1998L0057 — BG — 30.07.2006 — 001.001

Този документ е средство за документиране и не обвързва институциите

Изменен с









▼B

ДИРЕКТИВА 98/57/ЕО НА СЪВЕТА

от 20 юли 1998 година

за контрол на Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et.al.







СЪВЕТЪТ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ, като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност, и по-специално член 43 от него, като взе предвид предложението на Комисията ( 1 ), като взе предвид становището на Европейския парламент ( 2 ), като взе предвид становището на Икономическия и социален комитет ( 3 ), като има предвид, че патогенният организъм Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. преди е бил известен като Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; като има предвид, че Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. вероятно ще стане общоприето наименование на този организъм; като има предвид, че настоящата директива следва да вземе под внимание това развитие в науката; като има предвид, че производството на картофи и домати заема важно място в селското стопанство на Общността; като има предвид, че добивът на картофи и домати е постоянно застрашен от вредители; като има предвид, че чрез предпазване на картофените и доматени култури от вредители, не само ще се запази производствения капацитет, но ще се повиши и производителността в селското стопанство; като има предвид, че защитните мерки за предотвратяване внасянето на вредители на територията на държавите-членки биха имали само ограничен ефект, ако такива организми не се контролират едновременно и методично навсякъде в Общността и не се предотвратява тяхното разпространение; като има предвид, че един от вредителите по картофите и доматите е Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., патогенът на кафявото гниене по картофите и на бактериалното изсъхване по картофите и доматите; като има предвид, че в някои части на Общността възникнаха огнища на заболяване, причинено от този патогенен агент и все още съществуват някои ограничени източници на инфекция; като има предвид, че съществува значителен риск за отглеждането на картофи и домати навсякъде в Общността, ако не се вземат ефективни мерки по отношение на тези култури за да се установи местонахождението на този организъм и да се определи разпространението му, да се предотврати появата и разпространението му, а в случай че бъде открит, да се предотврати разпространението му и да се осъществи контрол с цел унищожаването му; като има предвид, че с цел да се постигне това, трябва да бъдат взети определени мерки в рамките на Общността; като има предвид, че в допълнение държавите-членки трябва да могат, при необходимост, да предприемат допълнителни или по-строги мерки, при условие че не се възпрепятства движението на картофи или домати в рамките на Общността, с изключение на случаите, посочени в Директива 77/93/ЕИО на Съвета от 21 декември 1976 г. относно защитните мерки срещу въвеждане в Общността на организми, вредни за растенията или растителните продукти и срещу тяхното разпространение в рамките на Общността ( 4 ); като има предвид, че другите държави-членки и Комисията трябва да бъдат уведомени за тези мерки; като има предвид, че мерките трябва да бъдат съобразени с необходимостта от провеждане на систематични официални обследвания за да се установи местонахождението на патогена; като има предвид, че такива обследвания следва да включват процедури за инспектиране и, при необходимост, като се има предвид, че при определени условия на околната среда заболяването може да остане латентно и незабелязано както при развиващите се картофени култури, така и при съхраняваните картофени клубени, процедури по вземане на проби и извършване на тестове; като има предвид, че разпространението на патогена сред развиващите се култури не е най-важният фактор, но имайки предвид, че патогенът може да се разпространява чрез надземните води и някои сродни диви картофени растения, и по тази причина напояването на картофените и доматените култури чрез използване на замърсена вода изглежда поставя риск от инфектиране на тези култури; като има предвид, че патогенът може да преживее зимата в саморасли картофени и доматени растения, които могат да бъдат източник на инфекция, която се пренася във всеки следващ сезон; като има предвид, че патогенът се разпространява също чрез замърсяване на картофи при контакт с инфектирани картофи и чрез контакт със съоръженията за засаждане, прибиране на реколтата и обработка или чрез контейнерите за транспорт и съхранение, които са били замърсени с организма при предишен контакт с инфектирани картофи; като има предвид, че разпространението на патогена може да бъде намалено или предотвратено чрез обеззаразяването на тези обекти, като има предвид, че всяко такова замърсяване на картофите за семе поставя значителен риск от разпространението на патогена; по същия начин латентната инфекция при картофите за семе поставя значителен риск от разпространението на патогена и това може да бъде предотвратено чрез използването на картофи за семе, произведени по официално одобрена програма, съгласно която картофите за семе са изследвани и е констатирано, че не носят инфекцията; като има предвид, че сегашните познания по отношение биологията и епидемиологията на Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. в условията на Европа са непълни и се очаква, че в рамките на няколко сезона ще е необходимо преразглеждане на предложените мерки; също така се очакват подобрения в процедурите по извършване на тестове, като се има предвид по-нататъшната изследователска работа, особено по отношение на чувствителността и специфичността на тест методите, с цел да се изберат и стандартизират оптимални валидни тест методи; като има предвид, че за определяне на подробностите на такива общи мерки, както и на по-стриктните или допълнителни мерки, взети от държавите-членки, за да се предотврати внасяне на патогена на тяхна територия, е желателно държавите-членки да осъществяват тясно сътрудничество с Комисията в рамките на Постоянния фитосанитарен комитет(наричан по-нататък „Комитетът“), ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:







Член 1

Настоящата директива се отнася до мерките, които ще се вземат в рамките на държавите-членки срещу Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., преди известен като Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (наричан по-нататък „организмът“), с цел, по отношение на растенията-гостоприемници за организма, изброени в приложение I, раздел 1, (наричани по-нататък „изброеният растителен материал“) да:

а) установят местонахождението му и да определят разпределението му;

б) предотвратят появата и разпространението му; и

в) предотвратят разпространението му и да осъществят контрол с цел унищожаването му, в случай че бъде открит.

Член 2

1. Държавите-членки провеждат ежегодни систематични официални обследвания за организма върху изброения растителен материал, произхождащ от тяхната територия. С цел да се открият други възможни източници на замърсяване, представляващи заплаха за производството на изброения растителен материал, държавите-членки извършват оценка на риска и, освен ако при оценката не е установен риск от разпространение на организма, провеждат в районите на производство на изброения растителен материал, контролни официални обследвания за организма върху растения, различни от изброения растителен материал, включително диви картофени растения-гостоприемници, както и на повърхностните води, които се използват за напояване или пръскане на изброения растителен материал и на отпадъчните води, отделяни от предприятията за промишлена преработка или пакетиране, в които се обработва изброеният растителен материал, и които се използват за напояване или пръскане на изброения растителен материал. Обхватът на тези контролни обследвания се определя съгласно установения риск. Държавите-членки могат също така да извършват официални обследвания за организма върху материали, като среди за отглеждане, почва и твърди отпадъци от предприятията за промишлената преработка или пакетиране.

2. Официалните обследвания, предвидени в параграф 1, се извършват:

а) за изброения растителен материал, съгласно критериите, изложени в точка 1 от раздел II, приложение I; и

б) за растения-гостоприемници, различни от изброения растителен материал, както и за водата, включително отпадъчните води, в съответствие с подходящи методи и, при необходимост, се вземат проби, които се подлагат на официални лабораторни изпитвания или такива под официален надзор;

в) при необходимост, за друг материал, в съответствие с подходящи методи.

Допълнителните подробности за тези обследвания по отношение на процедурите на инспектиране и броя, произхода, напластяването и времето за вземане на проби се решават от отговорните официални органи, по смисъла на Директива 77/93/ЕИО на базата на обосновани научни и статистически принципи и биологията на организма, като се вземат под внимание специфичните системи за производство на изброения растителен материал в заинтересованата държава-членка и, при необходимост, на други растения-гостоприемници за организма.

3. Останалите държави-членки и Комисията се уведомяват за подробностите и резултатите от официалните обследвания, предвидени в параграф 1, всяка година, в съответствие с разпоредбите на точка 2 от раздел II, приложение I. Тези уведомявания се предоставят до 1 юни, освен относно използването на картофите, запазени във фермата за семе, за които уведомяването се предоставя до 1 септември. Подробностите и резултатите за културите се отнасят за продукцията от предходната година. Подробностите от тези уведомявания може да се предоставят на Комитета.

4. Приема се следната разпоредба в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

— подходящите методи за обследвания и за лабораторни тестове, предвидени в параграф 2, алинея първа, буква б).

5. Могат да бъдат приети следните разпоредби в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

— подходящите методи за обследвания, предвидени в параграф 2, алинея първа, буква в),

— допълнителни подробности за обследванията, предвидени в параграф 2, алинея втора, с оглед да се гарантират сравними нива на осигуряване между държавите-членки.

Член 3

Държавите-членки вземат мерки, така че техните собствени отговорни официални органи да получават информация за предполагаема поява или потвърдено наличие на организма на тяхната територия.

Член 4

1. Във всеки случай на предполагаема поява, отговорните официални органи на засегнатите държави-членки осигуряват извършване на официално или под официален надзор лабораторно изследване, като за изброения растителен материал използват съответния метод, определен в приложение II и в съответствие с условията, посочени в точка 1 от приложение III, или, във всички останали случаи, който и да е друг официално одобрен метод, с цел да се потвърди или отхвърли предполагаемото наличие. В случай на потвърждаване се прилагат изискванията, посочени в точка 2 от приложение III.

2. До потвърждаване или отхвърляне на предполагаема поява, съгласно параграф 1, във всеки случай на предполагаема поява, в който:

i) са забелязани диагностични симптоми на заболяването, причинено от организма, и е получен положителен резултат при бързия/те скринингов/и тест/ове, в съответствие с предвиденото в приложение II, раздел I, точка 1 и раздел II; или

ii) е получен положителен резултат при скрининговия/те тест/ове в съответствие с предвиденото в приложение II, раздел I, точка 2 и раздел III;

отговорните официални органи на държавите-членки, във връзка със собственото си производство:

а) забраняват движението на растения и клубени от всички култури, партиди или пратки, от които са взети пробите, освен ако то не се извършва под техен контрол и при условие че е установено отсъствието на риск от разпространение на организма;

б) предприемат мерки за проследяване произхода на предполагаемата поява;

в) въвеждат подходящи допълнителни предохранителни мерки на базата на нивото на прогнозирания риск, особено във връзка с производството на изброения растителен материал и движението на партиди от картофи за семе, различни от тези, посочени в буква а), получени на мястото на производство, откъдето са взети пробите, посочени в буква а), с цел да се предотврати всякакво разпространение на организма.

3. В тези случаи на предполагаема поява, при която има риск от замърсяване на изброения растителен материал или надземните води от или към друга/и държава/и-членка/и, държавата-членка, в която е докладвано за предполагаемата поява, незабавно уведомява другите засегнати държави-членки, съобразно установения риск, за подробностите относно посочената предполагаема поява и се осъществява подходящо сътрудничество между посочените държави-членки. Уведомените държави-членки въвеждат предохранителни мерки в съответствие с параграф 2, буква в) и, при необходимост, предприемат по-нататъшни действия, съгласно параграфи 1 и 2.

4. Могат да бъдат приети следните разпоредби в съответствие с процедурата, предвидена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

— мерките, посочени в параграф 2, буква в).

