
přijatelnou pro navrhovaný ú čel (14).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43  ZKOUŠKA NEUROTOXICITY NA HLODAVCÍCH  
1. METODA  
Tato metoda je rovnocenná metod ě OECD TG 424 (1997).  
Tato zkušební metoda byla navržena za ú čelem získání informací, 
které jsou nezbytné ke schválení nebo k další charakterizaci poten ­
ciální neurotoxicity chemických látek u dosp ělých zvířat. Tuto 
metodu lze bu ď kombinovat s již existujícími zkušebními metodami 
pro studium toxicity po opakovaných dávkách, nebo ji lze provést 
jako samostatnou zkoušku. Pro usnadn ění plánování studií založe ­
ných na této zkušební metod ě se doporu čuje prostudovat Doporu čení 
OECD o strategiích a metodách zkoušení neurotoxicity (Neurotoxi ­
city Testing Strategies and Methods) (1). To je zvlášt ě důležité 
tehdy, je-li t řeba zvážit zm ěnu sledování a zkušebních postup ů, jak 
jsou doporu čeny pro rutinní používání této metody. Doporu čení byla 
připravena pro usnadn ění výběru zkušebních postup ů pro specifické 
podmínky použití.  
Posouzení vývojové neurotoxicity není p ředmětem této metody.  
1.1 ÚVOD  
Při posuzování a vyhodnocování toxických vlastností chemických 
látek je velmi d ůležité zvážit potenciál neurotoxických ú činků. Již 
metoda zkoušení systémové toxicity po opakovaných dávkách zahrnuje sledování, která mají odkrýt potenciální neurotoxicitu. Tuto zkušební metodu lze používat p ři plánování studie za ú čelem 
získání dalších informací o neurotoxických ú čincích zjišt ěných při 
studii systémové toxicity po opakovaných dávkách, nebo pro jejich potvrzení. Z úvah o potenciální neurotoxicit ě určitých druh ů chemic­
kých látek však m ůže vyplynout, že by mohly být vhodn ěji posou­
zeny pomocí této metody, pokud neexistují údaje o potenciální 
neurotoxicit ě ze studií systémové toxicity po opakovaných dávkách. 
Tyto úvahy zahrnují nap říklad:
 
— pozorování neurologických p říznaků nebo neuropatologických 
lézí v jiných studiích toxicity než studiích systémové toxicity 
po opakovaných dávkách, nebo  
— strukturní podobnost nebo jiné informace, které posuzovanou 
látku spojují se známými neurotoxickými látkami.  
Kromě toho mohou existovat i další p řípady, kdy je použití této 
metody vhodné; další podrobnosti jsou uvedeny v literatu ře (1).  
Tato metoda byla navržena tak, aby ji bylo možné p řizpůsobit 
zvláštním pot řebám při potvrzování specifické histopatologické 
a behaviorální neurotoxicity chemických látek a p ři charakterizaci 
a kvantifikaci neurotoxických ú činků. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Dříve se za neurotoxicitu považovaly neuropatie zahrnující neuro ­
patologické léze nebo neurologické dysfunkce, jako nap ř. záchvaty, 
ochrnutí nebo t řes. I když jsou neuropatie významným projevem 
neurotoxicity, dnes je již jasné, že existují mnohé další p říznaky 
toxicity pro nervový systém (nap ř. ztráta motorické koordinace, 
senzorické výpadky, poruchy u čení a pam ěti), které se nemusí 
projevovat ani neuropatií, ani v jiných typech zkoušek.  
Tato metoda zkoušení neurotoxicity je navržena tak, aby odhalovala 
závažné neurobehaviorální a neuropatologické ú činky na dosp ělé 
hlodavce. Zatímco behaviorální ú činky i při nepřítomnosti morfolo ­
gických zm ěn mohou odrážet nep říznivý vliv na organismus, nezna ­
mená to, že všechny behaviorální zm ěny jsou specifické pro nervový 
systém. Z tohoto d ůvodu by se m ěly jakékoliv zjišt ěné změny 
vyhodnotit v souvislosti s histopatologickými, hematologickými nebo biochemickými údaji, jakož i s údaji o ostatních typech systé ­
mové nervové toxicity. Zkoušení požadované v této metod ě za 
účelem charakterizace a kvantifikace neurotoxických odpov ědí 
zahrnuje specifické histopatologické a behaviorální postupy, které lze navíc podpo řit elektrofyziologickým a/nebo biochemickým 
vyšetřením (1, 2, 3, 4).
 
Neurotoxické látky mohou p ůsobit na množství cílových struktur 
v rámci nervového systému a prost řednictvím r ůzných mechanism ů. 
Protože neexistuje jediná sada zkoušek pro posouzení neurotoxic ­
kého potenciálu u všech látek, m ůže být nezbytné využít dalších 
zkoušek  in vivo  nebo  in vitro , které jsou specifické pro typ pozoro ­
vané nebo o čekávané neurotoxicity.  
Tuto zkušební metodu lze použít také spole čně s doporu čeními 
OECD o strategiích a metodách testování neurotoxicity (OECD 
Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods) (1) p ři plánování zkoušek ur čených k další charakterizaci 
nebo zvýšení citlivosti kvantifikace vztahu dávka-odezva s cílem 
lépe odhadnout úrove ň nevyvolávající pozorovatelné nep říznivé 
účinky, anebo potvrdit známá nebo o čekávaná rizika chemických 
látek. Lze nap říklad navrhnout zkoušky, které by identifikovaly 
a zhodnotily neurotoxický mechanismus (neurotoxické mechanismy) 
nebo doplnily údaje, které již byly získány základními neurobehavi ­
orálními a neuropatologickými vyšet řovacími postupy. Takové studie 
nemusí replikovat údaje použitím standardních postup ů doporuče­
ných v této metod ě, jsou-li takové údaje již k dispozici 
a nepovažují se za nezbytné k interpretaci výsledk ů z této studie.
 
Používá-li se tato zkouška neurotoxicity samotná nebo v kombinaci, 
poskytuje informace, které mohou:  
— určit, zda zkoušené chemické látky ovliv ňují nervový systém 
trvale, nebo vratn ě, 
— přispět k charakterizaci zm ěn nervového systému spojených 
s expozicí chemické látce a p řispět k pochopení mechanism ů 
účinku, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— stanovit vztahy mezi dávkou a odezvou a časem a odezvou 
s cílem odhadnout úrove ň nevyvolávající pozorovatelné nep ří­
znivé účinky (NOAEL) (kterou lze použít pro vytvo ření bezpe č­
nostních kritérií pro chemickou látku).  
Tato zkušební metoda používá orální aplikaci zkušební látky. Jiné 
typy aplikace (nap ř. kožní nebo inhala ční) mohou být vhodn ější 
a mohou si také vyžádat modifikaci doporu čovaných postup ů. 
Výběr způsobu aplikace závisí na zp ůsobu expozice člověka a na 
dostupných toxikologických nebo kinetických informacích.  
1.2 DEFINICE  
Nepříznivý ú činek:  jakákoliv zm ěna spojená s aplikací, která 
snižuje schopnost organismu p řežít, rozmnožovat se nebo p řizpůsobit 
prostředí. 
Dávka:  množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjad řuje jako 
hmotnost zkoušené látky (v gramech nebo miligramech) nebo jako 
hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zví řete 
(např. v miligramech na kilogram t ělesné hmotnosti) nebo jako 
konstantní koncentrace v potrav ě (v ppm nebo v miligramech na 
kilogram potravy).  
Dávkování:  obecný termín zahrnující dávku, četnost a trvání podá ­
vání látky.  
Neurotoxicita:  nepříznivá zm ěna struktury nebo funkce nervového 
systému, která je výsledkem expozice chemickému, biologickému 
nebo fyzikálnímu činiteli.  
Neurotoxické agens:  jakýkoliv chemický, biologický nebo fyzikální 
činitel, který má neurotoxický potenciál.  
NOAEL:  zkratka pro hladinu bez pozorovaného nep říznivého 
účinku; odpovídá nejvyšší úrovni dávky nebo expozice, p ři které 
nejsou pozorovány žádné nep říznivé nálezy související s podáním 
látky.  
1.3 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkoušená chemická látka se podává oráln ě v různých dávkách n ěko­
lika skupinám laboratorních hlodavc ů. Obvykle se vyžaduje podá ­
vání opakovaných dávek a dávkovací režim m ůže být bu ď 28denní, 
nebo subchronický (90 dn ů), nebo chronický (1 rok nebo déle). 
Postupy stanovené v této zkušební metod ě lze použít i p ři studii 
akutní neurotoxicity. Zví řata jsou testována za ú čelem zjišt ění nebo 
charakterizace behaviorálních a/nebo neurologických odchylek. 
Během každého pozorovacího období se hodnotí řada znak ů 
chování, které by mohly být ovlivn ěny neurotoxickými látkami. Na 
konci zkoušky se u podskupiny zví řat obou pohlaví z každé skupiny 
provede perfuze  in situ  a připraví se a vyšet ří řezy mozku, míchy 
a periferních nerv ů. 
Pokud se zkouška provádí jako samostatná zkouška pro vyšet ření 
neurotoxicity nebo charakterizaci neurotoxických ú činků, lze zvířata 
z každé skupiny, která nebyla použita k perfuzi a k následnému 
histopatologickému vyšet ření (viz tabulka 1), použít ke specifickým 
neurobehaviorálním, neuropatologickými, neurochemickým nebo elektrofyziologickým vyšet řením, která mohou doplnit údaje získané 
ze standardních vyšet ření vyžadovaných v této metod ě (1). Tyto 
doplňující postupy mohou být zvlášt ě užitečné tehdy, jestliže empi ­
rická pozorování nebo p ředpokládané ú činky nazna čují specifický 
typ nebo cílovou strukturu neurotoxicity chemické látky. Zbývající zvířata lze případně použít k n ěkterým jiným hodnocením, jako jsou 
např. hodnocení požadovaná ve zkušebních metodách u studií toxi ­
city po opakovaných dávkách na hlodavcích.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Pokud se postupy této zkušební metody kombinují s postupy jiných 
zkušebních metod, je nezbytný dostate čný počet zvířat, aby byly 
splněny požadavky pro pozorování v obou studiích.  
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Výb ěr živočišných druh ů 
Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, s odpovídajícím 
zdůvodnění lze použít i jiné druhy hlodavc ů. Mělo by se jednat 
o běžně používané laboratorní kmeny mladých zdravých dosp ělých 
zvířat. Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. Podávání látky 
by mělo začít co nejd říve po odstavení, nejlépe když zví řata 
dosáhnou stá ří šesti týdn ů a v každém p řípadě dříve, než dosáhnou 
stáří devíti týdn ů. Pokud se však tato zkouška kombinuje s dalšími 
zkouškami, je možné, že požadavky týkající se stá ří zvířat budou 
vyžadovat ur čité změny. Na za čátku studie by m ěl být 
u používaných zví řat jen minimální rozptyl hmotnosti a nem ěl by 
překročit 20 % pr ůměrné hmotnosti u jednotlivých pohlaví. Pokud se 
před dlouhodobou studií provádí orienta ční krátkodobá studie toxi ­
city po opakovaných dávkách, je t řeba u obou studií použít pokusná 
zvířata ze stejných kmen ů a stejného zdroje.  
1.4.2  Podmínky chovu a krmení  
Teplota v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22  o C (± 3  o C), 
relativní vlhkost vzduchu by m ěla být minimáln ě 30 % a pokud 
možno nep řesáhnout 70 %, krom ě doby úklidu místnosti, cílem by 
měla být hodnota 50–60 %. Osv ětlení bude um ělé se střídáním 12 
hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konven ční labo­
ratorní stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. Na výb ěr stravy 
může mít vliv nutnost zajistit vhodnou p řísadu pro zkoušenou látku, 
je-li látka podávána touto metodou. Zví řata lze chovat jednotliv ě, 
anebo je lze umístit v klecích v malých skupinkách zví řat stejného 
pohlaví.  
1.4.3  Příprava zví řat 
Zdravá mladá zví řata jsou náhodn ě rozdělena do experimentálních 
a kontrolních skupin. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby byl 
vliv umíst ění klecí minimalizován. Jednotlivá zví řata se jednozna čně 
identifikují a umístí se do klecí nejmén ě pět dnů před začátkem 
studie, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky.  
1.4.4  Zp ůsob aplikace a p říprava dávek  
V této zkušební metod ě se jedná konkrétn ě o orální zp ůsob aplikace 
zkoušené látky. Orální aplikaci lze provád ět prostřednictvím 
žaludeční sondy, potravy, pitné vody nebo tobolek. Použít lze 
i jiné zp ůsoby aplikace (nap ř. kožní nebo inhala ční), které si 
mohou vyžádat modifikaci doporu čených postup ů. Výběr způsobu 
aplikace závisí na zp ůsobu expozice člověka a na dostupných toxi ­
kologických nebo kinetických informacích. Je t řeba uvést d ůvody 
pro výběr způsobu aplikace a odpovídající modifikace postup ů 
v rámci této zkušební metody.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Zkoušená látka se podle pot řeby rozpustí nebo suspenduje ve 
vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporu čuje se zvážit použití 
vodného roztoku/suspense, potom použití roztoku/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku/suspenze v jiném vehi ­
kulu. Je t řeba znát toxické vlastnosti vehikula. Krom ě toho je t řeba 
věnovat pozornost následujícím typickým znak ům vehikula: ú činku 
na absorpci, distribuci, metabolismus nebo retenci zkoušené látky a dále účinku na chemické vlastnosti zkoušené látky, které mohou 
pozměnit její toxické charakteristiky, a ú činku na spot řebu potravy 
nebo vody anebo nutri ční stav zví řat.
 
1.5 POSTUPY  
1.5.1  Po čet a pohlaví zví řat 
Pokud se studie provádí jako samostatná studie, je t řeba použít 
v každé dávkové a kontrolní skupin ě alespoň 20 zvířat (10 samic 
a 10 samc ů) pro vyhodnocení podrobných klinických a funk čních 
pozorování. Alespo ň u pěti samců a pěti samic vybraných z t ěchto 
deseti samc ů a samic je t řeba na konci zkoušky provést perfúzi  in 
situ a použít je k podrobnému neurohistopatologickému vyšet ření.V 
případě, kdy jsou v dané dávkové skupin ě pozorovány p říznaky 
neurotoxických ú činků pouze u omezeného po čtu zvířat, je třeba 
zvážit přiřazení těchto zvířat ke zví řatům vybraným pro perfúzi. 
Pokud se studie provádí v kombinaci se studií toxicity po opakova ­
ných dávkách, je t řeba použít odpovídající po čet zvířat, aby bylo 
možné splnit cíle obou studií. Minimální po čet zvířat na skupinu 
u nejrůznějších kombinací studií je uveden v tabulce 1. Pokud se 
plánuje utracení ve vložených intervalech nebo vytvo ření repara ční 
skupiny ke sledování vratných ú činků, perzistence nebo zpožd ěného 
výskytu toxických ú činků po skon čení aplikace, nebo se zvažují 
dodatečná sledování, je t řeba zvýšit po čet zvířat, aby se zajistil 
dostatečný počet zvířat požadovaných ke sledování a k histopatolo ­
gickému vyšet ření. 
1.5.2  Experimentální a kontrolní skupina  
Obecně by měly být použity nejmén ě tři experimentální a jedna 
kontrolní skupina; pokud se však podle jiných údaj ů neočekávají 
žádné účinky po opakovaných dávkách 1 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti na den, m ůže být provedena limitní zkouška. Nejsou-li 
k dispozici žádné vhodné údaje, m ůže být provedena p ředběžná 
studie pro stanovení rozp ětí dávek, které mají být použity. 
S výjimkou aplikace zkoušené látky je t řeba se zví řaty v kontrolní 
skupině zacházet stejným zp ůsobem jako se zví řaty v experimentální 
skupině. Pokud se p ři podávání zkoušené látky používá vehikulum, 
podává se kontrolní skupin ě v nejvyšším použitém objemu.  
1.5.3  Kontrola spolehlivosti  
Laboratoř provádějící zkoušku by m ěla předložit údaje prokazující 
její způsobilost pro uskute čnění zkoušky a citlivost používaných 
postupů. Takové údaje by m ěly poskytnout d ůkaz o schopnosti 
odhalit a pop řípadě kvantifikovat zm ěny v různých ukazatelích 
doporučených ke sledování, jako jsou nap ř. vegetativní p říznaky, 
reaktivita na smyslové podn ěty, síla úchopu a motorická aktivita. 
Informace o chemických látkách, které zp ůsobují různé typy neuroto ­
xických reakcí a které jsou vhodné jako pozitivní kontrolní látky, lze 
nalézt v literatu ře (2 až 9). Historické údaje lze použít tehdy, pokud 
zůstanou stejné základní aspekty experimentálních postup ů. Doporu­ 
čuje se pravidelná aktualizace historických údaj ů. Nové kontrolní 
údaje by m ěly být dopln ěny tehdy, pokud provád ějící laborato ř 
v průběhu zkoušky zm ění některý základní prvek provád ění zkoušky 
nebo postupu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4  Výb ěr dávky  
Úrovně dávek je t řeba vybrat s ohledem na p ředchozí zjišt ěnou 
toxicitu a kinetické údaje dostupné pro zkoušenou slou čeninu nebo 
podobné látky. Nejvyšší úrove ň dávky se zvolí tak, aby vyvolala 
neurotoxické nebo jasné systémové toxické ú činky, aby bylo 
možné prokázat závislost odpov ědi na dávkách a úrove ň dávky 
bez pozorovatelného nep říznivého ú činku (NOAEL), zvolí se 
sestupná posloupnost úrovní dávek. V zásad ě je třeba stanovit 
úrovně dávek tak, aby bylo možné odlišit primární toxické ú činky 
na nervový systém od systémové toxicity. Obvykle jsou optimální dva až t ři intervaly a často je vhodn ější přidání čtvrté zkušební 
skupiny než používání velkých interval ů mezi jednotlivými dávkami 
(např. lišících se faktorem 10). Rovn ěž je třeba vzít v úvahu i odhad 
úrovně expozice u člověka, je-li k dispozici.
 
1.5.5  Limitní zkouška  
Pokud zkouška provedená podle postup ů popsaných v této studii p ři 
jedné dávce nejmén ě 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti na den nevy ­
volá pozorovatelné neurotoxické ú činky a pokud se na základ ě údajů 
o látkách s podobnou strukturou nep ředpokládá toxicita, není 
nezbytné provád ět kompletní studii za použití t ří úrovní dávek. 
V některých p řípadech p ředpokládaná expozice u člověka si vyžádá 
použití vyšší orální dávky v limitní zkoušce. U dalších zp ůsobů 
podávání látky, jako je inhala ční nebo kožní aplikace, m ůže být 
maximální dosažitelná úrove ň expozice dána fyzikáln ě-chemickými 
vlastnostmi zkoušené látky. P ři provedení orální akutní zkoušky by 
dávka pro limitní zkoušku m ěla činit alespo ň 2 000 mg/kg.  
1.5.6  Aplikace dávek  
Zkoušená látka se podává zví řatům denně, 7 dnů v týdnu, po dobu 
alespoň 28 dnů. Použití 5denního dávkovacího režimu nebo kratší 
expozice je t řeba zdůvodnit. Je-li látka podávána prost řednictvím 
žaludeční sondy, m ěla by se podávat v jedné dávce pomocí sondy 
nebo vhodné intuba ční kanyly. Maximální množství tekutiny, které 
lze jednorázov ě podat, závisí na velikosti pokusného zví řete. Objem 
by neměl překročit 1 ml/100 g t ělesné hmotnosti. V p řípadě vodných 
roztoků je však možné zvážit i použití až 2 ml/100 g t ělesné hmot ­
nosti. Krom ě dráždivých nebo žíravých látek, které p ři vyšších 
koncentracích obvykle vyvolají siln ější účinky, by se m ěly změny 
množství zkoušené látky minimalizovat upravením koncentrace, aby se na všech úrovních dávek zajistilo konstantní množství.
 
U látek podávaných prost řednictvím potravy nebo pitné vody je 
důležité zajistit, aby množství použité zkoušené látky neovlivnilo 
vyváženost b ěžné potravy nebo p říjmu vody. Je-li zkoušená látka 
podávána v potrav ě, je třeba používat bu ď konstantní koncentraci 
v potrav ě (v ppm), nebo konstantní úrovn ě dávky, pokud jde 
o tělesnou hmotnost zví řete. Použití jiné alternativy je t řeba zdůvod­
nit. U látky podávané prost řednictvím žalude ční sondy je t řeba 
dávku podávat každý den p řibližně ve stejnou dobu a alespo ň jednou 
týdně ji přizpůsobit tak, aby se udržela konstantní úrove ň dávky 
vzhledem k t ělesné hmotnosti zví řete. Provádí-li se studie 
s opakovanou dávkou jako p ředběžná studie pro dlouhodobou studii, 
měla by být v obou studiích používána stejná potrava. Nelze-li 
v případě studie akutní toxicity použít jednotlivou dávku, je možné 
podávat dávku po menších částech po dobu, která nep řekročí 24 
hodin.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6 POZOROVÁNÍ  
1.6.1  Četnost pozorování a zkoušek  
U studií s opakovanou dávkou by doba pozorování m ěla pokrýt celé 
dávkovací období. U studií akutní toxicity pokra čuje pozorování 
ještě 14 dnů po skončení aplikace. U zví řat v satelitních skupinách, 
která jsou v období po skon čení aplikace chována bez expozice, by 
pozorování m ělo zahrnovat i toto období.  
Pozorování je t řeba provád ět dostatečně často, aby se maximalizo ­
vala pravd ěpodobnost odhalení všech behaviorálních a/nebo neuro ­
logických anomálií. Pozorování se provádí denn ě, pokud možno ve 
stejnou dobu a s p řihlédnutím k dob ě očekávaného maxima ú činku 
po podání látky. Četnost klinických pozorování a funk čních zkoušek 
je shrnuta v tabulce 2. Pokud kinetické nebo jiné údaje získané z předchozích studií nazna čují potřebu zvolit časové body pozoro ­
vání nebo zkoušek nebo období po skon čení pozorování, je nutné 
zvolit takový náhradní plán, na jehož základ ě lze získat co nejvíce 
informací. Zm ěny plánu je t řeba zdůvodnit.
 
1.6.1.1  Pozorování celkového zdravotního stavu a úmrtnosti/nemocnosti  
U všech zví řat se alespo ň jednou denn ě pečlivě zkontroluje jejich 
zdravotní stav a nejmén ě dvakrát denn ě se provede prohlídka všech 
zvířat za účelem zjišt ění nemocnosti a úmrtnosti.  
1.6.1.2  Podrobná klinická pozorování  
Podrobná klinická pozorování se provedou u všech zví řat vybraných 
k těmto účelům (viz tabulka 1) nejprve p řed první expozicí (aby bylo 
možné intraindividuální srovnání) a poté v r ůzných intervalech podle 
trvání studie (viz tabulka 2). Podrobná klinická pozorování u satelitních zotavovacích skupin se provedou na konci zotavovacího období. Podrobná klinická pozorování se provád ějí mimo chovnou 
klec ve standardním pozorovacím prostoru. Pozorování se pe člivě 
zaznamenají pomocí systém ů hodnocení, které zahrnují kritéria 
nebo bodovací stupnice pro jednotlivá m ěření v rámci pozorování. 
Používaná kritéria nebo stupnice musí být explicitn ě definovány 
zkušební laborato ří. Je třeba dbát na to, aby byly rozdíly ve zkušeb ­
ních podmínkách co nejmenší (a nesouvisely systematicky s aplikací) a aby vyšet ření provád ěly osoby, které nejsou informovány 
o skupině, do které zví ře patří.
 
Doporučuje se provád ět pozorování strukturovan ě, přičemž se 
u každého zví řete při každém pozorování systematicky používají 
jasně definovaná kritéria (v četně definice normálního „rozp ětí“). 
„Normální rozp ětí“ je třeba dostate čně zdokumentovat. Všechny 
pozorované p říznaky se zaznamenají. Je-li to možné, zaznamená se 
rovněž závažnost pozorovaných p říznaků. Klinická pozorování 
zahrnují krom ě jiného zm ěny kůže, srsti, o čí a sliznic, výskyt sekret ů 
a exkretů a autonomních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic, 
nezvyklý pr ůběh dýchání a/nebo dýchání ústy, nezvyklé p říznaky 
močení nebo defekace a zbarvení mo či). ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Zaznamenají se rovn ěž nezvyklé projevy, pokud jde o polohu t ěla, 
úroveň aktivity (nap ř. snížené nebo zvýšené zkoumání standardního 
pozorovacího prostoru) a koordinaci pohybu. Zaznamenají se také změny chůze (např. kolébání, ataxie), polohy (nahrbení h řbetu) 
a reakce na manipulaci, umíst ění a další stimuly související 
s prostředím, dále p řítomnost klonických a tonických pohyb ů, 
křečí nebo třesu, stereotyp ů v chování (nap ř. nadměrného čištění, 
nezvyklých pohyb ů hlavy nebo opakovaného kroužení) nebo zvlášt ­
ního chování (nap ř. kousání nebo nadm ěrného olizování, sebepoško ­
zování, pohybu pozpátku, vydávání zvuk ů) anebo agresivity.
 
1.6.1.3  Funk ční zkoušky  
Podobně jako podrobná klinická pozorování se u jednotlivých zví řat 
vybraných k t ěmto účelům provedou i funk ční zkoušky – nejprve 
před expozicí a potom vícekrát po jejím provedení (viz tabulka 1). 
Četnost funk čního testování závisí rovn ěž na trvání studie (viz 
tabulka 2). Mimo dobu pozorování stanovenou v tabulce 2 se 
provede také funk ční pozorování satelitní zotavovací skupiny, a to 
těsně před plánovaným usmrcením. Funk ční zkoušky zahrnují reakce 
na různé smyslové podn ěty (nap ř. sluchové, zrakové 
a proprioceptivní podn ěty (5, 6, 7)), zm ěří se síla úchopu kon četiny 
(8) a motorická aktivita (9). Motorická aktivita se m ěří pomocí auto ­
matického p řístroje schopného odhalit jak snížení, tak i zvýšení této 
aktivity. Pokud se použije jiný systém, m ěl by být kvantitativní a je 
třeba prokázat jeho citlivost a spolehlivost. Každý p řístroj je nutné 
otestovat, aby se zajistila jeho spolehlivost po celé časové období 
a homogenita s ostatními p řístroji. Další podrobnosti o postupech, 
kterými se lze řídit, jsou uvedeny v p říslušných odkazech. Pokud 
neexistují žádné údaje (nap ř. údaje o vztahu mezi strukturou 
a biologickou aktivitou, epidemiologické údaje, jiné toxikologické 
studie), které by ukazovaly na potenciální neurotoxické ú činky, je 
nutné za ú čelem podrobn ějšího vyšet ření těchto možných ú činků 
zvážit za členění specializovan ějších zkoušek smyslových 
a motorických funkcí nebo u čení a pam ěti. Další informace 
o specializovan ějších zkouškách a jejich používání je uvedeno 
v literatuře (1).  
Ve výjime čných případech lze zví řata vykazující známky toxicity 
v takové mí ře, která by významn ě narušila provedení funk ční zkou­ 
šky, z této zkoušky vy řadit. Vyřazení těchto zvířat z funk čních 
zkoušek je nutné zd ůvodnit.  
1.6.2  Tělesná hmotnost a spot řeba potravy a vody  
U studií s délkou trvání do 90 dn ů se všechna zví řata váží alespo ň 
jednou týdn ě a každý týden se rovn ěž provádí m ěření spotřeby 
potravy (m ěření spotřeby vody se provádí tehdy, je-li zkoušená 
látka aplikována prost řednictvím tohoto média). U dlouhodobých 
studií se všechna zví řata váží alespo ň jednou týdn ě během prvních 
13 týdnů a poté alespo ň jednou za 4 týdny. B ěhem prvních 13 týdn ů 
se měří spotřeba potravy (m ěření spotřeby vody se provádí tehdy, je- 
li zkoušená látka aplikována prost řednictvím tohoto média) a poté 
přibližně v tříměsíčních intervalech, pokud si zm ěny zdravotního 
stavu nebo zm ěny tělesné hmotnosti nevyžádají jiný interval.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3  Oftalmologické vyšet ření 
U studií delších než 28 dn ů se před aplikací zkoušené látky a p řed 
ukončením studie provede oftalmologické vyšet ření pomocí oftal ­
moskopu nebo jiného vhodného nástroje, a to nejlépe u všech zví řat, 
alespoň však u všech zví řat ze skupin s vysokou dávkou a z kontrol ­
ních skupin. Pokud se zjistí zm ěny na očích nebo pokud klinické 
příznaky ukazují na nutnost vyšet ření očí, vyšetří se všechna zví řata. 
U dlouhodobých studií se oftalmologické vyšet ření provede ve 13. 
týdnu stá ří zvířat. Oftalmologická vyšet ření není nutné provád ět 
tehdy, jsou-li již k dispozici údaje z jiných podobn ě dlouhých studií 
s podobnými úrovn ěmi dávek.  
1.6.4  Hematologické a biochemické vyšet ření 
Pokud se studie neurotoxicity provádí v kombinaci se studií systé ­
mové toxicity po opakovaných dávkách, provede se hematologické 
vyšetření a stanovení klinických biochemických parametr ů tak, jak je 
uvedeno v p říslušné metod ě studie systémové toxicity. Odebírání 
vzorků se provede tak, aby se minimalizovaly jakékoliv ú činky na 
chování.  
1.6.5  Histopatologie  
Neuropatologické vyšet ření se navrhne tak, aby doplnilo a rozší řilo 
pozorování provedená v rámci této studie b ěhem fáze  in vivo . Tkáně 
alespoň pěti zvířat každého pohlaví z každé skupiny (viz tabulka 1 
a další odstavec) se fixují  in situ  za použití obecn ě uznávaných 
perfuzních a fixa čních technik (viz odkaz na literaturu 3, kapitola 
5 a odkaz 4, kapitola 50). Zaznamenají se jakékoliv výrazné zm ěny. 
Pokud se studie provádí jako samostatná studie neurotoxicity nebo studie charakterizující neurotoxické ú činky, lze použít zbytek zví řat 
buď ke specifickým neurobehaviorálním (10, 11), neuropatolo ­
gickým (10, 11, 12, 13), neurochemickým (10, 11, 14, 15), nebo elektrofyziologickým (10, 11, 16, 17) postup ům, které mohou 
doplnit zde popsané postupy a vyšet ření, anebo zvýšit po čet subjekt ů 
vyšetřovaných k histopatologickým ú čelům. Tyto dopl ňkové postupy 
jsou zvlášt ě užitečné tehdy, pokud empirická pozorování nebo 
očekávané ú činky ukazují na specifický typ nebo cílovou strukturu 
neurotoxicity (2, 3). Je také možné zbytek zví řat použít k b ěžným 
patologickým hodnocením, která jsou popsána v metod ě studií po 
opakovaných dávkách.
 
U všech tká ňových vzork ů zalitých parafínem se provede b ěžný 
postup barvení, nap ř. pomocí hematoxylinu a eosinu (H&E), 
a mikroskopické vyšet ření. Jsou-li pozorovány nebo existuje-li pode ­
zření na příznaky periferní neuropatie, vyšet ří se vzorky periferních 
nervů zalitých do prysky řic (vosků). Klinické p říznaky mohou 
rovněž poukázat na další místa, která je nutné vyšet řit, nebo na 
nutnost použít speciální postupy barvení. Pokyny k ur čení dalších 
míst, která je t řeba vyšet řit, lze nalézt v literatu ře (3, 4). K prokázání 
charakteristických typ ů patologické zm ěny může přispět 
i odpovídající speciální barvení (18).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
U reprezentativních řezů centrálního a periferního nervového 
systému se provede histologické vyšet ření (viz odkaz na literaturu 
3, kapitola 5 a odkaz 4, kapitola 50). Mezi vyšet řované oblasti 
obvykle pat ří: přední mozek, st řední část mozku, v četně řezu hippo ­
campem, st řední mozek, moze ček, Varol ův most, prodloužená 
mícha, oko se zrakovým nervem a sítnicí, mícha v oblasti cervikál ­
ního a lumbálního zesílení, dorsální ko řenová ganglia, dorsální 
a ventrální ko řenová vlákna, proximální část n. ischiadicus  
a proximální část n. tibialis  (v oblasti kolena) a  n. tibialis  
z oblasti lýtkového svalu. Řezy míchy a periferních nerv ů by měly 
zahrnovat jak p říčné, tak i podélné řezy. Pozornost je nutné v ěnovat 
uspořádání cév v oblasti nervového systému. Rovn ěž se vyšet ří 
vzorky z kosterního svalstva, a to zvlášt ě z lýtkového svalu. Zvláštní 
pozornost je nutné v ěnovat míst ům s buněčnou a vláknitou struk ­
turou a těm strukturám v oblasti CNS a PNS, o nichž je známo, že 
na ně mají neurotoxické látky zna čný vliv.  
Informace o neuropatologických zm ěnách, které typicky vznikají 
v důsledku expozice toxickým látkám, lze nalézt v literatu ře (3, 4). 
Doporučuje se postupné vyšet ření tkáňových vzork ů, při kterém se 
porovnají nejprve vzorky řezů ze skupiny s vysokou dávkou se 
vzorky řezů z kontrolní skupiny. Nejsou-li ve vzorcích z t ěchto 
skupin zjišt ěny žádné neuropatologické zm ěny, není nutné provád ět 
další analýzu. Jsou-li zjišt ěny ve skupin ě s vysokou dávkou neuro ­
patologické zm ěny, je třeba následn ě okódovat a vyšet řit vzorky ze 
všech potenciáln ě zasažených tkání ze skupin se st řední a nízkou 
dávkou.  
Pokud je b ěhem kvalitativního vyšet ření zjištěna přítomnost neuro ­
patologických zm ěn, provede se druhé vyšet ření všech oblastí nervo ­
vého systému, které vykazují tyto zm ěny. Okódují se řezy ze všech 
dávkových skupin ze všech potenciáln ě zasažených oblastí a vyšet ří 
v náhodném po řadí bez znalosti kódu. Zaznamená se četnost 
a závažnost všech lézí. Po zhodnocení všech oblastí ze všech dávko ­
vých skupin se kód odkryje a provede se statistická analýza za 
účelem vyhodnocení vztahu dávka-odezva. U každé léze se popíší 
příklady různých stup ňů závažnosti.  
Neuropatologické výsledky se vyhodnotí v souvislosti 
s pozorováním a m ěřením chování a rovn ěž spolu s dalšími údaji 
z předchozích a soub ěžných studií systémové toxicity zkoušené 
látky.  
2. ÚDAJE  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Uvedou se jednotlivá data, která se shrnou do tabulky, p řičemž se 
pro každou experimentální nebo kontrolní skupinu uvede po čet zvířat 
na začátku zkoušky, po čet zvířat uhynulých v pr ůběhu zkoušky nebo 
počet zvířat usmrcených z humánních d ůvodů a doba uhynutí nebo 
humánního usmrcení, po čet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, 
popis zjišt ěných příznaků toxicity, v četně doby nástupu, trvání, 
typu a závažnosti jakýchkoliv p říznaků toxicity, po čet zvířat vykazu ­
jících léze, v četně typu a závažnosti léze (lézí).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Výsledky studie je t řeba vyhodnotit z hlediska výskytu, závažnosti 
a korelace neurobehaviorálních a neuropatologických ú činků (rovněž 
i neurochemických nebo elektrofyziologických ú činků, jsou-li 
provedena dopl ňující vyšet ření) a z hlediska dalších zjišt ěných nepří­
znivých ú činků. Je-li to možné, je t řeba vyhodnotit číselné výsledky 
vhodnými a obecn ě uznávanými statistickými metodami. Statistické 
metody je t řeba zvolit b ěhem plánování studie.  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální vlastnosti (v četně isomerie, čistoty a fyzikáln ě-chemic­
kých vlastností),  
— identifika ční údaje.  
Vehikulum (je-li použito):  
— zdůvodnění výběru vehikula.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— původ, podmínky chovu, aklimatizace, potrava atd.,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku zkoušky.  
Zkušební podmínky:  
— podrobné údaje o úprav ě směsi zkoušené látky či přípravě 
potravy, dosažené koncentraci, stabilit ě a homogenit ě přípravku,  
— specifikace aplikovaných dávek, v četně podrobností o vehikulu, 
objemu a fyzikální form ě aplikovaného materiálu,  
— podrobnosti o zp ůsobu podávání zkoušené látky,  
— zdůvodnění výběru úrovní dávky,  
— zdůvodnění způsobu aplikace a trvání expozice,  
— přepočet koncentrace zkoušené látky v potrav ě nebo pitné vod ě 
(ppm) na skute čnou denní dávku v mg/kg t ělesné hmotnosti,  
— podrobnosti o potrav ě a kvalitě vody.  
Pozorovací a zkušební postupy:  
— podrobnosti o p řiřazení zví řat z jednotlivých skupin do 
podskupin s perfuzí,  
— podrobnosti o systémech hodnocení, v četně kritérií a hodnotících 
stupnic pro jednotlivá m ěření v rámci podrobných klinických 
pozorování,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— podrobnosti o funk čních zkouškách pro m ěření reakce na r ůzné 
smyslové podn ěty (např. sluchové, zrakové a hmatové), pro 
měření síly úchopu kon četiny, motorické aktivity (v četně podrob­
ností o automatických za řízeních pro zjiš ťování aktivity) a další 
použité postupy,  
— podrobnosti o oftalmologických vyšet řeních, hematologických 
a klinických biochemických zkouškách s p říslušnými výchozími 
(normálními) hodnotami,  
— podrobnosti o specifických neurobehaviorálních, neuropatologic ­
kých, neurochemických nebo elektrofyziologických postupech.  
Výsledky:  
— tělesná hmotnost a její zm ěny, včetně tělesné hmotnosti v dob ě 
usmrcení,  
— spotřeba potravy a p řípadně vody,  
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovn ě dávek, v četně 
popisu příznaků toxicity nebo úmrtnosti,  
— povaha, závažnost a trvání (doba nástupu a následný pr ůběh) 
podrobných klinických nález ů (zda jsou vratné nebo nevratné),  
— podrobný popis všech výsledk ů funkčních testů, 
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech neurobehaviorálních, neuropatologických 
a neurochemických nebo elektrofyziologických výsledk ů, jsou-li 
k dispozici,  
— údaje o absorpci a metabolismu, jsou-li k dispozici,  
— statistické vyhodnocení výsledk ů, je-li to možné.  
Diskuse o výsledcích:  
— informace o závislosti ú činku na dávce,  
— význam jakýchkoliv dalších toxických ú činků pro závěry týkající 
se neurotoxického potenciálu zkoušené chemické látky,  
— dávková úrove ň bez pozorovatelných nep říznivých ú činků 
(NOAEL).  
Závěry: 
— je žádoucí uvést konkrétní vyjád ření o celkové neurotoxicit ě 
zkoušené chemické látky.  
4. LITERATURA  
1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies 
and Test Methods. OECD, Paris. Návrh.  
2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Návrh.  
3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the 
Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
 
4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 
999–1003.  
6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indu ­
strial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704.  
7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observati ­
onal Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, 267–283.  
8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). 
A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb 
Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233–236.
 
9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599–609.
 
10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel 
Dekker, New York.  
12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689–695.  
13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343–352.
 
14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 
10, 445–452.  
15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368–378.
 
16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, s. 299–335.
 
17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuroto ­
xicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and 
Wilkins Co.,. Baltimore/London, s. 726–742.
 
18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Living ­
stone.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabulka 1  
Minimální po čet zvířat na skupinu, provádí-li se studie neurotoxicity samostatn ě nebo v kombinaci s dalšími 
studiemi  
TYP PROVEDENÉ STUDIE NEUROTOXICITY 
Samostatná studie Kombinovaná studie 
s 28denní studií Kombinovaná studie 
s 90denní studií Kombinovaná studie se 
studií chronické toxicity  
Počet zvířat na skupinu 10 samc ů a 10 
samic 10 samců a 10 
samic 15 samců a 15 
samic 25 samců a 25 samic 
Počet zvířat vybraných 
k funkčnímu testování, 
včetně podrobných klinic ­
kých pozorování 10 samců a 10 
samic 10 samců a 10 
samic 10 samců a 10 
samic 10 samců a 10 samic 
Počet zvířat vybraných 
k perfuzi  in situ  
a neurohistopatologickému 
vyšetření 5 samců a 5 samic 5 samc ů a 5 samic 5 samc ů a 5 samic 5 samc ů a 5 samic 
Počet zvířat vybraných 
k pozorování toxicity po 
opakované dávce subchro ­
nické/chronické, k hematologickému 
vyšetření, klinickému 
biochemickému vyšet ření, 
k histopatologickému vyšetření atd., jak je 
uvedeno v p říslušných 
doporučeních 5 samců a 5 samic 10 samc ů (
 1 ) a 10 
samic (  1 ) 20 samců ( 1 ) a 20 
samic (  1 ) 
Případná dopl ňující pozoro ­
vání 5 samců a 5 samic  
( 1 ) Zahrnuto je p ět zvířat vybraných k funk čnímu testování a podrobnému klinickému pozorování jako sou část studie neurotoxicity.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabulka 2  
Četnost klinických pozorování a funk čních testů 
Typ pozorování Délka studie 
akutní 28denní 90denní chronická  
U všech zví řat Celkový zdra ­
votní stav Denně Denn ě Denn ě Denn ě 
Mortalita/morbi ­
dita Dvakrát denn ě Dvakrát denn ě Dvakrát denn ě Dvakrát denn ě 
U všech zví řat 
vybraných k funkčním pozo ­
rováním Podrobná 
klinická pozoro ­
vání — před první 
expozicí 
— v průběhu 8 
hodin po 
podání 
dávky v době 
odhadova ­
ného nejvyš ­ 
šího účinku 
— 7. a 14. den 
po skončení 
dávkování — před první 
expozicí 
— poté jednou 
týdně — před první 
expozicí 
— jednou 
během 
prvního 
nebo druhého týdne expo ­
zice 
— poté m ěsíčně — před první 
expozicí 
— před první 
expozicí 
jednou na konci prvního měsíce expo ­
zice 
— poté každé t ři 
měsíce 
Funkční testy — p řed první 
expozicí 
— v průběhu 8 
hodin po 
podání 
dávky v době 
odhadova ­
ného nejvyš ­ 
šího účinku 
— 7. a 14. den 
po skončení 
dávkování — před první 
expozicí 
— během čtvr­
tého týdne 
aplikace co 
nejblíže ke konci období expozice — před první 
expozicí 
— jednou 
během 
prvního 
nebo druhého týdne expo ­
zice 
— poté m ěsíčně — před první 
expozicí 
— před první 
expozicí 
jednou na 
konci prvního měsíce expo ­
zice 
— poté každé t ři 
měsíce
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44  ABSORPCE K ŮŽÍ: METODA  IN VIVO  
1. METODA  
Tato zkušební metoda je ekvivalentní testu OECD TG 427 (2004).  
1.1 ÚVOD  
Expozice mnohým chemickým látkám se d ěje hlavně cestou p řes 
kůži, zatímco v ětšina toxikologických studií provedených na pokus ­
ných zvířatech užívá perorální podání. Perkutánní absorp ční studie  in 
vivo stanovená tímto návodem skýtá propojení nezbytné pro extra ­
polaci z perorálních studií na posouzení bezpe čnosti po expozicích 
dermálních.  
Látka musí proniknout velkým po čtem buněčných vrstev k ůže, než 
se může dostat do krevního ob ěhu. Vrstvou ur čující rychlost je pro 
většinu látek  stratum corneum  (zrohovat ělá vrstva) složená 
z mrtvých bun ěk. Permeabilita (propustnost) skrz k ůži závisí na 
lipofilitě chemické látky a na tlouš ťce vnější vrstvy epidermis 
a také na faktorech, jako je nap ř. molární hmotnost a koncentrace 
dané látky. Obecn ě je vrstva k ůže potkan ů a králíků permeabiln ější 
než kůže lidská, zatímco k ůže morčat a opic se k ůži lidské podobají 
více.  
Metody m ěření perkutánní absorpce se d ělí do dvou kategorií:  in 
vivo a in vitro . Metody  in vivo  jsou schopny skýtat dobré informace 
o absorpci k ůží s různými druhy pokusných zví řat. Nedávno byly 
vyvinuty  in vitro  metody. Ty využívají transport p řes plnou či 
částečnou tlouš ťku kůže zvířecí či lidské do rezervoáru tekutiny. 
Metody  in vitro  jsou popsány ve zvláštní metod ě zkoušení (1). 
Doporučuje se brát v úvahu dokument OECD Guidance Document 
for the Conduct of Skin Absorption Studies (2) na pomoc p ři výběru 
nejvhodnější metody pro danou situaci, nebo ť popisuje podrobn ěji 
vhodnost metod  in vivo  a in vitro . 
Metoda  in vivo  zde popsaná umož ňuje stanovení pr ůniku zkoušené 
látky kůží do systémových kompartment ů. Tento postup je široce 
používán mnoho let (3, 4, 5, 6, 7). A čkoli perkutánní absorp ční 
studie  in vitro  mohou být vhodné v mnoha p řípadech, mohou nastat 
situace, kdy lze získat pot řebné údaje pouze studií provedenou  in 
vivo. 
Výhodou  in vivo  metody je, že využívá fyziologicky a metabolicky 
intaktní systém, využívá druhy spole čné mnoha studiím toxicity 
a může být modifikována pro použití s jinými druhy. Nevýhodou 
je využívání živých zví řat, potřeba radiozna čených materiál ů 
k usnadn ění spolehlivých výsledk ů, potíže se stanovením časné 
fáze absorpce a rozdíly v permeabilit ě kůže preferovaného druhu 
(potkan) a k ůže lidské. Zví řecí kůže je obecn ě permeabiln ější, 
a proto m ůže být perkutánní absorpce u člověka nadhodnocena (6, 
8, 9). Leptavé/žíravé látky by na živých zví řatech zkoušeny být 
neměly. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2 DEFINICE  
Neabsorbovaná dávka:  množství smyté z povrchu k ůže po expozici 
a množství, které ulp ělo na neuzavírajícím krytu, v četně množství 
prokazateln ě odtěkaného z k ůže během expozice.  
Absorbovaná dávka ( in vivo ): množství v mo či, ve zbytcích v kleci, 
ve výkalech, ve vydechovaném vzduchu (je-li m ěřeno), v krvi, 
v tkáních (jsou-li sbírány) a ve zbývajících částech mrtvých t ěl po 
odstranění kůže z místa aplikace.  
Absorbovatelná dávka:  množství na k ůži nebo v k ůži po omytí.  
1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkušební látka, nejlépe radioaktivn ě značená, se aplikuje na zví řecí 
kůži zbavenou srsti na jedné nebo více vhodných úrovních dávky ve 
formě reprezentativní pro užívání p řípravku. Zkoušený p řípravek se 
ponechá ve styku s k ůží po předem určenou dobu pod vhodným 
krytem (neokluzivním, semiokluzivním či okluzivním), aby nedošlo 
k požití zkušebního p řípravku. Po uplynutí doby expozice se kryt 
odstraní a k ůže se očistí vhodným čisticím činidlem, kryt a čisticí 
materiály se uchovají pro analýzu a aplikuje se nový kryt. Zví řata 
jsou držena p řed expozicí, b ěhem ní a po ní v jednotlivých metabo ­
lických klecích a jejich exkrementy a vydechovaný vzduch b ěhem 
uvedených období se sbírají pro analýzy. Od sb ěru vydechovaného 
vzduchu lze upustit, jsou-li známy dostate čné údaje o tom, že se tvo ří 
jen málo radioaktivních t ěkavých metabolit ů nebo že se netvo ří žádné. 
Každá studie bude obvykle zahrnovat n ěkolik skupin zví řat, která 
budou exponována zkoušenému p řípravku. Jedna skupina zví řat 
bude usmrcena na konci doby expozice. Ostatní skupiny zví řat 
budou usmrcovány v naplánovaných časových intervalech poté (2). 
Po uplynutí vzorkovacího období se usmrtí zbývající zví řata, krev 
se odebere k analýze, místo aplikace se odebere k analýze a t ěla se 
analyzují vzhledem k nevym ěšenému materiálu. Vzorky se analyzují 
vhodnými prost ředky a odhadne se míra perkutánní absorpce (6, 8, 9).  
1.4 POPIS METODY  
1.4.1  Výb ěr druhu zví řat 
Nejběžnějším používaným druhem je potkan, ale lze používat rovn ěž 
kmeny bez srsti a druhy s rychlostí absorpce k ůží podobn ější 
lidským (3, 6, 7, 8, 9). Používána by m ěla být mladá dosp ělá zdravá 
zvířata stejného pohlaví (automaticky voleným pohlavím jsou samci) 
běžně využívaných pokusných kmen ů. Na počátku studie by hmot ­
nostní váhové odchylky zví řat váhy nem ěly přesáhnout ± 20 % 
střední hmotnosti. Nap říklad jsou vhodní samci potkan ů 
o hmotnosti 200–250 g, zvlášt ě v horní polovin ě uvedeného rozsahu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2  Po čet a pohlaví zví řat 
Pro každý zkoušený p řípravek a každý stanovený kone čný čas by 
měla být použita skupina nejmén ě čtyř zvířat stejného pohlaví. 
Každá skupina zví řat bude usmrcena po r ůzných časových interva ­
lech, nap ř. na konci expozi ční doby (obvykle 6 nebo 24 hodin) a v 
následných intervalech (nap ř. 48 a 72 hodin). Pokud dostupné údaje 
prokazují podstatný rozdíl v dermální toxicit ě u samců a samic, m ělo 
by být vybráno citliv ější pohlaví. Nejsou-li takové údaje dostupné, 
lze použít ob ě pohlaví.  
1.4.3  Podmínky útulku a krmení  
Teplota v experimentálních zví řecích místnostech by m ěla být 22  o C 
(± 3  o C). Ačkoli relativní vlhkost by m ěla být nejmén ě 30 % 
a přednostně by neměla přesáhnout 70 %, krom ě doby čištění míst­
ností, žádoucí vlhkost je 50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé 
a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. Ke krmení 
může být použita konven ční laboratorní potrava, m ěla by být voln ě 
dostupná spolu s neomezovaným zdrojem pitné vody. B ěhem studie 
a přednostně rovněž během aklimatizace jsou zví řata držena jedno ­
tlivě v metabolických klecích. Protože rozsypaná potrava a rozlitá 
voda může ohrozit výsledky, m ěla by být pravd ěpodobnost takových 
událostí minimalizována.  
1.4.4  Příprava zví řat 
Zvířata jsou ozna čena způsobem umož ňujícím jejich individuální 
identifikaci a držena v jejich klecích nejmén ě pět dnů před zahájením 
studie, aby se aklimatizovala na laboratorní podmínky.  
Po aklimatiza čním období a p řibližně 24 hodin p řed aplikací dávek 
je každé zví ře zbaveno srsti na k ůži v oblasti plece a zad. Perme ­
abilita poškozené a nepoškození k ůže se liší a m ělo by se p ředcházet 
jejímu od ření. Po odstran ění srsti a p řibližně 24 hodin p řed aplikací 
zkoušené látky na k ůži (viz bod 1.4.7) by k ůže měla být zbavena 
kožního tuku omytím acetonem. Nedoporu čuje se další omytí 
mýdlem a vodou, protože zbytky mýdla by mohly podpo řit absorpci 
zkoušené látky k ůží. Dotyčná oblast musí být dostate čně velká, před­
nostně nejméně 10 cm  2 , aby bylo možno spolehliv ě vypočítat absor ­
bované množství zkoušené chemické látky na cm  2 . Takto velkou 
plocha mají potkani o t ělesné hmotnosti 200–250 g. Po p řípravě 
jsou zvířata vrácena do metabolických klecí.  
1.4.5  Zkoušená látka  
Zkoušená látka je entita, jejíž penetra ční vlastnosti mají být zjišt ěny. 
V ideálním p řípadě by zkoušená látka m ěla být radioaktivn ě 
značena. 
1.4.6  Zkoušený p řípravek  
Zkoušený látkový p řípravek (nap ř. čistý, zředěný, nebo p řísadami 
doplněný materiál obsahující zkoušenou chemickou látku, která je 
aplikována na k ůži) by měl být stejný jako p řípravek, kterému lidé 
nebo jiné potenciáln ě cílové druhy mohou být exponovány (nebo by 
měl být jeho realistickou náhražkou). Jakákoli odchylka od užíva ­
ného přípravku musí být zd ůvodněna. Je-li to nutné, je zkoušená 
látka rozpušt ěna nebo suspendována ve vhodném vehikulu. Pro 
jiné vehikulum než voda by m ěly být známy charakteristiky jeho 
absorpce a potenciální interakce se zkoušenou látkou.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7  Aplikace na k ůži 
Na povrchu k ůže je definováno místo aplikace se specifickou veli ­
kosti povrchu. Na toto místo je rovnom ěrně naneseno známé množ ­
ství zkoušeného p řípravku. Toto množství by normáln ě mělo 
imitovat potenciální expozici člověka, obvykle 1–5 mg/cm  2 pro 
tuhé látky a až 10 μl/cm  2 pro kapaliny. Jiná množství by m ěla být 
zdůvodněna předpokládanými podmínkami použití, cíli studie nebo 
fyzikálními vlastnostmi zkoušeného p řípravku. Po aplikaci musí být 
aplikační místo chrán ěno před setřením. Příklad obvyklého opat ření 
je na obrázku 1. Obvykle je aplika ční místo chrán ěno neuzav řeným 
krytem (nap ř. překrytím permeabilní nylonovou gázou). Avšak pro 
neurčité aplikace by aplika ční místo m ělo být uzav řeno. V p řípadě, 
že vypařování polot ěkavých zkoušených látek snižuje podíl znovu ­
zachycené zkoušené látky až na nep řijatelný rozsah (viz též bod 
1.4.10, první odstavec), je nutné zachycovat vypa řovanou látku na 
filtru z aktivního uhlí kryjícím aplika ční zařízení (viz obrázek 1). 
Důležité je, aby žádné aplika ční zařízení nepoškozovalo k ůži, neab­
sorbovalo zkoušený p řípravek, ani s ním nereagovalo. Zví řata jsou 
vracena do jednotlivých metabolických klecí ke sb ěru exkrement ů. 
1.4.8  Doba trvání expozice a vzorkování  
Doba trvání expozice (expozi ční doba) je časový interval mezi aplikací 
a odstraněním zkoušeného p řípravku omytím k ůže. Relevantní expo ­
ziční doby (obvykle 6 až 24 hodin) by m ěly být stanoveny na základ ě 
předpokládané doby expozice člověka. Po expozi ční dobu jsou zví řata 
držena v metabolických klecích až do stanoveného ukon čení. Zvířata by 
měla být v pravidelných intervalech po celou dobu trvání studie pozo ­
rována, zda nevykazují p říznaky toxicity/abnormálních reakcí. Na konci 
expoziční doby by exponovaná k ůže měla být prohlédnuta ke zjišt ění 
viditelných p říznaků dráždění. 
Metabolické klece by m ěly umožnit separovaný sb ěr moči a výkalů 
během studie. Rovn ěž by měly umožnit sb ěr oxidu uhli čitého s  14 C- 
uhlíkem a t ěkavé organické slou čeniny s  14 C-uhlíkem, které by m ěly 
být analyzovány, jestliže jich vzniká množství > 5 %. Mo č, výkaly 
a zachycené plyny (nap ř. oxid uhli čitý s  14 C a těkavé organické 
sloučeniny s  14 C) by měly být odd ěleně sbírány pro každou skupinu 
v každém vzorkovacím čase. Pokud je dostate čně známo, že vzniká 
málo těkavých radioaktivních metabolit ů nebo nevznikají žádné, lze 
použít otev řené klece.  
Exkrementy jsou sbírány b ěhem expozi ční doby, až 24 hodin od 
počátečního styku s k ůží, a potom denn ě až do ukon čení experi ­
mentu. A čkoli normáln ě postačí tři intervaly sb ěru exkrement ů, 
z předpokládaného použití zkoušeného p řípravku nebo ze známých 
kinetických údaj ů mohou vyplynout vhodn ější nebo dodate čné časy 
sběru exkrement ů pro studii.  
Po uplynutí expozi ční doby je ochranný kryt odstran ěn z každého 
zvířete a uchován pro analýzu odd ěleně. Exponovaná k ůže všech 
zvířat by měla být omyta nejmén ě třikrát čisticím činidlem užitím 
vhodných tampon ů. Pečlivě je nutno dbát na to, aby se vylou čila 
kontaminace jiných částí těla. Čisticí činidlo by m ělo představovat 
obvyklou hygienickou praxi, nap ř. vodný roztok mýdla. Nakonec by 
měla být kůže vysušena. Veškeré tampony a mycí činidla by m ěla 
být zachována pro analýzu. P řed vrácením do jednotlivých klecí by 
měla být exponovaná místa zví řat, která budou zachována pro 
pozdější pozorování, chrán ěna čerstvým krytem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9  Terminální postupy  
V každé skupin ě budou jednotlivá zví řata usmrcována 
v plánovaných časových intervalech a krev sbírána k analýze. 
Ochranný kryt nebo za řízení by m ělo být odebráno k analýze. 
Kůže z aplika čního místa a podobná neexponovaná oblast k ůže 
zbavené srsti by m ěla být odebrána ke zvláštní analýze z každého 
zvířete. Kůže z aplika čního místa m ůže být rozd ělena oddělením  
stratum corneum  od podložní epidermis ke zjišt ění více údaj ů 
o distribuci zkoušené chemické látky. Stanovení časové závislosti 
této distribuce po expozi ční době by mělo poskytnout ur čité údaje 
o osudu zkoušené chemické látky v  stratum corneum . Rozdělení 
kůže (po posledním omytí k ůže a usmrcení zví řete) je usnadn ěno 
sejmutím všech ochranných kryt ů. Kůže z aplika čního místa spolu 
s prstencem okolní k ůže je vyříznuta z potkana a p řišpendlena na 
desku. Na povrch k ůže se jemn ě přitlačí lepící páska a tato pásku se 
sejme spolu s částí stratum corneum . Stejně se použijí další pásky až 
do stavu, kdy se páska na k ůži již nelepí a  stratum corneum  je úplně 
odstraněno. Pro každé zví ře jsou všechny pásky spole čně dány do 
stejného obalu, kam je p řidáno digestivum solubilizující  stratum 
corneum . Před analýzou absorbované dávky ve zbylém t ěle z něj 
lze vyjmout jakoukoli potenciáln ě cílovou tká ň. Těla jednotlivých 
zvířat by měla být zachována pro analýzu. Obvykle posta čí analýza 
celkového obsahu. Cílové orgány lze vyjímat pro zvláštní analýzu 
(pokud tak indikují další studie). Mo č z měchýře v plánované dob ě 
usmrcení by m ěla být přidána k mo či sebrané d říve. Po sb ěru exkre­
mentů z metabolických klecí v plánovaném dob ě usmrcení by klece 
a jejich filtry m ěly být omyty vhodným rozpoušt ědlem. Podobn ě by 
měla být analyzována i další potenciáln ě kontaminovaná za řízení.  
1.4.10  Analýza  
Ve všech studiích by m ělo být dosaženo dostate čného znovuzáchytu 
(výtěžku) (tj. st řední hodnoty 100 ± 10 % radioaktivity). Znovuzá ­
chyty mimo tento rozsah musí být zd ůvodněny. Množství podané 
dávky v každém vzorku musí být analyzováno vhodn ě validovaným 
postupem.  
Statistické hodnocení by m ělo zahrnout míru rozptylu opakovaných 
měření pro každou aplikaci.  
2. ÚDAJE  
Pro každé zví ře v každém vzorkovacím čase by pro zkoušenou 
chemickou látku a/nebo metabolity m ěla být provedena následující 
měření. Krom ě jednotlivých údaj ů by měly být hlášeny st řední 
hodnoty dat seskupených podle vzorkovacích časů: 
— množství spojené s ochrannými prost ředky,  
— množství, které lze uvolnit z k ůže, 
— množství na k ůži či v kůži, které nelze z k ůže smýt,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— množství ve vzorcích krve,  
— množství v exkrementech a vydechovaném vzduchu (je-li to rele ­
vantní),  
— množství v t ěle a v orgánech odebraných pro zvláštní analýzy.  
Množství zkoušené chemické látky a/nebo metabolity 
v exkrementech, ve vydechovaném vzduchu, v krvi a v t ěle umožní 
stanovení celkového absorbovaného množství v každém vzorko ­
vacím čase. Rovn ěž lze vyčíslit měrné množství zkoušené chemické 
látky absorbované jedním cm  2 kůže exponované zkoušené látce 
během expozi ční doby.  
3. ZPRÁVY  
3.1 ZKUŠEBNÍ PROTOKOL  
Zkušební protokol musí zahrnout požadavky stanovené protokolem, 
včetně zdůvodnění použitého zkušebního systému, a m ěl by obsa ­
hovat tyto údaje:  
Zkoušená látka:  
— identifika ční údaje (nap ř. číslo CAS, je-li známo; zdroj; čistota 
(radiochemická čistota); známé ne čistoty; číslo šarže),  
— fyzikální povaha, fyzikáln ě-chemické vlastnosti (nap ř. pH, těka­
vost, rozpustnost, stabilita, molární hmotnost a rozd ělovací koefi ­
cient log P  ow ). 
Zkoušený p řípravek:  
— složení a zd ůvodnění použití,  
— podrobnosti o zkušebním p řípravku, aplikované množství, 
dosažená koncentrace, vehikulum, stabilita a homogenita.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh a kmen,  
— počet, věk a stáří zvířat, 
— zdroj zví řat, podmínky jejich umíst ění, krmení, atd.,  
— hmotnosti jednotlivých zví řat na počátku zkoušky.  
Zkušební podmínky:  
— podrobnosti podání zkušebního p řípravku (místo aplikace, 
metody analýz, uzav řený/neuzav řený ochranný kryt, objem, 
extrakce, detekce),  
— podrobnosti o jakosti krmení a vody.  
Výsledky:  
— všechny známky toxicity,  
— tabelované absorp ční údaje (vyjád řené jako podíl, množství nebo 
procentní podíl),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— celkové znovuzachycené množství v experimentu,  
— interpretace výsledk ů, srovnání s dostupnými údaji o perkutánní 
absorpci zkoušené slou čeniny.  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Zkušební metoda B.45 Absorpce k ůží: Metoda  in vitro . 
2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3) ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph 
No. 20.  
4) Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol . 8(5), 829–835.  
5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
6) EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and Envi ­
ronmental Assessment.  
7) EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
 
8) Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason 
R (1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredi ­
ents in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic . 28, 
369–373.  
9) Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol . 54, 
399–404.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Obrázek 1  
Příklad konstrukce typického za řízení k definování a ochran ě místa dermální 
aplikace b ěhem studie perkutánní absorpce
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45  ABSORPCE K ŮŽÍ: METODA  IN VITRO  
1. METODA  
Tato zkušební metoda je rovnocenná testu OECD TG 428 (2004).  
1.1 ÚVOD  
Tato metoda byla ur čena ke zjišt ění informací o absorpci zkoušených 
látek aplikované na vy říznutou k ůži. Může být bu ď kombinována 
s metodou Absorpce k ůží: metoda  in vivo  (1), nebo m ůže být 
provedena samostatn ě. Při návrhu studií založených na této metod ě 
se doporu čuje se konzultovat dokument OECD Guidance Document 
for the Conduct of Skin Absorption Studies (2). Tento metodický dokument byl vypracován pro usnadn ění výběru vhodných postup ů 
in vitro  pro specifické podmínky v zájmu zajišt ění spolehlivosti 
výsledků získaných touto metodou.
 
Metody m ěření absorpce k ůží a dermálního p řenosu lze d ělit do 
dvou kategorií:  in vivo  a in vitro . Metody  in vivo  pro absorpci 
kůží jsou dob ře zavedeny a poskytují farmakokinetické údaje 
o širokém spektru živo čišných druh ů. Metoda  in vivo  je samostatn ě 
popsána v jiné zkušební metod ě (1). Metody  in vitro  jsou používány 
k měření absorpce k ůží po mnoho let. A čkoli formální valida ční 
studie metod  in vitro , na něž se vztahuje tato zkušební metoda, 
provedeny nebyly, odborníci OECD se shodli v roce 1999 na tom, 
že existovaly dostate čné údaje, které byly vyhodnoceny tak, že 
hovoří ve prosp ěch této metody  in vitro  (3). Další podrobnosti, 
které dokládají tuto podporu, v četně značného počtu přímých porov ­
nání metod  in vitro  a in vivo , jsou uvedeny v metodickém 
dokumentu OECD Guidance Document (2). Této problematice se věnuje řada monografií, které uvád ějí také podrobné základy pro 
využívání metod  in vitro  (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12). Metody  in 
vitro  umožňují měřit difusi chemických látek do k ůže a přes kůži do 
rezervoáru tekutiny a mohou využívat neživotaschopnou k ůži 
k měření samotné difuse, anebo čerstvou, metabolicky aktivní k ůži 
k současnému m ěření difuse a kožního metabolismu. Tyto metody 
našly zvláštní použití p ři porovnávání p řenosu chemických látek do 
kůže a přes kůži z různých sm ěsí a mohou rovn ěž skýtat užite čné 
modely pro posuzování perkutánní absorpce u člověka. 
Metody  in vitro  nemusejí být použitelné za všech situací a pro 
všechny t řídy chemických látek. Zkušební metody  in vitro  lze 
využívat pro po čáteční kvalitativní vyhodnocení pronikání k ůží. 
V určitých případech m ůže být nutné poté zjistit údaje  in vivo . Při 
dalším rozpracování otázky okolností, za kterých by byly vhodné  in 
vitro  metody, by m ěl být brán v úvahu metodický dokument (2). 
Dodatečné podrobné údaje na podporu rozhodnutí jsou 
uvedeny v (3).  
Tato metoda uvádí obecné zásady m ěření absorpce k ůží 
a dermálního p řenosu zkoušené látky užitím vy říznuté kůže. Lze 
použít kůži z mnoha sav čích druhů, včetně kůže lidské. Permeabilní 
vlastnosti k ůže jsou po jejím vy říznutí z t ěla zachovány, nebo ť 
hlavní barieru pro difusi p ředstavuje neživá rohová vrstva  stratum 
corneum ; aktivní p řenos chemických látek k ůží nebyl zjišt ěn. Byla 
prokázána schopnost k ůže metabolizovat ur čité chemické látky 
během perkutánní absorpce (6), ale tento proces není ur čující, 
pokud jde o rozsah skute čně absorbované dávky, a čkoli může 
ovlivnit povahu materiálu vstupujícího do krevního řečiště. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2 DEFINICE  
Neabsorbovaná dávka:  množství smyté z povrchu k ůže po expozici 
a množství, které ulp ělo na neuzavírajícím krytu, v četně množství 
prokazateln ě odtěkané z kůže během expozice.  
Absorbovaná dávka ( in vitro ): hmotnost zkušební látky proniklé do 
recepční tekutiny nebo do systémovém ob ěhu během určitého časo­
vého období.  
Absorbovatelná dávka ( in vitro ): množství na k ůži nebo v k ůži po 
omytí.  
1.3 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkušební látka, která m ůže být ozna čena radioaktivním izotopem, je 
aplikována na povrch vzorku k ůže oddělující dvě komory difusní 
cely. Doty čná chemická látka z ůstává na k ůži určitou dobu za stano ­
vených podmínek p řed jejím odstran ěním vhodným čisticím postu ­
pem. Recep ční tekutina je vzorkována ve vhodných časových inter ­
valech b ěhem experimentu a analyzována na obsah zkoušené 
chemické látky a/nebo metabolit ů. 
Jsou-li použity metabolicky aktivní systémy, mohou být vhodnými 
metodami analyzovány metabolity zkoušené chemické látky. Po skončení experimentu je p řípadně kvantifikována distribuce zkoušené 
chemické látky a jejich metabolit ů.
 
Za vhodných podmínek, které jsou popsány v této metod ě a v meto ­
dickém dokumentu (2), je m ěřena absorpce zkoušené látky b ěhem 
dané doby analýzou recep ční tekutiny a exponované k ůže. Zkoušená 
látka zbývající v k ůži by měla být pokládána za absorbovanou, 
nelze-li prokázat, že absorpci lze stanovit z hodnot recep ční tekutiny 
samotné. Analýza dalších složek (materiálu omytého z k ůže 
a materiálu, který z ůstal ve vrstvách k ůže) umož ňuje další vyhodno ­
cení údaj ů, včetně celkové distribuce zkušební látky a procentní 
podíl znovuzáchytu.  
V zájmu prokázání funk čnosti a spolehlivosti zkušebního systému 
v provád ějící laborato ři by měly být dostupné výsledky pro rele ­
vantní referen ční látky v souladu s publikovanými výsledky pro 
použitou metodu. Tento požadavek by mohl být spln ěn zkoušením 
vhodných referen čních látek (p řednostně s lipofilitou blízkou zkou ­ 
šené látce) soub ěžně se zkoušenou látkou nebo poskytnutím dosta ­
tečných stávajících výsledk ů pro řadu referen čních látek r ůzné lipo­
fility (nap ř. kofein, kyselina benzoová a testosteron).  
1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.4.1  Difusní cela  
Difusní cela se skládá z donorové komory a recep ční komory, mezi 
nimiž je umíst ěna kůže (příklad obvyklé konstrukce je uveden na 
obrázku 1). Cela by m ěla zajistit dobré ut ěsnění okolo k ůže, 
umožňovat snadné vzorkování a dobré promíchávání recep čního 
roztoku ve styku se spodní vrstvou k ůže a dobrou regulaci teploty 
cely a jejího obsahu. P řijatelné jsou jak statické, tak pr ůtočné difusní 
cely. Obvykle je ponechána donorová cela neuzav řená během expo ­
zice kone čné dávce zkušebního preparátu. Avšak pro neur čité apli­
kace a ur čité scénáře pro kone čnou dávku m ůže být donorová cela 
uzavřena. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2  Recep ční tekutina  
Přednost se dává používání fyziologicky p říznivých recep čních teku ­
tin, ačkoliv lze používat i jiné, je-li to od ůvodněné. Přesné složení 
recepční tekutiny by m ělo být uvedeno. M ěla by být prokázána 
dostatečná rozpustnost zkoušené chemické látky v recep ční tekutin ě 
tak, aby netvo řily překážku absorpce. Navíc by recep ční tekutina 
neměla poškozovat kožní preparát. V pr ůtočném systému nesmí 
rychlost toku brzdit difusi zkoušené látky do recep ční tekutiny. 
V systémech statické cely by kapalina m ěla být neustále míchána 
a pravideln ě vzorkována. Je-li studován metabolismus, musí recep ční 
tekutina b ěhem experimentu podporovat životaschopnost k ůže. 
1.4.3  Kožní preparáty  
Lze používat k ůži z lidských a zví řecích zdroj ů. Zohledňuje se, že 
používání lidské k ůže podléhá vnitrostátním a mezinárodním etickým 
ohledům a podmínkám. A čkoli je preferována životaschopná k ůže, 
lze též použít k ůži neživou za p ředpokladu, že lze prokázat její 
neporušenost. P řijatelné jsou bu ď epidermální membrány (separo ­
vané enzymaticky, teplem nebo chemicky) nebo k ůže 
s rozštěpenou tlouš ťkou (štěpený kožní transplantát) (obvykle 
s tloušťkou 200–400 μm) připravené za použití dermatomu. Plná 
tloušťka kůže může být použita, ale nadm ěrná tloušťka (přibližně 
> 1 mm) by m ěla být vylou čena, pokud není konkrétn ě žádoucí 
pro stanovení zkoušené chemické látky ve vrstvách k ůže. Výběr 
druhů, anatomického místa a postupu preparace musí být zd ůvodněn. 
Požadovány jsou p řijatelné údaje nejmén ě ze čtyř opakování 
s jedním zkušebním preparátem.  
1.4.4  Neporušenost kožního preparátu  
Je nutné, aby k ůže byla řádně preparována. Nevhodná manipulace 
s kůží může vést k poškození vrstvy  stratum corneum , proto musí 
být neporušenost kožního preparátu kontrolována. Je-li zkoumán kožní metabolismus, m ěla by čerstvě vyříznutá kůže být použita co 
nejdříve a za podmínek známých jako p říznivé pro metabolickou 
činnost. Obecn ě se doporu čuje čerstvě vyříznutou k ůži použít do 
24 hodin, avšak p řijatelná skladovací doba se m ůže lišit 
v závislosti na enzymovém systému zapojeném do metabolizace 
a na teplot ě skladování (13). Jsou-li kožní preparáty p řed použitím 
skladovány, m ěly by být uvedeny d ůkazy o zachování jejich bari ­
érové funk čnosti.
 
1.4.5  Zkoušená chemická látka  
Zkoušená látka je entita, jejíž schopnosti pronikání mají být studo ­
vány.V ideálním p řípadě by měla být ozna čena radioaktivním izoto ­
pem.  
1.4.6  Zkoušený p řípravek  
Přípravek zkušební látky (nap ř. čistý, zředěný nebo p řísadami 
doplněný materiál obsahující zkoušenou chemickou látku která je 
aplikována na k ůži) by měl být stejný jako p řípravek, kterému lidé 
nebo jiné potenciáln ě cílové druhy mohou být exponováni (nebo by 
měl být jeho realistickou náhražkou). Jakákoli odchylka od užíva ­
ného přípravku musí být zd ůvodněna. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7  Koncentrace a p řípravky zkoušené látky  
Obvykle je použita více než jedna koncentrace zkoušené látky 
zahrnující maximální potenciální expozice člověka. Podobn ě by 
mělo být uváženo zkoušení ur čitého spektra skladby obvyklých 
přípravků. 
1.4.8  Aplikace na k ůži 
Za běžných podmínek expozice lidí chemickým látkám se obvykle 
setkáváme s kone čnými dávkami. Proto by m ělo být aplikováno 
množství, které imituje expozici člověka, obvykle 1–5 mg/cm  2 
kůže pro tuhé látky a až 10 μl/cm  2 pro kapaliny. Aplikované množ ­
ství by m ělo být zdůvodněno předpokládanými podmínkami použití, 
cíli studie nebo fyzikálními vlastnostmi zkoušeného p řípravku. Nap ř. 
aplikace na povrch k ůže může být neur čitá, jsou-li aplikovány velké 
objemy na jednotku plochy.  
1.4.9  Teplota  
Pasivní difuse chemických látek (a tudíž i jejich absorpce k ůží) závisí na 
teplotě. Difusní komora a k ůže by měly být udržovány p ři konstantní 
teplotě blízké normální teplot ě kůže okolo 32 ± 1  o C. Různé konstrukce 
cely budou vyžadovat r ůznou vodní láze ň nebo teplotu vyh řívaných 
bloků k zajištění toho, aby byl doty čný receptor k ůže temperován na 
svůj fyziologický standard. Vlhkost by m ěla být přednostně v rozmezí 
30 až 70 %.  
1.4.10  Doba trvání expozice a vzorkování  
Expozice k ůže zkoušenému p řípravku m ůže trvat po celou dobu 
experimentu nebo po kratší doby (tj. m ůže imitovat specifické typy 
lidské expozice). K ůže by m ěla být omytím zbavena nadbytku 
zkušebního preparátu relevantním čisticím činidlem a tato činidla 
by měla být sebrána pro ú čely analýzy. Tyto postupy o čištění od 
zkoušeného p řípravku závisí na p ředpokládaných podmínkách 
použití a m ěly by být zd ůvodněny. Obvykle se požaduje doba vzor ­
kování 24 hodin, aby bylo možno dostate čně charakterizovat 
absorpční profil. Doba vzorkování by za normálních okolností 
neměla přesáhnout 24 hodin, nebo ť po této dob ě se neporušenost 
kůže může začít horšit. V p řípadě zkoušených látek rychle pronika ­
jící kůží to nemusí být nutné, v p řípadě látek pronikajících k ůží 
pomalu však není vylou čena nutnost delších dob. Frekvence vzorko ­
vání recep ční tekutiny by m ěla umožnit grafickou prezentaci 
absorpční profil zkoušené látky.  
1.4.11  Terminální postupy  
Všechny složky zkušebního systému by m ěly být analyzovány a m ěl 
by být stanoven výt ěžek znovuzáchytu. To zahrnuje donorovu 
komoru, oplachy povrchu k ůže, kožní preparát a recep ční 
tekutinu/komoru. V n ěkterých p řípadech m ůže být kůže frakciono ­
vána na exponovaný povrch k ůže a povrch k ůže pod přírubou cely 
a na frakce vrstvy  stratum corneum , epidermis a dermis k odd ěleným 
analýzám.  
1.4.12  Analýza  
Ve všech studiích by m ělo být dosaženo dostate čného znovuzáchytu 
(cílem by m ělo být dosažení st řední hodnoty 100 ± 10 % radio ­
aktivity). Množství zkoušené látky v receptorové tekutin ě, 
v kožním preparátu, ve zbytcích po o čištění povrchu k ůže 
a oplachu aparatury by m ěly být analyzováno vhodným postupem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. ÚDAJE  
Prezentovány by m ěly být údaje o analýze receptorové tekutiny, 
distribuci zkoušené chemické látky a časové závislosti absorp čního 
profilu. Pro podmínky expozice kone čnou dávkou by m ělo být 
vypočteno množství omyté z k ůže, množství spojené s k ůží (a 
v různých vrstvách k ůže, je-li analyzováno) a množství obsažené 
v recepční tekutin ě (podíl a množství nebo procentní podíl apliko ­
vané dávky). Absorpce k ůží může být v n ěkterých p řípadech vyjád ­ 
řena pouze užitím údaj ů o recepční tekutin ě. Zůstává-li však zkou ­ 
šená látka v k ůži při skončení studie, m ůže být nutné toto množství 
zahrnout do celkového absorbovaného množství (viz odkaz na lite ­
raturu 3, odstavec 66). Pro podmínky expozice neur čitou dávkou 
mohou údaje umožnit výpo čet permeabilní konstanty (Kp). Za t ěchto 
podmínek není absorbovaný procentní podíl relevantní.  
3. ZPRÁVY  
3.1 ZKUŠEBNÍ PROTOKOL  
Zkušební protokol musí zahrnout požadavky stanovené protokolem, 
včetně zdůvodnění použitého zkušebního systému, a m ěl by obsaho ­
vat: 
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha, fyzikáln ě-chemické vlastnosti (p řinejmenším 
molární hmotnost a rozd ělovací koeficient log P  ow ), čistota 
(radiochemická čistota),  
— identifika ční údaje (nap ř. číslo šarže),  
— rozpustnost v recep ční tekutin ě. 
Zkoušený p řípravek:  
— složení a zd ůvodnění použití,  
— homogenita.  
Zkušební podmínky:  
— zdroj a místo k ůže, metoda preparace, podmínky skladování p řed 
použitím, všechny p ředúpravy ( čištění, antibiotické ošet ření atd.), 
zjišťování neporušenosti k ůže, metabolický status, zd ůvodnění 
použití,  
— konstrukce cely, složení recep ční tekutiny, rychlost toku recep ční 
tekutiny nebo doby a postupy vzorkování,  
— podrobnosti aplikace zkoušeného p řípravku a kvantifikace apli ­
kované dávky,  
— doba expozice,  
— podrobnosti odstran ění zkoušeného p řípravku z k ůže, např. opla­
chem kůže, 
— podrobnosti analýzy k ůže a frakciona čních postup ů použitých ke 
zjištění distribuce v k ůži, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— postupy mytí cely a za řízení,  
— metody stanovení, extrak ční postupy, meze detekce a validace 
analytických metod.  
Výsledky:  
— celkový znovuzáchyt experimentu (aplikovaná dávka = obsah 
v mycích činidlech z k ůže + obsah v k ůži + obsah v recep ční 
tekutině + obsah v mycích činidlech cely),  
— tabelované výsledné znovuzáchyty jednotlivých cel v každém 
kompartmentu,  
— absorp ční profil,  
— tabelované absorp ční údaje (vyjád řené jako podíl, množství nebo 
procentní podíl).  
Rozbor výsledk ů. 
Závěry. 
4. LITERATURA  
1) Zkušební metoda B.44 Absorpce k ůží: metoda  in vivo . 
2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3) OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, 
Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.  
4) Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press, Boca Raton.  
5) Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Application s, RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, s. 237–241.
 
6) Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Application s. CRC 
Press, Boca Raton.  
7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
 
8) Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). 
Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191–205.
 
9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
10) Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et a l. (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11) Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
12) Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
13) Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlo ­
robenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356–365.  
Obrázek 1  
Příklad obvyklé konstrukce statické difusní cely pro studie perkutánní absorpce  in 
vitro
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46  DRÁŽD ĚNÍ KŮŽE IN VITRO : ZKUŠEBNÍ METODA ZA POUŽITÍ 
REKONSTRUOVANÉ LIDSKÉ EPIDERMIS  
ÚVOD  
1. Drážd ění kůže znamená tvorbu reverzibilního poškození k ůže po aplikaci 
zkoušené látky v délce 4 hodin (jak ji definuje globáln ě harmonizovaný 
systém klasifikace a ozna čování chemických látek (GHS) OSN a na řízení 
Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 16. prosince 2008 
o klasifikaci, ozna čování a balení látek a sm ěsí (1) (3)). Tato zkušební 
metoda poskytuje postup  in vitro , který lze použít k ur čení nebezpe čnosti 
dráždivých chemikálií (látek a sm ěsí) patřících v rámci systému GHS OSN 
a podle výše uvedeného na řízení EU o klasifikaci, ozna čování a balení látek 
a směsí (nařízení CLP) do kategorie 2 (1) (2) (3). V Evropské unii a dalších 
oblastech, které nep řijaly volitelnou kategorii 3 systému GHS OSN (slab ě 
dráždivé látky), se m ůže tato ZM rovn ěž používat k identifikaci nezat řídě­
ných látek, tzn. látek ozna čovaných v rámci systému GHS OSN a podle 
nařízení CLP Evropské unie výrazem „Bez kategorie“ (1) (3). Tuto ZM lze 
používat k ur čení dráždivých ú činků chemických látek na k ůži jakožto 
samostatnou zkoušku nahrazující zkoušky drážd ění kůže in vivo  v rámci 
strategie odstup ňovaného zkoušení (4 a kapitola B.4 této p řílohy).  
2. Hodnocení drážd ění kůže obvykle zahrnovalo používání laboratorních zví řat 
(zkušební metodika OECD č. 404; kapitola B.4 této p řílohy) (4). 
V souvislosti s ohledy na dobré životní podmínky zví řat byla metoda 
podle kapitoly B.4 v roce 2004 p řepracována, aby umož ňovala určit polep­
tání/drážd ění kůže uplatněním strategie odstup ňovaného zkoušení za použití 
validovaných metod  in vitro  a ex vivo , takže lze zabránit bolesti a utrpení 
zvířat. Tři validované zkušební metody  in vitro  byly přijaty jako zkušební 
metodiky OECD č. 430, 431 a 435 (5) (6) (7) a dv ě z nich jako 
kapitoly B.40a B.40 a této p řílohy a mají se používat pro tu část strategie 
odstupňovaného zkoušení podle kapitoly B.4 nebo zkušební metodika 
OECD č. 404, která se týká poleptání (4).  
3. Tato ZM se týká ukazatel ů dráždění kůže z hlediska lidského zdraví. Je 
založena na použití rekonstruované lidské epidermis, která svým celkovým uspořádáním (použitím netransformovaných keratinocyt ů získaných z lidské 
epidermis jakožto zdroje bun ěk, a použitím reprezentativní tkán ě 
a cytoarchitektury) v ěrně napodobuje biochemické a fyziologické vlastnosti 
svrchních částí lidské k ůže, tj. epidermis. Tato ZM rovn ěž obsahuje sadu 
standardů funkčnosti (P říloha 2) pro posuzování podobných 
a modifikovaných metod založených na použití rekonstruované lidské 
epidermis vyvinutou Evropským st řediskem pro validaci alternativních 
metod (EC-ECVAM) (8), v souladu se zásadami uvedenými v Pokynu OECD č. 34 (9).
 
4. K dispozici jsou t ři ověřené metody, které se drží této ZM. Pro zkušební 
metodu  in vitro  za použití rekonstruované lidské epidermis, komer čně 
dostupné jako EpiSkin  TM , (označenou jako validovaná referen ční metoda 
– VRM) byly provedeny prevalida ční, optimaliza ční a valida ční studie (10) 
(11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20). Dv ě další komer čně 
dostupné metody in vitro  pro zkoušení drážd ění kůže za použití rekonstru ­
ované lidské epidermis vykazují podle validace na základ ě standardů funkč­
nosti podobné výsledky jako VRM (21). Jedná se o metody EpiDerm  TM 
SIT (EPI-200) a SkinEthic  TM RHE (22).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Nežli lze pro regula ční účely použít navrhovanou podobnou nebo modifi ­
kovanou zkoušku  in vitro  za použití rekonstruované lidské epidermis – 
jinou než VRM a zkušební metody EpiDerm  TM SIT (EPI-200) nebo SkinE ­
thic  TM RHE – je zapot řebí stanovit její spolehlivost, relevantnost (p řesnost) 
a omezení týkající se jejího navrhovaného použití, aby se zajistilo, že je lze 
považovat za srovnatelné s odpovídajícími ukazateli VRM v souladu se 
standardy funk čnosti stanovenými v této ZM (dodatek 2). Krom ě toho se 
doporučuje před zahájením vývoje a validace podobné nebo modifikované 
metody  in vitro  za použití rekonstruované lidské epidermis a jejím p ředlo­ 
žením k p řijetí regula čním orgánem prostudovat si vysv ětlující dokument 
OECD o zkoumání drážd ění kůže in vitro  (23).  
DEFINICE  
6. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.  
VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ  
7. Jak prokazuje valida ční studie (16), omezením této ZM je to, že neumo ­ 
žňuje zatřídění chemických látek do volitelné kategorie 3 v rámci systému 
GHS OSN (slab ě dráždivé látky) (1). Pokud se tato ZM používá jako 
částečná náhradní zkouška, m ůže být nezbytné následné testování  in vivo , 
aby bylo možno pln ě charakterizovat potenciál látky dráždit k ůži 
(4 a kapitola B.4 této p řílohy). Je známo, že použití lidské k ůže je před­
mětem vnitrostátních a mezinárodních etických úvah a podmínek.  
8. Tato ZM se týká té části strategie odstup ňovaného zkoušení poleptání nebo 
dráždění kůže podle kapitoly B.4 (zkušební metodika OECD č. 404), která 
spočívá ve zkoušce drážd ění kůže in vitro  (4). Jelikož tato ZM neposkytuje 
odpovídající informace o poleptání k ůže, je třeba poznamenat, že kapitola 
B.40a (zkušební metodika OECD č. 431) o poleptání k ůže je založena na 
tomtéž zkušebním systému za použití rekonstruované lidské epidermis, 
i když podle jiného protokolu (kapitola B.40a). Tato metoda je založena 
na modelech rekonstruované lidské epidermis s použitím lidských keratino ­
cytů, které proto p ředstavují cílový orgán  in vitro  zájmového biologického 
druhu. Krom ě toho se p římo týká prvního stupn ě zánětlivé kaskády/mecha ­
nismu účinku (poškození bun ěk a poškození tkání vedoucí ke vzniku loka ­
lizovaného traumatu), k n ěmuž dochází p ři podrážd ění in vivo . Při validaci 
této ZM byla testována široká škála chemických látek a empirická databáze validační studie obsahuje celkem 58 látek (16) (18) (23). Týká se to 
pevných látek, kapalin, polotuhých látek a vosk ů. Kapaliny mohou být 
vodné či nevodné, pevné látky mohou být ve vod ě rozpustné či neroz­
pustné. Pevné látky by se p řed aplikací m ěly pokud možno rozm ělnit do 
podoby jemného prášku; žádná další p ředběžná úprava vzorku není nutná. 
Plyny a aerosoly dosud nebyly ve valida ční studii hodnoceny (24). A čkoli 
není jejich zkoušení postupem za použití rekonstruované lidské epidermis 
teoreticky vylou čeno, současná ZM zkoušení plyn ů a aerosol ů neumožňuje. 
Je třeba také poznamenat, že velmi barevné chemické látky mohou ovlivnit 
měření životaschopnosti bun ěk, a je proto za ú čelem korekcí nutno použít 
přizpůsobené kontroly (viz odstavce 24 až 26).  
9. U zkoušené látky s jednozna čným zatříděním by m ělo stačit jedno 
provedení zkoušky za použití t ří tkáňových replikát ů. Avšak v p řípadě 
hraničních výsledk ů, jako jsou nap říklad nesouhlasné výsledky opakova ­
ných m ěření a/nebo pr ůměrná hodnota životaschopnosti ve výši 
50 ± 5 %, by se m ělo zvážit druhé provedení zkoušky, jakož i t řetí 
provedení zkoušky v p řípadě nesouhlasných výsledk ů mezi prvními 
dvěma provedeními zkoušky.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
PODSTATA ZKOUŠKY  
10. Zkoušená látka se místn ě nanese na trojrozm ěrný model rekonstruované 
lidské epidermis tvo řené netransformovanými keratinocyty získanými 
z lidské epidermis, které byly kultivovány tak, aby vytvo řily vícevrstvý, 
vysoce diferenciovaný model lidské  epidermis . Skládá se z uspo řádaných 
bazálních, výb ěžkovitých a granulárních vrstev a vícevrstevného  stratum 
corneum , jež obsahuje mezibun ěčné lamelární lipidové vrstvy p ředstavující 
hlavní třídy lipidů analogické t ěm, které se nacházejí  in vivo . 
11. Chemicky vyvolané podrážd ění kůže, které se projevuje zarudnutím (ery ­
tém) a otokem (edém), je výsledkem kaskády událostí, která za číná pronik ­
nutím látky skrze  stratum corneum  a poškozením pod ním ležících vrstev 
keratinocyt ů. Z umírajících keratinocyt ů se uvol ňují mediátory, které 
zahajují zán ětlivou kaskádu, jež p ůsobí na bu ňky v  dermis , zejména na 
stromatické a endoteliální bu ňky. Jedná se o rozší ření a zvýšení propust ­
nosti endoteliálních bun ěk, při němž vzniká pozorovaný erytém a edém 
(24). Metody založené na použití rekonstruované lidské epidermis m ěří 
počáteční události kaskády.  
12. Životaschopnost bun ěk modelů rekonstruované lidské epidermis se m ěří 
enzymatickou p řeměnou vitálního barviva MTT [3–(4,5-dimethylthiazol-2- 
yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid, thiazolylová mod ř, číslo CAS 
298–93-1] na s ůl modrého formazanu, jehož množství se zm ěří po extrakci 
z tkání (25). Dráždivé látky se zjiš ťují na základ ě jejich schopnosti snižovat 
životaschopnost bun ěk pod definované prahové úrovn ě (tj. ≤ 50 % pro 
dráždivé látky pat řící v rámci systému GHS OSN a podle na řízení CLP 
Evropské unie do kategorie 2). V závislosti na právním rámci, v n ěmž se 
výsledky této ZM používají, lze chemické látky, p ři jejichž použití života ­
schopnost bun ěk přesahuje stanovenou prahovou úrove ň, považovat za 
nedráždivé (tzn. > 50 %, „Bez kategorie“).  
PROKÁZÁNÍ ZP ŮSOBILOSTI  
13. Před zahájením b ěžného používání n ěkteré z těchto tří validovaných metod, 
které se drží této ZM, by m ěly laborato ře prokázat svoji technickou zp ůso­
bilost za použití deseti srovnávacích látek uvedených v tabulce 1. V p řípadě 
podobných metod vyvinutých podle této ZM nebo v p řípadě modifikací 
kterékoli ze t ří validovaných metod je nutno splnit požadavky standard ů 
funkčnosti uvedené v P říloze 2 této ZM, nežli lze metodu za čít používat pro 
účely regula čního zkoušení.  
14. V rámci prokazování zp ůsobilosti se doporu čuje, aby uživatel po obdržení 
modelu rekonstruované lidské epidermis ov ěřil bariérové vlastnosti tkání 
uvedené jeho výrobcem. To je zvlášt ě důležité v p řípadě, že se tkán ě 
zasílají na dlouhé vzdálenosti nebo že jejich p řeprava trvá dlouhou dobu. 
Pokud je metoda úsp ěšně zavedena a je prokázána zp ůsobilost správn ě tuto 
metodu používat, není nutno b ěžně provádět takové ov ěřování. Při běžném 
používání metody se však doporu čuje i nadále v pravidelných intervalech 
bariérové vlastnosti posuzovat.  
Tabulka 1  
Srovnávací látky  ( 1 ) 
Chemická látka Číslo CAS Skóre  in vivo  ( 2 ) Skupenství Kategorie podle GHS 
OSN/ nařízení 
CLP EU  
kyselina naftalen-1-octová 86-87-3 0 pevné Bez kategorie 
isopropylalkohol 67-63-0 0,3 kapalné Bez kategorie  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Chemická látka Číslo CAS Skóre  in vivo  ( 2 ) Skupenství Kategorie podle GHS 
OSN/ nařízení 
CLP EU  
methyl-stearát 112-61-8 1 pevné Bez kategorie 
heptyl-butyrát 5870-93-9 1,7 kapalné Bez kategorie 
(Volitelná kat. 
3) ( 3 ), ( 4 ) 
hexyl-salicylát 6259-76-3 2 kapalné Bez kategorie 
(Volitelná kat. 
3) ( 3 ), ( 4 ) 
cyklamenaldehyd 103-95-7 2,3 kapalné Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 2,7 kapalné Kat. 2 hydroxid sodný (5 % vod.) 1310-58-3 3 kapalné Kat. 2 3-fenyl-1-methylpiperazin 5271-27-2 3,3 pevné Kat. 2 heptanal 111-71-7 3,4 kapalné Kat. 2
 
( 1 ) Tyto srovnávací látky jsou podmnožinou srovnávacích látek použitých ve valida ční studii. 
( 2 ) Skóre  in vivo  podle kapitoly B.4 a zkušební metodiky OECD č. 404 (4). 
( 3 ) rámci této zkušební metody se látky pat řící podle systému GHS OSN do volitelné kategorie 3 (slab ě dráždivé látky) (1) považují za 
látky s ozna čením „Bez kategorie“. 
( 4 ) Podle na řízení CLP Evropské unie nelze volitelnou kategorii 3 systému GHS OSN použít.  
POSTUP  
15. Následuje popis složek a postup ů zkušební metody s použitím rekonstru ­
ované lidské epidermis p ři hodnocení drážd ění kůže. Měl by být rekon ­
struován model lidské epidermis a lze jej rovn ěž připravit intern ě nebo 
získat na trhu. K dispozici jsou standardní provád ěcí postupy pro metody 
EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) a SkinEthic  TM RHE (26) (27) (28). 
Zkoušení by se m ělo provád ět následujícím zp ůsobem:  
Složky zkušební metody s použitím rekonstruované lidské epidermis  
Všeobecné podmínky  
16. K rekonstrukci epitelu je zapot řebí použít netransformované lidské kerati ­
nocyty. Pod funk čním stratum corneum  by měly být přítomno n ěkolik 
vrstev životaschopných epitelových bun ěk (bazální vrstva,  stratum spino ­
sum, stratum granulosum ). Stratum corneum  by mělo být vícevrstevné 
a obsahovat profil esenciálních lipid ů k vytvoření funkční bariéry robustní 
natolik, aby vzdorovala rychlému pr ůniku cytotoxických látek markeru, 
např. dodecylsulfátu sodného (SDS) nebo p řípravku Triton X-100. Funkce 
bariéry by m ěla být prokázána a lze ji hodnotit bu ď určením koncentrace, 
při níž látka markeru snižuje životaschopnost tkání o 50 % (IC  50 ) po pevn ě 
stanovené expozi ční době, nebo stanovením expozi ční doby pot řebné ke 
snížení životaschopnosti bun ěk o 50 % (ET  50 ) po aplikaci látky markeru 
v pevně stanovené koncentraci. Zadržovací vlastnosti modelu rekonstru ­
ované lidské epidermis by m ěly zabránit pr ůchodu materiálu v oblasti  
stratum corneum  do životaschopné tkán ě, což by vedlo k nesprávnému 
modelování expozice k ůže. Model rekonstruované lidské epidermis by 
neměl být kontaminován bakteriemi, viry, mykoplazmaty ani houbovými 
mikroorganismy.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Funkční podmínky  
Životaschopnost  
17. K ur čení míry životaschopnosti se používá zkouška MTT (25). Uživatelé 
modelu rekonstruované lidské epidermis by m ěli zajistit, aby každá použitá 
šarže modelu rekonstruované lidské epidermis spl ňovala stanovená kritéria 
pro negativní kontrolu. Optická hustota (OD) samotného extrak čního 
rozpouštědla by m ěla být dostate čně malá, tzn. OD < 0,1. Rozsah p řijatel­
nosti (horní a dolní mez) pro hodnoty OD negativní kontroly (za podmínek 
zkušební metody pro ur čení drážd ění kůže) stanoví subjekt, který vyvinul 
nebo dodává model rekonstruované lidské epidermis, a rozsahy p řijatelnosti 
pro 3 validované metody jsou uvedeny v tabulce 2. Je t řeba doložit, že 
tkáně ošetřené negativní kontrolou jsou stabiln ě kultivovány (poskytují 
podobné nam ěřené hodnoty životaschopnosti) po dobu trvání zkušební 
doby expozice.  
Tabulka 2  
Rozsahy p řijatelnosti pro hodnoty OD negativní kontroly  
Dolní mez p řijatelnosti Horní mez p řijatelnosti  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Bariérová funkce  
18. Stratum corneum  a jeho lipidové složení by m ělo dostačovat na to, aby odolá ­
valo rychlému pr ůniku cytotoxických látek markeru, nap ř. SDS nebo Triton 
X-100, podle odhadu na základ ě hodnoty IC  50 nebo ET  50 (tabulka 3).  
Morfologie  
19. Mělo by se provést histologické vyšet ření modelu rekonstruované lidské 
epidermis, které prokáže strukturu podobnou lidské  epidermis  (včetně více­
vrstevného  stratum corneum ). 
Reprodukovatelnost  
20. Výsledky zkušební metody za použití pozitivní kontrolní látky a negativních 
kontrol by m ěly prokázat reprodukovatelnost v pr ůběhu času. 
Kontrola kvality  
21. Subjekt, který vyvinul nebo dodává model rekonstruované lidské epidermis, 
by měl zajistit a prokázat, že každá použitá šarže modelu rekonstruované 
lidské epidermis spl ňuje stanovená produk ční kritéria pro uvoln ění do 
oběhu, přičemž mezi nejvýznamn ější z nich pat ří kritéria  životaschopnosti  
(odstavec 17),  bariérové funkce  (odstavec 18) a  morfologie  (odstavec 19). 
Tyto údaje by m ěly být poskytovány uživatel ům metody, aby je mohli uvést 
v protokolu o zkoušce. Rozsah p řijatelnosti (horní a dolní mez) pro IC  50 
nebo ET  50 je zapotřebí zjistit u subjektu, který model rekonstruované lidské 
epidermis vyvinul nebo dodává (nebo u zkoušejícího, pokud se používá vlastní model). Pro spolehlivou predikci zat řídění zkoušené látky co do 
dráždivosti mohou být p řijatelné pouze výsledky získané za použití náleži ­
tých tkání. Jako p říklad jsou v tabulce 3 uvedeny rozsahy p řijatelnosti pro 
tři validované referen ční metody.
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabulka 3  
Příklady kritérií kontroly kvality pro uvoln ění šarže do ob ěhu 
Dolní mez p řijatelnosti Horní mez p řijatelnosti  
EpiSkin  TM (SM) 
(18 hodin expozice za použití 
SDS) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100)(27) ET 50 = 4,8 hod. ET  50 = 8,7 hod. 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100)(28) ET 50 = 4,0 hod. ET  50 = 9,0 hod.  
Aplikace zkoušené látky a kontrolní látky  
22. Pro každou zkoušenou látku a pro kontroly by se p ři každém provedení 
zkoušky m ěly použít alespo ň tři replikáty. V p řípadě kapalných a pevných 
látek je zapot řebí nanést dostate čné množství zkušební látky, aby rovno ­
měrně pokryla povrch  epidermis , a současně se vyhnout nekone čné dávce, 
tzn. že je t řeba použít nejmén ě 25 μL/cm  2 nebo 25 mg/cm  2 . V případě 
pevných látek je nutno povrch  epidermis  před nanesením zvlh čit deionizo ­
vanou nebo destilovanou vodou, aby se zlepšil kontakt zkoušené látky 
s povrchem  epidermis . Pevné látky by se m ěly pokud možno zkoušet ve 
formě jemného prášku. Na konci expozi ční doby je nutno zkušební látku 
pečlivě spláchnout z povrchu  epidermis  vodným pufrem nebo 0,9 % 
roztokem NaCl. V závislosti na tom, která ze t ří validovaných metod 
s použitím rekonstruované lidské epidermis se použije, se doba expozice pohybuje v rozmezí od 15 do 60 minut a teplota inkubace v rozmezí od 20 do 37 °C. Tyto expozi ční doby a teploty jsou optimalizovány pro každou 
metodu s použitím rekonstruované lidské epidermis a p ředstavují r ůzné 
inherentní vlastnosti doty čných metod. Podrobnosti viz standardní provád ěcí 
postupy jednotlivých metod (26) (27) (28).
 
23. Při každém provedení zkoušky by se m ěly používat soub ěžné negativní 
kontroly a pozitivní kontroly, aby se prokázalo, že životaschopnost (p ři 
použití negativní kontroly), bariérová funkce a výsledná tká ňová citlivost 
tkání (při použití pozitivní kontroly) jsou v rámci stanoveného rozp ětí 
dosavadních hodnot p řijatelnosti. Navrhovanou pozitivní kontrolou je 5 % 
vodný SDS. Navrhovanými látkami pro negativní kontrolu jsou voda a fosfátový pufrový fyziologický roztok (PBS).
 
Měření životaschopnosti bun ěk 
24. Nejd ůležitějším prvkem zkušebního postupu je to, že se m ěření života ­
schopnosti neprovádí okamžit ě po expozici p ůsobení zkoušených látek, 
ale až po dostate čně dlouhé inkuba ční době po ošetření tkání opláchnutých 
v čerstvém médiu. Tato doba umož ňuje jak regeneraci po slabých dráždi ­
vých účincích, tak i vznik jasných známek cytotoxických ú činků. Během 
optimaliza ční fáze zkoušky (11) (12) (13) (14) (15) se jako optimální 
ukázala 42 hodinová inkuba ční doba po ošet ření. 
25. Zkouška MTT je kvantitativní validovaná metoda, která by se m ěla 
používat k m ěření životaschopnosti bun ěk podle této ZM. Je slu čitelná 
s použitím trojrozm ěrné tkáňové soustavy. Vzorek tkán ě se na dobu 3 
hodin vloží do roztoku MTT o vhodné koncentraci (nap ř. 0,3 až 
1 mg/ml). Vysrážený modrý formazan se poté extrahuje z tkán ě pomocí 
rozpouštědla (např. isopropylalkoholu nebo kyselého isopropylalkoholu) 
a koncentrace formazanu se zm ěří určením OD p ři vlnové délce 570 nm 
za použití filtru o pásmové propustnosti nejvýše ± 30 nm.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Optické vlastnosti zkoušené látky nebo její chemické p ůsobení na MTT 
mohou zkoušku ovlivnit, což vede k nepravdivému odhadu životaschop ­
nosti (protože zkoušená látka m ůže zabránit vybarvení, zm ěnit zabarvení 
v opačné, nebo naopak m ůže vybarvení zp ůsobit). K tomu m ůže dojít 
v případě, že se ur čitá zkoušená látka opláchnutím z tkán ě zcela neodstraní 
nebo že pronikne do  epidermis . Jestliže zkoušená látka p ůsobí přímo na 
MTT (tzn. že jej redukuje), má p řirozené zabarvení nebo se zabarví b ěhem 
svého působení na tká ň, pak jsou ke zjišt ění interference zkoušené látky 
s postupem m ěření životaschopnosti bun ěk a ke korekci této interference 
zapotřebí dodate čné kontroly. Podrobný popis, jak korigovat p římou redukci 
MTT a interference zp ůsobené barvivy, naleznete ve standardních provád ě­
cích postupech výše uvedených t ří validovaných metod (26) (27) (28).  
Kritéria p řijatelnosti  
27. U každé metody s použitím platných šarží modelu rekonstruované lidské 
epidermis (viz odstavec 21) by tkán ě ošetřené negativní kontrolou m ěly 
vykazovat hodnoty OD odrážející kvalitu tkání, která vznikla po všech 
přepravních a p řejímacích krocích a po všech procesech podle protokolu 
zkoušky. Hodnoty OD kontrol by nem ěly být pod dosud zjišt ěnými dolními 
hranicemi. Podobn ě by tkáně ošetřené pozitivní kontrolou, tj. 5 % vodným 
SDS, m ěly odrážet svou schopnost reagovat na dráždivou látku 
v podmínkách ZM (26) (27) (28). Je nutno vymezit související vhodné hodnoty variability mezi tká ňovými replikáty (nap ř. pokud se používají 
standardní odchylky (SD), m ěly by být v rozmezí jednostranného 95 % 
tolerančního intervalu vypo čteného z dosavadních údaj ů; u VRM by m ěla 
být SD < 18 %).
 
Interpretace výsledk ů a predik ční model  
28. Hodnoty OD získané s každou zkoušenou látkou lze použít k výpo čtu 
procentuálního podílu životaschopnosti bun ěk normalizovaného podle nega ­
tivní kontroly, která je stanovena na 100 %. Je zapot řebí jasně vymezit, 
zdokumentovat a v p řípadě potřeby prokázat mezní hodnotu procentuálního 
podílu životaschopnosti bun ěk odlišující dráždivou látku od nezat říděných 
zkoušených látek a statistický postup (statistické postupy) použité k vyhodnocení výsledk ů a identifikaci dráždivých látek. Mezní hodnoty 
pro predikci drážd ění jsou uvedeny níže:
 
— Zkoušená látka je považována za dráždivou pro k ůži v souladu 
s kategorií 2 v rámci systému GHS OSN nebo podle na řízení CLP 
Evropské unie, jestliže je životaschopnost tkán ě po expozici 
a inkubaci po ošet ření menší nebo rovna ( ≤) 50 %.  
— V závislosti na právním rámci, v n ěmž se výsledky této ZM používají, 
lze zkoušenou látku považovat za nedráždivou pro k ůži v souladu 
s označením „Bez kategorie“ v rámci systému GHS OSN nebo podle 
nařízení CLP Evropské unie, jestliže je životaschopnost tkán ě po expo­
zici a inkubaci po ošet ření větší než (>) 50 %.  
ÚDAJE A VYKAZOVÁNÍ  
Údaje  
29. Za každé provedení zkoušky by se údaje získané za použití jednotlivých 
tkáňových replikát ů (např. hodnoty OD a vypo čítané údaje procentuální 
životaschopnosti bun ěk pro každou zkoušenou látku, a to v četně jejího 
zatřídění) měly vykazovat ve form ě tabulky, pop řípadě včetně údajů 
z opakovaných experiment ů. Navíc je za každé provedení zkoušky nutno 
vykázat pr ůměr ± standardní odchylku. Pozorované interakce s činidlem 
MTT a barevnými zkoušenými látkami je nutno uvád ět za každou zkou ­ 
šenou látku.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Protokol o zkoušce  
30. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat následující informace:  
Zkoušená látka a kontrolní látka:  
— chemický název (chemické názvy), nap říklad název CAS a číslo CAS, 
název a číslo podle klasifikace ES, jsou-li známy,  
— čistota a složení látky (v hmotnostních procentech),  
— fyzikáln ě-chemické vlastnosti významné pro provád ění studie (nap ř. 
skupenství, stabilita, t ěkavost, pH a rozpustnost ve vod ě, jsou-li známy),  
— případné ošet ření zkoušených/kontrolních látek p řed zkouškou (nap ř. 
zahřívání, mletí),  
— podmínky uchovávání.  
Odůvodnění použitého modelu rekonstruované lidské epidermis a protokolu  
Zkušební podmínky:  
— použitý bun ěčný systém,  
— úplné podklady ke konkrétnímu použitému modelu rekonstruované 
lidské epidermis v četně jeho chování p ři zkoušce. Ty by m ěly zejména 
zahrnovat:  
i) životaschopnost,  
ii) bariérovou funkci,  
iii) morfologii,  
iv) reprodukovatelnost a p ředvídatelnost,  
v) kontroly kvality modelu,  
— podrobnosti použitého zkušebního postupu,  
— použité zkušební dávky, doba expozice a doba inkubace po ošet ření, 
— popis jakýchkoli úprav zkušebního postupu,  
— odkaz na dosavadní údaje modelu. Ty by m ěly zejména zahrnovat:  
i) přijatelnost údaj ů z kontrol kvality s odkazem na dosavadní údaje 
o šaržích,  
ii) přijatelnost hodnot pozitivních a negativních kontrol s odkazem na 
průměry a rozsahy pozitivních a negativních kontrol,  
— popis použitých kritérií hodnocení v četně odůvodnění volby mezní 
hodnoty pro predik ční model,  
— odkaz na dosavadní údaje kontrol.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Výsledky:  
— údaje pro jednotlivé zkoušené látky za každé provedení zkoušky 
a měření každého replikátu, uspo řádané do podoby tabulek,  
— přehled kontrol použitých pro látky, které p římo redukují MTT, a/nebo 
pro zbarvující zkoušené látky,  
— popis ostatních pozorovaných ú činků. 
Rozbor výsledk ů 
Závěr 
LITERATURA  
(1) UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. K dispozici na adrese: [http://www.unece.org/trans/danger/ publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html].
 
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards“, issued by the ECVAM Scientific Advi ­
sory Committee (ESAC30), 9 April 2009. K dispozici na adrese: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].
 
(3) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 
16. prosince 2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek a sm ěsí, 
o změně a zrušení sm ěrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zm ěně 
nařízení (ES) č. 1907/2006. Ú ř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.  
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. K dispozici na adrese: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].  
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines].
 
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. K dispozici 
na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].  
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? K dispozici na 
adrese: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].  
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. 
K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), 
A prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57–93.  
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in 
Vitro 16, 765–770.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351–367.  
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329–349.
 
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109–129.
 
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., 
Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559–601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
K dispozici na adrese: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].  
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603–619.
 
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 
351–358.
 
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. K dispozici na adrese: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].
 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. K dispozici na adrese: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].  
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  
tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advi ­
sory Committee (ESAC29), 5 November 2008. K dispozici na adrese: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].
 
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assess ­
ment, No. 137, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/ document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html].
 
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231–243.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55–63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min. – 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. K dispozici na adrese: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].
 
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). K dispozici na adrese: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].
 
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of 
chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. K dispozici 
na adrese: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7–18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.
 
(30) Směrnice Komise 2001/59/ES ze dne 6. srpna 2001, kterou se po dvacáté 
osmé přizpůsobuje technickému pokroku sm ěrnice Rady 67/548/EHS 
o sbližování právních a správních p ředpisů týkajících se klasifikace, balení 
a označování nebezpe čných látek, Ú ř. věst. L 225, 21.8.2001, s. 1.  
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1–4.
 
(32) Jírová, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlová, K., Bendová, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irrita ­
tion and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal  in vivo  data, ALTEX, 14, 359–365.  
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Derma ­
titis, 62, 109–116.
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Dodatek 1  
Definice  
Přesnost:  Blízkost shody mezi výsledky zkušební metody a uznávanými referen ­ 
čními hodnotami. Je to míra funk čnosti zkušební metody a jeden z aspekt ů její 
relevantnosti. Tento výraz se často používá namísto výrazu „soulad“ a rozumí se 
jím podíl správných výsledk ů zkušební metody (9).  
Životaschopnost bun ěk: Parametr m ěřící celkovou aktivitu bun ěčné populace, 
např. jako schopnost bun ěčných mitochondriálních dehydrogenáz redukovat 
vitální barvivo MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium- bromid, thiazolylová mod ř), které v závislosti na nam ěřené hodnot ě a koncepci 
použité zkoušky koreluje s celkovým po čtem a/nebo vitalitou živých bun ěk.
 
Soulad:  Je měřítkem funk čnosti u zkušebních metod poskytujících kategorické 
výsledky a je jedním z aspekt ů její relevantnosti. Tento výraz se používá namísto 
výrazu „p řesnost“ a je vymezen jako podíl všech zkoušených látek, které jsou 
správně zatříděny jako pozitivní nebo negativní (9).  
ET 50 : Tuto hodnotu lze odhadnout na základ ě určení doby expozice pot řebné 
k tomu, aby se životaschopnost bun ěk snížila o 50 % po aplikaci látky markeru 
v pevně stanovené koncentraci, viz rovn ěž IC  50 . 
Nařízení CLP Evropské unie (na řízení Evropského parlamentu a Rady (ES) 
č. 1272/2008 ze dne 16. prosince 2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek 
a směsí): Toto na řízení provádí v Evropské unii (EU) systém GHS OSN pro 
klasifikace a ozna čování chemikálií (látek a sm ěsí) (3).  
GHS (Globáln ě harmonizovaný systém klasifikace a ozna čování chemických látek 
vypracovaný Organizací spojených národ ů (OSN)):  Systém navrhující klasifikaci 
chemikálií (látek a sm ěsí) podle standardizovaných typ ů a úrovní fyzikální, 
zdravotní a environmentální nebezpe čnosti a řešící příslušné komunika ční prvky, 
jako jsou výstražné symboly nebezpe čnosti, signální slova, standardní v ěty 
o nebezpe čnosti, pokyny pro bezpe čné zacházení a bezpe čnostní listy, za ú čelem 
poskytování informací o jejich nežádoucích ú čincích s ohledem na ochranu lidí 
(včetně zaměstnavatelů, pracovník ů, přepravců, spotřebitelů a osob reagujících na 
havárie) a životního prost ředí (1).  
IC 50 : Tuto hodnotu lze odhadnout na základ ě určení koncentrace, p ři níž látka 
markeru snižuje životaschopnost tkání o 50 % (IC  50 ) po pevn ě stanovené dob ě 
expozice, viz rovn ěž ET  50 . 
Nekonečná dávka:  Množství zkušební látky nanesené na  epidermis , které přesa­
huje množství pot řebné k úplnému a rovnom ěrnému pokrytí povrchu  epidermis . 
Zkouška typu „me-too“:  Hovorový výraz pro zkušební metodu, která je struktu ­
rálně a funkčně podobná validované a uznávané referen ční zkušební metod ě. 
Taková zkušební metoda by byla kandidátem pro dodate čnou validaci. Používá 
se namísto podobné zkušební metody (9).  
Standardy funk čnosti:  Standardy založené na validované referen ční metodě, které 
slouží jako základ pro hodnocení srovnatelnosti navrhované zkušební metody, 
která je mechanicky a funk čně podobná. Pat ří mezi ně i) zásadní složky zkušební 
metody, i) minimální seznam srovnávacích látek vybraných z chemických látek používaných k prokázání p řijatelné funk čnosti validované referen ční metody a iii) 
srovnatelné hladiny p řesnosti a spolehlivosti založené na hodnotách získaných 
u validované referen ční metody, jež by navrhovaná zkušební metoda m ěla prokázat 
při vyhodnocení za použití minimálního seznamu srovnávacích látek (9).
 
Srovnávací látky:  Chemické látky zvolené k použití p ři procesu validace, pro n ěž 
jsou již známy odezvy v rámci zkušebního systému  in vitro  nebo  in vivo  nebo 
odezvy u biologického druhu, který je p ředmětem zájmu daného zkoumání. Tyto 
chemické látky by m ěly být reprezentativními zástupci t říd chemických látek, 
u nichž se p ředpokládá používání doty čné zkušební metody, a m ěly by před­
stavovat celou škálu reakcí, jež lze o čekávat u chemických látek, pro n ěž se 
může zkušební metoda používat, od silné p řes slabou až po negativní odezvu. 
Pro jednotlivé fáze procesu validace a pro r ůzné zkušební metody a r ůzná použití 
zkoušek mohou být pot řebné rozdílné sady srovnávacích látek (9).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Relevantnost:  Popis vztahu zkoušky k ú činku, který je p ředmětem zájmu, a také 
toho, zda je zkouška smysluplná a použitelná pro konkrétní ú čel. Vyjad řuje, do 
jaké míry zkouška správn ě měří nebo predikuje biologický ú činek, který je 
předmětem zájmu. Relevantnost zahrnuje také posouzení p řesnosti (shody) 
zkušební metody (9).  
Spolehlivost:  Míra, v jaké lze zkušební metodu provád ět reprodukovateln ě 
v rámci téže laborato ře i v rámci r ůzných laborato ří v průběhu doby, jestliže 
se provádí za použití stejného protokolu. Hodnotí se na základ ě výpočtu vnitro­
laboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti (9).  
Náhradní zkouška:  Zkouška, která je koncipována tak, aby nahradila b ěžně 
používanou a uznávanou zkoušku, která slouží ke ur čení nebezpe čnosti a/nebo 
posouzení rizika a u níž je zjišt ěno, že poskytuje stejnou nebo lepší úrove ň 
ochrany zdraví lidí nebo zví řat či případně ochrany životního prost ředí ve srov ­
nání s uznávanou zkouškou ve všech možných zkušebních situacích a pro všechny zkoušené látky (9).
 
Citlivost:  Podíl všech pozitivních/aktivních zkoušených látek, které jsou na 
základě zkoušky správn ě zatříděny. Je m ěřítkem přesnosti zkušební metody, 
která poskytuje kategorické výsledky, a je d ůležitým prvkem p ři hodnocení rele ­
vantnosti zkušební metody (9).  
Dráždění kůže: Vyvolání reverzibilního poškození k ůže po aplikaci zkoušené 
látky po dobu až 4 hodin. Drážd ění kůže je lokáln ě vznikající neimunogenní 
reakce, která se objevuje krátce po stimulaci (29). Její hlavní charakteristikou je reverzibilní povaha zahrnující zán ětlivé reakce a v ětšinu charakteristických 
klinických p říznaků podráždění (erytém, edém, sv ědění a bolest) souvisejících 
se zánětlivým procesem.
 
Specifičnost:  Podíl všech negativních/neaktivních zkoušených látek, které jsou na 
základě zkoušky správn ě zatříděny. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která 
poskytuje kategorické výsledky, a je d ůležitým prvkem p ři hodnocení relevant ­
nosti zkušební metody (9).  
Strategie odstup ňovaného zkoušení:  Zkoušení, které využívá metody zkoušení 
postupným zp ůsobem; zkušební metody se na každé následující úrovni volí na 
základě výsledků získaných na p ředchozí úrovni testování (9).  
Zkoušená látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs, která se zkouší za použití této 
zkušební metody.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Dodatek 2  
Standardy funk čnosti k posouzení navrhovaných podobných nebo 
modifikovaných metod pro zkoušení drážd ění kůže in vitro  za použití 
rekonstruované lidské  epidermis  
ÚVOD  
1. Účelem standard ů funkčnosti je stanovit základ, podle n ěhož lze ur čit, zda 
nové metody, a to jak chrán ěné (chrán ěné autorskými právy, chrán ěné 
ochrannými známkami, registrované), tak nechrán ěné, mají dostate čnou 
přesnost a spolehlivost pro konkrétní zkušební ú čely. Tyto standardy funk č­
nosti, založené na validovaných a uznávaných metodách, lze používat 
k hodnocení spolehlivosti a p řesnosti jiných podobných metod (hovorov ě 
označovaných jako zkoušky typu „me-too“), které jsou založeny na podob ­
ných vědeckých zásadách a m ěří nebo predikují tentýž biologický nebo 
toxický ú činek (9).  
2. Před přijetím modifikovaných metod (tzn. navrhovaných možných vylep ­ 
šení schválené zkušební metody) je t řeba provést posouzení, které ur čí 
dopad navrhovaných zm ěn na funk čnost zkoušky a také míru, v jaké tyto 
změny ovlivňují údaje, jež jsou k dispozici pro další složky procesu vali ­
dace. V závislosti na po čtu a povaze navrhovaných zm ěn, na výsledných 
údajích a podkladech pro tyto zm ěny by m ěly být navrhované metody 
podrobeny bu ď témuž procesu validace, jaký je stanoven pro novou 
zkušební metodu, nebo p řípadně omezenému posouzení spolehlivosti 
a relevantnosti za použití stávajících standard ů funkčnosti (9).  
3. Podobné metody (typu „me-too“) nebo modifikované metody odvozené od 
kterékoli ze t ří validovaných metod [EpiSkin  TM (validovaná referen ční 
metoda – VRM), EpiDerm  TM SIT (EPI-200) a SkinEthic  TM RHE] navrho ­
vané k použití v rámci této ZM je nutno vyhodnotit, aby se stanovila jejich spolehlivost a p řesnost za použití látek zastupujících celý rozsah Draizeho 
škály dráždivosti. P ři hodnocení za použití 20 srovnávacích látek doporu ­ 
čených ve standardech funk čnosti (tabulka 1) by navrhované podobné nebo 
modifikované metody m ěly mít hodnoty spolehlivosti a p řesnosti, které jsou 
srovnatelné nebo lepší než hodnoty získané p ři použití VRM (tabulka 2) (2) 
(16). Hodnoty spolehlivosti a p řesnosti, jichž by m ělo být dosaženo, jsou 
uvedeny v odstavcích 8 až 12 tohoto dodatku. Seznam srovnávacích látek obsahuje nezat říděné látky (ozna čované v rámci systému GHS OSN a podle 
nařízení CLP Evropské unie výrazem „Bez kategorie“) a zat říděné látky 
(patřící v rámci systému GHS OSN a podle na řízení CLP Evropské unie 
do kategorie 2) (1), které zastupují r ůzné třídy chemických látek, aby bylo 
možno spolehlivost a p řesnost (citlivost, specifi čnost a celkovou p řesnost) 
navrhované metody porovnat s odpovídajícími hodnotami VRM. Spolehli ­
vost metody, jakož i její schopnost správn ě určit dráždivé chemické látky 
patřící v rámci systému GHS OSN a podle na řízení CLP Evropské unie do 
kategorie 2 a – v závislosti na regula čním rámci, pro který jsou získávané 
údaje určeny – také její schopnost správn ě určit látky ozna čované v rámci 
systému GHS OSN a podle na řízení CLP Evropské unie výrazem „Bez 
kategorie“ je t řeba stanovit ješt ě před jejím použitím pro zkoušení nových 
zkušebních látek.
 
4. Tyto standardy funk čnosti jsou založeny na standardech funk čnosti vypracova ­
ných střediskem EC-ECVAM (8), aktualizovaných v souladu se systémy klasi ­
fikace a zna čení látek GHS OSN a CLP Evropské unie (1) (3). P ůvodní stan ­
dardy funk čnosti byly vymezeny po provedení valida ční studie (21) a byly 
založeny na klasifika čním systému EU stanoveném ve sm ěrnici 
Komise 2001/59/ES ze dne 6. srpna 2001, kterou se po dvacáté osmé p řizpů­
sobuje technickému pokroku sm ěrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních 
a správních p ředpisů týkajících se klasifikace, balení a ozna čování nebezpe č­
ných látek (  1 ). Vzhledem k p řijetí systému GHS OSN pro klasifikaci 
a označování látek i v rámci EU (na řízení CLP Evropské  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) Úř. věst. L 225, 21.8.2001, s. 1.
 unie) (3), k n ěmuž došlo v dob ě mezi provedením valida ční studie 
a vypracováním této ZM, byly standardy funk čnosti aktualizovány (8). Tato 
aktualizace spo čívá především ve zm ěnách i) sady srovnávacích látek uvede ­
ných ve standardech funk čnosti a ii) stanovených hodnot spolehlivosti 
a přesnosti (2) (23).  
STANDARDY FUNK ČNOSTI PRO ZKUŠEBNÍ METODY  IN VITRO  POUŽÍ­
VANÉ KE ZKOUŠKÁM DRÁŽD ĚNÍ KŮŽE ZA POUŽITÍ REKONSTRU ­
OVANÉ LIDSKÉ EPIDERMIS  
5. Standardy funk čnosti jsou tvo řeny těmito třemi prvky (9):  
I. Zásadní složky zkušební metody;  
II. Minimální seznam srovnávacích látek;  
III. Definované hodnoty p řesnosti a spolehlivosti.  
I. Zásadní složky zkušební metody  
6. Patří mezi ně zásadní strukturní, funk ční a procedurální prvky validované 
metody, které by m ěly být obsaženy v protokolu navrhované, mechanicky 
a funkčně podobné nebo modifikované metody. Tyto složky p ředstavují 
jedinečné vlastnosti metody, nejd ůležitější procedurální podrobnosti 
a opatření pro kontrolu kvality. Dodržování zásadních složek zkušební 
metody pom ůže zajistit, aby navrhovaná podobná nebo modifikovaná 
metoda byla založena na stejných pojmech jako odpovídající VRM (9). Základní sou části zkušební metody jsou podrobn ě popsány v odstavcích 
16 až 21 ZM a zkoušení by se m ělo provád ět v souladu s:
 
— všeobecnými podmínkami (odstavec 16),  
— funkčními podmínkami, mezi n ěž patří: 
— životaschopnost bun ěk (odstavec 17),  
— bariérová funkce (odstavec 18),  
— morfologie (odstavec 19),  
— reprodukovatelnost (odstavec 20) a  
— kontrola kvality (odstavec 21).  
II. Minimální seznam srovnávacích látek  
7. Srovnávací látky slouží k rozhodnutí, zda navrhovaná podobná nebo modi ­
fikovaná metoda, u níž je prokázáno, že je strukturáln ě a funkčně dostatečně 
podobná validované referen ční metod ě (VRM), nebo která p ředstavuje 
drobnou úpravu jedné ze t ří validovaných referen čních metod, má srovna ­
telnou nebo lepší spolehlivost a p řesnost nežli VRM (2) (8) (16) (23). 
Seznam 20 doporu čených srovnávacích látek uvedený v tabulce 1 obsahuje 
chemické látky, které zastupují r ůzné třídy chemických látek (tzn. kategorie 
chemických látek na základ ě funkčních skupin) a jsou reprezentativními 
zástupci celého rozsahu Draizeho škály dráždivosti (od nedráždivých až po silně dráždivé látky). Tento seznam obsahuje 10 látek pat řících 
v rámci systému GHS OSN a podle na řízení CLP Evropské unie do kate ­
gorie 2 a 10 nezat říděných chemických látek, z nichž 3 jsou volitelné látky 
patřící v rámci systému GHS OSN do kategorie 3. V rámci této zkušební 
metody se látky volitelné kategorie 3 považují za látky s ozna čením „Bez 
kategorie“. Chemické látky uvedené v tabulce 1 jsou vybrány z látek použ ­
itých v rámci optimaliza ční fáze, která následovala po prevalidaci, a ve 
validační studii VRM, s ohledem na chemickou funk čnost a skupenství
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
(14) (18). Tyto srovnávací látky p ředstavují minimální po čet látek, které by 
se měly používat k hodnocení p řesnosti a spolehlivosti navrhované podobné 
nebo modifikované metody, ale nem ěly by se používat k vývoji nových 
metod. V situacích, kdy n ěkterá z uvedených látek není k dispozici, lze 
použít jiné chemické látky, u nichž jsou k dispozici odpovídající referen ční 
údaje o jejich použití  in vivo , přičemž je t řeba vybírat p ředevším 
z chemických látek použitých v rámci optimaliza ční fáze, která následovala 
po prevalidaci, nebo ve valida ční studii VRM. Je-li to žádoucí, lze mini ­
mální seznam srovnávacích látek rozší řit o další látky zastupující jiné t řídy 
chemických látek, u nichž jsou k dispozici odpovídající referen ční údaje 
o použití  in vivo , za účelem dalšího hodnocení p řesnosti navrhované 
metody.  
Tabulka 1  
Minimální seznam srovnávacích látek ke stanovení hodnot p řesnosti a spolehlivosti podobných nebo 
modifikovaných metod zkoušení kožní dráždivosti za použití rekonstruované lidské epidermis  ( 1 ) 
Chemická látka Číslo CAS Skupenství Skóre  in vivo  Kat. VRM  in 
vitro  Kat. in vivo  podle 
GHS OSN/CLP 
Evropské unie  
1-brom-4-chlorbutan 6940-78-9 kapalné 0 Kat. 2 Bez kategorie 
diethyl-ftalát 84-66-2 kapalné 0 Bez kategorie Bez kategorie 
kyselina naftalen-1-octová 86-87-3 pevné 0 Bez kategorie Bez kategorie 
allyl-fenoxyacetát 7493-74-5 kapalné 0,3 Bez kategorie Bez kategorie isopropylalkohol 67-63-0 kapalné 0,3 Bez kategorie Bez kategorie 4-(methylthio)benzaldehyd 3446-89-7 kapalné 1 Kat. 2 Bez kategorie methyl-stearát 112-61-8 pevné 1 Bez kategorie Bez kategorie 
heptyl-butyrát 5870-93-9 kapalné 1,7 Bez kategorie Bez kategorie 
hexyl-salicylát 6259-76-3 kapalné 2 Bez kategorie Bez kategorie cinnamaldehyd 104-55-2 kapalné 2 Kat. 2 Bez kategorie 
(Volitelná kat. 
3) (
 3 ) 
dekan-1-ol  ( 2 ) 112-30-1 kapalné 2,3 Kat. 2 Kat. 2  
cyklamenaldehyd 103-95-7 kapalné 2,3 Kat. 2 Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 kapalné 2,7 Kat. 2 Kat. 2 2-(chlormethyl)-4-methoxy- 
3,5-dimethylpyridin-hydro ­
chlorid 86604-75-3 pevné 2,7 Kat. 2 Kat. 2  
dipropyldisulfid  (
 2 ) 629-19-6 kapalné 3 Bez kategorie Kat. 2  
hydroxid sodný (5 % vod.) 1310-58-3 kapalné 3 Kat. 2 Kat. 2 
benzenthiol, 5-(1,1-dimethy ­
lethyl)-2-methyl 7340-90-1 kapalné 3,3 Kat. 2 Kat. 2 
3-fenyl-1-methylpiperazin 5271-27-2 pevné 3,3 Kat. 2 Kat. 2  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Chemická látka Číslo CAS Skupenství Skóre  in vivo  Kat. VRM  in 
vitro  Kat. in vivo  podle 
GHS OSN/CLP 
Evropské unie  
heptanal 111-71-7 kapalné 3,4 Kat. 2 Kat. 2 
tetrachlorethen 127-18-4 kapalné 4 Kat. 2 Kat. 2  
( 1 ) Výběr chemických látek je založen na t ěchto kritériích: i) látky jsou dostupné na trhu, ii) jsou reprezentativními zástupci celého 
rozsahu Draizeho škály dráždivosti (od nedráždivých až po siln ě dráždivé látky), iii) mají jasn ě definovanou chemickou strukturu, 
iv) jsou p ředstavitelem chemické funk čnosti používané ve valida čním procesu a v) nejsou spojeny s mimo řádně toxickým profilem 
(jako jsou nap ř. karcinogenní látky nebo látky toxické pro reproduk ční systém) a nejsou spojeny s neúnosnými náklady na likvidaci. 
( 2 ) Chemické látky, které jsou dráždivé pro králíky, ale u nichž existují spolehlivé d ůkazy o tom, že jsou nedráždivé pro lidi (31) (32) (33). 
( 3 ) V rámci systému GHS OSN, nikoli podle na řízení CLP Evropské unie.  
III. Definované hodnoty p řesnosti a spolehlivosti  
8. Pro ú čely stanovení spolehlivosti a relevantnosti navrhovaných podobných 
nebo modifikovaných metod, jež se mají p řenášet mezi laborato řemi, by 
mělo být všech 20 srovnávacích látek uvedených v tabulce 1 odzkoušeno 
nejméně třemi laborato řemi. Pokud se však má navrhovaná metoda používat 
jen v jedné laborato ři, nebude zkoušení ve více laborato řích v rámci vali ­
dace nutné. Je však nezbytné, aby byly tyto valida ční studie samostatn ě 
vyhodnoceny mezinárodn ě uznávanými valida čními orgány v souladu 
s mezinárodními sm ěrnicemi (9). V každé laborato ři by se m ělo odzkoušet 
všech 20 srovnávacích látek ve t řech samostatných provedeních zkoušky 
vykonaných za použití r ůzných šarží tkán ě a s dostate čným časovým odstu ­
pem. Při každém provedení zkoušky by se m ěl použít nejmén ě tři souběžně 
zkoušené tká ňové replikáty pro každou zkoušenou látku, negativní kontrolu 
a pozitivní kontrolu.  
9. Hodnoty spolehlivosti a p řesnosti navrhované metody by se m ěly vypočítat 
s ohledem na všechna čtyři níže uvedená kritéria dohromady, p řičemž je 
třeba zajistit, aby se hodnoty spolehlivosti a relevantnosti vypo čítávaly 
předem vymezeným, jednotným zp ůsobem:  
1) K výpo čtu variability a prediktivní schopnosti (p řesnosti) metody 
v rámci jedné laborato ře i v rámci r ůzných laborato ří lze použít pouze 
údaje z takových provedení zkoušky, která jsou sou částí úplné série 
provedení.  
2) Konečné zatřídění každé srovnávací látky v každé zú častněné laborato ři 
by mělo vycházet z pr ůměrné hodnoty životaschopnosti bun ěk v rámci 
různých provedení zkoušky, která jsou sou částí úplné série provedení.  
3) K výpo čtu mezilaboratorní variability metody lze použít pouze údaje 
získané pro chemické látky, které byly podrobeny úplné sérii provedení 
zkoušky ve všech zú častněných laborato řích. 
4) Hodnoty p řesnosti by se m ěly vypočítat na základ ě jednotlivých labora ­
torních predikcí získaných u 20 srovnávacích látek jednotlivými zú čast­
něnými laborato řemi. 
V této souvislosti se  série provedení  skládá ze t ří samostatných provedení 
zkoušky v jedné laborato ři za použití jedné zkoušené látky.  Úplnou sérií 
provedení  se rozumí série provedení zkoušky v jedné laborato ři za použití 
jedné zkoušené látky, kdy všechna t ři provedení jsou platná. To znamená, 
že jakékoli neplatné provedení zp ůsobí neplatnost celé série t ří provedení.  
Vnitrolaboratorní reprodukovatelnost  
10. Hodnocení vnitrolaboratorní reprodukovatelnosti by m ělo ukázat 90 % nebo 
vyšší (≥) shodu zat řídění jednotlivých látek (do kategorie 2 v rámci systému 
GHS OSN a podle na řízení CLP Evropské unie, respektive mezi látky 
s označením „Bez kategorie“), k nimž se dosp ělo při různých nezávislých 
provedeních zkoušek 20 srovnávacích látek v rámci jediné laborato ře. ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Mezilaboratorní reprodukovatelnost  
11. Hodnocení mezilaboratorní reprodukovatelnosti není zásadn ě důležité, jest ­
liže se má navrhovaná metoda používat pouze v jediné laborato ři. U metod, 
které se mají p řenášet mezi laborato řemi, by shoda zat řídění jednotlivých 
látek (do kategorie 2 v rámci systému GHS OSN a podle na řízení CLP 
Evropské unie, respektive mezi látky s ozna čením „Bez kategorie“), k nimž 
se dospělo při různých nezávislých provedeních zkoušek 20 srovnávacích 
látek v rámci nejlépe alespo ň tří laborato ří, měla být rovna nebo vyšší ( ≥) 
než 80 %.  
Prediktivní schopnost (p řesnost)  
12. Přesnost (citlivosti, specifi čnost a celková p řesnost) navrhované podobné 
nebo modifikované metody by m ěla být srovnatelná nebo lepší než 
u VRM s p řihlédnutím k dalším informacím týkajícím se relevantnosti 
u biologického druhu, který je p ředmětem zájmu (Tabulka 2). Citlivost 
by měla být rovna nebo vyšší ( ≥) než 80 % (2) (8) (23). Avšak další 
zvláštní omezení se týká citlivosti navrhované metody  in vitro , kdy pouze 
dvě chemické látky pat řící v rámci zkoušek  in vivo  do kategorie 2 ( dekan-1- 
ol a dipropyldisulfid ) mohou být více než jednou zú častněnou laborato ří 
nesprávně zatříděny mezi látky „Bez kategorie“. Specifi čnost by m ěla být 
rovna nebo vyšší ( ≥) než 70 % (2) (8) (23). Nejsou stanovena žádná další 
omezení, pokud jde o specifi čnost navrhované metody  in vitro , tzn. že 
kterákoli ze zú častněných laborato ří může nesprávn ě zatřídit jakékoli 
látky patřící v rámci zkoušek  in vivo  mezi látky „Bez kategorie“, jestliže 
výsledná hodnota specifi čnosti zkušební metody je v p řijatelném rozsahu. 
Celková p řesnost by m ěla být rovna nebo vyšší ( ≥) než 75 % (2) (8) (23). 
Ačkoli citlivost VRM vypo čtená pro 20 srovnávacích látek uvedených 
v tabulce 1 činí 90 %, definovaná minimální hodnota citlivosti požadovaná 
u jakékoli podobné nebo modifikované metody, která má být považována za platnou, je stanovena na 80 %, jelikož je známo, že jak  dekan-1-ol  
(hraniční látka), tak  dipropyldisulfid  (falešně negativní látka p ři použití 
VRM) nep ůsobí u lidí dráždiv ě (31) (32) (33), a čkoli při zkoušce na králí ­
cích byly identifikovány jakožto dráždivé látky. Jelikož jsou modely rekon ­
struované lidské epidermis založeny na bu ňkách lidského p ůvodu, mohou 
u těchto chemických látek predikovat, že se jedná o nedráždivé látky (ozna ­ 
čené v rámci systému GHS OSN a podle na řízení CLP Evropské unie 
výrazem „Bez kategorie“).
 
Tabulka 2  
Prediktivní hodnoty citlivosti, specifi čnosti a celkové p řesnosti podobné nebo upravené metody 
nezbytné k tomu, aby byla metoda považována za platnou  
Citlivost Specifi čnost Celková p řesnost  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Kritéria p řijatelnosti studie  
13. Může se stát, že jedna nebo n ěkolik zkoušek týkajících se jedné nebo více 
zkoušených látek nespl ňují kritéria p řijatelnosti pro zkoušené a kontrolní 
látky a/nebo nejsou p řijatelné z jiných d ůvodů. Za účelem dopln ění chybě­
jících údaj ů je přípustné pro každou zkoušenou látku provést nejvýše dv ě 
doplňkové zkoušky („p řezkoušení“). P řesněji řečeno, jelikož v p řípadě 
přezkoušení je nutno soub ěžně provést i zkoušky pozitivních 
a negativních kontrol, pro každou zkoušenou látku je možno uskute čnit 
nejvýše dv ě doplňková provedení zkoušky.  
14. Je možné, že se ani po p řezkoušení nepoda ří získat minimální po čet tři 
platných provedení zkoušky pro každou srovnávací látku v každé zú čast­
něné laborato ři, což vede ke vzniku neúplné matice údaj ů. V takových 
případech by m ěla být spln ěna všechna t ři následující kritéria, aby byly 
soubory údaj ů považovány za p řijatelné:  
1) Všech 20 srovnávacích látek by m ělo mít alespo ň jednu úplnou sérii 
provedení zkoušky.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2) V každé z nejmén ě tří zúčastněných laborato ří musí být dokon čeno 
nejméně 85 % úplných sérií provedení zkoušky (pro 20 chemických 
látek, tzn. že v jedné laborato ři jsou povoleny nejvýše 3 neplatné série 
provedení zkoušky).  
3) Nejmén ě 90 % všech možných sérií provedení zkoušky z nejmén ě tří 
laboratoří musí být úplných (pro 20 chemických látek zkoušených ve 3 
laboratořích, tzn. že celkem je povoleno 6 neplatných sérií provedení 
zkoušky).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47  ZKUŠEBNÍ METODA PRO ZÁKAL A PROPUSTNOST 
ROHOVKY U SKOTU PRO ZJIŠ ŤOVÁNÍ LÁTEK 
S LEPTAVÝMI A SILN Ě DRÁŽDIVÝMI Ú ČINKY NA O ČI 
ÚVOD  
01. Zkušební metoda pro zákal a propustnost rohovky u skotu (BCOP – Bovine 
Corneal Opacity and Permeability) je zkušební metoda  in vitro , kterou lze za 
určitých okolností a s n ěkterými omezeními použít pro klasifikaci látek 
a směsí jako „látky s leptavými a siln ě dráždivými ú činky na 
oči“ (1) (2) (3). Pro ú čely této zkušební metody jsou silné dráždivé látky 
definovány jako látky zp ůsobující o ční léze, které p řetrvávají u králík ů po 
dobu nejmén ě 21 dní po jejich podání. I když se BCOP nepovažuje za 
úplnou náhradu za o ční test  in vivo  na králících, doporu čuje se použít 
jako sou část strategie stup ňovitých zkoušek pro regula ční klasifikaci 
a označování v rámci specifické oblasti použitelnosti (4) (5). Zkoušené 
látky a sm ěsi (6) lze klasifikovat jako látky s leptavými nebo siln ě dráždi­
vými účinky na o či bez dalšího zkoušení na králících. Látka, jejíž negativní 
zkoušky by si vyžádaly zkoušení na králících s použitím strategie stup ňo­
vitého zkoušení, jak je uvedeno v metodice OECD 405 (7) (kapitola B. 5 této přílohy).
 
02. Účelem této zkušební metody je popsat postupy používané k hodnocení 
potenciálních leptavých nebo siln ě dráždivých ú činků zkoušené látky na 
oči měřené její schopností zp ůsobit zákal a zvýšit propustnost v odd ělené 
rohovce skotu. Toxické ú činky na rohovku se m ěří: i) sníženou propustností 
světla (zákal) a ii) zvýšenou prostupností barviva fluoresceinu sodného (pro ­
pustnost). Hodnocení zákalu a propustnosti rohovky po expozici zkoušené látce se spojí, aby se odvodil stav podrážd ěnosti  in vitro  (IVIS –  In Vitro  
Irritancy Score), který se používá pro klasifikaci úrovn ě dráždivých ú činků 
zkoušené látky.
 
03. Látky s dráždivými ú činky na o či způsobující léze, které odezní nejpozd ěji 
do 21 dní a nedráždivé látky byly rovn ěž zkoušeny s použitím zkušební 
metody BCOP. P řesnost a spolehlivost zkušební metody BCOP u látek 
těchto kategorií však nebyla oficiáln ě hodnocena.  
04. Definice jsou uvedeny v dodatku l.  
POČÁTEČNÍ POSOUZENÍ A OMEZENÍ  
05. Tato zkušební metoda je založena na protokolu zkušební metody BCOP 
Koordina čního výboru mezi r ůznými organizacemi pro ov ěřování platnosti 
alternativních metod (ICCVAM) (8) zpracovaném v návaznosti na mezi ­
národní studii o ov ěřování platnosti (4)(5)(9) s p řispěním Evropského st ře­
diska pro validaci alternativních metod (ECVAM) a Japonského st řediska 
pro validaci alternativních metod (JaCVAM). Protokol vychází z informací 
získaných z Institutu pro v ědní obor  in vitro  (IIVS) a z protokolu 124 
INVITTOX (10), který p ředstavuje protokol používaný pro studii 
o předběžném ověřování platnosti analýzy BCOP sponzorovanou Evrop ­
ským spole čenstvím a vypracovanou v letech 1997–1998. Oba tyto 
protokoly jsou založeny na metodice analýzy BCOP poprvé ohlášené 
Gautheronem  et al.  (11).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
06. Stanovená omezení pro tuto zkušební metodu jsou založena na vysokých 
mírách falešné pozitivity pro alkoholy a ketony a na vysoké mí ře falešné 
negativity pro pevné látky sledované v databázi ov ěřování platnosti (viz bod 
44) (5). Jsou-li látky v rámci t ěchto chemických a fyzikálních t říd vyřazeny 
z databáze, p řesnost BCOP v klasifika čních systémech EU, EPA a GHS je 
podstatně vyšší (5). Vycházeje z ú čelu této analýzy (tj. zjiš ťovat pouze látky 
s leptavými/siln ě dráždivými ú činky na o či), míry falešné negativity nejsou 
kritické, protože tyto látky by se následn ě zkoušely na králících nebo jinými 
náležitě validovanými zkouškami  in vitro  v závislosti na požadavcích práv ­
ních předpisů s využitím strategie stup ňovitého zkoušení v p řístupu 
založeném na vážení d ůkazů. Kromě toho sou časná databáze ov ěřování 
platnosti neumož ňuje odpovídající hodnocení n ěkterých t říd chemických 
látek nebo produkt ů (např. směsí). Výzkumníci by však mohli zvážit použití 
této zkušební metody pro všechny druhy zkoušených látek (v četně směsí), 
přičemž kladné výsledky by mohly být p řijaty jako indikátor reakce o čí na 
leptavé nebo siln ě dráždivé látky. Kladné výsledky získané u alkohol ů 
a ketonů by se však m ěly interpretovat opatrn ě z důvodu rizika nep řiměřené 
předpovědi. 
07. V případě všech postup ů týkajících se o čí skotu a rohovek skotu by se m ěla 
dodržovat na řízení a postupy použitelné na zkušebny pro zacházení 
s materiály získanými ze zví řat, které krom ě jiného zahrnují tkán ě 
a mimobun ěčné tekutiny. Doporu čují se univerzální laboratorní preventivní 
opatření (12).  
08. Omezení zkušební metody spo čívá v tom, že i když tato metoda p řihlíží 
k některým ú činkům na oči vyhodnoceným zkušební metodou podrážd ění 
očí králíků a do ur čité míry i k jejich síle, nebere v úvahu poškození 
spojivky a duhovky. A také a čkoli reverzibilitu lézí rohovky nelze 
v analýze BCOP hodnotit samu o sob ě, na základ ě studií provád ěných na 
očích králík ů bylo navrženo, aby se posouzení po čáteční hloubky poškození 
rohovky použilo k rozlišení mezi nevratnými a vratnými ú činky (13). 
A konečně je třeba uvést, že BCOP neumož ňuje posouzení možnosti 
soustavné toxicity spojené s expozicí o čí určitým látkám.  
09. Vyvíjí se úsilí, aby se dále popsala ú čelnost a omezení analýzy BCOP pro 
zjišťování slabých dráždivých látek a nedráždivých látek (viz také bod 45). 
Uživatelům se rovn ěž doporučuje, aby organizacím pro ov ěřování platnosti 
poskytli vzorky a/nebo údaje pro oficiální hodnocení p řípadného budoucího 
použití zkušební metody BCOP, v četně zjišťování slabých dráždivých látek 
a nedráždivých látek.  
10. Každá laborato ř, která poprvé provádí tuto analýzu, by m ěla použít vhodné 
chemické látky uvedené v dodatku 2. Laborato ř může použít tyto chemické 
látky k prokázání své odborné zp ůsobilosti v provád ění zkušební metody 
BCOP před předložením analytických údaj ů BCOP pro regula ční účely 
klasifikace nebezpe čnosti.  
ZÁSADA ZKOUŠKY  
11. Zkušební metoda BCOP je organotypický model, který zajiš ťuje krátkodobé 
udržování b ěžné fyziologické a biochemické funkce rohovky skotu  in vitro.  
V této zkušební metod ě se poškození zkoušenou látkou posuzuje kvantita ­
tivním m ěřením změn v zákalu a propustnosti rohovky za pomoci opacito ­
metru (přístroje na m ěření průhlednosti) a optického lehkého spektrofotome ­
tru. Obě měření se používají k výpo čtu stavu podrážd ění in vitro  (IVIS) za 
účelem přidělení kategorie klasifikace nebezpe čnosti podrážd ění pro před­
povídání potenciálu o čního podrážd ění zkoušenou látkou  in vivo  (viz kritéria 
rozhodování).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. Zkušební metoda BCOP používá odd ělené rohovky z o čí čerstvě poráženého 
skotu. Zákal rohovky se m ěří kvantitativn ě jako množství pr ůchodu sv ětla 
rohovkou. Propustnost se m ěří kvantitativn ě jako množství barviva fluores ­
ceinu sodného, které prochází celou tlouš ťkou rohovky a zjiš ťuje se v mediu 
zadní komory. Zkoušené látky se aplikují na epiteliální povrch rohovky 
přidáním do p řední komory držáku rohovky. V dodatku 3 je uveden 
popis a schématický nákres držáku rohovky používaný v BCOP. Držáky rohovky lze komer čně získat z r ůzných zdroj ů, nebo je lze zkonstruovat.
 
Zdroj a v ěk očí skotu a výb ěr druhů zvířat 
13. Skot posílaný na jatka se zpravidla poráží bu ď pro lidskou spot řebu, nebo 
pro jiná komer ční použití. Jako zdroj rohovek pro použití v BCOP se použí ­
vají pouze zdravá zví řata, která se považují za vhodná pro vstup do lidského 
potravinového řetězce. Jelikož skot má široký rozsah hmotnosti v závislosti 
na chovu, v ěku a pohlaví, neexistuje žádné doporu čení týkající se hmotnosti 
zvířat v době porážky.  
14. Mohou se vyskytnout rozdíly ve velikosti rohovky, když se používají o či od 
zvířat různého věku. Rohovky o vodorovném pr ůměru > 30,5 mm a s 
hodnotami základní tlouš ťky rohovky (CCT) ≥ 1 100 μm se obvykle získá ­
vají ze skotu staršího osmi let, zatímco rohovky o vodorovném 
průměru < 28,5 mm a CCT < 900 μm se obvykle získávají ze skotu 
mladšího p ěti let (14). Z t ěchto důvodů se zpravidla nepoužívají o či ze 
skotu staršího 60 m ěsíců. Oči ze skotu mladšího 12 m ěsíců se tradičně 
nepoužívají, protože o či se ještě vyvíjejí a tlouš ťka a průměr rohovky 
jsou mnohem menší, než jsou zaznamenány u o čí dospělého skotu. Použí ­
vání rohovek z mladých zví řat (tj. 6 až 12 m ěsíců starých) je však p řípustné, 
jelikož mají ur čité výhody, nap ř. zvýšená dostupnost, úzký v ěkový rozsah 
a nižší nebezpe čnost související s potenciální expozicí zam ěstnanců bovinní 
spongiformní encefalopatii (15). Protože by bylo ú čelné další hodnocení 
vlivu velikosti nebo tlouš ťky rohovky na reakci na leptavé a dráždivé látky, 
uživatelům se doporu čuje oznamovat odhadovaný v ěk a/nebo hmotnost 
zvířat, které poskytují rohovky používané ve studii.  
Získávání a doprava o čí do laborato ře 
15. Oči shromaž ďují zaměstnanci jatek. Aby se minimalizovaly mechanické 
a jiné druhy poškození o čí, měly by se o či odstranit co nejd říve po úmrtí. 
Aby se zamezilo expozici o čí potenciáln ě dráždivým látkám, zam ěstnanci 
jatek by nem ěli při oplachování hlavy zví řete používat čistící prost ředky.  
16. Oči by měly být ve vhodn ě velké nádob ě úplně ponořeny do Hanksova 
vyváženého solného roztoku (HBSS) a dopraveny do laborato ře tak, aby se 
minimalizovalo poškození a/nebo bakteriální zne čištění. Jelikož o či se získá ­
vají během procesu porážení, mohou být vystaveny krvi a jiným 
biologickým látkám, v četně baktérií a jiných mikroorganism ů. Proto je d ůle­ 
žité zajistit, aby riziko zne čištění bylo minimalizováno (nap ř. držením 
nádoby, která obsahuje o či, v mokrém ledu, p řidáním antibiotik do Hank ­
sova vyváženého solného roztoku (HBSS) použitého k uchování o čí během 
dopravy [nap ř. penicilín se 100 m.j./ml a streptomycin se 100 μg/ml]).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Časový interval mezi získáním o čí a použitím rohovky v BCOP by m ěl být 
co nejkratší (získání a použití se uskute čňuje zpravidla tentýž den) a m ěl by 
být prokázán, aby se nenarušily výsledky analýzy. Tyto výsledky jsou založeny na kritériích výb ěru očí a také na reakcích na pozitivní 
a negativní kontroly. Všechny o či použité v analýze by m ěly být ze stejné 
skupiny o čí získaných v ur čitý den.
 
Kritéria výb ěru očí používaných v BCOP  
18. Jakmile se o či dostanou do laborato ře, jsou pe člivě vyšetřeny z hlediska 
vad, včetně zvýšeného zákalu, škrábanc ů a neovaskularizace. Sm ějí se 
používat pouze rohovky z o čí, které tyto vady nemají.  
19. Kvalita každé rohovky se také hodnotí v pozd ějších krocích analýzy. 
Rohovky, které mají zákal v ětší než sedm zákalových jednotek, se po po čá­
teční jednohodinové dob ě vyrovnání vy řadí (POZNÁMKA: opacitometr by 
měl být kalibrován podle norem zákalu používaných k ur čení zákalových 
jednotek, viz dodatek 3).  
20. Každá zkušební skupina (zkoušená látka, paralelní negativní a pozitivní 
kontroly) poz ůstává nejmén ě ze třech očí. V případě rohovek pro negativní 
kontrolu by se v analýze BCOP m ěly používat t ři rohovky. Protože všechny 
rohovky jsou vy říznuty z celé o ční boule a vloženy do komor rohovky, 
existuje možnost výtvor ů ze zpracování jednotlivých hodnot zákalu 
a propustnosti rohovky (v četně negativní kontroly). Krom ě toho se hodnoty 
zákalu a propustnosti rohovek z negativních kontrol používají k úprav ě 
zkoušených p ředmětů a hodnoty zákalu a propustnosti rohovek 
z pozitivních kontrol se používají ve výpo čtech IVIS.  
POSTUP  
Příprava očí 
21. Rohovky, které nemají vady, se vy řezávají s 2 až 3 mm okrajem o čního 
bělma, který z ůstává a pomáhá v následném ošet ření, přičemž se musí dávat 
pozor, aby se zamezilo poškození epitelu a endotelu rohovky. Odd ělené 
rohovky se zasazují do zvláš ť k tomu ur čených držák ů rohovek složených 
z předních a zadních částí, které se dotýkají p říslušně epiteliálních 
a endoteliálních stran rohovky. Ob ě komory se úpln ě zaplní p ředehřátým 
Eaglovým minimáln ě nutným médiem (EMEM) (nejd říve zadní komora) 
a tím se zajistí, že se nevytvo ří žádné bubliny. Za řízení se potom vyrovnává 
na teplotu 32 ± 1 °C nejmén ě po dobu jedné hodiny, aby se rohovky mohly 
srovnat s médiem a dosáhnout v co nejv ětším rozsahu b ěžné metabolické 
aktivity (p řibližná teplota povrchu rohovky  in vivo  je 32 °C).  
22. Po dob ě vyrovnání se čerstvé předehřáté médium EMEM p řidá do obou 
komor a pro každou rohovku se odeberou základní údaje o zákalu. Všechny rohovky, které vykazují makroskopické poškození tkání (nap ř. poškrábání, 
pigmentace, neovaskularizace) nebo zákal > 7 jednotek zákalu, se vy řadí. 
Vypočte se střední zákal vyrovnaných rohovek. Minimáln ě tři rohovky 
s hodnotami zákalu, které se blíží st řední hodnot ě všech rohovek, se 
vyberou jako rohovky pro negativní kontrolu (nebo pro kontrolu 
s rozpoušt ědlem). Zbylé rohovky se potom rozd ělí do zkušebních skupin 
a do skupin pro pozitivní kontrolu.
 ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Jelikož tepelná kapacita vody je ve srovnání se vzduchem vyšší, voda 
poskytuje stabiln ější teplotní podmínky pro inkubaci. Proto se doporu čuje 
používání vodní lázn ě pro udržování držáku rohovky a jeho obsahu p ři 
teplotě 32 ± 1 °C. Vzduchové inkubátory však lze také použít za p ředpo­
kladu, že budou p řijata preventivní opat ření k zachování tepelné stability 
(např. předehřátím držák ů a medií).  
Aplikace zkoušené látky  
24. Používají se dva r ůzné zkušební protokoly, jeden pro tekutiny a smá čedla 
(pevné nebo tekuté) a jeden pro pevné látky, které nejsou smá čedla.  
25. Tekutiny se zkoušejí ne ředěné, zatímco smá čedla se zkoušejí p ři koncentraci 
10 % objemové hmotnosti (w/v) v 0,9 % roztoku chloridu sodného, desti ­
lované vody nebo jiného rozpoušt ědla, u něhož se prokázalo, že nemá 
nepříznivé účinky na zkušební systém. Jako tekutiny se zpravidla zkoušejí 
polotuhé, krémové a voskovité látky. U alternativních koncentrací roztoku by mělo být předloženo p říslušné zd ůvodnění. Rohovky jsou vystaveny 
tekutinám a smá čedlům po dobu 10 minut. Použití jiných dob expozice 
by mělo být doprovázeno odpovídajícím v ědeckým zd ůvodněním.
 
26. Pevné látky, které nejsou smá čedla, se zpravidla zkoušejí jako roztoky nebo 
suspenze p ři 20 % koncentraci v 0,9 % roztoku chloridu sodného, destilo ­
vané vody nebo jiného rozpoušt ědla, u něhož se prokázalo, že nemá nep ří­
znivé účinky na zkušební systém. Za ur čitých okolností a s náležitým 
vědeckým zd ůvodněním se pevné látky mohou zkoušet také čisté 
s přímou aplikací na povrch rohovky a s použitím metody otev řených 
komor (viz bod 29). Rohovky jsou vystaveny pevným látkám po dobu 
čtyř hodin, ale podobn ě jako u tekutých látek a smá čedel lze 
s odpovídajícím v ědeckým zd ůvodněním použít alternativní doby expozice.  
27. Je možné použít r ůzné metody zkoušení v závislosti na fyzické povaze 
a chemických vlastnostech zkoušené látky (nap ř. pevné látky, tekutiny, 
viskózní látky versus neviskózní tekutiny). Kritický faktor zajiš ťuje, že 
zkoušená látka náležit ě pokrývá epiteliální povrch a že je p říslušně odstra­
něna během oplachování. Metoda uzav řených komor se obvykle používá 
pro neviskózní až mírn ě viskózní tekuté zkoušené látky, zatímco metoda 
otevřených komor se zpravidla používá pro poloviskózní a viskózní tekuté 
zkoušené látky a pro čisté pevné látky.  
28. V metod ě uzavřených komor se dostate čné množství zkoušené látky 
(750 μL) k pokrytí epiteliální strany rohovky zavádí do p řední komory 
přes dávkovací otvory na horním povrchu komory a otvory jsou potom 
během expozice uzav řeny komorovými zátkami. Je d ůležité zajistit, aby 
každá rohovka byla vystavena zkoušené látce po p říslušnou dobu.  
29. V metod ě otevřených komor se p řed zkoušením odstraní z p řední komory 
zavírací kli čka okénka a sklen ěné okénko. Kontrolní nebo zkoušená látka 
(750 μL nebo dostate čné množství zkoušené látky, aby úpln ě pokryla 
rohovku) se aplikuje p římo na epiteliální povrch rohovky s použitím mikro ­
pipety. Pokud je zkoušenou látku obtížné pipetovat, lze ji zavést pod tlakem 
do objemové pipety, což pom ůže v dávkování. Špi čka objemové pipety se 
zasune do dávkovací špi čky injekční stříkačky tak, aby látku bylo možné 
zavést pod tlakem do špi čky vytěsňování. Píst injek ční stříkačky se stla čí 
současně s tím, jak se píst pipety vytahuje nahoru. Pokud se ve špi čce 
pipety objeví vzduchové bubliny, zkoušený p ředmět se odstraní (vytla čí) 
a postup se opakuje, dokud špi čka není napln ěná bez vzduchových bublin. 
V případě potřeby lze použít b ěžnou injek ční stříkačku (bez jehly), protože 
umožňuje měření přesného objemu zkoušené látky a snadn ější aplikaci na 
epiteliální povrch rohovky. Po dávkování se sklen ěné okénko umístí znovu 
na přední komoru, aby se obnovil uzav řený systém.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubace po expozici  
30. Po dob ě expozice se zkoušená látka, látka pro negativní kontrolu nebo látka 
pro pozitivní kontrolu odstraní z p řední komory a epitel se nejmén ě třikrát 
opláchne (nebo se oplachuje tak dlouho, dokud nep řestanou být viditelné 
stopy zkoušené látky) médiem EMEM (obsahující fenolovou červeň). Na 
oplachování se používá médium obsahující fenolovou červeň, protože 
změnu barvy ve fenolové červeni lze sledovat, aby se zjistila ú činnost 
oplachovacích kyselých nebo alkalických látek. Rohovky se proplachují více než t řikrát, pokud je fenolová červeň ještě zbarvená (do žluta nebo 
do nachova), nebo pokud je zkoušená látka stále viditelná. Jakmile již 
v médiu není zkoušená látka, rohovky se naposledy opláchnou médiem 
EMEM (bez fenolové červeně). EMEM (bez fenolové červeně) se používá 
jako kone čný oplach, aby se p řed měřením zákalu zajistilo odstran ění feno­
lové červeně z přední komory. P řední komora se pak naplní čerstvým 
EMEM bez fenolové červeně.
 
31. U tekutin nebo smá čedel se rohovky po oplachu inkubují po dobu dalších 
dvou hodin p ři teplotě 32 ± 1 °C. Delší doba po expozici by byla za 
určitých okolností ú čelná a mohla by se zvážit p řípad od p řípadu. Rohovky 
zkoušené s pevnými látkami se d ůkladně propláchnou na konci doby čtyř­
hodinové expozice, ale nevyžadují si další inkubaci.  
32. Zákal a propustnost každé rohovky se v p řípadě tekutých látek a smá čedel 
zaznamená na konci doby inkubace po expozici a v p řípadě pevných látek, 
které nejsou smá čedla, na konci doby čtyřhodinové expozice. Každá 
rohovka se sleduje rovn ěž vizuáln ě a případná pozorování se zaznamenají 
(např. odlupování tkán ě, zbytky zkoušené látky, nejednotné struktury rohov ­
ky). Tato pozorování by mohla být d ůležitá, protože mohou odrážet zm ěny 
v údajích opacitometru.  
Látky pro kontrolu  
33. Do každého pokusu se za řazují soub ěžné negativní kontroly nebo kontroly 
s rozpoušt ědlem/vehikulem a pozitivní kontroly.  
34. Když se zkouší tekutá látka p ři 100 % koncentraci, soub ěžná negativní 
kontrola (nap ř. 0,9 % roztok chloridu sodného nebo destilovaná voda) se 
zahrne do zkušební metody BCOP tak, aby bylo možné zjistit nespecifické 
změny ve zkušebním systému a zajistit základnu pro koncové body analýzy. 
Tím se rovn ěž zajistí, že podmínky analýzy nebudou mít za následek 
nevhodnou dráždivou reakci.  
35. Když se zkouší roz ředěná tekutina, smá čedlo nebo pevná látka, skupina pro 
souběžnou kontrolu s rozpoušt ědlem/vehikulem se zahrne do zkušební 
metody BCOP tak, aby bylo možné zjistit nespecifické zm ěny ve zkušebním 
systému a zajistit základnu pro koncové body analýzy. Lze použít pouze rozpouštědlo/vehikul, u kterého se prokázalo, že nemá nep říznivé účinky na 
zkušební systém.
 
36. Do každého pokusu se za řadí známá látka s dráždivými ú činky na o či jako 
látka pro soub ěžnou pozitivní kontrolu, aby se ov ěřilo, že je vyvolána 
odpovídající reakce. Protože analýza BCOP se v této zkušební metod ě 
používá ke zjiš ťování leptavých nebo silných dráždivých látek, ideáln ě by 
pro pozitivní kontrolu m ěla být referen ční látka, která v této zkušební 
metodě vyvolá silnou reakci. Aby se však zajistilo, že prom ěnlivost 
v reakci na pozitivní kontrolu bude možné časem vyhodnotit, rozsah dráž ­
divé reakce by nem ěl být nadm ěrný. 
37. Příklady tekutých zkoušených látek pro pozitivní kontrolu jsou dimetylfor ­
mamid nebo 1 % hydroxid sodný. P říkladem pevných zkoušených látek pro 
pozitivní kontrolu je 20 % (objemové hmotnosti) imidazol v 0,9 % roztoku 
chloridu sodného.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Srovnávací látky jsou ú čelné pro hodnocení potenciálu podrážd ění očí 
neznámými chemickými látkami nebo specifickými t řídami chemických 
látek či produkt ů nebo pro hodnocení potenciálu relativního podrážd ění 
látkou s dráždivými ú činky na o či ve specifickém rozmezí dráždivých 
reakcí.  
Měřené koncové body  
39. Zákal se ur čuje množstvím sv ětelné propustnosti rohovkou. Zákal rohovky 
se kvantitativn ě měří za pomoci opacitometru a výsledkem jsou hodnoty 
zákalu m ěřené na celém rozsahu stupnice.  
40. Propustnost se ur čuje množstvím barviva fluoresceinu sodného, které 
proniká všemi vrstvami bun ěk rohovky (tj. epitelem na vn ějším povrchu 
rohovky p řes endotel na vnit řním povrchu rohovky). 1 ml roztoku fluores ­
ceinu sodného (4 nebo 5 mg/ml, když se p říslušně zkoušejí tekuté látky 
a smáčedla nebo pevné látky, které nejsou smá čedla) se p řidává do p řední 
komory držáku rohovky, která je spojena s epiteliální stranou rohovky, 
zatímco zadní komora, která je spojena s endoteliální stranou rohovky, se naplní čerstvým médiem EMEM. Držák se potom ve vodorovné poloze 
inkubuje po dobu 90 ± 5 min. na teplotu 32 ± 1 °C. Množství fluoresceinu 
sodného, který p řechází do zadní komory, se kvantitativn ě měří za pomoci 
spektrofotometrie UV/VIS. Spektrofotometrická m ěření hodnocená ve 
490 nm se zaznamenají jako optická hustota (OD
 490 ) nebo hodnoty absor ­
bance, které se m ěří na celém rozsahu stupnice. Hodnoty propustnosti 
fluoresceinu se stanoví s použitím hodnot OD  490 na základ ě spektrofoto ­
metru viditelného sv ětla s použitím b ěžné optické délky 1 cm.  
41. Alternativn ě se může použít analyzátor desti ček s 96 jamkami, pokud i) lze 
stanovit lineární dosah analyzátoru desti ček pro ur čení hodnot fluoresceinu 
OD  490 ; a ii) v 96jamkové desti čce je použito správné množství vzork ů 
fluoresceinu, jehož výsledkem jsou hodnoty OD  490 odpovídající b ěžné 
optické délce 1 cm (to by si mohlo vyžadovat úpln ě plnou jamku [obvykle 
360μL]). 
ÚDAJE A PODÁVÁNÍ ZPRÁV  
Hodnocení údaj ů 
42. Jakmile se hodnoty zákalu a st řední hodnoty propustnosti (OD  490 ) upraví na 
zákal pozadí a hodnoty propustnosti OD  490 pro negativní kontrolu, st řední 
hodnoty zákalu a propustnosti OD  490 pro každou zkušební skupinu by se 
měly spojit do empiricky odvozeného vzorce, aby se vypo čítal stav podráž ­
dění in vitro  (IVIS) pro každou zkušební skupinu takto:  
IVIS = st řední hodnota zákalu + (15 × st řední hodnota propustnosti OD  490 ) 
Sina et al.  (16) oznámil, že tento vzorec byl odvozen b ěhem laboratorních 
a mezilaboratorních studií. Údaje vytvo řené pro řady 36 slou čenin 
v multilaboratorní studii byly p ředmětem vícerozm ěrné analýzy s cílem 
určit nejvhodn ější rovnováhu mezi údaji  in vivo  a in vitro . Tuto analýzu 
uskutečnili ve dvou samostatných spole čnostech v ědci, kteří odvodili tém ěř 
stejné vzorce.  
43. Hodnoty zákalu a propustnosti by se m ěly rovněž posuzovat samostatn ě, aby se 
určilo, zda zkoušená látka zp ůsobuje poleptání nebo silné podrážd ění pomocí 
pouze jednoho nebo dvou koncových bod ů (viz kritéria rozhodování).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Kritéria rozhodování  
44. Látka, která zp ůsobuje IVIS ≥ 55,1, se definuje jako leptavá nebo siln ě 
dráždivá. Jak je uvedeno v bod ě 1, pokud zkoušená látka není ur čena 
jako látka s leptavými nebo siln ě dráždivými ú činky na o či, mělo by se 
uskutečnit další zkoušení pro ú čely klasifikace a ozna čování. Zkušební 
metoda BCOP má celkovou p řesnost 79 % (113/143) až 81 % (119/147), 
míru falešné pozitivity 19 % (20/103) až 21 % (22/103) a míru falešné 
negativity 16 % (7/43) až 25 % (10/40) ve srovnání s údaji ze zkušební metody  in vivo  na očích králík ů klasifikovanými podle klasifika čních 
systémů EPA (1), EU (2) nebo GHS (3). V p řípadě, že látky v ur čitých 
chemických t řídách (tj. alkoholy, ketony) nebo fyzikálních t řídách (tj. pevné 
látky) jsou vylou čeny z databáze, p řesnost BCOP se v klasifika čních systé ­
mech EU, EPA a GHS pohybuje v rozmezí od 87 % (72/83) do 92 % (78/85), míra falešné pozitivity od 12 % (7/58) do 16 % (9/56) a míra 
falešné negativity od 0 % (0/27) do 12 % (3/26).
 
45. I když se klasifikace látek s leptavými nebo siln ě dráždivými ú činky na o či 
pro zkoušenou látku nezíská, údaje BCOP mohou být užite čné ve spojení 
s testovacími údaji z o ční zkoušky  in vivo  na králících nebo z náležit ě 
validované zkoušky  in vitro , aby se dále vyhodnotila ú čelnost a omezení 
zkušební metody BCOP pro ur čení slabých dráždivých a nedráždivých látek 
(dokument s pokyny o používání zkušebních metod o ční toxicity  in vitro  se 
zpracovává).  
Kritéria p řijetí studie  
46. Zkouška se považuje za p řijatelnou, pokud pozitivní kontrola vykazuje IVIS 
spadající do obvyklých odchylek dosavadní st řední hodnoty, kterou je t řeba 
aktualizovat nejmén ě každé tři měsíce nebo pokaždé, když se p řijatelná 
zkouška vykonává v laborato řích, kde se zkoušky ned ělají často (tj. mén ě 
než jednou m ěsíčně). Výsledkem reakce na negativní kontrolu nebo na 
kontrolu s rozpoušt ědlem/vehikulem by m ěly být hodnoty zákalu 
a propustnosti, které jsou nižší než stanovené horní meze pro hodnoty 
zákalu pozadí a prostupnosti u rohovek skotu zkoušené p říslušnou negativní 
kontrolou nebo kontrolou s rozpoušt ědlem/vehikulem.  
Zpráva o zkoušce  
47. Zpráva o zkoušce by m ěla zahrnovat tyto informace, pokud se týkají usku ­
tečňování studie:  
Zkoušené látky a látky pro kontrolu  
Chemický název (chemické názvy), nap ř. strukturální název používaný 
službou chemických abstrakt (CAS) spolu s dalšími názvy, jsou-li známy;  
registrační číslo (RN) CAS, je-li známo;  
čistota a složení látky nebo sm ěsi (v procentu (procentech) podle váhy), 
jsou-li tyto informace dostupné;  
fyzikálně chemické vlastnosti, nap ř. fyzikální stav, t ěkavost, pH, stálost, 
třída chemických látek, rozpustnost ve vod ě odpovídající provád ění studie;  
případně ošetření zkoušené látky/látky pro kontrolu p řed zkoušením (nap ř. 
zahřátí, mletí);  
stálost, je-li známa.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Informace týkající se zadavatele a zkušebního za řízení  
Jméno a adresa zadavatele, zkušebního za řízení a vedoucího studie;  
určení zdroje o čí (tj. zařízení, z n ěhož byly získány);  
podmínky skladování a dopravy o čí (např. datum a čas získání o čí, časový 
interval p řed zahájením zkoušení, dopravní prost ředky a teplotní podmínky 
dopravy, všechna použitá antibiotika);  
specifické vlastnosti zví řat, z nichž byly získány o či, jsou-li tyto vlastnosti 
k dispozici (nap ř. věk, pohlaví, hmotnost zví řete, které je dárcem).  
Zdůvodnění použité zkušební metody a protokolu  
Úplnost zkušební metody  
Postup používaný k zajišt ění úplnosti (tj. p řesnosti a spolehlivosti) zkušební 
metody v pr ůběhu času (např. pravidelné zkoušení vhodných látek, využí ­
vání dosavadních údaj ů negativních a pozitivních kontrol).  
Kritéria pro p řijatelnou zkoušku  
Přijatelné rozsahy soub ěžných pozitivních a negativních kontrol založené na 
dosavadních údajích;  
případně přijatelné rozsahy soub ěžných srovnávacích kontrol na základ ě 
dosavadních údaj ů. 
Zkušební podmínky  
Popis použitého zkušebního systému;  
typ použitého držáku rohovek;  
informace o kalibraci p řístroje použitého k m ěření zákalu a propustnosti 
(např. opacitometr a spektrofotometr);  
informace o použitých rohovkách skotu, v četně prohlášení o jejich kvalit ě; 
podrobnosti o použitém zkušebním postupu;  
koncentrace použité zkoušené látky;  
popis všech zm ěn zkušebního postupu;  
odkaz na dosavadní údaje modelu (nap ř. negativní a pozitivní kontroly, 
vhodné látky, srovnávací látky);  
popis použitých hodnotících kritérií.  
Výsledky  
Sestavení údaj ů z jednotlivých zkušebních vzork ů do tabulek (nap ř. hodnoty 
zákalu OD  490 a vypočítaný IVIS pro zkoušenou látku a pozitivní, negativní 
a srovnávací kontroly [jsou-li zahrnuty] uvedené v tabulkové form ě, 
případně včetně údajů z několikrát opakovaných pokus ů a středních 
hodnot ± b ěžné odchylky pro každý pokus);  
popis jiných pozorovaných ú činků. 
Posouzení výsledk ů 
Závěr 
LITERATURA  
01) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2. vydání. EPA737-B-96-001. 
Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
02) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. ze dne 16. prosince 
2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek a sm ěsí, o změně a zrušení 
směrnice 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zm ěně nařízení (ES) 
č. 1907/2006. Ú ř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.  
03) OSN (2007). Globáln ě harmonizovaný systém klasifikace a ozna čování 
chemických látek (GHC). Druhé revidované vydání, New York a Ženeva: publikace Organizace spojených národ ů, 2007. Dostupné na:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html].  
04) ESAC (2007). Prohlášení o uzav ření retrospektivní studie ICCVAM 
o orgánových analýzách  in vitro  jako screeningové testy pro zjiš ťování 
potenciálních látek s leptavými a siln ě dráždivými ú činky na o či. 
Dostupné na:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
05) ICCVAM (2007). Zpráva o hodnocení zkušebních metod – zkušební 
metody o ční toxicity  in vitro  pro zjišťování látek se siln ě dráždivými 
a leptavými ú činky na o či. Koordina ční výbor mezi r ůznými organiza ­
cemi pro ov ěřování platnosti alternativních metod (ICCVAM) 
a Středisko mezi r ůznými organizacemi pro hodnocení alternativních 
toxikologických metod (NICEATM) národního toxikologického 
programu (NTP). Publikace NIH č.: 07-4517. Dostupné na:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
06) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 
18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, o z řízení Evropské agentury pro chemické látky, 
o změně směrnice 1999/45/ES a o zrušení na řízení Rady (EHS) 
č. 793/93, na řízení Komise (ES) č. 1488/94, sm ěrnice Rady 
76/769/EHS a sm ěrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES 
a 2000/21/ES. Ú ř. věst. L 396, 30.12.2006, s. 1.
 
07) OECD (2002). Metodika 405. Pokyn OECD pro zkoušení chemických 
látek. Akutní podrážd ění/poleptání o čí. Dostupné na:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html].  
08) ICCVAM (2007). Doporu čený protokol zkušební metody BCOP 
ICCVAM. Ve: Zpráv ě o hodnocení zkušebních metod ICCVAM – 
zkušební metody o ční toxicity  in vitro  pro zjiš ťování látek se siln ě 
dráždivými a leptavými ú činky na o či. Koordina ční výbor mezi 
různými organizacemi pro ov ěřování platnosti alternativních 
metod (ICCVAM) a St ředisko mezi r ůznými organizacemi pro hodno ­
cení alternativních toxikologických metod (NICEATM) národního toxi ­
kologického programu (NTP). Publikace NIH č.: 07-4517. Dostupné na:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
09) ICCVAM. (2006). Sou časný stav zkušebních metod  in vitro  pro zjišť­
ování látek s leptavými a siln ě dráždivými ú činky na o či: zkušební 
metoda pro zákal a propustnost rohovky u skotu. Publikace NIH č.: 
06-4512. Research Triangle Park: národní toxikologický program. Dostupné na:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm].  
10) INVITTOX (1999). Protokol 124: analýza zákalu a propustnosti 
rohovky skotu – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Itálie: 
Evropské st ředisko pro ov ěřování platnosti alternativních 
metod (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular irri ­
tancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Heal ­
thcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Health-care Settings. Dostupné na:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.  
14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  
Can. J. Zool.  73:2159-2165.  
15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., 
Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). 
A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irri ­
tation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl Toxicol  
26:20-31.  
17) ICCVAM (2006). Základní dokument o p řezkumu, sou časný stav 
zkušebních metod  in vitro  pro zjiš ťování látek s leptavými a siln ě 
dráždivými ú činky na o či: zkušební metoda pro zákal a propustnost 
rohovky u skotu (BCOP). Dostupné na:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].  
18) ICCVAM (2006). Základní dokument o p řezkumu, sou časný stav 
zkušebních metod  In Vitro  pro zjiš ťování látek s leptavými a siln ě 
dráždivými ú činky na o či: zkušební metoda odd ěleného ku řecího 
oka (ICE). Dostupné na:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Přesnost:  Přesnost shody mezi výsledky zkušební metody a p řijatými referen ­ 
čními hodnotami. Je to m ěření výsledku zkušební metody a jednoho aspektu 
„důležitosti“. Termín se často používá namísto „souladu“, kterým se rozumí 
podíl správných výsledk ů zkušební metody.  
Srovnávací látka:  Látka použitá jako norma pro srovnání se zkoušenou látkou. 
Srovnávací látka by m ěla mít tyto vlastnosti: i) nesporný a spolehlivý zdroj 
(nesporné a spolehlivé zdroje); ii) strukturální a funk ční podobnost s t řídou 
zkoušených látek; iii) známé fyzikální/chemické vlastnosti; iv) podp ůrné údaje 
o známých ú čincích a v) známá síla v rozsahu žádoucí reakce.  
Rohovka:  Průhledná přední část oční bulvy, která zahrnuje duhovku a o čnici 
a propouští sv ětlo dovnit ř oka.  
Zákal rohovky:  Měření rozsahu zákalu rohovky po expozici zkoušené látce. 
Zvýšený zákal rohovky je p říznačný pro poškození rohovky. Zákal lze hodnotit 
subjektivn ě, jak se to d ělá ve Draizeov ě oční zkoušce na králících, nebo objek ­
tivně s přístrojem jako „opacitometr“.  
Propustnost rohovky:  Kvantitativní m ěření poškození epitelu rohovky ur čením 
množství barviva fluoresceinu sodného, který prochází všemi vrstvami bun ěk 
rohovky.  
Kategorie 1 EPA:  Zasažení leptavou látkou (nevratné poškození o ční tkáně) 
nebo zasažení rohovky či podrážd ění přetrvávající déle než 21 dní (1).  
Kategorie R41 EU:  Tvorba poškození tkání v oku nebo závažné fyzické slábnutí 
vidění po aplikaci zkoušené látky na p řední plochu oka, které není pln ě vratné do 
21 dní od aplikace (2).  
Míra falešné negativity:  Podíl všech pozitivních látek falešn ě zjištěných 
zkušební metodou jako negativní. Je to jeden z ukazatel ů výsledku zkušební 
metody.  
Míra falešné pozitivity:  Podíl všech negativních látek falešn ě zjištěných 
zkušební metodou jako pozitivní. Je to jeden z ukazatel ů výsledku zkušební 
metody.  
GHS (Globáln ě harmonizovaný systém klasifikace a ozna čování chemických 
látek):  Systém klasifikace chemických látek (látek a sm ěsí) podle standardizo ­
vaných typ ů a úrovní fyzikálních, zdravotních a environmentálních rizik 
a odpovídajícího ozna čování pomocí prvk ů informací o nebezpe čnosti, jako 
jsou výstražné symboly nebezpe čnosti, signální slova, standardní v ěty 
o nebezpe čnosti, pokyny pro bezpe čné zacházení a bezpe čnostní listy, aby 
poskytly informace o nep říznivých ú čincích s ohledem na ochranu lidí (v četně 
zaměstnavatelů, zaměstnanců, dopravc ů, spotřebitelů a respondér ů nebezpe čí) 
a životního prost ředí (3).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
Kategorie 1 GHS:  Tvorba poškození tkání v oku nebo závažné fyzikální sláb ­
nutí vidění po aplikaci zkoušené látky na p řední plochu oka, které není pln ě 
vratné do 21 dní od aplikace (3).  
Nebezpečnost:  Základní charakteristika chemické látky nebo situace, která má 
potenciál vyvolat nep říznivé účinky, jsou-li organismus, systém nebo (sub)popu ­
lace vystaveny této látce.  
Stav podrážd ění in vitro  (IVIS):  Empiricky odvozený vzorec používaný 
v analýze BCOP, p řičemž střední hodnoty zákalu a propustnosti se pro každou 
zkušební skupinu spojí do jedné hodnoty  in vitro  pro každou zkušební skupinu.  
IVIS = střední hodnota zákalu + (15 x st řední hodnota propustnosti).  
Negativní kontrola:  Nezkoušená replika, která obsahuje všechny složky zkušeb ­
ního systému. Tento vzorek se zpracovává se vzorky zkoušené látky a jinými kontrolními vzorky, aby se zjistilo, zda rozpoušt ědlo vzájemn ě reaguje se 
zkušebním systémem.
 
Nedráždivá látka:  Látky, které nejsou klasifikovány jako látky s dráždivými 
účinky na o či kategorie I, II, nebo III EPA; kategorie R41 nebo R36 EU; 
nebo kategorie 1, 2A, nebo 2B GHS.  
Látka s leptavými ú činky na o či: a) Látka, která zp ůsobuje nevratné poškození 
tkání oka; b) látky které jsou klasifikovány jako látky s dráždivými ú činky na o či 
kategorie 1 GHS, kategorie I EPA nebo kategorie R41 EU (1) (2) (3).  
Látka s dráždivými ú činky na o či: a) Látka, která zp ůsobuje nevratnou zm ěnu 
v oku po aplikaci na p řední plochu oka; b) látky, které jsou klasifikovány jako 
látky s dráždivými ú činky na o či kategorie II nebo III EPA, kategorie R36 EU 
nebo kategorie 2A nebo 2B GHS (1) (2) (3).  
Látka se siln ě dráždivými ú činky na o či: a) Látka zp ůsobující poškození v oku 
po aplikaci na p řední plochu oka, které neodezní do 21 dní po aplikaci, nebo 
způsobující závažné fyzikální slábnutí vid ění; b) látky, které jsou klasifikovány 
jako látky s dráždivými ú činky na o či kategorie 1 GHS, kategorie I EPA nebo 
kategorie R41 EU, (1) (2) (3).  
Opacitometr:  Přístroj používaný k m ěření „zákalu rohovky“ kvantitativním 
hodnocením sv ětelné propustnosti p řes rohovku. Typický p řístroj má dv ě části, 
každá s vlastním zdrojem sv ětla a fotobu ňkou. Jedna část se používá pro zkou ­ 
šenou rohovku a druhá pro kalibraci a vynulování p řístroje. Sv ětlo z halogenové 
lampy se posílá p řes kontrolní část (prázdná komora bez okének nebo tekutin) do 
fotobuňky a vyrovnané se sv ětlem se posílá do fotobu ňky přes zkušební část, ve 
které je umíst ěna komora obsahující rohovku. Rozdíl ve sv ětelné propustnosti 
z fotobun ěk se porovnává a numerická hodnota zákalu se zobrazí na digitální 
obrazovce.  
Pozitivní kontrola:  Replika obsahující všechny složky zkušebního systému 
a zkoušená s látkou, o níž je známo, že vyvolává pozitivní reakci. Aby se 
zajistilo, že prom ěnlivost v reakci na pozitivní kontrolu bude možné časem 
vyhodnotit, rozsah silné reakce by nem ěl být nadm ěrný. ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Spolehlivost:  Měření rozsahu, v jakém m ůže být zkušební metoda časem repro ­
dukovatelná v laborato řích a mezi laborato řemi, když se provádí s použitím 
stejného protokolu. Hodnotí se to výpo čtem laboratorní a mezilaboratorní repro ­
dukovatelnosti a laboratorní opakovatelnosti.  
Kontrola s rozpoušt ědlem/vehikulem:  Neošetřený vzorek obsahující všechny 
složky zkušebního systému, v četně rozpoušt ědla nebo vehikulu, který se zpraco ­
vává ošet řenou zkoušenou látkou a jinými kontrolními vzorky, aby se zjistila 
základní reakce vzork ů ošetřených zkoušenou látkou rozpušt ěnou ve stejném 
rozpouštědle nebo vehikulu. Pokud se vzorek zkouší soub ěžnou negativní kontro ­
lou, ukazuje také, zda rozpoušt ědlo nebo vehikul vzájemn ě reaguje se zkušebním 
systémem.  
Stupňovité zkoušení:  Strategie postupného zkoušení, kde se všechny existující 
informace o zkoušené látce p řezkoumávají ve stanoveném po řadí s použitím 
postupu váhy d ůkazů na každém stupni, aby se zjistilo, zda jsou k dispozici 
dostačující informace pro rozhodnutí o klasifikaci nebezpe čnosti, než se postoupí 
do dalšího stupn ě. Pokud lze potenciál dráždivých ú činků zkoušené látky ur čit na 
základě existujících informací, další zkoušení není nutné. Jestliže potenciál dráž ­
divých ú činků zkoušené látky nelze ur čit na základ ě existujících informací, 
použije se stup ňovitý postupný postup zkoušení na zví řatech, dokud se neur čí 
jednoznačná klasifikace.  
Validovaná zkušební metoda:  zkušební metoda, pro kterou byly zpracovány 
validační studie s cílem ur čit důležitost (v četně přesnosti) a spolehlivost pro 
specifický ú čel. Je nutné poznamenat, že validovaná zkušební metoda nemusí 
poskytnout posta čující výsledek z hlediska p řesnosti a spolehlivosti, aby byla 
shledána p řijatelnou pro navržený ú čel. 
Váha důkazů: Postup zvažování silných a slabých stránek r ůzných informací 
v dosahování a podpo ře závěru týkajícího se potenciálu nebezpe čnosti látky.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Dodatek 2  
Vhodné látky pro zkušební metodu BCOP  
Než laborato ře rutinně použijí zkušební metodu, která dodržuje tuto zkušební 
metodu, m ěly by prokázat svou odbornou zp ůsobilost správným ur čením klasi ­
fikace 10 látek s dráždivými ú činky na o či doporučených v tabulce 1. Tyto látky 
byly vybrány tak, aby p ředstavovaly rozsah reakcí v p řípadě místního 
podráždění/poleptání o čí, které vycházejí z výsledk ů očních zkoušek  in vivo  na 
králících (TG 405) (tj. kategorie 1, 2A, 2B nebo neklasifikované a ozna čené 
podle GHS OSN) (3) (7). S p řihlédnutím k validované ú čelnosti těchto analýz 
(tj. zjišťování pouze látek s leptavými/siln ě dráždivými ú činky na o či) však 
existují pouze dva výsledky zkoušky pro klasifika ční účely (leptavá/siln ě dráž­
divá látka nebo neleptavá/slabá dráždivá látka), aby byla prokázána odborná 
způsobilost. Dalším kritériem výb ěru bylo to, zda látka je komer čně dostupná, 
zda jsou k dispozici kvalitní referen ční údaje  in vivo  a zda jsou kvalitní údaje ze 
dvou metod  in vitro , pro které byly zpracovány metodiky. Z tohoto d ůvodu byly 
dráždivé látky vybrány z doporu čeného seznamu 122 referen čních látek 
ICCVAM pro ov ěření platnosti zkušebních metod o ční toxicity  in vitro  (viz 
dodatek H: Doporu čené referen ční látky ICCVAM) (5). Referen ční údaje jsou 
dostupné v základním dokumentu o p řezkumu ICCVAM pro zkušební metodu 
BCOP a odd ěleného ku řecího oka (ICE) (17) (18).  
Tabulka 1  
Doporučené látky k prokázání odborné zp ůsobilosti pro BCOP  
Látka CASRN Třída chemických 
látek (  1 ) Fyzikální 
forma Klasifikace  in 
vivo ( 2 ) Klasifikace  in vitro  ( 3 ) 
Benzalkoniumch ­
lorid (5 %) 8001-54-5 Oniová slou če­
nina Tekutá Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráždivá látka 
Chlorhexidin 55-56-1 Amin, amidin Pevná Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráždivá látka 
Dibenzoyl-L–tarta ­
rová kyselina 2743-38-6 Karboxylová 
kyselina, ester Pevná Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráždivá látka 
Imidazol 288-32-4 Heterocyklická Pevná Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráždivá látka 
Kyselina trichlo ­
roctová (30 %) 76-03-9 Karboxylová 
kyselina Tekutá Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráždivá látka 
Dichlorbenzoyl 
chlorid 4659-45-4 Acylhalogenid Tekutá Kategorie 
2A Neleptavá/slabá dráždivá 
látka 
Etyl-2-metylace ­
to–acetát 609-14-3 Keton, ester Tekutá Kategorie 
2B Neleptavá/slabá dráždivá 
látka 
Dusičnan amonný 6484-52-2 Anorganická s ůl Pevná Kategorie 
2A Neleptavá/slabá dráždivá 
látka ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Látka CASRN Třída chemických 
látek (  1 ) Fyzikální 
forma Klasifikace  in 
vivo ( 2 ) Klasifikace  in vitro  ( 3 ) 
Glycerol 56-81-5 Alkohol Tekutá Neozna čená Neleptavá/Slabá dráždivá 
látka 
n-hexan 110-54-3 Uhlovodík 
(acyklický) Tekutá Neozna čená Neleptavá/slabá dráždivá 
látka  
Zkratky: CASRN = registra ční číslo podle služby chemických abstrakt 
( 1 ) Třídy chemických látek byly p řiděleny každé zkoušené látce s použitím standardního klasifika čního schématu na základ ě klasifi­
kačního systému Národní knihovny názv ů léků a léčivých látek (MeSH) (dostupné na http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Založena na o ční zkoušce  in vivo  na králících (OECD TG 405) s použitím GHS OSN (3)(7). 
( 3 ) Založena na výsledcích v BCOP a ICE.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Dodatek 3  
DRŽÁK ROKOVEK BCOP  
1. Držáky rohovek BCOP se vyráb ějí z inertního materiálu (nap ř. polypropy ­
lenu). Držáky se skládají ze dvou polovin (p řední a zadní komora) a mají 
dvě podobné cylindrické vnit řní komory. Každá komora pojme obsah 5 ml 
a končí ve sklen ěném okénku, p řes které se zaznamenávají m ěření zákalu. 
Každá vnit řní komora má pr ůměr 1,7 cm a hloubku 2,2 cm (  1 ). Použije se 
těsnící kroužek umíst ěný na zadní komo ře, aby se zamezilo úniku látky. 
Rohovky jsou umíst ěny na endoteliální stran ě pod těsnícím kroužkem 
zadních komor a p řední komory se nacházejí na epiteliální stran ě rohovek. 
Komory se udržují na míst ě za pomoci t řech nerezavých šroub ů umístěných 
na vnějších okrajích komory. Na konci každé komory se nachází sklen ěné 
okénko, které lze odstranit, aby byl snadný p řístup k rohovce. Jeden t ěsnící 
kroužek je také umíst ěn mezi sklen ěným okénkem a komorou, aby se 
zamezilo úniku látky. Dva otvory v horní části každé komory umož ňují 
zavedení a odstran ění média a zkoušených sm ěsí. Po dobu zkoušení 
a inkubace jsou uzav řeny gumovými uzáv ěry.
 
Glosář 
Glass disc: Sklen ěná kruhová desti čka 
PTFE-O-ring: T ěsnicí kroužek z PTFE  
Refill: Plnicí otvor  
Hanger: Skoba  
Cap: Krytka  
Nut: Matice  
O-ring: T ěsnicí kroužek  
Posterior compartment: Zadní komora  
Anterior compartment: P řední komora  
Fixing screws: Spojovací šrouby  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Poskytnuté rozm ěry vycházejí z držáku rohovek, který se používá u krav ve v ěku od 12 
do 60 měsíců. V případě, že se používají zví řata ve věku od 6 do 12 m ěsíců, držák by 
musel být zkonstruován tak, aby každá komora m ěla objem 4 ml a aby každá vnit řní 
komora m ěla průměr 1,5 cm a hloubku 2,2 cm. U každého nov ě zkonstruovaného držáku 
rohovek je velmi d ůležité, aby pom ěr exponované plochy povrchu rohovky k objemu 
zadní komory byl stejný jako pom ěr v tradičním držáku rohovek. Je to nutné k zajišt ění, 
že hodnoty propustnosti budou stanoveny správn ě pro výpo čet IVIS za pomoci navrže ­
ného vzorce.
 OPACITOMETR  
2. Opacitometr je p řístroj pro m ěření světelné propustnosti. Sv ětlo 
z halogenové lampy se posílá p řes kontrolní část (prázdná komora bez 
okének nebo tekutiny) do fotobu ňky a vyrovnané se sv ětlem se posílá do 
fotobuňky přes zkušební část, ve které se nachází komora obsahující 
rohovku. Rozdíl ve sv ětelné propustnosti z fotobun ěk se porovnává 
a numerická hodnota zákalu se zobrazí na digitální obrazovce. Tím se ur čí 
zákalové jednotky.  
3. Opacitometr by m ěl poskytnout lineární odezvu za pomoci řady údaj ů 
o zákalu, které zahrnují mezní hodnoty používané pro r ůzné klasifikace 
popsané v modelu p ředpovědí (tj. až do mezní hodnoty, která ur čuje 
leptavost/silnou dráždivost). Aby se zajistily lineární a p řesné údaje až 
do 75 – 80 zákalových jednotek, je nutné opacitometr kalibrovat s použitím řady kalibra čních přístrojů. Kalibrátory (nepr ůhledné fólie 
z polyesteru) se umístí do kalibra ční komory (komora rohovky ur čena 
k držení kalibrátor ů) a čtou se na opacitometru. Kalibra ční komora je 
určena k držení kalibrátor ů přibližně ve stejné vzdálenosti mezi sv ětlem 
a fotobuňkou, v jaké se umístí rohovky b ěhem měření zákalu. Opacito ­
metr se nejd říve kalibruje na 0 zákalových jednotek s použitím kalibra ční 
komory bez kalibrátoru. Potom se t ři různé kalibrátory umístí jeden po 
druhém do kalibra ční komory a m ěří se zákaly. Výsledkem kalibrátor ů 1, 
2 a 3 by m ěly být údaje o zákalu rovnající se p říslušně nastaveným 
hodnotám 75, 150, a 225 zákalových jednotek, ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B. 48  ZKUŠEBNÍ METODA ODD ĚLENÉHO KU ŘECÍHO OKA PRO 
ZJIŠŤOVÁNÍ LÁTEK S LEPTAVÝMI A SILN Ě DRÁŽDIVÝMI 
ÚČINKY NA O ČI 
ÚVOD  
01. Zkušební metoda odd ěleného ku řecího oka (ICE – Isolated Chicken Eye) je 
zkušební metoda  in vitro , kterou lze za ur čitých okolností a s n ěkterými 
omezeními použít pro klasifikaci látek a sm ěsí jako látky s leptavými a siln ě 
dráždivými ú činky na o či (1) (2) (3). Pro ú čely této zkušební metody jsou 
silně dráždivé látky definovány jako látky zp ůsobující o ční léze, které 
přetrvávají u králík ů po dobu nejmén ě 21 dní po jejich podání. I když se 
metoda ICE nepovažuje za úplnou náhradu za o ční test  in vivo  na králících, 
doporučuje se použít ji jako sou část strategie stup ňovitých zkoušek pro 
regulační klasifikaci a ozna čování v rámci specifické oblasti použitelnosti 
(4) (5). Zkoušené látky a sm ěsi (6), které jsou v této analýze pozitivní, lze 
klasifikovat jako látky s leptavými nebo siln ě dráždivými ú činky na o či bez 
dalšího zkoušení na králících. Látka s negativním výsledkem zkoušky by si 
vyžádala zkoušení na králících s použitím strategie stup ňovitého zkoušení, 
jak je uvedeno v metodice OECD 405 (7) (kapitola B. 5 této p řílohy).  
02. Účelem této zkušební metody je popsat postupy používané k hodnocení 
potenciálních testovacích látek s leptavými nebo siln ě dráždivými ú činky 
na oči měřené její schopností zp ůsobit toxicitu v odstran ěném kuřecím oku. 
Toxické ú činky na rohovku se m ěří i) kvalitativním hodnocením zákalu, ii) 
kvalitativním hodnocením poškození epitelu na základ ě aplikace fluores ­
ceinu do oka (zadržování fluoresceinu), iii) kvantitativním m ěřením zvýšené 
tloušťky (otok) a iv) kvalitativním hodnocením makroskopického morfolo ­
gického poškození povrchu. Hodnocení zákalu a otoku rohovky a poškození po expozici zkoušené látce se posuzuje samostatn ě a potom se spojí za 
účelem odvození klasifikace dráždivých ú činků na oči.
 
03. Látky s dráždivými ú činky na o či způsobující léze, které odezní nejpozd ěji 
do 21 dní a nedráždivé látky byly rovn ěž zkoušeny s použitím zkušební 
metody ICE. P řesnost a spolehlivost zkušební metody ICE u látek t ěchto 
kategorií však nebyla oficiáln ě hodnocena.  
04. Definice jsou uvedeny v dodatku l.  
POČÁTEČNÍ POSOUZENÍ A OMEZENÍ  
05. Tato zkušební metoda je založena na protokolu zkušební metody ICE Koor ­
dinačního výboru mezi r ůznými organizacemi pro ov ěřování platnosti alter ­
nativních metod (ICCVAM) (8) zpracovanému v návaznosti na mezinárodní 
studii o ov ěřování platnosti (4) (5) (9) s p řispěním Evropského st řediska pro 
ověřování platnosti alternativních metod, Japonského st řediska pro validaci 
alternativních metod a odd ělení toxikologie a aplikované farmakologie TNO 
Quality of Life (Nizozemsko). Protokol vychází z informací získaných 
z uveřejněných protokol ů a také z aktuálního protokolu, který používá 
TNO (10) (11) (12) (13) (14).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
06. Omezení stanovená pro tuto metodu jsou založena na mí ře falešné pozitivity 
pro alkoholy a na mírách falešné negativity pro pevné látky a smá čedla (viz 
bod 47) (4). Jsou-li látky v rámci t ěchto chemických a fyzikálních t říd 
vyřazeny z databáze, p řesnost ICE v klasifika čních systémech EU, EPA 
a GHS je podstatn ě vyšší (4). Vycházeje z ú čelu této analýzy (tj. zjiš ťovat 
pouze látky s leptavými/siln ě dráždivými ú činky na o či), míry falešné nega ­
tivity nejsou kritické, protože tyto látky by se následn ě zkoušely na králících 
nebo jinými náležit ě validovanými zkouškami  in vitro  v závislosti na poža ­
davcích právních p ředpisů s využitím strategie stup ňovitého zkoušení 
v přístupu založeném na vážení d ůkazů. Kromě toho sou časná databáze 
ověřování platnosti neumož ňuje odpovídající hodnocení n ěkterých chemic ­
kých tříd nebo t říd produkt ů (např. směsí). Výzkumníci by však mohli 
zvážit použití této zkušební metody pro zkoušení všech druh ů látek (včetně 
směsí), přičemž kladný výsledek by mohl být p řijat jako p říznak reakce o čí 
na leptavé nebo siln ě dráždivé látky. Kladné výsledky získané u alkohol ů by 
se však m ěly interpretovat opatrn ě z důvodu rizika nep řiměřené předpovědi. 
07. Veškeré postupy u ku řecích očí by měly dodržovat na řízení a postupy použ ­
itelné na zkušebny pro zacházení s lidskými materiály nebo materiály získa ­
nými ze zví řat, které krom ě jiného zahrnují tkán ě a mimobun ěčné tekutiny. 
Doporučují se univerzální laboratorní preventivní opat ření (15).  
08. Omezení zkušební metody spo čívá v tom, že i když p řihlíží k n ěkterým 
účinkům na oči vyhodnoceným metodou zkoušení podrážd ění očí na králí ­
cích a do ur čité míry i k jejich síle, nebere v úvahu poškození spojivky 
a duhovky. A čkoli reverzibilitu lézí rohovky nelze ve zkušební metod ě ICE 
hodnotit samu o sob ě, na základ ě studií o o čích králík ů bylo přesto navr ­ 
ženo, že by se posouzení po čáteční hloubky poškození rohovky mohlo 
použít k rozlišení mezi nevratnými a vratnými ú činky (16). A kone čně je 
třeba uvést, že zkušební metoda ICE neumož ňuje posouzení potenciálu 
soustavné toxicity spojené s expozicí o čí. 
09. Vyvíjí se úsilí, aby se dále popsala ú čelnost a omezení zkušební metody 
ICE pro zjiš ťování slabých dráždivých látek a nedráždivých látek (viz také 
bod 48). Uživatel ům se rovn ěž doporučuje, aby organizacím pro ov ěřování 
platnosti poskytli vzorky a/nebo údaje pro oficiální hodnocení p řípadného 
budoucího použití zkušební metody ICE, v četně zjišťování látek se slabými 
dráždivými a nedráždivými ú činky na o či. 
10. Každá laborato ř, která poprvé provádí tuto analýzu, by m ěla použít osv ěd­ 
čené chemické látky uvedené v dodatku 2. Laborato ř může použít tyto 
chemické látky k prokázání své odborné zp ůsobilosti v používání zkušební 
metody ICE p řed předložením údaj ů ICE pro regula ční účely klasifikace 
nebezpečí. 
ZÁSADA ZKOUŠKY  
11. Zkušební metoda ICE je organotypický model, který zajiš ťuje krátkodobé 
uchování ku řecího oka  in vitro.  V této zkušební metod ě se poškození zkou ­ 
šenou látkou posuzuje ur čením otoku a zákalu rohovky a zadržování 
fluoresceinu. Zatímco dva poslední parametry se týkají kvalitativního hodnocení, analýza otoku rohovky zajiš ťuje kvantitativní hodnocení. 
Každé m ěření se bu ď převádí na kvantitativní hodnotu používanou 
k výpočtu celkového ukazatele podrážd ění, nebo je p řiřazeno kvalitativní 
kategorizaci, která se používá ke stanovení klasifikace leptavých a silné dráždivých ú činků na oči in vitro.  Každý z t ěchto výsledk ů potom m ůže 
být použit k p ředvídání potenciálu zkoušené látky p ůsobit jako látka 
s leptavými a siln ě dráždivými ú činky na o či in vivo  (viz kritéria rozhodo ­
vání).
 ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Zdroj a v ěk kuřecích očí 
12. Tradi čně se pro tuto analýzu používají ku řecí oči získané z jatek, kde se 
kuřata zabíjejí pro lidskou spot řebu, čímž se eliminuje pot řeba laboratorních 
zvířat. Používají se pouze o či zdravých zví řat, které se považují za vhodné 
pro vstup do lidského potravinového řetězce. 
13. Ačkoli nebyla zpracována kontrolní studie pro hodnocení optimálního v ěku 
kuřat, věk a hmotnost ku řat tradičně používaných v této zkušební metod ě 
odpovídá mladým ku řatům tradičně zpracovávaným na jatkách pro dr ůbež 
(tj. přibližně 7 týdnů staré, o váze 1,5 – 2,5 kg).  
Shromaž ďování a doprava o čí do laborato ře 
14. Hlavy by se m ěly odstranit ihned po usmrcení ku řat obvykle elektrickým 
šokem a na říznutím krku za ú čelem zbavení krve. Místní zdroj ku řat blízko 
laboratoře by měl být umíst ěn tak, aby hlavy ku řat mohly být dopraveny 
z jatek do laborato ře dostatečně rychle s cílem minimalizovat zkažení a/nebo 
bakteriální zne čištění. Časový interval mezi shromážd ěním kuřecích hlav 
a použitím o čí ve zkušební metod ě ICE by m ěl být co nejkratší (zpravidla 
do dvou hodin) a m ěl by být prokázán, aby se nenarušily výsledky analýzy. 
Tyto výsledky vycházejí z kritérií výb ěru očí a také z reakcí na pozitivní 
a negativní kontroly. Všechny o či použité v analýze by m ěly být ze stejné 
skupiny o čí shromážd ěných v ur čitý den.  
15. Protože o či se oddělují v laborato ři, neporušené hlavy se dopravují z jatek 
za okolní teploty v um ělohmotných krabicích, které jsou navlh čeny ručníky 
namočenými v izotonickém fyziologickém roztoku.  
Kritéria výb ěru očí používaných v ICE  
16. Oči, které mají vysoké základní zbarvení fluoresceinem (tj. > 0,5) nebo 
vysokou hodnotu zákalu rohovky (tj. > 0,5) se po jejich odstran ění vyřadí. 
17. Každá zkušební skupina a soub ěžná pozitivní kontrola poz ůstává nejmén ě ze 
třech očí. Skupina pro negativní kontrolu nebo pro kontrolu s rozpoušt ědlem 
(používá-li se jiné rozpoušt ědlo než fyziologický roztok) poz ůstává nejmén ě 
z jednoho oka.  
POSTUP  
Příprava očí 
18. Oční víčka se opatrn ě vyříznou a p řitom se dává pozor, aby se nepoškodila 
rohovka. Neporušenost rohovky se rychle posoudí kápnutím 2 % (objemové 
hmotnosti) fluoresceinu sodného aplikovaného na povrch rohovky po dobu 
několika vte řin, který se potom opláchne izotonickým fyziologickým rozto ­
kem. Oči ošetřené fluoresceinem se pak zkoumají pod mikroskopem se 
štěrbinovou lampou, aby se zajistilo, že se rohovka nepoškodí (tj. hodnoty 
zadržení fluoresceinu a zákalu rohovky ≤ 0,5).  
19. Není-li oko poškozeno, vy řízne se z lebky a p řitom se dává pozor, aby se 
nepoškodila rohovka. O ční bulbus se vyjme z o čnice tak, že se chirurgickou 
pinzetou pevn ě uchopí mžurka a o ční sval se ust řihne zahnutými tupými 
nůžkami zakon čenými hrotem. Je d ůležité zamezit poškození rohovky 
nadměrným tlakem (tj. kompresní artefakty).  
20. Když je oko vyjmuto z o čnice, viditelná část očního nervu by se m ěla 
nechat spojena. Jakmile se oko vyjme z o čnice, položí se na absorp ční 
podložku a mžurka a jiné pojivové tkán ě se ustřihnou.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Odstran ěné oko se nasadí na nerezavý ocelový držák s rohovkou ve svislé 
poloze. Držák se potom p řenese do komory chladícího p řístroje (16). Držáky 
by se měly v chladícím p řístroji postavit tak, aby kapky izotonického fyzi ­
ologického roztoku dostávala celá rohovka. Teplota komor chladicího přístroje by m ěla být řízena na 32 ± 1,5 °C. V dodatku 3 je schématický 
nákres typického chladícího p řístroje a o čních držák ů, které je možné 
obchodně získat nebo zkonstruovat. P řístroje mohou být upraveny, aby 
splňovaly pot řeby jednotlivé laborato ře (např. umístění různého po čtu očí).
 
22. Když se o či vloží do chladícího p řístroje, znovu se prozkoumají pod mikros ­
kopem se št ěrbinovou lampou, aby se zjistilo, zda nebyly poškozeny b ěhem 
vyřezávání. Tlouš ťka rohovky by se v této dob ě měla také m ěřit na vrcholu 
rohovky s použitím za řízení pro m ěření hlouby na mikroskopu se št ěrbi­
novou lampou. O či s: i) hodnotou zadržení fluoresceinu > 0,5; ii) zákalem 
rohovky > 0,5; nebo iii) jakýmikoli dalšími znaky poškození by se m ěly 
vyměnit. V případě očí nevyřazených na základ ě jakéhokoli z t ěchto kritérií 
se musí vy řadit jednotlivé o či s tloušťkou rohovky, která se o víc než 10 % 
odchyluje od st řední hodnoty pro všechny o či. Uživatelé by si m ěli být 
vědomi toho, že mikroskopy se št ěrbinovou lampou by mohly ukazovat 
měření různé tlouš ťky rohovky, je-li rozdílné nastavení ší řky štěrbiny. 
Šířka štěrbiny by se m ěla nastavit na 0,095 mm.  
23. Poté, co byly o či prozkoumány a schváleny, inkubují se po dobu p řibližně 
45 až 60 minut, aby se uvedly do rovnováhy se zkušebním systémem p řed 
dávkováním. Po dob ě vyrovnání se pro tlouš ťku rohovky a zákal zaznamená 
nulové referen ční měření, které slouží jako základ (tj. čas = 0). Hodnota 
fluoresceinu stanovená p ři oddělování se pro tento koncový bod používá 
jako základní m ěření. 
Aplikace zkoušené látky  
24. Oči se (v držáku) ihned po nulovém referen čním měření vyberou 
z chladícího p řístroje, postaví se do vodorovné polohy a na rohovku se 
aplikuje zkoušená látka.  
25. Tekuté zkoušené látky se zpravidla zkoušejí ne ředěné, mohou se však ředit, 
pokud se to považuje za nutné (nap ř. jako sou část návrhu studie). Prefero ­
vaným ředidlem pro ředěné látky je fyziologický roztok. Za řízených 
podmínek lze však také použít alternativní ředidla, ale vhodnost jiných 
ředidel než fyziologického roztoku by se m ěla prokázat.  
26. Tekuté zkoušené látky se aplikují na rohovku tak, že celý povrch rohovky se 
rovnoměrně pokryje zkoušenou látkou; obvyklý objem je 0,03 ml.  
27. Podle možnosti by se pevné látky m ěly co nejjemn ěji položit do t řecí misky 
a těrky nebo do srovnatelného drtícího prost ředku. Prášek se aplikuje na 
rohovku tak, že se povrch stejnom ěrně pokryje zkoušenou látkou; obvyklé 
množství je 0,03 g.  
28. Zkoušená látka (tekutá nebo pevná) se aplikuje po dobu 10 vte řin a pak se 
z oka opláchne izotonickým fyziologickým roztokem (p řibližně 20 ml) p ři 
okolní teplot ě. Oko (v držáku) se potom v p ůvodní svislé poloze vrátí do 
chladícího p řístroje.  
Látky pro kontrolu  
29. Do každého pokusu by m ěly být zařazeny soub ěžné negativní kontroly nebo 
kontroly s rozpoušt ědlem/vehikulem a pozitivní kontroly.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Když se zkoušejí 100 % tekuté látky nebo pevné látky, fyziologický roztok 
se ve zkušební metod ě ICE používá pro soub ěžnou negativní kontrolu, aby 
se zjistily nespecifické zm ěny ve zkušebním systému a aby se zajistilo, že 
podmínky analýzy nebudou mít za následek nevhodnou dráždivou reakci.  
31. Když se zkoušejí z ředěné tekuté látky, do zkušební metody se za řadí 
skupina pro soub ěžnou kontrolu s rozpoušt ědlem/vehikulem, aby se zjistily 
nespecifické zm ěny ve zkušebním systému a aby se zajistilo, že podmínky 
analýzy nebudou mít za následek nevhodnou dráždivou reakci. Jak je uvedeno v bod ě 25, lze použít pouze rozpoušt ědlo/vehikul, u kterého se 
prokázalo, že nemá nep říznivé účinky na zkušební systém.
 
32. Do každého pokusu se za řadí známá látka s dráždivými ú činky na o či jako 
souběžná pozitivní kontrola, aby se ov ěřilo, že je vyvolána odpovídající 
reakce. Protože analýza ICE se v této zkušební metod ě používá ke zjiš ť­
ování leptavých nebo silných dráždivých látek, pozitivní kontrola by m ěla 
být referen ční látkou, která v této zkušební metod ě vyvolá silnou reakci. 
Aby se však zajistilo, že prom ěnlivost v reakci na pozitivní kontrolu bude 
možné časem vyhodnotit, rozsah silné reakce by nem ěl být nadm ěrný. Měl 
by se vytvo řit dostatek údaj ů in vitro  pro pozitivní kontrolu, aby bylo možné 
vypočítat statisticky stanovený, p řijatelný rozsah pozitivní kontroly. 
Nejsou-li údaje o zkušební metod ě ICE z minulosti pro ur čitou pozitivní 
kontrolu k dispozici, bude nutné uskute čnit studie za ú čelem získání t ěchto 
informací.  
33. Příklady tekutých zkoušených látek pro pozitivní kontroly jsou 10 % kyse ­
lina octová nebo 5 % benzalkonium chlorid, zatímco p říklady pevných 
zkoušených látek pro pozitivní kontroly jsou hydroxid sodný nebo imidazol.  
34. Srovnávací látky jsou ú čelné pro hodnocení potenciálu podrážd ění očí 
neznámými chemickými látkami nebo specifickými t řídami chemických 
látek nebo produkt ů nebo pro hodnocení relativního potenciálu podrážd ění 
látkou s dráždivými ú činky na o či ve specifickém rozmezí dráždivých 
reakcí.  
Měřené koncové body  
35. Zkoušené rohovky se hodnotí p ředběžně ošetřené a hodnocení za číná ve 30, 
75, 120, 180 a 240 minutách (± 5 minut) po oplachu po ošet ření. Tyto 
časové body zajiš ťují odpovídající po čet měření během čtyřhodinové doby 
zkoušení a p řitom ponechávají dostatek času mezi m ěřeními, aby pot řebná 
pozorování byla uskute čněna pro všechny o či. 
36. Hodnocené koncové body jsou zákal a otok rohovky, zadržování fluores ­
ceinu a morfologické ú činky (nap ř. tvoření jizev nebo uvol ňování epitelu). 
Všechny koncové body krom ě zadržování fluoresceinu (který je stanoven 
pouze v p ředběžné úprav ě a 30 minut po expozici zkoušené látce) se ur čují 
v každém výše uvedeném časovém bodu.  
37. Doporu čují se fotografické snímky, aby se zdokumentoval zákal rohovky, 
zadržování fluoresceinu, morfologické ú činky a histopatologie, pokud se 
provádí.  
38. Uživatel ům se po kone čné zkoušce doporu čuje, aby po uplynutí doby čtyř 
hodin uložili o či do vhodného fixa čního prost ředku (nap ř. neutrální pufro ­
vaný formalín) pro p řípadné histopatologické vyšet ření. ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Otok rohovky se ur čuje měřením tlouš ťky rohovky, které se provádí 
optickým pachymetrem pod mikroskopem se št ěrbinovou lampou. Vyjad řuje 
se jako procento a vypo čítává se z m ěření tloušťky rohovky podle následu ­
jícího vzorce: 
" 
corneal thickness at time t  Ä corneal thickness at time  ¼ 0 
corneal thickness at time  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Střední procento otoku rohovky se u všech zkoušených o čí vypočítává pro 
všechny časové body pozorování. Na základ ě nejvyšší st řední hodnoty 
otoku rohovky pozorované v jakémkoli časovém bodu se potom každé 
zkoušené látce p řidělí celková hodnota kategorie.  
41. Zákal rohovky se vypo čítává s použitím plochy rohovky pro hodnocení, 
která je nejvíce zakalena. St řední hodnota zákalu rohovky se u všech zkou ­ 
šených o čí vypočítává pro všechny časové body pozorování. Na základ ě 
nejvyšší st řední hodnoty zákalu rohovky pozorované v jakémkoli časovém 
bodě se potom každé zkoušené látce p řidělí celková hodnota kategorie 
(tabulka 1).  
Tabulka 1  
Hodnoty zákalu rohovky  
Hodnota Pozorování  
0 Žádný zákal. 
0,5 Velmi slabý zákal. 
1 Rozptýlené nebo roztroušené plochy; detaily duhovky jsou jasn ě viditelné. 
2 Snadno rozeznatelná pr ůhledná plocha; detaily duhovky jsou pon ěkud nejasné. 
3 Silný zákal rohovky; nejsou viditelné žádné konkrétní detaily duhovky; velikost 
pupily je st ěží rozeznatelná. 
4 Úplný zákal rohovky; duhovka není viditelná.  
42. Střední hodnota zadržování fluoresceinu se u všech zkoušených o čí vypočítává pouze pro časový 
bod 30minutového pozorování, který se používá pro celkovou hodnotu kategorie p řidělenou každé 
zkoušené látce (tabulka 2).  
Tabulka 2  
Hodnoty zadržování fluoresceinu  
Hodnota Pozorování  
0 Žádné zadržování fluoresceinu. 
0,5 Velmi slabé zbarvení jednotlivých bun ěk. 
1 Zbarvení jednotlivých bun ěk se rozší řilo po zkoušené ploše rohovky. 
2 Fokální nebo splývající úplné zbarvení jednotlivých bun ěk. 
3 Splývající velké plochy zadržování fluoresceinu rohovky.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Morfologické ú činky zahrnují „jizvy“ na epiteliálních bu ňkách rohovky, 
„uvolňování“ epitelu, „zdrsn ění“ povrchu rohovky a „nalepení“ zkoušené 
látky na rohovku. Tato zjišt ění se mohou ve své závažnosti m ěnit 
a mohou se vyskytovat soub ěžně. Klasifikace t ěchto zjišt ění je subjektivní 
podle interpretace výzkumníka.  
ÚDAJE A PODÁVÁNÍ ZPRÁV  
Hodnocení údaj ů 
44. Výsledky ze zákalu a otoku rohovky a zadržování fluoresceinu by se m ěly 
hodnotit zvláš ť, aby se pro každý koncový bod vytvo řila třída ICE. T řídy 
ICE pro každý koncový bod se pak spojí za ú čelem vytvo ření klasifikace 
dráždivých ú činků pro každou zkoušenou látku.  
Kritéria rozhodování  
45. Poté, co byl každý koncový bod vyhodnocen, lze na základ ě předem urče­
ného rozmezí p řiřadit třídy ICE. Interpretace tlouš ťky (tabulka 3) a zákalu 
rohovky (tabulka 4) a zadržování fluoresceinu (tabulka 5) s použitím čtyř 
tříd ICE se uskute čňuje podle t ěchto měřítek: 
Tabulka 3  
Klasifikační kritéria ICE pro tlouš ťku rohovky  
Střední otok rohovky (%) (*) T řída ICE  
0 až 5 I 
> 5 až 12 II 
> 12 až 18 (> 75 min. po zkoušení) II 
> 12 až 18 ( ≤ 75 min. po zkoušení) III 
> 18 až 26 III > 26 až 32 (> 75 min. po zkoušení) III > 26 až 32 ( ≤ 75 min. po zkoušení) IV 
> 32 IV
 
(*) Hodnoty otoku rohovky jsou použitelné pouze, m ěří-li se tlouš ťka pod mikroskopem se št ěrbinovou 
lampou Haag-Streit BP900 s m ěřícím přístrojem na m ěření hloubky č. I a nastavením ší řky štěrbiny na 
9½, což se rovná 0,095 mm. Uživatelé by si m ěli být vědomi toho, že mikroskopy se št ěrbinovou lampou 
by mohly ukazovat m ěření různé tloušťky rohovky, je-li rozdílné nastavení ší řky štěrbiny.  
Tabulka 4  
Klasifikační kritéria ICE pro zákal  
Střední maximální hodnota zákalu (*) T řída ICE  
0,0 – 0,5 I 
0,6 – 1,5 II 1,6 – 2,5 III 2,6 – 4,0 IV
 
(*) Viz tabulka 1.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabulka 5  
Klasifikační kritéria ICE pro st řední zadržování fluoresceinu  
Střední hodnota zadržování fluoresceinu 30 minut 
po zkoušení (*) Třída ICE  
0,0 – 0,5 I 
0,6 – 1,5 II 1,6 – 2,5 III 2,6 – 3,0 IV
 
(*) Viz tabulka 2.  
46. Klasifikace celkových dráždivých ú činků in vitro  pro zkoušenou látku se 
posuzuje z údaj ů klasifikace dráždivých ú činků, která odpovídá kombinaci 
kategorií získaných pro otok rohovky, zákal rohovky a zadržování fluores ­
ceinu a s použitím schématu uvedeného v tabulce 6.  
Tabulka 6  
Klasifikace celkových dráždivých ú činků in vitro  
Klasifikace Kombinace 3 koncových bod ů 
Leptavá/siln ě dráždivá látka 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 
2 × IV, 1 × I (*) 
Zákal rohovky ≥ 3 ve 30 min. (nejmén ě ve 2 
očích) 
Zákal rohovky = 4 v každém časovém bod ě 
(nejméně ve 2 očích) 
Silné uvol ňování epitelu (nejmén ě v 1 oku)
 
(*) Výskyt t ěchto kombinací je mén ě pravděpodobný.  
47. Jak je uvedeno v bod ě 1, pokud zkoušená látka není zjišt ěna jako látka 
s leptavými nebo siln ě dráždivými ú činky na o či, mělo by se uskute čnit 
další zkoušení pro ú čely klasifikace a ozna čování. Zkušební metoda ICE má 
celkovou p řesnost 83 % (120/144) až 87 % (134/154), míru falešné poziti ­
vity 6 % (7/122) až 8 % (9/116) a míru falešné negativity 41 % (13/32) až 
50 % (15/30) pro identifikaci látek s leptavými a siln ě dráždivými ú činky na 
oči, ve srovnání s údaji ze zkušební metody  in vivo  na očích králík ů, 
klasifikovanými podle klasifika čních systém ů EPA (1), EU (2) nebo 
GHS (3). V p řípadě, že látky v ur čitých chemických (tj. alkoholy 
a smáčedla) a fyzikálních (tj. pevné látky) t řídách jsou vylou čeny 
z databáze, p řesnost ICE se v klasifika čních systémech EU, EPA a GHS 
pohybuje v rozmezí od 91 % (75/82) do 92 % (69/75), míra falešné pozi ­
tivity od 5 % (4/73) do 6 % (4/70) a míra falešné negativity od 29 % (2/7) 
do 33 % (3/9) (4).  
48. I když se klasifikace látek s leptavými nebo siln ě dráždivými ú činky na o či 
pro zkoušenou látku nezíská, údaje ICE mohou být užite čné ve spojení 
s testovacími údaji z o ční zkoušky  in vivo  na králících nebo z náležit ě 
validované zkoušky  in vitro , aby se dále vyhodnotila ú čelnost a omezení 
zkušební metody ICE pro zjišt ění slabých dráždivých a nedráždivých látek 
(dokument s pokyny o používání zkušebních metod o ční toxicity  in vitro  se 
zpracovává).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Kritéria p řijetí studie  
49. Zkouška se považuje za p řijatelnou, pokud soub ěžné negativní kontroly 
s vehikulem/ rozpoušt ědlem a soub ěžné pozitivní kontroly poskytnou klasi ­
fikaci dráždivých ú činků, které spadají p říslušně do tříd nedráždivých a siln ě 
dráždivých/leptavých látek.  
Zpráva o zkoušce  
50. Zpráva o zkoušce by m ěla zahrnovat tyto informace, pokud se týkají usku ­
tečňování studie:  
Zkoušené látky a látky pro kontrolu  
Chemický název (chemické názvy), nap ř. strukturální název používaný 
službou chemických abstrakt (CAS), s dalšími názvy, jsou-li známy;  
registrační číslo (RN) CAS, je-li známo;  
čistota a složení látky nebo sm ěsi (v procentu (procentech) podle váhy), 
jsou-li tyto informace dostupné;  
fyzikálně chemické vlastnosti, nap ř. fyzikální stav, t ěkavost, pH, stálost, 
třída chemických látek, rozpustnost ve vod ě odpovídající provád ění studie;  
případně ošetření zkoušených látek/látek pro kontrolu p řed zkoušením (nap ř. 
zahřátí, mletí);  
stálost, je-li známa.  
Informace týkající se zadavatele a zkušebního za řízení  
Jméno a adresa zadavatele, zkušebního za řízení a vedoucího studie;  
určení zdroje o čí (např. zařízení, z n ěhož byly získány);  
podmínky skladování a dopravy o čí (např. datum a čas shromážd ění očí, 
časový interval p řed zahájením zkoušení);  
specifické vlastnosti zví řat, z nichž byly získány o či, jsou-li tyto vlastnosti 
k dispozici (nap ř. věk, pohlaví, hmotnost dárce).  
Zdůvodnění použité zkušební metody a protokolu  
Úplnost zkušební metody  
Postup používaný k zajišt ění úplnosti (tj. p řesnost a spolehlivost) zkušební 
metody v pr ůběhu času (např. pravidelné zkoušení vhodných látek, využí ­
vání dosavadních údaj ů negativních a pozitivních kontrol).  
Kritéria pro p řijatelnou zkoušku  
případně přijatelné rozsahy soub ěžných srovnávacích kontrol na základ ě 
dosavadních údaj ů. 
Zkušební podmínky  
Popis použitého zkušebního systému;  
použitý mikroskop se št ěrbinovou lampou (nap ř. model);  
nastavení p řístroje pro používaný mikroskop se št ěrbinovou lampou;  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
informace o použitých ku řecích očích, včetně prohlášení o jejich kvalit ě; 
podrobnosti o použitém zkušebním postupu;  
koncentrace použité zkoušené látky;  
popis všech zm ěn zkušebního postupu;  
odkaz na dosavadní údaje modelu (nap ř. negativní a pozitivní kontroly, 
vhodné látky, srovnávací látky);  
popis použitých hodnotících kritérií.  
Výsledky  
popis jiných pozorovaných ú činků; 
případně fotografické snímky o čí. 
Posouzení výsledk ů 
Závěr 
LITERATURA  
01) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
02) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 
16. prosince 2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek a sm ěsí, 
o změně a zrušení sm ěrnice 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zm ěně 
nařízení (ES) č. 1907/2006. Ú ř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.  
03) Organizace spojených národ ů (OSN) (2007). Globáln ě harmonizovaný 
systém klasifikace a ozna čování chemických látek (GHC), druhé revi ­
dované vydání, OSN New York a Ženeva, 2007. Dostupné na:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html].  
04) ICCVAM (2007). Zpráva o hodnocení zkušební metody – zkušební 
metody  oční toxicity in vitro  pro zjišťování látek se siln ě dráždivými 
a leptavými ú činky na o či. Koordina ční výbor mezi r ůznými organi ­
zacemi pro ov ěřování platnosti alternativních metod (ICCVAM) 
a Středisko mezi r ůznými organizacemi pro hodnocení alternativních 
toxikologických metod (NICEATM) národního toxikologického programu (NTP). Publikace NIH č.: 07-4517. Dostupné na:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
05) ESAC (2007). Prohlášení o uzav ření retrospektivní studie ICCVAM 
o orgánových analýzách  in vitro  jako screeningové testy pro zjiš ťování 
potenciálních látek s leptavými a siln ě dráždivými ú činky na o či. 
Dostupné na:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
06) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 
18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, o z řízení Evropské agentury pro chemické látky, 
o změně směrnice 1999/45/ES a o zrušení na řízení Rady (EHS) 
č. 793/93, na řízení Komise (ES) č. 1488/94, sm ěrnice Rady 
76/769/EHS a sm ěrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES 
a 2000/21/ES. Ú ř. věst. L 396, 30.12.2006, s. 1.
 
07) OECD (2002). Metodika 405. Pokyn OECD pro zkoušení chemických 
látek. Akutní podrážd ění/poleptání o čí. Dostupné na:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html].  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
08) ICCVAM (2007). Doporu čený protokol zkušební metody ICE 
ICCVAM. Ve: Zpráv ě o hodnocení zkušební metody ICCVAM – 
zkušební metody o ční toxicity  in vitro  pro zjišťování látek se siln ě 
dráždivými a leptavými ú činky na o či. Koordina ční výbor mezi 
různými organizacemi pro ov ěřování platnosti alternativních 
metod (ICCVAM) a St ředisko mezi r ůznými organizacemi pro hodno ­
cení alternativních toxikologických metod (NICEATM) národního toxikologického programu (NTP). Publikace NIH č.: 07-4517. 
Dostupné na:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
09) ICCVAM. (2006). Sou časný stav zkušebních metod  In Vitro  pro zjišť­
ování látek s leptavými a siln ě dráždivými ú činky na o či: zkušební 
metoda odd ěleného ku řecího oka (ICE). Publikace NIH č.: 06-4513. 
Research Triangle Park: národní toxikologický program. Dostupné na:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm].  
10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated 
eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  31:69-76.
 
11) INVITTOX (1994). Protokol 80: Zkouška odstran ěného kuřecího 
oka (CEET). Dostupné na: [http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): 
A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials.  Food Chem. Toxicol.  34:291-296.
 
14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  
35:23-37.
 
15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Heal ­
thcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Dostupné na:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.  
17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
18) ICCVAM (2006). Základní dokument o p řezkumu, sou časný stav 
zkušebních metod  in vitro  pro zjiš ťování látek s leptavými a siln ě 
dráždivými ú činky na o či: zkušební metoda pro zákal a propustnost 
rohovky u skotu (BCOP). Dostupné na:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].  
19) ICCVAM (2006). Základní dokument o p řezkumu, sou časný stav 
zkušebních metod  in vitro  pro zjiš ťování látek s leptavými a siln ě 
dráždivými ú činky na o či: zkušební metoda odd ěleného ku řecího 
oka (ICE). Dostupné na:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Přesnost:  Přesnost shody mezi výsledky zkušební metody a p řijatými referen ­ 
čními hodnotami. Je to m ěření výsledku zkušební metody a jednoho aspektu 
„důležitosti“. Termín se často používá namísto „souladu“, kterým se rozumí 
podíl správných výsledk ů zkušební metody.  
Srovnávací látka:  Látka použitá jako norma pro srovnání se zkoušenou látkou. 
Srovnávací látka by m ěla mít tyto vlastnosti: i) nesporný a spolehlivý zdroj 
(nesporné a spolehlivé zdroje); ii) strukturální a funk ční podobnost s t řídou 
zkoušených látek; iii) známé fyzikální/chemické vlastnosti; iv) podp ůrné údaje 
o známých ú čincích a v) známá síla v rozsahu žádoucí reakce.  
Rohovka:  Průhledná přední část oční bulvy, která zahrnuje duhovku a o čnici 
a propouští sv ětlo dovnit ř oka.  
Zákal rohovky:  Měření rozsahu zákalu rohovky po expozici zkoušené látce. 
Zvýšený zákal rohovky je p říznačný pro poškození rohovky.  
Otok rohovky:  Objektivní m ěření rozsahu zdu ření rohovky ve zkoušce ICE po 
expozici zkoušené látce. Vyjad řuje se procentuáln ě a vypočítává se z m ěření 
základní tlouš ťky rohovky (p řed dávkováním) a tlouš ťky zaznamenávané 
v pravidelných intervalech po vystavení zkoušené látce ve zkoušce ICE. Stupe ň 
otoku rohovky je p říznačný pro poškození rohovky.  
Kategorie 1 EPA:  Zasažení poleptáním (nevratné poškození o ční tkáně) nebo 
zasažení rohovky či dráždění přetrvávající déle než 21 dní (1).  
Kategorie R41 EU:  Tvorba poškození tkání v oku nebo závažné fyzikální 
slábnutí vid ění po aplikaci zkoušené látky na p řední plochu oka, které není 
plně vratné do 21 dní od aplikace (2).  
Míra falešné negativity:  Podíl všech pozitivních látek falešn ě zjištěných 
zkušební metodou jako negativní. Je to jeden z ukazatel ů výsledku zkušební 
metody.  
Míra falešné pozitivity:  Podíl všech negativních látek falešn ě zjištěných 
zkušební metodou jako pozitivní. Je to jeden z ukazatel ů výsledku zkušební 
metody.  
Zadržování fluoresceinu:  Subjektivní m ěření rozsahu fluoresceinu sodného ve 
zkoušce ICE, který je zadržován bu ňkami epitelu v rohovce po expozici zkou ­ 
šené látce. Stupe ň zadržování fluoresceinu je p říznačný pro poškození epitelu 
rohovky.  
GHS (Globáln ě harmonizovaný systém klasifikace a ozna čování chemických 
látek):  Systém klasifikace chemických látek (látek a sm ěsí) podle standardizo ­
vaných typ ů a úrovní fyzikálních, zdravotních a environmentálních rizik 
a odpovídajícího ozna čpvání pomocí prvk ů informací o nebezpe čnosti, jako 
jsou výstražné symboly nebezpe čnosti, signální slova, standardní v ěty 
o nebezpe čnosti, pokyny pro bezpe čné zacházení a bezpe čnostní listy, aby 
byly poskytnuty informace o jejich nep říznivých ú čincích s ohledem na ochranu 
lidí (včetně zaměstnavatelů, zaměstnanců, dopravc ů, spotřebitelů a respondér ů 
nebezpečí) a životního prost ředí (3).  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
Kategorie 1 GHS:  Tvorba poškození tkání v oku nebo závažné fyzikální sláb ­
nutí vidění po aplikaci zkoušené látky na p řední plochu oka, které není pln ě 
vratné do 21 dní od aplikace (3).  
Nebezpečnost:  Základní charakteristika látky nebo situace, která má potenciál 
vyvolat nep říznivé účinky, jsou-li organismus, systém nebo (sub)populace vysta ­
veny této látce.  
Negativní kontrola:  Nezkoušená replika, která obsahuje všechny složky zkušeb ­
ního systému. Tento vzorek se zpracovává se vzorky zkoušené látky a jinými 
kontrolními vzorky, aby se ur čilo, zda rozpoušt ědlo vzájemn ě reaguje se 
zkušebním systémem.  
Nedráždivá látka:  Látky, které nejsou klasifikovány jako látky s dráždivými 
účinky na o či kategorie I, II, nebo III EPA; kategorie R41 nebo R36 EU; 
nebo kategorie 1, 2A, nebo 2B GHS (1)(2)(3).  
Látka s leptavými ú činky na o či: a) Látka, která zp ůsobuje nevratné poškození 
tkání očí. b) Látky, které jsou klasifikovány jako látky s dráždivými ú činky na 
oči kategorie 1 GHS, kategorie I EPA nebo kategorie R41 EU (1)(2)(3).  
Látka s dráždivými ú činky na o či: a) látka, která zp ůsobuje nevratnou zm ěnu 
v oku po aplikaci na p řední plochu oka; b) látky, které jsou klasifikovány jako 
látky s dráždivými ú činky na o či kategorie II nebo III EPA, kategorie R36 EU 
nebo kategorie 2A nebo 2B GHS (1) (2) (3).  
Silně dráždivá látka:  a) Látka, která zp ůsobuje poškození tkání v oku po 
aplikaci na p řední plochu oka, které není vratné do 21 dní od aplikace, nebo 
způsobuje vážné fyzické snížení vid ění. b) Látky, které jsou klasifikovány jako 
látky s dráždivými ú činky na o či kategorie 1 GHS, kategorie I EPA nebo kate ­
gorie R41 EU (1)(2)(3).  
Pozitivní kontrola:  Replika obsahující všechny složky zkušebního systému 
a zkoušená s látkou, o níž je známo, že zp ůsobuje pozitivní reakci. Aby se 
zajistilo, že prom ěnlivost v reakci na pozitivní kontrolu bude možné časem 
vyhodnotit, rozsah silné reakce by nem ěl být nadm ěrný. 
Spolehlivost:  Měření rozsahu, v jakém se zkušební metoda m ůže časem použít 
opakovan ě v laborato řích a mezi laborato řemi, když se provádí s použitím stej ­
ného protokolu. Hodnotí se to výpo čtem laboratorní a mezilaboratorní reprodu ­
kovatelnosti a laboratorní opakovatelnosti.  
Mikroskop se št ěrbinovou lampou:  Přístroj používaný k p římému vyšet ření oka 
se zvětšením pod binokulárním mikroskopem a vytvo řením stereoskopického, 
přímého obrazu. Ve zkušební metod ě ICE se tento p řístroj používá 
k prohlížení p ředních struktur ku řecího oka a také k objektivnímu m ěření tlou­ 
šťky rohovky s p řídavným za řízením na m ěření hloubky.  
Kontrola s rozpoušt ědlem/vehikulem:  Neošetřený vzorek obsahující všechny 
složky zkušebního systému, v četně rozpoušt ědla nebo vehikulu, který se zpraco ­
vává s ošet řenou zkoušenou látkou a jinými kontrolními vzorky, aby se zjistila 
základní reakce vzork ů zkoušených se zkoušenou látkou rozpušt ěnou ve stejném 
rozpouštědle nebo vehikulu. Pokud se vzorek zkouší se soub ěžnou negativní 
kontrolou, ukazuje také, zda rozpoušt ědlo nebo vehikul vzájemn ě reaguje se 
zkušebním systémem.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Stupňovité zkoušení:  Strategie postupného zkoušení, kde se všechny existující 
informace o zkoušené látce p řezkoumávají ve stanoveném po řadí s použitím 
postupu váhy d ůkazů na každém stupni, aby se zjistilo, zda je k dispozici dost 
informací pro rozhodnutí o klasifikaci nebezpe čnosti, než se postoupí do dalšího 
stupně. Pokud potenciál dráždivých ú činků zkoušené látky lze ur čit na základ ě 
existujících informací, další zkoušení není nutné. Jestliže na základ ě existujících 
informací nelze ur čit potenciál dráždivých ú činků zkoušené látky, použije se 
stupňovitý postupný postup zkoušení na zví řatech, dokud se neur čí jednozna čná 
klasifikace.  
Validovaná zkušební metoda:  Zkušební metoda, pro kterou byly zpracovány 
validační studie s cílem ur čit důležitost (v četně přesnosti) a spolehlivost pro 
specifický ú čel. Je nutné poznamenat, že validovaná zkušební metoda nemusí 
poskytnout posta čující výsledek z hlediska p řesnosti a spolehlivosti, aby byla 
shledána p řijatelnou pro navržený ú čel. 
Váha důkazů: Postup zvažování silných a slabých stránek r ůzných informací 
v dosahování a podpo ře závěru týkajícího se potenciálu nebezpe čnosti látky.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Dodatek 2  
VHODNÉ CHEMICKÉ LÁTKY PRO ZKUŠEBNÍ METODU ICE  
Než laborato ře rutinně použijí zkušební metodu, která dodržuje tuto zkušební 
metodu, m ěly by prokázat svou odbornou zp ůsobilost správným ur čením klasi ­
fikace 10 látek s dráždivými ú činky na o či doporučených v tabulce 1. Tyto látky 
byly vybrány tak, aby p ředstavovaly rozsah reakcí pro místní podrážd ění/­
poleptání o čí, který vychází z výsledk ů očních zkoušek  in vivo  na králících 
(TG 405) (tj. kategorie 1, 2A, 2B nebo neklasifikované či označené podle 
GHS OSN (3)(7). S p řihlédnutím k validované ú čelnosti těchto analýz (tj. zjiš ť­
ování pouze látek s leptavými/siln ě dráždivými ú činky na o či) však existují 
pouze dva výsledky zkoušky pro klasifika ční účely (leptavá/siln ě dráždivá 
látka nebo neleptavá/slabá dráždivá látka), aby byla prokázána odborná zp ůsobi­
lost. Dalším kritériem výb ěru bylo to, zda látka je komer čně dostupná, zda jsou 
k dispozici kvalitní referen ční údaje  in vivo  a zda jsou k dispozici kvalitní údaje 
ze dvou metod  in vitro , pro které byly zpracovány metodiky. Z tohoto d ůvodu 
byly dráždivé látky vybrány z doporu čeného seznamu 122 referen čních látek 
ICCVAM pro ov ěření platnosti zkušebních metod o ční toxicity  in vitro  (viz 
dodatek H: Seznam doporu čených referen čních látek ICCVAM) (4). Referen ční 
údaje jsou dostupné v základním dokumentu o p řezkumu ICCVAM pro zkušební 
metodu pro zákal a propustnost rohovky u skotu (BCOP) a zkušební metodu odděleného ku řecího oka (ICE) (18) (19).
 
Tabulka 1  
Doporučené látky k prokázání odborné zp ůsobilosti pro ICE  
Chemická látka CASRN Třída chemických 
látek (*) Fyzikální forma Klasifikace (*) in 
vivo Klasifikace (*) in vitro  
Benzalkoniumchlorid 
(5 %) 8001-54-5 Oniová slou če­
nina Tekutá Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráž­
divá látka 
Chlorhexidin 55-56-1 Amin, amidin Pevná Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráž­
divá látka 
Dibenzoyl-L–tarta ­
rová kyselina 2743-38-6 Karboxylová 
kyselina, ester Pevná Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráž­
divá látka 
Imidazol 288-32-4 Heterocyklická Pevná Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráž­
divá látka 
Kyselina trichloroc ­
tová (30 %) 76-03-9 Karboxylová 
kyselina Tekutá Kategorie 1 Leptavá/siln ě dráž­
divá látka 
Dichlorobenzoylch ­
lorid 4659-45-4 Acylhalogenid Tekutá Kategorie 2A Neleptavá/slabá dráž ­
divá látka 
Ethyl-2-metylace ­
to–acetát 609-14-3 Keton, ester Tekutá Kategorie 2B Neleptavá/slabá dráž ­
divá látka 
Dusičnan amonný 6484-52-2 Anorganická 
sůl Pevná Kategorie 2A Neleptavá/slabá dráž ­
divá látka  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Chemická látka CASRN Třída chemických 
látek (*) Fyzikální forma Klasifikace (*) in 
vivo Klasifikace (*) in vitro  
Glycerol 56-81-5 Alkohol Tekutá Neozna čená Neleptavá/slabá dráž ­
divá látka 
n-hexan 110-54-3 Uhlovodík 
(acyklický) Tekutá Neozna čená Neleptavá/slabá dráž ­
divá látka  
Zkratky: CASRN = registra ční číslo podle služby chemických abstrakt 
( 1 ) Chemické t řídy byly p řiděleny každé zkoušené látce s použitím standardního klasifika čního schématu na základ ě klasifika čního 
systému Národní knihovny názv ů léků a léčivých látek (MeSH) (dostupný na http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Založena na o ční zkoušce  in vivo  na králících (OECD TG 405) a s použitím GHS OSN (3)(7). 
( 3 ) Založena na výsledcích v BCOP a ICE.  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Dodatek 3  
Schématický nákres chladícího p řístroje a držák ů očí ICE  
Další obecn ě použitelné popisy chladícího p řístroje a držáku o čí viz Burton et al. (17)
  ▼M2 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49  ZKOUŠKA  IN VITRO  NA P ŘÍTOMNOST MIKROJADER 
V BUŇKÁCH SAVC Ů 
ÚVOD  
1. Zkouška  in vitro  na přítomnost mikrojader (MNvit) je zkouška genotoxicity 
pro zjišťování přítomnosti mikrojader v cytoplazm ě interfázových bun ěk. 
Mikrojádra mohou pocházet z acentrických fragment ů chromozom ů (tzn. 
fragmentů, jimž chybí centromera) nebo z celých chromozom ů, které nejsou 
při buněčném dělení schopny se ve stádiu anafáze rozejít k pól ům. Zkouška 
zjišťuje působení klastogenních a aneugenních chemikálií (látek a sm ěsí) (1) 
(2) v buňkách, které prod ělaly buněčné dělení během expozice nebo po 
expozici zkoušené látce. Tato zkušební metoda (ZM) umož ňuje používat 
protokoly s inhibitorem polymerace aktinu, cytochalasinem B (cytoB), i bez 
něho. 5. P řidání cytoB p řed cílovou mitózou umož ňuje identifikaci 
a selektivní analýzu četnosti výskytu mikrojader v bu ňkách, které prod ělaly 
jednu mitózu, protože tyto bu ňky jsou dvoujaderné (3) (4). Tato ZM rovn ěž 
umožňuje použití protokol ů bez blokování cytokineze, pokud existují 
důkazy, že analyzovaná populace bun ěk prodělala mitózu.  
2. Krom ě použití zkoušky MNvit pro identifikaci chemikálií (látek a sm ěsí), 
které vyvolávají vznik mikrojader, lze informace o mechanismech poško ­
zení chromozom ů a tvorbě mikrojader získat rovn ěž použitím blokování 
cytokineze, imunochemického zna čení kinetochor ů nebo hybridizace za 
použití centromerických/telomerických sond (fluorescen ční hybridizace  in 
situ (FISH)) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Postupy 
značení a hybridizace lze použít, pokud dojde ke zvýšené tvorb ě mikrojader 
a zkoušející chce zjistit, zda je toto zvýšení výsledkem klastogenního a/nebo aneugenního p ůsobení.
 
3. Mikrojádra p ředstavují poškození p řenesené na dce řiné buňky, zatímco 
chromozomové aberace zjišt ěné v metafázových bu ňkách se p řenášet 
nemusí. Jelikož mikrojádra v interfázových bu ňkách lze posuzovat pom ěrně 
objektivn ě, laboratorní personál pot řebuje pouze zjistit, zda bu ňky prošly 
dělením, či nikoli, a kolik bun ěk obsahuje mikrojádra. Díky tomu lze 
preparáty vyhodnotit pom ěrně rychle a analýzu lze automatizovat. Proto 
je praktické hodnotit p ři každé zkoušce tisíce namísto stovek bun ěk, čímž 
se zvyšuje výkonnost této metody. A kone čně, jelikož mikrojádra mohou 
vznikat z mén ě vyvinutých chromozom ů, je možno zjiš ťovat látky, které 
vyvolávají aneuploidii, jež lze obtížn ě studovat za použití b ěžných zkoušek 
na chromozomové aberace, nap ř. podle zkušební metodiky OECD č. 473 
(kapitola B.10 této p řílohy) (17). Zkouška MNvit však neumož ňuje odlišit 
chemické látky vyvolávající polyploidii od látek vyvolávajících klastogeni ­
citu bez speciálních postup ů, jako je nap říklad metoda FISH popsaná 
v odstavci 2.  
4. Zkouška MNvit je metoda  in vitro , která obvykle využívá kultivované 
lidské bu ňky nebo bu ňky pocházející z hlodavc ů. Poskytuje komplexní 
základ pro vyšet řování potenciálu látek poškozovat chromozomy  in vitro , 
protože jejím prost řednictvím lze detekovat aneugeny i klastogeny.  
5. Zkouška MNvit je robustní a ú činná u široké škály r ůzných typ ů buněk, za 
přítomnosti nebo nep řítomnosti cytoB. Existuje množství údaj ů potvrzují ­
cích platnost zkoušky MNvit za použití r ůzných bun ěčných linií pocháze ­
jících z hlodavc ů (CHO, V79, CHL/IU a L5178Y) a také za použití 
lidských lymfocyt ů (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) 
(29) (30) (31). Pat ří mezi n ě zejména mezinárodní valida ční studie  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
koordinované spole čností Société Française de Toxicologie 
Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) a zprávy z Mezinárodního 
semináře o zkoušení genotoxicity (4) (16). Dostupné údaje byly rovn ěž 
přehodnoceny v retrospektivní valida ční studii v rámci p řístupu založeného 
na vážení d ůkazů, provedené Evropským st řediskem pro validaci alternativ ­
ních metod (ECVAM) Evropské komise, a zkušební metoda byla potvrzena 
jako vědecky platná v ědeckým poradním výborem ECVAM (ESAC) (32) 
(33) (34). Bylo popsáno využití lidské linie lymfoblastoidních bun ěk TK6 
(35), bun ěk HepG2 (36) (37) a primárních bun ěk z embryí syrského k řečka 
(38), ačkoli nebyly použity ve valida čních studiích.  
DEFINICE  
6. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
7. Zkoušky provád ěné in vitro  obecně vyžadují použití exogenního zdroje 
metabolické aktivace, pokud nejsou bu ňky metabolicky kompetentní 
s ohledem na zkoušené látky. Systém exogenní metabolické aktivace 
zcela nenapodobuje podmínky  in vivo . Je také nutno zabránit vzniku 
podmínek, které by vedly k um ěle pozitivním výsledk ům, jež neodrážejí 
vlastní mutagenitu zkoušené látky, a které mohou nastat p ůsobením tako ­
vých faktor ů, jako jsou výrazné zm ěny pH nebo osmolality, nebo 
v důsledku vysokých úrovní cytotoxicity (39) (40) (41). Pokud zkoušená 
látka způsobí při přidání změnu pH kultiva čního média, je nutno hodnotu 
pH upravit, nejlépe pufrováním zásobního roztoku tak, aby všechny objemy 
ve všech zkoušených koncentracích a pro všechny kontroly z ůstaly stejné.  
8. Pro analýzu indukce vzniku mikrojader je nezbytné, aby prob ěhla mitóza 
v exponovaných i neexponovaných kulturách. Nejinformativn ější fází pro 
hodnocení výskytu mikrojader jsou bu ňky, které prod ělaly jednu mitózu 
během expozice nebo po expozici zkoušené látce.  
PODSTATA ZKOUŠKY  
9. Bun ěčné kultury lidského a sav čího původu jsou vystaveny zkoušené látce 
za přítomnosti exogenního zdroje metabolické aktivace i bez n ěho, pokud 
ovšem nejsou použity bu ňky s dostate čnou schopností metabolismu. Do 
všech zkoušek se za řadí souběžné kontroly s rozpoušt ědlem nebo vehi ­
kulem a pozitivní kontrolní látky.  
10. Během nebo po expozici zkoušené látce se bu ňky kultivují dostate čně 
dlouho, aby poškození chromozom ů nebo d ělicího vřeténka vedlo 
v interfázových bu ňkách ke vzniku mikrojader. Pro vyvolání aneuploidie 
by měla být zkoušená látka obvykle p řítomna p ři mitóze. Získané 
a obarvené interfázové bu ňky se analyzují na p řítomnost mikrojader. 
V ideálním p řípadě by měla být přítomnost mikrojader zjišt ěna pouze 
v těch buňkách, které prod ělaly mitózu b ěhem expozice zkoušené látce 
nebo během postexpozi ční doby, pokud se používá. V kulturách, které 
byly ošet řeny blokátorem cytokineze, se toho dosáhne tím, že se zazname ­
nají pouze dvoujaderné bu ňky. V případě nepřítomnosti blokátoru cytoki ­
neze je nutno prokázat, že analyzované bu ňky pravd ěpodobně prodělaly 
buněčné dělení během expozice nebo po expozici zkoušené látce. 
U všech protokol ů je důležité prokázat, že došlo k proliferaci bun ěk jak 
v kontrolních, tak v ošet řených kulturách, a také je t řeba v kulturách (nebo 
v paralelních kulturách), u nichž se hodnotí výskyt mikrojader, posoudit 
míru cytotoxicity nebo cytostáze.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
POPIS ZKOUŠKY  
Preparáty  
11. Lze použít kultivované primární lidské lymfocyty z periferní krve (5) (19) 
(42) (43) a celou řadu buněčných linií pocházejících z hlodavc ů, například 
buňky CHO, V79, CHL/IU a L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) 
(27) (28) (30). Použití jiných bun ěčných linií a druh ů by mělo být od ůvod­
něno na základ ě jejich prokázané funk čnosti ve zkoušce, jak je popsáno 
v části „Kritéria p řijatelnosti“. Jelikož četnost mikrojader v rámci p řiroze­
ného pozadí ovlivní citlivost testu, doporu čuje se používat druhy bun ěk 
s nízkou, stabilní četností tvorby mikrojader v rámci p řirozeného pozadí.  
12. Lidské lymfocyty z periferní krve by m ěly být získány od mladých (p ři­
bližně ve věku 18–35 let) zdravých neku řáků bez jakékoli známé nedávné 
expozice genotoxickým látkám nebo radiaci. Pokud se spole čně používají 
buňky pocházející od více než jednoho dárce, m ěl by být po čet dárců 
uveden. Četnost mikrojader se zvyšuje s v ěkem a tato tendence je 
výraznější u žen než u muž ů (44), což je t řeba vzít v úvahu p ři výběru 
dárcovských bun ěk pro spole čné použití.  
Média a podmínky kultivace  
13. Pro udržování kultur by se m ěla používat vhodná kultiva ční média 
a inkuba ční podmínky (kultiva ční nádoby, koncentrace CO  2 , teplota 
a vlhkost). U stabilizovaných bun ěčných linií a kmen ů by se m ěla pravi­
delně kontrolovat stabilita modální hodnoty po čtu chromozom ů a mělo by 
se zjišťovat, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty. Pokud jsou kultury 
kontaminované nebo se modální hodnota po čtu chromozom ů změnila, 
neměly by se doty čné kultury používat. Je t řeba, aby bylo známo normální 
trvání bun ěčného cyklu p ři kultivačních podmínkách použitých ve zkušební 
laboratoři. V případě použití metody s blokováním cytokineze by se 
koncentrace inhibitoru cytokineze m ěla optimalizovat pro konkrétní typ 
buněk a mělo by se prokázat, že tato koncentrace poskytuje dostate čné 
množství dvoujaderných bun ěk pro vyhodnocení zkoušky.  
Příprava kultur  
14. Stabilizované bun ěčné linie a kmeny: bu ňky se pomnoží z kmenových 
kultur, nasadí se do kultiva čního média v takové hustot ě, aby před 
odebráním nedosáhly b ěžné kultury konfluence v monovrstvách a aby 
suspenzní kultury nedosáhly nadm ěrné hustoty, a inkubují se p ři teplotě 
37 °C.  
15. Lymfocyty: plná krev ošet řená antikoagulantem (nap ř. heparinem) nebo 
oddělené lymfocyty se p řed expozicí zkoušené látce a cytoB kultivují za 
přítomnosti mitogenu, nap ř. fytohemaglutininu (PHA).  
Metabolická aktivace  
16. Při použití bun ěk s nedostate čnou endogenní metabolickou schopností by se 
měly použít exogenní metabolizující systémy. Nej častěji používaným 
systémem je kofaktorem dotovaná postmitochondriální frakce (S9) p řipra­
vená z jater hlodavc ů ošetřených činidlem vyvolávajícím tvorbu enzym ů, 
jako je nap říklad Aroclor 1254 (45) (46), nebo sm ěsí fenobarbitonu a β- 
naftoflavonu (46) (47) (48) (49). Použití uvedené sm ěsi není v rozporu se 
Stockholmskou úmluvou o perzistentních organických zne čišťujících 
látkách (50) a s na řízením (ES) č. 850/2004 o perzistentních organických 
znečišťujících látkách (66), p řičemž bylo prokázáno, že co se tý če vyvolání 
tvorby oxidáz se smíšenou funkcí, je tato sm ěs stejně účinná jako Aroclor 
1254 (46) (47) (48) (49). V kone čném zkušebním médiu se frakce S9 
obvykle používá v koncentracích od 1 do 10 % (v objemovém vyjád ření). 
Stav systému pro aktivaci metabolismu m ůže záviset na chemické t řídě 
zkoušené látky a v n ěkterých p řípadech m ůže být vhodné použít více než 
jednu koncentraci S9.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Geneticky modifikované bun ěčné linie vylu čující aktiva ční enzymy speci ­
fické pro preparáty získané od lidí a hlodavc ů mohou eliminovat pot řebu 
exogenního systému pro aktivaci metabolismu a lze je používat jako zkušební bu ňky. V takových p řípadech je nutno volbu použitých bun ěčných 
linií vědecky zd ůvodnit, nap ř. důležitostí oxidáz se smíšenou funkcí pro 
metabolismus zkoušené látky (51) a jejich schopností reagovat na známé 
klastogeny a aneugeny (viz samostatná část „Kritéria p řijatelnosti“). Je t řeba 
počítat s tím, že zkoušené látky nemusí být vylou čenou oxidázou (vylou ­ 
čenými oxidázami) se smíšenou funkcí metabolizovány; v tom p řípadě by 
negativní výsledky neprokazovaly, že zkoušená látka nem ůže vyvolávat 
tvorbu mikrojader.
 
Příprava zkoušené látky  
18. Pevné chemické látky by se m ěly před použitím k ošet ření buněk rozpustit 
ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech a pop řípadě zředit. Kapalné 
látky lze p řidat přímo do zkušebních systém ů a/nebo je lze p řed použitím 
k ošetření buněk zředit. Plyny a t ěkavé látky by se m ěly zkoušet za použití 
vhodně upravených standardních protokol ů, například prost řednictvím 
ošetření buněk v neprodyšn ě uzavřených nádobách (52) (53). M ěly by se 
používat čerstvě připravené zkoušené látky, pokud údaje o stálosti nepro ­
kazují možnost skladování.  
Zkušební podmínky:  
Rozpoušt ědla nebo vehikula  
19. Rozpoušt ědlo nebo vehikulum nesmí reagovat se zkoušenou látkou a p ři 
použité koncentraci nesmí být neslu čitelné s p řežitím bun ěk nebo 
s udržením aktivity S9. Pokud se používají jiná než zavedená rozpoušt ědla 
nebo vehikula (jako jsou nap říklad voda, médium pro kultivaci bun ěk, 
dimethylsulfoxid), je nutno jejich použití podpo řit údaji o jejich kompati ­
bilitě se zkoušenou látkou a o tom, že nejsou genotoxické. Doporu čuje se 
pokud možno nejprve zvážit použití vodného rozpoušt ědla nebo vehikula.  
Používání cytoB jako blokátoru cytokineze  
20. Jedním z nejd ůležitějších hledisek p ři provádění zkoušky MNvit je zajistit, 
aby hodnocené bu ňky prodělaly mitózu b ěhem expozice zkoušené látce 
nebo během postexpozi ční doby, pokud se používá. CytoB je látka, která 
se nejčastěji používá k blokování cytokineze, protože inhibuje sestavení 
aktinu a tím zabra ňuje oddělení dceřiných bun ěk po mitóze, což vede ke 
vzniku dvoujaderných bun ěk (5) (54) (55). Proto lze hodnocení výskytu 
mikrojader omezit pouze na bu ňky, které prod ělaly mitózu b ěhem ošetření 
zkoušenou látkou nebo po n ěm. Současně lze měřit účinek zkoušené látky 
na kinetiku bun ěčné proliferace. CytoB by se m ěl používat jako blokátor 
cytokineze p ři použití lidských lymfocyt ů, protože délky trvání bun ěčného 
cyklu budou u r ůzných kultur a dárc ů proměnlivé a protože ne všechny 
lymfocyty budou reagovat na PHA. P ři zkoušení bun ěčných linií za ú čelem 
určení, zda se hodnocené bu ňky rozdělily, se používají i jiné metody, jež 
jsou uvedeny níže (viz odstavec 26).  
21. V laborato ři by se m ěla stanovit vhodná koncentrace cytoB pro každý druh 
buněk, aby se dosáhlo optimální četnosti dvoujaderných bun ěk 
v kontrolních kulturách s rozpoušt ědlem/vehikulem. Vhodná koncentrace 
cytoB obvykle činí 3 až 6 mg/ml.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Měření buněčné proliferace a cytotoxicity a volba expozi čních koncentrací  
22. Při určování nejvyšší koncentrace zkušební látky je nutno se vyhnout koncen ­
tracím, které mají schopnost produkovat um ěle pozitivní odezvy, nap říklad 
koncentracím, jež vyvolávají velmi vysokou cytotoxicitu, vysrážení v kultivačním médiu a výrazné zm ěny pH nebo osmolality (39) (40) (41).
 
23. Měření buněčné proliferace se provádí proto, aby bylo zajišt ěno, že ošet řené 
buňky prodělaly během zkoušky mitózu a že se jednotlivá ošet ření 
provádějí při vhodných úrovních cytotoxicity (viz odstavec 29). Cytotoxi ­
cita by m ěla být stanovena s metabolickou aktivací a bez metabolické 
aktivace u bun ěk, které vyžadují metabolickou aktivaci pomocí relativního 
nárůstu počtu buněk (RICC) nebo relativního zdvojnásobení 
populace (RPD) (p říslušné vzorce viz dodatek 2), pokud se ovšem nepo ­
užívá cytoB. P ři použití cytoB lze cytotoxicitu stanovit za použití replika č­
ního indexu (RI) (p říslušný vzorec viz dodatek 2).  
24. Ošet ření kultur cytoB a m ěření relativních četností jednojaderných, dvouja ­
derných a vícejaderných bun ěk v kultuře představuje p řesnou metodu kvan ­
tifikace ú činku na bun ěčnou proliferaci a cytotoxického nebo cytostatického 
působení látky použité k ošet ření kultury (5) a zajiš ťuje, že se hodnotí 
pouze bu ňky, které prod ělaly buněčné dělení během ošetření nebo po n ěm. 
25. Ve studiích s cytoB lze cytostázi nebo cytotoxicitu kvantifikovat podle 
proliferačního indexu p ři blokování cytokineze (CBPI) (5) (26) (56) nebo 
mohou být odvozeny z RI nejmén ě 500 bun ěk v každé kultu ře (příslušné 
vzorce viz dodatek 2). Když se k posouzení bun ěčné proliferace používá 
cytoB, měl by se CBPI nebo RI ur čit nejmén ě u 500 bun ěk v každé kultu ře. 
Tato měření lze mimo jiné použít k odhadu cytotoxicity porovnáním hodnot 
u exponované kultury s hodnotami u kontrolní kultury. Užite čné informace 
může poskytnout i hodnocení ostatních ukazatel ů cytotoxicity (nap ř. 
konfluence, po čtu buněk, apoptózy, nekrózy, po čítání metafází).  
26. Ve studiích bez použití cytoB je nutno prokázat, že hodnocené bu ňky 
v kultuře prodělaly buněčné dělení během ošetření zkoušenou látkou nebo 
po něm, jinak mohou vznikat falešn ě negativní odezvy. Mezi metody, které 
se doposud používaly k zajišt ění toho, aby se hodnotily pouze bu ňky, které 
prodělaly buněčné dělení, patří vpravení a následná detekce bromdeoxyuri ­
dinu (BrdU), který umož ňuje identifikovat bu ňky, které se replikovaly (57), 
vytváření klonů, když se bu ňky z permanentních bun ěčných linií ošet řují 
a hodnotí  in situ  na mikroskopickém sklí čku (prolifera ční index (PI)) (25) 
(26) (27) (28), nebo m ěření relativního zdvojnásobení populace (RPD) či 
relativního nár ůstu počtu buněk (RICC) nebo jiné osv ědčené metody (16) 
(56) (58) (59) (p říslušné vzorce viz dodatek 2). Užite čné informace m ůže 
poskytnout i hodnocení ostatních ukazatel ů cytotoxicity nebo cytostáze 
(např. konfluence, po čtu buněk, apoptózy, nekrózy, po čítání metafází).  
27. Měly by se vyhodnotit nejmén ě tři analyzovatelné zkušební koncentrace. 
K tomu m ůže být nezbytné provést experiment za použití v ětšího množství 
podobných koncentrací a analyzovat tvorbu mikrojader v t ěch koncentra ­
cích, jež poskytují vhodný rozsah hodnot cytotoxicity. Alternativní strategie 
spočívá v provedení p ředběžné zkoušky cytotoxicity, aby se zúžil rozsah 
pro konečnou zkoušku.  
28. Cílem je, aby nejvyšší koncentrace poskytla 55 ± 5 % cytotoxicitu. 32. Vyšší 
úrovně mohou jako sekundární efekt cytotoxicity vyvolat poškození chromo ­
zomů (60). Pokud dochází k výskytu cytotoxicity, m ěly by zvolené koncentrace 
pokrývat širokou škálu hodnot, které zp ůsobují různé úrovn ě cytotoxicity od 
55 ± 5 % cytotoxicity až po nízkou nebo žádnou cytotoxicitu.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Pokud není zjišt ěna žádná cytotoxicita nebo je pozorován vznik sraženiny, 
měla by nejvyšší zkušební koncentrace odpovídat nejnižší z hodnot 0,01 M, 
5 mg/ml nebo 5 μl/ml. Vzájemný rozdíl mezi jednotlivými koncentracemi 
zvolenými pro analýzu by obecn ě neměly činit více než 10 %. 
U zkoušených látek, které vykazují strmé k řivky závislosti odezvy na 
koncentraci, m ůže být nezbytné, zvolit menší kroky mezi jednotlivými 
koncentracemi zkoušené látky, aby mohly být ohodnoceny i kultury se středními a nízkými rozsahy toxicity.
 
30. Když je limitujícím faktorem rozpustnost, m ěla by se maximální koncent ­
race, pokud není omezena cytotoxicitou, rovnat nejnižší koncentraci, p ři 
které je v kulturách viditelná minimální sraženina, pokud to ovšem 
neovlivní vyhodnocení. Hodnocení precipitace by se m ělo provád ět tako­
vými metodami, jako je sv ětelná mikroskopie, p řičemž je nutno si všímat 
sraženiny, která p řetrvává nebo se objeví b ěhem kultivace (p řed ukončením 
expozice).  
Kontroly  
31. Součástí každého experimentu by m ěly být soub ěžné pozitivní kontroly 
a kontroly s rozpoušt ědlem/vehikulem p ři současné metabolické aktivaci 
a bez ní.  
32. Pozitivní kontroly jsou nezbytné k prokázání schopnosti použitých bun ěk 
a zkušebního protokolu identifikovat klastogeny a aneugeny a potvrdit metabolickou schopnost p řípravku S9. Pozitivní kontrola by m ěla využívat 
známé látky podn ěcující tvorbu mikrojader v koncentracích, u nichž se 
předpokládá malé, avšak reprodukovatelné zvýšení nad hodnoty pozadí, 
a měla by prokázat citlivost zkušebního systému. Koncentrace pozitivní 
kontroly by m ěly být zvoleny tak, aby byl ú činek zřetelný, ale aby p ři 
odečtu nevyšla ihned najevo totožnost kódovaného preparátu.
 
33. Klastogenní látka, která vyžaduje metabolickou aktivaci (nap ř. cyklofosfa ­
mid, benzo[a]pyren) by se m ěla použít k prokázání jak schopnosti metabo ­
lismu bun ěk, tak schopnosti zkušebního systému zjistit p řítomnost klasto ­
genů. V odůvodněných případech lze používat i další pozitivní kontroly. 
Jelikož n ěkteré pozitivní kontroly, které vyžadují metabolickou aktivaci, 
mohou za ur čitých podmínek ošet ření nebo u ur čitých bun ěčných linií 
působit i bez exogenní metabolické aktivace, je nutno u zvolené bun ěčné 
linie při zvolených koncentracích otestovat pot řebnost metabolické aktivace 
a rovněž účinnost přípravku S9.  
34. V sou časné době nejsou známy žádné aneugenní látky, které by ke svému 
genotoxickému p ůsobení vyžadovaly metabolickou aktivaci (16). Mezi 
v současnosti uznávané pozitivní kontroly aneugenního p ůsobení pat ří 
například kolchicin a vinblastin. Jiné chemické látky lze použít v p řípadě, 
že vyvolávají vznik mikrojader výhradn ě nebo převážně prostřednictvím 
aneugenního p ůsobení. Aby nebyly nutné dv ě pozitivní kontroly (na klas ­
togenicitu a aneugenicitu) bez metabolické aktivace, m ůže kontrola aneu ­
genicity sloužit jako pozitivní kontrola bez použití p řípravku S9 a kontrolu 
klastogenicity lze využít k testování vhodnosti použitého systému metabo ­
lické aktivace. Pozitivní kontrola na klastogenicitu a aneugenicitu by se měly používat u bun ěk, které nevyžadují použití p řípravku S9. Navrhované 
pozitivní kontroly jsou uvedeny v dodatku 3.
 
35. Lze zvážit použití pozitivní kontroly související s ur čitou chemickou t řídou, 
pokud jsou k dispozici vhodné chemické látky. Všechny použité pozitivní 
kontroly by m ěly být vhodné pro daný druh bun ěk a podmínky aktivace.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Studie by m ěla zahrnovat kontroly s rozpoušt ědlem/vehikulem p ři každém 
odběru buněk k vyhodnocení. Krom ě toho by se m ěly používat rovn ěž 
neošetřené negativní kontroly (bez rozpoušt ědla/vehikula), pokud nejsou 
publikovány nebo pokud nemá laborato ř dřívější kontrolní údaje, jež 
prokazují, že zvolené rozpoušt ědlo při použitých koncentracích nevyvolává 
žádné genotoxické ani jiné škodlivé ú činky.  
ZKUŠEBNÍ POSTUP  
Harmonogram aplikace  
37. Aby se maximalizovala pravd ěpodobnost detekce aneugenní nebo klasto ­
genní látky p ůsobící v ur čitém stadiu bun ěčného cyklu, je d ůležité, aby byl 
dostatečný počet buněk ošetřen zkoušenou látkou ve všech fázích jejich 
buněčných cykl ů. Harmonogram aplikace pro bun ěčné linie a primární 
buněčné kultury se proto m ůže poněkud lišit od harmonogramu aplikace 
u lymfocyt ů, které k zahájení svého bun ěčného cyklu pot řebují mitogenní 
stimulaci, p řičemž o jednotlivých harmonogramech pojednávají odstavce 41 
až 43 (16).  
38. Teoretické úvahy spolu s publikovanými údaji (18) ukazují, že v ětšina 
aneugenních a klastogenních látek bude detekována za použití krátkodobé expozice v trvání 3 až 6 hodin za p řítomnosti i nep řítomnosti p řípravku S9, 
po níž následuje odstran ění zkoušené látky a doba r ůstu v délce 1,5 až 2,0 
buněčných cykl ů (6). Vzorky bun ěk se odebírají v dob ě odpovídající asi 
1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžného bun ěčného cyklu (tzn. bez apli ­
kace zkoušené látky), bu ď po začátku nebo na konci aplikace (viz 
tabulka 1). Intervaly odb ěru vzorků nebo obnovy kultur lze prodloužit, 
pokud je známo nebo existuje podez ření, že zkoušená látka ovliv ňuje trvání 
buněčného cyklu (nap říklad při zkoušení analog ů nukleosid ů).
 
39. Vzhledem k možnému cytotoxickému p ůsobení přípravků S9 na kultivo ­
vané savčí buňky se prodloužená expozice v trvání 1,5násobku až 2,0ná ­
sobku běžných bun ěčných cykl ů používá jen za nep řítomnosti S9. P ři 
prodloužené expozici existují možnosti, které dovolují ošet řit buňky zkou­ 
šenou látkou za nep řítomnosti nebo za p řítomnosti cytoB. Tyto možnosti 
jsou určeny pro situace, kdy mohou být obavy ohledn ě možných interakcí 
mezi zkoušenou látkou a cytoB.  
40. Navrhované harmonogramy expozice bun ěk jsou uvedeny v tabulce 1. Tyto 
obecné harmonogramy expozice lze upravit v závislosti na stabilit ě 
a reaktivit ě zkoušené látky nebo zvláštních r ůstových charakteristikách 
použitých bun ěk. Veškeré expozice by m ěly být zahájeny a ukon čeny 
v okamžiku, kdy po čet buněk exponenciáln ě narůstá. Tyto harmonogramy 
jsou podrobn ěji uvedeny v následujících odstavcích 41 až 47.  
Tabulka 1  
Doby expozic a odb ěru buněk k vyhodnocení v rámci zkoušky MNvit  
Lymfocyty, primární bu ňky a bun ěčné linie 
ošetřené s cytoB + S9 Expozice po dobu 3–6 hod. za p řítomnosti S9; 
odstranění S9 a expozi čního média; 
doplnění čerstvého média a cytoB; 
odběr k vyhodnocení po uplynutí doby odpo ­
vídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání 
běžných bun ěčných cykl ů. 
– S9 
Krátká expozice Expozice po dobu 3–6 hod.; 
odstranění expozi čního média; 
doplnění čerstvého média a cytoB; 
odběr k vyhodnocení po uplynutí doby odpo ­
vídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání běžných bun ěčných cykl ů.
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Prodloužená expozice  Možnost A:  Expozice po dobu odpovídající 
1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných 
buněčných cykl ů za přítomnosti cytoB; 
odběr k vyhodnocení na konci doby expozice.  
Možnost B:  Expozice po dobu odpovídající 
1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných 
buněčných cykl ů; 
odstranění zkušební látky; 
doplnění čerstvého média a cytoB; 
odběr k vyhodnocení po uplynutí doby odpo ­
vídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání běžných bun ěčných cykl ů. 
Buněčné linie ošet řené bez cytoB 
(Harmonogramy jsou shodné s harmonogramy uvedenými výše s výjimkou toho, že se nep řidává žádný cytoB.)
 
