A.

Блокиращият или конкурентен Елайза тест се изпълнява в съответствие със следващия протокол: Конкурентният Елайза тест, използващ моноклонално антитяло 3-17-A3, е способен да идентифицира антитела на всички известни серумни типове на вирус на син език (BTV). Принципът на теста е прекъсването на реакцията между BTV антиген и групово специфично моноклонално антитяло (3-17-A3) чрез добавка на тестов серум. Антителата на BTV, присъствуващи в тестовия серум, блокират реактивността на моноклоналното антитяло (Mab) и водят до намаляване на очакваното цветово развитие след добавяне на ензимно маркирано антимишо антитяло и на хромоген/субстрата. Серуми могат да бъдат тествани при 1:5 (точков тест — допълнение 1) или могат да бъдат титрувани (серум титруване — допълнение 2) за достигане крайна точка на разреждането. Стойности на забавяне по-високи от 50 % могат да се считат като позитивни. 1. Подходящи Елайза микротитърни плаки. 2. Антиген: доставен като клетъчно екстрактиран концентрат, приготвен, както е описано по-долу, и съхраняван или при – 20 °C, или при – 70 °C. 3. Блокиращ буфер: фосфатно буферирана сол (PBS), съдържаща 0,3 % BTV отрицателен серум възрастни говеда, 0,1 % (v/v) Tween-20 (доставен като сироп на polyoxyethylene sorbiton monolaurate) в PBS. 4. Моноклонално антитяло: 3-17-A3 (доставено като hybridoma тъканно-културов каймак) насочено срещу групово специфичен полипептид VP7, съхраняван при – 20 °C или изсушен замразително и разреден 1/100 с блокиращ буфер преди употреба. 5. Съединете: заешки антимиши глобулин (адсорбиран и отмит), съединен с пероксидаза на хрян и държан на тъмно при 4 °C. 6. Хромоген и субстрат: Orthophenylene diamine (OPD-chromogen) при крайна концентрация от 0,4 mg/ml в стерилна дестилирана вода. Водороден прекис (30 % w/v-субстрат) 0,05 % v/v, добавени непосредствено преди употреба (5μl H2O2 на 10 ml OPD). (боравете внимателно с OPD — носете гумени ръкавици — предположим мутаген). 7. 1 моларна сярна киселина: 26,6 ml киселина добавена към 473,4 ml дестилирана вода. (Помнете — винаги прибавяйте киселина към вода, никога вода към киселина). 8. Орбитален шейкър. 9. Елайза плаков четец (тестът може да бъде четен визуално). Cc: контрол на съединяване (без серум) без моноклонално антитяло); C++: силно позитивен серум контрол; C+: слабо позитивен серум контрол; C–: отрицателен серум контрол; Cm: моноклонално антитяло контрол (без серум).



Допълнение 1: Точково разреждане(1:5) формат (40 серуми/плака) Контроли Тест серуми 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



Допълнение 2: Формат серумно титруване (10 серуми/плака) Контроли Тест серуми 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Контрол на съединяване (Сс) : ямки 1A и 1Б са бланков контрол, състоящ се от BTV антиген и съединение. Това може да бъде използуване на бланков четец на Елайза. Mab контрол (Cm) : Колони 1 и 2, редове Ж и З са контролни за моноклонално антитяло и съдържат BTV антиген, моноклонално антитяло и съединение. Тези източници представляват максимален цвят. Средното на отчетената оптическа плътност от този контрол представлява 0 % стойност на инхибиране. Позитивен контрол (C++, C–) : Колони 1 и 2, редове В-Г-Д-Е. Тези ямки съдържат BTV антиген, BTV силен и слаб позитивен антиген съответно, Mab и съединяване. Отрицателен контрол (C–) : Ямки 2A и 2Б са негативните контроли, които съдържат BTV антиген, BTV негативен антисерум, Mab и съединяване. Тестови серуми : За обширни изследвания и бърз скрининг, серуми биха могли да бъдат тествани при единствено разреждане от 1:5 (допълниние 1). Алтернативно, 10 серума могат да бъдат тествани в гама на разреждане от 1:5 до 1:640 (допълнение 2). Това ще даде определени индикации за титъра на тестваните серуми. 