Член 5

1. Ако в резултат на официално или извършено под официален надзор лабораторно изследване, използващо за изброения растителен материал определения в приложение II метод, или, във всички останали случаи, който и да е друг официално одобрен метод, се потвърди наличие на организма в проба, взета съгласно настоящата директива, тогава отговорните официални органи на държавата-членка, като вземат предвид обоснованите научни принципи, биологията на организма и специфичните системи на производство, пускане на пазара и обработка на растенията-гостоприемници за организма в тази държава-членка:

а) за изброения растителен материал; i) започват разследване за да определят обхвата и първоначалния/те източник/ци на замърсяване, в съответствие с разпоредбите на приложение IV, с последващо извършване на тестове в съответствие с член 4, параграф 1, на поне всички видове картофи за семе от един генетичен клон; и ii) обозначават като замърсен изброения растителен материал, пратката и/или партидата, от която е взета пробата, както и машините, превозните средства, съдовете, складовете или участъци от тях, и всички други предмети, включително опаковъчния материал, който е бил в контакт с изброения растителен материал, от който е взета пробата; също така, по целесъобразност, обозначава като замърсени полето/ата, участъка/ците за производство на защитени култури и мястото (местата) за производство, от които е получен изброения растителен материал и от които е взета пробата; а при пробите, взети по време на вегетация, обозначава като замърсени полето/ата, мястото/местата за производство и, при необходимост, участъка/ците за производство на защитени култури, от които е взета пробата; и iii) определят, в съответствие с разпоредбите на точка 1 от приложение V, обхвата на вероятното замърсяване чрез контакт преди или след прибиране на реколтата, чрез производствени, напоителни или оросителни връзки или чрез клонингова връзка с обявеното замърсяване; и iv) разграничават зона на базата на обявеното замърсяване по ii), на определения обхват на вероятното замърсяване по iii) и на възможното разпространение на организма, в съответствие с разпоредбите на буква 2, i) от приложение V;

б) за култури от растения-гостоприемници, различни от посочените в точка а), когато е установен риск за производството на изброения растителен материал, i) започват разследване, в съответствие с буква а), i); и ii) обозначават като замърсени растенията-гостоприемници за организма, от които е взета пробата; и iii) определят вероятното замърсяване и разграничават зона, в съответствие с буква а), iii) и iv) съответно, във връзка с производството на изброения растителен материал;

в) за повърхностни води (включително отпадъчни води, от предприятията за промишлена преработка или пакетиране, в които обработват изброения растителен материал) и сродни диви картофени растения-гостоприемници, когато производството на изброения растителен материал е изложено на риск чрез напояване, пръскане или наводняване от повърхностните води; i) започват разследване, включващо официално обследване през подходящи интервали от време на проби от повърхностни води и, ако присъстват диви картофени растения гостоприемници, установяват обхвата на замърсяването; и ii) обозначават като замърсени повърхностните води, от които са взети пробите, до подходящата степен и на базата на разследването съгласно i); и iii) определят вероятното замърсяване и разграничават зона на базата на обявеното замърсяване по точка ii) и възможното разпространение на организма, като вземат под внимание разпоредбите на точки 1 и 2, ii) от приложение V.

2. Държавите-членки незабавно уведомяват останалите държави-членки и Комисията, в съответствие с разпоредбите на точка 3 от приложение V, за всяко замърсяване, обявено съгласно параграфи 1, буква а), ii) и 1 буква в), ii) и за подробностите относно разграничаването на зоната, съгласно параграф 1, буква в), iv) и, при необходимост, съгласно параграф 1, буква в), iii). Подробностите от тези уведомявания могат да се предоставят на Комитета.

Държавите-членки в същото време предоставят на Комисията допълнителното известие, посочено в точка 4 от приложение V. Подробностите от известието по тази алинея незабавно се предоставят на членовете на Комитета.

3. В резултат на известието по параграф 2 и посочените там елементи, други държави-членки, които са изброени в известието, започват разследване съгласно параграф 1, буква а), i) и, при необходимост, по параграф 1, буква в), i) и предприемат по целесъобразност по-нататъшни действия в съответствие с параграфи 1 и 2.

Член 6

1. Държавите-членки постановяват, че този изброен растителен материал, обявен като замърсен по член 5, параграф 1, буква а), i), не може да се засажда и, под контрола и одобрението на техните отговорни официални органи, е предмет на една от разпоредбите в точка 1 от приложение VI, така че да се гарантира липсата на риск от разпространение на организма.

2. Държавите-членки постановяват, че този изброен растителен материал, определен като вероятно замърсен съгласно член 5, параграф 1, буква а), iii) и в), iii), включително изброения растителен материал, за който е установен риск и който е произведен на места, определени като вероятно замърсени по член 5, параграф 1, буква а), iii), не може да се засажда и, под контрола на техните отговорни официални органи, е подходящо оползотворен или ликвидиран, в съответствие с предвиденото в точка 2 от приложение VI, така че да не се установява съществуването на риск от разпространение на организма.

3. Държавите-членки постановяват, че всички машини, превозни средства, съдове, складове или участъци от тях и всички други предмети, включително опаковъчен материал, обозначени като замърсени по член 5, параграф 1, буква а), ii) или определени като вероятно замърсени по член 5, параграф 1, буква а), iii) и в), iii), трябва да бъдат или унищожени или обеззаразени чрез използване на подходящи методи, в съответствие с предвиденото в точка 3 от приложение VI. След обеззаразяване всички тези предмети не се считат вече за замърсени.

4. Без да се засягат мерките, предприети съгласно параграфи 1, 2 и 3, държавите-членки постановяват, че в зоната, разграничена съгласно член 5, параграф 1, буква а), iv) и в), iii), трябва да бъде изпълнена серия от мерки, в съответствие с предвиденото в точки 4.1 и 4.2 от приложение VI. Останалите държави-членки и Комисията се уведомяват ежегодно за подробностите във връзка с тези мерки. Подробностите от това известие могат да бъдат предоставени на Комитета.

Член 7

1. Държавите-членки постановяват, че картофите за семе трябва да отговарят на изискванията от Директива 77/93/ЕИО и да са добити по пряка линия от картофен материал, получен съгласно официално одобрена програма, за който е констатирано, че няма наличие на организма чрез официално изследване или чрез такова, извършено под официален надзор с използване на съответния метод, определен в приложение II.

Посоченото изследване се извършва от държава-членка:

а) в случаи, когато е потвърдено наличие на организма в нейна собствена продукция от картофи за семе; i) чрез изследване на по-ранния размножителен материал, включително първоначалната клонингова селекция и систематично изследване на основните картофени клонове за семе; или ii) в случаи, когато е установено, че няма клонингова връзка, чрез изследване на всички основни клонове картофи за семе или по-ранния размножителен материал, включително първоначалната клонингова селекция; и

б) в останалите случаи, или на всяко растение от първоначалната клонингова селекция, или на представителни проби от основните картофи за семе, или на по-ранния размножителен материал.

2. Следните разпоредби могат да бъдат приети в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

— подробните правила за прилагане на параграф 1, втора алинея, буква а),

— правилата относно представителните проби, предвидени в параграф 1, втора алинея, буква б).

Член 8

Държавите-членки забраняват притежаването и извършването на манипулации с организма.

Член 9

Без да се засягат разпоредбите на Директива 77/93/ЕИО, държавите-членки могат да разрешат дерогации от мерките, посочени в членове 6 и 8 от настоящата директива, в съответствие с разпоредбите, определени в Директива 95/44/ЕО ( 5 ) за експериментални или научни цели и за работа върху селекция на нови сортове.

Член 10

Държавите-членки могат да приемат, във връзка със собственото си производство, такива допълнителни или по-строги мерки, каквито може да са необходими за борба срещу организма или за да се предотврати неговото разпространение, доколкото те са в съответствие с разпоредбите на Директива 77/93/ЕИО.

Подробностите за прилагане на тези мерки се нотифицират на другите държави-членки и на Комисията. Комитетът може да бъде сезиран за условията и реда на това нотифициране.

Член 11

Изменения на приложенията към настоящата директива, изготвени съобразно развитието в научното и техническото познание, се приемат в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО. По отношение на методите, определени в приложение II и по отношение на мерките в параграфи 4.1 и 4.2 от приложение VI към настоящата директива, Комисията изготвя доклад за преразглеждане на тези методи и мерки на базата на натрупания опит, като докладът се предоставя на Комитета преди 1 януари 2002 г.

Член 12

1. Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими за да се съобразят с настоящата директива, преди 21 август 1999 г. Те незабавно информират Комисията за това.

Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позоваване се определят от държавите-членки.

2. Държавите-членки съобщават незабавно на Комисията текста на основните разпоредби от националното законодателство, които те приемат в областта, уредена с настоящата директива. Комисията информира останалите държави-членки за тези разпоредби.

Член 13

Настоящата директива влиза в сила в деня на публикуването ѝ в Официален вестник на Европейските общности.

Член 14

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.









ПРИЛОЖЕНИЕ I

РАЗДЕЛ I

Списък на растения-гостоприемници за Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., посочен в член 1







Растения (включително клубени), освен същинските семена, от вида Solanum tuberosum L. Картоф Растения, освен плодовете и семената, от вида Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. Домат

РАЗДЕЛ II

Обследвания

1. Официалните обследвания, посочени в член 2, параграф 2, буква а) се основават върху биологията на организма и специфичните системи на производство в засегнатата държава-членка и включват: i) при картофи; — през подходящи интервали от време, визуален преглед на растящата култура, и/или вземане на проби, както от картофите за семе, така и от останалите картофи по време на вегетация или в склада. Тези проби се подлагат на официален или извършен под официален надзор визуален преглед, чрез разрязване на клубените, и — при картофите за семе, а при необходимост и при други картофи, официално или извършено под официален надзор лабораторно изследване по метод, определен в приложение II; ii) при домати; — визуален преглед през подходящи интервали от време поне на растящите култури от растенията, предназначени за пресаждане с професионална цел.

2. Известяването на официалните обследвания, посочени в член 2, параграф 3 включва: i) в случай на обследвания върху картофи; — предполагаема обща площ, в хектари, засадена с картофи за семе и други картофи, — класифициране по категории за семе и продукция и, при необходимост, по район, — брой и обозначаване времето на взетите за изследване проби, — брой визуални прегледи на полето, — брой (и размер на пробата) визуални прегледи върху клубени; ii) в случай на обследвания поне върху растящите култури от доматени растения, предназначени за пресаждане с професионална цел: — предполагаем общ брой растения, — брой визуални прегледи; iii) в случай на обследвания върху растения-гостоприемници, различни от картофи и домати, включително диви картофени растения-гостоприемници: — вид, — брой и обозначаване времето на взетите проби, — по целесъобразност, район/река, откъдето е взета пробата, — метод на изследване; iv) в случай на обследвания на вода и течни отпадъци, отделяни от помещения за промишлена преработка или пакетиране; — брой и обозначаване времето на взетите проби, — по целесъобразност, район/река/местоположение на помещенията, откъдето е взета пробата, — метод на изследване.

▼M1









ПРИЛОЖЕНИЕ II

ТЕСТОВА СХЕМА ЗА ДИАГНОСТИКА, ОТКРИВАНЕ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ОБХВАТ НА ТЕСТОВАТА СХЕМА

Настоящата схема описва различните процедури, включени в:

i) диагностика на бактериалното кафяво гниене по картофените клубени и бактериалното увяхване при картофи, домати и други растения гостоприемници;

ii) откриване на Ralstonia solanacearum в проби, взети от картофени клубени, картофени растения, доматени растения и други растения гостоприемници, вода и почва;

iii) определяне на Ralstonia solanacearum (R. Solanacearum).