Lymfocyty, primární bu ňky a buněčné linie s cytoB  
41. U lymfocyt ů je nejúčinnější zahájit expozici zkoušené látce za 44–48 hodin 
po stimulaci PHA, až zmizí synchronizace cykl ů (5). Při úvodní zkoušce se 
nechá na bu ňky působit zkoušená látka po dobu 3 až 6 hodin za nep řítom­
nosti a za p řítomnosti S9. Zkušební médium se odstraní a nahradí čerstvým 
médiem obsahujícím cytoB a bu ňky se odeberou k vyhodnocení po uplynutí 
doby odpovídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných bun ěčných 
cyklů. 
42. Pokud jsou ob ě úvodní zkoušky s krátkou expozicí (3–6 hod.) negativní 
nebo nejednozna čné, použije se následná prodloužená expozice bez p řítom­
nosti S9. K dispozici jsou dv ě možnosti provedení zkoušky, p řičemž obě 
jsou stejn ě přijatelné. M ůže však být vhodn ější postupovat podle možnosti 
A pro stimulované lymfocyty, kde m ůže exponenciální nár ůst počtu buněk 
začít 96 hodin po stimulaci klesat. P ři použití možnosti B by také bun ěčné 
kultury nem ěly před konečným odběrem vzorku dosáhnout konfluence.  
— Možnost A: Bu ňky jsou vystaveny p ůsobení zkoušené látky po dobu 
odpovídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných bun ěčných cykl ů 
a odeberou se k vyhodnocení na konci doby expozice.  
— Možnost B: Bu ňky jsou vystaveny p ůsobení zkoušené látky po dobu 
odpovídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných bun ěčných 
cyklů. Zkušební médium se odstraní a nahradí čerstvým médiem 
a buňky se odeberou k vyhodnocení po uplynutí doby odpovídající 
1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných bun ěčných cykl ů. 
43. Primární bu ňky a bun ěčné linie je nutno ošet řit stejným zp ůsobem jako 
lymfocyty krom ě toho, že není nutno je stimulovat pomocí PHA po dobu 
44–48 hodin. Jiné bu ňky než lymfocyty by m ěly být vystaveny p ůsobení 
zkoušené látky tak, aby v okamžiku ukon čení studie byly bu ňky stále ve 
fázi růstu, při které se jejich po čet exponenciáln ě zvyšuje.  
Buněčné linie bez cytoB  
44. Buňky je nutno vystavit p ůsobení zkoušené látky po dobu 3–6 hodin za 
přítomnosti a nep řítomnosti S9. Zkušební médium se odstraní a nahradí 
čerstvým médiem a bu ňky se odeberou k vyhodnocení po uplynutí doby 
odpovídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných bun ěčných cykl ů. ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Pokud jsou ob ě úvodní zkoušky s krátkou expozicí (3–6 hod.) negativní 
nebo nejednozna čné, použije se následná prodloužená expozice (bez p řítom­
nosti S9). K dispozici jsou dv ě možnosti provedení zkoušky, p řičemž obě 
jsou stejn ě přijatelné.  
— Možnost A: Bu ňky jsou vystaveny p ůsobení zkoušené látky po dobu 
odpovídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných bun ěčných cykl ů 
a odeberou se k vyhodnocení na konci doby expozice.  
— Možnost B: Bu ňky jsou vystaveny p ůsobení zkoušené látky po dobu 
odpovídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných bun ěčných 
cyklů. Zkušební médium se odstraní a nahradí čerstvým médiem 
a buňky se odeberou k vyhodnocení po uplynutí doby odpovídající 
1,5násobku až 2,0násobku trvání b ěžných bun ěčných cykl ů. 
46. Na konci doby expozice v trvání 3–6 hodin se v monovrstvách mohou 
vyskytovat mitotické bu ňky (které se vyzna čují okrouhlým tvarem 
a odchlipováním od povrchu). Jelikož lze tyto mitotické bu ňky snadno 
oddělit, mohou být p ři odstranění média obsahujícího zkoušenou látku ztra ­
ceny. Tyto bu ňky je třeba při promývání kultur shromáždit a vrátit je zp ět, 
aby při odběru k vyhodnocení nedošlo ke ztrát ě buněk, které se nacházejí 
ve fázi mitózy a jsou ohroženy vznikem mikrojader.  
Počet kultur  
47. Pro každou koncentraci zkoušené látky a v p řípadě kultur 
s vehikulem/rozpoušt ědlem a kultur negativních kontrol je nutno použít 
duplicitní kultury. Pokud lze na základ ě předešlých laboratorních údaj ů 
prokázat minimální rozdíl mezi duplicitními kulturami, m ůže být přijatelné 
použít jen po jedné kultu ře. V případě použití vždy jen jedné kultury se 
doporučuje analyzovat zvýšený po čet koncentrací.  
Odběr buněk a příprava preparát ů 
48. Buňky z každé kultury se odebírají a zpracovávají zvláš ť. Příprava bun ěk 
může zahrnovat hypotonizaci, ale tento krok není nutný, pokud se dosáhne 
odpovídajícího rozší ření buněk jiným zp ůsobem. P ři přípravě preparátů lze 
použít různé postupy za p ředpokladu, že zajistí získání vysoce kvalitních 
buněčných preparát ů pro vyhodnocení. Cytoplazmu bun ěk je nutno uchovat, 
aby bylo možné provést detekci mikrojader a (v p řípadě metody 
s blokováním cytokineze) spolehlivou identifikaci dvoujaderných bun ěk. 
49. Preparáty lze barvit pomocí r ůzných metod, jako je Giemsa nebo použití 
fluorescen ční barviv se specifickou vazbou na DNA (59). Použitím barviva 
se specifickou vazbou na DNA (jako je nap ř. akridinová oranž (61) nebo 
Hoechst 33258 a pyronin-Y (62)) se lze vyhnout n ěkterým artefakt ům 
spojeným s použitím barviva bez specifické vazby na DNA. Jsou-li p řed­
mětem zájmu informace o mechanismu vzniku mikrojader, lze k identifikaci 
jejich obsahu (chromozom nebo chromozomální fragment) využít protilátky proti kinetochor ům, hybridiza ční metodu FISH využívající 
pan-centromerické DNA-sondy, p řípadně značení in situ  pomocí primer ů 
se specifickou pan-centromerickou vazbou spolu s vhodným kontrastním 
barvením DNA (15) (16). K rozlišení mezi klastogeny a aneugeny lze použít i jiné metody, pokud se ukázaly jako ú činné.
 
Analýza  
50. Všechny preparáty v četně preparátů s rozpoušt ědlem/vehikulem a preparát ů 
kontrol by m ěly být před analýzou pod mikroskopem nezávisle ozna čeny 
kódem. Nebo lze kódované vzorky analyzovat za použití validovaného 
automatického systému pro pr ůtokovou cytometrii nebo systému pro 
analýzu obrazu.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. V p řípadě kultur ošet řených pomocí cytoB by se m ěla analyzovat četnost 
výskytu mikrojader nejmén ě u 2 000 dvoujaderných bun ěk pro každou 
koncentraci (nejmén ě u 1 000 dvoujaderných bun ěk z každé kultury; po 
dvou kulturách pro každou koncentraci). V p řípadě použití vždy jen jedné 
kultury by se m ělo z každé kultury vyhodnotit alespo ň 2 000 dvoujaderných 
buněk pro každou koncentraci. Pokud je k dispozici k vyhodnocení pro 
každou koncentraci podstatn ě méně než 1 000 dvoujaderných bun ěk 
z každé kultury (respektive než 2 000, jestliže se použije jen jedna kultura) a není-li zjišt ěn výrazný nár ůst výskytu mikrojader, musí se zkouška zopa ­
kovat za použití v ětšího počtu buněk nebo p ři méně toxických koncentra ­
cích (podle toho, co z t ěchto dvou možností p řipadá v úvahu). Je t řeba dbát 
na to, aby se nezapo čítávaly dvoujaderné bu ňky, které mají nepravidelný 
tvar nebo jejichž dv ě jádra se svou velikostí navzájem zna čně liší; také se 
nesmějí za dvoujaderné bu ňky mylně považovat nedostate čně rozšířené 
jednojaderné bu ňky. Buňky obsahující více než dv ě hlavní jádra by se 
nemě
la analyzovat na p řítomnost mikrojader, jelikož základní četnost 
mikrojader m ůže být v t ěchto buňkách vyšší (63) (64). Zapo čtení jednoja ­
derných bun ěk je přijatelné, pokud se prokáže, že zkoušená látka narušuje 
působení cytoB.  
52. U bun ěčných linií zkoušených bez ošet ření cytochalasinem B by se m ěla 
vyhodnotit četnost mikrojader alespo ň u 2 000 bun ěk pro každou koncen ­
traci (alespo ň u 1 000 bun ěk z každé kultury; po dvou kulturách pro každou 
koncentraci). P ři použiti pouze jedné kultury pro každou koncentraci by se 
mělo vyhodnotit nejmén ě 2 000 bun ěk z dané kultury.  
53. Při použití cytoB by se m ěla určit hodnota CBPI nebo RI k posouzení 
buněčné proliferace (viz dodatek 2) za použití nejmén ě 500 bun ěk 
z každé kultury. Když se expozice provádí bez p řítomnosti cytoB, je 
nezbytné prokázat, že hodnocené bu ňky prodělaly proliferaci, jak je vysv ět­
leno v odstavcích 24 až 27.  
Kritéria p řijatelnosti  
54. Laborato ř, která navrhuje používání zkoušky MNvit popsané v této ZM, by 
měla prokázat svou schopnost spolehliv ě a přesně detekovat chemické látky 
se známým aneugenním a klastogenním p ůsobením, p ři použití metabolické 
aktivace i bez ní, jakož i známé negativní látky za použití srovnávacích 
látek uvedených v dodatku 3. Svou schopnost správn ě provádět tuto ZM by 
měla laborato ř prokázat p ředložením d ůkazů, že buňky, u nichž vyhodno ­
cuje tvorba mikrojader, prod ělaly jedno jaderné d ělení, pokud se zkouška 
provádí bez použití cytoB.  
55. Jako srovnávací látky se doporu čuje používat chemické látky uvedené 
v dodatku 3. Náhradní nebo další chemické látky lze rovn ěž používat, 
pokud jsou známy jejich ú činky, pokud vyvolávají tvorbu mikrojader 
stejným mechanismem p ůsobení a pokud je prokázáno, že mají vztah 
k chemickým látkám, které se budou testovat za použití postupu MNvit. Součástí zdůvodnění může být valida ční studie využívající širokou škálu 
látek nebo zam ěřená na užší spektrum na základ ě chemické t řídy zkoušené 
látky nebo zkoumaného mechanismu vzniku poškození.
 
56. Kontrola s rozpoušt ědlem/vehikulem a neošet řené kultury by m ěly posky­
tovat reprodukovateln ě nízké a konzistentní četnosti mikrojader (obvykle 
5–25 mikrojader na 1 000 bun ěk v případě druhů buněk uvedených 
v odstavci 11). Jiné druhy bun ěk mohou mít odlišné rozsahy odezvy, 
které by m ěly být stanoveny p ři validaci jejich používání v rámci zkoušky 
MNvit. Údaje z negativních kontrol, kontrol s rozpoušt ědlem a pozitivních 
kontrol by m ěly sloužit ke stanovení dosavadních kontrolních rozmezí. Tyto 
hodnoty by se m ěly použít p ři rozhodování o vhodnosti za řazení soub ě­ 
žných negativních nebo pozitivních kontrol do experimentu.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Jsou-li pro provedení zkoušky navrhovány menší zm ěny protokolu (nap ř. 
použití automatizovaných namísto ru čních postup ů vyhodnocování, použití 
nového druhu bun ěk), je nutno prokázat ú čelnost této zm ěny, nežli lze 
upravený protokol považovat za p řijatelný k použití. Sou částí prokázání 
účelnosti je d ůkaz, že lze zjistit hlavní mechanismy poškození chromozom ů 
a zvýšení nebo snížení jejich po čtu a že lze dosáhnout odpovídajících 
pozitivních i negativních výsledk ů u třídy jednotlivé látky nebo širokého 
spektra látek, které se mají testovat.  
ÚDAJE A VYKAZOVÁNÍ  
Zpracování výsledk ů 
58. Pokud se používá technika blokování cytokineze, slouží k hodnocení 
indukce vzniku mikrojader jen četnost dvoujaderných bun ěk s mikrojádry 
(nezávisle na po čtu mikrojader v každé bu ňce). Počítání buněk s jedním, 
dvěma nebo více mikrojádry by mohlo poskytnout užite čné informace, ale 
není povinné.  
59. Soub ěžně by se mělo provád ět měření cytotoxicity a/nebo cytostáze u všech 
ošetřených kultur a u kontrolních kultur s rozpoušt ědlem/vehikulem (58). 
Při použití metody s blokováním cytokineze, by se m ěly vypočítat hodnoty 
CBPI nebo RI u všech ošet řených a kontrolních kultur jako ukazatele 
zpoždění buněčného cyklu. V p řípadě nepřítomnosti cytoB by se m ěly 
použít hodnoty RPD, RICC nebo PI (viz dodatek 2).  
60. Je nutno uvést údaje za jednotlivé kultury. Krom ě toho se všechny údaje 
shrnou do tabulky.  
61. Chemické látky, které vyvolávají vznik mikrojader p ři zkoušce MNvit, mají 
tento účinek proto, že vyvolávají poškození chromozom ů, ztrátu chromo ­
zomů nebo kombinaci obou t ěchto dějů. Při určování, zda je mechanismus 
vyvolání tvorby mikrojader d ůsledkem klastogenního a/nebo aneugenního 
působení, lze uplatnit další analýzu za použití protilátek proti kinetochor ům, 
sond  in situ  se specifickou vazbou na centromery nebo jiných metod.  
Hodnocení a interpretace výsledk ů 
62. Žádné ov ěření jednozna čně pozitivní nebo negativní odezvy pomocí 
dodatečné zkoušky není nutné. Nejednozna čné výsledky lze objasnit 
analýzou dalšího 1 000 bun ěk ze všech kultur, aby se zabránilo ztrát ě 
zaslepení. Pokud tento p řístup výsledek neobjasní, m ělo by se provést 
další testování. P ři následných experimentech by se m ělo zvážit upravení 
parametrů studie u rozší řeného nebo zúženého rozsahu podmínek podle 
toho, co p řichází v úvahu. Mezi parametry studie, které lze p řípadně upra­
vit, patří velikost kroku mezi jednotlivými zkušebními koncentracemi, na ča­
sování expozice a odb ěru buněk k vyhodnocení a/nebo podmínky metabo ­
lické aktivace.  
63. Existuje n ěkolik kritérií pro stanovení pozitivního výsledku, nap říklad 
s koncentrací související nebo statisticky významné zvýšení po čtu buněk 
obsahujících mikrojádra. Nejprve je nutno posoudit biologický význam 
výsledků. Při hodnocení významu biologické odpov ědi může být vodítkem 
posouzení, zda jsou zjišt ěné hodnoty uvnit ř nebo vně rozsahu dosavadních 
hodnot kontrol. P ři hodnocení výsledk ů zkoušky lze jako pom ůcku použít 
vhodné statistické metody (65). Výsledky statistických test ů je však t řeba 
posuzovat s ohledem na závislost odezvy na dávku. V úvahu je nutno vzít 
také reprodukovatelnost a dosavadní údaje.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Ačkoli většina experiment ů poskytne jednozna čně pozitivní nebo negativní 
výsledky, v n ěkterých p řípadech neumožní soubor údaj ů vyslovit kone čný 
výrok o p ůsobení zkoušené látky. Tyto dvojzna čné nebo sporné odezvy se 
mohou vyskytovat bez ohledu na to, kolikrát je experiment opakován.  
65. Pozitivní výsledky zkoušky MNvit znamenají, že zkoušená látka vyvolává 
v kultivovaných sav čích buňkách poškození nebo ztrátu chromozom ů. 
Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za použitých podmínek zkoušky nevyvolává poškození chromozom ů a/nebo nár ůst či pokles po čtu 
kultivovaných sav čích buněk.
 
Protokol o zkoušce  
66. Protokol o zkoušce musí obsahovat alespo ň tyto informace, pokud jsou pro 
provedení studie významné:  
Zkoušená látka:  
— identifika ční údaje a registra ční číslo CAS a číslo ES,  
— skupenství a čistota,  
— fyzikáln ě-chemické vlastnosti významné pro provedení studie,  
— reaktivita zkoušené látky s rozpoušt ědlem/vehikulem nebo médiem pro 
kultivaci bun ěk. 
Rozpouštědlo/vehikulum:  
— zdůvodnění výběru rozpoušt ědla/vehikula,  
— rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpoušt ědle/vehikulu.  
Buňky: 
— druh a zdroj použitých bun ěk, 
— vhodnost použitého druhu bun ěk, 
— nepřítomnost mykoplasmat, pokud p řipadá v úvahu,  
— informace o trvání bun ěčného cyklu, dob ě zdvojnásobení populace nebo 
proliferačním indexu,  
— při použití lymfocyt ů je případně nutno uvést pohlaví, v ěk a počet dárců 
krve,  
— při použití lymfocyt ů je nutno uvést, zda se exponuje plná krev nebo 
odstředěné lymfocyty,  
— počet průchodů, pokud p řipadá v úvahu,  
— metody udržování bun ěčných kultur, pokud p řipadá v úvahu,  
— modální hodnota po čtu chromozom ů, 
— běžné trvání bun ěčného cyklu (u negativní kontroly).  
Zkušební podmínky:  
— totožnost látky blokující cytokinezi (nap ř. cytoB), pokud je použita, 
a její koncentrace a trvání expozice bun ěk, 
— zdůvodnění volby koncentrací a po čtu kultur v četně údajů o cytotoxicit ě 
a omezeních rozpustnosti, jsou-li tyto informace k dispozici,  
— složení média, p řípadně koncentrace CO  2 , 
— hodnoty koncentrace zkoušené látky,  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— koncentrace (a/nebo objem) p řidaného vehikula a zkoušené látky,  
— teplota a doba inkubace,  
— trvání expozice,  
— doba od expozice do odb ěru buněk k vyhodnocení,  
— hustota bun ěk při naočkování média, pokud p řipadá v úvahu,  
— druh a složení metabolického aktiva čního systému v četně kritérií p řija­
telnosti,  
— látky použité jako pozitivní a negativní kontrola,  
— metody p řípravy preparát ů a použitý postup barvení,  
— kritéria pro identifikaci mikrojader,  
— počty analyzovaných bun ěk, 
— metody m ěření cytotoxicity,  
— jakékoli dopl ňkové informace týkající se cytotoxicity,  
— kritéria pro ozna čení studií za pozitivní, negativní nebo dvojzna čné, 
— použité metody statistické analýzy,  
— tam, kde je to vhodné, je nutno uvést rovn ěž metody (nap říklad využití 
protilátek proti kinetochor ům), které slouží k ur čení, zda mikrojádra 
obsahují celé nebo rozlámané chromozomy.  
Výsledky:  
— použitý zp ůsob měření cytotoxicity, nap ř. CBPI nebo RI nebo v p řípadě 
metody blokování cytokineze, respektive RICC nebo RPD nebo PI, pokud se metody blokování cytokineze nepoužívají, pop řípadě jiné 
poznatky, nap ř. konfluence bun ěk, apoptóza, nekróza, po čítání metafází, 
četnost dvoujaderných bun ěk,
 
— známky precipitace,  
— hodnoty pH a osmolality zkušebního média, pokud jsou zjišt ěny, 
— vymezení p řijatelných bun ěk pro analýzu,  
— rozložení jednojaderných, dvoujaderných a vícejaderných bun ěk, pokud 
se používá metoda blokování cytokineze,  
— počet buněk s mikrojádry uvedený zvláš ť u každé ošet řené a kontrolní 
kultury a p řípadně určení, zda se jedná o dvoujaderné nebo jednojaderné 
buňky, 
— pokud možno závislost odezvy na koncentraci,  
— chemické údaje (koncentrace a rozpoušt ědla) soub ěžných negativních 
kontrol (s rozpoušt ědlem/vehikulem) a pozitivních kontrol,  
— chemické údaje (koncentrace a rozpoušt ědla) dřívějších negativních 
kontrol (s rozpoušt ědlem/vehikulem) a pozitivních kontrol s uvedením 
rozsahů, střední hodnoty, sm ěrodatné odchylky a intervalu spolehlivosti 
(např. 95 %),  
— statistická analýza, p řípadné p hodnoty.  
Rozbor výsledk ů 
Závěry ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
LITERATURA  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1–4.  
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3–15.  
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233–246.  
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167–172.
 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084–1104.  
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193–198.  
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34–43.
 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9–20.  
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with 
biotinylated gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297–302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329–334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with 
a centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205–213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519–525.  
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes follo ­
wing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor 
fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 
9–20.  
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centro ­
meric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 372, 
233–245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211–219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153–163.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. K dispozici na adrese: [www.oecd.org/env/testguidelines].  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13–36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37–60.
 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61–87.  
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., 
Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study 
on the  in vitro  micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 
607, 88–124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125–152.
 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187–208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
45–59.  
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81–116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemi ­
cally induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183–190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55–71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells - results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137–163.
 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 517, 123–134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in 
a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569–580.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 
1–152.  
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16–17 November, 2006, K dispozici na adrese: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, K dispozici na adrese: [http://ecvam.jrc.it/index.htm].
 
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271–283.  
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and 
Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid 
and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105–115.  
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257–260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315–328.
 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian 
hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61–70.  
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under 
extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147–205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 
297–305.  
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789–886.  
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes,  Mutation Res. , 147, 29–36.  
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11–18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. 
Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the 
frequency of micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31–45.
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173–215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. 
Toxicol. , 4, 55–65.
 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175–177.
 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85–88.  
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51–59.  
(50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). K dispozici na adrese: 
[http://www.pops.int/].  
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
247–274.
 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Muta ­
tion Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., Costa, 
D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New 
York, Plenum, pp. 91–103.  
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795–801.
 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: 
a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35–44.
 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 521, 103–112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the  in vitro  micronucleus assay working group“,  Mutation 
Res., 564, 97–100.
 
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61–65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1–3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169–184.
 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191–201.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241–247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269–275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, 241–247.  
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65–75.  
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463–467.  
(66) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 850/2004 ze dne 29. dubna 
2004 o perzistentních organických zne čišťujících látkách a o zm ěně směr­
nice 79/117/EHS (Ú ř. věst. L 229, 30.4.2004, s. 5).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Dodatek 1  
Definice  
Aneugen:  jakákoli látka nebo proces, který v interakci se složkami mitotického 
a meiotického cyklu bun ěčného dělení vede k aneuploidii v bu ňkách nebo orga ­
nismech.  
Aneuploidie:  jakákoli odchylka od normálního diploidního (nebo haploidního) 
počtu chromozom ů o jeden nebo více chromozom ů, avšak nikoli o celou sadu 
(nebo více sad) chromozom ů (polyploidie).  
Apoptóza:  programovaná bun ěčná smrt, která se vyzna čuje řadou krok ů vedou­
cích k rozpadu bun ěk na membránov ě vázané části, které jsou poté odstran ěny 
fagocytózou nebo rozkladem.  
Buněčná proliferace:  zvyšování po čtu buněk v důsledku jejich mitotického 
dělení. 
Centromera:  oblast DNA v chromozomu, kde se stýkají ob ě chromatidy a k níž 
jsou bok po boku p řipojeny oba kinetochory.  
Klastogen:  jakákoli látka nebo proces, který zp ůsobuje strukturální chromozo ­
mální aberace v populacích bun ěk nebo organism ů. 
Cytokineze:  proces rozd ělení buňky ihned po mitóze, čímž vzniknou dv ě dceřiné 
buňky, z nichž každá obsahuje jedno jádro.  
Proliferační index p ři blokování cytokineze (CBPI):  podíl počtu buněk z druhého 
dělení v ošet řené populaci k jejich po čtu v neošet řené kontrole (p říslušný vzorec 
viz dodatek 2).  
Cytostáze:  inhibice r ůstu buněk (příslušný vzorec viz dodatek 2).  
Cytotoxicita:  škodlivé ú činky na strukturu nebo funkci bu ňky, které nakonec 
způsobí její smrt.  
Genotoxický:  obecný termín zahrnující všechny typy poškození DNA nebo chro ­
mozomů včetně jejich rozlámání, p řestavby adukt ů, mutací, chromozomálních 
aberací a aneuploidie. Ne všechny druhy genotoxických ú činků způsobují mutace 
nebo stálé poškození chromozom ů. 
Interfázové bu ňky: buňky, které se nenacházejí ve stádiu mitózy.  
Kinetochor:  struktura obsahující proteiny, jež se vytvá ří u centromery chromo ­
zomu, na kterou se p ři dělení buněk napojují vlákna d ělicího vřeténka, což 
umožňuje správný pohyb dce řiných chromozom ů k pólům dceřiných bun ěk. 
Mikrojádra:  malá jádra existující odd ěleně od hlavních jader a vedle nich, vytvá ­ 
řená během telofáze mitózy (meiózy) nereplikujícími se (lagging) chromozomo ­
vými fragmenty nebo celými chromozomy.  
Mitóza:  proces d ělení buněčného jádra, který se obvykle člení na profázi, 
prometafázi, metafázi, anafázi a telofázi.  
Mitotický index:  poměr buněk v metafázi vyd ělený celkovým po čtem buněk 
zjištěných v populaci bun ěk; udává stupe ň buněčné proliferace této populace.  
Mutagenní:  produkující d ědičné změny sekvence (sekvencí) pár ů bází DNA 
v genech nebo struktury chromozom ů (chromozomální aberace).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Nondisjunkce:  děj, při kterém se párové chromatidy nerozlou čí a správn ě neroz­
dělí do vznikajících dce řiných bun ěk, což vede ke vzniku dce řiných bun ěk 
s abnormálními po čty chromozom ů. 
Polyploidie:  numerické chromozomální aberace v bu ňkách nebo organismech, 
které se týkají celé sady (celých sad) chromozom ů, na rozdíl od jednoho chro ­
mozomu nebo jednotlivých chromozom ů (aneuploidie).  
Proliferační index (PI):  metoda pro m ěření cytotoxicity bez použití cytoB (p ří­
slušný vzorec viz dodatek 2).  
Relativní nár ůst počtu buněk (RICC):  metoda pro m ěření cytotoxicity bez použití 
cytoB (příslušný vzorec viz dodatek 2).  
Relativní zdvojnásobení populace (RPD):  metoda pro m ěření cytotoxicity bez 
použití cytoB (p říslušný vzorec viz dodatek 2).  
Replikační index (RI):  podíl po čtu dokon čených cykl ů buněčného dělení 
v ošetřené kultu ře k jejich po čtu v neošet řené kontrole b ěhem expozi ční doby 
a obnovy kultury (p říslušný vzorec viz dodatek 2).  
Zkoušená látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs, která se zkouší za použití této 
zkušební metody.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Dodatek 2  
Vzorce pro hodnocení cytotoxicity  
1. Při použití cytoB  by mělo být hodnocení cytotoxicity založeno na prolife ­
račním indexu p ři blokování cytokineze (CBPI) nebo na replika čním indexu (RI) 
(16) (58). Hodnota CBPI udává pr ůměrný počet buněčných cykl ů na buňku 
v době jejího vystavení cytochalasinu B a lze ji použít k výpo čtu proliferace 
buněk. Hodnota RI udává relativní po čet jader v ošet řených kulturách ve srov ­
nání s kontrolními kulturami a lze ji použít k výpo čtu procenta cytostáze:  
% cytostáze = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
přičemž:  
T = kultura ošet řená zkoušenou látkou  
C = kontrolní kultura s vehikulem  
kde: 
CBPI ¼ ððpočet jednojaderných bun ěkÞ þ ð2 Ü počet dvoujaderných bun ěkÞ þ ð3 Ü počet vícejaderných bun ěkÞÞ 
ðcelkový po čet buněkÞ 
Hodnota CBPI = 1 (všechny bu ňky jsou jednojaderné) tedy odpovídá 100 % 
cytostázi.  
Cytostáze = 100 – RI  
RI ¼ ððpočet dvoujaderných bun ěkÞ þ ð2 Ü počet vícejaderných bun ěkÞÞ ö ðcelkový po čet buněkÞ T 
ððpočet dvoujaderných bun ěkÞ þ ð2 Ü počet vícejaderných bun ěkÞÞ ö ðcelkový po čet buněkÞ C Ü 100  
T = ošet řené kultury  
C = kontrolní kultury  
2. Hodnota RI = 53 % tedy znamená, že v porovnání s po čtem buněk, z nichž 
v kontrolní kultu ře vznikly rozd ělením dvoujaderné a vícejaderné bu ňky, se 
v ošetření kultuře rozdělilo pouze 53 % tohoto po čtu, což znamená 47 % cytos ­
tázi. 
3. Když se cytoB nepoužije , doporučuje se hodnotit cytotoxicitu na základ ě 
relativního nár ůstu počtu buněk (RICC) nebo relativního zdvojnásobení 
populace (RPD) (58), jelikož oba tyto ukazatele zohled ňují poměr buněčné popu­
lace, která se rozd ělila. 
RICC ¼ ðzvýšení po čtu buněk v ošetřených kulturách ðkonečný stav – po čáteční stavÞÞ 
ðzvýšení po čtu buněk v kontrolních kulturách  ðkonečný stav – po čáteční stavÞÞ Ü 100  
RPD ¼ ðpočet zdvojnásobení populace v ošet řených kulturáchÞ 
ðpočet zdvojnásobení populace v kontrolních kulturách Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
kde: 
Zdvojnásobení populace = [log (po čet buněk po ošet ření ÷ po čáteční počet 
buněk)] ÷ log 2  
4. Hodnota RICC nebo RPD ve výši 53 % tedy znamená 47 % 
cytotoxicitu/cytostázi.  
5. Za použití indexu proliferace (PI) lze posoudit cytotoxicitu spo čítáním 
klonů tvořených 1 bu ňkou (cl1), 2 bu ňkami (cl2), 3 až 4 bu ňkami (cl4) a 5 až 
8 buňkami (cl8)  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. Hodnota PI se používá jako cenný a spolehlivý parametr cytotoxicity i pro 
buněčné linie kultivované  in situ  bez přítomnosti cytoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Dodatek 3  
Srovnávací látky doporu čené pro hodnocení funk čnosti  ( 1 ) 
Kategorie Chemická látka Číslo CAS Číslo ES  
1. Klastogeny p ůsobící bez metabolické aktivace 
cytarabin 147-94-4 205-705-9 mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
2. Klastogeny vyžadující metabolickou aktivaci 
benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5 
cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugeny 
kolchicin 64-86-8 200-598-5 vinblastin 143-67-9 205-606-0 
4. Negativní látky 
bis(2-ethylhexyl)ftalát 117-81-7 204-211-0 
kyselina nalidixová 389-08-2 206-864-7 pyren 129-00-0 204-927-3 chlorid sodný 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Srovnávací látky jsou chemické látky doporu čené k použití. Chemické látky uvedené v seznamu srovnávacích látek je možno 
nahradit jinými látkami nebo lze do seznamu doplnit další látky, pokud jsou známy jejich ú činky a pokud vyvolávají tvorbu 
mikrojader stejným mechanismem p ůsobení a pokud je prokázáno, že mají vztah k chemickým látkám, které se budou testovat za 
použití postupu MNvit. V závislost na ú čelu může být sou částí zdůvodnění také valida ční studie využívající širokou škálu látek 
nebo zam ěřená na užší spektrum na základ ě chemické t řídy zkoušené látky nebo zkoumaného mechanismu vzniku poškození.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50  SENZIBILIZACE K ŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠET ŘENÍM 
LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN: DA  
ÚVOD  
1. Metodiky OECD pro testování chemických látek a zkušební metody EU 
jsou pravideln ě přezkoumávány s ohledem na v ědecký pokrok, zm ěny 
regulačních potřeb a dobré životní podmínky zví řat. První zkušební 
metoda (ZM) (kapitola B.42 této p řílohy) pro stanovení senzibilizace 
kůže u myší, tzv. zkouška s vyšet řením lokálních lymfatických uzlin 
(LLNA; zkušební metodika OECD č. 429) byla revidována (1). Podrob ­
nosti o validaci metody LLNA a p řehled souvisejících prací byly publiko ­
vány (2)(3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). V rámci metody LLNA se k m ěření 
proliferace lymfocyt ů využívají radioizotopy thymidinu nebo jódu, a proto 
má tato zkouška omezené použití, pokud získání, používání nebo likvidace radioaktivních látek p ředstavují problém. Metoda LLNA: DA (kterou 
vyvinula firma Daicel Chemical Industries, Ltd.) je neradioaktivní modifi ­
kací metody LLNA, která kvantifikuje obsah adenosintrifosfátu (ATP) prostřednictvím bioluminiscence, jež slouží jako indikátor proliferace 
lymfocytů. Zkušební metoda LLNA: DA byla ov ěřena, přezkoumána 
a doporučena mezinárodní komisí pro vzájemné hodnocení jakožto metoda, 
která je s ur čitými omezeními považována za užite čnou pro identifikaci 
chemických látek zp ůsobujících nebo naopak nezp ůsobujících senzibilizaci 
kůže (10) (11) (12) (13). Tato ZM je ur čena k hodnocení potenciálu 
chemikálií (látek a sm ěsí) způsobovat senzibilizaci k ůže u zvířat. Zkušební 
metoda podle kapitoly B.6 této p řílohy a zkušební metodiky OECD č. 406 
využívá zkoušek na mor čatech, a to zvlášt ě maximaliza ční zkoušku na 
morčatech a Bühler ův test (14). Zkušební metoda LLNA (podle 
kapitoly B.42 této p ř
ílohy a zkušební metodiky OECD č. 429 a její dv ě 
neradioaktivní modifikace, metoda LLNA DA (podle kapitoly B.50 této přílohy a zkušební metodiky OECD č. 442 A) a metoda LLNA: 
BrdU-ELISA (podle kapitoly B.51 této p řílohy a zkušební metodiky 
OECD č. 442 B) poskytují výhody ve srovnání se zkouškami na mor čatech 
podle kapitoly B.6 a zkušební metodiky OECD č. 406 (14), pokud jde 
o snížení po čtu využívaných zví řat a zdokonalení zp ůsobu jejich využívání.
 
2. Podobn ě jako metoda LLNA i metoda LLNA: DA zkoumá induk ční fázi 
senzibilizace k ůže a poskytuje kvantitativní údaje, které jsou vhodné pro 
hodnocení závislosti odezvy na dávce. Schopnost detekovat látky senzibi ­
lizující k ůži bez nutnosti použití radioizotop ů pro zna čení DNA navíc 
odstraňuje možnost expozice radioaktivit ě při práci a problémy 
s likvidací odpad ů. To zase m ůže umožnit zvýšené využívání myší 
k detekování látek senzibilizujících k ůži, což by mohlo dále snížit využí ­
vání morčat k testování potenciálu chemických látek zp ůsobovat senzibili ­
zaci kůže (tzn. metodou podle kapitoly B.6 a zkušební metodiky OECD 
č. 406 (14).  
DEFINICE  
3. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.  
VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ  
4. Zkušební metoda LLNA: DA je modifikovanou metodou LLNA, která 
s určitými omezeními slouží k identifikaci chemických látek, jež mohou 
způsobovat senzibilizaci k ůže. To však nutn ě neznamená, že by se 
metoda LLNA: DA m ěla používat ve všech p řípadech namísto metody 
LLNA nebo namísto zkoušek na mor čatech (tzn. podle kapitoly B.6 této 
přílohy a zkušební metodiky OECD č. 406 (14); znamená to spíše, že 
tato metoda má stejnou hodnotu a že ji lze použít jako alternativní 
metodu, jejíž pozitivní ani negativní výsledky obvykle již nevyžadují 
žádné další potvrzování (10) (11). Zkušební laborato ř by měla před ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
provedením studie zohlednit všechny dostupné informace o zkoušené 
látce. Mezi tyto informace pat ří totožnost a chemická struktura zkoušené 
látky, její fyzikáln ě-chemické vlastnosti, výsledky jakýchkoli jiných 
zkoušek toxicity  in vitro  a in vivo  za použití zkoušené látky 
a toxikologické údaje o strukturn ě příbuzných látkách. Tyto informace 
je nutno posoudit, aby se zjistilo, zda je metoda LLNA: DA vhodná pro 
danou látku (s ohledem na neslu čitelnost n ěkterých druh ů chemických 
látek s metodou LLNA: DA (viz odstavec 5)), a také aby se usnadnila volba dávkování.
 
5. Zkušební metoda LLNA: DA je metodou  in vivo , a tudíž neeliminuje 
používání zví řat při hodnocení alergického kontaktního senzibilizujícího 
působení. Umož ňuje však omezit využívání zví řat pro tento ú čel ve srov ­
nání se zkouškami na mor čatech (podle kapitoly B.6 a zkušební metodiky 
OECD č. 406 (14). Krom ě toho metoda LLNA: DA nabízí podstatné 
zlepšení zp ůsobu zacházení se zví řaty (mén ě bolesti a utrpení), která se 
využívají ke zkoušení kontaktní alergické senzibilizace, jelikož na rozdíl od metody podle kapitoly B.6 a zkušební metodiky OECD č. 406 metoda 
LLNA: DA nevyžaduje um ělé vyvolání kožní p řecitlivělosti. Ale i p řes 
výhody, které má metoda LLNA: DA ve srovnání s metodou popsanou 
v kapitole B.6 a zkušební metodice OECD č. 406 (14), existují ur čitá 
omezení, která si mohou vyžádat použití metody popsané v kapitole B.6 
nebo zkušební metodice OECD č. 406 (nap ř. falešně negativní výsledky p ři 
použití metody LLNA pro ur čité kovy, falešn ě pozitivní výsledky 
u určitých látek zp ůsobujících podrážd ění kůže (jako jsou nap říklad některé 
chemikálie typu povrchov ě aktivních látek) (6) (1 a kapitola B.42 této 
přílohy) nebo rozpustnost zkoušené látky). Krom ě toho si použití zkoušek 
na morčatech (tzn. podle kapitoly B.6 této p řílohy nebo zkušební metodiky 
OECD č. 406 (14) mohou vyžádat také n ěkteré třídy chemických látek 
nebo látky obsahující funk
ční skupiny, u nichž je prokázáno, že mohou 
způsobovat zkreslení výsledk ů (16). Doporu čuje se, aby se omezení zjiš ­
těná u metody LLNA (1 a kapitola B.42 této p řílohy) vztahovala rovn ěž na 
metodu LLNA: DA (10). Použití metody LLNA: DA navíc nemusí být vhodné pro zkoušení látek, které ovliv ňují hladiny ATP (nap ř. látek, jež 
působí jako inhibitory ATP), nebo látek, které ovliv ňují přesnost měření 
intracelulárního ATP (nap ř. přítomnost enzym ů snižujících hladinu ATP 
nebo přítomnost extracelulárního ATP v lymfatických uzlinách). 
S výjimkou t ěchto známých omezení by m ěla být metoda LLNA: DA 
použitelná k testování jakýchkoli látek, nejsou-li s t ěmito látkami spojeny 
vlastnosti, které mohou nep říznivě ovlivnit p řesnost metody LLNA: DA. 
Kromě toho je t řeba zvážit možnost hrani čních pozitivních výsledk ů při 
získání hodnot indexu stimulace (SI) v rozmezí od 1,8 do 2,5 (viz odstavce 
31 až 32). To je založeno na valida ční databázi 44 látek za použití hodnot 
SI ≥ 1,8 (viz odstavec 6), u kterých metoda LLNA: DA správn ě identifi­
kovala všech 32 látek identifikovaných jako senzibilizující látky metodou LLNA, ale nesprávn ě identifikovala t ři z 12 látek identifikovaných 
metodou LLNA jako nesenzibilizující látky s hodnotami SI v rozmezí od 
1,8 do 2,5 (tzn. hrani ční pozitivní) (10). Jelikož však byl stejný soubor 
údajů použit k stanovení hodnot SI a k výpo čtu prediktivních vlastností 
zkoušky, mohou uvedené výsledky p ředstavovat nadhodnocení skute čných 
prediktivních vlastností této metody.
 
PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
6. Základní podstata metody LLNA: DA spo čívá v tom, že senzibilizující 
látky vyvolávají proliferaci lymfocyt ů v lymfatických uzlinách drenujících 
místo aplikace zkoušené látky. Tato proliferace je úm ěrná dávce 
a potenciálu aplikovaného alergenu a p ředstavuje jednoduchý prost ředek 
k získání kvantitativního údaje o mí ře senzibilizace. Proliferace se m ěří 
porovnáním pr ůměrné proliferace u každé zkušební skupiny s pr ůměrnou 
proliferací u kontrolní skupiny s vehikulem. Ur čí se pom ěr průměrné 
proliferace u každé z exponovaných skupin k pr ůměrné proliferaci 
u souběžně testované kontrolní skupiny s vehikulem, nazývaný index  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
stimulace (SI), p řičemž jeho hodnota by m ěla být ≥ 1,8, aby bylo opráv ­
něné další hodnocení zkoušené látky jako potenciálního senzibilizátoru 
kůže. Zde popsané postupy jsou založeny na použití m ěření obsahu ATP 
za použití bioluminescence (o níž je známo, že její intenzita je úm ěrná 
počtu živých bun ěk) 17) k indikaci zvýšeného po čtu proliferujících bun ěk 
lymfatických uzlin drenujících aurikulární oblast (18) (19). Biolumines ­
cenční metoda využívá enzym luciferázu ke katalyzaci tvorby sv ětla 
z ATP a luciferin v rámci této reakce:  
ATP + Luciferin  + O 2
 Oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + Light  
Intenzita vyza řovaného sv ětla je přímo úměrná koncentraci ATP a m ěří se 
pomocí luminometru. Zkouška založená na použití luciferinu a luciferázy 
je citlivou metodou pro ur čení množství ATP, která se používá k široké 
škále účelů (20).  
POPIS ZKOUŠKY  
Volba druhu zví řat 
7. Vhodným druhem pro tuto zkoušku je myš. Valida ční studie metody 
LLNA: DA byly provád ěny výhradn ě s kmenem CBA/J, který je proto 
považován za up řednostňovaný kmen (12) (13). Používají se mladé dosp ělé 
samice myší, které musí být nullipary a nesm ějí být březí. Při zahájení 
studie by zví řata měla být přibližně 8 až 12 týdn ů stará, přičemž odchylky 
v hmotnosti zví řat by měly být pouze minimální a nem ěly by překročit 
20 % průměrné hmotnosti. P řípadně lze používat i jiné kmeny a samce, 
pokud je k dispozici dostatek údaj ů, které dokazují, že v rámci reakcí 
neexistují u metody LLNA: DA významné specifické odlišnosti mezi kmeny a/nebo pohlavími.
 
Podmínky chovu a krmení  
8. Myši by m ěly být chovány ve skupinách (21), není-li p ředloženo dosta ­
tečné vědecké zdůvodnění, proč by měly být chovány jednotliv ě. Teplota 
v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22 ± 3 °C. A čkoli by relativní 
vlhkost vzduchu m ěla být minimáln ě 30 % a pokud možno by krom ě doby 
úklidu místnosti nem ěla přesáhnout 70 %, cílem by m ěla být hodnota 
50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé se střídáním 12 hodin sv ětla 
a 12 hodin tmy. Ke krmení lze používat b ěžnou laboratorní stravu a k 
pití by m ěly mít myši k dispozici neomezené množství vody.  
Příprava zví řat 
9. Zví řata se náhodn ě vyberou, pro usnadn ění individuální identifikace se 
označí (nesmí se však použít žádná forma zna čení uší) a chovají se 
v klecích minimáln ě pět dnů před začátkem aplikování zkoušené látky, 
aby se mohla p řizpůsobit laboratorním podmínkám. P řed začátkem apli ­
kace látky se všechna zví řata vyšet ří, aby se ov ěřilo, že nemají žádné 
pozorovatelné kožní léze.  
Příprava dávkovacích roztok ů 
10. Pevné chemické látky by se m ěly před nanesením na ucho myši rozpustit 
nebo suspendovat ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech 
a popřípadě zředit. Kapalné látky lze aplikovat bez p řísad nebo je lze 
před dávkováním rozpustit. Nerozpustné látky, jaké se nej častěji používají 
k výrobě zdravotnických prost ředků, by měly být vystaveny intenzívní 
extrakci ve vhodném rozpoušt ědle, aby se p řed nanesením na ucho myši 
odhalily všechny extrahovatelné složky, které je nutno testovat. Zkoušené 
látky by se m ěly připravovat každý den čerstvé, pokud údaje o stálosti 
neprokazují p řijatelnost jejich skladování.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Kontrola spolehlivosti  
11. K prokázání řádné funk čnosti zkoušky slouží pozitivní kontrolní chemiká ­
lie, a to tak, že reagují s dostate čnou a reprodukovatelnou citlivostí na 
zkoušenou senzibilizující látku, u níž je dob ře popsána síla odezvy. 
Zařazení soub ěžné pozitivní kontroly se doporu čuje proto, že prokazuje 
způsobilost laborato ře úspěšně provést každou zkoušku a umož ňuje 
posoudit vnitrolaboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnost 
a srovnatelnost. N ěkteré regula ční orgány také vyžadují p ři každé studii 
pozitivní kontrolu, a proto se uživatel ům doporu čuje před provedením 
zkoušky LLNA: DA p říslušné orgány konzultovat. Doporu čuje se tudíž 
běžně používat soub ěžnou pozitivní kontrolu, aby nebylo nutné další zkou ­ 
šení na zví řatech ke spln ění požadavk ů, které by mohly vzniknout p ři 
používání periodické pozitivní kontroly (viz odstavec 12). Pozitivní kontrola by m ěla v rámci metody LLNA: DA vyvolat pozitivní odezvu 
při úrovni expozice, u které se o čekává zvýšení indexu stimulace (SI) > 1,8 
ve srovnání s negativní kontrolní skupinou. Dávka pozitivní kontroly by měla být zvolena tak, aby nevyvolala nadm ěrné podrážd ění kůže nebo 
systémovou toxicitu a p řitom aby indukce byla reprodukovatelná, avšak 
nikoli nadm ěrná (tzn. že hodnota SI > 10 by byla považována za p říliš 
velkou). K up řednostňovaným látkám pro pozitivní kontrolu pat ří 25 % 
roztok 2-benzylidenoktanalu (reg. č. Chemical Abstracts Service (CAS) 
101-86-0) nebo eugenolu ( číslo CAS 97-53-0) v acetonu s olivovým 
olejem (v objemovém pom ěru 4:1). Mohou existovat ur čité okolnosti, za 
nichž lze p ři řádném zd ůvodnění použít i jiné pozitivní kontrolní látky, 
které splňují výše uvedená kritéria.  
12. I když se za řazení skupiny soub ěžných pozitivních kontrol doporu čuje, 
mohou existovat situace, kdy m ůže být periodické testování (tzn. 
v intervalech ≤ 6 měsíců) pozitivních kontrol vhodné u laborato ří, které 
provádějí zkoušky LLNA: DA pravideln ě (tzn. nejmén ě jednou m ěsíčně) 
a mají k dispozici databázi d řívějších údaj ů pozitivních kontrol, která 
prokazuje schopnost laborato ře získat p ři použití pozitivních kontrol repro ­
dukovatelné a p řesné výsledky. Odpovídající zb ěhlost v používání metody 
LLNA: DA lze úsp ěšně prokázat dosažením shodných pozitivních 
výsledků při použití pozitivní kontroly alespo ň v 10 nezávislých zkouškách 
provedených b ěhem přiměřené doby (tzn. b ěhem mén ě než jednoho roku).  
13. Skupina soub ěžných pozitivních kontrol by se m ěla zařadit vždy, když 
dojde k procedurální zm ěně metody LLNA: DA (nap ř. při změně složení 
vyškoleného personálu, p ři změně materiálů a/nebo činidel či vybavení, jež 
se používají v rámci zkušební metody, nebo p ři změně zdroje pokusných 
zvířat), přičemž takové zm ěny by se m ěly vždy zdokumentovat 
v laboratorních zprávách. P ři určování nezbytnosti vytvo řit novou databázi 
ke zdokumentování shodnosti výsledk ů pozitivních kontrol by se m ěl 
zvážit dopad t ěchto změn na přiměřenost dosavadní databáze.  
14. Zkoušející by si m ěli uvědomit, že rozhodnutí používat pozitivní 
kontroly periodicky namísto soub ěžně má závažné dopady na p řimě­ 
řenost a p řijatelnost negativních výsledk ů studie získaných bez soub ě­ 
žných pozitivních kontrol b ěhem intervalu mezi jednotlivými periodic ­
kými použitími pozitivních kontrol. Nap říklad obdržení falešn ě nega­
tivního výsledku p ři periodickém používání pozitivních kontrol m ůže 
zpochybnit negativní výsledky zkoušené látky získané v období mezi 
poslední p řijatelnou periodickou studií pozitivních kontrol 
a nepřijatelnou periodickou studií pozitivních kontrol. D ůsledky, jež 
z toho vyplývají, je t řeba pečlivě zvážit p ři rozhodování, zda do 
zkoumání za řadit soub ěžné pozitivní kontroly, nebo používat pouze 
periodické pozitivní kontroly. Je také nutno vzít v úvahu možnost použít v rámci skupiny soub ěžných pozitivních kontrol mén ě zvířat, 
jestliže je to v ědecky opodstatn ěné a jestliže laborato ř na základ ě 
svých vlastních dosavadních údaj ů prokáže, že lze používat mén ě 
myší (22).
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Ačkoli by se pozitivní kontroly m ěly zkoušet ve vehikulu, o n ěmž je 
známo, že vždy vyvolává shodnou reakci (nap ř. aceton s olivovým olejem 
v objemovém pom ěru 4:1), mohou nastat ur čité situace, kdy je z d ůvodů 
požadovaných v právních p ředpisech nezbytné provést zkoušku s použitím 
nestandardního vehikula (klinicky/chemicky relevantní složení) (23). Pokud 
se souběžná pozitivní kontrola zkouší v jiném vehikulu než zkoušená látka, 
měla by být sou částí zkoušky se soub ěžnou pozitivní kontrolou také samo ­
statná kontrola s vehikulem.  
16. V p řípadech, kdy se hodnotí látky, které pat ří do určité třídy chemických 
látek nebo vykazují ur čitou škálu odezev, mohou být užite čné také srov ­
návací látky, jelikož mohou prokázat, že zkušební metoda je schopna správně zjistit potenciál t ěchto druh ů látek vyvolávat senzibilizaci k ůže. 
Vhodné srovnávací látky by m ěly mít tyto vlastnosti:
 
— strukturální a funk ční podobnost s t řídou, do níž pat ří zkoušená látka,  
— známé fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— podklady ze zkoušky LLNA: DA,  
— podklady získané p ři použití jiných zví řecích model ů a/nebo lidí.  
ZKUŠEBNÍ POSTUP  
Počet zvířat a dávkování  
17. Na každou dávkovou skupinu se použijí alespo ň čtyři zvířata, přičemž se 
použijí minimáln ě tři koncentrace zkoušené látky, dále se použije soub ěžná 
negativní kontrolní skupina, k jejíž expozici se použije pouze vehikulum 
zkoušené látky, a pozitivní kontrola (soub ěžná nebo z nedávné jiné 
zkoušky – v závislosti na postupech dané laborato ře při zohledn ění 
odstavců 11–15). M ělo by se zvážit zkoušení v ětšího počtu dávek pozitivní 
kontroly, a to zejména v p řípadě, že se pozitivní kontrola nepoužívá 
soustavně. Se zvířaty v kontrolních skupinách by se s výjimkou aplikace 
zkoušené látky m ělo zacházet stejn ě jako se zví řaty v exponovaných skupi ­
nách.  
18. Volba dávkování a vehikula by m ěla být založena na doporu čeních uvede ­
ných v literatu ře – (2) a (24). Po sob ě jdoucí dávky se b ěžně vybírají 
z vhodné řady koncentrací, nap říklad 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 
2,5 %, 1 %, 0,5 % atd. Volba této řady koncentrací by m ěla být dostate čně 
vědecky zdůvodněna. Při výběru tří po sobě jdoucích koncentrací je t řeba 
zvážit veškeré existující toxikologické informace (nap ř. o akutní toxicit ě 
a kožní dráždivosti) a informace o struktu ře a fyzikáln ě-chemických vlast ­
nostech zkoušené látky (a/nebo strukturn ě příbuzných látek), jsou-li 
k dispozici, aby nejvyšší koncentrace maximalizovala expozici, aniž by 
současně vyvolala systémovou toxicitu a/nebo nadm ěrné lokální podráž ­
dění kůže (24) (25). Nejsou-li takové informace k dispozici, m ůže být 
nezbytné provést úvodní p ředběžnou screeningovou zkoušku (viz odstavce 
21 až 24).  
19. Vehikulum by nem ělo nepříznivě ovlivňovat ani jinak zkreslovat výsledky 
zkoušky a m ělo by být vybráno tak, aby se maximalizovala rozpustnost 
umožňující dosáhnout nejvyšší možné koncentrace a zárove ň připravit 
roztok nebo suspenzi, jež jsou vhodné pro aplikaci zkoušené látky. 
K doporu čeným vehikul ům patří aceton s olivovým olejem (v objemovém 
poměru 4:1),  N,N -dimethylformamid, ethyl(methyl)keton, propan-1,2-diol 
a dimethylsulfoxid (6), avšak p ři dostatečném vědeckém zd ůvodnění lze 
použít i jiná vehikula. V ur čitých situacích m ůže být nezbytné použít jako 
doplňující kontrolu klinicky relevantní rozpoušt ědlo nebo b ěžně prodejný 
přípravek obsahující zkoušenou látku. Zvlášt ě je třeba dbát na to, aby byly 
hydrofilní látky zapracovány do takového vehikula, které zvlh čí kůži 
a nesteče ihned z pokožky. Toho lze dosáhnout použitím vhodných solu ­
bilizérů (jako je nap ř. 1 % Pluronic® L92). Není tudíž vhodné používat 
zcela vodná vehikula.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Zpracování lymfatických uzlin z jednotlivých myší umož ňuje posoudit 
variabilitu mezi jednotlivými zví řaty a provést statistické porovnání 
rozdílu mezi hodnotami zkoušené látky a hodnotami nam ěřenými 
u kontrolní skupiny se samotným vehikulem (viz odstavec 33). Posoudit možnost snížit po čet myší v pozitivní kontrolní skupin ě je krom ě toho 
vhodné jen tehdy, když se zaznamenávají údaje od jednotlivých zví řat 
(22). Sběr údajů od jednotlivých zví řat navíc vyžadují i n ěkteré regu ­
lační orgány. Pravidelný sb ěr údajů od jednotlivých zví řat je výhodn ější 
z hlediska dobrých životních podmínek zví řat, jelikož nevyžaduje dupli ­
citní zkoušení, které by bylo nezbytné, pokud by výsledky pro ur čitou 
zkoušenou látku, jež byly p ůvodně shromážd ěny jedním zp ůsobem (nap ř. 
za použití souhrnných údaj ů od všech zví řat), měly být pozd ěji posou­
zeny regula čními orgány s jinými požadavky (nap ř. vyžadujícími použití 
údajů od jednotlivých zví řat).
 
Předběžná screeningová zkouška  
21. Nejsou-li k dispozici informace pro stanovení nejvyšší dávky, která má být 
předmětem zkoušky (viz odstavec 18), m ěla by se provést p ředběžná scre­
eningová zkouška umož ňující vymezit vhodné dávkování, které se bude 
metodou LLNA: DA zkoušet. Ú čelem předběžné screeningové zkoušky je 
poskytnout vodítko pro volbu maximálního dávkování, které se má použít v hlavní studii LLNA: DA, pokud nejsou k dispozici informace o koncentraci, která vyvolává systémovou toxicitu (viz odstavec 24) 
a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění kůže (viz odstavec 23). Maximální 
zkoušenou dávkou by m ělo být 100 % zkoušené látky v p řípadě kapalin, 
respektive maximální možná koncentrace v p řípadě pevných látek nebo 
suspenzí.
 
22. Předběžná screeningová zkouška se provádí za stejných podmínek jako 
hlavní studie LLNA: DA až na to, že se nehodnotí proliferace bun ěk 
z lymfatických uzlin a lze použít mén ě zvířat na dávkovou skupinu. 
Navrhuje se po čet jednoho až dvou zví řat na dávkovou skupinu. 
Všechny myši se denn ě pozorují, zda nevykazují klinické p říznaky systé ­
mové toxicity nebo lokálního podrážd ění v míst ě aplikace. P řed 
zahájením zkoušky a p řed jejím ukon čením (den 8) se zaznamenají 
hodnoty t ělesné hmotnosti zví řat. Na obou uších každé myši se sleduje 
výskyt erytému, který se vyhodnotí podle tabulky 1 (25). Tlouš ťka ucha 
se změří tloušťkoměrem (nap ř. digitálním mikrometrem nebo tlouš ťko­
měrem s kruhovou stupnicí) v den 1 (p řed aplikací první dávky), v den 
3 (přibl. 48 hodin po první dávce) a v den 7 (24 hodin p řed ukončením) 
a v den 8. Krom ě toho lze v den 8 ur čit tloušťku ucha na základ ě 
stanovení hmotnosti části ucha vyseknuté speciálními klešt ěmi, což by se 
mělo provád ět až poté, co se zví řata humánn ě usmrtí. Známkou nadm ěr­
ného lokálního podrážd ění je zarudnutí ohodnocené 3 nebo více body 
a/nebo zvýšení tlouš ťky ucha o 25 % nebo více v kterýkoli den m ěření 
(26) (27). Jako nejvyšší dávka se pro hlavní studii LLNA: DA zvolí nejbližší nižší dávka v rámci řady koncentrací zjišt ěných při předběžné 
screeningové zkoušce (viz odstavec 18), která nevyvolává systémovou 
toxicitu a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění kůže.
 
Tabulka 1  
Bodové hodnocení erytému  
Pozorované p říznaky Bodové ohodnocení  
Žádný erytém 0 
Velmi slabý erytém (sotva patrný) 1 Zřetelně viditelný erytém 2
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Pozorované p říznaky Bodové ohodnocení  
Mírný až výrazný erytém 3 
Těžký erytém (silné zarudnutí) nebo tvorba p říškvaru znemož ňující 
posouzení erytému 4 
23. Krom ě 25 % zvýšení tlouš ťky ucha (26) (27) se k identifikaci dráždivých 
látek při zkoušce LLNA používá také statisticky významné zvýšení tlou ­ 
šťky ucha u myší ze zkušební skupiny ve srovnání s kontrolními zví řaty 
(28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). A čkoli mohou nastat p řípady statisticky 
významného zvýšení, i když se tlouš ťka ucha zvýší o mén ě než 25 %, 
nebyly tyto p řípady spojeny výhradn ě s nadměrným podrážd ěním (30) (31) 
(32) (33) (34).  
24. O systémové toxicit ě (35) mohou p ři použití v rámci integrovaného hodno ­
cení svědčit tyto poznatky z klinického pozorování, a tudíž mohou indi ­
kovat maximální dávku, která by se m ěla použít v hlavní studii LLNA: 
DA: změny fungování nervového systému (nap ř. piloerekce, ataxie, t řes 
a křeče), změny chování (nap ř. agresivita, zm ěna činností týkajících se 
péče o srst, výrazná zm ěna úrovně aktivity), zm ěny způsobů dýchání (tj. 
změny frekvence a intenzity dýchání, nap ř. dušnost, lapání po dechu 
a chropy) a zm ěny v přijímání potravy a vody. P ři hodnocení je navíc 
nutno brát v úvahu známky letargie a/nebo absence reagování, veškeré 
klinické p říznaky více než mírné nebo momentální bolesti či utrpení 
nebo snížení t ělesné hmotnosti ode dne 1 do dne 8 o více než 5 % 
a také úmrtnost. Umírající zví řata nebo zví řata, která jeví známky silné 
bolesti a utrpení, by se m ěla humánn ě usmrtit (36).  
Harmonogram zkoušek v rámci hlavní studie  
25. Harmonogram zkoušky je následující:  
— Den 1:  Každé zví ře se zváží a zaznamená se jeho hmotnost a jakékoli 
poznatky z klinického pozorování. Na h řbet každého ucha se čtyřmi až 
pěti tahy št ětečku namo čeného do 1 % vodného roztoku 
natrium-dodecyl-sulfátu (SLS) nanese tento roztok tak, aby pokryl 
celou plochu h řbetu ucha. Jednu hodinu po nanesení roztoku SLS se 
na hřbet každého ucha aplikuje 25 μl vhodně zředěného roztoku zkou ­ 
šené látky, samotné vehikulum nebo pozitivní kontrola (tu lze provád ět 
buď souběžně, nebo lze použít pozitivní kontrolu z nedávné jiné 
zkoušky – v závislosti na postupech dané laborato ře při zohledn ění 
odstavců 11–15).  
— Den 2, den 3 a den 7:  Zopakuje se postup p ředběžného ošet ření 1 % 
vodným roztokem SLS a nanesení zkoušené látky provedený v den 1.  
— Den 4, den 5 a den 6:  Žádná aplikace.  
— Den 8:  Zaznamená se hmotnost každého zví řete a jakékoli poznatky 
z klinického pozorování. P řibližně 24 až 30 hodin po zahájení aplikace 
v den 7 se zví řata humánn ě usmrtí. U každé myši se vyjmou lymfa ­
tické uzliny drenující aurikulární oblast obou uší a zpracují se ve fosfátovém pufrovém fyziologickém roztoku (PBS) od každého zví řete 
zvlášť. Podrobnosti a grafické znázorn ění vyhledání uzlin a jejich 
disekce lze nalézt v literatu ře (22). Pro ú čely dalšího sledování lokální 
kožní reakce v rámci hlavní studie lze do protokolu studie za řadit 
i další parametry, jako je bodové ohodnocení erytému ucha nebo údaje o tlouš ťce ucha (získané bu ď pomocí tlouš ťkoměru, nebo na 
základě stanovení hmotnosti části ucha vyseknuté speciálními klešt ěmi 
při pitvě).
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Příprava bun ěčných suspenzí  
26. Od každé myši se p řipraví jednobun ěčná suspenze obsahující bu ňky 
z vyňatých lymfatických uzlin drenujících oblast obou uší; suspenze se 
připraví tak, že se lymfatické uzliny vloží mezi dv ě podložná sklí čka 
a lehkým tlakem se rozdrtí. Po potvrzení, že je tká ň rozprostřena v tenké 
vrstvě, se sklíčka odtáhnou od sebe. Tkán ě z obou sklí ček se suspendují 
v roztoku PBS tak, že se každé sklí čko podrží naklon ěné nad Petriho 
miskou a oplachuje se roztokem PBS p ři současném seškrabování tkán ě 
ze sklíčka stěrkou na bu ňky. Krom ě toho jsou lymfatické uzliny u zví řat 
z negativní kontrolní skupiny malé, takže je t řeba postupovat opatrn ě, aby 
se zabránilo jakémukoli um ělému ovlivn ění hodnot SI. K opláchnutí obou 
sklíček by se m ěl použít celkový objem 1 ml PBS. Suspenzi bun ěk lymfa­
tických uzlin je nutno v Petriho misce zlehka homogenizovat st ěrkou na 
buňky. Mikropipetou se pak nabere 20 μL poměrný díl suspenze bun ěk 
z lymfatických uzlin – p řičemž je třeba nenabrat membránu, která je vidi ­
telná pouhým okem – a následn ě se smísí s 1,98 ml PBS, abychom dostali 
2 ml vzorku. Druhý vzorek o objemu 2 ml se pak p řipraví stejným zp ůso­
bem, aby vzniky od každého zví řete dva vzorky.  
Stanovení bun ěčné proliferace (m ěření obsahu ATP v lymfocytech)  
27. Zvýšení obsahu ATP v lymfatických uzlinách se zjiš ťuje metodou, která je 
založena na použití luciferinu a luciferázy, za pomoci soupravy pro m ěření 
obsahu ATP, která m ěří bioluminescenci v relativních jednotkách 
luminiscence (RLU). U všech jednotlivých zví řat je nutno dodržet stejnou 
dobu od usmrcení do zm ěření obsahu ATP, která by m ěla činit přibližně 30 
minut, protože se má za to, že obsah ATP postupn ě klesá v závislosti na 
době uplynulé od usmrcení zví řete 12). Proto je nutno celou řadu úkon ů od 
vynětí aurikulárních lymfatických uzlin až do zm ěření obsahu ATP 
dokončit do 20 minut podle p ředem stanoveného harmonogramu, který 
je u každého zví řete stejný. Luminescenci ATP je nutno zm ěřit 
u každého 2 ml vzorku, takže se získají dv ě hodnoty ATP za každé zví ře. 
Pak se ur čí průměrná luminescence ATP, která se použije v následných 
výpočtech (viz odstavec 30).  
ZÍSKANÉ POZNATKY  
Poznatky z klinického pozorování  
28. Každá myš se jednou denn ě pečlivě vyšetří, zda nevykazuje jakékoli 
klinické p říznaky lokálního podrážd ění v míst ě aplikace nebo p říznaky 
systémové toxicity. Všechny získané poznatky se systematicky zazname ­
nají, přičemž záznamy se vedou zvláš ť za každou myš. Plány sledování by 
měly obsahovat kritéria umož ňující rychle identifikovat myši, jež vykazují 
známky systémové toxicity, nadm ěrného lokálního podrážd ění pokožky 
nebo poleptání k ůže, aby mohly být usmrceny (36).  
Hodnoty t ělesné hmotnosti  
29. Jak je uvedeno v odstavci 25, t ělesnou hmotnost jednotlivých zví řat je 
nutno zjistit na za čátku zkoušky a v dob ě plánovaného humánního usmr ­
cení zvířete. 
VÝPOČET VÝSLEDK Ů 
30. Výsledky za každou exponovanou skupinu se vyjád ří jako průměrný index 
stimulace (SI). Hodnota SI se stanoví jako podíl pr ůměrné hodnoty RLU 
na zvíře jak u každé exponované skupiny, tak u pozitivní kontrolní 
skupiny, a pr ůměrné hodnoty RLU na zví ře u kontrolní skupiny 
s rozpoušt ědlem/vehikulem. Pr ůměrná hodnota SI u kontrolních skupin 
s vehikulem je pak rovna 1.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Při rozhodování o výsledku zkoušky se za pozitivní výsledek považuje, pokud 
hodnota SI ≥ 1,8 10). P ři rozhodování, zda hrani ční výsledek (tzn. hodnotu SI 
v rozmezí od 1,8 do 2,5) prohlásit za pozitivní, lze také použít míru závislosti odezvy na dávce, statistickou významnost a jednotnost výsledk ů kontrol 
s rozpoušt ědlem/vehikulem a pozitivních kontrol (2) (3) (37).
 
32. U hrani ční pozitivní odezvy v rozmezí hodnot SI od 1,8 do 2,5 mohou 
uživatelé zvážit další informace, nap říklad závislost odezvy na dávce, 
známky systémové toxicity nebo nadm ěrného podrážd ění, a tam, kde je 
to vhodné, také statistickou významnost spolu s hodnotami SI, aby se potvrdilo, že jsou takové výsledky pozitivní (10). M ěla by se rovn ěž 
věnovat pozornost r ůzným vlastnostem zkoušené látky v četně toho, zda 
se její struktura podobá struktu ře známých senzibilizátor ů kůže, zda 
u myší zp ůsobuje nadm ěrné lokální podrážd ění kůže, a také povaze zjiš ­
těné závislosti odezvy na dávce. T ěmito faktory a dalšími aspekty, které je 
třeba zvážit, se podrobn ě zabývá literatura (4).
 
33. Shromaž ďování údaj ů úrovni jednotlivých myší umožní provést statis ­
tickou analýzu, kterou se na základ ě těchto údaj ů zjistí existence a míra 
závislosti odezvy na dávce. P řípadné statistické hodnocení by mohlo obsa ­
hovat posouzení závislosti odezvy na dávce, jakož i vhodn ě upravená 
srovnání zkušebních skupin (nap ř. skupiny s párov ě srovnávaným dávko ­
váním oproti soub ěžné kontrolní skupin ě s rozpoušt ědlem/vehikulem). 
Statistické analýzy mohou zahrnovat nap ř. lineární regresi nebo Willi ­
amovu zkoušku k posouzení trend ů závislosti odezvy na dávce 
a Dunnettovu zkoušku pro párová srovnání. P ři výběru vhodné metody 
pro statistickou analýzu by si m ěl být zkoušející v ědom možných nestej ­
ných odchylek a jiných souvisejících problém ů, které si mohou vyžádat 
transformaci údaj ů nebo neparametrickou statistickou analýzu. V každém 
případě může být nezbytné, aby zkoušející provedl výpo čty SI a statistické 
analýzy jednak za použití ur čitých krajních hodnot (n ěkdy ozna čovaných 
výrazem „odlehlé hodnoty“) a jednak bez nich.  
ÚDAJE A VYKAZOVÁNÍ  
Údaje  
34. Údaje je nutno shrnout do tabulky s hodnotami RLU od jednotlivých 
zvířat, průměrnou hodnotou RLU na zví ře za celou skupinu, p říslušným 
chybovým výrazem (nap ř. směrodatnou odchylkou – SD, sm ěrodatnou 
odchylkou pr ůměrných hodnot – SEM) a pr ůměrnou hodnotou SI za 
každou dávkovou skupinu oproti soub ěžné kontrolní skupin ě 
s rozpoušt ědlem nebo vehikulem.  
Protokol o zkoušce  
35. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Zkoušená látka a kontrolní látka:  
— identifika ční údaje (nap ř. číslo CAS a číslo ES, jsou-li k dispozici, 
zdroj, čistota, známé ne čistoty, číslo šarže),  
— skupenství a fyzikáln ě-chemické vlastnosti (nap ř. prchavost, stálost, 
rozpustnost),  
— jedná-li se o sm ěs, je nutno uvést její složení a pom ěrné procentuální 
zastoupení složek.  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— identifika ční údaje ( čistota, pop řípadě koncentrace, použitý objem),  
— zdůvodnění volby vehikula.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Pokusná zví řata: 
— zdroj myší z kmene CBA,  
— mikrobiologický stav zví řat, je-li znám,  
— počet a věk zvířat, 
— původ zvířat, podmínky chovu, strava atd.  
Zkušební podmínky:  
— zdroj, číslo šarže a údaje od výrobce soupravy pro m ěření obsahu ATP, 
které se týkají prokazování a kontroly kvality,  
— podrobnosti o p řípravě a aplikaci zkoušené látky,  
— zdůvodnění volby dávkování (v četně výsledků předběžné screeningové 
zkoušky, pokud byla provedena),  
— použité koncentrace vehikula a zkoušené látky a celkové aplikované 
množství zkoušené látky,  
— podrobnosti o jakosti vody a potravy (v četně druhu/zdroje stravy, 
zdroje vody),  
— podrobnosti o harmonogramech expozice a odb ěru vzorků, 
— metody m ěření toxicity,  
— kritéria pro ozna čení studie za pozitivní nebo negativní,  
— údaje o p řípadných odchylkách od protokolu a vysv ětlení, jakým 
způsobem taková odchylka ovliv ňuje koncepci studie a její výsledky.  
Kontrola spolehlivosti:  
— souhrn výsledk ů nejnovější kontroly spolehlivosti v četně informací 
o použité zkoušené látce, koncentraci a vehikulu,  
— údaje ze soub ěžných a/nebo d řívějších pozitivních nebo negativních 
kontrolních skupin (s rozpoušt ědlem/vehikulem) zkoušených 
v dotyčné laborato ři, 
— pokud soub ěžná pozitivní kontrola nebyla sou částí studie, je nutno 
uvést datum a laboratorní zprávu nejnov ější periodické pozitivní 
kontroly a podrobnou zprávu s údaji z d řívějších pozitivních kontrol 
zkoušených v doty čné laborato ři, které od ůvodňují rozhodnutí nepro ­
vádět souběžné pozitivní kontroly.  
Výsledky:  
— hmotnost jednotlivých myší na po čátku aplikace a v dob ě plánovaného 
usmrcení, jakož i pr ůměrná hodnota a p říslušný chybový výraz (nap ř. 
SD, SEM) za každou exponovanou skupinu,  
— u každého zví řete časový pr ůběh nástupu p říznaků toxicity, v četně 
podráždění kůže v míst ě aplikace, pokud k n ěmu dojde,  
— doba usmrcení a doba zm ěření množství ATP u každého zví řete, 
— tabulka hodnot RLU a hodnot SI od jednotlivých myší za každou 
exponovanou skupinu,  
— průměrná hodnota RLU na zví ře a příslušný chybový výraz (nap ř. SD, 
SEM) za každou exponovanou skupinu a výsledky analýzy odlehlých 
hodnot za každou exponovanou skupinu,  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— vypočtená hodnota SI a p říslušná míra variability, která zohled ňuje 
variabilitu mezi jednotlivými zví řaty jak z testování zkoušené látky, 
tak z kontrolních skupin,  
— závislost odezvy na dávce,  
— případné statistické analýzy.  
Rozbor výsledk ů: 
— stručný komentá ř k výsledk ům, k analýze závislosti odezvy na dávce 
a k případným statistickým analýzám a dále záv ěr, zda se má zkoušená 
látka považovat za senzibilizátor k ůže. 
LITERATURA  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. 
K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999–1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985–997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. 
Toxicol., 36, 327–333.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: 
employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins. Toxicol., 146, 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. K dispozici na adrese: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf].
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258–273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274–286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249–257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioac ­
tive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551 A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam. 
niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm].
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated 
validation status of new versions and applications of the murine local lymph 
node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam. 
niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characteri ­
zation and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1–10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth., 58, 11–26.
 
(14) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines 
for Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96.
 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. 
Immunol. Meth., 160, 81–88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127–132.
 
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacte ­
rial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27–34.  
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346–370.  
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna- 
ps/LLNAPerfStds.pdf]
 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31.
 
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozici na adrese: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environ ­
mental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206.
 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxi ­
col. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.  
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.
 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and 
Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 
60–68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023–1028.
 
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Rese ­
arch Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ Tox_workshop.htm].
 
(36) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 563–79.
 
(38) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. K dispozici na 
adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Přesnost:  Blízkot shody mezi výsledky zkušební metody a uznávanými referen ­ 
čními hodnotami. Je to míra funk čnosti zkušební metody a jeden z aspekt ů její 
relevantnosti. Tento výraz se často používá namísto výrazu „soulad“ a rozumí se 
jím podíl správných výsledk ů zkušební metody (38).  
Srovnávací látka:  Senzibilizující nebo nesenzibilizující látka použitá jako stan ­
dard pro srovnání se zkoušenou látkou. Srovnávací látka by m ěla mít tyto vlast ­
nosti: i) konzistentní a spolehlivý zdroj (konzistentní a spolehlivé zdroje); ii) 
strukturální a funk ční podobnost s t řídou zkoušených látek; iii) známé fyzi ­
kálně-chemické vlastnosti; iv) podklady o známých ú čincích a v) známá ú činnost 
v rozsahu žádoucí odezvy.  
Falešně negativní:  Látka je zkušební metodou nesprávn ě označena za negativní 
nebo neaktivní, a čkoli ve skute čnosti je pozitivní nebo aktivní.  
Falešně pozitivní:  Látka je zkušební metodou nesprávn ě označena za pozitivní 
nebo aktivní, a čkoli ve skute čnosti je negativní nebo neaktivní.  
Nebezpečnost:  Potenciál látky p ůsobit nep říznivě na zdraví nebo životní 
prostředí. Nepříznivý účinek se projevuje pouze p ři dostatečné úrovni expozice.  
Mezilaboratorní reprodukovatelnost:  Míra, v jaké mohou r ůzné kvalifikované 
laboratoře za použití stejného protokolu a p ři testování stejných zkoušených 
látek získat kvalitativn ě a kvantitativn ě podobné výsledky. Mezilaboratorní repro ­
dukovatelnost se ur čuje během předvalidačních a valida čních postup ů a ukazuje, 
do jaké míry lze zkoušku úsp ěšně přenášet mezi r ůznými laborato řemi (38).  
Vnitrolaboratorní reprodukovatelnost:  Určení míry, v jaké m ůže kvalifikovaný 
personál ve stejné laborato ři jindy úsp ěšně dosáhnout stejných výsledk ů za 
použití ur čitého protokolu (38).  
Odlehlá hodnota:  Odlehlá hodnota je poznatek, který se výrazn ě liší od ostatních 
hodnot v náhodném vzorku od celé populace.  
Prokazování kvality:  Řídicí proces, v jehož rámci se hodnotí dodržování zkušeb ­
ních norem a standard ů laborato ře, příslušných požadavk ů a postup ů vedení 
záznamů, jakož i p řesnost přenosu údaj ů, přičemž tyto prvky jsou hodnoceny 
osobami, které jsou nezávislé na pracovnících, kte ří zkoušky provád ějí. 
Spolehlivost:  Míra, v jaké lze zkušební metodu provád ět reprodukovateln ě 
v rámci téže laborato ře i v rámci r ůzných laborato ří v průběhu doby, jestliže 
se provádí za použití stejného protokolu. Hodnotí se na základ ě výpočtu vnitro­
laboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti (38).  
Senzibilizace k ůže: Imunologický proces, který nastává, když je vnímavá osoba 
vystavena místn ě aplikovanému chemickému alergenu, který vyvolává kožní 
imunitní odezvu, jež m ůže vést ke vzniku kontaktní senzibilizace.  
Index stimulace (SI):  Hodnota vypo čtená za ú čelem posouzení potenciálu zkou ­ 
šené látky vyvolat senzibilizaci k ůže. Vyjad řuje poměr hodnoty proliferace 
u exponovaných skupin k hodnot ě proliferace u soub ěžné kontrolní skupiny 
s vehikulem.  
Zkoušená látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs, která se zkouší za použití této 
zkušební metody.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51  SENZIBILIZACE K ŮŽE: ZKOUŠKA S VYŠET ŘENÍM 
LOKÁLNÍCH LYMFATICKÝCH UZLIN: BRDU-ELISA  
ÚVOD  
1. Metodiky OECD pro testování chemických látek a zkušební metody EU 
jsou pravideln ě přezkoumávány s ohledem na v ědecký pokrok, zm ěny regu­
lačních pot řeb a dobré životní podmínky zví řat. První zkušební 
metoda (ZM) (kapitola B.42 této p řílohy) pro stanovení senzibilizace k ůže 
u myší, tzv. zkouška s vyšet řením lokálních lymfatických uzlin (LLNA; 
zkušební metodika OECD č. 429) byla revidována (1 a kapitola B.42 této 
přílohy). Podrobné údaje o validaci metody LLNA a p řehled prací spoje ­
ných s touto metodou byly publikovány (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). 
V rámci metody LLNA se k m ěření proliferace lymfocyt ů využívají radio ­
izotopy thymidinu nebo jódu, a proto má tato zkouška omezené použití, pokud získání, používání nebo likvidace radioaktivních látek p ředstavují 
problém. Zkušební metoda LLNA: BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immuno ­
sorbent Assay] je neradioaktivní modifikace zkušební metody LLNA, která k měření proliferace lymfocyt ů využívá neradioaktivn ě značený 5-brom-2- 
deoxyuridin (BrdU) (Reg. č. Chemical Abstracts Service [CAS] 59-14-3) 
v rámci systému založeném na zkoušce ELISA. Metoda LLNA: 
BrdU-ELISA byla ov ěřena, přezkoumána a doporu čena mezinárodní 
vědeckou komisí pro vzájemné hodnocení jakožto metoda, která je 
s určitými omezeními považována za užite čnou pro identifikaci chemických 
látek způsobujících nebo naopak nezp ůsobujících senzibilizaci k ůže (10) 
(11) (12). Tato ZM je ur čena k hodnocení potenciálu chemikálií (látek 
a směsí) způsobovat senzibilizaci k ůže u zvířat. Zkušební metoda podle 
kapitoly B.6 této p řílohy a zkušební metodiky OECD č. 406 využívá 
zkoušek na mor
čatech, a to zvlášt ě maximaliza ční zkoušku na mor čatech 
a Bühlerův test (13). Metoda LLNA (kapitola B.42 této p řílohy; zkušební 
metodika OECD č. 429) a její dv ě neradioaktivní modifikace, metoda 
LLNA: BrdU-ELISA (kapitola B.51 této p řílohy; zkušební metodika 
OECD č. 442 B) a metoda LLNA: DA (kapitola B.50 této p řílohy; zkušební 
metodika OECD č. 442 A) poskytují výhody ve srovnání se zkouškami na 
morčatech podle kapitoly B.6 a zkušební metodiky OECD č. 406 (13), 
pokud jde o snížení po čtu využívaných zví řat a zdokonalení zp ůsobu jejich 
využívání.  
2. Podobn ě jako metoda LLNA i metoda LLNA: BrdU-ELISA zkoumá 
indukční fázi senzibilizace k ůže a poskytuje kvantitativní údaje, které jsou 
vhodné pro hodnocení závislosti odezvy na dávce. Schopnost detekovat látky senzibilizující k ůži bez nutnosti použití radioizotop ů pro zna čení 
DNA navíc odstra ňuje možnost expozice radioaktivit ě při práci 
a problémy s likvidací odpad ů. To zase m ůže umožnit zvýšené využívání 
myší k detekování látek senzibilizujících k ůži, což by mohlo dále snížit 
využívání mor čat k testování potenciálu chemických látek zp ůsobovat senzi ­
bilizaci k ůže (tzn. metodou podle kapitoly B.6 a zkušební metodiky OECD 
č. 406) (13).
 
DEFINICE  
3. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.  
VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ  
4. Zkušební metoda LLNA: BrdU-ELISA je modifikovanou metodou LLNA, 
která s ur čitými omezeními slouží k identifikaci chemických látek, jež 
mohou zp ůsobovat senzibilizaci k ůže. To však nutn ě neznamená, že by 
se metoda LLNA: BrdU-ELISA m ěla používat ve všech p řípadech namísto 
metody LLNA nebo namísto zkoušek na mor čatech (tzn. podle kapitoly B.6 
této přílohy a zkušební metodiky OECD č. 406) (13); znamená to spíše, že 
tato metoda má stejnou hodnotu a že ji lze použít jako alternativní metodu, 
jejíž pozitivní ani negativní výsledky obvykle již nevyžadují žádné další  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
potvrzování (10) (11). Zkušební laborato ř by měla před provedením studie 
zohlednit všechny dostupné informace o zkoušené látce. Mezi tyto infor ­
mace pat ří totožnost a chemická struktura zkoušené látky, její fyzikáln ě- 
chemické vlastnosti, výsledky jakýchkoli jiných zkoušek toxicity  in vitro  
a in vivo  za použití zkoušené látky a toxikologické údaje o strukturn ě 
příbuzných látkách. Tyto informace je nutno posoudit, aby se zjistilo, zda 
je metoda LLNA: BrdU-ELISA vhodná pro danou látku (s ohledem na neslučitelnost n ěkterých druh ů chemických látek s metodou LLNA: 
BrdU-ELISA [viz odstavec 5]), a také aby se usnadnila volba dávkování.
 
5. Zkušební metoda LLNA: BrdU-ELISA je metodou  in vivo , a tudíž neeli ­
minuje používání zví řat při hodnocení alergického kontaktního senzibilizu ­
jícího působení. Umož ňuje však omezit využívání zví řat pro tento ú čel ve 
srovnání se zkouškami na mor čatech (podle kapitoly B.6 a zkušební meto ­
diky OECD č. 406) (13). Krom ě toho metoda LLNA: BrdU-ELISA nabízí 
podstatné zlepšení zp ůsobu zacházení se zví řaty, která se využívají ke 
zkoušení kontaktní alergické senzibilizace, jelikož na rozdíl od metody 
podle kapitoly B.6 a zkušební metodiky OECD č. 406 metoda LLNA: 
BrdU-ELISA nevyžaduje um ělé vyvolání kožní p řecitlivělosti. Krom ě 
toho metoda LLNA: BrdU-ELISA nevyžaduje ani používání adjuvantu, 
jak je tomu v p řípadě maximaliza ční zkoušky na mor čatech (podle 
kapitoly B.6 této p řílohy) (13). Díky tomu metoda LLNA: BrdU-ELISA 
snižuje utrpení zví řat. Ale i p řes výhody, které má metoda LLNA: 
BrdU-ELISA ve srovnání s metodou popsanou v kapitole B.6 a zkušební 
metodice OECD č. 406 (13), existují ur čitá omezení, která si mohou 
vyžádat použití metody popsané v kapitole B.6 nebo zkušební metodice OECD č. 406 (nap ř. zkoušení n ěkterých kov ů, falešně pozitivní výsledky 
u určitých látek zp ůsobujících podrážd ění kůže (jako jsou nap říklad některé 
chemikálie typu povrchov ě aktivních látek) (6) (1 a kapitola B.42 této 
přílohy) nebo rozpustnost zkoušené látky). Krom
ě toho si použití zkoušek 
na morčatech (tzn. podle kapitoly B.6 nebo zkušební metodiky OECD 
č. 406) (13) mohou vyžádat také n ěkteré třídy chemických látek nebo 
látky obsahující funk ční skupiny, u nichž je prokázáno, že mohou zp ůso­
bovat zkreslení výsledk ů (15). Doporu čuje se, aby se omezení zjišt ěná 
u metody LLNA (1 a kapitola B.42 této p řílohy) vztahovala rovn ěž na 
metodu LLNA: BrdU-ELISA (10). S výjimkou t ěchto známých omezení 
by měla být metoda LLNA: BrdU-ELISA použitelná k testování jakýchkoli 
látek, nejsou-li s t ěmito látkami spojeny vlastnosti, které mohou nep říznivě 
ovlivnit p řesnost metody LLNA: BrdU-ELISA. Krom ě toho je t řeba zvážit 
možnost hrani čních pozitivních výsledk ů při získání hodnot indexu 
stimulace (SI) v rozmezí od 1,6 do 1,9 (viz odstavce 31 až 32). To je 
založeno na valida ční databázi 43 látek za použití hodnot SI ≥ 1,6 (viz 
odstavec 6), u kterých metoda LLNA: BrdU-ELISA správn ě identifikovala 
všech 32 látek identifikovaných jako senzibilizující látky metodou LLNA, 
ale nesprávn ě identifikovala dv ě z 11 látek identifikovaných metodou 
LLNA jako nesenzibilizující látky s hodnotami SI v rozmezí od 1,6 do 1,9 (tzn. hrani ční pozitivní) (10). Jelikož však byl stejný soubor údaj ů 
použit k stanovení hodnot SI a k výpo čtu prediktivních vlastností zkoušky, 
mohou uvedené výsledky p ředstavovat nadhodnocení skute čných prediktiv ­
ních vlastností této metody.
 
PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
6. Základní podstata metody LLNA: BrdU-ELISA spo čívá v tom, že senzibi ­
lizující látky vyvolávají proliferaci lymfocyt ů v lymfatických uzlinách 
drenujících místo aplikace zkoušené látky. Tato proliferace je úm ěrná 
dávce a potenciálu aplikovaného alergenu a p ředstavuje jednoduchý 
prostředek k získání kvantitativního údaje o mí ře senzibilizace. Proliferace 
se měří porovnáním pr ůměrné proliferace u každé zkušební skupiny 
s průměrnou proliferací u kontrolní skupiny s vehikulem. Ur čí se pom ěr 
průměrné proliferace u každé z exponovaných skupin k pr ůměrné prolife ­
raci u soub ěžně testované kontrolní skupiny s vehikulem, nazývaný index  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
stimulace (SI), p řičemž jeho hodnota by m ěla být ≥ 1,6, aby bylo oprávn ěné 
další hodnocení zkoušené látky jako potenciálního senzibilizátoru k ůže. Zde 
popsané postupy jsou založeny na použití m ěření obsahu BrdU k indikaci 
zvýšeného po čtu proliferujících bun ěk v lymfatických uzlinách drenujících 
aurikulární oblast. Látka BrdU je analogem thymidinu a za čleňuje se 
podobným zp ůsobem do DNA proliferujících bun ěk. Začlenění BrdU se 
měří metodou ELISA, která využívá protilátku specifickou pro BrdU, 
která je rovn ě značí peroxidázou. Po p řidání substrátu peroxidáza reaguje 
se substrátem p ři vzniku barevného produktu, jehož množství se ur čuje při 
určité absorbanci za použití čtečky mikrotitra čních desti ček. 
POPIS ZKOUŠKY  
Volba druhu zví řat 
7. Vhodným druhem pro tuto zkoušku je myš. Valida ční studie metody 
LLNA: BrdU-ELISA byly provád ěny výhradn ě s kmenem CBA/JN, který 
je proto považován za up řednostňovaný kmen (10) (12). Používají se mladé 
dospělé samice myší, které musí být nullipary a nesm ějí být březí. Při 
zahájení studie by zví řata měla být přibližně 8 až 12 týdn ů stará, přičemž 
odchylky v hmotnosti zví řat by měly být pouze minimální a nem ěly by 
překročit 20 % pr ůměrné hmotnosti. P řípadně lze používat i jiné kmeny 
a samce, pokud je k dispozici dostatek údaj ů, které dokazují, že v rámci 
reakcí neexistují u metody LLNA: BrdU-ELISA významné specifické odliš ­
nosti mezi kmeny a/nebo pohlavími.  
Podmínky chovu a krmení  
8. Myši by m ěly být chovány ve skupinách (16), není-li p ředloženo dostate čné 
vědecké zd ůvodnění, proč by měly být chovány jednotliv ě. Teplota 
v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22 ± 3 °C. A čkoli by relativní 
vlhkost vzduchu m ěla být minimáln ě 30 % a pokud možno by krom ě doby 
úklidu místnosti nem ěla přesáhnout 70 %, cílem by m ěla být hodnota 
50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé se střídáním 12 hodin sv ětla a 12 
hodin tmy. Ke krmení lze používat b ěžnou laboratorní stravu a k pití by 
měly mít myši k dispozici neomezené množství vody.  
Příprava zví řat 
9. Zvířata se náhodn ě vyberou, pro usnadn ění individuální identifikace se 
označí (nesmí se však použít žádná forma zna čení uší) a chovají se 
v klecích minimáln ě pět dnů před začátkem aplikování zkoušené látky, 
aby se mohla p řizpůsobit laboratorním podmínkám. P řed začátkem aplikace 
látky se všechna zví řata vyšetří, aby se ov ěřilo, že nemají žádné pozorova ­
telné kožní léze.  
Příprava dávkovacích roztok ů 
10. Pevné chemické látky by se m ěly před nanesením na ucho myši rozpustit 
nebo suspendovat ve vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech a pop řípadě 
zředit. Kapalné látky lze aplikovat bez p řísad nebo je lze p řed dávkováním 
rozpustit. Nerozpustné látky, jaké se nej častěji používají k výrob ě zdravot­
nických prost ředků, by měly být vystaveny intenzívní extrakci ve vhodném 
rozpouštědle, aby se p řed nanesením na ucho myši odhalily všechny extra ­
hovatelné složky, které je nutno testovat. Zkoušené látky by se m ěly připra­
vovat každý den čerstvé, pokud údaje o stálosti neprokazují p řijatelnost 
jejich skladování.  
Kontrola spolehlivosti  
11. K prokázání řádné funk čnosti zkoušky slouží pozitivní kontrolní chemikálie, 
a to tak, že reagují s dostate čnou a reprodukovatelnou citlivostí na zkou ­ 
šenou senzibilizující látku, u níž je dob ře popsána síla odezvy. Za řazení 
souběžné pozitivní kontroly se doporu čuje proto, že prokazuje zp ůsobilost 
laboratoře úspěšně provést každou zkoušku a umož ňuje posoudit  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
vnitrolaboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnost a srovnatelnost. 
Některé regula ční orgány také vyžadují p ři každé studii pozitivní kontrolu, 
a proto se uživatel ům doporu čuje před provedením zkoušky LLNA: 
BrdU-ELISA p říslušné orgány konzultovat. Doporu čuje se tudíž b ěžně 
používat soub ěžnou pozitivní kontrolu, aby nebylo nutné další zkoušení 
na zvířatech ke spln ění požadavk ů, které by mohly vzniknout p ři používání 
periodické pozitivní kontroly (viz odstavec 12). Pozitivní kontrola by m ěla 
v rámci metody LLNA: BrdU-ELISA vyvolat pozitivní odezvu p ři úrovni 
expozice, u které se o čekává zvýšení indexu stimulace (SI) > 1,6 ve srov ­
nání s negativní kontrolní skupinou. Dávka pozitivní kontroly by m ěla být 
zvolena tak, aby nevyvolala nadm ěrné podrážd ění kůže nebo systémovou 
toxicitu a p řitom aby indukce byla reprodukovatelná, avšak nikoli nadm ěrná 
(tzn. že hodnota SI > 14 by byla považována za p říliš velkou). 
K upřednostňovaným látkám pro pozitivní kontrolu pat ří 25 % roztok 2- 
benzylidenoktanalu ( č. CAS 101-86-0) nebo eugenolu ( číslo CAS 97-53-0) 
v acetonu s olivovým olejem (v objemovém pom ěru 4:1). Mohou existovat 
určité okolnosti, za nichž lze p ři řádném zd ůvodnění použít i jiné pozitivní 
kontrolní látky, které spl ňují výše uvedená kritéria.  
12. I když se za řazení skupiny soub ěžných pozitivních kontrol doporu čuje, 
mohou existovat situace, kdy m ůže být periodické testování (tzn. 
v intervalech ≤ 6 měsíců) pozitivních kontrol vhodné u laborato ří, které 
provádějí zkoušky LLNA: BrdU-ELISA pravideln ě (tzn. nejmén ě jednou 
měsíčně) a mají k dispozici databázi d řívějších údaj ů pozitivních kontrol, 
která prokazuje schopnost laborato ře získat p ři použití pozitivních kontrol 
reprodukovatelné a p řesné výsledky. Odpovídající zb ěhlost v používání 
metody LLNA: BrdU-ELISA lze úsp ěšně prokázat dosažením shodných 
pozitivních výsledk ů při použití pozitivní kontroly alespo ň v 10 nezávislých 
zkouškách provedených b ěhem přiměřené doby (tzn. b ěhem mén ě než 
jednoho roku).  
13. Skupina soub ěžných pozitivních kontrol by se m ěla zařadit vždy, když 
dojde k procedurální zm ěně metody LLNA: BrdU-ELISA (nap ř. při 
změně složení vyškoleného personálu, p ři změně materiálů a/nebo činidel 
či vybavení, jež se používají v rámci zkušební metody, nebo p ři změně 
zdroje pokusných zví řat), přičemž takové zm ěny by se m ěly vždy zdoku ­
mentovat v laboratorních zprávách. P ři určování nezbytnosti vytvo řit novou 
databázi ke zdokumentování shodnosti výsledk ů pozitivních kontrol by se 
měl zvážit dopad t ěchto změn na přiměřenost dosavadní databáze.  
14. Zkoušející by si m ěli uvědomit, že rozhodnutí používat pozitivní kontroly peri ­
odicky namísto soub ěžně má závažné dopady na p řiměřenost a p řijatelnost 
negativních výsledk ů studie získaných bez soub ěžných pozitivních kontrol 
během intervalu mezi jednotlivými periodickými použitími pozitivních kontrol. 
Například obdržení falešn ě negativního výsledku p ři periodickém používání 
pozitivních kontrol m ůže zpochybnit negativní výsledky zkoušené látky získané 
v období mezi poslední p řijatelnou periodickou studií pozitivních kontrol 
a nepřijatelnou periodickou studií pozitivních kontrol. D ůsledky, jež z toho 
vyplývají, je t řeba pečlivě zvážit při rozhodování, zda do zkoumání za řadit 
souběžné pozitivní kontroly, nebo používat pouze periodické pozitivní kontroly. 
Je také nutno vzít v úvahu možnost použít v rámci skupiny soub ěžných pozi ­
tivních kontrol mén ě zvířat, jestliže je to v ědecky opodstatn ěné a jestliže labo ­
ratoř na základ ě svých vlastních dosavadních údaj ů prokáže, že lze používat 
méně myší (17).  
15. Ačkoli by se pozitivní kontroly m ěly zkoušet ve vehikulu, o n ěmž je 
známo, že vždy vyvolává shodnou reakci (nap ř. aceton s olivovým olejem 
v objemovém pom ěru 4:1), mohou nastat ur čité situace, kdy je z d ůvodů 
požadovaných v právních p ředpisech nezbytné provést zkoušku s použitím 
nestandardního vehikula (klinicky/chemicky relevantní složení) (18). Pokud se souběžná pozitivní kontrola zkouší v jiném vehikulu než zkoušená látka, 
měla by být sou částí zkoušky se soub ěžnou pozitivní kontrolou také samo ­
statná kontrola s vehikulem.
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. V p řípadech, kdy se hodnotí zkoušené látky, které pat ří do určité třídy 
chemických látek nebo vykazují ur čitou škálu odezev, mohou být užite čné 
také srovnávací látky, jelikož mohou prokázat, že zkušební metoda je schopna správn ě zjistit potenciál t ěchto druh ů zkoušených látek vyvolávat 
senzibilizaci k ůže. Vhodné srovnávací látky by m ěly mít tyto vlastnosti:
 
— strukturální a funk ční podobnost s t řídou, do níž pat ří zkoušená látka,  
— známé fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— podklady ze zkoušky LLNA: BrdU-ELISA,  
— podklady získané p ři použití jiných zví řecích model ů a/nebo lidí.  
ZKUŠEBNÍ POSTUP  
Počet zvířat a dávkování  
17. Na každou dávkovou skupinu se použijí alespo ň čtyři zvířata, přičemž se 
použijí minimáln ě tři koncentrace zkoušené látky, dále se použije 
souběžná negativní kontrolní skupina, k jejíž expozici se použije pouze 
vehikulum zkoušené látky, a pozitivní kontrolní skupina (soub ěžná nebo 
z nedávné jiné zkoušky – v závislosti na postupech dané laborato ře při 
zohlednění odstavc ů 11–15). M ělo by se zvážit zkoušení v ětšího počtu 
dávek pozitivní kontroly, a to zejména v p řípadě, že se pozitivní kontrola 
nepoužívá soustavn ě. Se zví řaty v kontrolních skupinách by se 
s výjimkou aplikace zkoušené látky m ělo zacházet stejn ě jako se zví řaty 
v exponovaných skupinách.  
18. Volba dávkování a vehikula by m ěla být založena na doporu čeních uvede ­
ných v literatu ře – (2) a (19). Po sob ě jdoucí dávky se b ěžně vybírají 
z vhodné řady koncentrací, nap říklad 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 
2,5 %, 1 %, 0,5 % atd. Volba této řady koncentrací by m ěla být dostate čně 
vědecky zd ůvodněna. Při výběru tří po sobě jdoucích koncentrací je t řeba 
zvážit veškeré existující toxikologické informace (nap ř. o akutní toxicit ě 
a kožní dráždivosti) a informace o struktu ře a fyzikáln ě-chemických vlast ­
nostech zkoušené látky (a/nebo strukturn ě příbuzných látek), jsou-li 
k dispozici, aby nejvyšší koncentrace maximalizovala expozici, aniž by 
současně vyvolala systémovou toxicitu a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění 
kůže (19) (20 a kapitola B.4 této p řílohy). Nejsou-li takové informace 
k dispozici, m ůže být nezbytné provést úvodní p ředběžnou screeningovou 
zkoušku (viz odstavce 21 až 24).  
19. Vehikulum by nem ělo nepříznivě ovlivňovat ani jinak zkreslovat výsledky 
zkoušky a m ělo by být vybráno tak, aby se maximalizovala rozpustnost 
umožňující dosáhnout nejvyšší možné koncentrace a zárove ň připravit 
roztok nebo suspenzi, jež jsou vhodné pro aplikaci zkoušené látky. 
K doporu čeným vehikul ům patří aceton s olivovým olejem (v objemovém 
poměru 4:1),  N,N -dimethylformamid, ethyl(methyl)keton, propan-1,2-diol 
a dimethylsulfoxid (6), avšak p ři dostatečném vědeckém zd ůvodnění lze 
použít i jiná vehikula. V ur čitých situacích m ůže být nezbytné použít 
jako dopl ňující kontrolu klinicky relevantní rozpoušt ědlo nebo b ěžně 
prodejný p řípravek obsahující zkoušenou látku. Zvlášt ě je třeba dbát na 
to, aby byly hydrofilní zkoušené látky zapracovány do takového vehikula, které zvlh čí kůži a neste če ihned z pokožky. Toho lze dosáhnout použitím 
vhodných solubilizér ů (jako je nap ř. 1 % Pluronic® L92). Není tudíž 
vhodné používat zcela vodná vehikula.
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Zpracování lymfatických uzlin z jednotlivých myší umož ňuje posoudit vari ­
abilitu mezi jednotlivými zví řaty a provést statistické porovnání rozdílu 
mezi zkoušenou látkou a hodnotami nam ěřenými u kontrolní skupiny se 
samotným vehikulem (viz odstavec 33). Posoudit možnost snížit po čet myší 
v pozitivní kontrolní skupin ě je krom ě toho vhodné jen tehdy, když se 
zaznamenávají údaje od jednotlivých zví řat (17). Sb ěr údajů od jednotlivých 
zvířat navíc vyžadují i n ěkteré regula ční orgány. Pravidelný sb ěr údajů od 
jednotlivých zví řat je výhodn ější z hlediska dobrých životních podmínek 
zvířat, jelikož nevyžaduje duplicitní zkoušení, které by bylo nezbytné, 
pokud by výsledky pro ur čitou zkoušenou látku, jež byly p ůvodně shro­
mážděny jedním zp ůsobem (nap ř. za použití souhrnných údaj ů od všech 
zvířat), měly být pozd ěji posouzeny regula čními orgány s jinými požadavky 
(např. vyžadujícími použití údaj ů od jednotlivých zví řat). 
Předběžná screeningová zkouška  
21. Nejsou-li k dispozici informace pro stanovení nejvyšší dávky, která má být 
předmětem zkoušky (viz odstavec 18), m ěla by se provést p ředběžná scre­
eningová zkouška umož ňující vymezit vhodné dávkování, které se bude 
metodou LLNA: BrdU-ELISA zkoušet. Ú čelem předběžné screeningové 
zkoušky je poskytnout vodítko pro volbu maximálního dávkování, které 
se má použít v hlavní studii LLNA: BrdU-ELISA, pokud nejsou 
k dispozici informace o koncentraci, která vyvolává systémovou toxicitu (viz odstavec 24) a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění kůže (viz odstavec 
23). Maximální zkoušenou dávkou by m ěla být 100 % koncentrace zkou ­ 
šené látky v p řípadě kapalin, respektive maximální možná koncentrace 
v případě pevných látek nebo suspenzí.
 
22. Předběžná screeningová zkouška se provádí za stejných podmínek jako 
hlavní studie LLNA: BrdU-ELISA až na to, že se nehodnotí proliferace buněk z lymfatických uzlin a lze použít mén ě zvířat na dávkovou skupinu. 
Navrhuje se po čet jednoho až dvou zví řat na dávkovou skupinu. Všechny 
myši se denn ě pozorují, zda nevykazují klinické p říznaky systémové toxi ­
city nebo lokálního podrážd ění v míst ě aplikace. P řed zahájením zkoušky 
a před jejím ukon čením (den 6) se zaznamenají hodnoty t ělesné hmotnosti 
zvířat. Na obou uších každé myši se sleduje výskyt erytému, který se 
vyhodnotí podle tabulky 1 (20 a kapitola B.4 této p řílohy). Tlouš ťka 
ucha se zm ěří tloušťkoměrem (nap ř. digitálním mikrometrem nebo tlouš ť­
koměrem s kruhovou stupnicí) v den 1 (p řed aplikací první dávky), v den 3 
(přibl. 48 hodin po první dávce) a v den 6. Krom ě toho lze v den 6 ur čit 
tloušťku ucha na základ ě stanovení hmotnosti části ucha vyseknuté speci ­
álními klešt ěmi, což by se m ělo provád ět až poté, co se zví řata humánn ě 
usmrtí. Známkou nadm ěrného lokálního podrážd ění je zarudnutí ohodno ­
cené 3 nebo více body a/nebo zvýšení tlouš ťky ucha o 25 % nebo více 
v kterýkoli den m ěření (21) (22). Jako nejvyšší dávka se pro hlavní studii 
LLNA: BrdU-ELISA v rámci ř
ady koncentrací zjišt ěných při předběžné 
screeningové zkoušce (viz odstavec 18) zvolí nejbližší nižší dávka, která nevyvolává systémovou toxicitu a/nebo nadm ěrné lokální podrážd ění kůže.
 
Tabulka 1  
Bodové hodnocení erytému  
Pozorované p říznaky Bodové ohodno ­
cení 
Žádný erytém 0 
Velmi slabý erytém (sotva patrný) 1 Zřetelně viditelný erytém 2
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Pozorované p říznaky Bodové ohodno ­
cení 
Mírný až výrazný erytém 3 
Těžký erytém (silné zarudnutí) nebo tvorba p říškvaru 
znemožňující posouzení erytému 4 
23. Krom ě 25 % zvýšení tlouš ťky ucha (21) (22) se k identifikaci dráždivých 
látek při zkoušce LLNA používá také statisticky významné zvýšení tlouš ťky 
ucha u myší ze zkušební skupiny ve srovnání s kontrolními zví řaty (22) 
(23) (24) (25) (26) (27) (28). A čkoli mohou nastat p řípady statisticky 
významného zvýšení, i když se tlouš ťka ucha zvýší o mén ě než 25 %, 
nebyly tyto p řípady spojeny výhradn ě s nadm ěrným podrážd ěním (25) 
(26) (27) (28) (29).  
24. O systémové toxicit ě (30) mohou p ři použití v rámci integrovaného hodno ­
cení svědčit tyto poznatky z klinického pozorování, a tudíž mohou indi ­
kovat maximální dávku pro hlavní studii LLNA: BrdU-ELISA: zm ěny 
fungování nervového systému (nap ř. piloerekce, ataxie, t řes a křeče), 
změny chování (nap ř. agresivita, zm ěna činností týkajících se pé če o srst, 
výrazná zm ěna úrovn ě aktivity), zm ěny způsobů dýchání (tj. zm ěny 
frekvence a intenzity dýchání, nap ř. dušnost, lapání po dechu a chropy) 
a změny v přijímání potravy a vody. P ři hodnocení je navíc nutno brát 
v úvahu známky letargie a/nebo absence reagování, veškeré klinické příznaky více než mírné nebo momentální bolesti či utrpení nebo snížení 
tělesné hmotnosti ode dne 1 do dne 6 o více než 5 % a také úmrtnost. 
Umírající zví řata nebo zví řata, která jeví známky silné bolesti a utrpení, by 
se měla humánn ě usmrtit (31).
 
Harmonogram zkoušek v rámci hlavní studie  
25. Harmonogram zkoušky je následující:  
— Den 1:  Každé zví ře se zváží a zaznamená se jeho hmotnost a jakékoli 
poznatky z klinického pozorování. Na h řbet každého ucha se aplikuje 
25 μl vhodně zředěného roztoku zkoušené látky, samotné vehikulum 
nebo pozitivní kontrola (tu lze provád ět buď souběžně, nebo lze použít 
pozitivní kontrolu z nedávné jiné zkoušky – v závislosti na postupech 
dané laborato ře při zohledn ění odstavc ů 11 až 15).  
— Den 2 a den 3:  Zopakuje se postup aplikace provedený v den 1.  
— Den 4:  Žádná aplikace.  
— Den 5:  Injekčně se intraperitoneáln ě aplikuje 0,5 ml (5 mg/myš) 
roztoku BrdU (10 mg/ml).  
— Den 6:  Zaznamená se hmotnost každého zví řete a jakékoli poznatky 
z klinického pozorování. P řibližně 24 hodin (24 hod.) po injek čním 
podání BrdU se zví řata humánn ě usmrtí. U každé myši se vyjmou 
lymfatické uzliny drenující aurikulární oblast obou uší a zpracují se ve fosfátovém pufrovém fyziologickém roztoku (PBS) od každého zvířete zvláš ť. Podrobnosti a grafické znázorn ění vyhledání uzlin 
a jejich disekce lze nalézt v literatu ře (17). Pro ú čely dalšího sledování 
lokální kožní reakce v rámci hlavní studie lze do protokolu studie zařadit i další parametry, jako je bodové ohodnocení erytému ucha 
nebo údaje o tlouš ťce ucha (získané bu ď pomocí tlouš ťkoměru, nebo 
na základ ě stanovení hmotnosti části ucha vyseknuté speciálními kleš ­
těmi při pitvě).
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Příprava bun ěčných suspenzí  
26. Od každé myši se p řipraví jednobun ěčná suspenze obsahující bu ňky 
z vyňatých lymfatických uzlin drenujících oblast obou uší; suspenze se 
připraví jemnou mechanickou deagregací p řes 200 μm sítko 
z korozivzdorné oceli nebo jiným p řijatelným postupem vytvo ření jednobu ­
něčné suspenze (nap ř. rozdrcením lymfatických uzlin za použití jednorázové 
plastové pali čky a následným protla čením tkán ě nylonovým sítkem # 70). 
Postup p řípravy suspenze bun ěk z lymfatických uzlin je v této zkoušce 
rozhodující, a proto by si m ěl každý pracovník osvojit tuto dovednost 
předem. Krom ě toho jsou lymfatické uzliny u zví řat z negativní kontrolní 
skupiny malé, takže je t řeba postupovat opatrn ě, aby se zabránilo jakému ­
koli umělému ovlivn ění hodnot SI. V každém p řípadě je nutno cílový 
objem suspenze bun ěk z lymfatických uzlin upravit na stanovený optimální 
objem (přibližně 15 ml). Optimální objem je založen na dosažení pr ůměrné 
absorbance negativní kontrolní skupiny v rozmezí 0,1–0,2.  
Stanovení bun ěčné proliferace (m ěření obsahu BrdU v DNA lymfocyt ů) 
27. Obsah BrdU se m ěří metodou ELISA za použit komer ční soupravy (nap ř. 
Roche Applied Science, Mannheim, N ěmecko, katalogové číslo 11 647 229 
001). Postup lze stru čně popsat tak, že 100 ml suspenze bun ěk 
z lymfatických uzlin se nakape do jamek t ří mikrotitra čních desti ček 
s plochým dnem. Po fixaci a denaturaci bun ěk z lymfatických uzlin se 
do každé jamky p řidá protilátka proti BrdU a obsah jamek se nechá zreago ­
vat. Následn ě se protilátka proti BrdU odstraní vymytím, p řidá se roztok 
substrátu a nechá se vzniknout chromogen. Pak se zm ěří absorbance p ři 
vlnové délce 370 nm s referen ční vlnovou délkou 492 nm. Ve všech p řípa­
dech je nutno optimalizovat zkušební podmínky (viz odstavec 26).  
ZÍSKANÉ POZNATKY  
Poznatky z klinického pozorování  
28. Každá myš se jednou denn ě pečlivě vyšetří, zda nevykazuje jakékoli 
klinické p říznaky lokálního podrážd ění v míst ě aplikace nebo p říznaky 
systémové toxicity. Všechny získané poznatky se systematicky zaznamenají, 
přičemž záznamy se vedou zvláš ť za každou myš. Plány sledování by m ěly 
obsahovat kritéria umož ňující rychle identifikovat myši, jež vykazují 
známky systémové toxicity, nadm ěrného lokálního podrážd ění pokožky 
nebo poleptání k ůže, aby mohly být usmrceny (31).  
Hodnoty t ělesné hmotnosti  
29. Jak je uvedeno v odstavci 25, t ělesnou hmotnost jednotlivých zví řat je 
nutno zjistit na za čátku zkoušky a v dob ě plánovaného humánního usmrcení 
zvířete. 
VÝPOČET VÝSLEDK Ů 
30. Výsledky za každou exponovanou skupinu se vyjád ří jako průměrný index 
stimulace (SI). Hodnota SI se stanoví jako podíl pr ůměrné hodnoty indexu 
značení BrdU na zví ře jak u každé exponované skupiny, tak u pozitivní 
kontrolní skupiny, a pr ůměrné hodnoty indexu zna čení BrdU na zví ře 
u kontrolní skupiny s rozpoušt ědlem/vehikulem. Pr ůměrná hodnota SI 
u kontrolních skupin s vehikulem je pak rovna 1.  
Index zna čení BrdU je definován jako:  
Index zna čení BrdU = (ABS  em – ABS blank  em ) – (ABS  ref – ABS blank  ref ) 
kde: em = vlnová délka zá ření; ref = referen ční vlnová délka.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Při rozhodování o výsledku zkoušky se za pozitivní výsledek považuje, 
pokud hodnota SI ≥ 1,6 (10). P ři rozhodování, zda hrani ční výsledek 
(tzn. hodnotu SI v rozmezí od 1,6 do 1,9) prohlásit za pozitivní, lze také použít míru závislosti odezvy na dávce, statistickou významnost a jednotnost výsledk ů kontrol s rozpoušt ědlem/vehikulem a pozitivních 
kontrol (3) (6) (32).
 
32. U hrani ční pozitivní odezvy v rozmezí hodnot SI od 1,6 do 1,9 mohou 
uživatelé zvážit další informace, nap říklad závislost odezvy na dávce, 
známky systémové toxicity nebo nadm ěrného podrážd ění, a tam, kde je 
to vhodné, také statistickou významnost spolu s hodnotami SI, aby se potvrdilo, že jsou takové výsledky pozitivní (10). M ěla by se rovn ěž 
věnovat pozornost r ůzným vlastnostem zkoušené látky v četně toho, zda 
se její struktura podobá struktu ře známých senzibilizátor ů kůže, zda 
u myší zp ůsobuje nadm ěrné lokální podrážd ění kůže, a také povaze zjišt ěné 
závislosti odezvy na dávce. T ěmito body a dalšími aspekty, které je t řeba 
zvážit, se podrobn ě zabývá literatura (4).
 
33. Shromaž ďování údaj ů úrovni jednotlivých myší umožní provést statistickou 
analýzu, kterou se na základ ě těchto údaj ů zjistí existence a míra závislosti 
odezvy na dávce. P řípadné statistické hodnocení by mohlo obsahovat 
posouzení závislosti odezvy na dávce, jakož i vhodn ě upravená srovnání 
zkušebních skupin (nap ř. skupiny s párov ě srovnávaným dávkováním oproti 
souběžné kontrolní skupin ě s rozpoušt ědlem/vehikulem). Statistické analýzy 
mohou zahrnovat nap ř. lineární regresi nebo Williamsovu zkoušku 
k posouzení trend ů závislosti odezvy na dávce a Dunnettovu zkoušku pro 
párová srovnání. P ři výběru vhodné metody pro statistickou analýzu by si 
měl být zkoušející v ědom možných nestejných odchylek a jiných souvise ­
jících problém ů, které si mohou vyžádat transformaci údaj ů nebo nepara ­
metrickou statistickou analýzu. V každém p řípadě může být nezbytné, aby 
zkoušející provedl výpo čty SI a statistické analýzy jednak za použití ur či­
tých krajních hodnot (n ěkdy ozna čovaných výrazem „odlehlé hodnoty“) 
a jednak bez nich.  
ÚDAJE A VYKAZOVÁNÍ  
Údaje  
34. Údaje je nutno shrnout do tabulky s hodnotami indexu zna čení BrdU od 
jednotlivých zví řat, průměrnou hodnotou indexu zna čení BrdU na zví ře za 
celou skupinu, p říslušným chybovým výrazem (nap ř. směrodatnou 
odchylkou – SD, sm ěrodatnou odchylkou pr ůměrných hodnot – SEM) 
a průměrnou hodnotou SI za každou dávkovou skupinu oproti soub ěžné 
kontrolní skupin ě s rozpoušt ědlem nebo vehikulem.  
Protokol o zkoušce  
35. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Zkoušená látka a kontrolní látka:  
— identifika ční údaje (nap ř. číslo CAS a číslo ES, jsou-li k dispozici, 
zdroj, čistota, známé ne čistoty, číslo šarže),  
— skupenství a fyzikáln ě-chemické vlastnosti (nap ř. prchavost, stálost, 
rozpustnost),  
— jedná-li se o sm ěs, je nutno uvést její složení a pom ěrné procentuální 
zastoupení složek.  
Rozpoušt ědlo/vehikulum:  
— identifika ční údaje ( čistota, pop řípadě koncentrace, použitý objem),  
— zdůvodnění volby vehikula.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Pokusná zví řata: 
— zdroj myší z kmene CBA,  
— mikrobiologický stav zví řat, je-li znám,  
— počet a věk zvířat, 
— původ zvířat, podmínky chovu, strava atd.  
Zkušební podmínky:  
— zdroj, číslo šarže a údaje od výrobce soupravy ELISA, které se týkají 
prokazování a kontroly kvality (citlivost a specifi čnost detekce protilátek 
a mez detekce),  
— podrobnosti o p řípravě a aplikaci zkoušené látky,  
— zdůvodnění volby dávkování (v četně výsledků předběžné screeningové 
zkoušky, pokud byla provedena),  
— použité koncentrace vehikula a zkoušené látky a celkové aplikované 
množství zkoušené látky,  
— podrobnosti o jakosti vody a potravy (v četně druhu/zdroje stravy, zdroje 
vody),  
— podrobnosti o harmonogramech expozice a odb ěru vzorků, 
— metody m ěření toxicity,  
— kritéria pro ozna čení studie za pozitivní nebo negativní,  
— údaje o p řípadných odchylkách od protokolu a vysv ětlení, jakým 
způsobem taková odchylka ovliv ňuje koncepci studie a její výsledky.  
Kontrola spolehlivosti:  
— souhrn výsledk ů nejnovější kontroly spolehlivosti v četně informací 
o použité zkoušené látce, koncentraci a vehikulu,  
— údaje ze soub ěžných a/nebo d řívějších pozitivních nebo negativních 
kontrolních skupin (s rozpoušt ědlem/vehikulem) zkoušených v doty čné 
laboratoři, 
— pokud soub ěžná pozitivní kontrola nebyla sou částí studie, je nutno uvést 
datum a laboratorní zprávu nejnov ější periodické pozitivní kontroly 
a podrobnou zprávu s údaji z d řívějších pozitivních kontrol zkoušených 
v dotyčné laborato ři, které od ůvodňují rozhodnutí neprovád ět souběžné 
pozitivní kontroly.  
Výsledky:  
— hmotnost jednotlivých myší na po čátku aplikace a v dob ě plánovaného 
humánního usmrcení, jakož i pr ůměrná hodnota a p říslušný chybový 
výraz (nap ř. SD, SEM) za každou exponovanou skupinu,  
— u každého zví řete časový pr ůběh nástupu p říznaků toxicity, v četně 
podráždění kůže v míst ě aplikace, pokud k n ěmu dojde,  
— tabulka hodnot indexu zna čení BrdU a hodnot SI od jednotlivých myší 
za každou exponovanou skupinu;  
— průměrná hodnota indexu zna čení BrdU na zví ře a příslušný chybový 
výraz (nap ř. SD, SEM) za každou exponovanou skupinu a výsledky 
analýzy odlehlých hodnot za každou exponovanou skupinu,  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— vypočtená hodnota SI a p říslušná míra variability, která zohled ňuje 
variabilitu mezi jednotlivými zví řaty jak z testování zkoušené látky, 
tak z kontrolních skupin,  
— závislost odezvy na dávce,  
— případné statistické analýzy.  
Rozbor výsledk ů: 
— stručný komentá ř k výsledk ům, k analýze závislosti odezvy na dávce 
a k případným statistickým analýzám a dále záv ěr, zda se má zkoušená 
látka považovat za senzibilizátor k ůže. 
LITERATURA  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999–1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985–997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. 
Toxicol., 36, 327–33.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins. Toxicol., 146, 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf].
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258–273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274–286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249–257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive 
local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552 A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm].
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated 
validation status of new versions and applications of the murine local lymph 
node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam. 
niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129–134.
 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozici na adrese: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90–96.
 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine 
Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ llna-ps/LLNAPerfStds.pdf].
 
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31.
 
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. K dispozici na adrese: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines].  
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
 
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam. niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195–206.  
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxi ­
col. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.
 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 
60–68.
 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.  
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023–1028.
 
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. K dispozici na adrese: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ acutetox/Tox_workshop.htm].
 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563–79.
 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Přesnost:  Blízkost shody mezi výsledky zkušební metody a uznávanými referen ­ 
čními hodnotami. Je to míra funk čnosti zkušební metody a jeden z aspekt ů její 
relevantnosti. Tento výraz se často používá namísto výrazu „soulad“ a rozumí se 
jím podíl správných výsledk ů zkušební metody (33).  
Srovnávací látka:  Senzibilizující nebo nesenzibilizující látka použitá jako stan ­
dard pro srovnání se zkoušenou látkou. Srovnávací látka by m ěla mít tyto vlast ­
nosti: i) konzistentní a spolehlivý zdroj (konzistentní a spolehlivé zdroje); ii) 
strukturální a funk ční podobnost s t řídou zkoušených látek; iii) známé fyzi ­
kálně-chemické vlastnosti; iv) podklady o známých ú čincích a v) známá ú činnost 
v rozsahu žádoucí odezvy.  
Falešně negativní:  Zkoušená látka je zkušební metodou nesprávn ě označena za 
negativní nebo neaktivní, a čkoli ve skute čnosti je pozitivní nebo aktivní (33).  
Falešně pozitivní:  Zkoušená látka je zkušební metodou nesprávn ě označena za 
pozitivní nebo aktivní, a čkoli ve skute čnosti je negativní nebo neaktivní (33).  
Nebezpečnost:  Potenciál látky p ůsobit nep říznivě na zdraví nebo životní 
prostředí. Nepříznivý účinek se projevuje pouze p ři dostatečné úrovni expozice.  
Mezilaboratorní reprodukovatelnost:  Míra, v jaké mohou r ůzné kvalifikované 
laboratoře za použití stejného protokolu a p ři testování stejné zkoušené látky 
získat kvalitativn ě a kvantitativn ě podobné výsledky. Mezilaboratorní reproduko ­
vatelnost se ur čuje během předvalidačních a valida čních postup ů a ukazuje, do 
jaké míry lze zkoušku úsp ěšně přenášet mezi r ůznými laborato řemi (33).  
Vnitrolaboratorní reprodukovatelnost:  Určení míry, v jaké m ůže kvalifikovaný 
personál ve stejné laborato ři jindy úsp ěšně dosáhnout stejných výsledk ů za 
použití ur čitého protokolu (33).  
Odlehlá hodnota:  Odlehlá hodnota je poznatek, který se výrazn ě liší od ostatních 
hodnot v náhodném vzorku od celé populace.  
Prokazování kvality:  Řídicí proces, v jehož rámci se hodnotí dodržování zkušeb ­
ních norem a standard ů laborato ře, příslušných požadavk ů a postup ů vedení 
záznamů, jakož i p řesnost přenosu údaj ů, přičemž tyto prvky jsou hodnoceny 
osobami, které jsou nezávislé na pracovnících, kte ří zkoušky provád ějí. 
Spolehlivost:  Míra, v jaké lze zkušební metodu provád ět reprodukovateln ě 
v rámci téže laborato ře i v rámci r ůzných laborato ří v průběhu doby, jestliže 
se provádí za použití stejného protokolu. Hodnotí se na základ ě výpočtu vnitro­
laboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti (33).  
Senzibilizace k ůže: Imunologický proces, který nastává, když je vnímavá osoba 
vystavena místn ě aplikovanému chemickému alergenu, který vyvolává kožní 
imunitní odezvu, jež m ůže vést ke vzniku kontaktní senzibilizace.  
Index stimulace (SI):  Hodnota vypo čtená za ú čelem posouzení potenciálu zkou ­ 
šené látky vyvolat senzibilizaci k ůže. Vyjad řuje poměr hodnoty proliferace 
u exponovaných skupin k hodnot ě proliferace u soub ěžné kontrolní skupiny 
s vehikulem.  
Zkoušená látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs, která se zkouší za použití této 
zkušební metody.  ▼M3 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52  AKUTNÍ INHALA ČNÍ TOXICITA – METODA STANOVENÍ 
TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokyn ům OECD pro zkoušení (TG) 436 
(2009). První pokyny k akutní inhala ční toxicit ě TG 403 byly schváleny 
v roce 1981 a od té doby byly revidovány (viz kapitola B.2 této p řílohy (1)). 
Po schválení revidované metody stanovení t řídy akutní toxicity (ATC) 
u orální toxicity (kapitola B.1  tris této přílohy) (5) se považovalo za vhodné 
vyvinout metodu ATC u inhala ční toxicity (2), (3), (4). Retrospektivní 
zhodnocení funk čnosti zkušební metody ATC pro akutní inhala ční toxicitu 
prokázalo, že je tato metoda vhodná pro použití k ú čelům klasifikace 
a označení (6). Inhala ční ATC zkušební metoda umožní použít sérii krok ů 
o fixních cílových koncentracích k získání klasifikace toxicity zkoušené 
chemické látky. Jako základní cílový parametr se používá letalita, nicmén ě 
zvířata trpící závažnou bolestí nebo strádáním, utrpením či blížícím se 
uhynutím by se m ěla humánním zp ůsobem utratit, aby se minimalizovalo 
jejich utrpení. Pokyny k humánním cílovým parametr ům jsou k dispozici 
v Pokynech OECD č. 19 (7).  
2. Pokyny k provád ění a interpretaci této zkušební metody naleznete 
v pokynech č. 39 – Guidance Document No. 39 on Acute Inhalation Toxi ­
city Testing (GD 39) (8).  
3. Definice použité v kontextu této zkušební metody naleznete v dodatku 1 a v 
GD 39 (8).  
4. Tato zkušební metoda poskytuje informace o nebezpe čných vlastnostech 
a umožňuje zařadit a klasifikovat zkoušenou chemickou látku podle 
nařízení (ES) č. 1272/2008 pro klasifikaci chemických látek, které zp ůsobují 
akutní toxicitu (9). V p řípadě, že jsou zapot řebí bodové odhady hodnot LC  50 
nebo analýzy odezvy na koncentraci, je vhodnou zkušební metodou, která 
by se měla použít, kapitola B.2 této p řílohy (1). Další pokyny k výb ěru 
zkušební metody naleznete v dokumentu GD 39 (8). Tato zkušební metoda 
není výslovn ě určena pro zkoušky speciálních materiál ů, jako jsou špatn ě 
rozpustné izometrické nebo vláknité materiály či vyráběné nanomateriály.  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
5. Před zamýšlením provést zkoušky v souladu s touto zkušební metodou by 
měla laborato ř provádějící zkoušky vzít v úvahu veškeré dostupné informace 
o zkoušené chemické látce, v četně stávajících studií, jejichž výsledky by 
podpořily neprovád ění dalších zkoušek, aby se minimalizovalo použití 
zvířat. Informace, které mohou pomoci p ři výběru nejvhodn ějších 
druhů, kmenů, pohlaví, zp ůsobu expozice a vhodných zkušebních koncen ­
trací, se týkají identity, chemické struktury a fyzikáln ě-chemických vlast ­
ností zkoušené chemické látky, výsledk ů jakýchkoli test ů toxicity  in vitro  
nebo  in vivo , předpokládaného použití a potenciální expozice u člověka, 
dostupných údaj ů (Q)SAR a toxikologických údaj ů o strukturn ě příbuzných 
chemických látkách. Koncentrace, u nichž se o čekává, že zp ůsobí intenzivní 
bolest a utrpení vzhledem k žíravým (  1 ) nebo siln ě dráždivým ú činkům, by 
se neměly touto zkušební metodou testovat [viz GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Vyhodnocení žíravosti by se m ěla zakládat na odborném posudku s použitím nap ř. těchto 
podkladů: zkušenosti u člověka a zvířat, stávající (in vitro) údaje, nap ř. kapitola B.40 
(10), B.40 bis (11) této p řílohy nebo OECD TG 435 (12), hodnoty pH, informace 
o podobných chemických látkách nebo jakékoli jiné relevantní údaje.
 PODSTATA ZKOUŠKY  
6. Podstatou zkoušky je, že se pomocí postupu provád ěného po krocích získají 
dostatečné informace o akutní inhala ční toxicit ě zkoušené chemické látky 
během 4hodinového období expozice, které umožní její klasifikaci. Pro 
specifické regula ční účely mohou být použity i jiné doby trvání expozice. 
V každém kroku s definovanou koncentrací se testují 3 zví řata od každého 
pohlaví. V závislosti na mortalit ě a/nebo stavu agónie zví řat lze o akutní 
toxicitě zkoušené chemické látky rozhodnout pr ůměrně na základ ě 2 kroků. 
Jsou-li k dispozici d ůkazy, že je jedno pohlaví citliv ější než druhé, pak je 
možné ve zkoušce pokra čovat pouze s citliv ějším pohlavím. Výsledek p řed­
chozího kroku ur čí následující krok tak, že:  
a) nebudou nutné žádné další zkoušky;  
b) provede se zkouška u t ří zvířat od každého pohlaví, nebo  
c) provede se zkouška se 6 zví řaty pouze citliv ějšího pohlaví, tj. nižší 
mezní odhady toxické t řídy by se m ěly zakládat na 6 zví řatech 
v každé skupin ě se zkoušenou koncentrací, bez ohledu na pohlaví.  
7. Umírající zví řata nebo zví řata, která zjevn ě projevují p říznaky bolesti nebo 
značného a přetrvávajícího utrpení, by se m ěla humánn ě utratit a p ři analýze 
výsledků se hodnotí jako zví řata uhynulá p ři zkoušce. Kritéria rozhodování 
o utracení umírajících nebo zna čně trpících zví řat a pokyny týkající se 
rozpoznání p ředvídatelného nebo blížícího se uhynutí jsou p ředmětem 
Pokynů č. 19 o humánních cílových parametrech (7).  
POPIS METODY  
Výběr zvířecích druh ů 
8. Měla by se použít mladá zdravá dosp ělá zvířata běžně používaných 
laboratorních kmen ů. Upřednostňovaným druhem je potkan, a pokud se 
použijí jiné druhy, m ělo by se uvést od ůvodnění. 
Příprava zví řat 
9. Samice musí být nullipary a nesmí být b řezí. V den expozice by m ělo jít 
o mladé dosp ělé jedince ve stá ří 8 až 12 týdn ů a jejich t ělesná hmotnost by 
se měla pohybovat v rozmezí ± 20 % pr ůměrné hmotnosti pro každé pohlaví 
již dříve exponovaných zví řat stejného stá ří. Zvířata jsou náhodn ě vybrána 
a označena pro pot řeby individuální identifikace. Zví řata se umístí do klecí 
nejméně 5 dnů před začátkem studie, aby si mohla zvyknout na laboratorní 
podmínky. Zví řata by se také m ěla nechat po krátkou dobu p řed zahájením 
zkoušky zvyknout na zkušební za řízení, nebo ť to sníží stres zp ůsobený 
novým prost ředím.  
Zvířecí chov  
10. Teplota zkušební místnosti, v níž se uchovávají zví řata, by m ěla být 22 
± 3 °C. Relativní vlhkost by se m ěla ideálně udržovat v rozmezí 30 až 
70 %, ačkoliv to nemusí být možné, používá-li se jako nosi č voda. Před 
expozicí a po ní by se m ěla zvířata držet v klecích rozd ělena do skupin 
podle pohlaví a koncentrace, avšak po čet zvířat v jedné kleci by nem ěl 
bránit jasnému pozorování každého zví řete a měl by minimalizovat ztráty 
v důsledku kanibalismu nebo boj ů. Jsou-li zví řata vystavena látce pouze 
nazální cestou, m ůže být nutné nechat je zvyknout si na omezující trubi čky. 
Omezující trubi čky by nem ěly zvířatům způsobovat p řílišný fyzický, 
termální nebo imobiliza ční stres. Zábrana m ůže ovlivnit fyziologické cílové 
parametry, jako je t ělesná teplota (hypertermie) a/nebo minutový dechový 
objem. Jsou-li k dispozici obecné údaje, které prokazují, že k takovým 
změnám nedochází ve zna čné míře, není p ředběžná adaptace na omezující  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
trubičky nutná. Zví řata, jež jsou vystavena aerosolu celým t ělem, by se m ěla 
držet během expozice odd ěleně, aby se zabránilo pronikání zkoušeného 
aerosolu z jejich t ěla do srsti ostatních zví řat v kleci. Mohou se používat 
konvenční a certifikovaná laboratorní krmiva, krom ě období expozice, podá ­
vaná s neomezeným množstvím pitné vody z vodovodu. Osv ětlení by m ělo 
být umělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy.  
Inhalační komory  
11. Při výběru inhalační komory by se m ěla zvážit povaha zkoušené chemické 
látky a cíl zkoušky. Up řednostňuje se expozice pouze nazální cestou (p ři­ 
čemž tento termín zahrnuje i výrazy pouze-hlava, pouze-nos, pouze- čenich). 
Expozice pouze nazální cestou se obecn ě upřednostňuje u studií kapalných 
nebo pevných aerosol ů a par, které mohou kondenzací vytvá řet aerosoly. 
Speciálních cíl ů studie lze snáze dosáhnout, použije-li se celot ělová expo ­
zice, avšak tato skute čnost by se m ěla zdůvodnit ve zpráv ě o studii. Pro 
zajištění stability atmosféry v komo ře pro celot ělovou expozici by nem ěl 
celkový objem zapln ěný pokusnými zví řaty přesáhnout 5 % objemu 
komory. Principy techniky expozice pouze nazální cestou a celot ělové expo ­
zice a jejich konkrétní výhody a nevýhody jsou popsány v dokumentu GD 
39 (8).  
PODMÍNKY EXPOZICE  
Podání koncentrací  
12. Doporu čuje se fixní doba expozice čtyři hodiny, nepo čítaje v to dobu 
potřebnou k dosažení rovnováhy. K spln ění specifických požadavk ů 
mohou být t řeba jiné délky trvání expozice, avšak m ělo by se pro n ě 
uvést zdůvodnění ve zpráv ě o studii [viz GD 39 (8)]. Zví řata vystavená 
látce v komorách pro celot ělovou expozici by se m ěla držet odd ěleně, aby 
se zabránilo poz ření zkoušené látky p ři vzájemné pé či o srst s ostatními 
zvířaty v kleci. B ěhem expozice by se m ělo pozastavit krmení zví řat. Během 
celotělové expozice je možno zví řatům podávat vodu.  
13. Zvířata jsou vystavena zkoušené chemické látce ve form ě plynu, páry, aero ­
solu nebo jejich sm ěsi. Skupenství látky, které se má zkoušet, závisí na 
fyzikálně-chemických vlastnostech zkoušené chemické látky, zvolené 
koncentraci a/nebo fyzické form ě, v níž se bude zkoušená chemická látka 
s největší pravděpodobností nacházet p ři manipulaci a používání. Hygros ­
kopické a chemicky reaktivní zkoušené chemické látky by se m ěly zkoušet 
v podmínkách suchého vzduchu. Je t řeba pečlivě zabránit vzniku exploziv ­
ních koncentrací.  
Distribuce velikosti částic  
14. U všech aerosol ů a par, které mohou kondenzací vytvo řit aerosoly, by se 
mělo provést stanovení velikosti částic. Aby byla možná expozice všech 
důležitých částí dýchací soustavy, doporu čují se aerosoly s hodnotami hmot ­
nostního mediánu aerodynamického pr ůměru (MMAD) v rozmezí 1 až 4 μm 
a s geometrickou sm ěrodatnou odchylkou ( σ g ) v rozmezí 1,5 až 3,0 (8), 
(13), (14). P řestože by se m ělo vynaložit dostate čné úsilí k spln ění této 
normy, není-li to možné, je t řeba poskytnout odborný posudek. Nap říklad 
kovové výpary mohou být menší, než je tato norma, a nabité částice, vlákna 
a hygroskopické materiály (které ve vlhkém prost ředí dýchacích cest nabý ­
vají na velikosti) mohou tuto normu p řekročit. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Příprava zkoušené chemické látky na nosi či 
15. K dosažení vhodné koncentrace a velikosti částic zkoušené chemické látky 
v ovzduší lze použít nosi č. Zpravidla by se m ěla dávat p řednost vod ě. 
Částicový materiál se m ůže zpracovat mechanickými postupy, aby se 
dosáhlo požadované distribuce velikosti částic, avšak m ělo by se zajistit, 
že nedojde k rozkladu nebo p řeměně zkoušené chemické látky. Domníváte- 
li se, že mechanické postupy zm ěnily chemické složení zkoušené látky 
(např. extrémn ě vysoká teplota v d ůsledku frikce p ři intenzivním mletí), 
mělo by se složení zkoušené chemické látky ov ěřit analyticky. Je t řeba 
dostatečně zabezpe čit, aby nedošlo ke kontaminaci zkoušené chemické 
látky. Nedrolivé zrnité materiály, které jsou zám ěrně zformulovány tak, 
aby je nebylo možno vdechnout, není t řeba zkoušet. K prokázání skute č­
nosti, že p ři manipulaci se zrnitým materiálem nevznikají vdechovatelné 
částice, by se m ěla použít zkouška ot ěru. Pokud p ři zkoušce ot ěru vzniknou 
vdechovatelné částice, měla by se provést zkouška inhala ční toxicity.  
Kontrolní zví řata 
16. Soub ěžná negativní (vystavena pouze vzduchu) kontrolní skupina není 
nutná. Používá-li se k vytvo ření zkušební atmosféry jiný nosi č než voda, 
měla by se kontrolní skupina s nosi čem použít pouze tehdy, nejsou-li 
k dispozici historické údaje o inhala ční toxicitě nosiče. Jestliže studie toxi ­
city zkoušené chemické látky formulované na nosi či neodhalí žádnou toxi ­
citu, vyplývá z toho, že nosi č je při zkoušené koncentraci netoxický 
a kontrola s nosi čem tudíž není nutná.  
MONITOROVÁNÍ PODMÍNEK EXPOZICE  
Proudění vzduchu komorou  
17. Proud ění vzduchu komorou by se m ělo pečlivě řídit, neustále sledovat 
a zaznamenávat alespo ň v hodinových intervalech p ři každé expozici. Moni ­
torování koncentrace látky ve zkušební atmosfé ře (nebo stability) je 
nedílnou sou částí měření všech dynamických parametr ů a poskytuje 
nepřímý prost ředek k řízení všech d ůležitých parametr ů generování dyna ­
mické atmosféry. V komorách ur čených k expozici pouze nazální cestou by 
se měl brát zvláštní ohled na to, aby se zamezilo op ětovnému vdechování, 
v případech, kdy proud ění vzduchu expozi čním systémem není dosta čující 
k zajištění dynamického proud ění zkušební chemické atmosféry. Existují 
předepsané metodiky, které lze použít k prokázání skute čnosti, že za vybra ­
ných provozních podmínek nedochází k op ětovnému vdechování (8), (15). 
Koncentrace kyslíku by m ěla být alespo ň 19 % a koncentrace oxidu uhli ­ 
čitého by nem ěla přesáhnout 1 %. Existuje-li d ůvod se domnívat, že tyto 
normy nelze splnit, m ěly by se koncentrace kyslíku a oxidu uhli čitého měřit. 
Teplota a relativní vlhkost v komo ře 
18. Teplota v komo ře by se m ěla udržovat na 22 ± 3 °C. Relativní vlhkost 
v zóně, kde zví řata dýchají, jak p ři expozici pouze nazální cestou, tak p ři 
celotělové expozici, by se m ěla sledovat a zaznamenat alespo ň třikrát při 
trvání expozice až 4 hodiny a každou hodinu p ři kratších expozicích. Rela ­
tivní vlhkost by se m ěla v ideálním p řípadě udržovat v rozmezí 30 až 70 %, 
to však nemusí být proveditelné (nap ř. při zkoušení sm ěsí na bázi vody) 
nebo ji nemusí být možné zm ěřit v důsledku interference zkoušené 
chemické látky se zkušební metodou.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Zkoušená chemická látka: nominální koncentrace  
19. Je-li to možné, m ěla by se vypo čítat a zaznamenat nominální koncentrace 
zkoušené chemické látky v expozi ční komoře. Nominální koncentrace je 
hmotnost generované zkoušené chemické látky vyd ělená celkovým 
objemem vzduchu procházejícím komorovým systémem. Nominální 
koncentrace se nepoužívá k charakterizaci expozice zví řat, avšak porovnání 
nominální koncentrace a skute čné koncentrace je ukazatelem výkonnosti 
zkušebního systému p ři generování zkušební atmosféry, a tudíž ji lze použít 
k odhalení problém ů při generování.  
Zkoušená chemická látka: skute čná koncentrace  
20. Skute čná koncentrace je koncentrace zkoušené chemické látky v zón ě, kde 
zvířata dýchají, v inhala ční komoře. Skutečné koncentrace lze zm ěřit speci­
fickými metodami (nap ř. přímý odběr vzorků, adsorpční metody nebo 
metody založené na chemické reakci a následná analytická charakterizace) 
nebo nespecifickými metodami, jako je vážková analýza (gravimetrie). 
Použití gravimetrie je p řípustné pouze u práškových aerosol ů obsahujících 
jedinou složku nebo u aerosol ů z kapalin s nízkou t ěkavostí a m ělo by se 
podložit p říslušnou specifickou charakterizací zkoušené chemické látky p řed 
provedením studie. Koncentraci práškového aerosolu sestávajícího z více 
složek lze rovn ěž stanovit gravimetricky. Vyžaduje to však analytické údaje, 
které prokazují, že složení materiálu ve vzduchu je podobné složení výcho ­
zího materiálu. Nejsou-li tyto informace k dispozici, m ůže být nutné 
provádět během studie v pravidelných intervalech opakovanou analýzu 
zkoušené chemické látky (ideáln ě ve vzdušné form ě). U látek 
v aerosolové form ě, které se mohou vypa řovat nebo sublimovat, by se 
mělo prokázat, že byly vybranou metodou zachyceny všechny fáze. Ve 
zprávě o studii by se m ěly uvést cílové, nominální a skute čné koncentrace, 
avšak k výpo čtu hodnot letální koncentrace ve statistických analýzách se 
použijí pouze skute čné koncentrace.  
21. Měla by se použít pokud možno jedna šarže zkoušené chemické látky 
a zkoušený vzorek by se m ěl uchovávat za podmínek, které udržují jeho 
čistotu, homogenitu a stabilitu. P řed zahájením studie by se m ěla provést 
charakterizace zkoušené chemické látky, v četně určení její čistoty a, je-li to 
technicky proveditelné, identity a množství identifikovaných kontaminují ­
cích látek a ne čistot. Je možné to prokázat mimo jiné t ěmito údaji: reten ční 
čas a relativní ší řka píku, molekulová hmotnost z hmotnostní spektroskopie 
nebo plynové chromatografie nebo jiné odhady. P řestože ur čení identity 
zkoušeného vzorku není povinností laborato ře provád ějící zkoušku, bývá 
rozumné, ov ěřit si charakterizaci látky poskytnutou zadavatelem, a sice 
alespoň omezeným zp ůsobem (nap ř. barva, fyzikální povaha atd.).  
22. Expozi ční atmosféra by se m ěla udržovat co možná nejstálejší a m ěla by se 
monitorovat bu ď nepřetržitě, nebo v pravidelných intervalech v závislosti na 
analytické metod ě. Používá-li se odb ěr vzorků v pravidelných intervalech, 
měly by se vzorky atmosféry v komo ře odebrat ve čtyřhodinové studii 
alespoň dvakrát. Není-li to v d ůsledku omezené rychlosti proud ění vzduchu 
nebo nízké koncentrace možné, m ůže se během celého období expozice 
odebrat jeden vzorek. Objeví-li se výrazné výkyvy mezi jednotlivými 
vzorky, m ěly by se u dalších zkoušených koncentrací použít čtyři vzorky 
na každou expozici. Jednotlivé vzorky k stanovení koncentrace v komo ře by 
se neměly lišit od pr ůměrné hodnoty koncentrace v komo ře o více než 
± 10 % u plyn ů a par a o více než ± 20 % u kapalných nebo pevných 
aerosolů. Měla by se vypo čítat a zaznamenat doba pot řebná k dosažení 
rovnovážného stavu v komo ře (t  95 ). Doba trvání expozice zahrnuje 
i dobu, b ěhem níž je zkoušená chemická látka generována, a ta bere 
v úvahu dobu nutnou k dosažení t  95 . Pokyny k výpo čtu t  95 naleznete 
v dokumentu GD 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. U vysoce komplexních sm ěsí složených z par/plyn ů a aerosol ů (např. atmo­
sféry obsahující produkty spalování a zkoušené chemické látky vyst řikované 
z účelových výrobk ů/zařízení pro koncové použití) se m ůže každá fáze 
chovat v inhala ční komoře odlišně, proto by se pro každou fázi (pára/plyn 
a aerosol) m ěla zvolit alespo ň jedna indika ční látka (analyt), obvykle hlavní 
účinná látka ve sm ěsi. Je-li zkoušená chemická látka sm ěsí, měla by se 
uvést analytická koncentrace celkové sm ěsi, a nikoliv pouze ú činné látky 
nebo složky (analytu). Další informace týkající se skute čných koncentrací 
naleznete v dokumentu GD 39 (8).  
Zkoušená chemická látka: distribuce velikosti částic  
24. Distribuce velikosti částic aerosol ů by se měla během čtyřhodinové expozice 
stanovit alespo ň dvakrát pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného 
přístroje, nap ř. aerodynamického spektrometru částic. Je-li možné prokázat 
shodu výsledk ů získaných pomocí kaskádového impaktoru nebo jiného 
přístroje, m ůže se tento jiný p řístroj používat v pr ůběhu celé studie. 
Kromě primárního p řístroje by se m ěl použít ješt ě druhý p řístroj, nap ř. 
gravimetrický filtr nebo impinger/plynová promýva čka, k ověření účinnosti 
záchytu primárním p řístrojem. Hmotnostní koncentrace získaná analýzou 
velikosti částic by m ěla ležet v p řiměřeném rozmezí hmotnostní koncentrace 
získané vážkovou analýzou [viz dokument GD 39 (8)]. Je-li možné v časné 
fázi studie prokázat jejich rovnocennost, lze od dalších potvrzujících m ěření 
upustit. Z d ůvodu zajišt ění dobrých životních podmínek zví řat by se m ěly 
podniknout kroky k minimalizaci nepr ůkazných údaj ů, které mohou vést 
k nutnosti opakovat expozici. U par by se m ělo provést m ěření velikosti 
částic, pokud existuje možnost, že kondenzace páry povede ke vzniku aero ­
solu nebo pokud jsou v parách detekovány částice s potenciálem pro tvorbu 
smíšených fází (viz odstavec 14).  
POSTUP  
Hlavní zkouška  
25. Pro každý krok se použijí t ři zvířata od každého pohlaví nebo šest zví řat 
citlivějšího pohlaví. Jsou-li k expozici pouze nazální cestou použity jiné 
druhy hlodavc ů než potkani, je možno upravit maximální doby trvání expo ­
zice za účelem minimalizace druhov ě specifického utrpení. Úrove ň koncent­
race, která se má použít jako po čáteční dávka, se vybere z jedné ze čtyř 
fixních úrovní, p řičemž by po čáteční úroveň koncentrace m ěla být ta, jež 
u některých z exponovaných zví řat nejpravd ěpodobněji způsobí toxicitu. 
Schémata zkoušek pro plyny, páry a aerosoly (zahrnutá v dodatcích 2–4) 
představují zkoušky s mezními hodnotami pro kategorie 1–4 dle na řízení 
CLP (9) pro plyny (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (dodatek 2), pro páry (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (dodatek 3) a pro aerosoly (0,05, 0,5, 1,5 mg/l/4 h) 
(dodatek 4). Kategorie 5, která není v na řízení (ES) č. 1272/2008 zavedena 
(9), se týká koncentrací p řesahujících p říslušné mezní koncentrace. Pro 
každou po čáteční koncentraci se používá p říslušné schéma zkoušky. Postup 
zkoušení se řídí nazna čenými šipkami v závislosti na po čtu humánn ě utra­
cených nebo uhynulých zví řat, dokud není možné provést kategorizaci.
 
26. Časový interval mezi exponovanými skupinami závisí na dob ě nástupu, 
trvání a závažnosti p říznaků toxicity. S expozicí zví řat další úrovni koncent ­
race by se m ělo vyčkat, dokud není dostate čná jistota, že d říve zkoušená 
zvířata přežila. Mezi jednotlivými expozicemi na každé úrovni koncentrace 
se doporu čuje ponechat dobu t ří nebo čtyř dnů, aby bylo umožn ěno pozo­
rování zpožd ěné toxicity. Časový interval lze podle pot řeby upravit, nap ř. 
v případě neprůkazné odezvy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Limitní zkouška  
27. Limitní zkouška se používá v p řípadě, že je o zkoušené chemické látce 
známo nebo se o ní p ředpokládá, že je prakticky netoxická, tj. vyvolává 
toxickou reakci pouze p ři koncentraci vyšší, než je regula ční mezní koncent ­
race. Informace o toxicit ě zkoušené chemické látky lze získat ze znalostí 
o podobných zkoušených látkách či podobných sm ěsích, vezme-li se 
v úvahu identita a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo v ůbec žádné 
informace o toxicit ě nebo kdy se o čekává, že zkoušená chemická látka bude 
toxická, by se m ěla provést hlavní zkouška [další pokyny naleznete 
v dokumentu GD 39 (8)].
 
28. Při použití obvyklého postupu se t ři zvířata od každého pohlaví nebo šest 
zvířat citlivějšího pohlaví vystaví koncentracím 20 000 ppm u plyn ů, 20 
mg/l u par a 5 mg/l u prach ů/mlh (jsou-li dosažitelné), což slouží jako 
limitní zkouška pro tuto zkušební metodu. P ři zkoušení aerosol ů by mělo 
být primárním cílem dosažení vdechovatelné velikosti částic (tj . MMAD = 
1–4 μm). U většiny zkoušených chemických látek toho lze dosáhnout p ři 
koncentraci 2 mg/l. Zkoušení aerosol ů při koncentracích v ětších než 2 mg/l 
by se mělo provád ět pouze tehdy, lze-li dosáhnout vdechovatelné velikosti 
částic [viz dokument GD 39 (8)]. V souladu s GHS (16) se nedoporu čuje 
provádět zkoušky p ři koncentracích p řesahujících mezní koncentraci 
z důvodu zajišt ění dobrých životních podmínek zví řat. O zkoušce v GHS 
kategorii 5 (16), která není zavedena v na řízení (ES) č. 1272/2008 (9), by se 
mělo uvažovat pouze v p řípadě, existuje-li velká pravd ěpodobnost, že 
výsledky takové zkoušky budou mít p římý význam pro ochranu lidského 
zdraví, a ve zpráv ě ze studie se uvede zd ůvodnění. V případě potenciáln ě 
výbušných zkoušených chemických látek je t řeba se pe člivě vyvarovat 
podmínek p říznivých pro explozi. Aby se zamezilo zbyte čnému použití 
zvířat, měla by se p řed limitní zkouškou provést jedna zkouška bez zví řat, 
aby se zajistilo, že lze v komo ře dosáhnout podmínek pro limitní zkoušku.  
POZOROVÁNÍ  
29. Během období expozice by se m ěla zvířata často klinicky sledovat. Po 
expozici by se m ěla v den expozice provést klinická pozorování alespo ň 
dvakrát nebo častěji, pokud to nazna čuje odezva zví řat na expozici a poté 
alespoň jednou denn ě po dobu celkem 14 dní. Délka období sledování není 
fixní, nýbrž by se m ěla určit na základ ě povahy a doby nástupu klinických 
příznaků a délky období zotavení. Doba, kdy se p říznaky toxicity objeví 
a vymizí, je d ůležitá zejména v p řípadě tendence ke zpožd ěným příznakům 
toxicity. Všechna sledování se systematicky zaznamenávají, p řičemž 
záznamy se vedou zvláš ť pro každé zví ře. Umírající zví řata a zví řata se 
známkami prudkých bolestí nebo s p řetrvávajícími p říznaky zna čného 
utrpení by se m ěla humánn ě utratit z d ůvodu zajišt ění dobrých životních 
podmínek zví řat. Při vyšetřování klinických p říznaků toxicity je t řeba dbát 
na to, aby se po čáteční špatný stav a p řechodné respira ční změny v důsledku 
postupu expozice neinterpretovaly myln ě jako účinky spojené se zkoušenou 
chemickou látkou. M ěly by se vzít v úvahu principy a kritéria shrnuté 
v dokumentu o humánních parametrech (7). Pokud jsou zví řata 
z humánních d ůvodů utracena nebo je zjišt ěn jejich úhyn, je nutné dobu 
uhynutí zaznamenat co nejp řesněji. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Pozorování v kleci se soust řeďují na zm ěny na kůži, na srsti, na o čích, na 
sliznicích a rovn ěž změny dýchání, krevního ob ěhu, změny funkce auto ­
nomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Je-li to možné, m ěly by se zaznamenat jakékoli rozdíly mezi místními 
a systémovými ú činky. Pozornost je t řeba věnovat pozorování tremoru, 
křečí, slinění, průjmu, letargie, spánku a kómatu. M ěření rektální teploty 
může poskytnout podp ůrné důkazy pro reflexní bradypnoe nebo hypo/hy ­
pertermii spojenou s expozicí nebo držením v kleci.
 
Tělesné hmotnosti  
31. Hmotnosti jednotlivých zví řat by se m ěly zaznamenat jednou b ěhem období 
aklimatizace, v den expozice p řed expozicí (den 0) a minimáln ě 1., 3. a 7. 
den (a poté jednou týdn ě) a v dob ě uhynutí nebo utracení, pokud k n ěmu 
dojde po dni 1. T ělesná hmotnost je uznávaná jako zásadní ukazatel toxicity 
a zvířata vykazující p řetrvávající úbytek hmotnosti ≥ 20 % v porovnání 
s hodnotami p řed studií by se m ěla pečlivě sledovat. Na konci období po 
expozici se zví řata, která p řežila, zváží a humánn ě utratí.  
Patologie  
32. Všechna pokusná zví řata, včetně těch, která v pr ůběhu zkoušky uhynula 
nebo byla utracena z d ůvodu zajišt ění dobrého zacházení se zví řaty, by se 
měla podrobit pitv ě. Není-li možno pitvu provést ihned po objevení uhynu ­
lého zvířete, mělo by se zví ře uchovávat v chladicím boxu (nikoli zmrazené) 
při teplotách dostate čně nízkých k minimalizaci autolýzy. Pitvy by se m ěly 
provést co možná nejd říve, obvykle b ěhem jednoho nebo dvou dn ů. 
U každého zví řete by se m ěly zaznamenat všechny makroskopické patolo ­
gické nálezy, p řičemž se v ěnuje zvláštní pozornost jakýmkoli nález ům 
v dýchacích cestách.  
33. Další vyšet ření zahrnutá  a priori  v návrhu lze zvážit za ú čelem rozší ření 
interpreta ční hodnoty studie, nap ř. měření hmotnosti plic p řeživších potkan ů 
a/nebo poskytnutí d ůkazů o podrážd ění pomocí mikroskopického vyšet ření 
dýchacích cest. Mezi vyšet řované orgány mohou pat řit ty, které vykazují 
makroskopické patologické známky u zví řat přežívajících po 24 či více 
hodin a orgány, o nichž je známo nebo se o čekává, že budou postiženy. 
Mikroskopické vyšet ření celých dýchacích cest m ůže poskytnout užite čné 
informace u zkoušených chemických látek, které reagují s vodou, nap říklad 
u kyselin a hygroskopických zkoušených materiál ů. 
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Údaje  
34. Měly by se uvést údaje o t ělesné hmotnosti a pitevních nálezech pro každé 
jednotlivé zví ře. Údaje z klinického sledování by se m ěly shrnout do 
tabulky, p řičemž se u každé zkušební skupiny uvede po čet použitých zví řat, 
počet zvířat vykazujících p říznaky toxicity, po čet zvířat uhynulých 
v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních d ůvodů, doba uhynutí 
jednotlivých zví řat, popis, časový pr ůběh a vratnost toxických ú činků 
a pitevní nálezy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Protokol o zkoušce  
35. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat následující informace:  
Pokusná zví řata a podmínky chovu  
— popis podmínek v klecích uvád ějící: počet (nebo zm ěnu počtu) zvířat 
v každé kleci, materiál podestýlky, teplotu a relativní vlhkost prost ředí, 
světelné období a druh stravy,  
— použitý druh/kmen a od ůvodnění použití jiného druhu než potkana,  
— počet, věk, a pohlaví zví řat, 
— metoda randomizace,  
— podrobnosti o jakosti vody a krmiva (v četně druhu/zdroje stravy, zdroje 
vody),  
— popis jakékoliv p řípravy před zkouškou v četně stravy, karantény a lé čby 
onemocnění. 
Zkoušená chemická látka  
— fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikáln ě-chemické 
vlastnosti (v četně izomerizace),  
— identifika ční údaje a číslo v registru Chemical Abstract Services (CAS), 
je-li známo.  
Nosič 
— zdůvodnění použití nosi če a zdůvodnění výběru nosiče (pokud se nepou ­ 
žije voda),  
— historické nebo sou časné údaje prokazující, že nosi č neovliv ňuje 
výsledek studie.  
Inhalační komora  
— popis inhala ční komory v četně jejích rozm ěrů a objemu,  
— zdroj a popis za řízení použitého pro expozici zví řat a rovn ěž pro gene ­
rování atmosféry,  
— zařízení pro m ěření teploty, vlhkosti, velikosti částic a skute čné koncent ­
race,  
— zdroj vzduchu, úprava dodávaného/odsávaného vzduchu a systém 
použitý pro klimatizaci,  
— metody použité ke kalibraci za řízení k zajišt ění homogenní zkušební 
atmosféry,  
— rozdíl tlak ů (kladný nebo záporný),  
— počet expozi čních otvor ů v každé komo ře (nazální expozice), umíst ění 
zvířat v systému (celot ělová expozice),  
— homogenita/stabilita zkušební atmosféry v čase, 
— umístění teplotních čidel a čidel vlhkosti a odb ěr vzorků zkušební atmo ­
sféry v komo ře, 
— průtokové rychlosti vzduchu, pr ůtoková rychlost vzduchu/expozi ční 
otvor (nazální expozice) nebo množství zví řat/komora (celot ělová expo ­
zice),  
— informace o za řízení použitém k m ěření kyslíku a oxidu uhli čitého, 
používá-li se,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— doba nutná k dosažení rovnovážného stavu v inhala ční komoře (t  95 ), 
— počet změn objemu za hodinu,  
— měřicí přístroje (používají-li se).  
Údaje o expozici  
— zdůvodnění výběru cílové koncentrace v hlavní studii,  
— nominální koncentrace (celková hmotnost zkoušené chemické látky 
generované do inhala ční komory vyd ělená objemem vzduchu prošlým 
komorou),  
— skutečné koncentrace zkoušené chemické látky nam ěřené v dýchací zón ě 
zvířat. U zkoušených sm ěsí, které vytvá řejí heterogenní fyzikální formy 
(plyny, páry, aerosoly), je možné analyzovat každou zvláš ť, 
— veškeré koncentrace látky ve vzduchu by se m ěly uvádět v hmotnostních 
jednotkách (nap ř. mg/l, mg/m  3 , atd.), v závorce lze uvést také hodnotu 
v objemových jednotkách (nap ř. ppm, ppb),  
— distribuce velikosti částic, hmotnostní medián aerodynamického 
průměru (MMAD) a geometrická sm ěrodatná odchylka ( σ g ), včetně 
metod jejich výpo čtu. Měly by se uvést jednotlivé analýzy velikosti 
částic.  
Zkušební podmínky  
— podrobné údaje o p řípravě zkoušené chemické látky v četně postupů 
použitých k snížení velikosti částic pevných látek nebo k p řípravě 
roztoků zkoušené chemické látky. V p řípadě, kdy mohly mechanické 
postupy zm ěnit chemické složení zkoušené látky, uve ďte také výsledky 
analýz ov ěřujících složení zkoušené chemické látky,  
— popis (pokud možno obsahující nákres) za řízení použitého ke generování 
zkušební atmosféry k expozici zví řat zkušební atmosfé ře, 
— podrobné údaje o použité chemické analytické metod ě a validaci metody 
(včetně účinnosti výt ěžnosti zkoušené chemické látky ze vzorkovaného 
média),  
— zdůvodnění výběru zkoušených koncentrací.  
Výsledky  
— tabulka s údaji o teplot ě, vlhkosti a pr ůtoku vzduchu v komo ře, 
— tabulka s údaji o nominální a skute čné koncentraci v komo ře, 
— tabulka s údaji o velikosti částic včetně údajů o odběru analytických 
vzorků, distribuce velikosti částic a výpo čtů MMAD a σ g , 
— tabulka s údaji o reakci a úrovni koncentrace u každého zví řete (tj. 
zvířata vykazující p říznaky toxicity, v četně mortality, charakteru, závaž ­
nosti a trvání ú činků), 
— hmotnosti jednotlivých zví řat naměřené ve dnech studie, datum a čas 
uhynutí, pokud k n ěmu došlo p řed plánovaným utracením, časový 
průběh nástupu p říznaků toxicity a zda byly vratné u každého ze zví řat, ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— pitevní a histopatologické nálezy pro každé zví ře, pokud jsou 
k dispozici,  
— klasifika ční kategorie dle na řízení CLP a mezní hodnota LC  50 . 
Diskuse a interpretace výsledk ů 
— měl by se klást zvláštní d ůraz na popis metod použitých ke spln ění 
kritérií této zkušební metody, nap ř. mezní koncentrace nebo velikost 
částic,  
— je třeba zabývat se vdechovatelností částic s ohledem na celkové nálezy, 
zejména pokud nebylo možno splnit kritéria pro velikost částic,  
— v celkovém hodnocení studie by se m ěla uvést konzistentnost metod 
použitých k stanovení nominálních a skute čných koncentrací a vztah 
mezi aktuální a skute čnou koncentrací,  
— měla by se uvést pravd ěpodobná p říčina úhynu a p řevládající mecha ­
nismus účinku (systémový nebo místní),  
— mělo by se uvést vysv ětlení, pokud bylo nutno humánn ě utratit zví řata 
trpící bolestí nebo vykazující známky intenzivního a p řetrvávajícího 
utrpení, na základ ě kritérií uvedených v dokumentu OECD 
o humánních parametrech (7).  
LITERATURA:  
1) Kapitola B.2 této p řílohy, Akutní toxicita (inhala ční). 
2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. Toxi ­
col. 77: 243-254.  
3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537-549.  
4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129-134.  
5) Kapitola B.1 tris této p řílohy, Akutní orální toxicita - metoda stanovení t řídy 
akutní toxicity.  
6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation 
Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing 
and Assessment No. 105, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/ env/testguidelines]
 
7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]
 
8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testgu ­
idelines]  
9) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 
16. prosince 2008 o klasifikaci, ozna čování a balení látek a sm ěsí, 
o změně a zrušení sm ěrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zm ěně 
nařízení (ES) č. 1907/2006, Ú ř. věst. L 353, 31.12.2008, s. 1.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
10) Kapitola B.40 této p řílohy, Leptavé ú činky na k ůži in vitro: Zkouška trans ­
kutánního elektrického odporu (TER).  
11) Kapitola B.40 bis této p řílohy, Leptavé ú činky na k ůži in vitro: Zkouška 
pomocí modelu lidské k ůže. 
12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Dostupné na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of 
Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321-327.  
15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160- 167
 
16) UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Dostupné na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ 
ghs_welcome_e.html]
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Zkoušená chemická látka:  Jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Dodatek 2  
Postup, který je nutno dodržet u každé z výchozích koncentrací u plyn ů 
(ppm/4h)  
Obecné poznámky (  1 ) 
Systém zkoušení u každé výchozí koncentrace obsažený v této p říloze nasti ňuje 
postup, který je t řeba sledovat.  
Dodatek 2a:  Výchozí koncentrace je 100 ppm  
Dodatek 2b:  Výchozí koncentrace je 500 ppm  
Dodatek 2c:  Výchozí koncentrace je 2 500 ppm  
Dodatek 2d:  Výchozí koncentrace je 20 000 ppm  
Postup zkoušení se řídí nazna čenými šipkami v závislosti na po čtu humánn ě 
utracených nebo uhynulých zví řat. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) V následujících tabulkách je uveden odkaz na GHS (globáln ě harmonizovaný systém 
klasifikace a ozna čování chemických látek). V EU mu odpovídá na řízení (ES) 
č. 1272/2008. V p řípadě akutní inhala ční toxicity na řízení (ES) č. 1272/2008 (9) neza ­
vádí kategorii 5.
 Dodatek 2a  
Testy akutní toxicity:  
Zkušební postupy s výchozí koncentrací plyn ů 100 ppm/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Dodatek 2b  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí koncentrací plyn ů 500 ppm/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Dodatek 2c  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí koncentrací plyn ů 2 500 ppm/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Dodatek 2d  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí koncentrací plyn ů 20 000 ppm/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Dodatek 3  
Postup, který je nutno dodržet u každé z výchozích koncentrací u par 
(mg/1/4h)  
Obecné poznámky (  1 ) 
Systém zkoušení u každé výchozí koncentrace obsažený v této p říloze nasti ňuje 
postup, který je t řeba sledovat.  
Dodatek 3a: Výchozí koncentrace je 0,5 mg/l  
Dodatek 3b: Výchozí koncentrace je 2,0 mg/l  
Dodatek 3c: Výchozí koncentrace je 10 mg/l  
Dodatek 3d: Výchozí koncentrace je 20 mg/l  
Postup zkoušení se řídí nazna čenými šipkami v závislosti na po čtu humánn ě 
utracených nebo uhynulých zví řat. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) V následujících tabulkách je uveden odkaz na GHS (globáln ě harmonizovaný systém 
klasifikace a ozna čování chemických látek). V EU mu odpovídá na řízení (ES) 
č. 1272/2008. V p řípadě akutní inhala ční toxicity na řízení (ES) č. 1272/2008 (9) neza ­
vádí kategorii 5.
 Dodatek 3a  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí koncentrací par 0,5 mg/l/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Dodatek 3b  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí koncentrací par 2 mg/l/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Dodatek 3c  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí koncentrací par 10 mg/L/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Dodatek 3d  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušebnní postup s výchozí koncentrací par 20 mg/l/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Dodatek 4  
Postup, který je nutno dodržet u každé z výchozích koncentrací 
u aerosol ů (mg/1/4h)  
Obecné poznámky (  1 ) 
Systém zkoušení u každé výchozí koncentrace obsažený v této p říloze nasti ňuje 
postup, který je t řeba sledovat.  
Dodatek 4a: Výchozí koncentrace je 0,05 mg/l  
Dodatek 4b: Výchozí koncentrace je 0,5 mg/l  
Dodatek 4c: Výchozí koncentrace je 1 mg/l  
Dodatek 4d: Výchozí koncentrace je 5 mg/l  
Postup zkoušení se řídí nazna čenými šipkami v závislosti na po čtu humánn ě 
utracených nebo uhynulých zví řat. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) V následujících tabulkách je uveden odkaz na GHS (globáln ě harmonizovaný systém 
klasifikace a ozna čování chemických látek). V EU mu odpovídá na řízení (ES) 
č. 1272/2008. V p řípadě akutní inhala ční toxicity na řízení (ES) č. 1272/2008 (9) neza ­
vádí kategorii 5.
 Dodatek 4a  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí koncentrací par 0,05 mg/L/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Dodatek 4b  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí konkcentrací aerosol ů 0,5 mg/l/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Dodatek 4c  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí konkcentrací aerosol ů 1 mg/l/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Dodatek 4d  
Akutní inhala ční toxicita:  
Zkušební postup s výchozí koncentrací aerosol ů 5 mg/l/4h
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  STUDIE VÝVOJOVÉ NEUROTOXICITY  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 426 
(2007). Pracovní skupina OECD pro reproduk ční a vývojovou toxicitu na 
svém zasedání v červnu 1995 v Kodani jednala o pot řebě aktualizovat 
stávající pokyny OECD pro zkoušení reproduk ční a vývojové toxicity 
a vypracovat nové pokyny pro ú činky, pro které pokyny ješt ě neexistují 
(1). Pracovní skupina doporu čila, aby pokyn pro zkoušení vývojové 
neurotoxicity byl vypracován na základ ě pokynu Ú řadu pro ochranu život ­
ního prost ředí USA (US EPA), který byl pozd ěji revidován (2). V červnu 
1996 se v Kodani konala druhá konzulta ční schůzka, která poskytla sekre ­
tariátu doporu čení k nástinu nového pokynu pro zkoušení vývojové 
neurotoxicity, v četně jejich hlavních prvk ů, např. podrobností týkajících 
se volby druhu zví řat, období podávání dávek, doby zkoušky, výsledných 
parametrů, které mají být posuzovány, a kritérií pro hodnocení výsledk ů. 
V roce 1998 byl zve řejněn pokyn USA pro posuzování rizik neurotoxicity 
(3). V říjnu 2000 se konala konzulta ční schůzka odborník ů OECD, na 
kterou bezprost ředně navázal seminá ř vědeckého ústavu pro výzkum rizik 
ILSI, a v roce 2005 se uskute čnila konzulta ční schůzka odborník ů v Tokiu. 
Cílem těchto zasedání bylo projednat v ědecké a technické otázky související 
se stávajícím pokynem pro zkoušení a doporu čení, jež z t ěchto zasedání 
vzešla (4)(5)(6)(7), byla zvážena p ři vývoji této zkušební metody. Další 
informace týkající se provád ění, interpretace a použité terminologie této 
zkušební metody lze najít v Pokynu OECD č. 43 „Zkoušení 
a posuzování reproduk ční toxicity“ (8) a Pokynu OECD č. 20 „Zkoušení 
neurotoxicity“ (9).  
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
2. Je známo, že n ěkteré chemické látky mají vývojové neurotoxické ú činky na 
člověka a další druhy (10)(11)(12)(13). Aby bylo možno posoudit 
a zhodnotit toxické vlastnosti ur čité chemické látky, m ůže být nutné stano ­
vit, jaká je její schopnost vývojové neurotoxicity. Studie vývojové neuroto ­
xicity jsou koncipovány s cílem poskytnout údaje, v četně charakterizace 
vztahu dávka-odpov ěď, o možných funk čních a morfologických ú čincích 
na vývoj nervové soustavy potomstva, jež mohou vzniknout v d ůsledku 
expozice  in utero  a v časném postnatálním období života.  
3. Studii vývojové neurotoxicity lze provád ět jako samostatnou studii, za členit 
ji do studie reproduk ční toxicity a/nebo neurotoxicity dosp ělých zvířat 
(např. zkušební metody B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) nebo ji p řipojit 
ke studii prenatální vývojové toxicity (nap ř. zkušební metoda B.31 (17)). 
Je-li studie vývojové neurotoxicity za členěna do jiné studie nebo p řipojena 
k jiné studii, musí být bezpodmíne čně zachována integrita obou typ ů studií. 
Všechny zkoušky musí spl ňovat platné právní p ředpisy nebo státní 
a institucionální pokyny pro používání laboratorních zví řat ve výzkumu 
(např. (18)).  
4. Zkušební laborato ř by před provedením studie m ěla vzít v úvahu veškeré 
dostupné informace o zkoušené chemické látce. Sou částí těchto informací je 
totožnost a struktura chemické látky, její fyzické a chemické vlastnosti, 
výsledky jiných zkoušek toxicity dané chemické látky  in vitro  nebo  in 
vivo, toxikologické údaje o strukturn ě příbuzných chemických látkách 
a očekávané použití chemické látky. Tyto informace jsou nezbytné 
k tomu, aby byli všichni zainteresovaní p řesvědčeni, že zkouška má význam 
pro ochranu lidského zdraví a pom ůže při výběru vhodné výchozí dávky.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
PODSTATA ZKOUŠKY  
5. Zkoušená chemická látka se podává zví řatům v dob ě březosti a laktace. 
Jsou testovány matky za ú čelem posouzení ú činků na březí a kojící samice 
a zkouška m ůže také poskytnout informace pro srovnání (mezi matkou 
a potomstvem). Z vrh ů se náhodn ě vybere potomstvo pro hodnocení 
neurotoxicity. Hodnocení se skládá z pozorování za ú čelem zjišt ění 
závažných neurologických abnormalit a abnormalit v chování, v četně 
posouzení fyzického vývoje, behaviorální ontogeneze, motorické aktivity, motorických a smyslových funkcí a u čení a pam ěti; a hodnocení hmotností 
mozku a neuropatologie b ěhem postnatálního vývoje a v dosp ělosti.
 
6. Pokud se zkušební metoda provádí jako samostatná studie, lze další 
dostupná zví řata z každé skupiny použít pro specifická neurobehaviorální, 
neuropatologická, neurochemická nebo elektrofyziologická vyšet ření, která 
mohou doplnit údaje získané z vyšet ření doporu čených touto zkušební 
metodou (16)(19)(20)(21). Tyto dopl ňující postupy mohou být zvlášt ě 
užitečné tehdy, pokud empirické pozorování, o čekávané ú činky nebo 
mechanismus ú činku ukazují na specifický typ neurotoxicity. Tyto dopl ňu­
jící postupy lze použít na matkách i na mlá ďatech. Krom ě toho lze použít 
také postup ů ex vivo  nebo  in vitro , pokud tyto zkoušky nezm ění integritu 
postupů in vivo . 
PŘÍPRAVA NA ZKOUŠKU  
Výběr druhu zví řat 
7. Upřednostňovaným zkušebním druhem je potkan; p řípadně lze použít i jiné 
druhy. Je však t řeba mít na pam ěti, že období b řezosti a období postnatál ­
ního vývoje stanovené v této zkušební metod ě jsou specifické pro b ěžně 
užívané kmeny potkan ů, a pokud jsou použity jiné druhy nebo 
neobvyklé kmeny, m ěla by být zvolena srovnatelná období. Použití jiných 
druhů by mělo být zd ůvodněno na základ ě toxikologických, farmakokine ­
tických a/nebo jiných údaj ů. Zdůvodnění by m ělo obsahovat dostupné 
postnatální neurobehaviorální a neuropatologické hodnocení specifické pro daný druh. Jestliže existuje d řívější zkouška, která vyvolala pozornost, m ělo 
by být zváženo, na kterém druhu/kmenu byla provedena. Vzhledem 
k různým reakcím jednotlivých kmen ů potkanů by měly existovat d ůkazy 
o tom, že kmen zvolený k použití má p řiměřenou plodnost a citlivost. 
Spolehlivost a citlivost jiných druh ů pro účely zjišťování vývojové neuroto ­
xicity by m ěly být zdokumentovány.
 
Podmínky chovu a krmení  
8. Teplota v místnosti pro pokusná zví řata by m ěla být 22 °C (± 3 °C). 
Relativní vlhkost by m ěla být nejmén ě 30 % a pokud možno nep řesáhnout 
70 %, krom ě doby úklidu místností; avšak cílem by m ěla být hodnota 
50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé a mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla 
a 12 hodin tmy. P řed pářením a po dobu trvání studie lze rovn ěž světelný 
cyklus obrátit, aby bylo možné posoudit sledované funk ční a behaviorální 
vlastnosti za tmy (pod červeným sv ětlem), tj. v dob ě, kdy jsou zví řata za 
běžných podmínek aktivní (22). Veškeré zm ěny v rytmu sv ětla a tmy by 
měly zahrnovat p řiměřenou dobu na aklimatizaci, aby se zví řatům umožnilo 
přizpůsobit se novému rytmu. Ke krmení lze použít konven ční laboratorní 
stravu s neomezenou dodávkou pitné vody. Druhy krmiva a vody by m ěly 
být zaznamenány a m ěly by být analyzovány na p řítomnost kontaminujících 
látek.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Zvířata lze chovat jednotliv ě nebo je umístit do klecí v malých skupinkách 
zvířat stejného pohlaví. Pá ření by m ělo probíhat v klecích, které jsou 
k tomuto ú čelu vhodné. Po spá ření nebo nejpozd ěji v 15. den b řezosti by 
oplodněné samice m ěly být umíst ěny individuáln ě do klecí ur čených k vrhu 
nebo chovu mlá ďat. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby byl vliv umís ­
tění klecí minimalizován. S blížící se dobou vrhu by oplodn ěným samicím 
měl být poskytnut odpovídající a p řesně stanovený materiál pro tvorbu 
hnízda. Je známo, že nevhodné zacházení nebo stres v dob ě březosti 
může vést k nep říznivým následk ům, včetně prenatální ztráty 
a změněného vývoje plodu a postnatálního vývoje. S cílem zabránit 
prenatálním ztrátám z d ůvodů, které nesouvisí s expozicí, by se m ělo se 
zvířaty během březosti zacházet opatrn ě a zamezit stresu zp ůsobenému 
zevními faktory, jako je nap ř. nadměrný vnější hluk.  
Příprava zví řat 
10. Použijí se zdravá zví řata, která se aklimatizovala na laboratorní podmínky 
a která nebyla podrobena p ředcházejícím zkušebním postup ům, pokud není 
studie začleněna do jiné studie (viz odstavec 3). Pokusná zví řata by m ěla 
být charakterizována podle druhu, kmenu, p ůvodu, pohlaví, hmotnosti 
a stáří. Každému zví řeti by m ělo být p řiděleno jedine čné identifika ční 
číslo a zví ře by jím m ělo být ozna čeno. Je-li to možné, m ěla by mít zví řata 
ze všech zkušebních skupin stejnou hmotnost a v ěk a měla by být v rámci 
normálního rozp ětí zkoumaného druhu a kmene. Pro každou úrove ň dávek 
se použijí mladé dosp ělé samice, které musí být nulipary. Je t řeba dbát na 
to, aby nedocházelo k pá ření sourozenc ů. Nultým dnem gestace je den, kdy 
je zpozorována vaginální zátka a/nebo sperma. Jsou-li od dodavatele naku ­
pována stejn ě dlouho b řezí zvířata, měla by jim být poskytnuta p řiměřená 
doba (nap ř. 2–3 dny) na aklimatizaci. Oplodn ěné samice se náhodným 
výběrem přidělí do kontrolních a experimentálních skupin a m ěly by být 
do skupin rozd ěleny pokud možno rovnom ěrně (pro zajišt ění rovnom ěrného 
rozdělení do všech skupin se doporu čuje např. postup stratifikovaného 
náhodného výb ěru, jako je postup založený na t ělesné hmotnosti). Samice 
oplodněné stejným samcem by m ěly být rovnom ěrně rozděleny do všech 
skupin.  
POSTUP  
Počet a pohlaví zví řat 
11. V každé zkušební a kontrolní skupin ě by měl být dostate čný počet březích 
samic, které budou exponovány zkoušené chemické látce, aby se zajistilo, 
že se narodí dostate čný počet potomk ů pro hodnocení neurotoxicity. Pro 
každou úrove ň dávky se doporu čuje použít celkem 20 vrh ů. Jsou povoleny 
režimy s opakovaným a stup ňovitým podáváním, pokud je dosažen celkový 
počet vrhů v každé skupin ě a pokud jsou použity vhodné statistické metody 
zohledňující opakování.  
12. Ve 4. postnatální den nebo d říve (postnatální den 0 je den vrhu) musí být 
velikost každého vrhu upravena odstran ěním nadbyte čných mlá ďat, aby 
byla dosažena stejná velikost všech vrh ů (3). Velikost vrhu by nem ěla 
přesahovat pr ůměrnou velikost vrhu u použitého kmene hlodavc ů (8–12 
mláďat). Ve vrhu by m ěl být pokud možno stejný po čet mladých samc ů 
a samic. Selektivní odstra ňování mlá ďat, např. na základ ě tělesné hmotnosti, 
není vhodné. Po standardizaci velikosti vrh ů (utracení) a p řed dalším zkou ­ 
šením sledovaných funk čních ukazatel ů by jednotlivá mlá ďata, která jsou 
určena pro zkoušky p řed odstavením a po odstavení, m ěla být jednozna čně 
identifikována pomocí jakékoli vhodné humánní metody pro identifikaci 
mláďat (např. (24)).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Přiřazení zví řat pro funk ční a behaviorální zkoušky, hmotnost mozk ů 
a neuropatologická hodnocení  
13. Tato zkušební metoda umož ňuje různé způsoby přiřazení zvířat exponova ­
ných  in utero  a prostřednictvím laktace pro funk ční a behaviorální zkoušky, 
určení pohlavní zralosti, stanovení váhy mozku a neuropatologické hodno ­
cení (25). V jednotlivých p řípadech lze p řidat i jiné zkoušky neurobehavi ­
orálních funkcí (nap ř. sociálního chování), neurochemie nebo neuropatolo ­
gie, pokud nebude ohrožena integrita p ůvodně požadovaných zkoušek.  
14. Z každé exponované skupiny se ve 4. postnatální den nebo pozd ěji vyberou 
mláďata a přiřadí se pro posouzení sledovaných vlastností. Výb ěr mláďat by 
měl být provád ěn tak, aby p ři všech zkouškách byla v každé exponované 
skupině v největším možném rozsahu rovnom ěrně zastoupena ob ě pohlaví 
z každého vrhu. Pro zkoušky motorické aktivity by m ěla být použita stejná 
dvojice mlá ďat samec-samice v každém zkoumaném v ěku před odstavením 
(viz odstavec 35). Pro všechny ostatní zkoušky lze pro r ůzné behaviorální 
zkoušky použít tytéž páry mlá ďat nebo páry r ůzné pro každou zkoušku. Pro 
zkoušky poznávacích funkcí odstavených mlá ďat v porovnání s dosp ělými 
zvířaty bude možná nutné p řiřadit odlišná mlá ďata, aby se zamezilo zkres ­
lujícím ú činkům věku a předchozího návyku na tato m ěření (26)(27). P ři 
odstavení (21. postnatální den) lze mlá ďata, která nebyla vybrána ke zkou ­ 
škám, humánn ě usmrtit. Veškeré zm ěny v přiřazení mlá ďat musí být zazna ­
menány. Statistickou jednotkou pro vyhodnocování výsledk ů by měl být 
vrh (nebo samice), a nikoli mlád ě. 
15. Existují r ůzné způsoby přiřazování mlá ďat k vyšet řením před odstavením 
a po odstavení, zkouškám poznávacích schopností, patologickým 
vyšetřením atd. (o obecném konceptu viz obrázek 1 a p říklady přiřazení 
viz dodatek 1). Doporu čené minimální po čty zvířat v každé exponované 
skupině pro vyšet ření před odstavením a po odstavení jsou tyto: 
Klinická pozorování a t ělesná hmotnost Všechna zví řata 
Podrobná klinická pozorování 20 od každého pohlaví (1 od 
každého pohlaví a vrhu) 
Hmotnost mozku (po fixaci) 11.–22. 
postnatální den 10 od každého pohlaví 
(1 z každého vrhu) 
Hmotnost mozku (nefixovaného) ~ 70. 
postnatální den 10 od každého pohlaví 
(1 z každého vrhu) 
Neuropatologie (fixace pono řením do 
fixačního roztoku nebo perfuzí) 
11.–22. postnatální den 10 od každého pohlaví 
(1 z každého vrhu) 
Neuropatologie (fixace perfuzí) ~ 70. 
postnatální den 10 od každého pohlaví 
(1 z každého vrhu) 
Pohlavní zralost 20 od každého pohlaví (1 od 
každého pohlaví a vrhu) 
Jiné vývojové znaky (není povinné) Všechna zví řata 
Behaviorální ontogeneze 20 od každého pohlaví (1 od 
každého pohlaví a vrhu) 
Motorická aktivita 20 od každého pohlaví (1 od 
každého pohlaví a vrhu) 
Motorické a smyslové funkce 20 od každého pohlaví (1 od 
každého pohlaví a vrhu) 
Učení a pam ěť 10 od každého pohlaví (  a ) 
(1 z každého vrhu)  
( a ) V závislosti na citlivosti zkoušek poznávacích funkcí by m ělo být zváženo 
vyšetření mnohem v ětšího počtu zvířat, např. až 1 samce a 1 samice z každého 
vrhu (o p řiřazení zvířat viz dodatek 1) (další pokyny týkající se velikosti vzorku 
obsahuje Pokyn OECD č. 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dávkování  
16. Použijí se alespo ň tři dávky a soub ěžná kontrolní skupina. Úrovn ě dávek se 
rozloží tak, aby byly toxické ú činky odstup ňovány. Pokud neexistuje žádné 
omezení vyplývající z fyzikáln ě-chemické podstaty nebo biologických vlast ­
ností chemické látky, zvolí se nejvyšší dávka s cílem vyvolat ur čitou toxi­
citu u březí samice (nap ř. klinické znaky, snížení p řírůstku tělesné hmot ­
nosti (ne více než o 10 %) a/nebo projevy limitní toxické dávky pro cílový 
orgán). Nejvyšší dávku lze s ur čitými výjimkami omezit na 1 000 mg na 
1 kg tělesné hmotnosti za den. Avšak nap říklad velikost o čekávané expo ­
zice člověka může vyvolat pot řebu použití vyšší dávky. Jinak by m ěly být 
provedeny p ředběžné studie nebo p ředběžné orienta ční zkoušky s cílem 
určit, jaké nejvyšší dávkování má být použito, aby zp ůsobilo minimální 
stupeň toxicity pro matku. Pokud se ve standardní studii vývojové toxicity 
nebo v p ředběžné studii ukázalo, že zkoušená chemická látka je vývojov ě 
toxická, m ěla by nejvyšší úrovní dávky být maximální dávka, která nevy ­
volá nadm ěrnou toxicitu pro potomstvo, nebo toxicitu  in utero  nebo neona ­
tální toxicitu, pop řípadě malformace v mí ře znemož ňující provést smys ­
luplné hodnocení neurotoxicity. Nejnižší dávka by nem ěla vyvolat žádné 
známky toxicity pro matku ani žádné známky vývojové toxicity, v četně 
neurotoxicity. M ěla by být zvolena sestupná řada úrovní dávek s cílem 
prokázat ú činky související s dávkou a nep řítomnost nep říznivých ú činků 
při nejnižší úrovni dávky (NOAEL) nebo by m ěly být použity dávky blížící 
se mezi detekovatelnosti, které by umožnily stanovení referen ční dávky. 
Často je pro stanovení sestupných úrovní dávek optimální dvoj- až čtyřná­
sobný interval mezi dávkami a je vhodn ější přidat čtvrtou exponovanou 
skupinu než použít velmi velké intervaly (odpovídající nap ř. faktoru 
většímu než 10) mezi dávkami.  
17. Při výběru dávek je t řeba brát v úvahu veškeré existující údaje o toxicit ě 
a také další informace o metabolismu a toxikokinetice zkoušené chemické 
látky nebo látek p říbuzných. Tyto informace mohou rovn ěž pomoci p ři 
prokazování p řiměřenosti dávkovacího režimu. P římé podávání mlá ďatům 
by mělo být zváženo na základ ě informací o expozici a farmakokinetických 
informací (28)(29). P řed provád ěním studií s p římým dávkováním by m ěly 
být pečlivě zváženy p řínosy a nevýhody (30).  
18. Soub ěžnou kontrolní skupinou by m ěla být kontrolní skupina 
s napodobeným podáváním nebo kontrolní skupina s vehikulem, pokud 
se vehikulum p ři podávání zkoušené chemické látky používá. Normáln ě 
by měl být všem zví řatům podáván stejný objem zkoušené chemické 
látky nebo vehikula na základ ě tělesné hmotnosti. Pokud se pro usnadn ění 
dávkování používá vehikulum nebo jiná p řísada, je t řeba vzít v úvahu 
následující možnosti: vliv na absorpci, distribuci, metabolismus nebo retenci 
zkoušené chemické látky; vliv na chemické vlastnosti zkoušené chemické látky, které mohou ovlivnit její toxický ú činek, a vliv na spot řebu potravy 
nebo vody anebo na nutri ční stav zví řat. Vehikulum by nem ělo vyvolávat 
účinky, které by mohly ovlivnit interpretaci studie, nem ělo by být neurobe ­
havioráln ě toxické a nem ělo by mít vliv na rozmnožování nebo vývoj. 
V případě nových vehikul by krom ě kontrolní skupiny s vehikulem m ěla 
být zařazena také kontrolní skupina s napodobeným podáváním. Se zví řaty 
v kontrolní skupin ě (skupinách) se zachází stejn ě jako se zví řaty ve 
zkušební skupin ě.
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Podávání dávek  
19. Zkoušená chemická látka nebo vehikulum by m ěly být podávány cestami 
nejvhodnějšími z hlediska potenciální expozice člověka a na základ ě 
dostupných informací o metabolismu a distribuci u zkušebních zví řat. Podá­
vány budou zpravidla orální cestou (nap ř. sondou nebo v potrav ě či v pitné 
vodě), ale lze použít i jiné cesty (nap ř. dermální expozici, inhalaci) 
v závislosti na vlastnostech a o čekávaných nebo známých zp ůsobech expo ­
zice člověka (další pokyny jsou uvedeny v Pokynu OECD č. 43 (8)). 
Zvolený zp ůsob podávání je t řeba zdůvodnit. Zkoušená chemická látka se 
podává každý den p řibližně ve stejnou dobu.  
20. Obvykle by dávka podávaná jednotlivým zví řatům měla vycházet z aktuáln ě 
zjištěné tělesné hmotnosti. Velkou pozornost je však t řeba věnovat úprav ě 
dávek během posledního trimestru b řezosti. Pokud je u experimentálních 
samic zaznamenána nadm ěrná toxicita, tato zví řata se humánn ě utratí.  
21. Zkoušená chemická látka nebo vehikulum by m ěly být podávány oplod ­
něným samicím nejmén ě jednou denn ě od doby implantace (6. den gestace) 
po celé období laktace (21. postnatální den), takže mlá ďata jsou zkoušené 
chemické látce exponována b ěhem prenatálního i postnatálního neurologic ­
kého vývoje. V ěk, ve kterém se za čne dávka podávat, a trvání a frekvenci 
podávání dávky lze upravit, pokud existují poznatky, že jiné experimentální 
uspořádání je vhodn ější z hlediska expozice člověka. Pro jiné druhy je 
podávání dávek nutno p řizpůsobit tak, aby se zajistila expozice b ěhem 
všech raných období vývoje mozku (tj. odpovídajících prenatálnímu a raně postnatálnímu r ůstu lidského mozku). Podávání dávek m ůže začít 
od vyvolání b řezosti (nultý den gestace), avšak m ěla by být zvážena schop ­
nost zkoušené chemické látky zp ůsobit preimplanta ční ztráty. Podávání od 
6. dne gestace by toto riziko vylou čilo, ale nebyla by podchycena stadia 
vývoje mezi nultým a 6. dnem gestace. Jestliže laborato ř nakupuje zví řata 
spářená ve stejnou dobu, za čínat podávání dávky v nultý den gestace je 
nepraktické, a vhodným po čátečním dnem by proto byl 6. den gestace. 
Zkušební laborato ř by měla stanovit režim dávkování na základ ě přísluš­
ných informací o ú čincích zkoušené chemické látky, p ředchozích zkušeností 
a s ohledem na logistické zajišt ění; to může zahrnovat prodloužení podávání 
dávek po odstavení. Dávky by nem ě
ly být podávány v den vrhu t ěm zvířa­
tům, která nevrhla celé své potomstvo. Obecn ě se předpokládá, že 
k expozici mlá ďat dojde prost řednictvím mate řského mléka; v p řípadech, 
kdy není dostatek d ůkazů o kontinuální expozici potomstva, by však m ělo 
být zváženo p římé dávkování potomstvu. D ůkazy o kontinuální expozici lze 
čerpat nap ř. z farmakokinetických informací, toxicity potomstva nebo zm ěn 
v biologických markerech (28).  
POZOROVÁNÍ  
Pozorování samic  
22. U všech samic se alespo ň jednou denn ě pečlivě zkontroluje jejich zdravotní 
stav, včetně nemocnosti a úmrtnosti.  
23. V období aplikace a pozorování by m ělo být periodicky (nejmén ě dvakrát 
za období podávání látky za b řezosti a dvakrát za období podávání látky 
v době laktace) provád ěno podrobn ější klinické pozorování nejmén ě deseti 
samic na každé úrovni dávky. Zví řata by m ěla být pozorována mimo 
chovnou klec kvalifikovanými laboranty, kte ří nejsou informováni o tom, 
do jaké experimentální skupiny zví ře patří, a s použitím standardizovaných 
postupů, které mají minimalizovat stres u zví řat a neobjektivnost pozorova ­
tele a maximalizovat spolehlivost jednotlivých pozorovatel ů. Je žádoucí, 
aby pozorování v rámci dané studie provád ěl pokud možno stejný laborant.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Přítomnost zpozorovaných p říznaků se zaznamená. Je-li to možné, zazna ­
mená se rovn ěž závažnost zpozorovaných p říznaků. Klinická pozorování by 
se měla mimo jiné zam ěřit na zm ěny kůže, srsti, o čí a sliznic, výskyt 
sekretů a autonomní funkce (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklý 
průběh dýchání a/nebo dýchání ústy, nezvyklé p říznaky mo čení nebo defe ­
kace).  
25. Zaznamenají se rovn ěž nezvyklé projevy, pokud jde o polohu t ěla, úroveň 
aktivity (nap ř. snížené nebo zvýšené zkoumání standardního prostoru) 
a koordinaci pohybu. Zaznamenají se také zm ěny chůze (např. kolébání, 
ataxie), polohy (nahrbení h řbetu) a reakce na manipulaci, umíst ění a další 
stimuly související s prost ředím, dále p řítomnost klonických a tonických 
pohybů, křečí, třesu, stereotyp ů v chování (nap ř. nadměrného čištění, 
nezvyklých pohyb ů hlavy nebo opakovaného kroužení) nebo zvláštního 
chování (nap ř. kousání nebo nadm ěrného olizování, sebepoškozování, 
pohybu pozpátku, vydávání zvuk ů) anebo agresivity.  
26. Zaznamenají se p říznaky toxicity, v četně dne jejich nástupu, denní doby, 
stupně a trvání.  
27. Zvířata by se m ěla v době podávání dávek vážit nejmén ě jednou týdn ě po 
celou dobu studie, v den vrhu nebo jeho blízkosti a v 21. postnatální den (odstavení). Ve studiích podávání látky žalude ční sondou by m ěly být 
samice váženy nejmén ě dvakrát týdn ě. Při každém stanovení t ělesné hmot ­
nosti by m ěly být upraveny dávky podle pot řeby. Během gesta čního 
a laktačního období se spot řeba potravy m ěří minimáln ě každý týden. 
Pokud je expozice provád ěna pomocí pitné vody, m ěří se spotřeba vody 
nejméně jednou týdn ě.
 
Pozorování potomstva  
28. Veškeré potomstvo se nejmén ě jednou denn ě bedlivě pozoruje, aby se 
zjistily příznaky toxicity, nemocnost a úmrtnost.  
29. Během doby aplikace a pozorování by m ělo být provád ěno podrobn ější 
klinické pozorování potomstva. Pozorování potomstva (nejmén ě jedno 
mládě od každého pohlaví a vrhu) by m ěli provádět kvalifikovaní laboranti, 
kteří nejsou informováni o tom, do které experimentální skupiny zví řata 
patří, a s použitím standardizovaných postup ů s cílem minimalizovat neob ­
jektivnost pozorovatele a maximalizovat spolehlivost jednotlivých pozoro ­
vatelů. Je žádoucí, aby pozorování provád ěl pokud možno stejný laborant. 
Sledují se p řinejmenším sledované vlastnosti popsané v odstavci 24 a 25 
podle pot řeby vývojového stadia, které je pozorováno.  
30. Zaznamenají se veškeré p říznaky toxicity u potomstva, v četně dne nástupu, 
denní doby, stupn ě a trvání.  
Fyzické a vývojové znaky  
31. Změny ve vývojových znacích v období p řed odstavením (nap ř. otevření uší 
a očí, prořezávání řezáků) úzce souvisejí s t ělesnou hmotností (30)(31). 
Tělesná hmotnost m ůže být nejlepším ukazatelem fyzického vývoje. M ěření 
vývojových znak ů se proto doporu čuje provád ět pouze tehdy, jestliže exis ­
tují dřívější poznatky, že tyto sledované vlastnosti poskytnou dopl ňující 
informace. Časový rozvrh pro posuzování t ěchto parametr ů je uveden 
v tabulce 1. Lze doporu čit, aby v závislosti na o čekávaných ú čincích 
a na výsledcích po čátečních měření byly dopln ěny další časové body 
nebo byla provád ěna měření v jiných vývojových stadiích.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Při posuzování fyzického vývoje se doporu čuje použít postkoitální v ěk, 
a nikoli postnatální v ěk (33). Jsou-li mlá ďata testována v den odstavení, 
doporučuje se, aby byly tyto zkoušky provád ěny před skutečným odstave ­
ním, aby se vylou čil zkreslující ú činek stresu spojeného s odstavením. 
V období po odstavení by krom ě toho nem ěly být provád ěny žádné 
zkoušky b ěhem dvou dn ů po odstavení.  
Tabulka 1  
Časový rozvrh posuzování fyzických a vývojových znak ů a sledovaných 
funkčních/behaviorálních vlastností  ( a ) 
Období v ěku 
Sledované 
vlastnosti Před odstavením (  b ) Dospívání (  b ) Mladá dosp ělost (  b ) 
Fyzické a vývojové znaky  
Tělesná hmotnost 
a klinická pozorování týdně ( c ) nejmén ě jednou za 
dva týdny nejméně jednou za 
dva týdny 
Hmotnost mozku 22. postnatální den (  d ) p ři ukončení studie 
Neuropatologie 22. postnatální den (  d ) p ři ukončení studie 
Pohlavní zralost — podle vhodnosti — Další vývojové 
znaky (
 e ) podle vhodnosti — —  
Sledované funk ční/behaviorální vlastnosti  
Behaviorální ontoge ­
neze nejméně dvě měření 
Motorická aktivita 
(včetně přivykání) 1–3krát (  f ) — jednou 
Motorické a smyslové 
funkce — jednou jednou 
Učení a pam ěť — jednou jednou  
( a ) Tato tabulka uvádí minimální po čet měření, jež by m ěla být provád ěna. Lze doporu čit, aby na základ ě 
očekávaných ú činků a výsledk ů počátečních měření byly dopln ěny další časové body (nap ř. starší 
zvířata) nebo byla provád ěna měření v jiných vývojových stadiích. 
( b ) Doporu čuje se, aby mlá ďata nebyla testována v prvních dvou dnech po odstavení (viz odstavec 32). 
Doporučený věk pro testování dospívajících je: u čení a pam ěť = 25. postnatální den ± 2; motorické 
a smyslové funkce = 25. postnatální den ± 2. Doporu čený věk pro testování mladých dosp ělých je 
60.–70. postnatální den. 
( c ) Tělesná hmotnost by m ěla být m ěřena nejmén ě dvakrát týdn ě při přímém dávkování mlá ďatům za 
účelem upravení dávek v dob ě rychlého nár ůstu tělesné hmotnosti. 
( d ) Hmotnost mozku a neuropatologii lze p řípadně posuzovat pon ěkud dříve (např. 11. postnatální den) (viz 
odstavec 39). 
( e ) Případně by krom ě tělesné hmotnosti m ěly být zaznamenány i jiné vývojové znaky (nap ř. otevření očí) 
(viz odstavec 31). 
( f ) Viz odstavec 35.  
33. Živá mlá ďata se spo čítají a rozd ělí podle pohlaví, nap ř. vizuální prohlídkou 
nebo měřením vzdálenosti od kone čníku ke genitálu (34)(35) a každé mlád ě 
ve vrhu se jednotliv ě zváží při narození nebo krátce po n ěm, nejmén ě 
jednou týdn ě během laktace a poté nejmén ě jednou za dva týdny. P ři 
hodnocení pohlavní zralosti by m ělo být stanoveno stá ří a tělesná hmotnost 
zvířete při vaginálním otev ření (36) nebo odpojení p ředkožky (37) nejmén ě 
u jednoho samce a jedné samice z každého vrhu.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Behaviorální ontogeneze  
34. Ontogeneze vybraných chování by m ěla být m ěřena ve vhodném v ěku 
nejméně u jednoho mlád ěte od každého pohlaví a vrhu, p řičemž ve všech 
zkušebních dnech by se pro všechna posuzovaná chování m ěla použít stejná 
mláďata. Dny m ěření by v tomto období m ěly být rozvrženy stejnom ěrně, 
aby bylo možno stanovit b ěžnou změnu v ontogenezi uvedeného chování 
nebo zm ěnu v souvislosti s aplikací (38). Dále jsou uvedeny n ěkteré 
příklady chování, u kterých by mohla být posuzována ontogeneze: reflex 
rovnováhy, negativní geotaxe a motorická aktivita (38)(39)(40).  
Motorická aktivita  
35. Motorická aktivita by m ěla být sledována (41)(42)(43)(44)(45) v období 
před odstavením a v dosp ělosti. Ke zkoušení v dob ě odstavení viz odstavec 
32. Zkušební sezení by m ělo být dostate čně dlouhé, aby bylo možno 
prokázat p řivykání neexponovaných kontrolních skupin v pr ůběhu sezení. 
Behaviorální ontogenezi se d ůrazně doporučuje posuzovat pomocí moto ­
rické aktivity. Je-li provád ěna zkouška behaviorální ontogeneze, m ěla by 
být při všech sezeních v období p řed odstavením použita stejná zví řata. 
Zkoušky by m ěly být provád ěny dostate čně často, aby bylo možno posoudit 
ontogenezi p řivykání v pr ůběhu sezení (44). To m ůže vyžadovat t ři nebo 
více časových období p řed odstavením v četně dne odstavení (nap ř. 13., 17. 
a 21. postnatální den). Testování stejných zví řat nebo sourozenc ů z vrhu by 
mělo být provád ěno také v dosp ělosti nedlouho p řed ukončením studie 
(např. 60.–70. postnatální den). Podle pot řeby lze provád ět zkoušky 
i v dalších dnech. Motorická aktivita by m ěla být sledována p řístrojem 
s automatizovaným zaznamenáváním aktivity, který by m ěl být schopen 
zjistit zvýšení i poklesy aktivity (tj. výchozí aktivita nam ěřená tímto 
zařízením by nem ěla být tak nízká, aby bránila zjišt ění zvýšení, ani tak 
vysoká, aby bránila zjišt ění poklesu aktivity. Každý p řístroj by m ěl být 
odzkoušen standardními postupy, aby se zajistila co nejv ětší spolehlivost 
měření všemi p řístroji a v r ůzných dnech. Experimentální skupiny by m ěly 
být mezi p řístroje rozd ěleny pokud možno vyvážen ě. Každé zví ře se testuje 
jednotlivě. Experimentální skupiny by m ěly být testovány vyvážen ě 
v různou denní dobu s cílem vylou čit zkreslení denními rytmy aktivity. 
Je třeba dbát na to, aby byly rozdíly ve zkušebních podmínkách co 
nejmenší a nesouvisely automaticky s aplikací. Mnohá m ěření chování 
včetně měření motorické aktivity mohou ovlivnit takové prom ěnné, jako 
je úroveň zvuku, velikost a tvar zkušební klece, teplota, relativní vlhkost, 
světelné podmínky, zápachy, použití chovné klece nebo nové, zkušební 
klece a odchylky v prost ředí. 
Motorické a smyslové funkce  
36. Motorické a smyslové funkce se podrobn ě vyšetřují nejmén ě jednou za 
období dospívání a jednou v období mladé dosp ělosti (nap ř. 60.–70. postna ­
tální den). O testování v dob ě odstavení pojednává odstavec 32. Zkoušení 
by se mělo provád ět v dostate čném rozsahu, aby zajistilo dostate čný kvan­
titativní odb ěr vzorků smyslových podn ětů (např. somatosenzorických, 
vestibulárních) a motorických aktivit (nap ř. síla, koordinace). Jako n ěkolik 
příkladů zkoušek motorických a smyslových funkcí lze uvést vzp ěrnou 
reakci extenzor ů (46), reflex rovnováhy (47)(48), p řivykání úlekové reakci 
na zvukový podn ět (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) a evokované potenciály 
(55). ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Zkoušky u čení a pam ěti 
37. Zkouška asociativního u čení a pam ěti se provádí po odstavení (nap ř. 25. 
postnatální den ± 2 dny) a u mladých dosp ělých (60. postnatální den 
a starší). K testování v dob ě odstavení viz odstavec 32. V obou t ěchto 
vývojových stadiích lze použít stejnou nebo odlišnou zkoušku (zkoušky). Při volbě zkoušky (zkoušek) u čení a pam ěti u odstavených mlá ďat 
a dospělých potkan ů je povolena ur čitá pružnost. Zkoušky by však m ěly 
být koncipovány tak, aby spl ňovaly dvě kritéria. Zaprvé, u čení by mělo být 
posuzováno bu ď jako zm ěna mezi n ěkolika opakovanými pokusy nebo 
sezeními zabývajícími se u čením, nebo p ři zkouškách sestávajících 
z jediného pokusu s odkazem na ur čitou podmínku, která kontroluje neaso ­
ciativní ú činky zkušeností získaných výcvikem. Zadruhé, zkoušky by krom ě 
počátečního učení (nabytí) m ěly zahrnovat ur čité měření paměti (krátkodobé 
nebo dlouhodobé), ale toto m ěření paměti nelze zaznamenat bez m ěření 
osvojených prvk ů získaných p ři stejné zkoušce. Jestliže zkouška (zkoušky) 
učení a pam ěti zjistí ú činek zkoušené chemické látky, lze zvážit další 
zkoušky za ú
čelem vylou čení jiné interpretace založené na zm ěnách smyslo ­
vých, motiva čních a/nebo motorických schopností. Krom ě obou výše 
uvedených kritérií se doporu čuje, aby byla zkouška u čení a pam ěti zvolena 
na základ ě prokázané citlivosti na t řídu zkoumaných chemických látek, 
pokud jsou takové informace v literatu ře dostupné. Pokud takové informace 
neexistují, lze pro spln ění výše uvedených kritérií provést nap říklad tyto 
zkoušky: pasivní vyhýbání (43)(56)(57), test pracovní pam ěti (DMP) pro 
dospělé potkany (58) a mlá ďata potkan ů (59), čichové podmi ňování 
(43)(60), Morrisovo vodní bludišt ě (61)(62)(63), Bielovo bludišt ě nebo 
bludiště Cincinnati (64)(65), radiální bludišt ě (66), „T“ bludišt ě (43) 
a osvojení a uchovávání pravidelných návyk ů (26)(67)(68). V literatu ře 
jsou popsány další zkoušky pro odstavená mlá ďata (26)(27) a dosp ělé 
potkany (19) (20).  
Pitva  
38. Matky lze po odstavení potomstva utratit.  
39. Neuropatologické hodnocení potomstva se provede vyšet řením tkání zví řat 
humánně usmrcených v 22. postnatální den nebo v d řívějším časovém bod ě 
mezi 11. a 22. postnatálním dnem, jakož i p ři ukončení studie. U potomstva 
usmrceného do 22. postnatálního dne se hodnotí mozkové tkán ě, u zvířat 
usmrcených p ři ukončení se hodnotí tkán ě centrální nervové 
soustavy (CNS) a tkán ě periferní nervové soustavy (PNS). Zví řata usmrcená 
v 22. postnatální den nebo d říve lze fixovat pono řením do fixa čního roztoku 
nebo perfuzí. Zví řata usmrcená p ři ukončení studie by m ěla být fixována 
perfuzí. Všechny aspekty p řípravy tká ňových vzork ů, od perfuze zví řat, 
přes odebrání tká ňových vzork ů, zpracování tkání a barvení preparát ů by 
měly být vyvážen ě koncipovány tak, aby každá sada obsahovala reprezen ­
tativní vzorky z každé exponované skupiny. Další pokyny týkající se neuro ­
patologie lze nalézt v Pokynu OECD č. 20 (9), viz také (103).  
Zpracování tká ňových vzork ů 
40. Všechny závažné abnormality zjevné v pr ůběhu pitvy se zaznamenají. 
Odebrané tká ňové vzorky by m ěly reprezentovat všechny hlavní oblasti 
nervové soustavy. Vzorky tkání by m ěly být ponechány ve vhodném fixa ­
tivu a zpracovány podle standardizovaných zve řejněných histologických 
protokolů (69)(70)(71)(103). U tkání centrální nervové soustavy 
a periferní nervové soustavy je p řípustné zalití do parafinu, avšak je-li 
požadován v ětší stupeň rozlišení (nap ř. u periferních nerv ů, pokud existuje  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
podezření na periferální neuropatii a/nebo p ři morfometrické analýze peri ­
ferních nerv ů), může být vhodná postfixace osmiem spolu se zalitím do 
pryskyřice. Mozkové tkán ě získané pro morfometrickou analýzu by m ěly 
být zality do vhodného média na všech úrovních dávky ve stejnou dobu, aby se zamezilo artefakt ům vzniklým smršt ěním, ke kterému m ůže dojít 
v souvislosti s dlouhým uchováváním ve fixativu.
 
Neuropatologické vyšet ření 
41. Účelem kvalitativního vyšet ření je:  
i) zjistit oblasti nervové soustavy vykazující známky neuropatologických 
změn; 
ii) zjistit typy neuropatologických zm ěn vyplývajících z expozice zkoušené 
chemické látce; a  
iii) stanovit míru závažnosti t ěchto neuropatologických zm ěn. 
Reprezentativní histologické řezy tkáňových vzork ů se mikroskopicky 
zkoumají za ú čelem prokázání neuropatologických zm ěn, vyšetření provádí 
patolog s odpovídající kvalifikací. Všem neuropatologickým zm ěnám se 
přiřadí subjektivní stupe ň vyjadřující jejich závažnost. Pro hodnocení řezů 
mozku zví řat, jež byla humánn ě usmrcena v 22. postnatální den nebo d říve, 
může být dostate čné barvení pomocí hematoxylinu a eosinu. U řezů tkání 
centrální nervové soustavy a periferní nervové soustavy zví řat usmrcených 
při ukončení studie se však doporu čuje použít barviva na myelin (nap ř. 
luxolová mod ř/kresylová viole ť) a barvení st říbrem (nap ř. podle Bielschow ­
ského nebo Bodiana). Na základ ě odborného úsudku patologa a druhu 
pozorovaných zm ěn lze zvážit jiná barvení vhodná pro zjišt ění 
a charakterizaci konkrétních typ ů změn (např. gliální fibrilární acidický 
protein (GFAP) nebo lektinová histochemie pro posouzení gliálních a mikrogliálních zm ěn (72), fluoro-jade pro zjiš ťování 
nekrózy (73)(74) nebo st říbrná barvení používaná p ři degeneraci nervové 
soustavy (75)).
 
42. Mělo by být provád ěno morfometrické (kvantitativní) hodnocení, jelikož 
tyto údaje mohou pomoci p ři zjišťování účinků souvisejících s expozicí 
a jsou cenné pro interpretaci rozdíl ů v hmotnosti mozku nebo 
v morfologii souvisejících s expozicí. K tomu, aby bylo možno provést 
morfometrické hodnocení, je t řeba odebrat a p řipravit nervovou tká ň. 
Morfometrická hodnocení mohou zahrnovat nap ř. lineární nebo plošné 
měření konkrétních oblastí mozku (78). Lineární nebo plošná m ěření 
vyžadují použití homologických řezů pečlivě vybraných na základ ě spoleh­
livých mikroskopických znak ů (6). Ke zjišt ění účinků expozice na para ­
metry, jako je objem konkrétních neuroanatomických oblastí nebo po čet 
buněk v těchto oblastech lze použít stereologii (79)(80)(81)(82)(83)(84).  
43. Vyšet ření mozk ů by se m ělo zaměřit na veškeré p říznaky neuropatologic ­
kých změn souvisejících s expozicí a m ěly by být odebrány dostate čné 
vzorky ze všech hlavních oblastí mozku (nap ř. čichové laloky, mozková 
kůra, hippocampus, bazální ganglia, thalamus, hypothalamus, st řední mozek 
(tektum, tegmentum a pedunculi cerebrales), Varol ův most, prodloužená 
mícha, moze ček), což umožní d ůkladné vyšet ření. Je d ůležité, aby řezy 
byly u všech zví řat provád ěny ve stejné rovin ě. Z dospělých zvířat humánn ě 
usmrcených p ři ukončení studie se odeberou reprezentativní řezy páteřní 
míchy a periferní nervové soustavy. Zkoumané oblasti by m ěly zahrnovat 
oko s očním nervem a sítnicí, míchu v oblasti cervikálního a lumbálního 
zesílení, dorzální a ventrální ko řenová vlákna, n. ischiadicus – proximální 
část a n. tibialis – proximální část (v oblasti kolena) a n. tibialis z oblasti 
lýtkového svalu. Řezy míchy a periferních nerv ů by měly zahrnovat jak 
příčné, tak i podélné řezy. ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Neuropatologické hodnocení by m ělo zahrnovat vyšet ření na p říznaky 
vývojových poškození nervové soustavy (6)(85)(86)(87)(88)(89), dále na 
buněčné změny (např. vakuolizace, degenerace a nekróza neuron ů) 
a tkáňové změny (např. glióza, infiltrace leukocyt ů, tvorba cyst). V této 
souvislosti je d ůležité odlišit ú činky související s expozicí od b ěžných 
vývojových jev ů, ke kterým, jak známo, dochází ve stadiu vývoje odpoví ­
dajícím dob ě usmrcení (90). Významnými zm ěnami, jež ukazují na 
vývojovou poruchu, jsou mimo jiné tyto:  
— změny v absolutní velikosti nebo tvaru čichových lalok ů, mozku nebo 
mozečku, 
— změny v relativní velikosti r ůzných oblastí mozku, v četně zvětšené nebo 
zmenšené velikosti oblastí vyplývající ze ztráty nebo p řetrvávání 
normálně přechodných populací bun ěk nebo z axonálních projekcí 
(např. vnější zárode čná vrstva moze čku, kalózní t ěleso),  
— změny v proliferaci, migraci a diferenciaci ov ěřené podle oblastí 
nadměrné apoptózy nebo nekrózy, klastr ů nebo rozptýlených populací 
ektopických, dezorientovaných nebo malformovaných neuron ů, nebo 
změny v relativní velikosti r ůzných vrstev kortikálních struktur,  
— změny v myelinaci, v četně snížení celkové velikosti nebo odlišného 
zbarvení myelinových struktur,  
— příznaky hydrocefalu, zejména zv ětšení komor, stenóza cerebrálního 
akvaduktu a zúžení cerebrálních hemisfér.  
Analýza neuropatologických zm ěn z hlediska vztahu dávka-odpov ěď 
45. Pro kvalitativní a kvantitativní neuropatologické analýzy se doporu čuje 
následující postup sestávající z postupných krok ů. Zaprvé, řezy ze skupiny, 
které byla podávána vysoká dávka, se porovnají s řezy z kontrolní skupiny. 
Jestliže se u zví řat ze skupiny s vysokou dávkou nenajdou žádné p říznaky 
neuropatologických zm ěn, není žádná další analýza nutná. Jestliže se ve 
skupině s vysokou dávkou najdou p říznaky neuropatologických zm ěn, 
vyšetří se zvířata ze skupin, kterým byla podávána st řední a nízká dávka. 
Jestliže je skupina s vysokou dávkou ukon čena v důsledku úhynu nebo jiné 
zkreslující toxicity, m ěly by se analyzovat neuropatologické zm ěny ve 
skupinách s vysokou a st řední dávkou. Existují-li jakékoli p říznaky neuroto ­
xicity ve skupinách s nižší dávkou, m ěla by být provedena neuropatolo ­
gická analýza t ěchto skupin. Jestliže se p ři kvalitativním nebo kvantita ­
tivním vyšet ření naleznou neuropatologické zm ěny související s expozicí, 
měla by být stanovena závislost výskytu, četnost a stupe ň závažnosti lézí 
nebo morfometrických zm ěn na velikosti dávky, a to na základ ě hodnocení 
všech zví řat ze všech exponovaných skupin. Do tohoto hodnocení by m ěly 
být zařazeny všechny oblasti mozku, které vykazují p říznaky neuropatolo ­
gické zm ěny. U každého typu lézí by m ěly být popsány typické znaky, 
podle nichž byl stanoven každý stupe ň závažnosti, a uvedou se prvky 
sloužící k odlišení každého stupn ě od ostatních stup ňů. Zaznamená se 
četnost a stupe ň závažnosti každého typu lézí a provede se statistická 
analýza za ú čelem zhodnocení vztahu dávka-odpov ěď. Doporu čuje se 
použít kódované preparáty (91).  
ÚDAJE A ZPRÁVy  
Údaje  
46. Výsledky se zaznamenávají individuáln ě a shrnou se do tabulek tak, aby 
byly u každé experimentální skupiny uvedeny typy zm ěn a počet samic, 
potomstvo podle pohlaví a vrhy vykazující každý typ zm ěny. Pokud byla 
prováděna přímá postnatální expozice potomstva, uvede se zp ůsob, trvání 
a doba expozice.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Hodnocení a interpretace výsledk ů 
47. Studie vývojové neurotoxicity bude obsahovat informace o ú čincích opako ­
vané expozice ur čité chemické látce b ěhem vývoje  in utero  a raně postna­
tálního vývoje. Vzhledem k tomu, že d ůraz je kladen na ukazatele 
všeobecné toxicity i na ukazatele vývojové neurotoxicity, umožní výsledky této studie rozlišení mezi ú činky na vývoj nervové soustavy vyskytujícími 
se za nep řítomnosti všeobecné toxicity u matek a mezi ú činky vyvolanými 
pouze na úrovních, které jsou toxické i pro b řezí samice. V d ůsledku složi ­
tých vzájemných souvislostí mezi koncepcí studie, statistickou analýzou a biologickým významem údaj ů, bude odpovídající interpretace údaj ů 
o vývojové neurotoxicit ě zahrnovat odborný posudek (107)(109). P ři inter­
pretaci výsledk ů zkoušek by m ěl být uplatn ěn přístup založený na existu ­
jících průkazných faktech (20)(92)(93)(94). Uvede se charakteristika beha ­
viorálních nebo morfologických nález ů, pokud jsou p řítomny, a poznatky 
o vztahu dávka-reakce. Tato charakterizace by m ěla zahrnovat údaje ze 
všech studií, které mají význam pro hodnocení vývojové neurotoxicity, včetně epidemiologických studií nebo p řípadových studií u lidí a studií 
na pokusných zví řatech (nap ř. toxikokinetické údaje, informace o vztahu 
struktura-ú činek, údaje z jiných studií toxicity). Pat ří sem i vztah mezi 
dávkami zkoušené chemické látky a p řítomností či nepřítomností, četností 
a rozsahem jakýchkoli neurotoxických ú činků na každé pohlaví (20)(95).
 
48. Hodnocení údaj ů by mělo zahrnovat rozbor výsledk ů z hlediska jejich 
biologického i statistického významu. Na statistickou analýzu je nutno 
pohlížet jako nástroj k řízení, a nikoli nástroj p ředurčující interpretaci údaj ů. 
Nedostate čná statistická významnost by nem ěla být jediným od ůvodněním 
pro učinění závěru o neexistenci ú činku souvisejícího s expozicí, stejn ě tak 
jako statistická významnost by nem ěla být jediným od ůvodněním pro 
vyvození záv ěru o existenci ú činku souvisejícího s expozicí. Aby se 
zamezilo p řípadným falešn ě negativním výsledk ům a přirozeným potížím 
při „prokazování negativního“, m ěly by být podrobeny rozboru dostupné 
pozitivní a historické kontrolní údaje, zejména pokud neexistují žádné 
účinky související s expozicí (102)(106). Pravd ěpodobnost falešn ě pozitiv­
ních výsledk ů by měla být analyzována s ohledem na celkové statistické 
hodnocení údaj ů (96). Hodnocení by m ělo zahrnovat vztah mezi pozorova ­
nými neuropatologickými a behaviorálními zm ěnami, pokud takový vztah 
existuje.  
49. Všechny výsledky by m ěly být analyzovány pomocí statistických model ů 
vhodných z hlediska koncepce daného experimentu (108). Volba parame ­
trické nebo neparametrické analýzy by m ěla být zdůvodněna s přihlédnutím 
k takovým faktor ům, jakými jsou povaha údaj ů (zda jsou transformovány, 
či nikoli) a jejich distribuce, jakož i relativní spolehlivost zvolené statistické 
analýzy. Zám ěr a koncepce studie by m ěly určovat volbu metod statistické 
analýzy, aby se minimalizovaly chyby typu I (falešn ě pozitivní) a typu II 
(falešně negativní) (96)(97)(104)(105). Vývojové studie, které používají 
druhy s více četnými vrhy, kdy je testováno více mlá ďat z každého vrhu, 
by měly mít ve statistickém modelu zahrnut i vrh, aby se zabránilo zvýše ­
nému výskytu chyb I. typu (98)(99)(100)(101). Statistickou jednotkou pro 
hodnocení výsledk ů by měl být vrh, a nikoli mlád ě. Experimenty by m ěly 
být koncipovány tak, aby výsledky získané u sourozenc ů z vrhu nebyly 
považovány za nezávislá pozorování. Všechny sledované vlastnosti m ěřené 
opakovan ě u stejného subjektu by m ěly být analyzovány pomocí statistic ­
kých model ů, které zohled ňují, že tato m ěření nejsou nezávislá.  
Protokol o zkoušce  
50. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Zkoušená chemická látka:  
— fyzikální povaha a tam, kde je to podstatné, fyzikáln ě-chemické 
vlastnosti,  
— identifika ční údaje, v četně zdroje,  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— čistota přípravku a známé a/nebo p ředpokládané ne čistoty.  
Vehikulum (je-li použito):  
— zdůvodnění volby jiného vehikula, pokud není použita voda nebo fyzi ­
ologický solný roztok.  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh a kmen a zd ůvodnění použití jiných pokusných zví řat, 
není-li použit potkan,  
— dodavatel pokusných zví řat, 
— počet, věk na začátku a pohlaví zví řat; 
— původ, podmínky chovu, strava, voda atd.,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku zkoušky.  
Podmínky pro provád ění zkoušky:  
— zdůvodnění volby dávek,  
— zdůvodnění způsobu podání a doby podávání dávek,  
— specifikace aplikovaných dávek, v četně podrobností o vehikulu, objemu 
a fyzikální form ě aplikovaného materiálu,  
— podrobnosti o složení zkoušené chemické látky/úprav ě potravy, 
o použité koncentraci, stálosti a homogenit ě přípravku,  
— metoda použitá pro jednozna čnou identifikaci samic a potomstva,  
— podrobný popis postupu (postup ů) náhodného výb ěru použitých pro 
přiřazení samic do experimentálních skupin, výb ěru mláďat pro utracení 
a zařazení mlá ďat do exponovaných skupin,  
— podrobnosti o podávání zkoušené chemické látky,  
— popřípadě přepočet koncentrace zkoušené látky v potrav ě/pitné vod ě 
nebo inhalaci (ppm) na skute čnou denní dávku (mg na 1 kg t ělesné 
hmotnosti),  
— podmínky prost ředí, 
— podrobné údaje o strav ě a kvalitě vody (nap ř. vodovodní, destilovaná),  
— datum zahájení a datum ukon čení studie.  
Pozorování a zkušební postupy:  
— podrobný popis postup ů použitých pro standardizaci pozorování 
a postupů, jakož i operativních definic pro pozorování s bodovacím 
systémem hodnocení ú činků, 
— seznam všech použitých zkušebních postup ů a zdůvodnění jejich použ ­
ití, 
— podrobnosti o použitých behaviorálních/funk čních, patologických, 
neurochemických nebo elektrofyziologických postupech, v četně infor­
mací a podrobností o automatických za řízeních,  
— postupy pro kalibrování a zajišt ění rovnocennosti za řízení a vyvážení 
experimentálních skupin v rámci zkušebních postup ů, 
— stručné zdůvodnění všech rozhodnutí obsahujících profesionální úsudky.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Výsledky (individuální i souhrnné, p řípadně včetně střední hodnoty 
a rozptylu:  
— počet zvířat na začátku studie a na konci studie,  
— počet zvířat a vrhů použitých pro každou zkušební metodu,  
— identifika ční číslo každého zví řete a vrhu, z kterého pochází,  
— velikost vrhu a st řední hmotnost p ři narození podle pohlaví,  
— údaje o t ělesné hmotnosti a o zm ěnách tělesné hmotnosti, v četně 
konečné tělesné hmotnosti samic a potomstva,  
— údaje o spot řebě potravy a pop řípadě o spotřebě vody (nap ř. pokud je 
zkoušená látka podávána s pitnou vodou),  
— údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovn ě dávky, v četně 
příznaků toxicity nebo úmrtnosti, pop řípadě doba a p říčina úmrtí,  
— povaha, závažnost, trvání, den nástupu, denní doba a následný pr ůběh 
podrobných klinických pozorování,  
— bodové hodnocení každého vývojového znaku (hmotnost, pohlavní 
zralost a behaviorální ontogeneze) v každé dob ě pozorování,  
— podrobný popis všech behaviorálních, funk čních, neuropatologických, 
neurochemických, elektrofyziologických nález ů podle pohlaví, v četně 
nárůstů a pokles ů v porovnání s kontrolními skupinami;  
— pitevní nálezy,  
— hmotnosti mozk ů, 
— jakékoli diagnózy vyvozené z neurologických znak ů a lézí, včetně přiro­
zeně se vyskytujících chorob nebo stav ů, 
— zobrazení exemplárních nález ů, 
— zobrazení s nízkým rozlišením pro posouzení homologie řezů použitých 
pro morfometrii,  
— údaje o absorpci a metabolismu, v četně doplňujících údaj ů ze samo ­
statné toxikokinetické studie, je-li k dispozici,  
— statistické zpracování výsledk ů, včetně statistických model ů použitých 
pro analýzu údaj ů, a výsledky, bez ohledu na to, zda byly významné, či 
nikoli,  
— seznam personálu studie, v četně jeho odborné kvalifikace.  
Rozbor výsledk ů: 
— informace o reakci na dávky podle pohlaví a skupin,  
— význam veškerých dalších toxických ú činků pro záv ěry týkající se 
neurotoxického potenciálu zkoušené chemické látky podle pohlaví 
a skupin,  
— dopad toxikokinetických informací na záv ěry, 
— podobnost ú činků jakýmkoli známým látkám schopným vyvolat 
neurotoxicitu,  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— údaje podporující spolehlivost a citlivost zkušební metody (tj. pozitivní 
a historické kontrolní údaje).  
— souvislosti, existují-li, mezi neuropatologickými a funk čními účinky,  
— NOAEL (hodnota dávky bez pozorovaného nep říznivého ú činku) nebo 
referenční dávka pro samice a potomstvo podle pohlaví a skupiny.  
Závěry: 
— rozbor celkové interpretace údaj ů na základ ě výsledků, včetně závěru, 
zda zkoušená látka zp ůsobila vývojovou neurotoxicitu či nikoli, 
a NOAEL.  
LITERATURA  
1) OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Koda ň, Dánsko, 
13.–14. června 1995.  
2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Dostupné na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/ OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].
 
3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Dostupné na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordi ­
splay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].  
4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109, 79–91.
 
5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., 
Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental 
neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109, 101–111.
 
6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize develop ­
mental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109, 93–100.  
7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23–25 October 2000.
 
8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian 
Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Paris. July 2008. Dostupné na: [http://search.oecd.org/officialdocu ­
ments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mo ­
no(2008)16&doclanguage=en].  
9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Dostupné na: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_ 
1916054_1_1_1_1,00.html].
 
10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12, 173–292.
 
11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8, 188–197.  
13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology , 1 st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
14) Kapitola B.34 této p řílohy, Jednogenera ční zkouška toxicity pro 
reprodukci.  
15) Kapitola B.35 této p řílohy, Dvougenera ční studie reproduk ční toxicity.  
16) Kapitola B.43 této p řílohy, Studie neurotoxicity na hlodavcích.  
17) Kapitola B.31 této p řílohy, Studie prenatální vývojové toxicity.  
18) Sm ěrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 
o ochran ě zvířat používaných pro v ědecké účely. Úř. věst. L 276, 
20.10.2010, s. 33.  
19) WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Dostupné na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm].
 
20) WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), World Health Orga ­
nization Publications, Geneva. Dostupné na: [http://www.intox.org/data ­
bank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].  
21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and 
Methods , 1 st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19, 499–509.  
23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38, 2–6.  
24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27, 110–112.  
25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of 
a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 
13, 118–136.  
26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  Peri­
natal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic Press, 
Orlando.  
28) Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC.  
29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group. Int. J. Toxicol., 24, 87–94.  
30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4.  
31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5 A). Mezinárodní konference 
o harmonizaci technických požadavk ů na registraci humánních lé čivých 
přípravků. 
32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6, 433–439.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20, 449–457.
 
34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13, 383–390.
 
35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but 
not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58, 350–365.
 
36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7, 579–586.
 
37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17, 298–303.
 
38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12, 489-495.  
39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23, 896–920.  
40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Raven Press, 
New York, s. 67–100.  
41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1, 53–66.  
42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology , 
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Raven Press, New 
York, s. 37–82.  
43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15, 117-129.  
44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18, 247-260.  
45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assess ­
ments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599–609.  
46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19, 1997. 405–411.  
47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Phy ­
siol. Behav., 64, 61–669.  
48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40, 589–591.  
49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, 
s. 287–351.  
50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59, 
107–128.  
51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, s. 181–211.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8, 
199–211.  
53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxi ­
city in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80, 25–30.
 
54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure.  Neurobehav. Toxicol. Teratol.,  
6, 437–445.  
55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. In:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. s. 125–145.  
56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105, 321–332.  
57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new 
results. Neurosci. Behav. Rev., 6, 247–296.  
58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10, 237–244.
 
59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103, 98–105.  
60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17, 465–479.
 
61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11, 47–60.  
62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48, 29–69.  
63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36, 60–90.  
64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of 
phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9, 235–241.  
65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20, 387–399.  
66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10, 327–332.  
67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71, 342–352.
 
68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding.  J. Gerontol.,  36, 
338–341.  
69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: 
A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28, 122–131.  
70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, s. 84–107.  
71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5 th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalu ­
ation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24, 291–304.
 
73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874, 123–130.  
74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53, 
365–372.  
75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.
 
76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., 
Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19, 745–755.
 
77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain 
after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for develop ­
mental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20, 417–432.
 
78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period.  Neurobehav. Toxicol. , 1, 
129–135.  
79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York.  
80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: 
A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57, 305–310.
 
81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609, 262–268.  
82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26, 707–710.  
83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22, 51–61.
 
84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130, 813–831.  
85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49, 113–121.
 
86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84, 294–298.  
87) Jensen, K.F., Catalano, S.M. (1998) Brain morphogenesis and develop ­
mental neurotoxicology. In:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , 
Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3–41.  
88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283, 70–74.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287, 1056-1060.
 
90) Friede, R.L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin.  
91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63, 127–133.
 
92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104, 401–405.  
93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644 A.  
94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274–56322.  
95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefo ­
ged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5, 113–126.  
97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8, 
21–27.  
98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6, 329–335.  
99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12, 165–172.  
100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14, 221–228.  
101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7, 587–590.
 
102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26, 345–352.
 
103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34, 
296–313.
 
104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3), 205–210.
 
105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41, 295–301.
 
106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4), 266–287.
 
107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology , 30(4), 288–325.
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4), 326–348.
 
109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4), 349–381.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Obrázek 1  
Obecný zkušební plán funk čních/behaviorálních zkoušek, neuropatologického hodnocení 
a stanovení hmotností mozku. Tento diagram vychází z popisu uvedeného v odstavci 13–15 
(PND = postnatální den). P říklady rozd ělení zvířat jsou uvedeny v dodatku 1
  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Dodatek 1  
1. Příklady možného rozd ělení jsou popsány a uvedeny v tabulce níže. Tyto 
příklady mají ukázat, že rozd ělení zvířat v rámci studie podle r ůzných 
zkušebních paradigmat m ůže být provedeno n ěkolika různými zp ůsoby.  
Příklad č. 1 
2. Pro zkoušky behaviorální ontogeneze p řed odstavením se použije jedna sada 
20 mláďat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec a 1 
samice z každého vrhu). Z t ěchto zvířat se v 22. postnatální den humánn ě 
usmrtí 10 mlá ďat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec 
nebo 1 samice z každého vrhu). Mozky se vyjmou, zváží a zpracují pro histopatologické hodnocení. Krom ě toho se shromáždí údaje o hmotnosti 
mozku s použitím nefixovaných mozk ů ostatních 10 samc ů a 10 samic 
z každé úrovn ě dávky.
 
3. Další sada 20 zví řat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec 
a 1 samice z každého vrhu) se použije pro funk čně/behaviorální zkoušky po 
odstavení (podrobná klinická pozorování, motorická aktivita, úleková reakce na zvukový podn ět a zkoušení poznávacích funkcí u dospívajících) a pro 
posouzení v ěku pohlavní zralosti. Z t ěchto zvířat se 10 zví řat od každého 
pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) 
anestetizuje a fixuje perfuzí p ři ukončení studie (p řibližně 70. postnatální 
den). Po další fixaci  in situ  se vyjme mozek a zpracuje se pro neuropato ­
logické hodnocení.
 
4. Pro zkoušky poznávacích funkcí u mladých dosp ělých (nap ř. 60.–70. 
postnatální den) se použije t řetí sada 20 mlá ďat od každého pohlaví 
a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec a 1 samice z každého vrhu). Z t ěchto 
zvířat se 10 zví řat od každého pohlaví a každé skupiny (1 samec nebo 1 
samice z každého vrhu) p ři ukončení studie usmrtí a mozek se vyjme 
a zváží.  
5. Zbývajících 20 zví řat od každého pohlaví a každé skupiny se ponechá 
v záloze pro p řípadné další zkoušky.  
Tabulka 1  
Mládě č. ( a ) Počet mláďat zařazených 
do zkoušky Vyšetření/zkouška 
♂ ♀ 
1 5 20 ♂ + 20 ♀ Behaviorální ontogeneze 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/ 
morfometrie mozku, 
22. postnatální den 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost mozku, 22. postna ­
tální den 
2 6 20 ♂ + 20 ♀ Podrobná klinická pozorování 
20 ♂ + 20 ♀ Motorická aktivita 
20 ♂ + 20 ♀ Pohlavní zralost 
20 ♂ + 20 ♀ Motorické a smyslové funkce 
20 ♂ + 20 ♀ Učení a pam ěť (25. postnatální 
den) 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/ 
morfometrie mozku mladých 
dospělých ~ 70. postnatální 
den) ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Mládě č. ( a ) 
Počet mláďat zařazených 
do zkoušky Vyšetření/zkouška 
♂ ♀ 
3 7 20 ♂ + 20 ♀ Učení a pam ěť (mladí dosp ělí) 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost mozku mladých 
dospělých ~ 70. postnatální 
den) 
4 8 — Zví řata v rezerv ě pro nahrazení 
nebo další zkoušky  
( a ) Pro tento p říklad jsou z vrh ů vybráni 4 samci + 4 samice; same čci jsou očíslováni 
čísly 1 až 4, sami čky čísly 5 až 8.  
Příklad č. 2 
6. Pro zkoušky behaviorální ontogeneze p řed odstavením se použije jedna sada 
20 mláďat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec a 1 
samice z každého vrhu). Z t ěchto zvířat se v 11. postnatální den 10 mlá ďat 
od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice 
z každého vrhu) humánn ě usmrtí. Mozky se vyjmou, zváží a zpracují pro 
histopatologické hodnocení.  
7. Další sada 20 zví řat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (1 samec a 1 
samice z každého vrhu) se použije pro vyšet ření po odstavení (podrobná 
klinická pozorování, motorická aktivita, posouzení v ěku pohlavní zralosti 
a motorické a smyslové funkce). Z t ěchto zvířat se 10 zví řat od každého 
pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) 
anestetizuje a fixuje perfuzí p ři ukončení studie (p řibližně v 70. postnatální 
den). Po další fixaci  in situ  se vyjme mozek, zváží se a zpracuje pro 
neuropatologické hodnocení.  
8. Pro testování poznávacích funkcí u dospívajících a mladých dosp ělých se 
použije 10 mlá ďat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec 
nebo 1 samice z každého vrhu). Pro zkoušky poznávacích funkcí v 23. postnatální den a u mladých dosp ělých se použijí odlišná zví řata. Při ukon­ 
čení se 10 zví řat od každého pohlaví a každé skupiny, která byla testována 
jako dosp ělá, usmrtí, mozek se vyjme a zváží.
 
9. Zbývajících 20 zví řat od každého pohlaví a každé skupiny, která nebyla 
vybrána pro zkoušky, se p ři odstavení usmrtí a vylou čí. 
Tabulka 2  
Mládě č. ( a ) Počet mláďat zařazených 
do zkoušky Vyšetření/zkouška 
♂ ♀ 
1 5 20 ♂ + 20 ♀ Behaviorální ontogeneze 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfo ­
metrie mozku, 11. postnatální 
den 
2 6 20 ♂ + 20 ♀ Podrobná klinická pozorování 
20 ♂ + 20 ♀ Motorická aktivita 
20 ♂ + 20 ♀ Pohlavní zralost 
20 ♂ + 20 ♀ Motorické a smyslové funkce 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfo ­
metrie mozku mladých dosp ě­
lých ~ 70. postnatální den)  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Mládě č. ( a ) Počet mláďat zařazených 
do zkoušky Vyšetření/zkouška 
♂ ♀ 
3 7 10 ♂ + 10 ♀ ( b ) Učení a pam ěť (23. postnatální 
den) 
3 7 10 ♂ + 10 ♀ ( b ) Učení a pam ěť (mladí dosp ělí) 
Hmotnost mozku mladých 
dospělých 
4 8 — Zví řata usmrcená a vylou čená, 
21. postnatální den  
( a ) Pro tento p říklad jsou z vrh ů vybráni 4 samci + 4 samice; same čci jsou očíslováni 
čísly 1 až 4, sami čky čísly 5 až 8. 
( b ) Pro zkoušky poznávacích funkcí v 23. postnatální den a u mladých dosp ělých se 
použijí odlišná mlá ďata (např. ze sudých/lichých vrh ů z celkového po čtu 20 vrh ů). 
Příklad č. 3 
10. Pro posouzení hmotnosti mozku a neuropatologie v 11. postnatální den se 
použije jedna sada 20 mlá ďat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 
1 samec a 1 samice z každého vrhu). Z t ěchto zvířat se v 11. postnatální 
den 10 mlá ďat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec nebo 
1 samice z každého vrhu) humánn ě usmrtí, mozky se vyjmou, zváží 
a zpracují pro histopatologické hodnocení. Krom ě toho se shromáždí 
údaje o hmotnosti mozku s použitím nefixovaných mozk ů ostatních 10 
samců a 10 samic z každé úrovn ě dávky.  
11. Další sada 20 zví řat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec 
a 1 samice z každého vrhu) se použije pro testování behaviorální ontoge ­
neze (motorická aktivita), vyšet ření po odstavení (motorická aktivita 
a posouzení v ěku pohlavní zralosti) a testování poznávacích funkcí 
u dospívajících.  
12. Další sada 20 zví řat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec 
a 1 samice z každého vrhu) se použije pro zkoušky motorických 
a smyslových funkcí (úleková reakce na zvukový podn ět) a pro podrobná 
klinická pozorování. Z t ěchto zvířat se 10 zví řat od každého pohlaví 
a každé úrovn ě dávky (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) aneste ­
tizuje a fixuje perfuzí p ři ukončení studie (p řibližně v 70. postnatální den). 
Po další fixaci  in situ  se vyjme mozek, zváží se a zpracuje pro neuro ­
patologické hodnocení.  
13. Další sada 20 mlá ďat od každého pohlaví a každé úrovn ě dávky (tj. 1 
samec a 1 samice z každého vrhu) se použije pro zkoušení poznávacích funkcí u mladých dosp ělých. Z t ěchto zvířat se 10 zví řat od každého 
pohlaví a každé skupiny (tj. 1 samec nebo 1 samice z každého vrhu) usmrtí 
při ukončení studie, mozek se vyjme a zváží.
 
Tabulka 3  
Mládě č. ( a ) Počet mláďat zařazených 
do zkoušky Vyšetření/zkouška 
♂ ♀ 
1 5 10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfo ­
metrie mozku v 11. postnatální 
den 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost mozku v 11. postna ­
tální den 
2 6 20 ♂ + 20 ♀ Behaviorální ontogeneze (moto ­
rická aktivita) 
20 ♂ + 20 ♀ Motorická aktivita 
20 ♂ + 20 ♀ Pohlavní zralost 
20 ♂ + 20 ♀ Učení a pam ěť (27. postnatální 
den) ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Mládě č. ( a ) Počet mláďat zařazených 
do zkoušky Vyšetření/zkouška 
♂ ♀ 
3 7 20 ♂ + 20 ♀ Úleková reakce (dospívající 
a mladí dosp ělí) 
20 ♂ + 20 ♀ Podrobná klinická pozorování 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost/neuropatologie/morfo ­
metrie mozku mladých dosp ě­
lých ~ 70. postnatální den 
4 8 20 ♂ + 20 ♀ Učení a pam ěť (mladí dosp ělí) 
10 ♂ + 10 ♀ Hmotnost mozku mladých 
dospělých  
( a ) Pro tento p říklad jsou z vrh ů vybráni 4 samci + 4 samice; same čci jsou očíslováni 
čísly1 až 4, sami čky čísly 5 až 8.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Dodatek 2  
Definice  
Chemická látka: látka nebo sm ěs. 
Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená touto zkušební 
metodou.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  UTEROTROFNÍ BIOLOGICKÁ ZKOUŠKA NA HLODAVCÍCH: 
KRÁTKODOBÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA ESTROGENNÍCH 
VLASTNOSTÍ  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 440 
(2007). Organizace OECD v roce 1998 zahájila činnost s vysokou prioritou 
zaměřenou na revizi stávajících pokyn ů a vypracování nových pokyn ů pro 
screening a zkoušení potenciálních endokrinních disruptor ů (1). Jedním 
z prvků této činnosti bylo vypracovat metodický návod pro provád ění 
uterotrofní biologické zkoušky u hlodavc ů. Uterotrofní biologická zkouška 
u hlodavc ů poté prošla rozsáhlým valida čním programem, který mimo jiné 
zahrnoval sestavení podrobného podkladového dokumentu (2)(3) 
a provedení rozsáhlých vnitrolaboratorních a mezilaboratorních studií, aby se prokázal význam a reprodukovatelnost biologické zkoušky s ú činným 
referenčním estrogenem, slabými agonisty estrogenního receptoru, silným 
antagonistou estrogenního receptoru a negativní referen ční chemickou 
látkou (4)(5)(6)(7)(8)(9). Tato zkušební metoda B.54 vychází ze zkušeností získaných b ěhem programu valida čních zkoušek a z výsledk ů těchto 
zkoušek s agonisty estrogen ů.
 
2. Uterotrofní biologická zkouška je krátkodobá screeningová zkouška, která 
pochází z 30. let 20. století (27)(28) a standardizovanou screeningovou metodou se stala na základ ě rozhodnutí expertního výboru v roce 
1962 (32)(35). Je založena na zvýšení hmotnosti d ělohy neboli uterotrofní 
reakce (p řehled viz 29). Hodnotí schopnost chemické látky vyvolávat 
biologické aktivity odpovídající agonist ům nebo antagonist ům přírodních 
estrogenů (např. 17-beta-estradiolu), avšak její použití pro zjišt ění antago ­
nistních látek je mnohem mén ě obvyklé než pro zjišt ění agonistních látek. 
Děloha reaguje na estrogeny dvojím zp ůsobem: Po čáteční reakcí je zvýšení 
hmotnosti v d ůsledku nasáknutí vodou. Po této reakci následuje nár ůst 
hmotnosti v d ůsledku r ůstu tkáně (30). Reakce d ělohy u potkan ů 
a u myší jsou kvalitativn ě srovnatelné.
 
3. Tato biologická zkouška slouží jako screeningová zkouška  in vivo  a na její 
provedení je t řeba pohlížet v kontextu „Koncep čního rámce OECD pro 
zkoušky a posuzování chemických látek narušujících činnost endokrinních 
žláz“ (dodatek 2). V tomto koncep čním rámci je uterotrofní biologická 
zkouška za řazena na úrove ň 3 jako zkouška  in vivo  poskytující údaje 
o jediném endokrinním mechanismu, tj. estrogenit ě. 
4. Předpokládá se za řazení uterotrofní biologické zkoušky do baterie zkoušek  
in vitro  a in vivo  za účelem zjišt ění chemických látek schopných interakce 
s endokrinním systémem, která nakonec bude sloužit k posouzení rizik pro 
lidské zdraví nebo životní prost ředí. V rámci valida čního programu OECD 
byli používáni silní a slabí agonisté estrogenu s cílem zhodnotit schopnost zkoušky identifikovat estrogenní chemické látky (4)(5)(6)(7)(8). Tímto 
způsobem byla jasn ě prokázána citlivost tohoto zkušebního postupu 
z hlediska agonist ů estrogenu, jakož i dobrá vnitrolaboratorní 
a mezilaboratorní reprodukovatelnost.
 
5. Pokud jde o negativní chemické látky, byla do valida čního programu 
zařazena pouze jedna „negativní“ referen ční chemická látka, u které byly 
známy negativní výsledky z uterotrofní zkoušky a dalších zkoušek  in vitro  
s využitím receptor ů a vazby na receptory. Avšak byly zhodnoceny i další 
zkušební údaje nesouvisející s valida čním programem OECD, jež dále 
podpořily specifi čnost uterofrofní biologické zkoušky pro screening 
agonistů estrogen ů (16).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ  
6. Agonisté a anatagonisté estrogen ů působí jako ligandy pro alfa a beta 
receptory estrogen ů a mohou aktivovat nebo potla čovat transkrip ční aktivitu 
receptorů. To může potenciáln ě vést k nep říznivým zdravotním d ůsledkům, 
včetně účinků na reprodukci a vývoj. Proto existuje pot řeba rychlého posou ­
zení a zhodnocení chemické látky jakožto možného agonisty nebo antago ­
nisty estrogen ů. Afinita ligandu k estrogenovému receptoru nebo aktivace 
transkripce reporterových gen ů in vitro , byť informativní, je pouze jedním 
z několika ur čujících faktor ů možného nebezpe čí. Jiné ur čující faktory 
mohou zahrnovat aktivaci a deaktivaci metabolismu po vstupu do orga ­
nismu, distribuci do cílových tkání a odstran ění z těla, což p řinejmenším 
zčásti závisí na zp ůsobu podávání a na zkoušené chemické látce. Z toho 
vyplývá pot řeba zjištění možné aktivity chemické látky  in vivo  za určitých 
podmínek, pokud dostate čné informace neposkytují již vlastnosti ADME 
(absorpce – distribuce – metabolismus – eliminace) dané chemické látky. 
Děložní tkán ě reagují na stimulaci estrogeny rychlým a mohutným r ůstem, 
zejména u laboratorních hlodavc ů, kde estrální cyklus trvá p řibližně čtyři 
dny. Druhy hlodavc ů, zejména potkan, se rovn ěž široce používají ve 
studiích toxicity za ú čelem charakterizace nebezpe čí. Děloha hlodavc ů je 
proto vhodným cílovým orgánem pro zjiš ťování estrogenních agonist ů 
a antagonist ů in vivo . 
7. Tato zkušební metoda je založena na postupech použitých p ři validační 
studii OECD, u kterých byla p ři vnitrolaboratorních a mezilaboratorních 
studiích prokázána jejich spolehlivost a opakovatelnost. V sou časné dob ě 
jsou k dispozici dv ě metody, a sice metoda používající dosp ělé samice 
s odstraněnými vaje čníky a metoda s použitím nezralých mlá ďat bez odstra ­
nění vaječníků. V rámci programu valida čních zkoušek OECD bylo 
prokázáno, že ob ě metody mají srovnatelnou citlivost 
a reprodukovatelnost. Nezralé mlád ě, protože má intaktní 
hypothalamo-hypofýzo-gonadální (HPG) osu, je ovšem pon ěkud mén ě 
specifické, avšak umož ňuje širší rozsah vyšet ření než zví ře 
s odstran ěnými vaje čníky, jelikož m ůže reagovat na chemické látky, které 
interagují s HPG osou, a nikoli pouze s estrogenním receptorem. HPG osa 
potkana je funk ční přibližně ve věku 15 dn ů. Předtím nelze pubertu urych ­
lit, např. podáváním hormonu uvol ňujícího gonadotropiny. Jak samice 
začínají dosahovat puberty, budou mít p řed otevřením vaginy n ěkolik 
tichých cykl ů, které nevedou k vaginálnímu otev ření nebo k ovulaci, ale 
v organismu probíhají ur čité hormonální výkyvy. Jestliže ur čitá chemická 
látka přímo či nepřímo stimuluje HPG osu, vede to k p ředčasné pubert ě, 
časné ovulaci a urychlenému vaginálnímu otev ření. Takové ú činky mohou 
být vyvolány nejen chemickými látkami prost řednictvím p ůsobení na HPG 
osu, ale podobný ú činek může mít i ur čitý typ potravy. N ěkteré diety 
s vyšší úrovní metabolizovatelné energie mohou stimulovat r ůst 
a urychlovat vaginální otev ření, aniž by byly p římo estrogenní. 
U dospělých zvířat s odstran ěnými vaje čníky by takové chemické látky 
nevyvolávaly uterotrofní reakci, jelikož jejich HPG osa nefunguje.  
8. S ohledem na zásadu dobrého zacházení se zví řaty by m ěla být up řednost­ 
ňována metoda používající nezralé potkany, kdy nedochází k chirurgické 
předúpravě zvířat a nedochází také k p řípadnému nepoužití t ěch zvířat, která 
vykazují p říznaky estru ( říje) (viz odstavec 30).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Uterotrofní reakce není čistě estrogenního p ůvodu, tj. reakci mohou vyvolat 
i jiné chemické látky než agonisté nebo antagonisté estrogen ů. Například ke 
stimulativní reakci mohou vést pom ěrně vysoké dávky progesteronu, testos ­
teronu nebo r ůzných syntetických progestin ů (30). Jakoukoli reakci lze 
analyzovat histologicky z hlediska keratinizace a kornifikace vaginy (30). 
Bez ohledu na možný p ůvod reakce by pozitivní výsledek uterotrofní 
biologické zkoušky m ěl běžně vyvolat kroky zam ěřené na další vyjasn ění. 
Další poznatky o estrogenit ě by mohly p řinést studie  in vitro , jako jsou 
studie vazby na estrogenní receptory a studie transkrip ční aktivace, nebo 
jiné in vivo  studie, jako nap ř. studie puberty u samic.  
10. Vzhledem k tomu, že uterotrofní biologická zkouška slouží jako screenin ­
gová zkouška  in vivo , byla při validaci zam ěřena pozornost hlavn ě na dobré 
zacházení se zví řaty a stup ňovitou strategii zkoušení. Proto bylo úsilí 
zaměřeno na p řísné ověření reprodukovatelnosti a citlivosti zkoušky na 
estrogenitu – což je hlavním zájmem u mnoha chemických látek – 
a složce antiestrogenity této zkoušky byla v ěnována malá pozornost. 
Zkoušen byl pouze jeden antiestrogen se silným p ůsobením, jelikož po čet 
chemických látek s jasným antiestrogenním profilem (nezastín ěným určitým 
estrogenním p ůsobením) je velmi omezený. Tato zkušební metoda je tudíž 
určena pro estrogenní protokol a protokol popisující antagonistní stránku 
zkoušky je obsažen v Pokynech (37). Reprodukovatelnost a citlivost zkoušky v p řípadě chemických látek s čistě antiestrogenním p ůsobením 
bude přesněji stanovena pozd ěji, až bude tento zkušební postup po n ějakou 
dobu běžně používán a bude identifikováno více chemických látek s tímto 
druhem p ůsobení.
 
11. Má se za to, že veškeré postupy založené na zví řatech budou spl ňovat 
normy jednotlivých zemí v oblasti pé če o zvířata. Popis pé če a zacházení, 
který je stanoven níže, p ředstavuje minimální požadavky a bude nahrazen 
místními p ředpisy, nap ř. směrnicí Evropského parlamentu a Rady 
2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 o ochran ě zvířat používaných pro v ědecké 
účely (38). Další pokyny týkající se humánního zacházení se zví řaty stano­
vila organizace OECD (25).  
12. Stejn ě jako u všech zkoušek používajících živá zví řata je nezbytné p řed 
zahájením zkoušek zajistit, že údaje jsou skute čně nezbytné. Dv ě podmínky, 
kdy mohou být údaje nutné, jsou nap říklad tyto:  
— vysoký expozi ční potenciál (úrove ň 1 koncep čního rámce, dodatek 2) 
nebo příznaky estrogenity (úrove ň 2), aby se zjistilo, zda takový ú činek 
může nastat  in vivo , 
— účinky nazna čující estrogenitu na úrovni 4 nebo 5 zkoušení  in vivo , aby 
se potvrdilo, že tyto ú činky souvisely s estrogenním mechanismem, 
který nelze objasnit použitím zkoušky  in vitro . 
13. Definice použité p ři této zkušební metod ě jsou uvedeny v dodatku 1.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
PODSTATA ZKOUŠKY  
14. Uterotrofní biologická zkouška je z hlediska své citlivosti založena na 
systému testování zví řat, při kterém hypothalamo-hypofýzo-ovariální osa 
není funk ční, což vede k nízkým endogenním úrovním cirkulujícího estro ­
genu. To zajistí nízkou výchozí hmotnost d ělohy a maximální ší ři reakce na 
podávané estrogeny. Tento požadavek spl ňují dva stavy samic hlodavc ů, 
kdy jsou citlivé na estrogeny:  
i) nezralé samice po odstavení a p řed pubertou; a  
ii) mladé dosp ělé samice po odstran ění vaječníků s dostate čnou dobou na 
to, aby se d ěložní tkán ě mohly vrátit do p ůvodního stavu.  
15. Zkoušená chemická látka je podávána denn ě žaludeční sondou nebo subku ­
tánní injekcí. Odstup ňované dávky zkoušené chemické látky se podávají 
nejméně dvěma experimentálním skupinám (pro pokyny viz odstavec 33) 
pokusných zví řat s použitím jedné úrovn ě dávky na každou skupinu 
a dobou aplikace t ři po sobě jdoucí dny v p řípadě použití metody nezralých 
mláďat a nejmén ě tři po sob ě jdoucí dny v p řípadě metody dosp ělého 
zvířete s odstran ěnými vaje čníky. Přibližně 24 hodin po poslední dávce 
se zvířata podrobí pitv ě. U agonist ů estrogenu se posoudí st řední hmotnost 
dělohy experimentálních skupin zví řat v porovnání se skupinou s vehikulem 
s cílem zjistit, zda došlo ke statisticky významnému zvýšení. Statisticky významné zvýšení st řední hmotnosti d ělohy experimentální skupiny ukazuje 
na pozitivní reakci v této biologické zkoušce.
 
POPIS METODY  
Výběr druhu zví řat 
16. Lze použít b ěžně užívané kmeny laboratorních hlodavc ů. Při validaci byly 
například použity kmeny potkan ů Sprague-Dawley a Wistar. Nem ěly by se 
používat kmeny, o kterých se ví nebo p ředpokládá, že mají mén ě reaktivní 
dělohu. Laborato ř by měla prokázat citlivost použitého kmene, jak je 
popsáno v odstavcích 26 a 27.  
17. Od 30. let 20. století jsou k uterotrofní biologické zkoušce b ěžně používáni 
potkani a myši. Valida ční studie OECD byly provád ěny pouze na potka ­
nech na základ ě toho, že existuje obecná shoda, jež p ředpokládá, že oba 
druhy jsou rovnocenné, a proto by v zájmu úspory zdroj ů a zvířat měl pro 
celosvětové ověření posta čovat jeden druh. Ve v ětšině studií reproduk ční 
a vývojové toxicity je zvoleným druhem potkan. Vzhledem k tomu, že u myší existuje rozsáhlá historická databáze a aby p ůsobnost zkušební 
metody pro provád ění uterotrofní biologické zkoušky na hlodavcích byla 
rozšířena i na použití myší jako zkušebního druhu, byla provedena zkrácená 
následná valida ční studie na myších (16). V souladu s p ůvodním zám ěrem 
úspory zdroj ů a zvířat byl vybrán p řeklenovací p řístup s omezeným po čtem 
zkoušených chemických látek, zú častněných laborato ří a bez testování 
kódovaných vzork ů. Tato p řeklenovací valida ční studie ukazuje, že 
v případě uterotrofní biologické zkoušky na mladých dosp ělých myších 
s odstraněnými vaje čníky jsou údaje získané u potkan ů a myší kvalitativn ě 
i kvantitativn ě v souladu. To umož ňuje v případech, kdy výsledek utero
­
trofní biologické zkoušky m ůže předcházet dlouhodobé studii, použít 
v obou studiích zví řata stejného kmene a p ůvodu. Překlenovací p řístup 
byl omezen na myši s odstran ěnými vaje čníky a zpráva neposkytuje spoleh ­
livý soubor údaj ů pro ověření modelu s nezralými mlá ďaty, a tudíž model 
s nezralými mlá ďaty u myší se do stávající zkušební metody nezahrnuje.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. V n ěkterých p řípadech tedy mohou být místo potkan ů použity myši. Výb ěr 
tohoto druhu je t řeba zdůvodnit na základ ě toxikologických, farmakokine ­
tických a/nebo jiných kritérií. U myší mohou být nezbytné zm ěny 
v testovacím postupu. Nap říklad spot řeba potravy na základ ě tělesné hmot ­
nosti je u myší vyšší než u potkan ů, a obsah fytoestrogenu v potrav ě by 
proto měl být u myší nižší než u potkan ů (9)(20)(22).  
Podmínky chovu a krmení  
19. Veškeré postupy by m ěly vyhovovat místním normám pé če o laboratorní 
zvířata. Zde uvedené popisy pé če a zacházení p ředstavují minimální poža ­
davky a budou nahrazeny místními právními p ředpisy, nap ř. směrnicí 
Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 
o ochraně zvířat používaných pro v ědecké účely (38). Teplota v místnosti 
pro pokusná zví řata by m ěla být 22 °C (s p řibližným rozp ětím ± 3 °C). 
Relativní vlhkost by m ěla být minimáln ě 30 % a pokud možno nep řesáh­
nout 70 %, krom ě doby úklidu místnosti. Cílem by m ěla být relativní 
vlhkost 50–60 %. Osv ětlení by m ělo být um ělé. Mělo by se st řídat 
12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy.  
20. Laboratorní stravu a pitnou vodu dostávají zví řata ad libitum . Mladá 
dospělá zvířata lze chovat jednotliv ě nebo v klecích po skupinách, maxi ­
málně tříčlenných. Vzhledem k nízkému v ěku nezralých zví řat se doporu ­ 
čuje chov v sociálních skupinách.  
21. Je známo, že vysoká úrove ň fytoestrogen ů v laboratorní strav ě zvyšuje 
hmotnost d ělohy u hlodavc ů v míře, která m ůže narušit uterotrofní 
biologickou zkoušku (13)(14)(15). Vysoká úrove ň fytoestrogen ů 
a metabolizovatelné energie v laboratorní strav ě může mít rovn ěž za 
následek časný nástup puberty, jestliže se používají nezralá zví řata. Přítom­
nost fytoestrogen ů vyplývá p ředevším ze za řazení produkt ů ze sóji 
a vojtěšky do laboratorní stravy a ukázalo se, že koncentrace fytoestrogen ů 
v jednotlivých šaržích standardní laboratorní stravy je r ůzná (23). D ůležitou 
proměnnou je t ělesná hmotnost, nebo ť množství spot řebované potravy 
souvisí s t ělesnou hmotností. Skute čná dávka spot řebovaných fytoestrogen ů 
ze stejné stravy se proto m ůže lišit podle druhu a podle v ěku (9). 
U nezralých samic potkana m ůže být spot řeba potravy na jednotku t ělesné 
hmotnosti p řibližně dvojnásobn ě vyšší než u mladých dosp ělých samic 
s odstran ěnými vaje čníky. U mladých dosp ělých myší m ůže být spot řeba 
potravy na jednotku t ělesné hmotnosti p řibližně čtyřnásobně vyšší než 
u mladých dosp ělých samic potkana s odstran ěnými vaje čníky.  
22. Výsledky uterotrofní biologické zkoušky (9)(17)(18)(19) však ukazují, že 
omezené množství fytoestrogen ů ve stravě je přijatelné a nesnižuje citlivost 
biologické zkoušky. Ur čitým vodítkem m ůže být, že u nezralých samic 
potkana Sprague-Dawley a Wistar by úrove ň fytoestrogen ů ve strav ě 
neměla přesáhnout 350 μg ekvivalent ů genisteinu na gram laboratorní 
stravy (6)(9). Taková strava by m ěla být vhodná i p ři zkouškách na 
mladých dosp ělých potkanech s odstran ěnými vaje čníky, protože spot řeba 
potravy m ěřená na jednotku t ělesné hmotnosti je u mladých dosp ělých nižší 
než u nezralých zví řat. Mají-li být použity dosp ělé myši s odstran ěnými 
vaječníky nebo potkani citliv ější na fytoestrogeny, musí být zváženo 
úměrné snížení úrovn ě fytoestrogen ů v stravě (20). Rozdíly v dostupné 
metabolizovatelné energii z r ůzné stravy navíc mohou vést k časovým 
posunům v nástupu puberty (21)(22).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Před studií je nutný pe člivý výběr stravy bez zvýšené úrovn ě fytoestrogen ů 
(jako vodítko viz (6)(9)) nebo zvýšené úrovn ě metabolizovatelné energie, 
jež mohou zkreslit výsledky (15)(17)(19)(22)(36). Pro zajišt ění náležité 
výkonnosti zkušebního systému, který laborato ř použije, jak stanoví 
odstavec 26 a 27, je d ůležité zkontrolovat oba tyto faktory. Pro jistotu by 
v souladu se zásadami správné laboratorní praxe (SLP) m ěly být z každé 
sady stravy podávané b ěhem studie odebrány reprezentativní vzorky pro 
případnou analýzu obsahu fytoestrogen ů (např. v případě vysoké kontrolní 
hmotnosti d ělohy ve srovnání s historickými kontrolami nebo nep řiměřené 
reakce na referen ční estrogen, 17-alfa-ethinylestradiol). Vzorky by m ěly být 
analyzovány b ěhem studie nebo zmrazené na –20 °C nebo ošet řené 
takovým zp ůsobem, aby se zabránilo zm ěně složení p řed analýzou.  
24. Některá steliva mohou obsahovat p řirozeně se vyskytující estrogenní nebo 
antiestrogenní chemické látky (nap ř. je známo, že kuku řičný klas ovliv ňuje 
cykličnost u potkan ů a podle všeho je antiestrogenní). Zvolené stelivo by 
mělo obsahovat minimální úrove ň fytoestrogen ů. 
Příprava zví řat 
25. Pokusná zví řata bez p říznaků jakékoli choroby nebo fyzických abnormalit 
se náhodným výb ěrem rozd ělí do kontrolních a experimentálních skupin. 
Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby byl vliv umíst ění klecí minimali ­
zován. Zví řata se jednozna čně identifikují. Nezralá zví řata by během akli­
matizace m ěla být pokud možno umíst ěna do klecí s matkami nebo adop ­
tivními matkami až do odstavení. Doba aklimatizace p řed zahájením studie 
by u mladých dosp ělých zvířat a u nezralých zví řat dodaných spolu 
s matkami nebo adoptivními matkami m ěla trvat p řibližně 5 dnů. Pokud 
jsou nezralá zví řata získána jako odstavená mlá ďata bez matek, m ůže se 
stát, že dobu aklimatizace bude nutné zkrátit, jelikož podávání dávek by 
mělo začít bezprost ředně po odstavení (viz odstavec 29).  
POSTUP  
Ověření odborné zp ůsobilosti laborato ře 
26. Odbornou zp ůsobilost laborato ře lze ověřit dvěma různými zp ůsoby:  
— pravidelné ov ěřování založené na po čáteční výchozí studii s pozitivní 
kontrolní látkou (viz odstavec 27). Nejmén ě každých 6 m ěsíců – 
a pokaždé, když dojde ke zm ěně, která m ůže ovlivnit provedení studie 
(např. nové složení stravy, zm ěna personálu provád ějícího sekce, 
změna kmene nebo dodavatele zví řat apod.) – by m ěla být ov ěřena 
reakční schopnost zkušebního systému (modelu zví řat) pomocí vhodné 
dávky (na základ ě výchozí studie s pozitivní kontrolní látkou popsané 
v odstavci 27) referen čního estrogenu: 17-alfa-ethinylestradiolu ( číslo 
CAS 57-63-6)(EE).  
— použití soub ěžných kontrol tak, že se do každé zkoušky za řadí skupina, 
které je podávána vhodná dávka referen čního estrogenu.  
Jestliže systém nereaguje podle o čekávání, m ěly by se zkušební podmínky 
přezkoumat a odpovídajícím zp ůsobem upravit. Doporu čuje se, aby dávka 
referenčního estrogenu, která má být použita p ři každém postupu, byla 
přibližně 70 až 80 ED.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Výchozí studie s pozitivní kontrolní látkou.  Dříve, než laborato ř provede 
poprvé studii podle této zkušební metody, m ěla by být prokázána odborná 
způsobilost laborato ře zkouškou reak ční schopnosti daného modelu zví řat, 
při které se vyvolá reakce na dávku referen čního estrogenu: 17-alfa-ethiny ­
lestradiolu ( číslo CAS 57-63-6) (EE) s aplikací nejmén ě čtyř dávek. 
Odpověď hmotnosti d ělohy bude porovnána se zjišt ěnými historickými 
údaji (viz odkaz (5)). Pokud tato výchozí studie s pozitivní kontrolní látkou nedá předpokládané výsledky, m ěly by se p řezkoumat a upravit zkušební 
podmínky.
 
Počet a stav zví řat 
28. Každá pokusná a kontrolní skupina by m ěla zahrnovat nejmén ě 6 zvířat 
(pro oba protokoly metody nezralých mlá ďat a metody dosp ělých 
s odstraněnými vaje čníky).  
Věk nezralých zví řat 
29. U uterotrofní biologické zkoušky s nezralými zví řaty musí být uveden den 
narození. Podávání dávek by m ělo začít dostatečně brzy, aby se zajistilo, že 
na konci podávání zkoušené chemické látky ješt ě nedojde k fyziologickému 
růstu endogenních estrogen ů spojenému s pubertou. Na druhé stran ě existují 
poznatky, že velmi mladá zví řata mohou být mén ě citlivá. Pro stanovení 
optimálního v ěku by každá laborato ř měla vzít v úvahu své vlastní podkla ­
dové údaje o dozrávání.  
Jako všeobecné vodítko lze uvést, že u potkan ů lze začít s podáváním 
dávek ihned po časném odstavení v 18. postnatální den (p řičemž den naro ­
zení je postnatálním dnem 0). Podávání dávek u potkan ů by mělo být 
ukončeno v 21. postnatální den, ale v každém p řípadě před 25. postnatálním 
dnem, protože po dosažení tohoto v ěku se hypothalamo-hypofýzo-ovariální 
osa stává funk ční a úrove ň endogenního estrogenu m ůže začít růst, což je 
doprovázeno r ůstem průměrné základní hmotnosti d ělohy a nár ůstem směro­
datných odchylek ve skupinách (2)(3)(10)(11)(12).  
Postup odstran ění vaječníků 
30. U samic potkana a myši (experimentální skupina a kontrolní skupina), 
kterým mají být odstran ěny vaječníky, by k odstran ění vaječníků mělo 
dojít mezi 6. a 8. týdnem v ěku. U potkan ů by mezi odstran ěním vaječníků 
a prvním dnem podávání m ělo uplynout nejmén ě 14 dnů, aby se umožnil 
návrat dělohy do minimálního, stabilního výchozího stavu. U myší by mezi 
odstraněním vaječníků a prvním dnem podávání m ělo uplynout nejmén ě 7 
dnů. Jelikož pro vyvolání významné cirkulující úrovn ě estrogenů (3) posta čí 
malé množství tkán ě vaječníků, zvířata by před použitím m ěla být nejmén ě 
po pět po sobě jdoucích dn ů (např. u potkan ů v 10.–14. den po odstran ění 
vaječníků) zkoušena pozorováním epiteliálních bun ěk získaných výt ěrem 
z vaginy. Pokud zví řata vykazují jakékoli p říznaky, že vstupují do estru, 
neměla by být použita. Dále by p ři pitvě měly být zkoumány zbytky vaje č­
níků, zda neexistují p říznaky přítomnosti vaje čníkové tkán ě. Pokud ano, 
dané zvíře by nem ělo být použito pro výpo čty (3).  
31. Při zahájení postupu odstran ění vaječníků je zvíře ve ventrální poloze poté, 
co bylo řádně anestetizováno. Řez otevírající dorzo-laterální st ěnu břišní by 
měl být přibližně 1 cm dlouhý, od st ředu mezi spodním okrajem žeber 
a hřebenem kosti ky čelní a několik milimetr ů vedle bo čního okraje beder ­
ního svalu. Vaje čník se vyjme z b řišní dutiny a položí na aseptickou 
podložku. Vaje čník se odd ělí ve spojení vejcovodu s t ělem dělohy. Po 
ujištění, že nedochází k masivnímu krvácení, by b řišní stěna měla být 
uzavřena suturou a k ůže klipsy nebo vhodným stehem. Místa podvazu 
jsou schematicky ukázány na obrázku 1. M ělo by být použito vhodné 
pooperační tišení bolesti v souladu s doporu čením veterinárního léka ře se 
zkušenostmi v oblasti pé če o hlodavce.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Tělesná hmotnost  
32. Při metodě dospělých samic s odstran ěnými vaje čníky tělesná hmotnost 
a hmotnost d ělohy spolu nekorelují, protože hmotnost d ělohy je ovliv ňo­
vána hormony, nap ř. estrogeny, ale nikoli r ůstovými faktory, které regulují 
velikost t ěla. Naopak v modelu s nezralými zví řaty tělesná hmotnost 
s hmotností d ělohy souvisí, dokud dospívají (34). V okamžiku zahájení 
studie by tak v modelu nezralých zví řat měla být odchylka v jejich hmot ­
nosti minimální a nem ěla by překročit ± 20 % st řední hodnoty hmotnosti. 
To znamená, že velikost vrhu by m ěla být chovatelem standardizována, aby 
se zajistilo, že potomstvo r ůzných mate řských zví řat bude krmeno p řibližně 
stejně. Zvířata by m ěla být p řiřazena ke skupinám (kontrolním 
a experimentálním) náhodným rozd ělením z hlediska hmotnosti, takže 
střední tělesná hmotnost každé skupiny se nebude statisticky lišit od které ­
koli jiné skupiny. M ělo by se dbát na to, aby nedošlo k p řiřazení souro ­
zenců z vrhu do stejné experimentální skupiny, pokud možno bez zvyšování 
počtu vrhů, jež mají být používány p ři vyšetřeních.  
Dávkování  
33. K tomu, aby se zjistilo, zda zkoušená chemická látka m ůže mít estrogenní 
účinek in vivo , běžně postačí dvě exponované skupiny a jedna kontrolní 
skupina, a s ohledem na zásadu dobrého zacházení se zví řaty je proto 
upřednostňováno toto uspo řádání. Je-li zám ěrem získat k řivku dávka- 
odpověď nebo extrapolovat na nižší dávky, jsou zapot řebí nejmén ě tři 
exponované skupiny. Jsou-li požadovány informace vycházející za rámec zjištění estrogenního p ůsobení (nap ř. odhad potence), m ěl by být zvážen 
odlišný režim dávkování. S výjimkou podávání zkoušené chemické látky se 
se zvířaty v kontrolní skupin ě zachází stejn ě jako se zví řaty 
v experimentální skupin ě. Pokud se p ři podávání zkoušené chemické 
látky používá vehikulum, podává se kontrolní skupin ě ve stejném objemu, 
který byl použit v experimentálních skupinách (nebo v nejvyšším objemu 
použitém v exponovaných skupinách, pokud je u jednotlivých skupin rozdílný).
 
