01991R2568 — BG — 04.12.2016 — 031.005

Този текст служи само за информационни цели и няма правно действие. Институциите на Съюза не носят отговорност за неговото съдържание. Автентичните версии на съответните актове, включително техните преамбюли, са версиите, публикувани в Официален вестник на Европейския съюз и налични в EUR-Lex. Тези официални текстове са пряко достъпни чрез връзките, публикувани в настоящия документ

Изменен с





поправен от







(*) Настоящият акт никога не е публикуван на български език.









▼B

РЕГЛАМЕНТ (ЕИО) № 2568/91 НА КОМИСИЯТА

от 11 юли 1991 година

относно характеристиките на маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал и съответните методи за анализ







▼M20

Член 1

1. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точки 1 и 2 от приложение I към настоящия регламент, се считат за необработено маслиново масло virgin по смисъла на точка 1, а) и б) от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

2. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 3 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло за осветление по смисъла на точка 1, в) от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

3. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 4 от приложение I към настоящия регламент се счита за рафинирано маслиново масло по смисъла на точка 2 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

4. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 5 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло съставено от рафинирани маслинови масла и необработени маслинови масла virgin по смисъла на точка 3 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

5. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 6 от приложение I към настоящия регламент се счита за сурово маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 4 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

6. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 7 от приложение I към настоящия регламент се счита за рафинирано маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 5 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

7. Масло, чиито характеристики отговарят на посочените в точка 8 от приложение I към настоящия регламент се счита за маслиново масло от остатъчен материал по смисъла на точка 6 от приложението към Регламент № 136/66/ЕИО.

▼M26

Член 2

1. Характеристиките на маслата, установени в приложение I, се определят в съответствие със следните методи за анализ:

а) за определяне на свободните мастни киселини, изразени като процент олеинова киселина, се използва методът, описан в приложение II;

б) за определяне на пероксидното число се използва методът, описан в приложение III;

в) за определяне на съдържанието на восъци се използва методът, описан в приложение IV;

г) за определяне на компонентния състав и съдържанието на стероли и тритерпенови диалкохоли чрез капилярна газова хроматография се използва методът, описан в приложение V;

д) за определяне на процентното съдържание на 2-глицерилмонопалмитат се използва методът, описан в приложение VII;

е) за извършване на спектрофотометричен анализ се използва методът, описан в приложение IX;

▼M28

ж) за определяне състава на мастните киселини се използва методът, описан в приложение Х;

▼M26

з) за определяне на съдържанието на летливи халогенирани разтворители се използва методът, описан в приложение XI;

и) за оценка на органолептичните характеристики на необработеното маслиново масло се използва методът, описан в приложение XII;

й) за определяне на съдържанието на стигмастадиени се използва методът, описан в приложение ХVII;

к) за определяне на съдържанието на триглицериди с ECN42 се използва методът, описан в приложение XVIII;

▼M28

л) за определяне на съдържанието на алифатни и тритерпенови алкохоли се използва методът, описан в приложение XIX;

▼M26

м) за определяне на съдържанието на восъци, метилови естери на мастни киселини и етилови естери на мастни киселини се използва методът, описан в приложение XX.

▼M28 —————

▼M26

2. Проверката на органолептичните характеристики на необработените масла от страна на националните органи или техни представители се извършва посредством групи от дегустатори, одобрени от държавите членки.

Ако такава група потвърди класифицирането на дадено масло, органолептичните характеристики на маслото, посочени в първа алинея, се приемат за отговарящи на категорията.

Ако групата не потвърди декларираната категория по отношение на органолептичните характеристики, при поискване от заинтересованата страна националните органи или техни представители своевременно организират две насрещни оценки, които се извършват от други одобрени групи дегустатори, като поне една от тези оценки се извършва от одобрена от засегнатата държава членка производител група дегустатори. Ако декларираната категория бъде потвърдена при най-малко две от насрещните оценки, съответните характеристики се приемат за отговарящи на декларираните. При липса на такова потвърждение разходите за насрещните оценки се поемат от заинтересованата страна.

3. Когато националните органи или техни представители извършват проверка на характеристиките на маслото съгласно посоченото в параграф 1, вземането на проби се извършва в съответствие с международните стандарти EN ISO 661 относно подготовката на пробата за изпитване и EN ISO 5555 относно вземането на проби. Независимо от разпоредбите на точка 6.8 от стандарт EN ISO 5555 обаче в случай на партиди от такива масла в директни опаковки пробите се вземат съгласно приложение Ia към настоящия регламент. При наличието на наливни масла, при които вземането на проби не може да се извърши в съответствие със стандарт EN ISO 5555, пробите се вземат в съответствие с инструкциите, предоставени от компетентния орган на държавата членка.

Без да се засягат разпоредбите на стандарт EN ISO 5555 и глава 6 от стандарт EN ISO 661, взетите проби се пренасят възможно най-бързо на тъмно и хладно място и се изпращат за лабораторен анализ не по-късно от петия работен ден след вземането им; в противен случай пробите се съхраняват така, че да се избегне тяхното повреждане или влошаването на състоянието им по време на транспортирането или съхранението, преди да бъдат изпратени в лабораторията.

4. За целите на предвидената в параграф 3 проверка анализите, посочени в приложения II, III, IX, XII и XX, и — когато е приложимо — всички необходими насрещни анализи, изисквани съгласно националното законодателство, се провеждат преди изтичането на срока на минималната трайност, ако тази проверка засяга пакетирани продукти. При вземане на проби от наливни масла анализите се извършват не по-късно от шестия месец след месеца, през който са били взети пробите.

