6)

Добавят се следните глави от В.31 до В.46: „ В.31. ИЗПИТВАНЕ НА СУХОЗЕМНИ РАСТЕНИЯ: ИЗПИТВАНЕ ЗА ПОНИКВАНЕ И РАСТЕЖ НА ПОНИЦИ УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 208 (2006). Методите за изпитване периодично се преразглеждат с оглед на научния прогрес и приложимостта за регулаторно използване. Настоящият актуализиран метод за изпитване е предназначен за оценка на потенциалните въздействия на химикалите върху поникването и растежа на поници. Като такъв той не обхваща хроничните въздействия или въздействията върху размножаването (напр. завръз, образуване на цветове, зреене на плода). Условията на експозиция и свойствата на химикала за изпитване трябва да се вземат под внимание по такъв начин, че да се гарантира, че се използват подходящи методи за изпитване (например при изпитване на метали/метални съединения трябва да се вземе под внимание въздействието на pH и свързаните с него противоположно натоварени йони) (1). Настоящият метод за изпитване не се отнася до растения, изложени на изпарения на химикали. Този метод на изпитване е приложим за проверката на общи химикали, биоциди и продукти за растителна защита (известни също като пестициди). Той е разработен въз основа на съществуващите методи (2) (3) (4) (5) (6) (7). Взети са предвид и други позовавания, отнасящи се до изпитвания на растения (8) (9) (10). Определенията, които са използвани, са дадени в допълнение 1. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 2. С изпитването се оценява въздействието върху поникването и началото на растежа на поници при висши растения след експозиция на изпитвания химикал в почвата (или друга подходяща почвена матрица). Семената се поставят в контакт с почва, третирана с изпитвания химикал и се прави оценка на въздействията, появяващи се обикновено от 14 до 21 дни след 50 % поникване на пониците в контролната група. Измерените крайни точки са визуална оценка на поникването на пониците, сухо тегло на поника (като алтернатива, свежо тегло на поника) и, в определени случаи, височина на поника, както и оценка на видимите неблагоприятни въздействия върху различни части на растението. Посочените измервания и наблюдения се сравняват с тези при нетретирани контролни растения. 3. В зависимост от очаквания път на експозиция, изпитваният химикал или се внася в почвата (или евентуално в изкуствена почвена матрица), или се прилага към почвената повърхност, което представя по подходящ начин потенциалния път за експозиция на химикала. Внасянето в почвата се извършва чрез третиране на почвата в насипно състояние. След прилагането почвата се прехвърля в саксии и след това семената от дадения растителен вид се засаждат в почвата. Прилагането към почвената повърхност се извършва върху почва, която вече е била поставена в саксии и в която семената вече са били засадени. След това изпитваните обекти (контроли и третирани почви плюс семена) се поставят при подходящи условия за подпомагане на покълването/растежа на растенията. 4. Изпитването може да се проведе за определяне на кривата доза-отклик, или при единична концентрация/доза като гранично изпитване в зависимост от целта на изследването. Ако резултатите от изпитването на единична концентрация/доза надвишават определено равнище на токсичност (например когато се наблюдават въздействия, по-големи от x %), се извършва изпитване за определяне на обхвата, за да се определят горни и долни граници за токсичност, последвано от изпитване с множество концентрации/дози, за да се генерира крива доза-отклик. Използва се подходящ статистически анализ за получаване на ефективна концентрация ECx или ефективна доза на прилагане ERx (например EC25, ER25, EC50, ER50) за най-чувствителния(те) параметър(ри), които представляват интерес. Също така, при това изпитване могат да бъдат изчислени концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) и най-ниската концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC). ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНИЯ ХИМИКАЛ 5. Следната информация е полезна за идентифициране на очаквания път на експозиция на химикала и за планирането на изпитването: структурната формула, чистотата, разтворимостта във вода, разтворимостта в органични разтворители, коефициентът на разпределение 1-октанол/вода, поведението при сорбция в почвата, парното налягане, стабилността на химикала във вода и на светлина, и биоразградимостта. ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО 6. За да бъде считано за валидно изпитването, за контролите следва да се изпълнят следните критерии: — поникването е най-малко 70 %; — пониците не проявяват видими признаци на фитотоксично въздействие (напр. хлороза, некроза, увяхване, деформации на листата и стъблото) и растенията показват само нормалното вариране по отношение на растежа и морфологията за този конкретен растителен вид; — средната стойност на преживелите поникнали поници в контролите е поне 90 % за периода на проучването; — условията на околната среда за конкретния растителен вид са идентични и средата на растеж съдържа еднакво количество от почвената матрица, поддържащата среда, или субстрата от един и същ източник. РЕФЕРЕНТЕН ХИМИКАЛ 7. Референтният химикал може да бъде изпитван на редовни интервали от време, за да се провери дали провеждането на изпитването, откликът при конкретните изпитвани растения и условията на изпитването не са се променили значително с течение на времето. Като алтернатива, данните за минали периоди за биомасата или за измервания на растежа в контролите могат да бъдат използвани за оценка на параметрите на системата за изпитване в конкретни лаборатории, и могат да послужат като вътрешнолабораторна мярка за контрол на качеството. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА Естествена почва — изкуствен субстрат 8. Растенията могат да се отглеждат в саксии, с използване на праховито-песъклива, песъклива (свързан пясък) или глинесто-песъклива почва, която съдържа до 1,5 процента органичен въглерод (около 3 процента органична материя). Могат да се използват също почви за саксийни растения или синтетични почвени смеси, които са на разположение в търговската мрежа и които съдържат до 1,5 процента органичен въглерод. Глинести почви не бива да се използват, ако за изпитвания химикал е известно, че е с висок афинитет към глина. Естествената почва следва да се пресее до частици с размер 2 mm, за да се хомогенизира и да се отстранят едрите частици. Типът и текстурата, %-ното съдържание на органичен въглерод, рН и съдържанието на соли, както и електропроводимостта на окончателната приготвена почва следва да бъдат протоколирани. Почвата следва да бъде класифицирана съгласно стандартна схема за класификация (11). Почвата може да бъде пастьоризирана или термично обработена, за да се намали въздействието на почвените патогени. 9. Естествената почва може да усложни тълкуването на резултатите и да повиши варирането поради различни физични/химични свойства и микробни популации. Тези променливи на свой ред променят капацитета за задържане на влага, капацитета за свързване на химикала, аерирането и съдържанието на хранителни вещества и микроелементи. В допълнение към варирането на тези физически фактори ще има и различия по отношение на химическите свойства, като например pH и редокси потенциала, което може да повлияе на бионаличността на изпитвания химикал (12) (13) (14). 10. Обикновено не се използват изкуствени субстрати за изпитване на препарати за растителна защита, но те могат да бъдат от полза за изпитване на общи химикали или когато е необходимо свеждане до минимум на варирането в естествените почви и увеличаване на съпоставимостта на резултатите от изпитването. Използваните субстрати следва да се състоят от инертни материали, които намаляват до минимум взаимодействието с изпитвания химикал, с разтворителя, използван като носител, или и с двете. За кварцовия пясък, промит с киселина, минералната вата и стъклените перли (напр. от 0.35 до 0,85 mm в диаметър) е установено, че са подходящи инертни материали, които абсорбират изпитвания химикал в минимална степен (15), като се гарантира, че химикалът ще е максимално достъпен за усвояване от пониците чрез корените. Неподходящи субстрати включват вермикулит, перлит и други силно абсорбиращи материали. Следва да се предоставят хранителни вещества за растежа на растенията, за да се гарантира, че растенията не са подложени на стрес от недостатъчно хранителни вещества, и когато е възможно, това следва да бъде оценено чрез химичен анализ или чрез визуална оценка на растенията в контролите. Критерии за подбор на изпитваните растителни видове 11. Изборът на растителни видове следва да бъде в разумно широки граници, напр. като се има предвид тяхното таксономично разнообразие в растителното царство, тяхното разпределение, изобилие, специфични за различните видове характеристики на жизнения цикъл и района на естествено срещане, с оглед получаване на диапазон от отклици (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). При подбор следва да бъдат взети предвид следните характеристики на евентуалните видове за изпитването: — видовете имат еднакви семена, които са леснодостъпни от надежден(ни) източник(ци) на посевен материал и които са с последователна, надеждна и равномерна кълняемост, както и еднакъв растеж на пониците; — растението може да бъде предмет на изпитвания в лабораторни условия, и може да дава надеждни и възпроизводими резултати във или извън рамките на изпитвателните съоръжения; — чувствителността на изпитваните видове следва да съответства на отклиците на растения в околната среда, експонирана на химикала; — те са били използвани до известна степен в предходни изпитвания за токсичност и тяхното използване, например при биологични изследвания на хербициди, скрининг на тежки метали, тестове за устойчивост към соленост или минерализация или проучвания за алелопатия, показва чувствителност спрямо голямо разнообразие от стресови фактори; — те са съвместими с условията на растеж на метода за изпитване; — те отговарят на критериите за валидност на изпитването. Някои от най-често използваните изпитвани видове през предходни периоди са включени в допълнение 2, а потенциални неземеделските видове — в допълнение 3. 12. Броят на видовете за изпитване зависи от съответните регулаторни изисквания, поради това не е посочен в настоящия метод за изпитване. Прилагане на изпитвания химикал 13. Химикалът трябва да бъде приложен в подходящ носител (напр. вода, ацетон, етанол, полиетиленгликол, арабска гума, пясък). Смеси (формулирани продукти или формулировки), които съдържат активни съставки и различни адюванти също могат да бъдат изпитвани. Внасяне в почва/изкуствен субстрат 14. Химикали, които са разтворими във вода или суспендират във вода, могат да бъдат добавени към вода, след което разтворът се смесва с почвата с подходящо смесително устройство. Този тип изпитване може да бъде подходящ, ако експозицията на химикала е чрез почвата или чрез водата между почвените частици, и усвояването чрез корените е източник на загриженост. Капацитетът на почвата за задържане на вода не трябва да бъде надхвърлян чрез добавянето на изпитвания химикал. Обемът на добавената вода трябва да е еднакъв за всяка изпитвана концентрация, но следва да бъде ограничен, за да се предотврати слепване на почвени агломерати. 