ПРИЛОЖЕНИЕ I

Схема за изпитванията, които следва да се извършват съгласно членове 3, 4, 5, 7 и 8

1. ОБЩИ ПРИНЦИПИ ОТНОСНО НАЛИЧИЕТО НА ПОСОЧЕНИЯ ВРЕДИТЕЛ

1.1. Има съмнение за наличие на посочения вредител, когато е получен положителен резултат от първия тест за откриване, извършено върху посоченото растение. Първият тест за откриване на симптоматичен растителен материал може да бъде селективна изолация.

1.2. Наличието на посочения вредител се потвърждава върху симптоматични проби от посочените растения в следните случаи: а) когато първият тест за откриване е селективна изолация, водеща до колонии с типична морфология: се получават положителни резултати при два теста за идентификация; б) когато първият тест за откриване е тест, различен от селективна изолация: i) се получават положителни резултати при два теста за идентификация, след като пробата е била подложена на селективна изолация; ii) се получават положителни резултати при втори тест за откриване, различен от селективна изолация.

1.3. Наличието на посочения вредител се потвърждава върху асимптоматични проби от посочените растения в следните случаи: а) когато е получен положителен резултат от втория тест за откриване, при условие че първият или вторият тест за откриване е молекулярен (на базата на ДНК) тест (TaqMan® PCR тест в реално време или конвенционален PCR тест); б) за проби, взети в държава членка или в зона от държава членка, в която не е известно да се среща посоченият вредител, и за проби с произход от друга държава членка: когато е получен положителен резултат при втория тест за откриване в съответствие с буква а) и са получени положителни резултати при два тестове за идентификация, извършени след като пробата е била подложена на селективна изолация.

2. ТЕСТОВЕ

2.1. Тестове за откриване

Тестовете за откриване трябва да позволяват системното откриване на най-малко 104 клетки/ml повторно суспендирана утайка.

Вторият тест за откриване следва да се основава на биологични принципи или нуклеотидни участъци, различни от тези при първия тест за откриване.

Тестовете за откриване са, както следва:

а) имунофлуоресцентни тестове съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

б) FISH тест (van Beuningen et al. (1995) (1), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

в) изолация съгласно описанието в международните диагностични стандарти; Прилага се един от следните два подхода: i) пряка изолация върху полуселективна (или неселективна) растежна среда, съгласно описанието в международните диагностични стандарти; ii) след обогатяване чрез биоанализ, изолиране съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

г) конвенционален PCR тест с използване на праймерите на Pastrik (2000) (2), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

д) TaqMan® PCR тестове в реално време с използване на праймери и сонди на: i) Schaad et al. (1999) (3), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (т.нар. NYtor тест), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; iii) Gudmestad et al. (2009), адаптирани от Vreeburg et al. (2018)4, съгласно описанието в международните диагностични стандарти; iv) Massart et al. (2014) (5), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

2.2. Тестове за идентификация

Тестовете за идентификация са, както следва:

а) имунофлуоресцентен тест съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

б) конвенционален PCR тест (Pastrik (2000), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

в) TaqMan® PCR тестове в реално време с използване на праймери и сонди на: i) Schaad et al. (1999), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; ii) Vreeburg et al. (2018) (т.нар. NYtor тест), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; iii) Gudmestad et al. (2009), адаптирани от Vreeburg et al. (2018), съгласно описанието в международните диагностични стандарти; iv) Massart et al. (2014), съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

г) баркодиране на ДНК, съгласно описанието в международните диагностични стандарти;

д) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011) (6), съгласно описанието в международните диагностични стандарти.

3. СХЕМИ НА ПРОЦЕДУРИТЕ

Схема № 1: Диагностична процедура за установяване на наличието на посочения вредител в симптоматични проби от посоченото растение

a Изолирането може да се използва като първи или втори тест за откриване. Ако има съмнение за наличие на посочения вредител в растежната среда, колониите се пречистват, за да се получат чисти култури, върху които се извършват два теста за идентификация. За да се потвърди наличието на вредителя, са необходими положителни резултати и от двата теста за идентификация.

б Третият тест за откриване следва да се основава на различни биологични принципи или различни нуклеотидни участъци.

Схема № 2: Диагностична процедура за установяване на наличието на посочения вредител в асимптоматични проби от посоченото растение

a Не се използва изолация.

б Третият тест за откриване следва да се основава на различни биологични принципи или различни нуклеотидни участъци. Не се използва изолация.

в За пробите, посочени в точка 1.3, буква б), потвърждаването на наличието на посочения вредител след втория тест за откриване с положителен резултат изисква изолиране на посочения вредител от пробата, последвано от два положителни теста за идентификация.

4. ПОДГОТОВКА НА ПРОБАТА

4.1. Проби от асимптоматични клубени

Стандартната проба за едно изпитване съдържа 200 клубена. Подходяща лабораторна процедура за обработка на сърцевините и надебеления край с цел получаване на екстракта за откриване на посочения вредител е описаната в международните диагностични стандарти.

4.2. Проби от асимптоматичен растителен материал, различен от клубени

Откриването на латентни инфекции се извършва върху съставни проби от стъблени сегменти. Процедурата може да се прилага за не повече от 200 стъблени части от различни растения в една проба. Подходяща лабораторна процедура за дезинфекция и обработка на стъблените сегменти с цел получаване на екстракта за откриване на посочения вредител е описаната в международните диагностични стандарти.

4.3. Проби от симптоматични посочени растения

Тъканните фрагменти се отстраняват асептично от проводящия пръстен на клубена или от проводящите снопчета на стъблата от посочените растения, проявяващи симптоми на увяхване. Подходяща лабораторна процедура за обработка на тези тъкани с цел получаване на екстракта за откриване на посочения вредител е изчерпателно описаната в международните диагностични стандарти.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400-7.10.1016/j.syapm.2011.05.001.