10.

Příloha IV se nahrazuje tímto:



„PŘÍLOHA IV STANOVENÍ OBSAHU VOSKU KAPILÁRNÍ PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ 1. PŘEDMĚT Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu a složení vosku v různých olejích a tucích při testovacích podmínkách. Tento postup lze použít zejména k rozlišení mezi olivovým olejem získaným lisováním a extrakcí (olivový olej z pokrutin). 2. PODSTATA METODY K tuku nebo oleji se přimísí vhodný vnitřní standard a poté se provádí chromatografická frakční destilace na hydratované silikagelové koloně. Získaná frakce eluovaná nejprve při testovacích podmínkách (jejíž polarita je menší než polarita triglyceridů) se přímo analyzuje pomocí kapilární plynové chromatografie. 3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY 3.1. Kónická 25ml baňka. 3.2. Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 15 mm a délce 30 až 40 cm. 3.3. Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a vybavený přímým vstřikováním, obsahující následující části: 3.3.1 Termostaticky ovládatelná kolonová komora, nastavitelná na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C. 3.3.2. Studené nástřikové zařízení pro přímé zavádění do kolony. 3.3.3. Plameno-ionizační detektor a konverzní zesilovač. 3.3.4. Integrátor se zapisovačem, vhodný pro provoz s konverzním zesilovačem (3.3.3.), s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru. 3.3.5. Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 10 až 15 mm s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi SE-52 nebo SE-54 nebo ekvivalentní, o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm. 3.4. Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou. 4. CHEMIKÁLIE 4.1. Silikagel, 70/230 mesh, článek 7754 Merck. Silikagel se umístí na čtyři hodiny do pouzdrové (muflové) pece o teplotě 500 °C, nechá se ochladit a přidají se 2 % vody. Řádným protřepáním se směs homogenizuje. Před použitím se ponechá nejméně 12 hodin v temnotě. 4.2. n-hexan pro chromatografii. 4.3. Diethylether pro chromatografii. 4.4. n-heptan pro chromatografii. 4.5. Standardní roztok 0,1 % (m/V) laurylarachidátu v hexanu (vnitřní standard). 4.6. Nosný plyn: vodík, čistý pro plynovou chromatografii. 4.7. Pomocné plyny: — vodík, čistý pro plynovou chromatografii, — vzduch, čistý pro plynovou chromatografii. 5. POSTUP 5.1. Oddělení voskové frakce. 5.1.1 Příprava chromatografické kolony. 15 g silikagelu se doplní 2 % vody, suspenduje v bezvodém n-hexanu a zavede do kolony. Po spontánní sedimentaci se tato dokončí pomocí elektrického vibrátoru, aby byla chromatografická vrstva co nejhomogennější, a provede se perkolace 30 ml n-hexanu za účelem odstranění případných nečistot. 5.1.2. Kolonová chromatografie Do 25ml baňky se naváží přesně 500 mg vzorku a přidá se vhodné množství vnitřního standardu v závislosti na předpokládaném obsahu vosku, např. 0,1 mg laurylu arachidátu v případě olivového oleje a 0,25 až 0,5 mg v případě olivového oleje z pokrutin. Získaný vzorek se za pomoci dvou dávek 2 ml n-hexanu převede do chromatografické kolony připravené podle 5.1.1. Umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 mm nad horní úrovní absorbentu. Poté se zahájí chromatografické eluování; odejme se 140 ml směsi n-hexanu/éteru (99: 1) při průtoku přibližně 15 kapek za 10 sekund (2,1 ml/min). Získaná frakce se usuší v rotačním odpařovači, až je téměř všechno rozpouštědlo odstraněno. Poslední 2 nebo 3 ml rozpouštědla se odstraní za pomoci slabého proudu dusíku, poté se přidá 10 ml n-heptanu. 5.2. Plynová chromatografická analýza 5.2.1. Přípravné práce, kondicionace kolony. 5.2.1.1. Kolona se spojí s plynovým chromatografem, vstupní port se připojí ke kolonovému systému (on-column system) a výstupní port k detektoru. Poté se plynový chromatograf překontroluje (těsnost plynových vedení, funkce detektoru a záznamníku atd.). 5.2.1.2. Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20°C vyšší, než je provozní teplota (viz poznámka). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do předepsaných podmínek (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače, nastavení teploty kolonové komory, detektoru, injektoru atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony. Teplota kondicionace musí být nejméně o 20°C nižší než maximální teplota specifikovaná pro použité eluční činidlo. 5.2.2. Výběr pracovních podmínek. 5.2.2.1. Všeobecné pracovní podmínky jsou tyto: — teplota kolony: počáteční teplota 80 °C, nárůst po 30 °C/min do teploty 120 °C a pak se naprogramuje růst o 5 °C/min do teploty 340 °C, — teplota detektoru: 350 °C, — lineární rychlost nosného plynu: vodík, 20 až 35 cm/s, — citlivost přístroje: 4 až 16násobek minimálního útlumu, — citlivost detektoru: 1 až 2 mV z plného rozsahu, — rychlost posunu papíru: 30 cm/hod, — množství nastříknuté látky: 0,5 až 1 μl roztoku. Výše uvedené podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto podmínky: retenční čas vnitřního standardu C32 musí být 25 ± 2 minuty a nejreprezentativnější pík vosku musí dosáhnout 60 až 100 % z plného rozsahu. 5.2.2.2. Parametry pro integraci píků se nastaví tak, aby došlo ke správnému vyhodnocení ploch uvažovaných píků. 5.2.3. Provedení analýzy 5.2.3.1. Do 10μl mikrostříkačky se natáhne 1 μl roztoku; píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. 5.2.3.2. Zaznamenávání je prováděno, dokud vosky nejsou zcela eluovány. Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům odstavce (5.2.1.2). 5.2.4. Identifikace píků Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsmi vosků, jejichž retenční časy jsou známé a které byly analyzované za stejných podmínek. Chromatogram vosků panenského olivového oleje je znázorněn na obrázku 1. 5.2.5. Kvantitativní vyhodnocení 5.2.5.1. Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu a alifatickým esterům C40 až C46. 5.2.5.2. Obsah vosku jednotlivých esterů vyjádřený v mg/kg tukové látky se vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku příslušného esteru, As = plocha píku laurylu arachidátu, ms = hmotnost přidaného laurylu arachidátu v mg, m = hmotnost vzorku použitého pro stanovení v g. 6. VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ Uvádí se obsahy jednotlivých vosků a souhrn těchto obsahů v mg/kg tukové látky.



DODATEK Stanovení lineární rychlosti plynu Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se nastříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu a pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku vzniku píků (tM). Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas v sekundách, změřený stopkami.