По отношение на другите анализи, предвидени в настоящия регламент, срок не е предвиден.

Освен в случаите, когато пробата е била взета по-малко от два месеца преди изтичането на срока на минималната трайност, ако резултатите от анализите не отговарят на характеристиките на декларираната категория маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал, засегнатата страна бива уведомена не по-късно от един месец преди изтичането на срока, посочен в първа алинея.

5. С оглед определянето на характеристиките на маслиновото масло по методите, предвидени в параграф 1, първа алинея, резултатите от анализа се подлагат на пряко сравнение с пределните стойности, посочени в настоящия регламент.

▼M25

Член 2а

1. За целите на настоящия член „търгувано маслиново масло“ означава общото количество маслиново масло и масло от маслинено кюспе на дадена държава членка, което се консумира в тази държава членка или се изнася от същата държава членка.

2. Държавите членки гарантират, че проверките за съответствие се извършват селективно, въз основа на анализ на риска и с подходяща честота, така че да се гарантира, че търгуваното маслиново масло съответства на декларираната категория.

3. Критериите за оценка на риска могат да включват:

а) категорията на маслото, периода на производство, цената на маслата в сравнение с други растителни масла, операциите по смесване и опаковане, съоръженията и условията за съхранение, държавата на произход, държавата на местоназначение, начина на транспорт или обема на партидата;

б) положението на операторите в търговската верига, търгуваните от тях обеми и/или стойности, асортимента на търгуваните от тях категории масла, вида на извършваната стопанска дейност, като пресоване, складиране, рафиниране, смесване, опаковане или продажба на дребно;

в) констатациите, направени по време на предишни проверки, включително броя и вида на констатираните недостатъци, обичайното качество на търгуваните масла, работните характеристики на използваните технически съоръжения;

г) надеждността на използваните от операторите системи за гарантиране на качеството или за самоконтрол във връзка със спазването на пазарните стандарти;

д) мястото на извършване на проверката, особено ако това е първият входен пункт на Съюза, последният изходен пункт на Съюза или мястото, където маслата се произвеждат, опаковат, товарят или продават на крайния потребител;

е) всяка друга информация, която би могла да покаже, че съществува риск от несъответствие.

4. Държавите членки определят предварително:

а) критериите за оценка на риска от несъответствие на партидите;

б) въз основа на анализ на риска за всяка категория риск — минималния брой на операторите или партидите и/или количествата, които ще бъдат подложени на проверка за съответствие.

Годишно се провежда най-малко една проверка за съответствие на всеки хиляда тона маслиново масло, търгувано в държавата членка.

5. Държавите членки проверят съответствието като:

а) провеждат, независимо в каква последователност, посочените в приложение I анализи; или

б) следват реда, посочен в приложение Iб относно схемата за вземане на решения, докато бъде достигнато едно от решенията, съдържащо се в схемата за вземане на решения.

▼M19 —————

▼M25

Член 3

Когато се установи, че дадено масло не отговаря на описанието за категорията си, съответната държава членка налага, без да се засягат другите санкции, ефективни, пропорционални и възпиращи санкции, които се определят в зависимост от сериозността на установената нередност.

Когато при проверките се откриват значителни нередности, държавите членки увеличават честотата на проверките по отношение на етапа на предлагане на пазара, категорията на маслата, произхода или други критерии.

▼M5

Член 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Когато държавите-членки изпитват затруднения при създаването на групи от дегустатори на тяхната територия, те могат да се обърнат към група от дегустатори, одобрени в друга държава-членка.

3. Всяка държава-членка съставя списък на групите от дегустатори, създадени от професионални или междубраншови организации в съответствие с условията, установени в параграф 1 и гарантира, че тези условия се спазват.

▼M19 —————

▼B

Член 6

1. Масленото съдържание на кюспето и другите остатъчни материали от добиването на маслиново масло (кодове по КН 2306 90 11 и 2306 90 19 ) се определя чрез използване на метода, изложен в приложение XV.

2. Масленото съдържание, посочено в параграф 1, се изразява като процентно съотношение от теглото на маслото към теглото на сухото вещество.

▼M20

Член 7

Разпоредбите на Общността, отнасящи се до наличието на примеси се прилагат:

По отношение на халогенираните разтворители, ограниченията за всички категории маслиново масло са, както следва:

— максималното съдържание на открит халогениран разтворител: 0,1 mg/kg.

— максималното общо съдържание на открити халогенирани разтворители: 0,2 mg/kg.

▼M25

Член 7а

Физическите или юридическите лица и групите от такива лица, които държат маслиново масло и масло от маслинено кюспе за каквито и да било професионални или търговски цели, от етапа на екстракция във фабриката за производство на маслиново масло до етапа на бутилиране включително, са длъжни да водят входящи и изходящи регистри за всяка категория от тези масла.

Държавата членка гарантира, че задължението, установено в първа алинея, надлежно се изпълнява.

▼M25

Член 8

1. Държавите членки уведомяват Комисията за мерките за прилагане на настоящия регламент. Те уведомяват Комисията за всички последващи изменения.

2. Най-късно до 31 май всяка година държавите членки предават на Комисията доклад относно прилагането на настоящия регламент през предходната календарна година. Докладът съдържа най-малко резултатите от проверките за съответствие, извършени по отношение на маслиновите масла съгласно образците, съдържащи се в приложение XXI.

