8)

в Част Б, се добавят следните глави: „Б.63 СКРИНИНГОВО ИЗПИТВАНЕ ЗА ТОКСИЧНОСТ ЗА РЕПРОДУКЦИЯТА/РАЗВИВАЩИЯ СЕ ОРГАНИЗЪМ ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 421 (2016). Насоките на ОИСР за изпитване на химикали се преразглеждат периодично в светлината на научния прогрес. Оригиналните насоки за скринингово изпитване 421 бяха приети през 1995 г., на базата на протокол за „Предварително скринингово изпитване за токсичност за репродукцията“, обсъден на две експертни срещи в Лондон през 1990 г. (1) и в Токио през 1992 г. (2). 2. Този метод за изпитване бе актуализиран с крайни точки, относими към вещества, нарушаващи функцията на ендокринната система, като последващо действие към дейност с висок приоритет, инициирана в ОИСР през 1998 г. за ревизиране на съществуващите насоки за изпитвания и за разработване на нови насоки за изпитвания за скрининг и изпитване на веществата с потенциал да нарушават функцията на ендокринната система (3). TG 407 на ОИСР (28-дневно изследване за токсичност с повтаряща се орална доза при гризачи, Глава Б.7 от настоящото приложение) например, бяха подобрени през 2008 г. с параметри, подходящи за откриване на въздействие на изпитваните химикали върху ендокринната система. Целта при актуализиране на TG 421 бе да се включат някои крайни точки, относими към вещества, нарушаващи функцията на ендокринната система в насоките за скринингови изпитвания (TG), при които периодите на експозиция обхващат някои от чувствителните периоди по време на развитието на организма (пред- или ранните постнатални периоди). 3. Избраните допълнителни крайни точки относими към вещества, нарушаващи функцията на ендокринната система, също част от TG 443 (Разширено изследване за токсичност за репродукцията в едно поколение, Глава Б.56 от настоящото приложение), бяха включени в TG 421 на базата на проучване на осъществимостта разглеждащо научни и технически въпроси, свързани с тяхното включване, както и възможните адаптации на плана на изпитването, необходими за тяхното включване (4). 4. Настоящият метод за изпитване е проектиран да генерира ограничена информация относно ефектите на изпитвания химикал върху мъжката и женската репродуктивна ефективност като например, функция на половите жлези, поведение при чифтосване, зачеване, развитие на заченатия организъм и раждане. Той не е алтернативен на, нито замества съществуващите методи за изпитване Б.31, Б.34, Б.35 или Б.56. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 5. Настоящият метод за скрининг изпитване може да се използва за предоставяне на първоначална информация за възможните ефекти върху репродукцията и/или развитието, в ранния етап на оценяване на токсикологичните свойства на химикали, или за химикали, които пораждат безпокойство. Той може да се използва и като част от набор от първоначални скрининг изпитвания за съществуващи химикали, за които има малко или липсва токсикологична информация, като проучване за определяне на диапазона на дозата за по-обширни проучвания върху репродукцията/развитието, или когато се счете за уместно по други причини. При провеждане на проучването следва да се спазват ръководните принципи и съображения, очертани в Ръководство на ОИСР № 19 относно признаването, оценката и употребата на клинични признаци като хуманни крайни точки за експериментални животни, използвани за оценяване на безопасността (5). 6. Настоящият метод за изпитване не предоставя пълна информация по всички аспекти на репродукцията и развитието на организма. По-конкретно, той предлага единствено ограничени средства за откриване на постнатални прояви на пренатална експозиция, или ефекти, които може да бъдат индуцирани по време на постнатална експозиция. Наред с другите причини, поради относително малкия брой животни в групите на определена доза, избирателността на крайните точки и кратката продължителност на проучването, този метод няма да предостави доказателство за категорични твърдения за липса на ефекти. Нещо повече, при отсъствието на данни от други изследвания за токсичност на репродукцията/развиващия се организъм, положителните резултати са полезни за първоначалната оценка на опасността и допринасят за вземането на решения по отношение на необходимостта и времето за допълнителни изпитвания. 7. Резултатите, получени от свързаните с жлезите с вътрешна секреция параметри, следва да се разглеждат в контекста на „Концептуалната рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система“ (6). В тази Концептуална рамка подобрените TG 421 на ОИСР се съдържат в ниво 4 като in vivo изследване, предоставящо данни за неблагоприятните ефекти върху крайните точки, относими към ендокринната система. Все пак, един ендокринен сигнал сам по себе си не може да се разглежда като достатъчно доказателство, че изпитваният химикал е вещество, нарушаващо функциите на ендокринната система. 8. Настоящият метод за изпитване предполага орален прием на изпитвания химикал. Ако се използват други пътища на експозиция може да се налагат изменения на метода. 9. Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Подобни съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. 10. Определенията, които са използвани, са дадени в допълнение 1. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 11. Изпитваният химикал се прилага в нарастващи дози на няколко групи от мъжки и женски индивиди. Мъжките следва да бъдат дозирани в продължение на най-малко четири седмици до и включително деня, преди планираното им умъртвяване (това включва минимум две седмици преди чифтосване, по време на периода на чифтосване и приблизително, две седмици след чифтосване). Предвид ограничения период на дозиране на мъжките преди чифтосване, плодовитостта може да не бъде особено чувствителен показател за тестикуларна токсичност. Ето защо, детайлно хистологично изследване на тестисите е от съществено значение. Комбинацията от период на дозиране преди чифтосване от две седмици и последващи наблюдения на чифтосването/плодовитостта с цялостния период на дозиране от минимум четири седмици, последван от детайлни хистопатологични изследвания на мъжките полови жлези, се разглежда като достатъчен за да могат да бъдат определени голяма част от ефектите върху мъжката плодовитост и сперматогенеза. 12. Женските следва да бъдат дозирани през целия период на проучването. Това включва две седмици преди чифтосване (като целта е да се обхванат най-малко два пълни естрални цикъла), променливото време до зачеване, продължителността на бременността и най-малко тринадесет дни след раждането, до и включително деня, преди планираното им умъртвяване. 13. Продължителността на проучването, след аклиматизацията и оценката на естралния цикъл преди дозиране, зависи от женската ефективност и е приблизително 63 дни, [най-малко 14 дни преди чифтосването, (до) 14 дни за чифтосване, 22 дни бременност, 13 дни лактация]. 14. По време на периода на прилагане, животните се наблюдават внимателно и ежедневно за признаци на токсичност. Животните, които умират или са умъртвени по време на периода на изпитването, се аутопсират, а преживелите животни се умъртвяват и се аутопсират при приключването на изпитването. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Избор на животински вид 15. Настоящият метод за изпитване е предназначен за употреба с плъхове. Ако параметрите, определени в рамките на този метод за изпитване, се изследват при друг вид гризачи, следва да бъде представена детайлна обосновка. Плъховете са единственият биологичен вид, използван в рамките на международната валидационна програма за откриване на вещества, нарушаващи функциите на ендокринната система в TG 407 на ОИСР (съответстващи на Глава Б.7 от настоящото приложение). Не трябва да се използват породи с ниска плодовитост или породи, за които е характерна висока честота на вродените аномалии. Трябва да се използват здрави, нераждали животни, които не са били подлагани на предишни експериментални процедури. Тестовите животни следва да се охаракеризират по вид, порода, пол, тегло и възраст. При започване на изследването измененията в теглото на използваните животни следва да бъде минимално и да не надвишава 20 % от средното за всеки пол тегло. Когато изследването се провежда като предварително до дългосрочно проучване или проучване на цяло поколение, за предпочитане е в двете изследвания да се използват животни от една и съща порода и източник. Условия на отглеждане и хранене 16. Всички процедури трябва да са в съответствие с местните стандарти за полагане на грижи за лабораторни животни. Температурата в стаята на опитните животни трябва да бъде 22 °C (± 3 °). Въпреки че относителната влажност трябва да е най-малко 30 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението, целта следва да е 50—60 %. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по настоящия метод. 17. Животните се настаняват групово, в малки групи от един и същи пол; животните могат да се настаняват отделно, ако това е научно обосновано. При групово настаняване в клетки не следва да има повече от пет животни в клетка. Чифтосването трябва да се извърши в клетки, подходящи за тази цел. Бременните женски следва да бъдат настанявани поотделно и да им бъдат предоставяни материали за изграждане на гнездо. Кърмещите женски се настаняват поотделно заедно с потомството си. 18. Храната следва да бъде редовно анализирана за наличието на замърсители. Проба от хранителния режим трябва да се съхранява до окончателното изготвяне на доклада. Подготовка на опитните животни 19. Здрави млади полово зрели животни се определят на произволен принцип за контролните и опитните групи. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Животните се идентифицират по уникален начин и се настаняват в клетките им най-малко пет дни преди началото на проучването, за да им се осигури време за аклиматизиране към лабораторните условия. Приготвяне на дозите 20. Препоръчително е изпитваният химикал да се прилага орално, освен ако други пътища на приложение не бъдат определени като по-подходящи. При избор на оралния път, изпитваният химикал обикновено се прилага с помощта на сонда; въпреки това, друга възможност за приложение на изпитваните химикали е чрез хранителната диета или питейната вода. 21. Когато е необходимо, изпитваният химикал е в разтвор или в суспензия в подходящ носител. Препоръчва се, когато е възможно, най-напред да се прецени дали може се използва воден разтвор/суспензия, след това — разтвор/емулсия в масло (напр. царевично олио), а след това — разтваряне в други носители. При работа с носители, различни от вода, трябва да бъдат известни токсичните характеристики на съответния носител. Трябва да се определят стабилността и хомогенността на изпитвания химикал в носителя. ПРОЦЕДУРА Брой и пол на животните 22. Препоръчително е в началото всяка група да е с най-малко 10 мъжки и 12-13 женски индивида. Женските се оценяват преди експозицията за естрална цикличност и животните, които не проявят типичните 4-5-дневни цикли не се включват в проучването; това е причината за препоръчителния допълнителен брой женски, с цел да се отделят по 10 женски в група. Освен в случай на ясно изразени токсични ефекти, в резултат от това се очаква да има най-малко 8 бременни женски в група, което обикновено е минималния приемлив брой бременни женски на група. Целта е да се постигнат достатъчно бременности и потомство, за да се гарантира значима оценка на потенциала на изпитвания химикал да оказва влияние върху плодовитостта, бременността, поведението на майката и кърменето, и растежа, и развитието на поколение F 1 от зачатието до ден 13 след раждането. Дозиране 23. Обикновено се използват поне три опитни групи и една контролна. Нивата на дозиране може да се базират на информацията от изпитванията за остра токсичност или на резултатите от изследванията с повторна доза. С изключение на третиране с изпитвания химикал, животните в контролната група трябва да бъдат отглеждани по идентичен начин на този при животните от изпитваната група. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва носител, контролната група трябва да получава най-голямото използвано количество носител. 24. Нивата на дозиране следва да бъдат подбрани така, че да вземат отчитат всички съществуващи и налични данни за токсичност и (токсико-) кинетика. Следва да се вземе предвид и факта, че може да съществуват различия в чувствителността на бременни и не-бременни животни. Целта при избор на най-високото ниво на доза е индуциране на токсични ефекти, но не смърт или силно страдание. След това следва да се избере последователност с намаляващи нива на дозиране с цел демонстриране на всеки отклик, свързан с дозирането и достигане на най-ниското ниво на дозиране, при което не се наблюдават неблагоприятни ефекти (NOAEL). За определяне на последователно намаляващите нива на доза в повечето случаи е най-подходящо всяка доза да намалява два до четири пъти спрямо най-близката по-висока доза, а добавянето на допълнителна четвърта изпитвана група често е за предпочитане пред използването на твърде големи интервали между дозите (напр. намаление повече от 10 пъти). 25. При наличие на наблюдения за обща токсичност (напр. намалено телесно тегло, ефекти върху черния дроб, сърцето, белите дробове или бъбреците и др.) или други промени, които може да не бъдат токсични реакции (напр. намален прием на храна, уголемяване на черния дроб), наблюдаваните ефекти върху ендокринни чувствителни крайни точки следва да се тълкуват предпазливо. Гранично изпитване 26. Ако орално изследване с ниво на една доза от най-малко 1 000 mg/kg телесно тегло/ден или при приложение с храната или питейната вода с доза, която е еквивалентен процент в храната или питейната вода, като се използват процедурите, описани в настоящото изследване, не доведе до забележими токсични ефекти и, ако въз основа на данните от структурно свързани вещества не се очаква токсичност, тогава пълно изследване с използване на няколко нива на дозиране може да не се счита за необходимо. При лимитиращото изпитване може да се приложи и по-висока орална доза, когато това се налага във връзка с нивото на експозиция за населението. За другите видове приложения, като например инхалация или дермално приложение, физикохимичните свойства на изпитваните химикали често предполагат използване на максимално постижимата концентрация. Прилагане на дозите 27. Животните се дозират с изпитвания химикал в продължение на 7 дни в седмицата. Когато изпитваният химикал се прилага чрез хранене през сонда, това следва да става чрез еднократна доза за животното през стомашна тръба или подходяща интубационна канюла. Максималният обем течност, който може да бъде въведен еднократно, зависи от телесното тегло на изпитваното животно. Обемът не следва да превишава 1 ml/100 g т.м., освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори. Тогава обемът може да достигне 2 ml/100 g т.м. С изключени на дразнещите или корозивни изпитвани химикали, които обикновено водят до засилени ефекти при по-високи концентрации, промените в изпитвания обем следва да бъдат сведени до минимум чрез коригиране на концентрацията, за да се гарантира постоянен обем при всички нива на дозиране. 28. За изпитван химикал, прилаган с храната или питейната вода, е важно да се гарантира, че количествата на приложения изпитван химикал не пречат на нормалния хранителен или воден баланс. Когато изпитваният химикал се прилага чрез хранителен режим, могат да бъдат използвани постоянна хранителна концентрация (ррm) или постоянно ниво на доза спрямо телесното тегло на животното; използваната алтернатива следва да бъде описана. За изпитван химикал, прилаган с помощта на сонда, дозата следва да бъде прилагана в сходни моменти всеки ден, и коригирана най-малко веднъж седмично, за да се поддържа постоянно ниво на дозиране, предвид телесното тегло на животното. Експериментален график 29. Дозирането на двата пола следва да започне най-малко 2 седмици преди чифтосване, след като животните са аклиматизирани в продължение на най-малко пет дни и женските са били скринирани за нормален естрален цикъл (в рамките на 2-седмичния период преди третиране). Изследването следва да бъде планирано по такъв начин, че оценката на естралния цикъл да започне скоро след като животните навършат пълна полова зрялост. Това може леко да варира за различните породи плъхове в различни лаборатории, напр. плъхове Sprague Dawley - 10-седмична възраст, плъхове Wistar - около 12-седмична възраст. Майките и потомството следва да бъдат умъртвени на ден 13 след раждането, или скоро след това. Денят на раждането (тоест, когато раждането завърши) се определя като ден 0 след раждането. Женските, които не показват признаци за копулация се умъртвяват 24-26 дни след последния ден от периода за чифтосване. Дозирането продължава за два пола по време на периода за чифтосване. Мъжките следва да бъдат допълнително дозирани след периода за чифтосване, най-малкото докато завърши минималния общ период за дозиране от 28 дни. След това се умъртвяват или друга възможност е да се запазят и да продължат да бъдат дозирани за евентуално провеждане на второ чифтосване, ако това се счете за уместно. 30. Ежедневното дозиране на женските майки следва да продължи през цялата бременност и най-малко до и включително ден 13 след раждането или до деня преди пожертването им. За изследвания, при които изпитваният химикал се прилага чрез инхалация или по дермален път, дозирането следва да продължи най-малко до и включително 19 ден от бременността, и да се възобнови възможно най-скоро и не по-късно от 4 ден след раждането (PND). 31. Схема на експерименталния график е дадена в допълнение 2. Процедура на чифтосването 32. В настоящото изследване обикновено следва да се използва чифтосване 1:1 (един мъжки с една женска). Изключения могат да възникнат в случай на непредвидена смърт на мъжките. Женските индивиди следва да бъдат поставени заедно с мъжкия, докато не бъде забелязано доказателство за копулация или до изтичането на две седмици. Всяка сутрин женските следва да бъдат преглеждани за наличие на сперма или вагинална запушалка. Ден 0 от бременността се определя като деня, в който е потвърдено доказателството за чифтосване (откриване на вагинална запушалка или сперма). Когато чифтосването е неуспешно, може да се извърши повторно чифтосване на женските животни с мъжки животни с доказан фертилитет от същата опитна група. Брой на животните в котилото 33. На ден 4 след раждането, броят на животните във всяко котило може да се коригира като се елиминират излишните новородени чрез произволна селекция, за да се постигне, доколкото е възможно, по четири или пет новородени от един пол в котило, в зависимост от нормалния брой на животните в котилото за използваната порода плъхове. От две от излишните новородени следва да се вземат кръвни проби, които да се обединят и използват за определяне на серумните нивата на T4. Селективно елиминиране на новородени, напр. въз основа на телесното тегло, или разстоянието между ануса и половите органи (РАПО) не е уместно. Когато броят на мъжките или женските новородени не позволява отделяне по четири или пет от един пол във всяко котило, е приемливо частично коригиране (например, шест мъжки и четири женски). Няма да се елиминират новородени, когато броят на животните в котилото падне под целта за бракуване (8 или 10 новородени/котило). Ако има само едно новородено над целта за бракуване, само едно новородено ще бъде бракувано и използвано за вземане на кръв за евентуални оценки на серумните нива на T4. 34. Ако броят на животните в котилото не се коригира, на ден 4 след раждането се пожертват две новородени на котило и се вземат кръвни проби за измерване на серумните концентрации на тироидния хормон. Ако е възможно, двете новородени на котило, следва да бъдат женски, с цел да се резервират мъжки новородени за оценка на запазването на зърната на млечните жлези, с изключение на случая, когато при премахването на тези новородени не остават женски за оценяване при прекратяване на изпитването. Когато броят на животните в котилото падне под 8 или 10 новородени/котило (в зависимост от нормалния брой на животните в котилото при използваната порода плъхове), няма да се елиминират новородени. Ако има само едно новородено над нормалния брой на животните в котилото, само едно новородено ще бъде елиминирано и използвано за вземане на кръв за евентуални оценки на серумните нива на T4. Интравитални наблюдения Клинични наблюдения 35. По време на периода на изпитване следва да бъдат извършвани общи клинични наблюдения минимум веднъж на ден и по-често, когато бъдат забелязани признаци на токсичност. За предпочитане е те да се правят по едно и също време всеки ден, като се има предвид пиковия период за поява на очакваните ефекти след дозиране. Следва да се записват относимите промени в поведението, признаци за трудно или удължено раждане, както и всички признаци за токсичност, включително смъртност. Тези записи следва да включват часа на започване, степента и продължителността на признаците за токсичност. Телесно тегло и консумация на храна/вода 36. Мъжките и женските следва да се претеглят на първия ден от дозирането, и минимум всяка седмица след това, както и при прекратяване на изследването. По време на бременност, женските следва да се претеглят на дни 0, 7, 14 и 20, и в рамките на 24 часа след раждането (ден 0 или 1 след раждането) и минимум на ден 4 и 13 след раждането. Тези наблюдения трябва да се описват индивидуално за всяко полово зряло животно. 37. По време на периода преди чифтосването, бременността и кърменето, консумацията на храна следва да се измерва най-малко веднъж седмично. Измерването на консумацията на храна по време на чифтосване е незадължително. Консумацията на вода по време на тези периоди също следва да се измерва, когато изпитваният химикал се прилага с питейната вода. Естрални цикли 38. Естралните цикли следва да бъдат наблюдавани преди да започне третирането, за да се подберат за изследването женски с редовна цикличност (вж. точка 22). Вагиналните натривки следва също да се наблюдават ежедневно от началото на периода на третиране до потвърждение за чифтосване. Ако има притеснения за ефекти на остър стрес, които биха могли да променят естралните цикли с началото на дозирането, лабораториите могат да изложат тестовите животни за 2 седмици, след което да вземат вагинални натривки ежедневно и да следят естралния цикъл в продължение на минимум две седмици по време на периода преди чифтосване, като наблюдението да продължи и през периода на чифтосване, докато бъде открито потвърждение за чифтосване. Вземането на клетки от влагалището/цервикса следва да бъде внимателно, за да се избегне увреждане на лигавицата, което може индуцира псевдобременност (7) (8). Показатели за потомството 39. Продължителността на бременността следва да бъде записвана и изчислявана от ден 0 от бременността. Всяко котило следва да бъде прегледано възможно най-скоро след раждането, за да се установи броя и пола на новородените, броя на мъртвородените, живородените, изтърсаците (новородени, които са значително по-малки от съответните контролни новородени) и наличието на макроскопски аномалии. 