19)

В част В се добавят следните глави: „В.47 Риби, изпитване за токсичност на ранни стадии от жизнения цикъл ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 210 (2013). Изпитванията, отнасящи се за ранните стадии при риби, имат за цел определяне на леталните и сублеталните въздействия на химикалите върху изпитваните стадии и видове. Те дават информация от значение за оценка на хроничните летални и сублетални въздействия на химикалите върху други видове риби. 2. Насоките за изпитване 210 се основават на предложение от страна на Обединеното кралство, което бе обсъдено на среща на експерти на ОИСР, състояла се в Medmenham (Обединено кралство) и са актуализирани през 2013 г., за да се отрази опитът при използването на изпитването и препоръките от семинар на ОИСР за изпитване за токсичност при риби, проведен през септември 2010 г. (1). ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 3. Рибите на ранни стадии се експонират на обхват от концентрации на изпитвания химикал, разтворен във вода. Предпочитат се проточни условия; независимо от това, ако не е възможно, приемливи са полустатични условия. За повече подробности следва да се консултира Ръководството на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (2). Изпитването започва с поставяне на оплодените хайверни зърна в камерите за изпитване и продължава за период от време, специфичен за животинския вид, който е необходим за достигане на контролните риби до ювенилен стадий от жизнения цикъл. Леталното и сублеталното въздействие се оценяват и сравняват със стойностите при контролите, за да се определи най-ниска концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) с цел да се определи i) концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) и/или ii) ECx (напр. EC10, EC20), като се използва регресионен модел, за да се оцени концентрацията, която би причинила х % изменение на измерваното въздействие. Протоколирането на относимите концентрации с определено въздействие и параметри може да зависи от регулаторната рамка. Изпитваните концентрации трябва да обграждат ECx (напр. EC10, EC50) така, че ЕСх впоследствие да се получи след интерполация, а не след екстраполация (вж. допълнение 1 за определения). ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНИЯ ХИМИКАЛ 4. Изпитваният химикал се отнася до това, което се изпитва. Разтворимостта във вода (вж. глава А.6 от настоящото приложение) и парното налягане (вж. глава А.4 от настоящото приложение) на изпитвания химикал трябва да са известни и да е на разположение надежден аналитичен метод за количествено определяне на химикала в изпитваните разтвори с известни и протоколирани точност и граница на количествено определяне. Въпреки че не са необходими за извършване на изпитването, резултатите от изпитването за остра токсичност (вж. глави В.1 или В.49 от настоящото приложение), за предпочитане извършено с видовете, избрани за настоящото изпитване, могат да предоставят полезна информация. 5. Ако методът за изпитване се използва за изпитване на смес, нейният състав следва да се охарактеризира възможно най-пълно, например чрез химичната идентичност на нейните съставки, количествения състав и специфичните свойства на веществата (като упоменатите по-горе). Преди използването на метода на изпитване за регулаторни изпитвания на смес, трябва да бъде преценено дали той ще предостави приемливи резултати за набелязаната регулаторна цел. 6. Полезна информация включва структурната формула, чистотата на веществото, стабилността във вода и на светлина, pKa, Pow и резултати от изпитване за пълна биоразградимост (напр. глава В.4 или В.29 от настоящото приложение). ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО 7. За да бъде валидно дадено изпитване се прилагат следните условия: — концентрацията на разтворен кислород трябва да бъде >60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух (ASV) по време на изпитването; — температурата на водата не трябва да се различава с повече от ±1,5 °C между камерите за изпитване или между последователните дни по всяко време на изпитването, и следва да се поддържа в рамките на температурните диапазони, посочени за изпитваните видове (допълнение 2); — аналитичното измерване на концентрациите на изпитване е задължително. — цялостната преживяемост на оплодените хайверни зърна в контролите и преживяемостта след излюпване и, където е относимо, в контролите на разтворител, трябва да бъде по-голяма или равна на границите, определени в допълнение 2; 8. Ако се наблюдава малко отклонение от критериите за валидност на изпитването, последиците следва да се съобразят с надеждността на данните от изпитването и тези съображения следва да бъдат включени в протокола. Въздействията върху преживяемостта, излюпването или растежа при контролата на разтворител, в сравнение с отрицателната контрола, следва да бъдат протоколирани и обсъдени в контекста на надеждността на данните от изпитването. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Камери за изпитване 9. Могат да се използват всякакви съдове от стъкло, неръждаема стомана или други химически неутрални материали. Тъй като за силикона е известно, че проявява висок капацитет за абсорбиране на липофилни вещества, използването на силиконови тръби при проточните изследвания и използването на силиконови запушалки в контакт с вода следва да бъде сведено до минимум чрез използването например на монолитни стъклени аквариуми. Размерите на съдовете следва да са достатъчно големи, за да позволяват подходящ растеж в контролата, поддържане на концентрацията на разтворен кислород (напр. при малки видове риби това се постига със съд с обем 7 l) и съответствие с критериите за скорост на зареждане, посочени в точка 19. Препоръчва се камерите за изпитване да са разположени на случаен принцип в зоната на извършване на изпитването. Рандомизираният блоков план, при който всяко третиране е налично във всеки блок, се предпочита пред напълно рандомизирания. Камерите за изпитване следва да са защитени от нежелани смущения. За предпочитане е системата за изпитване да бъде кондиционирана с концентрации на изпитвания химикал за достатъчно дълъг период, за да се докажат стабилни концентрации на експозиция преди въвеждането на изпитваните организми. Избор на видове 10. Препоръчваните видове риби са дадени в таблица 1. Това не изключва използването и на други видове, но за постигане на подходящи условия на изпитването може да се наложи адаптиране на процедурата за изпитване. В този случай следва да се протоколира основанието за избор на видовете и на опитния метод. Отглеждане за рибите за размножаване 11. Подробности относно отглеждането на рибния запас за размножаване при задоволителни условия могат да се намерят в допълнение 3 и в препратки към използваната литература (3) (4) (5). Третиране на оплодените хайверни зърна, ембрионите и ларвите 12. Първоначално оплодените хайверни зърна, ембрионите и ларвите могат да се експонират, в рамките на основния съд, в по-малки съдове от стъкло или неръждаема стомана, снабдени със страни или краища с отвори, за да се позволи протичане на изпитвания разтвор през съда. Нетурбулентно протичане през тези малки съдове може да се предизвика чрез поставянето им на ръчка, монтирана да премества съда нагоре и надолу, но като запазва винаги организмите във водата. Оплодените хайверни зърна на риби от семейството на сьомгата могат да се запазват с решетки или сито с достатъчно широки отвори, които да позволяват на ларвите да преминават през тях след излюпването. 13. Когато за задържане на хайвера в основния съд за изпитване са били използвани контейнери с хайвер, решетки и сита, тези ограничители следва да се отстранят след излюпването на ларвите, съгласно насоките в допълнение 3, c изключение на ситата, които следва да се задържат, за да се предотврати изпускането на ларвите. Ако има нужда от прехвърляне на ларвите, те следва да не се излагат на въздух и не следва да се използват мрежи, да за се освободят ларвите от контейнерите с хайвера. Графикът за това прехвърляне е различен за различните видове и следва да се документира в протокола. Независимо от това прехвърляне не е винаги необходимо. Вода 14. Всяка вода, в която изпитваният вид показва съответните признаци за дългосрочна преживяемост и растеж, може да се използва като вода за изпитването (вж. допълнение 4). Необходимо е постоянно качество на водата по време на изпитването. За да се гарантира, че водата за разреждане няма да повлияе неправилно върху резултата от изпитването (например чрез образуване на комплекс с изпитвания химикал) или да навреди на рибния запас за размножаване, пробите за анализ следва да се вземат на интервали. Правят се измервания на тежки метали (например Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), основни аниони и катиони (например Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO42–), амоняк, общо пестициди с остатъчни нива на хлор, общ органичен въглерод и суспендирани твърди частици, например два пъти годишно, когато се знае, че водата за разреждане има относително постоянно качество. В случаите, когато е известно, че водата е с променливо качество, измерванията трябва да се провеждат по-често; честотата зависи от това колко променливо е качеството. Някои от химичните характеристики на приемливата вода за разреждане са изброени в допълнение 4. Разтвори за изпитване 15. За изпитванията с проточна система се изисква система, която постоянно подава и разрежда изходен разтвор на изпитвания химикал (например система с измерваща помпа, пропорционално разреждащо устройство, сатуратор), за да се подават серии от концентрации към камерите за изпитване. Дебитът на изходните разтвори и този на водата за разреждане следва да се проверяват на интервали по време на изпитването и през това време не следва да варират с повече от 10 %. За подходящ се счита дебит, равен на поне пет обема на камера за изпитване за 24 часа (3). Независимо от това, ако се спазва скоростта на зареждане, посочена в параграф 19, за предотвратяване на бързото отстраняване на храна е възможна по-ниска скорост на протичане, напр. 2-3 обема на камера за изпитване. 16. Разтворите за изпитване при избраните концентрации се приготвят чрез разреждане на изходен разтвор. Изходният разтвор се приготвя за предпочитане чрез просто смесване и разбъркване на изпитвания химикал във водата за разреждане с помощта на механични средства (например разклащане и/или ултрасонификация). За постигане на подходящо концентриран изходен разтвор могат да се използват колони за насищане (колони за разтворимост) или методи за пасивно дозиране (6). Използването на разтворител за носител не е препоръчително. Независимо от това, в случай че е необходим разтворител, успоредно следва да се стартира изпитване с контрола на разтворител, при същата концентрация на разтворител, като тази при третиранията с химикала; т.е. нивото на разтворителя следва за предпочитане да бъде еднакво във всички концентрации, както и в контролата на разтворител. За някои системи за разреждане това може да е трудно от техническа гледна точка; тук концентрацията на разтворителя в контролата на разтворител следва да е равна на най-високата концентрация на разтворителя в третираната група. За вещества, които са трудни за изпитване, следва да се консултира Ръководство № 23 на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (2). Ако се използва разтворител, изборът на разтворител се определя в зависимост от химичните свойства на веществото. В Ръководство № 23 на ОИСР се препоръчва максимална концентрация от 100 μl/l. За да се избегне потенциалното влияние на разтворителя върху измерените крайни точки (7), препоръчително е концентрацията на разтворителя да се поддържа възможно най-ниска. 