3. Уведомленията, посочени в настоящия регламент, се извършват в съответствие с Регламент (ЕО) № 792/2009 на Комисията ( 1 ).

▼B

Член 9

Регламент (ЕИО) № 1058/77 се отменя.

Член 10

1. Настоящият регламент влиза в сила на третия ден след публикуването му в Официален вестник на Европейските общности.

Въпреки това методът, описан в приложение XII, се прилага от ►M1 1 ноември 1992 г. ◄ , освен за действия, свързани с режима на интервенция.

▼M5

Този метод не се прилага за необработено маслиново масло, подготвено за предлагане на пазара преди 1 ноември 1992 г.

▼B

2. Настоящият регламент не се прилага спрямо маслиновото масло и маслиновото масло от остатъчен материал, опаковани преди неговото влизане в сила и пуснати на пазара до 31 октомври 1992.

Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави-членки.









ПРИЛОЖЕНИЯ

Съдържание

Приложение I: Характеристики на категориите маслиново масло Приложение Iа: Вземане на проби от маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал, доставяни в директни опаковки Приложение Iб: Схема на решенията за проверка на съвместимостта на пробата от маслиново масло с декларираната категория Приложение II: Определяне на свободните мастни киселини, студен метод Приложение III: Определяне на пероксидното число Приложение IV: Определяне на съдържанието на парафини чрез капилярна газова хроматография Приложение V: Определяне на компонентния състав и съдържанието на стероли и на тритерпенови диалкохоли чрез капилярна газова хроматография Приложение VII: ►M21 Определяне на процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат ◄ ▼M20 ————— ▼B Приложение IX: Спектрофотометрично изследване в ултравиолетовия спектър ▼M28 Приложение Х: Определяне на метилови естери на мастни киселини чрез газова хроматография ▼B Приложение XI: Определяне на халоген-съдържащите разтворители на маслиновото масло Приложение XII: Метод за органолептична оценка на необработено маслиново масло на международния съвет за маслиновите продукти (ioc) ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Приложение XV: Маслено съдържание на остатъчния материал Приложение XVI: Определяне стойността на йодното число Приложение ХVII: Метод за определяне на стигмастадиени в растителни масла Приложение XVIII: Определяне на разликата между действителното и теоретичното съдържание на триацилглицерини с ecn 42 Annex XIX: ►M28 Определяне на съдържанието на алифатни и тритерпенови алкохоли чрез капилярна газова хроматография ◄ ▼M23 Приложение ХХ: Метод за установяване на съдържанието на восъци, етилови естери на мастни киселини и метилови естери на мастни киселини посредством капилярна газова хроматография ▼M28 ————— ▼M25 Приложение ХХI: Резултати от проверките за съответствие, извършени по отношение на маслиновите масла, посочени в член 8, параграф 2

▼M31









ПРИЛОЖЕНИЕ I

ХАРАКТЕРИСТИКИ НА КАТЕГОРИИТЕ МАСЛИНОВО МАСЛО

Характеристики на качеството







Категория Киселинност (%) (*) Пероксидно число mEq O2/kg (*) K232 (*) K268 или K270 (*) Делта-K (*) Органолептична оценка Етилови естери на мастни киселини mg/kg (*) Медиана на недостаъците (Md) (*) Медиана на признака „плодов аромат“(Mf) (*) 1. Необработено маслиново масло „Extra virgin“ ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 35 2. Необработено маслиново масло „Virgin“ ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 — 3. Маслиново масло за осветление > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Рафинирано маслиново масло ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — — 5. Маслиново масло, съставено от рафинирано маслиново масло и необработено маслиново масло „Virgin“ ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — — 6. Нерафинирано масло от остатъчен материал — — — — — — — — 7. Рафинирано маслиново масло от остатъчен материал ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — — 8. Маслиново масло от остатъчен материал ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — — (1) Медианата на недостатъците е по-малка или равна на 3,5, когато медианата на признака „плодов аромат“ е равна на 0.

Характеристики за чистота







Категория Съдържание на мастни киселини (1) Общо количество транс-олеинови изомери (%) Общо количество транс-линолови + транс-линоленови изомери (%) Стигмастадиени mg/kg (2) ►C2 Разлика: ECN42 (HPLC) и ECN42 (теоретично изчисление) ◄ 2-глицерил монопалмитат (%) Миристинова (%) Линоленова (%) Арахинова (%) Ейкозенова (%) Бехенова (%) Лигноцеринова (%) 1. Необработено маслиново масло „Extra virgin“ ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C2 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14 % ≤ 1,0 ако сумарният % палмитинова киселина > 14 % 2. Необработено маслиново масло „Virgin“ ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C2 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14 % ≤ 1,0 ако сумарният % палмитинова киселина > 14 % 3. Маслиново масло за осветление ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14 % ≤ 1,1 ако сумарният % палмитинова киселина > 14 % 4. Рафинирано маслиново масло ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14 % ≤ 1,1 ако сумарният % палмитинова киселина > 14 % 5. Маслиново масло, съставено от рафинирано маслиново масло и необработено маслиново масло „Virgin“ ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 ако сумарният % палмитинова киселина ≤ 14 % ≤ 1,0 ако сумарният % палмитинова киселина > 14 % 6. Нерафинирано масло от остатъчен материал ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ►C2 ≤ |0,6| ◄ ≤ 1,4 7. Рафинирано маслиново масло от остатъчен материал ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C2 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,4 8. Маслиново масло от остатъчен материал ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C2 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,2