40. Живите новородени следва да се преброят и да им се определи пола, а котилата да се претеглят в рамките на 24 маса след раждането (ден 0 или 1 след раждане) и поне на ден 4 и 13 след раждането. В допълнение към наблюденията, описани в точка 35, следва за се запише всяко аномално поведение на потомството. 41. РАПО разстоянието следва да се измери на същия ден след раждането между PND 0 до PND 4. Телесното тегло на новороденото следва да бъде измерено в деня на измерване на РАПО, и стойността на РАПО следва да бъде нормализирана към размера на новороденото, за предпочитане към кубичния корен от телесното тегло (9). Броят на зърната/ареолите на гърдите на мъжките новородени следва да се преброи на PND 12 или 13, както се препоръчва в GD 151 на ОИСР (10). Клинична биохимия 42. От определено място се вземат кръвни проби на базата на следния график: — от поне две новородени на котило, на ден 4 след раждането, ако броят на новородените го позволява (вж. точки 33-34) — от всички майки и поне от две новородени на котило при прекратяването на ден 13, и — от всички зрели мъжки, при прекратяването, Всички кръвни проби се съхраняват при подходящи условия. Кръвните проби от новородените на ден 13 и от зрелите мъжки се оценяват за серумни нива на тироидните хормони (T4). Ако е уместно се прави допълнителна оценка на T4 в кръвните проби от самките и новородените на ден 4. Също ако е уместно, може да се извърши незадължително измерване на други хормони. Кръвта на новородените може да се обедини по котила за анализите на тироидния хормон. За предпочитане е тироидните хормони (T4 и TSH) да се измерват като „общи“. 43. Следните фактори могат да повлияят на варирането и на абсолютните концентрации при определянето на хормони: — времето на умъртвяване, поради дневните колебания в концентрацията на хормони — методът на умъртвяване, за да се избегне ненужен стрес за животните, който може да повлияе на концентрациите на хормони — комплектите за изпитване за определяне на хормони, които могат да се различават по стандартните си криви. 44. Пробите от плазма, специално предназначени за определяне на хормони, следва да бъдат получени в сравними периоди през деня. Числовите стойности, получени при анализа на концентрации на хормони, се различават при употребата на различни търговски комплекти за анализ. Патология Макроскопска аутопсия 45. В момента на умъртвяване или смърт по време на изследването, следва да се извърши макроскопски оглед на възрастните животни за всякакви аномалии или патологични изменения. Особено внимание при огледа трябва да се обърне на органите на половата система. Броят на местата за имплантация следва да бъде записан. Вагиналните натривки следва да бъдат изследвани на сутринта в деня на аутопсия, за да се определи стадия на естралния цикъл и да се даде възможност за корелация с хистопатологичното изследване на яйчниците. 46. Тестисите и епидидимите, както и простатата и семенните мехурчета с коагулиращите жлези като цяло трябва да бъдат изрязани от всички мъжки зрели животни и почистени от прилежащите тъкани, според необходимостта, и трябва да се претеглят в мокро състояние възможно най-скоро след дисекцията, за да не се допусне изсъхването им. В допълнение, опционалното тегло на органите може да включва мускула повдигач на ануса плюс булбокавернозния мускулен комплекс, жлезите на Каупър и главичката на пениса при мъжките и двойката яйчници (мокро тегло) и матката (включително маточната шийка) при женските; ако са включени, тези тегла следва да бъдат взети възможно най-скоро след дисекцията. 47. Мъртвите новородени и новородените, умъртвени на ден 13 след раждането или скоро след това, трябва най-малко да бъдат внимателно огледани външно за макроскопски аномалии. Особено внимание следва да се обърне външните репродуктивни полови органи, които да се огледат за признаци на променено развитие. На ден 13 трябва да се запази щитовидната жлеза от 1 мъжко и 1 женско новородено на котило. 48. Яйчниците, тестисите, допълнителните полови органи (матката и шийката на матката, епидидимите, простатата, семенните мехурчета плюс коагулиращите жлези), щитовидната жлеза и всички органи показващи макроскопски лезии на всички възрастни животни следва да бъдат запазени. Фиксация във формалин не се препоръчва за рутинно изследване на тестиси и епидидими. Приемлив метод за тези тъкани е използването на фиксаж на Буен или модифициран Дейвидсън (11). Бялото покривало (tunica albuginea) може внимателно да се пробие на неголяма дълбочина в двата края на органа с помощта на игла, за да се позволи бързо проникване на фиксатора. Хистопатология 49. Подробно хистопатологично изследване следва да бъде направено на яйчниците, тестисите и епидидимите (със специален акцент върху етапите на сперматогенеза и хистопатология на интерстициалната тестикуларна клетъчна структура) на животните от групата, третирана с най-висока доза и контролната група. Другите запазени органи, включително щитовидната жлеза от новородени и възрастни животни могат да бъдат изследвани, когато е необходимо. Теглото на щитовидната жлеза може да се установи след фиксация. Почистването също следва да се осъществи много внимателно и само след фиксиране, за да се избегне увреждане на тъканите. Увреждането на тъканите може да постави под съмнение хистопатологичния анализ. Изследванията следва да обхванат и животните от групи с други нива на дозата, ако бъдат забелязани промени в групата, третирана с най-висока доза. В Указанията за хистопатология (11) се съдържа допълнителна подробна информация относно дисекцията, фиксирането, разрязването и хистопатологията на ендокринните тъкани. ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Данни 50. Следва да бъдат осигурени индивидуални данни за всяко животно. Допълнително, всички данни следва да бъдат обобщени в таблична форма, показвайки за всяка изпитвана група броя на животните в началото на изпитването, броя на животните открити мъртви по време на изпитването или умъртвени по хуманни причини, времето на смъртта или хуманното умъртвяване, броя на плодовитите животни, броя на бременните женски, броя на животните показващи признаци на токсичност, описание на наблюдаваните признаци на токсичност, включително времето на началото, продължителността и сериозността на всички токсични ефекти, видовете хистопатологични изменения и всички относими данни за котилото. Табличен формат на обобщено протоколиране, който се е доказал като особено полезен за оценката на ефекта върху репродукцията /развитието, е даден в допълнение 3. 51. Поради ограничените размери на изследването, статистически анализи във формата на изпитвания за „значимост“ са с ограничена стойност за много крайни точки, и особено за крайните точки на репродукцията. Ако се използват статистически анализи, тогава избраният метод следва да бъде подходящ за разпределението на изследваната променлива и да бъде избран преди началото на изследването. Статистическият анализ на РЕПО и запазването на зърната на млечните жлези трябва да бъде базиран на индивидуални данни за новороденото, като взема под внимание ефектите на котилото. Където е уместно, котилото е единицата за анализ. Статистическият анализ на телесното тегло на новороденото трябва да бъде базиран на индивидуални данни за новороденото, като взема под внимание броя на животните в котилото. Поради малкия размер на групите, използването на контролни данни от предходни периоди (напр. за брой на животните в котилото), когато са налични, могат също да бъдат полезни като спомагателно средство за интерпретиране на изследването. Оценка на резултатите 52. Констатациите на това изследване за токсичност следва да бъдат оценени като се вземат предвид наблюдаваните ефекти, аутопсията и микроскопските находки. Оценката включва връзката между дозата на изпитвания химикал и наличието или отсъствието, разпространението и сериозността на аномалиите, включително макроскопски лезии, идентифицирани прицелни органи, безплодие, клинични аномалии, засегната ефективност на репродукцията и на котилото, промени в телесното тегло, ефекти върху смъртността и всякакви други токсични ефекти. 53. Поради краткия период на третиране на мъжките индивиди, хистопатологичното изследване на тестисите и епидидимите следва да се разглеждат заедно с данните за плодовитост, когато се оценяват ефектите върху мъжката репродуктивност. Използването на контролни данни от предходни периоди за репродукцията/развитието на организма (напр., относно броя на животните в котилото, РЕПО, запазване на зърната на млечните жлези, серумни нива на T4), когато са налични, могат също да бъдат полезни като спомагателно средство за интерпретиране на изследването. 54. За контрол на качеството се предлага да се събират контролни данни за минали периоди и да се изчисляват коефициенти на вариация за числовите данни, особено за параметрите, свързани с откриване на нарушители на функциите на ендокринната система. Тези данни могат да бъдат използвани за сравнение когато се извършва оценка на актуалните изследвания. Протокол от изпитването 55. Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Изпитван химикал: — източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава — стабилност на изпитвания химикал, ако е известна. Вещество с една съставка: — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н. Вещество с повече съставки, UVCB и смеси: — определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките. Носител (когато се използва такъв): — обосновка за избора на носител, когато е различен от вода. Изпитвани животни: — използван вид/порода, — брой, възраст и пол на животните; — източник за доставка на животните, условия на отглеждане, хранителен режим и т.н.; — индивидуално тегло на животните в началото на изпитването. — обосновка при използване на видове, различни от плъх. Условия на изпитването: — обосновка за избора на нивото на доза; — подробна информация за това в какъв вид е изпитваният химикал/хранителната смес, постигнати концентрации, стабилност и хомогенност на сместа; — подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал; — превръщане от концентрация на изпитвания химикал в храна/питейна вода (ppm) в действителна доза (mg на kg телесно тегло дневно), ако е приложимо, — подробности относно качество на храната и водата; — подробно описание на процедурата за рандомизация при подбора на новородени за бракуване, ако се прилага бракуване. Резултати: — телесно тегло/промени в телесното тегло; — консумация на храна и консумация на вода, ако има налични данни; — данни за токсичната реакция по пол и доза, включително плодовитост, бременност и всякакви други признаци на токсичност; — продължителност на бременността; — токсични или други ефекти върху репродукцията, потомството, постнаталния растеж и др.; — природа, сила и продължителност на клиничните наблюдения (независимо обратими или необратими), — брой на възрастните женски с нормален или аномален естрален цикъл и продължителност на цикъла; — брой на живородените и пост-имплантационни загуби; — данни за телесното тегло на новороденото — РЕПО на всички новородени (и телесно тегло в деня на измерване на РЕПО) — запазване на зърната на млечните жлези при мъжките новородени, — нива на тириодния хормон, новородени на ден 13 и възрастни мъжки (и самки и новородени на ден 4, ако е измерван) — брой новородени с видими макроскопски аномалии, максоскопска оценка на външните полови органи, брой на изтърсаците; — време на смъртта в процеса на изпитването или дали животните са преживели до края на изпитването; — брой на имплантациите, брой на животните в котилото и тегло на котилото към момента на записване; — телесно тегло в момента на пожертване и данни за тегло на органи за животните родители; — находки при аутопсията; — подробно описание на хистопатологичните находки; — данни за абсорбция (ако има); — статистическа обработка на резултатите, ако е подходящо. Обсъждане на резултатите. Заключения. Обяснение на резултатите 56. Изследването предоставя оценки на токсичността на репродукцията/развиващия се организъм, свързана с приложението на повторени дози (вж. точки 5 и 6). Може да представи указание за необходимостта от провеждане на допълнителни разследвания и предоставя насоки за планиране на последващи изпитвания. Следва да се консултирате с Ръководството на ОИСР 43 за помощ при тълкуването на резултатите, свързани с репродукцията и развитието на организма (12). Ръководство № 106 на ОИСР относно Хистологичната оценка на ендокринните и репродуктивни изпитвания на гризачи (11) предоставя информация относно подготовката и оценката на (ендокринните) органи и вагиналните натривки, които могат да бъдат полезни за настоящите TG. ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Available upon request at Organisation for Economic and Cooperation and Development, Paris. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Available Upon Request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Available Upon Request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development,.Paris. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Допълнение 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ (ВИЖТЕ И GD 150 НА ОИСР (6)) Андрогенност е способността на даден химикал да действа като естествен андрогенен хормон (напр. тестостерон) в организма на бозайник. Антиандрогенност е способността на даден химикал да потиска действието на естествен андрогенен хормон (напр. тестостерон) в организма на бозайник. Антиестрогенност е способността на даден химикал да потиска действието на естествен естрогенен хормон (напр. естрадиол 17ß) в организма на бозайник. Антитиреоидна активност е способността на даден химикал да потиска действието на естествен тиреоиден хормон (напр. T3) в организма на бозайник. Химикал означава вещество или смес. Токсичност за развиващия се организъм: проявата на репродуктивна токсичност, представляваща пред-, пери- пост-натални, структурни или функционални разстройства в потомството. Дозировка е общ термин, обхващащ дозата, нейната честота и продължителност на дозиране. Доза е количеството приложен изпитван химикал. Дозата се изразява като маса на изпитвания химикал за единица телесно тегло на изпитваното животно на ден (напр. mg на kg телесно тегло дневно), или като постоянна концентрация в храната. Явна токсичност е общ термин, описващ ясните признаци на токсичност след прилагане на изпитвания химикал. Те следва да бъдат достатъчни за оценка на опасността и следва да бъдат такива, че при увеличаване на прилаганата доза да се очаква развитие на признаци на силна токсичност и вероятна смърт. Увреждане на плодовитостта представлява разстройства на мъжките или женските възпроизводителни функции или способности. Токсичност при майката: неблагоприятни ефекти върху бременните женски, възникващи или специфично (пряк ефект), или неспецифично (непряк ефект). NOAEL е съкращение за нивото, при което не се наблюдават неблагоприятни ефекти. Това е най-високото ниво на доза, при което не се наблюдават свързани с третирането неблагоприятни находки в резултат от третирането. Естрогенност е способността на даден химикал да действа като естествен естрогенен хормон (напр. естрадиол 17ß) в организма на бозайник. Репродуктивна токсичност представлява вредни ефекти върху потомството и/или увреждане на мъжките и женските възпроизводителни функции или способности. Изпитван химикал е всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Тиреоидна активност е способността на даден химикал да действа като естествен тиреоиден хормон (напр. T3) в организма на бозайник. Валидиране е научна процедура, предназначена за характеризиране на оперативните изисквания и ограничения на даден метод за изпитване и за доказване на неговата надеждност и относимост за определена цел. Допълнение 2 СХЕМА НА ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИЯ ГРАФИК, УКАЗВАЩА МАКСИМАЛНАТА ПРОДЪЛЖИТЕЛНОСТ НА ИЗСЛЕДВАНЕТО, НА БАЗАТА НА ПЪЛЕН 14-ДНЕВЕН ПЕРИОД НА ЧИФТОСВАНЕ Допълнение 3 ОБОБЩЕН ДОКЛАД В ТАБЛИЧЕН ВИД НА ЕФЕКТИТЕ ВЪРХУ РЕПРОДУКЦИЯТА/РАЗВИТИЕТО КОНСТАТАЦИИ И ОЦЕНКИ Стойности Дозировка (единици) 0 (контрол) … … … … Стартирани двойки (N) Естрален цикъл (поне средна продължителност и честота на нередовни цикли) Женски, показващи потвърждение за копулация (N) Женски, постигнали забременяване (N) Дни от зачатието 1 - 5 (N) Дни от зачатието 6 -… (21) (N) Бременност ≤ 21 дни (N) Бременност = 22 дни (N) Бременност ≥ 23 дни (N) Самки с живородени малки (N) Самки с живи малки на 4 ден след раждането (N) Импланти/самка (средно) Живи новородени/самка при раждането (средно) Живи новородени/самка на 4 ден (средно) Съотношение на половете (м/ж) при раждането (средно) Съотношение на половете (м/ж) на 4 ден (средно) Тегло на животните в котилото при раждането (средно) Тегло на животните в котилото на 4 ден (средно) Тегло на новороденото при раждането (средно) Тегло на новороденото към момента на измерване на РЕПО (средно мъжки, средно женски) РЕПО на новороденото на същия постнатален ден, раждане — ден 4 (средно мъжки, средно женски, отбелязване PND) Тегло на новороденото на 4 ден (средно) Запазване на зърната на млечните жлези при мъжките новородени на ден 13 (средно) Тегло на новороденото на 13 ден (средно) НОВОРОДЕНИ С АНОМАЛИИ Самки с 0 Самки с 1 Самки с ≥ 2 ЗАГУБА НА ПОТОМСТВО Пре-натално/след имплантация (имплантации минус живородени) Женски с 0 Женски с 1 Женски с 2 Женски с ≥ 3 Постнатално (живородени минус живи на постнатален ден 13) Женски с 0 Женски с 1 Женски с 2 Женски с ≥ 3 B.64 КОМБИНИРАНО ТОКСИКОЛОГИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ С ПОВТАРЯЩА СЕ ДОЗА СЪС СКРИНИНГ ИЗПИТВАНЕ ЗА ТОКСИЧНОСТ ЗА РЕПРОДУКЦИЯТА/РАЗВИВАЩИЯ СЕ ОРГАНИЗЪМ ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 422 (2016). Насоките на ОИСР за изпитване на химикали се преразглеждат периодично в светлината на научния прогрес. Оригиналните насоки за скрининг изпитване 422 бяха приети през 1996 г., на базата на протокол за „Комбинирано скрининг изпитване с повтаряща се доза и за токсичност за репродукцията/развиващия се организъм“, обсъден на две експертни срещи в Лондон през 1990 г. (1) и в Токио през 1992 г. (2). 2. Настоящият метод за изпитване съчетава частта за скрининг за токсичност за репродукцията/развиващия се организъм, която се основава на опита, придобит от страните членки при използването на оригиналния метод върху съществуващи химикали, произвеждани в големи количества и в проучвателни изпитвания с вещества за положителна контрола (3) (4), и частта за токсичност с повтаряща се доза, в съответствие с насоките за изпитване на ОИСР 407 (28-дневно изследване за токсичност при гризачи с повтаряща се орална доза, съответстващо на Глава Б.7 от настоящото Приложение). 3. Този метод за изпитване бе актуализиран с крайни точки, относими към вещества, нарушаващи функцията на ендокринната система, като последващо действие към дейност с висок приоритет, инициирана в ОИСР през 1998 г. за ревизиране на съществуващите насоки за изпитвания и за разработване на нови насоки за изпитвания за скрининг и изпитване на веществата с потенциал да нарушават функцията на ендокринната система (5). В този контекст TG 407 (съответстващи на глава Б.7 от настоящото приложение) бяха подобрени през 2008 г. с подходящи параметри за откриване на ендокринна активност на изпитваните химикали. Целта при актуализиране на TG 422 бе да се включат някои крайни точки, относими към вещества, нарушаващи функцията на ендокринната система в насоките за скринингови изпитвания (TG), при които периодите на експозиция обхващат някои от чувствителните периоди по време на развитието на организма (пред- или ранните постнатални периоди). 4. Избраните допълнителни крайни точки, относими към вещества, нарушаващи функцията на ендокринната система, също част от TG 443 (Разширено изследване за токсичност за репродукцията в едно поколение, съответстващо на глава Б.56 от настоящото приложение), бяха включени в TG 422 на базата на проучване на осъществимостта, разглеждащо научни и технически въпроси, свързани с тяхното включване, както и възможните адаптации на плана на изпитването, необходими за тяхното включване (6). 5. Настоящият метод за изпитване е проектиран да генерира ограничена информация относно ефектите на изпитвания химикал върху действието на мъжката и женската репродуктивна система, напр. функция на половите жлези, поведение при чифтосване, зачеване, развитие на заченатия организъм и раждане. Той не е алтернативен на съществуващите методи за изпитване Б.31, Б.34, Б.35 или Б.56, нито ги замества. ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 6. При оценката и оценяването на токсичните характеристики на изпитван химикал след получаване на първоначалната информация за токсичността от изпитването за остра токсичност може да се извърши определяне на оралната токсичност с използване на повтаряща се доза. Това проучване предоставя информация за възможните опасности за здравето, които е вероятно да възникнат при повторна експозиция за относително ограничен период от време. Методът се състои от базово проучване за токсичност с повтаряща се доза, което може да се използва за химикали, за които 90-дневно изследване не е гарантирано (напр. когато произведеното количество не превишава определени граници) или като предварително изследване към дългосрочно проучване. При провеждане на проучването следва да се спазват ръководните принципи и съображения, очертани в Ръководство на ОИСР № 19 относно признаването, оценката и употребата на клинични признаци като хуманни крайни точки за експериментални животни, използвани за оценяване на безопасността (7). 7. Освен това то включва и скринингово изпитване за токсичност за репродукцията/развиващия се организъм и поради това може да бъде използвано за осигуряване на първоначална информация за възможните ефекти върху мъжката и женската репродуктивна способност, като например функция на половите жлези, поведение при чифтосване, зачеване, развитие на зародиша и раждане, или в ранен етап на оценка на токсикологичните свойства на изпитваните химикали, или за изпитваните химикали, които пораждат безпокойство. Настоящият метод за изпитване не предоставя пълна информация по всички аспекти на репродукцията и развитието на организма. По-конкретно, той предлага единствено ограничени средства за откриване на постнатални прояви на пренатална експозиция, или ефекти, които може да бъдат индуцирани по време на постнатална експозиция. Наред с другите причини, поради избирателността на крайните точки и кратката продължителност на проучването, този метод няма да предостави доказателство за категорични твърдения за липса на ефекти върху репродукцията/развитието. Нещо повече, при отсъствието на данни от други изследвания за токсичност за репродукцията/развиващия се организъм, положителните резултати са полезни за първоначалната оценка на опасността и допринасят за вземането на решения по отношение на необходимостта и графика за допълнителни изпитвания. 