ПРИЛОЖЕНИЕ I

Схема за изпитванията, които следва да се извършват съгласно членове 3, 4, 5 и 7

1. ОБЩИ ПРИНЦИПИ ОТНОСНО НАЛИЧИЕТО НА ПОСОЧЕНИЯ ВРЕДИТЕЛ

1.1. Има съмнение за наличие на посочения вредител, когато е получен положителен резултат от първия тест за откриване, извършен върху посоченото растение или върху проби от вода.

1.2. Наличието на посочения вредител се потвърждава в следните случаи: а) когато първият или вторият тест за откриване е селективна изолация, водеща до колонии с типична морфология, и са получени положителни резултати от два теста за идентификация, извършени върху колониите; б) когато първият и вторият тест са тестове, различни от селективна изолация, и са получени положителни резултати от два теста за идентификация, след като пробата е била подложена на селективна изолация, водеща до колонии с типична морфология. Един от тези два теста за идентификация следва да бъде тест измежду посочените в точка 2.2, букви д), е) и ж).

2. ТЕСТОВЕ

2.1. Тестове за откриване

Тестовете за откриване трябва да позволяват системното откриване на най-малко 104 клетки/ml повторно суспендирана утайка, получена от асимптоматични проби.

Вторият тест за откриване следва да се основава на биологични принципи или нуклеотидни участъци, различни от тези при първия тест за откриване.

Тестовете за откриване са, както следва:

а) имунофлуоресцентни тестове съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

б) изолиране на посочения вредител върху полуселективна среда mSMSA, съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

в) конвенционален PCR тест с използване на праймерите на Pastrik et al. (2002) (1), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

г) TaqMan® PCR тестове в реално време с използване на праймери и сонди на: i) Weller et al. (2000) (2), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (с използване на сонда TaqMan®, представляваща модификация на оригиналната сонда, описана от Weller et al. (2000), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (т.нар. NYtor тест), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; iv) Massart et al. (2014) (5), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

д) LAMP (примково-медиирана изотермична амплификация) тест с използване на праймерите на Lenarčič et al. (2014) (6) (само за симптоматичен растителен материал), съгласно описанието в международните диагностични стандарти.

2.2. Тестове за идентификация

Тестовете за идентификация са, както следва:

а) имунофлуоресцентни тестове съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

б) конвенционални PCR тестове с използване на праймерите на Pastrik et al. (2002), съгласно изчерпателното описание в международните диагностични стандарти;

в) TaqMan® PCR тестове в реално време с използване на праймери и сонди на: i) Weller et al. (2000), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; ii) Vreeburg et al. (2016) (с използване на сонда TaqMan®, представляваща модификация на оригиналната сонда, описана от Weller et al. (2000), съгласно изчерпателното описание в международните диагностични стандарти; iii) Vreeburg et al. (2018) (т.нар. NYtor тест), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; iv) Massart et al. (2014), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

г) LAMP (примково-медиирана изотермична амплификация) тест с използване на праймерите на Lenarčič et al. (2014), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

д) специфичен за филотипа мултиплексен конвенционален PCR тест (Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

е) баркодиране на ДНК (Wicker et al. (2007) (9)), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

ж) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al. (2018) (10)), съгласно описанието в международните диагностични стандарти.

3. СХЕМИ НА ПРОЦЕДУРИТЕ

Схема № 1: Диагностична процедура за наличие на посочения вредител в проби от посоченото растение

a Изолирането може да се използва като първи или втори тест за откриване. Ако има съмнение за наличие на посочения вредител в растежната среда, колониите се пречистват, за да се получат чисти култури, върху които се извършват два теста за идентификация.

б Един от тези два теста за идентификация следва да бъде тест измежду посочените в точка 2.2, букви д), е) и ж). За да се потвърди наличието на вредителя, са необходими положителни резултати и от двата теста за идентификация.

в Третият тест за откриване следва да се основава на различни биологични принципи или различни нуклеотидни участъци.

Схема № 2: Диагностична процедура за установяване на наличието на посочения вредител в проби от вода

a Един от тези два теста за идентификация следва да бъде тест измежду посочените в точка 2.2, букви д), е) и ж). За да се потвърди наличието на вредителя, са необходими положителни резултати и от двата теста за идентификация.

4. ПОДГОТОВКА НА ПРОБАТА

4.1. Проби от асимптоматични клубени

Стандартната проба за едно изпитване съдържа 200 клубена. Подходяща лабораторна процедура за обработка на сърцевините и надебеления край с цел получаване на екстракта за откриване на посочения вредител е описаната в международните диагностични стандарти.

4.2. Проби от асимптоматични посочени растения

Откриването на латентни инфекции се извършва върху съставни проби от стъблени сегменти или листни дръжки. Процедурата може да се прилага за не повече от 200 стъблени части или 200 листни дръжки от различни растения в една проба. Подходяща лабораторна процедура за дезинфекция и обработка на стъблените сегменти или на тези от листни дръжки с цел получаване на екстракта за откриване на посочения вредител е описаната в международните диагностични стандарти.

4.3. Проби от симптоматичен материал от посочените растения

Тъканните фрагменти се отстраняват асептично от проводящия пръстен на картофения клубен или от проводящите снопчета на стъблата от посочените растения, проявяващи симптоми на увяхване. Подходяща лабораторна процедура за обработка на тези тъкани с цел получаване на екстракта за откриване на посочения вредител е изчерпателно описаната в международните диагностични стандарти.

4.4. Проби от повърхностни или рециркулационни води (включително от преработка на картофи или отходни води)

Основен тест за откриване на посочения вредител в проби от повърхностни води, вода от рециркулационни системи и проби от отпадъчни води (картофена преработвателна промишленост) е селективната изолация. Подходящата лабораторна процедура за обработка на проби от вода е описана в международните диагностични стандарти.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014 г.). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19—30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the „Ralstonia solanacearum species complex“. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds Allen C, Hayward AC & Prior P), pp. 449–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.