31998L0057



ДИРЕКТИВА 98/57/ЕО НА СЪВЕТА

от 20 юли 1998 година

за контрол на Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et.al.

СЪВЕТЪТ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ,

като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност, и по-специално член 43 от него,

като взе предвид предложението на Комисията (1),

като взе предвид становището на Европейския парламент (2),

като взе предвид становището на Икономическия и социален комитет (3),

като има предвид, че патогенният организъм Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. преди е бил известен като Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; като има предвид, че Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. вероятно ще стане общоприето наименование на този организъм; като има предвид, че настоящата директива следва да вземе под внимание това развитие в науката;

като има предвид, че производството на картофи и домати заема важно място в селското стопанство на Общността; като има предвид, че добивът на картофи и домати е постоянно застрашен от вредители;

като има предвид, че чрез предпазване на картофените и доматени култури от вредители, не само ще се запази производствения капацитет, но ще се повиши и производителността в селското стопанство;

като има предвид, че защитните мерки за предотвратяване внасянето на вредители на територията на държавите-членки биха имали само ограничен ефект, ако такива организми не се контролират едновременно и методично навсякъде в Общността и не се предотвратява тяхното разпространение;

като има предвид, че един от вредителите по картофите и доматите е Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., патогенът на кафявото гниене по картофите и на бактериалното изсъхване по картофите и доматите; като има предвид, че в някои части на Общността възникнаха огнища на заболяване, причинено от този патогенен агент и все още съществуват някои ограничени източници на инфекция;

като има предвид, че съществува значителен риск за отглеждането на картофи и домати навсякъде в Общността, ако не се вземат ефективни мерки по отношение на тези култури за да се установи местонахождението на този организъм и да се определи разпространението му, да се предотврати появата и разпространението му, а в случай че бъде открит, да се предотврати разпространението му и да се осъществи контрол с цел унищожаването му;

като има предвид, че с цел да се постигне това, трябва да бъдат взети определени мерки в рамките на Общността; като има предвид, че в допълнение държавите-членки трябва да могат, при необходимост, да предприемат допълнителни или по-строги мерки, при условие че не се възпрепятства движението на картофи или домати в рамките на Общността, с изключение на случаите, посочени в Директива 77/93/ЕИО на Съвета от 21 декември 1976 г. относно защитните мерки срещу въвеждане в Общността на организми, вредни за растенията или растителните продукти и срещу тяхното разпространение в рамките на Общността (4); като има предвид, че другите държави-членки и Комисията трябва да бъдат уведомени за тези мерки;

като има предвид, че мерките трябва да бъдат съобразени с необходимостта от провеждане на систематични официални обследвания за да се установи местонахождението на патогена; като има предвид, че такива обследвания следва да включват процедури за инспектиране и, при необходимост, като се има предвид, че при определени условия на околната среда заболяването може да остане латентно и незабелязано както при развиващите се картофени култури, така и при съхраняваните картофени клубени, процедури по вземане на проби и извършване на тестове; като има предвид, че разпространението на патогена сред развиващите се култури не е най-важният фактор, но имайки предвид, че патогенът може да се разпространява чрез надземните води и някои сродни диви картофени растения, и по тази причина напояването на картофените и доматените култури чрез използване на замърсена вода изглежда поставя риск от инфектиране на тези култури; като има предвид, че патогенът може да преживее зимата в саморасли картофени и доматени растения, които могат да бъдат източник на инфекция, която се пренася във всеки следващ сезон; като има предвид, че патогенът се разпространява също чрез замърсяване на картофи при контакт с инфектирани картофи и чрез контакт със съоръженията за засаждане, прибиране на реколтата и обработка или чрез контейнерите за транспорт и съхранение, които са били замърсени с организма при предишен контакт с инфектирани картофи;

като има предвид, че разпространението на патогена може да бъде намалено или предотвратено чрез обеззаразяването на тези обекти, като има предвид, че всяко такова замърсяване на картофите за семе поставя значителен риск от разпространението на патогена; по същия начин латентната инфекция при картофите за семе поставя значителен риск от разпространението на патогена и това може да бъде предотвратено чрез използването на картофи за семе, произведени по официално одобрена програма, съгласно която картофите за семе са изследвани и е констатирано, че не носят инфекцията;

като има предвид, че сегашните познания по отношение биологията и епидемиологията на Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. в условията на Европа са непълни и се очаква, че в рамките на няколко сезона ще е необходимо преразглеждане на предложените мерки; също така се очакват подобрения в процедурите по извършване на тестове, като се има предвид по-нататъшната изследователска работа, особено по отношение на чувствителността и специфичността на тест методите, с цел да се изберат и стандартизират оптимални валидни тест методи;

като има предвид, че за определяне на подробностите на такива общи мерки, както и на по-стриктните или допълнителни мерки, взети от държавите-членки, за да се предотврати внасяне на патогена на тяхна територия, е желателно държавите-членки да осъществяват тясно сътрудничество с Комисията в рамките на Постоянния фитосанитарен комитет(наричан по-нататък „Комитетът“),

ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:

Член 1

Настоящата директива се отнася до мерките, които ще се вземат в рамките на държавите-членки срещу Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., преди известен като Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (наричан по-нататък „организмът“), с цел, по отношение на растенията-гостоприемници за организма, изброени в приложение I, раздел 1, (наричани по-нататък „изброеният растителен материал“) да:

Член 2

1. Държавите-членки провеждат ежегодни систематични официални обследвания за организма върху изброения растителен материал, произхождащ от тяхната територия. С цел да се открият други възможни източници на замърсяване, представляващи заплаха за производството на изброения растителен материал, държавите-членки извършват оценка на риска и, освен ако при оценката не е установен риск от разпространение на организма, провеждат в районите на производство на изброения растителен материал, контролни официални обследвания за организма върху растения, различни от изброения растителен материал, включително диви картофени растения-гостоприемници, както и на повърхностните води, които се използват за напояване или пръскане на изброения растителен материал и на отпадъчните води, отделяни от предприятията за промишлена преработка или пакетиране, в които се обработва изброеният растителен материал, и които се използват за напояване или пръскане на изброения растителен материал. Обхватът на тези контролни обследвания се определя съгласно установения риск. Държавите-членки могат също така да извършват официални обследвания за организма върху материали, като среди за отглеждане, почва и твърди отпадъци от предприятията за промишлената преработка или пакетиране.