8. Резултатите, получени от свързаните с жлезите с вътрешна секреция параметри, следва да се разглеждат в контекста на „Концептуалната рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система“ (8). В тази Концептуална рамка подобрените TG 422 на ОИСР се съдържат в ниво 4 като изследване in vivo , предоставящо данни за неблагоприятните ефекти върху крайните точки, относими към ендокринната система. Все пак, един ендокринен сигнал сам по себе си не може да се разглежда като достатъчно доказателство, че изпитваният химикал е вещество, нарушаващо функциите на ендокринната система. 9. Методът на изпитване набляга и върху неврологичните ефекти като специфична крайна точка, а акцентът е поставен върху необходимостта от внимателни клинични наблюдения на животните с оглед получаване на възможно най-пълна информация. Методът следва да идентифицира химикали с невротоксичен потенциал и може да служи за основание за допълнително задълбочено проучване в тази посока. В допълнение, методът може да предоставя и базови указания за имунологичните ефекти. 10. При отсъствието на данни от други изследвания за системна токсичност, токсичност за репродукцията/развиващия се организъм, невротоксичност и/или имунотоксичност, положителните резултати са полезни за първоначалната оценка на опасността и допринасят за вземането на решения по отношение на необходимостта и графика за допълнителни изпитвания. Изпитването може да е особено полезно като част от Информационния набор от скрининг информация (SIDS) на ОИСР за оценка на съществуващите химикали, за които съществува малко или никаква информация и може да служи като алтернатива на провеждането на две отделни изпитвания за токсичност с повтаряща се доза (ОИСР TG 407, съответстващи на глава Б.7 от настоящото приложение) и токсичност за репродукцията/развиващия се организъм (ОИСР TG 421, съответстващи на глава Б.63 от настоящото приложение), респективно. Може да се използва и като проучване за определяне на обхвата на дозата за по-обхватни проучвания по отношение на репродукцията/развиващия се организъм или когато се приема за уместно по други причини. 11. Като цяло се смята, че съществуват различия в чувствителността между бременни и небременни животни. Следователно в настоящото комбинирано изпитване може да е по-сложно да се определят нива на дози, които да са адекватни за оценяване както на общата системна токсичност, така и на специфичната токсичност за репродукцията/развиващия се организъм, отколкото когато се провеждат индивидуални изпитвания поотделно. Нещо повече, тълкуването на резултатите от изпитването по отношение на общата системна токсичност може да бъде по-трудно отколкото когато се провежда отделно проучване с повтаряща се доза, особено когато не се оценяват серумните и хистопатологичните параметри по едно и също време в проучването. Поради тази техническа усложненост, при изпълнение на подобно комбинирано скринингово изпитване се изисква значителен опит в изпитванията за токсичност. От друга страна, освен малкия брой участващи животни, комбинираното изпитване може да предложи по-добри средства за разграничаване на преките ефекти върху репродукцията/развитието от ефектите, които са вторични спрямо други (системни) ефекти. 12. При това изпитване, периодът на дозиране е по-дълъг от този при конвенционалното 28-дневно проучване с повтаряща се доза. В него обаче се използват по-малко животни от всеки пол в група, отколкото в ситуацията, при която в допълнение към скрининговото изпитване за токсичност за репродукцията/развиващия се организъм се провежда конвенционално 28-дневно проучване с повтаряща се доза. 13. Настоящият метод за изпитване предполага орален прием на изпитвания химикал. Ако се използват други пътища на експозиция, може да се наложат изменения на метода. 14. Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Подобни съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. 15. Използваните оределения са дадени в допълнение 1. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 16. Изпитваният химикал се прилага в нарастващи дози на няколко групи от мъжки и женски индивиди. Мъжките следва да бъдат дозирани в продължение на най-малко четири седмици включително до деня преди планираното им умъртвяване и (това включва минимум две седмици преди чифтосване, по време на периода на чифтосване и приблизително две седмици след чифтосване). Предвид ограничения период на дозиране на мъжките преди чифтосване, плодовитостта може да не бъде особено чувствителен показател за тестикуларна токсичност. Ето защо, детайлно хистологично изследване на тестисите е от съществено значение. Комбинацията от период на дозиране преди чифтосване от две седмици и последващи наблюдения на чифтосването/плодовитостта с цялостния периодна дозиране от минимум четири седмици, последван от детайлни хистопатологични изследвания на мъжките полови жлези, се разглежда като достатъчен, за да могат да бъдат определени голяма част от ефектите върху мъжката плодовитост и сперматогенеза. 17. Женските следва да бъдат дозирани през целия период на проучването. Това включва две седмици преди чифтосване (като целта е да се обхванат най-малко два пълни естрални цикъла), променливото време до зачеване, продължителността на бременността и най-малко тринадесет дни след раждането, включително деня преди планираното им умъртвяване. 18. Продължителността на проучването, след аклиматизацията и оценката на естралния цикъл преди дозиране, зависи от функционирането на женската полова система и е приблизително 63 дни, [най-малко 14 дни преди чифтосването, (до) 14 дни за чифтосване, 22 дни бременност, 13 дни лактация]. 19. По време на периода на прилагане, животните се наблюдават внимателно и ежедневно за признаци на токсичност. Животните, които умират или са умъртвени по време на изпитването, се аутопсират, а преживелите животни се умъртвяват и се аутопсират при приключването на изпитването. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Избор на животински вид 20. Настоящият метод за изпитване е предназначен за употреба с плъхове. Ако параметрите, определени в рамките на тези TG 422, се изследват при друг вид гризачи, следва да бъде представена детайлна обосновка. Плъховете са единственият биологичен вид, използван в рамките на международната валидационна програма за откриване на вещества, нарушаващи функциите на ендокринната система в TG 407. Не трябва да се използват породи с ниска плодовитост или породи, за които е характерна висока честота на вродените аномалии. Трябва да се използват здрави, нераждали животни, които не са били подлагани на предишни експериментални процедури. Тестовите животни следва да се харакеризират по вид, порода, пол, тегло и възраст. При започване на изследването разликите в теглото на използваните животни следва да бъдат минимални и да не надвишава 20 % от средното за всеки пол тегло. Когато изследването се провежда като предварително до дългосрочно проучване или проучване на цяло поколение, за предпочитане е в двете изследвания да се използват животни от една и съща порода и източник. Условия на отглеждане и хранене 21. Всички процедури трябва да са в съответствие с местните стандарти за полагане на грижи за лабораторни животни. Температурата в стаята на опитните животни трябва да бъде 22 °C (± 3 °C). Относителната влажност трябва да е най-малко 30 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по настоящия метод. 22. Животните се настаняват групово, в малки групи от един и същи пол; животните могат да се настаняват отделно, ако това е научно обосновано. При групово настаняване в клетки не следва да има повече от пет животни в клетка. Чифтосването трябва да се извърши в клетки, подходящи за тази цел. Бременните женски следва да бъдат настанявани поотделно и да им бъдат предоставяни материали за изграждане на гнездо. Кърмещите женски се настаняват поотделно заедно с потомството си. 23. Храната следва да бъде редовно анализирана за наличието на замърсители. Проба от хранителния режим трябва да се съхранява до окончателното изготвяне на доклада. Подготовка на опитните животни 24. Здрави, млади, полово зрели животни се определят на произволен принцип за контролните и опитните групи. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Животните се идентифицират по уникален начин и се настаняват в клетките им най-малко пет дни преди началото на проучването, за да им се осигури време за аклиматизиране към лабораторните условия. Приготвяне на дозите 25. Препоръчително е изпитваният химикал да се прилага орално, освен ако други пътища на приложение не бъдат определени като по-подходящи. При избор на оралния път, изпитваният химикал обикновено се прилага с помощта на сонда; въпреки това, друга възможност за приложение на изпитваните химикали е също чрез хранителната диета или питейната вода. 26. Когато е необходимо, изпитваният химикал е в разтвор или в суспензия в подходящ носител. Препоръчва се, когато е възможно, най-напред да се прецени дали може се използва воден разтвор/суспензия, след това да се прецени за разтвор/емулсия в масло (напр. царевично олио), а след това — за разтваряне в други носители. При работа с не-водни носители, трябва да бъдат известни токсичните характеристики на съответния носител. Трябва да се определят стабилността и хомогенността на изпитвания химикал в носителя. ПРОЦЕДУРА Брой и пол на животните 27. Препоръчително е в началото всяка група да е с най-малко 10 мъжки и 12-13 женски индивида. Женските се оценяват преди експозицията за естрална цикличност и животните, които не проявят типичните 4-5-дневни цикли, не се включват в проучването; това е причината за препоръчителния допълнителен брой женски, с цел да се отделят по 10 женски в група. Освен в случай на ясно изразени токсични ефекти, в резултат от това се очаква да има най-малко 8 бременни женски в група, което обикновено е минималният приемлив брой бременни женски на група. Целта е да се осигурят достатъчно бременности и потомство, за да се гарантира значима оценка на потенциала на изпитвания химикал да оказва влияние върху плодовитостта, бременността, поведението на майката и това на малките при кърмене, растежа и развитието на поколение F 1 от зачеването до ден 13 след раждането. Ако междувременно се планира убиване на животни преди завършването на изследването, броят се увеличава в зависимост от броя на животните, които е планирано да бъдат убити. Следва да бъде разгледана възможността за допълнителна сателитна група от по пет животни от всеки пол в контролната група и в групата, третирана с най-високата доза за наблюдение на обратимостта, устойчивостта или забавеното възникване на системните токсични ефекти, в продължение на най-малко 14 дни след третиране. Животните от сателитните групи няма да бъдат чифтосвани и следователно, не се използват за оценяване на токсичност за репродукцията/развитието. Дозиране 28. Обикновено се използват поне три опитни групи и една контролна. Ако няма налични подходящи данни за общата токсичност, може да се проведе проучване за определяне на диапазона на дозата (с животни от същата порода и източник за набавяне), което да помогне при определянето на дозите, които да бъдат използвани. С изключение на третиране с изпитвания химикал, животните в контролната група трябва да бъдат отглеждани по идентичен начин на този при животните от изпитваната група. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва носител, контролната група трябва да получава най-голямото използвано количество носител. 