17. При полустатичните изпитвания могат да се следват две различни процедури за обновяване. Или се приготвят нови разтвори за изпитване в чисти съдове и преживелите хайверни зърна и ларви внимателно се пренасят в новите съдове, или изпитваните организми се запазват в съдовете за изпитване, като известен дял (поне две трети) от обема на разтвора за изпитване/контролата се сменя. ПРОЦЕДУРА Условия на експозиция Продължителност 18. Изпитването трябва да започне възможно най-бързо след оплождането на хайверните зърна, като е за предпочитане те да са потопени в разтворите за изпитване преди започването на дробенето на бластодиска или колкото е възможно по-скоро след този етап. Продължителността на изпитването зависи от видовете, които се използват. Някои препоръчителни продължителности са дадени в допълнение 2. Зареждане 19. Броят на оплодените хайверни зърна в началото на изпитването следва да е достатъчен за спазване на статистическите изисквания. Те следва да са разпределени на случаен принцип сред третиранията и минимум 80 хайверни зърна, разпределени по равно между най-малко четири камери за изпитване с повторения, следва да бъдат използвани за всяка концентрация. Скоростта на зареждане (биомаса на обем разтвор за изпитване) следва да е достатъчно ниска с оглед поддържане на концентрация на разтворен кислород от поне 60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух без вентилация по време на стадиите хайверни зърна и ларви. За изпитванията с проточна система се препоръчва скорост на зареждане не по-голяма от 0,5 g мокро тегло/1 за 24 часа и не повече от 5 g/1 от разтвора по всяко време (3). Светлина и температура 20. Продължителността на излагане на светлина и температурата на водата следва да са подходящи за изпитваните видове (допълнение 2). Хранене 21. Храната и храненето са изключително важни и е от съществено значение да се предоставя подходящата храна за всеки стадий от жизнения цикъл, в подходящо време и в количества, които са достатъчни за поддържане на нормален растеж. Храненето следва да бъде приблизително равно в повторенията, освен ако не е коригирано, за да отчете смъртността. Излишната храна и изпражненията трябва да бъдат отстранявани, когато е необходимо, за да се избегне натрупване на отпадъци. Подробни хранителни режими са дадени в допълнение 3, но с натрупването на опит храната и хранителните режими непрекъснато се усъвършенстват с оглед подобряване на преживяемостта и оптимизиране на растежа. Живата храна осигурява източник за облагородяване на околната средата и следователно следва да се използва вместо сухата или замразена храна, или в допълнение към нея, когато това е подходящо за вида и стадия от жизнения цикъл. Концентрации на изпитване 22. Обичайно се изискват пет концентрации на изпитвания химикал, с минимум четири повторения на концентрация, разделени на равни интервали с кратност, която не надвишава 3,2. При избирането на обхвата на изпитваните концентрации следва да бъдат разгледани информация за изпитвания за остра токсичност, за предпочитане със същите видове, и/или изпитване за определяне на обхвата (1), ако са налични. Независимо от това, при избирането на обхвата на изпитваните концентрации следва да бъдат разгледани всички източници на информация, включително източници като например „read across“, данни от изпитвания за остра токсичност за рибни ембриони. Когато трябва да бъдат установени само емпирични NOEC, като окончателно изпитване може да бъде приемливо гранично изпитване или разширено гранично изпитване с по-малко от пет концентрации. Трябва да се представи обосновка, ако са използвани по-малко от пет концентрации. Не е нужно да се изпитват концентрации на изпитвания химикал, по-високи от 96-часова LC50, или 10 mg/1, според това коя от двете е по-ниска. Контроли 23. в допълнение към серията от концентрации на изпитвания химикал следва да се изпита само една контрола на вода за разреждане и, ако е необходимо, една контрола на разтворител, съдържаща използван разтворител за носител (вж. точка 16). Честота на аналитичните определяния и измервания 24. Преди започване на периода на експозиция следва във всички повторения да бъде гарантирано правилното функциониране на системата за доставяне на химикала (например чрез измерване концентрации на изпитване). Следва да се установят изискваните методи за анализ, в това число подходяща граница на количествено определяне (LOQ) и достатъчни познания за стабилността на веществото в системата за изпитване. По време на изпитването концентрациите на изпитвания химикал се определят през постоянни интервали, за да се характеризира експозицията. Необходими са най-малко пет определяния. При проточните системи аналитичните измервания на изпитвания химикал в едно повторение за всяка концентрация следва да бъдат извършвани поне един път седмично, със систематична смяна между повторенията. Допълнителните аналитични определяния често подобряват качеството на резултатите от изпитването. Може да е необходимо пробите да бъдат филтрувани за отстраняване на всякакви твърди частици (например с използване на размер на порите 0,45 μm) или центрофугирани, за да се гарантира, че определянията на химикала се правят в истински разтвор. С цел да се намали адсорбцията на изпитвания химикал, филтрите трябва да бъдат наситени преди употреба. Когато измерените концентрации не остават в рамките на 80-120 % от номиналната концентрация, концентрации с определено въздействие трябва да бъдат определени и изразени по отношение на средноаритметичната стойност на концентрацията за проточните изпитвания (вж. допълнение 6 към метод за изпитване В.20 за изчисляването на средноаритметичната стойност (8)), и изразени по отношение на средната геометрична стойност на измерените концентрации за полустатичните изпитвания (вж. глава 5 в Ръководствоto на ОИСР за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (2)). 25. По време на изпитването разтвореният кислород, рН и температурата следва да се измерват във всички съдове за изпитване поне веднъж седмично, а солеността и твърдостта — в началото и в края на изпитването, ако има основания за това. За предпочитане е температурата да се наблюдава непрекъснато най-малко в един съд за изпитване. Наблюдения 26. Стадий на ембрионално развитие : стадият на развитие на ембриона в началото на експозицията на изпитвания химикал следва да бъде проверен колкото е възможно по-точно. Това може да се направи, като се използва представителна извадка от хайверни зърна, запазени и изчистени по подходящ начин. 27. Излюпване u преживяемост : наблюденията върху излюпването и преживяемостта следва да се правят поне веднъж на ден и се записва броят. Ако в началото на ембрионално развитие се наблюдават гъбички върху хайверните зърна (например в първия или втория ден от изпитването), тези хайверни зърна трябва да бъдат преброени и отстранени. Мъртвите ембриони, ларви и ювенилни екземпляри следва да се отстраняват веднага след като са забелязани, тъй като могат да се разложат бързо и да бъдат разкъсани от действията на другите риби. При отстраняването на мъртвите индивиди се полага изключителна грижа да не се наранят физически близкостоящите хайверни зърна/ларви. Признаците на смърт варират в зависимост от видовете и стадия от жизнения цикъл. Например: — за новооплодени хайверни зърна: по-специално в ранните стадии това са: явна загуба на прозрачност и изменение в оцветяването, причинени от коагулация и/или утаяване на белтъци, водещи до бял непрозрачен вид; — за ембрионите, ларвите и ювенилните екземпляри: неподвижност и/или липса на дихателни движения и/или липса на сърдечен ритъм и/или липса на реакция при механично стимулиране. 28. Необичаен външен вид : броят на ларвите и ювенилните екземпляри, които показват необичайна форма на тялото, следва да се записва на подходящи интервали в зависимост от продължителността на изпитването, а природата на необичайността във външния вид следва да се опише. Следва да се отбележи, че ларвите с аномалии и ювенилните екземпляри се срещат по естествен път и могат да бъдат от порядъка на няколко процента от контролата(ите) при някои видове. Когато деформациите и свързаното с тях необичайно поведение се смятат за толкова сериозни, че се наблюдава значително страдание за организма, и то е достигнало до точка, отвъд която няма да има възстановяване, той може да бъде отстранен от изпитването. Такива животни следва да бъдат умъртвени и третирани като смъртност при последващия анализ на данните. За повечето видове, които се препоръчват в настоящия метод за изпитване, е документирано нормално ембрионално развитие (9) (10) (11) (12). 29. Необичайно поведение : необичайното поведение, като хипервентилация, некоординирано плуване, нетипично състояние на покой и нетипично поведение при хранене, следва да се записват на достатъчни интервали в зависимост от продължителността на изпитването (например веднъж дневно за видове, обитаващи топлите води). Тези въздействия, въпреки че е трудно да бъдат определени количествено, могат при наблюдаване да допринесат за тълкуването на данните за смъртността. 30. Тегло : в края на изпитването всички преживели риби се претеглят на база повторения (като се протоколира броят животни в съответното повторение и средното тегло за животно): мокрото тегло (след попиване на водата) се предпочита, но независимо от това данните за сухото тегло също могат да бъдат протоколирани (13). 31. Дължина : в края на изпитването следва да се измерят индивидуалните дължини. Препоръчва се обща дължина, но ако се появят гниене на опашния плавник или ерозия на перка, може да се използва стандартна дължина. За всички риби в дадено изпитване следва да бъде използван един и същ метод. Индивидуалната дължина може да бъде измерена например с шублер, цифров фотоапарат или калибриран окулярен микрометър. Типичните минимални дължини са определени в допълнение 2. ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Обработка на резултатите 32. Препоръчва се планът на опита и изборът на статистическия тест да позволяват достатъчна мощност (80 % или по-голяма) за откриване на изменения от биологично значение в крайните точки, за които се протоколира NOEC. Протоколирането на относимите концентрации с определено въздействие и параметри може да зависи от регулаторната рамка. Ако следва да бъде протоколирана дадена ECx, планът на опита и изборът на регресионен модел следва да дават възможност за оценка на ECx, така че i) 95-процентният доверителен интервал, протоколиран за ECx, да не съдържа нула и да не е прекомерно широк, ii) 95-процентният доверителен интервал за прогнозната средна стойност в ECx не съдържа контролната средна стойност, iii) няма значима липса на съгласуваност на регресионния модел с данните. Всеки подход изисква определянето на процентното изменение във всяка крайна точка, което е важно да бъде открито или оценено. Планът на опита следва да бъде изготвен така, че да се даде възможност за това. Когато посочените по-горе условия за определяне на ECx не са изпълнени, следва да се използва NOEC подходът. Малко вероятно е както едно и също процентно изменение да се прилага за всички крайни точки, така и осъществим опит да може да бъде планиран по такъв начин, че да отговаря на тези критерии за всички крайни точки, поради което при планирането на опита по подходящ начин е важно вниманието да се насочи към крайните точки, които са от значение за съответния опит. Статистически блокови схеми и насоки за всеки подход са на разположение в допълнения 5 и 6, като те дават насоки за обработката на данните и за избора на най-подходящия статистически тест или модел. Могат да се използват други статистически подходи, при условие че са научно обосновани. 