ПРИЛОЖЕНИЕ VI

1. МЕТОД

Настоящият метод е еквивалентен на ОИСР TG 221 (2006) (1). Съществува широко съгласие между институциите на ЕС, че изпитването Lemna е подходяща алтернатива на изпитването с водорасли за силно оцветени вещества (2)(3).

1.1. ВЪВЕДЕНИЕ

Настоящият метод за изпитване е предназначен за оценяване на токсичността на вещества по отношение на сладководни растения от вида Lemna (водна леща). Той се базира на съществуващите насоки (4)(5)(6)(7)(8)(9), но включва и модификации на тези методи с цел да бъдат отразени най-скорошните научни изследвания и обсъждането на редица ключови въпроси. Предложеният метод е валидиран чрез международно кръгово изпитване (10).

Настоящият метод за изпитване описва изпитване за токсичност с използване на Lemna gibba и Lemna minor, като и двата вида са били пространно изследвани и са предмет на посочените по-горе стандарти. Таксономията на вида Lemna е трудна, тъй като е усложнена от съществуването на широк кръг от фенотипове. Въпреки че за Lemna може да възникне генетична изменчивост като реакция на токсични вещества, към момента няма достатъчно данни относно този източник на изменчивост, за да бъде препоръчан специфичен клонинг, който да бъде използван с настоящия метод за изпитване. Следва да се отбележи, че изпитването не е проведено при пълно отсъствие на чужди организми, но по време на процедурата за изпитване се предприемат поетапни стъпки за поддържане на минимално замърсяване с други организми.

Описани са подробности от изпитването с обновяване (полустатично или проточно) на изпитвания разтвор и без обновяване (статично) на изпитвания разтвор. В зависимост от целите на изпитването и регулаторните изисквания се препоръчва да се обмисли прилагането на полустатичния метод и на проточния метод, например за вещества, които бързо се губят от разтвора в резултат на изпаряване, фоторазграждане, утаяване или биоразграждане. Допълнителни насоки са дадени в (11).

1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

За целите на настоящия метод на изпитване са използвани следните определения и съкращения:

Биомаса: сухото тегло на живите организми, съдържащи се в една популация. В настоящото изпитване заместителите на биомасата, като количеството листовидни тела или площта на листовидните тела обикновено са измерени и поради това използването на термина „биомаса“ се отнася също и за измерванията на заместителите.

Хлороза: пожълтяване на тъканта на листовидните тела.

Клонинг: организъм или клетка, възникнал от единствен индивид чрез безполово възпроизвеждане. Следователно, индивидите от един и същи клонинг са генетично идентични.

Колония: означава съвкупност от майчини и дъщерни листовидни тела (обикновено от 2 до 4), закрепени един към друг. Понякога се посочва като растение.

ECx : концентрацията на изпитваното вещество, разтворено в средата на изпитване, която води до потискане на растежа от x % (например 50 %) на Lemna в рамките на определения период на експозиция (да бъде изрично отбелязано, ако има отклонение от пълната или нормалната продължителност на изпитването). С оглед на еднозначно обозначаване на стойността на EC, изведена от скоростта на растежа или от добива, символът „ErC“ се използва за скоростта на растежа, а „EyC“ се използва за добива, следван от използваната измервана променлива, например ErC (брой листовидни тела).

Проточно изпитване: изпитване, при което изпитваните разтвори се подменят постоянно.

Листовидно тяло: отделна/единична „листообразна“ структура на растението водна леща. Това е най-малката единица, т.е. годен за възпроизводство индивид.

Издутост: означава листовидни тела, чийто външен вид е изпъкнал или набъбнал.

Растеж: нарастване на измерваната променлива, например на броя на листовидните тела, сухото тегло, мокрото тегло или площта на листовидните тела през периода на изпитване.

Скорост на растеж (средна специфична скорост на растеж): логаритмичното нарастване на биомасата през периода на експозиция.

Най-ниска концентрация на наблюдавано въздействие (LOEC): най-ниската изпитвана концентрация, при която за веществото се наблюдава статистически значимо понижаващо въздействие върху растежа (при p < 0,05) в сравнение с контролната проба, в рамките на дадено време на експозиция. При все това, всички изпитвани концентрации над LOEC трябва да имат вредно въздействие, равно или по-голямо от наблюдаваното при LOEC. Когато тези две условия не могат да бъдат удовлетворени, трябва да се даде пълно обяснение за това как е била избрана LOEC (и следователно NOEC).

Измервани променливи: всички видове променливи, които се измерват с цел да се изрази крайната точка на изпитването с помощта на една или няколко различни променливи на реакцията. При настоящия метод измерваните променливи са броят на листовидните тела, площта на листовидните тела, свежото тегло и сухото тегло.

Монокултура: култура от един вид растение.

Некроза: мъртва (т.е. бледа или просмукана с вода) листна тъкан.

Концентрация без наблюдавано въздействие (NOEC): изпитваната концентрация, непосредствено под LOEC.

Фенотип: наблюдаемите характеристики на един организъм, определени от взаимодействието на неговите гени и неговата околна среда.