29. Нивата на дозиране следва да бъдат подбрани така, че да се отчитат всички съществуващи и налични данни за токсичност и (токсико-) кинетика. Следва да се вземе предвид и фактът, че може да съществуват различия в чувствителността на бременни и небременни животни. Целта при избор на най-високото ниво на доза е индуциране на токсични ефекти, но не смърт или явно страдание. След това следва да се избере последователност с намаляващи нива на дозиране с цел демонстриране на всеки отклик, свързан с дозирането и достигане на най-ниското ниво на дозиране без неблагоприятни ефекти. В повечето случаи е най-подходящо всяка доза да намалява два до четири пъти спрямо най-близката по-висока доза, а добавянето на допълнителна четвърта изпитвана група често е за предпочитане пред използването на твърде големи интервали между дозите (напр. намаление повече от 10 пъти). 30. При наличие на наблюдения за обща токсичност (напр. намалено телесно тегло, въздействие върху черния дроб, сърцето, белите дробове или бъбреците и др.) или други промени, които може да не бъдат токсични реакции (напр. намален прием на храна, уголемяване на черния дроб), наблюдаваните ефекти върху ендокринни чувствителни крайни точки следва да се тълкуват предпазливо. Гранично изпитване 31. Ако изследване с орално третиране с ниво на еднократна доза от най-малко 1 000 mg/kg телесно тегло/ден или при приложение с храната с доза, която е еквивалентен процент, в храната или питейната вода (на базата на определеното телесно тегло), като се използват процедурите, описани в настоящото изследване, не доведе до забележими токсични ефекти и, ако въз основа на данните от структурно свързани вещества не се очаква токсичност, тогава може да не се смята за необходимо провеждането на пълно изследване с използване на няколко нива на дозиране. Изпитването при пределна концентрация се прилага, с изключение на случаи, при които експозиция на хора подсказва нуждата от използване на по-високо ниво на доза. За другите видове приложения, като например инхалация или дермално приложение, физикохимичните свойства на изпитваните химикали често налагат използване на максимално постижимата експозиция. Прилагане на дозите 32. Животните се дозират с изпитвания химикал в продължение на 7 дни в седмицата. Когато изпитваният химикал се прилага чрез хранене през сонда, това следва да става чрез еднократна доза за животното през стомашна тръба или подходяща интубационна канюла. Максималният обем течност, който може да бъде въведен еднократно, зависиот телесното тегло на изпитваното животно. Обемът не следва да превишава 1 ml/100 g т.м., освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори. Тогава обемът може да достигне 2 ml/100 g т.м. С изключени на дразнещите или корозивни изпитвани химикали, които обикновено водят до засилени ефекти при по-високи концентрации, промените в изпитвания обем следва да бъдат сведени до минимум чрез коригиране на концентрацията, за да се гарантира постоянен обем при всички нива на дозиране. 33. За изпитвани химикали, прилагани с храната или питейната вода, е важно да се гарантира, че количествата на приложения изпитван химикал не пречат на нормалния хранителен или воден баланс. Когато изпитваният химикал се прилага чрез хранителен режим, могат да бъдат използвани постоянна хранителна концентрация (ррm) или постоянно ниво на доза спрямо телесното тегло на животното; използваната алтернатива следва да бъде описана. За изпитван химикал, прилаган с помощта на сонда, дозата следва да бъде прилагана в сходни моменти всеки ден, и коригирана най-малко веднъж седмично, за да се поддържа постоянно ниво на дозиране, предвид телесното тегло на животното. Когато комбинирано проучване се използва като предварително за дългосрочно или пълно проучване за токсичност за репродукцията, при двете проучвания следва да се използва сходна хранителна диета. Експериментален график 34. Дозирането на двата пола следва да започне 2 седмици преди чифтосване, след като животните са аклиматизирани в продължение на най-малко пет дни и женските са били проверени за нормален естрален цикъл (в рамките на 2-седмичния период преди третирането). Изследването следва да бъде планирано по такъв начин, че оценката на естралния цикъл да започне скоро след като животните навършат пълна полова зрялост. Това може леко да варира за различните породи плъхове в различни лаборатории, напр. плъхове Sprague Dawley - 10-седмична възраст, плъхове Wistar - около 12-седмична възраст. Майките и потомството следва да бъдат умъртвени на ден 13 след раждането, или скоро след това. За да се гарантира, че самките няма да приемат храна за през нощта преди вземането на кръв (ако тази опция е предпочитана), не е задължително самките и тяхното потомство да бъдат умъртвявани в един и същи ден. Денят на раждането (тоест, когато раждането завърши) се определя като ден 0 след раждането. Женските, които не показват признаци за копулация се умъртвяват 24-26 дни след последния ден от периода за чифтосване. Дозирането продължава за двата пола по време на периода за чифтосване. Мъжките следва да бъдат допълнително дозирани след периода за чифтосване, най-малкото докато завърши минималния общ период за дозиране от 28 дни. След това се умъртвяват или друга възможност е да се запазят и да продължат да бъдат дозирани за евентуално провеждане на второ чифтосване, ако това се сметне за уместно. 35. Ежедневното дозиране на женските майки следва да продължи през цялата бременност и най-малко до ден 13 след раждането включително, или до деня преди умъртвяването им. При проучвания, в които изпитваният химикал се прилага чрез инхалация или по кожен път, дозирането следва да бъде продължено най-малко до ден 19 от бременността включително, като то следва да бъде възобновено възможно най-скоро и не по-късно от постнатален ден (PND) 4. 36. Животните в сателитните групи, планирани за контролни наблюдения, ако са включени, не се чифтосват. Те следва да бъдат задържани за поне още 14 дни след първото планирано умъртвяване на самките, без третиране, за да се открие забавеното възникване или устойчивост на токсичните ефекти, или възстановяване от тях. 37. Схема на експерименталния график е дадена в допълнение 2. Естрални цикли 38. Естралните цикли следва да бъдат наблюдавани преди да започне третирането, за да се подберат за изследването женски с редовна цикличност (вж. точка 27). Вагиналните натривки следва също да се наблюдават ежедневно от началото на периода на третиране до потвърждение за чифтосване. Ако има притеснения за ефекти на остър стрес, които биха могли да променят естралните цикли с началото на дозирането, лабораториите могат да изложат тестовите животни за 2 седмици, след което да вземат вагинални натривки ежедневно и да следят естралния цикъл в продължение на минимум две седмици по време на периода преди чифтосване, като наблюдението да продължи и през периода на чифтосване, докато бъде открито потвърждение за чифтосване. Вземането на клетки от влагалището/цервикса следва да бъде внимателно, за да се избегне увреждане на лигавицата, което може индуцира псевдобременност (8) (9). Процедура на чифтосването 39. В настоящото изследване обикновено следва да се използва чифтосване 1:1 (един мъжки с една женска). Изключения могат да възникнат в случай на непредвидена смърт на мъжките. Женските индивиди следва да бъдат поставени заедно с мъжкия, докато не бъде забелязано доказателство за копулация или до изтичането на две седмици. Всяка сутрин женските следва да бъдат преглеждани за наличие на сперма или вагинална запушалка. Ден 0 от бременността се определя като деня, в който е потвърдено доказателството за чифтосване (откриване на вагинална запушалка или сперма). Когато чифтосването е било неуспешно, може да се извърши повторно чифтосване на женските животни с мъжки животни с доказан фертилитет от същата опитна група. Брой на животните в котилото 40. На ден 4 след раждането, броят на животните във всяко котило може да се коригира, като се елиминират излишните новородени чрез произволна селекция, за да се постигне, доколкото е възможно, по четири или пет новородени от един пол в котило, в зависимост от нормалния брой на животните в котилото за използваната порода плъхове. От две от излишните новородени следва да бъдат взети кръвни проби, които да бъдат, обединени и използвани за определяне на серумните нива на T4. Селективно елиминиране на новородени, напр. въз основа на телесното тегло, или разстоянието между ануса и половите органи (РАПО) не е уместно. Когато броят на мъжките или женските новородени не позволява отделяне по четири или пет от един пол във всяко котило, е приемливо частично коригиране (например, шест мъжки и четири женски). Не се елиминират новородени, когато броят на животните в котилото падне под целта за бракуване (8 или 10 новородени/котило). Ако има само едно новородено над целта за бракуване, само едно новородено ще бъде бракувано и използвано за вземане на кръв за евентуални оценки на серумните нива на T4. 41. Ако броят на животните в котилото не се коригира, на ден 4 след раждането се умъртвяват две новородени на котило и се вземат кръвни проби за измерване на серумните концентрации на тироидния хормон. Ако е възможно, двете новородени на котило следва да бъдат женски, с цел да се резервират мъжки новородени за оценка на запазването на зърната на млечните жлези, с изключение на случая, когато при премахването на тези новородени не остават женски за оценяване при прекратяване на изпитването. Когато броят на животните в котилото падне под 8 или 10 новородени/котило (в зависимост от нормалния брой на животните в котилото при използваната порода плъхове), не се елиминират новородени. Ако има само едно новородено над нормалния брой на животните в котилото, само едно новородено ще бъде елиминирано и използвано за вземане на кръв за евентуални оценки на серумните нива на T4. Наблюдения 42. Общи клинични наблюдения следва да бъдат извършвани поне един път дневно, за предпочитане по едно и също време всеки ден и като се има предвид пиковият период за поява на очакваните ефекти след дозиране. Здравословното състояние на животните следва да се записва. Поне два пъти дневно всички животни се наблюдават за заболяемост и смъртност. 43. Веднъж преди първата експозиция (с цел да са възможни сравнения в рамките на изпитвания обект) и най-малко веднъж седмично след това следва да бъдат правени детайлни клинични наблюдения на всички родители от животните. Тези наблюдения следва да се правят извън клетката, в която живеят, на стандартно място и за предпочитане по едно и също време на деня. Наблюденията следва да бъдат внимателно записвани; за предпочитане, като се използват системи за оценяване, изрично определени от изпитващата лаборатория. Следва да се положат усилия, за да се гарантира, че колебанията в условията на изпитването са минимални, както и че наблюденията се извършват за предпочитане от хора, неинформирани за изпитването. Отбелязваните признаци следва да включват промяна в кожата, козината, очите, лигавиците, поява на секреция и екскреция, както и автономна активност (напр. сълзене, пилоерекция, промяна в големината на зениците, необичаен начин на дишане), без да се ограничават до това. Следва да се записван и промени в походката, стойката и реакцията при манипулиране, както и наличието на клонични или тонични движения, стереотипи (напр. прекомерно близане на козината, повтарящо се движение в кръг), затруднено или продължително раждане или странно поведение (напр. само-осакатяване, вървене назад) (10). 