BG Официален вестник на Европейския съюз 80

31988L0302



ОФИЦИАЛЕН ВЕСТНИК НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ

ДИРЕКТИВА НА КОМИСИЯТА

от 18 ноември 1987 година

относно девето адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/EИО на Съвета за сближаване на законовите, подзаконовите и административните разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества

(88/302/EИО)

КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,

като взе предвид Договора за създаване на Европейската икономическа общност,

като взе предвид Директива 67/548/EИО на Съвета от 27 юни 1967 г. за сближаване на законовите, подзаконовите и административните разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества (1), изменена за шести път с Директива 79/831/EИО (2), и по-специално член 19 от нея,

като има предвид, че член 3, параграф 1 от Директива 67/548/EИО предвижда, че физико-химичните свойства, токсичността и екотоксичността на веществата и препаратите се определят в съответствие с методите, посочени в приложение V;

като има предвид, че член 3, параграф 2 от Директива 67/548/EИО предвижда, че действителната или потенциална опасност на дадено вещество или препарат за околната среда се преценява в съответствие с характеристиките, посочени в приложения VII и VIII;

като има предвид, че приложение V към версията, въведена с Директива 84/449/EИО на Комисията (3), понастоящем описва само тези методи за изпитване, които съответстват на характеристиките, изброени в приложение VII, и че е необходимо освен това да бъдат описани методи за изпитване, съответстващи на характеристиките, изброени в приложение VIII;

като има предвид, че разпоредбите в настоящата директива са в съответствие със становището на Комитета по адаптиране към техническия прогрес на директивите за премахване на техническите пречки при търговията с опасни вещества и препарати,

ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:

Член 1

Текстът на приложението към настоящата директива допълва текста на приложение V към Директива 67/548/EИО.

Член 2

Държавите-членки приемат и публикуват разпоредбите, необходими за да се съобразят с настоящата директива, преди 31 декември 1988 г. и незабавно информират Комисията за това. Те прилагат тези разпоредби най-късно до 30 юни 1989 г.

Член 3

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.

Съставено в Брюксел на 18 ноември 1987 година. За Комисията Stanley CLINTON DAVIS Член на Комисията

(1) ОВ 196, 16.8.1967 г., стр. 1/67.

(2) ОВ L 259, 15.10.1979 г., стр. 10.

(3) ОВ L 251, 19.9.1984 г., стр. 1.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Методите за изпитване, описани в настоящото приложение, са предназначени за определяне на някои токсикологични и екотоксикологични свойства, изброени в приложение VIII към Директива 79/831/EИО на Съвета. Описани са методите за изпитване, подходящи за ниво 1 и ниво 2 от приложение VIII, но изпитванията не са подразделени като функция на различните нива.

СЪДЪРЖАНИЕ

ЧАСТ Б: Методи за определяне на токсичността …

Общо въведение: Част Б…

Изпитване за субхронична орална токсичност: 90-дневни многократни орални дози при гризачи …

Изпитване за субхронична орална токсичност: 90-дневни многократни орални дози при видове, различни от гризачи …

Изпитване за субхронична дермална токсичност: 90-дневни многократни дермални дози при гризачи…

Изпитване за субхронична инхалационна токсичност: 90-дневни многократни инхалационни дози при гризачи …

Изпитване за тератогенност – гризачи и видове, различни от гризачи …

Изпитване за хронична токсичност …

Изпитване за канцерогенност …

Комбинирано изпитване за хронична токсичност/канцерогенност …

Изпитване за репродуктивна токсичност върху едно поколение…

Изпитване за репродуктивна токсичност върху две поколения …

Токсикокинетика …

Изпитване за мутагенност и пресяващо изпитване за канцерогенност…

— Генна мутация — Saccharomyces cerevisiae …

— Митотична рекомбинация — Saccharomyces cerevisiae …

— Изпитване in vitro за генни мутации в клетки от бозайници …

— Увреждане и репарация на ДНК — непланиран синтез на ДНК — клетки от бозайници in vitro …

— Изпитване in vitro за обмени на сестрински хроматиди…

— Изпитване за полово свързана рецесивна леталност при Drosophila melanogaster…

— Изпитвания in vitro за трансформации в клетки от бозайници …

— Изпитване за доминантна леталност при гризачи …

— Цитогенетични изпитвания in vivo на зародишни клетки от бозайници …

— Изпитване за петна по козината при мишки …

— Наследствени транслокации при мишки…

ЧАСТ В: Методи за определяне на токсичността за околната среда …

Общо въведение: Част В…

Изпитване за потискане растежа на водорасли…

Токсичност за земни червеи: Изпитване в изкуствена почва …

Биологично разграждане: Изпитване по Zahn — Wellens …

Биологично разграждане: Изпитвания за симулиране на активирана утайка …

Биологично разграждане: Изпитване за потискане дишането на активирана утайка …

Биологично разграждане: Модифицирано SCAS изпитване…

ЧАСТ Б: МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТОКСИЧНОСТТА

ОБЩО ВЪВЕДЕНИЕ: ЧАСТ Б

ПРОДЪЛЖИТЕЛНИ ИЗПИТВАНИЯ

Изпитвания за субхронична и хронична токсичност и канцерогенност

Характеризиране на изпитваното вещество и на сместа за третиране

Преди започване на всяко изпитване за токсичност трябва да бъдат известни съставът на изпитваното вещество, включително основните примеси, и съответните му физико-химични свойства, включително стабилността му.

Физико-химичните свойства на изпитваното вещество предоставят важна информация за избор на начина на прилагане, проекта на изпитванията за субхронична, хронична токсичност и канцерогенност и за съхраняването и работата с изпитваното вещество.

Информацията за химичната структура и физико-химичните свойства може да представлява и показател за абсорбционните характеристики на планирания начин на прилагане и за възможното метаболитно и тъканно разпределение. Информация за токсикокинетичните параметри може да има и от предшестващи изпитвания за токсичност и токсикокинетика.

Началото на изпитването трябва да бъде предшествано от разработване на аналитичен метод за качествено и количествено определяне на изпитваното вещество (включително основните примеси, когато това е възможно) в средата за дозиране и в биологичния материал.

Експериментални животни: избор на вид и порода

Налице е тенденция изпитванията да бъдат ограничени до експериментални видове, които се отглеждат лесно и имат сравнително кратък живот, тъй като е необходимо животните да бъдат третирани през голямата част от живота им. Желателно е да бъде известна честотата на спонтанните заболявания и туморите при използваната порода животни, когато се отглеждат при сходни условия.

Породите трябва да бъдат добре характеризирани и да нямат вродени дефекти, които да оказват влияние. Употребата на близкородствено кръстосани породи от Fl –хибриди в това отношение има някои предимства, но когато са налице достатъчно минали данни за близкородствено кръстосаните породи при животни, получени от затворени стада, такива са приемливи.

Грижи за животните, хранене и поене

Изпитванията и проучванията върху животни се провеждат в съответствие с националните разпоредби и се вземат предвид принципите на хуманността и международните разработки в областта на хуманното отношение към животните.

За получаване на значими резултати са задължителни строг контрол върху условията на околната среда и правилните техники за грижи за животните. Фактори като условия на настаняване, съпътстващи интеркурентни заболявания, медикаментозно лечение, примеси в храната, водата и мястото за спане, както и общите съоръжения за грижи за животните, могат да повлияят в значителна степен на изхода от изпитванията с многократни дози. Обикновено трябва да бъде известен ефектът на химичните стерилизиращи средства върху изпитването.

Диетата трябва да отговаря на всички хранителни нужди за изследвания вид и не трябва да съдържа примеси, които могат да окажат влияние върху изхода от изпитването. Гризачите трябва да се хранят и поят ad libitum, като храната трябва да се сменя поне един път седмично. В момента се използват три типа диети: конвенционална, синтетична, както и различни диети с отворени формули.

Независимо каква диета е избрана доставчиците трябва да проверяват хранителната стойност и нивото на замърсителите в основната диета посредством периодичен мониторинг и да предоставят тази информация на лабораторията заедно с всяка партида храна. Много е желателно да са известни ефектите на хранителния режим върху метаболизма, а също и върху развитието на тумори и дълголетието на животните

Допълнително в изследователската лаборатория може да се провеждат анализи за проверка на основната диета както за хранителните компоненти, така и за случайни замърсители, включително канцерогени. Ако това се прави, резултатите от анализите трябва да бъдат съхранени и включени в заключителния протокол за всяко изпитвано вещество.

Обичайните хранителни съставки, за които е известно, че оказват влияние върху канцерогенезата (например антиоксиданти, ненаситени мастни киселини, селен), не трябва да присъстват в пречещи концентрации. Потенциалното влияние на някои обичайни хранителни замърсители върху оценката на канцерогенезата изисква да се обръща специално внимание върху наличието на остатъци от пестициди, хлорорганични съединения, полициклични ароматни въглеводороди, естрогени, тежки метали, нитрозамини и микотоксини в храната.

Изпитванията за стабилност са изключително важни, когато изпитваното вещество се прилага във водата или храната. За установяване честотата на приготвяне на храната и необходимия мониторинг се използват правилно проведени изпитвания за стабилност и хомогенност преди изпитванията за многократни дози.

Когато храната се стерилизира, ефектите от тази процедура върху изпитваното вещество и хранителните съставки трябва да бъдат известни. Трябва да бъдат направени всички необходими промени.

По време на изпитвания за канцерогенност изследователите трябва да са наясно с потенциалните замърсители в използваната вода. Обикновено водата, която е одобрена за консумация от хора, е на задоволително равнище и трябва да има информация за нейния състав.

Може да се наложи концентрацията на дадено изпитвано вещество в диетата да бъде променена, тъй като животните растат така, че да се поддържа сравнително постоянен прием на изпитваното вещество по отношение на телесното тегло.

Хранителната стойност на контролните и изпитваните диети трябва да бъде колкото е възможно по-сходна. Трябва да се има предвид хранителната стойност на изпитваното вещество, което е смесено с храната. Въз основа на опита може да се предполага, че съдържание на нехранителни вещества в диетата до 5 % е малко вероятно да окаже значимо влияние върху нейната хранителна стойност.

1. Инхалационни изпитвания

Не е посочено гранично изпитване, тъй като се оказва невъзможно определянето на една-единствена гранична стойност за инхалационна експозиция.

2. Изпитване за тератогенност

Изпитването е насочено главно към прилагане по орален път. Алтернативно могат да се използват други пътища на прилагане в зависимост от физичните свойства на изпитваното вещество или вероятния начин на експозиция при хора. В такива случаи методът за изпитване трябва да бъде адаптиран по подходящ начин, като се вземат предвид съответните елементи на 28-дневните методи за изпитване.

3. Токсикокинетика

Токсикокинетичните изпитвания подпомагат интерпретирането и оценката на данните за токсичността. Предназначението на тези изпитвания е да изяснят конкретни аспекти на токсичността на изпитваното химическо вещество и резултатите могат да подпомогнат проектирането на допълнителни изпитвания за токсичност. Не се предвижда необходимостта да бъдат определяни всички параметри за всеки един случай. Пълната серия токсикокинетични изпитвания (абсорбция, екскреция, разпределение и метаболизъм) ще бъде необходима само в редки случаи. За определени съединения може да се препоръчат промени в тази серия или да е достатъчно изпитване с единична доза.

Определения

Токсикокинетика: изучаване на абсорбцията, разпределението, метаболизма и екскрецията на изпитваните вещества; Абсорбция: процесът(ите), чрез който (които) приложеното вещество попада в организма; Екскреция: процесът(ите), чрез който (които) приложеното вещество и/или неговите метаболити се отстраняват от организма; Разпределение: процесът(ите), чрез който (които) приложеното вещество и/или неговите метаболити се разделят в организма; Метаболизъм: процесът(ите), чрез който (които) структурата на приложените вещества се изменя в организма посредством ензимни или неензимни реакции.

