1991R2568 — BG — 01.04.2011 — 023.001

Този документ е средство за документиране и не обвързва институциите

Изменен с







(*) Настоящият акт никога не е публикуван на български език.









▼B

РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 2568/91 НА КОМИСИЯТА

от 11 юли 1991 година

относно характеристиките на маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал и съответните методи за анализ







КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ, като взе предвид Договора за създаване на Европейската икономическа общност, като взе предвид Регламент № 136/66/ЕИО на Съвета от 22 септември 1996 г. относно създаването на обща организация на пазара на масла и мазнини ( 1 ), последно изменен с Регламент (ЕИО) № 3577/90 ( 2 ), и по-специално член 35а от него, като има предвид, че приложението към Регламент № 136/66/ЕИО съдържа описанието и дефиницията на маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал за целите на търговията във всяка държава-членка в рамките на Общността и в търговията с трети страни; като има предвид, че за целите на разграничаването на различните типове мазнини е необходимо да се определят физическите и химическите характеристики на всяка от тях, както и органолептичните характеристики на необработеното маслиново масло virgin с цел гарантиране чистотата и качеството на съответните продукти, без това да засяга други съществуващи разпоредби; като има предвид, че наличието на характеристиките на различните типове мазнини трябва да се определя по еднакъв начин в рамките на цялата Общност; като има предвид, че за тази цел трябва да се установят общностни методи за химически и органолептичен анализ; като има предвид, че за известен преходен период трябва да се позволи използването на други методи за анализ, прилагани в държавите-членки, като при наличие на разлика в резултатите, получените с помощта на общия метод ще бъдат решаващи; като има предвид, че определянето на физическите и химически характеристики на маслиновото масло и на методите за анализ води до изменение на допълнителните бележки към глава 15 от Комбинираната номенклатура; като има предвид, че методът за органолептичен анализ на необработеното маслиново масло virgin включва създаването на групи от подбрани дегустатори; като има предвид, че срокът, необходим за създаването на подобна структура, трябва по тази причина да бъде определен; като има предвид, че с оглед трудностите, които някои държави-членки ще срещнат при създаването на групи от дегустатори, трябва да се даде разрешение за използването на групи в други държави-членки; като има предвид, че с цел осигуряване правилното функциониране на системата от такси върху вноса на остатъчни материали от преработката на маслини, трябва да се приеме общ метод за определяне масленото съдържание на тези продукти; като има предвид, че с цел да не се вреди на търговията, трябва да се предвиди разпоредба за реализирането в кратък срок на пакетираното маслиново масло преди влизането в сила на настоящия регламент; като има предвид, че е необходима отмяната на Регламент (ЕИО) № 1058/77 на Комисията ( 3 ), последно изменен с Регламент (ЕИО) № 1858/88 ( 4 ); като има предвид, че Управителният комитет по масла и мазнини не е дал становище в срока, определен от неговия председател, ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:







▼M20

Член 1

1. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точки 1 и 2 от приложение I към настоящия регламент, се считат за необработено маслиново масло virgin по смисъла на точка 1, а) и б) от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

2. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 3 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло за осветление по смисъла на точка 1, в) от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

3. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 4 от приложение I към настоящия регламент се счита за рафинирано маслиново масло по смисъла на точка 2 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

4. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 5 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло съставено от рафинирани маслинови масла и необработени маслинови масла virgin по смисъла на точка 3 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

5. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 6 от приложение I към настоящия регламент се счита за сурово маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 4 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

6. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 7 от приложение I към настоящия регламент се счита за рафинирано маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 5 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

7. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 8 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 6 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

▼B

Член 2

1. Характеристиките на маслата, установени в приложение I, се определят в съответствие с методите, описани по-долу:

— за определяне на свободните мастни киселини, изразени като процент олеинова киселина, се използва методът, описан в приложение II,

— за определяне на пероксидното число се използва методът, описан в приложение III,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— за определяне на стеролното съдържание се използва методът, описан в приложение V,

— за определяне на еритродиола и уваола се използва методът, описан в приложение VI,

▼M21

— за определянето на процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат, методът, цитиран в приложение VII,

▼M20 —————

▼B

— за спектрофотометричен анализ се използва методът, описан в приложение IX,

— за определяне състава на мастната киселина се използва методът, описан в приложение X A и X Б,

— за определяне на летливите халоген-съдържащи разтворители се използва методът, описан в приложение XI,

— за анализа на органолептичните характеристики на студено пресованото маслиново масло се използва методът, описан в приложение XII,

▼M20 —————

▼M11

— за определяне на стигмастадиени, методът, определен в приложение ХVII,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX,

▼M23

— за установяване на съдържанието на восъци, етилови естери на мастни киселини и метилови естери на мастни киселини посредством капилярна газова хроматография — методът, определен в приложение XX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

За целите на проверката, предвидена в параграф 3, анализите посочени в приложения II, III, IX, X и XII, и където е приложимо, всички необходими контра-анализи в съответствие с националното законодателство трябва да бъдат проведени преди датата на минималната трайност. Когато пробите са взети повече от четири месеца преди датата на минималната трайност, анализите се провеждат не по-късно от четвъртия месец след месеца, в който е взета пробата. За другите анализи, предвидени в посочения регламент, не се прилага срок.

◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Член 2а

Националните власти или техните представители могат да проверяват дали една мостра съответства на декларираната категория:

а) чрез провеждане, независимо от последователността, на анализите, предвидени в приложение I;

б) или като се следва редът, посочен в приложение Iб за схемата на решения, докато бъде достигнато едно от решенията, съдържащо се в схемата на решения.

▼M19 —————

▼M5

Член ►M19 3 ◄

Ако се установи, че органолептичните характеристики на маслиновото масло не отговарят на описанието им, заинтересуваните държави-членки, без да се засягат останалите санкции, налагат административно-финансови наказания, чийто размер се определя в зависимост от степента на констатираната нередност.

При оценяването на нередността се обръща специално внимание на естествените изменения в характеристиките на маслиновото масло, настъпващи при нормални условия на съхранение.

В началото на всяко полугодие държавите-членки информират Комисията за броя и вида на констатираните нередности и за наложените наказания през предходното полугодие.

▼M5

Член 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Когато държавите-членки изпитват затруднения при създаването на групи от дегустатори на тяхната територия, те могат да се обърнат към група от дегустатори, одобрени в друга държава-членка.

3. Всяка държава-членка съставя списък на групите от дегустатори, създадени от професионални или междубраншови организации в съответствие с условията, установени в параграф 1 и гарантира, че тези условия се спазват.

▼M19 —————

▼B

Член 6

1. Масленото съдържание на кюспето и другите остатъчни материали от добиването на маслиново масло (кодове по КН 2306 90 11 и 2306 90 19) се определя чрез използване на метода, изложен в приложение XV.

2. Масленото съдържание, посочено в параграф 1, се изразява като процентно съотношение от теглото на маслото към теглото на сухото вещество.

▼M20

Член 7

Разпоредбите на Общността, отнасящи се до наличието на примеси се прилагат:

По отношение на халогенираните разтворители, ограниченията за всички категории маслиново масло са, както следва:

— максималното съдържание на открит халогениран разтворител: 0,1 mg/kg.

— максималното общо съдържание на открити халогенирани разтворители: 0,2 mg/kg.

▼B

Член 8

1. Държавите-членки уведомяват Комисията за предприетите мерки по прилагането на настоящия регламент.

2. В началото на всяко полугодие държавите-членки изпращат на Комисията извлечение с аналитичните данни от тестовете, проведени в хода на предходното полугодие.

Резултатите се разглеждат от Управителния комитет по масла и мазнини в съответствие с процедурата, установена в член 39 от Регламент № 136/66/ЕИО.

Член 9

Регламент (ЕИО) № 1058/77 се отменя.

Член 10

1. Настоящият регламент влиза в сила на третия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейските общности.

Въпреки това методът, описан в приложение XII, се прилага от ►M1 1 ноември 1992 г. ◄ , освен за действия, свързани с режима на интервенция.

▼M5

Този метод не се прилага за необработено маслиново масло, подготвено за предлагане на пазара преди 1 ноември 1992 г.

▼B

2. Настоящият регламент не се прилага спрямо маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал, опаковани преди неговото влизане в сила и пуснати на пазара до 31 октомври 1992.

Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави-членки.









ПРИЛОЖЕНИЯ

Съдържание

Приложение I: Характеристики на видовете маслиново масло Приложение Iа: Вземане на проби маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал при директно опаковане на не повече от 100 литра Приложение Iб: Схема на решенията Приложение II: ►M21 Определяне на свободните мастни киселини, студен метод ◄ Приложение III: Определяне на перокисното число Приложение IV: Определяне на съдържанието на парафини чрез капилярна газова хроматография Приложение V: Определяне състава и съдържанието на стероли чрез капилярноколонкова газова хроматография Приложение VI: Определяне на съдържанието на еритродиол и уваол Приложение VII: ►M21 Определяне на процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат ◄ ▼M20 ————— ▼B Приложение IX: Спектрофотометрично изследване в ултравиолетовия спектър Приложение X А: Газовохроматографски анализ на метиловите естери на мастните киселини Приложение X Б: Създаване на метил естери на мастни киселини Приложение XI: Определяне на халоген-съдържащите разтворители на маслиновото масло Приложение XII: Органолептична експертиза на необработено маслиново масло virgin ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Приложение XV: Маслено съдържание на остатъчния материал Приложение XVI: Определяне стойността на йодното число Приложение ХVII: Определяне на стигмастадиени в растителни масла Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with ECN42 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content ▼M23 Приложение ХХ: Метод за установяване на съдържанието на восъци, етилови естери на мастни киселини и метилови естери на мастни киселини посредством капилярна газова хроматография

▼M23









ПРИЛОЖЕНИЕ I

ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ВИДОВЕТЕ МАСЛИНОВО МАСЛО







Категория Етилови естери на мастни киселини (FAME) и метилови естери на мастни киселини (FAEE) Киселин- ност (%) (*) Прекисно число mEq O2/kg (*) Парафини mg/kg (**) 2-глицерил монопалмитат (%) Стигмас- тадиен mg/kg (1) Разлика: ECN42 (HPLC) - ECN42 теоретично пресмятане K232 (*) K270 (*) ΔК (*) Органолептична оценка Средна стойност на дефектите (Md) (*) Органолептична оценка Средна стойност на плодовия аромат (Mf) (*) 1. Необработено маслиново масло екстра качество Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg или 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg и (FAEE/FAME) ≤ 1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14% ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 ако сумарният % палмитинова киселина > 14% 2. Необработено маслиново масло — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14% ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 2,5 Mf > 0 ≤ 1,0 ако сумарният % палмитинова киселина > 14% 3. Маслиново масло за осветление — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14% ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 2,5 (2) — ≤ 1,1 ако сумарният % палмитинова киселина > 14% 4. Рафинирано маслиново масло — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14% — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 ако сумарният % палмитинова киселина > 14% 5. Маслиново масло — смес от рафинирано и от висококачествено маслиново масло — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14% — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 ако сумарният % палмитинова киселина > 14% 6. Сурово маслиново масло от остатъчен материал — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Рафинирано маслиново масло от остатъчен материал — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Маслиново масло от остатъчен материал — ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Категория Съдържание на киселини (1) Общо кол. транс- олеинови изомери (%) Общо кол. транс- линолови + транс- линоленови изомери (%) Съдържание на стероли Общо стероли (mg/kg) Еритродиол и уваол (%) (**) Мирис- тинова (%) Лино- ленова (%) Арахи- нова (%) Ейко- зенова (%) Бехенова (%) Лигноце- ринова (%) Холестерол (%) Браси- кастерол (%) Кам- пестерол (%) Стигма- стерол (%) Бета- ситостерол (%) (2) Делта-7- Стигма- стенол (%) 1. Необработено маслиново масло екстра качество ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Необработено маслиново масло ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Маслиново масло за осветление ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Рафинирано маслиново масло ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Маслиново масло — смес от рафинирано и необработено ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Сурово маслиново масло от остатъчен материал ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Рафинирано маслиново масло от остатъчен материал ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Маслиново масло от остатъчен материал ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









ПРИЛОЖЕНИЕ Iа

Вземане на проби маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал при директно опаковане на не повече от 100 литра

Методът на вземане на проби се прилага за доставки на маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал, непревишаващи 125 000 литра, поставени в директни опаковки, непревишаващи 100 литра.