СЪДЪРЖАНИЕ

Общи принципи РАЗДЕЛ I: Прилагане на тестовата схема 1. Схема за диагностициране за наличие на бактериално кафяво гниене по картофените клубени и бактериално увяхване при картофени, доматени и други растения гостоприемници със симптоми на бактериално кафяво гниене или бактериално увяхване 2. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени клубени 3. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични, картофени, доматени или други растения гостоприемници РАЗДЕЛ II: Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в картофени клубени и картофени, доматени или други растения гостоприемници със симптоми на бактериално кафяво гниене или бактериално увяхване 1. Симптоми 2. Бързи скринингови тестове 3. Процедура за изолиране 4. Тестове за определяне на R. Solanacearum РАЗДЕЛ III: 1. Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени клубени 1.1. Изготвяне на проби 1.2. Тестване 2. Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени, доматени или други растения 2.1. Изготвяне на проби 2.2. Тестване РАЗДЕЛ IV: 1. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum във вода 2. Методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва 2.1. Изготвяне на проби 2.2. Тестване РАЗДЕЛ V: 1. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва 2. Методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва 2.1. Изготвяне на проби 2.2. Тестване РАЗДЕЛ VI: Оптимизирани протоколи за откриване и определяне на R. Solanacearum А Тестове за диагностициране и откриване 1. Стриминг тест на стеблото 2. Откриване на поли-β-хидроксибутиратни гранули 3. Серологични аглутинационни тестове 4. Селективна изолация 4.1. Селективно посяване 4.2. Процедура на обогатяване 5. Имунофлуоресцентен тест (IF тест) 6. Тестване на полимеразна верижна реакция (PCR тест) 6.1. Методи за очистване на ДНК а) Метод на Пастрик (2000) б) Други методи 6.2. PCR 6.3. Анализ на PCR продукт 7. Флуоресцентен in-situ хибридизационен тест (FISH тест) 8. Тествания на ензимно свързани имуносорбентни изследвания (Елайза тестове) а) Индиректен Елайза б) DASI Елайза 9. Тест на биологична проба Б. Идентификационни тестове 1. Хранителни и ензимни идентификационни тестове 2. IF тест 3. Елайза тест 4. PCR тест 5. FISH тест 6. Профилиране на мастни киселини (FAP) 7. Методи за характеризиране на щамове 7.1. Определяне на биовар 7.2. Геномен финтърпринтинг 7.3. PCR методи В. Тест за потвърждаване Допълнение 1 Лаборатории, които участват в оптимизирането и валидирането на протоколите Допълнение 2 Среда за изолиране и култивиране на R. solanacearum Допълнение 3 А) Стандартизиран контролен материал с търговско предназначение Б) Изготвяне на контроли Допълнение 4 Буфери за тестателни процедури Допълнение 5 Определяне на нивото на заразяване в IF и FISH тестове Допълнение 6 Валидирани PCR протоколи и реагенти Допълнение 7 Валидирани рагенти за FISH тест Допълнение 8 Кондициониране на култури от син домат и домат Източници

ОБЩИ ПРИНЦИПИ

В допълненията са дадени оптимизирани протоколи за различните методи, валидирани реагенти и подробна информация за подготвяне на тестовите и контролни материали. Списъкът на лабораториите, които са участвали в оптимизирането и валидирането на протоколите, е даден в допълнение 1.

Тъй като протоколите включват откриване на карантинен вредител и обикновено включват използването на жизнеспособни култури на R. Solanacearum като контролен материал, се налага процедурите да се извършват при подходящи карантинни условия със съответстващи възможности за депониране на отпадъците и в рамките на условията на съответстващи лицензи, издадени от официалните органи за растителна карантина.

Тестовите параметри трябва да осигуряват съвместимо и възпроизводимо откриване на нивата на R. Solanacearum при определените прагове на избраните методи.

Прецизната подготовка на положителни контроли е задължителна.

Тестването в съответствие със задължителните прагове означава също правилно разполагане, поддържане и калибриране на оборудването, внимателна транспортиране и съхраняване на реагентите и осигуряване на всички мерки за предотвратяване на заразяване между пробите, например отделяне на положителните контроли от тестовите пробите за тестване. За избягване на административни и други грешки, особено по отношение на етикетирането и документацията, трябва да се прилагат стандартите за управление на качеството.

Предполагано наличие, посочено в член 4, параграф 2 от Директива 98/57/ЕО, означава положителен резултат при диагностични или скринингови тестове, извършени върху проба, както е описано в диаграмите по-долу. Положителен първи скринингов тест (IF тест, PCR/FISH, селективна изолация) трябва да се потвърди от втори скринингов тест на базата на различен биологичен принцип.

Ако първият скринингов тест е положителен, тогава се предполага заразяване с R. Solanacearum и трябва да се направи втори скринингов тест. Ако вторият скринингов тест е положителен потвърждението се потвърждава (предполагано наличие) и тестването трябва да продължи по схемата. Ако вторият скринингов тест е отрицателен, се счита, че пробата не е заразена с R. Solanacearum.

Потвърдено наличие, посочено в член 5, параграф 1 от Директива 98/57/ЕО, означава изолирането и определянето на чиста култура на R. Solanacearum с потвърждение за патогенност.

РАЗДЕЛ I

ПРИЛАГАНЕ НА ТЕСТОВАТА СХЕМА

1. Схема за диагностициране за наличие на бактериално кафяво гниене по картофените клубени и бактериално увяхване при картофени, доматени и други растения гостоприемници със симптоми на бактериално кафяво гниене или бактериално увяхване.

Тестовата процедура е предназначена за картофени клубени и растения с типични симптоми или симптоми за съмнение за наличие на кафяво гниене или везикуларно увяхване. Тя включва бърз скринингов тест, изолиране на патогенни от инфектираната везикуларна тъкан върху (селектирана) среда и, ако резултатът е положителен, определяне на културата като Ralstonia solanacearum.

2. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени клубени

Принцип

Тестовата процедура е предназначена за откриване на латентни инфекции в картофени клубени. Положителен резултат от поне два скринингови теста, на базата на различни биологични принципи, трябва да се допълни от изолирането на патогена; последвано, при изолирането на типични колонии, от потвърждаването на чиста култура като R. Solanacearum. Положителен резултат само от един от скрининговите тестове не е достатъчен, за да се счете пробата за съмнителна.

Скрининговите тестовете и изолационните тестове трябва да позволяват откриване на 103 и 104 клетки/ml от повторно суспендирана пелета, включени като положителни контроли във всяка серия тестове.

3. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични, картофени, доматени или други растения гостоприемници

РАЗДЕЛ II

ПОДРОБНИ МЕТОДИ ЗА ОТКРИВАНЕ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА R. SOLANACEARUM В КАРТОФЕНИ КЛУБЕНИ И КАРТОФЕНИ, ДОМАТЕНИ ИЛИ ДРУГИ РАСТЕНИЯ ГОСТОПРИЕМНИЦИ СЪС СИМПТОМИ НА БАКТЕРИАЛНО КАФЯВО ГНИЕНЕ ИЛИ БАКТЕРИАЛНО УВЯХВАНЕ

1. Симптоми (Виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Симптоми по картофите

Картофеното растение. Ранният стадий на инфекцията в полето се разпознава по увяхването на листата към върха на растението при високите температури през деня и възстановяване през нощта. При ранните стадии на повяхване листата се запазват зелени, но по-късно настъпва пожълтяване и кафява некроза. Появява се и епинастия. Повяхването на един стрък или на цели растения бързо става необратимо и води до падане и смърт на растението. Съдовата тъкан на напречно разрязани стебла на увехнали растения обикновено изглежда кафява и от разрязаната повърхност се отделя млечен бактериален филтрат или може да се отдели при стискане. Когато отрязаното стебло се постави вертикално във вода, от съдовите снопчета изтичат слизести нишки.

Картофеният клубен. Картофените клубени трябва да се разрежат напречно близо до надебеления край (при ластуна) или надлъжно по надебеления край с ластуна. Ранният стадий на инфекцията се разпознава по стъклено жълтото до светло кафяво обезцветяване на съдовия пръстен, от който след няколко минути спонтанно се появява бледокремав бактериален филтрат. По-късно съдовото обезцветяване става по-забележимо кафяво и некрозата може да обхване и паренхимната тъкан. При напредналите стадии инфекцията се разпространява навън от надебеления край и очите, от които може да се отделя слизест бактериален филтрат, който предизвиква полепване на частици от почвата. Върху кората могат да се появят червеникаво-кафяви леко хлътнали увредени участъци поради вътрешно разпадане на съдова тъкан. Вторично развитие на гъбни и бактериални меки загнили участъци се среща често при напредналите стадии на болестта.

1.2. Симптоми по доматите

Доматеното растение. Първият видим симптом е омекване на най-младите листа. При благоприятни за патогена условия на околната среда (почвени температури около 25 °С; наситена влажност) настъпва епинастия и увяхване на едната страна или на цялото растение в рамките на няколко дни, което води до пълно падане на растението. При по-неблагоприятни условия на околната среда (почвени температури под 21 °С) увяхването е по-малко, но могат да се развият голям брой външни корени върху стеблото. Възможно е да се наблюдават набраздявания, пълни с вода, от основата на стеблото, което свидетелства за некроза на съдовата тъкан. При напречно разрязване на стеблото от обезцветената кафява съдова тъкан се отделя бял или жълтеникав бактериален филтрат.

1.3. Симптоми по други гостоприемници

Растения на Solanum dulcamara и S. nigrum. При естествени условия рядко се наблюдават симптоми на увяхване при тези плевелни растения гостоприемници, освен ако температурите на почвата не надвишават 25 °С или нивата на инокулация са изключително високи (например когато S. nigrum расте в близост до заразени доматени или картофени растения). При настъпване на увяхване симптомите са същите, както при доматите. При неувяхващите растения на Solanum dulcamara, чиито стебла и корени растат във вода, може да се забележи вътрешно светлокафяво обезцветяване на съдовите тъкани при напречен разрез в основата на стеблото или частите на стеблото, които са под водата. От разрязаните съдови тъкани или от слизестите нишки, ако отрязаното стебло се постави вертикално във водата, може да изтече филтрат с бактерии дори при отсъствие на симптоми за увяхване.

2. Бързи скринингови тестове

Бързите скринингови тестове могат да улеснят диагностицирането на вероятна зараза, но не са съществени. Използват се един или няколко валидирани тестове от дадените по-долу:

2.1. Стриминг тест на стеблото

(виж раздел VI, точка А, точка 1)

2.2. Откриване на поли-β-хидроксибутиратни (РНВ) гранули

Характерни РНВ гранули в клетките на R. Solanacearum се визуализират чрез оцветяване на топлинно фиксирано мазилно вещество от бактериален филтрат от заразена тъкан върху предметно стъкло с Nile Blue A или Sudan Black (виж раздел VI, точка А, точка 2).

2.3. Серологични аглутинационни тестове

(виж раздел VI, точка А, точка 3).

2.4. Други тестове

Други подходящи бързи скринингови тестове са IF тест (виж раздел VI, точка А, точка 5), FISH тест (виж раздел VI, точка А, точка 7), Елайза тестове (виж раздел VI, точка А, точка 8) и PCR тестове (виж раздел VI, точка А, точка 6).

3. Процедура за изолиране

а) Филтратът или участъци обезцветена тъкан от васкуларния пръстен в картофения клубен или от васкуларните клонки на стебла на картофени, доматени или други увехнали растения гостоприемници се отстраняват. Суспендират се в малък обем стерилна дестилирана вода или 50mM фосфатен буфер (допълнение 4) и се оставят за 5 до 10 минути.

б) Изготвя се серия десетични разреждания на суспензията.

в) 50—100 μl от суспензията и разрежданията се прехвърлят в обща хранителна среда (NA, YPGA или SPA; виж допълнение 2) и/или тетразолиева среда на Келман (допълнение 2) и/или валидирана селективна среда (например SMSA; виж допълнение 2). Намазват се или се прави щрихово посяване с помощта на подходяща техника за разреждане в петра. Ако е целесъобразно се подготвят отделни петри с разредена клетъчна суспензия на R. Solanacearum биовар 2 като положителна контрола.

г) Петрите се инкубират за период от 2 до 6 дни при 28 °С. — Върху общата хранителна среда вирулентните изолати на R. Solanacearum развиват перлени кремаво-бели с неправилна форма флуидни колонии, често с характерно венче в центъра. Авирулентните форми на R. Solanacearum образуват малки, кръгли, нефлуидни, маслени колонии, които са изцяло кремаво-бели. — Върху тетразолиева среда на Келман и SMSA среда венчетата са с кървавочервен цвят. Авирулентните форми на R. Solanacearum образуват малки, кръгли, нефлуидни, маслени колонии, които са изцяло наситено червени.

4. Тестове за определяне на R. Solanacearum

Тестове за потвърждаване идентичността на вероятни изолати на R. Solanacearum са дадени в раздел VI, точка Б.

РАЗДЕЛ III

1. Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени клубени

1.1. Изготвяне на проба

Забележка:

— Размерът на стандартната проба е 200 клубена за едно тестване. По-интензивното пробовземане изисква повече тестове върху проби с такъв размер. По-големият брой на клубените в пробата води до инхибиране или трудности при интерпретиране на резултатите. Но процедурата е удобна за използване при проби с по-малко от 200 клубена, когато наличните клубени не достигат.