Категория Компонентен състав на стероли Общо стероли (mg/kg) Еритродиол и уваол (%) (**) Восъци mg/kg (**) Холестерол (%) Брасикастерол (%) Кампестерол (3) (%) Стигмастерол (%) Привиден β–ситостерол (%) (4) Делта-7-стигмастенол (3) (%) 1. Необработено маслиново масло „Extra virgin“ ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Необработено маслиново масло „Virgin“ ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Маслиново масло за осветление ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (5) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (5) 4. Рафинирано маслиново масло ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42+C44 + C46 ≤ 350 5. Маслиново масло, съставено от рафинирано маслиново масло и необработено маслиново масло „Virgin“ ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Нерафинирано масло от остатъчен материал ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (6) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (6) 7. Рафинирано маслиново масло от остатъчен материал ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Маслиново масло от остатъчен материал ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Камп. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350

Забележки:

а) Резултатите от анализите трябва да бъдат изразени с толкова знака след десетичната запетая, с колкото се дава всяка една характеристика. Последната цифра трябва да бъде увеличена с една единица, ако следващата цифра е по-голяма от 4.

б) Ако дори само една характеристика не отговаря на посочените стойности, категорията на маслото може да бъде променена или то да бъде обявено за нечисто за целите на настоящия регламент.

в) Ако дадена характеристика, която се отнася за качеството на маслото, е обозначена със звездичка (*), това означава, че: — за маслиновото масло за осветление — може и двете относими граници да бъдат едновременно различни от посочените стойности; за необработените маслинови масла „Virgin“ — ако поне една от тези граници е различна от посочените стойности, категорията на растителното масло се променя независимо от това, че то все още се класифицира в някоя от категориите необработени маслинови масла „Virgin“.

г) Ако дадена характеристика е обозначена с две звездички (**), това означава, че може двете съответни граници за всички видове маслиново масло от остатъчен материал да бъдат едновременно различни от посочените стойности.









Допълнение

СХЕМА НА РЕШЕНИЯТА

Схема на решенията по отношение на кампестерола за необработено маслиново масло „Virgin“ и необработено маслиново масло „Extra virgin“:

Другите параметри трябва да са в границите, определени в настоящия регламент.

Схема на решенията по отношение на делта-7-стигмастенола за:

— необработено маслиново масло „Extra virgin“ и необработено маслиново масло „Virgin“ —

Другите параметри трябва да са в границите, определени в настоящия регламент.

— маслинови масла от остатъчен материал (нерафинирани и рафинирани) —

▼M26









ПРИЛОЖЕНИЕ Iа

ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО ИЛИ МАСЛИНОВО МАСЛО ОТ ОСТАТЪЧЕН МАТЕРИАЛ, ДОСТАВЯНИ В ДИРЕКТНИ ОПАКОВКИ

Методът за вземане на проби се прилага за партиди маслиново масло или маслиново масло от остатъчен материал в директни опаковки. В зависимост от това, дали директната опаковка надвишава 5 литра или не, се прилагат различни методи за вземане на проби.

„Партида“ означава набор продажни единици, които са произведени, изработени и опаковани в условия, позволяващи маслото, съдържащо се във всяка продажна единица, да бъде считано за хомогенно по отношение на всички аналитични характеристики. Идентифицирането на дадена партида трябва да се извършва в съответствие с Директива 2011/91/ЕС на Европейския парламент и на Съвета ( 8 ).

„Единична проба“ означава количеството масло, съдържащо се в директна опаковка и взето произволно от партидата.

1. СЪДЪРЖАНИЕ НА ПЪРВИЧНАТА ПРОБА

1.1. Директна опаковка, която не надвишава 5 литра

„Първична проба“ за директна опаковка, която не надвишава 5 литра, означава броят на единичните проби, взети от дадена партида и отговарящи на изискванията по таблица 1.







Таблица 1 Изисквания относно максималния размер на първичните проби Когато директната опаковка е с капцитет от Първичната проба трябва да съдържа масло от а) 1 литър или повече а) 1 директна опаковка б) по-малко от 1 литър б) минималния брой опаковки с общ капацитет най-малко 1,0 литър

В зависимост от потребностите си (например органолептична оценка, извършена от лаборатория, различна от тази, която е провела химичните анализи, насрещен анализ и др.) всяка държава членка може да увеличи посочения в таблица 1 брой опаковки, който представлява първична проба.

1.2. Директна опаковка, която надвишава 5 литра

„Първична проба“ за директна опаковка, която надвишава 5 литра, означава представителна част от общия брой единични проби, взети от дадена партида и отговарящи на изискванията по таблица 2. Първичната проба трябва да се състои от различни извадки.

„Извадка“ от първична проба означава всяка една от опаковките, съставляващи първичната проба.







Таблица 2 Минимален брой единични проби, които подлежат на подбор Брой опаковки в партидата Минимален брой единични проби, които подлежат на подбор До 10 1 От … 11 до 150 2 От … 151 до 500 3 От … 501 до 1 500 4 От … 1 501 до 2 500 5 > 2 500 на 1 000 опаковки 1 допълнителна единична проба

С цел да се намали обемът на директните опаковки, използвани при пробите, съдържанието на единичните проби се хомогенизира за приготвяне на първичната проба. Различните единични проби се изсипват в общ контейнер за хомогенизиране чрез разбъркване, така че да се осигури възможно най-добра защита от въздуха.

Съдържанието на първичната проба трябва да се излее в поредица от опаковки с минимален капацитет 1,0 литър, всяка от които представлява извадка от първичната проба.