Ако доставката превишава 125 000 литра, тя трябва да бъде разделена на партиди от по 125 000 литра или по-малко. Ако доставката е по-малка от 125 000 литра, тя трябва да представлява една партида. След това методът се прилага за всяка партида.

Минималният брой на подлежащите на вземане първични проби се определя от размера на партидата в съответствие със съставената в точка 1 таблица.

Размерът на първичната проба се определя на базата на капацитета на директното пакетиране в съответствие със съставената в точка 2.1 таблица.

Доставката, първичната проба и лабораторната проба трябва да отговарят на определенията, посочени в стандарт EN ISO 5555.

Под „партида“ се разбира набор продажни единици, които са произведени, изработени и опаковани в условия, позволяващи маслото, съдържащо се във всяка продажна единица да бъде считано за хомогенно в смисъла на всички аналитични характеристики.

1. БРОЙ НА НЕОБХОДИМИТЕ ПЪРВИЧНИ ПРОБИ

Минималният брой на необходимите първични проби се определя от размера на партидата в съответствие със следната таблица:







Размер на партида (в литри) по-малък от Минимален брой на първичните проби 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Избраните за формиране на първична проба директни опаковки трябва да бъдат съседни една на друга в партидата.

В случай на съмнение, държавите-членки увеличават броя на първичните проби, подлежащи на вземане.

2. СЪДЪРЖАНИЕ НА ПЪРВИЧНИТЕ ПРОБИ

2.1 Първичните проби трябва да съдържат следното:







Когато директното опаковане е с капацитет от: Първичната проба трябва да съдържа масло от: a) 5 литра или повече a) 3 директни опаковки б) 3 литра или повече, но по-малко от 5 литра б) 3 директни опаковки в) 2 литра или повече, но по-малко от 3 литра в) 3 директни опаковки г) 1 литър или повече, но по-малко от 2 литра г) 6 директни опаковки д) 0,75 литра или повече, но по-малко от 1 литър д) 6 директни опаковки е) по-малко от 0,75 литра е) тройно количество от растителното масло от минималния брой опаковки с общ капацитет повече от 1,5 литра

2.2. Първичните проби следва да бъдат съхранявани в в директни опаковки до времето за анализ. След това масло в първичните проби се разделя на три лабораторни проби, за да могат да бъдат извършени:

а) анализите, посочени в приложения II, III, IX и X,

б) анализът, посочен в приложение XII,

в) другите анализи.

2.3. опаковките, съдържащи първични проби, се разделят в съответствие с националното законодателство.

3. АНАЛИЗИ И РЕЗУЛТАТИ

а) Всяка от първичните проби, посочени в точка 1, се разделя на лабораторни проби в съответствие с точка 2.5 от стандарт EN ISO 5555 и се анализира, както следва: — определяне на свободни мастни киселини, както е посочено в първото тире на член 2, параграф 1, — определяне пероксидната стойност, както е посочено във второто тире на член 2, параграф 1, — спектрофотометричен анализ, както е посочено в осмото тире на член 2, параграф 1, — определяне състава на мастната киселина, както е посочено в деветото тире на член 2, параграф 1.

б) в случаите, когато един от резултатите от анализите, посочени в а) за на-малко една от първичните проби, взети от същата партида, не отговаря на характеристиките на декларираната категория масло, цялата въпросна партида се обявява за неотговаряща. В случаите, когато резултатите от анализите посочени в буква а) за всяка от първичните проби взети от същата партида са нееднородни, предвид характеристиките на повторяемост на въпросните методи, цялата партида се обявява за нееднородна и всяка първична проба подлежи на други необходими анализи. В противен случай, една първична проба от партидата подлежи на останалите необходими анализи.

в) в случаите, когато един от резултатите от анализите, посочени във втория параграф на буква б) не отговаря на характеристиките на обявената категория масло, цялата партида се обявява за неотговаряща. В случаите, когато всички резултати от анализите, посочени във втория параграф на буква б) отговарят на характеристиките на обявената категория масло, цялата партида се обявява за отговаряща.

▼M20









ПРИЛОЖЕНИЕ Iб

СХЕМА НА РЕШЕНИЯТА ЗА ПРОВЕРКА НА СЪВМЕСТИМОСТТА НА ПРОБАТА ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО С ДЕКЛАРИРАНАТА КАТЕГОРИЯ

Анализът за проверка на съвместимостта на едно маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал с декларираната категория може да бъде извършен:

а) чрез извършване в случаен ред на анализите, предвидени за целта на проверката на съвместимостта с характеристиките, определени в приложение I; или

б) чрез извършване в реда, показан в схемата на решенията на определените в него анализи, докато бъде достигнато едно от решенията, съдържащи се в схемата на решенията.

Анализите, свързани с примесите, необходими за проверка на съвместимостта със стандартите на Европейската Общност, трябва да бъдат извършени отделно.

Схемата на решенията важи за всички категории маслиново масло и маслиново масло от остатъчен материал. То се състои от таблици номерирани от 1 до 11, които трябва да бъдат третирани на базата на декларираната категория на въпросното масло в реда, определен в общата таблица.

Легенда за общите таблици до 11:

— двойна линия (=) показва маршрута, който трябва да бъде следван в случай на съответствие (положителен отговор) с критериите определени в предходната клетка. Пунктираната линия (…) показва алтернативния маршрут, който трябва да бъде следван в случай на несъответствие,

— позициите в клетките в таблици от1 до 11 се отнасят до анализите, предвидени в настоящия регламент на базата на таблицата за съответствие, определена в приложение I към настоящото приложение;

— буквите в скоби, съдържащи се в кръговете на отрицателните решения в таблици от 1 до 11 се отнасят до указваща информация, дадена в допълнение 2 към настоящото приложение. Буквите сами по себе си не водят до задължението да се следват анализите и не предполагат истинността на исказаните предположения.

Обща таблица

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Таблица 7

Таблица 8

Таблица 9

Таблица 10

Таблица 11









Допълнение 1

Таблица на сътоветствието между приложенията към настоящия регламент и анализите, определени в схемата на решения







▼M21 — Киселинност Приложение II Определяне на свободните мастни киселини, студен метод ▼M20 — Пероксидно число Приложение III Определяне на пероксидното число — Uvспектрометрия Приложение IX Спектрофотометричен анализ — Органолептична оценка Приложение XII Органолептична оценка на студенопресован маслиново масло — 3,5-стигмастадиени Приложение XVII Метод за определяне на стигмастадиените в растителните масла — Трансизомери на мастните киселини Приложение Xa и Анализ на метиловите естери на мастните киселини чрез газова хроматография Приложение Хб Подготовка на метиловите естери на мастните киселини — Съдържание на мастните киселини Приложение Xa и Анализ на метиловите естери на мастните киселини чрез газова хроматография Приложение Хб Подготовка на метиловите естери на мастните киселини — ΔЕСN42 Приложение XVIII Определяне на състава на триглицеридите с ECN42 (разлика между състава HLPC и теоритичния състав на триглицеридите) — Стеролен състав и общо стеролно съдържание Приложение V Определяне на състава и съдържанието на стероли чрез капилярно-колонна газова хроматография — Еритродиол и уваол Приложение VI Определяне на еритродиола и уваола — Восъци Приложение IV Определяне на восъчното съдържание чрез капилярно-колонна газова хроматография — Алифатични алкохоли Приложение XIX Определяне на съдържанието на алифатични алкохоли чрез капилярно-колонна газова хроматография ▼M21 — Наситени мастни киселини в позиция 2 Приложение VII Определяне на процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат ▼M20









Допълнение 2

Таблица 1

а) Вижте небоработено маслиново масло или маслиново масло за осветление (Таблица 2 Критерии за качество или Таблица 4 Критерии за качество и чистота )

б) Вижте маслиново масло за осветление (Таблица 4 Критерии за качество и чистота)

Таблица 2

а) Вижте маслиново масло за осветление (Таблица 4 Критерии за качество и чистота)

б) Вижте двойнопресовано маслиново масло (Таблица 1 Критерии за качество)

Таблица 3

а) Наличие на рафинирано масло (маслиново или друго)

б) Наличие на маслиново масло от остатъчен материал

Таблица 4

а) Вижте двойнопресовано и необработено маслиново масло (Таблица 1 и Таблица 2 Критерии за качество)

б) Наличие на рафинирано масло (маслиново или друго)

в) Наличие на маслиново масло от остатъчен материал

г) Наличие на естерифицирани масла

Таблица 7

а) Наличие на маслиново масло от остатъчен материал

б) Наличие на естерифицирани масла

Таблица 8

а) Наличие на рафинирано масло (маслиново или друго)

б) Вижте маслиново масло за осветление (Таблица 4 Критерии за качество и чистота)

в) Наличие на естерифицирани масла

Таблица 11

а) Наличие на естерифицирани масла

▼B









ПРИЛОЖЕНИЕ II

▼M21

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СВОБОДНИТЕ МАСТНИ КИСЕЛИНИ, СТУДЕН МЕТОД

▼B

1. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КИСЕЛИННОСТТА

Определянето на свободните мастни киселини в маслиновото масло. Съдържанието на свободни мастни киселини се изразява като стандартно изчислена киселинност.

1.1. Принцип

Проба се разтваря в смес от разтворители и наличните свободни мастни киселини се титруват, като се използва етанолов разтвор на калиев хидроксид.

1.2. Реактиви

Всички реактиви трябва да са с признато качество за аналитични цели, а водата, която се използва, да е или дестилирана, или с еквивалентна чистота.

1.2.1. Диетилов етер; 95 % етанол (v/v), смес от равни обемни части. Бележка: Диетиловият етер е лесно запалим и може да образува експлозивни пероксиди. Трябва да се работи със специално внимание при употребата му. Неутрализира се точно в момента на употреба с разтвор на калиев хидроксид (1.2.2.), с добавка от 0,3 ml разтвор на фенолфталеин (1.2.3.) на 100 ml от сместа. Бележка: Ако не е възможно да се използва диетилов етер, може да се използва смес от разтворители. Ако е необходимо, етанолът може да се замести с пропанол-2.

1.2.2. Калиев хидроксид, титриран етанолов разтвор, с(КОН) около 0,1 mol/l или, ако е необходимо, с(КОН) около 0,5 mol/l. Точната концентрация на етаноловия разтвор на калиев хидроксид трябва да се знае и да се провери точно преди употреба. Използва се разтвор, приготвен поне пет дни преди употреба, декантиран в бутилка от кафяво стъкло с гумена запушалка. Разтворът трябва да е безцветен или със сламен цвят. Бележка: Стабилизиран разтвор на калиев хидроксид може да се приготви по следния начин. Довеждат се до кипене 1 000 ml етанол с добавка на 8 g калиев хидроксид и 0,5 g алуминиеви стружки и кипенето се поддържа с обратен хладник за един час. Дестилира се веднага. Нужното количество калиев хидроксид се разтваря в дестилата. Оставя се за няколко дни и се декантира чистата супернатантна течност от утайката от калиев карбонат. Разтворът може също така да се приготви и без дестилация по следния начин: към 1 000 ml етанол се добавят 4 ml алуминиев бутилат и сместа се оставя за няколко дни. Декантира се супернатантната течност и се разтваря нужното количество калиев хидроксид. Разтворът е готов за употреба.

1.2.3. Фенолфталеин, разтвор от 10 g/l в 95 до 96 % етанол (v/v) или алкално синьо, (в случай че мазнините са силно оцветени) — разтвор от 20 g/l в 95 до 96 % етанол (v/v).

1.3. Апаратура

Обикновено лабораторно оборудване, включващо:

1.3.1. аналитична везна

1.3.2. 250-милилитрова ерленмайерова колба

1.2.3. 10-милилитрова бюрета, градуирана през 0,05 ml.

1.4. Ход на опита

1.4.1. Подготвяне на пробата за изследване (Опитът се провежда с филтрираната проба. В случай че водното съдържание и немаслените примеси, взети заедно, са по-малко от 1 %, пробата се използва без по-нататъшна обработка; в случай че те превишават 1 %, тя следва да се филтрира.)

1.4.2. Вземане на пробата Пробата се взима в зависимост от очакваното киселинно число, в съответствие със следната таблица:



Очаквана киселинна стойност Маса на пробата (g) Точност на претегляне (g) < 1 20 0,05 1 до 4 10 0,02 4 до 15 2,5 0,01 15 до 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Пробата се претегля в ерленмайеровата колба (1.3.2.).