34. V p řípadě uterotrofní biologické zkoušky je cílem vybrat dávky, které 
zaručují přežití zvířat a nezpůsobují významnou toxicitu nebo utrpení zví řat 
po uplynutí t ří po sob ě jdoucích dn ů podávání chemické látky, až do 
maximální dávky 1 000 mg/kg/den. P ři výběru všech úrovní dávek by 
měly být zohledn ěny veškeré existující údaje o toxických 
a toxikokinetických vlastnostech, které jsou pro zkoušenou chemickou látku nebo p říbuzné materiály dostupné. Nejvyšší úrove ň dávky by m ěla 
především zohlednit hodnotu LD50 a/nebo informace o akutní toxicit ě, aby 
nedošlo k úmrtí, vážnému poškození nebo utrpení zví řat (24)(25)(26). 
Nejvyšší dávka by m ěla představovat maximální tolerovanou dávku; p řijata 
by byla i studie provedená s úrovní dávky, jež vyvolala pozitivní uterotrofní 
reakci. V rámci screeningu jsou obecn ě přijatelné velké intervaly 
v dávkování (nap ř. jedna polovina logaritmických jednotek, což odpovídá 
zvyšování dávky po 3,2, nebo dokonce až do 1 logaritmické jednotky). Nejsou-li dostupné žádné vhodné údaje, m ůže být provedena p ředběžná 
studie pro zjišt ění rozmezí dávek, aby se podle ní ur čily dávky, které 
mají být použity.
 
35. Alternativn ě, pokud m ůže být estrogenní potence agonistní látky odhadnuta 
podle údaj ů získaných  in vitro  (nebo  in silico ), mohou být pro výb ěr dávky 
vzaty v úvahu tyto údaje. Nap říklad množství zkoušené chemické látky, 
které by vyvolalo uterotrofní reakce ekvivalentní referen ční agonistní látce 
(ethinylestradiolu), se odhaduje podle jejích relativních  in vitro  potencí v ůči 
ethinylestradiolu. Nejvyšší zkušební dávka by byla získána vynásobením 
této ekvivalentní dávky vhodným koeficientem, nap ř. 10 nebo 100.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Experimentální zjišt ění rozmezí dávek  
36. V p řípadě nutnosti m ůže být provedena p ředběžná studie pro zjišt ění 
rozmezí dávek na n ěkolika zví řatech. V této souvislosti lze použít Pokyn 
OECD č. 19 (25), který stanoví klinické p říznaky ukazující na toxicitu nebo 
utrpení zví řat. Je-li to v rámci této p ředběžné studie možné, pak po t řech 
dnech podávání lze p řibližně po 24 hodinách od poslední dávky vyjmout 
dělohy a zvážit je. Tyto údaje by poté mohly být použity jako pomocné 
údaje pro naplánování hlavní studie (vybrat p řijatelnou nejvyšší a nejnižší 
dávku a doporu čit počet exponovaných skupin).  
Podávání látky  
37. Zkoušená chemická látka je podávána ústní sondou nebo subkutánní injekcí. 
Při volbě způsobu podávání musí být zohledn ěny zásady dobrého zacházení 
se zvířaty, jakož i toxikologické aspekty, jako je vhodnost zvoleného 
způsobu podávání z hlediska expozice člověka dané chemické látce (nap ř. 
ústní sonda pro modelování požití, subkutánní injekce pro modelování 
inhalace nebo adsorpce k ůží), fyzikáln ě-chemické vlastnosti zkoušené 
chemické látky, a zvlášt ě pak existující toxikologické informace a údaje 
o metabolismu a kinetice (nap ř. potřeba vyhnout se metabolismu prvního 
průchodu, lepší ú činnost při konkrétním zp ůsobu podávání).  
38. Kdykoliv to bude možné, doporu čuje se nejprve zvážit použití vodného 
roztoku/suspenze. Jelikož však v ětšina estrogenních ligand ů nebo jejich 
metabolických prekursor ů má tendenci být hydrofobní, nej častějším 
postupem je použití roztoku/emulze v oleji (nap ř. v kukuřičném, arašído ­
vém, sezamovém nebo olivovém oleji). Tyto oleje však mají r ůznou kalo ­
rickou hodnotu a obsah tuku, a vehikulum by tak mohlo ovlivnit celkový 
příjem metabolizovatelné energie, což by mohlo zm ěnit měřené sledované 
vlastnosti, nap ř. hmotnost d ělohy, zvlášt ě při použití metody s nezralými 
zvířaty (33). Každé vehikulum, které má být použito, by m ělo být před 
studií testováno oproti kontrolní skupin ě bez vehikula. Zkoušené chemické 
látky lze rozpustit v minimálním množství 95 % ethanolu nebo jiných 
vhodných rozpoušt ědel a zředit na kone čnou pracovní koncentraci ve 
zkušebním vehikulu. Musí být známa toxická charakteristika daného rozpouštědla a měla by být prov ěřena na kontrolní skupin ě vystavené 
pouze působení rozpoušt ědla. Je-li zkoušená chemická látka považována 
za stabilní, lze rozpušt ění zkoušené chemické látky napomoci mírným 
ohřátím a intenzivním mechanickým p ůsobením. M ěla by být ur čena stálost 
zkoušené chemické látky ve vehikulu. Je-li zkoušená chemická látka po 
dobu studie stálá, lze p řipravit jeden zásobní roztok zkoušené chemické 
látky a denn ě připravovat roztok podle stanoveného dávkování.
 
39. Nastavení dávkování bude záviset na použitém modelu (viz odstavec 29 
o modelu nezralých zví řat a odstavec 30 o modelu dosp ělých zvířat 
s odstran ěnými vaje čníky). Nezralým samicím potkana se denn ě podává 
zkoušená chemická látka po dobu t ří po sobě jdoucích dn ů. Třídenní expo ­
zice se doporu čuje také u samic potkana s odstran ěnými vaje čníky, ale delší 
expozice jsou p řijatelné a mohou zlepšit detekci slab ě působících chemic ­
kých látek. U samic myší s odstran ěnými vaje čníky by aplikace po dobu 3 
dnů měla být dostate čná s tím, že prodloužení až na sedm dn ů by v případě 
silných agonist ů estrogenů nepřineslo významnou výhodu. Avšak u slabých 
estrogenů podle výsledk ů validační studie (16) toto neplatí a dávkování 
u dospělých myší s odstran ěnými vaje čníky by m ělo být prodlouženo až 
na 7 po sob ě jdoucích dn ů.Dávky je t řeba podávat každý den p řibližně ve 
stejnou dobu. M ěly by být p řizpůsobeny tak, aby se udržela konstantní 
úroveň dávky vzhledem k t ělesné hmotnosti zví řete (např. miligram zkou ­ 
šené chemické látky na kilogram t ělesné hmotnosti za den). Pokud jde 
o zkušební objem, jeho variabilita by na základ ě tělesné hmotnosti m ěla 
být minimalizována nastavením koncentrací podávaného roztoku tak, aby 
byl zajišt ěn konstantní objem ve vztahu k t ělesné hmotnosti p ři všech 
úrovních dávky a p ři jakémkoli zp ůsobu podávání.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Pokud se zkoušená chemická látka podává sondou, podává se zví řatům 
v jediné denní dávce za použití žalude ční sondy nebo vhodné intuba ční 
kanyly. Maximální objem tekutiny, kterou lze podat najednou, závisí na velikosti pokusného zví řete. Je třeba dodržovat místní pokyny týkající se 
péče o zvířata, avšak objem by nem ěl překročit 5 ml na 1 kg t ělesné 
hmotnosti, s výjimkou vodných roztok ů, kdy lze použít 10 ml na 1 kg 
tělesné hmotnosti.
 
41. Pokud se zkoušená chemická látka podává subkutánní injekcí, podává se 
v jedné denní dávce. Dávky by m ěly být aplikovány do dorsální skapulární 
nebo lumbální oblasti sterilní jehlou (nap ř. velikosti 23- nebo 25-gauge) 
a tuberkulinovou injek ční stříkačkou. Oholení místa vpichu je dobrovolné. 
Jakékoli ztráty, únik v míst ě vpichu nebo neúplné dávkování se zazname ­
nají. Celkový objem vst říknutý jednomu potkanovi za den by nem ěl 
překročit 5 ml na 1 kg t ělesné hmotnosti, rozd ělený do dvou míst vpichu, 
s výjimkou vodných roztok ů, kdy lze použít 10 ml na 1 kg t ělesné 
hmotnosti.  
Pozorování  
Obecná a klinická pozorování  
42. Všeobecné klinické pozorování by se m ělo provád ět nejméně jednou denn ě, 
a častěji, pokud jsou zpozorovány p říznaky toxicity. M ělo by se provád ět 
každý den nejlépe ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby o čeká­
vaného maxima ú činku po podání látky. Provede se prohlídka všech zví řat 
za účelem zjišt ění mortality, morbidity a obecných klinických p říznaků, 
jako jsou zm ěny chování, zm ěny na kůži, na srsti, na o čích, na sliznicích, 
výskyt sekret ů a exkret ů a vegetativních funkcí (nap ř. slzení, zježení srsti, 
velikost zornic, nezvyklé dýchání).  
Tělesná hmotnost a spot řeba potravy  
43. Všechna zví řata by se m ěla denně zvážit s p řesností na 0,1 g, první vážení 
by mělo být provedeno t ěsně před zahájením aplikace, tj. když jsou zví řata 
rozdělena do skupin. Alternativn ě lze měřit množství potravy spot řebované 
během doby aplikace na každou klec zvážením krmítek. Výsledky spot řeby 
potravy by m ěly být vyjád řeny v gramech na jednoho potkana za den.  
Sekce a m ěření hmotnosti d ělohy 
44. Po 24 hodinách od poslední aplikace se potkani humánn ě usmrtí. Ideáln ě 
bude pořadí pitev ur čeno náhodným výb ěrem mezi skupinami, aby nedošlo 
k přímému postupu od nejmén ě exponované skupiny k nejvíce exponované 
skupině, či naopak, což by mohlo pon ěkud ovlivnit údaje. Cílem biologické 
zkoušky je zm ěřit hmotnost d ělohy ve vlhkém a vysušeném stavu. Hmot ­
nost ve vlhkém stavu zahrnuje d ělohu a obsah luminální tekutiny. Hmotnost 
ve vysušeném stavu se m ěří po vytla čení a odstran ění luminálního obsahu.  
45. Před sekcí bude vyšet řena vagina, jaký je stav jejího otev ření u nezralých 
zvířat. Postup sekce za číná otevřením břišní stěny počínaje od sr ůstu stydké 
kosti. Poté se od dorzální b řišní stěny oddělí roh dělohy a vaje čníky. Od 
ventrální a laterální strany d ělohy a vaginy se odd ělí močový měchýř 
a močovody. Odd ěluje se fibrózní adheze mezi rektem a vaginou dokud 
nelze identifikovat spojení poševního vchodu s perineální k ůží. Děloha 
a vagina se odd ělí od těla naříznutím poševní st ěny těsně nad spojením 
mezi perineální k ůží, jak je ukázáno na obrázku 2. D ěloha by m ěla být 
oddělena od bo čního svalstva jemným od říznutím d ěložního okruží v bod ě ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
jeho připojení po celé délce dorzáln ě laterálního aspektu každého d ěložního 
rohu. Po odd ělení od t ěla by s d ělohou mělo být zacházeno dostate čně 
rychle, aby se zamezilo vysychání tekutin. U malých tkání, jako je d ěloha, 
ztráta hmotnosti v d ůsledku vysychání nabývá na významu (23). Jsou-li 
přítomny vaje čníky, odd ělí se ve vejcovodu, čímž se zamezí ztráty lumi ­
nální tekutiny z d ěložního rohu. Pokud byly u zví řete vaječníky odstran ěny, 
měly by být pahýly vyšet řeny, zda nejsou p řítomny tkán ě vaječníků. 
Přebytečný tuk a spojovací tká ň by měly být odstran ěny. Vagina se odd ělí 
od dělohy těsně pod děložním hrdlem, takže hrdlo z ůstane s tělem dělohy, 
jak je ukázáno na obrázku 2.  
46. Každá d ěloha by m ěla být přenesena do jednozna čně označené a zvážené 
nádobky (nap ř. Petriho misky nebo plastové misky vah), p řičemž je nadále 
třeba dbát na to, aby nedošlo k vysychání p řed zvážením (nap ř. do nádobky 
lze umístit filtra ční papír slab ě navlhčený fyziologickým roztokem). D ěloha 
s luminální tekutinou se zváží s p řesností na 0,1 mg (hmotnost d ělohy ve 
vlhkém stavu).  
47. Každá d ěloha pak bude jednotliv ě zpracována za ú čelem odstran ění lumi­
nální tekutiny. Oba d ěložní rohy budou propíchnuty nebo podéln ě rozří­
znuty. Děloha se položí na slab ě zvlhčený filtra ční papír (nap ř. Whatman 
č. 3) a jemn ě se stlačí druhým kusem slab ě navlhčeného filtra čního papíru 
tak, aby luminální tekutina byla zcela odstran ěna. Děloha bez luminálního 
obsahu se zváží s p řesností na 0,1 mg (hmotnost d ělohy ve vysušeném 
stavu).  
48. Hmotnost d ělohy při ukončení studie lze použít pro potvrzení toho, že nebyl 
překročen vhodný v ěk u nezralého intaktního potkana, avšak rozhodující 
v tomto sm ěru jsou historické údaje o kmeni potkan ů použitém laborato ří 
(viz odstavec 56 pro interpretaci výsledk ů). 
Volitelná vyšet ření 
49. Po zvážení m ůže být děloha fixována do 10 % neutrálního pufrovaného 
formalínu, aby po zbarvení hemotoxylinem a eosinem (HE) mohla být 
podrobena histopatologickému vyšet ření. Vaginu lze vyšet řit odpovídajícím 
způsobem (viz odstavec 9). Dále m ůže být provedeno morfometrické 
měření endometriálního epitelu za ú čelem kvantitativního srovnání.  
ÚDAJE A ZPRÁVY  
Údaje  
50. Údaje o studii by m ěly zahrnovat:  
— počet zvířat na začátku studie,  
— počet a identifikaci zví řat nalezených uhynulých nebo zví řat utracených 
během zkoušky z humánních d ůvodů a datum a čas každého úmrtí nebo 
humánního usmrcení,  
— počet a identifikaci zví řat vykazujících p říznaky toxicity a popis zjišt ě­
ných příznaků toxicity, v četně doby nástupu, doby trvání a závažnosti 
toxických ú činků, a 
— počet a identifikaci zví řat vykazujících léze a popis typu lézí.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. U jednotlivých zví řat by měly být zaznamenány údaje o t ělesné hmotnosti, 
hmotnosti d ělohy ve vlhkém stavu a hmotnosti d ělohy ve vysušeném stavu. 
Jednotné statistické analýzy agonistních látek by m ěly být použity ke stano ­
vení toho, zda podávání zkoušené chemické látky vedlo ke statisticky významnému (p < 0,05) zvýšení hmotnosti d ělohy. Měly by být provedeny 
vhodné statistické analýzy za ú čelem zjišt ění, zda v souvislosti s aplikací 
došlo ke zm ěnám hmotnosti d ělohy ve vlhkém a ve vysušeném stavu. Údaje 
lze například hodnotit pomocí metody analýzy kovariance (ANCOVA), kdy 
kovariátou (doprovodnou prom ěnnou) bude t ělesná hmotnost p ři pitvě. Před 
analýzou údaj ů lze provést logaritmickou transformaci údaj ů o děloze stabi ­
lizující rozptyl. Pro provedení párových srovnání každé exponované skupiny s kontrolními skupinami, kterým bylo podáváno vehikulum, a pro výpo čet interval ů spolehlivosti je vhodné použít Dunnettova 
a Hsuova testu. Pro zjišt ění případných odlehlých hodnot a posouzení 
homogenity rozptyl ů lze použít metodu  Studentised residual plots . Tyto 
postupy byly použity ve valida čním programu OECD za použití postupu 
PROC GLM v systému statistické analýzy (SAS Institute, Cary, NC), verze 
8 (6)(7).
 
52. Závěrečná zpráva musí obsahovat:  
Zkušební za řízení:  
— odpov ědní pracovníci a jejich odpov ědnost v rámci studie,  
— údaje z výchozí zkoušky s pozitivní kontrolní látkou a údaje 
z pravidelných pozitivních kontrol (viz odstavce 26 a 27).  
Zkoušená chemická látka:  
— charakterizace zkoušených chemických látek,  
— fyzikální povaha a tam, kde je to podstatné, fyzikáln ě-chemické 
vlastnosti,  
— metoda a frekvence p řípravy roztok ů, 
— veškeré získané údaje o stabilit ě, 
— veškeré analýzy roztok ů použitých k aplikaci  
Vehikulum:  
— charakterizace vehikula použitého p ři zkoušce (povaha, dodavatel 
a šarže),  
— zdůvodnění výběru vehikula (pokud není použita voda).  
Pokusná zví řata: 
— druh a kmen a zd ůvodnění jejich výb ěru, 
— dodavatel a konkrétní dodavatelské za řízení,  
— věk při dodání s datem narození,  
— v případě nezralých zví řat, zda byla dodána s matkou nebo adoptivní 
matkou, či nikoli, a datum odstavení,  
— podrobnosti o postupu aklimatizace zví řat, 
— počet zvířat v každé kleci,  
— podrobnosti a metoda identifikace jednotlivých zví řat a skupin.  
Podmínky zkoušky:  
— podrobnosti o procesu náhodného výb ěru (tj. použitá metoda),  
— zdůvodnění výběru dávek,  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— podrobnosti o složení zkoušené chemické látky, její dosažené koncent ­
race, stabilita a homogenita,  
— podrobnosti o podávání zkoušené chemické látky a zd ůvodnění volby 
způsobu expozice,  
— strava (název, typ, dodavatel, obsah a úrove ň fytoestrogen ů, je-li 
známa),  
— zdroj vody (nap ř. vodovodní voda nebo filtrovaná voda) a dodávka 
(potrubím z velké nádrže, v lahvích apod.),  
— stelivo (název, typ, dodavatel, obsah),  
— záznam o podmínkách chovu v kleci, interval osv ětlení, teplota 
a vlhkost v místnosti, úklid místnosti,  
— podrobný popis postup ů pitvy a vážení d ělohy,  
— popis statistických postup ů. 
Výsledky  
U jednotlivých zví řat: 
— všechny denní t ělesné hmotnosti jednotlivých zví řat (od přidělení do 
skupin až do pitvy) (s p řesností na 0,1 g),  
— věk každého zví řete (ve dnech, den narození se po čítá jako den 0) p ři 
zahájení podávání zkoušené chemické látky,  
— datum a čas podání každé dávky,  
— vypočtený objem a velikost podávaných dávek a pozorování ztrát látky 
během podávání nebo po podání,  
— denní záznamy o stavu zví řete, včetně významných p říznaků 
a pozorování,  
— předpokládaná p říčina smrti (pokud byla zví řata během studie nalezena 
ve stavu agónie nebo uhynulá),  
— datum a čas humánního usmrcení s časovým intervalem od posledního 
podání dávky,  
— hmotnost d ělohy ve vlhkém stavu (s p řesností na 0,1 mg) a jakékoli 
zjištěné ztráty luminální tekutiny b ěhem sekce a p řípravy na vážení,  
— hmotnost d ělohy ve vysušeném stavu (s p řesností na 0,1 mg).  
U každé skupiny zví řat: 
— průměrná denní t ělesná hmotnost (s p řesností na 0,1 g) a sm ěrodatná 
odchylka (od p řiřazení ke skupinám až do pitvy),  
— průměrná hmotnost vlhké d ělohy a pr ůměrná hmotnost usušené d ělohy 
(s přesností na 0,1 mg) a sm ěrodatné odchylky,  
— denní spot řeba potravy, je-li m ěřena (vypo čítaná jako gramy spot řebo­
vané potravy na každé zví ře), ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— výsledky statistických analýz srovnávajících hmotnosti d ělohy ve 
vlhkém a ve vysušeném stavu u experimentálních skupin se stejnými 
měřeními v kontrolních skupinách s vehikulem,  
— výsledky statistické analýzy srovnávající celkovou t ělesnou hmotnost 
a přírůstek tělesné hmotnosti experimentálních skupin se stejnými m ěře­
ními v kontrolních skupinách s vehikulem.  
53. Shrnutí d ůležitých aspekt ů zkušební metody, které mohou sloužit jako 
vodítko  
Potkani Myši  
Zvířata 
Kmen B ěžně užívaný kmen laboratorních hlodavc ů 
Počet zvířat Nejmén ě 6 zvířat v každé exponované skupin ě 
Počet skupin Nejmén ě 2 zkušební skupiny (viz pokyny v odstavci 33) a 1 
skupina negativní kontroly 
Pokyny týkající se skupin pozitivní kontroly viz odstavec 26 
a 27)  
Podmínky chovu a krmení  
v místnosti pro zví řata 22 °C ± 3 °C 
Relativní vlhkost 50–60 %, nejmén ě 30 % a nejvýše 70 % 
Denní střídání osv ětlení 12 hodin sv ětla, 12 hodin tmy 
Strava a pitná voda Ad libitum Chov Jednotliv ě nebo ve skupinách až do t ří zvířat (u nezralých zví řat 
se doporu čuje chov v sociálních skupinách) 
Strava a stelivo Doporu čuje se nízká úrove ň fytoestrogen ů ve stravě a stelivu  
Postup  
Metoda Metoda s nezralými zví řaty bez 
odstranění vaječníků (upřed­
nostňovaná metoda) 
Metoda s dosp ělými samicemi 
s odstraněnými vaje čníky Metoda s dosp ělými samicemi 
s odstraněnými vaje
čníky 
Věk podávání dávek 
u nezralých zví řat Nejdříve v 18. postnatální den. 
Podávání by m ělo být ukon ­ 
čeno před 25. postnatálním 
dnem. V rámci stávající zkušební 
metody není relevantní. 
Věk odstran ění vaječníků 6. až 8. týden v ěku. 
Věk podávání dávek 
u zvířat s odstran ěnými 
vaječníky Mezi odstran ěním vaječníků 
a 1. dnem podávání by m ělo 
uplynout nejmén ě 14 dnů. Mezi odstran ěním vaječníků 
a 1. dnem podávání by m ělo 
uplynout nejmén ě 7 dnů. 
Tělesná hmotnost Rozdíly v t ělesné hmotnosti by m ěly být minimální a od st řední 
hmotnosti by se m ěly lišit nejvýše o ± 20 %.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Potkani Myši  
Dávkování  
Způsob podání Orální sondou nebo subkutánní injekcí. 
Četnost podávání Jedna denní dávka 
Objem látky pro sondu 
nebo injekci ≤ 5 ml na 1 kg t ělesné hmotnosti (nebo až 10 ml na 1 kg t ělesné 
hmotnosti v p řípadě vodného roztoku) (ve 2 injekcích p ři 
subkutánním zp ůsobu) 
Trvání podávání 3 po sob ě jdoucí dny u modelu 
s nezralými 
Nejméně 3 po sob ě jdoucí dny 
u modelu s odstran ěnými 
vaječníky 7 po sobě jdoucích dn ů 
u modelu s odstran ěnými 
vaječníky 
Doba pitvy P řibližně 24 hodin po poslední dávce  
Výsledky  
Pozitivní reakce Statisticky významné zvýšení st řední hmotnosti d ělohy (ve 
vlhkém a/nebo ve vysušeném stavu) 
Referenční estrogen 17-alfa-ethinylestradiol  
POKYNY PRO INTERPRETACI A PLATNOST VÝSLEDK Ů 
54. Obecn ě by zkouška estrogenity m ěla být považována za pozitivní, jestliže 
existuje statisticky významné zvýšení hmotnosti d ělohy (p < 0,05) p řinej­
menším p ři vysoké úrovni dávky v porovnání s kontrolní skupinou vysta ­
venou pouze p ůsobení rozpoušt ědla. Pozitivní výsledek je dále podpo řen 
prokázáním biologicky p řijatelného vztahu mezi dávkou a velikostí odezvy 
s přihlédnutím k tomu, že tvar k řivky dávka-odpov ěď může ovlivnit p řekrý­
vající se estrogenní a antiestrogenní p ůsobení zkoušené chemické látky.  
55. Musí se dbát na to, aby nebyla p řekročena maximální tolerovaná dávka, aby 
bylo možno provést smysluplnou interpretaci údaj ů. V této souvislosti je 
třeba pečlivě posoudit snížení t ělesné hmotnosti, klinické p říznaky 
a jakékoli další nálezy.  
56. Důležitým faktorem pro p řijetí údajů získaných p ři uterotrofní biologické 
zkoušce jsou hmotnosti d ělohy v kontrolní skupin ě s vehikulem. Vysoké 
kontrolní hodnoty mohou zpochybnit citlivost biologické zkoušky 
a schopnost odhalit velmi slabé agonisty estrogenu. Literární rešerše 
a údaje získané p ři validaci uterotrofní biologické zkoušky nazna čují, že 
k případům vysokých kontrolních hodnot dochází spontánn ě, zejména 
u nezralých zví řat (2)(3)(6)(9). Jelikož hmotnost d ělohy nezralých potkan ů 
závisí na mnoha prom ěnných, jako je kmen nebo t ělesná hmotnost, nelze 
pro hmotnost d ělohy s kone čnou platností stanovit žádnou horní hranici. 
Jako určité vodítko m ůže posloužit, že pokud jsou hmotnosti d ělohy ve 
vysušeném stavu u nezralých potkan ů v kontrolní skupin ě v rozmezí 40 
až 45 mg, m ěly by být výsledky považovány za podez řelé, a hmotnosti 
dělohy vyšší než 45 mg mohou vést k provedení nové zkoušky. Toto však 
musí být zváženo v každém jednotlivém p řípadě (3)(6)(8). P ři zkouškách 
s dospělými potkany neúplné odstran ění vaječníků ponechá vaje čníkovou 
tkáň, která m ůže produkovat endogenní estrogen a brzdit návrat hmotnosti 
dělohy do p ůvodního stavu.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Hmotnosti d ělohy ve vysušeném stavu u zví řat z kontrolní skupiny 
s vehikulem, které jsou nižší než 0,09 % t ělesné hmotnosti pro nezralé 
samice potkana a nižší než 0,04 % t ělesné hmotnosti pro mladé dosp ělé 
samice s odstran ěnými vaje čníky, podle všeho znamenají p řijatelné 
výsledky [viz tabulka 31 (2)]. Jestliže jsou hmotnosti d ělohy v kontrolní 
skupině vyšší než tyto hodnoty, m ěly by být p řezkoumány r ůzné faktory 
včetně věku zvířat, řádného odstran ění vaječníků, obsahu fytoestrogen ů ve 
stravě atd. a negativní výsledky zkoušky (žádné p říznaky estrogenní akti ­
vity) by m ěly být používány s obez řetností.  
58. V laborato ři by měly být uchovávány historické údaje o kontrolních skupi ­
nách s vehikulem. V laborato ři by rovn ěž měly být uchovávány historické 
údaje o reakcích na pozitivní referen ční estrogeny, jako je 17-alfa-ethinyle ­
stradiol. Laborato ře též mohou zkoušet reakce na známé slabé agonisty 
estrogenů. Všechny tyto údaje je možné porovnat s dostupnými údaji 
(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8), aby bylo zaru čeno, že metody používané laborato ří 
zajišťují dostate čnou citlivost.  
59. Hmotnosti d ěloh ve vysušeném stavu v pr ůběhu valida ční studie OECD 
vykazovaly menší variabilitu než hmotnosti d ěloh ve vlhkém stavu (6)(7). 
Výrazná reakce p ři kterémkoli m ěření by však ukazovala na to, že zkoušená 
chemická látka je z hlediska estrogenního p ůsobení pozitivní.  
60. Uterotrofní reakce není zcela estrogenního p ůvodu, avšak pozitivní výsledek 
uterotrofní biologické zkoušky by obecn ě měl být interpretován jako d ůkaz 
estrogenního potenciálu  in vivo  a měl by normáln ě vyvolat kroky sm ěřující 
k dalšímu vyjasn ění (viz odstavec 9 a „OECD Conceptual Framework for the 
Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals“, p říloha 2).  
Obrázek 1  
Schematický diagram ukazující chirurgické odstran ění vaječníků
 
Postup za číná otevřením dorzo-laterální st ěny břišní ve st ředním bod ě mezi 
spodním okrajem žeber a h řebenem kosti ky čelní, několik milimetr ů vedle 
bočního okraje bederního svalu. Uvnit ř břišní dutiny by m ěly být umíst ěny 
vaječníky. Na aseptickém poli se vaje čníky poté fyzicky odd ělí od břišní 
dutiny, mezi vaje čník a dělohu se umístí podvaz za ú čelem kontroly krvá ­
cení a vaje čník se nad podvazem odd ělí řezem ve spojení vejcovodu 
s každým d ěložním rohem. Po ujišt ění, že nep řetrvává žádné výrazné krvá ­
cení, se b řišní stěna uzavře suturou a k ůže se uzav ře např. klipy nebo 
suturou. Zví řatům by m ělo být umožn ěno zotavení a návrat hmotnosti 
dělohy do p ůvodního stavu po dobu nejmén ě 14 dnů před použitím.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Obrázek 2  
Odstranění a zpracování d ěložních tkání pro m ěření hmotnosti
  
Postup za číná otevřením břišní stěny ve srůstu stydké kosti. Poté se od dorzální 
břišní stěny oddělí každý z vaje čníků, jsou-li p řítomny, a roh d ělohy. Od 
ventrální a laterální strany d ělohy a vaginy se odd ělí močový měchýř 
a močovody. Odd ěluje se fibrózní adheze mezi rektem a vaginou, dokud nelze 
identifikovat spojení poševního vchodu s perineální k ůží. Děloha a vagina se 
oddělí od těla naříznutím poševní st ěny těsně nad spojením mezi perineální 
kůží, jak je ukázáno na obrázku. D ěloha by m ěla být odd ělena od bo čního 
svalstva jemným od říznutím d ěložního okruží v bod ě jeho připojení po celé 
délce dorzáln ě laterálního aspektu každého d ěložního rohu. Po odd ělení od těla 
se odstraní p řebytečný tuk a spojovací tká ň. Jsou-li p řítomny vaje čníky, odd ělí se 
ve vejcovodu, aby nedošlo ke ztrát ě luminální tekutiny z d ěložního rohu. Pokud 
byly zvířeti vaječníky odstran ěny, měly by se vyšet řit pahýly, zda nejsou 
přítomny tkán ě vaječníků. Vagina se odd ělí od dělohy těsně pod děložním 
hrdlem, takže hrdlo z ůstane s tělem dělohy, jak je ukázáno na obrázku. Poté 
lze dělohu zvážit.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Antiestrogenita:  je schopnost chemické látky potla čit působení 17-beta-estra ­
diolu v organismu savc ů. 
Citlivost:  je podíl všech pozitivních/ú činných chemických látek, které jsou 
správně klasifikovány zkouškou. Je to m ěřítko přesnosti zkušební metody, 
která dává kategorické výsledky, a je d ůležitým prvkem p ři hodnocení relevance 
zkušební metody.  
Datum narození:  je 0. postnatální den.  
Dávkování:  je obecný termín zahrnující dávku, četnost a trvání podávání látky.  
Dávka:  je množství podané zkoušené chemické látky. U uterotrofní biologické 
zkoušky je dávka vyjád řena jako hmotnost zkoušené chemické látky na jednotku 
tělesné hmotnosti zkušebního zví řete za den (nap ř. mg/kg tělesné hmotnosti/den).  
Estrogenita:  je schopnost chemické látky p ůsobit jako 17-beta-estradiol 
v organismu savc ů. 
Chemická látka:  znamená látku nebo sm ěs. 
Maximální tolerovaná dávka (MTD):  je nejvyšší množství chemické látky, 
které, je-li zavedeno do t ěla, zkušební zví řata neusmrtí (ozna čuje se jako LD  0 ) 
(IUPAC, 1993).  
Specifičnost:  je podíl všech negativních/neú činných chemických látek, které jsou 
správně zkouškou klasifikovány. Je to m ěřítko přesnosti zkušební metody, která 
dává jednozna čné výsledky, a je d ůležitým prvkem p ři hodnocení relevance 
zkušební metody.  
Uterotrofní:  je termín používaný k popisu pozitivního vlivu na r ůst děložních 
tkání.  
Validace:  je vědecký proces, jehož cílem je charakterizovat provozní požadavky 
a provozní omezení zkušební metody a prokázat její spolehlivost a relevanci pro určitý konkrétní cíl.
 
X. postnatální den:  je x-tý den života po dni narození.  
Zkoušená chemická látka:  znamená jakoukoli látku nebo sm ěs zkoušenou touto 
zkušební metodou.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Dodatek 2
  
VMG mamm: Skupina pro řízení validace zkoušek provád ěných na savcích
 POZNÁMKY KE KONCEP ČNÍMU RÁMCI  
Poznámka 1:  Vstupy a výstupy na všech úrovních jsou možné a závisejí na 
aktuální pot řebě informací pro ú čely posouzení nebezpe čí 
a rizika.  
Poznámka 2:  Na úrovni 5 by ekotoxikologie m ěla zahrnovat ú činky, které 
ukazují na mechanismy negativních ú činků a potenciální poško ­
zení populace.  
Poznámka 3:  Pokud multimodální model zahrnuje n ěkolik zkoušek pro jedno ­
tlivý účinek, pak by uvedený model nahradil použití t ěchto 
jednotlivých zkoušek.  
Poznámka 4:  Hodnocení každé chemické látky by m ělo být specifické pro 
každý případ a m ělo by brát v úvahu všechny dostupné infor ­
mace s p řihlédnutím k úrovni v koncep čním rámci.  
Poznámka 5:  Uvedený koncep ční rámec by v sou časnosti nem ěl být pova ­ 
žován za vy čerpávající. Na úrovni 3, 4 a 5 obsahuje zkoušky, 
které jsou bu ď dostupné, nebo u kterých probíhá validace. Pokud 
jde o druhou jmenovanou skupinu, jsou tyto zkoušky zahrnuty 
prozatímn ě. Jakmile budou vyvinuty a validovány, budou do 
rámce formáln ě přidány.  
Poznámka 6:  U úrovn ě 5 nelze mít za to, že obsahuje pouze kone čné zkoušky. 
Zkoušky zahrnuté do této úrovn ě přispívají k obecnému posou ­
zení nebezpe čí a rizik.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
LITERATURA  
1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic 
Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.
 
3) Owens, J.W., Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the 
Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists 
and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic 
Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32, 445–520.  
4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/ JM/MONO(2006)33.
 
5) Kanno, J., Onyon, L., Haseman, J., Fenner-Crisp, P., Ashby, J., Owens, 
W. (2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for  in vivo  estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109, 785–94.  
6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.  
7) Kanno, J., Onyon, L., Peddada, S., Ashby, J., Jacob, E., Owens, W. 
(2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111, 
1530–1549.
 
8) Kanno, J., Onyon, L., Peddada, S., Ashby, J., Jacob, E., Owens, W. 
(2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111, 1550–1558.
 
9) Owens, W., Ashby, J., Odum, J., Onyon, L. (2003). The OECD program 
to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoe ­
strogen analyses. Environ. Health Persp. 111, 1559–1567.  
10) Ogasawara, Y., Okamoto, S., Kitamura, Y., Matsumoto, K. (1983). 
Proliferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorpora ­
tion of [I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology113, 582–587.  
11) Branham, W.S., Sheehan, D.M., Zehr, D.R., Ridlon, E., Nelson, C.J. 
(1985). The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects 
of 17β-estradiol. Endocrinology117, 2229–2237.  
12) Schlumpf, M., Berger, L., Cotton, B., Conscience-Egli, M., Durrer, S., 
Fleischmann, I., Haller, V., Maerkel, K., Lichtensteiger, W. (2001). Estrogen active UV screens.  SÖFW-J.  127, 10–15.
 
13) Zarrow, M.X., Lazo-Wasem, E.A., Shoger, R.L. (1953). Estrogenic acti ­
vity in a commercial animal ration. Science, 118, 650–651.  
14) Drane, H.M., Patterson, D.S.P., Roberts, B.A., Saba, N. (1975). The 
chance discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd . 
Cosmet. Toxicol.  13, 425–427.  
15) Boettger-Tong, H., Murphy, L., Chiappetta, C., Kirkland, J.L., Goodwin, 
B., Adlercreutz, H., Stancel, G.M., Makela, S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  
in vivo  responses to exogenously administered estrogens.  Environ. Health 
Perspec.  106, 369–373.
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Utero ­
trophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publications, Series on Testing and Assessment No. 67.  
17) Degen, G.H., Janning, P., Diel, P., Bolt, H.M.. (2002). Estrogenic isofla ­
vones in rodent diets. Toxicol. Lett. 128, 145–157.  
18) Wade, M.G., Lee, A., McMahon, A., Cooke, G., Curran, I. (2003). The 
influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41, 1517–1525.
 
19) Yamasaki, K., Sawaki, M., Noda, S., Wada, T., Hara, T., Takatsuki, M. 
(2002). Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given 
different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the imma ­
ture rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76, 613–620.
 
20) Thigpen, J.E., Haseman, J.K., Saunders, H.E., Setchell, K.D.R., Grant, 
M.F., Forsythe, D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of 
vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53, 477–485.  
21) Ashby, J., Tinwell, H., Odum, J., Kimber, I., Brooks, A.N., Pate, I., Boyle, 
C.C. (2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and 
rodent sexual development.  J. Appl. Toxicol.  20, 343–347.  
22) Thigpen, J.E., Lockear, J., Haseman, J., Saunders, H.E., Caviness, G., 
Grant, M.F., Forsythe, D.B. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer 
Detect. Prev. 26, 381–393.
 
23) Thigpen, J.E., Li, L-A., Richter, C.B., Lebetkin, E.H., Jameson, C.W. 
(1987). The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in 
rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37, 596–601.
 
24) OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 425, Paris.  
25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85, 320–333.  
28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19, 33–41.  
29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34, 288–305.
 
30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24, 284–291.  
31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
32) Dorfman, R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press.  
33) Thigpen, J.E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endoc ­
rine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4), 401–416.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
34) Gray, L.E. and Ostby, J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14(1–2), 159–184.  
35) Booth, A.N., Bickoff, E.M. and Kohler, G.O. (1960). Estrogen-like acti ­
vity in vegetable oils and mill by-products. Science, 131, 1807–1808.  
36) Kato, H., Iwata, T., Katsu, Y., Watanabe, H., Ohta, Y., Iguchi, T. (2004). 
Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410–1414.
 
37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay 
Procedure to Test for Antioestrogenity. Series on Testing and Assessment. 
No. 71.  
38) Sm ěrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 
o ochran ě zvířat používaných pro v ědecké účely. Úř. věst. L 276, 
20.10.2010, s. 33.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  HERSHBERGEROVA BIOLOGICKÁ ZKOUŠKA NA 
POTKANECH: KRÁTKODOBÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA 
ANDROGENNÍCH/ANTIANDROGENNÍCH VLASTNOSTÍ  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 441 
(2009). Organizace OECD v roce 1998 zahájila činnost s vysokou prioritou 
zaměřenou na revizi stávajících pokyn ů a vypracování nových pokyn ů pro 
zjišťování a zkoušení látek, které mohou narušovat činnost endokrinních 
žláz (1). Jedním z prvk ů této činnosti bylo vypracovat zkušební zásady 
pro provád ění Hershbergerovy biologické zkoušky na potkanech. Po n ěko­
lika desetiletích využívání ve farmaceutickém odv ětví byla tato zkouška 
poprvé standardizována oficiálním expertním výborem v roce 1962 jakožto 
nástroj pro zjiš ťování androgenních chemických látek (2). V letech 
2001–2007 prošla Hershbergerova biologická zkouška na potkanech rozsá ­
hlým valida čním programem, jehož sou částí mimo jiné bylo vytvo ření 
Základního hodnotícího dokumentu (23), sestavení podrobného metodic ­
kého listu (3), vypracování návodu pro pitvu (21) a provedení rozsáhlých vnitrolaboratorních a mezilaboratorních studií za ú čelem prokázání spoleh ­
livosti a reprodukovatelnosti této biologické zkoušky. Tyto valida ční studie 
byly provedeny s ú činným referen čním androgenem (testosteron 
propionát (TP)), dv ěma účinnými syntetickými androgeny (trenbolon acetát 
a methyltestosteron), ú činnou antiandrogenní farmaceutickou látkou (fluta ­
mid), účinným inhibitorem syntézy (finasterid) p řírodního androgenu 
(dihydrotestosteron (DHT)), n ěkolika slabými antiandrogenními pesticidy 
(linuron, vinklozolin, procymidon, p,p'-DDE), ú činným inhibitorem 5-alfa- 
reduktázy (finasterid) a dv ěma známými negativními chemickými látkami 
(dinitrofenol a nonylfenol) (4)(5)(6)(7)(8). Tato zkušební metoda je 
výsledkem dlouholetých historických zkušeností s touto biologickou zkou ­ 
škou a zkušeností získaných b ěhem programu valida čních zkoušek 
a z jejich výsledk ů.
 
2. Hershbergerova biologická zkouška je krátkodobá screeningová zkouška  in 
vivo s použitím p řídatných tkání sam čího reproduk čního traktu. Zkouška 
vznikla ve 30. letech 20. století a byla ve 40. letech pozm ěněna tak, aby 
zahrnovala svaly v sam čím reproduk čním traktu reagující na androgeny (2) 
(9–15). V 60. letech bylo pomoci standardizované verze protokolu hodno ­
ceno více než 700 možných androgen ů (2)(14) a použití této zkoušky bylo 
v 60. letech považováno za standardní metodu zjiš ťování androgenních 
i antiandrogenních látek (2)(15). Stávající biologická zkouška je založena na změnách v hmotnosti p ěti tkání závislých na androgenech 
u kastrovaných samc ů potkanů v peripubertálním období. Hodnotí schop ­
nost chemické látky vyvolat biologické aktivity odpovídající agonist ům 
a antagonist ům androgen ů a inhibitor ům 5-alfa-reduktázy. P ět cílových 
tkání závislých na androgenech, které jsou zahrnuty do této zkušební metody, jsou ventrální prostata (VP), semenný vá ček (SV) (spolu 
s tekutinami a koagula čními žlázami), svaly m. ligator ani a m. 
bulbocavernosus (LABC), pár Cowperových žláz (COW) a žalud penisu (GP). U kastrovaných samc ů potkanů v peripubertálním období 
všech těchto pět tkání reaguje na androgeny r ůstem absolutní hmotnosti. 
Jsou-li tytéž tkán ě podáváním ú činného referen čního androgenu stimulo ­
vány k nár ůstu hmotnosti, na antiandrogeny všech t ěchto pět tkání reaguje 
snížením absolutní hmotnosti. Primárním modelem pro Hershbergerovu biologickou zkoušku byl chirurgicky kastrovaný samec v peripubertálním 
období, což bylo validováno ve fázi 1, 2 a 3 programu validace Hersh ­
bergerovy zkoušky.
 
3. Hershbergerova biologická zkouška slouží jako mechanistická screeningová 
zkouška ke zjiš ťování agonist ů androgen ů, antagonist ů androgen ů 
a inhibitor ů 5-alfa-reduktázy  in vivo  a její provedení je nutno posuzovat 
v kontextu „Koncep čního rámce OECD pro zkoušky a posuzování chemic ­
kých látek narušujících činnost endokrinních žláz“ (dodatek 2). V tomto 
koncepčním rámci je Hershbergerova biologická zkouška za řazena na  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
úroveň 3 jako zkouška  in vivo  poskytující údaje o jednom endokrinním 
mechanismu, tj. androgenit ě/antiandrogenit ě. Předpokládá se její za řazení 
do série zkoušek  in vitro  a in vivo , jejichž ú čelem je zjiš ťování chemických 
látek schopných interakce s endokrinním systémem a které v kone čném 
důsledku vedou k posouzení nebezpe čí a rizik pro lidské zdraví nebo 
životní prost ředí. 
4. S ohledem na zásadu dobrého zacházení se zví řaty byl v souvislosti 
s kastrací pro Hershbergerovu biologickou zkoušku hledán alternativní 
model s využitím intaktních (nekastrovaných) stimulovaných odstavených mláďat, aby bylo možno se vyhnout kroku kastrace. Zkušební metoda se 
stimulovanými odstavenými mlá ďaty byla podrobena validaci (24); p ři vali­
dačních studiích se však ukázalo, že verze Hershbergerovy biologické 
zkoušky s odstavenými mlá ďaty nebyla schopna p ři zkoušených dávkách 
stabilně detekovat ú činky slabých antiandrogen ů na hmotnost orgán ů závis­
lých na androgenech. Proto nebyla do této zkušební metody za řazena. 
Uznává se však, že její použití m ůže být prosp ěšné nejen z hlediska 
dobrého zacházení se zví řaty, ale m ůže také poskytnout informace 
o jiných zp ůsobech p ůsobení a je k dispozici v Pokynech OECD č. 115 
(25).
 
VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ  
5. Agonisté a antagonisté androgen ů působí jako ligandy na receptor andro ­
genu a mohou aktivovat (agonisté) nebo potla čovat (antagonisté) transkripci 
genů, kterou tento receptor kontroluje. N ěkteré chemické látky krom ě toho 
potlačují přeměnu testosteronu na více ú činný přirozený androgen, dihydro ­
testosteron, v n ěkterých androgenních cílových tkáních (inhibitory 5-alfa- 
reduktázy). P ůsobení takových chemických látek m ůže vést k nep říznivým 
zdravotním d ůsledkům, včetně účinků na reprodukci a vývoj. Proto existuje 
regulační potřeba rychlého posouzení a zhodnocení chemické látky jakožto 
možného agonisty nebo antagonisty androgen ů nebo inhibitoru 5-alfa- 
reduktázy. Afinita ligandu k androgennímu receptoru m ěřená vazbou na 
receptor nebo aktivací transkripce reporterových gen ů in vitro , byť infor­
mativní, není jediným ur čujícím faktorem možného nebezpe čí. Jinými ur ču­
jícími faktory jsou nap ř. aktivace a deaktivace metabolismu po vstupu do 
organismu, distribuce chemické látky do cílových tkání a vymizení z t ěla. 
Proto je pot řeba zjišťovat možné aktivity chemické látky  in vivo  za přísluš­
ných podmínek a expozice. Hodnocení  in vivo  má mén ě zásadní význam, 
jsou-li známy typické znaky absorpce, distribuce, metabolismu 
a eliminace (ADME) dané chemické látky. Tkán ě závislé na androgenech 
reagují na stimulaci androgeny rychlým a mohutným r ůstem, zejména 
u kastrovaných samc ů potkanů v peripubertálním období. Druhy hlodavc ů, 
zejména potkan, jsou široce používány také ve studiích toxicity pro chara ­
kterizaci nebezpe čnosti chemických látek. Proto je verze zkoušky použí ­
vající kastrované potkany v peripubertálním v ěku a pět cílových tkání 
vhodná pro zjiš ťování agonist ů a antagonist ů androgen ů a inhibitor ů 5- 
alfa-reduktázy  in vivo . 
6. Tato zkušební metoda je založena na t ěch zkušebních postupech použitých 
při validační studii OECD, u kterých byla p ři vnitrolaboratorních 
a mezilaboratorních studiích prokázána jejich spolehlivost a reprodukovatelnost. V této zkušební metod ě jsou prezentovány jak andro ­
genní, tak antiandrogenní postupy.
 
7. V dávce TP použité jednotlivými laborato řemi v rámci programu OECD pro 
validaci Hershbergerovy biologické zkoušky se vyskytla ur čitá odchylka 
(0,2 mg oproti 0,4 mg na 1 kilogram t ělesné hmotnosti za den, p ři podávání 
subkutánní injekcí), avšak ob ě tyto varianty protokolu se jen málo lišily ve 
schopnosti detekovat slabou či silnou antiandrogenní aktivitu. Je však jasné, 
že dávka TP by nem ěla být příliš vysoká, aby neblokovala ú činek slabých 
antagonist ů androgenového receptoru, ani tak nízká, aby androgenní tkán ě 
i bez spolupodávání antiandrogen ů vykazovaly slabou r ůstovou reakci.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Růstová reakce jednotlivých tkání závislých na androgenech není zcela 
androgenního p ůvodu, tj. hmotnost ur čitých tkání mohou zm ěnit i jiné 
chemické látky než agonisté androgen ů. Avšak r ůstová reakce n ěkterých 
tkání je doprovodným jevem specifi čtějšího působení androgenního mecha ­
nismu. Nap říklad vysoké dávky ú činných estrogen ů mohou zvýšit hmotnost 
semenných vá čků; jiné tkán ě závislé na androgenech však p ři studii 
podobným zp ůsobem nereagovaly. Antiandrogenní chemické látky mohou 
působit buď jako antagonistní látky androgenních receptor ů, nebo jako 
inhibitory 5-alfa-reduktázy. Inhibitory 5-alfa-reduktázy mají variabilní 
účinek, protože p řeměna na více ú činný dihydrotestosteron se liší podle 
jednotlivých tkání. Antiandrogeny potla čující 5-alfa-reduktázu, nap ř. finas­
terid, mají výrazn ější účinek na ventrální prostatu než na jiné tkán ě, na 
rozdíl od ú činného antagonisty androgenního receptoru, jako je flutamid. 
Tato rozdílná reakce tkání m ůže být využita pro rozlišení mezi zp ůsoby 
působení zprost ředkovanými androgenním receptorem a p ůsobení zprost řed­
kovaného 5-alfa-reduktázou. Androgenní receptor krom ě toho vývojov ě 
souvisí s receptory jiných steroidních hormon ů a některých dalších 
hormonů, které, jsou-li podávány na vysokých, suprafyziologických úrov ­
ních dávkování, mohou vázat a antagonizovat ú činky TP podporující r ůst. 
Dále je také reálné, že zesílený steroidní metabolismus a následné snížení testosteronu v séru by mohly r ůst tkání závislých na androgenech oslabit. 
Jakýkoli pozitivní výsledek Hershbergerovy biologické zkoušky by proto 
měl být normáln ě hodnocen metodou posuzování závažnosti všech dostup ­
ných údaj ů, včetně zkoušek  in vitro , jako jsou zkoušky vazby receptor ů 
androgenů a receptor ů estrogen ů a zkoušky odpovídající transkrip ční akti­
vace, nebo údaj ů z jiných zkoušek  in vivo , které zkoumají podobné andro ­
genní cílové tkán ě, jako jsou zkoušky na samcích v pubertálním v ěku, 
15denní studie na intaktních dosp ělých samcích nebo 28denní či 90denní 
studie s opakovanými dávkami.
 
9. Zkušenosti ukazují, že xenobiotické androgeny jsou vzácn ější než xenobi ­
otické antiandrogeny. P ředpokládá se tedy, že Hershbergerova biologická 
zkouška se bude nej častěji používat pro zjiš ťování antiandrogen ů. Nicmén ě 
postup pro zkoušení androgen ů by se m ěl používat u steroid ů nebo stero ­
idům podobných chemických látek nebo u chemických látek, kde byly 
známky možných androgenních ú činků zjištěny metodami uvedenými 
uvedených na úrovni 1 nebo 2 koncep čního rámce (dodatek 2). Podobn ě 
mohou být nep říznivé účinky spojené s androgenními/antiandrogenními 
profily pozorovány p ři zkouškách na úrovni 5, což by m ělo vést 
k posouzení, zda ur čitá chemická látka p ůsobí endokrinn ě. 
10. Uznává se, že veškeré postupy založené na zví řatech by m ěly splňovat 
místní normy v oblasti pé če o zvířata; popisy pé če a zacházení, které 
jsou stanoveny níže, jsou minimální výkonnostní normy a budou nahrazeny 
místními p ředpisy, nap ř. směrnicí Evropského parlamentu a Rady 
2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 o ochran ě zvířat používaných pro v ědecké 
účely (26). Další pokyny týkající se humánního zacházení se zví řaty stano­
vila organizace OECD (17).  
11. Jako p ři každé biologické zkoušce, p ři které jsou použita zkušební zví řata, 
by se mělo pečlivě zvážit, zda je nezbytné tuto studii provád ět. Pro takové 
rozhodnutí mohou být v zásad ě dva důvody:  
— vysoká možnost expozice (úrove ň 1 koncep čního rámce) nebo p říznaky 
androgenity/antiandrogenity zjišt ěné při zkouškách  in vitro  (úroveň 2), 
kdy by se následn ě mělo zjistit, zda takové ú činky mohou nastat  in vivo , 
— účinky odpovídající androgenit ě/antiandrogenit ě zjištěné při zkouškách  
in vivo  na úrovni 4 nebo 5, kdy by se m ěl dále zkoumat specifický 
způsob účinku, to jest stanovit, zda ú činky byly vyvolány androgenním/ 
antiandrogenním mechanismem.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Definice použité v této zkušební metod ě jsou uvedeny v dodatku 1.  
PODSTATA ZKOUŠKY  
13. Hershbergerova biologická zkouška dosahuje své citlivosti díky použití 
samců s minimální endogenní produkcí androgen ů. Toho je dosaženo použ ­
itím kastrovaných samc ů za předpokladu, že po kastraci se poskytne 
dostatek času, aby se cílové tkán ě mohly vrátit k minimální a jednotné 
výchozí hmotnosti. P ři zjišťování potenciální androgenní aktivity tak exis ­
tují nízké endogenní úrovn ě cirkulujících androgen ů, 
hypothalamo-hypofýzo-gonadální osa není schopna prost řednictvím mecha ­
nismů zpětné vazby zajistit kompenzaci, maximalizuje se reaktivní schop ­
nost tkání a minimalizuje se variabilita výchozích hmotností tkání. P ři 
zjišťování potenciální antiandrogenní aktivity lze dosáhnout stabiln ějšího 
přírůstku hmotnosti tkání, jsou-li tkán ě stimulovány referen čním androge ­
nem. Vzhledem k uvedeným skute čnostem Hershbergerova biologická 
zkouška vyžaduje pouze 6 zví řat v každé exponované skupin ě, zatímco 
při jiných zkouškách s intaktními pubertálními nebo dosp ělými samci se 
doporučuje použít 15 samc ů v každé exponované skupin ě. 
14. Kastrace samc ů potkanů v peripubertálním období by m ěla být provedena 
vhodným zp ůsobem, s použitím schválených anestetik a aseptickou techni ­
kou. Několik prvních dn ů po operaci by m ěla být podávána analgetika 
s cílem eliminovat poopera ční utrpení. Pokud jde detekci slabých androgen ů 
a antiandrogen ů, kastrace zvyšuje p řesnost zkoušky tím, že vy řazuje 
kompenza ční mechanismy endokrinní zp ětné vazby p řítomné u intaktního 
zvířete, které mohou ú činky podávaných androgen ů a antiandrogen ů oslabit, 
a odstraňuje značné rozdíly v úrovni testosteronu v séru jednotlivých zví řat. 
Kastrace tedy snižuje po čet zvířat požadovaný pro zjišt ění těchto endokrin ­
ních aktivit.  
15. Při zjišťování potenciální androgenní aktivity se zkoušená chemická látka 
podává denn ě orální sondou nebo subkutánní injekcí po dobu deseti po sob ě 
jdoucích dn ů. Zkoušené chemické látky se podávají nejmén ě dvěma expe­
rimentálním skupinám zkušebních zví řat, přičemž každé skupin ě je apliko ­
vána jiná úrove ň dávky. P řibližně po 24 hodinách od poslední dávky se 
zvířata podrobí pitv ě. Statisticky významný nár ůst hmotnosti dvou nebo 
více cílových orgán ů ve skupinách, jimž byla podávána zkoušená chemická 
látka, v porovnání s kontrolní skupinou s vehikulem ukazuje, že zkoušená 
chemická látka je z hlediska potenciální androgenní aktivity pozitivní (viz 
odstavec 60). Androgeny, jako nap říklad trenbolon, které nemohou být 
redukovány 5-alfa-reduktázou, mají výrazn ější účinek na LABC a GP, 
než má TP, avšak zvýšený r ůst by měly vykázat všechny tkán ě. 
16. Při zjišťování potenciální antiandrogenní aktivity se zkoušená chemická 
látka podává denn ě orální sondou nebo subkutánní injekcí po dobu deseti 
po sobě jdoucích dn ů souběžně s denními dávkami TP (0,2 mg nebo 0,4 mg 
na 1 kg t ělesné hmotnosti za den) aplikovanými subkutánní injekcí. P ři 
validačním programu bylo stanoveno, že mohou být použity dávky TP 
buď 0,2 mg na 1 kg t ělesné hmotnosti za den, nebo 0,4 mg na 1 kg t ělesné 
hmotnosti za den, nebo ť při detekci antiandrogen ů byly účinné obě tyto 
hodnoty, a pro použití p ři zkoušce by proto m ěla být vybrána pouze jedna 
z těchto dávek. Odstup ňované dávky zkoušené chemické látky se podávají 
nejméně třem experimentálním skupinám pokusných zví řat, přičemž každé 
skupině je aplikována jiná úrove ň dávky. P řibližně po 24 hodinách od 
poslední dávky se zví řata podrobí pitv ě. Statisticky významný pokles hmot ­
ností dvou nebo více cílových orgán ů ve skupinách, jimž byla podávána 
zkoušená chemická látka spolu s TP, v porovnání s kontrolní skupinou, 
které byl podáván pouze TP, ukazuje, že zkoušená chemická látka je 
z hlediska potenciální antiandrogenní aktivity pozitivní (viz odstavec 61).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
POPIS METODY  
Výběr druhu a kmene  
17. Od 30. let 20. století je p ři Hershbergerov ě biologické zkoušce b ěžně 
používán potkan. A čkoli je z biologického hlediska možné, že potkan 
i myš by vykázaly podobné reakce, je na základ ě 70letých zkušeností 
s modelem potkan ů pro Hershbergerovu biologickou zkoušku up řednostňo­
vaným druhem potkan. Navíc, jelikož údaje získané p ři Hershbergerov ě 
biologické zkoušce mohou být p ředběžnými údaji pro dlouhodobou vícege ­
nerační studii, je možné použít p ři obou studiích zví řata stejného 
druhu, kmene a p ůvodu.  
18. Tento zkušební postup umož ňuje, aby si laborato ř pro použití v této 
zkoušce vybrala kmen potkan ů, který by obecn ě měl být stejný 
jako kmen historicky používaný v této laborato ři. Použity mohou být 
běžně používané kmeny laboratorních potkan ů; neměly by však být 
použity kmeny, které pohlavn ě dozrávají výrazn ě později než ve v ěku 42 
dnů, jelikož kastrace t ěchto samc ů ve věku 42 dn ů věku by mohla znemo ­ 
žnit měření hmotnosti žaludu penisu, které m ůže být provedeno teprve po 
odpojení p ředkožky od t ěla penisu. Nem ěly by tedy, až na vzácné p řípady, 
být použity kmeny odvozené od potkan ů Fisher 344. Potkani Fisher 344 
mají jiný časový pr ůběh pohlavního vývoje než jiné, b ěžněji 
používané kmeny, nap ř. kmeny Sprague Dawley nebo Wistar (16). Má-li 
být takový kmen použit, m ěla by laborato ř tato zvířata kastrovat v pon ěkud 
pozdějším věku a měla by být schopna prokázat citlivost použitého kmene. 
Výběr kmene potkan ů by laborato ř měla jasně zdůvodnit. Tam, kde scre ­
eningová zkouška m ůže být předběžnou studií pro studii s opakovaným 
podáváním dávky orální cestou, pro reproduk ční a vývojovou studii nebo 
pro dlouhodobou studii, m ěla by být ve všech studiích p řednostně použí­
vána zvířata stejného kmene a p ůvodu.  
Podmínky chovu a krmení  
19. Veškeré postupy by m ěly vyhovovat všem místním normám pé če 
o laboratorní zví řata. Tyto popisy pé če a zacházení jsou minimálními 
normami a budou nahrazeny p řísnějšími místními na řízeními, nap ř. směrnicí 
Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 o ochran ě 
zvířat používaných pro v ědecké účely (26). Teplota v místnosti pro pokusná 
zvířata by měla být 22 °C (s p řibližným rozp ětím ± 3 °C). Relativní vlhkost 
by měla být minimáln ě 30 % a nem ěla by pokud možno p řesáhnout 70 %, 
kromě doby úklidu místnosti. Cílem musí být relativní vlhkost 50–60 %. 
Osvětlení by m ělo být um ělé. Mělo by se st řídat 12 hodin sv ětla a 12 hodin 
tmy. 
20. Skupinový chov se up řednostňuje před izolací vzhledem k mladému v ěku 
zvířat a ke skute čnosti, že potkani jsou spole čenská zví řata. Chov po dvou 
nebo třech zvířatech v každé kleci zamezí stísn ěným podmínkám a s nimi 
spojenému stresu, který m ůže ovlivnit hormonální kontrolu vývoje p řídatné 
tkáně pohlavních orgán ů. Klece by m ěly být pečlivě čištěny, aby se odstra ­
nily možné kontaminující látky, a uspo řádány tak, aby byl možný vliv 
umístění klecí minimalizován. Klece náležité velikosti (~ 2 000 cm  2 ) 
zabrání stísn ěným podmínkám.  
21. Každé zví ře musí být jednotliv ě označeno (např. ušní známkou nebo štít ­
kem) humánním zp ůsobem. Metoda ozna čení se zaznamená.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Laboratorní stravu a pitnou vodu dostávají zví řata v libovolném množství. 
Laboratoře provád ějící Hershbergerovu biologickou zkoušku by m ěly 
používat laboratorní stravu, kterou b ěžně používají p ři své práci zkoušení 
chemických látek. P ři validačních studiích pro tuto biologickou zkoušku 
nebyly pozorovány žádné ú činky nebo variabilita, které by bylo možné 
přičíst stravě. Použitá strava se zaznamená a vzorek laboratorní stravy se 
uchová pro p řípadnou budoucí analýzu.  
Kritéria hmotnosti orgán ů závislých na androgenech  
23. Během valida ční studie nebyly získány žádné poznatky, že by pokles 
tělesné hmotnosti ovlivnil zvýšení nebo snížení r ůstu hmotnosti cílových 
tkání (tj. t ěch, které by se p ři této studii m ěly vážit).  
24. Z jednotlivých kmen ů potkanů, které byly úsp ěšně použity v rámci valida č­
ního programu, vykazují t ěžší kmeny potkan ů vyšší hmotnosti orgán ů závis­
lých na androgenech než leh čí kmeny. Proto kritéria pro Hershbergerovu 
biologickou zkoušku neobsahují absolutní o čekávané hmotnosti orgán ů pro 
pozitivní a negativní kontrolní skupiny.  
25. Vzhledem k existenci vztahu nep římé úm ěry mezi varia čním 
koeficientem (CV) pro ur čitou tkáň a statistickou váhou údaj ů, jsou kritéria 
Hershbergerovy biologické zkoušky založena na maximálních hodnotách 
variačního koeficientu pro každou tká ň (Tabulka 1). Varia ční koeficienty 
jsou odvozeny z valida čních studií OECD. V p řípadě negativních výsledk ů 
by laborato ře měly zkoumat varia ční koeficienty z kontrolní skupiny 
a z experimentální skupiny, které byly podávány vysoké dávky, 
a stanovit, zda nebyla p řekročena kritéria pro maximální varia ční koeficient.  
26. Studie my m ěla být zopakována, pokud: 1) t ři nebo více z deseti možných 
variačních koeficient ů u jednotlivých zví řat v kontrolní skupin ě a ve 
skupině, které byly podávány vysoké dávky, p řekročí maximum stanovené 
pro studie agonist ů a antagonist ů uvedené v tabulce 1 a 2) nejmén ě dvě 
cílové tkán ě byly margináln ě insignifikantní, tj. hodnoty ρ byly mezi 0,05 
a 0,10.  
Tabulka 1  
Maximální p řípustné varia ční koeficienty stanovené pro cílové p řídatné 
pohlavní tkán ě u modelu kastrovaných zví řat při validačních studiích 
OECD  ( 1 ) 
Tkáň Antiandrogenní ú činky Androgenní ú činky 
Semenné vá čky 40 % 40 % 
Ventrální prostata 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Cowperovy žlázy 35 % 55 % 
Žalud penisu 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Prahový varia ční koeficient pro danou tká ň byl zjištěn z grafu hodnot varia čního koefi ­
cientu – uspo řádaných od nejmenších postupn ě až po nejvyšší – u všech pr ůměrů ze 
všech experiment ů v rámci valida ční studie pomocí specifického modelu (agonistní nebo 
antagonistní). Prahový varia ční koeficient byl vzat z bodu, od kterého p řírůstky mezi 
nejbližšími nejvyššími varia čními koeficienty v řadě jsou dramaticky vyšší než n ěkolik 
předchozích varia čních koeficient ů – „bodu zlomu“. Je t řeba poznamenat, že tato analýza 
určila poměrně spolehlivé „body zlomu“ u antagonistního modelu zkoušky, ale k řivky 
variačních koeficient ů u zkoušky agonist ů vykázaly pozvoln ější růst, což činí určení 
prahového koeficientu touto metodou pon ěkud subjektivním.
 POSTUP  
Dodržování právních p ředpisů a laboratorní ov ěření 
27. Na rozdíl od uterotrofní zkoušky (kapitola B.54 této p řílohy) není p ři 
Hershbergerov ě biologické zkoušce nutné p řed zahájením studie prokazovat 
způsobilost laborato ře, protože nedílnou sou částí zkoušky je soub ěžné 
provádění pozitivní (testosteron propionát a flutamid) a negativní kontroly.  
Počet a stav zví řat 
28. Každá experimentální i kontrolní skupina by m ěla zahrnovat nejmén ě 6 
zvířat. To platí pro androgenní i pro antiandrogenní protokol.  
Kastrace  
29. Po p říjmu zvířat by m ělo proběhnout po čáteční aklimatiza ční období 
v trvání n ěkolika dní, aby se zajistilo, že zví řata jsou zdravá 
a prosperující. Jelikož zví řata kastrovaná p řed 42. dnem života nebo 42. 
postnatálním dnem nemusí mít odd ělenou předkožku, m ěla by být kastro ­
vána v 42. postnatální den nebo pozd ěji, ne však d říve. Kastrace zví řat se 
provádí v anestezii provedením řezu v šourku a odstran ěním obou varlat 
a nadvarlat s podvázáním cév a chámovod ů. Po ujišt ění, že nedochází ke 
krvácení, se šourek uzav ře suturou nebo klipsy. Po n ěkolik dnů po operaci 
by zvířatům měla být podávána analgetika ke zmírn ění poopera čního 
utrpení. Jsou-li od dodavatele zví řat nakupována kastrovaná zví řata, 
dodavatel by m ěl potvrdit jejich v ěk a stadium pohlavní zralosti.  
Aklimatizace po kastraci  
30. Po kastraci by zví řatům měla být poskytnuta další aklimatizace na labora ­
torní podmínky v trvání nejmén ě 7 dnů s cílem umožnit návrat hmotností 
cílových tkání do p ůvodního stavu. Zví řata by měla být denn ě pozorována 
a všechna zví řata s příznaky nemoci nebo fyzických abnormalit se odstraní. 
Expozice s podáváním dávek (v rámci studie) tak m ůže začít již 
v 49. postnatální den, avšak nejpozd ěji v 60. postnatální den. V ěk při 
pitvě by neměl být vyšší než 70. postnatální den. Tato pružnost umož ňuje 
laboratoři efektivn ě naplánovat experimentální práci.  
Tělesná hmotnost a náhodný výb ěr do skupin  
31. Rozdíly v t ělesné hmotnosti jednotlivých zví řat jsou zdrojem variability 
v hmotnosti tkání v rámci skupin zví řat i mezi t ěmito skupinami. Rostoucí 
variabilita v hmotnosti tkání vede k vyššímu varia čnímu koeficientu (CV) 
a snižuje statistickou váhu zkoušky (n ěkdy ozna čovanou jako citlivost 
zkoušky). Variace t ělesné hmotnosti by proto m ěly být experimentáln ě 
i statisticky kontrolovány.  
32. Experimentální kontrola zahrnuje dosažení malých variací t ělesné hmotnosti 
v rámci studijních skupin a mezi t ěmito skupinami. Zaprvé, neobvykle malá 
nebo neobvykle velká zví řata by m ěla být vylou čena a nem ěla by být 
umísťována do studijní kohorty. P ři zahájení studie by variace hmotnosti 
použitých zví řat neměla převyšovat ± 20 % st řední hodnoty hmotnosti 
(např. 175 g ± 35 g pro kastrované potkany v peripubertálním v ěku). 
Zadruhé, zví řata by m ěla být p řiřazena do skupin (kontrolní 
a experimentální) náhodnou hmotnostní distribucí, takže st řední hodnota 
tělesné hmotnosti každé skupiny se nebude statisticky lišit od kterékoli 
jiné skupiny. Použitý postup blokové randomizace je t řeba zaznamenat.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Jelikož toxicita m ůže snížit t ělesnou hmotnost exponovaných skupin 
v porovnání s kontrolní skupinou, mohla by jako statistický kovariát být 
použita tělesná hmotnost v první den podávání zkoušené chemické látky, 
a nikoli t ělesná hmotnost p ři pitvě. 
Dávkování  
34. K tomu, aby se zjistilo, zda zkoušená chemická látka m ůže mít androgenní 
účinek in vivo , běžně postačují dvě skupiny exponované zkoušené chemické 
látce a dále pozitivní kontrolní skupina a negativní kontrolní skupina 
s vehikulem (viz odstavec 43), S ohledem na zásadu dobrého zacházení se zvířaty je up řednostňováno uvedené uspo řádání. Je-li zám ěrem získat 
křivku dávka-reakce nebo extrapolovat na nižší dávky, jsou zapot řebí 
nejméně 3 exponované skupiny. Jsou-li požadovány informace vycházející 
za rámec zjiš ťování androgenní aktivity (nap ř. odhad potence), m ěly by být 
zváženy odlišné režimy dávkování. P ři zkoušce na antiandrogeny se zkou ­ 
šená chemická látka podává spolu s referen čním agonistou androgen ů. Měly 
by být použity nejmén ě 3 zkušební skupiny s r ůznými dávkami zkoušené 
chemické látky a pozitivní a negativní kontrolní skupina (viz odstavec 44). S výjimkou podávání zkoušené chemické látky se se zví řaty v kontrolní 
skupině zachází stejn ě jako se zví řaty ve zkušební skupin ě. Pokud se p ři 
podávání zkoušené chemické látky používá vehikulum, m ěla by kontrolní 
skupina dostávat vehikulum v nejvyšším objemu, jaký je použit ve zkušeb ­
ních skupinách.
 
35. Při navrhování a výb ěru všech úrovní dávek by m ěly být zohledn ěny 
veškeré existující údaje o toxických a toxikokinetických vlastnostech, 
které jsou pro zkoušenou chemickou látku nebo p říbuzné materiály 
dostupné. Nejvyšší úrove ň dávky by m ěla zaprvé zohlednit LD  50 a/nebo 
informace o akutní toxicit ě, aby se p ředešlo úmrtím, bolestivému strádání 
nebo utrpení zví řat (17)(18)(19)(20), a za druhé by m ěla zohlednit dostupné 
informace o dávkách použitých v subchronických a chronických studiích. Obecně by nejvyšší dávka nem ěla vyvolat snížení kone čné tělesné hmot ­
nosti zvířat o více než 10 % v porovnání s hmotností kontrolní skupiny. 
Nejvyšší dávka by m ěla být bu ď 1) nejvyšší dávka, která zaru čuje přežití 
zvířat a která nezp ůsobuje významnou toxicitu nebo utrpení zví řat po uply ­
nutí 10 po sob ě jdoucích dn ů od podávání, až po maximální dávku 
1 000 mg na 1 kilogram t ělesné hmotnosti za den (viz odstavec 36), 
nebo 2) dávka vyvolávající androgenní/antiandrogenní ú činky podle toho, 
která dávka je nižší. V rámci screeningu jsou p řijatelné velké intervaly 
v dávkování, nap ř. po 0,5 log (což odpovídá odstup ňování dávky 
v intervalech po 3,2) nebo dokonce v jednotkách logaritmické škály. 
Nejsou-li žádné vhodné údaje dostupné, m ůže být provedena p ředběžná 
studie pro stanovení rozmezí dávek (viz odstavec 37), aby se podle ní stanovily dávky, které mají být použity ve vlastní studii.
 
Limitní dávka  
36. Jestliže zkouška p ři limitní dávce 1 000 mg na 1 kg t ělesné hmotnosti za 
den nebo nižší dávce s použitím postup ů předepsaných pro tuto studii 
nepovede ke statisticky významné zm ěně v hmotnostech reproduk čních 
orgánů, pak mohou být další úrovn ě dávek považovány za zbyte čné. 
Limitní dávka se použije s výjimkou p řípadu, kdy údaje o expozici člověka 
naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovn ě dávek.  
Důvody pro zjišt ění rozmezí dávek  
37. V p řípadě nutnosti m ůže být provedena p ředběžná studie pro zjišt ění 
rozmezí dávek na n ěkolika zví řatech s cílem zvolit vhodné exponované 
skupiny [pomocí metod pro zkoušení akutní toxicity (kapitola B.1.a, B.1.b této p řílohy (27), OECD TG 425 (19)). V p řípadě Hershbergerovy 
biologické zkoušky je cílem vybrat dávky, které zaru čí přežití zvířat 
a nezpůsobí významnou toxicitu nebo utrpení zví řat po uplynutí deseti po
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
sobě jdoucích dn ů podávání chemické látky, až do limitní dávky 1 000 mg 
na 1 kg t ělesné hmotnosti za den uvedené v odstavcích 35 a 36. V této 
souvislosti lze použít Pokyn OECD (17), který stanoví klinické p říznaky 
toxicity nebo utrpení zví řat. Je-li to v rámci této p ředběžné studie po deseti 
dnech podávání proveditelné, lze p řibližně po 24 hodinách od podání 
poslední dávky vyjmout cílové tkán ě a zvážit je. Tyto údaje by pak 
mohly být podp ůrně použity p ři výběru dávek pro hlavní studii.  
Referenční chemické látky a vehikulum  
38. Referen čním agonistou androgen ů by měl být testosteron propionát (TP), 
č. CAS 57-82-5. Dávka referen čního TP m ůže být 0,2 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti za den nebo 0,4 mg/kg t ělesné hmotnosti za den. Referen čním anta­
gonistou androgen ů by měl být flutamid (FT), č. CAS 1311-84-7. Dávka 
referenčního FT by m ěla být 3 mg na 1 kg t ělesné hmotnosti za den a FT 
by měl být podáván spolu s dávkou referen čního TP.  
39. Je-li to možné, doporu čuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku/su ­
spenze. Jelikož však mnohé androgenní ligandy nebo jejich metabolické prekursory mají tendenci být hydrofobní, nej častějším postupem je použití 
roztoku/suspenze v oleji (nap ř. v kukuřičném, arašídovém, sezamovém nebo 
olivovém oleji). Zkoušené chemické látky lze rozpustit v minimálním množství 95 % ethanolu nebo jiných vhodných rozpoušt ědel a zředit ve 
zkušebním vehikulu na kone čnou pracovní koncentraci. M ěly by být 
známy typické toxické znaky daného rozpoušt ědla a měly by být prov ěřeny 
na kontrolní skupin ě vystavené pouze p ůsobení rozpoušt ědla. Je-li zkoušená 
chemická látka považována za stálou, lze jejímu rozpušt ění napomoci 
mírným oh řátím a intenzivním mechanickým p ůsobením. M ěla by být 
stanovena stálost zkoušené chemické látky ve vehikulu. Je-li zkoušená 
chemická látka po dobu studie stálá, lze p řipravit jeden výchozí alikvotní 
podíl zkoušené chemické látky a denn ě připravovat roztok podle stanove ­
ného dávkování, p řičemž je třeba dbát na to, aby nedošlo ke kontaminaci 
a znehodnocení vzork ů.
 
Podávání dávek  
40. TP by m ěl být podáván subkutánní injekcí a FT by m ěl být podáván orální 
sondou.  
41. Zkoušená chemická látka se podává orální sondou nebo subkutánní injekcí. 
Při výběru způsobu podávání musí být zohledn ěna zásada dobrého zacházení 
se zvířaty a fyzikáln ě-chemické vlastnosti zkoušené chemické látky. Je-li 
dosaženo pozitivních výsledk ů pomocí injekce, p řed zahájením rozsáhlého, 
dlouhodobého zkoušení by m ěly být zohledn ěny také toxikologické aspekty, 
jako je relevantnost z hlediska zp ůsobu expozice člověka dané chemické látce 
(např. orální sonda pro modelování požití, subkutánní injekce pro modelování 
inhalace nebo adsorpce k ůží), a existující toxikologické informace a údaje 
o metabolismu a kinetice (nap ř. potřeba vyhnout se metabolismu prvního 
průchodu, lepší ú činnost při určitém způsobu podávání).  
42. Dávky by m ěly být zví řatům podávány stejným zp ůsobem a ve stejné 
časové posloupnosti po dobu deseti po sob ě jdoucích dn ů přibližně 
v 24hodinových intervalech. Úrove ň dávek by m ěla být denn ě upravována 
na základ ě souběžně prováděných denních m ěření tělesné hmotnosti. Objem 
dávky a doba jejího podávání by v každém dni expozice m ěly být zazna ­
menány. Je zapot řebí dbát na to, aby nebyla p řekročena maximální dávka 
uvedená v odstavci 35, aby bylo možno provést smysluplnou interpretaci 
údajů. V této souvislosti je t řeba pečlivě posoudit snížení t ělesné hmotnosti, 
klinické p říznaky a veškeré další nálezy. P ři podávání orální sondou by  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
měla být použita žalude ční sonda nebo vhodná intuba ční kanyla. Maximální 
objem tekutiny, kterou lze podat najednou, závisí na velikosti pokusného 
zvířete. Je třeba dodržovat místní pokyny v oblasti pé če o zvířata, avšak 
objem by nem ěl překročit 5 ml na 1 kg t ělesné hmotnosti, s výjimkou 
vodných roztok ů, kdy lze použít 10 ml na 1 kg t ělesné hmotnosti. P ři 
podávání subkutánní injekcí by dávky m ěly být aplikovány do dorsální 
skapulární nebo lumbální oblasti sterilní jehlou (nap ř. velikosti 23- nebo 
25-gauge) a tuberkulinovou injek ční stříkačkou. Oholení místa vpichu je 
dobrovolné. Jakékoli ztráty, únik v míst ě vpichu nebo neúplné dávkování 
se zaznamenají. Celkový objem vst říknutý jednomu potkanovi za den by 
neměl překročit 0,5 ml na 1 kg t ělesné hmotnosti.  
Specifické postupy pro agonisty androgen ů 
43. Při zkoušce na agonisty androgen ů je negativní kontrolní skupinou skupina 
s vehikulem a pozitivní kontrolní skupinou je skupina exponovaná TP. Biologická aktivita odpovídající agonist ům androgen ů je zkoušena podá ­
váním zkoušené chemické látky experimentálním skupinám ve zvolených 
dávkách po dobu 10 po sob ě jdoucích dn ů. Hmotnosti p ěti přídatných 
pohlavních tkání ze skupin, kterým byla podávána zkoušená chemická látka, se porovnávají se skupinou s vehikulem, zda existují statisticky významné p řírůstky hmotnosti.
 
Specifické postupy pro antagonisty androgen ů a inhibitory 5-alfa- 
reduktázy  
44. Při zkoušce na antagonisty androgen ů a inhibitory 5-alfa-reduktázy je nega ­
tivní kontrolní skupinou skupina exponovaná TP a pozitivní kontrolní 
skupinou je skupina, které jsou spole čně podávány referen ční dávky TP 
a FT. Biologická aktivita odpovídající antagonist ům androgen ů 
a inhibitor ům 5-alfa-reduktázy je zkoušena podáváním referen ční dávky 
TP a podáváním zkoušené chemické látky po dobu 10 po sob ě jdoucích 
dnů. Hmotnosti p ěti přídatných pohlavních tkání ze skupin, kterým byl 
podáván TP spolu se zkoušenou chemickou látkou, se porovnávají s referenční skupinou, které byl podáván pouze TP, zda existují statisticky 
významné poklesy hmotnosti.
 
POZOROVÁNÍ  
Poznatky z klinického pozorování  
45. Všeobecné klinické pozorování by se m ělo provád ět nejméně jednou denn ě 
a častěji, pokud jsou zpozorovány p říznaky toxicity. M ělo by se provád ět 
každý den nejlépe ve stejnou dobu (doby) a s uvážením doby o čekávaného 
maxima ú činku po podání látky. Provede se prohlídka všech zví řat za 
účelem zjišt ění úmrtnosti, nemocnosti a obecných klinických p říznaků, 
jako jsou zm ěny chování, zm ěny na kůži, na srsti, na o čích, na sliznicích, 
výskyt sekret ů a exkret ů a vegetativních funkcí (nap ř. slzení, zježení srsti, 
velikost zornic, nezvyklé dýchání).  
46. Všechna zví řata nalezená uhynulá se odeberou a odstraní bez další analýzy 
údajů. V záznamu o studii by m ěla být uvedena veškerá uhynutí zví řat před 
pitvou, spolu se zjevnými p říčinami uhynutí. Zví řata v agónii se humánn ě 
utratí. Zví řata v agónii a následn ě usmrcená se uvedou v záznamu o studii, 
spolu se zjevnými p říčinami nemocnosti.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Tělesná hmotnost a spot řeba potravy  
47. Všechna zví řata by se m ěla denně zvážit s p řesností na 0,1 g, p řičemž první 
vážení by m ělo být provedeno t ěsně před zahájením aplikace, tj. když jsou 
zvířata rozdělena do skupin. Alternativn ě lze změřit množství potravy 
spotřebované b ěhem doby aplikace na každou klec zvážením krmítek. 
Výsledky spot řeby potravy by m ěly být vyjád řeny v gramech na jednoho 
potkana za den.  
Pitva a m ěření hmotnosti tkání a orgán ů 
48. Přibližně po 24 hodinách od posledního podání zkoušené chemické látky se 
potkani usmrtí, nechají vykrvácet v souladu s b ěžnými postupy provád ějící 
laboratoře a provede se pitva. V záv ěrečné zprávě laboratoře by měla být 
uvedena metoda humánního usmrcení.  
49. Ideáln ě by pořadí pitev m ělo být ur čeno náhodným výb ěrem mezi skupi ­
nami, aby nedošlo k lineárnímu po řadí od nejmén ě exponované skupiny 
k nejvíce exponované skupin ě, či naopak, což by mohlo ovlivnit údaje. 
Veškeré pitevní nálezy, tj. patologické zm ěny/viditelné léze by m ěly být 
zaznamenány a uvedeny ve zpráv ě. 
50. Zváží se p ět tkání závislých na androgenech (ventrální prostata (VP), 
semenné vá čky (SV), svaly m. ligator ani a m. bulbocavernosus (LABC), 
Cowperovy žlázy (COW), žalud penisu GP)), Tyto tkán ě se vyříznou, 
opatrně zbaví nadbyte čných ulpělých tkání a tuku a stanoví se jejich hmot ­
nost v čerstvém (nefixovaném) stavu. S každou tkání je nutno zacházet 
s obzvláštní pe člivostí, aby nedošlo ke ztrát ě tekutin a aby nedošlo 
k vysychání, což m ůže způsobit významné chyby a variabilitu v d ůsledku 
snížení zaznamenávaných hmotností. N ěkteré tkán ě mohou být velmi malé 
nebo jejich odd ělení může být obtížné, a to je zdrojem variability. Je proto 
důležité, aby osoby provád ějící pitvu p řídatných pohlavních tkání byly 
obeznámeny se standardními postupy pitvání t ěchto tkání. K dispozici je 
příručka standardních opera čních postup ů (SOP) pro pitvu vydaná OECD 
(21). Pečlivý výcvik v souladu s p říručkou minimalizuje potenciální zdroj 
variací ve studii. Za pitvu dané tkán ě by měl být ideáln ě odpovědný tentýž 
pracovník, aby se zabránilo rozdíl ům ve zpracování tkání r ůznými osobami. 
Není-li to možné, m ěla by být pitva uspo řádána tak, že každý pracovník 
provádí sekci dané tkán ě ze všech experimentálních skupin, a nikoli aby 
jedna osoba provád ěla sekci všech tkání z kontrolní skupiny a n ěkdo jiný 
byl odpov ědný za exponované skupiny. Každá p řídatná pohlavní tká ň se 
před osušením zváží s p řesností na 0,1 mg a hmotnosti nam ěřené u každého 
zvířete se zaznamenají.  
51. Některé tkán ě mohou být velmi malé nebo jejich odd ělení může být 
obtížné, a to je zdrojem variability. Z p ředchozí práce vyplynula řada vari­
ačních koeficient ů (CV), které se podle všeho liší podle odborné zp ůsobi­
losti té či oné laborato ře. V několika málo p řípadech byly zjišt ěny velké 
rozdíly v absolutních hmotnostech tkání, nap ř. VP a COW, v rámci jedné 
konkrétní laborato ře. 
52. Měření hmotnosti jater, párových ledvin a párových nadledvinek je voli ­
telné. Tkán ě by opět měly být zbaveny fascií adherens a tuku. Játra se zváží 
a hmotnost se zaznamená s p řesností na 0,1 g a párové ledviny a párové 
nadledvinky se zváží a hmotnost se zaznamená s p řesností na 0,1 mg. Játra, 
ledviny a nadledvinky jsou nejen ovlivn ěny androgeny; poskytují také 
užitečné důkazy systémové toxicity.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Měření luteiniza čního hormonu (LH), folikulárního stimulujícího 
hormonu (FSH) a testosteronu (T) v séru je fakultativní. Úrovn ě T v séru 
jsou užite čné pro stanovení, zda zkoušená chemická látka vyvolává meta ­
bolismus testosteronu v játrech a snižuje úrovn ě séra. Bez údaj ů o T by se 
takový ú činek mohl jevit jako výsledek antiandrogenního mechanismu. 
Úrovně LH poskytují informace o schopnosti ur čitého antiandrogenu 
nejen snižovat hmotnost orgán ů, ale také ovliv ňovat 
hypothalamo-hypofyzární funkci, což p ři dlouhodobých studiích m ůže 
vyvolávat nádory varlat. FSH je hormon d ůležitý pro spermatogenezi. 
Dobrovolná jsou rovn ěž měření séra T4 a T3, která mohou poskytnout 
užitečné doplňující informace o schopnosti narušovat homeostázu thyroid ­
ních hormon ů. Mají-li být provád ěna hormonální m ěření, potkani se p řed 
pitvou anestetizují a odebere se jim krev srde ční punkcí, p řičemž metoda 
anestezie by m ěla být pe člivě zvolena tak, aby neovlivnila hormonální 
měření. Metoda p řípravy séra, zdroj souprav pro radioimunologický test 
nebo jiná m ěření, analytické postupy a výsledky se zaznamenají. Úrovn ě 
LH se zaznamenají v ng na 1 ml séra a rovn ěž hodnota T se uvede v ng na 
1 ml séra.  
54. Pitva tkání je popsána dále, p řičemž podrobný návod pro pitvu 
s fotografiemi byl zve řejněn v rámci valida čního programu jako dopl ňující 
materiál (21). Na webových stránkách Korea Food and Drug Administration 
je k dispozici také videozáznam pitvy (22).  
— Se zví řetem ve ventrální poloze ur čete, zda se p ředkožka penisu odpo ­
jila od žaludu. Pokud ano, stáhn ěte předkožku nazad a odd ělte žalud, 
zvažte ho (s p řesností na 0,1 mg) a hmotnost zaznamenejte.  
— Otevřete kůži na břiše a břišní stěnu, obnažte vnit řnosti. Pokud se 
provádí volitelné vážení dalších orgán ů, oddělte játra a zvažte je 
s přesností na 0,1 g, odd ělte žaludek a st řeva, oddělte párové ledviny 
a párové nadledvinky a zvažte je s p řesností na 0,1 mg. Touto sekcí se 
obnaží mo čový měchýř a začíná sekce cílových sam čích přídatných 
tkání.  
— Pro odd ělení VP odd ělte močový měchýř od vrstvy ventrálního svalu 
odříznutím spojovací tkán ě podél osy. Odsu ňte měchýř anteriorn ě 
směrem k semenným vá čkům (SV), čímž se odkryje levý a pravý 
lalok ventrální prostaty (pokryté vrstvou tuku). Opatrn ě očistěte pravý 
a levý lalok VP od tuku. Jemn ě oddalte pravý lalok VP od mo čové 
trubice a od řízněte lalok od mo čové trubice. Zatímco stále držíte pravý 
lalok VP, jemn ě oddalte levý lalok VP od mo čové trubice a poté od ří­
zněte; zvažte s p řesností na 0,1 mg a hmotnost zaznamenejte.  
— Při sekci SVCG odsu ňte močový měchýř kaudálním sm ěrem, čímž se 
odkryje chámovod a pravé a levé lal ůčky semenných vá čků spolu 
s koagula čními žlázami (SVCG). Zabra ňte úniku tekutiny nasazením 
hemostatu v basi SVCG, kde se chámovod napojuje na mo čovou 
trubici. SVCG opatrn ě odřízněte, s nasazeným hemostatem stále na 
místě odstraňte tuk a p řipojené orgány, vložte do tárované misky vah, 
sejměte hemostat, zvažte s p řesností na 0,1 mg a hmotnost 
zaznamenejte.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Při sekci sval ů m. levator ani a m. bulbocavernosus (LABC) se odkryjí 
svaly a ko řen penisu. Svaly LA obtá čejí tračník a svaly LA anterior 
a BC jsou p řipojeny k bulbu penisu. Odstraní se k ůže a připojené 
orgány z perianální oblasti, která se táhne od ko řene penisu až po 
anteriorní konec kone čníku. Od bulbu a tkání penisu se postupn ě odří­
znou svaly BC. Tra čník se roz řízne na dv ě části a lze od říznout 
a oddělit celé LABC. LABC se zbaví tuku a p řipojených orgán ů, 
zváží s p řesností na 0,1 mg a hmotnost se zaznamená.  
— Po odstran ění LABC jsou vid ět zaoblené Cowperovy nebo též bulbou ­
retrální žlázy (COW) p ři basi bulbu penisu, pon ěkud dorzáln ě. Je nutný 
opatrný řez, aby nedošlo k pro říznutí tenkého vá čku a zamezilo se úniku 
tekutiny. Zvažte párové COW s p řesností na 0,1 mg a hmotnost 
zaznamenejte.  
— Dojde-li b ěhem pitvy a sekce ke ztrát ě tekutiny z kterékoli žlázy, je 
třeba to zaznamenat.  
55. Jestliže hodnocení každé chemické látky vyžaduje pitvu v ětšího počtu 
zvířat, než kolik se dá stihnout za jeden den, m ůže být za čátek studie 
rozložen do dvou po sob ě jdoucích dn ů, což vede k rozložení pitvy 
a související práce na dva dny. Pokud k takovému rozložení dojde, m ěla 
by být každý den použita polovina zví řat z každé experimentální skupiny.  
56. Zbývající části mrtvých t ěl se po pitv ě vhodným zp ůsobem zlikvidují.  
PŘEKLÁDÁNÍ ZPRÁV  
Údaje  
57. Měly by být uvedeny údaje o jednotlivých zví řatech (tj. t ělesná hmotnost, 
hmotnost p řídatných pohlavních tkání, volitelná m ěření a další reakce 
a pozorování) a za každou skupinu zví řat (střední hodnoty a sm ěrodatné 
odchylky všech uskute čněných měření). Údaje by se m ěly shrnout do 
tabulky. Údaje by m ěly uvádět počet zvířat na začátku zkoušky, po čet 
zvířat, která byla b ěhem zkoušky nalezena uhynulá nebo která vykazovala 
znaky toxicity, a popis pozorovaných znak ů toxicity, v četně doby nástupu, 
trvání a závažnosti.  
58. Závěrečná zpráva by m ěla obsahovat:  
Zkušební za řízení:  
— název a místo za řízení,  
— vedoucí studie a ostatní pracovníci a jejich odpov ědnost v rámci studie,  
— datum zahájení a datum ukon čení studie, tj. první den podávání zkou ­ 
šené chemické látky a poslední den pitvy.  
Zkoušená chemická látka:  
— původ, číslo šarže/sady, identifikace, čistota, plná adresa dodavatele 
a charakterizace zkoušené chemické látky (látek),  
— fyzikální povaha a tam, kde je to podstatné, fyzikáln ě-chemické 
vlastnosti,  
— podmínky skladování a metoda a frekvence p řípravy roztoku,  
— veškeré získané údaje o stálosti,  
— veškeré analýzy dávkování roztok ů/suspenzí.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Vehikulum:  
— charakterizace vehikula (identifikace, dodavatel a číslo šarže),  
— zdůvodnění výběru vehikula (pokud není použita voda).  
Pokusná zví řata a postupy chovu zví řat: 
— druh/kmen a zd ůvodnění jejich výb ěru, 
— zdroj nebo dodavatel zví řat, včetně plné adresy,  
— počet a stáří dodaných zví řat, 
— podmínky chovu (teplota, osv ětlení apod.),  
— strava (název, typ, dodavatel, číslo šarže, obsah a úrove ň fytoestrogen ů, 
je-li známa),  
— stelivo (název, typ, dodavatel, obsah),  
— podmínky chovu v kleci a po čet zvířat v jedné kleci.  
Podmínky zkoušky:  
— věk při kastraci a trvání aklimatizace po kastraci,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku studie (s p řesností na 0,1 g),  
— proces náhodného výb ěru a záznam o p řidělení do skupiny s vehikulem, 
do referen ční skupiny, do skupiny, které se podává zkoušená chemická 
látka, a do klecí,  
— střední hodnota a sm ěrodatná odchylka t ělesných hmotností u každé 
skupiny za každý den vážení po celou dobu studie,  
— zdůvodnění výběru úrovní dávek,  
— podrobnosti o podávání zkoušené chemické látky a zd ůvodnění volby 
způsobu expozice,  
— v případě zkoušky na antiandrogenitu, expozice TP (dávka a objem),  
— expozice zkoušené chemické látce (dávka a objem),  
— doba podávání dávek,  
— pitevní postupy, v četně způsobů vykrvení a veškeré anestezie,  
— pokud jsou provád ěny analýzy séra, m ěly by být uvedeny podrobnosti 
o metod ě. Je-li nap říklad použita metoda radioimunologické 
analýzy (RIA), m ěl by být uveden postup RIA, zdroj souprav RIA, 
datum použitelnosti souprav, postup scintila ční spektrometrie 
a standardizace.  
Výsledky:  
— každodenní pozorování každého zví řete během podávání dávky, v četně: 
— tělesné hmotnosti (s p řesností na 0,1 g),  
— klinických p říznaků (existují-li),  
— veškerých m ěření spotřeby potravy nebo poznámek k ní,  
— pozorování p ři pitvě každého zví řete, včetně: ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— data pitvy,  
— experimentální skupiny zví řat, 
— identifika čního čísla, 
— jména pracovníka provád ějícího pitvu,  
— denní doby, kdy byla provedena pitva a sekce,  
— věku zvířete, 
— konečné tělesné hmotnosti p ři pitvě, s uvedením veškerých statisticky 
významných zvýšených nebo snížených hodnot,  
— pořadí vykrvácení zví řete a sekcí p ři pitvě, 
— hmotnosti p ěti cílových tkání závislých na androgenech:  
— ventrální prostata (s p řesností na 0,1 mg),  
— semenné vá čky spolu s koagula čními žlázami, v četně tekutiny (páru, 
s přesností na 0,1 mg),  
— svalový komplex m. levator ani spolu s m. bulbocarvernosus 
(s přesností na 0,1 mg),  
— Cowperovy žlázy ( čerstvá hmotnost – párové, s p řesností na 0,1 mg),  
— žalud penisu ( čerstvá hmotnost, s p řesností na 0,1 mg),  
— hmotnosti tkání m ěřených fakultativn ě, provádí-li se:  
— játra (s p řesností na 0,1 g),  
— ledviny (pár, s p řesností na 0,1 mg),  
— nadledvinky (pár, s p řesností na 0,1 mg),  
— obecné poznámky a komentá ře. 
— analýzy hormon ů v séru, provád ějí-li se  
— sérový LH (fakultativní – ng na 1 ml séra) a  
— sérový T (fakultativní – ng na 1 ml séra)  
— obecné poznámky a komentá ře. 
Shrnutí údaj ů 
Údaje by m ěly být shrnuty v tabulce obsahující velikost vzorku u každé 
skupiny, st řední hodnotu a standardní odchylku od st řední hodnoty nebo 
směrodatnou odchylku. Tabulky by m ěly obsahovat t ělesné hmotnosti p ři 
pitvě, změny tělesné hmotnosti od zahájení podávání dávek až do pitvy, 
hmotnosti cílových p řídatných pohlavních tkání a veškeré hmotnosti orgán ů 
měřené dobrovoln ě. 
Diskuse výsledk ů 
Analýza výsledk ů 
59. Tělesné hmotnosti a hmotnosti orgán ů při pitvě se statisticky analyzují za 
účelem zjišt ění takových charakteristik, jako je homogenita rozptylu 
s vhodnou transformací údaj ů podle pot řeby. Experimentální skupiny by 
měly být porovnány s kontrolní skupinou pomocí technik jako je 
ANOVA s následnými párovými srovnáními (nap ř. Dunnett ův jednostranný 
test) a porovnáním s kritériem pro hodnocení statistických rozdíl ů, např. 
p ≤ 0,05. Měly by být ur čeny ty skupiny, které dosahují statistické význam ­
nosti. „Relativní hmotnost orgán ů“ by však nem ěla být použita vzhledem 
k neplatným statistickým p ředpokladům pro tuto manipulaci s daty.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. V případě androgenního agonismu by kontrolní skupinou m ěla být zkušební 
skupina, které je podáváno pouze vehikulum. Charakteristiky p ůsobení 
zkoušené chemické látky mohou vést k rozdílným relativním reakcím jednotlivých tkání, nap říklad trenbolon, který nem ůže být redukován 5- 
alfa-reduktázou, má výrazn ější účinky na LABC a GP, než jsou ú činky 
TP. Statisticky významné zvýšení (p ≤ 0,05) hmotností dvou nebo více 
z pěti cílových tkání závislých na androgenech (VP, LABC, GP, COW 
a SVCG) by m ělo být považováno za pozitivní výsledek androgenního 
agonismu a ur čitý stupeň zvýšení hmotnosti by m ěly vykazovat všechny 
tyto cílové tkán ě. Společného hodnocení reakcí všech tkání p řídatných 
pohlavních orgán ů by mohlo být dosaženo pomocí vhodné multivaria ční 
analýzy dat. To by mohlo zlepšit analýzu, zejména v p řípadech, kdy statis ­
ticky významná reakce byla zjišt ěna pouze u jediné tkán ě.
 
61. V p řípadě androgenního antagonismu by kontrolní skupinou m ěla být 
zkušební skupina, které je podáván pouze referen ční androgen (testosteron 
propionát). Typické znaky p ůsobení zkoušené chemické látky mohou vést 
k rozdílným relativním reakcím jednotlivých tkání; nap říklad inhibitory 5- 
alfa-reduktázy, jako finasterid, mají výrazn ější účinek na ventrální prostatu 
než na jiné tkán ě ve srovnání s ú činnými antagonisty androgenních recep ­
torů, jako je flutamid. Statisticky významné snížení (p ≤ 0,05) hmotností 
dvou nebo více z p ěti cílových tkání závislých na androgenech (VP, 
LABC, GP, COW a SVCG) související s aplikací pouze TP by m ělo být 
považováno za pozitivní výsledek androgenního antagonismu a ur čitý 
stupeň snížení hmotnosti by m ěly vykazovat všechny tyto cílové tkán ě. 
Společného hodnocení reakcí všech tkání p řídatných pohlavních orgán ů 
by mohlo být dosaženo pomocí vhodné multivaria ční analýzy dat. To by 
mohlo zlepšit analýzu, zejména v p řípadech, kdy statisticky významná 
reakce byla zjišt ěna pouze u jediné tkán ě. 
62. Údaje by m ěly být shrnuty v tabulce obsahující st řední hodnotu (pr ůměr), 
střední chybu pr ůměru (SE) (p řijatelná by byla i sm ěrodatná odchylka – 
SD) a velikost vzorku v každé skupin ě. Přiloženy by m ěly být také tabulky 
s údaji o jednotlivých zví řatech. Individuální hodnoty, st řední hodnota, 
SE (SD) a varia ční koeficient (CV) pro zví řata kontrolní skupiny by m ěly 
být posouzeny, zda spl ňují stanovená kritéria shody s historickými hodno ­
tami. Varia ční koeficienty, které p řevyšují hodnoty CV pro hmotnost 
každého orgánu uvedené v tabulce 1 (viz odstavce 25 a 26), ukazují, že 
mohlo dojít k chyb ě při zaznamenávání nebo vkládání údaj ů nebo že labo ­
ratoř dosud nezvládla p řesnou pitvu tkání závislých na androgenech a je 
nutný další výcvik/praxe. Obecn ě platí, že varia ční koeficienty (CV = 
směrodatná odchylka d ělená střední hodnotou hmotnosti orgánu) jsou repro ­
dukovatelné v r ůzných laborato řích a v různých studiích. P ředkládané údaje 
by měly zahrnovat p řinejmenším údaje o hmotnostech ventrální prostaty, 
semenných vá čků, svalů m. levator ani a m. bulbocavernosus, Cowperových 
žláz, žaludu penisu, jater a o t ělesné hmotnosti a zm ěně tělesné hmotnosti 
od začátku podávání dávek až do pitvy. P ředloženy mohou být také údaje 
po kovaria ční úpravě tělesné hmotnosti, ale to by nem ělo nahradit p ředlo­ 
žení neupravených údaj ů. Dále, nedojde-li v žádné ze skupin k odpojení 
předkožky, výskyt odpojení p ředkožky by m ěl být zaznamenán a m ělo by 
být provedeno jeho statistické srovnání s kontrolní skupinou pomocí  Fisher 
Exact  testu.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Při ověřování správnosti údaj ů vložených do po čítače porovnáním 
s původními záznamy by hodnoty hmotností orgán ů, které nejsou 
biologicky reálné nebo se od st ředních hodnot této experimentální skupiny 
liší více než o trojnásobek sm ěrodatné odchylky, m ěly být pe člivě zkon­
trolovány a možná budou muset být vylou čeny, nebo ť se pravd ěpodobně 
jedná o chyby v záznamu.  
64. Porovnání výsledk ů studie s hodnotami varia čních koeficient ů OECD 
(v tabulce 1) je často důležitým krokem p ři interpretaci validity výsledk ů 
studie. V laborato ři by měly být uchovávány historické údaje o kontrolních 
skupinách s vehikulem. V laborato ři by rovn ěž měly být uchovávány histo ­
rické údaje o reakcích na pozitivní referen ční chemické látky, jako je testos ­
teron propionát a flutamid. Laborato ře mohou rovn ěž periodicky testovat 
reakci na známé slabé agonisty a antagonisty androgen ů a tyto údaje ucho ­
vávat. Tyto údaje mohou být porovnávány s dostupnými údaji OECD, aby se zajistilo, že metody používané laborato ří mají dostate čnou statistickou 
přesnost a sílu.
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Androgenní  je výraz, který se používá k popisu kladného vlivu na r ůst tkání 
závislých na androgenech.  
Antiandrogenní  je schopnost chemické látky potla čit působení TP u savc ů. 
Citlivostí  se rozumí schopnost zkušební metody správn ě identifikovat chemické 
látky, které mají vlastnost, jež je testována.  
Datem narození  se rozumí postnatální den 0.  
Dávkou  se rozumí množství podané zkoušené chemické látky. V p řípadě Hersh­
bergerovy biologické zkoušky je dávka vyjád řena jako hmotnost zkoušené 
chemické látky na jednotku t ělesné hmotnosti pokusného zví řete za den (nap ř. 
mg/kg tělesné hmotnosti/den).  
Dávkováním  se rozumí obecný termín zahrnující dávku, četnost a trvání doby, 
po kterou je látka podávána.  
Chemickou látkou  se rozumí látka nebo sm ěs. 
Moribundní stav (agónie)  je výraz, který se používá k popisu umírajícího 
zvířete, tj. těsně před smrtí.  
Specifičností  se rozumí schopnost zkušební metody správn ě identifikovat 
chemické látky, které nemají vlastnost, jež je testována.  
Validací  se rozumí v ědecký proces, který má charakterizovat opera ční poža­
davky a omezení zkušební metody a prokázat její spolehlivost a vhodnost pro konkrétní ú čel.
 
X-tým postnatálním dnem  se rozumí x-tý den života po dni narození.  
Zkoušenou chemickou látkou  se rozumí jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená 
pomocí této zkušební metody.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Dodatek 2
  
VMG mamm: Skupina pro řízení validace zkoušek na savcích
 POZNÁMKY KE KONCEP ČNÍMU RÁMCI  
Poznámka 1:  Vstupy a výstupy na všech úrovních jsou možné a závisejí na 
aktuální pot řebě informací pro ú čely posouzení nebezpe čí 
a rizika.  
Poznámka 2:  Na úrovni 5 by ekotoxikologie m ěla zahrnovat ú činky, které 
ukazují na mechanismy negativních ú činků a potenciální poško ­
zení populace.  
Poznámka 3:  Pokud multimodální model zahrnuje n ěkolik zkoušek pro jedno ­
tlivý účinek, pak by uvedený model nahradil použití t ěchto 
jednotlivých zkoušek.  
Poznámka 4:  Hodnocení každé chemické látky by m ělo být specifické pro 
každý případ a m ělo by brát v úvahu všechny dostupné infor ­
mace s p řihlédnutím k úrovni v koncep čním rámci.  
Poznámka 5:  Uvedený koncep ční rámec by v sou časnosti nem ěl být pova ­ 
žován za vy čerpávající. Na úrovni 3, 4 a 5 obsahuje zkoušky, 
které jsou bu ď dostupné, nebo u kterých probíhá validace. Pokud 
jde o druhou jmenovanou skupinu, jsou tyto zkoušky zahrnuty prozatímn ě. Jakmile budou vyvinuty a validovány, budou do 
rámce formáln ě přidány.
 
Poznámka 6:  U úrovn ě 5 nelze mít za to, že obsahuje pouze kone čné zkoušky. 
Zkoušky zahrnuté do této úrovn ě přispívají k obecnému posou ­
zení nebezpe čí a rizik.  
LITERATURA  
1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. b řezna 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antian ­
drogenic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Protocols in 
Toxicology  16.9.1–16.9.15. J Wiley and Sons Inc.  
4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testos ­
terone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental 
Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N  o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30.  
5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing 
and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for  in vivo  androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol. Env. Health Persp. 114:1265–1269.
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob 
E (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for  in vivo  androgen and antiandrogen responses: phase 
2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671–8.  
9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413–422.  
10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem 
J26:1306–1314.  
11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38–44.  
12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113–119.
 
13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175–180.  
14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151–220.
 
16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, s. 38.  
17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
19) OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for  in vivo  
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.
 
22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hersh ­
berger assay procedure, including a dissection video. http:// rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html.
 
23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties. Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
26) Sm ěrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU ze dne 22. zá ří 2010 
o ochran ě zvířat používaných pro v ědecké účely. Úř. věst. L 276, 
20.10.2010, s. 33.  
27) Následující kapitoly v této p říloze:  
B.1a, akutní orální toxicita – metoda fixní dávky  
B.1b, akutní orální toxicita – metoda stanovení t řídy akutní toxicity  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56  ROZŠÍŘENÁ JEDNOGENERA ČNÍ STUDIE TOXICITY PRO 
REPRODUKCI  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 443 
(2012). Vychází z návrhu Institutu pro v ědy o živé p řírodě (ILSI), Institutu 
pro zdravotní a environmentální v ědy (HESI) a Technického výboru pro 
posuzování zem ědělsko-chemické bezpe čnosti (ACSA), týkajícího se rozší ­ 
řené jednogenera ční studie reprodukce v F  1 generaci publikovaném 
v dokumentu Cooper et al., 2006 (1). Struktura studie zaznamenala n ěkolik 
vylepšení a vyjasn ění s cílemzajistit flexibilitu a zd ůraznit, že je d ůležité 
začít se stávajícími poznatky, a sou časně používat pr ůběžná pozorování 
v životním cyklu k organizaci a modifikaci provád ění zkoušek. Tato 
zkušební metoda poskytuje podrobný popis rozší řené jednogenera ční studie 
toxicity pro reprodukci. Zkušební metoda popisuje t ři kohorty zví řat F  1 
generace:  
kohorta 1: posuzuje reproduk ční/vývojové ukazatele; tuto kohortu lze 
rozšířit o F  2 generaci.  
kohorta 2: posuzuje p řípadný dopad expozice chemické látce na vyvíjející 
se nervovou soustavu.  
kohorta 3: posuzuje p řípadný dopad expozice chemické látce na vyvíjející 
se imunitní systém.  
2. Rozhodnutí o tom, zda hodnotit druhou generaci a vypustit kohortu 
vývojové neurotoxicity a/nebo kohortu vývojové imunotoxicity, by se měla opírat o stávající poznatky o hodnocené chemické látce, stejn ě jako 
o potřeby různých regula čních orgán ů. Účelem této zkušební metody je 
poskytnout podrobné údaje o tom, jak lze studii provád ět a jak vy řešit 
způsob hodnocení jednotlivých kohort.
 
3. Pro regula ční orgány, které pro rozhodování o povinném za řazení druhé 
generace do postupu testování používají tzv. vnit řních příkazů, byl pro 
tyto účely vydán pokyn OECD č. 117 (39).  
VÝCHOZÍ ÚVAHY A CÍLE  
4. Hlavním cílem rozší řené jednogenera ční studie toxicity pro reprodukci je 
zhodnotit konkrétní životní stadia, která nejsou zahrnuta do jiných typ ů 
studií toxicity, a otestovat ú činky, které se mohou vyskytnout v d ůsledku 
expozice chemické látce v prenatálním a postnatálním stadiu. V p řípadě 
reprodukčních ukazatel ů se předpokládá, že pokud jsou takové údaje 
dostupné, tak jako první krok jsou pro odhalení ú činků na reproduktivní 
orgány samc ů a samic použity informace ze studií opakovaného dávkování, 
např. OECD TG 422 (32)), nebo krátkodobých screeningových zkoušek 
endokrinních disruptor ů, (např. Uterotrofní zkouška – zkušební metoda 
B.54 (36) a Hershbergerova zkouška – zkušební metoda B.55 (37)). To může zahrnovat údaje o spermatogenezi (histopatologické vyšet ření varlat) 
u samců a estrální cyklus, po čty folikul ů/zrání oocyt ů a integrita vaje čníků 
(histopatologické vyšet ření) u samic. Rozší řená jednogenera ční studie toxi ­
city pro reprodukci poté slouží jako zkouška reproduk čních ukazatel ů, které 
vyžadují interakci samc ů se samicemi, samic se zárodkem a samic 
s potomstvem a F
 1 generací až do doby po dosažení pohlavní zralosti 
(viz pokyn OECD č. 151 podporující tuto zkušební metodu (40)).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Tato zkušební metoda má poskytnout hodnocení prenatálních 
a postnatálních ú činků chemických látek na vývoj, jakož i d ůkladné zhod ­
nocení systémové toxicity u b řezích samic a samic v dob ě laktace 
a u mladého a dosp ělého potomstva. O čekává se, že p ři podrobném zkou ­
mání klíčových vývojových ukazatel ů, jakými jsou životaschopnost potom ­
stva, neonatální zdraví, vývojový stav p ři narození a fyzický a funk ční 
vývoj do dosp ělosti, budou ur čeny konkrétní cílové orgány v potomstvu. 
Studie navíc poskytne a/nebo potvrdí informace o ú čincích zkoušené 
chemické látky na integritu a výkonnost rozmnožovací soustavy dosp ělých 
samců a samic. V úvahu jsou brány konkrétn ě, nikoli však výlu čně tyto 
parametry: funkce pohlavních žláz, estrální cyklus, zrání epididymálních spermií, zp ůsob chování p ři páření, plození, b řezost, vrh a laktace. Dále 
budou informace získané z posouzení vývojové neurotoxicity a vývojové 
imunotoxicity charakterizovat potenciální ú činky v těchto systémech. Údaje 
odvozené z t ěchto zkoušek by m ěly umožnit ur čení dávek bez pozorova ­
ného nep říznivého ú činku ( No-Observed Adverse Effect Levels  – NOAEL), 
dávek s nejnižším pozorovaným nep říznivým ú činkem ( Lowest Observed 
Adverse Effect Levels  – LOAEL) a/nebo referen čních dávek pro r ůzné 
ukazatele a/nebo by m ěly být využity k charakterizaci ú čink
ů zjištěných 
v předchozích studiích s opakovaným dávkováním a/nebo by m ěly sloužit 
jako návod pro následné zkoušky.  
6. Schéma zkušebního postupu obsahuje obrázek 1. Zkoušená chemická látka 
je podávána nep řetržitě ve stup ňovaných dávkách n ěkolika skupinám 
pohlavně zralých samc ů a samic. Této rodi čovské generaci (P) jsou 
dávky podávány po stanovené období p řed pářením (vybráno na základ ě 
dostupných informací pro zkoušenou chemickou látku, ale minimáln ě po 
dobu dvou týdn ů) a po dvoutýdenní období pá ření. Samc ům z P generace 
jsou dávky podávány dále nejmén ě až do odstavení generace F  1 . Dávky by 
měli dostávat minimáln ě 10 týdn ů. Je-li nutné objasnit ú činky na repro ­
dukci, mohou dávky dostávat déle. Podávání dávek samicím P generace 
pokračuje během březosti a laktace až do utracení po odstavení jejich 
vrhu (tj. 8–10 týdn ů aplikace). Potomstvo z generace F  1 dostává další 
dávky zkoušené chemické látky od odstavení až do dosp ělosti. Pokud je 
hodnocena druhá generace (viz pokyn OECD č. 117 (39)), potomci 
z generace F  1 budou dávky dostávat až do odstavení generace F  2 nebo až 
do ukončení studie.  
7. U všech zví řat se provád ějí klinická pozorování a patologická vyšet ření 
příznaků toxicity, a to se zvláštním d ůrazem na integritu a výkonnost 
samčí a samičí rozmnožovací soustavy a na zdraví, r ůst, vývoj a funkci 
jejich potomstva. P ři odstavení jsou vybraní potomci za řazeni do konkrét ­
ních podskupin (kohorty č. 1–3, viz odstavce 33 a 34 a obrázek 1), kde jsou 
dále zkoumáni, v četně pohlavní zralosti, integrity a funkce reproduk čních 
orgánů, ukazatel ů v oblasti neurologie a chování a funkcí imunity.  
8. Při realizaci studie by m ěly být respektovány hlavní zásady a aspekty 
stanovené v pokynu OECD č. 19 o uznávání, posuzování a používání 
klinických znak ů jako humánních ukazatel ů pro pokusná zví řata používaná 
při hodnocení bezpe čnosti (34).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Až bude k dispozici dostate čný počet studií k posouzení ú činnosti experi ­
mentálního uspo řádání této nové metody, bude zkušební metoda p řezkou­
mána a v p řípadě potřeby bude tato zkušební metoda revidována z hlediska 
nabytých zkušeností.  
Obrázek 1  
Schéma rozší řené jednogenera ční studie toxicity pro reprodukci
  
POPIS METODY/P ŘÍPRAVY NA ZKOUŠKU  
Zvířata 
Výběr živočišných druh ů a kmenů 
10. Výb ěr druhů pro zkoušku toxicity pro reprodukci by m ěl být pečlivě zvážen 
z hlediska veškerých dostupných informací. Avšak vzhledem k rozsahu existujících základních údaj ů a vzhledem ke srovnatelnosti s výsledky obec ­
ných zkoušek toxicity je obvykle up řednostňovaným druhem potkan a práv ě 
na tento druh odkazují kritéria a doporu čení uvedená v této zkušební 
metodě. Pokud je použit jiný živo čišný druh, m ěl by být jeho výb ěr 
odůvodněn a bude nutné pat řičným způsobem upravit zkušební postup. 
Není vhodné používat kmeny s nižší plodností nebo s typicky vysokým 
výskytem spontánních vývojových vad.
 
Kritéria pro stá ří, tělesnou hmotnost a za řazení do skupin  
11. Měla by být použita zdravá rodi čovská zví řata, která nebyla p ředtím podro ­
bena žádným pokus ům. Měli by být zkoumáni samci i samice, samice by 
měly být nulipary a nem ěly by být b řezí. Zvířata z P generace by m ěla být 
pohlavně zralá, m ěla by mít v dob ě zahájení podávání dávek podobnou 
hmotnost (v rámci pohlaví), m ěla by být podobn ě stará (přibližně 90 dní) 
při páření a m ěla by být reprezentativní v rámci zkoumaného druhu 
a kmene. Zví řata by se m ěla po dobu nejmén ě pěti dnů po přejímce akli ­
matizovat. Zví řata jsou náhodn ě rozřazena do kontrolních skupin 
a experimentálních skupin tak, že výsledkem jsou srovnatelné st řední 
hodnoty t ělesné hmotnosti (tj. ±20 % st řední hodnoty).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Podmínky chovu a krmení  
12. Teplota v místnosti pro pokusná zví řata by měla být 22 °C (± 3°). Relativní 
vlhkost by se m ěla pohybovat mezi 30 a 70 %, p řičemž ideální je rozmezí 
od 50 do 60 %. Um ělé osvětlení by m ělo svítit 12 hodin a 12 hodin by 
měla být tma. M ůže být použita konven ční laboratorní potrava 
s neomezeným p řístupem k pitné vod ě. Zvláštní pozornost by se m ěla 
věnovat obsahu fytoestrogen ů ve stravě, jelikož vysoká míra fytoestrogenu 
ve stravě by mohla ovlivnit n ěkteré reproduktivní ukazatele. Je doporu čena 
standardizovaná strava s nestanoveným složením, v níž byly omezeny látky 
obsahující estrogeny (2) (30). Výb ěr potravy m ůže být ovlivn ěn potřebou 
zajistit dostate čné promísení s testovanou látkou, je-li látka podávána touto 
cestou. M ěl by být ov ěřen obsah, homogenita a stabilita zkoušené chemické 
látky v potrav ě. Měla by být pravideln ě prováděna analýza krmiva a pitné 
vody z hlediska p říměsí. Vzorky každé šarže potravy používané b ěhem 
studie by m ěly být až do dokon čení zprávy uchovávány za vhodných 
podmínek (nap ř. zmrazené p ři – 20 °C) pro p řípad, že bude nutné provést 
další analýzu složek potravy.  
13. Zvířata by m ěla být umíst ěna do klecí v malých skupinách obsahujících 
zvířata stejného pohlaví a experimentální skupiny. Zví řata lze chovat jedno ­
tlivě, aby se p ředešlo případným zran ěním (např. samci po období pá ření). 
Páření by m ělo probíhat ve vhodných klecích. Po spá ření je třeba umístit 
samice, u nichž se p ředpokládá, že byly oplodn ěny, odděleně do porodních 
nebo mate řských klecí, kde jim je poskytnut odpovídající a p řesně stano­
vený materiál pro tvorbu hnízda. Mlá ďata jsou až do odstavení se svými 
matkami. Zví řata F  1 generace by m ěla být umíst ěna v malých skupinách 
téhož pohlaví a experimentální skupiny od odstavení až do utracení. Je-li to vědecky odůvodněno, mohou být zví řata umístěna samostatn ě. Obsah fytoe ­
strogenů obsažených ve vybraném materiálu pro podestýlku by m ěla být 
minimální.
 
Počet a identifikace zví řat 
14. Každá zkušební a kontrolní skupina by m ěla obsahovat dostate čný počet 
spářených pár ů, aby mohlo být dosaženo alespo ň dvaceti b řezích samic 
v jedné dávkové skupin ě. Cílem je získat dostate čný počet březích samic 
a tím zajistit smysluplné hodnocení schopnosti dané chemické látky ovlivnit 
plodnost, b řezost, chování samic generace P, r ůst a vývoj potomstva gene ­
race F  1 od početí až do dosp ělosti. Nepoda ří-li se však dosáhnout požado ­
vaného po čtu březích zví řat, nemusí to nutn ě znamenat znehodnocení 
studie, a proto by hodnocení m ělo vždy probíhat individuáln ě případ od 
případu s uvážením možného p říčinného vztahu ke zkoušené chemické 
látce.  
15. Každému zví řeti P generace se p řed podáváním dávek p řiřadí vlastní iden ­
tifikační číslo. Nazna čují-li laboratorní historické údaje, že významná část 
samic nemusí vykazovat pravidelný ( čtyřdenní nebo p ětidenní) estrální 
cyklus, je doporu čeno provést p řed aplikací posouzení estrálního cyklu. 
Případně lze velikost skupiny zvýšit, aby bylo zajišt ěno, že alespo ň dvacet 
samic v každé skupin ě bude mít p ři zahájení aplikace pravidelný ( čtyřdenní 
nebo pětidenní) estrální cyklus. Veškeré potomstvo z F  1 generace dostane 
vlastní identifikaci p ři první prohlídce novorozených mlá ďat v postnatální 
den (PND) 0 nebo 1. Záznamy ozna čující vrh, z kterého pochází, by m ěly 
být uchovávány pro všechna zví řata F  1 generace, p říp. zvířata F  2 generace 
po celou dobu studie.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Zkoušená chemická látka  
Dostupné informace o zkoušené chemické látce  
16. Průzkum existujících informací je d ůležitý pro rozhodnutí o zp ůsobu 
podání, výb ěru vehikula, volb ě živočišných druh ů, volbě dávkování 
a potenciálních modifikacích dávkovacího programu. Z tohoto d ůvodu by 
při plánování rozší řené jednogenera ční studie toxicity pro reprodukci m ěly 
být vzaty v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené chemické látce, tj.fyzikáln ě-chemické vlastnosti, toxikokinetika (v četně metabolismu speci ­
fického pro daný druh), toxikodynamické vlastnosti, vztahy mezi strukturou 
a aktivitou (SAR), metabolické procesy  in vitro , výsledky p ředchozích 
studií toxicity a p říslušné informace pro strukturní analogy dané látky. 
Předběžné informace o absorpci, distribuci, metabolismu 
a eliminaci (ADME) a bioakumulaci lze odvodit z chemické struktury, 
fyzikálně-chemických údaj ů, míry vázání plazmatických bílkovin nebo 
toxikokinetických (TK) studií, zatímco dopl ňující informace jsou získávány 
z výsledk ů studií o toxicit ě, např. o NOAEL, metabolismu nebo indukci 
metabolismu.
 
Zohlednění toxikokinetických údaj ů 
17. Ačkoli to není vyžadováno, toxikokinetické údaje z d říve provedených 
předběžných studií pro stanovení rozmezí dávek nebo jiných studií jsou 
mimořádně užitečné při plánování struktury studie, volb ě úrovní dávek 
a interpretaci výsledk ů. Užitečné jsou zejména ty údaje, které: 1) ov ěřují 
expozici vyvíjejících se plod ů a mláďat zkoušené chemické látce (nebo 
příslušným metabolit ům), 2) poskytují odhad interní dozimetrie, a 3) 
hodnotí potenciální saturaci kinetických proces ů v závislosti na dávkách. 
Jsou-li k dispozici, m ěly by být zohledn ěny i další toxikokinetické údaje, 
jako jsou profily metabolit ů, vývoj koncentrace v čase atd. B ěhem hlavní 
studie lze shromáždit i dopl ňující toxikokinetické údaje za p ředpokladu, že 
tento sběr nezasahuje do sb ěru a interpretace ukazatel ů hlavní studie.  
Obecně při plánování rozší řené jednogenera ční studie toxicity pro repro ­
dukci je užite čné zařadit následující soubory toxikokinetických údaj ů: 
— pozdní b řezost (nap ř. den gestace 20) – krev matky a krev plodu,  
— střední laktace (PND 10) – krev matky, krev mlád ěte a/nebo mléko,  
— brzké odstavení (nap ř. PND 28) – krevní vzorky odstaveného mlád ěte. 
Při určování specifických analyt ů (např. chemická látka a/nebo metabolity 
u rodičů) a schématu odb ěru vzorků je zapot řebí postupovat flexibiln ě. 
Například počet a načasování sb ěru vzorků v daný den odb ěru vzorků 
bude záviset na zp ůsobu expozice a p ředchozích znalostech toxikokinetic ­
kých vlastností u zví řat, která nejsou b řezí. U studií potravy sta čí odběr 
vzorků v jeden pevný čas v každý z t ěchto dnů, zatímco podávání dávek 
žaludeční sondou m ůže vyžadovat další časy odběru vzorků pro získání 
lepšího odhadu rozmezí interních dávek. Není však nutné generovat v kterýkoli z dn ů odběru vzork ů úplný vývoj koncentrace v čase. 
V nezbytném p řípadě může být krev pro fetální a neonatální analýzu 
smíchána podle pohlaví v rámci vrh ů.
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Způsob podání  
18. Při volbě způsobu podání by m ěl být zohledn ěn způsob, případně způsoby, 
které jsou nejd ůležitější z hlediska expozice člověka. Ačkoli zkušební 
postup je popsán pro podávání zkoušené chemické látky ve strav ě, může 
být upraven pro podávání jinými zp ůsoby (pitnou vodou, žalude ční sondou, 
inhalací, k ůží) v závislosti na vlastnostech dané chemické látky 
a požadovaných informacích.  
Volba vehikula  
19. Je-li to nutné, je zkoušená chemická látka rozpušt ěna nebo suspendována ve 
vhodném vehikulu. Je doporu čeno, je-li to možné, nejprve zvážit použití 
vodného roztoku/suspense, potom použití roztoku/suspenze v oleji (nap ř. 
kukuřičném oleji). U jiného typu vehikula, než je voda, je t řeba znát jeho 
toxické charakteristiky. Nem ěla by být používána vehikula s vlastní toxi ­
citou (nap ř. aceton, DMSO). M ěla by být ur čena stabilita zkoušené 
chemické látky v daném vehikulu. Pokud se pro usnadn ění dávkování 
používá vehikulum nebo jiné aditivum, m ěla by být v ěnována pozornost 
jeho následujícím charakteristikám: ú činkům na absorpci, distribuci, meta ­
bolismus nebo retenci zkoušené chemické látky, ú činkům na chemické 
vlastnosti zkoušené chemické látky, které mohou pozm ěnit její toxické 
charakteristiky, a ú činkům na spot řebu potravy nebo vody nebo nutri ční 
stav zvířat. 
Výběr dávky  
20. Studie by zpravidla m ěla obsahovat nejmén ě tři úrovně dávek a soub ěžnou 
kontrolu. P ři výběru vhodných úrovní dávek by experimentátor m ěl zvážit 
všechny dostupné informace, v četně informací o dávkování z p ředchozích 
studií, toxikokinetických údaj ů získaných z b řezích nebo neb řezích zví řat, 
rozsahu lakta čního transferu a odhad ů expozice člověka. Jsou-li k dispozici 
toxikokinetické údaje, které uvád ějí saturaci toxikokinetických proces ů 
v závislosti na dávkách, je zapot řebí se vyvarovat vysokých úrovní dávek, 
které jasn ě ukazují saturaci, ovšem za p ředpokladu, že se o čekává, že 
expozice lidí budou výrazn ě nižší než bod saturace. V takových p řípadech 
by nejvyšší úrove ň dávek m ěla být na úrovni inflexního bodu pro p řechod 
na nelineární toxikokinetické chování nebo jen mírn ě nad ním.  
21. Nejsou-li k dispozici p říslušné toxikokinetické údaje, úrovn ě dávek by m ěly 
vycházet z toxických ú činků, nejsou-li omezeny fyzikální/chemickou 
povahou zkoušené chemické látky. Pokud se úrovn ě dávek opírají 
o toxicitu, nejvyšší dávka by m ěla být vybrána s cílem vyvolat ur čitou 
systémovou toxicitu, ne však uhynutí nebo velké utrpení zví řat. 
22. Měla by být zvolena sestupná řada úrovní dávek s cílem prokázat ú činky 
související s dávkou a stanovit hodnotu dávky bez pozorovaného nep řízni­
vého účinku (NOAEL) nebo dávky blízko limitu detekce, které by umožnily 
odvození referen ční dávky pro nejcitliv ější ukazatel(e). S cílem p ředejít 
velkým rozmezím dávek mezi NOAEL a LOAEL jsou často optimální 
dvojnásobné až čtyřnásobné intervaly. Často je vhodn ější přidat čtvrtou 
experimentální skupinu než použít velmi velký interval (nap ř. odpovídající 
faktoru v ětšímu než 10) mezi dávkami.  
23. S výjimkou aplikace zkoušené chemické látky je t řeba se zví řaty v kontrolní 
skupině zacházet stejným zp ůsobem jako se zví řaty v experimentální 
skupině. Této skupin ě se nepodává žádná látka nebo tvo ří kontrolní skupinu 
s napodobeným podáváním nebo se jí podává vehikulum, jestliže se p ři 
podávání zkoušené chemické látky vehikulum používá. Používá-li se vehi ­
kulum, m ělo by se kontrolní skupin ě podat v nejvyšším používaném 
objemu.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Limitní zkouška  
24. Pokud není prokázána toxicita u dávky nejmén ě 1 000 mg/kg t ělesné hmot ­
nosti a den ve studiích s opakovaným dávkováním nebo pokud se toxicita neočekává ani na základ ě existujících údaj ů o strukturn ě/metabolicky p říbu­
zných chemických látkách, nazna čujících podobnost metabolických vlast ­
ností  in vivo/in vitro , pak studie s n ěkolika dávkami nemusí být nutná. 
V takových p řípadech rozší řená jednogenera ční studie toxicity pro repro ­
dukci může být provedena s kontrolní skupinou s jednou dávkou o velikosti 
nejméně 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti a den. Pokud však bude toxicita 
pro reprodukci nebo vývoj v této limitní dávce nalezena, budou pro iden ­
tifikaci NOAEL požadovány další studie p ři nižších úrovních dávek. Tyto 
úvahy o limitní zkoušce se uplat ňují pouze tehdy, když expozice člověka 
nenaznačuje nutnost vyšší úrovn ě dávky.
 
POSTUPY  
Expozice potomstva  
25. Upřednostňovaným zp ůsobem podání je expozice v potrav ě. Pokud se 
provádějí studie s podáváním látky žalude ční sondou, je zapot řebí pozna ­
menat, že mlá ďata budou dostávat zkoušenou chemickou látku pouze 
nepřímo prost řednictvím mléka, dokud neza čne přímé dávkování po jejich 
odstavení . Ve studiích s podáváním látky v potrav ě nebo pitné vod ě budou 
mláďata navíc dostávat zkoušenou chemickou látku p římo, jakmile za čnou 
během posledního týdne lakta čního období sama žrát. Pokud je vylu čování 
zkoušené chemické látky v mléce špatné a pokud je nedostatek doklad ů 
o nepřetržité expozici potomstva, m ěly by být zváženy modifikace uspo řá­
dání studie. V t ěchto případech by m ělo být zváženo na základ ě dostupných 
toxikokinetických informací, toxicity u potomstva nebo zm ěnách biomar ­
kerů (3) (4) p římé podávání dávek mlá ďatům v lakta čním období. P řed 
provedením studií p římého podávání dávek kojeným mlá ďatům (5) by 
měly být pe člivě zváženy p řínosy a nevýhody.  
Plán dávkování a podávání dávek  
26. Z p ředchozích studií toxicity p ři opakovaném dávkování, které m ěly 
adekvátní trvání, mohou být k dispozici ur čité informace o estrálních 
cyklech, histopatologických vyšet řeních sam čího a sami čího pohlavního 
ústrojí a analýze varlat/epididymálních spermií. Délka expozice p řed 
pářením v rámci rozší řené jednogenera ční studie toxicity pro reprodukci 
se tudíž zam ěřuje na odhalení ú činků na funk ční změny, které mohou 
zasáhnout do zp ůsobu chování p ři páření a do oplodn ění. Expozice p řed 
pářením by m ěla být dostate čně dlouhá kv ůli tomu, aby bylo dosaženo 
stálých podmínek expozice u samc ů i samic P generace. Ve v ětšině případů 
se za adekvátní pro ob ě pohlaví považuje dvoutýdenní expozice p řed páře­
ním. U samic zahrnuje t ři až čtyři celé estrální cykly a m ěla by sta čit 
k odhalení jakýchkoli negativních ú činků na cykly. U samc ů toto trvání 
odpovídá dob ě požadované pro epididymální p řechod zrajících spermií 
a mělo by umožnit odhalení posttestikulárních ú činků na spermie p ři páření 
(během kone čných stadií spermiace a epididymálního zrání spermií). 
V době utracení, kdy je naplánováno histopatologické vyšet ření varlat 
a nadvarlat a analýza parametr ů spermií, budou samci P a F  1 generace 
mít za sebou expozici pro nejmén ě jeden celý spermatogenní proces ((6) 
(7) (8) (9) a pokyn OECD č. 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Scéná ře expozice samc ů před pářením lze p řizpůsobit, pokud v p ředchozích 
studiích byla jasn ě identifikována toxicita pro varlata (zhoršení spermato ­
geneze) nebo ú činky na integritu a funkci spermatu. Podobn ě i u samic 
mohou známé ú činky zkoušené chemické látky na estrální cyklus, a tudíž 
i pohlavní citlivost od ůvodnit různé scéná ře expozice p řed pářením. Ve 
zvláštních p řípadech lze akceptovat, aby aplikace u samic P generace 
byla zahájena až po získání st ěru pozitivního na spermie (viz pokyn 
OECD č. 151 (40)).  
28. Po stanovení období podávání dávek p řed pářením by m ěla být zví řatům 
zkoušená chemická látka podávána nep řetržitě po dobu sedmi dn ů v týdnu 
až do pitvy. Všem zví řatům by měly být dávky podávány stejným zp ůso­
bem. Podávání dávek by m ělo pokračovat během dvoutýdenního pá ření 
a u samic P generace po dobu gestace a laktace až do jejich utracení po 
odstavení mlá ďat. U samc ů by aplikace m ěla probíhat stejným zp ůsobem až 
do utracení v dob ě, kdy jsou zví řata F  1 generace odstavena. U pitvy by 
přednost m ěla být dána samicím, které by m ěly být pitvány ve stejném/ 
přibližně stejném dni laktace. Pitvu samc ů lze v závislosti na laboratorních 
možnostech rozložit na dobu v ětšího počtu dnů. Nebylo-li p římé podávání 
dávek vybraným samc ům a samicím F  1 generace zahájeno již b ěhem období 
laktace, m ělo by začít při odstavení a m ělo by pokra čovat až do napláno ­
vané pitvy v závislosti na za řazení do kohorty.  
29. U chemických látek podávaných v potrav ě nebo v pitné vod ě je důležité 
zajistit, aby množství použité zkoušené chemické látky neovliv ňovalo 
normální výživu nebo vodní rovnováhu. Pokud je zkoušená chemická látka podávána v potrav ě, lze uplat ňovat buď konstantní koncentraci 
v potravě (ppm) nebo konstantní úrove ň dávek z hlediska t ělesné hmotnosti 
zvířete; vybraná možnost by m ěla být specifikována.
 
30. Při podávání zkoušené chemické látky žalude ční sondou by objem jedno ­
rázově podané kapaliny nem ěl zpravidla p řekročit 1 ml/100 g t ělesné hmot ­
nosti (0,4 ml/100 g t ělesné hmotnosti je maximum pro olej, nap ř. kukuřičný 
olej). S výjimkou dráždivých nebo žíravých chemických látek, kde se ve vyšších koncentracích obvykle ukáže další zhoršení ú činků, se prom ěnlivost 
množství zkoušené látky sníží nastavením takové koncentrace, která zajistí 
konstantní množství na všech úrovních dávek. Aplikace by m ěla být 
prováděna každý den zhruba ve stejnou dobu. Dávka pro každé zví ře by 
měla zpravidla vycházet z posledního individuálního ur čení tělesnéhmot ­
nosti a m ěla by být upravována nejmén ě jednou týdn ě u dosp ělých 
samců a dospělých nebřezích samic a jednou za dva dny u b řezích samic 
a zvířat F
 1 generace, pokud je podávána p řed odstavením a v pr ůběhu dvou 
týdnů po odstavení. Nazna čují-li toxikokinetické údaje nízký placentární 
přenos zkoušené chemické látky, m ůže být nutné podávání žalude ční 
sondou v posledním týdnu b řezosti upravit tak, aby b řezí samici nebyla 
podána příliš toxická dávka. Samicím by chemická látka v den vrhu nem ěla 
být podávána žalude ční sondou ani žádným jiným zp ůsobem, při kterém se 
se zvířaty musí manipulovat; v tento den se up řednostňuje zkoušenou 
chemickou látku nepodávat a nerušit proces porodu.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Páření 
31. Každá samice P generace by m ěla být umíst ěna s jedním, náhodn ě vybra­
ným, nep říbuzným samcem z téže dávkové skupiny (pá ření 1:1) až do 
doby, kdy budou pozorovány d ůkazy o spá ření, nebo do uplynutí dvou 
týdnů. Pokud je nedostatek samc ů, například z d ůvodu jejich uhynutí 
před pářením, lze samce, který/kte ří se již spá řil/i, pářit (1:1) s druhou 
samicí, aby byly spá řeny všechny samice. Den 0 b řezosti je definován 
jako den, kdy je potvrzen d ůkaz o spá ření (je nalezena vaginální zátka 
nebo sperma). Zví řata by m ěla být odd ělena co nejd říve po zpozorování 
důkazů o spáření. Nedošlo-li ke spá ření do dvou týdn ů, zvířata by měla být 
oddělena bez další možnosti pá ření. Spářené páry se v záznamech jasn ě 
označí. 
Velikost vrhu  
32. Čtvrtý den po vrhu se velikost všech vrh ů upraví náhodným vy řazením 
nadbytečných jedinc ů tak, aby bylo pokud možno dosaženo po čtu pěti 
samců a pěti samic z jednoho vrhu. Selektivní eliminace jedinc ů, např. na 
základě tělesné hmotnosti, není vhodná. Pokud po čet mladých samc ů nebo 
samic neumož ňuje ponechat p ět od každého pohlaví a vrhu, je možná 
částečná úprava (nap ř. ponechat šest samc ů a čtyři samice).  
Výběr mláďat pro studie po odstavení (viz obrázek 1)  
33. Pro další zkoumání je p ři odstavení (kolem PND 21) mlá ďat ze všech 
dostupných vrh ů vybráno až do 20 jedinc ů na jednu dávkovou skupinu 
a také kontrolní skupina a tento stav je udržován až do pohlavní zralosti 
(pokud nejsou vyžadovány d řívější zkoušky). Jedinci jsou vybíráni náhodn ě 
s tou výjimkou, že by nem ěla být do t ěchto skupin za řazována zakrslá 
mláďata (zvířata s tělesnou hmotností, jež je o dv ě směrodatné odchylky 
nižší než st řední hmotnost mlá ďat v příslušném vrhu), jelikož nejsou prav ­
děpodobně reprezentativními zástupci experimentální skupiny.  
V PND 21 jsou vybraní jedinci F  1 generace následujícím zp ůsobem 
náhodně zařazeni do jedné ze t ří kohort zví řat: 
kohorta 1 (1 A a 1B)= zkoušení toxicity pro reprodukci/vývoj,  
kohorta 2 (2 A a 2B)= zkoušení vývojové neurotoxicity,  
kohorta 3= zkoušení vývojové imunotoxicity.  
Kohorta 1 A: jeden samec a jedna samice z vrhu a skupiny (20/pohlaví/ 
skupinu): prioritní výb ěr pro primární posouzení ú činků na rozmnožovací 
soustavu a hodnocení obecné toxicity.  
Kohorta 1B: jeden samec a jedna samice z vrhu a skupiny (20/pohlaví/ 
skupinu): prioritní výb ěr pro následné posouzení reproduktivního výkonu 
pářením zví řat F  1 generace, když je to p ředepsáno (viz pokyn OECD 
č. 117 (39)), a pro získání dalších údaj ů o histopatologických vyšet řeních 
v případě podezření na reproduktivní nebo endokrinní toxikanty nebo 
v případě, kdy jsou výsledky z kohorty 1 A dvojzna čné. 
Kohorta 2 A: celkem 20 mlá ďat na skupinu (10 samc ů a 10 samic na 
skupinu; jeden samec nebo jedna samice z každého vrhu) p řidělených pro 
účely neurobehaviorálních zkoušek následovaných neurohistopatologickým 
posouzením u dosp ělých.  
Kohorta 2B: celkem 20 mlá ďat na skupinu (10 samc ů a 10 samic na 
skupinu; jeden samec nebo jedna samice z každého vrhu) p řidělených pro 
účely neurohistopatologického posouzení p ři odstavení (PND 21 nebo PND 
22). Pokud není dostatek zví řat, měla by být zví řata přednostně zařazena do 
kohorty 2 A.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Kohorta 3: celkem 20 mlá ďat na skupinu (10 samc ů a 10 samic na skupinu; 
pokud možno z každého vrhu jeden jedinec). Další mlá ďata z kontrolní 
skupiny mohou být použita pro pozitivní kontrolu p ři zkoušce protilátkové 
odezvy závislé na T bu ňkách (TDAR) v PND 56 ± 3.  
34. Pokud by ve vrhu byl nedostatek mlá ďat na to, aby mohla být za řazena do 
všech kohort, má p řednost kohorta č. 1, jelikož m ůže být rozší řena 
o produkci F  2 generace. V p řípadě specifické pot řeby lze do kterékoli 
z kohort za řadit další mlá ďata, např. pokud existuje podez ření, že daná 
chemická látka je neurotoxikant, imunotoxikant nebo reproduktivní toxi ­
kant. Tato mlá ďata lze využít ke zkouškám v jiných časových intervalech 
nebo pro hodnocení dopl ňujících ukazatel ů. Mláďata, která nebudou 
zařazena do kohort, budou podrobena klinickým biochemickým vyšet řením 
(odstavec 55) a celkové pitv ě (odstavec 68).  
Druhé pá ření zvířat P generace  
35. Druhé pá ření není u zví řat P generace zpravidla doporu čováno, jelikož 
probíhá na úkor ztráty d ůležitých informací o po čtu implanta čních míst 
(a tedy údaj ů o postimplanta čních a perinatálních ztrátách, indikátor ů 
o možném teratogenním potenciálu) pro první vrh. Pot řeba ověřit nebo 
objasnit ú činek u samic, které byly vystaveny expozici, by byla uspokojena 
lépe, pokud by studie byla rozší řena o pá ření F  1 generace. Avšak druhé 
páření samc ů P generace se samicemi, kterým nebyla podávána daná 
chemická látka, je vždy možností, jak vyjasnit nejednozna čné nálezy nebo 
dále charakterizovat ú činky na plodnost pozorované p ři prvním pá ření. 
POZOROVÁNÍ ŽIVÝCH ZVÍ ŘAT 
Poznatky z klinického pozorování  
36. U zví řat P generace a vybraných zví řat F  1 generace se všeobecné klinické 
pozorování provádí jednou denn ě. V případě podávání dávek žalude ční 
sondou by klinické pozorování m ělo proběhnout před podáním a po podání 
dávky (za ú čelem zjišt ění případných známek toxicity spojených se špi č­
kovou koncentrací plazmy). Zaznamenají se významné zm ěny chování, 
známky ztíženého nebo prodlužovaného vrhu a všechny p říznaky toxicity. 
Dvakrát denn ě, o víkendech jednou denn ě, se provede vyšet ření všech 
zvířat za účelem zjišt ění závažné toxicity, morbidity a mortality.  
37. Navíc se jednou týdn ě provede podrobn ější vyšetření všech zví řat P a F  1 
generace (po odstavení), p řičemž toto vyšet ření lze p říhodně provádět při 
vážení zví řete, což by minimalizovalo stres z manipulace. Pozorování by 
měla být provád ěna pečlivě a měla by být zaznamenávána pomocí systém ů 
hodnocení, které byly definovány zkušební laborato ří. Je třeba se pokusit 
zajistit, aby rozdíly mezi podmínkami zkoušek byly minimální. Vyšet ření 
by mělo mimo jiné zahrnovat zm ěny kůže, srsti, o čí a sliznic, výskyt sekret ů 
a exkretů a vegetativních funkcí (nap ř.slzení, zježení srsti, velikost zornic, 
nezvyklé dýchání). Zaznamenávat by se m ěly změny chůze, polohy a reakce 
na manipulaci, dále p řítomnost klonických a tonických pohyb ů, stereotyp ů 
v chování (nap ř.vytrvalých čistících pohyb ů nebo opakovaného kroužení) 
nebo bizarního chování (nap ř.sebepoškozování, pohybu pozpátku).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Tělesná hmotnost a spot řeba potravy a vody  
38. Zvířata P generace jsou vážena první den podání dávky a poté nejmén ě 
jednou týdn ě. Kromě toho jsou samice P generace váženy b ěhem laktace ve 
stejné dny, ve které probíhá vážení mlá ďat z jejich vrh ů (viz odstavec 44). 
Všechna zví řata F  1 generace jsou vážena individuáln ě při odstavení (PND 
21) a poté nejmén ě jednou týdn ě. Tělesná hmotnost je také zaznamenána 
v den, kdy dosáhnou puberty (dokon čení odlou čení předkožky nebo vagi ­
nální průchodnost). Všechna zví řata jsou vážena p ři utracení.  
39. Během studie je nejmén ě jednou týdn ě ve stejné dny jako vážení t ělesné 
hmotnosti zví řat (s výjimkou období kohabitace) zaznamenávána spot řeba 
potravy a vody (v p řípadě podávání zkoušené chemické látky v pitné vod ě). 
Spotřeba potravy v každé kleci zví řat F  1 generace je po čínaje výb ěrem do 
příslušné kohorty zaznamenávána jednou týdn ě. 
Estrální cykly  
40. Předběžné informace o ú čincích zkoušené chemické látky na estrální cyklus 
mohou být k dispozici již z p ředchozích studií toxicity p ři opakovaném 
dávkování a lze je použít p ři sestavování zkušebního postupu specifického 
pro zkoušenou chemickou látku, který se týká rozší řené jednogenera ční 
studie toxicity pro reprodukci. Hodnocení estrálních cykl ů (při vaginální 
cytologii) za čne zpravidla na za čátku období expozice a bude pokra čovat 
až do potvrzení pá ření nebo do konce dvoutýdenního období pá ření. Pokud 
před aplikací prob ěhl screening samic z hlediska normálního estrálního 
cyklu, je pak vhodné pokra čovat se st ěry i po zahájení aplikace. Pokud 
však existuje podez ření na nespecifické ú činky při zahájení expozice (nap ř. 
počáteční výrazné snížení spot řeby potravy), m ůže být zví řatům dána 
možnost adaptace na expozici po dobu až dvou týdn ů před zahájením 
dvoutýdenního období odb ěru stěrů trvajícího až do pá ření. Pokud je období 
expozice látce samicím takto prodlouženo (tj. na čtyřtýdenní aplikaci p řed 
pářením), m ěl by být zvážen nákup mladších zví řat a prodloužení období 
expozice samc ů před pářením. Při získávání vaginálních/cervikálních bun ěk 
je třeba neporušit sliznice a následn ě tak nevyvolat stav falešné b řezosti 
(10) (11).  
41. Vaginální st ěry by měly být od za čátku vaginální pr ůchodnosti zkoumány 
každý den u všech samic F  1 generace v kohort ě 1 A, dokud nebude zazna ­
menán první st ěr zrohovat ělých bun ěk, aby bylo možno ur čit časový 
interval mezi t ěmito dvěma událostmi. Estrální cykly všech samic F  1 gene­
race v kohort ě 1 A by m ěly být monitorovány po dobu dvou týdn ů, a to 
přibližně od PND 75. Krom ě toho, bude-li nutné pá ření F  1 generace, bude 
po období spárování až okamžiku odhalení d ůkazů o spáření následovat 
vaginální cytologie v kohort ě 1B. 
Páření a březost  
42. Krom ě standardních ukazatel ů (např. tělesná hmotnost, spot řeba potravy, 
klinická pozorování v četně kontroly mortality/morbidity), jsou zaznamenána 
data páření, datum oplodn ění a datum vrhu a vypo čítá se prekoitální interval 
(páření až oplodn ění) a trvání b řezosti (oplodn ění až vrh). Samice 
P generace by m ěly být v dob ě očekávaného vrhu pe člivě prohlédnuty, 
zda nevykazují známky dystokie. M ěly by být zaznamenány jakékoli 
anomálie p ři tvorbě hnízda nebo pé či o mláďata. ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Den, kdy dojde k vrhu, je pro samici nultý den laktace (LD 0) a pro 
potomstvo nultý postnatální den (PND 0). P řípadně mohou veškerá srovnání 
vycházet také z postkoitální doby, aby se eliminovaly nejasnosti v údajích o postnatálním vývoji na základ ě rozdílů v trvání b řezosti; mělo by být však 
zaznamenáno i na časování v souvislosti s vrhem. To je d ůležité zejména 
tehdy, když zkoušená chemická látka vykazuje vliv na trvání b řezosti.
 
Parametry potomstva  
44. Vrhy se vyšet ří co nejd říve po vrhu (PND 0 nebo 1), aby bylo možno 
stanovit po čet a pohlaví mlá ďat, počet mrtvě a živě narozených mlá ďat 
a přítomnost nápadných anomálií (z vn ějšku patrné anomálie, mezi n ěž 
patří rozštěp patra, podkožní krevní výrony, abnormální barva nebo textura 
kůže, přítomnost pupe ční šňůry, nedostatek mléka v žaludku, p řítomnost 
suchých sekret ů). Kromě toho první klinické vyšet ření novorozených 
mláďat zahrnuje kvalitativní hodnocení t ělesné teploty, stav aktivity 
a reakci na manipulaci. Mlá ďata, která byla nalezena mrtvá v PND 0 
nebo pozd ěji, se vyšet ří na možné defekty a p říčinu smrti. Živá mlá ďata 
se spočítají, každé se zváží v PND 0 nebo PND 1 a poté v pravidelných 
intervalech, nap ř. alespoň v PND 4, 7, 14 a 21. Klinické vyšet ření dle stá ří 
zvířat se zopakuje p ři vážení potomstva nebo častěji, pokud byly p ři naro­
zení učiněny specifické nálezy. Zaznamenané p říznaky by mohly mimo jiné 
zahrnovat externí anomálie, zm ěny kůže, srsti, o čí, sliznic, výskyt sekret ů 
a exkretů a vegetativních funkcí. Zaznamenávat by se m ěly změny chůze, 
polohy a reakce na manipulaci, dále p řítomnost klonických a tonických 
pohybů, stereotyp ů v chování nebo bizarního chování.  
45. U každého mlád ěte je třeba nejmén ě jednou v dob ě od PND 0 do PND 4 
změřit anogenitální vzdálenost (AGD). V den m ěření AGD by m ěla být 
zjištěna tělesná hmotnost mlád ěte a AGD by m ěla být normalizována na 
nějakou míru velikosti mlá ďat, nejlépe t řetí odmocninu t ělesné hmotnosti 
(12). V PND 12 nebo 13 se zkontroluje p řítomnost bradavek/prsních dvorc ů 
u mladých samc ů. 
46. Všechna vybraná zví řata F  1 generace jsou každý den posuzována z hlediska 
odpojení p ředkožky u samc ů nebo vaginální prostupnosti u samic, anebo 
tato pozorování mohou zapo čít před dnem, kdy se o čekává dosažení t ěchto 
ukazatelů, aby se zjistilo, zda pohlavní zralost nastane brzy. Zaznamenají se 
jakékoli anomálie pohlavních orgán ů, jako je perzistentní vaginální vlákno, 
hypospadie nebo rozšt ěp penisu. Pohlavní zralost zví řat F  1 generace je 
porovnána s fyzickým vývojem p ři určení stáří a tělesné hmotnosti 
v případě odpojení p ředkožky u samc ů nebo vaginální prostupnosti 
u samic (13).  
Posouzení potenciální vývojové neurotoxicity (kohorty 2 A a 2B)  
47. Pro posouzení neurotoxicity se použije deset samc ů a deset samic z kohorty 
2 A a deset samc ů a deset samic z kohorty 2B z každé experimentální 
skupiny (za každou kohortu: jeden samec nebo jedna samice z vrhu; všechny vrhy zastoupené nejmén ě jedním mladým jedincem; náhodný 
výběr). U zví řat z kohorty 2 A jsou posuzovány reakce na ne čekané 
zvukové podn ěty, je provedena funk ční pozorovací baterie, je provedeno 
vyšetření motorické činnosti (viz odstavce 48–50) a neuropatologická 
vyšetření (viz odstavce 74–75). Je t řeba zajistit, aby byly rozdíly ve zkušeb ­
ních podmínkách jen minimální a nesouvisely systematicky s aplikací. Mezi 
proměnnými, které mohou ovlivnit chování, jsou hladina zvuku (nap ř. 
přerušovaný hluk), teplota, vlhkost, osv ětlení, zápachy, denní doba 
a odchylky v životním prost ředí. Výsledky zkoušek neurotoxicity by 
měly být interpretovány v souvislosti s náležitými historickými kontrolními 
referenčními rozmezími. Zví řata kohorty 2B by m ěla být použita 
k neuropatologickému posouzení v PND 21 nebo 22 (viz odstavce 74–75).
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
48. Zkouška odezvy na ne čekané zvukové podn ěty se provede v PND 24 (± 1 
den) na zví řatech z kohorty 2 A. Den zkoušek by m ěl být rovnom ěrně 
rozložen nap říč skupinami, jimž je podávána daná chemická látka, 
a kontrolními skupinami. Každá sekce je tvo řena 50 pokusy. P ři provádění 
zkoušky reakce na ne čekané zvukové podn ěty se stanoví st řední reak ční 
amplituda v každém bloku deseti pokus ů (pět bloků o deseti pokusech), 
přičemž zkušební podmínky by m ěly být optimalizovány tak, aby byla 
zajištěna habituace uvnit ř sekce. Tyto postupy by m ěly být konzistentní 
se zkušební metodou B.53 (35).  
49. Ve vhodnou dobu mezi PND 63 a PND 75 jsou zví řata z kohorty 2 A 
podrobena funk ční pozorovací baterii a automatizované zkoušce motorické 
činnosti. Tyto postupy by m ěly být konzistentní se zkušebními metodami 
B.43 (33) a B.53 (35). Sou částí funkční pozorovací baterie je d ůkladný 
popis vzhledu, chování a funk ční integrity subjektu. Tyto parametry se 
hodnotí na základ ě pozorování v chovné kleci, po p řesunu do standardního 
pozorovacího prostoru (otev řený prostor), kde se zví ře pohybuje voln ě, a při 
manipulačních zkouškách. P ři zkouškách se postupuje od té nejmén ě až po 
tu nejvíce interaktivní. Seznam sledovaných parametr ů je uveden v dodatku 
1. Všechna zví řata by měla být pečlivě pozorována zkušenými pracovníky, 
kteří nemají informaci o skupin ě, do které zví ře patří, za použití standardi ­
zovaných postup ů, které by m ěly minimalizovat variabilitu zp ůsobenou 
pozorovatelem. Doporu čuje se, aby zví řata hodnotila v dané zkoušce 
pokud možno tatáž osoba. Není-li to možné, je pot řebné mít n ějaký 
odhad spolehlivosti mezi osobami provád ějících vyšet ření. U každého para ­
metru funk ční pozorovací baterie se používají explicitní definované stupnice 
a kritéria hodnocení. Pro ukazatele, kde se používá subjektivní posouzení, je třeba definovat objektivní kvantitativní kritéria. V p řípadě motorické 
činnosti je každé zví ře testováno individuáln
ě. Zkouška by m ěla trvat dosta ­
tečně dlouho na to, aby u kontrolní skupiny mohla být prokázána habituace 
v rámci sekce. Motorická činnost se monitoruje pomocí za řízení pro auto ­
matický záznam aktivity, které je schopno odhalit nár ůst i pokles aktivity 
(tj. základní aktivita zm ěřená zařízením by nem ěla být tak nízká, aby bylo 
vyloučeno odhalení pokles ů, ani tak vysoká, aby bylo vylou čeno odhalení 
nárůstu činnosti). Každé za řízení by m ělo být otestováno standardními 
postupy, aby byla v možném rozsahu zajišt ěna spolehlivost provozu 
zařízení v p říslušné dny. Pokud jde o za řízení, experimentální skupiny by 
měly být co nejvyvážen ější. Experimentální skupiny by m ěly být vyvážen ě 
zastoupeny ve zkušebních časech, aby se p ředešlo zkreslení denním rytmem 
činnosti.  
50. Pokud stávající informace nazna čují potřebu dalších funk čních zkoušek 
(např. smyslových, sociálních, kognitivních), m ěly by takové zkoušky být 
zařazeny tak, aby nebyla ohrožena integrita ostatních hodnocení provád ě­
ných v rámci studie. Pokud jsou tyto zkoušky provád ěny u stejných zví řat, 
u kterých byly provád ěny standardní zkoušky reakce na ne čekané zvukové 
podněty, hodnocení funk ční pozorovací baterie a zkoušky motorické 
činnosti, m ěly by být naplánovány jiné zkoušky, aby se minimalizovalo 
riziko ohrožení integrity t ěchto zkoušek. Pokud empirické pozorování, p řed­
pokládané ú činky nebo mechanismus/zp ůsob účinku nazna čují specifický 
typ neurotoxicity, mohou být obzvlášt ě užitečné doplňující postupy.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Posouzení potenciální vývojové imunotoxicity (kohorta 3)  
51. V PND 56 (± 3 dny) se deset samc ů a deset samic z kohorty 3 z každé 
experimentální skupiny (jeden samec nebo jedna samice z vrhu; všechny 
vrhy zastoupeny nejmén ě jedním mladým jedincem; náhodný výb ěr) 
použije v testu protilátkové odezvy závislé na T bu ňkách, tj. ve zkoušce 
primární IgM protilátkové odezvy na antigen závislý na T bu ňkách, jako je 
např. SRBC test využívající ov čích krvinek nebo test KLH ( Keyhole Limpet 
Hemocyanin ) s využitím hemocyaninu mo řského členovce  Megathura 
crenulata , konzistentní se sou časnými postupy imunotoxikologických 
zkoušek (14) (15). Odezvu lze zhodnotit tak, že se spo čítají specifické 
buňky vytvářející plak (PFC,  plaque-forming cells ) na slezin ě nebo že se 
určí titr protilátky IgM specifické pro SRBC nebo KLH v séru metodou 
ELISA p ři maximální odpov ědi. Odpov ěď zpravidla vrcholí čtyři (počet 
PFC) nebo p ět dní (metoda ELISA) po nitrožilní imunizaci. Pokud je 
primární protilátková odpov ěď analyzována spo čítáním bun ěk vytvářejících 
plak, je p řípustné zhodnotit podskupiny zví řat v oddělené dny za p ředpo­
kladu, že: imunizace a utracení podskupiny jsou na časovány tak, že PFC 
jsou počítány na vrcholu odpov ědi; že podskupiny obsahují stejný po čet 
samčích a sami čích potomk ů ze všech dávkových skupin, v četně kontrol­
ních skupin; a že podskupiny jsou hodnoceny v dobu p řibližně stejného 
postnatálního stá ří.Expozice zkoušené chemické látce bude pokra čovat až 
do dne p řed odběrem slezin pro ú čely reakce PFC nebo séra pro ú čely 
analýzy ELISA.  
Následné hodnocení potenciální toxicity pro reprodukci (kohorta 1B)  
52. Zvířata z kohorty 1B lze zachovat pro ú čely aplikace i po PND 90 a lze je 
chovat s cílem získat v p řípadě potřeby F  2 generaci. Samci a samice z téže 
dávkové skupiny by m ěli být páření (přičemž je třeba zamezit pá ření souro ­
zenců) až po dobu dvou týdn ů počínaje po PND 90 nejdéle však do PND 
120. Postupuje se podobn ě jako u zví řat P generace. Avšak na základ ě 
posouzení závažnosti d ůkazů možná posta čí, když budou vrhy utraceny 
v PND 4 a nebudou sledovány až do odstavení nebo ješt ě déle.  
KONEČNÁ POZOROVÁNÍ  
Klinická biochemická/hematologická vyšet ření 
53. U zví řat P generace se sledují systémové ú činky. Při utracení jsou deseti 
náhodně vybraným samc ům a samicím P generace z každé dávkové skupiny 
odebrány nala čno krevní vzorky z definovaného místa, které jsou uloženy 
za vhodných podmínek a podrobeny částečnému nebo komplexnímu hema ­
tologickému vyšet ření, klinickému biochemickému vyšet ření, analýze T4 
a TSH nebo jiným vyšet řením vyplývajícím z profilu známého ú činku 
zkoušené chemické látky (viz pokyn OECD č. 151 (40)). Zkoumají se 
tyto hematologické parametry: hematokrity, koncentrace hemoglobinu, 
počet erytrocyt ů, celkový a diferenciální po čet leukocyt ů, počet krevních 
destiček a srážlivost krve ( čas/potenciál). Vyšet ření plazmy nebo séra 
zahrnují: glukózu, celkový cholesterol, mo čovinu, kreatinin, celkové bílko ­
viny, albumin a nejmén ě dva enzymy ukazující na hepatocelulární ú činky 
(jako nap ř. alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická 
fosfatáza, gamma-glutamyltranspeptidáza a sorbitoldehydrogenasa). Za ur či­
tých okolností lze získat užite čné informace m ěřením dalších enzym ů 
a žlučových kyselin. Mimo to lze krev odebrat všem zví řatům a uložit ji 
pro případnou pozd ější analýzu, aby bylo možné vyjasnit nejednozna čné 
účinky nebo získat údaje o interní expozici. Pokud není zamýšleno druhé  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
páření zvířat P generace, jsou krevní vzorky odebrány t ěsně před procesem 
plánovaného utracení nebo v jeho rámci. V p řípadě zachování zví řat se 
krevní vzorky shromáždí n ěkolik dní p řed druhým pá řením zvířat. Pokud 
existující údaje ze studií s opakovaným podáváním dávek neuvád ějí, že 
daný parametr není zkoušenou chemickou látkou dot čen, provede se 
analýza mo či před utracením a zhodnotí se následující parametry: vzhled, 
objem, osmolalita nebo hustota, pH, p řítomnost bílkovin, glukózy, krve 
a krvinek, bun ěčné zbytky. Mo č lze také odebrat pro ú čely monitorování 
vylučování zkoušené chemické látky a/nebo metabolitu/ ů. 
54. U zví řat F  1 generace se sledují systémové ú činky. Při utracení jsou deseti 
náhodně vybraným samc ům a samicím z kohorty 1 A z každé dávkové 
skupiny odebrány nala čno krevní vzorky z definovaného místa, které jsou 
uloženy za vhodných podmínek a podrobeny standardnímu klinickému 
biochemickému vyšet ření, včetně posouzení sérových hladin hormon ů štítné 
žlázy (T4 a TSH), hematologického vyšet ření (celkový a diferenciální po čet 
leukocytů a počet erytrocyt ů) a vyšetření moči. 
55. U p řebytečných mlá ďat je v PND 4 provedena celková pitva a je na 
uvážení, zda provést m ěření koncentrací hormonu štítné žlázy (T4) 
v séru. V p řípadě potřeby lze krev novorozených mlá ďat (PND 4) 
z jednotlivých vrh ů smíchat použít pro biochemické analýzy/analýzy 
hormonu štítné žlázy. Krev pro analýzu T4 a TSH je také odebrána odsta ­
veným jedinc ům, u nichž byla v PND 22 provedena celková pitva (mlá ďata 
F 1 generace nevybraná do kohort).  
Parametry spermatu  
56. Parametry spermatu se zm ěří u všech samc ů P generace, pokud dostupné 
údaje neukazují, že b ěhem devadesátidenní studie parametry spermií nebyly 
postiženy. Parametry spermií se zkoumají u všech samc ů z kohorty 1 A.  
57. Při ukončení studie je u všech samc ů P a F  1 generace (kohorta 1 A) 
zaznamenána hmotnost varlat a nadvarlat. Nejmén ě jedno varle a jedno 
nadvarle je vyhrazeno pro histopatologické vyšet ření. Zbývající nadvarle 
se použije ke spo čítání zásoby spermií v ocasu nadvarlete (16) (17). 
Kromě toho se z ocasu nadvarlete (nebo chámovodu) pro ú čely posouzení 
motility a morfologie spermií odebere sperma pomocí metod, které mini ­
malizují poškození.  
58. Motilitu spermií lze vyhodnotit bu ď bezprost ředně po utracení, nebo lze 
provést záznam pro pozd ější analýzu. Procento progresivn ě pohyblivých 
spermií se stanoví subjektivn ě, nebo objektivn ě pomocí po čítačové analýzy 
pohyblivosti (19) (20) (21) (22) (23) (24). Pro ú čely hodnocení morfologie 
spermií se vzorky epididymálních spermií (nebo spermií z chámovodu) vyšetří jako fixované nebo vlhké (25) a (minimáln ě 200 na vzorek) klasi ­
fikují se jako normální (jako normální se jeví hlava i st řední část/bičík), 
nebo abnormální. P říklady morfologických odchylek spermií zahrnují 
spojení, izolované hlavi čky a zdeformované hlavi čky a/nebo bi číky (26). 
Zdeformované nebo velké hlavi čky spermií mohou poukazovat na defekty 
tvorby spermií.
 
59. Pokud jsou vzorky spermií p ři pitvě zmraženy, st ěry zakonzervovány 
a pořízeny obrazové záznamy pro analýzu motility spermií (27), lze 
následnou analýzu omezit na kontrolní samce a na samce, jimž byly podá ­
vány vysoké dávky. Pokud se však zjistí ú činky spojené s aplikací, je nutné 
zhodnotit i skupiny s nižšími dávkami.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Celková pitva  
60. Po utracení nebo uhynutí b ěhem studie jsou všechna zví řata P a F  1 generace 
podrobena pitv ě a vyšet řena makroskopicky na jakékoliv strukturální 
anomálie anebo patologické zm ěny. Speciální pozornost je t řeba věnovat 
orgánům rozmnožovací soustavy. U mlá ďat, která jsou humánním 
způsobem utracena ve stavu agónie, a u mrtvých mlá ďat, která nejsou 
rozložena, se provede záznam o této skute čnosti a vyšet ření za účelem 
zjištění možných defekt ů a/nebo p říčiny uhynutí.  
61. U samic P a F  1 generace se v den pitvy vyšet ří vaginální st ěr s cílem ur čit 
stadium estrálního cyklu a umožnit korelaci s histopatologickým vyšet řením 
pohlavních orgán ů. Děloha všech samic P generace (a p řípadně F 1 ) se 
vyšetří na přítomnost a po čet zachycených vají ček v děloze způsobem, 
který nebude mít vliv na histopatologické hodnocení.  
Hmotnost orgán ů a uchování tkání – dosp ělá zvířata P a F  1 generace  
62. V okamžiku utracení se u všech zví řat P generace a všech dosp ělých zvířat 
F 1 generace z p říslušných kohort (jak je uvedeno níže) stanoví t ělesná 
hmotnost a hmotnost dále uvedených orgán ů ve vlhkém stavu co nejd říve 
po pitvě, aby nedošlo k vyschnutí. Tyto orgány se poté uchovají za vhod ­
ných podmínek. Není-li stanoveno jinak, párové orgány se mohou zvážit odděleně nebo spole čně, a sice v souladu s obvyklou praxí dané laborato ře.
 
— děloha (s vejcovody a d ěložním hrdlem), vaje čníky,  
— varlata, nadvarlata (celkem a kaudální část pro vzorky použité ke stano ­
vení počtu spermií),  
— prostata (dorzolaterální a ventrální části spole čně). Při odstraňování 
celku prostaty je t řeba postupovat opatrn ě, aby nedošlo k propíchnutí 
semenných vá čků naplněných kapalinou. V p řípadě účinku aplikace 
látky na celkovou hmotnost prostaty by dorzolaterální a ventrální části 
měly být po fixaci pitvány opatrn ě a měly by být zváženy samostatn ě, 
— semenné vá čky s koagula čními žlázami a jejich tekutinami (jako jedna 
jednotka),  
— mozek, játra, ledviny, slezina, brzlík, hypofýza, štítná žláza (po fixaci), 
nadledvinky a známé cílové orgány nebo tkán ě. 
63. Krom ě orgánů uvedených výše se za vhodných podmínek uchovají vzorky 
periferního nervu, sval ů, míchy, oka s o čním nervem, trávicí soustavy, 
močového m ěchýře, plic, pr ůdušnice (s p řipojenou štítnou žlázou 
a příštítnými t ělísky), kostní d řeně, chámovodu (samci), prsní žlázy (samci 
a samice) a vaginy.  
64. Všechny orgány zví řat kohorty 1 A se zváží a uchovají pro ú čely histopa ­
tologického vyšet ření. 
65. Pro ú čely zkoumání prenatáln ě a postnatáln ě indukovaných imunotoxických 
účinků bude deset samc ů a deset samic z kohorty 1 A z každé exponované 
skupiny (jeden samec nebo jedna samice z vrhu, všechny vrhy zastoupené nejméně jedním mladým jedincem; náhodný výb ěr) podrobeno p ři utracení 
následujícím krok ům:
 
— vážení lymfatických uzlin spojených i nespojených se zp ůsobem expo ­
zice (krom ě hmotnosti nadledvinek, brzlíku a sleziny již zvážených 
u všech zví řat z kohorty 1 A),  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analýza subpopulace lymfocyt ů ve slezin ě (CD4+ a CD8+ T lymfocyty, 
B lymfocyty a NK bu ňky) v jedné polovin ě sleziny, druhá polovina 
bude uložena pro histopatologické posouzení.  
Analýza subpopulací lymfocyt ů ve slezin ě u neimunizovaných zví řat 
(kohorta 1 A) stanoví, zda expozice souvisí se zm ěnou v imunologické 
rovnovážné distribuci „pomocných“ (CD4+) nebo cytotoxických (CD8+) 
lymfocytů odvozených z brzlíku nebo NK bun ěk (rychlé reakce na neoplas ­
tické buňky a patogeny).  
66. U zví řat kohorty 1 A se zváží následující orgány a odpovídající tkán ě se 
zpracují do stadia blo čků: 
— vagina (nevážená),  
— děloha s děložním hrdlem,  
— vaječníky,  
— varlata (alespo ň jedno),  
— nadvarlata,  
— semenné vá čky a koagula ční žlázy,  
— prostata,  
— hypofýza,  
— určené cílové orgány.  
V kohort ě 1B se provede histopatologické vyšet ření, pokud výsledky 
z kohorty 1 A budou nejednozna čné nebo bude existovat podez ření na 
reprodukční nebo endokrinní toxikanty.  
67. Kohorty 2a a 2B: zkouška vývojové neurotoxicity (PND 21 nebo PND 22 
a dospělé potomstvo). Zví řata kohorty 2 A jsou utracena po zkouškách 
chování, p řičemž je zaznamenána hmotnost mozku a je provedeno 
kompletní neurohistopatologické vyšet ření pro ú čely neurotoxikologického 
posouzení. Zví řata kohorty 2B jsou utracena v PND 21 nebo PND 22, 
přičemž je zaznamenána hmotnost mozku a je provedeno mikroskopické 
vyšetření mozku pro ú čely neurotoxikologického posouzení. Perfúzní fixace 
se provádí povinn ě u zvířat kohorty 2 A a je volitelná u zví řat kohorty 2B, 
postup je uveden v metod ě B.53 (35).  
Hmotnost orgán ů a uchování tkání – odstavení potomci generace F  1 
68. Mlá ďata, která nejsou vybrána do kohort, v četně zakrslých mlá ďat, jsou po 
odstavení, v PND 22, utracena, pokud z výsledk ů nevyplývá pot řeba dalších 
vyšetření za života. Utracená mlá ďata jsou v souladu s odstavci 62 a 63 
podrobena celkové pitv ě, která zahrnuje posouzení rozmnožovacích orgán ů. 
U maximáln ě deseti mlá ďat od každého pohlaví a skupiny, z co nejv ětšího 
počtu vrhů, se váží mozek, slezina a brzlík, které se uchovají za vhodných 
podmínek. Krom ě toho lze pro další mikroskopickou analýzu (  1 )(viz pokyn 
OECD č. 151 (40)) uchovat prsní tkán ě těchto mladých samc ů a samic. 
Strukturní abnormality a cílové tkán ě se uloží pro p řípadné histologické 
vyšetření. ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Výzkum ukázal, že prsní žláza, zejména v období jejího raného vývoje, je citlivým 
ukazatelem ú činku estrogenu. Doporu čuje se, aby do této zkušební metody byly po 
validaci zahrnuty ukazatele zahrnující prsní žlázy mlá ďat obou pohlaví.
 Histopatologická vyšet ření – zví řata P generace  
69. Je provedeno úplné histologické vyšet ření orgán ů vyjmenovaných 
v odstavcích 62 a 63 u všech zví řat skupiny s vysokou dávkou 
a kontrolní skupiny P generace. Na pomoc p ři určování NOAEL by 
u všech zví řat ze skupin s nižšími dávkami m ěly být vyšet řeny orgány 
vykazující zm ěny související s aplikací. Histopatologické vyšet ření se 
navíc provede u rozmnožovacích orgán ů všech zví řat, u kterých je pode ­
zření na sníženou plodnost, nap ř. u těch, u kterých nedošlo k pá ření, zabře­
znutí, oplodn ění nebo k vrhu zdravého potomstva nebo u kterých byl 
ovlivněn estrální cyklus nebo po čet, motilita nebo morfologie spermií, 
a u všech tkání s výraznými lézemi.  
Histopatologická vyšet ření – zví řata F  1 generace  
Zvířata kohorty 1  
70. U všech dosp ělých zvířat kohorty 1 A z kontrolní skupiny a skupiny 
s vysokou dávkou je provedeno celkové histologické vyšet ření orgán ů 
vyjmenovaných v odstavcích 62 a 63. Všechny vrhy by m ěly být zastou ­
peny nejmén ě jedním mlád ětem od každého pohlaví. Na pomoc p ři určo­
vání NOAEL by u všech zví řat ze skupin s nižšími dávkami m ěly být 
vyšetřeny orgány a tkán ě vykazující zm ěny související s aplikací 
a všechny tkán ě s výraznými lézemi. Pro hodnocení prenatáln ě 
a postnatáln ě indukovaných ú činků na lymfatické orgány bude u deseti 
samců a deseti samic z kohorty 1 A provedeno vedle histopatologického 
hodnocení brzlíku, sleziny a nadledvinek, které bylo již provedeno u všech zvířat 1 A, také histopatologické vyšet ření odebraných lymfatických uzlin 
a kostní d řeně.
 
71. V případě podezření na reproduk ční nebo endokrinní toxikanty by m ěly být 
vyšetřeny reproduktivní a endokrinní tkán ě všech zví řat kohorty 1B zpra ­
cované do stadia blo čků, jak je uvedeno v odstavci 66. Zví řata kohorty 1B 
by také m ěla být podrobena histologickému vyšet ření, pokud jsou výsledky 
z kohorty 1 A nejednozna čné. 
72. Vaje čníky dosp ělých samic by m ěly obsahovat primordiální a rostoucí foli ­
kuly i žlutá t ělíska. Z tohoto d ůvodu by histopatologické vyšet ření mělo být 
zaměřeno na kvantitativní hodnocení primordiálních a malých rostoucích 
folikulů i žlutých t ělísek u samic F  1 generace. Je nutné mít statisticky 
odpovídající po čet zvířat, výběr řezů vaječníků a velikost vzork ů řezů pro 
použitý zp ůsob hodnocení. Nejprve m ůže být proveden výpo čet počtu foli­
kulů u zvířat z kontrolní skupiny a skupiny s vysokou dávkou a v p řípadě 
nepříznivých ú činků by měly být potom hodnoceny i skupiny s nižšími 
dávkami. Pro porovnání exponovaných a kontrolních vaje čníků by měl 
být zjišťován počet primordiálních folikul ů, což může být kombinováno 
s počítáním malých rostoucích folikul ů (viz pokyn OECD č. 151 (40)). 
Posouzení žlutých t ělísek je třeba provést soub ěžně s hodnocením estrálních 
cyklů, aby mohlo být p ři posouzení vzato v úvahu stadium cyklu. Vejco ­
vod, děloha a vagina jsou vyšet řeny, zda u nich prob ěhl patřičný vývoj 
typický pro daný orgán.  
73. U samc ů F 1 generace jsou provedena podrobná histopatologická vyšet ření 
varlat s cílem identifikovat ú činky související s aplikací na diferenciaci 
a vývoj varlat a na spermatogenezi (38). Pokud je to možné, m ěly by být 
vyšetřeny řezy sítí  rete testis . Hlava, t ělo a ocas nadvarlete a chámovod jsou 
vyšetřeny, zda u nich prob ěhl patřičný vývoj typický pro daný orgán, jakož 
i z hlediska parametr ů požadovaných pro samce P generace.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Zvířata kohorty 2  
74. U všech zví řat skupiny s vysokou dávkou a u kontrolní skupiny z kohorty 
2 A obou pohlaví se po dokon čení neurobehaviorálních zkoušek (po PND 
75, nejpozd ěji však v PND 90) provede neurohistopatologické vyšet ření. 
U všech zví řat skupiny s vysokou dávkou a u kontrolní skupiny z kohorty 
2B obou pohlaví se v PND 21 nebo PND 22 provede histopatologické vyšetření mozku. Orgány nebo tkán ě vykazující zm ěny související 
s aplikací by m ěly být vyšet řeny u zví řat ze skupin s nižší dávkou 
s cílem pomoci p ři určování NOAEL. U zví řat kohorty 2 A a 2B je 
vyšetřeno více řezů mozku, aby bylo možno vyšet řit čichový bulbus, 
mozkovou k ůru, hippocampus, bazální ganglia, thalamus, hypothalamus, 
střední mozek (tectum, tegmentum a pedunculi cerebrales), 
mozkový kmen a moze ček. Pouze u kohorty 2 A jsou vyšet řeny oči (sítnice 
a oční nerv) a vzorky periferního nervu, svalu a míchy. Všechny neurohis ­
tologické postupy by m ěly být konzistentní se zkušební metodou B.53 (35).
 
75. V reprezentativních částech mozku (homologické řezy pečlivě vybrané na 
základě spolehlivých mikroskopických vývojových znak ů) by měla být 
provedena morfometrická (kvantitativní) hodnocení, která mohou zahrnovat lineární a/nebo plošná m ěření konkrétních částí mozku. Na každé úrovni by 
měly být provedeny nejmén ě tři po sobě jdoucí řezy s cílem vybrat co 
nejvíce homologní a reprezentativní řez pro konkrétní hodnocenou část 
mozku. Neuropatolog by m ěl náležitě posoudit, zda řezy připravené 
k měření jsou homologní s ostatními v souboru vzork ů, a tudíž je vhodné 
je zahrnout, jelikož zejména lineární m ěření se mohou v relativn ě krátké 
vzdálenosti zm ěnit (28). Nem ěly by se používat nehomologické řezy. 
Ačkoli cílem je odebrat vzorky všem zví řatům vyčleněným pro tento ú čel 
(10/pohlaví/úrove ň dávky), mohou i p řesto být adekvátní menší po čty. 
Avšak vzorky od mén ě než šesti zví řat jednoho pohlaví a jedné dávky by 
pro účely této zkušební metody nebyly považovány za dostate čné. Pro 
identifikaci ú činků souvisejících s aplikací na parametry, jako je objem 
nebo počet buněk pro konkrétní neuroanatomické oblasti, lze použít stereo ­
logii. Všechny aspekty p řípravy vzork ů tkání, od fixace tkán ě, přes sekci 
vzorků tkání, zpracování tkání a obarvení preparát ů, by měly být vyvážen ě 
organizovány tak, aby každá šarže obsahovala reprezentativní vzorky z každé dávkové skupiny. Když mají být provedeny morfometrické nebo 
stereologické analýzy, pak by m ěla být mozková tká ň zalita do p říslušného 
média u všech dávkových skupin sou časně, aby se zamezilo vzniku arte ­
faktů smrštěním, k čemuž dochází v souvislosti s dlouhým uchováváním ve 
fixativu.
 
PODÁVÁNÍ ZPRÁV  
Údaje  
76. Údaje jsou p ředkládány pro každé jednotlivé zví ře zvlášť a jsou shrnuty ve 
formě tabulek. Kde je to vhodné, jsou pro každou zkušební skupinu 
a každou generaci p ředkládány následující údaje: po čet zvířat na začátku 
zkoušky, po čet zvířat nalezených uhynulých v pr ůběhu zkoušky nebo utra ­
cených z humánních d ůvodů a doba úmrtí nebo humánního utracení, po čet 
plodných zví řat, počet březích samic, po čet samic s vrhem a po čet zvířat 
vykazujících p říznaky toxicity. M ěl by být uvád ěn i popis toxických 
příznaků, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti.  
77. Číselné výsledky by m ěly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou 
a uznávanou statistickou metodou. Statistické metody se zvolí jako sou část 
plánu studie a m ěly by náležit ě hodnotit i údaje s jinou než normální 
distribucí (nap ř. údaje o po čtech), ohrani čené údaje (nap ř. omezený čas ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
pozorování), závislost prom ěnných (nap ř. účinky na vrh a opakovaná 
měření) a rozdílnost rozptyl ů. Generalizované lineární smíšené modely 
a modely závislosti ú činku na dávce zahrnují širokou skupinu analytických 
nástrojů, které mohou být vhodné pro údaje vygenerované v rámci této 
zkušební metody. Zpráva by m ěla obsahovat dostate čné informace 
o použité metod ě analýzy a po čítačovém programu, aby mohl tuto analýzu 
vyhodnotit/znovu vyhodnotit nezávislý posuzovatel/statistik.  
Vyhodnocení výsledk ů 
78. Nálezy by m ěly být vyhodnoceny z hlediska pozorovaných ú činků, včetně 
pitvy a mikroskopických nález ů. Hodnocení zahrnuje vztah, nebo jeho 
absenci, mezi dávkou a p řítomností, frekvencí a závažností anomálií, v četně 
významných lézí. Posouzeny by m ěly být též cílové orgány, plodnost, 
klinické anomálie, reproduk ční parametry a parametry vrhu, zm ěny tělesné 
hmotnosti, mortalita a jakékoli další toxické a vývojové ú činky. Zvláštní 
pozornost je t řeba věnovat zm ěnám u jednotlivých pohlaví. P ři hodnocení 
výsledků zkoušek je t řeba brát v úvahu fyzikáln ě-chemické vlastnosti zkou ­ 
šené chemické látky, a jsou-li k dispozici, toxikokinetické údaje, v četně 
placentárního p řenosu a vylu čování mléka.  
Závěrečná zpráva  
79. Závěrečná zpráva by m ěla obsahovat tyto údaje z provedené studie 
o zvířatech P a F  1 generace, pop ř. také F  2 generace:  
Zkoušená chemická látka:  
— veškeré dostupné informace o chemických, toxikokinetických 
a toxikodynamických vlastnostech zkoušené chemické látky,  
— identifika ční údaje,  
— čistota.  
Vehikulum (je-li použito):  
— zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.  
Pokusná zví řata: 
— použitý živo čišný druh/kmen,  
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— původ, podmínky chovu, strava, materiál na výrobu hnízda atd.,  
— hmotnost jednotlivých zví řat na začátku zkoušky,  
— údaje o vaginálních st ěrech u samic P generace p řed zahájením aplikace 
(pokud byly st ěry v tuto dobu provád ěny), 
— záznamy o párování zví řat P generace s uvedením sami čího a sam čího 
partnera a úsp ěch páření, 
— u dosp ělých zvířat F  1 generace záznam o vrhu, ze kterého pocházejí.  
Zkušební podmínky:  
— zdůvodnění zvolených úrovní dávek,  
— podrobné údaje o složení aplika ční formy zkoušené chemické látky 
nebo o p řípravě směsi s krmivem, o dosažené koncentraci,  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— stabilita a homogenita p řípravku ve vehikulu nebo nosi či (např. strava, 
pitná voda), v krvi a/nebo mléku za podmínek použití a uložení mezi 
jednotlivými použitími,  
— podrobnosti o zp ůsobu podávání zkoušené chemické látky,  
— v případě potřeby přepočet koncentrace zkoušené chemické látky (ppm) 
ve stravě/pitné vod ě na skute čnou dávku (mg na kg t ělesné hmotnosti 
na den), je-li to možné,  
— podrobnosti o jakosti vody a potravy (v četně složení krmné sm ěsi, je-li 
k dispozici),  
— podrobný popis postup ů randomizace p ři výběru mláďat pro třídění 
a rozdělení mláďat do zkušebních skupin,  
— podmínky prost ředí, 
— seznam pracovník ů provádějících zkoušky, v četně odborného školení.  
Výsledky (souhrnné a individuální údaje podle pohlaví a dávky):  
— spotřeba potravy, spot řeba vody (je-li k dispozici), využití potravy (p ří­
růstek tělesné hmotnosti na gram spot řebované potravy, krom ě období 
kohabitace a laktace) a spot řeba zkoušené chemické látky (podle 
způsobu podávání potravy/pitné vody) u zví řat P a F  1 generace,  
— údaje o absorpci (jsou-li k dispozici),  
— údaje o t ělesné hmotnosti zví řat P generace,  
— údaje o t ělesné hmotnosti u vybraných zví řat F  1 generace po odstavení,  
— den úhynu b ěhem studie nebo údaj, že zví řata přežila až do dne utra ­
cení,  
— povaha, závažnost a trvání klinických pozorování (zda p říznaky jsou 
vratné, či ne),  
— údaje o hematologickém vyšet ření, vyšet ření moči a klinickém 
chemickém vyšet ření včetně TSH a T4,  
— fenotypická analýza slezinných bun ěk (T, B, NK bu ňky), 
— celularita kostní d řeně, 
— údaje o toxických reakcích,  
— počet samic P a F  1 generace s normálním nebo abnormálním estrálním 
cyklem a trváním cyklu,  
— čas do pá ření (prekoitální interval, po čet dnů mezi spárováním 
a spářením),  
— toxické nebo jiné ú činky na reprodukci, v četně počtu a procenta zví řat, 
která se spá řila, jsou b řezí, vrhla a mají laktaci, samc ů, kteří přivodili 
březost, samic se známkami dystokie/prodlužovaného nebo ztíženého 
vrhu,  
— trvání b řezosti, a prob ěhl-li, údaj o vrhu,  
— počty implantovaných plod ů, velikost vrhu a procento sam čích mláďat, 
— počet a procento postimplanta čních ztrát, živ ě a mrtvě narozených 
mláďat, ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— údaje o hmotnosti vrhu a hmotnosti mlá ďat (samci, samice 
a dohromady), po čet zakrslých mlá ďat, byl-li stanoven,  
— počet mláďat s nápadnými strukturálními abnormalitami,  
— toxické nebo jiné ú činky na potomstvo, postnatální r ůst, životaschopnost 
apod.,  
— údaje o fyzických vývojových milnících u mlá ďat a další údaje 
o postnatálním vývoji,  
— údaje o pohlavní zralosti zví řat F  1 generace,  
— případně údaje o funk čním pozorování mlá ďat a dosp ělých zvířat, 
— tělesná hmotnost p ři utracení a údaje o absolutní a relativní hmotnosti 
orgánů u zvířat P generace a dosp ělých zvířat F  1 generace,  
— pitevní nálezy,  
— podrobný popis všech histopatologických nález ů, 
— celkový po čet kaudálních epididymálních spermií, procento progresivn ě 
pohyblivých spermií, procento morfologicky normálních spermií 
a procento spermií se všemi identifikovanými anomáliemi u samc ů 
P a F  1 generace,  
— případně počty a matura ční stadia folikul ů ve vaječnících u samic P a F  1 
generace,  
— generace výpo čet počtu žlutých t ělísek ve vaje čnících samic F  1 
generace,  
— statistické vyhodnocení výsledk ů, kde je to možné.  
Parametry kohorty 2:  
— Podrobný popis postup ů použitých ke standardizaci pozorování 
a postupů, jakož i definice pro hodnocení s použitím skóre,  
— seznam všech použitých zkušebních postup ů a odůvodnění jejich použ ­
ití, 
— podrobnosti o behaviorálních/funk čních, neuropatologických 
a morfometrických postupech, v četně informací a podrobností 
o automatických za řízeních,  
— postupy pro kalibraci a zajišt ění ekvivalence u t ěchto zařízení 
a proporcionálním složení experimentálních skupin p ři zkušebních 
postupech,  
— krátké od ůvodnění vysvětlující jakákoli rozhodnutí zahrnující profesní 
úsudek,  
— podrobný popis všech behaviorálních/funk čních, neuropatologických 
a morfometrických nález ů ve skupinách podle pohlaví a podle dávky, 
včetně nárůstu a pokles ů u kontrolních skupin,  
— hmotnost mozku,  
— jakékoli diagnózy odvozené od neurologických známek a lézí, v četně 
přirozeně se vyskytujících chorob nebo podmínek,  
— optické záznamy typických nález ů, 
— optické záznamy s nízkofrekven čními filtry pro posouzení shodnosti 
řezů použitých k morfometrii,  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— statistické zpracování výsledk ů, včetně statistických model ů použitých 
k analýze údaj ů a výsledk ů bez ohledu na to, zda jsou významné či 
nikoli,  
— význam jakýchkoliv dalších toxických ú činků pro záv ěry týkající se 
neurotoxického potenciálu zkoušené chemické látky, ve skupinách 
podle pohlaví a podle dávky,  
— vliv jakýchkoli toxikokinetických údaj ů na závěry, 
— údaje podporující spolehlivost a citlivost zkušební metody ( tj. pozitivní 
a historické kontrolní údaje),  
— vztahy, existují-li, mezi neuropatologickými a funk čními účinky,  
— NOAEL nebo referen ční dávka pro samice a potomstvo podle pohlaví 
a dávkové skupiny,  
— diskuse o celkové interpretaci údaj ů na základ ě výsledků, včetně závěru, 
zda daná chemická látka zp ůsobila vývojovou neurotoxicitu či nikoli, 
a NOAEL.  
Parametry kohorty 3:  
— titry protilátek IgM v séru (senzibilizace na SRBC nebo KLH) nebo 
PFC jednotky IgM ve slezin ě (senzibilizace na SRBC),  
— správné provád ění metody TDAR by m ělo být u laborato ře, která 
vykonává zkoušku poprvé, prokázáno v procesu optimalizace metody, u všech laborato ří pak pravideln ě (např. jednou ro čně),
 
— diskuse o celkové interpretaci údaj ů na základ ě výsledků, včetně závěru, 
zda daná chemická látka zp ůsobila vývojovou imunotoxicitu či nikoli, 
a NOAEL.  
Diskuse o výsledcích  
Závěry včetně hodnot NOAEL pro ú činky na rodi če a potomstvo  
Měly by být poskytnuty veškeré informace nezískané b ěhem studie, ale 
přínosné pro interpretaci výsledk ů (např. podobnost ú činků jakýchkoli 
známých neurotoxikant ů). 
Interpretace výsledk ů 
80. Rozší řená jednogenera ční studie toxicity pro reprodukci poskytne v p řípadě 
potřeby informace o ú čincích opakované expozice chemické látce b ěhem 
všech fází reproduk čního cyklu. Studie zejména poskytne informace 
o reproduk čním systému a o vývoji, r ůstu, přežití a funk čních ukazatelích 
potomstva do PND 90.  
81. Při interpretaci výsledk ů studie by m ěly být vzaty v úvahu všechny 
dostupné informace o chemické látce, v četně fyzikálně-chemických, toxiko ­
kinetických a toxikodynamických vlastností, dostupné podstatné informace 
o analogických strukturách a výsledky p ředchozích studií toxicity se zkou ­ 
šenou chemickou látkou (nap ř. akutní toxicita, toxicita po opakovaném 
podání, mechanistické studie a studie posuzující, zda existují podstatné 
kvalitativní a kvantitativní rozdíly mezi druhy, pokud jde o metabolické 
procesy  in vivo  a in vitro ). Je-li to proveditelné, zhodnotí se výsledky 
celkové pitvy a hmotnosti orgán ů v souvislosti s výsledky zjišt ěnými 
v jiných studiích s opakovaným dávkováním. P ři zpomalení r ůstu 
u potomstva by mohl být brán v úvahu vliv zkoušené chemické látky na 
složení mléka (29).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Kohorta 2 (vývojová neurotoxicita)  
82. Výsledky neurobehaviorálních a neuropatologických vyšet ření by m ěly být 
interpretovány v kontextu všech nález ů s využitím metody posouzení závaž ­
nosti důkazů a odborného úsudku. M ěly by být prodiskutovány vzorce 
behaviorálních nebo morfologických nález ů, jsou-li p řítomny, jakož 
i důkazy o závislosti odpov ědi na dávce. Do této charakterizace by m ělo 
být zahrnuto hodnocení vývojové neurotoxicity, v četně humánních epide ­
miologických studií nebo p řípadových zpráv a studií pokusných zví řat 
(např. toxikokinetické údaje, informace o vztazích mezi strukturou 
a aktivitou, údaje z jiných studií toxicity). Sou částí hodnocení údaj ů by 
měla být diskuse biologického i statistického významu. Hodnocení by 
mělo zahrnovat p řípadný vztah mezi pozorovanými neuropatologickými 
a behaviorálními zm ěnami. Pokyny k interpretaci výsledk ů vyšetření 
v souvislosti s vývojovou neurotoxicitou odkazují na zkušební metodu 
B.53 (35) a práci autor ů Tyla et al., 2008 (31).  
Kohorta 3 (vývojová imunotoxicita)  
83. Potla čení nebo podpo ření imunitních funkcí vyhodnocené metodou TDAR 
(protilátková odezva závislá na T bu ňkách) by m ělo být posuzováno 
v kontextu všech provedených pozorování. Významnost výsledku TDAR může být podpo řena jinými ú činky na indikátory související s imunitou 
(např. celularita kostní d řeně, hmotnost a histopatologické vyšet ření lymfa ­
tických tkání, distribuce podsoubor ů lymfocyt ů). Účinky stanovené pomocí 
TDAR mohou být mén ě smysluplné v p řípadě jiných toxicit pozorovaných 
při nižších expozi čních koncentracích.
 
84. Jako pom ůcka při interpretaci výsledk ů v oblasti reprodukce a neurotoxicity 
by měl posloužit pokyn OECD č. 43 (26).  
LITERATURA  
1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69–98.
 
2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530–536.
 
3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.
 
4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI 
Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87–94.  
5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating Rese ­
arch to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicological 
Sciences , 49, 1–4.  
6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction – a Literature Survey’,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293–327.  
7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356–369.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1–21.
 
9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408–415.  
10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84–97.  
11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York.  
12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383–390.
 
13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial 
Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male 
Rat’,  Biological Reproduction , 17, 298–303.  
14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods , 41, 9–19.  
15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23–35.  
16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92–108.
 
17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility ,54, 103–107.  
18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproductive 
Toxicology ,5, 39–44.  
19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237–244.
 
20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267–273.
 
21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409–421.  
22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 
449–458.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida. 
s. 319–333.  
24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401–415.  
25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491–505.  
26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Paris.  
27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’  Journal of Andrology , 8, 330–337.  
28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee 
(2006), ‘A 'Best Practices' Approach to Neuropathologic Assessment in 
Developmental Neurotoxicity Testing – for Today’,  Toxicological Patho ­
logy, 34, 296–313.  
29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of 
their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8–16.
 
30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in 
Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717–1726.
 
31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental 
Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpo ­
ints’,  Neurotoxicology and Teratology , 30: 349–381.  
32) OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for 
Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris.  
33) Kapitola B.43 této p řílohy, Studie neurotoxicity na hlodavcích.  
34) OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
35) Kapitola B.53 této p řílohy, Studie vývojové neurotoxicity.  
36) Kapitola B.54 této p řílohy, Uterotrofní biologická zkouška na hlodavcích: 
Krátkodobá screeningová zkouška estrogenních vlastností.  
37) Kapitola B.55 této p řílohy, Hershbergerova biologická zkouška na potka ­
nech: Krátkodobá screeningová zkouška androgenních/antiandrogenních 
vlastností.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
38) OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris.  
39) OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.
 
40) OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assess ­
ment, No. 151, OECD, Paris.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Dodatek 1  
Opatření a pozorování zahrnutá do funk ční pozorovací baterie (Kohorta 2 A)  
Chovná klec a otev řený prostor Manipula ční Fyziologická  
Poloha Snadnost p řemístění Teplota 
Nedobrovolné klonické a tonické 
pohyby Snadnost manipulace T ělesná hmotnost 
Srostlá ví čka Svalový tonus Reakce zorni ček 
Naježení chlup ů Reakce p ři přiblížení Velikost zorni ček 
Tvorba slin Reakce na dotyk Tvorba slz Reakce na zvukový podn ět 
Vydávání zvuk ů Reakce na sev ření ocasu 
Odchov Vzp řimovací reakce 
Anomálie ch ůze Roztažení zadních nohou p ři 
pádu z výšky 
Vzrušení Síla úchopu p ředních 
končetin 
Stereotypy v chování Síla úchopu zadních kon četin 
Zvláštní chování 
Skvrny 
Respirační anomálie
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Dodatek 2  
DEFINICE  
Chemická látka:  látka nebo sm ěs. 
Zkoušená chemická látka:  jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57  ZKOUŠKA STEROIDOGENEZE H295R  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda je rovnocenná pokynu OECD pro zkoušení (TG) 456 
(2011). V roce 1998 zahájila OECD činnost vysoké priority, jejíž podstatou 
je revize stávajících a vytvo ření nových pokyn ů pro screening a zkoušení 
potenciálních endokrinních disruptor ů. Koncep ční rámec OECD z roku 
2002 pro zkoušení a posuzování endokrinních disruptor ů je tvořen pěti 
úrovněmi, které odpovídají r ůzným úrovním biologické komplexnosti (1). 
Zkouška steroidogeneze  in vitro  H295R (zkouška H295R) popsaná v této 
zkušební metod ě využívá lidskou bun ěčnou linii adrenálního karcinomu 
(buňky NCI-H295R) a p ředstavuje úrove ň 2 koncep čního rámce: „zkoušky  
in vitro  poskytující mechanistické údaje‘ pro ú čely screeningu a stanovení 
priorit. Vývoj a standardizace zkoušky jako screeningu pro chemické účinky na steroidogenezi, konkrétn ě na produkci estradiolu (E2) 
a testosteronu (T), prob ěhly formou vícestup ňového procesu. Zkouška 
H295R byla optimalizována a validována (2) (3) (4) (5).
 
2. Cílem zkoušky steroidogeneze H295R je odhalit chemické látky, které mají 
vliv na produkci hormon ů E2 a T. Cílem zkoušky H295R je identifikovat 
xenobiotika, která mají jako své cílové místo, p řípadně cílová místa, endo ­
genní složky, které zahrnují nitrobun ěčnou biochemickou dráhu za čínající 
řadou reakcí po čínaje cholesterolem až po produkci E2 a/nebo T. Ú čelem 
zkoušky H295R není identifikovat chemické látky, které mají vliv na stero ­
idogenezi z d ůvodu účinků na osu hypotalamus – hypofýza – pohlavní 
žlázy (HPG). Cílem zkoušky je poskytnout odpov ěď ANO/NE, pokud jde 
o potenciál chemické látky vyvolávat nebo tlumit produkci hormon ů 
T a E2. V n ěkterých p řípadech však mohou být získány kvantitativní 
výsledky (viz odstavce 53 a 54). Výsledky zkoušky jsou vyjád řeny jako 
relativní zm ěny v produkci hormonu v porovnání s kontrolami pomocí 
rozpouštědel (SC). Ú čelem zkoušky není poskytnout specifické mechanis ­
tické informace týkající se interakce zkoušené chemické látky s endokrinním systémem. Prob ěhly výzkumy, které používaly tuto 
buněčnou linii k identifikaci ú činků na specifické enzymy 
a meziproduktové hormony, nap ř. progesteron (2).
 
3. Definice a zkratky používané v této zkušební metod ě jsou popsány 
v dodatku. Podrobný pracovní postup v četně pokynů, jak připravit roztoky, 
kultivovat bu ňky a provád ět různé aspekty zkoušek, je k dispozici 
v dodatku I–III dokumentu OECD ‘Multi-Laboratory Validation of the 
H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production’ (4).
 
VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ  
4. Biosyntézy pohlavních steroidních hormon ů se účastní pět různých enzym ů, 
které působí jako katalyzátor v šesti r ůzných reakcích. Enzymatická 
konverze cholesterolu na pregnenolon cytochromem P450 (CYP), konkrétn ě 
štěpením cholesterolového bo čního řetězce enzymem CYP11 A, p ředstavuje 
úvodní krok v sérii biochemických reakcí, které vrcholí syntézou steroid ­
ních kone čných produkt ů. V závislosti na po řadí dalších dvou reakcí se 
steroidogenní dráha rozdvojí, na Δ 5 -hydroxysteroidní dráhu a Δ 4 -ketostero ­
idní dráhu, které se sbíhají v produkci androstendionu (obrázek 1).  
5. Androstendion se p řeměňuje na testosteron (T) p ůsobením 17 β-hydroxyste ­
roid dehydrogenasou (17 β-HSD). Testosteron je meziprodukt i kone čný 
produkt/hormon. V mužském t ěle se T m ůže přeměnit na 
dihydrotestosteron (DHT) díky 5 α-reduktáze, která se nachází 
v buněčných membránách, jaderném obalu a endoplazmatickém retikulu 
cílových tkání androgenního p ůsobení, nap ř. v prostat ě a semenných 
váčcích. DHT je jako androgen výrazn ě účinnější než T a je též považován 
za konečný hormon. Zkouška H295R nedetekuje DHT (viz odstavec 10).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Enzym na steroidogenní dráze, který p řeměňuje androgenní chemické látky 
na estrogenní chemické látky, je aromatáza (CYP19). CYP19 p řeměňuje 
T na 17β-estradiol (E2) a androstendion na estron. E2 a T jsou považovány 
za konečné hormony steroidogenní dráhy.  
7. Specifi čnost činnosti lyázy CYP17 se mezi druhy liší z hlediska intermedi ­
álních substrát ů. U lidí enzym up řednostňuje substráty Δ 5 -hydroxysteroidní 
dráhy (pregnenolon), zatímco substráty na Δ 4 -ketosteroidní dráze (progeste ­
ron) jsou up řednostňovány u potkan ů (19). Takové rozdíly v činnosti lyázy 
CYP17 mohou vysv ětlovat některé rozdíly závislé na daném živo čišné 
druhu v reakci na chemické látky, které m ění steroidogenezi  in vivo  (6). 
Bylo prokázáno, že bu ňky H295 nejblíže odrážejí expresi adrenálního 
enzymu a vzorec produkce steroid ů u dospělých osob (20), ale je známo, 
že zajišťují expresi enzym ů jak pro Δ 5 -hydroxysteroidní, tak pro Δ 4 -ketos­
teroidní dráhu androgenní syntézy (7) (11) (13) (15).  
Obrázek 1  
Steroidogenní dráha v bu ňkách H295R
  
Poznámka:  
Enzymy jsou psány kurzivou, hormony jsou psány tu čně a šipky zna čí směr 
syntézy. Šedé pozadí zna čí kortikosteroidní dráhy/produkty. Dráhy/produkty 
pohlavních steroid ů jsou v bílém poli. CYP = cytochrom P450; 
HSD = hydroxysteroidní dehydrogenasa; DHEA = dehydroepiandrosteron.  
8. Lidská bun ěčná linie adrenálního karcinomu H295R je užite čným modelem  
in vitro  pro zkoumání ú činků na syntézu steroidních hormon ů (2) (7) (8) (9) 
(10). Bun ěčná linie H295R má exprimovány geny, které kódují všechny 
klíčové enzymy pro steroidogenezi uvedenou výše (11) (15) (obrázek 1). To 
je jedinečná vlastnost, protože exprese t ěchto genů in vivo  je specifická 
z hlediska tkán ě a vývojového stadia, p řičemž zpravidla žádná tká ň ani 
žádné vývojové stadium neexprimuje všechny geny ú častnící se steroidoge ­
neze (2). Bu ňky H295R mají fyziologické charakteristiky zonáln ě nedife­
rencovaných adrenálních bun ěk lidského plodu (11). Tyto bu ňky představují 
jedinečný systém  in vitro v  tom, že mají schopnost produkovat veškeré 
steroidní hormony, které se nacházejí v k ůře nadledvin a v pohlavních 
žlázách, což umož ňuje provést zkoušky jak ú činků na kortikosteroidovou 
syntézu, tak ú činků na produkci pohlavních steroidních hormon ů, jako jsou  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
androgeny a estrogeny, a čkoli zkouška byla validována pouze pro detekci 
hormonů T a E2. Zm ěny, které tento zkušební systém zaznamenává ve 
formě změn v produkci T a E2, mohou být výsledkem velkého množství 
různých interakcí zkoušených chemických látek se steroidogenními funk ­
cemi, které probíhají v bu ňkách H295R. Pat ří mezi ně modulace exprese, 
syntézy nebo funkce enzym ů, které se ú častní produkce, p řeměny nebo 
eliminace steroidních hormon ů (12) (13) (14). Inhibice produkce hormon ů 
může být zp ůsobena p římou kompetitivní vazbou na enzym v této dráze 
účinkem na kofaktory jako jsou NADPH (nikotinamidadenindinukleotidfos ­
fát) a cAMP (cyklický adenosinmonofosfát), a/nebo zvýšením metabolismu 
steroidů nebo potla čením genové exprese ur čitých enzym ů v dráze stero ­
idogeneze. Zatímco inhibice m ůže být funkcí jak p římých, tak nep římých 
procesů účastnících se produkce hormon ů, indukce má zpravidla nep římý 
charakter, nap říklad ovliv ňuje kofaktory, jako jsou NADPH a cAMP (stejn ě 
jako v p řípadě forskolinu), snižuje metabolismus steroid ů (13) a/nebo 
zvyšuje steroidogenní genovou expresi.  
9. Zkouška H295R má n ěkolik výhod:  
— umožňuje odhalení nár ůstů i poklesů v produkci T i E2,  
— dovoluje p římé zhodnocení p řípadného vlivu chemické látky na 
buněčnou životaschopnost/cytotoxicitu. To je d ůležitá vlastnost, protože 
umožňuje rozlišení ú činků, které jsou vyvolány cytotoxicitou, a ú činků, 
které jsou vyvolány p římou interakcí chemických látek se steroidogen ­
ními drahami, což není možné v systémech tká ňových explantát ů, které 
jsou tvo řeny mnoha bun ěčnými typy s prom ěnlivou citlivostí 
a funkčností,  
— není nutné využívat zví řata, 
— buněčná linie H295R je komer čně dodávána.  
10. Základní omezení zkoušky jsou následující:  
— Není známa její metabolická schopnost, ale pravd ěpodobně je dost 
omezená; chemické látky, které musí být metabolicky aktivovány, prav ­
děpodobně nebudou v této zkoušce zachyceny.  
— Jelikož je H295R získávána z tkán ě nadledvin, obsahuje enzymy 
schopné produkovat gluko- a mineralokortikoidy, stejn ě jako pohlavní 
hormony. Z tohoto d ůvodu by ú činky na produkci gluko- 
a mineralokortikoid ů mohly ovlivnit úrovn ě hormonů T a E2 pozoro ­
vané ve zkoušce.  
— Neměří DHT, a tudíž se neo čekává, že by p ři ní byly odhaleny 
chemické látky, které inhibují 5 α-reduktázu. V takovém p řípadě lze 
použít Hershbergerovu zkoušku (16).  
— Zkouška H295R neodhalí chemické látky, které zasahují do steroidoge ­
neze tím, že postihují osu hypotalamus – hypofýza – pohlavní 
žlázy (HPG), protože tu lze studovat pouze u zví řat in vivo . 
PODSTATA ZKOUŠKY  
11. Účelem této zkoušky je odhalit chemické látky, které mají vliv na produkci 
T a E2. T je také meziproduktem na dráze k produkci E2. Zkouška m ůže 
odhalit chemické látky, které zpravidla inhibují anebo indukují enzymy 
dráhy steroidogeneze.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Zkouška se obvykle provádí za standardních podmínek kultivace bun ěk 
v 24jamkových kultiva čních desti čkách. Případně lze k provedení zkoušky 
použít jiné velikosti desti ček. Nasazení bun ěk a experimentální podmínky 
by však m ěly být podle toho upraveny tak, aby byl zachován soulad 
s kritérii provedení testu.  
13. Po aklimatiza čním období v délce 24 hodin ve vícejamkových desti čkách 
jsou buňky po dobu 48 hodin vystaveny sedmi koncentracím zkoušené 
chemické látky, alespo ň ve třech soub ěžných experimentech/opakováních. 
Rozpoušt ědlo a známý inhibitor a induktor produkce hormon ů v určené 
koncentraci jsou použity jako negativní a pozitivní kontroly. Na konci období expozice je médium ze všech jamek odstran ěno. Bezprost ředně po 
odstranění média je analyzována životaschopnost bun ěk v každé jamce. 
Koncentrace hormon ů v médiu lze m ěřit pomocí celé řady metod v četně 
komerčně dostupných sad k m ěření hormon ů a/nebo p řístrojových technik, 
jako je kombinace kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií 
(LC-MS). Údaje jsou vyjád řeny jako násobná zm ěna vztažená k negativní 
kontrole (rozpoušt ědlo) a jako nejnižší koncentrace testované látky, p ři které 
jsou pozorovány ú činky ( Lowest-Observed-Effect-Concentration , LOEC). 
Je-li zkouška negativní, je nejvyšší testovaná koncentrace ozna čena jako 
nejvyšší koncentrace testovaného vzorku nevyvolávající žádné pozorova ­
telné účinky ( No-Observed-Effect-Concentration , NOEC). Záv ěry týkající 
se schopnosti chemické látky ovlivnit steroidogenezi by m ěly vycházet 
nejméně ze dvou nezávislých pokus ů. První pokus m ůže fungovat jako 
pokus zjiš ťující rozmezí dávek p řípadně
 s následnou úpravou koncentrací 
pro pokusy 2 a 3, pokud se objeví problémy s rozpustností nebo cytotoxi ­
citou nebo pokud se zdá, že aktivita chemické látky je na hranici rozp ětí 
zkoušených koncentrací.  
KULTIVACE  
Buněčná linie  
14. Buňky NCI-H295R lze komer čně získat z  American Type Culture 
Collections  (ATCC) po podpisu smlouvy o prodeji materiálu ( Material 
Transfer Agreement , MTA) (  1 ). 
Úvod  
15. Z důvodu změn schopnosti bun ěk produkovat E2 se zvyšujícím se stá řím/ 
počtem pasáží (2) by kultivace bun ěk měla před jejich použitím probíhat 
v souladu s konkrétním pracovním postupem a m ěl by být zaznamenán 
počet pasáží od rozmrazení bun ěk i číslo/pořadí pasáže, v níž byly bu ňky 
zmraženy a umíst ěny do kapalného dusíku. První číslo uvádí skute čný počet 
buněčných pasáží a druhé číslo popisuje číslo pasáže, v níž byly bu ňky 
zmraženy a uloženy. Nap říklad buňky, které byly zmraženy po pasáži p ět 
a rozmraženy a poté byly t řikrát rozd ěleny (čtyři pasáže po čítající čerstvě 
rozmražené bu ňky se počítají jako pasáž 1) by poté, co byly op ět kultivo­
vány, byly ozna čeny jako pasáž 4,5. P říklad schématu číslování je uveden 
v dodatku I valida ční zprávy (4).  
16. Jako základ pro obohacené médium a mrazicí médium se použije zásobní 
médium. Obohacené médium je nezbytnou sou částí kultivace bun ěk. 
Mrazicí médium je speciáln ě navrženo tak, aby umožnilo ni čím nedotčené 
zmrazení bun ěk pro dlouhodobé skladování. P řed použitím by z hlediska 
základních koncentrací T a E2 m ěla proběhnout analýza Nu-séra (nebo 
srovnatelného séra se stejnými vlastnostmi, kde bylo prokázáno, že spl ňuje 
požadavky na provedení zkoušky a kontrolu kvality), které je sou částí 
obohaceného média. P říprava těchto roztok ů je popsána v dodatku II vali ­
dační zprávy (4).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Po zahájení kultivace bun ěk H295R z p ůvodní dodávky z ATCC by bu ňky 
měly růst po pět pasáží (tj. bu ňky jsou rozd ěleny čtyřikrát). Bu ňky pasáže 5 
jsou poté zmraženy v kapalném dusíku a uskladn ěny. Před zmrazením 
buněk je na desti čce pro kontrolu kvality (QC-desti čce) odebrán vzorek 
buněk předchozí pasáže 4 (viz odstavec 36 a 37), aby se ov ěřilo, zda 
bazální produkce hormon ů a reakce pozitivní kontrolní látky spl ňují kritéria 
kontroly kvality zkoušky definovaná v tabulce 5.  
18. Buňky H295R musí být kultivovány, zmraženy a uchovávány v kapalném 
dusíku, aby bylo zajišt ěno, že pro ú čely kultivace a použití budou vždy 
k dispozici bu ňky příslušné pasáže/stá ří. Aby to bylo p řijatelné pro zkoušku 
H295R, tak pasáží po odebrání nové (  1 ) nebo zmrazené (  2 ) dodávky bun ěk 
do kultury by nem ělo být více než deset. Nap říklad přijatelné pasáže pro 
kultury bun ěk z dávky zmrazené v pasáži 5 by byly 4,5 až 10,5. U bun ěk 
kultivovaných z t ěchto zmrazených dávek by m ěl být dodržen postup 
popsaný v odstavci 19. Tyto bu ňky by se m ěly před použitím kultivovat 
alespoň čtyři (4) další pasáže (pasáž 4,5).  
Aktivace bun ěk ze zmrazené zásoby  
19. Postup pro aktivaci bun ěk ze zmrazené zásoby se uplat ňuje tehdy, když se 
z uskladn ění v kapalném dusíku vyjme pro ú čely kultivace a zkoušení nová 
dávka bun ěk. Podrobnosti o tomto postupu jsou stanoveny v dodatku III 
validační zprávy (4). Bu ňky jsou vyjmuty ze skladovacích nádob 
s kapalným dusíkem, rychle jsou rozmraženy, umíst ěny do obohaceného 
média v centrifuga ční zkumavce, odst ředěny při pokojové teplot ě, opětovně 
suspendovány v obohaceném médiu a p řeneseny do kultiva ční baňky. 
Médium by m ělo být následující den vym ěněno. Buňky H295R se kultivují 
v inkubátoru p ři teplotě 37 °C s 5 % CO  2 ve vzduchové atmosfé ře 
a médium se obnovuje 2–3krát týdn ě. Jakmile bu ňky dosáhnou konfluence 
přibližně 85–90 %, m ěly by být rozd ěleny. Rozd ělení buněk je nezbytné 
pro zajišt ění zdraví a r ůstu buněk a pro zachování bun ěk pro účely 
provádění biologických zkoušek. Bu ňky jsou třikrát opláchnuty ve fyziolo ­
gickém roztoku ve fosfátovém pufru (PBS, bez Ca  2+ Mg 2+. ) a vyňaty 
z kultivační baňky přidáním vhodného odlu čovacího enzymu, nap ř. tryp­
sinu, do PBS (bez Ca  2+ Mg 2+ ). Bezprost ředně po vynětí buněk z kultiva ční 
baňky by působení enzymu m ělo být zastaveno p řidáním obohaceného 
média v pom ěru trojnásobku objemu použitého pro aplikaci enzymu. 
Buňky jsou umíst ěny do centrifuga ční zkumavky, odst ředěny při pokojové 
teplotě, je odstran ěn supernatant a sediment bun ěk se resuspenduje 
v obohaceném médiu. P říslušné množství bun ěčné suspenze se umístí do 
nové kultiva ční baňky. Toto množství bun ěčné suspenze by se m ělo upravit 
tak, aby bu ňky dosáhly do 5–7 dn ů konfluence. Doporu čený subkultiva ční 
poměr je 1:3 až 1:4. Desti čka by měla být pe člivě označena. Buňky jsou 
nyní připraveny k použití p ři zkoušce a p řebytečné buňky by m ěly být 
podle odstavce 20 zmraženy v kapalném dusíku.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) „Novou dávkou“ se rozumí čerstvá dávka bun ěk obdržená od ATCC. 
( 2 ) „Zmrazenou dávkou“ se rozumí bu ňky, které byly d říve kultivovány a poté zmrazeny 
v jiné laborato ři, než je ATCC.
 Zmrazení bun ěk H295R (p říprava bun ěk na skladování v kapalném 
dusíku)  
20. Pro p řípravu bun ěk H295R na zmrazení je zapot řebí dodržet postup 
popsaný výše u d ělení buněk až do kroku resuspenze sedimentu bun ěk 
na dně odstředivkové zkumavky. Zde je sediment bun ěk resuspendován 
v mrazicím médiu. Roztok je p řenesen do řádně označené kryogenní 
ampulky a zmražen p ři teplotě – 80 °C na 24 hodin, po jejichž uplynutí 
je kryogenní ampulka p řemístěna do kapalného dusíku k uskladn ění. 
Podrobnosti o tomto postupu jsou stanoveny v dodatku III valida ční zprávy 
(4). 
Umístění buněk na desti čky a preinkubace p řed zkoušením  
21. Počet 24jamkových desti ček připravených podle odstavce 19, které budou 
zapotřebí, závisí na po čtu zkoušených chemických látek a konfluenci bun ěk 
v kultivačních miskách. Zpravidla jedna kultiva ční baňka (75 cm  2 ) buněk 
s 80–90 % konfluencí zajistí dostate čné množství bun ěk pro 1–1,5 (24jam ­
kové) desti čky při cílové hustot ě 200 000 až 300 000 bun ěk na 1 ml média 
s výslednou p řibližnou 50–60 % konfluencí v jamkách b ěhem 24 hodin 
(obrázek 2). To je obvykle optimální hustota bun ěk pro produkci hormonu 
při zkoušce. P ři vyšších hustotách se vzorce produkce T i E2 m ění. Před 
prvním provedením zkoušky se doporu čuje vyzkoušet r ůzné hustoty nasa ­
zení mezi 200 000 a 300 000 bu ňkami na 1 ml a pro další pokusy vybrat 
hustotu, která b ěhem 24 hodin p řinese 50–60 % konfluenci v jamce.  
Obrázek 2  
Mikrosnímek bun ěk H295R p ři 50 % hustot ě nasazení v 24jamkové kultiva ční destičce 
po 24 hodinách po řízený na okraji (A) a ve st ředu (B) jamky
  
22. Médium je rozpipetováno z kultiva ční baňky a buňky jsou třikrát proplách ­
nuty sterilním PBS (bez Ca  2+ Mg 2+ ). Je přidán roztok enzymu (v PBS) pro 
oddělení buněk od kultiva ční baňky. Po uplynutí náležité doby pro odd ělení 
buněk by působení enzymu m ělo být zastaveno p řidáním obohaceného 
média v pom ěru trojnásobku objemu použitého pro aplikaci enzymu. 
Buňky jsou umíst ěny do centriguga ční zkumavky, odst ředěny při pokojové 
teplotě, odstraní se supernatant a sediment bun ěk se resuspenduje  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
v obohaceném médiu. Hustota bun ěk se vypo čítá např. pomocí hemocyto ­
metru nebo po čítače buněk. Buněčná suspenze by m ěla být zředěna na 
požadovanou hustotu pro desti čku a důkladně rozmíchána, aby byla zajiš ­
těna homogenní hustota bun ěk. Buňky by měly být umíst ěny na desti čky 
s 1 ml bun ěčné suspenze na jamku a desti čky a jamky by m ěly být ozna ­ 
čeny. Desti čky s nasazenými bu ňkami se inkubují p ři teplotě 37 °C ve 
vzduchové atmosfé ře s 5 % CO  2 na dobu 24 hodin, aby se bu ňky mohly 
přichytit k jamkám.  
POŽADAVKY KONTROLY KVALITY  
23. Je velmi d ůležité, aby b ěhem dávkování byl do jamek umíst ěn přesný 
objem roztok ů a vzorků, protože tento objem ur čuje koncentrace používané 
při počítání výsledk ů zkoušky.  
24. Před zahájením kultivace bun ěk a jakýmkoli následným zkoušením by 
každá laborato ř měla doložit citlivost svého systému m ěření hormon ů 
(odstavce 29–31).  
25. Používají-li se zkoušky m ěření hormonu na základ ě protilátek, musí být 
před zahájením zkoušení provedena analýza zkoušených chemických látek, 
aby se zjistilo, zda mají potenciál p ůsobit rušiv ě na systém m ěření použí ­
vaný ke kvantifikaci T a E2 podle odstavce 32.  
26. Doporu čovaným rozpoušt ědlem pro zkoušku je DMSO. Pokud se používá 
alternativní rozpoušt ědlo, je zapot řebí stanovit toto:  
— rozpustnost zkoušené chemické látky, forskolinu a prochlorazu 
v rozpoušt ědle, a  
— cytotoxicitu jako funkci koncentrace rozpoušt ědla. 
Doporučuje se, aby maximální p řípustná koncentrace rozpoušt ědla nepře­
kročila desetinásobek z ředění nejmenší cytotoxické koncentrace rozpouš ­
tědla. 
27. Před prvním provedením zkoušky by laborato ř měla provést kvalifika ční 
pokus prokazující, že laborato ř je schopna udržet a dosáhnout vhodných 
kultivačních a experimentálních podmínek, které jsou požadovány pro zkou ­ 
šení chemické látky podle odstavc ů 33–35.  
28. Na za čátku zkoušení p ři použití nové dávky bun ěk by před použitím nové 
dávky bun ěk ke zkoušení m ěl být proveden kontrolní experiment (desti čka 
pro kontrolu kvality –  QC plate ) ke zhodnocení vlastností bun ěk podle 
odstavců 36 a 37.  
Fungování systému m ěření hormon ů 
Citlivost metody, p řesnost, preciznost a k řížová reaktivita s matricí vzork ů 
29. Každá laborato ř může k analýze produkce T a E2 bu ňkami H259R používat 
systém m ěření hormon ů dle své volby, pokud spl ňuje kritéria provedení 
zkoušky, v četně meze kvantifikace (LOQ). Nomináln ě to je 100 pg/ml 
pro T a 10 pg/ml pro E2, které vycházejí z bazálních hladin hormon ů 
pozorovaných ve valida čních studiích. Avšak v závislosti na bazálních 
hladinách hormon ů dosažených v provád ějící laborato ři mohou být vhodné 
vyšší nebo nižší hladiny. P řed zahájením pokus ů s destičkou pro kontrolu 
kvality a pokus ů v rámci zkoušky by laborato ř měla prokázat, že p ři uplat­
něné zkoušce hormon ů lze změřit koncentrace hormon ů v obohaceném 
médiu s dostate čnou přesností a precizností, aby mohla být p ři analýze 
obohaceného média dopln ěné o interní kontrolu hormon ů splněna kritéria  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
kontroly kvality specifikovaná v tabulkách 1 a 5. Obohacené médium by 
mělo být dopln ěno nejmén ě o tři koncentrace každého hormonu (nap ř. 100, 
500 a 2 500 pg/ml hormonu T; 10, 50 a 250 pg/ml hormonu E2; nebo pro nejnižší obohacené koncentrace T a E2 lze použít nejnižší možné koncent ­
race na základ ě limitů zjištění vybraného systému m ěření hormon ů) 
a analyzováno. Nam ěřené koncentrace hormon ů u neextrahovaných vzork ů 
by měly spadat do rozmezí 30 % nominálních koncentrací a rozdíl mezi 
opakovanými m ěřeními téhož vzorku by nem ěl překročit 25 % (viz rovn ěž 
tabulka 8, kde jsou uvedena další kritéria kontroly kvality). Pokud jsou tato 
kritéria kontroly kvality spln ěna, předpokládá se, že vybraná metoda m ěření 
hormonů je dostate čně přesná, precizní a nedochází p ři ní ke křížové reakci 
se složkami média (matrice vzork ů), tak, že by se o čekával významný vliv 
na výsledek zkoušky. V tomto p řípadě není vyžadována extrakce vzork ů 
před měřením hormon ů.
 
30. V p řípadě, že kritéria kontroly kvality v tabulkách 1 a 8 nejsou spln ěna, 
může se objevit významný ú činek matrice a m ěl by být proveden pokus 
s extrahovaným obohaceným médiem. P říklad postupu extrakce je popsán 
v dodatku II valida ční zprávy (4). M ěření koncentrací hormon ů 
v extrahovaných vzorcích by m ěla být provedena trojmo. (  1 ) Pokud lze 
dokázat, že po extrakci nenarušují složky média metodu zjiš ťování hormon ů 
podle kritérií kontroly kvality, m ěly by být všechny další pokusy uskute č­
něny pomocí extrahovaných vzork ů. Pokud kritéria kontroly kvality nelze 
po extrakci splnit, použitý systém m ěření hormon ů není pro ú čely zkoušky 
steroidogeneze H295R vhodný a m ěla by se použít alternativní metoda 
zjišťování hormon ů. 
Standardní k řivka 
31. Koncentrace hormon ů v kontrolních vzorcích rozpoušt ědla by m ěly být 
v rozmezí lineární části standardní k řivky. V ideálním p řípadě by se 
hodnoty kontrolních vzork ů rozpoušt ědla měly pohybovat kolem st ředu 
lineární části, aby bylo zajišt ěno, že bude možné zm ěřit indukci a inhibici 
syntézy hormon ů. Podle toho je t řeba vybrat z ředění média (nebo extrakty), 
které budou m ěřeny. Lineární vztah se stanoví vhodným statistickým p řístu­
pem.  
Zkouška interference chemické látky  
32. Pokud se k m ěření hormon ů použijí metody založené na protilátkách, jako 
jsou enzymové imunoanalýzy s enzymem vázaným na 
imunosorbent (ELISA) a radio-imunoanalýzy (RIA), m ěla by být každá 
chemická látka otestována z hlediska potenciální interference se systémem měření hormon ů, který bude použit, a to ješt ě před zahájením vlastního 
zkoušení chemických látek (dodatek III valida ční zprávy (4)), protože 
některé chemické látky mohou s t ěmito zkouškami interferovat (17). 
Dochází-li k interferenci, která je ≥ 20 % bazální produkce hormon ů pro 
T a/nebo E2, jak stanoví analýza hormon ů, měl by u všech ředění zásob­
ního roztoku zkoušené chemické látky prob ěhnout test interference 
chemické látky s hormony p ři zkoušce (nap ř. jak je popsáno v dodatku 
III valida ční zprávy (4) oddílu 5.0) s cílem ur čit prahovou dávku, p ři níž
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Pozn.:  Je-li požadována extrakce, jsou pro každý extrakt provedena t ři opakovaná 
měření. Každý vzorek bude extrahován pouze jednou.
 dochází k významné interferenci ( ≥ 20 %). Pokud je interference menší než 
30 %, výsledky lze opravit. Pokud interference p řesáhne 30 %, údaje jsou 
neplatné a údaje pro tyto koncentrace by m ěly být odstran ěny. Pokud p ři 
více než jedné necytotoxické koncentraci dochází k významné interferenci zkoušené chemické látky se systémem m ěření hormon ů, měl by se použít 
jiný systém m ěření hormon ů. Aby se p ředešlo interferenci 
s kontaminujícími chemickými látkami, je doporu čeno, aby hormony byly 
z média extrahovány pomocí vhodného rozpoušt ědla. Možné metody lze 
najít ve valida ční zprávě (4).
 
Tabulka 1  
Kritéria provedení pro systémy m ěření hormon ů 
Parametr Kritérium  
Citlivost metody m ěření Mez kvantifikace (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Účinnost extrakce hormon ů (pouze 
pokud je extrakce nutná) Průměrné podíly výt ěžnosti (na 
základě tří měření) u standardního 
přídavku hormonu by se nem ěly 
odchylovat od množství, které bylo 
přidáno, o více než 30 %. 
Interference chemické látky (pouze 
systémy na základ ě protilátek) Nemělo by docházet k žádné 
podstatné ( ≥ 30 % bazální produkce 
příslušného hormonu) k řížové reakti ­
vitě s kterýmkoli z hormon ů 
produkovaných bu ňkami (  b ) ( c ) 
( a ) Poznámka:  Limity metody m ěření vycházejí z hodnot bazální produkce hormon ů 
uvedených v tabulce 5 a opírají se o provedení. Pokud lze dosáhnout vyšší bazální 
produkce hormon ů, může být limit vyšší. 
( b ) Některé protilátky T a E2 mohou p ři vyšším procentu k řížově reagovat 
s androstendionem, resp. estronem. V takových p řípadech nelze p řesně určit 
účinky na 17 β-HSD. Údaje však i p řesto mohou poskytnout užite čné informace 
týkající se ú činků na produkci estrogenu nebo androgenu obecn ě. V takových 
případech by údaje m ěly být vyjád řeny spíše jako odpov ědi na androgen/estrogen 
než E2 a T. 
( c ) Patří mezi ně: cholesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoxykortikosteron, korti ­
kosteron, aldosteron, 17 α-pregnenolon,17 α-progesteron, deoxykortizol, kortizol, 
DHEA, androstendion, estron.  
Test způsobilosti laborato ře 
33. Před zkoušením neznámých chemických látek by laborato ř měla 
provedením testu zp ůsobilosti prokázat, že je schopna dosáhnout náležitých 
podmínek pro kultivaci bun ěk a zkušebních podmínek, které jsou požado ­
vány pro úsp ěšné provedení zkoušky, a udržet je. Jelikož uskute čnění 
zkoušky je p římo spojeno s pracovníky laborato ře, kteří budou danou 
zkoušku provád ět, měly by být tyto postupy částečně zopakovány, pokud 
dojde ke zm ěně laboratorního personálu.  
34. Tento test zp ůsobilosti bude uskute čněn za podmínek uvedených 
v odstavcích 38 až 40 tak, že bu ňky budou vystaveny sedmi rostoucím 
koncentracím silných, mírných a slabých induktor ů a inhibitor ů, jakož 
i negativní chemické látce (viz tabulka 2). Mezi chemické látky, které 
mají být zkoušeny, pat ří konkrétn ě silný induktor forskolin ( č. CAS 
66575-29-9), silný inhibitor prochloraz ( č. CAS 67747-09-5), mírný  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
induktor atrazin ( č. CAS 1912-24-9), mírný inhibitor aminoglutethimid 
(č. CAS 125-84-8), slabý induktor (produkce E2) a slabý inhibitor (pro ­
dukce T) bisfenol A ( č. CAS 80-05-7) a negativní chemická látka 
choriogonadotropin (HCG) ( č. CAS 9002-61-3) (viz tabulka 2). Pomocí 
formátu podle tabulky 6 jsou všechny chemické látky umís ťovány do odd ě­
lených desti ček. U chemických látek pro test zp ůsobilosti by m ěla být 
v každém dnu zkoušení za řazena jedna QC-desti čka (tabulka 4, odstavce 
36–37).  
Tabulka 2  
Chemické látky pro test zp ůsobilosti a expozi ční koncentrace  
Chemická látka pro test 
způsobilosti Expoziční koncentrace [ μM] 
Prochloraz 0 (  a ); 0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10 
Forskolin 0 (  a ); 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30 
Atrazin 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
Aminoglutethimid 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
Bisfenol A 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
HCG 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100  
( a ) Kontrola rozpoušt ědla (DMSO) (0), 1 μl DMSO/jamka.  
Při testu zp ůsobilosti laborato ře by expozice bun ěk H295R chemickým 
látkám m ěla proběhnout v 24jamkových desti čkách. U všech dávek zkou ­ 
šených chemických látek se dávky stanovují v μM. Dávky by se m ěly 
podávat v DMSO p ři 0,1 % obj. na jamku. Všechny zkoušené koncentrace 
by měly být testovány ve t řech jamkách (tabulka 6). Pro každou chemickou 
látku se používají odd ělené desti čky. V každém dnu zkoušení se za řadí 
jedna QC-desti čka. 
35. Analýzy životaschopnosti bun ěk a hormon ů by měly být provedeny 
v souladu s odstavci 42 až 46. M ěly by být oznámeny prahová hodnota 
(nejnižší koncentrace testovaného vzorku, p ři které jsou pozorovány ú činky, 
LOEC) a rozhodnutí o klasifikaci a m ěly by být porovnány s hodnotami 
v tabulce 3. Údaje jsou považovány za p řijatelné, pokud spl ňují LOEC 
a klasifikaci v tabulce 3.  
Tabulka 3  
Prahové hodnoty (LOEC) a klasifikace výsledku pro chemické látky v testu zp ůsobilosti  
Číslo CAS LOEC [μM] Klasifikace výsledku 
T E2 T E2  
Prochloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (Inhibice) + (Inhibice) 
Forskolin 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (Indukce) + (Indukce) 
Atrazin 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (Indukce) + (Indukce) 
Aminoglute ­
thimid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (Inhibice) + (Inhibice)  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
Číslo CAS LOEC [μM] Klasifikace výsledku 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (Inhibice) + (Indukce) 
HCG 9002-61-3 nepou ­ 
žije se nepou­ 
žije se negativní negativní  
( a ) +, pozitivní 
nepoužije se – vzhledem k tomu, že po expozici necytotoxickým koncentracím negativní kontroly by nem ělo 
dojít k žádným zm ěnám. 
Destička pro kontrolu kvality ( Quality Control Plate ), QC-desti čka 
36. QC-desti čka se používá k ov ěření chování bun ěk H295R za standardních 
podmínek kultivace a k vytvo ření dosavadní databáze koncentrací hormon ů 
při kontrolách rozpoušt ědel, pozitivních a negativních kontrolách a p ři 
jiných opat řeních kontroly kvality v pr ůběhu času. 
— Chování bun ěk H295R by m ělo být posuzováno pomocí QC-desti čky 
pro každou novou dávku ATCC nebo po prvním použití d říve zmrazené 
zásoby bun ěk, pokud test zp ůsobilosti laborato ře (odstavce 32–34) 
proběhl s touto dávkou bun ěk. 
— QC-desti čka zajišťuje kompletní posouzení podmínek zkoušky (nap ř. 
životaschopnost bun ěk, kontroly rozpoušt ědel, negativní a pozitivní 
kontroly, jakož i rozdíly v rámci zkoušky a mezi zkouškami) p ři zkou­ 
šení chemických látek a m ěla by být sou částí každé zkoušky.  
37. Test kontroly kvality se provádí v 24jamkové desti čce a probíhá stejnými 
postupy inkubace, dávkování, životaschopnosti bun ěk/cytotoxicity, extrakce 
hormonů a analýzy hormon ů, které jsou popsány v odstavcích 38 až 46 pro 
zkoušení chemických látek. QC-desti čka obsahuje slepé pokusy, kontroly 
rozpouštědla a dvě koncentrace známého induktoru (forskolin, 1, 10 μM) 
a inhibitoru (prochloraz, 0,1, 1 μM) syntézy E2 a T. Krom ě toho se ve 
vybraných jamkách používá jako pozitivní kontrola pro zkoušku života ­
schopnosti/cytotoxicity MeOH. Podrobný popis rozvržení desti čky obsahuje 
tabulka 4. Kritéria, která musí QC-desti čka splňovat, jsou vyjmenována 
v tabulce 5. Minimální bazální produkce hormonu u T a E2 by m ěla být 
splněna jak při kontrole rozpoušt ědla, tak v jamkách pro slepé pokusy.  
Tabulka 4  
Rozvržení QC-desti čky pro zkoušení chování bun ěk H295R nevystavených expozici 
a buněk vystavených expozici známých inhibitor ů (PRO = prochloraz) a stimulant ů 
(FOR = forskolin) produkce E2 a T. Po ukon čení pokusu s expozicí a odstran ění 
média bude do všech jamek s MeOH p řidán 70 % roztok metanolu, který poslouží 
jako pozitivní kontrola cytotoxicity (viz zkouška cytotoxicity v dodatku III valida ční 
zprávy (4))  
1 2 3 4 5 6  
A Slepý 
pokus (  a ) Slepý 
pokus (  a ) Slepý 
pokus (  a ) Slepý 
pokus (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Slepý 
pokus (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Slepý pokus (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Buňky v jamkách pro slepý pokus dostanou pouze médium (tj. žádné rozpoušt ědlo). 
( b ) Metanol (MeOH) bude p řidán až po  ukončení expozice a odstran ění média z t ěchto jamek. 
( c ) Kontrola rozpoušt ědla DMSO (1 μl/jamku).  
Tabulka 5  
Kritéria výsledk ů pro QC-desti čku 
T E2  
Bazální produkce 
hormonu p ři kontrole 
rozpouštědla (SC) ≥ 5násobek LOQ ≥ 2,5násobek LOQ 
Indukce (10 μM forsko ­
linu) ≥ 1,5násobek SC ≥ 7,5násobek SC 
Inhibice (1 μM prochlo ­
razu) ≤ 0,5násobek SC ≤ 0,5násobek SC  
POSTUP EXPOZICE CHEMICKÉ LÁTCE  
38. Preinkubované bu ňky se vyjmou z inkubátoru (odstavec 21) a zkontrolují 
pod mikroskopem, aby p řed dávkováním bylo jisté, že jsou v dobrém stavu 
(přichycení, morfologie).  
39. Buňky jsou umíst ěny do biologické bezpe čnostní sk říně (laminární box) 
a obohacené médium je odstran ěno a nahrazeno novým obohaceným 
médiem (1 ml/jamku). Pro tuto zkušební metodu se jako rozpoušt ědlo 
upřednostňuje DMSO. Pokud je však d ůvod pro použití jiných rozpoušt ě­
del, mělo by být popsáno v ědecké zd ůvodnění. Buňky jsou vystaveny 
zkoušené chemické látce p řidáním 1 μl vhodného zásobního roztoku 
v DMSO (viz dodatek II valida ční zprávy (4)) na 1 ml obohaceného 
média (objem jamky). Výsledkem toho je kone čná koncentrace 0,1 % 
DMSO v jamkách. Pro zajišt ění odpovídající sm ěsi se obecn ě upřednost­ 
ňuje, aby byl vhodný zásobní roztok zkoušené chemické látky v DMSO 
smíchán s obohaceným médiem, aby se dosáhlo požadované kone čné 
koncentrace pro každou dávku a aby sm ěs byla přidána do každé jamky 
bezprostředně po odstran ění starého média. Je-li použita tato možnost, m ěla 
by koncentrace DMSO (0,1 %) z ůstat ve všech jamkách stejná. U jamek 
obsahujících dv ě největší koncentrace se vizuáln ě pomocí stereomikroskopu 
posoudí, zda se vytvo řily sraženiny nebo zákal, což je známka neúplné 
rozpustnosti zkoušené chemické látky. Pokud jsou takové podmínky (zákal, tvorba sraženin) pozorovány, jsou p řezkoumány i jamky obsahující další 
nižší koncentrace (a tak dále) a koncentrace, kde se látka zcela nerozpustila, 
musí být vylou čeny pro ú čely dalšího hodnocení a analýzy. Desti č
ka se na 
48 hodin vrátí do inkubátoru p ři teplotě 37  o C ve vzduchové atmosfé ře 
s 5 % CO  2 . Rozvržení desti čky se zkoušenou chemickou látkou je uvedeno 
v tabulce 6. Zásoby 1–7 ukazují umíst ění rostoucích dávek zkoušené 
chemické látky.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabulka 6  
Schéma dávkování pro expozici bun ěk H295R zkoušeným chemickým látkám v 24 
jamkové desti čce 
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Zásoba 4 Zásoba 4 Zásoba 4 
B Zásoba 1 Zásoba 1 Zásoba 1 Zásoba 5 Zásoba 5 Zásoba 5 C Zásoba 2 Zásoba 2 Zásoba 2 Zásoba 6 Zásoba 6 Zásoba 6 
D Zásoba 3 Zásoba 3 Zásoba 3 Zásoba 7 Zásoba 7 Zásoba 7
 
40. Po 48 hodinách jsou expozi ční destičky vyňaty z inkubátoru a každá jamka 
se zkontroluje pod mikroskopem ohledn ě stavu bun ěk (přichycení, morfo ­
logie, stupe ň konfluence) a známek cytotoxicity. Médium z každé jamky je 
rozděleno na dv ě stejná množství (každé p řibližně 490 μl) a přeneseno do 
dvou samostatných, řádně označených ampulek (tj. jeden díl poskytuje pro 
každou jamku náhradní vzorek). Aby se p ředešlo vyschnutí bun ěk, odstra­ 
ňuje se médium po řadách nebo sloupcích najednou a nahrazuje se médiem 
pro zkoušku životaschopnosti/cytotoxicity bun ěk. Pokud je nutné života ­
schopnost/cytotoxicitu bun ěk změřit okamžit ě, je do každé jamky p řidáno 
200 μl PBS s Ca  2+ a Mg  2+ . Média se zmrazí p ři teplotě – 80 °C až do 
dalšího zpracování pro analýzu koncentrací hormon ů (viz odstavce 44–46). 
I když hormony T a E2 uchovávané v médiu p ři teplotě – 80 °C jsou 
obecně stálé po dobu nejmén ě tří měsíců, měla by být v každé laborato ři 
zdokumentována stálost hormon ů během uskladn ění. 
41. Okamžit ě po odstran ění média se pro každou expozi ční destičku určí života­
schopnost bun ěk/cytotoxicita.  
Určení životaschopnosti bun ěk 
42. Pro ur čení potenciálního vlivu zkoušené chemické látky na životaschopnost 
buněk není metoda testování životaschopnosti bun ěk/cytotoxicity p řede­
psána, je možno ji zvolit. Zkouška by m ěla být schopna m ěřit skutečnou 
výši procentního podílu životaschopných bun ěk přítomných v jamce nebo 
by mělo být prokázáno, že ji lze p římo srovnat se zkouškou Live/Dead® 
(její lineární funkcí) (viz dodatek III valida ční zprávy (4)). Alternativní 
zkouškou, u které se ukázalo, že funguje stejn ě dobře, je test MTT [3- 
(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid] (18). Posouzení 
životaschopnosti bun ěk využívající výše uvedené metody je relativní 
měření, které nemusí nutn ě být lineární závislé na absolutním po čtu 
buněk v jamce. Proto by analyzující pracovník m ěl provést subjektivní 
paralelní vizuální posouzení každé jamky a je zapot řebí udělat digitální 
snímky kontrol rozpoušt ědel a dvou nejv ětších necytotoxických koncentrací, 
které se archivují, aby bylo možno pozd ěji posoudit skute čnou hustotu 
buněk, bude-li to zapot řebí. Pokud se na základ ě vizuální prohlídky nebo 
podle důkazů ze zkoušky životaschopnosti/cytotoxicity zdá, že po čet buněk 
narostl, je nutné zdánlivý nár ůst ověřit. Je-li nár ůst počtu buněk ověřen, 
mělo by to být uvedeno v protokolu o zkoušce. Životaschopnost bun ěk 
bude vyjád řena v pom ěru k pr ůměrné reakci p ři kontrolách 
s rozpoušt ědly, která je považována za 100 % životaschopných bun ěk, 
výpočet se provádí podle pravidel metody použité k ur čení cytototoxicity. 
Pro zkoušku MTT lze použít následující vzorec:  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% životaschopných bun ěk =  (reakce v jamce – pr ůměrná reakce 
v jamkách s aplikovaným MeOH [= 100 % odum řelých]) ÷ (pr ůměrná 
reakce v jamkách SC – pr ůměrná reakce v jamkách s aplikovaným 
MeOH [= 100 % odum řelých])  
43. Do záv ěrečné analýzy údaj ů by nem ěly být za řazeny jamky 
s životaschopností nižší než 80 %, v pom ěru k průměrné životaschopnosti 
při kontrolách s rozpoušt ědly (= 100 % životaschopnost). Inhibice steroido ­
geneze, vyskytující se p ři cytotoxicit ě kolem 20 %, by m ěla být pe člivě 
posouzena, aby bylo zajišt ěno, že příčinou inhibice není práv ě cytotoxicita.  
Analýza hormon ů 
44. Každá laborato ř může pro analýzu T a E2 použít systém m ěření hormon ů 
podle své volby. Zbylé podíly média z každé experimentální skupiny lze 
použít pro p řípravu dalších ředění tak, aby byly k dispozici koncentrace pro 
lineární část standardní k řivky. Jak je uvedeno v odstavci 29, každá labo ­
ratoř by měla prokázat soulad svého systému m ěření hormon ů (např. 
ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) s kritérii pro kontrolu kvality tak, že 
provede analýzu obohaceného média dopln ěnou o vnit řní kontrolu hormon ů 
před provedením pokus ů pro kontrolu kvality nebo zkoušením chemických 
látek. Aby bylo zajišt ěno, že sou části systému zkoušení nebudou rušiv ě 
zasahovat do m ěření hormon ů, bude možná zapot řebí hormony p řed jejich 
měřením z média extrahovat (viz odstavec 30 s podmínkami, za kterých je 
nebo není extrakce požadována). Doporu čuje se provést extrakci v souladu 
s postupy uvedenými v dodatku III valida ční zprávy (4).  
45. Pokud se k m ěření produkce hormon ů používá komer ční zkušební sada 
(kit), měla by být provedena analýza hormon ů v souladu s manuály, které 
dodal výrobce zkušební sady. V ětšina výrobc ů má jedine čný postup, kterým 
se mají analýzy hormon ů provádět. Roztoky vzork ů je třeba upravit, aby 
očekávané koncentrace hormon ů pro kontroly roztok ů spadaly do st ředu 
lineárního rozmezí standardní k řivky konkrétní zkušební sady (dodatek III 
validační zprávy (4)). Hodnoty, které leží mimo lineární část standardní 
křivky, by m ěly být zamítnuty.  
46. Kone čné koncentrace hormon ů se vypočítají takto:  
Příklad: 
Extrahováno: 450 μl média 
Rekonstituováno v: 250 μl zkušebního pufru 
Ředění při zkoušce: 1:10 (s cílem zajistit, aby se vzorek 
dostal do lineárního rozmezí standardní 
křivky) 
Koncentrace hormonu p ři 
zkoušce: 150 pg/ml (již p řizpůsobena koncentraci 
na 1 ml zkoušeného vzorku) 
Výtěžnost: 89 % 
Konečná koncentrace hormon ů = (Koncentrace hormon ů (na 1 ml) ÷ 
výtěžnost) (faktor ředění) 
Konečná koncentrace hormon ů = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Výběr zkušebních koncentrací  
47. V rámci zkoušky by m ěly být provedeny minimáln ě dva nezávislé pokusy. 
Pokud starší informace, nap říklad informace o limitech rozpustnosti nebo 
cytotoxicit ě neposkytují základ pro výb ěr zkušebních koncentrací, doporu ­ 
čuje se, aby zkušební koncentrace pro po čáteční pokus byly voleny 
v intervalech logaritmické škály, p řičemž 10  -3 M je maximální koncentrace. 
Pokud je chemická látka rozpustná a není p ři žádné ze zkoušených koncen ­
trací cytotoxická a první pokus byl pro všechny koncentrace negativní, pak to musí být potvrzeno p ři jednom dalším pokusu za stejných podmínek, za 
jakých prob ěhl první pokus (tabulka 7). Pokud jsou výsledky prvního 
pokusu  nejednozna čné (tj. násobek efektu je statisticky významn ě odlišný 
od kontrolní hodnoty pouze p ři jedné koncentraci) nebo pozitivní (tj. 
násobná zm ěna je při dvou nebo více následujících koncentracích statisticky 
významná), zkouška by se m ěla zopakovat s up řesněním vybraných koncen ­
trací, jak ukazuje tabulka 7. Aby se zjistil ú činek, měly by být zkušební 
koncentrace v pokusech 2 a 3 (uskute ční-li se) upraveny na základ ě 
výsledků hraničních koncentrací úvodního pokusu, které vyvolaly ú činek 
s použitím koncentrací v intervalech 1/2-log (nap ř. pokud p ůvodní pokus 
0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM vyústil v indukce p ři 1 a 10 μM, 
koncentrace zkoušené ve druhém pokusu by m ěly být 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 
100 μM), pokud pro dosažení LOEC nemusí být uplatn ěny nižší koncent ­
race. Ve druhém uvedeném p řípadě by ve druhém pokusu, p ři kterém se 
použije stupnice 1/2-log, m ělo být použito nejmén ě pět koncentrací pod 
nejnižší koncentrací zkoušenou v prvním pokusu. Pokud druhý pokus nepo ­
tvrdí výsledky prvního pokusu (tj. p ři dříve pozitivn ě zkoušené 
koncentraci ± 1 p řírůstek koncentrace neprokáže statistickou významnost), 
je nutné provést t řetí experiment za p ůvodních zkušebních podmínek. 
Nejednozna čné výsledky v prvním pokusu jsou považovány za negativní, 
pokud pozorovaný ú činek nemohl být potvrzen v žádném ze dvou násled ­
ných pokus ů. Nejednozna čné výsledky jsou považovány za pozitivní odpo ­
vědi (účinek), pokud lze odpov ěď potvrdit v nejmén ě jednom dalším 
pokusu v rámci ± 1 p řírůstku koncentrace (viz oddíl 55 postupu p ři inter­
pretaci údaj ů). 
Tabulka 7  
Matice rozhodnutí pro možné výsledné scéná ře 
Pokus 1 Pokus 2 Pokus 3 Rozhodnutí 
Scénář Rozhodnutí Scéná ř Rozhodnutí Scéná ř Pozitivní Negativní  
Negativní Potvrdit (  a ) Negativní Konec X 
Negativní Potvrdit (  a ) Pozitivní Up řesnit (  b ) Negativní X 
Nejednozna čné Up řesnit (  b ) Negativní Potvrdit (  a ) Negativní X 
Nejednozna č­
né (  c ) Upřesnit (  b ) Negativní Potvrdit (  a ) Pozitivní X 
Nejednozna č­
né (  c ) Upřesnit (  b ) Pozitivní X 
Pozitivní Up řesnit (  b ) Negativní Potvrdit (  a ) Pozitivní X  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Pokus 1 Pokus 2 Pokus 3 Rozhodnutí 
Scénář Rozhodnutí Scéná ř Rozhodnutí Scéná ř Pozitivní Negativní  
Negativní Potvrdit (  a ) Pozitivní Up řesnit (  b ) Pozitivní X 
Pozitivní Up řesnit (  b ) Pozitivní Konec X  
( a ) Potvrdit p ředchozí pokus pomocí stejné struktury experimentu. 
( b ) Provést zkoušku znovu s intervalem koncentrací 1/2-log (stanovení meze u koncentrace, která p ři předchozím experimentu 
dopadla výrazn ě jinak). 
( c ) Násobná zm ěna při jedné koncentraci se ze statistického hlediska výrazn ě liší od kontrolní hodnoty.  
Kontrola kvality testu  
48. Krom ě splnění kritérií pro QC-desti čky by měla být spln ěna i další kritéria 
kvality, která jsou stanovena v tabulce 8 a která se týkají p řijatelných 
variací mezi replikovanými jamkami, opakovanými experimenty, linearity 
a citlivosti systém ů měření hormon ů, rozdílu mezi opakovanými m ěřeními 
hormonů téhož vzorku, a procentní výt ěžnosti standardního p řídavku 
hormonů po extrakci média (je-li to použitelné; viz odstavec 30 ohledn ě 
požadavk ů extrakce). Aby údaje mohly být použity pro další hodnocení, 
měly by spadat do p řijatelných rozmezí definovaných pro každý parametr. 
Pokud tato kritéria nejsou spln ěna, mělo by být do pracovního formulá ře 
poznamenáno, že kritéria kontroly kvality nebyla u daného vzorku spln ěna 
a že je nutné vzorek analyzovat znovu nebo ho vypustit ze souboru údaj ů. 
Tabulka 8  
Přijatelná rozmezí a/nebo variace (%) pro parametry zkušební desti čky pro zkoušku 
H295R.  
LOQ: mez kvantifikace systému m ěření hormon ů. CV: varia ční koeficient; SC: kontrola 
s rozpoušt ědlem; DPM: rozpady za minutu  
Srovnání mezi T E2  
Bazální produkce hormon ů 
při SC O násobek v ětší než LOQ ≥ 5násobek ≥ 2,5násobek 
Experimenty v oblasti 
expozice – v rámci CV destičky pro SC (repliko ­
vané jamky) Absolutní koncentrace ≤ 30 % ≤ 30 % 
Experimenty v oblasti 
expozice – mezi desti čkami 
CV pro SC (opakované 
experimenty) Násobná zm ěna ≤ 30 % ≤ 30 % 
Systém m ěření hormon ů – 
citlivost Zjistitelný násobný pokles 
poměrný k SC ≥ 5násobek ≥ 2,5násobek 
Systém m ěření hormon ů – 
opakovaná m ěření CV pro 
SC (
 a ) Absolutní koncentrace ≤ 25 % ≤ 25 % 
Extrakce média – výt ěžnost 
interního 3H standardu 
(použije-li se) DPM ≥ 65 % nominální  
( a ) Odkazuje na opakovaná m ěření téhož vzorku  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ANALÝZA ÚDAJ Ů A ZPRÁVY  
Analýza údaj ů 
49. Pro vyhodnocení relativního nár ůstu/poklesu chemicky zm ěněné produkce 
hormonů by se výsledky m ěly normalizovat na st řední hodnotu kontroly 
s rozpoušt ědlem ( solvent control , SC) u každé zkušební desti čky a výsledky 
by se měly vyjádřit jako zm ěny relativní k SC v každé zkušební desti čce. 
Veškeré údaje musí být vyjád řeny jako st řední hodnoty ± 1 sm ěrodatná 
odchylka ( standard deviation , SD).  
50. Do analýzy údaj ů by měly být zahrnuty pouze údaje o hormonech z jamek, 
v nichž byla cytotoxicita nižší než 20 %. Relativní zm ěny by se m ěly 
vypočítat takto:  
Relativní zm ěna =  (koncentrace hormon ů v každé jamce) ÷ (st řední 
koncentrace hormon ů ve všech jamkách pro kontrolu s rozpoušt ědlem).  
51. Pokud se na základ ě vizuální prohlídky jamky nebo dle d ůkazů ze zkoušky 
životaschopnosti/cytotoxicity popsané v odstavci 42 zdá, že narostl po čet 
buněk, je nutné zdánlivý nár ůst ověřit. Je-li nár ůst počtu buněk ověřen, 
mělo by to být uvedeno v záv ěrečné zprávě. 
52. Před provedením statistických analýz by m ěly být vyhodnoceny p ředpo­
klady normality rozd ělení a homogenity rozptylu. Normalita by se m ěla 
hodnotit pomocí standardních graf ů pravděpodobnosti ( probability plot ) 
nebo jiné vhodné statistické metody (nap ř. Shapiro-Wilk ův test). Pokud 
nejsou údaje (násobné zm ěny) distribuovány normáln ě, měl by být pro 
účely aproximace normální distribuce u činěn pokus o jejich transformaci. 
Pokud jsou údaje distribuovány normáln ě nebo se p řibližují normální distri ­
buci, měly by být rozdíly mezi exponovanými skupinami a kontrolou 
s rozpoušt ědlem analyzovány pomocí parametrického testu (nap ř. 
Dunnettův test), kde  koncentrace  je nezávislá a  reakce  (násobná zm ěna) 
závislá prom ěnná. Pokud údaje nejsou normáln ě distribuovány, m ěl by se 
použít neparametrický test (nap ř. Kruskal Wallis ův test, Steel ův srovnávací 
„Many-one rank“ test). Rozdíly jsou považovány za významné, když platí  p 
≤ 0,05 . Statistická hodnocení se provád ějí na základ ě průměrných hodnot 
pro každou jamku, které p ředstavují nezávislé replikované údaje. P ředpo­
kládá se, že z d ůvodu velkých interval ů mezi dávkami v prvním pokusu 
(škála dekadických logaritm ů) v mnoha p řípadech nebude možné popsat 
jasné vztahy mezi koncentrací a odpov ědí, tak aby dv ě největší dávky 
byly v lineární části S křivky. Z tohoto d ůvodu budou pro první pokus 
nebo jakékoli jiné soubory údaj ů, kde nastane tato podmínka (nap ř. tam, 
kde nelze odhadnout maximální ú činnost), použity statistiky pevných 
proměnných typu I popsané výše.  
53. Pokud více než dva údaje leží v lineární části křivky a pokud lze vypo čítat 
maximální ú činnost (jak se p ředpokládá u n ěkterých z druhých pokus ů, 
které se provád ějí pomocí semilogaritmických interval ů expozičních 
koncentrací), m ěl by být pro výpo čet účinných koncentrací použit 
probitový, logitový nebo jiný vhodný regresní model (nap ř. EC50 a EC20).  
54. Výsledky by m ěly být prezentovány v grafickém (sloupcové diagramy 
vyjadřující střední hodnotu ± 1 SD) a tabulkovém formátu (LOEC/NOEC, 
směr účinku a síla maximální odpov ědi, která je sou částí údajů typu 
dávka–reakce) (viz nap ř. obrázek 3). Posouzení údaj ů se považuje za platné 
pouze v p řípadě, že se opírá nejmén ě o dva nezávisle provedené pokusy. 
Experiment nebo pokus se považuje za nezávislý, pokud byl proveden v jiný den za pomoci nového souboru roztok ů a kontrol. Rozmezí koncen ­
trací použitých v pokusech 2 a 3 (v p řípadě potřeby) lze upravit na základ ě 
výsledků pokusu 1 tak, aby bylo lépe definováno rozmezí závislosti dávka- 
odpověď zahrnující LOEC (viz odstavec 47).
 ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Obrázek 3  
Příklad prezentace a hodnocení údaj ů získaných b ěhem zkoušky H295R v grafickém a tabulkovém 
formátu  
Hvězdičky označují statisticky významné rozdíly od kontroly s rozpoušt ědlem ( p < 0,05 ). LOEC: nejnižší 
koncentrace s pozorovaným ú činkem; max. zm ěna: maximální síla reakce pozorovaná p ři jakékoli koncentraci 
ve vztahu k pr ůměrné reakci SC (= 1)
  
Chemická látka LOEC Max. zm ěna 
Forskolin 0,01 0,15 násobek 
Letrozol 0,001 29 násobek  
Postup p ři interpretaci údaj ů 
55. Má se za to, že zkoušená chemická látka je pozitivní, pokud se násobná 
indukce statisticky liší ( p ≤ 0,05) od kontroly s rozpoušt ědlem při dvou 
sousedních koncentracích nejmén ě ve dvou nezávislých pokusech 
(tabulka 7). Má se za to, že zkoušená chemická látka je negativní po 
dvou nezávislých negativních pokusech nebo p ři třech pokusech, které 
zahrnují dva negativní pokusy a jeden dvojzna čný nebo pozitivní pokus. 
Pokud údaje získané p ři třech nezávislých experimentech nespl ňují kritéria 
rozhodnutí uvedená v tabulce 7, nelze výsledky pokus ů interpretovat. Do 
interpretace výsledk ů by neměly být zahrnuty výsledky p ři koncentracích 
překračujících limity rozpustnosti nebo p ři cytotoxických koncentracích.  
Závěrečná zpráva  
56. Závěrečná zpráva by m ěla obsahovat následující informace:  
Zkušební za řízení  
— název a adresa za řízení,  
— vedoucí studie a další pracovníci a jejich povinnosti v rámci studie,  
— data zahájení a ukon čení studie.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Zkoušená chemická látka, chemická činidla a kontroly  
— totožnost (název, p říp. číslo CAS), zdroj, číslo šarže, čistota, dodavatel 
a charakterizace zkoušené chemické látky, chemických činidel a kontrol,  
— fyzikální povaha a p říslušné fyzikáln ě-chemické vlastnosti zkoušené 
chemické látky,  
— podmínky uskladn ění a metoda a četnost přípravy zkoušených chemic ­
kých látek, chemických činidel a kontrol,  
— stabilita zkoušené chemické látky.  
Buňky 
— zdroj a typ bun ěk, 
— počet buněčných pasáží (identifikátor bun ěčné pasáže) bun ěk použitých 
při zkoušce,  
— popis postup ů uchovávání bun ěčných kultur.  
Požadavky p řed zkouškou (je-li to relevantní)  
— popis a výsledky testu chemické interference hormon ů, 
— popis a výsledky m ěření účinnosti extrakce hormon ů, 
— standardní a kalibra ční křivky pro všechny analytické zkoušky, které 
budou provedeny,  
— limity detekce pro vybrané analytické zkoušky.  
Zkušební podmínky  
— složení média,  
— koncentrace zkoušené chemické látky,  
— hustota bun ěk (odhadované nebo zm ěřené buněčné koncentrace b ěhem 
24 hodin a 48 hodin),  
— rozpustnost zkoušené chemické látky (limit rozpustnosti, je-li ur čen), 
— inkuba ční doba a podmínky.  
Výsledky zkoušek  
— prvotní údaje týkající se jednotlivých jamek pro kontroly a testované 
látky – každé opakované m ěření ve form ě původních údaj ů získaných 
z přístroje použitého k m ěření produkce hormon ů (např. OD, fluores ­
cenční jednotky, DPM atd.),  
— prokázání normality rozd ělení nebo vysv ětlení transformace údaj ů, 
— průměrná odpov ěď ± 1 SD pro každou m ěřenou jamku,  
— údaje o cytotoxicit ě (zkoušené koncentrace, které zp ůsobily cytotoxicitu),  
— potvrzení, že byly spln ěny požadavky kontroly kvality,  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— relativní ú činek v porovnání s kontrolou s rozpoušt ědlem po korekci na 
cytotoxicitu,  
— sloupcový graf ukazující vztah (násobnou zm ěnu) při každé koncentraci, 
SD a statistickou významnost, jak je uvedeno v odstavcích 49–54.  
Interpretace údaj ů 
— uplatn ění postupu pro interpretaci údaj ů na výsledky a diskuse 
o nálezech.  
Diskuse  
— Vyplývají ze studie n ějaké známky týkající se toho, že by údaje o T/E2 
mohly být ovlivn ěny nepřímými ú činky na dráhy gluko- 
a mineralokortikoid ů? 
Závěry 
LITERATURA  
1) OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assess ­
ment of Endocrine Disrupting Chemicals, v dodatku 2 kapitoly B.54 této 
přílohy.  
2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone 
production,  Toxicol. Environ. Pharmacol.,  217, 114–124.
 
3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone 
and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Tecn. Pollut. Res ., 14, 23–30.
 
4) OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Paris. K dispozici na internetové adrese [http://www. 
oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_343 77_1916638_1_1_1_1,00.html]  
5) OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Paris. K dispozici na adrese: [http://www.oecd.org/ document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_ 1_1_1_1,00.html]
 
6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, k dispozici na 
adrese: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_ 
3_29_05.pdf]  
7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Stero ­
idogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci. 81, 78–89.
 
8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  
Toxicol. Environ. Pharmacol.,  182, 44–54.
 
9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265–272.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Tecn. Poll. Res.,  17:1137–1148.  
11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488–5496.
 
12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the stero ­
idogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the 
H295R cell line,  Chemosphere,  80:578–584.  
13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Tecn. Technol.,  39:2777–2785.
 
14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Tecn. Ind. Res.,  
17:1137–1148.
 
15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731–737.
 
16) Kapitola B.55 této p řílohy: Hershbergerova biologická zkouška na potka ­
nech: Krátkodobá screeningová zkouška androgenních/antiandrogenních vlastností.
 
17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222–231.  
18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55–63.  
19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598–1606.  
20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal 
gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 
26:484–492.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Dodatek  
DEFINICE  
CV se rozumí varia ční koeficient, který je definován jako pom ěr směrodatné 
odchylky distribuce k jejímu aritmetickému pr ůměru. 
CYP  označuje cytochrom P450 monooxygenázy, což je rodina gen ů a enzym ů 
z nich vyprodukovaných, které se ú častní katalyzace široké škály biochemických 
reakcí zahrnujících syntézu a metabolismus steroidních hormon ů. 
Destička pro kontrolu kvality (QC-desti čka) je 24jamková desti čka obsahující 
dvě koncentrace pozitivních a negativních kontrol pro sledování chování nové 
dávky bun ěk nebo pro zajišt ění pozitivních kontrol pro zkoušku p ři zkoušení 
chemických látek.  
DPM  (disintegration per minute ) je zkratkou pro rozpad za minutu. Je to po čet 
atomů v daném množství radioaktivního materiálu, u n ěhož bylo zjišt ěno, že se 
rozpadne za jednu minutu.  
E2 je 17β-estradiol, nejd ůležitější estrogen v t ěle savců. 
H295R  buňkyjsou bu ňky lidského adrenálního karcinomu, které mají fyziolo ­
gické charakteristiky zonáln ě nediferencovaných adrenálních bun ěk lidského 
plodu a které zajiš ťují expresi enzym ů dráhy steroidogeneze. Lze je získat ze 
sbírky ATCC.  
Chemickou látkou  se rozumí látka nebo sm ěs. 
Konfluencí  se rozumí pokrytí nebo množství bun ěk, které je u bun ěk povoleno 
nad kultiva čním médiem nebo v n ěm. 
Kontrola kvality , zkráceně QC, ozna čuje opatření nezbytná k zajišt ění platných 
údajů. 
Lineární oblast  je interval v rámci standardní k řivky pro systém m ěření 
hormonů, kde výsledky jsou úm ěrné koncentraci analytu p řítomného ve vzorku.  
Mrazicí médium  se používá ke zmrazování a uchovávání zmrazených bun ěk. 
Obsahuje zásobní médium, BD Nu-sérum a dimethylsulfoxid.  
LOQ  je zkratkou pro  mez kvantifikace  (‘Limit of Quantification ’), a je to nejnižší 
množství chemické látky, které lze odlišit od nep řítomnosti této chemické látky 
(slepá hodnota) v rámci stanovené meze spolehlivosti. Pro ú čely této metody je 
LOQ obvykle definován výrobcem testovacích systém ů, není-li specifikován 
jiným způsobem.  
LOEC  (Lowest Observed Effect Concentration ) je zkratkou pro nejnižší koncen ­
traci s pozorovaným ú činkem, tedy nejnižší úrove ň koncentrace, u níž se reakce 
na zkoušku ze statistického hlediska liší od reakce na kontrolu rozpoušt ědla. 
NOEC  (No Observed Effect Concentration ) je zkratkou pro koncentraci bez 
pozorovaných ú činků, což je nejvyšší zkoušená koncentrace, kde nebyla zjišt ěna 
pozitivní odpov ěď. 
Obohacené médium  se skládá ze zásobního média s BD Nu-sérem a prémiovou 
směsí ITS+, viz dodatek II valida ční zprávy (4).  
Pasáž je číslo udávající po čet dělení buněk po zahájení kultivace ze zmrazených 
zásob. Po čáteční pasáž, která byla vytvo řena ze zmrazených zásob, nese číslo 
jedna (1). Bu ňky, které byly rozd ěleny jednou, jsou ozna čeny jako pasáž 2 atd.  
PBS je Dulbecc ův fyziologický roztok ve fosfátovém pufru.  
Pokus  je nezávislý experiment, který je charakterizován novým souborem 
roztoků a kontrol.  
Steroidogeneze  je syntetická dráha vedoucí od cholesterolu k r ůzným steroidním 
hormonům. Některé meziprodukty v dráze steroidní syntézy, nap ř. progesteron 
a testosteron, jsou d ůležitými hormony samy o sob ě, ale slouží také jako prekur ­
zory hormon ů dále v syntetické dráze.  
T představuje testosteron, jeden ze dvou nejd ůležitějších androgen ů v těle savců. ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Trypsin 1X  je zředěný roztok enzymu trypsin, serinové proteázy vyskytující se 
ve dvanácterníku, používaný k uvol ňování bun ěk z destičky pro kultivaci bun ěk, 
viz dodatek III valida ční zprávy (4).  
Zásobní médium  je základ pro p řípravu dalších roztok ů/reagencií. Skládá se ze 
směsi Dulbeccovy modifikace Eagleova média a Hamovy sm ěsi živin F12 
v poměru 1:1 (DMEM/F12) v 15mM pufru HEPES bez fenolové červeně nebo 
hydrogenuhli čitanu sodného. Hydrouhli čitan sodný se p řidává jako pufr, viz 
dodatek II valida ční zprávy (4).  
Zkoušenou chemickou látkou  se rozumí jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená 
pomocí této zkušební metody.  
Zkušební desti čkou se rozumí desti čka, na které jsou bu ňky H295R vystaveny 
zkoušeným chemickým látkám. Zkušební desti čky obsahují kontrolu 
s rozpoušt ědlem a zkoušenou chemickou látku v sedmi úrovních koncentrace 
ve třech provedeních.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58  ZKOUŠKY GENOVÝCH MUTACÍ U SOMATICKÝCH 
A ZÁRODE ČNÝCH BUN ĚK TRANSGENNÍCH HLODAVC Ů 
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 488 
(2013). Zkušební metody EU jsou k dispozici pro širokou škálu  in vitro  
testů mutagenity, které jsou schopny odhalit chromozomové a/nebo genové 
mutace. Existují zkušební metody pro testování  in vivo  (ty detekují chro ­
mozomové aberace a neplánovanou syntézu DNA), ale pro genové mutace 
takové metody dosud nebyly k dispozici. Zkoušky mutací u transgenních hlodavců (Transgenic Rodent , TGR) spl ňují potřebu praktických a obecn ě 
dostupných zkoušek  in vivo  pro genové mutace.
 
2. O zkouškách mutací u TGR existují rozsáhlé p řehledové dokumenty (24) 
(33). Tyto zkoušky používají transgenní potkany a myši, jejichž organismy obsahují velké množství kopií chromozomov ě integrovaných plazmidových 
nebo fágových shuttle vektor ů. Transgeny obsahují reporterové geny pro 
zjišťování různých typ ů mutací indukovaných  in vivo  zkoušenými chemic ­
kými látkami.
 
3. Mutace, k nimž dochází u hlodavc ů, se získávají pomocí obnovy/odkrytí 
transgenu a analýzy fenotypu reporterového genu v bakteriálním hostiteli, 
který postrádá reporterový gen. Zkoušky genových mutací u TGR posuzují mutace indukované u geneticky neutrálních gen ů znovu získaných 
v podstat ě z jakékoli tkán ě hlodavce. Tyto analýzy tudíž obcházejí mnohá 
ze stávajících omezení spojených se studiem genových mutací  in vivo  
u endogenních gen ů (např. omezení na tkán ě vhodné pro analýzu, negativní/ 
pozitivní selekce proti mutacím).
 
4. Posouzení závažnosti d ůkazů naznačuje, že transgeny reagují na mutageny 
podobně jako endogenní geny, zejména pokud se týká detekce substituce 
párů bází, posunových mutací a malých delecí a insercí (24).  
5. Mezinárodní seminá ře o zkoušení genotoxicity (International Workshops on 
Genotoxicity Testing, IWGT) schválily za řazení zkoušek genových mutací 
u TGR mezi metody zjiš ťování genových mutací  in vivo  a doporu čily 
postup pro jejich provád ění (15) (29). Tato zkušební metoda (B.58) se 
opírá o tato doporu čení. Další analýzu podporující používání tohoto postupu 
lze najít v (16).  
6. Předpokládá se, že v budoucnu bude možné zkombinovat zkoušky geno ­
vých mutací u TGR se studií toxicity p ři opakované aplikaci (kapitola B.7 
této přílohy). Je však t řeba mít další údaje, aby bylo zajišt ěno, citlivost 
zkoušek genových mutací u TGR nebude ovlivn ěna kratším, jednodenním 
intervalem mezi ukon čením aplikace a odb ěrem vzork ů, jak je tomu 
u studie toxicity s opakovanou aplikací v porovnání s t řídenním intervalem 
používaným p ři zkouškách genových mutací u TGR. Je také nutné mít 
údaje o tom, že provedení studie s opakovaným podáváním látky nebude negativně ovlivn ěno použitím transgenního kmene namísto 
tradičních kmen ů hlodavců. Až tyto údaje budou k dispozici, bude tato 
zkušební metoda aktualizována.
 
