Добавят се следните приложения:

„

Допълнение

МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ НА КРАВЕ МЛЯКО И КАЗЕИНАТИ В СИРЕНА ОТ ОВЧЕ МЛЯКО, КОЗЕ МЛЯКО ИЛИ БИВОЛСКО МЛЯКО, ИЛИ СМЕСИ ОТ ОВЧЕ, КОЗЕ И БИВОЛСКО МЛЯКО

1. ОБХВАТ

Откриване на краве мляко и казеинати в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко, чрез изоелектрическо фокусиране на γ-казеини след плазминолиза.

2. ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Методът е подходящ за чувствително и специфично откриване на натурално и топлинно обработвано краве мляко и казеинати в пресни и узрели сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко. Той не е подходящ за откриване на подправяне на мляко и сирене чрез топлинно обработени концентрати на суроватъчен протеин от краве мляко.

3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА

3.1. Изолиране на казеини от сирене и от референтните проби.

3.2. Разтваряне на изолираните казеини и разграждане чрез плазмин (EC.3.4.21.7).

3.3. Изоелектрическо фокусиране на обработени с плазмин казеини в присъствието на уреа и оцветяване на протеините.

3.4. Оценка на оцветените γ3 и γ2-ивици на казеин (доказателство за краве мляко) чрез сравняване на получените от пробата ивици с тези, които са получени в същия гел от референтните проби, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко.

4. РЕАГЕНТИ

Ако не е посочено друго, трябва да бъдат използвани химикали с аналитично качество. Водата трябва да е двойно дестилирана или с еквивалента степен на чистота.

Забележка: Указанията по-долу се прилагат за лаборатория, която е подготвила полиакриламидни гелове, съдържащи уреа, с размери 265 × 125 × 0,25 mm. Когато се използват други размери и типове гел, може да е необходимо коригиране на условията за отделяне.

Изоелектрическо фокусиране

4.1. Реагенти за получаване на полиакриламидни гелове, съдържащи уреа

4.1.1. Основен разтвор на гел

Разтварят се:

4,85 g акриламид

0,15 g N, N′-метиленбисакриламид (BIS)

48,05 g уреа

15,00 g глицерин (87 % w/w)

във вода, допълва се до 100 ml и се съхранява в бутилка от кафяво стъкло в хладилник.

Забележка: Вместо цитираните определени дози невротоксични акриламиди може да се използва готов разтвор акриламид/BIS, наличен в търговската мрежа. Когато такъв разтвор съдържа 30 % w/v акриламид и 0,8 % w/v BIS, вместо определените дози за сместа трябва да бъде използван обем от 16,2 ml. Годността на основния разтвор е максимум 10 дни; ако неговата проводимост е повече от 5 μS, той се дейонизира чрез разклащане с 2 g Амберлит MB-3 за 30 минути, след това се филтрира през мембрана от 0,45 μm.

4.1.2. Разтвор на гел

Приготвя се разтвор на гел чрез смесване на добавките и амфолити (*) с основния разтвор на гел (виж 4.1.1).

9,0 ml основен разтвор

24 mg β-аланин

500 μl амфолит pH 3,5—9,5

250 μl амфолит pH 5—7

250 μl амфолит pH 6—8

Разтворът на гел се смесва и се дегазира за две до три минути в ултразвукова баня или във вакуум.

Забележка: Разтворът на гел се приготвя непосредствено преди изливането му (вж. 6.2).

4.1.3. Катализаторни разтвори

4.1.3.1. N, N, N′ N′ — тетраметилетилендиамин (Temed)

4.1.3.2. 40 % w/v амониев персулфат (PER):

800 mg PER се разтварят във вода и се долива до 2 ml

Забележка: Винаги се използва прясно приготвен разтвор на PER.

4.2. Контактна течност

Керосин или течен парафин

4.3. Aноден разтвор

5,77 g фосфорна киселина (85 % w/w) се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml.

4.4. Катоден разтвор

2,00 g натриев хидроксид се разтваря във вода и се разрежда до 100 ml с вода.

Подготовка на пробите

4.5. Реагенти за изолиране на протеин

4.5.1. Разредена оцетна киселина (25,0 ml ледена оцетна киселина с добавена вода до 100 ml)

4.5.2. Дихлорометан

4.5.3. Ацетон

4.6. Буфер за разтваряне на протеин

Разтварят се:

5,75 g глицерин (87 % w/w)

24,03 g уреа

250 mg дитиотрейтол

във вода и се долива до 50 ml.