— Потвърждаването на всички методи за откриване на наличие, описани по-долу, става на базата на тестване на проби от 200 клубени.

— Картофеният екстракт, описан по-долу, може също да се използва за откриване наличието на бактерията Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, причиняваща пръстеновидно гниене по картофите.

Незадължително предварително третиране преди изготвяне на пробата:

а) Инкубация на пробите при 25 до 30 °С за период до две седмици преди тестването с цел насърчаване на мултиплицирането на евентуални популации на R. Solanacearum.

б) Измиване на клубените. Използват се подходящи дезинфектанти (хлорни съединения, когато ще се използва PCR тест, за да се отстрани патогенната ДНК) и детергенти между всяка проба. Клубените се изсушават с въздух. Тази процедура за измиване е особено полезна (но не е задължителна) за силно замърсени с пръст проби или ако трябва да се направи PCR тест или процедура за пряка изолация.

1.1.1. Отстранява се с чист и дезинфекциран скалпел или нож за зеленчуци кората при надебеления край (с ластун) на всеки клубен, така че да се вижда съдовата тъкан. Внимателно се изрязва малка сърцевина от съдовата тъкан при надебеления край с минимално количество несъдова тъкан. (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Забележка: Отделят се всички (загнили) клубени с вероятни симптоми на кафяво гниене и се тестват отделно. Ако при отстраняването на надебеления край се наблюдават симптоми на кафяво гниене в сърцевината, се прави визуална проверка на клубена и той се разрязва близо до надебеления край. Всеки разрязан клубен с вероятни симптоми трябва да се запази най-малко два дена при стайна температура, за да се създаде възможност за суберизация, и да се пази в хладилник (при температури от 4 до 10 °С) при подходящи карантинни условия. Всички клубени, включително тези с вероятни симптоми, се съхраняват в съответствие с изискванията на приложение III.

1.1.2. Събират се сърцевините от надебеления край в неизползвани контейнери за еднократна употреба, които могат да се затварят и/или запечатват (ако се използват повторно контейнерите, трябва да се почистят основно и да се дезинфекцират с хлорни съединения). Предпочита се сърцевините от надебеления край да се обработят незабавно. Когато това не е възможно, те се съхраняват в контейнер, без да се прибавя буфер, в хладилник за не повече от 72 часа или за 24 час при стайна температура. Надебеленият край и сърцевините се обработват с една от следните процедури: а) Сърцевините се покриват с достатъчно количество (около 40 ml) екстракционен буфер (допълнение 4) и се разбъркват с ротационен шейкър (50—100 rpm) в продължение на 4 часа при температура под 24 °С или в продължение на 16 до 24 часа охладени, или б) Сърцевините се хомогенизират с достатъчно количество (около 40 ml) екстракционен буфер (допълнение 4) или в блендер (например Waring или Ultra Thurax) или чрез трошене в запечатана торбичка за мацерация (например от усилен полиетилен Stomacher или Bioreba, 150 mm × 250 mm; стерилизирана чрез облъчване), като се използва гумен чук или подходящ апарат за мелене (например Homex). Забележка: При използване на блендер за хомогенизиране има голяма опасност от кръстосано заразяване на пробите. Необходимо е да се вземат предпазни мерки, за да се избегне създаването на аерозоли или разливане по време на процеса на екстракция. За всяка проба се осигуряват прясно стерилизирани ножове на блендера и съдове. Ако ще се използва PCR тест, избягвайте пренасянето на ДНК върху контейнерите и апаратите за мелене. Препоръчва се трошене в торбички за еднократна употреба и използването на еднократни тръби, когато ще се използва PCR.

1.1.3. Декантира се изплувалата на повърхността част. Ако мътността е голяма, се налага избистряне чрез центрофугиране при ниска скорост (при не повече от 180 g за 10 минути при температура между 4 и 10 °С) или чрез вакуумна филтрация (40 до 100 μm), като филтърът се измива с допълнителен (около 10 ml) екстракционен буфер.

1.1.4. Сгъстява се бактериалната фракция чрез центрофугиране при 7 000 g за 15 минути (или 10 000 g за 10 минути) при температура между 4 и 10 °С и се отстранява изплувалата на повърхността част, без да се нарушава пелетата.

1.1.5. Повторно се суспендира пелетата в 1,5 ml пелетен буфер (допълнение 4). Използват се 500 μl за тестване за R. solanacearum, 500 μl за Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus и 500 μl за сравняване. Добавя се стерилен глицерин към окончателната концентрация —10 до 25 % (v/v) към 500 μl от референтната аликвотна част и към останалата аликвотна част за тестване, разбърква се и се оставя при температура от –16 до –24 °С (седмици) или от –68 до –86 °С (месеци). Аликвотните части за тестване се съхраняват при температура от 4 до 10 °С по време на тестването. Не се препоръчва многократно замразяване и размразяване на пробите. Ако се налага транспортиране на екстракта доставката се осигурява в охладена кутия в рамките на 24 до 48 часа.

1.1.6. Задължително е отделното третиране на всички R. solanacearum положителни контроли и проби, за да се избегне заразяване. Това се отнася за предметните стъкла за IF тест и за всички други тестове.

1.2. Тестване

Виж схемата и описанието на тестовете и оптимизираните протоколи в съответните допълнения:

Селективна изолация (виж раздел VI, точка А, точка 4)

IF тест (виж раздел VI, точка А, точка 5)

PCR тестове (виж раздел VI, точка А, точка 6)

FISH тест (виж раздел VI, точка А, точка 7)

Елайза тестове (виж раздел VI, точка А, точка 8)

Биологична проба (виж раздел VI, точка А, точка 9)

2. Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени, доматени или други растения

2.1. Изготвяне на проба

Забележка: За откриване на наличие на латентни популации на R. Solanacearum се препоръчва използването на съставни проби. Процедурата е удобна за използване при съставни проби от не повече от 200 стеблени части. Когато се правят изследвания, те трябва да се базират на статистическа представителна извадка на изследваната растителна популация.

2.1.1. Събират се сегменти от стеблото с дължина от 1 до 2 cm в затворен стерилен контейнер в съответствие със следната процедура за пробонабиране: Ранен доматен разсад: С чист дезинфекциран нож се отстранява сегмент с дължина 1 cm от основата на всяко стебло точно над нивото на почвата. Полски или парникови доматени растения: С чист дезинфекциран нож се отстранява най-ниското странично клонче на всяко растение, като се реже точно над връзката с главното стебло. Отстранява се сегмент с дължина 1 cm от най-долната част на всяко странично клонче. Други гостоприемници: С чист дезинфекциран нож или градинарски ножици се отстранява сегмент с дължина 1 cm от основата на всяко стебло точно над нивото на почвата. При S. dulcamara или други растения гостоприемници, които виреят във вода, се отстраняват участъци с дължина 1—2 cm от частта на стеблото под водата или от ластуните, пуснали корени във водата. Когато се прави пробонабиране от определено място, се препоръчва да се тества статистическа представителна извадка, съставена от най-малко 10 растения от всяко място на пробовземане за всеки потенциален плевелен гостоприемник. Откриването на наличие на патоген е най-надеждно през пролетта, лятото и есента, въпреки че естествените инфекции могат да се откриват през цялата година в многогодишното Solanum dulcamara, което расте в реките. Познатите гостоприемници включват саморасли картофени растения (задържащи почвата), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium и други представители на семейство Solanaceае. Други гостоприемници са Pelargonium spp. и Portulaca oleracea. Някои европейски плевелни spp., които потенциално могат да дават подслон на популации биовар 2/род 3 на R. Solanacearum в корени и/или ризосфери при специфични условия на околната среда, включват Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra и Urtica dioica. Забележка: Визуалната проверка за откриване на вътрешни симптоми (съдово оцветяване или бактериален филтрат) може да се направи на този етап. Всички сегменти от стеблото със симптоми се отделят и се тестват отделно (виж раздел II).

2.1.2. Сегментите от стеблото за кратко време се дезинфекцират със 70 % етанол и веднага се подсушават върху салфетка. След това сегментите от стеблото се обработват с помощта на една от следните процедури: а) Сегментите се покриват с достатъчно количество (около 40 ml) екстракционен буфер (допълнение 4) и се разбъркват с ротационен шейкър (50—100 rpm) в продължение на четири часа при температура под 24 °С или в продължение на 16 до 24 часа охладени, или б) Сегментите се обработват незабавно чрез трошене в здрава торбичка за мацерация (например Stomacher или Bioreba) с достатъчно количество екстракционен буфер (допълнение 4), като се използва гумен чук или подходящ апарат за мелене (например Homex). Ако това е невъзможно, сегментите от стеблото се съхраняват охладени не повече от 72 часа или не повече от 24 часа при стайна температура.

2.1.3. След 15 минути утаяване се декантира изплувалата на повърхността част.

2.1.4. Обикновено не се налага допълнително избистряне на екстракта или концентриране на бактериалната фракция, но може да се получат чрез филтриране и/или центрофугиране, описани в раздел III, точки 1.1.3—1.1.5.

2.1.5. Неразреденият или концентриран екстракт се разделя на две равни части. Едната част се поддържа при температура от 4 до 10 °С по време на тестването, а другата се съхранява с 10 до 25 % (v/v) стерилен глицерин — при температура от –16 до –24 °С (седмици) или от –68 до –86 °С (месеци) в случай, че се наложи допълнително тестване.

2.2. Тестване

Виж схемата и описанието на тестовете и оптимизираните протоколи в съответните допълнения:

Селективна изолация (виж раздел VI, точка А, точка 4)

IF тест (виж раздел VI, точка А, точка 5)

PCR тестове (виж раздел VI, точка А, точка 6)

FISH тест (виж раздел VI, точка А, точка 7)

Елайза тестове (виж раздел VI, точка А, точка 8)

Биологична проба (виж раздел VI, точка А, точка 9)

РАЗДЕЛ IV

1. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum във вода

2. Методи за откриване и определяне на R. Solanacearum във вода

Принцип

Валидираната схема за откриване наличието на бактерията, описана в настоящия раздел, се прилага за откриване на патоген в проби от повърхностна вода и може също да се прилага за тестване на проби от води от преработка на картофи или отпадъчни води. Важно е, обаче, да се отбележи, че очакваната чувствителност на откриването на наличие се променя в зависимост от субстрата. Чувствителността на теста за изолация се влияе от популациите конкурентни сапрофитни бактерии, които по принцип са много повече във водите от преработка на картофи и в отпадъчните води, отколкото в повърхностните води. Въпреки че от схемата, дадена по-долу, се очаква да установи не по-малко от 103 клетки на литър в повърхностни води, чувствителността на откриването на наличие във водите от преработка на картофи и в отпадъчните води е значително по-ниска. Поради тази причина се препоръчва тестването на отпадъчни води да става след всяко третиране за пречистване, при което се редуцират популациите на сапрофитни бактерии. Ограниченията в чувствителността на тестовата схема трябва да се имат предвид, когато се оценява надеждността на получени отрицателни резултати. Въпреки че схемата се използва успешно при изследвания за определяне на наличие или отсъствие на патогена в повърхностни води, нейните ограничения трябва да се имат предвид, когато схемата се използва в подобни изследвания на води от преработка на картофи или отпадъчни води.

2.1. Изготвяне на проба

Забележка:

— Откриването на R. Solanacearum в повърхностни води е най-надеждно през пролетта, лятото и есента, когато температурата на водата надвишава 15 °С.

— Многократното пробонабиране по различно време през периода, упоменат по-горе, на определени места за пробовземане увеличава надеждността на откриването, като намалява последствията от промените в климата.

— Необходимо е да се вземе предвид въздействието на силните валежи и географията на реките, за да се избегнат последствията от продължително разреждане, които могат да замъглят наличието на патогена.