1.4.3. Определяне Пробата (1.4.2.) се разтваря в 50 до 150 ml от предварително неутрализираната смес от диетилов етер и етанол (1.2.1.). Титрира се с разклащане с 0,1 mol/l разтвор на калиев хидроксид (1.2.2.) (виж бележка 2) до промяната на индикатора (розовото оцветяване на фенолфталеина се задържа за поне 10 секунди). Бележка 1. Титрираният етанолов разтвор на калиев хидроксид (1.2.2.) може да се замени с воден разтвор на калиев или натриев хидроксид, като се предвиди обемът на добавената вода да не предизвика фазово разделяне. Бележка 2. Ако количеството на необходимия 0,1 mol/l разтвор на калиев хидроксид превишава 10 ml, се използва 0,5 mol/l разтвор. Бележка 3. Ако разтворът помътнее по време на титруването, се добавя достатъчно количество от разтворителите (1.2.1.) до получаването на бистър разтвор.

1.5. Киселинност: изразена като процентно съдържание на олеинова киселина

Киселинността в проценти е равна на:

където:

V = обемът на използвания титриран разтвор на калиев хидроксид, в милиметри;

c = точната концентрация от използвания титриран разтвор на калиев хидроксид, в молове на литър;

M = моларното тегло на мол от киселината, използвана за изразяване на резултата (= 282), в грамове;

m = теглото на пробата, в грамове.

Като резултат се приема средната аритметична стойност ►M6 от две калкулации ◄ .









ПРИЛОЖЕНИЕ III

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПЕРОКИСНОТО ЧИСЛО

1. ОБХВАТ

Стандартът описва метод за определянето на перокисното число на маслата и мазнините.

2. ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Стандартът е приложим за животински и растителни масла и мазнини.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Перокисното число е количеството на тези вещества в пробата, изразени в милиеквиваленти активен кислород на килограм, които окисляват калиевия йодид, съгласно описаната опитна постановка.

4. ПРИНЦИП

Обработка на част от пробата в разтвор на оцетна киселина и хлороформ с разтвор на калиев йодид.

5. АПАРАТУРА

Цялото оборудване трябва да е свободно от редуциращи или оксидиращи вещества.

Бележка: Не бива да се омазняват стените.

5.1. 3-милилитрова стъклена лопатка.

5.2. Колби с шлифовани гърла и запушалки с вместимост от около 250 ml, предварително изсушени и запълнени с чист сух инертен газ (азот или за предпочитане въглероден диоксид).

5.3. 25- или 30-милилитрова бюрета, градуирана през 0,1 ml.

6. РЕАКТИВИ

6.1. Хлороформ, с качество за аналитични цели, освободен от кислород чрез прокарване на поток от чист сух инертен газ през него.

6.2. Ледена оцетна киселина, с качество за аналитични цели, освободена от кислород чрез прокарване на поток от чист сух инертен газ през нея.

6.3. Калиев йодид, наситен воден разтвор, прясно приготвен, свободен от йод и йодати.

6.4. Натриев тиосулфат, 0,01 или 0,002 Mol/L, прецизно стандартизиран воден разтвор, стандартизиран точно преди употребата.

6.5. Разтвор на скорбяла, 10 g/l водна дисперсия, прясно приготвена от естествено разтворима скорбяла.

7. ПРОБА

Пробата следва да се вземе и съхранява без достъп на светлина, на студено и да се съхранява в изцяло запълнени стъклени контейнери, херметично запечатани със запушалки от шлифовано стъкло или корк.

8. ХОД НА ОПИТА

Опитът се провежда при разсеяна светлина или при изкуствено осветление. Измерва се в стъклена лопатка (5.1.) или, ако това е невъзможно, в колба (5.2.), с точност до 0,001 g, маса от пробата в съответствие със следната таблица, съгласно очакваното перокисно число:







Очаквано перокисно число (meq) Тегло на част от пробата (g) 0 до 12 5,0 до 2,0 12 до 20 2,0 до 1,2 20 до 30 1,2 до 0,8 30 до 50 0,8 до 0,5 50 до 90 0,5 до 0,3

Отпушва се колбата (5.2.) и се поставя стъклената лъжичка, съдържаща частта от пробата. Прибавят се 10 ml хлороформ (6.1.). Разтваря се частта от пробата чрез бързо разбъркване. Добавят се 15 ml оцетна киселина (6.2.) и след това — 1 ml разтвор на калиев йодид (6.3.). Поставя се бързо запушалката, разклаща се в продължение на една минута и се оставя в покой за точно пет минути, без достъп на светлина, при температура от 15 до 25 °C.

Прибавя се около 75 ml дестилирана вода. Титрира се освободеният йод с разтвор на натриев тиосулфат (6.4.) (0,002 Mol/L разтвор за очаквани стойности по-малки от 12 и 0,01 Mol/L разтвор за очаквани стойности над 12), като се разклаща енергично при използването на разтвор на скорбяла като индикатор.

Провеждат се две определяния на същата опитна проба.

Провежда се едновременно контролен опит. Ако резултатът от контролния опит превишава 0,05 ml от 0,01 Mol/L разтвор на натриев тиосулфат (6.4.) нечистите реактиви се подменят.

9. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Перокисното число (ПЧ), изразено в милиеквиваленти активен кислород на килограм, е представено чрез формулата:

където:

V = броят милилитри от стандартизирания разтвор на натриев тиосулфат (6.4.), използван за опита, коригиран, след като се вземат предвид резултатите от контролния опит;

T = точната молярност на използвания разтвор на натриев тиосулфат (6.4.);

m = масата на частта от пробата, в грамове.

За резултат се приема средната аритметична стойност от две проведени определяния.

▼M21









ПРИЛОЖЕНИЕ IV

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ПАРАФИНИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1. ПРЕДМЕТ

Този метод описва способ за определяне на съдържанието на парафини в маслиново масло. Парафините се анализират съобразно броя въглеродни атоми. Методът може да се използва по-специално за диференциране на маслиновото масло, получено чрез пресоване, от това, което е получено чрез екстракция (маслиново масло от остатъчен материал).

2. ПРИНЦИП

Мастното вещество, към което е добавен подходящ вътрешен стандарт, се фракционира чрез хроматография върху колонка от хидратиран силикагел; снема се фракцията, която първа се елуира в опитните условия (при полярност, по-ниска от тази на триглицеридите), след което се анализира директно чрез капилярна газова хроматография.

3. ОБОРУДВАНЕ

3.1. Ерленмайерова колба от 25 ml.

3.2. Стъклена колонка за газова хроматография с вътрешен диаметър 15 mm, височина 30 до 40 cm, оборудвана с кранче.

3.3. Апарат за газова хроматография, приспособен за функциониране с капилярна колонка, оборудван със система за директно въвеждане в колонката, състояща се от: 3.3.1. Термостатна камера за колонките, оборудвана с температурен програматор. 3.3.2. Инжектор за студено пускане — за директно вкарване в колонката. 3.3.3. Пламъчно-йонизационен детектор и усилвателен преобразувател. 3.3.4. Записващ интегратор, пригоден за работа с усилвателен преобразувател (3.3.3), с време на отговор под 1 секунда и променлива скорост на подаване на хартията. (Възможно е да се използват и информационни системи, които позволяват компютризирано събиране на данните от газовата хроматография.) 3.3.5. Капилярна колонка от стъкло или кварц, с дължина от 8 до 12 m, вътрешен диаметър от 0,25 до 0,32 mm, покрита отвътре със стационарна фаза, с еднородна дебелина между 0,10 и 0,30 μm. (Стационарни фази от тип SE-52 или SE-54, годни за употреба, се намират в търговската мрежа.)

3.4. Микроспринцовка с вместимост 10 μl, за директно подаване в колонката, снабдена със закалена игла.

3.5. Електровибратор.

3.6. Ротационен изпарител.

3.7. Муфелна пещ.

3.8. Аналитични везни, гарантиращи точност на измерване до ± 0,1 mg.

3.9. Обикновена лабораторна стъклария.

4. РЕАКТИВИ

4.1. Силикагел с гранулометричен състав между 60 и 200 μm. Силикагелът трябва да престои в пещ при 500 °C в продължение на минимум 4 часа. След охлаждане добавете към него вода, равна на 2 % от снетото количество силикагел. Разбъркайте добре, за да хомогенизирате сместа. Оставете я на тъмно в продължение на минимум 12 часа преди употреба.

4.2. n-хексан за хроматография.

4.3. Етилов етер за хроматография.

4.4. n-хептан за хроматография.

4.5. Стандартен разтвор на лауринов арахидат — 0,1 % (m/v) в хексан (вътрешен стандарт). (Възможно е да се използва и цетилов палмитат или миристилов стеарат.) 4.5.1. Судан 1 (1-фенил-азо-2-нафтол).

4.6. Газ носител: чист водород или хелий, за газова хроматография.

4.7. Спомагателни газове: — чист водород за газова хроматография; — чист въздух за газова хроматография.

5. РАБОТЕН РЕЖИМ

5.1. Подготовка на хроматографската колонка

Потопете 15 g силикагел (4.1) в n-хексан (4.2) и го поставете в колонката (3.2). Компенсирайте бързата седиментация с помощта на електрическа бъркалка (3.5), за да направите хроматографския пласт по-хомогенен. Перколирайте 30 ml n-хексан, за да отстраните евентуалните примеси. Претеглете с помощта на везните (3.8) точно 500 mg от пробата в ерленмайеровата колба с вместимост 25 ml (3.1), добавете нужното количество вътрешен стандарт (4.5), в зависимост от предполагаемото съдържание на парафини. Например, когато се касае за маслиново масло, добавете 0,1 mg лауринов арахидат, а когато става въпрос за маслиново масло от остатъчен материал — 0,25 до 0,5 mg. Прехвърлете така приготвената проба в хроматографската колонка с помощта на две дози n-хексан, всяка по 2 ml (4.2).

Оставете разтворителя да изтече, така че да достигне на 1 mm от горното ниво на абсорбента, след което перколирайте допълнително 70 ml n-хексан, за да отстраните естествено наличните n-алкани. После започнете хроматографското елуиране, събирайки 180 ml от сместа n-хексан/етилов етер, в съотношение 99:1, като поддържате дебит от около 15 капки на 10 секунди. Елуирането на пробата трябва да се извърши при стайна температура 22 ± 4 °C.

Бележки:

— Сместа n-хексан/етилов етер (99:1) трябва да се приготвя всеки ден.

— За да контролирате визуално правилното елуиране на парафините, възможно е да добавите към разтворената проба 100 μl судан (1 %) в елуираната смес. Тъй като оцветителят е с междинно време на задържане спрямо парафините и триглицеридите, уместно е елуирането да се прекрати тогава, когато оцветяването достигне дъното на хроматографската колонка, тъй като на този етап всички парафини са елуирани.

Изсушете така получената фракция в ротационен изпарител (3.6) до практически пълното отстраняване на разтворителя. Последните 2 ml от разтворителя се отстраняват с помощта на слаб азотен поток; след това добавете 2-4 ml n-хептан.

5.2. Анализ чрез газова хроматография

5.2.1. Предварителни операции

Поставете колонката в газовия хроматограф (3.3), свързвайки входния извод към системата on-column, а изходния — към детектора. Извършете основните проверки на апаратурата за газова хроматография (здравина на газовите контури, ефективност на детектора и на записващата система и т. н.).

Ако колонката се използва за първи път, се препоръчва да пристъпите към кондиционирането ѝ. Прокарайте през колонката малко газ, след което включете апаратурата за газова хроматография. Нагрейте постепенно до достигане, след около 4 часа, на температура 350 °C. Поддържайте тази температура в продължение на минимум 2 часа, след което пристъпете към настройката на апаратурата към условията на работа (настройка на газовия поток, запалване на пламъка, включване към електронното записващо устройство (3.3.4), настройка на температурата на камерата за колонката, на детектора и т. н.) и настройте сигнала на чувствителност поне 2 пъти по-висока от предвидената за провеждане на анализа. Ходът на основната линия трябва да бъде линеен, без пикове от каквото и да е естество, и не трябва да показва отклонения.

Отрицателното праволинейно отклонение е показател за неизправни връзки на колонката; положителното отклонение е показател за недостатъчно кондициониране на колонката.