Забележка: Съхранява се в хладилник, максимална годност — една седмица.

4.7. Реагенти за разграждане на казеини чрез плазмин

4.7.1. Буфер — амониев карбонат

0,2 mol/l разтвор на амониев бикарбонат (1,58 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA, 1,46 g/100 ml), се титрува с 0,2 mol/l разтвор на амониев кaрбонат (1,92 g/100 ml вода), съдържащ 0,05 mol/l EDTA, до pH 8.

4.7.2. Говежди плазмин (EC. 3.4.21.7) с активност най-малко 5 U/ml

4.7.3. Разтвор на ε-аминокапронова киселина за инхибиране на ензими

2,624 g ε-аминокапронова киселина (6 амино-n-хексанова киселина) се разтварят в 100 ml 40 % (v/v) етанол.

4.8. Стандартни проби

4.8.1. Сертифицирани референтни стандартни проби от смес от подсирени овче и козе обезмаслено мляко, съдържащи 0 % и 1 % краве мляко, могат да се намерят от Института за референтни материали и метрология на Комисията, B-2440 Гил, Белгия.

4.8.2. Подготовка на вътрешни лабораторни стандартни проби от подсирено биволско мляко, съдържащо 0 % и 1 % краве мляко

Обезмасленото мляко се приготвя чрез центрофугиране на сурово непакетирано биволско или краве мляко при 37 °C (2 500 g, 20 минути). След бързо охлаждане на съда и съдържанието му до 6—8 °C, горният слой мазнина се отстранява напълно. За подготовката на 1 %-на стандартна проба към 495 ml биволско обезмаслено мляко се добавя 5,00 ml краве обезмаслено мляко в 1 l бехерова чаша и се постига pH 6,4 чрез прибавяне на разредена млечна киселина (10 % w/v). Температурата се довежда до 35 °C и се прибавят 100 μl телешко сирище (активност 1: 10 000, около 3 000 U/ml), разклаща се за 1 минута и бехеровата чаша се оставя покрита с алуминиево фолио при 35 °C за един час, за да може съдържанието да се съсири. След образуването на съсирека цялото подсирено мляко се суши чрез сублимиране без предварително хомогенизиране или отцеждане на суроватката. След сушенето чрез сублимиране то се смила ситно на хомогенен прах. За подготовката на 0 %-ната стандартна проба се извършва същата процедура с използване на натурално биволско обезмаслено мляко. Стандартните проби трябва да бъдат съхранявани при – 20 °C.

Забележка: Препоръчително е да се проверява чистотата на биволското мляко чрез изоелектрическо фокусиране на третираните с плазмин казеини преди подготовката на стандартните проби.

Реагенти за оцветяване на протеин

4.9. Фиксатор

150 g трихлорооцетна киселина се разтварят във вода и се долива до 1 000 ml.

4.10. Обезцветяващ разтвор

500 ml метанол и 200 ml ледена оцетна киселина се разреждат до 2 000 ml с дестилирана вода.

Забележка: Всеки ден се приготвя пресен обезцветяващ разтвор; той може да бъде приготвен чрез смесване на равни обеми основни разтвори на 50 % (v/v) метанол и 20 % (v/v) ледена оцетна киселина.

4.11. Оцветяващи разтвори

4.11.1. Оцветяващ разтвор (основен разтвор 1)

3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) се разтваря в 1 000 ml 90 % (v/v) метанол, като се използва магнитна бъркалка (приблизително 45 минути), филтрира се през два нагънати филтъра със средна скорост.

4.11.2. Оцветяващ разтвор (основен разтвор 2)

5,0 g меден сулфат пентахидрат се разтваря в 1 000 ml 20 % (v/v) оцетна киселина.

4.11.3. Оцветяващ разтвор (работен разтвор)

Смесват се по 125 ml от всеки от основните разтвори (4.11.1, 4.11.2) непосредствено преди оцветяването.

Забележка: Оцветяващият разтвор следва да бъде приготвен в деня, в който се използва.