— Пробите от повърхностни води се вземат в близост до растенията гостоприемници, ако има такива.

2.1.1. На избраните за пробовземане места се събират проби чрез напълване на стерилни епруветки или бутилки на дълбочина по възможност под 30 cm и до 2 m от брега. За водите от преработка и отпадъчните води пробите се събират на мястото на заустване. Препоръчва се размерът на пробите за едно място на пробовземане да не надвишава 500 ml. Ако се предпочитат по-малки проби, се препоръчва пробовземането да стане поне на три пъти за всяко място на пробовземане, като всяка проба е съставена от две еднакви подпроби по 30 ml най-малко. При интензивни изследвания се избират поне три места на пробовземане през 3 km по речното течение, като се осигурява пробонабиране и от притоците, които се вливат в реката.

2.1.2. Пробите се транспортират на хладно и тъмно (4 до 10 °С) и се тестват в рамките на 24 часа.

2.1.3. При необходимост бактериалната фракция може да бъде концентрирана, като се използва един от следните методи: а) 30 до 50 ml подпроби се центрофугират при 10 000 g за 10 минути (или 7 000 g за 15 минути) за предпочитане при температури от 4 до 10 °С, отстранява се изплувалата на повърхността част и повторно се суспендира пелетата в 1 ml пелетен буфер (допълнение 4). б) Мембранна филтрация (минимален размер на порите 0,45 μm) последвана от измиване на филтъра в 5 до 10 ml пелетен буфер и запазване на отмитото. Този метод е подходящ за големи количества вода, съдържащи малък брой сапрофити. Обикновено концентрацията не се препоръчва за проби от води от преработката на картофи или отпадъчни води откакто увеличената популация от конкурентни сапрофитни бактерии ще инхибира откриването на Ralstonia solanacearum.

2.2. Тестване

Виж схемата и описанието на тестовете в съответните допълнения.

РАЗДЕЛ V

1. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва

2. Методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва

Принципи

Схемата за потвърждаване на откриване на наличието на бактерията, описана в настоящия раздел, се прилага за откриване на патоген в проби от почва, но може също да се прилага за тестване на проби от твърди отпадъци от преработката на картофи или утайки от отпадъчни води. Но е необходимо да се отбележи, че тези методи не са достатъчно чувствителни, за да се гарантира откриване на малък брой и/или разпръснати популации на R. Solanacearum, които могат да се появят в естествено заразени проби на такива субстрати.

Ограниченията в чувствителността на тази тестова схема трябва да се имат предвид, когато се оценява надеждността на получени отрицателни резултати, а също и когато се използва в изследвания за определяне на наличие или отсъствие на патогена в почви или утайки. Най-надеждният тест за наличието на патогена в полски почви е да се засади възприемчив гостоприемник и да се наблюдава за поява на инфекция, но дори и при този метод може да убегне откриването на ниски нива на заразяване.

2.1. Изготвяне на проба

2.1.1. Пробонабирането от полска почва трябва да следва стандартните принципи, използвани за пробонабиране на нематоди. Събира се 0,5 до 1 kg почва за една проба от 60 места на 0,3 ha на дълбочина от 10 до 20 cm (или в мрежа 7 × 7 метра). Ако е налице съмнение за наличие на патогена броят на местата на пробовземане се увеличава до 120 на 0,3 ha. Пробите се държат на температура от 12 до 15 °С преди тестването. Пробонабирането за води от преработката на картофи и за отпадъчни води става чрез събиране на общо 1 kg от местата, което представлява общото количество утайка за тестване. Всяка проба се разбърква добре преди тестване.

2.1.2. Пробите от 10 до 25 g почва или утайка се диспергират чрез въртене и разклащане (250 rpm) в 60 до 150 ml буфер за екстракция (допълнение 4) в продължение на не повече от два часа. При необходимост диспергирането може да се улесни като се добави 0, 02 % стерилен Tween-20 и 10 до 20 g стерилна баластра.

2.1.3. По време на тестване се поддържа температура на суспензията от 4 °С.

2.2. Тестване

Виж схемата и описанието на тестовете в съответните допълнения.

РАЗДЕЛ VI

ОПТИМИЗИРАНИ ПРОТОКОЛИ ЗА ОТКРИВАНЕ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА R. SOLANACEARUM

А. ТЕСТОВЕ ЗА ДИАГНОСТИЦИРАНЕ И ОТКРИВАНЕ

1. Стриминг тест на стеблото

Наличието на R. Solanacearum в стеблата на увехнали картофени, доматени и други растения гостоприемници може да се установи с помощта на следното просто вероятностно тестване: Стеблото се отрязва точно над нивото на почвата. Отрязаната повърхност се потапя в епруветка с чиста вода. Наблюдава се дали след няколко минути от отрязаните съдови възелчета ще се появи характерно спонтанно изтичане на бактериални слизести нишки.

2. Откриване на поли-β-хидроксибутиратни гранули

1. Изготвя се мазилно вещество от бактериален филтрат от инфектирана тъкан или от 48-часова култура върху YPGA или SPA среда (допълнение 2) върху предметно стъкло.

2. За положителни контроли се изготвя мазилно вещество от щам на R. Solanacearum и ако се счита за полезно — мазилно вещество за отрицателна контрола на познат PHB отрицателен sp.

3. Всяко предметно стъкло се изсушава на въздух и долната му повърхност се прекарва бързо над пламък за фиксиране на мазилното вещество.

4. Препаратът се оцветява с Nile Blue A или Sudan Black и се наблюдава под микроскоп, както е описано по-долу:

Тестване с Nile Blue A

а) Всяко предметно стъкло обилно се залива с 1 % воден разтвор на Nile Blue A и се инкубира за 10 минути при 55 °С.

б) Оцветеният разтвор се отцежда. Всяко предметно стъкло се измива внимателно на течаща вода. Излишната вода се отстранява със салфетка.

в) Мазилното вещество обилно се залива с 8 % воден разтвор на оцетна киселина и се инкубира за 1 минута при стайна температура.

г) Измива се за кратко време на леко течаща вода. Излишната вода се отстранява със салфетка.

д) Навлажнява се отново с капка вода и се покрива с покривно стъкло.

е) Оцветеното мазилно вещество се изследва с епифлуоресцентен микроскоп при 450 nm маслено потопяване с увеличение от 600 до 1 000, като се използва маслено- или водопотопяем обектив.

ж) Наблюдава се за ярко оранжева флуоресценция на РНВ гранули. Гранулите се наблюдават и при пропусната нормална светлина, за да се постигне увереност, че гранулите са вътрешноклетъчни и че клетъчната морфология е типична за R. Solanacearum.

Тестване със Sudan Black

а) Всяко предметно стъкло обилно се залива с 0,3 % разтвор на Sudan Black B в 70 % етанол и се инкубира за 10 минути при стайна температура.

б) Оцветеният разтвор се отцежда. Всяко предметно стъкло се измива внимателно на течаща вода, като излишната вода се отстранява със салфетка.

в) За кратко време предметните стъкла се потапят в ксилол и се изсушават върху салфетка. Внимание: Ксилолът е вреден, трябва да се вземат необходимите предпазни мерки и да се работи в смукателен шкаф за газове.

г) Предметните стъкла обилно се заливат с 0,5 % (w/v) воден разтвор на сафранин и се оставят за 10 секунди при стайна температура. Внимание: Сафранинът е вреден, трябва да се вземат необходимите предпазни мерки и да се работи в смукателен шкаф за газове.

д) Измиват се за кратко време на леко течаща вода, подсушават се със салфетка и се покриват с покривно стъкло.

е) Оцветеното мазилно вещество се изследва със светлинен микроскоп, който използва пропусната светлина при маслено потопяване с увеличение от 1 000 като се използва масленопотопяем обектив.

ж) Наблюдава се за синьо-черно оцветяване на РНВ гранули в клетки на R. Solanacearum, с оцветени в розово клетъчни стени.

3. Серологични аглутинационни тестове

Аглутинацията на клетки на R. Solanacearum в бактериален филтрат или симптоматични тъканни екстракти се наблюдава най-добре като се използват валидирани антитела (виж допълнение 3), етикетирани с маркери с подходящ цвят, например червено за клетки на Staphylococcus aureus или цветни латексови частици. Когато се използва комплект, закупен в търговската мрежа (виж допълнение 3), се спазват указанията на производителя. В противен случай се извършва следната процедура:

а) Смесват се капки от суспензия на етикетирано антитяло и бактериален филтрат (приблизително 5 μm от всяко) върху прозорци на многогнездови тестателни предметни стъкла.

б) Изготвят се положителни и отрицателни контроли като се използва суспензия на R. Solanacearum биовар 2 и хетероложен щам.

в) Наблюдава се за аглутинация в положителни проби след внимателно разбъркване за 15 секунди.

4. Селективна изолация

4.1. Селективно посяване в петра

Забележка: Преди да се използва този метод за пръв пет се извършват предварителни тестове, за да се гарантира възпроизводимо откриване на 103 до 104 единици, образуващи колонии, на R. Solanacearum на ml, добавени към екстракти от проби, които са дали отрицателен резултат при предишно тестване.

Използва се съответстващо валидирана селективна среда като например SMSA (модифицирана от Elphinstone et al., 1996 г.; виж допълнение 2).

Изисква се внимание, за да се разграничи R. Solanacearum от други бактерии, които могат да развият колонии върху средата. Освен това колониите от R. Solanacearum могат да покажат атипична морфология, ако петрите са пренаселени или присъстват и антагонистични бактерии. Когато има съмнение за последствия от конкуриране или антагонизъм, пробата следва да се теста повторно, като се използва друг вид тест.

Най-висока чувствителност на откриване чрез този метод може да се очаква, когато се използват прясно приготвени екстракти от проби. Но методът е приложим и към използването на екстракти, които са били съхранявани в глицерин при температура от –68 до –86 °С.

За положителни контроли се изготвят десетични разреждания от суспензия на 106 cfu на ml от вирулентен биовар 2 щам на R. solanacearum (например NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). За да се избегне всяка възможност за заразяване, положителните контроли се изготвят напълно отделно от пробите за тестване.

За всяка новоизготвена партида селективна среда задължително се тества нейната пригодност за растеж на патогена, преди да се използва за тестване на рутинни проби.

Контролният материал се тества по същия начин както пробата/пробите.

4.1.1. Изпълнява се подходяща техника за селективно посяване в петра, чиято цел е да се гарантира отстраняването чрез разреждане на фоновите сапрофитни популации, образуващи колонии. Разпределят се 50—100 μl от екстракта от пробата на петра и на всяко разреждане.

4.1.2. Петрите се инкубират при 28 °С. Отчитането на петрите става след 48 часа, а след това ежедневно до 6 дни. Типичните R. solanacearum колонии върху SMSA среда са млечнобели, плоски, с неправилна форма и флуидни и след тридневна инкубация развиват розово до кървавочервено оцветяване в центъра с вътрешно набраздяване или венче. (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Забележка: Върху тази среда понякога се образуват атипични колонии. Те може да са малки, кръгли, само червени на цвят и нефлуидни или само отчасти флуидни и затова трудно се различават от сапрофитните бактерии, образуващи колонии.

4.1.3. Вероятните колонии на R. solanacearum след щрихово посяване или разреждане в петра се пречистват върху обща хранителна среда, за да се получат изолирани колонии (виж допълнение 2).

4.1.4. Културите се съхраняват краткосрочно в стерилна вода (Ph от 6 до 8, без съдържание на хлор) при стайна температура на тъмно или дългосрочно в подходяща криозащитна среда при –68 до –86 °С или лиофилизирани.

4.1.5. Определят се вероятните култури (виж раздел VI, точка Б) и се извършва тест за патогенност (виж раздел VI, точка В).

Тестването на селективно посяване в петра е отрицателно, ако не се наблюдават никакви бактериални колонии след шест дни или ако не са открити никакви вероятни колонии, типични за R. solanacearum, при условие че не се очаква вероятно инхибиране поради конкуриране или антагонизъм на други бактерии и са намерени типични R. solanacearum колонии в положителните контроли. Тестването на селективно посяване е възможно, ако са изолирани вероятни R. solanacearum колонии.