В зависимост от потребностите си (например органолептична оценка, извършена от лаборатория, различна от тази, която е провела химичните анализи, насрещен анализ и др.) всяка държава членка може да увеличи броя първични проби.

Всяка опаковка трябва да се напълни така, че горният въздушен слой да бъде ограничен до минимум, след което да се затвори и запечата по подходящ начин, гарантиращ, че продуктът е защитен от външна намеса.

Извадките трябва да бъдат етикетирани, за да се гарантира правилното им идентифициране.

2. АНАЛИЗИ И РЕЗУЛТАТИ

2.1. Всяка първична проба трябва да се раздели на лабораторни проби в съответствие с точка 2.5 от стандарт EN ISO 5555 и да се анализира съобразно реда, показан в съдържащата се в приложение Iб схема на решенията, или по всеки друг начин на случаен принцип.

2.2. В случаите, когато всички резултати от анализите отговарят на характеристиките на обявената категория масло, цялата партида се обявява за отговаряща на изискванията.

Ако дори един резултат от анализите не отговаря на характеристиките на обявената категория масло, цялата партида се обявява за неотговаряща на изискванията.

3. ПРОВЕРКА НА КАТЕГОРИЯТА НА ПАРТИДАТА

3.1. С цел да се провери категорията на дадена партида, компетентният орган може да увеличи броя на първичните проби, взети от различни точки на партидата, в съответствие със следната таблица:







Таблица 3 Брой първични проби съгласно размера на партидата Размер на партидата (в литри) Брой първични проби По-малко от 7 500 2 От 7 500 до по-малко от 25 000 3 От 25 000 до по-малко от 75 000 4 От 75 000 до по-малко от 125 000 5 125 000 и повече 6 + 1 за всеки допълнителни 50 000 литра

Всяка единична проба, съставляваща първична проба, трябва да се взема от точно определено място в партидата, без да се прави прекъсване; необходимо е местоположението на всяка първична проба да се записва и да може да се идентифицира безпогрешно.

Съставянето на всяка първична проба трябва да се извършва в съответствие с процедурите, посочени в точки 1.1 и 1.2.

След това всяка първична проба се подлага на анализите, посочени в член 2, параграф 1.

3.2. Когато един от резултатите от посочените в член 2, параграф 1 анализи на поне една първична проба не отговаря на характеристиките на декларираната категория масло, цялата партида, от която е била взета пробата, се обявява за неотговаряща на изискванията.









ПРИЛОЖЕНИЕ Iб

СХЕМА НА РЕШЕНИЯТА ЗА ПРОВЕРКА НА СЪВМЕСТИМОСТТА НА ПРОБАТА ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО С ДЕКЛАРИРАНАТА КАТЕГОРИЯ

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3









Допълнение 1







Таблица на съответствието между приложенията към настоящия регламент и анализите, определени в схемата на решенията — Киселинност Приложение II Определяне на свободните мастни киселини, студен метод — Пероксидно число Приложение III Определяне на пероксидното число — UV-спектрометрия Приложение IX Спектрофотометричен анализ — Органолептична оценка Приложение ХII Органолептична оценка на необработено маслиново масло — Етилови естери Приложение ХХ Метод за определяне на съдържанието на восъци, метилови естери на мастни киселини и етилови естери на мастни киселини чрез капилярна газова хроматография — 3,5-стигмастадиени Приложение ХVII Метод за определяне на стигмастадиени в растителни масла ▼M28 — Транс-изомери на мастните киселини Приложение X Определяне на метилови естери на мастни киселини чрез газова хроматография — Съдържание на мастни киселини Приложение X Определяне на метилови естери на мастни киселини чрез газова хроматография ▼M26 — ΔЕСN42 Приложение ХVIII Определяне на компонентния състав на триглицеридите с ECN42 (разлика между данните от ВЕТХ и теоретичното съдържание) — Компонентен състав и общо съдържание на стероли — Еритродиол и уваол Приложение V Определяне на компонентния състав и съдържанието на стероли и на тритерпенови алкохоли чрез капилярна газова хроматография — Восъци Приложение IV Определяне на съдържанието на парафини чрез капилярна газова хроматография ▼M28 — Алифатни и тритерпенови алкохоли Приложение ХIХ Определяне на съдържанието на алифатни и тритерпенови алкохоли чрез капилярна газова хроматография ▼M26 — Наситени мастни киселини в позиция 2 Приложение VII Определяне на процентното съдържание на 2-глицерилмонопалмитат

▼M29









ПРИЛОЖЕНИЕ II

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СВОБОДНИТЕ МАСТНИ КИСЕЛИНИ, СТУДЕН МЕТОД

1. ОБХВАТ И ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Този метод описва определянето на свободните мастни киселини в маслиновите масла и маслиновите масла от остатъчен материал. Съдържанието на свободни мастни киселини се изразява като киселинност, изчислена като процент олеинова киселина.

2. ПРИНЦИП

Проба се разтваря в смес от разтворители и наличните свободни мастни киселини се титруват, като се използва разтвор на калиев хидроксид или на натриев хидроксид.

3. РЕАКТИВИ

Всички реактиви трябва да са с квалификация „чист за анализ“, а водата, която се използва, трябва да е или дестилирана, или с еквивалентна чистота.