5. ОБОРУДВАНЕ

5.1. Стъклени плочи (265 × 125 × 4 mm); каучукова ролка (ширина 15 cm); нивелирна маса

5.2. Лист носител на гел (265 × 125 mm)

5.3. Покривен лист (280 × 125 mm). По двете му дължини отстрани се поставя самозалепваща лента (280 × 6 × 0,25 mm) (вж. фигура 1)

5.4. Камера за електрофокусиране с охлаждаща плоча (напр. 265 × 125 mm) и подходящо електрическо захранване (≥ 2,5 kV) или автоматично устройство за електрофореза

5.5. Криостат с циркулация, термостатно контролиран на 12 ± 0,5 °C

5.6. Центрофуга, регулируема за 3 000g

5.7. Електродни ленти (с дължина ≥ 265 mm)

5.8. Пластмасови флакони за капене на анодните и катодните разтвори

5.9. Апликатори за проби (10 × 5 mm, вискозна филтърна хартия или филтърна хартия с ниска абсорбция на протеин)

5.10. Съдове от неръждаема стомана или от стъкло за оцветяване и обезцветяване (напр. 280 × 150 mm таблички за инструменти)

5.12. Регулируем хомогенизатор (с диаметър на оста 10 mm), от 8 000 до 20 000 об./мин.

5.13. Магнитна бъркалка

5.14. Ултразвукова баня

5.15. Апарат за залепване на листовете

5.16. 25 μl микро-капкомери

5.17. Вакуумен концентратор или сушилня чрез сублимиране

5.18. Термостатично контролирана водна баня, регулируема за 35 и за 40 ± 1 °C с възможност за разбъркване

5.19. Денсиметър, четящ при λ = 634 nm

6. ПРОЦЕДУРА

6.1. Подготовка на пробите

6.1.1. Изолиране на казеини

Количество, еквивалентно на 5 g сухо вещество сирене, или референтните стандартни проби се претеглят в 100 ml центрофужна епруветка, прибавя се 60 ml дестилирана вода и се хомогенизира с хомогенизатор (от 8 000 до 10 000 об./мин). Регулира се до pH 4,6 с разредена оцетна киселина (4.5.1) и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Мазнината и суроватката се отделят, утайката се хомогенизира при 20 000 об./мин в 40 ml дестилирана вода, регулирана до pH 4,5 с разредена оцетна киселина (4.5.1), добавят се 20 ml дихлорометан (4.5.2), отново се хомогенизира и се центрофугира (5 минути, 3 000 g). Казеиновият слой, който се намира между водната и органичната фази (вж. фигура 2), се отстранява със шпатула и двете фази се отделят. Казеинът се хомогенизира отново в 40 ml дестилирана вода (виж по-горе) и 20 ml дихлорометан (4.5.2) и се центрофугира. Тази процедура се повтаря, докато двете фази на екстракцията останат безцветни (от два до три пъти). Утайката от протеин се хомогенизира с 50 ml ацетон (4.5.3) и се филтрира през нагъната филтърна хартия със средна скорост. Утайката върху филтъра се измива с две отделни части от 25 ml ацетон и се оставя да се изсуши на въздух или в струя азот, след което се стрива на фин прах в хаван.

Забележка: Сухият изолиран казеин следва да бъде съхраняван при – 20 °C.

6.1.2. Разграждане чрез плазмин на β-казеини за интензифициране на γ-казеини

25 mg изолирани казеини (6.1.1) се разпръскват в 0,5 ml буфер с амониев карбонат (4.7.1) и се хомогенизират за 20 минути, например чрез обработка с ултразвук. Подгрява се до 40 °C и се добавя 10 μl плазмин (4.7.2), смесва се и се инкубира за един час при 40 °C с непрекъснато разклащане. За да се инхибира ензимът, се добавя 20 μl разтвор на ε-аминокапронова киселина (4.7.3), след това се добавят 200 mg твърда уреа и 2 mg дитиотрейтол.

Забележка: За да се получи по-голяма симетрия на фокусираните казеинови ивици е препоръчително разтворът да се изсуши чрез сублимиране след добавянето на ε-аминокапронова киселина, като след това утайките се разредят в 0,5 ml буфер за разтваряне на протеин (4.6).

6.2. Приготвяне на полиакриламидни гелове, съдържащи уреа

С помощта на няколко капки вода листът носител на гел (5.2) се разстила върху стъклена плоча (5.1), като излизащата навън вода се отстранява с хартиена салфетка. По същия начин покривният лист (5.3) с ограничители (0,25 mm) се разстила върху друга стъклена плоча. Плочата се поставя хоризонтално върху нивелирна маса.