1. Разредете BTV антиген към предварително титрувана концентрация на PBS, въздействайте ултразвуково за кратко, за да диспергирате агрегирания вирус (ако няма наличен ултразвуков апарат, пипетирайте енергично) и прибавете 50 ml към всички ямки на Елайза плаката. Потупайте страните на плаката за диспергиране на антиген. 2. Инкубирайте при 37 °C за 60 минути в орбитален шейкър. Измийте плаките три пъти чрез наводняване и изпразване на ямките с нестерилна PBS и попийте с попивателна хартия. 3. Контрол ямки: Прибавете 100 μl блокиращ буфер към Cc ямките. Прибавете 50 μl позитивни и негативни контролни серуми при разреждане от 1:5 (10 μl серуми + 40 μl блокиращ буфер), към съответните ямки C–, C + и C++. Прибавете 50 μl блокиращ буфер към Mab контролните ямки. Метод точково титруване: Прибавете 1:5 разреждане от всеки тестов серум в блокиращ буфер, за да дублирате ямките на колони 3—12 (10 μl серум + 40 μl блокиращ буфер), или Метод за серумно титруване: Пригответе двукратни серии на всеки от тестовите образци (1:5 до 1:640) в блокиращ буфер върху осем ямки на единични колони 3—12. 4. Веднага след прибавянето на тестовите серуми разредете Mab 1:100 в блокиращ буфер и добавете 50 μl към всички ямки на плаката, освен за празните контролни. 5. Инкубирайте при 37 °C за 60 минути в орбитален шейкър. Измийте три пъти с PBS и попийте до сухо. 6. Разредете заешки антимиши концентрат до 1/5000 в блокиращ буфер и добавете 50 μl към всички ямки на плаката. 7. Инкубирайте при 37 °C за 60 минути в орбитален шейкър. Измийте три пъти с PBS и попийте до сухо. 8. Размразете OPD и веднага преди употреба добавете 5 μl от 30 % въглероден прекис към всеки 10 ml на OPD. Добавете 50 μl към всички ямки на плаката. Оставете цвета да се развие за приблизително 10 минути и спрете реакцията с 1 M сярна киселина (50 μl на отвор). Цвят ще се развие в Mab контролните ямки и в тези ямки, съдържащи серуми без антитяло на BTV. 9. Изследвайте и запишете плаките или визуално, или използвайки спектрофотометричен четец. Използвайки софтуерния пакет, отпечатайте OD стойностите и процентното инхибиране (PI) за тестови и контролни серуми, основани на средната записана стойност в антиген контролните ямки. Данните, изразени като OD или PI стойности, се използуват за определяне дали е изпълнен в рамките на приемливи лимити. Горните контролни лимити (UCL) и долните контролни лимити (LCL) за Mab контрола (антиген плюс Mab при отсъствие на тестови серуми) са между OD стойности 0,4 и 1, 4. Всяка плака, която не отговаря на горните критерии, трябва да се отхвърли. Ако не е налице компютърен софтуерен пакет, отпечатайте OD стойностите, използвайки Елайза принтера. Изчислете средната OD стойност за антиген — контролните ямки, което се равнява на 100 % стойност. Определете 50 % OD стойност и ръчно пресметнете положителността и отрицателността на всяка проба. Процент на инхибиционна (PI) стойност = 100 – (OD на всеки тест контрол/средно OD на Cm) × 100. Дублиращите отрицателни контролно серумни ямки и дублиращите празни ямки би следвало да регистрират PI стойности между + 25 % и – 25 %, и между + 95 % и + 105 %, съответно. Невписването в тези граници не прави плаките невалидни, но предполага наистина, че фоновият цвят се развива. Силните и слаби положителни контролни серуми би следвало да регистрират PI стойности между + 81 % и + 100 %, и между + 51 % и + 80 %, съответно. Диагностичният