4. Изпитване на остра и подостра токсичност при втори вид

Целта на изпитването при втори вид е да допълни изводите, направени при първия вид.

По време на изпитване при втори вид може да се използва методът за изпитване, който вече е описан, или той може да бъде адаптиран за по-малък брой животни.

5. Изпитвания за плодовитост

Когато е необходимо изпитване за размножаването в три поколения, описаният метод за изпитване на размножаване в две поколения може да бъде разширен така, че да покрие трето поколение.

6. Изпитвания за мутагенност

Допълнителни изпитвания за мутагенност, включително пресяващи изпитвания за канцерогенност

В приложение VIII към директивата са споменати допълнителни изпитвания за по-нататъшно проучване на мутагенността или за предварително пресяващо изпитване за канцерогенност. Изпитванията, които са изложени схематично в този раздел, обикновено могат да се използват за проучване и на двата аспекта.

Въведение

Първоначалната оценка на мутагенната активност на едно вещество се състои от изпитвания за генни (точкови) мутации при бактерии и за цитогенетични увреждания в клетки на бозайници (in vitro или in vivo). По-горе бяха описани методи, подходящи за този „основен набор“ изпитвания. Настоящият раздел се отнася до допълнителни изпитвания, които са подходящи за потвърждаване и/или разширяване на резултатите, получени при основния набор, и които могат да се използват за голям брой цели:

1. за потвърждаване на резултатите, получени при основния набор;

2. за изпитване на крайните точки, които не са проучвани при основния набор;

3. за започване или разширяване на проучвания in vivo.

За тези цели диапазонът на описаните тестове включва еукариотни системи, както in vitro, така и in vivo, а също разширен диапазон биологични крайни точки. Тестовете предоставят информация за точковите мутации в организми, които са по-сложни от бактериите, използвани в основния набор, и разширяват информацията за способността на веществото да предизвиква хромозомни аберации.

Описани са и изпитвания за крайни точки, които са различни от точкови мутации и хромозомни аберации. Те предоставят допълнителна информация и при необходимост могат да бъдат използвани в схемите за изпитване.

Като общ принцип, когато се има предвид програма за допълнителни изпитвания за мутагенност, тя трябва да бъде проектирана така, че да предоставя съответна допълнителна информация за мутагенния и/или канцерогенния потенциал на веществото.

Действителните изпитвания, които може да са подходящи в конкретен случай, ще зависят от многобройни фактори, включително химичните и физичните характеристики на веществото, резултатите от първоначалните бактериални и цитогенетични изпитвания, метаболитния профил на веществото, резултатите от други изпитвания за токсичност и известните приложения на веществото. Следователно, като се има предвид разнообразието на факторите, които може да се наложи да се вземат под внимание, строгата програма за избор на изпитвания не е целесъобразна. Някои общи принципи обаче могат да послужат като ръководство. Ако изпитване от основния набор се окаже положително, допълнителните изпитвания трябва да включват поне един метод, който може да открие същата генетична крайна точка. Ако и двете изпитвания от основния набор са отрицателни, обикновено като допълнителни проучвания трябва да се проведат изпитване за генни мутации и изпитване за хромозомни аберации. Може да е целесъобразно да се получат и допълнителни данни от индикаторните изпитвания (както са изброени по-долу).

Методите за такива изпитвания са групирани по-долу въз основа на тяхната първостепенна генетична крайна точка.

Изпитвания за генни (точкови) мутации

За допълнително изпитване на потенциала на веществото да предизвиква генни (точкови) мутации, може да са целесъобразни един или повече от следните методи:

a) Изпитвания за прави или обратни мутации с еукариотни микроорганизми (Saccharomyces cerevisiae).

б) Изпитвания in vitro за прави мутации в клетки на бозайници.

в) Изпитване за полово свързана леталност при Drosophila melanogaster.

г) Изпитване in vivo за мутации в соматични клетки: изпитване за петна по козината при мишки.

Изпитвания за хромозомни аберации

За допълнително изпитване на потенциала на веществото да предизвиква хромозомни аберации, може да е целесъобразен един от следните два метода:

a) Цитогенетични изпитвания in vivo при бозайници; Ако не е бил включен в първоначалната оценка („основен набор“ изпитвания), трябва да се предвиди метафазен анализ на костномозъчни клетки in vivo. Допълнително може да се направят и цитогенетични изпитвания in vivo на зародишни клетки.

б) Цитогенетични изпитвания in vitro на клетки на бозайници, ако не са включени в първоначалната оценка;

в) Изпитвания за доминантна леталност при гризачи;

г) Изпитване за наследствени транслокации при мишки.

Индикаторни изпитвания за ефекти върху ДНК

Съществуват методи, които представляват индикатор за някои ефекти върху ДНК, но които нямат за „крайна точка“ мутагенно явление. Тези изпитвания могат да предоставят информация, която допълва информацията, получена от изпитванията за мутагенност, и която може да бъде полезна за интерпретирането на такива изпитвания. Когато съществува необходимост от тези изпитвания, може да бъде подходящ един или друг от следните методи с използване на еукариотни микроорганизми или клетки на бозайници:

a) Митотична рекомбинация при Saccharomyces cerevisiae;

б) Увреждане и репарация на ДНК — непланиран синтез на ДНК — клетки от бозайници (in vitro);

в) Обмен на сестрински хроматиди в клетки от бозайници (in vitro).

Други индикаторни изпитвания за канцерогенен потенциал

Съществуват трансформационни изпитвания на клетки от бозайници, с помощта на които се определя способността за предизвикване на морфологични и поведенчески изменения в клетъчна култура, за които се смята, че са свързани със злокачествено трансформиране in vivo. Могат да се използват голям брой различни типове клетки и критерии за трансформиране.

Оценка на риска от наследствени ефекти при бозайници

Съществуват методи за определяне като цяло на наследствените ефекти при бозайници, които са предизвикани от генни (точкови) мутации (изпитване за специфичен локус при мишки (1) или от хромозомни аберации (изпитване за наследствени транслокации при мишки). Такива методи може да се използват при оценяване на възможния генетичен риск на дадено вещество за човека. Като се имат предвид сложността на тези методи и големият брой необходими животни обаче, особено за изпитването за специфичен локус, е необходимо добро обосноваване преди провеждане на тези изпитвания.

ИЗПИТВАНЕ ЗА СУБХРОНИЧНА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ

90-ДНЕВНИ МНОГОКРАТНИ ОРАЛНИ ДОЗИ ПРИ ГРИЗАЧИ

1. МЕТОД

1.1. Въведение

Виж общо въведение, част Б.

1.2. Определения

Виж общо въведение, част Б.

1.3. Вещества за сравнение

Няма.

1.4. Принцип на метода за изпитване

Изпитваното вещество се прилага ежедневно, по орален път, в нарастващи дози, върху няколко групи експериментални животни, по една доза за група, в продължение на 90 дни. По време на прилагането животните се наблюдават ежедневно, за да се открият признаци на токсичност. Животните, които умират по време на изпитването, се подлагат на аутопсия, а преживелите животни се подлагат на аутопсия при приключване на изпитването.

1.5. Критерии за качество

Няма.

1.6. Описание на метода за изпитване

Подготовка

Животните се държат при експериментални условия на настаняване и хранене в продължение поне на пет дни преди изпитването. Преди изпитването здрави млади животни се избират на случаен принцип и се разпределят в третирани и контролни групи.

Изпитваното вещество може да се прилага с храната, чрез сонда, в капсули или в питейната вода. Определянето на дозите при всички животни трябва да се извършва по един и същ метод по време на целия експеримент. Ако за подпомагане на дозирането се използват неактивно вещество или други добавки, трябва да е известно, че те не водят до токсични ефекти. Ако е необходимо, могат да се използват исторически данни.

Условия на изпитване

Експериментални животни

Предпочитаният вид е плъх, ако няма противопоказания. Трябва да се използват млади здрави животни от широко използвани лабораторни породи, като в идеалния случай дозирането трябва да започне преди плъховете да достигнат шестседмична възраст, но във всички случаи, преди да навършат осем седмици. При започване на изпитването колебанията в теглото на животните не трябва да превишават ± 20 % от средната му стойност. Когато изпитването за субхронична орална токсичност се провежда като предварително проучване преди продължително изпитване, и при двете изпитвания трябва да се използват същият вид и порода.

Брой и пол

За всяко ниво на дозиране трябва да се използват поне 20 животни (10 женски и 10 мъжки). Женските животни трябва да са нераждали и да не са бременни. Ако се планират междинни жертви, броят трябва да бъде увеличен съответно с броя животни, които са планирани за пожертване преди завършване на изпитването. Освен това една сателитна група от 20 животни (по 10 животни от пол) може да бъде третирана с високо ниво на дозиране в продължение на 90 дни и да бъде наблюдавана в продължение на 28 дни след третирането за обратимост, запазване или забавена проява на токсичните ефекти.

Нива на дозиране

Трябва да се използват поне три нива на дозиране и една контрола. С изключение на третирането с изпитваното вещество, животните от контролната група трябва да бъдат третирани по идентичен начин с животните от изпитваните групи. Когато за подпомагане на дозирането трябва да се използва помощно вещество, дозирането на носителя при контролните животни трябва да бъде същото, както при третираните групи, а контролните животни трябва да получават същото количество носител като това, което получава групата, третирана с най-високата доза. Най-високото ниво на дозиране трябва да води до токсични ефекти, но да не предизвиква или да предизвиква малък брой фатални изходи. Най-ниското ниво на дозиране не трябва да предизвиква никакви признаци на токсичност. Когато съществува оценка на нивото на експозиция при хора, която може да се използва, най-ниското ниво на дозиране трябва да е по-високо от него. В идеалния случай междинното ниво на дозиране трябва да предизвиква минимални наблюдаеми токсични ефекти. Ако се използва повече от една междинна доза, нивата на дозиране трябва да бъдат разделени едно от друго така, че да се получи градиране на токсичните ефекти.

При групите, третирани с ниска и междинна доза, и при контролите честотата на фаталните изходи трябва да бъде ниска така, че да позволи значима оценка на резултатите.

Когато изпитваното вещество се прилага с храната, може да се използва постоянна концентрация (ppm или мг/кг храна) или постоянно ниво на дозиране по отношение телесното тегло на животното, като използваната алтернатива трябва да бъде посочена. За вещество, прилагано през сонда, дозата трябва да се дава по едно и също време всеки ден. Нивата на дозиране трябва да бъдат коригирани на интервали (на една или две седмици), за да се поддържа постоянно ниво на дозиране по отношение на телесното тегло на животното.

Гранично изпитване

Ако 90-дневното изпитване, проведено в съответствие с метода, разгледан подробно по-долу, при ниво на дозиране 1 000 мг/кг телесно тегло/ден или при по-високо ниво на дозиране, свързано с възможна експозиция при хора, когато такава е известна, не показва данни за токсични ефекти, допълнително изпитване може да не се сметне за необходимо. За вещества с ниска токсичност, прилагани с храната, е важно да се обезпечи количеството и другите свойства на съответното изпитвано вещество да не повлияват нормалните хранителни нужди.

Период на наблюдение

Всички животни трябва да бъдат наблюдавани ежедневно и признаците на токсичност да бъдат регистрирани, включително времето им на настъпване, силата и продължителността им. Трябва да се регистрират времето на смъртта и времето, по което се появяват и изчезват признаците на токсичност.

Процедура

В идеалния случай животните се дозират с изпитваното вещество седем дни в седмицата в продължение на 90 дни. Животните от всички сателитни групи, планирани за контролни наблюдения трябва да бъдат гледани в продължение на допълнителни 28 дни без третиране, за да бъдат доловени възстановяването от токсичните ефекти или запазването им.