Към приготвения и с отстранен въздух разтвор на гел (4.1.2) се добавят 10 μl Temed (4.1.3.1), разклаща се и се добавят 10 μl разтвор на PER (4.1.3.2), внимателно се смесва и веднага се излива равномерно в центъра на покривния лист. Единият край на плочата с носителя на гела (с листа надолу) се поставя върху плочата с покривния лист и плочата се сваля бавно надолу, така че между листовете да се образува и разстеле равномерно филм от гел, без да се образуват мехурчета (фигура 3). Плочата с носителя на гела се оставя внимателно да легне напълно с помощта на тънка шпатула и върху нея се поставят още три стъклени плочи за тежест. След завършването на полимеризацията (около 60 минути) полимеризираният гел върху плочата носител на гела и върху покривния лист се изважда чрез разделяне на стъклените плочи. Обратната страна на листа носител се почиства внимателно, за да се отстранят остатъците от гела и уреата. „Гел-сандвичът“ се навива и залепва на тръбичка и се съхранява в хладилник (максимум шест седмици).

Забележка: Покривният лист с ограничителите може да бъде използван повторно. Полиакриламидният гел може да бъде нарязан на по-малки части, което е препоръчително, когато има няколко проби или ако се използва автоматично устройство за електрофореза (два гела, с размер 4,5 × 5 сm).

6.3. Изоелектрическо фокусиране

Охлаждащият термостат се настройва на 12 °C. Обратната страна на листа носител на гел се избърсва с керосин, след това в центъра на охлаждащия блок се капват няколко капки керосин (4.2.). След това „гел-сандвичът“ се разстила върху него със страната на носителя надолу, като се внимава да не се образуват мехурчета. Излишният керосин се избърсва и покривният лист се отстранява. Електродните ленти се напояват с електродните разтвори (4.3, 4.4), изрязват се до дължината на гела и се поставят на предвидените места (разстояние на електродите 9,5 cm).

Условия за изоелектрическо фокусиране:

6.3.1. Размер на гела 265 × 125 × 0,25 mm

Стъпка Време (min.) Електрическо напрежение (V) Електрически ток (mA) Мощност (W) Волт-часове (Vh) 1. Предварително фокусиране 30 максимум 2 500 максимум 15 постоянна 4 ок. 300 2. Фокусиране на пробата (7) 60 максимум 2 500 максимум 15 постоянна 4 ок. 1 000 3. Окончателно фокусиране 60 максимум 2 500 максимум 5 максимум 20 ок. 3 000 40 максимум 2 500 максимум 6 максимум 20 ок. 3 000 30 максимум 2 500 максимум 7 максимум 25 ок. 3 000

Забележка: Ако плътността или ширината на геловете се променят, стойностите за електрически ток и мощност следва да се адаптират по подходящ начин (напр. удвояване на стойностите за електрически ток и за мощност, ако се използва гел с размери 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Пример за програмиране на автоматично устройство за електрофореза (2 гела с размери 5,0 × 4,5 cm); електродите без ленти се поставят направо върху гела

Стъпка Електрическо напрежение Електрически ток Мощност Температура Волт-часове 1. Предварително фокусиране 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Фокусиране на пробата 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Фокусиране 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Фокусиране 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

В стъпка 2 апликаторът на пробата се поставя на 0 Vh.

В стъпка 2 апликаторът на пробата се отстранява при 30 Vh.

6.4. Оцветяване на протеин

6.4.1. Фиксиране на протеин

Електродните ленти се отстраняват веднага след изключване на захранването и гелът незабавно се поставя в съд за оцветяване/обезцветяване, пълен с 200 ml фиксатор (4.9); оставя се за 15 минути, като непрекъснато се разклаща.

6.4.2. Измиване и оцветяване на плочата с гел

Фиксаторът се отцежда внимателно и плочата с гел се измива два пъти за по 30 секунди, всеки път със 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10). Обезцветяващият разтвор се излива и съдът се пълни с 250 ml оцветяващ разтвор (4.11.3); оставя се да се оцвети за 45 минути с леко разклащане.

6.4.3. Обезцветяване на плочата с гел

Оцветяващият разтвор се излива, плочата с гел се измива два пъти, като всеки път се използва по 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10), след това се разклаща с 200 ml обезцветяващ разтвор за 15 минути и обезцветяването се повтаря най-малко два или три пъти, докато основата стане чиста и безцветна. След това плочата с гел се изплаква с дестилирана вода (2 × 2 минути) и се изсушава на въздух (от 2 до 3 часа) или със сешоар (от 10 до 15 минути).

Забележка 1: Фиксирането, измиването, оцветяването и обезцветяването се извършват при 20 °C. Да не се използват високи температури.

