РЕГЛАМЕНТ (ЕО) № 440/2008 НА КОМИСИЯТА

от 30 май 2008 година

за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH)

(текст от значение за ЕИП)

КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,

като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,

като взе предвид Регламент (EО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/EО и за отмяна на Регламент (EИО) № 793/93 на Съвета и Регламент (EО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/EИО на Съвета и директиви 91/155/EИО, 93/67/EИО, 93/105/EО и 2000/21/EО на Комисията (1), и по-специално член 13, параграф 3 от него,

като има предвид, че:

ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:

Член 1

Методите на изпитване, които следва да се прилагат за целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006, са посочени в приложението към настоящия регламент.

Член 2

Когато е целесъобразно, Комисията ще преразгледа методите на изпитване, съдържащи се в настоящия регламент, с цел заместване, намаляване или усъвършенстване на изпитванията върху гръбначни животни.

Член 3

Всички позовавания на приложение V към Директива 67/548/ЕИО се тълкуват като позовавания на настоящия регламент.

Член 4

Настоящият регламент влиза в сила в деня след публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз.

(1) ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 1.

(2) ОВ X 196, 16.8.1967 г., стр. 1. Директива, последно изменена с Директива 2006/121/ЕО на Европейския парламент и на Съвета (ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 850) — ще последва актуализация със съответни препратки веднага след публикуването на 30-то адаптиране към техническия прогрес.

ASTM D 5296-92, 1992. Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, 1991. Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography — GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds., 1979. Modem Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Amiya, S., et al., 1990. Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

Garmon, R. G., 1975. End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

Morris, C. E. M., 1989. Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

ASTM 3592-77, 1977. Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Coll, H., 1989. Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.

ASTM D 3750-79, 1979. Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Glover, C. A., 1975. Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

Billmeyer, F. W. Jr., 1984. Textbook of Polymer Science, 3rd Ed., John Wiley, New York.

ASTM D 5296-92, 1992. Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, 1991. Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography – GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, 1979. Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

NF T 20-036 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of explosion risk.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-041 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

NF T 20-042 (SEPT 85), Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

R. F. Rekker, The hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Am. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

C. Hansch, A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

W. J. Lyman, W. F. Rehl and D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978.

J. K. Seydel and K. J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Activitaetvon Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.

C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani and E. J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1 207.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

C. V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 459.

NF T 20-043 AFNOR, 1985. Chemical products for industrial use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219.

Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

C. Hansch and A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.

NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.

R. Weissberger ed.; Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.

ASTM D 2879-86, Standart test method for vapour pressure — tempetature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa — Vapor pressure balance method.

NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa — Static method.

R.Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.

Determination of the density of soils (Определяне на плътността на почви)

Chemical products for industrial use — Détermination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric method (Химични продукти за индустриална употреба — определяне на плътността на твърди вещества в прахове и течности — пикнометричен метод);

Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics (Метод В: Методи за определяне на плътността и относителната плътност на пластмаси с изключение на разпенени пластмаси);

Chemical products for industrial use — Détermination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric method (Химични продукти за индустриална употреба — определяне на плътността на твърди вещества в прахове и течности — пикнометричен метод);

Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary — stoppered pycnometer method (Метод за определяне на относителната плътност и плътността на нефтени продукти с капилярка — метод със запушен пикнометър);

Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) (Метод за определяне на специфичното тегло и плътността на нефтени продукти (метод с градуиран двукапилярен пикнометър);

Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density (Точка 7: Изследване на минерални масла и свързаните с тях продукти; определяне на плътността);

Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer (Изпитване на бои, лакове и подобни продукти; определяне на плътността чрез пикнометър);

Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) (Пикнометър с вграден термометър и странична капилярна тръбичка (за течности, които не са твърде вискозни));

Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol — water mixture) (Пикнометър на Йолм (по-специално за смес етанол—вода));

Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801) (Пикнометър на Бингам (за течности както в DIN 12801));

Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) (Пикнометър на Хубард (за вискозни течности от всички типове, които нямат много високо налягане на парите, по-специално също и за бои, лакове и битуми));

Reischauer pyenometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00.10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC) (Пикнометър на Райшауер (за течности с кинематиченвискозитет по-малък от 100.10-6 m2 s-1 при 20 oС, приложим по-специално също и за въглеводороди и водни разтвори, както и за течности с по-високо налягане на парите, приблизително 100 kPa при 90 oС));

Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798) (Пикнометър на Шпренгел (за течности както в DIN 12798));

Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100.10-6 m2 s-1 at 15 oC) (Пикнометър на Липкин (за течности с кинематичен вискозитет, по-малък от 100.10-6 m2 s-1 при 15 oС));

Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous) (Пикнометър на Гей-Люсак (за нелетливи течности, които не са много вискозни));

Liquid chemical products; determination of density at 20 oC (Течни химични продукти; определяне на плътността при 20 oС);

Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method (Изпитване на бои, лакове и подобни материали за покрития; определяне на плътността; метод с потопено тяло)

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method (Плътност, специфично тегло или API относително тегло на суров нефт и течни нефтени продукти чрез хидрометричен метод);

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method (Плътност, специфично тегло или API относително тегло на суров нефт и течни нефтени продукти чрез хидрометричен метод);

Testing of mineral oils and related materials; determination of density (Изпитване на минерални масла и свързани с тях материали; определяне на плътността);

Testing of plastics and elastomers; determination of density (Изследване на пластмаси и еластомери; определяне на плътността);

Specific gravity and density of plastics by displacement (Относително тегло и плътност на пластмаси чрез изместване);

Chemical products for industrial use — Determination of the density of solids other than powders and cellular products — Hydrostatic balance method (Химични продукти за индустриална употреба. Определяне плътността на твърди вещества с изключение на прахообразни и разпенени продукти — метод с хидростатична везна);

Method A: Methods for determining the density and relative density of рlastics excluding cellular plastics (Метод А: Методи за определяне на плътността и относителната плътност на пластмаси с изключение на пенопластмаси) ;

Chemical products for industrial use — Determination of density of liquids — Areometric method (Химични продукти за индустриална употреба — определяне плътността на течности — ареометричен метод);

Part III: Use and test (Част III: Употреба и методи за изпитване).

Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use (Част I: Ареометри за плътност: конструкция, настройка и употреба);

IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and Applied Chemistry, 1976, vol. 48, 508.

R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ. New York, 1959, vol. I, Part 1.

Standard definitions of terms relating to thermal analysis (Стандартни определения на термините, отнасящи се до термичния анализ)

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis (Стандартен метод за оценка на термичната устойчивост на химикали чрез методите на диференциалния термичен анализ)

Method for the determination of distillation characteristics (Метод за определяне на дестилационни характеристики)

Method for determination of distillation of petroleum products (Метод за определяне на дестилацията на нефтени продукти)

Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range) Метод за изпитване на дестилацията (дестилационен добив и дестилационен обхват)

Standard test method for boiling point of engine anti-freezes (Стандартен метод за определяне на температурата на кипене на антифриз за двигатели)

R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.

Standard test method for pour point of petroleum oils (Стандартен метод за определяне на точката на застиване на нефтени масла)

Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monstememing en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt

Standard definitions of terms relating to thermal analysis (Стандартни определения на термините, отнасящи се до термичния анализ)

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis (Стандартен метод за оценка на термичната устойчивост на химикали чрез методите на диференциалния термичен анализ)

Standard definitions of terms relating to thermal analysis (Стандартни определения на термините, отнасящи се до термичния анализ)

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis (Стандартен метод за оценка на термичната устойчивост на химикали чрез методите на диференциалния термичен анализ)

Method for the determination of the freezing point (Метод за определяне на точката на замръзване)

Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve) (Метод за определяне на точката на топене на нефтен парафин (крива на охлаждане)

Method for the determination of crystallizing point (Метод за определяне на точката на кристализация)

Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials (Стандартни характеристики на материали за шприцоване под налягане и екструдиране на основата на ацетални смоли)

Testing methods for melting point of chemical products (Методи за изпитване на точката на топене на химически продукти)

Method for the determination of melting point and/or melting range (Метод за определяне на точка на топене и/или интервал на топене)

Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals (Стандартен метод за изпитване на относителната начална и крайна точка на топене и областите на топене на органични химикали)

IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.

R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

ЧАСТ Б: МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТОКСИЧНОСТТА И ДРУГИ ЕФЕКТИ ВЪРХУ ЗДРАВЕТО

СЪДЪРЖАНИЕ

ОБЩО ВЪВЕДЕНИЕ

Б.1А. ОСТРА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ — ПРОЦЕДУРА С ФИКСИРАНИ ДОЗИ

Б.1Б. ОСТРА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ — МЕТОД КЛАС ОСТРА ТОКСИЧНОСТ

Б.2. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ (ИНХАЛАТОРНА)

Б.3. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ (ДЕРМАЛНА)

Б.4. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ: КОЖНО ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ

Б.5. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ: ОЧНО ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ

Б.6. КОЖНА СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ

Б.7. ТОКСИЧНОСТ НА ПОВТАРЯЩА СЕ (ОРАЛНА) ДОЗА (28 ДНИ)

Б.8. ТОКСИЧНОСТ (ИНХАЛАТОРНА) С МНОГОКРАТНИ ДОЗИ (28 ДНИ)

Б.9. ТОКСИЧНОСТ (ДЕРМАЛНА) С МНОГОКРАТНИ ДОЗИ (28 ДНИ)

Б.10. МУТАГЕННОСТ — ТЕСТ IN VITRO ЗА ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ

Б.11. МУТАГЕННОСТ — ТЕСТ IN VIVO ЗА ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ В КОСТНИЯ МОЗЪК НА БОЗАЙНИЦИ

Б.12. МУТАГЕННОСТ — IN VIVO МИКРОЯДРЕН ТЕСТ НА ЕРИТРОЦИТИ ОТ БОЗАЙНИЦИ

Б.13/14. МУТАГЕННОСТ — БАКТЕРИИ ЗА ТЕСТВАНЕ НА ОБРАТНИ МУТАЦИИ

Б.15. ИЗПИТВАНЕ ЗА МУТАГЕННОСТ И ПРЕСЯВАЩО ИЗПИТВАНЕ ЗА КАНЦЕРОГЕННОСТ НА ГЕННИ МУТАЦИИ — SАССНАRОМYСЕS СЕREVISIAE

Б.16. МИТОТИЧНИ РЕКОМБИНАЦИИ — SАССНАRОМYСЕS СЕREVISIAE

Б.17. МУТАГЕННОСТ — IN VITRO ТЕСТ ЗА КЛЕТЪЧНИ ГЕННИ МУТАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ

Б.18. УВРЕЖДАНЕ И РЕПАРАЦИЯ НА ДНК — НЕПЛАНИРАН СИНТЕЗ НА ДНК КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ (IN VITRO )