3.1 Диетилов етер; 95 % етанол (v/v), смес от равни обемни части. Неутрализира се точно в момента на употреба с разтвора на калиев хидроксид (3.2), с добавяне на 0,3 ml от разтвора на фенолфталеин (3.3) на 100 ml от сместа. Забележка 1: диетиловият етер е лесно запалим и може да образува експлозивни пероксиди. Трябва да се работи със специално внимание при употребата му. Забележка 2: ако не е възможно да се използва диетилов етер, може да се използва смес от разтворители, съдържаща етанол и толуен. Ако е необходимо, етанолът може да се замести с пропан-2-ол.

3.2 Калиев хидроксид или натриев хидроксид, титруван етанолов или воден разтвор, c(KOH) [или c(NaOH)] около 0,1 mol/l или, ако е необходимо, c(KOH) [или c(NaOH)] около 0,5 mol/l. Разтвори могат да се доставят от търговската мрежа. Точната концентрация на разтвора на калиев хидроксид (или на разтвора на натриев хидроксид) трябва да е известна и да се провери преди употреба. Използва се разтвор, приготвен поне пет дни преди употреба и декантиран в бутилка от кафяво стъкло с гумена запушалка. Разтворът трябва да е безцветен или със сламен цвят. Ако при използването на воден разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид) се наблюдава разделяне на фази, водният разтвор се заменя с етанолов разтвор. Забележка 3: стабилизиран безцветен разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид) може да се приготви по следния начин. Довеждат се до кипене 1 000 ml етанол или вода с 8 g калиев хидроксид (или натриев хидроксид) и 0,5 g алуминиеви стружки и кипенето се поддържа с обратен хладник в продължение на един час. Дестилира се незабавно. Изискваното количество калиев хидроксид (или натриев хидроксид) се разтваря в дестилата. Оставя се за няколко дни и бистрата супернатантна течност се декантира от утайката от калиев карбонат (или натриев карбонат). Разтворът може също така да се приготви и без дестилация по следния начин: към 1 000 ml етанол (или вода) се добавят 4 ml алуминиев бутилат и сместа се оставя за няколко дни. Декантира се супернатантната течност и се разтваря нужното количество калиев хидроксид (или натриев хидроксид). Разтворът е готов за употреба.

3.3 Фенолфталеин, разтвор от 10 g/l в 95 до 96 % етанол (v/v) или алкалиблау 6B, или тимолфталеин, разтвор от 20 g/l в 95 до 96 % етанол (v/v). В случай на силно оцветени масла следва да се използва алкалиблау или тимолфталеин.

4. АПАРАТУРА

Обикновено лабораторно оборудване, включващо:

4.1 Аналитична везна;

4.2 250 ml конусовидна колба;

4.3 10 ml бюрета клас A, градуирана през 0,05 ml, или еквивалентна автоматична бюрета.

5. ПРОЦЕДУРА

5.1 Подготовка на пробата за изпитване

Ако пробата е мътна, тя следва да се филтрува.

5.2 Маса на пробата

Пробата се взема в зависимост от очакваната киселинност, в съответствие със следната таблица:







Очаквана киселинност (киселинност, изразена като олеинова киселина g/100 g) Маса на пробата (g) Точност на претегляне (g) от 0 до 2 10 0,02 > 2 до 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Пробата се претегля в конусовидната колба (4.2).

5.3 Определяне

Пробата (5.2) се разтваря в 50 до 100 ml от предварително неутрализираната смес от диетилов етер и етанол (3.1).

Титрува се, като се разклаща, с 0,1 mol/l разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид) (3.2) (вж. забележка 4) до промяна в индикатора (цветът на оцветения индикатор се задържа в продължение на най-малко 10 секунди).

Забележка 4: ако изискваното количеството от 0,1 mol/l разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид) надвишава 10 ml, се използва 0,5 mol/l разтвор или се променя масата на пробата, в съответствие с очакваното съдържание на свободни киселини и предложената таблица.

Забележка 5: ако разтворът помътнее по време на титруването, се добавя достатъчно количество от разтворителите (3.1) до получаването на бистър разтвор.

Второ определяне се извършва само ако първият резултат е по-висок от определената граница за категорията на маслото.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Киселинността в тегловни проценти олеинова киселина е равна на:

където:

V = обемът на използвания титруван разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид), в милилитри;

c = точната концентрация на използвания титруван разтвор на калиев хидроксид (или на натриев хидроксид), в mol/l;

M = 282 g/mol, моларната маса на олеиновата киселина, в g/mol;

m = масата на пробата, в грамове.

Киселинността, изразена като олеинова киселина, се протоколира, както следва:

а) до втория знак след десетичната запетая за стойности от 0 до 1 включително;

б) до първия знак след десетичната запетая за стойности над 1 до 100 включително.

▼M30









ПРИЛОЖЕНИЕ III

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПЕРОКСИДНОТО ЧИСЛО

1. Обхват

В настоящото приложение се описва метод за определяне на пероксидното число на животинските и растителните масла и мазнини.

2. Определение

Пероксидното число е количеството на онези вещества в пробата, изразени в милиеквиваленти активен кислород на килограм, които окисляват калиевия йодид при описаните работни условия.

3. Принцип

Обработка на пробата за анализ в разтвор на оцетна киселина и хлороформ с разтвор на калиев йодид. Титруване на отделения йод със стандартизиран разтвор на натриев тиосулфат.

4. Апаратура

Цялото използвано оборудване трябва да е свободно от редуциращи и окисляващи вещества.

Забележка 1: Шлифованите повърхности не бива да се омазняват.

4.1. Стъклена лопатка с вместимост 3 ml.