15. Химикали с ниска водоразтворимост трябва да се разтворят в подходящ летлив разтворител (напр. ацетон, етанол) и да се смесят с пясък. След това разтворителят може да бъде отстранен от пясъка, с използване на струя въздух при непрекъснато разбъркване на пясъка. Третираният пясък се смесва с опитната почва. Установява се втора контрола, която получава само пясък и разтворител. Равни количества пясък, смесен с разтворител, който след това е отстранен, се добавят към всички равнища на третиране и към втората контрола. За твърди, неразтворими изпитвани химикали, суха почва и химикалът се смесват в подходящо смесително устройство. След това почвата се добавя към саксиите и семената са засяват веднага. 16. Когато вместо почва се използва изкуствен субстрат, химикалите, които са разтворими във вода, могат да бъдат разтворени в хранителния разтвор непосредствено преди началото на изпитването. Химикали, които са неразтворими във вода, но които могат да бъдат суспендирани във вода с използвани като носител разтворители, следва да бъдат добавени с носителя към хранителния разтвор. Неразтворимите във вода химикали, за които няма нетоксичен водоразтворим носител, следва да се разтворят в подходящ летлив разтворител. Разтворът се разбърква с пясък или стъклени перли, поставя се в ротационен вакуумен изпарител, и се изпарява, в резултат на което равномерен слой от химикала остава върху пясъка или перлите. Претеглена част от перлите трябва да се подложи на екстракция със същия органичен разтворител и химикалът се анализира преди поставянето в саксиите. Прилагане към почвената повърхност 17. При продуктите за растителна защита разпръскването по повърхността на почвата на изпитвания разтвор се използва често за прилагане на изпитвания химикал. Всяко оборудване, използвано при провеждане на изпитванията, включително оборудване, което се използва за подготовка и прилагане на изпитвания химикал, следва да бъде с такъв дизайн и капацитет, че изпитванията с това оборудване да могат да се провеждат с точност и то да дава възпроизводимо покритие. Покритието следва да е еднакво по цялата почвена повърхност. Следва да се положат грижи за избягване на възможността химикалите да бъдат адсорбирани в оборудването или да реагират с него (напр. пластмасови епруветки и липофилни химикали, или стоманени части и елементи). Изпитваният химикал се разпръсква върху повърхността на почвата, като се симулира типично прилагане с устройство за разпръскване. Като цяло, разпръскваните обеми следва да съответстват на обичайната земеделска практика и обеми (количеството вода и т.н., следва да бъдат протоколирани). Типът на дюзите трябва да е избран така, че да се осигурява еднакво покритие на повърхността на почвата. Ако се прилагат разтворители и носители, следва да бъде създадена втора група от контролни растения, които да получат само разтворител/носител. Това не е необходимо за продукти за растителна защита, изпитвани като формулировки. Проверка на концентрацията/дозата на изпитвания химикал 18. Концентрациите/дозите трябва да бъдат потвърдени с подходяща аналитична проверка. За разтворими химикали проверката на всички изпитвани концентрации/дози може да бъде потвърдена чрез анализ на изпитвания разтвор с най-високата концентрация, използван за изпитването, с документиране относно последващото разреждане и използването на калибрирано оборудване за прилагането (напр. калибрирана лабораторна стъклария, калибриране на оборудването за пръскане). За неразтворимите химикали трябва да се направи проверка на съставния материал с теглата на изпитвания химикал, добавен към почвата. Ако се изисква доказване на хомогенност, може да бъде необходим анализ на почвата. ПРОЦЕДУРА ПЛАНИРАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО 19. Семена от един и същ вид се засаждат в саксии. Броят на засадените във всяка саксия семена зависи от растителния вид, размера на саксията и продължителността на изпитването. Чрез броя на засадените във всяка саксия растения следва да се предоставят подходящи условия за растеж и да се избягва прекомерно струпване по време на изпитването. Максималната плътност на растенията следва да е 3—10 семена на 100 cm2 в зависимост от големината на семената. Като пример се препоръчват от едно до две растения царевица, соя, домати, краставици или захарно цвекло за контейнер с размер 15 cm; три растения рапица или грах за контейнер с размер 15 cm; и 5—10 растения лук, пшеница или други малки семена за контейнер с размер 15 cm. Броят на семената и на саксиите за повторения (повторението се определя като саксия и следователно растенията в рамките на една и съща саксия не представляват повторение) следва да бъде достатъчен за оптимален статистически анализ (21). Следва да се отбележи, че варирането ще бъде по-голямо при изпитването на растителни видове, при които на саксия (повторение) се използват по-малко на брой големи по размер семена, в сравнение с изпитвани растителни видове, при които на саксия могат да се използват повече на брой малки по размер семена. Чрез засаждане на равен брой семена във всяка саксия това вариране може да бъде сведено до минимум. 20. Контролните групи се използват, за да се гарантира, че наблюдаваните въздействия са свързани с експозиция на изпитвания химикал, или са резултат само от такава. Подходящата контролна група трябва да е еднаква във всяко едно отношение с изпитваната група, с изключение на експозицията на изпитвания химикал. В рамките на дадено изпитване всички изпитвани растения, включително контролите, трябва да са от един и същ източник. Изисква се случайно определяне на изпитваните и контролните саксии, с цел да се предотврати изместването. 21. Семената, покрити с инсектицид, фунгицид (т.е. „обработени“ семена), следва да бъдат избягвани. Независимо от това използването на някои несистемни фунгициди с контактно действие (например каптан, тирам) е разрешено от някои регулаторни органи (22). Ако семепреносимите патогени са повод за загриженост, семената може да се напоят за кратко в слаб 5 % разтвор на хипохлорит, след това да се изплакнат многократно в течаща вода и да се изсушат. Не се разрешава лечебно третиране с други продукти за растителна защита. Условия на изпитването 22. Условията на изпитването следва да се доближават до условията, необходими за нормалния растеж на изпитваните видове и сортове (в допълнение 4 се съдържат примери за условия на изпитването). Нововъзникващите растения следва да се съхраняват с използването на добри градинарски практики в климатични камери, вегетационни къщи или оранжерии. Когато се използват съоръжения за регулиране на растежа, тези практики обикновено включват контрол и достатъчно често (например ежедневно) записване на температурата, влажността, концентрацията на въглероден диоксид, осветлението (интензитет, дължина на вълната, фотосинтетично активно излъчване) и времетраенето му, средства за напояване и др., за осигуряване на добро развитие на растенията, в сравнение с контролните растения от избрания растителен вид. Температурите в оранжериите трябва да се контролират чрез вентилиране, отоплителни и/или охладителни системи. За изпитване в оранжерии обикновено се препоръчват следните условия: — температура: 22 °C ± 10 °C; — влажност: 70 % ± 25 %; — времетраене на осветлението: минимум 16 часа светлина; — светлинен интензитет: 350 ± 50 μE/m2/s. Може да необходимо допълнително осветление, ако интензитетът намалее под 200 μE/m2/s при дължина на вълната 400—700 nm, с изключение на някои растителни видове, при които изискванията към осветлението са по-ниски. Условията на околната среда следва да бъдат наблюдавани и протоколирани по време на изследването. Растенията трябва да се отглеждат в непорести пластмасови или глазирани саксии с табли или чинийки под саксиите. Саксиите могат да бъдат премествани периодично, за да се сведе до минимум варирането в растежа на растенията (дължащо се на разлики в условията на изпитване в рамките на съоръженията за регулиране на растежа). Саксиите следва да бъдат достатъчно широки, за да позволяват нормален растеж. 23. Хранителните вещества в почвата могат да бъдат допълнени според необходимостта, за да се поддържа добра жизненост на растенията. Необходимостта от допълнителни хранителни вещества и и моментът на подаването им могат да се преценят чрез наблюдение на контролните растения. Препоръчва се дънно напояване на изпитвателните съдове (например чрез използване на фитили от стъклена вата). Независимо от това, първоначалното напояване отгоре може да се използва за стимулиране на покълването на семената, а при прилагане на повърхността на почвата то улеснява навлизането на химикала в почвата. 24. Специфичните условия за отглеждане следва да са подходящи за изпитваните растителни видове и за изпитвания химикал, предмет на проучването. Контролните и третираните растения трябва да се съхраняват при същите условия на околната среда, като обаче следва да бъдат взети подходящи мерки, за да не се допусне кръстосана експозиция на изпитвания химикал (напр. при летливи химикали) между различни третирани и контролни растения. Изпитване при единична концентрация/доза 25. За да се определи подходящата концентрация/доза на даден химикал за провеждане на изпитване при единична концентрация или доза (предизвикваща/гранична следва да бъдат взети предвид редица фактори. За общите химикали те включват физичните/химичните свойства на химикала. При продуктите за растителна защита трябва да бъдат взети предвид физичните/химичните свойства и начинът на употреба на изпитвания химикал, неговата максимална концентрация или приложена доза, броят прилагания на сезон и/или устойчивостта му. За да се определи дали един общ химикал притежава фитотоксични свойства, може да е целесъобразно той да се изпита при максимално равнище от 1 000 mg/kg суха почва. Изпитване за определяне на обхвата 26. Когато е необходимо, може да се извърши изпитване за определяне на обхвата, за да се предоставят насоки относно концентрациите/дозите, които да бъдат изпитвани в окончателно изследване на зависимостта доза-отклик. За изпитването за определяне на обхвата изпитваните концентрации/дози следва да бъдат широко раздалечени (напр. 0,1, 1,0, 10, 100 и 1 000 mg/kg суха почва). При продуктите за растителна защита концентрациите/дозите могат да се основават на препоръчаната или максимално допустимата концентрация или доза, напр. 1/100, 1/10, 1/1 от препоръчаната/максимално допустимата концентрация или доза на прилагане. Изпитване при множество концентрации/дози 27. Целта на изпитването при множество концентрации/дози е да се установи зависимостта доза-отклик и да се определи стойност на ECx или ERx за въздействия върху поникването, биомасата и/или видимите белези в сравнение с неекспонираните контроли, както се изисква от регулаторните органи. 