33. Ще бъде необходимо варирането да се анализира във всеки набор от повторения, като се използват дисперсионен анализ или таблица на спрегнатост, и въз основа на този анализ се използват подходящи статистически методи за анализ. За да се направи множествено сравнение на резултатите при индивидуалните концентрации и тези при контролите, се препоръчват тест на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад или тест на Уйлямс за непрекъснатия отклик, и тест на Кокрън-Армитидж със стъпка назад за двоичния отклик, които са съвместими с монотонна зависимост концентрация-отклик и липсват доказателства за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение (14). Когато има доказателства за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, се препоръчва модификация на Рао-Скот на теста на Кокрън-Армитидж (15) (16), или към съотношенията от повторенията се прилагат тестовете на Уйлямс или на Дънет (след трансформация „аркуссинус от корен квадратен“), или тестът на Йонкхере-Терпстра. Когато данните не са съвместими с монотонна зависимост концентрация-отклик, методите на Дънет или на Дън, или на Ман-Уитни, може да се окажат полезни за непрекъснат отклик, а точният тест на Фишер — за двоичен отклик (14) (17) (18). Когато се прилага какъвто и да е статистически метод или модел, следва да се внимава да се гарантира удовлетворяването на изискванията на метода или модела (например от камера до камера се оценява и отчита при плана на опита и изпитването и използвания статистически тест или модел). Данните трябва да се оценяват по отношение на тяхната нормалност, като допълнение 5 посочва какво следва да се направи по отношение на остатъците в рамките на ANOVA. В допълнение 6 се разглеждат допълнителни съображения за регресионния подход. Следва да бъдат взети предвид трансформации с оглед удовлетворяване на изискванията за даден статистически тест. Независимо от това трансформациите, които да позволят изглаждането с регресионен модел, изискват голямо внимание, тъй като например 25 % изменение в нетрансформирания отклик не съответства на 25 % изменение в трансформиран отклик. Във всички анализи обектът за анализ и опитната единица е камерата за изпитване, а не отделната риба, и както тестването на хипотези, така и регресията, трябва да са съобразени с това (3) (14) (19) (20). Протокол от изпитването 34. Протоколът от изпитването следва да включва следната информация: Изпитван химикал: Вещество с една съставка — външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства; — химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др. (включително съдържание на органичен въглерод, ако е уместно). Вещество с повече съставки, UVCB и смеси: — характеризирани, доколкото е възможно, напр. от химичната идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките. Изпитван вид: — научно наименование, порода, източник и метод на събиране на оплодените хайверни зърна и последващо боравене. Условия на изпитването: — използвана процедура на изпитване (напр. полустатична или проточна, зареждане); — Продължителност(и) на излагане на светлина; — план за изпитването (напр. брой на камерите за изпитване и повторенията, брой хайверни зърна в едно повторение, материал и размери на камерата за изпитване (височина, ширина, обем), обем вода на камера за изпитване); — метод за приготвяне на изходния разтвор и честота на обновяване (при използване трябва да се посочат разтворителят и неговата концентрация); — метод на дозиране на изпитвания химикал (напр. помпи, системи за разреждане) — коефициентът на аналитичния добив на метода и номиналните концентрации на изпитване, границата на количествено определяне, средните на измерените стойности и техните стандартни отклонения в съдовете за изпитване, методът за получаването им и доказателство, че измерванията се отнасят за концентрациите на изпитвания химикал в истински разтвор; — характеристики на разтворимост във вода: рН, твърдост, температура, концентрация на разтворен кислород, нива на остатъци от хлор (ако са измерени), общо органичен въглерод (ако е измерен), суспендирани твърди частици (ако са измерени), соленост на изпитваната среда (ако е измерена) и всички други направени измервания; — качество на водата в съдовете за изпитване, рН, твърдост, температура и концентрация на разтворен кислород; — подробна информация за храненето (например вид на храната или храните, източник, дадено количество и честота). Резултати, протоколирани на индивидуална база (или на база повторения) и като средна стойност и коефициент на вариация, според конкретния случай, за следните крайни точки: — доказателство, че при контролите е изпълнен стандартът за приемливост по отношение на общата преживяемост за изпитваните видове (допълнение 2); — данни за смъртността на всеки стадий (ембрион, ларва и ювенилен екземпляр) и кумулативна смъртност; — дни до излюпването, брой на ларвите, които се излюпват всеки ден, и край на излюпването; — брой на здравите риби в края на изпитването; — данни за дължината (посочва се дали е стандартна или обща) и теглото на преживелите животни; — срещане, описание и брой на морфологичните аномалии, ако има такива; — срещане, описание и брой на въздействията върху поведението, ако има такива; — подход за статистическия анализ (регресионен анализ или дисперсионен анализ) и обработката на данните (използван статистически тест или модел); — концентрация без наблюдавано въздействие (NOEC) за всеки оценен отклик; — най-ниска концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) (при р = 0,05) за всеки оценен отклик; — ECx а всеки оценен отклик, ако е приложимо, и доверителен интервал (напр. 90 % или 95 %) и графика на изгладения модел, използван за нейното изчисляване, наклон на кривата концентрация-отклик, формула на регресионния модел, очакваните параметри на модела и техните стандартни грешки. Всякакви отклонения от метода за изпитване: Обсъждане на резултатите, включително всякакво влияние на отклонения от метода за изпитване върху резултата от изпитването. Таблица 1 Видове риби, които се препоръчват за изпитване СЛАДКОВОДНИ ЕСТУАРНИ и МОРСКИ Oncorhynchus mykiss Дъгова пъстърва Cyprinodon variegatus Cyprinodon variegatus Pimephales promelas Pimephales promelas Menidia sp. Атерина Danio rerio Зеброво данио Oryzias latipes Японска оризия или Медака ЛИТЕРАТУРА (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Глава В.20 от настоящото приложение, Изпитване за размножаване на Daphnia magna. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 — 376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. (15) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. (17) Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. (18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Допълнение 1 ОПРЕДЕЛЕНИЯ Дължина на тялото до развилката на опашната перка (FL): отнася се за дължина от върха на муцуната до края на средните лъчи на опашната перка и се използва при риби, при които е трудно да посочи краят на гръбначния стълб (www.fishbase.org) Стандартна дължина (SL): отнася се за дължина на рибата, измервана от върха на муцуната до задния край на последния прешлен или до задния край на средно-страничната част на подопашната става. По-просто казано, това измерване изключва дължината на опашната перка. (www.fishbase.org) Обща дължина (TL): отнася се за дължина от върха на муцуната до върха на по-дългият дял от опашната перка, обикновено измерван чрез притискане на дяловете по дължината на страничната линия. Това е измерване по права линия, не се измерва по контура на тялото (www.fishbase.org) Фигура 1 Описание на използваните различни дължини Химикал: вещество или смес. ECx: (концентрация, при която се наблюдава х % от въздействието) е концентрацията, която причинява х % от дадено въздействие върху изпитвани организми в рамките на даден период на експозиция, при сравнение с контрола. Например EC50 е концентрация, за която е направена оценка, че предизвиква дадено въздействие върху изпитвана крайна точка в 50 % от експонираната популация в рамките на определен период на експозиция. Изпитван химикал: всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Най-ниска концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) е най-ниската изпитвана концентрация на изпитван химикал, при която за химикала се наблюдава статистически значимо въздействие (при p < 0,05) в сравнение с контролата. Независимо от това, всички изпитвани концентрации над LOEC трябва да имат вредно въздействие, равно или по-голямо от наблюдаваното при LOEC. Когато тези две условия не могат да бъдат удовлетворени, трябва да се даде цялостно обяснение за това как е била избрана LOEC (и следователно NOEC). В допълнения 5 и 6 се предоставят насоки. Концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) е изпитваната концентрация непосредствено под LOEC, която при сравнение с контролата няма статистически значимо въздействие (р < 0,05) в рамките на даден период на експозиция. UVCB: Вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали. IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry (Международен съюз по чиста и приложна химия). SMILES: Спецификация за опростено линейно въвеждане на молекули (Simplified Molecular Input Line Entry Specification). Допълнение 2 УСЛОВИЯ ЗА ИЗПИТВАНЕ, ПРОДЪЛЖИТЕЛНОСТ И КРИТЕРИИ ЗА ПРЕЖИВЯЕМОСТ ПРИ ПРЕПОРЪЧАНИТЕ ВИДОВЕ ВИДОВЕ УСЛОВИЯ НА ИЗПИТВАНЕ ПРЕПОРЪЧИТЕЛНА ПРОДЪЛЖИТЕЛНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО Типична минимална средна обща дължина на контролните риби в края на изследването (mm) (98) ПРЕЖИВЯЕМОСТ ПРИ КОНТРОЛИТЕ (минимална) Температура (°C) Соленост (0/00) Период на излагане на светлина (часове) при излюпването след излюпването Сладководни: Oncorhynchus mykiss Дъгова пъстърва 10 ± 1,5 (99) 12 – 16 (100) 2 седмици след хранене ad libitum на контролите (или 60 дни след излюпване) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Pimephales promelas 25 ± 1,5 16 32 дни след началото на изпитването (или 28 дни след излюпване) 18 70 % 75 % Danio rerio Зеброво данио 26 ± 1,5 12 – 16 (101) 30 дни след излюпване 11 70 % 75 % Oryzias latipes Японска оризия или Медака 25 ± 2 12– 16 (101) 30 дни след излюпване 17 80 % 80 % Естуарни и Морски: Cyprinodon variegatus Cyprinodon variegatus 25 ± 1,5 15-35 (102) 12 – 16 (101) 32 дни след началото на изпитването (или 28 дни след излюпване) 17 75 % 80 % Menidia sp. Атерина 22 – 25 15-35 (102) 13 28 дни 20 80 % 60 % Допълнение 3 НАСОКИ ЗА ХРАНЕНЕ И БОРАВЕНЕ ЗА ЖИВОТНИТЕ ЗА РАЗВЪЖДАНЕ И ЖИВОТНИТЕ ЗА ИЗПИТВАНЕ ОТ ПРЕПОРЪЧВАНИТЕ ВИДОВЕ ВИДОВЕ ХРАНА (*9) ВРЕМЕ НА ПРЕХВЪРЛЯНЕ СЛЕД ИЗЛЮПВАНЕ ВРЕМЕ ДО ПЪРВОТО ХРАНЕНЕ Риби за размножаване Новоизлюпени ларви Ювенилни екземпляри Тип Честота Сладководни: Oncorhynchus mykiss Дъгова пъстърва храна за пъстърва Няма (1) стартова храна за пъстърва науплии от артемии (BSN) 2-4 пъти на ден 14-16 дни след излюпване или при изплуване (не е от съществено значение) 19 дни след излюпване, или при изплуване Pimephales promelas Pimephales promelas науплии от артемии, храна във вид на люспи замразени артемии науплии от артемии науплии от артемии, храна във вид на люспи 2-3 пъти на ден след като излюпването е 90 % 2 дни след излюпването Danio rerio Зеброво данио науплии от артемии, храна във вид на люспи храна от ларви от търговската мрежа, протозоа (2), белтъци (3) BSN48, храна във вид на люспи BSN веднъж дневно; храна във вид на люспи два пъти дневно след като излюпването е 90 % 2 дни след излюпването Oryzias latipes Японска оризия или Медака храна във вид на люспи BSN, храна във вид на люспи (или протозоа или ротатории) BSN48, храна във вид на люспи (или ротатории) BSN веднъж дневно; храна във вид на люспи два пъти на ден или храна във вид на люспи и ротатории веднъж на ден не е приложимо. 