Наблюденията в клетките трябва да включват най-вече измененията на кожата и козината, очите и лигавиците, а също дихателната, сърдечно-съдовата, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и начина на поведение. Ежеседмично трябва да се извършва измерване на консумацията на храна (и на консумацията на вода, когато изпитваното вещество се прилага с питейната вода) и животните трябва да се претеглят.

Редовното наблюдение на животните е необходимо, за да не се губят, доколкото е възможно, животни при изпитването поради причини като канибализъм, тъканна автолиза или преместване. В края на изпитването всички оживели животни от несателитните третирани групи се подлагат на аутопсия. Умиращите животни трябва да бъдат отстранени и подложени на аутопсия, когато бъдат забелязани.

На всички животни, включително контролните, обичайно се правят следните прегледи:

a) Преди прилагане на изпитваното вещество и при преустановяване на изпитването трябва да се проведе офталмологичен преглед с помощта на офталмоскоп или еквивалентно подходящо оборудване, за предпочитане при всички животни, но поне в групата, третирана с висока доза, и в контролната група. Ако бъдат доловени очни изменения, трябва да бъдат прегледани всички животни.

б) В края на изпитването трябва да бъде направено хематологично изследване, включващо хематокрита, концентрацията на хемоглобина, броя на еритроцитите, общия брой на левкоцитите и диференциалното им броене и измерване на потенциала за съсирване, например време на съсирване, протромбиново време, тромбопластиново време или брой на тромбоцитите.

в) В края на изпитването трябва да се определят клиничните биохимични параметри на кръвта. Изследвания, които се смятат за целесъобразни при всички изпитвания, са електролитният баланс, въглехидратният метаболизъм, чернодробната и бъбречната функция. Изборът на конкретни изследвания ще се повлияе от наблюденията върху механизма надействие на веществото. Препоръчва се определянето на: калций, фосфор, хлориди, натрий, калий, глюкоза на гладно (с период на гладуване, подходящ за вида), серумна глутамат-пируват трансаминаза (2), серумна глутамат-оксалоацетат трансаминаза (3), орнитин декарбоксилаза, гама-глутамил транспептидаза, уреен азот, албумин, креатинин в кръвта, общ билирубин и общ серумен белтък. Други определяния, които може да са необходими за адекватна токсикологична оценка, включват анализ на липиди, хормони, киселинно-алкално равновесие, метхемоглобин и холинестеразна активност. Когато е необходимо да бъде разширено изпитването на наблюдаваните ефекти, може да се използват допълнителни биохимични параметри.

г) Рутинно изследване на урина не е необходимо, освен когато съществуват показания въз основа на очаквана или наблюдавана токсичност.

Ако историческите изходни данни не са адекватни, трябва да се предвиди определяне на параметрите на кръвната картина и клиничната биохимия преди да започне дозирането.

Макроскопска аутопсия

Всички животни трябва да бъдат подложени на пълна макроскопска аутопсия, която включва преглед на външната повърхност на тялото, на всички отвори, както и на черепната, гръдната и коремната кухина и на съдържанието им. Черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези и тестисите трябва да бъдат претеглени във влажно състояние колкото е възможно по-бързо след дисекцията, за да се избегне изсъхването им.

Следните органи и тъкани трябва да бъдат съхранени в подходяща среда за възможно бъдещо хистопатологично изследване: всички макроскопски лезии, мозъкът — включително срези на продълговатия мозък/варолиевият мост, кората на малкия мозък и кората на главния мозък, хипофизата, щитовидната/паращитовидните жлези, цялата тимусна тъкан, трахеята и белите дробове, сърцето, аортата (слюнчените жлези), черният дроб, слезката, бъбреците, надбъбречните жлези, панкреасът, гонадите, матката (допълнителните полови органи), (кожата), хранопроводът, стомахът, дванадесетопръстникът, празното черво, хълбочното черво, сляпото черво, ободното черво, правото черво, пикочния мехур, представителен лимфен възел, (женската млечна жлеза), (бедрената мускулатура), периферен нерв, гръдната кост с костен мозък, (очи), (бедрената кост, включително ставна повърхност), (гръбначният мозък на три нива — шийно, гръдно и поясно) и (извънорбитните слъзни жлези). Тъканите, посочени в скоби, трябва да се изследват, само ако въз основа на признаци на токсичност или ангажиране на целевите органи са налице показания за това.

Хистопатологично изследване

a) Пълно хистопатологично изследване трябва да се провежда само върху органи и тъкани на животни от контролната група и групата, третирана с висока доза.

б) Всички макроскопски лезии трябва да бъдат изследвани.

в) Целевите органи трябва да бъдат изследвани и в другите дозирани групи.

г) Белите дробове на животните от групите, третирани с ниска и междинна доза, трябва да бъдат подложени на хистопатологично изследване за данни за инфекция, тъй като това дава възможност за лесно оценяване на здравословното състояние на животните. При тези групи трябва да се предвиди и хистопатологично изследване на черния дроб и бъбреците. При животни от тези групи допълнително рутинно хистопатологично изследване може да не е необходимо, но в групата, третирана с висока доза, то винаги трябва да се провежда на органите, при които са налице данни за лезии.

д) Когато се използва сателитна група, хистопатологично изследване трябва да се провежда на тъканите и органите, които в третираните групи показват аномалии.

2. ДАННИ

Данните трябва да бъдат обобщени в табличен вид, като за всяка изпитвана група се дават броят на животните в началото на изпитването, броят на животните, при които са налице лезии, и процентът на животните, които демонстрират всеки тип лезия. Резултатите трябва да бъдат оценени с помощта на подходящ статистически метод. Може да се използва всеки признат статистически метод.

3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1. Протокол от изпитването

Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:

— вид, порода, източник, условия на околната среда, диета,

— условия на изпитването,

— нива на дозиране (включително носител, ако е използван) и концентрации,

— данни за токсичния отговор по пол и доза,

— ниво без ефект, където е възможно,

— време на смъртта по време на изпитването или дали животните са оживели до прекратяването му,

— описание на токсичните или други ефекти,

— време на наблюдение на всеки абнормен признак и неговото последващо развитие,

— данни за храната и телесното тегло,

— данни от офталмологичния преглед,

— използвани хематологични изследвания и всички резултати,

— използвани клинични биохимични изследвания и всички резултати (включително резултати от всички изследвания на урина),

— резултати от аутопсията,

— подробно описание на всички резултати от хистопатологичните изследвания,

— статистическа обработка на резултатите, където е възможно,

— обсъждане на резултатите,

— интерпретиране на резултатите.

3.2. Оценка и интерпретиране

Виж общо въведение, част Б.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

Виж общо въведение, част Б.

ИЗПИТВАНЕ ЗА СУБХРОНИЧНА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ

90-ДНЕВНИ МНОГОКРАТНИ ОРАЛНИ ДОЗИ ПРИ ВИДОВЕ, РАЗЛИЧНИ ОТ ГРИЗАЧИ

1. МЕТОД

1.1. Въведение

Виж общо въведение, част Б.

1.2. Определения

Виж общо въведение, част Б.

1.3. Вещества за сравнение

Няма.

1.4. Принцип на метода за изпитване

Изпитваното вещество се прилага ежедневно, по орален път, в нарастващи дози, върху няколко групи експериментални животни (различни от гризачи), по една доза за група, в продължение на 90 дни. По време на периода на прилагане животните се наблюдават ежедневно, за да се открият признаци на токсичност. Животните, които умират по време на изпитването, се подлагат на аутопсия, а преживелите животни се подлагат на аутопсия при приключване на изпитването.

1.5. Критерии за качество

Няма.

1.6. Описание на метода за изпитване

Подготовка

Животните се държат при експерименталните условия на настаняване и хранене в продължение поне на пет дни преди изпитването. Преди изпитването здрави млади животни се избират по случаен признак и се разпределят в третирани и контролни групи.

Изпитваното вещество може да се прилага с храната или да се окаже по-удобно прилагането му в капсули. Могат да се използват други начини за прилагане по орален път. Дозирането при всички животни трябва да се извършва по един и същ метод по време на целия експериментален период. Ако за подпомагане на дозирането се използва неактивно вещество или други добавки, трябва да е известно, че те не водят до токсични ефекти. Ако е необходимо, могат да се използват исторически данни.

Условия на изпитване

Експериментални животни

Често използваният вид, различен от гризачи, е кучето, за предпочитане от определена порода. Могат да се използват други видове, различни от гризачи. Трябва да се използват млади здрави животни, като при кучетата дозирането трябва да започне за предпочитане на четири- до шестмесечна възраст и не по-късно от деветмесечна възраст. Когато изпитването за субхронична орална токсичност се провежда като предварително проучване преди продължително изпитване, и при двете изпитвания трябва да се използват същият вид и порода.

Брой и пол

За всяко ниво на дозиране трябва да се използват най-малко по осем животни (четири женски и четири мъжки животни). При прекратяване на изпитването броят на животните трябва да бъде адекватен за значима оценка на токсичните ефекти.

Нива на дозиране

Трябва да се използват поне три нива на дозиране и една контрола. С изключение на третирането с изпитваното вещество, животните от контролната група трябва да бъдат третирани по идентичен начин с животните от изпитваните групи. Най-високото ниво на дозиране трябва да води до токсични ефекти, но да не предизвиква фатални изходи. Най-ниското ниво на дозиране не трябва да предизвиква никакви признаци на токсичност. Когато съществува оценка на нивото на експозиция при хора, която може да се използва, най-ниското ниво на дозиране трябва да е по-високо от него.

В идеалния случай междинното ниво на дозиране трябва да предизвиква минимални наблюдаеми токсични ефекти. Ако се използва повече от една междинна доза, нивата на дозиране трябва да бъдат разделени едно от друго така, че да се получи градиране на токсичните ефекти.

В групата, третирана с ниска и междинна доза, и в контролните групи също не трябва да има фатални изходи.

За вещества с ниска токсичност, когато се прилагат с храната, е важно да се обезпечи количеството и други свойства на изпитваното вещество да не повлияват нормалното хранене.

Когато изпитваното вещество се прилага с храната, може да се използва постоянна концентрация в диетата (ppm или мг/кг храна) или постоянно ниво на дозиране по отношение на телесното тегло на животното, като използваната алтернатива трябва да бъде посочена. Когато дозата се прилага пряко, например в капсула, тя трябва да се дава по едно и също време всеки ден и да бъде коригирана, ако е необходимо, през интервали от една седмица, за да се поддържа постоянно ниво на дозиране по отношение на телесното тегло на животното. Когато изпитването за субхронична токсичност се използва като предварително проучване преди продължително изпитване, обикновено и при двете изпитвания трябва да се използва сходна диета.

Гранично изпитване

Ако 90-дневното изпитване, проведено в съответствие с метода, разгледан подробно по-долу, при едно ниво на дозиране 1 000 мг/кг телесно тегло/ден или при по-високо ниво на дозиране, свързано с възможна експозиция при хора, когато такава е известна, не показва данни за токсични ефекти, допълнителното изпитване може да не се смята за необходимо. За вещества с ниска токсичност, когато се прилагат с храната, е важно да се обезпечи количеството и други свойства на изпитваното вещество да не повлияват нормалните хранителни нужди.

Период на наблюдение

Всички животни трябва да бъдат наблюдавани ежедневно и признаците на токсичност да бъдат регистрирани, включително времето им на настъпване, силата и продължителността им. Трябва да се регистрират времето на смъртта и времето, по което се появяват и изчезват признаците на токсичност.

Процедура

В идеалния случай животните се дозират с изпитваното вещество седем дни в седмицата в продължение на 90 дни. Обаче въз основа главно на практически съображения, когато веществото се прилага по друг начин освен с храната, дозирането пет дни в седмицата се смята за приемливо.