28. Броят и раздалечеността на концентрациите или дозите следва да бъде достатъчен, за да осигури надеждна зависимост доза-отклик и регресионно уравнение и да даде оценка за стойностите на ECx. или ERx.. Избраните концентрации/дози следва да обхващат стойностите на ECx или ERx, които трябва да бъдат определени. Например, ако е необходима стойност на ЕС50, би било желателно да се проведе изпитване с дози, които предизвикват въздействие от 20 до 80 %. Препоръчаният в изпитването брой концентрации/дози за постигането на тази цел, е най-малко пет в геометрична прогресия плюс нетретирана контролна група, раздалечени една от друга с кратност, която не надвишава три. За всяка третирана и контролна група броят на отделните повторения следва да е най-малко четири и общият брой на семената следва да бъде най-малко 20. При някои растения с ниска кълняемост или вариращ растеж може да са необходими повече повторения за увеличаване на статистическата мощност на изпитването. Ако са използвани по-голям брой изпитвани концентрации/дози, броят на повторенията може да бъде намален. Ако трябва да се оценя NOEC, може да са необходими повече повторения, за да се получи желаната статистическа мощност (23). Наблюдения 29. По време на периода на наблюдение, а именно от 14 до 21 дни след поникването на 50 % от контролните растения (също и при контролите на разтворител, ако е приложимо), растенията се наблюдават често (най-малко веднъж седмично и, ако е възможно, ежедневно) за поникване, визуални признаци на фитотоксичност и смъртност. В края на изпитването следва да се запишат измереният процент на поникване и биомасата на преживелите растения, както и видимите неблагоприятни въздействия върху различните части на растението. Последните включват аномалии във външния вид на поникналите поници, забавен растеж, хлороза, обезцветяване, смъртност и въздействия върху развитието на растенията. Крайната биомаса може да бъде измерена чрез крайната средна стойност на теглото на пониците на преживелите растения, като поникът се взема от повърхността на почвата нагоре и се изсушава до постоянно тегло при температура от 60 °С. Като алтернатива, крайната биомаса може да бъде измерена с използване на свежото тегло на пониците. Височината на пониците може да бъде друга крайна точка, ако това се изисква от регулаторните органи. За оценка на наблюдаемия токсичен отклик следва да се използва единна скала по отношение на видимите увреждания. Примери за извършването на качествена и количествена визуална оценка по скала са дадени в (23) (24). ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Статистически анализ Изпитване при единична концентрация/доза 30. Данните за всеки растителен вид следва да се анализират чрез използване на подходящ статистически метод (21). Следва да се протоколира както степента на въздействие при изпитваната концентрация/доза, така и невъзможността да се постигне дадено въздействие при изпитваната концентрация/доза (напр. < x % наблюдавано въздействие при y концентрация или доза). Изпитване при множество концентрации/дози 31. Установява се зависимост доза-отклик под формата на регресионно уравнение. Могат да се използват различни модели: Така например при поникването, за оценка на стойностите на ECx или ERx (напр. EC25, ER25, EC50, ER50) и техните доверителни граници като двоични данни могат да бъдат подходящи методите логит, пробит, на Вейбул, на Спирмън-Карбър, на Спирмън-Карбър с изключване на данни и други. При растежа на пониците (тегло и височина) крайните точки ECx или ERx и техните доверителни граници като непрекъснати величини могат да се оценят с използване на подходящ регресионен анализ (напр. нелинеен регресионен анализ на Брус-Верстийг (25)). Където е възможно, R2 следва да бъде 0,7 или по-висок за най-чувствителните растителни видове и използваните изпитвани концентрации/дози следва да обхващат 20 % до 80 % въздействия. Ако трябва да се оценя NOEC, следва да се предпочете прилагането на мощни статистически тестове и те трябва да се избират въз основа на разпределението на данните (21) (26). Протокол от изпитването 32. Протоколът от изпитването следва да представя резултатите от изследванията, както и подробно описание на условията на изпитване, задълбочено обсъждане на резултатите, анализ на данните и направените заключения от анализа. Трябва да бъда представени в табличен вид обобщение и резюмирана информация за резултатите. Протоколът трябва да включва следното: Изпитван химикал: — данни за идентификацията на химикала, относими свойства на изпитвания химикал (например log Pow, разтворимост във вода, парното налягане и информация за съдбата и поведението му в околната среда, ако са налични); — подробни данни относно приготвянето на разтвора за изпитване и проверката на изпитваните концентрации, както е посочено в точка 18. Изпитван растителен вид: — подробни данни относно изпитвания организъм: растителен вид/сорт, семейство, научни и общоприети наименования, източник и история на семената възможно най-подробно (т.е., име на доставчика, процент на кълняемост, клас по размер на семената, номер на партида или на пратка, година за семената или вегетативен период, през който са събрани, дата за кълняемостта), жизнеспособност и т.н.; — брой на изпитаните едносемеделни и двусемеделни видове; — обосновка за избора на растителните видове; — описание на съхранението, третирането и поддръжката на семената. Условия на изпитване: — съоръжение за изпитване (напр. климатична камера, вегетационна къща и оранжерия); — описание на системата за изпитване (например, размери и материал, от който е направена саксията и количества почва); — характеристики на почвата (текстура или тип на почвата: разпределение и класификация на почвените частици, физични и химични свойства, включително % органична материя, % съдържание на органичен въглерод и рН); — приготвяне на почвата/субстрата (напр. почва, изкуствена почва, пясък и др.) преди изпитването; — описание на хранителната среда, ако е използвана такава; — прилагане на изпитвания химикал: описание на метода на прилагане, описание на оборудването, дозите на експозиция и обемите, включително проверка на химикала, описание на метода за калибриране иописание на условията на околната среда по време на прилагането; — условия на растеж: светлинен интензитет (напр. фотосинтетично активно излъчване), времетраене на осветлението, максимални/минимални температури, график и метод за напояването, торене; — брой семена в саксия, брой растения на доза, брой повторения (саксии) на доза на експозиция; — тип и брой на контролите (негативни и/или положителни контроли, контроли на разтворител, ако се използват); — продължителност на изпитването. Резултати: — таблица с всички крайни точки за всяко повторение, изпитвана концентрация/доза и растителен вид; — броят и процентът на поникване в сравнение с контролите; — измервания на биомасата на растенията (сухо или свежо тегло на пониците) като процент от стойността при контролите; — височина на пониците на растенията като процент от стойността при контролите, ако се измерва; — процент видими увреждания и количествено и качествено описание на видимите увреждания (хлороза, некроза, увяхване, деформация на листата и стъблото, както и всякаква липса на въздействие) в резултат от изпитвания химикал в сравнение с контролните растения; — описание на скалата, използвана за преценка на видимите увреждания, ако е правена визуална преценка; — за проучвания с една доза следва да се протоколира процентът на уврежданията; — Стойностите на ECx или ERx (напр. EC50, ER50, EC25, ER25) и свързаните с тях доверителни граници. Където е извършен регресионен анализ, се предоставят стандартната грешка за регресионното уравнение, както и стандартна грешка на оценката на отделния параметър (напр. наклон, отсечка); — стойностите на NOEC (и LOEC), ако са изчислени; — описание на статистическите процедури и направените допускания; — графично представяне на тези данни и на зависимостта доза-отклик при изпитвания растителен вид. Отклонения от процедурите, описани в настоящия метод за изпитване, и всички необичайни обстоятелства по време на изпитването. ЛИТЕРАТУРА (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background — Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms — A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Глава В.33 от настоящото приложение: Изпитване за размножаване на земни червеи (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Допълнение 1 Определения Активна съставка (a.i.) (или активно вещество (a.s.)) е материал, предназначен за предизвикване на специфично биологично въздействие (напр. контрол на насекоми, борба с болести по растенията, борба с плевели в третираната площ), известно също като активна съставка или активно вещество с квалификация „технически чист“. Химикал означава вещество или смес. Продукти за растителна защита или пестициди са материали със специфична биологична активност, целенасочено използвани за растителна защита от вредители (например гъбични болести, насекоми и конкурентни растения). ECx. концентрация с въздействие x % или ERx. доза с въздействие x % е концентрацията или дозата, в резултат от която се получава нежелано изменение или промяна от х % в изпитваната крайна точка, която се измерва, по отношение на контролата (напр. 25 % или 50 % намаляване на поникването на пониците, тегло на пониците, краен брой налични растения или увеличение на видимите увреждания би представлявало съответно EC25/ER25 или EC50/ER50). Поникване е появата на колеоптила или на котиледон над повърхността на почвата. Формулировка е наличният в търговската мрежа формулиран продукт, съдържащ активното вещество (активната съставка), известен също като краен продукт (8) или типичен продукт за крайно потребление. LOEC (най-ниската концентрация, при която се наблюдава ефект) е най-ниската концентрация на изпитвания химикал, при която е наблюдавано въздействие. В настоящото изпитване концентрацията, съответстваща на LOEC, има статистически значимо (р < 0,05) въздействие в рамките на даден период на експозиция, при сравнение с контролата, и е по-висока от NOEC. Неприцелни растения: Тези растения, които са извън прицелната растителна площ. При продуктите за растителна защита това обикновено се отнася за растения извън третираната площ. NOEC (концентрация без наблюдавано въздействие) е най-високата концентрация на изпитвания химикал, при която не е наблюдавано въздействие. В настоящото изпитване концентрацията, съответстваща на NOEC, няма статистически значимо (р < 0,05) въздействие в рамките на даден период на експозиция, при сравнение с контролата. Фитотоксичност: Неблагоприятни отклонения (от оценки от измервания и от визуални оценки) от обичайния външен вид и растеж на растения като отклик на даден химикал. Повторение е опитната единица, която представлява контролната група и/или третираната група. В разглежданите изследвания за повторение е определена саксията. Визуална оценка: преценка за видимо увреждане, основавана на наблюдение на стъблостой, жизненост, малформация, хлороза, некроза и цялостен изглед в сравнение с контрола. Изпитван химикал: всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване. Допълнение 2 Списък на растителните видове, за които съществуват данни за използването им за изпитване на растения през предходни периоди Семейство Вид Общоприети наименования DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Морков Asteraceae (Сложноцветни) Helianthus annuus Слънчоглед Asteraceae (Сложноцветни) Lactuca sativa Марули Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Бял синап Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Китайско зеле Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Рапица Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Бяло зеле Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Ряпа Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Градински кресон Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Репички Chenopodiaceae Beta vulgaris Захарно цвекло Cucurbitaceae Cucumis sativus Краставици Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Соя Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Боб мунг Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Фасул пешак, нисък френски фасул, градински фасул Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Грах Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Сминдух Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Звездан обикновен Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Детелина червена Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Фий Linaceae Linum usitatissimum Лен Polygonaceae Fagopyrum esculentum Елда Solanaceae Solanum lycopersicon Домат MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Лук Poaceae (Gramineae) Avena sativa Овес Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Ечемик Poaceae (Gramineae) Lolium perenne 0·3 Английски райграс Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Ориз Poaceae (Gramineae) Secale cereale Ръж Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Сорго на зърна, сорго Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Пшеница Poaceae (Gramineae) Zea mays Царевица Допълнение 3 Списък на възможните неземеделски растителни видове Възможни растителни видове на ОИСР за изпитване за токсичност. Бележка: В таблицата по-долу се предоставя информация за 52 неземеделски растителни вида (за всяко вписване в скоби е посочена референтна информация). Предоставената информация за кълняемостта е от публикуваната литература и служи само като общи насоки. Индивидуалният опит може да варира в зависимост от източника на семената и други фактори. СЕМЕЙСТВО Вид Ботаническо наименование (Общоприето наименование на български език) Продължителност на живота (9) и местообитание Тегло на семето (mg) Времетраене на осветлението за покълване и растеж (10) Дълбочина на засаждане (mm) (11) Време до покълване (дни) (12) Специален режим на третиране (13) Изпитване за токсичност (14) Доставчици на семената (15) Друга референтна информация (16) APIACEAE Torilis japonica (японски торилис) А, В нарушени терени, живи плетове, пасища (16, 19) 1,7 — 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) студена стратификация (7, 14, 18, 19) може да е необходимо зреене (19) покълването се потиска от тъмнина (1, 19) няма специални третирания (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (многогодишна паричка) Ρ пасища, обработваеми земи, торф (16, 19) 0,09-0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) покълването не е засегнато от лъчение (18, 19) няма специални третирания (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (Обикновена метличина) A полета, крайпътни пространства и открити местообитания (16) 4,1-4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) няма специални третирания (2, 4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (вид червена метличина) Ρ полета, крайпътни пространства и открити местообитания (16, 19) 2,4-2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) може да е необходимо зреене (18, 19) покълването се потиска от тъмнина (19) няма специални третирания (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (бял оман) Ρ влажни, нарушени терени (16) 1 — 1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) няма специални третирания (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (космата жълтица) Ρ полета, крайпътни пространства, нарушени терени (16, 19) 0,85 -1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) покълването се потиска от тъмнина (17, 18, 19) няма специални третирания (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (влакнеста рудбекия) Β, Ρ нарушени 16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) няма специални третирания (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (канадски енчец) Ρ пасища, открити терени (16) 0,06-0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) разбърква се с равна част пясък и се напоява в 500 ppm GA в течение на 24 часа (11) няма специални третирания (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicu (влакнест казашки бодил, разновидност canadense) A полета, открити местообитания (16) 25-61 (14, 29) 0(1) 5(29) покълването може да се потиска от тъмнина (1) потапяне в топла вода в течение на 12 часа (29) PRE & POST (31) A Xanthium spinosum (влакнест казашки бодил) A открити местообитания (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 6) скарификация (14) няма специални третирания (6) PRE & POST (6) A Xanthium strumarium (влакнест казашки бодил) A полета, открити местообитания (16) 67,4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) няма специални третирания (6, 14, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Card amine pratensis (ливадна горва) Ρ полета, крайпътни пространства, торф (6, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) покълването се потиска от тъмнина (18, 19) няма специални третирания (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (румянка) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) може да е необходимо зреене (18) няма специални третирания (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (бяла куча лобода) A синорни ивици, нарушени терени (16, 19) 0,7 — 1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) третирането е различно в зависимост от цвета на семената (19) покой на семето при съхранение на сухо (19) покълването се потиска от тъмнина (1, 18, 19) студена стратификация (18) няма специални третирания (14, 34) PRE & POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (жълт кантарион) Ρ полета, обработваеми земи, открити местообитания (16, 19) 0,1-0,23 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) покълването се потиска от тъмнина (1, 18, 19) няма специални третирания (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (бръшляноподобна ипомея) A полета, открити местообитания, ниви (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) покълването не е засегнато от лъчение (1) няма специални третирания (6, 21) PRE & POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (лилава острица) Ρ обработваеми земи, пасища, крайпътни пространства (16, 30) 0,2 (14) L = D (14) 0 (1) 10-20 (6, 10) 12 (91 %) (10) покълването се потиска от тъмнина (1) няма специални третирания (6, 10, 14) PRE & POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (обикновен звездан) Ρ тревисти райони, крайпътни пространства, открити местообитания (16, 19) 1-1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) скарификация (14, 19) покълването не е засегнато от лъчение (18, 19) няма специални третирания (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (китайска сена, тъполистна касия) A влажни гори (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) потапяне на семената във вода в продължение на 24 часа (9) скарификация (14) жизнеспособността на семената се различава в зависимост от цвета (1) няма специални третирания (6) POST (6,9) A Sesbania exaltata (Сесбания екзалтата) A алувиални почви (16) 11 — 13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) потапяне на семената във вода в продължение на 24 часа (9) покълването не е засегнато от лъчение (1) няма специални третирания (21) PRE & POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense ливадна детелина Ρ полета, крайпътни пространства, обработваеми земи (16, 19) 1,4 — 1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) скарификация (14, 18) може да е необходимо зреене (19), покълването не е засегнато от лъчение (1, 19) няма специални третирания (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (дяволска уста) Ρ открити местообитания (16) 0,75-1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) няма специални третирания (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (обикновена мента) Ρ влажни зони (16) 2,21 (4) 0 (4) няма специални третирания (4) POST (4) F Nepeta cataria (коча билка обикновена) Ρ нарушени терени (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) няма специални третирания (2, 4, 14) POST (2,4) F Prunella vulgaris (обикновена пришница) Ρ обработваеми полета, тревисти площи, нарушени терени (16, 19) 0,58-1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) покълването се потиска от тъмнина (18, 19) покълването е по-голямо при по-големи семена (1,) няма специални третирания (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (лечебен ранилист) Ρ тревни съобщества, синорни ивици (19) 14-18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) няма специални третирания (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilon theophrasti (просфорник) A полета, открити местообитания (16) 8,8 (14) L = D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) скарификация (14) няма специални третирания (5, 10, 21) PRE & POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (Сида спиноза) A полета, крайпътни пространства (6, 19) 3,8 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) скарификация (14) покълването не е засегнато от лъчение (1) няма специални третирания (6, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (полски мак) A полета, обработваеми земи, нарушени терени (16, 19) 0,1-0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) студена стратификация и скарификация (1, 19, 32) няма специални третирания (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (обикновена полевица) тревни площи, пасища (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) покълването се потиска от тъмнина (1, 17-19) няма специални третирания (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (полска класица) A полета, открити местообитания (16) 0,9-1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) скарификация (14) третира се със 101 mg/l KNO3 (14) топла стратификация (1) покълването се потиска от тъмнина (1) няма специални третирания (34) PRE & POST (28, 34) A 32 Avena fatua (див овес) A обработваеми площи, открити местообитания (16) 7-37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10-20 (6, 10) 3 (70 %) (18) скарификация (7, 32) покълването се потиска от тъмнина (1) студена стратификация (1, 18) няма специални третирания (6, 10, 14) PRE & POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (покривна овсига) A полета, крайпътни