ПРИЛОЖЕНИЕ I

Методи за наблюдение за откриване и идентифициране на посочения вредител съгласно член 3, параграф 2

1. Изпитване с помощта на спори

За откриване и идентифициране се използват летни спорангии и спящи спори, които се получават от почвата след пресяване или директно от растителния материал.

2. Методи за откриване

За екстрахирането на спори на посочения вредител от почвата се използва един от следните методи:

а) метод за пресяване на почвата, описан от Pratt (1976) (1);

б) метод за пресяване на почвата, описан от Leeuwen et al. (2005) (2);

в) техника за зонално центрофугиране за обработка на проби с висока пропускателна способност, описана от Wander et al. (2007) (3).

3. Методи за идентифициране

След екстрахирането спорите на посочения вредител се идентифицират по един от следните методи:

а) морфологична идентификация под светлинен микроскоп с увеличение от 100 до 400 пъти;

б) стандартен PCR с използване на праймери по Lévesque et al. (2001) (4) и van den Boogert et al. (2005) (5);

в) PCR в реално време с използване на праймери по van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

г) PCR в реално време с използване на праймери по Smith et al. (2014) (7).

4. Жизнеспособност на спящите спори

Жизнеспособността на спящите спори може да се определи чрез микроскопско или биологично изследване. Жизнеспособността на спорангиите може да се определи чрез микроскопско изследване на спорангията с използване на лактофенол или във вода (Przetakiewicz 2015) (8). Спорангии с гранулирано съдържание или с леко заоблена протоплазма може да се считат за жизнеспособни. Тези, при които се наблюдава трайна плазмолиза или които нямат видимо съдържание, се считат за мъртви.

Като алтернативно решение или в случай на съмнение може да се извърши биологично изследване съгласно описанието в точка 3 от приложение IV.

5. Определяне на патотиповете

Определянето на патотиповете изисква израстъците да са свежи.

Инокулумът за изпитването се получава по един от следните методи:

а) метод на SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture — Научно-консултантски институт за шотландско земеделие), състоящ се от следните два етапа: i) получаване на инокулум Старата (кафява) тъкан на израстъците се натрошава на по-малки парчета и се изсушава на въздух при стайна температура, докато стане твърда. Твърдата тъкан се раздробява ръчно или механично. Раздробеният материал се пресява чрез сухо пресяване, като се събира фракцията от 25 до 75 μm, след което се екстрахира по метода с използване на хлороформ на Pratt (1976)1; ii) получаване на свежи израстъци Приблизително 10 mg от екстрахираните спящи спори се разпръскат по повърхността на 10 ml стерилна дестилирана вода в малко пластмасово блюдо на Петри и се инкубират на тъмно при 20 °C до покълването. Картофените клубени с малки кълнове с дължина около 1 до 2 mm се поставят в прозрачни пластмасови кутии, обвити с влажна хартия тип тишу с маркирани кълнове, ориентирани нагоре. Кълновете се опръстеняват с разтопен вазелин, като се използва спринцовка. Пръстенът трябва да не е разкъсан и да е достатъчно висок, за да задържи суспензията от спори без изтичане. 10 ml покълнали спящи спори се разреждат допълнително до 20 ml със стерилна вода и се поставят вътре в пръстените с пипета или флакон с изстискване до пълното потапяне на кълновете в суспензията от спори. Пластмасовите кутии се покриват с капаци и се инкубират в продължение на 4 дни при температура 10 °C, след което кутиите се отварят, инокулумът и вазелиновите пръстени се отстраняват и кутиите се преместват в оранжерия с водна мъгла при 15 до 18 °C (16 часа светлина);

б) метод на Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

в) метод на Potoček et al. (1991) (10);

г) метод на Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble и Glynne 1970 (13)).

За определяне на всички патотипове, за които е известно, че са от значение за Съюза (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) и 38(Nevşehir), се използва диференциален тест за инфектиране с различни сортове на посоченото растение, както е посочено в таблицата. Тестът за инфектиране се извършва съгласно упоменатия в буква г) протокол (метод на Glynne-Lemmerzahl).

Селективна чувствителност на отделните видове картофени култури за целите на определянето на патотиповете на S. endobioticum

Видове култури Патотипове на S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R „S“: Възприемчив „R“: Устойчив *: сочи слаба възприемчивост на сорта към S. endobioticum („наличие на ненекротични сорусни полета без образуване на израстъци“).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21 – 29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25 – 31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165 – 174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200–201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47 – 57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129 – 133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422 – 432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114 – 115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191 – 205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34 – 60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288 – 297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125 – 135.