Б.19. ИЗПИТВАНЕ IN VITRO ЗА ОБМЕНИ НА СЕСТРИНСКИ ХРОМАТИДИ

Б.20. ИЗПИТВАНЕ ЗА ПОЛОВО СВЪРЗАНА РЕЦЕСИВНА ЛЕТАЛНОСТ ПРИ DROSOPHILA MELANOGASTER

Б.21. ИЗПИТВАНИЯ IN VITRO ЗА ТРАНСФОРМАЦИИ В КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ

Б.22. ИЗПИТВАНЕ ЗА ДОМИНАНТНА ЛЕТАЛНОСТ ПРИ ГРИЗАЧИ

Б.23. ТЕСТ ЗА СПЕРМАТОГОНИАЛНИ ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ ПРИ БОЗАЙНИЦИ

Б.24. ИЗПИТВАНЕ ЗА ПЕТНА ПО КОЗИНАТА ПРИ МИШКИ

Б.25. НАСЛЕДСТВЕНИ ТРАНСЛОКАЦИИ ПРИ МИШКИ

Б.26. ТЕСТВАНЕ НА СУБХРОНИЧНА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ — 90-ДНЕВНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА ТОКСИЧНОСТТА ПРИ ГРИЗАЧИТЕ С ПОВТАРЯЩА СЕ ДОЗА

Б.27. ИЗСЛЕДВАНЕ НА СУБХРОНИЧНА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ — 90-ДНЕВНО ИЗСЛЕДВАНЕ НА ТОКСИЧНОСТТА ПРИ НЕ ГРИЗАЧИ С ПОВТАРЯЩА СЕ ДОЗА

Б.28. ИЗПИТВАНЕ ЗА СУБХРОНИЧНА ДЕРМАЛНА ТОКСИЧНОСТ — 90-ДНЕВНИ МНОГОКРАТНИ ДЕРМАЛНИ ДОЗИ ПРИ ГРИЗАЧИ

Б.29. ИЗПИТВАНЕ ЗА СУБХРОНИЧНА ИНХАЛАЦИОННА ТОКСИЧНОСТ — 90-ДНЕВНИ МНОГОКРАТНИ ИНХАЛАЦИОННИ ДОЗИ ПРИ ГРИЗАЧИ

Б.30. ИЗПИТВАНЕ ЗА ХРОНИЧНА ТОКСИЧНОСТ

Б.31. ИЗПИТВАНЕ ЗА ОЦЕНКА НА ТОКСИЧНОСТТА ЗА ПРЕНАТАЛНОТО РАЗВИТИЕ

Б.32. ИЗПИТВАНЕ ЗА КАНЦЕРОГЕННОСТ

Б.33. КОМБИНИРАНО ИЗПИТВАНЕ ЗА ХРОНИЧНА ТОКСИЧНОСТ/КАНЦЕРОГЕННОСТ

Б.34. ИЗПИТВАНЕ ЗА ТОКСИЧНОСТ ЗА РАЗМНОЖАВАНЕТО В ЕДНО ПОКОЛЕНИЕ

Б.35. ИЗПИТВАНЕ ЗА РЕПРОДУКТИВНА ТОКСИЧНОСТ В ДВЕ ПОКОЛЕНИЯ

Б.36. ТОКСИКОКИНЕТИКА

Б.37. ЗАБАВЕНА НЕВРОТОКСИЧНОСТ КЪМ ОРГАНИЧНИ ФОСФОРСЪДЪРЖАЩИ ВЕЩЕСТВА СЛЕД ОСТРО ИЗЛАГАНЕ

Б.38. ЗАБАВЕНА НЕВРОТОКСИЧНОСТ КЪМ ОРГАНИЧНИ ФОСФОРСЪДЪРЖАЩИ ВЕЩЕСТВА НА 28-ИЯ ДЕН В ПРОУЧВАНЕ ЗА ПОВТАРЯЩА СЕ ДОЗА

Б.39. ИЗПИТВАНЕ ЗА НЕРЕПАРАТИВЕН СИНТЕЗ НА ДНК (НСД) С ЧЕРНОДРОБНИ КЛЕТКИ ОТ БОЗАЙНИЦИ IN VIVO

Б.40. IN VITRO КОЖНА КОРОЗИЯ: ТРАНСКУТАННО ИЗМЕРВАНЕ НА ЕЛЕКТРИЧЕСКОТО СЪПРОТИВЛЕНИЕ НА КОЖАТА (TER)

Б.40А. IN VITRO КОЖНА КОРОЗИЯ: ИЗПИТВАНЕ ВЪРХУ МОДЕЛ НА ЧОВЕШКА КОЖА

Б.41. IN VITRO 3T3 NRU ИЗПИТВАНЕ ЗА ФОТОТОКСИЧНОСТ

Б.42. КОЖНА СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ: ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЛОКАЛНИТЕ ЛИМФНИ ВЪЗЛИ

Б.43. НЕВРОТОКСИКОЛОГИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ ПРИ ГРИЗАЧИ

Б.44. КОЖНА АБСОРБЦИЯ: IN VITRO МЕТОД

Б.45. КОЖНА АБСОРБЦИЯ: IN VIVO МЕТОД

ОБЩО ВЪВЕДЕНИЕ

А. ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПРОУЧВАНОТО ВЕЩЕСТВО

Преди началото на всяко едно проучване на токсичност следва да се знае съставът на проучваното вещество, включително основните примеси, както и съответстващите физикохимични свойства, включително стабилност.

Физикохимичните свойства на проучваното вещество предоставят важна информация за избор на пътя на прилагане на веществото, за проектиране на всяко отделно проучване, както и за начина на работа и съхранение на проучваното вещество.

Създаването на аналитичен метод за количествено и качествено определяне на проучваното вещество (включително основните примеси, при възможност) в средата за дозиране, както и в биологичния материал, следва да предхожда началото на проучването.

Цялата информация, отнасяща се до идентифицирането, физикохимичните свойства, чистотата и поведението на проучваното вещество, следва да бъде включена в доклада за теста.

Б. ГРИЖИ ЗА ЖИВОТНИТЕ

Строгият контрол на условията на заобикалящата среда и техниката за добри грижи към животните са основни изисквания за тестовете върху токсичност.

i) Условия на отглеждане

Условията на средата в стаите или определените места на експерименталните животни следва да бъдат подходящи за проучваните видове. Подходящи условия за плъхове, мишки и морски свинчета са стайна температура – 22o С ± 3o С при относителна влажност от 30 до 70 %; за зайците температурата следва да бъде 20 + 3o С при относителна влажност от 30 до 70 %.

Някои експериментални техники са особено чувствителни към температурните ефекти, ето защо в такива случаи в описанието на тестовия метод се посочват всички подробности за подходящите условия. Във всички изследвания за токсични ефекти температурата и влажността следва да се мониторират, записват и включат в окончателния доклад на проучването.

Осветлението е изкуствено, последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. Подробностите, свързани с начина на осветление, се записват и включват в окончателния доклад на проучването.

Ако няма други изисквания, специални за метода, животните могат да се отглеждат индивидуално или в клетки на малки групи от един и същи пол; при групово отглеждане не бива да има повече от пет животни в клетка.

В докладите за експериментални животни е важно да се посочат видът на клетката и броят на животните, обитаващи всяка една клетка, както по време на излагане на действието на химическото вещество, така и в последвалия период на наблюдение.

ii) Условия на хранене

Диетата следва да отговаря на всички хранителни изисквания на видовете, участващи в теста. При прилагане на проучваните вещества в храната на животните хранителната стойност на последната може да бъде намалена поради взаимодействие между веществото и хранителните съставки. Възможността за такава реакция следва да се отчита при интерпретиране на резултатите от теста. Уместно е да се използват конвенционални лабораторни храни при неограничено количество вода за пиене. Изборът на храната се влияе от необходимостта да се осигури подходяща смес за проучваното вещество при прилаганата му по този метод.

Хранителните примеси, за които се знае, че влияят на токсичността, не бива да присъстват в интерфериращи концентрации.

В. АЛТЕРНАТИВНО ТЕСТВАНЕ

Европейският съюз се е ангажирал с насърчаване на развитието и узаконяването на алтернативни техники, които могат да предоставят същото ниво на информация, както и настоящите тестове с животни, но използват по-малко животни, причиняват по-малко страдание или изобщо избягват употребата на животни.

След като станат достъпни, тези методи трябва да се имат предвид винаги, когато е възможно, за характеризиране на риска и последваща класификация и етикетиране на съществени рискове.

Г. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

При оценка и интерпретация на тестовете следва да се има предвид границата на областта, до която резултатите от проучванията сред животни и in vitro могат да бъдат директно екстраполирани към човека. Ето защо данните за наличие на странични ефекти при хората, където ги има, могат да се използват за потвърждение на опитните резултати.

Д. ПРЕПРАТКИ

Повечето от тези методи са създадени в рамките на програмата на ОИСР за изработване на ръководство за тестове и следва да се прилагат в съгласие с принципите за добрата лабораторна практика, така че да се осигури възможно най-широко „взаимно приемане на данните“.

Допълнителна информация може да се намери в препратките на ръководството на ОИСР, както и в съответната литература, публикувана на други места.

Б.1А. ОСТРА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ — ПРОЦЕДУРА С ФИКСИРАНИ ДОЗИ

1. МЕТОД

Този метод за изпитване е еквивалентен на ОИСР ТG 420 (2001).

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

При традиционните методи за оценяване на остра токсичност като краен резултат се достига до смърт на използваните животни. През 1984 г. бе предложен нов подход за тестване на остра токсичност от Британското токсикологично дружество, основаващ се на определяне на поредица от нива с фиксирани дози (1). При този подход се избягва смъртта на животните в края на експериментите и се разчита изпяло на наблюдението за ясни признаци за токсичност във всяка поредица от нива с фиксирани дози. След направените в Обединеното кралство (2) и международните (3) изследвания in vivo за утвърждаване процедурата бе одобрена като метод за изпитване през 1992 г. Впоследствие статистическите възможности на процедурата с фиксирани дози са оценени чрез използването на математически модели в поредица от изследвания (4) (5) (6). Едновременно, изследванията in vivo и тези чрез създаване на модели показват, че процедурата е репродуктивна, използва по-малко животни и причинява по-малко страдание от традиционните методи и дава възможност да се категоризират веществата по начин, подобен на този при другите методи за изпитване на остра токсичност.

Насоки за избор на най-подходящия метод за изследване с определена цел могат да бъдат намерени в Ръководството за провеждане на изследвания на остра орална токсичност (7). Това ръководство също съдържа допълнителна информация за провеждането и интерпретирането на метода за изследване Б.1А.