пространства, обработваеми земи (16) 0,45-2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) период на зреене (1, 7, 32) покълването се потиска от светлина (1) няма специални третирания (14) PRE & POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (обикновен сеноклас) P полета, крайпътни пространства, открити местообитания (16, 19) 0,5-0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) покълването не е засегнато от лъчение (19) няма специални третирания (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (кървава росичка) A полета, торф, открити местообитания (16) 0,52-0,6 (14, 30) L = D (14) 10-20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) скарификация, студена стратификация (1, 7, 14, 32) третира се със 101 mg/l KNO3 (14) покълването се потиска от тъмнина (1) няма специални третирания (21) PRE & POST (18, 25, 31) A Echinochloa crus-galli (дараджан) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10-20 (7, 21) скарификация (7, 32) покълването не е засегнато от лъчение (1) няма специални третирания (3, 14, 21) PRE & POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (Елимус канаденсис) P крайречни зони, нарушени терени (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14-28 (11) няма специални третирания (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (ливадна власатка) P полета, влажни зони (16, 19) 1,53-2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) няма специални третирания (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (вид дребен ечемик) A пасища, крайпътни пространства, открити местообитания (16) 3,28 (14) топла стратификация (1) покълването не е засегнато от лъчение (1) PRE (31) 7 Phleum pratense (ливадна тимотейка) P пасища, обработваеми полета, нарушени терени (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) покълването се потиска от тъмнина (19) покълването не е засегнато от лъчение (17) няма специални третирания (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (поветицово пипериче) A открити местообитания, крайпътни пространства (16) 5-8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) студена стратификация в продължение на 4-8 седмици (1, 2, 4, 20, 29) покълването не е засегнато от лъчение (1) PRE & POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (лападоволистно пипериче) A влажни почви (16) 1,8-2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) покълването не е засегнато от излъчване (1) покълването се потиска от тъмнина (18) студена стратификация (1) няма специални третирания (5) PRE & POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (пенсилванско пипериче) A полета, открити местообитания (16) 3,6-7 (14, 29) 2 (29) студена стратификация в продължение на 4 седмици при 0-5 °C (1, 29), покълването се потиска от тъмнина (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (обикновено пипериче) A нарушени терени, обработваеми земи (16, 19) 2,1 -2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) скарификация, студена стратификация (14) третира се с GA (17-19) покълването се потиска от тъмнина (19) няма специални третирания (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (къдрав лапад) P обработваеми полета, крайпътни пространства, открити зони (16, 19) 1,3-1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) покълването се потиска от тъмнина (18, 19) може да е необходимо зреене (18) няма специални третирания (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (полско огнивче) A обработваеми полета, открити терени, нарушени терени (16, 19) 0,4-0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) студена стратификация, третиране с GA (1,14, 18, 19, 32), за покълване е необходима светлина (1) няма специални третирания (2, 4) POST (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (лютиче обикновено) Ρ обработваеми полета, крайпътни пространства, открити зони (16, 19) 1,5-2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 -56 (19, 29) няма специални третирания (5, 14, 22, 24-26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (градско омайниче) Ρ живи плетове, влажни зони (16, 19) 0,8 — 1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) покълването се потиска от тъмнина (18, 19) топла стратификация (1) няма специални третирания (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (лепка) A обработваеми полета, влажни зони, нарушени терени (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) студена стратификация (1, 18, 19), покълването не е засегнато от лъчение (18, 19) покълването се потиска от светлина (1) няма специални третирания (6, 14) PRE & POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (меко еньовче) Ρ насипи, открити райони (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) няма специални третирания (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (червен напръстник) Β, Ρ живи плетове, открити райони (16, 19) 0,1-0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) покълването се потиска от тъмнина (1, 17-19) няма специални третирания (4, 22-26) POST (4, 22 — 26) D, G, F Veronica persica (персийско великденче) A обработваеми полета, открити терени, нарушени терени (16, 19) 0,5-0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18) покълването се потиска от тъмнина (18, 19) студена стратификация (18) няма специални третирания (14) PRE & POST (28) A 32 Цитирани доставчици на семена Идентификатор на доставчика Информация за доставчика A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 — 4050 www.tropilab.com C Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 — 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 — 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 - 7333 www.thompson-morgan.com ЦИТИРАНИ ПОЗОВАВАНИЯ (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. pp 197 — 208. (7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. (10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC — Weeds. pp. 151 — 156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Personal communication. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. (16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. (21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. (22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. (23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. (24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. (25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC — Weeds. pp. 1021-1028. (28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Personal communication. (34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Допълнение 4 Примери за подходящи условия за растеж за някои растителни видове Следните условия са възприети като подходящи за 10 растителни вида и могат да бъдат използвани като насоки за изпитвания в климатични камери, също така при някои други растителни видове: Концентрация на въглероден диоксид: 350 ± 50 ppm; Относителна влажност: 70 ± 5 % през светлите периоди и 90 ± 5 % през тъмните периоди; Температура: 25 ± 3 °C през деня, 20 ± 3 °C през нощта; Времетраене на осветлението: 16 часа светлина/8 часа тъмнина при средна дължина на вълната от 400 до 700 nm; Светлина: яркост 350 ± 50 μE/m2/s, измерена непосредствено над листата. Растителните видове са: — домат (Solanum lycopersicon); — краставици (Cucumis sativus); — марули (Lactuca sativa); — соя (Glycine max); — зеле (Brassica oleracea var. capitata); — моркови (Daucus carota); — овес (Avena sativa); — английски райграс (Lolium perenne); — царевица (Zea mays); — лук (Allium cepa). В.32. ИЗПИТВАНЕ ЗА РАЗМНОЖАВАНЕ НА ПРЕДСТАВИТЕЛИ НА СЕМ. ENCHYTRAEIDAE УВОД 1. Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 220 (2004). Той е предназначен да бъде използван за оценяване на въздействието на химикали върху репродуктивната способност в почвата на червеи от вида Enchytraeus albidus Henle 1873. Той се основава главно на метод, разработен от Агенцията по околна среда, Германия (1), който е бил предмет на кръгово изпитване (2). Други методи за изпитване на токсичността на химикали към представители на сем. Enchytraeidae и земни червеи също са взети предвид (3) (4) (5) (6) (7) (8). ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ 2. Обитаващите почвата прешленести червеи от род Enchytraeus са екологично значими видове по отношение на екотоксикологичните изпитвания. Докато представителите на сем. Enchytraeidae се срещат често в почвите, обитавани от земни червеи, вярно е също така, че те често са в изобилие в много почви, които не са обитавани от земни червеи. Представителите на сем. Enchytraeidae могат да се използват при лабораторни изпитвания, както и в полуполеви и полеви изследвания. От практическа гледна точка много видове от род Enchytraeus са лесни за боравене и отглеждане и тяхното време за създаване на поколение е значително по-кратко от това на земните червеи. Продължителността на едно изпитване за размножаване на представители на сем. Enchytraeidae следователно трае само 4-6 седмици, докато при земните червеи (Eisenia fetida) то е 8 седмици. 3. Основна информация относно екологията и екотоксикологията на представителите на сем. Enchytraeidae в сухоземни условия могат да бъдат намерени в (9) (10) (11) (12). ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО 4. Възрастни (полово зрели) представители на сем. Enchytraeidae се експонират на диапазон от концентрации на изпитвания химикал, примесен с изкуствена почва. Изпитването може да бъде разделено на две стъпки: а) изпитване за определяне на обхвата, в случай че не е налице достатъчно информация, при която смъртността е основната крайна точка, оценена след две седмици експозиция, и б) окончателното изпитване за размножаване, в което се оценяват общият брой на ювенилните екземпляри, произлезли от родител, и преживяването на родителите. Продължителността на окончателното изпитване е шест седмици. След първите три седмици полово зрелите червеи се отстраняват и морфологичните промени се записват. След още три седмици се отчита броят на новоизлюпените от пашкулчетата червеи, произлезли от полово зрели индивиди. Репродуктивната способност на животните, експонирани на изпитвания химикал, се сравнява с тази на контролата(ите), за да се определи (i) концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) и/или (ii) ECx (напр. EC10, EC50), като се използва регресионен модел, за да се оцени концентрацията, която би причинила х % намаляване в репродуктивната способност. Изпитваните концентрации трябва да обхващат ECx (напр. EC10, EC50), така че ЕСх впоследствие да се получи след интерполация, вместо след екстраполация. ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНИЯ ХИМИКАЛ 5. Разтворимостта във вода, log Kow, коефициентът на разпределение почва-вода (вж. напр. глава В.18 или В.19 от настоящото приложение) и парното налягане на изпитвания химикал следва да са известни. Желателно е да е налична допълнителна информация относно съдбата на изпитвания химикал в почвата, като например скоростите на фотолиза и хидролиза. 6. Този метод за изпитване може да се използва за разтворими във вода и неразтворими химикали. Начините на прилагане на изпитвания химикал обаче съответно ще се различават. Методът за изпитване е неприложим за летливи химикали, т.