5.2.2. Избор на работните условия

Общо взето, работните условия, които следва да се спазват, са следните:

— температура на колонката: —



20 °C/минута 5 °C/минута 20 °C/минута в началото 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′),

— температура на детектора: 350 °C,

— количество инжектирано вещество: 1 μl от разтвора (2—4 ml) n-хептан,

— газ носител: хелий или водород с оптимална линейна скорост за съответния газ (виж допълнението),

— инструментална чувствителност: в състояние да удовлетвори посочените по-долу условия:

Тези условия могат да варират в зависимост от характеристиките на колонката и на газовия хроматограф по такъв начин, че да се постигне анализиране на всички парафини, задоволителна разделителна способност на пиковете (виж фигурата); времето на задържане на вътрешния стандарт C32 следва да бъде 18 ± 3 минути. Най-изразеният пик на парафините следва да се намира на минимум 60 % височина от основата на скалата.

Параметрите на интегриране на пиковете следва да се определят по начин, който позволява правилно изчисление на лицата на пиковете, взети под внимание.

Бележка. Като се има предвид високата крайна температура, се допуска положително отклонение, което не бива да надвишава 10 % височина от основата на скалата.

5.3. Провеждане на анализа

С помощта на микроспринцовка с вместимост 10 μl вземете 1 μl от разтвора; издърпайте буталото на спринцовката, така че иглата да остане празна. Вкарайте иглата в инжекционния прибор и след 1—2 секунди бързо инжектирайте разтвора; след около 5 секунди бавно извадете иглата.

Проведете запис на анализа до пълното елуиране на парафините.

Основната линия следва винаги да отговаря на необходимите условия.

5.4. Идентифициране на пиковете

Идентифицирането на различните пикове следва да се извършва въз основа на времената на задържане и в сравнение със смеси от парафини с познати времена на задържане, анализирани при същите условия.

Фигурата представя хроматограма на парафините в необработено маслиново масло.

5.5. Количествено изчисление

С помощта на интегратора пристъпете към изчислението на лицата на пиковете на вътрешния стандарт и на алифатните естери от C40 до C46.

Изчислете съдържанието на парафин във всеки един от естерите, в mg/kg мастно вещество, по формулата:

където:

Ax = лице на пика на всеки естер, в квадратни милиметри;

As = лице на пика на вътрешния стандарт, в квадратни милиметри;

ms = добавена маса на вътрешния стандарт, в милиграми;

m = маса на пробата, взета за анализ, в грамове.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Отбележете сумата на съдържанията на отделните парафини от C40 до C46, в mg/kg мастно вещество (ppm).

Забележка. Компонентите, които трябва да се определят, се отнасят до пиковете с четно въглеродно число между естерите C40 и C46, съгласно примера на хроматограмата на парафините в маслиновото масло, посочена на фигурата по-долу. Ако естерът C46 се появи двойно, се препоръчва за идентифицирането му да се анализира фракцията на парафините в маслиново масло от остатъчен материал, където пикът C46 се идентифицира лесно, тъй като е най-изразеният.

Резултатите се дават с точност до една десета.

Фигура

Хроматограма на парафините в маслиново масло ( 5 )

Легенда:

I.S. = лауринов арахидат;

1 = дитерпенови естери;

2 + 2′ = естери C40;

3 + 3′ = естери C42;

4 + 4′ = естери C44;

5 = естери C46;

6 = стеролови естери и тритерпенови алкохоли.









Допълнение

Определяне на линейната скорост на газа

Инжектирайте от 1 до 3 μl метан (или пропан) в газовия хроматограф след настройката му към нормални условия на работа. Засечете с хронометър времето, необходимо на газа да премине през колонката, от момента на инжектирането му до момента, в който пикът се очертае (tM).

Линейната скорост, в cm/s, се изчислява по формулата L/tM, където L е дължината на колонката в сантиметри, а tM е засеченото време в секунди.

▼B









ПРИЛОЖЕНИЕ V

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪСТАВА И СЪДЪРЖАНЕТО НА СТЕРОЛИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНОКОЛОНКОВА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1. ОБХВАТ

Методът описва процедура за определяне на отделното количество и общото количество на съдържанието на стероли в мастните вещества.

2. ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Мастното вещество, след добавянето на β-холестанол като вътрешен стандарт, се осапунява с етанолов разтвор на калиев хидроксид и неосапуняемите съставки се екстрахират с помощта на диетилов етер.

Стероловата фракция се отделя от неосапуняемия екстракт чрез хроматография на основна плака със силикагел. Стеролите, възстановени от силикагела, се преобразуват в триметилсилил етери и се анализират чрез капилярно-колонкова газова хроматография.

3. АПАРАТУРА

3.1. 250 ml колба с обратен хладник със снадки от шлифовано стъкло.

3.2. Разделителни фунии с вместимост от 500 ml.

3.3. Колби с вместимост от 250 ml.

3.4. Пълен набор за тънкослоен хроматографски анализ, с използване на стъклени плаки с размери 20 × 20 cm.

3.5. Ултравиолетова лампа с дължина на вълната 366 до 254 nm.

3.6. Микроспринцовки с вместимост съответно 100 μl и 500 μl.

3.7. Цилиндрична стъклена филтрационна фуния с порьозна преграда G3 (порьозност 15 до 40 μ) с диаметър приблизително 2 cm и височина приблизително 5 cm, подходяща за филтриране под вакуум и шлифована мъжка снадка 12/21.

3.8. Вакуумна колба с вместимост 50 ml с шлифована женска снадка 12/21 за свързване с филтрационната фуния (3.7.).

3.9. Епруветка с вместимост 10 ml с конично дъно и тапа.

3.10. Газов хроматограф за използване с капилярна колонка и снабден с разделителна система, състояща се от: 3.10.1. термостатична камера за колонки с възможност за поддържане на желаната температура с точност до ± 1 °С; 3.10.2. изпарителен агрегат с възможност за настройка на температурата с изпарителен елемент от персиланизирано стъкло; 3.10.3. детектор за пламъчна йонизация и усилвателен преобразувател; 3.10.4. записващ интегратор за използване с усилвателния преобразувател (3.10.3.), с време на отговор, което не превишава една секунда, и променлива скорост на подаване на хартията.

3.11. Стъклена или кварцова капилярна колонка с дължина 20 до 30 m, вътрешен диаметър 0,25 до 0,32 mm, с течна фаза с SE-52 или SE-54 или еквивалентна, с плътност на слоя между 0,10 и 0,30 μm.

3.12. Микроспринцовка за газова хроматография, с вместимост 10 μl със закалена игла.

4. РЕАКТИВИ

4.1. Приблизително 2 mol/L етанолов разтвор на калиев хидроксид. Разтварят се 130 g калиев хидроксид (минимална концентрация 85 %), с охлаждане, в 200 ml дестилирана вода и се долива до един литър с етанол. Разтворът трябва да се съхранява в добре затворени стъклени бутилки с тъмен цвят.

4.2. Диетилов етер, пречистен за аналитични цели.

4.3. Безводен натриев сулфат, пречистен за аналитични цели

4.4. Стъклени плаки, обвити със силикагел, без флуоресцентен индикатор, с дебелина 0,25 mm (могат да се доставят от търговската мрежа).

4.5. 0,2 mol/L етанолов разтвор на калиев хидроксид: 13 g калиев хидроксид се разтварят в 20 ml дестилирана вода и се доливат до един литър с етанол.

4.6. Бензен, за хроматография. (Виж 5.2.2.).

4.7. Ацетон, за хроматография, (Виж 5.2.2.).

4.8. Хексан, за хроматография. (Виж 5.2.2.).

4.9. Диетилов етер, за хроматография. (Виж 5.2.2.).

4.10. Хлороформ, пречистен за аналитични цели. (Виж 5.2.2.).

4.11. Стандартен разтвор за тънкослойна хроматография: ►M6 2 % ◄ разтвор в хлороформ на холестерол или фитостероли.

4.12. 0,2 % разтвор на 2,7-дихлорофлуоресцин в етанол. Той се алкализира слабо чрез добавяне на няколко капки 2 mol/L алкохолен разтвор на калиев хидроксид.

4.13. Безводен пиридин, за хроматография.

4.14. Хексаметилдисилазан.

4.15. Триметилхлоросилан.

4.16. Стандартни разтвори на триметилсилил етери. Те се приготвят в момента на употреба от чисти стероли или смеси от стероли, получени от масла, които ги съдържат.

4.17. 0,2 % разтвор (m/V) на β-холестанол в хлороформ (вътрешен стандарт).

4.18. Газове носители: водород и хелий, пречистени за газова хроматография.

4.19. Спомагателни газове: — водород, пречистен за газова хроматография; — въздух, пречистен за газова хроматография.

5. ХОД НА ОПИТА

5.1. Приготвяне на неосапуняемите съставки. 5.1.1. С помощта на спринцовка с вместимост 500 μl се поставя в 250-милилитрова колба обем 0,2 % разтвор на α-холестанол в хлороформ (4.17.), съдържащ такова количество холестанол, което съответства на приблизително 10 % от стероловото съдържание на аликвотната част от пробата, взета за определяне. Например за 5 g от пробата се добавят 500 μl от 0,2 % разтвор на α-холестанол, когато става въпрос за маслиново масло и 1 500 μl — за масло от маслиново кюспе. Изсушава се до сухо с поток от азот и тогава се измерва прецизно 5 g от сухата филтрирана проба в същата колба. ►M6 Масла ◄ , съдържащи значителни количества холестерол могат да покажат пик, имащ време на задържане, идентичен с този на холестанола. Ако това се прояви, стероловата фракция следва да се анализира двукратно със и без вътрешен стандарт ►M6 или е необходимо да се използва бетулинол вместо холестанол ◄ . 5.1.2. Добавят се 50 ml 2 mol/L етанолов разтвор на калиев хидроксид, поставя се обратният хладник и се подгрява до слабо кипене на водна баня с непрекъснато силно разбъркване, докато се извърши осапуняването (разтворът се избистря). Нагряването се продължава за още 20 минути, след което се прибавят 50 ml дестилирана вода до върха на хладника, хладникът се отстранява, а колбата се охлажда до приблизително 30 °С. 5.1.3. Съдържанието на колбата се прехвърля количествено в 500 ml разделителна фуния с помощта на няколко промивки с дестилирана вода, възлизаща общо на около 50 ml. Прибавят се приблизително 80 ml диетилов етер, разклаща се енергично в продължение на около 30 секунди и се оставя да се утаи (бележка 1). Отделя се долната водна фаза, като тя се събира в отделна разделителна фуния. Извършват се две по-нататъшни екстракции на водната фаза по същия начин, като всеки път се използват 60 до 70 ml етилов етер. Бележка 1: Която и да е емулсия може да се раздели чрез прибавянето на малки количества етилов или метилов алкохол с помощта на опръскване. 5.1.4. Изтеглят се етерните екстракти в отделна разделителна фуния и се промиват в дестилирана вода (50 ml всеки път), докато промивната вода не даде неутрална реакция. След като промивната вода е била отстранена, се изсушава с безводен натриев сулфат и се филтрира през безводен натриев сулфат в предварително претеглена 250-милилитрова колба, като фунията и филтърът се промиват с малки количества диетилов етер. 5.1.5. Етерът се дестилира до няколко милилитра, след това се изсушава под лек вакуум или под поток от азот, като изсушаването се довършва в пещ при 100 °С за приблизително четвърт час и след охлаждане в десикатор се претегля.