В този метод по принцип се използват само дози с умерена токсичност и следва да се избягва прилагането на дози, за които се очаква да са летални. Така също дози, за които е известно, че могат да причинят болка и страдание поради корозивни или силно дразнещи въздействия, не следва да бъдат прилагани. Умиращите животни или животните, очевидно изпитващи болка или показващи признаци на дълбоко и продължително страдание, се убиват по хуманен начин и се вземат предвид при интерпретирането на резултатите по същия начин, както животните, умрели по време на експеримента. Критериите за вземане на решение да бъде убито умиращо или дълбоко страдащо животно и насоките за разпознаване на предвидима или предстояща смърт са предмет на отделно ръководство (8).

Методът осигурява информация за опасните свойства и позволява веществото да бъде категоризирано и класифицирано съгласно Глобалната система за хармонизиране (GHS) на класификацията на химични вещества, които причиняват остра токсичност (9).

Лабораториите за изпитване следва да вземат предвид цялата налична информация за изпитваното вещество преди провеждане на експеримента. Такава информация включва идентичността и химичната структура на веществото; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vitro или in vivo токсикологични изпитвания на веществото; токсикологичните данни за структурно близки вещества и очакваната(ите) употреба(и) на веществото. Тази информация е необходима, за да се удостовери напълно, че това изпитване е свързано със защитата на човешкото здраве и ще бъде от полза при избора на подходяща начална доза.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Остра орална токсичност: отнася се до онези вредни ефекти, които се появяват в резултат на орален прием на еднократна доза вещество или многократни дози, давани в рамките на 24 часа.

Бавна смърт означава, че животното не умира или не се проявяват признаци, че умира в рамките на 48 часа, но умира по-късно през 14-дневния период на наблюдение.

Доза е количеството на приетото вещество за тестване. Дозата се изразява като маса на тестваното вещество за единица тегло на изследваното животно (напр. mg/kg).

Доказана токсичност е общоприет термин, описващ ясните признаци на токсичност вследствие на приемане на изпитваното вещество (вж. (3) например), такива че при приемане на следваща най-висока фиксирана доза могат да бъдат очаквани всякакви признаци на дълбока болка и продължителни дълбоки страдания, терминално състояние (критериите са представени в Ръководството за хуманен край (8) или вероятна смърт на повечето животни.

GHS: Глобална система за хармонизиране на класификацията на химични вещества и смеси. Съвместна дейност на ОИСР (човешко здраве и околна среда), Комитета на ООН от експерти в областта на транспортирането на опасни стоки (физикохимични свойства) и МОТ (опасни комуникации) и координирана чрез Междуорганизационната програма за правилно управление на химикалите (IOМС).

Неизбежна смърт: когато животното умира или се очаква настъпването на смъртта преди следващото планирано време за наблюдение. Признаците, които показват това състояние при гризачите, могат да включват конвулсии, латерално положение, отпуснатост и треперене. (Вж. Ръководството за хуманен край (8) за повече подробности.)

LD50 (средна летална доза) е статистически получена еднократна доза на вещество, за което може да се очаква, че ще причини смърт при 50 % от животните, когато бъде въведено в тях по орален път. Стойността LD50 се изразява за определени периоди като масата на изпитваното вещество за единица тегло на изследваното животно (mg/kg).

Ограничена доза: отнася се до доза, при която има по-високо ограничаване при изследването (2 000 или 5 000 mg/kg).

Настъпване на смърт: оставане в терминално състояние или неспособност да оцелее, дори ако се приложи лечение. (Вж. Ръководството за хуманен край (8) за повече подробности.)

Предсказуема смърт: присъствие на клинични признаци, които показват, че ще настъпи смърт в един предстоящ период от време преди планирания край на експеримента, например: неспособност да се достигне вода или храна. (Вж. Ръководството за хуманен край (8) за повече подробности.)

1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ

Групи животни от един и същ пол са дозирани чрез прилагане на поетапна процедура чрез използване на фиксирани дози от 5, 50, 300 и 2 000 mg/kg (по изключение може да бъде приложена допълнителна фиксирана доза от 5 000 mg/kg, вижте точка 1.6.2). Нивото на началната доза е определено въз основа на зрителни изследвания, като се очаква дозата да предизвика някои признаци на токсичност, без да причинява дълбоки токсични ефекти или смърт. Клиничните признаци и условията, свързани с болка, страдание и неизбежна смърт, са подробно описани в отделно ръководство на ОИСР (8). Следващи групи животни могат да бъдат дозирани с по-високи или по-ниски фиксирани дози в зависимост от присъствието или отсъствието на признаци за отравяне или смърт. Тази процедура продължава до достигане на дозата, причиняваща доказана токсичност, или дотогава, докато бъде идентифицирана смъртта на животното или не се наблюдават ефекти при най-високата доза, или когато се появят смъртни случаи при най-ниската доза.

1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ

1.4.1. Избор на животински видове

Предпочитаният вид от групата на гризачите е плъх, въпреки че могат да бъдат използвани и други видове гризачи. Обикновено се използват животни от женски пол (7). Причината за това е, че изследванията в научната литература от конвенционални изпитвания на LD50 показват, че обикновено има малка разлика в междуполовата сетивност, но в случаите, при които се наблюдават различия, женските индивиди като цяло са малко по-чувствителни (10). Въпреки това, ако познанията за токсикологичните и токсикокинетичните свойства на структурно близки химикали показват, че има вероятност мъжките индивиди да са по-чувствителни от женските, тогава се използват екземпляри от този пол. Когато изпитването се провежда върху мъжки индивиди, трябва да бъде предоставено адекватно обяснение за това.

Обикновено в лабораторните опитни постановки следва да се използват здрави млади полово зрели животни. Женските индивиди следва да не са раждали и да не са бременни. Всяко животно, при започване на дозирането му, следва да бъде на възраст между 8 и 12 седмици и теглото му да попада в интервала ± 20 % от средното тегло на всички предварително дозирани животни.

1.4.2. Условия за отглеждане и хранене

Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 oС (± 3 oС). Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 %, освен при почистване на стаята, целта е да се постигне 50—60 % относителна влажност. Светлината следва да бъде изкуствена, с редуващи се 12 часа светъл период, 12 часа тъмен период. За хранене могат да бъдат използвани конвенционалните лабораторни диети с неограничен достъп до питейна вода. Животните могат да бъдат групирани в клетките по доза, но броят на животните в клетка не трябва да възпрепятства точните наблюдения на всяко животно.

1.4.3. Подготовка на животните

Животните са произволно избрани, маркирани, за да е възможно индивидуалното им идентифициране, и поставени в клетките си поне 5 дни преди започване на дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия.

1.4.4. Подготовка на дозите

Най-общо изпитваните вещества трябва да бъдат приемани в постоянен обем в обхвата на дозите, които се изпитват чрез вариране в концентрацията на дозирания препарат. Когато крайният продукт, който трябва да бъде изпитван, е под формата на течност или смес обаче, за последващата оценка на риска от това вещество може да бъде по-подходящо изпитваното вещество да се употребява неразредено, т.е. при постоянна концентрация, което е и изискване от страна на някои регулаторни органи. Във всеки случай, обемът на максималната доза за администриране не трябва да бъде завишаван. Максималният обем на течността, която може да бъде приета наведнъж, зависи от размера на изследваното животно. При гризачи обикновено обемът не надвишава 1 ml/100 g телесно тегло: обаче в случай на водни разтвори може да се приемат 2 ml/100 g телесно тегло. Във връзка с изготвянето на дозирани препарати се препоръчва, където е възможно, да се използва воден разтвор/суспензия/емулсия, следван първо от разтвор/суспензия/емулсия в масло (напр. царевично масло) и след това по възможност от разтвор при други разтворители. Трябва да се знаят токсикологичните характеристики на разтворителите, с изключение на водата. Дозите не трябва да бъдат приготвяни дълго време преди приемането им, освен когато е известно и доказано, че препаратът ще остане стабилен и в добро състояние през времето, в което ще бъде използван.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Приемане на дозите

Изпитваното вещество се приема на еднократни дози, чрез изкуствено хранене, в стомашния тръбопровод или чрез подходяща интубационна канюла. При извънредни обстоятелства, при които приемането на еднократна доза не е възможно, дозата може да бъде давана на по-малки части през период, който не може да превишава 24 часа.

Преди дозирането животните следва да бъдат поставени на ограничен режим на хранене за известно време (напр. на плъховете не следва да се дава храна, а само вода през нощта преди експеримента; на мишките в продължение на 3—4 часа не следва да се дава храна, а само вода). След периода на „постене“ животните трябва да бъдат претеглени и изпитваното вещество – приложено. След като веществото бъде прието, може да не се дава храна в следващите 3—4 часа при плъховете или 1—2 часа при мишките. Когато дозата се приема на части, в определен период от време може да се наложи да се осигури храна и вода на животните в зависимост от продължителността на периода.

1.5.2. Зрително изследване

Целта на зрителното изследване е да подпомогне избора на подходящата начална доза за основното изследване. Изпитваното вещество се приема от отделните животни последователно по начина, показан на графичните алгоритми в приложение 1. Зрителното изследване приключва, когато може да бъде взето решение за първоначалната доза в основното изследване (или ако смъртта е настъпила при най-ниската фиксирана доза).

Началната доза за зрителното изследване се избира от нивата на фиксираната доза: 5, 50, 300 и 2 000 mg/kg. Като основа се взема дозата, при която се очаква проява на доказана токсичност, когато е възможно, на база доказателство от in vivo и in vitro данни за същия химикал или за структурно близки химикали. При липсата на такава информация началната доза е 300 mg/kg.

Следва да има поне 24-часов период между дозирането на всяко животно. Всички животни следва да бъдат наблюдавани поне 14 дни.

По изключение и само когато е оправдано от определени регулаторни нужди, може да бъде приложена допълнителна фиксирана доза с по-високо ниво 5 000 mg/kg (вж. приложение 3). По причини, свързани с хуманното отношение към животните, изследването на животни в категория 5 на GHS в обхвата 2 000—5 000 mg/kg е нежелателно и следва да се има предвид само когато съществува голяма вероятност резултатите от такова изследване да имат практическо значение за опазване здравето на хората или животните, или за околната среда.

В случаите, когато животното, изследвано при най-ниското ниво с фиксирана доза (5 mg/kg) при провеждане на зрителното изследване, умре, при нормалната процедура изследването приключва и веществото се отнася към категория 1 на GHS (както е показано в приложение 1). Обаче, ако се изисква последващо потвърждаване на класифицирането, може да се предвиди евентуална допълнителна процедура, както следва. Второ животно се дозира с 5 mg/kg. Ако и второто животно умре, тогава категория 1 в GHS се потвърждава и изследването незабавно се прекратява. Ако второто животно оцелее, тогава максимум три допълнителни животни биват дозирани с по 5 mg/kg. Тъй като ще съществува висок риск от смъртност, тези животни следва да бъдат дозирани по начин, целящ опазване на хуманното отношение към животните. Времевият интервал между дозирането на всяко животно следва да бъде достатъчен, за да се установи, че предишното животно вероятно ще оцелее. Ако се установи втора смърт, дозирането следва да бъде незабавно преустановено и следващите животни не се дозират. Заради появата на втори смъртен случай (независимо от броя на изследваните животни в периода на приключването), попадащ в резултат А (два или повече смъртни случаи), следва правилото за класифициране на приложение 2 при 5 mg/kg фиксирана доза (категория 1, ако има два или повече смъртни случаи или категория 2, ако няма повече от 1 смъртен случай). Освен това приложение 4 дава насоки за класифициране по системата на ЕС, докато бъде въведена новата система GHS.