Наблюденията в клетките трябва да включват, без да се ограничават до това, измененията на кожата и козината, очите и лигавиците, а също дихателната, сърдечно съдовата, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и начина на поведение. Ежеседмично трябва да се извършва измерване на консумацията на храна (и на консумацията на вода, когато изпитваното вещество се прилага с питейната вода) и животните трябва да се претеглят.

Ежедневно трябва да се провежда внимателен клиничен преглед на животните, като се предприемат съответни действия, за да се намали до минимум загубата на животни от изпитването. В края на експозицията всички оживели животни се подлагат на аутопсия. Умиращите животни трябва да бъдат отстранени и подложени на аутопсия, когато бъдат забелязани.

На всички животни, включително контролните, обичайно се правят следните прегледи:

a) Преди прилагане на изпитваното вещество и при преустановяване на изпитването трябва да се проведе офталмологичен преглед с помощта на офталмоскоп или еквивалентно подходящо оборудване, за предпочитане при всички животни, но поне в групата, третирана с висока доза, и в контролната група. Ако бъдат открити очни изменения, трябва да бъдат прегледани всички животни.

б) В началото и в края на изпитването трябва да бъде направено хематологично изследване, включващо хематокрита, концентрацията на хемоглобина, броя на еритроцитите, общия брой на левкоцитите и диференциалното им броене и измерване на потенциала за съсирване, например време на съсирване, протромбиново време, тромбопластиново време или брой на тромбоцитите.

в) В началото на изпитването, а след това или на едномесечни интервали, или по средата на изпитването и накрая при прекратяването му, трябва да се определят клиничните биохимични параметри на кръвта. Изследвания, които се смятат за целесъобразни при всички изпитвания, са електролитният баланс, въглехидратният метаболизъм и чернодробната и бъбречната функция. Изборът на конкретни изследвания ще се повлияе от наблюденията върху механизма на действие на веществото. Препоръчва се определянето на калций, фосфор, хлориди, натрий, калий, глюкоза на гладно (с период на гладуване, подходящ за вида/породата), серумна глутамат пируват трансаминаза (2), серумна глутамат оксалоацетат трансаминаза (3), орнитин декарбоксилаза, гама-глутамил транспептидаза, уреен азот, албумин, креатинин в кръвта, общ билирубин и общ серумен белтък. Други определяния, които може да са необходими за адекватна токсикологична оценка, включват анализ на липиди, хормони, киселинно/алкално равновесие, метхемоглобин и холинестеразна активност. Когато е необходимо да бъде разширено изпитването на наблюдаваните ефекти, може да се използват допълнителни клинични биохимични параметри. Видовете, различни от гризачи, трябва да гладуват известно време (за период не по-дълъг от 24 часа) преди вземане на кръвните проби.

г) Рутинно изследване на урина не е необходимо, освен когато съществуват показания поради очаквана или наблюдавана токсичност.

Макроскопска аутопсия

Всички животни трябва да бъдат подложени на пълна макроскопска аутопсия, която включва преглед на външната повърхност на тялото, на всички отвори, както и на черепната, гръдната и коремната кухина и на съдържанието им. Черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези, щитовидната жлеза (с паращитовидните жлези) и тестисите трябва да бъдат претеглени във влажно състояние колкото е възможно по-бързо след дисекцията, за да се избегне изсъхването им.

Следните органи и тъкани трябва да бъдат съхранени в подходяща среда за възможно бъдещо хистопатологично изследване: всички макроскопски лезии, мозъкът — включително срези на продълговатия мозък/варолиевият мост, кората на малкия мозък и кората на главния мозък, хипофизата, щитовидната/паращитовидните жлези, цялата тимусна тъкан, (трахеята), белите дробове, сърцето, аортата, слюнчените жлези, черният дроб, слезката, бъбреците, надбъбречните жлези, панкреасът, гонадите, матката (допълнителните полови органи), (кожата), жлъчният мехур, хранопроводът, стомахът, дванадесетопръстникът, празното черво, хълбочното черво, сляпото черво, ободното черво, правото черво, пикочният мехур, представителен лимфен възел, (женската млечна жлеза), (бедрената мускулатура), периферен нерв, (очи), гръдната кост с костен мозък, (бедрената кост, включително ставна повърхност) и (гръбначният мозък на три нива — шийно, гръдно и поясно). Тъканите, посочени в скоби, трябва да се изследват, само ако въз основа на признаци на токсичност или ангажиране на целевите органи са налице показания за това.

Хистопатологично изследване

Пълно хистопатологично изследване трябва да се извършва само върху органи и тъкани на животни от контролната група и групата, третирана с висока доза. Допълнително хистопатологично изследване при групи, третирани с други дози, трябва да се извършва само върху органи, които демонстрират лезии в групата, третирана с висока доза, или за които клиничните наблюдения показват такава необходимост.

2. ДАННИ

Данните трябва да бъдат обобщени в табличен вид, като за всяка изпитвана група са показани броят на животните в началото на изпитването, броят на животните, при които са налице лезии, типовете лезии и процентът на животните, които демонстрират всеки тип лезия. Резултатите трябва да бъдат оценени с помощта на подходящ статистически метод. Може да се използва всеки признат статистически метод.

3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1. Протокол от изпитването

Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:

— вид или порода, източник, условия на околната среда, диета,

— условия на изпитването,

— нива на дозиране (включително носител, ако е използван) и концентрации,

— данни за токсичния отговор по пол и доза,

— ниво без ефект, където е възможно,

— време на смъртта по време на изпитването или дали животните са оживели до прекратяването му,

— описание на токсичните или други ефекти (с особено внимание към резултатите от клиничните изследвания),

— време на наблюдение на всеки абнормен признак и неговото последващо развитие,

— данни за храната и телесното тегло,

— резултати от офталмологичното изследване,

— използвани хематологични изследвания и всички резултати,

— използвани биохимични изследвания и всички резултати (включително резултати от всички изследвания на урина),

— резултати от аутопсията,

— подробно описание на всички резултати от хистопатологичните изследвания,

— статистическа обработка на резултатите, където е целесъобразно,

— обсъждане на резултатите,

— интерпретиране на резултатите.

3.2. Оценка и интерпретиране

Виж общо въведение, част B.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

Виж общо въведение, част Б.

ИЗПИТВАНЕ ЗА СУБХРОНИЧНА ДЕРМАЛНА ТОКСИЧНОСТ

90-ДНЕВНИ МНОГОКРАТНИ ДЕРМАЛНИ ДОЗИ ПРИ ГРИЗАЧИ

1. МЕТОД

1.1. Въведение

Виж общо въведение, част B.

1.2. Определения

Виж общо въведение, част B.

1.3. Вещества за сравнение

Няма.

1.4. Принцип на метода за изпитване

Изпитваното вещество се прилага ежедневно, върху кожата, в нарастващи дози, върху няколко групи експериментални животни, по една доза за група, в продължение на 90 дни. По време на прилагането животните се наблюдават ежедневно, за да се открият признаци на токсичност. Животните, които умират по време на изпитването, се подлагат на аутопсия, а преживелите животни се подлагат на аутопсия при приключване на изпитването.

1.5. Критерии за качество

Няма.

1.6. Описание на метода за изпитване

Подготовка

Животните се държат при експериментални условия на живот и хранене в продължение поне на пет дни преди изпитването. Преди изпитването здрави млади животни се избират по случаен признак и се разпределят в третирана и контролна групи. Малко преди изпитването кожата в дорзалната област на туловището на експерименталните животни се остригва. Може да се използва бръснене, но то трябва да се извършва приблизително 24 часа преди изпитването. Повторно остригване или бръснене е необходимо обикновено през интервали от една седмица. Когато козината се остригва или бръсне, трябва да се внимава да се избягва нараняване на кожата. Не по-малко от 10 % от повърхността на тялото трябва да бъде подготвена за прилагане на изпитваното вещество. Когато се решава каква повърхност трябва да бъде подготвена и какви да бъдат размерите на превръзката, трябва да се вземе предвид теглото на животното. Когато се изпитват твърди вещества, които при нужда могат да бъдат стрити на прах, изпитваното вещество трябва да бъде достатъчно намокрено с вода или с подходящ носител, когато е необходимо, за да се осигури добър контакт с кожата. Течните изпитвани вещества обикновено се използват неразредени. Прилагането е ежедневно, от пет до седем дни седмично.

Условия на изпитване

Експериментални животни

Могат да се използват възрастни плъхове, зайци или морски свинчета. Могат да се използват други видове, но употребата им трябва да бъде обоснована. При започване на изпитването диапазонът на колебание на теглото трябва да бъде ± 20 % от средното тегло. Когато изпитването за субхронична дермална токсичност се провежда като предварително проучване преди продължително изпитване, и при двете изпитвания трябва да се използват същият вид и порода.

Брой и пол

За всяко ниво на дозиране трябва да се използват поне 20 животни (10 женски и 10 мъжки) със здрава кожа. Женските трябва да са нераждали и да не са бременни. Ако се планират междинни жертви, броят трябва да бъде увеличен с броя животни, които са планирани за пожертване преди завършване на изпитването. Освен това една сателитна група от 20 животни (по 10 животни от пол) може да бъде третирана при високо ниво на дозиране в продължение на 90 дни и да бъде наблюдавана в продължение на 28 дни след третирането за обратимост, запазване или забавена проява на токсичните ефекти.

Нива на дозиране

Необходими са поне три нива на дозиране с контрол или контрол за носителя, ако се използва носител. Експозицията трябва да продължава поне по шест часа дневно. Прилагането на изпитваното вещество трябва да се извършва по едно и също време всеки ден и количеството на прилаганото вещество трябва да бъде коригирано през определени интервали (от една или две седмици), за да се поддържа постоянно ниво на дозиране по отношение на телесното тегло на животното. С изключение на третирането с изпитваното вещество, животните от контролната група трябва да бъдат третирани по идентичен начин с животните от изпитваните групи. Когато за подпомагане на дозирането се използва помощно вещество, дозирането на контролната група с носител трябва да бъде същото, както при третираните групи, а контролната група трябва да получава същото количество носител като това, което получава групата, третирана с най-високата доза. Най-високото ниво на дозиране трябва да води до токсични ефекти, но да не предизвиква или да предизвиква малък брой фатални изходи. Най-ниското ниво на дозиране не трябва да предизвиква никакви признаци на токсичност. Когато съществува оценка на нивото на експозиция при хора, която може да се използва, най-ниското ниво на дозиране трябва да е по-високо от него. В идеалния случай междинното ниво на дозиране трябва да предизвиква минимални наблюдаеми токсични ефекти. Ако се използва повече от една междинна доза, нивата на дозиране трябва да бъдат разделени едно от друго така, че да се получи градиране на токсичните ефекти. При групите, третирани с ниска и междинни дози, и при контролните групи честотата на фаталните изходи трябва да бъде ниска така, че да позволи значима оценка на резултатите.

Ако прилагането на изпитваното вещество води до силно кожно дразнене, концентрациите трябва да бъдат намалени и това може да доведе до намаляване или липса на други токсични ефекти при високото ниво на дозиране. Ако кожата е силно увредена, може да се наложи прекратяване на изпитването и предприемане на ново изпитване при по-ниска концентрация.

Гранично изпитване

Може да се приеме, че допълнително изпитване не е необходимо, ако е известно, че предварително проучване при доза 1 000 мг/кг или по-висока, която е свързана с възможна експозиция при хора, когато такава е известна, не предизвиква токсични ефекти.

Период на наблюдение

Експерименталните животни трябва ежедневно да бъдат наблюдавани за признаци на токсичност. Трябва да се регистрират времето на смъртта и времето, през което се появяват и изчезват признаците на токсичност.