4.2. Колби с шлифовани гърла и запушалки, с вместимост от около 250 ml, предварително изсушени и запълнени с чист сух инертен газ (азот или за предпочитане въглероден диоксид).

4.3. Бюрета с вместимост 5 ml, 10 ml или 25 ml, градуирана най-малко през 0,05 ml, за предпочитане с автоматично нулиране, или еквивалентна автоматична бюрета.

4.4. Аналитична везна.

5. Реактиви

5.1. Хлороформ, с качество за аналитични цели, освободен от кислород чрез прокарване на поток от чист сух инертен газ през него.

5.2. Ледена оцетна киселина, с качество за аналитични цели, освободена от кислород чрез прокарване на поток от чист сух инертен газ през нея.

5.3. Калиев йодид, наситен воден разтвор, прясно приготвен, свободен от йод и йодати. Разтварят се около 14 g калиев йодид в около 10 ml вода при стайна температура.

5.4. Натриев тиосулфат, 0,01 mol/l прецизно стандартизиран воден разтвор (еквивалентен на 0,01 N), стандартизиран непосредствено преди употреба.

Пресният разтвор на 0,01 mol/l натриев тиосулфат се приготвя ежедневно преди употреба от 0,1 mol/l стандартен разтвор на натриев тиосулфат или се определя точната моларна концентрация. Както показва опитът, стабилността е ограничена и зависи от стойността на pH и от съдържанието на свободен въглероден диоксид. За разреждане се използва само прясно преварена вода, евентуално пречистена с азот.

За определяне на точната моларна концентрация на разтвора на натриев тиосулфат се препоръчва следната процедура:

В градуирана колба (250 ml или 500 ml) се претеглят с точност до 0,001 g 0,27—0,33 g калиев йодат (mKIO3) и се разреждат до пълния обем с прясно преварена вода (V2), охладена до стайна температура. С пипета се прехвърлят 5 ml или 10 ml от този разтвор на калиев йодат (V1) в ерленмайерова колба с вместимост 250 ml. Добавят се 60 ml прясно преварена вода, 5 ml солна киселина 4 mol/l и 25—50 mg калиев йодид или 0,5 ml от наситения разтвор на калиев йодид. Този разтвор се титрува с разтвора на натриев тиосулфат (V3), за да се определи точната моларна концентрация на разтвора на натриев тиосулфат.

където:

mKIO3 е масата на калиевия йодат в g

V1 е обемът на разтвора на калиев йодат в ml (5 ml или 10 ml)

V2 е общият обем на разтвора на калиев йодат в ml (250 ml или 500 ml)

V3 е обемът на разтвора на натриев тиосулфат в ml

wKIO3 е чистотата на калиевия йодат в g/100 g

MKIO3 е молекулната маса на калиевия йодат (214 g/mol)

T е точната моларна концентрация на разтвора на натриев тиосулфат (mol/l).

5.5. Разтвор на скорбяла, 10 g/l водна дисперсия, прясно приготвен от естествена разтворима скорбяла. Могат да се използват и еквивалентни реактиви.

6. Проба

Пробата следва да се вземе и съхранява далеч от светлина, на студено и в изцяло запълнени стъклени съдове, херметично запечатани със запушалки от шлифовано стъкло или корк.

7. Процедура

Изпитването се провежда при разсеяна дневна светлина или при изкуствено осветление. В стъклена лопатка (4.1), или ако това е невъзможно — в колба (4.2), се претегля с точност до 0,001 g проба с маса съгласно следната таблица, в зависимост от очакваното пероксидно число:







Очаквано пероксидно число (meq) Маса на пробата за анализ (g) от 0 до 12 от 5,0 до 2,0 от 12 до 20 от 2,0 до 1,2 от 20 до 30 от 1,2 до 0,8 от 30 до 50 от 0,8 до 0,5 от 50 до 90 от 0,5 до 0,3

Отпушва се една колба (4.2) и в нея се поставя стъклената лопатка, съдържаща пробата за анализ. Добавят се 10 ml хлороформ (5.1). Пробата за анализ се разтваря бързо чрез разбъркване. Добавят се 15 ml оцетна киселина (5.2) и след това — 1 ml разтвор на калиев йодид (5.3). Поставя се бързо запушалката, разклаща се в продължение на една минута и се оставя в покой за точно пет минути, без достъп на светлина, при температура от 15 до 25 °C.

Добавят се около 75 ml дестилирана вода. Титрува се отделеният йод с разтвора на натриев тиосулфат (5.4), като се разклаща енергично, а за индикатор служи разтворът на скорбяла (5.5).

На една и съща проба за изпитване се правят две определяния.

Едновременно се провежда изпитване с празна проба. Ако резултатът от празната проба надхвърля 0,05 ml от разтвора на натриев тиосулфат 0,01 N (5.4), замърсените реактиви се подменят.

8. Изразяване на резултатите

Пероксидното число (ПЧ), изразено в милиеквиваленти активен кислород на килограм, се получава по следната формула:

където:

V = броят милилитри от стандартизирания разтвор на натриев тиосулфат (5.4), използван при изпитването, коригиран в зависимост от резултатите от празната проба.

T = точната моларна концентрация на използвания разтвор на натриев тиосулфат (5.4) в mol/l.

m = масата на пробата за анализ в g.

Като резултат се взема средноаритметичната стойност от двете извършени определяния.

Резултатът от определянето се протоколира с точност до един десетичен знак.