4.2. Процедура на обогатяване

Използва се валидирана среда за обогатяване като например хранителна среда на Уйлбринк (виж допълнение 2).

Тази процедура може да се използва за селективно увеличаване на R. solanacearum популациите в екстрактите от проби и за увеличаване на чувствителността на откриването. Процедурата също така ефективно разрежда инхибиторите на PCR реакцията (1:100). Но следва да се обърне внимание, че обогатяването на R. solanacearum може да се провали поради конкурирането или антагонизма на сапрофитни организми, които често се обогатяват едновременно. Поради тази причина изолирането на R. solanacearum от обогатени хранителни култури може да се затрудни. Освен това, тъй като популациите на серологично свързани сапрофити могат да се увеличат, се препоръчва използването на специфични моноклонални антитела пред поликлоналните антитела, когато ще се използва Елайза тест.

4.2.1. За обогатяване чрез PCR 100 μl от екстракта от пробата се прехвърлят в 10 ml хранителна среда за обогатяване (виж допълнение 2), предварително разпределена в епруветки и колби без наличие на ДНК. За обогатяване чрез Елайза могат да се използват по-високи съотношения на екстракта към хранителната среда (например 100 μl в 1,0 ml хранителна среда за обогатяване).

4.2.2. Инкубира се за 72 часа при температура от 27 до 30 °С във вибрираща или в статична култура, като капачките не са плътно затворени, за да има възможност за аерация.

4.2.3. Разбърква се добре, преди да се използва в Елайза или PCR тестове.

4.2.4. Обогатената хранителна среда се третира по същия начин както пробата/пробите в тестовете по-горе. Забележка: Ако се очаква инхибиране на обогатяването на R. solanacearum поради високи популации на някои конкурентни сапрофитни бактерии, обогатяването на екстрактите от пробите преди центрофугиране или други форми на концентрация може да даде по-добри резултати.

5. IF тест

Принцип

Използването на IF теста като основен скринингов тест е препоръчително поради доказаната му сила при постигане на задължителните прагове.

Когато IF тестът е използван като основен скринингов тест и отчитането по него е положително, като втори скринингов тест трябва да се направи изолационен тест, PCR тест или FISH тест. Когато IF тестът е използван като втори скринингов тест и отчитането по него е положително, за завършване на анализа е необходимо допълнително тестване в зависимост от схемата.

Забележка: Използва се валидиран източник на антитела на R. solanacearum (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Препоръчва се за всяка нова партида антитела да се определи титърът. Титър е най-високото разреждане, при което се осъществява оптимална реакция при тестването на суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки на ml от хомоложния щам на R. solanacearum, като се използва подходящо конюгатно съединение на флуоресцеин изотиоцианат (FITC) в съответствие с указанията на производителя. Всичките валидирани антисеруми са имали IF титър 1:2 000. По време на тестването антителата трябва да се използват при работно разреждане/работни разреждания, близки до или равни на титъра.

Тестването трябва да се извърши с прясно приготвени екстракти от проби. При необходимост то може успешно да се извърши с проби, съхранявани при температура от –68 до –86 °С в глицерин. Глицеринът може да се отстрани от пробата чрез добавяне на 1 ml пелетен буфер (допълнение 4), повторно центрофугиране за 15 минути при 7 000 g и повторно суспендиране в равно количество пелетен буфер. Това не се налага често, особено ако пробите са фиксирани към предметните стъкла на пламък.

Подготвят се отделни предметни стъкла с положителни контроли на хомоложния щам или друг референтен щам на R. solanacearum и се потапят в картофен екстракт, определен в допълнение 3, точка Б, а по избор — в буфер.

При възможност трябва да се използва естествено заразена тъкан (запазена чрез лиофилизация или замразяване при температура от –16 до –24 °С) като подобна контрола върху предметните стъкла.

Като отрицателни контроли могат да се използват аликвоти от екстрактите от проби, които при предходно тестване са дали отрицателни резултати.

Стандартизираните положителни и отрицателни контролни материали, които могат да се използват с този тест, са изброени в допълнение 3.

Използват се многогнездови предметни стъкла на микроскоп, като се предпочитат тези с 10 прозореца с диаметър 6 mm всеки.

Контролният материал се тества по същия начин като пробата/пробите.

5.1. Тестателните предметни стъкла се изготвят, като се използва една от следните процедури:

i) За пелети със сравнително малък скорбелен седимент: С пипета се отмерва стандартно количество (15 μm е подходящо за прозорец с диаметър 6 mm — в мащаб се изчисляват количествата за по-големите прозорци) с разреждане 1/100 от повторно суспендираната картофена пелета върху първия прозорец. След това се отмерва с пипета сходно количество неразредена пелета (1/1) върху останалите прозорци в реда. Вторият ред може да се използва като дублиращ или за втора проба, както е показано във фигура 1.

ii) За други пелети: Изготвят се десетични разреждания (1/10, 1/100) на повторно суспендираната пелета в пелетен буфер. С пипета се отмерва измерено стандартно количество (15 μm е подходящо за прозорец с диаметър 6 mm — в мащаб се изчисляват количествата за по-големите прозорци) от повторно суспендираната пелета и всяко разреждане върху реда от прозорци. Вторият ред може да се използва като дублиращ или за втора проба, както е показано във фигура 2.

5.2. Капчиците се изсушават при стайна температура или чрез затопляне до температури от 40 до 45 °С. Бактериалните клетки се фиксират върху предметното стъкло чрез загряване (15 минути при 60 °С), с помощта на пламък, с 95 % етанол или в съответствие с конкретните указания на доставчиците на антителата. При необходимост фиксираните предметни стъкла могат да се съхраняват в замразено състояние в сушилна камера за необходимото време (не повече от три месеца), преди да бъдат подложени на тестване отново.

5.3. IF процедура i) В съответствие с изготвянето на тестово предметно стъкло в точка 5.1, i): Изготвя се набор от двойни разреждания. В първото гнездо се поставя ½ от титъра (Т/2), а в другите — ¼ от титъра (Т/4), ½ от титъра (Т/2), титъра (Т) и два пъти титъра (2Т). ii) В съответствие с изготвянето на тестово предметно стъкло в точка 5.1, ii): Изготвя се работното разреждане (WD) на антитялото в IF буфер. Работното разреждане оказва въздействие върху спецификата. 5.3.1. Предметните стъкла се подреждат върху влажна салфетка. Всеки тестов прозорец се покрива изцяло с разреденото антитяло/антитела. Във всеки прозорец количеството на антитялото трябва да е най-малко равно на количеството на екстракта. Когато не са дадени конкретни указания от доставчиците на антителата, се извършва следната процедура: 5.3.2. Предметните стъкла се инкубират покрити върху влажна хартия в продължение на 30 минути при стайна температура (от 18 до 25 °С). 5.3.3. От всяко предметно стъкло се изтръскват капчиците и внимателно се изплаква с IF буфер. Измива се чрез потапяне за пет минути в IF буфер-Tween (допълнение 4), а след това в IF буфер. Трябва да се внимава да не се образуват аерозоли или да се разпръснат капчици, което би довело до кръстосано заразяване. Излишната влага се отстранява чрез внимателно попиване. 5.3.4. Предметните стъкла се подреждат върху влажна салфетка. Тестовите прозорци се покриват с разредено FITC конюгатно съединение, използвано за определянето на титъра. Във всеки прозорец количеството на съединението трябва да е най-малко равно на количеството на антитялото. 5.3.5. Предметните стъкла се инкубират покрити върху влажна хартия в продължение на 30 минути при стайна температура (от 18 до 25 °С). 5.3.6. От всяко предметно стъкло се изтръскват капчиците. Изплаква се и се измива, както по-горе (5.3.3). Излишната влага се отстранява внимателно. 5.3.7. С пипета се отмерват 5—10 μm от 0,1М фосфатен буферен глицерин (допълнение 4) или предпазващо от обезцветяване вещество, продавано в търговската мрежа, върху всеки прозорец и се покрива с хартия.

5.4. Отчитане на IF тест: 5.4.1. Тестовите предметни стъкла се изследват с епифлуоресцентен микроскоп с филтри, подходящи за възбуждане на FITC, потопени в масло или вода при увеличение 500—1 000. Прозорците се сканират по дължината на двата диаметъра под прав ъгъл и по периметъра. За пробите, които не показват никакви клетки или малък брой клетки, се наблюдават поне 40 микроскопски полета. Най-напред се проверява предметното стъкло с положителна контрола. Клетките трябва да се светли, флуоресцентни и напълно оцветени при определения титър за антитяло или работно разреждане. Ако оцветяването е нетипично, IF тестът (раздел VI, точка А, точка 5) трябва да се повтори. 5.4.2. Тестателните прозорци на тестовите предметни стъкла се наблюдават за светли флуоресциращи клетки с характерната морфология на R. solanacearum (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интензитетът на флуоресценцията трябва да е равен на положителното контролно оцветяване при същото разреждане на антителата. Клетките с непълно оцветяване или със слаба флуоресценция не се зачитат. При съмнение за заразяване тестът трябва да се повтори. Това става, когато всички предметни стъкла в партидата показват положителни клетки поради заразяване на буфера или ако се открият положителни клетки (извън прозорците на предметните стъкла) върху покритието на предметните стъкла. 5.4.3. Няколко проблема са присъщи за спецификата на имунофлуоресцентния тест. В пелетите от картофена сърцевина откъм надебеления край и сегменти от стеблото могат да се появят фонови популации от флуоресциращи клетки с атипична морфология и сапрофитни бактерии с кръстосано действие, чиито размер и морфология са сходни до тези на R. solanacearum. 5.4.4. Разглеждат се само флуоресциращите клетки с типичен размер и морфология при титъра или работното разреждане на антителата в 5.3. 5.4.5. Интерпретиране на отчетените резултати от IF тест i) При откриване на светли флуоресциращите клетки с характерна морфология се определя средният брой на типични клетки за микроскопско поле и се изчислява броят на типичните клетки за ml повторно суспендирана пелета (допълнение 5). Отчетените резултати от IF тест са положителни за пробите с поне 5 × 103 типични клетки за ml повторно суспендирана пелета. ii) Отчетените резултати от IF тест са отрицателни за пробите с по-малко от 5 × 103 типични клетки за ml повторно суспендирана пелета и пробата се счита за отрицателно. Не се налага допълнително тестване.

6. PCR тестове

Принципи

Когато PCR тест се използва като основен скринингов тест и резултатите от него са положителни, трябва да се направи изолационен или IF тест като втори задължителен скринингов тест. Когато PCR тест се използва като втори скринингов тест и резултатите от него са положителни, трябва да се направи допълнително тестване в съответствие със схемата, за да завърши диагностицирането.

Пълното използване на този метод като основен скринингов тест се препоръчва само когато са натрупани необходимите експертни знания и умения.

Забележка: Предварителното тестване с помощта на този метод трябва да позволява възпроизводимо откриване на 103 до 104 клетки на R. solanacearum на ml, добавени към екстракти от проби, които са дали отрицателни резултати при предишно тестване. За да се постигнат максимални нива на чувствителност и конкретност във всички лаборатории, може да се наложи експериментиране с цел оптимизиране на тестването.

Използват се валидирани PCR реагенти и протоколи (виж допълнение 6). По-добре е да се избере метод с вътрешна контрола.

Използват се подходящи предпазни мерки, за да се избегне заразяване на пробите с целева ДНК. За да се минимизира възможността за заразяване с целева ДНК, PCR тестът трябва да се провежда от опитни технически лица в специализирани лаборатории по молекулярна биология.

Отрицателните контроли (за екстракция на ДНК и за PCR процедури) винаги трябва да се обработват като окончателни проби в процедурата, за да стане ясно дали е настъпило пренасяне на ДНК.