Процедура

Животните трябва да бъдат настанени в индивидуални клетки. В идеалния случай животните се третират с изпитваното вещество седем дни в седмицата в продължение на 90 дни.

Животните от всяка сателитна група, планирана за контролни наблюдения, трябва да бъдат гледани в продължение на допълнителни 28 дни без третиране, за да бъдат открити възстановяването от токсичните ефекти или запазването им. Експозицията трябва да продължава шест часа на ден.

Изпитваното вещество трябва да бъде прилагано по еднакъв начин върху площ, която представлява приблизително 10 % от общата площ на телесната повърхност. При силно токсични вещества покритата повърхностна площ може да бъде по-малка, но колкото е възможно по-голяма площ трябва да бъде покрита с тънък и еднакъв филм.

При експозицията изпитваното вещество се поддържа в контакт с кожата с помощта на пореста марлена превръзка и недразнеща лента. Изпитваното място трябва да бъде допълнително покрито по подходящ начин така, че марлената превръзка и изпитваното вещество да се запазят и животните да не могат да погълнат изпитваното вещество. За да бъде предотвратено поглъщането на изпитваното вещество, могат да се използват ограничаващи средства, но пълно обездвижване не се препоръчва.

В края на експозицията останалото изпитвано вещество трябва да бъде отстранено, когато е възможно, с помощта на вода или друг подходящ метод за почистване на кожата.

Всички животни трябва да бъдат наблюдавани ежедневно и признаците на токсичност да бъдат регистрирани, включително времето им на настъпване, силата и продължителността им. Наблюденията в клетките трябва да включват измененията на кожата и козината, очите и лигавиците, а също дихателната, сърдечно съдовата, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и начина на поведение. Трябва да се извършват ежеседмични измервания на консумираната храна и на теглото на животните. Редовните наблюдения на животните са необходими, за да не се губят животни при изпитването поради причини като канибализъм, тъканна автолиза или преместване. В края на периода на изпитването всички оживели животни от несателитните третирани групи се подлагат на аутопсия. Умиращите животни трябва да бъдат отстранени и подложени на аутопсия, когато бъдат забелязани.

На всички животни, включително контролните, обичайно се правят следните прегледи:

а) Преди експозицията на изпитваното вещество и при преустановяване на изпитването трябва да се проведе офталмологичен преглед с помощта на офталмоскоп или еквивалентно подходящо оборудване, за предпочитане при всички животни, но поне в групите, третирани с висока доза, и в контролните групи. Ако бъдат доловени очни изменения, трябва да бъдат прегледани всички животни.

б) В края на изпитването трябва да бъде направено хематологично изследване, включващо хематокрита, концентрацията на хемоглобина, броя на еритроцитите, общия брой на левкоцитите и диференциалното им броене и измерване на потенциала за съсирване, например време на съсирване, протромбиново време, тромбопластиново време или брой на тромбоцитите.

в) В края на изпитването трябва да се определят клиничните биохимични параметри на кръвта. изследвания, които се смятат за целесъобразни при всички изпитвания, са електролитният баланс, въглехидратният метаболизъм и чернодробната и бъбречната функция. Изборът на конкретни изследвания ще се повлияе от наблюденията върху механизма на действие на веществото. Препоръчва се определянето на калций, фосфор, хлориди, натрий, калий, глюкоза на гладно (с период на гладуване, подходящ за вида), серумна глутамат пируват трансаминаза (2), серумна глутамат оксалоацетат трансаминаза (3), орнитин декарбоксилаза, гама-глутамил транспептидаза, уреен азот, албумин, креатинин в кръвта, общ билирубин и общ серумен белтък. Други определяния, които може да са необходими за адекватна токсикологична оценка, включват анализ на липиди, хормони, киселинно/алкално равновесие, метхемоглобин и холинестеразна активност. Когато е необходимо да бъде разширено изпитването на наблюдаваните ефекти, може да се използват допълнителни клинични биохимични параметри.

г) Рутинно изследване на урина не е необходимо, освен когато съществуват показания въз основа на очаквана или наблюдавана токсичност.

Ако историческите изходни данни не са адекватни, трябва да се предвиди определяне на хематологичните параметри и на параметрите на клиничната биохимия преди да започне дозирането.

Макроскопска аутопсия

Всички животни трябва да бъдат подложени на пълна макроскопска аутопсия, която включва преглед на външната повърхност на тялото, на всички отвори, както и на черепната, гръдната и коремната кухина и на съдържанието им. Черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези и тестисите трябва да бъдат претеглени във влажно състояние колкото е възможно по-бързо след дисекцията, за да се избегне изсъхването им. Следните органи и тъкани трябва да бъдат съхранени в подходяща среда за възможно бъдещо хистопатологично изследване: всички макроскопски лезии, мозъкът — включително срези на продълговатия мозък/варолевият мост, кората на малкия мозък и кората на главния мозък, хипофизата, щитовидната/паращитовидните жлези, цялата тимусна тъкан (трахеята), белите дробове, сърцето, аортата, слюнчените жлези, черният дроб, слезката, бъбреците, надбъбречните жлези, панкреасът, гонадите, матката, допълнителните полови органи, жлъчният мехур (ако е налице), хранопроводът, стомахът, дванадесетопръстникът, празното черво, хълбочното черво, сляпото черво, ободното черво, правото черво, пикочният мехур, представителен лимфен възел, (женската млечна жлеза), (бедрената мускулатура), периферен нерв, (очи), (гръдната кост с костен мозък), (бедрената кост, включително ставна повърхност), (гръбначният мозък на три нива – шийно, гръдно и поясно) и (извънорбитните слъзни жлези). Тъканите, посочени в скоби, трябва да се изследват, само ако въз основа на признаци на токсичност или ангажиране на целевите органи са налице показания за това.

Хистопатологично изследване

a) Пълно хистопатологично изследване трябва да се извършва на нормалната и третираната кожа и на органи и тъкани на животни от контролната група и групата, третирана с висока доза.

б) Всички макроскопски лезии трябва да бъдат изследвани.

в) Целевите органи трябва да бъдат изследвани и в групите, третирани с други дози.

г) Когато се използват плъхове, белите дробове на животните от групите, третирани с ниска и междинна доза, трябва да бъдат подложени на хистопатологично изследване за признаци на инфекция, тъй като това дава възможност за лесно оценяване на здравословното състояние на животните. При животни от тези групи допълнително рутинно хистопатологично изследване може да не е необходимо, но в групата, третирана с висока доза, то винаги трябва да се извършва върху органите, при които са налице данни за лезии.

д) Когато се използва сателитна група, трябва да се прави хистопатологично изследване на тъканите и органите, при които се наблюдават ефекти в другите третирани групи.

2. ДАННИ

Данните трябва да бъдат обобщени в табличен вид, като за всяка изпитвана група са показани броят на животните в началото на изпитването, броят на животните, при които са налице лезии, типът на лезиите и процентът на животните, които демонстрират всеки тип лезия. Резултатите трябва да бъдат оценени с помощта на подходящ статистически метод. Може да се използва всеки признат статистически метод.

3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1. Протокол от изпитването

Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:

— вид, порода, източник, условия на околната среда, диета,

— условия на изпитването,

— нива на дозиране (включително носител,ако е използван) и концентрации,

— данни за токсичния отговор по пол и доза,

— ниво без ефект, където е възможно,

— време на смъртта по време на изпитването или дали животните са оживели до прекратяването му,

— описание на токсичните или други ефекти,

— време на наблюдение на всеки абнормен признак и неговото последващо развитие,

— данни за храната и телесното тегло,

— резултати от офталмологичното изследване,

— използвани хематологични изследвания и всички резултати,

— използвани клинични биохимични изследвания и всички резултати (включително резултати от всички изследвания на урина),

— резултати от аутопсията,

— подробно описание на всички резултати от хистопатологичните изследвания,

— статистическа обработка на резултатите, където е възможно,

— обсъждане на резултатите,

— интерпретиране на резултатите.

3.2. Оценка и интерпретиране

Виж общо въведение, част Б.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

Виж общо въведение, част Б.

ИЗПИТВАНЕ ЗА СУБХРОНИЧНА ИНХАЛАЦИОННА ТОКСИЧНОСТ

90-ДНЕВНИ МНОГОКРАТНИ ИНХАЛАЦИОННИ ДОЗИ ПРИ ГРИЗАЧИ

1. МЕТОД

1.1. Въведение

Виж общо въведение, част Б.

1.2. Определения

Виж общо въведение, част Б.

1.3. Вещества за сравнение

Няма.

1.4. Принцип на метода за изпитване

При няколко групи експериментални животни се осъществява ежедневна експозиция с определена продължителност на изпитваното вещество в нарастващи концентрации, като се използва по една концентрация за група, в продължение на 90 дни. Когато се използва носител, за да подпомогне създаването на подходяща концентрация на изпитваното вещество в атмосферата, трябва да се използва контролна група за носителя. По време на прилагането на изпитваното вещество животните се наблюдават ежедневно, за да се открият признаци на токсичност. Животните, които умират по време на изпитването, се подлагат на аутопсия, а преживелите животни се подлагат на аутопсия при приключване на изпитването.

1.5. Критерии за качество

Няма.

1.6. Описание на метода за изпитване

Подготовка

Животните се държат при експериментални условия на живот и хранене в продължение поне на пет дни преди експеримента. Преди изпитването здрави млади животни се избират по случаен признак и се разпределят в третирана и контролна група. Когато е необходимо, към изпитваното вещество може да се добави подходящ носител, за да подпомогне създаването на съответна концентрация на веществото в атмосферата. Ако за улесняване на дозирането се използват неактивно вещество или други добавки, трябва да е известно, че те не водят до токсични ефекти. Ако е необходимо, могат да се използват исторически данни.

Условия на изпитване

Експериментални животни

Предпочитан вид е плъхът, освен ако няма противопоказания. Трябва да се използват млади здрави животни от обичайно употребявани лабораторни породи. При започване на изпитването колебанието в теглото на използваните животни не трябва да превишава с ± 20 % съответната средна стойност. Когато инхалационното субхронично изпитване се провежда като предварително проучване преди продължително изпитване, и при двете изпитвания трябва да се използват същият вид и порода.

Брой и пол

За всяка експозиционна концентрация трябва да се използват поне по 20 животни (10 женски и 10 мъжки). Женските трябва да са нераждали и да не са бременни. Ако се планират междинни жертви, броят трябва да бъде увеличен с броя животни, които са планирани за пожертване преди завършване на изпитването. Допълнително една сателитна група от 20 животни (по 10 животни от пол) може да бъде третирана при високо ниво на дозиране в продължение на 90 дни и да бъде наблюдавана в продължение на 28 дни след третирането за обратимост, запазване или забавена проява на токсичните ефекти.

Експозиционни концентрации

Необходими са поне три концентрации, с контрола и, ако се използва носител, контрола за носителя (съответстваща на концентрацията на носителя при най-високото ниво на дозиране). С изключение на третирането с изпитваното вещество, животните от контролната група трябва да бъдат третирани по идентичен начин с животните от изпитваните групи. Най-високата концентрация трябва да води до токсични ефекти, но да не предизвиква или да предизвиква малък брой фатални изходи. Когато съществува оценка на нивото на експозиция при хора, която може да се използва, най-ниското ниво на дозиране трябва да е по-високо от него. В идеалния случай междинната концентрация трябва да предизвиква минимални наблюдаеми токсични ефекти. Ако се използва повече от една междинна концентрация, концентрациите трябва да бъдат разделени една от друга така, че да се получи градиране на токсичните ефекти. В групите, третирани с ниска и междинна доза, и в контролната група честотата на фаталните изходи трябва да бъде ниска така, че да позволи значима оценка на резултатите.