6-7 дни след хвърляне на хайвера Естуарни и Морски: Cyprinodon variegatus Cyprinodon variegatus науплии от артемии, храна във вид на люспи замразени артемии науплии от артемии (BSN) BSN48 2-3 пъти на ден не е приложимо. 1 ден след излюпване/при изплуване Menidia sp. Атерина науплии от артемии, храна във вид на люспи науплии от артемии (BSN) BSN48 2-3 пъти на ден не е приложимо 1 ден след излюпване/при изплуване Допълнение 4 НЯКОИ ХИМИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПРИЕМЛИВА ВОДА ЗА РАЗРЕЖДАНЕ Компонент Гранична концентрация Твърди частици 5 mg/l Общ органичен въглерод 2 mg/l Нейонизиран амоняк 1 μg/l Остатъчен хлор 10 μg/l Общо органофосфорни пестициди 50 ng/l Общо органохлорни пестициди плюс полихлорирани бифенили 50 ng/l Общ органичен хлор 25 ng/l Алуминий 1 μg/l Арсен 1 μg/l Хром 1 μg/l Кобалт 1 μg/l Мед 1 μg/l Желязо 1 μg/l Олово 1 μg/l Никел 1 μg/l Цинк 1 μg/l Кадмий 100 ng/l Живак 100 ng/l Сребро 100 ng/l Допълнение 5 СТАТИСТИЧЕСКИ НАСОКИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА NOEC Общи положения Единицата за анализ е съдът с повторение. Следователно, по отношение на непрекъснатите измервания, като например размера, следва да бъде изчислена средната стойност или медианата за повторението и тези стойности от повторението са данните за анализ. Мощността на използваните статистически тестове трябва да бъде доказана, за предпочитане въз основа на достатъчна база с данни от предходни периоди за всяка лаборатория. Статистическият тест, който ще се използва, следва за всяка крайна точка да предоставя въздействие върху размера, което може да бъде открито със 75-80 % мощност. Базите данни, налични към момента на разработване на настоящия метод за изпитване, установяват възможната мощност според препоръчаните статистически процедури. Индивидуалната лаборатория следва да докаже способността си да изпълни това изискване за мощност или чрез извършване на свой собствен анализ на мощността, или като докаже, че коефициентът на вариация (CV) за всеки отклик не надвишава 90-ия процентил от коефициентите на вариация, използвани при разработването на насоките за изпитване. Тези коефициенти на вариация са дадени в таблица 1. Ако за дадено повторение са налични само средни стойности или медиани, коефициентът на вариация в рамките на повторението може да бъде игнориран. Таблица 1 90-и процентил на CV за избрани сладководни видове Животински вид Отклик CV между повторенията CV в рамките на повторението Дъгова пъстърва Дължина 17,4 9,8 Тегло 10,1 28 Pimephales promelas Дължина 16,9 13,5 Тегло 11,7 38,7 Зеброво данио Дължина 43,7 11,7 Тегло 11,9 32,8 За почти всички статистически тестове, използвани за оценка на лабораторни токсикологични изследвания, представляващите интерес сравнения са на третирани групи спрямо контроли. Поради това не е целесъобразно да се изисква ANOVA F-тест за значимост преди да се използват тестовете на Дънет или на Уйлямс, нито тест на Кръскал-Уолис за значимост, преди да се използва тест на Йонкхере-Терпстра, тест на Ман-Уитни или тест на Дън (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). Тестът на Дънет има вградена настройка за множествени сравнения и използването на F-теста като референтен се отразява неблагоприятно на неговите неверни положителни и неверни отрицателни резултати. По подобен начин, тестовете на Уйлямс със стъпка назад и на Йонкхере-Терпстра, като се използва 0,05 ниво на значимост при всяка стъпка, запазват общо 5 % неверни положителни резултати и използването на F-теста или теста на Кръскал-Уолис като референтен се отразява неблагоприятно на този процент и на мощността на теста. На тестовете на Ман-Уитни и на Дън трябва да се направи корекция за множественост, като се препоръчва корекцията на Бонферони-Холм. Задълбочено обсъждане за повечето от препоръките за тестване на хипотези и проверка на допусканията, на които се основават тези тестове, се съдържа в OECD (2006), който съдържа също и обширна библиография. Третиране на контролите при използване на разтворител Ако се използва разтворител, следва да бъдат включени както контрола на вода за разреждане, така и контрола на разтворител. Двете контроли следва да се сравняват за всеки отклик и да се обединят за статистическия анализ, ако не се установи значима разлика между контролите. В противен случай за определянето на NOEC или за оценката на ECx следва да се използва контролата на разтворител, а контролата на вода за разреждане не се използва. Вж. ограничение в критериите за валидност (точка 7) За дължина, тегло, дял на излюпени хайверни зърна или смъртност при ларви, или ларви с аномалии, и първи или последен ден на излюпване или изплуване следва да се използва T-тест или тест на Ман-Уитни за сравняване на контролата на вода за разреждане с контролата на разтворител, при 0,05 ниво на значимост, като се игнорират всички третирани групи. Резултатите от тези тестове следва да се протоколират. Размери (дължина и тегло) Стойностите на дължината и теглото на отделната риба могат да са с нормално или log-нормално разпределение. Във всички случаи средните стойности от повторение като тенденция са с нормално разпределение по силата на централната гранична теорема и както е потвърдено от данни от над 100 изследвания, отнасящи се до влияние върху ранни стадии от жизнения цикъл за три сладководни вида. Като алтернатива, когато данните или базите данни за предходни периоди предполагат log-нормално разпределение за стойностите на дължината на отделната риба, могат да се изчислят логаритмите на средните стойности от повторение за отделната риба и след това данните за анализа могат да бъдат антилогаритмите на тези логаритми на средните стойности от повторение. Данните следва да бъдат оценени за съвместимост с нормалното разпределение и хомогенност на дисперсията. За тази цел следва да се използват остатъците от ANOVA модел, с концентрацията като единствена независима променлива. За визуално определяне могат да бъдат използвани диаграми на разсейване и хистограми или диаграми „стъбло с листа“. Като алтернатива може да се използва формален тест, като тестовете на Шапиро-Уилк или на Андерсън-Дарлинг. Съгласуваността с хомогенност на дисперсията може да бъде оценена визуално чрез оглед на същата диаграма на разсейване, или формално с теста на Левин. Оценката за нормалност и хомогенност на дисперсията е необходима само за параметрични тестове (напр. на Уйлямс, Дънет). Следва да се обърне внимание на евентуални стойности, силно различаващи се от нормалните, и тяхното въздействие върху анализа. Могат да бъдат използвани тестът на Тюки за стойности, силно различаващи се от нормалните, и визуална инспекция на същите графики на остатъците, описани по-горе. Следва да се припомни, че наблюденията представляват цели повторения, поради което изпускане на стойности, силно различаващи се от нормалните, следва да се извършва само след внимателно разглеждане. Статистическите тестове, които се възползват от характеристиките на плана на опита и очакванията от биологична гледна точка, са трендовите тестове със стъпка назад, като тест на Уйлямс и тест на Йонкхере-Терпстра. Тези тестове допускат монотонна концентрация-отклик и данните трябва да бъдат оценени за съвместимост с това допускане. Това може да бъде направено визуално от диаграма на разсейване на средните от изпитване спрямо изпитваната концентрация. От полза ще е припокриването на тази диаграма на разсейване със сегментирана линейна диаграма, която свързва средните стойности на концентрацията, претеглени с размера на пробата от повторението. Голямо отклонение на тази сегментирана линейна диаграма от монотонността сочи възможна необходимост от използване на тестове, различни от трендовите. Като алтернатива могат да се използват формални тестове. Прост формален тест представлява да се изчислят линейните и квадратните контрасти на концентрационните средни. Ако квадратният контраст е значим, а линейният контраст не е значим, това е показател за възможен проблем, свързан с монотонността, който следва да бъде допълнително оценен от диаграми. Когато нормалността и хомогенността на дисперсията може да представляват проблем, тези контрасти могат да бъдат построени от данни, трансформирани чрез подреждане по рангова скала. Може да се използват алтернативни процедури, като например теста на Бартоломю за монотонността, но те увеличават сложността. Фигура 2 Схема за NOEC — размери (дължина и тегло) Освен ако данните не са съгласувани с допусканията за тези тестове, NOEC се определя чрез прилагане със стъпка назад на тест на Уйлямс или на тест на Йонкхере-Терпстра. OECD (2006) дава подробна информация за тези процедури. За данните, които не са в съответствие с изискванията за трендов тест със стъпка назад, може да се използва тест на Дънет или тест на Тамхане-Дънет (T3), като и двата имат вградена корекция за множественост. Тези тестове допускат нормалност, в случая с теста на Дънет — хомогенност на дисперсията. Когато тези условия не са изпълнени, може да бъде използван непараметричният тест на Дън. OECD (2006) съдържа подробна информация за всички тези тестове. Фигура 2 дава обзор как да се избере тест. Излюпване на хайверните зърна и преживяване на ларвите Данните са делът на излюпените хайверни зърна или на ларвите, които преживяват в отделните повторения. Тези дялове трябва да бъдат оценени за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, която се среща често, но не е универсална при такива измервания. Схемата във фигура 3 е насока за избор на тест; вж. текста за подробни описания. Обикновено се използват два теста. Това са C(α)-тестът на Тарон (Tarone, 1979) и хи-квадрат тестовете, всеки от тях се прилага поотделно за всяка изпитвана концентрация. Ако дори само в една изпитвана концентрация се установи дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, следва да се използват методи, които са съобразени с това. Формула 1 C(α)-тест на Тарон (Tarone, 1979) където ̂ е средният дял за дадена концентрация, m е броят на съдовете с повторения, nj е броят на субектите в повторение j, а xj е броят на представляващите отклик субекти в това повторение, например неизлюпените или мъртвите. Този тест се прилага поотделно за всяка изпитвана концентрация. Този тест може да се разглежда като коригиран хи-квадрат тест, но ограниченото симулиране на мощността, извършено от Тарон, показа че той е с по-голяма мощност от тази на хи-квадрат теста. Фигура 3 Схема за NOEC — излюпени хайверни зърна и смъртност при ларви Когато няма значими доказателства за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, може да се използва тестът на Кокрън-Армитидж със стъпка назад. Този тест игнорира повторенията, поради което, когато съществуват такива доказателства, се препоръчва корекцията на Рао-Скот на теста на Кокрън-Армитидж (RSCA), която отчита повторенията, размерите при повторенията и дисперсията, по-голяма от очакваната при биномно разпределение. Алтернативни тестове са тестовете на Уйлямс със стъпка назад и на Йонкхере-Терпстра и тестът на Дънет, както е описан във връзка с