7. Definice nejd ůležitějších výraz ů jsou uvedeny v dodatku.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
8. Zkoušky genových mutací u TGR, pro které je k dispozici dostatek údaj ů, 
aby mohly být za řazeny v této zkušební metod ě, jsou tyto: myš 
s bakteriofágem  lacZ  (Muta™Mouse); myš s plazmidem  lacZ , delta myš 
a potkan  gpt (gpt a Spi  – ), myš a potkan  lacI  (Big Blue®), provád ěné podle 
standardních podmínek. Krom ě toho lze pro posouzení mutací v modelech 
Big Blue® a Muta™Mouse použít zkoušku pozitivní selekce  cII. Mutage­
neze v modelech TGR se zpravidla posuzuje jako četnost mutací; v p řípadě 
potřeby však m ůže další informace dodat molekulární analýza mutací (viz 
odstavec 24).  
9. Tyto zkoušky genových mutací  in vivo  u hlodavc ů jsou při posuzování 
mutagenního rizika d ůležité zejména proto, že ú činky zjišt ěné v těchto 
zkouškách jsou závislé na metabolismu  in vivo , farmakokinetice, procesech 
opravy DNA a translézní syntéze DNA, a čkoli ty se mohou u jednotlivých 
druhů, tkání a typ ů poškození DNA lišit. Zkouška  in vivo  pro genové 
mutace je užite čná pro další šet ření mutagenního ú činku zjišt ěného 
systémem  in vitro  a pro následné monitorování výsledk ů testů pomocí 
jiných cílových parametr ů in vivo  (24). Vedle toho, že jsou genové mutace 
příčinným vztahem spojeny se vznikem rakoviny, jsou také významným 
parametrem pro predikci nezhoubných onemocn ění způsobených mutacemi 
v somatických tkáních (12) (13), jakož i pro onemocn ění přenášená 
zárodečnými buňkami.  
10. Existují-li d ůkazy o tom, že zkoušená chemická látka nebo relevantní meta ­
bolit se nedostanou do žádné z relevantních tkání, není vhodné provád ět 
zkoušku genových mutací u TGR.  
PODSTATA ZKOUŠKY  
11. Ve zkouškách popsaných v odstavci 8 je cílový gen p ůvodně bakteriální 
nebo bakteriofágový a prost ředkem pro znovuzískání genu z genomické 
DNA hlodavc ů je začlenění transgenu do bakteriofágu λ nebo plazmidového 
shuttle vektoru. Proces zahrnuje extrakci genomické DNA ze sledované 
tkáně hlodavců, zpracování genomické DNA  in vitro  (tj. sbalování vektor ů 
λ nebo ligace a elektroporace plazmid ů pro obnovu shuttle vektoru) 
a následné zjišt ění mutací v bakteriálních hostitelích za vhodných 
podmínek. Zkoušky využívají neutrální transgeny, které lze snadno znovu 
získat z v ětšiny tkání.  
12. Základní experiment zkoušky genových mutací u TGR zahrnuje podávání 
chemické látky hlodavc ům po určité časové období. Chemické látky mohou 
být podávány jakýmkoli vhodným zp ůsobem, v četně implantace (nap ř. 
zkoušení léka řských přístrojů). Celkové období, b ěhem kterého je zví řeti 
látka podávána, se nazývá doba aplikace. Po aplikaci obvykle následuje 
období p řed utracením, b ěhem kterého není chemická látka podávána 
a kdy jsou neopravené léze DNA fixovány do stálých mutací. V literatu ře 
je toto období ozna čováno různě: jako doba manifestace, doba fixace nebo 
doba exprese; toto období kon čí odběrem vzork ů(15) (29). Po utracení 
zvířete je genomická DNA izolována ze sledované tkán ě (tkání) a vy čištěna. ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Údaje pro jednu tká ň z jednoho zví řete z více sbalení/ligací jsou obvykle 
agregovány a četnost mutací je obecn ě hodnocena pomocí celkového po čtu 
cca 10  5 až 10  7 jednotek tvo řících plak nebo kolonii. P ři používání metod 
pozitivní selekce po čet jednotek tvo řících plak ur čen pomocí samostatného 
souboru neselektivních desti ček. 
14. Metody pozitivního selektivního výb ěru byly vyvinuty s cílem usnadnit 
zjišťování mutací v genu  gpt [myš a potkan  gpt, fenotyp  gpt  – (20) (22) 
(28)] a genu  lacZ  [Muta™Mouse nebo myš s plazmidem  lacZ  (3) (10) (11) 
(30)]; zatímco mutace genu  lacI  ve zvířatech Big Blue® jsou zjiš ťovány 
prostřednictvím neselektivní metody, která identifikuje mutace pomocí 
tvorby barevných (modrých) plak ů. Metodika pozitivní selekce se používá 
i k zjišťování bodových mutací vznikajících v genu  cII shuttle vektoru 
bakteriofágu λ [myš nebo potkan Big Blue® a Muta™Mouse (17)] 
a mutací vyvolaných delecí v genech λ red a gam  [selekce Spi  – u delta 
myši a potkana  gpt (21) (22) (28)]. Četnost mutacíse vypo čítá vydělením 
počtu plaků/plazmidů obsahujících mutace v transgenu celkovým po čtem 
plaků/plazmidů získaných z téhož vzorku DNA. Ve studiích genových 
mutací TGR je četnost mutací výsledným parametrem. Četnost mutací lze 
navíc určit jako frakci bun ěk nesoucích nezávislé mutace; pro tento výpo čet 
je požadována korekce pro klonální expanzisekvenováním obnovených mutací (24).
 
15. Mutace hodnocené v zkouškách bodových mutací  lacI, lacZ, cII  a gpt jsou 
tvořeny primárn ě mutacemi substitucí páru bází, posunovými mutacemi 
a malými insercemi/delecemi. Relativní podíl t ěchto typů mutací mezi spon ­
tánními mutacemi je podobný podílu, který je pozorován u endogenního 
genu  Hprt . Velké delece jsou zjiš ťovány pouze u selekce Spi  – genu 
a zkoušek plazmid ů lacZ  (24). Předmětem zájmu jsou zde mutace  in 
vivo, které vznikají u myší nebo potkan ů. Mutace  in vitro  a ex vivo , 
které mohou vzniknout b ěhem znovuzískávání, replikace nebo opravy fágu/ 
plazmidu, jsou relativn ě vzácné a v n ěkterých systémech mohou být speci ­
álně identifikovány nebo vylou čeny systémem pozitivní selekce 
u bakteriálního hostitele.  
POPIS METODY  
Přípravy  
Volba druhu zví řat 
16. V sou časné době je k dispozici široká paleta model ů pro zjištění genových 
mutací u transgenních myší a tyto systémy se používají častěji než modely 
transgenních potkan ů. Pokud je potkan jasn ě vhodnějším modelem než myš 
(např. pokud je p ři šetření mechanismu karcinogeneze pozorován nádor 
pouze u potkan ů, pro korelaci se studií toxicity u potkan ů, nebo pokud je 
o metabolismu potkan ů známo, že je podobn ější lidskému metabolismu), 
mělo by být zváženo použití model ů transgenních potkan ů. 
Podmínky chovu a krmení  
17. Teplota v místnosti s pokusnými zví řaty by m ěla být v ideálním p řípadě 
22 °C (± 3 °C). A čkoli by relativní vlhkost vzduchu m ěla být minimáln ě 
30 % a pokud možno by, krom ě doby úklidu místnosti, nem ěla přesáhnout 
70 %, cílem by m ělo být dosažení relativní hodnoty 50–60 %. Osv ětlení by 
mělo být um ělé s každodenním st řídáním 12 hodin sv ětla a 12 hodin tmy. 
Ke krmení lze používat b ěžnou laboratorní potravu a k pití by m ělo být  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
k dispozici neomezené množství vody. Výb ěr druhu potravy m ůže být 
ovlivněn její dostate čnou mísitelností se zkoušenou chemickou látku, je-li 
látka podávána touto cestou. Zví řata by m ěla být umíst ěna v klecích 
v malých skupinkách (maximáln ě pět zvířat) stejného pohlaví, pokud se 
neočekává agresivní chování. Je-li to z v ědeckého hlediska d ůvodné, 
mohou být zví řata v klecích individuáln ě. 
Příprava zví řat 
18. Zdravá mladá pohlavn ě zralá dosp ělá zvířata (8–12 týdn ů stará na za čátku 
aplikace) jsou náhodn ě rozdělena do kontrolních a experimentálních skupin. 
Zvířata se jednozna čně identifikují. Nechají se v laboratorních podmínkách 
alespoň pět dní aklimatizovat. Klece by m ěly být uspo řádány tak, aby byl 
vliv umíst ění klecí minimalizován. V okamžiku zahájení studie by m ěla být 
odchylka v hmotnosti zví řat minimální a nem ěla by u obou pohlaví 
překročit ± 20 % st řední hodnoty hmotnosti.  
Příprava dávek  
19. Pevné zkoušené chemické látky by se m ěly rozpustit nebo suspendovat ve 
vhodných rozpoušt ědlech nebo vehikulech nebo by m ěly být přimíchány do 
potravy nebo pitné vody p řed podáním dávky zví řatům. Kapalné zkoušené 
chemické látky mohou být podávány p římo nebo mohou být p řed podáním 
zředěny. Pro ú čely expozice inhalací lze zkoušené chemické látky 
v závislosti na jejich fyzikáln ě-chemických vlastnostech podávat jako 
plyn, páru nebo pevný/kapalný aerosol. M ěly by být použity čerstvě připra­
vené aplika ční formy zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti 
neprokazují možnost skladování.  
Zkušební podmínky  
Rozpouštědlo/vehikulum  
20. Rozpoušt ědlo/vehikulum by nem ělo mít p ři použitých objemech dávek 
toxické ú činky a mělo by být vylou čeno podez ření, že reaguje se zkoušenou 
chemickou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpoušt ědla/vehikula, 
mělo by být jejich za řazení podloženo údaji o jejich kompatibilit ě. Doporu­ 
čuje se pokud možno nejprve zvážit použití vodného rozpoušt ědla nebo 
vehikula.  
Pozitivní kontroly  
21. Měly by se zpravidla používat zví řata pro sou časnou pozitivní kontrolu. 
Avšak u laborato ří, které prokázaly zp ůsobilost (viz odstavec 23) a tyto 
zkoušky používají b ěžně, lze do každé studie pro potvrzení úsp ěšného 
provedení metody za řadit DNA zví řat, která byla sou částí předchozích 
pozitivních kontrol. Vzorky DNA z p ředchozích experiment ů by měly být 
pořízeny ze stejných druh ů a požadovaných tkání a m ěly by být náležit ě 
skladovány (viz odstavec 36). Pokud se využívají soub ěžné pozitivní 
kontroly, není nutné podávat je stejným zp ůsobem jako zkoušenou 
chemickou látku. O t ěchto pozitivních kontrolách by však m ělo být známo, 
že indukují mutace v jedné nebo více sledovaných tkáních pro zkoušenou 
chemickou látku. Dávky pozitivních kontrolních chemických látek by m ěly 
být vybrány tak, aby vyvolaly slabé nebo mírné ú činky, které nejlépe 
dokládají správné provedení a citlivost zkoušky. P říklady pozitivních 
kontrolních chemických látek a n ěkteré z jejich cílových tkání jsou uvedeny 
v tabulce 1.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabulka 1  
Příklady pozitivních kontrolních látek a n ěkteré z jejich cílových tkání  
Chemická látka a číslo CAS Název a číslo Einecs Charakteristika Cílová tká ň pro mutace 
Potkan Myš  
1-ethyl-1-nitrosomo čovina 
[č. CAS 759-73-9] 1-ethyl-1-nitrosomo čo­
vina 
[212-072-2] Přímo působící 
mutagen Játra, plíce Kostní d řeň, tračník, 
epitel tračníku, 
střevo, játra, plíce, 
slezina, ledvina, 
buňky zrnité 
membrány na vaje č­
nících, sam čí 
zárodečné buňky 
Ethyl-karbamát (uretan) 
[č. CAS 51-79-6] Uretan 
[200-123-1] Mutagen, vyžaduje 
metabolismus, ale 
produkuje pouze slabé účinky Kostní dřeň, předža­
ludek, tenké st řevo, 
játra, plíce, slezina 
2,4-diaminotoluen 
[č. CAS 95-80-7] 4-methyl-1,3-fenylendi ­
amin 
[202-453-1] Mutagen, vyžaduje 
metabolismus, také 
pozitivní p ři 
zkoušce Spi
 – Játra Játra 
Benzo[e]pyren 
[CAS č. 50-32-8] Benzo[def]chrysen 
[200-028-5] Mutagen, vyžaduje 
metabolismus Játra, před­
stěra, Kostní dřeň, prsa, 
tračník, předžaludek, 
žláznatý žaludek, srdce, játra, plíce, 
samčí zárodečné 
buňky
 
Negativní kontroly  
22. Součástí každého odb ěru vzorků by měly být negativní kontroly s aplikací 
pouze rozpoušt ědla nebo vehikula, které jsou jinak provád ěny stejně jako 
u experimentálních skupin. Nejsou-li k dispozici dosavadní nebo zve řejněné 
kontrolní údaje, které by ukazovaly, že vybrané rozpoušt ědlo/vehikulum 
nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní ú činky, měly by být do 
každého odb ěru vzorků zahrnuty i kontroly bez aplikace pro posouzení 
účinku vehikula.  
Ověření způsobilosti laborato ře 
23. Způsobilost pro tyto zkoušky by m ěla být stanovena na základ ě doložení 
schopnosti reprodukovat o čekávané výsledky ze zve řejněných údaj ů (24) 
týkajících se: 1) četností mutací s chemickými látkami pozitivní kontroly 
(včetně slabých reakcí), nap ř. s chemickými látkami uvedenými v tabulce 1, 
nemutagen ů a kontrol vehikula; 2) znovuzískání transgen ů z genomické 
DNA (nap ř. účinnost sbalování).  
Sekvenování mutací  
24. Při použití výsledku zkoušky pro legislativní ú čely není vyžadováno sekve ­
nování DNA mutací, obzvlášt ě pak tam, kde bylo dosaženo jasného pozi ­
tivního nebo negativního výsledku. Údaje o sekvenování však mohou být 
užitečné při pozorování rozdílu mezi jedinci. V t ěchto případech lze sekve ­
nování použít k vylou čení možnosti vzniku jackpot ů nebo klonálních 
událostí identifikací podílu jedine čných mutací z konkrétní tkán ě. Sekveno ­
vání přibližně 10 mutací na tká ň a zvíře by mělo být dostate čné pro jedno ­
duché určení, zda klonální mutace p řispívají k četnosti mutací. Sekvenování 
až 25 mutací bude možná nutné pro matematickou korekci četnosti mutací  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
na klonalitu. O sekvenování mutací lze také uvažovat p ři zjištění malého 
nárůstu četnosti mutací (tj. mírné p řekročení hodnot kontrol bez aplikace). 
Rozdíly ve spektru mutací mezi koloniemi mutací ze zví řat, jimž je a není 
podávána látka, mohou podpo řit rozhodnutí o mutagenním ú činku (29). 
Spektra mutací mohou být rovn ěž užitečná pro formulování mechanistic ­
kých hypotéz. Má-li být sekvenování zahrnuto do provedení studie, je t řeba 
věnovat speciální pozornost plánování takových studií, zvlášt ě s ohledem na 
počet mutací sekvenovaných na jeden vzorek, aby bylo možné dosáhnout 
adekvátní síly experimentu vzhledem k použitému statistickému modelu 
(viz odstavec 43).  
POSTUP  
Počet a pohlaví zví řat 
25. Počet zvířat ve skupin ě by měl být stanoven p ředem tak, aby sta čil 
k dosažení statistické síly nezbytné pro zjišt ění nejmén ě zdvojnásobení 
četnosti mutací. V jedné skupin ě bude minimáln ě pět zvířat. Pokud ale 
bude statistická síla nedostate čná, počet zvířat by měl být dle pot řeby 
zvýšen. Zpravidla by se m ěli používat samci. V n ěkterých p řípadech 
může být od ůvodněné používat ke zkouškám pouze samice, nap říklad při 
zkoušení humánních lék ů pro ženy nebo p ři zkoumání ženského metabo ­
lismu. Pokud jsou mezi pohlavími z hlediska toxicity nebo metabolismu 
výrazné rozdíly, budou požadováni samci i samice.  
Doba podávání  
26. Na základ ě pozorování, že se mutace s každou aplikací akumulují, je nutný 
režim opakované každodenní aplikace po dobu 28 dn ů. To je obecn ě pova­ 
žováno za p řijatelné pro produkci dostate čné akumulace mutací slabými 
mutageny a pro poskytnutí doby expozice vhodné pro zjišt ění mutací 
v pomalu rostoucích orgánech. Pro n ěkterá hodnocení mohou být vhodné 
alternativní režimy aplikace a tyto alternativní harmonogramy podávání dávek by m ěly být v ědecky od ůvodněny v plánu studie. Aplikace by 
neměla být kratší než doba požadovaná pro úplnou indukci všech p řísluš­
ných metabolizujících enzym ů a kratší aplikace mohou vyžadovat n ěkolik 
intervalů pro odběr vzorků, přizpůsobených pro orgány s r ůznou rychlostí 
růstu. Veškeré dostupné informace (nap ř. o obecné toxicit ě nebo metabo ­
lismu a farmakokinetice) by každopádn ě měly být použity p ři odůvodňo­
vání plánu studie, zejména pokud se odchyluje od výše uvedených stan ­
dardních doporu čení. Ačkoli se m ůže zvýšit citlivost, doba aplikace delší 
než osm týdn ů by měla být jasn ě vysvětlena a od ůvodněna, jelikož dlouhé 
doby aplikace mohou zp ůsobit zjevný nár ů
st četnosti mutací prost řednic­
tvím klonální expanze (29).  
Dávkování  
27. Dávkování by m ělo vycházet z výsledk ů studie pro stanovení rozmezí 
dávek, která m ěří obecnou toxicitu a která byla provedena se stejným 
způsobem expozice, nebo z výsledk ů starších studií subakutní toxicity. 
Při určování rozmezí dávek lze použít netransgenní zví řata 
stejného kmene hlodavc ů. V hlavní zkoušce by s cílem získat informace 
o závislosti ú činku na dávce m ěla úplná studie zahrnovat negativní 
kontrolní skupinu (viz odstavec 22) a minimáln ě tři, náležitě rozvržené 
úrovně dávek, ledaže byla použita limitní dávka (viz odstavec 28). Nejvyšší 
dávka by m ěla být maximální tolerovaná dávka (MTD). MTD je definována  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že vyšší dávky by vedly 
podle očekávání p ři stejném režimu dávkování k letalit ě. Chemické látky se 
specifickým biologickým p ůsobením p ři nízkých netoxických dávkách (jako 
jsou hormony a mitogeny) a chemické látky, které vykazují saturaci toxi ­
kokinetických vlastností, mohou p ředstavovat výjimky z kritérií stanovení 
dávek a každý p řípad by m ěl být hodnocen individuáln ě. Použité dávky by 
měly pokrývat rozp ětí dané maximální a minimální toxicitou, p řípadně 
nulovou toxicitou.  
Limitní zkouška  
28. Pokud experimenty pro ur čení rozmezí dávek nebo stávající údaje získané 
u příbuzných kmen ů hlodavců naznačují, že aplikace limitní dávky (viz 
níže) nevyvolá pozorovatelné toxické ú činky,a pokud by genotoxicita 
nebyla očekávána na základ ě údajů o strukturn ě příbuzných chemických 
látkách, nemusí být úplná studie se t řemi úrovn ěmi dávek pokládána za 
nutnou. Pro dobu podávání v délce 28 dn ů (tj. 28 každodenních aplikací) 
je limitní dávka 1 000 mg/kg t ělesné hmotnosti a den. Pro dobu podávání 
v délce maximáln ě 14 dnů je limitní dávka 2 000 mg/kg t ělesné hmotnosti 
a den (harmonogramy podávání dávek odlišné od 28 každodenních aplikací by měly být vědecky od ůvodněny v plánu studie, viz odstavec 26).
 
Podávání dávek  
29. Zkoušená chemická látka se obvykle podává nitrožalude čně žaludeční 
sondou nebo vhodnou intuba ční kanylou. P ři plánování zkoušky by m ěl 
být zvážen p ředpokládaný zp ůsob expozice člověka. Z tohoto d ůvodu 
mohou být p řijatelné i jiné zp ůsoby expozice (nap říklad v pitné vod ě, 
podkožně, nitrožiln ě, místně, inhalací, intratracheáln ě, stravou nebo implan ­
tací), pokud je bude možné od ůvodnit. Intraperitoneální aplikace se nedo ­
poručuje, protože to není fyziologicky relevantní zp ůsob expozice člověka. 
Maximální objem kapaliny, který m ůže být najednou podán žalude ční 
sondou nebo injek čně, závisí na velikosti pokusného zví řete. Objem by 
neměl překročit 2 ml/100 g t ělesné hmotnosti. Použití objem ů větších než 
tento by m ělo být od ůvodněno. S výjimkou dráždivých nebo žíravých 
chemických látek, které ve vyšších koncentracích mají obvykle navýšený 
účinek, měla by být variabilita aplikovaného objemu minimalizována tím, 
že aplikované koncentrace se nastaví tak, aby aplikovaný objem byl konstantní p ři všech úrovních dávek.
 
Doba odb ěru vzork ů 
Somatické bu ňky 
30. Doba odb ěru vzorků je kritická prom ěnná, protože je ur čována dobou 
potřebnou pro fixaci mutací. Toto období závisí na p říslušné tkáni a zdá 
se, že souvisí s dobou obratu bun ěčné populace, p řičemž kostní d řeň 
a střevo reagují rychle a játra jsou mnohem pomalejší. Vhodným kompro ­
misem pro m ěření četností mutací v rychle a pomalu se množících tkáních 
je 28 po sob ě jdoucích každodenních aplikací (jak je uvedeno v odstavci 
26) a odb ěr vzorků tři dny po kone čné aplikaci, a čkoli za těchto podmínek 
se maximální četnost mutací v pomalu rostoucích tkáních nemusí projevit. 
Pokud jsou pomalu rostoucí tkán ě obzvlášt ě důležité, pak bude možná 
vhodnější pozdější doba odb ěru vzorků, a to 28 dní následujících po 
28denní dob ě podávání. V takových p řípadech by pozd ější doba odb ěru 
vzorků nahradila t řídenní dobu odb ěru a musela by být v ědecky od ůvod­
něna. ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Zárodečné buňky 
31. Zkoušky TGR jsou velmi vhodné pro studii indukce genových mutací 
v samčích zárode čných buňkách (7) (8) (27), kde je dob ře definováno 
načasování a kinetika spermatogeneze (27). Nízké po čty vajíček dostupných 
pro analýzu, dokonce i po superovulaci, a skute čnost, že v oocytu neprobíhá 
žádná syntéza DNA, vylu čují detekci mutací v sami čích zárode čných 
buňkách pomocí transgenních zkoušek (31).  
32. Doby odb ěru vzorků pro samčí zárodečné buňky by měly být zvoleny tak, 
aby byl pokryt celý rozsah exponovaných bun ěčných typů po celou dobu 
vývoje zárode čných bun ěk a pro bu ňky ve stadiu zachyceném dobou 
odběru byla zajišt ěna dostate čná expozice. Progrese vývoje zárode čných 
buněk ze spermatogonálních kmenových bun ěk ve zralou spermii, která 
se dostane do chámovodu/ocasu nadvarletetrvá ~49 dn ů u myší (36) 
a ~70 dn ů u potkan ů (34) (35). Po 28denní expozici s následnou t řídenní 
dobou odb ěru vzork ů budou akumulované spermie odebrané 
z chámovodu/ocasu nadvarlete (7)(8) p ředstavovat populaci bun ěk, které 
byly předmětem expozice p řibližně během druhé poloviny spermatogeneze, 
která zahrnuje meiotické a postmeiotické období, nikoli však spermatogo ­
nální období nebo období kmenových bun ěk. Pro adekvátní odb ěr vzorků 
buněk z chámovodu/ocasu nadvarlete, které byly b ěhem období expozice 
spermatogonálními kmenovými bu ňkami, je vyžadována další doba odb ěru 
vzorků v minimální délce sedmi týdn ů (myši) nebo deseti týdn ů (potkani) 
po ukončení aplikace.  
33. Buňky vypuzené ze semenných tubul ů po režimu 28 + 3 dny zahrnují 
smíšenou populaci obohacenou pro všechna stadia vývoje zárode čných 
buněk (7) (8). Odb ěr vzorků těchto buněk pro detekci genových mutací 
nezajišťuje tak p řesné posouzení stadií, v nichž jsou indukovány mutace 
zárodečných bun ěk, jakého lze dosáhnout p ři odběru vzork ů spermií 
z chámovodu/ocasu nadvarlete (z tubul ů se totiž odebírají vzorky celé 
řady typů zárodečných bun ěk a tato bun ěčná populace bude kontaminována 
určitými somatickými bu ňkami). Odb ěr vzorku bun ěk ze semenných tubul ů 
vedle spermií z chámovodu/ocasu nadvarlete po režimu odb ěru 28 + 3 dny 
by ale zajistil ur čité pokrytí bun ěk exponovaných ve v ětšině fází vývoje 
zárodečných bun ěk a může být užite čný pro zjiš ťování určitých mutagen ů 
zárodečných bun ěk. 
Pozorování  
34. Všeobecné klinické pozorování by se m ělo provád ět nejméně jednou denn ě, 
nejlépe ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby o čekávaného 
maxima ú činku po podání látky. Zaznamenává se zdravotní stav zví řat. 
Nejméně dvakrát denn ě by měla být provedena prohlídka všech zví řat za 
účelem zjišt ění morbidity a mortality. Všechna zví řata by měla být vážena 
nejméně jednou týdn ě a při utracení. M ěření spotřeby potravy by se m ělo 
provádět nejméně jednou týdn ě. Pokud je zkoušená chemická látka podá ­
vána v pitné vod ě, měla by se spot řeba vody m ěřit při každé vým ěně vody 
a alespo ň jednou týdn ě. Zvířata, která vykazují neletální indikátory 
nadměrné toxicity, by m ěla být utracena p řed uplynutím doby zkoušky (23).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Odběr tkání  
35. Mělo by být jasn ě definováno od ůvodnění odběru tkání. Jelikož lze 
studovat indukci mutací v podstat ě v jakékoli tkáni, výb ěr tkání, které 
budou odebrány, by se m ěl opírat o d ůvody, k jakému ú čelu má být studie 
provedena, a o jakékoli stávající údaje o mutagenit ě, karcinogenit ě nebo 
toxicitě týkající se šet řené chemické látky. K d ůležitým zvažovaným 
faktorům by m ěl patřit způsob podání (na základ ě pravděpodobných 
způsobů expozice člověka), předpokládaná distribuce látky v tkáních 
a možný mechanismus p ůsobení. P ři absenci jakýchkoli základních infor ­
mací by m ělo být odebráno n ěkolik somatických tkání, které mohou být 
zajímavé. Ty by m ěly reprezentovat rychle rostoucí a pomalu rostoucí tkán ě 
a tkáně prvního kontaktu. Krom ě toho by pro p řípad, že bude v budoucnosti 
požadována analýza mutagenity zárode čných bun ěk, měly být ze semen ­
ných tubul ů (viz odstavce 32 a 33) odebrány spermie z chámovodu/ocasu 
nadvarlat a vyvíjející se zárode čné buňky. Měla by být zjišt ěna hmotnost 
orgánů a v případě větších orgán ů by měly být odb ěry provád ěny vždy ze 
stejného místa u všech zví řat. 
Uskladnění tkání a DNA  
36. Tkán ě (nebo tká ňové homogenáty) by se m ěly skladovat p ři teplotě – 70 °C 
nebo nižší a pro izolaci DNA by se m ěly použít do p ěti let. Izolovaná DNA 
uskladněná v chladni čce při teplotě 4 °C ve vhodném pufru by se m ěla 
využít pro analýzu mutací optimáln ě do jednoho roku.  
Výběr tkání pro analýzu mutací  
37. Výb ěr tkání by m ěl vycházet z úvah jako: 1) zp ůsob podání nebo místo 
prvního kontaktu (nap ř. žláznatý žaludek, dochází-li k orální aplikaci, plíce, 
probíhá-li aplikace formou inhalace, nebo k ůže, pokud byla použita místní 
aplikace); a 2) farmakokinetické parametry pozorované ve studiích obecné toxikologie, které ukazují na distribuci ve tkáních, retenci nebo akumulaci 
nebo cílové orgány pro toxicitu. Pokud jsou studie provád ěny s cílem 
navázat na studie karcinogenity, m ěly by být zváženy cílové tkán ě pro 
karcinogenitu. Výb ěr tkání pro analýzu by m ěl maximalizovat zjiš ťování 
účinků chemických látek, které jsou p římo působícími mutageny  in vitro , 
které jsou rychle metabolizované, vysoce reaktivní nebo nedostate čně absor­
bované, nebo ty, pro které je cílová tká ň určena způsobem aplikace (6).
 
38. Nejsou-li k dispozici základní informace, a s p řihlédnutím k místu kontaktu 
z důvodu způsobu aplikace by m ěla být mutagenita detekována v játrech 
a nejmén ě jedné rychle se d ělící tkáni (nap ř. žláznatý žaludek nebo kostní 
dřeň). Ve většině případů lze výše uvedených požadavk ů dosáhnout 
analýzou dvou pe člivě vybraných tkání, avšak n ěkdy budou zapot řebí tři 
nebo více tkání. Existují-li d ůvody specifického zájmu o ú činky na 
zárodečné buňky, včetně pozitivních výsledk ů získaných v somatických 
buňkách, pak m ěly být mutace zjiš ťovány i v zárode čných buňkách.  
Metody m ěření 
39. Pro doporu čené transgenní modely jsou k dispozici standardní laboratorní 
nebo publikované metody pro zjiš ťování mutací: lambda bakteriofág 
a plazmid  lacZ  (30), myš  lacI  (2) (18), delta myš  gpt (22), delta potkan  
gpt (28),  cII (17). Modifikace by m ěly být od ůvodněny a náležit ě zdoku­
mentovány. Lze agregovat a k dosažení vhodného po čtu plaků nebo kolonií 
použít údaje z n ěkolika sbalení. Pot řeba velkého po čtu sbalování pro 
dosažení vhodného po čtu plaků může být známkou nízké kvality DNA. 
V takových p řípadech by údaje m ěly být brány v úvahu obez řetně, protože 
mohou být nespolehlivé. Optimální celkový po čet plaků nebo kolonií na  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
jeden vzorek DNA je upravován podle statistické pravd ěpodobnosti zjišt ění 
dostatečných počtů mutací p ři dané spontánní četnosti mutací. Obecn ě je 
požadováno minimáln ě 125 000 až 300 000 plak ů, pokud spontánní četnost 
mutací je v řádu 3 × 10  –5 (15). U zkoušky Big Blue®  lacI  je důležité 
prokázat, že celý rozsah barevných fenotyp ů mutací lze zjistit zahrnutím 
příslušných barevných kontrol soub ěžných s každým nanesením. Tkán ě 
a výsledné vzorky (položky) by se m ěly zpracovávat a analyzovat pomocí 
blokového p řístupu, kde jsou položky z kontrolní skupiny vehikulum/roz ­
pouštědlo, ze skupiny pozitivní kontroly (je-li použita) nebo DNA pozitivní 
kontroly (je-li to relevantní) a z každé experimentální skupiny zpracovány 
společně. 
ÚDAJE A ZPRÁVY  
Zpracování výsledk ů 
40. Údaje pro jednotlivá zví řata by m ěly být zpracovány ve form ě tabulky. 
Experimentální jednotkou je zví ře. Protokol by m ěl obsahovat celkový 
počet jednotek tvo řících plak (pfu) nebo jednotek tvo řících kolonii (cfu), 
počet mutací a četnost mutací pro každou tká ň z každého zví řete. Pokud 
existuje více reakcí sbalování ( packaging/rescue reactions ), měl by být 
dokumentován po čet reakcí na jeden vzorek DNA. Údaje o každé jednotlivé 
reakci by m ěly být archivovány, ve zpráv ě stačí uvádět pouze celkové po čty 
pfu nebo cfu. M ěly by být uvedeny údaje o toxicit ě a klinických známkách 
podle odstavce 34. Jakékoli výsledky sekvenování by m ěly být prezento ­
vány pro každou analyzovanou mutaci a m ěly by být zobrazeny výsledné 
výpočty četnosti mutací pro každé zví ře a tkáň. 
Statistické vyhodnocení a interpretace výsledk ů 
41. Existuje n ěkolik kritérií pro ur čení pozitivního výsledku, jako je nár ůst 
četnosti mutací v závislosti na dávce nebo jasný nár ůst četnosti mutací 
v jedné exponované skupin ě v porovnání s kontrolní skupinou (rozpoušt ěd­
lo/vehikulum). Aby byly k dispozici dostate čné údaje pro analýzu vztahu 
dávky a odpov ědi, měly by být analyzovány nejmén ě tři exponované 
skupiny. Prvotní by m ěla být biologická relevance výsledk ů, vhodné statis ­
tické metody mohou být použity jako pomocné p ři hodnocení výsledk ů 
zkoušek (4) (14) (15) (25) (26). Použité statistické testy by m ěly brát 
v úvahu zví ře jako experimentální jednotku.  
42. Zkoušená chemická látka, pro kterou výsledky nespl ňují výše uvedená 
kritéria v žádné tkáni, je v této zkoušce považována za nemutagenní. Pro 
potvrzení biologického významu negativního výsledku by m ěla být 
prokázána expozice tkán ě. 
43. Pro výsledky získané sekvenováním DNA je k dispozici celá řada statistic ­
kých přístupů, které jsou nápomocny p ři interpretaci výsledk ů (1) (5) (9) 
(19).  
44. Při hodnocení biologického významu reakce m ůže být vodítkem posouzení, 
zda jsou zjišt ěné hodnoty uvnit ř nebo vně rozsahu historických kontrolních 
hodnot (32).  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Závěrečná zpráva  
45. Závěrečná zprávaby m ěla obsahovat následující informace:  
Zkoušená chemická látka:  
— identifika ční údaje a číslo CAS, je-li známo,  
— zdroj, číslo šarže, je-li k dispozici,  
— skupenství a čistota,  
— fyzikáln ě-chemické vlastnosti významné pro provedení studie,  
— stabilita zkoušené chemické látky, je-li známa.  
Rozpouštědlo/vehikulum:  
— zdůvodnění volby vehikula,  
— rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpoušt ědle/vehikulu, 
je-li známa,  
— příprava potravy, pitné vody nebo inhala čních aplika čních forem,  
— analytická stanovení aplika ční formy (nap ř. stabilita, homogenita, nomi ­
nální koncentrace).  
Pokusná zví řata: 
— použitý druh/kmen a od ůvodnění výběru, 
— počet, stáří a pohlaví zví řat, 
— zdroj, podmínky chovu, potrava atd.,  
— individuální hmotnost zví řat na počátku zkoušky, v četně rozpětí tělesné 
hmotnosti, st řední hodnoty a sm ěrodatné odchylky pro každou skupinu.  
Zkušební podmínky:  
— údaje o pozitivní a negativní (vehikulum/rozpoušt ědlo) kontrole,  
— údaje ze studie pro stanovení rozmezí dávek,  
— zdůvodnění zvolených úrovní dávek,  
— podrobnosti o p řípravě zkoušené chemické látky,  
— podrobnosti o zp ůsobu podávání zkoušené chemické látky,  
— zdůvodnění způsobu podávání,  
— metody zjiš ťování toxicity, v četně případně histopatologických nebo 
hematologických analýz a četnosti, s jakou jsou provád ěna pozorování 
zvířat, a četnosti vážení,  
— metody ov ěřování, zda se zkoušená chemická látka dostala k cílové 
tkáni, nebo ov ěřování obecné cirkulace, pokud byly získány negativní 
výsledky,  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— skutečná dávka (mg/kg t ělesné hmotnosti na den) vypo čítaná 
z koncentrace zkoušené chemické látky v potrav ě/pitné vod ě (ppm) 
a ze spot řeby, je-li to relevantní,  
— podrobnosti o jakosti krmení a vody,  
— podrobný popis harmonogram ů aplikace a odb ěru vzorků a odůvodnění 
výběru konkrétního schématu,  
— způsob utracení,  
— postupy izolace a uchovávání tkání,  
— metody izolace genomické DNA hlodavc ů, získání transgenu 
z genomické DNA a p řenos transgenní DNA do bakteriálního hostitele,  
— zdroje a čísla šarží všech bun ěk, sad a chemických činidel (je-li to 
relevantní),  
— metody po čítání mutací,  
— metody molekulární analýzy mutací a použití p ři korekci pro klonalitu 
a/nebo výpo čet četností mutací, jsou-li použitelné.  
Výsledky:  
— stav zví řat před zkouškou a b ěhem zkoušky, v četně známek toxicity,  
— tělesná hmotnost a hmotnost orgán ů při utracení,  
— pro každou tká ň/zvíře počet mutací, po čet hodnocených plak ů nebo 
kolonií, četnost mutací,  
— pro každou tká ň/skupinu zví řat počet reakcí sbalování na jeden vzorek 
DNA, celkový po čet mutací, st řední četnost mutací, sm ěrodatná 
odchylka,  
— podle možnosti závislost odpov ědi na dávce,  
— pro každou tká ň/zvíře počet nezávislých mutací a st řední četnost mutací, 
pokud byla provedena molekulární analýza mutací,  
— souběžné a dosavadní údaje o negativní kontrole s rozp ětími, středními 
hodnotami a sm ěrodatnými odchylkami,  
— údaje o soub ěžné pozitivní kontrole (nebo nesoub ěžné pozitivní kontrole 
DNA),  
— analytická stanovení, jsou-li k dispozici (nap ř. koncentrace DNA použité 
při sbalování, údaje o sekvenování DNA),  
— použité statistické analýzy a metody.  
Diskuse o výsledcích  
Závěr ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
LITERATURA  
1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391–396.  
2) Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107–112.  
3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  
Mutations’  Nature , 377(6550): 657–659.  
4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice ’, Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255.  
5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413.
 
6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151.  
7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Proc. Acad. Sci. Tecn. 
USA, 92: 7485–7489.
 
8) Douglas, G.R ., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2-3): 197–212.
 
9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418.  
10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo’, Proc. Proc. Acad. Sci. Tecn. USA,  86(20): 7971–7975.
 
11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques , 14(3): 326, 330.  
12) Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125–136.  
13) Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96–106.  
14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255.  
15) Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. 
Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘ In vivo  Trans­
genic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253–259.
 
16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Muta ­
gen., 41: 1–6.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‚Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  Muta­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target‘,  Proc. Proc. Acad. Sci. Tecn. 
USA, 93(17): 9073–9078.  
18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term,  in vivo  Muta­
genicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.  
19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772–778.  
20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi – and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.
 
21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15.  
22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215.  
23) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, ENV/ 
JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OECD, Paris.  
25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245.  
26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.
 
27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164–193.
 
28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of  in vivo  Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats:  
in vivo  Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6- 
diaminotoluene Structural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71–78.
 
29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glic ­
kman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Transgenic Muta ­
tion Assays’,  Mutation Res ., 540: 141–151.
 
30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo ’ in: G. Pfeifer (ed.),  
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  
Plenum Press, New York, NY, USA, s. 391–410.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1–2): 
117–123.  
32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control 
Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.  
33) OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays , Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Paris.  
34) Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198–236.
 
35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epidi ­
dymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, 
Elsevier, the Netherlands, s. 1071–1148.  
36) Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Dodatek  
DEFINICE  
Bodová mutace : obecný výraz pro mutaci postihující pouze malou sekvenci 
DNA včetně malých insercí, delecí a substitucí základního páru.  
Delece : mutace, ve které genom ztratil jeden nebo více (po sob ě jdoucích) 
nukleotid ů. 
Doba odb ěru vzork ů: konec období, p řed utracením, b ěhem kterého chemická 
látka není podávána a b ěhem kterého jsou nezpracované léze DNA fixovány do 
stálých mutací.  
Doba podávání : celková doba, b ěhem níž jsou zví řeti podávány dávky.  
Elektroporace : aplikace elektrických impulz ů pro zvýšení propustnosti bun ěč­
ných membrán.  
Endogenní gen : vlastní gen genomu.  
Extrabinomické rozd ělení: větší variabilita p ři opakovaných odhadech podílu 
populace, než by se čekalo, pokud by populace m ěla binomické rozd ělení. 
Chemická látka : látka nebo sm ěs. 
Inserce : doplnění jednoho nebo více pár ů bází do sekvence DNA.  
Jackpot : velký po čet mutací, které vznikly klonální expanzí z jedné mutace.  
Jednotka tvo řící kolonii (cfu) : míra po čtu životaschopných bakterií.  
Jednotka tvo řící plak (pfu) : míra po čtu životaschopných bakteriofág ů. 
Kapsida : bílkovinné pouzdro, které obklopuje virovou částici.  
Klonální expanze : produkce mnoha bun ěk z jedné (mutující) bu ňky. 
Konkatemer : dlouhá spojitá biomolekula složená z mnoha identických kopií 
spojených do série.  
Ligace : kovalentní vazba dvou konc ů molekul DNA pomocí ligázy DNA.  
Místo cos : 12nukleotidový segment jedno řetězcové DNA, který se vyskytuje na 
obou koncích dvou řetězcového genomu bakteriofágu lambda.  
Mitogen : chemická látka, která stimuluje bu ňku k zahájení bun ěčného dělení, 
navozuje mitózu (tj. d ělení buněk). 
Neutrální gen : gen, který není dot čen tlaky pozitivní nebo negativní selekce.  
Posunová mutace : genetická mutace zp ůsobená insercemi nebo delecemi ur či­
tého počtu nukleotid ů, již nelze rovnom ěrně dělit třemi v rámci sekvence DNA, 
která udává kódy pro bílkovinu/peptid.  
Pozitivní selekce : metoda, díky níž p řežívají pouze mutace.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Reporterový gen : gen, jehož mutace se snadno zjiš ťuje. 
Sbalování ( packaging ): syntéza infek čních částic fágu z p řípravy bílkovin 
kapsidy a konce fágu a konkatemeru molekul DNA fágu. Obvykle se používá 
ke sbalení DNA naklonované na lambda vektor (odd ělený místy cos) do infek č­
ních částic lambda.  
Shuttle vektor : vektor sestavený tak, že se m ůže množit ve dvou r ůzných 
hostitelských druzích; v souladu s tím lze DNA vloženou do shuttle vektoru 
testovat nebo vmanipulovat do dvou r ůzných typ ů buněk nebo dvou r ůzných 
organizm ů. 
Substituce páru bází : typ mutace, který zp ůsobuje nahrazení jedné nukleotidové 
báze DNA jinou nukleotidovou bází DNA.  
Transgenní : patřící organismu, týkající se organismu nebo organismus, jehož 
genom byl zm ěněn transferem genu nebo gen ů z jiných druh ů. 
Účinnost sbalování : účinnost, se kterou jsou sbalené bakteriofágy znovu zachy ­
covány v hostitelských bakteriích.  
Velké delece : delece v DNA o více než n ěkolika tisících bází (které se ú činně 
zjistí při selekci Spi  – a při zkouškách plazmidu lacZ).  
Zkoušená chemická látka : jakákoli látka nebo sm ěs zkoušená pomocí této 
zkušební metody.  ▼M5 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
ČÁST C: METODY STANOVENÍ EKOTOXICITY  
OBSAH 
C.1. AKUTNÍ TOXICITA PRO RYBY 
C.2. ZKOUŠKA AKUTNÍ IMOBILIZACE DAFNIÍ ( DAPHNIA  SP.) 
C.3. ZKOUŠKA INHIBICE R ŮSTU SLADKOVODNÍCH ŘAS 
A SINIC 
C.4. STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ČÁST I. OBECNÉ ÚVAHY 
ČÁST II. ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC (Metoda C.4-A) 
ČÁST III. MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD 
(Metoda C.4-B)) 
ČÁST IV. ZKOUŠKA NA UVOL ŇOVÁNÍ CO
 2 (Metoda C.4-C) 
ČÁST V. ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ (Metoda 
C.4-D) 
ČÁST VI. ZKOUŠKA V UZAV ŘENÝCH LAHVI ČKÁCH (Metoda C.4-E) 
ČÁST VII. ZKOUŠKA MITI (Metoda C.4-F) 
C.5. ROZKLAD – BIOCHEMICKÁ SPOT ŘEBA KYSLÍKU 
C.6. ROZKLAD – CHEMICKÁ SPOT ŘEBA KYSLÍKU 
C.7. ABIOTICKÝ ROZKLAD – HYDROLÝZA JAKO FUNKCE PH C.8. TOXICITA PRO ŽÍŽALY C.9. BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST – ZAHN – WELLENSOVA 
ZKOUŠKA 
C.10. SIMULA ČNÍ ZKOUŠKA AEROBNÍHO ČIŠTĚNÍ ODPADNÍCH 
VOD: C.10-A: JEDNOTKY AKTIVOVANÉHO KALU – C.10- B: BIOFILMY 
C.11. BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST – ZKOUŠKA NA INHI ­
BICI DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU 
C.12. BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST – MODIFIKOVANÁ 
ZKOUŠKA SCAS 
C.13. BIOAKUMULACE: PR ŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH 
C.14. R ŮSTOVÁ ZKOUŠKA NA NEDOSP ĚLÝCH RYBÁCH 
C.15. ZKOUŠKA KRÁTKODOBÉ TOXICITY NA RYBÍM EMBRYU 
A VÁČKOVÉM PL ŮDKU 
C.16. ZKOUŠKA AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO V ČELU 
MEDONOSNOU 
C.17. V ČELA MEDONOSNÁ – ZKOUŠKA AKUTNÍ KONTAKTNÍ 
TOXICITY 
C.18. STANOVENÍ ADSORPCE/DESORPCE ŠARŽOVITOU 
ROVNOVÁŽNOU METODOU
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. ODHAD ADSORP ČNÍHO KOEFICIENTU (K  OU ) PRO PŮDY 
A ČISTÍRENSKÉ KALY POMOCÍ VYSOKOÚ ČINNÉ KAPA ­
LINOVÉ CHROMATOGRAFIE (HPLC) 
C.20. ZKOUŠKA TOXICITY PRO REPRODUKCI  DAPHNIA MAGNA  
C.21. P ŮDNÍ MIKROORGANISMY: ZKOUŠKA NA TRANSFOR ­
MACI DUSÍKU 
C.22. P ŮDNÍ MIKROORGANISMY: ZKOUŠKA NA TRANSFOR ­
MACI UHLÍKU 
C.23. AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V P ŮDĚ 
C.24. AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE 
V SYSTÉMECH VODA/SEDIMENT 
C.25 AEROBNÍ MINERALIZACE V POVRCHOVÉ VOD Ě – 
SIMULA ČNÍ ZKOUŠKA BIOLOGICKÉHO ROZKLADU 
C.26 ZKOUŠKA INHIBICE R ŮSTU  LEMNA  SPP.  
▼M4 
C.27. TEST TOXICITY NA CHIRONOMIDAE V SYSTÉMU 
SEDIMENT-VODA ZA POUŽITÍ OBOHACENÉHO SEDIMENTU 
C.28. TEST TOXICITY NA CHIRONOMIDAE V SYSTÉMU 
SEDIMENT–VODA ZA POUŽITÍ OBOHACENÉ VODY 
C.29. HODNOCENÍ SNADNÉ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – 
UVOLŇOVÁNÍ CO
 2 V TĚSNĚ UZAVŘENÝCH LAHVI Č­
KÁCH ( HEADSPACE TEST ) 
C.30. BIOAKUMULACE U TERESTRICKÝCH MÁLOŠT ĚTINATCŮ ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. AKUTNÍ TOXICITA PRO RYBY  
1. METODA  
1.1. ÚVOD  
Účelem této zkoušky je stanovit akutní letální toxicitu látek pro 
sladkovodní ryby. Pro usnadn ění výběru nejvhodn ější zkušební 
metody (statické, semistatické nebo pr ůtokové) s cílem zajistit dosta ­
tečně konstantní koncentrace zkoušené látky po celou dobu experi ­
mentu je žádoucí mít pokud možno k dispozici data o rozpustnosti 
látky ve vod ě, o tenzi par, chemické stálosti, disocia čních konstan ­
tách a o biologické rozložitelnosti látky.  
Další informace (nap ř. strukturní vzorec, stupe ň čistoty, povaha 
a podíl významných ne čistot v procentech, p řítomnost a množství 
přísad a rozd ělovací koeficient n-oktanol/voda) je t řeba vzít v úvahu 
při plánování zkoušky i p ři interpretaci výsledk ů. 
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
Akutní toxicitou se rozumí z řetelný nep říznivý účinek, který je 
v krátké dob ě (řádově ve dnech) v organismu vyvolán expozicí látce. 
V této zkoušce se akutní toxicita vyjad řuje prostřednictvím st řední 
letální koncentrace (LC  50 ), tj. takové koncentrace látky ve vod ě, 
která během nep řetržité expozice po ur čitou dobu zp ůsobí úhyn 
50 % jedinc ů ve zkušební skupin ě ryb.  
Všechny koncentrace zkoušené látky se udávají v hmotnosti na 
jednotku objemu (mg/l). Mohou se také vyjád řit v hmotnostních 
podílech (mg.kg  -l ). 
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Zkoušky s referen čními látkami mohou být provedeny s cílem 
prokázat, že se reakce zkušebních druh ů za laboratorních zkušebních 
podmínek podstatn ě nezměnila. 
Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.  
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg/l, s cílem 
prokázat, že LC  50 je vyšší než tato koncentrace.  
Ryby se vystaví ú činku různým koncentracím zkoušené látky 
přidané do vody po dobu 96 hodin. Úhyn se zaznamenává nejmén ě 
každých 24 hodin a je-li to možné, vypo čtou se při každém pozo ­
rování koncentrace, které zp ůsobí úhyn 50 % ryb (LC  50 ). 
1.5. KRITÉRIA JAKOSTI  
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný 
zkušební postup.  
Mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkoušky v ětší 
než 10 % (nebo jedna ryba, pokud se použije mén ě než deset ryb).  
Koncentrace rozpušt ěného kyslíku musí být po celou dobu zkoušky 
vyšší než 60 % hodnoty nasycení vzduchem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Koncentrace zkoušené látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 
80 % původních hodnot koncentrací.  
U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpoušt ějí a dávají stálé 
roztoky, tj. v podstatné mí ře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují 
nebo se neadsorbují, lze po čáteční koncentraci pokládat za ekviva ­
lentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncent ­
race po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.  
U látek, které:  
i) jsou ve zkušebním médiu špatn ě rozpustné nebo  
ii) mohou vytvá řet stálé emulze nebo disperse nebo  
iii) jsou ve vodných roztocích nestálé,  
musí být po čáteční koncentrace brána jako koncentrace nam ěřená 
v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) 
na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po ur čité době jejího 
ustálení, avšak p řed nasazením zkušebních ryb.  
Ve všech uvedených p řípadech musí být b ěhem zkoušky provedena 
další měření s cílem potvrdit skute čné expozi ční koncentrace nebo 
dodržení kritérií jakosti.  
pH by se nem ělo změnit o více než o 1.  
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Mohou být použity t ři postupy:  
Statická zkouška:  
Zkouška, p ři níž zkušební roztok neprotéká. (Roztoky se b ěhem celé 
zkoušky nem ění.) 
Semistatická metoda:  
Zkouška, p ři níž zkušební roztok neprotéká, ale je pravideln ě po 
delších časových úsecích (nap ř. po 24 hodinách) zcela vym ěňován.  
Průtoková metoda:  
Zkouška toxicity, p ři níž se voda ve zkušebních nádržích neustále 
obměňuje, přičemž se zkoušená látka p řivádí s vodou, kterou se 
zkušební médium obnovuje.  
1.6.1.  Činidla  
1.6.1.1.  Roztoky zkoušených látek  
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se p řipraví rozpušt ěním 
látky v deionizované vod ě nebo ve vod ě podle bodu 1.6.1.2.  
Zvolené zkoušená koncentrace se p řipraví ředěním zásobního 
roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku 
rozpustit p římo v ředicí vod ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Látky se obvykle zkouší až do meze jejich rozpustnosti. U n ěkterých 
látek (nap ř. u látek s nízkou rozpustností ve vod ě nebo vysokou 
hodnotou P  ow , nebo u látek, které ve vod ě vytvářejí spíše stálé 
disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku p ři koncen­
traci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajišt ěno, že je 
dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální 
rozpustnosti/stálosti. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (nap ř. vytvořením filmu na hladin ě 
bránícího okysli čení vody atd.).
 
Pro přípravu zásobních roztok ů látek s nízkou rozpustností ve vod ě 
nebo pro usnadn ění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít 
ultrazvukovou dispergaci, organická rozpoušt ědla či emulgátory nebo 
dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, m ěly by všechny 
zkušební koncentrace obsahovat stejné množství t ěchto pomocných 
látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích 
by měly být exponovány další kontrolní ryby. Koncentrace pomoc ­
ných látek by m ěla být minimální a v žádném p řípadě by neměla 
překročit 100 mg/l zkušebního média.  
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že 
dochází k výrazné zm ěně pH, doporu čuje se zkoušku opakovat 
s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém p řípadě se upraví 
pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu 
neexistuji specifické d ůvody. Při úpravě pH se dává p řednost HCl 
a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkou ­ 
šené látky v zásobním roztoku v podstatné mí ře změněna. Dojde-li 
úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, 
skutečnosti se zaznamenají.  
1.6.1.2.  Voda pro chov ryb a ředění 
Může být použita pitná voda (nekontaminovaná potenciáln ě škodli­
vými koncentracemi chloru, t ěžkých kov ů nebo jiných látek), 
kvalitní p řírodní voda nebo upravená voda (viz dopln ěk 1). Upřed­
nostňuje se voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg/l (vztaženo na 
CaCO  3 ) a pH od 6,0 do 8,5.  
1.6.2.  Přístroje  
Veškeré p řístroje musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu:  
— systém pro automatické ředění (pro pr ůtokovou metodu),  
— přístroj pro m ěření koncentrace kyslíku,  
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,  
— vhodný p řístroj pro m ěření teploty,  
— pH-metr.  
1.6.3.  Testovací ryby  
Ryby by m ěly být zdravé a bez zjevných malformací.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Použitý druh by m ěl být zvolen podle praktických kritérií, jako je 
jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, 
relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoli další významné ekonomické a biologické faktory. P ři výběru druhu ryb by m ěla 
být také zohledn ěna potřeba srovnatelnosti získaných dat 
a mezinárodní harmonizace (1).
 
Seznam doporu čených druh ů ryb pro provedení této zkoušky je 
uveden v dopl ňku 2; dává se p řednost druh ům danio pruhované 
a pstruh duhový.  
1.6.3.1.  Chov  
Ryby by m ěly pocházet pokud možno z jednoho chovu a m ěly by 
být stejné délky a stejného stá ří. Ryby musí být chovány nejmén ě 12 
dní v těchto podmínkách:  
Obsádka:  
Vhodná vzhledem k metod ě (metoda s recirkulací nebo pr ůtoková 
metoda) a druhu ryb.  
Voda:  
Viz 1.6.1.2.  
Osvětlení:  
Osvětlení 12 až 16 hodin denn ě. 
Koncentrace rozpušt ěného kyslíku:  
Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.  
Krmení:  
Třikrát týdn ě nebo jednou za den; vysazení krmení 24 hodin p řed 
začátkem zkoušky.  
1.6.3.2.  Mortalita  
Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se tato 
kritéria:  
— mortalita vyšší než 10 % populace za 7 dní:  
celá obsádka ryb se vy řadí, 
— mortalita 5 až 10 % populace:  
v chovu se pokra čuje dalších 7 dní.  
Nedojde-li k dalším p řípadům úhynu, obsádka se použije, 
v opačném případě musí být vy řazena,  
— mortalita menší než 5 % populace:  
obsádka je pro zkoušku použitelná.  
1.6.4.  Aklimatizace  
Všechny ryby musí být nejmén ě na 7 dnů před použitím ve zkoušce 
nasazeny do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se použije p ři 
zkoušce.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Zkušební postup  
Před vlastní zkouškou m ůže být provedena p ředběžná zkouška 
s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.
 
Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkoušené 
látky a podle pot řeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.  
V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkoušené 
látky se zvolí statická, semistatická nebo pr ůtoková zkouška, aby 
byla spln ěna kritéria jakosti.  
Ryby se exponují zkoušené látce za níže uvedených podmínek:  
— délka expozice: 96 hodin,  
— počet ryb: nejmén ě 7 na každou koncentraci,  
— nádrže: vhodný objem vzhledem k doporu čené obsádce,  
— obsádka: pro statickou a semistatickou zkoušku se doporu čuje 
1,0 g/l; v pr ůtokovém systému je p řijatelná vyšší obsádka,  
— zkušební koncentrace: nejmén ě pět koncentrací, které jsou 
odstupňovány faktorem nep řevyšujícím 2,2 a které pokrývají 
rozsah mortality od 0 % do 100 %,  
— voda: viz 1.6.1.2,  
— osvětlení: osv ětlení 12 až 16 hodin denn ě, 
— teplota: podle druhu ryb (dopln ěk 2), avšak v rámci dané 
zkoušky kolísající v toleranci ± 1  o C, 
— koncentrace rozpušt ěného kyslíku: ne nižší než 60 % hodnoty 
nasycení vzdušným kyslíkem p ři dané teplot ě, 
— krmení: žádné.  
Ryby se kontrolují po prvních 2 až 4 hodinách a dále nejmén ě 
každých 24 hodin. Ryby se považují za mrtvé, jestliže p ři dotyku 
ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné 
dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, 
a úhyn se zaznamená. Zaznamenají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, zm ěny v plavání, chování, v dýchací funkci, 
v pigmentaci atd.).
 
Měření pH, obsahu rozpušt ěného kyslíku a teploty se provádí denn ě. 
Limitní zkouška  
S využitím postup ů popsaných v této metod ě může být provedena 
limitní zkouška s koncentrací 100 mg/l s cílem prokázat, že LC  5o je 
vyšší než tato koncentrace.  
Je-li povaha zkoušené látky taková, že ve vod ě nelze dosáhnout 
koncentrace 100 mg/l, provede se limitní zkouška p ři koncentraci 
odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo p ři 
maximální koncentraci, kdy látka vytvá ří stálou disperzi) (viz také 
bod 1.6.1.1).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Limitní zkouška se provede se 7 až 10 rybami a se stejným po čtem 
ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozd ělení je 
při použití 10 ryb a p ři nulové mortalit ě 99,9 % pravd ěpodobnost, že 
je LC  50 větší než 100 mg/l. P ři 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová 
mortalita nejmén ě 99 % pravd ěpodobnost, že je LC  50 větší než 
koncentrace použitá v limitní zkoušce.)  
Dojde-li k úhyn ům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány 
subletální ú činky, zaznamenají se.  
2. DATA A HODNOCENÍ  
Na pravd ěpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy 
byla provád ěna pozorování (24, 48, 72 a 96 hodin), vynese pro 
každou dobu expozice mortalita v procentech proti koncentraci.  
Pokud je to možné, odhadnou se standardními postupy pro každou 
délku expozice hodnoty LC  50 a meze spolehlivost (p = 0,05); tyto 
hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dv ě platné číslice 
(příklad zaokrouhlení na dv ě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 
170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).  
V případech, kdy je sklon k řivky závislosti mortality v procentech na 
koncentraci látky p říliš strmý, aby umožnil výpo čet hodnoty LC  50 , 
postačuje grafický odhad této hodnoty.  
Jestliže dv ě po sob ě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 
vyvolají mortalitu 0 a 100 %, jsou dostate čnou informací o tom, 
že se LC  50 nachází mezi t ěmito hodnotami.  
Zjistí-li se, že není možné udržet stálost nebo homogenitu zkoušené 
látky, uvede se to ve zpráv ě a výsledky se interpretují s opatrností.  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— údaje o zkušebních rybách (v ědecký název, kmen, dodavatel, 
veškerá p ředchozí ošet ření, velikost a po čet ryb použitých p ři 
každé zkušební koncentraci),  
— zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, tvrdost, 
teplota),  
— u látek s malou rozpustností ve vod ě údaj o metod ě přípravy 
zásobních a zkušebních roztok ů, 
— koncentrace všech pomocných látek,  
— přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace 
o stálosti zkoušené látky ve zkušebním roztoku p ři použitých 
koncentracích,  
— jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých 
metodách a získané výsledky,  
— výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena,  
— důvody pro volbu použitého zkušebního postupu a podrobnosti 
o něm (např. statický, semistatický, dávkování, pr ůtoková rych ­
lost, zda byla voda provzduš ňována obsádka ryb atd.),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— popis zkušebního za řízení,  
— světelný režim,  
— koncentrace rozpušt ěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušeb ­
ních roztok ů každých 24 hodin,  
— důkaz, že byla spln ěna kritéria jakosti,  
— tabulka kumulativních hodnot mortality p ři každé koncentraci 
a při kontrolní zkoušce (a pop řípadě při kontrolní zkoušce 
s pomocnou látkou) p ři každé z doporu čených dob pozorování,  
— graf k řivky závislosti ú činku, vyjád řeného v procentech, na 
koncentraci na konci zkoušky,  
— podle možnosti hodnoty LC  50 při každé z doporu čených dob 
pozorování (p ři 95 % intervalu spolehlivosti),  
— použité statistické metody stanovení hodnot LC  50 , 
— při použití referen ční látky údaj o získaných výsledcích,  
— nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky 
úhyn ryb,  
— nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 
100 % mortalitu.  
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates.  
2) AFNOR -Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio  -Static and Flow Through methods – NFT 
90-303 June 1985.  
3) AFNOR- Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri  -Static and Flow – Through methods – NFT 
90-305 June 1985.  
4) ISO 7346/1,/2 and/3 -Water Quality -Determination of the acute 
lethal toxicity of substances to a fresh water fish ( Brachydanio 
rerio  Hamilton-Buchanan -Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static 
method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through 
method.  
5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungs ­
methoden – Part II 1974.  
6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 
(15).  
7) JIS k 0102, Acute toxicity test for fish.  
8) NEN 6506- Water -Bepaling van de akute toxiciteit met behulp 
van Poecilia reticulata , 1980.  
9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
 
10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 
fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test 
programme concerning the study of the ecotoxicityof a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979.
 
14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grund ­
lagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
15) Litchfield, J. T .and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, tExp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
 
16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
17) Sprague, J .B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793–821.
 
18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utili ­
sing and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 
3–32.  
19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634, 1977, 65–84.
 
20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Doplněk 1 
Upravená voda  
Příklad vhodné ředicí vody  
Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.  
Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 
μS/cm.  
Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné m ěděné části. 
Zásobní roztoky  
CaCl  2 . 2H  2 O (chlorid vápenatý dihydrát) 
se rozpustí ve vod ě a doplní vodou na 1 litr. 11,76 g 
MgSO  4 . 7H  2 O (síran ho řečnatý heptahydrát) 
se rozpustí ve vod ě a doplní vodou na 1 litr. 4,93 g 
NaHCO  3 (hydrogenuhli čitan sodný) 
se rozpustí ve vod ě a doplní vodou na 1 litr. 2,59 g 
KCl (chlorid draselný) 
se rozpustí ve vod ě a doplní vodou na 1 litr. 0,23 g  
Upravená ředicí voda  
Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztok ů a doplní vodou na 1 litr.  
Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpušt ěného kyslíku neodpovídá koncen ­
traci nasycení vzdušným kyslíkem.  
pH musí být 7,8 ± 0,2.  
Podle pot řeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina 
chlorovodíková).  
Tato ředicí voda se nechá 12 hodin stát a nemusí být dále provzduš ňována.  
Koncentrace úhrnu iont ů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol/l. Pom ěr množ­
ství iontů Ca: Mg je 4:1 a pom ěr množství iont ů Na:k je 10:1. Celková koncent ­
race alkalických kov ů v tomto roztoku je 0,8 mmol/l.  
Jakákoli odchylka v p řípravě vody k ředění nesmí zm ěnit složení ani vlastnosti 
vody.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Doplněk 2 
Druhy ryb doporu čené pro zkoušení  
Doporučený druh Doporučený 
rozsah teplot p ři 
zkoušce (  o C) Doporučená 
celková délka ryb 
(cm) 
Brachydanio rerio  (Teleostei, Cyprinidae ) 
(Hamilton-Buchanan), danio pruhované 20 až 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas  (Teleostei, Cyprinidae ) 
(Rafinesque), st řevle 20 až 24 5,0 ± 2,5  
Cyprinus carpio  (Teleostei, Cyprinidae ) 
(Linneaus 1758), kapr obecný 20 až 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes  (Teleostei, Poeciliidae ) 
Cyprinodontidae (Tomminck and Schlege 
1850), halan čík japonský 20 až 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata  (Teleostei, Poeciliidae ) 
(Peters 1859), živorodka duhová 20 až 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus  (Teleostei, Centrar ­
chidae)  (Rafinesque Linneaus 1758), 
slunečnice modrá 20 až 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss  (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988), pstruh duhový 12 až 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus  (Teleostei, Cyprinidae ) (Lin­
neaus 1758), jelec jesen 20 až 24 6,0 ± 2,0  
Opatřování ryb  
Ryby uvedené v seznamu se snadno chovají nebo jsou dob ře dostupné po celý 
rok. Lze je množit a chovat bu ď v rybích farmách, nebo v laborato ři za kontro ­
lovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé 
a byly známého p ůvodu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech sv ěta. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Doplněk 3 
Příklad křivky závislosti mortality, vyjád řené v procentech, na koncentraci  
Příklad stanovení LC  50 na pravděpodobnostním logaritmickém papíru
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. ZKOUŠKA AKUTNÍ IMOBILIZACE DAFNIÍ ( DAPHNIA  SP.)  
1. METODA  
Tato zkušební metoda akutní imobilizace je ekvivalentní testu OECD 
TG 202 (2004).  
1.1. ÚVOD  
Tato metoda popisuje zkoušku akutní toxicity ke stanovení ú činku 
chemických látek na dafnie. Stávající zkušební metody byly užity 
v největším možném rozsahu (1, 2, 3).  
1.2. DEFINICE  
V kontextu této metody jsou použity tyto definice:  
EC 50 : je koncentrace odhadnutá pro imobilizaci 50 % dafnií b ěhem 
stanovené expozi ční doby. Je-li použita jiná definice, musí to být 
uvedeno spolu s p říslušným odkazem.  
Imobilizace:  Dafnie neschopné plavat do 15 sekund po mírném 
zamíchání zkušební nádoby jsou pokládány za imobilizované (a to 
i když stále ješt ě mohou hýbat tykadly).  
1.3. PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY  
Mladé dafnie, staré mén ě než 24 hodin p ři zahájení zkoušky, jsou 
vystaveny zkoušené látce v ur čitém rozsahu koncentrací po dobu 48 
hodin. Imobilizace je zaznamenána po 24 hodinách a po 48 hodinách a porovnána s kontrolními hodnotami. Výsledky jsou analyzovány 
s cílem vypo číst hodnotu EC
 50 po 48 hodinách (viz definici v oddílu 
1.2). Stanovení hodnoty EC  50 pro 24 hodin je volitelné.  
1.4. ÚDAJE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Pro zkoušenou látku by m ěla být známa rozpustnost ve vod ě a tenze 
par a spolehlivá analytická metoda ke stanovení koncentrace doty čné 
látky v zkoušeném roztoku s udanou ú činností znovuzáchytu a m ěly 
by být dostupné meze stanovení. Užite čné údaje zahrnují strukturní 
vzorec, čistotu látky, stabilitu ve vod ě nebo vůči světlu, rozdělovací 
koeficient P  ow a výsledky zkoušek snadné biologické rozložitelnosti 
(viz metoda C.4).  
Poznámka: Návod pro zkoušení látek s fyzikáln ě-chemickými vlast ­
nostmi, které činí jejich zkoušení obtížné, je uveden v položce 
seznamu literatury (4).  
1.5. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Hodnoty EC  50 pro referen ční látky mohou být zm ěřeny pro ov ěření, 
že zkušební podmínky jsou spolehlivé. K tomuto ú čelu jsou doporu ­ 
čeny toxické látky použité v mezinárodních mezilaboratorních zkou ­ 
škách (1, 5) (  1 ). Zkoušky s referen čními látkami by m ěly být 
prováděny přednostně každý m ěsíc a nejmén ě dvakrát ro čně. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Výsledky t ěchto mezilaboratorních zkoušek a technická oprava normy ISO 6341 udává 
EC 50 – 24 hodin pro dvojchroman draselný (K  2 Cr 2 O 7 ) v rozmezí 0,6 mg/l až 1,7 mg/l.
 1.6. KRITÉRIA JAKOSTI  
Platnost zkoušky je podmín ěna splněním následujících kritérií:  
— při kontrolách, v četně kontroly zahrnující solubiliza ční činidlo, 
nesmí být imobilizováno více než 10 % dafnií,  
— koncentrace rozpušt ěného kyslíku na konci zkoušky musí být ≥ 
3 mg/l v kontrolní i ve zkušební nádob ě. 
Poznámka: Pro první kritérium smí být imobilizováno nebo 
vykazovat jiné známky choroby nebo stresu, nap ř. odbarvení, neob ­
vyklé chování jako nap ř. zdržování se na povrchu vody, ne více než 
10 % kontrolních dafnií.  
1.7. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.7.1.  Aparatura  
Zkušební nádoby a další aparatura, která p řichází do styku se 
zkoušenými roztoky, by m ěla být zhotovena ze skla nebo z jiného 
chemicky inertního materiálu. Zkušebními nádobami b ěžně budou 
skleněné zkumavky či kádinky; p řed každým použitím by m ěly 
být umyty standardními laboratorními postupy. Zkušební nádoby by měly být voln ě překryty ke snížení ztrát vody odparem a k p řed­
cházení vnikání prachu do roztok ů. Těkavé látky by m ěly být zkou ­ 
šeny v pln ě zaplněných a uzav řených nádobách dostate čně velkých 
k předcházení p říliš nízkým nebo limitním koncentracím kyslíku (viz 
oddíl 1.6 nebo první odstavec oddílu 1.8.3).
 
Navíc budou použity n ěkteré nebo všechna následující za řízení: 
kyslíková sonda (s mikroelektrodou nebo jiným vhodným čidlem 
pro měření koncentrace rozpušt ěného kyslíku v nízkoobjemových 
vzorcích); pH-metr; dostate čný termostat; vybavení pro stanovení 
koncentrace celkového organického uhlíku (TOC), vybavení pro 
stanovení chemické spot řeby kyslíku (ChSK); vybavení pro stano ­
vení tvrdosti atd.  
1.7.2.  Zkušební organismy  
Preferovaným zkušebním druhem je  Daphnia magna  Straus, a čkoli 
v této zkoušce lze využívat i další druhy dafnií (nap ř. Daphnia 
pulex ). Na za čátku zkoušky by dafnie m ěly být mén ě než 24 
hodin staré a ke snížení rozptylu je siln ě doporučeno nepoužívat 
první generaci potomk ů. Dafnie by m ěly pocházet ze zdravého 
matečného rodu (tj. bez p říznaků stresu, jako jsou vysoká úmrtnost, 
přítomnost samc ů nebo efipií (vají ček dafnií), zpožd ění líhnutí 
prvních potomk ů, změna barvy organism ů atd.). Všechny organismy 
použité konkrétní zkoušky by m ěly pocházet z kultur vyp ěstovaných 
ze stejného mate čného rodu. Tento rod dafnií musí být chován 
v kultiva čních podmínkách (sv ětlo, teplota, médium) podobných 
podmínkám v použité zkoušce. Má-li být kultiva ční médium dafnií 
použité ve zkoušce odlišné od rutinního kultiva čního média dafnií, je 
správnou praxí za řadit předzkouškové aklimatiza ční období. 
K tomuto ú čelu by generace dafnií m ěla být chována ve z řeďovací 
vodě při teplotě zkoušky, a to nejmén ě 48 hodin p řed začátkem 
zkoušky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Zásobní voda a z řeďovací voda  
Přírodní voda (povrchová nebo podzemní), rekonstituovaná voda 
nebo odchlorovaná vodovodní voda je p řijatelná jako zásobní 
a zřeďovací voda, pokud v ní dafnie p řežijí po dobu kultivace, 
aklimatizace a zkoušení bez známek stresu. Jako zkušební voda je 
přijatelná jakákoli voda, která vyhovuje chemickým vlastnostem 
přijatelných z řeďovacích vod uvedeným v dodatku 1. M ěla by mít 
stálou jakost b ěhem doby zkoušení. Rekonstituovaná voda m ůže být 
připravena p řídavkem ur čitého množství reagencií uznané analytické 
čistoty k deionizované nebo destilované vod ě. Příklady rekonstitu ­
ované vody jsou uvedeny v položkách seznamu literatury (1, 6) a v 
dodatku 2. D ůležité je, že média obsahující známá chelata ční činidla, 
např. média M4 a M7 uvedená v dodatku 2, by m ěla být vylou čena 
ze zkoušení látek obsahujících kovy. Hodnoty pH by m ěly ležet 
v rozmezí 6 až 9. Pro  Daphnia magna  je doporu čena tvrdost mezi 
140 a 250 mg/l (jako CaCO  3 ), zatímco pro jiné druhy dafnií m ůže 
být vhodná nižší tvrdost. Z řeďovací voda m ůže být před zkouškou 
provzdušňována tak, aby koncentrace rozpušt ěného kyslíku dosáhla 
koncentrace nasycení.  
Je-li použita p řírodní voda, parametry jakosti by m ěly být m ěřeny 
nejméně dvakrát ro čně nebo kdykoli vznikne podez ření, že se tyto 
parametry mohly významn ě změnit (viz p ředchozí odstavec 
a dodatek 1). Rovn ěž by mělo být provedeno stanovení t ěžkých 
kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Je-li použita odchlorovaná 
vodovodní voda, je žádoucí každodenní analýza chloru. Pochází-li zřeďovací voda ze zdroj ů povrchových nebo podzemních vod, m ěla 
by být stanovena vodivost a celkový organický uhlík (TOC) nebo 
chemická spot řeba kyslíku (ChSK).
 
1.7.4.  Zkoušené roztoky  
Zkoušené roztoky zvolené koncentrace jsou obvykle p řipraveny 
ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky by m ěly být připraveny 
přednostně rozpuštěním zkoušené látky ve z řeďovací vod ě. Použí­
vání rozpoušt ědel, emulga čních a disperga čních činidel by m ělo být 
podle možností vylou čeno. V n ěkterých p řípadech však mohou být 
takováto činidla nutná k p řípravě vhodně koncentrovaného zásobního 
roztoku. Pokyny k výb ěru vhodných rozpoušt ědel, emulga čních 
a disperga čních činidel jsou uvedeny v položce seznamu literatury 
(4). V žádném p řípadě by koncentrace zkoušené látky ve zkoušených 
roztocích nem ěla překročit rozpustnost ve z řeďovací vod ě. 
Zkouška by m ěla být provedena bez úpravy pH. Nez ůstane-li pH 
v rozmezí 6–9, lze provést druhou zkoušku s upraveným pH zásob ­
ního roztoku na hodnotu pH z řeďovací vody p řed přidáním zkoušené 
látky. Hodnota pH zásobního roztoku by m ěla být upravena tak, aby 
se koncentrace zásobního roztoku významn ě nezměnila a aby 
nedošlo k žádné chemické reakci se zkoušenou látkou nebo 
k jejímu vysrážení. Up řednostněny jsou HCl a NaOH.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. POSTUP  
1.8.1.  Podmínky expozice  
1.8.1.1.  Zkoušené skupiny a kontroly  
Zkušební nádoby jsou napln ěny vhodným objemem z řeďovací vody 
a roztoku zkoušené látky. Pom ěr objemů vzduchu a vody v nádob ě 
by měl být stejný pro zkušební i kontrolní skupinu. Dafnie jsou pak 
vneseny do zkušební nádoby. Pro každou zkoušenou koncentraci a pro kontroly by m ělo být užito p řinejmenším 20 organism ů, před­
nostně rozdělených do čtyř skupin s p ěti organismy v každé skupin ě. 
Na každý organismus by m ělo být dáno nejmén ě 2 ml zkoušeného 
roztoku (tj. objem 10 ml pro p ět dafnií ve zkušební nádob ě). 
Zkouška m ůže proběhnout semistaticky dopl ňováním roztoku nebo 
v průtočném systému, pokud koncentrace zkoušené látky není 
stabilní.
 
Navíc k expozi ční řadě musí být provedena jedna řada kontrol 
zřeďovací vody, a je-li to relevantní, tak též kontrolní řada obsahující 
solubiliza ční činidlo.  
1.8.1.2.  Zkušební koncentrace  
Nejsou-li dostupné údaje o toxicit ě zkoušené látky, lze rozsah 
koncentrací kone čné zkoušky stanovit testem pro stanovení rozsahu. 
K tomuto ú čelu jsou dafnie exponovány řadě široce odstup ňovaných 
koncentrací zkoušené látky. Každé zkušební koncentraci by m ělo být 
exponováno p ět dafnií po dobu 48 hodin nebo mén ě, replikace 
nejsou zapot řebí. Expozi ční dobu lze zkrátit (nap ř. na 24 hodin 
nebo mén ě), lze-li vhodné údaje pro test ke stanovení rozsahu získat 
v kratší dob ě. 
Mělo by být použito nejmén ě pět zkušebních koncentrací. Ty by 
měly tvořit geometrickou řadu s dělícím faktorem p řednostně nepře­
sahujícím 2,2. Použití mén ě než pěti koncentrací by m ělo být 
zdůvodněno. Nejvyšší zkoušená koncentrace by m ěla přednostně 
vést ke 100 % imobilizaci, a nejnižší zkoušená koncentrace by neměla mít žádné pozorovatelné ú činky.
 
1.8.1.3.  Inkuba ční podmínky  
Teplota by m ěla být v rozsahu 18  o C až 22  o C, a v každé jednotlivé 
zkoušce by m ěla být konstantní v rozp ětí ± 1  o C. Doporu čen je 
cyklus 16 hodin sv ětla a 8 hodin temna. Úplná tma je rovn ěž přija­
telná, zejména pro zkoušené látky nestabilní na sv ětle. 
Zkušební nádoby nesmí být b ěhem zkoušky provzduš ňovány. 
Zkouška probíhá bez úpravy hodnot pH. B ěhem zkoušky by dafnie 
neměly být krmeny.  
1.8.1.4.  Doba trvání zkoušky  
Doba trvání zkoušky je 48 hodin.  
1.8.2.  Pozorování  
V každé zkušební nádob ě by měl být zkontrolován po čet imobilizo ­
vaných dafnií po 24 a 48 hodinách po zahájení zkoušky (viz definice 
v oddílu 1.2). Krom ě imobilizace by m ělo být uvedeno jakékoli 
nestandardní chování nebo vzhled.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Analytická m ěření 
Koncentrace rozpušt ěného kyslíku a pH jsou m ěřeny na po čátku a na 
konci zkoušky v kontrolách a u zkoušky p ři nejvyšší koncentraci 
zkoušené látky. Koncentrace rozpušt ěného kyslíku v kontrolách by 
měla odpovídat kritériu platnosti (viz oddíl 1.6). Hodnota pH by se 
neměla standardn ě v žádné zkoušce zm ěnit o více než 1,5 jednotky. 
Teplota je obvykle m ěřena v kontrolních nádobách nebo v okolním 
ovzduší a m ěla by být registrována nejlépe nep řetržitě během zkou ­ 
šky, nebo alespo ň na začátku a na konci zkoušky.  
Koncentrace zkoušené látky by m ěla být měřena alespo ň při nejvyšší 
a nejnižší zkoušené koncentraci na za čátku a na konci zkoušky (4). 
Doporučeno je výsledky zakládat na m ěřených koncentracích. Jsou-li 
však dostupné d ůkazy prokazující, že b ěhem zkoušky byly koncent ­
race zkoušené látky uspokojiv ě udrženy s p řesností ± 20 % jmeno ­
vité koncentrace nebo z po čáteční naměřené koncentrace, lze 
výsledky zakládat na jmenovitých nebo po čátečních změřených 
hodnotách.  
1.9. MEZNÍ ZKOUŠKA  
Mezní zkouška m ůže být provedena postupy popsanými v této 
metodě při koncentraci zkoušené látky 100 mg/l nebo až p ři její 
mezní rozpustnosti ve zkoušeném médiu s cílem prokázat, že hodnota EC
 50 je vyšší než tato koncentrace. Mezní zkouška by 
měla být provedena s 20 dafniemi (p řednostně rozdělenými do čtyř 
skupin po p ěti organismech) se stejným po čtem v kontrole či 
v kontrolách. Dojde-li k jakékoli imobilizaci, m ěla by být provedena 
úplná studie. Pozorované nestandardní chování by m ělo být zazna ­
menáno.  
2. ÚDAJE  
Údaje by m ěly být shrnuty v tabulkách, uvád ějících pro každou 
exponovanou skupinu a kontrolu po čet použitých a z toho imobili ­
zovaných dafnií pro všechna pozorování. Procentní podíl imobilizo ­
vaných dafnií za 24 hodin a za 48 hodin je vynesen proti zkoušeným 
koncentracím. Údaje jsou analyzovány vhodnými statistickými meto ­
dami (nap ř. probit analýzou atd.) k výpo čtu směrnice doty čné křivky 
dávka – odezva a hodnot EC  50 s 95 % intervalem spolehlivosti (p = 
0,05) (7, 8).  
Nelze-li ze získaných údaj ů vypočíst EC  50 standardními metodami, 
měla by být hodnota EC  50 aproximována jako geometrická st řední 
hodnota z nejvyšší koncentrace nezp ůsobující žádnou imobilizaci 
a nejnižší koncentrace zp ůsobující 100 % imobilitu.  
3. ZPRÁVY  
3.1. ZKUŠEBNÍ PROTOKOL  
Zkušební protokol musí obsahovat toto:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha, fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— chemické identifika ční údaje v četně čistoty.  
Zkušební druhy:  
— zdroj a druhy dafnií  Daphnia , dodavatel zdroje (je-li znám) 
a použité kultiva ční podmínky (v četně zdroje, druhu 
a množství potravy a frekvence krmení).  
Zkušební podmínky:  
— popis zkušební nádoby: typ nádoby, objem roztoku, po čet dafnií 
ve zkušební nádob ě, počet zkušebních nádob (replikací) p ři dané 
koncentraci,  
— metody p řípravy zásobních a zkoušených roztok ů včetně použití 
jakýchkoli rozpoušt ědel nebo disperga čních činidel, použité 
koncentrace,  
— podrobné údaje o z řeďovací vod ě: zdroj a charakteristiky jakosti 
vody (pH, tvrdost, pom ěr Ca/Mg a Na/K, alkalita, vodivost atd.); 
složení rekonstituované vody, je-li použita,  
— inkuba ční podmínky: teplota, intenzita a periodicita sv ětla, 
koncentrace rozpušt ěného kyslíku, pH atd.  
Výsledky:  
— počet a procentní podíl dafnií imobilizovaných nebo vykazujících 
nepříznivé účinky (včetně nestandardního chování) v kontrolách 
a v každé exponované skupin ě, v každém pozorovacím čase 
a popis povahy pozorovaných ú činků, 
— výsledky a datum zkoušky provedené s referen ční látkou, jsou-li 
dostupné,  
— jmenovité zkoušené koncentrace a výsledky všech analýz ke 
stanovení koncentrace zkoušené látky ve zkušebních nádobách; 
regenerační účinnost metody a mez stanovení by rovn ěž měla být 
uvedena,  
— veškerá fyzikáln ě-chemická m ěření teploty, pH a koncentrace 
rozpuštěného kyslíku provedená b ěhem zkoušky,  
— hodnoty EC  50 po 48 hodinách pro imobilizaci s uvedením inter ­
valu spolehlivosti a graf ů proloženého modelu použitého pro 
jejich výpo čet, směrnice křivek dávka – odezva a jejich stan ­
dardní odchylka; statistické postupy použité ke stanovení hodnoty EC
 50 (pokud byly m ěřeny tyto datové položky i pro 
24 hodin, m ěly by být rovn ěž uvedeny),  
— vysvětlení jakýchkoli odchylek od této zkušební metody 
a případné ovlivn ění výsledk ů těmito odchylkami.  
4. LITERATURA  
1) ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, Crus ­
tacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 
23. Paris 2000.
 
5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daph­
nia.
 
6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society 
for Testing and Materials. s. 65–84.
 
8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
DODATEK 1  
NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY P ŘIJATELNÉ 
ZŘEĎOVACÍ VODY  
Látka Koncentrace  
Hmotné částice (prach) < 20 mg/l 
Celkový organický uhlík < 2 mg/l 
Volný (neiontový) amoniak < 1 μg/l 
Zbytkový chlor < 10 μg/l 
Celkové organofosforové pesticidy < 50 ng/l Celkové organické chlorované pesticidy a polychlorované 
bifenyly < 50 ng/l 
Celkový organicky vázaný chlor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
DODATEK 2  
PŘÍKLADY VHODNÉ REKONSTITUOVANÉ ZKUŠEBNÍ VODY  
Zkušební voda ISO (1)  
Zásobní roztok (jednotlivé látky) K přípravě rekonstituované 
vody přidejte následující objem 
zásobních roztok ů k 1 litru 
vody (*) Látka Navážka p řidaná k 1 litru 
vody (*)  
Chlorid vápenatý 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Síran hořečnatý 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Hydrouhli čitan sodný 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Chlorid draselný 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Voda vhodné čistoty, nap ř. deionizovaná, destilovaná nebo čištěná reversní osmosou 
s vodivostí nep řesahující 10 μS/cm.  
Elendtovo médium M7 a M4  
Aklimatizace na Elendtova média M4 a M7  
V některých laborato řích nastaly potíže s p římým vnášením dafnií do médií M4 
a M7. Ur čitý úspěch však byl dosažen postupnou aklimatizací, tj. s p ředáním 
z vlastního média do 30 % Elendtova média, poté do 60 % Elendtova média a nakonec do 100 % Elendtova média. Pot řebné délky dob aklimatizace mohou 
být až m ěsíc.
 
Příprava  
Stopové prvky  
Ve vodě vhodné čistoty, nap ř. v deionizované nebo destilované vod ě nebo ve 
vodě přečištěné reversní osmosou, se nejprve p řipraví samostatné zásobní roztoky 
(I) jednotlivých stopových prvk ů. Z těchto oddělených zásobních roztok ů (I) se 
připraví jeden zásobní roztok (II) obsahující všechny stopové prvky (sm ěsný 
roztok), tj.:  
Zásobní roztoky I (jednotlivá 
látka) Množství p řidané do 
vody (mg/l) Koncentrace (vzhledem 
k médiu M4) Kombinovaný zásobní roztok II se p řipraví 
přidáním následujícího množství zásobního 
roztoku I do vody (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 4H 2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Zásobní roztoky I (jednotlivá 
látka) Množství p řidané do 
vody (mg/l) Koncentrace (vzhledem 
k médiu M4) Kombinovaný zásobní roztok II se p řipraví 
přidáním následujícího množství zásobního 
roztoku I do vody (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 
SrCl  2 6H 2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 2H 2 O 1 230 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 2H 2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 6H 2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA 2H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 7H 2 O 1 991 2 000 — — 
Jak roztok Na 2 EDTA, tak roztok FeSO  4 se připraví samostatn ě, spojí se a ihned se autoklávují. 
Získají se: 
2 l Fe-EDTA roztoku 1 000 20,0 5,0  
Média M4 a M7  
Média M4 a M7 se p řipraví ze zásobního roztoku II, makroživin a vitamin ů tímto 
způsobem:  
Množství p řidané do 
vody (mg/l) Koncentrace (vzhledem 
k médiu M4) Množství zásobního roztoku p řidané za ú čelem 
přípravy média II (ml/l) 
M4 M7  
Zásobní roztok II (obsahu ­
jící kombinaci stopových 
prvků) 20 50 50 
Zásobní roztok makroživin 
(jednotlivá látka) 
CaCl  2 · 2H  2 0 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Množství p řidané do 
vody (mg/l) Koncentrace (vzhledem 
k médiu M4) Množství zásobního roztoku p řidané za ú čelem 
přípravy média II (ml/l) 
M4 M7  
Kombinovaný vitaminový 
zásobní roztok — 10 000 0,1 0,1 
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se p řipraví přidáním 3 vitamin ů do 1 litru vody takto: 
Thiamin-hydrochlorid 750 10 000 
Kyanokobalamin (B  12 ) 10 10 000 
Biotin 7,5 10 000  
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se uchovává v malých zmrazených 
podílech. Vitaminy se p řidají do média krátce p řed použitím.  
Poznámka: Vysrážení solí p ři přípravě kompletního média se zabrání p řidáním 
podílů zásobních roztok ů do přibližně 500–800 ml deionizované 
vody a objem se poté doplní na 1 litr.  
Poznámka: Poprvé byly informace o médiu M4 uvedeny v práci Elendt, B. 
P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual 
approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. 
Protoplasma, 154, 25–33.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3 ZKOUŠKA INHIBICE R ŮSTU SLADKOVODNÍCH ŘAS A SINIC  
1. METODA  
Tato metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 201 (2006) (1).  
1.1 ÚVOD  
Zkušební metody se pravideln ě přezkoumávají a aktualizují 
s ohledem na v ědecký pokrok. Zkušební metoda C.3 musela být 
přepracována tak, aby zahrnovala další druhy a spl ňovala požadavky 
na hodnocení nebezpe čnosti a klasifikace chemických látek. P řepra­
cování bylo dokon čeno na základ ě rozsáhlých praktických zkuše ­
ností, vědeckého pokroku na poli studií toxicity řas a širokého uplat ­ 
ňování příslušných právních p ředpisů od přijetí původního zn ění. 
1.2 DEFINICE  
Pro účely této zkušební metody se používají následující definice 
a zkratky:  
Biomasa : je suchá hmotnost živé hmoty p řítomné v populaci vyjád ­ 
řená ve vztahu k danému objemu; nap ř. mg řas/litr zkušebního 
roztoku. „Biomasa“ je obvykle definována jako hmota, ale v rámci 
této zkoušky se toto slovo používá pro hmotu vztaženou na objem. 
V této zkoušce se obvykle m ěří náhrady biomasy, nap říklad počet 
buněk, fluorescence atd., a používání termínu „biomasa“ tedy odka ­
zuje na tyto náhradní míry.  
Variační koeficient : je bezrozm ěrná veličina proměnlivosti parame ­
tru, definovaná jako pom ěr směrodatné odchylky a st řední hodnoty. 
Lze jej rovn ěž vyjádřit jako procentuální údaj. St řední varia ční koefi­
cient průměrné specifické r ůstové rychlosti v kontrolních kulturách 
použitých k opakování se vypo čítává následovn ě: 
1) Vypočítejte % varia ční koeficient pr ůměrné specifické r ůstové 
rychlosti z denních r ůstových rychlostí nebo r ůstových rychlostí 
po jednotlivých časových úsecích pro p říslušné opakování.  
2) Vypočítejte střední hodnotu ze všech hodnot vypo čítaných v bod ě 
1 pro získání st ředního varia čního koeficientu denní specifické 
růstové rychlosti nebo specifické r ůstové rychlosti po jednotli ­
vých časových úsecích v kontrolních kulturách použitých 
k opakování.  
EC x : je koncentrace zkoušené látky rozpušt ěné ve zkušebním médiu, 
která pro danou expozi ční dobu vede k x% (nap ř. 50 %) snížení 
růstu testovacího organismu (musí se výslovn ě uvést, pokud se 
odchyluje od plné či normální doby trvání zkoušky). Pro jedno ­
značný popis hodnoty EC odvozené z r ůstové rychlosti nebo 
z výtěžku se v p říslušných p řípadech používají symboly „E  r C“ 
a „E  y C“. 
Růstové médium : je úplné syntetické kultiva ční médium, v n ěmž 
rostou zkušební řasy při expozici zkoušené látce. Zkoušená látka 
bude za normálních podmínek ve zkušebním médiu rozpušt ěna. 
Růstová rychlost (pr ůměrná specifická r ůstová rychlost) : je loga­
ritmické zvýšení biomasy b ěhem období expozice.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Nejnižší koncentrace s pozorovanými ú činky (Lowest Observed 
Effect Concentration, LOEC) : je nejnižší zkušební koncentrací, p ři 
níž je pro danou expozi ční dobu pozorován statisticky významný 
účinek látky na snížení r ůstu (na hladin ě spolehlivosti p < 0,05) 
ve srovnání s kontrolou. Všechny zkušební koncentrace vyšší než 
LOEC musí však mít stejné nebo vážn ější škodlivé ú činky, než jsou 
účinky pozorované p ři koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dv ě 
podmínky splnit, musí být podrobn ě vysvětleno, jak byla LOEC (a 
tedy i NOEC) zvolena.  
Koncentrace bez pozorovaných ú činků (No Observed Effect 
Concentration, NOEC) : je zkušební koncentrace bezprost ředně 
nižší než LOEC.  
Proměnná odezvy : je prom ěnná pro odhad toxicity odvozená 
z jakýchkoliv nam ěřených parametr ů, jež popisují biomasu, r ůznými 
metodami výpo čtu. U této metody jsou prom ěnnými odezvy r ůstová 
rychlost a výt ěžek, které se odvozují p římo z měření biomasy nebo 
jakékoliv z uvedených náhrad.  
Specifická r ůstová rychlost : je prom ěnná odezvy definovaná jako 
kvocient rozdílu p řirozených logaritm ů sledovaného parametru (v 
této zkušební metod ě je jím biomasa) a p říslušného časového období.  
Výtěžek: je hodnota prom ěnné měření na konci expozi ční doby 
minus hodnota prom ěnné měření na po čátku expozi ční doby pro 
vyjádření nárůstu biomasy b ěhem zkoušky.  
1.3 POUŽITELNOST ZKUŠEBNÍ METODY  
Tato zkušební metoda se nejsnadn ěji používá pro látky rozpustné ve 
vodě, které za podmínek zkoušky pravd ěpodobně ve vodě zůstanou. 
Pro zkoušení látek, které jsou t ěkavé, siln ě adsorbují, jsou zbarvené, 
mají nízkou rozpustnost ve vod ě, nebo látek, které mohou nep říznivě 
ovlivňovat dostupnost živin či minerálů ve zkušebním médiu, mohou 
být potřebné určité úpravy popsaného postupu (nap ř. uzavřený 
systém, klimatizace zkušebních nádob). Pokyny k n ěkterým 
vhodným úpravám jsou uvedeny v literatu ře (2, 3 a 4).  
1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Účelem této zkoušky je stanovit ú činek látky na r ůst sladkovodních 
mikrořas a/nebo sinic. Exponenciáln ě rostoucí testovací organismy 
jsou vystaveny zkoušené látce v dávkových kulturách obvykle po dobu 72 hodin. Navzdory relativn ě krátké dob ě trvání zkoušky lze 
posoudit ú činky na n ěkolik generací.
 
Systémovou odezvou je snížení r ůstu v řadě kultur řas (zkušebních 
jednotek) vystavených r ůzným koncentracím zkoušené látky. Odezva 
se vyhodnocuje jako funkce expozi ční koncentrace v porovnání 
s průměrným růstem neexponovaných kontrolních kultur použitých 
k opakování. Pro plné vyjád ření systémové odezvy na toxické 
účinky (optimální citlivost) se kultury ponechají r ůst exponenciáln ě 
bez omezení za dostate čných vyživovacích podmínek a nep řetržitého 
osvětlení po dostate čnou dobu, aby bylo možné zm ěřit snížení speci ­
fické růstové rychlosti.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Růst a inhibice r ůstu se kvantifikují m ěřeními biomasy řas jakožto 
funkce času. Biomasa řas se definuje jako suchá hmotnost na objem, 
např. mg řas/litr zkušebního roztoku. Ovšem suchá hmotnost se m ěří 
obtížně, proto se používají náhradní parametry. Z t ěchto náhrad se 
nejčastěji používají po čty buněk. Mezi další náhradní parametry pat ří 
buněčný objem, fluorescence, optická hustota atd. Je t řeba znát 
přepočítávací faktor mezi nam ěřeným náhradním parametrem 
a biomasou.  
Zkoumaným ú činkem je inhibice r ůstu vyjád řená jako logaritmické 
zvýšení biomasy (pr ůměrná specifická r ůstová rychlost) b ěhem expo ­
ziční doby. Z pr ůměrných specifických r ůstových rychlostí zazname ­
naných v řadě zkušebních roztok ů se stanoví koncentrace zp ůsobující 
stanovenou x% inhibici r ůstové rychlosti (nap ř. 50 %) a vyjád ří se 
jako E  r C x (např. E r C 50 ). 
Při použití této metody v rámci práva EU by m ěl být výpo čet 
výsledků založen na pr ůměrné specifické r ůstové rychlosti, a to 
z důvodů uvedených v bod ě 2.2. Další prom ěnnou odezvy použitou 
v této zkušební metod ě je výtěžek, který m ůže být nutný ke spln ění 
specifických právních požadavk ů v některých zemích. Je definován 
jako biomasa na konci expozi ční doby minus biomasa na po čátku 
expoziční doby. Z výt ěžku zaznamenaného v řadě zkušebních 
roztoků se vypočítá koncentrace zp ůsobující stanovenou x% inhibici 
výtěžku (např. 50 %) a vyjád ří se jako E  y C x (např. E y C 50 ). 
Kromě toho se m ůže statisticky ur čit nejnižší koncentrace 
s pozorovanými ú činky (LOEC) a koncentrace bez pozorovaných 
účinků (NOEC).  
1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro ú čely stanovení 
zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota, stálost 
na světle, stálost v podmínkách zkoušky, vlastnosti sv ětelné 
absorpce, p K a a výsledky studií transformace v četně biologické 
rozložitelnosti ve vod ě. 
Měly by být známy rozpustnost zkoušené látky ve vod ě, její rozd ě­
lovací koeficient oktanol/voda ( P o/v ) a tlak jejích par a m ěla by být 
k dispozici validovaná metoda kvantitativního stanovení látky ve 
zkušebních roztocích, a to s doloženou výt ěžností a mezí detekce.  
1.6 REFEREN ČNÍ LÁTKA  
Jako prost ředek kontroly zkušebního postupu lze zkoušet referen ční 
látku (látky), nap říklad 3,5-dichlorfenol použitý v mezinárodní 
kroužkové zkoušce (4). Dichroman draselný lze rovn ěž použít jako 
referenční látku pro zelené řasy. Je žádoucí zkoušet referen ční látku 
nejméně dvakrát ro čně. 
1.7 VALIDITA ZKOUŠKY  
Má-li být zkouška platná, musí být spln ěna tato kritéria reproduk ční 
schopnosti:  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Biomasa by se m ěla v kontrolních kulturách b ěhem 72hodinové 
zkušební doby zvýšit exponenciáln ě, a to nejmén ě šestnáctkrát. 
To odpovídá specifické r ůstové rychlosti 0,92 den  –1 . U nejčastěji 
používaných druh ů je obvykle r ůstová rychlost výrazn ě vyšší 
(viz dodatek 1). M ůže se stát, že se toto kritérium nesplní, 
pokud se používají druhy, které rostou pomaleji než druhy 
uvedené na seznamu v dodatku 1. V takovém p řípadě je třeba 
prodloužit zkušební dobu, aby bylo dosaženo nejmén ě šestnácti ­
násobného r ůstu kontrolních kultur, p řičemž růst musí být b ěhem 
zkušebního období exponenciální. Zkušební dobu lze zkrátit až 
na minimální dobu 48 hodin, aby se b ěhem zkoušky udržel 
neomezený exponenciální r ůst, pokud bude dosaženo minimál ­
ního násobícího koeficientu 16.  
— Střední varia ční koeficient pro specifické r ůstové rychlosti 
v jednotlivých obdobích (dny 0–1, 1–2 a 2–3 p ři 72hodinové 
zkoušce) v kontrolních kulturách (viz bod 1.2 odstavec „varia ční 
koeficient“) nesmí p řekročit 35 %. Pro výpo čet specifické 
růstové rychlosti v jednotlivých obdobích viz bod 2.2.1 druhý 
odstavec. Toto kritérium platí pro st řední hodnotu varia čních 
koeficient ů vypočítaných pro kontrolní kultury použité 
k opakování.  
— Variační koeficient pr ůměrných specifických r ůstových rychlostí 
během celého zkušebního období u kontrolních kultur použitých 
k opakování nesmí p řekročit 7 % u zkoušek 
s Pseudokirchneriella subcapitata  a Desmodesmus subspicatus . 
U jiných mén ě často zkoušených druh ů by hodnota nem ěla 
překročit 10 %.  
1.8 POPIS METODY  
1.8.1  Přístroje a pom ůcky 
Zkušební nádoby a jiné p řístroje a pom ůcky, které p řijdou do styku 
se zkušebními roztoky, by m ěly být celosklen ěné nebo z jiného 
chemicky inertního materiálu. Jednotlivé díly je zapot řebí důkladně 
vymýt, aby bylo zajišt ěno, že žádné organické ani anorganické ne čis­
toty nebudou moci narušovat r ůst řas nebo složení zkušebních 
roztoků. 
Zkušebními nádobami budou za normálních podmínek sklen ěné 
baňky takových rozm ěrů, aby pojaly dostate čný objem kultury pro 
měření během zkoušky a umožnily dostate čný hmotnostní p řenos 
CO 2 z atmosféry (viz bod 1.8.9 druhý odstavec). Je t řeba mít na 
paměti, že objem kapaliny musí být dosta čující pro analytická stano ­
vení (viz bod 1.8.11 pátý odstavec).  
Kromě toho bude pot řebné veškeré následující vybavení nebo jeho 
část: 
— Kultiva ční zařízení: doporu čuje se místnost nebo komora, v níž 
lze udržovat zvolenou inkuba ční teplotu na ±2 °C.  
— Přístroje na m ěření světla: je důležité mít na pam ěti, že metoda 
měření intenzity sv ětla a zejména typ sníma če (kolektoru) ovlivní 
naměřenou hodnotu. M ěření by se m ělo nejlépe provád ět pomocí 
kulového (4 π) snímače (reaguje na p římé a odražené sv ětlo ze 
všech úhl ů nad a pod rovinou m ěření), nebo 2 π snímače 
(reaguje na sv ětlo ze všech úhl ů nad rovinou m ěření). ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Zařízení pro stanovení biomasy řas. Počet buněk, který je nej čas­
těji používaným náhradním parametrem pro biomasu řas, lze 
určit pomocí elektronického po čítače částic, mikroskopu 
s počítací kom ůrkou nebo pr ůtokovým cytometrem. Další 
náhrady biomasy lze m ěřit průtokovým cytometrem, fluorime ­
trem, spektrofotometrem nebo kolorimetrem. Je užite čné 
vypočítat faktor pro konverzi po čtu buněk na suchou hmotnost. 
Aby bylo možné zajistit užite čná měření při nízkých koncentra ­
cích biomasy p ři použití spektrofotometru, m ůže vzniknout 
nutnost používat kyvety s dráhou sv ětla nejmén ě 4 cm.  
1.8.2  Testovací organismy  
Lze použít n ěkolik druh ů nevázaných mikro řas a sinic. Kmeny 
uvedené v dodatku 1 se ukázaly jako vhodné na základ ě zkušebního 
postupu uvedeného v této zkušební metod ě. 
Jestliže se použijí jiné druhy, je t řeba uvést ve zpráv ě kmen a/nebo 
původ. Musí se potvrdit, že lze udržovat exponenciální r ůst vybra­
ných zkušebních řas po zkušební dobu za p řevažujících podmínek.  
1.8.3  R ůstové médium  
Doporučují se dv ě alternativní r ůstová média, médium OECD 
a AAP. Složení t ěchto médií je uvedeno v dodatku 2. Je t řeba mít 
na paměti, že po čáteční hodnota pH a kapacita pufru (regulující 
zvýšení pH) t ěchto dvou médií jsou odlišné. Proto mohou být 
výsledky zkoušek odlišné v závislosti na použitém médiu, zejména při zkoušení ionizujících látek.
 
Pro určité účely může být nezbytná úprava r ůstových médií, nap ř. 
když se zkouší kovy a chelátotvorná činidla nebo se provádí zkoušky 
při různých hodnotách pH. Použití upraveného média musí být 
podrobně popsáno a zd ůvodněno (3, 4).  
1.8.4  Po čáteční koncentrace biomasy  
Počáteční biomasa musí být stejná ve všech zkušebních kulturách 
a dostate čně nízká, aby umož ňovala exponenciální r ůst po celou 
inkubační dobu bez rizika vy čerpání živin. Po čáteční biomasa by 
neměla překročit 0,5 mg/l suché hmotnosti. Doporu čují se následující 
počáteční koncentrace bun ěk: 
Pseudokirchneriella subcapitata  5 × 10  3 –10  4 buněk/ml 
Desmodesmus subspicatus  2–5 × 10  3 buněk/ml 
Navicula pelliculosa  10  4 buněk/ml 
Anabaena flos-aquae  10  4 buněk/ml 
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 –10  5 buněk/ml 
1.8.5  Koncentrace zkoušené látky  
Koncentra ční rozmezí, ve kterém lze o čekávat účinky, lze ur čit na 
základě výsledků orientačních zkoušek. Pro záv ěrečnou definitivní 
zkoušku je zapot řebí vybrat alespo ň pět koncentrací tvo řících 
geometrickou řadu s faktorem nep řekračujícím 3,2. U zkušebních 
látek vykazujících plochou k řivku závislosti odezvy na koncentraci 
může být opodstatn ěný vyšší faktor. Řady koncentrací by nejlépe 
měly pokrývat rozmezí zp ůsobující 5–75 % inhibici r ůstové rychlosti 
řas. ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6  Opakování a kontroly  
Plán zkoušky by m ěl zahrnovat t ři opakování s každou zkušební 
koncentrací. Jestliže se stanovení NOEC nepožaduje, plán zkoušky lze pozm ěnit tak, že se zvýší po čet koncentrací a sníží po čet opako­
vání na p říslušnou koncentraci. Po čet kontrolních opakování musí 
být nejmén ě tři a v ideálním p řípadě by měl být dvojnásobkem 
počtu opakování používaných pro každou zkušební koncentraci.
 
Pro analytická stanovení koncentrací zkušební látky lze p řipravit 
samostatnou sadu zkušebních roztok ů (viz bod 1.8.11 čtvrtý 
a šestý odstavec).  
Pokud se k rozpoušt ění zkoušené látky používá rozpoušt ědlo, musí 
být do plánu zkoušky zahrnuty dodate čné kontroly obsahující 
rozpouštědlo o stejné koncentraci, jaká se používá ve zkušebních 
kulturách.  
1.8.7  Příprava očkovací kultury  
K přizpůsobení zkušebních řas na podmínky zkoušky a zajišt ění 
toho, aby řasy byly v exponenciální r ůstové fázi, když se použijí 
pro naočkování zkušebních roztok ů, se očkovací kultura p řipravuje 
ve zkušebním médiu 2 až 4 dny p řed zahájením zkoušky. Biomasu 
řas je třeba upravit, aby mohl v o čkovací kultu ře převážit do zahájení 
zkoušky exponenciální r ůst. Očkovací kultura se musí inkubovat za 
stejných podmínek jako zkušební kultury. M ěřte nárůst biomasy 
v očkovací kultu ře, aby bylo zajišt ěno, že je r ůst v rámci normálního 
rozmezí pro zkušební kmen za podmínek kultivace. P říklad postupu 
pro kultivaci řas je popsán v dodatku 3. Aby se zabránilo synchron ­
nímu dělení buněk během zkoušky, m ůže být pot řebné provést druhý 
krok propagace o čkovací kultury.  
1.8.8  Příprava zkušebních roztok ů 
Všechny zkušební roztoky musí obsahovat stejné koncentrace r ůsto­
vého média a po čáteční biomasy zkušebních řas. Zkušební roztoky 
zvolených koncentrací se obvykle p řipravují smísením zásobního 
roztoku zkoušené látky s r ůstovým médiem a o čkovací kulturou. 
Zásobní roztoky se oby čejně připravují rozpušt ěním látky ve 
zkušebním médiu.  
Jako nosi če pro přidávání látek o nízké rozpustnosti ve vod ě do 
zkušebního média mohou být použita rozpoušt ědla, např. aceton,  
terc-butylalkohol a dimethylformamid (2, 3). Koncentrace rozpouš ­
tědla by nem ěla překročit 100 μl/l a do všech kultur (v četně kontrol) 
ve zkušební řadě by měla být přidána stejná koncentrace rozpouš ­
tědla. 
1.8.9  Inkubace  
Zakryjte zkušební nádoby zátkami, které propouští vzduch. Nádoby 
se protřepou a umístí se do kultiva čního zařízení. Během zkoušky je 
nezbytné udržovat řasy v suspensi a umožnit p řenos CO  2 . Za tímto 
účelem je třeba provád ět nepřetržité třepání nebo míchání. Kultury se 
udržují p ři teplotě 21–24 °C udržované s p řesností na ±2 °C. 
U jiných druh ů, než jsou druhy uvedené v seznamu v dodatku 1, 
např. u tropických druh ů, mohou být vhodné vyšší teploty, pokud lze 
ovšem splnit kritéria validity. Doporu čuje se umís ťovat baňky 
náhodně a denně je v inkubátoru p řemísťovat. ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
Hodnota pH kontrolního média by nem ěla během zkoušky vzr ůst 
o více než 1,5. U kov ů a sloučenin, které částečně ionizují p ři pH 
okolo pH zkoušky m ůže být nezbytné omezit posun pH pro získání 
reprodukovatelných a dob ře definovaných výsledk ů. Posun o < 0,5 
pH je technicky proveditelný a lze jej dosáhnout zajišt ěním 
adekvátní rychlosti p řesunu hmoty CO  2 z okolního vzduchu do 
zkušebního roztoku, nap ř. zvýšením rychlosti t řepání. Další možností 
je snížit pot řebu CO  2 snížením po čáteční biomasy nebo doby trvání 
zkoušky.  
Povrch, kde jsou kultury inkubovány, by m ěl být trvale osv ětlen 
jednotným fluorescen čním světlem, nap ř. „chladným bílým“ nebo 
„denním“ sv ětlem. Jednotlivé kmeny řas a sinic mají r ůzné poža ­
davky na osv ětlení. Intenzita sv ětla by m ěla být zvolena tak, aby 
vyhovovala použitému testovacímu organismu. Pro doporu čené 
druhy zelených řas se intenzita sv ětla na úrovni zkušebních roztok ů 
zvolí v rozmezí 60–120 μE·m –2 ·s –1 , přičemž se m ěří ve fotosynte ­
ticky efektivním rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm pomocí 
vhodného sníma če. Některé druhy, zejména  Anabaena flos-aquae , 
dobře rostou p ři nízkých intenzitách osv ětlení a mohou být p ři 
vysokých intenzitách poškozeny. U takových druh ů by měla být 
zvolena pr ůměrná intenzita sv ětla 40–60 μE·m –2 ·s –1 . (Měří-li se 
intenzita luxmetry, ekvivalentní rozp ětí 4 440 až 8 880 lux ů pro 
chladné bílé sv ětlo odpovídá p řibližně doporučené světelné intenzit ě 
60–120 μE·m –2 ·s –1 ). Intenzita sv ětla se nesmí lišit o více než ±15 % 
od průměrné intenzity sv ětla nad plochou inkubace.  
1.8.10  Doba trvání zkoušky  
Zkouška obvykle trvá 72 hodin. Lze však použít kratších nebo 
delších dob trvání zkoušky, pokud lze splnit všechna kritéria validity uvedená v bod ě 1.7.
 
1.8.11  Měření a analytická stanovení  
Biomasa řas se během doby zkoušky ur čí v každé ba ňce nejmén ě 
jednou denn ě. Jestliže se m ěření provádí na malých objemech 
vyjmutých ze zkušebního roztoku pipetou, nem ěly by se nahrazovat.  
Měření biomasy se provádí ru čním počítáním bun ěk pod mikros ­
kopem nebo pomocí elektronického po čítače částic (počty buněk 
a/nebo biologický objem). Alternativní techniky, nap ř. průtoková 
cytometrie, fluorescence chlorofylu  in vitro  nebo  in vivo  (6, 7) 
nebo optická hustota, lze použít za p ředpokladu, že je možné 
prokázat uspokojivou korelaci s biomasou v rozmezí, v n ěmž se 
biomasa b ěhem zkoušky vyskytuje.  
pH roztok ů se měří na počátku a na konci zkoušky.  
Pokud je dostupný analytický postup k ur čení zkoušené látky 
v rozmezí použitých koncentrací, zkušební roztoky je t řeba analyzo ­
vat, aby se ov ěřily počáteční koncentrace a udržení expozi čních 
koncentrací b ěhem zkoušky.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Analýza koncentrace zkoušené látky na po čátku a konci zkoušky p ři 
nízké a vysoké zkušební koncentraci a koncentrace okolo o čekávané 
EC 50 mohou dosta čovat, jestliže je pravd ěpodobné, že se budou 
během zkoušky expozi ční koncentrace lišit o mén ě než 20 % od 
nominálních hodnot. Analýza všech zkušebních koncentrací na 
počátku a konci zkoušky se doporu čuje v případě, kdy je nepravd ě­
podobné, že koncentrace z ůstanou v rozmezí 80 až 120 % nominální 
hodnoty. U t ěkavých, nestabilních nebo siln ě adsorbujících zkouše ­
ných látek se doporu čuje provést dodate čný odběr vzorků k analýze 
v 24hodinových intervalech b ěhem expozi ční doby s cílem lépe 
definovat ztrátu zkoušené látky. U t ěchto látek jsou zapot řebí 
dodatečná opakování. Ve všech p řípadech je t řeba provést ur čení 
koncentrací zkoušené látky p ři každé zkušební koncentraci pouze 
u jedné nádoby k opakování (nebo u sdruženého obsahu nádob 
jednoho opakování).  
Zkušební média specificky p řipravená k analýze expozi čních 
koncentrací b ěhem zkoušky by m ěla být exponována stejným 
způsobem jako zkušební média použitá ke zkoušení, tj. m ěla by 
být naočkována řasami a inkubována za identických podmínek. Jest ­
liže se požaduje analýza koncentrace rozpušt ěné zkušební látky, 
může být nezbytné odd ělit řasy od média. Odd ělení by se m ělo 
nejlépe provád ět odstřeďováním p ři nízké síle  g dostatečné pro 
usazení řas. 
Lze-li prokázat, že byla po celou dobu zkoušky koncentrace zkou ­ 
šené látky uspokojiv ě udržována v rozmezí ±20 % nominální nebo 
naměřené počáteční koncentrace, m ůže být analýza výsledk ů 
založena na nominálních nebo nam ěřených po čátečních hodnotách. 
Je-li odchylka od nominální nebo nam ěřené počáteční koncentrace 
větší než ±20 %, analýza výsledk ů by měla být založena na geomet ­
rické střední koncentraci b ěhem expozice nebo na modelech popisu ­
jících pokles koncentrace zkoušené látky (3, 8).  
Zkouška inhibice r ůstu řas je dynami čtější zkušební systém než 
většina jiných krátkodobých zkoušek vodní toxicity. V d ůsledku 
toho může být obtížné definovat skute čné expozi ční koncentrace, 
zvláště u adsorbujících látek zkoušených p ři nízkých koncentracích. 
V takových p řípadech vymizení látky z roztoku adsorpcí do zvyšu ­
jící se biomasy řas neznamená, že se ztratila ze zkušebního systému. 
Při analýze výsledku zkoušky je t řeba zkontrolovat, zda-li je pokles 
koncentrace zkoušené látky v pr ůběhu zkoušky doprovázen 
poklesem inhibice r ůstu. Pokud tomu tak je, lze zvážit použití vhod ­
ného modelu popisujícího pokles koncentrace zkoušené látky (8). 
Pokud tomu tak není, m ůže být vhodné založit analýzu výsledk ů 
na počátečních (nominálních či naměřených) koncentracích.  
1.8.12  Další pozorování  
Pro ověření normálního a zdravého vzhledu o čkovací kultury 
a sledování jakéhokoliv abnormálního vzhledu řas (které m ůže být 
způsobeno expozicí zkoušené látce) na konci zkoušky by m ělo být 
provedeno mikroskopické pozorování.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13  Limitní zkouška  
Za určitých okolností, nap ř. pokud p ředběžná zkouška nazna čuje, že 
zkoušená látka nemá žádné toxické ú činky při koncentracích až do 
100 mg l  –1 nebo až do meze své rozpustnosti ve zkušebním médiu 
(podle toho, co je nižší), m ůže být provedena limitní zkouška 
zahrnující porovnání odezvy v kontrolní skupin ě a odezvy v jedné 
exponované skupin ě (100 mg l  –1 nebo koncentrace rovná mezi 
rozpustnosti). D ůrazně se doporu čuje podpo řit tuto zkoušku analýzou 
expozičních koncentrací. Všechny d říve popsané zkušební podmínky 
a kritéria validity se vztahují i na limitní zkoušku s výjimkou toho, že by mělo být provedeno alespo ň šest opakování s exponovanými 
vzorky. Prom ěnné odezvy v kontrolní a exponované skupin ě mohou 
být analyzovány pomocí statistického testu pro porovnání st ředních 
hodnot, nap ř. Studentova t-testu. Jestliže rozptyly obou skupin 
nejsou shodné, je t řeba provést t-test upravený pro rozdílné rozptyly.
 
1.8.14  Úprava pro intenzivn ě zbarvené látky  
Ozářenost (intenzita sv ětla) by m ěla dosahovat hodnot na nejvyšším 
konci rozsahu p ředepsaného v této zkušební metod ě: 120 μE·m  –2 ·s –1 
nebo více.  
Dráha sv ětla by m ěla být zkrácena snížením objemu zkušebních 
roztoků (v rozmezí 5–25 ml).  
Je nezbytné dostate čné míchání (nap říklad mírným prot řepáváním), 
aby bylo dosaženo vysoké frekvence expozice řas vysoké ozá řenosti 
na povrchu kultury.  
2. DATA  
2.1 VYNÁŠENÍ R ŮSTOVÝCH K ŘIVEK  
Biomasa ve zkušebních nádobách m ůže být vyjád řena v jednotkách 
náhradního parametru použitého pro m ěření (např. počet buněk, 
fluorescence).  
Pro vynesení r ůstových k řivek do grafu sestavte tabulku odhadova ­
ných koncentrací biomasy ve zkušebních kulturách a kontrolách 
společně s koncentracemi zkušebního materiálu a časy měření zazna ­
menanými v rozlišení nejmén ě na celé hodiny. V tomto prvním 
stadiu mohou být užite čné jak logaritmické, tak lineární stupnice, 
ale logaritmické stupnice jsou povinné a obecn ě poskytují lepší 
zobrazení odchylek ve vzorci r ůstu během zkušebního období. Neza ­
pomeňte, že exponenciální r ůst má při vynesení na logaritmické 
stupnici podobu p římky a že sklon (sm ěrnice) přímky ukazuje speci ­
fickou růstovou rychlost.  
Po vynesení prov ěřte, zda-li rostou kontrolní kultury exponenciáln ě 
očekávanou rychlostí po celou dobu zkoušky. Kriticky zhodno ťte 
všechny datové body a vzhled graf ů a zkontrolujte, zda v hrubých 
datech a postupech nejsou chyby. Zejména zkontrolujte všechny datové body, u nichž se zdá, že se odchylují na základ ě systematické 
chyby. Pokud je z řejmé, že lze rozpoznat procesní chyby a/nebo je 
lze považovat za vysoce pravd ěpodobné, specifický datový bod se 
označí jako odlehlá hodnota a nebude zahrnut do následné statistické 
analýzy. (Nulová koncentrace řas v jedné ze dvou nebo t ří nádob 
použitých k opakování m ůže ukazovat na to, že nádoba nebyla 
správně naočkována nebo byla nesprávn ě vyčištěna.) Důvody 
k odmítnutí datového bodu jako odlehlé hodnoty musí být jasn ě 
uvedeny ve zkušebním protokolu. P řijatelnými d ůvody jsou pouze 
(vzácné) procesní chyby a nikoli jen malá preciznost. Statistické 
postupy pro rozpoznání odlehlé hodnoty mají u tohoto typu prob ­
lému pouze omezené použití a nemohou nahradit odborné posouzení. Odlehlé hodnoty (takto ozna čené) by nejlépe m ěly zůstat mezi dato ­
vými body zobrazenými v jakémkoliv následné grafickém či tabu­
lárním zobrazení dat.
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2 PROM ĚNNÉ ODEZVY  
Účelem této zkoušky je stanovit ú činky zkoušené látky na r ůst řas. 
Tato zkušební metoda popisuje dv ě proměnné odezvy, protože 
členské zem ě mají odlišné preference a právní požadavky. Mají-li 
být výsledky zkoušky p řijatelné ve všech členských zemích, ú činky 
je třeba vyhodnotit pomocí obou prom ěnných odezvy a) a b) popsa ­
ných dále.  
a) Průměrná specifická r ůstová rychlost: tato prom ěnná odezvy se 
vypočítává na základ ě logaritmického zvýšení biomasy b ěhem 
zkušebního období a vyjád ří se na den.  
b) Výtěžek: tato prom ěnná odezvy je biomasa na konci zkoušky 
minus po čáteční biomasa.  
Při použití této metody v rámci práva EU by m ěl být výpo čet 
výsledků založen na pr ůměrné specifické r ůstové rychlosti, a to 
z níže uvedených d ůvodů. Je třeba uvést, že hodnoty toxicity vypo čí­
tané pomocí t ěchto dvou prom ěnných odezvy nejsou srovnatelné 
a při používání výsledk ů zkoušky se musí vzít tento rozdíl na 
vědomí. Hodnoty EC  x založené na pr ůměrné specifické r ůstové rych ­
losti (E  r C x ) budou všeobecn ě vyšší než výsledky založené na 
výtěžku (E  y C x ), pokud se dodrží zkušební podmínky této zkušební 
metody, a to díky matematické základn ě příslušných p řístupů. Tuto 
skutečnost nelze vykládat jako rozdíl v citlivosti mezi t ěmito dvěma 
proměnnými odezvy; hodnoty jsou jednoduše matematicky odlišné. 
Koncepce pr ůměrné specifické r ůstové rychlosti je založena na 
obecném pr ůběhu exponenciálního r ůstu řas v nelimitovaných kultu ­
rách, u nichž se toxicita odhaduje na základ ě účinků na růstovou 
rychlost, aniž by závisela na absolutní úrovni specifické r ůstové 
rychlosti kontroly, na sklonu k řivky závislosti koncentrace-odezva 
nebo na dob ě trvání zkoušky. Naproti tomu výsledky založené na 
proměnné odezvy „výt ěžek“ jsou závislé na všech t ěchto ostatních 
proměnných. E  y C x závisí na specifické r ůstové rychlosti druh ů řas 
použitých v každé zkoušce a na maximální specifické r ůstové rych ­
losti, která se m ůže u jednotlivých druh ů, a dokonce i u r ůzných 
kmenů řas lišit. Tato prom ěnná odezvy by se nem ěla používat pro 
srovnávání citlivosti na toxické látky mezi druhy řas nebo dokonce 
různými kmeny. P řestože se z v ědeckého hlediska dává p řednost 
použití pr ůměrné specifické r ůstové rychlosti pro odhad toxicity, 
odhady toxicity založené na výt ěžku jsou rovn ěž do této zkušební 
metody zahrnuty, aby uspokojily sou časné právní požadavky 
v některých zemích.  
2.2.1  Pr ůměrná růstová rychlost  
Průměrná specifická r ůstová rychlost pro konkrétní období se 
vypočítá jako logaritmické zvýšení biomasy z rovnice pro každou 
jednotlivou nádobu s kontrolními a exponovanými vzorky:  
μ iÄj ¼ lnX j – lnX i 
t j – t i (den  –1 ) 
kde: 
μ i-j : je průměrná specifická r ůstová rychlost od doby  i do doby  j, 
X i : je biomasa v dob ě i, 
X j : je biomasa v dob ě j. ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Pro každou exponovanou skupinu a kontrolní skupinu vypo čítejte 
střední hodnotu r ůstové rychlosti a odhady rozptylu.  
Vypočítejte průměrnou specifickou r ůstovou rychlost po celou dobu 
trvání zkoušky (obvykle dny 0 až 3), p řičemž namísto nam ěřené 
počáteční hodnoty použijte jako po čáteční hodnotu spíše nomináln ě 
naočkovanou biomasu, protože se tímto zp ůsobem obvykle dosáhne 
větší preciznosti. Jestliže za řízení použité pro m ěření biomasy 
umožňuje dostate čně precizní ur čení nízké biomasy inokula (nap ř. 
průtokovým cytometrem), pak lze použít nam ěřenou počáteční 
koncentraci biomasy. Rovn ěž se vyhodnotí r ůstová rychlost po 
jednotlivých časových úsecích vypo čtená jako specifické r ůstové 
rychlosti pro každý den v pr ůběhu zkoušky (dny 0–1, 1–2 a 2–3) 
a prozkoumá se, zda-li r ůstová rychlost kontroly z ůstává konstantní 
(viz kritéria validity, bod 1.7). Významn ě nižší specifická r ůstová 
rychlost v den jedna v porovnání s celkovou pr ůměrnou specifickou 
růstovou rychlostí m ůže poukazovat na fázi iniciace. Zatímco 
v kontrolních kulturách lze fázi iniciace minimalizovat a prakticky vyloučit správnou kultivací p ř
edkultury, fáze iniciace 
v exponovaných kulturách m ůže být známkou obnovy po po čá­
tečním toxickém stresu nebo známkou snížené expozice vyvolané 
ztrátou zkoušené látky (v četně sorpce na biomasu řas) po po čáteční 
expozici. Odpovídajícím zp ůsobem lze vyhodnocovat r ůstovou rych ­
lost v jednotlivých časových úsecích s cílem zhodnotit ú činky zkou ­ 
šené látky, které se vyskytly b ěhem expozi ční doby. Významné 
rozdíly mezi r ůstovou rychlostí v jednotlivých časových úsecích 
a průměrnou růstovou rychlostí jsou známkou odchylky od konstant ­
ního exponenciálního r ůstu a vyžadují d ůkladné prozkoumání r ůsto­
vých křivek.  
Vypočítejte procentuální inhibici r ůstové rychlosti u jednotlivých 
opakování s exponovanými vzorky z rovnice:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100 
kde: 
%I r : procentuální inhibice pr ůměrné specifické r ůstové rychlosti,  
μ C : střední hodnota pr ůměrné specifické r ůstové rychlosti ( μ ) 
v kontrolní skupin ě, 
μ T : průměrná specifická r ůstová rychlost u opakování 
s exponovaným vzorkem.  
Jestliže se k p řípravě zkušebních roztok ů používají rozpoušt ědla, pro 
výpočet procentuální inhibice by se m ěly namísto kontrol bez 
rozpouštědel používat kontroly s rozpoušt ědly. 
2.2.2  Výt ěžek 
Výtěžek se vypo čítá jako biomasa na konci zkoušky minus po čáteční 
biomasa pro každou jednotlivou nádobu s kontrolními a exponovanými vzorky. Pro každou zkušební koncentraci a kontrolu vypo čítejte střední hodnotu výt ěžku a odhady rozptylu. 
Procentuální inhibici výt ěžku (% I
 y ) lze vypo čítat pro každé opako ­
vání s exponovanými vzorky následovn ě: 
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
kde: 
% I  y : procentuální inhibice výt ěžku, 
Y C : střední hodnota výt ěžku v kontrolní skupin ě, 
Y T : hodnota výt ěžku u opakování s exponovaným vzorkem.  
2.3 VYNÁŠENÍ K ŘIVKY ZÁVISLOSTI KONCENTRACE-ODEZVA  
Vyneste procentuální hodnotu inhibice proti logaritmu koncentrace 
zkušební látky a vynesené body pe člivě prozkoumejte, p řičemž 
neberte v úvahu žádný takový datový bod, který byl v první fázi 
vyloučen jako odlehlá hodnota. Podle oka nebo pomocí po čítačové 
interpolace ve ďte datovými body tenkou čáru, abyste získali první 
dojem o vztahu koncentrace a odezvy, poté p řistupte k podrobn ější 
metodě, nejlépe po čítačové statistické metod ě. V závislosti na 
zamýšleném použití dat, jakosti (preciznosti) a množství dat, jakož i na dostupnosti nástroj ů pro analýzu dat m ůže být rozhodnuto (a 
někdy je to dostate čně odůvodněno) o tom, že se analýza dat v tomto 
stadiu zastaví a klí čové hodnoty EC
 50 a EC  10 (a/nebo EC  20 ) se 
jednoduše ode čtou z křivky vytvo řené podle oka (rovn ěž viz násle ­
dující bod o stimula čních účincích). Platnými d ůvody pro nepoužití 
statistické metody mohou být:  
— Údaje nejsou vhodné pro po čítačové metody, které neposkytnou 
žádné spolehliv ější výsledky než ty, které lze získat odborným 
posouzením – v takových situacích mohou dokonce n ěkteré počí­
tačové programy selhat p ři získání spolehlivého řešení (iterace 
nemusí konvergovat atd.).  
— Stimula ční růstové odezvy nelze odpovídajícím zp ůsobem zpra ­
covat pomocí dostupných po čítačových program ů (viz níže).  
2.4 STATISTICKÉ POSTUPY  
Cílem je získat kvantitativní vztah mezi koncentrací a odezvou 
pomocí regresní analýzy. Je možné použít váženou lineární regresi 
po provedení linearizující transformace dat odezvy – nap říklad do 
probitových nebo logitových či Weibullových jednotek (9), ale dává 
se přednost nelineárním regresním postup ům, s jejichž pomocí se 
lépe zpracovávají nevyhnutelné nepravidelnosti dat a odchylky od 
hladkých distribucí. P ři přiblížení se k nule či úplné inhibici 
mohou být takové nepravidelnosti zesíleny transformací a rušit p ři 
analýze (9). Je zapot řebí uvést, že standardní metody analýzy použí ­
vající probitové, logitové nebo Weibullovy transformace jsou ur čeny 
k použití s kvantálními daty (nap ř. mortalita nebo p řežití) a musí se 
upravit, aby mohly být použity s daty r ůstu či biomasy. Speciální 
postupy pro stanovení hodnoty EC  x ze spojitých dat lze nalézt 
v literatu ře (10, 11 a 12). Použití nelineární regresní analýzy je 
dále podrobn ě popsáno v dodatku 4.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Pro každou prom ěnnou odezvy, která se má analyzovat, použijte 
vztah koncentrace a odezvy pro výpo čet bodových odhad ů hodnot 
EC x . Je-li to možné, je zapot řebí určit 95 % intervaly spolehlivosti 
pro každý odhad. Jakost shodnosti dat odezvy s regresním modelem je zapotřebí vyhodnotit bu ď graficky, nebo statisticky. Regresní 
analýza by se m ěla provád ět pomocí odezev jednotlivých opakování, 
nikoliv pomocí st ředních hodnot exponovaných skupin. Pokud však 
je vynesení nelineární k řivky obtížné či neúspěšné kvůli příliš 
velkému rozptylu dat, problém lze obejít provedením regrese na 
skupinových st ředních hodnotách, což je praktický zp ůsob pro 
snížení vlivu podez řelých odlehlých hodnot. Použití této možnosti 
je zapotřebí zaznamenat ve zkušebním protokolu jako odchylku od 
normálního postupu v d ůsledku skute čnosti, že k řivka, která 
vyhovuje jednotlivých opakováním, nevedla k uspokojivému 
výsledku.
 
Odhady EC  50 a intervaly spolehlivosti lze rovn ěž získat lineární 
interpolací s bootstrapem (13), pokud se dostupné regresní modely/metody pro p říslušná data nehodí.
 
Pro odhad LOEC, a tedy i NOEC a pro ú činky zkoušené látky na 
růstovou rychlost je nezbytné porovnat st řední hodnoty exponova ­
ných vzork ů pomocí metod analýzy rozptylu (ANOVA). St řední 
hodnota pro každou koncentraci musí být poté porovnána se st řední 
hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou vícenásob ­
ného porovnání nebo metodou zkoušky trendu. Užite čné mohou být 
Dunnettův nebo Williams ův test (14, 15, 16, 17, 18). Je nezbytné 
vyhodnotit, zda je spln ěn předpoklad homogenity rozptylu nezbytný 
pro ANOVA. Toto hodnocení lze provád ět graficky nebo formálním 
testem (18). Mezi vhodné testy pat ří Levenův nebo Bartlett ův test. 
Nesplnění předpokladu o homogenit ě rozptylů lze někdy napravit 
logaritmickou transformací dat. Jestliže je heterogenita rozptylu 
extrémní a nelze ji napravit transformací, pak je t řeba zvážit analýzu 
takovými metodami, jako jsou testy sestupného trendu Jonckheere. Další pokyny pro stanovení NOEC lze nalézt v (12).
 
Vědecký rozvoj poslední doby vedl k doporu čení opustit koncepci 
NOEC a nahradit ji odhady bod ů EC  x na základ ě regrese. Vhodná 
hodnota pro x nebyla pro tuto zkoušku pomocí řas stanovena. Zdá 
se, že vhodné je rozmezí od 10 do 20 % (v závislosti na zvolené proměnné odezvy) a nejlépe by se m ěly ve zkušebním protokolu 
uvádět jak EC
 10 , tak EC  20 . 
2.5 STIMULACE R ŮSTU  
Při nízkých koncentracích bývá n ěkdy pozorována stimulace r ůstu 
(negativní inhibice). To m ůže být důsledkem bu ď hormese („toxická 
stimulace“), nebo p řidání stimulujících r ůstových faktor ů se 
zkušebním materiálem k minimálnímu použitému médiu. Nezapo ­
meňte, že přidání anorganických živin by nem ěl mít žádný p římý 
účinek, protože zkušební médium by m ělo po celou dobu zkoušky 
udržovat p řebytek živin. Stimulaci nízkými dávkami lze ve výpo č­
tech EC  50 obvykle ignorovat, pokud není extrémní. Je-li však 
extrémní nebo má-li být vypo čtena hodnota EC  x pro nízké x, 
může být zapot řebí speciálních postup ů. K vymazání stimula čních 
odezev z analýzy dat by nem ělo pokud možno dojít, a pokud 
dostupný software pro stanovení k řivky nem ůže drobnou stimulaci 
přijmout, lze použít lineární interpolaci s bootstrapem. Jestliže je 
stimulace extrémní, lze zvážit použití modelu p ředpokládajícího 
hormesi (19).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6 NETOXICKÁ INHIBICE R ŮSTU  
Zkušební materiály absorbující sv ětlo mohou zp ůsobit snížení 
růstové rychlosti, protože stín ění snižuje množství dostupného sv ětla. 
Takové ú činky fyzikální povahy je zapot řebí oddělit od toxických 
účinků, a to úpravou zkušebních podmínek, p řičemž takové fyzikální 
účinky je zapot řebí uvád ět ve zkušebním protokolu samostatn ě. 
Pokyny lze nalézt v literatu ře (2 a 3).  
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha a relevantní fyzikáln ě-chemické vlastnosti 
včetně meze rozpustnosti ve vod ě, 
— údaje o chemické identifikaci v četně čistoty.  
Testovací druhy:  
— kmen, dodavatel nebo zdroj a použité podmínky kultivace.  
Zkušební podmínky:  
— datum zahájení zkoušky a délka jejího trvání,  
— popis plánu zkoušky: zkušební nádoby, objemy kultur, hustota 
biomasy na po čátky zkoušky,  
— složení média,  
— zkušební koncentrace a opakování (nap říklad počet opakování, 
počet zkušebních koncentrací a použitá geometrická progrese),  
— popis p řípravy zkušebních roztok ů včetně použití rozpoušt ědel 
atd., 
— kultiva ční zařízení,  
— intenzita a kvalita sv ětla (zdroj, homogenita),  
— teplota,  
— zkušební koncentrace: nominální zkušební koncentrace 
a jakékoliv výsledky analýz pro stanovení koncentrace zkoušené látky ve zkušebních nádobách. Ve zkušebním protokolu je t řeba 
uvést výt ěžnost metody a mez kvantifikace ve zkušební matrici,
 
— všechny odchylky od této zkušební metody,  
— metoda pro stanovení biomasy a d ůkaz o korelaci mezi nam ě­ 
řeným parametrem a suchou hmotností.  
Výsledky:  
— hodnoty pH na po čátku a konci zkoušky u všech expozic,  
— biomasa pro každou ba ňku v každém m ěřicím bodě a metoda pro 
měření biomasy,  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— růstové křivky (vynášení biomasy v ůči času),  
— vypočítané prom ěnné odezvy pro všechna opakování 
s exponovanými vzorky, spolu se st ředními hodnotami 
a variačním koeficientem pro opakování,  
— grafické znázorn ění vztahu koncentrace a ú činku,  
— odhady toxicity pro prom ěnné odezvy, nap ř. EC  50 , EC  10 , EC  20 , 
a související intervaly spolehlivosti. Jestliže se po čítají LOEC 
a NOEC, uvedou se jejich hodnoty a statistické metody použité k jejich stanovení,
 
— jestliže byla použita ANOVA, uvede se velikost ú činku, který lze 
detekovat (nap ř. nejmenší významný rozdíl),  
— jakákoliv stimulace r ůstu zjištěná v jakémkoli exponovaném 
vzorku,  
— jakékoliv jiné pozorované ú činky, nap ř. morfologické zm ěny řas, 
— diskuse výsledk ů včetně jakéhokoli vlivu na výsledek zkoušky 
v důsledku odchylek od této zkušební metody.  
4. LITERATURA  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test.  
(2) ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibi ­
tion tests with poorly soluble materials, volatile compounds, 
metals and waster water. ISO/DIS 14442.  
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health 
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, 
no. 23.  
(4) ISO 1998: Jakost vod – Odb ěr vzorků – Část 16: Pokyny pro 
biologické zkoušení vzork ů. ISO 5667–16.  
(5) ISO 1993: Jakost vod – Zkouška inhibice r ůstu sladkovodních 
zelených řas. ISO 8692.  
(6) Mayer, P., Cuhel, R., Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth 
inhibition tests.  Water Research  31: 2525–2531.  
(7) Slovacey, R.E., Hanna, P.J. In vivo fluorescence determina ­
tions of phytoplancton chlorophyll,  Limnology 
& Oceanography  22,5 (1977), 919–925  
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L., Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints.  Environ. Toxicol. Chem . 22, 2073–2079.
 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves.  Env. Sci. Technol . 
19, 713–718.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O., Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests.  Environ. Toxicol. Chem . 11, 157–167.  
(11) Bruce, R.D., Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data.  Env. Toxicol. Chem . 
11:1485–1494.  
(12) OECD (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control.  J. Amer. Statist. 
Assoc . 50: 1096–1121.  
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control.  Biometrics  20: 482–491.  
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control.  Biometrics  27: 103–117.  
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control.  Biometrics  28: 510–531.  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses.  
Weed Research , 29, 93–96.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Dodatek 1  
Kmeny, u nichž byla prokázána vhodnost pro zkoušku  
Zelené řasy 
— Pseudokirchneriella subcapitata  (dříve známá jako  Selenastrum capricornu ­
tum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (dříve známá jako  Scenedesmus subspicatus ) 
86.81 SAG  
Rozsivky  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Sinice  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Zdroje kmen ů 
Doporučené kmeny jsou k dispozici v jednodruhových kulturách z následujících 
sbírek (v abecedním po řadí): 
ATCC: American Type Culture Collection 
10801 University Boulevard 
Manassas, Virginia 20110–2209 
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa 
Institute of Freshwater Ecology, Windermere Laboratory 
Far Sawrey, Amblerside 
Cumbria LA22 0LP SPOJENÉ KRÁLOVSTVÍ
 
SAG: Sammlung von Algenkulturen 
Albrecht-von-Haller-Institut 
Universität Göttingen Nikolausberger Weg 18 37073 Göttingen 
NĚMECKO
 
UTEX Culture Collection of Algae 
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology School of Biological Sciences the University of Texas at Austin 
Austin, Texas 78712 
USA
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Vzhled a charakteristiky doporu čených druh ů 
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Vzhled zak řivené, 
zkroucené 
jednotlivé buňky oválné, 
většinou 
jednotlivé buňky tyčinky řetězce ovál­
ných bun ěk tyčinky 
Velikost (d × š) μm 8–14 × 2–3 7–15 × 3–12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Buněčný objem ( μm
 3 /buňka) 40–60 (  1 ) 60–80 (  1 ) 40–50 (  1 ) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Hmotnost bun ěčné sušiny (mg/ 
buňka) 2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Růstová rychlost (  3 ) (den  –1 ) 1,5–1,7 1,2–1,5 1,4 1,1–1,4 2,0–2,4  
( 1 ) Měřeno elektronickým po čítačem částic. 
( 2 ) Vypočítáno z velikosti. 
( 3 ) Nejčastěji pozorovaná r ůstová rychlost v médiu OECD p ři světelné intenzit ě přibližně 70 μE·m –2 ·s –1 a teplotě 21 °C.  
Specifická doporu čení ohledn ě kultivace doporu čených zkušebních druh ů 
a nakládání s nimi  
Pseudokirchneriella subcapitata a Desmodesmus subspicatus  
Tyto zelené řasy se všeobecn ě snadno udržují v r ůzných kultiva čních médiích. 
Informace o vhodných médiích lze získat od sbírek kultur. Bu ňky jsou normáln ě 
samostatné a m ěření hustoty bun ěk lze snadno provád ět pomocí elektronického 
počítače částic nebo mikroskopu.  
Anabaena flos-aquae  
Pro uchovávání zásobní kultury lze použít r ůzná růstová média. Zvlášt ě důležité 
je zabránit tomu, aby vsázková kultura p řekročila při obnově fázi logaritmického 
růstu; zpětné získání je v tomto bod ě obtížné.  
Anabaena flos-aquae  vytváří shluky vno řených řetězců buněk. Velikost t ěchto 
shluků se může měnit s kultiva čními podmínkami. M ůže vzniknout pot řeba tyto 
shluky rozrušit, pokud se ke stanovení biomasy použije po čítání pod mikros ­
kopem nebo elektronický po čítač částic.  
Pro snížení variability po čtu mohou být v díl čích vzorcích použity k rozrušení 
řetězců ultrazvukové vibrace. Delší ultrazvukové vibrace, než jsou nutné 
k rozrušení řetězců do kratších délek, mohou bu ňky zničit. Intenzita ultrazvuko ­
vých vibrací a doba trvání musí být shodné pro každou expozici.  
Spočítejte na hemocytometru dostatek polí ček (nejmén ě 400 buněk), což pom ůže 
variabilitu kompenzovat. Tím se zlepší spolehlivost mikroskopického stanovení 
hustoty.  
Pro stanovení celkového bun ěčného objemu sinic rodu  Anabaena  po rozrušení 
buněčných řetězců opatrnými ultrazvukovými vibracemi lze použít elektronický 
počítač částic. Ultrazvuková energie se musí nastavit tak, aby se zabránilo naru ­ 
šení buněk. 
Aby se zajistilo dobré promíchání a homogenita suspense řas použitých 
k naočkování zkušebních nádob, použijte ví řivou mícha čku nebo podobnou 
odpovídající metodu.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Zkušební nádoby je nutno umístit na st ůl orbitální nebo reciproké t řepačky při 
přibližně 150 otáčkách za minutu. P řípadně lze použít ob časné promíchávání ke 
snížení sklonu sinic rodu  Anabaena  vytvářet shluky. Jestliže ke shlukování dojde, 
musí se postupovat pe člivě k získání reprezentativních vzork ů pro měření 
biomasy. Pro rozrušení shluk ů sinic před odběrem vzork ů může být nezbytné 
intenzivní promíchávání.  
Synechococcus leopoliensis  
Pro uchovávání zásobní kultury lze použít r ůzná růstová média. Informace 
o vhodných médiích lze získat od sbírek kultur.  
Synechococcus leopoliensis  vyrůstají jako jednotlivé bu ňky tyčinkového tvaru. 
Buňky jsou velmi malé, což zt ěžuje použití po čítání pod mikroskopem pro 
měření biomasy. Užite čné jsou elektronické po čítače částic vybavené pro po čítání 
částic až do velikosti p řibližně 1 μm. Rovn ěž jsou využitelná fluorometrická 
měření in vitro . 
Navicula pelliculosa  
Pro uchovávání zásobní kultury lze použít r ůzná růstová média. Informace 
o vhodných médiích lze získat od sbírek kultur. Je nutné mít na pam ěti, že 
v médiu se vyžaduje p řítomnost k řemičitanu.  
Navicula pelliculosa  může za ur čitých růstových podmínek vytvá řet shluky. 
Buňky mají n ěkdy sklon se shlukovat v povrchovém filmu kv ůli produkci lipid ů. 
Za těchto okolností se musí p řijmout zvláštní opat ření, když se odebírají díl čí 
vzorky pro stanovení biomasy s cílem získat reprezentativní vzorky. M ůže být 
nutné intenzivní prot řepávání, nap ř. použití ví řivé mícha čky. ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Dodatek 2  
Růstová média  
Lze použít jedno ze dvou následujících r ůstových médií:  
Médium OECD: p ůvodní médium podle Pokynu OECD pro zkoušení 201, 
rovněž podle normy ISO 8692.  
Médium US. EPA AAP, rovn ěž podle ASTM.  
Při přípravě těchto médií je zapot řebí používat chemické látky analytické čistoty 
nebo na úrovni činidel a deionizovanou vodu.  
Složení média AAP (US. EPA) a média podle Pokynu OECD pro zkoušení 201  
Složka EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6H 2 O 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2H 2 O 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7H 2 O 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6H 2 O 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2H 2 O 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4H 2 O 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6H 2 O 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2H 2 O 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 ·2H 2 O 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Molární pom ěr EDTA k železu mírn ě překračuje jednu. Tím se zabrání srážení železa a sou časně se 
minimalizuje chelatace iont ů těžkých kov ů. 
Při zkoušce s rozsivkou  Navicula pelliculosa  musí být ob ě média dopln ěna 
Na 2 SiO  3 ·9H 2 0 pro dosažení koncentrace 1,4 mg Si/l.  
pH média se získá p ři rovnováze mezi uhli čitanovým systémem média 
a parciálním tlakem CO  2 v atmosférickém vzduchu. P řibližný vztah mezi pH 
při 25 °C a molární koncentrací hydrogenuhli čitanu je:  
pH rovan = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
S 15 mg/l NaHCO  3 je pH  rovn = 7,5 (médium US. EPA) a s 50 mg/l NaHCO  3 je 
pH rovn = 8,1 (médium OECD).  
Prvkové složení zkušebních médií  
Prvek EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Příprava média OECD  
Živina Koncentrace v zásobním roztoku 
Zásobní roztok č. 1: makroživiny  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H 2 O 
CaCl  2 ·2H 2 O 
MgSO  4 ·7H 2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l –1 
1,2 g·l –1 
1,8 g·l –1 
1,5 g·l –1 
0,16 g·l –1 
Zásobní roztok č. 2: železo  
FeCl  3 ·6H 2 O 
Na 2 EDTA·2H 2 O 64 mg·l –1 
100 mg·l –1 
Zásobní roztok č. 3: stopové prvky  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H 2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H 2 O 
CuCl  2 ·2H 2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H 2 O 185 mg·l –1 
415 mg·l –1 
3 mg·l –1 
1,5 mg·l –1 
0,01 mg·l –1 
7 mg·l –1 
Zásobní roztok 4: hydrogenuhli čitan 
NaHCO  3 50 g·l –1 
Na 2 SiO  3 ·9H 2 0 
Vysterilizujte zásobní roztoky membránovou filtrací (st řední průměr pórů 0,2 
μm) nebo v autoklávu (120 °C, 15 minut). Roztoky skladujte v temnu p ři 4 °C.  
Zásobní roztoky 2 a 4 neošet řujte v autoklávu, ale sterilizujte je membránovou 
filtrací.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Připravte růstové médium p řidáním odpovídajícího objemu zásobních roztok ů 1 
až 4 do vody:  
Do 500 ml sterilizované vody p řidejte:  
— 10 ml zásobního roztoku 1,  
— 1 ml zásobního roztoku 2,  
— 1 ml zásobního roztoku 3,  
— 1 ml zásobního roztoku 4.  
Doplňte do 1 000 ml sterilizovanou vodou.  
Nechte stát dostate čně dlouhou dobu na to, aby se vytvo řila rovnováha média 
s atmosférickým CO  2 , v případě potřeby pomocí probublávání sterilním filtro ­
vaným vzduchem po n ěkolik hodin.  
Příprava média AAP  
A1.1 P řidejte 1 ml každého zásobního roztoku v A1.2.1–A1.2.7 do p řibližně 
900 ml deionizované nebo destilované vody a poté na řeďte do 1 l.  
A1.2 Zásobní roztoky makroživin se p řipravují rozpušt ěním následujících 
látek v 500 ml deionizované nebo destilované vody. Činidla A1.2.1, 
A1.2.2, A1.2.3 a A1.2.4 lze spojit do jednoho zásobního roztoku:  
A1.2.1 NaNO  3 —12,750 g.  
A1.2.2 MgCl  2 ·6H 2 O—6,082 g.  
A1.2.3 CaCl  2 ·2H 2 O—2,205 g.  
A1.2.4 Zásobní roztok mikroživin – (viz A1.3).  
A1.2.5 MgSO  4 ·7H 2 O—7,350 g.  
A1.2.6 K  2 HPO  4 —0,522 g.  
A1.2.7 NaHCO  3 —7,500 g.  
A1.2.8 Na  2 SiO  3 ·9H 2 O – viz poznámka A1.1.  
Poznámka A1.1 – Používejte pouze pro testovací druhy rozsivek. M ůže 
být přidán přímo (202,4 mg) nebo prost řednictvím zásobního roztoku, 
aby bylo dosaženo kone čné koncentrace 20 mg/l Si v médiu.  
A1.3 Zásobní roztok mikroživin se p řipravuje rozpušt ěním následujících 
látek v 500 ml deionizované nebo destilované vody:  
A1.3.1 H  3 BO 3 —92,760 mg.  
A1.3.2 MnCl  2 ·4H 2 O—207,690 mg.  
A1.3.3 ZnCl  2 —1,635 mg.  
A1.3.4 FeCl  3 ·6H 2 O—79,880 mg.  
A1.3.5 CoCl  2 ·6H 2 O—0,714 mg.  
A1.3.6 Na  2 MoO  4 ·2H 2 O—3,630 mg.  
A1.3.7 CuCl  2 ·2H 2 O—0,006 mg.  
A1.3.8 Na  2 EDTA·2H 2 O—150,000 mg.  
[dinatrium-ethylendiamintetraacetát dihydrát].  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9 Na  2 SeO  4 ·5H 2 O—0,005 mg, viz poznámka A1.2.  
Poznámka A1.2 – Používejte pouze v médiu pro zásobní kultury druh ů 
rozsivek.  
A1.4 Upravte pH na 7,5 ± 0,1 p řidáním 0,1  N nebo 1,0  N NaOH nebo HCl.  
A1.5 Odfiltrujte média do sterilní nádoby prost řednictvím 0,22 μm membrá ­
nového filtru, pokud se má používat po čítač částic, nebo 0,45 μm filtru, 
pokud se po čítač částic používat nemá.  
A1.6 Médium skladujte až do použití v temnu p ři teplotě přibližně 4 °C.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Dodatek 3  
Příklad postupu kultivace řas 
Obecné poznámky  
Účelem kultivace následujícím postupem je získání kultur řas pro zkoušky toxi ­
city. 
Musí být použity vhodné metody k tomu, aby bylo zajišt ěno, že kultury řas 
nebudou infikovány bakteriemi. Vhodné mohou být axenické kultury, avšak 
musí se vytvo řit a používat jednodruhové kultury.  
Všechny operace se musí provád ět za sterilních podmínek, aby nedošlo ke 
kontaminaci bakteriemi a jinými řasami.  
Zařízení a materiály  
Viz zkušební metoda: P řístroje a pom ůcky. 
Postupy p ři získávání kultur řas 
Příprava živných roztok ů (média):  
Všechny soli živin média se p řipravují jako koncentrované zásobní roztoky 
a skladují se v temnu a chladu. Tyto roztoky jsou sterilizovány filtrací nebo 
autoklávem.  
Médium se p řipraví přidáním správného množství zásobního roztoku do sterilní 
destilované vody, p řičemž se dbá na to, aby nedošlo k žádné infekci. K získání 
pevného média se p řidává 0,8 procent agaru.  
Kmenová kultura:  
Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se pravideln ě přenášejí do 
čerstvého média, kde slouží jako výchozí zkušební materiál. Nejsou-li kultury 
pravideln ě používány, vyo čkovávají se na šikmý agar. Poté se nejmén ě jednou za 
dva měsíce přenášejí do čerstvého média.  
Kmenové kultury se p ěstují v Erlenmeyerových ba ňkách obsahujících vhodné 
médium (objem p řibližně 100 ml). Jsou-li řasy kultivovány p ři teplotě 20 °C 
a stálém osv ětlení, musí se p řenášet každý týden.  
Při přeočkování se p řenese sterilní pipetou do ba ňky s čerstvým médiem takové 
množství „staré“ kultury, aby byla po čáteční koncentrace u rychle rostoucího 
druhu řas asi stokrát menší než koncentrace kultury staré.  
Růstovou rychlost druhu řas lze ode číst z růstové křivky. Je-li známa, lze z ní 
odhadnout hustotu, p ři níž musí být kultura p řenesena do čerstvého média. 
K tomu musí dojít p řed fází odumírání kultury.  
Předkultura:  
Účelem předkultur je poskytnout dostate čné množství řas potřebných pro nao č­
kování zkušebních kultur. P ředkultura se kultivuje za zkušebních podmínek 
a použije se ješt ě během exponenciálního r ůstu, to znamená obvykle po inku ­
bační lhůtě o délce 2 až 4 dní. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnor ­
mální buňky, musí se odstranit.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Dodatek 4  
Datová analýza pomocí nelineární regrese  
Obecné poznámky  
Odezva ve zkoušce r ůstu řas a jiných zkouškách mikrobiálního r ůstu – růstu 
biomasy je svojí povahou spojitá nebo metrická prom ěnná – procesní rychlost, 
jestliže se používá r ůstové rychlosti, a její integrál b ěhem doby, pokud se zvolí 
biomasa. Ob ě jsou popsány p říslušnou st řední odezvou neexponovaných kontrol 
použitých k opakování, jež ukazují maximální odezvu p ři daných podmínkách – 
přičemž světlo a teplota jsou primární ur čující faktory ve zkoušce r ůstu řas. 
Systém je distribuovaný nebo homogenní a na biomasu lze pohlížet jako na 
kontinuum p ři zanedbání jednotlivých bun ěk. Distribuce rozptylu typu odezvy 
pro takový systém závisí výlu čně na experimentálních faktorech (obvykle popsa ­
ných lognormálními nebo normálními distribucemi chyb). To je v kontrastu 
k typickým odezvám biologických zkoušek s kvantálními daty, u nichž se 
často předpokládá, že tolerance (obvykle binomináln ě distribuovaná) jednotlivých 
organismů je dominantní složkou rozptylu. Zde jsou kontrolní odezvy nula nebo 
základní úrove ň. 
V nekomplikované situaci normalizovaná nebo relativní odezva,  r, monotónn ě 
klesá z 1 (nulová inhibice) na 0 (stoprocentní inhibice). Je t řeba mít na pam ěti, že 
všechny odezvy mají p řidruženou chybu a že o čividně negativní inhibice lze 
vypočítat pouze jako výsledek náhodné chyby.  
Regresní analýza  
Modely  
Cílem regresní analýzy je kvantitativn ě popsat k řivku závislosti koncentrace 
a odezvy ve form ě matematické regresní funkce Y = f (C) nebo častěji F (Z), 
kde Z = log C. Použití inverzní funkce C = f  –1 (Y) dovoluje vypo čítat hodnoty 
EC x včetně EC  50 , EC  10 a EC  20 a jejich 95 % intervaly spolehlivosti. Prokázalo 
se, že vztah koncentrace a odezvy získané ve zkouškách inhibice r ůstu řas 
úspěšně popisuje n ěkolik jednoduchých matematických funkcí. Funkce nap říklad 
obsahují logistickou rovnici, nesymetrickou Weibullovu rovnici a lognormální distribuční funkci, které jsou všechny esovitými k řivkami asymptoticky se blíží ­
cími jedné pro C → 0 a nule pro C → nekonečno.
 
Použití model ů spojité prahové funkce (nap ř. Kooijman ův model „pro inhibici 
populačního růstu“, Kooijman  et al . 1996) byl nedávno navržen jako alternativa 
k modelům asymptotickým. Tento model nep ředpokládá žádné ú činky při 
koncentracích pod ur čitým prahem, EC0+, který se odhaduje extrapolací vztahu 
koncentrace a odezvy pro protnutí osy koncentrace pomocí jednoduché spojité 
funkce, která není v po čátečním bodě diferencovatelná.  
Je třeba mít na pam ěti, že analýza m ůže být prostou minimalizací reziduálních 
součtů čtverců (za předpokladu konstantního rozptylu) nebo vážených čtverců, 
pokud se kompenzuje heterogenita rozptylu.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Postup  
Postup lze nastínit následovn ě: zvolte p říslušnou funk ční rovnici, Y = f (C), 
a uzpůsobte ji podle údaj ů pomocí nelineární regrese. Je lepší použít m ěření 
z každé jednotlivé ba ňky než st řední hodnoty opakování, aby se z dat získalo 
co nejvíce informací. Jestliže je rozptyl vysoký, praktická zkušenost naopak 
naznačuje, že st řední hodnoty opakování mohou poskytovat spolehliv ější mate­
matický odhad, mén ě ovlivněný náhodnými chybami v datech, než tomu je 
u každého zachovaného jednotlivého datového bodu.  
Vyneste vytvo řenou křivku a nam ěřená data a prozkoumejte, zda-li byla k řivka 
vynesena správn ě. Analýza reziduálních hodnot m ůže být pro tento ú čel mimo­ 
řádně užitečným nástrojem. Jestliže zvolený funk ční vztah pro vyjád ření odezvy 
koncentrace nepopisuje celou k řivku nebo její n ěkterou zásadn ě důležitou část, 
například odezvu p ři propadu nízkých koncentrací, zvolte jinou variantu vložení 
křivky – nap ř. nesymetrickou k řivku, jako je Weibullova funkce, namísto k řivky 
symetrické. Negativní inhibice mohou být problém nap říklad u lognormální 
distribuční funkce, která podobn ě vyžaduje alternativní regresní funkci. Takovým 
negativním hodnotám se nedoporu čuje přiřazovat nulu nebo malou kladnou 
hodnotu, protože se tím deformuje distribuce chyb. M ůže být vhodné nasadit 
na části křivky samostatnou k řivku, nap říklad v části s nízkou inhibicí pro odhad 
hodnot EC  nízké x  . Vypočítejte ze vsazené rovnice („inverzním odhadem“ C = f  –1 
(Y)) odhady charakteristického bodu EC  x a uveďte minimáln ě EC  50 a jeden nebo 
dva odhady EC  nízké x  . Zkušenost z praktického zkoušení ukázala, že preciznost 
zkoušky r ůstu řas obyčejně umožňuje přiměřeně přesný odhad na úrovni 10 % 
inhibice, jsou-li datové body dosta čující – pokud se nevyskytne stimulace p ři 
nízkých koncentracích jakožto zkreslující faktor. Preciznost odhadu EC  20 je často 
značně lepší než p řesnost odhadu EC  10 , protože EC  20 je obvykle umíst ěna na 
přibližně lineární části centrální k řivky odezvy koncentrace. N ěkdy lze EC  10 
interpretovat jen obtížn ě kvůli růstové stimulaci. Proto zatímco je EC  10 normálně 
zjistitelná s dostate čnou přesností, rovn ěž se vždy doporu čuje uvádět EC  20 . 
Váhové faktory  
Experimentální rozptyl není obecn ě konstantní a typicky zahrnuje proporcionální 
složku, proto je výhodné b ěžně provádět váženou regresi. Váhové faktory pro 
takovou analýzu se obvykle považují za nep římo úměrné k rozptylu:  
w i = 1/Var( r i ) 
Mnoho regresních program ů má možnost vážené regresní analýzy s váhovými 
faktory uvedenými v tabulce. Váhové faktory by se m ěly pohodln ě normalizovat 
vynásobením  n/∑ w i (n je počet datových bod ů) tak, aby se jejich sou čet rovnal 
jedné.  
Normalizace odezev  
Normalizování st řední kontrolní odezvou zp ůsobuje ur čité principiální problémy 
a vede ke vzniku pon ěkud komplikované struktury rozptyl ů. Dělením odezev 
střední kontrolní odezvou pro získání procentuální hodnoty inhibice se zavádí 
dodatečná chyba zp ůsobená chybou kontrolní st řední hodnoty. Není-li tato chyba 
zanedbateln ě malá, musí se opravit váhové faktory v regresi a intervaly spoleh ­
livosti na kovarianci s kontrolou (17). Je nutné mít na pam ěti, že je d ůležitá 
vysoká preciznost u odhadované st řední kontrolní odezvy pro minimalizaci 
celkového rozptylu u relativní odezvy. Tento rozptyl je následující:  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
(i v dolním indexu znamená úrove ň koncentrace  i a 0 v dolním indexu odkazuje 
na kontroly)  
Y i = relativní odezva =  r i /r 0 = 1 –  I = f ( C i ) 
s rozptylem:  
Var ( Y i ) = Var ( r i /r 0 ) δ (δY i / δ r i ) 2 · Var( r i ) + (δ Y i / δ r 0 ) 2 ·Var ( r 0 ) 
a jelikož  
(δ Y i / δ r i ) = 1/ r 0 a (δ Y i / δ r 0 ) = r i /r 0 2 
s normáln ě distribuovanými daty a opakováními m  i a m  0 : 
Var(r i ) = σ 2 /m i 
se pak celkový rozptyl relativní odezvy  Y i vypočítá: 
Var(Y i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Chyba kontrolní st řední hodnoty je nep římo úměrná druhé odmocnin ě počtu 
zprůměrovaných kontrolních opakování, p řičemž někdy je od ůvodněné zanést 
historická data, čímž se chyba zna čně sníží. Alternativním postupem je data 
nenormalizovat a nevynášet absolutní odezvy v četně dat kontrolní odezvy, 
nýbrž zavést hodnoty kontrolní odezvy jakožto dodate čný parametr, který bude 
upraven lineární regresí. Zatímco obvyklá regresní rovnice je dvouparametrická, 
tato metoda vyžaduje vnesení 3 parametr ů, a proto pot řebuje více datových bod ů 
než nelineární regrese provád ěná s daty, která jsou normalizována pomocí 
předem stanovené kontrolní odezvy.  
Inverzní intervaly spolehlivosti  
Výpočet nelineárních regresních interval ů spolehlivosti inverzním odhadem je 
poněkud složité a není to dostupná standardní možnost v b ěžných balících statis ­
tických po čítačových program ů. Přibližné intervaly spolehlivosti lze získat 
pomocí standardních program ů nelineární regrese s opakovanou parametrizací 
(Bruce a Versteeg, 1992), což zahrnuje p řepisování matematické rovnice za 
použití požadovaných odhad ů bodů, např. EC  10 a EC  50 jakožto parametr ů, 
které se mají odhadnout. Nech ť je funkce  I = f (α, β, koncentrace); defini ční 
vztahy f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 a f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 se použijí k nahrazení f ( α, β, 
koncentrace) ekvivalentní funkcí g (EC  10 , EC  50 , koncentrace).  
Přímější výpočet (Andersen  et al ., 1998) se provádí zachováním p ůvodní rovnice 
a použitím Taylorova rozší ření okolo st ředních hodnot  r i a r 0 . 
V poslední dob ě se staly oblíbenými metody „bootstrap“. Takové metody použí ­
vají naměřených údaj ů a častého op ětovného odb ěru vzorků určovaného generá ­
torem náhodných čísel pro odhad empirické distribuce rozptyl ů. 
Literatura  
Kooijman, S.A.L.M., Hanstveit, A.O., Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests.  Water Research , 30, 1625–1632.  
Bruce, R.D.; Versteeg, D.J.(1992): A Statistical Procedure for Modelling Conti ­
nuous Ecotoxicity Data.  Env. Toxicol. Chem .11, 1485–1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A., Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response.  
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics , 3, 405–420.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI  
ČÁST I.  OBECNÉ ÚVAHY  
I.1. ÚVOD  
Je popsáno šest metod, které umož ňují screeningové posouzení 
snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním 
vodním prost ředí: 
a) zkouška na úbytek rozpušt ěného organického uhlíku (DOC) 
(metoda C.4-A);  
b) modifikovaná screeningová zkouška OECD – na úbytek DOC 
(metoda C.4-B);  
c) zkouška na uvol ňování oxidu uhli čitého (CO  2 ) (modifikovaná 
Sturmova zkouška) (metoda C.4-C);  
d) zkouška manometrickou respirometrií (metoda C.4-D);  
e) zkouška v uzav řených lahvi čkách (metoda C.4-E);  
f) zkouška MITI (Ministerstvo zahrani čního obchodu a pr ůmyslu – 
Japonsko) (metoda C.4-F).  
Obecné a spole čné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny 
v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny 
v částech II až VII. Dodatky obsahují definice, vzorce a návody.  
Mezilaboratorní srovnávací test OECD provedený v roce 1988 
ukázal, že metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzi ­
kálním charakteru látky, která má být zkoušena, se však m ůže dávat 
přednost ur čité metod ě. 
I.2. VÝB ĚR VHODNÉ METODY  
Pro volbu nejvhodn ější metody jsou nezbytné informace 
o rozpustnosti, tenzi par a o adsorp čních vlastnostech chemické 
látky. Pro výpo čet teoretických hodnot a/nebo ov ěření naměřených 
hodnot parametr ů, např. TSK, TCO  2 , DOC, TOC, CHSK (viz 
dodatky 1 a 2) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.  
Zkoušené chemické látky, jejichž rozpustnost ve vod ě je alespo ň 
100 mg/l, lze zkoušet všemi metodami za p ředpokladu, že net ěkají 
a neadsorbují se. Pro látky špatn ě rozpustné ve vod ě, které těkají 
nebo se adsorbují, jsou vhodné metody uvedené v tabulce 1. Zp ůsob, 
jakým je t řeba zacházet s látkami špatn ě rozpustnými ve vod ě a s 
látkami t ěkavými, je popsán v dodatku 3. Mírn ě těkavé látky je 
možno zkoušet metodou úbytku DOC, pokud je ve zkušebních nádo ­
bách (které musí být vhodn ě uzavřeny) dostate čně velký prostor pro 
plyn. V tomto p řípadě musí být provedena abiotická kontrola pro 
zohlednění případné fyzikální ztráty.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabulka 1  
Použitelnost zkušebních metod  
Zkouška Analytická metoda Vhodnost pro látky 
špatně 
rozpustné těkavé adsorbující se  
na úbytek DOC rozpušt ěný organický uhlík - - +/- 
modif. zkouška OECD – na 
úbytek DOC rozpuštěný organický uhlík - - +/- 
na uvolňování CO  2 respirometrie: uvol ňování 
CO 2 + - + 
manometrická respirometrie manometrická respirome- 
trie: spotřeba kyslíku + +/- + 
zkouška v uzav řených 
lahvičkách respirometrie: rozpušt ěný 
kyslík +/- + + 
MITI respirometrie: spot řeba 
kyslíku + +/- +  
Pro interpretaci získaných výsledk ů, zejména pokud jsou výsledky 
nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativ ­
ních podílech hlavních složek zkoušeného materiálu.  
Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi 
užitečné informace o toxicit ě zkoušené chemické látky pro bakterie 
(dodatek 4); tyto informace mohou být d ůležité pro správnou inter ­
pretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.  
I.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Pro ověření postupu se soub ěžně se zkouškou a ve vlastní ba ňce 
zkoušejí referen ční chemické látky, které spl ňují kritéria snadné 
biologické rozložitelnosti.  
Vhodnými chemickými látkami jsou anilin ( čerstvě předestilovaný), 
natriumacetát, natriumbenzoát. Všechny tyto referen ční chemické 
látky se za podmínek v uvedených metodách rozkládají, i když se 
záměrně nepřidá žádné inokulum.  
Byl podán návrh hledat referen ční chemickou látku, která by byla 
snadno rozložitelná, avšak vyžadovala by p řidání inokula. Navržen 
byl kaliumhydrogenftalát. O této látce je t řeba ještě získat více údaj ů, 
než ji bude možné p řijmout jako referen ční látku.  
V respirometrických zkouškách mohou v d ůsledku nitrifikace 
ovlivnit spot řebu kyslíku látky obsahující dusík (viz dodatky 2 a 5).  
I.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD  
Roztok nebo suspense zkoušené látky v minerálním prost ředí se 
inokuluje a kultivuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difuzním sv ětle. Množství DOC ve zkušebním roztoku pocházející 
z inokula se musí udržovat ve srovnání s DOC pocházejícího ze 
zkoušené látky co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základ ě souběžné slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené 
látky, třebaže endogenní aktivita bun ěk v přítomnosti látky p řesně 
neodpovídá aktivit ě v endogenní kontrolní zkoušce. Za ú čelem 
kontroly postupu se soub ěžně provádí zkouška s referen ční látkou.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Obecně se rozklad sleduje stanovením parametr ů jako DOC, tvorba 
CO 2 nebo spot řeba kyslíku a m ěření se provád ějí v dostate čně krát­
kých intervalech, aby bylo možné identifikovat za čátek a konec 
biologického rozkladu. M ěření automatickými respirometry je konti ­
nuální. N ěkdy se dopl ňkově k jinému parametru m ěří DOC, avšak 
obvykle pouze na za čátku a na konci zkoušky. Lze rovn ěž použít 
specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkoušené látky nebo kterou se stanoví koncentrace kterého ­
koli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).
 
Zkouška obvykle trvá 28 dn ů. Je však možné ukon čit měření před 
uplynutím 28 dní, tj. jakmile vykazuje k řivka biologického rozkladu 
plató po t ři po sobě následující m ěření. Je také možné m ěření po 28 
dnech prodloužit, jestliže z k řivky vyplývá, že biologický rozklad 
začal, avšak 28. dne ješt ě nebylo ješt ě dosaženo plató.  
I.5. KRITÉRIA JAKOSTI  
I.5.1.  Reprodukovatelnost  
Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a sm ěsných populací 
bakterií používaných jako inokula se stanovení provád ějí nejmén ě 
duplicitně. 
Je obecn ě známo, že čím vyšší je koncentrace mikroorganism ů 
přidaných na po čátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly 
mezi vícenásobnými m ěřeními. Okružní testy rovn ěž ukázaly, že 
mezi výsledky získanými r ůznými laborato řemi mohou být velké 
rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných slou čenin se 
obvykle dosahuje dobré shody.  
I.5.2.  Platnost zkoušky  
Zkouška se považuje za platnou, je-li na konci zkoušky nebo pop ří­
padě na konci 10denního období rozkladu rozdíl hodnot krajních 
výsledků vícenásobných m ěření rozkladu zkoušené chemické látky 
v oblasti plató k řivky menší než 20 % a dosáhl-li stupe ň rozkladu 
referenční látky vyjád řený v procentech úrovn ě snadné biologické 
rozložitelnosti do 14 dní. Není-li spln ěna kterákoli z t ěchto 
podmínek, m ěření se opakuje. Vzhledem k náro čnosti metod nezna ­
menají nízké hodnoty nutn ě skutečnost, že zkoušená látka není 
v podmínkách životního prost ředí biologicky rozložitelná, ale zname ­
nají, že k prokázání biologické rozložitelnosti jsou t řeba další studie.  
Jestliže ve zkoušce toxicity zahrnující jak zkoušenou látku, tak refe ­
renční chemickou látku došlo b ěhem 14 dn ů k méně než 35 % 
rozkladu (stanoveného podle DOC) nebo k mén ě než 25 % rozkladu 
(stanoveného podle TSK nebo TCO  2 ), lze zkoušené chemické látky 
považovat za inhibující (viz také dodatek 4). Série zkoušek by m ěla 
být opakována, pokud možno s nižší koncentrací zkoušené chemické látky a/nebo s vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací 
vyšší než 30 mg pevných látek v litru.
 
I.6. OBECNÉ POSTUPY A P ŘÍPRAVA  
Obecné podmínky pro zkoušky jsou shrnuty v tabulce 2. P řístroje 
a další experimentální podmínky specifické pro jednotlivé metody 
jsou popsány dále v kapitolách pro tyto p říslušné metody.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Tabulka 2  
Zkušební podmínky  
Zkouška Zkouška na 
úbytek DOC Zkouška na 
uvolňování 
CO 2 Manometrická 
respirometrie Modif. scre ­
eningová 
zkouška OECD Zkouška 
v uzavřených 
lahvičkách Zkouška MITI 
(l) 
Koncentrace 
zkoušené 
látky 2–10 100 
mg/l 100 
mg DOC/l 10–40 10–20 10–40 mg TSK/l 50–100 5–10 
Koncentrace 
inokula (bu ň­
ky/1, přibližně) ≤ 30 mg/l SL 
nebo ≤ 100 ml odpadní vody/l 
(10
 7 –10  8 ) 0,5 ml 
sekundární 
odpadní 
vody/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
odpadní 
vody/l 
(10 4 –10  6 ) 30 mg/l SL 
(10 7 –10  8 ) 
Koncentrace 
prvků 
v minerálním médiu (v mg/l) 
P 116 11,6 29 
N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 
Mg 2,2 2,2 6,6 
Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05-0,1 0,05-0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 nejlépe 7,0 
Teplota 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = rozpušt ěný organický uhlík, TSK = teoretická 
spotřeba kyslíku, SL = suspendované 
látky  
I.6.1.  Ředicí voda  
Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda neobsahující inhibu ­
jící koncentrace toxických látek (nap ř. ionty Cu  2+ ). Voda smí obsa ­
hovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku vneseného zkou ­ 
šeným materiálem. Vysoká čistota vody pro zkoušky je nezbytná 
proto, aby se nevyskytovaly vysoké hodnoty slepého pokusu. Konta ­
minace m ůže pocházet z vlastních p řítomných ne čistot, z materiálu 
měniče iontů, z rozkladných látek z bakterií a řas. Pro každou sérii 
měření se použije pouze jedna šarže vody, která byla p ředem překon­
trolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvi čkách, spot řeba kyslíku vodou však musí být 
nízká.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Zásobní roztoky minerálních složek  
Pro přípravu zkušebních roztok ů se připraví zásobní roztoky 
o vhodných koncentracích minerálních složek. Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (p ři různých zřeďovacích faktorech) pro 
metodu s úbytkem DOC, modifikovanou screeningovou metodu 
OECD, metodu s uvol ňováním CO
 2 , pro manometrickou respirome ­
trii a pro metodu s uzav řenými lahvi čkami.  
Zřeďovací faktory a specifická p říprava minerálního media pro 
zkoušku MITI jsou uvedeny v oddílech pro jednotlivé zkoušky.  
Zásobní roztoky:  
Za použití reak čních činidel čistoty p.a. se p řipraví tyto zásobní 
roztoky: 
a) Dihydrogenfosfore čnan draselný, KH  2 PO 4 8,50 g 
Hydrogenfosfore čnan didraselný, K  2 HPO  4 21,75 g 
Hydrogenfosfore čnan disodný dihydrát, Na  2 HPO  4 . 
2 H  2 O 33,40 g 
Chlorid amonný, NH  4 Cl 0,50 g 
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr. pH roztoku 
musí být 7,4. 
b) Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl  2 27,50 g 
nebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl  2 , 2 H  2 O 36,40 g 
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr. 
c) Síran ho řečnatý heptahydrát, MgSO  4 . 7H  2 O 22,50 g 
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr. 
d) Chlorid železitý hexahydrát, FeC1  3 . 6H  2 O 0,25 g 
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr.  
Poznámka: Aby nebylo nutné p řipravovat tento roztok bezprost ředně 
před použitím, p řidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chloro ­
vodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové 
(EDTA) na 1 litr.  
I.6.3.  Zásobní roztoky chemických látek  
Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g/l, rozpustí se nap říklad 1–10 
g (podle pot řeby) zkoušené nebo referen ční látky v deionizované 
vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se zásobní roztoky p řipravují 
v minerálním médiu, nebo se chemická látka p řidá přímo do mine ­
rálního média. Pokud jde o postup s mén ě rozpustnými chemickými 
látkami, viz dodatek 3; ve zkoušce MITI (metoda C.4-F) se nepo ­
užívají ani rozpoušt ědla, ani emulga ční činidla.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Inokula  
Inokulum lze získat z řady zdroj ů: z aktivovaného kalu, ze splaško ­
vých vod (nechlorovaných), z povrchových vod a p ůd nebo z jejich 
směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce na úbytek DOC, na 
uvolňování CO  2 a ve zkoušce manometrickou respirometrií, m ěl by 
být odebrán z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně 
domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdroj ů byl zjišt ěn větší 
rozptyl výsledk ů. V modifikované screeningové zkoušce OECD a ve 
zkoušce v uzav řených lahvi čkách je pot řebné zředěnější inokulum 
bez vloček kalu a nejvhodn ějším zdrojem je voda z druhého stupn ě 
čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro 
zkoušku MITI se inokulum získává ze sm ěsi zdrojů a je popsáno 
v oddílu v ěnovaném této zkoušce.  
I.6.4.1.  Inokulum z aktivovaných kal ů 
Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aera ční nádrže 
čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně 
domovní odpadní vody. Podle pot řeby se filtrací p řes jemné síto 
odstraní hrubé částice a kal se udržuje v aerobních podmínkách.  
Jinou možností je usazení nebo odst ředění (např. 10 minut p ři 1 100 
g) po odstran ění hrubých částic. Voda nad usazeninou se odstraní. 
Kal se promyje minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspen ­
duje v minerálním médiu na koncentraci 3–5 g suspendovaných pevných látek na litr a až do použití se provzduš ňuje.
 
Kal by m ěl být odebrán z dob ře fungující konven ční čistírny. Je-li 
nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem nebo p ředpokládá-li 
se, že kal obsahuje inhibitory, je t řeba jej promýt. Po d ůkladném 
promíchání se kal nechá usadit nebo se odst ředí, voda nad usaze ­
ninou se odstraní a promytý kal se op ět suspenduje v nové dávce 
minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepova ­ 
žuje za prostý p řebytečného substrátu nebo inhibitoru.  
Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se t ěsně 
před použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny 
suspendovaných pevných látek.  
Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3–5 g suspendo ­
vaných látek v litru). Kal se 2 minuty zpracovává v mechanickém mísiči při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá 30 minut, pop ří­
padě déle, usazovat a kapalina se dekantuje pro použití jako 
inokulum v koncentraci 10 ml/l minerálního média.
 
I.6.4.2.  Jiné zdroje inokula  
Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupn ě čistírny odpadních 
vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající p řevážně domovní 
odpadní vody. Odebere se čerstvý vzorek a b ěhem přepravy se 
udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se 1 hodinu usadit nebo se zfiltruje p řes hrubý filtra ční papír a dekantovaná kapalina nebo 
filtrát se až do použití udržuje v aerobních podmínkách. Na litr 
média lze použít až 100 ml tohoto typu inokula.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto p řípadě se 
odebere vzorek vhodné povrchové vody, nap ř. říční nebo jezerní 
vody, a uchovává se až do použití v aerobních podmínkách. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo odst ředě­
ním.
 
I.6.5.  Předběžná úprava inokulí  
Inokula je možné p ředběžně upravit pro experimentální podmínky, 
ale nikoli p ředběžně adaptovat na zkušenou látku. P ředběžná úprava 
spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo 
výstupu z druhého stupn ě čistírny po dobu 5–7 dn ů při zkušební 
teplotě. Předběžná úprava n ěkdy zlepší p řesnost zkušebních metod 
snížením hodnot ze slepých pokus ů. Předúprava inokula pro zkoušku 
MITI se nepovažuje za nutnou.  
I.6.6.  Abiotické kontroly  
V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkoušené 
látky stanovením úbytku DOC, p řijmu kyslíku nebo uvol ňování 
oxidu uhli čitého ve sterilních kontrolách bez inokula. Sterilizace se 
provádí filtrací p řes membránu (0,2–0,45 μm) nebo p řidáním vhodné 
toxické látky v odpovídající koncentraci. Používá-li se membránová filtrace, odebírají se vzorky asepticky, aby byla zachována sterilita. 
Pokud nebyla p ředem vylou čena adsorpce zkoušené látky, m ěly by 
zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména p ři použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat 
abiotickou kontrolu, která je inokulována a intoxikována.
 
I.6.7.  Po čet nasazených ban ěk 
Počet nasazených ban ěk v typické zkoušce je uveden v oddílech 
věnovaných jednotlivým zkouškám.  
Mohou být použity tyto ba ňky: 
— zkušební suspense: obsahující zkoušenou látku a inokulum,  
— slepá zkouška s inokulem: obsahující pouze inokulum,  
— kontrolní zkouška postupu: obsahující referen ční látku 
a inokulum,  
— abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahující zkoušenou látku 
(viz I.6.6),  
— kontrola adsorpce: obsahující zkoušenou látku, inokulum 
a steriliza ční činidlo,  
— kontrola toxicity: obsahující zkoušenou látku, referen ční látku 
a inokulum.  
Stanovení ve zkušební suspensi a slepý pokus s inokulem musí být 
prováděny souběžně. Doporu čuje se, aby stanovení v ostatních 
baňkách bylo provád ěno rovněž souběžně. 
To však nemusí být vždy možné. Je t řeba zajistit, aby se odebíral 
dostatečný počet vzorků nebo aby se provád ěl dostatečný počet 
odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10denním období 
rozkladu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. DATA A HODNOCENÍ  
Při výpočtu rozkladu v procentech D  t se použijí st řední hodnoty 
z měření parametru provedených duplicitn ě v obou zkušebních nádo ­
bách a ze slepého pokusu s inokulem.Vzorce jsou uvedeny dále 
v oddílech pro jednotlivé zkoušky. Pr ůběh rozkladu se znázorní 
graficky a vyzna čí se 10denní období rozkladu. Vypo čte se 
a uvede úbytek v procentech dosažený na konci 10denního období rozkladu a hodnota pro plató k řivky nebo pop řípadě hodnota odpo ­
vídající konci zkoušky.
 
V respirometrických zkouškách mohou v d ůsledku nitrifikace 
ovlivnit spot řebu kyslíku látky obsahující dusík (viz dodatky 2 a 5).  
I.7.1.  M ěření rozkladu prost řednictvím stanovení DOC  
Za účelem posouzení platnosti zkoušky (viz I.5.2) by se m ěla 
hodnota rozkladu D  t v procentech v každém časovém okamžiku, 
ve kterém se odebral vzorek, vypo čítat odděleně pro každou ba ňku 
obsahující zkoušenou látku, a to pomocí st ředních hodnot m ěření 
DOC provedených duplicitn ě. Vypočte se podle této rovnice:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100 
kde: 
D t = rozklad v procentech v čase t,  
C o = střední počáteční koncentrace DOC v inokulovaném kulti ­
vačním médiu obsahujícím zkoušenou látku (v mg DOC na 
litr), 
C t = střední koncentrace DOC v inokulovaném kultiva čním 
médiu obsahujícím zkoušenou látku v čase t (v mg DOC 
na litr),  
C bo = střední počáteční koncentrace DOC ve slepém inokulo ­
vaném minerálním médiu (v mg DOC na litr),  
C bt = střední koncentrace DOC ve slepém inokulovaném mine ­
rálním médiu v čase t (v mg DOC na litr).  
Všechny koncentrace se stanoví experimentáln ě. 
I.7.2.  Rozklad m ěřený specifickou analýzou  
Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypo čte se primární 
biologický rozklad z rovnice:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
kde: 
D t = rozklad v procentech v čase t, obvykle po 28 dnech,  
S a = zbylé množství zkoušené látky v médiu s inokulem na konci 
zkoušky (mg),  
S b = zbylé množství zkoušené látky ve slepém pokusu s vodou/ 
médiem, do kterých byla p řidána pouze zkoušená látka (mg).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
1.7.3.  Abiotický rozklad  
Použije-li se abiotická sterilní kontrola, vypo čte se abiotický rozklad 
v procentech podle rovnice:  
abiotický rozklad v%  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
kde: 
C s(o) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den 0,  
C s(t) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den t.  
I.8. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— zkoušené a referen ční chemické látky a jejich čistota,  
— zkušební podmínky,  
— inokulum: charakter a místo/místa odb ěru, koncentrace a jakákoli 
předúprava,  
— podíl a charakter pr ůmyslového odpadu obsaženého v odpadní 
vodě, jsou-li známy,  
— délka zkoušky a teplota,  
— v případě špatně rozpustných zkoušených látek použitý zp ůsob 
zpracování,  
— použitá zkušební metoda; m ěly by být uvedeny v ědecké důvody 
a vysvětlení pro veškeré zm ěny postupu,  
— přehled dat,  
— veškeré pozorované projevy inhibice,  
— jakýkoli pozorovaný abiotický rozklad,  
— specifická analytická data o chemické látce, pokud existují,  
— analytická data o meziproduktech, pokud existují,  
— graf závislosti rozkladu v procentech na čase pro zkoušenou 
a referen ční látku; je t řeba zřetelně označit fázi iniciace, fázi 
rozkladu, 10denní období rozkladu a sm ěrnici (dodatek 1). 
Vyhovuje-li zkouška kritériím jakosti, je možné v grafu použít 
střední hodnotu rozkladu v procentech v ba ňkách obsahujících 
zkoušenou látku,  
— rozklad v procentech po 10denním období rozkladu, v oblasti 
plató a na konci zkoušky.  
ČÁST II.  ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC  (metoda C.4-A)  
II.1. PODSTATA METODY  
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahujícího 
známou koncentraci zkoušené látky (10–40 mg DOC na litr) jako 
nominální jediný zdroj organického uhlíku se provzduš ňuje v temnu 
nebo v difusním sv ětle při 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Rozklad se sleduje v krátkých intervalech b ěhem 28denního období 
prostřednictvím analýzy DOC. Stupe ň biologického rozkladu se 
vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na 
koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla p řítomna na za čátku. Stupe ň primárního 
biologického rozkladu lze rovn ěž vypočítat z dopl ňkové chemické 
analýzy provedené na za čátku a na konci kultivace.
 
II.2. POPIS METODY  
II.2.1.  Aparatura  
a) Erlenmeyerovy ba ňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu 
potřebného pro analýzu DOC;  
b) třepačka upravená pro umíst ění Erlenmeyerových ban ěk, buď 
s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostate čným výkonem pro udržení aero ­
bních podmínek ve všech ba ňkách;
 
c) filtrační aparatura s vhodnými membránami;  
d) analyzátor DOC;  
e) přístroj pro stanovení rozpušt ěného kyslíku;  
f) odstředivka.  
II.2.2.  Příprava minerálního média  
Příprava zásobních roztok ů je popsána v bod ě I.6.2.  
Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, p řidá se po 1 ml 
roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.  
II.2.3.  Příprava a p ředběžná úprava inokula  
Inokulum lze získat z řady zdroj ů: z aktivovaného kalu, ze splaško ­
vých vod, z povrchových vod, z p ůd nebo z jejich sm ěsi. 
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.  
II.2.4.  Příprava ban ěk 
Do dvoulitrových Erlenmeyerových ban ěk se nap říklad odm ěří 
800 ml minerálního média a do jednotlivých ban ěk se přidají dosta ­
tečná množství zásobních roztok ů zkoušené a referen ční látky tak, 
aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10–40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a pop řípadě se upraví na 7,4. Ba ňky se 
inokulují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz 
I.6.4.), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspen ­
dovaných látek na litr. P řipraví se rovn ěž kontroly s inokulem 
v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referen ční látky.
 
Podle pot řeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhi ­
bičního účinku zkoušené látky inokulací roztoku, který obsahuje 
srovnatelná množství jak zkoušené, tak referen ční chemické látky 
v minerálním médiu.  
Podle pot řeby se také použije další, sterilní ba ňka s roztokem 
chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkoušená 
chemická látka rozkládá abioticky (viz I.6.6).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Existuje-li dále podez ření, že se zkoušená látka významn ě adsorbuje 
na skle, kalu apod., provede se p ředběžný odhad pravd ěpodobného 
rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se ba ňka obsahující zkoušenou látku, inokulum 
a steriliza ční činidlo.
 
Obsah všech ban ěk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po 
promíchání se z každé ba ňky odebere vzorek pro stanovení po čáteční 
koncentrace DOC (viz bod 4 dodatku 2). Ústí ban ěk se zakryjí nap ř. 
hliníkovou fólií tak, aby byla umožn ěna volná vým ěna vzduchu mezi 
baňkami a okolní atmosférou. Ba ňky se poté umístí do t řepačky 
a zahájí se zkouška.  
II.2.5.  Počet baněk v typické zkoušce  
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense  
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem  
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu  
Dále se doporu čují nebo se podle pot řeby použijí:  
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola  
Baňka 7: Kontrola adsorpce  
Baňka 8: Kontrola toxicity  
Viz také bod I.6.7.  
II.2.6.  Provedení zkoušky  
Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitn ě 
stanovuje koncentrace DOC v každé ba ňce, a to dostate čně často, 
aby bylo možné ur čit začátek 10denního období rozkladu a úbytek 
v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stano ­
vení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.
 
Před každým odb ěrem vzork ů se podle pot řeby nahradí ztráty odpa ­ 
řováním z ban ěk přidáním pot řebného množství ředicí vody (1.6.1). 
Před odběrem vzork ů se kultiva ční médium dob ře promíchá a zajistí 
se, aby látky ulp ělé na stěnách nádob p řešly do roztoku nebo 
suspense. Vzorky se ihned po odb ěru zfiltrují p řes membránu nebo 
odstředí (viz bod 4 dodatku 2). Zfiltrované nebo odst ředěné vzorky 
se analyzují týž den, v opa čném případě se uchovávají nejdéle 48 
hodin při 2–4  o C nebo delší dobu p ři teplotě nižší než –18  o C. 
II.3. ÚDAJE A P ŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV  
II.3.1.  Zpracování výsledk ů 
Rozklad v procentech v čase t se vypo čte podle bodu I.7.1 (stano ­
vení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).  
Všechny výsledky se uvedou na p říslušných formulá řích 
přehledu dat.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Platnost výsledk ů 
Viz bod I.5.2.  
II.3.3.  Zprávy  
Viz bod I.8.  
II.4. P ŘEHLED DAT  
Dále je uveden p říklad přehledu dat.  
ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC  
1. LABORATO Ř 
2. DATUM PO ČÁTKU ZKOUŠKY  
3. ZKOUŠENÁ LÁTKA  
Název:  
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg/l  
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t  0 : mg/l  
4. INOKULUM  
Zdroj:  
Provedená úprava:  
Předběžná úprava, pokud byla provedena:  
Koncentrace suspendovaných látek v reak ční směsi: mg/l  
5. STANOVENÍ UHLÍKU  
Analyzátor uhlíku:  
Baňka č. DOC po n dnech (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Zkoušená látka 
a inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, střední hodnota 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, střední hodnota 
C b(t) ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Baňka č. DOC po n dnech (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Slepá zkouška 
s inokulem bez zkoušené látky 3 c
 1 
c 2 
c, střední hodnota 
C c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, střední hodnota 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VYHODNOCENÍ NAM ĚŘENÝCH DAT  
Baňka č. Rozklad v % po n dnech 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Střední 
hodnota (  1 ) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
( 1 ) Hodnoty D  1 a D  2 by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.  
Poznámka:  Podobné formulá ře lze použít pro referen ční chemickou 
látku a kontrolu toxicity.  
7. ABIOTICKÁ KONTROLA  (nepovinná)  
Čas (dny) 
0 t  
DOC (mg/l) ve sterilní kontrole C s(o) C s(t) 
abiotický rozklad v %  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA  (nepovinná)  
Zbylé množství zkoušené 
chemické látky na konci zkoušky 
(mg/l) Primární rozklad v procentech  
Sterilní kontrola S  b ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Zbylé množství zkoušené 
chemické látky na konci zkoušky 
(mg/l) Primární rozklad v procentech  
Inokulované zkušební médium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
ČÁST III.  MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA 
OECD  (metoda C.4-B)  
III.1. PODSTATA METODY  
Odměřený objem minerálního média obsahujícího známou koncen ­
traci zkoušené látky (10–40 mg DOC na litr) jako jediný zdroj organického uhlíku se inokuluje 0,5 ml odpadní vody na litr média. Směs se provzduš ňuje v temnu nebo v difusním sv ětle při 22 ± 2
 o C. 
Rozklad se sleduje v krátkých intervalech b ěhem 28denního období 
prostřednictvím analýzy DOC. Stupe ň biologického rozkladu se 
vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na 
koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla p řítomna na za čátku. Stupe ň primárního 
biologického rozkladu lze rovn ěž vypočítat z dopl ňkové chemické 
analýzy provedené na za čátku a na konci inkubace.
 
III.2. POPIS METODY  
III.2.1 Aparatura  
a) Erlenmeyerovy ba ňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu 
potřebného pro analýzu DOC;  
b) třepačka pro umíst ění Erlenmeyerových ban ěk, buď 
s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostate čným výkonem pro udržení aero ­
bních podmínek ve všech ba ňkách;
 
c) filtrační aparatura s vhodnými membránami;  
d) analyzátor DOC;  
e) přístroj pro stanovení rozpušt ěného kyslíku;  
f) odstředivka.  
III.2.2.  Příprava minerálního média  
Příprava zásobních roztok ů je popsána v bod ě I.6.2.  
Smísí se 10 ml roztoku a) s 80 ml ředicí vody, p řidá se po 1 ml 
roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.  
V této metod ě se používá jako inokulum pouze 0,5 ml odpadní vody 
na litr, a proto je nutné do média dodat stopové prvky a r ůstové 
faktory. Toho se dosáhne p řidáním 1 ml každého z dále uvedených 
roztoků na jeden litr výsledného média:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Roztok stopových prvk ů: 
Síran manganatý tetrahydrát, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg 
Kyselina boritá, H  3 BO 3 57,2 mg 
Síran zine čnatý heptahydrát, ZnSO  4 . 7 H  2 O 42,8 mg 
Heptamolybdenan hexaamonný, (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Chelát Fe (FeCl  3 s kyselinou ethylendiamintetraocto ­
vou) 100,0 mg 
Rozpustí se v ředicí vod ě a doplní se touto vodou na 
1 000 ml. 
Vitaminový roztok: Kvasničný extrakt 15,0 mg
 
Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se 
průchodem membránou 0,2 μm, nebo se p řipraví čerstvě. 
III.2.3.  Příprava a p ředběžná úprava inokula  
Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupn ě čistírny odpadních 
vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající p řevážně domovní 
odpadní vody. Viz I.6.4.2 a I.6.5.  
Použije se 0,5 ml na litr minerálního média.  
III.2.4.  Příprava ban ěk 
Do dvoulitrových Erlenmeyerových ban ěk se nap říklad odm ěří 
800 ml minerálního média a do jednotlivých ban ěk se přidají dosta ­
tečná množství zásobních roztok ů zkoušené a referen ční látky tak, 
aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10–40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a pop řípadě se upraví na 7,4. Ba ňky se 
inokulují odpadní vodou z druhého stupn ě čištění odpadních vod 
(viz I.6.4.2) v objemu 0,5 ml na litr. P řipraví se rovn ěž kontroly 
s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referen ční 
látky.
 
Podle pot řeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhi ­
bičního účinku zkoušené látky inokulací roztoku, který obsahuje 
srovnatelná množství jak zkoušené, tak referen ční chemické látky 
v minerálním médiu.  
Podle pot řeby se také použije další, sterilní ba ňka s roztokem 
chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkoušená chemická látka rozkládá abioticky (viz I.6.6).
 
Existuje-li dále podez ření, že se zkoušená látka významn ě adsorbuje 
na skle, kalu apod., provede se p ředběžný odhad pravd ěpodobného 
rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se ba ňka obsahující zkoušenou látku, inokulum 
a steriliza ční činidlo.
 
Obsah všech ban ěk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po 
promíchání se z každé ba ňky odebere vzorek pro stanovení po čáteční 
koncentrace DOC (viz bod 4 dodatku 2). Ústí ban ěk se zakryjí nap ř. 
hliníkovou fólií tak, aby byla umožn ěna volná vým ěna vzduchu mezi 
baňkami a okolní atmosférou. Ba ňky se poté umístí do t řepačky 
a zahájí se zkouška.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Počet baněk v typické zkoušce  
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense  
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem  
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu  
Dále se doporu čují nebo se podle pot řeby použijí:  
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola  
Baňka 7: Kontrola adsorpce  
Baňka 8: Kontrola toxicity  
Viz také bod I.6.7.  
III.2.6.  Provedení zkoušky  
Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitn ě 
stanovuje koncentrace DOC v každé ba ňce, a to dostate čně často, 
aby bylo možné ur čit začátek 10denního období rozkladu a úbytek 
v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stano ­
vení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.
 
Před každým odb ěrem vzork ů se podle pot řeby nahradí ztráty odpa ­ 
řováním z ban ěk přidáním pot řebného množství ředicí vody (1.6.1). 
Před odběrem vzork ů se kultiva ční médium dob ře promíchá a zajistí 
se, aby látky ulp ělé na stěnách nádob p řešly do roztoku nebo 
suspense. Vzorky se ihned po odb ěru zfiltrují p řes membránu nebo 
odstředí (viz bod 4 dodatku 2). Zfiltrované nebo odst ředěné vzorky 
se analyzují týž den, v opa čném případě se uchovávají nejdéle 48 
hodin při 2–4  o C nebo delší dobu p ři teplotě nižší než –18  o C. 
III.3. ÚDAJE A P ŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV  
III.3.1.  Zpracování výsledk ů 
Rozklad v procentech v čase t se vypo čte podle bodu I.7.1 (stano ­
vení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).  
Všechny výsledky se uvedou na p říslušných formulá řích přehledu 
dat. 
III.3.2 Platnost výsledk ů 
Viz bod I.5.2.  
III.3.3 Zprávy  
Viz bod I.8.  
III.4. P ŘEHLED DAT  
Dále je uveden p říklad přehledu dat.  
MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD  
1. LABORATO Ř 
2. DATUM PO ČÁTKU ZKOUŠKY  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. ZKOUŠENÁ LÁTKA  
Název:  
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: … mg/l  
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t  0 : … 
mg/l 
4. INOKULUM  
Zdroj:  
Provedená úprava:  
Předběžná úprava, pokud byla provedena:  
Koncentrace suspendovaných látek v reak ční směsi: … mg/l  
5. STANOVENÍ UHLÍKU  
Analyzátor uhlíku:  
Baňka č. DOC po n dnech (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Zkoušená látka 
a inokulutn 
1 a 1 
a 2 
a, střední hodnota 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, střední hodnota 
C b(t) 
Slepá zkouška 
s inokuletn bez 
zkoušené látky 3 c 1 
C 2 
c, střední hodnota 
C c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, střední hodnota 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. VYHODNOCENÍ NAM ĚŘENÝCH DAT  
Baňka č. Rozklad po n dnech 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Baňka č. Rozklad po n dnech 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Střední 
hodnota (  1 ) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
( 1 ) Hodnoty D  1 a D  2 by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.  
Poznámka:  Podobné formulá ře lze použít pro referen ční chemickou 
látku a kontrolu toxicity.  
7. ABIOTICKÁ KONTROLA  (nepovinná)  
Cas (dny) 
0 t  
DOC (mg/l) ve sterilní kontrole C s(o) C s(t) 
abiotický rozklad v %  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA  (nepovinná)  
Zbylé množství zkoušené 
chemické látky na konci zkoušky 
(mg/l) Primární rozklad v procentech  
Sterilní kontrola S  b 
Inokulované zkušební médium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
ČÁST IV. ZKOUŠKA NA UVOL ŇOVÁNÍ CO  2 (metoda C.4-C)  
IV.1. PODSTATA METODY  
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující 
známou koncentraci zkoušené látky (10–20 mg DOC nebo TOC 
na litr), která je jediným zdrojem uhlíku, se provzduš ňuje v temnu 
nebo v difusním sv ětle regulovaným proudem vzduchu bez CO  2 . 
Rozklad se sleduje po dobu 28 dn ů prostřednictvím vznikajícího 
CO 2 jímaného v roztoku hydroxidu barnatého nebo sodného, kde 
se stanoví titrací zbytkového hydroxidu nebo jako anorganický uhlík. Množství CO
 2 vzniklého ze zkoušené látky (po korekci na CO  2 
pocházející z čistého inokula) se vyjád ří v procentech TCO  2 . Stupeň 
biologického rozkladu m ůže být také vypo čten z dopl ňkového stano ­
vení DOC na za čátku a na konci inkubace.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. POPIS METODY  
IV.2.1.  Přístroje a pom ůcky 
a) baňky na 2–5 l vybavené provzduš ňovací trubicí dosahující až ke 
dnu nádoby a výstupním otvorem;  
b) magnetické mícha čky pro zkoušení špatn ě rozpustných látek;  
c) absorp ční lahev;  
d) zařízení pro regulaci a m ěření průtoku vzduchu;  
e) zařízení pro odstra ňování CO  2 při přípravě vzduchu bez CO  2 , 
popřípadě může být použita sm ěs kyslíku bez CO  2 a dusíku 
bez CO  2 ve správném pom ěru (20 % O  2 a 80 % N  2 ) z lahví 
se stlačenými plyny;  
f) zařízení na stanovení CO  2 buď titračně nebo pomocí analyzátoru 
anorganického uhlíku;  
g) zařízení pro membránovou filtraci (podle volby);  
h) analyzátor DOC (podle volby).  
IV.2.2.  Příprava minerálního média  
Příprava zásobních roztok ů je popsána v bod ě I.6.2.  
Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, p řidá se po 1 ml 
roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.  
IV.2.3.  Příprava a p ředběžná úprava inokula  
Inokulum lze získat z řady zdroj ů: z aktivovaného kalu, ze splaško ­
vých vod, z povrchových vod, z p ůd nebo z jejich sm ěsi. 
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.  
IV.2.4.  Příprava ban ěk 
Jako příklad jsou uvedeny hodnoty pro ba ňky na 5 litr ů obsahující 3 
litry suspense. V p řípadě použití menších objem ů se hodnoty úm ěrně 
upraví, musí být ovšem zajišt ěno, aby bylo možné p řesně měřit 
vznikající CO  2 . 
Do každé ba ňky na 5 litr ů se přenese 2 400 ml minerálního média. 
Přidá se vhodné množství p řipraveného inokula (viz I.6.4.1 a I.6.5), 
aby koncentrace suspendovaných látek v kone čném objemu 3 litry 
inokulované sm ěsi byla 30 mg/l. Eventuáln ě lze nejd říve zředit 
připravený kal v minerálním médiu na suspensi o koncentraci 
500–1 000 mg/l a poté p řidat alikvotní části do ba ňky na 5 litr ů, 
aby byla dosažena koncentrace 30 mg/l; zajistí se tím v ětší přesnost. 
Mohou být použity i jiné zdroje inokula (viz I.6.4.2).  
Inokulovaná sm ěs se přes noc provzduš ňuje vzduchem bez CO  2 , aby 
se ze systému odstranil oxid uhli čitý. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Odděleně do dvojic ban ěk se ze zásobních roztok ů přidá zkoušená 
látka a referen ční látka tak, aby koncentrace pocházející 
z chemických látek byla v rozmezí 10 až 20 mg DOC nebo TOC na litr; n ěkteré lahve se nasadí jako kontrola inokula bez p řidání 
chemických látek. Špatn ě rozpustné látky se odváží nebo odm ěří 
přímo do ban ěk, nebo se postupuje podle dodatku 3.
 
Podle pot řeby se jedna ba ňka použije ke kontrole možného inhibi č­
ního účinku zkoušené látky, a to p řidáním zkoušené i referen ční 
látky ve stejných koncentracích jako v ostatních ba ňkách.  
Podle pot řeby se další ba ňka použije k ov ěření, zda se zkoušená 
látka nerozkládá abioticky, p řičemž se použije roztok chemické 
látky bez inokula (viz I.6.6). Sterilizace se provádí p řidáním vhodné 
koncentrace toxické látky.  
Ve všech ba ňkách se upraví objem na 3 litry p řídavkem minerálního 
média bez CO  2 . Podle pot řeby lze odebrat vzorky pro stanovení 
DOC (viz bod 4 dodatku 2) a/nebo pro specifickou analýzu. Poté se na výstup plyn ů u baněk připojí absorp ční lahve.
 
V případě použití hydroxidu barnatého se za každou ba ňku na 5 litr ů 
zařadí tři absorpční lahve, každá obsahující 100 ml roztoku Ba(OH)  2 
o koncentraci 0,0125 mol/l. Roztok nesmí obsahovat sraženinu 
síranů a uhličitanu barnatého a jeho koncentrace musí být stanovena 
bezprostředně před použitím. Je-li použit hydroxid sodný, spojí se 
dvě absorpční lahve, z nichž druhá slouží jako kontrola, že byl 
veškerý CO  2 zachycen v první absorp ční lahvi. K tomuto ú čelu se 
hodí absorp ční lahve opat řené sérovými uzáv ěry. Do každé 
absorpční lahve se p řidá po 200 ml roztoku NaOH o koncentraci 
0,05 mol/l, což posta čuje k absorpci veškerého oxidu uhli čitého, 
který by se uvolnil p ři úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu 
sodného, i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhli čitanů; 
korekce se provede ode čtením množství uhli čitanů ve slepém 
pokusu.  
IV.2.5.  Počet baněk v typické zkoušce  
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense  
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem  
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu  
Dále se doporu čují nebo se podle pot řeby použijí:  
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola  
Baňka 7: Kontrola toxicity  
Viz také bod I.6.7.  
IV.2.6.  Provedení zkoušky  
Zkouška se zahájí probubláváním vzduchu bez CO  2 suspensí p ři 
průtoku 30–100 ml/min. Za ú čelem analýzy obsahu CO  2 se pravi­
delně odebírají vzorky absorbentu. Doporu čuje se, aby se v pr ůběhu 
prvních 10 dn ů prováděly analýzy každý druhý až t řetí den a dále 
pak každý pátý den až do 28. dne, což umožní rozpoznat období 
10denního období rozkladu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
28. den se (nepovinn ě) odebere vzorek pro stanovení DOC a/nebo 
pro specifickou analýzu, zm ěří se pH suspensí a poté se do každé 
baňky přidá 1 ml koncentrované HCl; provzduš ňuje se přes noc, aby 
se odstranil CO  2 přítomný v suspensi. Poslední analýza uvoln ěného 
CO 2 se provede 29. den.  
Ve dnech, kdy se provádí stanovení CO  2 , se odpojí absorp ční lahev 
s hydroxidem barnatým bližší zkušební ba ňce a roztok hydroxidu 
barnatého se titruje 0,05 M HCl za p řítomnosti fenolftaleinu jako 
indikátoru. Zbývající dv ě absorpční lahve se posunou k ba ňce a na 
konec řady se za řadí nová absorp ční lahev se 100 ml čerstvě připra­
veného 0,0125 M hydroxidu barnatého. Titrace se provád ějí podle 
potřeby, nap ř. je-li pozorována v první absorp ční lahvi z řetelná 
sraženina a p řed tím, než vznikne viditelná sraženina ve druhé 
absorpční lahvi, nebo alespo ň jednou týdn ě. Jinou možností je 
provést p ři použití NaOH jako absorbentu odb ěr malého vzorku 
hydroxidu sodného pomocí injek ční stříkačky (podle použitého 
analyzátoru uhlíku) z absorp ční lahve, která je nejblíž k ba ňce. 
Vzorek se nast říkne přímo do IC- části analyzátoru uhlíku pro 
analýzu anorganického uhlíku.  
Obsah druhé absorp ční lahve se analyzuje pouze na konci zkoušky 
s cílem stanovit korekci na možný únik CO  2 . 
IV.3. DATA A P ŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV  
IV.3.1.  Zpracování výsledk ů 
Množství CO  2 zachyceného v absorp ční lahvi je v p řípadě titračního 
stanovení dáno vztahem:  
mgCO  2 = (100 × C  B – 0,5 × V × C  A ) × 44  
kde: 
V = objem HCl spot řebovaný p ři titraci 100 ml obsahu 
absorpční lahve (ml),  
C B = koncentrace roztoku hydroxidu barnatého (mol/l),  
C A = koncentrace roztoku kyseliny chlorovodíkové (mol/l).  
Je-li CB 0,0125 mol/l a CA 0,05 mol/l, je spot řeba pro titraci 100 ml 
roztoku Ba(OH)  2 50 ml a hmotnost CO  2 je dána vztahem:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü počet ml HCl spot řebované p ři titraci ¼ 1; 1 Ü ml HCl  
V tomto p řípadě se tedy k p řepočtu objemu HCl spot řebovaného p ři 
titraci na hmotnost vzniklého CO  2 použije faktor 1,1.  
S použitím p říslušných výsledk ů titrace se vypo čte hmotnost CO  2 
vzniklého ze samotného inokula a inokula se zkoušenou látkou 
a jejich rozdíl je hmotnost CO  2 vzniklého ze samotné zkoušené 
látky.  
Je-li např. výsledkem titrace samotného inokula 48 ml a inokula se 
zkoušenou látkou 45 ml, je množství  
CO 2 z inokula = 1,1 × (50 – 48) = 2,2 mg,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 z inokula a zkoušené látky = 1,1 × (50 – 45) = 5,5 mg,  
a tedy hmotnost CO  2 vzniklého ze zkoušené látky 3,3 mg.  
Biologický rozklad v procentech se vypo čte podle vztahu:  
rozklad v procentech  ¼ vzniklý CO  2 v mg Ü 100 
TCO  2 Ü přidaná zkušební látka v mg  
nebo  
rozklad v procentech  ¼ vzniklý CO  2 v mg Ü 100 
TCO přidaný ve zkoušce v mg  Ü 3; 67 
přičemž 3,67 je p řevodní faktor (44/12) pro uhlík a oxid uhli čitý. 
Rozklad v procentech se po každém období vypo čte dosazením 
hodnoty TCO  2 vypočítané pro každý den až do doby, kdy byl 
měřen. 
Při zachytávání do NaOH se vypo čte hmotnost vzniklého CO  2 , 
vyjádřeného jako anorganický uhlík v mg, vynásobením koncentrace 
anorganického uhlíku v absorp ční lahvi objemem absorp čního 
roztoku.  
Rozklad v procentech se vypo čte podle vztahu:  
% ThCO  2 ¼ anorg : C ze zkušeb : baňky v mg Ä anorg : C ze slep : pokusu v mg 
TOC přidaný jako zkoušená látka v mg  Ü 100 
Úbytky DOC se (nepovinn ě) vypočítají podle bodu I.7. Tento 
výsledek spolu s ostatními výsledky se zaznamenají do p říslušného 
formuláře přehledu dat.  
IV.3.2.  Platnost výsledk ů 
Obsah anorganického uhlíku ve zkušební suspensi v minerálním 
médiu na za čátku zkoušky musí být menší než 5 % TC a celkové 
množství CO  2 vzniklé na konci slepé zkoušky s inokulem nesmí za 
normálních okolností p řekročit 40 mg na litr média. Jsou-li hodnoty 
větší než 70 mg CO  2 na litr, m ěla by být data i experimentální 
postup kriticky p řehodnoceny.  
Viz také I.5.2.  
IV.3.3.  Zprávy  
Viz bod I.8.  
IV.4. P ŘEHLED DAT  
Dále je uveden p říklad přehledu dat.  
ZKOUŠKA NA UVOL ŇOVÁNÍ OXIDU UHLI ČITÉHO  
1. LABORATO Ř 
2. DATUM PO ČÁTKU ZKOUŠKY  
3. ZKOUŠENÁ LÁTKA  
Název:  
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: … mg/l  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu: … mg/l  
Celkové množství uhlíku p řidaného do ba ňky: … mg C  
TCO  2 : mg CO  2 
4. INOKULUM  
Zdroj:  
Provedená úprava:  
Předběžná úprava, pokud byla provedena:  
Koncentrace suspendovaných látek v reak ční směsi: … mg/l  
Čas 
(dny) CO 2 uvolněný ve 
zkoušce (mg) CO 2 uvolněný ve slepé 
zkoušce (mg) Celkové množství CO  2 
(průměr ve zkoušce 
minus průměr ve slepé 
zkoušce) (mg) TCO  2 
kumulativní  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 průměr 3 
4 průměr 1 2 1 2 pr ůměr 
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Poznámka: podobný formulá ř lze použil i pro referen ční látku a pro 
kontroly toxicity.  
6. ANALÝZA UHLÍKU  (podle volby)  
Analyzátor uhlíku:  
Čas (dny) Slepý pokus (mg ·l -1 ) Zkoušená látka (rng.l  -1 ) 
0 C  b(o) C O 
28 (  1 ) C  b(t) C t 
( 1 ) nebo na konci kultivace.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
odstraněný DOC v % ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C t Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. ABIOTICKÝ ROZKLAD  (nepovinné) 
abiotický rozklad v %  ¼ CO  2 – tvorba CO2 ve steril : podm : po 28 dnech v mg 
TCO  2 Ü 100 
ČÁST V.  ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROME ­
TRIÍ  (metoda C.4-D)  
V.1. PODSTATA METODY  
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující 
známou koncentraci zkoušené chemické látky (100 mg zkoušené látky na litr, dávající nejmén ě 50–100 mg TSK na litr), která je 
jediným zdrojem organického uhlíku, se míchá v uzav řené nádob ě 
při konstantní teplot ě (tolerance ± 1
 o C nebo menší) po dobu 28 dn ů. 
Spotřeba kyslíku se stanoví bu ď měřením množství kyslíku (elek ­
trolyticky produkovaného), který je pot řebný k udržení konstantního 
objemu plynu v respira ční nádobce, nebo ze zm ěn objemu nebo 
tlaku (nebo obojího) v aparatu ře. Uvolněný CO  2 se jímá v roztoku 
hydroxidu draselného nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, které je zkoušenou látkou spot řebováno (korigované na 
spotřebu kyslíku inokulem ve slepé zkoušce, která se provádí sou čas­
ně), se vyjád ří v procentech TSK nebo CHSK. Pop řípadě může být 
z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na za čátku a na 
konci kultivace vypo čten primární biologický rozklad a z analýzy 
DOC úplný biologický rozklad.
 
V.2. POPIS METODY  
V.2.1.  Přístroje  
a) vhodný respirometr;  
b) regulátor teploty s p řesností na ± 1  o C nebo lepší;  
c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);  
d) analyzátor uhlíku (nepovinné).  
V.2.2.  Příprava minerálního média  
Příprava zásobních roztok ů je popsána v bod ě I.6.2.  
Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, p řidá se po 1 ml 
roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.  
V.2.3.  Příprava a p ředběžná úprava inokula  
Inokulum lze získat z řady zdroj ů: z aktivovaného kalu, ze splaško ­
vých vod, z povrchových vod, z p ůd nebo z jejich sm ěsi. 
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.  
V.2.4.  Příprava ban ěk 
S použitím zásobních roztok ů se připraví samostatné sady roztok ů 
zkoušené chemické látky a referen ční chemické látky v minerálním 
médiu o koncentraci odpovídající obvykle 100 mg chemické látky na 
litr (dávající nejmén ě 50–100 mg TSK na litr).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
TSK se vypo čte z tvorby amoniových solí, pokud lze vylou čit nitri­
fikaci, v opa čném případě by měl být výpo čet založen na tvorb ě 
dusičnanů (viz bod 2 dodatku 2).  
Změří se pH a v p řípadě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.  
Špatně rozpustné látky se p řidají v pozd ějším stádiu (viz dále).  
Má-li se stanovit toxicita zkoušené látky, p řipraví se další roztok 
v minerálním médiu, jenž obsahuje referen ční i zkoušenou látku, 
a to ve stejných koncentracích jako v roztocích obsahujících jen jednu látku.
 
Požaduje-li se stanovení fyzikáln ě-chemické spot řeby kyslíku, 
připraví se roztok zkoušené látky obvykle o koncentraci 100 mg 
TSK na litr sterilizovaný p řídavkem vhodné toxické látky (viz I.6.6).  
Připravené objemy roztok ů zkoušené a referen ční chemické látky se 
rozdělí alespoň duplicitn ě do baněk. Do dalších ban ěk se přidá pouze 
minerální médium (pro kontrolu inokula) a podle pot řeby směs 
roztoku zkoušené a referen ční chemické látky a sterilní roztok.  
Je-li zkoušená chemická látka špatn ě rozpustná, odváží se nebo 
odměří v tomto stadiu p římo do ban ěk, nebo se postupuje podle 
dodatku 3. Do lahví pro absorpci CO  2 se přidá hydroxid draselný, 
pelety hydroxidu sodného nebo jiný absorbent.  
V.2.5.  Počet baněk v typické zkoušce  
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense  
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem  
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu  
Dále se doporu čují nebo se podle pot řeby použijí:  
Baňka 6: Sterilní kontrola  
Baňka 7: Kontrola toxicity  
Viz také bod I.6.7.  
V.2.6.  Provedení zkoušky  
V baňkách se nechá ustavit požadovaná teplota a vybrané ba ňky se 
inokulují p řidáním aktivovaného kalu nebo jiného zdroje inokula, 
aby nebyla koncentrace suspendovaných látek v ětší než 30 mg/l. 
Zařízení se sestaví, spustí se mícha čka, přezkouší se na vzduchot ěs­
nost a zahájí se m ěření spotřeby kyslíku. Obvykle není t řeba věnovat 
zkoušce žádnou zvláštní pozornost, krom ě nezbytných ode čtů 
a denní kontroly teploty a míchání.  
Z pravidelných častých ode čtů se podle postupu uvedeného 
výrobcem za řízení vypo čte spotřeba kyslíku. Na konci inkubace, 
obvykle po 28 dnech, se zm ěří pH v ba ňkách, a to zvlášt ě tehdy, 
je-li spotřeba kyslíku malá nebo v ětší než TSK  NH4 (platí pro látky 
obsahující dusík).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
V případě potřeby se na za čátku a na konci odebírá vzorek 
z respiračních nádobek pro stanovení DOC nebo pro specifickou 
analýzu (viz bod 4 dodatku 2). P ři počátečním odběru z baňky se 
zajistí, aby byl znám objem zkušební suspense, která v ba ňce zůstala. 
Je-li kyslík spot řebováván látkami obsahujícími dusík, stanoví se 
přírůstek koncentrací dusi čnanů a dusitan ů za 28 dn ů a vypočte se 
korekce na spot řebu kyslíku nitrifikací (dodatek 5).  
V.3. DATA A P ŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV  
V.3.1.  Zpracování výsledk ů 
Spotřeba kyslíku (mg) zkoušenou látkou za danou dobu (korigovaná 
na spotřebu kyslíku inokulem za stejnou dobu ve slepé zkoušce) se 
podělí hmotností zkoušené látky v ba ňce. Získá se tak hodnota BSK 
vyjádřená v mg kyslíku na mg zkoušené látky:  
BOD ¼ ðspotř: O 2 zk: chem : látkou v mg Ä spotř: O 2 ve slep zkoušce v mg Þ 
ðhmotnost zkoušené chem : látky v ba ňce v mgÞ 
= mg O  2 na mg zkoušené chemické látky.  
Biologický rozklad v procentech se vypo čte buď z rovnice:  
biolog : rozklad v % ¼ %ThOD ¼ BODðmg O  2=mg BSK ðmg O2 na mg chem : látkyÞÞ 
ThODðmg O  2=mg TSKðmg O2 na mg chem : látkyÞÞ Ü 100 
nebo z rovnice:  
% COD ¼ BODðmg O  2=mg BSK ðmg O2 na mg chem : látkyÞÞ 
ThODðmg O  2=mg COD ðmg O2 na mg chem : látkyÞÞ Ü 100 
Je třeba poznamenat, že tyto dv ě metody nemusí poskytovat stejné 
hodnoty; p řednost se dává první metod ě. 
Pro látky, jež obsahují dusík, se použije vhodná hodnota TSK (pro 
NH  4 nebo NO  3 ) podle toho, zda se o čekává nitrifikace, či nikoli (bod 
2 dodatku 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypo čte 
se korekce na spot řebu kyslíku p ři nitrifikaci ze zm ěn koncentrace 
dusitanů a dusičnanů (dodatek 5).  
V případě, že se provádí nepovinné stanovení organického uhlíku 
a/nebo specifické chemické látky, vypo čte se stupe ň rozkladu podle 
bodu I.7.  
Všechny výsledky se zaznamenají do p říslušného formulá ře přehledu 
dat. 
V.3.2.  Platnost výsledk ů 
Obvyklá spot řeba kyslíku inokulem je 20–30 mg O  2 na litr a nem ěla 
by být v ětší než 60 mg/l za 28 dn ů. Hodnoty v ětší než 60 mg/l 
vyžadují kritické p řehodnocení výsledk ů a experimentální techniky. 
Je-li pH mimo rozp ětí 6–8,5 a spot řeba kyslíku zkoušenou látkou je 
menší než 60 %, m ěla by být zkouška opakována s nižší koncentrací 
zkoušené látky.  
Viz také I.5.2.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Zprávy  
Viz I.8.  
V.4. P ŘEHLED DAT  
Dále je uveden p říklad přehledu dat.  
ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ  
1. LABORATO Ř 
2. DATUM PO ČÁTKU ZKOUŠKY  
3. ZKOUŠENÁ LÁTKA  
Název:  
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku:... mg/l  
Počáteční koncentrace v médiu, C  0 :... mg/l  
Objem zkušební ba ňky (V):... ml  
TSK nebo CHSK:... v mg O  2 /mg zkoušené látky (NH  4 nebo 
NO  3 ) 
4. INOKULUM  
Zdroj:  
Provedená úprava:  
Předběžná úprava, pokud byla provedena:  
Koncentrace suspendovaných látek v reak ční směsi: mg/l  
5. SPOT ŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITEL ­
NOST  
Čas (dny) 
0 7 14 21 28  
Spotřeba O  2 
(mg) zkou ­ 
šenou látkou 1 
2 
a, průměr 
Spotřeba O  2 
(mg) ve slepé 
zkoušce 3 
4 
b, průměr 
Korigovaná 
BSK (mg) (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
BSK na mu 
zkoušené látky ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Čas (dny) 
0 7 14 21 28  
Rozklad v %  
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a1)  
D 2 (a2)  
Průměr ( 1 ) 
V = objem média ve zkušební ba ňce 
( 1 ) Hodnoty D  1 a D  2 by neměly být průměrovány, je-li mezd nimi výrazný rozdil.  
Poznámka: Podobný formulát lze použit i pro referen ční látku a pro 
kontroly toxicity.  
6. KOREKCE NA NITRIFIKACI  (viz příloha V)  
Den 0 28 Rozdíl  
i) Koncentrace dusi čnanů (mg N na litr) M 
ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57 × N × V) (mg) — — iii) Koncentrace dusitan ů (mg N na litr) (N) 
iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43 × N × V) (mg) — — ii+iv) Celkový kyslíkový ekvivalent — —
 
7. ANALÝZA UHLÍKU  (podle volby)  
Analyzátor uhlíku:  
Čas (dny) Slepá zkouška (mg · l -1 ) Zkoušená látka (mg/l)  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (  1 ) (C  blt ) (C  t ) 
( 1 ) nebo na konci inkubace  
odstraněný DOC v % ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100 
8. SPECIFICKÁ ANALÝZA  (nepovinné)  
S b = koncentrace ve fyzikáln ě-chemické kontrole (sterilní) po 
28 dnech,  
S a = koncentrace v inokulované ba ňce po 28 dnech.  
biologický rozklad v %  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. ABIOTICKÝ ROZKLAD  (nepovinné)  
a = spot řeba kyslíku ve sterilních ba ňkách po 28 dnech v mg  
spotřeba kyslíku na mg zkoušené chemické látky  ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(viz oddíl 1 a 3)  
abiotický rozklad v %  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
ČÁST VI.  ZKOUŠKA V UZAV ŘENÝCH LAHVI ČKÁCH  
(metoda C.4-E)  
VI.1. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Roztok zkoušené látky v minerálním médiu, obvykle o koncentraci 
2–5 mg/l, se inokuluje malým množstvím mikroorganism ů ze 
směsné kultury a udržuje se ve zcela napln ěných uzav řených lahvi č­
kách, v temnu a p ři konstantní teplot ě. Rozklad se sleduje po dobu 
28 dnů prostřednictvím analýzy rozpušt ěného kyslíku. Množství 
spotřebovaného kyslíku po korekci na soub ěžnou slepou zkoušku 
s inokulem se vyjád ří jako TSK nebo CHSK.  
VI.2. POPIS METODY  
VI.2.1.  Přístroje a pom ůcky 
a) lahve pro analýzu BSK se sklen ěnými zátkami, nap ř. na 250 až 
300 ml;  
b) vodní láze ň nebo inkubátor pro udržování lahvi ček při konstantní 
teplotě (tolerance ± 1  o C nebo menší) v temnu;  
c) velké sklen ěné lahve na 2–5 litry pro p řípravu média a pro napl ­
nění lahviček pro analýzu BSK;  
d) kyslíková elektroda a oxymetr nebo vybavení a činidla pro 
Winklerovu titra ční metodu.  
VI.2.2.  Příprava minerálního média  
Příprava zásobních roztok ů je popsána v bod ě I.6.2.  
Smísí se po 1 ml roztok ů a) až d) a doplní se vodou na 1 litr.  
VI.2.3.  Příprava inokula  
Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupn ě čistírny odpadních 
vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající p řevážně domovní 
odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula m ůže být povrchová 
voda. Obvykle se použije jedna kapka (0,05 ml) až 5 ml filtrátu na 
litr média; k nalezení optimálního objemu dané odpadní vody m ůže 
být nezbytné provést pokusy (viz I.6.4.2 a I.6.5).  
VI.2.4.  Příprava ban ěk 
Minerální médium se alespo ň 20 minut siln ě provzduš ňuje. Všechny 
série zkoušek se provedou s minerálním médiem ze stejné dávky. 
Obecně je médium p řipraveno k použití po 20 hodinách stání p ři 
zkušební teplot ě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu; 
jeho obsah by m ěl být asi 9 mg/l p ři 20  o C. Všechny operace 
přenosu média nasyceného vzduchem a jeho pln ění se provedou 
tak, aby nevznikaly bublinky, nap ř. pomocí nasáva ček. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Připravují se shodné skupiny lahvi ček pro analýzu BSK pro stano ­
vení se zkoušenou látkou a referen ční látkou v soub ěžných sériích 
experiment ů. Připraví se dostate čný počet lahviček, včetně slepých 
pokusů, tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu, nap ř. 0, 7, 
14, 21 a 28 dn ů, bylo možné provést alespo ň dvě měření spotřeby 
kyslíku. K tomu, aby bylo možné rozpoznat 10denní období 
rozkladu, m ůže být pot řeba více lahvi ček. 
Velké lahve se p řibližně do jedné t řetiny naplní provzdušn ěným 
médiem. Poté se zvláš ť do jednotlivých velkých lahví p řidá dosta ­
tečný objem zásobního roztoku zkoušené látky a referen ční látky, 
a to obvykle tak, aby nebyla kone čná koncentrace chemických 
látek větší než 10 mg/l. Ke slepému pokusu v další velké lahvi se 
nepřidávají žádné chemické látky.  
S cílem zajistit, aby aktivita inokula nebyla omezená, nesmí koncent ­
race kyslíku v lahvi čkách pro analýzu BSK klesnout pod 0,5 mg/l. 
Toto omezuje koncentraci zkoušené látky na 2 mg/l. Pro látky, které se špatně rozkládají, a pro látky s nízkou hodnotou TSK lze použít 
koncentraci 5–10 mg/l. V n ěkterých p řípadech se doporu čuje provést 
souběžné série m ěření při dvou r ůzných koncentracích zkoušené 
látky, nap ř. při 2 a 5 mg/l. Obvykle se TSK po čítá na základ ě tvorby 
amonných solí, ale v p řípadech, kdy se p ředpokládá nitrifikace nebo 
kdy dochází k nitrifikaci, se TSK vypo čte na základ ě tvorby dusi č­
nanů (TSK
 NO3 , viz bod 2 dodatku 2). V p řípadech, kdy nitrifikace 
není úplná, se provede korekce na zm ěny analyticky stanovených 
koncentrací dusitan ů a dusičnanů (viz dodatek 5).  
Má-li být vyšet řena toxicita zkoušené látky (nap ř. v případě dříve 
zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), je nezbytné nasadit další 
sérii lahvi ček. 
Připraví se další velká láhev s provzdušn ěným minerálním médiem 
(naplněná asi do jedné t řetiny objemu), do které se p řidá zkoušená 
a referenční chemická látka o kone čné koncentraci obvykle stejné 
jako v případě ostatních velkých lahví.  
Roztoky ve velkých lahvích se inokulují výstupem z druhého stupn ě 
čistírny odpadních vod (jedna kapka nebo 0,05 až 5 ml/l) nebo 
z jiného zdroje inokula, jako je nap ř. říční voda (viz I.6.4.2). 
Nakonec se lahve doplní na objem provzdušn ěným minerálním 
médiem za použití hadi čky, která sahá na dno, aby se dosáhlo dosta ­
tečného promíchání.  
VI.2.5.  Počet lahviček v typické zkoušce  
V typické zkoušce se použijí tyto lahvi čky: 
— nejmén ě 10 lahvi ček se zkoušenou látkou a inokulem (zkušební 
suspense),  
— nejmén ě 10 lahvi ček pouze s inokulem (slepá zkouška 
s inokulem),  
— nejmén ě 10 lahvi ček s referen ční látkou a inokulem (kontrolní 
zkouška postupu),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— a podle pot řeby 6 lahvi ček se zkoušenou látkou, referen ční látkou 
a inokulem (kontrola toxicity). Pro rozpoznání 10denního období 
rozkladu je však pot řebný dvojnásobný po čet lahviček. 
VI.2.6 Provedení zkoušky  
Všechny p řipravené roztoky se ihned po p řípravě rozdělí do 
příslušné skupiny lahvi ček pro analýzu BSK, a to pomocí hadi čky 
zavedené do spodní čtvrtiny velké lahve (nikoliv ke dnu) tak, aby se 
všechny lahvi čky pro analýzu BSK zcela naplnily. Jemn ě se poklepe, 
aby se odstranily bublinky. V lahvi čkách se Winklerovou metodou 
nebo pomocí oxymetru ihned stanoví obsah rozpušt ěného kyslíku 
k počátku zkoušky (k času nula). Obsah lahvi ček lze konzervovat 
pro pozd ější analýzu p řídavkem síranu manganatého a hydroxidu 
sodného (prvním Winklerovým činidlem). P řed provedením zbývají ­
cích krok ů Winklerovy metody se pe člivě uzavřené lahvi čky obsa­
hující kyslík vázaný ve form ě hydratovaného oxidu manganitého 
skladují v temnu nejdéle 24 hodin p ři teplotě 10–20  o C. Zbývající 
souběžně připravené lahvi čky se uzav řou tak, aby v nich nez ůstaly 
bublinky vzduchu, a inkubují se v temnu p ři 20  o C. Každá série 
musí být doprovázena úplnou sérií slepého pokusu s inokulovaným médiem. Ve všech sériích se b ěhem 28 dn ů inkubace v pravidelných 
intervalech (nejmén ě jednou týdn ě) stanoví alespo ň ve dvou lahvi č­
kách obsah rozpušt ěného kyslíku.
 
Týdenní vzorky umožní stanovení rozkladu v procentech ve 
14denním období rozkladu, zatímco vzorky odebírané každé 3–4 
dny umožní rozpoznat 10denní období rozkladu, což vyžaduje dvoj ­
násobný po čet lahviček. 
U látek obsahujících dusík se provede korekce na spot řebu kyslíku 
při nitrifikaci. K tomuto ú čelu se stanoví koncentrace rozpušt ěného 
kyslíku oxymetrem a poté se z lahvi čky pro analýzu BSK odebere 
vzorek pro stanovení dusitan ů a dusičnanů. Z přírůstku koncentrace 
dusitanů a dusičnanů se vypo čte množství spot řebovaného kyslíku 
(viz dodatek 5).  
VI.3. DATA A P ŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV  
VI.3.1.  Zpracování výsledk ů 
Nejprve se vypo čte BSK, ke které došlo po každé časové period ě, 
a to odečtením spot řeby kyslíku (v mg O  2 /litr) ve slepém pokusu 
s inokulem od spot řeby zkoušenou chemickou látkou. Takto korigo ­
vaná spot řeba se vyd ělí koncentrací zkoušené látky (mg/l) a získá se 
specifická BSK v mg kyslíku na mg zkoušené látky. Biologická rozložitelnost v procentech se vypo čte jako podíl specifické BSK 
a specifické TSK (vypo čtené podle bodu 2 dodatku 2) nebo 
CHSK (stanovené analyticky, viz bod 3 dodatku 2), tedy:
 
BOD ¼ ðspotř: O 2 zk: chem : látkou v mg Ä spotř: O 2 ve slep : pokusu v mgÞ 
ðhmotnost zkoušené chem : látky v ba ňce v mgÞ ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 na mg zkoušené chemické látky.  
rozklad v % ¼ BOD ðmg O  2=mg BSK ðmg O2 na mg zkušeb : chem : látkyÞÞ 
ThODðmg O  2=mg TSK ðmg O2 na mg zkušeb : chem : látkyÞÞ Ü 100 
nebo  
Rozklad v % ¼ BOD ðmg O  2=mg BSK ðmg O2 na mg zkušeb : chem : látkyÞÞ 
CODðmg O  2=mg COD ðmg O2 na mg zkušeb : chem : látkyÞÞ Ü 100 
Je třeba poznamenat, že tyto dv ě metody nemusí poskytovat stejné 
hodnoty; p řednost se dává první metod ě. 
Pro látky, jež obsahují dusík, se použije vhodná hodnota TSK (pro 
NH  4 nebo NO  3 ) podle toho, zda se o čekává nitrifikace, či nikoli (bod 
2 dodatku 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypo čte 
se korekce na spot řebu kyslíku p ři nitrifikaci ze zm ěn koncentrace 
dusitanů a dusičnanů (dodatek 5).  
VI.3.2.  Platnost výsledk ů 
Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu s inokulem by nem ěla být po 28 
dnech vyšší než 1,5 mg/l. Vyšší hodnoty vyžadují p řešetření expe­
rimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku ve zkušebních lahvičkách by nem ěla nikdy klesnout pod 0,5 mg/l. Takto nízké 
úrovně kyslíku jsou platné pouze tehdy, lze-li použitou metodou 
stanovení rozpušt ěného kyslíku tak nízké úrovn ě přesně změřit.
 
Viz také I.5.2.  
VI.3.3.  Zprávy  
Viz I.8.  
VI.4. P ŘEHLED DAT  
Dále je uveden p říklad přehledu dat.  
ZKOUŠKA V UZAV ŘENÝCH LAHVI ČKÁCH  
1. LABORATO Ř 
2. DATUM PO ČÁTKU ZKOUŠKY  
3. ZKOUŠENÁ LÁTKA  
Název:  
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: … mg/l  
Počáteční koncentrace v lahvi čce: … mg/l  
TSK nebo CHSK: v mg O  2 /mg zkoušené látky  
4. INOKULUM  
Zdroj:  
Provedená úprava:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
Předběžná úprava, pokud byla provedena:  
Koncentrace v reak ční směsi: … mg/l  
5. STANOVENÍ ROZPUŠT ĚNÉHO KYSLÍKU  
Metoda: Winklerova metoda/oxymetr  
Analýzy lahvi ček 
Doba kultivace (d} Rozpuštěný kyslík (mg/l) 
0 n  1 n 2 
(bez chemické látky) 1 C  1 
2 C  2 
Průměr 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Zkoušená chemická 
látka 1 a  1 
2 a  2 
Průměr 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Poznámka: Podobný formulá ř lze použít i pro referen ční látku a pro 
kontroly toxicity.  
6. KOREKCE NA NITRIFIKACI  (viz příloha V)  
Doba kultivace 0 n  1 n 2 n 3 
i) Koncentrace dusi čnanů (mg N na litr) 
ii) Zm ěna koncentrace dusi čnanů (mg N na litr) — 
iii) Kyslíkový ekvivalent (mg. l  -1 ) — 
iv) Koncentrace dusitan ů (mg N na litr) 
v) Zm ěna koncentrace dusitan ů (mg N na litr) — 
vi) Kyslíkový ekvivalent (mg · l -1 ) — 
iii + vi) Celkový kyslíkový ekvivalent (mg · l -1 ) —  
7. ÚBYTEK ROZPUŠT ĚNÉHO KYSLÍKU: ROZKLAD 
V PROCENTECH  
Úbytek po n dnech (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
LAHVIČKA 1: (m  to - m  tx ) - (m  bo - m  bx ) 
LAHVIČKA 2: (m  to - m  tx ) - (m  bo - m  bx ) ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Úbytek po n dnech (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
LAHVIČKA 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
konc : zkuš : chem Ü ThOD látky 
LAHVIČKA 2 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
konc : zkuš : chem Ü ThOD látky 
průměr ( 1 ) % D =  D 1 Ä D 2 
2 
( 1 ) Hodnoty nelze pr ůměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.  
m to = hodnota pro zkušební lahvi čku v čase 0  
m tx = hodnota pro zkušební lahvi čku v čase x  
m bo = hodnota pro slepý pokus v čase 0  
m bx = hodnota pro slepý pokus v čase x  
Použijí se rovn ěž korekce na nitrifikaci z bodu iii + vi v oddílu 6.  
8. ÚBYTEK ROZPUŠT ĚNÉHO KYSLÍKU VE SLEPÉM 
POKUSU  
Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je: (m  b0 – m  b28 ) v mg/l. 
Tato spot řeba je důležitá pro platnost zkoušky. M ěla by být 
menší než 1,5 mg/l.  
ČÁST VII.  ZKOUŠKA MITI  (Metoda C.4-F)  
VII.1. PODSTATA METODY  
Měření spotřeby kyslíku v míchaném roztoku nebo suspensi zkou ­ 
šené chemické látky v minerálním médiu inokulovaném speciální kulturou neadaptovaných mikroorganism ů se provádí automaticky 
po dobu 28 dn ů za tmy v uzav řeném respirometru p ři 25 ± 1
 o C. 
Uvolňovaný oxid uhli čitý se jímá v hydroxidu sodném. Biologická 
rozložitelnost se vyjád ří jako spot řeba kyslíku (korigovaná na slepý 
pokus) vyjád řená v procentech teoretické spot řeby kyslíku (TSK). 
Primární biologická rozložitelnost vyjád řená v procentech se rovn ěž 
vypočte z dopl ňkové specifické chemické analýzy provedené na 
začátku a na konci kultivace, pop řípadě z analýzy DOC.  
VII.2. POPIS METODY  
VII.2.1.  Přístroje a pom ůcky 
a) automatický elektrolytický m ěřič BSK nebo respirometr stan ­
dardně vybavený 6 ba ňkami na 300 ml opat řenými uzáv ěry obsa­
hujícími absorbent CO  2 ; ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní láze ň nastavená na 25 
± 1  o C; 
c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);  
d) analyzátor uhlíku (nepovinné).  
VII.2.2.  Příprava minerálního média  
Za použití reak čních činidel čistoty p.a. se p řipraví tyto zásobní 
roztoky (I.6.1): 
a) Dihydrogenfosfore čnan draselný, KH  2 PO 4 8,50 g 
Hydrogenfosfore čnan didraselný, K  2 HPO  4 21,75 g 
Hydrogenfosfore čnan disodný dodekahydrát, 
Na 2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
Chlorid amonný, NH  4 Cl 1,70 g 
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr. 
PH roztoku musí být 7,2. 
b) Síran ho řečnatý heptahydrát, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g 
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr. 
c) Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl  2 27,50 g 
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr. 
d) Chlorid železitý hexahydrát, FeCl  3 6 H  2 O 0,25 g 
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr.  
Spojí se po 3 ml roztok ů a), b), c), a d) a doplní se na 1 litr.  
VII.2.3.  Příprava inokula  
Odeberou se čerstvé vzorky nejmén ě z deseti lokalit, kde se použí ­
vají a vypoušt ějí různé chemické látky. Z míst, jako jsou čistírny 
městských a pr ůmyslových odpadních vod, řeky, jezera a mo ře, se 
odeberou litrové vzorky kalu, povrchových p ůd, vody atd., které se 
pečlivě smíchají. Po odstran ění vyplavených látek a ustálení se pH 
supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou.
 
Vhodným objemem filtrovaného supernatantu se naplní nádoba na 
aktivaci kalu a kapalina se 23,5 hodiny provzduš ňuje. Třicet minut 
po ukončení provzduš ňování se odlije p řibližně jedna třetina celko ­
vého objemu supernatantu a k usazenému materiálu se p řidá stejný 
objem roztoku (pH 7), který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, 
peptonu a dihydrogenfosfore čnanu draselného, a obnoví se provzduš ­ 
ňování. Tento postup se opakuje jednou denn ě. Kalová jednotka 
musí být provozovaná podle zásad správné laboratorní praxe: odtok má být čirý, teplota má být udržována p ři 25 ± 2
 o C, pH 
má být 7 ± 1, kal se má dob ře usazovat, provzduš ňování musí být 
za všech okolností dostate čné, mají být p řítomni prvoci a aktivita 
kalu se má kontrolovat pomocí referen ční látky nejmén ě každé tři 
měsíce. Inokulum se nepoužívá d říve než po 1 m ěsíci kultivace, ale 
ne později než po čtyřech měsících. Proto se v pravidelných inter ­
valech jednou za t ři měsíce odebírají vzorky z 10 míst.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný super ­
natant aktivovaného použitého kalu mísí se stejným objemem filtro ­
vaného supernatantu čerstvě odebraného kalu pocházejícího z deseti 
zdrojů a směs se kultivuje podle výše uvedeného postupu. Kal se 
použije jako inokulum až 18–24 hodin po uvedeném zpracování.  
VII.2.4.  Příprava ban ěk 
Připraví se t ěchto 6 ban ěk: 
Baňka č. 1: zkoušená chemická látka v ředicí vod ě, 100 mg/l  
Baňka č. 2, 3 a 4: zkoušená chemická látka v minerálním médiu, 
100 mg/l  
Baňka č. 5: referen ční látka (nap ř. anilin) v minerálním médiu, 
100 mg/l  
Baňka č. 6: pouze minerální médium  
Špatně rozpustné chemické látky se odváží nebo odm ěří, nebo se 
zpracují podle dodatku 3, s výjimkou t ěch, u nichž nesm ějí být 
použita rozpoušt ědla ani emulgátory. Do speciálních uzáv ěrů všech 
lahví se p řidá absorbent oxidu uhli čitého. pH v ba ňkách č. 2, 3 a 4 
se upraví na 7,0.  
VII.2.5.  Provedení zkoušky  
Baňky č. 2, 3 a 4 (zkušební suspense), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 
(slepý pokus s inokulem) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby byla výsledná koncentrace kalu 30 mg/l. Do lahve č. 1 se 
inokulum nep řidává, slouží jako abiotická kontrola. Za řízení se 
sestaví, p řezkouší se na vzduchot ěsnost, spustí se mícha čka a v 
temnu se zahájí m ěření spotřeby kyslíku. Denn ě se kontroluje 
teplota, míchání, coulometrický zapisova č spotřeby kyslíku 
a zaznamenají se všechny zm ěny barvy obsahu ban ěk. Spotřeba 
kyslíku pro 6 ban ěk se odečítá přímo, např. šestikanálovým zapiso ­
vačem, čímž se získá k řivka BSK. Na konci kultivace, obvykle po 
28 dnech, se zm ěří pH v ba ňkách a stanoví se zbytková koncentrace 
zkoušené chemické látky a jejích produkt ů rozkladu a v p řípadě 
zkoušení látek rozpustných ve vod ě také koncentrace DOC (postup 
podle bodu 4 dodatku 2). Zvláštní pozornost je t řeba věnovat 
těkavým látkám. Pokud se p ředpokládá nitrifikace, stanoví se podle 
možnosti koncentrace dusi čnanů a dusitan ů.
 
VII.3. DATA A P ŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV  
VII.3.1.  Zpracování výsledk ů 
Spotřeba kyslíku (mg) zkoušenou látkou za danou dobu (korigovaná 
na spotřebu inokulem za stejnou dobu ve slepém pokusu) se pod ělí 
hmotností použité zkoušené látky. Získá se tak hodnota BSK vyjád ­ 
řená v mg kyslíku na mg zkoušené látky:  
BOD ¼ ðspotř: O 2 zk: chem : látkou v mg Ä spotř: O 2 ve slepé zkoušce v mg Þ 
ðhmotnost zkoušené chem : látky v ba ňce v mgÞ 
= mg O  2 na mg zkoušené chemické látky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Biologický rozklad v procentech se potom vypo čte z rovnice:  
biolog : rozklad v % ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2 BSK ðmg O2 na mg chem : látkyÞÞ 
ThOD ðmg O  2 TSKðmg O2 na mg chem : látkyÞÞ Ü 100 
Pro směsi se TSK vypo čte z elementární analýzy, tak jako pro 
jednoduché slou čeniny. Použije se odpovídající hodnota TSK 
(TSK  NH4 nebo TSK  NO3 ) podle toho, zda se o čekává nitrifikace, či 
nikoli (bod 2 dodatku 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypo čte se korekce na spot řebu kyslíku p ři nitrifikaci ze zm ěn 
koncentrace dusitan ů a dusičnanů (dodatek 5).
 
Vypočte se primární biologický rozklad v procentech z úbytku speci ­
fické (výchozí) chemické látky (viz I.7.2):  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Zjistí-li se p ři měření fyzikáln ě-chemického úbytku ztráta zkoušené 
chemické látky v ba ňce č. 1, zaznamená se to a jako koncentrace 
zkoušené látky (S  b ) po 28 dnech se pro výpo čet biologické rozloži ­
telnosti dosadí tato koncentrace.  
Stanovuje-li se koncentrace DOC (nepovinné), vypo čte se kone čná 
hodnota biologického rozkladu v procentech podle vztahu:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î  
Ü 100  
jak je uvedeno v bod ě I.7.1. Zjistí-li se p ři měření fyzikáln ě-chemic­
kého úbytku ztráta DOC v ba ňce č. 1, použije se p ři výpočtu 
biologického rozkladu v procentech tato koncentrace DOC.  
Všechny výsledky se zaznamenají do p říslušného formulá ře přehledu 
dat. 
VII.3.2.  Platnost výsledk ů 
Obvyklá spot řeba kyslíku inokulem je 20–30 mg O  2 na litr a nem ěla 
by být v ětší než 60 mg/l za 28 dn ů. Hodnoty v ětší než 60 mg/l 
vyžadují kritické p řehodnocení výsledk ů a experimentální techniky. 
Je-li pH mimo rozp ětí 6–8,5 a spot řeba kyslíku zkoušenou látkou je 
menší než 60 %, m ěla by být zkouška opakována s nižší koncentrací 
zkoušené látky.  
Viz také I.5.2.  
Pokud procenta rozkladu anilinu vypo čítaná ze spot řeby kyslíku 
nepřekročí 40 % po 7 dnech a 65 % po 14 dnech, test je považován 
za neplatný.  
VII.3.3.  Zprávy  
Viz I.8.  
VII.4. P ŘEHLED DAT  
Dále je uveden p říklad přehledu dat:  
ZKOUŠKA MITI (I)  
1. LABORATO Ř 
2. DATUM PO ČÁTKU ZKOUŠKY  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. ZKOUŠENÁ LÁTKA  
Název:  
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: … mg/l  
Počáteční koncentrace v médiu, C  0 : … mg/l  
Objem reak ční směsi, V: … ml  
TSK: mg O  2 /litr 
4. INOKULUM  
Místa odb ěru kalu: 
1. … 6. … 
2. … 7. … 
3. … 8. … 4. … 9. … 
5. … 10. …
 
Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po akli ­
matizaci se syntetickými splašky = … mg/l.  
Objem aktivovaného kalu v litru kone čného média = … ml  
Koncentrace kalu v kone čném médiu = … mg/l  
5. SPOT ŘEBA KYSLÍKU BIOLOGICKÁ ROZLOŽITEL ­
NOST  
Typ použitého respirometru:  
Čas {dny) 
0 7 14 il 2S  
Spotřeba O  2 (mg) 
zkoušenou látkou a 1 
a 2 
a 3 
Spotřeba O  2 (mg) 
ve slepé zkoušce b 
Korigovaná 
spotřeba O  2 (mg) (a 1 – b) 
(a 1 – b) 
(a 1 – b) 
BSK na mg zkou ­ 
šené látky ða Ä bÞ 
C o V Baňka 1 
Baňka 2 
Baňka 3 
Rozklad v % BOD  
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 3 
Průměr (
 1 ) 
( 1 ) Hodnoty nelze pr ůměrovat. je-li mezi nimi výrazný rozdíl.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Poznámka: podobný formulár lze použít i pro referen ční látku.  
6. ANALÝZA UHLÍKU  (podle volby)  
Analyzátor uhlíku:  
Baňka DOC 
úbytek DOC v % Pr ůměr 
Naměřená hodnota Korigovaná hodnota  
Voda + zkoušená látka a — — 
Kal + zkoušená látka b  1 b 1 – c 
Kal + zkoušená látka b  2 b 2 – c 
Kal + zkoušená látka b  3 b 3 – c 
Kontrolní slepá zkouška c — — —  
odstraněný DOC v % ¼ a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. DATA ZE SPECIFICKÉ CHEMICKÉ ANALÝZY  
Zbytkové množství zkoušené chemické 
látky na konci zkoušky Rozklad v %  
Slepá zkouška s vodou S  b 
Inokulované médium S a1 
S a2 
S a3 
rozklad v % ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Rozklad v % se vypo čte pro ba ňky a1, a2, a3.  
8. POZNÁMKY  
Připojí se k řivka závislosti BSK na čase, je-li k dispozici.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
DODATEK 1  
ZKRATKY A DEFINICE  
DO: Rozpušt ěný kyslík (dissolved oxygen) (mg/l) je koncentrace kyslíku, 
který je rozpušt ěn ve vodném vzorku.  
BSK: Biochemická spot řeba kyslíku (biochemical oxygen demand, BOD) (g) 
je množství kyslíku, jež je v pr ůběhu metabolizace zkoušené látky 
spotřebováno mikroorganismy; vyjad řuje se také jako spot řeba kyslíku 
v gramech na gram zkoušené látky (viz metoda C.5).  
CHSK: Chemická spot řeba kyslíku (chemical oxygen demand, COD) (g) je 
množství kyslíku, jež je spot řebováno v pr ůběhu oxidace zkoušené 
látky horkým kyselým dichromanem; je m ěřítkem množství p řítomných 
oxidovatelných látek; vyjad řuje se také v gramech kyslíku spot řebova­
ného na gram zkoušené látky (viz metoda C.6).  
DOC: Rozpušt ěný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový orga ­
nický uhlík, který je p řítomný v roztoku nebo projde p řes filtr o velikosti 
pórů 0,45 μm nebo z ůstane v supernatantu po odst řeďování po dobu 
15 minut p ři zrychlení 40 000 m/s  2 (asi 4 000 g).  
TSK: Teoretická spot řeba kyslíku (theoretical oxygen demand, ThOD) (mg) je 
celkové množství kyslíku nezbytné pro úplnou oxidaci chemické látky; 
vypočte se z molekulového vzorce látky (viz bod 2 dodatku 2) 
a vyjadřuje se také jako množství kyslíku v mg nezbytné na mg zkou ­ 
šené látky.  
TCO  2 : Teoretický oxid uhli čitý (theoretical carbon dioxide, ThCO  2 ) je množství 
oxidu uhli čitého, které bym ělo vzniknout ze známého nebo zm ěřeného 
obsahu uhlíku ve zkoušené látce za p ředpokladu její úplné mineralizace; 
vyjadřuje se v mg oxidu uhli čitého uvoln ěného z 1 mg zkoušené látky.  
TOC: Celkový organický uhlík (total organic carbon) ve vzorku je sou čtem 
organického uhlíku v roztoku a v suspensi.  
IC: Anorganický uhlík (inorganic carbon).  
TC: Celkový uhlík (total carbon) je sou čtem organického a anorganického 
uhlíku ve vzorku.  
Primární biologický rozklad:  
jsou změny chemické struktury látky zp ůsobené biologickým p ůsobením, 
vedoucí ke ztrát ě specifických vlastností látky.  
Úplný biologický rozklad (aerobní):  
je stupeň rozkladu látky dosažený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, 
vedoucí k produkci oxiduuhli čitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální 
buněčné hmoty (biomasy).  
Snadno biologicky rozložitelná:  
je dohodnutá klasifikace chemických látek, které prošly screeningovými zkou ­ 
škami úplné biologické rozložitelnosti; tyto zkoušky jsou tak p řísné, že lze p řed­
pokládat, že se látky budou ve vodném prost ředí za aerobních podmínek rychle 
a úplně biologicky rozkládat.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Biologicky rozložitelná:  
je klasifikace chemických látek, pro n ěž existuje nepochybný d ůkaz o jejich 
biologické rozložitelnosti (primární nebo kone čné) v kterékoli uznávané zkoušce 
biologické rozložitelnosti.  
Odstranitelnost:  
je náklonnost látek k jejich odstran ění při biologickém čištění odpadních vod, 
aniž by byl nep říznivě ovlivněn normální pr ůběh čisticích pochod ů. Látky snadno 
biologicky rozložitelné jsou obecn ě odstranitelné, avšak ne všechny rozložitelné 
látky jsou odstranitelné. Mohou zde p ůsobit také abiotické procesy.  
Fáze iniciace:  
je doba, ve zkoušce na úbytek rozpušt ěného organického uhlíku, od inokulace do 
dosažení alespo ň 10 % biologického rozkladu. Fáze iniciace je často různě 
dlouhá a špatn ě reprodukovatelná.  
Doba rozkladu:  
je doba od konce fáze zdržení do dosažení 90 % maximální dosažitelné úrovn ě 
rozkladu.  
10denní období rozkladu:  
je 10 dnů, které následují bezprost ředně po dosažení 10 % rozkladu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
DODATEK 2  
VÝPOČET A STANOVENÍ N ĚKTERÝCH SOUHRNNÝCH 
PARAMETR Ů 
V závislosti na zvolené zkušební metod ě se vyžaduje ur čení některých 
souhrnných parametr ů. V následujícím oddíle je popsán výpo čet těchto hodnot. 
Využití těchto parametr ů je popsáno u jednotlivých metod.  
1. Obsah uhlíku  
Obsah uhlíku se po čítá ze známého elementárního složení nebo se stanoví 
analýzou prvk ů ve zkoušené látce.  
2. Teoretická spot řeba kyslíku (TSK)  
Teoretickou spot řebu kyslíku (TSK) lze vypo čítat ze znalosti elementárního 
složení nebo z výsledk ů analýzy prvk ů. Pro látku  
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
bez nitrifikace  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
nebo s nitrifikací  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
3. Chemická spot řeba kyslíku (CHSK)  
Chemická spot řeba kyslíku (CHSK) se stanoví metodou C.6.  
4. Rozpušt ěný organický uhlík (DOC)  
Rozpuštěným organickým uhlíkem je podle definice organický uhlík 
přítomný ve vodném roztoku chemické látky nebo sm ěsi, který projde 
přes filtr o velikosti pór ů 0,45 μm. 
Odeberou se vzorky ze zkušebních nádob a ihned se filtrují pomocí filt ­
račního zařízení s vhodným membránovým filtrem. Prvních 20 ml (toto 
množství m ůže být p ři použití malých filtr ů zmenšeno) se odstraní. 
10–20 ml, nebo v p řípadě nástřiku menší objem (objem závisí na množství 
potřebném pro analýzu), se uschová pro analýzu uhlíku. Koncentrace DOC 
se stanoví pomocí analyzátoru organického uhlíku, který umož ňuje přesné 
stanovení koncentrace uhlíku, která je menší nebo rovna 10 % po čáteční 
koncentrace DOC použité ve zkoušce.  
Zfiltrované nebo odst ředěné vzorky se analyzují týž den, v opa čném 
případě se uchovávají nejdéle 48 hodin p ři 2–4  o C nebo delší dobu p ři 
teplotě nižší než –18  o C. 
Poznámky:  
Membránové filtry jsou často impregnovány povrchov ě aktivními látkami 
za účelem jejich hydrofilizace. Filtr tedy m ůže obsahovat až n ěkolik mg 
rozpustného organického uhlíku, který m ůže ovlivnit stanovení biologické 
rozložitelnosti. Povrchov ě aktivní látky a jiné rozpustné organické látky se 
z filtrů odstraňují vyvařením třikrát jednu hodinu v deionizované vod ě. 
Filtry lze poté skladovat 1 týden ve vod ě. Při použití filtra čních patron 
pro jedno použití se musí u každé šarže ov ěřit, zda neobsahuje rozpustný 
organický uhlík.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
V závislosti na typu membránového filtru m ůže docházet k adsorpci zkou ­ 
šené látky na filtru. Doporu čuje se ov ěřit, zda k adsorpci zkoušené 
chemické látky na filtru nedochází.  
Místo filtrace lze použít k rozlišení TOC od DOC odst řeďování při 40 000 
m· s –2 (4 000 g) po dobu 15 minut. Tato metoda však není spolehlivá p ři 
počáteční koncentraci DOC < 10 mg/l, protože bu ď nelze odstranit všechny 
bakterie, nebo se zp ětně rozpouští uhlík, který je sou částí bakteriální 
plasmy.  
LITERATURA  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen 
Demand, 1965, P 65.  
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und 
Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoff ­
bedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e. V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
DODATEK 3  
VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ŠPATN Ě 
ROZPUSTNÝCH LÁTEK  
Při zkouškách biologické rozložitelnosti špatn ě rozpustných látek si zaslouží 
zvláštní pozornost následující aspekty.  
Zatímco odb ěr vzorků homogenních kapalin je problémem jen z řídka, u pevných 
látek se doporu čuje provést homogenizaci vhodnými prost ředky, aby v d ůsledku 
nehomogenity nedošlo k chybám. Zvláštní pozornost musí být v ěnována 
odběrům reprezentativních vzork ů o několika miligramech ze sm ěsí látek, které 
obsahují velké množství ne čistot.  
V průběhu zkoušek lze použít r ůzné způsoby míchání. Je t řeba věnovat pozornost 
tomu, aby míchání bylo p řiměřené práv ě pro udržení látky v disperzi 
a nedocházelo k p řehřívání, nadm ěrnému pěnění a nadm ěrným třecím silám.  
Může se použít emulgátor vytvá řející stálé disperzi chemické látky. Nesmí být 
toxický pro bakterie a nesmí se biologicky rozkládat nebo p ěnit za zkušebních 
podmínek.  
Stejná kritéria jako pro emulgátory platí i pro rozpoušt ědla. 
U pevných zkoušených látek se nedoporu čuje používat pevné nosi če, mohou 
však být vhodné v p řípadě olejovitých látek.  
Použijí-li se pomocné látky, jako jsou emulgátory, rozpoušt ědla a nosi če, musí 
být proveden slepý pokus s pomocnou látkou.  
Pro studium biologické rozložitelnosti špatn ě rozpustných látek lze použít kterou ­
koli ze tří respirometrických zkoušek (zkouška na úbytek CO  2 , na BSK, zkouška 
MITI).  
LITERATURA  
— de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.  
— Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
DODATEK 4  
VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI LÁTEK 
POTENCIÁLN Ě TOXICKÝCH PRO INOKULUM  
Je-li chemická látka podrobena zkoušení snadné biologické rozložitelnosti a jeví 
se jako biologicky nerozložitelná, doporu čuje se postupovat p ři požadavku 
rozlišit inhibi ční působení od odolnosti látky v ůči rozkladu následujícím 
způsobem (Reynolds et al., 1987).  
Ve zkouškách toxicity i ve zkouškách biologické rozložitelnosti se použijí 
podobná nebo stejná inokula.  
K posouzení toxicity chemických látek zkoušených ve zkouškách snadné 
biologické rozložitelnosti se doporu čuje použít zkoušku inhibice dýchání aktivo ­
vaného kalu (sm ěrnice 88/302/EHS), stanovení BSK nebo metodu inhibice r ůstu 
nebo kombinaci t ěchto metod.  
Nemá-li dojít k inhibici z d ůvodu toxicity, m ěla by být koncentrace zkoušené 
látky použitá ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti menší než 1/10 
hodnoty EC  50 (nebo menší než EC  20 ) zjištěné zkouškou toxicity. Látky s EC  50 
> 300 mg/l pravd ěpodobně nemají p ři zkouškách snadné biologické rozložitel ­
nosti toxické ú činky.  
Hodnoty EC  50 < 20 mg/l mohou p ři následném zkoušení p ůsobit potíže. M ěly by 
být použity nízké koncentrace, což vyžaduje použít p řísné a citlivé zkoušky 
v uzavřených lahvi čkách nebo materiál zna čený  14 C. Použití vyšších koncentrací 
zkoušené látky m ůže být pop řípadě umožněno nasazením aklimatizovaného 
inokula. V tomto p řípadě se však ztrácí specifické kritérium zkoušky snadné 
biologické rozložitelnosti.  
LITERATURA  
Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
DODATEK 5  
KOREKCE NA SPOT ŘEBU KYSLÍKU P ŘI NITRIFIKACI  
Chyby zp ůsobené tím, že p ři stanovení spot řeby kyslíku ve zkouškách látek, 
které neobsahují dusík, není vzata v úvahu nitrifikace, nejsou významné (nejsou větší než 5 %), i když je oxidace amoniakálního dusíku ve zkušebních nádobách 
a ve slepém pokusu nepravidelná. U zkoušených látek obsahujících dusík m ůže 
dojít ke zna čným chybám.
 
Dochází-li k nitrifikaci, avšak nikoli úplné, musí být spot řeba kyslíku reak ční 
směsí korigována na množství kyslíku spot řebovaného na oxidaci amoniaku 
a amonných iont ů na dusitany a dusi čnany, jsou-li zm ěny koncentrace dusitan ů 
a dusičnanů během kultivace stanoveny pomocí t ěchto rovnic: 
2 NH  4 Cl + 3O  2 = 2 HN O  2 + 2 HCI + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Celkově: 
2 NH  4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Podle rovnice 1 je spot řeba kyslíku p ři oxidaci 28 g dusíku obsaženého v NH  4 Cl 
na dusitan 96 g, tzn., že p řepočítávací faktor je 3,43 (96/28). Stejn ě tak je podle 
rovnice 3 spot řeba kyslíku p ři oxidaci na dusi čnan 128 g, tzn. p řepočítávací 
faktor je 4,57 (128/28).  
Protože popsané reakce následují po sob ě, přičemž jsou realizovány odlišnými 
druhy bakterií, m ůže koncentrace dusitan ů stoupat i klesat; p ři poklesu roste 
odpovídajícím zp ůsobem koncentrace dusi čnanů. Spotřeba kyslíku p ři tvorbě 
dusičnanů se tedy vypo čte vynásobením p řírůstku koncentrace dusi čnanů 
faktorem 4,57, zatímco spot řeba kyslíku p ři tvorbě dusitanů se vypočte vynáso ­
bením přírůstku koncentrace dusitan ů faktorem 3,43, nebo p ři poklesu obsahu 
dusitanů se ztráty kyslíku vypo čtou vynásobením poklesu koncentrace faktorem - 
3,43.  
To znamená: 
O 2 spotřebovaný p ři tvorbě dusičnanů = 4,57 × p řírůstek 
koncentrace dusi čnanů (4) 
a 
O 2 spotřebovaný p ři tvorbě dusitanů = 3,43 × p řírůstek 
koncentrace dusitan ů (5) 
a 
O 2 při úbytku dusitan ů: = - 3,43 × pokles koncentrace dusitan ů (6) 
Tedy spotřeba O
 2 při nitrifikaci = ± 3,43 × zm ěna koncentrace 
dusitanů + 4,57 × zm ěna koncentrace dusi čnanů (7) 
a tedy 
spotřeba O  2 při oxidaci uhlíku = celková zjišt ěná spotřeba – 
spotřeba při nitrifikaci (8) 
Jestliže se stanoví pouze celkový oxidovaný dusík, bude se v prvním p řiblížení 
rovnat spot řeba kyslíku p ři nitrifikaci hodnot ě 4,57 × p řírůstek koncentrace 
oxidovaného dusíku.  
Korigovaná hodnota spot řeby kyslíku p ři oxidaci uhlíku se poté porovná s TSK 
NH  3 vypočtenou podle dodatku 2.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. ROZKLAD – BIOCHEMICKÁ SPOT ŘEBA KYSLÍKU  
1. METODA  
1.1. ÚVOD  
Metoda je ur čena pro m ěření biochemické spot řeby kyslíku (BSK) 
pevných nebo kapalných organických látek.  
Data získaná p ři této zkoušce platí pro látky rozpustné ve vod ě; 
těkavé látky a látky s nízkou rozpustností ve vod ě lze touto metodou 
alespoň v zásadě rovněž zkoušet.  
Metodu lze použít pouze pro organické látky, které nemají 
v koncentracích používaných p ři zkoušce inhibi ční účinek na bakte ­
rie. Není-li daná látka p ři koncentracích používaných ve zkoušce 
rozpustná, m ůže být nezbytné použít pro dosažení dobré dispergace 
zkoušeného materiálu zvláštní postupy, nap ř. dispergaci ultrazvukem.  
Informace o toxicit ě chemické látky mohou být užite čné při inter­
pretaci nízkých hodnot výsledku zkoušky a p ři volbě vhodných 
zkoušených koncentrací.  
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
Biochemická spot řeba kyslíku (BSK) je definována jako množství 
rozpuštěného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci ur čitého 
objemu roztoku látky za p ředepsaných podmínek.  
Výsledky se vyjad řují v gramech spot řeby kyslíku (BSK) na 1 
g zkoušené látky.  
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Je žádoucí použít vhodnou referen ční látku pro kontrolu aktivity 
inokula.  
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Předem stanovené množství látky rozpušt ěné nebo dispergované ve 
vhodném, dob ře provzdušn ěném médiu se inokuluje mikroorganismy 
a kultivuje se v temnu za stálé, definované teploty.  
BSK se stanoví z rozdílu mezi obsahem rozpušt ěného kyslíku na 
začátku a na konci zkoušky. Zkouška musí trvat nejmén ě pět dní 
a nejdéle 28 dní.  
Souběžně musí být provedena slepá zkouška bez obsahu zkoušené 
látky.  
1.5. KRITÉRIA JAKOSTI  
Stanovení BSK nelze považovat za ov ěřené stanovení biologické 
rozložitelnosti látky. Tuto zkoušku lze považovat pouze za screeni ­
govou zkoušku.  
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Připraví se p ředběžný roztok nebo disperse zkoušené látky 
o koncentraci vhodné pro použitou metodu. Poté se stanoví BSK 
některou vhodnou národní nebo mezinárodní standardizovanou meto ­
dou. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. DATA A HODNOCENÍ  
BSK předběžného roztoku se vypo čte vybranou normalizovanou 
metodou a p řepočte se na BSK vyjád řenou v gramech na 1 
g zkoušené látky.  
3. ZPRÁVY  
Uvede se použitá metoda.  
Biochemická spot řeba kyslíku se vypo čte jako pr ůměr výsledk ů 
alespoň tří platných m ěření. 
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou d ůle­ 
žité pro interpretaci výsledk ů a které by mohly ovlivnit výsledek, 
zejména pokud jde o ne čistoty, fyzikální stav, toxické ú činky 
a vlastní složení zkoušené látky.  
Použití p řísad pro inhibici biologické nitrifikace musí být uvedeno.  
4. LITERATURA  
Seznam p říkladů standardizovaných metod:  
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik 
(BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, 
London.  
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after 
n days.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. ROZKLAD – CHEMICKÁ SPOT ŘEBA KYSLÍKU  
1. METODA  
1.1. ÚVOD  
Metoda je ur čena pro m ěření chemické spot řeby kyslíku (CHSK) 
pevných nebo kapalných organických látek provád ěné standardním 
dohodnutým zp ůsobem za pevn ě stanovených laboratorních 
podmínek.  
Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledk ů jsou užite čné 
informace o chemickém vzorci látky (nap ř. zda jde o soli halogen ů, 
železnaté soli organických slou čenin, organické slou čeniny chloru).  
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
Chemická spot řeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky, 
která se vyjad řuje jako ekvivalentní množství kyslíku oxida čního 
činidla spot řebovaného látkou za pevn ě stanovených laboratorních 
podmínek.  
Výsledek se vyjad řuje jako množství spot řebovaného kyslíku (COD) 
v gramech na 1 g zkoušené látky.  
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referen ční látky. 
Měly by v první řadě sloužit k ob časné kontrole provedení metody 
a ke vzájemnému porovnávání výsledk ů získaných jinými metodami.  
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Předem stanovené množství látky rozpušt ěné nebo dispergované ve 
vodě se za přítomnosti síranu st říbrného jako katalyzátoru oxiduje 
dichromanem draselným v prost ředí koncentrované kyseliny sírové 
pod zpětným chladi čem. Přebytečný dichroman se stanoví titrací 
odměrným roztokem síranu amonnoželeznatého.  
U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy p řidává 
síran rtuťnatý (  1 ). 
1.5. KRITÉRIA JAKOSTI  
Vzhledem k dohodnutým podmínkám stanovení je CHSK „ukaza ­
telem oxidovatelnosti“ a jako takový se používá pro hodnocení orga ­
nických látek.  
Ve zkoušce mohou rušit chloridy; na stanovení CHSK mohou mít 
rovněž vliv anorganické reduk ční a oxida ční látky.  
U některých cyklických slou čenin a u řady těkavých slou čenin (nap ř. 
u nižších mastných kyselin) nedochází v této zkoušce k úplné 
oxidaci.  
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Připraví se po čáteční roztok nebo disperse látky tak, aby bylo 
dosaženo CHSK od 250 do 600 mg/l.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) S roztoky obsahujícími rtu ť se po použití nakládá tak, aby nedošlo k pr ůniku rtuti do 
životního prost ředí.
 Poznámky:  
U špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek lze jemn ě 
rozmělněnou látku nebo kapalinu v množství odpovídajícím 5 mg 
CHSK odvážit a vpravit p římo do experimentální aparatury s vodou.  
Často je výhodné, zejména v p řípadě špatně rozpustných látek, 
stanovit CHSK upravenou metodou, tj. v uzav řeném systému 
s vyrovnáva čem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto upravenou 
metodou lze často úspěšně kvantifikovat i látky, u nichž je stanovení 
konvenční metodou obtížné – nap ř. kyselinu octovou. Metoda však 
také selhává v p řípadě pyridinu. Zvýší-li se koncentrace dichromanu 
draselného p ředepsaná v (1) na 0,25 N (0,0416 M), usnadní se p římé 
navažování 5–10 mg látky, což je d ůležité pro stanovení CHSK látek 
obtížně rozpustných ve vod ě (2). 
Jinak se CHSK stanoví vhodnou národní nebo mezinárodní metodou.  
2. DATA A HODNOCENÍ  
CHSK obsahu experimentální ba ňky se vypo čte vybranou normali ­
zovanou metodou a p řepočte se na CHSK vyjád řenou v gramech na 
1 g zkoušené látky.  
3. ZPRÁVY  
Uvede se odkaz na použitou metodu.  
Chemická spot řeba kyslíku se vypo čte jako pr ůměr výsledk ů alespoň 
tří měření. Jsou-li známy, musí být uvedeny všechny informace 
a poznámky, které jsou d ůležité pro interpretaci výsledk ů a které 
by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o ne čistoty, fyzikální 
stav a základní vlastnosti zkoušené látky.  
Uvede se použití síranu rtu ťnatého za ú čelem omezení rušení chlo ­
ridy. 
4. LITERATURA  
1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  
Seznam p říkladů normovaných metod:  
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen 
demand.  
ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate 
methods.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. ABIOTICKÝ ROZKLAD – HYDROLÝZA JAKO FUNKCE PH  
1. METODA  
Tato zkušební metoda odpovídá pokyn ům OECD TG 111 (2004).  
1.1. ÚVOD  
Chemikálie mohou vstupovat do povrchových vod cestami, jako je 
přímá aplikace, rozprášený post řik, odplavení, odvod ňování, zneš ­
kodňování odpadu, pr ůmyslové odpadní vody, odpadní vody 
z domácností a ze zem ědělství a atmosférické depozice, a v t ěchto 
vodách se mohou chemickými (nap ř. hydrolýza, oxidace), fotoche ­
mickými a/nebo mikrobiálními procesy m ěnit. Tyto pokyny popisují 
laboratorní zkušební metody pro hodnocení abiotických hydrolytic ­
kých přeměn chemikálií ve vodních systémech p ři hodnotách pH 
běžně se nacházejících v životním prost ředí (pH 4–9), p řičemž 
vycházejí ze stávajících pokyn ů (1, 2, 3, 4, 5, 6 a 7).  
Pokusy se provád ějí pro stanovení i) rychlosti hydrolýzy zkoušené 
látky jako funkce pH a ii) identity nebo povahy a rychlosti tvorby a rozkladu produkt ů hydrolýzy, kterým mohou být organismy vysta ­
veny. Tyto studie lze požadovat pro chemikálie, které se aplikují 
přímo do vody, nebo u nichž existuje pravd ěpodobnost, že vniknou 
do životního prost ředí jinými než výše popsanými cestami.
 