2. Официалните обследвания, предвидени в параграф 1, се извършват:

Допълнителните подробности за тези обследвания по отношение на процедурите на инспектиране и броя, произхода, напластяването и времето за вземане на проби се решават от отговорните официални органи, по смисъла на Директива 77/93/ЕИО на базата на обосновани научни и статистически принципи и биологията на организма, като се вземат под внимание специфичните системи за производство на изброения растителен материал в заинтересованата държава-членка и, при необходимост, на други растения-гостоприемници за организма.

3. Останалите държави-членки и Комисията се уведомяват за подробностите и резултатите от официалните обследвания, предвидени в параграф 1, всяка година, в съответствие с разпоредбите на точка 2 от раздел II, приложение I. Тези уведомявания се предоставят до 1 юни, освен относно използването на картофите, запазени във фермата за семе, за които уведомяването се предоставя до 1 септември. Подробностите и резултатите за културите се отнасят за продукцията от предходната година. Подробностите от тези уведомявания може да се предоставят на Комитета.

4. Приема се следната разпоредба в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

5. Могат да бъдат приети следните разпоредби в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

Член 3

Държавите-членки вземат мерки, така че техните собствени отговорни официални органи да получават информация за предполагаема поява или потвърдено наличие на организма на тяхната територия.

Член 4

1. Във всеки случай на предполагаема поява, отговорните официални органи на засегнатите държави-членки осигуряват извършване на официално или под официален надзор лабораторно изследване, като за изброения растителен материал използват съответния метод, определен в приложение II и в съответствие с условията, посочени в точка 1 от приложение III, или, във всички останали случаи, който и да е друг официално одобрен метод, с цел да се потвърди или отхвърли предполагаемото наличие. В случай на потвърждаване се прилагат изискванията, посочени в точка 2 от приложение III.

2. До потвърждаване или отхвърляне на предполагаема поява, съгласно параграф 1, във всеки случай на предполагаема поява, в който:

отговорните официални органи на държавите-членки, във връзка със собственото си производство:

3. В тези случаи на предполагаема поява, при която има риск от замърсяване на изброения растителен материал или надземните води от или към друга/и държава/и-членка/и, държавата-членка, в която е докладвано за предполагаемата поява, незабавно уведомява другите засегнати държави-членки, съобразно установения риск, за подробностите относно посочената предполагаема поява и се осъществява подходящо сътрудничество между посочените държави-членки. Уведомените държави-членки въвеждат предохранителни мерки в съответствие с параграф 2, буква в) и, при необходимост, предприемат по-нататъшни действия, съгласно параграфи 1 и 2.

4. Могат да бъдат приети следните разпоредби в съответствие с процедурата, предвидена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

Член 5

1. Ако в резултат на официално или извършено под официален надзор лабораторно изследване, използващо за изброения растителен материал определения в приложение II метод, или, във всички останали случаи, който и да е друг официално одобрен метод, се потвърди наличие на организма в проба, взета съгласно настоящата директива, тогава отговорните официални органи на държавата-членка, като вземат предвид обоснованите научни принципи, биологията на организма и специфичните системи на производство, пускане на пазара и обработка на растенията-гостоприемници за организма в тази държава-членка:

2. Държавите-членки незабавно уведомяват останалите държави-членки и Комисията, в съответствие с разпоредбите на точка 3 от приложение V, за всяко замърсяване, обявено съгласно параграфи 1, буква а), ii) и 1 буква в), ii) и за подробностите относно разграничаването на зоната, съгласно параграф 1, буква в), iv) и, при необходимост, съгласно параграф 1, буква в), iii). Подробностите от тези уведомявания могат да се предоставят на Комитета.

Държавите-членки в същото време предоставят на Комисията допълнителното известие, посочено в точка 4 от приложение V. Подробностите от известието по тази алинея незабавно се предоставят на членовете на Комитета.

3. В резултат на известието по параграф 2 и посочените там елементи, други държави-членки, които са изброени в известието, започват разследване съгласно параграф 1, буква а), i) и, при необходимост, по параграф 1, буква в), i) и предприемат по целесъобразност по-нататъшни действия в съответствие с параграфи 1 и 2.

Член 6

1. Държавите-членки постановяват, че този изброен растителен материал, обявен като замърсен по член 5, параграф 1, буква а), i), не може да се засажда и, под контрола и одобрението на техните отговорни официални органи, е предмет на една от разпоредбите в точка 1 от приложение VI, така че да се гарантира липсата на риск от разпространение на организма.

2. Държавите-членки постановяват, че този изброен растителен материал, определен като вероятно замърсен съгласно член 5, параграф 1, буква а), iii) и в), iii), включително изброения растителен материал, за който е установен риск и който е произведен на места, определени като вероятно замърсени по член 5, параграф 1, буква а), iii), не може да се засажда и, под контрола на техните отговорни официални органи, е подходящо оползотворен или ликвидиран, в съответствие с предвиденото в точка 2 от приложение VI, така че да не се установява съществуването на риск от разпространение на организма.

3. Държавите-членки постановяват, че всички машини, превозни средства, съдове, складове или участъци от тях и всички други предмети, включително опаковъчен материал, обозначени като замърсени по член 5, параграф 1, буква а), ii) или определени като вероятно замърсени по член 5, параграф 1, буква а), iii) и в), iii), трябва да бъдат или унищожени или обеззаразени чрез използване на подходящи методи, в съответствие с предвиденото в точка 3 от приложение VI. След обеззаразяване всички тези предмети не се считат вече за замърсени.