е., химикали, за които константата на Хенри или коефициентът на разпределение въздух-вода е по-голям от единица, или за химикали, при които парното налягане превишава 0,0133 Pa при 25 °С. ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО 7. За да бъде изпитването валидно, при контролите следва да се изпълнят следните критерии: — Смъртността при възрастните индивиди не трябва да превишава 20 % в края на изпитването за определяне на обхвата и след първите три седмици от изпитването за размножаване. — Ако се предположи, че са били използвани 10 възрастни индивиди на съд при подготвянето на изпитването, в края му трябва да са получени средно най-малко 25 ювенилни индивиди на съд. — Коефициентът на вариация около средната величина на ювенилните индивиди не трябва да е по-голям от 50 % в края на изпитването за размножаване. Когато дадено изпитване не отговаря на посочените по-горе критерии, то следва да бъде прекратено, освен ако не може да бъде предоставена обосновка за продължаването му. Обосновката следва да се включи в протокола от изпитването. РЕФЕРЕНТЕН ХИМИКАЛ 8. Референтният химикал или трябва да се изпитва редовно, или евентуално да бъде включен във всяко изпитване, за да се провери дали откликът на изпитваните организми не се е променил значително с течение на времето. Подходящ референтен химикал е карбендазим, за когото е било доказано, че оказва въздействие върху преживяването и размножаването на представителите на сем. Enchytraeidae (13) (14), като също могат да бъдат използвани и други химикали, при които данните за токсичността са добре известни. В кръгово изпитване е използвана формулировка на карбендазим, известна с търговското наименование Derosal™, доставена от AgrEvo Company (Франкфурт, Германия) и съдържаща 360 g/l (32,18 %) активна съставка (2). Стойността на EC50 за размножаването, определена в кръговото изпитване, е в интервала 1,2 ± 0,8 mg активна съставка (a.i.) на kg суха маса (2). Ако в поредицата изпитвания е включена положителна стандартна проба за токсичност, използва се една концентрация, като броят на отделните повторения следва да е същият като този при контролите. По отношение на карбендазим се препоръчва изпитване с 1,2 mg a.i./kg сухо тегло (изпитва се във вид на течна формулировка). ОПИСАНИЕ НА ИЗПИТВАНЕТО Оборудване 9. Съдовете за изпитване следва да са направени от стъкло или друг химически инертен материал. Подходящи са стъклени буркани (напр. с обем: 0,20—0,25 литра; диаметър: ≈ 6 cm). Съдовете следва да са с прозрачни капаци (напр. стъкло или полиетилен), които са разработени така, че да намаляват изпаряването на водата, като същевременно дават възможност за газообмен между почвата и атмосферата. Капаците следва да бъдат прозрачни, за да се позволи пропускането на светлина. 10. Необходимо е обикновено лабораторно оборудване, по-специално следното: — сушилна камера; — стереомикроскоп; — pH-метър и фотометър; — подходящи точни везни; — подходящо оборудване за контрол на температурата; — подходящо оборудване за контрол на влажността (не е от съществено значение, ако съдовете за експозицията са снабдени с капаци); — инкубатор или малко помещение с климатик; — пинсети, куки или примки; — фотографска вана. Приготвяне на изкуствената почва 11. В настоящото изпитване се използва изкуствена почва (5)(7) със следния състав (на базата на сухо тегло след изсушаване до постоянно тегло при температура от 105 °C): — 10 % торфен мъх, изсушен на въздух и фино смлян (приема се размер на частиците от 2 ± 1 mm); препоръчва се да се провери дали преди използване в изпитването дадена почва, приготвена с прясна партида торф, е подходяща за отглеждане на червеите; — 20 % каолин (за предпочитане съдържанието на каолинит да е над 30 %); — приблизително от 0,3 до 1,0 % калциев карбонат (CaCO3 на прах, с квалификация „чист“) за получаване на pH, равно на 6,0 ± 0,5; количеството на калциевия карбонат за добавяне може да зависи основно от качеството/естеството на торфа; — приблизително 70 % кварцов пясък, изсушен на въздух (в зависимост от количеството на необходимия CaCO3), предимно фин пясък с над 50 % от частиците между 50 и 200 микрона. Преди използването на почвата в окончателното изпитване е препоръчително да се демонстрира пригодността на изкуствената почва за отглеждането на червеите и за постигането на критериите за валидност на изпитването. Особено е препоръчително да се направи такава проверка, за да се гарантира, че ефективността на изпитването не е изложена на риск, ако съдържанието на органичен въглерод в изкуствената почва се намали, например чрез понижаване на съдържанието на торф до 4 — 5 % и съответно повишаване на съдържанието на пясък. С подобно намаляване на съдържанието на органичен въглерод може да се намали и способността за адсорбция на изпитвания химикал в почвата (органичен въглерод) и да се увеличи наличният изпитван химикал за червеите. Беше показано, че Enchytraeus albidus може да изпълни критериите за валидност по отношение на размножаването, когато се изпитва в естествени почви с по-ниско съдържание на органичен въглерод от упоменатото по-горе (напр. 2,7 %) (15), като е експериментално установено, макар и в ограничен мащаб, че това може да се постигне и в изкуствена почва със съдържание на торф 5 %. Забележка: Когато се използва естествена почва в допълнително изпитване (напр. изпитване на по-високо стъпало), следва също да бъдат доказани пригодността на почвата и постигането на критериите за валидност на изпитването. 12. Сухите съставки на почвата се смесват старателно (напр. в голямо лабораторно устройство за смесване). Това следва да се извърши най-малко една седмица преди началото на изпитването. Смесената почва следва да се съхранява в продължение на два дни, за да се достигне равновесие при киселинността/да се стабилизира киселинността. За определянето на рН се използва смес от почва и разтвор на 1 М калиев хлорид (KCl) или 0,01 M калциев хлорид (CaCl2) в съотношение 1:5 (вж. (16) и Допълнение 3). Ако почвата е по-киселинна от изисквания диапазон (вж. точка 11), може да бъде коригирана чрез добавяне на подходящо количество CaCO3. Ако почвата е твърде алкална, може да се коригира чрез добавяне на повече от сместа, посочена в параграф 11, но без съдържание на CaCO3. 13. Максималната способност за задържане на вода (СЗВ) на изкуствената почва се определя в съответствие с процедурите, описани в допълнение 2. Един или два дни преди началото на изпитването сухата изкуствена почва предварително се навлажнява чрез добавяне на дейонизирана вода, до получаване на приблизително половината от крайното съдържание на вода, което представлява 40 до 60 % от максималната способност за задържане на вода. В началото на изпитването предварително навлажнената почва се разделя на части, съответстващи на броя изпитвани концентрации (и референтен химикал, когато е целесъобразно) и контроли. Влажността се коригира до 40—60 % от максималната СЗВ чрез добавяне на разтвор на изпитвания химикал и/или като се добавя дестилирана или дейонизирана вода (вж. точки 19—21). Съдържанието на влага се измерва в началото и в края на изпитването (чрез изсушаване до постоянно тегло при 105 °С) и следва да бъде в оптимални граници за преживяването на червеите. Приблизителна проверка на съдържанието на влага в почвата може да се извърши чрез леко стискане в ръка на почвата — ако съдържанието на влага е коректно, трябва между пръстите да се появят малки капки вода. Избор и подготвяне на изпитваните животински видове 14. Препоръчаният за изпитването вид е Enchytraeus albidus Henle 1837 (бял червей), представител на семейство Enchytraeidae (клас Oligochaeta, тип Annelida). E. albidus е един от най-големите видове измежду представителите на семейство Enchytraeidae, като е съобщавано за екземпляри, достигащи дължина до 35 mm (17) (18). Enchytraeus albidus се среща по целия свят в морски, сладководни и сухоземни местообитания, главно в разлагаща се органична материя (водорасли, компост) и рядко по ливади (9). Неговата широка екологична толерантност и някои морфологични изменения може да показват, че съществуват различни подвидове. 15. Enchytraeus albidus е достъпен в търговската мрежа като храна за риби. Следва да се провери дали отгледаните екземпляри не са замърсени от други, обикновено по-дребни видове (1) (19). Ако е налице замърсяване, всички червеи следва да се измият с вода в стъкло на Петри. След това следва да се изберат едри полово зрели екземпляри от E. albidus (с използване на стереомикроскоп) за започване на нова култура, като всички други червеи се отстраняват. E. albidus може да се отглежда лесно в широка гама от органични материали (виж допълнение 4). Жизненият цикъл при E. albidus е къс, тъй като той достига до зрелост между 33 дни (при 18 °C) и 74 (при 12 °С). В изпитвания следва да се използват само култури, които са били държани безпроблемно в лаборатория в продължение на най-малко 5 седмици (едно поколение). 16. Други видове от род Enchytraeus също са подходящи, напр. E. buchholzi Vejdovsky 1879 или E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (вж. допълнение 5). Ако се използват други видове от род Enchytraeus, те следва да бъдат ясно определени и да се отчетат причините за избора им. 17. При изпитванията се използват полово зрели червеи. Те следва да имат яйца (бели точки) в областта на клителума и да са с приблизително еднакъв размер (около 1 см в дължина). Синхронизиране при отглеждането им не е необходимо. 18. Ако представителите на семейство Enchytraeidae не са отгледани в същия тип почва и при условията (включително хранене), използвани при крайното изпитване, те трябва да бъде аклиматизирани в продължение на най-малко 24 часа и най-много до три дни. Първоначално следва да бъде аклиматизиран по-голям брой полово зрели индивиди в сравнение с необходимите за извършване на изпитването, за да се остави възможност за отстраняване на увредени или други неподходящи екземпляри. В края на периода на аклиматизация единствено червеите, които са с яйца и не проявяват поведенчески отклонения (например, опити да избягат от почвата) се избират за изпитването. Червеите внимателно се отстраняват, като се използват мека златарска пинсета, куки или примки, и се поставят в блюдо на Петри, съдържащо малко количество прясна вода. Възстановената сладка вода, както е предложено в глава В.20 от настоящото приложение („тест за възпроизвеждане на гигантска водна бълха“) се предпочита за целта, тъй като дейонизираната, деминерализираната или чешмяната вода биха могли да навредят на червеите. Червеите се проверяват под стереомикроскоп и всички, които не съдържат яйца, се отстраняват. Вземат се мерки за отстраняване и изхвърляне на всички акари или колемболи, които може да са заразили културите. Здравите червеи, които не се използват за изпитването, се връщат в изходната култура. Приготвяне на концентрации за изпитване Разтворим във вода изпитван химикал 19. Разтвор на изпитвания химикал се приготвя в дейонизирана вода в количество, достатъчно за всички повторения на една концентрация за изпитване. Препоръчително е да се използва подходящо количество вода до достигане на изискуемото съдържание на влага, т.