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
Viz příloha 2.  
1.3. VHODNOST ZKUŠEBNÍ METODY  
Tato metoda je obecn ě použitelná na chemické látky (radioizotopov ě 
neznačené nebo zna čené), pro které je k dispozici analytická metoda 
s dostatečnou přesností a citlivostí. Je použitelná na slab ě těkavé 
a netěkavé směsi dostate čné rozpustnosti ve vod ě. Zkouška by se 
neměla používat na chemikálie, které jsou vysoce t ěkavé z vody 
(např. fumiganty, organická rozpoušt ědla), a nelze je tedy udržovat 
v roztoku za experimentálních podmínek této zkoušky. Zkouška 
může být obtížn ě proveditelná v p řípadě látek s minimální rozpust ­
ností ve vod ě (8). 
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Sterilní vodní pufra ční roztoky r ůzných hodnot pH (pH 4, 7 a 9) se 
podrobují chemickému p ůsobení zkušební látkou a inkubují v temnu 
za regulovaných laboratorních podmínek (p ři konstantních teplotách). 
Po příslušném časovém intervalu se pufra ční roztoky analyzují pro 
přítomnost zkoušené látky a produkt ů hydrolýzy. Látkovou bilanci 
lze snadn ěji stanovit u radioizotopov ě značených zkoušených látek 
(např. 14 C). 
Tato zkušební metoda je navržena jako stup ňovitý přístup, dále 
uvedený a vysv ětlený v příloze 1. Každý stupe ň závisí na výsledcích 
předchozího stupn ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. ÚDAJE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Pro měření rychlosti hydrolýzy lze použít radioizotopov ě neznače­
ných nebo zna čených zkoušených látek. Pro studium zp ůsobu hydro ­
lýzy a pro stanovení hmotnostní bilance se obvykle dává p řednost 
radioizotopov ě značené látce. Ve zvláštních p řípadech však nemusí 
být radioizotopové zna čení nezbytn ě nutné. Doporu čuje se radioizo ­
topové zna čení 14 C, ale použití jiných izotop ů jako  13 C, 15 N, 3 H 
může být také vhodné. Pokud je to možné, m ělo by se zna čení 
nacházet v nejstabiln ější části molekuly. Pokud nap říklad zkoušená 
látka obsahuje jedno jádro, vyžaduje se zna čení na tomto řetězci. 
Jestliže zkoušená látka obsahuje dv ě nebo více jader, bude pot řeba 
provést odd ělené studie pro zhodnocení rozpadu každého zna čeného 
jádra a získání odpovídajících informací o vzniku produkt ů hydro­
lýzy. Čistota zkoušené látky by m ěla být alespo ň 95 %.  
Před provád ěním hydrolytických zkoušek by m ěly být o zkoušené 
látce známy tyto informace:  
a) rozpustnost ve vod ě (zkušební metoda A.6);  
b) rozpustnost v organických rozpoušt ědlech;  
c) tlak par (zkušební metoda A.4) a/nebo Henryho konstanta;  
d) rozdělovací koeficient oktanol/voda (zkušební metoda A.8);  
e) disocia ční konstanta (pK  a ) (pokyny OECD 112) (9);  
f) rychlost p řípadné přímé a nep římé fototransformace ve vod ě. 
Měly by být k dispozici analytické metody pro kvantitativní stano ­
vení zkoušené látky a p řípadně pro identifikaci a kvantitativní stano ­
vení produkt ů hydrolýzy ve vodných roztocích (viz také oddíl 1.7.2).  
1.6. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Kde je to možné, m ěly by být pro identifikaci a kvantitativní stano ­
vení produkt ů hydrolýzy pomocí spektroskopické a chromatografické 
metody nebo jiné dostate čně citlivé metody použity referen ční látky.  
1.7. KRITÉRIA JAKOSTI  
1.7.1.  Výt ěžek metody  
Analýza alespo ň dvou pufra čních roztok ů nebo jejich extrakt ů okam­ 
žitě po p řidání zkoušené látky poskytuje první údaje 
o opakovatelnosti analytické metody a o shodnosti postupu použití zkoušené látky. Výt ěžky v posledních fázích pokus ů závisí na 
příslušných hmotnostních bilancích (p ři použití radioizotopov ě 
značené látky). Výt ěžky by se m ěly pohybovat od 90 % do 
110 % u radioizotopov ě značených a radioizotopov ě neznačených 
chemikálií (7). V p řípadě, že je technicky obtížné dosáhnout tohoto 
rozpětí, je pro radioizotopov ě neznačené chemikálie p řípustný 
výtěžek 70 %. V tomto p řípadě však musí být poskytnuto zd ůvod­
nění.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Opakovatelnost a citlivost analytické metody  
Opakovatelnost analytické metody použité pro kvantitativní stano ­
vení zkoušené látky a produkt ů hydrolýzy v pozd ějších stadiích lze 
zkontrolovat dvojí analýzou stejných pufra čních roztok ů (nebo jejich 
extraktů) poté, co vznikne dostate čné množství produkt ů hydrolýzy 
pro jejich kvantitativní stanovení.  
Analytická metoda by m ěla být dostate čně citlivá na to, aby bylo 
možno kvantitativn ě stanovit zkoušenou látku v koncentraci až do 
10 % počáteční koncentrace nebo nižší. Je-li to pot řeba, měly by být 
analytické metody také dostate čně citlivé, aby bylo možno kvantita ­
tivně stanovit všechny produkty hydrolýzy p ředstavující 10 % nebo 
více aplikované zkoušené látky (a to aplikované kdykoli b ěhem 
studie) a 25 % nebo mén ě její maximální koncentrace.  
1.7.3.  Intervaly spolehlivosti hydrolytických kinetických dat  
Intervaly spolehlivosti by m ěly být vypo čítány a uvedeny pro 
všechny regresní koeficienty, rychlostní konstanty, polo časy a další 
kinetické parametry (nap ř. DT50).  
1.8. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.8.1.  Přístroje a pom ůcky 
Studie by se m ěla provád ět ve sklen ěných nádobách (nap ř. 
zkumavky, malé ba ňky) v temnu a ve sterilních podmínkách, 
pokud ovšem p ředběžná informace (jako rozd ělovací koeficient 
oktanol/voda) nenazna čuje, že by zkoušená látka mohla lnout ke 
sklu. V t ěchto případech je pot řeba zvážit alternativní materiály 
(jako teflon). Problém lnutí ke sklu by mohlo také být možné zmírnit 
použitím jedné nebo více z následujících metod:  
— stanovení hmotnosti zkoušené látky a produkt ů hydrolýzy sorbo ­
vaných ke zkušební nádob ě, 
— použití ultrazvukové lázn ě, 
— zajištění omytí skla rozpoušt ědlem mezi každým intervalem 
odběru vzorku,  
— použití upravených p řípravků, 
— použití zvýšeného množství kosolventu pro p řidávání zkoušené 
látky do systému; v p řípadě použití kosolventu by se m ěl použít 
kosolvent, který nezp ůsobuje hydrolýzu zkoušené látky.  
Pro inkubaci r ůzných zkušebních roztok ů je obvykle pot řeba použít 
třepací vodní lázn ě s regulací teploty nebo inkubátory 
s termostatickou regulací.  
Vyžaduje se standardní laboratorní vybavení, zejména:  
— pH-metr,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analytické p řístroje jako za řízení pro GC, HPLC, TLC, v četně 
odpovídajících detek čních systém ů pro analýzu radioizotopov ě 
značených a nezna čených látek nebo inverzní z řeďovací metodu 
pro izotopy,  
— přístroje pro ú čely identifikace (nap ř. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR atd.),  
— tekutý scintila ční počítač, 
— dělicí nálevky na extrakci kapalina-kapalina,  
— přístroje pro zvyšování koncentrace roztok ů a extrakt ů (např. 
rotační odpařovací zařízení),  
— zařízení pro regulaci teploty (nap ř. vodní láze ň). 
Chemická činidla zahrnují nap říklad:  
— organická rozpoušt ědla, činidla analytické kvality jako hexan, 
dichlormetan atd.,  
— scintila ční kapalinu,  
— pufrační roztoky (podrobnosti viz v oddíle 1.8.3).  
Veškeré sklo, voda čistoty p.a. a pufra ční roztoky používané 
v hydrolytických zkouškách by m ěly být sterilizované.  
1.8.2.  Aplikace zkoušené látky  
Zkoušená látka by se m ěla aplikovat jako vodný roztok do r ůzných 
pufračních roztok ů (viz dodatek 3). Je-li to nutné pro dosažení 
řádného rozpušt ění, je dovoleno pro aplikaci a distribuci zkoušené 
látky použít malé množství rozpoušt ědel mísitelných s vodou (jako 
acetonitril, aceton, etanol), nem ěly by však p řekročit 1 % obj. 
Uvažuje-li se o vyšší koncentraci rozpoušt ědel (např. v případě 
málo rozpustných zkoušených látek), je to možné pouze tehdy, lze-li dokázat, že rozpoušt ědlo nemá žádný vliv na hydrolýzu zkou ­ 
šené látky.
 
Použití upraveného p řípravku se b ěžně nedoporu čuje, protože nelze 
vyloučit, že by složky formulace nem ěly vliv na hydrolytický proces. 
U zkoušených látek špatn ě rozpustných ve vod ě nebo u látek, které 
lnou ke sklu (viz oddíl 1.8.1), však m ůže být použití upraveného 
materiálu vhodnou alternativou.  
Použít by se m ěla jen jedna koncentrace zkoušené látky. Nem ěla by 
překročit 0,01 M nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku 
(viz dodatek 1).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Pufra ční roztoky  
Hydrolytická zkouška by se m ěla provád ět při hodnotách pH 4, 7 
a 9. K tomuto ú čelu se za použití chemikálií a vody čistoty p.a. 
připraví pufra ční roztoky. N ěkteré vhodné pufra ční roztoky jsou 
uvedeny v p říloze 3. Je t řeba poznamenat, že použitý pufra ční roztok 
může mít vliv na rychlost hydrolýzy. Je-li tomu tak, je t řeba zvolit 
jiný pufra ční roztok (  1 ). 
Hodnota pH každého pufra čního roztoku by se m ěla ověřit kalibro ­
vaným pH-metrem s p řesností alespo ň 0,1 při požadované teplot ě. 
1.8.4.  Zkušební podmínky  
1.8.4.1.  Zkušební teplota  
Hydrolytické pokusy by se m ěly provád ět za konstantních teplot. Pro 
účely extrapolace je d ůležité udržovat teplotu alespo ň na ± 0,5  o C. 
Není-li hydrolytické chování zkoušené látky známé, m ěla by se 
předběžná zkouška (stupe ň 1) provést p ři teplotě 50  o C. Pokud 
zkouška stupn ě 1 neprokáže, že je zkoušená látka stálá v ůči hydro­
lýze, měly by se kinetické zkoušky vyšších stup ňů provést mini ­
málně při třech různých teplotách (v četně zkoušky p ři 50  o C). 
Doporučovaný rozsah teplot je 10–70  o C (nejlépe s alespo ň jednou 
teplotou pod 25  o C), což bude zahrnovat vykazovanou teplotu 25  o C 
a většinu teplot vyskytujících se v poli.  
1.8.4.2.  Světlo a kyslík  
Všechny hydrolytické zkoušky by m ěly být provedeny s využitím 
vhodné metody, která umožní zabránit fotolytickým vliv ům. Měla by 
se přijmout veškerá vhodná opat ření proti vlivu kyslíku (nap ř. pěti­
minutovým probubláváním roztoku heliem, dusíkem nebo argonem 
před přípravou roztoku).  
1.8.4.3.  Trvání zkoušky  
Předběžná zkouška by se m ěla provád ět 5 dní, zatímco zkoušky 
vyššího stupn ě by se měly provád ět až do 90 % hydrolýzy zkoušené 
látky nebo po dobu 30 dní podle toho, co nastane d říve. 
1.8.5.  Provedení zkoušky  
1.8.5.1.  Předběžná zkouška (stupe ň 1) 
Předběžná zkouška se provede p ři teplotě 50 ± 0,5  o C a při hodnotách 
pH 4,0; 7,0 a 9,0. Pokud se po 5 dnech pozoruje stupe ň hydrolýzy 
nižší než 10 % (t  0.525  o C > 1 rok), považuje se zkoušená látka za 
hydrolyticky stálou a obvykle nejsou žádné zkoušky pot řeba. Je-li 
o látce známo, že je za teplot b ěžných v životním prost ředí (  2 ) 
nestálá, není p ředběžná zkouška nutná. Analytická metoda musí 
být dostate čně přesná a citlivá pro zjišt ění úbytku po čáteční koncent ­
race o 10 %.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey a Mill doporu čují použít namísto fosfore čnanových pufra čních roztok ů boritanové 
a acetátové pufra ční roztoky (11). 
( 2 ) Tato informace m ůže pocházet z jiných zdroj ů, jako jsou hydrolytické údaje o strukturn ě 
podobných sm ěsích z literatury, nebo z jiných p ředběžných, semikvantitativních hydro ­
lytických zkoušek se zkoušenou látkou v ran ější fázi vývoje.
 1.8.5.2.  Hydrolýzy nestabilních látek (stupe ň 2) 
Zkoušky vyššího stupn ě by se m ěly provád ět při hodnotách pH, p ři 
kterých bylo na základ ě předběžné zkoušky zjišt ěno, že je zkoušená 
látka nestálá. Pufra ční roztoky zkoušených látek by se m ěly přecho­
vávat v termostatech p ři zvolených teplotách. Pro zkoušku reakce 
prvního řádu by se m ěl každý reak ční roztok analyzovat 
v časových intervalech, které dávají minimáln ě šest bod ů obvykle 
mezi 10 % a 90 % hydrolýzy zkoušené látky. M ěly by se odebrat 
jednotlivé paralelní zkušební vzorky (minimáln ě dva vzorky obsa ­ 
žené v odd ělených reak čních nádobách) a jejich obsah by se m ěl při 
každém z minimáln ě šesti odb ěrů vzorků analyzovat (pro získání 
minimáln ě dvanácti paralelních bod ů). Použití jednoho souhrnného 
vzorku, ze kterého se odeberou jednotlivé podíly zkoušeného roztoku v každém intervalu odb ěru vzorku, se považuje za nevhodné, protože 
tento způsob neumož ňuje analýzu prom ěnnosti dat a m ůže vést 
k problém ům s kontaminací zkušebního roztoku. Na konci zkoušky 
vyššího stupn ě (tj. buď při dosažení 90 % hydrolýzy nebo po 30 
dnech) by se m ě
ly provést zkoušky potvrzení sterility. Pokud však 
není pozorován žádný rozklad (tj. p řeměna), nepovažují se zkoušky 
sterility za nutné.  
1.8.5.3.  Určení produkt ů hydrolýzy (stupe ň 3) 
Všechny d ůležité produkty hydrolýzy, alespo ň ty, které p ředstavují 
více než 10 % aplikované dávky, by se m ěly identifikovat pomocí 
příslušných analytických metod.  
1.8.5.4.  Nepovinné zkoušky  
U hydrolyticky nestálých zkoušených látek se mohou požadovat 
další zkoušky p ři jiných hodnotách pH než 4, 7 a 9. Nap říklad pro 
fyziologické ú čely lze požadovat zkoušku provedenou za kyselejších 
podmínek (nap ř. pH 1,2) s využitím jediné fyziologicky významné 
teploty (37  o C). 
2. ÚDAJE  
Množství zkoušené látky a p řípadně produktů hydrolýzy by m ělo být 
vyjádřeno jako % po čáteční aplikované koncentrace a tam, kde to je 
vhodné, jako množství vyjád řené v mg/l pro každý interval odb ěru 
vzorku a každou hodnotu pH a zkušební teplotu. Krom ě toho 
v případě použití radioizotopov ě značené zkoušené látky by m ěla 
být hmotnostní bilance vyjád řena jako procento aplikované po čáteční 
koncentrace.  
Ve zpráv ě by mělo být uvedeno grafické znázorn ění logaritmicky 
převedených údaj ů o koncentracích zkoušené látky v závislosti na 
čase. Určeny by m ěly být všechny d ůležité produkty hydrolýzy, 
alespoň ty, které p ředstavují 10 % anebo více, a stejným zp ůsobem 
jako u původní látky by m ěly být zakresleny také jejich logaritmicky 
převedené koncentrace, aby byla z řejmá rychlost tvorby a rozkladu 
těchto produkt ů hydrolýzy.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Použitím vhodných výpo čtů podle kinetických model ů by mělo být 
možno přesněji stanovit polo časy nebo hodnoty DT  50 . Pro každé pH 
a teplotu by m ěly být vykázány hodnoty polo času a/nebo DT  50 
(včetně intervalů spolehlivosti), a to spole čně s popisem použitého 
modelu, řádem kinetiky a koeficientem ur čení (r  2 ). Je-li to vhodné, 
měly by být výpo čty použity také na produkty hydrolýzy.  
V případě studia rychlosti provedeného p ři různých teplotách by 
měly být rychlostní konstanty hydrolytických reakcí pseudoprvního 
řádu (k  pozorov  ) popsány jako funkce teploty. Výpo čet by m ěl 
vycházet jak z rozd ělení k  pozorov  do rychlostních konstant pro hydro ­
lýzu s kyselým katalyzátorem, neutrální hydrolýzu a hydrolýzu se 
zásaditým katalyzátorem (k  H , k  neutral  a k  OH ) tak z Arrheniovy 
rovnice:  
k pozorov ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
kde A  i a B  i jsou regresní konstanty z úseku a sm ěrnice nejlépe 
proložených k řivek získaných lineární regresí ln k  i proti převrácené 
hodnotě absolutní teploty v kelvinech (T). Pomocí využití Arrhe ­
niovy rovnice pro kyselé, neutrální a zásadité hydrolýzy lze 
vypočítat rychlostní konstanty reakcí pseudoprvního řádu, a tudíž 
poločasy pro ostatní teploty, pro které nelze stanovit rychlostní 
konstantu p římým experimentálním stanovením (10).  
2.2. VYHODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Většina hydrolytických reakcí sleduje z řejmé rychlosti reakcí prvního 
řádu, proto jsou polo časy nezávislé na koncentraci (viz rovnici 4 
v příloze 2). To obvykle umož ňuje použití laboratorních výsledk ů 
stanovených p ři látkovém množství 10  –2 až 10  –3 M na podmínky 
životního prost ředí (≤ 10 –6 M) (10). Mabey a Mill (11) publikovali 
několik příkladů dobré shody mezi rychlostmi hydrolýzy nam ěře­
nými v čisté vodě i v přírodních vodách u r ůzných chemikálií za 
předpokladu, že byly m ěřeny jak pH, tak teplota.  
3. ZPRÁVY  
3.1. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat alespo ň tyto informace:  
Zkoušená látka:  
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec 
(uvádějící místo zna čení v případě použití radioizotopov ě znače­
ného materiálu) a p říslušné fyzikáln ě-chemické vlastnosti (viz 
oddíl 1.5),  
— čistota (zne čištění) zkoušené látky,  
— izotopová čistota radioizotopov ě značené chemikálie a molární 
aktivita (kde to je možné).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Pufrační roztoky:  
— data p řípravy a podrobnosti o p řípravě, 
— použité pufry a vody,  
— molarita a pH pufra čních roztok ů. 
Zkušební podmínky:  
— data provedení studií,  
— množství aplikované zkoušené látky,  
— metoda a rozpoušt ědla (druh a množství) použitá pro aplikaci 
zkoušené látky,  
— objem inkubovaných pufra čních roztok ů zkoušené látky,  
— objem inkubovaných pufra čních roztok ů zkoušené látky,  
— pH a teplota b ěhem studie,  
— časy odběrů vzorků, 
— metody extrakce,  
— metody pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkoušené látky 
a produkt ů její hydrolýzy v pufra čních roztocích,  
— počet paralelních vzork ů. 
Výsledky:  
— opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod,  
— výtěžky (procentuální hodnoty pro platnou studii jsou uvedeny 
v oddíle 1.7.1),  
— paralelní údaje a prost ředky ve form ě tabulky,  
— hmotnostní bilance b ěhem studií a na jejich konci (v p řípadě 
použití radioizotopov ě značené zkoušené látky),  
— výsledky p ředběžné zkoušky,  
— rozbor a interpretace výsledk ů, 
— všechny p ůvodní údaje a čísla. 
Následující informace jsou pot řeba, pouze je-li stanovena rychlost 
hydrolýzy:  
— grafy závislosti koncentrací na čase pro zkoušenou látku 
a popřípadě produkt hydrolýzy p ři každé hodnot ě pH a teplot ě, 
— tabulky výsledk ů Arrheniovy rovnice pro teploty 20  o C/25  o C, 
s hodnotami pH, rychlostní konstantou (h  –1 nebo den  –1 ), polo­ 
časem nebo DT  50 , teplotami (  o C) včetně intervalů spolehlivosti 
a korelačních koeficient ů (r 2 ) nebo srovnatelných informací,  
— navrhovaný zp ůsob hydrolýzy.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. LITERATURA  
1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.  
2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
4) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment.
 
5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
 
7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assess ­
ment Nr. 23.
 
9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994–2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
 
10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of Envi ­
ronmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 
1993).  
11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis of 
organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-41
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
DODATEK 1  
Schéma stup ňovité hydrolytické zkoušky
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
DODATEK 2  
Definice a jednotky  
V každém p řípadě by se měly používat  standardní mezinárodní jednotky (SI).  
Zkoušená látka:  jakákoli látka, a ť už původní látka, nebo p říslušné produkty 
přeměny. 
Produkty p řeměny: veškeré látky vzniklé reakcemi biotické nebo abiotické 
přeměny zkoušené látky.  
Produkty hydrolýzy:  veškeré látky vzniklé reakcemi hydrolytické p řeměny 
zkoušené látky.  
Hydrolýza  je reakce zkoušené látky RX s vodou s prostou vým ěnou skupiny 
X za skupinu OH v reak čním centru: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
Rychlost, kterou klesá koncentrace látky RX v tomto zjednodušeném procesu, je 
dána vztahem: 
rychlost = k [H  2 O] [RX] reakce druhého řádu 
nebo 
rychlost = k [RX] reakce prvního řádu 
v závislosti na kroku ur čujícím rychlost. Protože je voda p řítomna vůči zkoušené 
látce ve velkém p řebytku, ozna čuje se obvykle tento typ reakce jako reakce 
pseudoprvního řádu, ve které je pozorovaná rychlostní konstanta dána vztahem 
k pozorov.  = k [H  2 O] [2]  
a lze ji ur čit z výrazu (*)  
k pozorov : ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
kde: 
kde t = čas 
a C  o , C t = koncentrace látky RX v časech 0 a t.  
Jednotky této konstanty mají rozm ěr (čas) –1 a poločas reakce ( čas pro zreagování 
50 % látky RX) je dán vztahem  
t 0;5 ¼ ln2 
k pozorov : [4] 
Poločas: (t 0,5 ) je čas pro dosažení 50 % hydrolýzy zkoušené látky, kdy lze reakci 
popsat pomocí kinetiky prvního řádu; je závislý na koncentraci.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Jestliže vynesení logaritmicky p řevedených údaj ů proti času nemá lineární funkci (rov ­
nající se rychlosti reakce prvního řádu), potom není použití rovnice [3] vhodné pro 
stanovení rychlostní konstanty hydrolýzy zkoušené látky.
 DT 50 (čas úbytku 50):  je čas, během kterého dojde k 50 % snížení koncentrace 
zkoušené látky; liší se od polo času t  0,5 , kdy reakce nesleduje kinetiku prvního 
stupně. 
Odhad k p ři odlišné teplot ě 
Jsou-li rychlostní konstanty známy pro dv ě teploty, lze vypo čítat rychlostní 
konstantu p ři jiných teplotách pomocí Arrheniovy rovnice:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T nebo  ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Vynesením ln k proti 1/T do grafu vzniká rovná čára se sm ěrnicí – E/R  
kde: 
k = rychlostní konstanta nam ěřená při různých teplotách  
E = aktiva ční energie [kJ/mol]  
T = absolutní teplota [K]  
R = plynová konstanta [8,314 J/mol.K]  
Aktivační energie byla vypo čtena pomocí regresní analýzy nebo následující 
rovnice:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
kde: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
DODATEK 3  
Pufrační roztoky  
A. CLARK A LUBS:  
Pufrační směsi CLARKA a LUBSE  (*) 
Složení pH  
0,2 N HC1 A 0,2 N KC1 P ŘI 20  o C 
47,5 ml HC1 + 25 ml KC1 doplnit do 100 ml 1,0 
32,25 ml HC1 + 25 ml KC1 doplnit do 100 ml 1,2 
20,75 ml HC1 + 25 ml KC1 doplnit do 100 ml 1,4 
13,15 ml HC1 + 25 ml KC1 doplnit do 100 ml 1,6 
8,3 ml HC1 + 25 ml KC1 doplnit do 100 ml 1,8 
5,3 ml HC1 + 25 ml KC1 doplnit do 100 ml 2,0 
3,35 ml HC1 + 25 ml KC1 doplnit do 100 ml 2,2  
0,1 M hydrogenftalát draselný + 0,1 N HC1 p ři 20  o C 
46,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 2,2 
39,60 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 2,4 32,95 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 2,8 
20,32 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 3,0 14,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 3,4 
5,97 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 3,6 2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 3,8  
0,1 M hydrogenftalát draselný + 0,1 N NaOH p ři 20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 4,0 3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 4,6 17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Hodnoty pH uvedené v t ěchto tabulkách byly vypo čteny na základ ě potenciálních m ěření pomocí Sörense ­
nových standardních rovnic (1909). Odpovídající hodnoty pH jsou o 0,04 jednotek vyšší než hodnoty 
uvedené v tabulkách.
 Složení pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml hydrogenftalátu do 100 ml 6,0
 
Pufrační směsi CLARKA a LUBSE (pokra čování) 
0,1 M dihydrogenfosfore čnan draselný + 0,1 N NaOH p ři 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 6,0 
8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 6,4 
17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 6,6 
23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 6,8 
29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 7,0 
35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 7,6 
45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 7,8 
46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfore čnanu do 100 ml 8,0  
0,1 M H  3 B0 3 v 0,1 M KC1 + 0,1 N NaOH p ři 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 9,6 
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kyseliny borité do 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF A VLEESCHHOUWER:  (*) 
Citrátové pufry KOLTHOFFA a VLEESCHHOUWERA  
Složení pH  
0,1 M citrát monodraselný a 0,1 N HC1 p ři 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 2,4 36,8 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 2,6 
30,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 2,8 
23,6 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 3,0 17,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 3,2 10,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 3,6  
0,1 M citrát monodraselný a 0,1 N NaOH p ři 18
 o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,2 23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,4 31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 5,0 54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 5,4 
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 5,6 74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 5,8 81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 6,0
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Přidejte malý krystalek thymolu nebo podobné látky pro zabrán ění vzniku plísní.
 C. SÖRENSEN:  
SÖRENSENOVY boritanové sm ěsi 
Složení Sörensen 
18 o C Walbum, pH p ři 
ml boraxu ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M boraxu + 0,1 N HC1  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 
8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 
8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M boraxu + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
SÖRENSENOVY fosfátové sm ěsi 
Složení pH  
0,0667M dihydrogenfosfore čnanu draselného + 0,0667 M hydrogenfosfore čnanu disodného 
při 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOXICITA PRO ŽÍŽALY  
ZKOUŠKA NA UM ĚLÉ PŮDĚ 
1. METODA  
1.1. ÚVOD  
V této laboratorní zkoušce se zkoušená látka p řidá do um ělé půdy, 
do které se na 14 dní umístí žížaly. Po této dob ě (a popřípadě po 
sedmi dnech) se vyšet ří letální ú činek látky na žížaly. Zkouška je 
metodou pro relativn ě krátkodobý orienta ční screening ú činku 
chemických látek na žížaly p ři dermálním a dietárním p říjmu.  
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
LC 50 : Koncentrace látky, u níž lze o čekávat, že zp ůsobí během 
zkoušky uhynutí 50 % testovacích zví řat. 
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKA  
Referenční látka se použije k pravidelnému ov ěřování toho, že se 
citlivost zkušebního systému podstatn ě nezměnila. 
Jako referen ční látka se doporu čuje chloracetamid analytické čistoty.  
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Půda je prom ěnlivé prost ředí, takže se pro tuto zkoušku používá 
pečlivě definovaná um ělá hlinitá p ůda. V definované um ělé půdě 
se chovají dosp ělé žížaly druhu  Eisenia foetida  (viz poznámka 
v příloze) a exponují se r ůzným koncentracím zkoušené látky. 
Obsah nádob se po 14 dnech (a pop řípadě i po sedmi dnech) po 
začátku zkoušky rozprost ře na podložku a spo čítají se žížaly, které 
při jednotlivých koncentracích p řežily.  
1.5. KRITÉRIA JAKOSTI  
Zkouška je navržena tak, aby byla z hlediska zkušebního substrátu 
a organism ů co nejreprodukovateln ější. Úhyn v kontrolních skupi ­
nách nesmí na konci zkoušky p řekročit 10 %, jinak je zkouška 
neplatná.  
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1.  Materials  
1.6.1.1. Z k u š e b n í s u b s t r á t  
Jako základní substrát pro zkoušku se používá definovaná um ělá 
půda. 
a) Základní substrát (procenta jsou vztažena k hmotnosti sušiny):  
— 10 % sfagnové rašeliny (o pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez 
viditelných zbytk ů rostlin a jemn ě mleté),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaolinitického jílu, pokud možno s více než 50 % 
kaolinitu,  
— asi 69 % pr ůmyslového k řemenného písku (p řevažuje jemný 
písek s více než 50 % částic velikosti 0,05 až 0,2 mm). Pokud 
zkoušená látka není dostate čně dispergovatelná ve vod ě, je 
třeba ponechat k dispozici pro pozd ější míšení se zkoušenou 
látkou 10 g na každou zkušební nádobu,  
— asi 1 % práškového chemicky čistého uhli čitanu vápenatého 
(CaCO  3 ), přidaného pro úpravu pH na pH 6,0 ± 0,5.  
b) Zkušební substrát:  
Zkušební substrát obsahuje základní substrát, zkoušenou látku 
a deionizovanou vodu.  
Obsah vody činí asi 25 až 42 % suché hmotnosti základního 
substrátu. Obsah vody v substrátu se stanoví vysušením vzorku 
do konstantní hmotnosti p ři 105  o C. Klíčovým kritériem je, aby 
byla umělá půda zvlhčena tak, aby neobsahovala stojící vodu. 
Mísení musí být provád ěno pečlivě, aby bylo dosaženo rovno ­
měrného rozd ělení zkoušené látky a substrátu. Zp ůsob vpravení 
zkoušené látky do substrátu je t řeba uvést ve zpráv ě. The way of 
introducing the test substance to the substrate has to be reported.  
c) Kontrolní substrát:  
Kontrolní substrát obsahuje základní substrát a vodu. P řidává-li se 
přísada, musí další kontrola obsahovat stejné množství p řísady  
1.6.1.2. Z k u š e b n í n á d o b y  
Skleněné nádoby asi na jeden litr ( řádně přikryté víky z plastu, 
miskami nebo fólií z plastu s v ětracími otvory) napln ěné takovým 
množstvím vlhkého zkušebního nebo kontrolního substrátu, které odpovídá 500 g suchého substrátu.
 
1.6.2.  Zkušební podmínky  
Nádoby se uchovávají v klimatizovaných komorách p ři teplotě 20 ± 
2 o C se stálým sv ětlem. Intenzita sv ětla by měla být 400 až 800 lx.  
Doba trvání zkoušky je 14 dní, avšak úhyn lze pop řípadě vyhodnotit 
po sedmi dnech od za čátku zkoušky.  
1.6.3.  Zkušební postup  
Z k o u š e n é k o n c e n t r a c e  
Koncentrace zkoušené látky se vyjád ří v hmotnosti látky vztažené na 
jednotku suché hmotnosti základního substrátu (mg/kg).  
O r i e n t a č n í z k o u š k a  
Rozsah koncentrací, které zp ůsobují úhyn od 0 do 100 %, lze 
stanovit v orienta ční zkoušce, která poskytne informace o vhodném 
rozmezí koncentrací pro hlavní zkoušku.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Látka se zkouší p ři těchto koncentracích: 1 000; 100; 10; 1; 0,1 mg 
látky na kg (suché hmotnosti) zkušebního substrátu.  
Je-li třeba provést úplnou hlavní zkoušku, sta čí pro orienta ční 
zkoušku jedna zkušební skupina o 10 žížalách na každou koncentraci a jedna pro neexponovanou kontrolu.
 
H l a v n í z k o u š k a  
Výsledky orienta ční zkoušky se použijí pro volbu nejmén ě pěti 
koncentrací tvo řících geometrickou řadu, lišících se faktorem nep ře­
kračujícím 1,8 a p řesně pokrývajících rozsah 0 až 100 % mortality.  
Zkoušky s t ěmito řadami koncentrací by m ěly umožnit co nejp řes­
nější odhad hodnoty LC  50 a jejího intervalu spolehlivosti.  
V hlavní zkoušce se použijí nejmén ě čtyři zkušební skupiny na 
každou koncentraci a čtyři neexponované kontrolní skupiny, každá 
o 10 žížalách. Jako výsledek pro tyto replikované skupiny se uvede průměr a standardní sm ěrodatná odchylka.
 
Vyvolají-li dv ě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 1,8 
úhyn 0 a 100 %, jsou tyto dv ě hodnoty dostate čné pro identifikaci 
oblasti, ve které se nachází hodnota LC  50 . 
M í s e n í z á k l a d n í h o z k u š e b n í h o s u b s t r á t u 
a z k o u š e n é l á t k y  
Zkušební substrát musí být pokud možno p řipraven bez jakýchkoli 
jiných přísad, než je voda. T ěsně před začátkem zkoušky se emulze 
nebo disperse zkoušené látky v deionizované vod ě nebo v jiném 
rozpouštědle smísí se základním zkušebním substrátem nebo se na 
něj rovnom ěrné rozstříká jemným rozprašova čem pro chromatografii 
nebo podobným rozprašova čem. 
Je-li zkoušená látka nerozpustná ve vod ě, může být rozpušt ěna v co 
nejmenším objemu vhodného organického rozpoušt ědla (nap ř. 
hexanu, acetonu nebo chloroformu).  
K rozpušt ění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené látky mohou být 
použita pouze činidla, která snadno vyt ěkají. Zkušební substrát musí 
být před použitím odv ětrán. Množství odpa řené vody musí být 
nahrazeno. Kontroly musí obsahovat stejné množství všech p řísad. 
Není-li zkoušená látka rozpustná, dispergovatelná ani emulgovatelná 
v organických rozpoušt ědlech, připraví se sm ěs 10 g k řemenného 
písku a takového množství zkoušené látky, které je pot řebné pro 
zapracování do 500 g zkušebního substrátu (suchá hmotnost), a ta 
se smísí s 490 g základního substrátu (suchá hmotnost).  
Pro každou zkušební skupinu se do sklen ěné nádoby vpraví množ ­
ství vlhkého zkušebního substrátu, která odpovídá 500 g suchého substrátu, a na povrch substrátu se umístí 10 žížal, které byly p řed 
použitím 24 hodin aklimatizovány v podobném vlhkém základním 
substrátu, poté rychle omyty a zbaveny p řebytečné vody osušením na 
filtračním papíru.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Nádoby se p řikryjí víky z plastu s otvory, miskami nebo fólií, aby se 
zabránilo vysychání substrátu, a udržují se ve zkušebních podmín ­
kách 14 dní.  
Vyhodnocení se provede 14 dní (pop řípadě i sedm dní) po zahájení 
zkoušky. Substrát se rozprost ře na podnos ze skla nebo korozivz ­
dorné oceli. Žížaly se vyšet ří a stanoví se po čet přežívajících jedinc ů. 
Žížaly se považují za mrtvé, jestliže nereagují na jemné mechanické 
podráždění na předním konci.  
Provádí-li se vyšet ření po sedmi dnech, nádoba se op ět naplní 
substrátem a p řežívající žížaly se op ět vloží na povrch téhož zkušeb ­
ního substrátu.  
1.6.4.  Zkušební organismy  
Ve zkoušce se použijí dosp ělé žížaly druhu  Eisenia foetida  (viz 
poznámku v dopl ňku) (alespo ň dva m ěsíce staré s klitellem) 
o hmotnosti (ve vlhkém stavu) 300 až 600 mg. (Metody množení viz dopln ěk.)
 
2. ÚDAJE  
2.1. ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ VÝSLEDK Ů 
Uvedou se koncentrace zkoušené látky a odpovídající podíl mrtvých 
žížal v procentech.  
Jsou-li údaje dosta čující, stanoví se standardními metodami (Litch ­
field a Wilcoxon, 1949, nebo rovnocenná metoda) hodnota LC  50 
a interval spolehlivosti (p = 0,05). LC  50 se udává v mg zkoušené 
látky na kg (suché hmotnosti) zkušebního substrátu.  
V případech, kdy je sklon koncentra ční křivky pro výpo čet LC  50 , 
příliš strmý, sta čí grafický odhad této hodnoty.  
Vyvolají-li dv ě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 1,8 
úhyn 0 a 100 %, jsou tyto dv ě hodnoty dostate čné pro identifikaci 
oblasti, ve které se nachází hodnota LC  50 . 
3. ZPRÁVY  
3.1. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— prohlášení, že zkouška byla provedena v souladu s výše uvede ­
nými kritérii jakosti,  
— provedené zkoušky (orienta ční zkouška a/nebo hlavní zkouška),  
— přesný popis zkušebních podmínek nebo prohlášení, že zkouška 
byla provedena podle této metody; musí být uvedeny všechny odchylky,
 
— přesný popis zp ůsobu smísení zkoušené látky se základním 
substrátem,  
— informace o zkušebních organismech (druhy, stá ří, průměrná 
hmotnost a rozp ětí hmotnosti, podmínky množení, p ůvod), ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— metoda použitá pro stanovení LC  50 , 
— výsledky zkoušky v četně všech použitých údaj ů, 
— popis pozorovaných symptom ů nebo zm ěn v chování zkušebních 
organismů, 
— úhyn v kontrolách,  
— hodnota LC  50 nebo nejvyšší zkoušená koncentrace nevyvoláva ­
jící úhyn a nejnižší zkoušená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (pop řípadě i sedm dní) od za čátku zkoušky,
 
— graf závislosti koncentrace/odezva,  
— výsledky získané s referen ční látkou, a ť v souvislosti s touto 
zkouškou, nebo z d řívějších zkoušek kontroly jakosti.  
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, rozhodnutí Rady 
C(81)30 v kone čném znění. 
2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, 
Chapman and Hall, london, str. 331.  
3) Bouche. M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Syste ­
matique, Institut National de la Recherche Agronomique, str. 
671. 
4) Litchfield, J. T. andWilcoxon, F., A simplified method of evalu ­
ation dose effect experiments. I. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 
1949, str. 99.  
5) Komise Evropských spole čenství, Development of a standardized 
laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
 
6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitätstest 
am Regenwurm  Eisenia foetida  in künstlichem Boden“, in: 
Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Doplněk 
Množení a chov žížal p řed zkouškou  
Pro účely množení se 30 až 50 dosp ělých žížal umístí do chovné schránky 
s čerstvým substrátem a vyjmou se po 14 dnech. Tyto jedince je možné použít 
pro další chovné vsázky. Žížaly vylíhlé ze zámotk ů se použijí ke zkoušení poté, 
co dospějí (v uvedených podmínkách po dvou až t řech měsících).  
Podmínky chovu a množení  
Klimatizovaná komora: teplota 20 ± 2  o C, nejlépe s nep řetržitým osv ětlením 
(intenzita 400–800 lx).  
Chovné nádoby: vhodné m ělké nádoby o objemu 10 až 20 l.  
Substrát: druh  Eisenia foetida  je možné chovat v r ůzných zví ře­
cích exkrementech. Jako chovné médium se doporu ­ 
čuje používat sm ěs 50 % (obj.) rašeliny a 50 % (obj.) 
hovězího nebo ko ňského hnoje. Médium musí mít pH 
asi 6 až 7 (upraví se uhli čitanem vápenatým) a nízkou 
iontovou vodivost (mén ě než 6 mmhos nebo s 0,5 % 
koncentrací solí).  
Substrát musí být vlhký, ale ne p říliš mokrý.  
Kromě výše uvedené metody je možné používat i jiné 
úspěšné postupy.  
Poznámka : Druh  Eisenia foetida  existuje ve dvou formách, které n ěkteří taxono­
mové rozlišili na druhy (Bouche, 1972). Jsou si morfologicky podobné, avšak jeden,  Eisenia foetida foetida , má na článcích typické p říčné pruhování nebo 
páskování a druhý,  Eisenia foetida andrei , toto pruhování postrádá a je r ůzně 
červeně zbarven. Pokud je to možné, použije se  Eisenia foetida andrei . Jiné 
druhy je možné použít, pokud je k dispozici pot řebná metodika.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST  
ZAHN-WELLENSOVA ZKOUŠKA  
1. METODA  
1.1. ÚVOD  
Účelem metody je posoudit statickou zkouškou možnost úplné 
biologické rozložitelnosti net ěkavých organických látek rozpustných 
ve vodě, jsouli vystaveny ú činku pom ěrně vysokých koncentrací 
mikroorganism ů. 
Může docházet k fyzikáln ě-chemické adsorpci na suspendovaných 
pevných částicích; tato skute čnost musí být zohledn ěna při interpre ­
taci výsledk ů (viz bod 3.2).  
Zkoušené látky jsou používány v koncentracích odpovídajících 
hodnotám DOC od 50 do 400 mg/l nebo hodnotám CHSK od 100 do 1 000 mg/l (DOC = rozpušt ěný organický uhlík, CHSK = 
chemická spot řeba kyslíku). Tyto pom ěrně vysoké koncentrace 
umožňují spolehlivou analýzu. Slou čeniny s toxickými vlastnostmi 
mohou však proces rozkladu zpomalit nebo zastavit.
 
V této metod ě se úplná biologická rozložitelnost zkoušené látky 
posuzuje podle míry rozpušt ěného organického uhlíku nebo 
chemické spot řeby kyslíku.  
Současným použitím specifické analytické metody m ůže být stano ­
vena také primární biologická rozložitelnost látek (úbytek výchozí 
chemické látky).  
Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které 
mají při koncentracích použitých ve zkoušce tyto vlastnosti:  
— jsou za zkušebních podmínek rozpustné ve vod ě, 
— mají za zkušebních podmínek zanedbatelný tlak par,  
— neinhibují bakterie,  
— jsou ve zkušebním systému pouze omezen ě adsorbovány,  
— pěněním nedochází ve zkoušeném roztoku ke ztrátám.  
Při interpretaci získaných výsledk ů budou užite čné informace 
o relativním podílu hlavních složek zkušebního materiálu, zejména pokud jsou stanovené hodnoty biologické rozložitelnosti nízké nebo 
marginální.
 
Informace o toxicit ě zkoušené látky pro mikroorganismy jsou d ůle­ 
žité rovněž pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti 
a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
Po ukončení zkoušky se míra rozkladu ozna čí za „biologickou rozlo ­ 
žitelnost stanovenou ZahnWellensovou zkouškou“:  
D t ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
kde: 
D t = rozklad (%) v čase t,  
C A = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkušební sm ěsi měřené tři 
hodiny po zahájení zkoušky (mg/l) (DOC = rozpušt ěný 
organický uhlík, CHSK = chemická spot řeba kyslíku),  
C T = hodnoty DOC nebo CHSK zkušební sm ěsi v době odběru 
vzorku (mg/l),  
C B = hodnoty DOC nebo CHSK slepého pokusu v dob ě odběru 
vzorku (mg/l),  
C BA = hodnoty DOC nebo CHSK slepého pokusu t ři hodiny po 
zahájení zkoušky (mg/l).  
Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhlí na celá procenta.  
Jako procentuální rozložitelnost se uvede procentuální snížení hodnot 
DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.  
Rozdíl mezi hodnotou nam ěřenou po t řech hodinách a vypo čítanou 
nebo přednostně naměřenou počáteční hodnotou poskytuje užite čnou 
informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz bod 3.2 Interpretace výsledků).
 
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
V některých p řípadech mohou být p ři posuzování nových látek 
využity referen ční látky; zatím však nelze doporu čit žádné specifické 
referenční látky.  
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka jako zdroj 
uhlíku ve vodném roztoku se smíchají ve sklen ěné nádob ě na jeden 
až čtyři litry s míchadlem a provzduš ňovacím za řízením. Suspense se 
míchá a provzduš ňuje až 28 dní p ři teplotě 20–25  o C při rozptýleném 
světle nebo v temnu. Rozklad se sleduje denn ě nebo v jiných vhodn ě 
stanovených pravidelných časových intervalech prost řednictvím 
měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho 
filtraci. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vyjád ří 
jako pom ěr hodnot DOC (nebo CHSK) v dob ě odběru vzorku 
a hodnoty po t řech hodinách od zahájení zkoušky a slouží jako 
míra rozkladu v daném čase. Výsledky se vynesou do grafu proti 
času a vytvo ří křivku biologického rozkladu.  
Při použití specifické analytické metody se m ěří změny koncentrací 
původní molekuly látky zp ůsobené biologickým rozkladem (míra 
primární biologické rozložitelnosti).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. KRITÉRIA JAKOSTI  
Reprodukovatelnost této zkoušky byla ov ěřena mezilaboratorními 
okružními testy.  
Citlivost metody je zna čně závislá na variabilit ě slepého vzorku, 
v menší mí ře na přesnosti stanovení množství rozpušt ěného organic ­
kého uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspensi.  
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU  
1.6.1.  Příprava  
1.6.1.1. R e a k č n í č i n i d l a  
Zkušební voda: pitná voda s obsahem organického uhlíku menším 
než 5 mg/l. Koncentrace vápenatých a ho řečnatých iont ů nesmí 
překročit 2,7 mmol/l; v opa čném případě je nutné jako rozpoušt ědlo 
použít deionizovanou nebo destilovanou vodu. 
Kyselina sírová p.a 50 g/l 
Hydroxid sodný p.a 40 g/l 
Minerální živné médium: v jednom litru deionizované 
vody se rozpustí: 
Chlorid amonný NH  4 Cl p.a. 38,5 g 
Dihydrogenfosfore čnan sodný, NaH  2 PO 4 .2H  2 O p.a. 33,4 g 
Dihydrogenfosfore čnan draselný, KH  2 PO 4 p.a. 8,5 g 
Hydrogenfosfore čnan draselný, KH  2 PO 4 p.a. 21,75 g  
Tento roztok slouží jako živný roztok a jako pufr pH.  
1.6.1.2. P ř í s t r o j e a p o m ů c k y  
Skleněné nádoby na jeden až čtyři litry (nap ř. válcové nádoby).  
Míchačka se sklen ěným nebo kovovým míchadlem na vhodné stopce 
(míchadlo by m ělo být umíst ěno 5–10 cm nad dnem nádoby). 
Namísto toho lze použít magnetické míchadlo dlouhé 7–10 cm.  
Skleněná provzduš ňovací trubice o vnit řním průměru 2–4 mm. 
Vyústění trubice by m ělo být umíst ěno asi 1 cm nad dnem nádoby.  
Odstředivka (cca 3 550g).  
pH-metr.  
Oxymetr.  
Papírové filtry.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Zařízení pro membránovou filtraci.  
Membránové filtry o velikosti pór ů 0,45 μm. Vhodné membránové 
filtry nesmí b ěhem filtrace uvol ňovat ani absorbovat uhlík.  
Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke 
stanovení CHSK.  
1.6.1.3. P ř í p r a v a i n o k u l a  
Aktivovaný kal z biologické čistírny se promyje zkušební vodou (viz 
výše), a to bu ď (opakovanou) centrifugací, nebo sedimentací.  
Aktivovaný kal musí mít vhodné složení. Takový kal se vyskytuje 
v řádně fungujících čistírnách odpadních vod. Má-li být získáno co 
nejvíce různých druh ů nebo kmen ů bakterií, m ůže být vhodné namí ­
chat inokulum z r ůzných zdroj ů (např. z různých čistíren, z p ůdního 
extraktu, z říčních vod atd.). Sm ěs se zpracuje výše uvedeným 
způsobem.  
Kontrola aktivity aktivovaného kalu je popsána níže v bodu 1.6.2 
v odstavci Funk ční kontrola aktivovaného kalu.  
1.6.1.4. P ř í p r a v a z k u š e b n í c h r o z t o k ů 
Do zkušební nádoby se odm ěří 500 ml zkušební vody, 2,5 ml mine ­
rálního živného roztoku na litr a p řidá se aktivovaný kal v množství 
odpovídajícím 0,2 až 1,0 g sušiny v litru kone čné směsi. Přidá se 
takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby byla dosaženo koncentrace rozpušt ěného organického uhlíku 50 až 400 mg na litr 
suspense. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1 000 mg/l. 
Směs se doplní vodou do celkového objemu jeden až čtyři litry. 
Celkový zvolený objem je závislý na po čtu odebíraných vzork ů 
nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, jaký 
objem budou mít odb ěry požadované pro analytický postup.
 
Zpravidla se za dostate čný objem považují dva litry. Sou časně se 
s každou zkušební sérií nasadí alespo ň jeden kontrolní slepý vzorek; 
obsahuje pouze aktivovaný kal a minerální živné médium dopln ěné 
vodou na stejný objem jako zkoušená sm ěs. 
1.6.2.  Postup zkoušky  
Zkušební nádoby se promíchávají magnetickými míchadly nebo 
šroubovitými míchadly p ři rozptýleném sv ětle nebo v temnu p ři 
teplotě 20–25  o C. Nádoba se provzduš ňuje tlakovým vzduchem, 
který je podle pot řeby čištěn vatovým filtrem a p řes promýva čku. 
Musí být zajišt ěno, aby nedošlo k usazení kalu a aby koncentrace 
rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg/l.  
V pravidelných intervalech (nap ř. denně) se měří pH a podle pot řeby 
se upraví na pH 7–8.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Ztráty vypa řováním se p řed každým odb ěrem vzorku vyrovnají 
potřebným množstvím destilované nebo deionizované vody. Je 
účelné vyzna čit na nádob ě hladinu kapaliny p řed začátkem zkoušky. 
Nové vyzna čení se provede vždy po odebrání vzorku (p ři vypnutém 
provzdušňování a míchaní). První vzorky se odebírají vždy t ři 
hodiny po zahájení zkoušky s cílem zjistit míru adsorpce zkoušeného 
materiálu na aktivovaném kalu.  
Rozklad zkoušené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC 
a CHSK provád ěným denn ě nebo v jiných pravidelných intervalech. 
Vzorky ze zkušební nádoby a ze slepého pokusu se zfiltrují p řes 
pečlivě promytý papírový filtr. Prvních 5 ml filtrátu se odstraní. 
Kaly, které se špatn ě filtrují, mohou být odd ěleny desetiminutovým 
odstřeďováním. Provádí se nejmén ě dvě souběžná stanovení DOC 
a CHSK. Sm ěs se nechá inkubovat až 28 dní.  
Poznámka:  Vzorky, které z ůstávají zakalené, se zfiltrují p řes 
membránový filtr. Membránový filtr nesmí uvol ňovat ani adsorbovat 
žádné organické látky.  
F u n k č n í k o n t r o l a a k t i v o v a n é h o k a l u  
Souběžně s každou sérií pokus ů se nasadí nádoba se známou látkou, 
která slouží ke kontrole funk ční kapacity aktivovaného kalu. Jako 
vhodná látka pro tento ú čel se ukázal diethylenglykol.  
A d a p t a c e  
Jsou-li v pom ěrně krátkých časových intervalech (nap ř. denně) 
prováděny analýzy, lze na k řivce rozložitelnosti rozlišit adapta ční 
fázi (viz obrázek 2). Proto by zkouška nem ěla být nasazována na 
konci pracovního týdne.  
Jestliže k adaptaci dochází na konci normální délky zkoušky, m ůže 
být zkouška prodloužena až do kone čného rozložení zkoušené látky.  
Poznámka:  Je-li třeba důkladně poznat chování aktivovaného kalu, 
exponuje se tentýž aktivovaný kal ješt ě jednou zkoušené látce takto:  
Míchadlo a provzduš ňovací zařízení se vypnou, aby se mohl aktivo ­
vaný kal usadit. Supernatant se odlije, dekantovaný kal v nádob ě se 
doplní vodou na objem dvou litr ů, 15 minut se míchá a op ět se 
nechá sedimentovat. Po dekantaci supernatantu se zkouška opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou postupem 
podle výše uvedených bod ů 1.6.1.4 a 1.6.2. Aktivovaný kal m ůže 
být namísto usazováním odd ělen centrifugací.
 
Adaptovaný kal m ůže být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem 
tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2–1 g sušiny na litr suspense.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
P ř í p r a v a p r o a n a l ý z u  
Vzorky se obvykle zfiltrují p řes pečlivě promytý papírový filtr (k 
promývání se použije deionizovaná voda).  
Vzorky, které z ůstanou zakalené, se zfiltrují p řes membránové filtry 
(0,45 μm). 
Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se odstraní) se p řístrojem 
pro měření TOC provedou dv ě stanovení koncentrace rozpušt ěného 
uhlíku (DOC). Nem ůže-li být filtrát analyzován v den odb ěru 
vzorku, musí být do p říštího dne uchován v ledni čce. Delší sklado ­
vání se nedoporu čuje. 
CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví analytickým postupem pro stano ­
vení CHSK popsaným níže v literatu ře (2).  
2. ÚDAJE A VYHODNOCENÍ  
Koncentrace DOC a/nebo CHSK se stanoví alespo ň ve dvou dupli ­
kátních vzorcích postupem uvedeným výše v bodu 1.6.2. Rozklad 
v čase t se vypo čte podle vzorce (s definicemi) uvedeného výše 
v bodu 1.2.  
Hodnota stupn ě rozkladu se zaokrouhlí na celá procenta. Dosažená 
rozložitelnost na konci zkoušky se ozna čí za „biologickou rozloži ­
telnost stanovenou Zahn-Wellensovou zkouškou“.  
Poznámka:  Je-li dosaženo úplného rozkladu zkoušené látky p řed 
řádným termínem ukon čení zkoušky a výsledek je potvrzen druhý 
den další analýzou, m ůže být zkouška ukon čena. 
3. ZPRÁVY  
3.1. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— počáteční koncentrace látky,  
— všechny informace a experimentální výsledky týkající se zkou ­ 
šené látky, pop řípadě referenční látky a kontrolního vzorku,  
— koncentrace látky po t řech hodinách,  
— křivka biologického rozkladu s popisem,  
— datum a místo odb ěru zkušebních organism ů, stav adaptace, 
použitá koncentrace atd.,  
— vědecké odůvodnění všech zm ěn ve zkušebního postupu.  
3.2. INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Postupné ubývání DOC nebo snižování CHSK, ke kterému dochází 
během dnů až týdn ů, naznačuje, že zkoušená látka je biologicky 
rozkládána.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
V mnoha p řípadech však m ůže ovlivňovat výsledky zkoušky fyzi ­
kálně-chemická adsorpce; to lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo 
částečné ubývání DOC nebo snižování CHSK b ěhem prvních t ří 
hodin zkoušky a že rozdíl mezi supernatantem ze slepého vzorku a ze zkoušeného vzorku je ne čekaně malý.
 
Má-li se rozlišit biologická rozložitelnost (nebo částečná biologická 
rozložitelnost) od adsorpce, je t řeba provést další zkoušky.  
To lze provést n ěkolika zp ůsoby, nejsprávn ější je však použít super ­
natant nebo kal jako inokulum v n ěkteré základní zkoušce (nejlépe 
ve zkoušce respirometrií).  
Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo pokles 
CHSK, který není ovlivn ěn adsorpcí, lze pokládat za biologicky 
rozložitelné. Částečný, neadsorp ční úbytek znamená, že látka je 
alespoň částečně biologicky rozložitelná. Nízký nebo nulový úbytek 
DOC nebo pokles CHSK m ůže být zp ůsoben inhibicí mikroorga ­
nismů zkoušenou látkou, která se m ůže projevovat rozpušt ěním 
nebo úbytkem kalu nebo zákalem supernatantu. V takových p řípa­
dech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.  
Vyšší citlivosti m ůže být dosaženo specifickými analytickými meto ­
dami nebo použitím zkoušených látek zna čených 14C. P ři použití 
zkoušené látky zna čené 14C bude probíhající rozklad zkoušené látky 
potvrzen vývinem 14CO  2 . 
Pokud se výsledek udává jako primární biologická rozložitelnost, 
měly by být podle možnosti uvedeny zm ěny v chemické struktu ře, 
které způsobily, že se snížil signál výchozí zkoušené látky.  
Musí být popsána vhodnost analytické metody a výsledky stanovení 
ve slepém živném médiu.  
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, rozhodnutí Rady 
C(81) 30 v kone čném znění. 
2) Příloha V sm ěrnice Komise 84/449/EHS (Ú ř. věst. L 251, 
19.9.1984, s. 1), metoda C.9 Rozložitelnost: Chemická spot řeba 
kyslíku.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Doplněk 
PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ 
Organická látka 4-ethoxybenzoová kyselina 
Teoretická koncentrace ve zkoušce 600 mg/l Teoretický DOC: 390 mg/l 
Inokulum čistírna odpadních vod v … 
Koncentrace: 1 g sušiny na litr Adaptace: bez adaptace Analýza: stanovení DOC 
Množství vzorku: 3 ml 
Referenční látka: diethylenglykoll 
Toxicita zkoušené látky: žádné toxické ú činky při koncentraci menší než 
1 000 mg/l 
Použitá zkouška: zkouška ve fermenta čních 
trubicích
 
Čas 
v průběhu 
zkoušky Referenční látka Zkoušená látka 
Slepý 
vzorek 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l DOC (netto) 
mg/l Rozklad 
% DOC (  1 ) 
mg/l DOC (netto) 
mg/l Rozklad 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 hodiny 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 
1 den 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 dny 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dnů 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 
6 dnů 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 
7 dnů 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 
8 dnů 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 
9 dnů 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 
10 dnů 18,0 37,0 19,0 94 20,2 2,0 99
 
( 1 ) Střední hodnota ze t ří stanovení.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Obrázek 1  
Příklad křivek biologického rozkladu
  
Obrázek 2  
Příklady adaptace kalu
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10 SIMULA ČNÍ ZKOUŠKA AEROBNÍHO ČIŠTĚNÍ ODPADNÍCH 
VOD: C.10-A: JEDNOTKY AKTIVOVANÉHO KALU – C.10-B: 
BIOFILMY  
C.10-A: Jednotky aktivovaného kalu  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 303 
(2001). V 50. letech bylo zjišt ěno, že nov ě zavedené povrchov ě aktivní 
látky způsobují nadm ěrné pěnění v čistírnách odpadních vod a v řekách. 
Tyto látky nebyly zcela odstran ěny při aerobním čištění a v n ěkterých 
případech omezovaly odstra ňování jiných organických látek. Tato skute č­
nost byla d ůvodem celé řady šetření, jakým zp ůsobem by bylo možno 
odstranit povrchov ě aktivní látky z odpadních vod a zda by byly nové 
chemické látky produkované pr ůmyslem vhodné pro čištění odpadních 
vod. Za tímto ú čelem byly použity modelové jednotky reprezentující dva 
hlavní druhy aerobního biologického čištění odpadních vod (aktivovaný kal 
a biologická perkola ční nebo skráp ěná filtrace). Bylo by nepraktické a velmi 
nákladné distribuovat každou novou chemikálii a sledovat velké čistírny 
odpadních vod, a to i v místním m ěřítku. 
VÝCHOZÍ ÚVAHY  
Jednotky aktivovaného kalu  
2. Jsou popsány modelové jednotky aktivovaného kalu, jejichž velikost se 
pohybuje od 300 ml p řibližně do 2 000 ml. N ěkteré byly v ěrnou napodo ­
beninou plnohodnotných čistíren, kde se usazovací nádrže s usazeným 
kalem přečerpávají zp ět do aera ční nádrže, zatímco jiné nem ěly žádná 
usazovací za řízení, nap ř. Swisher (1). Velikost za řízení je kompromisem; 
na jedné stran ě musí být dostate čně velké, aby umož ňovalo úsp ěšné 
provedení mechanických operací a zajiš ťovalo dostate čné množství vzork ů, 
aniž by byl ovlivn ěn provoz, avšak na druhé stran ě by nemělo být tak velké, 
aby kladlo nadm ěrné nároky na prostor a materiál.  
3. Rozsáhle a uspokojiv ě jsou využívány dva druhy za řízení – Husmann ův 
model (2) a za řízení s porézní nádobou (3),(4), jichž bylo poprvé užito 
při studii povrchov ě aktivních látek; jejich popis je uveden v této zkušební 
metodě. S uspokojivým výsledkem byla použita i další za řízení, nap říklad 
Eckenfelder ův model (5). Vzhledem k pom ěrně vysoké cen ě a náročnosti 
použití této simula ční zkoušky byly sou časně zkoumány jednodušší 
a levnější screeningové zkoušky, které jsou nyní za členěny do 
kapitoly C.4 A - F této p řílohy (6). Zkušenosti s celou řadou povrchov ě 
aktivních látek a dalších chemických látek ukázaly, že chemické látky, které 
prošly screeningovými zkouškami (snadno biologicky rozložitelné látky) se 
rozložily i p ři simulační zkoušce. N ěkteré chemické látky, které neprošly 
screeningovou zkouškou, prošly zkouškami vlastní biologické rozložitelnosti (kapitoly C.12 (7) a C.19 (8) této p řílohy), ale pouze n ěkteré z této posledn ě 
jmenované skupiny se rozložily p ři simulační zkoušce, zatímco chemické 
látky, které neprošly zkouškou vlastní biologické rozložitelnosti, se neroz ­
ložily ani p ři simulačním zkoušce (9), (10), (11).
 
4. Pro n ěkteré účely jsou simula ční zkoušky provád ěné na základ ě jediného 
souboru pracovních podmínek dostate čné; výsledky jsou vyjád řeny 
procentem úbytku zkoušené chemické látky nebo rozpušt ěného organického 
uhlíku (DOC). Popis takové zkoušky je uveden v této zkušební metod ě. 
Nicméně na rozdíl od p ředchozí verze této kapitoly, která popisovala 
pouze jeden typ za řízení čistícího syntetické odpadní vody ve sp řaženém 
režimu pomocí pom ěrně hrubé metody odstra ňování kal ů, tento text uvádí  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
celou řadu variant. Popisuje alternativy typu za řízení, způsobu provozu, 
likvidace odpadních vod a odstra ňování kalu. Tento text se úzce drží 
textu normy ISO 11733 (12), který byl b ěhem jeho p řípravy pe člivě zkou­
mán, přestože uvedená metoda nebyla podrobena mezilaboratorní porovná ­
vací zkoušce.  
5. Pro jiné ú čely je zapot řebí zjistit koncentraci zkoušené chemické látky 
v odtoku a k tomu je nezbytné použít složit ější metodu. Je nap říklad 
nezbytná p řesnější kontrola rychlosti odtahu kalu v pr ůběhu každého dne 
a po celou dobu zkoušky a za řízení je nutno provozovat p ři řadě různých 
rychlostí odtah ů kalu. U pln ě komplexní metody by m ěly zkoušky probíhat 
rovněž při dvou nebo t řech různých teplotách: tuto metodu popisuje Birch 
(13), (14) a je shrnuta v dodatku 6. Na základ ě současných znalostí však 
nelze rozhodnout, který z t ěchto kinetických model ů lze uplatnit na 
biologickou rozložitelnost chemických látek p ři čištění odpadních vod 
a ve vodném prost ředí obecn ě. Použití kinetiky dle Monoda, které je 
uvedeno v dodatku 6 jako p říklad, je omezeno na chemické látky p řítomné 
v množství 1 mg/l a v ětším, ale podle n ěkterých názor ů je i toto užití nutno 
odůvodnit. Zkoušky p ři koncentracích, které v ěrněji odrážejí koncentrace 
v odpadních vodách, jsou uvedeny v dodatku 7, ale tyto zkoušky 
a rovněž zkoušky v dodatku 6 jsou uvedeny v dodatcích, místo aby byly 
vydány jako samostatné zkušební metody.  
Filtry  
6. Mnohem menší pozornost byla v ěnována modelu biologických skráp ěných 
filtrů, pravděpodobně proto, že jsou t ěžkopádnější a mén ě kompaktní než 
modelová za řízení s aktivovaným kalem. Gerike se spolupracovníky vyvinul 
zařízení pro skráp ěnou filtraci a provozoval je ve sp řaženém režimu (15). 
Tyto filtry byly pom ěrně velké (výška 2 m, objem 60 l) a každý z nich 
vyžadoval až 2 l/h odpadní vody. Baumann se spolupracovníky (16) simu ­
loval skráp ěné filtry vložením proužk ů polyesterového „rouna“ do trubek 
o délce 1 m (vnit řní průměr 14 mm) poté, co byly tyto proužky na dobu 30 
minut pono řeny do koncentrovaného aktivovaného kalu. Zkoušená chemická 
látka jako jediný zdroj C v roztoku minerálních solí byla čerpána do svislé 
trubky a biologický rozklad byl posouzen na základ ě měření hodnot DOC 
v odtoku a CO  2 ve vzniklém plynu.  
7. Biofiltry byly simulovány jiným zp ůsobem (15), na vnit řní plochy rota čních 
trubek sklon ěné pod malým úhlem k vodorovné rovin ě se přiváděla odpadní 
voda (asi 250 ml/h) se zkoušenou látkou a bez ní a shromážd ěný odtok pak 
byl analyzován na p řítomnost DOC a/nebo konkrétní zkoušené chemické 
látky.  
PODSTATA ZKOUŠKY  
8. Touto metodou se stanoví odstranitelnost a primární a/nebo úplný 
biologický rozklad ve vod ě rozpustných organických látek aerobními mikro ­
organismy v kontinuáln ě pracujícím testovacím systému simulujícím proces 
s aktivovaným kalem. Jedinými zdroji uhlíku a energie pro mikroorganismy 
jsou snadno rozložitelné organické médium a zkoušená organická látka.  
9. Dva kontinuáln ě pracující modely (modely aktivace nebo modely s porézní 
nádobou) pracují paraleln ě za stejných podmínek zvolených tak, aby 
vyhovovaly ú čelu zkoušky. Pr ůměrná hydraulická doba zdržení je obvykle 
6 h a průměrné stáří kalu (doba zdržení kalu) se pohybuje od 6 do 10 dn ů. 
Kal se odtahuje jednou ze dvou metod; zkoušená chemická látka se zpra ­
vidla přidává do p řítoku (organického média) pouze jednoho z model ů 
v koncentraci odpovídající 10–20 mg/l rozpušt ěného organického 
uhlíku (DOC). Druhý model se provozuje jako kontrolní model pro stano ­
vení biologické rozložitelnosti organického média.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. V pravidelných intervalech se odebírají vzorky odtok ů, ve kterých se stano ­
vuje v optimálním p řípadě DOC, nebo chemická spot řeba kyslíku (CHSK) 
a rovněž koncentrace zkoušené chemické látky (je-li vyžadována) speci ­
fickou analýzou v odtoku z modelu, do n ěhož je vypoušt ěna zkoušená 
chemická látka. P ředpokládá se, že rozdíl mezi koncentrací DOC nebo 
CHSK v odtoku ze zkušebního a kontrolního modelu pochází ze zkoušené 
chemické látky nebo jejích organických metabolit ů. Tento rozdíl se porovná 
s koncentrací DOC nebo CHSK v p řítoku pocházející ze zkoušené chemické 
látky, aby se ur čila její rozložitelnost.  
11. Biologický rozklad lze zpravidla odlišit od bioadsorpce pe člivým prozkou ­
máním k řivky odstranitelnosti v čase a obecn ě jej lze potvrdit pomocí 
zkoušky snadného biologického rozkladu pomocí aklimatizovaného inokula 
z modelu, do n ěhož je vypoušt ěna zkoušená chemická látka.  
INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE  
12. Pro správnou interpretaci výsledk ů by měla být známa čistota zkoušené 
chemické látky, její rozpustnost ve vod ě, těkavost a adsorp ční vlastnosti. 
Těkavé a nerozpustné chemické látky lze zpravidla zkoušet jen tehdy, jsou-li 
přijata zvláštní opat ření (viz dodatek 5). Pro výpo čet teoretických hodnot 
a/nebo pro ov ěření naměřených hodnot parametr ů, např. teoretické spot řeby 
kyslíku (ThOD), rozpušt ěného organického uhlíku (DOC) a chemické 
spotřeby kyslíku (CHSK) je rovn ěž nutno znát chemickou strukturu nebo 
alespoň empirický vzorec.  
13. Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být užite čné informace 
o toxicitě zkoušené chemické látky pro mikroorganismy (viz dodatek 4); 
tyto informace mohou být d ůležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot 
biologického rozkladu.  
HODNOTY, P ŘI NICHŽ VÝROBEK VYHOVUJE  
14. Při původním uplatn ění této simula ční (potvrzující) zkoušky na primární 
biologický rozklad povrchov ě aktivních látek je vyžadováno odstran ění 
více než 80 % ur čité chemické látky, aby mohla být povrchov ě aktivní 
látka uvedena na trh. Pokud není dosaženo hodnoty 80 %, lze použít tuto 
simulační (potvrzující) zkoušku a povrchov ě aktivní látku uvést na trh pouze 
za předpokladu odstran ění více než 90 % dané chemické látky. Obecn ě se 
chemické látky neposuzují z hlediska vyhov ěla/nevyhov ěla a při přibližných 
výpočtech pravd ěpodobné koncentrace v životním prost ředí, které se užívají 
při posuzování rizik plynoucích z chemických látek, lze použít získané 
hodnoty procenta úbytku. Výsledky mají tendenci sledovat vzorec tzv. „všechno nebo nic“. V řadě studií čistých chemických látek bylo zjišt ěno 
procento úbytku DOC > 90 % u více než t ří čtvrtin a > 80 % u více než 
90 % chemických látek, které nevykazují žádný významný stupe ň 
biologické rozložitelnosti.
 
15. V odpadní vod ě je přítomno relativn ě málo chemických látek (nap ř. 
povrchov ě aktivních chemických látek) v koncentracích (asi 10 mg C/l) 
užitých p ři této zkoušce. N ěkteré chemické látky mohou být v t ěchto 
koncentracích inhibující, zatímco kinetika úbytku jiných látek se m ůže 
v nízkých koncentracích lišit. P řesnější stanovení rozkladu lze provést 
s využitím modifikovaných metod pomocí realisticky nízkých koncentrací zkoušené chemické látky a získané údaje by mohly být použity pro výpo čet 
kinetických konstant. Pot řebné experimentální techniky však dosud nejsou 
plně validovány a rovn ěž nebyly stanoveny modely kinetiky popisující 
reakce biologického rozkladu (viz dodatek 7).
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
REFEREN ČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY  
16. Aby bylo zajišt ěno správné provedení experimentálního postupu, je vhodné 
současně se zkoumáním zkoušených chemických látek provád ět občasné 
zkoušky látek, jejichž chování je známé. Tyto chemické látky zahrnují 
kyselinu adipovou, 2-fenyl fenol, 1-naftol, kyselinu difenovou,1-kyselinu 
naftoovou apod. (9)(10)(11).  
REPRODUKOVATELNOST VÝSLEDK Ů ZKOUŠKY  
17. Existuje mnohem mén ě zpráv o studiích simula čních zkoušek než 
o zkouškách snadné biologické rozložitelnosti. Reprodukovatelnost mezi 
(simultánními) opakováními je dobrá (v rozmezí 10–15 %) u zkoušených látek rozložených z 80 % nebo více, ale u h ůře rozložitelných chemických 
látek je variabilita v ětší. Také u n ěkterých hrani čních chemických látek byly 
při různých příležitostech v pr ůběhu 9 týdn ů povolených v testu zazname ­
nány zcela rozdílné výsledky (nap ř. 10 %, 90 %).
 
18. U výsledk ů získaných z uvedených dvou typ ů aparatur byly zaznamenány 
jen malé rozdíly, ale u n ěkterých chemických látek prob ěhl rozsáhlejší 
a konzistentn ější rozklad za p řítomnosti domovních odpadních vod než za 
přítomnosti syntetické odpadní vody dle OECD.  
POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
Přístroje a pom ůcky 
Zkušební systém  
19. Zkušební systém pro jednu zkoušenou chemickou látku se skládá ze zkušeb ­
ního a kontrolního modelu; pokud se však provád ějí pouze specifické 
analýzy (primární biologický rozklad), je vyžadován pouze zkušební model. 
Jeden kontrolní model m ůže být použit pro více zkušebních za řízení, do 
nichž se vypoušt ějí buď stejné, nebo odlišné zkoušené chemické látky. 
V případě spřaženého za řízení (dodatek 3) se používá jeden kontrolní 
model pro každé zkušební za řízení. Zkušebním za řízením m ůže být bu ď 
model aktivace, tj. Husmann ův model (dodatek 1, obr. 1), nebo model 
s porézní nádobou (Dodatek 1, obr. 2). V obou p řípadech se použijí zásobní 
nádoby s dostate čným objemem pro p řítok a odtok a dávkovací čerpadla pro 
přítok, a to bu ď ve směsi s roztokem zkoušené chemické látky, nebo odd ě­
leně. 
20. Každý model aktivace se skládá z aera ční nádrže se známým objemem 
přibližně 3 litry aktivovaného kalu a sedimenta ční nádoby (sekundární 
dosazovací nádrže), s pracovním objemem p řibližně 1,5 litru; objem lze 
do určité míry m ěnit nastavením výšky sedimenta ční nádoby. Jsou p řípustné 
i nádoby s odlišnými objemy, pokud model pracuje s podobným hydrau ­
lickým zatížením. Pokud není možno udržet ve zkušební místnosti teplotu v požadovaném rozsahu, doporu čuje se modely temperovat vodním plášt ěm. 
Pro kontinuální nebo v pravidelných intervalech p řerušovanou recirkulaci 
aktivovaného kalu z dosazovací nádrže do aera ční nádrže se používá dávko ­
vací čerpadlo nebo mamutka.
 
21. Model s porézní nádobou se skládá z vnit řního porézního válce 
s kuželovitým zakon čením, který je vložen do pon ěkud větší nádoby stej ­
ného tvaru z nepropustného plastového materiálu. Jako materiál pro porézní nádobu m ůže být použit porézní polyethylen s maximální velikostí pór ů 
90 μm a s tlouš ťkou 2 mm. K separaci kalu od upraveného organického 
média dochází filtrací porézní st ěnou. Odtok se shromaž ďuje v prostoru 
mezi nádobami a odtéká do sb ěrné nádoby. Nedochází k sedimentaci, 
a proto aktivovaný kal nerecirkuluje. Celé za řízení může být umíst ěno 
v termostatované vodní lázni. N ěkdy dojde v po čátečním stadiu k ucpání 
porézní nádoby a obsah p řeteče. V takovém p řípadě se ucpaný porézní válec
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
nahradí novým, p řičemž se kal z nádoby nejprve p řelije do čisté nádoby 
a ucpaný válec se odstraní. Po ot ření nepropustného vn ějšího válce se vloží 
čistý vnitřní válec a kal se vrátí do nádoby. Veškerý kal, který ulpí na 
stěnách ucpaného vnit řního válce, se rovn ěž pečlivě seškrábe a p řenese. 
Ucpané válce se čistí nejprve pomocí tenkého proudu vody pro odstran ění 
zbývajícího kalu a poté pono řením do z ředěného roztoku chlornanu 
sodného, pak do vody a nakonec se vodou dokonale vypláchnou.  
22. Pro oba modely lze použít vhodné zp ůsoby provzduš ňování kalu v aera ční 
nádrži, nap říklad různé provzduš ňovací krychli čky (rozvad ěče) a tlakový 
vzduch. Pokud je to nutné, musí být vzduch čištěn, například vhodným 
filtrem a promýváním. Provzduš ňování musí být dostate čné, aby byly 
v systému po celou dobu zkoušky zajišt ěny aerobní podmínky a dokonalá 
suspenze vlo ček kalu.  
Filtrační přístroj nebo odst ředivka  
23. Přístroj pro membránovou filtraci s filtry vhodné velikosti pór ů (průměr 
pórů 0,45 μm), které co nejmén ě adsorbují rozpustné organické chemické 
látky nebo uvol ňují organický uhlík. Pokud použité filtry uvol ňují organický 
uhlík, promyjí se pe člivě horkou vodou, aby byl odstran ěn vyluhovatelný 
organický uhlík. Lze použít rovn ěž odstředivku, která je schopna dosáhnout 
odstředivého zrychlení 40 000 m/s  2 . 
Analytické vybavení  
24. Zařízení pro stanovení:  
— DOC (rozpušt ěného organického uhlíku) a TOC (celkového organického 
uhlíku), nebo CHSK (chemické spot řeby kyslíku),  
— případně pro stanovení ur čité chemické látky,  
— nerozpušt ěných tuhých látek, hodnoty pH a koncentrace kyslíku ve 
vodě, 
— teploty, zásaditosti a kyselosti,  
— jestliže systém pracuje s nitrifikací, pak vybavení pro stanovení amoni ­
akálního, dusitanového a dusi čnanového dusíku.  
Voda  
25. Vodovodní voda s koncentrací DOC menší než 3 mg/l. Ur čení zásaditosti, 
pokud již není známé.  
26. Deionizovaná voda s koncentrací DOC menší než 2 mg/l.  
Organické médium  
27. Jako organické médium je p řípustná syntetická odpadní voda, splašková 
odpadní voda nebo jejich sm ěs. Bylo prokázáno (11), (14), že použití 
samotné splaškové odpadní vody často vede k v ětšímu procentu odstran ění 
DOC, a dokonce umož ňuje odstran ění a biologický rozklad n ěkterých 
chemických látek, které se p ři užití syntetické odpadní vody dle OECD 
biologicky nerozloží. Kontinuální nebo p řerušované p řidávání splaškové 
odpadní vody rovn ěž často vede ke stabilizaci aktivovaného kalu v četně 
zásadní schopnosti dobrého usazování. Proto se doporu čuje použití splaš ­
kové odpadní vody. Koncentrace DOC nebo CHSK se stanovuje v každé 
nové šarži organického média. Má být známa kyselost nebo zásaditost organického média. Organické médium m ůže vyžadovat p řidání vhodného 
pufru (hydrogenuhli čitan sodný nebo dihydrogenfosfore čnan draselný) 
v případě, že má nízkou kyselost nebo zásaditost, s cílem udržet pH 
v aerační nádob ě v průběhu zkoušky na hodnot ě přibližně 7,5 ± 0,5. 
V každém jednotlivém p řípadě je nutné rozhodnout o množství pufru, 
které má být p řidáno, a dob ě jeho přidání. Ať už jsou sm ěsi přidávány 
kontinuáln ě nebo přerušovaně, musí být hodnota DOC (nebo CHSK) ve 
směsi udržována na p
řibližně konstantní hodnot ě, např. zředěním vodou.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Syntetická odpadní voda  
28. V 1 litru vodovodní vody se rozpustí: pepton: 160 mg; masový extrakt: 110 
mg; močovina, 30 mg; bezvodý hydrogenfosfore čnan draselný (K  2 HPO  4 ): 
28 mg; chlorid sodný (NaCl): 7 mg; dihydrát chloridu vápenatého 
(CaCl  2 .2H  2 O): 4 mg; heptahydrát síranu ho řečnatého (Mg  2 SO 4 .7H  2 0): 2 
mg. Tato syntetická odpadní voda (OECD médium) je modelovým příkladem a vykazuje pr ůměrnou koncentraci DOC v p řítoku přibližně 
100 mg/l. Další možností je použít jiná složení o p řibližně stejné koncentraci 
DOC, která se více blíží skute čnému složení odpadní vody. Je-li pot řeba užít 
přítok s nižší koncentrací, ředí se syntetická odpadní voda vodovodní vodou 
například v pom ěru 1:1 na koncentraci p řibližně 50 mg/l. Taková slabší 
koncentrace p řítoku umožní lepší r ůst nitrifika čních organism ů a tato úprava 
by měla být použita v p řípadě, že je třeba zkoumat simulaci čistíren odpad ­
ních vod pracujících s nitrifikací. Tuto syntetickou odpadní vodu lze připravit v destilované vod ě v koncentrované podob ě a uchovávat p ři teplotě 
asi 1 °C po dobu až jednoho týdne. V p řípadě potřeby lze zředit vodovodní 
vodou. (Toto médium je nevyhovující, nap ř. koncentrace dusíku je velmi 
vysoká, obsah uhlíku je relativn ě nízký, avšak nebyla navržena žádná lepší 
varianta krom ě přidání dalšího fosfátu jako pufru a více peptonu).
 
Splašková odpadní voda  
29. Použije se čerstvá odsazená odpadní voda odebíraná každý den z čistírny, 
která čistí převážně splaškové domovní odpadní vody. Odebírá se p řed 
primární sedimentací z p řepadu mechanického stupn ě čistírny nebo 
z přítoku do čistírny pracující s aktivovaným kalem, a musí z ní být 
z větší části odstran ěny hrubé částice. Odpadní voda m ůže být uchovávána 
po několik dní (ale zpravidla ne déle než sedm dní) p řibližně při 4 °C, 
pokud se prokáže, že hodnota DOC (nebo CHSK) se b ěhem uchovávání 
výrazně nesníží (tj. o více než 20 %). K zamezení poruchového provozu 
systému se p řed použitím adjustuje DOC (nebo CHSK) u každé nové šarže 
na příslušnou stálou koncentraci, nap ř. zředěním vodovodní vodou.  
Aktivovaný kal  
30. Pro inokulaci se odebere aktivovaný kal z aera ční nádrže dob ře pracující 
čistírny odpadních vod nebo z laboratorního modelu aktivace, který pracuje 
převážně se splaškovou odpadní vodou.  
Zásobní roztoky zkoušené chemické látky  
31. U chemikálií s dostate čnou rozpustností se p řipraví zásobní roztok zkoušené 
chemické látky vhodné koncentrace (nap ř. 1 až 5 g/l) v deionizované vod ě 
nebo v minerální složce syntetické odpadní vody (u nerozpustných a těkavých látek viz dodatek 5). V zásobním roztoku se stanoví DOC 
a celkový organický uhlík (TOC) a m ěření se u každé nové šarže zopakuje. 
Jestliže je rozdíl mezi DOC a TOC v ětší než 20 %, ov ěří se rozpustnost 
zkoušené chemické látky ve vod ě. DOC nebo koncentrace zkoušené 
chemické látky stanovená v zásobním roztoku specifickou analýzou se 
porovná se jmenovitou hodnotou, aby se zjistilo, zda je analytická výt ěžnost 
dostatečná (obvykle lze o čekávat > 90 %). Zhodnotí se, zvlášt ě u disperzí, 
zda může být DOC použit jako analytický ukazatel nebo zda lze použít jen 
analytickou techniku specifickou pro danou zkoušenou chemickou látku. 
Vzorky s disperzí je nutné odst ředit. V každé nové šarži se stanoví hodnoty 
DOC, CHSK nebo zkoušené chemické látky pomocí specifické analýzy.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. V zásobním roztoku se stanoví hodnota pH. Extrémní hodnoty indikují, že 
přidání chemické látky m ůže ovlivňovat hodnotu pH aktivovaného kalu ve 
zkušebním systému. V takovém p řípadě se zásobní roztok neutralizuje na 
hodnotu pH 7 ± 0,5 malým objemem anorganické kyseliny nebo zásady. Nesmí však dojít k vysrážení zkoušené chemické látky.
 
POSTUP  
33. Tento postup platí pro za řízení s aktivovaným kalem. Pro zkoušku v modelu 
s porézní nádobou musí být mírn ě upraven.  
Příprava inokula  
34. Zkušební za řízení se na po čátku zkoušky inokuluje bu ď aktivovaným kalem, 
nebo inokulem s nízkou koncentrací mikroorganism ů. Inokulum se 
provzdušňuje při pokojové teplot ě až do doby použití a použije se b ěhem 
24 h. V prvním p řípadě se vzorek aktivovaného kalu odebere z aera ční 
nádrže dob ře pracující biologické čistírny odpadních vod nebo 
z laboratorního modelu aktivace, který pracuje p řevážně se splaškovou 
odpadní vodou. P ři simulaci nitrifika čních podmínek se odebere kal 
z čistírny odpadních vod pracující s nitrifikací. Stanoví se koncentrace 
sušiny, a pokud je to nutné, koncentruje se kal usazováním tak, aby 
objem kalu p řidávaný do zkušebního modelu byl co nejmenší. Po čáteční 
koncentrace sušiny kalu musí být p řibližně 2,5 g/l.  
35. Ve druhém p řípadě se jako inokulum použijí 2 ml/l až 10 ml/l odtoku 
z biologické čistírny splaškových odpadních vod. Aby se získalo dostate čné 
zastoupení r ůzných bakteriálních druh ů, je vhodné použít inokula z r ůzných 
dalších zdroj ů, například z povrchové vody. V takovém p řípadě se aktivo ­
vaný kal vyvíjí a roste ve zkušebním modelu.  
Dávkování organického média  
36. Je nutné zajistit d ůkladné vy čištění sběrných nádob na p řítok a na odtok 
a trubek vedoucích z nádob na p řítok a do nádob na odtok, aby se zabránilo 
růstu mikroorganism ů na počátku zkoušky i v celém jejím pr ůběhu. 
Zkušební za řízení se sestaví v místnosti s kontrolovanou teplotou (obvykle 
v rozmezí 20–25 °C) nebo se použije zkušební za řízení s vodním plášt ěm. 
Připraví se dostate čný objem požadovaného organického média (odstavce 
27–29). Nejprve se aera ční a dosazovací nádrž naplní organickým médiem 
a potom se p řidá inokulum (odstavce 34, 35). Intenzita provzduš ňování se 
nastaví tak, aby byl kal udržován ve vznosu a v aerobním stavu. Potom se začne s dávkováním p řítoku a recyklací usazeného kalu. Organické médium 
se dávkuje ze zásobních nádob do aera čních nádrží (odstavce 20, 21) 
zkušebního a kontrolního modelu a p říslušné odtoky se shromaž ďují 
v obdobných zásobnících. Aby se dosáhlo obvyklé hydraulické doby zdržení 6 h, dávkuje se 0,5 litru organického média za 1 h. Pro potvrzení této rychlosti je nutno m ěřit dávkovaný denní objem organického média zjiš ť­
ováním snížení objemu média v zásobnících. Pro stanovení ú činků přerušo­
vaného uvol ňování a nárazového dávkování chemických látek by bylo 
nezbytné použít jiné zp ůsoby dávkování
 
37. Jestliže je organické médium p řipraveno k použití po dobu delší než 1 den, 
je nutné je ochladit p řibližně na 4 °C, p řípadně použít jinou vhodnou 
metodu ochrany proti r ůstu mikroorganism ů a biologickému rozkladu 
mimo zkušební za řízení (odstavec 29). Jestliže se používá syntetická 
odpadní voda, je možné p řipravit a uchovat p ři teplotě přibližně 4 °C 
koncentrovaný zásobní roztok (nap ř. odpovídající desetinásobku b ěžné 
koncentrace, odstavec 28). Tento zásobní roztok lze p řed použitím snadno 
zředit odpovídajícím objemem vodovodní vody; lze jej rovn ěž čerpat přímo 
a odpovídající objem vodovodní vody čerpat zvláš ť. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dávkování zkoušené chemické látky  
38. Příslušný objem zásobního roztoku zkoušené chemické látky (odstavec 31) 
se buď přidá do zásobní nádoby p řítoku, nebo se dávkuje samostatným 
čerpadlem p římo do aera ční nádrže. Obvyklá pr ůměrná zkušební koncent ­
race v přítoku by se m ěla pohybovat mezi 10 mg/l až 20 mg/l DOC, nemá 
však být vyšší než 50 mg/l. Pokud je zkoušená chemická látka málo rozpustná ve vod ě nebo se mohou projevit její toxické ú činky, lze snížit 
koncentraci DOC na 5 mg/l nebo i níže, pouze však za p ředpokladu, že je 
k dispozici vhodná specifická analytická metoda a že je rovn ěž provedena 
(dispergované zkoušené chemické látky s malou rozpustností se mohou dávkovat zvláštními zp ůsoby, viz dodatek 5).
 
39. Zkoušená chemická látka se za čne přidávat až po dosažení ustáleného stavu 
systému, kdy dochází k ú činnému odstra ňování DOC z biologického média 
(účinnost kolem 80 %). Je nutno dbát na to, aby všechny modely p řed 
přidáním zkoušené chemické látky pracovaly se stejnou ú činností; pokud 
tomu tak není, doporu čuje se smíchat jednotlivé kaly a znovu rozd ělit stejné 
objemy do jednotlivých model ů. Při použití inokula s (p řibližně) 2,5 g/l 
(sušiny) aktivovaného kalu lze p řidávat zkoušenou chemickou látku hned 
od počátku zkoušky vzhledem k tomu, že p římé přídavky rostoucích dávek 
zkoušené chemické látky od po čátku zkoušky mohou mít tu výhodu, že 
aktivovaný kal se na tuto látku lépe adaptuje. Bez ohledu na zp ůsob přidání 
zkoušené chemické látky se doporu čuje měřit v pravidelných intervalech 
průtok a/nebo objem v zásobní nádob ě. 
Nakládání s aktivovaným kalem  
40. Koncentrace tuhých látek v aktivovaném kalu se b ěhem zkoušky obvykle 
ustaluje v rozsahu od 1 g/l do 3 g/l (sušiny) nezávisle na použitém inokulu a tato koncentrace závisí na jakosti a koncentraci organického média, na provozních podmínkách, na druhu p řítomných mikroorganism ů a na vlivu 
zkoušené chemické látky.
 
41. Buď se stanovuje koncentrace suspendovaných tuhých látek aktivovaného 
kalu v aera čních nádobách nejmén ě jednou týdn ě a odstraňuje se přebytečný 
kal tak, aby se koncentrace udržovala v rozsahu od 1 g/l do 3 g/l (sušiny), nebo se udržuje pr ůměrné stáří kalu na konstantní hodnot ě zpravidla 
v rozsahu od 6 dn ů do 10 dn ů. Pokud se nap říklad zvolí doba zdržení 
kalu 8 dn ů, odstraní se denn ě 1/8 objemu aktivovaného kalu z aera ční 
nádrže a odlije se. To se provádí denn ě, nebo nejlépe p řerušovaným auto ­
matickým provozem čerpadla. Udržování koncentrace suspendovaných 
tuhých látek aktivovaného kalu na konstantní úrovni nebo v úzkém rozmezí 
neznamená udržování konstantní doby zdržení kalu (SRT), která je provozní proměnnou určující hodnotu koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku.
 
42. Během zkoušky se nejmén ě jednou denn ě stírá kal ulpívající na st ěnách 
aerační a dosazovací nádrže tak, aby došlo k jeho resuspenzi. Všechny 
trubky a potrubí se pravideln ě kontrolují a čistí, aby se zabránilo r ůstu 
biofilmu. Usazený kal v dosazovací nádrži se vrací do aera ční nádrže p řed­
nostně občasným čerpáním. V modelu s porézní nádobou neprobíhá recy ­
klace, ale d říve, než objem v nádob ě výrazně stoupne, je nutno zajistit 
vložení čistých vnit řních nádob (odstavec 21).  
43. V Husmannov ě modelu m ůže docházet ke špatnému usazování a ztrátám 
kalu v důsledku jeho špatné usaditelnosti. Tomu je možné zabránit použitím 
jednoho nebo více níže uvedených opat ření, která se mají provád ět paraleln ě 
jak ve zkušebním, tak v kontrolním modelu:  
— v pravidelných intervalech (nap ř. každý týden) m ůže být p řidáván 
čerstvý kal nebo flokula ční činidlo (nap říklad 2 ml 50 g FeCl  3 v 1 
litru na nádobu), avšak je nutno dbát na to, aby FeCl  3 nereagoval se 
zkoušenou chemickou látkou, ani ji nesrážel,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— mamutka m ůže být nahrazena peristaltickým čerpadlem a recirkulace 
kalu upravena tak, aby p řibližně odpovídala p řítoku, což umožní vytvo ­ 
ření anaerobní zóny v usazeném kalu (geometrie mamutky omezuje 
minimální rychlost vracení kalu p řibližně na dvanáctinásobek rychlosti 
přítoku),  
— kal m ůže být čerpán z dosazovací do aera ční nádrže p řerušovaně 
(např. 5 minut b ěhem 2,5 hodiny), aby se recirkuloval l litr až 1,5 
litru kalu za hodinu,  
— aby se zabránilo ztrátám kalu p ěněním, lze dávkovat co nejmenší 
koncentrace netoxického odp ěňovacího činidla (nap ř. silikonového 
oleje),  
— vzduch m ůže být přerušovaně v krátkých intervalech p řiváděn do 
sedimentujícího kalu v dosazovací nádrži (nap ř. po dobu 10 sekund 
každou hodinu),  
— organické médium m ůže být dávkováno do aera ční nádrže p řerušo­
vaně (např. 3–10 minut b ěhem každé hodiny).  
Odběr vzorků a analýza  
44. V pravidelných intervalech se m ěří koncentrace rozpušt ěného kyslíku, 
teplota a hodnota pH aktivovaného kalu v aera ční nádrži. Musí se zajistit 
vždy dostate čná koncentrace kyslíku (> 2 mg/l) a udržovat požadovaný 
rozsah teploty (obvykle od 20 °C do 25 °C). Hodnota pH se udržuje na 7,5 ± 0,5 dávkováním malých objem ů anorganické zásady nebo kyseliny do 
aerační nádrže nebo do p řítoku nebo zvýšením tlumivé kapacity organického 
média (viz odstavec 27). P ři nitrifikaci dochází ke vzniku kyseliny, p řičemž 
při oxidaci 1 mg N vznikne ekvivalent p řibližně 7 mg CO
 3 –. Četnost měření 
závisí na m ěřeném ukazateli a na stabilit ě systému a m ůže se pohybovat 
v denních nebo týdenních intervalech.  
45. Změří se DOC nebo CHSK v p řítocích kontrolní nádrže a zkušební nádrže 
(modelu). Zm ěří se koncentrace zkoušené chemické látky v p řítoku zkušeb ­
ního modelu specifickou analýzou, p řípadně se stanoví odhadem podle 
koncentrace zkoušené chemické látky v zásobním roztoku (odstavec 31), z použitého objemu a z množství odpadní vody dávkované do zkušebního zařízení. Aby se snížila variabilita údaj ů o koncentracích, doporu čuje se 
koncentraci zkoušené chemické látky stanovit výpo čtem.
 
46. Odebírají se vhodné objemy vzork ů odtoku (nap ř. 24h sm ěsný vzorek) 
a filtrují se pomocí membrány o pr ůměru pórů 0,45 μm nebo se odst řeďují 
při odstředivém zrychlení zhruba 40 000 m/s  2 po dobu p řibližně 15 min. 
Je-li filtrace obtížná, použije se odst řeďování. Pro zjišt ění úplného biologic ­
kého rozkladu se stanovuje DOC nebo CHSK v každém vzorku nejmén ě 
dvakrát, a pokud je to nutné, zjiš ťuje se primární biologický rozklad speci ­
fickým stanovením zkoušené chemické látky.  
47. Při použití CHSK mohou vzniknout analytické problémy p ři nízkých 
koncentracích, a proto se doporu čuje používat CHSK jen p ři dostatečně 
vysokých hodnotách zkušební koncentrace (p řibližně 30 mg/l). Jestliže se 
zkoušená chemická látka zna čně adsorbuje, doporu čuje se, aby se množství 
adsorbované látky na kalu zm ěřilo analytickou metodou specifickou pro 
danou zkoušenou chemickou látku.  
48. Četnost odb ěru vzorků závisí na o čekávané dob ě trvání zkoušky. Doporu ­ 
čená četnost odb ěrů jsou tři vzorky za 1 týden. Jakmile modely pracují 
s dostatečnou účinností, pak po p řídavku zkoušené chemické látky bývá 
adaptace a ustáleného stavu dosaženo po 1 týdnu až 6 týdnech provozu. Pro výpo čet výsledku zkoušky se použije nejmén ě 15 platných hodnot 
získaných v ustáleném stavu (odstavec 59), která zpravidla trvá 3 týdny. 
Zkouška m ůže být ukon čena, jakmile bylo dosaženo dostate čného stupn ě 
odstranění (např. > 90 %) a je k dispozici t ěchto 15 hodnot, které p řed­
stavují analýzy provedené v jednotlivých pracovních dnech po dobu 3 
týdnů. Doba zkoušky po p řidání zkoušené chemické látky by obvykle 
neměla překročit 12 týdn ů.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Jestliže dochází k nitrifikaci kalu a je-li pot řeba zkoumat dopady zkoušené 
chemické látky na nitrifikaci, analyzují se vzorky z odtoku zkušebního 
i kontrolního modelu nejmén ě jednou týdn ě a stanoví se v nich amoniak 
a/nebo dusitan a dusi čnan. 
50. Všechny analýzy se provedou co nejd říve, zejména stanovení dusíku. Je-li 
nutné analýzy odložit, musí být vzorky uchovávány p řibližně při 4 °C 
v temnu ve zcela napln ěných a dob ře uzavřených lahvi čkách. Je-li zapot řebí 
uchovat vzorky déle než 48 h, konzervují se zmrazením, okyselením (nap ř. 
přídavkem 10 ml/l roztoku kyseliny sírové koncentrace 400 g/l) pop ř. 
vhodnou toxickou látkou (nap ř. přídavkem 20 ml/l roztoku chloridu rtu ťna­
tého koncentrace 10 g/l). Ov ěří se, zda použitý zp ůsob konzervace neovlivní 
výsledky analýzy.  
Zkouška se sp řaženým za řízením  
51. Jestliže se používá sp řažené zařízení (dodatek 3), vym ění se každý den 
stejné množství aktivovaného kalu (150 ml až 1 500 ml pro aera ční nádrž 
objemu 3 l sm ěsi) mezi aera čními nádržemi zkušebního a kontrolního 
modelu. Pokud se zkoušená chemická látka siln ě adsorbuje na kal, vym ění 
se pouze supernatant v dosazovacích nádržích. V obou p řípadech se pro 
výpočet výsledk ů zkoušky použije korek ční faktor (odstavec 55).  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Zpracování výsledk ů 
52. Stupe ň odstranění zkoušené chemické látky v procentech DOC nebo CHSK 
pro každý časový odhad se vypo čte podle rovnice:  
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
kde 
D t = stupeň odstranění DOC nebo CHSK v čase t vyjád řený v procentech  
C s = koncentrace DOC nebo CHSK zkoušené chemické látky v p řítoku 
v mg/l, p řednostně stanovená odhadem ze zásobního roztoku  
E = zm ěřená koncentrace DOC nebo CHSK v odtoku ze zkušebního 
modelu v mg/l v čase t  
E o = změřená koncentrace DOC nebo CHSK v odtoku z kontrolního 
modelu v mg/l v čase t  
53. Stupe ň odstranění organického média prost řednictvím DOC nebo CHSK 
v kontrolní jednotce je užite čnou informací k posouzení biodegrada ční akti­
vity aktivovaného kalu b ěhem zkoušky. Stupe ň odstranění organického 
média se vypo čte podle rovnice:  
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
kde 
D B = stupeň odstranění organického média vyjád řený v procentech DOC 
nebo CHSK v kontrolním modelu v čase t  
C M = koncentrace DOC nebo CHSK organického média v p řítoku do 
kontrolního modelu v mg/l  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Nepovinn ě se vypočte procento odstran ění DOC nebo CHSK organického 
média a zkoušené chemické látky ve zkušebním za řízení podle rovnice:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
kde 
D T = stupeň odstranění DOC nebo CHSK v celkovém p řítoku do zkušeb ­
ního modelu vyjád řený v procentech  
C T = DOC nebo CHSK v celkovém p řítoku do zkušebního modelu nebo 
vypočtený na základ ě zásobních roztok ů v mg/l  
54. Stupe ň odstranění zkoušené chemické látky stanovený specifickou analy ­
tickou metodou p ři každém hodnocení v čase se vypo čte podle rovnice:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
kde 
D ST = stupeň primárního odstran ění zkoušené chemické látky v čase 
t vyjádřený v procentech  
S i = změřená nebo vypo čtená koncentrace zkoušené chemické látky 
v přítoku do zkušebního modelu v mg/l  
S e = změřená koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku ze zkušeb ­
ního modelu v mg/l v čase t  
55. Jestliže se používá sp řažené zařízení, upraví se ředění zkoušené chemické 
látky v aera ční nádrži o vým ěnu kalu a použije se korek ční faktor (viz 
dodatek 3). Jestliže je pr ůměrná hydraulická doba zdržení 6 h a vym ění 
se polovina objemu aktivovaného kalu v aera čních nádržích, je pro získání 
skutečného stupn ě odstranění zkoušené chemické látky D  tc nutné upravit 
stanovené denní hodnoty odstran ění (D  t , odstavec 52) na základ ě rovnice:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Vyjadřování výsledk ů zkoušky  
56. Do grafu se vynese procento odstran ění D  t (nebo D  tc ) a D  ST , pokud je 
k dispozici, v závislosti na čase (viz dodatek 2). Z tvaru této k řivky odstra ­
nitelnosti zkoušené chemické látky (samostatn ě nebo jako DOC) lze vyvodit 
některé záv ěry o postupu odstra ňování.  
Adsorpce  
57. Je-li hned na po čátku zkoušky pozorován vysoký stupe ň odstranění DOC 
zkoušené chemické látky, je zkoušená chemická látka pravd ěpodobně 
odstraňována adsorpcí na sušin ě aktivovaného kalu. To je možné ov ěřit 
stanovením adsorbované zkoušené chemické látky specifickou analýzou. Není obvyklé, aby stupe ň odstranění DOC adsorbovatelných chemických 
látek zůstával vysoký v celém pr ůběhu zkoušky; vysoký stupe ň odstranění 
je zpravidla pozorován na po čátku zkoušky a pozd ěji klesne na rovnovážnou 
hodnotu. Pokud ale adsorbovatelná zkoušená chemická látka byla schopna tak či onak zp ůsobit aklimatizaci populace mikroorganism ů, stupeň odstra­
nění DOC zkoušené chemické látky by následn ě vzrostl a dosáhl vysoké 
hodnoty ve fázi prodlevy.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Lagová fáze  
58. Obdobn ě jako u statických screeningových zkoušek musí u řady zkoušených 
látek dříve, než prob ěhne úplný biologický rozklad, prob ěhnout lagová fáze. 
V lagové fázi dochází k aklimatizaci nebo adaptaci rozkládajících se bakté ­
rií, přičemž nedochází tém ěř k žádnému úbytku zkoušené chemické látky; 
následně dochází k po čátečnímu růstu těchto baktérií. Tato fáze kon čí a má 
se za to, že za číná fáze rozkladu, po úbytku p řibližně 10 % po čátečního 
množství zkoušené chemické látky (po zohledn ění adsorpce, pokud k ní 
dojde). Lagová fáze je často různě dlouhá a špatn ě reprodukovatelná.  
Prodleva  
59. Fáze prodlevy k řivky odstranitelnosti p ři kontinuální zkoušce je definována 
jako fáze, v níž dochází k maximálnímu rozkladu. Fáze prodlevy musí trvat 
nejméně 3 týdny a musí mít alespo ň 15 změřených platných hodnot.  
Průměrný stupe ň odstranění zkoušené chemické látky  
60. Střední hodnota se vypo čte z hodnot odstran ění (D  t ) zkoušené chemické 
látky ve fázi prodlevy. Po zaokrouhlení na nejbližší celé číslo (1 %) získáme 
stupeň odstranění zkoušené chemické látky. Doporu čuje se rovn ěž vypočítat 
95 % konfiden ční interval této st řední hodnoty.  
Odstranění organického média  
61. Do grafu se vynese procento odstran ění DOC nebo CHSK organického 
média v kontrolním za řízení (D  B ) v závislosti na čase. Průměrný stupe ň 
odstranění se ozna čí stejně jako u zkoušené chemické látky (odstavec 60).  
Indikace biologické rozložitelnosti  
62. Jestliže se zkoušená chemická látka výrazn ě neadsorbuje na aktivovaném 
kalu a k řivka odstranitelnosti vykazuje typický pr ůběh biologického 
rozkladu s lagovou fází, fází rozkladu a fází prodlevy (odstavce 58, 59), 
lze změřené odstran ění zkoušené chemické látky bezpe čně přisoudit jejímu 
biologickému rozkladu. Dojde-li na po čátku zkoušky k velkému odstran ění, 
nemůže tato simula ční zkouška rozlišit biologické a abiotické elimina ční 
procesy. V takovém p řípadě a také v jiných p řípadech, kdy jsou pochybnosti 
o biologické rozložitelnosti (nap ř. jestliže dochází ke stripování), se zjiš ťuje 
adsorpce zkoušené chemické látky nebo se provád ějí další statické zkoušky 
biologické rozložitelnosti založené na ukazatelích jednozna čně indikujících 
biologické procesy. Takovými zkouškami jsou metoda zkoumání spot řeby 
kyslíku (kapitola C.4 D, E a F této p řílohy (6)) nebo metoda stanovení 
uvolněného oxidu uhli čitého (kapitola C.4 C této p řílohy (6)) nebo metoda 
ISO Headspace (18) s využitím adaptovaného inokula ze simula ční zkoušky. 
Pokud byly zm ěřeny procentuální hodnoty jak odstran ění DOC, tak odstra ­
nění konkrétních chemických látek, a existují-li mezi t ěmito hodnotami 
významné rozdíly (u DOC nižší hodnoty, u konkrétních látek vyšší), pak to naznačuje přítomnost organických meziprodukt ů v odpadních vodách, 
které mohou být obtížn ěji rozložitelné než výchozí chemická látka.
 
Platnost výsledk ů zkoušky  
63. Stanovením stupn ě biologického rozkladu organického média (odstavec 53) 
v kontrolním modelu se získají informace o normální biologické rozložitel ­
nosti inokula. Zkouška se považuje za platnou, jestliže je v kontrolním 
modelu stupe ň biologického rozkladu podle DOC nebo CHSK po 2 týdnech 
větší než 80 % a nebyly pozorovány žádné neobvyklé jevy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Pokud byla užita snadno biologicky rozložitelná (referen ční) chemická látka, 
měl by být stupe ň biologického rozkladu (D  t , odstavec 52) > 90 %.  
65. Jestliže je zkouška provedena za nitrifika čních podmínek, m ěla by být 
průměrná odtoková koncentrace < 1 mg/l amoniakálního dusíku a < 2 
mg/l dusitanového dusíku.  
66. Pokud tato kritéria (odstavce 63–65) nebyla spln ěna, je třeba zkoušku 
opakovat s použitím inokula z jiného zdroje, provést zkoušku referen ční 
chemické látky a p řezkoumat všechny experimentální postupy.  
Protokol o zkoušce  
67. V protokolu o zkoušce musí být uvedeny tyto údaje:  
Zkoušená chemická látka:  
— údaje nutné k identifikaci,  
— fyzikální povaha a tam, kde je to podstatné, fyzikáln ě -chemické vlast ­
nosti.  
Zkušební podmínky:  
— typ zkušebního za řízení, jakákoli úprava za ú čelem zkoušek nerozpust ­
ných a těkavých látek,  
— typ organického média,  
— podíl a charakter pr ůmyslového odpadu obsaženého v odpadní vod ě, 
jsou-li známy,  
— inokulum, charakter a místo/místa odb ěru, koncentrace a jakákoli p řed­
úprava,  
— zásobní roztok zkoušené chemické látky: obsah DOC a TOC, zp ůsob 
přípravy, jedná-li se o suspenzi, užitá zkušební koncentrace; pokud se 
tato koncentrace pohybuje mimo rozmezí 10–20 mg/l DOC, d ůvody, 
proč tomu tak je, metoda p řidávání, datum prvního p řidání, jakékoli 
změny, 
— průměrné stáří kalu a pr ůměrná hydraulická doba zdržení, metoda 
odtahu kalu, metody p ředcházející bytn ění kalu, ztrát ě kalu apod.,  
— použité analytické metody,  
— zkušební teplota,  
— vlastnosti kalu, nap ř. bytnění, kalový index (KI), koncentrace aktivova ­
ného kalu,  
— údaje o odchylkách od normalizovaného postupu a o dalších okolnos ­
tech, které by mohly ovlivnit výsledky.  
Výsledky zkoušky:  
— všechny zm ěřené údaje (DOC, CHSK, specifické analýzy, hodnota pH, 
teplota, koncentrace kyslíku, suspendované tuhé látky a slou čeniny 
dusíky, pokud je to relevantní),  
— všechny vypo čtené hodnoty D  t (nebo D  tc ), D  B , D ST v tabelované form ě 
a křivky odstranitelnosti,  
— údaje o lagové fázi a fázi prodlevy, doba trvání zkoušky, stupe ň odstra­
nění zkoušené chemické látky a stupe ň odstranění organického média 
v kontrolním modelu spole čně se statistickými informacemi 
a vyjádřením k biologické rozložitelnosti zkoušené chemické látky 
a platnosti zkoušky,  
— diskuse o výsledcích.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
LITERATURA:  
1) Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation“, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, 1085 pp.  
2) German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in 
washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698–706.  
3) Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmen ­
ham, UK.  
4) Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. 
Res. 12: 909–915.  
5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
6) Kapitola C.4 této p řílohy, Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti.  
7) Kapitola C.12 této p řílohy, Biologická rozložitelnost – modifikovaná 
zkouška SCAS.  
8) Kapitola C.19 této p řílohy, Odhad adsorp čního koeficientu (K  OU ) pro půdy 
a čistírenské kaly pomocí vysokoú činné kapalinové chromatografie (HPLC).  
9) Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157–173.
 
10) Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclu ­
sions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55.  
11) Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp 113–138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
12) ISO 11733 (1995; p řepracována v roce 2004). Stanovení odstranitelnosti 
a biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prost ředí - simu ­
lační zkouška s aktivovaným kalem.  
13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33–48.  
14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340–343.  
15) Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753–758.
 
16) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214–220.  
17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 
91–98 ISBN 011 751661 9.  
18) ISO 14593 (1998). Jakost vod – Hodnocení úplné aerobní biologické rozlo ­ 
žitelnosti organických látek ve vodním prost ředí. Metoda stanovení anorga ­
nického uhlíku v t ěsně uzavřených lahvi čkách.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Dodatek 1  
Obrázek 1  
Zařízení použité pro posouzení biologické rozložitelnosti  
Husmann ův model
  
A. zásobník  
B. dávkovací čerpadlo  
C. aerační nádrž (kapacita 3 l)  
D. sedimenta ční nádrž  E. mamutka  
F. sběrná nádrž  
G. provzduš ňovací zařízení (frita)  
H. průtokoměr vzduchu  
Obrázek 2  
Zařízení použité pro posouzení biologické rozložitelnosti  
Porézní nádoba
  
A. zásobník  
B. dávkovací čerpadlo  
C. porézní nádoba aera ční nádrže  
D. vnější nepropustná nádoba  E. sběrná nádrž  
F. difuzér  
G. průtokoměr vzduchu  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Obrázek 3  
Podrobný popis porézní nádoby t řílitrové aera ční nádrže
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Dodatek 2  
Příklad křivky odstranitelnosti
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Dodatek 3  
[INFORMATIVNÍ]  
ZKOUŠKA SE SP ŘAŽENÝM ZA ŘÍZENÍM  
S cílem pokusit se vyrovnat mikrobiální populace v kalech ve zkušebním 
zařízení, do n ějž je vpoušt ěna odpadní voda a zkoušená chemická látka, a v 
kontrolním za řízení, do n ějž je vpoušt ěna pouze odpadní voda, byla zavedena 
denní vým ěna kalu (1). Tento postup byl nazván sp řažením a metoda je známa 
jako zkouška se sp řaženým za řízením. Sp řažení bylo p ůvodně prováděno pomocí 
Husmannových model ů aktivovaného kalu, bylo však provád ěno i s využitím 
modelů s porézní nádobou (2)(3). Nebyly zjišt ěny žádné významné rozdíly ve 
výsledcích mezi nesp řaženými a sp řaženými jednotkami bez ohledu na to, zda se 
jednalo o Husmann ův model nebo model s porézní nádobou, takže vynaložení 
času a energie na sp řažení zařízení by nep řineslo žádnou výhodu.  
Výměna kalu m ůže být zdánliv ě příčinou značně vysokého stupn ě odstranění, 
protože část zkoušené chemické látky se p řenáší do druhého modelu 
a koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku ze zkušebního a kontrolního 
modelu se tém ěř vyrovná. Proto se používají korek ční faktory, jejichž hodnota 
závisí na objemu vym ěňované aktiva ční směsi a na pr ůměrné hydraulické dob ě 
zdržení. Podrobnosti pro výpo čet byly zve řejněny (1).  
Korigovaná hodnota stupn ě odstranění DOC nebo CHSK se vypo čte podle 
obecné rovnice:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
kde 
D tc = korigovaný stupe ň odstranění DOC nebo CHSK v procentech  
D t = stanovený stupe ň odstranění DOC nebo CHSK v procentech  
a = vym ěněný podíl aktiva ční směsi mezi jednotkami aktivovaného kalu  
r = pr ůměrná hydraulická doba zdržení v hodinách  
Jestliže se nap říklad vym ění polovina objemu aera čních nádrží (a = 0,5) 
a průměrná hydraulická doba zdržení je 6 h, korek ční vzorec je následující:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LITERATURA:  
1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units 
of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.  
2) Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Acti ­
vated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for Simula ­
tion of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Dodatek 4  
HODNOCENÍ INHIBICE AKTIVOVANÝM KALEM  
Postup podle zkoušených chemických látek  
1. Při simulační zkoušce nemusí dojít k rozkladu nebo odstran ění chemické látky 
(nebo odpadní vody), která m ůže mít dokonce inhibi ční účinek na mikroor ­
ganismy v kalu. Jiné chemické látky se biologicky rozkládají v nízkých koncentracích, ale ve vyšší koncentraci p ůsobí inhibi čně (hormeze). Inhibi ční 
účinky mohou být zjišt ěny v dřívější fázi nebo mohou být stanoveny zkou ­ 
škou toxicity s použitím obdobného nebo totožného inokula jako u simula ční 
zkoušky (1). Jedná se o metodu inhibice spot řeby kyslíku (kapitola C.11 této 
přílohy (2) a ISO 8192(3)), nebo inhibice r ůstu organism ů v kalu (ISO 15522 
(4)).
 
2. V simula ční zkoušce se inhibice projeví rozdílem obsahu rozpušt ěného orga ­
nického uhlíku (DOC) nebo chemické spot řeby kyslíku CHSK mezi odtokem 
ze zkušební nádoby a odtokem z kontrolní nádoby, který bude v ětší než 
v případě DOC přidaného jako zkoušená chemická látka. Vyjád řeno jiným 
způsobem se procento odstran ění DOC (a biochemická spot řeba kyslíku BSK, 
chemická spot řeba kyslíku CHSK a/nebo NH  + 4 ) ve zpracovávaném orga ­
nickém médiu v d ůsledku p řítomnosti zkoušené chemické látky sníží. 
Pokud k tomu dojde, m ěla by být zkouška opakována p ři postupném snižo ­
vání koncentrace zkoušené chemické látky, dokud nebude dosaženo úrovn ě, 
při které nedojde k inhibici; potenciáln ě lze dále snižovat koncentraci až do 
doby, kdy bude zkoušená chemická látka biologicky rozložena. Nicmén ě 
pokud má zkoušená chemická látka (nebo odpadní voda) na tento proces negativní vliv ve všech zkoušených koncentracích, nasv ědčuje to tomu, že 
tuto chemickou látku je obtížné až nemožné biologicky odstranit, ale m ůže 
být vhodné opakovat zkoušku s aktivovaným kalem z jiného zdroje a/nebo vystavení kalu postupn ější aklimatizaci.
 
3. Naopak pokud dojde p ři simulační zkoušce k bioeliminaci zkoušené chemické 
látky napoprvé, m ěla by být její koncentrace zvýšena, je-li cílem zjistit, zda 
by daná chemická látka mohla p ůsobit inhibi čně. 
4. Při snaze zjistit stupe ň inhibice je t řeba mít na pam ěti, že populace 
v aktivovaném kalu se m ůže změnit, takže se v pr ůběhu času 
u mikroorganism ů může vyvinout tolerance v ůči inhibující látce.  
5. Výpočet stupně inhibice:  
Celkové procento úbytku R  o , BSK, DOC, CHSK atd., ve zkušebních 
a kontrolních za řízeních lze vypo čítat na základ ě rovnice:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
kde: 
I = koncentrace BSK, DOC, CHSK atd. v p řítoku zkušebních nebo kontrol ­
ních nádob v mg/l  
E = příslušné koncentrace v odtoku v mg/l.  
I a E musí být korigovány o DOC v d ůsledku přítomnosti zkoušené chemické 
látky ve zkušebních za řízeních; v opa čném případě budou výpo čty procenta 
inhibice nesprávné.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Stupeň inhibice zp ůsobené přítomností zkoušené chemické látky lze vypo čítat 
na základ ě rovnice:  
% inhibice ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
kde: 
R c = procento úbytku v kontrolních nádobách  
R t = procento úbytku ve zkušebních nádobách  
LITERATURA:  
1) Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
2) Kapitola C.11 této p řílohy, Biologická rozložitelnost – Zkouška na inhibici 
dýchání aktivovaného kalu.  
3) ISO 8192 (2007) Jakost vod – Zkouška inhibice spot řeby kyslíku aktivo ­
vaným kalem p ři oxidaci uhlíkatých látek a amoniakálního dusíku.  
4) ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Dodatek 5  
Ve vodě těžko rozpustné zkoušené chemické látky – t ěkavé chemické látky  
Ve vodě těžko rozpustné chemické látky  
Evidentně bylo zve řejněno jen málo zpráv o podrobení chemických látek t ěžko 
rozpustných a nerozpustných ve vod ě zkouškám simulujícím čištění odpadních 
vod (1), (2), (3).  
Neexistuje jednotná metoda dispergace zkoušené chemické látky, kterou by bylo 
možno použít pro všechny nerozpustné chemické látky. Jako vhodné pro pokus o dispergaci zkoušených látek p ři simulační zkoušce by se jevily dva ze čtyř typů 
metod popsaných v norm ě ISO 10634 (4); jedná se o použití emulga čního činidla 
a/nebo ultrazvukové energie. M ěla by být stanovena stabilita výsledné disperze 
po dobu alespo ň 24 h. Vhodn ě stabilizované disperze v neustále míchaných 
nádržích (odstavec 38) pak budou nadávkovány do aera ční nádrže odd ěleně od 
splaškové (nebo syntetické) odpadní vody.
 
V případě stabilní disperze je nutno prozkoumat zp ůsob stanovení zkoušené 
chemické látky v dispergované form ě. Metoda DOC nebude pravd ěpodobně 
pro tento ú čel vhodná, takže bude t řeba stanovit analytickou metodu specifickou 
pro zkoušenou chemickou látku, kterou bude možno použít pro odtok, tuhé látky v odtoku a aktivovaný kal. Následn ě se stanoví osud zkoušené chemické látky 
v simulaci procesu čištění aktivovaným kalem v pevné a kapalné fázi. To 
znamená, že bude stanovena „hmotnostní bilance“ za ú čelem rozhodnutí, zda 
došlo k biologickému rozkladu zkoušené chemické látky. To by však indikovalo pouze primární biologický rozklad. Pokus o prokázání úplného biologického 
rozkladu by m ěl proběhnout na základ ě respirometrické zkoušky na snadnou 
biologickou rozložitelnost (viz kapitola C.4 této p řílohy (5) C, F nebo D), 
přičemž se jako inokulum použije kal vystavený zkoušené chemické látce p ři 
simulační zkoušce.
 
Těkavé chemické látky  
Uplatnění simulace čištění odpadních vod na t ěkavé chemické látky je sporné 
a problematické. Obdobn ě jako u zkoušených látek špatn ě rozpustných ve vod ě 
bylo publikováno jen velmi málo zpráv popisujících simula ční zkoušky pomocí 
těkavých látek. Konven ční typ kompletního míchadla se upraví ut ěsněním aerač­
ních a usazovacích nádrží, m ěřením a regulací pr ůtoku vzduchu pomocí pr ůtoko­
měrů a vypoušt ěním výstupního plynu p řes zařízení na zachycování t ěkavých 
organických látek. V n ěkterých p řípadech se použije k vypoušt ění výstupního 
plynu výv ěva přes „studené“ zachycovací za řízení nebo p řes čisticí zachycovací 
zařízení obsahující Tenax a silikagel pro analýzu pomocí plynové chromatogra ­
fie. Přítomnost zkoušené chemické látky v zachycovacím za řízení lze stanovit 
analyticky.  
Zkouška se provádí ve dvou částech. Za řízení jsou nejprve spušt ěna bez kalu, 
přičemž se do aera ční nádrže čerpá syntetická odpadní voda a zkoušená chemická 
látka. Vzorky p řítoku, odtoku a výstupního plynu se po dobu n ěkolika dn ů 
shromažďují a analyzují na zkoušenou chemickou látku. Ze shromážd ěných 
údajů lze vypo čítat procentní podíl (R  vs ) zkoušené chemické látky odstran ěné 
ze systému.  
Následně je provedena normální biologická zkouška (s kalem) za stejných 
provozních podmínek jako ve stripovací studii. Jsou provedena také m ěření 
DOC nebo CHSK s cílem zkontrolovat efektivní fungování za řízení. V první 
části zkoušky jsou provád ěny příležitostné analýzy ke stanovení zkoušené 
chemické látky v p řítoku, odtoku a výstupním plynu; po aklimatizaci se analýzy 
provádějí častěji. Opět platí, že z údaj ů v ustáleném stavu lze vypo čítat procento 
odstranění zkoušené chemické látky z kapalné fáze všemi procesy (R  T ) (fyzikál ­
ními i biologickými) i podíl látek (R  V ), odstran ěných ze systému.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Výpočet: 
a) V nebiologické zkoušce lze procentní podíl (R  VP ) zkušebního materiálu 
odstraněného ze systému vypo čítat pomocí následující rovnice:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
kde 
R VP = odstran ění zkoušené chemické látky t ěkáním (%),  
S VP = zkoušená chemická látka shromážd ěná v zařízení pro zachycování 
vyjádřená jako ekvivalentní koncentrace v kapalné fázi v mg/l,  
S IP = koncentrace zkoušené chemické látky v p řítoku (mg/l).  
b) V biologické zkoušce lze procentní podíl (R  V ) zkušebního materiálu odstra ­
něného ze systému vypo čítat pomocí následující rovnice:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
kde 
R V = odstran ění zkoušené chemické látky t ěkáním při biologické zkoušce 
(v %),  
S V = zkoušená chemická látka shromážd ěná v zařízení pro zachycování p ři 
biologické zkoušce vyjád řená jako ekvivalentní koncentrace 
v kapalném p řítoku v mg/l,  
S I = koncentrace zkoušené chemické látky v p řítoku v mg/l.  
c) V biologické zkoušce se procento (R  T ) zkoušené chemické látky odstran ěné 
všemi procesy vypo čte pomocí následující rovnice:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
kde 
S E = koncentrace zkoušené chemické látky v (kapalném) odtoku v mg/l.  
d) Procentní podíl (R  BA ) odstraněný biologickým rozkladem a adsorpcí lze tedy 
vypočítat na základ ě rovnice:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Měly by být provedeny samostatné zkoušky s cílem zjistit, zda je zkoušená 
chemická látka adsorbována; pokud tomu tak je, lze provést další korekci.  
e) Srovnání mezi podílem zkoušené chemické látky odstran ěné z biologických 
(R v ) a nebiologických (R  vp ) zkoušených systém ů naznačuje celkový dopad 
biologického čištění na emise zkoušené chemické látky do atmosféry.  
Příklad:  benzen  
doba zdržení kalu = 4 dny  
syntetická odpadní voda; doba zdržení = 8 h  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Platí tedy, že  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % a R  BA = 85 %.  
Předpokládalo se, že benzen není absorbován na kal.  
LITERATURA:  
1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
4) ISO 10634 (1995) Jakost vod - Pokyny pro p řípravu a zpracování ve vod ě 
těžko rozpustných organických látek pro následující hodnocení jejich 
biologické rozložitelnosti ve vodním prost ředí 
5) Kapitola C.4 této p řílohy, Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Dodatek 6  
Vliv doby zdržení kalu (SRT) na odstranitelnost chemických látek  
ÚVOD  
1. Metoda popsaná v hlavní části textu byla navržena ke zjišt ění, zda zkoušené 
chemické látky (zpravidla takové, o nichž je známo, že jsou biologicky 
rozložitelné, avšak nikoli snadno biologicky rozložitelné) podléhají biologic ­
kému rozkladu v mezích vyžadovaných v čistírnách odpadních vod. 
Výsledky jsou vyjad řovány v procentech úbytku a v procentech biologic ­
kého rozkladu. Podmínky provozu jednotek aktivovaného kalu a volba 
přítoku dovolují spíše širší rozp ětí koncentrací zkoušené chemické látky 
v odtoku. Zkoušky jsou provád ěny pouze p ři jedné jmenovité koncentraci 
suspendovaných látek nebo p ři jedné jmenovité dob ě zdržení kalu (SRT) 
a popsané režimy odtahování mohou zp ůsobit při zkoušce zna čné kolísání 
doby zdržení kalu jak den ode dne, tak b ěhem dne.  
2. V této variant ě (1), (2) je popsána metoda regulace doby zdržení kalu 
v mnohem užším rozmezí v pr ůběhu každého 24hodinového období 
(obdobně jako ve v ětším měřítku), které m ůže mít za následek ustálen ější 
koncentraci zkoušené chemické látky v odtoku. Doporu čuje se použít splaš ­
kovou odpadní vodu vzhledem k tomu, že vykazuje konzistentn ější a vyšší 
procenta úbytku. Jsou rovn ěž zkoumány ú činky řady hodnot doby zdržení 
kalu a v podrobn ější studii mohou být stanoveny ú činky rozmezí teplot na 
koncentraci chemické látky v odtoku.  
3. Dosud neexistuje obecná shoda ohledn ě toho, které modely kinetiky p ůsobí 
při biologickém rozkladu chemických látek za podmínek panujících p ři 
čištění odpadních vod. Byl zvolen Monod ův model r ůstu baktérií 
a využití substrátu (1), (2), který bude uplatn ěn na shromážd ěné údaje 
vzhledem k tomu, že tato metoda m ěla být použita pouze na chemické 
látky vyráb ěné ve velkých objemech, což má za následek koncentrace 
v odpadní vod ě nad 1 mg/l. Platnost zjednodušeného modelu a užitých 
předpokladů byly stanoveny za použití řady alkoholethoxylát ů s různým 
stupněm primární biologické rozložitelnosti (2), (3).  
Poznámka:  Tato variantní metoda úzce sleduje v ětšinu textu této zkušební 
metody C.10-A a níže jsou uvedeny pouze podrobnosti, které se od ní liší.
 
PODSTATA ZKOUŠKY  
4. Zařízení s porézní nádobou s aktivovaným kalem, ur čená k (tém ěř) konti­
nuálnímu odtahu aktiva ční směsi umožňující velmi p řesné řízení doby 
zdržení kalu (SRT nebo θ s ) jsou provozována v nesp řaženém režimu pro 
řadu dob zdržení kalu a voliteln ě i pro řadu teplot. Obvyklá doba zdržení je 
2 až 10 dn ů při teplotě 5 až 20 °C. Odpadní voda, nejlépe splašková, 
a roztok zkoušené chemické látky se do za řízení dávkují odd ěleně takovou 
rychlostí, aby se dosáhlo požadované doby zdržení kalu (3–6 hodin) a požadované koncentrace zkoušené chemické látky v p řítoku. Kontrolní 
zařízení se provozují paraleln ě bez zkoušené chemické látky za ú čelem 
srovnání.
 
5. Lze použít i jiné typy za řízení, ale je nutné v ěnovat velkou pozornost 
správné kontrole doby zdržení kalu. Nap říklad při použití za řízení obsahu ­
jících usazovací nádrže m ůže být nezbytné zohlednit ztrátu tuhých látek 
odtokem čistírny. M ěla by být p řijata speciální opat ření s cílem zabránit 
chybám v d ůsledku kolísání množství kalu v usazovací nádrži.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Zařízení se provozují p ři každé zvolené sérii podmínek až do ustáleného 
stavu a pr ůměrná koncentrace zkoušené chemické látky a p řípadně i DOC se 
pak stanovuje v odtoku po dobu p řibližně tří týdnů. Kromě posouzení 
procenta úbytku zkoušené chemické látky a p řípadně i DOC se vztah 
mezi podmínkami provozu čistíren a koncentrací zkoušené chemické látky 
v odtoku vyjad řuje v grafické form ě. Výsledky jsou použitelné pro výpo čet 
předběžných kinetických konstant a p ředpověď podmínek, za nichž lze 
zkoušenou chemickou látku čistit. 
INFORMACE O ZKOUŠENÉ CHEMICKÉ LÁTCE  
7. Použije se se kapitola C.10 A, odstavce 12 až 13.  
HODNOTY, P ŘI NICHŽ VÝROBEK VYHOVUJE  
8. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 14 až 15.  
REFEREN ČNÍ ZKOUŠENÁ CHEMICKÁ LÁTKA  
9. Použije se kapitola C.10 A, odstavec 16.  
REPRODUKOVATELNOST VÝSLEDK Ů zkoušek  
10. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 17 až 18.  
POPIS METODY  
Přístroje a pom ůcky 
11. Vhodným za řízením je modifikovaný systém s porézní nádobou (dodatek 
6.1). Skládá se z vnit řní nádoby (nebo vložky) vyrobené z porézního poly ­
propylenu o síle st ěn 3,2 mm, velikosti pór ů přibližně 90 μm a s natupo 
svařenými spoji. (Vznikne tak pevn ější zařízení, než je uvedeno v bod ě 21 
této kapitoly C.10 A) Porézní válec je vložen do vn ější nádoby 
z nepropustného polyetylenu skládající se ze dvou částí: z kruhové 
základny, ve které jsou vyvrtány dva otvory pro p řívod vzduchu a jeden 
pro odběr kalu, a z horního válce, který je p řišroubován na základnu a má 
odtok umíst ěn tak, aby udržel daný objem (3 l) v porézní nádob ě. Na jeden 
přívod vzduchu je napojena provzduš ňovací krychli čka a druhý konec 
přívodu vzduchu je otev řený a nastavený v pravém úhlu 
k provzduš ňovacímu elementu základny. Toto uspo řádání umož ňuje 
potřebnou turbulenci, aby obsah nádoby byl dokonale promícháván a aby 
byla zajišt ěna koncentrace rozpušt ěného kyslíku v ětší než 2 mg/l.  
12. Odpovídající po čet zařízení je udržován p ři kontrolované teplot ě v rozmezí 
od 5 do 20 °C (±1 °C), a to bu ď ve vodní lázni nebo v místnosti 
s konstantní teplotou. Čerpadla musí dávkovat do aera čních nádob roztok 
zkoušené chemické látky požadovanou rychlostí 0–1,0 ml/min a usazené 
odpadní vody požadovanou rychlostí 0–25 ml/min a t řetí čerpadlo musí 
odstraňovat odpadní kal z aera čních nádrží Pot řebného velmi nízkého 
průtoku odpadního kalu je dosaženo pomocí čerpadla nastaveného na 
vyšší rychlost a spoušt ěného přerušovaně pomocí časového spína če, např. 
tak, že je v chodu po dobu 10 sekund za minutu, rychlost čerpadla je 3 
ml/min a rychlost odtahování kalu 0,5 ml/min.  
Filtrační přístroj nebo odst ředivka  
13. Použije se kapitola C.10 A, odstavec 23.  
Analytické vybavení  
14. Použije se kapitola C.10 A, odstavec 24.  
Voda  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 25 až 26.  
Organické médium  
16. Použije se kapitola C.10 A, odstavec 27.  
Syntetická odpadní voda  
17. Použije se kapitola C.10 A, odstavec 28.  
Splašková odpadní voda  
18. Použije se kapitola C.10 A, odstavec 29.  
Aktivovaný kal  
19. Použije se kapitola C.10 A, odstavec 30.  
Zásobní roztoky zkoušené chemické látky  
20. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 31 až 32.  
POSTUP  
Příprava inokula  
21. Použije se pouze kapitola C.10 A, odstavec 34 – užití aktivovaného kalu 
(přibližně 2,5 g/l).  
Počet zkušebních za řízení  
22. Pro jednoduchou zkoušku, tzn. k m ěření procenta úbytku, je zapot řebí pouze 
jedna hodnota doby zdržení kalu, avšak za ú čelem získání údaj ů potřebných 
pro výpo čet předběžných kinetických konstant je pot řeba 4 nebo 5 hodnot 
doby zdržení kalu. Obvykle se volí hodnoty mezi 2 a 10 dny. V praxi je 
vhodné provád ět zkoušku zárove ň za stejné teploty p ři čtyřech nebo p ěti 
různých dobách zdržení kalu; p ři rozšířených studiích se užijí stejné hodnoty 
SRT, případně jiný rozsah hodnot, p ři jiných teplotách v rozsahu 5 až 
20 °C. U primárního biologického rozkladu (hlavní využití) je vyžadována zpravidla pouze jedna jednotka na každou sérii podmínek. Pro úplnou biologickou rozložitelnost je však pro každou sérii podmínek zapot řebí 
kontrolní model, do kterého je vpoušt ěna odpadní voda, ale nikoli zkoušená 
chemická látka. Vychází-li se z toho, že v použité odpadní vod ě je přítomna 
zkoušená chemická látka, bylo by p ři posuzování primárního biologického 
rozkladu nutné použít kontrolní za řízení a provést nezbytnou korekci 
výpočtů.
 
Dávkování organického média a zkoušené chemické látky  
23. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 36 až 39, ale je nutné upozornit na to, 
že roztok zkoušené chemické látky je dávkován samostatn ě a že jsou 
užívány r ůzné rychlosti odtahování kalu. Pr ůtok přítoku, odtoku a odtah 
kalu se pravideln ě sleduje, nap ř. dvakrát denn ě, a pokud je to nutné, upra ­
vuje se v intervalu ±10 %. Pokud vzniknou u analytických metod problémy 
při použití splaškové odpadní vody, provede se zkouška se syntetickou 
odpadní vodou, ale je t řeba zajistit, aby z r ůzných médií vycházela srovna ­
telná kinetická data.  
Nakládání s jednotkami na aktivovaný kal  
24. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 40 až 43, ale doba zdržení kalu 
v kontrolním modelu pouze z hlediska „nep řetržitého“ odtahu kalu.  
Odběr vzorků a analýza  
25. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 44 až 50 s tou výjimkou, že musí být 
stanovena koncentrace zkoušené chemické látky, zatímco DOC m ůže být 
stanoven voliteln ě; CHSK by se užívat nem ěl. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Zpracování výsledk ů 
26. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 52 až 54.  
Vyjadřování výsledk ů zkoušky  
27. Použije se kapitola C.10 A, odstavce 56 až 62.  
Výpočet kinetických konstant  
28. Je realisti čtější uvádět průměrnou koncentraci zkoušené chemické látky 
v odtoku získanou po dosažení ustáleného stavu a popsat, jak se m ění 
podle provozních podmínek čistírny, než uvád ět procentuální primární 
biologický rozklad. To lze provést posouzením rovnice (6) v dodatku 6.2, 
z níž mohou vyplynout hodnoty K  S , μ m a θ SC – kritická doba zdržení kalu.  
(Případně lze získat p řibližné hodnoty K  S a μm pomocí jednoduchého po čí­
tačového programu v souladu s teoretickou k řivkou vypo čtenou podle 
rovnice 2 (dodatek 6.2) na základ ě získaných experimentálních hodnot. 
I když žádný daný roztok nebude jedine čný, lze získat p řiměřenou aproxi ­
maci K  S a μ m .) 
Variabilita výsledk ů 
29. Je obecn ě známo, že získané hodnoty kinetických parametr ů pro jednotlivé 
chemické látky jsou variabilní. Má se za to, že podmínky, za nichž byl kal vypěstován, jakož i podmínky p řevládající v použité zkoušce (stejn ě jako 
v odstavci 5 a v jiných zkouškách), mají velký vliv na výsledné hodnoty. 
Jedním aspektem této variability se zabýval Grady se svými spolupracov ­
níky (4), který se domníval, že by se pro dv ě extrémní podmínky p ředsta­
vující hranice fyziologického stavu, jehož m ůže kultura dosáhnout p ři kine­
tickém experimentu, m ěly užívat pojmy „existující“ a „podstatné“. Pokud se 
tento stav nesmí v pr ůběhu zkoušky m ěnit, odrážejí hodnoty kinetických 
parametrů podmínky v prost ředí, ze kterého byly mikroorganismy odebrány; 
tyto hodnoty se nazývají „existující“ nebo aktuáln ě existující. Na druhé 
straně, pokud podmínky zkoušky umož ňují plný rozvoj systému syntetizu ­
jícího proteiny, který umož ňuje maximální možnou míru r ůstu, nazývají se 
získané kinetické parametry „podstatnými“ a jsou závislé pouze na povaze substrátu a na druzích bakterií v kultu ře. Jako vodítko m ůže posloužit fakt, 
že existující hodnoty se získají udržováním nízkého pom ěru koncentrace 
substrátu a p říslušných mikroorganism ů (S
 o /X o ), např. 0,025, a podstatné 
hodnoty vznikají, když je tento pom ěr vysoký, nap ř. alespoň 20. V obou 
případech by se tedy hodnota S  o měla rovnat p říslušné hodnot ě K s , polosa­
turační konstant ě, nebo ji p řevyšovat.  
30. Variabilita a další aspekty kinetiky biologického rozkladu byly projedná ­
vány na nedávném workshopu SETAC (5). Z t ěchto vykazovaných 
a plánovaných studií by m ěl vyplynout jasn ější pohled na kinetiku p ůsobící 
v čistírnách odpadních vod, který umožní lepší interpretaci stávajících údaj ů 
a návrh více relevantních podob budoucích zkušebních metod.  
LITERATURA:  
1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33–48.  
2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340–343.  
3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742–748.  
5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Dodatek 6.1  
Porézní nádoba s kontrolou doby zdržení kalu
  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Dodatek 6.2  
Výpočet kinetických konstant  
1. Za p ředpokladu platnosti kinetiky dle Monoda a s p řihlédnutím 
k hmotnostní bilanci aktivní sušiny kalu a substrátu v aktiva čním systému 
(1) lze vyjád řit ustálený stav následujícími rovnicemi:  
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
nebo  
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
kde: 
S 1 = koncentrace substrátu v odtoku (v mg/l)  
K S = půlrychlostní (satura ční) konstanta, koncentrace, p ři které μ = μ m /2 
(mg/l)  
μ = specifická rychlost r ůstu (d  –1 ) 
μ m = maximální hodnota μ m (d –1 ) 
K d = specifická rozkladná konstanta aktivní sušiny kalu (d  –1 ) 
θ S = střední doba zdržení kalu, SRT (d)  
Přezkoumání této rovnice vede k následujícím záv ěrům: 
i) Koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku nezávisí na koncentraci 
zkoušené chemické látky S  0 v přítoku; z tohoto d ůvodu procento 
biologického rozkladu kolísá podle koncentrace zkoušené chemické látky S
 0 v přítoku.  
ii) Jediným technologickým parametrem ovliv ňujícím hodnotu S  1 je doba 
zdržení kalu θ S . 
iii) Pro danou koncentraci zkoušené chemické látky S  0 v přítoku existuje 
kritická doba zdržení kalu, která je popsána rovnicí:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
kde: 
θ SC = kritická doba zdržení kalu; p ři nižší dob ě budou p říslušné orga ­
nismy z čistírny vypláchnuty.  
iv) Vzhledem k tomu, že ostatní parametry v rovnici 2) jsou spojeny 
s kinetikou r ůstu, bude úrove ň substrátu v odtoku pravd ěpodobně 
příznivě ovlivněna teplotou a kritické stá ří biomasy, tj. doba zdržení 
kalu pot řebná k dosažení ur čitého stupn ě rozkladu, se bude 
s poklesem teploty zvyšovat.  
2. Z hmotnostní bilance sušiny kalu v modelu s porézní nádobou a za p ředpo­
kladu nízké koncentrace sušiny kalu X  2 v odtoku z modelu v porovnání ke 
koncentraci sušiny kalu X  1 v aerační nádrži je doba zdržení kalu  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
a 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
kde: 
V = objem aera ční nádrže v litrech  
X 1 = koncentrace sušiny kalu v aera ční nádrži v mg/l  
X 2 = koncentrace sušiny kalu v odtoku v mg/l  
Q 0 = průtok přítoku v litrech za den  
Q 1 = průtok přebytečného kalu v litrech za den.  
Takže dobu zdržení kalu je možné řídit přednastaveným pr ůtokem přebyteč­
ného kalu Q  1 . 
Závěry: 
3. Hlavním ú čelem této zkoušky je tedy p ředpovědět koncentraci zkoušené 
chemické látky v odtoku, a tudíž i v recipientu.  
4. Kritickou dobu zdržení kalu θ SC lze někdy snadno vyhodnotit vynesením S  1 
v závislosti na θ S , například v k řivce 3 na obrázku 1. Pokud tento zp ůsob 
není možný, lze θ SC vypočítat spolu s p řibližnými hodnotami μ m a K  S 
vynesením S  1 v závislosti na sou činu S  1 ·θ S . 
Úpravou rovnice (1) se získá rovnice:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Pokud je hodnota K  d nízká, potom výraz 1 + θ s · K d ~ 1 a rovnice [5] se 
zjednoduší na rovnici:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Vynesením do grafu se získá p římka (viz obrázek 2) se sm ěrnicí 1/μ m 
a úsekem K  S /μ m . Přibližně platí rovn ěž θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Obrázek 1  
Tři teploty; p ět dob zdržení kalu
  
Obrázek 2  
Regresní p římka doby zdržení kalu S  1 jako funkce S  1 (T = 5 °C)
  
Slovníček: 
Koncentrace v odtoku:  
Křivka: ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Dodatek 7  
ZKOUŠKA P ŘI NÍZKÉM ROZMEZÍ KONCENTRACÍ ( μg/l) 
1. Mnohé chemické látky jsou obvykle p řítomny ve vodním prost ředí, a to i v 
odpadních vodách, ve velmi nízkých koncentracích ( μg/l). V takových 
koncentracích pravd ěpodobně neslouží jako primární substráty zajiš ťující 
růst, ale spíše se rozkládají jako „ner ůstové“ sekundární substráty soub ěžně 
s různými přirozeně se vyskytujícími uhlíkatými látkami. V d ůsledku toho 
nelze pro rozklad t ěchto látek použít model popsaný v dodatku 6. Lze 
uplatnit celou řadu model ů a za podmínek p řevažujících v systémech čištění 
odpadních vod m ůže současně fungovat více t ěchto model ů. K objasn ění 
tohoto problému bude zapot řebí dalšího rozsáhlého výzkumu.  
2. Do té doby se lze řídit postupem uvedeným v hlavním textu (kapitola C.10), 
avšak pouze pro primární biologickou rozložitelnost pomocí vhodn ě nízkých 
koncentrací (< 100 μg/l) a validovaných analytických postup ů. Procento 
biologického rozkladu lze vypo čítat (viz odst. 54 zkušební metody) za 
předpokladu, že jsou zohledn ěny abiotické procesy (adsorpce, t ěkavost atd.). 
Příkladem je studie Nyholma a spolupracovník ů (1, 2), která užívá čtyřho­
dinový cyklus v systému pln ění a odběru. Uvedli konstanty pseudoprvního 
řádu u 5 chemických látek p řidávaných do syntetické odpadní vody 
v koncentraci 5 až 100 0 μg/l. (Pro úplnou biologickou rozložitelnost lze 
použít zkoušené chemické látky zna čené izotopem  14 C. Popis tohoto 
postupu p řesahuje rámec této zkušební metody, protože dosud neexistují 
dohodnuté postupy, p řestože metoda navrhovaná pro ISO 14592 (3) obsa ­
huje návod na používání látek zna čených izotopem  14 C. 
Zkouška SCAS  
3. Pozd ěji byla navržena jednodušší dvoustup ňová zkouška; (4, 5, 6); po 
semikontinuální metod ě s aktivovaným kalem (SCAS) jsou provedeny krát ­
kodobé kinetické zkoušky vzork ů odebraných z model ů SCAS. Systém 
SCAS pracuje se známými objemy odtahování kalu (na rozdíl od p ůvodní 
zkušební metody C.12) a p řidává se do n ěj modifikovaná syntetická odpadní 
voda dle OECD nebo splašková odpadní voda. Syntetická odpadní voda 
byla upravena (z d ůvodu změny hodnoty pH a nízké schopnosti usazování 
kalů) přídavkem fosfátu jako pufru, kvasnicového extraktu, chloridu železi ­
tého a solí stopových prvk ů a její CHSK byla zvýšena p řibližně na 750 mg/l 
zvýšením koncentrace peptonu a masového extraktu. Za řízení byla provozo ­
vána ve 24hodinovém cyklu: provzduš ňování po dobu 23 hodin, odtah kalu, 
vypuštění supernatantu (z odtoku) s následným p řídavkem syntetické 
odpadní vody a zkoušené chemické látky, a to až do 100 μg/l, (tj. ve zhruba 
stejné koncentraci jako p ři krátkodobé zkoušce). Jednou týdn ě bylo 10 % 
celkového kalu nahrazeno čerstvým kalem za ú čelem udržení rovnováhy 
mikrobiální populace.  
4. Změří se koncentrace zkoušené chemické látky na za čátku a ke konci 
provzdušňování a zkouška se provádí až do dosažení konstantního odstra ­
nění zkoušené chemické látky, což trvá od jednoho týdne do n ěkolika 
měsíců. 
Krátkodobá zkouška  
5. Krátkodobá zkouška (nap ř. 8 hodin) se používá k ur čení kinetické rychlostní 
konstanty (pseudo) prvního řádu rozkladu zkoušené chemické látky 
v aktivovaném kalu známého, ale r ůzného původu a historie. Vzorky kal ů 
se v průběhu aklimatiza čního experimentu (odstavce 3, 4) odebírají zejména 
z reaktorů SCAS na konci provzduš ňovacího období, kdy je koncentrace 
organického substrátu nízká. Kal m ůže být pro srovnání odebrán také 
z paralelního modelu SCAS, který nebyl vystaven zkoušené látce. Sm ěsi 
kalu a zkoušené chemické látky p řidané ve dvou nebo více koncentracích  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
v rozsahu 1–50 μg/l se provzdušní bez p řídavku syntetické odpadní vody 
nebo jiného organického substrátu. Zkoušené chemické látky zbývající 
v roztoku se stanovují v pravidelných intervalech, nap ř. každou hodinu 
v závislosti na rozložitelnosti dané chemické látky, ne však déle než po dobu 24 hodin. Vzorky se p řed provedením p říslušné analýzy odst ředí.
 
Výpočty 
6. Údaje z model ů SCAS se užívají pro výpo čet procenta úbytku zkoušené 
chemické látky (odstavec 54). Je rovn ěž možné vypo čítat průměrnou rych ­
lostní konstantu K  1 (normalizovanou na koncentraci nerozpušt ěných látek) 
podle vzorce:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
kde: 
t = doba provzduš ňování (23 h),  
C e = koncentrace na konci provzduš ňovacího období v μg/l, 
C i = koncentrace na po čátku provzduš ňování v μg/l, 
SS = koncentrace tuhých látek v aktivovaném kalu v g/l).  
7. V krátkodobé zkoušce se do grafu vynese zbývající koncentrace log % 
v závislosti na čase a sklon po čáteční části křivky (10–50 % rozklad) odpo ­
vídá K  1 , konstant ě (pseudo) prvního řádu. Tato konstanta se normalizuje 
s ohledem na koncentraci sušiny kalu tak, že se sklon k řivky vydělí koncen ­
trací sušiny kalu. Uvedený výsledek musí rovn ěž obsahovat podrobnosti 
o počátečních koncentracích zkoušené chemické látky a nerozpušt ěných 
látek, dob ě zdržení kalu, množství a zdroji zapravovaného kalu 
a podrobnosti p řípadné adaptace za p řítomnosti zkoušené látky.  
Variabilita výsledk ů 
8. Variabilita a další aspekty kinetiky biologického rozkladu byly projedná ­
vány na nedávném workshopu SETAC (7). Z t ěchto vykazovaných 
a plánovaných studií by m ěl vyplynout jasn ější pohled na kinetiku p ůsobící 
v čistírnách odpadních vod, který umožní lepší interpretaci stávajících údaj ů 
a navržení více relevantních podob budoucích zkušebních metod.  
LITERATURA:  
1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz 
B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. 
Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.  
2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.
 
3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evalu ­
ation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations in water.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
 
5) Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.  
6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegra ­
dability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
 
7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. 
King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6  th Sept. 1996. SETAC- Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilmy  
ÚVOD  
1. Simula ční zkoušky se zpravidla užívají u látek, které nevyhov ěly screenin ­
gové zkoušce na snadnou biologickou rozložitelnost (kapitola C.4 A až F této p řílohy (9)), ale vyhov ěly zkoušce biologické rozložitelnosti. 
Výjimečně se simula ční zkoušky použijí také pro chemické látky, 
o kterých je pot řeba zjistit více informací, zejména pro velkotonážní 
chemické látky, a zpravidla se použije zkouška s aktivovaným kalem (C.10 A). V n ěkterých p řípadech je však nutné získat specifické informace 
týkající se chování chemické látky p ři metodách čištění odpadních vod 
využívajících biofilmy; konkrétn ě se jedná o biologické perkola ční nebo 
skrápěné filtry, rota ční ponořené filtry a reaktory se vznášeným ložem. 
Pro splnění této pot řeby byla vyvinuta r ůzná zařízení.
 
2. Gerike  a spolupracovníci  (1) používali velké pilotní skráp ěné filtry v režimu 
spřažení. Tyto filtry zabíraly mnoho místa a vyžadovaly relativn ě velké 
objemy odpadní vody nebo syntetické odpadní vody. Truesdale  a spolupra ­
covníci  (2) popsali menší filtry (o pr ůměru 6 stop × 6 palc ů), ve kterých se 
používala p řírodní odpadní voda bez p říměsi povrchov ě aktivních látek, 
avšak i ty vyžadovaly relativn ě velké objemy. K vytvo ření „zralého“ 
biofilmu bylo zapot řebí až 14 týdn ů a aklimatizace prob ěhla až po dalších 
4–8 týdnech po prvním zavedení zkušební povrchov ě aktivní látky.  
3. Baumann  a spolupracovníci  (3) vyvinuli mnohem menší filtr, který používal 
polyesterové „rouno“ p ředem namo čené v aktivovaném kalu jako inertní 
médium na podporu r ůstu biofilmu. Zkoušená chemická látka byla užita 
jako jediný zdroj uhlíku a biologická rozložitelnost byla hodnocena na 
základě měření rozpušt ěného organického uhlíku (DOC) v p řítoku 
a odtoku a množství CO  2 ve výstupním plynu.  
4. Zcela jiný p řístup použili Gloyna  a spolupracovníci  (4) kteří vynalezli 
rotační trubkový reaktor. Na vnit řním povrchu otá čející se trubky se vytvo řil 
biofilm na známé ploše povrchu p ůsobením p řítoku zavedeného do horního 
konce trubky sklon ěné pod malým úhlem k vodorovné rovin ě. Tento reaktor 
byl použit ke studiu biologické rozložitelnosti povrchov ě aktivních látek (5) 
i ke zkoumání optimální tlouš ťky biofilmu a difuze filmem (6). Uvedení 
posledně jmenovaní auto ři tento reaktor dále vyvíjeli, v četně úpravy 
umožňující stanovit CO  2 ve výstupním plynu.  
5. Rota ční trubkový reaktor byl p řijat stálým výborem analytik ů (Standing 
Committee of Analysts ) (UK) jako standardní metoda stanovení jak 
biologické rozložitelnosti chemických látek (7), tak upravitelnosti 
a toxicity odpadních vod (8). Zde popsaná metoda je výhodná pro svou jednoduchost, kompaktnost, reprodukovatelnost a pot řebu relativn ě malých 
objemů organického média.
 
PODSTATA ZKOUŠKY  
6. Syntetická odpadní voda nebo splašková odpadní voda a zkoušená chemická 
látka se ve sm ěsi nebo samostatn ě aplikují na vnit řní povrch pomalu rotující 
šikmé trubky. Na tomto vnit řním povrchu se vytvo ří vrstva mikroorganism ů 
podobných mikroorganism ům, které se vyskytují na médiích biologického 
filtru. Podmínky pro provoz reaktoru jsou zvoleny tak, aby umož ňovaly 
odpovídající odstran ění organických látek a v p řípadě potřeby i oxidaci 
amonia.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Odpadní vody z trubky se shromaž ďují a před analýzou na rozpušt ěný 
organický uhlík (DOC) a/nebo zkoušenou látku prost řednictvím specifické 
metody se bu ď usazují, a/nebo filtrují. Paraleln ě se za stejných podmínek 
provozují kontrolní za řízení bez zkoušené chemické látky za ú čelem srov ­
nání. Předpokládá se, že rozdíl mezi koncentrací DOC nebo CHSK v odtoku 
ze zkušebního a kontrolního modelu pochází ze zkoušené chemické látky 
nebo jejích organických metabolit ů. Tento rozdíl se porovná s koncentrací 
přidané zkoušené chemické látky (jako DOC) s cílem vypo čítat odstran ění 
zkoušené chemické látky.  
8. Biologický rozklad lze zpravidla rozpoznat podle biologické adsorpce 
pečlivým prozkoumáním časové křivky odstran ění. Potvrzení lze obvykle 
získat pomocí zkoušky snadné rozložitelnosti (spot řeba kyslíku nebo 
produkce oxidu uhli čitého) s použitím aklimatizovaného inokula odebraného 
na konci zkoušky z reaktor ů, do nichž je vpoušt ěna zkoušená chemická 
látka.  
INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
9. Pro správnou interpretaci výsledk ů by měla být známa čistota zkoušené 
chemické látky, její rozpustnost ve vod ě, těkavost a adsorp ční vlastnosti.  
10. U těkavých a t ěžko rozpustných chemických látek nelze zpravidla zkoušku 
provést, pokud nebudou p řijata zvláštní opat ření (viz dodatek 5 ke 
kapitole C.10 A). Pro výpo čet teoretických hodnot a/nebo ov ěření naměře­
ných hodnot parametr ů, např. teoretické spot řeby kyslíku (TSK) 
nebo (DOC), je rovn ěž nutno znát chemickou strukturu nebo alespo ň empi­
rický vzorec.  
11. Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi užite čné 
informace o toxicit ě zkoušené chemické látky v ůči mikroorganism ům (viz 
dodatek 4 ke kapitole C.10 A); tyto informace mohou být d ůležité pro 
správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.  
HODNOTY, P ŘI NICHŽ VÝROBEK VYHOVUJE  
12. Původně musel primární biologický rozklad povrchov ě aktivních látek p řed 
uvedením chemické látky na trh dosáhnout 80 % nebo více. Pokud není 
dosaženo hodnoty 80 %, lze použít tuto simula ční (potvrzující) zkoušku 
a danou povrchov ě aktivní látku uvést na trh pouze za p ředpokladu odstra ­
nění více než 90 % dané chemické látky. Obecn ě se chemické látky nepo ­
suzují z hlediska vyhov ěla/nevyhov ěla a při přibližných výpo čtech pravd ě­
podobné koncentrace v životním prost ředí, které se užívají p ři posuzování 
rizik plynoucích z chemických látek, lze použít získané hodnoty procenta úbytku. V řadě studií čistých chemických látek bylo zjišt ěno procento 
úbytku DOC > 90 % u více než t ří čtvrtin a > 80 % u více než 90 % 
chemických látek, které nevykazují žádný významný stupe ň biologické 
rozložitelnosti.
 
REFEREN ČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY  
13. Aby bylo zajišt ěno správné provedení experimentálního postupu, je vhodné 
provádět občasné zkoušky látek, jejichž chování je známé. Tyto chemické 
látky zahrnují kyselinu adipovou, 2-fenyl fenol, 1-naftol, kyselinu difenovou 
a 1-naftoovou kyselinu.  
REPRODUKOVATELNOST VÝSLEDK Ů ZKOUŠKY  
14. Laborato ř v UK zjistila, že relativní sm ěrodatná odchylka v rámci zkoušek 
činí 3,5 % a mezi jednotlivými testy 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
POPIS METODY  
Přístroje a pom ůcky 
Rotační trubkové reaktory  
15. Zařízení (viz obr. 1 a 2 v dodatku 8) se skládá ze svazku akrylových trubek 
o délce 30,5 cm a vnit řním průměru 5 cm; trubky spo čívají na kolech 
s gumovými pneumatikami zasazených do kovového nosného rámu. Každá trubka má vn ější výčnělek o hloubce p řibližně 0,5 cm, který ji drží 
na kolech; její vnit řní povrch je zdrsn ěn hrubou drát ěnkou a na horním 
(přítočném) konci má 0,5 cm hluboký vnit řní výčnělek, který umož ňuje 
udržení kapaliny. Trubky jsou sklon ěny pod úhlem p řibližně jednoho stupn ě 
k vodorovné rovin ě, aby bylo dosaženo požadované doby kontaktu p ři 
aplikaci zkušebního média do čisté trubky. Kola opat řená gumovými pneu ­
matikami se otá čejí pomocí pomalého motoru s prom ěnnými otá čkami. 
Teplota trubek je řízena instalací do místnosti s konstantní teplotou.
 
16. Uzav řením každého trubkového reaktoru do pon ěkud větší zkrácené trubky 
a zajištěním plynot ěsnosti spoj ů lze plynný CO  2 na výstupu sbírat do zásadi ­
tého roztoku za ú čelem následného m ěření (6).  
17. V zásobníku o objemu 20 l (A) (viz obrázek 2) je uložena 24hodinová 
zásoba organického média pro každou trubku, p řípadně s přidáním zkoušené 
chemické látky. Pokud je to nutné, lze roztok zkoušené chemické látky 
dávkovat odd ěleně. V dolní části každého zásobníku je výstup, který je 
připojen pomocí vhodného potrubí, nap ř. ze silikonového kau čuku, přes 
peristaltické čerpadlo (B) ke sklen ěné nebo akrylové výstupní trubici, 
která v délce 2–4 cm ústí do vyššího (p řítočného) konce naklon ěné 
trubky (C). Odtok se nechá odkapat ze spodního konce naklon ěné trubky 
a je shromaž ďován v jiném zásobníku (D). Odtok se p řed analýzou usazuje 
nebo filtruje.  
Filtrační zařízení – odst ředivka  
18. Přístroj pro membránovou filtraci s filtry vhodné velikosti pór ů (jmenovitý 
průměr pórů 0,45 μm), které co nejmén ě adsorbují organické chemické látky 
nebo uvol ňují organický uhlík. Pokud použité filtry uvol ňují organický 
uhlík, promyjí se pe člivě horkou vodou, aby byl odstran ěn vyluhovatelný 
organický uhlík. Lze použít rovn ěž odstředivku vhodnou pro odst řeďování 
při odstředivém zrychlení 40 000 m/s  2 . 
19. Analyzátor pro stanovení:  
— DOC/celkového organického uhlíku (TOC) nebo chemické spot řeby 
kyslíku (CHSK),  
— podle pot řeby specifické chemické analýzy (HPLC, GC atd.),  
— pH, teploty, kyselosti, zásaditosti,  
— jestliže systém pracuje s nitrifikací, pak vybavení pro stanovení amoni ­
akálního, dusitanového a dusi čnanového dusíku.  
Voda  
20. Vodovodní voda s koncentrací DOC menší než 3 mg/l.  
21. Destilovaná nebo deionizovaná voda s koncentrací DOC menší než 2 mg/l.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Organické médium  
22. Jako organické médium je p řípustná syntetická odpadní voda, splašková 
odpadní voda nebo jejich sm ěs. Bylo prokázáno, že použití samotné splaš ­
kové odpadní vody často vede k v ětšímu procentu odstran ění DOC (v 
zařízeních s aktivovaným kalem), a dokonce umož ňuje odstran ění některých 
chemických látek, které se p ři užití syntetické odpadní vody dle OECD 
biologicky nerozloží. Proto se doporu čuje použití splaškové odpadní vody. 
Koncentrace DOC (nebo CHSK) se stanovuje v každé nové šarži organic ­
kého média. M ěla by být známa kyselost nebo zásaditost organického 
média. Organické médium m ůže vyžadovat p řidání vhodného pufru (hydro ­
genuhličitan sodný nebo dihydrogenfosfore čnan draselný) v p řípadě, že má 
nízkou kyselost nebo zásaditost, s cílem udržet pH v reaktoru v pr ůběhu 
zkoušky na hodnot ě přibližně 7,5 ± 0,5. V každém jednotlivém p řípadě je 
nutno rozhodnout o množství pufru, které má být p řidáno, a dob ě jeho 
přidání.  
Syntetická odpadní voda  
23. V 1 litru vodovodní vody se rozpustí 160 mg peptonu, 110 mg masového 
výtažku, 30 mg mo čoviny, 28 mg bezvodého hydrogenfosfore čnanu drasel ­
ného (K  2 HPO  4 ), 7 mg chloridu sodného (NaCl), 4 mg dihydrátu chloridu 
vápenatého (CaCl  2 .2H  2 O) a 2 mg heptahydrátu síranu ho řečnatého 
(MgSO  4 .7H  2 O). Tato syntetická odpadní voda (OECD médium) je mode ­
lovým p říkladem a vykazuje pr ůměrnou koncentraci DOC v p řítoku 
přibližně 100 mg/l. Další možností je použít jiná složení o p řibližně stejné 
koncentraci DOC, která se více blíží skute čnému složení odpadní vody. 
Tuto syntetickou odpadní vodu lze p řipravit v destilované vod ě 
v koncentrované podob ě a uchovávat p ři teplotě asi 1 °C po dobu až 
jednoho týdne. V p řípadě potřeby lze z ředit vodovodní vodou. (Toto 
médium je nevyhovující, nap ř. koncentrace dusíku je velmi vysoká, obsah 
uhlíku je relativn ě nízký, avšak nebyla navržena žádná lepší varianta krom ě 
přidání dalšího fosfátu jako pufru a více peptonu).  
Splašková odpadní voda  
24. Použije se čerstvá usazená odpadní voda odebíraná každý den z čistírny, 
která zpracovává p řevážně splaškové domovní odpadní vody. Odebírá se 
primární sedimentací z p řepadu čistírny nebo z p řítoku do čistírny pracující 
s aktivovaným kalem a musí z ní být z v ětší části odstran ěny hrubé částice. 
Odpadní voda m ůže být uchovávána po n ěkolik dní p řibližně při 4 °C, 
pokud se prokáže, že hodnota DOC (nebo CHSK) se b ěhem uchovávání 
výrazně nesníží (tj. o více než 20 %). K zamezení poruchového provozu 
systému se p řed použitím upraví DOC (nebo CHSK) u každé nové šarže na 
příslušnou stálou koncentraci, nap ř. zředěním vodovodní vodou.  
Mazivo  
25. Na mazání vále čků peristaltických čerpadel lze použít glycerol nebo olivový 
olej; obojí je vhodné pro použití na potrubí ze silikonové pryže.  
Zásobní roztoky zkoušené chemické látky  
26. U chemických látek s dostate čnou rozpustností se p řipraví zásobní roztok 
zkoušené chemické látky vhodné koncentrace (nap ř. 1 až 5 g/l) 
v deionizované vod ě nebo v minerální složce syntetické odpadní vody. 
U nerozpustných látek viz dodatek 5 v kapitole C.10-A. Tato metoda není 
vhodná pro t ěkavé chemické látky bez úpravy trubkových reaktor ů 
(odstavec 16). V zásobním roztoku se stanoví DOC a TOC a m ěření se 
u každé nové šarže zopakuje. Jestliže je rozdíl mezi DOC a TOC v ětší než 
20 %, ov ěří se rozpustnost zkoušené chemické látky ve vod ě. DOC nebo 
koncentrace zkoušené chemické látky stanovená v zásobním roztoku speci ­
fickou analýzou se porovná se jmenovitou hodnotou, aby se zjistilo, zda  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
analytická výt ěžnost je dostate čná (obvykle lze o čekávat > 90 %). Zhodnotí 
se, zvlášt ě u disperzí, zda DOC m ůže být použit jako analytický ukazatel 
nebo zda lze použít jen analytickou techniku specifickou pro danou zkou ­ 
šenou chemickou látku. Vzorky s disperzí je nutné odst ředit. V každé nové 
šarži se stanoví hodnoty DOC, CHSK nebo zkoušené chemické látky 
pomocí specifické analýzy.  
27. V zásobním roztoku se stanoví hodnota pH. Extrémní hodnoty indikují, že 
přidání chemické látky m ůže ovlivňovat hodnotu pH aktivovaného kalu ve 
zkušebním systému. V takovém p řípadě se zásobní roztok neutralizuje na 
hodnotu pH 7 ± 0,5 malým objemem anorganické kyseliny nebo zásady. Nesmí však dojít k vysrážení zkoušené látky.
 
POSTUP  
Příprava organického média pro dávkování  
28. Je nutné zajistit d ůkladné vy čištění sběrných nádob na p řítok a na odtok 
a trubek vedoucích z nádob na p řítok a do nádob na odtok, aby se zabránilo 
růstu mikroorganism ů na počátku zkoušky i v celém jejím pr ůběhu 
29. Syntetická odpadní voda (bod 23) se p řipravuje každý den čerstvá bu ď ze 
sušiny kalu, nebo z koncentrovaného zásobního roztoku odpovídajícím zředěním vodovodní vodou. Požadované množství se odm ěří ve válci 
a přidá se do čisté nádoby na p řítok. V p řípadě potřeby se do syntetické 
odpadní vody p řed zředěním rovn ěž přidá požadované množství zásobního 
roztoku zkoušené chemické látky nebo referen ční chemické látky. Pokud je 
to výhodn ější nebo nutné, aby se zabránilo ztrátám zkoušené chemické 
látky, připraví se odd ěleně zředěný roztok zkoušené chemické látky 
v oddělené nádrži a p řidá se do naklon ěných trubek prost řednictvím jiného 
dávkovacího čerpadla.
 
30. Lze rovn ěž (a přednostně) použít usazenou splaškovou odpadní vodu 
(odstavec 24), která je získávána čerstvě, pokud možno každý den.  
Provoz rota čních trubkových reaktor ů 
31. Pro posouzení jedné zkoušené chemické látky jsou zapot řebí dva identické 
trubkové reaktory, které se sestaví v místnosti s konstantní teplotou, zpra ­
vidla 22 ± 2 °C.  
32. Peristaltická čerpadla se upraví tak, aby dávkovala do naklon ěných trubek, 
které se otá čejí rychlostí 18 ± 2 ot/min, 250 ± 25 ml/h organického média 
(bez zkoušené chemické látky). Na trubky čerpadel se na po čátku nanese 
mazivo (bod 25) a v pr ůběhu zkoušky se bude pravideln ě nanášet dále 
s cílem zajistit řádné fungování a delší životnost trubek.  
33. Úhel sklonu trubek se nastaví vzhledem k horizontální rovin ě tak, aby se 
zajistila doba zdržení 125 ± 12,5 s p řívodu v čisté trubce. Reten ční čas se 
odhadne p řidáním nebiologického markeru (nap ř. NaCl, inertní barvivo) do 
přiváděného média; za pr ůměrnou dobu zdržení se považuje čas potřebný 
k dosažení maximální koncentrace v odtoku (je-li dosaženo maximální tlou ­ 
šťky filmu, m ůže se reten ční čas zvýšit až na p řibližně 30 min.).  
34. Bylo zjišt ěno, že při tomto pr ůtoku, rychlosti a čase dochází k adekvátnímu 
odstranění (> 80 %) DOC (nebo CHSK) a vzniku nitrifikovaného odtoku. 
Pokud je odstran ění nedostate čné nebo v p řípadě, že je t řeba simulovat 
výkon konkrétní čistírny odpadních vod, bude zapot řebí průtok změnit. 
Ve druhém z t ěchto případů je třeba upravit rychlost dávkování organického 
média, dokud výkon reaktoru nedosáhne stejného výkonu jako čistírna 
odpadních vod.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inokulace  
35. Při použití syntetické odpadní vody m ůže být pro zahájení r ůstu mikroor ­
ganismů dostatečná inokulace vzdušnou cestou, v jiných p řípadech se však 
do přiváděného média po dobu 3 dn ů přidává 1 ml/l odsazené odpadní 
vody.  
Měření 
36. V pravidelných intervalech se kontroluje, zda se rychlost dávkování 
a rychlost rotace pohybují v požadovaných mezích. M ěří se rovn ěž pH 
v odtoku, a to zejména tehdy, pokud se p ředpokládá nitrifikace.  
Odběr vzorků a analýza  
37. Způsob, vzor a četnost odb ěru vzorků jsou vybrány tak, aby vyhovovaly 
účelu zkoušky. Odeberou se nap říklad jednorázové (nebo prosté) vzorky 
přítoku a odtoku, nebo se vzorky shromaž ďují po delší dobu, nap ř. 3–6 
hodin. V prvním období bez zkoušené chemické látky se odb ěr vzorků 
provádí dvakrát týdn ě. Vzorky se filtrují p řes membrány nebo pomocí 
odstředivky p ři odstředivém zrychlení p řibližně 40 000 m/s  2 přibližně 15 
min. (odstavec 18). P řed membránovou filtrací m ůže být nutné nechat 
vzorky usadit a/nebo je p řefiltrovat p řes hrubý filtr. Provedou se nejmén ě 
dvě souběžná stanovení DOC (nebo CHSK) a v p řípadě potřeby i BSK, 
amoniakálního a dusi čnanového/dusitanového dusíku.  
38. Všechny analýzy by m ěly být provedeny co nejd říve po odb ěru a přípravě 
vzorků. Je-li třeba analýzy odložit, musí být vzorky uchovávány p řibližně 
při 4 °C v temnu, ve zcela napln ěných a dob ře uzavřených lahvi čkách. Je-li 
zapotřebí uchovat vzorky déle než 48 h, konzervují se zmrazením, okyse ­
lením nebo p řidáním vhodné toxické chemické látky (nap ř. přídavkem 20 
ml/l roztoku chloridu rtu ťnatého koncentrace 10 g/l). Ov ěří se, zda použitý 
způsob konzervace neovlivní výsledky analýzy.  
Rozběhová fáze  
39. V této fázi povrchový biofilm roste za ú čelem dosažení optimální tlouš ťky; 
tato fáze trvá obvykle asi 2 týdny, avšak nem ěla by být delší než šest týdn ů. 
Odstranění (bod 44), DOC (nebo CHSK) se zvyšuje a dosahuje hodnoty 
fáze prodlevy. Když bylo dosaženo fáze prodlevy p ři obdobné hodnot ě 
v obou trubkách, jedna z nich se vybere jako kontrolní po celý zbytek zkoušky, v jejímž pr ůběhu by měla být její ú činnost konzistentní.
 
Přidání zkoušené chemické látky  
40. V této fázi se zkoušená látka p řidá do druhého reaktoru v požadované 
koncentraci, obvykle 10–20 mg C/l. Do kontrolního reaktoru je i nadále čerpáno pouze organické médium.
 
Období aklimatizace  
41. I nadále se dvakrát týdn ě provádějí analýzy na DOC (nebo CHSK), a pokud 
je potřeba posoudit primární biologickou rozložitelnost, zm ěří se také 
koncentrace zkoušené chemické látky specifickou analýzou. Po prvním přídavku zkoušené chemické látky bývá adaptace dosaženo po 1 týdnu až 
6 týdnech provozu (za zvláštních podmínek i po delší dob ě). Když procento 
úbytku (odstavce 43–45), dosáhne maximální hodnoty, získá se 12–15 plat ­
ných hodnot ve fázi prodlevy po dobu p řibližně 3 týdnů za účelem vyhod ­
nocení pr ůměrného procenta úbytku. Zkouška se považuje za ukon čenou, 
jakmile bylo dosaženo dostate čného stupn ě odstranění. Doba zkoušky po 
prvním p řidání zkoušené chemické látky by obvykle nem ěla překročit 12 
týdnů.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Odlučování filmu  
42. Náhlé odstran ění velkého množství p řebytečného filmu z trubek neboli 
odlučování probíhá v relativn ě pravidelných intervalech. Aby bylo zajišt ěno, 
že nebude ovlivn ěna srovnatelnost výsledk ů, je třeba při zkoušce nechat 
proběhnout alespo ň dva kompletní cykly r ůstu a odlu čování.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Zpracování výsledk ů 
43. Stupe ň odstran ění DOC (nebo CHSK) zkoušené chemické látky 
v procentech se pro každý časový odhad vypo čte podle rovnice:  
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
kde: 
D t = stupeň odstran ění DOC (nebo CHSK) v čase t vyjád řený 
v procentech,  
Cs = koncentrace DOC (nebo CHSK) zkoušené chemické látky v p řítoku, 
přednostně odhadnutá z koncentrace zásobního roztoku a p řidaného 
objemu zkoušené chemické látky v mg/l,  
E = zm ěřená koncentrace DOC nebo CHSK v odtoku ze zkušebního 
modelu v mg/l v čase t,  
Eo = zm ěřená koncentrace DOC nebo CHSK v odtoku z kontrolního 
modelu v mg/l v čase t.  
Výpočet se opakuje pro referen ční chemické látky, pokud jsou p ředmětem 
zkoušky.  
Výkon kontrolního reaktoru  
44. Stupe ň (D  B ) odstran ění DOC (nebo CHSK) organického média 
v kontrolních reaktorech je užite čnou informací k posouzení biodegrada ční 
aktivity biofilmu b ěhem zkoušky. Stupe ň odstranění organického média se 
vypočte podle rovnice:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
kde: 
Cm = koncentrace DOC nebo CHSK organického média v p řítoku do 
kontrolního modelu v mg/l.  
45. Pokud je m ěřen stupeň odstranění zkoušené chemické látky (D  ST ) stanovený 
specifickou analytickou metodou p ři každém hodnocení v čase, vypo čte se 
podle rovnice:  
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
kde: 
Si = zm ěřená nebo p řednostně odhadnutá koncentrace zkoušené 
chemické látky v p řítoku do zkušebního modelu v mg/l,  
Se = zm ěřená koncentrace zkoušené chemické látky v odtoku ze zkušeb ­
ního modelu v mg/l v čase t.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Pokud je na základ ě této analytické metody stanovena pozitivní hodnota 
neexponované odpadní vody odpovídající S  c v mg/l, vypo čte se úbytek 
v procentech (D  SC ) podle rovnice:  
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Vyjadřování výsledk ů zkoušky  
46. Do grafu se vynese stupe ň odstranění D  t a D  ST (nebo D  SC ) vyjádřený 
v procentech, pokud je k dispozici, v závislosti na čase (viz dodatek 2 
v kapitole C.10-A). Vypo čte se pr ůměrná hodnota (zaokrouhlená na 
nejbližší celé číslo) a standardní odchylka 12–15 hodnot pro D  T (a pro 
D ST, jsou-li k dispozici) získaných ve fázi prodlevy a vyjád řených stupn ěm 
odstranění zkoušené chemické látky v procentech. Z tvaru k řivky odstrani ­
telnosti lze vyvodit n ěkteré záv ěry o procesech odstran ění. 
Adsorpce  
47. Je-li hned na po čátku zkoušky pozorován vysoký stupe ň odstranění DOC 
zkoušené chemické látky, je zkoušená látka pravd ěpodobně odstraňována 
adsorpcí na biofilmu. To m ůže být ov ěřitelné určením adsorbované zkou ­ 
šené chemické látky na sušin ě odloučené z filmu. Není obvyklé, aby stupe ň 
odstranění DOC z ůstával vysoký v celém pr ůběhu zkoušky; vysoký stupe ň 
odstranění je zpravidla pozorován na po čátku zkoušky, avšak pak postupn ě 
klesá na rovnovážnou hodnotu. Pokud by ale adsorbovaná zkoušená látka 
byla schopna zp ůsobit aklimatizaci populace mikroorganism ů, stupeň odstra­
nění DOC zkoušené chemické látky by následn ě vzrostl a ve fázi prodlevy 
dosáhl vysoké hodnoty.  
Lagová fáze  
48. Obdobn ě jako u statických metod i p ři řadě screeningových zkoušek musí 
u řady zkoušených chemických látek prob ěhnout lagová fáze d říve, než 
dojde k biologickému rozkladu. V lagové fázi dochází k aklimatizaci nebo adaptaci rozkládajících se baktérií, p řičemž nedochází tém ěř 
k žádnému úbytku zkoušené chemické látky; následn ě dochází 
k počátečnímu růstu těchto bakterií. Tato fáze kon čí a fáze rozkladu 
konvenčně začíná po úbytku p řibližně 10 % po čátečního množství zkoušené 
chemické látky (po zapo čítání případné adsorpce). Lagová fáze je často 
různě dlouhá a špatn ě reprodukovatelná.
 
Fáze prodlevy  
49. Fáze prodlevy k řivky odstranitelnosti p ři kontinuální zkoušce je definována 
jako fáze, v níž dochází k maximálnímu rozkladu. Tato fáze musí trvat 
nejméně 3 týdny a musí z ní vzejít p řibližně 12–15 zm ěřených platných 
hodnot.  
Průměrná hodnota stupn ě odstranění zkoušené chemické látky  
50. Průměrná hodnota se vypo čte z hodnot odstran ění D  t (a D  st , pokud je 
k dispozici) zkoušené chemické látky b ěhem fáze prodlevy. Po zaokrouhlení 
na nejbližší celé číslo (1 %) získáme stupe ň odstranění zkoušené chemické 
látky. Doporu čuje se rovn ěž vypočítat 95 % konfiden ční interval této 
průměrné hodnoty. Podobným zp ůsobem se vypo čte průměrná hodnota 
stupně (D  B ) odstranění organického média v kontrolní nádob ě. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Indikace biologické rozložitelnosti  
51. Jestliže se zkoušená látka výrazn ě neadsorbuje na biofilmu a k řivka odstra ­
nitelnosti vykazuje typický pr ůběh biologického rozkladu s lagovou fází, 
fází rozkladu a fází prodlevy (odstavce 48, 49), lze bezpe čně přisoudit 
změřené odstran ění zkoušené chemické látky jejímu biologickému rozkladu. 
Dojde-li na po čátku zkoušky k velkému odstran ění, nemůže tato simula ční 
zkouška rozlišit biologické a abiotické elimina ční procesy. V takovém 
případě a také v jiných p řípadech, kdy jsou pochybnosti o biologické rozlo ­ 
žitelnosti (nap ř. jestliže dochází ke stripování), se zjiš ťuje adsorpce zkou ­ 
šené chemické látky na vzorcích filmu nebo se provedou další statické (screeningové) zkoušky biologické rozložitelnosti založené na ukazatelích 
jednoznačně indikujících biologické procesy, jako je metoda stanovení 
spotřebou kyslíku (kapitola C.4 této p řílohy D, E a F) (9) nebo zkouška, 
která měří produkci CO
 2 (viz kapitola C.4-C této p řílohy nebo metoda 
Headspace) (10); jako inokulum se použije adaptovaný biofilm 
z příslušného reaktoru.  
52. Pokud bylo zm ěřeno odstra ňování DOC a odstra ňování konkrétní chemické 
látky, signalizují významné procentuální rozdíly (v p řípadě první hodnoty 
jsou nižší než druhé) v odstran ění látek p řítomnost organických mezipro ­
duktů v odtoku, které mohou být obtížn ěji rozložitelné; ty je nutno prozkou ­
mat. 
Platnost výsledk ů zkoušky  
53. Zkouška se považuje za platnou, jestliže je v kontrolním modelu stupe ň 
biologického rozkladu (D  B ) podle DOC (nebo CHSK) po 2 týdnech v ětší 
než 80 % a nebyly pozorovány žádné neobvyklé jevy.  
54. Pokud byla p ředmětem zkoušky snadno biologicky rozložitelná (referen ční) 
látka, měl by být stupe ň biologického rozkladu > 90 % a rozdíl mezi dupli ­
citními hodnotami by nem ěl být větší než 5 %. Pokud nebyla tato dv ě 
kritéria spln ěna, je třeba přezkoumat experimentální postupy a/nebo získat 
splaškovou odpadní vodu z jiného zdroje.  
55. Obdobn ě by se rozdíly mezi hodnotami biologického rozkladu z duplicitních 
modelů (pokud byly použity) pracujících se zkoušenou chemickou látkou 
neměly lišit o více než 5 %. Pokud není toto kritérium spln ěno, ale míra 
úbytku je vysoká, pokra čuje se v analýze po dobu dalších t ří týdnů. Pokud 
je míra úbytku nízká, p řezkoumají se inhibi ční účinky zkoušené chemické 
látky, pokud nejsou známy, a zkouška se opakuje s nižší koncentrací zkou ­ 
šené chemické látky, pokud je to možné.  
Protokol o zkoušce  
56. V protokolu o zkoušce musí být uvedeny tyto údaje:  
Zkoušená látka:  
— údaje nutné k identifikaci,  
— fyzikální povaha a pop řípadě fyzikálně-chemické vlastnosti.  
Zkušební podmínky:  
— jakékoli modifikace zkušebního systému zejména v p řípadě, že jsou 
zkoušce podrobeny nerozpustné nebo t ěkavé chemické látky,  
— typ organického média,  
— podíl a charakter pr ůmyslových odpad ů obsažených v odpadní vod ě, 
jsou-li užívány a jsou-li známy,  
— metoda inokulace,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— obsah – DOC (rozpušt ěného organického uhlíku) a TOC (celkového 
organického uhlíku) v zásobním roztoku zkoušené chemické látky, 
způsob přípravy, jedná-li se o suspenzi, použitá (použité) zkušební 
koncentrace, p řípadné od ůvodnění, pokud se obsah DOC pohybuje 
mimo rozmezí 10–20 mg/l, metoda p řidání, datum prvního p řidání, 
veškeré zm ěny koncentrace,  
— průměrná hydraulická doba zdržení (bez nár ůstu), rychlost otá čení 
trubky; pokud možno p řibližný úhel sklonu,  
— podrobnosti o odlu čování, čas a intenzita,  
— zkušební teplota a rozsah,  
— použité analytické metody.  
Výsledky zkoušky:  
— všechny zm ěřené údaje (DOC, CHSK, specifické analýzy, hodnota pH, 
teplota a dusíkaté látky, pokud je to relevantní),  
— všechny vypo čtené hodnoty D  t (nebo D  tc ), D  B , D  s v tabelované form ě 
a křivky odstranitelnosti,  
— údaje o lagové fázi a fázi prodlevy, doba trvání zkoušky, stupe ň odstra­
nění zkoušené chemické látky, referen ční chemické látky (pokud byla 
předmětem zkoušky) a stupe ň odstran ění organického média (v 
kontrolním modelu) spole čně se statistickými informacemi 
a vyjádřením k biologické rozložitelnosti zkoušené chemické látky 
a platnosti zkoušky,  
— diskuse o výsledcích.  
LITERATURA:  
1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753-758.  
2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.
 
3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. 
Ökotox. 10: 214–220.  
4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling 
filter. JAOCS 43: 92-94.  
6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.  
7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London.  
8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
 
9) Kapitola C.4 této p řílohy, Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti 
A–F.  
10) ISO 14593 (1998). Jakost vod - Hodnocení úplné aerobní biologické rozlo ­ 
žitelnosti organických látek ve vodním prost ředí. Metoda stanovení anorga ­
nického uhlíku v t ěsně uzavřených lahvi čkách.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Dodatek 8  
Obrázek 1  
Rotační trubky
  
Slovníček 
Půdorysný pohled  
Pohled A/B  
Hnací kola  
Volnoběžná kola  
Hnací motor  
Redukční převodovka  
Vnitřní příruba  
Sklopný mechanismus  
Pohon kuželových ozubených kol  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Obrázek 2  
Graf toku
  
A: zásobník  
B: peristaltické čerpadlo  
C: rotační trubka  
D: zásobník na výtok  
DEFINICE:  
Zkoušená látka:  jakákoliv látka nebo sm ěs testovaná pomocí této zkušební 
metody.  
Chemické látky:  „Je třeba poznamenat, že pojem ‚chemická látka‘ je obecn ě 
užíván v dohodách UNCED i v navazujících dokumentech a zahrnuje látky, výrobky, sm ěsi, přípravky nebo jakékoliv jiné termíny, které lze použít ve stáva ­
jících systémech pro ozna čení pokrytí.“
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST  
ZKOUŠKA NA INHIBICI DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU  
1. METODA  
1.1. ÚVOD  
Popsanou metodou se posuzuje vliv zkoušené látky na mikroorga ­
nismy měřením rychlosti jejich dýchání za definovaných podmínek 
v přítomnosti r ůzných koncentrací zkoušené látky.  
Účelem této metody je poskytnout rychlou screeningovou metodu, 
kterou lze ur čit látky, které mohou nep říznivě ovlivnit aerobní 
mikrobiální čistírny vod, a odhadnout vhodné koncentrace zkouše ­
ných látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkou ­ 
škách biologické rozložitelnosti.  
Hlavní zkoušce m ůže předcházet orienta ční zkouška. Poskytne infor ­
mace o rozsahu koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.  
Do plánu zkoušky se za řadí dvě kontroly, jedna na za čátku a druhá 
na konci řady pokus ů. Každá dávka aktivovaného kalu se také 
kontroluje pomocí referen ční látky.  
Tato metoda je nejsnadn ěji použitelná pro látky, které díky své 
rozpustnosti a nízké t ěkavosti zůstávají většinou ve vod ě. 
U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce 
může být nemožné stanovit EC  50 . 
Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxida ční fosforylací, 
mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům.
 
Před provedením zkoušky je užite čné ověřit tyto informace:  
— rozpustnost látky ve vod ě, 
— tlak par,  
— strukturní vzorec,  
— čistota zkoušené látky.  
Doporučení 
Aktivovaný kal m ůže obsahovat potenciáln ě patogenní organismy 
a je třeba s ním zacházet opatrn ě. 
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
Respirační rychlost je spot řeba kyslíku mikroorganismy odpadních 
vod v aerobním kalu obecn ě vyjádřená v mg O  2 na 1 mg kalu za 
hodinu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky p ři určité koncentraci 
se respira ční rychlost vyjad řuje v procentech pr ůměrné hodnoty dvou 
kontrolních respira čních rychlostí: 
Í 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Î 
Ü 100 ¼ % inhibice  
kde: 
R s = rychlost spot řeby kyslíku p ři použité koncentraci zkoušené 
látky,  
R c1 = rychlost spot řeby kyslíku v kontrole 1,  
R c2 = rychlost spot řeby kyslíku v kontrole 2,  
EC 50 je v této zkoušce koncentrace zkoušené látky, p ři které činí 
respirační rychlost 50 % hodnoty vycházející z kontroly za podmínek 
popsaných v této metod ě. 
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Jako referen ční látka se doporu čuje známý inhibitor dýchání 3,5- 
dichlorfenol, kterým by m ělo být prost řednictvím ov ěření EC  50 
u každé dávky aktivovaného kalu zkontrolováno, že kal není mimo ­ 
řádně citlivý.  
1.4. PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY  
Respirační rychlost aktivovaného kalu vyživovaného standardním 
množstvím syntetické odpadní vody se m ěří po dob ě kontaktu 
30 minut nebo 3 hodiny, pop řípadě v obou časech. M ěří se také 
respirační rychlost téhož aktivovaného kalu v p řítomnosti r ůzných 
koncentrací zkoušené látky za jinak stejných podmínek. Inhibi ční 
účinek zkoušené látky p ři určité koncentraci se vyjád ří 
v procentech pr ůměrné respira ční rychlosti ze dvou kontrol. Hodnota 
EC 50 se vypočte ze stanovení p ři různých koncentracích.  
1.5. KRITÉRIA JAKOSTI  
Výsledky zkoušky jsou platné, jestliže  
— se respira ční rychlosti dvou kontrolních pokus ů od sebe liší 
nejvýše o 15 %,  
— EC  50 (pro 30 minut a/nebo pro 3 hodiny) 3,5 dichlorfenolu leží 
v přijatelném rozmezí 5–30 mg/l.  
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1.  Činidla  
1.6.1.1. R o z t o k y z k o u š e n é l á t k y  
Roztoky zkoušené látky se p řipraví čerstvé na za čátku studie 
s použitím zásobního roztoku. Postupuje-li se níže popsaným postu ­
pem, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g/l.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. R o z t o k k o n t r o l n í l á t k y  
Roztok 3,5-dichlorfenolu lze p řipravit nap říklad rozpušt ěním 0,5 
g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, z ředěním na p řibližně 
30 ml destilovanou vodou, za míchání p řidáním 0,5M H  2 SO 4 do 
začínajícího srážení – bude pot řeba asi 8 ml 0,5M H  2 SO 4 – 
konečným dopln ěním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí 
být poté 7 až 8.  
1.6.1.3. S y n t e t i c k á o d p a d n í v o d a  
Syntetická odpadní voda se p řipraví rozpušt ěním následujícího 
množství látek v 1 litru vody:  
— 16 g peptonu,  
— 11 g masového extraktu,  
— 3 g mo čoviny,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 ·2H 2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 ·7H 2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncen ­
traci oproti vod ě popsané v technické zpráv ě OECD „Návrh metody 
stanovení biologické rozložitelnosti povrchov ě aktivních látek použí ­
vaných v syntetických detergentech“ (11. června 1976), s p řídavkem 
hydrogenfosfore čnanu draselného.  
Poznámka 2: Nepoužije-li se p řipravené médium ihned, p řechovává 
se v temnu p ři 0–4  o C ne déle než jeden týden za podmínek, které 
nezpůsobují žádné zm ěny v jeho složení. Médium m ůže být před 
uschováním sterilizováno, nebo je možné pepton a masový extrakt 
přidat krátce p řed provedením zkoušky. P řed použitím je nutné 
médium d ůkladně promíchat a upravit pH.  
1.6.2.  Přístroje a pom ůcky 
Měřicí aparatura: P řesná konstrukce není podstatná. Musí však mít 
volný prostor nad kapalinou a sonda musí p řesně zapadat do hrdla 
odměrné baňky. 
Kromě běžného laboratorního vybavení jsou nezbytné zejména tyto 
přístroje:  
— měřicí přístroje,  
— provzduš ňovací zařízení,  
— pH-metr s elektrodou,  
— kyslíková elektroda.  
1.6.3.  Příprava inokula  
Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá aktivovaný kal 
z čistírny odpadních vod čistící převážně odpadní vody 
z domácností.  
Je-li to nutné, je možné p ři dodání kalu do laborato ře odstranit hrubé 
částice krátkodobým usazením (nap ř. 15 minut) a dekantovat horní 
vrstvu jemn ějších pevných částic pro použití. Alternativn ě je možné 
kal několik sekund promíchávat.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Pokud se krom ě toho předpokládá, že je p řítomna látka s inhibi čním 
účinkem, promyje se kal vodovodní vodou nebo isotonickým rozto ­
kem. Po centrifugaci se supernatant dekantuje (tento postup se opakuje t řikrát).
 
Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné 
vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve 
vodě, aby se získal aktivovaný kal v oblasti koncentrací suspendo ­
vaných pevných látek ve sm ěsné kapalin ě mezi 2 a 4 g/l. Dodrží-li 
se níže doporu čený postup získá se zkušební médium s koncentrací 
kalu 0,8 až 1,6 g/l.  
Není-li možné kal použít v den, kdy byl odebrán, p řidá se ke 
každému litru aktivovaného kalu p řipraveného tak, jak je popsáno 
výše, 50 ml syntetické odpadní vody, kal se poté provzduš ňuje přes 
noc při 20 ± 2  o C. Poté se b ěhem dne za provzduš ňování udržuje až 
do použití. P řed použitím se zkontroluje pH, a je-li t řeba, upraví se 
na 6–8. Obsah suspendovaných pevných látek ve sm ěsné kapalin ě se 
stanoví zp ůsobem popsaným v p ředchozím odstavci.  
Je-li třeba v následující dny použít stejné dávky kalu (nejvýše po 
čtyři dny), přidá se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml 
syntetické odpadní vody na litr kalu.  
1.6.4.  Provedení zkoušky  
Trvání/doba kontaktu: 30 minut a/nebo 3 hodiny, b ěhem 
kterých probíhá provzduš ňování 
Voda: Pitná voda (v p řípadě potřeby zbavená 
chlóru) 
Přívod vzduchu: Čistý vzduch, prostý oleje. Pr ůtok 
0,5–1 l/min 
Měřicí aparatura: Ba ňka s plochým dnem, jaká se 
používá pro stanovení BSK 
Oxymetr: Vhodná kyslíková elektroda se zapiso ­
vačem 
Živný roztok: Syntetická odpadní voda (viz výše) 
Zkoušená látka Roztok zkoušené látky se p řipraví 
čerstvý na za čátku zkoušky 
Referenční látka: Nap ř. 3,5-dichlorfenol (nejmén ě tři 
koncentrace) 
Kontrola: Nao čkovaný vzorek bez zkoušené látky 
Teplota: 20 ± 2  o C 
Níže je uveden navržený experimentální postup, který je možné 
použít pro dobu kontaktu t ři hodiny jak pro zkoušenou, tak pro 
referenční látku:  
Použije se n ěkolik nádob (nap ř. kádinek na jeden litr).  
Použije se alespo ň pět koncentrací lišících se konstantním faktorem 
pokud možno nep řevyšujícím hodnotu 3,2.  
V čase „0“ se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 
300 ml. P řidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná sm ěs 
(500 ml) se p řevede do první nádoby (první kontrola C  1 ). ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Zkušební nádoby je nutno nep řetržitě provzduš ňovat, aby bylo 
zaručeno, že koncentrace rozpušt ěného kyslíku neklesne pod 2,5 
mg/l, a aby t ěsně před měřením respira ční rychlosti byla koncentrace 
kyslíku p řibližně 6,5 mg/l.  
V čase „15 minut“ (15 minut je libovoln ě zvolený, avšak vhodný 
interval) se opakuje tentýž postup, který se liší pouze tím, že se k 16 ml syntetické odpadní vody p řidá 100 ml zásobního roztoku 
zkoušené látky p řed doplněním vodou na 300 ml a p řidáním mikro ­
biálního inokula na celkový objem 500 ml. Tato sm ěs se poté 
převede do druhé nádoby a provzduš ňuje se, jak bylo popsáno 
výše. Tento postup se opakuje v 15minutových intervalech 
s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá 
řada nádob obsahujících r ůzné koncentrace zkoušené látky. Nakonec 
se připraví druhá kontrola (C
 2 ). 
Po třech hodinách se zaznamená pH, dob ře promíchaný vzorek 
obsahu první nádoby se p řevede do m ěřicí aparatury a v dob ě do 
10 minut se zm ěří respirační rychlost.  
Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových inter ­
valech tak, že doba kontaktu v každé nádob ě je tři hodiny.  
Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula 
týmž způsobem.  
Mají-li se m ěření provád ět po 30 minutách kontaktu, je t řeba použít 
jiný režim (nap ř. použití více než jednoho oxymetru).  
Je-li požadováno m ěření chemické spot řeby kyslíku, p řipraví se další 
nádoby obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, avšak žádný aktivovaný kal. Spot řeba kyslíku se 
změří a zaznamená po dob ě provzduš ňování 30 minut a/nebo t ři 
hodiny (doba kontaktu).
 
2. ÚDAJE A VYHODNOCENÍ  
Respirační rychlost se vypo čte ze záznamu zapisova če mezi koncent ­
racemi O2 p řibližně 6,5 mg/l a 2,5 mg/l, nebo za období deseti 
minut, je-li respira ční rychlost nízká. Úsek respira ční křivky, ze 
které se vyhodnocuje respira ční rychlost, musí být lineární.  
Jestliže se respira ční rychlosti v obou kontrolách od sebe liší o více 
než 15 % nebo EC  50 referenční látky (za 30 min a/nebo t ři hodiny) 
neleží v p řijatelném rozmezí (5–30 mg/l pro 3,5-dichlorfenol), je 
zkouška neplatná a musí se opakovat.  
Pro každou zkoušenou koncentraci (viz bod 1.2) se vypo čte inhibice 
v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci do semilogaritmic ­
kého (nebo logaritmicko-probitového) papíru a ode čte se hodnota 
EC 50 . 
Standardními postupy lze stanovit pro hodnoty EC  50 95 % interval 
spolehlivosti.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. ZPRÁVY  
3.1. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— zkoušená látka chemické identifika ční údaje,  
— systém použitý p ři zkoušce: zdroj, koncentrace a veškerá p řed­
běžná úprava aktivovaného kalu,  
— zkušební podmínky:  
— pH reak ční směsi před měřením respirace,  
— zkušební teplota,  
— doba trvání zkoušky,  
— referen ční látka a její zm ěřená hodnota EC  50 , 
— abiotická spot řeba kyslíku (pokud k ní dochází).  
— výsledky:  
— všechny nam ěřené hodnoty,  
— křivka inhibice a metoda výpo čtu EC  50 , 
— EC  50 a podle možnosti 95 % interval spolehlivosti, EC  20 
a EC  80 , 
— veškerá pozorování a veškeré odchylky od této zkušební 
metody, které mohly ovlivnit výsledek.  
3.2. INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Hodnotu EC  50 je třeba považovat pouze za orienta ční hodnotu prav ­
děpodobné toxicity zkoušené látky bu ď při zpracování odpadních 
vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganismy v odpadních 
vodách, protože složité interakce, ke kterým dochází v životním prostředí, nelze p řesně simulovat laboratorní zkouškou. Krom ě 
toho zkoušené látky, které mohou mít inhibi ční účinky na oxidaci 
amoniaku, mohou také zp ůsobovat atypické inhibi ční křivky. Proto 
je nutné interpretovat tyto k řivky opatrn ě.
 
4. LITERATURA  
1) Norma ISO 8192-1986.  
2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165.  
3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 
245. 
4) ETAD (Ecological and Tox.icological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, také 
popsáno v:  
5) Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, str. 80.  
6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247.  
7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, rozhodnutí Rady C(84) 
30 v kone čném znění. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST  
MODIFIKOVANÁ ZKOUŠKA SCAS  
1. METODA  
1.1. ÚVOD  
Účelem této metody je hodnocení potenciální úplné biologické rozlo ­ 
žitelnosti net ěkavých organických látek rozpustných ve vod ě, jsou-li 
po dlouhou dobu vystaveny pom ěrně vysokým koncentracím mikro ­
organismů. Životaschopnost mikroorganism ů se udržuje po tuto dobu 
denními p řídavky živin z usazené odpadní vody. (Pro pot řebu během 
víkendů lze odpadní vodu p řechovávat p ři 4 o C. Lze rovn ěž použít 
syntetickou odpadní vodu podle potvrzující zkoušky OECD.)  
Při interpretaci výsledk ů (viz bod 3.2) je t řeba vzít v úvahu, že m ůže 
docházet k fyzikáln ě-chemické adsorpci na suspendovaných pevných 
látkách.  
V důsledku dlouhé doby zdržení kapalné fáze (36 hodin) 
a průběžného přidávání živin nesimuluje zkouška podmínky existu ­
jící v čistírně odpadních vod. Výsledky získané p ři pokusech 
s různými zkoušenými látkami ukazují, že zkouška má vysoký 
potenciál biologického rozkladu.  
Podmínky, za nichž probíhá zkouška, jsou vysoce p říznivé pro výb ěr 
a/nebo adaptaci mikroorganism ů schopných rozkládat zkoušenou 
látku. (Postup je možné použít také k získávání aklimatizovaných inokul, pro použití v jiných zkouškách.)
 
V této metod ě se úplná biologická rozložitelnost zkoušené látky 
posuzuje podle míry rozpušt ěného organického uhlíku. Spíše než 
z rozdílu C  celk – C  anorg se doporu čuje stanovovat DOC po okyselení 
a přečistění. 
Současným použitím specifické analytické metody m ůže být stano ­
vena také primární biologická rozložitelnost látky (úbytek výchozí 
chemické látky).  
Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které 
mají při koncentracích použitých ve zkoušce tyto vlastnosti:  
— jsou rozpustné ve vod ě (nejméně 20 mg rozpušt ěného organic ­
kého uhlíku na litr),  
— mají zanedbatelný tlak par,  
— neinhibují bakterie,  
— nejsou ve zkušebním systému významn ě adsorbovány,  
— pěněním nedochází ve zkoušeném roztoku ke ztrátám.  
Musí být stanoven obsah organického uhlíku ve zkoušené látce.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Při interpretaci získaných výsledk ů budou užite čné informace 
o relativním podílu hlavních složek zkušebního materiálu, zejména 
pokud jsou stanovené hodnoty biologické rozložitelnosti nízké nebo marginální.
 
Informace o toxicit ě zkoušené látky pro mikroorganismy jsou d ůle­ 
žité rovněž pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti 
a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky.  
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
C T = koncentrace zkoušené látky na za čátku provzduš ňovacího 
cyklu, vyjád řená jako množství organického uhlíku p řítom­
ného nebo p řidaného k usazené odpadní vod ě (mg/l),  
C t = koncentrace rozpušt ěného organického uhlíku zjišt ěná 
v supernatantu zkušebního roztoku na konci provzduš ňova­
cího cyklu (mg/l),  
C c = koncentrace rozpušt ěného organického uhlíku zjišt ěná 
v supernatantu zkušebního roztoku na konci provzduš ňova­
cího cyklu (mg/l).  
Biologický rozklad je v této metod ě definován jako úbytek organic ­
kého uhlíku. Biologický rozklad lze vyjád řit jako:  
1. Procentuální úbytek D  da množství denn ě přidávané látky:  
D da ¼ C T Ä ðC t Ä C c Þ 
C T Ü 100  
[1] 
kde 
D da = rozklad/denní p řídavek.  
2. Procentuální úbytek D  ssd množství látky p řítomné na za čátku 
každého dne:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2(a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2(b)]  
kde: 
D ssd = rozklad/množství látky na za čátku dne,  
indexy i a (i + 1) se vztahují ke dni m ěření. 
Rovnice 2(a) se doporu čuje, jestliže se DOC ve výtokové vod ě ze 
dne na den m ění, zatímco rovnici 2(b) lze použít v p řípadě, že 
DOC zůstává ve výtokové vod ě ze dne na den relativn ě 
konstantní.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
V některých p řípadech mohou být p ři posuzování nových látek 
využity referen ční látky; zatím však nelze doporu čit žádné specifické 
referenční látky.  
V doplňku 1 jsou uvedeny údaje k n ěkolika slou čeninám vyhodno ­
ceným v okružních testech; jsou ur čeny především pro pot řebu 
občasné kalibrace metody a dále umožní srovnání výsledk ů získa­
ných jinými metodami.  
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Aktivovaný kal z čistírny odpadních vod se vpraví do semikontinu ­
ální jednotky pro aktivovaný kal (SCAS, semi-continuous activated 
sludge unit). P řidá se zkoušená látka a usazená odpadní voda 
z domácností a sm ěs se 23 hodin provzduš ňuje. Provzduš ňování se 
poté ukon čí, kal se nechá usadit a supernatant se odstraní.  
Zbývající kal v provzduš ňovací komo ře se pak smísí s další alikvotní 
části zkoušené látky a odpadní vody a cyklus se opakuje.  
Biologický rozklad se ur čí stanovením obsahu rozpušt ěného organic ­
kého uhlíku v supernatantu. Tato hodnota se porovná s hodnotou 
zjištěnou pro supernatant z kontrolní nádoby, do které byla p řidána 
pouze usazená odpadní voda.  
Při použití specifické analytické metody se m ěří změny koncentrací 
původní molekuly látky zp ůsobené biologickým rozkladem (míra 
primární biologické rozložitelnosti).  
1.5. KRITÉRIA JAKOSTI  
Reprodukovatelnost této metody založené na úbytku rozpušt ěného 
organického uhlíku dosud nebyla stanovena. (Pokud jde o primární biologický rozklad, dosahuje se velmi p řesných hodnot pro látky, 
které dosahují vysokého stupn ě rozkladu.)
 
Citlivost metody je ve velké mí ře dána kolísáním slepého pokusu a v 
menší mí ře přesností stanovení rozpušt ěného organického uhlíku 
a obsahem zkoušené látky v kapalin ě na začátku každého cyklu.  
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU  
1.6.1.  Příprava  
Pro každou zkoušenou látku a pro kontrolní zkoušky se sestaví 
dostatečný počet čistých provzduš ňovacích jednotek, pop řípadě je 
možné použít originální zkušební jednotku SCAS o obsahu 1,5 l, 
a trubice pro p řívod vzduchu (obrázek 1). Stla čený vzduch p řiváděný 
do zkušebních jednotek, p řečištěný vatovým filtrem, nesmí obsa ­
hovat organický uhlík a musí být p ředem nasycen vodou, aby se 
snížily ztráty vypa řováním.  
Vzorek kapaliny s aktivovaným kalem obsahující 1–4 
g suspendovaných pevných látek v 1 litru se získá z čistírny pracující 
s aktivovaným kalem, čistící převážně odpadní vody z domácností. 
Pro každou provzduš ňovací jednotku je pot řeba přibližně 150 ml 
kapaliny s aktivovaným kalem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Zásobní roztoky zkoušené látky se p řipravují s použitím destilované 
vody; obvykle se požaduje koncentrace 400 mg organického uhlíku 
na litr, aby se nastavila na za čátku každého cyklu provzduš ňování 
koncentrace zkoušené látky 20 mg uhlíku na litr, nedochází-li k biologickému rozkladu.
 
Umožňuje-li to toxicita pro mikroorganismy, jsou p řípustné vyšší 
koncentrace.  
Změří se obsah organického uhlíku zásobních roztok ů. 
1.6.2.  Zkušební podmínky  
Zkouška se provádí p ři 20–25  o C. 
Použije se vysoká koncentrace aerobních mikroorganism ů (1–4 g na 
litr suspendovaných látek) a efektivní doba zdržení je 36 hodin. 
Uhlíkaté látky v p řiváděné odpadní vod ě se ve velké mí ře oxidují, 
obvykle b ěhem osmi hodin po za čátku každého cyklu provzduš ňo­
vání. Poté kal po zbytek provzduš ňovacího cyklu endogenn ě dýchá 
a v této dob ě je jediným dostupným substrátem zkoušená slou čenina, 
pokud se také rychle nerozloží. Tyto skute čnosti spolu s denním 
opakovaným o čkováním, používá-li se jako médium odpadní voda 
z domácnosti, vytvá řejí vysoce p říznivé podmínky jak pro aklimati ­
zaci, tak pro vysoký stupe ň rozkladu.  
1.6.3.  Provedení zkoušky  
Odebere se vzorek kapaliny s aktivovaným kalem z vhodné čistírny 
pracující s aktivovaným kalem a čistící převážně odpadní vody 
z domácností nebo vzorek kapaliny z laboratorní jednotky a udržuje se v aerobních podmínkách až do použití v laborato ři. 
Každá provzduš ňovací i kontrolní jednotka se naplní 150 ml kapa ­
liny s aktivovaným kalem (používá-li se originální jednotka pro zkoušku SCAS, je t řeba uvedené objemy násobit 10) a zahájí se 
provzdušňování. Po 23 hodinách se provzduš ňování ukon čí a kal 
se nechá 45 minut usazovat. Postupn ě se otevřou kohouty všech 
nádob a odeberou se 100ml podíly supernatantu. Ke zbývajícímu kalu v každé provzduš ňovací jednotce se p řidá 100 ml usazené 
odpadní vody z domácností získané bezprost ředně před použitím. 
Opět se zahájí provzduš ňování. V této etap ě se nepřidávají žádné 
zkoušené látky a do jednotek se denn ě přidává pouze odpadní voda 
z domácnosti do té doby, dokud není voda po usazení čirá. To trvá 
obvykle až dva týdny, b ěhem nichž se obsah rozpušt ěného organic ­
kého uhlíku v supernatantu na konci každého provzduš ňovacího 
cyklu přiblíží konstantní hodnot ě.
 
Na konci této fáze se jednotlivé usazené kaly smísí a do každé 
jednotky se vpraví 50 ml výsledného sm ěsného kalu.  
Do kontrolních jednotek se p řidá 95 ml usazené odpadní vody 
a 5 ml vody a do zkušebních jednotek se p řidá 95 ml usazené 
odpadní vody a 5 ml p říslušného zásobního roztoku zkoušené 
látky (400 mg/l). Znovu se zahájí provzduš ňování a pokra čuje se 
v něm 23 hodin. Kal se poté nechá 45 minut usazovat, odebere se 
supernatant a analyzuje se na obsah rozpušt ěného organického 
uhlíku.  
Výše uvedený postup pln ění a odběru se opakuje v pr ůběhu zkoušky 
denně. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Před usazováním m ůže být nezbytné o čistit stěny jednotek, aby se 
předešlo hromad ění pevných látek nad hladinou kapaliny. Pro 
každou jednotku se použije samostatná st ěrka nebo kartá č, aby 
nedošlo ke vzájemné kontaminaci.  
V ideálním p řípadě se rozpušt ěný organický uhlík stanoví 
v supernatantu denn ě, ale připouštějí se i mén ě časté analýzy. P řed 
analýzou se kapaliny zfiltrují p řes promyté membránové filtry 
o velikosti pór ů 0,45 μm nebo se odst ředí. Vhodný membránový 
filtr nesmí uvol ňovat uhlík a p ři filtraci nesmí adsorbovat zkoušenou 
látku. Teplota vzorku po dobu, kdy je v odst ředivce, nesmí p řesáh­
nout 40  o C. 
Délka zkoušky u látek, u nichž dochází k malému biologickému 
rozkladu nebo se nerozkládají v ůbec, není stanovena, ale na základ ě 
zkušenosti lze doporu čit, aby trvala nejmén ě 12 týdnů, ne avšak déle 
než 26 týdn ů. 
2. ÚDAJE A VYHODNOCENÍ  
Hodnoty koncentrace rozpušt ěného organického uhlíku 
v supernatantu ve zkušebních jednotkách a v kontrolních jednotkách se vynesou do grafu proti času.
 
Po skončení biologického rozkladu by se koncentrace zjišt ěná ve 
zkušební jednotce m ěla blížit hodnot ě v kontrolní jednotce. Jakmile 
se ve třech po sob ě následujících m ěřeních zjistí, že rozdíl mezi 
oběma hladinami je konstantní, provede se takový po čet dalších 
měření, který je posta čující pro statistické vyhodnocení výsledk ů, 
a vypočte se procentuální hodnota biologického rozkladu zkoušené 
látky (D  da nebo D  ssd , viz bod 1.2).  
3. ZPRÁVY  
3.1. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí pokud možno obsahovat tyto údaje:  
— veškeré informace o druhu odpadní vody, typu použité jednotky 
a o experimentálních výsledcích týkajících se zkoušené látky, referenční látky (pokud byla použita) a slepého pokusu,
 
— teplota,  
— křivka úbytku s popisem, zp ůsob výpo čtu (viz bod 1.2),  
— datum a lokalita, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní 
voda, stav adaptace, koncentrace atd.,  
— vědecké důvody pro jakékoli zm ěny ve zkušebním postupu,  
— podpis a datum.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Protože látky, které mají být zkoušené touto metodou, nejsou snadno 
biologicky rozložitelné, bude obvykle jakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v d ůsledku biologického rozkladu, rozložený 
do dnů nebo týdn ů, s výjimkou p řípadů, kdy je aklimatizace náhlá, 
což se projeví náhlým vymizením zkoušené látky po n ěkolika 
týdnech.
 
Někdy však m ůže hrát významnou úlohu fyzikáln ě-chemická 
adsorpce, která se projeví úplným nebo částečným úbytkem p řida­
ného DOC na za čátku. Další vývoj závisí na faktorech, jako jsou 
míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepoužité výtokové vod ě. Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC 
v supernatantech u kontrol a u zkušebních jednotek postupn ě vzrůstá 
z počáteční nízké hodnoty a tento rozdíl poté z ůstává na nové 
hodnotě po zbytek experimentu, pokud nedojde k aklimatizaci.
 
Má-li se rozlišit biologická rozložitelnost (nebo částečná biologická 
rozložitelnost) od adsorpce, je t řeba provést další zkoušky. To lze 
provést n ěkolika zp ůsoby, nejsprávn ější je však použít supernatant 
nebo kal jako inokulum v n ěkteré základní zkoušce (nejlépe ve 
zkoušce respirometrií).  
Zkoušené látky, které vykazují v této zkoušce velký úbytek DOC, 
lze pokládat za potenciáln ě biologicky rozložitelné. Částečný, nead­
sorpční úbytek znamená, že látka je alespo ň částečně biologicky 
rozložitelná.  
Nízký nebo nulový úbytek DOC m ůže být zp ůsoben inhibicí mikro ­
organismů zkoušenou látkou, která se m ůže projevovat rozpušt ěním 
nebo úbytkem kalu nebo zákalem supernatantu. V takových p řípa­
dech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.  
Vyšší citlivosti m ůže být dosaženo specifickými analytickými meto ­
dami nebo použitím látek zna čených  14 C. Při použití zkoušené látky 
značené 14 C bude probíhající rozklad zkoušené látky potvrzen 
vývinem  14 CO 2 . 
Pokud se výsledek udává jako primární biologická rozložitelnost, 
měly by být podle možnosti uvedeny zm ěny v chemické struktu ře, 
které způsobily, že se snížil signál výchozí zkoušené látky.  
Musí být popsána vhodnost analytické metody a výsledky stanovení 
ve slepém živném médiu.  
4. LITERATURA  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, rozhodnutí Rady 
C(81) 30 v kone čném znění. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Doplněk 1 
Zkouška SCAS: p říklad výsledk ů 
Látka C T 
(mg/l) C t –C c 
(mg/l) Procento 
biologického 
rozkladu 
D da Délka zkoušky 
(dny)  
4-acetamidobenzen-1-sulfonát 17,2 2,0 85 40 
4-dodecylbenzen-1-sulfonát 17,3 8,4 51,4 40 4nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 diethylenglykol 16,5 0,2 98,8 40 anilin 16,9 1,7 95,9 40 cyklopentantetrakarboxylát 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Doplněk 2 
Příklad zkušební aparatury
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOAKUMULACE: PR ŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH  
1. METODA  
Tato bioakumula ční metoda je replikou metody OECD TG 305 
(1996).  
1.1. ÚVOD  
V této metod ě je popsán postup pro charakterizaci schopnosti látek 
bioakumulovat se v rybách za pr ůtokových podmínek. A čkoliv jsou 
průtokové režimy preferovány, p řipouštějí se i semistatické režimy, 
jsou-li spln ěna kritéria validace.  
V metodě jsou dostate čně popsány podrobnosti pro provedení zkou ­ 
šky, přičemž je poskytnuta dostate čná volnost pro p řizpůsobení 
experimentálního uspo řádání podmínkám v jednotlivých laborato řích 
a různým vlastnostem zkoušených látek. Metoda je nejefektivn ější 
pro stabilní organické chemikálie s hodnotou log P  ow od 1,5 do 
6,0 (1), ale m ůže být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou 
log P  ow > 6,0). P ředběžně odhadnutý bioakumula ční faktor (BCF), 
někdy označovaný jako K  B bude pro takové superlipofilní látky prav ­
děpodobně vyšší než hodnota bioakumula čního faktoru v ustáleném 
stavu (BCF  US ), která je o čekávána z laboratorních experiment ů. 
Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log P  ow až asi 
9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina at al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumula ční potenciál, pat ří rychlostní 
konstanta p říjmu (k
 2 ), rychlostní konstanta vylu čování (k  1 ) a BCF  US . 
Izotopově značené zkoušené látky mohou usnadnit analýzu vzork ů 
vody a ryb a mohou být použity v p řípadě, že by m ěla být 
provedena identifikace a kvantifikace produkt ů rozkladu. M ěří-li se 
celkový obsah radioaktivního zbytku (nap říklad po spálení nebo 
solubilizaci tkán ě), je hodnota BCF založena na výchozí slou čenině, 
všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. 
Hodnoty BCF založené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku 
tedy nemohou být p římo srovnatelné s hodnotou BCF získanou 
specifickou chemickou analýzou pouze výchozí slou čeniny.  
V izotopových studiích mohou být pro stanovení BCF výchozí slou ­ 
čeniny zařazeny čisticí postupy, a je-li to považováno za nezbytné, 
mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovn ěž 
kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou 
a identifikací zbytk ů v tkáních.  
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
Biokoncentrace/bioakumulace je nár ůst koncentrace zkoušené látky 
v organismu (v jeho specifikované tkáni) nebo na n ěm vzhledem ke 
koncentraci zkoušené látky v okolním médiu.  
Bioakumula ční faktor (BCF or K  B ) je koncentrace zkoušené látky 
v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (C  r as 
μg/g (ppm)) d ělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (C  w as 
μg/ml (ppm)), a to kdykoliv ve fázi p říjmu při této zkoušce.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Bioakumula ční faktor v ustáleném stavu (BCF  US nebo K  B ) se po 
dlouhou dobu výrazn ě nemění; koncentrace zkoušené látky 
v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.  
Plató nebo ustálený stav je stav dosažený tehdy, je-li p ři grafickém 
znázornění křivka časové závislosti koncentrace zkoušené látky 
v rybách (C  r ) rovnob ěžná s časovou osou a t ři po sob ě jdoucí 
analýzy C  r vzorků odebraných v intervalech alespo ň dvou dn ů se 
neliší více než o ± 20 % a není-li mezi t ěmito třemi dobami odb ěru 
žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se spojené vzorky, požadují se 
čtyři po sobě jdoucí analýzy. v p řípadě zkoušených látek, jejichž 
příjem probíhá pomalu, jsou vhodn ější sedmidenní intervaly.  
Bioakumula ční faktory vypo čtené přímo z kinetických rychlostních 
konstant (k  1 /k 2 ) se nazývají kinetické akumula ční faktory (BCF  K ). 
Rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (P  ow je rovnovážný pom ěr 
mezi rozpustností chemikálie v n-oktanolu a ve vod ě (metoda A.8) 
a označuje se také jako K  ow . Logaritmus hodnoty P  ow se používá 
jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních 
organismech.  
Expozice nebo fáze p říjmu je časový úsek, b ěhem něhož jsou ryby 
vystaveny p ůsobení zkoušené chemikálie.  
Rychlostní konstanta p říjmu (k  1 ) je číselná hodnota definující rych ­
lost nárůstu koncentrace zkoušené látky v testovacích rybách nebo na 
nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsouli ryby této chemi ­
kálii vystaveny (k  1 se vyjadřuje v jednotce/den).  
Poexpoziční nebo vylu čovací fáze je časový úsek po p řemístění 
testovacích ryb z média obsahujícího zkoušenou látku do média, 
které tuto látku neobsahuje, b ěhem něhož se studuje vylu čování 
látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich).  
Rychlostní konstanta vylu čování (k  2 ) je číselná hodnota definující 
rychlost poklesu koncentrace zkoušené látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich p řemístění 
z média obsahujícího zkoušenou látku do média, které tuto látku 
neobsahuje (k
 2 se vyjadřuje v jednotce/den).  
1.3. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Zkouška má dv ě fáze: fázi expozice (p říjem) a poexpozi ční fázi 
(vylučování). B ěhem fáze p říjmu jsou dv ě oddělené skupiny ryb 
stejného druhu vystaveny alespo ň dvěma koncentracím zkoušené 
látky. Poté jsou p řemístěny do média, které zkoušenou látku neob ­
sahuje, aby za čala fáze vylu čování. Fáze vylu čování je vždy 
nezbytná, není-li p říjem látky b ěhem fáze p říjmu nevýznamný (nap ř. 
je-li BCF menší než 10). Koncentrace zkoušené látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v pr ůběhu 
obou fází zkoušky. Vedle t ěchto dvou zkušebních koncentrací se za 
stejných podmínek, s výjimkou p řítomnosti zkoušené látky, udržuje 
kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány možné nep říznivé účinky pozorované p ři bioaku­
mulačních zkouškách a aby byly získány koncentrace zkoušené látky 
v pozadí.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Fáze příjmu trvá 28 dn ů, není-li prokázáno, že je rovnováhy 
dosaženo d říve. Délku fáze p říjmu a dobu pot řebnou k ustavení 
rovnovážného stavu lze p ředpovědět pomocí rovnice v p říloze 
3. Fáze vylu čování poté za čne po přemístění ryb do jiné nádrže 
bez zkoušené látky. Je-li to možné, vypo čítají se bioakumula ční 
faktory nejlépe jako pom ěr (BCF  US ), tj. pom ěr koncentrace 
v rybách (C  r ) a ve vod ě (C  w ) ve zřetelném rovnovážném stavu, 
a jako kinetický bioakumula ční faktor BCF  K , tj. poměr rychlostních 
konstant p říjmu (k  1 ) a vylu čování (k  2 ) za předpokladu kinetiky 
prvního řádu. Neřídí-li se zjevn ě naměřené hodnoty kinetikou 
prvního řádu, měl by být použit složit ější model (dodatek 5).  
Nedojde-li k ustálenému stavu do 28 dn ů, měla by být fáze p říjmu 
prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dn ů, podle toho, co 
nastane d říve; poté za čne fáze vylu čování.  
Rychlostní konstanta p říjmu, rychlostní konstanta (nebo konstanty, 
jsou-li použity složit ější modely) vylu čování (úbytku), bioakumu ­
lační faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého 
z těchto parametr ů se vypočítají z modelu, který popisuje nam ěřené 
koncentrace zkoušené látky v rybách a ve vod ě. 
Faktor BCF se vyjad řuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. 
Pro zvláštní ú čely však mohou být použity specifikované tkán ě nebo 
orgány (nap ř. svalovina, játra), je-li ryba dostate čně velká nebo je-li 
možné ji rozd ělit na jedlý (vykost ěný) podíl a nejedlý podíl (vnit ř­
nosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi schopností bioakumulace a lipofilností, existuje 
také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách 
a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolí ­
sání výsledk ů pro tyto látky s vysokou lipofilností (tj. s log P
 ow > 3), 
měla by být bioakumulace vztažena vedle celkové hmotnosti t ěla 
také k obsahu tuku.  
Obsah tuku by m ěl být stanoven pokud možno na stejném 
biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkou ­ 
šené látky.  
1.4. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Před provád ěním zkoušek bioakumulace by m ěly být o zkoušené 
látce známy tyto informace:  
— rozpustnost ve vod ě, 
— rozdělovací koeficient n-oktanol/voda P  ow (označovaný také jako 
K ow , stanovený metodou HPLC, viz A.8),  
— hydrolýza,  
— fototransformace ve vod ě stanovená ozá řením slune čním nebo 
simulovaným slune čním světlem za podmínek zkoušky bioaku ­
mulace (3),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— povrchové nap ětí (u látek, u nichž nelze stanovit log P  ow ), 
— tlak par,  
— v případě potřeby „snadná“ biologická rozložitelnost.  
Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být 
použit, nejlépe asymptotická hodnota LC  50 (tj. časově nezávislá). 
K dispozici musí být vhodná analytická metoda o známé p řesnosti 
a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkoušené látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o p řípravě 
a uchovávání vzork ů. Měly by být také známy meze stanovitelnosti 
zkoušené látky jak ve vod ě, tak v rybích tkáních. Je-li použita zkou ­ 
šená látka zna čená
 14 C, měla by být známá aktivita ne čistot vyjád ­ 
řená v procentech.  
1.5. VALIDITA ZKOUŠKY  
Aby byla zkouška platná, m ěly by být spln ěny tyto podmínky:  
— kolísání teploty je menší než ± 2  o C, 
— koncentrace rozpušt ěného kyslíku neklesne pod 60 % nasycení,  
— koncentrace zkoušené látky v nádrži je udržována v intervalu ± 
20 % kolem st řední hodnoty nam ěřených hodnot b ěhem fáze 
příjmu,  
— mortalita nebo jiné nep říznivé ú činky a choroby jak 
u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na n ěkolik 
týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nep říznivé účinky 
v obou skupinách ryb menší než 5 % za m ěsíc nebo by nem ěl 
překročit celkem 30 %.
 
1.6. REFEREN ČNÍ SLOU ČENINY  
Použití referen čních sloučenin o známém bioakumula čním potenciálu 
by mohlo být užite čné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím 
však ještě nelze doporu čit žádné specifické látky.  
1.7. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.7.1.  Přístroje a pom ůcky 
U všech částí zařízení je třeba se vyhýbat použití materiál ů, které se 
mohou rozpoušt ět, sorbovat nebo vyluhovat a mají nep říznivý účinek 
na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem 
na náplň. Použití m ěkkých trubek z plastu by m ělo být minimalizo ­
váno. Měly by být použity trubky z teflonu ®, z korozivzdorné oceli 
a/nebo ze skla. Zkušenosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorp č­
ními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je nutné použít 
silanizované sklo. V t ěchto případech musí být za řízení po použití 
zlikvidováno.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Voda  
Ke zkoušce se používá p řírodní voda, která by m ěla být získána 
z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít 
kvalitu, která umožní p řežití zvoleného druhu ryby po dobu aklima ­
tizace a v pr ůběhu fází zkoušky, aniž by vykazoval abnormální 
vzhled nebo chování. V ideálním p řípadě by mělo být prokázáno, 
že testovací druh m ůže v ředicí vod ě přežít, růst a rozmnožovat se 
(např. zkouškou s laboratorní kulturou nebo zkouškou toxicity 
během životního cyklu). Voda by m ěla být charakterizována alespo ň 
hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem pevných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem 
amoniaku a dusi čnanů, alkalitou a v p řípadě mořských druh ů salini­
tou. Všechny parametry, které jsou d ůležité pro optimální prospívání 
ryb, jsou známy; v p říloze I jsou p řesto uvedeny doporu čené maxi ­
mální koncentrace pro řadu parametr ů sladké a mo řské vody.
 
Voda by m ěla mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota 
pH by m ěla být v rozmezí 6,0 až 8,5, avšak b ěhem zkoušky by se 
pH nemělo lišit o více než ± 0,5. Pro ujišt ění, že voda nebude mít 
přílišný vliv na výsledky zkoušky (nap říklad tvorbou komplex ů se 
zkoušenou látkou) nebo nep říznivý vliv na stav obsádky ryb, by 
měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro 
analýzu. Je-li kvalita ředicí vody relativn ě konstantní, m ělo by být 
stanovení t ěžkých kov ů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních 
aniontů a kationt ů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO  4 ), pesticid ů (např. 
celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticid ů), 
celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek 
provedeno nap ř. každé t ři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody 
je konstantní po dobu alespo ň jednoho roku, mohou být stanovení 
méně častá a intervaly lze prodloužit (nap ř. každých šest m ěsíců). 
Celkový p řirozený obsah částic a rovn ěž obsah organického uhlíku 
(TOC) v ředicí vod ě by měl být co nejnižší, aby nedošlo k adsorpci 
zkoušené látky na organických látkách, což m ůže snížit její 
biologickou dostupnost (4). Maximální p řijatelná hodnota je 5 mg/l 
pro částice (sušina zachycená filtrem 0,45 μm) a 2 mg/l pro celkový 
organický uhlík (viz dodatek 1). Je-li to nezbytné, m ěla by být voda 
před použitím filtrována. P říspěvek k obsahu organického uhlíku od 
testovacích ryb (exkrety) a ze zbytk ů potravy by m ěl být co 
nejmenší. V pr ůběhu zkoušky by nem ěla koncentrace organického 
uhlíku ve zkušební nádrži p řekročit koncentraci organického uhlíku 
pocházejícího ze zkoušené látky a ze solubiliza čního činidla, je-li 
použito, o více než 10 mg/l (±20 %).  
1.7.3.  Zkušební roztoky  
Zásobní roztok zkoušené látky se p řipraví ve vhodné koncentraci. 
Zásobní roztok by m ěl být p řipraven nejlépe jednoduchým 
smícháním nebo prot řepáním zkoušené látky s ředicí vodou. Použití 
rozpouštědel nebo dispersant ů (solubiliza čních činidel) se nedoporu ­ 
čuje; v některých p řípadech však m ůže být pro vytvo ření zásobního 
roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Rozpoušt ědly, která mohou 
být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol-monomethylester, ethylenglykol-dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. 
Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, 
Tween 80, 0,01 % methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná činidla je t řeba používat rozvážn ě, neboť mohou 
způsobit problémy s r ůstem bakterií v pr ůtokových zkouškách. 
Zkoušená látka m ůže být zna čena radioaktivními izotopy a m ěla 
by být nejvyšší čistoty (nap ř. > 98 %).
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Při průtokových zkouškách je pro zajišt ění koncentrací zkoušené 
látky nezbytný systém, který nep řetržitě dávkuje a ředí zásobní 
roztok zkoušené látky (nap ř. měřicí čerpadlo, proporcionální ředění, 
saturační systém). P řijatelná je vým ěna nejlépe p ěti objemů v každé 
zkušební nádrži za den. Up řednostňuje se průtokový režim, není-li to 
však možné (nap ř. jsou-li testovací organismy nep říznivě ovlivňová­
ny), může být použita semistatická technika za p ředpokladu, že jsou 
splněna kritéria validity. Rychlosti pr ůtoku zásobního roztoku 
a ředicí vody by m ěly být kontrolovány jak 48 hodin p řed zkouškou, 
tak poté alespo ň denně během zkoušky. Tato kontrola by m ěla 
zahrnovat stanovení rychlosti pr ůtoku v každé testovací nádrži 
a měla by zajistit, aby se rychlost pr ůtoku nem ěnila o více než 
20 % v rámci jedné nádrže nebo mezi nádržemi.  
1.7.4.  Výb ěr druhů 
Důležitými kritérii pro výb ěr druhu jsou jeho dostupnost, možnost 
získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laborato ři. Dalšími kritérii pro výb ěr druhu ryb jsou jeho rekrea ční, 
komerční a ekologický význam a rovn ěž srovnatelná citlivost, 
úspěšné dřívější použití atd.
 
Doporučené druhy jsou uvedeny v p říloze 2. Mohou být použity 
i jiné druhy, avšak zkušební postup musí být upraven, aby byly 
vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém p řípadě by 
měly být uvedeny d ůvody pro výb ěr druhu a experimentální 
podmínky.  
1.7.5.  Chov ryb  
Obsádka ryb se nechá aklimatizovat alespo ň dva týdny p ři zkušební 
teplotě a krmí se odpovídající stravou stejného typu jako v pr ůběhu 
zkoušky.  
Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená mortalita a použijí se tato 
kritéria:  
— úhyn vyšší než 10 % populace za sedm dn ů: vyměnit celou 
obsádku,  
— úhyn 5 až 10 % populace za sedm dn ů: nechat aklimatizovat 
dalších sedm dn ů, 
— úhyn nižší než 5 % populace za sedm dn ů: násada se p řijímá; 
dojde-li b ěhem dalších sedmi dn ů k úhynu vyššímu než 5 %, 
celá obsádka se vym ění. 
Zajistí se, aby ryby použité pro zkoušku nevykazovaly pozorovatelné 
nemoci a abnormality. Všechny nemocné ryby se vym ění. Dva týdny 
před zkouškou nebo v pr ůběhu zkoušky nesmí být lé čeny u ryb 
žádné nemoci.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. PROVEDENÍ ZKOUŠKY  
1.8.1.  Předběžná zkouška  
Může být užite čné provést p ředběžný experiment s cílem optimali ­
zovat zkušební podmínky kone čné zkoušky, nap ř. výběr koncentrace 
(koncentrací) zkoušené látky, délka fáze p říjmu a fáze vylu čování.  
1.8.2.  Podmínky expozice  
1.8.2.1. D é l k a f á z e p ř í j m u  
Předpověď délky fáze p říjmu lze získat z praktických zkušeností 
(např. z dřívější studie nebo podle chemikálie podobné akumulace) 
nebo z ur čitých empirických vztah ů využívajících znalosti bu ď 
rozpustnosti ve vod ě, nebo rozd ělovacího koeficientu n-oktanol/voda 
pro zkoušenou látku (viz dodatek 3).  
Fáze příjmu trvá 28 dn ů, není-li prokázáno, že je rovnováhy 
dosaženo d říve. Nedosáhne-li se ustáleného stavu do 28 dn ů, měla 
by být fáze p říjmu prodloužena do jeho dosažení, p řičemž se 
provádějí další m ěření, nebo na 60 dn ů, podle toho, co nastane d říve. 
1.8.2.2. D é l k a f á z e v y l u č o v á n í  
Doba odpovídající polovin ě délky fáze p říjmu je obvykle dostate čná 
k tomu, aby se p řiměřeně snížil (nap ř. o 95 %) obsah látky 
v organismu (vysv ětlení odhadu – viz dodatek 3). Jestliže doba 
nezbytná pro dosažení 95 % úbytku je neprakticky dlouhá, p řekra­ 
čuje například dvakrát b ěžnou délku fáze p říjmu (tj. více než 56 
dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace 
zkoušené látky menší než 10 % koncentrace v rovnovážném stavu). 
V případě látek se složit ějším charakterem p říjmu a vylu čování, než 
jaký představuje model ryby s jedním kompartmentem řídícím se 
kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylu čování umožní stanovit 
rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však m ůže být ur čena 
dobou, po kterou z ůstává koncentrace zkoušené látky v rybách nad 
mezí detekce analytické metody.  
1.8.2.3. P o č t y t e s t o v a c í c h r y b  
Počet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby byly pro 
každý odb ěr k dispozici nejmén ě čtyři ryby na jeden vzorek. Je-li 
požadována v ětší statistická váha, budou pro vzorek nezbytná v ětší 
množství ryb.  
Použijí-li se pohlavn ě dospělé ryby, uvede se, zda byly 
v experimentu použity samice nebo samci nebo obojí. Jsou-li použita obě pohlaví, m ělo by být p řed započetím expozice prokázáno, že 
rozdíl v obsahu lipid ů mezi oběma pohlavími není významný; odd ě­
lení samc ů a samic m ůže být nezbytné.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmot ­
nost nejmenší z nich nebyla nižší než dv ě třetiny hmotnosti nejv ětší 
ryby. Všechny by m ěly být stejného stá ří a měly by pocházet ze 
stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že stá ří a hmotnost ryby mají 
zřejmě často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto 
podrobnosti p řesně zaznamenány. Doporu čuje se zvážit p řed zkou­ 
škou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout st řední hmotnost.  
1.8.2.4. N á s a d a  
Volí se vysoký pom ěr množství vody k množství ryb, aby se mini ­
malizovalo snížení koncentrace C  W způsobené p řidáním ryb na 
začátku zkoušky, a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace 
rozpuštěného kyslíku. Je d ůležité, aby rychlost nasazování byla 
přiměřená použitému druhu. V každém p řípadě se obvykle doporu ­ 
čuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr 
vody za den. Vysoká rychlost nasazování m ůže být zvolena, je-li 
prokázáno, že požadovaná koncentrace zkoušené látky m ůže být 
udržována v mezích ± 20 % a že koncentrace rozpušt ěného kyslíku 
neklesne pod 60 % nasycení.  
Při volbě režimu nasazování má být p řihlédnuto k obvyklému p řiro­
zenému prost ředí ryb. Nap říklad ryby žijící u dna mohou vyžadovat 
při stejném objemu vody v ětší plochu dna než pelagické druhy ryb.  
1.8.2.5. K r m e n í  
Během aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou 
stravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou 
v množství dostate čném pro udržení zdravého stavu a pro udržení 
tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denn ě v průběhu aklimatizace a po 
dobu zkoušky množstvím p řibližně 1 až 2 % t ělesné hmotnosti; tím 
se udrží v pr ůběhu zkoušky obsah tuku u v ětšiny druh ů ryb na 
relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by m ělo být nap říklad 
jednou týdn ě nově přepočítáno, aby byla udržena odpovídající 
tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži m ůže 
být pro tento výpo čet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebra ­
ných z doty čné nádrže. Ryby, které z ůstaly v nádrži, se neváží.  
Nezkrmená potrava a exkrety se odstra ňují z nádrží odsátím denn ě 
krátce po krmení (30 minut až 1 hodina). Nádrže se udržují v celém 
průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace orga ­
nických látek co nejnižší, nebo ť přítomnost organického uhlíku m ůže 
snižovat biologickou dostupnost zkoušené látky (1).  
Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí mou čky, mělo by být krmivo 
analyzováno na p řítomnost zkoušené látky. Je rovn ěž žádoucí, aby 
bylo krmivo analyzováno na p řítomnost pesticid ů a těžkých kov ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. S v ě t l o a t e p l o t a  
Fotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (± 2  o C)) by m ěla 
odpovídat testovacímu druhu (viz dodatek 2). Druh a charakteristiky osvětlení by m ěly být známy. M ěla by být v ěnována pozornost 
možné fototransformaci zkoušené látky za sv ětelných podmínek 
studie. M ělo by být použito vhodné osv ětlení, aby ryby nebyly 
vystaveny fotoprodukt ům nevyskytujícím se v p řírodě. V některých 
případech m ůže být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV zá ření 
s vlnovou délkou kratší než 290 nm.
 
1.8.2.7. Z k u š e b n í k o n c e n t r a c e  
Ryby jsou vystaveny za pr ůtokových podmínek alespo ň dvěma 
koncentracím zkoušené látky ve vod ě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace 
zkoušené látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC
 50 a aby byla desetkrát vyšší než 
je mez detekce této látky ve vod ě při použité analytické metod ě. 
Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit d ělením akutní 96ho ­
dinové LC  50 příslušným pom ěrem akutní/chronická letální dávka (u 
některých chemikálií m ůže koeficient ležet mezi 3 a 100). Je-li to 
možné, volí se další koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není-li to možné z d ůvodu kritéria 1 % z LC
 50 nebo 
z důvodu kritéria meze detekce, m ůže být použit nižší faktor než 10 
nebo by m ělo být zváženo použití zkoušené látky zna čené 14 C. 
Žádná koncentrace by nem ěla překročit rozpustnost látky.  
Je-li použito solubiliza ční činidlo, nem ěla by jeho koncentrace být 
vyšší než 0,1 ml/l a m ělo by být stejné ve všech zkušebních nádr ­ 
žích. Jeho p říspěvek, spole čně s příspěvkem zkoušené látky, 
k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vod ě by měl 
být znám. M ěla by však být vynaložena maximální snaha takové 
látky nepoužívat.  
1.8.2.8. K o n t r o l n í e x p e r i m e n t y  
Vedle zkušební série by m ěl být proveden kontrolní experiment 
s ředicí vodou, která pop řípadě obsahuje solubiliza ční činidlo, 
pokud bylo zjišt ěno, že toto činidlo nemá na ryby žádné ú činky. 
Není-li tomu tak, m ěly by být provedeny oba kontrolní experimenty.  
1.8.3.  Četnost měření kvality vody  
V průběhu zkoušky by m ělo být v každé nádrži m ěřeno množství 
rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost 
a popřípadě salinita by m ěly být měřeny v kontrolních experimen ­
tech a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství 
rozpuštěného kyslíku a pop řípadě salinita by m ěly být m ěřeny 
alespoň třikrát – na za čátku, přibližně uprostřed a na konci fáze 
příjmu – a jednou týdn ě ve fázi vylu čování. Hodnota TOC by 
měla být m ěřena na za čátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin p řed 
započetím fáze p říjmu) před nasazením ryb a alespo ň jednou týdn ě 
jak v průběhu fáze p říjmu, tak v pr ůběhu fáze vylu čování. Teplota 
by měla být měřena denn ě, pH na za čátku a na konci každé fáze 
a tvrdost vody jednou v pr ůběhu zkoušky. Teplota by m ěla být 
měřena nejlépe nep řetržitě alespoň v jedné nádrži.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Odb ěr vzorků a analýza ryb a vody  
1.8.4.1. Č a s o v ý r o z v r h o d e b í r á n í v z o r k ů r y b a v o d y  
Voda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkoušené 
látky odebírá p řed nasazením ryb a b ěhem fáze p říjmu i během fáze 
vylučování. Voda se odebírá alespo ň ve stejnou dobu jako ryby 
a před krmením. B ěhem fáze p říjmu se stanovují koncentrace zkou ­ 
šené látky, aby se ov ěřilo, že jsou v souladu s kritérii validity.  
Ryby se odebírají alespo ň pětkrát během fáze p říjmu a alespo ň čtyři­
krát během fáze vylu čování. Vzhledem k tomu, že v mnoha p řípa­
dech bude obtížné s tímto po čtem vzork ů vypočítat rozumn ě přesný 
odhad hodnoty BCF, zejména jde-li o jinou než jednoduchou kine ­
tiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích 
častěji (viz dodatek 4). Dodate čné vzorky se uloží a analyzují až 
poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostate čné 
pro výpo čet hodnoty BCF o požadované p řesnosti.  
Příklad přijatelného časového rozvrhu odb ěru vzork ů je uveden 
v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné p ředpoklá­
dané hodnoty P  ow , s níž se vypo čítá expozi ční doba pro 95 % 
příjem.  
V odběru vzorků se pokra čuje během fáze p říjmu do dosažení ustá ­
leného stavu nebo po dobu 28 dn ů, podle toho, co nastane d říve. 
Není-li ustáleného stavu dosaženo do 28 dn ů, v odběru vzorků se 
pokračuje do ustavení ustáleného stavu nebo do 60 dn ů, podle toho, 
co nastane d říve. Před zahájením fáze vylu čování se ryby p řemístí do 
čistých nádrží.  
1.8.4.2. O d b ě r v z o r k ů a p ř í p r a v a v z o r k ů 
Vzorky vody pro analýzy se odebírají nap říklad odsáváním potrubím 
z inertního materiálu ze st ředu zkušební nádrže. Vzhledem k tomu, 
že se biologicky nedostupná frakce zkoušené látky nedá často oddělit 
od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odst ředěním (zejména 
v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log P  ow > 5) (1, 
5), nemohou být vzorky takto zpracovány.  
Namísto toho je t řeba učinit opatření pro to, aby byly nádrže udržo ­
vány co nej čistší, a obsah organického uhlíku by m ěl být pravideln ě 
monitorován jak b ěhem fáze p říjmu, tak b ěhem fáze vylu čování.  
Při každém odb ěru se z nádrží odebere vhodný po čet ryb (obvykle 
alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, 
důkladně se osuší, ihned se usmrtí nejvhodn ější humánní metodou 
a zváží se.  
Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odb ěru s cílem 
předejít degradaci nebo ztrátám a vypo čítat přibližné rychlosti p říjmu 
a vylučování ješt ě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovn ěž 
zabrání opožd ěnému stanovení plató p ři jeho dosažení.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Neprovádí-li se analýza okamžit ě, vzorky se vhodným zp ůsobem 
uchovají. P řed zahájením studie je t řeba zjistit informace o řádné 
metodě uchovávání vzork ů s ohledem na doty čnou zkoušenou 
látku – nap říklad hluboké zmrazení, udržování p ři 4 o C, délka ucho ­
vávání, vyluhování atd.  
1.8.4.3. K v a l i t a a n a l y t i c k é m e t o d y  
Vzhledem k tomu, že celý postup je ur čen hlavně správností, p řes­
ností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkoušené 
látky, je t řeba experimentáln ě kontrolovat, že p řesnost 
a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovn ěž výtěžek zkoušené 
látky jak z vody, tak ze vzork ů ryb jsou pro danou analytickou 
metodu dostate čné. Kontroluje se také, zda se zkoušená látka nevys ­
kytuje v použité ředicí vod ě. 
Hodnoty C  w and C  r se podle pot řeby korigují na výt ěžky a hodnoty 
pozadí v kontrolních experimentech. Vzorky ryb a vody se zpraco ­
vávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (nap ř. 
v důsledku adsorpce odb ěrným zařízením).  
1.8.4.4. A n a l ý z a v z o r k ů r y b  
Je-li ve zkoušce použit materiál zna čený radioizotopy, je možné 
provést analýzu na celkovou aktivitu (tj. pro výchozí látku i s meta ­
bolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatn ě. Také hlavní metabolity mohou být chara ­
kterizovány v rovnovážném stavu nebo na konci fáze p říjmu, podle 
toho, k čemu dojde d říve. Je-li hodnota BCF vyjád řená celkovou 
aktivitou reziduí ≥ 1 000 %, m ůže být účelné, a pro ur čité kategorie 
chemikálií, nap ř. pesticidy, se to d ůrazně doporučuje, identifikovat 
a kvantifikovat produkty rozkladu p ředstavující ≥ 10 % celkového 
množství reziduí v tkáních ryb v ustáleném stavu. Jsou-li produkty rozkladu p ředstavující ≥ 10 % celkových zna čených reziduí identi ­
fikovány a kvantifikovány, doporu čuje se také identifikovat 
a kvantifikovat produkty rozkladu ve zkušební vod ě.
 
Koncentrace zkoušené látky by m ěla být obvykle stanovena pro 
každou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky p ři každém odb ěru sdružovány, avšak sdružování omezuje 
statistické postupy, které lze na údaje aplikovat. Pokud je d ůležitý 
určitý statistický postup a statistická váha, m ěl by být ve zkoušce 
nasazen p řiměřený počet ryb vyhovující požadovanému sdružování 
a statistické váze (6, 7).
 
Hodnota BCF by m ěla být vyjád řena jako funkce celkové hmotnosti 
a v případě lipofilních látek také jako funkce obsahu lipid ů. Obsah 
lipidů v rybách se stanoví pokud možno p ři každém odb ěru. Pro 
stanovení obsahu lipid ů by měla být použita vhodná metoda (odkazy 
8 a 2 v p říloze 3). Jako standardní metoda m ůže být doporu čena 
technika extrakce sm ěsí chloroform a methanol (9). R ůzné metody 
neposkytují stejné hodnoty (10), a proto je d ůležité uvést podrobnosti 
o použité metod ě. Je-li to možné, m ěla by být analýza lipid ů 
provedena na extraktu p řipraveném pro analýzu zkoušené látky, 
neboť lipidy musí být často před chromatografickou analýzou odstra ­
něny. Obsah lipid ů v rybách (v mg/kg živé hmotnosti) na konci 
experimentu by se nem ěl lišit od jejich obsahu na po čátku o více 
než ± 25 %. M ěl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, 
aby bylo možné provést p řepočet koncentrace tuk ů z živé hmotnosti 
na sušinu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. ÚDAJE  
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Křivka příjmu zkoušené látky se sestrojí vynesením její koncentrace 
v rybách nebo na nich (nebo ve specifikovaných tkáních) v pr ůběhu 
fáze příjmu proti času v lineárním m ěřítku. Dosáhla-li k řivka plató, 
tj. pokud za číná být rovnob ěžná s časovou osou, vypo čítá se hodnota 
BCF  us v rovnovážném stavu z pom ěru: 
C r v ustáleném stavu  ðstřední hodnotaÞ 
C v v ustáleném stavu  ðstřední hodnotaÞ 
Není-li dosaženo ustáleného stavu, je možné vypo čítat hodnotu 
BCF  us s dostate čnou přesností pro posouzení rizika z ustáleného 
stavu při 80 % (1,6/k  2 ) nebo 95 % (3,0/k  2 ) rovnováze.  
Také akumula ční faktor (BCF  K se stanoví jako pom ěr dvou rych ­
lostních konstant prvního řádu k  1 /k 2 . Rychlostní konstanta vylu čo­
vání (k  2 ) se obvykle stanoví z k řivky vylu čování (tj. grafu poklesu 
koncentrace zkoušené látky v rybách v čase). Rychlostní konstanta 
příjmu se poté vypo čte pomocí hodnoty (k  1 ) k 2 a hodnoty C  r , odvo­
zené z k řivky příjmu (viz také dodatek 5). Up řednostňovanou 
metodou pro získání hodnoty BCF  K a rychlostních konstant k  1 
a k 2 je metoda nelineárního odhadu parametr ů s využitím po čítače 
(11). K výpo čtu hodnot k  1 a k  2 lze jinak použít grafické metody. 
Není-li zjevn ě křivka vylu čování křivkou prvního řádu, měly by být 
použity složit ější modely (viz odkazy v p říloze 3) a m ěl by být 
konzultován biostatistik.  
2.2. INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Výsledky by m ěly být interpretovány opatrn ě v případě, že se nam ě­ 
řené koncentrace zkoušených roztok ů pohybují na úrovních blízkých 
mezi detekce analytické metody.  
Jasně vymezené k řivky příjmu a úbytku jsou ukazatelem dobré 
kvality údaj ů o bioakumulaci. Rozdíl konstant p říjmu a vylu čování 
pro dvě zkušební koncentrace by m ěl být nižší než 20 %. Pozoro ­
vané významné rozdíly v rychlostech p říjmu a vylu čování mezi 
dvěma použitými zkušebními koncentracemi by m ěly být zazname ­
nány a m ělo by být uvedeno jejich možné vysv ětlení. Interval 
spolehlivosti hodnot BCF u dob ře navržených studií se obecn ě 
blíží ± 20 %.  
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
3.1. ZKOUŠENÁ LÁTKA  
— fyzikální povaha a pop řípadě fyzikálně-chemické vlastnosti,  
— chemické identifika ční údaje (v četně obsahu organického uhlíku, 
je-li to třeba),  
— v případě značení radioaktivními izotopy jejich p řesná poloha 
a aktivita ne čistot, vyjád řená v procentech.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. TESTOVACÍ DRUH  
— vědecký název, kmen, zdroj, p řípadné předběžné ošetření, akli­
matizace, stá ří, rozmezí velikostí atd.  
3.3. ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY:  
— použitý zkušební postup (nap ř. průtokový nebo semistatický),  
— typ a charakteristiky použitého osv ětlení a fotoperioda (fotoperi ­
ody),  
— uspořádání zkoušky (nap ř. počet a velikost zkušebních nádrží, 
rychlost vým ěny objemu vody, po čet opakování, po čet ryb 
v jednom opakování, po čet zkušebních koncentrací, délka fází 
příjmu a vylu čování, četnost odb ěru vzorků ryb a vzork ů vody),  
— metoda p řípravy zásobních roztok ů a častost jejich obnovování 
(je-li použito solubiliza ční činidlo, musí být uvedena jeho 
koncentrace a jeho p říspěvek k obsahu organického uhlíku ve 
vodě), 
— nominální zkušební koncentrace, st řední hodnoty nam ěřených 
koncentrací ve zkušebních nádržích, jejich sm ěrodatné odchylky 
a metody jejich stanovení,  
— zdroj ředicí vody, popis jakékoli p ředchozí úpravy, výsledky 
jakéhokoli prokazování schopnosti zkušebních ryb žít v této 
vodě a charakteristiky vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, 
koncentrace rozpušt ěného kyslíku, koncentrace zbytkového 
chloru (je-li m ěřena), obsah celkového organického uhlíku, 
obsah suspendovaných látek, pop řípadě salinita zkušebního 
média a výsledky jakýchkoli jiných provedených m ěření, 
— kvalita vody ve zkušebních nádržích, hodnota pH, tvrdost vody, 
obsah TOC, teplota a koncentrace rozpušt ěného kyslíku,  
— podrobné informace o krmení (nap říklad typ krmiva, zdroj, 
složení – alespo ň pokud možno obsah lipid ů a bílkovin, podá ­
vané množství a četnost),  
— informace o zpracování vzork ů ryb a vody, v četně podrobností 
o přípravě, uchovávání, o extrakci a analytických postupech (a 
přesnosti), pokud jde o zkoušenou látku a obsah tuku (je-li 
měřen). 
3.4. VÝSLEDKY:  
— výsledky jakýchkoli provedených p ředběžných studií,  
— úhyn kontrolních ryb a ryb v každé expozi ční nádrži a jakékoli 
pozorované neobvyklé chování,  
— obsah lipid ů v rybách (je-li stanoven p ři zkoušce),  
— křivky (včetně všech nam ěřených údaj ů) příjmu a vylu čování 
zkoušené chemikálie rybami, doba dosažení ustáleném stavu,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— hodnoty Cr a Cv (pop řípadě se směrodatnými odchylkami 
a rozpětím) pro všechny odb ěry (hodnota Cr se vyjad řuje 
v μg/g živé hmotnosti (ppm) celého t ěla nebo specifikovaných 
tkání, nap ř. lipidů, a Cv se vyjad řuje v μg/ml (ppm)); hodnoty 
Cv pro kontrolní experimenty (m ěly by být uvedeny také 
hodnoty pozadí),  
— bioakumula ční faktor v ustáleném stavu (BCF  us ) a/nebo kinetický 
akumulační faktor (BCF  k ) a popřípadě 95 % meze spolehlivosti 
pro rychlostní konstanty p říjmu a vylu čování (úbytku) (vše vzta ­ 
ženo na celý organismus a na celkový obsah lipid ů v rybě, je-li 
stanoven, nebo na její specifikované tkán ě), intervaly spolehli ­
vosti a sm ěrodatné odchylky (jsou-li k dispozici) a metody 
výpočtu nebo analýzy údaj ů pro každou použitou koncentraci 
zkoušené látky,  
— v případě použití látek zna čených radioaktivními izotopy a je-li 
to nutné, musí být uvedena akumulace jakýchkoli detekovaných 
metabolit ů, 
— všechny zvláštnosti zkoušky, všechny odchylky od t ěchto 
postupů a ostatní relevantní informace.  
Výsledky typu „nedetekováno p ři uvedené mezi detekce“ by se m ěly 
minimalizovat p ředběžným vývojem metod a uspo řádáním experi ­
mentu, nebo ť takové výsledky nelze pro výpo čet rychlostních 
konstant použít.  
4. LITERATURA  
1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxi ­
col. 102, str. 117–156.  
2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29–390.
 
3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No. 3.
 
4) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioava ­
ilability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
 
5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initi ­
ative Technical Support Document for the Procedure to Deter ­
mine Bioaccumulation Factors. July 1994.  
6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
 
7) US EPA (1974). Section 5, A(1) Analysis of Human or Animal 
Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research 
Triangle Park, N.C. 27711.
 
8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“ Ch. 2.3, 
Part II. Government Publishing Office, the Hague, The Nether ­
lands.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
9) Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, 1099–1105.  
10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, str. 1431–1436.
 
11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow- 
through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final 
report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.  
12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
DODATEK 1  
Chemické charakteristiky p řijatelné ředicí vody  
Látka Koncentra ční limit  
1 Částice pevné 5 mg/l 
2 Celkový obsah organického uhlíku 2 mg/l 3 Neionizovaný amoniak 1 μg/l 
4 Zbytkový chlor 10 μg/l 
5 Celkové organické fosforové pesticidy 50 ng/l 6 Celkové organické chlorové pesticidy a polychlorované 
bifenyly 50 ng/l 
7 Celkový organický chlor 25 ng/l 
8 Hliník 1 μg/l 
9 Arsen 1 μg/l 
10 Chrom 1 μg/l 
11 Kobalt 1 μg/l 
12 M ěď 1 μg/l 
13 Železo 1 μg/l 
14 Olovo 1 μg/l 
15 Nikl 1 μg/l 
16 Zinek 1 μg/l 
17 Kadmium 100 ng/l 18 Rtu ť 100 ng/l 
19 St říbro 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
DODATEK 2  
Doporučené druhy ryb pro zkoušení  
Doporučený druh Doporučené 
rozpětí teploty p ři 
zkoušce (  o C) Doporučená 
celková délka 
těla testovacích 
jedinců (cm)  
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) danio pruhované 20–25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque), st řevle 20–25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus), 
kapr obecný 20–25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
and Schlegel), halan čík japonský 20–25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters), 
živorodka duhová 20–25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque Linneaus), slune čnice 20–25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum), pstruh duhový 13–17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus), koljuška t říostná 18–20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. R. Soc. London, Ser. B., sv. 252, str. 231.  
V různých zemích byly použity r ůzné druhy estuarinních a mo řských druh ů, například: 
ryba z čeledi Scienidae (smuhovití)  Leiostomus xanthurus  
halančík Cyprinodon variegatus  
ryba z čeledi Argentinidae (st říbronicovití)  Menidia beryllina  
ryba z čeledi Enbiotocidae (p říbojkovití)  Cymatogaster aggregata  
platýz z čeledi Pleuronectidae  Parophrys vetulus  
vranka z čeledi Cottidae  Leptocottus armatus  
koljuška t říostná  Gasterosteus aculeatus  
mořčák z čeledi Moronidae  Dicentracus labrax  
ouklej obecná  Alburnus alburnus  
Opatřování ryb  
Sladkovodní ryby uvedené v tabulce se snadno chovají nebo jsou dob ře dostupné po celý rok, 
zatímco dostupnost mo řských nebo estuarinních ryb je omezena na ur čité země. Lze je množit 
a chovat bu ď v rybích farmách, nebo v laborato ři za kontrolovaných zdravotních 
a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého p ůvodu. Tyto ryby 
jsou dostupné v mnoha částech sv ěta. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
DODATEK 3  
Předpověď délky fáze p říjmu a fáze vylu čování  
1. Předpověď délky fáze p říjmu 
Před provedením zkoušky lze získat odhad hodnoty k  2 a odtud lze získat 
dobu nezbytnou pro dosažení ur čitého stupn ě rovnovážného stavu (v 
procentech) z empirických vztah ů mezi k  2 a rozdělovacím koeficientem 
noktanol/voda (P  ov ) nebo mezi k  2 a rozpustností ve vod ě (s). 
Odhad hodnoty k  2 (den  -1 ) lze získat nap říklad z tohoto empirického 
vztahu (1): 
log 10 k 2 = – 0,414 log  10 (P o/v ) + 1,47 ( r 2 = 0,95) (rovnice 1)  
Další vztahy viz odkaz (2).  
Není-li rozd ělovací koeficient (P  ov ) znám, lze jej odhadnout (3) ze znalosti 
rozpustnosti látky ve vod ě (s) pomocí vztahu: 
log 10 (P o/v ) = – 0,862 log  10 (s) + 0,710 ( r 2 = 0,994) (rovnice 2)  
kde 
s = rozpustnost (v mol/l): (n=36).  
Tyto vztahy platí pouze pro chemikálie s hodnotou log P  ov od 2 do 6,5 (4).  
Dobu, za kterou dojde k dosažení ur čitého stupn ě rovnovážného stavu 
vyjádřeného v procentech, lze získat pomocí odhadu hodnoty k  2 –z obecné 
rovnice kinetiky popisující p říjem a vylu čování (kinetika prvního řádu):  
dC r 
dt ¼ k 1 · C v Ä k 2 · C r 
nebo je-li C  v konstanta:  
C r ¼ k 1 
k 2 · C v ð1 Ä e Äk 2 t Þ (rovnice 3)  
Pro blízký ustálený stav ( t → ∞), může být rovnice 3 zjednodušena (5, 6) 
na: 
C r ¼ k 1 
k 2: C v nebo  C r /C v = k 1 /k 2 = BCF  
Pak ( k 1 /k 2 ) × C v je přiblížením ke koncentraci v rybách v „ustáleném stavu“ 
(C r, s ). 
Rovnice 3 m ůže být přepsána na rovnici:  
C r ¼ C r;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ or C r 
C rs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (rovnice 4).  
Při použití rovnice 4 lze p ředpovědět dobu pot řebnou k dosažení ur čitého 
stupně ustáleného stavu vyjád řeného v procentech, je-li hodnota k  2 předem 
odhadnuta z rovnice 1 nebo 2.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Je pravidlem, že statisticky optimální délka fáze p říjmu pro získání statis ­
ticky přijatelných údaj ů (BCF  K ) je doba nezbytná k tomu, aby k řivka sestro ­
jená vynesením logaritmu koncentrace zkoušené látky v rybách proti času 
v lineárním m ěřítku dosáhla svého st ředního bodu, pop řípadě 1,6/k  2 neboli 
80 % ustáleného stavu, ale ne více než 3,0/k  2 neboli 95 % rovnovážného 
stavu (7).  
Doba nezbytná pro dosažení 80 % ustáleného stavu je (rovnice 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 or t 80 ¼ 1; 6 
k 2 (rovnice 5).  
Podobně 95 % ustáleného stavu je dosaženo:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (rovnice 6).  
Například délka fáze p říjmu (fp) pro zkoušenou látku s P  ov = 4 je (p ři 
použití rovnic 1, 5 a 6): 
log 10 k 2 = – 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 den  -1 
nebo fp (80 %) = 1,6/0,652, tj. 2,45 dn ů (59 hodin)  
fp (95 %) = 3,0/0,652, tj. 4,60 dn ů (110 hodin)  
Podobně pro zkoušenou látku s hodnotou s = 10  –5 mol/l (log(s) = - 5,0) je 
délka fáze p říjmu (při použití rovnic 1, 2, 5 a 6):  
log 10 (P o/v ) = - 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 K 2 = 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 den  -1 
fp (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dn ů (156 hodin)  
nebo fp (95 %) = 3,0/0,246,tj. 12,2 dn ů (293 hodin).  
Rovnice  
t eq = 6,54 × 10  -3 P o/v + 55,31 (hodin)  
může být eventuáln ě použita pro výpo čet doby pot řebné pro dosažení efek ­
tivního ustáleného stavu (4).  
2. Předpověď délky fáze vylu čování  
Předpověď doby nezbytné pro snížení obsahu látky v organismu na ur čitou 
procentuální úrove ň počáteční koncentrace m ůže být rovn ěž získána 
z obecné rovnice kinetiky popisující p říjem a vylu čování (kinetika prvního 
řádu) (1, 8):  
V případě fáze vylu čování se C  v předpokládá rovna nule. Rovnice m ůže být 
zjednodušena na rovnici:  
dC r 
dt ¼ Äk 2 C r nebo C  r ¼ C r;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
kde C r, o je koncentrace na po čátku fáze vylu čování. 50 % vylou čení bude 
dosaženo v čase (t  50 ): 
C r 
C r;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 nebo  t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Podobně 95 % vylou čení bude dosaženo v čase 
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Je-li pro první fázi zvoleno dosažení 80 % p říjmu (1,6/k  2 ) a pro fázi 
vylučování je zvoleno dosažení 95 % úbytku (3,0/k  2 ), je délka fáze vylu čo­
vání přibližně dvojnásobkem délky fáze p říjmu.  
Je však d ůležité poznamenat, že odhady jsou založeny na p ředpokladu, že se 
příjem a vylu čování řídí kinetikou prvního řádu. Neřídí-li se z řejmě kine­
tikou prvního řádu, měly by být použity složit ější modely (nap ř. odkaz (1)).  
Literatura  (k příloze 3)  
1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 
1, str. 309–320.  
2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality 
Institute.  
3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), str. 4–10.
 
4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coeffi ­
cient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), str. 701–707.
 
5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), str. 785–792.  
6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by 
Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 str. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.
 
7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to esti ­
mate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, str. 614–622.
 
8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. 
Chemosphere, 9, str. 3–19.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
DODATEK 4  
Teoretický p říklad plánu odb ěru vzork ů pro bioakumula ční zkoušky látek s log P  ow = 4 
Odběr vzorků ryb Plán dob odb ěru vzorků 
Počet vzorků vody Po čet ryb na vzorek Minimální požadovaná 
četnost (dny) Dodatečný odběr vzorků 
Fáze příjmu – 1 
0 2 (*) 
2 Přídavek 45 až 80 ryb 
1. 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2. 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3. 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4. 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5. 4,7 2 6 
Fáze vylu čování P řenesení ryb do vody 
neobsahující zkoušené 
chemikálie 
6. 5,0 5,3 4 
(4) 
7. 5,9 7,0 4 
(4) 
8. 9,3 11,2 4 
(4) 
9. 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Odb ěr vzorku vody po dodání alespo ň tří „objemů nádrže“. 
Hodnoty v závorkách jsou po čty vzorků (vody, ryb), které mají být odebrány, je-li provád ěn dodatečný odběr. 
Poznámka : Předběžný odhad k  2 pro log P  ov rovný 4,0 je 0,652 den  -1 . Celková délka experimentu je stanovena na 3 × fp = 3 × 4,6 dn ů, 
tj. 14 dnů. Odhad hodnoty „fp“ viz dodatek 3.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
DODATEK 5  
Omezení modelu  
U většiny údaj ů týkajících se bioakumulace se p ředpokládá, že jsou „rozumn ě“ 
dobře popsány jednoduchým dvoukompartmentovým nebo dvouparametrovým 
modelem, jak je patrné z p římky, která je aproximací bod ů pro koncentrace 
v rybách b ěhem fáze vylu čování, je-li vynesena na semilogaritmickém papíru. 
(Nelze-li tyto body popsat p římkou, m ěl by být použit složit ější model, viz 
například Spacie a Hamelink, odkaz 1 v p říloze 3.)  
Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty vylu čování (úbytku) k  2 
Koncentrace zkoušené látky nalezená v každém vzorku ryb se vynese na semilo ­
garitmickém papíru proti času odběru vzorků. Směrnice této p římky je rovna k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC r1=C r2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Je třeba si všimnout, že odchylky od p římky mohou znamenat složit ější model 
vylučování, než je kinetika prvního řádu. Pro analýzu typ ů vylučování, které se 
odchylují od kinetiky prvního řádu, mohou být použity grafické metody.  
Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty p říjmu k  1 
Při dané konstant ě k 2 se k  1 vypočte takto:  
k 1 ¼ C f k 2 
C v Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (rovnice 1)  
Hodnota C  r se odečte ze středního bodu hladké k řivky příjmu vytvo řené 
vynesením logaritmu koncentrace proti času (v lineárním m ěřítku).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Počítačová metoda výpo čtu rychlostních konstant p říjmu a vylu čování 
(úbytku)  
Pro získání hodnoty bioakumula čního faktoru a rychlostních konstant k  1 a k 2 se 
dává přednost metod ě nelineárního odhadu parametr ů s využitím po čítače. 
Těmito programy se naleznou hodnoty k  1 a k  2 založené na souboru po sob ě 
jdoucích údaj ů o koncentracích a na modelu:  
C r ¼ C  v · k 1 
k 2 Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ0 < t < t c (rovnice 2)  
C r ¼ C v · k 1 
k 2 Ü ðe Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Þt < t c (rovnice 3)  
kde t  c = čas konce fáze p říjmu.  
Tento přístup poskytuje odhady sm ěrodatné odchylky k  1 and k  2 . 
Vzhledem k tomu, že ve v ětšině případů lze odhadnout k  2 z křivky vylu čování 
s relativn ě vysokou p řesností, a vzhledem k tomu, že mezi t ěmito dvěma para­
metry k  1 a k  2 existuje silná korelace, jsou-li odhadovány sou časně, může být 
účelné nejdříve vypočítat k  2 pouze z údaj ů o vylučování a následn ě vypočítat k  1 
z údajů příjmu nelineární regresí.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  RŮSTOVÁ ZKOUŠKA NA NEDOSP ĚLÝCH RYBÁCH  
1. METODA  
Tato metoda r ůstové zkoušky pro stanovení toxicity je replikou 
metody OECD TG 215 (2000).  
1.1. ÚVOD  
Tato zkouška je ur čena k posouzení ú činků dlouhodobé expozice 
chemickým látkám na r ůst nedosp ělých ryb. Je založena na metod ě 
pro posouzení ú činků chemických látek na r ůst nedosp ělého pstruha 
duhového ( Oncorynchus mykiss ) při průtokových podmínkách, která 
byla vyvinuta v Evropské unii a testována v okružních testech (1, 3). 
Mohou být použity také jiné dob ře popsané druhy. Byly nap říklad 
získány zkušenosti z r ůstových zkoušek s daniem pruhovaným 
(Danio rerio ) ( 1 ) (2, 4, 5) a halan číkem japonským ( Oryzias latipes ) 
(6, 7, 8).  
Viz také Obecný úvod, část C.  
1.2. DEFINICE  
Nejnižší koncentrace s pozorovanými ú činky  (Lowest Observed 
Effect Concentration, LOEC ): nejnižší zkušební koncentrace zkou ­ 
šené látky, p ři níž jsou u látky pozorovány významné ú činky ve 
srovnání s kontrolou (na hladin ě spolehlivosti p < 0,05). Všechny 
zkušební koncentrace vyšší než LOEC musí mít škodlivé ú činky 
stejné nebo v ětší, než ú činky pozorované p ři LOEC.  
Koncentrace bez pozorovaných ú činků (No Observed Effect 
Concentration, NOEC) : zkušební koncentrace bezprost ředně nižší 
než LOEC.  
EC x : pro tuto metodu koncentrace zkoušené látky, která vyvolává 
x % změnu rychlosti r ůstu ryb ve srovnání s kontrolami.  
Velikost násady:  živá hmotnost ryb v jednotce objemu vody.  
Hustota obsádky:  počet ryb v jednotce objemu vody.  
Individuální specifická rychlost r ůstu ryby:  vyjadřuje rychlost 
růstu jedince vycházející z jeho výchozí hmotnosti.  
Průměrná specifická rychlost r ůstu pro nádrž:  vyjadřuje střední 
rychlost r ůstu populace v nádrži p ři určité koncentraci.  
Pseudospecifická rychlost r ůstu: vyjadřuje rychlost r ůstu jedno ­
tlivce vycházející ze st řední počáteční hmotnosti populace v nádrži.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231–236.
 1.3. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Nedospělé ryby v exponenciální fázi r ůstu se po zvážení umístí do 
zkušebních nádrží a vystaví se řadě subletálních koncentrací zkou ­ 
šené látky p řednostně za průtokových podmínek, nebo pokud to není 
možné, za vhodných semistatických podmínek (statické podmínky 
s obnovováním média). Zkouška trvá 28 dn ů. Ryby se krmí denn ě. 
Přísun potravy se řídí počáteční hmotností ryb a m ůže být po 14 
dnech nov ě vypočten. Na konci zkoušky se ryby op ět zváží. Ú činky 
na rychlost r ůstu se analyzují pomocí regresního modelu s cílem 
odhadnout koncentraci, která vyvolává x % zm ěnu rychlosti r ůstu, 
tj. EC  x (např. EC  10 , EC  20 , nebo EC  30 ). Údaje mohou být pop řípadě 
porovnány s hodnotami pro kontrolní skupiny s cílem stanovit 
nejnižší koncentraci s pozorovanými ú činky (LOEC), a tím 
i koncentraci bez pozorovaných ú činků (NOEC).  
1.4. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Musí být p ředloženy výsledky zkoušky akutní toxicity (viz zkušební 
metoda C.1) provedené p řednostně na druhu zvoleném pro tuto 
zkoušku. To znamená, že jsou známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a je k dispozici vhodná analytická metoda 
pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se 
známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.
 