Променливи на реакцията: променливите за оценяване на токсичността, изведени от произволни измервани променливи, описващи биомасата, с помощта на различни методи за изчисление. При настоящия метод, скоростите на растежа и на добива са променливи на реакцията, изведени от измервани променливи като брой листовидни тела, площ на листовидните тела, свежо тегло или сухо тегло.

Полустатично (обновяемо) изпитване: изпитване, при което изпитваният разтвор периодично се подменя на определени интервали по време на изпитването.

Статично изпитване: метод за изпитване без обновяване на изпитвания разтвор по време на изпитването.

Крайна точка на изпитване: описва общия показател, който ще бъде изменен от химикала за изпитване по отношение на контролната проба като цел на изпитването. При настоящия метод крайната точка на изпитването е потискането на растежа, което може да се изрази чрез различни променливи на реакцията на базата на една или повече измервани променливи.

Среда на изпитване: напълно синтетичната среда на растеж, върху която растат изпитваните растения, когато са подложени на въздействието на веществото за изпитване. Веществото за изпитване обикновено се разтваря в средата на изпитване.

Добив: стойността на измервана променлива, чрез която се изразява биомасата в края на периода на експозиция минус измерваната променлива в началото на периода на експозиция.

1.3. ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО

Дадена е възможност експоненциално растящите растителни култури от вида Lemna да растат като монокултури при различни концентрации на изпитваното вещество за период от седем дни. Целта на изпитването е да се измерят количествено свързаните с веществото въздействия върху вегетативния растеж през този период, на базата на оценки на избрани измервани променливи. Броят на листовидните тела е главната измервана променлива. Най-малко още една измервана променлива (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло) също се измерва, тъй като някои вещества могат да окажат много по-голямо въздействие върху други измервани променливи, отколкото върху броя на листовидните тела. За количествена оценка на свързани с веществата въздействия, растежът в изпитваните разтвори се сравнява с този на контролните проби и се определят концентрациите, при които се осъществява потискане на растежа до определените x % (например 50 %) и се изразяват като ECx (например EC50)

Крайната точка на изпитването е потискането на растежа, изразено като логаритмично нарастване на измерваната променлива (средна специфична скорост на растеж) през периода на експозицията. От средните специфични скорости на растеж, регистрирани в серия от изпитвани разтвори, се определя концентрацията, при която се осъществява потискане на скоростта на растежа до определените x % (например 50 %) и се изразява като ErCx (например ErC50).

Допълнителната променлива на растеж, използвана в настоящия метод на изпитване, е добивът, който може да е необходим, за да бъдат изпълнени специфични регулаторни изисквания в някои държави. Той се определя като измерваните променливи в края на периода на експозиция минус измерваните променливи в началото на периода на експозиция. От добива, регистриран в серия от разтвори на изпитване се изчислява концентрацията, при която се осъществява потискане на добива до определените x % (например 50 %) и се изразява като EyCx (например EyC50).

В допълнение концентрацията с най-ниско наблюдавано въздействие (LOEC) и концентрацията с ненаблюдавано въздействие (NOEC) могат да бъдат определени статистически.

1.4. ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСНО ИЗПИТВАНОТО ВЕЩЕСТВО

Следва да е възможно използването на аналитичен метод с достатъчна чувствителност за количествено измерване на веществото в средата на изпитване.

Информацията относно изпитваното вещество, която може да бъде полезна при установяване на условията на изпитване, включва структурната формула, чистотата, водоразтворимостта, стабилността във вода и на светлина, pKa, Kow, парното налягане и биоразградимостта. Разтворимостта във вода и парното налягане може да се използват за изчисляване на константата по закона на Хенри, която ще покаже дали са възможни значителни загуби на изпитваното вещество през периода на изпитването. Това ще помогне да се разбере дали следва да се предприемат определени стъпки за контролиране на тези загуби. Когато информацията за разтворимостта и стабилността на изпитваното вещество е несигурна, се препоръчва те да бъдат оценени в условията на изпитване, т.е. среда на растеж, температура, режим на осветеност, които ще бъдат използвани при изпитването.

Когато контролът върху pH на средата на изпитването е особено важен, например при изпитване на метали или вещества, които са нестабилни при хидролизата, се препоръчва добавянето на буферно вещество към хранителната среда (вж. първата алинея от раздел 1.7.4). Допълнителни насоки относно изпитвани вещества, чиито физикохимични свойства затрудняват тяхното изпитване, са дадени в (11).

1.5. РЕФЕРЕНТНО ВЕЩЕСТВО

Референтното вещество (референтните вещества), като например 3,5-дихлорфенол, използвано в международното кръгово изпитване (10), може да бъде изпитвано като средство за проверка на процедурата за изпитване. Желателно е референтното вещество да се изпитва най-малко два пъти годишно или, когато изпитването се извършва по-рядко, да се извършва едновременно с определянето на токсичността на изпитваното вещество.