измерването на размери. Тези тестове се прилагат независимо от това дали има или няма дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, но са с малко по-малка мощност (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). Първи или последен ден на излюпване или изплуване Откликът е цяло число, даващо деня от изпитването, в който се наблюдава посоченото наблюдение за даден съд с повторение. Диапазонът от стойности като цяло е доста ограничен и често има висок процент на свързани стойности, напр. еди и същ първи ден на излюпване се наблюдава във всички контролни повторения и, може би, в една или две ниски концентрации на изпитване. Параметрични тестове, като тези на Уйлямс и на Дънет, не са подходящи за такива данни. Освен в случаите, когато има доказателства за сериозна немонотонност, тестът на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад е с голяма мощност за откриване на въздействия на изпитвания химикал. В противен случай може да бъде използван тест на Дън. Аномалии на ларви Откликът е броят на ларвите с някакви аномалии. Често този отклик е рядко срещан и има някои от същите проблеми като първия ден на излюпване, като също така понякога показва колебания концентрация-отклик. Ако данните поне приблизително следват монотонна концентрационна форма, тестът на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад е мощен при откриване на въздействия. В противен случай може да бъде използван тест на Дън. ПОЗОВАВАНИЯ Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) — A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) — A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. Допълнение 6 СТАТИСТИЧЕСКИ НАСОКИ ЗА ОЦЕНКИ ОТ РЕГРЕСИЯ Общи положения Наблюденията, използвани за изглаждане на модел, са средните стойности от повторение (дължина и тегло) или дяловете в повторение ( излюпени хайверни зърна и смъртност при ларви) (OECD 2006). Обикновено се препоръчва използването на претеглена регресия с тегло размерът на извадката от повторението. Възможни са други схеми за претегляне, като претегляне от прогнозна средна стойност на отклика, или комбинация от това и размера на извадката от повторението. Претегляне чрез реципрочната стойност на дисперсията в извадката при определена концентрация не се препоръчва (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Всяка трансформация на отклиците преди анализа следва да запази независимостта на наблюденията и ECх и нейните доверителни граници следва да бъдат изразени в оригиналните мерни единици, а не в преобразувани единици. Например, 20 % изменение в логаритъма на дължината не е еквивалентно на 20 % изменение в дължината (Lyles et al. 2008, Draper and Smith 1999). Схемата във фигура 4 представя преглед на оценките на ECx. Подробностите са описани в текста по-долу. Фигура 4 Схема за оценка на ECx за средна дължина, средно тегло или дял на излюпени хайверни зърна или смъртност от повторение, вж. текста за повече подробности Съображения относно излюпени хайверни зърна и смъртност при ларви При излюпените хайверни зърна и смъртността при ларви като цяло най-добро е изглаждането с модел с намаляване, освен ако не се изглажда с probit модел, както е описано по-долу. Т.е. следва да се моделира делът на хайверните зърна, които не се излюпват, или ларвите, които умират. Причината за това е, че ECx означава концентрация, при която е налице изменение, равно на х % от средната стойност на отклика в контролата. Ако в контролата има 5 % хайверни зърна, които не се излюпват, и се моделира липсата на излюпване, тогава ЕС20 означава концентрация, при която е налице изменение, равно на 20 % от 5-те % хайверни зърна в контролата, които не се излюпват, и това е изменение от 0,2*0,05=0,01, или 1 процентен пункт, до 6 % хайверни зърна, които не се излюпват. Такова малко изменение не може да бъде оценено по никакъв смислен начин от наличните данни и не е с важно биологично значение. Докато ако се моделира делът на излюпените хайверни зърна, делът между контролите ще бъде 95 % в този пример и 20 % намаление от средната стойност в контролите би било изменение на 0,95*0,2=0,18, т.е. от 95 % излюпени на 77 % (= 95-18) излюпени и концентрацията, водеща до такова въздействие, може да бъде оценена и е вероятно да е от по-голям интерес. Това не е въпрос с измерванията на размера, въпреки че неблагоприятните въздействия върху размера по принцип означават намаляване на размера. Модели за размер (дължина или тегло) и процент на излюпване или преживяване на ларвите. С изключение на хорметичния модел на Brain-Cousеns, всички тези модели са описани и препоръчвани в OECD (2006). Т.нар. ОИСР 2-5 също се обсъждат при опити за екотоксичност в Slob (2002). Съществуват, разбира се, много други модели, които биха могли да бъдат полезни. В Bunke et al. (1999) са изброени множество модели, които не са включени тук, и са дадени многобройни препратки към други модели. Изброените по-долу се предлагат като особено подходящи и широко използвани при опити за екотоксичност. С 5 концентрации на изпитване, плюс контрола — Bruce-Versteeg — Обикновен експоненциален (ОИСР 2) — Експоненциален с параметър, определящ формата (ОИСР 3) — Обикновен експоненциален с долна граница (ОИСР 4) С 6 концентрации на изпитване, плюс контрола — Експоненциален с параметър, определящ формата, и долна граница (ОИСР 5) — Michaelis-Menten — Hill Когато има видими следи от хормезис (малко вероятно при процента на излюпване или преживяването на ларвите, но понякога се наблюдава при наблюденията на размерите) — хорметичен Brain-Cousеns; Brain and Cousens (1989) Алтернативни модели за процента на неизлюпване и смъртността на ларвите — Моделите с увеличаване за тези отклици могат да бъдат пригодени чрез probit (или логистични) модели, ако липсват доказателства за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, и честотата в контролите е оценена в пригодността на модела. Това не е предпочитаният метод, тъй като той третира индивида, а не повторението, като единица за анализ (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Съответствие (goodness of fit) на единствен модел — Визуално се сравняват наблюдаваното и прогнозираното процентно намаление при всяка изпитвана концентрация (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper and Smith 1999). — Сравнява се средният квадрат на грешката от регресията със средния квадрат на чистата грешка, с помощта на F-тест (Draper and Smith 1999). — Проверява се дали всички компоненти на модел се различават значимо от нула (т.е. определя се дали всички компоненти на модела са важни (Motulsky and Christopoulos 2004). — Точки с остатъците от регресията спрямо изпитваната концентрация, евентуално върху скала log(конц.). Не следва да има никакъв модел за тази диаграма; точките следва да бъдат случайно разпръснати около хоризонтална линия на височина нула. — Данните трябва да бъдат оценени за нормалност и хомогенност на дисперсията по същия начин, както е посочено в допълнение 5. — Освен това нормалността на остатъците в регресионния модел следва да бъде оценена, като се използват същите методи, посочени в допълнение 5 за остатъците от ANOVA Сравняване на модели — Използват се коригираните информационни критерии на Акайке (AICc). По-малките стойности на AICc означават по-добра съгласуваност и ако AICc(B)-AICc(A)≥10, модел A почти със сигурност е по-добър от модел B (Motulsky and Christopoulos (2004). — Двата модела се сравняват визуално по отношение на тяхната степен на изпълнение на горепосочените критерии за единствен модел. — Препоръчва се прилагането на принципа на простотата, съгласно който се използва най-простият модел, който се съгласува сравнително добре с данните (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008). Качество на оценката на ECx Доверителният интервал (CI) за ECx следва да не бъде прекомерно широк. Необходима е статистическа преценка при вземането на решение за това колко широк може да е доверителния интервал, така че стойността ECx да запази полезността си. Симулации на регресионни модели, съгласувани с данни за излюпването на хайверни зърна и за размерите показват, че около 75 % от доверителните интервали за ECx (x = 10, 20 или 30) обхващат не повече от две концентрации на изпитване. Това дава общи насоки относно какво е приемливо, и практически насоки относно какво е постижимо. Много автори твърдят, че е необходимо да се протоколират доверителните интервали за всички параметри на модела, и че широките доверителни интервали за параметрите на модела показват неприемливи модели (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). CI за ECx (или всеки друг параметър на модела) следва да не съдържа нула (Motulsky and Christopoulos 2004). В регресионните модели той е еквивалентен на минималната значима разлика, която често се посочва в подходите с тестване на хипотези (напр. Wang et al 2000). Той също така съответства на това доверителният интервал за средните отклици при LOEC да не съдържа средната стойност на контролата. Следва да се зададе въпросът дали оценките на параметъра са научно достоверни. Например ако доверителният интервал за y0 е ± 20 %, оценката за EC10 не е достоверна. Ако моделът предвижда 20 % въздействие при концентрация със стойност C и наблюдаваното максимално въздействие при тази и при по-ниски стойности на концентрацията е 10 %, тогава EC20 не е достоверна (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). ECx следва да не изисква екстраполация извън обхвата от положителни концентрации (Draper and Smith 1999, OECD 2006). Например, обща насока за стойността на ECx може да е, че тя не трябва превишава около 25 % под най-ниската изпитвана концентрация, или над най-високата изпитвана концентрация. ПОЗОВАВАНИЯ Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. В.48 Краткосрочно изследване на размножаването при риби ВЪВЕДЕНИЕ 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 229 (2012). Необходимостта от разработване и валидиране на изследване, позволяващо откриване на ендокринно активни химикали, произлиза от загрижеността, че нивата на химикали в околната среда могат да причинят неблагоприятни въздействия както за хората, така и за дивата флора и фауна, поради взаимодействието на тези химикали с ендокринната система. През 1998 г. ОИСР стартира с висок приоритет дейност по преразглеждане на съществуващите Насоки за изпитване и по разработване на нови Насоки за изпитване за скрининг и изпитвания за потенциални нарушители на функциите на ендокринната система. Един от елементите на дейността бе да се разработи насока за изпитване за скрининг на химикали, активни в ендокринната система на риби. Краткосрочното изследване на размножаването при риби премина през обширна програма за валидиране, състояща се от междулабораторни изследвания с подбрани химикали, за доказване уместността и надеждността на изследването за откриване на химикали, които оказват въздействие върху размножаването при риби чрез различни механизми, в това число ендокринни механизми (1, 2, 3, 4, 5). Всички крайни точки на насоките за изпитване на ОИСР са валидирани за Pimephales promelas, и поднабор от крайни точки е валидиран за японската оризия (т.е. вителогенин и вторични полови белези) и за зебровото данио (т.е. вителогенин). Работата по валидирането е преминала през партньорска проверка от група от експерти, назначени от националните координатори на Програмата на ОИСР за насоки за изпитване (6) частично, и от независима група експерти по поръчка на Американската агенция за защита на околната среда (29). Изследването не е предназначено за идентифициране на специфични механизми на хормонални нарушения, тъй като изпитваните животни имат интактна хипоталамус-хипофиза-гонадна ос (ХХГ ос), която може да реагира на химикали, оказващи въздействие върху ХХГ оста на различни равнища. 