1.5.3. Основно изпитване

1.5.3.1. Брой животни и нива на дозиране

След изпитване с началното ниво на дозиране действието, което трябва да се извърши, е показано чрез графичния алгоритъм в приложение 2. Изисква изпълнението на едно от следните действия: да се прекрати всяко изпитване и да се определи, след класифициране, подходящият клас на опасност; да се проведе изпитване при по-висока фиксирана доза или изпитване при по-ниска фиксирана доза. Въпреки това, за защита на животните, нивото на дозата, причинила смърт при зрителното изследване, не се повтаря при основното изследване (вж. приложение 2). Опитът показва, че най-вероятният резултат при нивото на началната доза е, че веществото може да бъде класифицирано и не е необходимо по-нататъшно изследване.

Обикновено се използват общо пет животни от един и същ пол при всяко изследвано ниво на дозата. Едно от петте животни, което е било използвано при зрителното изследване, се дозира заедно с четирите останали животни (освен, по изключение, ако използваното ниво на дозата при основното изследване не е било включено в зрителното изследване).

Интервалът от време между дозирането на всяко ниво се определя от началото, продължителността и остротата на токсичните признаци. Третирането на животните със следваща доза следва да бъде забавено, докато се докаже, че животните, приели определената доза по-рано, ще оцелеят. Препоръчва се да има период от 3 или 4 дни между дозирането на всяко ниво, ако е нужно, за да има възможност за наблюдения върху забавената токсичност. При необходимост времевият интервал може да бъде регулиран, напр. в случай на незавършен отговор.

Когато се обмисля прилагането на по-високата фиксирана доза 5 000 mg/kg, се следва процедурата, представена в приложение 3 (вж. също точка 1.6.2).

1.5.3.2. Ограничено изпитване

Ограниченото изпитване се използва предимно в случаите, при които експериментаторът разполага с информация, съгласно която изпитваният материал по всяка вероятност не е токсичен, т.е. проявява токсичност само над нормативно ограничените дози. Информация за токсичността на изпитвания материал може да бъде събрана от познания за подобни тествани съединения или подобни тествани смеси или продукти, като се вземат предвид идентичността и процентното съдържание на съединенията, за които е известно, че са токсикологически значими. В случаите, когато има малко или няма информация за токсичността на материала или когато се очаква изпитваният материал да бъде токсичен, трябва да бъде проведено основното изследване.

Прилага се нормалната процедура, като началната доза при зрително изследване е 2 000 mg/kg (или по изключение 5 000 mg/kg), последвана от дозиране на допълнителни четири животни на това ниво на ограниченото изпитване по това ръководство.

1.6. НАБЛЮДЕНИЯ

Животните се наблюдават индивидуално след поне еднократно дозиране през първите 30 минути, периодично през първите 24 часа, с повишено внимание през първите 4 часа и ежедневно след това, през общо 14-дневен период от време, освен когато е необходимо да бъдат извадени от експеримента и убити по хуманен начин по причини, свързани с хуманното отношение към животните, или когато са намерени мъртви. Продължителността на наблюдението обаче не следва да бъде строго фиксирана. Тя следва да се определя въз основа на токсичните реакции, началното време и продължителността на периода за възстановяване и може да бъде увеличена, когато се сметне за необходимо. Периодите от време, в които се появяват и изчезват признаците на токсичност, са важни, особено ако има тенденция токсичните признаци да бъдат забавени (11). Всички наблюдения систематично се записват, с отделни записи, направени за всяко животно.

Допълнителни изследвания са необходими, ако животните продължат да показват признаци на токсичност. Наблюденията следва да включват промените в кожата и козината, очите и лигавиците, и също респираторната, циркулационната, автономната и централната нервна система, соматомоторна активност и моделите на поведение. Следва да бъде обърнато внимание на наблюденията за треперене, конвулсии, слюноотделяне, диария, летаргия, сън и кома. Следва да бъдат взети предвид принципите и критериите, резюмирани в Ръководството за хуманен край (8). Животните, намерени в терминално състояние, и животните, показващи дълбока болка или трайни признаци на дълбоко страдание, следва да бъдат хуманно убити. Когато животните са убити по хуманни причини или са намерени мъртви, следва да бъде записано времето на смъртта им, колкото е възможни по-точно.

1.6.1. Телесно тегло

Индивидуалното тегло на животните следва да бъде измервано в кратък интервал от време преди приемането на изпитваното вещество и поне веднъж седмично след това. Промените в теглото следва да бъдат изчислявани и записвани. В края на експеримента оцелелите животни се претеглят и след това хуманно се убиват.

1.6.2. Патология

Всички изследвани животни (включително умрелите по време на експеримента или извадените от експеримента животни по причини, свързани с хуманното отношение към животните) следва да бъдат подложени на цялостна аутопсия. Всички цялостни патологични изменения във всяко животно следва да бъдат записани. Микроскопските изследвания на органите показват доказателствата за цялостна патология при животните, оцелели 24 часа или повече след първоначалното дозиране, и също могат да допринесат за получаването на полезна информация.

2. ДАННИ

Следва да бъдат осигурени индивидуални данни за всяко животно. Освен това всички данни следва да бъдат обобщени в таблична форма, показваща броя на използваните животни във всяка от изследваните групи, броя на животните, проявяващи признаци за токсичност, броя на животните, намерени мъртви по време на изследването или убити по хуманни причини, времето на настъпване на смъртта на животинския индивид, описание и развитие във времето на токсичните ефекти и обратимостта им, както и заключенията от аутопсията.

3. ОТЧИТАНЕ

3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО

Протоколът от изпитването по целесъобразност трябва да включва следната информация:

Изпитвано вещество: — физична форма, чистота и, където е подходящо, физикохимични свойства (включително изомеризация); — данни за идентичността, включително САS номер.

Разтворител (ако има такъв): — обосноваване на избора на разтворител, ако е различен от вода.

Изследвани животни: — използвани видове/породи; — микробиологично състояние на животните, когато е известно; — брой, възраст и пол на животните (включително, при необходимост, обосноваване използването на мъжки индивиди вместо женски); — водоизточник, условия за отглеждане, диета и т.н.

Условия на експеримента: — подробности за формулирането на изпитваното вещество, включително подробности за физичното състояние на приемания материал; — подробности, свързани с приемането на изпитваното вещество, обеми на дозите и време на дозиране; — подробности във връзка с качеството на храната и водата (включително вид/източник на диетата, водоизточник); — обосновка на избора на началната доза.

Резултати: — таблици/диаграми на получените данни и ниво на дозата за всяко животно (т.е. при които животното показва признаци на токсичност, включително смърт, природа, острота и продължителност на ефектите); — таблици/диаграми на телесното тегло и на измененията в него; — индивидуални тегла на животните в деня на дозиране, през седмични интервали след това и по време на смърт или убиване; — дата и време на смъртта, ако умрат преди програмираното унищожаване; — развитие във времето от първоначалното появяване на признаци за токсичност и дали са били обратими при всяко животно; — заключения при аутопсията и хистопатологични заключения за всяко животно, ако има такива.

Дискусия и интерпретиране на резултатите.

Заключения.

4. ПРЕПРАТКИ

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85—92.

(2) Van den Heuvel, M. J., Dayan, A. D. and Shillaker, R. O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279—291.

(3) Van den Heuvel, M. J., Clark, D. G., Fielder, R. J., Koundakjian, P. P., Oliver, G. J. A., Pelling, D., Tomlinson, N. J. and Walker, A. P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469—482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R. N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313—324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315—323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183—196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-№-24-№-0,FF.html].

(10) Lipnick, R. L., Cotruvo, J. A., Hill, R. N., Bruce, R. D., Stitzel, K. A., Walker, A. P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A. and Myers, R. C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223—231.

(11) Chan P. K and A. W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology . 3 rd Edition. A. W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 ГРАФИЧЕН АЛГОРИТЪМ ЗА ЗРИТЕЛНОТО ИЗСЛЕДВАНЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ 2: ГРАФИЧЕН АЛГОРИТЪМ ЗА ОСНОВНОТО ИЗСЛЕДВАНЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 КРИТЕРИИ ЗА КЛАСИФИЦИРАНЕ НА ИЗПИТВАНО ВЕЩЕСТВО С ОЧАКВАНА СТОЙНОСТ НА LD50 НАД 2 000 MG/KG БЕЗ НЕОБХОДИМОСТОТ ИЗПИТВАНЕ Критериите за опасност в категория 5 се предназначени да подпомогнат идентифицирането на изпитваните вещества, които са с относително ниска опасност от остра токсичност, но които при определени обстоятелства могат да представляват опасност за уязвимите поколения. Тези вещества се очаква да имат орална или дермална LD50 в обхвата 2 000—5 000 mg/kg или еквивалентни дози при други начини на приемане. Изпитваните вещества могат да бъдат класифицирани в категория на опасност, определена чрез: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (категория 5 в GHS) в следните случаи: а) ако са стигнали до тази категория по някоя от схемите за изследване от приложение 2, основани на смъртни инциденти; б) ако вече съществува достоверно доказателство, което показва, че LD50 е в обхвата от стойности на категория 5, или други изследвания върху животни, или токсикологични изследвания върху хора дават основания за сериозно безпокойство относно човешкото здраве; в) чрез данни от екстраполация, оценяване или измерване, ако няма основание да се отнесе към по-висок клас на опасност, и — има налична достоверна информация, показваща значителни токсикологични ефекти при хората, или — наблюдава се смъртност при изпитване с високи стойности като тези в категория 4 чрез орален път на приемане, или — когато експертната оценка потвърди съществените клинични признаци на токсичност при изпитване с високи стойности като тези в категория 4, освен при диария, пилоерекция или недобър външен вид, или — когато експертната оценка потвърди достоверната информация, която индикира потенциална възможност за значими остри ефекти от други изпитвания върху животни. ИЗСЛЕДВАНЕ С ДОЗИ НАД 2 000 MG/KG По изключение и само когато е оправдано от определена необходимост за регулиране, може да се проведе изследване с използване на допълнителна по-висока фиксирана доза с ниво 5 000 mg/kg. Приемайки необходимостта от хуманно отношение към животните, не се препоръчва изследване с 5 000 mg/kg и следва да бъде взето предвид само, когато има голяма вероятност резултатите от такова изследване да имат пряко практическо значение за опазване здравето на хората или животните (9). Зрително изследване Правилата за вземане на решение, които са указани в следващата процедура, представена в приложение 1, включват доза с ниво 5 000 mg/kg. По този начин, когато при зрително изследване се използва начална доза 5 000 mg/kg и резултатът е А (смърт), се налага второто животно да бъде изследвано с 2 000 mg/kg; резултати В и С (доказана токсичност или нетоксичност) позволяват като начална доза за основното изследване да бъде избрана 5 000 mg/kg. По подобен начин, ако се използва начална доза, различна от 5 000 mg/kg, тогава изпитването ще доведе до прилагане на 5 000 mg/kg в случай на резултат В или С при 2 000 mg/kg; резултат А след прилагането на 5 000 mg/kg налага началната доза за основното изследване да бъде 2 000 mg/kg, a резултати В и С налагат началната доза за основното изследване да бъде 5 000 mg/kg. Основно изследване Правилата за вземане на решение, които са указани в следващата процедура, представена в приложение 2, включват доза с ниво 5 000 mg/kg. По този начин, когато при основно изследване се използва начална доза 5 000 mg/kg, резултат А (> 2 смъртни случая) налага изследване на втора група при 2 000 mg/kg; резултат В (доказана токсичност и/или < 1 смъртен случай) или С (нетоксичност) води до резултат веществото да не бъде класифицирано съгласно GHS. По подобен начин, ако се използва начална доза, различна от 5 000 mg/kg, тогава изпитването води до прилагане на 5 000 mg/kg в случай на резултат С при 2 000 mg/kg; резултат А след прилагането на 5 000 mg/kg води до това веществото да бъде определено в категория 5 на GHS, а резултат В или С води до това веществото да не бъде класифицирано.