4. Без да се засягат мерките, предприети съгласно параграфи 1, 2 и 3, държавите-членки постановяват, че в зоната, разграничена съгласно член 5, параграф 1, буква а), iv) и в), iii), трябва да бъде изпълнена серия от мерки, в съответствие с предвиденото в точки 4.1 и 4.2 от приложение VI. Останалите държави-членки и Комисията се уведомяват ежегодно за подробностите във връзка с тези мерки. Подробностите от това известие могат да бъдат предоставени на Комитета.

Член 7

1. Държавите-членки постановяват, че картофите за семе трябва да отговарят на изискванията от Директива 77/93/ЕИО и да са добити по пряка линия от картофен материал, получен съгласно официално одобрена програма, за който е констатирано, че няма наличие на организма чрез официално изследване или чрез такова, извършено под официален надзор с използване на съответния метод, определен в приложение II.

Посоченото изследване се извършва от държава-членка:

2. Следните разпоредби могат да бъдат приети в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

Член 8

Държавите-членки забраняват притежаването и извършването на манипулации с организма.

Член 9

Без да се засягат разпоредбите на Директива 77/93/ЕИО, държавите-членки могат да разрешат дерогации от мерките, посочени в членове 6 и 8 от настоящата директива, в съответствие с разпоредбите, определени в Директива 95/44/ЕО (5) за експериментални или научни цели и за работа върху селекция на нови сортове.

Член 10

Държавите-членки могат да приемат, във връзка със собственото си производство, такива допълнителни или по-строги мерки, каквито може да са необходими за борба срещу организма или за да се предотврати неговото разпространение, доколкото те са в съответствие с разпоредбите на Директива 77/93/ЕИО.

Подробностите за прилагане на тези мерки се нотифицират на другите държави-членки и на Комисията. Комитетът може да бъде сезиран за условията и реда на това нотифициране.

Член 11

Изменения на приложенията към настоящата директива, изготвени съобразно развитието в научното и техническото познание, се приемат в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО. По отношение на методите, определени в приложение II и по отношение на мерките в параграфи 4.1 и 4.2 от приложение VI към настоящата директива, Комисията изготвя доклад за преразглеждане на тези методи и мерки на базата на натрупания опит, като докладът се предоставя на Комитета преди 1 януари 2002 г.

Член 12

1. Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими за да се съобразят с настоящата директива, преди 21 август 1999 г. Те незабавно информират Комисията за това.

Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позоваване се определят от държавите-членки.

2. Държавите-членки съобщават незабавно на Комисията текста на основните разпоредби от националното законодателство, които те приемат в областта, уредена с настоящата директива. Комисията информира останалите държави-членки за тези разпоредби.

Член 13

Настоящата директива влиза в сила в деня на публикуването ѝ в Официален вестник на Европейските общности.

Член 14

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.

(1) ОВ С 124, 21.4.1997 г., стр. 12, и

ОВ С 108, 7.4.1998 г., стр. 85.

(2) ОВ С 14, 19.1.1998 г., стр. 34.

(3) ОВ С 206, 7.7.1997 г., стр. 57.

(4) ОВ L 26, 31.1.1977 г., стр. 20. Директива, последно изменена с Директива 98/2/ЕО на Комисията (ОВ L 15, 21.1.1998 г., стр. 34).

(5) ОВ L 184, 3.8.1995 г., стр. 34. Директива, последно изменена с Директива 97/46/ЕО на Комисията (ОВ L 204, 31.7.1997 г., стр. 43).

ПРИЛОЖЕНИЕ I

РАЗДЕЛ I

Списък на растения-гостоприемници за Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., посочен в член 1

РАЗДЕЛ II

Обследвания

1. Официалните обследвания, посочени в член 2, параграф 2, буква а) се основават върху биологията на организма и специфичните системи на производство в засегнатата държава-членка и включват:

2. Известяването на официалните обследвания, посочени в член 2, параграф 3 включва:

ПРИЛОЖЕНИЕ II

СХЕМА ЗА ИЗПИТВАНЕ ЗА ДИАГНОСТИЦИРАНЕ, ОТКРИВАНЕ И ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL

ОБХВАТ НА ТЕСТ СХЕМАТА

Представената схема описва различните процедури, включени в:

В допълненията са дадени подробности относно подготовката на материалите за теста, т. е. среда на култивиране, буфери, разтвори, реактиви.

СЪДЪРЖАНИЕ:

1. Диагностициране на кафяво гниене по картофени клубени и на бактериално изсъхване по картофени и доматени растения…

2. Откриване и идентифициране на Ralstonia solanacearum в проби от картофени клубени…

1. Симптоми…

2. Бърз/и скринингов/и тест/ове

3. Процедура по изолиране

4. Тест/ове за доказване

1. Подготовка на пробите за изследване…

2. Имунофлуоресцентен тест (IF)

3. Тест с ензимно-свързан имуно-сорбентен анализ (ELISA)

4. Тест с верижно-полимеразна реакция (PCR™)

5. Тест в селективни блюда…

6. Биологичен тест

7. Обогатителни тестове

8. Тест за патогенност

Литература

РАЗДЕЛ I

ПРИЛАГАНЕ НА ТЕСТ СХЕМАТА

1. Диагностициране на кафяво гниене по картофените клубени и на бактериално изсъхване по картофени и доматени растения

Процедурата по тестването е предназначена за картофени клубени с характерни или предполагаеми симптоми на кафяво гниене и за картофени и доматени растения с характерни или предполагаеми симптоми на бактериално изсъхване. Тя включва бърз скринингов тест, изолиране на патогена от инфектираната васкуларна тъкан върху диагностични среди и в случай, че се получи положителен резултат, идентифициране на културата като Ralstonia solanacearum.

Представяне във вид на диаграма

Забележки по диаграмата:

2. Откриване и идентифициране на Ralstonia solanacearum в проби от картофени клубени

Процедурата е предназначена за откриване на латентна инфекция при картофени клубени чрез един, или за предпочитане, повече скринингови тестове, които, в случай че дадат положителен резултат, се допълват от изолиране на патогена; последвано от идентифициране на чиста култура Ralstonia solanacearum, в случай на изолиране на типични колонии.