1.6. ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО

За да е валидно изпитването, времето за удвояване на листовидното тяло в контролната проба трябва да бъде по-малко от 2,5 дни (60 часа), съответстващо на седемкратно увеличение за седем дни и средна специфична скорост на растеж от 0,275 d–1. Използването на средата и на условията на изпитване, описани в настоящия метод за изпитване, позволяват постигането на този критерий с помощта на статичен режим на изпитване (8). Очаква се също, че този критерий е достижим и в условия на полустатично и проточно изпитване. Изчисляването на времето за удвояване е показано в раздел 2.1.

1.7. ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА

1.7.1. Апаратура

Цялото оборудване в контакт със средата на изпитване следва да е направено от стъкло или друг химически инертен материал. Стъклените съдове, използвани за отглеждане на култури и за изпитване, трябва да бъдат почистени от химични замърсители, които биха могли да проникнат в средата на изпитване, както и да бъдат стерилни. Съдовете за изпитването трябва да са достатъчно широки, така че листовидното тяло от различни колонии в контролните съдове да расте без припокриване в края на изпитването. Няма значение дали корените докосват дъното на съдовете за изпитване, но се препоръчва минимална дълбочина от 20 mm и минимален обем от 100 ml за всеки съд за изпитване. Изборът на съда за изпитването не е от решаващо значение, при условие че тези изисквания са изпълнени. Доказано е, че подходящи за целта са стъклени лабораторни чаши, блюда кристализатори или стъклени блюда на Петри с нужните размери. Съдовете за изпитването трябва да бъдат покрити с оглед минимизиране на изпарението и на случайното замърсяване, като същевременно се даде възможност за циркулиране на въздуха. Подходящите съдове за провеждане на изпитването и особено капаците трябва да предотвратяват засенчването или промените в спектралните характеристики на светлината.

Културите и съдовете за изпитването трябва да не се съхраняват заедно. Това се постига най-добре с използването на изолирани от въздействията на околната среда, камери, инкубатори или помещения за растеж. Необходимо е осветлението и температурата да могат да се контролират и да се поддържат на постоянно ниво (вж. раздел 1.7.8).

1.7.2. Изпитван организъм

Организмът, използван за настоящото изпитване, е Lemna gibba или Lemna minor. Кратки описания на видовете водна леща, използвани за изпитване за токсичност, са дадени в допълнение 1. Растителният материал може да бъде получен от колекция от култури, от друга лаборатория или от полето. Ако са събрани от полето, растенията следва да се съхраняват в култура в същата среда, която се използва за изпитването, в течение на минимум осем седмици преди да се използват. Полевите обекти за събиране на началните култури трябва да са без явни източници на замърсяване. Ако са получени от друга лаборатория или от колекция от култури, те следва да се съхраняват по същия начин в течение на минимум три седмици. За източника на растителен материал, вида и клонинга (ако е известен), използвани в изпитването, трябва винаги да се докладва.

Трябва да бъдат използвани монокултури, които нямат видимо замърсяване с други организми като водорасли и протозоа. Здравите растения от L. minor трябва да се състоят от колонии, включващи между два и пет листовидни тела, докато здравите колонии на L. gibba могат да съдържат до седем листовидни тела.

Качеството и еднородността на използваните за изпитването растения оказват значително влияние върху резултата от изпитването и поради това растенията трябва да бъдат грижливо подбрани. Трябва да се използват млади, бързорастящи растения без видими повреди и обезцветяване (хлороза). Признак за култури с добро качество е големият обхват на колонии, съставени от поне две листовидни тела. Голям брой отделни листовидни тела е показателен за екологичен стрес, например ограничаване на хранителните вещества, като растителен материал от такива култури не трябва да се използва за изпитване.

1.7.3. Култивиране

За намаляване на честотата за поддръжка на културата (например когато не са планирани изпитвания с Lemna за известен период), културите трябва да се съхраняват при намалено осветление и температура (4—10 °C). Подробности за култивирането са дадени в допълнение 2. Очевидни знаци за замърсяване с водорасли или други организми изискват стерилизация на повърхността на подпроба от листообразните тела на Lemna, последвана от прехвърляне в прясна среда (вж. допълнение 2). В такъв случай останалата замърсена култура трябва да се изхвърли.

Най-малко седем дни преди изпитването достатъчно колонии се прехвърлят по стерилен начин в прясна стерилна среда и се култивират в течение на 7—10 дни при условията на изпитването.

1.7.4. Среда на изпитване

Препоръчват се различни среди за Lemna minor и за Lemna gibba, както е описано по-долу. Трябва внимателно да се прецени включването на pH буфер в средата на изпитване (MOPS (4-морфолинпропанова сулфонна киселина, № по CAS: 1132—61—2; № по EINECS: 214—478—5) в средата за L. minor и NaHCO3 в средата за L. gibba), когато има предположения, че буферът може да реагира с изпитваното вещество и да повлияе на изразяването на неговата токсичност. Средата на Steinberg (12) също е приемлива, при условие че критериите за валидност са изпълнени.

За култивиране и изпитване с L. minor се препоръчва модификация на средата на растеж за Lemna по шведския стандарт (SIS). Съставът на тази среда е даден в допълнение 3.