Užitečnými informacemi jsou strukturní vzorec, čistota látky, její 
stálost ve vod ě a na sv ětle, pK  a , P ov a výsledky zkoušky snadné 
biologické rozložitelnosti (viz zkušební metoda C.4).  
1.5. VALIDITA ZKOUŠKY  
Má-li být zkouška platná, musí být spln ěny tyto podmínky:  
— mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkoušky 
větší než 10 %,  
— nárůst střední hodnoty hmotnosti ryb v kontrolní skupin ě (kon­
trolních skupinách) musí být dostate čný na to, aby umožnil roze ­
znat minimální významnou zm ěnu rychlosti r ůstu. Okružní test 
(3) ukázal, že u pstruha duhového musí st řední hmotnost ryb 
v kontrolních skupinách vzr ůst alespoň o polovinu (tj. o 50 %) 
jejich počáteční hmotnosti za 28 dn ů; např. počáteční hmotnost: 
1 g/rybu (= 100 %), kone čná hmotnost po 28 dnech: ≥ 1,5 g/rybu 
(≥ 150 %);  
— koncentrace rozpušt ěného kyslíku musí dosahovat alespo ň 60 % 
hodnoty nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,  
— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními 
nádržemi lišit o více než ± 1  o C a měla by být udržována 
v rozpětí 2  o C v rozsahu teplot stanovených pro testovací druh 
(doplněk 1).  
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1.  Přístroje a pom ůcky 
Normální laboratorní vybavení a zejména:  
— přístroj pro stanovení kyslíku a pH-metr,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody a alkality,  
— vhodné za řízení pro regulaci teploty a pro její pokud možno 
nepřetržité sledování,  
— nádrže z chemicky inertního materiálu o vhodném objemu 
vzhledem k doporu čenému nasazování a obsádce (viz bod 
1.8.5 a dopln ěk 1),  
— dostate čně přesné váhy (tj. vážící s p řesností na ± 0,5 %).  
1.6.2.  Voda  
Jako zkušební voda m ůže být použita jakákoli voda, v níž testovací 
druh dlouhodob ě přežívá a roste. M ěla by mít po celou dobu 
zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by m ěla být v rozmezí 6,5 
až 8,5, avšak b ěhem zkoušky by se pH nem ělo lišit o více než 
± 0,5. Doporu čuje se tvrdost nad 140 mg/l (jako CaCO  3 ). S cílem 
zajistit, aby ředicí voda nem ěla nadměrný vliv na výsledek zkoušky 
(například v důsledku tvorby komplex ů zkoušené látky), by m ěly být 
v určitých intervalech odebírány vzorky k analýze. Je-li kvalita ředicí 
vody relativn ě konstantní, m ělo by být stanovení t ěžkých kov ů (např. 
Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniont ů a kationt ů (např. Ca, Mg, 
Na, K, Cl, SO  4 ), pesticid ů (např. celkový obsah organických fosfo ­
rových a chlorových pesticid ů), celkový obsah organického uhlíku 
a suspendovaných látek provedeno nap ř. každé t ři měsíce. Je-li 
prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespo ň jednoho 
roku, mohou být stanovení mén ě častá a intervaly lze prodloužit 
(např. každých šest m ěsíců). Některé chemické charakteristiky p řija­
telné ředicí vody jsou uvedeny v dopl ňku 2.  
1.6.3.  Zkušební roztoky  
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se p řipraví ředěním 
zásobního roztoku.  
Zásobní roztok by m ěl být připraven p řednostně jednoduchým 
mechanickým mícháním nebo prot řepáváním zkoušené látky 
v ředicí vod ě (např. mechanickým mícháním nebo pomocí ultrazvu ­
ku). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity syticí kolony.
 
Použití rozpoušt ědel nebo dispergátor ů (solubiliza čních činidel) 
může být v n ěkterých p řípadech pro vytvo ření zásobního roztoku 
o vhodné koncentraci nezbytné. Ke vhodným rozpoušt ědlům patří 
aceton, ethanol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid 
a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátor ům patří Cremophor 
RH40, Tween 80, 0,01 % methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (nap ř. aceton) nebo vysoce t ěkavé 
sloučeniny je t řeba používat s rozvahou, nebo ť mohou zp ůsobit 
problémy s r ůstem bakterií v pr ůtokových zkouškách. Je-li použito 
solubiliza ční činidlo, nesmí mít významné ú činky na r ůst ryb ani 
viditelné nep říznivé účinky na nedosp ělé ryby, což musí být 
prokázáno na kontrolní skupin ě vystavené pouze p ůsobení rozpouš ­
tědla.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Při průtokových zkouškách je pro zajišt ění řady koncentrací 
nezbytný systém, který nep řetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok 
zkoušené látky (nap ř. dávkovací čerpadlo, za řízení pro proporci ­
onální ředění, syticí systém). Pr ůtok zásobních roztok ů a ředicí 
vody by m ěl být v pr ůběhu zkoušky kontrolován v ur čitých interva ­
lech, nejlépe denn ě, a neměl by se v pr ůběhu zkoušky m ěnit o více 
než 10 %. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je vým ěna 
vody 6 litr ů na gram ryb za den p řijatelná (viz bod 1.8.2.2).  
U semistatických zkoušek (s obnovováním média) bude četnost 
obnovování média záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporu ­ 
čuje se obnovovat vodu denn ě. Není-li podle p ředběžných zkoušek 
stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními 
média stálá, (tj. nepohybuje-li se v intervalu 80–120 % nominální koncentrace nebo klesá-li pod 80 % nam ěřené počáteční koncentra ­
ce), měla by být zváženo použití pr ůtokové zkoušky.
 
1.6.4.  Výb ěr druhů 
Doporučeným druhem pro tuto zkoušku je pstruh duhový ( Oncor­
hynchus mykiss ), neboť u něj bylo v okružních testech získáno 
nejvíce zkušeností (1, 3). Mohou však být použity jiné dob ře 
popsané druhy, m ůže však být nutné v tomto p řípadě zkušební 
postup upravit, aby byly vytvo řeny vhodné zkušební podmínky. 
Zkušenosti jsou nap říklad s daniem pruhovaným ( Danio rerio ) (4, 
5) a halan číkem japonským ( Oryzias latipes ) (6, 7, 8). V takovém 
případě by m ěly být uvedeny d ůvody pro výb ěr druhu 
a experimentální podmínky.  
1.6.5.  Chov ryb  
Testovací ryby by m ěly pocházet z jednoho chovu (p řednostně ze 
stejného t ření), který se alespo ň dva týdny p řed zkouškou udržuje 
v podmínkách kvality vody a osv ětlení, které jsou podobné 
podmínkám použitým ve zkoušce. V pr ůběhu chovu a v pr ůběhu 
zkoušky by m ěly být krmeny množstvím potravy odpovídajícím 
minimáln ě 2 % tělesné hmotnosti za den a nejlépe 4 % t ělesné 
hmotnosti za den.  
Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se tato 
kritéria:  
— mortalita vyšší než 10 % populace za sedm dn ů: vyměnit celou 
obsádku,  
— mortalita od 5 do 10 % populace za sedm dn ů: aklimatizace 
dalších sedm dn ů; je-li mortalita b ěhem následujících sedmi 
dnů vyšší než 5 %, vym ění se celá obsádka,  
— mortalita nižší než 5 % populace za sedm dn ů: obsádka se 
přijme.  
Dva týdny p řed zkouškou nebo v pr ůběhu zkoušky nesmí být lé čeny 
u ryb žádné nemoci.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. USPO ŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY  
„Uspořádáním zkoušky“ se rozumí výb ěr počtu zkušebních koncen ­
trací a jejich odstup ňování, po čet nádrží pro každou koncentraci 
a počet ryb v nádrži. Uspo řádání by m ělo být v ideálním p řípadě 
zvoleno s ohledem na:  
— cíl studie,  
— metodu statistické analýzy, která bude použita,  
— dostupnost a cenu prost ředků pro experiment.  
S cílem studie by m ěly být specifikovány pokud možno statistická 
významnost, s jakou má být daná velikost zm ěny (např. změny 
rychlosti r ůstu) rozeznána, nebo p řesnost, s jakou má být odhadnuta 
hodnota EC  x (např. při x = 10, 20 nebo 30, pokud možno ne mén ě 
než 10). Bez t ěchto údaj ů nelze stanovit p řesně rozsah studie.  
Je důležité vzít na v ědomí, že uspo řádání, které je optimální (nejlépe 
využívá prost ředky) při použití jedné metody statistické analýzy, 
není nezbytn ě optimální pro jinou metodu. Doporu čené uspořádání 
pro odhad LOEC/NOEC tedy nebývá stejné jako uspo řádání pro 
analýzu regresí.  
V mnoha p řípadech se regresní analýze dává p řednost před analýzou 
rozptylu, a to z d ůvodů diskutovaných Stephanem a Rogersem (9). 
Není-li však nalezen vhodný regresní modelfound (r  2 < 0,9), m ěla by 
být použito stanovení NOEC/LOEC.  
1.7.1.  Uspo řádání pro regresní analýzu  
Pro uspo řádání zkoušky, která má být analyzována regresí, jsou 
důležitá tato hlediska:  
— koncentrace použité ve zkoušce musí v každém p řípadě pokrývat 
koncentraci vyvolávající ú činek (nap ř. EC  10,20,30  ) a rozsah 
koncentrací, p ři nichž dochází k ú činku, který je p ředmětem 
zájmu. P řesnost, s jakou mohou být odhadnuty koncentrace 
vyvolávající ú činek, bude nejlepší, bude-li koncentrace vyvolá ­
vající účinek ležet uprost řed rozsahu zkušebních koncentrací. 
Předběžné orienta ční zkoušky mohou být užite čné při výběru 
vhodných zkušebních koncentrací,  
— aby mohl být vytvo řen uspokojivý statistický model, m ěla by 
zkouška zahrnovat alespo ň jednu kontrolní nádrž a p ět dalších 
nádrží o r ůzných koncentracích. Pop řípadě by při použití solubi ­
lizačního činidla měla být vedle zkušebních skupin nasazena 
jedna kontrolní skupina vystavená koncentraci solubiliza čního 
činidla použité p ři nejvyšší zkušební koncentraci (viz body 
1.8.3 a 1.8.4),  
— může být použita vhodná geometrická nebo logaritmická řada 
koncentrací (10) (viz dopln ěk 3). Upřednostňuje se logaritmické 
stupňování koncentrací,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— je-li k dispozici více než šest nádrží, m ěly by být další nádrže 
použity bu ď pro duplicitní stanovení, nebo by m ěly být použity 
pro koncentrace rozložené v rozsahu koncentrací tak, aby se zmenšily rozestupy mezi koncentracemi. Ob ě použití lze 
doporučit stejnou m ěrou.
 
1.7.2.  Uspo řádání pro odhad NOEC/LOEC analýzou rozptylu 
(ANOVA)  
Pro každou koncentraci by m ěly být nejlépe k dispozici nádrže pro 
duplicitní stanovení a statistická analýza by m ěla být provedena na 
úrovni nádrže (11). Bez duplicitních nádrží není možné zohlednit jinou variabilitu mezi nádržemi, než jaká je d ůsledkem rozdíl ů 
mezi jednotlivými rybami. Ve vyšet řovaném p řípadě (12) se však 
ukázalo, že variabilita mezi nádržemi byla velmi malá ve srovnání 
s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami). Relativn ě přijatelnou 
alternativou je tedy provedení statistické analýzy pro jednotlivé ryby.
 
Zpravidla se použije alespo ň pět zkušebních koncentrací tvo řících 
geometrickou řadu s faktorem nep řekračujícím 3,2.  
Provádí-li se zkouška s duplicitními nádržemi, m ěl by být po čet 
duplicitních kontrolních nádrží, a tedy i po čet ryb, dvojnásobkem 
počtu použitého pro každou zkušební koncentraci, jenž by m ěl být 
pro všechny koncentrace stejný (13, 14, 15). Nejsou-li naproti tomu duplicitní nádrže použity, m ěl by být v kontrolní skupin ě stejný 
počet ryb jako ve skupin ě pro každou zkušební koncentraci.
 
Je-li ANOVA založena na nádržích namísto na jednotlivých rybách 
(což by znamenalo bu ď ryby jednotliv ě označit, nebo použít „pseu ­
dospecifickou“ rychlost r ůstu (viz bod 2.1.2)), je nezbytné po čet 
nádrží dostate čně znásobit, aby bylo možné stanovit sm ěrodatnou 
odchylku pro nádrže použité v rámci jednotlivé koncentrace. To 
znamená, že by m ěl být po čet stupňů volnosti pro chybu 
v analýze rozptylu alespo ň 5 (11). Je-li znásoben pouze po čet 
kontrolních skupin, existuje nebezpe čí, že bude zjišt ěná proměnlivost 
ovlivněna, neboť může narůstat se střední hodnotou sledované rych ­
losti růstu. Vzhledem k tomu, že rychlost r ůstu s nejv ětší pravděpo­
dobností klesá s rostoucí koncentrací, povede to k nadhodnocení variability.
 
1.8. POSTUP  
1.8.1.  Výb ěr a vážení testovacích ryb  
Je důležité minimalizovat rozdíly v hmotnostech ryb na za čátku 
zkoušky. Vhodná rozp ětí velikostí ryb r ůzných druh ů doporučených 
pro tuto zkoušku jsou uvedena v dodatku 1. Rozp ětí individuálních 
hmotností na za čátku zkoušky by m ělo být pro celou násadu ryb 
použitých ve zkoušce nejlépe ± 10 % aritmetického pr ůměru hmot­
ností a v žádném p řípadě by nemělo překročit 25 %. Doporu čuje se 
zvážit před zkouškou menší vzorek ryb s cílem odhadnout st řední 
hodnotu hmotnosti.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
24 hodin p řed zahájením zkoušky se obsádka ryb p řestane krmit. 
Poté se provede náhodný výb ěr ryb. Za použití b ěžného anestetika 
(např. vodný roztok trikain-methan-sulfonátu (MS 222) o koncentraci 
100 mg/l neutralizovaný p řídavkem dvou díl ů hydrogenuhli čitanu 
sodného na jeden díl MS 222) se ryby jednotliv ě s přesností 
uvedenou v dopl ňku 1 zváží za ú čelem stanovení živé hmotnosti 
(po osušení do sucha). Ryby s hmotností v požadovaném rozsahu se náhodn ě rozdělí do nádrží. Zaznamená se celková živá hmotnost 
ryb v každé zkušební nádrži. P ři manipulaci s rybami za použití 
anestetik (v četně osušení a zvážení) m ůže u nedosp ělých ryb, 
a zejména u druh ů o malé velikosti, dojít ke stresu a poran ění. 
S nedosp ělými rybami se tedy musí manipulovat s nejvyšší opatr ­
ností, aby nedošlo u testovacích ryb ke stresu a poran ění.
 
Ryby se op ět zváží po 28 dnech zkoušky (viz bod 1.8.6). Považuje-li 
se však za nezbytné nov ě vypočítat přísun potravy, mohou být ryby 
opět zváženy po 14 dnech zkoušky (viz bod 1.8.2.3). Ke stanovení 
změn velikosti ryb, na jejichž základ ě se upravuje p řísun potravy, 
může být použita jiná metoda, nap ř. fotografická metoda.  
1.8.2.  Podmínky expozice  
1.8.2.1.  Délka expozice  
Zkouška trvá 28 dn ů nebo déle.  
1.8.2.2.  Velikost násady a hustota obsádky  
Je důležité, aby velikost násady a hustota obsádky vyhovovaly použ ­
itému testovacímu druhu (viz dopln ěk 1). Je-li hustota obsádky p říliš 
vysoká, dojde ke stresu vedoucímu ke snížené rychlosti r ůstu 
a popřípadě k nemocem. Je-li p říliš nízká, m ůže vyvolat teritoriální 
chování, což by mohlo rovn ěž ovlivnit r ůst. V každém p řípadě by 
měla být velikost násady tak nízká, aby bylo možné udržet koncen ­
traci rozpušt ěného kyslíku na alespo ň 60 % ASV bez provzduš ňo­
vání. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je p řijatelná 
velikost násady 16 ryb o hmotnosti 3–5 g do objemu 40 litr ů. 
Doporučené obnovování vody b ěhem zkoušky je 6 litr ů na gram 
ryb za den.  
1.8.2.3.  Krmení  
Ryby by m ěly být krmeny dostate čným množstvím vhodného krmiva 
(dodatek 1), aby byla umožn ěna přijatelná rychlost r ůstu. Je třeba 
dbát na to, aby nedošlo k r ůstu mikroorganism ů a k zakalení vody. 
U pstruha duhového by m ělo těmto požadavk ům vyhovovat množ ­
ství odpovídající 4 % jejich t ělesné hmotnosti za den (3, 16, 17, 18). 
Denní množství m ůže být rozd ěleno na dva stejné díly a podáno 
rybám dvakrát za den s odstupem alespo ň pěti hodin. Množství se 
řídí celkovou po čáteční hmotností ryb v každé zkušební nádrži. 
Pokud se ryby op ět zváží 14. den, množství se nov ě vypočte. 24 
hodin před vážením se ryby p řestanou krmit.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Nespotřebovaná potrava a výkaly se ze zkušebních nádrží každý den 
odstraní d ůkladným odsátím ze dna každé nádrže.  
1.8.2.4.  Světlo a teplota  
Fotoperioda a teplota vody by m ěly vyhovovat testovacím druh ům 
(doplněk 1).  
1.8.3.  Zkušební koncentrace  
Obvykle je nutných p ět koncentrací zkoušené látky, a to bez ohledu 
na uspořádání zkoušky (viz bod 1.7.2). P ředchozí znalost toxicity 
zkoušené látky (nap ř. ze zkoušek akutní toxicity nebo 
z orientačních studií) by m ěla pomoci p ři volbě vhodných zkušeb ­
ních koncentrací. Použije-li se mén ě než pět koncentrací, m ělo by to 
být zdůvodněno. Nejvyšší zkušební koncentrace by nem ěla překročit 
rozpustnost látky ve vod ě. 
Použije-li se k usnadn ění přípravy zásobního roztoku solubiliza ční 
činidlo, nem ěla by být jeho kone čná koncentrace vyšší než 0,1 ml/l 
a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná (viz bod 1.6.3). 
Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepo ­
užívat.  
1.8.4.  Kontrolní skupiny  
Počet kontrolních skupin v ředicí vod ě závisí na uspo řádání zkoušky 
(viz body 1.7 až 1.7.2). Použije-li se solubiliza ční činidlo, měl by být 
nasazen stejný po čet kontrolních skupin se solubiliza čním činidlem 
jako s ředicí vodou.  
1.8.5.  Četnost analytických stanovení a m ěření 
Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky stanoví 
v pravidelných intervalech (viz níže).  
Při průtokových zkouškách se pr ůtok zásobních roztok ů toxické 
látky a ředicí vody kontroluje v ur čitých intervalech, p řednostně 
denně, a neměl by se v pr ůběhu zkoušky m ěnit o více než 10 %. 
Mají-li se koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. 80–120 %, viz body 1.6.2 a 1.6.3), doporu ­ 
čuje se, aby byly nejnižší a nejvyšší koncentrace analyzovány 
alespoň na začátku zkoušky a poté v týdenních intervalech. 
U zkoušek, u nichž se (na základ ě údajů o stálosti látky) nep ředpo­
kládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební 
koncentrace, a to stejn ě často jako u stálých látek.
 
U semistatických zkoušek (s obnovováním média), u nichž se má 
zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot, se doporu čuje analyzovat alespo ň nejvyšší a nejnižší 
zkušební koncentrace alespo ň na začátku studie ihned po jejich 
přípravě a bezprost ředně před obnovením a poté v týdenních inter ­
valech. U zkoušek, u nichž se nep ředpokládá, že se bude zkušební 
koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, musí 
být analyzovány všechny koncentrace stejn ě často jako u stálejších 
látek.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Doporučuje se zakládat výsledky na nam ěřených koncentracích. Lze- 
li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkou ­ 
šené látky v roztoku uspokojiv ě udržována v rozmezí ± 20 % nomi ­
nální hodnoty nebo m ěřené počáteční koncentrace, mohou být 
výsledky založeny na nominálních nebo nam ěřených hodnotách.  
Může být nezbytné vzorky filtrovat (nap ř. přes filtr s pr ůměrem pórů 
0,45 μm nebo odst ředit. Doporu čuje se odst řeďování. Neadsorbuje-li 
se zkoušená látka na filtry, je filtrace p řijatelná.  
V průběhu zkoušky se m ěří v každé zkušební nádrži množství 
rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost, alkalita 
a popřípadě salinita se m ěří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži 
s nejvyšší koncentrací. Množství rozpušt ěného kyslíku a salinita 
(podle pot řeby) se m ěří alespoň třikrát (na za čátku, uprost řed a na 
konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporu čuje měřit 
množství rozpušt ěného kyslíku častěji, přednostně před každým 
obnovením média a po n ěm, nebo alespo ň jednou týdn ě. pH se 
měří na začátku a na konci každé vým ěny vody u statických zkoušek 
a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody a alkalita se 
měří v každé zkoušce jednou. Teplota se m ěří přednostně nepřetržitě 
alespoň v jedné zkušební nádrži.  
1.8.6.  Pozorování  
Hmotnost: na konci každé zkoušky se musí ryby, které p řežily, 
zvážit za ú čelem stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha), 
a to buď jako skupina pro každou zkušební nádrž, nebo jednotliv ě. 
Vážení ryb jako skupin se up řednostňuje před vážením jednotlivých 
ryb, které vyžaduje, aby byly ryby jednotliv ě označeny. V p řípadě 
vážení jednotlivých ryb pro stanovení individuální specifické rych ­
losti růstu by nem ěla zvolená technika ozna čení vyvolávat u ryb 
stres (alternativou ke zna čení ryb vymražením m ůže být pop řípadě 
použití barevného jemného rybá řského vlasce).  
Ryby se v pr ůběhu zkoušky vyšet řují denně a jakékoli vn ější abnor­
mality (hemoragie, odbarvení) a neobvyklé chování se zaznamená. 
Každý úhyn se zaznamená a uhynulé ryby se co nejd říve odstraní. 
Uhynulé ryby se nenahrazují, nebo ť velikost násady a hustota 
obsádky by m ěly být dostate čné na to, aby nedošlo k ovlivn ění 
růstu v důsledku zm ěn počtu ryb v nádrži. Bude však nutné upravit 
množství krmiva.  
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Doporučuje se, aby se navrhování i analýzy zkoušky ú častnil statis ­
tik, nebo ť tato zkušební metoda umož ňuje značné variace 
v experimentálním uspo řádání, nap říklad v po čtu zkušebních nádrží, 
v počtu zkušebních koncentrací, v po čtu ryb atd. S ohledem na 
možnosti uspo řádání zkoušky zde nejsou uvedeny specifické pokyny 
pro postup statistického zpracování.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Rychlost r ůstu se nevypo čítává pro zkušební nádrže, v nichž morta ­
lita překročila 10 %. Velikost mortality se však uvede pro všechny 
zkušební koncentrace.  
Bez ohledu na použitou metodu analýzy údaj ů je hlavním ukaza ­
telem specifická rychlost r ůstu r od okamžiku t  1 do t  2 . Může být 
definována n ěkolika zp ůsoby v závislosti na tom, zda jsou, či nejsou 
ryby individuáln ě značeny nebo zda se požaduje pr ůměrná hodnota 
pro nádrž.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
kde, 
r 1 = individuální specifická rychlost r ůstu ryby,  
r 2 = průměrná specifická rychlost r ůstu pro nádrž,  
r 3 = „pseudospecifická“ rychlost r ůstu, 
w 1 , w 2 = hmotnosti ur čité ryby v čase t  1 a t 2 , 
log e w 1 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na za čátku 
vyšetřovacího intervalu,  
log e w 2 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na konci 
vyšetřovacího intervalu,  
log e W 1 = průměr logaritm ů hodnot w  1 pro ryby v nádrži na 
začátku vyšet řovacího intervalu,  
log e W 2 = průměr logaritm ů hodnot w  2 pro ryby v nádrži na 
konci vyšet řovacího intervalu,  
t 1 , t 2 = čas (ve dnech) za čátku a konce vyšet řovacího inter ­
valu.  
r 1 , r 2 , r 3 mohou být vypo čteny pro interval 0–28 dn ů a popřípadě 
(bylo-li provedeno m ěření 14. den) pro intervaly 0–14 a 14–28 dn ů. 
2.1.1.  Analýza výsledk ů regrese (modelování závislosti koncentrace- 
odezva)  
V této metod ě analýzy se závislostí mezi specifickou rychlostí r ůstu 
a koncentrací proloží vhodná matematická funkce, a to umožní 
odhadnout „EC  x “, tj. jakoukoli požadovanou hodnotu EC. U této 
metody není nutný výpo čet r pro jednotlivou rybu (r  1 ) a namísto 
toho se analýza m ůže založit na pr ůměrné hodnot ě r (r  2 ) pro nádrž. 
Dává se p řednost posledn ě uvedené metod ě. Je také vhodn ější při 
použití velmi malých druh ů. 
Průměrné specifické rychlosti r ůstu pro nádrž (r  2 ) se graficky 
vynesou proti koncentraci, aby bylo možno zkontrolovat závislost 
odezvy na koncentraci.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
K vyjádření závislosti r  2 na koncentraci se zvolí vhodný model; jeho 
volba musí být řádně zdůvodněna. 
Liší-li se pro jednotlivé nádrže po čty ryb, které p řežily, je nutno 
prokládání každé závislosti, a ť již jednoduché nebo nelineární, 
vážit s ohledem na r ůzné velikosti skupin.  
Metoda proložení modelu musí umožnit odhadnout nap říklad 
hodnotu EC  20 a stanovit její rozptyl (bu ď směrodatnou odchylku, 
nebo interval spolehlivosti). Graf proložené závislosti se vynese spolu s údaji, aby byla z řejmá vhodnost použitého modelu (9, 19, 
20, 21).
 
2.1.2.  Analýza výsledk ů pro odhad LOEC  
Bylo-li ve zkoušce použito pro každou koncentraci více nádrží, m ůže 
být odhad LOEC založen na analýze rozptylu (ANOVA) pr ůměrné 
specifické rychlosti r ůstu pro nádrž (viz bod 2.1) a poté na vhodném 
srovnání pr ůměrné hodnoty r pro každou koncentraci s pr ůměrnou 
hodnotou r pro kontrolní skupiny (nap ř. Dunnettovým nebo Willi ­
amsovým testem (13, 14, 15, 22)) s cílem zjistit nejmenší koncen ­
traci, u níž je na hladin ě spolehlivosti 0,05 tento rozdíl významný. 
Nejsou-li p ředpoklady pro použití parametrických metod spln ěny, 
kvůli jinému než normálnímu rozd ělení (nap ř. se použije Shapiro- 
Wilkův test) nebo kv ůli heterogennímu rozptylu (Bartlett ův test), 
měla by být p řed provedením ANOVA zvážena transformace údaj ů 
za účelem homogenizace rozptyl ů nebo by m ěla být provedena 
vážená ANOVA.  
Nebylo-li pro každou koncentraci použito více nádrží, není použití 
ANOVA u jednotlivé nádrže dostate čně citlivé nebo je nemožné. 
v takovém p řípadě je přijatelným kompromisem založit ANOVA 
na „pseudospecifické“ rychlosti r ůstu r  3 pro jednotlivé ryby.  
Průměrná hodnota r  3 pro každou koncentraci m ůže být poté porov ­
nána s pr ůměrnou hodnotou r  3 pro kontrolní skupiny. Hodnotu 
LOEC lze poté nalézt výše uvedeným zp ůsobem. The LOEC can 
then be identified as before. Je t řeba vzít na v ědomí, že tato metoda 
neumožňuje zohlednit variabilitu mezi nádržemi ve v ětší míře, než 
s jakou se po čítá v důsledku variability mezi rybami, a ani p řed ní 
nechrání. Ukázalo se však (9), že variabilita mezi nádržemi byla 
velmi malá ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi ryba ­
mi). Nejsou-li v analýze zahrnuty jednotlivé ryby, musí být uvedena metoda zjišt ění odlehlých hodnot a její použití musí být zd ůvodněno.
 
2.2. INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Výsledky je t řeba interpretovat opatrn ě, leží-li nam ěřené hodnoty 
koncentrací toxické látky v roztocích blízko meze stanovitelnosti analytické metody nebo klesá-li u semistatických zkoušek koncent ­
race zkoušené látky od okamžiku p řípravy roztoku do jeho obnovení.
 
2.3. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha, fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— údaje o chemické identifikaci v četně údajů o čistotě a podle 
potřeby o metod ě kvantitativního stanovení zkoušené látky.  
2.3.2.  Testovací druh:  
— vědecký název, podle možnosti,  
— kmen, velikost, p ůvod, jakákoli p říprava atd.  
2.3.3.  Zkušební podmínky:  
— použitý zkušební postup (nap ř. semistatický/s obnovováním, 
průtokový, nasazování, hustota obsádky atd.),  
— uspořádání zkoušky (nap ř. počet zkušebních nádrží, zkušební 
koncentrace a znásobení po čtu nádrží, po čet ryb v nádrži),  
— metoda p řípravy zásobních roztok ů a četnost obnovování (je-li 
použito, uvede se solubiliza ční činidlo a jeho koncentrace),  
— nominální zkušební koncentrace, pr ůměry naměřených hodnot 
v jednotlivých nádržích, jejich sm ěrodatné odchylky a metody 
jejich stanovení a d ůkazy toho, že nam ěřené hodnoty odpovídají 
koncentracím zkoušené látky v pravém roztoku,  
— charakteristiky ředicí vody: pH, alkalita, tvrdost, teplota, koncent ­
race rozpušt ěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li 
měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendo ­
vaných pevných látek, pop řípadě salinita zkušebního média 
a výsledky jakýchkoli jiných provedených m ěření, 
— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota 
a koncentrace rozpušt ěného kyslíku,  
— podrobné informace o krmení (nap ř. druh krmiva (krmiv), p ůvod, 
podávané množství a frekvence krmení).  
2.3.4.  Výsledky:  
— doklady o tom, že kontrolní skupiny vyhov ěly kriteriu p řežití, 
a údaje o mortalit ě pro každou zkušební koncentraci,  
— použité metody statistické analýzy, statistiky založené na znáso ­
beném po čtu nádrží nebo na jednotlivých rybách, zpracování 
údajů a zdůvodnění použitých metod,  
— údaje ve form ě tabulky o individuálních a st ředních hodnotách 
hmotností ryb v den 0, 14 (bylo-li provád ěno vážení) a 28, 
hodnoty pr ůměrných rychlostí r ůstu pro nádrž nebo pop řípadě 
pseudospecifických rychlostí r ůstu pro intervaly 0–28 dn ů nebo 
popřípadě 0–14 a 14–28 dn ů, 
— výsledky statistické analýzy (tj. regresní analýzy nebo ANOVA) 
přednostně ve form ě tabulky nebo v grafické form ě a hodnota 
LOEC (p = 0,05) a NOEC nebo ECx, pop řípadě se směrodat­
nými odchylkami,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— výskyt jakýchkoli neobvyklých reakcí ryb a viditelné ú činky 
vyvolané zkoušenou látkou.  
3. LITERATURA  
1) Solbe J.F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. 
WRc Report No. PRD 1388-M/2.  
2) Meyer, A., Bierman, C. H., Orti, G. (1993). The phylogenetic 
position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in deve ­
lopmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231–236.
 
3) Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J. (1990). EEC Ring Test 
of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the 
European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
4) Crossland N.O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, str. 1855–1870.  
5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B.B. (1991). Effect of 3,4-dich ­
loroaniline on the early life stages of the Zebrafish ( Brachy­
danio rerio ): results of a comparative laboratory study. Ecotox. 
Environ. Safety, 21, str. 157–164.  
6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological 
field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
 
7) Holcombe, G.W., Benoit D.A., Hammermeister, D.E., Leonard, 
E.N. and Johnson, R.D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka ( Oryzias latipes ).Arch. 
Environ. Conta. Toxicol. 28, str. 287–297.
 
8) Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L. (1991). Guide ­
lines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka ( Oryzias latipes ). Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minesota.
 
9) Stephan C.E. and Rogers J.W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Sympo ­
sium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, Eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, str. 328–338.
 
10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS 1/RM/28, str. 81.
 
11) Cox D.R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.  
12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on 
Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10–12 December 
1991.
 
13) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, str. 1096–1121.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
14) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, str. 482–491.  
15) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, str. 103–117.
 
16) Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T. (1994). 
A technique using sequential feedings of different coloured 
food to determine food intake by individual rainbow trout,  
Oncorhynchus mykiss : effect of feeding level. Aquaculture 
120, 123–133.  
17) Quinton, J. C. and Blake, R.W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response 
in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss . Journal of Fish 
Biology, 37, 33–41.  
18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, 
Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 str.  
19) Bruce, R.D. and Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485–1494.
 
20) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, 
J.H., Dean, Marcus, M.D. and McIntyre, D.O. (1989). Precision 
of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power Rese ­
arch Institute, Palo alto, CA.
 
21) Norbert-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment 
Center. Sept. 1988. 12 str. 12.
 
22) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, str. 510–531.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
Doplněk 1 
DRUHY RYB DOPORU ČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY  
Druhy Doporučený rozsah 
zkušební teploty 
( o C) Fotoperioda 
(h) Doporučené rozpětí 
počáteční hmot­
nosti ryb 
(g) Doporučená přesnost 
měření Velikost násady 
(g/l) Hustota obsádky 
(l -1 ) Krmivo Délka zkoušky 
(d) 
Doporučené druhy:  
Oncorhynchus mykiss  
pstruh duhový 12,5–16,0 12–16 1–5 na 100 mg 1,2–2,0 4 zna čkové sušené krmivo pro 
mladé lososovité ≥ 28 
Jiné dob ře popsané druhy:  
Danio rerio  
danio pruhované 21–25 12–16 0,050–0,100 na 1 mg 0,2–1,0 5–10 živé krmivo ( Brachionus Arte ­
mia) ≥ 28 
Oryzias latipes  
halančík japonský 21–25 12–16 0,050–0,100 na 1 mg 0,2–1,0 5–20 živé krmivo ( Brachionus Arte ­
mia) ≥ 28
DOPLNĚK 2 
NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY P ŘIJATELNÉ 
ŘEDICÍ VODY  
LÁTKA KONCENTRACE  
Nerozpušt ěné látky < 20 mg/l 
Celkový organický uhlík < 2 mg/l 
Volný amoniak < 1 μg/l 
Zbytkový chlor < 10 μg/l 
Celkové organofosforové pesticidy < 50 ng/l Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované 
bifenyl < 50 ng/l 
Celkový organický chlor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
DOPLNĚK 3 
Logaritmické řady koncentrací vhodných pro zkoušku toxicity (9)  
Sloupec (po čet koncentrací mezi 100 a 10, nebo mezi 10 a 1) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Ze sloupc ů může být zvolena řada pěti (nebo více) po sob ě jdoucích koncentrací. Mezilehlé body pro koncentrace ve sloupci (x) 
jsou uvedeny ve sloupci (2x + 1). Uvedené hodnoty mohou být koncentracemi vyjád řenými v objemových nebo hmotnostních 
procentech (mg/l nebo μg/l). Hodnoty mohou být podle pot řeby násobeny nebo d ěleny jakoukoli mocninou 10. Sloupec 1 by se 
měl použít, pokud je úrove ň toxicity zna čně neurčitá. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  ZKOUŠKA KRÁTKODOBÉ TOXICITY NA RYBÍM EMBRYU 
A VÁČKOVÉM PL ŮDKU  
1. METODA  
Tato zkouška krátkodobé toxicity je replikou metody OECD TG 212 
(1998).  
1.1. ÚVOD  
Tato zkouška krátkodobé toxicity na rybím embryu a vá čkovém 
plůdku je krátkodobou zkouškou, p ři níž jsou exponována životní 
stadia od čerstvě oplodněných jiker do stadia vá čkových pl ůdků. Při 
zkoušce na embryu a na vá čkovém pl ůdku se nekrmí, a zkouška by 
tedy měla být ukon čena, dokud je vá čkový plůdek stále vyživován 
ze žloutkového vá čku. 
Zkouška je ur čena k zjišt ění letálních a v omezené mí ře subletálních 
účinků chemických látek na specifická stadia a testovací druhy. Tato 
zkouška by m ěla poskytnout užite čné informace, nebo ť by a) mohla 
být přechodem mezi letálními a subletálními zkouškami, b) mohla 
být použita jako screeningová zkouška pro úplnou zkoušku toxicity 
na raných životních stadiích nebo pro zkoušky chronické toxicity 
a c) mohla být použita pro zkoušení na druzích, u nichž nejsou dostatečně rozvinuty chovné techniky, aby pokryly období od endo ­
genní výživy k exogenní.
 
Je třeba mít na pam ěti, že pouze zkoušky pokrývající celý životní 
cyklus ryb obecn ě umožňují odhadnout chronickou toxicitu 
chemické látky pro ryby a že jakékoli omezení expozice n ějakého 
životního stadia m ůže snížit citlivost, a tím podhodnotit chronickou 
toxicitu. O čekává se tedy, že zkouška na embryu a vá čkovém pl ůdku 
je méně citlivá než úplná zkouška na raných životních stadiích, 
zejména pokud jde o vysoce lipofilní chemické látky (log P  ov > 4) 
a chemické látky se specifickým mechanismem toxického ú činku. 
v citlivostech t ěchto dvou zkoušek se však o čekávají menší rozdíly 
v případě chemických látek s nespecifickým, narkotickým mecha ­
nismem ú činku (1).  
Před publikováním této zkoušky bylo nejvíce zkušeností s touto 
zkouškou na embryu a vá čkovém pl ůdku získáno u sladkovodní 
ryby Danio rerio  Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – 
obecný název danio pruhované). Podrobn ější pokyny pro zkoušku 
s tímto druhem jsou tedy uvedeny v dopl ňku 1. To nevylu čuje 
použití jiného druhu, pro n ěhož jsou zkušenosti rovn ěž k dispozici 
(tabulky IA a IB).  
1.2. DEFINICE  
Nejnižší koncentrace s pozorovanými ú činkyLowest Observed 
Effect Concentration (LOEC) : je nejnižší zkušební koncentrace 
zkoušené látky, p ři níž jsou u látky pozorovány významné ú činky 
ve srovnání s kontrolou (na hladin ě spolehlivosti p < 0,05). Všechny 
zkušební koncentrace vyšší než LOEC musí mít škodlivé ú činky 
stejné nebo v ětší, než ú činky pozorované p ři LOEC.  
Koncentrace bez pozorovaných ú činků No Observed Effect 
Concentration (NOEC) : je zkušební koncentrace bezprost ředně 
nižší než LOEC.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Rybí embrya a vá čkové plůdky se vystaví rozsahu koncentrací zkou ­ 
šené látky rozpušt ěné ve vod ě. Zkouška umož ňuje volit mezi semis ­
tatickým a pr ůtokovým uspo řádáním. Volba závisí na povaze zkou ­ 
šené látky. Zkouška se zahájí umíst ěním oplodn ěných jiker do 
zkušebních nádrží a ukon čí se těsně před tím, než dojde k úplné 
absorpci žloutkového vá čku čerstvých pl ůdků v některé ze zkušeb ­
ních nádrží, nebo než za čne v kontrolních skupinách docházet 
k úhynu v d ůsledku hladov ění. Posoudí se letální a subletální ú činky 
a porovnají se s hodnotami kontrolních skupin s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými ú činky, a tedy koncentraci 
bez pozorovaných ú činků. Mohou být pop řípadě analyzovány za 
použití regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která způsobuje ur čitý procentuáln ě vyjádřený účinek (tj. LC/ECx, kde 
x je definovaný procentuální ú činek).
 
1.4. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Měly by být dostupné výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda 
C.1) provedené p řednostně na druhu zvoleném pro tuto zkoušku. 
Výsledky mohou být užite čné při výběru vhodného rozsahu zkušeb ­
ních koncentrací ve zkoušce na raných životních stadiích. M ěly by 
být známy rozpustnost látky ve vod ě (včetně rozpustnosti ve 
zkušební vod ě) a tlak par látky. M ěla by být k dispozici vhodná 
analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkoušených 
roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.
 
Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro ú čely stanovení 
zkušebních podmínek jsou strukturní vzorec, čistota látky, stálost 
na světle, pKa, P  ov a výsledky zkoušky snadné biologické rozloži ­
telnosti (viz metoda C.4).  
1.5. VALIDITA ZKOUŠKY  
Má-li být zkouška platná, musí být spln ěny tyto podmínky:  
— celková míra p řežití oplodn ěných jiker v kontrolních skupinách 
a podle pot řeby v nádržích, do nichž bylo p řidáno pouze 
rozpouštědlo, musí být rovna limit ům stanoveným v dodatcích 
2 a 3 nebo vyšší,  
— koncentrace rozpušt ěného kyslíku musí ležet mezi 60 a 100 % 
hodnoty nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,  
— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními 
nádržemi nebo mezi dny, které po sob ě následují, lišit o více než 
± 1,5  o C a měla by být udržována v rozp ětí teplot stanoveném pro 
testovací druh (dodatky 2 a 3).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1.  Zkušební nádrže  
Mohou být použity jakékoli nádrže ze skla nebo z jiného inertního 
materiálu. Rozm ěry zkušebních nádrží by m ěly být dostate čné 
k tomu, aby vyhovovaly velikosti násady (viz bod 1.7.1.2). Doporu ­ 
čuje se, aby byly nádrže umíst ěny ve zkušebním prostoru náhodn ě. 
Uspořádání do náhodných blok ů se zastoupením všech variant expo ­
zice v každém bloku se up řednostňuje před zcela náhodným uspo ­ 
řádáním, kdy existují systémové ú činky v laborato ři, které mohou 
být blokovým uspo řádáním kontrolovány. Je-li použito blokové 
uspořádání, m ělo by být zohledn ěno při následné analýze údaj ů. 
Nádrže by m ěly být chrán ěny před nežádoucími rušivými vlivy.  
1.6.2.  Výb ěr druhů ryb  
Doporučené druhy ryb jsou uvedeny v tabulce 1A. To nevylu čuje 
použití jiného druhu (p říklady jsou uvedeny v tabulce 1B), avšak 
zkušební postup musí být upraven tak, aby byly vytvo řeny vhodné 
zkušební podmínky. V takovém p řípadě by měly být uvedeny 
důvody pro výb ěr druhu a experimentální podmínky.  
1.6.3.  Chov mate čných ryb  
Podrobnosti o chovu mate čných ryb v uspokojivých podmínkách 
jsou uvedeny v metod ě OECD TG 210 (  1 ) a v odkazech (2, 3, 4, 
5, 6).  
1.6.4.  Chov embryí a pl ůdků 
Embrya a pl ůdky mohou být exponovány v hlavní nádrži v menších 
nádobách s pletivovými st ěnami nebo konci, aby jimi mohl proudit 
zkušební roztok. Neví řivého průtoku nádobami lze dosáhnout jejich 
zavěšením do ramen, pomocí nichž lze pohybovat nádobami nahoru 
a dolů, přičemž organismy z ůstanou stále pono řeny; lze rovn ěž 
použít systém sifonového pr ůtoku. Oplodn ěné jikry lososovitých 
ryb mohou ležet na podložce nebo pletivu s dostate čně velkými 
oky, aby jimi mohly pl ůdky po vylíhnutí propadnout. K p řemístění 
embryí a pl ůdků v semistatické zkoušce s každodenní úplnou 
výměnou média je vhodné použít odsáva čky (viz bod 1.6.6).  
Jsou-li k udržení jiker v hlavní nádrži použity nádoby, m řížky nebo 
pletiva, m ěly by být po vylíhnutí pl ůdků odstraněny (  1 ), pokud 
ovšem nemají být ponechány k zamezení úniku ryb. Je-li t řeba 
přemístit pl ůdky, nem ěly by být vystaveny vzduchu a nem ěly by 
se k jejich vytažení z nádob používat sí ťky (taková opatrnost není 
nutná u mén ě křehkých druh ů, např. u kapra). Okamžik p řemístění 
se liší podle druhu a p řemístění nemusí být vždy nutné. 
U semistatických technik mohou být použity kádinky nebo m ělké 
nádobky a podle pot řeby mohou být opat řeny sítem umíst ěným 
nepatrně nad dnem kádinky. Je-li objem t ěchto nádob dostate čný, 
aby vyhovoval požadavk ům na nasazování (viz bod 1.7.1.2), nemusí 
být přemístění embryí nebo pl ůdků nutné.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, „Fish, Early-life Stage Toxicity Test“.
 1.6.5.  Voda  
Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoli voda, která vyhovuje 
chemickým charakteristikám p řijatelné ředicí vody, jak jsou uvedeny 
v dodatku 4, a v níž testovací druhy kontrolních skupin p řežívají 
alespoň tak, jak je uvedeno v dodatcích 2 a 3. M ěla by mít po celou 
dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by se nem ěla měnit 
o více než ± 0,5. Pro ujišt ění, že voda nebude mít p řílišný vliv na 
výsledky zkoušky (nap říklad tvorbou komplex ů se zkoušenou 
látkou) nebo nep říznivý vliv na stav mate čných ryb, by m ěly být 
odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Je-li kvalita ředicí vody relativn ě konstantní, m ělo by být stanovení 
těžkých kov ů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniont ů 
a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), pesticid ů (např. celkový 
obsah organických fosforových a chlorových pesticid ů), celkový 
obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno nap ř. 
každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po 
dobu alespo ň jednoho roku, mohou být stanovení mén ě častá 
a intervaly lze prodloužit (nap ř. každých šest m ěsíců). 
1.6.6.  Zkušební roztoky  
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se p řipraví ředěním 
zásobního roztoku.  
Zásobní roztok by m ěl být připraven p řednostně jednoduchým 
mechanickým mícháním nebo prot řepáváním zkoušené látky 
v ředicí vod ě (např. mechanickým mícháním nebo pomocí ultrazvu ­
ku). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být 
použity syticí kolony. Nem ěla by být používána rozpoušt ědla nebo 
dispergátory (solubiliza ční činidla), v n ěkterých p řípadech však m ůže 
být použití takových látek pro vytvo ření zásobního roztoku o vhodné 
koncentraci nezbytné. Ke vhodným rozpoušt ědlům patří aceton, etha ­
nol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a triethylengly ­
kol. Ke vhodným dispergátor ům patří Cremophor RH40, Tween 80, 
0,01 % methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná činidla (nap ř. aceton) nebo vysoce t ěkavé slou čeniny je t řeba 
používat rozvážn ě, neboť mohou zp ůsobit problémy s r ůstem bakterií 
v průtokových zkouškách. Je-li použito solubiliza ční činidlo, nesmí 
mít významné ú činky na p řežití ani viditelné nep říznivé účinky na 
raná životní stadia, což musí být prokázáno na kontrolní skupin ě 
vystavené pouze rozpoušt ědlu. Měla by však být vynaložena maxi ­
mální snaha takové látky nepoužívat.
 
U semistatických technik mohou být použity dva r ůzné postupy 
obměny; buď i) se do čistých nádob p řipraví nové zkušební roztoky 
a přežívající jikry a pl ůdky se s malým objemem starého roztoku 
opatrně přemístí do nových nádob, aniž by se vystavily vzduchu, 
nebo ii) se testovací organismy ponechají v nádob ě a vymění se 
určitý podíl (alespo ň tři čtvrtiny) zkušební vody. Četnost obnovování 
média bude záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporu čuje se 
obnovovat médium denn ě. Není-li podle p ředběžných zkoušek 
stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními 
média stálá, (tj. nepohybuje-li se v intervalu 80–120 % nominální koncentrace nebo klesá-li pod 80 % nam ěřené počáteční koncentra ­
ce), měla by být zváženo použití pr ůtokové zkoušky. V každém 
případě je třeba dbát na to, aby pl ůdky nebyly p ři obnovování 
vody vystaveny stresu.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Při průtokových zkouškách je pro zajišt ění řady koncentrací 
nezbytný systém, který nep řetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok 
zkoušené látky (nap ř. dávkovací čerpadlo, za řízení pro proporci ­
onální ředění, syticí systém). Pr ůtok zásobních roztok ů a ředicí 
vody by m ěl být kontrolován v ur čitých intervalech, nejlépe denn ě, 
a neměl by se v pr ůběhu zkoušky m ěnit o více než 10 %. Jako 
vhodný byl shledán pr ůtok odpovídající vým ěně alespoň pětinásobku 
objemu nádrže za 24 hodin (2).  
1.7. POSTUP  
Užitečné informace o provád ění zkoušek toxicity na rybím embryu 
a váčkovém pl ůdku jsou dostupné v literatu ře, přičemž některé lite­
rární zdroje jsou uvedeny v tomto textu v oddílu s literaturou (7, 8, 9).  
1.7.1.  Podmínky expozice  
1.7.1.1.  Délka expozice  
Zkouška se zahájí p řednostně do 30 minut po oplodn ění jiker. 
Embrya se pono ří do zkušebního roztoku p řed započetím rýhování 
blastuly nebo co nejd říve po n ěm, a v každém p řípadě před 
počátkem stadia gastruly. U jiker získaných od komer čního dodava ­
tele nemusí být možné zahájit zkoušku ihned po oplodn ění. 
Vzhledem k tomu, že citlivost zkoušky m ůže být vážn ě ovlivněna 
zpožděním začátku zkoušky, m ěla by být zkouška zahájena do osmi 
hodin po oplodn ění. Vzhledem k tomu, že se pl ůdky v pr ůběhu 
expozice nekrmí, ukon čí se zkouška t ěsně před tím, než dojde 
k úplné absorpci žloutkového vá čku u některého pl ůdku v některé 
ze zkušebních nádrží, nebo než za čne v kontrolních skupinách 
docházet k úhynu v d ůsledku hladov ění. Délka zkoušky bude záviset 
na použitém druhu. N ěkteré doporu čené délky zkoušky jsou uvedeny 
v dodatcích 2 a 3.  
1.7.1.2.  Nasazování  
Počet oplodn ěných jiker na za čátku zkoušky by m ěl dostatečný ke 
splnění statistických požadavk ů. Měly by být náhodn ě rozděleny 
mezi varianty expozice a na jednu koncentraci by m ělo být rozd ě­
leno alespo ň 30 jiker rovným dílem (nebo alespo ň tak, jak je to 
možné s ohledem na to, že u n ěkterých druh ů může být obtížné 
získat stejn ě velké podíly) mezi alespo ň tři zkušební nádrže. Velikost 
násady (biomasa v jednotce objemu) by m ěla být tak nízká, aby bylo 
možné udržet koncentraci rozpušt ěného kyslíku na alespo ň 60 % 
hodnoty ASV bez provzduš ňování. U pr ůtokových zkoušek se 
doporučuje nasazování nep řekračující 0,5 g/l za 24 hodin a v žádném 
okamžiku nep řekračující 5 g/l roztoku (2).  
1.7.1.3.  Světlo a teplota  
Fotoperioda a teplota zkušební vody by m ěly vyhovovat testovacím 
druhům (dodatky 2 a 3). Pro ú čely sledování teploty m ůže sloužit 
další zkušební nádrž.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Zkušební koncentrace  
Obvykle je nezbytných p ět koncentrací zkoušené látky lišících se od 
sebe konstatním faktorem nep řekračujícím 3,2. P ři výběru rozsahu 
zkušebních koncentrací by m ěla být zohledn ěna křivka závislosti 
hodnoty LC  50 na délce expozice ve studii akutní toxicity. Za ur čitých 
okolností m ůže být oprávn ěné použít mén ě než pět koncentrací, 
např. v limitní zkoušce, a užší rozsah koncentrací. Použití mén ě 
než pěti koncentrací by m ělo být zd ůvodněno. Koncentrace látky, 
které jsou vyšší než 96hodinová LC  50 nebo vyšší než 100 mg/l, 
podle toho, co je nižší, nemusí být zkoušeny. Látky by nem ěly 
být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve 
zkušební vod ě. 
Použije-li se k usnadn ění přípravy zásobního roztoku solubiliza ční 
činidlo (viz bod 1.6.6), nem ěla by být jeho kone čná koncentrace ve 
zkušební nádrži vyšší než 0,1 ml/l a m ěla by být ve všech zkušeb ­
ních nádržích stejná.  
1.7.3.  Kontrolní skupiny  
Jako další zkušební sady by m ěly být nasazeny kontrolní skupina 
v ředicí vod ě (příslušným zp ůsoben znásobená) a podle pot řeby také 
jedna kontrolní skupina se solubiliza čním činidlem (p říslušným 
způsoben znásobená).  
1.7.4.  Četnost analytických stanovení a m ěření 
Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky stanovují 
v pravidelných intervalech.  
U semistatických zkoušek, u nichž se má zkušební koncentrace 
pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. 80–120 %, viz bod 1.4 a 1.6.6), se doporu čuje analyzovat nejvyšší a nejnižší 
zkušební koncentrace na za čátku studie, ihned po jejich p řípravě, 
a bezprost ředně před obnovením, a to alespo ň třikrát ve stejných 
intervalech v pr ůběhu celé doby zkoušky (tj. analýzy se provedou 
na vzorku z téhož roztoku – ihned po jeho p řípravě a při jeho 
obnovení).
 
U zkoušek, u nichž se (na základ ě údajů o stálosti látky) nep ředpo­
kládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace ihned po jejich p řípravě a před jejich vým ěnou, a to 
stejně často (tj. alespo ň ve třech okamžicích rovnom ěrně rozložených 
na celou dobu zkoušky). Stanovení koncentrací zkoušené látky p řed 
obnovením je t řeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné 
paralelní nádrže. Stanovení se provád ějí v odstupu ne více než 7 
dnů. Doporu čuje se, aby výsledky byly založeny na nam ěřených 
koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace uspokojiv ě udržována v rozmezí ± 20 % nominální 
hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo nam ě­ 
řených po čátečních hodnotách.
 
Pro průtokové zkoušky je vhodný podobný vzorkovací režim, jaký je 
popsán u semistatických zkoušek (v tomto p řípadě se však neprovádí 
měření „starých“ roztok ů). Je-li však zkouška delší než sedm dn ů, 
doporučuje se zvýšit po čet odběrů v prvním týdnu (nap ř. tři sady 
měření) pro ujišt ění, že jsou zkušební koncentrace stálé.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Může být nezbytné vzorky odst ředit nebo filtrovat (nap ř. přes filtr 
s průměrem pórů 0,45 μm). Vzhledem k tomu, že však odst ředění 
ani filtrace vždy neodd ělí od sebe biologicky dostupný a biologicky 
nedostupný podíl zkoušené látky, nemusí být vzorky takto zpraco ­
vány.  
V průběhu zkoušky se m ěří v každé zkušební nádrži množství 
rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost a salinita se 
měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. 
Množství rozpušt ěného kyslíku a salinita (podle pot řeby) se m ěří 
alespoň třikrát (na za čátku, uprost řed a na konci zkoušky). 
U semistatických zkoušek se doporu čuje měřit množství rozpušt ě­
ného kyslíku častěji, přednostně před každým obnovením média a po 
něm, nebo alespo ň jednou týdn ě. pH se m ěří na začátku a na konci 
každého období mezi vým ěnami vody u semistatických zkoušek 
a alespoň jednou týdn ě u průtokových zkoušek. Tvrdost vody se 
měří v každé zkoušce jednou. Teplota se m ěří denně a přednostně 
nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.  
1.7.5.  Pozorování  
1.7.5.1.  Stadia vývoje embrya  
Embryonální stadium (tj. stadium gastruly) na za čátku expozice 
zkoušené látce by m ělo být identifikováno co nejp řesněji. Lze to 
provést za použití reprezentativního vzorku vhodn ě uchovávaných 
a očištěných jiker. Popis a vyobrazení embryonálních stadií lze 
také nalézt v literatu ře (2, 5, 10, 11).  
1.7.5.2.  Líhnutí a p řežívání  
Líhnutí a p řežívání se pozoruje alespo ň jednou denn ě 
a zaznamenávají se po čty. Může být žádoucí provád ět na začátku 
zkoušky častější pozorování (nap ř. každých 30 minut b ěhem prvních 
tří hodin), nebo ť v některých p řípadech mohou být d ůležitější doby 
přežití než pouhé po čty úhynů (např. dochází-li k akutním toxickým 
účinkům). Uhynulá embrya a pl ůdky se odstraní ihned po nalezení, 
neboť se mohou rychle rozkládat. P ři odstraňování uhynulých 
jedinců se postupuje s mimo řádnou opatrností, aby se nenarazilo 
do sousedních jiker/pl ůdků nebo aby se fyzicky nepoškodily, 
neboť jsou mimo řádně křehké a citlivé. Kritéria uhynutí se 
u životních stadií liší:  
— u jiker: zejména v raných stadiích z řetelná ztráta pr ůsvitnosti 
a změna ve zbarvení vyvolaná koagulací a/nebo sražením bílko ­
vin, které vedou k bílému zakalení,  
— u embryí: absence pohybu nebo tepu srdce nebo nepr ůsvitné 
zbarvení u druh ů, jejichž embrya jsou za normálních okolností 
průsvitná,  
— u plůdků: nepohyblivost nebo absence dýchacích pohyb ů nebo 
tepu srdce nebo bílé nepr ůsvitné zbarvení centrálního nervového 
systému a nedostate čná reakce na mechanické podn ěty. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Neobvyklý vzhled  
Počet plůdků vykazujících neobvyklý t ělesný vzhled nebo pigmen ­
taci a stav absorpce žloutkového vá čku se zaznamenávají 
v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky a na povaze 
popisované abnormality. Je t řeba si uv ědomit, že se neobvyklá 
embrya a pl ůdky přirozeně vyskytují a u n ěkterých druh ů jich 
může být v kontrolních skupinách řádově několik procent. Neobvyklí 
jedinci by m ěli být ze zkušební nádrže odstran ěni pouze v p řípadě 
uhynutí.  
1.7.5.4.  Neobvyklé chování  
Abnormality, nap ř. hyperventilace, nekoordinované plavání 
a netypická ne činnost, se zaznamenávají v p řiměřených intervalech 
závisejících na délce zkoušky. Tyto ú činky, přestože je obtížné je 
kvantifikovat, mohou – jsou-li pozorovány – napomoci interpretovat 
údaje o mortalit ě, tj. mohou poskytnout informace o mechanismu 
toxického p ůsobení látky.  
1.7.5.5.  Tělesná délka  
Doporučuje se zm ěřit na konci zkoušky individuální délky; m ůže být 
použita standardní délka, délka k vidlici nebo celková délka. Došlo-li však k uhnití ocasní ploutve nebo k erozi ploutví, použijí se stan ­
dardní délky. Obecn ě by měl být v dob ře provedených zkouškách 
variační koeficient pro délku mezi jednotlivými kontrolními skupi ­
nami ≤ 20 %.
 
1.7.5.6.  Hmotnost  
Na konci zkoušky lze stanovit hmotnosti jedinc ů; hmotnost po 
vysušení (24 hodin p ři 60  o C) se up řednostňuje před živou váhou 
(po osušení do sucha).Obecn ě by měl být v dob ře provedených 
zkouškách varia ční koeficient pro hmotnost mezi jednotlivými 
kontrolními skupinami ≤ 20 %.  
Tato pozorování poskytnou n ěkteré nebo všechny následující údaje, 
které budou k dispozici pro statistickou analýzu:  
— kumulativní mortalita,  
— počty zdravých pl ůdků na konci zkoušky,  
— čas začátku líhnutí a konce líhnutí (tj. 90 % vylíhnutí v každé 
paralelní skupin ě), 
— počty plůdků vylíhnutých každý den,  
— délka (a hmotnost) ryb, které p řežily do konce zkoušky,  
— počty plůdků, které jsou deformované nebo mají neobvyklý 
vzhled,  
— počty plůdků vykazujících neobvyklé chování.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Doporučuje se, aby se navrhování i analýzy zkoušky ú častnil statis ­
tik, nebo ť tato zkušební metoda umož ňuje značné variace 
v experimentálním uspo řádání, nap říklad v po čtu zkušebních nádrží, 
v počtu zkušebních koncentrací, ve výchozím po čtu oplodn ěných 
jiker a v m ěřených parametrech. S ohledem na možnosti uspo řádání 
zkoušky zde nejsou uvedeny specifické pokyny pro postup statistic ­
kého zpracování.  
Mají-li být odhadnuty hodnoty LOEC/NOEC, bude nezbytné analy ­
zovat rozdíly v rámci každé sady paralelních skupin pomocí analýzy 
rozptylu (ANOVA) nebo pomocí kontingen ční tabulky. 
k vícenásobnému porovnání výsledk ů pro jednotlivé koncentrace 
a pro kontrolní skupiny m ůže být užite čný Dunnett ův test 
(12, 13). K dispozici jsou další užite čné příklady (14, 15). Vypo čte 
se a uvede velikost ú činku, zjišt ěná pomocí analýzy ANOVA nebo 
jiných metod (tj. vypovídací schopnost zkoušky). Je t řeba si uv ědo­
mit, že ne všechna pozorování uvedená v bodu 1.7.5.6 jsou vhodná 
pro statistickou analýzu pomocí ANOVA. Nap říklad kumulativní 
mortalita a po čet zdravých pl ůdků na konci zkoušky by mohly být 
analyzovány probitovými metodami.  
Mají-li být odhadnuty LC nebo EC  x , proloží se údaji vhodná k řivka 
(vhodné k řivky), jako nap ř. logistická k řivka, a to statistickou meto ­
dou, nap ř. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou 
nejmenších čtverců. Křivka nebo k řivky by m ěly být popsány para ­
metry tak, aby bylo možné p římo odhadnout požadované hodnoty 
LC nebo EC  x a jejich sm ěrodatné odchylky. To zna čně usnadní 
výpočet interval ů spolehlivosti pro hodnoty LC nebo EC  x . Pokud 
nejsou dobré d ůvody pro up řednostnění jiných interval ů spolehli­
vosti, uvede se oboustranný 95 % interval spolehlivosti. Metoda proložení by m ěla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedo ­
statků proložení. Proložení lze provést graficky. Regresní analýza je 
vhodná pro všechna pozorování uvedená v bodu 1.7.5.6.
 
2.2. INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Výsledky by m ěly být interpretovány opatrn ě v případě, že se nam ě­ 
řené koncentrace toxické látky ve zkušebních roztocích pohybují na 
úrovních blízkých mezi stanovení analytické metody. Interpretace 
výsledků pro koncentrace vyšší, než je rozpustnost látky ve vod ě, 
by měla být rovn ěž opatrná.  
2.3. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
2.3.1.  Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha, fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— údaje o chemické identifikaci v četně údajů o čistotě a podle 
potřeby o metod ě kvantitativního stanovení zkoušené látky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Testovací druh:  
— vědecký název, kmen, po čet matečných ryb (tj. kolik sami ček 
bylo ve zkoušce použito pro získání požadovaného po čtu jiker), 
zdroj a metoda sb ěru oplodn ěných jiker a následné zpracování.  
2.3.3.  Zkušební podmínky:  
— použitá zkušební metoda (nap ř. semistatická nebo pr ůtoková 
metoda, doba od oplodn ění do začátku zkoušky, nasazování atd.),  
— fotoperioda (fotoperiody),  
— uspořádání zkoušky (nap ř. počet zkušebních nádrží a jejich 
znásobení, po čet embryí v nádrži),  
— metoda p řípravy zásobních roztok ů a četnost obnovování (je-li 
použito, uvede se solubiliza ční činidlo a jeho koncentrace),  
— nominální zkušební koncentrace, nam ěřené hodnoty ve zkušeb ­
ních nádržích, jejich st řední hodnoty a sm ěrodatné odchylky 
a metody jejich stanovení, a je-li zkoušená látka rozpustná ve vodě v koncentracích nižších, než jsou vyšet řované koncentrace, 
uvede se d ůkaz toho, že nam ěřené koncentrace odpovídají 
koncentraci zkoušené látky v roztoku,
 
— charakteristiky ředicí vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, 
koncentrace rozpušt ěného kyslíku, koncentrace zbytkového 
chloru (je-li m ěřena), obsah celkového organického uhlíku, 
obsah suspendovaných látek, pop řípadě salinita zkušebního 
média a výsledky jakýchkoli jiných provedených m ěření, 
— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota 
a koncentrace rozpušt ěného kyslíku.  
2.3.4.  Výsledky  
— výsledky p řípadných p ředběžných studií stálosti zkoušené látky,  
— doklady o tom, že kontrolní skupiny splnily obecné požadavky 
na přijatelnou míru p řežití pro testovací druh (dodatky 2 a 3),  
— údaje o mortalit ě nebo přežití v embryonálním stadiu a ve stadiu 
plůdku a údaje o celkové mortalit ě nebo přežití,  
— doba do vylíhnutí, po čty vylíhnutých jedinc ů, 
— údaje o délce (a hmotnosti),  
— výskyt a popis morfologických odchylek, vyskytly-li se,  
— výskyt a popis ú činků na chování, vyskytly-li se,  
— statistická analýza a zpracování údaj ů, 
— u zkoušek analyzovaných pomocí ANOVA nejnižší koncentrace 
s pozorovanými ú činky (LOEC) na hladin ě spolehlivosti p = 0,05 
a koncentrace bez pozorovaných ú činků (NOEC) pro každou 
posuzovanou odezvu, v četně popisu použité statistické metody 
a údaje o tom, jak velký ú činek bylo možné zjistit,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— u zkoušek analyzovaných pomocí regresních metod, hodnoty LC 
a ECx a intervaly spolehlivosti a graf proložené závislosti použité 
pro jejich výpo čet, 
— vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.  
3. LITERATURA  
1) Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Communities, str. 60. June 1990.
 
2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage 
Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and 
Materials. E 1241-88. 26 str.  
3) Brauhn J.L. and Schoettger R.A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p.54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
 
4) Brungs W.A. and Jones B.R. (1977) Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
 
5) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish ( Bra­
chydanio rerio ) in Fisheries Research. A Literature Review. J. 
Biol. 10, 121–173.  
6) Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brachy­
danio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, str. 328–330.  
7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J.E., Rosander B. 
and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity 
Test with Zebrafish ( Brachydanio rerio ) Using Chromium and 
Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, 
str. 61–71.  
8) Birge J.W., Black J.A. and Westerman A.G. (1985). Short-term 
Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the 
Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating 
Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, str. 807–821.
 
9) Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout 
(Salmo gairdneri ). J. Aquatic Toxicology, 9, 129–145.
 
10) Kirchen R.V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. 
Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.  
11) Kirchen R.V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply 
Company, North Carolina. 36 str.  
12) Dunnett C.W. (1955) A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, str. 1096–1121.  
13) Dunnett C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, 482–491.  
14) Mc Clave J.T., Sullivan J.H. and Pearson J.G. (1980). Statistical 
Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 
4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
15) Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, str. 321–334.  
16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, str. 81.
 
17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio . Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, 126–134.  
18) Meyer A., Bierman C.H. and Orti G. (1993). The phylogenetic 
position of the Zebrafish ( Danio rerio ), a model system in deve ­
lopmental biology – an invitation to the comperative methods. 
Proc. Royal Society of London, Series B, 252; 231-236.  
19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Envi ­
ronmental Safety 32, 19–28.
 
20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka,  Oryzias latipes . EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 
1991, EPA, Duluth.  
21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, ( Oryzias latipes ). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
22) De Graeve G.M., Cooney J.D., McIntyre D.O., Poccocic T.L., 
Reichenbach N.G., Dean J.H. and Marcus M.D. (1991). Vali ­
dity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas ) larval survival and growth test: an intra- 
and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189–1203.
 
23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.
 
24) Balon E.K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, 280 str.  
25) Blaxter J.H.S. (1988). Pattern and variety in development, In: 
W.S. Hoar and D.J. Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, Academic press, str. 1–58.
 
Tabulka 1A  
Druhy ryb doporu čené pro zkoušku  
SLADKOVODNÍ  
Oncorhynchus mykiss  
pstruh duhový (9, 16)  
Danio rerio  
danio pruhované (7, 17, 18)  
Cyprinus caprio  
kapr obecný (8, 19)  
Oryzias latipes  
halančík japonský (20, 21)  
Pimephales promelas  
střevle (8, 22)  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabulka 1B  
Příklady dalších dob ře popsaných druh ů, které byly rovn ěž použity  
SLADKOVODNÍ MO ŘSKÉ 
Carassius auratus  
karas zlatý (8)  Menidia peninsulae  (23, 24, 25)  
Lepomis macrochirus  
slunečnice modrá (8)  Clupea harengus  (24, 25)  
Gadus morhua  (24, 25)  
Cyprinodon variegatus  (23, 24, 25)  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
DODATEK 1  
NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH 
A VÁ ČKOVÝCH PL ŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO  
(BRACHYDANIO RERIO)  
ÚVOD  
Danio pruhované pochází z indického pob řeží Coromandel, kde žije v byst řinách. 
Je běžnou akvarijní rybou z čeledi kaprovitých a informace o pé či o něj a o jeho 
chovu jsou uvedeny v standardních p říručkách o tropických rybách. P řehled jeho 
biologie a použití ve výzkumu ryb podává Laale (1).  
Ryba zřídka dorůstá délky více než 45 mm. Má válcové t ělo se 7–9 horizontál ­
ními tmav ě modrými st říbřitými pruhy. Pruhy pokra čují přes ocasní a řitní plou­
tve. Hřbet má olivov ě zelený. Same čci jsou štíhlejší než sami čky. Samičky jsou 
stříbrnější a mají rozší řené břicho, zejména p řed třením.  
Dospělé ryby dokážou snášet velké kolísání teploty, pH a tvrdosti vody. Mají-li 
se však získat zdravé ryby poskytující jikry dobré kvality, m ěly by být zajišt ěny 
optimální podmínky.  
Při tření sameček sleduje sami čku a doráží na ni a p ři vypuzení jiker je oplodní. 
Jikry, které jsou pr ůsvitné a nejsou p řilnavé, dopadají na dno, kde mohou být 
pozřeny rodiči. Na tření má vliv sv ětlo. Při odpovídajícím ranním sv ětle se ryby 
třou v prvních hodinách po rozedn ění. 
Samička může klást v odstupu jednoho týdne dávky o n ěkolika stech jiker.  
PODMÍNKY PRO MATE ČNÉ RYBY, REPRODUKCE A RANÁ ŽIVOTNÍ 
STADIA  
Vybere se vhodný po čet zdravých ryb, které se alespo ň dva týdny p řed předpo­
kládaným t řením udržují ve vhodné vod ě (např. dodatek 4). Skupina ryb by m ěla 
mít možnost se p řed kladením jiker pro zkoušku alespo ň jednou vyt řít. Hustota 
obsádky ryb by v tomto období nem ěla přesáhnout 1 gram ryb na litr. Pravidelná 
výměna vody nebo použití p řečišťovacího systému umožní hustotu zvýšit. 
Teplota v chovných nádržích se má udržovat na 25 ± 2  ο C. Ryby by m ěly 
dostávat rozmanitou potravu, která m ůže obsahovat nap říklad komer ční suché 
krmivo, čerstvě vylíhnuté žábronožky (Arthemia), chironomidy, dafnie, bílé 
červy roupice (Enchytraeids).  
Dále jsou uvedeny dv ě metody, které v praxi vedly k dostate čnému množství 
zdravých oplodn ěných jiker pro provedení zkoušky:  
i) Osm sami ček a 16 same čků se umístí do nádrže obsahující 50 litr ů ředicí 
vody a chrán ěné před přímým světlem a ponechá se alespo ň 48 hodin co 
nejvíce v klidu. Na dno nádrže se odpoledne v den p řed započetím zkoušky 
umístí vytírací rošt. Vytírací rošt se skládá z 5–7 cm vysokého rámu (z plexiskla nebo jiného vhodného materiálu) s 2–5 cm hrubým roštem naho ře 
a s 10–30 μm jemným roštem vespod. Na hrubém roštu je p řipevněna řada 
vytíracích st řapců pro kladení jiker z nekrouceného silonového vlákna. Poté, 
co byly ryby drženy 12 hodin v temnu, se slab ě nasvítí, čímž se vyvolá t ření. 
Dvě až čtyři hodiny po vyt ření se vytírací rošt vyjme a jikry se seberou. 
Vytírací rošt zabrání rybám v požírání jiker a zárove ň umožní snadný sb ěr 
jiker. Skupina ryb by se m ěla před třením určeným k produkci jiker pro 
zkoušku vyt řít alespoň jednou.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) Pět až deset same čků a samiček se alespo ň dva týdny p řed zamýšleným 
třením chová odd ěleně. Po 5 až 10 dnech se b řicha sami ček rozšíří 
a zviditelní se jejich genitální papily. Same čci papily nemají. T ření se provede 
v nádržích pro t ření opatřených falešným dnem z pletiva (jako výše). Nádrž 
se naplní ředicí vodou tak, aby voda sahala 5–10 cm nad dno. Jedna sami čka 
a dva same čci se umístí do nádrže den p řed zamýšleným t řením. Teplota vody 
se postupn ě zvýší jeden stupe ň nad aklimatiza ční teplotu. Vypne se osv ětlení 
a nádrž se ponechá co nejvíce v klidu. Ráno se slab ě nasvítí, čímž se vyvolá 
tření. Po 2–4 hodinách se ryby vyjmou a jikry se seberou. Je-li pot řeba více 
dávek jiker, než lze získat od jedné sami čky, nasadí se paraleln ě dostatečný 
počet nádrží pro t ření. Zaznamenáním úsp ěšnosti (množství a kvality) repro ­
dukce jednotlivých sami ček před zkouškou lze vybrat pro chov sami čky 
s nejvyšší úsp ěšností.  
Jikry se p řenesou do zkušební nádrže sklen ěnou trubi čkou (o vnit řním průměru 
ne menším než 4 mm) opat řenou pružným nasávacím balónkem. Množství vody, 
které se p řenáší s jikrami, by m ělo být co nejmenší. Jikry jsou t ěžší než voda a z 
trubičky vypadnou. Je t řeba zabránit tomu, aby jikry (a pl ůdky) přišly do 
kontaktu se vzduchem. Provede se mikroskopické vyšet ření vzorku (vzork ů) 
jiker, aby se ov ěřilo, že v prvních stadiích vývoje nedošlo k nepravidelnostem. 
Dezinfekce jiker není p řípustná.  
Mortalita jiker je nejvyšší b ěhem prvních 24 hodin po oplodn ění. V této dob ě je 
často pozorována mortalita 5–40 %. Jikry degenerují v d ůsledku neúsp ěšného 
oplodnění nebo vývojových vad. Zdá se, že kvalita jiker závisí na sami čce, neboť 
některé sami čky soustavn ě kladou jikry dobré kvality, jakou jiné sami čky nepo­
skytují. Rovn ěž rychlost vývoje a líhnutí se mezi jednotlivými soubory liší. 
Úspěšně oplodněné jikry a pl ůdky se žloutkovým vá čkem přežívají dob ře, 
obvykle jich p řežívá více než 90 %. P ři 25  o C se z jiker líhnou jedinci po 
3–5 dnech po oplodn ění a žloutkový vá ček je absorbován p řibližně po 13 
dnech po oplodn ění. 
Embryonální vývoj byl dob ře definován Hisaokou a Battlem (2). Díky pr ůsvit­
nosti jiker a pl ůdků čerstvě po vylíhnutí lze vývoj ryb dob ře sledovat a lze 
pozorovat malformace. P řibližně čtyři hodiny po vyt ření lze rozlišit neoplodn ěné 
jikry od oplodn ěných (3). K tomuto vyšet ření se jikry a pl ůdky umístí do 
nádobky o malém objemu a prohlížejí se pod mikroskopem.  
Zkušební podmínky požadované pro raná životní stadia jsou uvedeny v dodatku 
2. Optimální hodnoty pH a tvrdosti vody jsou 7,8 a 250 mg/l, vyjád řeno jako 
CaCO  3 . 
VÝPOČTY A STATISTIKA  
Navrhuje se dvoufázový postup. V první fázi se statisticky analyzují údaje 
o mortalit ě, nenormálním vývoji a dob ě líhnutí. Poté se pro ty koncentrace, p ři 
nichž nebyly pozorovány žádné nep říznivé účinky na tyto parametry, statisticky 
vyhodnotí t ělesná délka. Tento postup se doporu čuje, nebo ť toxická látka m ůže 
selektivně usmrcovat menší ryby, prodlužovat dobu líhnutí a indukovat viditelné 
malformace, a tedy zkreslovat výsledky m ěření délky. Krom ě toho tak bude pro 
každou expozici m ěřen zhruba stejný po čet ryb, čímž se zajistí validita statistiky 
zkoušky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
STANOVENÍ LC  50 A EC  50 
Procento p řežití jiker a pl ůdků se vypočte a zkoriguje na mortalitu v kontrolních 
skupinách podle Abbottovy rovnice (4):  
P ¼ 100 Ä Í 
C Ä P 0 
C Ü 100 Î 
kde, 
P = korigované procento p řežití,  
P' = procento p řežití pozorované ve zkoušené koncentraci,  
C = procento p řežití v kontrolní skupin ě. 
Podle možnosti se vhodnou metodou stanoví hodnota LC  50 na konci zkoušky.  
Požaduje-li se, aby byly do statistiky pro EC  50 zahrnuty morfologické odchylky, 
lze k tomu nalézt návod v práci Stephana (5).  
ODHAD LOEC A NOEC  
Cílem zkoušky na jikrách a vá čkových pl ůdcích je porovnat koncentrace, u nichž 
nebyl účinek nulový, s kontrolními skupinami, tj. stanovit LOEC. Použijí se tedy 
metody vícenásobného srovnání (6, 7, 8, 9, 10).  
LITERATURA  
1) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish ( Brachydanio 
rerio ) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 
121–173.  
2) Hisaoka K.K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, str. 
311. 
3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling 
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, str. 173–181.  
4) Finney D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, str. 1–333.  
5) Stephan C.E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American Society 
for Testing and Materials, str. 69–81.
 
6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, str. 1096–1121.
 
7) Dunnett C.W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with 
a Control. Biometrics, 20, 482–491.  
8) Williams D.A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, str. 103–117.
 
9) Williams D.A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with 
a Zero Dose Control. Biometrics 28, str. 519–531.  
10) Sokal R.R. and Rohlf F.J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
DODATEK 2  
ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA P ŘEŽITÍ PRO DOPORU ČENÉ DRUHY  
Druh Teplota 
( o C) Salinita 
( ‰) Fotoperioda 
(H) Délka stadií 
(D) 
Typická délka zkoušky Přežití v kontrolních skupinách 
(minimální hodnota v %) 
Embryo Vá čkový plůdek Úspěšnost 
líhnutí Po vylíhnutí  
Sladkovodní  
Brachydanio rerio  
Danio pruhovaný 25 ± 1 — 12–16 3–5 8–10 Pokud možno ihned od oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 5 dn ů po vylíh ­
nutí (8–10 dn ů) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
pstruh duhový 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30–35 25–30 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 20 dn ů po 
vylíhnutí (50–55 dn ů) 66 70  
Cyprinus carpio  
kapr obecný 21–25 — 12–16 5 > 4 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 4 dn ů po vylíh ­
nutí (8–9 dn ů) 80 75  
Oryzias latipes  
halančík japonský 24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12–16 8–11 4–8 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 5 dn ů po vylíh ­
nutí (13–16 dn ů) 80 80  
Pimephales promelas  
střevle 25 ± 2 — 16 4–5 5 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 4 dn ů po vylíh ­
nutí (8–9 dn ů) 60 70  
( 1 ) Pro embrya. 
( 2 ) Pro pl ůdky. 
( a ) Temno pro embrya a pl ůdky do jednoho týdne po vylíhnutí, s výjimkou doby prohlídky. Poté po dobu zkoušky tlumené sv ětlo.
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
DODATEK 3  
Zkušební podmínky, délka zkoušky a kritéria p řežití pro jiné dob ře popsané druhy  
Druh Teplota (  o C) Salinita ( ‰) Fotoperioda (H) Délka stadií (D) 
Typická délka zkoušky Přežití v kontrolních skupinách 
(minimální hodnota v % 
Embryo Vá čkový plůdek Úspěšnost 
líhnutí Po vylíhnutí  
Sladkovodní  
Carassius auratus  
karas zlatý 24 ± 1 — — 3 — 4 > 4 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 4 dn ů po vylíh ­
nutí (7 dn ů) — 80  
Leopomis macrochirus  
slunečnice modrá 21 ± 1 — 16 3 > 4 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 4 dn ů po vylíh ­
nutí (7 dn ů) — 75 
Mořský 
Menidia peninsulae  22 – 25 15 – 22 12 1,5 10 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 5 dn ů po vylíh ­
nutí (6–7 dn ů) 80 60  
Clupea harengus  
Sleď obecný 10 ± 1 8 – 15 12 20 – 25 3 – 5 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 3 dn ů po vylíh ­
nutí (23–27 dn ů) 60 80  
Gadus morhua  
Treska obecná 5 ± 1 5 – 30 12 14 – 16 3 – 5 Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 3 dn ů po vylíh ­
nutí (18 dn ů) 60 80  
Cyprinodon variegatus  25 ± 1 15 – 30 12 – — Pokud možno ihned po oplodn ění (od 
raného stadia gastruly) do 4/7 dn ů po 
vylíhnutí (28 dn ů) > 75 80
DODATEK 4  
NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY P ŘIJATELNÉ 
ŘEDICÍ VODY  
Látka Koncentrace  
Nerozpušt ěné látky < 20 mg/l 
Celkový organický uhlík < 2 mg/l 
Volný amoniak < 1 μg/l 
Zbytkový chlor < 10 μg/l 
Celkové organofosforové pesticidy < 50 ng/l Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované 
bifenyly < 50 ng/l 
Celkový organický chlor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  ZKOUŠKA AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO V ČELU 
MEDONOSNOU  
1. METODA  
Tato metoda zkoušky akutní toxicity je replikou metody OECD TG 
213 (1998).  
1.1. ÚVOD  
Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou ur čenou k posouzení 
orální akutní toxicity p řípravků na ochranu rostlin a jiných chemic ­
kých látek pro d ělnice včely medonosné (dosp ělce). 
Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek m ůže být 
nezbytné stanovení akutní orální toxicity pro v čelu medonosnou, 
např. je-li expozice v čel dané chemické látce pravd ěpodobná. 
Zkouška akutní orální toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticid ů a jiných chemických látek pro v čely. Výsledky 
této zkoušky by m ěly být použity pro definování pot řeby dalšího 
hodnocení. The results of this test should be used to define the 
need for further evaluation. Tato metoda m ůže být použita zejména 
ve stupňovaných programech hodnocení nebezpe čnosti pesticid ů pro 
včely založených na postupném p řechodu od laboratorních zkoušek 
k semi-polním a polním experiment ům (1). Pesticidy mohou být 
zkoušeny ve form ě účinné látky (ú. l.) nebo ve form ě finálně upra­
vených p řípravků.
 
K ověření citlivosti v čel a přesnosti zkušebního postupu se použije 
standard toxicity.  
1.2. DEFINICE  
Akutní orální toxicita:  jsou nep říznivé účinky, ke kterým dojde 
nejpozději do 96 hodin od orálního podání jediné dávky zkoušené 
látky.  
Dávka:  je množství požité zkoušené látky. Dávka se vyjad řuje 
v hmotnosti ( μg) zkoušené látky na jednoho testovacího živo čicha 
(v μg na včelu). Skute čnou dávku u každé v čely nelze vypo čítat, 
neboť se včely krmí vzájemn ě, lze však odhadnout pr ůměrnou dávku 
(celkově odebrané množství zkoušené látky d ělené počtem včel 
v jedné klícce).  
LD 50 (střední letální dávka) oráln ě je statisticky vypo čtená jedno ­
tlivá dávka látky, která m ůže po orálním podání zp ůsobit úhyn 50 % 
jedinců. Hodnota LD  50 se vyjadřuje v μg zkoušené látky na jednu 
včelu. U pesticid ů muže být zkoušenou látkou bu ď účinná látka (ú. 
l.), nebo fináln ě upravený p řípravek obsahující jednu nebo více ú čin­
ných látek.  
Mortalita : jedinec se považuje za uhynulého, je-li zcela nepohyb ­
livý. 
1.3. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Dělnice včely medonosné ( Apis mellifera ) (dospělci) se exponují 
řadě dávek zkoušené látky rozptýlené v cukerném roztoku. V čely 
jsou poté krmeny stejným roztokem neobsahujícím zkoušenou látku. Mortalita se zaznamenává denn ě během alespo ň 48 hodin 
a porovnává se s kontrolními hodnotami. Jestliže se mortalita mezi 
24 a 48 hodinami zvyšuje, zatímco mortalita v kontrolních skupinách zůstává na p řijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku 
prodloužit maximáln ě na 96 hodin. Výsledky zkoušky se analyzují 
s cílem vypo čítat LD
 50 pro 24 hodin a 48 hodin a v p řípadě prodlou­ 
žené studie pro 72 hodin a 96 hodin.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. VALIDITA ZKOUŠKY  
Má-li být zkouška platná, musí být spln ěny tyto podmínky:  
— průměrná mortalita ve všech kontrolních skupinách nesmí na 
konci zkoušky p řekročit 10 %,  
— LD  50 pro standard toxicity odpovídá specifikovanému rozsahu.  
1.5. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.5.1.  Sb ěr včel 
Použijí se mladušky téhož plemena, tj. v čely stejného stá ří, téže 
funkce vzhledem ke krmení plodu atd. V čely by m ěly být získány 
z dobře potravou zásobených zdravých, pokud možno chorob 
prostých v čelstev, s kladoucí matkou, se známým p ůvodem, chovem 
a fyziologickým stavem. M ěly by být sesbírány ráno v den zkoušky 
nebo by m ěly být sesbírány ve čer před zkouškou a drženy 
v podmínkách zkoušky do p říštího dne. Vhodné jsou v čely sesbírané 
z rámků bez plod ů. Včely by nem ěly být sbírány brzy na ja ře nebo 
pozdě na podzim, nebo ť během těchto období mají zm ěněnou fyzi­
ologii. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na ja ře nebo pozd ě na 
podzim, mohou se v čely vylíhnout v inkubátoru a chovat s „v čelím 
chlebem“ (na plástovém pylu) a s cukerným roztokem. V čely 
ošetřené chemickými látkami, jako jsou antibiotika, prost ředky 
proti varroatóze atd., by nem ěly být použity pro zkoušky toxicity 
po čtyři týdny od konce posledního ošet ření. 
1.5.2.  Podmínky chovu a krmení  
Použijí se snadno čistitelné a dob ře větrané klícky. Lze použít jaký ­
koli vhodný materiál, nap ř. klícky z korozivzdorné oceli, drát ěného 
pletiva, plastu nebo jednorázov ě použitelné d řevěné klícky atd. Dává 
se přednost skupinám po 10 v čelách. Velikost zkušebních klícek by 
měla vyhovovat po čtu včel, tj. měla by poskytovat dostatek prostoru.  
Včely by m ěly být přechovávány ve tm ě v experimentální místnosti 
při teplotě 25 ± 2  o C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní 
vlhkost, která je obvykle 50–70 %. Zacházení se v čelami, včetně 
ošetřování a pozorování, m ůže být provád ěno za (denního) sv ětla. 
Jako potrava se používá vodný cukerný roztok o kone čné koncen ­
traci 500 g/l (50 % m/V). Po podání zkušebních dávek se podává 
potrava  ad libitum . Systém krmení by m ěl umožňovat zaznamenání 
příjmu potravy pro každou klícku (viz bod 1.6.3.1). Lze použít skle ­
něnou trubi čku (přibližně 50 mm dlouhou, s pr ůměrem 10 mm, 
zúženou na otev řeném konci na pr ůměr asi 2 mm).  
1.5.3.  Příprava včel 
Sesbírané v čely se náhodn ě umístí do klícek, které se náhodn ě 
rozmístí v experimentální místnosti.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Před začátkem zkoušky mohou v čely až 2 hodiny hladov ět. Doporu ­ 
čuje se, aby nebyla v čelám před expozicí podávána potrava, aby byly 
na začátku zkoušky rovnocenné, pokud jde o obsah zažívacího 
ústrojí. Hynoucí v čely se p řed zahájením zkoušky odstraní 
a nahradí zdravými v čelami.  
1.5.4.  Příprava dávek  
Je-li zkoušená látka mísitelná s vodou, m ůže být rozptýlena p římo 
v 50 % cukerném roztoku. U technických p řípravků a látek s nízkou 
rozpustností ve vod ě mohou být použity nosi če, jako jsou organická 
rozpouštědla, emulgátory nebo dispergátory s nízkou toxicitou pro 
včely (např. aceton, dimethylformamid, dimethylsulfoxid). Koncent ­
race nosi če závisí na rozpustnosti zkoušené látky a m ěla by být 
stejná pro všechny zkušební koncentrace. Obecn ě je vhodná 1 % 
koncentrace nosi če a neměla by být p řekračována.  
Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použijí-li se k rozpušt ění 
zkoušené látky rozpoušt ědlo nebo dispergátor, použijí se dv ě samo­
statné kontrolní skupiny: roztok ve vod ě a cukerný roztok 
s rozpoušt ědlem/nosi čem v koncentraci použité v dávkování.  
1.6. POSTUP  
1.6.1.  Zkušební a kontrolní skupiny  
Počet zkoušených dávek a jejich opakování by m ěl splňovat statis ­
tické požadavky na stanovení LD  50 na hladin ě spolehlivosti 95 %. 
Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespo ň pět dávek tvo řících 
geometrickou řadu s faktorem nep řekračujícím 2,2 a pokrývajících 
rozsah pro LD  50 . Faktor ředění a počet koncentrací pro dávkování se 
však stanoví s ohledem na sm ěrnici křivky toxicity (dávka versus 
mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu 
výsledků. Vhodné koncentrace pro dávkování je možné zvolit 
pomocí orienta ční zkoušky.  
Každá zkušební koncentrace se podá alespo ň třem soub ěžným 
zkušební skupinám o 10 v čelách. Vedle zkušebních skupin se nasadí 
alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 v čelách. Nasadí se také 
zkušební skupiny pro použitá rozpoušt ědla nebo nosi če (viz bod 
1.5.4).  
1.6.2.  Standard toxicity  
Do sérií zkoušení se za řadí standard toxicity. Zvolí se alespo ň tři 
dávky pokrývající o čekávanou hodnotu LD  50 . Pro každou zkoušenou 
dávku se použijí alespo ň tři klícky po deseti v čelách, tj. t ři opako­
vání. Přednostním standardem toxicity je dimethoát, pro n ějž se 
uvádí LD  50 24 hodin, oráln ě v rozmezí 0,10–0,35 μg účinné látky 
na včelu (2). Jsou však p řijatelné i jiné standardy toxicity, pokud lze 
předložit dostatek údaj ů pro ověření očekávané reakce na dávku 
(např. parathion).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Expozice  
1.6.3.1.  Podávání dávek  
Každé zkušební skupin ě včel se musí poskytnout 100–200 μl 50 % 
vodného cukerného roztoku obsahujícího zkoušenou látku ve vhodné 
koncentraci. V ětší objem je nezbytný u látek s nízkou rozpustností, 
nízkou toxicitou nebo nízkou koncentrací ve formulaci, nebo ť 
v cukerném roztoku musí být použit v ětší podíl. Sleduje se množství 
potravy se zkoušenou látkou odebrané zkušební skupinou. Po spot ře­
bování potravy (obvykle do 3–4 hodin) se z klícky odebere krmítko 
a nahradí se krmítkem obsahujícím pouze cukerný roztok. Cukerný roztok se poté poskytne  ad libitum . Vysoké koncentrace n ěkterých 
sloučenin mohou p ůsobit odpudiv ě. To má za následek, že je p řijí­
mámo málo potravy, nebo že se žádná potrava neodebere. Po maxi ­
málně 6 hodinách se nespot řebovaná potrava se zkoušenou látkou 
nahradí samotným cukerným roztokem. Stanoví se množství spot ře­
bované potravy se zkoušenou látkou (nap ř. měřením objemu nebo 
zvážením neodebrané potravy).
 
1.6.3.2.  Délka trvání zkoušky  
Upřednostňuje se délka trvání zkoušky 48 hodin od okamžiku, kdy 
byl zkušební roztok nahrazen samotným cukerným roztokem. Jestliže se mortalita po prvních 24 hodinách zvyšuje o více než 10 %, 
zkouška se prodlouží maximáln ě na 96 hodin, pokud mortalita 
v kontrolních skupinách nep řekročí 10 %.
 
1.6.4.  Pozorování  
Mortalita se zaznamená po 4 hodinách od zahájení zkoušky a poté 
po 24 hodinách a 48 hodinách (rozumí se po podání dávky). Je-li nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení 
v 24hodinových intervalech maximáln ě do 96 hodin, pokud mortalita 
v kontrolních skupinách nep řekračuje 10 %.
 
Odhadne se množství spot řebované potravy na jednu skupinu. 
Porovnáním rychlostí spot řebování potravy se zkoušenou látkou 
a bez ní lze získat informaci o chutnosti potravy se zkoušenou 
látkou.  
Zaznamená se neobvyklé chování pozorované b ěhem doby zkoušky.  
1.6.5.  Limitní zkouška  
V některých p řípadech (nap ř. očekává-li se u látky nízká toxicita) 
může být provedena limitní zkouška za použití 100 μg účinné látky 
na včelu s cílem prokázat, že LD  50 je vyšší než tato hodnota. P ři ní 
se postupuje stejným zp ůsobem, tj. nasadí se t ři souběžné zkušební 
skupiny pro každou zkušební dávku, odpovídající kontrolní skupiny, stanoví se množství spot řebované potravy s ú činnou látkou a použije 
se standard toxicity. Dojde-li k úhyn ům, měla by se provést úplná 
studie. Jsou-li pozorovány subletální ú činky (viz bod 1.6.4), zazna ­
menají se.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
2.1. ÚDAJE  
Údaje se shrnou do tabulky, p řičemž se pro každou zkušební 
skupinu, kontrolní skupiny a skupiny se standardem toxicity uvede 
počet použitých v čel, mortalita v každé dob ě pozorování a po čet včel 
s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalit ě se analyzují 
vhodnými statistickými metodami (nap ř. probitovou analýzou, klou ­
zavým pr ůměrem, proložením binomického rozd ělení) (3, 4). Sestrojí 
se křivky závislosti dávka-reakce pro každou dobu pozorování 
a vypočtou se sm ěrnice křivek a st řední letální dávky (LD  50 ) 
s 95 % intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu 
v kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). 
Pokud nebyla potrava se zkoušenou látkou zcela odebrána, stanoví se spotřebovaná dávka zkoušené látky na skupinu. LD
 50 se vyjádří 
v μg zkoušené látky na v čelu. 
2.2. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
2.2.1.  Zkoušená látka:  
— fyzikální stav a p říslušné fyzikáln ě-chemické vlastnosti (nap ř. 
stálost ve vod ě, tlak par),  
— údaje o chemické identifikaci v četně strukturního vzorce, čistota, 
(tj. u pesticid ů identifikace a koncentrace ú činné látky (ú činných 
látek)).  
2.2.2.  Testovací druh:  
— vědecký název, plemeno, p řibližné stá ří (v týdnech), metoda 
sběru včel, datum sb ěru, 
— informace o v čelstvech použitých pro sb ěr testovacích v čel, 
včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dosp ělců, 
o všech ošet řeních před pokusem atd.,  
2.2.3.  Zkušební podmínky:  
— teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,  
— podmínky chovu v četně typu, velikosti a materiálu klícek,  
— metody p řípravy zásobních a zkušebních roztok ů (je-li použito, 
uvede se rozpoušt ědlo a jeho koncentrace),  
— metoda p řípravy zásobních roztok ů a četnost obnovování (je-li 
použito rozpoušt ědlo, musí být uvedeno, v četně koncentrace), 
uspořádání zkoušky, nap ř. použité zkušební koncentrace 
a jejich po čet, počet kontrolních skupin, pro každou koncentraci 
a kontrolu po čet paralelních klícek a po čet včel na klícku,  
— datum zkoušky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Výsledky:  
— výsledky p ředběžné orienta ční zkoušky, byla-li provedena,  
— nekorigované údaje: mortalita pro každou zkoušenou dávku 
v každé dob ě pozorování,  
— graf k řivek závislosti dávka-reakce na konci zkoušky,  
— hodnoty LD  50 intervaly spolehlivosti pro každý doporu čený čas 
pozorování, a to pro zkoušenou látku a standard toxicity,  
— statistické metody použité pro stanovení LD  50 , 
— mortalita v kontrolních skupinách,  
— jiné pozorované nebo nam ěřené biologické ú činky, nap ř. neob­
vyklé chování v čel (včetně odmítnutí zkušební dávky), rychlost 
odebírání potravy v exponovaných a neexponovaných skupinách,  
— jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu a jiné 
důležité informace.  
3. LITERATURA  
1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151–165. March 
1993.
 
2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, 119–125.
 
3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113.
 
4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.,18, 265–267.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  VČELA MEDONOSNÁ – ZKOUŠKA AKUTNÍ KONTAKTNÍ 
TOXICITY  
1. METODA  
Tato metoda zkoušky akutní toxicity je replikou metody OECD TG 
214 (1998).  
1.1. ÚVOD  
Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou ur čenou k posouzení 
akutní kontaktní toxicity p řípravků na ochranu rostlin a jiných 
chemických látek pro d ělnice včely medonosné (dosp ělce). 
Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek m ůže být 
nezbytné stanovení akutní kontaktní toxicity pro v čelu medonosnou, 
např. je-li expozice v čel dané chemické látce pravd ěpodobná. 
Zkouška akutní kontaktní toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticid ů a jiných chemických látek pro v čely. Výsledky této 
zkoušky by m ěly být použity pro definování pot řeby dalšího hodno ­
cení. Tato metoda m ůže být použita zejména ve stup ňovaných 
programech hodnocení nebezpe čnosti pesticid ů pro včely založených 
na postupném p řechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním 
a polním experiment ům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve 
formě účinné látky (ú. l.) nebo ve form ě finálně upravených 
přípravků.
 
K ověření citlivosti v čel a přesnosti zkušebního postupu se použije 
standard toxicity.  
1.2. DEFINICE  
Akutní kontaktní toxicita:  je nepříznivý účinek, ke kterému dojde 
nejpozději do 96 hodin od topikální aplikace jedné dávky zkoušené 
látky.  
Dávka:  je množství aplikované zkoušené látky. Dávka se vyjad řuje 
v hmotnosti ( μg) zkoušené látky na jednoho testovacího živo čicha (v 
μg na včelu). 
LD 50 (střední letální dávka) kontaktn ě: je statisticky vypo čtená 
jednotlivá dávka látky, která m ůže po kontaktní aplikaci zp ůsobit 
úhyn 50 % jedinc ů. Hodnota LD  50 se vyjadřuje v μg zkoušené 
látky na jednu v čelu. U pesticid ů muže být zkoušenou látkou bu ď 
účinná látka (ú. l.), nebo fináln ě upravený p řípravek obsahující jednu 
nebo více ú činných látek.  
Mortalita : jedinec se považuje za uhynulého, je-li zcela nepohyb ­
livý. 
1.3. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Dělnice včely medonosné ( Apis mellifera ) (dospělci) se exponují 
řadě dávek zkoušené látky rozpušt ěné ve vhodném nosi či přímou 
aplikací na torax (jako kapi čky). Zkouška trvá 48 hodin. Jestliže 
se mortalita mezi 24 a 48 hodinami zvyšuje, zatímco mortalita 
v kontrolních skupinách z ůstává na p řijatelné úrovni, tj. < 10 %, 
je vhodné zkoušku prodloužit maximáln ě na 96 hodin. Mortalita se 
zaznamenává denn ě a porovnává se s kontrolními hodnotami. 
Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypo čítat LD  50 pro 24 
hodin a 48 hodin a v p řípadě prodloužené studie pro 72 hodin 
a 96 hodin.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. VALIDITA ZKOUŠKY  
Má-li být zkouška platná, musí být spln ěny tyto podmínky:  
— průměrná mortalita ve všech kontrolních skupinách nesmí na 
konci zkoušky p řekročit 10 %,  
— LD  50 pro standard toxicity odpovídá specifikovanému rozsahu.  
1.5. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.5.1.  Sb ěr včel 
Použijí se mladušky téhož plemena, tj. v čely stejného stá ří, téže 
funkce vzhledem ke krmení plodu atd. V čely by m ěly být získány 
z dobře potravou zásobených zdravých, pokud možno chorob 
prostých v čelstev, s kladoucí matkou, se známým p ůvodem, chovem 
a fyziologickým stavem. M ěly by být sesbírány ráno v den zkoušky 
nebo by m ěly být sesbírány ve čer před zkouškou a drženy 
v podmínkách zkoušky do p říštího dne. Vhodné jsou v čely sesbírané 
z rámků bez plod ů. Včely by nem ěly být sbírány brzy na ja ře nebo 
pozdě na podzim, nebo ť během těchto období mají zm ěněnou fyzi­
ologii. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na ja ře nebo pozd ě na 
podzim, mohou se v čely vylíhnout v inkubátoru a chovat s „v čelím 
chlebem“ (na plástovém pylu) a s cukerným roztokem. V čely 
ošetřené chemickými látkami, jako jsou antibiotika, prost ředky 
proti varroatóze atd., by nem ěly být použity pro zkoušky toxicity 
po čtyři týdny od konce posledního ošet ření. 
1.5.2.  Podmínky chovu a krmení  
Použijí se snadno čistitelné a dob ře větrané klícky. Lze použít jaký ­
koli vhodný materiál, nap ř. klícky z korozivzdorné oceli, drát ěného 
pletiva, plastu nebo d řevěné klícky na jednorázové použití atd. Veli ­
kost zkušebních klícek by m ěla vyhovovat po čtu včel, tj. klícky by 
měly poskytovat dostatek prostoru. Dává se p řednost skupinám po 
10 včelách.  
Včely by m ěly být přechovávány ve tm ě v experimentální místnosti 
při teplotě 25 ± 2  o C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní 
vlhkost, která je obvykle 50–70 %. Zacházení se v čelami, včetně 
ošetřování a pozorování, m ůže být provád ěno za (denního) sv ětla. 
Jako potrava se používá vodný cukerný roztok o kone čné koncen ­
traci 500 g/l (50 % m/V) a podává se za použití krmítka v čel po 
dobu zkoušky  ad libitum . Lze použít sklen ěnou trubi čku (přibližně 
50 mm dlouhou, s pr ůměrem 10 mm, zúženou na otev řeném konci 
na průměr asi 2 mm).  
1.5.3.  Příprava včel 
Sesbírané v čely mohou být za ú čelem aplikace zkoušené látky narko ­
tizovány oxidem uhli čitým nebo dusíkem. Množství anestetika 
v době expozice by m ělo být minimalizováno. Hynoucí v čely se 
před zahájením zkoušky odstraní a nahradí zdravými v čelami.  
1.5.4.  Příprava dávek  
Zkoušená látka se aplikuje jako roztok v nosi či, tj. v organickém 
rozpouštědle nebo jako vodný roztok se smá čedlem. Jako organické 
rozpouštědlo se up řednostňuje aceton, mohou však být použita i jiná 
rozpouštědla s nízkou toxicitou pro v čely (např. dimethylformamid, 
dimethylsulfoxid). U fináln ě upravených p řípravků dispergovaných 
ve vodě a u siln ě polárních organických látek nerozpustných 
v organických nosi čových rozpoušt ědlech lze aplikaci usnadnit jejich 
rozpuštěním ve slabém roztoku komer čního smá čedla (nap ř. 
smáčedla Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použijí-li se k rozpušt ění 
zkoušené látky rozpoušt ědlo nebo dispergátor, použijí se dv ě samo­
statné kontrolní skupiny: jedna ošet řená vodou a jedna 
rozpouštědlem/dispergátorem.  
1.6. POSTUP  
1.6.1.  Zkušební a kontrolní skupiny  
Počet zkoušených dávek a jejich opakování by m ěl splňovat statis ­
tické požadavky na stanovení LD  50 na hladin ě spolehlivosti 95 %. 
Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespo ň pět dávek tvo řících 
geometrickou řadu s faktorem nep řekračujícím 2,2 a pokrývajících 
rozsah pro LD  50 . Počet dávek se však musí stanovit s ohledem na 
směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na 
statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledk ů. Vhodné dávky 
je možné zvolit pomocí orienta ční zkoušky.  
Každá zkušební koncentrace se podá alespo ň třem soub ěžným 
zkušební skupinám o 10 v čelách.  
Vedle zkušebních skupin se nasadí alespo ň tři kontrolní skupiny, 
každá o 10 v čelách. Je-li použito organické rozpoušt ědlo nebo 
smáčedlo, musí se za řadit další t ři kontrolní skupiny po 10 v čelách 
pro rozpoušt ědlo a smá čedlo.  
1.6.2.  Standard toxicity  
V rámci zkušebních skupin musí být použit standard toxicity. Zvolí 
se alespo ň tři dávky pokrývající o čekávanou hodnotu LD  50 . Pro 
každou zkoušenou dávku se použijí alespo ň tři klícky po deseti 
včelách, tj. t ři opakování. Up řednostňovaným standardem toxicity 
je dimethoát, pro n ějž se uvádí LD  50 24 hodin, kontaktn ě 
v rozmezí 0,10–0,30 μg účinné látky na v čelu (2). Jsou však p řija­
telné i jiné standardy toxicity, pokud lze p ředložit dostatek údaj ů pro 
ověření očekávané reakce na dávku (nap ř. parathion).  
1.6.3.  Expozice  
1.6.3.1.  Podávání dávek  
U narkotizovaných v čel se jednotliv ě provede topikální aplikace. 
Včely se náhodn ě rozdělí do různých zkušebních a kontrolních 
skupin. Objem 1 μl roztoku obsahujícího zkoušenou látku ve vhodné 
koncentraci se aplikuje mikroaplikátorem na dorsální stranu thoraxu každé včely. Mohou být použity i jiné objemy, je-li to opodstatn ěné. 
Po aplikaci se v čely umístí do zkušebních klícek a zásobí se 
cukerným roztokem.
 
1.6.3.2.  Délka doby trvání zkoušky  
Upřednostňuje se délka doby trvání zkoušky 48 hodin. Jestliže se 
mortalita mezi 24 a 48 hodinami zvyšuje o více než 10 %, je vhodné 
zkoušku prodloužit maximáln ě na 96 hodin, pokud mortalita 
v kontrolních skupinách nep řekračuje ≤ 10 %.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Pozorování  
Mortalita se zaznamená po 4 hodinách od aplikace a poté po 24 
hodinách a 48 hodinách. Je-li nezbytné dobu pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech maxi ­
málně do 96 hodin, pokud mortalita v kontrolních skupinách nep ře­
kračuje 10 %.
 
Zaznamená se neobvyklé chování pozorované b ěhem doby zkoušky.  
1.6.5.  Limitní zkouška  
V některých p řípadech (nap ř. očekává-li se u látky nízká toxicita) 
může být provedena limitní zkouška za použití 100 μg účinné látky 
na včelu s cílem prokázat, že LD  50 je vyšší než tato hodnota. Postu ­
puje se stejným zp ůsobem, v četně nasazení t ří souběžných zkušeb ­
ních skupin pro každou zkušební dávku, tj. t ří opakování, odpovída ­
jících kontrolních skupin a použití standardu toxicity. Dojde-li k úhynům, měla by se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány 
subletální ú činky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.
 
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
2.1. ÚDAJE  
Údaje se shrnou do tabulky, p řičemž se pro každou zkušební 
skupinu, kontrolní skupiny a skupiny se standardem toxicity uvede počet použitých v čel, mortalita v každé dob ě pozorování a po čet včel 
s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalit ě se analyzují 
vhodnými statistickými metodami (nap ř. probitovou analýzou, klou ­
zavým pr ůměrem, proložením binomického rozd ělení) (3, 4). Sestrojí 
se křivky závislosti dávka-reakce pro každou dobu pozorování (tj. 24 
hodin, 48 hodin a podle pot řeby 72 hodin, 96 hodin) a vypo čtou se 
směrnice křivek a st řední letální dávky (LD
 50 ) s 95 % intervalem 
spolehlivosti. Korekce na mortalitu v kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). LD
 50 se vyjádří v μg zkoušené 
látky na v čelu. 
2.2. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
2.2.1.  Zkoušená látka:  
— fyzikální stav a fyzikáln ě-chemické vlastnosti (nap ř. stálost ve 
vodě, tlak par),  
— údaje o chemické identifikaci v četně strukturního vzorce, čistota, 
(tj. u pesticid ů identifikace a koncentrace ú činné látky (ú činných 
látek)).  
2.2.2.  Testovací druh:  
— vědecký název, plemeno, p řibližné stá ří (v týdnech), metoda 
sběru včel, datum sb ěru, 
— informace o v čelstvech použitých pro sb ěr testovacích v čel, 
včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dosp ělců, 
o všech ošet řeních před pokusem atd.,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Zkušební podmínky:  
— teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,  
— podmínky chovu v četně typu, velikosti a materiálu klícek,  
— metody aplikace zkoušené látky, nap ř. použité nosi čové rozpouš ­
tědlo, aplikovaný objem zkušebního roztoku, použitý narkoti ­
zační prostředek,  
— uspořádání zkoušky, nap ř. použité zkoušené dávky a jejich po čet, 
počet kontrolních skupin, pro každou dávku a kontrolu po čet 
paralelních klícek, tj. opakování, a po čet včel na klícku,  
— datum zkoušky.  
2.2.4.  Výsledky:  
— výsledky p ředběžné orienta ční zkoušky, byla-li provedena,  
— primární údaje: mortalita pro každou zkoušenou dávku v každém 
čase pozorování,  
— graf k řivek závislosti dávkareakce na konci zkoušky,  
— hodnoty LD  50 s 95 % intervaly spolehlivosti pro každou doporu ­ 
čenou dobu pozorování, a to pro zkoušenou látku a standard 
toxicity,  
— statistické metody použité pro stanovení LD  50 , 
— mortalita v kontrolních skupinách,  
— jiné pozorované nebo zm ěřené biologické ú činky a jakékoli 
neobvyklé reakce v čel, 
— jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu metody 
a jiné důležité informace.  
3. LITERATURA  
1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products 
– Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151–165. March, 
1993.  
2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981–1992. Journal of 
Apicultural Research 22, 119–125.  
3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113.
 
4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, 265–267.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  STANOVENÍ ADSORPCE/DESORPCE ŠARŽOVITOU 
ROVNOVÁŽNOU METODOU  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 106 pro stanovení p ůdní 
adsorpce/desorpce šaržovitou rovnovážnou metodou (2000).  
1.1. ÚVOD  
Tato metoda se opírá o okružní testy a seminá ř o výběru půd pro 
vývoj zkoušky adsorpce (1, 2, 3, 4) a rovn ěž o existující metodiky 
na vnitrostátní úrovni (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11).  
Studie adsorpce/desorpce jsou užite čné pro získávání d ůležitých 
informací o mobilit ě a distribuci chemických látek v p ůdních, 
vodních a vzdušných složkách biosféry (12, 13, 14, 15, 16, 17, 
18, 19, 20, 21). Informace lze použít k p ředpovědi nebo odhadu 
například dostupnosti chemické látky pro odbourávání (22, 23), 
transformaci a p říjem organismy (24), vymývání p ůdním profilem 
(16, 18, 19, 21, 25, 26, 27, 28), vyt ěkávání z p ůdy (21, 29, 30) 
a odtékání z p ůdního povrchu do vod (18, 31, 32). Údaje o adsorpci 
lze použít pro ú čely porovnání a modelování (19, 33, 34, 35).  
Distribuce chemické látky mezi p ůdu a vodnou fázi je složitý proces, 
který závisí na řadě různých faktor ů: na chemické povaze látky (12, 
36, 37, 38, 39, 40), na charakteristikách p ůdy (4, 12, 13, 14, 41, 42, 
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49) a na klimatických faktorech, jako jsou 
dešťové srážky, teplota, slune ční svit a vítr. Četné jevy 
a mechanismy p ři adsorpci chemické látky v p ůdě tedy nelze 
v celém rozsahu definovat zjednodušeným laboratorním modelem, 
jakým je tato metoda. P řestože nelze tímto pokusem zahrnout 
všechny možné p řípady z životního prost ředí, poskytuje hodnotné 
informace o významnosti adsorpce chemické látky z hlediska život ­
ního prost ředí. 
Viz také Obecný úvod.  
1.2. ROZSAH  
Tato metoda je zam ěřena na odhad adsorp čního/desorp čního chování 
látky v půdách. Cílem je získat sorp ční hodnoty, které lze použít pro 
předpověď distribuce za mnoha podmínek v životním prost ředí; 
k tomuto ú čelu se pro chemickou látku stanovují rovnovážné 
adsorpční koeficienty v r ůzných půdách jako funkce p ůdních chara ­
kteristik (nap ř. obsahu organického uhlíku, obsahu jílu, p ůdní struk­
tury a pH). Pro co nejširší podchycení interakcí dané látky s p ůdami 
vyskytujícími se v p řírodě musí být použity r ůzné druhy p ůd. 
Při této metod ě vyjadřuje adsorpce proces vázání chemické látky na 
půdní povrch; nerozlišuje se mezi r ůznými adsorp čními procesy 
(fyzikální a chemickou adsorpcí) a procesy, jako jsou povrchov ě 
katalyzované odbourávání, adsorpce hmotou nebo chemická reakce. 
Adsorpce na koloidních částicích (pr ůměr < 0,2 μm) vznikajících 
v půdě se nebere v úvahu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Půdními parametry, které jsou považovány za nejd ůležitější, jsou: 
obsah organického uhlíku (3, 4, 12, 13, 14, 41, 43, 44, 45, 46, 
47, 48), obsah jílu a p ůdní struktura (3, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 
47, 48) a pro ionizovatelné slou čeniny také pH (3, 4, 42). Dalšími 
půdními parametry, které mohou mít vliv na adsorpci/desorpci ur čité 
látky jsou efektivní kationtová vým ěnná kapacita (ECEC), obsah 
amorfních oxid ů železa a hliníku, zejména u vulkanických 
a tropických p ůd (4) a rovn ěž specifický povrch (49).  
Zkouška je navržena pro vyhodnocení adsorpce chemické látky na 
různých druzích p ůd s prom ěnlivým obsahem organického uhlíku, 
jílu, prom ěnlivou půdní strukturou a prom ěnlivým pH. Je trojstup ­ 
ňová: 
Stupeň 1:. Předběžná studie pro stanovení:  
— poměru půda/roztok,  
— rovnovážné adsorp ční doby a množství zkoušené 
látky adsorbované p ři rovnováze,  
— adsorpce zkoušené látky na povrchu zkušební 
nádobky a stálosti zkoušené látky po dobu zkoušky.  
Stupeň 2:. Screeningová zkouška: adsorpce je studována v p ěti 
různých typech p ůd měřením adsorp ční kinetiky p ři 
jedné koncentraci zkoušené látky a stanovením distri ­
bučních koeficient ů K d a K  ou . 
Stupeň 3: Stanovení Freundlichových adsorp čních isotherm za 
účelem zjišt ění vlivu koncentrace na rozsah adsorpce 
v půdách.  
Studie desorpce m ěřením desorp ční kinetiky/Freundlicho ­
vých desorp čních isotherm (dodatek 1).  
1.3. DEFINICE A JEDNOTKY  
Symbol Definice Jednotky  
A t i procento adsorpce v čase t  i % 
A eq procento adsorpce p ři adsorpční rovnováze %  
m p ads ðt i Þ hmotnost zkoušené látky adsorbované v p ůdě v čase t i μg 
m p ads ðΔt i Þ hmotnost zkoušené látky adsorbované v p ůdě v časovém 
intervalu Δt i μg 
m p ads ðeqÞ hmotnost zkoušené látky adsorbované v p ůdě při adsorpční 
rovnováze μg 
m 0 hmotnost zkoušené látky ve zkušební nádobce na za čátku 
adsorpční zkoušky μg 
m m ads ðt i Þ hmotnost zkoušené látky nam ěřené v podílu ( v a A ) μg 
m vod ads ðeqÞ hmotnost zkoušené látky v roztoku p ři adsorpční rovno­
váze μg 
m půda množství p ůdní fáze vyjád řené v suché hmotnosti p ůdy g  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Symbol Definice Jednotky  
C zás hmotnostní koncentrace zásobního roztoku látky μg/cm  3 
C 0 počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku 
v kontaktu s p ůdou μg/cm  3 
C vod ads ðt i Þ hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase t i , kdy 
je provád ěna analýza μg/cm  3 
C p ads ðeqÞ množství látky adsorbované v p ůdě při adsorpční rovno­
váze μg/g 
C vod ads ðeqÞ hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi p ři adsorpční 
rovnováze μg/cm  3 
V 0 počáteční objem vodné fáze v kontaktu s p ůdou během 
adsorpční zkoušky cm 3 
v a A objem podílu, ve kterém je látka stanovovánad cm  3 
K d distribuční koeficient pro adsorpci cm  3 /g 
K ou adsorpční koeficient normalizovaný na organický uhlík cm  3 /g 
K om distribuční koeficient normalizovaný na obsah organických 
látek cm 3 /g 
K F ads Freundlich ův adsorpční koeficient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n Freundlich ův exponent  
D t i procento desorpce v čase t i % 
D Δt i procento desorpce v časovém intervalu Δt i % 
K des zdánlivý desorp ční koeficient cm  3 /g 
K F des Freundlich ův desorpční koeficient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m vod des ðt i Þ hmotnost zkoušené látky desorbované z p ůdy v čase t  i μg 
m p des ðΔt i Þ hmotnost látky, která z ůstává adsorbovaná v p ůdě po 
uplynutí časového intervalu Δt i μg 
m m des ðeqÞ analyticky stanovená hmotnost látky ve vodné fázi p ři 
desorpční rovnováze μg 
m vod des ðeqÞ hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi p ři desorpční 
rovnováze μg 
m p des ðΔt i Þ hmotnost látky, která z ůstává adsorbovaná v p ůdě po 
uplynutí časového intervalu μg 
m vod A hmotnost látky zbylé z adsorp ční rovnováhy v d ůsledku 
neúplné vým ěny objemu vodné fáze μg 
C p des ðeqÞ množství zkoušené látky, které z ůstalo adsorbované v p ůdě 
při desorpční rovnováze μg/g ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Symbol Definice Jednotky  
C vod des ðeqÞ hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi p ři desorpční 
rovnováze μg/cm  3 
V T celkový objem vodné fáze v kontaktu s p ůdou při měření 
desorpční kinetiky sériovou metodou cm 3 
V R objem supernatantu odebraného ze zkušební nádobky po 
dosažení adsorp ční rovnováhy a nahrazeného stejným 
objemem 0,01 M roztoku CaCl  2 cm 3 
v a D objem podílu odebraného k analýze od okamžiku  t i při 
měření desorp ční kinetiky provedeného sériovou metodou cm 3 
V r i objem roztoku odebraného ze zkušební nádobky ( i) ke 
stanovení zkoušené látky p ři měření desorp ční kinetiky 
(paralelní metoda) cm 3 
V r F objem roztoku odebraného ze zkušební nádobky ke 
stanovení zkoušené látky p ři desorpční rovnováze cm 3 
MB hmotnostní bilance % 
m E celková hmotnost zkoušené látky extrahované z p ůdy a ze 
stěn zkušební nádobky ve dvou stupních μg 
V rec objem supernatantu získaný po dosažení adsorp ční rovno­
váhy cm 3 
P ov rozdělovací koeficient oktanol/voda 
pK a disociační konstanta 
S v rozpustnost ve vod ě g/l  
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Známé objemy roztok ů zkoušené látky isotopov ě značené nebo 
neznačené, o známé koncentraci, se v 0,01 M CaCl  2 přidají 
k půdním vzork ům o známé suché hmotnosti, které byly p ředem 
uvedeny do rovnováhy s 0,01 M CaCl  2 . Směs se přiměřenou dobu 
míchá. Půdní suspense se poté odd ělí centrifugací a pop řípadě zfil­
truje a vodná se fáze se analyzuje. Množství zkoušené látky adsor ­
bované v p ůdním vzorku se vypo čte z rozdílu mezi po čátečním 
množstvím zkoušené látky v roztoku a množstvím, které v n ěm 
zbylo na konci experimentu (nep římá metoda).  
Alternativn ě lze adsorbované množství zkoušené látky stanovit také 
přímo analýzou p ůdy (přímá metoda). Tato metoda, která zahrnuje 
postupnou extrakci vhodným rozpoušt ědlem, se doporu čuje 
v případech, kdy nelze p řesně stanovit rozdíl koncentrací látky 
v roztocích. Jde nap říklad o tyto p řípady: adsorpce zkoušené látky 
na stěnách zkušebních nádobek, nestálost zkoušené látky vzhledem 
k délce experimentu, nízká adsorpce s malou zm ěnou koncentrace 
v roztoku a vysoká adsorpce, jejímž d ůsledkem je nízká koncentrace, 
kterou nelze p řesně stanovit. Použije-li se látka isotopov ě značená, 
lze se extrakci p ůdy vyhnout analýzou p ůdní fáze spálením 
a počítáním scintilací v roztoku. To je však nespecifická technika, 
která nerozlišuje mezi výchozími a transforma čními produkty; m ěla 
by tedy být použita pouze tehdy, je-li zkoušená chemická látka po 
dobu studie stálá.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Chemická činidla musí mít analytickou čistotu. Doporu čuje se 
použití radioisotopov ě neznačených zkoušených látek se známým 
složením a alespo ň 95 % čistotou, nebo zna čených zkoušených látek, 
které mají známé složení a jsou isotopov ě čisté. U zna čených atom ů 
s krátkým polo časem musí být provedena korekce na rozpad.  
Před provád ěním zkoušek adsorpcedesorpce by m ěly být o zkoušené 
látce známy tyto informace:  
a) rozpustnost ve vod ě (A.6);  
b) tlak par (A.4) a/nebo Henryho konstanta;  
c) abiotický rozklad: hydrolýza jako funkce pH (C.7);  
d) rozdělovací koeficient (A.8);  
e) snadná biologická rozložitelnost (C.4) nebo aerobní a anaerobní 
transformace v p ůdě; 
f) pKa ionizovatelných látek;  
g) přímá fotolýza ve vod ě (tj. UV-Vis absorp ční spektrum ve vod ě, 
kvantový výt ěžek) a fotodegradace v p ůdě. 
1.6. POUŽITELNOST ZKOUŠKY  
Zkouška je použitelná u látek, pro n ěž existuje analytická metoda 
s dostatečnou správností. D ůležitým parametrem, který m ůže ovlivnit 
spolehlivost výsledku, zejména p ři nepřímé metod ě, je stálost zkou ­ 
šené látky po celou dobu zkoušky. Je tedy p ředpokladem ov ěřit 
stálost v p ředběžné studii; je-li v pr ůběhu zkoušky pozorována 
přeměna látky, doporu čuje se, aby byla v hlavní studii analyzována 
jak půdní, tak vodná fáze.  
Obtíže mohou nastat p ři provádění této zkoušky u látek s nízkou 
rozpustností ve vod ě (S  v < 10  -4 g/l) a rovn ěž u látek s vyšším 
nábojem v d ůsledku toho, že koncentraci ve vodné fázi nelze zm ěřit 
s dostatečnou správností. V t ěchto případech musí být podniknuty 
další kroky. Pokyny pro řešení těchto problém ů jsou uvedeny 
v příslušných částech této metody.  
Při zkoušení t ěkavých látek je t řeba dbát na to, aby se v pr ůběhu 
studie předešlo ztrátám.  
1.7. POPIS METODY  
1.7.1.  Přístroje a pom ůcky, chemická činidla  
Standardní laboratorní vybavení, zejména:  
a) Zkumavky nebo nádobky pro provedení experiment ů. Je důležité, 
aby tyto zkumavky nebo nádobky:  
— odpovídaly odst ředivce, aby se minimalizovaly nep řesnosti 
v důsledku manipulace a p řenášení,  
— byly z inertního materiálu, který minimalizuje adsorpci zkou ­ 
šené látky na jejich st ěnách.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) Třepací zařízení: třepačka s rotačním pohybem nebo rovnocenné 
zařízení; třepačka musí v pr ůběhu třepání udržovat p ůdu 
v suspensi;  
c) Odstředivka: p řednostně vysokootá čková, nap ř. s odstředivým 
zrychlením > 3 000 g, s řízenou teplotou, schopná odst ředit 
z vodného roztoku částice o pr ůměru větším než 0,2 μm. Kyvety 
by měly být během třepání a centrifugace opat řeny víčky, aby 
nedošlo ke ztrátám t ěkavých látek a vody; aby se minimalizovala 
adsorpce na ví čkách, použijí se deaktivovaná ví čka, např. šrou­
bová víčka potažená teflonem.  
d) Volitelné: filtra ční zařízení; filtry s pr ůměrem pórů 0,2 μm, 
sterilní, na jedno použití. Zvláštní pé če by měla být věnována 
volbě materiálu filtru, aby se p ředešlo ztrátám zkoušené látky; 
u špatně rozpustných zkoušených látek se organický materiál 
filtru nedoporu čuje. 
e) Analytické p řístroje vhodné pro m ěření koncentrace zkoušené 
látky.  
f) Laboratorní sušárna umož ňující udržovat teplotu od 103  o C do 
110  o C. 
1.7.2.  Charakterizace a výb ěr půd 
Půdy by m ěly být charakterizovány t řemi parametry, které jsou 
hlavně odpovědné za adsorp ční kapacitu: obsahem organického 
uhlíku, obsahem jílu a p ůdní strukturou a hodnotou pH. Jak již 
bylo uvedeno, (viz oddíl Rozsah), mohou mít další fyzikáln ě- 
chemické charakteristiky p ůdy vliv na adsorpci/desorpci ur čité 
látky a m ěly by být v takových p řípadech zohledn ěny. 
Metody použité pro charakterizaci p ůdy jsou velmi d ůležité a mohou 
významně ovlivnit výsledky. Doporu čuje se tedy, aby pH bylo odpo ­
vídající metodou ISO (ISO-10390-1) m ěřeno v 0,01 M CaCl  2 (jde 
o roztok použitý p ři zkoušení adsorpce/desorpce). Doporu čuje se 
rovněž, aby byly ostatní d ůležité půdní charakteristiky stanoveny 
standardními metodami (nap ř. ISO „Handbook of Soil Analysis“); 
to umožní, aby byla analýza sorp čních údaj ů založena na sv ětově 
standardizovaných p ůdních parametrech. Informace o existujících 
standardních metodách analýzy a charakterizace p ůdy jsou uvedeny 
v literatuře (50–52). Ke kalibraci metod zkoušení p ůd se doporu čují 
referenční půdy. 
Návod pro výb ěr půd pro adsorp ční/desorpční experimenty je uveden 
v tabulce 1. Sedm vybraných druh ů půd pokrývá p ůdní druhy vysky ­
tující se v mírném zem ěpisném pásu. V p řípadě ionizovatelných 
zkoušených látek by m ěly vybrané p ůdy pokrývat široký rozsah 
pH, aby bylo možné hodnotit adsorpci látky v její ionizované 
a neionizované form ě. Návod k volb ě počtu různých půd, které 
mají být použity v jednotlivých stadiích zkoušky, je uveden v bodu 1.9 Provedení zkoušky.
 
Upřednostňují-li se jiné druhy p ůd, měly by být charakterizovány 
stejnými parametry a m ěly by mít podobný rozsah vlastností jako 
v tabulce 1, t řebaže kritériím neodpovídají p řesně. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabulka 1  
Návod pro výb ěr půdních vzork ů pro adsorpci/desorpci  
Druh půdy Rozsah pH (v 0,01 
M CaCl  2 ) Obsah organického 
uhlíku (%) Obsah jílu (%) Struktura p ůdy (  1 ) 
1 4,5–5,5 1,0–2,0 65–80 jílovitá 
2 > 7,5 3,5–5,0 20–40 jílovitohlinitá 
3 5,5–7,0 1,5–3,0 15–25 prachovitohlinitá 4 4,0–5,5 3,0–4,0 15–30 hlinitá 5 < 4,0–6,0 (
 2 ) < 0,5–1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10–15 (  2 ) hlinitopís čitá 
6 > 7,0 < 0,5–1,0 (  2 ) ( 3 ) 40–65 jílovitohlinitá/jíl 
7 < 4,5 > 10 < 10 písek/hlinitopís čitá 
( 1 ) Podle FAO a amerického systému (85). 
( 2 ) Příslušné hodnoty parametr ů by měly přednostně ležet v uvedeném rozmezí. Vyskytnouli se však p ři hledání vhod ­
ného půdního materiálu obtíže, jsou p řijatelné i hodnoty ležící pod uvedeným minimem. 
( 3 ) U půd s obsahem organického uhlíku nižším než 0,3 % m ůže být porušena korelace mezi obsahem organických látek 
a adsorpcí. Doporu čuje se tedy používat p ůdy s minimálním obsahem organického uhlíku 0,3 %.  
1.7.3.  Sb ěr a uchovávání p ůdních vzork ů 
1.7.3.1.  Sběr 
Není doporu čena žádná specifická technika odb ěru vzorků; technika 
odběru závisí na ú čelu studie (53, 54, 55, 56, 57, 58).  
Je třeba zvážit tyto hlediska:  
a) informace o historii lokality jsou nezbytné; zahrnují informace 
o lokalit ě, vegetaci, použití pesticid ů nebo hnojiv, 
o biologických nánosech nebo náhodné kontaminaci. Pokud jde 
o popis místa odb ěru, měla by být dodržena doporu čení normy 
ISO o vzorkování p ůd (ISO 10381-6);  
b) místo odb ěru musí být definováno sou řadnicemi UTM (Universal 
Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) 
nebo zem ěpisnými sou řadnicemi; to by mohlo umožnit opako ­
vaný odb ěr dané p ůdy v budoucnu nebo pomoci p ři určení 
půdy podle r ůzných klasifika čních systém ů používaných 
v různých zemích. Krom ě toho by m ěl být vzorkován pouze 
horizont A do maximální hloubky 20 cm. Zvlášt ě je-li 
u půdního druhu č. 7 součástí půdy horizont O  h , měl by být 
zahrnut do vzorkování.  
Půdní vzorky by m ěly být přepravovány v kontejnerech a za teploty, 
jež zaručí, že nedojde k výrazné zm ěně původních charakteristik 
půdy. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Uchovávání  
Upřednostňuje se použití čerstvě odebraných p ůd. Pouze není-li to 
možné, mohou být p ůdy uchovávány p ři teplotě okolí a suzšeny na 
vzduchu. Pro dobu uchovávání neexistuje žádný doporu čený limit, 
ale půdy uchovávané déle než t ři roky by m ěly být před použitím 
znovu analyzovány na obsah organického uhlíku, pH a CEC (kati ­
ontovou vým ěnnou kapacitu).  
1.7.3.3.  Zpracování p ůdních vzork ů a jejich p říprava ke zkoušce  
Půdy se vysuší na vzduchu p ři teplotě okolí (přednostně při 20–25  
o C). Rozrušení p ůd se provede minimální silou, aby se p ůvodní 
struktura p ůdy změnila co nejmén ě. Půdy se prosejí na sítu, aby se 
získaly částice o velikosti ≤ 2 mm; p ři prosévání by m ěla být 
dodržována doporu čení normy ISO o vzorkování p ůdy (ISO 
10381-6). Doporu čuje se opatrná homogenizace, nebo ť tím se 
zvyšuje reprodukovatelnost výsledk ů. Vlhkost každé p ůdy se stanoví 
v třech alikvotech zah říváním při 105  o C, dokud se významn ě mění 
hmotnost (p řibližně 12 hodin). Ve všech výpo čtech se hmotností 
půdy rozumí hmotnost po sušení v sušárn ě, tj. hmotnost p ůdy kori­
govaná na obsah vlhkosti.  
1.7.4.  Příprava zkoušené látky pro aplikaci na p ůdu 
Zkoušená látka se rozpustí v 0,01 M roztoku CaCl  2 v destilované 
nebo deionizované vod ě; roztok CaCl  2 se použije jako vodná 
rozpouštědlová fáze, aby se zlepšila centrifugace a minimalizovala 
kationtová vým ěna. Koncentrace zásobního roztoku by m ěla být 
přednostně o tři řády vyšší než mez stanovitelnosti použité analytické 
metody. Tento práh zabezpe čuje přesnost měření s ohledem na meto ­
diku použitou p ři tomto postupu; krom ě toho by m ěla být koncent ­
race zásobního roztoku nižší než rozpustnost zkoušené látky ve vod ě. 
Zásobní roztok by se m ěl připravovat nejlépe t ěsně před aplikací na 
půdní vzorky a uchovávat uzav řený v temnu p ři 4 o C. Doba ucho ­
vávání závisí na stálosti zkoušené látky a na její koncentraci v roztoku.
 
Pouze u špatn ě rozpustných látek (S  v < 10  –4 g/l) může být nezbytné 
použití solubiliza čního činidla, je-li obtížné zkoušenou látku rozpus ­
tit. Solubiliza ční činidlo: a) by m ělo být mísitelné s vodou, nap ř. 
methanol nebo acetonitril, b) jeho koncentrace by nem ěla překročit 
1 % celkového objemu zásobního roztoku a jeho podíl by m ěl být 
nižší v roztoku zkoušené látky p řicházejícím do kontaktu s p ůdou 
(přednostně v koncentraci nižší než 0,1 %) a c) nem ělo by být 
povrchov ě aktivní a nem ělo by podléhat solvolytickým reakcím se 
zkoušenou chemickou látkou. Použití solubiliza čního činidla by m ělo 
být uvedeno a od ůvodněno při uvádění údajů. 
Jinou možností u špatn ě rozpustných látek je jejich vmíchání do 
systému: zkoušená látka se rozpustí v organickém rozpoušt ědle 
a alikvot se p řidá ke sm ěsi půdy a 0,01 M roztoku CaCl  2 
v destilované nebo deionizované vod ě. Obsah organického rozpouš ­
tědla ve vodné fázi by m ěl být co nejnižší a obvykle by nem ěl 
překročit 0,1 %. Nedostatkem vmíchání v organickém rozpoušt ědle 
je nereprodukovatelnost objemu. To m ůže znamenat vnesení další 
chyby, nebo ť koncentrace zkoušené látky a kosolventu nebývají ve 
všech zkouškách stejné.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. P ŘEDPOKLADY PRO PROVEDENÍ ADSORP ČNÍ/DESORP ČNÍ 
ZKOUŠKY  
1.8.1.  Analytická metoda  
Klíčovými parametry, které mohou mít vliv na správnost m ěření 
sorpce, jsou správnost metody analýzy jak roztoku, tak adsorbované 
fáze, stálost a čistota zkoušené látky, dosažení sorp ční rovnováhy, 
velikost zm ěny koncentrace roztoku, pom ěr půda/roztok a zm ěny 
v půdní struktu ře během ustavování rovnováhy (35, 59–62). N ěkteré 
příklady týkající se problematiky správnosti jsou uvedeny 
v dodatku 2.  
Spolehlivost použité analytické metody musí být ov ěřována 
v rozmezí koncentrací, které se mohou vyskytnout v pr ůběhu zkou­ 
šky. Je na experimentátorovi, aby vyvinul vhodnou metodu 
s náležitou správností, p řesností, reprodukovatelností, mezí stanovi ­
telnosti a výt ěžkem. Návodem k provedení takové zkoušky je níže 
uvedený experiment.  
Vhodný objem 0,01 M CaCl  2 , např. 100 cm  3 , se protřepává 4 hodiny 
např. s 20 g p ůdy o vysoké adsorp ční schopnosti, tj. s vysokým 
obsahem organického uhlíku a jílu; tato hmotnost a objem se mohou m ěnit podle požadavk ů analýzy, avšak pom ěr půda/roztok 
1:5 je vhodnou výchozí hodnotou. Sm ěs se odst ředí a vodná fáze 
se může zfiltrovat. K vodné fázi se p řidá určitý objem zásobního 
roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo nominální hodnoty v koncentra čním rozsahu, který se m ůže vyskytnou v pr ůběhu zkou­ 
šky. Tento objem by nem ěl překročit 10 % kone čného objemu vodné 
fáze, aby byl charakter roztoku p řed ustavením rovnováhy zm ěněn 
co nejmén ě. Roztok se analyzuje.
 
Založí se jeden slepý pokus s p ůdou a roztokem CaCl  2 (bez zkou ­ 
šené látky) a podrobí se kontrole, pokud jde o nahodilé chyby analy ­
tické metody a vlivy matrice zp ůsobené půdou. 
Mezi analytické metody, které mohou být použity k sorp čním měře­
ním, pat ří plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází, 
(GLC), vysokoú činná kapalinová chromatografie (HPLC), spektro ­
metrie (nap ř. GC/hmotová spektrometrie, HPLC/hmotová spektrome ­
trie) a po čítání scintilací v roztoku (pro isotopov ě značené látky). 
Bez ohledu na použitou analytickou metodu se za p řiměřené pova ­ 
žují výtěžky od 90 % do 110 % nominální hodnoty. Má-li se provést 
detekce a vyhodnocení poté, co došlo k rozd ělení, musí být meze 
stanovitelnosti analytické metody alespo ň o dva řády nižší než nomi ­
nální koncentrace.  
Charakteristiky a meze stanovitelnosti analytické metody použitelné 
pro provedení studií adsorpce hrají významnou roli p ři určení 
zkušebních podmínek a p ři celém experimentálním provedení zkou ­ 
šky. Tato metoda sleduje obecný experimentální postup a obsahuje 
doporučení a pokyny pro alternativní řešení, pokud analytická 
metoda a laboratorní vybavení p řinášejí omezení.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Výb ěr optimálních pom ěrů půda/roztok  
Výběr vhodných pom ěrů půda/roztok pro sorp ční studie závisí na 
distribučním koeficientu K  d a na požadovaném relativním stupni 
adsorpce. Zm ěna koncentrace látky v roztoku je ur čující pro statis ­
tickou správnost m ěření v d ůsledku formy adsorp ční rovnice 
a omezení analytické metodiky p ři stanovování koncentrace 
chemické látky v roztoku. V obecné praxi je tedy užite čné určit 
několik fixních pom ěrů, pro něž je adsorbovaný podíl vyšší než 
20 %, a p řednostně > 50 % (62), a dbát na to, aby byla koncentrace 
zkoušené látky ve vodné fázi dostate čně vysoká pro její p řesné 
změření. To je zvlášt ě důležité u vysokých adsorbovaných podíl ů. 
Vyhovující p řístup k výb ěru vhodných pom ěrů půda/voda je založen 
na odhadu hodnoty K  d buď předběžnými studiemi, nebo zavedenými 
metodami odhadu (dodatek 3). Vhodný pom ěr lze poté vybrat na 
základě grafického znázorn ění závislosti pom ěru půda/roztok na K  d 
pro pevné hodnoty adsorpce (obrázek 1). V tomto grafickém vyjád ­ 
ření se předpokládá, že je adsorp ční rovnice lineární (  1 ). Použitelný 
poměr se získá upravením rovnice pro K  d (4) do tvaru rovnice (1):  
V 0 
m půda ¼ Í 
m 0 
m p ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
nebo do její logaritmické formy za p ředpokladu, že  R = m půda /V 0 
a A  eq %/100 =  m p ads ðeqÞ 
m 0 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Obrázek 1  Vztah mezi pom ěry půda/roztok a hodnotou K  d 
při různých podílech adsorbované zkoušené látky  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K d ·C aq ads ðeqÞ
 Na obrázku 1 jsou uvedeny požadované pom ěry půda/roztok jako 
funkce K  d pro různé úrovn ě adsorpce. Nap říklad při poměru půda/­
roztok 1:5 a p ři K  d 20 by došlo p řibližně k 80 % adsorpci. Má-li 
dojít při téže hodnot ě K d k 50 % adsorpci, musí být použit pom ěr 
1:25. Tento p řístup k výb ěru vhodných pom ěrů půda/roztok 
umožňuje pružn ě vyhovět experimentálním pot řebám.  
Obtížněji se řeší oblasti, kde se chemická látka adsorbuje siln ě nebo 
velmi slab ě. Je-li adsorpce nízká, doporu čuje se pom ěr půda/roztok 
1:1, třebaže u n ěkterých vysloven ě organických druh ů půdy může 
být k získání suspense nezbytný nižší pom ěr. Musí být p řitom věno­
vána péče analytické metodice m ěření malých zm ěn koncentrace 
roztoku, jinak bude adsorp ční měření nepřesné. Na druhé stran ě se 
může při velmi vysokých distribu čních koeficientech K  d dospět až 
k poměru půda/roztok 1:100, má-li v roztoku z ůstat významné množ ­
ství chemické látky. Je však t řeba dbát na dobré promíchání a musí 
být ponechána dostate čná doba k tomu, aby systém dosáhl rovno ­
váhy. Jiným p řístupem k řešení těchto extrémních p řípadů, kdy chybí 
vhodná anylytická metodika, je p ředpověď hodnoty K  d za použití 
techniky odhadu založené nap říklad na hodnotách P  ov (dodatek 3). 
Může být užite čný zvlášt ě u slabě adsorbovaných nebo polárních 
chemických látek s P  ov < 20 a u lipofilních/siln ě adsorbovaných 
chemických látek P  ov > 10  4 . 
1.9. PROVEDENÍ ZKOUŠKY  
1.9.1.  Zkušební podmínky  
Všechny experimenty se provád ějí při teplotě okolí a pokud možno 
při konstantní teplot ě od 20  o C do 25  o C. 
Podmínky odst řeďování by m ěly umožnit odstranit z roztoku částice 
větší než 0,2 μm. Tato velikost pat ří nejmenším částicím považo ­
vaným za pevné částice a je hranicí mezi pevnými a koloidními 
částicemi. Návod ke stanovení podmínek odst řeďování je uveden 
v dodatku 4.  
Nezaručuje-li odst ředivka, že částice větší než 0,2 μm, budou odstra ­
něny, může být použita kombinace odst řeďování a filtrace p řes 
0,2 μm filtry. Tyto filtry musí být z vhodného inertního materiálu, 
aby na nich nedošlo k žádným ztrátám zkoušené látky. V každém případě by mělo být ov ěřeno, že p ři filtraci nedochází k žádným 
ztrátám zkoušené látky.
 
1.9.2.  Stupe ň 1 – předběžná studie  
Účel provedení p ředběžné studie byl již uveden v oddíle Rozsah. 
Návodem pro provedení takové studie je dále navržený experiment.  
1.9.2.1.  Výběr optimálních pom ěrů půda/roztok  
Použijí se dva p ůdní druhy a t ři poměry půda/roztok (šest experi ­
mentů). Jeden p ůdní druh s vysokým obsahem organického uhlíku 
a nízkým obsahem jílu a druhý p ůdní druh s nízkým obsahem orga ­
nického uhlíku a vysokým obsahem jílu. Jsou navrženy tyto pom ěry 
půda/roztok:  
— 50 g p ůdy a 50 cm  3 vodného roztoku zkoušené látky 
(poměr 1/1),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g p ůdy a 50 cm  3 vodného roztoku zkoušené látky 
(poměr 1/5),  
— 2 g p ůdy a 50 cm  3 vodného roztoku zkoušené látky 
(poměr 1/25).  
Minimální množství p ůdy, se kterým lze experiment provést, závisí 
na laboratorním vybavení a na ú činnostních charakteristikách použ ­
itých analytických metod. Doporu čuje se však použít alespo ň 1 g, 
a přednostně 2 g, aby zkouška poskytla spolehlivé výsledky.  
Jeden kontrolní vzorek obsahující pouze zkoušenou látku v 0,01 
M CaCl  2 (bez půdy) se podrobí naprosto stejnému postupu jako 
zkušební systémy, a to s cílem ov ěřit stálost zkoušené látky 
v roztoku CaCl  2 a její eventuální adsorpci na povrchu zkušebních 
nádob.  
Se stejným množstvím p ůdy a celkem 50 cm  3 0,01 M CaCl  2 (bez 
zkoušené látky) se provede slepý pokus stejným postupem. Ú čelem 
je kontrola hodnot pozadí b ěhem analýzy s cílem najít rušící látky 
nebo rozeznat kontaminované p ůdy. 
Všechny experimenty v četně kontrolních a slepých pokus ů se 
provedou alespo ň dvojmo. Celkový po čet vzorků, které by m ěly 
být pro studii p řipraveny, lze vypo čítat s ohledem na metodiku, 
podle které bude postupováno.  
Metody pro p ředběžnou studii a hlavní studii jsou obecn ě stejné, 
případné výjimky jsou uvedeny.  
Vzorky vysušené na vzduchu se den p řed experimentem uvedou p řes 
noc (12 hodin) do rovnováhy prot řepáváním s 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 . 
Poté se ur čitým objemem zásobního roztoku zkoušené látky upraví 
konečný objem na 50 cm  3 . Tento objem p řidaného zásobního 
roztoku: a) by nem ěl být vyšší než 10 % kone čného objemu 
50 cm  3 vodné fáze, aby byl charakter roztoku p řed ustavením rovno ­
váhy změněn co nejmén ě; a b) měl by vést k po čáteční koncentraci 
zkoušené látky v kontaktu s p ůdou (C  0 ) alespoň o dva řády vyšší než 
je mez stanovitelnosti analytické metody; tento práh zabezpe čuje 
možnost provést p řesné měření i při vysoké adsorpci (> 90 %) 
a později stanovit adsorp ční izotermy. Doporu čuje se rovn ěž, aby 
počáteční koncentrace látky (C  0 ) pokud možno nep řekračovala polo ­
vinu hodnoty rozpustnosti látky.  
Příklad výpo čtu koncentrace zásobního roztoku látky (C  zás ) je 
uveden níže. P ředpokládá se mez stanovitelnosti 0,01 μg/cm  3 
a 90 % adsorpce; po čáteční koncentrace zkoušené látky v kontaktu 
s půdou by tedy m ěla být přednostně 1 μg/cm  3 (o dva řády vyšší, 
než je mez stanovitelnosti). Za p ředpokladu, že bude p řidán maxi ­
mální doporu čený objem zásobního roztoku, tj. 5 k 45 cm  3 0,01 
M CaCl  2 pro ustavení rovnováhy, (tj. 10 % p řídavek zásobního 
roztoku v celkovém objemu vodné fáze 50 cm  3 ) by měla být 
koncentrace zásobního roztoku 10 μg/cm; tj. o t ři řády vyšší než 
mez stanovitelnosti analytické metody.  
pH vodné fáze se m ěří před kontaktem s p ůdou a po n ěm, neboť 
hraje významnou roli v celém adsorp čním procesu, zvlášt ě 
u ionizovatelných látek.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Směs se protřepává, dokud se neustaví adsorp ční rovnováha. Doba 
nezbytná k dosažení rovnováhy v p ůdě silně kolísá v závislosti na 
chemické látce a p ůdě; zpravidla sta čí 24 hodin (77). V p ředběžné 
studii lze vzorky odebírat postupn ě v průběhu 48hodinového míchání 
(například 4, 8, 24, 48 hodin). Čas analýzy by však m ěl být volen 
pružně s ohledem na pracovní plán laborato ře. 
Existují dv ě možnosti analýzy zkoušené látky ve vodném roztoku: a) 
paralelní metoda a b) sériová metoda. Je t řeba zdůraznit, že a čkoli je 
paralelní metoda experimentáln ě pracnější, je matematické zpraco ­
vání jejích výsledk ů jednodušší (dodatek 5). Volba metodiky, 
podle které se bude postupovat, se však ponechává na experimentá ­
torovi, který bude muset zvážit dostupné laboratorní vybavení 
a zdroji.  
a) Paralelní metoda: p řipraví se tolik vzork ů s se stejným pom ěrem 
půda/roztok, kolik je časových interval ů, v nichž se má provést 
studium adsorp ční kinetiky. Po centrifugaci a pop řípadě po filt­
raci se z první zkušební nádobky odebere pokud možno úpln ě 
vodná fáze a m ěří se např. po 4 hodinách; vodná fáze druhé 
zkušební nádobky se zm ěří po 8 hodinách, vodná z fáze t řetí 
zkušební nádobky po 24 hodinách atd.  
b) Sériová metoda: pro každý pom ěr půda/roztok se p řipraví pouze 
dva vzorky. V definovaných časových intervalech se sm ěs zcen­
trifuguje a fáze se odd ělí. Malý podíl vodné fáze se ihned analy ­
zuje na zkoušenou látku; v experimentu se poté pokra čuje 
s původní sm ěsí. Následuje-li po centrifugaci filtrace, m ěla by 
mít laborato ř zařízení pro filtraci malých podíl ů vodné fáze. 
Doporučuje se, aby celkový objem odebraného podílu nep řesa­
hoval 1 % celkového objemu roztoku, aby se významn ě nezměnil 
poměr půda/roztok a aby se b ěhem zkoušky nesnížilo množství 
rozpuštěné látky, které je k dispozici pro adsorpci.  
Procento adsorpce  A t i se pro každý čas (t  i ) vypočte z nominální 
počáteční koncentrace a nam ěřené koncentrace v čase odebrání 
vzorku (t  i ), po korekci na hodnoty slepého pokusu. Sestrojí se 
závislosti  A t i na čase (obrázek 1 v dodatku 5), aby se ur čilo dosažení 
rovnovážného plató (  1 ). Rovněž se vypo čte hodnota K  d při rovno­
váze. Na základ ě této hodnoty K  d se z obrázku 1 vyberou vhodné 
poměry půda/roztok tak, aby adsorpce dosahovala více než 20 % 
a přednostně více než 50 % (61). Všechny použitelné rovnice 
a zásady pro sestrojování závislostí jsou uvedeny v oddíle Údaje a jejich p ředkládání a v dodatku 5.
 
1.9.2.2.  Stanovení rovnovážné adsorp ční doby a množství zkoušené látky 
adsorbované p ři rovnováze  
Jak již bylo uvedeno, závislosti  A t i nebo  C aq ads na čase umož ňují 
odhadnout ur čit dosažení adsorp ční rovnováhy a množství zkoušené 
látky adsorbované p ři rovnováze. P říklady těchto závislostí jsou na 
obrázcích 1 a 2 v dodatku 5. Rovnovážná doba je doba nezbytná k tomu, aby bylo v systému dosaženo plató.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Závislosti koncentrace zkušební látky ve vodné fázi  C aq ads na čase by mohly být rovn ěž 
použity k ur čení dosažení rovnovážného plató (viz obrázek 2 v dodatku 5).
 Nevyskytuje-li se u ur čité půdy plató, nýbrž je pozorován stálý 
nárůst, může to být zp ůsobeno komplikujícími faktory, jako jsou 
biologický rozklad a pomalá difuse. Biologický rozklad lze prokázat opakováním experimentu se sterilizovaným vzorkem p ůdy. Není-li 
ani v tomto p řípadě dosaženo plató, m ěl by experimentátor pátrat po 
jiných jevech, ke kterým by mohlo p ři studiích docházet; m ůže tak 
učinit vhodnou zm ěnou experimentálních podmínek (teploty, doby 
protřepávání, pom ěrů půda/roztok). Ponechává se na rozhodnutí 
experimentátora, zda bude pokra čovat ve zkušebním postupu 
i přesto, že rovnováhy p řípadně nebude dosaženo.
 
1.9.2.3.  Adsorpce na st ěnách zkušební nádobky a stálost zkoušené látky  
Některé informace o adsorpci zkoušené látky na povrchu zkušební 
nádobky a rovn ěž o stálosti zkoušené látky lze odvodit z analýzy 
kontrolních vzork ů. Pozoruje-li se úbytek v ětší, než odpovídá 
obvyklé chyb ě analytické metody, m ůže docházet k abiotickému 
rozkladu a/nebo adsorpci na povrchu zkušební nádobky. Tyto dva jevy lze rozlišit d ůkladným omytím st ěn nádobky známým objemem 
vhodného rozpoušt ědla a analýzou výplachu na zkoušenou látku. 
Není-li zjišt ěna adsorpce na povrchu zkušební nádobky, ukazuje 
úbytek na abiotickou nestálost zkoušené látky. Je-li zjišt ěna 
adsorpce, je nezbytné zm ěnit materiál zkušebních nádobek. Údaje 
o adsorpci na povrchu zkušebních nádobek získaná v tomto experi ­
mentu však nelze p římo extrapolovat na experimenty p ůdou 
a roztoky. P řítomnost p ůdy bude mít na tuto adsorpci vliv.
 
Další informace o stálosti zkoušené látky lze odvodit z hmotnostní 
bilance výchozí látky provedené v pr ůběhu času. To znamená, že se 
na zkoušenou látku analyzují vodná fáze, extrakty p ůdy a stěny 
zkušební nádobky. Rozdíl mezi hmotností p řidané zkoušené látky 
a součtem hmotností zkoušené látky ve vodné fázi, v extraktech 
půdy a na povrchu zkušební nádobky je roven hmotnosti, které se 
rozložila, vyt ěkala nebo se neextrahovala. Má-li být provedena hmot ­
nostní bilance, m ělo by být v dob ě experimentu dosaženo adsorp ční 
rovnováhy.  
Hmotnostní bilance se provede u obou druh ů půd a pro jeden pom ěr 
půda/roztok u každé p ůdy, u něhož je úbytek p ři rovnováze v ětší než 
20 % a nejlépe v ětší něž 50 %. Je-li experiment ukon čen analýzou 
posledního vzorku po 48 hodinách, fáze se odd ělí centrifugací 
a popřípadně i filtrací. Odd ělí se pokud možno veškerá vodná fáze 
a k půdě se přidá vhodné extrak ční rozpoušt ědlo (extrak ční koefi­
cient alespo ň 95 %) pro extrakci zkoušené látky. Doporu čují se 
alespoň dvě extrakce za sebou. Stanoví se množství zkoušené látky 
v půdě a v extraktech ze zkušební nádobky a vypo čítá se hmotnostní 
bilance (rovnice 10, Údaje a jejich p ředkládání). Je-li nižší než 90 %, 
považuje se zkoušená látka za nestálou v časovém m ěřítku zkoušky. 
Studie však m ůže pokra čovat, zohlední-li se nestálost zkoušené 
látky; v takovém p řípadě se doporu čuje, aby byly v hlavní studii 
analyzovány ob ě fáze.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4.  Stupe ň 2 – adsorp ční kinetika p ři jedné koncentraci zkoušené látky  
Použije se p ět druhů půd vybraných z tabulky 1. Je výhodné 
zahrnout p řitom některé nebo všechny p ůdy z předběžné studie. 
V tomto p řípadě nemusí být stupe ň 2 opakován pro p ůdy použité 
v předběžné studii.  
Rovnovážná doba, pom ěr půda/roztok, hmotnost p ůdního vzorku, 
objem vodné fáze v kontaktu s p ůdou a koncentrace zkoušené 
látky v roztoku se volí na základ ě výsledk ů předběžné studie. 
Analýzy se provád ějí přednostně po 2, 4, 6, 8 (eventuáln ě také po 
10) a 24 hodinách kontaktu s p ůdou; protřepávání m ůže být prodlou ­ 
ženo maximáln ě na 48 hodin u chemických látek, u nichž je pro 
dosažení rovnováhy podle výsledk ů předběžných studií nezbytný 
delší čas. Doby lze však volit pružn ě. 
Každý experiment (s jednou p ůdou a s jedním roztokem) se provede 
alespoň dvakrát, aby bylo možné odhadnout rozptyl výsledk ů. 
S každým experimentem se provede jeden slepý pokus. Provede se s půdou a s 0,01 M roztokem CaCl
 2 bez zkoušené látky a se stejnou 
hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému zkušebnímu 
postupu se podrobí kontrolní vzorek zkoušené látky v 0,01 M roztoku CaCl
 2 (bez půdy), který slouží jako pojistka proti ne če­
kaným výsledk ům. 
Procento absorpce se vypo čte pro každý čas A t i a pro každý interval  
A Δt i (podle pot řeby) a vynese se proti času. Rovn ěž se vypo čtou 
distribuční koeficient K  d při rovnováze a adsorp ční koeficient norma ­
lizovaný na obsah organického uhlíku K  ou (pro nepolární organické 
chemické látky).  
Výsledky zkoušky adsorp ční kinetiky  
Lineární model K  d vyjadřující vlastní pohyblivost chemických látek 
v půdě je obecn ě dostatečně přesný (35, 78). Nap říklad chemické 
látky s K  d ≤ 1 cm  3 /g jsou obecn ě považovány za kvalitativn ě 
mobilní. Podobn ě bylo MacCallem et al. (16) vyvinuto klasifika ční 
schéma mobility založené na hodnotách K  ou . Kromě toho existují 
klasifikační schémata vymývatelnosti založená na vztahu mezi K  ou 
a DT-50 (  1 ) (32, 79).  
Podle analýzy chyb (61) nelze z poklesu koncentrace ve vodné fázi 
přesně určit hodnoty K  d nižší než 0,3 cm  3 /g, a to ani p ři nejpřízni­
vějším (z hlediska správnosti) pom ěru půda/roztok, tj. p ři poměru 
1:1. V takovém p řípadě se doporu čuje analýza obou fází – p ůdy 
i roztoku.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: doba rozkladu 50 % zkoušené látky.
 S ohledem na výše uvedené poznámky se doporu čuje pokra čovat ve 
studii adsorp čního chování chemické látky v p ůdě a její případné 
mobility stanovením Freundlichových adsorp čních isotherm pro tyto 
systémy, u nichž je p řesné stanovení K  d možné provést zp ůsobem, 
kterým se postupuje v této zkušební metod ě. Přesné stanovení je 
možné, je-li sou čin hodnoty K  d a poměru půda/roztok > 0,3 p ři 
měření založeném na poklesu koncentrace ve vodné fázi (nep římá 
metoda), nebo je-li sou čin > 0,1 p ři analýze obou fází (p římá 
metoda) (61).  
1.9.2.5.  Stupe ň 3 – adsorp ční isothermy a desorp ční kinetika/desorp ční 
isothermy  
1.9.2.5.1. A d s o r p č n í i s o t h e r m y  
Použije se p ět koncentrací zkoušené látky, p řednostně v rozsahu 
dvou řádů; při volbě koncentrací se zohlední rozpustnost ve vod ě 
a výsledná rovnovážná koncentrace ve vodné fázi. P ři studii se 
u každé p ůdy použije tentýž pom ěr půda/roztok. Adsorp ční zkouška 
se provede výše uvedenou metodou pouze s tím rozdílem, že se 
vodná fáze analyzuje pouze jednou po uplynutí doby, která je 
nezbytná pro dosažení rovnováhy a která byla stanovena d říve ve 
stupni 2. Stanoví se rovnovážné koncentrace v roztoku a adsorbované množství se vypo čte z úbytku zkoušené látky 
v roztoku nebo p římou metodou. Adsorbovaná hmotnost na jednotku 
hmotnosti p ůdy se vynese jako funkce rovnovážné koncentrace 
zkoušené látky (viz oddíl Údaje a jejich p ředkládání)
 
Výsledky experimentu pro stanovení adsorp čních isotherm  
Z dosud navržených matematických model ů adsorpčních isotherm se 
k popisu adsorp čních proces ů používá Freundlichova isotherma 
nejčastěji. Podrobn ější informace o interpretaci a významu adsorp č­
ních model ů jsou uvedeny v literatu ře (41, 45, 80, 81, 82).  
Poznámka:  Je třeba poznamenat, že hodnoty K  F (Freundlichovy 
adsorpční koeficienty) lze pro r ůzné látky porovnávat pouze tehdy, 
jsou-li tyto hodnoty vyjád řeny ve stejných jednotkách (83).  
1.9.2.5.2. D e s o r p č n í k i n e t i k a  
Účelem tohoto experimentu je vyšet řit, zda je chemická látka adsor ­
bována v p ůdě vratně nebo nevratn ě. Tato informace je d ůležitá, 
neboť desorpční proces hraje také d ůležitou roli v chování chemické 
látky v p ůdě. Desorpční údaje jsou krom ě toho užite čným vstupem 
pro počítačové modelování vyluhování a pro simulaci vyplavování 
rozpuštěných látek. Je-li studie desorpce žádoucí, doporu čuje se, aby 
byla níže popsaná studie provedena na každém systému, na kterém bylo v p ředchozí studii adsorp ční kinetiky možné provést p řesné 
stanovení K
 d . 
Podobně jako u studie adsorp ční kinetiky existují dv ě volby, jak 
postupovat p ři studium desorp ční kinetiky: a) paralelní metoda a b) 
sériová metoda. Volba metodiky, podle které se bude postupovat, se 
ponechává na experimentátorovi, který bude muset zvážit laboratorní 
vybavení a zdroje, které jsou k dispozici.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Paralelní metoda: pro každou p ůdu zahrnutou do studie desorpce 
se připraví tolik vzork ů se stejným pom ěrem půda/roztok, kolik 
bude časových interval ů, v nichž se má studovat desorp ční kine­
tika. Zvolí se p řednostně stejné časové intervaly jako 
v experimentu p ři studium adsorp ční kinetiky; celkový čas se 
však může prodloužit podle pot řeby, aby bylo v systému 
dosaženo desorp ční rovnováhy. S každým experimentem (s 
jednou p ůdou a s jedním roztokem) se provede slepý pokus 
s půdou a s 0,01 M roztokem CaCl  2 bez zkoušené látky a se 
stejnou hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému 
zkušebnímu postupu se podrobí kontrolní vzorek zkoušené látky v 0,01 M roztoku CaCl
 2 (bez půdy). Všechny sm ěsi půdy 
s roztokem se prot řepávají do ustavení adsorp ční rovnováhy 
(jak byla ur čena dříve ve stupni 2). Poté se fáze odd ělí centrifu ­
gací a vodná fáze se co nejúpln ěji odebere. Objem odebraného 
roztoku se nahradí stejným objemem 0,01 M CaCl  2 bez zkoušené 
látky a nová sm ěs se opět protřepává. Vodná fáze první zkušební 
nádobky se co nejúpln ěji odebere a zm ěří například po 2 hodi ­
nách, vodná fáze druhé zkušební nádobky se zm ěří po 4 hodi ­
nách, vodná fáze t řetí zkušební nádobky se zm ěří po 6 hodinách 
atd., až do dosažení desorp ční rovnováhy.  
b) Sériová metoda: po experimentu pro stanovení adsorp ční kinetiky 
se směs zcentrifuguje a vodná fáze se co nejúpln ěji odebere. 
Objem odebraného roztoku se nahradí stejným objemem 0,01 M CaCl
 2 bez zkoušené látky. Nová sm ěs se prot řepává až do 
ustavení desorp ční rovnováhy. B ěhem této doby se ve stanove ­
ných časových intervalech sm ěs centrifuguje, aby se odd ělily 
fáze. Malý podíl vodné fáze se ihned analyzuje na zkoušenou látku; v experimentu se poté pokra čuje s původní sm ěsí. Objem 
každého jednotlivého podílu by m ěl být menší než 1 % celko ­
vého objemu. Ke sm ěsi se přidá stejné množství čerstvého 0,01 
M roztoku CaCl
 2 , aby se zachoval pom ěr půda/roztok, a v prot ře­
pávání se pokra čuje až do dalšího časového intervalu.  
Procento desorpce se vypo čte pro každý čas ðD t i Þ a pro každý 
interval ðD Δt i Þ (podle pot řeb studie) a vynese se do grafu proti 
času. Rovn ěž se vypo čte hodnota desorp čního koeficientu K  des při 
rovnováze. Všechny použité rovnice jsou uvedeny v oddíle Údaje a jejich p ředkládání a v dodatku 5.
 
Výsledky studia desorp ční kinetiky  
Společný graf závislostí procenta desorpce  D t i a adsorpce  A t i na čase 
umožní odhadnout vratnost adsorp čního procesu. Je-li desorp ční 
rovnováhy dosaženo v čase menším než dvojnásobek doby pot řebné 
pro dosažení adsorp ční rovnováhy a je-li celková desorpce vyšší než 
75 % adsorbovaného množství, považuje se adsorpce za vratnou.  
1.9.2.5.3. D e s o r p č n í i s o t h e r m y  
Freundlichovy desorp ční isothermy se ur čují v půdách použitých ke 
stanovení adsorp čních isotherm. Zkouška desorpce se provede 
způsobem popsaným v oddíle Desorp ční kinetika, pouze s tím rozdílem, 
že se vodná fáze analyzuje pouze jednou, a to p ři desorpční rovnováze. 
Vypočte se množství desorbované zkoušené látky. Množství zkoušené 
látky, která z ůstala adsorbovaná v p ůdě po dosažení desorp ční rovno­
váhy se vynese do grafu jako funkce rovnovážné koncentrace zkoušené 
látky v roztoku (viz oddíl Údaje a jejich p ředkládání a dodatek 5).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Analytické údaje se uvedou ve form ě tabulky (viz dodatek 6). Uvedou se 
jednotlivá m ěření a vypo čtené průměrné hodnoty. P ředloží se grafy 
adsorpčních isotherm. Výpo čty se provedou níže uvedeným zp ůsobem.  
Pro účely zkoušky se p ředpokládá, že hmotnost 1 cm  3 vodného 
roztoku je 1 g. Pom ěr půda/roztok m ůže být vyjád řen stejným číslem 
pro rozm ěr hmotnost/hmotnost i pro rozm ěr hmotnost/objem.  
2.1. ADSORPCE  
Adsorpce  A t i je definována jako procentuální podíl látky z množství 
látky na za čátku zkoušky, která se za zkušebních podmínek adsor ­
bovala v p ůdě. Je-li zkoušená látka stálá a neadsorbuje se významn ě 
na stěnách nádobky, vypo čte se  A t i pro každý čas z rovnice:  
A t i ¼ m p ads ðt i Þ·100 
m 0 ð%Þ (3) 
kde: 
A t i = procento adsorpce v čase t  i (%); 
m p ads ðt i Þ = hmotnost zkoušené látky adsorbované v p ůdě v čase t  i (μg); 
m 0 = hmotnost zkoušené látky v nádobce na za čátku 
zkoušky ( μg). 
Podrobné informace o zp ůsobu výpo čtu procenta adsorpce  A t i pro 
paralelní a sériovou metodu jsou uvedeny v dodatku 5.  
Distribuční koeficient K  d je poměr mezi množstvím látky v p ůdě 
a hmotnostní koncentrací látky ve vodném roztoku za zkušebních 
podmínek a p ři dosažení adsorp ční rovnováhy.  
K d ¼ C p ads ðeqÞ 
C vod ads ðeqÞ ¼ m p ads ðeqÞ 
m vod ads ðeqÞ · V 0 
m půda (cm  3 · g -1 ) (4) 
kde: 
C p ads ðeqÞ = množství látky adsorbované v p ůdě při adsorpční 
rovnováze ( μg/g), 
C vod ads ðeqÞ = hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi p ři 
adsorpční rovnováze ( μg/cm). Tato koncentrace se 
stanoví analyticky a zohlední se hodnoty ze slepých pokusů,
 
m p ads ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky adsorbované v p ůdě při 
adsorpční rovnováze ( μg), 
m vod ads ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky v roztoku p ři adsorpční 
rovnováze ( μg), 
m půda = množství p ůdní fáze vyjád řené v suché hmotnosti 
půdy (g),  
V 0 = počáteční objem vodné fáze v kontaktu s p ůdou (cm  3 ). 
Vztah mezi A  eq a K  d je dán rovnicí:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m půda (cm  3 · g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
kde: 
A eq = procento adsorpce p ři adsorpční rovnováze, %.  
Vztah adsorp čního koeficientu normalizovaného na obsah organic ­
kého uhlíku K  ou , distribučního koeficientu K  d a obsahu organického 
uhlíku v p ůdním vzorku je tento:  
K ou ¼ K d · 100 
%ou  (cm  3 ·g -1 ) (6) 
kde: 
%ou = procentuální obsah organického uhlíku v p ůdním vzorku 
(g/g).  
Koeficient K  ou je jedinou veli činou, která charakterizuje rozd ělení 
hlavně anorganických nepolárních látek mezi organický uhlík 
v půdě nebo sediment a vodu. Adsorpce t ěchto chemických látek 
koreluje s obsahem organických látek v pevném sorbujícím materiálu (7); hodnoty K
 ou závisí na specifických charakteristikách humino ­
vých podíl ů, jejichž sorp ční kapacita se zna čně liší podle p ůvodu, 
vzniku atd.  
2.1.1.  Adsorp ční isothermy  
Rovnice Freundlichových adsorp čních isotherm vyjad řují vztah mezi 
množstvím adsorbované zkoušené látky a koncentrací zkoušené látky 
v roztoku p ři rovnováze (rovnice 8).  
Údaje se zpracovávají jako v oddíle Adsorpce a pro každou zkušební 
nádobku se vypo čte množství zkoušené látky adsorbované v p ůdě po 
adsorpční zkoušce ( C p ads ðeqÞ, jinde ozna čeno jako x/m). P ředpokládá 
se, že rovnováhy bylo dosaženo a že  C p ads ðeqÞ představuje rovnová ­ 
žnou hodnotu:  
C s ads ðeqÞ ¼ m p ads ðeqÞ 
m půda ¼ ½C 0 Ä C vod ads ðeqÞâ·V 0 
m půda (μg · g -1 ) (7) 
Freundlichova adsorp ční rovnice má tento tvar (8):  
C p ads ðeqÞ ¼ K F ads ·C vod ads ðeqÞ 1=n (μg · g -1 ) (8) 
nebo v lineární form ě: 
logC  p ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  vod ads ðeqÞ (9) 
kde: 
K F ads = Freundlich ův adsorpční koeficient; jeho rozm ěr je cm  3 /g 
pouze tehdy, je-li 1/n = 1; ve všech ostatních p řípadech se 
směrnice 1/n zavádí do rozm ěru K F ads (μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n /g); 
n = regresní konstanta; 1/n se zpravidla pohybuje v rozmezí 
od 0,7 do 1,0, což znamená, že jsou sorp ční údaje často 
nelineární.  
Rovnice (8) a (9) se znázorní graficky a hodnoty  K F ads a 1/n se 
vypočítají regresní analýzou podle rovnice 9. Vypo čte se rovn ěž 
korelační koeficient r  2 této logaritmické rovnice. P říklady takových 
znázornění jsou uvedeny na obrázku 2.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Obrázek 2  Freundlichovy adsorp ční závislosti, normální 
a linearizovaná  
2.1.2.  Hmotnostní bilance  
Hmotnostní bilance (MB) je definována jako procentuální podíl látky 
z nominálního množství látky na za čátku zkoušky, který lze znovu 
analyticky stanovit po adsorp ční zkoušce.  
Zpracování údaj ů se bude lišit podle toho, zda je rozpoušt ědlo 
neomezen ě mísitelné s vodou. U rozpoušt ědel mísitelných s vodou 
mohou být údaje ke stanovení množství látky získané extrakcí rozpouštědlem zpracována stejným zp ůsobem jako v oddíle 
Desorpce. Je-li rozpoušt ědlo mísitelné s vodou omezen ě, musí být 
stanoveno množství znovu získané látky.
 
Hmotnostní bilance pro adsorpci se vypo čte takto; p ředpokládá se, že 
(m E ) se odpovídá sou čtu množství zkoušených látek extrahovaných 
organickým rozpoušt ědlem z p ůdy a z povrchu zkušební nádobky:  
MB ¼ ðV rec ·C vod ads ðeqÞ þ m E Þ·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
kde: 
MB = hmotnostní bilance (%),  
m E = celková hmotnost zkoušené látky extrahované z p ůdy a ze 
stěn zkušební nádobky ve dvou stupních ( μg), 
C 0 = počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku 
v kontaktu s p ůdou (μg/cm),  
V rec = objem supernatantu vyzískaný po dosažení adsorp ční 
rovnováhy (cm  -3 ). 
2.2. DESORPCE  
Desorpce (D) je definována jako procentuální podíl z d říve adsorbo ­
vaného množství zkoušené látky, který se za zkušebních podmínek 
desorbuje:  
D t i ¼ m vod des ðt i Þ 
m p ads ðeqÞ ·100ð%Þ (11) 
kde: 
D t i = procento desorpce v čase t  i (%), ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m vod des ðt i Þ = hmotnost zkoušené látky desorbované z p ůdy v čase 
t i (μg), 
m pãda ads ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky adsorbované v p ůdě při 
adsorpční rovnováze ( μg). 
Podrobné informace o zp ůsobu výpo čtu procenta adsorpce  D 
t i pro 
paralelní a sériovou metodu jsou uvedeny v dodatku 5.  
Zdánlivý desorp ční koeficient (K  des ) je za zkušebních podmínek 
poměr mezi množstvím zkoušené látky, která z ůstala v p ůdě, 
a hmotnostní koncentrací desorbované látky ve vodném roztoku po dosažení desorp ční rovnováhy:
 
K des ¼ m p ads ðeqÞ Ä m vod des ðeqÞ 
m vod des ðeqÞ V T 
m půda (cm  3 ·g -1 ) (12) 
kde: 
K des = desorp ční koeficient (cm  3 /g), 
m vod des ðeqÞ = celková hmotnost zkoušené látky desorbované 
z půdy při desorpční rovnováze ( μg), 
V T = celkový objem vodné fáze v kontaktu s p ůdou 
během zkoušky desorp ční kinetiky (cm  3 ). 
Návod pro výpo čet hodnoty  m  vod des ðeqÞ je uveden v dodatku 5 
v oddíle Desorpce.  
Poznámka:  
Provede-li se p ředcházející adsorp ční zkouška paralelní metodou, je 
objem V  T v rovnici 12 roven V  0 . 
2.2.1.  Desorp ční isothermy  
Freundlichovy desorp ční isothermy vyjad řují vztah mezi množstvím 
zkoušené látky, která z ůstala adsorbovaná v p ůdě a koncentrací 
zkoušené látky v roztoku p ři desorpční rovnováze (rovnice 16).  
Pro každou zkušební nádobku se množství zkoušené látky, které 
zůstalo při desorpční rovnováze adsorbované v p ůdě, vypočte takto:  
C p des ðeqÞ ¼ m p ads ðeqÞ Ä m vod des ðeqÞ 
m půda (μg · g -1 ) (13) 
m vod des ðeqÞ je definována takto:  
m vod des ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ· V 0 
V r F Ä m vod A (μg) (14) 
kde: 
C p des ðeqÞ = množství zkoušené látky, která z ůstala adsorbovaná 
v půdě při desorpční rovnováze ( μg/g), 
m m des ðeqÞ = analyticky stanovená hmotnost látky ve vodné fázi 
při desorpční rovnováze ( μg), ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m vod A = hmotnost látky zbylé z adsorp ční rovnováhy 
v důsledku neúplné vým ěny objemu vodné fáze 
(μg), 
m vod des ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky v roztoku p ři adsorpční 
rovnováze ( μg); 
m vod A ¼ m vod ads ðeqÞ· Í 
V 0 Ä V R 
V 0 Î (15) 
V r F = objem roztoku odebraného ze zkušební nádobky ke stano ­
vení zkušební látky p ři desorpční rovnováze (cm  3 ), 
V R = objem supernatantu odebraného ze zkušební nádobky po 
dosažení adsorp ční rovnováhy a nahrazeného stejným 
objemem 0,01 M roztoku CaCl  2 (cm  3 ). 
Freundlichova desorp ční rovnice je (16):  
C p des ðeqÞ ¼ K F des ·C vod des ðeqÞ 1=n (μg · g -1 ) (16) 
nebo v lineární form ě: 
logC  p des ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n·logC  vod des ðeqÞ (17) 
kde: 
K F des = Freundlich ův desorpční koeficient,  
n = regresní konstanta,  
C vod des ðeqÞ = hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi p ři 
desorpční rovnováze ( μg/cm).  
Rovnice 16 a 17 se znázorní graficky a hodnoty  K F des a 1/n se 
vypočítají regresní analýzou z rovnice 17.  
Poznámka:  
Je-li Freundlich ův adsorpční nebo desorp ční exponent 1/n roven 1, 
bude Freundlichova adsorp ční nebo desorp ční konstanta ( K F ads 
a K F des ) rovna adsorp ční resp. desorp ční rovnovážné konstant ě (K  d 
a K  des ) a závislosti C  p na C  vod budou lineární. Nejsou-li exponenty 
rovny 1, závislosti C  p na C  vod budou nelineární a adsorp ční 
a desorpční konstanty se budou podél isotherm lišit.  
2.2.2.  Protokol o zkoušce  
Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat tyto informace:  
— úplná identifikace použitých p ůdních vzork ů včetně: 
— zeměpisných parametr ů lokality (zem ěpisné šířky, zeměpisné 
délky),  
— údaje odb ěru vzorku,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— využití p ůdy (např. zemědělská půda, lesní p ůda atd.),  
— hloubky odb ěru vzorků, 
— obsahu písku/prachových částic/jílu,  
— pH (v 0,01 M CaCl  2 ), 
— obsahu organického uhlíku,  
— obsahu organického materiálu,  
— obsahu dusíku,  
— poměru C/N,  
— kationtové vým ěnné kapacity (mmol/kg),  
— všech informací týkajících se sb ěru a uchovávání vzork ů, 
— všech významných informací pro interpretaci adsorpce/desorpce 
zkoušené látky,  
— odkazu na metody reference použité pro stanovení jednotlivých 
parametrů, 
— podle pot řeby informace o zkoušené látce,  
— teplota p ři experimentu,  
— podmínky centrifugace,  
— analytický postup použitý p ři analýze zkoušené látky,  
— odůvodnění jakéhokoli použití solubiliza čního činidla p ři 
přípravě zásobního roztoku zkoušené látky,  
— vysvětlení korekcí provedených ve výpo čtech, je-li to d ůležité,  
— údaje podle formulá ře (dodatek 6) a grafická znázorn ění, 
— všechny informace a pozorování užite čné pro interpretaci 
výsledků zkoušky.  
3. LITERATURA  
1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. 
UBA Report 106 02045, Part II.  
2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Repre ­
sentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I.
 
3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
no. 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, 
ISPRA, December 1994.  
4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995 (June 1995).
 
5) US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
6) US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
 
7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guide ­
lines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.  
9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dange ­
rous to health or especially harmful to the environment.  
11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture 
and Forestry, Braunschweig, Germany.  
12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in 
Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour 
in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).  
13) Calvet R., (1980) „Adsorption-Desorption Phenomena“ in Inte ­
ractions between herbicides and the soil. (R.J. Hance ed.), 
Academic Press, London, str. 83–122.  
14) Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and 
Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society 
of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, str. 31–44.  
15) van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations 
for the prediction of pesticide movement through porous 
media“. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), 29–35.  
16) McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger 
H.J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic 
chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in Test 
Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
 
17) Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. 
Weeds, 13, 185–190.  
18) Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) „Determina ­
tion of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. 
J.Agric.Food Chem., 18, 524–528.  
19) Russell M.H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil“ in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John Wiley 
& Sons Ltd.  
20) Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk J.W. 
and Holland P.T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
901–932.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
21) Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, str. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
 
22) Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967), „Persistence of 
herbicides in soil“. J. Sci. Fd Agric., 18, 269–273.  
23) Burkhard N., and Guth J.A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2- 
Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. 
Sci. 12, 45–52.
 
24) Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977). „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological availa ­
bility of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, 961–971.
 
25) Osgerby J.M., (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil“. Pestic. Sci., 4, 247–258.  
26) Guth J.A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden“. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, 143–154.  
27) Hamaker J.W., (1975), „The interpretation of soil leaching 
experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), str. 135-172, Plenum Press, NY.
 
28) Helling C.S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc., 35, 732–210.  
29) Hamaker J.W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in 
Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and 
J.W. Hamaker eds), Vol. I, 49–143.  
30) Burkhard N. and Guth J.A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, 37–44.
 
31) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, str. 297–325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
32) Gustafson D.I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), 339–357.
 
33) Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. of Soil 
Sci., 28, 340–350.  
34) Bromilov R.H., and Leistra M., (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, 389–395.
 
35) Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), „Sorption estimates 
for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, str. 80–101,
 
36) Lambert S.M., (1967), „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, 
572–576.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
37) Hance R.J., (1969), „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils“. J. Agri. Food Chem., 17, 667–668.  
38) Briggs G.G. (1969), „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils“. Nature, 223, 1288.  
39) Briggs G.G. (1981). „Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, 1050–1059.
 
40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology“. J. 
Agric. Food Chem., 32, 243–246.  
41) Bailey G.W., and White J.L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, 29–92.
 
42) Bailey G.W., J.L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32: 222–234.
 
43) Karickhoff S.W., (1981) „Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, 833–846.
 
44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, 1–17.  
45) Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972). „Adsorption in 
organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, str. 49–143.
 
46) Deli J., and Warren G.F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19: 67–69.  
47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Science, Vol. 23, 454–457.
 
48) Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparati ­
ons“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
49) Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980), „Methods for distri ­
buting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management 
Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
 
50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994).  
51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
52) Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark F.E., 
eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes.  
54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques.  
55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling.  
56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils.  
57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and indu ­
strial sites.  
58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
59) Green R.E., and Yamane V.K., (1970) „Precision in pesticide 
adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc., 34, 353–354.  
60) Grover R., and Hance R.J. (1970), „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., 109–138.
 
61) Boesten, J.J.T.I, „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. 
Pest. Sci. 1990, 30, 31–41.  
62) Boesten, J.J.T.I. „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD guide ­
line 106“ Proceedings of 5th international workshop on envi ­
ronmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brus ­
sels, 26–29 April 1994.  
63) Bastide J., Cantier J.M., et Coste C., (1980), „Comportement de 
substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique“. Weed Res. 21, 227–231.
 
64) Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), „Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Envi ­
ron.Qual., 10(3), 382–386.  
65) Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), „Par ­
tition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), 227–231.
 
66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic 
substances by soils and sediments“. J. Environm. Sci. Health, 
B19 (3), 297–312.  
67) Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), 109–116.
 
68) Lyman W.J., Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods. Environmental 
Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Soci ­
ety, Washington DC.  
69) Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980). „Relationship between 
water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and 
concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology 
(eds J.G. Eaton, et al.), str.78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
70) Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds“. Science, Vol. 206, 831–832.  
71) Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., (1981), 
„Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 38–42.
 
72) Karickhoff S.W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. 
Chemosphere, Vol. 10(8), 833–846.  
73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilité – reactivité. 
Revue de l’Agric.“, 34 (4), 319–322.  
74) Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil“. Chemosphere, 32(12), 2493–2504.  
75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), 1373–1384.  
76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases“. Chemosphere 
27 (12), 2341–2352.
 
77) Hance, R.J., (1967), „The speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Rese ­
arch, Vol. 7, str. 29–36.  
78) Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: 
Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
79) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G. 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater 
from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, str. 297–325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
 
80) Giles C.H., (1970), „Interpretation and use of sorption 
isotherms“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. 
Monograph No. 37, 14–32.  
81) Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, 
(1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of 
adsorption mechanisms and in measurements of pesticides 
surface areas of soils“. J. Chem. Soc., 3973–93.
 
82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C., (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques générales de l’adsorption“. Ann. Agron. 31: 239–251.
 
83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation“, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13–15 May 1996, Stratford-upon-Avon, U.K.  
84) Guth, J.A., (1985), „Adsorption/desorption“, in Joint Internati ­
onal Symposium, Physicochemical Properties and their Role in 
Environmental Hazard Assessment, July 1–3, Canterbury, UK.  
85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26: 305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
DODATEK 1  
Schéma zkoušky
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
DODATEK 2  
VLIV SPRÁVNOSTI ANALYTICKÉ METODY A ZM ĚNY KONCENT ­
RACE NA SPRÁVNOST VÝSLEDK Ů ADSORP ČNÍ STUDIE  
Z následující tabulky (84) je z řejmé, že je-li rozdíl mezi po čáteční hmotností 
zkoušené látky (m  0 = 110 μg) a její rovnovážnou hmotností v roztoku ( m aq ads ðeqÞ­
=100 μg) velmi malý, je d ůsledkem 5 % chyby m ěření rovnovážné koncentrace 
50 % chyba ve výpo čtu hmotnosti zkoušené látky adsorbované v p ůdě 
(m p ads ðeqÞ) a 52,4 % chyba ve výpo čtu K  d . 
Hmotnost p ůdy m  půda = 10 g 
Objem roztoku V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
PRO A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg nebo 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 skute čná 
hodnota 10 1,00 skute čná 
hodnota 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
PRO A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg nebo 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 skute čná 
hodnota 60,0 6,00 skute čná 
hodnota 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
PRO A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg nebo 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 skute čná 
hodnota 108,9 10,89 skute čná 
hodnota 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
äm s ads ðeqÞ = m  0 Ä m vod ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C vod ads ðeqÞ i 
V 0 
m půda; Kd ¼ m p ads ðeqÞ 
m vod ads ðeqÞ V 0 
m půda 
m p ads ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky v p ůdě při rovnováze, μg; 
m v ads ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky ve vodné fázi p ři rovnováze, μg; 
C p ads ðeqÞ = množství zkoušené látky v p ůdě při rovnováze, μg g -1 ; 
C v ads ðeqÞ = množství zkoušené látky ve vodné fázi p ři rovnováze, μg cm  -3 ; 
R = analytická chyba stanovení  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = vypo čtená chyba zp ůsobená analytickou chybou R.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
DODATEK 3  
METODY ODHADU K  D 
1. Metody odhadu umož ňují předpovědět K  d na základ ě korelací nap říklad 
s hodnotami P  ow (12, 39, 63–68), s údaji o rozpustnosti ve vod ě (12, 19, 
21, 39, 68–73) nebo s údaji o polarit ě získanými p ři použití HPLC 
s obrácenou fází (74–76). Jak je ukázáno v tabulkách 1 a 2, vypo čtou se 
z takových rovnic hodnoty K  ou nebo K  om a poté nep římo hodnoty K  d z 
rovnic:  
K ou ¼ K d · 100 
%ou ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%ou ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Koncepce t ěchto korelací je založena na dvou p ředpokladech: 1) adsorpci 
látky nejvíce ovliv ňuje organický materiál v p ůdě a 2) interakce jsou 
převážně nepolární. V d ůsledku toho tyto korelace: 1) nejsou použitelné 
pro polární látky (nebo jsou použitelné jen do ur čité míry) a 2) nejsou 
použitelné v p řípadech, kdy je obsah organického materiálu v p ůdě velmi 
malý (12). Krom ě toho, ačkoli byla zjišt ěna uspokojivá korelace mezi P  ov 
a a adsorpcí (19), nelze totéž říci o vztahu mezi rozpustností ve vod ě 
a rozsahem adsorpce (19, 21); dosud si tyto studie proti řečí. 
3. Některé příklady korelace mezi adsorp čním koeficientem a rozd ělovacím 
koeficientem mezi oktanol a vodu a rovn ěž rozpustností ve vod ě jsou 
uvedeny v tabulkách 1 a 2.  
Tabulka 1  
Příklady korelací mezi adsorp čním distribu čním koeficientem a rozd ělovacím koeficientem mezi oktanol 
a vodu; další p říklady jsou uvedeny v literatu ře (12, 68)  
Látky Korelace Auto ři 
Substituované mo čoviny log  K om = 0,69 + 0,52 log  P o/v Briggs (1981) (39) 
Chlorované aromatické log  K ou = - 0,779 + 0,904 log  P o/v Chiou  et al . (1983) (65) 
Různé pesticidy log  K om = 4,4 + 0,72 log  P o/v Gerstl and Mingelgrin (1984) (66) 
Aromatické uhlovodíky log  K ou = - 2,53 + 1,15 log  P o/v Vowles and Mantoura (1987) (67)  
Tabulka 2  
Příklady korelací mezi adsorp čním distribu čním koeficientem a rozpustností ve vod ě; další p říklady jsou 
uvedeny v literatu ře (68, 69)  
Sloučeniny Korelace Auto ři 
Různé pesticidy log  K om = 3,8 – 0,561 log  S v Gerstl and Mingelgrin (1984) (66) 
Chlorované alifatické 
a aromatické látky log K om = (4,040 ± 0,038) – (0,557 
± 0,012) log  S v Chiou  et al . (1979) (70) 
1-Naftol log  K ou = 4,273 – 0,686 log  S v log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Cyklické, alifaticko-aroma ­
tické látky log K ou = - 1,405 – 0,921 log S  v - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Různé sloučeniny log  K om = 2,75 – 0,45 log  S v Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
DODATEK 4  
VÝPOČTY PRO UR ČENÍ PODMÍNEK CENTRIFUGACE  
1. Centrifuga ční doba se za p ředpokladu, že jsou částice kulové, vypo čte 
podle této rovnice:  
t ¼ 9 
2 " 
η 
ω 2 rp 2 ðρ p Ä ρ vod Þ # 
lnðR b=R t Þ (1) 
Pro zjednodušení nejsou parametry uvedeny v základních jednotkách SI 
(ale v jednotkách soustavy CGS).  
kde: 
ω = úhlová rychlost (= 2 π·(rpm)/60), rad/s,  
rpm = po čet otáček za minutu,  
η = viskozita roztoku, g ·s -1 /cm, 
r p = polom ěr částic, cm,  
ρ p = hustota p ůdy, g/cm  3 , 
ρ vod = hustota roztoku, g/cm  3 , 
R t = vzdálenost od st ředu rotoru odst ředivky k hladin ě roztoku 
v centrifuga ční kyvetě, cm,  
R b = vzdálenost od st ředu rotoru odst ředivky ke dnu kyvety, cm,  
R b – R t = výška sloupce sm ěsi půda/roztok v kyvet ě, cm.  
Všeobecn ě se v praxi k zajišt ění úplného odd ělení volí dvojnásobek vypo č­
teného času. 
2. Rovnici (1) lze dále zjednodušit, jestliže se považují viskozita ( η) a hustota 
(ρ vod ) roztoku rovny viskozit ě a hustotě vody při 25  o C; tedy, η = 8,95 × 
10–3g s  –1 /cm a ρ vod = 1,0 g/cm  -3 . 
Centrifuga ční doba je tedy dána rovnicí (2):  
t ¼ 3:7 
ðrpmÞ 2:r p 2 ðρ s Ä lÞ ln Rb 
Rt (2) 
3. Z rovnice 2 je z řejmé, že p ři určení podmínek centrifugace k dosažení 
separace částic o ur čité velikosti (v našem p řípadě o polom ěru 0,1 μm), 
doby (t) po čtu otáček za minutu (rpm), jsou d ůležité: 1) hustota p ůdy a 2) 
výška sloupce sm ěsi v centrifuga ční kyvetě (R b – R  t ), tj. vzdálenost, kterou 
částice půdy urazí mezi hladinou v kyvet ě a jejím dnem; výška sloupce 
směsi v kyvet ě bude při fixním stanoveném objemu samoz řejmě záviset na 
druhé mocnin ě poloměru kyvety.  
4. Na obrázku 1 jsou znázorn ěny změny centrifuga ční doby (t) v závislosti na 
centrifuga ční rychlosti (rpm) pro r ůzné hustoty p ůdy (ρ s ) (obrázek 1a) a pro 
různé výšky sloupce sm ěsi v centrifuga čních kyvetách (obrázek 1b). 
Z obrázku 1a je z řejmý vliv hustoty p ůdy; např. při obvyklých 3 000 
ot/min. je centrifuga ční doba p řibližně 240 minut pro hustotu p ůdy 1,2 
g/cm3, ale pouze 50 minut pro 2,0 g/cm3.Podobn ě je podle obrázku 1b 
při obvyklých 3 000 ot/min. centrifuga ční doba p řibližně 50 minut pro 
výšku sloupce sm ěsi 10 cm a pouze 7 minut pro výšku sloupce 1 cm. Je 
však důležité nalézt optimální pom ěr mezi centrifugací, která vyžaduje co 
nejmenší výšku sloupce, a snadnou manipulaci experimentátora p ři oddě­
lování fází po centrifugaci.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Krom ě toho je p ři určování experimentálních podmínek p ři separaci fází 
půda/roztok d ůležité zvažovat možnou p řítomností t řetí „pseudofáze“, kolo ­
idu. Koloidní částice s velikostí menší než 0,2 μm, mohou mít zna čný vliv 
na celý mechanismus adsorpce látky v p ůdní suspensi. P ři centrifugaci, jak 
je popsána výše, z ůstanou koloidní částice ve vodné fázi a analyzují se 
společně s vodnou fází. Informace o jejich vlivu se tedy ztratí.  
Má-li laborato ř, která studii provádí, za řízení pro ultracentrifugaci nebo 
ultrafiltraci, mohly by být adsorpce/desorpce látky v p ůdě studovány hlou ­
běji včetně informací o adsorpci látky na koloidních částicích. v takovém 
případě by k odd ělení tří fází – p ůdy, koloidních částic a roztoku m ěla být 
použita ultracentrifugace p ři 60 000 ot/min. nebo ultrafiltrace na filtru 
o porositě 100 000 Da. Protokol o zkoušce by m ěl být také odpovídajícím 
způsobem pozm ěněn, mají-li být analyzovány všechny t ři fáze.  
Obrázek 1a
  
Změny centrifuga ční doby ( t) v závislosti na centrifuga ční rychlosti 
(ot/min.) pro r ůzné hustoty p ůdy (ρ p ). R t = 10 cm,  R b – R t = 10 cm,  η = 
8,95 × 10  -3 g·s -1 /cm a  ρ vod = 1,0 g/cm  3 při 25  o C. 
Obrázek 1b
  
Změna centrifuga ční doby ( t) v závislosti na centrifuga ční rychlosti 
(ot/min) pro r ůzné výšky sloupce sm ěsi v centrifuga ční kyvetě (R b – 
R t ) = L; R t = 10 cm,  η = 8,95 × 10–3 gs  –1 /cm, ρ vod = 1,0 g/cm  3 při 
25 o C a ρ p = 2,0 g/cm  3 . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
DODATEK 5  
VÝPOČET ADSORPCE A ( %) A DESORPCE D ( %)  
Časové schéma postupu je toto:
  
U všech výpo čtů se předpokládá, že zkoušená látka je stálá a že se významn ě 
neadsorbuje na st ěnách nádobky.  
ADSORPCE A (%)  
a) Paralelní metoda  
Procento adsorpce se vypo čte pro každou zkušební nádobku (i) pro každý 
čas (t  i ), podle této rovnice:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Veličiny v této rovnici lze vypo čítat takto: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m p ads ðt i Þ ¼ m 0 Ä C vod ads ðt i Þ· V 0 (μg) (3) 
kde: 
A t i = procento adsorpce ( %) v čase t  i , 
m p ads ðt i Þ = hmotnost zkoušené látky v p ůdě v čase t  i , kdy je provád ěna 
analýza ( μg) 
m 0 = hmotnost zkoušené látky v nádobce na za čátku zkoušky 
(μg), 
C 0 = počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku 
v kontaktu s p ůdou (μg/cm),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C vod ads ðt i Þ = hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase i , kdy je 
prováděna analýza ( μg/cm); tato koncentrace se stanoví 
analyticky, p řičemž se vezmou v úvahu hodnoty ze slepých 
pokusů, 
V 0 = počáteční objem zkušebního roztoku v kontaktu s p ůdou 
(cm  3 ). 
Hodnoty procenta adsorpce  A t i nebo  C vod ads ðt i Þ se vynesou do grafu proti 
času a zjistí se doba pot řebná k ustavení sorp ční rovnováhy. P říklady 
takových výnos ů jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2.
  
Obrázek 1  
Ustavování adsorp ční rovnováhy
  
Obrázek 2  
Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (C  aq ) na čase ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Sériová metoda  
V následujících rovnicích je zohledn ěno, že se p ři studii adsorpce provád ějí 
měření zkoušené látky v malých podílech vodné fáze v ur čitých časových 
intervalech.  
— Pro každý časový interval se hmotnost látky adsorbované v p ůdě 
vypočte takto:  
— pro první časový interval Δt 1 = t 1 – t 0 
m p ads ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m ads 
m ðt 1 Þ· Í 
V 0 
v a A Î (4) 
— pro druhý časový interval Δt2 = t2 – t1  
m p ads ðΔt 2 Þ ¼ m  m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— pro třetí časový interval Δt3 = t3 – t2  
m p ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î (6) 
— pro ntý časový interval Δt n = t n – t n – 1 
m p ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Procento adsorpce v každém časové intervalu  A Δt i se vypočte za použití 
rovnice:  
A Δt i ¼ m p ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) 
zatímco procento adsorpce  A t i v čase t  i je dáno rovnicí:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt i Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Hodnoty procenta adsorpce  A  t i nebo  A  Δt i (podle pot řeb studie) se 
vynesou do grafu proti času a určí se čas, kdy se ustavila sorp ční 
rovnováha.  
— V čase ustavení rovnováhy t  eq : 
— je hmotnost zkoušené látky adsorbované v p ůdě: 
m p ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m p ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— hmotnost zkoušené látky v roztoku:  
m vod ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m p ads ðΔt i Þ (11) 
— a procento adsorpce p ři rovnováze:  
A eq ¼ m p ads ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
Výše uvedené parametry jsou definovány takto:  
m p ads ðΔt 1 Þ; m p ads ðΔt 2 Þ; :::; m p ads ðΔt n Þ = hmotnost látky adsorbované 
v půdě v časovém intervalu 
Δ t1 , Δ t2 ,..., Δ tn respectively ( μg); 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = hmotnost látky nam ěřené 
v podílu  v a A v okamžiku t  1 , 
t 2 ,t n respectively ( μg); 
m p ads ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky adsor ­
bované v p ůdě při adsorpční 
rovnováze ( μg), 
m vod ads ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky 
v roztoku p ři adsorpční rovno­
váze (μg), 
v a A = objem podílu, ve kterém je látka 
stanovována (cm  3 ) 
A Δt i = procento adsorpce odpovídající 
časovému intervalu Δt i (%), 
A eq = procento adsorpce p ři adsorpční 
rovnováze (%).  
DESORPCE D (%)  
Časem t  0 v němž začíná experiment pro studium desorp ční kinetiky, je okamžik, 
kdy je co nejv ětší objem roztoku zkoušené látky (po dosažení adsorp ční rovno­
váhy) nahrazen stejným objemem 0,01 M roztoku CaCl  2 . 
a) Paralelní metoda  
V čase t  i se změří hmotnost zkoušené látky ve vodné fázi odebrané ze 
zkušební nádobky i ( V i 
r ) a desorbovaná hmotnost se vypo čte z rovnice:  
m vod des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m vod A (13) 
Při desorpční rovnováze platí, že t  i = t eq , a tedy  m vod des ðt i Þ = m vod des ðeqÞ. 
Hmotnost zkoušené látky desorbované v časovém intervalu ( Δt i ) je dána 
rovnicí:  
m vod des ðΔt i Þ ¼ m  vod des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m vod des ðjÞ (14) 
Procento desorpce se vypo čte takto:  
včase t  i z rovnice:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m vod des ðt i Þ 
m p ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
a v časovém intervalu ( Δt i ) z rovnice:  
D Δt i ¼ m vod des ðΔt i Þ 
m p ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
kde: 
D t i = procento desorpce v čase t  i (%); 
D Δt i = procento desorpce v časovém intervalu Δt i (%); 
m vod des ðt 1 Þ = hmotnost zkoušené látky desorbované b ěhem časového 
intervalu Δt i (μg); 
m vod des ðΔt 1 Þ = hmotnost zkoušené látky desorbované b ěhem časového 
intervalu Δt i (μg); 
m m des ðt i Þ = hmotnost zkoušené látky analyticky stanovená v čase t  i 
v roztoku o objemu  V r i , který byl odebrán k analýze 
(μg); 
m vod A = hmotnost látky zbylé z adsorp ční rovnováhy v d ůsledku 
neúplné vým ěny objemu vodné fáze ( μg); 
m vod A ¼ m vod ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m vod ads ðeqÞ = hmotnost zkoušené látky v roztoku p ři adsorpční rovno­
váze (μg); 
V R = objem supernatantu odebraného ze zkušební nádobky po 
dosažení adsorp ční rovnováhy a nahrazeného stejným 
objemem 0,01 M roztoku CaCl  2 (cm  3 ); 
V r i = objem roztoku odebraného ze zkušební nádobky (i) ke 
stanovení zkoušené látky v experimentu pro studium 
desorpční kinetiky (cm  3 ). 
Hodnoty procenta desorpce  D t i nebo  D Δt i (podle pot řeb studie) se vynesou 
proti času a stanoví se doba, po níž se ustavila desorp ční rovnováha.  
b) Sériová metoda  
V následujících rovnicích je zohledn ěno, že adsorpce, která p ředcházela, 
byla provád ěna měřením zkoušené látky v malých podílech  ðv A 
a Þ vodné 
fáze (sériová metoda v bodu 1.9 Provedení zkoušky). P ředpokládá se, že a) 
objem supernatantu odebraného ze zkušební nádobky po experimentu pro studium adsorp ční kinetiky byl nahrazen stejným objemem 0,01 M roztoku 
CaCl
 2 (V R ) a b) celkový objem vodné fáze v kontaktu s p ůdou (V  T ) 
zůstává konstantní b ěhem pokusu na získání desorp ční kinetiky a je vyjád ­ 
řená rovnicí:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
V čase t  i : 
— Hmotnost zkoušené látky se zm ěří v malých podílech  ðv a D Þ 
a desorbovaná hmotnost se vypo čte z této rovnice:  
m vod des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  vod A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— Při desorpční rovnováze platí, že t  i = t eq a tedy  m vod des ðt i Þ = m vod des ðeqÞ. 
— Procento desorpce  D t i se vypočte z této rovnice:  
D t i ¼ m vod des ðt i Þ 
m p ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
V časovém intervalu ( Δt i ): 
Pro každý časový interval se desorbované množství látky vypo čte takto:  
— pro první časový interval Δt 1 = t 1 – t 0 
m vod des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  vod A and m  p des ðt 1 Þ ¼ m  p vod ðeqÞ Ä m vod des ðΔt 1 Þ (21) 
— pro druhý časový interval Δt 2 = t 2 – t 1 
m vod des ðΔt 2 Þ ¼ m m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m vod des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m vod A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A a 
m p des ðt 2 Þ ¼ m p ads ðeqÞ Ä m  vod des ðΔt 1 Þ þ m vod des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— pro n-tý časový interval Δt n = t n – t n-1 
m vod des ðΔt n Þ ¼ " 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m  vod A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m vod des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
a 
m p des ðt n Þ ¼ m  p ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m vod des ðΔt i Þ (23) 
Procento desorpce v každém časovém intervalu  D Δt i se nakonec vypo čte 
z této rovnice:  
D Δt i ¼ m vod des ðΔt i Þ 
m p ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
zatímco procento desorpce  D t i v čase t  i je dáno rovnicí:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m vod des ðjÞ 
m p ads ðeqÞ · 100 ¼ m vod des ðt i Þ 
m p ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
přičemž jsou použité veli činy definovány takto:  
m des 
p ðΔt 1 Þ, m des 
p ðΔt 2 Þ,..., m des 
p ðΔt n Þ = hmotnost látky, která z ůstala 
adsorbovaná v p ůdě po časo­
vých intervalech Δt 1 , Δt 2 ,..., 
Δt n (μg); 
m des 
p ðΔt 1 Þ, m des 
p ðΔt 2 Þ,..., m des 
p ðΔt n Þ = hmotnost látky desorbované 
v časových intervalech Δt 1 , 
Δt 2 ,..., Δt n resp. (μg); 
m des 
p ðt 1 Þ, m des 
p ðt 2 Þ,..., m des 
p ðt n Þ = hmotnost látky nam ěřená 
v podílu ðv D 
a Þ v časových 
intervalech t  1 , t 2 ,..., t  n , resp. 
(μg); 
V T = celkový objem vodné fáze 
v kontaktu s p ůdou během 
experimentu pro studium 
desorpční kineticky provede ­
ného sériovou metodou (cm
 3 ); 
m A 
vod = hmotnost látky zbylé 
z adsorp ční rovnováhy 
v důsledku neúplné vým ěny 
objemu vodné fáze ( μg); 
m A 
vod ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m ads 
vod ðeqÞ (26) 
V R = objem supernatantu odebra ­
ného ze zkušební nádobky po dosažení adsorp ční rovno­
váhy a nahrazeného stejným 
objemem 0,01 M roztoku 
CaCl
 2 (cm  3 ); 
v D 
a = objem alikvotu odebraného 
k analýze ze zkušební nádobky 
(i) během experimentu pro 
studium desorp ční kinetiky 
provedeného sériovou meto ­
dou (cm  3 ); 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
DODATEK 6  
ADSORPCE – DESORPCE V P ŮDÁCH: FORMULÁ ŘE PRO P ŘEDLOŽENÍ ÚDAJ Ů 
Zkoušená látka:  
Zkušební p ůda: 
Obsah sušiny v p ůdě (105  o C, 12 hodin): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . %  
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Použitelnost analytické metody  
Navážka p ůdy g 
Půda: suchá hmotnost g 
Objem roztoku CaCl  2 cm 3 
Nominální koncentrace kone čného roztoku μg/cm  3 
Analytická koncentrace kone čného roztoku μg/cm  3 
Podstata použité analytické metody:  
Kalibrace analytické metody:  
Zkoušená látka:  
Zkušební p ůda: 
Obsah sušiny v p ůdě (105  o C, 12 hodin): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . %  
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Použitá metodika analýzy: Nep římá □ Paralelní  □ Sériová  □ 
Přímá □ 
Adsorpční zkouška: zkušební vzorky  
Symbol Jednotky Doba ustavo ­
vání rovnováhy Doba ustavo ­
vání rovnováhy Doba ustavo ­
vání rovnováhy Doba ustavo ­
vání rovnováhy  
Zkušební nádobka č. 
Navážka p ůdy — g 
Půda: suchá hmotnost m  půda g 
Objem vody v navážce p ůdy 
(vypočtený) V vp cm 3 
Objem 0,01 M roztoku CaCl  2 
použitého k uvedení do rovno ­
váhy s půdou cm 3 
Objem zásobního roztoku cm  3 
Celkový objem vodné fáze 
v kontaktu s p ůdou V 0 cm 3 
Počáteční koncentrace zkušeb ­
ního roztoku C 0 μg/cm  3 
Hmotnost zkoušené látky na 
začátku zkoušky m 0 μg ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Symbol Jednotky Doba ustavo ­
vání rovnováhy Doba ustavo ­
vání rovnováhy Doba ustavo ­
vání rovnováhy Doba ustavo ­
vání rovnováhy  
Po protřepávání a centrifugaci  
NEPŘÍMÁ METODA 
Paralelní metoda 
Koncentrace zkoušené látky ve 
vodné fázi, po korekci na slepý 
pokus  C vod ads ðt i Þ μg/cm  3 
Sériová metoda 
Naměřená hmotnost zkoušené 
látky v podílu  m m ads ðt i Þ μg 
PŘÍMÁ METODA 
Hmotnost zkoušené látky adsor ­
bované v p ůdě m p ads ðt i Þ μg 
Výpočet adsorpce 
Adsorpce  A  t i % 
A Δt i % 
Střední hodnota 
Adsorpční koeficient K  d cm 3 /g 
Střední hodnota 
Adsorpční koeficient K  ou cm 3 /g 
Střední hodnota  
Zkoušená látka:  
Zkušební p ůda: 
Obsah sušiny v p ůdě (105  o C, 12 hodin): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . %  
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorpční zkouška: slepý pokus a kontrolní vzorky  
Symbol Jednotky Slepý pokus Slepý pokus Kontrolní vzorek  
Zkušební nádobka č. 
Navážka p ůdy g 0 0 
Množství vody v navážce p ůdy 
(vypočtené) cm 3 — — 
Přidaný objem 0,01 M roztoku CaCl  2 cm 3 
Přidaný objem zásobního roztoku 
zkoušené látky cm 3 0 0 
Celkový objem vodné fáze (vypo čtený cm  3 — —  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Symbol Jednotky Slepý pokus Slepý pokus Kontrolní vzorek  
Počáteční koncentrace zkoušené látky 
ve vodné fázi μg/cm  3 
Po protřepávání a centrifugaci  
Koncentrace ve vodné fázi μg/cm  3 
Poznámka: Podle pot řeby lze p řidat sloupce.  
Zkoušená látka:  
Zkušební p ůda: 
Obsah sušiny v p ůdě (105  o C, 12 hodin): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . %  
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Hmotnostní bilance  
Symbol Jednotky  
Zkušební nádobka č. 
Navážka p ůdy — g 
Půda: suchá hmotnost m  půda g 
Objem vody v navážce p ůdy (vypočtený) V  vp ml 
Objem 0,01 M roztoku CaCl  2 použitého 
k uvedení do rovnováhy s p ůdou ml 
Objem zásobního roztoku cm  3 
Celkový objem vodné fáze v kontaktu 
s půdou V 0 cm 3 
Počáteční koncentrace zkušebního 
roztoku C 0 μg/cm  3 
Doba ustavování rovnováhy — h  
Po protřepávání a centrifugaci  
Koncentrace zkoušené látky ve vodné 
fázi při adsorpční rovnováze, po korekci 
na slepý pokus  C aq ads ðeqÞ μg/cm  3 
Rovnovážná doba t  eq h 
První zředění rozpoušt ědlem 
Odebraný objem vodné fáze V  rec cm 3 
Přidaný objem rozpoušt ědla ΔV cm  3 
První extrakce rozpoušt ědlem 
Signál při analýze rozpoušt ědla S  E1 var. 
Koncentrace zkoušené látky 
v rozpoušt ědle C E1 μg/cm  3 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Symbol Jednotky  
Hmotnost látky extrahované z p ůdy 
a stěn nádobky m E1 μg 
Druhé zředění rozpoušt ědlem 
Odebraný objem rozpoušt ědla V  rozp cm 3 
Přidaný objem rozpoušt ědla V' cm  3 
Druhá extrakce rozpoušt ědlem 
Signál při analýze rozpoušt ědlové fáze S  E2 var. 
Koncentrace zkoušené látky 
v rozpoušt ědle C E2 μg/cm  3 
Hmotnost látky extrahované z p ůdy 
a stěn nádobky m E2 μg 
Celková hmotnost zkoušené látky extra ­
hované ve dvou stupních m E μg 
Hmotnostní bilance MB %  
Zkoušená látka:  
Zkušební p ůda: 
Obsah sušiny v p ůdě (105  o C, 12 hodin): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . %  
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorpční isothermy  
Symbol Jednotky  
Zkušební nádobka č. 
Navážka p ůdy — g 
Půda: suchá hmotnost E g 
Objem vody v navážce p ůdy 
(vypočtený) V vp cm 3 
Objem 0,01 M roztoku CaCl  2 
použitého k uvedení do rovno ­
váhy s půdou cm 3 
Přidaný objem zásobního 
roztoku cm 3 
Celkový objem vodné fáze 
v kontaktu s p ůdou (vypo čtený) V 0 cm 3 
Koncentrace roztoku C  0 μg/cm  3 
Doba ustavování rovnováhy — h  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Symbol Jednotky  
Po protřepávání a centrifugaci  
Koncentrace látky ve vodné 
fázi, po korekci na slepý pokus  C vod ads ðeqÞ μg/cm  3 
Teplota  o C 
Adsorbovaná hmotnost na 
jednotku množství p ůdy C p ads ðeqÞ μg/g 
Regresní analýza:  
hodnota:  
hodnota l/n:  
regresní koeficient r  2 : 
Zkoušená látka:  
Zkušební p ůda: 
Obsah sušiny v p ůdě (105  o C, 12 hodin): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . %  
Teplota: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Použitá metodika analýzy: Nep římá □ Paralelní  □ Sériová  □ 
Desorpční zkouška  
Symbol Jednotky Časový 
interval Časový 
interval Časový 
interval Časový 
interval  
Číslo zkušební nádobky z adsorp čního 
experimentu 
Hmotnost látky adsorbované v p ůdě při 
adsorpční rovnováze  m p ads ðeqÞ μg 
Odebraný objem vodné fáze nahrazený 
0,01 M CaCl  2 V 
R cm 3 
Celkový objem vodné 
fáze v kontaktu s p ůdou PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Hmotnost látky zbylé z rovnováhy 
v důsledku neúplné vým ěny objemu 
vodné fáze  m vod A μg 
Desorpční kinetika  
Naměřená hmotnost látky desorbované 
z půdy v čase t  i m m des ðt i Þ μg 
Objem roztoku odebraný 
ze zkušební nádobky (i) pro měření zkoušené látky PM V
 f i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Hmotnost látky desorbované z p ůdy 
v čase t  i (vypočtená)  m vod des ðt i Þ μg 
Hmotnost látky desorbované z p ůdy 
během časového intervalu (vypo čtená)  m vod des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Symbol Jednotky Časový 
interval Časový 
interval Časový 
interval Časový 
interval  
Procento desorpce  
Desorpce v čase t  i D ti % 
Desorpce v časovém intervalu  D  Δt i % 
Zdánlivý desorp ční koeficient K  des 
PM: paralelní metoda  
SM: sériová metoda  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  ODHAD ADSORP ČNÍHO KOEFICIENTU ( K OU ) PRO P ŮDY 
A ČISTÍRENSKÉ KALY POMOCÍ VYSOKOÚ ČINNÉ 
KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE (HPLC)  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG121 (2000).  
1.1. ÚVOD  
Sorpční chování látek v p ůdách a v čistírenských kalech m ůže být 
popsáno parametry experimentáln ě stanovenými zkušební metodou 
C.18. Důležitým parametrem je adsorp ční koeficient, který je defi ­
nován jako pom ěr koncentrace látky v p ůdě nebo kalu a koncentrace 
látky ve vodné fázi p ři rovnováze. Adsorp ční koeficient normalizo ­
vaný na obsah organického uhlíku v p ůdě K ou je užitečným ukaza ­
telem schopnosti chemické látky vázat se na organické látky v p ůdě 
a v čistírenském kalu a umož ňuje porovnat r ůzné chemické látky. 
Tento parametr lze odhadnout z korelace s rozpustností ve vod ě a s 
rozdělovacím koeficientem oktanol/voda (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).  
Experimentální metoda popsaná v této zkoušce používá k odhadu 
adsorpčního koeficientu K  ou v půdě a v čistírenských kalech vysoko ­
účinnou kapalinovou chromatografii (8). Tyto odhady jsou spolehli ­
vější než odhady z výpo čtů metodikou QSAR (9). Jako metoda 
odhadu nem ůže plně nahradit šaržovitou rovnovážnou metodu použ ­
itou v metod ě C.18. Odhady K  ou však mohou být užite čné pro volbu 
vhodných parametr ů pro adsorp ční/desorpční studie podle zkušební 
metody C.18, a to výpo čtem K  d (distribučního koeficientu) nebo K  f 
(Freundlichova adsorp čního koeficientu) z rovnice 3 (viz bod 1.2).  
1.2. DEFINICE  
K d : Distribu ční koeficient je definován jako pom ěr rovnovážných 
koncentrací C rozpušt ěné látky ve dvoufázovém systému skládajícím 
se ze sorbentu (p ůda nebo čistírenský kal) a vodné fáze; je bezroz ­
měrný, jsou-li koncentrace v obou fázích vyjád řeny na hmotnostním 
základě. Je-li koncentrace ve vodné fázi vyjád řena na základ ě 
hmotnost/objem, je jednotkou ml/g. K  d se může měnit 
s vlastnostmi sorbentu a m ůže záviset na koncentraci.  
K d ¼ C půda 
C vod nebo  C kal 
C vod (1) 
kde: 
C půda = koncentrace zkoušené látky v p ůdě při rovnováze ( μg/g);  
C kal = koncentrace zkoušené látky v kalu p ři rovnováze ( μg/g);  
C vod = koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi p ři rovnováze 
(μg/g, μg/ml).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Freundlich ův adsorpční koeficient je definován jako koncentrace 
zkoušené látky v p ůdě nebo v čistírenském kalu (x/m), je-li rovno ­
vážná koncentrace C  vod ve vodné fázi rovna jedné; vyjad řuje se 
v μg/g sorbentu. Hodnota se m ůže měnit s vlastnostmi sorbentu.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  vod (2) 
kde: 
x/m = množství zkoušené látky x ( μg) adsorbované p ři rovno­
váze na ur čitém množství sorbentu m (g);  
1/n = sm ěrnice Freundlichovy adsorp ční isothermy;  
C vod = koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi p ři rovnováze 
(μg/ml).  
Při C vod ¼ 1; log K  f ¼ log x 
m 
K ou : Distribu ční koeficient (K  d ) nebo Freundlich ův adsorpční koefi­
cient (K  f ) normalizovaný na obsah organického uhlíku (f  ou ) 
v sorbentu; zejména u neionizovatelných chemických látek je p řibli­ 
žným ukazatelem míry adsorpce látky na sorbentu a umož ňuje 
provést porovnání r ůzných chemických látek. V závislosti na 
rozměru K  d a K  f , K  ou může být bezrozm ěrný nebo m ůže být jeho 
jednotkou ml/g nebo μg/g organického materiálu.  
Kou ¼ Kd 
fou ððbezrozměrný nebo v ml =gÞÞ nebo  Kf 
fou ðμg=gÞ (3) 
Vztah mezi  K ou a K d není vždy lineární a hodnoty K  ou se mohou pro 
jednotlivé p ůdy měnit, avšak jejich zm ěny jsou zna čně omezeny ve 
srovnání s hodnotami K  d nebo K  f . 
Adsorpční koeficient (K  ou ) lze ode číst pomocí kapacitního faktoru 
(k') z kalibra ční křivky log k' versus log K  ou pro vybrané referen ční 
sloučeniny.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
kde: 
t R = retenční časy zkoušené a referen ční látky v HPLC (min)  
t 0 = mrtvý čas HPLC (min) (viz bod 1.8.2).  
P OV : Rozdělovací koeficient oktanol/voda je definován jako pom ěr 
koncentrací rozpušt ěné látky v oktan-1-olu a ve vod ě; je bezroz ­
měrný. 
P o=v ¼ C oktanol  
C voda ð¼ K o=v Þ (5) 
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Před použitím metody by m ěly být známy strukturní vzorec, čistota 
a disocia ční konstanta (pokud existuje). Užite čné jsou informace 
o rozpustnosti ve vod ě a v organických rozpoušt ědlech, 
o rozdělovacím koeficientu oktanol-voda a o hydrolýze.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Mají-li se korelovat nam ěřené retenční údaje z HPLC pro zkoušenou 
látku s jejím adsorp čním koeficientem, musí být sestrojen kalibra ční 
graf log K  ou , K ou versus log k'. Použije se minimáln ě šest referen ­ 
čních bodů, alespoň po jednom nad a pod o čekávanou hodnotou pro 
zkoušenou látku. Správnost metody se významn ě zlepší, budou-li 
použity referen ční látky, které mají podobnou strukturu jako zkou ­ 
šená látka. Nejsou-li takové údaje k dispozici, ponechává se na uživateli, aby vybral vhodné kalibra ční látky. V takovém p řípadě 
by měla být vybrán obecn ější soubor strukturn ě heterogenních látek. 
Látky a jejich hodnoty K
 ou , které mohou být použity, jsou uvedeny 
v dodatku, a to v tabulce 1 pro čistírenský kal a v tabulce 3 pro 
půdu. Volba jiných kalibra čních látek by m ěla být zd ůvodněna. 
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
HPLC se provádí na analytických kolonách pln ěných komer čně 
dostupnou kyanopropylovou stacionární fází obsahující lipofilní a polární skupiny. Použije se mírn ě polární stacionární fáze na sili ­
kagelové matrici: 
— O – Si — CH
 2 – CH  2 – CH  2 — CN 
silikagel nepolární spojka polární skupina  
Podstata zkušební metody je obdobná jako ve zkušební metod ě A.8 
(rozdělovací koeficient, metoda HPLC). P ři průchodu kolonou 
s mobilní fázi zkoušená látka interaguje se stacionární fází. V důsledku distribuce mezi mobilní a stacionární fází se postup 
zkoušené látky zpomaluje. Dvojí složení stacionární fáze 
s polárními a nepolárními místy umož ňuje interakci polárních 
a nepolárních skupin molekuly podobn ě jako v organickém materiálu 
v půdě nebo v matrici čistírenského kalu. To umož ňuje stanovit 
vztah mezi reten čním časem v kolon ě a adsorp čním koeficientem 
na organickém materiálu.
 
pH má významný vliv na sorp ční chování zejména u polárních látek. 
U zemědělských p ůd nebo nádrží s čistírenskými kaly se pH 
normálně pohybuje od pH 5,5 do 7,5. U ionizovatelných látek se 
ve vhodném pufru provedou dv ě zkoušky, a to jak s ionizovanou 
formou, tak s neionizovanou formou, avšak pouze v p řípadě, že 
v rozmezí pH 5,5 až 7,5 je ionizováno alespo ň 10 % zkoušené 
sloučeniny.  
Vzhledem k tomu, že se k hodnocení použije pouze vztah mezi 
retencí na kolon ě HPLC a adsorp čním koeficientem, není nutná 
žádná kvantitativní metoda, nýbrž pouze stanovení reten čního času. 
Je-li k dispozici vhodný soubor referen čních látek a lze-li užít stan ­
dardní experimentální podmínky, poskytuje metoda rychlý a ú činný 
způsob odhadu adsorp čního koeficientuK  ou . 
1.5. POUŽITELNOST ZKOUŠKY  
Metoda HPLC je použitelná pro chemické látky (isotopov ě značené 
i neznačené), pro n ěž je k dispozici vhodný detek ční systém (nap ř. 
spektrofotometr, detektor radioaktivity) a jež jsou po dobu experi ­
mentu dostate čně stálé. M ůže být zvlášt ě užitečná pro chemické 
látky, jejichž studium je v jiných experimentálních systémech 
obtížné (pro t ěkavé látky, látky, které nejsou rozpustné ve vod ě 
v koncentraci, kterou lze analyticky m ěřit, pro látky s vysokou 
afinitou k povrchu inkuba čních systém ů). Metoda m ůže být použita 
pro směsi, které dávají nerozlišitelné elu ční pásy. v takovém p řípadě 
se stanoví horní a dolní meze hodnot log K  ou pro sloučeniny 
přítomné ve sm ěsi. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Nečistoty mohou n ěkdy působit problémy p ři interpretaci výsledk ů 
HPLC, ale ty nejsou p říliš důležité, nebo ť zkoušené látky lze jasn ě 
analyticky identifikovat a odd ělit od nečistot.  
Metoda je validována pro látky uvedené v tabulce 1 v dodatku a byla 
rovněž použita u řady jiných chemických látek z t ěchto chemických 
tříd: 
— aromatické aminy (nap ř. trifluralin, 4-chloranilin, 3,5-dinitroani ­
lin, 4-methylanilin, N-methylanilin, 1-naftylamin),  
— estery aromatických karoxylových kyselin (nap ř. methyl-benzoát, 
ethyl-3,5-dinitrobenzoát),  
— aromatické uhlovodíky a deriváty (nap ř. toluen, xylen, ethylben ­
zen, nitrobenzen),  
— estery aryloxyfenoxypropanové kyseliny (nap ř. diklofop-methyl, 
fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-P-ethyl),  
— benzimidazolové a imidazolové fungicidy (nap ř. karbendazim, 
fuberidazol, triazoxid),  
— amidy karboxylových kyselin (nap ř. 2-chlorbenzamid, N,N-dime ­
thylbenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-methylbenzamid, 2-nitro ­
benzamid, 3-nitrobenzamid),  
— chlorované uhlovodíky (nap ř. endosulfan, DDT, hexachlorben ­
zen, kvintozen, 1,2,3-trichlorbenzen),  
— organofosforové insekticidy (nap ř. azinfosmethyl, disulfoton, 
fenamifos, isofenfos, pyrazofos, sulprofos, triazofos),  
— fenoly (nap ř. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlorfenol, 
2,4,6-trichlorfenol, 1-naftol),  
— deriváty fenylmo čoviny (nap ř. isoproturon, monolinuron, pency ­
kuron),  
— pigmentová barviva (nap ř. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, 
Direct Red 81),  
— polyaromatické uhlovodíky (nap ř. acenaften, naftalen),  
— 1,3,5-triazinové herbicidy (nap ř. prometryn, propazin, simazin, 
terbutryn),  
— triazolové deriváty (nap ř. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, 
triapenthenol).  
Metoda není použitelná pro látky, které reagují s eluentem nebo 
stacionární fází. Rovn ěž není použitelná pro látky, které interagují 
specifickým zp ůsobem s anorganickými složkami (nap ř. tvoří 
klastrové komplexy s minerály jílu). Metoda nemusí fungovat pro 
povrchov ě aktivní látky, anorganické slou čeniny a pro st ředně silné 
nebo silné organické kyseliny a zásady. Lze stanovit hodnotu log K
 ou od 1,5 do 5,0. Ionizovatelné látky musí být m ěřeny s pufrovanou 
mobilní fázi, avšak je t řeba dbát na to, aby se p ředešlo srážení složek 
pufru nebo zkoušené látky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. KRITÉRIA JAKOSTI  
1.6.1.  Správnost  
Obvykle lze adsorp ční koeficient zkoušené látky stanovit v rozmezí 
+/- 0,5 řádu hodnoty stanovené šaržovitou rovnovážnou metodou 
(viz tabulka 1 v dodatku). Vyšší správnosti lze dosáhnout, pokud 
jsou použité referen ční látky strukturn ě příbuzné se zkoušenou 
látkou.  
1.6.2.  Opakovatelnost  
Stanovení se provedou alespo ň dvakrát. Hodnoty log K  ou získané 
z jednotlivých m ěření by m ěly ležet v rozmezí ± 0,1.  
1.6.3.  Reprodukovatelnost  
Dosud získané zkušenosti s použitím metody potvrzují její validitu. 
Ověřování metody HPLC za použití 48 látek (p řevážně pesticidů), 
u nichž byly k dispozici spolehlivé údaje o K  ou v půdě, vedlo ke 
korelačnímu koeficientu R = 0,95 (10, 11).  
Pro zlepšení a validaci metody bylo proveden mezilaboratorní srov ­
návací test za ú časti 11 laborato ří (12). Výsledky jsou uvedeny 
v tabulce 2 v dodatku.  
1.7. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.7.1.  Předběžný odhad adsorp čního koeficientu  
Rozdělovací pom ěr oktanolvoda P  ov (= K  ov ) a do ur čité míry 
i rozpustnost ve vod ě lze použít jako indikátory rozsahu adsorpce 
zejména u neionizovaných látek, a mohou tedy být použity pro jeho předběžné určení. Pro r ůzné skupiny chemických látek byla publiko ­
vána řada užitečných korelací (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
 
1.7.2.  Přístroje a pom ůcky 
Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený 
bezpulzním čerpadlem a vhodným detek čním zařízením. Doporu čuje 
se používat nást řikový ventil se vst řikovací smy čkou. Použije se 
komerční fáze s vázanými kyanopropylovými skupinami na silika ­
gelu (nap ř. Hypersil a Zorbax CN). Mezi nást řikem a analytickou 
kolonou m ůže být umíst ěna předkolona ze stejného materiálu. 
Kolony od r ůzných dodavatel ů se mohou podstatn ě lišit, pokud jde 
o účinnost. Jako vodítko by m ěly být dosaženy následující kapacitní 
faktory: log k' > 0,0 pro log K  ou = 3,0 a log k' > – 0,4 pro log K  ou = 
2,0 při použití sm ěsi methanol/voda 55/45 % jako mobilní fáze.  
1.7.3.  Mobiní fáze  
Bylo testováno n ěkolik mobilních fází a doporu čují se tyto dv ě 
mobilní fáze:  
— methanol/voda (55/45 % obj.),  
— methanol/0,01 M citrátový pufr pH 6,0 (55/45 % obj.).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
K přípravě elučního rozpoušt ědla se použije methanol a voda nebo 
citrátový pufr, vše čistoty pro HPLC. Sm ěs se před použitím odplyní. 
Měla by být provedena isokratická eluce. Nevyhovuje-li sm ěs 
methanol/voda, lze vyzkoušet sm ěsi jiných organických rozpoušt ědel 
s vodou, nap ř. směsi ethanol/voda nebo acetonitril/voda. 
U ionizovatelných slou čenin se doporu čuje použití pufru ke stabili ­
zaci pH. Je nezbytné dbát na to, aby se zamezilo srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u n ěkterých sm ěsí organické 
fáze s pufrem.
 
Nesmí být použity žádné p řísady, jako jsou iontov ě párová činidla, 
neboť mohou ovlivnit sorp ční vlastnosti stacionární fáze. Takové 
změny mohou být nevratné. Z tohoto d ůvodu musí být experimenty 
s použitím p řísad provád ěny na zvláštních kolonách.  
1.7.4.  Rozpušt ěné látky  
Zkoušené a referen ční látky se rozpustí v mobilní fázi.  
1.8. PROVEDENÍ ZKOUŠKY  
1.8.1.  Zkušební podmínky  
Teplota b ěhem měření se zaznamenává. Pro zajišt ění konstantních 
podmínek b ěhem kalibrace a p ředběžných měření a během měření 
zkoušené látky se velmi doporu čuje použití kolony s regulací teploty.  
1.8.2.  Stanovení mrtvého času t0  
Pro stanovení mrtvého času lze použít dv ě různé metody (viz také 
bod 1.2).  
1.8.2.1.  Stanovení mrtvého času t  0 pomocí homologické řady 
Je ověřeno, že tato metoda poskytuje spolehlivé a standardizované 
hodnoty t  0 . Podrobnosti viz zkušební metoda A.8 Rozd ělovací koefi ­
cient (oktanol/voda) metodou HPLC.  
1.8.2.2.  Stanovení mrtvého času t  0 pomocí inertních látek, které nejsou 
v koloně zadržovány  
Tato technika je založena na nást řiku roztok ů formamidu, mo čoviny 
nebo dusi čnanu sodného. M ěření se provedou alespo ň dvakrát.  
1.8.3.  Stanovení reten čních časů tR 
Referenční látky se vyberou tak, jak je uvedeno v bodu 1.3. Pro 
stanovení jejich reten čních časů mohou být nast říknuty jako sm ěsný 
standard, pokud je potvrzeno, že reten ční čas žádného referen čního 
standardu není ovliv ňován přítomností ostatních referen čních stan ­
dardů. Kalibrace by m ěla být provád ěna pravideln ě, alespoň dvakrát 
denně, aby se objasnily neo čekané zm ěny účinnosti kolony. Nást řiky 
pro kalibraci by m ěly být provád ěny přednostně před nástřikem 
zkoušené látky a po n ěm, aby se potvrdilo, že nedošlo ke zm ěně 
retenčních časů. Zkoušené látky se nast říknou odd ěleně v co nejmen ­ 
ších množstvích (aby se kolona nep řetížila) a stanoví se jejich 
retenční časy. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
S cílem zvýšit d ůvěryhodnost m ěření musí být provedena alespo ň 
dvě stanovení. Hodnoty log K  ou získané z jednotlivých m ěření by 
měly ležet v rozmezí ± 0,25.  
1.8.4.  Hodnocení  
Kapacitní faktory k' se vypo čtou z mrtvého času t  0 a retenčních časů 
t R vybraných referen čních látek podle rovnice 4 (viz bod 1.2). 
Hodnoty log k' referen čních látek se poté vynesou proti jejich 
hodnotám log K  ou z experiment ů šaržovitou rovnovážnou metodou 
uvedeným v tabulkách 1 a 3 v dodatku. Z tohoto grafu se poté 
s použitím hodnoty log k' zkoušené látky ur čí její hodnota log 
K ou . Je-li z vlastních výsledk ů zřejmé, že hodnota log K  ou leží 
mimo obor kalibra ční křivky, zkouška se opakuje s vhodn ějšími 
referenčními látkami.  
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Zpráva musí obsahovat tyto informace:  
— identifikace zkoušené látky a referen čních látek, jejich čistota 
a podle pot řeby hodnoty pK  a , 
— popis za řízení a pracovních podmínek, nap ř. typ a rozm ěry 
analytické kolony a p ředkolony, detek ční zařízení, mobilní fáze 
(poměr složek a pH), rozmezí teploty b ěhem měření, 
— mrtvý čas a použitá metoda jeho stanovení,  
— množství zkoušené látky a referen čních látek zavedených do 
kolony,  
— retenční časy referen čních slou čenin použitých ke kalibraci,  
— charakteristiky proložené regresní k řivky (log k' versus log K  ou ) 
a graf regresní k řivky,  
— průměrné reten ční údaje a odhad hodnoty log Kou zkoušené 
sloučeniny,  
— chromatogramy.  
3. LITERATURA  
1) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). Hand ­
book of  chemical property estimation methods, chapt. 4, 
McGraw-Hill, New York.  
2) J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 167.  
3) G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, 
water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. 
J. Agric. Food Chem., 29, 1050–1059.  
4) C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, 227–231.
 
5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic 
substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, 
B19, 297–312.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
6) C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic 
compounds, Science, 106, 831–832.  
7) S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, 833–846.
 
8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2), 121–128.  
9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), 2493–2504.  
10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 
27(12), 2341–2352.
 
11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, 285–304.  
12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373–1384.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
DODATEK  
Tabulka 1  
Srovnání hodnot K  ou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypo čtených screeningovou metodou s HPLC  ( 1 ), ( 2 ) 
Látka Číslo CAS log K  ou pro 
čistírenské 
kaly log K  ou 
pomocí 
HPLC log K  ou pro 
půdy log K  ou 
pomocí 
HPLC  
Atrazin 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fenthion 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 
Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 
Fenanthren 85-01-8 4,35 3,72
 0,63 4,09 3,52 0,57 
Fenylbenzoát 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Benzamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-Nitrobenzamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Acetanilid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Anilin 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dichloranilin 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121–128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), 107–119.  
Tabulka 2  
Výsledky mezilaboratorního srovnávacího testu provedeného za ú čelem zlepšení a validace metody HPLC (11 
zúčastněných laborato ří) ( 1 ) 
Látka Číslo CAS log K  ou K ou log K  ou 
(OECD 106) HPLC  
Atrazin 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapenthenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fenthion 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373—1384.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabulka 3  
Referenční látky doporu čené pro screeningovou metodu s HPLC na základ ě adsorpčních údaj ů pro půdu 
Referenční látka Číslo CAS Logaritmy st řed­
ních hodnot K  ou 
z šaržovité 
rovnovážné 
metody Počet hodnot 
K ou Logaritmus 
směrodatné 
odchylky Zdroj  
Acetanilid 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N,N-Dimethylbenzamid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Methylbenzamid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Methyl-benzoát 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazin 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamid 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilin 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Karbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxide 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftalen 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Methiokarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Trichlorbenzen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH (lindan) 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fenthion 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyrazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
alfa-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diklofop-methyl 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenanthren 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (sm ěs) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & 
D Report No. 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285–304 
( c ) Údaje poskytnuté pr ůmyslem.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  ZKOUŠKA TOXICITY PRO REPRODUKCI U  DAPHNIA 
MAGNA  
1. METODA  
Tato zkouška toxicity pro reprodukci je replikou metody OECD TG 
211 (1998).  
1.1. ÚVOD  
Hlavním cílem zkoušky je posoudit ú činky chemických látek na 
reprodukční schopnost druhu  Daphnia magna . 
1.2. DEFINICE A JEDNOTKY  
Rodičovské organismy:  dafnie sami čího pohlaví, které jsou 
přítomné na za čátku zkoušky a jejich reproduk ční schopnost je p řed­
mětem studie.  
Potomstvo:  mladé dafnie pocházející z rodi čovských organism ů 
v průběhu zkoušky.  
Nejnižší koncentrace s pozorovanými ú činky (lowest observed 
effect concentration, LOEC):  nejnižší zkušební koncentrace, p ři 
níž je pro danou expozi ční dobu pozorován statisticky významný 
účinek látky na reprodukci a na mortalitu rodi čovských organism ů 
(na hladin ě významnosti p < 0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou. 
Všechny zkušební koncentrace vyšší než LOEC musí mít škodlivé účinky stejné nebo v ětší, než ú činky pozorované p ři LOEC. Nelze-li 
tyto dvě podmínky splnit, musí být podrobn ě vysvětleno, jak byla 
LOEC (a tedy i NOEC) zvolena.
 
Koncentrace bez pozorovaných ú činků (no observed effect 
concentration NOEC):  zkušební koncentrace bezprost ředně nižší 
než LOEC, která p ři srovnání s kontrolní skupinou nemá pro 
danou expozi ční dobu statisticky významný ú činek (při p < 0,05).  
EC x : koncentrace zkoušené látky rozpušt ěné ve vod ě, která pro 
danou expozi ční dobu vede k x % snížení reprodukce dafnií  
Daphnia magna . 
Vnitřní míra r ůstu populace:  míra růstu populace, v níž je zahrnuta 
reprodukční schopnost a mortalita specifická z hlediska stá ří (20, 21, 
22). V ustáleném stavu bude nulový. Pro rostoucí populaci bude 
kladný a pro snižující se populaci bude záporný. Je z řejmé, že p ři 
záporném r ůstu nelze druh zachovat a nakonec dojde k jeho 
vyhynutí.  
Mez detekovatelnosti:  nejnižší koncentrace, v níž lze látku deteko ­
vat, nikoli však stanovit.  
Mez stanovitelnosti:  nejnižší koncentrace, v níž lze látku kvantita ­
tivně naměřit. 
Mortalita:  organismus se zaznamená jako mrtvý, je-li nepohyblivý, 
tj. není-li schopen plavat nebo není-li u kon četin nebo zade čku 
pozorován pohyb do 15 sekund po lehkém zat řepání zkušební nádo ­
bou. (Použije-li se jiná definice, musí být uvedena spole čně 
s odkazem na literaturu.)  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Mladé sami čí dafnie (rodi čovské organismy) na za čátku zkoušky 
mladší než 24 hodin se exponují zkoušené látce p řidané do vody 
v určitém rozsahu koncentrací. Zkouška trvá 21 dní. Na konci 
zkoušky se odhadne celkový po čet vylíhnutých živých potomk ů 
pocházejících z jednoho rodi čovského organismu, který p řežil do 
konce zkoušky. To znamená, že nedosp ělé dafnie pocházející 
z dospělých dafnií, které v pr ůběhu zkoušky uhynuly, se z odhad ů 
vyloučí. Reproduk ční schopnost rodi čovských organism ů lze vyjád řit 
jiným zp ůsobem (nap ř. jako po čet živých potomk ů pocházejících 
z jednoho rodi čovského organismu za den, a to od prvního dne, 
kdy bylo potomstvo pozorováno), který se však uvede dopl ňkově 
vedle celkového po čtu nedosp ělých dafnií pocházejících z jedné 
rodičovské dafnie živé na konci zkoušky. Reproduk ční schopnost 
organismů exponovaných zkoušené látce se porovná s reproduk ční 
schopností kontrolní skupiny (kontrolních skupin) s cílem stanovit 
nejnižší koncentraci s pozorovanými ú činky (LOEC), a tím 
i koncentraci bez pozorovaných ú činků (NOEC). Krom ě toho se 
údaje pokud možno analyzují pomocí regresního modelu s cílem 
odhadnout koncentraci, která vyvolává x % snížení reproduk ční 
schopnosti, (tj. EC  50 , EC  20 nebo EC  10 ). 
Musí být rovn ěž uvedeno p řežití rodičovských organism ů a okamžik 
vylíhnutí prvních potomk ů. Zkoumány mohou být také jiné ú činky 
vyvolané látkou, které mají vliv na charakteristiky, jako jsou r ůst 
(např. vliv na délku) a pop řípadě vnitřní míra růstu populace  
1.4. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Měly by být k dispozici výsledky zkoušky akutní toxicity (viz 
metoda C.2, část I) provedené u  Daphnia magna . Výsledky 
mohou být užite čné pro volbu vhodného rozsahu zkušebních koncen ­
trací ve zkouškách toxicity pro reprodukci. M ěly by být známy 
rozpustnost zkoušené látky ve vod ě a tlak jejích par a m ěla by být 
k dispozici spolehlivá analytická metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to s doloženým výt ěžkem a mezí 
stanovitelnosti.
 
Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro ú čely stanovení 
zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota látky, 
stálost na sv ětle, stálost v podmínkách zkoušky pKa, P  o/v 
a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda 
C.4).  
1.5. VALIDITA ZKOUŠKY  
Má-li být zkouška platná, musí být u kontrolní skupiny (kontrolních 
skupin) spln ěna tato kriteria reproduk ční schopnosti:  
— mortalita rodi čovských organism ů (dafnií sami čího pohlaví) 
nesmí na konci zkoušky p řekročit 20 %,  
— střední hodnota po čtu živých potomk ů pocházejících z jednoho 
rodičovského organismu živého na konci zkoušky je ≥ 60. 
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1.  Přístroje a pom ůcky 
Zkušební nádoby nebo jiné p řístroje a pom ůcky, které p řijdou do 
styku se zkušebními roztoky, by m ěly být sklen ěné nebo z jiného 
chemicky inertního materiálu. Zkušebními nádobami jsou obvykle skleněné kádinky.
 
Kromě toho bude nezbytné n ěkteré nebo veškeré toto za řízení:  
— přístroj pro m ěření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou nebo 
jiným vhodným vybavením na m ěření koncentrace rozpušt ěného 
kyslíku ve vzorcích malého objemu),  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— vhodný p řístroj pro regulaci teploty,  
— pH-metr,  
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,  
— zařízení pro stanovení celkového organického uhlíku (TOC) ve 
vodě nebo za řízení pro stanovení chemické spot řeby kyslíku 
(COD),  
— vhodné za řízení pro ovládání režimu osv ětlení a pro m ěření 
intenzity sv ětla. 
1.6.2.  Testovací organismy  
Ke zkoušce se použije druh  Daphnia magna  Straus. Jiné druhy 
dafnií mohou být použity, pokud spl ňují příslušná kritéria validity 
(kritérium validity týkající se reproduk ční schopnosti kontrolních 
skupin by m ělo být relevantní pro daný druh dafnií). Použijí-li se 
jiné druhy dafnií, musí být jasn ě identifikovány a jejich použití musí 
být zdůvodněno. 
Klon by m ěl být identifikován p řednostně uvedením genotypu. 
Výzkum (1) ukázal, že reproduk ční schopnost klonu A (který 
pochází z institutu IRCHA ve Francii) (3) stabiln ě splňuje kritérium 
validity, jímž je ≥ 60 potomk ů na přeživší rodi čovský organismus p ři 
kultivaci za podmínek popsaných v této metod ě. Jiné klony jsou 
však přijatelné, spl ňuje-li kultura dafnií prokazateln ě kriteria validity 
pro tuto zkoušku.  
Na začátku zkoušky musí být dafnie nejvýše 24 hodin staré a nesmí 
pocházet z první generace potomk ů. Musí pocházet ze zdravé kultury 
(tj. nesmí vykazovat známky stresu, nap ř. zvýšenou mortalitu, 
přítomnost jedinc ů samčího pohlaví a efipií, zpožd ění produkce 
prvních potomk ů, přítomnost jinak zbarvených jedinc ů atd.). Orga ­
nismy z kmenové kultury musí být chovány v podmínkách podob ­
ných těm, které mají být použity p ři zkoušce (osv ětlení, teplota, 
médium, krmení a po čet dafnií na jednotku objemu). Liší-li se kulti ­
vační médium pro dafnie, které má být použito p ři zkoušce, od 
média používaného k rutinní kultivaci dafnií, doporu čuje se za řadit 
před zkouškou obvykle t řítýdenní aklimatiza ční období (tj. v délce 
odpovídající jedné generaci), aby nedošlo u rodi čovských organism ů 
ke stresu.  
1.6.3.  Zkušební médium  
Doporučuje se, aby bylo v této zkoušce použito p řesně definované 
médium. Tím se lze vyhnout použití p řísad (nap ř. mořských řas, 
extraktu z p ůdy atd.), které je obtížné charakterizovat, a zvýšit tak 
vyhlídky mezilaboratorní standardizace. Elendtova média M4 (4) a M7 byla shledána pro tento ú čel jako vyhovující. Jiná média (nap ř. 
(5, 6)) jsou však p řijatelná, spl ňuje-li reproduk ční schopnost kultury 
dafnií prokazateln ě kriteria validity pro tuto zkoušku.
 
Použije-li se médium, které obsahuje nestanovené p řísady, měly by 
být tyto p řísady jasn ě specifikovány a v protokolu o zkoušce se 
uvedou informace o složení, a to zejména o obsahu organického 
uhlíku, nebo ť může přispívat k dodávané potrav ě. Doporu čuje se, 
aby byl stanoven celkový organický uhlík (TOC) a/nebo chemická spotřeba kyslíku (COD) výchozího preparátu organické p řísady a aby 
byl odhadnut výsledný p říspěvek k TOC nebo COD ve zkušebním 
médiu. Doporu čuje se, aby byly úrovn ě TOC v médiu (tj. p řed 
přidáním řas) nižší než 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Při zkoušení látek obsahujících kovy je d ůležité si uv ědomit, že 
vlastnosti zkušebního média (nap ř. tvrdost, chelata ční schopnosti) 
mohou mít vliv na toxicitu látky. Z tohoto d ůvodu je žádoucí, aby 
bylo médium p řesně definováno. V sou časnosti jsou však jedinými 
přesně definovanými médii, o nichž je známo, že jsou vhodná pro 
dlouhodobou kultivaci kultury druhu  Daphnia magna , Elendtova 
média M4 a M7. Ob ě média obsahují chelata ční činidlo EDTA. 
Práce (2) ukázaly, že provádí-li se zkouška v médiích M4 a M7, je „zdánlivá toxicita“ kadmia zpravidla nižší než v médiu, které 
neobsahuje EDTA. Média M4 a M7 se tedy nedoporu čují pro zkou ­ 
šení látek obsahujících kovy a nem ěla by se používat ani jiná média 
obsahující činidla známá svou chelata ční schopností. V p řípadě látek 
obsahujících kovy se doporu čuje používat jiné médium, nap říklad 
rekonstituovanou tvrdou sladkou vodu podle ASTM (7), která neob ­
sahuje EDTA a do níž je p řidán extrakt z řas (8). Tato kombinace 
rekonstituované tvrdé sladké vody podle ASTM a extraktu z řas je 
také vhodná pro dlouhodobou kultivaci druhu  Daphnia magna  (2) 
a pro zkoušení na tomto druhu, p řestože stále vykazuje slabé chela ­
tační účinky způsobené organickými složkami p řidaného extraktu 
z řas.
 
Na začátku zkoušky a v jejím pr ůběhu by m ěla být koncentrace 
rozpuštěného kyslíku vyšší než 3 mg/l. pH by m ělo být v rozmezí 
6 až 9 a zpravidla by se nem ělo v žádné zkoušce m ěnit o více než 
1,5. Doporu čuje se tvrdost nad 140 mg/l (jako CaCO  3 ). Ve zkou ­ 
škách při této a vyšší tvrdosti reproduk ční schopnost prokazateln ě 
vyhovovala kritériím validity (9, 10).  
1.6.4.  Zkušební roztoky  
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se obvykle p řipraví 
ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky se p řipraví nejlépe 
rozpuštěním látky ve zkušebním médiu.  
Pro přípravu vhodn ě koncentrovaného zásobního roztoku m ůže být 
někdy nezbytné použití organických rozpoušt ědel nebo dispergátor ů, 
měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepo ­
užívat. Ke vhodným rozpoušt ědlům patří aceton, ethanol, methanol, 
dimethylsulfoxid, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátor ům patří Cremophor RH40, 0,01 % methylcelulosa 
a HCO-40. V žádném p řípadě by však nem ěl obsah zkoušené 
látky ve zkušebních roztocích vést k p řekročení její rozpustnosti ve 
zkušebním médiu.
 
K přípravě zásobního roztoku, který lze p řesně dávkovat do vody, se 
použijí rozpoušt ědla. Při doporu čené koncentraci rozpoušt ědla 
v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml/l) nejsou výše uvedená 
rozpouštědla toxická a nezvyšují rozpustnost látky ve vod ě. 
Dispersanty mohou usnadnit p řesné dávkování a dispergaci. P ři 
doporučené koncentraci v kone čném zkušebním médiu ( ≤ 0,1 ml/l) 
nejsou výše uvedené dispergátory toxické a nezvyšují rozpustnost 
látky ve vod ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. USPO ŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY  
Expozice se rozvrhne pro jednotlivé zkušební nádoby a veškerá další 
manipulace se zkušebními nádobami se provád ějí náhodn ě. Nedodr­ 
žení této zásady m ůže vést k jednostrannému vychýlení, které m ůže 
být považováno za ú činek koncentrace. Je-li nap říklad 
s experimentálními jednotkami manipulováno v po řadí varianty 
nebo v po řadí koncentrací, mohl n ějaký časově podmíněný efekt, 
např. únava obsluhy nebo jiné pochybení, vést k vyšším ú činkům 
při vyšších koncentracích. Mohou-li být výsledky ovlivn ěny počá­
tečními podmínkami zkoušky nebo okolními podmínkami, jako je 
např. umístění v laborato ři, mělo by být dále zváženo blokové uspo ­ 
řádání zkoušky.  
1.8. POSTUP  
1.8.1.  Podmínky expozice  
1.8.1.1.  Délka expozice  
Zkouška trvá 21 dní.  
1.8.1.2.  Nasazování  
Rodičovské organismy se umístí po jednom do zkušebních nádob 
s 50 až 100 ml média.  
V některých p řípadech m ůže být nezbytné použít v ětší objemy, aby 
bylo možné splnit požadavky analytické metody použité pro stano ­
vení koncentrace zkoušené látky, t řebaže je sdružování paralelních 
vzorků k chemické analýze rovn ěž přípustné. Jsou-li použity objemy 
větší než 100 ml, m ůže být nezbytné zvýšit dávky podávané dafniím, 
aby se zajistila odpovídající dostupnost potravy a splnila kritéria validity. U pr ůtokových zkoušek mohou být z technických d ůvodů 
zvážena jiná uspo řádání (nap ř. čtyři skupiny po 10 organismech ve 
větším zkušebním objemu), avšak jakékoli zm ěny uspo řádání 
zkoušky musí být uvedeny.
 
1.8.1.3.  Počet organism ů 
U semistatických zkoušek se nasadí jednotliv ě alespoň 10 organism ů 
pro každou zkušební koncentraci a alespo ň 10 organism ů jednotliv ě 
do kontrolních skupin.  
U průtokových zkoušek se ukázalo vhodným rozd ělit pro každou 
koncentraci 40 organism ů do čtyř skupin po 10 organismech (1). 
Může být použit menší po čet testovacích organism ů, přičemž se 
doporučuje na jednu koncentraci rozd ělit minimáln ě 20 organism ů 
do dvou nebo více paralelních skupin o stejném po čtu organism ů 
(např. čtyři paralelní skupiny po p ěti dafniích). Je t řeba poznamenat, 
že u zkoušek, p ři nichž se organismy nasazují jako skupiny, nebude 
možné vyjád řit reproduk ční schopnost jako po čet živých potomk ů 
pocházejících z jednoho rodi čovského organismu, který p řežil do 
konce zkoušky, v p řípadě, že rodi čovský organismus uhyne. 
V takovém p řípadě se reproduk ční schopnost vyjád ří jako „celkový 
počet živých potomk ů pocházejících z jednoho rodi čovského orga ­
nismu přítomného na za čátku zkoušky“.  
1.8.1.4.  Krmení  
U semistatických zkoušek se dafnie krmí p řednostně denně, nejméně 
však třikrát týdn ě (tj. s vým ěnou média). Odchylky od této praxe 
(např. u průtokových zkoušek) se uvedou v protokolu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Potrava rodi čovských organism ů během zkoušky by m ěla sestávat 
přednostně z živých jednobun ěčných řas jednoho nebo více t ěchto 
druhů: Chlorella  sp, Selenastrum capricornutum  (nyní  Pseudokirch ­
neriella subcapitata  (11)) a  Scenedesmus subspicatus . Dodávaná 
potrava by m ěla vycházet z množství organického uhlíku (C) 
dodávaného na jeden rodi čovský organismus. Výzkum (12) ukázal, 
že u druhu  Daphnia magna  je množství potravy obsahující od 0,1 do 
0,2 mg C na dafnii za den dostate čné na to, aby bylo dosaženo 
požadovaného potomstva nezbytného pro spln ění kritérií validity. 
Potrava m ůže být dodávána bu ď ve stejných dávkách po celou 
dobu zkoušky, nebo podle požadavku v nižších dávkách na za čátku 
zkoušky a poté ve zvyšujících se dávkách s ohledem na r ůst rodičov­
ských organism ů. V takovém p řípadě by mělo množství potravy po 
celou dobu obsahovat doporu čené množství 0,1 až 0,2 mg C na 
dafnii za den.  
Použije-li se k ur čení požadovaného množství potravy zástupný 
ukazatel, jako je po čet jednobun ěčných řas nebo absorbance ve vidi ­
telném sv ětle (z praktických d ůvodů, neboť měření obsahu uhlíku je 
časově náročné), musí každá laborato ř vytvořit vlastní nomogram 
vztahu zástupného ukazatele a obsahu uhlíku v kultu ře řas (viz 
dodatek 2 s návodem na vytvo ření nomogramu). Nomogramy by 
měly být ov ěřovány jednou ro čně a častěji v případě, že se zm ění 
podmínky kultivace řas. Absorbance ve viditelném sv ětle byla shle ­
dána lepším zástupným ukazatelem celkového obsahu uhlíku než počet buněk (13).
 
Dafniím by m ěla být dodávána koncentrovaná suspense řas, aby se 
minimalizoval objem kultiva čního média řas uváděný do zkušební 
nádoby. Zkoncentrování řas lze dosáhnout centrifugací a následnou 
resuspensí v destilované vod ě, v deionizované vod ě nebo 
v kultivačním médiu dafnií.  
1.8.1.5.  Osvětlení 
16 hodin sv ětla při intenzit ě nepřekračující 15 až 20 μE· m -2 ·s -1 . 
1.8.1.6.  Teplota  
Teplota testovacího média by m ěla být v rozm ězí 18–22  o C. V žádné 
zkoušce by však teplota nem ěla v těchto mezích kolísat o více než 
2 o C (např. 18 až 20, 19 až 21 nebo 20 až 22  o C). Pro ú čely 
sledování teploty m ůže být vhodné použít další zkušební nádobu.  
1.8.1.7.  Provzduš ňování  
Zkušební nádoby nesmí být b ěhem zkoušky provzduš ňovány.  
1.8.2.  Zkušební koncentrace  
Zpravidla se použije alespo ň pět zkušebních koncentrací tvo řících 
geometrickou řadu s faktorem nep řekračujícím 3,2 a p řiměřený 
počet paralelních zkušebních skupin v rámci každé zkušební 
koncentrace (viz bod 1.8.1.3). Použití mén ě než pěti koncentrací 
by mělo být zdůvodněno. Látky by nem ěly být zkoušeny p ři koncen­
tracích vyšších, než je jejich rozpustnost ve zkušebním médiu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Při volbě rozsahu koncentrací m ěly být zohledn ěny tyto zásady:  
i) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejnižší zkušební 
koncentrace dostate čně nízká, aby nebyla plodnost p ři této 
koncentraci významn ě nižší, než je plodnost v kontrolní skupin ě. 
V opačném případě bude muset být zkouška opakována se 
sníženou nejnižší koncentrací;  
ii) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejvyšší zkušební 
koncentrace dostate čně vysoká, aby byla plodnost p ři této 
koncentraci významn ě nižší, než je plodnost v kontrolní skupin ě. 
V opačném případě bude muset být zkouška opakována se 
zvýšenou nejvyšší koncentrací;  
iii) má-li být pro ú činky na reprodukci odhadnuta EC  X , doporučuje 
se, aby byl použit dostate čný počet koncentrací s cílem zjistit 
EC X s přijatelným intervalem spolehlivosti. Je-li znám odhad 
EC 50 pro účinky pro reprodukci, doporu čuje se, aby byla 
nejvyšší zkušební koncentrace vyšší než tato EC  50 . Jinak sice 
bude stále možné odhadnout EC  50 , interval spolehlivosti však 
bude velmi široký a nemusí být možné uspokojivé posouzení přiměřenosti navrženého modelu;
 
iv) do rozsahu zkušebních koncentrací by pokud možno nem ěly 
spadat koncentrace, které mají statisticky významný ú činek na 
přežití dosp ělců, neboť by mohl být zm ěněn charakter zkoušky 
z pouhé zkoušky toxicity pro reprodukci na kombinovanou 
zkoušku toxicity pro reprodukci a mortality, která vyžaduje 
daleko složit ější statistickou analýzu.  
Předchozí znalost toxicity zkoušené látky (nap ř. ze zkoušek akutní 
toxicity nebo z orienta čních studií) by m ěla pomoci p ři volbě vhod­
ných zkušebních koncentrací.  
Použije-li se k usnadn ění přípravy zásobního roztoku rozpoušt ědlo 
nebo dispergátor (viz bod 1.6.4), nem ěla by být jeho kone čná 
koncentrace ve zkušební nádob ě vyšší než 0,1 ml/l a m ěla by být 
ve všech zkušebních nádobách stejná.  
1.8.3.  Kontrolní skupiny  
Kromě zkušební série se nasadí jedna série kontrolních skupin pro 
kontrolu zkušebního média a podle pot řeby jedna série kontrolních 
skupin obsahujících rozpoušt ědlo nebo dispergátor. Použije-li se 
rozpouštědlo nebo dispergátor, m ěla by být jejich koncentrace stejná 
jako koncentrace v nádobách se zkoušenou látkou. Použije se 
vhodný po čet paralelních skupin (viz oddíl 1.8.1.3).  
V dobře vedených zkouškách by m ěl být varia ční koeficient st řed­
ního počtu živých potomk ů připadajících na rodi čovský organismus 
v kontrolní skupin ě (kontrolních skupinách) zpravidla ≤ 25 %, a m ěl 
být uveden v návrzích zkoušek s odd ělenými jedinci.  
1.8.4.  Obnovování zkušebního média  
Četnost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, 
médium se však obnovuje alespo ň třikrát týdn ě. Není-li podle p řed­
běžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky 
po maximální dobu mezi obnoveními média (tj. po t ři dny) stálá (tj. 
nepohybuje-li se v intervalu 80–120 % nominální koncentrace nebo 
klesá-li pod 80 % nam ěřené počáteční koncentrace), m ělo by být 
zváženo častější obnovování média nebo pr ůtoková zkouška.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Při obnovování média v semistatických zkouškách se p řipraví druhá 
série zkušebních nádob a rodi čovské organismy se do nich p řenesou 
např. skleněnou pipetou o vhodném pr ůměru. Objem média p řenese­
ného s dafniemi by m ěl být co nejmenší.  
1.8.5.  Pozorování  
Výsledky pozorování provád ěných během zkoušky se zaznamenávají 
do přehledu údaj ů (viz příklady v dodatcích 3 a 4). Jsou-li požado ­
vána další m ěření (viz body 1.3 a 1.8.8), m ůže být nezbytné 
provádět další pozorování.  
1.8.6.  Potomstvo  
Potomstvo pocházející z každého rodi čovského organismu se od jeho 
prvního výskytu nejlépe denn ě vybírá a po čítá, aby nespot řebovávalo 
potravu ur čenou pro dosp ělého jedince. Pro ú čely této metody je 
třeba počítat pouze živé potomstvo, avšak p řítomnost nevylíhnutých 
vajíček nebo mrtvého potomstva se zaznamená.  
1.8.7.  Mortalita  
Mortalita rodi čovských organism ů se zaznamenává p řednostně 
denně, a měla by být stanovována alespo ň při počítání potomstva.  
1.8.8.  Další parametry  
Třebaže je tato metoda navržena hlavn ě k posouzení ú činků na 
reprodukci, mohou však být i jiné ú činky kvantifikovány v mí ře 
dostatečné pro statistickou analýzu. Zvlášt ě měření růstu jsou 
žádoucí, nebo ť poskytují informaci o možných subletálních ú čincích, 
které mohou být užite čnější než samotná m ěření reprodukce; doporu ­ 
čuje se na konci zkoušky zm ěřit délku rodi čovských organism ů (tj. 
délku těla bez zade čkového hrotu). Mezi další parametry, které lze 
měřit nebo vypo čítávat, pat ří doba do vylíhnutí prvních pl ůdků (a 
následně dalších potomk ů), počet a velikost potomk ů na jeden orga ­
nismus, po čet nevylíhnutých pl ůdků, přítomnost jedinc ů samčího 
pohlaví nebo efipií a vnit řní míra růstu populace.  
1.8.9.  Četnost analytických stanovení a m ěření 
Koncentrace kyslíku, teplota, tvrdost a pH se m ěří alespoň jednou 
týdně před obnovením média a po n ěm, v kontrolních nádobách a u 
nejvyšší zkušební koncentrace.  
Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky stanovují 
v pravidelných intervalech.  
U semistatických zkoušek (s obnovováním média), u nichž se má 
zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ±20 % nominálních 
hodnot (tj. od 80 do 120 % – viz body 1.4 a 1.4.8), se doporu čuje 
analyzovat alespo ň nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace ihned po 
jejich přípravě a při obnovování, a to jednou b ěhem prvního týdne 
zkoušky (tj. analýzy se provedou na vzorku z téhož roztoku – p ři 
jeho přípravě a při obnovování). Tato stanovení se poté opakují 
alespoň v týdenních intervalech.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
U zkoušek, u nichž se nep ředpokládá, že se bude koncentrace zkou ­ 
šené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, je 
nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to ihned po jejich přípravě a při obnovování. U zkoušek, u nichž není nam ěřená 
počáteční koncentrace zkoušené látky v rozsahu ± 20 % nominální 
koncentrace, avšak u nichž lze dostate čně prokázat, že po čáteční 
koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé (tj. od 80 do 120 % po čá­
tečních koncentrací), by mohla být stanovení ve 2. a 3. týdnu 
zkoušky omezena na nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace. Ve 
všech případech je stanovení koncentrací zkoušené látky p řed obno­
vením třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní 
nádoby.
 
U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jaký 
je popsán u semistatických zkoušek (v tomto p řípadě se však nepro ­
vádí měření „starých“ roztok ů). Doporu čuje se však zvýšit po čet 
odběrů v prvním týdnu (nap ř. tři sady měření) pro ujišt ění, že jsou 
zkušební koncentrace stálé.V t ěchto typech zkoušky se pr ůtok ředicí 
vody a zkoušené látky kontroluje denn ě. 
Lze-li prokázat, že byla po celou dobu zkoušky koncentrace zkou ­ 
šené látky uspokojiv ě udržována v rozmezí ± 20 % nominální 
hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo nam ě­ 
řených po čátečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo 
naměřené počáteční koncentrace v ětší než ± 20 %, vyjád ří se 
výsledky jako časově vážené pr ůměry (viz dodatek 5).  
2. ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Účelem této zkoušky je stanovit ú činek zkoušené látky na celkový 
počet živých potomk ů pocházejících z jednoho rodi čovského orga ­
nismu, který p řežil do konce zkoušky. Celkový po čet potomk ů na 
rodičovský organismus se vypo čte pro každou zkušební nádobu (tj. 
pro každou paralelní nádobu). Jestliže v kterékoli paralelní nádob ě 
rodičovský organismus b ěhem zkoušky uhyne nebo se zjistí, že jde 
o samečka, vylou čí se nádoba z experimentu. Analýza se poté 
provede se zmenšeným po čtem paralelních nádob.  
Pro odhad LOEC, a tedy i NOEC vztahujících se k ú činkům 
chemické látky na reproduk ční schopnosti je nezbytné vypo čítat 
střední hodnotu reproduk ční schopnosti pro všechny paralelní 
nádoby pro každou koncentraci a celkový residuální rozptyl, a to lze provést analýzou rozptylu (ANOVA). St řední hodnota pro 
každou koncentraci musí být poté porovnána se st řední hodnotou 
pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou vícenásobného porov ­
nání. Užite čné mohou být Dunnett ův nebo Williams ův test (14, 15, 
16, 17). Je nezbytné ov ěřit, že je spln ěn předpoklad homogenity 
rozptylu nezbytný pro ANOVA. Doporu čuje se provést ov ěření 
raději graficky než formálním testem významnosti (18); vhodnou 
alternativou je Bartlett ův test. Není-li tento p ředpoklad spln ěn, 
měla by být p řed provedením ANOVA zvážena transformace údaj ů 
za účelem homogenizace rozptylu, nebo by m ěla být provedena 
vážená ANOVA. Vypo čte se a uvede se velikost ú činku zjistitelná 
pomocí ANOVA (tj. nejmenší významný rozdíl).
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Pro odhad koncentrace, která zp ůsobuje 50 % snížení reproduk ční 
schopnosti (tj. EC  50 ), se údaji proloží vhodná k řivka (vhodné k řiv­
ky), jako nap ř. logistická k řivka, a to statistickou metodou, nap ř. 
metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších 
čtverců. Křivka by m ěla být parametrizována tak, aby bylo možné 
přímo odhadnout EC  50 a její sm ěrodatnou odchylku. To zna čně 
usnadní výpo čet interval ů spolehlivosti pro hodnotu EC  50 . Pokud 
nejsou dobré d ůvody pro up řednostnění jiných interval ů spolehli­
vosti, uvede se oboustranný 95 % interval spolehlivosti. Metoda 
proložení by m ěla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedo ­
statků proložení. To lze provést graficky nebo rozd ělením reziduál ­
ního sou čtu čtverců na složku „chyby v proložení“ a „náhodné 
chyby“ a provedením testu významnosti chyby v proložení. 
Vzhledem k tomu, že u expozic, jejichž d ůsledkem je vyšší repro ­
dukční schopnost, je v ětší rozptyl po čtu vylíhnutých potomk ů než 
u expozic vedoucích k nejnižší reproduk ční schopnosti, je t řeba 
promyslet vážení pozorovaných hodnot s cílem zohlednit r ůzné 
rozptyly u r ůzně exponovaných skupin (18).  
Při analýze údaj ů z rozhodujícího okružního testu (2) byl použit 
tento model prokládající logistickou k řivku; lze však použít i jiné 
modely:  
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
kde: 
Y = celkový po čet živých potomk ů na rodičovský organismus, 
který přežil do konce zkoušky (vypo čteno pro každou nádo ­
bu); 
x = koncentrace látky;  
c = o čekávaný po čet potomk ů při x = 0;  
x 0 = EC  50 v populaci;  
b = sm ěrnice.  
Tento model bude pravd ěpodobně vhodný pro velký po čet situací, 
budou však existovat zkoušky, pro n ěž bude nevhodný. Jak bylo 
výše doporu čeno, je třeba ověřit validitu modelu. V n ěkterých p řípa­
dech může být vhodn ější model p ředpokládající hormesi, u n ěhož 
vedou nižší koncentrace k vyšším ú činkům (19).  
Lze rovn ěž odhadnout další koncentrace s ur čitým účinkem, nap ř. 
EC 10 nebo EC  20 ,může být však t řeba použít jinou parametrizaci 
modelu, než je použita pro odhad EC  50 . 
2.2. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace  
2.2.1.  Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha a p říslušné fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— údaje o chemické identifikaci v četně údaje o čistotě. 
2.2.2.  Testovací druhy:  
— klon (byl-li geneticky popsán), dodavatel nebo zdroj (je-li znám) 
a použité kultiva ční podmínky. Byl-li použit jiný druh než  
Daphnia magna , musí to být uvedeno a zd ůvodněno. 
2.2.3.  Zkušební podmínky:  
— použitý zkušební postup (nap ř. semistatická nebo pr ůtoková 
metoda, objem, velikost obsádky v po čtu dafnií na litr),  
— fotoperioda a intenzita sv ětla, 
— uspořádání zkoušky (nap ř. počet paralelních nádob, po čet rodi­ 
čovských organism ů na jednu paralelní nádobu),  
— podrobnosti o použitém kultiva čním médiu,  
— byly-li použity, p řidané organické materiály v četně složení, 
zdroje, metody p řípravy, TOC/COD výchozích preparát ů, 
odhad výsledného TOC/COD ve zkušebním médiu,  
— podrobné informace o krmení, zejména množství (v mg C na 
dafnii za den) a plán (nap ř. typ krmiva, v četně specifického 
názvu (druhu) u řas a kmene, je-li znám, a kultiva ční podmínky),  
— metoda p řípravy zásobních roztok ů a četnost obnovování (jsou-li 
použity, uvedou se rozpoušt ědlo nebo dispergátor a jejich 
koncentrace).  
2.2.4.  Výsledky:  
— výsledky p řípadných p ředběžných studií stálosti zkoušené látky,  
— nominální zkušební koncentrace a výsledky všech analýz pro 
stanovení koncentrace zkoušené látky ve zkušebních nádobách 
(viz příklad formulá ře pro přehled údaj ů v dodatku 4); uvede 
se také výt ěžek metody a mez stanovitelnosti,  
— kvalita vody ve zkušebních nádobách (tj. pH, teplota, koncent ­
race rozpušt ěného kyslíku a TOC a/nebo COD a dále podle 
potřeby tvrdost) (viz p říklad formulá ře pro p řehled údaj ů 
v dodatku 3),  
— celkový po čet živých potomk ů na každý rodi čovský organismus 
(viz příklad formulá ře pro přehled údaj ů v dodatku 3),  
— počet uhynulých rodi čovských organism ů a den, kdy k úhynu 
došlo (viz p říklad formulá ře pro přehled údaj ů v dodatku 3),  
— variační koeficient reproduk ční schopnosti kontrolních skupin 
(založený na celkovém po čtu živých potomk ů na rodičovský 
organismus, který p řežil do konce zkoušky),  
— křivka závislosti celkového po čtu živých potomk ů na rodičovský 
organismus, který p řežil do konce zkoušky (pro každou paralelní 
nádobu), na koncentraci zkoušené látky,  
— nejnižší koncentrace s pozorovanými ú činky (LOEC) na repro ­
dukci včetně popisu použitých statistických metod a údaje 
o velikosti ú činku, který mohl být detekován, a koncentrace 
bez pozorovaných ú činků (NOEC) na reprodukci; je-li 
k dispozici, uvede se LOEC/NOEC pro mortalitu rodi čovských 
organismů, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— je-li k dispozici, ECx pro reprodukci a interval spolehlivosti, dále 
graf křivky modelu použitého pro její výpo čet, směrnice křivky 
závislosti dávka-reakce a její sm ěrodatná odchylka,  
— jiné pozorované biologické ú činky a jiná m ěření: uvedou se 
jakékoli jiné biologické ú činky, které byly pozorovány nebo 
změřeny (např. růst rodičovských organism ů) včetně přiměřeného 
zdůvodnění, 
— zdůvodnění jakékoli odchylky od této zkušební metody.  
3. LITERATURA  
1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20–21 March 1993.  
2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on 
Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring Test of 
the Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, 257–265.
 
4) Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, 25–33.  
5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine 
Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
 
6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, 775–782.  
7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. 20 str.
 
8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; prob ­
lems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Confe ­
rence on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle 
& F. Bro-Rasmussen. Eds.) str. 144–148.  
9) Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P. (1981). Reproduci ­
bility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. and Toxicol., 26, 1–8.  
10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), 185–196.
 
11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard  
Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxicology 
and Chemistry, 12, 2053–2058.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459–466.
 
14) Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096–1121.  
15) Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491.  
16) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, 103–117.  
17) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, 510–531.  
18) Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93–96.  
20) Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population 
Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
21) Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, str. 
532. 
22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156–1166.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
DODATEK 1  
PŘÍPRAVA P ŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ 
M7 A M4  
Aklimatizace na Elendtova media M4 a M7  
Některé laborato ře narazily na obtíže p ři přímém přenosu dafnií do médií M4 (1) 
a M7. Ur čitého úsp ěchu však bylo dosaženo postupnou aklimatizací, tj. 
s přenesením z vlastního média do 30 % Elendtova média, poté do 60 % Elend ­
tova média a nakonec do 100 % Elendtova média. Délky doby aklimatizace mohou být nepochybn ě jeden m ěsíc.
 
PŘÍPRAVA  
Stopové prvky  
Ve vodě vhodné čistoty, nap ř. v deionizované nebo destilované vod ě nebo ve 
vodě přečištěné reversní osmosou, se nejprve p řipraví samostatné zásobní roztoky 
(I) jednotlivých stopových prvk ů. z těchto oddělených zásobních roztok ů (I) se 
připraví jeden zásobní roztok (II) obsahující všechny stopové prvky (sm ěsný 
roztok), tj.:  
Zásobní roztoky I 
(jednotlivá látka) Množství p řidané 
do vody 
mg/l Koncentrace 
(vzhledem k médiu 
M4) 
násobek Kombinovaný zásobní roztok II se 
připraví přidáním následujícího množ ­
ství zásobního roztoku I do vody 
(ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 · 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 
SrCl  2 · 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 · 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 · 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 · 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA· 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 · 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Jak roztok Na  2 EDTA, tak roztok FeSO  4 se připraví samostatn ě, spojí se a ihned se autoklávují. Získají se: 
2 litry roztoku Fe-EDTA 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
Média M4 a M7  
Média M4 a M7 se p řipraví ze zásobního roztoku II, makroživin a vitamin ů tímto 
způsobem:  
Množství p řidané 
do vody 
mg/l Koncentrace 
(vzhledem k médiu 
M4) 
násobek Množství zásobního roztoku p řidané za 
účelem přípravy média 
ml/l 
M4 M7  
Zásobní roztok II obsahující kombinaci 
stopových prvk ů 20 50 50 
Zásobní roztok makroživin (jednotlivá látka) 
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok — 10 000 0,1 0,1 
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se p řipraví přidáním 3 vitamin ů do 1 litru vody takto: 
Thiaminhydrochlorid 750 10 000 — — 
Kyanokobalamin (B  12 ) 10 10 000 — — 
Biotin 7,5 10 000 — —  
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se usklad ňuje zmrazený v malých alikvotních dílech. Vitaminy se do média p řidávají krátce 
před použitím.  
Poznámky : Aby nedošlo p ři přípravě kompletního média k vysrážení solí, p řidají se podíly zásobních roztok ů do asi 500–800 ml 
deionizované vody a objem se poté doplní na 1 litr.  
Poznámky : Poprvé byly informace o médiu M4 uvedeny v práci Ele ndt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultra ­
structural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus.  Protoplasma , 154, 25–33.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
DODATEK 2  
ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) 
A VYTVO ŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC v KRMIVU NA 
BÁZI ŘAS 
Je známo, že obsah uhlíku v krmivu na bázi řas se obvykle nem ěří přímo, ale 
stanoví se z korelací (tj. z nomogram ů) se zástupnými ukazateli, jako jsou po čet 
buněk řas nebo absorbance ve viditelném sv ětle. 
TOC by m ěl být stanoven spíše vysokoteplotní oxidací než pomocí UV nebo 
persíranovou metodou. (Viz: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 
49 High Holborn, London WC1V 6HB.)
 