Представяне във вид на диаграма

Забележки по диаграмата:

IF тест има предимството, че морфологията на клетъчното оцветяване и интензитета на флуоресценцията, които дават информация за специфичността на реакцията, се тълкуват субективно. Често се срещат кръстосани реакции със серологично сходни бактерии от почвата или свързани с картофени тъкани, чиито клетки имат морфологията на Ralstonia solanacearum. IF тестът може да бъде използван като единствен скринингов тест, въпреки че в случай на предполагаема кръстосана реакция, трябва да се направи допълнителен скринингов тест основан на различен биологичен принцип. В такива случаи най-подходящ е тестът в селективни блюда.

РАЗДЕЛ II

Диагностициране на кафяво гниене по картофени клубени и на бактериално изсъхване по картофени и доматени растения

1. Симптоми

1.1 Симптоми при картофите

Картофеното растение. Ранният стадий на инфекцията се характеризира с изсъхване на листата към върха на растението при високи температури през деня и възстановяване през нощта. Изсъхването бързо става необратимо и в резултат растението умира. Васкуларната тъкан в напречно прерязани стебла от изсъхнали растения може да стане кафява, а от разрезната повърхност да се отделя или да бъде лесно изцедена чрез притискане подобна на мляко течност. Когато прерязано стебло се постави вертикално във вода от проводящите снопчета се отделят нишки слуз.

Картофеният клубен. Картофените клубени трябва да се прережат напречно близо до края на столона. Ранният стадий на инфекцията се характеризира с прозрачно жълто до светлокафяво обезцветяване на проводящия пръстен, от който спонтанно след няколко минути или след като се приложи лек натиск с палците върху обвивката близо до разрезната повърхност се отделя бледокремава течност. Впоследствие обезцветяването на проводящата тъкан става по-силно кафяво и некрозата може да се разпространи в паренхимната тъкан. В напреднали стадии инфекцията се разпространява навън от края на столона и очите, което може да доведе до появата на червеникаво-кафяви, леко вдлъбнати изменения по обвивката, от които може да се отделят капки съдържащи бактерии, предизвиквайки слепване на почвените частици.

1.2 Симптоми при доматите

Доматено растение. Първият явен симптом е отпуснат вид на по-младите листа. При благоприятни за патогена условия на околната среда (температура на почвата около 25 °С и висока влажност) до няколко дни настъпва епинастия и изсъхване на едната страна или на цялото растение, което води до загиване на растението. При по-неблагоприятни условия (температура на почвата под 21 °С) върху стеблото може да се развият голям брой добавъчни корени. Възможно е да се забележи размекната връв по дължина на стеблото, което е доказателство за некротизиране на васкуларната система. Когато стеблото се пререже на кръст, обезцветените кафяви васкуларни тъкани на стеблото отделят капки бяла или жълтеникава течност, съдържаща бактерии.

2. Бързи скринингови тестове

Бързите скринингови тестове улесняват предварителната диагноза. Използват се един или повече от следните тестове:

Тест за изтечения от стеблото

Наличието на Ralstonia solanacearum в изсъхващи стебла от картоф или домат може да се определи чрез следния елементарен предварителен тест:

Стеблото се прерязва точно над почвената повърхност. Прерязаната повърхност се поставя в мензура с вода. След кратко време от проводящите снопчета спонтанно започват да се отделят нишки от слуз, съдържаща бактерии. Никоя друга бактерия, която причинява инфекция на проводящата тъкан при картофени или доматени растения, не показва този феномен.

Откриване на гранули от поли-β-хидроксибутират (ПХБ)

Гранулите ПХБ в клетките на Ralstonia solanacearum стават видими след боядисване с нилско синьо А или със суданово черно Б.

Приготвя се намазка от течността или суспендираната тъкан върху предметно стъкло или намазка от 48-часова култура върху YPGA или SPA. (допълнение 1) Приготвят се положителни контролни намазки от щам биовариант2/раса 3 и ако счетете за полезно, отрицателна контролна намазка от хетероложен щам. Оставя се да изсъхне. Долната повърхност на предметното стъкло се прекарва няколко пъти бързо през пламъка докато намазката се фиксира.

Тест с нилско синьо

Наблюдава се за светло-оранжева флуоресценция от гранули ПХБ. Също така се наблюдава при обикновена светлина, за да се провери дали гранулите са вътреклетъчни и дали морфологията на клетките е типична за Ralstonia solanacearum.

Тест със суданово черно

Други тестове

Други подходящи скринингови изпитвания са IF тест (раздел III.2), ELISA тестът (раздел III. 3), и PCR тестът (раздел III.4).

3. Процедура по изолиране

3.1 Отстранява се течността или участъците с обезцветена тъкан от проводящия пръстен в картофения клубен или от проводящите нишки в стеблото от картофените или доматени растения. Суспендира се в малко количество стерилна дестилирана вода или 50 mM фосфатен буфер и се оставя 5—10 минути върху масата.

3.2 Извършва се поредица от десетократни разреждания на суспензията, напр. 1/10 и 1/100 или повече, ако е необходимо.

3.3 Стандартно количество от суспензията и разрежданията се прехвърля върху обикновена хранителна среда (NA, YPGA и SPA, допълнение 1) и/или върху тетразолна среда на Келман (допълнение 1) и/или върху селективна среда SMSA (допълнение 7). Разстила се или се нанася на резки с подходяща техника за посявка от разтвор. При необходимост се извършват отделни посявки върху всяка използвана среда с разредена клетъчна суспензия от култура на вирулентен щам биовариант 2/раса 3 на Ralstonia solanacearum като положителна контрола.

3.4 Блюдата се инкубират три дни при 28 °С. Инкубирането може да продължи до шест дни, ако растежът е бавен, но колониите в блюда със SMSA често стават атипични и отмират.

Върху обикновените хранителни среди, вирулентните изолати от Ralstonia solanacearum развиват бисернобели, плоски, неправилни и разляти колонии, често с характерни извивки.