Средата на растеж 20X — AAP, както е описана в допълнение 3, се препоръчва за култивиране и изпитване с L. gibba.

Средата на Steinberg, както е описана в допълнение 3, също е подходяща за L. minor, но би могла да се използва и за L. gibba, при условие че са изпълнени критериите за валидност.

1.7.5. Разтвори за изпитване

Разтворите за изпитване обикновено се приготвят чрез разреждане на изходните разтвори. Изходният разтвор на изпитваното вещество обикновено се приготвя чрез разтваряне на веществото в среда на растеж.

Най-високата изпитвана концентрация на изпитваното вещество обикновено не трябва да надвишава разтворимостта във вода на веществото при условията за провеждане на изпитването. Следва да се отбележи обаче, че видът Lemna плава на повърхността и може да бъде изложен на въздействието на вещества, които се събират на границата между водата и въздуха (например, слабо разтворими във вода или хидрофобни вещества или повърхностно активни вещества). При такива обстоятелства експозицията ще произтича от материал, различен от този в разтвора, и изпитваните концентрации могат, в зависимост от характеристиките на изпитваното вещество, да надвишат разтворимостта във вода. За изпитвани вещества с ниска водоразтворимост може да е необходимо да се приготви концентриран изходен разтвор или емулсия на веществото, като се използва органичен разтворител или дисперсант, за да се улесни добавянето на точни количества от изпитваното вещество към средата на изпитване и да се подпомогне неговото диспергиране и разтваряне. Трябва да се положат всички усилия, за да се избегне използването на такива материали. Не трябва да има фитотоксичност в резултат на използването на спомагателни разтворители и дисперсанти. Например обичайно използваните разтворители, които не предизвикват фитотоксичност при концентрации до 100 μl·l–1, включват ацетон и диметил формамид. Ако се използва разтворител или дисперсант, трябва да бъде отчетена неговата крайна концентрация и тя да се поддържа на минимално ниво (≤ 100 μl·l–1), а всички третирани и контролни проби трябва да съдържат еднаква концентрация на разтворителя или дисперсанта. Допълнителни насоки относно използването на дисперсанти са дадени в (11).

1.7.6. Изпитвана и контролна групи

Предварителното познаване на токсичността на изпитваното вещество по отношение на Lemna, например от изпитване за определяне на диапазон, ще помогне при избирането на подходящи изпитвани концентрации. В окончателното изпитване за токсичност обикновено би следвало да има най-малко пет изпитвани концентрации, подредени в геометрична прогресия. За предпочитане е коефициентът на разделяне между изпитваните концентрации да не надхвърля 3,2, но могат да се използват и по-големи стойности, при които кривата „концентрация—реакция“ е полегата. Трябва да се представи обосновка, ако са използвани по-малко от пет концентрации. Най-малко три идентични проби трябва да се използват за всяка от изпитваните концентрации.

При задаването на диапазона на изпитваните концентрации (за изпитване за определяне на диапазон и/или за окончателно изпитване за токсичност), трябва да се има пред вид следното:

Всяко изпитване трябва да включва контролни проби, състоящи се от същата хранителна среда, същия брой листовидни тела и колонии, същите условия на околната среда и процедури както при съдовете за изпитване, но без изпитваното вещество. Ако се използва спомагателен разтвор или дисперсант, трябва да бъде включена допълнително контролна третирана проба, като разтворителят/дисперсантът трябва да присъстват в същата концентрация като тази в съдовете с изпитваното вещество. Броят на съдовете за повторни контролни проби (и съдовете с разтворител, ако е приложимо) трябва да е най-малко равен, а в идеалния случай да е два пъти по-голям от броя на съдовете, използвани за всяка изпитвана концентрация.

Ако не се изисква определяне на NOEC, планът за изпитването може да бъде променен, като се увеличи броят на концентрациите и се намали броят на повторните проби за всяка от концентрациите. Но все пак броят на повторните контролни проби трябва да е най-малко три.

1.7.7. Експозиция

Колониите, състоящи се от 2 до 4 видими листовидни тела, се прехвърлят от инокулираната култура и се прехвърлят на принципа на случайността в съдовете за изпитване при стерилни условия. Всеки съд за изпитване трябва да съдържа общо от 9 до 12 листовидни тела. Броят на листовидните тела и колонии трябва да е еднакъв във всеки съд за изпитване. Придобитият опит за настоящия метод и данните от кръговото изпитване показват, че използването на три повторни проби от една третирана проба, като всяка повторна проба съдържа в началото от 9 до 12 листовидни тела, е достатъчно за откриването на различията в растежа приблизително от 4 до 7 % на потискането, изчислено чрез скоростта на растежа (10 до15 %, изчислени чрез добива) между третираните проби (10).

За минимизиране влиянието на пространствените различия в интензитета на светлината и температурата се изисква схема за случаен подбор за разполагане на съдовете за изпитване в инкубатора. При извършване на наблюдения (или при по-честа промяна на разполагането) също се изискват блокова схема или промяна на разполагането чрез случаен подбор.