ПРИЛОЖЕНИЕ 4 МЕТОД ЗА ИЗПИТВАНЕ Б.1А Ръководство за класифициране съгласно схемата на ЕС за обхващане на преходния период до пълното прилагане на Глобалната система за хармонизиране на класификацията (GНS) (взето от препратка 8)

Б.1Б. ОСТРА ОРАЛНА ТОКСИЧНОСТ — МЕТОД КЛАС ОСТРА ТОКСИЧНОСТ

1. МЕТОД

Този метод за изпитване е еквивалентен на ОИСР ТG 423 (2001)

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

Методът при клас остра токсичност (1), представен с това изследване, е поетапна процедура, при която се използват по 3 животни от един и същ пол на всеки етап. В зависимост от смъртността и/или състоянието на предстояща смърт при животните може да се наложи средно на 2—4 стъпки да бъде взето решение относно острата токсичност на изпитваното вещество. Тази процедура е репродуктивна, използва много малко животни и дава възможност за категоризиране на веществата по начин, подобен на този при други методи за изпитване за остра токсичност. Методът при клас остра токсичност се основава на биометрични оценки (2)(3)(4)(5) с фиксирани дози, подходящо отделени, за да може едно вещество да бъде категоризирано за целите на класифицирането и оценката на риска. Методът, който е одобрен през 1996 г., е широко утвърден in vivo спрямо LD50 данните, получени от публикуваните национални (6) и международни (7) изследвания.

Насоките за избор на най-подходящият метод за изпитване с определена цел се намират в Ръководството за изпитване на острата орална токсичност (8). Това ръководство съдържа също допълнителна информация за провеждането и интерпретирането на метода за тестване Б.1б.

Изпитваните вещества, в дози, за които е известно, че могат да причинят болка и страдание поради корозивно или силно дразнещо действие, не следва да бъдат прилагани. Умиращи животни или животни, очевидно изпитващи болка или показващи признаци на дълбоко и продължително страдание, биват хуманно убивани и също се вземат предвид при интерпретирането на резултатите, по същия начин както животните, умрели по време на експеримента. Критериите за вземане на решение да бъде убито умиращо или дълбоко страдащо животно и насоки за разпознаване на предсказуема или предстояща смърт са обект на отделно ръководство (9).

При този метод се използват предварително определени дози и резултатите позволяват веществото да бъде категоризирано и класифицирано съгласно Глобалната система (GНS) за хармонизиране на класификацията на химични вещества, които причиняват остра токсичност (10).

По принцип методът цели изчисляването на точната LD50, но позволява установяването на определени области на експозиция, в които се очаква леталност, доколкото смъртност като пропорционално съотношение при животните се достига едва в самия край на това изследване. Методът позволява определяне стойността на LD50 само когато в резултат от прилагането на най-малко две дози се постига ръст на смъртността, по-висок от 0 % и по-нисък от 100 %. Използването на избрани предварително определени дози, независимо от изпитваното вещество, с класифициране, което е категорично свързано с броя на наблюдаваните животни в различните етапи, подобрява възможността за последователно и многократно докладване на резултатите между отделните лаборатории.

В лабораторията за изследване следва да се вземе предвид цялата налична информация за изследваното вещество преди провеждане на експеримента. Такава информация включва идентичност и химична структура на веществото; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vivo или in vitro токсикологични изпитвания на веществото; токсикологични данни за структурно близки вещества и очаквана(и) употреба(и) на веществото. Тази информация е необходима, за да се удостовери напълно, че това изпитване е свързано със защитата на човешкото здраве и ще бъде от полза при избора на най-подходящата начална доза.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Остра орална токсичност: отнася се до онези вредни ефекти, които се появяват в резултат на орален прием на еднократна доза вещество или многократни дози, давани в рамките на 24 часа.

Бавна смърт: означава животното да не умира или да не се проявят признаци на смърт в рамките на 48 часа, но да умре по-късно, през 14-дневния период на наблюдения.

Доза: е количеството прието изпитвано вещество. Дозата се изразява като маса на изпитваното вещество за единица тегло на изследваното животно (напр. mg/kg).

GНS: Глобална система за хармонизиране на класификацията на химични вещества и смеси. Съвместна дейност на ОИСР (човешко здраве и околна среда), Комитета на ООН от експерти в областта на транспортирането на опасни стоки (физикохимични свойства) и МОТ (опасни комуникации) и координирана чрез Междуорганизационната програма за правилно управление на химикалите (IOМС).

Неизбежна смърт: когато животното умира или се очаква настъпването на смърт преди следващото планирано време за наблюдение. Признаците, показващи това състояние при гризачи, могат да включват конвулсии, латерално (странично) положение, лежане и треперене. (Вж. Ръководството за хуманен край (9) за повече подробности.)

LD50 (средна летална орална доза): е статистически получена еднократна доза на вещество, за която може да се очаква, че ще причини смърт при 50 % от животните, когато бъде въведена в тях по орален път. Стойността LD50 се изразява за периоди като масата на изпитваното вещество за единица тегло на изследваното животно (mg/kg).

Ограничена доза: отнася се до доза с по-голямо ограничение при изследването (2 000 или 5 000 mg/kg).

Настъпване на смърт: оставане в терминално състояние или неспособност да се оцелее, дори ако се приложи лечение. (Вж. Ръководството за хуманен край (9) за повече подробности.)

Предсказуема смърт: присъствие на клинични признаци, които показват, че е налице смърт в определен предстоящ период от време преди планирания край на експеримента, например: неспособност да се достигне вода или храна. (Вж. Ръководството за хуманен край (9) за повече подробности.)

1.3. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ

Принцип на метода за изследване е, че въз основа на поетапна процедура, при която се използват минимален брой животни на етап, се получава допълнителна информация за острата токсичност на изследваното вещество, която дава възможност за неговото класифициране. Веществото се приема по орален път на постъпване от група експериментални животни в една от определените дози. Веществото се изпитва чрез прилагане на поетапна процедура, като на всеки етап се използват по три животни от един и същ пол (обикновено женски индивиди). Наличието или отсъствието на смъртни случаи, свързани с веществото на един етап, е определящо за дозирането на следващия етап, т.е.:

— не са необходими допълнителни изследвания;

— дозиране на три допълнителни животни със същата доза;

— дозиране на три допълнителни животни с по-високо или по-ниско ниво на дозата.

Подробностите около провеждането на процедурата за изпитване са описани в приложение 1. Методът дава възможност да се вземе решение относно класифицирането на изследваното вещество и да бъде причислено към един от поредицата токсикологични класове чрез определяне на точните стойности на LD50.

1.4. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ

1.4.1. Избор на животински видове

Предпочитаният вид от групата на гризачите е плъх, въпреки че и други видове гризачи могат да бъдат използвани. Обикновено се използват животни от женски пол (9). Причина за това е, че изследванията в научната литература чрез конвенционални тестове с LD50 показват, че независимо от малката разлика в междуполовата сетивност в случаите, при които се наблюдават различия, женските индивиди като цяло са малко по-чувствителни (11). Въпреки това, ако познанията за токсикологичните и токсикокинетичните свойства на близки по структура химически вещества показват, че има вероятност мъжките индивиди да са по-чувствителни от женските, тогава се използват животни от този пол. Когато изпитването се провежда върху мъжки индивиди, то следва да бъде подходящо обосновано.

Използват се здрави млади полово зрели животни от най-често употребяваните за лабораторни изследвания видове. Женските индивиди следва да не са раждали и да не са бременни. Всяко животно в началото на дозирането му следва да бъде на възраст между 8 и 12 седмици и теглото му следва да попада в интервала ± 20 % от средното тегло на всички дозирани преди това животни.

1.4.2. Условия за отглеждане и хранене

Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 oС (± 3 oС). Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен при почистване на стаята, като целта е да се постигне 50—60 % относителна влажност. Светлината следва да бъде изкуствена, с редуващи се 12 часа светъл период, 12 часа тъмен период. За хранене могат да бъдат използвани конвенционалните лабораторни диети с неограничен достъп до питейна вода. Животните могат да бъдат групирани в клетките по доза, но броят на животните в клетка не трябва да възпрепятства точните наблюдения върху всяко животно.

1.4.3. Подготовка на животните

Животните са произволно избрани, маркирани, за да е възможно индивидуалното им идентифициране, и държани в клетките си поне 5 дни преди дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия.

1.4.4. Подготовка на дозите

Най-общо изпитваните вещества следва да бъдат приемани в постоянен обем в рамките на дозите, които се изпитват чрез изменения в концентрацията на дозирания препарат. Когато обаче крайният продукт, който трябва да бъде изследван, е под формата на течност или смес, за последващата оценка на риска от това вещество може да се окаже по-подходяща употребата му в неразредено състояние, т.е. при постоянна концентрация, което е и изискване от страна на някои регулаторни органи. Във всеки случай обемът на максималната доза за администриране не следва да бъде завишаван. Максималният обем на течността, която може да бъде въвеждана наведнъж, зависи от големината на изследваното животно. При гризачи обикновено обемът не надвишава 1 ml/100 g телесно тегло: обаче в случай на водни разтвори може да се приемат 2 ml/100 g телесно тегло. Във връзка с изготвянето на дозирани препарати се препоръчва, където е възможно, да се използва воден разтвор/суспензия/емулсия, следван първоначално от разтвор/суспензия/емулсия в масло (напр. царевично масло), а след това е възможен разтвор в други разтворители. Следва да се знаят токсикологичните характеристики на разтворителите с изключение на водата. Дозите следва да бъдат приготвяни кратко време преди приемането им, освен когато е известно, че препаратът остава стабилен и в добро състояние през периода, в който се използва.