Върху тетразолна среда на Келман, типичните колонии на вирулентните изолати от Ralstonia solanacearum са кремави, плоски, неправилни и разляти с кървавочервени извивки в центъра. Авирулентните форми на Ralstonia solanacearum развиват маслоподобни тъмночервени колонии.

Върху SMSA среда, типичните колонии на вирулентните изолати от Ralstonia solanacearum са млечнобели, плоски, неправилни и разлети с кървавочервено оцветяване в центъра.

Авирулентните форми на Ralstonia solanacearum развиват по-слабо разлети колонии, които са изцяло розови до червени върху средата SMSA.

3.5 Пречисват се колониите с характерна морфология, чрез рекултивиране върху обикновена хранителна среда. Многократно рекултивиране трябва да се избягва, защото може да предизвика загуба на вирулентност.

4. Тест/ове за доказване

4.1 Идентифициране на Ralstonia solanacearum

Идентифицира се чиста култура от Ralstonia solanacearum, чрез поне една от следните процедури:

Хранителни и ензимни тестове

Забележка: Включват се подходящи контролни щамове при всеки използван тест.

Следните фенотипни качества на Ralstonia solanacearum присъстват или отсъстват при всички случаи:

Хранителните среди и методите са дадени в Lelliott & Stead (1987г.)

IF тест

Изготвя се суспензия с 106 клетки/ml от културата и контролния щам/ове. Провежда се поредица от двукратни разреждания на антисерума и се прилага процедурата за IF тест (раздел III.2). IF титрите за културата и положителната контрола трябва да бъдат равни.

Тест ELISA

Изготвя се суспензия с > 106 клетки/ml от културата и от контролния/те щам/ове и се прилага процедурата за ELISA теста. (раздел III.3). ELISA стойностите от теста за културата и положителната контрола трябва да бъдат равни.

Тест PCR

Изготвя се суспензия с 106 клетки/ml от културата и контролния/те щам/ове и се прилага процедурата за PCR теста (раздел III.4). Културата и положителната контрола трябва да имат един и същ размер на PCR продукта и еднаква структура при рестриктазно-ензимния анализ (REA).

Флуоресцентна in-situ хибридизация (FISH)

Изготвя се суспензия с 106 клетки/ml от културата и контролния щам/ове. При ага се процедурата за FISH (van Beuningen et al, 1995) с PCR праймер OLI-1 (Seal et al, 1993). Културата и положителната контрола трябва да дадат еднаква реакция.

Протеинов профил

Протеини от денатурирани цели клетки се разделят чрез електрофореза в полиакриламиден гел — PAGE (Stead, 1992a)

Мастнокиселинен профил (FAP)

Изготвя се посявка от културата и щам за положителна контрола върху соев агар и се инкубира 48 часа при 28 °С, след което се прилагапроцедурата за FAP. (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Профилът на културата трябва да бъде идентичен с този на положителната култура. При описаните условия, характерните мастни киселини са 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH и 18:1 2OH.

4.2 Определяне на щама

Определянето на щама не е задължително, но се препоръчва за всеки нов случай чрез използване на поне някое от следните:

Определяне на биоварианта

Ralstonia solanacearum се разделя на биоварианти въз основа на способността да произвежда киселина от три хексозни алкохола и три въглехидрата (Hayward, 1964 & 1994).

Допълнителни тестове разграничават биовариант 2 на субфенотипове (Hayward, 1994)

Определяне на расата

Расата (Buddenhagen et al., 1962) може да бъде определена въз основа на тест за патогенност в доматени растения или патладжани и в тютюневи растения и чрез тест за реакция на свръхчувствителност (HR) в тютюневи листа (Lozano и Sequeira, 1970):

Определянето на расата чрез теста за патогенност или теста за тютюнева свръхчувствителност може да не е много сигурно и вместо това за нея може да се съди по биоварианта и първоначалния естествен гостоприемник.

Освен това, културата може да бъде характеризирана чрез:

Молекулно разграничаване на щамове в комплекс от Ralstonia solanacearum може да се направи чрез:

PCR за серийни последователности [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995)]

4.3 Тест за патогенност

Тестът служи за потвърждаване на диагнозата и оценка на вирулентността на културите, идентифицирани като Ralstonia solanacearum.

Изготвя се ваксина с 106 клетки/ml от културата и щам служещ като положителна контрола. Заразяват се 5—10 доматени растения или патладжани на стадий трети същински лист, за предпочитане, или по-възрастни (раздел ΙΙΙ.6). Инкубира се до две седмици при 22 °С—28 °С и висока относителна влажност с ежедневно напояване. Наблюдава се за изсъхване и/или епинастия, хлороза, спиране на растежа.

Изолират се растения със симптоми, както следва:

РАЗДЕЛ III

ОТКРИВАНЕ И ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА RALSTONIA SOLANACEARUM В ПРОБИ ОТ КАРТОФЕНИ КЛУБЕНИ

Забележка: Стандартният размер на пробата е 200 клубена. Независимо от това, процедурата може да бъде приложена и за проби с по-малко от 200 клубена.

1. Подготовка на пробата за изследване

Забележка: Полученият при тази процедура гранулиран картофен екстракт може също да бъде използван за откриване на Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

При необходимост, преди теста:

1.1 С чист и дезинфекциран скалпел или нож за зеленчуци се отстранява обвивката при края на столона на клубена, така че първо да се видят васкуларните тъкани. Внимателно се изрязва малка конична сърцевина (диаметър 3—5 mm) от васкуларната тъкан при края на столона. Запазва се колкото може по-малко количество непроводяща тъкан. Всеки от клубените се обработва в пробата.

Забележка: Визуалният оглед на клубените (раздел II.1) може да се направи на този етап. Отделят се всички клубени със симптоми или напреднало гниене и се изследват отделно (раздел II).

1.2 Столоновите краища се събират в затворен съд. За предпочитане е столоновите краища да се обработят незабавно. Ако не е възможно, се схраняват ги за не повече от 24 часа или при 4 °С за не повече от 72 часа.