Pro účely vytvo ření nomogramu se řasy oddělí od růstového média centrifugací 
a poté se resuspendují v destilované vod ě. Zástupný ukazatel a koncentrace TOC 
se měří v každém vzorku t řikrát. Provede se analýza slepého pokusu 
s destilovanou vodou a jeho koncentrace TOC se ode čte od koncentrace TOC 
ve vzorku s řasami.  
Nomogram by m ěl být lineární v požadovaném rozsahu koncentrací uhlíku. 
Příklady jsou uvedeny níže.  
Poznámka: Tyto p říklady nelze pro ú čely přepočtu použít; je d ůležité, aby si 
laboratoře připravily vlastní nomogramy.
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
DODATEK 3  
PŘÍKLAD FORMULÁ ŘE PŘEHLEDU ÚDAJ Ů PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLN ĚCHEMICKÝCH ÚDAJ Ů, KRMENÍ, REPRODUK ČNÍ 
SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSP ĚLCŮ 
Experiment č.: Datum zahájení: Klon: Médium: Typ krmiva: Zkoušená látka Nominální koncentrace: 
Den 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Obnovení média 
(zaškrtněte) 
pH (  1 ) nové 
staré 
O 2 mg/l (  1 ) nové 
staré 
Teplota (  o C) (  1 ) nové 
staré 
Podání krmiva 
(zaškrtněte) 
Počet živých 
potomků ( 2 ) Celkem 
Nádoba 1 
2 
3 
4 5
 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Experiment č.: Datum zahájení: Klon: Médium: Typ krmiva: Zkoušená látka Nominální koncentrace: 
Den 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Celkem 
Kumulativní mortalita 
dospělců (
 3 ) 
( 1 ) Uvede se, ve které nádob ě bylo měření provedeno. 
( 2 ) Do příslušné bu ňky se zaznamenají nevylíhnuté pl ůdky jako „AB“ ( aborted broods ). 
( 3 ) Do příslušné bu ňky se zaznamená mortalita dosp ělců jako „M“
 DODATEK 4  
PŘÍKLAD FORMULÁ ŘE PŘEHLEDU ÚDAJ Ů PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDK Ů CHEMICKÉ ANALÝZY  
a) Nam ěřené koncentrace  
Nominální 
koncentrace Vzorek z týdne 1 Vzorek z týdne 2 Vzorek z týdne 3 
Čerstvé médium Staré médium Čerstvé médium Staré médium Čerstvé médium Staré médium  
b) Nam ěřené koncentrace vyjád řené v procentech nominální koncentrace  
Nominální 
koncentrace Vzorek z týdne 1 Vzorek z týdne 2 Vzorek z týdne 3 
Čerstvé médium Staré médium Čerstvé médium Staré médium Čerstvé médium Staré médium  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
DODATEK 5  
VÝPOČET ČASOVĚ VÁŽENÉ ST ŘEDNÍ HODNOTY  
Časově vážená st řední hodnota  
Vzhledem k tomu, že mezi vým ěnami média m ůže koncentrace zkoušené látky 
klesat, je nezbytné zvážit, jaká koncentrace bude považována za reprezentativní 
pro rozsah koncentrací, jimž byly dosp ělé dafnie vystaveny. Výb ěr by měl být 
založen na biologických i statistických úvahách. Vychází-li se nap říklad z toho, 
že reprodukce je ovliv ňována hlavn ě maximální koncentrací, jíž byl organismus 
vystaven, m ěla by být použita maximální koncentrace Považuje-li se však za 
významnější akumulované nebo dlouhodobé p ůsobení toxické látky, má v ětší 
opodstatn ění průměrná koncentrace. v takovém p řípadě je vhodným pr ůměrem 
časově vážená st řední koncentrace, nebo ť zohledňuje časové zm ěny okamžité 
koncentrace.  
Obrázek 1:  
Příklad časově vážené st řední hodnoty
  
Na obrázku 1 je znázorn ěn příklad (zjednodušené) zkoušky trvající sedm dní 
s obnovou média v den 0, 2 a 4.  
Tenká klikatá čára znázor ňuje koncentraci v kterémkoli okamžiku. Má se za to, 
že pokles koncentrace sleduje proces exponenciálního rozkladu bun ěk. 
Šest vyzna čených bod ů představuje koncentrace nam ěřené na za čátku a na konci 
období mezi obnoveními média.  
Silná plná čára vyzna čuje hodnotu časově vážené st řední hodnoty.  
Časově vážená st řední hodnota je vypo čtena tak, aby se plocha pod čarou pro 
časově váženou st řední hodnotu rovnala ploše pod čarou průběhu koncentrace. 
Výpočet pro výše uvedený p říklad je ilustrován v tabulce 1.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabulka 1  
Výpočet časově vážené st řední hodnoty  
Obnovení média č. Dny Konc0 Konc1 Ln(Konc0) Ln(Konc1) Plocha  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Celkový po čet dnů: 7 Celková 
plocha 50,091 
ČV střední 
hodnota 7,156
 
Dny se rozumí po čet dnů mezi obnoveními média.  
Konc0  je naměřená koncentrace na za čátku období mezi obnoveními média.  
Konc1  je naměřená koncentrace na konci období mezi obnoveními média.  
Ln(Konc0)  je přirozený logaritmus Konc0.  
Ln(Konc1)  je přirozený logaritmus Konc1.  
Plocha  je plocha pod exponenciální k řivkou pro každé období mezi obnoveními média. 
Vypočte se z rovnice:  
Area ¼ Konc  0 Ä Konc  1 
LnðKonc  0 Þ Ä LnðKonc  1 Þ Ü Days  
Časově vážená st řední hodnota ( ČV střední hodnota ) se vypo čte jako podíl  
celkové plochy  a celkového po čtu dnů. 
Pro zkoušku toxicity pro reprodukci na dafniích se tabulka pochopiteln ě rozšíří 
tak, aby pokrývala 21 dn ů. 
Je zřejmé, že provádí-li se m ěření pouze na za čátku a na konci období mezi 
obnoveními média, není možné potvrdit, že je proces rozkladu skute čně expo­
nenciální. Jiná k řivka by vedla k jinému zp ůsobu výpo čtu „plochy“. Exponen ­
ciální rozklad však není nep řijatelný a jemu odpovídající k řivka je pravd ěpo­
dobně nejideáln ější, chybí-li jiné informace.  
Je však nezbytné postupovat opatrn ě, není-li v médiu na konci období mezi jeho 
obnoveními zjišt ěno žádné množství zkoušené látky. Není-li možné odhadnout, 
jak rychle látka z roztoku zmizela, není možné získat realistickou plochu pod křivkou, a není tedy možné získat rozumnou časově váženou st řední hodnotu.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  PŮDNÍ MIKROORGANISMY: ZKOUŠKA NA TRANSFOR ­
MACI DUSÍKU  
1. METODA  
Tato zkušební metoda je replikou metody OECD TG 216 (2000).  
1.1. ÚVOD  
Tato zkušební metoda popisuje laboratorní postup pro vyšet řování 
dlouhodobých ú činků chemických látek po jednorázové expozici na 
aktivitu p ůdních mikroorganism ů při transformaci dusíku. Tato 
zkouška je v zásad ě založena na doporu čení Evropské 
a středozemní organizace ochrany rostlin (European and Mediterra ­
nean Plant Protection Organization, EPPO) (1). Bylo však p řihléd­
nuto i k jiným doporu čením, nap ř. doporučením německého ústavu 
Biologische Bundesanstalt (2), agentury US Environmental Protec ­
tion Agency (3), spole čnosti SETAC (4) a Mezinárodní organizace 
pro normalizaci (5). O po čtu a druzích p ůd, které mají být použity ve 
zkoušce, byla u činěna dohoha na seminá ři OECD o výb ěru půd 
a sediment ů v Belgirate v Itálii v roce 1995 (6). Doporu čení pro 
odběr, zpracování a skladování p ůdních vzork ů vychází ze sm ěrnice 
ISO (7) a z doporu čení seminá ře v Belgirate. P ři posuzování 
a hodnocení toxických vlastností zkoušených látek bude z řejmě 
nezbytné stanovit ú činky na aktivitu p ůdních mikroorganism ů, 
např. jsou-li požadovány údaje o vedlejších ú čincích přípravků na 
ochranu rostlin na p ůdní mikroflóru nebo o čekává-li se expozice 
půdních mikroorganism ů chemickým látkám jiným než p řípravkům 
na ochranu rostlin. Cílem zkoušky na transformaci dusíku je zjistit 
účinky takových chemických látek na p ůdní mikroflóru. Pokud se 
zkoušejí agrochemikálie (nap ř. přípravky na ochranu rostlin, hnojiva, 
chemické p řípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouška na trans ­
formaci dusíku, tak zkouška na transformaci uhlíku. Pokud se zkou ­ 
šejí jiné chemické látky než agrochemikálie, posta čuje zkouška na 
transformaci dusíku. Nacházejí-li se však u t ěchto chemických látek 
hodnoty EC  50 pro transformaci dusíku v rozp ětí hodnot pro 
komerčně dostupné inhibitory nitrifikace (nap ř. nitrapyrin), lze pro 
získání dalších informací provést zkoušku na transformaci uhlíku.  
Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve 
formě složitých a heterogenních sm ěsí. Mikroorganismy hrají d ůle­ 
žitou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných 
půdách, přičemž různé druhy p řispívají k r ůzným aspekt ům úrod­
nosti půdy. Jakékoli dlouhodobé narušení t ěchto biochemických 
procesů může porušit kolob ěh živin a tak mít vliv na úrodnost 
půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u všech úrodných 
půd. Ačkoliv se populace mikroorganism ů odpovědných za tyto 
procesy u jednotlivých p ůd liší, jedná se v podstat ě o totéž schéma 
transformace.  
Popsaná zkušební metoda slouží ke zjišt ění dlouhodobých nep řízni­
vých účinků látky na proces transformace dusíku v aerobních 
povrchových p ůdách. Tato metoda rovn ěž umožňuje odhadnout 
účinky látek na transformaci uhlíku p ůdní mikroflórou. K tvorb ě 
dusičnanů dochází po rozpadu vazeb uhlík-dusík. Pokud je tedy 
u zkušebních a kontrolních p ůd zjištěna stejná rychlost tvorby dusi č­
nanů, je vysoce pravd ěpodobné, že hlavní schéma odbourávání 
uhlíku je neporušené a funk ční. Substrát zvolený pro zkoušku (práš ­
ková vojt ěšková mou čka) má p říznivý pom ěr uhlíku a dusíku 
(obvykle od 12/1 do 16/1). Je tedy snížen nedostatek uhlíku 
v průběhu zkoušky, a dojde-li k poškození populace mikroorganism ů 
chemickou látkou, m ůže k jejich obnov ě dojít opět do 100 dn ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Zkouška, z níž vychází tato zkušební metoda, byla zprvu vyvinuta 
pro látky, u nichž lze p ředvídat množství, které pronikne do p ůdy. 
Příkladem jsou p řípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní apli ­
kační dávka známá. U agrochemikálií posta čuje provést zkoušku se 
dvěma úrovn ěmi dávky, které odpovídají p ředpokládané nebo odha ­
dované aplika ční dávce. U agrochemikálií lze zkoušet ú činné složky 
nebo přípravky v komer ční úpravě. Použití zkoušky však není 
omezeno pouze na agrochemikálie. Zm ěnou množství zkoušené 
látky aplikované na p ůdu a způsobu vyhodnocení údaj ů lze zkoušku 
využít také pro chemické látky, u nichž není známo, v jakém množ ­
ství proniknou do p ůdy. U jiných chemických látek než agrochemi ­
kálií se tedy stanovuje ú činek řady koncentrací na transformaci 
dusíku. Data z t ěchto zkoušek se použijí k sestrojení k řivky 
závislosti odezvy na dávce a k výpo čtu hodnot EC  x , kde x je procen ­
tuální účinek.  
1.2. DEFINICE  
Transformace dusíku:  konečný rozklad dusíkaté organické látky 
mikroorganismy cestou amonifikace a nitrifikace na p říslušný 
konečný anorganický produkt – dusi čnan. 
EC x (Účinná koncentrace) : koncentrace zkoušené látky v p ůdě, 
která vede k x-procentní inhibici transformace dusíku na dusi čnan. 
EC 50 (Medián ú činné koncentrace):  koncentrace zkoušené látky 
v půdě, která vede k 50 % inhibici transformace dusíku na dusi čnan. 
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Nejsou uvedenay.  
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Do proseté p ůdy se vpraví prášková rostlinná mou čka a na p ůdu se 
poté aplikuje zkoušená látka, nebo se p ůda ponechá nedot čená (jako 
kontrola). P ři zkoušení agrochemikálií se doporu čuje provést 
zkoušku s nejmén ě dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly 
v určitém vztahu k nejvyšší p ředpokládané koncentrací na poli. Po 0, 
7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní p ůdy 
vyluhují vhodným rozpoušt ědlem a stanoví se obsah dusi čnanů. 
Rychlost tvorby dusi čnanů v exponovaných vzorcích se porovnává 
s rychlostí v kontrolních vzorcích a vypo čte se procentuální odchylka 
hodnot experimentálních vzork ů od kontrolních vzork ů. Všechny 
zkoušky musí probíhat alespo ň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly 
mezi experimentální a kontrolní p ůdou 25 % nebo v ětší, v měření 
se pokračuje až do 100 dn ů. Při zkoušení jiných látek než agroche ­
mikálií se do vzork ů půdy přidá řada koncentrací zkoušené látky 
a množství vzniklých dusi čnanů v experimentálních a kontrolních 
vzorcích se m ěří po 28denní inkubaci. Výsledky zkoušek s více 
koncentracemi se analyzují za použití regresního modelu 
a vypočtou se hodnoty EC  x (tj. EC  50 , EC  25 a/nebo EC  10 ). Viz defi ­
nice.  
1.5. VALIDITA ZKOUŠKY  
Vyhodnocení výsledk ů zkoušek u agrochemikálií se provádí 
s relativn ě malými rozdíly (tj. pr ůměrná hodnota ± 25 %) mezi 
koncentracemi dusi čnanů v kontrolní a exponovaných vzorcích, 
takže velké kolísání u kontrolních vzork ů může vést k nesprávným 
výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto 
měly být menší než ± 15 %.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.6.1.  Zkušební za řízení  
Při zkoušce se použijí nádoby z chemicky inertního materiálu. M ěly 
by mít vhodný objem, ktery bude odpovídat postupu použitému pro 
inkubaci p ůdy, tzn. bu ď inkubace celého množství p ůdy, nebo inku ­
bace jednotlivých vzork ů půdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je t řeba, aby 
během zkoušky došlo k co nejmenším ztrátám vody a aby byla 
umožněna výměna plynů (např. tím, že se nádoby zakryjí perforo ­
vanou polyethylenovou fólií). P ři zkoušení t ěkavých látek se použijí 
hermeticky uzavíratelné nádoby. M ěly by být tak velké, aby 
přibližně jedna čtvrtina jejich objemu byla zapln ěna vzorkem p ůdy. 
Použije se standardní laboratorní vybavení, které zahrnuje:  
— třepačku: mechanickou t řepačku nebo rovnocenné vybavení,  
— odstředivku (3 000 g) nebo filtra ční zařízení (za použití filtra č­
ního papíru bez dusi čnanů), 
— měřicí zařízení pro stanovení dusi čnanů s vhodnou citlivostí 
a reprodukovatelností.  
1.6.2.  Výb ěr a počet půd 
Použije se jedna p ůda. Půda by měla mít tyto charakteristiky:  
— obsah písku: nejmén ě 50 % a nejvýše 75 %,  
— pH: 5,5–7,5,  
— obsah organického uhlíku: 0,5–1,5 %,  
— stanoví se mikrobiální biomasa (8, 9) a její uhlík by m ěl tvořit 
nejméně 1 % celkového organického uhlíku v p ůdě. 
Ve většině případů představuje p ůda s těmito charakteristikami 
nejhorší p řípad, nebo ť adsorpce zkoušené chemické látky je mini ­
mální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkoušení s dalšími p ůdami zbyte čné. 
Za určitých okolností však m ůže být použití další p ůdy nezbytné, 
např. při zamýšleném hlavním použití zkoušené látky na ur čité druhy 
půd, jako jsou kyselé lesní p ůdy nebo elektrostaticky nabité p ůdy.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Odb ěr a skladování vzork ů půd 
1.6.3.1.  Odb ěr 
K dispozici by m ěly být podrobné informace o historii místa, ze 
kterého je p ůda odebírána. Mezi t ěmito informacemi musí být p řesná 
poloha, vegetace, údaje o ošet řování přípravky na ochranu rostlin, 
použití organických a minerálních hnojiv, p řídavky biologického 
materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odb ěr půdy by mělo být 
zvoleno místo, které umož ňuje dlouhodobé používání. Vhodnými 
místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými obilovinami (krom ě 
kukuřice) nebo hust ě oseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná 
pro odběr vzorků by neměla být minimáln ě jeden rok p řed odběrem 
ošetřována přípravky na ochranu rostlin. Rovn ěž by nem ěla být 
alespoň šest měsíců použita organická hnojiva. Použití minerálních 
hnojiv je p řípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, 
a vzorky p ůdy by nem ěly být odebírány d říve než po t řech měsících 
po aplikaci. Nem ěly by být používány p ůdy s hnojivy, o nichž je 
známo, že mají biocidní ú činky (nap ř. kyanamid vápenatý).  
Vzorky by nem ěly být odebírány p ři dlouhých obdobích sucha nebo 
podmáčení (delších než 30 dn ů) nebo po nich. Vzorky orných p ůd se 
odebírají z hloubky 0 až 20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných p ůd, 
u nichž po delší dobu (alespo ň po jedno vegeta ční období) nebyla 
prováděna orba, m ůže maximální hloubka odb ěru nepatrn ě překra­ 
čovat 20 cm (nap ř. až 25 cm).  
Vzorky p ůd by měly být přepravovány v takových nádobách a za 
takové teploty, aby bylo zaru čeno, že se p ůvodní vlastnosti p ůdy 
významně nezmění. 
1.6.3.2.  Skladování  
Upřednostňuje se použití čerstvě odebrané p ůdy. Pokud je sklado ­
vání půdy v laborato ři nevyhnutelné, je možné ji skladovat v temnu 
při 4 ± 2  o C maximáln ě po dobu t ří měsíců. Během skladování p ůd 
musí být zajišt ěny aerobní podmínky. Pokud jsou p ůdy odebírány 
z oblastí, v nichž jsou po dobu alespo ň tří měsíců v roce zmrzlé, lze 
zvážit šestim ěsíční skladování p ři –18  o C až –22  o C. Před každým 
experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných p ůd 
a uhlík pocházející z biomasy by m ěl tvořit nejmén ě 1 % celkového 
organického uhlíku v p ůdě (viz oddíl 1.6.2).  
1.6.4.  Zacházení s p ůdou a její p říprava pro zkoušku  
1.6.4.1.  Předběžná inkubace  
Pokud byla p ůda skladována (viz oddíl 1.6.3.2), doporu čuje se 
provést p ředběžnou inkubaci v délce 2 až 28 dn ů. Teplota 
a vlhkost p ůdy během předběžné inkubace by m ěly být podobné 
podmínkám p ři zkoušce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Fyzikáln ě-chemické charakteristiky  
Z půdy se ručně odstraní velké kusy (nap ř. kameny, části rostlin atd.) 
a poté se za vlhka, aniž je p ůda nadměrně vysoušena, prosejí částice 
o velikosti 2 mm a menší. Vlhkost vzorku p ůdy se upraví destilo ­
vanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až 60 % maxi ­
mální vodní kapacity.  
1.6.4.3.  Obohacení organickým substrátem  
Půda by měla být obohacena vhodným organickým substrátem, nap ř. 
zelenou travní mou čkou s vojt ěškou (hlavní složka:  Medicago sativa) 
s poměrem C/N od 12/1 do 16/1. Doporu čená dávka vojt ěškové 
moučky je 5 g vojt ěšky na kilogram p ůdy (vztaženo na sušinu).  
1.6.5.  Příprava zkoušené látky pro aplikaci na p ůdu 
Zkoušená látka se obvykle aplikuje pomocí nosi če. Nosičem může 
být voda (u látek rozpustných ve vod ě) nebo inertní tuhá látka, nap ř. 
jemný křemičitý písek (velikost zrna: 0,1–0,5 mm). Jiné kapalné 
nosiče než voda (nap ř. organická rozpoušt ědla jako aceton, chloro ­
form) by nem ěly být používány, nebo ť mohou zni čit mikroflóru. 
Použije-li se jako nosi č písek, m ůže být obalen zkoušenou látkou 
rozpuštěnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpoušt ědle. V takovém 
případě se rozpoušt ědlo před smísením s p ůdou odstraní odpa řením. 
Pro optimální rozptýlení zkoušené látky v p ůdě se doporu čuje použít 
10 g písku na kilogram p ůdy (vztaženo na sušinu). Do kontrolních 
vzorků se aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku.  
Při zkoušení t ěkavých chemických látek je t řeba pokud možno 
zabránit ztrátám p ři aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení 
látky v p ůdě (látka se nap ř. nastříkne do p ůdy na více místech).  
1.6.6.  Zkušební koncentrace  
Při zkoušení agrochemikálií se použijí alespo ň dvě koncentrace. 
Nižší koncentrace by m ěla odpovídat p řinejmenším maximálnímu 
očekávanému množství látky, které se v reálných podmínkách 
dostane do p ůdy, zatímco vyšší koncentrace by m ěla být násobkem 
nižší koncentrace. Výpo čet koncentrace zkoušené látky p řidávané do 
půdy se provede za p ředpokladu rovnom ěrného zapravení do 
hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu p ůdy 1,5. U agrochemikálií, 
které se aplikují p římo do p ůdy, nebo u chemikálií, u nichž lze 
množství, které se dostane do p ůdy, předpovědět, jsou doporu čenými 
zkušebními koncentracemi maximální p ředpokládané koncentrace 
v životním prost ředí (Predicted Environmental Concentration, PEC) 
a jejich p ětinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do p ůdy 
několikrát za sezónu, se zkušební koncentrace odvodí ze sou činu 
PEC a očekávaného maximálního po čtu aplikací. Horní koncentrace 
by však nem ěla překročit desetinásobek maximální jednorázov ě apli­
kované dávky. U jiných látek než agrochemikálií se použije geomet ­
rická řada nejmén ě pěti koncentrací. v rozp ětí těchto zkušebních 
koncentrací by se m ěly nacházet stanovované hodnoty EC  x values.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. PROVEDENÍ ZKOUŠKY  
1.7.1.  Podmínky expozice  
1.7.1.1.  Expozice a kontrola  
Při zkoušení agrochemikálií se p ůda rozdělí na tři díly o stejné 
hmotnosti. Dva díly se smísí s nosi čem obsahujícím látku a t řetí 
díl se smísí pouze s nosi čem (kontrola). Doporu čuje se, aby byla 
zkouška provedena s minimáln ě třemi duplikátními vzorky expono ­
vaných i neexponovaných p ůd. Při zkoušení jiných látek než agro ­
chemikálií se p ůda rozdělí na šest díl ů o stejné hmotnosti. P ět vzorků 
se smísí s nosi čem obsahujícím zkoušenou látku a šestý vzorek se 
smísí pouze s nosi čem bez chemické látky. Doporu čuje se použít t ři 
duplikátní vzorky exponované i neexponované p ůdy. Je t řeba 
věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkoušené látky 
v exponovaných vzorcích p ůdy. Při mísení by nem ělo docházet 
k hutnění nebo shlukování p ůdy. 
1.7.1.2.  Inkubace vzork ů půd 
Inkubaci vzork ů půd lze provést dv ěma způsoby: se souhrnným 
vzorkem exponované p ůdy a souhrnným vzorkem neexponované 
půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejn ě velkých díl čích vzork ů 
jak exponované, tak neexponované p ůdy. U těkavých látek se však 
zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých díl čích vzork ů. Pokud 
se inkubují souhrnné vzorky, p řipraví se velká množství exponované 
a neexponované p ůdy a během zkoušky se podle pot řeby odebírají 
dílčí vzorky k analýze. Výchozí množství p řipravené pro expono ­
vané vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti díl čích vzork ů, 
počtu duplikátních vzork ů použitých pro analýzu a na p ředpoklá­
daném po čtu interval ů, v nichž se odeberou vzorky. P ůdy inkubo ­
vané jako souhrnný vzorek se p řed odběrem dílčích vzork ů důkladně 
promísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzork ů půd, rozdělí se 
souhrnný vzorek exponované p ůdy a souhrnný vzorek neexponované 
půdy na požadovaný po čet dílčích vzork ů a ty se použijí podle 
potřeby. U experiment ů, kdy lze p ředpokládat více než dva intervaly 
odběru, by m ěl být připraven dostate čný počet dílčích vzork ů 
s ohledem na všechny duplikátní vzorky a všechny intervaly odb ěru. 
Alespoň tři duplikátní vzorky zkušební p ůdy měly být inkubovány za 
aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U všech zkoušek by m ěly 
být použity vhodné nádoby s dostate čným prostorem pod víkem, aby 
nenastaly anaerobní podmínky. U t ěkavých látek se však zkouška 
provádí pouze se sériemi jednotlivých díl čích vzork ů. 
1.7.1.3.  Podmínky zkoušky a její trvání  
Test probíhá v temnu p ři pokojové teplot ě 20 ± 2  o C. Vlhkost 
vzorku p ůdy se udržuje po dobu zkoušky v rozmezí 40 % až 
60 % (± 5 %) maximální vodní kapacity p ůdy (viz oddíl 1.6.4.2). 
Podle pot řeby se přidává destilovaná nebo deionizovaná voda.  
Zkoušky trvají nejmén ě 28 dnů. Při zkouškách agrochemikálií se 
porovnávají rychlosti tvorby dusi čnanů v exponovaných 
a kontrolních vzorcích. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liší o více 
než 25 %, pokra čuje se ve zkoušce do doby, než rozdíl klesne na 
25 % a mén ě, nebo do 100 dn ů, podle toho, co nastane d říve. 
U jiných látek než agrochemikálií se zkouška ukon čí po 28 dnech. 
28. den se stanoví množství dusi čnanů v exponovaných 
a kontrolních vzorcích a vypo čítají se hodnoty EC  x . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Odb ěry vzork ů a analýzy p ůd 
1.7.2.1.  Intervaly odb ěru vzorků 
Při zkoušení agrochemikálií se obsah dusi čnanů ve vzorcích analy ­
zuje v 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouška prodlužuje, provede se 
další měření ve 14denních intervalech po 28. dni.  
Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se použije alespo ň pět 
zkušebních koncentrací a obsah dusi čnanů se ve vzorcích p ůd analy­
zuje na za čátku expozi ční doby (den 0) a na jeho konci (po 28 
dnech). Je-li to považováno za nutné, lze provést další pr ůběžné 
měření, např. v 7. den. Data získaná 28. den se použijí pro stanovení 
hodnoty EC  x chemické látky. Podle pot řeby lze data ze dne 0 
u kontrolních vzork ů použít ve zpráv ě jako výchozí koncentraci 
dusičnanů v půdě. 
1.7.2.2.  Analýza vzork ů půd 
Pro každý čas odběru vzorků se v exponovaných i kontrolních vzor ­
cích stanoví obsah dusi čnanů. Dusičnany se extrahují ze vzork ů 
třepáním s vhodným extrak čním roztokem, nap ř. s 0,1 M roztokem 
chloridu draselného. Doporu čuje se použít 5 ml roztoku KCl na 
gram sušiny p ůdy. Při optimální extrakci by m ěly být nádoby 
s půdou a extrak čním roztokem napln ěny nejvýše z jedné poloviny. 
Směsi se extrahují t řepáním p ři 150 ot./min. po dobu 60 minut. 
Směsi se odst ředí nebo zfiltrují a kapalná fáze se analyzuje na dusi č­
nany. Kapalný extrakt zbavený pevných částic lze p řed analýzou 
skladovat p ři 20 ± 5  o C) po dobu šesti m ěsíců. 
2. ÚDAJE  
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Při zkoušení agrochemikálií se zaznamená množství vytvo řených 
dusičnanů v každém duplikátním vzorku a pr ůměrné hodnoty se 
zaznamenají do tabulky. Rychlost p řeměny dusíku se vyhodnotí 
vhodnými všeobecn ě uznávanými statistickými metodami (nap ř. F- 
testem při 5 % hladin ě významnosti). Množství vzniklých dusi čnanů 
se vyjádří v mg dusi čnanů na kg sušiny p ůdy za den. Rychlost 
tvorby dusi čnanů se pro každou expozici porovná s rychlostí 
získanou pro kontrolní vzorky a vypo čte se odchylka od kontrolních 
vzorků v procentech.  
Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se stanoví množství 
dusičnanů v každém duplikátním vzorku a pro ú čely odhadu hodnot 
EC x se sestrojí k řivka závislosti odezvy na dávce. Množství dusi č­
nanů (tj. množství dusi čnanů v mg na kg sušiny p ůdy) zjištěná 
v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami 
zjištěnými u kontrolních vzork ů. Z těchto údaj ů se pro každou 
zkušební koncentraci vypo čte velikost inhibice v procentech. Tyto 
hodnoty v procentech se zanesou do grafu proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypo čítají hodnoty EC
 x . Standardními meto ­
dami (10, 11, 12) se rovn ěž vypočítají intervaly spolehlivosti (p = 
0,95) pro vypo čtené hodnoty EC  x . 
Zkoušené látky s vysokým obsahem dusi čnanů mohou p řispívat 
k množství dusi čnanu vytvo řeného při zkoušce. Pokud se zkouší 
vysoké koncentrace t ěchto látek (nap ř. chemikálie, u nichž se 
očekává opakované použití), musí být sou částí zkoušky vhodné 
kontrolní vzorky (tj. p ůda a zkoušená látka bez rostlinné mou čky). 
Data z těchto kontrol musí být zohledn ěna při výpočtech EC  x . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Pokud je p ři hodnocení výsledk ů zkoušek s agrochemikáliemi p ři 
jakémkoli odb ěru po 28 dnech rozdíl rychlosti tvorby dusi čnanů 
při nižší expozici (tj. p ři maximální o čekávané koncentraci) 
a rychlosti tvorby v kontrolách roven 25 % nebo nižší, lze konsta ­
tovat, že zkoušená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci dusíku v p ůdách. Pro hodnocení výsledk ů zkoušek jiných látek než 
agrochemikálií se použijí hodnoty EC
 50 , EC  25 a/nebo EC  10 . 
3. ZPRÁVY  
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:  
Úplnou identifikaci použité p ůdy zahrnující tyto údaje:  
— zeměpisná poloha místa (zem ěpisná šířka a délka),  
— informace a historii místa (tj. vegeta ční kryt, ošet ření přípravky 
na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.),  
— způsob využití (nap ř. zemědělská půda, les atd.),  
— hloubka odb ěru vzorků (cm),  
— obsah písku/prachu/jílu (v % sušiny),  
— pH (ve vod ě), 
— obsah organického uhlíku (v % sušiny),  
— obsah dusíku (v % sušiny),  
— výchozí koncentrace dusi čnanů (mg dusi čnanů na kg sušiny),  
— kapacita vým ěny kation ů (mmol/kg),  
— mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku,  
— odkaz na metody použité pro stanovení jednotlivých parametr ů, 
— všechny informace týkající se odb ěru a skladování vzork ů půd, 
— podrobné údaje o p řípadné předběžné inkubaci p ůdy. 
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha a pop řípadě fyzikálně-chemické vlastnosti,  
— případně údaje o chemické identifikaci, v četně strukturního 
vzorce, čistoty (tj. procentuální obsah ú činné složky 
u přípravků na ochranu rostlin), obsahu dusíku.  
Substrát:  
— zdroj substrátu,  
— složení (tj. vojt ěšková mou čka, zelená travní mou čka 
s vojtěškou),  
— obsah uhlíku, dusíku (v % sušiny),  
— velikost síta (mm).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Zkušební podmínky:  
— podrobné údaje o obohacení p ůdy organickým substrátem,  
— počet použitých koncentrací zkoušené látky, pop řípadě zdůvod­
nění volby koncentrací,  
— podrobné údaje o aplikaci zkoušené látky do p ůdy, 
— inkuba ční teplota,  
— vlhkost p ůdy na začátku zkoušky a v jejím pr ůběhu, 
— použitá metoda inkubace p ůdy (tj. inkubace souhrnného vzorku, 
nebo inkubace jednotlivých díl čích vzork ů půdy), 
— počet duplikátních vzork ů, 
— doby odb ěrů vzorků, 
— metoda použitá pro extrakci dusi čnanů z půdy. 
Výsledky:  
— postup analýzy a za řízení použité pro stanovení dusi čnanů, 
— jednotlivé nam ěřené hodnoty obsahu dusi čnanů a jejich pr ůměrné 
hodnoty ve form ě tabulky,  
— rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních 
vzorků půd, 
— podle pot řeby vysv ětlení oprav provedených p ři výpočtech,  
— procentuální odchylka v rychlosti tvorby dusi čnanů pro každou 
dobu odb ěru vzorků, popřípadě hodnota EC  50 s 95 % intervalem 
spolehlivosti, jiné hodnoty EC  x (tj. EC  25 nebo EC  10 ) s intervaly 
spolehlivost a graf k řivky závislosti odpov ědi na dávce,  
— statistické zpracování výsledk ů. 
— všechny informace a pozorování užite čné pro interpretaci 
výsledků. 
4. LITERATURA  
1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil 
Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994.  
2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990).
 
3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  
4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
 
5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical 
Committee ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality – Biological 
Methods .
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.  
7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.  
9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113.
 
11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  PŮDNÍ MIKROORGANISMY: ZKOUŠKA NA TRANSFOR ­
MACI UHLÍKU  
1. METODA  
Tato metoda je replikou metody OECD TG 217 (2000).  
1.1. ÚVOD  
Tato zkušební metoda popisuje laboratorní postup pro vyšet řování 
možných dlouhodobých ú činků jednorázové expozice p řípravkům na 
ochranu rostlin a pop řípadě jiným chemický látkam na aktivitu 
půdních mikroorganism ů při transformaci uhlíku. Tato zkouška je 
v zásadě založena na doporu čení Evropské a st ředozemní organizace 
ochrany rostlin (European and Mediterranean Plant Protection Orga ­
nization, EPPO) (1). Bylo však p řihlédnuto k jiným doporu čením, 
např. doporučením německého ústavu Biologische Bundesanstalt (2), 
agentury US Environmental Protection Agency (3) a spole čnosti 
SETAC (4). O po čtu a druzích p ůd, které mají být použity ve 
zkoušce, byla u činěna dohoha na seminá ři OECD o výb ěru půd 
a sediment ů v Belgirate v Itálii v roce 1995 (5). Doporu čení pro 
odběr, zpracování a skladování p ůdních vzork ů je založeno na sm ěr­
nici ISO (6) a na doporu čeních ze seminá ře v Belgirate.  
Při posuzování a hodnocení toxických vlastností zkoušených látek 
bude zřejmě nezbytné stanovit ú činky na aktivitu p ůdních mikroor ­
ganismů, např. jsou-li požadovány údaje o vedlejších ú čincích 
přípravků na ochranu rostlin na p ůdní mikroflóru nebo o čekává-li 
se expozice p ůdních mikroorganism ů chemickým látkám jiným než 
přípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkoušky na transformaci 
uhlíku je zjistit ú činky takových chemických látek na p ůdní mikro ­
flóru. Pokud se zkoušejí agrochemikálie (nap ř. přípravky na ochranu 
rostlin, hnojiva, chemické p řípravky pro lesnictví), provádí se jak 
zkouška na transformaci uhlíku, tak zkouška na transformaci dusíku. 
Pokud se zkoušejí jiné chemické látky než agrochemikálie, posta čuje 
zkouška na transformaci dusíku. Nacházejí-li se však u t ěchto 
chemických látek hodnoty EC  50 pro transformaci dusíku v rozp ětí 
hodnot pro komer čně dostupné inhibitory nitrifikace (nap ř. nitrapy­
rin), lze pro získání dalších informací provést zkoušku na transfor ­
maci uhlíku.  
Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve 
formě složitých a heterogenních sm ěsí. Mikroorganismy hrají d ůle­ 
žitou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných půdách, přičemž různé druhy p řispívají k r ůzným aspekt ům úrod­
nosti půdy. Jakékoli dlouhodobé narušení t ěchto biochemických 
procesů může porušit kolob ěh živin a tak mít vliv na úrodnost 
půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u všech úrodných 
půd. Ačkoliv se populace mikroorganism ů odpovědných za tyto 
procesy u jednotlivých p ůd liší, jedná se v podstat ě o totéž schéma 
transformace.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Popsaná zkušební metoda slouží ke zjišt ění dlouhodobých nep řízni­
vých účinků látky na proces transformace uhlíku v aerobních 
povrchových p ůdách. Zkouška je citlivá na zm ěny ve velikosti 
a aktivitě mikrobiální populace, která je odpov ědná za transformaci 
uhlíku, nebo ť tyto populace budou vystaveny jak chemickému 
stresu, tak nedostatku uhlíku. Použijí se pís čité půdy s nízkým 
obsahem organického materiálu. Tyto p ůdy se exponují zkoušené 
látce a inkubují za podmínek, které umož ňují rychlý mikrobiální 
metabolismus. Za t ěchto podmínek se zdroje snadno dostupného 
uhlíku rychle vy čerpají. To zp ůsobí nedostatek uhlíku, který vede 
nejen k odum ření mikrobiálních bun ěk, ale také indukuje klidové 
stadium a/nebo tvorbu spor ů. Pokud se zkouška provádí déle než 
28 dnů, lze souhrn t ěchto reakcí m ěřit v kontrolních vzorcích (neex ­
ponovaná p ůda) jako postupnou ztrátu metabolicky aktivní mikrobi ­
ální biomasy (7). Pokud je biomasa v p ůdě s nedostatkem uhlíku za 
podmínek zkoušky ovlivn ěna přítomností chemické látky, pravd ěpo­
dobně se nevrátí do téhož stavu jako kontrolní vzorek. Porušení 
stavu způsobené zkoušenou látkou kdykoliv b ěhem zkoušky tedy 
často přetrvává až do konce zkoušky.  
Zkouška, z níž vychází tato zkušební metoda, byla zprvu vyvinuta 
pro látky, u nichž lze p ředvídat množství, které pronikne do p ůdy. 
Příkladem jsou p řípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní apli ­
kační dávka známá. U agrochemikálií posta čuje provést zkoušku se 
dvěma úrovn ěmi dávky, které odpovídají p ředpokládané nebo odha ­
dované aplika ční dávce. U agrochemikálií lze zkoušet ú činné složky 
nebo přípravky v komer ční úpravě. Zkouška však není omezena na 
chemické látky, jejichž koncentraci v životním prost ředí lze předpo­
vědět. Změnou množství zkoušené látky aplikované na p ůdu 
a způsobu vyhodnocení údaj ů lze zkoušku využít také pro chemické 
látky, u nichž není známo, v jakém množství proniknou do p ůdy. 
U jiných chemických látek než agrochemikálií se proto stanovuje 
účinek řady koncentrací na transformaci uhlíku. Údaje z t ěchto 
zkoušek se použijí k sestrojení k řivky závislosti odezvy na dávce 
a k výpo čtu hodnot EC  x , kde x je procentuální ú činek.  
1.2. DEFINICE  
Transformace uhlíku:  rozklad organického materiálu p ůsobením 
mikroorganism ů, jehož výsledkem je kone čný produkt – anorganický 
oxid uhličitý. 
EC x (Účinná koncentrace):  koncentrace zkoušené látky v p ůdě, 
která vede k x % inhibici transformace uhlíku na oxid uhli čitý. 
EC 50 (Medián ú činné koncentrace):  koncentrace zkoušené látky 
v půdě, která vede k 50 % inhibici transformace uhlíku na oxid 
uhličitý. 
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Žádné.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Prosetá p ůda se bu ď exponuje zkušební látce, nebo se ponechá 
neexponovaná (kontrola). P ři zkoušení agrochemikálií se doporu čuje 
provést zkoušku s nejmén ě dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby 
byly v ur čitém vztahu k nejvyšší p ředpokládané koncentrací na poli. 
Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy smísí s glukosou a po následujících 12 hodinách se m ěří 
respirační rychlost vyvolaná glukosou. Respira ční rychlost se vyjád ří 
jako uvoln ěný oxid uhli čitý (v mg oxidu uhli čitého na kg sušiny za 
hodinu) nebo jako spot řebovaný kyslík (v mg kyslíku na kg p ůdy za 
hodinu). Pr ůměrná respira ční rychlost u exponovaných vzork ů půd 
se porovná s rychlostí u kontrolních vzork ů a vypočte se procentu ­
ální odchylka exponovaných vzork ů od kontrolních vzork ů. Všechny 
zkoušky musí probíhat alespo ň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi 
experimentální a kontrolní p ůdou rovné 25 % nebo v ětší, v měření se 
pokračuje ve 14denních intervalech nejdéle do 100 dn ů. Při zkoušení 
jiných chemických látek než agrochemikálií se do vzork ů půdy přidá 
řada koncentrací zkoušené látky a respira ční rychlost vyvolaná 
glukosou (tj. pr ůmě
rné množství uvoln ěného oxidu uhli čitého nebo 
spotřebovaného kyslíku) se zm ěří po 28 dnech. Výsledky zkoušek 
s řadou koncentrací se analyzují za použití regresního modelu 
a vypočtou se hodnoty EC  x (tj. EC  50 , EC  25 a/nebo EC  10 ). Viz defi ­
nice.  
1.5. VALIDITA ZKOUŠKY  
Vyhodnocení výsledk ů zkoušek u agrochemikálií se provádí 
s relativn ě malými rozdíly (tj. pr ůměrná hodnota ± 25 %) mezi 
uvolněným oxidem uhli čitým nebo spot řebovaným kyslíkem 
u kontrolních a exponovaných vzork ů, takže velké kolísání 
u kontrolních vzork ů může vést k nesprávným výsledk ům. Rozdíly 
mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto m ěly být menší než 
± 15 %.  
1.6. POPIS METODY  
1.6.1.  Zkušební za řízení  
Při zkoušce se použijí nádoby z chemicky inertního materiálu. M ěly 
by mít vhodný objem, ktery bude odpovídat postupu použitému pro inkubaci p ůdy, tzn. bu ď inkubace celého množství p ůdy, nebo inku ­
bace jednotlivých vzork ů půdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je t řeba, aby 
během zkoušky došlo k co nejmenším ztrátám vody a aby byla 
umožněna výměna plynů (např. tím, že se nádoby zakryjí perforo ­
vanou polyethylenovou fólií). P ři zkoušení t ěkavých látek se použijí 
hermeticky uzavíratelné nádoby. M ěly by být tak velké, aby 
přibližně jedna čtvrtina jejich objemu byla zapln ěna vzorkem p ůdy.
 
Pro stanovení respirace vyvolané glukosou jsou nezbytné inkuba ční 
systémy a p řístroje pro m ěření uvolňovaného oxidu uhli čitého nebo 
spotřeby kyslíku. P říklady takových systém ů lze nalézt v literatu ře 
(8, 9, 10, 11).  
1.6.2.  Výb ěr a počet půd 
Použije se jedna p ůda. Půda by měla mít tyto charakteristiky:  
— obsah písku: nejmén ě 50 % a nejvýše 75 %,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5–7,5,  
— obsah organického uhlíku: 0,5–1,5 %,  
— stanoví se mikrobiální biomasa (12, 13) a její obsah uhlíku by 
měl tvořit nejmén ě 1 % celkového organického uhlíku v p ůdě. 
Ve většině případů představuje p ůda s těmito charakteristikami 
nejhorší p řípad, nebo ť adsorpce zkoušené chemické látky je mini ­
mální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. 
v důsledku toho je zpravidla zkoušení s dalšími p ůdami zbyte čné. 
Za určitých okolností však m ůže být použití další p ůdy nezbytné, 
např. při zamýšleném hlavním použití zkoušené látky na ur čité druhy 
půd, jako jsou kyselé lesní p ůdy nebo elektrostaticky nabité p ůdy. 
1.6.3.  Odb ěr a skladování vzork ů půd 
1.6.3.1.  Odb ěr 
K dispozici by m ěly být podrobné informace o historii místa, ze 
kterého je p ůda odebírána. Mezi t ěmito informacemi musí být p řesná 
poloha, vegetace, údaje o ošet řování přípravky na ochranu rostlin, 
použití organických a minerálních hnojiv, p řídavky biologického 
materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odb ěr půdy by mělo být 
zvoleno místo, které umož ňuje dlouhodobé používání. Vhodnými 
místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými obilovinami (krom ě 
kukuřice) nebo hust ě oseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná 
pro odběr vzorků by neměla být minimáln ě jeden rok p řed odběrem 
ošetřována přípravky na ochranu rostlin. Rovn ěž by nem ěla být 
alespoň šest měsíců použita organická hnojiva. Použití minerálních 
hnojiv je p řípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, 
a vzorky p ůdy by nem ěly být odebírány d říve než po t řech měsících 
po aplikaci. Nem ěly by být používány p ůdy s hnojivy, o nichž je 
známo, že mají biocidní ú činky (nap ř. kyanamid vápenatý).  
Vzorky by nem ěly být odebírány p ři dlouhých obdobích sucha nebo 
podmáčení (delších než 30 dn ů) nebo po nich. Vzorky orných p ůd se 
odebírají z hloubky 0 až 20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných p ůd, 
u nichž po delší dobu (alespo ň po jedno vegeta ční období) nebyla 
prováděna orba, m ůže maximální hloubka odb ěru nepatrn ě překra­ 
čovat 20 cm (nap ř. až 25 cm). Vzorky p ůd by měly být přepravo­
vány v takových nádobách a za takové teploty, aby bylo zaru čeno, 
že se původní vlastnosti p ůdy významn ě nezmění. 
1.6.3.2.  Skladování  
Upřednostňuje se použití čerstvě odebrané p ůdy. Pokud je sklado ­
vání půdy v laborato ři nevyhnutelné, je možné ji skladovat v temnu 
při 4 ± 2  o C maximáln ě po dobu t ří měsíců. Během skladování p ůd 
musí být zajišt ěny aerobní podmínky. Pokud jsou p ůdy odebírány 
z oblastí, v nichž jsou po dobu alespo ň tří měsíců v roce zmrzlé, lze 
zvážit šestim ěsíční skladování p ři –18  o C. Před každým experi ­
mentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných p ůd a uhlík 
pocházející z biomasy by m ěl tvořit nejmén ě 1 % celkového orga ­
nického uhlíku v p ůdě (viz oddíl 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Zacházení s p ůdou a její p říprava pro zkoušku  
1.6.4.1.  Předběžná inkubace  
Pokud byla p ůda skladována (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3), doporu ­ 
čuje se provést p ředběžnou inkubaci v délce 2 až 28 dn ů. Teplota 
a vlhkost p ůdy během předběžné inkubace by m ěly být podobné 
podmínkám p ři zkoušce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3).  
1.6.4.2.  Fyzikáln ě-chemické charakteristiky  
Z půdy se ručně odstraní velké kusy (nap ř. kameny, části rostlin atd.) 
a poté se za vlhka, aniž je p ůda nadměrně vysoušena, prosejí částice 
o velikosti 2 mm a menší. Vlhkost vzorku p ůdy se upraví destilo ­
vanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až 60 % maxi ­
mální vodní kapacity.  
1.6.5.  Příprava zkoušené látky pro aplikaci na p ůdu 
Zkoušená látka se obvykle aplikuje pomocí nosi če. Nosičem může 
být voda (u látek rozpustných ve vod ě) nebo inertní tuhá látka, nap ř. 
jemný křemičitý písek (velikost zrna: 0,1–0,5 mm). Jiné kapalné 
nosiče než voda (nap ř. organická rozpoušt ědla jako aceton, chloro ­
form) by nem ěly být používány, nebo ť mohou zni čit mikroflóru. 
Použije-li se jako nosi č písek, m ůže být obalen zkoušenou látkou 
rozpuštěnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpoušt ědle. V takovém 
případě se rozpoušt ědlo před smísením s p ůdou odstraní odpa řením. 
Pro optimální rozptýlení zkoušené látky v p ůdě se doporu čuje použít 
10 g písku na kilogram p ůdy (vztaženo na sušinu). Do kontrolních 
vzorků se aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku.  
Při zkoušení t ěkavých chemických látek je t řeba zabránit ztrátám p ři 
aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v p ůdě (látka se 
např. nastříkne do p ůdy na více místech).  
1.6.6.  Zkušební koncentrace  
Při zkoušení p řípravků na ochranu rostlin nebo jiných chemických 
látek, u nichž lze p ředpovědět koncentraci v životním prost ředí, se 
použijí alespo ň dvě koncentrace. Nižší koncentrace by m ěla odpo­
vídat přinejmenším maximálnímu o čekávanému množství látky, které 
se v reálných podmínkách dostane do p ůdy, zatímco vyšší koncent ­
race by m ěla být násobkem nižší koncentrace. Výpo čet koncentrace 
zkoušené látky p řidávané do p ůdy se provede za p ředpokladu rovno ­
měrného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu p ůdy 1,5. 
U agrochemikálií, které se aplikují p římo do p ůdy, nebo 
u chemikálií, u nichž lze množství, které se dostane do p ůdy, před­
povědět, jsou doporu čenými zkušebními koncentracemi maximální 
předpokládané koncentrace v životním prost ředí (Predictable Envi ­
ronmental Concentration, PEC) a jejich p ětinásobky. U látek, které 
se zpravidla aplikují do p ůdy několikrát za sezónu, se zkušební 
koncentrace odvodí ze sou činu PEC a o čekávaného maximálního 
počtu aplikací. Horní koncentrace by však nem ěla překročit deseti­
násobek maximální jednorázov ě aplikované dávky.  
U jiných látek než agrochemikálií se použije geometrická řada 
nejméně pěti koncentrací. v rozp ětí těchto zkušebních koncentrací 
by se měly nacházet stanovované hodnoty EC  x . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. PROVEDENÍ ZKOUŠKY  
1.7.1.  Podmínky expozice  
1.7.1.1.  Expozice a kontrola  
Při zkoušení agrochemikálií se p ůda rozdělí na tři díly o stejné 
hmotnosti. Dva díly se smísí s nosi čem obsahujícím látku a t řetí 
díl se smísí pouze s nosi čem (kontrola). Doporu čuje se, aby byla 
zkouška provedena s minimáln ě třemi duplikátními vzorky expono ­
vaných i neexponovaných p ůd. Při zkoušení jiných látek než agro ­
chemikálií se p ůda rozdělí na šest díl ů o stejné hmotnosti. P ět vzorků 
se smísí s nosi čem obsahujícím zkoušenou látku a šestý vzorek se 
smísí pouze s nosi čem bez chemické látky. Doporu čuje se použít t ři 
duplikátní vzorky exponované i neexponované p ůdy. Je t řeba 
věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkoušené látky 
v exponovaných vzorcích p ůdy. Při mísení by nem ělo docházet 
k hutnění nebo shlukování p ůdy. 
1.7.1.2.  Inkubace vzork ů půd 
Inkubaci vzork ů půd lze provést dv ěma způsoby: se souhrnným 
vzorkem exponované p ůdy a souhrnným vzorkem neexponované 
půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejn ě velkých díl čích vzork ů 
jak exponované, tak neexponované p ůdy. U těkavých látek se však 
zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých díl čích vzork ů. Pokud 
se inkubují souhrnné vzorky, p řipraví se velká množství exponované 
a neexponované p ůdy a během zkoušky se podle pot řeby odebírají 
dílčí vzorky k analýze. Výchozí množství p řipravené pro expono ­
vané vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti díl čích vzork ů, 
počtu duplikátních vzork ů použitých pro analýzu a na p ředpoklá­
daném po čtu interval ů, v nichž se odeberou vzorky. P ůdy inkubo ­
vané jako souhrnný vzorek se p řed odběrem dílčích vzork ů důkladně 
promísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzork ů půd, rozdělí se 
souhrnný vzorek exponované p ůdy a souhrnný vzorek neexponované 
půdy na požadovaný po čet dílčích vzork ů a ty se použijí podle 
potřeby. U experiment ů, kdy lze p ředpokládat více než dva intervaly 
odběru, by m ěl být připraven dostate čný počet dílčích vzork ů 
s ohledem na všechny duplikátní vzorky a všechny intervaly odb ěru. 
Alespoň tři duplikátní vzorky zkušební p ůdy měly být inkubovány za 
aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U všech zkoušek by m ěly 
být použity vhodné nádoby s dostate čným prostorem pod víkem, aby 
nenastaly anaerobní podmínky. U t ěkavých látek se však zkouška 
provádí pouze se sériemi jednotlivých díl čích vzork ů. 
1.7.1.3.  Podmínky zkoušky a její trvání  
Test probíhá v temnu p ři pokojové teplot ě 20 ± 2  o C. Vlhkost 
vzorku p ůdy se udržuje po dobu zkoušky v rozmezí 40 % až 
60 % (± 5 %) maximální vodní kapacity p ůdy (viz oddíl 1.6.4.2). 
Podle pot řeby se přidává destilovaná nebo deionizovaná voda.  
Zkoušky trvají nejmén ě 28 dnů. Při zkouškách agrochemikálií se 
porovná množství uvoln ěného oxidu uhli čitého nebo množství 
spotřebovaného kyslíku v exponovaných a kontrolních vzorcích. 
Pokud se 28. dne tyto rychlosti liší o více než 25 %, pokra čuje se 
ve zkoušce do doby, než rozdíl klesne na 25 % a mén ě, nebo do 100 
dnů, podle toho, co nastane d říve. U jiných látek než agrochemikálií 
se zkouška ukon čí po 28 dnech. 28. den se stanoví množství uvol ­
něného oxidu uhli čitého nebo množství spot řebovaného kyslíku 
u exponovaných a kontrolních vzork ů a vypočítají se hodnoty EC  x . ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Odb ěry vzork ů a analýzy p ůd 
1.7.2.1.  Intervaly odb ěru vzorků 
Při zkoušení agrochemikálií se rychlost respirace vyvolané glukosou 
ve vzorcích analyzuje 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouška prodlu ­ 
žuje, provede se další m ěření ve 14denních intervalech po 28. dni.  
Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se použije alespo ň pět 
zkušebních koncentrací a obsah respirace vyvolané glukosou se ve 
vzorcích p ůd analyzuje na za čátku expozi ční doby (den 0) a na jejím 
konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nutné, lze provést další průběžné měření, např. 7. den. Data získaná 28. den se použijí pro 
stanovení hodnoty EC
 x chemické látky. v p řípadě potřeby lze data ze 
dne 0 u kontrolních vzork ů použít k odhadu výchozího množství 
metabolicky aktivní mikrobiální biomasy v p ůdě. 
1.7.2.2.  Měření rychlostí respirace vyvolané glukosou  
Pro každý okamžik odb ěru vzorků se v exponovaných i kontrolních 
vzorcích stanoví rychlost respirace vyvolané glukosou. Vzorky p ůd 
se smísí s dostate čným množstvím glukosy, aby se ihned vyvolala 
maximální respira ční odezva. Množství glukosy pot řebné pro 
vyvolání maximální respira ční odezvy u dané p ůdy lze stanovit 
v orientační zkoušce se sérií koncentrací glukosy (14). U pís čitých 
půd s obsahem organického uhlíku od 0,5 do 1,5 % obvykle sta čí 
2 000 mg až 4 000 mg glukosy na kg sušiny. Glukosu lze rozm ělnit 
na prášek s čistým křemenným pískem (10 g písku na kg sušiny) 
a homogenn ě smísit s p ůdou. 
Vzorky p ůdy obohacené glukosou se inkubují ve vhodné aparatu ře, 
která umož ňuje měřit respirační rychlosti p ři 20 ± 2  o C kontinuáln ě, 
každou hodinu, nebo každé dv ě hodiny (viz oddíl 1.6.1). M ěření 
uvolněného oxidu uhli čitého nebo spot řebovaného kyslíku se provádí 
nepřetržitě po dobu 12 hodin a m ěření se zahájí co nejd říve, tj. do 1 
až 2 hodin po p řidání glukosy. Zm ěří se celkové množství uvoln ě­
ného oxidu uhli čitého nebo celkové množství spot řebovaného 
kyslíku za 12 hodin a stanoví se pr ůměrná respira ční rychlost.  
2. ÚDAJE  
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Při zkoušení agrochemikálií se zaznamená množství uvoln ěného 
oxidu uhli čitého nebo množství spot řebovaného kyslíku u každého 
duplikátního vzorku a pr ůměrné hodnoty se zaznamenají do tabulky. 
Výsledky se vyhodnotí vhodnými všeobecn ě uznávanými statistic ­
kými metodami (nap ř. F-testem p ři 5 % hladin ě významnosti). Rych ­
losti respirace vyvolané glukosou se vyjád ří v mg oxidu uhli čitého 
na kg sušiny za hodinu nebo v mg kyslíku na kg sušiny za hodinu. Průměrná rychlost uvol ňování oxidu uhli čitého nebo pr ůměrná rych­
lost spotřeby kyslíku u každé expozice se porovná s odpovídajícími 
hodnotami u kontrolních vzork ů a vypočte se procentuální odchylka 
exponovaných vzork ů od kontrolních vzork ů.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se stanoví množství 
uvolněného oxidu uhli čitého nebo množství spot řebovaného kyslíku 
v každém duplikátním vzorku a pro ú čely odhadu hodnot EC  x se 
sestrojí k řivka závislosti odezvy na dávce. Rychlosti respirace 
vyvolané glukosou (tj. mg oxidu uhli čitého na kg sušiny za hodinu 
nebo mg kyslíku na kg sušiny za hodinu) zjišt ěné v exponovaných 
vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjišt ěnými 
u kontrolních vzork ů. z těchto údaj ů se pro každou zkušební koncen ­
traci vypo čte velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty 
v procentech se zanesou do grafu proti koncentraci a poté se statis ­
tickými metodami vypo čítají hodnoty EC  x . Standardními metodami 
(15, 16, 17) se rovn ěž vypočítají intervaly spolehlivosti (p = 0,95) 
pro vypo čtené hodnoty EC  x . 
2.2. INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Pokud je p ři hodnocení výsledk ů zkoušek s agrochemikáliemi p ři 
kterémkoli odb ěru po 28 dnech rozdíl respira čních rychlostí p ři 
nižší expozici (tj. p ři maximální o čekávané koncentraci) a rychlosti 
u kontroly roven 25 % nebo nižší, lze konstatovat, že zkoušená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci uhlíku v p ůdách. Pro hodno ­
cení výsledk ů zkoušek jiných látek než agrochemikálií se použijí 
hodnoty EC
 50 , EC  25 a/nebo EC  10 . 
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:  
Úplnou identifikaci použité p ůdy zahrnující tyto údaje:  
— zeměpisná poloha místa (zem ěpisná šířka a délka),  
— informace a historii místa (tj. vegeta ční kryt, ošet ření přípravky 
na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.),  
— využití p ůdy (např. zemědělská půda, les atd.),  
— hloubka odb ěru vzorků (cm),  
— obsah písku/prachu/jílu (v % sušiny),  
— pH (ve vod ě), 
— obsah organického uhlíku (v % sušiny),  
— obsah dusíku (v % sušiny),  
— kapacita vým ěny kation ů (mmol/kg),  
— výchozí mikrobiální biomasa v procentech celkového organic ­
kého uhlíku,  
— odkaz na metody použité pro stanovení jednotlivých parametr ů, 
— všechny informace týkající se odb ěru a skladování vzork ů půd, 
— podrobné údaje o p řípadné předběžné inkubaci p ůdy. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha a pop řípadě fyzikálně-chemické vlastnosti,  
— případně údaje o chemické identifikaci, v četně strukturního 
vzorce, čistoty (tj. procentuální obsah ú činné složky 
u přípravků na ochranu rostlin), obsahu dusíku.  
Zkušební podmínky:  
— podrobné údaje o obohacení p ůdy organickým substrátem,  
— počet použitých koncentrací zkoušené látky, pop řípadě zdůvod­
nění volby koncentrací,  
— podrobné údaje o aplikaci zkoušené látky do p ůdy, 
— inkuba ční teplota,  
— vlhkost p ůdy na začátku zkoušky a v jejím pr ůběhu, 
— použitá metoda inkubace p ůdy (tj. inkubace souhrnného vzorku, 
nebo inkubace jednotlivých díl čích vzork ů půdy), 
— počet duplikátních vzork ů, 
— doby odb ěru vzorků. 
Výsledky:  
— metoda a za řízení použité pro m ěření respira čních rychlostí,  
— údaje v četně jednotlivých hodnot a pr ůměrných hodnot množství 
oxidu uhli čitého nebo kyslíku zpracované/ve form ě tabulky,  
— rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních 
vzorků půd, 
— v případě potřeby vysv ětlení oprav provedených p ři výpočtech,  
— procentuální odchylka v rychlostech respirace vyvolané glukosou 
pro každou dobu odb ěru vzorků, popřípadě hodnota EC  50 s 95 % 
intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty EC  x (tj. EC  25 nebo EC  10 ) 
s intervaly spolehlivost a graf k řivky závislosti odpov ědi na 
dávce,  
— v případě potřeby vysv ětlení oprav provedených p ři výpočtech,  
— všechny informace a pozorování užite čné pro interpretaci 
výsledků. 
4. LITERATURA  
1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994.
 
2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990).
 
3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. 
SETAC-Europe, Brussels.  
5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.  
6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory.  
7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra“. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45–60.  
8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties“. 
Agronomy Monograph N  o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41: 831–871.  
9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant 
and Soil, 116: 77–81.  
12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.  
13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzens ­
chutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. 
(Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on 
the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzens ­
chutzd., Braunschweig, 38: 113–120.
 
15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99–113.  
16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V P ŮDĚ 
1. METODA  
Tato zkušební metoda je replikou metody OECD TG 307 (2002).  
1.1. ÚVOD  
Tato zkušební metoda je založena na existujících sm ěrnicích (1, 2, 3, 
4, 5, 6, 7, 8, 9). Postup popsaný v této zkušební metod ě je vyvinut 
pro účely hodnocení aerobní a anaerobní transformace chemické 
látky v p ůdě. Účelem experiment ů je stanovit i) rychlost transfor ­
mace zkoušené látky a ii) povahu a rychlost tvorby a rozkladu trans ­
formačních produkt ů, kterým mohou být rostliny a p ůdní organismy 
vystaveny. Tyto studie jsou požadovány u chemických látek, které se aplikují p římo do p ůdy nebo pravd ěpodobně mohou proniknout do 
půdního ekosystému. Výsledky t ěchto laboratorních studií mohou 
být také použity pro vypracování postup ů odběru vzorků a analýzy 
u podobných polních studií.
 
Pro vyhodnocení zp ůsobu transformace obvykle posta čují aerobní 
a anaerobní studie s jedním druhem p ůdy (8, 10, 11). Rychlosti 
transformace se stanoví alespo ň pro tři další půdy (8, 10).  
O počtu a druzích p ůd, které mají být použity v této zkoušce, došo 
k dohodě na seminá ři OECD Workshop on soil/sediment Selection 
v Belgirate v Itálii v roce 1995. Druhy zkušebních p ůd by měly být 
reprezentativní pro environmentální podmínky, v nichž dojde k použití látky nebo k jejímu uvoln ění. Například chemické látky, k jejichž uvol ­
nění může dojít v subtropickém až tropickém klimatu, by m ěly být 
zkoušeny s ferrasoly nebo nitosoly (systém FAO). Na tomto seminá ři 
byla také vydána doporu čení týkající se odb ěru, zpracování a skladování 
vzorků půd založená na sm ěrnicích ISO (15). Tato metoda se rovn ěž 
týká půd rýžových polí.
 
1.2. DEFINICE  
Zkoušená látka:  jakákoli látka, a ť již výchozí látka, nebo p říslušné 
transforma ční produkty.  
Transforma ční produkty:  všechny látky vznikající p ři biotických 
a abiotických transforma čních reakcích zkoušené látky, v četně CO  2 
a látek, které jsou p řítomny ve vázaných reziduích.  
Vázaná rezidua:  sloučeniny v p ůdě, rostlině nebo v živo čichu, které 
po extrakci z ůstávají v matrici ve form ě výchozí látky nebo jejího 
metabolitu (jejích metabolit ů) nebo transforma čních produkt ů. 
Metoda extrakce nesmí podstatn ě měnit samotné slou čeniny nebo 
strukturu matrice. Povahu vazeb lze částečně vyjasnit extrakcí 
spojenou se zm ěnami v matrici a náro čnými analytickými techni ­
kami. Dosud byly tímto zp ůsobem vyjasn ěny např. kovalentní, 
iontové a adsorp ční vazby a rovn ěž záchyty. Tvorba vázaných 
reziduí obecn ě podstatn ě snižuje biologickou p řístupnost 
a dostupnost (12) (upraveno podle IUPAC 1984 (13)).  
Aerobní transformace:  reakce, ke kterým dochází za p řítomnosti 
kyslíku (14).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaerobní transformace:  reakce probíhající s vylou čením moleku ­
lárního kyslíku (14).  
Půda: směs minerálních a organických chemických složek oživená 
malými organismy (v ětšinou mikroorganismy), p řičemž organické 
složky obsahují slou čeniny s vysokým obsahem uhlíku a dusíku 
a vysokou molekulovou hmotností. Lze pracovat s dv ěma formami 
půdy: 
a) s neporušenou p ůdou, jak v pr ůběhu času vznikla, 
s charakteristickými vrstvami r ůzných druh ů půdy; 
b) s porušenou p ůdou, která se obvykle vyskytuje na obd ělávaných 
polích v p řípadě, že se vzorky odebírají vyrýváním a používají se 
v této zkušební metod ě (14).  
Mineralizace:  úplný rozklad organické slou čeniny na CO  2 , H 2 O za 
aerobních podmínek a na CH  4 , CO  2 a H  2 O za anaerobních 
podmínek. V souvislosti s touto metodou, p ři níž se používají slou ­ 
čeniny zna čené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad 
molekuly, p ři němž se radioisotopy uhlíku oxidují za tvorby odpo ­
vídajícího množství  14 CO 2 (14).  
Poločas: t 0,5, je čas, za který dojde k 50 % transformaci zkoušené 
látky, jestliže lze transformaci popsat kinetikou prvního řádu; nezá ­
visí na po čáteční koncentraci.  
DT 50 (doba odbourání 50):  doba, za kterou se po čáteční koncent ­
race zkoušené látky sníží o 50 %; liší se od polo času t  0,5 , pokud 
transformace neprobíhá podle kinetiky prvního řádu. 
DT 75 (doba odbourání 75):  doba, za kterou se po čáteční koncent ­
race zkoušené látky sníží o 75 %.  
DT 90 (doba odbourání 90):  doba, za kterou se po čáteční koncent ­
race zkoušené látky sníží o 90 %;.  
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Referenční látky se použijí pro charakterizaci a/nebo identifikaci 
transforma čních produkt ů spektroskopickými a chromatografickými 
metodami.  
1.4. POUŽITELNOST ZKOUŠKY  
Tato je metoda je použitelná pro všechny chemické látky (nezna čené 
nebo zna čené radioaktivními isotopy), pro n ěž je k dispozici analy ­
tická metoda s dostate čnou správností a citlivostí. Je použitelná pro 
mírně těkavé a net ěkavé slou čeniny rozpustné i nerozpustné ve vod ě. 
Zkouška by nem ěla být použita u látek, které z p ůdy silně těkají 
(např. fumiganty, organická rozpoušt ědla), a nelze je tedy v p ůdě 
udržet za experimentálních podmínek této zkoušky.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Pro stanovení rychlosti transformace lze použít jak látky nezna čené 
radioisotopy, tak zna čené látky. Zna čený materiál je nezbytný pro 
studium zp ůsobu transformace a pro stanovení látkové bilance. 
Doporučuje se zna čení isotopem  14 C, avšak užite čné mohou být 
i jiné isotopy, nap ř. 13 C, 15 N, 3 H, 32 P. Značena by m ěla být pokud 
možno nejstabiln ější část/části molekuly (  1 ). Čistota zkoušené látky 
by měla být alespo ň 95 %.  
Před provedením zkoušky na aerobní a anaerobní transformaci 
v půdě by měly být k dispozici alespo ň tyto informace o látce:  
a) rozpustnost ve vod ě (metoda A.6);  
b) rozpustnost v organických rozpoušt ědlech;  
c) tlak par (metoda A.4) a/nebo Henryho konstanta;  
d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8);  
e) chemická stabilita v temnu (hydrolýza) (metoda C.7);  
f) pK  a pokud u molekuly nastává protonace nebo deprotonace 
(směrnice OECD 112) (16).  
Mezi další užite čné informace pat ří údaje o toxicit ě zkoušené látky 
pro půdní mikroorganismy (zkušební metody C.21 a C.22) (16).  
K dispozici by m ěly být analytické metody (v četně extrakčních 
a izolačních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkou ­ 
šené látky a jejích transforma čních produkt ů. 
1.6. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
Vzorky p ůdy se exponují zkušební látce a inkubují se v temnu 
v biometrických ba ňkách nebo v pr ůtokových systémech za řízených 
laboratorních podmínek (p ři konstantní teplot ě a vlhkosti p ůdy). Ve 
vhodných intervalech se vzorky p ůd extrahují a analyzuje se obsah 
výchozí látky a transforma čních produkt ů. Vhodným absorp čním 
zařízením se k analýze shromáždí také t ěkavé produkty. Prost řednic­
tvím materiálu zna čeného isotopem  14 C lze po zachycení uvoln ěného  
14 CO 2 měřit různé rychlosti mineralizace zkoušené látky a dále lze 
stanovit látkovou bilanci v četně tvorby vázaných reziduí v p ůdě. 
1.7. KRITÉRIA JAKOSTI  
1.7.1.  Výt ěžnost  
Extrakce a analýza provedená alespo ň u dvou duplikátních vzork ů 
půdy ihned po p řidání zkoušené látky poskytne první informaci 
o opakovatelnosti analytické metody a o stejnom ěrnosti aplikace 
zkoušené látky. Výt ěžnosti pozd ějších stup ňů experimentu se zjistí 
z příslušných látkových bilancí, m ěly by se nacházet v rozmezí 90 % 
až 110 % u zna čených chemických látek (8) a v rozmezí 70 % až 
110 % u nezna čených chemických látek (3).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Pokud nap říklad zkoušená látka obsahuje jeden kruh, je t řeba, aby byl tento kruh ozna ­ 
čen. Pokud zkoušená látka obsahuje dva nebo více kruh ů, může být nezbytné provést 
samostatné studie s cílem podchytit zbytky každého z kruh ů, a získat tak vhodné infor ­
mace o tvorb ě transforma čních produkt ů.
 1.7.2.  Opakovatelnost a citlivost analytické metody  
Opakovatelnost analytické metody (krom ě účinnosti první extrakce) 
pro kvantifikaci zkoušené látky a transforma čních produkt ů lze ověřit 
provedením analýzy duplikátních vzork ů týchž extrakt ů půdy, která 
byla dostate čně dlouho inkubována, aby došlo k vytvo ření transfor ­
mačních produkt ů. 
Mez detekce (LOD) analytické metody pro zkoušenou látku a pro 
transforma ční produkty by m ěla být alespo ň 0,01 mg na kg p ůdy 
(pro zkoušenou látku) nebo 1 % aplikované dávky, podle toho, která 
z hodnot je nižší. Rovn ěž by měla být specifikována mez kvantifi ­
kace (LOQ).  
1.7.3.  Správnost dat o transformaci/transforma čních dat  
Regresní analýza závislosti koncentrace zkoušené látky na čase 
poskytuje vhodné informace o spolehlivosti transforma ční křivky 
a umožňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro polo časy (v případě 
zdánlivé kinetiky prvního řádu) nebo pro hodnoty DT  50 , popřípadě 
hodnot DT  75 a DT  90 . 
1.8. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.8.1.  Vybavení a chemická činidla  
Inkubačními systémy jsou statické uzav řené systémy nebo vhodné 
průtokové systémy (7, 17). P říklady vhodných pr ůtokových inku ­
bačních aparatur a biometrických ban ěk jsou uvedeny na obrázcích 
1 a 2. Oba typy inkuba čních systém ů mají své výhody a svá 
omezení (7, 17).  
Pro zkoušku je nezbytné standardní laboratorní vybavení, zejména:  
— analytické p řístroje jako za řízení pro GC, HPLC, TLC, v četně 
odpovídajících detek čních systém ů pro analýzu zna čených 
a neznačených látek pro inverzní isotopovou z řeďovací metodu,  
— přístroje pro ú čely identifikace (nap ř. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR atd.),  
— kapalinový scintila ční spektrometr,  
— okysli čovací zařízení pro spalování radioaktivního materiálu,  
— odstředivka,  
— extrak ční aparatura (nap ř. centrifuga ční zkumavky pro studenou 
extrakci a Soxhlet ův přístroj pro kontinuální extrakci s refluxem),  
— zařízení pro zkoncentrování roztok ů a extrakt ů (např. rotační 
odparka),  
— vodní láze ň, 
— mechanické míchací za řízení (nap ř. hnětací zařízení, rota ční 
mixér).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Použijí se nap ř. tato chemická činidla:  
— NaOH p.a, 2 mol/l, nebo jiná vhodná zásada (nap ř. KOH, etha ­
nolamin),  
— H  2 SO 4 , p.a., 0,05 mol · dm  3 , 
— ethylenglykol p.a.,  
— tuhý absorp ční materiál, nap ř. natronové vápno, a polyurethanové 
zátky,  
— organická rozpoušt ědla čistoty p.a., nap ř. aceton, methanol atd.,  
— kapalný scintilátor.  
1.8.2.  Aplikace zkoušené látky  
Za účelem aplikace zkoušené látky do p ůdy a jejího rozptýlení lze 
zkoušenou látku rozpustit ve vod ě (v deionizované nebo destilované 
vodě) nebo lze v p řípadě potřeby použít co nejmenší množství 
acetonu nebo jiných organických rozpoušt ědel (6), ve kterých je 
zkoušená látka dostate čně rozpustná a stabilní. Zvolené množství 
rozpouštědla však nesmí mít významný vliv na mikrobiální aktivitu 
půdy (viz oddíly 1.5 a 1.9.2 až 1.9.3). Rozpoušt ědla, která p ůsobí 
jako inhibitory mikrobiální aktivity, nap ř. chloroform, dichlorome ­
than a jiná halogenovaná rozpoušt ědla, nesm ějí být použita.  
Látku lze do p ůdy přidat také nap ř. ve směsi s křemenným pískem 
(6) nebo ve form ě malých díl čích vzork ů zkušební p ůdy, které byly 
předem vysušeny na vzduchu a sterilizovány. Pokud se látka p řidává 
pomocí rozpoušt ědla, mělo by být rozpoušt ědlo odpařeno ještě před 
tím, než jsou k p ůvodním nesterilním vzork ům půdy přidány oboha ­
cené dílčí vzorky.  
U běžně používaných chemických látek, jež se dostávají do p ůdy 
prostřednictvím zem ědělské aplikace čistírenských kal ů, se zkoušená 
látka nejprve p řidá do kalu, který se poté vpraví do vzorku p ůdy (viz 
oddíly 1.9.2 a 1.9.3).  
Nedoporu čuje se rutinn ě používat p řípravky v komer ční úpravě. 
Například u špatn ě rozpustných látek však m ůže být použití 
přípravku v komer ční úpravě vhodnou alternativou.  
1.8.3.  Půdy 
1.8.3.1.  Výběr půd 
Pro stanovení zp ůsobu transformace lze použít reprezentativní p ůdy; 
doporučují se písčitohlinitá, prachovitohlinitá, hlinitá nebo hlinitopís ­ 
čitá půda (podle klasifikace FAO a USDA (18)) o hodnot ě pH 5,5 až 
8,0 a obsahu organického uhlíku 0,5–2,5 %, p řičemž mikrobiální 
biomasa by m ěla tvořit nejmén ě 1 % celkového organického 
uhlíku (10).  
Pro studie transforma čních rychlostí se použijí alespo ň tři další půdy 
reprezentující rozsah relevantních p ůd. Půdy by se m ěly lišit, pokud 
jde o obsah organického uhlíku, pH, obsah jílu a mikrobiální 
biomasy (10).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Všechny p ůdy by m ěly být charakterizovány alespo ň: strukturou 
(% písku, % prachu, % jílu) (podle klasifikace FAO a USDA (18)), 
pH, kationtovou vým ěnnou kapacitou, organickým uhlíkem, sypnou 
hustotou, schopností zadržet vodu (  1 ) a mikrobiální biomasou (pouze 
pro aerobní studie). Pro interpretaci výsledk ů mohou být užite čné 
další informace o vlastnostech p ůdy. Pro stanovení vlastností p ůdy 
lze použít metody doporu čené v literatu ře (19, 20, 21, 22, 23). 
Mikrobiální biomasa se stanoví metodou respirace indukované substrátem (SIR) (25, 26) nebo alternativními metodami (20).
 
1.8.3.2.  Odb ěr, příprava a skladování p ůd 
K dispozici by m ěly být podrobné informace o historii místa, ze 
kterého je p ůda odebírána. T ěmito informacemi jsou p řesná poloha, 
vegetační kryt, údaje o ošet řování chemickými látkami, použití orga ­
nických a minerálních hnojiv, p řídavky biologického materiálu nebo 
jiná kontaminace. Pokud byla p ůda v předchozích čtyřech letech 
ošetřena zkoušenou látkou nebo látkami s analogickou strukturou, 
neměla by být použita pro transforma ční studie (10, 15).  
Půda by měla být čerstvě odebraná z terénu (z A horizontu nebo 
z horní dvaceticentimetrové vrstvy) a m ěla by být tak vlhká, aby 
bylo možné snadné prosévání. Krom ě půd z rýžových polí by p ůdy 
neměly být odebírány v pr ůběhu dlouhých období (více než 30 dn ů) 
sucha, mraz ů nebo zavodn ění nebo krátce po t ěchto obdobích (14). 
Vzorky se p řepravují zp ůsobem, který minimalizuje zm ěny obsahu 
vody v p ůdě, a uchovávají se v temnu za co nejv ětšího přístupu 
vzduchu. Pro tento ú čel je obecn ě vhodný voln ě uzavřený polyethy ­
lenový sá ček. 
Půda se zpracuje co nejd říve po odb ěru. Před proséváním na sítu 
o velikosti 2 mm se z p ůdy odstraní vegetace, v ětší živočichové 
a kameny, p ři proséváním se p ůda zbaví malých kamen ů, drobných 
živočichů a zbytk ů rostlin. P řed proséváním by nem ělo dojít 
k nadměrnému vysušení a rozdrcení p ůdy (15).  
Pokud je v zim ě obtížné odebrat vzorky v terénu (zmrzlá p ůda, 
sněhová pokrývka), mohou být odebrány z p ůdy skladované ve 
skleníku pod vegeta čním pokryvem (nap ř. zatravn ěné půdy nebo 
půdy s travní sm ěsí s jetelem). V každém p řípadě se upřednostňují 
studie s čerstvě odebranými p ůdami; pokud má být odebraná 
a zpracovaná p ůda před zahájením studie skladována, musí být skla ­
dována za odpovídajících podmínek a pouze po omezenou dobu (p ři 
4 ± 2  o C po dobu maximáln ě tří měsíců), aby byla zachována 
mikrobiální aktivita (  2 ). Podrobné pokyny pro odb ěr, zpracování 
a skladování p ůd pro biotransforma ční experimenty lze nalézt 
v literatuře (8, 10, 15, 26, 27).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Schopnost p ůdy zadržet vodu lze m ěřit jako polní kapacitu, jako reten ční vodní kapacitu 
nebo jako vodní sací tlak (pF). Vysv ětlení je uvedeno v dodatku 1. V protokolu 
o zkoušce by m ělo být uvedeno, zda byly schopnost p ůdy zadržet vodu a sypná hustota 
stanoveny u neporušených polních vzork ů, nebo porušených (zpracovaných) vzork ů. 
( 2 ) Z výsledk ů nedávných výzkum ů vyplývá, že p ůdy z mírného pásma lze skladovat 
při 20  o C déle než t ři měsíce (28, 29), aniž dojde k významné ztrát ě mikrobiální aktivity.
 Před tím, než se zpracovaná p ůda použije ve zkoušce, provede se její 
předběžná inkubace, aby se umožnilo klí čení a odstranila se semena 
a aby se po zm ěnách podmínek, ke kterým došlo od odb ěru nebo 
skladování po nastolení inkuba čních podmínek, znovu ustavila 
rovnováha mikrobiálního metabolismu. Obecn ě postačuje předběžné 
inkubační období v délce od 2 do 28 dn ů při podmínkách teploty 
a vlhkosti blížících se podmínkám zkoušky (15). Skladování a předběžná inkubace by dohromady nem ěly trvat déle než t ři 
měsíce.
 
1.9. PROVEDENÍ ZKOUŠKY  
1.9.1.  Zkušební podmínky  
1.9.1.1.  Zkušební teplota  
V průběhu celé zkoušky by m ěly být půdy inkubovány v temnu p ři 
stálé teplot ě, která je typická pro klimatické podmínky, ve kterých 
dojde k použití látky nebo k jejímu uvoln ění. Pro zkoušky všech 
látek, které se dostávají do p ůdy v mírném klimatickém pásu, se 
doporučuje teplota 20 ± 2  o C. Teplota musí být monitorována.  
V případě chemických látek aplikovaných nebo uvol ňovaných 
v chladném klimatickém pásu (nap ř. v severských zemích, b ěhem 
podzimu/zimy) se inkubují další vzorky p ůdy, avšak p ři nižší teplot ě 
(např. při 10 ± 2  o C). 
1.9.1.2.  Vlhkost  
Pro transforma ční zkoušky p ři aerobních podmínkách se vlhkost (  1 ) 
nastaví a udržuje na hodnot ě pF od 2,0 do 2,5 (3). Vlhkost p ůdy se 
vyjádří jako hmotnost vody na jednotku hmotnosti sušiny p ůdy, 
pravideln ě se kontroluje (nap ř. každé 2 týdny) vážením inkuba čních 
baněk a ztráta vody se vyrovnává p řidáním vody (nejlépe steriln ě 
filtrované vody z vodovodu). P ři upravování vlhkosti je t řeba 
zabránit ztrátám zkoušené látky a/nebo transforma čních produkt ů 
v důsledku těkání nebo p řípadné fotodegradace, nebo je t řeba tyto 
ztráty minimalizovat.  
V případě transforma čních zkoušek za anaerobních podmínek a za 
podmínek rýžového pole se p ůda nasytí vodou tak, že se zaplaví.  
1.9.1.3.  Podmínky aerobní inkubace  
V průtokových systémech se aerobní podmínky udržují ob časným 
propláchnutím nebo nep řetržitým prov ětráváním zvlh čeným vzdu ­
chem. v biometrických ba ňkách se vým ěna vzduchu udržuje difuzí.  
1.9.1.4.  Sterilní aerobní podmínky  
Za účelem získání informací o možné abiotické transformaci zkou ­ 
šené látky lze vzorky p ůdy sterilizovat (metody sterilizace jsou 
uvedeny v literatu ře 16 a 29), exponovat je sterilní zkoušené látce 
(např. přidáváním roztoku p řes sterilní filtr) a provzduš ňovat je zvlh ­ 
čeným sterilním vzduchem, jak je popsáno v oddíle 1.9.1.3. U p ůd 
z rýžových polí se p ůda a voda sterilizuje a inkubace provede 
způsobem uvedeným v oddílu 1.9.1.6.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Pro účely dostate čného provzduš ňování a výživy p ůdní mikroflóry by p ůda neměla být 
ani příliš vlhká, ani p říliš suchá. Vlhkost p ůdy doporu čená pro optimální r ůst mikroflóry 
se nachází v rozmezí od 40 % do 60 % reten ční vodní kapacity a v rozmezí od 0,1 do 
0,33 bar (6). Naposledy uvedený rozsah odpovídá rozsahu pF od 2,0 do 2,5. Typická 
vlhkost různých druh ů půd je uvedena v dodatku 2.
 1.9.1.5.  Podmínky aerobní inkubace  
S cílem nastolit a udržovat anaerobní podmínky se p ůda, která byla 
exponována zkoušené látce a inkubována za aerobních podmínek 30 dnů nebo jeden polo čas nebo po dobu odpovídající DT
 50 (podle 
toho, co je kratší), zaplaví vodou (vrstva vody 1–3 cm) 
a inkubační systém se propláchne inertním plynem (nap ř. dusíkem 
nebo argonem) (  1 ). Zkušební systém musí umož ňovat měření pH, 
koncentrace kyslíku a oxida čně-redukčního potenciálu a musí být 
vybaven za řízením pro zachycování t ěkavých produkt ů. Biometrický 
systém musí být uzav řený, aby bylo zabrán ěno přístupu vzduchu 
difuzí.  
1.9.1.6.  Inkubace za podmínek rýžového pole  
Pro účely studia transformace v p ůdách rýžových polí se p ůda 
zaplaví vrstvou vody o výšce asi 1–5 cm a zkoušená látka se apli ­
kuje do vodné fáze (9). Doporu čená tloušťka vrstvy p ůdy je alespo ň 
5 cm. Systém se provzduš ňuje vzduchem jako za aerobních 
podmínek. Hodnota pH, koncentrace kyslíku a oxida čně-redukční 
potenciál vodné vrstvy se monitorují a zaznamenávají. P řed 
zahájením transforma čních studií je nezbytné alespo ň dvoutýdenní 
předběžné inkuba ční období (viz oddíl 1.8.3.2).  
1.9.1.7.  Délka zkoušky  
Studie rychlosti a zp ůsobu transformace by nem ěly za normálních 
podmínek trvat déle než 120 dn ů ( 2 ) (3, 6, 8), nebo ť poté by podle 
očekávání mohlo v um ělém laboratorním systému, izolovaném od 
přirozeného dopl ňování, postupn ě docházet ke snižování mikrobiální 
aktivity p ůdy. Pokud je to nezbytné pro popis rozkladu zkoušené 
látky a tvorby a rozkladu hlavních transforma čních produkt ů, lze 
studie prodloužit (nap ř. na 6 nebo 12 m ěsíců) (8). Delší inkuba ční 
období by m ěla být zd ůvodněna ve zpráv ě o zkoušce a dopln ěna 
měřením biomasy b ěhem těchto období a na jejich konci.  
1.9.2.  Provedení zkoušky  
Do každé z inkuba čních baněk se vpraví asi 50 až 200 g p ůdy 
(hmotnost sušiny) (viz obrázky 1 a 2 v p říloze 3) a p ůda se jednou 
z metod uvedených v oddílu 1.8.2 exponuje zkoušené látce. Pokud 
se pro účely aplikace zkoušené látky použijí organická rozpoušt ědla, 
odstraní se z p ůdy odpařením. Půda se poté d ůkladně promíchá 
špachtlí nebo se ba ňka protřepe. Pokud se studie provádí za 
podmínek rýžového pole, p ůda a voda se po aplikaci zkoušené 
látky důkladně promísí. Malé podíly (nap ř. 1 g) exponované p ůdy 
se analyzují na zkoušenou látku za ú čelem kontroly rovnom ěrnosti 
distribuce. Alternativní metody jsou uvedeny níže.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Aerobní podmínky p řevažují v povrchových p ůdách a dokonce v podpovrchových 
půdách, jak ukázal výzkumný projekt podporovaný EU (K. Takagi et al. (1992). Micro ­
bial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil 
temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides 
Microbiol., 270–277, 17–21 17–21. srpen 1992, Sigtuna, Švédsko). Anaerobní podmínky 
se mohou vyskytovat jen p říležitostně během zaplavení p ůdy po vydatných srážkách, 
nebo jsou-li takové podmínky ustaveny na rýžových polích. 
( 2 ) Aerobní studie mohou být ukon čeny daleko d říve než za 120 dn ů, pokud je v dané dob ě 
jasně dosaženo kone čného transforma čního schématu a kone čné mineralizace. Zkoušku 
lze ukončit po 120 dnech, nebo pokud se transformovalo 90 % zkoušené látky, avšak 
pouze tehdy, vytvo řilo-li se alespo ň 5 % CO  2 .
 Aplikované množství by m ělo odpovídat nejvyššímu aplikovanému 
množství p řípravku na ochranu rostlin doporu čenému podle pokyn ů 
k použití a rovnom ěrnému zapravení do vhodné hloubky na poli 
(např. do horní deseticentimetrové vrstvy p ůdy (  1 ). Například 
u chemických látek aplikovaných na list nebo do p ůdy bez zapravení 
se pro výpo čet množství chemické látky, které je t řeba přidat do 
každé ba ňky, použije hloubka vrstvy p ůdy 2,5 cm. U chemických 
látek zapravovaných do p ůdy je příslušná hloubka specifikována 
v pokynech pro použití. U chemických látek obecn ě by mělo být 
aplikované množství odhadnuto na základ ě hlavní cesty vstupu do 
půdy; jsou-li nap říklad hlavní cestou vstupu do p ůdy čistírenské 
kaly, měla by být chemická látka p řidána do kalu v koncentraci, 
která odráží o čekávanou koncentraci v kalu, a množství kalu zapra ­
vené do p ůdy by mělo odpovídat normálnímu množství kalu zapra ­
vovanému do zem ědělských půd. Pokud tato koncentrace není dosta ­
tečná pro identifikaci hlavních transforma čních produkt ů, může 
napomoci inkubace samostatných p ůdních vzork ů obsahujících 
vyšší koncentrace, avšak nem ěly by být používány nadm ěrné 
koncentrace, které mají vliv na mikrobiální funkce (viz oddíly 1.5 a 1.8.2).
 
Jinou možností je expozice velké dávky p ůdy (tj. 1 až 2 kg), její 
důkladné promísení vhodným míchacím za řízením a p řenesení 
malých podíl ů o hmotnosti 50 až 200 g do inkuba čních baněk (např. 
pomocí d ěliče vzorku). Malé podíly (nap ř. 1 g) exponované p ůdy se 
analyzují na zkoušenou látku za ú čelem kontroly rovnom ěrnosti 
distribuce. Takový postup se up řednostňuje, nebo ť umožňuje stejno ­
měrnější rozptýlení zkoušené látky v p ůdě. 
Neexponované vzorky se inkubují za stejných (aerobních) podmínek 
jako vzorky exponované zkoušené látce. Tyto vzorky se použijí pro 
stanovení biomasy b ěhem studií a na jejich konci.  
Pokud se látka aplikuje do p ůdy rozpušt ěná v organickém rozpouš ­
tědle (organických rozpoušt ědlech), inkubují se vzorky p ůdy vysta­
vené témuž množství rozpoušt ědla (rozpoušt ědel) za týchž (aero ­
bních) podmínek jako vzorky exponované zkoušené látce. Tyto vzorky se použijí pro stanovení biomasy na za čátku studií, v jejich 
průběhu a na jejich konci za ú čelem kontroly ú činků rozpoušt ědla 
(rozpoušt ědel) na mikrobiální biomasu.
 
Baňky obsahující exponovanou p ůdu se buď zapojí do pr ůtokového 
systému popsaného na obrázku 1, nebo se uzav řou absorb ční kolo­
nou, jak je uvedeno na obrázku 2 (viz dodatek 3).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Výpočet výchozí koncentrace na základ ě plochy se provede takto:  
C půda mg =kg½ â ¼ A½kg=haâ · 10 6 ½mg =kgâ 
l½mlâ · 10 4 ½m 2=haâ · d kg  půda=m 3 h i  
C půda = výchozí koncentrace v p ůdě (mg · kg -1 ) 
A = aplika ční dávka (kg · ha -1 ); 1 = tlouš ťka půdní vrstvy na poli [m]; d = sypná 
hustota suché p ůdy (kg · m -3 ). 
Zhruba platí, že aplika ční dávka 1 kg · ha -1 vede ke koncentraci v p ůdě přibližně 1 mg · kg -1 
v 10 cm vrstv ě (při předpokládané sypné hustot ě 1 g ·cm -3 ).
 1.9.3.  Odb ěr vzorků a měření 
V příslušných časových intervalech se vyberou duplikátní inkuba ční 
baňky, vzorky p ůd se extrahují vhodnými rozpoušt ědly různé pola­
rity a analyzují na zkoušenou látku a/nebo na transforma ční 
produkty. U kvalitn ě připravených studií je k dispozici dostate čný 
počet baněk, aby bylo možné ke každému odb ěru vybrat dv ě baňky. 
V různých časových intervalech (v sedmidenních intervalech b ěhem 
prvního m ěsíce a po prvním m ěsíci v sedmnáctidenních intervalech) 
během inkubace každého vzorku p ůdy a dále na konci inkubace se 
také odeberou absorp ční roztoky nebo tuhé absorp ční materiály 
a analyzují se na t ěkavé produkty. Krom ě vzorku p ůdy odebraného 
ihned po aplikaci (vzorek ze dne 0) se provede alespo ň dalších 5 
odběrů. Časové intervaly se zvolí tak, aby bylo možné stanovit 
schéma rozkladu zkoušené látky a zp ůsob tvorby a rozkladu trans ­
formačních produkt ů (např. po 0, 1, 3, 7 dnech; po 2, 3 týdnech; po 
1, 2, 3 m ěsících atd.).  
V případě zkoušené látky zna čené isotopem  14 C se spálením kvan ­
titativně stanoví neextrahovatelná radioaktivita a pro každý vzorko ­
vací interval se vypo čte látková bilance.  
V případě anaerobní inkubace nebo inkubace za podmínek rýžového 
pole se p ůda a vodná fáze analyzují na zkoušenou látku 
a transforma ční produkty bu ď společně, nebo se p řed extrakcí 
a analýzou odd ělí filtrací nebo centrifugací.  
1.9.4.  Nepovinné zkoušky  
Pro odhad vlivu teploty a vlhkosti p ůdy na rychlosti transformace 
zkoušené látky a/nebo jejích transforma čních produkt ů v půdě 
mohou být užite čné aerobní nesterilní studie p ři další teplot ě nebo 
vlhkosti p ůdy. 
O další charakterizaci neextrahovatelné radioaktivity se lze pokusit 
například použitím metody extrakce tekutinou v nadkritickém stavu.  
2. ÚDAJE  
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Pro každý vzorkovací interval se uvede množství zkoušené látky, 
transforma čních produkt ů, těkavých látek (pouze v %) 
a neextrahovatelných látek v procentech výchozí koncentrace, pop ří­
padě v mg na kg p ůdy (na hmotnost sušiny). Pro každý vzorkovací 
interval se uvede látková bilance v procentech použité výchozí 
koncentrace. Grafické znázorn ění závislosti koncentrace zkoušené 
látky na čase umožní provést odhad jejího polo času transformace 
nebo hodnoty DT  50. Měly by být identifikovány hlavní transforma ční 
produkty a sestrojeny k řivky závislosti koncentrace na čase, aby se 
ukázala rychlost jejich tvorby a rozkladu. Hlavním transforma čním 
produktem je jakýkoli produkt, který kdykoli b ěhem studie tvo ří ≥ 
10 % aplikované dávky.  
Zachycené t ěkavé produkty jsou ur čitým ukazatelem t ěkavosti zkou ­ 
šené látky a jejích transforma čních produkt ů z půdy. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Přesnější stanovení polo časů nebo hodnot DT  50 a popřípadě hodnot 
DT 75 a DT  90 se provede výpo čtem za použití vhodného modelu 
kinetiky. Spole čně s hodnotami polo času a DT  50 se uvede popis 
použitého modelu kinetiky, řád kinetiky a koeficient determinace 
(r 2 ). Pokud není r  2 < 0,7 up řednostňuje se kinetika prvního řádu. 
Podle možnosti se výpo čty použijí také na hlavní transforma ční 
produkty. P říklady vhodných model ů jsou popsány v literatu ře (31 
až 35).  
V případě studií rychlosti provád ěných při různých teplotách se 
závislost rychlosti transformace na teplot ě popíše v rozsahu experi ­
mentálních teplot pomocí Arrheniovy rovnice:  
k ¼ A·e ÄB=T nebo  ln k ¼ ln A Ä B 
T , 
kde ln A a B jsou regresní konstanty získané z úseku na abscise a ze 
směrnice regresní p římky závislosti ln k na 1/T, kde k je rychlostní 
konstanta p ři teplotě T a T je teplota v Kelvinech. Je t řeba věnovat 
pozornost omezení rozsahu teplot, v n ěmž platí Arrheniova rovnice, 
jestliže transformaci ur čuje mikrobiální činnost.  
2.2. HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Přestože se studie provád ějí v um ělém laboratorním systému, 
umožňují výsledky odhadnout rychlost transformace zkoušené látky 
a rovněž rychlost tvorby a rozkladu transforma čních produkt ů za 
polních podmínek (36, 37).  
Studie transforma čního způsobu zkoušené látky poskytuje informaci 
o způsobu, jakým se m ění struktura aplikované látky v p ůdě půso­
bením chemických a mikrobiálních reakcí.  
3. ZPRÁVY  
PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená látka:  
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (s 
uvedením polohy zna čícího atomu (zna čících atom ů) při použití 
radionuklid ů) a relevantní fyzikáln ě-chemické vlastnosti (viz 
oddíl 1.5),  
— čistota zkoušené látky (obsah ne čistot),  
— popřípadě radiochemická čistota zna čené chemické látky 
a specifická aktivita.  
Referenční látky:  
— chemický název a struktura referen čních látek použitých 
k charakterizaci a/nebo identifikaci transforma čního produktu.  
Zkušební p ůdy: 
— podrobné údaje o míst ě odběru, 
— datum a postup odb ěru vzorků půdy, ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— vlastnosti p ůdy, např. pH, obsah organického uhlíku, struktura 
(% písku, % prachu, % jílu), kationtová vým ěnná kapacita, sypná 
hustota, schopnost zadržet vodu a mikrobiální biomasa,  
— doba skladování p ůdy a podmínky skladování (pokud byla skla ­
dována).  
Zkušební podmínky:  
— datum provedení studií,  
— množství aplikované zkoušené látky,  
— použitá rozpoušt ědla a metoda aplikace zkoušené látky,  
— hmotnost exponované p ůdy na začátku zkoušky a hmotnost p ůdy 
odebírané pro analýzu v každém intervalu,  
— popis použitého inkuba čního systému,  
— rychlosti pr ůtoku vzduchu (pouze u pr ůtokových systém ů), 
— zkušební teplota,  
— vlhkost p ůdy během inkubace,  
— mikrobiální biomasa na za čátku aerobních studií, b ěhem nich 
a na jejich konci,  
— pH, koncentrace kyslíku a oxida čně-redukční potenciál na 
začátku anaerobních studií a studií za podmínek rýžového pole, 
během nich a na jejich konci,  
— metoda (metody) extrakce,  
— metody kvantitativního stanovení a identifikace zkoušené látky 
a hlavních transforma čních produkt ů v půdě a v absorp čních 
materiálech,  
— počet duplikátních vzork ů a počet kontrol.  
Výsledky:  
— výsledky stanovení mikrobiální aktivity,  
— opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod,  
— hodnoty výt ěžnosti (hodnoty v % pro platnou studii jsou uvedeny 
v oddíle 1.7.1),  
— tabulky s výsledky vyjád řenými v % výchozí aplikované dávky, 
popřípadě v mg na kg p ůdy (vztaženo na hmotnost sušiny p ůdy), 
— látková bilance b ěhem studií a na jejich konci,  
— charakterizace neextrahovatelné (vázané) radioaktivity nebo 
reziduí v p ůdě, 
— kvantifikace uvoln ěného CO  2 a dalších t ěkavých slou čenin,  
— křivky závislostí koncentrací zkoušené látky, pop řípadě hlavních 
transforma čních produkt ů v půdě na čase, 
— poločas nebo hodnoty DT  50 , DT  75 a DT  90 pro zkoušenou látku, 
popřípadě i pro hlavní transforma ční produkty v četně příslušných 
intervalů spolehlivosti,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— odhad rychlosti abiotického rozkladu za sterilních podmínek,  
— posouzení kinetiky transformace pro zkoušenou látku, pop řípadě 
i pro hlavní transforma ční produkty,  
— případný návrh zp ůsobu transformace,  
— diskuse a interpretace výsledk ů, 
— nezpracovaná data (tj. chromatogramy jednotlivých vzork ů, 
příklady výpo čtu rychlostí transformace a metody použité pro 
identifikaci transforma čních produkt ů). 
4. LITERATURA  
1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assess ­
ment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
 
2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the 
market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and 
Behaviour in the Environment.
 
4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzens ­
chutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
 
6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality – Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: 
Aerobic conditions.  
7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals 
in soil under aerobic conditions.  
8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded).  
10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.  
11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic 
Press, 123–157.  
12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).  
13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945–956 (IUPAC 1984)  
14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981)  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
16) Annex v to Dir. 67/548/EEC  
17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114.
 
18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26: 305 (1962).  
19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Minera ­
logical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, 
Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.  
21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
 
22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologis ­
chen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen 
Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method 
for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. 
Soil Biol. Biochem. 10, 215–221.  
25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
 
26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesti ­
cide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. 
Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45–60.  
27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesti ­
cides in aqueous environment. Proceedings of the 16  th Sympo­
sium on Environmental Science of Pesticide, 105–120.  
28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, 59–63 (SETAC-Europe).  
29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Sten ­
ström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pestici ­
des, Soil Microbiology and Soil Quality, 68–69 (SETAC-Euro ­
pe).
 
30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical charac ­
teristics. Plant and Soil 102, 197–200.  
31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. 
Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. 
BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181–199.
 
33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. 
(1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environ ­
mental Dynamics of Pesticides“. R. Haque and V.H. Freed, 
Eds., 135–172.  
34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 
39, 188–204.
 
35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47–60.  
36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissi ­
pation in soil; a new model based on spatial variability. Envi ­
ronm. Sci. Technol. 24, 1032–1041.  
37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83–122.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
DODATEK 1  
TLAK VODY, POLNÍ KAPACITY (PK) A RETEN ČNÍ VODNÍ KAPACITA (RVK)  ( 1 ) 
Výška vodního sloupce 
(cm) pF (  a ) bar (  b ) Poznámky  
10 7 7 10  4 Suchá půda 
1,6 · 10 4 4,2 16 Bod vadnutí 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6· 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Rozpětí 
polní kapacity (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 RVK (p řibližná hodnota) 
1 0 0,001 P ůda nasycená vodou
 
( a ) pF = dekadický logaritmus výšky vodního sloupce v cm. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Odpovídá p řibližnému obsahu vody p ři složení 10 % písku, 35 % hlíny a 45 % jílu. 
( d ) Polní kapacita není konstanta, ale m ění se v závislosti na druhu p ůdy od pF 1,5 do 2,5.  
Tlak vody  se vyjad řuje v cm vodního sloupce nebo v jednotkách bar. Vzhledem k velkému rozp ětí 
se sací tlak vyjad řuje jednoduše jako hodnota pF, která je ekvivalentní logaritmu vodního sloupce 
v cm.  
Polní kapacita  je definována jako množství vody, které p řírodní půda po delším deštivém období 
nebo po dostate čném zavlažení udrží proti gravitaci 2 dny. Stanovuje se u neporušené p ůdy 
v polním pokusu. Nam ěřená hodnota tedy není použitelná pro laboratorní vzorky porušené p ůdy. 
Hodnoty PK stanovené u porušených p ůd mohou vykazovat v ětší systematické odchylky.  
Retenční vodní kapacita  (RVK) se stanovuje v laborato ři u neporušené i porušené p ůdy tak, že se 
kapilárním vzlínáním nasytí sloupec p ůdy vodou. Využije se zejména u porušených p ůda může být 
až o 30 % vyšší než polní kapacita (1). Také se stanovuje snadn ěji než spolehlivé hodnoty PK.  
Poznamky  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
DODATEK 2  
VLHKOST PUDY (V G VODY NA 100 G SUSINY) U RUZNÝCH DRUHU PUD 
Z RUZNÝCH ZEMI  
Vlhkost p ůdy při 
Druh půdy Zem ě 
RVK (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Písčitá N ěmecko 28,7 8,8 3,9 
Hlinitopís čitá N ěmecko 50,4 17,9 12,1 
Hlinitopís čitá Švýcarsko 44,0 35,3 9,2 
Prachovitohlinitá Švýcarsko 72,8 56,6 28,4 Jílovitohlinitá Brazílie 69,7 38,4 27,3 Jílovitohlinitá Japonsko 74,4 57,8 31,4 Písčitohlinitá Japonsko 82,4 59,2 36,0 
Prachovitohlinitá USA 47,2 33,2 18,8 Písčitohlinitá USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Retenční vodní kapacita.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
DODATEK 3  
Obrázek 1  
Příklad průtokové aparatury pro studium transformace chemických látek v p ůdě ( 1 ) ( 2 )
 
Obrázek 2  
Příklad biometrické ba ňky pro studium transformace chemických látek v p ůdě ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In: Interactions between Herbicides and the Soil (R. J. 
Hance, ed.), Academic Press, 123–157. 
( 2 ) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, (eds.) J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114. 
( 3 ) Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung 
von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.
 C.24.  AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V SYSTÉMECH 
VODA/SEDIMENT  
1. METODA  
Tato zkušební metoda je replikou metody OECD TG 308 (2002).  
1.1. ÚVOD  
Chemické látky se mohou dostat do m ělkých nebo hlubokých 
povrchových vod cestami, jako jsou p římá aplikace, unášení 
postřiku, odtok, ukládání odpadu, pr ůmyslové, komunální nebo 
zemědělské emise a atmosférický spad. V této zkušební metod ě je 
popsán laboratorní postup posouzení aerobní a anaerobní transfor ­
mace organických chemických látek v systémech voda/sediment. 
Vychází ze stávajících sm ěrnic (1, 2, 3, 4, 5, 6). O po čtu 
a druzích p ůd, které mají být použity ve zkoušce, byla u činěna 
dohoha na pracovním seminá ři OECD  Workshop on soil/sediment 
Selection held at Belgirate , Itálie, 1995 (7). Zde byla rovn ěž přijata 
doporučení týkající se odb ěru, zpracování a skladování vzork ů 
sedimentů založená na sm ěrnici ISO (8). Tyto studie jsou požado ­
vány u chemických látek, které jsou aplikovány bezprost ředně do 
vody nebo které se mohou dostat do vody výše uvedenými cestami.  
Podmínky ve vrchní vodní fázi p řírodních systém ů voda/sediment 
jsou často aerobní. Podmínky v povrchové vrstv ě sedimentu 
mohou být bu ď aerobní, nebo anaerobní, zatímco podmínky hlou ­
běji v sedimentu jsou obvykle anaerobní. S cílem zahrnout 
všechny tyto možnosti je v tomto dokumentu popsána zkouška jak za aerobních podmínek, tak za anaerobních podmínek. Aerobní 
zkouškou se simuluje aerobní vodní sloupec nad aerobní vrstvou 
sedimentu, pod níž leží vrstva s anaerobním gradientem. Anaerobní zkouška simuluje zcela anaerobní systém voda/sediment. Pokud je z okolností z řejmé, že je t řeba se odchýlit od t ěchto doporu čení, 
např. použít nedot čené střední vrstvy sediment ů nebo sedimenty, 
které mohly být exponovány zkoušenou látkou, existují jiné metody ur čené k tomuto ú čelu (9).
 
1.2. DEFINICE  
Ve všech p řípadech je t řeba používat mezinárodní soustavu 
jednotek SI.  
Zkoušená látka:  jakákoli látka, a ť již výchozí látka, nebo p říslušné 
transforma ční produkty.  
Transforma ční produkty:  všechny látky vznikající p ři biotických 
a abiotických transforma čních reakcích zkoušené látky, v četně CO  2 
a vázaných reziduí.  
Vázaná rezidua: „vázaná rezidua“ jsou slou čeniny v p ůdě, rostlinách 
nebo v živo čiších, které po extrakci z ůstávají v matrici ve form ě výchozí 
látky nebo jejího metabolitu (jejích metabolit ů). Metoda extrakce nesmí 
podstatně měnit samotné slou čeniny nebo strukturu matrice. Povahu 
vazeb lze částečně vysvětlit extrakcí spojenou se zm ěnami v matrici 
a moderními analytickými postupy. Dosud byly tímto zp ůsobem vyjas ­
něny např. kovalentní, iontové a adsorp ční vazby a rovn ěž záchyty. 
Tvorba vázaných reziduí obecn ě podstatně snižuje biologickou p řístup­
nost a dostupnost (10) (upraveno IUPAC 1984 (11)).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aerobní transformace:  (oxidační): reakce, ke kterým dochází za 
přítomnosti kyslíku (12).  
Anaerobní transformace:  (reduk ční): reakce probíhající 
s vyloučením molekulárního kyslíku (12).  
Přírodní vody:  jsou povrchové vody získané z rybník ů, řek, potok ů 
atd. 
Sediment:  je směs minerálních a organických chemických složek, 
přičemž organické složky obsahují slou čeniny s vysokým obsahem 
uhlíku a dusíku a vysokou molekulovou hmotností. Ukládají se v přírodních vodách a vytvá řejí rozhraní s t ěmito vodami.
 
Mineralizace:  je úplný rozklad organické slou čeniny na CO  2 a H  2 O 
za aerobních podmínek a na CH  4 , CO  2 a H  2 O za anaerobních 
podmínek. V rámci této zkušební metody, p ři níž se používají slou ­ 
čeniny zna čené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad 
molekuly, p ři němž se zna čící atomy uhlíku kvantitativn ě oxidují 
nebo redukují, p řičemž se uvol ňuje odpovídající množství  14 CO 2 
nebo  14 CH 4 . 
Poločas, t 0,5 : je čas, za který dojde k 50 % transformaci zkoušené 
látky, jestliže lze transformaci popsat kinetikou prvního řádu; nezá ­
visí na po čáteční koncentraci.  
DT 50 (doba odbourání 50):  doba, za kterou se po čáteční koncent ­
race zkoušené látky sníží o 50 %.  
DT 75 (doba odbourání 75):  doba, za kterou se po čáteční koncent ­
race zkoušené látky sníží o 75 %.  
DT 90 (doba odbourání 90):  doba, za kterou se po čáteční koncent ­
race zkoušené látky sníží o 90 %.  
1.3. REFEREN ČNÍ LÁTKY  
Referenční látky by m ěly být použity pro identifikaci a kvantitativní 
stanovení transforma čních produkt ů spektroskopickými 
a chromatografickými metodami.  
1.4. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Pro stanovení rychlosti transformace lze použít jak látky nezna čené 
radioisotopy, tak látky zna čené, přičemž značené materiály jsou 
upřednostňovány. Zna čený materiál je nezbytný pro studium 
způsobu transformace a pro stanovení látkové bilance. Doporu čuje 
se značení isotopem  14 C, avšak užite čné mohou být i jiné isotopy, 
např. 13 C, 15 N, 3 H, 32 P. Značena by m ěla být pokud možno nejsta ­
bilnější část (části) molekuly (  1 ). Chemická a/nebo radiochemická 
čistota látky by m ěla být alespo ň 95 %.  
Před provedením zkoušky by m ěly být k dispozici tyto informace 
o látce:  
a) rozpustnost ve vod ě (metoda A.6);  
b) rozpustnost v organických rozpoušt ědlech;  
c) tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta;  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Pokud nap říklad látka obsahuje kruh, je t řeba tento kruh ozna čit; pokud látka obsahuje 
dva nebo více kruh ů, může být nezbytné provést samostatné studie za ú čelem stanovení 
osudu každého z ozna čených kruh ů, a získat tak vhodné informace o tvorb ě transfor­
mačních produkt ů.
 d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8);  
e) adsorp ční koeficient (podle pot řeby K d , K f nebo  K oc ) (metoda 
C.18);  
f) hydrolýza (metoda C.7);  
g) disocia ční konstanta (p K a ) (směrnice OECD 112) (13);  
h) chemická struktura zkoušené látky a p řípadně poloha zna čícího 
nuklidu.  
Poznámka:  Ve zpráv ě se uvede teplota, p ři které byla m ěření 
prováděna. 
Mezi další užite čné informace pat ří údaje o toxicit ě zkoušené látky 
pro půdní mikroorganismy, údaje o snadné nebo vlastní biologické 
rozložitelnosti a údaje o aerobní a anaerobní transformaci v p ůdě. 
K dispozici by m ěly být analytické metody (v četně extrakčních 
a izolačních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkou ­ 
šené látky a jejích transforma čních produkt ů ve vodě a sedimentu 
(viz oddíl 1.7.2).  
1.5. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY  
V metodě popsané v této zkoušce se používají aerobní i anaerobní 
systémy voda/sediment (viz dodatek 1), které umož ňují: 
i) měřit rychlost transformace zkoušené látky v systému 
voda/sediment,  
ii) měřit rychlost transformace zkoušené látky v sedimentu,  
iii) měřit rychlost mineralizace zkoušené látky a/nebo produkt ů její 
transformace (pokud se použije zkoušená látka zna čená 
isotopem  14 C), 
iv) identifikaci a kvantifikace produkt ů transformace ve vod ě a v 
sedimentu, v četně látkové bilance (pokud se použije zna čená 
zkoušená látka),  
v) měřit distribuci zkoušené látky a produkt ů její transformace mezi 
dvěma fázemi b ěhem inkubace v temnu (aby nedošlo nap ř. 
k vykvetení řas) při konstantní teplot ě. Pokud to údaje umož ňují, 
stanoví se polo časy a hodnoty DT  50 , DT  75 a DT  90 , které by však 
neměly být p říliš extrapolovány mimo obor experimentálních 
hodnot (viz oddíl 1.2).  
Pro aerobní i anaerobní studie jsou nezbytné alespo ň dva sedimenty 
a příslušné vodní fáze (7). V n ěkterých p řípadech by však m ěly být 
použity více než dva systémy voda/sediment, nap ř. u chemických 
látek, které mohou být p řítomny ve sladkovodním i mo řském 
ekosystému.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. POUŽITELNOST ZKOUŠKY  
Tato metoda je použitelná pro všechny chemické látky (nezna čené 
nebo značené radioaktivními isotopy), pro které je k dispozici analy ­
tická metoda s dostate čnou přesností a citlivostí. Je použitelná pro 
mírně těkavé a net ěkavé slou čeniny rozpustné nebo špatn ě rozpustné 
ve vodě. Zkouška by nem ěla být použita u látek, které z vody siln ě 
těkají (např. fumiganty, organická rozpoušt ědla), a nelze je tedy ve 
vodě nebo v sedimentu udržet za experimentálních podmínek této 
zkoušky.  
Tato metoda je dosud používána ke studiu transformace chemických 
látek ve sladkovodním systému voda/sediment, avšak m ůže být 
v zásadě použita také na estuarní a mo řské systémy. Není vhodná 
k simulaci podmínek v tekoucích vodách (nap ř. řekách) nebo na 
otevřeném mo ři. 
1.7. KRITÉRIA JAKOSTI  
1.7.1.  Výt ěžnost  
Extrakce a analýza provedená alespo ň u dvou duplikátních vzork ů 
systému voda/sediment ihned po p řidání zkoušené látky poskytne 
první informaci o opakovatelnosti analytické metody a o stejnom ěr­
nosti aplikace zkoušené látky. Výt ěžnosti pozd ějších stup ňů experi­
mentu se zjistí z p říslušných látkových bilancí (pokud se použije 
značený materiál). Výt ěžnosti by se m ěly nacházet v rozmezí 
90 % až 110 % u zna čených chemických látek (6) a v rozmezí 
70 % až 110 % u nezna čených chemických látek.  
1.7.2.  Opakovatelnost a citlivost analytické metody  
Opakovatelnost analytické metody (krom ě účinnosti první extrakce) 
pro kvantifikaci zkoušené látky a transforma čních produkt ů lze ověřit 
paralelním provedením analýzy duplikátních vzork ů týchž extrakt ů 
(vzorků) vody nebo sedimentu, které byly dostate čně dlouho inku ­
bovány, aby došlo k vytvo ření transforma čních produkt ů. 
Mez detekce analytické metody (LOD) pro zkoušenou látku a pro 
transforma ční produkty by m ěla být alespo ň 0,01 mg na kg vody 
nebo sedimentu (pro zkoušenou látku) nebo 1 % výchozího množství aplikovaného do zkušebního systému, podle toho, která z t ěchto 
hodnot je nižší. Rovn ěž by měla být specifikována mez kvantitativní 
stanovitelnosti (LOQ).
 
1.7.3.  Správnost dat o transformaci  
Regresní analýza závislosti koncentrace zkoušené látky na čase 
poskytuje vhodné informace o správnosti transforma ční křivky 
a umožňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro polo časy (v případě 
zdánlivé kinetiky prvního řádu) nebo pro hodnoty DT  50 a popřípadě 
hodnoty DT  75 a DT  90 . 
1.8. POPIS METODY  
1.8.1.  Zkušební systém a aparatura  
Studie se provede se sklen ěnými nádobami (nap ř. baňkami, centri ­
fugačními kyvetami), pokud z p ředběžných informací (nap ř. 
z rozdělovacího koeficientu n-oktanol/voda, ze sorp čních dat atd.) 
nevyplývá, že látka m ůže ulpívat na skle; v takovém p řípadě lze 
zvážit použití náhradního materiálu (nap ř. teflonu). Pokud je 
o zkoušené látce známo, že ulpívá na skle, lze problém zmírnit 
jednou z následujících metod:  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— stanovením hmotnosti zkoušené látky a transforma čních produkt ů 
sorbovaných na skle,  
— zajištěním, aby se na konci zkoušky omylo rozpoušt ědlem 
veškeré laboratorní sklo,  
— použitím komer ční úpravy p řípravků (viz také oddíl 1.9.2),  
— použitím v ětšího množství pomocného rozpoušt ědla za účelem 
přidání zkoušené látky do systému; pokud se použije pomocné 
rozpouštědlo, nesmí št ěpit zkoušenou látku solvolýzou.  
Příklady typických zkušebních aparatur, tj. pr ůtokové a biometrické 
systémy, jsou uvedeny v dodatcích 2 a 3 (14). Jiné užite čné inku­
bační systémy jsou popsány v literatu ře (15). Experimentální apara ­
tura by m ěla být konstruována tak, aby byla možná vým ěna vzduchu 
nebo dusíku a zachycení t ěkavých produkt ů. Rozměry aparatury 
musí splňovat požadavky zkoušky (viz oddíl 1.9.1). Ventilace musí 
být zajištěna buď jemným probubláváním, nebo prohán ěním vzduchu 
nebo dusíku nad hladinou vody. V druhém p řípadě se doporu čuje 
vodu seshora mírn ě promíchávat, aby docházelo k lepší distribuci 
kyslíku nebo dusíku ve vod ě. Neměl by se použít vzduch zbavený 
CO 2 , neboť by došlo ke zvýšení pH vody. V žádném p řípadě není 
žádoucí, aby došlo ke zví ření sedimentu, a je tomu t řeba pokud 
možno zabránit. Slab ě těkavé chemické látky se zkoušejí 
v biometrickém systému za mírného promíchávání vodní hladiny. Lze rovněž použít uzav řené nádobky s volným objemem pod ví čkem 
vyplněným atmosférickým vzduchem nebo dusíkem a vnit řní 
ampulky pro zachycování t ěkavých produkt ů (16). U aerobních 
zkoušek je nezbytná pravidelná vým ěna plynu pod ví čkem, aby se 
vyrovnávala spot řeba kyslíku biomasou.
 
Mezi vhodné lapa če pro shromaž ďování těkavých transforma čních 
produktů patří kromě jiných roztok hydroxidu draselného nebo 
sodného o koncentraci 1 mol/dm  3 pro zachycování oxidu uhli čitého (  1 ) 
a ethylenglykol, ethanolamin nebo 2 % parafín v xylenu pro organické sloučeniny. Těkavé látky vznikající za anaerobních podmínek, nap ř. 
methan, lze zachycovat na molekulovém sítu. Tyto t ěkavé látky lze 
spálit nap ř. na CO
 2 v křemenné trubi čce za přítomnosti CuO p ři teplotě 
900  o C a vzniklý CO  2 lze zachytit v absorbéru s alkálií (17).  
Pro chemickou analýzu zkoušené látky a transforma čních produkt ů 
jsou nezbytné laboratorní p řístroje (nap ř. přístroje pro plynovou 
chromatografii s kapalinovou stacionární fází (GLC), vysokoú činnou 
kapalinovou chromatografii (HPLC), pro chromatografii na tenké vrstvě (TLC), hmotnostní spektrometrii (MS), kombinaci plynové 
chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS), kombinaci 
kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (LC-MS), jadernou magnetickou rezonanci (NMR) atd.), v četně detekčních 
systémů pro detekci slou čenin značených nebo nezna čených radio ­
isotopy. Pokud se použije materiál zna čený radioisotopy, je t řeba mít 
k dispozici scintila ční spektrometr a za řízení pro spalování za 
přítomnosti oxida čního činidla (pro spalování vzork ů sediment ů 
před analýzou radioaktivity).
 
Další standardní laboratorní vybavení pro fyzikáln ěchemická 
a biologická m ěření (viz oddíl 1.8.2.2 tabulka 1), laboratorní sklo, 
chemikálie a činidla se použijí podle pot řeby. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Vzhledem k tomu, že alkalické roztoky absorbují oxid uhli čitý ze vzduchu ur čeného 
k provzduš ňování a oxid uhli čitý uvolňující se respirací v aerobních experimentech, musí 
být pravideln ě vyměňovány, aby se nevy čerpala jejich absorp ční kapacita.
 1.8.2.  Výb ěr a počet vodních sediment ů 
Místa odb ěru by měla být vybrána podle ú čelu zkoušky v dané 
situaci. P ři výběru místa odb ěru vzork ů musí být p řihlédnuto 
k historii p řípadných zem ědělských, pr ůmyslových nebo komunál ­
ních vstup ů do povodí a do horních tok ů. Sedimenty by nem ěly být 
použity, pokud byly v p ředchozích 4 letech kontaminovány zkou ­ 
šenou látkou nebo jejími strukturními analogy.  
1.8.2.1.  Výběr sediment ů 
Pro aerobní studie se obvykle použijí dva sedimenty (7). Tyto dva 
vybrané sedimenty by se m ěly lišit co do obsahu organického uhlíku 
a struktury. Jeden sediment by m ěl mít vysoký obsah organického 
uhlíku (2,5–7,5 %) a jemnou strukturu a druhý sediment by m ěl mít 
nízký obsah organického uhlíku (0,5–2,5 %) a hrubou strukturu. 
Obsah organického uhlíku by se m ěl zpravidla lišit alespo ň o 2 %. 
„Jemná struktura“ je definována obsahem složky (jíl + prach) (  1 ) 
vyšším než 50 % a „hrubá textura“ je definována obsahem složky 
(jíl + prach) nižším než 50 %. Rozdíl v obsahu složek (jíl + prach) 
u obou sediment ů by měl být zpravidla alespo ň 20 %. V p řípadě, že 
se může chemikálie dostat do mo řských vod, m ěl by alespo ň jeden 
systém voda/sediment pocházet z mo ře. 
Pro přísně anaerobní studie by m ěly být odebrány dva sedimenty 
(včetně okolní vody) z anaerobních zón povrchových vod (7). Se 
sedimentem i vodní fází by m ělo být zacházeno opatrn ě a měly by 
být přepravovány s vylou čením přístupu kyslíku.  
Pro výběr sedimentu mohou být d ůležité i jiné parametry, které by 
měly být zvažovány p řípad od p řípadu. Rozp ětí pH sediment ů je 
například důležité pro zkoušení chemikálií, u nichž transformace 
a/nebo sorpce mohou záviset na pH. Závislost sorpce na pH by se mohla odrážet v hodnot ě pK
 a zkoušené látky.  
1.8.2.2.  Charakterizace vzork ů systému voda/sediment  
Klíčové parametry, které musí být jak u vody, tak u sedimentu 
měřeny a uvedeny ve zpráv ě (s odkazem na použitou metodu), 
a fáze zkoušky, ve které mají být m ěřeny, jsou shrnuty v níže 
uvedené tabulce. Metody stanovení t ěchto parametr ů jsou pro infor ­
maci uvedeny v literatu ře (18, 19, 20, 21).  
Kromě toho může být případ od p řípadu nezbytné m ěřit a uvád ět 
další parametry (nap ř. u sladkovodního systému: obsah částic, alka ­
lita, tvrdost, vodivost, NO  3 /PO  4 (poměr jednotlivých hodnot); 
u sediment ů: kationtová vým ěnná kapacita, reten ční vodní kapacita, 
obsah uhli čitanů, celkový obsah dusíku a fosforu; u mo řských 
systémů: salinita). Pro posouzení oxida čně-redukčních podmínek, 
a zejména v souvislosti s anaerobní transformací, m ůže být také 
užitečná analýza sediment ů a vody na dusi čnany, sírany, biologicky 
dostupné železo, pop řípadě na jiné akceptory elektron ů. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) (Jíl + prach) je minerální frakce sedimentu s velikostí částic < 50 μm.
 Měření parametr ů pro charakterizaci vzork ů systémů voda/sediment (7, 22, 23)  
Parametr Fáze zkušebního postupu 
odběr 
v terénu manipulace 
po odběru zahájení 
aklimatizace zahájení 
zkoušky samotná 
zkouška konec 
zkoušky  
Voda  
Původ/zdroj x 
Teplota x pH x x x x x TOC x x x Koncentrace O
 2 (*) x x x x x 
Oxidačně-redukční potenciál (*) x x x x  
Sediment  
Původ/zdroj x 
Hloubka vrstvy x pH x x x x x Distribuce částic x 
TOC x x x x 
Mikrobiální biomasa (**) x x x 
Oxidačně-redukční potenciál (*) Pozoro ­
vání 
(barva/ zápach) x x x x
 
(*) Výsledky nedávných výzkum ů ukázaly, že m ěření koncentrace kyslíku ve vod ě a oxidačně-redukčního potenciálu 
vody nemají vypovídací hodnotu, pokud jde o mechanismus r ůstu a vývoje mikrobiální populace v povrchových 
vodách, a nemají ani p ředpovědní hodnotu (24, 25). Stanovení biochemické spot řeby kyslíku (BOD, p ři odběru 
vzorků v terénu a p ři zahájení a na konci zkoušky) a koncentrace mikro- a makroživin Ca, Mg a Mn ve vod ě (při 
zahájení a na konci zkoušky) a m ěření celkového obsahu N a P v sedimentech (p ři odběru vzorků v terénu a na konci 
zkoušky) m ůže být lepším nástrojem pro interpretaci a hodnocení rychlosti a zp ůsobů aerobní biotransformace. 
(**) Metoda m ěření rychlosti mikrobiální respirace (26), fumiga ční metoda (27) nebo m ěření počtu mikroorganism ů (např. 
bakterií, aktinomycet, plísní a celkového po čtu kolonií) pro aerobní studie; rychlost methanogeneze u anaerobních 
studií.  
1.8.3.  Odb ěr vzorků, manipulace s nimi a jejich skladování  
1.8.3.1.  Odb ěr 
Vzorky sedimentu se odeberou podle návrhu sm ěrnice ISO pro odb ěr 
vzorků sediment ů ze dna (8). Vzorky se odeberou z celé 5 až 10 cm 
silné horní vrstvy sedimentu. Sou časně se sedimentem se odebere 
z téhož místa i vzorek okolní vody. U anaerobní studie musí být 
sediment a okolní voda odebrány a p řepravovány s vylou čením 
přístupu kyslíku (28) (viz oddíl 1.8.2.1). V literatu ře je popsáno 
několik odb ěrových za řízení (8, 23).  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2.  Manipulace  
Sediment se odd ělí od vody filtrací a poté se pomocí p řebytku vody 
z místa odb ěru prosévá za mokra na 2mm sítu; voda se poté odstraní. 
Následně se v inkuba ční baňce v požadovaném pom ěru (viz oddíl 
1.9.1) smísí známé množství sedimentu a vody a sm ěs se připraví 
pro aklimatizaci (viz oddíl 1.8.4). U anaerobní studie musí být všechny kroky provád ěny s vylou čením přístupu kyslíku (29, 30, 
31, 32, 33).
 
1.8.3.3.  Skladování  
V každém p řípadě se doporu čuje používat čerstvě odebraný sediment 
a vodu; je-li však skladování nezbytné, sediment s vodou se proseje výše popsaným zp ůsobem a zalitý vodou (vrstva vody 6–10 cm) se 
skladuje v temnu p ři 4 ± 2
 o C (4) maximáln ě 4 týdny (7, 8, 23). 
Vzorky pro aerobní studie se skladují za volného p řístupu vzduchu 
(např. v otevřených nádobách), zatímco vzorky pro anaerobní studie 
se skladují s vylou čením přístupu kyslíku. P ři přepravě a skladování 
nesmí sediment a voda zmrznout a sediment nesmí být vysušován.  
1.8.4.  Příprava vzork ů sedimentu/vody ke zkoušce  
Před přidáním zkoušené látky musí prob ěhnout aklimatizace, p ři níž 
musí být vzorky sedimentu/vody umíst ěny v inkuba ční nádobě, která 
se použije p ři hlavní zkoušce; podmínky aklimatizace musí být 
totožné s podmínkami inkubace p ři zkoušce (viz oddíl 1.9.1). 
Doba aklimatizace je čas nezbytný pro dostate čnou stabilizaci 
systému, kterou lze posoudit podle pH, koncentrace kyslíku ve vodě, oxida čně-redukčního potenciálu sedimentu a vody 
a makroskopické separace fází. Doba aklimatizace není obvykle 
delší než jeden až dva týdny a nem ěla by překročit čtyři týdny. 
Výsledky m ěření provedených b ěhem této doby se uvedou ve 
zprávě.
 
1.9. PROVEDENÍ ZKOUŠKY  
1.9.1.  Zkušební podmínky  
Zkouška se provede v inkuba ční aparatu ře (viz oddíl 1.8.1) 
s poměrem objemu vody a sedimentu 3:1 až 4:1 a vrstvou sedimentu 
2,5 cm (± 0,5 cm) (  1 ). Doporu čené minimální množství sedimentu na 
inkubační nádobu je 50 g (hmotnost sušiny).  
Zkouška se provádí v temnu za konstantní teploty v rozmezí 10 až 
30 o C. Vhodná je teplota 20 ± 2  o C. Podle pot řeby lze p řípad od 
případu v závislosti na zam ěření zkoušky zvolit jinou, nižší teplotu 
(např. 10  o C). Inkuba ční teplota se sleduje a uvede se ve zpráv ě. ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Z nedávných studií vyplývá, že skladování p ři 4 o C může vést k poklesu obsahu orga ­
nického uhlíku v sedimentu, který by mohl p řípadně vést k poklesu mikrobiální aktivity.
 1.9.2.  Úprava zkoušené látky a její aplikace  
Použije se jedna zkušební koncentrace chemické látky (  1 ). 
U přípravků na ochranu rostlin aplikovaných p římo do vodního 
tělesa se použije maximální dávkování uvedené na etiket ě jako maxi ­
mální aplikovaná dávka vypo čtená podle plochy hladiny vody ve 
zkušební nádob ě. Ve všech ostatních p řípadech se použije koncent ­
race založená na odhadech emisí do životního prost ředí. Je třeba 
spolehlivě zajistit, aby byla aplikována dostate čná koncentrace zkou ­ 
šené látky pro charakterizaci postupu transformace a tvorby 
a odbourávání transforma čních produkt ů. v situaci, kdy se koncent ­
race zkoušené látky na za čátku studie blíží mezím detekce a/nebo 
kdy by nebylo možné detekovat hlavní transforma ční produkty, jsou- 
li přítomny v množství odpovídajícím 10 % výchozí aplikované 
dávky, m ůže být nezbytné aplikovat vyšší dávky (nap ř. desetkrát 
vyšší). Použité vyšší koncentrace však nesmí mít zna čně nepříznivé 
účinky na mikrobiální aktivitu voday/sedimentu. S cílem dosáhnout 
konstantní koncentrace v nádobách r ůzných rozm ěrů může být 
nezbytné upravit množství použitého materiálu, p řičemž se vychází 
z výšky vodního sloupce v nádob ě v poměru k hloubce vody 
v odběrovém míst ě (předpokládá se hloubka 100 cm, možná je 
však i jiná hloubka). P říklad výpo čtu je uveden v p říloze 4.  
V ideálním p řípadě se zkoušená látka aplikuje do vodné fáze zkou ­ 
šeného systému ve form ě vodného roztoku. Je-li to nevyhnutelné, je 
přípustné použít pro aplikaci a rozptýlení zkoušené látky malé množ ­
ství rozpoušt ědla mísitelného s vodou (nap ř. acetonu nebo ethanolu), 
avšak jeho množství by nem ělo překročit 1 % (obj.); rozpoušt ědlo by 
nemělo mít nep říznivé účinky na mikrobiální aktivitu ve zkušebním 
systému. P řípravě vodného roztoku zkoušené látky je t řeba věnovat 
pozornost a k zajišt ění naprosté homogenity m ůže být vhodné použít 
generátorové kolony a p ředem připravené sm ěsi. Po přidání vodného 
roztoku do zkušebního systému se doporu čuje vodnou fázi mírn ě 
promíchat tak, aby se sediment zví řil co nejmén ě. 
Použití komer čních úprav p řípravků se v zásad ě nedoporu čuje, neboť 
složky p řípravku mohou mít vliv na rozptýlení zkoušené látky 
a/nebo transforma čních produkt ů mezi vodu a sediment. U špatn ě 
rozpustných zkoušených látek však m ůže být použití komer ční 
úpravy vhodnou možností.  
Počet inkuba čních nádob závisí na po čtu interval ů, v nichž mají být 
prováděny odběry (viz oddíl 1.9.3). Je t řeba nasadit dostate čný počet 
zkušebních systém ů, aby bylo možné v každém intervalu vyhodnotit 
dva systémy. Použijí-li se pro každý systém voda/sediment kontrolní systémy, neexponují se zkoušené látce. Kontrolní systémy lze použít 
pro stanovení mikrobiální biomasy sedimentu a celkového organic ­
kého uhlíku ve vod ě na konci studie. Dva kontrolní systémy (tj. po 
jednom kontrolním systému z každého systému voda/sediment) mohou být použity pro sledování požadovaných parametr ů 
v sedimentu a ve vod ě v průběhu aklimatizace (viz tabulka 
v oddílu 1.8.2.2). Dva další kontrolní systémy musí být nasazeny za účelem měření nepříznivých ú činků na mikrobiální aktivitu ve 
zkušebním systému v p řípadě, že se zkoušená látka aplikuje pomocí 
rozpouštědla.
 ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Zkouška s druhou koncentrací m ůže být užite čná u chemických látek, které se dostávají 
do vod různými cestami, a vykazují tedy významn ě odlišné koncentrace, pokud lze nižší 
koncentraci analyzovat s dostate čnou správností.
 1.9.3.  Délka zkoušky a odb ěry vzork ů 
Délka experimentu by nem ěla překročit 100 dnů (6) a experiment by 
měl trvat tak dlouho, dokud se nestanoví zp ůsob rozkladu 
a rozptýlení ve vod ě/sedimentu, nebo dokud se transformací a/nebo 
těkáním nevy čerpá 90 % zkoušené látky. Odb ěr by měl být proveden 
nejméně šestkrát za sebou (v četně času 0), p řičemž vhodný režim 
odběrů a délka zkoušky se stanoví nepovinnou orienta ční studií (viz 
oddíl 1.9.4), nejsou-li k dispozici dosta čující údaje o zkoušené látce 
z dřívějších studií. U hydrofobních zkoušených látek m ůže být 
potřeba dodate čným vzorkováním v pr ůběhu počáteční fáze studie 
zjistit stupe ň rozptýlení mezi vodu a sediment.  
V příslušnou dobu se k analýze odebere celý obsah inkuba čních 
nádob (v četně duplikátních nádob). Sediment a voda nad 
sedimentem se analyzují zvláš ť ( 1 ). Voda se za minimálního zví ření 
sedimentu opatrn ě odebere. Vhodnými analytickými postupy se 
provedou extrakce a charakterizace zkoušené látky a transforma čních produkt ů. Je třeba také pe člivě shromáždit mate ­
riál, který m ůže být adsorbován na inkuba ční nádobě nebo ve spojo ­
vacích trubi čkách použitých k zachycení t ěkavých látek.
 
1.9.4.  Nepovinná orienta ční zkouška  
Nelze-li délku a režim odb ěrůodhadnout z jiných relevantních studií 
zkoušené látky, m ůže se provést p ředběžná zkouška za týchž zkušeb ­
ních podmínek, jaké jsou navrženy pro hlavní studii. P říslušné 
podmínky a výsledky orienta ční zkoušky, pokud byla provedena, 
by měly být stru čně uvedeny ve zpráv ě. 
1.9.5.  Měření a analýza  
Pro každý jednotlivý odb ěr se provede m ěření koncentrace zkoušené 
látky a transforma čních produkt ů ve vodě a v sedimentu a výsledky 
se uvedou ve zpráv ě (jako koncentrace a v procentech aplikovaného 
množství). V zásad ě by měla být při každém odb ěru provedena 
identifikace transforma čních produkt ů, které obsahují ≥ 10 % radio ­
aktivity aplikované do celého systému voda/sediment, nejsou-li dostatečné důvody pro jiný postup. M ěly by být také identifikovány 
transforma ční produkty, jejichž koncentrace se v pr ůběhu studie 
nepřetržitě zvyšuje, t řebaže nedosahuje výše uvedené meze, nebo ť 
to může znamenat, že se jedná o perzistentní produkty. Tento postup 
by měl být zvážen p řípad od p řípadu a ve zpráv ě by měl být 
odůvodněn.
 
Pro každý jednotlivý odb ěr se uvedou výsledky ze systém ů pro 
zachycování plyn ů/těkavých látek (CO  2 a jiných t ěkavých organic ­
kých slou čenin). Uvede se rychlost mineralizace. Pro každý jedno ­
tlivý odběr se uvedou neextrahovatelná (vázaná) rezidua v sedimentu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) Může-li snadno docházet k rychlé op ětovné oxidaci produkt ů anaerobní transformace, 
měly by být b ěhem odběru a analýzy zachovány anaerobní podmínky.
 2. ÚDAJE  
2.1. ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
Pro každý jednotlivý odb ěr se vypo čte celková látková bilance nebo 
výtěžnost (viz oddíl 1.7.1) p řidané radioaktivity. Výsledky se uvedou 
v procentech p řidané radioaktivity. Pro každý jednotlivý odb ěr se 
uvede rozptýlení radioaktivity mezi vodu a sediment (vyjád řeno 
v koncentracích a v procentech).  
Pro zkoušenou látku se vypo čítá poločas a hodnoty DT  50, případně 
hodnoty DT  75 a DT  90 a intervaly spolehlivosti t ěchto hodnot (viz 
oddíl 1.7.3). Vhodnými hodnotícími nástroji lze zjistit míru zániku 
zkoušené látky ve vod ě a v sedimentu. M ůže jít o použití zdánlivé 
kinetiky prvního řádu, o techniky proložení empirické k řivky za 
použití grafického nebo numerického řešení a o složit ější hodnocení, 
např. pomocí modelu s jednou nebo více složkami. Další podrobné 
informace lze získat z p říslušné publikované literatury (35, 36, 37).  
Všechny p řístupy mají své silné a slabé stránky a zna čně se liší 
z hlediska komplexnosti. Použití kinetiky prvního řádu může být 
sice přílišným zjednodušením procesu rozkladu a distribuce, vede 
však v ideálním p řípadě k hodnotám (rychlostní konstant ě nebo 
poločasu), které jsou snadno srozumitelné a mají význam pro simu ­
lační modelování a výpo čet předpokládaných koncentrací v životním 
prostředí. Empirický p řístup nebo lineární transformace mohou vést 
k lepšímu proložení dat k řivkami, a tedy k lepšímu odhadu polo časů, 
hodnot DT  50, případně DT  75 a DT  90 . Použití odvozených konstant 
však má své meze. Složkové modely mohou poskytovat řadu užiteč­
ných konstant, které jsou d ůležité pro posouzení rizika a pro popis 
rozkladu chemické látky v r ůzných složkách a pro její distribuci. 
Použijí se rovn ěž pro odhad rychlostních konstant tvorby 
a rozkladu hlavních transforma čních produkt ů. v každém p řípadě 
však musí být volba metody od ůvodněna a experimentátor by m ěl 
graficky nebo statisticky prokázat její oprávn ěnost.  
3. ZPRÁVY  
3.1. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol musí obsahovat následující informace:  
Zkoušená látka:  
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (s 
uvedením polohy zna čícího nuklidu u látek zna čených radionu ­
klidy) a relevantní fyzikáln ě-chemické vlastnosti,  
— čistota zkoušené látky (obsah ne čistot),  
— popřípadě radiochemická čistota zna čené chemické látky 
a molární aktivita.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Referenční látky:  
— chemický název a struktura referen čních látek použitých 
k charakterizaci a/nebo identifikaci transforma čního produktu.  
Zkušební sedimenty a vody:  
— lokalita a popis místa/míst odb ěru sedimentu a vody, pokud 
možno včetně dřívější kontaminace,  
— všechny informace týkající se odb ěru, případného skladování 
a aklimatizace systému voda/sediment,  
— charakteristiky vzork ů systému voda/sediment, jak jsou uvedeny 
v tabulce v oddílu 1.8.2.2.  
Zkušební podmínky:  
— použitý zkušební systém (nap ř. průtokový systém, biometrický 
systém, zp ůsob provzduš ňování, míchání, objem vody, hmotnost 
sedimentu, tlouš ťka vrstvy vody i sedimentu, rozm ěry zkušeb ­
ních nádob atd.),  
— aplikace zkoušené látky do systému: použitá zkušební koncent ­
race, počet duplikátních vzork ů a kontrol, zp ůsob aplikace zkou ­ 
šené látky (nap ř. případné použití rozpoušt ědla) atd.,  
— inkuba ční teplota,  
— doby odb ěru, 
— metody extrakce a ú činnosti extrakce, analytické metody a meze 
detekce,  
— metody charakterizace/identifikace transforma čních produkt ů, 
— odchylky od zkušebního postupu nebo zkušebních podmínek.  
Výsledky:  
— původní číselná data reprezentativních analýz (všechna p ůvodní 
data musí být uložena v archivu vedeném podle zásad správné 
laboratorní praxe),  
— opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod,  
— hodnoty výt ěžnosti (hodnoty v % pro platnou studii jsou uvedeny 
v oddíle 1.7.1),  
— výsledky pro zkoušenou látku, pop řípadě i pro transforma ční 
produkty a neextrahovatelnou radioaktivitu, zpracované 
v tabulkové form ě a vyjád řené v % aplikované dávky a v 
mg/kg pro vodu, sediment a celý systém (pouze v %),  
— látková bilance b ěhem studií na jejich konci,  
— grafické schéma transformace ve vod ě a sedimentu a v celém 
systému (v četně mineralizace),  
— rychlosti mineralizace,  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— poločas, hodnoty DT  50 a popřípadě DT  75 a DT  90 pro zkoušenou 
látku, pop řípadě i pro hlavní transforma ční produkty, v četně 
intervalů spolehlivosti, pro vodu, sediment a celý systém,  
— charakteristika kinetiky transformace zkoušené látky, pop řípadě 
i hlavních transforma čních produkt ů, 
— případný návrh zp ůsobu transformace,  
— diskuse o výsledcích.  
4. LITERATURA  
1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. 
Germany.
 
2) Commission for registration of pesticides: Application for regis ­
tration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product 
and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
 
3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guide ­
line for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United King ­
dom.
 
4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic 
(Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. 35–37.  
5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162–3, Anaerobic aquatic metabolism.
 
6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. (ed. Dr. Mark R. Lynch.) SETAC-Europe, Brussels.
 
7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, 
Italy, 18–20 January 1995.  
8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments.  
9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080.  
10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
11) T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants.  Pure Appl. Chem . 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(přijato 12. kv ětna 1981).  
13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C., Spiteller M. (1988) Degra ­
dation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – 
Pests and Diseases, 3B-4, 149–158.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
15) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(ed. D. H. Hutson, T. R. Roberts), Vol. 1, 85–114. J. Wiley & Sons.
 
16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocula ­
tion and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil.  Environ. Toxicol. Chem . 16, 
631–637.  
17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C- 
labelled model surfactants.  Water Research  21, 661–667.  
18) Black, C. A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and 
Wastewater (17. vyd.). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
 
20) Rowell, D. L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
21) Light, T. S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements.  Anal. Chem.  44, 1038–1039.  
22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests“, 3.–4. června 1991.
 
23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8.–10. listopadu 1993. (ed. I. R. Hill, 
P. Matthiessen, F. Heimbach).
 
24) Vink, J. P. M., van der Zee, S. E. A. T. M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of 
environmental factors at field sites.  Water Research  31, 
2858–2868.  
25) Vink, J. P. M., Schraa, G., van der Zee, S. E. A. T. M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters.  Environ. Toxicol , 329–338.  
26) Anderson, T. H., Domsch, K. H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions.  Soil Biol. Biochem . 17, 197–203.
 
27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
28) Beelen, P. Van, F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic 
Sediment from the River Rhine.  Hydrobiol. Bull . 24 (1), 13–21.  
29) Shelton, D. R., Tiedje, J. M. (1984). General method for deter ­
mining anaerobic biodegradation potential.  App. Environ. 
Microbiol . 47, 850–857.  
30) Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H., Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation.  Chemosphere , 19, 
1527–1550.
 
31) Pagga, U., Beimborn, D. B. (1993). Anaerobic biodegradation 
tests for organic compounds.  Chemoshpere , 27, 1499–1509.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
32) Nuck, B. A., Federle, T. W. (1986). A batch test for assessing 
the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions.  Environ. Sci. Technol . 30, 
3597–3603.  
33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemi ­
cals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 
712-C-98-090.  
34) Sijm, Haller, Schrap (1997). Influence of storage on sediment 
characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants.  Bulletin Environ. Contam. Toxicol . 58, 
961–968.
 
35) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986) Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187–203.
 
36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47–60.  
37) Carlton, R.R., Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Dise ­
ases, 1349–1354.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
DODATEK 1  
POKYNY K AEROBNÍM A ANAEROBNÍM ZKUŠEBNÍM SYSTÉM ŮM 
Aerobní zkušební systém  
Aerobní zkušební systém popsaný v této zkušební metod ě se skládá z aerobní 
vodní vrstvy (typická koncentrace kyslíku v rozmezí od 7 do 10 mg/l) a vrstvy 
sedimentu, která je na povrchu aerobní a pod povrchem anaerobní (typické 
průměrné oxida čně-redukční potenciály ( E h ) v anaerobní zón ě sedimentu jsou 
v rozmezí – 80 až – 190 mV). Nad vodní hladinu v každé inkuba ční jednotce 
se zavádí zvlh čený vzduch, aby se v prostoru pod ví čkem udržovala dostate čná 
koncentrace kyslíku.  
Anaerobní zkušební systém  
Pro anaerobní zkušební systém je zkušební postup v podstat ě tentýž, jako postup 
popsaný pro aerobní systém, liší se však tím, že nad hladinu vody v každé 
inkubační jednotce se zavádí zvlh čený dusík, aby se udržovala jeho koncentrace 
v prostoru pod ví čkem. Sediment a voda jsou považovány za anaerobní, pokud je 
oxidačně-redukční potenciál ( E h ) nižší – 100 mV.  
V anaerobní zkoušce se mineralizace posuzuje na základ ě měření uvoln ěného 
oxidu uhli čitého a methanu.  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
DODATEK 2  
PŘÍKLAD SKLEN ĚNÉ PRŮTOKOVÉ APARATURY
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
DODATEK 3  
PŘÍKLAD BIOMETRICKÉ APARATURY
  ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
DODATEK 4  
PŘÍKLAD VÝPO ČTU DÁVKY APLIKOVANÉ DO ZKUŠEBNÍCH 
NÁDOB  
Vnitřní průměr válce: = 8 cm 
Výška vodního sloupce bez sedimentu: = 12 cm Plocha hladiny: 3,142 × 4
 2 = 50,3 cm  2 
Dávkování: 500 g zkoušené látky na ha odpo ­
vídá 5 μg/cm  2 
Celkové množství v μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Přepočet celkového množství na hloubku 
100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Objem vodního sloupce: 50,3 × 12 = 603 ml 
Koncentrace ve vod ě: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml nebo 50 μg/l ▼B 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25  AEROBNÍ MINERALIZACE V POVRCHOVÉ VOD Ě – 
SIMULA ČNÍ ZKOUŠKA BIOLOGICKÉHO ROZKLADU  
1. METODA  
Tato metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 309 (2004) (1).  
1.1 ÚVOD  
Cílem této zkoušky je zm ěřit časový průběh biologického rozkladu 
zkoušené látky p ři nízké koncentraci v aerobní p řírodní vod ě 
a kvantifikovat pozorování ve form ě výrazů pro kinetickou rychlost. 
Tato simula ční zkouška je dávková zkouška v laboratorní t řepací 
lahvi pro stanovení rychlostí aerobního biologického rozkladu orga ­
nických látek ve vzorcích p řírodní povrchové vody (sladkovodní, 
brakické nebo mo řské). Je založena na ISO/DIS 14592–1 (2) 
a rovněž obsahuje prvky ze zkušebních metod C.23 a C.24 (3) (4). 
Volitelně při dlouhých zkušebních časech je dávkové zkoušení 
nahrazeno polospojitou zkouškou s cílem zabránit zhoršení zkušeb ­
ního mikrokosmu. Základním cílem simula ční zkoušky je ur čit mine­
ralizaci zkoušené látky v povrchové vod ě a mineralizace tvo ří 
základnu pro vyjád ření kinetiky rozkladu. Ovšem volitelným sekun ­
dárním cílem zkoušky je získat informace o primárním rozkladu a tvorbě významn ějších transforma čních produkt ů. Určení transfor ­
mačních produkt ů, a bude-li to možné, kvantitativní stanovení jejich 
koncentrací jsou zvlášt ě důležité pro látky, které jsou velmi pomale 
mineralizované (nap ř. s poločasy pro celkový zbytkový
 14 C překra­ 
čující 60 dn ů). Pro určení a kvantitativní stanovení významn ějších 
transforma čních produkt ů by se vzhledem k analytickým omezením 
měly obvykle používat vyšší koncentrace zkoušené látky (nap ř. 
> 100 μg/l). 
Nízká koncentrace v této zkoušce znamená koncentraci (nap ř. méně 
než 1 μg/l až 100 μg/l), která je dostate čně nízká na to, aby zajistila, 
že kinetika biologického rozkladu získaná ve zkoušce odráží kinetiku 
očekávanou v životním prost ředí. V porovnání s celkovou hmotností 
biologicky rozložitelných uhlíkových substrát ů dostupných 
v přírodní vod ě používané pro zkoušku slouží zkoušená látka 
přítomná v nízké koncentraci jako sekundární substrát. To znamená, 
že očekávaná kinetika biologického rozkladu je prvního řádu („ne­
růstová“ kinetika) a že zkoušená látka m ůže být rozkládána „spolu ­
metabolismem“. Z kinetiky prvního řádu vyplývá, že rychlost 
rozkladu (mg/l/den) je p římo úměrná koncentraci substrátu, která 
s časem klesá. P ři opravdové kinetice prvního řádu je specifická 
rychlostní konstanta rozkladu,  k, nezávislá na času a koncentraci. 
To znamená, že  k se znateln ě nemění během doby experimentu 
a nemění se s rostoucí koncentrací b ěhem experiment ů. Z definice 
je specifická rychlostní konstanta rozkladu rovna relativní zm ěně 
koncentrace za čas: k = (1/ C) · (dC/dt). Ačkoliv se za p ředepsaných 
podmínek normáln ě očekává kinetika prvního řádu, mohou nastat 
určité okolnosti, za kterých se projeví kinetiky jiných řádů. Odchylky 
od kinetiky prvního řádu lze pozorovat nap říklad tehdy, jestliže 
rychlost biologické transformace omezuje spíše než biologická reakční rychlost jev spojený s p řenosem hmoty, nap říklad rychlost 
difuse. Ovšem údaje lze tém ěř vždy popsat kinetikou pseudoprvního 
řádu a přijmout rychlost závislou na koncentraci jako konstantní.
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Informace o biologické rozložitelnosti zkoušené látky p ři vyšších 
koncentracích (nap ř. ze standardních screeningových zkoušek) 
společně s informacemi o abiotické rozložitelnosti, transforma čních 
produktech a relevantních fyzikáln ě-chemických vlastnostech by 
měly být dostupné p řed zkouškou jako pom ůcka pro vypracování 
plánu experimentu a interpretaci výsledk ů. Použití zkoušených 
látek značených isotopem  14 C a stanovení fázové distribuce  14 C na 
konci zkoušky umož ňuje stanovení úplné biologické rozložitelnosti. 
Při použití nezna čené zkoušené látky lze úplný biologický rozklad 
pouze odhadovat, pokud se zkouší vyšší koncentrace a jsou známy 
všechny významn ější transforma ční produkty.  
1.2 DEFINICE  
Primární biologický rozklad : strukturální zm ěna (transformace) 
chemické látky p ůsobením mikroorganism ů, která má za následek 
ztrátu chemické identity.  
Funkční biologický rozklad : strukturální zm ěna (transformace) 
chemické látky p ůsobením mikroorganism ů, která má za následek 
ztrátu specifické vlastnosti.  
Úplný aerobní biologický rozklad : rozložení chemické látky p ůso­
bením mikroorganism ů za přítomnosti kyslíku na oxid uhli čitý, vodu 
a minerální soli jakýchkoli jiných p řítomných prvk ů (mineralizace) 
a tvorba nové biomasy a organických mikrobiálních produkt ů 
biologické syntézy.  
Mineralizace : rozložení chemické látky nebo organické hmoty p ůso­
bením mikroorganism ů za přítomnosti kyslíku na oxid uhli čitý, vodu 
a minerální soli jakýchkoli jiných p řítomných prvk ů. 
Fáze iniciace : doba od po čátku zkoušky do dosažení adaptace 
rozkládajících mikroorganism ů a zvýšení stupn ě biologického 
rozkladu chemické látky nebo organické hmoty na detekovatelnou 
úroveň (např. 10 % maximálního teoretického biologického rozkladu 
nebo nižší v závislosti na p řesnosti techniky m ěření). 
Maximální úrove ň biologického rozkladu : stupeň biologického 
rozkladu chemické látky nebo organické hmoty p ři zkoušce uvád ěný 
v procentech, p ři jehož překročení neprobíhá b ěhem zkoušky žádný 
další biologický rozklad.  
Primární substrát : soubor p řírodního uhlíku a zdroj ů energie, který 
zajišťuje růst a udržování mikrobiální biomasy.  
Sekundární substrát : substrátová složka p řítomná v tak nízké 
koncentraci, že svými rozkladem dodává pouze nevýznamná množ ­
ství uhlíku a energie kompetentním mikroorganism ům v porovnání 
s uhlíkem a energií dodávanou rozkladem hlavních složek substrátu (primárních substrát ů).
 
Rychlostní konstanta rozkladu : rychlostní konstanta kinetiky prvního 
nebo pseudoprvního řádu, k (d –1 ), která ukazuje rychlost rozkladných 
procesů. U dávkového experimentu se  k odhaduje z po čáteční části 
rozkladové k řivky získané po ukon čení fáze iniciace.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Poločas, t 1/2 (d): termín používaný pro charakteristiku rychlosti 
reakce prvního řádu. Je to časový interval, který odpovídá poklesu 
koncentrace na polovinu. Polo čas a rychlostní konstanta rozkladu 
jsou ve vzájemném vztahu vyjád řeném rovnicí  t 1/2 = ln2/ k. 
Poločas rozkladu, DT  50 (d): termín používaný pro kvantifikaci 
výsledků zkoušek biologického rozkladu. Je to časový interval 
včetně fáze iniciace pot řebný k dosažení 50 % biologického 
rozkladu.  
Mez detekce (LOD) a mez kvantifikace (LOQ) : Mez detekce 
(LOD) je koncentrace látky, pod níž nelze totožnost látky rozlišit od analytických artefakt ů. Mez kvantifikace (LOQ) je koncentrace 
látky, pod níž nelze koncentraci ur čit s přijatelnou p řesností.
 
Rozpuštěný organický uhlík ( dissolved organic carbon , DOC) : ta 
část organického uhlíku ve vzorku vody, kterou nelze odstranit 
stanovenou fázovou separací, nap říklad odst řeďováním po dobu 
15 minut p ři zrychlení 40 000 ms  –2 nebo membránovou filtrací 
pomocí membrán s póry o pr ůměru 0,2 μm až 0,45 μm. 
Celková aktivita organického  14 C (total organic  14 C activity , 
TOA) : Celková aktivita  14 C spojená s organickým uhlíkem.  
Aktivita rozpušt ěného organického  14 C (dissolved organic  14 C 
activity , DOA) : Celková aktivita  14 C spojená s rozpušt ěným orga ­
nickým uhlíkem.  
Aktivita částicového organického  14 C (particulate organic  14 C 
activity , POA) : Celková aktivita  14 C spojená s částicovým orga ­
nickým uhlíkem.  
1.3 POUŽITELNOST ZKUŠEBNÍ METODY  
Tato simula ční zkouška je použitelná pro net ěkavé nebo slab ě těkavé 
organické látky zkoušené p ři nízkých koncentracích. P ři použití 
baněk otevřených do atmosféry (nap ř. se zátkou z vaty) lze látky 
s Henryho konstantou nižší než 1 Pa ·m 3 /mol (přibližně 10 –5 atm·m 3 /­
mol) považovat za prakticky net ěkavé. Při použití uzav řených ban ěk 
s dostatečným volným prostorem nad látkou je možné zkoušet mírn ě 
těkavé látky (s Henryho konstantami < 100 Pa ·m 3 /mol nebo < 10  –3 
atm·m 3 /mol) beze ztrát ve zkušebním systému. P ři odstraňování CO  2 
může dojít ke ztrátám látek zna čených isotopem  14 C, pokud nejsou 
přijata správná p ředběžná opatření. V takových situacích m ůže být 
nezbytné jímat CO  2 v interním absorbéru s alkálií nebo použít 
externí systém pro absorpci CO  2 (přímé stanovení  14 CO 2 , viz 
dodatek 3). Pro stanovení kinetiky biologického rozkladu musí být 
koncentrace zkoušené látky nižší než její rozpustnost ve vod ě. Je 
však nutné uvést, že hodnoty rozpustnosti ve vod ě uváděné 
v literatu ře mohou být významn ě vyšší než rozpustnost zkoušené 
látky v přírodních vodách. P řípadně lze stanovit rozpustnost zkouše ­
ných látek se zvlášt ě špatnou rozpustností ve vod ě pomocí zkušeb ­
ních přírodních vod.  
Tuto metodu lze použít pro simulování biologického rozkladu 
v povrchové vod ě bez hrubých částic („pelagická zkouška“) nebo 
ve zkalené povrchové vod ě, která by nap říklad mohla existovat 
v blízkosti rozhraní voda/sediment („zkouška se suspendovanými 
sedimenty“).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4 PODSTATA ZKOUŠKY  
Zkouška se provádí v dávce inkubací zkoušené látky bu ď pouze 
s povrchovou vodou („pelagická zkouška“), nebo povrchovou vodou dopln ěnou suspendovanými pevnými látkami/sedimenty 
o suché hmotnosti 0,01 až 1 g/l („zkouška se suspendovanými 
sedimenty“) pro simulaci vodní hmoty se suspendovanými pevnými látkami nebo resuspendovanými sedimenty. Koncentrace suspendo ­
vaných pevných látek/sediment ů v nižším rozmezí tohoto intervalu je 
typická pro v ětšinu povrchových vod. Zkušební ba ňky se inkubují ve 
tmě za teploty okolí za aerobních podmínek a míchání. Pro stanovení 
kinetiky rozkladu je zapot řebí použít nejmén ě dvou odlišných 
koncentrací zkoušené látky. Koncentrace by se m ěly navzájem lišit 
faktorem 5 až 10 a m ěly by představovat o čekávané rozmezí koncen ­
trací v životním prost ředí. Maximální koncentrace zkoušené látky by 
neměla překročit 100 μg/l, ale dává se p řednost maximálním koncen ­
tracím nižším než 10 μg/l, aby se zajistilo, že biologický rozklad 
dodržuje kinetiku prvního řádu. Nejnižší koncentrace by nem ěla 
překročit 10 μg/l, ale dává se p řednost nejnižším zkušebním koncen ­
tracím 1–2 μg/l nebo mén ě než 1 μg/l. Normáln ě lze odpovídající 
analýzy takové nízké koncentrace provést pomocí komer čně dostup­
ných látek zna čených isotopem
 14 C. Kvůli analytickým omezením je 
často nemožné zm ěřit koncentraci zkoušené látky s požadovanou 
přesností, pokud se zkoušená látka používá v koncentraci ≤ 100 
μg/l (viz bod 1.7.2 druhý odstavec). Vyšší koncentrace zkoušené 
látky (> 100 μg/l a někdy > 1 mg/l) lze použít pro indentifikaci 
a stanovení množství významn ějších transforma čních produkt ů, 
nebo není-li k dispozici specifická analytická metoda s nízkou 
mezí detekce. Jestliže se zkouší vysoké koncentrace zkoušené látky, 
nemusí být použití výsledk ů pro odhad rozkladové konstanty prvního 
řádu a polo času možné, protože rozklad pravd ěpodobně nebude 
probíhat podle kinetiky prvního řádu. 
Rozklad je sledován v p říslušných časových intervalech m ěřením 
zbytkového  14 C nebo zbytkové koncentrace zkoušené látky p ři 
použití specifické chemické analýzy. Zna čení nejstabiln ější části 
molekuly isotopem  14 C zaručuje určení celkové mineralizace, 
zatímco zna čení méně stabilní části molekuly isotopem  14 C společně 
s využitím specifické analýzy umož ňuje hodnotit pouze primární 
biologický rozklad. Ovšem nejstabiln ější část nemusí nutn ě obsa­
hovat relevantní funk ční část molekuly (kterou lze vztahovat ke 
konkrétní vlastnosti, nap říklad toxicit ě, bioakumulaci atd.). 
V tomto p řípadě může být vhodné použít zkoušenou látku, která je 
značena isotopem  14 C, ve funk ční části ke sledování eliminace 
konkrétní vlastnosti.  
1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
V této zkoušce lze použít jak zkoušené látky zna čené radioisotopy, 
tak látky nezna čené. Doporu čuje se metoda zna čení isotopem  14 C, 
přičemž značena by obvykle m ěla být nejstabiln ější část (části) mole ­
kuly (viz také bod 1.4). U látek obsahujících více než jeden aroma ­
tický kruh by se isotopem  14 C měly nejlépe ozna čit jeden či více 
uhlíků v každém kruhu. Dále by se isotopem  14 C měl nejlépe ozna čit 
jeden či více uhlík ů na obou stranách snadno rozložitelných vazeb. 
Chemická a/nebo radiochemická čistota zkoušené látky by m ěla být 
> 95 %. U radioisotopov ě značených látek se dává p řednost speci ­
fické aktivit ě přibližně 50 μCi/mg (1,85 MBq) nebo více, aby se 
usnadnila m ěření 14 C u zkoušek provád ěných s nízkými po čátečními 
koncentracemi. O zkoušené látce by m ěly být k dispozici následující 
informace:  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— rozpustnost ve vod ě (metoda A.6),  
— rozpustnost v organickém(ých) rozpoušt ědle(ch) (látky používané 
s rozpoušt ědlem nebo s nízkou rozpustností ve vod ě), 
— disocia ční konstanta (p K a ), jestliže látka podléhá protonaci nebo 
deprotonaci (Pokyn OECD pro zkoušení 112) (5),  
— tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta,  
— chemická stálost ve vod ě a ve tm ě (hydrolýza) (metoda C.7).  
Zkouší-li se v mo řské vodě látky špatn ě rozpustné ve vod ě, může být 
rovněž užitečné znát vysolovací konstantu (neboli „Se čenovovu 
konstantu“)  K s , která je definována výrazem: log ( S/S') = K s C m , 
kde S je rozpustnost látky ve sladké vod ě a S' v mořské vodě, 
a C m je molární koncentrace soli.  
Jestliže se zkouška provádí jako „zkouška se suspendovanými 
sedimenty“, m ěly by být k dispozici rovn ěž následující informace:  
— rozdělovací koeficient oktanol-1-ol/voda (metoda A.8),  
— adsorp ční koeficient (metoda C.18).  
Mezi další užite čné informace pat ří: 
— koncentrace v životním prost ředí, je-li známá nebo odhadnutá,  
— toxicita zkoušené látky pro mikroorganismy (metoda C.11),  
— snadná a/nebo vlastní biologická rozložitelnost (metody C.4 A–F, 
C.12, C.9, Pokyn OECD pro zkoušení 302 (5)),  
— aerobní nebo anaerobní biologická rozložitelnost v p ůdě a studie 
transformace v systémech voda/sediment (metody C.23, C.24).  
1.6 REFEREN ČNÍ LÁTKA  
Jako referen ční látka by se m ěla používat látka, která se za aerobních 
podmínek obvykle snadno rozkládá (nap ř. anilin nebo benzoát 
sodný). O čekávaný časový interval pro rozklad anilinu a benzoátu 
sodného je obvykle mén ě než 2 týdny. Ú čelem referen čních látek je 
zajistit, aby byla mikrobiální aktivita zkušební vody v ur čitých 
mezích, tj., aby voda obsahovala aktivní mikrobiální populaci.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7 KRITÉRIA JAKOSTI  
1.7.1  Výt ěžnost  
Bezprostředně po přidání zkoušené látky je t řeba ověřit každou po čá­
teční zkušební koncentraci m ěřením aktivity  14 C nebo – v p řípadě 
neznačených látek – chemickými analýzami vždy nejmén ě 
v duplikátních vzorcích. Takto se získají informace o použitelnosti a opakovatelnosti analytické metody a o homogenit ě distribuce zkou ­ 
šené látky. V následných analýzách údaj ů se obvykle namísto nomi ­
nální koncentrace použije spíše nam ěřená počáteční aktivita
 14 C nebo 
koncentrace zkoušené látky, nebo ť se jejich použitím kompenzují 
ztráty zp ůsobené sorpcí a chybami p ři dávkování. U zkoušené 
látky zna čené isotopem  14 C se hodnota výt ěžnosti na konci experi ­
mentu udává pomocí hmotnostní bilance (viz bod 1.8.9.4 poslední odstavec). V ideálním p řípadě by se hmotnostní bilance radioisoto ­
pově značené látky m ěla pohybovat od 90 % do 110 %, zatímco 
analytická p řesnost by m ěla vést k po čáteční výtěžnosti od 70 % do 
110 % pro nezna čené zkoušené látky. Tato rozmezí je zapot řebí 
vykládat jako cíle a nem ěla by se používat jako kritéria pro p řijetí 
zkoušky. P řípadně lze analytickou p řesnost stanovit pro zkoušenou 
látku při nižší koncentraci, než je koncentrace po čáteční, a pro 
významnější transforma ční produkty.
 
1.7.2  Opakovatelnost a citlivost analytické metody  
Opakovatelnost analytické metody (v četně účinnosti první extrakce) 
pro kvantitativní stanovení zkoušené látky a p řípadně transforma č­
ních produkt ů by se měla ověřit pěti opakovanými analýzami jedno ­
tlivých extrakt ů povrchové vody.  
Mez detekce (LOD) analytické metody pro zkoušenou látku a pro 
transforma ční produkty by m ěla být pokud možno alespo ň 1 % 
počátečního množství použitého ve zkušebním systému. Mez kvan ­
tifikace (LOQ) by se m ěla rovnat nebo být menší než 10 % použité 
koncentrace. Chemické analýzy mnoha organických látek a jejich 
transforma čních produkt ů často vyžadují, aby se zkoušená látka 
používala v relativn ě vysoké koncentraci, tj. > 100 μg/l. 
1.8 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY  
1.8.1  Vybavení  
Zkoušku lze provád ět v Erlenmeyerových ba ňkách nebo válcových 
nádobách vhodné kapacity (nap ř. 0,5 nebo 1,0 litru) uzav řených 
silikonovou nebo pryžovou zátkou nebo v ba ňkách na sérum 
s víky těsnícími proti úniku CO  2 (např. opatřené septou z butylové 
pryže). Další možností je provád ět zkoušku pomocí více ban ěk 
a používat jako vzorek celý objem vždy nejmén ě dvou ban ěk 
v každém intervalu odb ěru vzorku (viz bod 1.8.9.1 poslední odsta ­
vec). Pro net ěkavé zkoušené látky, které nejsou radioisotopov ě ozna­ 
čeny, nejsou nutné plynot ěsné zátky nebo víka; vhodné jsou volné 
vatové zátky, které brání kontaminaci ze vzduchu (viz bod 1.8.9.1 druhý odstavec). Lehce t ěkavé látky by m ěly být zkoušeny 
v systému biometrického typu s jemným mícháním povrchu vody. 
Aby se zajistilo, že nedojde k bakteriální kontaminaci, lze nádoby 
před použitím p řípadně sterilizovat oh řevem nebo autoklávováním. 
Dále se používá toto standardní laboratorní vybavení:
 
— desková t řepačka nebo magnetické mícha čky pro nep řetržité 
míchání zkušebních ban ěk, ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— odstředivka,  
— pH-metr,  
— turbidimetr pro nefelometrická m ěření turbidity (zákalu),  
— pec nebo mikrovlnná pec pro stanovení suché hmotnosti,  
— membránový filtra ční přístroj,  
— autokláv nebo pec pro tepelnou sterilizaci sklen ěného nádobí,  
— zařízení pro manipulaci s látkami zna čenými isotopem  14 C, 
— zařízení pro kvantifikaci aktivity  14 C ve vzorcích z roztok ů pro 
s jímaným CO  2 a, bude-li to nutné, ze vzork ů sediment ů, 
— analytické vybavení pro ur čení zkoušené (a referen ční) látky, 
jestliže se použije specifická chemická analýza (nap ř. plynový 
chromatograf, chromatograf pro vysokotlakou kapalinovou chro ­
matografii).  
1.8.2  Zásobní roztoky zkoušené látky  
Pro přípravu zásobních roztok ů zkoušených a referen čních látek se 
používá deionizovaná voda (viz bod 1.8.7 první odstavec). Deioni ­
zovaná voda by m ěla být zbavená látek, které mohou být toxické pro 
mikroorganismy a podíl rozpušt ěného organického uhlíku (DOC) by 
neměl být vyšší než 1 mg/l (6).  
1.8.3  Odb ěr a přeprava povrchové vody  
Místo odb ěru povrchové vody by m ělo být vybráno podle ú čelu 
zkoušky v dané situaci. P ři výběru míst odb ěru musí být p řihlédnuto 
k historii p řípadných zem ědělských, pr ůmyslových nebo domácích 
vstupů. Jestliže je známo, že bylo vodní prost ředí v předchozích 
čtyřech letech kontaminováno zkoušenou látkou nebo jejími struk ­
turními analogy, nem ělo by se používat k odb ěru zkušební vody, 
s výjimkou p řípadů, kdy je zkoumání rychlostí rozkladu v d říve 
exponovaných místech výslovným ú čelem zkoušejícího. V míst ě 
odběru by se m ěly změřit pH a teplota vody. Dále je t řeba zazna ­
menat hloubku odb ěru a vzhled vzorku vody (nap ř. barva a turbidita) 
(viz bod 3). M ěly by se m ěřit koncentrace kyslíku a/nebo oxida čně- 
redukční potenciál ve vod ě a v povrchové vrstv ě sedimentu s cílem 
prokázat aerobní podmínky, s výjimkou p řípadů, kdy je jejich exis ­
tence patrná ze vzhledu a historické zkušenosti s daným místem. 
Povrchová voda by se m ěla přepravovat v d ůkladně vyčištěném 
zásobníku. B ěhem přepravy by teplota vzorku nem ěla významn ě 
překračovat teplotu použitou p ři zkoušce. Doporu čuje se chlazení 
na 4 °C, pokud trvání p řepravy překračuje 2 až 3 hodiny. Vzorek 
vody se nesmí zmrazit.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4  Skladování a p říprava povrchové vody  
Zkouška by m ěla být nejlépe zahájena do jednoho dne po odb ěru 
vzorku. Skladování vody, je-li nutné, by se m ělo minimalizovat 
a nesmí v žádném p řípadě překračovat maximální hranici 4 týdn ů. 
Vzorek vody je zapot řebí skladovat až do použití p ři teplotě 4 °C za 
provzdušňování. Před použitím je t řeba odstranit hrubé částice, nap ř. 
filtrací přes nylonový filtr s velikostí ok okolo 100 μm nebo p řes 
hrubý papírový filtr, p řípadně sedimentací.  
1.8.5  Příprava vody dopln ěné sedimentem (nepovinné)  
Pro zkoušku se suspendovanými sedimenty se do ban ěk obsahujících 
přírodní vodu (p řefiltrovanou za ú čelem odstran ění hrubých částic, 
jak je popsáno v bod ě 1.8.4) p řidává povrchový sediment, aby 
vznikla suspenze; koncentrace suspendovaných pevných látek by 
měla být v rozmezí 0,01 až 1 g/l. Povrchový sediment by m ěl 
pocházet ze stejného místa, z n ěhož byl odebrán vzorek vody. 
V závislosti na konkrétním vodním prost ředí může být povrchový 
sediment bu ď charakterizován vysokým obsahem organického uhlíku 
(2,5–7,5 %) a jemnou strukturou, nebo nízkým obsahem organického 
uhlíku (0,5–2,5 %) a hrubou strukturou (3). Povrchový sediment lze připravit následovn ě: odeberte n ěkolik jader sedimentu pomocí 
zkumavky z pr ůhledného plastu, bezprost ředně po odběru vzorku 
oddělte horní aerobní vrstvy (od povrchu do hloubky maximáln ě 
5 mm) a smiste je. Výsledný vzorek sedimentu by m ěl být přepra­
vován v zásobníku s velkým vzduchovým prostorem nad sedimen ­
tem, aby se sediment udržel za aerobních podmínek (chladit na 4 °C, 
jestliže doba p řepravy překračuje 2 až 3 hodiny). Vzorek sedimentu 
by měl být suspendován ve zkušební vod ě v poměru 1:10 a do 
použití skladován p ři teplotě 4 °C za provzduš ňování. Skladování 
sedimentu, je-li nutné, by se m ělo minimalizovat a nesmí v žádném 
případě překračovat maximální hranici 4 týdn
ů. 
1.8.6  Polospojitý postup (nepovinné)  
Jestliže nastává dlouhá fáze iniciace p řed tím, než je možné m ěřit 
významný rozklad zkoušené látky, m ůže být nezbytná prodloužená 
inkubace (n ěkolik měsíců). Pokud je tato skute čnost z předchozího 
zkoušení látky známa, zkoušku lze zahájit používáním polospojitého 
postupu, který umož ňuje pravidelné obnovování části zkušební vody 
nebo suspenze (viz dodatek 2). Alternativn ě lze normální dávkovou 
zkoušku zm ěnit na polospojitou zkoušku, pokud nebylo dosaženo 
rozkladu zkoušené látky p řibližně během 60 dn ů zkoušení 
s využitím dávkového postupu (viz bod 1.8.8.3 druhý odstavec).  
1.8.7  Přidání zkoušené (nebo referen ční) látky  
U látek s vysokou rozpustností ve vod ě (> 1 mg/l) a nízkou t ěkavostí 
(Henryho konstanta < 1 Pa ·m 3 /mol nebo < 10  –5 atm·m 3 /mol) lze 
připravit zásobní roztok v deionizované vod ě (viz bod 1.8.2), vhodný 
objem zásobního roztoku se p řidává do zkušebních nádob pro dosažení 
požadované koncentrace. Objem jakéhokoliv p řidaného zásobního 
roztoku je t řeba omezit na co nejnižší možnou míru (< 10 % kone čného 
objemu kapaliny, je-li to možné). Dalším postupem, který lze považovat 
za alternativu pro používání organických rozpoušt ědel, je rozpustit zkou ­ 
šenou látku ve v ětším objemu zkušební vody.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Je-li to nevyhnutelné, m ěly by se zásobní roztoky net ěkavých látek 
se špatnou rozpustností ve vod ě připravit za použití t ěkavého orga ­
nického rozpoušt ědla, avšak množství rozpoušt ědla přidaného do 
zkušebního systému by nem ělo překročit 1 % obj. a nem ělo by 
mít nepříznivé účinky na mikrobiální aktivitu. Rozpoušt ědlo by 
nemělo ovlivňovat stálost zkoušené látky ve vod ě. Rozpoušt ědlo 
by mělo být odstran ěno na mimo řádně malé množství tak, aby 
významně nezvyšovalo koncentraci DOC zkušební vody nebo 
suspenze. Toto je t řeba zkontrolovat analýzou specifickou pro 
danou látku, nebo je-li to možné, analýzou DOC (6). Musí se 
vynaložit úsilí na omezení p řenášeného rozpoušt ědla na absolutn ě 
nezbytné množství a zajistit, aby množství zkoušené látky bylo možné rozpustit v kone čném objemu zkušební vody. Pro zavedení 
zkoušené látky do zkušebních nádob lze používat i další metody, 
které jsou popsané v literatu ře (7) a (8). Používá-li se k aplikaci 
zkoušené látky organické rozpoušt ědlo, měly by se kontroly 
s rozpoušt ědlem obsahující zkušební vodu (bez p řídavků) 
a zkušební vodu s p řidanou referen ční látkou exponovat podobn ě 
jako aktivní zkušební nádoby dopln ěné zkoušenou látkou 
v nosném rozpoušt ědle. Cílem kontrol s rozpoušt
ědlem je 
prozkoumat na základ ě rozkladu referen ční látky možné nežádoucí 
účinky na mikrobiální populaci zp ůsobené rozpoušt ědlem.  
1.8.8  Zkušební podmínky  
1.8.8.1  Zkušební teplota  
Inkubace by m ěla probíhat (nejlépe) v temnu nebo v difuzním sv ětle 
při kontrolované (±2 °C) teplot ě, která m ůže být teplotou terénu 
nebo standardní teplotou 20 až 25 °C. Teplotou terénu m ůže být 
buď skutečná teplota vzorku v dob ě odběru, nebo pr ůměrná teplota 
terénu na míst ě odběru. 
1.8.8.2  Promíchávání  
Je nutné zajistit promíchávání nep řetržitým prot řepáváním nebo 
mícháním, aby se částice a mikroorganismy udržovaly v suspenzi. 
Promíchávání rovn ěž umožňuje přenos kyslíku do kapaliny 
z volného prostoru nad kapalinou tak, aby bylo možné odpovída ­
jícím způsobem udržovat aerobní podmínky. Umíst ěte baňky na 
deskovou t řepačku (promíchávání p řibližně při 100 ot/min) nebo 
použijte magnetické míchání. Promíchávání musí být nep řetržité. 
Třepání nebo míchání by však m ělo být co nejjemn ější, přičemž je 
třeba udržovat homogenní suspenzi.  
1.8.8.3  Doba trvání zkoušky  
Doba trvání zkoušky by obecn ě neměla překročit 60 dnů, pokud se 
nepoužije polospojitý postup s pravidelným obnovováním zkušební 
suspenze (viz bod 1.8.6 a dodatek 2). Ovšem doba trvání m ůže být 
u dávkové zkoušky prodloužena na maximáln ě 90 dnů, jestliže 
rozklad zkoušené látky za čal během prvních 60 dn ů. Rozklad se 
sleduje ve vhodných časových intervalech ur čováním zbytkové akti ­
vity  14 C nebo uvoln ěného  14 CO 2 (viz bod 1.8.9.4) a/nebo chemickou 
analýzou (bod 1.8.9.5). Doba inkubace musí být dostate čně dlouhá 
pro vyhodnocení procesu rozkladu. Rozsah rozkladu by m ěl nejlépe 
překročit 50 %; u pomalu rozložitelných látek musí být rozsah 
rozkladu dostate čný (obvykle v ětší než 20 % rozklad) k tomu, aby 
byl možný odhad kinetické rychlostní konstanty rozkladu.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Musí se provád ět pravidelná m ěření pH a koncentrace kyslíku ve 
zkušebním systému, pokud nejsou k dispozici p ředchozí zkušenosti 
z podobných zkoušek se vzorky vody a sediment ů odebraných ze 
stejného místa, p řičemž v takovém p řípadě by tato m ěření nebyla 
potřebná. Za ur čitých podmínek by mohl metabolismus primárních 
substrátů při mnohem vyšších koncentracích ve vod ě nebo 
v sedimentu vést k tak velkému uvol ňování CO  2 , a tak zna čnému 
vyčerpání kyslíku, že by to významn ě změnilo experimentální 
podmínky b ěhem zkoušky.  
1.8.9  Postup  
1.8.9.1  Příprava ban ěk pro pelagickou zkoušku  
Do zkušebních ban ěk se převede vhodný objem zkušební vody, a to 
až do přibližně jedné třetiny objemu ba ňky a ne mén ě než přibližně 
100 ml. Jestliže se používá více ban ěk (umožňujících zkoušení na 
celém objemu ba ňky v každém čase odběru vzorku), je vhodný 
objem zkušební vody rovn ěž přibližně 100 ml, protože malé objemy 
vzorku mohou ovlivnit délku fáze iniciace. Zkoušená látka se p řidá 
ze zásobního roztoku, jak je popsáno v bodech 1.8.2 a 1.8.7. Pro určení kinetiky rozkladu a výpo čet kinetické rychlostní konstanty 
rozkladu by se m ěly použít nejmén ě dvě odlišné koncentrace zkou ­ 
šené látky lišící se faktorem 5 až 10. Ob ě zvolené koncentrace by 
měly být nižší než 100 μg/l a nejlépe v rozmezí < 1–10 μg/l.
 
Baňky se uzav řou zátkami nebo ví čky nepropustnými pro vzduch 
a CO  2 . U netěkavých zkušebních chemických látek nezna čených 
isotopem  14 C jsou vhodné volné vatové zátky, které brání kontami ­
naci ze vzduchu (viz bod 1.8.1), pokud je ovšem o všech hlavních 
produktech rozkladu známo, že jsou net ěkavé, a pokud se používá 
nepřímé stanovení CO  2 (viz dodatek 3).  
Baňky se inkubují p ři zvolené teplot ě (viz bod 1.8.8.1). Vzorky pro 
chemickou analýzu nebo m ěření 14 C je třeba odebrat na po čátku 
zkoušky (tj. p ředtím, než za čne biologický rozklad; viz bod 1.7.1) 
a poté ve vhodných časových intervalech v pr ůběhu zkoušky. Odb ěr 
vzorků lze provád ět odběrem dílčích vzork ů (např. 5 ml alikvotních 
objemů) z každého opakování nebo odb ěrem vždy celého objemu 
baňky v každém čase odběru vzorku. Mineralizace zkoušené látky 
může být určena buď přímo, nebo nep římo (viz dodatek 3). Obvykle 
se vyžaduje minimáln ě pět bodů pro odb ěr vzorku b ěhem fáze 
rozkladu (tj. po ukon čené fázi iniciace) s cílem odhadnout spoleh ­
livou rychlostní konstantu, s výjimkou p řípadů, kdy je možné 
odůvodnit, že u rychle rozložitelných látek jsou dostate čné tři body 
odběru vzorku. U látek, které nepodléhají rychlému rozkladu, lze 
snadno provést více m ěření během fáze rozkladu, a proto by se 
k odhadu  k mělo používat více datových bod ů. Pro odb ěr vzorků 
nelze uvést žádný pevný časový harmonogram, protože rychlost 
biologického rozkladu se v jednotlivých p řípadech liší; ovšem 
doporučuje se odebírat vzorky jednou týdn ě, pokud je rozklad 
pomalý. Jestliže zkoušená látka podléhá rychlému rozkladu, odb ěr 
vzorků by se m ěl během prvních t ří dnů provádět jednou denn ě 
a poté každý druhý nebo t řetí den. Za ur čitých okolností, nap říklad 
u velmi rychle hydrolyzujících látek, m ůže být nezbytné odebírat 
vzorky v hodinových intervalech. Doporu čuje se, aby se p řed zkou­ 
škou provedla p ředběžná studie s cílem ur čit vhodné intervaly 
odběru vzorků. Pokud musí být vzorky k dispozici pro další speci ­
fickou analýzu, je užite čné odebrat více vzork ů a poté na konci 
experimentu zvolit ty, které se mají analyzovat, v opa čném pořadí, 
tj. poslední vzorky se analyzují první (viz bod 1.8.9.5 druhý odsta ­
vec, kde jsou pokyny ke stálosti vzork ů během skladování).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2  Počet baněk a vzork ů 
Nasaďte dostate čný počet zkušebních ban ěk v tomto rozsahu:  
— zkušební ba ňky; nejmén ě dvojí ba ňky pro každou koncentraci 
zkoušené látky (nejlépe minimáln ě 3) nebo více zkušebních 
baněk pro každou koncentraci, jestliže se jako vzorek použije 
vždy celý objem ba ňky v každém čase odběru vzorků (označeno 
symbolem F  T ), 
— zkušební ba ňky pro výpo čet hmotnostní bilance; nejmén ě dvojí 
baňky pro každou zkušební koncentraci (ozna čeno symbolem 
F M ), 
— slepé zkoušky, bez zkoušené látky; nejmén ě jedna zkušební 
baňka pro slepou zkoušku obsahující pouze zkušební vodu (ozna ­ 
čeno symbolem F  B ), 
— referen ční kontrola; dvojí ba ňky s referen ční látkou (nap ř. 
anilinem nebo benzoátem sodným v koncentraci 10 μg/l) (ozna ­ 
čeno symbolem F  C ). Cílem referen ční kontroly je potvrdit 
minimum mikrobiální aktivity. Je-li to výhodné, lze použít radio ­
isotopově značenou referen ční látku, a to i tehdy, je-li rozklad 
zkoušené látky sledován chemickými analýzami,  
— sterilní kontrola; jedna nebo dv ě baňky obsahující sterilizovanou 
zkušební vodu ke zkoumání možného abiotického rozkladu nebo 
jiného nebiologického odstran ění zkoušené látky (ozna čeno 
symbolem F  S ). Biologickou aktivitu lze zastavit autoklávováním 
(121 °C, 20 minut) zkušební vody nebo p řidáním toxické látky 
(např. azidu sodného (NaN  3 ) v množství 10–20 g/l, chloridu 
rtuťnatého (HgCl  2 ) v množství 100 mg/l nebo formalinu 
v množství 100 mg/l) nebo zá řením gama. Použije-li se HgCl  2 , 
měl by se zneškodnit jako toxický odpad. U vody s velkým 
množstvím p řidaného sedimentu se sterilních podmínek dosahuje 
nesnadno; v tomto p řípadě se doporu čuje opakované autoklávo ­
vání (nap ř. třikrát). Je t řeba vzít v úvahu, že sorp ční charakteris ­
tiky sedimentu se mohou autoklávováním pozm ěnit, 
— kontroly s rozpoušt ědlem obsahující zkušební vodu a zkušební 
vodu s referen ční látkou; dvojí ba ňky ošetřené stejným množství 
rozpouštědla a podrobené stejnému postupu jako v p řípadě apli­
kace zkoušené látky. Cílem je zkoumat pomocí ur čení rozkladu 
referenční látky možné nežádoucí ú činky rozpoušt ědla. 
V plánu zkoušky by m ěl zkoušející vzít v úvahu relativní d ůležitost 
většího počtu opakování oproti zvýšenému po čtu časů odběru 
vzorků. Přesný počet požadovaných ban ěk bude záviset na metod ě 
použité pro m ěření rozkladu (viz bod 1.8.9.1 t řetí odstavec, bod 
1.8.9.4 a dodatek 3).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
V každém čase odběru vzorku by se m ěly odebrat dva díl čí vzorky 
(např. 5 ml alikvotních objem ů) z každé zkušební ba ňky. Jestliže se 
používá více ban ěk, aby bylo možné použít jako vzorek vždy celý 
objem ba ňky, v každém čase odběru vzorků by se m ěly odebrat 
minimáln ě dvě baňky (viz bod 1.8.9.1 první odstavec).  
1.8.9.3  Příprava ban ěk pro zkoušku se suspendovanými sedimenty [nepo ­
vinné]  
Přidejte do zkušebních nádob pot řebná množství zkušební vody 
a případně sedimentu (viz bod 1.8.5). P říprava ban ěk pro zkoušku 
se suspendovanými sedimenty je stejná jako pro pelagickou zkoušku 
(viz body 1.8.9.1 a 1.8.9.2). Nejlépe použijte lahvi čky na sérum nebo 
baňky podobných tvar ů. Umístěte uzavřené baňky horizontáln ě do 
třepačky. Je zřejmé, že otev řené baňky pro net ěkavé látky nezna čené 
isotopem  14 C by se m ěly umístit do svislé polohy; v tomto p řípadě 
se doporu čuje magnetické míchání a používání magnetických ty činek 
pokrytých sklem. Je-li to nezbytné, p řivádějte do lahví vzduch, aby 
se udržely správné aerobní podmínky.  
1.8.9.4  Radiochemická stanovení  
Uvolněný 14 CO 2 se měří nepřímo a přímo (viz dodatek 3). Nep římo 
se 14 CO 2 určuje jako rozdíl mezi po čáteční aktivitou  14 C ve zkušební 
vodě nebo suspenzi a celkovou zbytkovou aktivitou v dob ě odběru 
vzorku po okyselení vzorku na pH 2–3 a odvedení CO  2 . Odstraní se 
tak anorganický uhlík a nam ěřená zbytková aktivita se odvodí 
z organického materiálu. Nep římé stanovení  14 CO 2 by se nem ělo 
používat, jestliže b ěhem transformace zkoušené látky vznikají 
významnější těkavé transforma ční produkty (viz dodatek 3). Je-li 
to možné, uvol ňování  14 CO 2 by se mělo měřit přímo (viz dodatek 
3) v každém čase odběru vzorků v nejmén ě jedné zkušební ba ňce; 
tento postup umož ňuje kontrolovat jak hmotnostní bilanci, tak proces 
biologického rozkladu, ale je omezen na zkoušky provád ěné 
s uzavřenými ba ňkami.  
Jestliže je uvoln ěný 14 CO 2 během zkoušky m ěřen přímo, vyčlení se 
pro tento ú čel na po čátku zkoušky více ban ěk. Přímé stanovení  
14 CO 2 se doporu čuje tehdy, jestliže b ěhem transformace zkoušené 
látky vznikají významn ější těkavé transforma ční produkty. V každém 
bodě měření se dodate čné zkušební ba ňky okyselí na pH 2 až 3 
a 14 CO 2 se jímá v interním či externím absorbéru (viz dodatek 3).  
Případně lze koncentrace zkoušené látky zna čené isotopem  14 C 
a významn ějších transforma čních produkt ů stanovit radiochromato ­
graficky (nap ř. chromatografií na tenké vrstv ě, RAD-TLC) nebo 
pomocí HPLC s radiochemickou detekcí.  
Případně lze určit fázovou distribuci zbývající radioaktivity (viz 
dodatek 1) a zbytkovou zkoušenou látku a transforma ční produkty.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Na konci zkoušky by se m ěla určit hmotnostní bilance, a to p římým 
měřením  14 CO 2 pomocí samostatných zkušebních ban ěk, z nichž se 
v průběhu zkoušky neodebírají žádné vzorky (viz dodatek 3).  
1.8.9.5  Specifická chemická analýza  
Jestliže je k dispozici citlivá specifická analytická metoda, lze 
primární biologický rozklad hodnotit m ěřením celkové zbytkové 
koncentrace zkoušené látky namísto využívání metod zna čení radio­
isotopem. Jestliže se použije zkoušená látka zna čená radioisotopem 
(pro měření celkové mineralizace), lze soub ěžně provádět specifické 
chemické analýzy s cílem získat užite čné dodate čné informace 
a ověřit postup. Specifické chemické analýzy lze rovn ěž použít pro 
měření transforma čních produkt ů vzniklých b ěhem rozkladu zkou ­ 
šené látky, p řičemž se toto doporu čuje u látek, které jsou minerali ­
zovány s polo časy překračujícími 60 dn ů. Měla by se zm ěřit a v 
protokolu o zkoušce uvést koncentrace zkoušené látky 
a transforma čních produkt ů v každém čase odběru vzorků (jako 
koncentrace a jako procentuální podíl použité koncentrace). Obecn ě 
je zapotřebí identifikovat transforma ční produkty zjišt ěné při ≥ 10 % 
použité koncentrace v jakoukoliv dobu odb ěru vzorku; v opa čném 
případě je nutné p řiměřeně odůvodnit, pro č nebyly identifikovány. 
Transforma ční produkty, jejichž koncentrace b ěhem studie trvale 
rostou, by rovn ěž měly být ur čeny, a to i tehdy, pokud jejich 
koncentrace nep řekračuje shora uvedenou mez, nebo ť tyto transfor ­
mační produkty mohou být známkou perzistentnosti. Analýzy trans ­
formačních produkt ů ve sterilních kontrolách by se m ěly vzít v potaz 
v případě, že se rychlá abiotická p řeměna zkoušené látky (nap ř. 
hydrolýza) považuje za možnou. Pot řeba kvantitativního stanovení 
a identifikace transforma čních produkt ů by se měla posuzovat p řípad 
od případu a od ůvodnění by m ěla být uvedena v protokolu 
o zkoušce. Extrak ční postupy s organickými rozpoušt ědly by se 
měly používat podle pokyn ů uvedených v p říslušném analytickém 
postupu.  
Všechny vzorky by se m ěly skladovat vzduchot ěsně při teplotách od 
2 do 4 °C, pokud se analýza provádí do 24 hodin (nejlépe). P ři 
delším skladování je zapot řebí vzorky zmrazovat na teplotu nižší 
než –18 °C nebo je chemicky konzervovat. Okyselení jako metoda 
pro konzervaci vzork ů se nedoporu čuje, protože okyselené vzorky 
mohou být nestálé. Jestliže se vzorky neanalyzují do 24 hodin a jsou-li skladovány po delší dobu, je zapot řebí provést studii stabi ­
lity při skladování, aby se prokázala stálost dot čených chemických 
látek při teplotách skladování nižších než –18 °C nebo p ři konzer­
vaci. Jestliže analytická metoda vyžaduje extrakci rozpoušt ědla nebo 
extrakci tuhé fáze (SPE), je t řeba provést tuto extrakci bezprost ředně 
po odběru vzorků nebo po skladování vzorku v chlazeném stavu po 
dobu maximáln ě 24 hodin.
 
V závislosti na citlivosti analytické metody mohou být nezbytné 
větší objemy vzork ů než objemy uvedené v bod ě 1.8.1. Zkoušku 
lze snadno provést p ři zkušebních objemech jeden litr v ba ňkách 
o objemu 2 až 3 litry, což umož ňuje odebírat vzorky o objemu 
přibližně 100 ml.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. DATA A ZPRÁVY  
2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK Ů 
2.1.1  Vynášení dat  
Časy odb ěru vzorku se zaokrouhlí na celé hodiny (s 
výjimkou p řípadů, kdy se látka významn ě rozkládá 
v řádu minut až hodin), ne však na celé dny. Odhady 
zbytkové aktivity zkoušené látky (pro látky zna čené 
isotopem  14 C) nebo zbytkové koncentrace (pro nezna čené 
látky) se vynesou proti času jak v lineárním, tak 
v semilogaritmickém tvaru (viz obrázky 1a a 1b). Jestliže došlo k rozkladu, výsledky z ban ěk F
 T je třeba porovnat 
s výsledky z ban ěk F  S . Jestliže se st řední hodnoty 
výsledků z ban ěk se zkoušenou látkou (F  T ) a sterilních 
baněk (F  S ) odchylují o mén ě než 10 %, lze p ředpokládat, 
že pozorovaný rozklad je p řevážně abiotický. Jestliže je 
rozklad v ba ňkách F  S nižší, lze hodnoty použít pro 
korekci hodnot získaných pomocí ban ěk F  T (odečtením), 
odhadnout tak rozsah biologického rozkladu. Provádí-li se nepovinné analýzy významn ějších transforma čních produkt ů, 
je zapot řebí získat krom ě grafického znázorn ění úbytku 
zkoušené látky také grafické znázorn ění jejich tvorby 
a úbytku.
 
Trvání fáze iniciace  t  L se odhadne z k řivky rozkladu 
(semilogaritmický graf) extrapolací její lineární části na 
nulový rozklad nebo p řípadně určením doby p řibližně 
10 % rozkladu (viz obrázky 1a a 1b). Ze semilogaritmic ­
kého grafu se odhadne rychlostní konstanta prvního řádu, 
k, a její standardní chyba lineární regresí ln (zbytková 
aktivita  14 C nebo koncentrace zkoušené látky) ve vztahu 
k času. Zejména p ři měřeních  14 C je nutné používat 
pouze údaje pat řící do po čáteční lineární části křivky po 
ukončení fáze iniciace a dávat p řednost výb ěru spíše 
malého po čtu reprezentativních údaj ů před výběrem velkého 
počtu více nejistých dat. Nejistota zde zahrnuje chyby 
vlastní doporu čenému p římému použití nam ěřených zbytko ­
vých aktivit  14 C (viz dále). N ěkdy může být d ůležité 
vypočítat dvě odlišné rychlostní konstanty, pokud rozklad 
postupuje ve dvou fázích. Za tímto ú čelem se definují 
dvě odlišné fáze rozkladové k řivky. Rychlostní konstanta,  
k, a polo čas, t  ½ = ln2/ k, by se m ěly vypo čítat pro 
každou z jednotlivých ban ěk k opakování, pokud se odebí ­
rají dílčí vzorky ze stejné ba ňky, nebo pomocí pr ůměrných 
hodnot, pokud se použije jako vzorek celý objem ba ňky 
v každé dob ě odběru vzorku (viz bod 1.8.9.2 poslední 
odstavec). Použije-li se první uvedený postup, je t řeba 
v protokolu o zkoušce uvést rychlostní konstantu a poločas pro každou z jednotlivých ban ěk k opakování 
a vyjádřit je rovn ěž jako pr ůměrnou hodnotu se standardní 
chybou. Jestliže se používaly vysoké koncentrace zkoušené látky, k řivka rozkladu se m ůže značně odchylovat od 
přímky (semilogaritmický graf) a kinetika prvního řádu 
nemusí platit. Definování polo času proto nemá žádným 
smysl. Ovšem p ři omezeném rozp ětí dat lze použít kinetiku 
pseudoprvního řádu a polo čas rozkladu DT
 50 (čas pro 
dosažení 50 % rozkladu) odhadnout. Je však t řeba mít 
na paměti, že časový pr ůběh rozkladu nad zvolené datové 
rozpětí nelze p ředpovídat pomocí parametru DT  50 , který 
slouží pouze k popisu dané datové množiny. Analytické nástroje pro usnadn ění statistických výpo čtů a sestavení 
křivky jsou snadno dostupné a doporu čuje se používat 
software tohoto typu.
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Jestliže se provádí specifické chemické analýzy, je t řeba odhadnout 
rychlostní konstanty a polo časy primárního rozkladu, jak je shora 
uvedeno pro celkovou mineralizaci. Jestliže je limitujícím procesem primární rozklad, lze n ěkdy použít datové body z celého pr ůběhu 
rozkladu. Je to proto, že m ěření jsou p římá, na rozdíl od m ěření 
aktivity
 14 C. 
Jestliže se použijí látky zna čené isotopem  14 C, hmotnostní bilance by 
měla být vyjád řena v procentech použité po čáteční koncentrace 
nejméně na konci zkoušky.  
2.1.2  Zbytková aktivita  
Při biologickém rozkladu té části organické látky, která je zna čená 
isotopem  14 C, se hlavní část 14 C přemění na  14 CO 2 , zatímco další 
část se využije pro r ůst biomasy a/nebo syntézu mimobun ěčných 
metabolit ů. Proto zcela „úplný“ biologický rozklad látky nedává 
100 % přeměnu jejího uhlíku na  14 CO 2 . Isotop  14 C zabudovaný do 
produktů vytvářených biologickou syntézou se následn ě v důsledku 
„sekundární mineralizace“ pomalu uvol ňuje jako  14 CO 2 . Z těchto 
důvodů vykazují grafy zbytkové aktivity organického  14 C (měřeno 
po odstran ění CO  2 ) nebo vzniklého  14 CO 2 v závislosti na čase i po 
dokončení rozkladu „chvostování“. Tím se komplikuje kinetická 
interpretace dat, a proto je k odhadu rychlostní konstanty rozkladu zapotřebí obvykle používat pouze po čáteční část křivky (po skon čení 
fáze iniciace a p řed dosažením p řibližně 50 % rozkladu). P ři 
rozkladu zkoušené látky je celková zbytková aktivita organického
 
14 C vždy vyšší než aktivita  14 C spojená se zbývající nedot čenou 
zkoušenou látkou. Jestliže se zkoušená látka rozkládá reakcí prvního 
řádu a konstantní frakce α se mineralizuje na CO  2 , počáteční sklon 
křivky úbytku  14 C (celkový organický  14 C vzhledem k času) bude α- 
násobkem sklonu p říslušné křivky koncentrace zkoušené látky (nebo 
přesněji řečeno té části zkoušené látky, která je zna čená isotopem  
14 C). Při použití nekorigovaného m ěření celkové aktivity organic ­
kého  14 C bude proto vypo čítaná rychlostní konstanta rozkladu 
konzervativní. V literatu ře (2) (9) (10) (11) byly popsány postupy 
pro odhad koncentrací zkoušené látky z nam ěřených radiochemic ­
kých aktivit na základ ě různých zjednodušujících p ředpokladů. 
Takové postupy se nejsnáze používají u rychle rozložitelných látek.  
2.2 INTERPRETACE VÝSLEDK Ů 
Jestliže se zjistí, že  k nezávisí na rostoucí koncentraci (tj. pokud je 
vypočítaná konstanta  k přibližně stejná p ři různých koncentracích 
zkoušené látky), lze p ředpokládat, že rychlostní konstanta prvního 
řádu je reprezentativní pro použité zkušební podmínky, tj. pro zkou ­ 
šenou látku, vzorek vody a zkušební teplotu. Odborníci musí vyhod ­
notit, do jaké míry lze výsledky generalizovat či extrapolovat na jiné 
systémy. Jestliže se zkoušená látka použije ve vysoké koncentraci, 
a rozklad proto neprobíhá podle kinetiky prvního řádu, nelze data 
použít pro p římý odhad rychlostní konstanty prvního řádu nebo 
odpovídajícího polo času. Ovšem data odvozená ze zkoušky 
s vysokou koncentrací zkoušené látky mohou být p řesto použitelná 
pro odhad stupn ě celkové mineralizace a/nebo pro detekci 
a kvantifikaci transforma čních produkt ů. ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Jestliže jsou známy rychlosti jiných ztrátových proces ů než biologic ­
kého rozkladu (nap říklad hydrolýza nebo t ěkání), mohou být 
odečteny od čisté ztrátové rychlosti pozorované b ěhem zkoušky, 
čímž se získá p řibližný odhad rychlosti biologického rozkladu. 
Údaje o hydrolýze mohou být nap říklad získány ze sterilní kontroly 
nebo ze soub ěžného zkoušení pomocí vyšší koncentrace zkoušené 
látky.  
Nepřímé a přímé stanovení  14 CO 2 (bod 1.8.9.4 a dodatek 3) lze 
použít pouze pro m ěření rozsahu mineralizace zkoušené látky na 
CO 2 . K analýze koncentrací zkoušené látky zna čené isotopem  14 C 
a tvorby významn ějších transforma čních produkt ů lze použít radio ­
chromatografii (RAD-TLC) nebo HPLC (bod 1.8.9.4 t řetí odstavec). 
Aby byl možný p římý odhad polo času, je nezbytné, aby nebyly 
přítomny žádné významn ější transforma ční produkty (definované 
jako ≥ 10 % použitého množství zkoušené látky). Jestliže jsou 
přítomny významn ější transforma ční produkty odpovídající této defi ­
nici, požaduje se podrobné hodnocení dat. To m ůže zahrnovat 
opakované zkoušení a/nebo identifikaci transforma čních produkt ů 
(viz bod 1.8.9.5 první odstavec), pokud nelze osud transforma čních 
produktů přiměřeně vyhodnotit na základ ě zkušenosti (nap ř. infor­
mace o cest ě rozkladu). Protože se pom ěr uhlíku zkoušené látky 
přeměněného na CO  2 mění (do velké míry závisí na koncentraci 
zkoušené látky a dalších dostupných substrátech, na zkušebních 
podmínkách a mikrobiálním spole čenství), tato zkouška nedovoluje 
přímý odhad úplného biologického rozkladu, jako tomu je u zkoušky 
na úbytek rozpušt ěného organického uhlíku (DOC); výsledek je však 
podobný výsledku získanému zkouškou respirometrií. Stupe ň mine­
ralizace tak bude rovný minimální úrovni úplného biologického rozkladu nebo bude nižší. Pro získání ucelen ějšího obrazu úplného 
biologického rozkladu (mineralizace a zabudování do biomasy) by se 
měla analýza fázové distribuce
 14 C provád ět na konci zkoušky (viz 
dodatek 1).  14 C obsažený v souboru částic bude obsahovat  14 C 
zabudovaný do bakteriální biomasy a  14 C sorbovaný do organických 
částic.  
2.3 VALIDITA ZKOUŠKY  
Jestliže se referen ční látka nerozloží b ěhem očekávaného časového 
intervalu (u anilinu a benzoátu sodného je to obvykle mén ě než dva 
týdny), validita zkoušky je zpochybn ěna a musí být dále ov ěřena, 
případně by se zkouška m ěla opakovat s novým vzorkem vody. 
V kroužkové zkoušce této metody po řádané ISO, které se ú častnilo 
sedm laborato ří z celé Evropy, se upravené rychlostní konstanty 
rozkladu pro anilin pohybovaly od 0,3 do 1,7 dne  –1 s průměrem 
0,8 d  –1 při teplotě 20 °C a standardní chyb ě ±0,4 d  –1 (t ½ = 0,9 
dne). Typické fáze iniciace trvaly 1 až 7 dn ů. Ve zkoumaných 
vodách byla uvád ěna bakteriální biomasa odpovídající 10  3 až 10  4 
jednotek tvo řících kolonie (CFU) na ml. Rychlosti rozkladu ve st ře­
doevropských vodách bohatých na živiny byly vyšší než ve skandi ­
návských oligotrofních vodách, což m ůže být zp ůsobeno odlišným 
trofickým stavem nebo expozicí chemickým látkám.  
Celková výt ěžnost (hmotnostní bilance) na konci experimentu by 
měl být v rozmezí 90 % až 110 % pro radioisotopov ě značené látky, 
zatímco po čáteční výtěžnost na po čátku experimentu by se m ěla 
pohybovat v rozmezí 70 % až 110 % pro nezna čené látky. Ovšem 
tato rozmezí je zapot řebí vykládat pouze jako cílová a nem ěla by se 
používat jako kritéria pro p řijetí zkoušky.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. PROTOKOL O ZKOUŠCE  
V protokolu o zkoušce, který bude rovn ěž obsahovat nejmén ě násle­
dující informace, musí být jasn ě uveden typ studie, tj. pelagická nebo 
zkouška se suspendovanými sedimenty:  
Zkoušená látka a referen ční látka(y):  
— obecné názvy, chemické názvy (doporu čují se názvy podle 
IUPAC a/nebo CAS), čísla CAS, strukturní vzorce (uvád ějící 
polohu  14 C, pokud se použije radioisotopov ě značená látka) 
a relevantní fyzikáln ě-chemické vlastnosti zkoušené a referen ční 
látky (viz body 1.5 a 1.6),  
— chemické názvy, čísla CAS, strukturní vzorce (uvád ějící polohu  
14 C, pokud se použije radioisotopov ě značená látka) a relevantní 
fyzikálně-chemické vlastnosti látek použitých jako standardy 
k identifikaci a kvantifikaci transforma čních produkt ů, 
— čistota zkoušené a referen ční látky (obsah ne čistot),  
— popřípadě radiochemická čistota zna čené chemické látky 
a specifická aktivita.  
Povrchová voda:  
O vzorku vody musí být poskytnuty tyto minimální informace:  
— lokalita a popis místa odb ěru vzorku, pokud možno v četně 
dřívější kontaminace,  
— datum a čas odběru vzorku,  
— živiny (celkový obsah N, amonia, dusitan ů, dusičnanů, celkový 
fosfor, rozpušt ěný orthofosfore čnan),  
— hloubka odb ěru, 
— vzhled vzorku (nap ř. barva a turbidita),  
— DOC a TOC,  
— BOD,  
— teplota a pH v míst ě a době odběru, 
— kyslík nebo oxida čně-redukční potenciál (povinné pouze 
v případě, že nejsou z řejmé aerobní podmínky),  
— slanost nebo vodivost (v p řípadě mořské vody a brakické vody),  
— suspendované pevné látky (v p řípadě zakaleného vzorku),  
— podle možnosti další významné informace o lokalit ě odběru 
vzorku v dob ě jeho odb ěru (např. aktuální či dřívější údaje 
o průtoku řek nebo mo řských proudech v blízkosti hlavních 
výpustí a typ výpustí, meteorologické podmínky p ředcházející 
době odběru vzorku),  
a nepovinn ě: 
— mikrobiální biomasa (nap ř. AODC (p římé počítání za použití 
akridinové oranže) nebo jednotky tvo řící kolonie),  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— anorganický uhlík,  
— koncentrace chlorofylu  a jakožto specifický odhad biomasy řas. 
Dále by se m ěly poskytovat následující informace o sedimentu, 
pokud se provádí zkouška se suspendovanými sedimenty:  
— hloubka odb ěru sedimentu,  
— vzhled sedimentu (nap říklad barevný, blátivý, bahnitý nebo 
písečný), 
— struktura (nap ř. % hrubého písku, jemného písku, bahna a jílu),  
— suchá hmotnost v g/l suspendovaných pevných látek, koncentrace 
TOC nebo hmotnostní ztráta p ři vznícení jako m ěřítko obsahu 
organické hmoty,  
— pH,  
— kyslíkový nebo oxida čně-redukční potenciál (povinné pouze 
v případě, že nejsou z řejmé aerobní podmínky).  
Zkušební podmínky:  
— zpožd ění mezi odb ěrem a použitím v laboratorní zkoušce, skla ­
dování vzork ů a předúprava vzorku, data provád ění studií,  
— množství použité zkoušené látky, zkušební koncentrace 
a referenční látka,  
— metoda aplikace zkoušené látky v četně použití rozpoušt ědel, 
— objem použité povrchové vody a sedimentu (používá-li se) 
a objem vzork ů odebraných v každém intervalu pro analýzu,  
— popis použitého zkušebního systému,  
jestliže zkouška nemusí být provád ěna v temnu, informace 
o podmínkách „difuzního sv ětla“, 
— informace o použité metod ě nebo metodách k vytvo ření sterilních 
kontrol (nap ř. teplota, čas a počet autoklávování),  
— inkuba ční teplota,  
— informace o analytických technikách a metod ě nebo metodách 
použitých pro radiochemická m ěření a pro kontrolu hmotnostní 
bilance a m ěření fázové distribuce (provádí-li se),  
— počet opakování.  
Výsledky:  
— výtěžnost v procentech (viz bod 1.7.1),  
— opakovatelnost a citlivost používaných analytických metod 
včetně meze detekce (LOD) a meze kvantifikace (LOQ) (viz 
bod 1.7.2),  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— všechna nam ěřená data (v četně časových bod ů odběru vzorků) 
a vypočítané hodnoty v tabulkové form ě a křivky rozkladu; pro 
každou zkušební koncentraci a pro každou ba ňku k opakování je 
nutné v protokolu o zkoušce uvést lineární korela ční koeficient 
pro sklon logaritmického grafu, odhadovanou fázi iniciace 
a rychlostní konstantu prvního řádu nebo pseudoprvního řádu 
(je-li to možné) a odpovídající polo čas rozkladu (nebo doba 
poločasu t 50 ), 
— v protokolu o zkoušce zaznamenejte relevantní hodnoty jako 
průměry výsledk ů zjištěných u jednotlivých opakování, nap ř. 
délka fáze iniciace, rychlostní konstanta rozkladu a polo čas 
rozkladu (nebo  t 50 ), 
— na základ ě vzhledu k řivky rozkladu a možného vlivu zkušební 
koncentrace je t řeba systém kategorizovat bu ď jako nep řizpůso­
bený, nebo p řizpůsobený,  
— výsledky kontroly kone čné hmotnostní bilance a výsledky m ěření 
pro stanovení fázových distribucí (jsou-li k dispozici),  
— podíl mineralizovaného  14 C, a použijí-li se specifické analýzy, 
konečná úroveň primárního rozkladu,  
— případně identifikace, molární koncentrace a procentuální podíl 
aplikovaných významn ějších transforma čních produkt ů (viz bod 
1.8.9.5 první odstavec),  
— případně navrhovaná cesta transformace,  
— diskuse výsledk ů. 
4. LITERATURA  
(1) OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
– Simulation Biodegradation Test.  
(2) ISO/DIS 14592–1 (1999) Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions.
 
(3) Zkušební metoda C.23 Aerobní a anaerobní transformace 
v půdě. 
(4) Zkušební metoda C.24 Aerobní a anaerobní transformace 
v systémech voda/sediment.  
(5) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
(6) ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic 
carbon (DOC).  
(7) ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the prepara ­
tion and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 
(8) OECD, p ředloha (2000). Guidance Document on aquatic toxi ­
city testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Assess ­
ment. No 22 (p ředpokládané zve řejnění v létě roku 2000).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
(9) Simkins, S., Alexander, M. (1984). Models for mineralization 
kinetics with the variables of substrate concentration and popu ­
lation density.  Appl. Environ. Microbiol . 47, 394–401.  
(10) Ingerslev, F., Nyholm, N. (2000). Shake-flask test for determi ­
nation of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems.  Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274–283.  
(11) ISO/CD 14592–1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water 
or surface water/sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Dodatek 1  
Fázová distribuce  14 C 
Pro kontrolu postupu je zapot řebí doplnit rutinní m ěření zbytkové celkové akti ­
vity organického  14 C (TOA) m ěřeními hmotnostní bilance zahrnující p římé 
stanovení uvoln ěného  14 CO 2 po jímání v absorbéru (viz dodatek 3). Sama 
o sobě je pozitivní tvorba  14 CO 2 přímým důkazem o biologickém rozkladu, na 
rozdíl od abiotického rozkladu nebo jiných ztrátových mechanism ů, jakými jsou 
těkání a sorpce. Dodate čné užitečné informace charakterizující chování p ři 
biologické rozložitelnosti lze získat z m ěření distribuce TOA mezi rozpušt ěným 
stavem (aktivita rozpušt ěného organického  14 C, DOA) a částicovým stavem 
(aktivita částicového organického  14 C, POA) po separaci částic membránovou 
filtrací nebo odst řeďováním. POA obsahuje zkoušenou látku sorbovanou na 
mikrobiální biomasu a na další částice a dále z uhlíku zkoušené látky, který 
byl použit k syntéze nového bun ěčného materiálu, a tím za členěn do frakce 
částicové biomasy. Tvorbu rozpušt ěného organického materiálu s  14 C lze odhad ­
nout jako DOA na konci biologického rozkladu (plató na k řivce závislosti 
rozkladu na čase). 
Fázová distribuce zbytkového  14 C ve zvolených vzorcích se odhadne filtrováním 
vzorků na membránovém filtru s velikostí pór ů 0,22 μm nebo 0,45 μm a z 
materiálu, který neabsorbuje významná množství zkoušené látky (vhodné mohou být polykarbonátové filtry). Jestliže sorpce zkoušené látky na filtr není zanedbateln ě nízká (tuto skute čnost je nutné ov ěřit před experimentem), lze 
použít místo filtrace vysokorychlostní odst řeďování (2 000 g, 10 minut).
 
Dále je třeba s filtrátem či centrifugátem pracovat tak, jak je uvedeno v dodatku 
3 pro nefiltrované vzorky. Membránové filtry se rozpustí ve vhodné scintila ční 
kapalině a počítá se jako obvykle, obecn ě pouze za použití metody externího 
standardního pom ěru pro korekci na zhášení, nebo se použije oxida ční činidlo na 
vzorek. Pokud bylo použito odst řeďování, vytvo řené pelety částicové frakce se 
resuspendují v 1–2 ml destilované vody a p řevedou se do scintila ční lahvičky. 
Následně se provedou dv ě promytí pomocí 1 ml destilované vody a promývací 
voda se p řevede do lahvi čky. V případě potřeby lze suspenzi ukotvit do gelu za 
účelem počítání scintilací v roztoku.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Dodatek 2  
Polospojitý postup  
Pro dosažení významného rozkladu obtížn ě rozložitelných látek m ůže být 
vyžadována prodloužená inkubace až po n ěkolik měsíců. Doba trvání zkoušky 
by obecn ě neměla překročit 60 dnů, pokud nebudou zachovány charakteristiky 
původního vzorku vody obnovením zkušební suspenze. Ovšem doba trvání 
zkoušky m ůže být prodloužena na maximáln ě 90 dnů bez obnovení zkušební 
suspenze, jestliže rozklad zkoušené látky za čal během prvních 60 dn ů. 
Během inkubace po dlouhá období m ůže být různorodost mikrobiální komunity 
snížena v d ůsledku různých ztrátových mechanism ů a možného vy čerpání 
významných živin a primárních uhlíkových substrát ů ze vzorku vody. Proto se 
doporučuje, aby se pro adekvátní ur čení rychlosti rozkladu pomalu se rozkláda ­
jících látek používala polospojitá zkouška. Zkouška by se m ěla zahájit použitím 
polospojitého postupu, pokud se na základ ě předchozí zkušenosti o čekává, že pro 
dosažení 20 % rozkladu látky je nezbytná inkuba ční doba t ří měsíců. Alterna­
tivně lze normální dávkovou zkoušku zm ěnit na polospojitou zkoušku, pokud 
nebylo dosaženo rozkladu zkoušené látky p řibližně během 60 dn ů zkoušení 
s využitím dávkového postupu. Polospojitý postup lze zastavit a ve zkoušce 
pokračovat jakožto v dávkovém experimentu, když je zaznamenán významný 
rozklad (nap ř. > 20 %).  
Při polospojité zkoušce se každé dva týdny nahrazuje p řibližně jedna třetina 
objemu zkušební suspenze čerstvě odebranou vodou, do níž byla p řidána zkou ­ 
šená látka v po čáteční koncentraci. Podobn ě se do vody, která má být použita 
k obnovení, p řidá sediment v po čáteční koncentraci (mezi 0,01 a 1 g/l), pokud se 
provádí nepovinná zkouška se suspendovanými sedimenty. P ři provád ění 
zkoušky se suspendovanými částicemi sedimentu je d ůležité, aby byl pln ě 
suspendovaný systém zachován také b ěhem obnovování vody a aby doba zdržení 
byla shodná pro pevné látky a vodu, protože jinak se m ůže ztratit zamýšlená 
podobnost s homogenním vodným systémem bez zakotvených fází. Z t ěchto 
důvodů se při použití polospojitého postupu dává p řednost po čáteční koncentraci 
suspendovaných sediment ů s nižším rozp ětím stanoveného intervalu.  
U předepsaného p řídavku zkoušené látky se p ředpokládá, že po čáteční koncent ­
race zkoušené látky není p řekročena částečným obnovením zkušební suspenze, 
a proto se zabrání p řizpůsobení, které je často pozorováno p ři vysokých koncen ­
tracích zkoušených látek. Protože postup obsahuje opakovanou inokulaci 
i náhradu vy čerpaných živin a primárních substrát ů, obnoví se p ůvodní mikro ­
biální různorodost a dobu trvání zkoušky lze v zásad ě prodloužit do nekone čna. 
Při použití polospojitého postupu je d ůležité mít na pam ěti, že zbytková koncent ­
race zkoušené látky se musí korigovat na množství zkoušené látky p řidané 
a odstran ěné v každém postupu obnovení. U slou čenin, které se málo sorbují, 
lze celkovou koncentraci a koncentraci rozpušt ěné zkoušené látky používat 
zaměnitelně. Sorpce je za stanovených podmínek (0,1–1 g pevných látek/l) pro 
látky s log  K o/v < 3 (platí pro neutrální, lipofilní slou čeniny) nevýznamná (< 
5 %). To je ilustrováno následujícím p říkladem výpo čtu. 0,1 g/l pevných látek 
zhruba odpovídá 10 mg uhlíku na litr (uhlíková frakce,  f C = 0,01). P ředpoklá­
dejme, že:  
Log K o/v (zkoušené látky) = 3  
K ou = 0,42 ×  K o/v 
Rozdělovací koeficient  K d = f C × K ou 
rozpuštěná frakce celkové koncentrace ( C-voda( C v )/C-celkové( C c ) je pak:  
C v /C c = 1/(1 +  K d × SS) = 1(1 +  K oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 0,1 
× 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Dodatek 3  
Stanovení  14 co 2 
Nepřímé stanovení  14 CO  2 
Pro rutinní m ěření je nep římá metoda obvykle nejmén ě časově náročnou 
a nejpřesnější metodou, pokud je zkoušená látka net ěkavá a netransformuje se 
na těkavé transforma ční produkty. Nefiltrované vzorky, nap ř. o objemu 5 ml, se 
jednoduše p řevedou do scintila čních lahvi ček. Vhodná aktivita ve vzorcích je na 
počátku 5 000 dpm–10 000 dpm (80–170 Bq) a minimální po čáteční aktivita je 
přibližně 1 000 dpm. CO  2 by měl být odstran ěn po okyselení na pH 2 až 3 
pomocí 1 či 2 kapek koncentrované H  3 PO 4 nebo HCl. Odstra ňování CO  2 lze 
provádět probubláváním vzduchem p řibližně po ½–1 hodinu. Eventuáln ě lze 
lahvičky intenzivn ě protřepávat po dobu 1 až 2 hodin (nap říklad na t řepačce 
s mikrodeskou) nebo jemn ě protřepávat přes noc. Ú činnost procesu odstra ňování 
CO 2 se musí zkontrolovat (prodloužením doby provzduš ňování nebo prot řepává­
ní). Poté by se m ěla přidat scintila ční kapalina vhodná pro po čítání vodných 
vzorků, vzorek by se m ěl homogenizovat ví řivou mícha čkou a radioaktivita 
určit počítáním scintilací v roztoku, p řičemž je nutné ode číst aktivitu pozadí 
zjištěnou ve slepých zkouškách (F  B ). Pokud nebude zkušební voda velmi zabar ­
vená ani nebude obsahovat vysokou koncentraci částic, vzorky budou obvykle 
vykazovat jednotné zhášení a posta čí provedení korekcí na zhášení pomocí exter ­
ního standardu. Je-li zkušební voda vysoce zbarvená, m ůže být nutná korekce na 
zhášení p řidáním interního standardu. Je-li koncentrace částic vysoká, nemusí být 
možné získat homogenní roztok či gel, případně může být odchylka zhášení mezi 
vzorky velká. V takovém p řípadě lze použít níže popsanou metodu po čítání pro 
zkušební suspenze. Provádí-li se zkouška jako zkouška se suspendovanými 
sedimenty, m ěření 14 CO 2 by se mohlo provád ět nepřímo odběrem homogenního 
10ml vzorku zkušební vody/suspenze a odd ělením fází pomocí odst řeďování při 
vhodných otá čkách (nap ř. při 40 000 m/s  2 po dobu 15 minut). Vodní fáze by 
poté měla být ošet řena shora popsaným postupem. Aktivita  14 C v částicové fázi 
(POA) by se m ěla určit resuspendací sedimentu v malém objemu destilované 
vody, převedením do scintila čních lahvi ček a přidáním scintila ční kapaliny pro 
vytvoření gelu (za tímto ú čelem jsou k dispozici speciální scintila ční kapaliny). 
V závislosti na povaze částic (nap ř. jejich obsahu organického materiálu) m ůže 
být před přidáním scintila ční kapaliny vzorek p řes noc vyluhován tká ňovým 
rozpustidlem a poté homogenizován ví řivou mícha čkou. Alternativn ě lze POA 
určit spalováním v nadbytku kyslíku použitím oxida čního činidla na vzorek. P ři 
počítání je třeba vždy zahrnout interní standard a m ůže být nezbytné provád ět 
korekce na zhášení pomocí p řidání interního standardu pro každý jednotlivý 
vzorek.  
Přímé stanovení  14 CO  2 
Měří-li se uvol ňovaný  14 CO 2 přímo, je třeba nasadit na po čátku zkoušky více 
baněk, používat jako vzorek vždy celý objem zkušební ba ňky v každém m ěřicím 
bodě, okyselit zkušební ba ňky na pH 2 až 3 a jímat  14 CO 2 v interním (umíst ěný 
v každé zkušební ba ňce na po čátku zkoušky) nebo externím absorbéru. Jako 
absorpční médium lze používat alkálii (nap ř. 1 N roztok NaOH nebo peleta 
NaOH), ethanolamin nebo na ethanolaminu založený absorbér a komer čně 
dostupné absorbéry. Pro p římé měření 14 CO 2 je třeba baňky uzavřít např. septou 
z butylové pryže.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Obrázek 1a  
Příklad aritmetického vynášení dat (zbytková aktivita vzhledem k času)
 
Obrázek 1b  
Příklad semilogaritmického vynesení dat (ln zbytkové aktivity vzhledem k času)
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26  ZKOUŠKA INHIBICE R ŮSTU  LEMNA  SPP.  
1. METODA  
Tato metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení 221 (2006) (1). 
Mezi orgány EU panuje široká shoda v tom, že zkouška na  Lemna  spp. je 
u intenzivn ě zbarvených látek vhodnou alternativou ke zkoušce na 
řasách (2, 3).  
1.1 ÚVOD  
Tato zkušební metoda je ur čena k hodnocení toxicity látek pro slad ­
kovodní rostliny rodu  Lemna  (okřehek). Je založena na existujících 
pokynech (4, 5, 6, 7, 8, 9), ale obsahuje úpravy t ěchto metod, aby 
odrážela nejnov ější výsledky výzkumu a konzultace v řadě klíčových 
záležitostí. Navrhovaná metoda byla validována mezinárodní krouž ­
kovou zkouškou (10).  
Tato zkušební metoda popisuje zkoušení toxicity pomocí  Lemna 
gibba  a Lemna minor , které byly ob ě rozsáhle studovány a jsou 
předmětem shora uvedených norem. Taxonomie  Lemna  spp. je 
obtížná a je komplikována existencí široké škály fenotyp ů. Ačkoliv 
se u  Lemna  může vyskytnout genetická variabilita v odezv ě na 
toxické látky, není v sou časnosti dostatek údaj ů o tomto zdroji vari ­
ability, aby mohl být pro použití v rámci této metody doporu čen 
specifický klon. Je t řeba uvést, že zkouška se neprovádí axenicky, 
ale v jednotlivých stupních b ěhem zkušebního procesu se provádí 
opatření pro udržení kontaminace jinými organismy na minimu.  
Podrobně se popisuje zkoušení s obnovením (semistatické 
a průtokové) a bez obnovení (statické) zkušebního roztoku. 
V závislosti na cílech zkoušky a právních požadavcích se doporu čuje 
zvážit použití semistatických a pr ůtokových metod, nap říklad pro 
látky, které se z roztoku rychle ztrácí v d ůsledku odpa ření, fotode ­
gradace, srážení nebo biologického rozkladu. Další pokyny jsou uvedeny v (11).
 
1.2 DEFINICE  
Pro účely této zkušební metody se používají následující definice 
a zkratky:  
Biomasa : je suchá hmotnost živé hmoty p řítomné v populaci. V této 
zkoušce se obvykle m ěří náhrady biomasy, nap říklad počet lístků 
nebo plocha lístk ů a používání termínu „biomasa“ rovn ěž odkazuje 
na tyto náhradní míry.  
Chloróza : je žloutnutí tkán ě lístků. 
Klon : je organismus nebo bu ňka vzniklá z jediného jedince asexu ­
ální reprodukcí. Jedinci ze stejného klonu jsou proto geneticky iden ­
tičtí. 
Kolonie : znamená soubor mate řských a dce řiných lístk ů (obvykle 2 
až 4) navzájem spolu spojených. N ěkdy se ozna čuje jako rostlina.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : je koncentrace zkoušené látky rozpušt ěné ve zkušebním médiu, 
která pro danou expozi ční dobu vede k x% (nap ř. 50 %) snížení 
růstu Lemna  (musí se výslovn ě uvést, pokud se odchyluje od plné či 
normální doby trvání zkoušky). Pro jednozna čný popis hodnoty EC 
odvozené z r ůstové rychlosti nebo z výt ěžku se pro r ůstovou rychlost 
používá symbol „E  r C“ a pro výt ěžek „E  y C“ následovaný prom ěnnou 
měření, např. E r C (počet lístků). 
Průtoková zkouška : je zkouškou, p ři níž jsou zkušební roztoky 
průběžně vyměňovány.  
Lístek : je individuální/samostatnou listovitou strukturou rostliny 
okřehku. Je to nejmenší jednotka, tj. jedinec, schopná reprodukce.  
Hrbatost : znamená lístky mající hrbolatý či napuchlý vzhled.  
Růst: je zvýšením prom ěnné měření, např. počtu lístků, suché hmot ­
nosti, hmotnosti za mokra nebo plochy lístk ů, během doby zkoušky.  
Růstová rychlost (pr ůměrná specifická r ůstová rychlost) : je loga­
ritmické zvýšení biomasy b ěhem období expozice.  
Nejnižší koncentrace s pozorovanými ú činky (Lowest Observed 
Effect Concentration, LOEC) : je nejnižší zkušební koncentrací, p ři 
níž je pro danou expozi ční dobu pozorován statisticky významný 
účinek látky na snížení r ůstu (na hladin ě spolehlivosti p < 0,05) 
ve srovnání s kontrolou. Všechny zkušební koncentrace vyšší než 
LOEC musí však mít stejné nebo vážn ější škodlivé ú činky, než jsou 
účinky pozorované p ři koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dv ě 
podmínky splnit, musí být podrobn ě vysvětleno, jak byla LOEC (a 
tedy i NOEC) zvolena.  
Proměnné měření: jsou jakýmkoliv druhem prom ěnných, které se 
měří pro vyjád ření zkoumaného ú činku pomocí jedné či více 
různých prom ěnných odezvy. V této metod ě jsou prom ěnnými 
měření počet lístků, plocha lístk ů, čerstvá hmotnost a suchá hmot ­
nost.  
Monokultura : je kultura s jedním druhem rostliny.  
Nekróza : je mrtvá (tj. bílá či vodou nasáklá) tká ň lístku.  
Koncentrace bez pozorovaných ú činků (No Observed Effect 
Concentration, NOEC) : je zkušební koncentrace bezprost ředně 
nižší než LOEC.  
Fenotyp : je pozorovatelnou charakteristikou organismu ur čenou inte ­
rakcí jeho gen ů s prostředím.  
Proměnné odezvy : jsou prom ěnné pro odhad toxicity odvozené 
z jakýchkoliv nam ěřených prom ěnných, jež popisují biomasu, 
různými metodami výpo čtu. U této metody jsou prom ěnnými odezvy 
růstová rychlost a výt ěžek, které se odvozují z prom ěnných měření 
jako např. počtu lístků, plochy lístk ů, čerstvé hmotnosti nebo suché 
hmotnosti.  
Semistatická (obnovovací) zkouška : je zkouškou, p ři níž je 
zkušební roztok b ěhem zkoušky ve stanovených intervalech pravi ­
delně nahrazován.  
Statická zkouška : je zkušební metoda bez obnovování zkušebního 
roztoku b ěhem zkoušky.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Zkoumaný ú činek: popisuje obecný faktor, který bude jakožto cíl 
zkoušky zm ěněn zkoušenou chemickou látkou vzhledem ke kontrole. 
Při této metod ě je zkoumaným ú činkem inhibice r ůstu, kterou lze 
vyjádřit různými prom ěnnými odezvy, jež jsou založeny na jedné či 
více prom ěnných měření. 
Zkušební médium : je úplné syntetické r ůstové médium, v n ěmž 
rostou zkušební rostliny p ři expozici zkoušené látce. Zkoušená 
látka bude za normálních podmínek ve zkušebním médiu rozpušt ěna. 
Výtěžek: je hodnota prom ěnné měření pro vyjád ření biomasy na 
konci expozi ční doby minus prom ěnná měření na po čátku expozi ční 
doby.  
1.3 PODSTATA ZKOUŠKY  
Exponenciáln ě rostoucí kultury rostlin rodu  Lemna  se po dobu sedmi 
dnů nechají r ůst jako monokultury v r ůzných koncentracích zkoušené 
látky. Cílem zkoušky je kvantifikovat ú činky související s látkou na 
vegetativní r ůst během tohoto období, a to na základ ě hodnocení 
zvolených prom ěnných m ěření. Primární prom ěnnou měření je 
počet lístků. Rovněž se měří nejméně jedna další prom ěnná měření 
(celková plocha lístk ů, suchá hmotnost nebo čerstvá hmotnost), 
protože n ěkteré látky mohou ovliv ňovat jiné prom ěnné měření 
mnohem více než po čet lístků. Pro kvantifikaci ú činků souvisejících 
s látkou se r ůst ve zkušebních roztocích porovnává s r ůstem kontrol 
a stanoví se koncentrace zp ůsobující stanovenou x% inhibici r ůstu 
(např. 50 %) a vyjád ří jako EC  x (např. EC  50 ). 
Zkoumaným ú činkem je inhibice r ůstu vyjád řená jako logaritmické 
zvýšení prom ěnné měření (průměrná specifická r ůstová rychlost) 
během expozi ční doby. Z pr ůměrných specifických r ůstových rych ­
lostí zaznamenaných v řadě zkušebních roztok ů se stanoví koncent ­
race způsobující stanovenou x% inhibici r ůstové rychlosti (nap ř. 
50 %) a vyjád ří se jako E  r C x (např. E r C 50 ). 
Další prom ěnnou odezvy použitou v této zkušební metod ě je 
výtěžek, který m ůže být nutný ke spln ění specifických právních 
požadavk ů v některých zemích. Je definován jako prom ěnné měření 
na konci expozi ční doby minus prom ěnné měření na po čátku expo ­
ziční doby. Z výt ěžku zaznamenaného v řadě zkušebních roztok ů se 
vypočítá koncentrace zp ůsobující stanovenou x% inhibici výt ěžku 
(např. 50 %) a vyjád ří se jako E  y C x (např. E y C 50 ). 
Kromě toho se m ůže statisticky ur čit nejnižší koncentrace 
s pozorovanými ú činky (LOEC) a koncentrace bez pozorovaných 
účinků (NOEC).  
1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
Měla by být k dispozici analytická metoda s odpovídající citlivostí 
pro kvantifikaci látky ve zkušebním médiu.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro ú čely stanovení 
zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota, rozpust ­
nost ve vod ě, stálost ve vod ě na světle, p K a , K o/v , tlak par 
a biologická rozložitelnost. Pro výpo čet Henryho konstanty, která 
bude ukazovat, zda-li jsou pravd ěpodobné významné ztráty zkoušené 
látky během doby zkoušky, lze použít rozpustnost ve vod ě a tlak par. 
To pomáhá zjistit, zda-li by se m ěly podniknout konkrétní opat ření 
ke kontrole takových ztrát. Jestliže nejsou informace o rozpustnosti a stálosti zkoušené látky jisté, doporu čuje se, aby byly hodnoceny za 
podmínek zkoušky, tj. v r ůstovém médiu, p ři teplotě a režimu osv ět­
lení, které mají být p ři zkoušce použity.
 
Pokud je zvlášt ě důležitá kontrola pH zkušebního média, nap ř. 
zkouší-li se kovy nebo látky, které jsou hydrolyticky nestálé, doporu ­ 
čuje se přídavek pufru do r ůstového média (viz bod 1.7.4 první 
odstavec). Další pokyny pro zkoušení látek s fyzikáln ě-chemickými 
vlastnostmi, které zp ůsobují jejich obtížnou testovatelnost, je uveden 
v (11).  
1.5 REFEREN ČNÍ LÁTKA  
Jako prost ředek kontroly zkušebního postupu lze zkoušet referen ční 
látku (látky), nap říklad 3,5-dichlorfenol použitý v mezinárodní 
kruhové zkoušce (10). Doporu čuje se zkoušet referen ční látku 
nejméně dvakrát ro čně nebo – pokud se zkoušení provádí s menší 
četností – soub ěžně se stanovováním toxicity zkoušené látky.  
1.6 VALIDITA ZKOUŠKY  
Má-li být zkouška platná, musí být doba do zdvojnásobení po čtu 
lístků v kontrole menší než 2,5 dn ů (60 hodin), což odpovídá 
přibližně sedminásobnému zvýšení za sedm dn ů a průměrné speci ­
fické růstové rychlosti 0,275 d  –1 . Při využití médií a zkušebních 
podmínek popsaných v této zkušební metod ě lze tohoto kritéria 
dosáhnout použitím statické zkoušky (8). Rovn ěž se předpokládá, 
že toto kritérium bude splnitelné za podmínek semistatické 
a průtokové zkoušky. Výpo čet doby zdvojnásobení je uveden 
v bodě 2.1.  
1.7 POPIS METODY  
1.7.1  Přístroje a pom ůcky 
Veškeré vybavení p řicházející od styku se zkušebními médii by m ělo 
být vyrobeno ze skla nebo jiného chemicky inertního materiálu. Skleněné pomůcky použité pro kultiva ční a zkušební ú čely je 
zapotřebí vyčistit od chemických kontaminant ů, které by mohly 
unikat do zkušebního média, a musí být sterilní. Zkušební nádoby by měly být dostate čně široké, aby mohly lístky jednotlivých kolonií 
v kontrolních nádobách r ůst, aniž by se na konci zkoušky p řekrý­
valy. Není d ůležité, zda se ko řeny dotýkají dna zkušebních nádob, 
ale doporu čuje se, aby v každé zkušební nádob ě byla minimální 
hloubka 20 mm a minimální objem 100 ml. Volba zkušebních nádob není zásadn ě důležitá, pokud budou spln ěny tyto požadavky. 
Jako vhodné se potvrdily sklen ěné kádinky, krystaliza ční misky nebo 
skleněné Petriho misky vhodných rozm ěrů. Zkušební nádoby musí 
být zakryty, aby se minimalizovalo odpa řování a náhodná kontami ­
nace, přičemž však musí být umožn ěna nezbytná vým ěna vzduchu. 
Vhodné zkušební nádoby a zejména kryty musí zabránit stín ění nebo 
změnám spektrálních charakteristik sv ětla.
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Kultury a zkušební nádoby by se nem ěly přechovávat spole čně. 
Toho se nejlépe dosáhne pomocí samostatných komor, inkubátor ů 
či místností pro r ůst za podmínek prost ředí. Osvětlení a teplota musí 
být regulovatelné a musí se udržovat na stálé úrovni (viz bod 1.7.8).  
1.7.2  Testovací organismus  
Organismem použitým pro tuto zkoušku je  Lemna gibba  nebo  
Lemna minor . Krátké popisy druh ů okřehků, které byly použity 
pro zkoušky toxicity, jsou uvedeny v dodatku 1. Rostlinný materiál 
lze získat ze sbírek kultur, z jiné laborato ře nebo z terénu. Jestliže se 
sběr provádí z terénu, rostliny by se m ěly kultivovat ve stejném 
médiu, jaké se používá ke zkoušení, minimáln ě po dobu osmi 
týdnů před použitím. Terénní místa použitá pro sb ěr výchozích 
kultur musí být prostá z řejmých zdroj ů kontaminace. Pokud se získá ­
vají z jiné laborato ře nebo ze sbírek kultur, m ěly by se podobn ě 
uchovávat minimáln ě po tři týdny. Ve zkušebním protokolu je 
vždy třeba uvést zdroj rostlinného materiálu a druh ů a klonu (je-li 
znám) použitých ke zkoušení.  
Měly by se používat monokultury, které jsou o čividně prosté konta ­
minace jinými organismy, nap říklad řasami a prvoky. Zdravé rostliny  
L. minor  obsahují kolonie skládající se ze dvou až p ěti lístků, 
zatímco zdravé kolonie  L. gibba  mohou obsahovat až sedm lístk ů. 
Kvalita a jednotnost rostlin použitých pro zkoušku bude mít 
významný vliv na výsledek zkoušky, a proto by se m ěla volit 
s velkou pé čí. Měly by se používat mladé, rychle rostoucí rostliny 
bez viditelných lézí či odbarvení (chlorózy). Kultury dobré kvality se 
vyznačují vysokým výskytem kolonií obsahujících nejmén ě dva 
lístky. Velký po čet jednotlivých lístk ů je ukazatelem environmentál ­
ního stresu, nap ř. nedostatku živin, a rostlinný materiál z takovýchto 
kultur by se ke zkoušení nem ěl používat.  
1.7.3  Kultivace  
Pro snížení četnosti udržování kultury (nap ř. pokud se na ur čité 
období neplánují žádné zkoušky s  Lemna ) lze kultury udržovat za 
sníženého osv ětlení a teploty (4–10 °C). Podrobnosti o kultivaci jsou 
uvedeny v dodatku 2. O čividné známky kontaminace řasami nebo 
jinými organismy vyžadují povrchovou sterilizaci díl čího vzorku 
lístků Lemna  a následný p řenos do čerstvého média (viz dodatek 
2). V tomto p řípadě je třeba zbývající kontaminovanou kulturu 
zlikvidovat.  
Nejméně sedm dn ů před zkoušením se asepticky p řevede dostate čný 
počet kolonií do čerstvého sterilního média a kultivuje se 7 až 10 
dnů za podmínek zkoušky.  
1.7.4  Zkušební médium  
Pro Lemna minor  a Lemna gibba  se doporu čují odlišná média, jak je 
dále uvedeno. Je t řeba pečlivě zvážit zahrnutí pufru pH do zkušeb ­
ního média (MOPS (3-( N-morfolino)propansulfonová kyselina, číslo 
CAS: 1132–61–2; číslo EINECS: 214–478–5) do média pro  L. minor  
a NaHCO  3 do média pro  L. gibba ), jestliže existuje podez ření, že by 
mohl reagovat se zkoušenou látkou a ovliv ňovat expresi její toxicity. 
Steinbergovo médium (12) je rovn ěž přijatelné, pokud jsou spln ěna 
kritéria validity.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Pro kultivaci a zkoušení s  L. minor  se doporu čuje úprava švédského 
standardního (SIS) r ůstového média pro  Lemna . Složení tohoto 
média je uvedeno v dodatku 3.  
Ke kultivaci a zkoušení s  L. gibba  se doporu čuje růstové médium 
20X AAP, popsané v dodatku 3.  
Steinbergovo médium, popsané v dodatku 3, je rovn ěž vhodné pro  L. 
minor , ale může se používat i pro  L. gibba , pokud jsou spln ěna 
kritéria validity.  
1.7.5  Zkušební roztoky  
Zkušební roztoky se obvykle p řipravují ředěním zásobního roztoku. 
Zásobní roztoky zkoušené látky se oby čejně připravují rozpušt ěním 
látky v růstovém médiu.  
Nejvyšší zkušební koncentrace zkoušené látky by obvykle nem ěla 
překročit rozpustnost látky ve vod ě za zkušebních podmínek. Je však 
třeba poznamenat, že  Lemna  spp. plují na povrchu a mohou být 
vystaveny p ůsobení látek, které se hromadí na rozhraní voda-vzduch 
(např. látky špatn ě rozpustné ve vod ě nebo hydrofobní či povrchov ě 
aktivní látky). Za takových podmínek dochází k expozici jiným 
látkám, než jaké se nachází v roztoku, a zkušební koncentrace mohou v závislosti na vlastnostech zkoušené látky p řekračovat 
rozpustnost ve vod ě. Pro zkoušené látky s nízkou rozpustností ve 
vodě může být nezbytné p řipravit koncentrovaný zásobní roztok 
nebo disperzi látky pomocí organického rozpoušt ědla nebo dispergá ­
toru, aby se usnadnilo p řidávání p řesných množství zkoušené látky 
do zkušebního média, a napomohlo se tak její dispergaci 
a rozpušt ění. Měla by být vynaložena maximální snaha takové 
látky nepoužívat. Používání pomocných rozpoušt ědel nebo dispergátor ů 
by nemělo způsobovat žádnou fytotoxicitu. P říkladem b ěžně použí­
vaných rozpoušt ědel, která nezp ůsobují fytotoxicitu p ři koncentracích 
až do 100 μl·l
 –1 , jsou aceton a dimethylformamid. Jestliže se použije 
rozpouštědlo nebo dispergátor, jeho kone čná koncentrace by se m ěla 
zapsat ve zkušební zpráv ě a udržovat na minimu ( ≤ 100 μl·l –1 ) 
a všechny exponované vzorky a kontroly by m ěly obsahovat stejnou 
koncentraci rozpoušt ědla nebo dispergátoru. Další pokyny k používání 
dispergátor ů jsou uvedeny v (11).  
1.7.6  Zkušební a kontrolní skupiny  
Předběžná znalost toxicity zkoušené látky pro  Lemna , např. 
z orienta ční zkoušky, pom ůže při volbě vhodných zkušebních 
koncentrací. P ři definitivní zkoušce toxicity se zpravidla použije 
alespoň pět zkušebních koncentrací tvo řících geometrickou řadu. 
Faktor mezi zkušebními koncentracemi by nejlépe nem ěl překročit 
3,2, ale lze použít vyšší hodnotu, jestliže je k řivka závislosti 
koncentrace a odezvy plochá. Použití mén ě než pěti koncentrací by 
mělo být zd ůvodněno. V rámci každé zkušební koncentrace se 
použijí nejmén ě tři opakování.  
Při volbě rozsahu zkušebních koncentrací (pro orienta ční a/nebo 
definitivní zkoušku toxicity) je zapot řebí zvážit následující:  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Pro stanovení EC  x by se zkušební koncentrace m ěly pohybovat 
pod a nad hodnotu EC  x , aby se zajistila vhodná úrove ň spoleh­
livosti. Nap říklad pokud se odhaduje EC  50 , nejvyšší zkušební 
koncentrace by m ěla být vyšší než hodnota EC  50 . Jestliže 
hodnota EC  50 leží mimo rozmezí zkušebních koncentrací, souvi ­
sející intervaly spolehlivosti budou velké a správné hodnocení 
statistické vhodnosti modelu nemusí být možné.  
— Jestliže je cílem odhadnout LOEC/NOEC, nejnižší zkušební 
koncentrace by m ěla být dostate čně nízká, aby r ůst nebyl výrazn ě 
nižší než r ůst kontroly. Dále by nejvyšší zkušební koncentrace 
měla být dostate čně vysoká, aby byl r ůst výrazn ě nižší než r ůst 
kontroly. Pokud tomu tak není, zkouška se bude muset opakovat v odlišném rozmezí koncentrací (s výjimkou p řípadů, kdy je 
nejvyšší koncentrace na mezi rozpustnosti nebo je maximální 
požadovanou limitní koncentrací, nap ř. 100 mg.l
 –1 ). 
Každá zkouška by m ěla zahrnovat kontroly, pro n ěž se použije stejné 
živné médium, stejný po čet lístků a kolonií, stejné podmínky okol ­
ního prost ředí a postupy jako pro zkušební nádoby, avšak neobsahují 
zkoušenou látku. Jestliže se použije pomocné rozpoušt ědlo nebo 
dispergátor, m ěla by být zahrnuta i další kontrolní expozice 
s rozpoušt ědlem/dispergátorem p řítomným ve stejné koncentraci 
jako v nádobách se zkoušenou látkou. Po čet kontrolních nádob použ ­
itých k opakování (a p řípadných nádob s rozpoušt ědly) by m ěl být 
nejméně roven po čtu nádob použitých pro každou zkušební koncen ­
traci; v ideálním p řípadě by měl být dvojnásobný.  
Jestliže se stanovení NOEC nepožaduje, plán zkoušky lze pozm ěnit 
tak, že se zvýší po čet koncentrací a sníží po čet opakování na 
příslušnou koncentraci. Po čet kontrolních opakování však musí být 
nejméně tři. 
1.7.7  Expozice  
Kolonie tvo řené 2 až 4 viditelnými lístky se p řevedou z o čkovací 
kultury a za aseptických podmínek se náhodn ě přiřadí do zkušebních 
nádob. Každá nádoba by m ěla celkem obsahovat 9 až 12 lístk ů. 
Počet lístků a kolonií by m ěl být v každé zkušební nádob ě stejný. 
Zkušenosti získané s touto metodou a údaje z kruhové zkoušky 
ukazují, že použití t ří opakování na expozici, p řičemž pro každé 
opakování se zpo čátku použije od 9 do 12 lístk ů, dostačuje ke zjiš ­
tění rozdílů v inhibici r ůstu přibližně o 4 až 7 % vypo čítané pomocí 
růstové rychlosti (10 až 15 % po čítáno pomocí výt ěžku) mezi jedno ­
tlivými expozicemi (10).  
K minimalizaci vlivu prostorových rozdíl ů v intenzit ě světla nebo 
v teplotě je potřebné náhodné uspo řádání zkušebních nádob 
v inkubátoru. P ři provádění pozorování se rovn ěž vyžaduje uspo řá­
dání do blok ů nebo náhodné p řemísťování nádob (nebo častější 
přemísťování).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Jestliže p ředběžná zkouška stálosti ukazuje, že b ěhem doby trvání 
zkoušky (7 dn ů) nelze udržet koncentraci zkoušené látky (tj. m ěřená 
koncentrace poklesne pod 80 % nam ěřené počáteční koncentrace), 
doporučuje se semistatická zkouška. V tomto p řípadě by měly být 
kolonie nejmén ě dvakrát b ěhem zkoušky (nap ř. v den 3 a 5) vysta ­
veny čerstvě připraveným zkušebním a kontrolním roztok ům. 
Četnost expozice čerstvému médiu závisí na stálosti zkoušené látky; 
pro udržení tém ěř konstantních koncentrací vysoce nestálých či těka­
vých látek m ůže být zapot řebí vyšší četnost. Za ur čitých okolností 
může být nutný pr ůtokový postup (11, 13).  
Scénář expozice prost řednictvím aplikace na lístek (rozprašování) 
není do této zkušební metody zahrnut, avšak tomuto tématu se věnuje literatura (14).
 
1.7.8  Inkuba ční podmínky  
Pomocí kontinuálního teplého nebo chladného bílého fluorescen č­
ního osv ětlení je t řeba zajistit sv ětelnou intenzitu zvolenou 
z rozmezí 85–135 μE·m –2 ·s –1 , přičemž se tato intenzita m ěří při 
fotosynteticky aktivním zá ření (400 až 700 nm) v bodech nacháze ­
jících se ve stejné vzdálenosti od zdroje sv ětla jako lístky  Lemna  
(ekvivalent 6 500 až 10 000 lux ů). Jakékoliv odchylky od zvolené 
světelné intenzity nad zkušební plochou by nem ěly překročit ±15 %. 
Naměřenou hodnotu bude ovliv ňovat metoda detekce sv ětla 
a měření, zejména typ čidla. Kulová čidla (která reagují na sv ětlo 
ze všech úhl ů nad a pod rovinou m ěření) a „kosinová“ čidla (která 
reagují na sv ětlo ze všech úhl ů nad rovnou m ěření) jsou vhodn ější 
než jednosm ěrná čidla, nebo ť poskytují vyšší nam ěřené hodnoty pro 
vícebodový sv ětelný zdroj zde popsaného typu.  
Teplota ve zkušebních nádobách by m ěla být (24 ± 2) °C. Hodnota 
pH kontrolního média by nem ěla během zkoušky vzr ůst o více než 
1,5. Ovšem odchylka o více než 1,5 nebude znamenat neplatnost zkoušky, pokud je možné prokázat, že byla spln ěna kritéria validity. 
Zvláštní pozornost je zapot řebí věnovat posunu pH ve zvláštních 
případech, jako jsou zkoušky nestálých látek nebo kov ů. Další 
pokyny naleznete v (11).
 
1.7.9  Doba trvání  
Zkouška je ukon čena za 7 dn ů poté, co byly rostliny p řevedeny do 
zkušebních nádob.  
1.7.10  Měření a analytická stanovení  
Na počátku zkoušky se ur čí a zaznamená po čet lístků ve zkušebních 
nádobách, p řičemž se pe člivě dbá na to, aby byly zapo čítány vystu ­
pující, jasn ě viditelné lístky. Na po čátku zkoušky, dále nejmén ě 
jednou během každých 3 dn ů během expozi ční doby (tj. nejmén ě 
dvakrát b ěhem celkové doby 7 dn ů) a při ukončení zkoušky se musí 
určit počty lístků, které mají normální či abnormální vzhled. Je 
zapotřebí zaznamenat ve zkušební zpráv ě změny ve vývoji rostlin, 
např. velikost lístku, vzhled, známky nekrózy, chlorózy nebo hrba ­
tosti, rozpadávání kolonií nebo ztráta vzplývavosti a v délce a vzhledu ko řenu. Je rovn ěž nutné zaznamenat významné vlastnosti 
zkušebního média (nap ř. přítomnost nerozpušt ěného materiálu, r ůst 
řas ve zkušební nádob ě).
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Kromě určení počtu lístků během zkoušky se také hodnotí ú činky 
zkoušené látky na jednu (nebo více) následujících prom ěnných 
měření: 
i) celková plocha lístk ů, 
ii) suchá hmotnost,  
iii) čerstvá hmotnost.  
Celková plocha lístk ů má tu výhodu, že ji lze u každé zkušební 
a kontrolní nádoby ur čit na počátku zkoušky, v jejím pr ůběhu i na 
jejím konci. Suchá nebo čerstvá hmotnost by se m ěla určit na 
počátku zkoušky ze vzorku o čkovací kultury, jaké se obvykle 
používá k zahájení zkoušky, a na konci zkoušky pak na základ ě 
rostlinného materiálu z každé zkušební a kontrolní nádoby. Jestliže se plocha lístk ů neměří, dává se p řednost suché hmotnosti p řed 
čerstvou hmotností.
 
Celková plocha lístk ů, suchá hmotnost a čerstvá hmotnost se mohou 
určit následovn ě: 
i) Celková plocha lístk ů: Celková plocha lístk ů všech kolonií m ůže 
být stanovena analýzou obrazu. Pomocí videokamery lze zachytit siluetu zkušební nádoby a rostlin (tj. umístíte nádobu na svítící skříň) a výsledný obraz se digitalizuje. Plochu lístk ů ve zkušební 
nádobě lze poté stanovit kalibrací pomocí plochých tvar ů 
o známé ploše. Je t řeba dbát na vylou čení rušení zp ůsobeného 
hranou zkušební nádoby. Alternativní, ale pracn ější způsob 
spočívá v po řízení fotografie zkušebních nádob a rostlin, 
vyříznutí výsledné siluety kolonií a ur čení jejich plochy pomocí 
analyzátoru lístkové plochy nebo milimetrového papíru. Mohou být vhodné i další postupy (nap říklad pom ěr hmotnosti papíru 
mezi plochou siluety kolonií a jednotkovou plochou).
 
ii) Suchá hmotnost: Z každé ze zkušebních nádob se shromáždí 
všechny kolonie a propláchnou se destilovanou nebo deionizo ­
vanou vodou. Nadbyte čná voda se odstraní savým papírem a pak 
se vzorky suší p ři 60 °C do konstantní hmotnosti. M ěly by být 
zahrnuty jakékoliv úlomky ko řenů. Suchá hmotnost by se m ěla 
vyjádřit s přesností na nejmén ě 0,1 mg.  
iii) Čerstvá hmotnost: Všechny kolonie se p řevedou do p ředem 
zvážených polystyrenových zkumavek (nebo vyrobených 
z jiného interního materiálu) s malými (1 mm) otvory v zakulacených dnech. Zkumavky se poté odst řeďují při 3 000 
ot/min po dobu 10 minut p ři pokojové teplot ě. Zkumavky obsa ­
hující nyní osušené kolonie se op ětovně zváží a čerstvá hmotnost 
se vypočítá odečtením hmotnosti prázdné zkumavky.
 
1.7.10.1  Četnost měření a analytická stanovení  
Jestliže se používá plán statické zkoušky, pH každé expozice by se 
mělo změřit na počátku a na konci zkoušky. Jestliže se používá plán 
semistatické zkoušky, pH by se m ělo měřit v každé vsázce „ čer­
stvého“ zkušebního roztoku p řed každým obnovením a rovn ěž i v 
odpovídajících „spot řebovaných“ roztocích.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Intenzita osv ětlení by se m ěla měřit v růstové komo ře, inkubátoru 
nebo místnosti v bodech nacházejících se ve stejné vzdálenosti od 
zdroje sv ětla jako lístky  Lemna . Měření je třeba provád ět nejméně 
jednou během zkoušky. Teplota média v náhradní nádob ě držené za 
stejných podmínek v r ůstové komo ře, inkubátoru nebo místnosti by 
se měla zaznamenávat nejmén ě jednou denn ě. 
Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky ur čují ve vhodných 
intervalech. Ve statických zkouškách je minimálním požadavkem určení koncentrací na po čátku a na konci zkoušky.
 
U semistatických zkoušek, u nichž se neo čekává, že koncentrace 
zkoušené látky z ůstane v rozmezí ±20 % nominální koncentrace, 
je nezbytné analyzovat všechny čerstvě připravené zkušební roztoky 
a tytéž roztoky p ři každém obnovení (viz bod 1.7.7 t řetí odstavec). 
Ovšem u t ěch zkoušek, u nichž nejsou nam ěřené počáteční koncent ­
race zkoušené látky v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, avšak 
u nichž lze dostate čně prokázat, že po čáteční koncentrace jsou repro ­
dukovatelné a stálé (tj. od 80 do 120 % po čátečních koncentrací), 
mohou být chemická stanovení provedena pouze na nejvyšších 
a nejnižších zkušebních koncentracích. Ve všech p řípadech je t řeba 
provést ur čení koncentrací zkoušené látky p řed obnovením p ři každé 
zkušební koncentraci vždy pouze u jedné nádoby k opakování (nebo u sdruženého obsahu nádob jednoho opakování).
 
U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jaký 
je popsán u semistatických zkoušek v četně analýzy na po čátku, upro ­
střed a na konci zkoušky, ale m ěření „spotřebovaného“ roztoku není 
v tomto p řípadě vhodné. U tohoto typu zkoušky je zapot řebí kontro ­
lovat denn ě průtok ředicí vody a zkoušené látky nebo zásobního 
roztoku zkoušené látky.  
Lze-li prokázat, že byla po celou dobu zkoušky koncentrace zkou ­ 
šené látky uspokojiv ě udržována v rozmezí ±20 % nominální nebo 
naměřené počáteční koncentrace, m ůže být analýza výsledk ů 
založena na nominálních nebo nam ěřených po čátečních hodnotách. 
Je-li odchylka od nominální nebo nam ěřené počáteční koncentrace 
větší než ±20 %, analýza výsledk ů by měla být založena na geomet ­
rické střední koncentraci b ěhem expozice nebo na modelech popisu ­
jících pokles koncentrace zkoušené látky (11).  
1.7.11  Limitní zkouška  
Za určitých okolností, nap ř. pokud p ředběžná zkouška nazna čuje, že 
zkoušená látka nemá žádné toxické ú činky při koncentracích až do 
100 mg l  –1 nebo až do meze své rozpustnosti ve zkušebním médiu 
(podle toho, co je nižší), m ůže být provedena limitní zkouška 
zahrnující porovnání odezvy v kontrolní skupin ě a odezvy v jedné 
exponované skupin ě (100 mg l  –1 nebo koncentrace rovná mezi 
rozpustnosti). D ůrazně se doporu čuje podpo řit tuto zkoušku analýzou 
expozičních koncentrací. Všechny d říve popsané zkušební podmínky 
a kritéria validity se vztahují i na limitní zkoušku s výjimkou toho, že počet opakování s exponovanými vzorky by se m ěl zdvojnásobit. 
Růst v kontrolní a exponované skupin ě může být analyzován pomocí 
statistického testu pro porovnání st ředních hodnot, nap ř. Studentova 
t-testu.
 ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. DATA A ZPRÁVY  
2.1 DOBA ZDVOJNÁSOBENÍ  
Pro stanovení doby zdvojnásobení ( T d ) počtu lístků a dodržování 
tohoto kritéria validity ve studii (bod 1.6) se používá následující 
vzorec s údaji získanými z kontrolních nádob:  
T d = ln 2/μ 
kde μ je průměrná specifická r ůstová rychlost ur čená podle bodu 
2.2.1 prvního a druhého odstavce.  
2.2 PROM ĚNNÉ ODEZVY  
Účelem této zkoušky je stanovit ú činky zkoušené látky na vegeta ­
tivní růst Lemna . Tato zkušební metoda popisuje dv ě proměnné 
odezvy, protože členské zem ě mají odlišné preference a právní poža ­
davky. Mají-li být výsledky zkoušky p řijatelné ve všech členských 
zemích, ú činky je třeba vyhodnotit pomocí obou prom ěnných odezvy 
a) a b) popsaných dále.  
a) Průměrná specifická r ůstová rychlost: tato prom ěnná odezvy se 
počítá na základ ě změn logaritm ů počtů lístků a dále na základ ě 
změn logaritm ů jiného parametru m ěření (celková plocha lístk ů, 
suchá hmotnost nebo čerstvá hmotnost) v čase (vyjád řeno na den) 
v kontrolách a každé exponované skupin ě. Někdy se ozna čuje 
jako relativní r ůstová rychlost (15).  
b) Výtěžek: tato prom ěnná odezvy se po čítá na základ ě změn počtu 
lístků a dále na základ ě změn jiného parametru m ěření (celková 
plocha lístk ů, suchá hmotnost nebo čerstvá hmotnost) 
v kontrolách a každé exponované skupin ě až do konce zkoušky.  
Je třeba uvést, že hodnoty toxicity vypo čítané pomocí t ěchto dvou 
proměnných odezvy nejsou srovnatelné a p ři používání výsledk ů 
zkoušky se musí vzít tento rozdíl na v ědomí. Hodnoty EC  x založené 
na průměrné specifické r ůstové rychlosti (E  r C x ) budou všeobecn ě 
vyšší než výsledky založené na výt ěžku (E  y C x ), pokud se dodrží 
zkušební podmínky této zkušební metody, a to díky matematické základně příslušných p řístupů. Tuto skute čnost nelze vykládat jako 
rozdíl v citlivosti mezi t ěmito dvěma proměnnými odezvy; hodnoty 
jsou jednoduše matematicky odlišné. Koncepce pr ůměrné specifické 
růstové rychlosti je založena na obecném pr ůběhu exponenciálního 
růstu okřehku v nelimitovaných kulturách, u nichž se toxicita odha ­
duje na základ ě účinků na růstovou rychlost, aniž by závisela na 
absolutní úrovni specifické r ůstové rychlosti kontroly, na sklonu 
křivky závislosti koncentrace-odezva nebo na dob ě trvání zkoušky. 
Naproti tomu výsledky založené na prom ěnné odezvy „výt ěžek“ jsou 
závislé na všech t ěchto ostatních prom ěnných. E
 y C x závisí na speci ­
fické růstové rychlosti druh ů okřehku použitých v každé zkoušce 
a na maximální specifické r ůstové rychlosti, která se m ůže 
u jednotlivých druh ů, a dokonce i u r ůzných klon ů lišit. Tato 
proměnná odezvy by se nem ěla používat pro srovnávání citlivosti 
na toxické látky mezi druhy ok řehku nebo dokonce r ůznými klony. 
Přestože se z v ědeckého hlediska dává p řednost použití pr ůměrné 
specifické r ůstové rychlosti pro odhad toxicity, odhady toxicity 
založené na výt ěžku jsou rovn ěž do této zkušební metody zahrnuty, 
aby uspokojily sou časné právní požadavky v n ěkterých zemích.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Odhady toxicity by m ěly být založeny na po čtu lístků a na jedné 
další prom ěnné měření (celková plocha lístk ů, suchá hmotnost nebo 
čerstvá hmotnost), protože n ěkteré látky mohou ovliv ňovat jiné 
proměnné měření mnohem více než po čet lístků. Pouhým ur čováním 
počtu lístků by se tento ú činek nezjistil.  
Počet lístků a jakákoliv další zaznamenaná prom ěnná měření, tj. 
celková plocha lístk ů, suchá hmotnost nebo čerstvá hmotnost, se 
pro každé m ěření uvedou v tabulce spole čně s koncentracemi zkou ­ 
šené látky. Následná analýza dat, nap ř. odhad LOEC, NOEC nebo 
EC x , by měla být založena na hodnotách pro jednotlivá opakování, 
a nikoliv na vypo čítaných st ředních hodnotách pro každou expono ­
vanou skupinu.  
2.2.1  Pr ůměrná specifická r ůstová rychlost  
Průměrná specifická r ůstová rychlost pro konkrétní období se 
vypočítá jako logaritmické zvýšení prom ěnných růstu – počtu lístků 
a jedné další prom ěnné měření (celková plocha lístk ů, suchá hmot ­
nost nebo čerstvá hmotnost) – pomocí následujícího vzorce pro 
každé opakování kontrolních roztok ů a exponovaných roztok ů: 
μ i–j ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
kde: 
— μ i –j: průměrná specifická r ůstová rychlost od doby  i do doby  j, 
— N  i : proměnná měření ve zkušební nebo kontrolní nádob ě 
v době i, 
— N  j : proměnná měření ve zkušební nebo kontrolní nádob ě 
v době j, 
— t: čas od  i do j. 
Pro každou exponovanou skupinu a kontrolní skupinu vypo čítejte 
střední hodnotu r ůstové rychlosti a odhady rozptylu.  
Průměrná specifická r ůstová rychlost by se m ěla vypočítat pro celou 
dobu trvání zkoušky (doba „ i“ ve shora uvedeném vzorci je 
počátkem zkoušky a doba „ j“ je ukon čením zkoušky). Pro každou 
zkušební koncentraci a kontrolu vypo čítejte střední hodnotu 
průměrné specifické r ůstové rychlosti a odhady rozptylu. Dále je 
zapotřebí vyhodnocovat r ůstovou rychlost v jednotlivých časových 
úsecích s cílem zhodnotit ú činky zkoušené látky, které se vyskytly 
během expozi ční doby (nap ř. kontrolou logaritmicky transformova ­
ných růstových k řivek). Významné rozdíly mezi r ůstovou rychlostí 
v jednotlivých časových úsecích a pr ůměrnou růstovou rychlostí jsou 
známkou odchylky od konstantního exponenciálního r ůstu a vyžadují 
důkladné prozkoumání r ůstových k řivek. V tomto p řípadě by konzer ­
vativní přístup spočíval v porovnání specifických r ůstových rychlostí 
exponovaných kultur b ěhem doby maximální inhibice se specific ­
kými růstovými rychlostmi kontrol pro totéž období.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Procentuální inhibici r ůstové rychlosti ( I r ) lze potom vypo čítat pro 
každou zkušební koncentraci (exponovaná skupina) podle následují ­
cího vzorce:  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100 
kde: 
— % I  r : procentuální inhibice pr ůměrné specifické r ůstové rych ­
losti,  
— μ C : střední hodnota  μ v kontrolní skupin ě, 
— μ T : střední hodnota  μ v exponované skupin ě. 
2.2.2  Výt ěžek 
Účinky na výt ěžek se určují na základ ě dvou prom ěnných měření, tj. 
počtu lístků a jedné další prom ěnné měření (celková plocha lístk ů, 
suchá hmotnost nebo čerstvá hmotnost), p řítomných v každé 
zkušební nádob ě na počátku a konci zkoušky. Pro suchou hmotnost 
nebo čerstvou hmotnost se po čáteční biomasa ur čuje na základ ě 
vzorku lístk ů odebraných ze stejné vsázky použité k nao čkování 
zkušebních nádob (viz bod 1.7.3 druhý odstavec). Pro každou zkušební koncentraci a kontrolu vypo čítejte střední hodnotu výt ěžku 
a odhady rozptylu. St řední procentuální inhibici výt ěžku (% I
 y ) lze 
vypočítat pro každou exponovanou skupinu následovn ě: 
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100 
kde: 
— % I  y : procentuální snížení výt ěžku, 
— b  C : kone čná biomasa minus po čáteční biomasa pro 
kontrolní skupinu,  
— b  T : kone čná biomasa minus po čáteční biomasa pro expono ­
vanou skupinu.  
2.2.3  Vynášení k řivek závislosti koncentrace-odezva  
Je zapotřebí vynést k řivky závislosti koncentrace na odezv ě vyjadřu­
jící vztah st řední procentuální inhibice prom ěnné odezvy ( I r nebo  I y 
vypočítané podle pokyn ů v bodě 2.2.1 posledním odstavci nebo 
v bodě 2.2.2) a logaritmu koncentrace zkoušené látky.  
2.2.4  Odhad EC  x 
Odhady EC  x (např. EC  50 ) by měly být založeny jak na pr ůměrné 
specifické r ůstové rychlosti (E  r C x ), tak na výt ěžku (E  y C x ) a obě tyto 
hodnoty by zase m ěly vycházet z po čtu lístků a jedné další 
proměnné měření (celková plocha lístk ů, suchá hmotnost nebo 
čerstvá hmotnost). D ůvodem je skute čnost, že existují zkoušené 
látky, které mají odlišný dopad na po čet lístků a na další prom ěnné 
měření. Požadovanými parametry toxicity jsou proto čtyři hodnoty 
EC x pro každou vypo čítanou hodnotu inhibice x: E  r C x (počet lístků), 
E r C x (celková plocha lístk ů, suchá hmotnost nebo čerstvá hmotnost), 
E y C x (počet lístků) a E  y C x (celková plocha lístk ů, suchá hmotnost 
nebo čerstvá hmotnost),  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3 STATISTICKÉ POSTUPY  
Cílem je získat kvantitativní vztah mezi koncentrací a odezvou 
pomocí regresní analýzy. Je možné použít váženou lineární regresi po provedení linearizující transformace dat odezvy, nap říklad do 
probitových nebo logitových či Weibullových jednotek (16), ale 
dává se p řednost nelineárním regresním postup ům, s jejichž pomocí 
se lépe zpracovávají nevyhnutelné nepravidelnosti dat a odchylky od hladkých distribucí. P ři přiblížení se k nule či úplné inhibici mohou 
být takové nepravidelnosti zesíleny transformací a rušit p ři analýze 
(16). Je zapot řebí uvést, že standardní metody analýzy používající 
probitové, logitové nebo Weibullovy transformace jsou ur čeny 
k použití s kvantálními daty (nap ř. mortalita nebo p řežití) a musí 
se upravit, aby mohly být použity s daty r ůstové rychlosti či výtěžku. 
Speciální postupy pro stanovení hodnot EC
 x ze spojitých dat lze 
nalézt v literatu ře (17, 18 a 19).  
Pro každou prom ěnnou odezvy, která se má analyzovat, použijte 
vztah koncentrace a odezvy pro výpo čet bodových odhad ů hodnot 
EC x . Je-li to možné, je zapot řebí určit 95 % intervaly spolehlivosti 
pro každý odhad. Jakost shodnosti dat odezvy s regresním modelem 
je zapotřebí vyhodnotit bu ď graficky, nebo statisticky. Regresní 
analýza by se m ěla provád ět pomocí odezev jednotlivých opakování, 
nikoliv pomocí st ředních hodnot exponovaných skupin.  
Odhady EC  50 a intervaly spolehlivosti lze rovn ěž získat lineární 
interpolací s bootstrapem (20), pokud se dostupné regresní 
modely/metody pro p říslušná data nehodí.  
Pro odhad LOEC, a tedy i NOEC je nezbytné porovnat st řední 
hodnoty exponovaných vzork ů pomocí metod analýzy rozptylu 
(ANOVA). St řední hodnota pro každou koncentraci musí být poté 
porovnána se st řední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou 
metodou vícenásobného porovnání nebo metodou zkoušky trendu. 
Užitečné mohou být Dunnett ův nebo Williams ův test (21, 22, 23, 
24). Je nezbytné vyhodnotit, zda je spln ěn předpoklad homogenity 
rozptylu nezbytný pro ANOVA. Toto hodnocení lze provád ět graficky 
nebo formálním testem (25). Mezi vhodné testy pat ří Levenův 
a Bartlett ův test. Nespln ění předpokladu o homogenit ě rozptylů lze 
někdy napravit logaritmickou transformací dat. Jestliže je heterogenita 
rozptylů extrémní a nelze ji napravit transformací, pak je t řeba zvážit 
analýzu takovými metodami, jako jsou testy sestupného trendu Jonck ­
heere. Další pokyny pro stanovení NOEC lze nalézt v (19).  
Vědecký vývoj poslední doby vedl k doporu čení opustit koncepci 
NOEC a nahradit ji odhady bod ů EC  x na základ ě regrese. Vhodná 
hodnota pro x nebyla pro tuto zkoušku s  Lemna  stanovena. Nicmén ě 
se zdá, že vhodné je rozmezí od 10 do 20 % (v závislosti na zvolené proměnné odezvy) a nejlépe by se m ěly uvádět jak EC
 10 , tak EC  20 . 
3. ZPRÁVY  
3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE  
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální povaha a fyzikáln ě-chemické vlastnosti v četně meze 
rozpustnosti ve vod ě, ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— údaje o chemické identifikaci (nap ř. číslo CAS) v četně čistoty.  
Testovací druhy:  
— vědecký název, klon (je-li znám) a zdroj.  
Zkušební podmínky:  
— použitý zkušební postup (statický, semistatický nebo pr ůtokový),  
— datum zahájení zkoušky a délka jejího trvání,  
— zkušební médium,  
— popis experimentálního provedení: zkušební nádoby a kryty, 
objemy roztok ů, počty kolonií a lístk ů na zkušební nádobu na 
počátku zkoušky,  
— zkušební koncentrace (nominální, pop ř. naměřené) a po čet 
opakování na každou koncentraci,  
— metody p řípravy zásobních a zkušebních roztok ů včetně použití 
jakýchkoliv rozpoušt ědel nebo dispergátor ů, 
— teplota b ěhem zkoušky,  
— zdroj sv ětla, intenzita sv ětla a homogenita,  
— hodnoty pH zkušebních a kontrolních médií,  
— koncentrace zkoušené látky a metoda analýzy s p říslušnými údaji 
pro hodnocení jakosti (valida ční studie, sm ěrodatné odchylky 
nebo intervaly spolehlivosti analýz),  
— metody pro ur čení počtu lístků a dalších prom ěnných m ěření, 
např. suchá hmotnost, čerstvá hmotnost nebo plocha lístk ů, 
— všechny odchylky od této zkušební metody.  
Výsledky:  
— hrubá data: po čet lístků a dalších prom ěnných měření v každé 
zkušební a kontrolní nádob ě při každém pozorování a každé 
analýze,  
— střední hodnoty a sm ěrodatné odchylky pro každou prom ěnnou 
měření, 
— růstové křivky pro každou koncentraci (doporu čuje se 
s logaritmicky transformovanou prom ěnnou měření, viz bod 
2.2.1 druhý odstavec),  
— doba zdvojnásobení/r ůstová rychlost v kontrole na základ ě počtu 
lístků, 
— vypočítané prom ěnné odezvy pro všechna opakování 
s exponovanými vzorky, spolu se st ředními hodnotami 
a variačním koeficientem pro opakování,  
— grafické znázorn ění vztahu koncentrace a ú činku,  
— odhady toxických ú činků pro prom ěnné odezvy, nap ř. EC  50 , 
EC 10 , EC  20 , a související intervaly spolehlivosti. Jestliže se po čí­
tají LOEC a/nebo NOEC, uvedou se jejich hodnoty a statistické 
metody použité k jejich stanovení,  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— jestliže byla použita ANOVA, uvede se velikost ú činku, který lze 
detekovat (nap ř. nejmenší významný rozdíl),  
— jakákoliv stimulace r ůstu zjištěná v jakémkoli exponovaném 
vzorku,  
— jakékoliv vizuální známky fytotoxicity, jakož i pozorování 
zkušebních roztok ů, 
— diskuse výsledk ů včetně jakéhokoliv vlivu na výsledek zkoušky 
v důsledku odchylek od této zkušební metody.  
4. LITERATURA  
(1) OECD TG 221 (2006)  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test.  
(2) O použití studií na  Lemna  spp. u zbarvených látek pojednává 
oddíl 13.5.3 publikace EU  Manual of Decisions  z 
července 2006, která je dostupná na internetových stránkách 
http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals.  
(3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment – kapitola R.7b: Endpoint specific guidance; tabulka 7.8.3: Summary of difficult substance testing issues, dostupné na internetových stránkách
 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ ­
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A.  
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reap ­
proved 1998). s. 733–742.  In: Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.  
(5) USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  
Lemna  spp., „Public draft“. EPA 712-C-96–156. 8 stran.  
(6) AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10 stran.  
(7) SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duck­
weed. SS 02 82 13. 15 stran (švédsky).  
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37, 120 stran.
 