праг за тестови серуми е 50 % (PI 50 % или OD 50 %). Проби, регистриращи PI стойности > 50 %, се регистрират като отрицателни. Проби, които регистрират PI стойности над и под прага за дублиращите ямки, се считат за съмнителни; такива проби могат да се тестват отново в спот тест и/или титруване. Положителни проби могат също да бъдат титрувани за осигуряване на индикация за степента на положителност. Визуално отчитане: Положителните и отрицателните проби са лесно забележими с невъоръжено око; слабо положителните и силно отрицателните проби могат да бъдат по-трудни за интерпретиране само с невъоръжено око. 1. Измийте 40-60 запръжки на сливащи се BHK-21 клетки три пъти с безсерумна тъканна среда и инфектирайте със син език вирусния серотип 1 в безсерумнна тъканна среда. 2. Инкубирайте при 37 °C и изследвайте дневно за цитопатичен ефект (CPE). 3. Когато CPE са завършени на 90 до 100 % на клетъчния лист на запръжка, съберете вируса чрез разклащане на все още залепнали клетки от стъклото. 4. Центрофугирайте при 2 000 до 3 000 rpm, за да направите клетките на пелети. 5. Отстранете повърхностно плуващото и суспендирайте отново клетките в приблизително 30 ml от PBS, съдържащ 1 % „Sarkosyl“ и 2 ml phenylmethylsulphonyl fluoride (lysis буфер). Това може да доведе до това клетките да формират гел и за редуциране на този ефект може да бъде добавен повече lysis буфер. (NB phenylmethylsulphonyl fluoride е опасен — трябва да се борави с изключителна предпазливост.) 6. Разрушавайте клетките за 60 секунди, използвайки ултразвукова сонда при амплитуда от 30 микрона. 7. Центрофугирайте при 10 000 rpm за 10 минути. 8. Съхранявайте повърхностно плаващото при + 4 °C и суспендирайте отново оставащата клетъчна пелета в 10 до 20 ml на lysis буфер. 9. Въздействайте ултразвуково и прояснете, съхранявайки повърхностно плуващото при всеки етап, общо от три пъти. 10. Съберете повърхностно плуващото и центрофугирайте при 24 000 rpm (100 000 g) за 120 минути при + 4 °C върху подложка от 5 ml 40 % захароза (w/v в PBS), използвайки 30 ml Вескмann центрофужни тръби и SW 28 ротор. 11. Отстранете повърхностно плаващото, дренирайте тръбите цялостно и суспендирайте отново пелета в PBS чрез ултразвуково въздействие. Съхранете антигена в кратни обеми при – 20 °C. Антиген на син език Елайза се титрува чрез индиректна техника Елайза. Двукратните разреждания на антигена се титруват срещу константно разреждане (1/100) на моноклоналното антитяло 3-17-A3. Протоколът е, както следва: 1. Титрувайте 1:20 разреждане на BTV антиген в PBS през микротитърната плака в двукратно разредителни серии (50 μl/ямка), използувайки многоканална пипета. 2. Инкубирайте за един час при 37 °C върху орбитален шейкър. 3. Измийте плаките три пъти с PBS. 4. Добавете 50 μl моноклонално антитяло 3-17-A3 (разредено 1/100) към всеки отвор на микротитърната плака. 5. Инкубирайте за един час при 37 °C върху орбитален шейкър. 6. Измийте плаките три пъти с PBS. 7. Добавете 50 μl от заешки антимиши глуболин, съединен към хрянова пероксидоза, разредена до предварително титрувана оптимална концентрация, към всяка ямка на микротитърна плака. 8. Инкубирайте за един час при 37 °C върху орбитален шейкър. 9. Добавете субстрат и хромоген, както е описано преди. Спрете реакцията след 10 минути чрез добавянето на 1 моларна сярна киселина (50 μl/ямка). В конкурентния образец моноклоналното антитяло би трябвало да е в излишък, поради това се избира разреждане на антиген, което попада в титърната крива (не в областта на платото), която дава приблизително 0,8 OD след 10 минути.