5.2. Отделяне на стероловата фракция. 5.2.1. Подготовка на основните плаки. Плаки със силикагел (4.4.) се потапят напълно в 0,2 mol/L етанолов разтвор на калиев хидроксид (4.5.) за 10 секунди, след което се оставят да изсъхнат в изпарителен шкаф за два часа и накрая се поставят в пещ при 100 °С за един час. Изваждат се от пещта и се съхраняват в десикатор с калциев хлорид до използването им (така обработените плаки трябва да се използват в рамките на 15 дни). Бележка 2: Когато се използват плаки със силикагел за отделяне на стероловата фракция, няма нужда да се обработват неосапуняемите съставки с диалуминиев триоксид. По този начин всички съединения с киселинни свойства (мастни киселини и други) се задържат в точката на накапване и стероловата ивица ясно се отделя от ивиците на алифатните или тритерпеновите алкохоли. 5.2.2. В проявителната камера се налива до дълбочина около 1 cm смес от бензен и ацетон в съотношение 95:5 (v/v). Като алтернатива може да се използва смес от хексан и етилов етер в съотношение 65:35 (v/v). Камерата се затваря с подходящ капак и се оставя така за около половин час, така че да се установи равновесие между течността и парите. Към вътрешните повърхности на камерата могат да се прикрепят ивици от филтърна хартия, потопени в отмивния агент. Това намалява времето за проявяване с приблизително една трета и се постига по-равномерно, правилно отмиване на съставките. Бележка 3: Проявителният разтвор трябва да се подменя преди всеки анализ, с оглед на получаването на възпроизводими условия за проявяване. 5.2.3. Подготвя се приблизително 5 % разтвор на неосапуняеми съставки (5.1.5.) в хлороформ и 300 μl от разтвора се нанася на възможно най-тънка равномерна ивица с помощта на микроспринцовката с вместимост 100 μl на плака за хроматография на приблизително 2 cm от единия край на плаката. На същото равнище като ивицата се накапват 2 до 3 μl от стандартния разтвор (4.11.) за разпознаването на ивицата от алифатни алкохоли след завършването на проявяването. 5.2.4. Плаката се поставя в проявителната камера както е указано в 5.2.2. Температурата се поддържа между 15 и 20 °С. Камерата се затваря с капака веднага и пробата се оставя за отмиване, докато фронтът на разтворителя достигне на разстояние 1 cm от горния край на плаката. След това плаката се изважда от проявителната камера и разтворителят се изпарява под горещ въздушен поток или плаката се оставя под камината. 5.2.5. Плаката се напръсква леко и равномерно с разтвора на 2,7-дихлорофлуоресцин. Когато плаката се наблюдава под ултравиолетова светлина, ивицата от стероли може да се разпознае като се обедини с петното, получено от стандартния разтвор. Границите на ивицата по краищата на флуоресценцията се очертават с черен молив. 5.2.6. Силикагелът, включен в тази определена област, се изчегъртва с метална шпатула. Отделеният надробен материал от силикагел се поставя във филтърната фуния (3.7.). Прибавят се 10 ml горещ хлороформ, разбърква се добре с металната шпатула и се филтрира под вакуум, като филтратът се събира в колбата (3.8.), която е свързана с филтърната фуния. Утайката от фунията се промива три пъти с диетилов етер (с около 10 ml всеки път), като филтратът се събира в същата колба, свързана с филтърната фуния. Филтратът се изпарява до обем от 4 до 5 ml и остатъчният разтвор се прехвърля в епруветка с вместимост 10 ml (3.9.), която е била претеглена предварително; изпарява се до сухо чрез леко подгряване под азотен поток, утайката се разтваря отново с няколко капки ацетон, отново се изпарява до сухо, след което се поставя в пещ при 105 °С за около 10 минути, след което се охлажда в десикатор и се претегля. Остатъкът в епруветката се състои от стероловата фракция.

5.3. Подготовка на триметилсилиловите етери. 5.3.1. Реактивът за силилация, състоящ се от смес от пиридин-хексаметилдисилазан-триметилхлоросилан в съотношение 9:3:1 (v/v/v) (бележка 4) се добавя в епруветката, съдържаща алкохолната фракция, в съотношение 50 μl за всеки милиграм стероли, като се избягва абсорбцията на влага (бележка 5). Бележка 4: Готови за употреба разтвори могат да се доставят от търговската мрежа; други силанизиращи реактиви, като например бис-триметилсилил, трифлуороацетамид + 1 % триметилхлоросилан, който трябва да се разрежда със същия обем безводен пиридин, също могат да се набавят. 5.3.2. Епруветката се затваря, внимателно се разклаща (без да се преобръща), докато стеролите се разтворят. След това се оставя за поне 15 минути при стайна температура и после се центрофугира за няколко минути. Бистрият разтвор е готов за газов хроматографски анализ. Бележка 5: Слабата опалесценция, която може да се получи, е нормална и не влияе по никакъв начин. Формирането на бял флокулат или появяването на розово оцветяване е знак за наличието на влага или за увреждането на реактива. В този случай опитът се повтаря.

5.4. Газов хроматографски анализ 5.4.1. Предварителни операции, запълване на колонката. 5.4.1.1. Капилярната колонка се поставя в газовия хроматограф чрез свързване на входния край с изпарителя, който е свързан с разделителната система, а изходния край — с детектора. Извършва се обща проверка на газовохроматографския агрегат (течове от газовите вериги, ефикасност на детектора, ефективност на разделителната система и на записващата система и тъй нататък). 5.4.1.2. Ако колонката се използва за пръв път, се препоръчва да бъде подложена на кондициониране. Прокарва се слаб поток от газ през колонката, след което газовохроматографкият агрегат се включва и се започва постепенно нагряване до достигането и поддържането на температура от поне 20 °С над температурата за експлоатация (бележка 6). Тази температура се поддържа за поне два часа, след което целият агрегат се привежда в работен режим (настройка на газовия поток и разделянето, възпламеняване на пламъка, свързване с електронното записващо устройство, настройване на температурата на пещта за капилярни колонки, детектора и инжектора и тъй нататък) и се записва сигналът с поне два пъти по-голяма чувствителност от тази, която ще се използва при анализа. Ходът на основната линия трябва да е прав, без пикове от какъвто и да било вид и не трябва да се измества. Отрицателно праволинейно изместване е показател за изтичане от колонковите свръзки; положителното изместване е показател за неподходящо кондициониране на колонката. Бележка 6: Температурата на кондициониране трябва да е винаги поне с 20 °С по-ниска от максималната температура, определена за използваната стационарна фаза. 5.4.2. Избор на условията за работа. 5.4.2.1. Насоката за условията за работа е следната: — температура на колонките: 260 °С ± 5 °С, — температура на изпарителя: 280 °С, — температура на детектора: 290 °С, — линейна скорост на газа носител: хелий — 20 до 35 cm/sec, водород — 30 до 50 cm/sec, — съотношение на разделяне: 1:50 до 1:100, — чувствителност на инструмента: 4 до 16 пъти минималното намаляване, — чувствителност на записване: 1 до 2 mV f.s., — скорост на подаване на хартията: 30 до 60 cm/h, — количество на инжектираното вещество: 0,5 до 1 μl от разтвора на ТМСЕ. Тези условия могат да се изменят в светлината на характеристиките на колонковата и газовата хроматография, с оглед получаването на хроматограми, задоволяващи следните условия: — времето за задържане на β-ситостерола трябва да е 20 ± 5 минути, — пикът на кампестерола трябва да е: за маслиновото масло (общо съдържание 3 %) — 15 ± 5 % от пълната стойност; за соевото масло (общо съдържание 20 %) — 80 ± 10 % от пълната стойност — всички налични стероли трябва да са отделени. В добавка на това, че трябва да са разделени, пиковете трябва да бъдат също така напълно отделени един от друг, т.е. следата на пика трябва да се върне напълно до основата, преди да се издигне за следващия пик. Непълното отделяне обаче се допуска, като е предвидено, че пикът при TRR 1,02 може да се изрази количествено чрез използването на перпендикуляр. 5.4.3. Провеждане на анализа. 5.4.3.1. С помощта на микропипетата с вместимост 10 μl се изтегля 1 μl хексан, въвежда се 0,5 μl въздух и впоследствие — 0,5 до 1 μl от разтвора на пробата. Буталото на спринцовката се повдига, за да се изпразни иглата. Иглата се въвежда през мембраната на мястото за инжектиране и след една до две секунди разтворът се инжектира бързо, а иглата се изважда бавно след приблизително пет секунди. 5.4.3.2. Извършва се запис до пълното отмиване на наличните ТМСЕ на стеролите. Основната линия трябва да отговаря на изискванията на точка 5.4.1.2. 5.4.4. Разпознаване на пиковете. Разпознаването на индивидуалните пикове се извършва съгласно времената за задържане и в сравнение със смеси от стеролови ТМСЕ, анализирани при същите условия. Стеролите се отмиват в следния ред: холестерол, брасикастерол, 24-метиленхолестерол, кампестерол, кампестанол, стигмастерол, Δ 7-кампестерол, Δ 5,23-стигмастадиенол, клеростерол, β-ситостерол, ситостанол, Δ 5-авенастерол, Δ 5,24-стигмастадиенол, Δ 7-стигмастенол, Δ 7-авенастерол. Времената за задържане за ситостерол за колони SE-52 и SE-54 са показани в таблица 1. Фигури 1 и 2 показват типични хроматограми за някои масла. 5.4.5. Количествена преценка. 5.4.5.1. Изчисляват се лицата на β-холестанола и стероловите пикове при използването на интегратора. Пиковете за всички вещества, които не са включени сред тези, включени в таблица 1, не се вземат под внимание. Коефициентът на отговор за β-холестанола се приема за 1. 5.4.5.2. Концентрацията на всеки отделен стерол, изразена в mg/100 g мастно вещество се изчислява по следния начин: където: Ах = лицето на пика за стерола, ►M6 ————— ◄ ; Аs = лицето на пика на β-холестанола, ►M6 ————— ◄ ; ms = масата на добавения β-холестанол, в милиграми; m = масата на пробата, взета за определяне, в грамове.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1. Записват се индивидуалните концентрации на стеролите в mg/100 g мастно вещество, а сборът им като общо количество на стеролите.

6.2. Изчислява се процентното съдържание на всеки отделен стерол чрез отношение на имащото значение лице на пика към сбора от лицата на пиковете на стеролите. , където: Ах = лицето на пика за х; ΣА = сборът от лицата на пиковете на стеролите.









ДОПЪЛНЕНИЕ

Определяне на линейната скорост на газа

1 до 3 μl метан (или пропан) се инжектират в газовия хроматограф, настроен на нормални условия за работа, и се измерва времето, необходимо на метана или пропана за преминаване през колонката от момента на инжектиране до момента на появяване на пика (tM).

Линейната скорост на газа, в cm/sec, е представена чрез L/tM, където L е дължината на колоната, в сантиметри, а tM е измереното времето, в секунди.







Таблица 1 Относително време за задържане за стеролите Пик Идентификация Относително време за задържане SE 54 колонка SE 52 колонка 1 холестерол Δ-5-холестен-3β-ол 0,67 0,63 2 холестанол 5α-холестан-3β-ол 0,68 0,64 3 брасикастерол [24S]-24-метил-Δ-5,22-холестадиен-3β-ол 0,73 0,71 4 24-метилен-холестерол 24-метилен-Δ-5,24-холестен-3β-ол 0,82 0,80 5 кампестерол [24R]-24-метил-Δ-5-холестен-3β-ол 0,83 0,81 6 кампестанол [24R]-24-метил-холестан-3β-ол 0,85 0,82 7 стигмастерол [24R]-24-етил-Δ-5,22-холестадиен-3β-ол 0,88 0,87 8 Δ-7-кампестерол [24R]-24-метил-Δ-7-холестен-3β-ол 0,93 0,92 9 Δ-5,23-стигмастадиенол [24R,S]-24-етил-Δ-5,23-холестадиен-3β-ол 0,95 0,95 10 хлеростерол [24S]-24-етил-Δ-5,25-холастадиен-3β-ол 0,96 0,96 11 β-ситостерол [24R]-24-етил-Δ-5-холестан-3β-ол 1,00 1,00 12 ситостанол 24-етил-холестан-3β-ол 1,02 1,02 13 Δ-5-авенастерол [24Z]-24-етилиден-5-холестен-3β-ол 1,03 1,03 14 Δ-5,24-стигмастадиенол [24R,S]-24-етил-Δ-5,24-холестадиен-3β-ол 1,08 1,08 15 Δ-7-стигмастенол [24R,S]-24-етил-Δ7,24-холестадиен-3β-ол 1,12 1,12 16 Δ-7-авенастерол [24Z]-24-етилиден-Δ-7-холестен-3β-ол 1,16 1,16

Фигура 1

Газова хроматограма на стероловата фракция на нерафинирано маслиново масло

Фигура 2

Газова хроматограма на стероловата фракция на рафинирано маслиново масло









ПРИЛОЖЕНИЕ VI

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЕРИТРОДИОЛ И УВАОЛ

ВЪВЕДЕНИЕ

Еритродиолът (често подразбиран като гликолите еритродиол и уваол взети заедно) е съставка на неосапуняемата фракция, характерна за някои типове мастни вещества. Намира се в значително високи концентрации в екстрахираното с разтворители маслиново масло и в други масла, такива като пресованото маслиново масло и маслото от семената на гроздето, които също го съдържат, така че неговото наличие може да показва наличието на екстрахирано с разтворители маслиново масло.