Ако предварителното изпитване за стабилност показва, че концентрацията на изпитваното вещество не може да бъде поддържана (т.е. измерената концентрация пада под 80 % от първоначално измерената концентрация) по време на изпитването (7 дни), се препоръчва полустатичен режим на изпитване. В този случай колониите трябва да бъдат експонирани в прясно приготвени разтвори за изпитване и за контролни проби най-малко два пъти по време на изпитването (например, ден 3 и 5). Честотата на експониране в прясна среда ще зависи от стабилността на изпитваното вещество; може да е необходима по-голяма честота, за да се поддържа почти постоянна концентрация за силно нестабилни или летливи вещества. При някои обстоятелства може да се изисква процедура с протичане (11)(13).

Сценарият на експозиция чрез листно подхранване на растенията (пръскане) не е включен в настоящия метод за изпитване, вместо това вж. (14).

1.7.8. Инкубационни условия

Трябва постоянно да се използва топло или студено бяло флуоресцентно осветление, за да се осигури интензитет на светлината, избрана в диапазона 85—135 μE·m–2·s–1, когато се измерва във фотосинтетично активно излъчване (400—700 nm) в точки, чието разстояние от източника на светлина е еднакво с това на листовидни тела на Lemna (еквивалентно на 6 500—10 000 lux). Разликите в интензитета на светлината и избрания за площта на изпитването интензитет на светлината не трябва да нахвърлят ± 15 %. Методът за засичане и измерване на светлината, особено видът на сензора, ще оказват влияние върху измерваната стойност. Сферичните сензори (които реагират на светлина, излъчвана от всички ъгли над и под равнината на измерване) и „косинусовите“ сензори (които реагират на светлината, излъчвана от всички ъгли над равнината на измерване), са за предпочитане пред еднопосочните сензори и ще отчитат по-прецизни показания за описания тук вид многоточков източник на светлина.

Температурата в съдовете за изпитване трябва да бъде 24 ± 2 °C. Стойността на pH на контролната среда не трябва да се повишава с повече от 1,5 единици по време на изпитването. Въпреки това, отклонение с повече от 1,5 единици не прави изпитването невалидно, при условие че може да се покаже, че критериите за валидност са изпълнени. Необходимо е да се обърне допълнително внимание на отклонението в стойността на pH в някои специални случаи, например когато се изпитват нестабилни вещества или метали. Вж. (11) за допълнителни насоки.

1.7.9. Продължителност

Изпитването се прекратява 7 дни след прехвърлянето на растенията в съдовете за изпитване.

1.7.10. Измервания и аналитични определения

В началото на изпитването се преброяват и записват листовидните тела в съдовете за изпитване, като се внимава да бъде гарантирано отчитането на подаващите се, ясно видими листовидни тела. Броят на листовидните тела, които изглеждат нормални или анормални, следва да се определи в началото на изпитването и най-малко веднъж на всеки 3 дни по време на експозицията (т.е. в най-малко 2 случая по време на 7-дневния период), както и при завършване на изпитването. Трябва да бъдат отбелязани промените в развитието на растението, например в размера на листовидните тела, външния вид, показания за некроза, хлороза или набъбналост, разпадане на колонията или загуба на способността за задържане върху повърхността на водата, както и дължината и външния вид на корените. Трябва да се отбележат и значими характеристики на средата на изпитване (например наличието на неразтворен материал, растеж на водорасли в съда за изпитване).

В допълнение към определянето на броя на листовидните тела по време на изпитването, трябва да се оценят и въздействията на изпитваното вещество върху една (или повече) от следните измервани променливи:

Общата площ на листовидните тела има предимство, че може да се определи за всеки изпитван и контролен съд в началото, по време и в края на изпитването. Сухото или свежото тегло трябва да се определят в началото на изпитването от проба на инокулативната култура, която е образец на това, което се използва за начало на изпитването, както и в края на изпитването с растителен материал от всеки съд за изпитване и всеки контролен съд. Ако не се измерва площта на листовидните тела, за предпочитане е сухото пред свежото тегло.

Общата площ на листовидните тела, сухото тегло и свежото тегло могат да бъдат определени, както следва:

1.7.10.1. Честота на измерванията и аналитичните определения

Ако се използва схема за статично изпитване, pH на всяка третирана проба трябва да се измери в началото и в края на изпитването. Ако се използва схема за полустатично изпитване, pH трябва да се измерва във всяка партида от „свеж“ разтвор за изпитване преди всяко подновяване, както и в съответните „изчерпани“ разтвори.

Интензитетът на светлината трябва да се измерва във вегетационната камера, в инкубатора или помещението в точки, които са на разстояние от източника на светлина, което е еднакво с това на листовидните тела на Lemna. Измерванията трябва да се извършват най-малко веднъж по време на изпитването. Температурата на средата в заместващия съд, който се държи при същите условия във вегетационната камера, инкубатора или помещението, трябва да се записва най-малко веднъж дневно.

По време на изпитването концентрациите на изпитваното вещество се определят през подходящи интервали. При статични изпитвания минималното изискване е концентрациите да се определят в началото и края на изпитването.