44. В даден момент по време на проучването следва да се извърши оценка на сензорната реактивност на стимули от различно естество (напр. слухови, визуални и проприоцептивни стимули) (8) (9) (11), оценка на силата на захват(12) и оценка на моторната активност (13) на пет мъжки и пет женски животни, произволно избрани от всяка група. Допълнителни уточнения по процедурите, които могат да бъдат следвани, са дадени в съответните препратки. Въпреки всичко могат да се използват и алтернативни процедури, различни от тези, към които се препраща. При мъжките, тези функционални наблюдения следва да се правят към края на техния период на дозиране, малко преди планираното им умъртвяване, но преди вземането на кръв за хематологични или клинико-химични изследвания (вж. точки 53-56, включително бележката под линия 1). Женските следва да бъдат в сходно физиологично състояние по време на тези функционални изпитвания и за предпочитане е да бъдат изпитани веднъж по време на последната седмица кърмене (напр., LD 6-13), малко преди планираното им умъртвяване. Доколкото е възможно, времето за разделяне на самките от новородените трябва да се сведе до минимум. 45. Функционалните наблюдения, извършени веднъж към края на проучването, може да бъдат пропуснати, когато проучването се провежда като предварително проучване към последващо субхронично (90-дневно) или дългосрочно проучване. В този случай функционалните наблюдения следва да бъдат включени в това последващо изследване. От друга страна, наличието на данни от функционалните наблюдения от проучването с повтаряща се доза може да подобри способността за избор на нива на дозата за последващото субхронично или дългосрочно проучване. 46. По изключение, функционалните наблюдения могат също да се избегнат за групи, които иначе показват признаци на токсичност в размер, който значително би попречил на извършването на функционалното изпитване. 47. Продължителността на бременността следва да бъде записвана и изчислявана от ден 0 от бременността. Всяко котило следва да бъде прегледано възможно най-скоро след раждането, за да се установи броят и полът на новородените, броят на мъртвородените, живородените, изтърсаците (новородени, които са значително по-малки от съответните контролни новородени) и наличието на макроскопски аномалии. 48. Живите новородени следва да се преброят и да се определи полът им, а котилата да се претеглят в рамките на 24 часа след раждането (ден 0 или 1 след раждане) и поне на ден 4 и ден 13 след раждането. В допълнение към наблюденията на животните родители (вж. точки 43 и 44) следва за се запише всяко аномално поведение на потомството. 49. РАПО разстоянието следва да се измери на същия ден след раждането между PND 0 до PND 4. Телесното тегло на новороденото следва да бъде измерено в деня на измерване на РАПО, и стойността на РАПО следва да бъде нормализирана към размера на новороденото, за предпочитане към кубичния корен от телесното тегло (14). Броят на зърната/ареолите на гърдите на мъжките новородени следва да се преброи на PND 12 или 13, както се препоръчва в GD 151 на ОИСР (15). Телесно тегло и консумация на храна/вода 50. Мъжките и женските следва да се претеглят на първия ден от дозирането, и минимум всяка седмица след това, както и при прекратяване на изследването. По време на бременност, женските следва да се претеглят на дни 0, 7, 14 и 20, и в рамките на 24 часа след раждането (ден 0 или 1 след раждането) и минимум на ден 4 и ден 13 след раждането. Тези наблюдения трябва да се описват индивидуално за всяко полово зряло животно. 51. По време на периода преди чифтосването, бременността и кърменето, консумацията на храна следва да се измерва най-малко веднъж седмично. Измерването на консумацията на храна по време на чифтосване е незадължително. Консумацията на вода по време на тези периоди също следва да се измерва, когато изпитваният химикал се прилага с тази среда. Хематология 52. Веднъж по време на проучването следва да се правят следните хематоложки изследвания на пет мъжки и пет женски животни, избрани на произволен принцип от всяка група: хематокрит, концентрации на хемоглобин, брой на еритроцитите, ретикулоцити, общ и диференциален брой на левкоцити, брой на тромбоцитите, както и измерване на времето на съсирване/потенциала за съсирване на кръвта. Други определяния, които следва да се извършат, ако изпитваният химикал или неговите предполагаеми метаболити имат, или се предполага че имат, окислителни свойства, включват концентрация на метхемоглобин и телца на Heinz. 53. Кръвните проби следва да бъдат вземани от предварително определено място. Женските следва да бъдат в сходно физиологично състояние по време на вземането на проби. За да се избегнат практически трудности, свързани с различното начало на бременността, вземането на кръв от женските може да се прави в края на периода преди чифтосване като алтернатива на вземането на кръв непосредствено преди процедурата за евтаназия на животните или като част от нея. За предпочитане е кръвните проби от мъжките да се вземат непосредствено преди процедурата за евтаназия на животните или като част от нея. Като алтернатива, вземането на кръв от мъжките може да се прави и в края на периода преди чифтосване, когато този момент е бил предпочетен и за женските. 54. Кръвните проби следва да се съхраняват при подходящи условия. Клинична биохимия 55. Клинични биохимични изследвания за проучване на основните токсични ефекти върху тъканите и по-специално, ефектите върху бъбреците и черния дроб, следва да се извършват върху кръвни проби, получени от подбрани пет мъжки и пет женски животни от всяка група. Препоръчва се една нощ гладуване на животните преди вземане на кръвни проби ( 22 ) . Изследванията на плазма или серум следва да включват натрий, калий, глюкоза, общ холестерол, урея, креатинин, общ протеин и албумин, най-малко два ензима, показателни за хепатоцелуларни ефекти (като аланин аминотрансфераза, аспартат аминотрансфераза и сорбитол дехидрогеназа) и жлъчни киселини. Измерванията за допълнителни ензими (от чернодробен и друг произход) и билирубин могат да дадат полезна информация при определени обстоятелства. 56. От определено място се вземат кръвни проби на базата на следния график: — от поне две новородени на котило, на ден 4 след раждането, ако броят на новородените го позволява (вж. точки 40-41) — от всички майки и поне от две новородени на котило при прекратяването на ден 13, и — от всички зрели мъжки, при прекратяването Всички кръвни проби се съхраняват при подходящи условия. Кръвните проби от новородените на ден 13 и от зрелите мъжки се оценяват за серумни нива на тироидните хормони (T4). Ако е уместно се прави допълнителна оценка на T4 в кръвните проби от самките и новородените на ден 4. Също ако е уместно, може да се извърши незадължително измерване на други хормони. Кръвта на новородените може да се обедини по котила за анализите на тироидния хормон. За предпочитане е тироидните хормони (T4 и TSH) да се измерват като „общи“. 57. По избор, през последната седмица от проучването могат да се проведат следните изследвания на урината от пет мъжки от всяка група, избрани на произволен принцип, като се използва събиране на урината по часове; външен вид, количество, осмолалитет и относително тегло, рН, протеини, глюкоза и кръв/кръвни клетки. 58. Като допълнение следва да се предвидят изследвания на серумни маркери за основните увреждания на тъканите Други изследвания, които трябва да се проведат, ако известните свойства на изпитвания химикал може или има подозрения, че засягат свързаните метаболитни профили, включват калций, фосфат, триглицериди и глюкоза на гладно, специфични хормони, метхемоглобин и холинестераза. Те трябва да бъдат идентифицирани за всеки отделен случай. 59. Следните фактори могат да повлияят на варирането и на абсолютните концентрации при определянето на хормони: — времето на умъртвяване, поради дневните колебания в концентрацията на хормони — методът на умъртвяване, за да се избегне ненужен стрес за животните, който може да повлияе на концентрациите на хормони — комплектите за изпитване за определяне на хормони, които могат да се различават по стандартните си криви. 60. Пробите от плазма, специално предназначени за определяне на хормони, следва да бъдат получени в сравними периоди през деня. Числовите стойности, получени при анализа на концентрации на хормони, се различават при употребата на различни търговски комплекти за анализ. 61. Ако базовите данни за минали периоди са недостатъчни, следва да се разгледа възможност за определяне на хематологичните и клиничните биохимични променливи преди началото на дозирането или за предпочитане в набор от животни, които не са включени в опитните групи За женските данните трябва да бъдат от кърмещи животни. ПАТОЛОГИЯ Макроскопска аутопсия 62. Всички възрастни животни, подложени на изследване, са обект на цялостна, подробна макроскопска аутопсия, която включва внимателно изследване на външната повърхност на тялото, всички отвори и черепната, гръдната и коремната кухини и тяхното съдържание Особено внимание при огледа трябва да се обърне на органите на половата система. Броят на местата за имплантация следва да бъде записан. Вагиналните натривки следва да бъдат изследвани в деня на аутопсията, за да се определи стадият на естралния цикъл и да се даде възможност за корелация с хистопатологичното изследване на женските репродуктивни органи. 63. Тестисите и епидидимите, както и простатата и семенните мехурчета с коагулиращите жлези като цяло трябва да бъдат изрязани от всички мъжки зрели животни и почистени от прилежащите тъкани, според необходимостта, и трябва да се претеглят в мокро състояние възможно най-скоро след дисекцията, за да не се допусне изсъхването им. В допълнение, опционалното тегло на органите може да включва мускула повдигач на ануса плюс булбокавернозния мускулен комплекс, жлезите на Каупър и главичката на пениса при мъжките и двойката яйчници (мокро тегло) и матката (включително маточната шийка) при женските; ако са включени, тези тегла следва да бъдат взети възможно най-скоро след дисекцията. Яйчниците, тестисите, епидидимите, допълнителните полови органи и всички органи, показващи макроскопски лезии при всички възрастни животни следва да бъдат запазени. 64. От всички възрастни мъжки и женски и от едно мъжко и едно женско новородено на 13 дни от всяко котило следва да се запазят щитовидните жлези в най-подходящата среда за фиксиране за предвиденото последващо хистопатологично изследване. Теглото на щитовидната жлеза може да се установи след фиксиране. Почистването също следва да се осъществи много внимателно и само след фиксиране, за да се избегне увреждане на тъканите. Увреждането на тъканите може да постави под съмнение хистопатологичния анализ. Кръвните проби следва да се вземат от определено място, точно преди или като част от процедурата за евтаназия на животните и да се съхраняват при подходящи условия (вж. точка 56). 65. В допълнение, от най-малко пет възрастни мъжки и женски, произволно избрани от всяка група (освен онези, които са намерени агонизиращи и/или са евтаназирани преди прекратяване на изследването), следва да се изрежат черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези, тимусът, далакът, мозъкът и сърцето от всички прилежащи тъкани, според необходимостта, и да се претеглят в мокро състояние възможно най-скоро след дисекцията, за да не се допусне изсъхването им. Следните тъкани следва да бъдат запазени в най-подходящата среда за фиксиране, както за типа тъкан, така и за предвиденото последващо хистопатологично изследване: всички макроскопски лезии, мозъкът (представителни области, включително главният мозък, малкият мозък и моста), гръбначният мозък, очите, стомахът, тънките и дебелите черва (включително Пайеровите плаки), черният дроб, бъбреците, надбъбречните жлези, далакът, сърцето, тимусът, трахеята и белите дробове (запазени чрез инфлация с фиксатор, след което потопени), половите жлези (тестиси и яйчници), допълнителните полови органи (матка и маточна шийка, епидидими, простата, семенни мехурчета плюс коагулиращи жлези), вагина, пикочен мехур, лимфни възли (освен разположеният най-близо до средата на тялото дрениращ възел следва да бъде взет и друг лимфен възел, в съответствие с опитана лабораторията (16)), периферен нерв (седалищен или тибиален) за предпочитане в непосредствена близост до мускула, скелетен мускул и кост с костен мозък (срез от костен мозък или, като алтернатива, прясно фиксиран костномозъчен аспират). Препоръчва се тестисите да бъдат фиксирани чрез потапяне във фиксатор на Буен или модифициран фиксатор на Дейвидсън (16) (17) (18); фиксиране във формалин не се препоръчва за тези тъкани. Бялото покривало (tunica albuginea) може внимателно да се пробие на неголяма дълбочина в двата края на органа с помощта на игла, за да се позволи бързо проникване на фиксатора. Клиничните и другите сведения могат да посочат необходимостта от изследвания на допълнителни тъкани. Също така всички органи, които на основата на познатите свойства на изпитвания химикал се считат за вероятни прицелни органи, също следва да бъдат консервирани. 