1. ОБХВАТ

Методът описва процедура за откриване на еритродиол в мастни вещества.

2. ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Мастното вещество се осапунява с етанолов разтвор на калиев хидроксид. След това неосапуняемата фракция се екстрахира с диетилов етер и се пречиства чрез пасиране върху колона от диалуминиев триоксид.

След това неосапуняемите вещества се подлагат на тънкослойна хроматография върху плаки със силикагел, докато ивиците, съответстващи на стероловата и еритродиоловата фракция, се разделят. Стеролите и еритродиолът, възстановени от плаката, се преобразуват в триметилсилил етери и сместа се анализира чрез газова хроматография.

Резултатът се изразява като процентното съдържание на еритродиол в сместа от еритродиол и стероли.

3. АПАРАТУРА

3.1. Апаратурата, описана в приложение V (определяне на съдържанието на стероли).

4. РЕАКТИВИ

4.1. Реактивите, описани в приложение V (определяне на съдържанието на стероли).

4.2. Стандартен разтвор на еритродиол — 0,5 % разтвор в хлороформ.

5. ХОД НА ОПИТА

5.1. Подготовка на неосапуняемите вещества

Както е описано в параграф 5.1.2. от приложение V.

5.2. Отделяне на еритродиола и стеролите.

5.2.1. Виж параграф 5.2.1. от приложение V.

5.2.2. Виж параграф 5.2.2. от приложение V.

5.2.3. Приготвяне на 5 % разтвор на неосапуняемите вещества в хлороформ. С помощта на 0,1-милилитрова микроспринцовка се нанася на хроматографска плака 0,3 ml разтвор на приблизително 1,5 cm от долния ръб на възможно най-тънка и равномерна ивица. На единия край на плаката се поставят няколко микролитра от разтворите на холестерол и еритродиол, за да служат за сравнение.

5.2.4. Плаката се поставя в камерата за промиване, подготвена, както е упоменато в 5.2.1. Околната температура трябва да е около 20 °С. Камерата се затваря веднага с капака и се оставя за отмиване, докато фронтът на разтворителя не достигне приблизително 1 cm от горния ръб на плаката. Плаката се изважда от камерата за промиване, а разтворителят се изпарява под горещ въздушен поток.

5.2.5. Плаката се опръсква леко и равномерно с алкохолния разтвор на 2,7-дихлорофлуоресцин. Когато плаката се наблюдава под ултравиолетова светлина, ивиците на стерола и еритродиола могат да се познаят по това, че са на едно равнище с тази на стандарта. Маркира се с точки точно по външния ръб на флуоресценцията.

5.2.6. С помощта на метална шпатула се изстъргва силикагелът в маркираните части. Материалът от плаката се поставя в 50 ml колба. Добавят се 15 ml горещ хлороформ, разклаща се добре и се филтрира през фуния с диск от шлифовано стъкло, така че силикагелът да се пренесе върху филтъра. Филтратът се изпарява до обем от 4 до 5 ml, пренася се в калибрована 10 ml епруветка за филтриране с конично дъно, изсушава се чрез леко нагряване под поток от азот и се претегля.

5.3. Подготовка на триметилсилил естерите

Както е описано в параграф 5.3. от приложение V.

5.4. Газовохроматографски анализ

Както е описано в параграф 5.4. на гореописания метод. Условията за работа на газовият хроматограф при анализа трябва да са такива, че да се извърши стероловият анализ и да се отделят ТМСЕ от еритродиола и уваола.

След като пробата е била инжектирана, записването се продължава докато наличните стероли, еритродиолът и уваолът бъдат отмити. След това се идентифицират пиковете (времената за задържане на еритродиола и уваола, отнесени към β-ситостерола, са съответно около 1,45 и 1,55) и се изчисляват лицата както при стеролите.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

където:

А1 = лицето на пика за еритродиола, ►M6 ————— ◄ ;

А2 = лицето на пика за уваола, ►M6 ————— ◄ ;

ΣАстероли = сборът от лицата на пиковете на стеролите ►M6 ————— ◄ .

Резултатът се изразява до една цифра след десетичната запетая.

▼M21









ПРИЛОЖЕНИЕ VII

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПРОЦЕНТНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА 2-ГЛИЦЕРИЛ МОНОПАЛМИТАТ

1. ПРЕДМЕТ И СФЕРА НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Този метод описва аналитичната процедура за определяне на процентното съдържание на палмитинова киселина в позиция 2 на триглицеридите посредством анализа на 2-глицерил монопалмитат.

Методът е приложим за течни растителни масла при стайна температура (20 °C).

2. ПРИНЦИП

След подготовката ѝ маслената проба се подлага на въздействието на панкреатична липаза: частична хидролиза, специфична за позиции 1 и 3 на молекулата на триглицерида, води до появата на моноглицериди в позиция 2. Процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат в моноглицеридната фракция се определя, след силилация, посредством капилярна газова хроматография.

3. АПАРАТУРА И ЛАБОРАТОРНО ОБОРУДВАНЕ

3.1. Ерленмайерова колба от 25 ml.

3.2. Бехерови чаши от 100, 250 и 300 ml.

3.3. Стъклена колонка за хроматография, с вътрешен диаметър 21—23 mm, дължина 400 mm, оборудвана с диск с поресто дъно и кранче.

3.4. Градуирани епруветки от 10, 50, 100 и 200 ml.

3.5. Колби с вместимост 100 и 250 ml.

3.6. Ротационен изпарител.

3.7. Центрофужни епруветки с конично дъно, с вместимост 10 ml, с шлифована запушалка.

3.8. Центрофуга за епруветки от 10 и 100 ml.

3.9. Термостат, който позволява поддържане на постоянна температура от 40 °C ± 0,5 °C.

3.10. Калибровани пипети от 1 и 2 ml.

3.11. Хиподермична спринцовка от 1 ml.

3.12. Микроспринцовка от 100 μl.

3.13. Фуния от 1 000 ml.

3.14. Газов хроматограф за капилярни колонки, оборудван със система за студено инжектиране „on column“, за директно вкарване на пробата в колонката и с пещ, която е в състояние да поддържа желаната температура с точност до 1 °C.

3.15. Инжектор за студено пускане „on column“ за директно вкарване на пробата в колонката.

3.16. Пламъчно-йонизационен детектор и електрометър.

3.17. Записващ интегратор, адаптиран към електрометъра, с време на отговор под 1 секунда и променлива скорост на подаване на хартията.

3.18. Капилярна колонка от стъкло или кварц, с дължина 8—12 метра, с вътрешен диаметър от 0,25 до 0,32 mm, с покритие от метилполисилоксан или фенил метилполисилоксан 5 %, с дебелина 0,10—0,30 μm, която може да се използва при 370 °C.

3.19. Микроспринцовка с вместимост 10 μl, снабдена със закалена игла, с минимална дължина 7,5 cm, за директно инжектиране върху колонката.

4. РЕАКТИВИ

4.1. Силикагел с гранулометричен състав между 0,063 и 0,200 mm (70/280 mesh), приготвен по следния начин: поставете силикагела в порцеланова капсула, изсушете в пещ при 160 °C в продължение на 4 часа, след което оставете да се охлади на стайна температура в ексикатор. Добавете обем вода, равен на 5 % от теглото на силикагела, като процедирате по следния начин: в ерленмайерова колба от 500 ml претеглете 152 g силикагел и добавете 8 g дестилирана вода, запушете с тапа и разклатете внимателно до равномерно разпределяне на водата. Оставете да престои минимум 12 часа преди употреба.

4.2. n-хексан (за хроматография).

4.3. Изопропанол.

4.4. Воден разтвор на изопропанол, в обемно съотношение 1/1.

4.5. Панкреатична липаза. Използваната липаза трябва да има активност между 2,0 и 10 липазни единици/mg. (В търговската мрежа се предлагат панкреатични липази с активност между 2 и 10 единици на милиграм ензим.)

4.6. Буферен разтвор: 1 M воден разтвор на трисхидрокси-метиламинометан, доведен до pH 8 (проверява се с потенциометър), чрез добавяне на концентрирана солна киселина (1/1 v/v).

4.7. Натриев холат с ензимно качество — воден разтвор 0,1 % (разтворът трябва да се използва до 15 дни след приготвянето му).

4.8. Калциев хлорид, воден разтвор 22 %.

4.9. Диетилов етер за хроматография.

4.10. Проявяващ разтворител: смес n-хексан/диетилов етер (87/13) (v/v).

4.11. Натриев хидроокис, разтвор 12 тегловни процента.

4.12. Разтвор в етилов алкохол на 1 % фенолфталеин.

4.13. Газ носител: водород или хелий, за газова хроматография.

4.14. Спомагателни газове: водород, минимум 99 %, свободен от влага и органични примеси, и въздух, за газова хроматография, със същата чистота.

4.15. Реактив за силанизация: смес пиридин(хексаметилдисилазан) триметилхлоросилан 9/3/1 (v/v/v). (В търговската мрежа се предлагат готови за употреба разтвори. Могат да се използват други реактиви за силилация като бис-триметилсилил трифлуорацетамид + 1 % триметилхлоросилан, разреден със същия обем безводен пиридин.)

4.16. Сравнителни проби: чисти моноглицериди или смеси от моноглицериди с известен състав на процентното съдържание, подобен на този на пробата.

5. ПРОЦЕДУРА

5.1. Подготовка на пробата

5.1.1. Маслото със свободна киселинност под 3 % не се нуждае от неутрализация преди хроматографията върху колонката със силикагел. Маслото със свободна киселинност над 3 % трябва да се подложи на неутрализация, както е описано в точка 5.1.1.1. 5.1.1.1. Във фунията с вместимост 1 000 ml (3.13) налейте 50 g масло и 200 ml n-хексан. Добавете 100 ml изопропанол и такова количество от разтвора на натриевия хидроокис 12 % (4.11), което съответства на свободната киселинност на маслото плюс добавка от 5 %. Разклатете енергично в продължение на една минута. Добавете 100 ml дестилирана вода, разбъркайте отново и оставете в покой. След декантирането отстранете долния слой от сапуни. Отстранете евентуалните междинни слоеве (клей и неразтворими вещества). Промийте хексановия разтвор от неутрализираната киселина с последователни дози от по 50—60 ml от разтвора изопропанол/вода 1/1 (v/v) (4.4) до изчезване на розовото оцветяване на фенолфталеина. Отстранете по-голямата част от хексана чрез дестилация под вакуум (използвайте например ротационен изпарител) и прехвърлете маслото в колба от 100 ml (3.5). Изсушете маслото под вакуум до пълното отстраняване на разтворителя. В края на тази операция киселинността на маслото трябва да бъде под 0,5 %.

5.1.2. Поставете 1,0 g масло, приготвено по горепосочения начин, в ерленмайерова колба от 25 ml (3.1) и разтворете в 10 ml проявяваща смес (4.10). Оставете разтвора да престои в продължение на минимум 15 минути преди хроматографията върху колонка със силикагел. Ако разтворът е мътен, го центрофугирайте, за да гарантирате оптимални условия за хроматография. (Могат да се използват готови за употреба патрони силикагел SPE от 500 mg.)

5.1.3. Подготовка на хроматографската колонка Сипете в колонката (3.3) около 30 ml от проявяващия разтвор (4.10), поставете парче памук в долната част на колонката с помощта на стъклена пръчица; натиснете, за да отстраните въздуха. В бехерова чаша пригответе суспензия от 25 g силикагел (4.1) в около 80 ml проявяващ разтвор и я сипете в колонката с помощта на фуния. Проверете дали цялото количество силикагел е постъпило в колонката; промийте с проявяващия разтвор (4.10), отворете кранчето и оставете нивото на течността да стигне до около 2 mm над горното ниво на силикагела.