Продължителност на експозицията

Продължителността на ежедневната експозиция трябва да бъде шест часа след изравняване на концентрациите в камерата. За да се изпълнят конкретни изисквания, може да се използва и друга продължителност.

Оборудване

Животните трябва да бъдат изследвани с инхалационно оборудване, предназначено за поддържане на динамичен въздушен поток при поне 12-кратно обменяне на въздуха за час, за да се осигурят адекватно кислородно съдържание и равномерно разпределена експозиционна атмосфера. Когато се използва камера, тя трябва да бъде проектирана така, че струпването на експерименталните животни да бъде намалено до минимум и да се постигне максимална инхалационна експозиция на изпитваното вещество. Като правило, за да се постигне стабилност на атмосферата в камерата, общият обем на експерименталните животни не трябва да надвишава 5 % от обема на експерименталната камера. Може да се използват индивидуални камери за ороназална експозиция, изолирана експозиция на главата или за експозиция на цялото тяло, като първите две намаляват до минимум приема на изпитваното вещество по други пътища.

Период на наблюдение

Експерименталните животни трябва да бъдат наблюдавани ежедневно за признаци на токсичност по време на цялото третиране и възстановяване. Трябва да се регистрират времето на смъртта и времето, през което се появяват и изчезват признаците на токсичност.

Процедура

Животните се подлагат на експозиция на изпитваното вещество ежедневно, от пет до седем дни в седмицата в продължение на 90 дни. Животните от всяка сателитна група, планирана за контролни наблюдения, трябва да бъдат държани в продължение на допълнителни 28 дни без третиране, за да бъдат открити възстановяването от токсичните ефекти или запазването им. Изпитването трябва да се провежда при температура 22 ± 3 °C. В идеалния случай относителната влажност трябва да се поддържа между 30 % и 70 %, но в определени случаи (например изпитвания на аерозоли) това може да е невъзможно. По време на експозицията на животните не трябва да се дават храна и вода.

Трябва да се използва динамична инхалационна система с подходяща аналитична система за контрол на концентрация. За установяване на подходящите експозиционни концентрации се препоръчва пробно изпитване. Въздушният поток трябва да бъде нагласен така, че да осигури хомогенни условия в цялата експозиционна камера. Системата трябва да осигури възможно най-бързо постигане на стабилни условия на експозиция.

Измерванията или мониторингът трябва да включват:

a) дебита на въздушния поток (непрекъснато);

б) действителната концентрация на изпитваното вещество, измерена в зоната на дишане. По време на ежедневната експозиция концентрацията не трябва да се колебае с повече от ± 15 % от средната стойност. При прахове и аерозоли обаче това ниво на контрол не може да се постигне и тогава може да се приеме по-широк диапазон. По време на цялото изпитване дневните концентрации трябва да бъдат поддържани колкото е възможно по-постоянни. При разработване на генериращата система трябва да се анализира размерът на частиците, за да се установи стабилността на концентрациите им в аерозолите. По време на експозицията анализите трябва да се провеждат толкова често, колкото е необходимо за определяне устойчивостта на разпределението на размерите на частиците.

в) температурата и влажността;

г) по време на експозицията и след нея се провеждат наблюдения, които се регистрират системно, като за всяко животно се съхраняват отделни записи. Всички животни трябва да бъдат наблюдавани ежедневно и признаците на токсичност да бъдат регистрирани, включително времето им на настъпване, силата и продължителността им. Наблюденията в клетките трябва да включват: измененията на кожата и козината, очите, лигавиците, дихателната, сърдечно съдовата, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и начина на поведение. Консумацията на храна трябва да се измерва и животните трябва да се претеглят всяка седмица Необходимо е редовно наблюдаване на животните, за да се осигури животните да не се губят от изпитването поради причини като канибализъм, тъканна автолиза или преместване. В края на експозицията всички оживели животни се подлагат на аутопсия. Умиращите животни трябва да бъдат отстранени и подложени на аутопсия, когато бъдат забелязани.

На всички животни, включително контролните, обичайно се правят следните прегледи:

a) преди експозицията на изпитваното вещество и при прекратяване на изпитването трябва да се проведе офталмологичен преглед с помощта на офталмоскоп или еквивалентно подходящо оборудване, за предпочитане при всички животни, но поне в групите, третирани с висока доза, и в контролните групи. Ако бъдат открити очни изменения, трябва да бъдат прегледани всички животни;

б) в края на изпитването трябва да бъде направено хематологично изследване, включващо хематокрита, концентрацията на хемоглобина, броя на еритроцитите, общия брой на левкоцитите и диференциалното им броене и измерване на потенциала за съсирване, например време на съсирване, протромбиново време, тромбопластиново време или брой на тромбоцитите;

в) в края на изпитването трябва да се определят клиничните биохимични параметри на кръвта. Изследвания, които се смятат за целесъобразни при всички изпитвания, са електролитният баланс, въглехидратният метаболизъм и чернодробната и бъбречната функция. Изборът на конкретни изследвания ще се повлияе от наблюденията върху механизма на действие на веществото. Предложени са параметрите: калций, фосфор, хлориди, натрий, калий, глюкоза на гладно (с период на гладуване, подходящ за вида), серумна глутамат пируват трансаминаза (2), серумна глутамат оксалоацетат трансаминаза (2), орнитин декарбоксилаза, гама-глутамил транспептидаза, уреен азот, албумин, креатинин в кръвта, общ билирубин и общ серумен белтък. Други параметри, които може да са необходими за адекватна токсикологична оценка, включват анализ на липиди, хормони, киселинно/алкално равновесие, метхемоглобин и холинестеразна активност. Когато е необходимо да бъде разширено изпитването на наблюдаваните ефекти, може да се използват допълнителни клинични биохимични параметри;

г) Рутинно изследване на урина не е необходимо, освен когато съществуват показания въз основа на очаквана или наблюдавана токсичност.

Ако историческите изходни данни не са адекватни, трябва да се предвиди определяне на хематологичните параметрите и на параметрите на клиничната биохимия преди да започне дозирането.

Макроскопска аутопсия

Всички животни трябва да бъдат подложени на пълна макроскопска аутопсия, която включва преглед на външната повърхност на тялото, на всички отвори, както и на черепната, гръдната и коремната кухина и на съдържанието им. Черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези и тестисите трябва да бъдат претеглени във влажно състояние колкото е възможно по-бързо след дисекцията, за да се избегне изсъхването им. Следните органи и тъкани трябва да бъдат съхранени в подходяща среда за възможно бъдещо хистопатологично изследване: всички макроскопски лезии, белите дробове, които трябва да бъдат извадени интактни, претеглени и третирани с подходящ фиксатор, за да се обезпечи съхраняване на белодробната структура (префузията с фиксатор се смята за ефективна процедура), назо-фарингеални тъкани, мозък — включително срези на продълговатия мозък/варолиевият мост, кората на малкия мозък и кората на главния мозък, хипофизата, щитовидната/паращитовидните жлези, цялата тимусна тъкан, трахеята, белите дробове, сърцето, аортата, слюнчените жлези, черният дроб, слезката, бъбреците, надбъбречните жлези, панкреасът, гонадите, матката (допълнителните полови органи), (кожата), жлъчният мехур (ако е налице), хранопроводът, стомахът, дванадесетопръстникът, празното черво, хълбочното черво, сляпото черво, ободното черво, правото черво, пикочният мехур, представителен лимфен възел, (женската млечна жлеза), (бедрената мускулатура), периферен нерв, (очи), (гръдната кост с костен мозък), (бедрената кост, включително ставна повърхност) и (гръбначният мозък на три нива – шийно, средно гръдно и поясно) Тъканите, посочени в скоби, трябва да се изследват, само ако въз основа на признаци на токсичност или ангажиране на целевите органи са налице показания за това.

Хистопатологично изследване

a) Пълно хистопатологично изследване трябва да се извършва върху дихателната система и други органи и тъкани на всички животни от контролната група и групата, третирана с висока доза.

б) Всички макроскопски лезии трябва да бъдат изследвани.

в) Целевите органи трябва да бъдат изследвани и в групите, третирани с други дози.

г) Белите дробове на животните от групите, третирани с ниска и междинна доза, също трябва да бъдат подложени на хистопатологично изследване, тъй като това дава възможност за лесно оценяване на здравословното състояние на животните. Допълнително рутинно хистопатологично изследване може да не е необходимо при животни от тези групи, но в групата, третирана с висока доза, винаги трябва да се извършва върху органите, при които са налице данни за лезии.

д) Когато се използва сателитна група, трябва да се прави хистопатологично изследване на тъканите и органите, при които се наблюдават дефекти в другите третирани групи.

2. ДАННИ

Данните трябва да бъдат обобщени в табличен вид, като за всяка изпитвана група са показани броят на животните в началото на теста, броят на животните, при които са налице лезии, типовете лезии и процентът на животните, които демонстрират всеки тип лезия. Резултатите трябва да бъдат оценени с помощта на подходящ статистически метод. Може да се използва всеки признат статистически метод.

3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1. Протокол от изпитването

Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:

— вид, порода, източник, условия на околната среда, диета,

— условия на изпитването: Описание на експозиционната апаратура: включително проектиране, тип, размери, източник на въздух, система за генериране на частици и аерозоли, метод за климатизиране, пречистване на използвания въздух и метод за настаняване на животните в експериментална камера, когато се използва такава. Трябва да бъде описано оборудването за измерване на температурата, влажността и, където е необходимо, стабилността на концентрациите на частиците в аерозолите или на размера на частиците. Данни за експозицията: те трябва да бъдат представени в табличен вид със средни стойности и мярка за вариабилността (например стандартно отклонение) и трябва да включват: a) дебити на въздушните потоци през инхалационното оборудване; б) температура и влажност на въздуха; в) номинални концентрации (общо количество на изпитваното вещество, заредено в инхалационното оборудване, разделено на обема въздух); г) естество на носителя, ако е използван; д) действителни концентрации в изпитвателната зона на дишане; е) стойност на медианата на размерите на частиците (когато е необходимо);

— данни за токсичния отговор по пол и концентрация,

— ниво без ефект, където е възможно,

— време на смъртта по време на изпитването или дали животните са оживели до прекратяването му,

— описание на токсичните или други ефекти,

— време на наблюдение на всеки абнормен признак и неговото последващо развитие,

— данни за храната и телесното тегло,

— резултати от офталмологичното изследване,

— използвани хематологични изследвания и всички резултати,

— използвани клинични биохимични изследвания и всички резултати (включително резултати от всички изследвания на урина),

— резултати от аутопсията,

— подробно описание на всички резултати от хистопатологичните изследвания,

— статистическа обработка на резултатите, където е необходимо,

— обсъждане на резултатите,

— интерпретиране на резултатите.

3.2. Оценка и интерпретиране

Виж общо въведение, част Б.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

Виж общо въведение, част Б.

ИЗПИТВАНЕ ЗА ТЕРАТОГЕННОСТ – ГРИЗАЧИ И ВИДОВЕ, РАЗЛИЧНИ ОТ ГРИЗАЧИ

1. МЕТОД

1.1. Въведение

Виж общо въведение, част Б.

1.2. Определения

Виж общо въведение, част Б.

1.3. Вещества за сравнение

Няма.

1.4. Принцип на метода за изпитване

Изпитваното вещество се прилага в нарастващи дози или концентрации в продължение поне на тази част от бременността, която съвпада с периода на органогенезата, върху няколко групи бременни експериментални животни, като се използва по една доза за група. Малко преди очакваната дата на раждане майката се пожертва, матката се отстранява и съдържанието се изследва. Този метод изследва токсичността за зародиша и плода (ембрио- и фетотоксичността).

1.5. Критерии за качество

Няма.