1.5. ПРОЦЕДУРА

1.5.1. Приемане на дозите

Изпитваното вещество се приема на еднократни дози чрез принудително хранене или с подходяща интубационна канюла. При извънредни обстоятелства, при които приемането на еднократна доза не е възможно, дозата може да бъде давана на по-малки части през период, който не може да превишава 24 часа.

Преди дозирането животните следва да бъдат поставени на ограничен режим на хранене за известно време (напр. на плъхове следва да не се дава храна, но не и вода през нощта преди експеримента; на мишки в продължение на 3—4 часа следва да не се предоставя храна, но не и вода). След периода на „постене“, животните следва да бъдат претеглени и изпитваното вещество да бъде приложено. След като веществото бъде прието, може да не се предоставя храна в следващите 3—4 часа при плъхове или 1—2 часа при мишки. Когато дозата се приема на части в определен период от време, може да се наложи да бъдат осигурени храна и вода на животните в зависимост от продължителността на периода.

1.5.2. Брой на животните и нива на дозите

Във всеки етап се използват по три животни. Нивото на дозата, която ще бъде използвана като начална доза, се избира от едно от четирите фиксирани нива: 5, 50, 300 и 2 000 mg/kg телесно тегло. Нивото на началната доза следва да бъде такова, при което вероятността да причини смърт при някое от дозираните животни е най-висока. Графичните алгоритми на приложение 1 описват процедурата, която трябва да бъде следвана за всяка от началните дози. Освен това приложение 4 дава насоки за класифициране по системата на ЕС, докато бъде въведена новата система GHS.

Когато по наличната информация се предполага, че смъртност при начално дозиране с най-високото ниво (2 000 mg/kg телесно тегло) е малко вероятна, тогава се прилага ограничено изпитване. Когато няма информация за изпитваното вещество, с цел хуманно отношение към животните се препоръчва за начална доза да се използва 300 mg/kg телесно тегло.

Интервалът от време между третирането на групите се определя от началото, продължителността и остротата на токсичните признаци. Третирането на животните със следваща доза следва да бъде забавено, докато не се докаже, че дозираните по-рано животни са останали живи.

По изключение и само когато е оправдано от определени регулаторни нужди, може да бъде приложена допълнителна фиксирана доза с по-високо ниво 5 000 mg/kg телесно тегло (вж. приложение 2). По причини, свързани с хуманното отношение към животните, изследването на животни в категория 5 от GHS в обхвата 2 000—5 000 mg/kg е нежелателно и следва да се има предвид само когато съществува голяма вероятност резултатите от такова изследване да имат практическо значение за опазване здравето на хората или животните или околната среда.

1.5.3. Ограничено изпитване

Ограниченото изпитване се използва предимно в случаите, при които извършващият опитите разполага с информация, съгласно която изследваният материал по всяка вероятност не е токсичен, т.е. проявява токсичност само над нормативно ограничените дози. Информация за токсичността на изпитвания материал може да бъде получена от познания за подобни изпитани съединения или подобни изпитани смеси или продукти, като се вземат предвид идентичността и процентното съдържание на съставките, за които е известно, че са с токсикологично значение. В случаите, когато има малко или няма информация за неговата токсикологичност, или при които се очаква изпитваният материал да бъде токсичен, следва да се провежда основното изследване.

При ниво на еднократна доза 2 000mg/kg телесно тегло може да бъде проведено ограничено изследване на 6 животни (по три животни на етап). По изключение може да бъде проведено ограничено изследване на три животни при ниво на еднократната доза 5 000 mg/kg (вж. приложение 2). Ако има смъртни случаи, свързани с веществото, може да се окаже необходимо следващите изследвания да се проведат при по-ниски нива на дозиране.

1.6. НАБЛЮДЕНИЯ

Животните се наблюдават индивидуално, след поне еднократно дозиране през първите 30 минути, периодично през първите 24 часа, с повишено внимание през първите 4 часа и ежедневно след това през общо 14-дневен период от време, освен когато е необходимо да бъдат извадени от експеримента и убити по хуманен начин по причини на хуманно отношение към животните, или са намерени мъртви. Продължителността на наблюдението обаче не следва да бъде строго фиксирана. Тя следва да се определя въз основа на токсичните реакции, началния момент и продължителността на периода за възстановяване и може да бъде увеличена, когато се сметне за необходимо. Периодите от време, в които се появяват и изчезват признаците на токсичност, са важни, особено ако има тенденция токсичните признаци да бъдат забавени (12). Всички наблюдения систематично се записват, с отделни записи, направени за всяко животно.

Допълнителни изследвания ще бъдат необходими, ако животните продължат да показват признаци на токсичност. Наблюденията следва да включват промените в кожата и козината, очите и лигавицата и също дихателната, кръвоносната, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и моделите на поведение. Вниманието следва да бъде насочено към наблюдения на треперене, конвулсии, слюноотделяне, диария, летаргия, сън и кома. Следва да бъдат взети предвид принципите и критериите, резюмирани в Ръководството за хуманен край (9). Животните, намерени в терминално състояние, и животните, показващи дълбока болка или непрекъснати признаци на дълбоко страдание, следва да бъдат убити по хуманен начин. Когато животните са убити по хуманни причини или са намерени мъртви, времето на смъртта им следва да бъде записано колкото е възможно по-точно.

1.6.1. Телесно тегло

Индивидуалното тегло на животните следва да бъде измервано в кратък интервал от време преди приемането на изпитваното вещество и поне веднъж седмично след това. Промените в теглото следва да бъдат изчислявани и записвани. В края на експеримента оцелелите животни се претеглят и след това се убиват по хуманен начин.

1.6.2. Патология

Всички изследвани животни (включително умрелите по време на експеримента или извадените от експеримента животни по причини на хуманно отношение към животните) следва да бъдат подложени на цялостна аутопсия. Всички цялостни патологични изменения във всяко животно следва да бъдат записани. Микроскопските изследвания на органите, даващи доказателства за цялостна патология при животните, оцелели 24 часа или повече след първоначалното дозиране, също могат да допринесат за получаването на полезна информация.

2. ДАННИ

Следва да бъдат осигурени индивидуални данни за всяко животно. Освен това всички данни следва да бъдат обобщени в таблична форма, показваща броя на използваните животни във всяка от изследваните групи, броя на животните, проявяващи признаци за токсичност, броя на животните, намерени мъртви по време на изследването или убити по хуманни причини, времето на настъпване на смъртта на животинския индивид, описание и развитие във времето на токсичните ефекти и обратимостта им, както и заключенията от аутопсията.

3. ОТЧИТАНЕ

3.1. Протокол от изпитването

Протоколът от изпитването по целесъобразност следва да включва следната информация:

Изпитвано вещество: — физична форма, чистота и, където е подходящо, физикохимични свойства (включително изомеризация); — данни за идентичността, включително САS номер.

Разтворител (ако има такъв): — обосноваване на избора на разтворител, ако е различен от вода.

Изследвани животни: — използвани видове/породи; — микробиологично състояние на животните, когато е известно; — брой, възраст и пол на животните (включително, при необходимост, обосноваване на използването на мъжки индивиди вместо женски); — водоизточник, условия за отглеждане, диета и т.н.

Условия на експеримента: — подробности за формулирането на изпитваното вещество, включително подробности за физичното състояние на приемания материал; — подробности, свързани с приемането на изпитваното вещество, обеми на дозите и време на дозиране; — подробности във връзка с качеството на храната и водата (включително вид/източник на диетата, водоизточник); — обосновка на избора на началната доза.

Резултати: — таблици/диаграми на получените данни и ниво на дозата за всяко животно (т.е. при които животното показва признаци на токсичност, включително смърт; природа, острота и продължителност на ефектите); — таблици/диаграми на телесното тегло и на измененията в него; — индивидуални тегла на животните през деня на дозиране, на седмични интервали след това и при смърт; — дата и време на смъртта, ако умрат преди приключване на програмата; — развитие във времето от първоначалното появяване на признаци за токсичност и дали е имало обратимост за всяко животно; — заключения при аутопсията и хистопатологични заключения за всяко животно, ако има такива.

Дискусия и интерпретиране на резултатите.

Заключения.

4. ПРЕПРАТКИ

(1) Roll R., Hцfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86

(2) Roll R., Riebschlflдger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitдt von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336—341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559—610

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729—734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129—134

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method — An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455—470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659—670.

(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-№-24-№-0,FF.html]

(11) Lipnick R. L., Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I; Goddard M., Segal L., Springer J. A. and Myers R. C. (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223—231.

(12) Chan P. K. and A. W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A. W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 ПРОЦЕДУРА, КОЯТО ТРЯБВА ДА БЪДЕ СЛЕДВАНА ЗА ВСЯКА ОТ НАЧАЛНИТЕДОЗИ ОБЩИ БЕЛЕЖКИ За всяка начална доза в това приложение са включени съответните схеми за изпитване, които трябва да бъдат следвани. — Приложение 1а: началната доза е 5 mg/kg тт — Приложение 1б: началната доза е 50 mg/kg тт — Приложение 1в: началната доза е 300 mg/kg тт — Приложение 1г: началната доза е 2 000 mg/kg тт В зависимост от броя на убитите по хуманен начин или умрели животни процедурата за изпитване следва посочените стрелки. ПРИЛОЖЕНИЕ 1А ПРОЦЕДУРА ЗА ИЗПИТВАНЕ С НАЧАЛНА ДОЗА 5 МG/КG ТЕЛЕСНО ТЕГЛО ПРИЛОЖЕНИЕ 1Б ПРОЦЕДУРА ЗА ИЗПИТВАНЕ С НАЧАЛНА ДОЗА 50 МG/КG ТЕЛЕСНО ТЕГЛО ПРИЛОЖЕНИЕ 1В ПРОЦЕДУРА ЗА ИЗПИТВАНЕ С НАЧАЛНА ДОЗА 300 МG/КG ТЕЛЕСНО ТЕГЛО ПРИЛОЖЕНИЕ 1Г ПРОЦЕДУРА ЗА ИЗПИТВАНЕ С НАЧАЛНА ДОЗА 2 000 МG/КG ТЕЛЕСНО ТЕГЛО