5.1.4. Хроматография върху колонка В ерленмайерова колба от 25 ml (3.1) претеглете точно 1,0 g от пробата, приготвена по описания в точка 5.1 начин. Разтворете пробата в 10 ml проявяващ разтвор (4.10). Сипете разтвора, приготвен по указанията в точка 5.1.3, в хроматографската колонка. Избягвайте движението на повърхността на колонката. Отворете кранчето и оставете разтвора на пробата да изтече, докато достигне нивото на силикагела. Проявете със 150 ml проявяващ разтвор. Регулирайте дебита на 2 ml/min (така че 150 ml да изтекат в колонката за около 60—70 минути). Съберете елуата в предварително претеглена колба с вместимост 250 ml. Изпарете разтворителя под вакуум и отстранете последните следи от него под азотен поток. Претеглете колбата и изчислете събрания екстракт. (В случай че използвате готови за употреба SPE патрони от силикагел, процедирайте по следния начин: поставете 1 ml разтвор (5.1.2) в предварително приготвените с 3 ml n-хексан патрони.) След перколация на разтвора проявете с 4 ml n-хексан/диетилов етер 9/1 (v/v). Съберете елуата в епруветка от 10 ml и го подложете на изпарение под азотен поток до изсъхване. Подложете сухия остатък на въздействие на панкреатична липаза (5.2). От основно значение е да проверите съдържанието на мастни киселини преди и след преминаването върху SPE патрона).

5.2. Хидролиза с панкреатична липаза

5.2.1. В центрофужна епруветка претеглете 0,1 g масло, приготвено съгласно точка 5.1. Добавете 2 ml буферен разтвор (4.6), 0,5 ml разтвор на натриев холат (4.7) и 0,2 ml разтвор на калциев хлорид, като разклащате добре след всяко добавяне. Затворете епруветката с шлифованата запушалка и я поставете в термостата при 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Добавете 20 mg липаза, разклатете старателно (като внимавате да не намокрите запушалката) и поставете епруветката в термостата за точно 2 минути, след което я извадете, разклатете енергично в продължение точно на 1 минута и оставете да се охлади.

5.2.3. Добавете 1 ml диетилов етер, запушете с тапата и разклатете енергично, след което центрофугирайте и прехвърлете етеровия разтвор в чиста и суха епруветка с помощта на микроспринцовка.

5.3. Подготовка на силанизираните деривати и на газовата хроматография

5.3.1. С помощта на микроспринцовка поставете 100 μl разтвор (5.2.3) в епруветка с конично дъно от 10 ml.

5.3.2. Отстранете разтворителя под слаб азотен поток, добавете 200 μl реактив за силанизация (4.15), запушете епруветката и оставете да престои 20 минути.

5.3.3. След 20 минути добавете от 1 до 5 ml n-хексан (в зависимост от хроматографските условия): полученият разтвор е готов за газова хроматография.

5.4. Газова хроматография

Условията на работа са следните:

— температура на инжектора (инжектор „on column“): под температурата на кипене на разтворителя (68 °C);

— температура на детектора: 350 °C;

— температура на колонката: програмиране на температурата на пещта: 60 °C в продължение на 1 минута, увеличавайки с 15 °C на минута до 180 °C, след това с 5 °C на минута до 340 °C, после се поддържа температура от 340 °C в продължение на 13 минути;

— газ носител: водород или хелий, настроен на адекватната линейна скорост с оглед постигане на разделителната способност, отразена във фигура 1. Времето на задържане на триглицерид C54 трябва да бъде 40 + 5 минути (виж фигура 2) (Условията на работа, посочени по-горе, се дават с указателна цел. Всеки оператор следва да ги оптимизира до постигане на желаната разделителна способност. Височината на пика, съответстващ на 2-глицерил монопалмитат, трябва да има минимална величина, равна на 10 % от скалата на записващото устройство.);

— количество инжектирано вещество: 0,5—1 μl от разтвора (5 ml) n-хексан (5.3.3).

5.4.1. Идентифициране на пиковете

Идентифицирането на индивидуалните моноглицериди се извършва в съответствие с получените времена на задържане и в сравнение със стандартните смеси моноглицериди, анализирани при същите условия.

5.4.2. Количествена преценка

Лицето на всеки пик се изчислява с помощта на електронен интегратор.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Процентното съдържание на глицерил монопалмитат се изчислява от съотношението между лицето на съответния пик и сбора от лицата на пиковете на всички моноглицериди (виж фигура 2) по формулата:

където:

Ax = лицето на пика, съответстващ на глицерил монопалмитат;

ΣА = сборът от лицата на всички пикове на моноглицеридите.

Резултатът се дава с точност до една десета.

7. ПРОТОКОЛ ОТ АНАЛИЗА

Протоколът от анализа следва да посочва:

— позоваването на този метод,

— всяка информация, необходима за пълното идентифициране на пробата,

— резултата от анализа,

— всяко отклонение от този метод, било то по решение на заинтересованите страни или по друга причина,

— идентификационните данни на лабораторията, датата на анализа и подписа на отговорните лица по неговото провеждане.

Фигура 1

Хроматограма на продуктите от реакцията на силанизация, получени чрез действието на липазата върху рафинирано маслиново масло, към което е добавено 20 % естерифицирано масло (100 %)

Легенда: „acides gras libres“ = свободни мастни киселини; „Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée“ = рафинирано маслиново масло + 20 % естерифицирано масло; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 монопалмитолеин; „1-2 mono C18 insat.“ = 1-2 моно C18 ненаситени; „squalene“ = скуален

Фигура 2

Хроматограма на:

A) неестерифицирано маслиново масло, след липаза; след силанизация; в тези условия (капилярна колонка 8—12 m) парафиновата фракция се елуира едновременно с диглицеридната фракция или малко след това. След липаза съдържанието на триглицериди не би следвало да надвишава 15 %. Легенда: 1 = Свободни мастни киселини 2 = Моноглицериди 3 = Диглицериди 4 = Триглицериди * = 2-монопалмитин ** = Триглицерид C54

Хроматограма на:

Б) естерифицирано масло след липаза; след силанизация; в тези условия (капилярна колонка 8—12 m), парафиновата фракция се елуира едновременно с диглицеридната фракция или малко след това. След липаза съдържанието на триглицериди не би следвало да надвишава 15 %. Легенда: 1 = Свободни мастни киселини 2 = Моноглицериди 3 = Диглицериди 4 = Триглицериди * = 2-монопалмитин ** = Триглицерид C54

8. БЕЛЕЖКИ

В търговската мрежа се предлагат липази със задоволителна липазна активност. Възможно е и да бъдат приготвени лабораторно по следния начин:

Охладете до 0 °C 5 kg пресен свински панкреас. Отстранете околните твърда мазнина и съединителна тъкан и раздробете добре в ножова мелница до получаване на гладка кремообразна смес. Разбъркайте в продължение на 4 до 6 часа с 2,5 литра безводен ацетон, след което центрофугирайте. Екстрахирайте утайката още три пъти със същото количество безводен ацетон, след това два пъти със смес от равни части ацетон и диетилов етер и два пъти с диетилов етер.

Изсушете остатъка под вакуум за 48 часа до получаването на устойчив прах, който трябва да се съхранява в хладилник и на сухо.

Пригответе емулсия от маслиново масло, както следва:

Разбъркайте в смесител в продължение на 10 минути смес от 165 ml от разтвор на гуми арабика при 100 g/l, 15 g натрошен лед и 20 ml предварително неутрализирано маслиново масло.

Сипете последователно в бехерова чаша с вместимост 50 ml 10 ml от тази емулсия, а след това 0,3 ml разтвор на натриев холат при 0,2 g/ml и 20 ml дестилирана вода.

Поставете бехеровата чаша в термостат, настроен на 37 °C; потопете електродите на pH метъра и спиралната бъркалка.

Прибавете, капка по капка, с помощта на бюрета, разтвор на натриев хидроокис (0,1 N), докато pH достигне 8,3.

Добавете един обем водна суспензия на липазен прах (0,1 g/ml липаза). Веднага щом pH метърът покаже pH 8,3, включете хронометъра и добавете разтвора на натриевия хидроокис, капка по капка, така че да се поддържа pH от 8,3. Отчитайте всяка минута обема на консумирания разтвор.

Нанесете данните в координатна система, чиято абсциса съответства на времето, а ординатата ѝ — на милилитрите алкален разтвор (0,1 N), нужни за поддържането на постоянно pH. Трябва да се получи линейна графика.

Активността на липазата, измерена в липазни единици/mg, се изчислява по следната формула:

където:

A — е активността в липазни единици/mg;

V — използваният обем на разтвор на натриев хидроокис — 0,1 N за минута, в милилитри (изчислен по графиката);

N — нормалността на разтвора на натриев хидроокис;

m — масата в mg на опитната липаза.

Единица липаза се дефинира като количеството ензим, което отделя 10 микроеквивалента киселина в минута.

▼M20 —————

▼B









ПРИЛОЖЕНИЕ IX

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ В УЛТРАВИОЛЕТОВИЯ СПЕКТЪР

ПРЕДИСЛОВИЕ

Спектрофотометричното изследване в ултравиолетовия спектър може да осигури информация за качеството на дадена мазнина, състоянието ѝ на запазеност и промените, настъпили в нея при технологичните процеси.

Абсорбцията на вълните с дължина, упомената в метода, е вследствие на конюгирани системи от диени и триени. Тези абсорбции са изразени като специфични екстинкции Е1 % 1 cm (екстинкцията на 1 % разтвор на мазнината в упоменатия разтворител, при дебелина на слоя 1 cm), обикновено обозначавани като К (наричан още „коефициент на екстинкция“).

1. ОБХВАТ

Методът описва процедурата за извършване на спектрофотометрично изследване на маслиново масло в ултравиолетовия спектър.

2. ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Въпросната мазнина се разтваря в нужния разтворител и след това екстинкцията на разтвора се определя при определени дължини на вълната срещу чистия разтворител. Специфичните екстинкции се изчисляват от спектрофотометричните показания.

3. ОБОРУДВАНЕ

3.1. Спектрофотометър за измерване на екстинкцията в ултравиолетовия спектър между 220 и 360 nm, с възможност за отчитане на отделните нанометрични единици.

3.2. Правоъгълни кварцови кювети с капачки, имащи оптична дължина 1 cm. Когато се изпълнят с вода или друг подходящ разтворител, кюветите не трябва да показват помежду си разлики по-големи от 0,01 екстинкционни единици.

3.3. 25-милилитрови градуирани колби.

▼M6

3.4. Хроматографска колба, чиято горна част е с дължина 270 мм и диаметър 35 мм, а долната ѝ част е с дължина 270 мм и диаметър приблизително 10 мм.

▼B

4. РЕАКТИВИ

4.1. Изооктан (2,2,4-триметилпентан), пречистен за спектрофотометричен анализ. Срещу дестилирана вода той трябва да има пропускливост от не по-малко от 60 % при дължина на вълната 220 nm и не по-малко от 95 % — при 250 nm или — циклохексан, пречистен за спектрофотометричен анализ: срещу дестилираната вода той трябва да има пропускливост не по-малко от 40 % при 220 nm и не по-малко от 95 % — при 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Основен диалуминиев триоксид за колонкова хроматография, приготвен и изпитан, както е описано в приложение I.

4.3. n-хексан, за хроматография.

5. ХОД НА ОПИТА

5.1. Въпросната проба трябва да е напълно хомогенна и без евентуални примеси. Масла, които са в течно състояние при стайна температура, следва да се филтрират през хартия при температура приблизително 30 °С, твърдите мазнини се хомогенизират и се филтрират при температура от не повече от 10 °С над точката на топене.

5.2. Измерват се прецизно приблизително 0,25 g от така подготвената проба в 25-милилитровата градуирана колба, долива се от определения разтворител до резката и се хомогенизира. Полученият разтвор трябва да е напълно бистър. Ако има наличност на опалесценция или мътност, бързо се филтрира през хартия.

5.3. Напълва се кювета с получения разтвор и се измерва екстинкцията при подходяща дължина на вълната между 232 и 276 nm, като се използва разтворителя като стандарт. Записаните стойности на екстинкцията трябва да са в рамките от 0,1 до 0,8. Ако не са, измерванията трябва да се повторят, като според нуждата се използват по-концентрирани или по-слаби разтвори.