При полустатични изпитвания, при които концентрацията на изпитваното вещество не се очаква да остане в рамките на ± 20 % от номиналната концентрация, е необходимо да се анализират всички прясно приготвени изпитвани разтвори и същите разтвори при всяко обновяване (вж. третата алинея от раздел 1.7.7). Обаче при тези изпитвания, при които измерената начална концентрация на изпитваното вещество не е в рамките на ± 20 % от номиналната, но за които може да се предоставят достатъчно доказателства, показващи че началните концентрации са повторяеми и стабилни (т.е. в диапазона 80—120 % от началната концентрация), химичните определения могат да се извършат само за най-високата и най-ниската изпитвана концентрация. Във всички случаи определянето на концентрациите на изпитваното вещество преди обновяването е необходимо да се извършва само за един повторен съд за всяка изпитвана концентрация (или съдържанието на съдовете, обединени в пул от повторени проби).

Ако се използва проточно изпитване, подходящ е режим за взимане на проби, подобен на описания при полустатичните изпитвания, включително анализа в началото, по средата и в края на изпитването, но измерванията на „изчерпаните“ разтвори в този случай не са подходящи. В този тип на изпитване скоростта на потока на разреждащото и изпитваното вещество или изходният разтвор на изпитваното вещество трябва да се проверяват ежедневно.

Ако има доказателство, че концентрацията на веществото, което се изпитва, се поддържа задоволително в рамките на ± 20 % от номиналната или измерената начална концентрация през цялото време на изпитването, анализът на резултатите може да се базира на номиналните или измерените начални стойности. Ако отклонението от номиналната или измерената начална концентрация е по-голямо от ± 20 %, анализът на резултатите трябва да се базира на средногеометричната стойност на концентрацията по време на експозицията или на модели, които описват намаляването на концентрацията на изпитваното вещество (11).

1.7.11. Гранично изпитване

При някои обстоятелства, например когато едно предварително изпитване е показало, че изпитваното вещество няма токсично въздействие при концентрации до 100 mg·l–1, или до неговата граница на разтворимост в средата на изпитване (която от двете стойности е по-ниска), може да се предприеме гранично изпитване, включващо сравнение на реакциите в контролна група и една група с третирани проби (100 mg·l–1 или концентрация, равна на границата на разтворимост). Настоятелно се препоръчва това да бъде подкрепено с анализ на концентрацията на експозиция. Всички предходни условия на изпитване и критерии за валидност се прилагат и за гранично изпитване, с изключение на това, че броят на третираните повторни проби трябва да се удвои. Растежът в контролната и третираната група може да се анализира чрез използване на статистическо изпитване за сравняване на средните стойности, например t-тест на Student.

2. ДАННИ И ОТЧИТАНЕ

2.1. ВРЕМЕ НА УДВОЯВАНЕ

За определяне на времето за удвояване (Td) на броя на листовидните тела и придържането към този критерий за валидност при изследването (раздел 1.6) се използва следната формула с данните, получени от контролните съдове:

Td = ln 2/μ

където μ е средната специфична скорост на растеж, определена според описанието в първа и втора алинея от раздел 2.2.1.

2.2. ПРОМЕНЛИВИ НА РЕАКЦИЯТА

Целта на изпитването е да се определят въздействията на изпитваното вещество върху вегетативния растеж на Lemna. Настоящият метод за изпитване описва две променливи на реакцията, тъй като държавите-членки имат различни предпочитания и регулаторни нужди. За да се приемат резултатите от изпитването във всички държави-членки, въздействията следва да се оценяват с използването и на двете променливи a) и б) на реакцията, описани по-долу.

Следва да се отбележи, че стойностите на токсичността, изчислени с помощта на тези две променливи на реакцията, не са сравними и тази разлика трябва да се разпознава, когато се използват резултатите от изпитването. Стойностите на ECx, базирани на средната специфична скорост на растеж (ErCx), по правило ще бъдат по-високи от резултатите, базирани на добива (EyCx), ако се придържате към условията за изпитване на настоящия метод за изпитване, което се дължи на математическата основа на съответните подходи. Това не трябва да се интерпретира като разлика между чувствителността на двете променливи на растеж, тъй като стойностите просто са различни чисто математически. Концепцията за средната специфична скорост на растеж се основава на общия експоненциален модел за растежа на водната леща в неограничени култури, където токсичността се оценява на базата на въздействието върху скоростта на растежа, без да зависи от абсолютното ниво на специфичната скорост на растеж на контролната проба, от наклона на кривата на концентрация-реакция или продължителността на изпитването. Противоположно на това, резултатите, базирани на променливата на реакцията за добива, зависят от всички тези други променливи. EyCx зависи от специфичната скорост на растеж на вида водна леща, използван във всяко изпитване, както и от максималната специфична скорост на растеж, която може да варира между видовете и дори различните клонинги. Тази променлива на реакцията не следва да се използва за сравняване на чувствителността към токсични вещества между видовете водна леща и дори различните клонинги. Докато използването на средната специфична скорост на растеж за оценяване на токсичността е за предпочитане от научна гледна точка, оценките за токсичността, базирани на добива, които също са включени в настоящия метод за изпитване, удовлетворяват действащите регулаторни изисквания в някои държави.