В PCR теста трябва да се включат следните контроли:

— екстракт от проба, която е дала отрицателен резултат за R. solanacearum при предишно тестване,

— буферни контроли, използвани за екстракция на бактерията, и ДНК от пробата,

— микс за PCR реакция.

Включват се задължително следните положителни контроли:

— аликвоти на повторно суспендирани пелети, към които е добавена R. solanacearum (изготвяне виж в допълнение 3, точка Б),

— суспензия от 106 клетки на ml R. solanacearum във вода от вирулентен изолат (например NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; виж допълнение 3, точка Б),

— при възможност се използва също ДНК, екстрахирана от положителни контролни проби в PCR теста.

За да се избегне потенциално заразяване, положителните контроли се изготвят отделно от пробите за тестване.

Екстрактите от проби трябва по възможност да нямат замърсяване с почва. Затова в някои случаи се препоръчва да се изготвят екстракти от измити картофи, когато ще се използват PCR протоколи.

Стандартизираните положителни и отрицателни контролни материали, които могат да се използват с този тест, са изброени в допълнение 3.

6.1. Методи за очистване на ДНК

Използват се описаните по-горе положителни и отрицателни контролни проби (виж допълнение 3).

Контролният материал се тества по същия начин като пробата/пробите.

Съществуват голям брой методи за очистване на целева ДНК от сложни пробни субстрати, като се отстраняват инхибиторите на PCR и други ензимни реакции и се концентрира целева ДНК в екстракта от пробата. За използване с валидираните PCR методи, дадени в допълнение 6, е оптимизиран следният метод.

а) Метод на Пастрик (2000)

1. Отмерват се с пипета 220 μl лизисен буфер (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) в епруветка на Епендорф от 1,5 ml.

2. Добавят се 100 μl екстракт от пробата и се поставят в подгряващ блок или водна баня при 95 °С за 10 минути.

3. Оставя се епруветката за 5 минути върху лед.

4. Добавят се 80 μl основен разтвор от лизозим (50 mg лизозим на ml в 10 mM Tris HCl, pH 8,0) и се инкубира при 37 °С за 30 минути.

5. Добавят се 220 μl Easy DNA® разтвор A (Invitrogen), разбърква се силно, докато преципитатът започне да се движи свободно в епруветката и пробата добива еднообразен вискозитет.

6. Добавят се 220 μl Easy DNA® разтвор В (Invitrogen), разбърква се силно, докато преципитатът започне да се движи свободно в епруветката и пробата добива еднообразен вискозитет.

7. Добавят се 500 μl хлороформ и се разбърква до намаляване на вискозитета и сместа става хомогенна.

8. Центрофугира се при 15 000 g за 20 минути при 4 °С за отделяне на фазите и създаване на фазова граница.

9. Горната фаза се прехвърля във неизползвана епруветка на Епендорф.

10. Добавя се 1 μl 100 % етанол (–20 °С), разбърква се бързо и се инкубира върху лед за 10 минути.

11. Центрофугира се при 15 000 g за 20 минути при 4 °С и се отстранява етанолът от пелетата.

12. Добавят се 500 μl 80 % етанол (–20 °С) и се разбърква чрез обръщане на епруветката.

13. Центрофугира се при 15 000 g за 10 минути при 4 °С, оставя се пелетата и се отстранява етанолът.

14. Оставя се пелетата да изсъхне на въздух или в ДНК speed vac.

15. Суспендира се повторно пелетата в 100 μl стерилен UPW и се оставя при стайна температура най-малко за 20 минути.

16. Съхранява се при –20 °С, докато потрябва за PCR.

17. Утаява се белият преципитат чрез центрофугиране и се използват 5 μl от изплувалата на повърхността част, съдържаща ДНК, за PCR.

б) Други методи

Могат да се използват и други методи за екстракция на ДНК например Qiagen DNeasy Plant Kit, при условие че са доказали, че са еднакво ефективни при очистване на ДНК от контролни проби, съдържащи от 103 до 104 патогенни клетки на μl.

6.2. PCR

6.2.1. Изготвят се тестателни и контролни темплети за PCR в съответствие с валидираните протоколи (раздел VI, точкаА, точка 6). Изготвя се едно десетично разреждане на пробен ДНК екстракт (1:10 в UPW).

6.2.2. Изготвя се подходящ микс за PCR реакция в среда без заразяване в съответствие с публикуваните протоколи (допълнение 6). При възможност се препоръчва де се използва съставен PCR протокол, който включва и вътрешна PCR контрола.

6.2.3. Добавят се 2—5 μl ДНК екстракт на 25 μl PCR реакция в стерилни PCR епруветки в съответствие с PCR протоколите (виж допълнение 6).

6.2.4. Включете отрицателна контролна проба, съдържаща само микс за PCR реакция, и добавете същият източник на UPW, който е използван в PCR сместа вместо пробата.

6.2.5. Епруветките се поставят в същото термоциклично устройство, което е използвано при предварителното тестване и се изпълнява подходящо оптимизирана PCR програма (допълнение 6).

6.3. Анализ на PCR продукт

6.3.1. PCR ампликоните се разделят чрез агарозна гел електрофореза. Пуска се поне 12 μl амплифициран микс за ДНК реакция от всяка проба, смесена с 3 μl пълнителен буфер (допълнение 6) в 2,0 % (w/v) агарозни гелове в трис-ацетат-EDTA (TAE) буфер (допълнение 6) при 5—8 V за cm. Използва се подходящ ДНК маркер например 100 bp ladder (набор от ДНК фрагменти с фиксирана дължина).

6.3.2. Разкриват се ДНК веригите чрез оцветяване в етидиев бромид (0,5 mg на l) за 30 до 60 минути като се вземат необходимите предпазни мерки за работа с този мутаген.

6.3.3. Наблюдава се оцветеният гел при късовълнова UV трансилюминация (λ = 302 nm) за амплифицирани PCR продукти с очаквания размер (допълнение 6) и се документира.

6.3.4. За всички нови констатации/случаи се прави проверка на автентичността на PCR ампликона чрез извършване на ограничителен ензимен анализ върху проба от останалата амплифицирана ДНК, като се инкубира при оптимална температура и време с подходящ ензим и буфер (виж допълнение 6). Стабилизираните фрагменти се отделят чрез агарозна гел електрофореза, както е описано по-горе, и се следи за поява на характерно рестрикционно фрагментиране при UV трансилюминация след оцветяване с етидиев бромид и се сравнява с нестабилизираната и стабилизираната положителна контрола.

Интерпретиране на резултатите от PCR тест:

PCR тестът е отрицателен, ако за въпросната проба не е установен R. Solanacearum специфичен ампликон с очакван размер, но е установен за всички положителни контролни проби (в случай на съставна PCR със специфични за растението вътрешни контролни праймери: втори PCR продукт с очакван размер трябва да се амплифицира с въпросната проба).

PCR тестът е положителен, ако е установен R. Solanacearum специфичен PCR ампликон с очакван размер и е установен ограничителен модел (при необходимост), при условие че той не е амплифициран от никоя отрицателна контролна проба. Надеждно потвърждаване на положителен резултат може също да се получи, като се повтори теста с втори набор от PCR праймери (допълнение 6).

Забележка: Може да има съмнение за инхибиране на PCR, ако очакваният ампликон е получен от положителната контролна проба, съдържаща R. Solanacearum във вода, но отрицателните резултати се получават от положителни контроли с R. Solanacearum в картофен екстракт. В съставните PCR протоколи с вътрешни PCR контроли инхибиране на реакцията се отбелязва, когато не е получен нито един от двата ампликона.

Може да има съмнение за заразяване, ако очакваният ампликон е получен от една или няколко отрицателни контроли.

7. FISH тест

Принцип

Когато FISH тест се използва като първи скринингов тест и резултатите от него са положителни, трябва да се направи изолационен или IF тест като втори задължителен скринингов тест. Когато FISH тест се използва като втори скринингов тест и резултатите от него са положителни, трябва да се направи допълнително тестване в съответствие със схемата, за да завърши диагностицирането.

Забележка: Използват се валидирани специфични за R. solanacearum олигопроби. Предварителното тестване с помощта на този метод трябва да позволява възпроизводимо откриване на 103 до 104 клетки на R. solanacearum на ml, добавени към екстракти от проби, които са дали отрицателни резултати при предишно тестване.

Следната процедура се препоръчва да се извърши с прясно приготвен екстракт от проби, но може успешно да се извърши с екстракт от проби, съхраняван в глицерин при температура от –16 до –24 °С и от –68 до –86 °С.

За отрицателни контроли се използват аликвоти на екстракт от проби, които са дали отрицателни резултати за R. solanacearum при предишни изследвания.

За положителни контроли се използват суспензии, съдържащи от 105 до 106 клетки на ml R. Solanacearum биовар 2 (например щам NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, виж допълнение 3) в 0,01М фосфатен буфер (РВ) от 3- до 5-дневна култура). Отделно се изготвят предметни стъкла с положителни контроли от хомоложния щам или друг референтен щам на R. Solanacearum, потопени в картофен екстракт, определени в допълнение 3, точка Б.

Използването на FITC-етикетирана еубактериална олигопроба предлага контрола за процеса на хибридизация, тъй като тя ще оцвети всички еубактерии, които се намират в пробата.

Стандартизираните положителни и отрицателни контролни материали, които могат да се използват с този тест, са изброени в допълнение 3, точка А.

Контролният материал се тества по същия начин като пробата/пробите.

7.1. Фиксиране на картофен екстракт

Следващият протокол е на базата на Wullings et al. (1998):

7.1.1. Изготвя се фиксиращ разтвор (виж допълнение 7).

7.1.2. Отмерват се с пипета 100 μl от всеки екстракт в епруветка на Епендорф и се центрофугира за 7 минути при 7 000 g.

7.1.3. Отстранява се изплувалата на повърхността част и пелетата се разтваря в 200 μl от фиксиращия разтвор, изготвен < 24 часа предварително. Разбърква се и се инкубира за един час в хладилник.

7.1.4. Центрофугира се за 7 минути при 7 000 g, отстранява се изплувалата на повърхността част и пелетата се разтваря в 75 μl 0,01М РВ (виж допълнение 7).

7.1.5. Капват се 16 μl от фиксиращата суспензия върху чисто предметно стъкло, предназначено за множество тестове, както е показано на фиг. 7.1. На всяко стъкло се слагат две различни проби, неразредени, и се използват 10 μl за разреждане 1:100 (в 0,01М РВ). Останалият разтвор от пробата (49 μl) може да се съхрани при –20 °С след добавяне на 1 обем 96 % етанол. Ако е необходимо да се повтори FISH тестът, етанолът се отстранява чрез центрофугиране и се добавя равен обем 0,01 РВ (размесен чрез разбъркване).

7.1.6. Предметните стъкла се изсушават на въздух (или в сушилня за предметните стъкла при 37 °С) и се фиксират на пламък. На този етап процедурата може да се прекъсне и да се продължи с хибридизацията на другия ден. Предметните стъкла се съхраняват обезпрашени и сухи на стайна температура.

7.2. Хибридизация

7.2.1. Клетките се дехидрират, като всяко предметно стъкло се поставя за 1 минута в етанолова серия с нарастващ процент —50 %, 80 % и 96 %. Предметните стъкла се изсушават на въздух, поставени в държател.

7.2.2. Приготвя се влажна инкубационна камера, като дъното на херметизирана кутия се покрива със салфетка или филтърна хартия, напоена с 1x hybmix (допълнение 7). Кутията се инкубира предварително в хибридизационна пещ.

7.2.3. Разпределят се 10 μl от хибридизационния разтвор (допълнение 7) в 8 прозореца (прозорци 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 и 10; виж фиг. 7.1) върху всяко предметно стъкло, като двата централни прозореца (3 и 8) се оставят празни.

7.2.4. Върху първите и последните четири прозореца се поставят покривни стъкла (24 × 24 mm) без изпускане на въздуха. Предметните стъкла се поставят в предварително затоплената влажна камера и се хибридизират за пет часа в пещта при 45 °С на тъмно.