1.6. Описание на метода за изпитване

Подготовка

Здрави млади възрастни девствени женски животни със сходна възраст и размери се аклиматизират към лабораторните условия в продължение на поне пет дни преди изпитването и след това се чифтосват с мъжки животни с доказана плодовитост. Оплодените женски животни се избират по случаен признак и се разпределят в третираните групи.

Чифтосването може да бъде осъществено по естествен път или чрез изкуствено оплождане. Изпитваното вещество се прилага ежедневно върху женските животни, като се започва веднага след имплантирането и се продължава през целия период на органогенеза. Един ден преди термина фетусите се раждат чрез хистеректомия и се изследват за висцерални или скелетни аномалии, включително забавяне на растежа, забавено вкостяване (осификация) и вътрешни кръвоизливи.

Условия на изпитване

Експериментални животни

Обичайно се използват видовете плъх, мишка, хамстер и заек. Предпочитаните видове са плъх и заек. Трябва да се използват обичайно употребявани лабораторни породи. Породата не трябва да бъде с ниска плодовитост и трябва да бъде характеризирана по отношение на отговора към тератогени. Животните трябва да бъдат настанени в индивидуални клетки.

Брой и пол

За всяко ниво на дозиране са необходими поне 20 бременни плъха, мишки или хамстера или 12 бременни заека. Целта е да се осигурят достатъчно котила и новородени животни, за да дадат възможност за оценка на тератогенния потенциал на веществото.

Нива на дозиране

Трябва да се използват поне три нива на дозиране и едно контролно. Когато изпитваното вещество се прилага в носител, трябва да се използва и контролна група за носителя. Ако се използва носител, неговите токсикологични свойства трябва да са ясни, той не трябва да бъде тератогенен или да оказва влияние върху размножаването. Освен третирането с изпитваното вещество, животните от контролната(ите) група(и) трябва да бъдат третирани по идентичен начин с животните от изпитваните групи. Освен ако не са ограничени от физичното/химичното естество или биологичните свойства на веществото най-високата доза трябва в идеалния случай да предизвиква известна видима токсичност за майката, например лека загуба на тегло, но не повече от 10 % майчина смъртност. Ниското ниво на дозиране не трябва да предизвиква видими ефекти, които могат да се дължат на изпитваното вещество. Междинната(ите) доза(и) трябва да е (са) разделена(и) геометрично между ниското и високото ниво на дозиране.

Гранично изпитване

При вещества с ниска токсичност ако доза, която е поне 1000 мг/кг, не води до поява на признаци на ембриотоксичност или тератогенност, изпитвания с други дози може да не се смятат за необходими.

Продължителност на експозицията

Ден 0 на изпитването е денят, в който се наблюдават вагинална запушалка и/или сперма (когато е възможно). Периодът на дозиране трябва да съвпада с периода на основната органогенеза. Това може да стане през ден от 6 до 15 за плъхове и мишки, ден от 6 до 14 за хамстери или ден от 6 до 18 за зайци. Ако ден 0 се базира на наблюдаваното чифтосване или изкуствено оплождане, споменатите времена трябва да бъдат коригирани чрез добавяне на един ден. Алтернативно дозирането можа да бъде удължено до приблизително един ден преди датата на очакваното раждане.

Период на наблюдение

Внимателен клиничен преглед трябва да се провежда поне един път дневно. Ежедневно трябва да се извършват допълнителни наблюдения, като се предприемат подходящи действия за намаляване до минимум на загубата на животни от изпитването.

Процедура

Изпитваното вещество се прилага по орален път със сонда. Изпитваното вещество трябва да се прилага всеки ден по приблизително едно и също време.

Женските експериментални животни се третират с изпитваното вещество ежедневно през целия подходящ период на третиране. Дозата може да се базира на теглото на женските животни при започване прилагането на веществото. Като се има предвид бързото наддаване на тегло по време на бременност, животните може да се претеглят периодично и дозата да се базира на най-скорошното измерване на телесното тегло. Признаците на токсичност трябва да бъдат регистрирани при наблюдението, включително времето им на настъпване, силата и продължителността им. Женските животни, показващи признаци на аборт или преждевременно раждане, трябва да бъдат пожертвани и подложени на подробно макроскопско изследване. Наблюдението след третирането трябва да продължи приблизително до един ден преди термина, като целта е да съвпадне с по-голямата част от бременността, но да се избегне усложняването при интерпретирането на резултатите, което може да възникне след раждане по естествен път. Наблюденията в клетките трябва да включват, но не се ограничават до измененията на кожата и козината, очите и лигавиците, а също дихателната, сърдечно съдовата, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и начина на поведение. Консумацията на храна трябва да се измерва всяка седмица. Животните трябва да се претеглят всяка седмица.

Аутопсия

В случай на смърт по време на или в края на изпитването, майката трябва да бъде изследвана макроскопски за структурни аномалии или патологични изменения, които може да са оказали влияние върху бременността. Веднага след смъртта матката трябва да бъде отстранена и съдържанието да бъде изследвано за ембрионална или фетална смърт и за определяне броя на живите фетуси. Обикновено е възможно да се прецени момента на смъртта in utero, когато това е станало. При плъхове и зайци може да се определи броят на corpora lutea (жълтите тела). Трябва да се определи полът на фетусите и те трябва да бъдат претеглени поотделно, теглата да бъдат регистрирани и да бъде получено средното фетално тегло. След отстраняването всеки фетус трябва да бъде прегледан отвън. За плъхове, мишки и хамстери една трета до една втора от всяко котило трябва да бъде подготвено и изследвано за скелетни аномалии, а оставащата част от всяко котило трябва да бъде подготвена и изследвана за аномалии на меките тъкани, като се използват подходящи методи. За зайци всеки фетус трябва да бъде изследван посредством внимателна дисекция за висцерални аномалии и след това да бъде изследван за скелетни аномалии.

2. ДАННИ

Данните трябва да бъдат обобщени в табличен вид, като представят за всяка експериментална група броя на животните в началото на изпитването, броя забременели животни, броя и процентите на живите фетуси и на фетусите със скелетни аномалии и тяхната връзка с конкретни котила. Резултатите трябва да бъдат оценени с помощта на подходящ статистически метод. Може да се използва всеки признат статистически метод.

3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1. Протокол от изпитването

Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:

— вид, порода, източник, условия на околната среда, диета,

— условия на изпитването,

— нива на дозиране (включително носител,ако е използван) и концентрации,

— данни за токсичния отговор по дози,

— ниво без ефект (където е възможно),

— време на смъртта по време на изпитването или дали животните са оживели до прекратяването му,

— описание на токсичните или други ефекти,

— време на наблюдение на всеки абнормен признак и неговото последващо развитие,

— данни за храната и телесното тегло,

— продължителност на бременността и данни за котилото (включително исторически данни),

— данни за фетусите (жив/мъртъв, пол, мекотъканни и скелетни дефекти),

— данни за котилото (живо/мъртво, пол, мекотъканни и скелетни дефекти за всяко котило),

— статистическа обработка на резултатите,

— обсъждане на резултатите,

— интерпретиране на резултатите.

3.2. Оценка и интерпретиране

Виж общо въведение, част Б.

4. ПОЗОВАВАНИЯ

Виж общо въведение, част Б.

ИЗПИТВАНЕ ЗА ХРОНИЧНА ТОКСИЧНОСТ

1. МЕТОД

1.1. Въведение

Виж общо въведение, част Б.

1.2. Определения

Виж общо въведение, част Б.

1.3. Вещества за сравнение

Няма.

1.4. Принцип на метода за изпитване

Обикновено изпитваното вещество се прилага седем дни седмично, по подходящ начин, върху няколко групи експериментални животни, по една доза за група, през голяма част от живота им. По време на експозицията на изпитваното вещество и след нея, експерименталните животни се наблюдават ежедневно, за да се открият някакви признаци на токсичност.

1.5. Критерии за качество

Няма.

1.6. Описание на метода за изпитване

Подготовка

Животните се държат при експериментални условия на настаняване и хранене в продължение поне на пет дни преди изпитването. Преди изпитването здрави млади животни се избират на случаен принцип и се разпределят в третирана и контролна група.

Условия на изпитване

Експериментални животни

Предпочитаният вид е плъх. Въз основа на резултатите от изпитвания, проведени в миналото, могат да се използват други видове (гризачи и различни от гризачи). Трябва да се използват млади здрави животни от обичайно употребявани лабораторни породи и дозирането трябва да започне колкото е възможно по-скоро след отбиването.

При започване на изпитването колебанията в теглото на животните не трябва да превишават ± 20 % от средната стойност. Когато изпитването за субхронична орална токсичност се провежда като предварително проучване преди продължително изпитване, и при двете изпитвания трябва да се използват същият вид и порода.

Брой и пол

За гризачи за всяко ниво на дозиране и паралелната контролна група трябва да се използват най-малко по 40 животни (20 женски и 20 мъжки). Женските животни трябва да са нераждали и да не са бременни. Ако се планират междинни жертви, броят трябва да бъде увеличен съответно с броя животни, които са планирани за пожертване преди завършване на изпитването.

За видове, различни от гризачи, е приемлив по-малък брой животни, но най-малко по четири от пол за всяка група.

Нива на дозиране нива и честота на експозицията

В допълнение към паралелната контролна група трябва да се използват поне три нива на дозиране. Най-високото ниво на дозиране трябва да предизвиква явни признаци на токсичност без да причинява излишна смъртност. Най-ниското ниво на дозиране не трябва да предизвиква никакви признаци на токсичност.

Междинната(ите) доза(и) трябва да се намира(т) по средата на диапазона между високите и ниските дози.

При избиране на нива на дозиране трябва да се вземат предвид данните от предшестващи проучвания и изпитвания за токсичност.

Обикновено експозицията е ежедневна. Ако дадено химическо вещество се прилага с питейната вода или се смесва с храната, то трябва да е непрекъснато в наличност.

Контроли

Трябва да се използва една паралелна контролна група, която е идентична с третираната група във всяко отношение, освен експозицията на изпитваното вещество.

При особени обстоятелства, например инхалационни изпитвания с аерозоли или емулгиращо средство с нехарактеризирана при орални изпитвания биологична активност, трябва да се използва и паралелна отрицателна контролна група. Отрицателната контролна група се третира по същия начин както експерименталните групи, с изключение на това, че животните не са подложени на експозиция на изпитваното вещество или някакъв носител.

Начин на прилагане

Двата основни начина на прилагане са орален и инхалационен. Изборът на начин на прилагане зависи от физичните и химичните характеристики на изпитваното вещество и вероятния начин на експозиция при хора.

Използването на дермалния път създава значителни практически проблеми. За хроничната системна токсичност, дължаща се на перкутанна абсорбция, нормално може да се съди по резултатите от друго орално изпитване и по информацията за степента на перкутанна абсорбция, получена от предишни изпитвания за перкутанна абсорбция.

Орални изпитвания

Когато изпитваното вещество се абсорбира от стомашно-чревния тракт и ако храносмилателният път е един от тези, чрез които хората могат да бъдат подложени на експозиция, се предпочита оралният начин на прилагане, освен ако няма противопоказания.

Животните могат да получават изпитваното вещество с храната, разтворено в питейната вода или дадено с капсула.

В идеалния случай дозирането трябва да бъде ежедневно, седем дни в седмицата, тъй като дозирането пет дни в седмицата може да даде възможност за възстановяване или намаляване на токсичността през периода, през който дозирането е прекъснато, и по този начин да повлияе върху резултата и последващата оценка. Обаче въз основа главно на практически съображения дозирането пет дни в седмицата се смята за приемливо.