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145.
 
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 
003. WRc plc – Environment Agency.  
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23.
 
(12) ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3–77 108. September 1977.
 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). 
Bioassays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of 
sprayed and dissolved glyphosate.  Hydrobiologia , 118/119, 
353–359.  
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds.  Environmental Toxi ­
cology and Chemistry , 12, 481–483.  
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves.  Env. Sci. Technol . 
19, 713–718.  
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests.  Environ. Toxicol. Chem . 11, 157–167.  
(18) Bruce R.D., Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data.  Environmental Toxicology 
and Chemistry , 11, 1485–1494.  
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096–1121.  
(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491.  
(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103–117.  
(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
(25) Brain P., Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93–96.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Dodatek 1  
Popis  Lemna  spp.  
Vodní rostlina ozna čovaná jako ok řehek,  Lemna  spp., pat ří do čeledi  Lemnaceae , 
která zahrnuje celosv ětově rozšířené druhy ve čtyřech rodech. Jejich vzhled 
a taxonomie byly popsány vy čerpávajícím zp ůsobem (1, 2).  Lemna gibba  a L. 
minor  jsou představitelé druh ů mírných oblastí a b ěžně se používají pro zkoušky 
toxicity. Oba druhy mají plovoucí nebo pono řenou lodyžku diskového tvaru 
(lístek) a ze st ředu spodní části každého lístku vychází velmi tenký ko řínek.  
Lemna  spp. zřídkakdy kvetou a rostliny se množí vegetativn ě vytvářením nových 
lístků (3). Při srovnání se staršími rostlinami jsou mladší rostliny sv ětlejší, mají 
kratší kořínky a skládají se ze dvou až t ří lístků různých velikostí. Díky své malé 
velikosti, jednoduché struktu ře, asexuálnímu rozmnožování a krátké genera ční 
době jsou rostliny rodu  Lemna  velmi vhodné pro laboratorní zkoušení (4, 5).  
Z důvodu pravd ěpodobných mezidruhových rozdíl ů v citlivosti jsou platná pouze 
srovnání citlivosti v rámci druhu.  
Příklady druh ů Lemna , které byly použity ke zkoušení: odkazy na druhy  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as 
a function of intensity and duration of light.  J. Phys. Chem ., 29: 935–941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. 
EPA 712-C-96–156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90–337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Švédský normaliza ční institut (SIS). (1995). Water quality – Determination of 
growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15 stran (švéd ­
sky).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). s. 733–742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. EPA 
712-C-96–156. 8 stran.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals.  Arch. Environ. Contam. Toxicol ., 10:1959–1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf ., 5:87–96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds.  Environ. Toxicol. and Chem ., 12:481–483.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds.  Verh.-Int. Ver. Limnol ., 19:2102–2111.  
Zdroje druh ů Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Kanada, M5S 3 B2  
Tel.: +1–416–978–3641  
Fax:+1–416–978–5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695–8002  
USA  
Tel.: 001 (919) 515–7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institutionen före tillämpad miljövetenskap (ITM) Stockholms universitet  
SE-106 91 Stockholm  
ŠVÉDSKO  
Tel.: +46 86747240  
Fax: +46 86747636  
Umweltbundesamt (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
Německo  
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Literatura  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the desc ­
riptive and experimental literature.  The Botanical Review , 27:221–287.  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82–991150–0–0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed.  Environmental Pollution , Ser B, 11:1–14.  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing.  Environ­
mental Research , 52:7–22.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Dodatek 2  
Uchovávání zásobní kultury  
Zásobní kultury lze uchovávat za nízkých teplot (4–10 °C) po delší dobu, aniž by 
bylo zapot řebí je znovu zakládat. R ůstové médium pro  Lemna  může být stejné 
jako médium používané ke zkoušení, ale pro zásobní kultury lze použít jiná 
média bohatá na živiny.  
Pravideln ě se odebere n ěkolik mladých, sv ětlezelených rostlin a aseptickým 
postupem se umístí do nových kultiva čních nádob obsahujících čerstvé médium. 
Za chladn ějších podmínek, které se zde navrhují, lze provád ět tvorbu díl čích 
kultur v intervalech až do t ří měsíců. 
Je třeba používat chemicky čisté (kyselinou promyté) a sterilní sklen ěné kulti­
vační nádoby a pracovat aseptickými manipula čními postupy. V p řípadě konta­
minace zásobní kultury nap ř. řasami či kvasinkami, je nezbytné p řijmout opat ření 
na odstran ění kontaminujících organism ů. V případě řas a většiny dalších konta ­
minujících organism ů toho lze dosáhnout povrchovou sterilizací. Odebere se 
vzorek kontaminovaného rostlinného materiálu a od říznou se ko řeny. Materiál 
se poté intenzivn ě protřepává v čisté vodě, poté následuje pono ření do 0,5 % 
(obj.) roztoku chlornanu sodného po dobu 30 sekund až 5 minut. Rostlinný 
materiál se dále opláchne sterilní vodou a p řevede se jako řada vsázek do kulti ­
vačních nádob obsahujících čerstvé růstové médium. Mnoho lístk ů v důsledku 
tohoto ošet ření odum ře, zejména použijí-li se delší expozi ční doby, ale n ěkteré 
z přeživších rostlin budou obvykle zbaveny kontaminace. Ty lze poté použít pro 
přeočkování nových kultur.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Dodatek 3  
Média  
Pro L. minor  a L. gibba  se doporu čují různá růstová média. Pro  L. minor  se 
doporučuje upravené švédské standardní (SIS) médium, zatímco pro  L. gibba  se 
doporučuje médium 20X AAP. Složení obou médií je uvedeno níže. P ři přípravě 
těchto médií je zapot řebí používat chemické látky analytické čistoty nebo na 
úrovni činidel a deionizovanou vodu.  
Švédské standardní (SIS) r ůstové médium pro  Lemna  
— Zásobní roztoky I–V se sterilizují v autoklávu (120 °C, 15 minut) nebo 
membránovou filtrací (p řibližná velikost pór ů 0,2 μm). 
— Zásobní roztok VI (a p řípadně VII) se sterilizují pouze membránovou filtrací, 
neautoklávují se.  
— Sterilní zásobní roztoky se skladují v chladu a temnu. Zásobní roztoky 
I až V je t řeba zlikvidovat po šesti m ěsících, zatímco zásobní roztoky VI 
(a případně VII) mají životnost jeden m ěsíc. 
Zásobní roztok 
č. Látka Koncentrace 
v zásobním 
roztoku (g.l  –1 ) Koncentrace 
v připraveném 
médiu (mg.l  –1 ) Připravené médium 
Prvek Koncentrace 
(mg·l –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO 4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 0,010 0,050 
0,0050 
0,010 1,00 
0,20 0,010 0,050 
0,0050 
0,010 B 
Mn Mo Zn 
Cu 
Co 0,17 
0,056 0,0040 0,011 
0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H 2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (pufr) 490 490 — —  
— Pro p řípravu jednoho litru média SIS se do 900 ml deionizované vody p řidá: 
— 10 ml zásobního roztoku I,  
— 5 ml zásobního roztoku II,  
— 5 ml zásobního roztoku III,  
— 5 ml zásobního roztoku IV,  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml zásobního roztoku V,  
— 5 ml zásobního roztoku VI,  
— 1 ml zásobního roztoku VII (volitelné).  
Poznámka:  Pro některé zkoušené látky možná bude zapot řebí další zásobní roztok VII 
(pufr MOPS) (viz bod 1.4 poslední odstavec).  
— pH se upraví na 6,5 ± 0,2 p řidáním 0,1M nebo 1M-HCl nebo NaOH a objem 
se doplní deionizovanou vodou do jednoho litru.  
Růstové médium 20X AAP  
Zásobní roztoky se p řipravují ve sterilní destilované nebo deionizované vod ě. 
Sterilní zásobní roztoky se skladují v chladu a temnu. Za t ěchto podmínek budou 
mít zásobní roztoky životnost nejmén ě 6 až 8 týdn ů. 
Pro médium 20X AAP se p řipraví pět zásobních roztok ů živin (A1, A2, A3, B a 
C), přičemž se použijí chemické látky na úrovni činidel. Růstové médium se 
vytvoří přidáním 20 ml každého zásobního roztoku živin do p řibližně 850 ml 
deionizované vody. pH se upraví na 7,5 ± 0,1 p řidáním 0,1M nebo 1M-HCl nebo 
NaOH a objem se doplní do jednoho litru deionizovanou vodou. Médium se poté filtruje přes (přibližně) 0,2μm membránový filtr do sterilního zásobníku.
 
Růstové médium ur čené ke zkoušení by se m ělo připravovat 1 až 2 dny p řed 
použitím, aby se mohlo stabilizovat pH. pH r ůstového média by se p řed použitím 
mělo zkontrolovat a znovu upravit, bude-li to nezbytné, p řídavkem 0,1M nebo 
1M-NaOH či HCl, jak je popsáno výše.  
Zásobní roztok č. Látka Koncentrace 
v zásobním 
roztoku (g.l  –1 ) (*) Koncentrace 
v připraveném 
médiu (mg.l  –1 ) (*) Připravené médium 
Prvek Koncentrace (mg ·l –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H 2 O 
CaCl  2 ·2H 2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H 2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H 2 O 1,4 30 K; P 9,4; 3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H 2 O 
FeCl  3 ·6H 2 O 
Na 2 EDTA·2H 2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H 2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H 2 O 
CuCl  2 ·2H 2 O 0,19 
0,42 0,16 
0,30 
3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l –1 
7,3 mg·l –1 
0,012 mg ·l –1 3,7 
8,3 3,2 
6,0 
66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn Fe 
— 
Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 0,66 
— 
31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Pokud není uvedeno jinak.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Poznámka pod čarou: Teoreticky správná kone čná koncentrace hydrogenuhli čitanu (při níž 
není nutná výrazná úprava pH) je 15 mg/l, nikoliv 300 mg/l. Ovšem 
historické používání média 20X AAP v četně kruhové zkoušky pro 
tuto metodu je založeno na 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test. Develop ­
ment and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Tech ­
nical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency).
 
STEINBERGOVO médium (podle ISO 20079)  
Koncentrace a zásobní roztoky  
— Upravené Steinbergovo médium se v norm ě ISO 20079 používá pouze pro  
Lemna minor  (protože uvedená norma povoluje pouze  Lemna minor ), ale 
zkoušky ukázaly, že by se mo hlo dosáhnout dobrých výsledk ů i s Lemna gibba . 
— Při přípravě média je zapot řebí používat chemické látky analytické čistoty 
nebo na úrovni činidel a deionizovanou vodu.  
— Připravte živné médium ze zásobních roztok ů nebo desetinásobn ě koncen­
trovaného média, které umož ňuje maximální koncentraci média bez srážení.  
Tabulka 1  
STEINBERGOVO médium se stabilizovaným pH (upraveno podle Altenburgera)  
Látka Živné médium  
Makroprvky  molekulová hmotnost mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroprvky  molekulová hmotnost μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
dinatrium-EDTA dihydrát 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabulka 2  
Zásobní roztoky (makroprvky)  
1. Makroprvky (50 násobn ě koncentrované)  g/l  
Zásobní roztok 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Zásobní roztok 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Zásobní roztok 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabulka 3  
Zásobní roztoky (mikroprvky)  
2. Mikroprvky (1 000 násobn ě koncentrované)  mg/l  
Zásobní roztok 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Zásobní roztok 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Zásobní roztok 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Zásobní roztok 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Zásobní roztok 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
Ethylendiamintetraoctan dvojsodný-dihydrát 1 500,00  
— Zásobní roztoky 2 a 3 a odd ěleně 4 až 7 lze sdružovat (p ři zohledn ění 
požadovaných koncentrací).  
— K dosažení delší životnosti autoklávujte zásobní roztoky p ři teplotě 121 °C 
po dobu 20 minut nebo alternativn ě proveďte sterilní filtraci (0,2 μm). 
U zásobního roztoku 8 se d ůrazně doporučuje sterilní filtrace (0,2 μm). 
Příprava kone čné koncentrace STEINBERGOVA média (upraveného)  
— Přidejte 20 ml zásobních roztok ů 1, 2 a 3 (viz tabulka 2) do p řibližně 900 ml 
deionizované vody, aby se zabránilo srážení.  
— Přidejte 1,0 ml zásobních roztok ů 4, 5, 6, 7 a 8 (viz tabulka 3).  
— pH by m ělo být 5,5 ± 0,2 (upravte p řidáním minimálního objemu roztoku 
NaOH nebo HCl).  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Doplňte vodou do 1 000 ml.  
— Jestliže se zásobní roztoky sterilizují a použije-li se vhodná voda, žádná další 
sterilizace není zapot řebí. Pokud se sterilizuje kone čné médium, zásobní 
roztok 8 se p řidá po autoklávování (p ři teplotě 121 °C po dobu 20 min).  
Příprava 10násobn ě koncentrovaného STEINBERGOVA média (uprave ­
ného) pro p řechodné uložení  
— Přidejte 20 ml zásobních roztok ů 1, 2 a 3 (viz tabulka 2) do p řibližně 30 ml 
vody, aby se zabránilo srážení.  
— Přidejte 1,0 ml zásobních roztok ů 4, 5, 6, 7 a 8 (viz tabulka 3). Dopl ňte 
vodou do 100 ml.  
— Jestliže se zásobní roztoky sterilizují a použije-li se vhodná voda, žádná další 
sterilizace není zapot řebí. Pokud se sterilizuje kone čné médium, zásobní 
roztok 8 se p řidá po autoklávování (p ři teplotě 121 °C po dobu 20 minut).  
— pH média (kone čná koncentrace) by m ělo být 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27  TEST TOXICITY NA CHIRONOMIDAE V SYSTÉMU 
SEDIMENT-VODA ZA POUŽITÍ OBOHACENÉHO SEDIMENTU  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 218 
(2004). Tato zkušební metoda je ur čena k posouzení ú činků dlouhodobé 
expozice larev sladkovodních pakomár ů Chironomus  sp. žijících 
v sedimentu chemickým látkám. Je založena na stávajících protokolech o zkoušce toxicity p ro Chironomus riparius  a Chironomus tentans,  která 
byla vyvinuta v Evrop ě (1, 2, 3) a v Severní Americe (4, 5, 6, 7, 8) 
a ověřována v mezilaboratorních porovnávacích zkouškách (1, 6, 9). Lze 
užít rovn ěž další dob ře zdokumentované druhy pakomár ů, jako nap říklad  
Chironomus yoshimatsui  (10, 11).
 
2. Scéná ř expozice užitý p ři této zkušební metod ě je vmíchání zkoušené látky 
do sedimentu. Výb ěr vhodného scéná ře expozice závisí na zamýšleném 
použití testu. Ú čelem scéná ře vmíchání látky do sedimentu je simulovat 
nahromad ěné množství chemických látek p řetrvávajících v sedimentu. 
Tento systém expozice zahrnuje vmíchání látky do sedimentu ve zkušebním systému sediment–voda.
 
3. Látky, které je t řeba testovat z hlediska organism ů žijících v sedimentu, 
v této složce obvykle p řetrvávají po dlouhá časová období. Expozici orga ­
nismů žijících v sedimentu lze zajistit celou řadou možných cest. Relativní 
význam jednotlivých cest, jimiž dochází k expozici, a doba nezbytná 
k tomu, aby každá z nich p řispěla k celkovým toxickým ú činkům, jsou 
závislé na fyzikáln ě chemických vlastnostech dot čené chemické látky. 
V případě silně adsorbujících látek (nap ř. log K  ow > 5) nebo pro chemické 
látky s kovalentní vazbou na sediment m ůže být významnou expozi ční 
cestou požití kontaminované potravy. Aby nedošlo k podcen ění toxicity 
vysoce lipofilních látek, lze zvážit užití potravy p řidané do sedimentu 
před aplikací zkoušené chemické látky. Aby bylo možné zohlednit všechny 
potenciální zp ůsoby expozice, zam ěřuje se tato zkušební metoda na dlou ­
hodobou expozici. Délka trvání zkoušky se pohybuje v rozmezí 20–28 dní 
pro C. riparius  and C. yoshimatsui  a 28–65 dní pro  C. tentans . Pokud jsou 
pro konkrétní ú čel, například pro studium ú činků nestabilní chemické látky, 
potřebné krátkodobé údaje, mohou být další duplikátní vzorky po deseti 
dnech odstran ěny. 
4. Měřené výsledné ú činky se rovnají celkovému po čtu vylíhlých dosp ělců 
a času do vylíhnutí. Pokud jsou nezbytné další krátkodobé údaje, doporu ­ 
čuje se provád ět měření přežití a růstu larev až po uplynutí desetidenního 
období, podle pot řeby s využitím dalších duplikátních vzork ů. 
5. Doporu čuje se použití sedimentu dopln ěného přísadami. P řísadami dopln ěný 
sediment má n ěkolik výhod oproti p řírodním sediment ům: 
— jeho experimentální variabilita je snížena, protože tvo ří reprodukova ­
telnou „standardizovanou matrici“ a je eliminována pot řeba hledat zdroje 
nekontaminovaného čistého sedimentu,  
— zkoušky lze zahájit kdykoliv, aniž by bylo nutno čelit sezonním 
výkyvům zkušebního sedimentu, a sediment není t řeba předem upravit, 
aby se z n ěj odstranili p ůvodní živo čichové; užití p řísadami dopln ěného 
sedimentu také snižuje náklady spojené s terénním shromaž ďováním 
dostatečného množství sedimentu pro rutinní testování,  
— užití p řísadami dopln ěného sedimentu umož ňuje porovnání toxicity 
a odpovídající řazení látek.  
6. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
PODSTATA ZKOUŠKY  
7. Larvy pakomár ů v prvním instaru jsou vystaveny koncentra čnímu rozmezí 
zkoušené chemické látky v systému sediment–voda. Zkoušená látka se vmíchá do sedimentu a následn ě jsou do zkušebních kádinek se stabilizo ­
vanou koncentrací sedimentu a vody nasazeny larvy prvního instaru. Na 
konci zkoušky se m ěří rychlost líhnutí a vývoje pakomár ů. V případě 
potřeby lze po 10 dnech m ěřit rovněž přežití larev a jejich hmotnost (v 
případě potřeby lze použít další duplikátní vzorky). Tyto údaje se analyzují 
buď pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která by 
způsobila x% snížení líhnutí nebo p řežití či růstu larev (nap ř. EC
 15 , EC  50 , 
atd.), nebo s využitím testování statistických hypotéz pro stanovení NOEC/ 
LOEC. Posledn ě uvedená metoda vyžaduje srovnání hodnoty ú činku 
s kontrolními hodnotami pomocí statistických test ů. 
INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
8. Měla by být známa rozpustnost zkoušené chemické látky ve vod ě, její tlak 
par, naměřená nebo vypo čtená distribuce v sedimentu a stabilita ve vod ě 
a sedimentu. M ěla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda pro 
kvantitativní stanovení zkoušené chemické látky ve vod ě nad sedimentem, 
kapilární vod ě a v sedimentu, a to se známou a doloženou p řesností a mezí 
stanovitelnosti. Užite čné informace zahrnují strukturní vzorec a čistotu zkou ­ 
šené chemické látky. Užite čnou informací je rovn ěž chemický osud zkou ­ 
šené chemické látky (nap ř. zánik, abiotický a biotický rozklad atd.). Další 
návod pro zkoušení látek s fyzikáln ě chemickými vlastnostmi, které činí 
jejich zkoušení obtížné, je uveden v položce seznamu literatury (12).  
REFEREN ČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY  
9. Referen ční chemické látky mohou být pravideln ě kontrolovány pro ov ěření, 
že zkušební podmínky a protokol o zkoušce jsou spolehlivé. P říkladem 
referenčních toxických látek úsp ěšně použitých v mezilaboratorních zkou ­ 
škách a valida čních studiích jsou lindan, trifluralin, pentachlorfenol, chlorid 
kademnatý a chlorid draselný (1, 2, 5, 6, 13).  
PLATNOST ZKOUŠKY  
10. Aby byla zkouška platná, m ěly by být spln ěny tyto podmínky:  
— vylíhnutí v kontrolních nádobách musí být na konci zkoušky nejmén ě 
70 % (1, 6),  
— k líhnutí dosp ělců C. riparius  a C. yoshimatsui  v kontrolních nádobách 
by mělo dojít mezi 12. a 23. dnem po jejich zavedení do nádob; pro  C. 
tentans  je nutná doba 20–65 dn ů, 
— na konci zkoušky se v každé nádob ě změří pH a koncentrace rozpušt ě­
ného kyslíku. Koncentrace kyslíku by m ěla činit alespo ň 60 procent 
hodnoty nasycení vzduchem (ASV) p ři použité teplot ě a pH vody nad 
sedimentem by se m ělo ve všech zkušebních nádobách pohybovat 
v rozmezí pH 6–9,  
— teplota vody by se nem ěla lišit o více než ± 1,0 °C. Teplota vody m ůže 
být řízena v izotermální místnosti a v tomto p řípadě by měla být teplota 
v místnosti ve vhodném časovém intervalu potvrzována.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
POPIS METODY  
Zkušební nádoby  
11. Studie se provádí ve sklen ěných 600ml kádinkách o pr ůměru 8 cm. Vhodné 
jsou i jiné nádoby, ale m ěly by zaru čit odpovídající hloubku vody nad 
sedimentem a sedimentu. Plocha sedimentu by m ěla být dostate čná, aby 
poskytovala 2 až 3 cm  2 na larvu. Pom ěr hloubky sedimentu k hloubce 
vody nad sedimentem by m ěl být 1:4. Zkušební nádoby a další aparatura, 
která přichází do styku se zkušebním systémem, by m ěly být celé zhotoveny 
ze skla nebo z jiného chemicky inertního materiálu (nap ř. z teflonu).  
Výběr druhů 
12. Při zkoušce má být p řednostně užito druhu  Chironomus riparius . Vhodný je 
i druh  Chironomus tentans , avšak h ůře se s ním manipuluje a vyžaduje 
i delší trvání zkoušky. Lze užít rovn ěž druh  Chironomus yohimatsui . 
Podrobnosti o kultiva čních metodách pro druh  Chironomus riparius  jsou 
uvedeny v dodatku 2. Informace o kultiva čních podmínkách jsou 
k dispozici také pro jiné druhy, tj.  Chironomus tentans  (4) a  Chironomus 
yoshimatsui  (11). Identifikace druhu musí být potvrzena p řed zkouškou, ale 
není vyžadována p řed každou zkouškou, pokud organismy pocházejí 
z domácí kultury.  
Sediment  
13. Při zkoušce se doporu čuje přednostně užívat p řísadami dopln ěný sediment 
(nazývaný rovn ěž rekonstituovaný, artificiální nebo syntetický sediment). 
Pokud se však použije p řírodní sediment, je pot řeba ho charakterizovat 
(alespoň pH, obsah organického uhlíku a doporu čuje se i stanovení dalších 
parametrů, jako je pom ěr C/N a zrnitost), a m ěl by být prost veškerého 
znečištění a dalších organism ů, které by mohly pakomár ům konkurovat 
nebo je konzumovat. Doporu čuje se také p řírodní sediment p řed použitím 
při zkoušce toxicity pro pakomáry kondicionovat po dobu sedmi dn ů za 
stejných podmínek, které p řevládají v následující zkoušce. Pro použití v této 
zkoušce se doporu čuje následující p řísadami dopln ěný sediment založený na 
umělé půdě užité při zkušební metod ě C.8 (14) (1, 15, 16):  
a) 4–5 % (sušiny) rašeliny s pH co nejblíže 5,5 až 6,0; je d ůležité, aby byla 
ve formě prášku, jemn ě namletá (velikost částic ≤ 1 mm) a sušená 
výhradně na vzduchu;  
b) 20 % (sušiny) kaolinitického jílu (pokud možno s více než 30 % kaoli ­
nitu);  
c) 75–76 % (sušiny) k řemenného písku (m ěl by převažovat jemný písek 
s více než 50 % částic velikosti 50 až 200 μm); 
d) přidá se deionizovaná voda s cílem dosáhnout 30–50 % vlhkosti 
v konečné směsi; 
e) přidá se chemicky čistý uhličitan vápenatý (CaCO  3 ) pro úpravu pH 
konečné směsi sedimentu na pH 7,0 ± 0,5. Obsah organického uhlíku 
v konečné směsi by měl být 2 % (± 0,5 %) a je t řeba jej upravit použitím 
vhodného množství rašeliny a písku v souladu s písm. a) a c).  
14. Rašelina, kaolinitický jíl a písek by m ěly pocházet ze známého zdroje. 
Jednotlivé složky sedimentu by m ěly být kontrolovány z hlediska nep řítom­
nosti chemické kontaminace (nap ř. těžké kovy, chlorované organické slou ­ 
čeniny, organofosforové slou čeniny atd.). P říklad přípravy přísadami dopln ě­
ného sedimentu je popsán v dodatku 3. P řijatelné je i míchání suchých 
složek, pokud se prokáže, že po p řidání vody nad sedimentem nedochází 
k separaci složek sedimentu (nap ř. plovoucí částice rašeliny) a že rašelina 
nebo sediment jsou dostate čně kondicionovány.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Voda  
15. Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoli voda, která vyhovuje chemickým 
charakteristikám p řípustné ředicí vody uvedeným v dodatcích 2 a 4. Jakákoli 
vhodná voda, p řírodní voda (povrchová nebo podzemní), rekonstituovaná 
voda (viz p říloha 2) nebo odchlorovaná vodovodní voda je p řijatelná jako 
kultivační a zkušební voda, pokud v ní pakomá ři přežijí po dobu kultivace 
a zkoušení bez známek stresu. Na za čátku zkoušky by se hodnota pH 
zkušební vody m ěla pohybovat mezi 6 a 9 a její celková tvrdost by nem ěla 
být vyšší než 400 mg/l CaCO  3 . V případě, že je podez ření na interakci mezi 
ionty způsobujícími tvrdost vody a zkoušenou látkou, m ěla by však být 
použita voda nižší tvrdosti (a proto v této situaci nelze použít Elendtovo 
médium M4). V pr ůběhu celé studie by m ěl být užíván stejný typ vody. 
Charakteristiky jakosti vody uvedené v dodatku 4 by m ěly být m ěřeny 
nejméně dvakrát ro čně, nebo pokud existuje podez ření, že mohlo dojít 
k podstatné zm ěně těchto vlastností.  
Zásobní roztoky – obohacené sedimenty  
16. Obohacené sedimenty zvolené koncentrace se obvykle p řipraví přidáním 
roztoku zkoušené chemické látky p římo do sedimentu. Zásobní roztok zkou ­ 
šené chemické látky rozpušt ěné v deionizované vod ě se smísí s p řísadami 
doplněným sedimentem pomocí krouživé mícha čky, mícha čky krmiv nebo 
ručním smícháním. Je-li zkoušená látka špatn ě rozpustná ve vod ě, může být 
rozpuštěna v co nejmenším objemu vhodného organického rozpoušt ědla 
(např. hexanu, acetonu nebo chloroformu). Tento roztok se pak smísí s 10 
g jemného k řemičitého písku na jednu zkušební nádobu. Rozpoušt ědlo se 
nechá odpa řit a musí být zcela odstran ěno z písku, písek se pak smísí 
s vhodným množstvím usazenin na jednotlivé zkušební kádinky. K rozpušt ění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené chemické látky mohou 
být použita pouze činidla, která snadno vyt ěkají. Je t řeba mít na pam ěti, 
že při přípravě sedimentu je nutno zohlednit písek ze zkoušené chemické 
látky a sm ěsi písku (tj. p ři přípravě sedimentu by proto m ělo být použito 
menší množství písku). Je t řeba dbát, aby zkoušená látka p řidaná do 
sedimentu byla v sedimentu d ůkladně a rovnom ěrně rozložena. Pokud je 
to nutné, lze analyzovat díl čí vzorky za ú
čelem stanovení stupn ě homoge­
nity. 
USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY  
17. Uspo řádáním zkoušky se rozumí výb ěr počtu zkušebních koncentrací 
a jejich odstup ňování, po čet nádrží pro každou koncentraci a po čet larev 
v nádrži. Jsou popsána uspo řádání pro odhad koncentrace vyvolávající 
účinek EC, pro odhad NOEC a pro provedení limitní zkoušky.  
Uspořádání pro regresní analýzu  
18. Koncentrace použité ve zkoušce musí v každém p řípadě pokrývat koncen ­
traci vyvolávající ú činek (nap ř. EC  15 , EC  50 ) a rozsah koncentrací, p ři nichž 
dochází k ú činku, který je p ředmětem zájmu. Obecn ě platí, že p řesnost, 
a zejména platnost, s níž lze provést odhady koncentrace vyvolávající 
účinek (EC  x ), se zvýší, pokud se daná koncentrace vyvolávající ú činek 
nachází v rozmezí zkoušených koncentrací. Je t řeba se vyhnout extrapolaci 
hluboko pod nejnižší pozitivní koncentrací nebo p řesahující nejvyšší 
koncentraci. P ředběžná orienta ční zkouška je užite čná pro výb ěr rozsahu 
koncentrací, které mají být použity (viz odstavec 27).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. V případě, že EC  x je třeba odhadnout, je t řeba zkoušku provést alespo ň 
v pěti koncentracích a t řech opakováních pro každou koncentraci. V každém 
případě je vhodné, aby byly užity dostate čné zkušební koncentrace umož ňu­
jící dobrý odhad modelu. Faktor mezi koncentracemi nesmí být v ětší než 2 
(výjimku lze u činit v případech, kdy má k řivka závislosti odezvy na dávce 
malý sklon). Po čet opakování p ři každé expozici lze snížit, pokud se zvýší 
počet zkušebních koncentrací s r ůznými odezvami. Zvýšení po čtu opakování 
nebo snížení velikosti zkušebních koncentrací obvykle vede k zúžení inter ­
valu spolehlivosti zkoušky. Pro odhad desetidenního p řežití a růstu larev 
jsou nutná další opakování.  
Uspořádání odhadu NOEC/LOEC  
20. Pro odhad LOEC nebo NOEC se použije p ět zkušebních koncentrací 
s nejmén ě čtyřmi opakováními a faktor mezi koncentracemi by nem ěl být 
vyšší než 2. Po čet opakování by m ěl být dostate čný, aby zajistil odpovída ­
jící statistickou významnost, s jakou má být rozeznán 20 % rozdíl oproti 
kontrolnímu vzorku na 5 % hladin ě významnosti (p = 0,05). Pro rychlost 
vývoje je zpravidla vhodné použít analýzu rozptylu (ANOVA) jako nap ří­
klad Dunnett ův nebo Williams ův test (17, 18, 19, 20). Pro procento 
vylíhlých jedinc ů lze použít Cochran ův-Armitage ův test, Fisher ův exaktní 
test (s Bonferroniho korekcí) nebo Mantel ův-Haenszel ův test.  
Limitní zkouška  
21. Limitní zkouška m ůže být provedena (jedna zkušební koncentrace 
a kontrola), pokud nebyl zjišt ěn žádný dopad p ři předběžné orienta ční 
zkoušce. Ú čelem limitní zkoušky je provést zkoušku p ři dostatečně vysoké 
koncentraci umož ňující osobám s rozhodovací pravomocí vylou čit možné 
toxické ú činky zkoušené chemické látky a limit je stanoven v takové 
koncentraci, jejíž výskyt se v žádném p řípadě nepředpokládá. Doporu čená 
koncentrace je 1 000 mg/kg (sušiny). Obvykle je pro expozici i kontrolu 
zapotřebí alespo ň šesti opakování. Po čet opakování by m ěl být dostate čný, 
aby zajistil odpovídající statistickou významnost, s jakou má být rozeznán 20 % rozdíl oproti kontrolnímu vzorku na 5 % hladin ě významnosti (p = 
0,05). S metrickou reakcí (rychlost vývoje a hmotnost), je t-test vhodnou 
statistickou metodou, pokud údaje spl ňují požadavky tohoto testu (norma ­
lita, homogenní rozptyly). Pokud tyto požadavky spln ěny nejsou, lze použít 
t-test nestejných rozptyl ů nebo neparametrický test, jako je nap říklad 
Wilcoxon-Mann-Whitney ův test. Pro procento vylíhlých jedinc ů je vhodný 
Fisherův exaktní test.
 
POSTUP  
Podmínky expozice  
Příprava systému obohacený sediment–voda  
22. Pro aplikaci zkoušené chemické látky se doporu čuje postup vmíchání 
popsaný ve zkušební metod ě C.8: Toxicita pro žížaly (14). Obohacené 
sedimenty se umístí do nádob a p řidá se voda nad sediment tak, aby vznikl 
objemový pom ěr vody a sedimentu 1:4 (viz odstavce 11 a 15). Hloubka 
vrstvy sedimentu by se m ěla pohybovat v rozmezí od 1,5 do 3 cm. Aby se 
zabránilo odd ělení složek sedimentu a resuspenzi jemného materiálu 
v průběhu přidávání zkušební vody ve vodním sloupci, lze sediment p řikrýt 
plastovým diskem, na který se voda nalije, a disk se bezprost ředně poté 
vyjme. Mohou být vhodná i jiná za řízení.  
23. Zkušební nádoby se p řikryjí (nap říklad sklen ěnými víčky). Pokud je to 
nutné, v pr ůběhu studie se hladina vody doplní na p ůvodní objem s cílem 
kompenzovat odpa řování vody. K tomuto ú čelu by m ěla být použita desti ­
lovaná nebo deionizovaná voda, aby se zabránilo hromad ění solí.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilizace  
24. Jakmile je p řipraven obohacený sediment s vodou nad sedimentem, je 
žádoucí umožnit rozd ělení zkoušené chemické látky z vodné fáze do 
sedimentu (3, 4, 6, 13). To by se m ělo provád ět pokud možno za stejných 
podmínek z hlediska teploty a provzduš ňování, které byly použity p ři 
zkoušce. Vhodná rovnovážná doba je specifická pro konkrétní sediment a chemickou látku a m ůže se pohybovat v řádu hodin až dní, z řídka až 
několika týdn ů (4–5 týdn ů). Vzhledem k tomu, že tato doba by umožnila 
rozklad mnoha chemických látek, není o čekávána rovnováha, ale doporu čuje 
se doba do ustavení rovnováhy v trvání 48 hodin. Na konci této další doby do ustavení rovnováhy by m ěla být zm ěřena koncentrace zkoušené 
chemické látky ve vod ě nad sedimentem, v kapilární vod ě a v sedimentu, 
a to nejmén ě při nejvyšší koncentraci a p ři jedné nižší koncentraci (viz 
odstavec 38). Tato analytická stanovení zkoušené chemické látky umož ňují 
výpočet hmotnostní bilance a vyjád ření výsledk ů na základ ě naměřených 
koncentrací.
 
Přidání zkušebních organism ů 
25. Čtyři až pět dnů před přidáním zkušebních organism ů do zkušebních nádob 
by měly být z kultur odebrány shluky vají ček a umíst ěny do malých nádob 
do kultiva čního média. Lze použít starší médium ze zásobní kultury nebo 
čerstvě připravené médium. Pokud je použito čerstvé médium, m ělo by být 
do kultiva čního média p řidáno malé množství potravy, nap ř. zelené řasy 
a/nebo několik kapek filtrátu z jemn ě mleté suspenze vlo čkového krmiva 
pro ryby (viz dodatek 2). M ěly by být použity pouze čerstvě nakladené 
shluky vají ček. Za normálních okolností se larvy za čínají líhnout n ěkolik 
dní po nakladení vají ček (2 až 3 dny u  Chironomus riparius  při 20 °C a 1 
až 4 dny u  Chironomus tentans  při 23 °C a  Chironomus yoshimatui  při 
25 °C) a b ěhem larválního vývoje se vyst řídají čtyři instary, z nichž 
každý trvá 4–8 dn ů. Při zkoušce se použijí larvy prvního instarového stadia 
(2–3 nebo 1–4 dn ů po vylíhnutí). Instar pakomár ů lze případně zkontrolovat 
pomocí ší řky hlavové kapsuly (6).  
26. Dvacet larev prvního instaru se pomocí pipety bez špi čky náhodn ě rozdělí 
do jednotlivých zkušebních nádob obsahujících obohacený sediment a vodu. 
Provzdušňování vody je nutné ukon čit při přidání larev do zkušebních 
nádob a znovu ho zahájit nejd říve po uplynutí dalších 24 hodin po p řidání 
larev (viz odstavce 25 a 32). Podle použitého uspo řádání zkoušky (viz 
odstavce 19 a 20) je po čet larev užitý na jednu koncentraci minimáln ě 60 
pro odhad koncentrace vyvolávající ú činek a 80 pro stanovení NOEC.  
Zkušební koncentrace  
27. Orienta ční zkouška m ůže být užite čná pro stanovení rozsahu koncentrací pro 
vlastní zkoušku. K tomuto ú čelu jsou pakomá ři exponováni řadě široce 
odstupňovaných koncentrací zkoušené chemické látky. S cílem zajistit 
stejnou hustotu povrchu na jednoho pakomára, která má být užita pro vlastní 
zkoušku, se pakomá ři vystaví jednotlivým koncentracím zkoušené chemické 
látky po dobu, která umož ňuje odhad vhodných zkušebních koncentrací; 
opakování nejsou vyžadována.  
28. Zkušební koncentrace pro vlastní zkoušku jsou stanoveny podle výsledku 
zjištění předběžné orienta ční zkoušky. M ělo by být vybráno a použito 
nejméně pět koncentrací v souladu s popisem uvedeným v odstavcích 18 
až 20.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontroly  
29. Při zkoušce se použijí kontrolní nádoby bez zkoušené chemické látky, avšak 
obsahující sediment, s p říslušným po čtem opakování (viz odstavce 19–20). 
Pokud bylo pro aplikaci zkoušené chemické látky použito rozpoušt ědlo (viz 
odstavec 16), bude p řidána kontrola rozpoušt ědla v sedimentu.  
Zkušební za řízení  
30. Užívají se statické systémy. Ve výjime čných případech, jako nap říklad 
tehdy, pokud je specifikace kvality vody nevhodná pro r ůst zkušebního 
organismu nebo ovliv ňuje chemickou rovnováhu (nap ř. přílišný pokles 
úrovně rozpuštěného kyslíku, p řílišné zvýšení koncentrace exkrement ů 
nebo výluh minerál ů ze sediment ů, který ovliv ňuje pH a/nebo tvrdost 
vody) lze použít semistatické nebo pr ůtokové systémy s p řerušovanou 
nebo kontinuální obnovou vody nad sedimentem. Zpravidla však budou 
postačující a vhodn ější jiné metody zvýšení jakosti vody nad sedimentem, 
jako je nap říklad provzduš ňování.  
Krmení  
31. Larvy je t řeba krmit optimáln ě denně nebo nejmén ě třikrát týdn ě. Jako 
dostatečná dávka pro mladé larvy po dobu prvních 10 dn ů se jeví krmivo 
pro ryby (suspenze ve vod ě nebo jemn ě rozmělněné krmivo, nap ř. 
Tetra-Min nebo Tetra-Phyll, viz podrobnosti v dodatku 2) v množství 
0,25 až 0,5 mg (0,35 až 0,5 mg pro  C. yoshimatui ) na larvu za den. Starší 
larvy mohou pot řebovat o n ěco větší množství potravy: po zbývající dobu 
zkoušky by m ělo dostačovat 0,5–1 mg na larvu denn ě. U všech expozic by 
se měl snížit přísun potravy a m ělo by se kontrolovat, zda dochází k r ůstu 
plísní nebo je pozorována mortalita. Pokud není možné r ůst plísní zastavit, 
je nutno zkoušku opakovat. P ři testování siln ě adsorbujících látek (nap ř. log 
K ow > 5) nebo látek s kovalentní vazbou na sediment lze dávku potravy 
nezbytnou pro zajišt ění přežití a p řirozeného r ůstu organism ů přidat do 
přísadami dopln ěného sedimentu p řed fází stabilizace. V takovém p řípadě 
je nutno místo krmiva pro ryby použít rostlinný materiál, nap říklad přídavek 
0,5 % (sušiny) jemn ě mletých list ů např. kopřivy dvoudomé ( Urtica dioica ), 
morušovníku bílého ( Morus alba ), jetele plazivého ( Trifolium repens ), 
špenátu setého ( Spinacia oleracea ) nebo jiného rostlinného materiálu 
(Cerophylu  nebo alfa-celulózy).  
Inkubační podmínky  
32. Voda nad sedimentem ve zkušebních nádobách se mírn ě provzduš ňuje 
v optimálním p řípadě 24 hodin po p řidání larev a je sledována po celou 
dobu zkoušky (je t řeba dbát, aby koncentrace rozpušt ěného kyslíku neklesla 
pod 60 procent ASV). Provzduš ňování se provádí pomocí sklen ěné Pasteu ­
rovy pipety upevn ěné 2–3 cm nad vrstvou sedimentu (tj. jedna nebo n ěkolik 
bublin/s). P ři zkoušení t ěkavých chemických látek lze zvolit možnost systém 
sediment-voda neprovzduš ňovat.  
33. Zkouška se provádí p ři konstantní teplot ě 20 °C (± 2 °C). Doporu čená 
teplota pro  C. tentans  je 23 °C a pro  C. yoshimatui  25 °C (± 2 °C). Foto ­
perioda je 16 hodin a intenzita sv ětla by měla být 500 až 1 000 lux.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Trvání expozice  
34. Expozice je zahájena p řidáním larev do obohacených a kontrolních nádob. 
Maximální délka trvání expozice je 28 dn ů pro C. riparius  a C. yoshimatsui  
a 65 dnů pro C. tentans.  Pokud se pakomá ři vylíhnou d říve, lze zkoušku 
ukončit po uplynutí nejmén ě pěti dnů od vylíhnutí posledního dosp ělce 
v kontrolní nádob ě. 
Pozorování  
Líhnutí  
35. Určí se čas potřebný pro vývoj a celkový po čet plně vylíhlých samc ů 
a samic pakomár ů. Samce lze snadno rozlišit podle v ějířovitých tykadel.  
36. Zkušební nádoby se kontrolují alespo ň třikrát týdn ě s cílem vizuáln ě 
posoudit jakékoli neobvyklé chování (nap ř. opouštění sedimentu, neobvyklé 
plavání) ve srovnání s kontrolními nádobami. B ěhem období p ředpokláda ­
ného líhnutí je nutné denn ě počítat vylíhlé pakomáry. Pohlaví a po čet plně 
vylíhlých pakomár ů se denn ě zaznamenávají. Po identifikaci se pakomá ři 
z nádob odstraní. Veškeré shluky vají ček nakladené p řed ukončením testu se 
zaznamenají a pak se odstraní, aby se zabránilo op ětovnému zavle čení larev 
do sedimentu. Zaznamená se rovn ěž počet viditelných kukel, které se dosud 
nevylíhly. Pokyny pro m ěření líhnutí jsou uvedeny v dodatku 5.  
Růst a přežívání  
37. Pokud je nutné uvést údaje o desetidenním p řežití a růstu larev, je t řeba na 
počátku zkoušky p řidat další zkušební nádoby tak, aby je bylo možné 
následně použít. Sediment z t ěchto dalších nádob se proseje za použití 
síta o velikosti 250 μm, které udrží larvy. Kritéria uhynutí jsou nepohybli ­
vost nebo nedostate čná reakce na mechanické podn ěty. Larvy, které nejsou 
nalezeny, by m ěly být rovn ěž považovány za uhynulé (larvy uhynulé na 
počátku zkoušky mohly být již rozloženy mikroby). Stanoví se hmotnost 
sušiny (prosté popelovin) larev, které p řežily, na zkušební nádobu a vypo čte 
se průměrná individuální hmotnost sušiny na nádobu. Je vhodné ur čit, do 
kterého instaru p řežívající larvy pat ří, pomocí zm ěření šířky hlavové kapsuly 
každého jedince.  
Analytická m ěření 
Koncentrace zkoušené chemické látky  
38. Před zahájením zkoušky (tj. p řidáním larev), se alespo ň z jedné nádoby na 
každou expozici odstraní souhrnné vzorky sedimentu za ú čelem analytic ­
kého stanovení koncentrace zkoušené chemické látky v sedimentu. Doporu ­ 
čuje se, aby byly analyzovány minimáln ě vzorky vody nad sedimentem, 
kapilární vody a sedimentu na po čátku (viz bod 24) a na konci zkoušky 
při nejvyšší koncentraci a jedné nižší koncentraci. Tato stanovení koncent ­
race zkoušené chemické látky poskytují informace o chování/distribuci 
zkoušené chemické látky v systému voda–sediment.  
39. Při provádění průběžných měření (např. 7. den) a v p řípadě, že jsou pro 
analýzu zapot řebí rozsáhlé vzorky, které nelze ze zkušebních nádob odebrat 
bez dopadu na zkušební systém, je pot řeba provést analytická stanovení na 
vzorcích z dalších zkušebních nádob, s nimiž bylo zacházeno stejným 
způsobem (v četně přítomnosti zkušebních organism ů), ale nebyly použity 
pro biologická pozorování.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Doporu čeným postupem izolace intersticiální vody je odst řeďování nap ř. při 
10 000 g a 4 °C po dobu 30 minut. Neadsorbuje-li se však zkoušená látka 
prokazateln ě na filtry, je p řijatelná i filtrace. V n ěkterých p řípadech m ůže 
být nemožné provést analýzu koncentrací v kapilární vod ě vzhledem 
k tomu, že vzorek je p říliš malý.  
Fyzikálně-chemické parametry  
41. pH a teplotu ve zkušebních nádobách je nutno m ěřit vhodným zp ůsobem 
(viz odstavec 10). Tvrdost a obsah amoniaku by m ěly být m ěřeny 
v kontrolních nádobách a v jedné zkušební nádob ě při nejvyšší koncentraci 
na počátku zkoušky a na jejím konci.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Zpracování výsledk ů 
42. Účelem této zkoušky je stanovit ú činek zkoušené chemické látky na rychlost 
vývoje a celkový po čet plně vylíhlých samc ů a samic, pakomár ů nebo 
v případě desetidenní zkoušky ú činky na p řežití a hmotnost larev. Pokud 
nejsou k dispozici žádné údaje o statistických rozdílech citlivosti mezi oběma pohlavími, lze výsledky pro samce a pro samice slou čit pro účely 
statistické analýzy. Rozdíly v citlivosti mezi pohlavími lze statisticky 
posoudit nap ř. pomocí tabulkového χ
 2 – r × 2 testu. Je-li vyžadováno 
stanovení p řežití larev a pr ůměru individuální sušiny na jednu nádobu, je 
nutno tak u činit po 10 dnech.  
43. Koncentrace s pozorovanými ú činky vyjád řené a vztažené k sušin ě se 
vypočtou přednostně na základ ě naměřených koncentrací sedimentu na 
počátku zkoušky (viz odstavec 38).  
44. Pro výpo čet bodového odhadu EC  50 nebo jakékoli jiné hodnoty EC  x lze 
jako skute čné opakování použít statistiku na jednu nádobu. P ři výpočtu 
intervalu spolehlivosti pro každý EC  x je nutno zohlednit variabilitu mezi 
jednotlivými nádobami, p řípadně prokázat, že tato variabilita je tak nízká, že 
ji lze ignorovat. Je-li u modelu užita metoda nejmenších čtverců, je nutné 
u statistik jednotlivých nádob uplatnit transformaci za ú čelem homogenity 
rozptylu. Hodnoty EC  x je však t řeba vypo čítat až poté, co je reakce 
převedena zp ět na původní hodnotu.  
45. Pokud je cílem statistické analýzy stanovení hodnoty NOEC/LOEC testo ­
váním hypotéz, je nutno vzít v úvahu variabilitu mezi nádobami, nap říklad 
pomocí analýzy rozptylu ANOVA. P řípadně mohou být vhodn ější robust ­
nější testy (21) v p řípadě, že dojde k porušení p ředpokladů obvykle užitých 
při analýze ANOVA.  
Procento vylíhlých jedinc ů 
46. Procenta vylíhlých jedinc ů jsou binární údaje a lze je analyzovat s použitím 
postupně klesajícího Cochranova-Armitageova testu, který p ředpokládá 
monotónní odezvu na dávku, a údaje jsou konzistentní s tímto o čekáváním. 
V opačném případě lze použít Fisher ův exaktní test nebo Mantel ův-Haens­
zelův test s Bonferroniho-Holmovou korekcí p-hodnot. Pokud existují 
důkazy o v ětší variabilit ě mezi replikacemi ve stejné koncentraci, pak by 
binomické rozd ělení (často uvád ěné jako „extra-binomická“ variabilita) 
nasvědčovalo tomu, že je nutno použít robustní Cochran ův-Armitage ův 
test nebo Fisher ův exaktní test, jak je navrhováno v odstavci (21).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Určí se součet pakomár ů vylíhlých v jedné nádob ě ne a vyd ělí se počtem 
vložených larev na:  
ER ¼ n e 
n a 
kde: 
ER = procento vylíhlých jedinc ů, 
n e = počet pakomár ů vylíhlých v nádob ě, 
n a = počet larev nasazených do nádoby.  
47. Nejvhodn ější alternativou pro rozsáhlé vzorky s extra binomickou variací je 
pojmout procento vylíhlých jedinc ů jako kontinuální odezvu a použít 
postupy, jako je nap říklad Williams ův test, pokud existuje p ředpoklad 
monotónní odezvy na dávku a je konzistentní s t ěmito daty ER. 
V případě nemonotónní odezvy by byl vhodný Dunnett ův test. Rozsáhlý 
vzorek je zde definován situací, p ři níž jak po čet vylíhlých jedinc ů, tak 
počet nevylíhlých jedinc ů přesáhnou v jednom duplikátním vzorku (nádob ě) 
hodnotu p ět. 
48. Při použití metody ANOVA je nutno hodnoty ER nejprve transformovat 
(například druhou odmocninou funkce arcsin) nebo transformací podle 
Freemana-Tukeyho s cílem získat p řibližné normální rozd ělení údaj ů 
a vyrovnat odchylky. P ři použití absolutních frekvencí lze použít test dle 
Cochrana-Armitage, Fisher ův exaktní test (s Bonferroniho korekcí), nebo 
Mantelův-Haenszel ův test. Transformace funkcí √arcsin se vypo čte pomocí 
převrácené hodnoty sinu (sin  –1 ) z odmocniny ER.  
49. Pro procento vylíhlých jedinc ů se hodnoty EC  x vypočtou pomocí regresní 
analýzy (nebo nap ř. pomocí modelu probit (22), logit, Weibull, vhodného 
komerčního softwaru atd.). V p řípadě selhání regresní analýzy (nap ř. 
v případě méně než dvou koncentrací s parciálními odezvami) se použijí 
další neparametrické metody, jako je nap říklad klouzavý pr ůměr nebo prostá 
interpolace.  
Rychlost vývoje  
50. Průměrná doba vývoje p ředstavuje pr ůměrné časové rozp ětí mezi nasazením 
larev (den 0 zkoušky) a vylíhnutím experimentální kohorty pakomár ů. (Pro 
výpočet skutečné doby vývoje by m ělo být zohledn ěno stáří larev 
v okamžiku nasazení. Rychlost vývoje je p řevrácenou hodnotou doby 
vývoje (jednotka: 1/den) a p ředstavuje tu část larválního vývoje, která se 
odehraje za den. Rychlost vývoje je z hlediska hodnocení t ěchto studií 
toxicity sediment ů preferována p řed dobou vývoje vzhledem k její nižší 
variabilitě, vyšší homogenit ě a vyšší blízkosti normálnímu rozd ělení. 
Z tohoto d ůvodu mohou být použity silné parametrické zkušební postupy 
pro rychlost vývoje spíše než pro dobu vývoje. Pro rychlost vývoje jako kontinuální odezvu lze hodnoty EC
 x stanovit odhadem pomocí regresní 
analýzy (nap ř. (23), (24)).  
51. U následujících statistických test ů se má za to, že po čet pakomár ů pozoro­
vaných v inspek čním dni × se vylíhl v pr ůměru časového intervalu mezi 
dnem x a dnem x – l (l = délka intervalu mezi pozorováními, obvykle 1 
den). Průměrná rychlost vývoje na nádobu ( x) se vypo čte podle vzorce:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
kde: 
x: střední rychlost vývoje v kádince,  
i: index intervalu mezi pozorováními,  
m: počet všech interval ů mezi pozorováními,  
ƒ i : počet vylíhlých jedinc ů během daného intervalu i mezi pozorováními,  
n e : počet vylíhlých jedinc ů celkem na konci pokusu  P ƒ i , 
x: rychlost vývoje larev vylíhlých v intervalu i,  
x i ¼ 1 Í 
den  i Ä 1 i 
2 Î 
kde: 
den  i : den pozorování (ve dnech od aplikace),  
l i : délka intervalu mezi pozorováními (ve dnech, obvykle 1 den).  
Protokol o zkoušce  
52. Protokol o zkoušce musí obsahovat minimáln ě tyto údaje:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální povahu a p řípadně fyzikláně-chemické vlastnosti (rozpustnost 
ve vodě, tlak par, rozd ělovací koeficient v p ůdě (případně v sedimentu), 
stabilita ve vod ě atd.,  
— chemické identifika ční údaje (obecný název, chemický název, strukturní 
vzorec, číslo CAS atd.) v četně čistoty a analytické metody pro kvanti ­
tativní stanovení zkoušené látky.  
Testovací druh:  
— užitá pokusná zví řata: druh, v ědecký název, zdroj organism ů 
a podmínky množení,  
— informace o nakládání se shluky vají ček a s larvami,  
— stáří testovaných zví řat po nasazení do zkušebních nádob.  
Zkušební podmínky:  
— použitý sediment, tj. p řírodní nebo p řísadami dopln ěný sediment,  
— u přírodního sedimentu lokalita a popis místa odb ěru sedimentu, pokud 
možno včetně dřívější kontaminace, charakteristiky: pH, obsah organic ­
kého uhlíku, pom ěr C/N a zrnitost (je-li to vhodné),  
— příprava přísadami dopln ěného sedimentu: složky a charakteristiky 
(obsah organického uhlíku, pH, vlhkost, atd. na za čátku zkoušky),  
— příprava zkušební vody (pokud se používá rekonstituovaná voda) a její 
charakteristiky (koncentrace kyslíku, pH, vodivost, tvrdost, atd. na 
začátku zkoušky),  
— hloubka sedimentu a vody nad sedimentem,  
— objem vody nad sedimentem a kapilární vody, hmotnost vlhkého 
sedimentu s kapilární vodou a bez ní,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— zkušební nádoby (materiál a rozm ěry), 
— způsob vmíchávání do sedimentu, použité zkušební koncentrace, po čet 
duplikátních vzork ů a případné použití rozpoušt ědla, 
— stabilizace rovnovážné fáze obohaceného systému sediment/voda: trvání 
a podmínky,  
— inkuba ční podmínky: teplota, cyklus a intenzita sv ětla, provzduš ňování 
(frekvence a intenzita),  
— podrobn ější informace o krmení v četně typu krmiva, p řípravy, množství 
a režimu krmení.  
Výsledky:  
— nominální zkušební koncentrace, nam ěřené zkušební koncentrace 
a výsledky všech analýz pro stanovení koncentrace zkoušené chemické 
látky ve zkušební nádob ě, 
— jakost vody ve zkušebních nádobách, tj. pH, teplota, rozpušt ěný kyslík, 
tvrdost a amoniak,  
— případné nahrazování odpa řené zkušební vody,  
— počet vylíhlých samc ů a samic pakomár ů na nádobu za den,  
— počet larev, z nichž se nevylíhli dosp ělci, na nádobu,  
— průměrná individuální hmotnost sušiny larev na nádobu a p řípadně na 
instar,  
— procento vylíhlých jedinc ů na duplikátní vzorek a zkušební koncentraci 
(směsný vzorek samc ů a samic pakomár ů), 
— průměrná rychlost vývoje pln ě vylíhlých pakomár ů na duplikátní vzorek 
a aplikované množství (sm ěsný vzorek samc ů a samic pakomár ů), 
— odhady koncových bod ů toxicity, nap ř. ECx (a související intervaly 
spolehlivosti), NOEC a/nebo LOEC a statistické metody použité k jejich stanovení,
 
— diskuse o výsledcích v četně případného vlivu na výsledek zkoušky 
v důsledku odchylek od této zkušební metody.  
LITERATURA:  
1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
 
2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK.  
3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
 
4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 
1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
 
5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. Prosinec 1997.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
 
7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chi­
ronomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14) Zkušební metoda C.8 této p řílohy, Toxicita pro žížaly.  
15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
 
17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.  
18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482–491.  
19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103–117.  
20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48: 577–585.  
22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.  
24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Pro účely této zkušební metody se použijí tyto definice:  
Přísadami dopln ěný sediment  nebo rekonstituovaný, um ělý nebo syntetický 
sediment je sm ěs materiál ů užitá k napodobení fyzických složek p řírodního 
sedimentu.  
Voda nad sedimentem  je voda nacházející se nad sedimentem ve zkušební 
nádobě. 
Intersticiální voda  nebo kapilární voda je voda zabírající prostor mezi 
sedimentem a částicemi p ůdy. 
Obohacený sediment  je sediment, do n ěhož byla p řidána zkoušená látka.  
Zkoušená chemická látka:  jakákoli látka nebo sm ěs testovaná pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Dodatek 2  
Doporučení pro kultivaci kultury  Chironomus riparius  
1. Larvy rodu  Chironomus  lze chovat v krystaliza čních miskách nebo ve 
větších nádobách. Jemný k řemičitý písek se rozprost ře po dně nádoby 
v tenké vrstv ě silné 5 až 10 mm. Bylo prokázáno, že substrátem vhodným 
jako podklad je také k řemelina (nap ř. Merck, čl. 8117), (dosta čující je ten čí 
vrstva silná jen n ěkolik málo mm). Následn ě se přidá několikacentimetrová 
vrstva vhodné vody. Objem vody by se m ěl podle pot řeby dopl ňovat 
s cílem nahradit ztráty vzniklé odpa řováním a zabránit vysychání. Vodu 
lze v případě potřeby vym ěnit. Je třeba zajistit mírné provzduš ňování. 
Nádoby, v nichž jsou larvy chovány, by m ěly být umíst ěny ve vhodné 
kleci, která zabrání úniku líhnoucích se dosp ělců. Tato klec by m ěla být 
dostatečně velká, aby umož ňovala rojení vylíhlých dosp ělců, jinak by nemu ­
selo dojít k jejich pá ření (minimum je p řibližně 30 × 30 × 30 cm).  
2. Klece by m ěly být umíst ěny při pokojové teplot ě nebo v místnosti 
s konstantní teplotou 20 ± 2 °C s fotoperiodou 16 hodin sv ětlo (intenzity 
přibližně 1 000 lux) a 8 hodin tma. Bylo zjišt ěno, že vzdušná vlhkost nižší 
než 60 % RH m ůže bránit rozmnožování.  
Ředicí voda  
3. Lze použít jakoukoli vhodnou p řírodní nebo syntetickou vodu. Zpravidla se 
užívá studni ční voda, odchlorovaná vodovodní voda a um ělá média (nap ř. 
Elendtovo médium „M4“ nebo „M7“, viz níže). Vodu je p řed použitím 
nutno provzdušnit. Je-li to nutné, lze kultiva ční vodu obnovit opatrným 
odlitím nebo od čerpáním použité vody z kultiva čních nádob tak, aby 
nedošlo k poškození schránek larev.  
Krmení larev  
4. Larvy rodu  Chironomus  se krmí vlo čkovým krmivem pro ryby (Tetra ­
Min(®, Tetra Phyll® nebo jiná podobná zna čka patentovaného krmiva 
pro ryby), v množství p řibližně 250 mg na nádobu a den. Potravu lze 
aplikovat v podob ě suchého mletého prášku nebo v podob ě suspenze ve 
vodě: 1,0 g vlo čkového krmiva se p řidá do 20 ml ředicí vody a vytvo ří se 
homogenní sm ěs. Tento p řípravek lze dodávat v množství p řibližně 5 ml na 
nádobu na den (p řed použitím prot řepat). Starším larvám lze p řidat více 
krmiva.  
5. Krmení se upraví podle kvality vody. V p řípadě, že se kultiva ční médium 
„zakalí“, je t řeba krmnou dávku snížit. P řidávání potravy je nutno pe člivě 
sledovat. P říliš malé množství krmiva zp ůsobí, že larvy opoušt ějí sediment 
a vznášejí se ve vodním sloupci, a p říliš mnoho krmiva zp ůsobí zvýšenou 
mikrobiální činnost a pokles koncentrace kyslíku. Obojí m ůže způsobit 
snížení rychlosti r ůstu. 
6. Do nových kultiva čních nádob mohou být p řidány i bu ňky zelených řas 
(např. Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ). 
Krmení vylíhlých dosp ělců 
7. Někteří experimentáto ři se domnívají, že jako potrava vylíhlých dosp ělců 
může sloužit vata namo čená do nasyceného roztoku sacharózy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Líhnutí  
8. Dosp ělci se začnou v chovných nádobách líhnout p ři teplotě 20 ± 2 °C 
přibližně po 13–15 dnech. Samce lze snadno rozlišit podle v ějířovitých 
tykadel.  
Shluky vají ček 
9. Jakmile se ve snubní kom ůrce nacházejí dosp ělci, je třeba třikrát týdn ě 
kontrolovat všechny reproduk ční nádoby, zda se v nich nacházejí shluky 
vajíček spojené želatinózní hmotou. Pokud se zde shluky vají ček nacházejí, 
je nutno je opatrn ě odstranit a p řemístit do malé misky obsahující vzorek 
chovného vodního prost ředí. Shluky vají ček se užijí pro založení nové 
nádoby s kulturou (nap ř. 2–4 shluky vají ček na nádobu) nebo se užijí pro 
zkoušky toxicity.  
10. Larvy prvního instarového stadia by se m ěly vylíhnout za 2–3 dny.  
Zakládání nových kultiva čních nádob  
11. Jakmile jsou kultury založeny, m ělo by být možné zakládat nové nádoby 
s kulturami larev jednou týdn ě nebo mén ě často v závislosti na zkušebních 
požadavcích a odstra ňovat starší nádoby po vylíhnutí dosp ělců. Pomocí 
tohoto systému se zajistí pravidelné dodávky dosp ělců s minimální pot řebou 
dohledu.  
Příprava zkušebních roztok ů „M4“ a „M7“  
12. Elendt (1990) popsal médium „M4“. Médium „M7“ se p řipraví obdobn ě 
jako médium „M4“ s výjimkou látek uvedených v tabulce 1, u nichž jsou koncentrace u „M7“ čtyřikrát nižší než u „M4“. P řipravuje se publikace 
o médiu „M7“ (Elendt, osobní sd ělení). Podle Elendta a Biase (1990) by 
se zkušební roztok nem ěl připravovat pro koncentrace NaSiO
 3 5 H  2 O, 
NaNO  3 , KH  2 PO 4 a K  2 HPO  4 vzhledem k tomu, že nejsou pro p řípravu 
zásobních roztok ů vyhovující.  
Příprava média „M7“  
13. Každý zásobní roztok (I) se p řipraví samostatn ě a z těchto zásobních 
roztoků (I) se pak p řipraví kombinovaný zásobní roztok (II) (viz tabulka 
1). Médium „M7“ se p řipraví přidáním 50 ml kombinovaného zásobního 
roztoku (II) a množství zásobního roztoku jednotlivých makroživin, které jsou uvedeny v tabulce 2, do 1 litru deionizované vody. P řipraví se vita ­
minový zásobní roztok p řidáním tří vitaminů do deionizované vody, jak je 
uvedeno v tabulce 3, a 0,1 ml kombinovaného vitaminového zásobního 
roztoku se p řidá do výsledného média „M7“ krátce p řed použitím. (Vitami ­
nový zásobní roztok se usklad ňuje zmrazený v malých alikvotních dílech.) 
Médium se provzdušní a stabilizuje.
 
LITERATURA:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabulka 1  
Zásobní roztoky stopových prvk ů pro médium M4 a M7  
Zásobní roztoky (I) Množství (mg) 
doplněné na 1 litr 
deionizované 
vody Kombinovaný zásobní roztok (II) se 
připraví smícháním následujících 
množství (v ml) zásobních 
roztoků (I) a dopln ěním na 1 litr 
deionizované vody Konečné koncentrace ve zkušebním 
roztoku (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Tyto chemické látky se u M4 a M7 liší, jak je uvedeno výše. 
( 2 ) Tyto roztoky se p řipravují samostatn ě, spojí se a ihned se zpracují v autoklávu.  
Tabulka 2  
Zásobní roztoky makroživin pro médium M4 a M7  
Množství dopln ěné na 
1 litr deionizované 
vody 
(mg) Množství zásobních 
roztoků makroživin p řidané 
za účelem přípravy média 
M4 a M7 
(ml/l) Konečné koncentrace 
ve zkušebním roztoku 
M4 a M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabulka 3  
Vitaminový zásobní roztok pro médium M4 a M7. Všechny t ři vitaminové roztoky se smísí do 
jediného vitaminového zásobního roztoku  
Množství dopln ěné na 1 
litr deionizované vody 
(mg) Množství vitaminového 
zásobního roztoku p řidané za 
účelem přípravy média M4 
a M7 
(ml/l) Konečné koncentrace ve 
zkušebním roztoku M4 
a M7 
(mg/l)  
Thiaminhydrochlorid 750 0,1 0,075 
Kyanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075
 
LITERATURA:  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25–33.  
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Dodatek 3  
PŘÍPRAVA P ŘÍSADAMI DOPLN ĚNÉHO SEDIMENTU  
Složení sedimentu  
Složení p řísadami dopln ěného sedimentu by m ělo být následující:  
Složka Charakteristika % sušiny 
sedimentu  
Rašelina: rašelina mechu Sphagnum 
s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, 
bez viditelných zbytk ů rostlin 
a jemně mletá (velikost částic 
≤ 1 mm) a vysušená na 
vzduchu 4–5 
Křemičitý písek velikost zrn: > 50 % částic 
musí být v rozp ětí 50–200 
μm 75–76 
Kaolinitický jíl obsah kaolinitu ≥ 30 % 20 
Organický uhlík upraven p řidáním rašeliny 
a písku 2 (± 0,5) 
Uhličitan vápenatý CaCO  3 , práškový, chemicky 
čistý 0,05–0,1 
Voda vodivost ≤ 10 μS/cm 30–50  
Příprava  
Rašelina se usuší na vzduchu a rozemele se na jemný prášek. P řipraví se 
suspenze požadovaného množství rašelinného prášku v deionizované vod ě 
s použitím vysoce výkonného homogeniza čního zařízení. pH této suspenze se 
upraví na 5,5 ± 0,5 pomocí CaCO  3 . Suspenze se kondicionuje po dobu nejmén ě 
dvou dní za mírného promíchávání p ři 20 ±2° C za ú čelem stabilizace pH 
a vytvoření stabilní mikrobiální složky. Poté se op ět změří pH, které by se 
mělo rovnat 6,0 ± 0,5. Pak se suspenze rašeliny smísí s ostatními složkami (písek 
a kaolín) a s deionizovanou vodou s cílem získat homogenní sediment s obsahem vody v rozmezí 30–50 procent sušiny sedimentu. Znovu se zm ěří pH kone čné 
směsi a v případě nutnosti je op ět upraveno pomocí CaCO
 3 na hodnotu 6,5 až 
7,5. Odeberou se vzorky sedimentu pro stanovení obsahu sušiny a obsahu orga ­
nického uhlíku. Následn ě se doporu čuje před použitím pro zkoušku toxicity pro 
pakomáry p řísadami dopln ěný sediment kondicionovat po dobu sedmi dn ů za 
stejných podmínek, které p řevládají v následné zkoušce.  
Skladování  
Suché složky pro p řípravu um ělého sedimentu lze skladovat na suchém 
a chladném míst ě při pokojové teplot ě. Přísadami dopln ěný (mokrý) sediment 
by neměl být před použitím ve zkoušce skladován. M ěl by být použit ihned po 
uplynutí sedmidenního období kondicionování, kterým kon čí jeho příprava.  
LITERATURA:  
Kapitola C.8 této p řílohy. Toxicita pro žížaly.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Dodatek 4  
Chemické charakteristiky p řípustné ředicí vody  
Látka Koncentrace  
Částice tuhé < 20 mg/l 
Celkový obsah organického uhlíku < 2 mg/l Neionizovaný amoniak < 1 μg/l 
Tvrdost jako CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Zbytkový chlor < 10 μg/l 
Celkové organické fosforové pesticidy < 50 ng/l Celkové organické chlorové pesticidy a polychlorované 
bifenyly < 50 ng/l 
Celkový organický chlor < 25 ng/l
 
(*) Je však t řeba poznamenat, že v p řípadě, že je podez ření na interakci mezi ionty zp ůso­
bujícími tvrdost vody a zkoušenou látkou, by m ěla být použita voda nižší tvrdosti (a 
proto v této situaci nesmí být použito Elendtovo médium M4).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Dodatek 5  
Pokyny pro monitorování líhnutí larev pakomár ů 
Na zkušební kádinky jsou umíst ěny výletové pasti. Tyto pasti jsou pot řebné od 
20. dne až do konce zkoušky. Níže je nakreslen p říklad používané pasti:
  
A: nylonová sí ťka 
B: plastový kryt  
C: kádinka bez zobá čku D: otvory na vým ěnu vody  
E: voda  
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28  TEST TOXICITY NA CHIRONOMIDAE V SYSTÉMU 
SEDIMENT–VODA ZA POUŽITÍ OBOHACENÉ VODY  
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 219 
(2004). Tato zkušební metoda je ur čena k posouzení ú činků dlouhodobé 
expozice larev sladkovodních pakomár ů Chironomus  sp. žijících 
v sedimentu chemickým látkám. Je založena p ředevším na pokynu BBA 
s užitím zkušebního systému sediment-voda s um ělou půdou a scéná ře 
expozice vodního sloupce (1). Zohled ňuje rovn ěž stávající protokoly 
o zkouškách toxicity pro  Chironomus riparius  a Chironomus tentans , 
které byly vyvinuty v Evrop ě a Severní Americe a (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) 
a zkoušeny v mezilaboratorních porovnávacích zkouškách (1, 6, 9). Lze užít 
rovněž další dob ře zdokumentované druhy pakomár ů, jako nap říklad  Chiro­
nomus yoshimatsui  (10, 11).  
2. Scéná ř expozice užitý p ři této zkušební metod ě spočívá v obohacení vody. 
Výběr vhodného scéná ře expozice závisí na zamýšleném použití testu. 
Účelem scéná ře expozice vody, který zahrnuje obohacení vodního sloupce, 
je simulovat rozprášení pesticidního post řiku a zahrnuje po čáteční maxi­
mální koncentrace v kapilární vod ě. Je vhodný také pro jiné druhy expozic 
(včetně úniků chemikálií) s výjimkou akumula čních proces ů, jejichž délka 
přesahuje trvání zkušebního období.  
3. Látky, které je t řeba testovat z hlediska organism ů žijících v sedimentu, 
v této složce obvykle p řetrvávají po dlouhá časová období. Expozici orga ­
nismů žijících v sedimentu lze zajistit celou řadou možných cest. Relativní 
význam jednotlivých cest, jimiž dochází k expozici, a doba nezbytná k tomu, aby každá z nich p řispěla k celkovým toxickým ú činkům, je závislá 
na fyzikáln ě chemických vlastnostech dot čené chemické látky. V p řípadě 
silně adsorbujících látek (nap ř. log K
 ow > 5) nebo pro chemické látky 
s kovalentní vazbou na sediment m ůže být významnou expozi ční cestou 
požití kontaminované potravy. Aby nedošlo k podcen ění toxicity vysoce 
lipofilních látek, lze zvážit užití potravy p řidané do sedimentu p řed aplikací 
zkoušené chemické látky. Aby bylo možné zohlednit všechny potenciální 
způsoby expozice, zam ěřuje se tato zkušební metoda na dlouhodobou expo ­
zici. Délka trvání zkoušky se pohybuje v rozmezí 20–28 dní pro  C. riparius  
and C. yoshimatsui  a 28–65 dní pro  C. tentans . Pokud jsou pro konkrétní 
účel, například pro studium ú činků nestabilní chemické látky, pot řebné 
krátkodobé údaje, mohou být další duplikátní vzorky po deseti dnech odstra ­
něny. 
4. Měřené výsledné ú činky se rovnají celkovému po čtu vylíhlých dosp ělců 
a času do vylíhnutí. Pokud jsou nezbytné další krátkodobé údaje, doporu ­ 
čuje se provád ět měření přežití a růstu larev až po uplynutí desetidenního 
období, podle pot řeby s využitím dalších duplikátních vzork ů. 
5. Doporu čuje se použití p řísadami dopln ěného sedimentu. P řísadami dopln ěný 
sediment má n ěkolik výhod oproti p řírodním sediment ům: 
— jeho experimentální variabilita je snížena, protože tvo ří reprodukova ­
telnou „standardizovanou matrici“, a odpadá pot řeba hledat zdroje 
nekontaminovaného čistého sedimentu,  
— zkoušky lze zahájit kdykoliv, aniž by bylo nutné čelit sezónním 
výkyvům zkušebního sedimentu, a sediment není t řeba předem upravit 
s cílem odstranit p ůvodní živo čichy; užití p řísadami dopln ěného 
sedimentu také snižuje náklady spojené s terénním shromaž ďováním 
dostatečného množství sedimentu pro rutinní testování,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— užití p řísadami dopln ěného sedimentu umož ňuje porovnání toxicity 
a odpovídající řazení látek; údaje o toxicit ě ze zkoušek s p řírodními 
a umělými sedimenty byly pro více látek porovnatelné (2).  
6. Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.  
PODSTATA ZKOUŠKY  
7. Larvy pakomár ů jsou během prvního instaru vystaveny koncentra čnímu 
rozmezí zkoušené chemické látky v systému sediment-voda. Zkouška za číná 
tím, že se larvy prvního instaru nasadí do zkušebních kádinek obsahujících 
systém sediment-voda a voda se následn ě obohatí zkoušenou látkou. Na 
konci zkoušky se m ěří počet vylíhnutí a rychlost vývoje pakomár ů. 
V případě potřeby lze po 10 dnech m ěřit rovněž přežití larev a jejich hmot ­
nost (v p řípadě potřeby lze použít další duplikátní vzorky). Tyto údaje se 
analyzují bu ď pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, 
která by zp ůsobila x% snížení líhnutí nebo p řežití či růstu larev (nap ř. EC  15 , 
EC 50 , atd.), nebo s využitím testování statistických hypotéz pro stanovení 
NOEC/LOEC. Posledn ě uvedená metoda vyžaduje srovnání hodnoty ú činku 
s kontrolními hodnotami pomocí statistických test ů. 
INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
8. Měla by být známa rozpustnost zkoušené chemické látky ve vod ě, její tlak 
par, naměřená nebo vypo čtená distribuce v sedimentu a stabilita ve vod ě 
a sedimentu. M ěla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda pro 
kvantitativní stanovení zkoušené chemické látky ve vod ě nad sedimentem, 
kapilární vod ě a v sedimentu, a to se známou a doloženou p řesností a mezí 
stanovitelnosti. Užite čné informace zahrnují strukturní vzorec a čistotu zkou ­ 
šené chemické látky. Užite čnou informací je rovn ěž chemický osud zkou ­ 
šené chemické látky (nap ř. zánik, abiotický a biotický rozklad atd.) Další 
návod pro zkoušení látek s fyzikáln ě chemickými vlastnostmi, které činí 
jejich zkoušení obtížné, je uveden v odstavci (12).  
REFEREN ČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY  
9. Referen ční chemické látky mohou být pravideln ě kontrolovány pro ov ěření, 
že zkušební podmínky a protokol o zkoušce jsou spolehlivé. P říkladem 
referenčních toxických látek úsp ěšně použitých v mezilaboratorních zkou ­ 
škách a valida čních studiích jsou lindan, trifluralin, pentachlorfenol, chlorid 
kademnatý a chlorid draselný (1, 2, 5, 6, 13).  
PLATNOST ZKOUŠKY  
10. Aby byla zkouška platná, m ěly by být spln ěny tyto podmínky:  
— vylíhnutí v kontrolních nádobách musí být na konci zkoušky nejmén ě 
70 % (1, 6),  
— k líhnutí dosp ělců C. riparius  and  C. yoshimatsui  v kontrolních nádo ­
bách by m ělo dojít mezi 12. a 23. dnem po jejich zavedení do nádob; 
pro C. tentans  je nutná doba 20–65 dn ů, 
— na konci zkoušky se v každé nádob ě změří pH a koncentrace rozpušt ě­
ného kyslíku. Koncentrace kyslíku by m ěla činit alespo ň 60 procent 
hodnoty nasycení vzduchem (ASV), p ři použité teplot ě, a pH vody 
nad sedimentem by se m ělo ve všech zkušebních nádobách pohybovat 
v rozmezí pH 6–9,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— teplota vody by se nem ěla lišit o více než ± 1,0 °C. Teplota vody m ůže 
být řízena v izotermální místnosti a v tomto p řípadě by měla být teplota 
v místnosti ve vhodném časovém intervalu potvrzována.  
POPIS METODY  
Zkušební nádoby  
11. Studie se provádí ve sklen ěných 600ml kádinkách o pr ůměru 8 cm. Vhodné 
jsou i jiné nádoby, ale m ěly by zaru čit odpovídající hloubku vody nad 
sedimentem a sedimentu. Plocha sedimentu by m ěla být dostate čná, aby 
poskytovala 2 až 3 cm  2 na larvu. Pom ěr hloubky sedimentu k hloubce 
vody nad sedimentem by m ěl být 1:4. Zkušební nádoby a další aparatura, 
která přichází do styku se zkušebním systémem, by m ěly být celé zhotoveny 
ze skla nebo z jiného chemicky inertního materiálu (nap ř. z teflonu).  
Výběr druhů 
12. Při zkoušce má být p řednostně užito druhu  Chironomus riparius . Vhodný je 
i druh  Chironomus tentans , avšak h ůře se s ním manipuluje a vyžaduje 
i delší trvání zkoušky. Lze užít rovn ěž druh  Chironomus yohimatsui . 
Podrobnosti o kultiva čních metodách pro druh  Chironomus riparius  jsou 
uvedeny v dodatku 2. Informace o kultiva čních podmínkách jsou 
k dispozici také pro jiné druhy, tj.  Chironomus tentans  (4) a  Chironomus 
yoshimatsui  (11). Identifikace druhu musí být potvrzena p řed zkouškou, ale 
není vyžadována p řed každou zkouškou, pokud organismy pocházejí 
z domácí kultury.  
Sediment  
13. Doporu čuje se přednostně užívat p řísadami dopln ěný sediment (nazývaný 
rovněž rekonstituovaný, um ělý nebo syntetický sediment). Pokud se však 
použije p řírodní sediment, je pot řeba ho charakterizovat (alespo ň pH, obsah 
organického uhlíku a doporu čuje se i stanovení dalších parametr ů, jako je 
poměr C/N a zrnitost) a m ěl by být prost veškerého zne čištění a dalších 
organismů, které by mohly pakomár ům konkurovat nebo je konzumovat. 
Doporučuje se také p řírodní sediment p řed použitím p ři zkoušce toxicity pro 
pakomáry kondicionovat po dobu sedmi dn ů za stejných podmínek, které 
převládají v následující zkoušce. Pro použití v této zkoušce se doporu čuje 
následující p řísadami dopln ěný sediment založený na um ělé půdě užité při 
zkušební metod ě C.8 (14) (1, 15, 16):  
a) 4–5 % (sušiny) rašeliny s pH co nejblíže 5,5 až 6,0; ve form ě prášku, 
jemně namletá (velikost částic ≤ 1 mm) a vysušená výhradn ě na vzdu­
chu; 
b) 20 % (sušiny) kaolinitického jílu (pokud možno s více než 30 % kaoli ­
nitu);  
c) 75–76 % (sušiny) k řemenného písku (m ěl by převažovat jemný písek 
s více než 50 % částic velikosti 50 až 200 μm); 
d) přidá se deionizovaná voda s cílem dosáhnout 30–50 % vlhkosti 
v konečné směsi; 
e) přidá se chemicky čistý uhličitan vápenatý (CaCO  3 ) pro úpravu pH 
konečné směsi sedimentu na pH 7,0 ± 0,5;  
f) obsah organického uhlíku v kone čné směsi by měl být 2 % (± 0,5 %) 
a je třeba jej upravit použitím vhodného množství rašeliny a písku 
v souladu s písm. a) a c).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Rašelina, kaolinitický jíl a písek by m ěly pocházet ze známého zdroje. 
Jednotlivé složky sedimentu by m ěly být kontrolovány z hlediska nep řítom­
nosti chemické kontaminace (nap ř. těžké kovy, chlorované organické slou ­ 
čeniny, organofosforové slou čeniny atd.). P říklad přípravy přísadami dopln ě­
ného sedimentu je popsán v dodatku 3. P řijatelné je i míchání suchých 
složek, pokud se prokáže, že po p řidání vody nad sedimentem nedochází 
k separaci složek sedimentu (nap ř. vyplavování částic rašeliny) a že rašelina 
nebo sediment jsou dostate čně kondicionovány.  
Voda  
15. Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoli voda, která vyhovuje chemickým 
charakteristikám p řípustné ředicí vody uvedeným v dodatcích 2 a 4. Jakákoli 
vhodná voda, p řírodní voda (povrchová nebo podzemní), rekonstituovaná 
voda (viz p říloha 2) nebo odchlorovaná vodovodní voda je p řijatelná jako 
kultivační a zkušební voda, pokud v ní pakomá ři přežijí po dobu kultivace 
a zkoušení bez známek stresu. Na za čátku zkoušky by se hodnota pH 
zkušební vody m ěla pohybovat mezi 6 a 9 a její celková tvrdost by nem ěla 
být vyšší než 400 mg/l CaCO  3 . V případě, že je podez ření na interakci mezi 
ionty způsobujícími tvrdost vody a zkoušenou látkou, m ěla by však být 
použita voda nižší tvrdosti (a proto se v této situaci nesmí použít Elendtovo 
médium M4). V pr ůběhu celé studie by m ěl být užíván stejný typ vody. 
Charakteristiky jakosti vody uvedené v dodatku 4 by m ěly být m ěřeny 
nejméně dvakrát ro čně, nebo pokud existuje podez ření, že mohlo dojít 
k podstatné zm ěně těchto vlastností.  
Zásobní roztoky – obohacená voda  
16. Zkušební koncentrace se vypo čtou na základ ě koncentrace vodního sloupce, 
tj. vody nad sedimentem. Zkušební roztoky zvolené koncentrace jsou obvykle p řipraveny ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky by m ěly 
být připraveny p řednostně rozpuštěním zkoušené látky ve z řeďovací vod ě. 
Použití rozpoušt ědel nebo dispergátor ů může být v n ěkterých p řípadech pro 
vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Ke vhodným 
rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, ethylenglykol-monoethyle ­
ther, ethylenglykol-dimethylether, dimethylformamid a triethylenglykol. 
Disperzní činidla, která mohou být použita, jsou Cremophor RH40, 
Tween 80, 0,01 % methylcelulosa a HCO-40. Koncentrace solubiliza čního 
činidla v kone čném zkušebním médiu by m ěla být minimální (tj. ≤ 0,1 ml/l) 
a měla by být u všech expozic stejná. Je-li použito solubiliza ční činidlo, 
nesmí mít významné ú činky na p řežití ani viditelné nep říznivé účinky na 
larvy  Chironomidae , což musí být prokázáno na kontrolní skupin ě vysta­
vené pouze rozpoušt ědlu. Měla by však být vynaložena maximální snaha 
takové chemické látky nepoužívat.
 
USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY  
17. Uspo řádáním zkoušky se rozumí výb ěr počtu zkušebních koncentrací 
a jejich odstup ňování, po čet nádrží pro každou koncentraci a po čet larev 
v nádrži. Jsou popsána uspo řádání pro odhad koncentrace vyvolávající 
účinek EC, odhad NOEC a pro provedení limitní zkoušky. Regresní analýze 
se dává p řednost před testováním hypotéz.  
Uspořádání pro regresní analýzu  
18. Koncentrace použité ve zkoušce musí v každém p řípadě pokrývat koncen ­
traci vyvolávající ú činek (nap ř. EC  15 , EC  50 ) a rozsah koncentrací, p ři nichž 
dochází k ú činku, který je p ředmětem zájmu. Obecn ě platí, že p řesnost, 
a zejména platnost, s níž lze provést odhady koncentrace vyvolávající 
účinek (EC  x ), se zvýší, pokud se daná koncentrace vyvolávající ú činek ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
nachází v rozmezí zkoušených koncentrací. Je t řeba se vyhnout extrapolaci 
hluboko pod nejnižší pozitivní koncentrací nebo p řesahující nejvyšší 
koncentraci. P ředběžná orienta ční zkouška je užite čná pro výb ěr rozsahu 
koncentrací, které mají být použity (viz odstavec 27).  
19. V případě, že ECx je t řeba odhadnout, je t řeba zkoušku provést alespo ň 
v pěti koncentracích a t řech opakováních pro každou koncentraci. V každém 
případě je vhodné, aby byly užity dostate čné zkušební koncentrace umož ňu­
jící dobrý odhad modelu. Faktor mezi koncentracemi nesmí být v ětší než 2 
(výjimku lze u činit v případech, kdy má k řivka závislosti odezvy na dávce 
malý sklon). Po čet opakování p ři každé expozici lze snížit, pokud se zvýší 
počet zkušebních koncentrací s r ůznými odezvami. Zvýšení po čtu opakování 
nebo zúžení rozsahu zkušebních koncentrací obvykle vede k zúžení inter ­
valu spolehlivosti zkoušky. Pro odhad desetidenního p řežití a růstu larev 
jsou nutná další opakování.  
Uspořádání odhadu NOEC/LOEC  
20. Pro odhad LOEC/NOEC se použije p ět zkušebních koncentrací s nejmén ě 
čtyřmi opakováními a faktor mezi koncentracemi by nem ěl být vyšší než 2. 
Počet opakování by m ěl být dostate čný, aby zajistil odpovídající statistickou 
významnost, s jakou má být rozeznán 20 % rozdíl oproti kontrolnímu 
vzorku na 5 % hladin ě významnosti (p = 0,05). Pro rychlost vývoje je 
zpravidla vhodné použít analýzu rozptylu (ANOVA), jako nap říklad 
Dunnettův nebo Williams ův test (17, 18, 19, 20). Pro procento vylíhlých 
jedinců lze použít Cochran ův-Armitage ův test, Fisher ův exaktní test (s 
Bonferroniho korekcí) nebo Mantel ův-Haenszel ův test.  
Limitní zkouška  
21. Limitní zkouška m ůže být provedena (jedna zkušební koncentrace 
a kontrola), pokud nebyl zjišt ěn žádný dopad p ři předběžné orienta ční 
zkoušce. Ú čelem limitní zkoušky je ur čit, že hodnota toxicity zkoušené 
látky je vyšší než zkoušený koncentra ční limit. V této zkušební metod ě 
nelze navrhnout doporu čenou koncentraci: její stanovení je ponecháno na 
úsudku osob s rozhodovací pravomocí. Obvykle je pro expozici i kontrolu zapotřebí alespo ň šesti opakování. Po čet opakování by m ěl být dostate čný, 
aby zajistil odpovídající statistickou významnost, s jakou má být rozeznán 
20 % rozdíl oproti kontrolnímu vzorku na 5 % hladin ě významnosti (p = 
0,05). S metrickou reakcí (rychlost vývoje a hmotnost), je t-test vhodnou statistickou metodou, pokud údaje spl ňují požadavky tohoto testu (norma ­
lita, homogenní rozptyly). Pokud tyto požadavky spln ěny nejsou, lze použít 
t-test nestejných rozptyl ů nebo neparametrický test, jako je nap říklad 
Wilcoxon-Mann-Whitney ův test. Pro procento vylíhlých jedinc ů je vhodný 
Fisherův exaktní test.
 
POSTUP  
Podmínky expozice  
Příprava systému obohacená voda–sediment  
22. Do zkušebních nádob se p řidá vhodné množství p řísadami dopln ěného 
sedimentu (viz odstavce 13–14 a dodatek 3) tak, aby tvo řil vrstvu 
o hloubce nejmén ě 1,5 cm. P řidá se voda do hloubky 6 cm (viz odstavec 
15). Pom ěr vrstvy sedimentu a hloubky vody by nem ěl překročit 1:4 
a vrstva sedimentu by nem ěla být hlubší než 3 cm. Systém sediment–voda 
se před přidáním zkušebních organism ů (viz odstavec 14 a dodatek 3). 
mírně provzduš ňuje po dobu sedmi týdn ů. Aby se zabránilo odd ělení složek 
sedimentu a resuspenzi jemného materiálu v pr ůběhu přidávání zkušební 
vody ve vodním sloupci, lze sediment p řikrýt plastovým diskem, na který 
se voda nalije a disk se bezprost ředně poté vyjme. Mohou být vhodná i jiná 
zařízení.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Zkušební nádoby se p řikryjí (nap říklad sklen ěnými víčky). Pokud je to 
nutné, v pr ůběhu studie se hladina vody doplní na p ůvodní objem s cílem 
kompenzovat odpa řování vody. K tomuto ú čelu by m ěla být použita desti ­
lovaná nebo deionizovaná voda, aby se zabránilo hromad ění solí.  
Přidání zkušebních organism ů 
24. Čtyři až pět dnů před přidáním zkušebních organism ů do zkušebních nádob 
by měly být z kultur odebrány shluky vají ček a umíst ěny do malých nádob 
do kultiva čního média. Lze použít starší médium ze zásobní kultury nebo 
čerstvě připravené médium. Pokud je použito čerstvé médium, m ělo by být 
do kultiva čního média p řidáno malé množství potravy, nap ř. zelené řasy 
a/nebo několik kapek filtrátu z jemn ě mleté suspenze vlo čkového krmiva 
pro ryby (viz dodatek 2). M ěly by být použity pouze čerstvě nakladené 
shluky vají ček. Za normálních okolností se larvy za čínají líhnout n ěkolik 
dní po nakladení vají ček (2 až 3 dny u  Chironomus riparius  při 20 °C a 1 
až 4 dny u  Chironomus tentans  při 23 °C a  Chironomus yoshimatui  při 
25 °C) a b ěhem larválního vývoje se vyst řídají čtyři instary, z nichž 
každý trvá 4–8 dn ů. Při zkoušce se použijí larvy prvního instaru (2–3 
nebo 1–4 dn ů po vylíhnutí). Instar pakomár ů lze případně zkontrolovat 
pomocí ší řky hlavové kapsuly (6).  
25. Dvacet larev prvního instaru se pomocí pipety bez špi čky náhodn ě rozdělí 
do jednotlivých zkušebních nádob obsahujících obohacený sediment a vodu. 
Provzdušňování vody je nutno ukon čit při přidání larev do zkušebních 
nádob a znovu ho zahájit nejd říve po uplynutí dalších 24 hodin po p řidání 
larev (viz odstavce 25 a 32). Podle užitého uspo řádání zkoušky (viz 
odstavce 19 a 20) je po čet larev užitý na jednu koncentraci minimáln ě 60 
pro odhad koncentrace vyvolávající ú činek a 80 pro stanovení NOEC.  
26. Dvacet čtyři hodin po p řidání larev se zkoušená látka vmísí do sloupce vody 
nad sedimentem a znovu se zavede mírné provzduš ňování. Pod hladinou 
vody se pomocí pipety aplikují malé objemy roztok ů zkoušené látky. Voda 
nad sedimentem se poté opatrn ě promíchá, aby se nerozrušil sediment.  
Zkušební koncentrace  
27. Orienta ční zkouška m ůže být užite čná pro stanovení rozsahu koncentrací pro 
vlastní zkoušku. K tomuto ú čelu jsou pakomá ři exponováni řadě široce 
odstupňovaných koncentrací zkoušené chemické látky. S cílem zajistit 
stejnou hustotu povrchu na jednoho pakomára, která má být užita pro vlastní zkoušku, se pakomá ři vystaví jednotlivým koncentracím zkoušené chemické 
látky po dobu, která umož ňuje odhad vhodných zkušebních koncentrací; 
opakování nejsou vyžadována.
 
28. Zkušební koncentrace pro vlastní zkoušku jsou stanoveny podle výsledku 
zjištění předběžné orienta ční zkoušky. M ělo by být vybráno a použito 
nejméně pět koncentrací v souladu s popisem uvedeným v odstavcích 18 
až 20.  
Kontroly  
29. Při zkoušce se použijí kontrolní nádoby bez zkoušené chemické látky, avšak 
obsahující sediment s p říslušným po čtem opakování (viz odstavce 19–20). 
Pokud bylo pro aplikaci zkoušené chemické látky použito rozpoušt ědlo (viz 
odstavec 16), bude p řidána kontrola rozpoušt ědla v sedimentu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Zkušební za řízení  
30. Užívají se statické systémy. Ve výjime čných případech, jako nap říklad 
tehdy, pokud je specifikace kvality vody nevhodná pro r ůst zkušebního 
organismu nebo ovliv ňuje chemickou rovnováhu (nap ř. přílišný pokles 
úrovně rozpuštěného kyslíku, p řílišné zvýšení koncentrace exkrement ů 
nebo výluh minerál ů ze sediment ů, který ovliv ňuje pH a/nebo tvrdost vody), 
lze použít semistatické nebo pr ůtokové systémy s p řerušovanou nebo konti ­
nuální obnovou vody nad sedimentem. Zpravidla však budou posta čující 
a vhodnější jiné metody zvýšení kvality vody nad sedimentem, jako je 
například provzduš ňování.  
Potrava  
31. Larvy je t řeba krmit optimáln ě denně nebo nejmén ě třikrát týdn ě. Jako 
dostatečná dávka pro mladé larvy po dobu prvních 10 dn ů se jeví krmivo 
pro ryby (suspenze ve vod ě nebo jemn ě rozmělněné krmivo, nap ř. 
Tetra-Min nebo Tetra-Phyll, viz podrobnosti v dodatku 2) v množství 
0,25 až 0,5 mg (0,35 až 0,5 mg pro  C. yoshimatui )) na larvu za den. Starší 
larvy mohou pot řebovat o n ěco větší množství potravy: po zbývající dobu 
zkoušky by m ělo dostačovat 0,5–1 mg na larvu denn ě. Pokud dojde 
v kontrolních skupinách k r ůstu plísní nebo je u nich zjišt ěna mortalita, je 
nutné přísun potravy u všech expozic snížit a kontrolovat. Pokud není 
možné růst plísní zastavit, je nutné zkoušku opakovat. P ři testování siln ě 
adsorbujících látek (nap ř. log K  ow > 5), nebo látek s kovalentní vazbou na 
sediment lze dávku potravy nezbytnou pro zajišt ění přežití a přirozeného 
růstu organism ů přidat do p řísadami dopln ěného sedimentu p řed fází stabi ­
lizace. V takovém p řípadě je nutno místo krmiva pro ryby použít rostlinný 
materiál, nap říklad přídavek 0,5 % (sušiny) jemn ě mletých list ů např. 
kopřivy dvoudomé ( Urtica dioica ), morušovníku bílého ( Morus alba ), jetele 
plazivého ( Trifolium repens ), špenátu setého ( Spinacia oleracea ) nebo 
jiného rostlinného materiálu ( Cerophylu  nebo alfa-celulózy).  
Inkubační podmínky  
32. Voda nad sedimentem ve zkušebních nádobách se mírn ě provzduš ňuje 
v optimálním p řípadě 24 hodin po p řidání larev a je sledována po celou 
dobu zkoušky (je t řeba dbát, aby koncentrace rozpušt ěného kyslíku neklesla 
pod 60 % ASV). Provzduš ňování se provádí pomocí sklen ěné Pasteurovy 
pipety upevn ěné 2–3 cm nad vrstvou sedimentu (tj. jedna nebo n ěkolik 
bublin/s). P ři zkoušení t ěkavých chemických látek je možné zvolit možnost 
systém sediment–voda neprovzduš ňovat.  
33. Zkouška se provádí p ři konstantní teplot ě 20 °C (± 2 °C). Doporu čená 
teplota pro  C. tentans  je 23 °C a pro  C. yoshimatui  25 °C (± 2 °C). Foto ­
perioda je 16 hodin a intenzita sv ětla by měla být 500 až 1 000 lux.  
Trvání expozice  
34. Expozice je zahájena p řidáním larev do obohacených a kontrolních nádob. 
Maximální délka trvání expozice je 28 dn ů pro C. riparius  a C. yoshimatsui  
a 65 dnů pro C. tentans.  Pokud se pakomá ři vylíhnou d říve, lze zkoušku 
ukončit po uplynutí nejmén ě pěti dnů od vylíhnutí posledního dosp ělce 
v kontrolní nádob ě. 
POZOROVÁNÍ  
Líhnutí  
35. Určí se čas potřebný pro vývoj a celkový po čet plně vylíhlých samc ů 
a samic pakomár ů. Samce lze snadno rozlišit podle v ějířovitých tykadel.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Zkušební nádoby se kontrolují alespo ň třikrát týdn ě s cílem vizuáln ě 
posoudit jakékoli neobvyklé chování (nap ř. opouštění sedimentu, neobvyklé 
plavání), ve srovnání s kontrolními nádobami. B ěhem období p ředpokláda ­
ného líhnutí je nutné denn ě počítat vylíhlé pakomáry. Pohlaví a po čet plně 
vylíhlých pakomár ů se denn ě zaznamenávají. Po identifikaci se pakomá ři 
z nádob odstraní. Veškeré shluky vají ček nakladené p řed ukončením testu se 
zaznamenají a pak se odstraní, aby se zabránilo op ětovnému zavle čení larev 
do sedimentu. Zaznamená se rovn ěž počet viditelných kukel, které se dosud 
nevylíhly. Pokyny pro m ěření líhnutí jsou uvedeny v dodatku 5.  
Růst a přežívání  
37. Pokud je nutné uvést údaje o desetidenním p řežití a růstu larev, je t řeba na 
počátku zkoušky p řidat další zkušební nádoby tak, aby je bylo možné 
následně použít. Sediment z t ěchto dalších nádob se proseje za použití 
síta o velikosti 250 μm, které udrží larvy. Kritéria uhynutí jsou nepohybli ­
vost nebo nedostate čná reakce na mechanické podn ěty. Larvy, které nejsou 
nalezeny, by m ěly být rovn ěž považovány za uhynulé (larvy uhynulé na 
počátku zkoušky mohly být již rozloženy mikroby). Stanoví se váha sušiny 
(prosté popelovin) larev, které p řežily, na zkušební nádobu a vypo čte se 
průměrná individuální hmotnost sušiny na nádobu. Je vhodné ur čit, do 
kterého instaru p řežívající larvy pat ří; tohoto cíle lze dosáhnout pomocí 
změření šířky hlavové kapsuly každého jedince.  
Analytická m ěření 
Koncentrace zkoušené chemické látky  
38. Musí být analyzovány minimáln ě vzorky vody nad sedimentem, kapilární 
vody a sedimentu na po čátku (nejlépe hodinu po aplikaci zkoušené látky) 
a na konci zkoušky p ři nejvyšší koncentraci a jedné nižší koncentraci. Tato 
stanovení koncentrace zkoušené chemické látky poskytují informace o chování/distribuci zkoušené chemické látky v systému voda/sediment. 
Odběr vzorků sedimentu p ři zahájení zkoušky m ůže ovlivnit zkušební 
systém (m ůže dojít k odstran ění zkušebních larev), a m ěly by proto být 
užity další zkušební nádoby k provedení analytického stanovení koncentrace na počátku zkoušky a v jejím pr ůběhu, pokud je to vhodné (viz odstavec 
39). Měření v sedimentu nemusí být nutná, pokud distribuce zkoušené látky 
mezi vodou a sedimentem byla jasn ě stanovena studií voda/sediment za 
srovnatelných podmínek (nap ř. poměr sedimentu k vod ě, typ aplikace, 
obsah organického uhlíku v sedimentu).
 
39. Při provádění průběžných měření (např. 7. den), a v p řípadě, že jsou pro 
analýzu zapot řebí rozsáhlé vzorky, které nelze ze zkušebních nádob odebrat 
bez dopadu na zkušební systém, je pot řeba provést analytická stanovení na 
vzorcích z dalších zkušebních nádob, s nimiž bylo zacházeno stejným způsobem (v četně přítomnosti zkušebních organism ů), ale nebyly použity 
pro biologická pozorování.
 
40. Doporu čeným postupem izolace intersticiální vody je odst řeďování nap ř. při 
odstředivé síle 10 000 g a 4 °C po dobu 30 minut. Neadsorbuje-li se však 
zkoušená látka prokazateln ě na filtry, je p řijatelná i filtrace. V n ěkterých 
případech m ůže být nemožné provést analýzu koncentrací v kapilární vod ě 
vzhledem k tomu, že vzorek je p říliš malý.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fyzikálně-chemické parametry  
41. pH a rozpušt ěný kyslík ve zkušební vod ě a teplotu ve zkušebních nádobách 
je nutno m ěřit vhodným zp ůsobem (viz odstavec 10). Tvrdost a obsah 
amoniaku by m ěly být měřeny v kontrolních nádobách a v jedné zkušební 
nádobě při nejvyšší koncentraci na po čátku zkoušky a na jejím konci.  
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Zpracování výsledk ů 
42. Účelem této zkoušky je stanovit ú činek zkoušené chemické látky na rychlost 
vývoje a celkový po čet plně vylíhlých samc ů a samic pakomár ů, nebo 
v případě desetidenní zkoušky ú činky na p řežití a hmotnost larev. Pokud 
nejsou k dispozici žádné údaje o statistických rozdílech citlivosti mezi oběma pohlavími, lze výsledky pro samce a pro samice slou čit pro účely 
statistické analýzy. Rozdíly v citlivosti mezi pohlavími lze statisticky 
posoudit nap ř. pomocí χ
 2 – r × 2 tabulkového testu. Je-li vyžadováno 
stanovení p řežití larev a pr ůměru individuální sušiny na jednu nádobu, je 
nutné tak u činit po 10 dnech.  
43. Koncentrace s pozorovanými ú činky vyjád řené jako koncentrace ve vod ě 
nad sedimentem se vypo čtou přednostně na základ ě naměřených koncentrací 
na počátku zkoušky (viz bod 38).  
44. Pro výpo čet bodového odhadu EC  50 nebo jakékoli jiné hodnoty EC  x lze 
jako skute čné opakování použít statistiku na jednu nádobu. P ři výpočtu 
intervalu spolehlivosti pro každý EC  x je nutno zohlednit variabilitu mezi 
jednotlivými nádobami, p řípadně prokázat, že tato variabilita je tak nízká, že 
ji lze ignorovat. Je-li u modelu užita metoda nejmenších čtverců, je nutné 
u statistik jednotlivých nádob uplatnit transformaci za ú čelem homogenity 
rozptylu. Hodnoty EC  x je však t řeba vypo čítat až poté, co je reakce 
převedena zp ět na původní hodnotu.  
45. Pokud je cílem statistické analýzy stanovení hodnoty NOEC/LOEC testo ­
váním hypotéz, je nutné vzít v úvahu variabilitu mezi nádobami, nap říklad 
pomocí analýzy rozptylu ANOVA. P řípadně mohou být vhodn ější robust ­
nější testy (21) v p řípadě, že dojde k porušení p ředpokladů obvykle užitých 
při analýze ANOVA.  
Procento vylíhlých jedinc ů 
46. Procento vylíhlých jedinc ů jsou kvantové údaje a lze je analyzovat 
s použitím postupn ě klesajícího Cochranova-Armitageova testu, který p řed­
pokládá monotónní odezvu na dávku, a tato data jsou konzistentní s tímto 
očekáváním. V opa čném případě lze použít Fisher ův exaktní test nebo 
Mantelův-Haenszel ův test s Bonferroniho-Holmovou korekcí hodnot p. 
Pokud existují d ůkazy o větší variabilit ě mezi replikacemi ve stejné koncen ­
traci, pak by binomické rozd ělení (často uvád ěné jako „extra-binomická“ 
variabilita) nasv ědčovala tomu, že je nutno použít robustní Cochran ův- 
Armitage ův test nebo Fisher ův exaktní test, jak je navrhováno v odstavci 
(21).  
47. Určí se součet pakomár ů vylíhlých v jedné nádob ě ne a vyd ělí se počtem 
vložených larev na:  
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
kde: 
ER = procento vylíhlých jedinc ů, 
n e = počet pakomár ů vylíhlých v nádob ě, 
n a = počet larev nasazených do nádoby.  
48. Nejvhodn ější alternativou pro rozsáhlé vzorky s extra binomickou variací je 
pojmout procento vylíhlých jedinc ů jako kontinuální odezvu a použít 
postupy, jako je nap říklad Williams ův test, pokud existuje p ředpoklad 
monotónní odezvy na dávku a je konzistentní s t ěmito daty ER. 
V případě nemonotónní odezvy by byl vhodný Dunnett ův test. Rozsáhlý 
vzorek je zde definován situací, p ři níž jak po čet vylíhlých jedinc ů, tak 
počet nevylíhlých jedinc ů přesáhnou v jednom duplikátním vzorku (nádob ě) 
hodnotu p ět. 
49. Při použití metody ANOVA je nutno hodnoty ER nejprve transformovat 
(například druhou odmocninou arcsinu) nebo transformací podle 
Freemana-Tukeyho s cílem získat p řibližné normální rozd ělení údaj ů 
a vyrovnat odchylky. P ři použití absolutních frekvencí lze použít test dle 
Cochrana-Armitage, Fisher ův exaktní test (s Bonferroniho korekcí) nebo 
Mantelův-Haenszel ův test. Transformace funkcí rovnou √arcsin se vypo čte 
pomocí p řevrácené hodnoty sinu (sin  –1 ) z odmocniny ER.  
50. Pro procento vylíhlých jedinc ů se hodnoty EC  x vypočtou pomocí regresní 
analýzy (nebo nap ř. pomocí modelu probit, (22), logit, Weibull, vhodného 
komerčního softwaru atd.). V p řípadě selhání regresní analýzy (nap ř. 
v případě méně než dvou koncentrací s parciálními odezvami) se použijí 
další neparametrické metody, jako je nap říklad klouzavý pr ůměr nebo prostá 
interpolace.  
Rychlost vývoje  
51. Průměrná doba vývoje p ředstavuje pr ůměrné časové rozp ětí mezi nasazením 
larev (den 0 zkoušky) a vylíhnutím experimentální kohorty pakomár ů. (Pro 
výpočet skutečné doby vývoje by m ělo být zohledn ěno stáří larev 
v okamžiku nasazení. Rychlost vývoje je p řevrácenou hodnotou doby 
vývoje (jednotka: 1/den) a p ředstavuje část larválního vývoje, která se 
odehraje za den. Rychlost vývoje je z hlediska hodnocení t ěchto studií 
toxicity sediment ů preferována p řed dobou vývoje vzhledem k její nižší 
variabilitě, vyšší homogenit ě a větší blízkosti normálnímu rozd ělení. 
Z tohoto d ůvodu mohou být použity silné parametrické zkušební postupy 
pro rychlost vývoje, a ne pro dobu vývoje. Pro rychlost vývoje jako konti ­
nuální odezvu lze hodnoty EC  x stanovit odhadem pomocí regresní analýzy 
(např. (23), (24).)  
52. U následujících statistických test ů se má za to, že po čet pakomár ů pozoro­
vaných v inspek čním dni x se vylíhl v pr ůměru časového intervalu mezi 
dnem x a dnem x – l (l = délka intervalu mezi pozorováními, obvykle 1 den). Průměrná rychlost vývoje na nádobu ( x) se vypo čte podle vzorce:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
kde: 
x: střední rychlost vývoje v kádince,  
i: index intervalu mezi pozorováními,  
m: maximální po čet všech interval ů mezi pozorováními,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : počet vylíhlých jedinc ů během daného intervalu mezi pozorováními i,  
n e : celkový po čet vylíhlých jedinc ů celkem na konci pokusu (  P ƒ i ) 
x i : rychlost vývoje pakomár ů vylíhlých v intervalu i,  
x i ¼ 1= Í 
den  i Ä l i 
2 Î 
kde: 
den  i : den pozorování (ve dnech od aplikace),  
l i : délka intervalu i mezi pozorováními (ve dnech, obvykle 1 den).  
Protokol o zkoušce  
53. Protokol o zkoušce musí obsahovat minimáln ě tyto údaje:  
Zkoušená látka:  
— fyzikální povahu a p řípadně fyzikálně-chemické vlastnosti (rozpustnost 
ve vodě, tlak par, rozd ělovací koeficient v p ůdě (případně v sedimentu), 
stabilita ve vod ě, atd.),  
— chemické identifika ční údaje (obecný název, chemický název, strukturní 
vzorec, číslo CAS atd.) v četně čistoty a analytické metody pro kvanti ­
tativní stanovení zkoušené látky.  
Testovací druh:  
— užitá pokusná zví řata: druh, v ědecký název, zdroj organism ů 
a podmínky množení,  
— informace o nakládání se shluky vají ček a s larvami,  
— stáří testovaných zví řat po nasazení do zkušebních nádob.  
Zkušební podmínky:  
— použitý sediment, tj. p řírodní nebo p řísadami dopln ěný sediment,  
— u přírodního sedimentu lokalita a popis místa odb ěru sedimentu, pokud 
možno včetně dřívější kontaminace, charakteristiky: pH, obsah organic ­
kého uhlíku, pom ěr C/N a zrnitost (je-li to vhodné),  
— příprava přísadami dopln ěného sedimentu: složky a charakteristiky 
(obsah organického uhlíku, pH, vlhkost, atd. na za čátku zkoušky),  
— příprava zkušební vody (pokud se používá rekonstituovaná voda) a její 
charakteristiky (koncentrace kyslíku, pH, vodivost, tvrdost, atd. na 
začátku zkoušky),  
— hloubka sedimentu a vody nad sedimentem,  
— objem vody nad sedimentem a kapilární vody, hmotnost vlhkého 
sedimentu s kapilární vodou a bez ní,  
— zkušební nádoby (materiál a rozm ěry), 
— metoda p řípravy zásobních roztok ů a zkušební koncentrace,  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— aplikace zkoušené látky, použité zkušební koncentrace, po čet duplikát ­
ních vzork ů a případné použití rozpoušt ědla, 
— inkuba ční podmínky: teplota, cyklus a intenzita sv ětla, provzduš ňování 
(frekvence a intenzita),  
— podrobné informace o krmení v četně typu krmiva, p řípravy, množství 
a režimu krmení.  
Výsledky:  
— nominální zkušební koncentrace, nam ěřené zkušební koncentrace 
a výsledky všech analýz pro stanovení koncentrace zkoušené chemické látky ve zkušební nádob ě,
 
— kvalita vody ve zkušebních nádobách, tj. pH, teplota, rozpušt ěný kyslík, 
tvrdost a amoniak,  
— případné nahrazování odpa řené zkušební vody,  
— počet vylíhlých samc ů a samic pakomár ů na nádobu a na den,  
— počet larev, z nichž se nevylíhli dosp ělci, na nádobu,  
— průměrná individuální hmotnost sušiny larev na nádobu a p řípadně na 
instar,  
— procento vylíhlých jedinc ů na duplikátní vzorek a zkušební koncentraci 
(směsný vzorek samc ů a samic pakomár ů), 
— průměrná rychlost vývoje pln ě vylíhlých pakomár ů na duplikátní vzorek 
a aplikované množství (sm ěsný vzorek samc ů a samic pakomár ů), 
— odhady koncových bod ů toxicity, nap ř. ECx (a související intervaly 
spolehlivosti), NOEC a/nebo LOEC a statistické metody použité 
k jejich stanovení,  
— diskuse o výsledcích v četně případného vlivu na výsledek zkoušky 
v důsledku odchylek od této zkušební metody.  
LITERATURA:  
1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
 
2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK.  
3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA 
Workshop held in the Netherlands.  
4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 
1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
 
5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated 
June 1994.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chi­
ronomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14) Kapitola C.8 této p řílohy, Toxicita pro žížaly,  
15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
 
17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.  
18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482–491.  
19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103–117.  
20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510–531.  
21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48:577–585.  
22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.  
24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Pro účely této metody se použijí tyto definice:  
Přísadami dopln ěný sediment  nebo rekonstituovaný, um ělý nebo syntetický 
sediment je sm ěs materiál ů užitá k napodobení fyzických složek p řírodního 
sedimentu.  
Voda nad sedimentem  je voda nacházející se nad sedimentem ve zkušební 
nádobě. 
Intersticiální voda  nebo kapilární voda je voda zabírající prostor mezi 
sedimentem a částicemi p ůdy. 
Obohacená voda  je zkušební voda, do níž byla p řidána zkoušená látka.  
Zkoušená chemická látka:  jakákoli látka nebo sm ěs testovaná pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Dodatek 2  
Doporučení pro kultivaci kultury  Chironomus riparius  
1. Larvy rodu  Chironomus  lze chovat v krystaliza čních miskách nebo ve 
větších nádobách. Jemný k řemičitý písek se rozprost ře po dně nádoby 
v tenké vrstv ě silné 5 až 10 mm. Bylo prokázáno, že substrátem vhodným 
jako podklad je také k řemelina (nap ř. Merck, čl. 8117), (dosta čující je ten čí 
vrstva silná jen n ěkolik málo mm). Následn ě se přidá několikacentimetrová 
vrstva vhodné vody. Objem vody by se m ěl podle pot řeby dopl ňovat 
s cílem nahradit ztráty vzniklé odpa řováním a zabránit vysychání. Vodu 
lze v případě potřeby vym ěnit. Je třeba zajistit mírné provzduš ňování. 
Nádoby, v nichž jsou larvy chovány, by m ěly být umíst ěny ve vhodné 
kleci, která zabrání úniku líhnoucích se dosp ělců. Tato klec by m ěla být 
dostatečně velká, aby umož ňovala rojení vylíhlých dosp ělců, jinak by nemu ­
selo dojít k jejich pá ření (minimum je p řibližně 30×30×30 cm).  
2. Klece by m ěly být umíst ěny při pokojové teplot ě nebo v místnosti 
s konstantní teplotou 20 ± 2 °C s fotoperiodou 16 hodin sv ětlo (intenzity 
přibližně 1 000 lux) a 8 hodin tma. Bylo zjišt ěno, že vzdušná vlhkost nižší 
než 60 % RH m ůže bránit rozmnožování.  
Ředicí voda  
3. Lze použít jakoukoli vhodnou p řírodní nebo syntetickou vodu. Zpravidla se 
užívá studni ční voda, odchlorovaná vodovodní voda a um ělá média (nap ř. 
Elendtovo médium „M4“ nebo „M7“, viz níže). Vodu je p řed použitím 
nutno provzdušnit. Je-li to nutné, lze kultiva ční vodu obnovit opatrným 
odlitím nebo od čerpáním použité vody z kultiva čních nádob tak, aby 
nedošlo k poškození schránek larev.  
Krmení larev  
4. Larvy rodu  Chironomus  by se m ěly krmit vlo čkovým krmivem pro ryby 
(TetraMin(®, Tetra Phyll® nebo jiná podobná zna čka patentovaného krmiva 
pro ryby), v množství p řibližně 250 mg na nádobu a den. Potravu lze 
aplikovat v podob ě suchého mletého prášku nebo v podob ě suspenze ve 
vodě: 1,0 g vlo čkového krmiva se p řidá do 20 ml ředicí vody a vytvo ří se 
homogenní sm ěs. Tento p řípravek lze dodávat rychlostí p řibližně 5 ml na 
nádobu na den (p řed použitím prot řepat). Starším larvám lze p řidat více 
krmiva.  
5. Krmení se upraví podle kvality vody. V p řípadě, že se kultiva ční médium 
„zakalí“, je t řeba krmnou dávku snížit. P řidávání potravy je nutno pe člivě 
sledovat. P říliš malé množství krmiva zp ůsobí, že larvy opoušt ějí sediment 
a vznášejí se ve vodním sloupci, a p říliš mnoho krmiva zp ůsobí zvýšenou 
mikrobiální činnost a pokles koncentrace kyslíku. Obojí m ůže způsobit 
snížení rychlosti r ůstu. 
6. Do nových kultiva čních nádob mohou být p řidány i bu ňky zelených řas 
(např. Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ). 
Krmení vylíhlých dosp ělců 
7. Někteří experimentáto ři se domnívají, že jako potrava vylíhlých dosp ělců 
může sloužit vata namo čená do nasyceného roztoku sacharózy.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Líhnutí  
8. Dosp ělci se začnou v chovných nádobách líhnout p ři teplotě 20 ± 2 °C 
přibližně po 13–15 dnech. Samce lze snadno rozlišit podle v ějířovitých 
tykadel.  
Shluky vají ček 
9. Jakmile se ve snubní kom ůrce nacházejí dosp ělci, je třeba třikrát týdn ě 
kontrolovat všechny reproduk ční nádoby, zda se v nich nacházejí shluky 
vajíček spojené želatinózní hmotou. Pokud se zde shluky vají ček nacházejí, 
je nutno je opatrn ě odstranit a p řemístit do malé misky obsahující vzorek 
chovného vodního prost ředí. Shluky vají ček se užijí pro založení nové 
nádoby s kulturou (nap ř. 2–4 shluky vají ček na nádobu) nebo se užijí pro 
zkoušky toxicity.  
10. Larvy prvního instarového stadia by se m ěly vylíhnout za 2–3 dny.  
Zakládání nových kultiva čních nádob  
11. Jakmile jsou kultury založeny, m ělo by být možné zakládat nové nádoby 
s kulturami larev jednou týdn ě nebo mén ě často v závislosti na zkušebních 
požadavcích a odstra ňovat starší nádoby po vylíhnutí dosp ělců. Pomocí 
tohoto systému se zajistí pravidelné dodávky dosp ělců s minimální pot řebou 
dohledu.  
Příprava zkušebních roztok ů „M4“ a „M7“  
12. Elendt (1990) popsal médium „M4“. Médium „M7“ se p řipraví obdobn ě 
jako médium „M4“ s výjimkou látek uvedených v tabulce 1, u nichž jsou 
koncentrace u „M7“ čtyřikrát nižší než u „M4“. P řipravuje se publikace 
o médiu „M7“ (Elendt, osobní sd ělení). Podle Elendta a Biase (1990) by 
se zkušební roztok nem ěl připravovat pro koncentrace NaSiO  3 5 H  2 O, 
NaNO  3 , KH  2 PO 4 a K  2 HPO  4 vzhledem k tomu, že nejsou pro p řípravu 
zásobních roztok ů vyhovující.  
Příprava média „M7“  
13. Každý zásobní roztok (I) se p řipraví samostatn ě a z těchto zásobních 
roztoků (I) se pak p řipraví kombinovaný zásobní roztok (II) (viz tabulka 
1). Médium „M7“ se p řipraví přidáním 50 ml kombinovaného zásobního 
roztoku (II) a množství zásobního roztoku jednotlivých makroživin, které 
jsou uvedeny v tabulce 2, do 1 litru deionizované vody. P řipraví se vita ­
minový zásobní roztok p řidáním tří vitaminů do deionizované vody, jak je 
uvedeno v tabulce 3, a 0,1 ml kombinovaného vitaminového zásobního roztoku se p řidá do výsledného média „M7“ krátce p řed použitím. (Vitami ­
nový zásobní roztok se usklad ňuje zmrazený v malých alikvotních dílech.) 
Médium se provzdušní a stabilizuje.
 
Tabulka 1  
Zásobní roztoky stopových prvk ů pro médium M4 a M7  
Zásobní roztoky (I) Množství (mg) 
doplněné na 1 litr 
deionizované 
vody Kombinovaný zásobní roztok (II) se 
připraví smícháním následujících 
množství (v ml) zásobních 
roztoků (I) a dopln ěním na 1 litr 
deionizované vody Konečné koncentrace ve zkušebním 
roztoku (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Zásobní roztoky (I) Množství (mg) 
doplněné na 1 litr 
deionizované 
vody Kombinovaný zásobní roztok (II) se 
připraví smícháním následujících 
množství (v ml) zásobních 
roztoků (I) a dopln ěním na 1 litr 
deionizované vody Konečné koncentrace ve zkušebním 
roztoku (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Tyto chemické látky se u M4 a M7 liší, jak je uvedeno výše. 
( 2 ) Tyto roztoky se p řipravují samostatn ě, spojí se a ihned se zpracují v autoklávu.  
Tabulka 2  
Zásobní roztoky makroživin pro médium M4 a M7  
Množství dopln ěné na 
1 litr deionizované 
vody 
(mg) Množství zásobních 
roztoků makroživin p řidané 
za účelem přípravy média 
M4 a M7 
(ml/l) Konečné koncentrace 
ve zkušebním roztoku 
M4 a M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabulka 3  
Vitaminový zásobní roztok pro médium M4 a M7  
Všechny t ři vitaminové roztoky se smísí do jediného vitaminového zásobního roztoku.  
Množství dopln ěné na 1 
litr deionizované vody 
(mg) Množství vitaminového 
zásobního roztoku p řidané za 
účelem přípravy média M4 
a M7 
(ml/l) Konečné koncentrace ve 
zkušebním roztoku M4 
a M7 
(mg/l)  
Thiaminhydrochlorid 750 0,1 0,075 
Kyanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075
 
LITERATURA:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Dodatek 3  
PŘÍPRAVA P ŘÍSADAMI DOPLN ĚNÉHO SEDIMENTU  
Složení sedimentu  
Složení p řísadami dopln ěného sedimentu by m ělo být následující:  
Složka Charakteristika % sušiny 
sedimentu  
Rašelina: rašelina mechu Sphagnum 
s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, 
bez viditelných zbytk ů rostlin 
a jemně mletá (velikost částic 
≤ 1 mm) a vysušená na 
vzduchu 4–5 
Křemičitý písek velikost zrn: > 50 % částic 
musí být v rozp ětí 50–200 
μm 75–76 
Kaolinitický jíl obsah kaolinitu ≥ 30 % 20 
Organický uhlík upraven p řidáním rašeliny 
a písku 2 (± 0,5) 
Uhličitan vápenatý CaCO  3 , práškový, chemicky 
čistý 0,05–0,1 
Voda vodivost ≤ 10 μS/cm 30–50  
Příprava  
Rašelina se usuší na vzduchu a rozemele se na jemný prášek. P řipraví se 
suspenze požadovaného množství rašelinného prášku v deionizované vod ě 
s použitím vysoce výkonného homogeniza čního zařízení. pH této suspenze se 
upraví na 5,5 ± 0,5 pomocí CaCO  3 . Suspenze se kondicionuje po dobu nejmén ě 
dvou dní za mírného promíchávání p ři 20 ± 2 °C za ú čelem stabilizace pH 
a vytvoření stabilní mikrobiální složky. Poté se op ět změří pH, které by se 
mělo rovnat 6,0 ± 0,5. Pak se suspenze rašeliny smísí s ostatními složkami (písek 
a kaolín) a s deionizovanou vodou s cílem získat homogenní sediment s obsahem vody v rozmezí 30–50 procent sušiny sedimentu. Znovu se zm ěří pH kone čné 
směsi a v případě nutnosti je op ět upraveno pomocí CaCO
 3 na hodnotu 6,5 až 
7,5. Odeberou se vzorky sedimentu pro stanovení obsahu sušiny a obsahu orga ­
nického uhlíku. Následn ě se doporu čuje před použitím pro zkoušku toxicity pro 
pakomáry p řísadami dopln ěný sediment kondicionovat po dobu sedmi dn ů za 
stejných podmínek, které p řevládají v následné zkoušce.  
Skladování  
Suché složky pro p řípravu um ělého sedimentu lze skladovat na suchém 
a chladném míst ě při pokojové teplot ě. Přísadami dopln ěný (mokrý) sediment 
by neměl být před použitím ve zkoušce skladován. M ěl by být použit ihned po 
uplynutí sedmidenního období kondicionování, kterým kon čí jeho příprava.  
LITERATURA:  
Kapitola C.8 této p řílohy. Toxicita pro žížaly.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Dodatek 4  
Chemické charakteristiky p řípustné ředicí vody  
Látka Koncentrace  
Částice tuhé < 20 mg/l 
Celkový obsah organického uhlíku < 2 mg/l Neionizovaný amoniak < 1 μg/l 
Tvrdost jako CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Zbytkový chlor < 10 μg/l 
Celkové organické fosforové pesticidy < 50 ng/l Celkové organické chlorové pesticidy a polychlorované 
bifenyly < 50 ng/l 
Celkový organický chlor < 25 ng/l
 
(*) Je však t řeba poznamenat, že v p řípadě, že je podez ření na interakci mezi ionty zp ůso­
bujícími tvrdost vod a zkoušenou látkou, by m ěla být použita voda nižší tvrdosti (a 
proto se v této situaci nesmí použít Elendtovo médium M4).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Dodatek 5  
Pokyny pro monitorování líhnutí larev pakomár ů 
Na zkušební kádinky jsou umíst ěny výletové pasti. Tyto pasti jsou pot řebné od 
20. dne až do konce zkoušky. Níže je nakreslen p říklad používané pasti:
  
A: nylonová sí ťka 
B: plastový kryt  
C: kádinka bez zobá čku D: otvory na vým ěnu vody  
E: voda  
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29  HODNOCENÍ SNADNÉ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – 
UVOLŇOVÁNÍ CO  2 V TĚSNĚ UZAV ŘENÝCH LAHVI ČKÁCH 
(HEADSPACE TEST ) 
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 310 
(2006). Tato zkušební metoda je screeningovou metodou pro hodnocení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek a poskytuje obdobné informace jako šest zkušebních metod popsaných v kapitole C.4 této p řílohy 
A až F. Proto lze chemickou látku, která v této zkušební metod ě vykazuje 
pozitivní výsledky, považovat za snadno biologicky rozložitelnou a v důsledku toho rychle rozložitelnou v prost ředí.
 
2. Dobře vyzkoušená metoda uvol ňování oxidu uhli čitého (CO  2 ) (1), která je 
založena na p ůvodní Sturmov ě zkoušce (2) hodnocení biologické rozložitel ­
nosti organických chemických látek m ěřením emisí oxidu uhli čitého 
produkovaného mikrobiální činností, je zpravidla první možností testování 
špatně rozpustných a siln ě absorbujících chemických látek. Je užívána 
rovněž v případě rozpustných (avšak nikoli t ěkavých) látek, protože uvol ­ 
ňování oxidu uhli čitého řada odborník ů považuje za jediný nepochybný 
důkaz mikrobiální aktivity. Odstran ění rozpušt ěného organického uhlíku se 
může uskute čnit fyzikáln ě-chemickými procesy – adsorpcí, vypa řováním, 
srážením, hydrolýzou, ale je spot řebováván i mikrobiální činností a p ři 
řadě nebiologických reakcí; jen vzácn ě vzniká CO  2 z organických slou čenin 
abioticky. V p ůvodní a modifikované Sturmov ě zkoušce (1, 2) se odstraní 
CO 2 z kapalné fáze do absorp čních nádob probubláváním (tj. bublající 
vzduch upravený na odstra ňování CO  2 prostřednictvím kapalného prost ředí), 
zatímco v Larsonov ě verzi (3, 4) se CO  2 přenáší z reak ční nádoby do 
absorbérů proháněním vzduchu bez CO  2 přes plynnou fázi, a navíc 
neustálým t řepáním zkušební nádobou. Pouze v Larsonov ě modifikaci se 
reakční nádobou t řepe; míchání je ur čeno pouze pro nerozpustné látky podle 
normy ISO 9439 (5) a v originální americké verzi (6), které ob ě uvádějí 
probublávání, a nikoli nahrazování plynné fáze. V jiné oficiální metod ě US 
EPA (7) založené na Gledhillov ě metodě (8) se t řesená reak ční nádoba 
uzavře před atmosférou a vytvo řený CO  2 se shromaž ďuje ve vnit řním 
zásaditém za řízení pro zachycování p římo z plynné fáze, stejn ě jako 
v klasických Warburg/Barcroftových respirometrických ba ňkách.  
3. U anorganického uhlíku (IC) však bylo prokázáno, že se p ři použití stan ­
dardní modifikované Sturmovy zkoušky u řady chemických látek hromadí 
v médiu (9). P ři rozkladu 20 mg C/l anilinu byla zjišt ěna koncentrace IC až 
8 mg/l. To znamená, že zachycování CO  2 v zásaditém za řízení pro zachy ­
cování neposkytovalo v ěrný obraz o množství CO  2 vyprodukovaného 
mikrobiologicky v mezi časech během rozkladu. V d ůsledku této skute čnosti 
nebude specifikace, že > 60 % teoretické maximální produkce CO  2 (TCO  2 ) 
se musí shromáždit v pr ůběhu „10denního období rozkladu“ (10 dn ů, které 
následují bezprost ředně po dosažení 10 % rozkladu), aby bylo možno zkou ­ 
šenou chemickou látku klasifikovat jako snadno biologicky rozložitelnou, dodržena u n ěkterých chemických látek, které by byly takto klasifikovány 
pomocí odstran ění rozpušt ěného organického uhlíku (DOC).
 
4. Když má procento rozkladu nižší než p ředpokládanou hodnotu, je možné, že 
dochází k hromad ění IC ve zkušebním roztoku. V takovém p řípadě lze 
rozložitelnost odhadnout pomocí ostatních zkoušek snadné biologické rozlo ­ 
žitelnosti.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Další nedostatky Sturmovy metodiky (t ěžkopádná, časově náročná, náchyl ­
nější k experimentálním chybám a nepoužitelná pro t ěkavé chemické látky) 
již dříve podnítily snahu hledat jinou než Gledhillovu techniku využívající 
těsně uzavřené nádoby, která by nebyla založena na pr ůtoku plynu. (10, 11). 
Boatman a spolupracovníci (12) p řezkoumali již existující metody a p řijali 
metodu systému t ěsně uzavřených lahvi ček, v nichž se CO  2 uvolňuje do 
plynné fáze na konci inkubace po okyselení média. Obsah CO  2 byl měřen 
pomocí plynové chromatografie (analýza GC)/IC) ve vzorcích automaticky odebíraných z plynné fáze, avšak nebyl zohledn ěn rozpušt ěný anorganický 
uhlík (DIC) v kapalné fázi. Rovn ěž použité nádobky byly velmi malé (20 
ml) a obsahovaly pouze 10 ml média, což bylo p říčinou problém ů, např. při 
přidávání množství nerozpustných zkoušených chemických látek, které 
nutně muselo být jen velmi malé, p řípadně vzhledem k p řítomnosti nedo ­
statečného nebo nulového množství mikroorganism ů schopných rozložit 
zkoušené chemické látky v inokulovaném médiu.
 
6. Tyto obtíže p řekonaly nezávislé studie Struijse a Stoltenkampa (13) a Birche 
a Fletchera (14), p řičemž poslední z uvedených byli inspirováni svými 
zkušenostmi se za řízením používaným p ři zkoušce anaerobního biologic ­
kého rozkladu (15). P ři užití původní metody (13) se m ěří CO  2 v plynné 
fázi po okyselení a ustavení rovnováhy, zatímco ve druhém p řípadě (14) se 
měřil DIC v plynné i v kapalné fázi bez expozice; p řes 90 % vytvo řeného 
IC se nacházelo v kapalné fázi. Ob ě metody mají oproti Sturmov ě zkoušce 
výhodu v tom, že zkušební systém byl kompaktn ější a lépe ovladatelný, lze 
v něm zkoušet t ěkavé chemické látky a lze se vyhnout zpožd ění při měření 
vyprodukovaného CO  2 . 
7. Oba tyto p řístupy byly spojeny v norm ě ISO upravující CO  2 „headspace“ 
metodu (16), která byla zkoušena v mezilaboratorních porovnávacích zkou ­ 
škách (17), a tato norma tvo ří základ této zkušební metody. Oba uvedené 
přístupy byly použity rovn ěž v metod ě US EPA (18). Jsou doporu čovány 
dvě metody m ěření CO  2 , a to měření CO  2 v plynné fázi po okyselení (13) 
a IC v kapalné fázi po p řídavku nadbytku zásady. Druhou metodu zavedl 
Peterson p ři mezilaboratorní porovnávací zkoušce CONCAWE (19) této 
headspace metody upravené tak, aby m ěřila vlastní biologickou rozložitel ­
nost. Do této zkušební metody byly za členěny změny provedené p ři přepra­
cování těchto metod z roku 1992 (20) v kapitole C.4 této p řílohy o snadné 
biologické rozložitelnosti, takže podmínky (médium, trvání apod.) jsou jinak stejné jako podmínky v p řepracované Sturmov ě zkoušce (20). Birch 
a Fletcher (14) ukázali, že pomocí této headspace zkoušky byly získány 
velmi podobné výsledky jako u stejných chemických látek 
v mezilaboratorní porovnávací zkoušce p řepracovaných zkušebních metod 
OECD (21).
 
PODSTATA ZKOUŠKY  
8. Zkoušená látka se zpravidla v koncentraci 20 mg C/l jako jediný zdroj 
uhlíku a energie inkubuje v pufru – médiu vytvo řeném z minerálních solí, 
které je inokulováno sm ěsnou kulturou mikroorganism ů. Zkouška se provádí 
v těsně uzavřených nádobách s ur čitým volným objemem vzduchu pod 
víčkem, který p ředstavuje rezervoár kyslíku pro aerobní biologický rozklad. 
Uvolňování CO  2 v důsledku úplného aerobního biologického rozkladu 
zkoušené chemické látky se stanoví m ěřením produkce IC ve zkušebních 
nádobách, která je v ětší než produkce slepým stanovením u nádob obsahu ­
jících pouze inokulované médium. Stupe ň biologického rozkladu se 
vyjadřuje v procentech teoretické maximální produkce anorganického uhlíku 
(ThIC), vztažené k množství zkoušené chemické látky (jako je nap říklad 
organický uhlík) p řidané na za čátku zkoušky.  
9. U zkoušených látek lze stanovit také úbytek DOC a/nebo rozsah primárního 
biologického rozkladu nebo zkoušené chemické látky (20).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE  
10. Pro výpo čet procenta rozkladu musí být znám obsah organického uhlíku (% 
w/w) ve zkoušené chemické látce, a to bu ď na základ ě její chemické struk ­
tury, nebo na základ ě měření. U těkavých zkoušených látek je pro stanovení 
vhodného pom ěru mezi plynnou a kapalnou fází vhodné použít zm ěřenou 
nebo vypo čítanou Henryho konstantu. Informace o toxicit ě zkoušené látky 
pro mikroorganismy jsou užite čné při výběru vhodné zkušební koncentrace 
a při interpretaci výsledk ů, které ukazují na špatnou biologickou rozložitel ­
nost; doporu čuje se zahrnout kontrolu inhibice s výjimkou p řípadů, kdy je 
známo, že zkoušená látka nep ůsobí inhibi čně na mikrobiální aktivity (viz 
odstavec 24).  
VHODNOST ZKUŠEBNÍ METODY  
11. Zkoušku lze použít pro zkoušené chemické látky, které jsou rozpustné ve 
vodě, i pro nerozpustné zkoušené chemické látky, avšak je nezbytné, aby se 
zkoušená chemická látka dob ře rozptýlila. P ři použití doporu čeného pom ěru 
1:2 mezi plynnou a kapalnou fází lze zkoušet t ěkavé chemické látky 
s Henryho konstantou do 50 Pa.m  3 .mol  –1 vzhledem k tomu, že podíl zkou ­ 
šené chemické látky v plynné fázi nep řesáhne 1 % (13). P ři zkoušení 
chemických látek, které jsou mén ě stálé, lze použít menší objem plynné 
fáze, avšak jejich biologická dostupnost m ůže být omezující, zejména 
v případě, že jsou špatn ě rozpustné ve vod ě. Uživatelé však musí zajistit, 
aby poměr mezi plynnou a kapalnou fází a koncentrace zkoušené chemické 
látky byly takové, aby zajiš ťovaly dostate čnou koncentraci kyslíku v plynné 
fázi pro úplný aerobní biologický rozklad (nap ř. je nutné se vyvarovat 
použití vysokých koncentrací substrátu a malého objemu plynné fáze). Pokyny týkající se této problematiky lze nalézt v bodech (13, 23).
 
REFEREN ČNÍ CHEMICKÉ LÁTKY  
12. Za ú čelem kontroly zkušebního postupu by m ěla být sou časně zkoušena 
referenční látka známé biologické rozložitelnosti. Za tímto ú čelem lze použít 
anilin, benzoát sodný nebo ethylenglykol pro zkoušení chemických látek rozpustných ve vod ě a oktan-1-ol pro špatn ě rozpustné zkoušené chemické 
látky (13). Biologický rozklad t ěchto látek musí do 14 dn ů dosáhnout > 
60 % ThIC.
 
REPRODUKOVATELNOST  
13. V mezilaboratorní porovnávací zkoušce této metody dle ISO (17), byly p ři 
dodržení doporu čených podmínek v četně koncentrace zkoušené chemické 
látky 20 mg C/l dosaženy tyto výsledky:  
Zkoušená chemická 
látka Průměrné procento 
biologického 
rozkladu 
(28 d) Variační koeficient 
(%) Počet laborato ří 
Anilin 90 16 17 
Oktan-1-ol 85 12 14  
Mezilaboratorní variabilita (reprodukovatelnost) byla u anilinu nízká, 
přičemž varia ční koeficient tém ěř u všech zkoušek nep řesáhl 5 %. V obou 
případech, kdy byla reprodukovatelnost nižší, byla vyšší variabilita pravd ě­
podobně důsledkem vysoké produkce IC u slepého stanovení. Reproduko ­
vatelnost u oktan-1-olu byla nižší, p řesto však byla u 79 % zkoušek nižší 
než 10 %. Tato v ětší variabilita v rámci zkoušek m ůže být zp ůsobena 
chybami v dávkování vzhledem k tomu, že do pevn ě uzavřených zkušebních 
lahviček je nutno vst říknout malý objem (3–4 μl) oktan-1-olu. Vyšších 
variačních koeficient ů by bylo dosaženo p ři použití nižších koncentrací 
zkoušené chemické látky, a to zejména v koncentracích nižších než 10 
mg C/l. Tomu by bylo možné částečně předejít snížením koncentrace celko ­
vého anorganického uhlíku (TIC) v inokulu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. V mezilaboratorní porovnávací zkoušce EU (24) byly z p ěti povrchov ě 
aktivních látek p řidaných na 10 mg C/l získány tyto výsledky:  
Zkoušená chemická látka Průměrné procento 
biologického 
rozkladu 
(28 d) Variační koefi­
cient 
(%) Počet laborato ří 
Tetrapropylen 
Benzensulfonát 17 45 10 
Di-iso-oktylsulfo- 
sukcinát 
(aniontový) 72 22 9 
Hexadecyl-trime ­
thyl (*) 
Chlorid amonný 
(kationtový) 75 13 10 
Iso-nonylfenol - (etho­
xylát)  9 
(neiontový) 41 32 10 
Kokamidopropyl 
Dimethylhydroxy 
sulfobetain 
(amfoterní) 60 23 11  
(*) Pro neutralizaci toxicity byl p řidán SiO  2 . 
Výsledky ukazují, že obecn ě platí, že variabilita byla vyšší u h ůře rozlože ­
ných povrchov ě aktivních látek. Variabilita v rámci zkoušky byla u více než 
90 % případů nižší než 15 %, p řičemž nejvyšší dosáhla 30–40 %.  
POZNÁMKA: V ětšina povrchov ě aktivních látek nejsou jednotlivé mole ­
kuly, ale jedná se o sm ěsi izomer ů, homology atd., které se 
rozkládají po r ůzných charakteristických lagových fázích 
a podle r ůzných kinetických rychlostních konstant vedou ­
cích k „rozost ření“ zeslabených k řivek, takže 60 % hodnoty 
„vyhověla“ nelze dosáhnout v rámci „10denního období 
rozkladu“, i kdyby každá jednotlivá molekula dosáhla 
hodnoty > 60 % b ěhem 10 dn ů, pokud by byla testována 
samostatn ě. Obdobn ě je tomu p ři použití jiných komplex ­
ních směsí. 
POPIS METODY  
Přístroje a pom ůcky 
15. Obvyklé laboratorní vybavení a dále:  
a) skleněné lahvi čky na sérum, t ěsně uzavřené pryžovým septem 
z butylkau čuku s hliníkovými lemovacími uzáv ěry. Doporu čená velikost 
je „125 ml“, která má celkový objem asi 160 ml (v tomto p řípadě by 
mělo být známo, že objem každé láhve je 160 ± 1 ml). Menší nádobu lze 
použít tehdy, pokud výsledky spl ňují podmínky uvedené v odstavcích 66 
a 67;  
b) analyzátor uhlíku nebo jiný p řístroj (nap říklad plynový chromatograf) ke 
stanovení anorganického uhlíku;  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) stříkačky s vysokou p řesností pro plynné a vodné vzorky;  
d) orbitální t řepačka v termostatovaném prost ředí; 
e) zásoba vzduchu bez CO  2 – lze ji p řipravit prohán ěním vzduchu p řes 
granule natronového vápna nebo použitím plynné sm ěsi 80 % N  2 
a 20 % O  2 (nepovinné) (viz odstavec 28);  
f) zařízení pro filtraci s membránovými filtry porozity 0,20 až 0,45 μm 
(nepovinné);  
g) analyzátor organického uhlíku (nepovinné).  
Činidla  
16. Používají se pouze chemikálie zaru čené analytické jakosti.  
Voda  
17. Měla by se používat destilovaná nebo deionizovaná voda s celkovým 
obsahem organického uhlíku ≤ 1 mg/l. To p ředstavuje ≤ 5 % z po čáteční 
hodnoty organického uhlíku vneseného doporu čenou dávkou zkoušené 
chemické látky.  
Zásobní roztoky pro médium s minerálními solemi  
18. Zásobní roztoky a médium s minerálními solemi jsou obdobné jako 
u zkoušek „snadné biologické rozložitelnosti“ podle ISO 14593 (16) 
a C.4 (20). Použití vyšší koncentrace chloridu amonného (2,0 g/l místo 
0,5 g/l) by m ělo být nutné jen ve velmi výjime čných případech, nap ř. tehdy, 
pokud je koncentrace zkoušené chemické látky > 40 mg C/l. Zásobní roztoky by m ěly být skladovány v chladni čce a zlikvidovány po šesti m ěsí­
cích, nebo d říve, pokud dochází k tvorb ě sraženin nebo r ůstu mikroorga ­
nismů. Připraví se tyto zásobní roztoky:
 
a) Bezvodý dihydrogenfosfore čnan draselný (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
Bezvodý hydrogenfosfore čnan draselný (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
Dihydrát hydrogenfosfore čnanu sodného (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g  
Chlorid amonný(NH  4 Cl) 0,50 g  
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr. pH tohoto roztoku musí být 7,4 (± 
0,2). Pokud tomu tak není, p řipraví se nový roztok.  
b) Dihydrát chloridu vápenatého (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g  
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr.  
c) Heptahydrát síranu ho řečnatého (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g  
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr.  
d) Hexahydrát chloridu železitého (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g  
Rozpustí se ve vod ě a doplní na 1 litr a p řidá se kapka koncentrované 
kyseliny chlorovodíkové.  
Příprava minerálního média  
19. Smísí se 10 ml roztoku a) s p řibližně 800 ml vody (odstavec 17), p řidá se 
po 1 ml roztok ů b), c) a d) a doplní se vodou na 1 litr (odstavec 17).  
Další činidla  
20. Koncentrovaná kyselina orthofosfore čná (H  3 PO 4 ) (> 85 % hmotnosti na 
objem).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Roztok hydroxidu sodného 7M  
21. V litru vody se rozpustí 280 g hydroxidu sodného (NaOH) (odstavec 17). 
Stanoví se koncentrace DIC tohoto roztoku a tato hodnota se bere v úvahu při výpočtu výsledku zkoušky (viz odstavce 55 a 61), zejména ve sv ětle 
kritéria validity v odstavci 66 b). Pokud je koncentrace DIC p říliš vysoká, 
použije se čerstvě připravený roztok.
 
Zkoušená látka  
22. Připraví se zásobní roztok zkoušené chemické látky dostate čně rozpustné ve 
vodě (odstavec 17) nebo ve zkušebním médiu (odstavec 19) v koncentraci 
optimálně stonásobn ě vyšší, než bude výsledná koncentrace p ři zkoušce; 
může být nutné upravit pH zásobního roztoku. Zásobní roztok se p řidá do 
minerálního média tak, aby kone čná koncentrace organického uhlíku byla 2 
až 40 mg C/l, optimáln ě 20 mg C/l. P ři použití nižších koncentrací m ůže 
dojít k omezení výsledné p řesnosti. Rozpustné i nerozpustné kapalné 
chemické látky mohou být do nádob dávkovány p římo stříkačkami 
s vysokou p řesností. Málo rozpustné a nerozpustné zkoušené chemické 
látky mohou vyžadovat speciální zacházení (25). Lze použít následující postupy:
 
a) přímý přídavek známých odvážených množství;  
b) dispergace ultrazvukem p řed přidáním;  
c) dispergace za p řídavku emulga čních činidel, která bude nezbytná pro 
zjištění, zda mají inhibi ční nebo stimula ční účinky na mikrobiální akti ­
vitu před přidáním;  
d) adsorpce kapalných zkoušených chemických látek nebo roztoku ve 
vhodném t ěkavém rozpoušt ědle, na inertním nosi či nebo prost ředí (např. 
filtr ze sklen ěných vláken) s následným odpa řením rozpoušt ědla, pokud 
bylo použito, a p římé přidání známého množství;  
e) přidání známého množství roztoku zkoušené chemické látky v lehce 
těkavém rozpoušt ědle do prázdné zkušební nádoby a následné odpa ření 
rozpouštědla. 
Prostředky nebo rozpoušt ědla užitá v písmenech c), d) a e) musí být testo ­
vány na p řípadné stimula ční nebo inhibi ční účinky na mikrobiální aktivitu 
(viz odstavec 42 (b)).  
Referenční chemická látka  
23. Připraví se zásobní roztok (rozpustné) referen ční chemické látky ve vod ě 
(odstavec 17) v koncentraci optimáln ě stonásobn ě vyšší než bude výsledná 
koncentrace (20 mg C/l) p ři zkoušce.  
Kontrola inhibice  
24. U zkoušených chemických látek často nedochází k významnému rozkladu 
za podmínek užitých p ři stanovení snadného biologického rozkladu. Jednou 
z možných p říčin je to, že zkoušená látka p ůsobí inhibi čně na inokulum 
v koncentraci užité p ři zkoušce. Do zkoušky m ůže být zahrnuta kontrola 
inhibice s cílem usnadnit (zp ětnou) identifikaci inhibice jako možné p říčiny 
nebo přispívajícího faktoru. Kontrola inhibice m ůže rovněž vyloučit takové 
interference a prokázat, že nulový nebo jen mírný rozklad je d ůsledkem 
výhradně nedostate čné náklonnosti k mikrobiologickému napadení za 
podmínek zkoušky. Pro získání informací o toxicit ě zkoušené chemické 
látky pro (aerobní) mikroorganismy se p řipraví roztok ve zkušebním 
médiu obsahujícím zkoušenou látku a referen ční chemickou látku (bod 
19) obsahující stejnou koncentraci jak zkoušené chemické látky, tak refe ­
renční chemické látky (viz odstavec 22 a 23).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inokulum  
25. Inokulum lze získat z řady zdroj ů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod 
(nechlorovaných), z povrchových vod a p ůd nebo z jejich sm ěsi (20). Akti ­
vita zdroje z hlediska biologického rozkladu se ov ěří referenční látkou. Bez 
ohledu na zdroj by v p řípadě, že se postup má užít jako zkouška na snadnou 
biologickou rozložitelnost, nem ěly použít mikroorganismy, které byly již 
dříve vystaveny p ůsobení zkoušené chemické látky.  
Upozornění: Aktivovaný kal, odpadní voda a splašková voda obsahují 
patogenní organismy a je nutno s nimi zacházet s opatrností.  
26. Na základ ě zkušeností se optimálním objemem inokula rozumí:  
— objem, který vykazuje dostate čnou aktivitu k biologickému rozkladu,  
— objem, který rozkládá referen ční látku v dohodnuté procentuální mí ře 
(viz odstavec 66)  
— objem obsahující 10  2 až 10  5 kolonie tvo řících jednotek v 1 ml kone čné 
směsi, 
— objem, který obvykle poskytuje koncentraci sušiny aktivovaného kalu ve 
výsledné sm ěsi 4 mg/l (koncentrace až do 30 mg/l jsou možné, mohou 
však významn ě ovlivnit produkci CO  2 slepého stanovení (26),  
— objem, který poskytuje koncentraci rozpušt ěného organického uhlíku 
v inokulu menší než 10 % po čáteční koncentrace organického uhlíku 
v přidané zkoušené látce,  
— obecn ě objem 1–10 ml inokula na litr zkoušeného roztoku.  
Aktivovaný kal  
27. Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aera ční nádrže čistírny 
odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní 
vody. Pokud je to nutné, odstraní se hrubé částice filtrací sítem (nap ř. 
s velikostí ok 1 mm  2 ) a kal se udržuje za aerobních podmínek.  
28. Kal se m ůže po odstran ění hrubých částic také usadit nebo odst ředit (např. 
1 100 × g po dobu 10 minut). Kapalná fáze nad usazeninou se odstraní. Kal lze promýt minerálním roztokem. Koncentrovaný kal se suspenduje 
v minerálním médiu na koncentraci 3–5 g suspendovaných tuhých látek 
na litr. Následn ě se kal p řed použitím provzduš ňuje.
 
29. Kal by m ěl být odebrán z dob ře fungující konven ční čistírny. Je-li nutné 
odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem, nebo p ředpokládá-li se, že kal 
obsahuje inhibitory, je t řeba jej promýt. Po d ůkladném promíchání se kal 
nechá usadit nebo se odst ředí, kapalina nad usazeninou se odstraní 
a promytý kal se op ět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento 
postup se opakuje, dokud se kal nepovažuje za prostý p řebytečného 
substrátu nebo inhibitoru.  
30. Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se t ěsně před 
použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny suspendovaných 
tuhých látek.  
31. Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3–5 g suspendovaných 
látek v litru). Kal se 2 minuty rozm ělňuje v mixeru Waring p ři střední 
rychlosti. Rozm ělněný kal se nechá 30 minut (pop řípadě déle) usazovat 
a kapalina se dekantuje pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml/l 
minerálního média.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Aby se ješt ě dále snížila hodnota slepého stanovení CO  2 , může být kal p řed 
použitím aklimatizován provzduš ňováním p řes noc vzduchem bez obsahu 
CO 2 . Jako inokulum se p ři této zkoušce použije koncentrace sušiny aktivo ­
vaného kalu 4 mg/l.  
Inokulum z druhého stupn ě čistírny odpadních vod  
33. Inokulum lze získat rovn ěž z výstupu druhého stupn ě čistírny odpadních 
vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající p řevážně domovní odpadní 
vody. Tento vzorek se udržuje v aerobních podmínkách a používá se v den odb ěru nebo podle pot řeby po aklimatizaci. Z odtoku se odstraní 
větší částice filtrací p řes hrubý filtr a zm ěří se hodnota pH.
 
34. Filtrát se za ú čelem snížení obsahu IC provzduš ňuje vzduchem bez CO  2 
(odstavec 15-e) po dobu 1 h, p řičemž se hodnota pH udržuje na 6,5 kyse ­
linou fosfore čnou (odstavec 20). Potom se hodnota pH upraví na p ůvodní 
hodnotu hydroxidem sodným (odstavec 21) a nakonec se vzorek ponechá v klidu po dobu 1 h a vhodný objem kapalné fáze se použije pro inokulaci. Tento postup snižuje obsah IC inokula. Jestliže se nap říklad použije jako 
inokulum maximáln ě 100 ml filtrovaného provzdušn ěného odtoku na 1 litr, 
mělo by se p ři slepém stanovení množství vznikajícího IC pohybovat 
v rozmezí od 0,4 do 1,3 mg/l (14), což p ředstavuje 2–6,5 % zkoušené 
chemické látky C p ři 20 mg C/l a 4–13 % p ři 10 mg C/l.
 
Povrchové vody  
35. Odebere se vzorek vhodné povrchové vody. Vzorek se uchovává za aero ­
bních podmínek a použije se v den odb ěru. Podle pot řeby se vzorek koncen ­
truje filtrací nebo odst ředěním. Objem inokula, které má být použito 
v jednotlivých zkušebních nádobách, by m ěl splňovat kritéria uvedená 
v odstavci 26.  
Půdy 
36. Odebere se vzorek vhodné p ůdy do maximální hloubky 20 cm pod 
povrchem. Ze vzorku p ůdy se nejprve odstraní kameny, zbytky rostlin 
a bezobratlých a p ůda se následn ě proseje p řes síto o velikosti oka 2 mm 
(v případě, že vzorek je p říliš mokrý na to, aby ho bylo možné prosít 
okamžitě, částečně se usuší na vzduchu pro usnadn ění prosévání). Vzorek 
se uchová v aerobních podmínkách a musí být použit v týž den, kdy byl 
odebrán. (Je-li vzorek p řepravován ve voln ě uzavřeném černém polyethyle ­
novém sá čku, lze jej v tomto sá čku skladovat p ři 2 až 4 °C po dobu až 
jednoho m ěsíce.)  
Aklimatizace inokula  
37. Inokulum lze aklimatizovat pro experimentální podmínky, ale nikoli p řed­
běžně adaptovat na zkoušenou chemickou látku. Aklimatizace m ůže snížit 
uvolňování CO  2 ve slepých pokusech. Aklimatizace spo čívá v aeraci akti ­
vovaného kalu po jeho rozpušt ění ve zkušebním médiu na 30 mg/l vlhkým 
vzduchem bez obsahu CO  2 po dobu 5 až 7 dn ů při zkušební teplot ě. 
POSTUP ZKOUŠKY  
Počet lahviček 
38. Počet potřebných zkušebních lahvi ček (odstavec 15-a) závisí na četnosti 
analýz a na trvání testu.  
39. Doporu čuje se provést analýzu lahvi ček třikrát po uplynutí dostate čného 
počtu časových interval ů tak, aby bylo možno identifikovat desetidenní 
období rozkladu. Na konci zkoušky se rovn ěž analyzuje nejmén ě pět 
zkušebních lahvi ček (odstavec 15 písm. a)) ze sady a), b) a c) (viz odstavec 
42) s cílem umožnit výpo čet 95 % interval ů spolehlivosti pro pr ůměrnou 
hodnotu biologického rozkladu v procentech.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Inokulované médium  
40. Inokulum se používá v koncentraci sušiny v aktivovaném kalu 4 mg/l. 
Dostatečně inokulované médium se p řipraví bezprost ředně před použitím 
například přidáním 2 ml vhodn ě upraveného aktivovaného kalu (odstavce 
27 až 32) na 2 000 mg/l na 1 litr média s minerálními solemi (odstavec 19). 
Při použití výstupu z druhého stupn ě čistírny odpadních vod se p řidá až 100 
ml odtoku (odstavec 33) do 900 ml média s minerálními solemi (odstavec 19) a zředí se médiem na 1 litr.
 
Příprava lahvi ček 
41. Alikvotní díly inokulovaného média se rozd ělí do duplikátních lahvi ček tak, 
aby se pom ěr mezi plynnou a kapalnou fází rovnal 1:2 (p řidá se nap ř. 107 
ml do lahvi ček o kapacit ě 160 ml). Lze použít i jiné pom ěry, ale je nutno 
dbát upozorn ění uvedeného v odstavci 11. P ři použití jednoho i druhého 
typu inokula je nutno zajistit, aby bylo inokulované médium odpovídajícím 
způsobem promícháno s cílem zajistit jeho rovnom ěrné rozdělení do zkušeb ­
ních lahvi ček. 
42. Připraví se sady lahvi ček (odstavec 15a), které budou obsahovat:  
a) zkušební nádoby (ozna čené F  T ), obsahující zkoušenou chemickou látku;  
b) nádoby pro slepé stanovení (ozna čené F  B ) obsahující jen zkušební 
médium a inokulum; je nutné p řidat rovn ěž veškeré chemické látky, 
rozpouštědla, činidla nebo filtry ze skelných vláken užívané k zavedení 
zkoušené chemické látky do zkušebních nádob;  
c) nádoby pro kontrolu postupu (ozna čené F  C ), obsahující referen ční 
chemickou látku;  
d) podle pot řeby nádoby pro kontrolu možného inhibi čního vlivu zkoušené 
chemické látky (ozna čené F  I ) obsahující zkoušenou chemickou látku 
a referenční chemickou látku ve stejné koncentraci (odstavec 24) jako 
v lahvích F  T (zkoušená látka) a F  C , (referen ční látka);  
e) nádoby pro kontrolu p řípadného biotického rozkladu (ozna čeného F  S ), 
jako v bod ě a) plus 50 mg/l HgCl  2 , nebo sterilizované jiným zp ůsobem 
(např. v autoklávu).  
43. Ve vod ě rozpustné zkoušené chemické látky a referen ční chemické látky se 
přidají jako vodné zásobní roztoky (odstavce 22, 23 a 24) tak, aby výsledná 
koncentrace byla 10 až 20 mg C/l.  
44. Nerozpustné zkoušené chemické látky a nerozpustné referen ční chemické 
látky se p řidávají do lahvi ček celou řadou různých zp ůsobů (viz odstavec 
22a-e) v závislosti na povaze zkoušené látky, a to bu ď před přidáním 
inokulovaného média, nebo po n ěm v závislosti na metod ě expozice zkou ­ 
šené chemické látky. Pokud se užije n ěkterý z postup ů uvedených 
v odstavci 22a-e, bude se slepými lahvi čkami F  B (odstavec 42b) zacházeno 
podobným zp ůsobem, avšak bez p řidání zkoušené chemické látky nebo 
referenční chemické látky.  
45. Těkavé zkoušené chemické látky je t řeba vstříknout do uzav řených lahvi ček 
(bod 47) s použitím injek ční mikrost říkačky. Dávka se vypo čítá ze vst řík­
nutého objemu a z hustoty zkoušené chemické látky.  
46. Potom se v p řípadě potřeby do nádob p řidá voda tak, aby objem kapaliny 
byl ve všech nádobách stejný. Pom ěr mezi plynnou a kapalnou fází 
(obvykle 1:2) a koncentrace zkoušené látky musí zajistit dostate čnou 
koncentraci kyslíku v plynné fázi pro úplný biologický rozklad.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Všechny lahve se poté t ěsně uzavřou, například pryžovými septy 
z butylkau čuku a hliníkovými lemovacími uzáv ěry. V této fázi jsou p řidány 
těkavé zkoušené chemické látky (bod 45). Pokud má být sledován pokles 
koncentrace DOC ve zkušebním roztoku a provedeny analýzy po čáteční 
koncentrace IC v čase nula (sterilní kontroly, bod 42e) nebo jiné determi ­
nanty, příslušný vzorek se odstraní ze zkušební nádoby. Zkušební nádoba 
a její obsah jsou pak vy řazeny.  
48. Těsně uzavřené lahvi čky se umístí na orbitální t řepačku (odstavec 15d) p ři 
rychlosti zajiš ťující dostate čné promíchání obsahu zkušebních nádob a v 
suspenzi (nap ř. 150 až 200 otá ček za minutu), a jsou inkubovány 
v temnu p ři teplotě 20 °C ± 1 °C.  
Odběr vzorků 
49. Vzorec odb ěru vzorků závisí na trvání lagové fáze a na kinetické rychlosti 
biologického rozkladu zkoušené chemické látky. Vybrané nádoby se analy ­
zují v den vzorkování, ale nejmén ě jednou za týden nebo častěji (např. 
dvakrát týdn ě), jestliže se požaduje celková k řivka biologické rozložitel ­
nosti. Z t řepačky se odstraní pot řebný počet opakovaných vzork ů odpoví­
dajících F  T , F B a F C a pokud byly nasazeny také F  I a F S (viz odstavec 42). 
Zkouška musí obvykle probíhat 28 dní. Zkouška m ůže být ukon čena před 
uplynutím 28 dní, jestliže z k řivky biologické rozložitelnosti vyplývá, že 
prodlevy bylo dosaženo již d říve. Odeberou se vzorky pro analýzu z p ěti 
lahví rezervovaných pro 28. den zkoušky a výsledky se použijí k výpo čtu 
mezí spolehlivosti nebo varia čního koeficientu procenta biologického 
rozkladu. Z lahvi ček představujících kontrolní vzorky pro inhibici 
a abiotický rozklad nemusí být vzorky odebírány tak často jako 
z ostatních lahvi ček; postačí odběr v 1. den a v 28. den.  
Analýza anorganického uhlíku (IC)  
50. Produkce CO  2 v lahvičkách se stanoví m ěřením zvýšení koncentrace 
anorganického uhlíku (IC) v pr ůběhu inkubace. Existují dv ě doporučené 
metody stanovení množství IC vznikajícího b ěhem zkoušky, které jsou 
popsány bezprost ředně níže. Tyto metody mohou poskytovat pon ěkud 
odlišné výsledky, a proto by b ěhem zkoušky m ěla být používána jen 
jedna z nich.  
51. Metoda a) se doporu čuje v případě, že médium pravd ěpodobně obsahuje 
zbytky nap říklad sklen ěného filtra čního papíru a/nebo nerozpustné zkoušené 
chemické látky. Pokud není k dispozici analyzátor uhlíku, lze tuto analýzu 
provést pomocí plynového chromatografu. Je d ůležité, aby láhve m ěly při 
analýze plynu v plynné fázi zkušební teplotu nebo se jí alespo ň blížily. 
Metoda b) m ůže být jednodušší pro laborato ře, které užívají pro m ěření 
IC analyzátory uhlíku. Je d ůležité, aby roztok hydroxidu sodného (odstavec 
21), který slouží k p řeměně CO  2 na uhličitan, byl bu ď čerstvě připravený, 
nebo byl znám jeho obsah IC, aby jej bylo možno zohlednit p ři výpočtu 
výsledků zkoušek (viz odstavec 66-b).  
Metoda a): okyselení na hodnotu pH < 3  
52. Před analýzou každé šarže se analyzátor uhlíku kalibruje vhodným IC stan ­
dardem (nap ř. dusíkem s hmotnostním podílem CO  2 1 %). Septem se 
vstříkne do každé zkušební nádoby koncentrovaná kyselina fosfore čná 
(odstavec 20), aby se hodnota pH média snížila na < 3 (p řidá se nap říklad 
1 ml kyseliny na každých 107 ml zkušebního média). Potom se nádoby znovu umístí na t řepačku. Po 1 h t řepání při zkušební teplot ě se nádoby 
sejmou z t řepačky a z každé zkušební nádoby se odebere alikvotní podíl 
(např. 1 ml) plynné fáze a vst říkne se do analyzátoru uhlíku. Zaznamenají se 
naměřené koncentrace IC (v mg C na litr plynu).
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Podstata této metody spo čívá v tom, že po okyselení na pH < 3 a po 
dosažení rovnováhy p ři 20 °C je rovnovážná konstanta pro distribuci CO  2 
mezi kapalnou a plynnou fází ve zkušebních nádobách rovna 1,0, pokud je 
měřena jako koncentrace (13). To by m ělo být nejmén ě jednou ov ěřeno pro 
zkušební systém následujícím zp ůsobem:  
Připraví se zkušební nádoby obsahující roztok bezvodého uhli čitanu 
sodného (Na  2 CO 3 ) ve vodě prosté CO  2 o koncentracích odpovídajících 5 
a 10 mg IC na litr, p řičemž voda prostá CO  2 se připraví okyselením vody na 
pH 6,5 koncentrovanou kyselinou orthofosfore čnou (odstavec 20), kterou se 
přes noc prohání vzduch prostý CO  2 a nakonec se pH sníží p řidáním zásady 
na neutrální hodnotu. Zajistí se, aby pom ěr mezi plynnou a kapalnou fází 
byl stejný jako p ři vlastní zkoušce (nap ř. 1:2). Obsah v nádobách se okyselí 
a po dosažení rovnováhy, jak je uvedeno v odstavci 52, se stanoví koncent ­
race IC v plynné i kapalné fázi. Ov ěří se, zda v rámci experimentální chyby 
jsou obě koncentrace stejné. V p řípadě, že tomu tak není, experimentátor by 
měl uvedené postupy p řehodnotit. Tuto kontrolu distribuce IC mezi plynnou 
a kapalnou fází není nutné provád ět vždy při provedení testu; lze ji provád ět 
nejspíše p ři provádění kalibrace.  
54. Jestliže má být stanoven úbytek DOC (platí pouze pro vodou rozpustné 
zkoušené chemické látky), odeberou se vzorky kapalné fáze ze samostatných (neokyselených) nádob, filtrují se membránovým filtrem a vst říknou do 
DOC analyzátoru. Tyto nádoby lze podle pot řeby užít pro další analýzy 
s cílem stanovit primární biologický rozklad.
 
Metoda b): p řeměna CO  2 na uhličitany  
55. Před analýzou každé šarže se analyzátor IC kalibruje na vhodný standard – 
například roztokem hydrogenuhli čitanu sodného (NaHCO  3) ve vodě prosté 
CO 2 (viz odstavec 53) v koncentra čním rozsahu IC od 0 mg/l do 20 mg/l. 
Septem se do každé zkušební lahvi čky vstříkne 1 ml roztoku hydroxidu 
sodného (7M, odstavec 21) (nap ř. 1 ml do 107 ml média) a nádobami se 
třepe při zkušební teplot ě po dobu 1 h. Tentýž roztok NaOH se použije pro 
všechny lahvi čky užité v daném dni, avšak není nutno jej užívat p ři každém 
odběru vzorků v průběhu zkoušky. Jestliže jsou p ři všech odb ěrech vzork ů 
požadovány absolutní slepé hodnoty IC, bude stanovení IC v roztoku NaOH 
požadováno p ři každém jeho použití. Nádoby se sejmou z t řepačky a nechají 
se odsadit. Z každé nádoby se st říkačkou odebere vhodný objem kapalné 
fáze (nap ř. od 50 μl do 1 000 μl). Vzorky se vst říknou do analyzátoru IC 
a zaznamenají se koncentrace IC. Je t řeba zajistit, aby užívaný analyzátor 
byl řádně vybaven ke zpracování zásaditých vzork ů vytvořených v rámci 
této metody.  
56. Podstata této metody spo čívá v tom, že po p řídavku zásady a t řepání je 
koncentrace IC v plynné fázi zanedbatelná. To by m ělo být ov ěřeno pro 
zkušební systém nejmén ě jednou s použitím standard ů IC, přidáním zásady 
a ustálením a zm ěřením koncentrace IC v plynné i kapalné fázi (viz 
odstavec 53). Koncentrace v plynné fázi by se m ěla blížit nule. Tuto 
kontrolu na tém ěř kompletní absorpci CO  2 není nutno provád ět při každé 
zkoušce.  
57. Jestliže má být stanoven úbytek DOC (platí pouze pro vodou rozpustné 
zkoušené chemické látky), odeberou se vzorky kapalné fáze ze samostatných nádob (které neobsahují p řidanou zásadu), filtrují se membránovým filtrem 
a vstříknou do DOC analyzátoru. Tyto nádoby lze podle pot řeby užít pro 
další analýzy s cílem stanovit primární biologickou rozložitelnost.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Výpočet výsledk ů 
58. Za p ředpokladu 100 % mineralizace zkoušené chemické látky na CO  2 se 
teoretická produkce anorganického uhlíku (ThIC), která je v ětší než 
produkovaná slepým stanovením, rovná množství celkového organického uhlíku (TOC) p řidaného do každé zkušební nádoby na za čátku zkoušky, 
takže:
 
ThIC ¼ TOC : 
Celkový objem anorganického uhlíku (TIC) v každé zkušební nádob ě je: 
TIC ¼ ðmg C v kapalné fázi  þ mg C v plynné fázi Þ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ rovnice [1]  
kde: 
V L = objem kapaliny v láhvi (v litrech),  
CL = koncentrace IC v kapalné fázi (v mg uhlíku na 1 litr kapalné fáze),  
VH = objem plynné fáze (v litrech),  
CL = koncentrace IC v plynné fázi (v mg uhlíku na 1 litr plynné fáze).  
Výpočet TIC pro tyto dv ě analytické metody užívané ke stanovení IC p ři 
této zkoušce je popsán níže v odstavcích 60 a 61. Procento biologického rozkladu ( % D ) se pro každý p řípad vypo čte podle: 
%D ¼
 ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Rovnice [2]  
kde: 
TIC  t = TIC ve zkušební nádob ě v čase t v miligramech,  
TIC  b = průměrná hodnota TIC v nádobách pro slepé stanovení v čase t v 
miligramech,  
TOC = TOC p ůvodně přidaný do zkušební nádoby v miligramech.  
Procento biologického rozkladu % D se vypo čte ve zkušebních nádobách 
(F T ), referen čních nádobách (F  C ) a nádobách pro kontrolu inhibice 
z příslušného množství TIC produkovaného p ři každé dob ě odběru vzorku 
(pokud byly za řazeny).  
59. Jestliže došlo b ěhem zkušební doby k významnému vzr ůstu TIC sterilních 
kontrol (F  S ), pak lze dosp ět k závěru, že došlo k abiotickému rozkladu 
zkoušené chemické látky a tuto skute čnost je třeba zohlednit ve výpo čtu 
D v rovnici [2].  
Okyselení na hodnotu pH < 3  
60. Vzhledem k tomu, že okyselení na hodnotu pH < 3 a ustálení má za 
následek dosažení rovnováhy mezi koncentrací TIC v kapalné a plynné fázi, stačí měřit jen koncentraci IC v plynné fázi. Proto je v rovnici [1]
 
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , kde V  B = je objem lahve se sérovým 
uzávěrem. 
Přeměna CO  2 na uhličitany  
61. Při této metod ě se výpočty provád ějí, jak je popsáno v rovnici [1], avšak 
zanedbatelný obsah IC v plynné fázi se nebere v úvahu, to znamená, že  
V H Ü C H ¼ 0, a TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Vyjadřování výsledk ů 
62. Křivka biologického rozkladu se získá vynesením závislosti procenta 
biologického rozkladu D na čase inkubace, a pokud možno se vyzna čí 
také lagová fáze, doba biologického rozkladu, 10denní období rozkladu 
a prodleva, tj. fáze, v níž bylo dosaženo maximálního rozkladu a v níž se 
vyrovnala k řivka biologického rozkladu. Jestliže se pro dv ě souběžná stano ­
vení ve zkušebních nádobách F  T (rozdíl menší než 20 %) získají srovnatelné 
výsledky, vynesou se do graf ů průměrné hodnoty (viz dodatek 2, obr. 1); 
v opačném případě se vynesou k řivky pro každou nádobu zvláš ť. Zjistí se 
průměrná hodnota biologického rozkladu v procentech v prodlev ě nebo se 
odhadne nejvyšší hodnota (nap říklad když k řivka v prodlev ě klesá), ale je 
důležité stanovit, že v tomto druhém p řípadě se nejedná o odlehlou hodnotu. 
Tento maximální stupe ň biologického rozkladu se v protokolu o zkoušce 
uvede jako „stupe ň biologického rozkladu zkoušené chemické látky“. Jest ­
liže počet zkušebních nádob nebyl dostate čný pro odhad prodlevy, použijí 
se údaje zm ěřené poslední den zkoušky a vypo čte se průměrná hodnota. 
Tato poslední hodnota, pr ůměr pěti opakovaných zkoušek, slouží jako indi ­
kátor přesnosti, s nímž bylo stanoveno procento biologického rozkladu. 
Uvede se rovn ěž hodnota získaná na konci 10denního období rozkladu.  
63. Stejným zp ůsobem se vynese k řivka biologického rozkladu pro referen ční 
látku F  C , a pokud byla provedena, i pro závislost abiotické eliminace F  S 
a kontroly inhibice F  I . 
64. Zaznamená se produkce TIC p ři slepém stanovení (F  B ) a v nádobách pro 
kontrolu abiotické eliminace (F  S ), pokud byly tyto nádoby za řazeny do 
zkoušky.  
65. Vypo čte se D pro nádoby F  I na základ ě teoretické produkce IC p ředpoklá­
dané pouze na základ ě referenční složky sm ěsi. Jestliže je 28. den [(D  FC ( 1 ) 
– D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, lze p ředpokládat, se zkoušená chemická látka 
působí inhibi čně na aktivitu inokula, a to m ůže být d ůsledkem nízkých 
hodnot D  FT získaných za podmínek zkoušky. V tomto p řípadě by mohla 
být zkouška opakována s nižší zkušební koncentrací, a pokud možno se 
snížením DIC v inokulu a TIC vytvo řeného ve slepých kontrolních nádo ­
bách vzhledem k tomu, že nižší koncentrace jinak sníží p řesnost této 
metody. V úvahu p řichází i použití jiného inokula. Jestliže v nádob ě F S 
(abiotické) byl pozorován významný nár ůst (> 10 %) množství TIC, 
mohou přicházet v úvahu procesy abiotického rozkladu.  
Platnost výsledk ů 
66. Zkouška se považuje za platnou, jestliže:  
a) průměrné procento rozkladu v nádobách F  C s referenční látkou je po 14 
dnech inkubace > 60 % a  
b) průměrná produkce TIC p ři slepých stanoveních F  B na konci zkoušky je 
> 3 mg C/l.  
Pokud není t ěchto limit ů dosaženo, m ěla by se zkouška opakovat 
s inokulem z jiného zdroje, p řípadně by měl být přezkoumán užitý postup. 
Pokud je nap říklad problémem vysoká produkce IC p ři slepých stanoveních, 
je nutno opakovat postup uvedený v odstavcích 27 až 32.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Procento rozkladu v nádobách F  C obsahujících referen ční látku. 
( 2 ) Procento rozkladu v nádobách F  I.
 67. Pokud zkoušená látka nedosáhne 60 % ThIC a bylo prokázáno, že není 
inhibující (odstavec 65), lze zkoušku opakovat s vyšší koncentrací inokula 
(až 30 mg/l aktivovaného kalu a 100 ml odtoku/l) nebo s inokuly z jiných zdrojů, zejména tehdy, pokud byl rozklad v rozmezí 20 až 60 %.
 
Interpretace výsledk ů 
68. Biologický rozklad > 60 % ThIC v rámci 10denního období rozkladu v této 
zkoušce prokazuje, že zkoušená chemická látka je snadno biologicky rozlo ­ 
žitelná v aerobních podmínkách.  
69. Pokud není dosaženo vyhovující hodnoty 60 % ThIC, ur čí se hodnota pH 
v médiích v lahvi čkách, které nebyly upraveny kyselinou ani zásadou; 
hodnota menší než 6,5 by mohla znamenat, že došlo k nitrifikaci. 
V takovém p řípadě se zkouška opakuje s roztokem pufru o vyšší koncen ­
traci.  
Protokol o zkoušce  
70. Sestaví se tabulka % D pro každou zkušební nádobu (F  T ), referenční nádobu 
(F C ) a nádobu pro kontrolu inhibice (F  I ), pokud byly za řazeny do vzorku, 
pro každý den odb ěru vzorku. Pokud jsou získány srovnatelné výsledky pro 
duplikátní vzorky, vynese se k řivka průměrných hodnot % D v reálném 
čase. Zaznamená se množství TIC ve slepých (F  B ) a sterilních kontrolách 
(F S ) DOC a/nebo jiné determinanty a jejich procento úbytku.  
71. Určí se průměrná hodnota procenta D ve fázi prodlevy, nebo se použije 
nejvyšší hodnota, pokud k řivka biologického rozkladu ve fázi prodlevy 
klesá, a tato skute čnost se uvede jako „stupe ň biologického rozkladu zkou ­ 
šené chemické látky“. Je d ůležité zajistit, aby v tomto druhém p řípadě 
nejvyšší hodnota nebyla hodnotou odlehlou.  
72. Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:  
Zkoušená chemická látka:  
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec a relevantní 
fyzikálně-chemické vlastnosti,  
— čistota zkoušené látky (obsah ne čistot).  
Zkušební podmínky:  
— odkaz na tuto zkušební metodu,  
— popis užitého zkušebního systému (nap ř. objem nádoby, pom ěr mezi 
plynnou a kapalnou fází, metoda míchání atd.),  
— aplikace zkoušené chemické látky a referen ční chemické látky do 
zkušebního systému: užitá zkušební koncentrace a množství uhlíku 
dávkovaného do jednotlivých zkušebních nádob; jakékoli užití rozpouš ­
tědla, 
— podrobnosti o použitém inokulu, jakákoli adaptace a aklimatizace,  
— teplota inkubace,  
— validace principu analýzy IC,  
— hlavní charakteristika použitého analyzátoru IC (a jakýchkoli dalších 
použitých analytických metod),  
— počet duplikátních vzork ů. 
Výsledky:  
— nezpracovaná data a vypo čtené hodnoty biologického rozkladu 
v tabelární form ě, ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— graf závislosti procenta rozkladu na čase u zkoušených a referen čních 
chemických látek, lagová fáze, fáze rozkladu, 10denní období rozkladu 
a směrnice,  
— procento úbytku ve fázi prodlevy, na konci zkoušky a po uplynutí 
10denního období rozkladu,  
— odůvodnění případného odmítnutí výsledk ů zkoušky,  
— jakékoli další skute čnosti, které jsou d ůležité pro užitý postup,  
— diskuse o výsledcích.  
LITERATURA:  
1) Kapitola C.4 této p řílohy – Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti – 
Zkouška na uvol ňování CO  2 (metoda C.4-C).  
2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 
159–167.  
3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.  
4) Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide reco ­
very in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210.
 
5) ISO 9439 (1990; p řepracována v roce 1999). Jakost vod – Hodnocení úplné 
biologické rozložitelnosti organických látek ve vodném prost ředí – Metoda 
stanovení uvoln ěného oxidu uhli čitého (Sturm).  
6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substances Washington, DC.  
7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.  
9) Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812.
 
10) Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing 
biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.  
11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.  
12) Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measu ­
ring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
 
13) Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204–211.
 
14) Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507–524.  
15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, 
and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegrada ­
tion. Chemosphere 19: 1527–1550.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
16) ISO 14593, (1999) Jakost vod – Hodnocení úplné aerobní biologické rozlo ­ 
žitelnosti organických látek ve vodním prost ředí – Metoda stanovení 
anorganického uhlíku v t ěsně uzavřených lahvi čkách (C0  2 headspace meto ­
da). 
17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, Chemo ­
sphere 34: 1813–1822.  
18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835,3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance, Washington, DC.  
19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An „inherent“ biodegradability test for oil products: 
description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 
3219–3235.  
20) Kapitola C.4 této p řílohy – Stanovení „snadné“ biologické rozložitelnosti.  
21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegra ­
dability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. 
Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.  
22) Kapitola C.11 této p řílohy – Zkouška na inhibici dýchání aktivovaného 
kalu.  
23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319–327.
 
24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
 
25) ISO 10634 (1996) Jakost vod – Pokyny pro p řípravu a zpracování ve vod ě 
těžko rozpustných organických látek pro následující hodnocení jejich 
biologické rozložitelnosti ve vodním prost ředí. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Dodatek 1  
ZKRATKY A DEFINICE  
IC: Anorganický uhlík ( Inorganic carbon ). 
TCO  2 : Teoretický oxid uhli čitý (theoretical carbon dioxide, ThCO  2 ) (mg) je 
množství oxidu uhli čitého, které by m ělo vzniknout ze známého nebo zm ěřeného 
obsahu uhlíku ve zkoušené chemické látce za p ředpokladu její úplné minerali ­
zace; vyjad řuje se rovn ěž v mg oxidu uhli čitého uvoln ěného z 1 mg zkoušené 
látky.  
DOC:  Rozpuštěný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový orga ­
nický uhlík, který je p řítomný v roztoku nebo projde p řes filtr o velikosti pór ů 
0,45 μm nebo z ůstane v supernatantu po odst řeďování po dobu 15 minut p ři 
odstředivém zrychlení 40 000 m/s  –2 (což odpovídá odst ředivé síle p řibližně 
4 000 g)  
DIC:  Rozpuštěný anorganický uhlík.  
ThIC:  Teoretická produkce anorganického uhlíku.  
TIC:  Celkový anorganický uhlík.  
Snadno biologicky rozložitelná:  je dohodnutá klasifikace chemických látek, 
které prošly ur čitými screeningovými zkouškami úplné biologické rozložitelnosti; 
tyto zkoušky jsou tak p řísné, že lze p ředpokládat, že se látky budou ve vodném 
prostředí za aerobních podmínek rychle a úpln ě biologicky rozkládat.  
10denní období rozkladu:  je 10 dn ů, které následují bezprost ředně po dosažení 
10 % biologického rozkladu.  
Biologická rozložitelnost:  je klasifikace chemických látek, pro n ěž existuje 
nepochybný d ůkaz o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo kone čné) 
v kterékoli uznávané zkoušce biologické rozložitelnosti.  
Úplný aerobní biologický rozklad:  je stupeň rozkladu zkoušené látky dosažený 
po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhli či­
tého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální bun ěčné hmoty (biomasy).  
Mineralizace:  Mineralizace je úplný rozklad organické látky na CO  2 a H  2 O za 
aerobních podmínek a na CH  4 , CO  2 a H  2 O za anaerobních podmínek.  
Lagová fáze:  Čas od začátku zkoušky až do doby dosažení aklimatizace a/nebo 
adaptace rozkládajících se mikroorganism ů a vzrůstu stupn ě biologického 
rozkladu zkoušené chemické látky nebo organické chemické látky na detekova ­
telnou úrove ň (např. 10 % maxima teoretického biologického rozkladu nebo nižší 
v závislosti na p řesnosti techniky m ěření). 
Doba rozkladu:  Doba od konce lagové fáze až do doby, kdy bylo dosaženo 
90 % maximálního stupn ě biologického rozkladu.  
Prodleva (plato):  Prodleva je fáze, kdy bylo dosaženo maximálního rozkladu 
a křivka biologického rozkladu se ustálila.  
Zkoušená chemická látka:  Jakákoliv látka nebo sm ěs testovaná pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Dodatek 2  
Příklad křivky biologického rozkladu  
Obrázek 1  
Biologický rozklad oktan-1-olu CO  2 headspace metodou
  
Slovníček 
Biologický rozklad:  
Fáze rozkladu:  
Maximální stupe ň biologického rozkladu:  
Fáze prodlevy (plato):  
10denní období rozkladu:  
Čas průběhu zkoušky (dny):  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C. 30  BIOAKUMULACE U TERESTRICKÝCH MÁLOŠT ĚTINATC Ů 
ÚVOD  
1. Tato zkušební metoda odpovídá pokynu OECD pro zkoušení (TG) 317 
(2010). Ze zkušebních metod týkajících se rozpadu v životním prost ředí 
byly v roce 1996 publikovány Bioakumulace: Pr ůtoková zkouška na rybách 
(kapitola C.13 této p řílohy (49)) a v roce 2008 Bioakumulace u bentických 
máloštětinatců žijících v sedimentu (53). Extrapolovat údaje o bioakumulaci 
ve vodním prost ředí na suchozemské organismy, jako jsou žížaly, je obtížné 
až nemožné. Pro stanovení bioakumulace chemických látek v p ůdě se 
v současné době užívají modelové výpo čty založené na lipofilit ě zkoušené 
chemické látky, nap ř. (14, 37), jako nap ř. v technických pokynech EU (19). 
Potřeba zkušební metody specifické pro ur čité prostředí již byla vy řešena, 
např. (55). Tato metoda je zvlášt ě důležitá pro posouzení druhotné otravy 
v terestrických potravních řetězcích (4). N ěkolik vnitrostátních zkušebních 
metod řeší problém bioakumulace u jiných organism ů než u ryb, nap ř. (2) 
a (72). Jednu z metod m ěření bioakumulace z kontaminovaných p ůd 
v žížalách (Eisenia fetida, Savigny) a kroužkovcích vyvinula Americká 
společnost pro zkoušení a materiály (3). Mezinárodn ě uznávaná metoda 
pro stanovení bioakumulace v obohacené p ůdě zlepší posuzování rizik, 
která představují chemické látky pro terestrické ekosystémy, nap ř. (25, 29).  
2. Půdu přijímající bezobratlí jsou exponováni chemickým látkám vázaným 
v půdě. Mezi tyto živo čichy patří terestričtí málošt ětinatci, kte ří hrají 
významnou úlohu ve struktu ře a funkci p ůdy (15), (20). Teresti čtí máloště­
tinatci žijí v p ůdě a částečně na jejím povrchu (zejména ve vrstv ě L) a často 
reprezentují nejpo četnější druh, pokud jde o biomasu (54). Jelikož tito živo ­ 
čichové ví ří půdu a slouží jako potrava, mohou mít silný vliv na biologickou 
dostupnost látek pro jiné organismy, jako jsou bezobratlí (nap ř. draví rozto či 
a brouci, nap ř. (64)) nebo dravci (nap ř. lišky a racci) z řad obratlovc ů (18, 
62). Některé druhy terestrických málošt ětinatců, kteří jsou v sou časné době 
využíváni pro ekotoxikologické zkoušky, jsou popsány v dodatku 5.  
3. Řadu podstatných a užite čných údaj ů pro provedení této zkušební metody 
bioakumulace v p ůdě poskytuje dokument „ASTM Standard Guide for 
Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid Potworm Enchy ­
traeus albidus“ 3). Dalšími dokumenty, na které tato zkušební metoda odka ­
zuje, je kapitola C.13 této p řílohy Bioakumulace: Pr ůtoková zkouška na 
rybách (49) a OECD TG 315: Bioakumulace u bentických málošt ětinatců 
žijících v sedimentu (53). Významným zdrojem informací pro tuto zkušební 
metodu jsou rovn ěž praktické zkušenosti se studiemi bioakumulace v p ůdě 
a publikovaná literatura, nap ř. (1, 5, 11, 12, 28, 40, 43, 45, 57, 59, 76, 78, 
79).
 
4. Tato metoda je vhodná zejména pro testování stabilních, neutrálních orga ­
nických chemických látek, které mají tendenci k adsorpci na p ůdu. Touto 
zkušební metodou lze rovn ěž testovat bioakumulaci s p ůdou spjatých stabil ­
ních organokovových slou čenin. Lze ji použít i pro kovy a jiné stopové 
prvky.  
PŘEDPOKLADY  
5. Zkoušky pro m ěření bioakumulace chemické látky v pozemních málošt ěti­
natcích byly provedeny s t ěžkými kovy (viz nap ř. (63)) a persistentními 
organickými chemickými látkami, jejichž hodnoty log K  ow se pohybují 
mezi 3,0 a 6,0 nap ř. (40). Tyto zkoušky lze použít také pro:  
— chemické látky, které mají log K  ow vyšší než 6,0 (superhydrofobní 
chemické látky),  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— chemické látky, které pat ří do kategorie organických látek, o nichž je 
známo, že mají potenciál bioakumulace v živých organismech, nap ř. 
povrchov ě aktivní nebo vysoce adsorp ční chemické látky,  
— chemické látky, které vykazují potenciál pro bioakumulaci na základ ě 
strukturálních prvk ů, např. analogy chemické látky se známým bioaku ­
mulačním potenciálem, a  
— kovy.  
6. Informace o zkoušené chemické látce, jako je obecný název, chemický 
název, (optimáln ě název podle IUPAC), strukturní vzorec, registra ční číslo 
CAS, čistota, bezpe čnostní opat ření, vhodné podmínky skladování 
a analytické metody, by m ěly být získány p řed zahájením studie. Krom ě 
toho by m ěly být známy tyto údaje:  
a) rozpustnost ve vod ě; 
b) rozdělovací koeficient oktanol-voda K  ow ; 
c) rozdělovací koeficient p ůda-voda vyjád řený jako K  oc ; 
d) tlak par;  
e) rozložitelnost (nap ř. v půdě, ve vodě); 
f) známé metabolity.  
7. Lze použít radioizotopov ě značené i nezna čené zkoušené chemické látky. 
Pro usnadn ění analýzy se však doporu čuje použít radiotopov ě značenou 
zkoušenou chemickou látku. Rozhodnutí bude záviset na mezích stanovitel ­
nosti nebo na požadavku na m ěření výchozí zkoušené chemické látky 
a metabolit ů. Je-li použita radioizotopov ě značená zkoušená látka a m ěří-li 
se celkový obsah radioaktivního zbytku, je pro výpo čet bioakumula čního 
faktoru (BAF) výchozí chemické látky a p říslušných p ůdních metabolit ů 
(viz odstavec 50) d ůležité, aby radioizotopov ě značené zbytky v p ůdě 
i ve zkušebních organismech a testovací organismy byly charakterizovány procentem výchozí zkoušené chemické látky a zna čené nevýchozí chemické 
látky, nap ř. ve vzorcích odebraných v ustáleném stavu nebo na konci fáze 
příjmu. U m ěření radioaktivn ě neznačené organické zkoušené látky nebo 
kovů může být nutné popsanou metodu upravit nap říklad tak, aby vzniklo 
dostatečné množství biomasy. M ěří-li se celkový obsah radioaktivního 
zbytku (po čítáním scintilací v roztoku nap říklad po extrakci, spálení nebo 
solubilizaci tkán ě), je hodnota bioakumula čního faktoru založena na výchozí 
zkoušené chemické látce a na metabolitech. Výpo čet BAF by m ěl být 
přednostně založen na koncentraci výchozí zkoušené chemické látky 
v organismech a na celkovém objemu radioaktivních zbytk ů. Následn ě by 
měl být na základ ě BAF vypo čten akumula ční faktor sediment-biota (BSAF) 
normalizovaný na obsah lipid ů v červech a obsah organického uhlíku (OC) 
v půdě z důvodů srovnatelnosti mezi výsledky r ůzných bioakumula čních 
zkoušek.  
8. Měla by být známa toxicita zkoušené látky pro druh použitý p ři zkoušce, 
například koncentrace vyvolávající ú činek (EC  x ) nebo letální koncentrace 
(LC  x ) po dobu fáze p říjmu (nap ř. (19)). Zvolená koncentrace zkoušené látky 
by měla v optimálním p řípadě být na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty 
akutní LC  50 a měla by být nejmén ě desetkrát vyšší než je mez detekce této 
látky v půdě při použité analytické metod ě. Pokud je to možné, m ěla by být 
dána přednost hodnotám toxicity odvozeným z dlouhodobých studií 
o subletálních koncových bodech (51, 52). Pokud tyto údaje nejsou 
k dispozici, poskytne užite čné informace zkouška akutní toxicity (viz 
např. (23)).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. K dispozici musí být vhodná analytická metoda o známé správnosti, p řes­
nosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení chemické látky ve zkušebních 
roztocích, v p ůdě a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o p řípravě 
a uchovávání vzork ů a materiálové bezpe čnostní listy. M ěly by být také 
známy meze stanovitelnosti zkoušené látky jak v p ůdě, tak v tkáních červů. 
Je-li použita zkoušená látka zna čená 14 C, měla by být známá specifická 
radioaktivita ((tj. Bq/mol) a aktivita ne čistot vyjád řená v procentech. Speci ­
fická radioaktivita zkoušené chemické látky by m ěla být dostate čně vysoká, 
aby umož ňovala analýzu a použité zkušební koncentrace by nem ěly 
vyvolávat toxické ú činky.  
10. Zkoušku je možno provést s um ělou půdou nebo s p řírodními p ůdami. 
U přírodních p ůd je před zahájením zkoušky t řeba znát informace 
o vlastnosti užité p řírodní půdy, jako je nap říklad původ půdy nebo jejích 
složek, pH, obsah organického uhlíku, distribuce částic (procento písku, 
prachu a jílu) a vodní kapacita (WHC) (3, 48).  
PODSTATA ZKOUŠKY  
11. Mezi parametry, které charakterizují bioakumulaci zkoušené chemické látky, 
patří bioakumula ční faktor (BAF), rychlostní konstanta p říjmu (k  s ) 
a rychlostní konstanta vylu čování (k  e ). Definice jsou uvedeny v dodatku 1.  
12. Zkouška se skládá ze dvou fází: fáze p říjmu (expozice) a vylu čovací (poex ­
poziční) fáze. Ve fázi p říjmu jsou paralelní vzorky červů vystaveny p ůso­
bení půdy, která byla obohacena zkoušenou chemickou látkou. Zárove ň se 
zkušebními organismy je za stejných podmínek, ale bez zkoušené chemické látky držena kontrolní skupina červů. Měří se hmotnost po vysušení a obsah 
lipidů ve zkušebních organismech. To lze provést pomocí červů v kontrolní 
skupině. Analytické hodnoty pozadí (slepé) lze získat analýzou vzork ů červů 
z kontrolní skupiny a p ůdy. Ve fázi vylu čování jsou červi přemístěni do 
půdy bez zkoušené chemické látky. Fáze vylu čování je nutná vždy 
s výjimkou p řípadů zanedbatelné absorpce zkoušené chemické látky 
v průběhu fáze expozice. Fáze vylu čování poskytuje informace o mí ře 
vylučování testované látky zkušebními organismy (nap ř. (27)). Pokud 
nebylo ve fázi p říjmu dosaženo ustáleného stavu, m ělo by být stanovení 
kinetických parametr ů – kinetického bioakumula čního faktoru BAF
 K 
a rychlostní konstanty (rychlostních konstant) p říjmu a vylu čování – 
založeno v optimálním p řípadě na současném proložení výsledk ů fáze 
příjmu a fáze vyprázdn ění. Koncentrace zkoušené látky v červech a na 
nich je sledována v pr ůběhu obou fází zkoušky.  
13. Během fáze p říjmu se provádí m ěření v dob ě odběru vzorků po dobu až 14 
dnů (roupice) nebo 21 dn ů (žížaly), dokud není dosaženo ustáleného stavu 
(11, 12, 67). Ustálený stav nastává, jestliže vynesení koncentrace červů 
v čase je rovnob ěžné s časovou osou a t ři po sobě jdoucí analýzy koncen ­
trací provedené na vzorcích odebraných nejmén ě v dvoudenních intervalech 
se vzájemn ě neliší o více než ± 20 % na základ ě statistických srovnání 
(např. analýza rozptylu, regresní analýza).  
14. Fáze vylu čování spo čívá v přenesení zkušebních organism ů do nádob, které 
obsahují stejný substrát bez obsahu zkoušené chemické látky. V pr ůběhu 
fáze vyprázdn ění se měření provád ějí v době odběru vzorků po dobu až 14 
dnů (roupice) nebo 21 dn ů (žížaly), pokud již d říve nebylo analyticky 
stanoveno 90 % snížení reziduí zkoušené chemické látky v červech. 
Koncentrace zkoušené chemické látky v červech na konci fáze vyprázdn ění 
se uvede jako neodstran ěná rezidua. Bioakumula ční faktor ustáleného stavu  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
(BAF  SS ) se optimáln ě vypočte jako pom ěr koncentrace v červech (C  a ) a v 
půdě (C  s ) ve zřetelném ustáleném stavu, a jako kinetický bioakumula ční 
faktor BAF  K , tj. pom ěr rychlostní konstanty p říjmu z p ůdy (k  s ) 
a rychlostní konstanty vylu čování (k  e ) (definice viz dodatek 1) za p ředpo­
kladu kinetiky prvního řádu (výpo čty viz dodatek 2). Pokud kinetiku 
prvního řádu zjevn ě nelze použít, m ěly by být použity jiné modely.  
15. Rychlostní konstanta p říjmu, rychlostní konstanta (nebo konstanty, jsou-li 
použity složit ější modely) vylu čování, kinetický bioakumula ční faktor 
(BAF  K ) a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z t ěchto parametr ů 
se vypočítají z modelových rovnic za použití po čítače (návod viz dodatek 
2). Oprávn ěnost jakéhokoli modelu lze ur čit např. z korela čního koeficientu 
nebo z koeficientu determinace (koeficienty, jejichž hodnota se blíží jedné, 
indikují oprávn ěnost), nebo na základ ě druhé mocniny chí ( χ 2 ). Také veli ­
kost standardní odchylky nebo intervalu spolehlivosti kolem odhadovaných parametrů mohou sv ědčit o oprávn ěnosti modelu.
 
16. Ke snížení rozptylu výsledk ů zkoušek pro zkoušené chemické látky 
s vysokou lipofilností by m ěly být bioakumula ční faktory vyjád řeny ve 
vztahu k obsahu lipid ů a obsahu organického uhlíku (kg organického uhlíku 
v půdě (OC) na kg lipid ů v červech). Tento p řístup je založen na skute č­
nosti, že u n ěkterých skupin chemických látek existuje jasný vztah mezi 
potenciálem bioakumulace a lipofilností, což je široce používáno v p řípadě 
ryb (47). Existuje vztah mezi obsahem lipid ů v rybách a bioakumulací 
těchto chemických látek. U bentických organism ů byly zjišt ěny podobné 
korelace nap ř. (30, 44). Obdobn ě byla tato korelace prokázána 
u terestrických málošt ětinatců, např. (5, 6, 7, 14). Pokud je k dispozici 
dostatečné množství tkání červů, lze stanovit obsah lipid ů u pokusných 
živočichů na stejném biologickém materiálu, který byl použit ke stanovení 
koncentrace zkoušené chemické látky. Ke stanovení obsahu lipid ů lze použít 
rovněž kontrolní živo čichy.  
PLATNOST ZKOUŠKY  
17. Má-li být zkouška platná, musí být p ři kontrole i expozici spln ěny následu ­
jící podmínky:  
— Celková úmrtnost ve fázi p říjmu a ve fázi vyprázdn ění nesmí na konci 
zkoušky p řekročit 10 % (žížaly) nebo 20 % (roupice) z celkového po čtu 
vložených červů. 
— Průměrná ztráta hmotnosti u  Eisenia fetida a Eisenia andrei  měřená na 
konci fáze p říjmu a na konci fáze vylu čování by nem ěla přesáhnout 
20 % v porovnání s p ůvodní čerstvou hmotností (f.w.) na za čátku 
každé fáze.  
POPIS METODY  
Testovací druh  
18. Pro zkoušky bioakumulace se doporu čuje používat n ěkolik druh ů terestric­
kých málošt ětinatců. Nejběžněji používané druhy  Eisenia fetida  nebo  
Eisenia Andrei  (Lumbricidae) nebo  Enchytraeus albidus , Enchytraeus cryp ­
ticus , nebo  Enchytraeus luxuriosus  (Enchytraeidae)) jsou popsány 
v dodatku 5.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Přístroje a pom ůcky 
19. U všech částí zařízení je třeba se vyhýbat použití materiál ů, které se mohou 
rozpouštět, adsorbovat zkoušenou chemickou látku nebo vyluhovat jiné 
chemické látky a mají nep říznivý účinek na pokusné živo čichy. Lze použít 
standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z chemicky inertního 
materiálu a mající vhodný objem s ohledem na nápl ň, tj. počet zkušebních 
červů. Veškeré vybavení, které se dostane do styku se zkušebním médiem, 
může být vyrobeno z korozivzdorné oceli, plastu nebo skla. Zkušební 
nádoby by m ěly být vhodným zp ůsobem zakryty, aby se zabránilo úniku 
červů, přičemž je nutné zajistit dostate čný přívod vzduchu. Pro látky 
s vysokými adsorp čními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, 
může být nutné použít silanizované sklo. V t ěchto případech musí být 
zařízení po použití zlikvidováno (49). U radioaktivn ě značených zkoušených 
látek a těkavých chemických látek je nutné zabránit jejich úniku. Je nutno 
použít lapa če (např. skleněné promýva čky plynu) obsahující vhodný absor ­
bent schopný udržet zbytky odpa řující se ze zkušebních nádob.  
Půda 
20. Zkušební p ůda by měla mít takovou kvalitu, která umožní p řežití zkušebních 
organismů, a pokud možno jejich reprodukci po dobu aklimatizace a v 
průběhu fází zkoušky, aniž by vykazovaly abnormální vzhled nebo chování. 
Červi by se m ěli zavrtat do p ůdy. 
21. Jako zkušební substrát se doporu čuje užít um ělou půdu popsanou 
v kapitole C.8 této p řílohy (48). P říprava um ělé půdy pro použití p ři zkou­ 
škách bioakumulace a doporu čení pro skladování um ělé půdy jsou uvedeny 
v příloze 4. Um ělou půdu vysušenou na vzduchu lze uchovávat p ři poko­
jové teplot ě až do použití.  
22. Jako zkušební a/nebo kultiva ční půdu však lze použít i p řírodní půdu 
z neznečištěných lokalit. P řírodní půdy by m ěly být charakterizovány 
alespoň podle p ůvodu (místa odb ěru), pH, obsahu organického uhlíku, 
distribuce částic (procento písku, prachu a jílu), maximální vodní kapacity 
(WHC  max ) a procenta obsahu vody (3). Užite čné informace by m ěla posky­
tnout analýza p ůdy nebo jejích složek na mikroskopické zne čišťující látky 
před použitím. Pokud se využívá zem ědělská půda z pole, nem ěla by být 
ošetřena přípravky na ochranu rostlin ani hnojem od exponovaných zví řat 
jako hnojivem po dobu nejmén ě jednoho roku a organickými hnojivy po 
dobu nejmén ě šesti měsíců před odběrem vzorku (50). Postupy manipulace 
s přírodními p ůdami před použitím p ři ekotoxikologických laboratorních 
zkouškách na málošt ětinatcích jsou popsány v bod ě (3). U p řírodní půdy 
by doba skladování v laborato ři měla být co nejkratší.  
Aplikace zkoušené chemické látky  
23. Zkoušená chemická látka se p řidá do půdy. Měly by být vzaty v úvahu 
fyzikálně-chemické vlastnosti zkoušené chemické látky. Ve vod ě rozpustná 
zkoušená chemická látka by m ěla být před smísením s p ůdou zcela rozpuš ­
těna ve vod ě. Doporu čený postup vmíchávání t ěžko rozpustných zkouše ­
ných chemických látek zahrnuje obalení jedné nebo více složek (um ělé) 
půdy zkoušenou chemickou látkou. Nap říklad křemenný písek nebo jeho 
část se pono ří do roztoku zkoušené chemické látky ve vhodném organickém 
rozpouštědle, které se pak pomalu odpa ří do sucha. Obalenou frakci lze 
následně promíchat s vlhkou p ůdou. Hlavní výhodou tohoto postupu je, 
že se do p ůdy nevpravují žádná rozpoušt ědla. Je-li použita p řírodní půda, ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
lze zkoušenou chemickou látku p řidat vmícháním části půdy vysušené na 
vzduchu, jak bylo popsáno výše u um ělé půdy, nebo vmícháním zkoušené 
chemické látky do vlhké p ůdy s následným odpa řováním, pokud bylo 
použito solubiliza ční činidlo. Obecn ě platí, že je t řeba pokud možno se 
vyhnout kontaktu vlhké p ůdy s rozpoušt ědly. Je třeba zvážit následující 
skutečnosti (3):  
— Užije-li se jiné rozpoušt ědlo než voda, m ělo by být takové, aby bylo 
mísitelné s vodou a/nebo odbouratelné (nap říklad odpa řením) tak, že 
v půdě zůstane jen zkoušená chemická látka.  
— Použije-li se kontrola rozpoušt ědla, není nutno provést negativní 
kontrolu. Kontrola rozpoušt ědla by měla obsahovat nejvyšší koncentraci 
rozpouštědla přidávaného do p ůdy a mělo by při ní být užito rozpouš ­
tědla ze stejné šarže, která byla použita pro zásobní roztok. Hlavním 
kritériem pro výb ěr vhodného solubiliza čního činidla by m ěla být toxi ­
cita a těkavost rozpoušt ědla a rozpustnost zkoušené látky ve zvoleném 
rozpouštědle. 
24. Pro chemické látky, které jsou obtížn ě rozpustné ve vod ě a v organických 
rozpouštědlech, lze smísit 2,0–2,5 g jemn ě rozemletého k řemenného písku 
na zkušební nádobu, nap ř. pomocí t řecí misky a tlou čku s takovým množ ­
stvím zkoušené látky, aby bylo dosaženo požadované zkušební koncentrace. 
Tato směs křemenného písku a zkoušené chemické látky se p řidá do navlh ­ 
čené půdy a důkladně se promíchá s p říslušným množstvím deionizované 
vody, aby bylo dosaženo požadované vlhkosti. Kone čná směs se rozdělí do 
zkušebních nádob. Tento postup se opakuje pro každou zkušební koncen ­
traci a připraví se také p říslušná kontrola s 2,0–2,5 g jemn ě rozemletého 
křemenného písku na zkušební nádobu.  
25. Po vmíchání by m ěla být stanovena koncentrace zkoušené látky v p ůdě. 
Před vložením zkušebních organism ů je třeba ověřit homogenní distribuci 
zkoušené chemické látky v p ůdě. Měla by být uvedena metoda vmíchání 
a důvody pro výb ěr konkrétní metody vmíchání (24).  
26. Rovnováha mezi p ůdou a fází kapilární vody by m ěla být v ideálním 
případě nastolena p řed přidáním organism ů; doporučuje se doba čtyř dnů 
při teplotě 20 °C. Pro řadu organických chemických látek t ěžko rozpustných 
ve vodě se doba pot řebná k dosažení skute čné rovnováhy mezi adsorbo ­
vanou a rozpušt ěnou frakcí po čítá ve dnech nebo v m ěsících. V závislosti na 
účelu studie, nap říklad když je pot řeba napodobit podmínky okolního 
prostředí, může obohacená p ůda „zrát“ i déle, nap říklad u kov ů po dobu 
tří týdnů při teplotě 20 °C (22).  
Kultivace zkušebních organism ů 
27. Červi by m ěli být v optimálním p řípadě nepřetržitě udržováni 
v laboratorních podmínkách. Pokyny týkající se metod laboratorní kultury pro Eisenia fetida , Eisenia Andrei  a roupice jsou uvedeny v p říloze 5 (viz 
také (48, 51, 52)).
 
28. Červi použití p ři zkouškách nesmí vykazovat pozorovatelné nemoci, abnor ­
mality a parazity.  
PROVEDENÍ ZKOUŠKY  
29. Zkušební organismy se exponují zkoušené látce b ěhem fáze p říjmu. Fáze 
příjmu by m ěla trvat 14 dn ů (roupice) nebo 21 dn ů (žížaly), pokud není 
prokázáno, že bylo dosaženo ustáleného stavu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Ve fázi vylu čování se červi přenesou do p ůdy bez zkoušené látky. První 
vzorek by m ěl být odebrán 4–24 hodin po zahájení fáze vylu čování. 
Příklady harmonogram ů odběru vzorků pro jedenadvacetidenní fázi p říjmu 
a jedenadvacetidenní fázi vylu čování jsou uvedeny v dodatku 3.  
Zkušební organismy  
31. Řada druhů terestrických roupic má jen velmi nízkou individuální hmotnost 
(např. 5–10 mg hmotnosti ve vlhkém stavu na jedince u  Enchytraeus 
albidus  a ještě méně u Enchytraeus crypticus  či Enchytraeus luxuriosus ); 
aby bylo možné provést vážení a chemickou analýzu, m ůže být nezbytné 
sdružovat červy v paralelních zkušebních nádobách (tj. k získání jednoho 
analytického výsledku tkán ě se použijí všichni červi v paralelní nádob ě). Do 
každé paralelní nádoby se vloží 20 jednotlivých roupic a použijí se nejmén ě 
tři paralelní nádoby. V p řípadě, že jsou meze stanovitelnosti zkoušené látky 
příliš vysoké, m ůže být pot řeba více červů. U zkušebních druh ů s vyšší 
individuální hmotnosti ( Eisenia fetida  a Eisenia Andrei ) lze použít paralelní 
nádoby obsahující pouze jednoho jedince.  
32. Žížaly použité ke zkoušce by m ěly mít podobnou hmotnost (nap ř. Eisenia 
fetida  a Eisenia Andrei  by měly mít individuální hmotnost 250–600 mg). 
Roupice nap ř. Enchytraeus albidus ) by měly být přibližně 1 cm dlouhé. 
Všichni červi užití pro konkrétní zkoušku musí pocházet ze stejného zdroje 
a mělo by se jednat o dosp ělé jedince s opaskem (viz p říloha 5). Vzhledem 
k tomu, že hmotnost a stá ří živočicha může mít vliv na hodnoty BAF (nap ř. 
z důvodu různého obsahu lipid ů a/nebo p řítomnosti vají ček), měly by být 
tyto parametry p řesně zaznamenány a zohledn ěny při interpretaci výsledk ů. 
Kromě toho mohou být v pr ůběhu doby expozice vyprodukovány kokony, 
což rovněž ovlivní hodnoty BAF. Doporu čuje se zvážit p řed zkouškou díl čí 
vzorek zkoušených červů s cílem odhadnout st řední hmotnost ve vlhkém a v 
suchém stavu.  
33. Volí se vysoký pom ěr množství p ůdy k počtu červů, aby se minimalizovalo 
snížení koncentrace zkoušené chemické látky v p ůdě v průběhu fáze p říjmu. 
V případě Eisenia fetida  a Eisenia Andrei  se doporu čuje minimální množství 
50 g suché hmotnosti (d.w.) p ůdy na jednoho červa a v p řípadě roupic 
minimáln ě 10–20 g suché hmotnosti p ůdy na zkušební nádobu. Nádoby 
by měly obsahovat vrstvu p ůdy o tlouš ťce 2–3 cm (roupice) nebo 4–5 cm 
(žížaly).  
34. Červi použití ke zkoušce se vyjmou z kultury (nap ř. roupice pomocí klenot ­
nické pinzety). Dosp ělí jedinci se p řenesou na neexponovanou zkušební 
půdu za účelem aklimatizace a krmí se (viz odstavec 36). V p řípadě, že 
se zkušební podmínky liší od kultiva čních podmínek, m ěla by pro p řizpů­
sobení červů zkušebním podmínkám posta čovat aklimatiza ční fáze v trvání 
24 až 72 hodin. Po aklimatizaci se žížaly omyjí p řenesením do sklen ěných 
misek (nap ř. Petriho misek), které obsahují čistou vodu, a následn ě se před 
přidáním do zkušební p ůdy zváží. P řed zvážením se z červů odstraní 
přebytečná voda jemným oklepáním o okraj misky nebo opatrným osušením 
do sucha pomocí lehce navlh čeného papírového ru čníku.  
35. Zavrtávání zkušebních organism ů by mělo být sledováno a zaznamenáváno. 
Při zkouškách s žížalami se jedinci (v kontrolních i exponovaných nádo ­
bách), běžně zavrtají do p ůdy do několika hodin; tuto skute čnost je nutno 
zkontrolovat nejpozd ěji do 24 hodin po vložení červů do zkušebních nádob. 
V případě, že se žížaly nezavrtají do p ůdy (např. více než 10 % v dob ě 
přesahující polovinu fáze p říjmu), znamená to, že bu ď nejsou vytvo řeny 
vhodné zkušební podmínky, nebo zkušební organismy nejsou zdravé.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
V takovém p řípadě je nutno zkoušku ukon čit a opakovat. Roupice žijí 
hlavně v intersticiálních pórech v p ůdě a jejich integument je často 
v kontaktu s okolním substrátem jen částečně; expozice zavrtávajících se 
a nezavrtávajících se roupic se považuje za rovnocennou a nezavrtávání roupic nemusí nutn ě vyžadovat opakování zkoušky.
 
Krmení  
36. Krmení by se m ělo předpokládat p ři použití p ůdy s nízkým celkovým 
obsahem organického uhlíku. P ři použití um ělé půdy se doporu čuje týdenní 
frekvence krmení (tj. červi by m ěli být krmeni jednou týdn ě) 7 mg sušeného 
hnoje na gram suché hmotnosti p ůdy pro žížaly a týdenní frekvence 2–2,5 
mg mletých ovesných vlo ček na gram suché hmotnosti p ůdy pro roupice 
(11). První krmná dávka se smíchá s p ůdou bezprost ředně před přidáním 
zkušebních organism ů. Optimáln ě by měl být užíván stejný typ krmiva jako 
v kulturách (viz dodatek 5).  
Světlo a teplota  
37. Zkouška se provede za řízených sv ětelných podmínek v prostorách, kde jsou 
umístěny zkušební nádoby, nejlépe 16 h sv ětlo / 8 h tma, optimáln ě při 
intenzitě osvětlení 400 lux až 800 lux (3). Zkušební teplota by se m ěla 
udržovat na 20 ± 2 °C po celou dobu zkoušky.  
Zkušební koncentrace  
38. Použije se jedna koncentrace. Situace, kdy je vyžadována (jsou vyžadovány) 
další koncentrace, by m ěly být zd ůvodněny. Pokud se toxicita (EC  x ) zkou­ 
šené chemické látky blíží mezi detekce analytické metody, doporu čuje se 
užití zkoušené látky zna čené radioizotopy s vysokou specifickou radioakti ­
vitou. Pro kovy by její koncentrace m ěla být vyšší než koncentrace v pozadí 
ve tkáních a v p ůdě. 
Paralelní vzorky  
39. Pro kinetická m ěření (ve fázi p říjmu a vylu čování) je minimální po čet 
exponovaných paralelních nádob t ři na jeden odb ěr. Celkový po čet připra­
vených paralelních nádob by m ěl být dostate čný k pokrytí všech odb ěrů ve 
fázi příjmu i vylu čování.  
40. Pro biologická pozorování a m ěření (např. poměr hmotnosti ve vlhkém 
stavu a suché hmotnosti, obsah lipid ů) a pro analýzu koncentrací v pozadí 
v červech a p ůdě je zapot řebí nejmén ě 12 paralelních nádob negativních 
kontrol ( čtyři vzorky odebrané na za čátku a čtyři na konci fáze p říjmu 
a čtyři na konci fáze vylu čování) v p řípadě, že není použito jiné rozpouš ­
tědlo než voda. Pokud bylo pro aplikaci zkoušené chemické látky užito 
jakékoli solubiliza ční činidlo, měly by být krom ě exponovaných paralelních 
nádob připraveny i kontroly rozpoušt ědla (ze čtyř paralelních nádob by m ěly 
být odebrány vzorky na za čátku, ze čtyř na konci fáze p říjmu a ze čtyř na 
konci fáze vylu čování), které budou obsahovat všechny složky s výjimkou 
zkoušené látky. V tomto p řípadě je možno použít další čtyři paralelní 
nádoby jako negativní kontroly (bez rozpoušt ědla) za ú čelem volitelného 
odběru vzorků na konci fáze p říjmu. Tyto paralelní nádoby lze biologicky 
srovnat s kontrolou rozpoušt ědla s cílem získat informace o možném vlivu 
rozpouštědla na zkušební organismy. Doporu čuje se použít dostate čný počet 
dalších rezervních paralelních nádob (nap ř. osm) pro expozici a kontrolu.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Četnost m ěření kvality p ůdy 
41. Na po čátku a na konci fáze p říjmu a fáze vyprázdn ění se změří pH půdy, 
vlhkost p ůdy a teplota (kontinuáln ě) ve zkušební místnosti. Jednou týdn ě by 
se měla kontrolovat vlhkost p ůdy zvážením zkušebních nádob a porovnáním 
jejich skute čné hmotnosti s po čáteční hmotností na za čátku zkoušky. Ztráty 
vody by m ěly být kompenzovány p řidáním deionizované vody.  
Odběr vzorků a analýza červů a půdy 
42. Příklad harmonogramu fází p říjmu a vylu čování u bioakumula čních zkoušek 
na žížalách a roupicích je uveden v dodatku 3.  
43. Vzorky p ůdy ze zkušebních nádob pro stanovení koncentrace zkoušené 
chemické látky se odebírají p řed vložením červů, během fáze p říjmu 
a během fáze vylu čování. Během zkoušky se stanoví koncentrace zkoušené 
chemické látky v červech a v p ůdě. Obecně platí, že se m ěří celkové 
koncentrace v p ůdě. Nepovinn ě lze měřit koncentrace v kapilární vod ě, 
a v takovém p řípadě je před zahájením studie nutno uvést zd ůvodnění 
a vhodné metody, které jsou zahrnuty také do zprávy.  
44. Vzorky z červů a půdy se odebírají nejmén ě šestkrát b ěhem fáze p říjmu 
a fáze vylu čování. V p řípadě, že se prokáže stabilita zkoušené chemické 
látky, lze po čet analýz p ůdy snížit. Doporu čuje se analyzovat nejmén ě tři 
paralelní vzorky na za čátku a na konci fáze p říjmu. V p řípadě, že se 
koncentrace v p ůdě měřená na konci fáze p říjmu liší od po čáteční koncent ­
race o více než 30 %, m ěly by být analyzovány i vzorky p ůdy odebrané 
v jiných termínech.  
45. Červi v dané paralelní nádob ě se vyjmou z p ůdy při každém odb ěru (např. 
rozprostřením půdy z paralelní nádoby na m ělkou podložku a vyjmutím 
červů pomocí m ěkké klenotnické pinzety) a rychle se opláchnou vodou na 
mělké sklen ěné nebo ocelové podložce. Odstraní se p řebytečná voda (viz 
bod 34). Červi se opatrn ě přenesou do p ředem zvážené nádoby a okamžit ě 
se zváží, v četně střevního obsahu.  
46. Žížalám ( Eisenia  sp.) by pak m ělo být umožn ěno přes noc vyprázdnit st řeva 
např. na vlhkém filtra čním papíru v p řikryté Petriho misce (viz bod 34). Po 
vyprázdnění by měla být stanovena hmotnost červů za účelem posouzení 
možného úbytku biomasy b ěhem zkoušky (viz kritéria platnosti v bod ě 17). 
Vážení a analýza tkání u roupic se provádí bez vyprázdn ění, které by bylo 
technicky obtížné vzhledem k malé velikosti t ěchto červů. Po kone čném 
určení hmotnosti by m ěli být červi okamžit ě usmrceni nejvhodn ější metodou 
(např. pomocí tekutého dusíku nebo zmrazením p ři teplotách pod –18 °C).  
47. V pr ůběhu fáze vylu čování nahradí červi kontaminovaný st řevní obsah 
čistou zeminou. To znamená, že m ěření u nevyprázdn ěných červů (v 
tomto kontextu roupic), kde byly odebrány vzorky bezprost ředně před fází 
vylučování, obsahují kontaminovanou p ůdu ze střeva. U vodních málošt ě­
tinatců se předpokládá, že po po čátečních 4–24 hodinách vylu čovací fáze je 
již většina kontaminovaného obsahu st řeva nahrazena čistým sedimentem, 
např. (46). Obdobné výsledky jsou uvád ěny u žížal v p řípadě studií 
o hromad ění radioaktivn ě značeného kadmia a zinku (78). 
U nevyprázdn ěných roupic lze koncentraci tohoto prvního vzorku vylu čo­
vací fáze považovat za koncentraci v tkáni po vyprázdn ění střeva. Pro 
zohlednění naředění koncentrace zkoušené látky nekontaminovanou p ůdou 
v průběhu fáze vylu čování lze odhadnout hmotnost st řevního obsahu 
z poměru hmotnosti červa ve vlhkém stavu a hmotnosti popela po spálení 
červa, případně z poměru suché hmotnosti červa a hmotnosti popela po 
spálení červa. ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Vzorky p ůdy a červů se pokud možno analyzují ihned po vyjmutí (tj. do 
1–2 dnů) s cílem p ředejít rozkladu nebo jiným ztrátám a výpo čet přibližné 
rychlosti p říjmu a vylu čování se doporu čuje provést ješt ě v průběhu zkou­ 
šky. Neprovede-li se analýza okamžit ě, vzorky se vhodným zp ůsobem ucho ­
vají, např. hlubokým zmrazením ( ≤ –18 °C).  
49. Je třeba zkontrolovat, že p řesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy 
a rovněž výtěžek zkoušené látky jak z p ůdy, tak ze vzork ů červů jsou pro 
danou analytickou metodu dostate čné; uvádí se rovn ěž účinnost extrakce, 
mez detekce (LOD) a mez kvantifikace (LOQ). Stejn ě tak je třeba zkon ­
trolovat, zda se zkoušená chemická látka nevyskytuje v kontrolních nádo ­
bách v koncentracích vyšších než koncentrace v pozadí. Pokud je koncent ­
race zkoušené chemické látky ve zkušebním organismu u kontrolní skupiny 
červů Ca > 0, m ěla by být zahrnuta do výpo čtu kinetických parametr ů (viz 
dodatek 2). Všechny vzorky by m ěly být v pr ůběhu celé zkoušky zpraco ­
vávány tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (nap ř. v důsledku 
adsorpce zkoušené chemické látky odb ěrným zařízením).  
50. Jsou-li použity zkušební chemické látky zna čené radioizotopy, je možné 
provést analýzu pro výchozí látku i s metabolity. Kvantifikace výchozí 
zkušební chemické látky a metabolit ů v ustáleném stavu nebo na konci 
fáze příjmu poskytuje d ůležité informace. Následn ě by měla být provedena 
separace, aby mohla být výchozí látka analyzována samostatn ě. Pokud 
obsah radioaktivity v jednotlivých metabolitech p řesáhne 10 % celkové 
radioaktivity v analyzovaném vzorku (vzorcích), doporu čuje se stanovit 
i tyto metabolity.  
51. Měl by být zaznamenán a hlášen celkový vývin a vývin zkoušené látky 
v červech, v p ůdě a případně i v lapa čích obsahujících absorbenty 
k zachycení odpa řené zkoušené chemické látky.  
52. U roupic, které jsou menší než žížaly, je p řijatelné sdružování jedinc ů 
odebraných jako vzorek z dané zkušební nádoby. Pokud sdružování znamená redukci po čtu paralelních nádob, omezuje to statistické postupy, 
které lze na údaje aplikovat. Pokud je vyžadován ur čitý statistický postup 
a statistická váha, m ěl by být ve zkoušce nasazen p řiměřený počet paralel ­
ních zkušebních nádob vyhovující požadovanému sdružování, postupu a statistické váze.
 
53. Doporu čuje se, aby byla hodnota BAF vyjád řena jako funkce celkové suché 
hmotnosti, a bude-li to vyžadováno (nap ř. u vysoce hydrofobních chemic ­
kých látek), také jako funkce obsahu lipid ů. Pro stanovení obsahu lipid ů by 
měla být použita vhodná metoda (pro tento ú čel by měly být přizpůsobeny 
některé již existující metody – nap ř. (31), (58). yto metody využívají 
extrakci pomocí chloroformu/methanolu. Aby se zabránilo používání chlo ­
rovaných rozpoušt ědel, měla by však být použita modifikace Bligh/Dyerovy 
metody (9) uvedené v odstavci (17). Vzhledem k tomu, že r ůzné metody 
nemusí poskytovat stejné hodnoty (10), je d ůležité uvést podrobnosti 
o použité metod ě. Je-li to možné, tj. pokud je k dispozici dostate čné množ­
ství tkáně červů, měla by být analýza lipid ů provedena optimáln ě na stejném 
vzorku extraktu, který byl užit pro analýzu zkoušené chemické látky, nebo ť 
lipidy musí být často z extraktu p řed chromatografickou analýzou odstra ­
něny. Pro stanovení obsahu lipid ů lze použít rovn ěž kontrolní živo čichy 
a tento obsah lze pak použít k normalizaci hodnot BAF. Tento druhý postup 
snižuje kontaminaci za řízení zkoušenou chemickou látkou.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
ÚDAJE A JEJICH P ŘEDKLÁDÁNÍ  
Zpracování výsledk ů 
54. Křivka příjmu zkoušené látky se sestrojí vynesením její koncentrace 
v červech nebo na nich v pr ůběhu fáze p říjmu proti času v lineárním 
měřítku. Dosáhla-li k řivka fáze plató čili ustáleného stavu (viz definice 
v dodatku 1), vypo čítá se hodnota bioakumula čního faktoru v ustáleném 
stavu BAF  SS z poměru: 
C a v ustáleném stavu nebo na konci fáze p říjmu ðstřední hodnotaÞ 
C s v ustáleném stavu nebo na konci fáze p říjmu ðstřední hodnotaÞ 
C a je koncentrace zkoušené chemické látky ve zkušebním organismu,  
C s je koncentrace zkoušené chemické látky v p ůdě. 
55. Není-li dosaženo ustáleného stavu, m ěla by být místo hodnoty BAF  SS 
vypočtena hodnota BAF  K na základ ě rychlostních konstant, jak je popsáno 
níže:  
— Stanoví se akumula ční faktor (BAF  K ) jako pom ěr k s /k e . 
— Rychlost p říjmu a vylu čování se optimáln ě vypočtou současně (viz 
rovnice 11 v dodatku 2).  
— Rychlostní konstanta vylu čování (k  e ) se obvykle stanoví z k řivky 
vylučování (tj. grafu poklesu koncentrace zkoušené chemické látky 
v červech v pr ůběhu fáze vylu čování). Následn ě se vypočte rychlostní 
konstanta p říjmu pomocí hodnoty k  e a hodnoty C  a , odvozené z k řivky 
příjmu (popis t ěchto metod viz dodatek 2). Up řednostňovanou metodou 
pro získání hodnoty BAF  K a rychlostních konstant k  s a k  e je metoda 
nelineárního odhadu parametr ů s využitím po čítače. Není-li zjevn ě 
křivka vylu čování křivkou prvního řádu, měly by být použity složit ější 
modely.  
Protokol o zkoušce  
56. Protokol o zkoušce by m ěl obsahovat tyto informace:  
Zkoušená látka:  
— veškeré dostupné informace o akutní nebo dlouhodobé toxicit ě (např. 
EC x , LC  x“ NOEC) zkoušené chemické látky pro p ůdní málošt ětinatce,  
— čistotu, fyzikální povahu a fyzikáln ě-chemické vlastnosti, nap ř. log K  ow , 
rozpustnost ve vod ě, 
— chemické identifika ční údaje; zdroj zkoušené položky, identifikaci 
a koncentraci p řípadného použitého rozpoušt ědla, 
— v případě značení radioaktivními izotopy jejich p řesnou polohu, speci ­
fickou radioaktivitu a radiochemickou čistotu.  
Testovací druh:  
— vědecký název, kmen, zdroj, p řípadné předběžné ošetření, aklimatizace, 
stáří, rozmezí velikostí atd.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Zkušební podmínky:  
— použitý zkušební postup,  
— typ a charakteristiky použitého osv ětlení a fotoperioda (fotoperiody),  
— uspořádání zkoušky (nap ř. počet a velikost zkušebních nádob, hmotnost 
půdy a tlouš ťka půdní vrstvy, po čet paralelních nádob, po čet červů 
v jedné paralelní nádob ě, počet zkušebních koncentrací, délka fází 
příjmu a vylu čování, četnost odb ěru vzorků), 
— zdůvodnění výběru materiálu zkušební nádoby,  
— metoda p řípravy a aplikace zkoušené položky a d ůvody pro výb ěr 
konkrétní metody,  
— nominální zkušební koncentrace, st řední hodnoty nam ěřených koncen ­
trací ve zkušebních nádobách, jejich sm ěrodatné odchylky a metody, 
jimiž byly tyto hodnoty získány,  
— zdroj složek um ělé půdy nebo – v p řípadě užití přírodního média – 
původ půdy, popis jakékoli p ředchozí úpravy, výsledky kontrol (p řežití, 
vývoj biomasy, reprodukce), charakteristika p ůdy, (pH, obsah celkového 
organického uhlíku, distribuce částic (procento písku, prachu a jílu), 
procento obsahu vody WHC  max na začátku a na konci zkoušky a jiná 
provedená m ěření), 
— podrobné informace o expozici vzork ů půdy a červů včetně podrobností 
o přípravě, uchovávání, postupech vmíchávání, extrakci a analytických 
postupech (a p řesnosti), pokud jde o zkoušenou látku v červech a p ůdě, 
obsah lipid ů (je-li měřen) a výt ěžky zkoušené položky.  
Výsledky:  
— úhyn kontrolních červů a červů v každé zkušební nádob ě a jakékoli 
pozorované neobvyklé chování (nap ř. snaha uniknout z p ůdy, nerozm ­
nožování v bioakumula čních zkouškách na roupicích),  
— poměr suché hmotnosti p ůdy a zkušebních organism ů k jejich hmotnosti 
ve vlhkém stavu (užite čné pro normalizaci),  
— hmotnost červů ve vlhkém stavu p ři každém odb ěru; u žížal vlhká 
hmotnost na za čátku zkoušky a po každém odb ěru před pročištěním 
střev a po n ěm, 
— obsah lipid ů ve zkoušených organismech (je-li stanoven),  
— křivky kinetiky p říjmu a vylu čování zkoušené chemické látky červy 
a doba dosažení ustáleného stavu,  
— hodnoty C  a a C  s (popřípadě se směrodatnými odchylkami a rozp ětím) 
pro všechny odb ěry (hodnota C  a se vyjadřuje v g/kg vlhké a suché 
hmotnosti celého t ěla, hodnota C  s se vyjadřuje v g/kg vlhké a suché 
hmotnosti p ůdy). Pokud je vyžadován akumula ční faktor 
biota-půda (BSAF) (nap říklad pro porovnání výsledk ů dvou nebo více 
zkoušek provedených s živo čichy s odlišným obsahem lipid ů), lze navíc 
vyjádřit i hodnotu C  a jako g/kg obsahu lipid ů v organismu a hodnotu C  s 
jako g/kg organického uhlíku (OC) v p ůdě. 
— dodate čně lze uvést i BAF (vyjád řený v kg p ůdy na·kg červů), rychlostní 
konstantu p říjmu půdy k  s (vyjádřenou v g p ůdy na kg červů za den) 
a rychlostní konstantu vylu čování k  e (vyjádřenou v číselné hodnot ě za 
den); BSAF (vyjád řený v kg organického p ůdního uhlíku na kg obsahu 
lipidů v červech),  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— měří-li se, procentuální podíl výchozí chemické látky, metabolit ů 
a vázaných reziduí (tj. procentní podíl zkoušené chemické látky, který 
nelze extrahovat b ěžnými metodami extrakce) zjišt ěný v půdě a ve zkou ­ 
šených živo čiších,  
— metody užívané pro statistické analýzy dat.  
Vyhodnocení výsledk ů 
— soulad výsledk ů s kritérii validity uvedenými v odstavci 17,  
— neočekávané nebo neobvyklé výsledky, nap ř. neúplné odstran ění zkou­ 
šené látky z pokusných zví řat. 
LITERATURA:  
1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.  
2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
 
3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Internati ­
onal, E1676-04: 26 pp.  
4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger 
G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. 
Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag 
Berlin Heidelberg: 235–276.
 
5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.  
6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens 
J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms 
(Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 
154–165.  
7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel 
C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms 
(Eisenia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191.  
8) Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.  
9) Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.  
10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, 
Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.  
11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). 
Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestris ­
chen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency 
(Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.  
12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccu ­
mulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchytraeus 
luxuriosus  and Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). 
Hydrobiologia 463: 185–196.  
13) Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13–20.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
14) Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.  
15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2-29.  
16) Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The 
Netherlands, pp. 555–576.  
17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. 
Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
 
18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bach ­
mann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following 
field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145.
 
19) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 
18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemic ­
kých látek, o z řízení Evropské agentury pro chemické látky, o zm ěně směr­
nice 1999/45/ES a o zrušení na řízení Rady (EHS) č. 793/93, na řízení 
Komise (ES) č. 1488/94, sm ěrnice Rady 76/769/EHS a sm ěrnic Komise 
91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES, Ú ř. věst. L 396, 
30.12.2006, s. 1.  
20) Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.  
21) OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris.  
22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisi ­
erten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). 
Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Ke stažení na adrese: 
http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
 
23) Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI 
Technical Report 325: 57 pp.
 
24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.
 
26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.  
27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501–1514.  
28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6- 
Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbri ­
cidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflan ­
zenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 
78–84.  
30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcen ­
tration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.  
31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for 
lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.
 
32) Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 
701–707.  
33) Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15–20.
 
34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxi ­
kologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.  
35) ISO 11268-2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
36) Jaenike J (1982). „ Eisenia foetida “ is two biological species. Megadrilogica 
4: 6–8.  
37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090.
 
38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.  
39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong 
A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of poly ­
cyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligochaeta) 
in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 
22: 767–775.  
40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.  
41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Compa ­
rison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
 
42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.  
43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, 137 pp.  
44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.  
45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accu ­
mulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26.  
46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
48) Kapitola C.8 této p řílohy - Toxicita pro žížaly.  
49) Kapitola C.13 této p řílohy - Bioakumulace: pr ůtoková zkouška na rybách.  
50) Kapitola C.21 této p řílohy - P ůdní mikroorganismy: zkouška na transfor ­
maci dusíku.  
51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.  
52) OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia 
Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris.  
53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
 
54) Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.  
55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook Ecotoxicology Vol. 1. 
Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.  
56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- 
Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.  
57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.  
59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulation ­
stests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an inter ­
national ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
 
61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & 
Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.  
62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, 
Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127.
 
63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
 
64) Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413–433.
 
65) Schmelz R and Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93–100.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
66) Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
 
68) Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.  
69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins 
RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxico ­
logy. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac 
Press, Pensacola, 67–81.
 
70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. Toxi ­
col. Chemistry 22: 1167–1171.
 
71) UBA (Umweltbundesamt, 1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of 
sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, 
MN, March 2000.  
73) Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277–285.  
74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxi ­
city of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
75) Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. 
Chemosphere 21: 1023–1033.  
76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.  
77) Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.  
78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated floodplain 
soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
 
79) Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Dodatek 1  
DEFINICE  
Bioakumulace  je nárůst koncentrace zkoušené chemické látky v organismu nebo 
na něm vzhledem ke koncentraci zkoušené chemické látky v okolním médiu. 
Bioakumulace je výsledkem biokoncentra čních a bioobohacovacích proces ů (viz 
níže).  
Biokoncentrace  je nárůst koncentrace zkoušené chemické látky v organismu 
nebo na n ěm příjmem zkoušené chemické látky výhradn ě z okolního média (tj. 
povrchem t ěla a ingescí p ůdy) vzhledem ke koncentraci zkoušené chemické látky 
v okolním médiu.  
Bioobohacování  je nárůst koncentrace zkoušené chemické látky v organismu 
nebo na n ěm hlavně příjmem kontaminované potravy nebo ko řisti vzhledem ke 
koncentraci zkoušené chemické látky v této potrav ě nebo kořisti. Bioobohacování 
může vést k p řestupu nebo akumulaci zkoušené látky v potravních řetězcích.  
Vylučování  zkoušené chemické látky je úbytek této chemické látky z tkán ě 
zkoušeného organismu na základ ě aktivních nebo pasivních proces ů, ke kterému 
dochází nezávisle na p řítomnosti nebo nep řítomnosti zkoušené položky 
v okolním médiu.  
Bioakumula ční faktor  (BAF) je koncentrace zkoušené látky ve zkoušeném 
organismu nebo na n ěm (C  a v g/kg suché hmotnosti červů) dělená koncentrací 
chemikálie v okolním médiu (C  s jako g/kg suché hmotnosti p ůdy), a to kdykoliv 
ve fázi příjmu při této bioakumula ční zkoušce. Jednotkou BAF je kg p ůdy·na kg 
červů. 
Bioakumula ční faktor v ustáleném stavu  (BAF  SS ) je BAF v ustáleném stavu 
a po dlouhou dobu se výrazn ě nemění; koncentrace zkoušené látky v okolním 
médiu (C  s jako g/kg suché hmotnosti p ůdy) je po tuto dobu konstantní.  
Biokoncentra ční faktory  vypočtené přímo z pom ěru rychlostní konstanty p říjmu 
z půdy a rychlostní konstanty vylu čování (k  s a k e , viz níže) se nazývají kinetický 
bioakumula ční faktor (BAF  K ). 
Akumula ční faktor biota-p ůda (BSAF) je koncentrace zkoušené látky ve zkou ­ 
šeném organismu nebo na n ěm normalizovaná na lipidy, d ělená koncentrací 
zkoušené látky v p ůdě v ustáleném stavu normalizované na organický uhlík. 
C a se pak vyjád ří jako g/kg obsahu lipid ů v organismu a C  s jako g/kg obsahu 
organických látek v p ůdě; jednotkami BSAF jsou kg OC na ·kg lipidů. 
Plató  nebo  ustálený stav  je definován jako rovnováha mezi procesem p říjmu 
a vylučování, k n ěmuž dochází p ři fázi expozice sou časně. Ustáleného stavu je 
dosaženo tehdy, je-li p ři grafickém znázorn ění křivka časové závislosti BAF 
rovnoběžná s časovou osou a t ři po sobě jdoucí analýzy BAF vzork ů odebraných 
v intervalech alespo ň dvou dnů se neliší více než o ±20 % a není-li mezi t ěmito 
třemi dobami odb ěru žádný statisticky významný rozdíl. V p řípadě zkoušených 
látek, jejichž p říjem probíhá pomalu, jsou vhodn ější sedmidenní intervaly (49).  
Rozdělovací koeficient organický uhlík/voda  (K  oc ) je rovnovážný pom ěr mezi 
koncentrací chemické látky ve/na frakci organického uhlíku v p ůdě a koncentrace 
chemické látky ve vod ě. 
Rozdělovací koeficient n-oktanol/voda  (K  ow ) je rovnovážný pom ěr mezi 
rozpustností chemické látky v n-oktanolu a ve vod ě (někdy se ozna čuje také 
jako P  ow) . Logaritmus hodnoty K  ow (log K  ow ) se používá jako ukazatel poten ­
ciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Expozice nebo fáze p říjmu  je časový úsek, b ěhem něhož jsou zkoušené orga ­
nismy vystaveny p ůsobení zkoušené chemické látky.  
Rychlostní konstanta p říjmu z půdy (k s ) je číselná hodnota definující rychlost 
nárůstu koncentrace zkoušené položky ve zkoušených organismech nebo na nich 
v důsledku příjmu z půdní fáze. k  s se vyjadřuje v g p ůdy na kg červů za den.  
Vylučovací fáze je  časový úsek po p řemístění zkušebních organism ů 
z kontaminovaného média do média, které zkoušenou látku neobsahuje, b ěhem 
něhož se studuje vylu čování chemické látky ze zkušebních organism ů (nebo její 
čistý úbytek v nich).  
Rychlostní konstanta vylu čování  (k  e ) je číselná hodnota definující rychlost 
poklesu koncentrace zkoušené látky ve zkoušeném organismu nebo na n ěm po 
přemístění zkoušených organism ů z média obsahujícího zkoušenou látku do 
média, které neobsahuje chemické látky; k  e je vyjádřeno jako číselná hodnota 
za den.  
Zkoušená chemická látka:  jakákoliv látka nebo sm ěs testovaná pomocí této 
zkušební metody.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Dodatek 2  
Výpočet parametr ů příjmu a vylu čování  
Hlavním koncovým bodem bioakumula ční zkoušky je bioakumula ční faktor 
BAF. Měřený BAF lze vypo čítat tak, že se koncentrace ve zkušebním organismu 
C a , vydělí koncentrací v p ůdě C s v ustáleném stavu. Pokud není ustáleného stavu 
dosaženo b ěhem fáze p říjmu, vypo čte se BAF  K z rychlostních konstant místo 
BAF  SS . Je však t řeba zaznamenat, zda je BAF založen na koncentracích 
v ustáleném stavu či nikoli.  
Obvyklou metodou pro získání hodnoty kinetického bioakumula čního faktoru 
(BAF  K ), rychlostní konstanty p říjmu (k  s ) a rychlostní konstanty vylu čování 
(k e ) jsou metody nelineárního odhadu parametr ů s využitím po čítače, např. na 
základě modelů popsaných v odstavci (68). Na základ ě souboru po sob ě jdoucích 
údajů o koncentracích a modelových rovnic: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [rovnice 1]  
nebo 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [rovnice 2]  
kde: 
C a = koncentrace chemické látky v červech [g/kg hmotnosti ve vlhkém stavu 
nebo suché hmotnosti],  
k s = rychlostní konstanta p říjmu v tkáni [g p ůdy na kg červů za den],  
C s = koncentrace chemické látky v p ůdě [g/kg hmotnosti ve vlhkém stavu nebo 
suché hmotnosti],  
k e = rychlostní konstanta vylu čování [1/d],  
t c = čas konce fáze p říjmu.  
Tyto počítačové programy vypo čtou hodnoty BAF  K , k s a k e . 
V případě, že se koncentrace neexponovaných červů například v den 0 významn ě 
liší od nuly (k tomu m ůže dojít nap říklad v p řípadě kovů), měla by být tato 
koncentrace v pozadí (C  a,0 ) zahrnuta do uvedených rovnic takto: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [rovnice 3]  
a 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [rovnice 4]  
V případech, kdy dojde v pr ůběhu času během fáze p říjmu k významnému 
poklesu koncentrace zkoušené chemické látky v p ůdě lze použít následující 
modely, nap ř. (67, 79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 
0 t Þ [rovnice 5]  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
kde: 
C s = koncentrace chemické látky v p ůdě [g/kg hmotnosti ve vlhkém stavu 
nebo suché hmotnosti],  
k 0 = rychlostní konstanta rozkladu v p ůdě [1/d],  
C 0 = počáteční koncentrace chemické látky v p ůdě [g/kg hmotnosti ve vlhkém 
stavu nebo suché hmotnosti]. 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [rovnice 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [rovnice 7]  
kde: 
C a = koncentrace chemické látky v červech [g na kg hmotnosti ve vlhkém 
stavu nebo suché hmotnosti],  
k s = rychlostní konstanta p říjmu v tkáni [g p ůdy na kg červů za den],  
k 0 = rychlostní konstanta rozkladu v p ůdě [1/d],  
k e = rychlostní konstanta vylu čování [1/d],  
t c = čas konce fáze p říjmu.  
Když je b ěhem fáze p říjmu dosaženo ustáleného stavu (tj. t = ∞), rovnice 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [rovnice 1]  
může být zjednodušena na rovnici:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
nebo 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [rovnice 8]  
Pak k  s /k e x C  s je přiblížením ke koncentraci zkoušené látky ve tkáni červů 
v ustáleném stavu (C  a,ss ). 
Akumulační faktor biota-p ůda (BSAF) lze vypo čítat následovn ě: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [rovnice 9]  
kde f  oc je frakcí organického uhlíku v p ůdě a f  lip je frakcí lipid ů v červech, obojí 
v optimálním p řípadě stanoveno na vzorcích odebraných p ři zkoušce bu ď na 
základě hmotnosti po vysušení (f  oc ) nebo živé váhy (f  lip ). 
Kinetiku vylu čování lze modelovat pomocí dat z fáze vylu čování za použití níže 
uvedené modelové rovnice a metody nelineárního odhadu parametr ů s využitím 
počítače. Pokud data vynesená do grafu proti času indikují konstantní exponen ­
ciální pokles koncentrace zkoušené látky u zví řat, lze použít k popisu časového 
průběhu vylučování model s jedním kompartmentem (rovnice 9). 
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [rovnice 10]  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Procesy vylu čování se n ěkdy jeví jako dvoufázové, nebo ť vykazují rychlý pokles 
C a během raných fází, který se v pozd ějších fázích vylu čování zm ění na poma ­
lejší úbytek zkoušených látek, nap ř. (27) (68). Tyto dv ě fáze mohou být inter ­
pretovány na základ ě předpokladu, že v organismu existují dva r ůzné kompart ­
menty, z nichž dochází k úbytku zkoušené látky odlišnou rychlostí. V t ěchto 
případech je nutno studovat specifickou literaturu, nap ř. (38, 39, 40, 78).  
Pomocí výše uvedených modelových rovnic lze rovn ěž zároveň vypočítat kine­
tické parametry (k  s a k e ) uplatněním modelu kinetiky prvního řádu na všechna 
data z fáze p říjmu a z fáze vylu čování sou časně. Popis metody, která by mohla 
umožnit takovýto kombinovaný výpo čet rychlostních konstant p říjmu 
a vylučování, lze nalézt v odkazech (41, 73 a 70). 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[rovnice 11]  
Poznámka:  Pokud se parametry p říjmu a vylu čování odhadují sou časně 
z kombinovaných dat o p říjmu a vylu čování, je hodnota „m“ 
uvedená v rovnici 11 deskriptorem, který umož ňuje počítačovému 
programu p řiřadit dílčí členy rovnice datovým sadám p říslušné fáze 
a provést správné vyhodnocení (m = 1 pro fázi p říjmu, m = 2 pro 
fázi vylučování).  
Tyto modelové rovnice je však nutno užívat obez řetně, zvláště v případě změn 
biologické dostupnosti zkoušené chemické látky nebo (bio) rozkladu, k nimž 
dojde během zkoušky (viz nap ř. (79)).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Dodatek 3  
PŘÍKLADY HARMONOGRAM Ů ZKOUŠEK BIOAKUMULACE 
V PŮDĚ 
Zkouška na žížalách  
a) Fáze p říjmu s 8 daty odb ěrů vzorků užitými pro výpo čet kinetiky  
Den Činnost  
– 6 kondicionování p řipravené p ůdy po dobu 48 hodin 
– 4 vmíchání roztoku zkoušené chemické látky do p ůdní frakce, 
odpaření případného rozpoušt ědla, promísení p ůdních složek, 
rozdělení půdy do zkušebních nádob, ustavování rovnováhy p ři 
zkušebních podmínkách po dobu 4 dn ů (3 týdny u p ůdy 
obohacené kovem) 
– 3 až – 1 odd ělení zkušebních organism ů z kultury za ú čelem aklimatizace; 
příprava a zvlh čení půdních složek, 
0 m ěření teploty a pH p ůdy, odstra ňování vzork ů půdy ze 
zkušebních nádob a kontrola rozpoušt ědel pro stanovení 
koncentrace zkoušené chemické látky, dopln ění krmné dávky, 
zvážení a náhodné rozd ělení červů do zkušebních nádob, 
zachování dostate čných dílčích vzork ů červů pro stanovení 
analytických hodnot pozadí, hmotnosti ve vlhkém stavu a suché hmotnosti a obsahu lipid ů, zvážení všech zkušebních nádob za 
účelem kontroly vlhkosti p ůdy, kontrola p řívodu vzduchu, pokud 
je užit uzav řený zkušební systém 
1 kontrola p řívodu vzduchu, zaznamenání chování červů a teploty, 
odebrání vzork
ů půdy a červů za účelem stanovení koncentrace 
zkoušené položky 
2 stejný jako 1. den 3 kontrola p řívodu vzduchu, chování červů a teploty 
4 stejný jako 1. den 
5–6 stejný jako 3. den 
7 stejný jako 1. den; dopln ění krmné dávky, kontrola vlhkosti p ůdy 
převážením zkušebních nádob a dopln ění odpařené vody 
8–9 stejný jako 3. den 
10 stejný jako 1. den 
11–13 stejný jako 3. den 
14 stejný jako 1. den; dopln ění krmné dávky, kontrola vlhkosti p ůdy 
převážením zkušebních nádob a dopln ění odpařené vody 
15–16 stejný jako 3. den 
17 stejný jako 1. den 
18–20 stejný jako 3. den
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Den Činnost  
21 stejný jako 1 den; m ěření teploty a pH p ůdy, kontrola vlhkosti 
půdy převážením zkušebních nádob, ukon čení fáze p říjmu, 
přenesení červů ze zbývajících exponovaných paralelních nádob 
do nádob obsahujících čistou půdu pro fázi eliminace (bez 
vyprázdnění střev), odběr vzorků půdy a červů z rozpoušt ědlové 
kontroly 
adaptační činnosti (fáze ustavování rovnováhy) by m ěly být 
naplánovány s ohledem na vlastnosti zkoušené chemické látky 
činnosti popsané pro 3. den by se m ěly provád ět denně (alespoň 
v pracovní dny).  
b) Fáze vylu čování  
Den Činnost  
– 6 p říprava a zvlh čení půdních složek, kondicionování p řipravené 
půdy po dobu 48 hodin 
– 4 smísení p ůdních složek, rozd ělení půdy do zkušebních nádob, 
inkubace p ři zkušebních podmínkách po dobu 4 dn ů 
0 (konec fáze 
příjmu) měření teploty a pH p ůdy, vážení a náhodné rozd ělení červů do 
zkušebních nádob, dopln ění krmné dávky, p řemístění červů ze 
zbývajících exponovaných paralelních vzork ů do nádob obsahu ­
jících čistou půdu, odebrání vzork ů půdy a červů po 4–6 hodi ­
nách za ú čelem stanovení koncentrace zkoušené chemické látky 
1 kontrola p řívodu vzduchu, zaznamenání chování červů a teploty, 
odebrání vzork ů půdy a červů za účelem stanovení koncentrace 
zkoušené chemické látky 
2 stejný jako 1. den 3 kontrola p řívodu vzduchu, chování červů a teploty 
4 stejný jako 1. den 
5–6 stejný jako 3. den 
7 stejný jako 1. den; dopln
ění krmné dávky, kontrola vlhkosti p ůdy 
převážením zkušebních nádob a dopln ění odpařené vody 
8–9 stejný jako 3. den 
10 stejný jako 1. den 
11–13 stejný jako 3. den 
14 stejný jako 1. den; dopln ění krmné dávky, kontrola vlhkosti p ůdy 
převážením zkušebních nádob a dopln ění odpařené vody 
15–16 stejný jako 3. den 
17 stejný jako 1. den  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Den Činnost  
18–20 stejný jako 3. den 
21 stejný jako 1. den; m ěření teploty a pH p ůdy; kontrola vlhkosti 
půdy převážením zkušebních nádob; odb ěr vzorků půdy a červů 
z kontrol rozpoušt ědla 
příprava půdy před zahájením fáze vylu čování by m ěla být 
provedena stejným zp ůsobem jako p řed fází příjmu. 
činnosti popsané pro 3. den by se m ěly provád ět denně (alespoň 
v pracovní dny)  
Zkouška na roupicích  
a) Fáze p říjmu s 8 daty odb ěrů vzorků užitými pro výpo čet kinetiky  
Den Činnost  
– 6 kondicionování p řipravené p ůdy po dobu 48 hodin 
– 4 vmíchání roztoku zkoušené chemické látky do p ůdní frakce, 
odpaření případného rozpoušt ědla, promísení p ůdních složek, 
rozdělení půdy do zkušebních nádob, ustavování rovnováhy p ři 
zkušebních podmínkách po dobu 4 dn ů (3 týdny u p ůdy 
obohacené kovem) 
– 3 až – 1 odd ělení zkušebních organism ů z kultury za ú čelem aklimatizace; 
příprava a zvlh čení půdních složek 
0 m ěření teploty a pH p ůdy, odstra ňování vzork ů půdy ze 
zkušebních nádob a kontrola rozpoušt ědel pro stanovení 
koncentrace zkoušené chemické látky, dopln ění krmné dávky do 
půdy, zvážení a náhodné rozd ělení červů do zkušebních nádob, 
zachování dostate čných dílčích vzork ů červů pro stanovení 
analytických hodnot pozadí, hmotnosti ve vlhkém stavu a suché hmotnosti a obsahu lipid ů, zvážení všech zkušebních nádob za 
účelem kontroly vlhkosti p ůdy, kontrola p řívodu vzduchu, pokud 
je užit uzav řený zkušební systém 
1 kontrola p řívodu vzduchu, zaznamenání chování červů
 a teploty, 
odebrání vzork ů půdy a červů za účelem stanovení koncentrace 
zkoušené položky 
2 stejný jako 1. den 3 kontrola p řívodu vzduchu, zaznamenání chování červů a teploty 
4 stejný jako 1. den 
5–6 stejný jako 3. den 
7 stejný jako 1. den; dopln ění krmné dávky do p ůdy, kontrola 
vlhkosti p ůdy převážením zkušebních nádob a dopln ění odpařené 
vody 
9 stejný jako 1. den 
10 stejný jako 3. den
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Den Činnost  
11 stejný jako 1. den 
12–13 stejný jako 3. den 
14 stejný jako 1. den; dopln ění krmné dávky do p ůdy, měření 
teploty a pH p ůdy, kontrola vlhkosti p ůdy převážením zkušeb ­
ních nádob, ukon čení fáze p říjmu, přenesení červů ze zbývajících 
exponovaných paralelních nádob do nádob obsahujících čistou 
půdu pro fázi vylu čování (bez vyprázdn ění střev), odběr vzorků 
půdy a červů z rozpoušt ědlové kontroly 
adaptační činnosti (fáze ustavování rovnováhy) by m ěly být 
naplánovány s ohledem na vlastnosti zkoušené chemické látky 
činnosti popsané pro 3. den by se m ěly provád ět denně (alespoň 
v pracovní dny)  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Dodatek 4  
Umělá půda – doporu čení pro p řípravu a skladování  
Vzhledem k tomu, že p řírodní půda z určitého zdroje nemusí být k dispozici po 
celý rok a zkoušku mohou ovlivnit p ůvodní organismy i p řítomnost mikrosko ­
pických zne čišťujících látek, doporu čuje se použít p ři této zkoušce um ělý 
substrát, um ělou půdu podle kapitoly C.8 této p řílohy – Toxicita pro žížaly 
(48). V této p ůdě může přežít, růst a rozmnožovat se více zkušebních testovacích 
druhů a je zajišt ěna maximální standardizace i zkušební a kultiva ční podmínky 
srovnatelné vnitrolaboratorn ě i mezilaboratorn ě. 
Složky půdy 
Rašelina: 10 % Sfagnová rašelina v souladu se sm ěrnicí 
OECD č. 207 (48); 
Křemenný písek: 70 % Pr ůmyslový k řemenný písek (vysušený na 
vzduchu); velikost částic: více než 50 % 
částic by se m ěla pohybovat v rozp ětí 
50–200 μm, ale všechny částice by m ěly být 
≤ 2 mm 
Kaolinitický jíl 20 % Obsah kaolinitu ≥ 30 % 
Uhličitan vápenatý ≤ 1 % CaCO  3 , práškový, chemicky čistý 
Obsah organického uhlíku v um ělé půdě lze podle pot řeby snížit nap říklad 
snížením obsahu rašeliny na 4–5 % suché p ůdy a odpovídajícím zvýšením 
obsahu písku. Takovým snížením obsahu organického uhlíku se m ůže snížit 
schopnost adsorpce zkoušené chemické látky (organický uhlík), do p ůdy 
a dostupnost zkoušené chemické látky pro červy se m ůže zvýšit (74). Bylo 
prokázáno, že  Enchytraeus albidus  a Eisenia fetida  mohou splnit kritéria validity 
pro reprodukci p ři testování v polních p ůdách s nižším obsahem organického 
uhlíku, nap ř. 2,7 % (33), (61), a dle zkušenosti toho lze dosáhnout i v um ělé 
půdě s 5 % obsahem rašeliny.  
Příprava  
Suché složky p ůdy se důkladně promísí (nap ř. ve velké laboratorní mícha čce). To 
by mělo být provedeno p řibližně týden před zahájením zkoušky. Smíchané suché 
složky půdy by se m ěly navlhčit deionizovanou vodou minimáln ě 48 hodin p řed 
aplikací zkoušené chemické látky, aby se vyrovnala/stabilizovala kyselost. Hodnota pH se m ěří po smíchání p ůdy s roztokem 1M KCl v pom ěru 1:5. 
Pokud není hodnota pH v požadovaném rozsahu (6,0 ± 0,5), musí se do p ůdy 
přidat dostate čné množství CaCO
 3 nebo se musí p řipravit nová šarže p ůdy. 
Maximální vodní kapacita (WHC) v um ělé půdě se stanoví v souladu s normou 
ISO 11268-2 (35). Nejmén ě dva dny p řed započetím zkoušky se suchá um ělá 
půda zvlhčí přídavkem dostate čného množství deionizované nebo rekonstitu ­
ované vody, aby bylo dosaženo p řibližně poloviny výsledného obsahu vody. 
Výsledný obsah vody by se m ěl rovnat 40 % až 60 % maximální vodní kapacity. 
Na začátku zkoušky se navlh čená půda rozdělí do tolika dávek, kolik je zkušeb ­
ních koncentrací a kontrol p ři zkoušce, a obsah vlhkosti se upraví na 40–60 % 
WHC  max pomocí roztoku zkoušené chemické látky a/nebo p řidáním deionizované 
nebo rekonstituované vody. Obsah vlhkosti se stanoví na za čátku a na konci 
zkoušky (p ři 105 °C). M ěl by optimáln ě vyhovovat pot řebám jednotlivých 
druhů (obsah vlhkosti lze rovn ěž ověřit lehkým stla čením rukou a mezi prsty 
by se měly objevit pouze malé kapi čky vody).  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Uchovávání  
Suché složky um ělé půdy mohou být uchovávány p ři pokojové teplot ě až do 
použití. P řipravenou p ředvlhčenou půdu lze skladovat v chladu po dobu až t ří 
dnů před vmícháním; je t řeba dbát na minimalizaci odpa řování vody. P ůda 
obohacená zkoušenou látkou by m ěla být použita bezprost ředně, pokud nejsou 
k dispozici informace o tom, že tuto ur čitou půdu lze skladovat bez vlivu na 
toxicitu a biologickou dostupnost zkoušené chemické látky. Vzorky obohacené půdy pak mohou být uchovány za podmínek doporu čených pro konkrétní zkou ­ 
šenou látku až do provedení analýzy.
 ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Dodatek 5  
Druhy terestrických málošt ětinatců doporučené pro zkoušky bioakumulace 
z půdy 
Žížaly  
Doporučeným zkušebním druhem je  Eisenia fetida  (Savigny 1826), pat řící do 
čeledi Lumbricidae. Od roku 1972 je rozd ělen do dvou poddruh ů (Eisenia fetida  
and Eisenia andrei  (10)). Podle Jaenikeho (36) se jedná o samostatné odd ělené 
druhy.  Eisenia fetida  je snadno rozpoznatelná podle jasn ě žlutých pruh ů na 
článcích, zatímco  Eisenia andrei  má jednolitou tmav ě červenou barvu. Oba 
druhy pravd ěpodobně pocházejí z černomořské oblasti a dnes jsou rozší řeny 
po celém sv ětě, zejména v antropogenn ě modifikovaných p řírodních stanovištích, 
jako jsou hromady kompostu. Oba tyto druhy lze použít pro ekotoxikologické 
zkoušky i pro zkoušky bioakumulace.  
Eisenia fetida  a Eisenia andrei  jsou komer čně dostupné, nap ř. jako rybí návnada 
Ve srovnání s jinými druhy z čeledi žížalovitých mají krátký životní cyklus, 
dosahují dosp ělosti za p řibližně 2–3 měsíce (při pokojové teplot ě). Jejich opti ­
mální teplota je p řibližně 20 až 24 °C. Dávají p řednost relativn ě vlhkým 
substrátům s tém ěř neutrálním pH a vysokým obsahem organických látek. 
Vzhledem k široce rozší řenému využívání t ěchto druh ů ve standardizovaných 
ekotoxikologických zkouškách po dobu již asi 25 let je jejich kultivace dob ře 
zavedena (48, 77).  
Oba druhy lze chovat v celé řadě zvířecích exkrement ů. Chovné médium, které 
doporučuje ISO (35) je 50:50 sm ěs koňského nebo hov ězího hnoje a rašeliny. 
Médium musí mít pH asi 6 až 7 (upraví se uhli čitanem vápenatým) a nízkou 
iontovou vodivost (mén ě než 6 mS/cm nebo koncentraci solí nižší než 0,5 %), 
a nemělo by být p říliš znečištěno amoniakem nebo zví řecí močí Lze použít 
rovněž komerční zahradní zeminu bez p řísad nebo um ělou půdu podle OECD 
(48), nebo jejich sm ěs v poměru 50:50. Substrát musí být vlhký, ale ne p říliš 
mokrý. Jako chovné nádoby jsou vhodné nádoby o objemu 10 až 50 litr ů. 
Pro získání červů standardního stá ří a hmotnosti je nejlépe založit kulturu se 
zámotky. Dosp ělí červi se proto vloží do chovné nádoby obsahující čerstvý 
substrát umož ňující vytvo ření zámotk ů. Praktické zkušenosti ukázaly, že 
k dobrým hodnotám reprodukce vede hustota populace p řibližně 100 dosp ělých 
červů na 1 kg substrátu (hmotnost ve vlhkém stavu). Po 28 dnech se dosp ělí 
červi vyjmou. Žížaly vylíhlé ze zámotk ů se použijí ke zkoušení poté, co dosp ějí 
(nejméně po dvou, ale po mén ě než dvanácti m ěsících).  
Červy výše popsaných druh ů lze považovat za zdravé, pokud se v substrátu 
pohybují, nepokoušejí se ze substrátu uniknout a nep řetržitě se rozmnožují. 
Velmi pomalý pohyb nebo žlutý zadní konec v p řípadě Eisenia fetida ) svědčí 
o vyčerpání substrátu. V takovém p řípadě se doporu čuje použít čerstvý substrát 
a/nebo snížit po čet živočichů v nádob ě. 
Další vybrané odkazy  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
 
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1-171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331–338 pp.
 
Roupice  
Doporučovaným zkušebním druhem je  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (roupice 
bělavá).  Enchytraeus albidus  je jeden z nejv ětších druh ů roupic (m ěří až 15 mm) 
z čeledi  Enchytraeidae , řádu Oligochaeta , kmene  Annelida  a je celosv ětově 
rozšířen, např. (8).  Enchytraeus albidus  lze nalézt v mo řském, sladkovodním 
a suchozemském prost ředí, zejména v rozkládajícím se organickém materiálu 
(chaluhách, kompostu) a pouze z řídkakdy na loukách (42). Tato široká ekolo ­
gická tolerance a n ěkteré morfologické prom ěny nazna čují, že tento druh m ůže 
tvořit několik ras.  
Enchytraeus albidus  lze získat komer čně, protože se prodává jako krmivo pro 
ryby. Mělo by se ov ěřit, zda není kultura kontaminována jinými, obvykle 
menšími druhy (60). Pokud se zne čištění objeví, omyjí se všechny roupice 
vodou v Petriho misce. Pomocí stereomikroskopu se následn ě vyberou velké 
dospělé exemplá ře Enchytraeus albidus  jako po čátek nové kultury. Všechny 
ostatní roupice se vy řadí. Tato roupice má krátký životní cyklus: dosp ělosti 
dosahuje mezi 33 dny (p ři 18 °C) až 74 dny (p ři 12 °C). Pro zkoušku mohou 
být použity pouze kultury, které byly bez problém ů udržovány v laboratorních 
podmínkách minimáln ě 5 týdnů (jeden genera ční cyklus).  
Jako zkušební organismy jsou vhodné i další druhy rodu  Enchytraeus,  zejména  
Enchytraeus luxuriosus.  Tento druh je skute čným obyvatelem p ůdy, který byl 
nově popsán v (65). Pokud se použijí jiné druhy  Enchytraeus , musí být jasn ě 
identifikovány a musí být logicky zd ůvodněna volba druhu.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) je druh, který náleží ke stejné 
skupině jako  Enchytraeus luxuriosus . Dosud nebylo s jistotou zjišt ěno, zda exis ­
tuje ve volné p řírodě, neboť byl popsán pouze v kulturách žížal a hromadách 
kompostu (Römbke 2003). Jeho p ůvodní ekologické požadavky proto nejsou 
známy. Nedávné laboratorní studie r ůzných polních p ůd však potvrdily, že 
tento druh má širokou toleranci k vlastnostem p ůdy, jako je pH a struktura 
(Jänsch et al. 2005). Vzhledem k jednoduchosti jeho chovu a postupu zkoušení 
se v posledních letech tento druh velmi často používá p ři ekotoxikologických 
studiích, nap ř. Kuperman et al. 2003). Avšak malá velikost (3–12 mm; 
v průměru 7 mm (Westheide & Müller 1996), je d ůvodem obtížn ější manipulace 
s ním než s  Enchytraeus albidus . Je-li použit tento druh namísto druhu  Enchy­
traeus albidus , lze použít menší zkušební nádobu, není to však povinností. Navíc 
je potřeba vzít v úvahu, že tento druh se velmi rychle rozmnožuje – doba jeho 
reprodukce je kratší než 20 dn ů při teplotě 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) a p ři 
vyšších teplotách ješt ě kratší.  
Enchytraeidae druhu  Enchytraeus albidus  (právě tak jako jiné druhy  Enchytraeus  
sp.) je možno chovat ve velkých plastových boxech (nap ř. 30×60×10 cm nebo 
20×12×8 cm, který je vhodn ější pro pěstování menších červů) naplněných směsí 
umělé půdy a komer čně dostupné p řírodní nezne čištěné zahradní p ůdy. Kompos ­
tovaný materiál by se nem ěl používat, protože by mohl obsahovat toxické 
chemické látky, jakými jsou t ěžké kovy. P řed použitím by m ěla být z chovné 
půdy odstran ěna veškerá fauna trojnásobným hlubokým zmrazením. Je možné 
použít také nezne čištěnou umělou půdu, ale ve srovnání s míchanými substráty 
by reprodukce mohla být pomalejší. Substrát by m ěl mít pH 6,0 ± 0,5. Kultura se 
udržuje v inkubátoru ve tm ě při teplotě 15 ± 2 °C. V každém p řípadě by teplota 
neměla být vyšší než 23 °C. Um ělá/přírodní půda by m ěla být vlhká, ale ne 
mokrá. Pokud se p ůda jemně stlačí rukou, m ěly by se objevit pouze malé 
kapičky vody. V každém p řípadě by se m ělo zabránit vzniku anaerobních 
podmínek (nap ř. pokud se použije ví čko, mělo by mít dostate čný počet otvorů, 
který umožní dostate čnou výměnu vzduchu). Chovný substrát by m ěl být jednou 
týdně provzduš ňován opatrným promícháváním.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Roupice se krmí nejmén ě jednou týdn ě ad libitum ovesnými vlo čkami, které se 
umístí do dutiny na povrchy p ůdy a přikryjí se p ůdou. Pokud v nádob ě zbude 
potrava od posledního krmení, m ělo by se dodávané množství potravy odpoví ­
dajícím zp ůsobem upravit. Pokud na zbylé potrav ě rostou plísn ě, měla by se 
nahradit novou dávkou ovesných vlo ček. Pro stimulaci reprodukce se do oves ­
ných vloček může každé dva týdny p řidat komer čně dostupný proteinový prášek 
s příměsí vitamin ů. Po třech měsících se živo čichové přemístí do čerstvě připra­
vené kultury nebo chovného substrátu. Ovesné vlo čky, které se uchovávají 
v utěsněných nádobách, by se m ěly před použitím autoklávovat nebo zah řát, 
aby se zabránilo infikování rozto či (např. Glyzyphagus  sp., Astigmata, Acarina) 
nebo dravými rozto či (např. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , Gamasida, Acari ­
na). Po dezinfekci se potrava rozdrtí, takže ji lze snadno rozsypat po povrchu půdy. Dalším možným zdrojem potravy jsou peka řské kvasnice nebo krmení pro 
ryby TetraMin  ® . 
Obecně jsou podmínky pro kultivaci dostate čné, pokud se roupice nepokoušejí 
uniknout ze substrátu, pohybují se p ůdou rychle, povrch jejich t ěla je lesklý bez 
ulpělých částic půdy, mají vícemén ě bělavé zabarvení a jsou viditelné roupice 
různého stá ří. Roupice lze považovat za zdravé, pokud se nep řetržitě rozmnožují.  
Další vybrané odkazy  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing 
success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.  
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. 
Reviews 13: 51–83.  
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
 
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607–616.  
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.  
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.  ▼M4 2008R0440 — CS — 24.08.2014 — 005.001 — 1467