7.2.5. Изготвят се три химични чаши, съдържащи 1 l Milli Q (молекулярна степен), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix и 666 ml Milli Q вода) и 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix и 958 ml Milli Q вода). Всяка чаша предварително се инкубира във водна баня при 45 °С.

7.2.6. Отстраняват се покривните стъкла от предметните стъкла и последните се поставят в държател.

7.2.7. Отмива се излишната проба чрез инкубиране за 15 минути в химичната чаша с 1x hybmix при 45 °С.

7.2.8. Държателят се поставя в 1/8 hybmix миещ разтвор и се инкубира за още 15 минути.

7.2.9. Предметните стъкла се потапят за кратко време в Milli Q вода и се поставят върху филтърна хартия. Отстранява се излишната вода чрез внимателно покриване на повърхността с филтърна хартия. Отмерват се с пипета 5—10 ml предпазващ от обезцветяване клей (например Vectashield, Vecta Laboratories, Калифорния, САЩ или равностоен) и върху цялото предметно стъкло се поставя голямо покривно стъкло (24 × 60 mm).

7.3. Отчитане на резултатите от FISH тест

7.3.1. Предметните стъкла незабавно се подлагат на наблюдение с микроскоп, пригоден за епифлуоресцентна микроскопия с увеличение от 630 или 1 000 с маслено потапяне. С филтър, подходящ за флуоресцентен изоцианат (FITC), еубактериалните клетки (включително и повечето грам отрицателни клетки) в пробата се оцветяват в флуоресцентно зелено. При използването на филтър за тетраметилродамин-5-изотиоцианат Су3-оцветените клетки на R. Solanacearum изглеждат оцветени в флуоресциращо червено. Сравнява се морфологията на клетките с тази на положителните контроли. Клетките трябва да са светли, флуоресциращи и напълно оцветени. Ако оцветяването е нетипично, FISH тестът (раздел VI, точка А, точка 7) трябва да се повтори. Прозорците се сканират по дължината на двата диаметъра под прав ъгъл и по периметъра. За пробите, които не показват никакви клетки или малък брой клетки, се наблюдават поне 40 микроскопски полета.

7.3.2. Тестовите прозорци на тестовите предметни стъкла се наблюдават за светли флуоресциращи клетки с характерната морфология на R. solanacearum (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интензитетът на флуоресценцията трябва да е равен или по-силен. Клетките с непълно оцветяване или със слаба флуоресценция не се зачитат.

7.3.3. При съмнение за заразяване тестът трябва да се повтори. Това става, когато всички предметни стъкла в партидата показват положителни клетки поради заразяване на буфера или ако се открият положителни клетки (извън прозорците на предметните стъкла) върху покритието на предметните стъкла.

7.3.4. Няколко проблема са присъщи за спецификата на FISH теста. В пелетите от картофена сърцевина откъм надебеления край и сегменти от стеблото могат да се появят фонови популации от флуоресциращи клетки с атипична морфология и сапрофитни бактерии с кръстосано действие, чиито размер и морфология са сходни до тези на R. solanacearum.

7.3.5. Разглеждат се само флуоресциращите клетки с типичен размер и морфология.

7.3.6. Интерпретиране на резултата от FISH тест: i) Валидни резултати от FISH тест се получават, когато се наблюдават яркозелени флуоресциращите клетки с размер и морфология, типични за R. Solanacearum, когато се използва FITC филтър, и яркочервени флуоресциращите клетки, когато се използва родаминов филтър, във всички положителни контроли и нито в една отрицателна контрола. При откриване на светли флуоресциращи клетки с характерна морфология се определя средният брой на типични клетки за микроскопско поле и се изчислява броят на типичните клетки за ml повторно суспендирана пелета (допълнение 4). Пробите с поне 5 × 103 типични клетки за ml повторно суспендирана пелета се считат за потенциално заразени. Налага се допълнително тестване. Пробите с по-малко от 5 × 103 типични клетки за ml повторно суспендирана пелета се считат за отрицателни. ii) FISH тестът е отрицателен, не се наблюдават яркочервени флуоресциращи клетки с размер и морфология, типични за R. Solanacearum, когато се използва родаминов филтър, при условие че се наблюдават типични яркочервени флуоресциращите клетки в положителните контролни препарати, когато се използва родаминов филтър.

8. Елайза тестове

Принцип

Поради сравнително ниската чувствителност на Елайза този тест може да се използва само като незадължителен допълнителен тест към IF, PCR и FISH. Когато се използва DAS Елайза, задължително се прави обогатяване и се използват моноклонални антитела (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Обогатяването на пробите преди да се използва Елайза може да е полезно като начин за увеличаване на чувствителността на теста, но може да се провали поради конкуриране от страна на други организми в пробата.

Забележка: Използва се валидиран източник на антитела на R. solanacearum (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Препоръчва се за всяка нова партида антитела да се определи титърът. Титър е най-високото разреждане, при което се осъществява оптимална реакция при тестването на суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки на ml от хомоложния щам на R. solanacearum, като се използват подходящи конюгатни съединение на вторични антитела в съответствие с указанията на производителя. По време на тестването антителата трябва да се използват при работно разреждане, близко до или равно на титъра на търговската рецептура.

Определя се титърът на антителата върху суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки на ml от хомоложния щам на R. solanacearum.

Включва се екстракт от проби, които са дали отрицателен резултат за R. solanacearum при предишно тестване, и суспензия на бактерия без кръстосано действие във фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS) като отрицателни контроли.

Като положителни контроли се използват аликвоти от екстракт от проби, които при предходно тестване са дали отрицателни резултати, смесени с 103 до 104 клетки на ml R. Solanacearum биовар 2 (например щам NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, виж допълнение 2, точки А и Б). За сравняване на резултатите във всяка петра се използва стандартна суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки на ml в PBS на R. Solanacearum. Осигурява се отделяне на положителните контроли върху микротитърната петра от пробата/пробите за тестване.

Стандартизираните положителни и отрицателни контролни материали, които могат да се използват с този тест, са изброени в допълнение 3, точка А.

Контролният материал се тества по същия начин както пробата/пробите.

Потвърдени са два Елайза протокола.

а) Индиректен Елайза (Robinson Smith et al., 1995)

1. Използват се 100 до 200 μm аликвоти от екстракт от проби. (Загряването при 100 °С за четири минути във водна баня или загряващ блок може да намали неспецифичните резултати в някои случаи).

2. Добавя се равен обем покривен буфер с двойна сила (допълнение 4) и се разбърква.

3. Добавят се 100 μm аликвоти към поне две гнезда на микротитърната петра (например Nunc-Polysorp или еквивалентна) и се инкубира за един час при 37 °С или за едно денонощие — при 4 °С.

4. Екстрактите се изваждат от гнездата. Гнездата се измиват трикратно с PBS-Tween (допълнение 4), като последният промивен разтвор се оставя да престои в гнездата най-малко пет минути.

5. Изготвя се подходящо разреждане на антитела към R. Solanacearum в блокиращ буфер (допълнение 4). За валидираните търговски антитела се използват препоръчаните разреждания (обикновено два пъти по-концентрирани от титъра).

6. Добавя се 100 μm във всяко гнездо и се инкубира за един час при 37 °С.

7. Изважда се разтворът с антитела от гнездата и се измива като преди (4).

8. Изготвя се подходящо разреждане на вторичното конюгатно антитяло от алкална фосфатаза в блокиращ буфер. Добавят се 100 μm във всяко гнездо и се инкубира за един час при 37 °С.

9. Изважда се конюгираното антитяло от гнездада и се измива както преди (4).

10. Добавят се 100 μm алкален фосфатазен субстратен разтвор (допълнение 4) към всяко гнездо. Инкубира се на тъмно при стайна температура и се отчита абсорбция при 405 nm на равни интервали в рамките на 90 минути.

б) DASI Елайза

1. Изготвя се подходящо разреждане на противо-R. Solanacearum поликлонални имуноглоболини в покривен буфер pH 9,6 (допълнение 4). Добавя се към всяко гнездо. Инкубира при 37 °С за четири до пет часа или при 4 °С — за 16 часа.

2. Гнездата се измиват трикратно с PBS-Tween (допълнение 4). Добавят се 190 μm екстракт в най-малко две от гнездата. Добавят се и положителни и отрицателни контроли — всяка в две гнезда за всяка петра. Инкубира се за 16 часа при 4 °С.

3. Гнездата се измиват трикратно с PBS-Tween (допълнение 4).

4. Изготвя се подходящо разреждане на специфични за R. Solanacearum моноклонални антитела в PBS (допълнение 4), съдържащи също 0,5 % говежди серумен албумин (BSA) и се добавят 190 μm във всяко гнездо. Инкубира се при 37 °С за два часа.

5. Гнездата се измиват трикратно с PBS-Tween (допълнение 4).

6. Изготвя се подходящо разреждане на противомишкови имуноглобулини, конюгирани с алкална фосфатаза в PBS. Добавят се 190 μm във всяко гнездо. Инкубира се при 37 °С за два часа.

7. Гнездата се измиват трикратно с PBS-Tween (допълнение 4).

8. Изготвя се 100 μm алкален фосфатазен субстратен разтвор, съдържащ 1 mg п-нитрофенил фосфат на ml субстратен буфер (допълнение 4). Добавят се 200 μm към всяко гнездо. Инкубира се на тъмно при стайна температура и се отчита абсорбция при 40 nm на равни интервали в рамките на 90 минути.

Интерпретиране на резултатите от Елайза тест:

Елайза тест е отрицателен, ако отчитането на средната оптична плътност (OD) от дубликатни пробни гнезда е < 2x OD от това в контролното гнездо с екстракт от отрицателна проба, при условие че всички оптичните плътности за положителните контроли са над 1,0 (след 90 минути инкубация със субстрата) и са по-големи от два пъти OD, получено за екстрактите от отрицателните проби.

Елайза тест е положителен, ако отчитанията на средната оптична плътност (OD) от дубликатни пробни гнезда е >2x OD в екстракта от отрицателната проба при категоричното условие, че отчитанията на средната оптична плътност във всички отрицателни контролни гнезда са < 2х отчитанията в положителните контролни гнезда.

Отрицателни отчитания от Елайза в положителните контролни гнезда означава, че тестът не е проведен правилно или е бил инхибиран. Положителни отчитания от Елайза в отрицателни контролни гнезда означава, че е настъпило кръстосано заразяване или неспецифично свързване на антитела.

9. Тестване на биологична проба

Забележка: Предварителното тестване с този метод трябва да дава възможност за възпроизводимо откриване на 103 до 104 единици, образуващи колонии, на R. Solanacearum на ml, добавени към екстракти от проби, които са дали отрицателен резултат при предишно тестване (за приготвянето виж допълнение 3).

Най-висока чувствителност на откриване чрез този метод може да се очаква, когато се използват прясно приготвени екстракти от проби и оптимални условия за растеж. Но методът може да се прилага успешно и към екстракти, които са били съхранявани в глицерин при температура от –68 до –86 °С.

Протоколът по-долу е на базата на Janse (1988)

9.1. Използват се 10 тестови растения от възприемчив доматен култивар (например Moneymaker или култивар със сходна възприемчивост, определена от тестващата лаборатория) във фаза трети същински лист за всяка проба. За подробна информация по отношение на културите виж допълнение 8. Могат също да се използват сини домати (например култивар Black Beauty или култивари със сходна възприемчивост), като се използват само растения във втора или трета фаза до пълно разгръщане на трети същински лист. Симптомите се проявяват по-слабо и се развиват по-бавно при синия домат. Затова се препоръчва при възможност да се използва доматен разсад.

9.2. Разпределят се 100 μl екстракт от проби между тестовите растения. 9.2.1. Инокулация със спринцовка Инокулират се стеблата на растенията точно над котиледоните, като се използва спринцовка с хиподермична игла (най-малко 23G). Пробата се разпределя между тестателните растения. 9.2.2. Инокулация чрез разр