2. Настоящият метод за изпитване описва скринингово изследване in vivo, при което полово зрели мъжки и хвърлящи хайвер женски индивиди се държат заедно и се експонират на даден химикал през ограничена част от жизнения им цикъл (21 дни). При приключване на 21-дневния период на експозиция като крайни точки се измерват два биомаркера в мъжки и женски индивиди, в качеството им на показатели за ендокринна активност на изпитвания химикал; тези крайни точки са вителогенин и вторични полови белези. Вителогенин се измерва в Pimephales promelas, японска оризия и зеброво данио, докато вторични полови белези се измерват в Pimephales promelas и японска оризия. Освен това плодовитостта в количествено отношение се наблюдава ежедневно по време на изпитването. Гонадите също се запазват и хистопатологията може да бъде оценена за определяне на репродуктивното здраве на изпитваните животни и за увеличаване на тежестта на доказателствата от други крайни точки. 3. Това биологично изследване служи като скринингово изследване in vivo на репродукцията и неговото прилагане следва да се разглежда в контекста на „Концептуалната рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система“ (30). В тази концептуална рамка краткосрочното изследване на размножаването при риби е предложено в равнище 3 като изследване in vivo, предоставящо данни относно избран(и) ендокринен(ни) механизъм(и)/път(ища). ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ 4. Вителогенинът (VTG) обикновено се произвежда от черния дроб на женски яйценосни гръбначни животни в отговор на циркулиращия ендогенен естроген. Той е прекурсор на белтъците в яйчния жълтък и след образуването си в черния дроб преминава в кръвообращението, откъдето стига до яйчника и там се модифицира в образуващия се хайвер. Вителогенинът е почти неоткриваем в плазмата на незрели женски и мъжки риби поради липса на достатъчно циркулиращ естроген; черният дроб обаче може да синтезира и секретира VTG в отговор на външно естрогенно стимулиране. 5. Измерването на VTG служи за откриване на химикали с различни естрогенни механизми на действие. Откриването на химикали с естрогенно действие е възможно чрез измерване на индуцирането на VTG в мъжки риби, и е много добре документирано в научната литература, преминала през партньорска проверка (напр. (7)). Индуцирането на VTG е доказано и след експозиция на андрогени, които могат да се ароматизират (8, 9). Намаляването на равнището на циркулиращ естроген в женските животни, например посредством инхибиране на ароматазата, превръщаща ендогенния андроген в природния естроген 17β-естрадиол, води до намаляване на нивото на VTG, което се използва за откриване на химикали, притежаващи свойства на инхибитори по отношение на ароматазата (10, 11). Биологичната значимост на отговора с VTG след естрогенно/ароматазно инхибиране е установена и е широко документирана. Възможно е обаче образуването на VTG в женски животни да е също така повлияно от обща токсичност и начини на токсично действие, различни от ендокринните, напр. хепатотоксичност. 6. Успешно са разработени и стандартизирани за рутинна употреба няколко метода за измерване. Такъв е случаят със специфичните за отделните видове ензимно-свързани имуносорбентни анализи (ELISA), използващи имунохимия за количествено определяне на получавания VTG в малки проби от кръв или черен дроб, взети от отделните риби (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Проби за измерване на VTG се вземат от кръв от Pimephales promelas, кръв или хомогенат глава/опашка от зеброво данио и черен дроб от японска оризия. При японската оризия е налице добра корелация между VTG, измерен от кръв и от черен дроб (19). В допълнение 6 са дадени препоръчителните процедури за събирането на проби за анализ на VTG. Комплектите за измерване на VTG са широко разпространени; такива комплекти следва да се основават на валидиран специфичен за отделните видове ELISA метод. 7. Вторичните полови белези в мъжки екземпляри от някои видове риби са видими външно, количествено определяеми и чувствителни към нивата на циркулиращите ендогенни андрогени; такъв е случаят с Pimephales promelas и японската оризия, но не и със зебровото данио, което не притежава количествено определяеми вторични полови белези. Женските запазват способността си за развиване на мъжки вторични полови белези, когато са експонирани на андрогенни химикали във вода. В научната литература са на разположение няколко проучвания, документиращи този тип отговор в Pimephales promelas (20) и японската оризия (21). Намаляването при вторични полови белези у мъжките индивиди следва да се тълкува внимателно поради неголямата статистическата мощност, и следва да се основава на експертна оценка и на тежестта на доказателствата. Съществуват ограничения за използването на зебровото данио в настоящото изследване поради липсата на количествено определяеми вторични полови белези, реагиращи на андрогенно активни химикали. 8. При Pimephales promelas основният показател за външна андрогенна експозиция е броят на размножителните туберкули, разположени по муцуната на женския индивид. При оризията броят на папиларните израстъци представлява основният маркер на екзогенна експозиция на андрогенни химикали при женските риби. Допълнение 5А и допълнение 5Б посочват препоръчваните процедури, които трябва да се спазват при оценката на половите белези съответно при Pimephales promelas и оризията. 9. 21-дневното изследване на риби включва количествена оценка на получаването на хайверни зърна и запазване на гонадите за незадължително хистопатологично изследване. Някои регулаторни органи могат да изискват тази допълнителна крайна точка за по-пълна оценка на репродуктивното здраве на изпитваните животни, или в случаи, когато при VTG и вторичните полови характеристики не е имало отклик на експозицията на химикала. Въпреки че някои крайни точки могат да са с висока диагностична стойност (напр. индуциране на VTG в мъжки и образуване на туберкули в женски), не всички крайни точки (напр. плодовитост и гонадна хистопатология) в изследването са предназначени за недвусмислено идентифициране на специфични клетъчни механизми на действие. Обратно, наборът от крайни точки, взети заедно, позволява да се правят изводи по отношение на възможни ендокринни смущения и по този начин да се предоставят насоки за по-нататъшно изпитване. Въпреки че не е ендокринно специфична, плодовитостта, поради нейната доказана чувствителност към известните ендокринно активни химикали (5), е важна крайна точка за включване, тъй като когато тя и други крайни точки не са повлияни, това дава по-голяма увереност, че дадено съеднинение е малко вероятно да е ендокринно активно. Въпреки това, когато е засегната, плодовитостта ще допринесе значително за изводите по отношение на тежестта на доказателствата. Насоки за тълкуване на данните и приемането на резултатите от изпитването са предоставени по-нататък в настоящия метод за изпитване. 10. Определенията, използвани за този метод за изпитване, са дадени в Допълнение 1. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 11. В рамките на изследването мъжки и женски риби, способни на размножаване, се експонират заедно в съдове за изпитване. Техният статус на полово зрели и способни на размножаване индивиди позволява ясното разграничаване на половете и следователно дава възможност за свързан с пола анализ на всяка крайна точка, и гарантира тяхната чувствителност към външни химикали. При завършване на изпитването полът се потвърждава с макроскопско изследване на гонадите след отваряне на корема с ножици. Преглед на съответните условия на биологичното изследване е даден в допълнение 2. Изследването обикновено започва с риби, пробовзети от популация, която е в състояние на хвърляне на хайвер; застаряващи индивиди не следва да се използват. Указания относно възрастта на рибите и репродуктивния им статус са дадени в раздела за подбора на риби. Изпитването се провежда, като се използват три концентрации на експозиция на химикал, както и контрола на вода и, ако е необходимо, контрола на разтворител. За зебровото данио се използват два съда или повторения на третиране (всеки съд съдържа 5 мъжки и 5 женски). За Pimephales promelas се използват четири съда или повторения на третиране (всеки съд съдържа 2 мъжки и 4 женски). Това е така с цел приспособяване към териториалното поведение на мъжките при Pimephales promelas, като се поддържа достатъчна мощност на изследването. За оризията се използват четири съда или повторения на третиране (всеки съд съдържа 3 мъжки и 3 женски). Експозицията се провежда в продължение на 21 дни и вземане на проби от риби се извършва на 21-ия ден от експозицията. Плодовитостта в количествено отношение се наблюдава ежедневно. 12. При вземането на проби на 21-ия ден от експозицията животните се умъртвяват по хуманен начин. Вторичните полови белези се измерват при Pimephales promelas и японската оризия (виж допълнение 5А и допълнение 5Б); кръвни проби за определяне на VTG се вземат от зебровото данио и Pimephales promelas, като алтернатива хомогенат глава/опашка може да се вземе от зебровото данио за определяне на VTG (допълнение 6); черен дроб за анализа на VTG се взема от оризията (допълнение 6). Гонадите се фиксират или цели, или след дисекция, за евентуална хистопатологична оценка (22). КРИТЕРИИ ЗА ПРИЕМАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО 13. За да са приемливи резултатите от изпитването, се прилагат следните условия: — смъртността в контролите на вода (или на разтворител) не трябва да надвишава 10 % в края на периода на експозиция; — концентрацията на разтворен кислород трябва да бъде най-малко 60 от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух (ASV) по време на периода на експозиция; — температурата на водата трябва да се различава с не повече от ± 1,5 °C между съдовете за изпитване по всяко време на периода на експозиция, и се поддържа в диапазон от 2 °C в рамките на температурните диапазони, посочени за изпитваните видове (допълнение 2). — следва да бъдат на разположение доказателства, че концентрацията на изпитвания химикал в разтвора е била задоволително поддържана в рамките на ± 20 % от усреднените измерени стойности; — доказателства, че рибата активно хвърля хайвер във всички повторения преди да започне експозицията на химикала, и в повторенията с контроли по време на изпитването. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Апаратура 14. Обикновено лабораторно оборудване и специално следното: а. устройства за измерване на съдържанието на кислород и рН-метри; б. оборудване за определяне твърдост и алкалност на водата; в. подходяща апаратура за контрол на температурата и за предпочитане продължителен мониторинг; г. съдове, направени от химически инертни материали и с подходящ капацитет по отношение на препоръчителната гъстота на зареждане и отглеждане (вж. допълнение 2); д. субстрат за хвърляне на хайвер за Pimephales promelas и зебровото данио, допълнение 4 съдържа необходимите подробности; е. подходящи точни везни (т.