Забележка 2: Ако се предпочита по-чувствително сребърно оцветяване (напр. кит за сребърно оцветяване, протеин, Pharmacia Biotech, код No 17-1150-01), пробите от казеин, третирани с плазмин, следва да бъдат разредени до 5 mg/ml.

7. ОЦЕНКА

Оценяването се извършва чрез сравняване на ивиците на протеините в непознатата проба с референтни проби върху същия гел. Откриването на краве мляко в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко, се извършва чрез γ3- и γ2-казеини, чийто обхват на изоелектрически точки е между pH 6,5 и pH 7,5 (фигури 4 a и б, фигура 5). Границата на откриване е по-ниска от 0,5 %.

7.1. Визуална оценка

За визуална оценка на количеството краве мляко се препоръчва да се адаптират концентрациите на пробите и стандартите за получаване на същото ниво на интензивност на овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (виж „γ2 E,G,B“ и „γ3 E,G,B“ на фигури 4 a и б и фигура 5). След това количеството на кравето мляко (по-малко от, равно на или по-голямо от 1 %) в непознатата проба може да бъде оценявано директно чрез сравняване на интензитета на крави γ3- и γ2-казеини (виж „γ3 C“ и „γ2 C“ на фигури 4 a и б и фигура 5) с тези на 0 % и 1 % референтни стандарти (овчи, кози) или вътрешнолабораторни стандарти (биволски).

7.2. Денсиметрична оценка

Ако е приложимо, за определянето на съотношението на площта на пика на крави спрямо овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (вж. фигура 5) се използва денсиметър (5.19). Тази стойност се сравнява със съотношението на площта на пика на γ2- и γ3-казеини от 1 % референтния стандарт (овчи, кози) или вътрешнолабораторен стандарт (биволски), анализирани върху същия гел.

Забележка: Методът функционира задоволително, ако има ясен положителен сигнал за двата крави γ2- и γ3-казеина в 1 % референтния стандарт, но не и в 0 % референтния стандарт. Ако няма, процедурата се оптимизира, като точно се спазват детайлите на метода.

Пробата се оценява като положителна, ако двата крави γ2- и γ3-казеина или съответните съотношения на площта на пиковете са равни или по-големи от нивото на 1 % референтен стандарт.

8. ЗА СПРАВКА

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. (Използване на плазмин за увеличаване на чувствителността на откриване на краве мляко в овче и/или козе сирене с изоелектрическо фокусиране с гел на γ2-казеини). Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990 г.).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting (Контролен метод за откриване на краве мляко в овче и биволско сирене чрез използване на имуноблотинг). Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995 г.).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier (Чувствително откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез амфолит-носител и амфолит-носител/неутрализиран pH градиент — изоелектрическо фокусиране на γ-казеини с помощта на плазмин като индикаторен фермент) в: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.), стр 389—393, Bode-Verlag, München (1989 г.).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen (Откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез изоелектрическо фокусиране в полиакриламидни гелове, съдържащи уреа). Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films (Изоелектрическо фокусиране със свръхтънък слой в 50-100 μm полиакриламидни гелове върху силанизирани стъклени съдове или полиестерни филми). Electrophoresis 1, 43-56 (1980 г.).

Фигура 1

Схематично представяне на покривния лист

Фигура 2

Слой казеин между водната и органичната фази след центрофугиране

Фигура 3

Техника на захлупване за изливане на свръхтънки полиакриламидни гелове

a = разделителна лента (0,25 mm); b = покривен лист (5.3); c, e = стъклени плочи (5.1); d = разтвор на гел (4.1.2); f = лист носител на гел (5.2)

Фигура 4a

Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от овче и от козе мляко и съдържащо различни количества краве мляко

% CM = процент краве мляко, C = краве, E = овче, G = козе

Показана е горната половина на гел IEF.

Фигура 4б

Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от смеси от овче, козе и биволско мляко и съдържащо различни количества краве мляко

% CM = процент краве мляко; 1 + = проба, съдържаща 1 % краве мляко и прибавен чист крави казеин в средата на пътеката. C = краве, E = овче, G = козе, B = биволско

Показано е общото разстояние на разделяне на гела IEF.

Фигура 5

Поредица денситограми на стандартните проби (STD) и пробите сирене, произведено от смес от овче и козе мляко, след изоелектрическо фокусиране

a,b = стандартни проби, съдържащи 0 и 1 % краве мляко; c-g = проби сирене, съдържащи 0, 1, 2, 3 и 7 % краве мляко. C = краве, E = овче, G = козе.

Сканирана е горната половина от гела IEF при λ = 634 nm.