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 КРИТЕРИИ ЗА КЛАСИФИЦИРАНЕ НА ИЗПИТВАНОТО ВЕЩЕСТВО С ОЧАКВАНИ СТОЙНОСТИ НА LD50 НАД 2 000 МG/КG БЕЗ ,НЕОБХОДИМОСТ ОТ ИЗПИТВАНЕ Критериите за категория на опасност 5 са предназначени да подпомогнат идентифицирането на изпитвани вещества, които представляват относително ниска остра токсикологична опасност, но които при определени обстоятелства могат да представляват опасност за уязвимото поколение. Тези вещества се очаква да имат орална или дермална LD50 в обхвата от 2 000 до 5 000 mg/kg или еквивалентни дози при други начини на въвеждане. Изпитваното вещество следва да бъде класифицирано в категория на опасност, определена по: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (категория 5 от GHS) в следните случаи: а) ако е насочено към тази категория по някоя от схемите за изследване от приложения 1а—1г, основани на смъртни инциденти; б) ако вече съществува достоверно доказателство, което показва, че LD50 е в обхвата от стойности на категория 5, или други изследвания върху животни, или токсикологични изследвания върху хора дават основание за сериозно безпокойство поради въздействие върху здравето на човека; в) чрез данни от екстраполации, оценяване или измерване, ако няма основание да се отнесе към по-висок клас на опасност, и — има налична достоверна информация, показваща значителни токсикологични ефекти при хората, или — се наблюдава смърт при изпитване със стойности, по-високи от посочените в категория 4 по орален начин на въвеждане, или — когато експертната оценка потвърди значимите клинични признаци на токсичност при изпитване със стойности, по-високи от тези в категория 4, освен при диария, пилоерекция или недобър външен вид, или — когато експертната оценка потвърди достоверната информация, която посочва потенциална възможност за значителни остри ефекти от други изследвания върху животни. ИЗСЛЕДВАНЕ С ДОЗИ НАД 2 000 МG/КG Признавайки необходимостта от запазване на хуманно отношение към животните, изследването на животни, попадащи в обхвата на категория 5 (5 000 mg/kg), не е препоръчително и следва да бъде разглеждано само когато има голяма вероятност резултатите от такова изследване да имат пряко практическо значение за опазване здравето на хората или животните (10). Следва да не бъдат провеждани допълнителни изследвания при по-високи нива на дозите. Когато за изследването се изисква прилагане на доза 5 000 mg/kg, се изпълнява само един етап (т.е. три животни). Ако първото дозирано животно умре, тогава продължава дозирането при 2 000 mg/kg в съответствие с графичния алгоритъм в приложение 1. Ако първото животно оцелее, се дозират и другите две животни. Ако само едно от трите животни умре, се очаква стойността на LD50 да надвишава 5 000 mg/kg. Ако и двете животни умрат, тогава дозирането продължава при 2 000 mg/kg.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 МЕТОД ЗА ИЗПИТВАНЕ Б.1б: Ръководство за класифициране съгласно схемата на ЕС за обхващане на преходния период до пълното прилагане на Глобалната система за хармонизиране на класификацията (GНS) (взето от препратка 8)

Б.2. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ (ИНХАЛАТОРНА)

1. МЕТОД

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

Полезно е да има предварителна информация за разпределението на частиците по размери, както и за парното налягане, температурата на топене, температурата на кипене, точката на възпламеняване и експлозивните свойства (когато могат да намерят приложение) на изпитваното вещество.

Виж също общо въведение към част Б (А).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Виж общо въведение към част Б (Б).

1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ

Няма

1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ

Няколко групи от експериментални животни се подлагат на въздействието на изпитваното вещество за определен период от време, при нарастващи концентрации, като за всяка група се използва една концентрация. След това се провеждат наблюдения върху ефектите и случаите на смърт. Животните, умрели по време на изпитването, се подлагат на аутопсия. Оцелелите животни в края на изпитването също се аутопсират.

Животните, които показват тежки и трайни симптоми на стрес и болка, може да се наложи да бъдат убити по безболезнен начин. Дозирането на изпитваните вещества по начин, за който се знае, че причинява значителна болка и стрес поради разяждащи или остро дразнещи въздействия, няма нужда да се прилага.

1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО

Няма.

1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ

1.6.1. Подготовка

Животните се настаняват и хранят при експерименталните условия най-малко пет дни преди началото на опита. Преди изпитването на случаен принцип се подбират здрави млади животни и се разпределят в съответния брой групи. Няма нужда животните да се подлагат на симулирана (предварителна) експозиция, освен ако това не е включено в изискванията към използвания тип апаратура за експониране.

Твърдите изпитвани вещества следва да се стрият до получаването на частици с подходящ размер.

Когато е необходимо, към изпитваното вещество може да се прибави подходящ носител, който ще помогне да се получи нужната концентрация на веществото в атмосферата. В такива случаи следва да се предвиди контролна група за носителя. Ако за улесняване на дозирането се използва носител или други добавки, за тях следва да е известно, че нямат токсични ефекти. За тази цел могат да се използват данни, получени при предишни опити.

1.6.2. Условия на изпитването

1.6.2.1. Опитни животни

Плъховете са предпочитаният вид за този опит, освен ако няма други данни. Използват се обичайните лабораторни породи. В началото на изпитването диапазонът на масата на животните не бива да надвишава ± 20 % спрямо съответната средна стойност за всеки от половете.

1.6.2.2. Брой и пол

При всяка концентрация се използват най-малко 10 гризачи (пет женски и пет мъжки). Женските не бива да са раждали, нито да са бременни.

Забележка: При опитите за остра токсичност с животни от по-висш разред от гризачите следва да се обмисли използването на по-малък брой животни. Дозите следва да се подберат внимателно, като се полагат усилия да не се надвиши умерено токсичната доза. При тези изпитвания следва да се избягва въвеждането на летални дози от веществото.

1.6.2.3. Концентрации на експозицията

Концентрациите следва да бъдат достатъчно на брой (поне три) и да са правилно разпределени, така че да се получат групи от животни с определен обхват от токсични въздействия и степени на смъртност. Данните следва да бъдат достатъчни за начертаването на крива концентрация/смъртност и, където е възможно, да позволят приемливо определяне на стойността на LC50.

1.6.2.4. Гранично изпитване

Ако експозицията на пет мъжки и пет женски опитни животни на 5 mg/l газ или 5 rug/l аерозол на течни или твърди вещества в продължение на четири часа дневно в рамките на 14 дни не предизвиква смъртност, свързана с третирането, по-нататъшно изследване се смята за ненужно. В случаи, когато изследваното вещество има физикохимична характеристика (включително експлозивни свойства), непозволяваща достигане на тези концентрации, то се прилага максимално постижимата технически концентрация на изследваното вещество.

1.6.2.5. Време на експозицията

Периодът на експозицията следва да бъде четири часа.

1.6.2.6. Апаратура

Опитите с животните се провеждат в апаратура за инхалации, проектирана така, че да поддържа динамичен въздушен поток (поне 12 смени на въздуха за един час), да осигурява подходящо съдържание на кислород и равномерно разпределение на веществото в атмосферата за експозиция. Когато се използва камера, нейната конструкция следва да е такава, че да свежда до минимум струпването на животните и да осигурява максимално тяхната експозиция чрез вдишване на изпитваното вещество. Основно правило за осигуряването на стабилна атмосфера в камерата е общият „обем“ на опитните животни да не е по-голям от 5 % от обема на камерата. Могат да се използват индивидуални камери, които да обхващат устата и носа, само главата или цялото тяло. Първите два вида камери спомагат да бъде сведено до минимум поемането на веществото по други пътища.

1.6.2.7. Период на наблюдение

Периодът на наблюдение следва да бъде най-малко 14 дни. Продължителността на наблюденията обаче не бива да е строго фиксирана. Тя се определя от токсичните реакции, скоростта, с която те настъпват, и времетраенето на възстановителния период. Така периодът на наблюдение може да се удължи, докогато се сметне за необходимо. Времето, за което се появяват и изчезват симптомите на токсичното действие, както и времето на смъртта са много важни, особено когато съществува тенденция към забавяне на смъртния изход.

1.6.3. Процедура

Животните се претеглят малко преди експозицията. Те се подлагат на въздействието на изпитваното вещество при съответната концентрация за период от четири часа, който се отчита след нагласяването на концентрацията в камерата. Времето за постигане на нужната концентрация в камерата следва да бъде кратко. Температурата по време на изпитването следва да се поддържа в интервала 22 ± 3 oС. В идеалния случай относителната влажност следва да бъде между 30 и 70 %, но понякога (например при изпитването на някои аерозоли) това не може да се постигне. Поддържането на малко по-ниско налягане в камерата (< 5 mm воден стълб) би предотвратило изтичане на изпитваното вещество в околната среда. По време на експозицията на животните не бива да се дават храна и вода. Следва да се използват подходящи системи за създаване и контрол на атмосферата за изпитването. Тези системи следва да осигуряват колкото е възможно по-бързото постигане на стабилни условия на експозицията. Камерата следва да е така проектирана и с нея да се работи по такъв начин, че да се поддържа равномерно разпределение на изпитваното вещество в обема на камерата.

Провеждат се следните измервания или наблюдения:

а) на дебита на въздушния поток (постоянно);

б) на действителната концентрация на изпитваното вещество. Тя се измерва в зоната на дишане поне три пъти по време на експозицията (при някои атмосфери, например аерозоли във високи концентрации, може да е необходимо по-често контролиране на концентрацията). По време на експозицията концентрацията не бива да варира с повече от ± 15 % от средната стойност. При някои аерозоли обаче това ниво на контрол не може да се постигне. В такива случаи се налага да се приемат по-широки граници на вариране на концентрациите. При аерозолите следва да се провеждат анализи на размера на частиците толкова често, колкото е необходимо (поне един път за всяка група животни);

в) на температурата и влажността (ако е възможно, непрекъснато).

Наблюдения се провеждат както по време на експозицията, така и след това. Те се записват системно, като се води индивидуален протокол за всяко животно. През първия ден наблюденията се правят много често. Обстоен клиничен преглед следва да се прави поне един път на всеки работен ден. Другите наблюдения се правят ежедневно, като се предприемат мерки за свеждане до минимум на загубата на животни от изпитването, например аутопсия или замразяване на животните, намерени мъртви, и изолиране или умъртвяване на слабите или умиращите животни.

Наблюденията следва да включват промените на кожата и козината, очите, лигавиците, измененията в дихателната, кръвоносната, автономната и централната нервна система, както и соматомоторната активност и поведението на животните. Особено внимание следва да се обърне на наблюденията на дишането, треморите, конвулсиите, слюноотделянето, диария, летаргия, сън и кома. Времето на смъртта следва да се записва колкото е възможно по-точно. Масата на всяко животно се определя по веднъж на седмица след експозиция и при настъпването на смъртта.

Животните, умрели по време на изпитването, както и оцелелите до края на експеримента се подлагат на аутопсия, като особено внимание се обръща на измененията в горните и долните дихателни пътища. Записват се всички видими макроскопски патологични изменения. Където е нужно, следва да се вземат тъкани за хистопатологично изпитване.