е. точност до ± 0,5 mg). Вода 15. Всяка вода, в която изпитваният вид показва съответните признаци за дългосрочно преживяване и растеж, може да се използва като вода за изпитването. Необходимо е постоянно качество на водата по време на изпитването. Стойността на рН на водата следва да е от 6,5 до 8,5, но по време на дадено изпитване трябва да е в диапазон ± 0,5 рН единици. За да се гарантира, че водата за разреждане няма да повлияе неправилно върху резултата от изпитването (например чрез образуване на комплекс с изпитвания химикал), пробите за анализ следва да се вземат на интервали. Следва да се правят измервания за тежки метали (например Cu, Pb, Zn, Hg, Cd и Ni), основни аниони и катиони (например Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– и SO4 2–), пестициди (например общо органофосфорни и общо органохлорни пестициди), общ органичен въглерод и суспендирани частици, например на всеки три месеца, когато се знае, че водата за разреждане има относително постоянно качество. Ако е доказано, че качеството на водата е постоянно най-малко в продължение на една година, определянията могат да се правят по-рядко и могат да се увеличат интервалите (например на всеки шест месеца). Някои от химичните характеристики на приемливата вода за разреждане са изброени в допълнение 3. Разтвори за изпитване 16. Разтворите за изпитване при избраните концентрации се приготвят чрез разреждане на изходен разтвор. Изходният разтвор се приготвя за предпочитане чрез просто смесване и разбъркване на изпитвания химикал във водата за разреждане с помощта на механични средства (например разклащане или ултрасонификация). За постигане на подходящо концентриран изходен разтвор могат да се използват колони за насищане (колони за разтворимост). Използването на разтворител за носител не е препоръчително. Независимо от това, в случай че е необходим разтворител, успоредно следва да се проведе изпитване на контрола на разтворител, при същата концентрация на разтворител, като тази при третиранията с химикала. За трудно разтворими изпитвани химикали е възможно разтворителят да бъде технически най-доброто решение; следва да се консултира Ръководството на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (23). Изборът на разтворител се определя в зависимост от химичните свойства на веществото или сместа. Ръководството на ОИСР препоръчва максимум от 100μl/l, което следва да се спазва. Независимо от това неотдавнашен преглед (24) подчерта допълнителни проблеми при използването на разтворители за изпитване на ендокринна активност. Поради това се препоръчва концентрацията на разтворителя, ако е необходим, да бъде сведена до минимум, когато това е технически осъществимо (в зависимост от физичните и химичните свойства на изпитвания химикал). 17. Използва се проточна система за изпитване. Такава система постоянно подава и разрежда изходен разтвор на изпитвания химикал (например система с измерваща помпа, пропорционално разреждащо устройство, сатуратор), за да се подават серии от концентрации към камерите за изпитване. Параметрите на потока на изходния разтвор и водата за разреждане следва да се проверяват на интервали, за предпочитане всеки ден по време на извършването на изпитването, и през това време не следва да се променят с повече от 10 %. Трябва внимателно да се избягва използването на нискокачествени пластмасови тръби или други материали, които могат да съдържат биологично активни химикали. При избора на материали за проточната система трябва да бъде взета под внимание възможна адсорбция на изпитвания химикал върху този материал. Отглеждане на рибата 18. Рибата за изпитването следва да се избира от лабораторна популация, за предпочитане от един и същ рибен запас, която е била аклиматизирана в продължение на поне две седмици преди изпитването, при условия, свързани с качеството на водата и осветлението, подобни на тези, използвани при изпитването. Важно е скоростта на зареждане и гъстотата на отглеждане (за определения, виж допълнение 1) да са подходящи за използваните за изпитването видове (вж. допълнение 2). 19. След 48-часов период на свикване се отчита смъртността и се прилагат следните критерии: — при смъртност, по-голяма от 10 % от популацията за седем дни: отхвърля се цялата партида; — при смъртност между 5 % и 10 % от популацията: аклиматизация за нови седем дни; ако смъртността е повече от 5 % през вторите седем дни, се отхвърля цялата партида; — при смъртност по-малко от 5 % от популацията за седем дни: партидата се приема. 20. По време на аклиматизационния период, в периода преди експозицията или по време на периода на експозиция рибата не следва да бъде лекувана от заболявания. Период преди експозицията и подбор на риби 21. Препоръчва се едноседмичен до двуседмичен период преди експозицията, в който животните се поставят в съдове, подобни на съдовете при действителното изпитване. Рибите следва да бъдат хранени ad libitum през време на периода на отглеждане и по време на фазата на експозиция. Фазата на експозиция започва с полово диморфни възрастни риби от лабораторна доставка на зрели животни, способни на размножение (напр. с ясно видими вторични полови белези що се отнася до Pimephales promelas и японската оризия) и активно хвърлящи хайвер. Само за общ ориентир (и без да се разглежда изолирано от наблюдаването на настоящия репродуктивен статус на дадена партида от риби), Pimephales promelas трябва да бъде на възраст приблизително 20 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 25 ± 2 °C през жизнения им цикъл. Японската оризия трябва да бъде на възраст приблизително 16 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 25 ± 2 °C през жизнения им цикъл. Зебровото данио трябва да бъде на възраст приблизително 16 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 26 ± 2 °C през жизнения им цикъл. Получаването на хайверни зърна следва да се оценява ежедневно по време на фазата преди експозицията. Препоръчва се хвърлянето на хайвера да се наблюдава във всички съдове с повторения преди включване във фазата на експозиция от изследването. На този етап не могат да бъдат дадени количествени насоки относно желателното ежедневно получаване на хайверни зърна, но е сравнително обичайно да се наблюдава средно хвърляне на > 10 хайверни зърна/женска/ден за всеки вид. Следва да се използва рандомизиран блоков план в съответствие с получените хайверни зърна, за разпределяне в повторенията на различните опитни равнища, за да се осигури балансирано разпределение при повторенията. ПЛАНИРАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО 22. Използват се три концентрации на изпитвания химикал, една контрола (вода) и, ако е необходимо, една контрола на разтворител. Данните могат да бъдат анализирани, за да се определят статистически значими разлики между отклиците в третиранията и контролите. Тези анализи ще дадат информация дали вместо за употреба при оценка на риска, не се изисква по-нататъшно по-дългосрочно изпитване за неблагоприятни последици (а именно преживяване, развитие, растеж и размножение) (25). 23. За зебровото данио, в ден 21 на опита се пробовземат мъжки и женски животни от всяко ниво на третиране (5 мъжки и 5 женски животни във всяко от двете повторения) и от контролата(ите), за измерване на VTG. За оризията, в ден 21 на опита се пробовземат мъжки и женски животни от всяко ниво на третиране (3 мъжки и 3 женски животни във всяко от четирите повторения) и от контролата(ите), за измерване на VTG и вторични полови белези. За Pimephales promelas в ден 21 на опита се пробовземат мъжки и женски животни (2 мъжки и 4 женски животни във всяко от четирите повторения) и от контролата(ите), за измерване на VTG и вторични полови белези. Изисква се количествена оценка на плодовитостта, и гонадните тъкани се фиксират изцяло или им се извършва дисекция за евентуална хистопатологичната оценка, ако се изисква. Избор на концентрации на изпитване 24. За целите на това изпитване най-високата изпитвана концентрация трябва да се определя от максимално поносимата концентрация (МПК), определена при изпитване за определяне на обхвата, или от други данни за токсичност, или 10 mg/l, или максималната разтворимост във вода, в зависимост от това коя е най-ниска. МПК се определя като най-високата изпитвана концентрация на химикала, която води до по-малко от 10 % смъртност. При използването на този подход се допуска, че са налице емпирични данни за смъртността от остра и друга токсичност, от които може да се оцени МПК. Оценката на МПК може да бъде неточна и обикновено се изисква определена професионална преценка. 25. Изискват се три изпитвани концентрации, раздалечени на равни интервали една от друга с кратност, която не надвишава 10, и контрола на вода за разреждане (както и контрола на разтворител, ако е необходимо). Препоръчва се раздалечаване с кратност между 3,2 и 10. ПРОЦЕДУРА Подбор и измерване теглото на изпитваните риби 26. Важно е варирането в теглото на рибите в началото на изпитването да се сведе до минимум. Подходящи диапазони на размерите за различните видове, които се препоръчват за използване в настоящото изпитване, са дадени в допълнение 2. За цялата партида от риби, използвани в изпитването, стойностите на индивидуалните тегла в началото на изпитването следва да се запазят в ± 20 % от средноаритметичното тегло на рибите от същия пол. Препоръчва се да се измерва и теглото на подпроба от рибния запас преди изпитването с цел да се оцени средното тегло. Условия на експозиция Продължителност 27. Продължителността на изпитването е 21 дни, след период преди експозицията. Препоръчаният период преди експозицията е една до две седмици. Хранене 28. Рибите следва да бъдат хранени ad libitum с подходяща храна (допълнение 2) в достатъчно количество за поддържане на телесното състояние. Следва да се полагат грижи за избягване на развитието на микроби и на помътняване на водата. Като обща насока дневната порция може да бъде разделена на две или три равни части за многократно ежедневно хранене, с поне три часа между всяко хранене. Еднократна по-голяма порция е приемлива, особено за съботите и неделите. Даването на храна се прекратява 12 часа преди пробовземането/аутопсията. 29. Храната за риби следва да бъде оценявана за наличието на замърсители, като например органохлорни пестициди, полициклични ароматни въглеводороди (PAH), полихлорирани бифенили (PCB). Храна с повишени нива на фитоестрогени, които биха нарушили отклика при изследването с познати естрогенни агонисти (напр. 17b-естрадиол), следва да се избягва. 30. Неконсумираната храна и фекалните отпадъци следва да се отстраняват от съдовете за изпитване най-малко два пъти седмично, напр. чрез внимателно почистване на дъното на всеки съд, с използване на сифон. Светлина и температура 31. Продължителността на излагане на светлина и температурата на водата следва да са подходящи за изпитваните видове (допълнение 2). Честота на аналитичните определяния и измервания 32. Преди започване на периода на експозиция следва да бъде гарантирано правилното функциониране на системата за доставяне на химикала. Всички необходими методи за анализ следва да бъдат установени, включително с достатъчно информация за стабилността на химикала в системата за изпитване. По време на изпитването концентрациите на изпитвания химикал се определят през постоянни интервали, както следва: дебитът на водата за разреждане и на изходния разтвор на токсичния химикал следва да се проверяват, за предпочитане ежедневно, но като минимум два пъти седмично и през време на изпитването не следва да се променят с повече от 10 %. Препоръчва се действителните концентрации на изпитвания химикал да се измерват във всички съдове в началото на изпитването и след това на интервали от една седмица. 