1.3 Столоновите краища се обработват по някоя от следните процедури:

1.4 Бактериите се извличат от обработените столоновите краища чрез някоя от следните процедури:

1.5 Суспендира се повторно гранулата в 1 ml буфер за гранули (допълнение 2).

Разделя се на две равни части и се прехвърля всяка в малко шишенце.

За изследване се използва едно шишенце. Запазва се остатъкът от този екстракт при 4 °С докато трае изследването.

Добавят се 10—25 % (обемно/обемен) стерилен глицерол към другото шишенце. Разклаща се кръгообразно и се съхранява при - 18 °С (седмици) или при - 70 °С (месеци).

2. Имунофлуоресцентен тест (IF)

Използва се антисерум за Ralstonia solanacearum, за предпочитане срещу раса 3/ биовариант 2. Титърът се определя върху суспензия от 106 клетки/ml от хомоложен щам на Ralstonia solanacearum с подходящо разреждане на флуоресцеин-изотиоцианатния (FITC) конюгат, в съответствие с препоръките на производителя. Непречистеният антисерум трябва да има титър поне 1:2 000.

Използват се многокладенчови предметни стъкла, за предпочитане с 10 прозорчета с диаметър най-малко 6 mm.

Контролът от FITC-конюгат се поставя върху всяко предметно стъкло. Тестът трябва да се повтори с включване на контрола от PBS, ако се наблюдават положително реагиращи клетки във FITC контролата.

Подготвят се отделни предметни стъкла с положителни контроли от суспензия с 106 клетки/ml от щам на подходяща раса/биовариант на Ralstonia solanacearum. Използва се едно предметно стъкло за всяка серия проби.

2.1 Предметните стъкла се подготвят с пробите по някоя от следните процедури:

2.2 Капчиците се оставят да изсъхнат. Бактериалните клетки се фиксират към предметното стъкло чрез загряване, на пламък или с 95 % етанол.

IF процедура

2.3.1 Предметните стъкла се подреждат върху влажна книжна салфетка.

Прозорчетата с пробите с разреждането (разрежданията) на антисерума се покриват. PBS върху прозорчетата се поставя FITC. Количеството на прибавения върху прозорчетата антисерум трябва да бъде еднакво с количеството на поставения екстракт.

2.3.2 Инкубира се под похлупак за 30 минути при стайна температура.

2.3.3 Изтръскват се капчиците антисерум от предметното стъкло и се изплакват внимателно в IF буфер. Промива се в IF-Твин-буфер за 5 минути и след това в IF буфер за 5 минути (допълнение 3). Внимателно се отстранява излишната влага.

2.3.4 Предметните стъкла се подреждат върху влажна филтърна хартия. Прозорчетата с пробите се покриват и прозорчето FITC с разтвора от FITC-конюгата, използван за определяне на титъра. Количеството на прибавения върху прозорчетата конюгат трябва да бъде еднакво с количеството на поставения антисерум.

2.3.5 Инкубира се под похлупак за 30 минути при стайна температура.

2.3.6 Изтръскват се капчиците конюгат от предметното стъкло. Изплакват се и се промиват както преди (2.3.3). Внимателно се отстранява излишната влага.

2.3.7 Отпипетират се 5—10 μl 0,1 М глицерол във фосфатен буфер (допълнение 3) или подобен обемозаместител върху всяко прозорче и поставете покривно стъкло.

2.4 Отчитане на IF тест

Предметните стъкла с пробите се разглеждат под епифлуоресцентен микроскоп с филтри подходящи за възбуждане на FITC под маслена имерсия и увеличение 500—1 000. Прозорчетата се преглеждат на кръст през два диаметъра, сключващи прав ъгъл и по периферията.

Проверява се първо предметното стъкло с положителната контрола. Клетките трябва да бъдат ярко флуоресцентни и напълно оцветени. Забележка: Тестът трябва да се повтори, ако оцветяването е нетипично.

Пробите се отчитат върху предметните стъкла. Наблюдава се първо за отсъствие на флуоресциращи клетки в прозорчетата с FITC-контролата. Флуоресциращи клетки в прозорчетата с FITC-контролата означават неспецифично свързване на конюгата, автофлуоресценция или замърсяване. Забележка: Ако това се наблюдава, тестът се повтаря.

Наблюдава се за ярко флуоресциращи клетки с характерна за Ralstonia solanacearum морфология в прозорчетата с пробите. Интензивността на флуоресценцията трябва да е еднаква с тази на щама, който служи за положителна контрола, при същото разреждане на антисерума. Клетките с непълно оцветяване или слаба флуоресценция не трябва да се вземат под внимание, освен ако няма много такива клетки (виж тълкуване на резултатите от IF тест).

Тълкуване на резултатите от IF тест:

3. ELISA тест

По Robinson-Smith et al, 1995

Използва се антисерум за Ralstonia solanacearum, за предпочитане срещу раса 3/ биовариант 2. Титърът се определя върху суспензия от 106 клетки/ml от хомоложен щам на Ralstonia solanacearum.

Препоръчва се използването на микротитърни плаки NUNC-Polysorb.

Включва се отрицателна контрола от картофен екстракт и контрола от физиологичен разтвор с фосфатен буфер (PBS).

Използва се суспензия с > 106 клетки/ml от щам на подходяща раса/биовариант на Ralstonia solanacearum като положителната контрола. Тества се по същия начин както пробата/ите, но добре отделени от пробите върху микротитърната плака.

3.1 Отпипетират се 100—200 μl от повторно суспендираната гранула в малко шишенце.

Загрява се 4 минути на 100 °С. Шишенцето се премества върху лед.

3.2 Добавя се същото количество покриващ карбонатен буфер с двойна сила (допълнение 5) и се разклаща кръгообразно.

3.3 Поставят по 100 μl във всяко от най-малко две кладенчета в микротитърната плака. Инкубира се 1 час при 37 °С или една нощ при 4 °С.

3.4 С лек удар се отделят екстрактите от кладенчетата. Кладенчетата се промиват три пъти с PBS-Твин (допълнение 5), като се задържа последният промиващ разтвор в кладенчетата най-малко пет минути.