2. ДАННИ

Данните се обобщават в табличен вид. За всяка група от опитни животни те следва да показват: брой на животните в началото на изпитването, време на смъртта на всяко животно, брой на животните, показали други симптоми на токсичното действие, описание на токсичните ефекти и находките при аутопсията. Когато времето на преживяване е по-дълго от един ден, следва да се изчисляват и записват промените в телесната маса. Животните, които са умъртвени по хуманни съображения поради свързани с веществото признаци на стрес и болка, се отчитат като умрели в резултат на въздействието на веществото. Стойността на LС50 се определя по утвърдения метод. Оценката на данните следва да включва връзката (ако има такава) между експозицията на животното и проявите и степента на всички аномалии, включително тези в поведението, клиничните аномалии, видимите поражения, промените в телесната маса, смъртността и другите ефекти на токсичното действие.

3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО

Протоколът от изпитването следва по възможност да съдържа следната информация:

— вид, порода, източник, условия на околната среда, диета и т.н.;

— условия на изпитването: описание на апаратурата за експозиция, в това число конструкцията, типа, размерите, източника на въздух, системата за получаване на аерозоли, метода за кондициониране на въздуха и метода за разполагане на животните в камерата (когато е използвана камера). Също следва да се описват техническите средства за измерване на температурата, влажността и концентрацията на аерозола, както и разпределението на частиците по размери.

Данни за експозицията.

Данните за експозицията следва да се представят в табличен вид, като се представят със средните си стойности и измерените отклонения (например стандартното отклонение) и, ако е възможно, да включват:

а) дебитите на въздушния поток през апаратурата за инхалиране;

б) температурата и влажността на въздуха;

в) номиналните концентрации (общото количество изследвано вещество, подадено в апаратурата за инхалиране, разделено на обема въздух);

г) природата на носителя (ако е използван);

д) действителните концентрации в изпитваната зона на дишане;

е) масовия среден аеродинамичен диаметър (ММАD) и геометричното стандартно отклонение (СSD);

ж) периода за влизане на апаратурата в режим;

з) периода на експозиция; — таблични данни за отговора по пол и ниво на експозицията (например брой животни, които са умрели или са били убити по време на изпитването; брой животни, показващи признаци на токсично действие; брой животни, подложени на експозиция); — времена на смъртта по време на експозицията или след нея, причини и използвани критерии за умъртвяването по хуманни съображения; — всички наблюдения; — стойността на LС50 за всеки от половете, определена в края на наблюдателния период (като се посочи и методът на изчисляване); — 95 % интервал на достоверност за LС50 (където може да се предостави); — крива доза/смъртност и наклон на кривата (където е възможно да се измери в зависимост от метода на определянето); — находки при аутопсията; — всички хистопатологични находки; — обсъждане на резултатите (особено внимание се обръща на ефекта, който оказва умъртвявянето на животни по хуманни съображения по време на изпитването върху изчислената стойност на LС50); — интерпретиране на резултатите.

3.2. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТИРАНЕ

Вж. Общо въведение, част Б, буква Г.

4. ПРЕПРАТКИ

Вж. Общо въведение, част Б, буква Д.

Б.3. ОСТРА ТОКСИЧНОСТ (ДЕРМАЛНА)

1. МЕТОД

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

Вж. Общо въведение, част Б, буква А.

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Вж. Общо въведение, част Б, буква Б.

1.3. ВЕЩЕСТВА ЗА СРАВНЕНИЕ

Няма.

1.4. ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ

Изпитваното вещество в нарастващи дози се нанася върху кожата при няколко групи експериментални животни, като за всяка група се използва по една доза. След това се провеждат наблюдения върху вредните ефекти и смъртните случаи. Животните, умрели по време на изпитването, се подлагат на аутопсия. Оцелелите животни се аутопсират в края на изпитването.

Животните с остри и продължителни симптоми на болка и стрес може да се наложи да бъдат убити по безболезнен начин. Не бива да се прилага дозиране на изследваните вещества по начини, за които е известно, че причиняват силна болка и стрес, поради характерни за тях ефекти на разяждане или силно дразнене.

1.5. КРИТЕРИИ ЗА КАЧЕСТВО

Няма.

1.6. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ

1.6.1. Подготовка

Животните се разполагат по клетки и се държат и хранят в експериментални условия най-малко пет дни преди началото на експеримента. Преди изпитването млади, полово зрели животни в добро здравословно състояние се подбират по произволен начин и се разпределят на групи. Приблизително 24 часа преди опита козината по гръбната (дорзалната) част на тялото се отстранява чрез подрязване или бръснене. Следва да се внимава да не се охлузи кожата, защото това би могло да промени нейната пропускливост. За прилагането на изпитваното вещество е необходимо да се почистят най-малко 10 % от повърхността на тялото. При изпитването на твърди вещества (които може да се приведат в прахообразно състояние) веществото следва добре да се омокри с вода или, ако е необходимо, с подходящ носител, за да се осигури добър контакт с кожата. Ако се използва носител, следва да се има предвид неговото влияние върху проникването на веществото през кожата. По принцип течните вещества се прилагат без разреждане.

1.6.2. Условия на изпитването

1.6.2.1. Опитни животни

Могат да се използват плъхове или зайци в зряла възраст. Възможно е използването и на други видове животни, но за това е необходима обосновка. Използват се обикновените лабораторни породи. Вариациите в телесната маса на животните в началото на изпитването не бива да надвишават ± 20 % от съответната средна стойност за всеки от двата пола.

1.6.2.2. Брой и пол

При всяко ниво на дозиране се използват най-малко пет животни. Всички те следва да са от един и същи пол. Женските не бива да са раждали, както и да не са бременни. Ако има информация, че един от двата пола проявява значително по-висока чувствителност, то се използват животни от този пол.

Забележка: При изследванията за остра токсичност с животни от по-висш разред от гризачите, следва да се обмисли употребата на по-малък брой животни. Дозите следва да се подбират внимателно, като се полагат усилия да не се надвишават умерено токсичните дози. При тези изпитвания се избягва прилагането на летални дози от веществото.

1.6.2.3. Нива на дозите

Те следва да са достатъчно на брой (поне три) и да са правилно разпределени количествено, така че при изпитването да се получат групи от животни с определен обхват от токсични ефекти и нива на смъртност. При определянето на нивата на дозите следва да се вземат под внимание всички ефекти на дразнене и разяждане на кожата. Данните следва да са достатъчни за получаването на крива доза/отговор и, когато е възможно, да позволяват приемливо определяне на LD50.

1.6.2.4 .Гранично изпитване

С помощта на описаните по-горе процедури може да се проведе гранично изпитване с една доза на ниво най-малко 2 000 mg/кg телесна маса върху група от 5 мъжки и 5 женски животни. Ако това доведе до смъртност, свързана със съединението, може да се реши провеждане на пълното изследване.

1.6.2.5. Период на наблюдение

Периодът на наблюдение следва да бъде най-малко 14 дни. Продължителността на наблюдението обаче не бива да се фиксира точно. Тя се определя от реакциите на токсичното въздействие, скоростта, с която те настъпват, и времетраенето на възстановителния период. Така тя може да се удължи, докогато се сметне за необходимо. Времето, за което се появяват и изчезват симптомите на токсичното действие, тяхната продължителност и моментът на смъртта са важни, особено когато съществува тенденция към забавяне на смъртния изход.

1.6.3. Процедура

Животните се разполагат по клетки индивидуално. Изпитваното вещество се нанася равномерно върху площ около 10 % от общата повърхност на тялото. При силно токсичните вещества покритата повърхност от тялото може да бъде и по-малка, но при всички случаи покриването следва да стане на колкото е възможно по-тънък и равномерен пласт.

Изпитваните вещества се поддържат в контакт с кожата с помощта на марлена превръзка и лепенки, които не предизвикват дразнене. Времетраенето на експозицията е 24 часа. Мястото на прилагане следва да се покрие допълнително по подходящ начин, така че марлята и веществото да са добре закрепени и да се избегне възможността животното да погълне веществото. За тази цел може да се използват приспособления за ограничаване на движенията, но пълното обездвижване на животното не е препоръчително.

В края на експозиционния период останалото вещество се отстранява, като кожата се почиства с вода (ако е възможно) или по друг подходящ начин.

Наблюденията се записват системно в реда, в който са направени. За всяко животно се води индивидуален протокол. През първия ден наблюденията се провеждат често. Поне веднъж на всеки работен ден се прави обстоен клиничен преглед. Останалите наблюдения се провеждат ежедневно, като се прави всичко възможно загубата на животни да бъде сведена до минимум, например аутопсия или замразяване на животните, намерени мъртви, и изолиране или умъртвяване на слабите или умиращите животни.

Наблюденията следва да включват: промени в козината, третираната кожа, очите и лигавиците, както и на дихателната, кръвоносната, автономната и централната нервна система, соматомоторната активност и поведението на животните. Особено внимание следва да се обръща за тремори, конвулсии, слюноотделяне, диария, летаргия, сън и кома. Времето на смъртта се записва колкото е възможно по-точно. Животните, умрели по време на изпитването, както и оцелелите до края на изпитването се подлагат на аутопсия. Записват се всички видими патологични изменения. Когато е необходимо, някои тъкани се вземат за хистопатологично изследване.

Оценка на токсичното действие при другия пол

След приключването на опита с единия пол група от най-малко пет животни от другия пол също се подлага на третиране. Така може да се разбере дали животните от този пол не са забележимо по-чувствителни към изпитваното вещество. В отделни случаи е оправдано използването на по-малък брой животни. Когато има адекватна информация, показваща, че животните от изследвания пол са много по-чувствителни, то експериментирането с другия пол може и да не се прави.

2. ДАННИ

Данните се обобщават в табличен вид като за всяка група животни се показват: брой на животните в началото на изпитването, време на смъртта на всяко животно поотделно, брой животни с други признаци на токсично въздействие, описание на тосичните ефекти и находките при аутопсията. Индивидуалните телесни маси на животните се определят и записват непосредствено преди прилагането на изпитваното вещество, по един път на седмица след това и при смъртта. Когато времето на преживяване е по-голямо от един ден, измененията в теглото на животните се изчисляват и записват. Животните, убити по хуманни съображения заради стреса и болката, свързани с въздействието на веществото, се отчитат като случаи на смърт, причинена от веществото. Стойността на LD50 следва да се определи по утвърдения метод.

Оценката на данните следва да включва преценка на зависимостта (ако има такава) между експозицията на животните и появата и остротата на всички аномалии, включително в поведението и клиничните аномалии, видимите поражения, промените в телесната маса, смъртността и всички останали токсикологични ефекти.

3. ОТЧИТАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО

Протоколът от изпитването следва по възможност да съдържа следната информация:

— вид, порода, източник, условия на средата, диета и т.н.;

— условия на изпитван