33. Препоръчва се резултатите да се основават на измерени концентрации. Обаче ако концентрацията на изпитвания химикал в разтвора е поддържана на задоволително ниво в рамките на ± 20 % от номиналната концентрация по време на изпитването, тогава резултатите могат да се основават или на номиналната, или на измерената стойност. 34. Възможно е да се наложи филтруване (напр. с използване на отвори с размер 0,45 μm) или центрофугиране на пробите. Ако е необходимо, центрофугирането се препоръчва като процедура. Обаче в случай че изпитваният материал не се адсорбира върху филтрите, филтруването също може да е приемливо. 35. По време на изпитването разтвореният кислород, температурата и рН следва да бъдат измервани във всеки съд за изпитване най-малко веднъж седмично. Общата твърдост и алкалността следва да се измерват в контролите и в един съд с най-висока концентрация най-малко веднъж седмично. За предпочитане е температурата да се наблюдава непрекъснато най-малко в един съд за изпитване. Наблюдения 36. По време на изследването или при приключването му се оценяват редица общи (напр. преживяване) и биологични отклици (напр. нива на VTG). Изисква се ежедневно наблюдаване на плодовитостта в количествено отношение. Измерването и оценката на тези крайни точки и ползата от тях са описани по-долу. Преживяване 37. Рибите следва да се преглеждат всеки ден през периода на изпитването и всякаква смъртност следва да се записва, а мъртвите екземпляри да се отстраняват колкото е възможно по-бързо. Мъртвите риби не следва да се заменят нито в съдовете с контроли, нито в съдове за третиране. Полът на рибите, които умират по време на изпитването, трябва да се определи чрез макроскопска оценка на гонадите. Поведение и външен вид 38. Всяко необичайно поведение (в сравнение с контролите) трябва да бъде отбелязвано; това може да включва признаци на обща токсичност, включително хипервентилация, некоординирано плуване, загуба на равновесие, и нетипично състояние на покой или нетипично поведение при хранене. Освен това следва да бъдат отбелязвани и външните аномалии (като кръвоизлив, обезцветяване). Такива признаци на токсичност следва да се разглеждат внимателно при интерпретирането на данните, тъй като те могат да сочат концентрации, при които биомаркерите за ендокринна активност не са надеждни. Такива наблюдения на поведението могат също да предоставят полезна качествена информация за потенциалните бъдещи изисквания за изпитвания на риби. Така например, териториалната агресивност при нормални мъжки или при женски, придобили мъжки вторични полови белези, е наблюдавана при Pimephales promelas при андрогенна експозиция; при зебровото данио характерното поведение при чифтосване и хвърляне на хайвера, проявяващо се непосредствено след изгрев, се ограничава или се възпрепятства от естрогенна или антиандрогенна експозиция. 39. Тъй като някои аспекти на външния вид (предимно цветът) могат да се променят бързо при боравенето, важно е качествените наблюдения да бъдат извършени преди отстраняването на животните от системата за изпитване. От досегашния опит с Pimephales promelas се предполага, че някои ендокринно активни химикали може първоначално да предизвикат промени в следните външни характеристики: оцветяване на тялото (светло или тъмно), начини на оцветяване (наличие на вертикални ленти) и форма на тялото (главата и гръдната област). Поради това наблюденията на външния вид на рибите следва да бъдат правени по време на изпитването и при приключване на изследването Плодовитост 40. Ежедневните количествени наблюдения на хвърлянето на хайвера следва да се записват на основа повторение. Получените хайверни зърна следва да бъдат записвани като брой хайверни зърна/преживяла женска/ден на основа повторение. Хайверните зърна ще бъдат отстранявани ежедневно от камерите за изпитване. Субстратите за хвърляне на хайвер трябва да се поставят в камерата за изпитване за Pimephales promelas и зебровото данио, за да се даде възможност на рибите да хвърлят хайвера си в нормални условия. В допълнение 4 се дават допълнителни подробности за препоръчителни субстрати за хвърляне на хайвер за зебровото данио (приложение 4А) и Pimephales promelas (приложение 4Б). Не се счита за необходимо да се предоставя субстрат за хвърляне на хайвер на оризията. Умъртвяване на риби по хуманен начин 41. На ден 21, т.е. при приключване на експозицията, рибите следва да бъдат подложени на евтаназия с подходящи количества трикаин (трикаинов метансулфонат, метакаин, MS-222 (CAS 886-86-2), 100-500 mg/l буфериран с 300 mg/l NaHCO3 (натриев хидрогенкарбонат, CAS 144-55-8), за да се намали дразненето на мукозните мембрани; след това се вземат проби от кръв или тъкани за определяне на VTG, както е обяснено в раздела за VTG. Наблюдение на вторични полови белези 42. Някои химикали с активно действие върху ендокринната система могат да предизвикат промени в специализирани вторични полови белези (брой размножителни туберкули при мъжки Pimephales promelas, брой на папиларните израстъци при оризията от мъжки пол). Следва да се отбележи, че химикали с определени начини на действие могат да са причина за анормална проява на вторични полови белези при животни от противоположния пол; например агонисти на андрогенните рецептори като например тренболон, метилтестостерон и дихидротестостерон, могат да предизвикат поява на подчертано развити размножителни туберкули у женски Pimephales promelas, или развитие на папиларни израстъци при оризията от женски пол (11, 20, 21). Протоколирано е също, че агонисти на естрогенните рецептори могат да намалят броя на размножителните туберкули и размера на дорзалните отлагания на колаген при полово зрели мъжки индивиди от Pimephales promelas (26, 27). Такива макроскопски наблюдения на морфологията могат да предоставят полезна качествена и количествена информация за потенциалните бъдещи изисквания за изпитвания на риби. Броят и размерът на размножителните туберкули при Pimephales promelas и папиларните израстъци при оризията могат да бъдат количествено определени директно или, по-практично, в консервирани екземпляри. Препоръчваните процедури за оценка на вторични полови белези при Pimephales promelas и при оризията са на разположение съответно в допълнение 5А и допълнение 5Б. Вителогенин (VTG) 43. Пробовземането на кръв се извършва от опашната артерия/вена с хепаринизирана микрокапилярка за хематокрит или, като алтернативен вариант, чрез сърдечна пункция със спринцовка. В зависимост от размера на рибата обемът на кръвта за пробовземане обикновено варира между 5 и 60 μl на индивид за Pimephales promelas и 5-15 μl на индивид за зеброво данио. Плазмата се отделя от кръвта чрез центрофугиране и се съхранява с протеазни инхибитори при – 80 °C до анализа за вителогенин. Като алтернатива, при оризията се използва черният дроб, а при зебровото данио като източник на тъкан за определяне на VTG може да се използва хомогенат глава/опашка (допълнение 6). Измерването на VTG следва да се основава на валидиран хомоложен ELISA метод, като се използва хомоложен VTG стандарт и хомоложни антитела. Препоръчва се използването на метод, който позволява да се открият нива VTG от порядъка на няколко ng/ml плазма (или ng/mg тъкан), което е фоновото ниво при неекспонирани мъжки риби. 44. Контролът на качеството на анализа на VTG се извършва чрез използването на еталони, празни проби и анализи с най-малко две повторения. За всеки ELISA метод следва да се проведе изпитване за матричен ефект (ефект на разреждане на пробата), за да се определи минималният коефициент на разреждане на пробата. Всяка ELISA плака, използвана за изследвания на VTG, следва да включва следните проби за контрол на качеството: най-малко 6 еталона за калибриране, покриващи диапазона от очаквани концентрации на VTG, и поне една празна проба за изследване за неспецифично свързване (анализ в две повторения). абсорбцията при тези празни проби следва да е по-малко от 5 % от максималната абсорбция на еталона за калибриране. Следва да се анализират най-малко две аликвотни части (две повторения в отделни гнезда) от всяко разреждане на проба. Повторенията в отделни гнезда, които се различават с повече от 20 %, следва да бъдат анализирани повторно. 45. Коефициентът на корелация (R2) за калибрационните криви трябва да бъде по-голям от 0,99. Независимо от това, високата корелация не е достатъчна, за да гарантира адекватна прогноза за концентрацията във всички диапазони. В допълнение към достатъчно високата степен на корелация за калибрационната крива, концентрацията на всеки еталон, както е изчислена от калибрационната крива, следва да попада между 70 и 120 % от неговата номинална концентрация. В случай, че трендът на номиналните концентрации се отдалечава от тренда на регресионната линия (напр. при по-ниски концентрации), може да е необходимо калибрационната крива да се раздели на ниски и високи диапазони, или да се използва нелинеен модел за подходящо изглаждане на данните от абсорбцията. Ако кривата е раздвоена, и двата линейни участъка следва да са с R2 > 0,99. 46. Границата на откриване (LOD) се определя като границата, под която концентрацията е твърде ниска за откриване на веществото, а границата на количествено определяне (LOQ) се определя като границата, под която концентрацията е твърде ниска за откриване на веществото, умножена по най-ниската кратност на разреждане. 47. Всеки ден, в който се извършват изследвания за VTG, се анализира проба с внесена добавка с използване на еталон, който е референтен между различни изследвания (допълнение 7). Отношението на очакваната концентрация към измерената концентрация се протоколира заедно с резултатите от всеки набор от изследвания от този ден. Оценка на гонадната хистопатология 48. Извършването на гонадна хистопатология може да се изисква от регулаторните органи за проучване на прицелния орган по оста ХХГ след експозиция на химикали. В тази връзка гонадите се фиксират или in situ, или им се прави дисекция. Когато се изисква хистопатология, при оценката на ендокринна активност на изпитвания химикал се търсят специфични ендокринно-свързани отклици при гонадите. Тези диагностични отклици по същество включват наличието на тестикулни ооцити, хиперплазия на Лайдиговите клетки, намалено образуване на жълтък, увеличени сперматогонии и перифоликуларна хиперплазия. Други увреждания на гонадите, като атрезия на ооцити, дегенерация на тестисите и изменения на стадии, могат да имат различни причини. В документа с насоки за хистопатологията на гонадите за риби се определят процедури, които ще бъдат използвани в дисекцията, фиксирането, разрязването и хистопатологичната оценка на гонадите (22). ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Оценка на отклиците на биомаркерите чрез дисперсионен анализ (ANOVA) 49. За идентифициране на потенциална активност на даден химикал се сравняват отклиците между третираните и контролните групи с помощта на дисперсионен анализ (ANOVA). Когато се използва контрола на разтворител, за всяка крайна точка следва да се приложи подходящ статистически тест между контролите на вода за разреждане и на разтворител. Насоки за работата с данните за контролите на вода за разреждане и на разтворител при последващия статистически анализ могат да се намерят в източник OECD, 2006c (28). Всички биологични данни, свързани с отклици, следва да се анализират и протоколират отделно по пол. Ако изискваните допускания за използване на параметричен метод не са изпълнени — не е налице нормалност на разпределението (например тест на Шапиро-Уилк) или дисперсията е хетерогенна (тест на Бартлет или тест на Левин), преди извършването на ANOVA следва да се разгледа трансформиране на данните с оглед хомогенизиране на дисперсията,