е., 40—60 % от максималната СЗВ (вж. точка 13). Всеки разтвор на изпитвания химикал се смесва старателно с една партида от предварително навлажнена почва, преди да бъде внесен в съда за изпитване. Неразтворим във вода изпитван химикал 20. За химикалите, които са неразтворими във вода, но разтворими в органични разтворители, изпитваният химикал може да бъде разтворен във възможно най-малък обем подходящ носител (напр. ацетон). Следва да се използват само летливи разтворители. Носителят се разпръсква върху малко количество фин кварцов пясък, например 2,5 g, или се смесва с него., Носителят се отстранява чрез изпаряване в лабораторна камина в продължение най-малко на един час. Сместа от кварцов пясък и изпитван химикал се добавя в предварително навлажнената почва и старателно се смесва, след добавяне на подходящо количество дейонизирана вода, за да се получи необходимото съдържание на влага. Крайната смес се въвежда в съдовете за изпитване. 21. За малко разтворимите във вода и в органични разтворители химикали, еквивалентът на 2,0—2,5 g фино стрит кварцов пясък на изпитвателен съд се смесва с количеството изпитван химикал, така че да се получи желаната концентрация за изпитването. Сместа от кварцов пясък и изпитван химикал се добавя в предварително навлажнената почва и старателно се смесва, след добавяне на подходящо количество дейонизирана вода, за да се получи необходимото съдържание на влага. Крайната смес се разпределя между съдовете за изпитване. Процедурата се повтаря за всяка концентрация за изпитване, като се приготвя и подходяща контролна проба. 22. Химикали обикновено не следва да се изпитват в концентрации, по-високи от 1 000 mg/kg суха маса почва. Изпитването при по-високи концентрации обаче може да се изисква в съответствие с целите на определено изпитване. ПРОВЕЖДАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО Групи на изпитване и контроли 23. За всяка концентрация за изпитване в съда за изпитване (вж. точки 19-21) се поставя количество почва за изпитване, съответстващо на 20 g сухо тегло. Приготвят се и контролите без изпитвания химикал. Към всеки съд се добавя храна в съответствие с процедурите, описани в точка 29. Десет червея се разпределят на случаен принцип във всеки съд за изпитване. Червеите внимателно се прехвърлят във всеки съд за изпитване и се поставят върху повърхността на почвата, например чрез използване на мека златарска пинсета, куки или примки. Броят на повторенията за концентрациите за изпитване и за контролите зависи от използвания план за изпитването (вж. точка 34). Съдовете за изпитване се поставят в инкубатор за изпитване на случаен принцип и тези позиции се разместват веднъж седмично, също на случаен принцип. 24. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва носител, една поредица контроли, съдържащи кварцов пясък, напръскани или смесени с разтворител, следва да бъдат включени допълнително към изпитваните поредици. Концентрацията на разтворителя или на диспергиращото средство следва да е същата, като използваната в съдовете за изпитване, съдържащи изпитвания химикал. Една поредица контроли, съдържаща допълнително кварцов пясък (2,5 g за всеки съд) следва да бъде приготвена за химикали, които изискват прилагане в съответствие с процедурите, описани в точка 21. Условия на изпитването 25. Температурата на изпитването е 20 ± 2 °C. С цел да не се насърчава избягването на червеи от почвата, изпитването се провежда при контролирани цикли светлина-тъмнина (за предпочитане 16 часа светлина и 8 часа тъмнина) с осветление от 400 до 800 lux в зоната на съдовете за изпитване. 26. С цел проверка на влажността на почвата, съдовете се претеглят в началото на изпитването и един път седмично след това. Загубата на тегло се запълва чрез добавяне на подходящо количество дейонизирана вода. Следва да се отбележи, че загубата на вода може да се намали чрез поддържане на висока влажност на въздуха в инкубатора за изпитване (> 80 %). 27. Съдържанието на влага и стойността на pH трябва да се измерят в началото и в края както на изпитването за определяне на обхвата, така и на окончателното изпитване. Измерванията трябва да се извършват в контролните и третираните почвени проби (всички концентрации), подготвени и поддържани по същия начин като изпитваните култури, но несъдържащи червеи. Храна следва да се добавя само към тези почвени проби в началото на изпитването за улесняване на микробната активност. Количеството на храната следва да бъде същото като добавеното към изпитваните култури. Не е необходимо да се добавя допълнително храна към тези съдове по време на изпитването. Хранене 28. Може да се използва храна, която е в състояние да поддържа популацията от представители на сем. Enchytraeidae. Сплескани овесени ядки, за предпочитане обработени в автоклав преди употреба, за да се избегне микробно замърсяване (загряване също е целесъобразно), се считат за подходящ материал за храненето. 29. Храната се предоставя най-напред чрез смесване на 50 mg смлени сплескани овесени ядки с почвата във всеки съд, преди въвеждането на червеите. След това храна се доставя седмично до ден 21. Хранене не се извършва в ден 28, тъй като на този етап полово зрелите индивиди се отстраняват, а ювенилните червеи се нуждаят от сравнително малко допълнителна храна след този ден. Храненето по време на изпитването се състои от 25 mg смлени сплескани овесени ядки на съд, поставени внимателно върху повърхността на почвата, така че да се избегне нараняването на червеите. С цел да се намали растежът на гъбички, овесените ядки трябва да се заровят в почвата, като се покриват с малки количества от почвата. Ако храната остава неизядена, дажбата трябва да бъде намалена. План за изпитването за определяне на обхвата 30. Когато е необходимо, се провежда изпитване за определяне на обхвата, например за пет концентрации на изпитвания химикал от 0,1, 1,0, 10, 100 и 1 000 mg/kg (сухо тегло на почвата). За всяка третирана и контролна проба е достатъчно едно повторение. 31. Продължителността на изпитването за определяне на обхвата е две седмици. В края на изпитването се оценява смъртността на червеите. Червеят се отчита като мъртъв, когато не реагира на механичен стимул в предния край. Допълнителна информация за смъртността може също да бъде полезна при вземането на решение за диапазона на концентрациите, които да се използват в окончателното изпитване. Промени в поведението (напр. не е способен да копае в почвата; лежи неподвижно срещу стъклената стена на съда за изпитване) и морфологията (напр. наличие на открити рани) на полово зрелите индивиди също следва да бъдат записвани заедно с наличието на ювенилни екземпляри. Последното може да се определи с помощта на метода с оцветяване, описан в допълнение 6. 32. Стойността на LC50 може да бъде приблизително определена чрез изчисляване на геометричната средна стойност от данните за смъртността. При определяне на диапазона на концентрациите за окончателното изпитване, въздействието върху размножаването се приемат с по-ниска стойност от стойността на LC50 с коефициент в размер до 10. Това обаче е емпирична зависимост и във всеки конкретен случай би могла да бъде различна. Допълнителните наблюдения при изпитването за определяне на обхвата, като срещането на ювенилни екземпляри, могат да допринесат за по-точно определяне на диапазона на концентрациите на изпитвания химикал, които да се използват за окончателното изпитване. 33. С цел точно определяне на LC50 се препоръчва изпитване с използване най-малко на четири повторения за всяка от концентрациите на изпитвания химикал, и достатъчен брой концентрации за получаване на най-малко четири статистически значими различни средни отклика при тези концентрации. Когато се прилагат контроли, за тях се използва подобен брой концентрации и повторения. План за окончателното изпитване за размножаване 34. Въз основа на препоръките от кръгово изпитване се предлагат три вида планове (2) — За определяне на NOEC следва да се изпитат най-малко пет концентрации в геометрична прогресия. Препоръчват се четири повторения за всяка концентрация за изпитване, плюс осем контроли. Концентрациите трябва да бъдат разделени една от друга с кратност, която не превишава 1,8. — За определяне на ECx (напр. EC10, EC50) следва да се изпитат поне пет концентрации, като те трябва да обхващат ECx, за да се даде възможност за определяне на ECx чрез интерполация, а не чрез екстраполация. Препоръчват се най-малко по четири повторения за всяка изпитвана концентрация и четири контролни повторения. Кратността на разделянето може да варира, т.е., да е по-малка или равна на 1,8 в диапазона на очакваното въздействие и над 1,8 при по-високите и по-ниските концентрации. — Комбиниран подход дава възможност за едновременно определяне на NOEC и ЕСх. Следва да бъдат използвани осем концентрации на третиране в геометрична прогресия. Препоръчват се четири повторения за всяко третиране, плюс осем контроли. Концентрациите трябва да бъдат разделени една от друга с кратност, която не превишава 1,8. 35. Трябва да бъдат използвани по десет полово зрели червея на съд за изпитване (вж. точка 23). Храната се добавя в стъклените съдове за изпитване в началото на теста, след това веднъж седмично (вж. точка 29) включително до ден 21. В ден 21 почвените проби се подлагат на внимателно ръчно претърсване и живите полово зрели червеи се наблюдават и отчитат и се записват промените в поведението (напр. неспособност да се копае в почвата; лежане неподвижно срещу стъклената стена на съда за изпитване) и морфологията (напр. наличие на открити рани). След това всички полово зрели червеи се отстраняват от съдовете за изпитване и от изпитваната почва. Използваната при изпитването почва и всички получени пашкулчета, съдържащи се в нея, се инкубират в продължение на три допълнителни седмици при същите условия на изпитване, с изключение на това, че храненето се извършва само в ден 35 (т.е. 25 mg смлени сплескани овесени ядки, за всеки съд). 36. След шест седмици новоизлюпените червеи се преброяват. Методът, основан на оцветяване в бенгалско червено (вж. допълнение 6), се препоръчва, въпреки че други техники, като извличане с вода (но не с топлина) и флотация (вж. допълнение 6), също са се оказали подходящи (4) (10) (11) (20). Оцветяването в бенгалско червено се препоръчва, тъй като извличането с вода от почвата може да се възпрепятства от мътност, причинена от суспендирани частици глина. Гранично изпитване 37. Ако при изпитването за определяне на обхвата не се наблюдават въздействия при най-високата концентрация (т.