66. Следните тъкани могат да предоставят ценни показания за свързани с ендокринната система последици: полови жлези (яйчници и тестиси), допълнителни полови органи (матка, включително маточна шийка, епидидими, семенни мехурчета плюс коагулиращи жлези, простата, локализирана дорзолатерално и вентрално), влагалището, хипофиза, мъжка млечна жлеза и надбъбречна жлеза. Промените в мъжките млечни жлези не са достатъчно добре документирани, но този параметър може да бъде особено чувствителен към вещества с естрогенно действие. Наблюдението на органи/тъкани, които не са изброени в точка 65, е по избор. 67. Мъртвите новородени и новородените, умъртвени на ден 13 след раждането или скоро след това, трябва най-малко да бъдат внимателно огледани външно за макроскопски аномалии. Особено внимание следва да се обърне външните репродуктивни полови органи, които да се огледат за признаци на променено развитие. Хистопатология 68. На запазените органи и тъкани от избраните животни от контролната група и от групите с най-висока доза (като специално се наблегне върху стадиите на сперматогенеза в мъжките полови жлези и хистопатологично изследване на интерстициалната тестикуларна клетъчна структура) следва да се направят пълни хистопатологични изследвания. Щитовидни жлези от новородени и от останалите възрастни животни може да бъдат изследвани, когато е необходимо. Тези изследвания следва да обхванат и животните от групи с други нива на дозата, ако бъдат забелязани промени в групата, третирана с най-висока доза. В Указанията за хистопатология (10) се съдържа допълнителна подробна информация относно дисекцията, фиксирането, разрязването и хистопатологията на ендокринните тъкани. 69. Изследват се всички общи наранявания. Прицелните органи от групи, третирани с други дози, особено от групи, за които се твърди, че показват NOAEL, следва да бъдат изследвани, за да се установят нивата на NOAEL. 70. Когато се използва сателитна група, хистопатология следва да се извършва на тъкани и органи, за които е установено, че показват ефект при третираните групи. ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Данни 71. Следва да бъдат осигурени индивидуални данни за всяко животно. Допълнително, всички данни следва да бъдат обобщени в таблична форма, като за всяка изпитвана група се посочва броят на животните в началото на изпитването, броят на животните, открити мъртви по време на изпитването или евтаназирани, времето на смъртта или евтаназията, броят на плодовитите животни, броят на бременните женски, броят на животните, показващи признаци на токсичност, описание на наблюдаваните признаци на токсичност, включително времето на началото, продължителността и сериозността на всички токсични ефекти, видовете хистопатологични изменения и всички относими данни за котилото. Табличен формат на обобщено протоколиране, който се е доказал като особено полезен за оценката на ефектите върху репродукцията /развитието, е даден в допълнение 3. 72. Когато е възможно, цифровите резултати следва да бъдат оценени с помощта на подходящ и общоприет статистически метод. Чрез сравнения на въздействието в рамките на даден обхват на дозиране следва да се избегне използването на множество t-изпитвания. Статистическите методи следва да бъдат избрани при планирането на изследването. Статистическият анализ на РЕПО и запазването на зърната на млечните жлези трябва да бъде базиран на индивидуални данни за новороденото, като взема под внимание ефектите на котилото. Където е уместно, котилото е единицата за анализ. Статистическият анализ на телесното тегло на новороденото трябва да бъде базиран на индивидуални данни за новороденото, като взема под внимание броя на животните в котилото. Поради ограничените размери на изследването, статистически анализи във формата на изпитвания за „значимост“ са с ограничена стойност за много крайни точки, и особено за крайните точки на репродукцията. Някои от най-широко използваните методи, особено параметричните изпитвания за измерване на централна тенденция, са неподходящи. Ако се използват статистически анализи, тогава избраният метод следва да бъде подходящ за разпределението на изследваната променлива и да бъде избран преди началото на изследването. Оценка на резултатите 73. Констатациите на това изследване за токсичност следва да бъдат оценени, като се вземат предвид наблюдаваните ефекти, аутопсията и микроскопските находки. Оценката включва връзката между дозата на изпитвания химикал и наличието или отсъствието, разпространението и сериозността на аномалиите, включително макроскопски лезии, идентифицирани прицелни органи, безплодие, клинични аномалии, засегната ефективност на репродукцията и на котилото, промени в телесното тегло, ефекти върху смъртността и всякакви други токсични ефекти. 74. Поради краткия период на третиране на мъжките индивиди, хистопатологичното изследване на тестисите и епидидимите следва да се разглежда заедно с данните за плодовитост, когато се оценяват ефектите върху мъжката репродуктивна система. Използването на контролни данни от предходни периоди за репродукцията/развитието на организма (напр. относно броя на животните в котилото, РЕПО, запазване на зърната на млечните жлези, серумни нива на T4), когато са налични, могат също да бъдат полезни като спомагателно средство за интерпретиране на изследването. 75. За контрол на качеството се предлага да се събират контролни данни за минали периоди и да се изчисляват коефициенти на вариация за числовите данни, особено за параметрите, свързани с откриване на нарушители на функциите на ендокринната система. Тези данни могат да бъдат използвани за сравнение когато се извършва оценка на актуалните изследвания. Протокол от изпитването 76. Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Изпитван химикал: — източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава — стабилност на изпитвания химикал, ако е известна. Вещество с една съставка: — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н. Вещество с повече съставки, UVCB и смеси: — определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките. Носител (когато се използва такъв): — обосновка за избора на носител, когато е различен от вода. Изпитвани животни: — използван вид/порода, — брой, възраст и пол на животните; — източник за доставка на животните, условия на отглеждане, хранителен режим и т.н.; — индивидуално тегло на животните в началото на изпитването. — обосновка при използване на видове, различни от плъх. Условия на изпитването: — обосновка за избора на нивото на доза; — подробна информация за това в какъв вид е изпитваният химикал/хранителната смес, постигната концентрация, стабилност и хомогенност на сместа; — подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал; — превръщане от концентрация на изпитвания химикал в храна/питейна вода (ppm) в действителна доза (mg на kg телесно тегло дневно), ако е приложимо, — подробности относно качество на храната и водата; — подробно описание на процедурата за рандомизация при подбора на новородени за бракуване, ако се прилага бракуване. Резултати: — телесно тегло/промени в телесното тегло; — консумация на храна и консумация на вода, ако е приложимо; — данни за токсичната реакция по пол и доза, включително относно плодовитостта и бременността, както и всякакви други признаци на — токсичност; — продължителност на бременността; — токсични или други ефекти върху репродукцията, потомството, постнаталния растеж и др.; — природа, сила и продължителност на клиничните наблюдения (независимо обратими или необратими), оценки на сензорната активност, силата на захвата и двигателната активност, — хематологични изпитвания с относими базови стойности, — клинични биохимични изпитвания с относими базови стойности, — брой на възрастните женски с нормален или аномален естрален цикъл и продължителност на цикъла; — брой на живородените и постимплантационни загуби; — брой на новородените с макроскопски видими аномалии; макроскопска оценка на външните полови органи, брой на изтърсаците; — време на смъртта в процеса на изпитването или дали животните са преживели до края на изпитването; — брой на имплантациите, брой на животните в котилото и тегло на котилото към момента на записване; — данни за телесното тегло на новороденото — РЕПО на всички новородени (и телесно тегло в деня на измерване на РЕПО) — запазване на зърната на млечните жлези при мъжките новородени, — нива на тиродния хормон, новородени на ден 13 и възрастни мъжки (и самки и новородени на ден 4, ако е измерван) — телесно тегло в момента на умътрвяване и данни за тегло на органи за животните родители; — находки при аутопсията; — подробно описание на хистопатологичните находки; — данни за абсорбция (ако има); — статистическа обработка на резултатите, ако е подходящо. Обсъждане на резултатите. Заключения. Тълкуване на резултатите 77. Проучването предоставя оценки на токсичността за репродукцията/развиващия се организъм, свързана с приложението на повторени дози. По-конкретно, тъй като акцентът е поставен както върху общата токсичност, така и върху крайните точки за токсичност за репродукцията/развиващия се организъм, резултатите от изследването позволяват разграничаване на ефектите върху репродукцията/развиващия се организъм, възникващи при липса на обща токсичност, и онези, които се изразяват само на нива, които са токсични и за животните родители (вж. точки 7-11). То може да представи указание за необходимостта от провеждане на допълнителни изследвания и да предоставя насоки за планиране на следващи изпитвания. Неодходима е консултация с Ръководството на ОИСР 43 за помощ при тълкуването на резултатите, свързани с репродукцията и развитието на организма (19). Ръководство 106 на ОИСР относно „Хистологичната оценка на ендокринните и репродуктивните изпитвания на гризачи“ (16) предоставя информация относно подготовката и оценката на (ендокринните) органи и вагиналните натривки, които могат да бъдат полезни за настоящия метод за изпитване. ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141-149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol ., 18, 89-95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Part B, 80 (2), 84-97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60). (11) Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267-283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233-236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). „Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights“, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (16) OECD (20