5.4. Когато се изисква определянето на специфичната екстинкция да се извършва след пасиране върху диалуминиев триоксид, се постъпва по следния начин. Приготвя се суспензия от 30 g основен диалуминиев триоксид в хексан и се поставя в хроматографската колонка. След утаяването на адсорбента излишният хексан се източва до приблизително 1 cm над горния край на диалуминиевия триоксид. Разтварят се 10 g от мазнината, хомогенизирана и филтрирана, както е описано в 5.1., в 100 ml хексан и разтворът се излива в колонката. Отмивката се събира, а разтворителят се изпарява под вакуум при температура под 25 °С. С получената по този начин мазнина веднага се постъпва, както е указано в 5.2.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1. Записват се специфичните екстинкции (коефициенти на екстинкция) при различните дължини на вълната, изчислено по следния начин: , където: Кλ = специфичната екстинкция при дължина на вълната λ; Еλ = екстинкцията, измерена при дължина на вълната λ; c = концентрация на разтвора, в g/100 ml; s = дебелина на кюветата, в cm. Резултатите се изразяват до две цифри след десетичната запетая.

6.2. Спектрофотометричният анализ на маслиновото масло в съответствие с официалния метод на регламентите на ЕИО указва определянето на специфичната екстинкция в разтвор на изооктан при дължина на вълната от 232 и 270 nm и детерминантата К, която е представена чрез: , където Км е специфичната екстинкция при дължина на вълната m, дължината на вълната за максимална абсорбция около 270 nm.









ДОПЪЛНЕНИЕ I

Приготвяне на диалуминиевия триоксид и изпитване на неговата активност

А.1.1. Приготвяне на диалуминиевия триоксид

Поставя се диалуминиевият триоксид, който е бил предварително изсушен в пещ при 380 до 400 °С, за три часа в херметично затворен контейнер, добавя се дестилирана вода в съотношение 5 ml за 100 g диалуминиев триоксид, веднага се затваря контейнерът, разклаща се непрекъснато, след което се оставя да престои поне 12 часа преди употреба.

А.1.2. Проверка на активността на диалуминиевия триоксид

Подготвя се хроматографска колонка с 30 g диалуминиев триоксид. Като се работи, както е описано в параграф 5.4., се пасира смес, състояща се от:

— 5 % студено пресовано маслиново масло, имащо специфична екстинкция поне 0,18 при 268 nm,

— 5 % масло от млени ядки, третирано с пръст в процеса на рафиниране, имащо специфична екстинкция не по-малка от 4 при 268 nm

през колонката.

Ако след пасиране през колонката сместа има специфична екстинкция от повече от 0,11 при 268 nm, диалуминиевият триоксид се допуска за работа, ако не е — нивото на дехидратация трябва да се увеличи.









ДОПЪЛНЕНИЕ II

Калибриране на спектрофотометъра

А.2. Оборудването трябва да се проверява на периоди (поне на всеки шест месеца) както за отговор към дължината на вълната, така и за точността на отговор.

А.2.1. Дължината на вълната може да се провери при използването на живачна лампа или с помощта на подходящи филтри.

А.2.2. С оглед на проверката на отговора на фотоклетката и фотоумножителя се постъпва по следния начин: претеглят се 0,2000 g чист калиев хромат за спектрофотометрия и се разтваря в 0,05 N разтвор на калиев хидроксид в 1 000 ml градуирана колба като се долива до резката. Вземат се точно 25 ml от получения разтвор, пренасят се в 500 ml градуирана колба и се разреждат до резката като се използва същият разтвор на калиев хидроксид. Измерва се екстинкцията на така получения разтвор при 275 nm, като се използва разтвор на калиев хидроксид като стандарт. Измерената екстинкция при използването на 1 cm кювета трябва да е 0,200 ± 0,005.









ПРИЛОЖЕНИЕ X A

ГАЗОВОХРОМАТОГРАФСКИ АНАЛИЗ НА МЕТИЛОВИТЕ ЕСТЕРИ НА МАСТНИТЕ КИСЕЛИНИ

1. ОБХВАТ

Този метод дава общи насоки за прилагането на газова хроматография, като се използват запълнени или капилярни колонки за определяне на качествения и количествен състав на сместа от метилови естери на мастните киселини, получени в съответствие с метода, указан в приложение X Б.

Методът не е приложим за полимеризирани мастни киселини.

2. РЕАКТИВИ

2.1. Газ носител

Инертен газ (азот, хелий, аргон, водород и т.н.), щателно подсушен и с кислородно съдържание не по-малко от 10 mg/kg.

Бележка 1: Водородът, който се използва само с капилярни колонки, може да удвои скоростта на анализа, но е опасен. Достъпни са средства за безопасност.

2.2. Спомагателни газове

2.2.1. Водород (чистота ≥ 99,9 %), свободен от органични примеси.

2.2.2. Въздух или кислород, свободен от органични примеси.

2.3. Референтен стандарт

Смес от метилови естери на химически чисти мастни киселини или метиловите естери на мазнина с известен състав, за предпочитане по-близък до този на мастното вещество, което ще се анализира.

Трябва да се вземат мерки за предотвратяване на оксидирането на полиненаситените мастни киселини.

3. АПАРАТУРА

Дадените инструкции се отнасят до обикновеното оборудване, използвано за газова хроматография, включващо запълнени и/или капилярни колонки и детектор за пламъчна йонизация. Всеки апарат, показващ ефективността и разделителната способност, указани в 4.1.2., е подходящ.

3.1. Газов хроматограф

Газовият хроматограф се състои от следните елементи.

3.1.1. Система за инжектиране

Използва се система за инжектиране или:

а) със запълни колонки, имащи възможно най-малкото мъртво пространство (в този случай системата за инжектиране трябва да може да се нагрява до температура с 20 до 50 °С по-висока от тази на колонката); или

б) с капилярни колонки, като в този случай системата за инжектиране да е специално проектирана за използване с такива колонки. Тя може да от разделителен тип или може да е от типа без разделяне на колонковия инжектор.

Бележка 2: При отсъствието на мастни киселини с по-малко от 16 въглеродни атома, може да се използва инжектор с подвижна игла.

3.1.2. Пещ

Пещта трябва да е в състояние на нагрява колонката до температура от поне 260 °С и да поддържа желаната температура с точност до 1 °С за запълнена колонка и с точност до 0,1 °С за капилярна колонка. Последното изискване е особено важно, когато се използва епруветка от кварц.

Използването на програмирано температурно нагряване се препоръчва във всички случаи и в частност за мастни киселини с по-малко от 16 въглеродни атома.

3.1.3. Запълнена колонка

3.1.3.1. Колонка, изградена от материал, който е инертен по отношение на веществата, които ще се анализират (т.е. стъкло или неръждаема стомана), имаща следните размери: а) дължина: 1 до 3 m. Когато има наличие на дълговерижни мастни киселини (над С20), следва да се използва относително къса колонка. Когато се анализират киселини с 4 до 6 въглеродни атома, се препоръчва да се използва колонка с дължина 2 m. б) вътрешен диаметър: 2 до 4 mm. Бележка 3: Когато има наличие на полиненаситени съставки с повече от три двойни връзки, те могат да се разградят с колонка от неръждаема стомана. Бележка 4: Може да се използва система с двойни запълнени колонки.

3.1.3.2. Пълнеж, състоящ се от следните елементи: а) абсорбент: промита с киселина и силанизирана инфузорна пръст или друг подходящ инертен абсорбент с тесни разлики в размера на частиците (25 μm разлика в частиците в границите от 125 до 200 μm), като средният размер на частиците се определя от вътрешния диаметър и дължината на колонката; б) неподвижна фаза: полярна течност от полиестерен тип (напр. диетиленгликолов сукцинат, бутандиолов полисукцинат, етиленгликолов полиадипат и т.н.), цианосиликони или друга течност, позволяваща изискваното хроматографско фракциониране (виж клауза 4). Неподвижната фаза трябва да възлиза на 5 до 20 % (m/m) от пълнежа. За определени фракционирания може да се използва неполярна неподвижна фаза.

3.1.3.3. Кондициониране на колонката Докато колонката не е свързана с детектора, ако това е възможно, постепенно се нагрява пещта до 185 °С и се пропуска поток от инертен газ през прясно приготвената колонка с дебит от 20 до 60 ml/min за поне 16 часа при тази температура и за още 2 часа при 195 °С.

3.1.4. Капилярна колонка

3.1.4.1. Тръба, изготвена от материал, инертен към веществата, които ще се анализират (обикновено от стъкло или кварц). Вътрешният диаметър трябва да е между 0,2 и 0,8 mm. Вътрешната повърхност следва да се обработи по подходящ начин (напр. подготовка на повърхността, инактивация), преди да се запълни с покритието от неподвижната фаза. В повечето случаи е достатъчна дължина от 25 mm.

3.1.4.2. Неподвижна фаза, обикновено от типа полигликол (поли(етилен гликол) 20 000), полиестер (бутандиолов полисукцинат) или полярен полисилоксан (цианосиликони). Подходящи са и свързаните (напречносвързани) колонки. Бележка 5: Съществува риск полярните полисилоксани да създадат трудности при разпознаването и фракционирането на линоленовата киселина и С20 киселините. Покритието трябва да е тънко, т.е. 0,1 до 0,2 μm.

3.1.4.3. Сглобяване и кондициониране на колонката Спазват се нормалните мерки за безопасност при сглобяване на капилярните колонки, т.е. подреждането на колонката в пещта (адсорбент), избор и сглобяване на свръзките (плътност за недопускане на изтичане), поставяне на краищата на колонката в инжектора и детектора (намаляване на мъртвите пространства). Поставя се колонката под поток от газ носител (напр. 0,3 bar (30 kPa) за колонка с дължина 25 mm и вътрешен диаметър 0,3 mm). Колонката се кондиционира чрез програмиране на пещта за повишаване на температурата от околната с 3 °С/min до температура с 10 °С по-ниска от границата за разграждане на неподвижната фаза. Поддържа се температурата на пещта за един час до стабилизиране на основната линия. Понижава се до 180 °C за работа при изотермални условия. Бележка 6: Предварително кондиционирани по подходящ начин колонки се предлагат в търговската мрежа.

3.1.5. Детектор, за предпочитане такъв, който да може да се нагрява до температура по-висока от тази на колонката.

3.2. Спринцовка

Спринцовката трябва да има максимална вместимост 10 μl и да е градуирана на деления от 0,1 μl.

3.3. Записващо устройство

Ако ще се използва кривата от записващото устройство за изчисляване на състава на анализираната смес, се изисква електронно записващо устройство с висока прецизност, съвместимо с използвания апарат. Записващото устройство трябва да има следните характеристики:

а) коефициент на отговор под 1,5 sec за предпочитане 1 sec (коефициентът на отговор е времето, необходимо на писеца на записващото устройство да премине от 0 до 90 % след внезапното въвеждане на сигнал от 100 %;

б) ширина на хартията минимум 20 cm;

в) скорост на подаване на хартията, която може да се настройва между 0,4 и 2,5, cm/min.

3.4. Интегратор

С помощта на електронен интегратор могат да се извършват бързи и точни изчисления. Настоящият трябва да дава линеен отговор с адекватна чувствителност, а корекцията на изместването на основната линия трябва да е задоволителна.

4. ХОД НА ОПИТА

Дейностите, описани от 4.1. до 4.3., се отнасят до използването на детектор с пламъчна йонизация.

Като алтернатива може да се използва газов хроматограф, използващ катарометричен детектор (работещ на принципа на промяна в топлинната проводимост). Условията за работа тогава се изменят, както е описано в клауза 6.

4.1. Условия на опита

4.1.1. Избор на оптимални условия на работа 4.1.1.1. Запълнена колонка При избора на условията на работа трябва да се вземат предвид следните променливи величини: а) дължината и диаметъра на колонката; б) естеството и количеството на неподвижната фаза; в) температурата на колонката; г) потока на газа носител; д) изискваната разделителна способност; е) размера на частта от пробата, избран по такъв начин, че свързването на детектора и електрометъра да дава линеен отговор; ж) времетраенето на анализа. Най-общо стойностите, представени в таблица 1 и таблица 2, водят до желаните резултати, т.е. поне 2 000 теоретични плаки за метър дължина на колонката за метилов стеарат и неговото отмиване в рамките на 15 минути. В случаите, когато апаратът позволява, инжекторът трябва да е с температура от около 200 °С, а детекторът — с температура, равна или по-висока от тази на колонката. Като правило отношението на дебита на постъпващия към детектора за пламъчна йонизация водород към този на газа носител варира между 1:2 до 1:1, в зависимост от диаметъра на колонката. Пото