3.5 Изготвят се съответните разреждания на антисерума срещу Ralstonia solanacearum в блокиращ буфер (допълнение 5). В кладенчетата се поставят 100 μl от разтвора на антисерума.

Инкубира се един час при 37 °С.

3.6 С лек удар се отделя антисерумът от кладенчетата. Кладенчетата се промиват както е указано по-горе (3.4).

3.7 Изготвят се съответните разреждания на алкално-фосфатазния конюгат в блокиращ буфер (допълнение 5) и в кладенчетата се поставят 100 μl от разтвора на конюгата.

Инкубира се един час при 37 °С.

3.8 С лек удар се отделя конюгатът от кладенчетатът. Кладенчетата се промиват, както е указано по-горе (3.4 и 3.6).

3.9 Изготвя се разтворът на алкално-фосфатазния субстрат (допълнение 5). В кладенчетата се поставят 100 μl. Инкубира се 30 минути до един час на тъмно при стайна температура.

3.10 Отчета се абсорбцията при 409 nm.

Тълкуване на ELISA теста:

ELISA тестът е отрицателен, ако оптичната плътност (OD) на пробата е < 2×OD на отрицателната контрола.

ELISA тестът е положителен, ако оптичната плътност (OD) на пробата е > 2×OD на отрицателната контрола.

4. PCR тест

По Seal et al., 1993

Забележка: По време на всички етапи от подготовката на пробите и други манипулации включващи PCR, трябва да се използват връхчета за пипети с филтри.

Изготвя се суспензия с 106 клетки/ml от щам на Ralstonia solanacearum раса 3/биовариант 2 като положителната контрола. Тества се по същия начин, както пробата/ите.

4.1 Отпипетират се 100 μl от повторно суспендираната гранула в малко шишенце или се прехвърлят 90 μl от повторно суспендираната гранула в малко шишенце, съдържащо 10 μl 0,5М NaOH. Разбърква се, като шишенцето се обръща многократно.

4.2 Загрява се 4 минути при 100 °С. Шишенцето се премества незабавно върху лед.

4.3 Изготвя се най-малко две десетократни разреждания, напр. 1/10 и 1/100 или повече, ако е необходимо, в стерилна дестилирана или свръхчиста вода (UPW).

4.4 Изготвя се сместа за реакцията PCR (допълнение 6) в стерилно шишенце, като се прибавят следните компоненти в следния ред:

За 50 μl обем на реакцията:

За повече реакции:

Изчислява се количеството на всеки компонент за необходимия брой реакции.

Компонентите се смесват и се прехвърлят 45 μl—48 μl от сместа в стерилни шишенца за PCR.

Шишенцата със сместа се съхраняват за PCR реакцията върху лед.

За 25 μl обем на реакцията:

Компонентите се намаляват пропорционално.

4.5 PCR увеличаване

4.5.1 По желание: Шишенцата със сварената проба и положителната контрола се центрофугират.

В указания ред, се прибавят 2—5 μl от пробата/ите, водна контрола и положителна контрола към шишенцата със сместа за PCR реакцията. Шишенцата се поставят в загряващия блок на ДНК-термосайклера.

4.5.2 Стартира се следната програма:

1 цикъл от:

i) 2 минути при 96 °С: денатурация на структурата;

50 цикъла от:

ii) 20 секунди при 94 °С: денатурация;

iii) 20 секунди при 68 °С: свързване на праймерите;

iv) 30 секунди при 72 °С: удължаване на копието;

1 цикъл от:

v) 10 минути при 72 °С: последващо удължаване;

1 цикъл от:

Забележка: Тези параметри са за Perkin Elmer 9600. Други термосайклери може да изискват слой от минерално масло в шишенцата за PCR реакцията и/или промяна в продължителността на стъпки ii), iii) и iv) и профилът за увеличаване.

4.5.3 Шишенцата се отстраняват от термосайклера. Анализира се PCR продуктът. Ако не се извърши незабавно, шишенцата се съхраняват при 4 °С, за употреба в същия ден или при – 18 °С за по-дълъг период.

Анализ на PCR продукта

PCR фрагментите се откриват чрез електрофореза в агарозен гел и оцветяване с етидиев бромид.

4.6.1 Подготвя се подходящ агарозен гел, като внимателно се загрява агарозата до завиране в трис-ацетат-електрофорезов (TAE) буфер.

4.6.2 Разтопената агароза се охлажда до 50—60 °С и се излива във формата на уреда за електрофореза и пъхнете гребена. Разтворът се оставя да се втвърди.

4.6.3 Отстранява се гребена. Гелът се потапя в трис-ацетат-електрофорезовия буфер, така че да се покрие (2—3 mm) с буфера.

4.6.4 Поставят се капчици по 3 μl от зареден буфер върху парафилм. Добавят се по 12 μl PCR продукт от пробите, от положителната или водната контрола и смесете чрез леко всмукване във върха на пипетата преди да заредите. Дадените обеми могат да бъдат променяни, в зависимост от вместимостта на кладенчетата в агарозния гел.

4.6.5 Зареждат се кладенчетата на гела. Като еталон се включва подходящ ДНК маркер в поне едно от кладенчетата.

4.6.6 Проводниците на електрическото захранване се свързват с уреда за електрофореза. Герът се стартира при 5—8 V/cm докато предната част на индикатора за проследяване достигне на 1 cm от края на гела.

4.6.7 Изключва се електрическото захранване и се разкачват проводниците от уреда за електрофореза.

Внимателно се отстранява гелът И се потапя в разтвор на етидиев бромид за 30—45 минути.

Забележка: Използват се ръкавици за еднократна употреба по време на работа с етидиев бромид, който е мощен мутаген!

4.6.8 Просветлява се в дестилирана вода за 10—15 минути.

4.6.9 Увеличените ДНК фрагмент/и се наблюдават при УВ осветление. PCR продуктът на Ralstonia solanacearum с комплект праймери OLI-1 и Y-2 е с дължина 288 bp. Сравнява се с ДНК маркера и с положителната контрола.