е. 1 000 mg/kg), изпитването за размножаването може да бъде проведено като гранично изпитване, като се използва 1 000 mg/kg, за да се покаже, че NOEC за размножаването е по-висока от тази стойност. Обобщение и график за провеждане на изпитването 38. Етапите на изпитването могат да бъдат обобщени както следва: Време Изпитване за определяне на обхвата Окончателно изпитване Ден – 7 или по-рано — приготвяне на изкуствена почва (смесване на сухи съставки) — приготвяне на изкуствена почва (смесване на сухи съставки) Ден – 5 — проверява се pH на изкуствената почва — измерва се максималната СЗВ на почвата — проверява се pH на изкуствената почва — измерва се максималната СЗВ на почвата Ден – 5 до – 3 — сортиране на червеите с оглед на аклиматизацията — сортиране на червеите с оглед на аклиматизацията Ден – 3 to 0 — червеите се аклиматизират в продължение на поне 24 часа — червеите се аклиматизират в продължение на поне 24 часа Ден – 1 — предварително намокряне на изкуствената почва и разделяне на партиди — предварително намокряне на изкуствената почва и разделяне на партиди Ден 0 — приготвят се изходни разтвори — прилага се изпитваният химикал — претегляне на изпитвания субстрат в съдовете за изпитване — смесване на храната — въвеждане на червеите — измерване на рН и съдържанието на влага на почвата — приготвят се изходни разтвори — прилага се изпитваният химикал — претегляне на изпитвания субстрат в съдовете за изпитване — смесване на храната — въвеждане на червеите — измерване на рН и съдържанието на влага на почвата Ден 7 — проверка на съдържанието на влага на почвата — проверка на съдържанието на влага на почвата — фуражи Ден 14 — определяне на смъртността при полово зрелите индивиди — оценка на броя ювенилни индивиди — измерване на рН и съдържанието на влага на почвата — проверка на съдържанието на влага на почвата — хранене Ден 21 — наблюдение на поведението на полово зрелите индивиди — отстраняване на полово зрелите индивиди — определяне на смъртността при полово зрелите индивиди — проверка на съдържанието на влага на почвата — фуражи Ден 28 — проверка на съдържанието на влага на почвата — без хранене Ден 35 — проверка на съдържанието на влага на почвата — хранене Ден 42 — преброяване на ювенилните червеи — измерване на рН и съдържанието на влага на почвата ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ Обработка на резултатите 39. Въпреки че в допълнение 7 е направен общ преглед, в настоящия метод за изпитване не се дават окончателни насоки за статистически анализ на резултатите от изпитването. 40. В изпитването за определяне на обхвата основната крайна точка е смъртността. Промени в поведението (напр. неспособност за копаене в почвата; лежане неподвижно срещу стъклената стена на съда за изпитване) и морфологията (напр. открити рани) на полово зрелите индивиди следва обаче също да бъдат записвани, заедно с наличието на ювенилни екземпляри. Обичайно за определяне на LC50 следва да се прилагат пробит-анализ (21) или логистична регресия. Независимо от това в случаите, когато този метод за анализ е неподходящ (например, ако на разположение са по-малко от три концентрации с частично проявена смъртност), могат да се използват алтернативни методи. Тези методи могат да включват хлъзгащи средни (22), метод на Спирмън-Карбър с изключване на данни (23) или обикновена интерполация (напр. геометрична средна стойност на LC0 и LC100, изчислена чрез корен квадратен на LC0, умножена по LC100). 41. При окончателното изпитване крайна точка на изпитване е плодовитостта (т.е. брой на получените ювенилни индивиди). Независимо от това, също както и при изпитването за определяне на обхвата, всички други признаци за неблагоприятно въздействие трябва да бъдат записани в окончателния протокол. За изчисляване на размножаването статистическият анализ изисква средноаритметичната стойност и стандартното отклонение за всяко отделно третиране и за контролата. 42. Ако е направен дисперсионен анализ, стандартното отклонение s и степените на свобода df могат да бъдат заменени съответно с обединената оценка на дисперсията, получена от ANOVA, и от нейните степени на свобода, при условие че дисперсията не зависи от концентрацията. В такъв случай се използват единичните дисперсии на контролната и на третираните проби. Тези стойности обикновено се изчисляват с търговски статистически софтуер, с използване на резултатите по съдове като повторения. Ако обединяването на данни за негативните контроли и контролите на разтворител изглежда по-разумно, отколкото изпитването само на една от тях, те трябва да бъдат тествани дали не са значимо различни (за подходящи тестове вж. точка 45 и допълнение 7). 43. Допълнителното статистическо тестване и статистическите изводи и заключения зависят от това дали стойностите на повторенията са нормално разпределени и са с хомогенна дисперсия. Оценка на NOEC 44. Следва да се предпочита прилагането на мощни тестове. За това дали данните са приблизително нормално разпределени следва да се използва информация, например от предходен опит с кръгови изпитвания или от други данни за предходни периоди. Хомогенността на дисперсията (хомоскедастичността) е по-важна. Опитът показва, че дисперсията често се увеличава с увеличаването на средната стойност. В тези случаи преобразуване на данните би могло да доведе до хомоскедастичност. Такава трансформация обаче следва да се основава на опита, натрупан с данните за предходни периоди, вместо с данните, които са предмет на проучването. При хомогенни данни следва да се използват множествени t-тестове като тестът на Уйлямс (α = 0,05, едностранен) (24) (25) или, в някои случаи, тестът на Дънет (26) (27). Следва да се отбележи, че в случай на неравни повторения табличните t-стойности трябва да се коригират, както се предлага от Дънет и Уйлямс. В някои случаи, поради наличието на големи колебания, отклиците не се увеличават/намаляват регулярно. В този случай на голямо отклонение от монотонността тестът на Дънет е по-подходящ. Ако са налице отклонения от хомоскедастичността, може да е уместно да се проучат по-подробно възможните въздействия върху дисперсията, за да се вземе решение дали могат да бъдат прилагани t-тестове без да се губи много мощност (28). Множествен U-тест като например U-тестът на Бонферони по Holm (29) или — когато тези данни показват хетероскедастичност, но иначе са съобразени с базисната монотонна зависимост доза-отклик — друг непараметричен тест [напр. на Йонкхере-Терпстра (30) (31) или на Шърли (32) (33)] могат да бъдат прилагани като алтернатива и като цяло се предпочитат пред t-тестовете при неравна дисперсия. (виж също и схемата в допълнение 7). 45. Ако e извършено гранично изпитване и критериите за използване на параметрични тестови процедури (нормалност, хомогенност) са изпълнени, може да се използва на t-тестът на Стюдънт за сравнения по двойки, или в противен случай — процедурата на U-теста на Ман-Уитни (29). Оценка на ECx 46. За да се изчисли стойността на ECx средните стойности от всяко третиране се използват за извършване на регресионен анализ (линеен или нелинеен), след като е получена подходяща функция доза-отклик. За растежа на червеите като непрекъснат отклик стойностите на ECx могат да се оценят с използване на подходящ регресионен анализ (35). Сред подходящите функции за двоични данни (смъртност/преживяване и брой получени новородени индивиди) са нормалната сигмоидна, логистичната функция или функцията на Вейбул, съдържащи от два до четири параметъра, като някои от тях могат също така да моделират хорметични отклици. Ако функция доза-отклик е била изгладена с линеен регресионен анализ, при този анализ трябва да е получен значим r2 (коефициент на детерминация) и/или наклон преди изчисляване на ЕСх чрез добавяне на стойност, съответстваща на х % от средната стойност на контролна проба, в полученото чрез регресионен анализ уравнение. 95 %-ните доверителни граници се изчисляват по Fieller (цитиран във Finney (21)) или с други подходящи съвременни методи. 47. Като алтернативна възможност откликът се моделира като процент или пропорция от параметър на модел, който се тълкува като средна стойност на отклика на контролната проба. В тези случаи нормалната (логистична, на Вейбул) сигмоидна крива може често да бъде лесно изгладена по отношение на резултатите, като се използва пробит-регресия (21). В тези случаи функцията на претеглянето трябва да бъде коригирана за метрични отклици, както е по Christensen (36). Въпреки това, ако е наблюдаван хормезис, пробит-анализът следва да бъде заменен с логистична функция с четири параметъра, или функция на Вейбул, изгладена чрез нелинейна регресия (36). Ако подходяща функция доза-отклик функция не може да се съгласува с данните, може да се използват алтернативни методи за оценяване на ECx и нейните доверителни граници, като хлъзгащи средни по Томпсън (22) и метод на Спирмън-Карбър с изключване на данни (23). ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО 48. Протоколът от изпитването трябва да съдържа следната информация: Изпитван химикал: — физична природа и, където е уместно, съответните физични и химични свойства (например водоразтворимост, парно налягане); — химична идентификация на изпитвания химикал според номенклатурата на IUPAC, номер по CAS, партида, пратка, структурна формула и чистота; — дата на валидност на пробата: Изпитван вид: — използвани в изпитването животни: вид, научно наименование, източник на организмите и условия на отглеждане; Условия на изпитване: — съставки и приготвяне на изкуствената почва; — метод за прилагане на изпитвания химикал: — описание на условията на изпитване, включително температура, съдържание на влага, pH и др.; — пълно описание на плана на проучването и на процедурите. Резултати от изпитването: — смъртност при полово зрели червеи след две седмици и брой на ювенилните екземпляри в края на изпитването за определяне на обхвата; — смъртност при полово зрели червеи след експозиция от три седмици и пълно описание на ювенилните екземпляри в края на окончателното изпитване; — всички наблюдавани физиологични или патологични симптоми и промени в поведението на изпитваните организми; — стойностите на LC50, NOEC и/или ECx (напр. EC50, EC10) за размножаването, ако някои от тях са приложими с доверителни интервали, и графика на изгладения модел, използвана за изчисляването им, цялата информация и полезни наблюдения за тълкуване на резултатите; Отклонения от процедурите, описани в настоящия метод за изпитване, и всички необичайни обстоятелства по време на изпитването. ЛИТЕРАТУРА (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. (3) Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. (5) Глава В.8 от настоящото приложение „Токсичност за земни червеи“ (6) ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. (7) ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. (8) Rundgren, S. and A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. (11) Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen — Prüfungskategorien der Forschung. UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. (14) Römbke, J. and Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. (15) Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. (16) ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. (17) Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. (18) Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. (19) Bouguenec, V. and Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. (20) Korinkova, J. and Sigmund, J. (1