Оценките за токсичността трябва да са базирани на броя на листовидните тела и на още една допълнителна измервана променлива (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло), тъй като някои вещества могат да въздействат на други измервани променливи много повече, отколкото броят на листовидните тела. Това въздействие не може да бъде открито само чрез изчисляване на броя на листовидните тела.

Броят листовидни тела, както и всяка друга записана измервана променлива, т.е. общата площ на листовидните тела, сухото тегло или свежото тегло, се табулират заедно с концентрациите на изпитваното вещество за всеки измерван случай. Последващият анализ на данни, например оценяването на LOEC, NOEC или ECx, трябва да се основава на стойностите за отделните повторни проби, а не на изчислените средни стойности за група третирани проби.

2.2.1. Средна специфична скорост на растеж

Средната специфична скорост на растеж за определен период се изчислява като логаритмичното нарастване в променливите за растеж — брой на листовидните тела и още една измервана стойност (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло) — като се използва формулата, дадена по-долу, за всяка повторна проба на контролната проба и третираните проби:

където:

За всяка група от третирани проби и контролна група да се изчисли средната стойност за скоростта на растеж заедно с оценки на променливостта.

Средната специфична скорост на растеж трябва да се изчисли за целия период на изпитване (времето „i“ в горната формула е началото на изпитването, а времето „j“ е краят на изпитването). За всяка изпитвана и контролна концентрация да се изчисли средната стойност на скоростта за растеж заедно с оценки на променливостта. Допълнително трябва да се оцени скоростта на растеж сектор по сектор с цел да се оценят въздействията на изпитваното вещество, които възникват в периода на експозиция (например чрез проверка на логаритмично преобразуваните криви на растежа). Значителните различия между скоростта на растеж по сектори и средната скорост на растеж показват отклонение от постоянния експоненциален растеж и че има основание за внимателна проверка на кривите на растежа. В този случай консервативният подход ще бъде да се сравнят специфичните скорости на растежа на третираните култури в течение на времевия интервал на максимално потискане с тези за контролните проби за същия времеви интервал.

Процентът на потискане на скоростта на растежа (Ir) тогава може да се изчисли за всяка изпитвана концентрация (група от третирани проби) съгласно следната формула:

където:

2.2.2. Добив

Въздействията върху добива се определят на базата на две измервани променливи, броя на листовидните тела и още една измервана променлива (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло), които присъстват във всеки съд за изпитване в началото и в края на изпитването. За сухото тегло или свежото тегло началната биомаса се определя на базата на проба от листовидни тела, взета от същата проба, използвана за инокулацията на съдовете за изпитване (вж. втората алинея от раздел 1.7.3). За всяка изпитвана концентрация и контролна концентрация да се изчисли средната стойност на добива заедно с оценки на променливостта. Средното процентно потискане на добива (% Iy) може да се изчисли за всяка група от третирани проби, както следва:

където:

2.2.3. Построяване на кривите „концентрация—реакция“

Трябва да се построят кривите концентрация—реакция, които дават съотношението на средното процентно потискане на променливата на реакцията (Ir или Iy, изчислени както е показано в последната алинея от раздел 2.2.1 или в раздел 2.2.2) и логаритъма на концентрацията на изпитваното вещество.

2.2.4. Оценяване на ECx

Оценките на ECx (например EC50) следва да се базират както на средната специфична скорост на растеж (ErCx), така и на добива (EyCx), като всяка от тях от своя страна се основава на броя на листовидните тела и една допълнителна измервана променлива (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло). Това е така, тъй като има изпитвани вещества, който оказват различно въздействие върху броя на листовидните тела и други измервани променливи. Следователно исканите параметри за токсичност са четирите стойности на ECx за всяко изчислено ниво x на потискане на растежа: ErCx (брой на листовидните тела); ErCx (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло); EyCx (брой на листовидните тела); и EyCx (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло).

2.3. СТАТИСТИЧЕСКИ ПРОЦЕДУРИ

Целта е да се получи количествено съотношение концентрация—реакция чрез регресивен анализ. Може да се използва тегловна линейна регресия след извършване на линеаризираща трансформация на данните от ответната реакция — например в единици пробит или логит или Weibull (16), но предпочитаните техники са тези на нелинейната регресия, които по-добре обработват неизбежните неравномерности и отклонения от гладките разпределения. При приближаване на нулево или пълно потискане подобни неравномерности може да бъдат увеличени от трансформацията, като по този начин пречат на анализа (16). Трябва да се отбележи, че стандартните методи за анализ с помощта на преобразования на пробит, логит или Weibull са предназначени за използване за количествени данни (например смъртност или оцеляване) и трябва да се модифицират, за да се приспособят към данните за скоростта на растежа или добива. Специфични процедури за определяне на стойностите на ECx от непрекъснати данни могат да се намерят в (17), (18) и (19).