Забележка: Водната контрола трябва да е отрицателна при всички случаи. Ако е положителна, повторете теста.

4.6.10 Фотографира се гелът, ако се изисква постоянен регистър.

4.6.11 Достоверността на увеличените фрагменти се потвърждава чрез рестриктазно-ензимен анализ (REA).

Рестриктазно-ензимен анализ (REA)

4.7.1 Прехвърля се 8,5 μl от PCR продукта (4.5.3) в ново шишенце. Добавя се 1 μl от 10х ензимен буфер и 0,5 μl от рестриктазния ензим Ava II.

4.7.2 Смесва се чрез леко всмукване във върха на пипетата. Ако останат капки върху стените на шишенцето се обработва в микроцентрофуга. Инкубира се един час при 37 °С.

4.7.3 Разградените PCR фрагменти се анализират чрез електрофореза в агарозен гел както преди (4.6).

Тълкуване на резултатите от PCR теста:

PCR тестът е отрицателен, ако не се открие характерния 288 bp фрагмент, а фрагментът е открит в положителната контрола от щам на Ralstonia solanacearum.

PCR тестът е положителен, ако се открие 288 bp фрагмент и рестриктазно-ензимният анализ на увеличения фрагмент е идентичен с положителната контрола от щам на Ralstonia solanacearum.

5. Тест в селективни блюда

По Elphinstone et al., 1996

5.1 Тестът се провежда чрез подходящата техника за посявка от разреждания, напр.:

5.2 По същата техника за посявка от разреждания се нанася суспензия от 106 клетки/ml от вирулентен щам раса 3/биовариант 2 на Ralstonia solanacearum като положителна контрола върху серия от отделни модифицирани SMSA среди.

5.3 Посявките се инкубират при 28 °С. Посявките се отчитат след три дни. Ако са отрицателни се инкубират допълнително до шест дни. Колониите на вирулентните изолати от Ralstonia solanacearum са млечно-бели, плоски, неправилни и разлети с кървавочервено оцветяване в центъра и показващи резки или извивки във вътрешността.

5.4 Колониите с характерна морфология се пречистват чрез рекултивиране върху обикновени хранителни среди. (допълнение 1).

5.5 Идентифицират се чисти култури (раздел II.4.1) и се доказват култури на Ralstonia solanacearum чрез тест за патогенност (раздел II.4.3).

Тълкуване на резултатите от теста в селективни блюда:

Тестът в селективни блюда е отрицателен, ако след шест дни не се изолират никакви бактериални колонии или не се изолират никакви колонии, характерни за Ralstonia solanacearum, при условие че не се очаква инхибиране от колонии на други бактерии и колониите характерни за Ralstonia solanacearum се откриват в положителните контроли.

Тестът в селективни блюда е положителен, ако се изолират колонии, характерни за Ralstonia solanacearum.

6. Биологичен тест

По Janse, 1988.

6.1 Използват се 10 опитни растения от възприемчиви стръкчета домат или патладжан на стадий трети същински лист за всяка проба. Опитните растения не се поливат 24 часа преди заразяването.

6.2 Разпределят се 100 μl от повторно суспендираната топчица между опитните растения. Стеблата между котиледоните се заразяват и на едно или повече други места.

6.3 Заразяват се по същия начин 10 стръкчета със суспензия от 106 клетки/ml от вирулентен щам биовариант 2/раса 3 на Ralstonia solanacearum като положителна контрола и с буфер за гранули като отрицателна контрола. Растенията на положителната контрола се отделят от останалите растения за да се избегне кръстосаното замърсяване.

6.4 Опитните растения се отглеждат до четвъртата седмица при 22 °С—28 °С и висока относителна влажност с ежедневно поливане. Наблюдава се за изсъхване, епинастия, хлороза, и/или спиране на растежа.

6.5 Изолират се от заразените растения (раздел II). Идентифицират се чисти култури с характерна морфология (раздел II.4.1) и се потвърждават култури на Ralstonia solanacearum чрез тест за патогенност (раздел II.4.3).

6.6 Ако е необходимо се проверява за липса на инфекция в групи от опитни растения, които не показват никакви признаци на инфекция. Отстраняват се от всяко опитно растение участък от стеблото с големина 1 cm от два сантиметра над мястото на заразяване. тъканите се хомогенизират в мацериращ буфер. Изготвят се посявки от разреждания (раздел III.5.1) Ако са положителни, се идентифицират чисти култури с характерна морфология (раздел II.4.1) и се потвърждават култури на Ralstonia solanacearum чрез тест за патогенност (раздел II.4.3).

Тълкуване на резултатите от биологичния тест:

Биологичният тест е отрицателен, ако опитните растения не са инфектирани с Ralstonia solanacearum и при условие че Ralstonia solanacearum е открита в положителните контроли.

Биологичният тест е положителен, ако опитните растения са инфектирани с Ralstonia solanacearum.

7. Обогатителен тест

По Elphinstone et al., 1996

7.1 Прехвърлят се 100 μl от повторно суспендираната гранула в 3 ml от модифициран бульон SMSA (допълнение 7)

7.2 Инкубират се 48 часа и в никакъв случай повече от 72 часа при 28 °С с разхлабена тапа на епруветката за проветряване.

7.3 Тапата се затяга и съдът се разклаща кръгообразно. Разделя се по равно за IF тест (този раздел, точка 2), ELISA тест (този раздел, точка 3) и/или PCR тест (този раздел, точка 4).

8. Тест за патогенност

Отнесете се към раздел II. 4.3.

Литература

Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962, Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726.

Cook, D.; Elizabeth, B. and Sequeira, L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113—121.

Dinesen, I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133—142.

Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith)Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.

Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3—5.

Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265—277.

Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127—135.

Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343—351.

Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335—345.

Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293—695.

Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp.

Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528—536.

Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838.

Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029—1034.

Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67—79.

Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587—1594.

Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262—4268.

Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76—111.

Stead, D.E., 19 92b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281—295.

Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse, J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266—269.