Инхалационни изпитвания

Тъй като инхалационните изпитвания създават по-сложни технически проблеми в сравнение с другите начини на прилагане, тук са дадени по-подробни указания за този начин на прилагане. Трябва да се отбележи и че в особени ситуации интратрахеалното накапване може да представлява валидна алтернатива.

Продължителната експозиция обикновено наподобява предполаганата експозиция при хора, като животните са подложени на ежедневна експозиция в продължение на шест часа след изравняване на концентрациите в камерата, по пет дни в седмицата (интермитентна експозиция) или на 22- до 24-часова експозиция през деня по седем дни седмично (непрекъсната експозиция), съответстваща на възможна експозиция от околната среда, като около един час дневно по едно и също време се отделя за хранене на животните и за поддържане на камерата. И в двата случая животните обикновено са подложени на експозиция на фиксирани концентрации на изпитваното вещество. Основна разлика между интермитентната и непрекъснатата експозиция е, че при първата съществува период от 17 до 18 часа, през който животните могат да се възстановят от ефектите на ежедневната експозиция, като в края на седмицата има дори още по-дълъг период за възстановяване.

Изборът на интермитентна или непрекъсната експозиция зависи от целите на изпитването и от експозицията при хора, която трябва да се симулира. Трябва обаче да се имат предвид определени технически трудности. Например, предимствата на непрекъсната експозиция при симулиране на условията в околната среда могат да бъдат изместени от нуждата от поене и хранене по време на експозицията и от необходимостта от по-сложно (и сигурно) генериране на аерозол и пара и от мониторингови техники.

Експозиционни камери

Животните трябва да бъдат изследвани в инхалационни камери, предназначени да поддържат динамичен въздушен поток при поне 12-кратно обменяне на въздуха за час, за да се осигурят адекватно кислородно съдържание и равномерно разпределена експозиционна атмосфера. Контролните и експозиционните камери трябва да бъдат идентични и да бъдат проектирани така, че да осигурят условия на експозиция, които са сравними във всички отношения, освен експозицията на изпитваните вещества. Обикновено в камерите се поддържа леко отрицателно налягане, за да се предотврати изтичането на изпитваното вещество в заобикалящата зона. Камерите трябва да намалят до минимум струпването на експериментални животни. Като правило, за да се постигне стабилност на атмосферата в камерата, общият обем на експерименталните животни не трябва да надвишава 5 % от обема на камерата.

Измерванията или мониторингът трябва да включват:

i) въздушен поток: за предпочитане е дебитът на въздушния поток през камерата да се мониторира непрекъснато;

ii) концентрация: по време на ежедневната експозиция концентрацията на изпитваното вещество не трябва да варира с повече от ± 15 % от средната стойност;

iii) температура и влажност: за гризачи изпитването трябва да се провежда при температура от 22 ± 2 °C, а влажността в камерата трябва да е между 30 и 70 %, освен когато за суспендиране на изпитваното вещество в атмосферата на камерата се използва вода. За предпочитане е и двата показателя да се мониторират непрекъснато;

iv) измерване размера на частиците: разпределението на размерите на частиците се определя в атмосферата на камери, които включват течни или твърди аерозоли. Частиците на аерозола трябва да бъдат с размери, позволяващи вдишването им от използваните експериментални животни. Проби от атмосферата в камерите трябва да се вземат в зоната на дишане на животните. Пробата въздух трябва да бъде представителна за разпределението на частиците, с които животните са в контакт, и трябва гравиметрично да се вземе предвид целият суспендиран аерозол, дори когато голяма част от него не се вдишва. При разработване на генериращата система трябва често да се анализират размерите на частиците, за да се осигури стабилността на аерозола, а впоследствие толкова често, колкото е необходимо по време на експозицията, за да се определи адекватно устойчивостта на разпределението на частиците, с които животните са в контакт.

Продължителност на изпитването

Продължителността на прилагането трябва да бъде най-малко 12 месеца.

Процедура

Наблюдения

Внимателен клиничен преглед трябва да се провежда поне един път дневно. Допълнителни наблюдения трябва да се извършват ежедневно, като се предприемат необходимите действия, за да се избегне загуба на животни при изпитването, например аутопсия или съхраняване в хладилник на животните, които са намерени мъртви, и изолиране или пожертване на слабите или умиращи животни. Трябва да се провеждат внимателни наблюдения, за да се долови началото и прогресирането на всички токсични ефекти, а също и за намаляване до минимум на загубите поради заболявания, автолиза или канибализъм.

Клиничните признаци, включително неврологични и очни изменения, а също смъртността, трябва да се регистрират за всички животни. Трябва да се регистрира времето на поява и прогресирането на токсичните състояния, включително съмнителните тумори.

Телесното тегло трябва да се регистрира индивидуално за всички животни един път седмично през първите 13 седмици на изпитването и поне един път на всеки четири седмици след това. Приемът на храна трябва да се определя всяка седмица през първите 13 седмици от изпитването, а после на интервали от приблизително три месеца, освен ако измененията на телесното тегло не изискват друго.

Хематологично изследване

Хематологично изпитване (т.е. съдържание на хемоглобин, хематокрит, общ брой на еритроцитите, общ брой на левкоцитите, тромбоцити и други показатели на потенциала за съсирване) трябва да се извършва на третия и шестия месец, след това на интервали от приблизително шест месеца, както и в края на изпитването върху кръвни проби, взети от всички видове, които са различни от гризачи, и от по 10 плъха/пол от всички групи. Ако е възможно, пробите трябва да се вземат от едни и същи плъхове при всеки интервал. Освен това от всички видове, различни от гризачи, трябва да се вземе изходна проба преди изпитването.

Ако въз основа на клиничните наблюдения може да се предположи влошаване на здравословното състояние на животните по време на изпитването, на засегнатите животни трябва да се направи диференциално броене на кръвните клетки.

Диференциално броене на кръвните клетки се извършва върху проби от животни в групата , третирана с най-високата доза, и в контролната група. Диференциалното броене на кръвни клетки се извършва при групата, третирана със следващата по-ниска доза, само ако е налице голямо несъответствие между групата, третирана с най-високата доза, и контролната група или ако това е показано въз основа на патологични резултати.

Изследване на урина

За анализ трябва да се вземат проби урина от всички видове, различни от гризачи, и от 10 плъха/пол от всички групи и, ако е възможно, от едни и същи плъхове през същите интервали, както за хематологичните изследвания. При гризачи трябва да се изследват следните параметри за отделни животни или за пул от проби от същия пол/група.

— външен вид: обем и плътност при отделните животни,

— белтък, глюкоза, кетони, скрита кръв (полуколичествено изследване),

— микроскопско изследване на седимент (полуколичествено).

Клинична биохимия

Приблизително на шестмесечни интервали и при прекратяване на изпитването се вземат кръвни проби за клинични биохимични параметри от всички видове, различни от гризачи, и от 10 плъха/пол от всички групи и, ако е възможно, от същите плъхове при всеки интервал. Освен това от всички видове, различни от гризачи, преди изпитването трябва да се вземе изходна проба. От тези проби се приготвя плазма и се изследват следните параметри:

— концентрация на общия белтък,

— концентрация на албумина,

— функционални чернодробни изследвания (като активност на алкалната фосфатаза, активност на глутамат пируват трансаминазата (2), активност на глутамат оксалоацетат трансаминазата (3), гама-глутамил транспептидаза, орнитин декарбоксилаза,

— въглехидратен метаболизъм, например кръвна захар на гладно,

— бъбречни функционални изследвания като уреен азот в кръвта.

Макроскопска аутопсия

Всички животни, включително тези, които са умрели по време на експеримента или са били убити, защото са намерени в умиращо състояние, трябва да бъдат подложени на пълна макроскопска аутопсия. Преди пожертването от всички животни трябва да бъдат взети кръвни проби за диференциално броене на кръвни клетки. Всички макроскопски видими лезии, тумори или лезии, които са съмнителни за тумори, трябва да бъдат съхранени. Трябва да се направи опит за съпоставяне на резултатите от макроскопското и микроскопското изследване.

Всички органи и тъкани трябва да бъдат съхранени за хистопатологично изследване. Обикновено това се отнася до следните органи и тъкани: мозъка (4) (продълговатия мозък/варолиевия мост, кората на малкия мозък, кората на главния мозък), хипофизата, щитовидната жлеза (включително паращитовидните жлези), тимуса, белите дробове (включително трахеята), сърцето, аортата, слюнчените жлези, черния дроб (4), слезката, бъбреците (4), надбъбречните жлези (4), хранопровода, стомаха, дванадесетопръстника, празното черво, хълбочното черво, сляпото черво, ободното черво, правото черво, матката, пикочния мехур, лимфните възли, панкреаса, гонадите (4), допълнителните полови органи, женската млечна жлеза, кожата, мускулите, периферния нерв, гръбначния мозък (шиен, гръден и поясен), гръдната кост с костен мозък, бедрената кост (включително става) и очите. Раздуването на белите дробове и пикочния мехур с фиксатор представлява оптимален начин за съхраняване на тези тъкани. Раздуването на белите дробове при инхалационни изпитвания е много важно за правилното хистопатологично изследване. При специални изпитвания като инхалационните изпитвания трябва да бъде изследван целият респираторен тракт, включително носа, фаринкса и ларинкса.

Ако се провеждат други клинични изследвания, информацията, получена при тези процедури, трябва да бъде налице преди микроскопското изследване, тъй като тя може да даде важни насоки на патолога.

Хистопатологично изследване

Всички видими изменения, особено туморите и други лезии, възникващи в който и да е орган, трябва да бъдат изследвани микроскопски. Допълнително се препоръчват следните процедури:

a) Микроскопско изследване на всички съхранени органи и тъкани с пълно описание на всички лезии, открити при: 1. всички животни, които са умрели или са били убити по време на изпитването; 2. всички животни от групата, третирана с висока доза, и контролната група;

б) Органите или тъканите, показващи аномалии, които са причинени или е възможно да са причинени от изпитваното вещество, също се изследват при групите, третирани с по-ниски дози;

в) Когато резултатът от изпитването показва данни за значително съкращаване на нормалната продължителност на живота или за предизвикване на ефекти, които могат да окажат влияние върху токсичния отговор, следващата по-ниска доза трябва да бъде изследвана по начина, описан по-горе.

г) Информацията за честотата на лезиите, които нормално възникват при използваната порода животни, при същите лабораторни условия, т.е. исторически контролни данни, е незаменима за правилната оценка на значимостта на измененията, наблюдавани при третираните животни.

2. ДАННИ

Данните трябва да бъдат обобщени в табличен вид, като за всяка изпитвана група са показани броят на животните в началото на изпитването, броят на животните, при които са налице лезии, и процентът на животните, които демонстрират всеки тип лезия. Резултатите трябва да бъдат оценени с помощта на подходящ статистически метод. Може да се използва всеки признат статистически метод.

3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1. Протокол от изпитването

Ако е възможно, протоколът от изпитването съдържа следната информация:

— вид, порода, източник, условия на околната среда, диета,

— условия на изпитването: Описание на експозиционната апаратура: включително проектиране, тип, размери, източник на въздух, система за генериране на частици и аерозоли, метод за климатизиране, пречистване на използвания въздух и метод за настаняване на животните в експериментална камера, когато такава се използва. Трябва да бъде описано оборудването за измерване на температурата, влажността и, където е необходимо, стабилността на концентрациите на частиците в аерозолите или на размера на частиците. Данни за експозицията: те трябва да бъдат представени в табличен вид със средни стойности и мярка за вариабилността (например стандартно отклонение) и трябва да включват: a) дебити на въздушните потоци през инхалационното оборудване; б) температура и влажност на въздуха; в) номинални концентрации (общо количество на изпитваното вещество, заредено в инхалационното оборудване, разделено на обема въздух); г) естество на носителя, ако е използван; д) действителни концентрации в изпитвателната зона на