За анализа на всяка от променливите на реакцията да се използва съотношението концентрация—реакция, за да се изчислят точковите оценки на стойностите на ECx. По възможност трябва да се определят 95 % доверителни граници за всяка от оценките. Адекватността на данните от реакцията спрямо регресивния модел може да се оцени графично или статистически. Регресивният анализ трябва да се извърши, като се използват реакциите на отделните повторни проби, а не средните стойности на група от третирани проби.

Оценките на EC50 и доверителните граници могат да се получат също и чрез използване на линейна интерполация с оценка на извадковата грешка (20), ако наличните регресивни модели/методи са неподходящи за данните.

За оценяване на LOEC и следователно на NOEC е необходимо да се сравнят средните стойности на третирана проба, като се използва техниките за анализ на променливостта (ANOVA). Средната стойност за всяка концентрация след това трябва да се сравни със средната стойност на контролна проба с помощта на съответния метод за многократно сравняване или на изпитване за тенденция. Могат да се използват изпитвания на Dunnett или на William (21)(22)(23)(24). Необходимо е да се оцени дали предположението ANOVA за хомогенност на променливостта се запазва. Тази оценка може да се извърши графично или чрез изпитване за формална значимост (25). Подходящи са изпитванията на Levene или на Bartlett. Невъзможността за удовлетворяване на предположението за хомогенност на променливостта понякога може да се коригира чрез логаритмична трансформация на данните. Ако хетерогенността е много голяма, следва да се обмисли анализ с методи като низходящите изпитвания на Jonkheere за тенденцията. Допълнителни насоки относно определянето на NOEC могат да се намерят в (19).

Най-скорошните научни разработки водят до препоръка да бъде изоставена концепцията за NOEC и тя да бъде заменена с регресия, базирана на точкови оценки на ECx. Не е установена подходяща стойност на x за това изпитване на Lemna. Но изглежда, че диапазонът от 10 до 20 % е подходящ (в зависимост от избраната променлива на реакцията) и за предпочитане е да бъде отчетена както стойността EC10, така и EC20.

3. ОТЧИТАНЕ

3.1. ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО

Протоколът от изпитването трябва да включва следното:

Изпитвано вещество:

Изпитвани видове:

Условия на изпитване:

Резултати:

4. ЛИТЕРАТУРА

The use of Lemna studies for coloured substances is detailed in Section 13.5.3 of the EU Manual of Decisions dated July 2006, at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals

Guidance on information requirements and chemical safety assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, available at

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415—91 (Reapproved 1998). pp. 733—742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37—120 pp

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The ОИСР Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft ОИСР Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23.

ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test.

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3—77 108. September 1977.

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353—359.

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481—483.

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157—167.

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485—1494.

OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of Ecotoxicity Data.

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05—88. USEPA, Duluth, MN.

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096—1121.

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482—491.

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103—117.

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510—531.

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93—96.

Допълнение 1

Описание на вида Lemna

Водното растение Lemna, обикновено наричано водна леща, принадлежи на семейството Lemnaceae, което има няколко вида в четири рода, разпространени в целия свят. Техният различен външен вид и таксономия са описани изчерпателно в (1)(2). Lemna gibba и L. minor са представители на вида в умерените области и обикновено се използват за изпитвания за токсичност. И двата вида имат плаващо или потопено във водата дисковидно стъбло (листовидно тяло), а много тънък корен излиза от центъра на долната повърхност на всяко листовидно тяло. Видът Lemna рядко дава цвят и растенията се размножават чрез вегетативно създаване на нови листовидни тела (3). В сравнение с по-възрастните растения младите са по-бледи, имат по-къси корени и се състоят от две до три листовидни тела с различни размери. Малкият размер на Lemna, опростената структура, безполовото размножаване и краткото време за създаване на поколение правят растението много подходящо за лабораторни изпитвания (4)(5).

Поради възможно междувидово вариране по отношение на чувствителност, валидни са сравнения на чувствителността единствено в рамките на един вид.

Примери за видове Lemna, които са били използвани за изпитване: Референтни видове

Lemna aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935—941.

Lemna minor: United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft“. EPA 712-C-96—156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90—337: Détermination de l’inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415—91 (Reapproved 1998). pp. 733—742.

United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft“. EPA 712-C-96—156. 8pp.

Lemna paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959—1969.

Lemna perpusilla: Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87—96.

Lemna trisulca: Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481—483.

Lemna valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102—2111.

Източници на видове Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria Department of Botany, University of Toronto Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2 Tel: +1–416–978–3641 Fax:+1–416–978–5878 e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca http://www.botany.utoronto.ca/utcc

North Carolina State University Forestry Dept Duckweed Culture Collection Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695–8002 United States phone 001 (919) 515–7572 astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University SE-106 91 Stockholm SWEDEN Tel: +46 8 674 7240 Fax +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA) FG III 3.4 Schichauweg 58 12307 Berlin Germany e-mail: lemna@uba.de http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm

Литература

(1) Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221—287.

(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82—991150—0—0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1—14.