▼M21









ПРИЛОЖЕНИЕ IV

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ПАРАФИНИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1. ПРЕДМЕТ

Този метод описва способ за определяне на съдържанието на парафини в маслиново масло. Парафините се анализират съобразно броя въглеродни атоми. Методът може да се използва по-специално за диференциране на маслиновото масло, получено чрез пресоване, от това, което е получено чрез екстракция (маслиново масло от остатъчен материал).

2. ПРИНЦИП

Мастното вещество, към което е добавен подходящ вътрешен стандарт, се фракционира чрез хроматография върху колонка от хидратиран силикагел; снема се фракцията, която първа се елуира в опитните условия (при полярност, по-ниска от тази на триглицеридите), след което се анализира директно чрез капилярна газова хроматография.

3. ОБОРУДВАНЕ

3.1. Ерленмайерова колба от 25 ml.

3.2. Стъклена колонка за газова хроматография с вътрешен диаметър 15 mm, височина 30 до 40 cm, оборудвана с кранче.

3.3. Апарат за газова хроматография, приспособен за функциониране с капилярна колонка, оборудван със система за директно въвеждане в колонката, състояща се от: 3.3.1. Термостатна камера за колонките, оборудвана с температурен програматор. 3.3.2. Инжектор за студено пускане — за директно вкарване в колонката. 3.3.3. Пламъчно-йонизационен детектор и усилвателен преобразувател. 3.3.4. Записващ интегратор, пригоден за работа с усилвателен преобразувател (3.3.3), с време на отговор под 1 секунда и променлива скорост на подаване на хартията. (Възможно е да се използват и информационни системи, които позволяват компютризирано събиране на данните от газовата хроматография.) 3.3.5. Капилярна колонка от стъкло или кварц, с дължина от 8 до 12 m, вътрешен диаметър от 0,25 до 0,32 mm, покрита отвътре със стационарна фаза, с еднородна дебелина между 0,10 и 0,30 μm. (Стационарни фази от тип SE-52 или SE-54, годни за употреба, се намират в търговската мрежа.)

3.4. Микроспринцовка с вместимост 10 μl, за директно подаване в колонката, снабдена със закалена игла.

3.5. Електровибратор.

3.6. Ротационен изпарител.

3.7. Муфелна пещ.

3.8. Аналитични везни, гарантиращи точност на измерване до ± 0,1 mg.

3.9. Обикновена лабораторна стъклария.

4. РЕАКТИВИ

4.1. Силикагел с гранулометричен състав между 60 и 200 μm. Силикагелът трябва да престои в пещ при 500 °C в продължение на минимум 4 часа. След охлаждане добавете към него вода, равна на 2 % от снетото количество силикагел. Разбъркайте добре, за да хомогенизирате сместа. Оставете я на тъмно в продължение на минимум 12 часа преди употреба.

4.2. n-хексан за хроматография.

4.3. Етилов етер за хроматография.

4.4. n-хептан за хроматография.

4.5. Стандартен разтвор на лауринов арахидат — 0,1 % (m/v) в хексан (вътрешен стандарт). (Възможно е да се използва и цетилов палмитат или миристилов стеарат.) 4.5.1. Судан 1 (1-фенил-азо-2-нафтол).

4.6. Газ носител: чист водород или хелий, за газова хроматография.

4.7. Спомагателни газове: — чист водород за газова хроматография; — чист въздух за газова хроматография.

5. РАБОТЕН РЕЖИМ

5.1. Подготовка на хроматографската колонка

Потопете 15 g силикагел (4.1) в n-хексан (4.2) и го поставете в колонката (3.2). Компенсирайте бързата седиментация с помощта на електрическа бъркалка (3.5), за да направите хроматографския пласт по-хомогенен. Перколирайте 30 ml n-хексан, за да отстраните евентуалните примеси. Претеглете с помощта на везните (3.8) точно 500 mg от пробата в ерленмайеровата колба с вместимост 25 ml (3.1), добавете нужното количество вътрешен стандарт (4.5), в зависимост от предполагаемото съдържание на парафини. Например, когато се касае за маслиново масло, добавете 0,1 mg лауринов арахидат, а когато става въпрос за маслиново масло от остатъчен материал — 0,25 до 0,5 mg. Прехвърлете така приготвената проба в хроматографската колонка с помощта на две дози n-хексан, всяка по 2 ml (4.2).

Оставете разтворителя да изтече, така че да достигне на 1 mm от горното ниво на абсорбента, след което перколирайте допълнително 70 ml n-хексан, за да отстраните естествено наличните n-алкани. После започнете хроматографското елуиране, събирайки 180 ml от сместа n-хексан/етилов етер, в съотношение 99:1, като поддържате дебит от около 15 капки на 10 секунди. Елуирането на пробата трябва да се извърши при стайна температура 22 ± 4 °C.

Бележки:

— Сместа n-хексан/етилов етер (99:1) трябва да се приготвя всеки ден.

— За да контролирате визуално правилното елуиране на парафините, възможно е да добавите към разтворената проба 100 μl судан (1 %) в елуираната смес. Тъй като оцветителят е с междинно време на задържане спрямо парафините и триглицеридите, уместно е елуирането да се прекрати тогава, когато оцветяването достигне дъното на хроматографската колонка, тъй като на този етап всички парафини са елуирани.

Изсушете така получената фракция в ротационен изпарител (3.6) до практически пълното отстраняване на разтворителя. Последните 2 ml от разтворителя се отстраняват с помощта на слаб азотен поток; след това добавете 2-4 ml n-хептан.

5.2. Анализ чрез газова хроматография

5.2.1. Предварителни операции

Поставете колонката в газовия хроматограф (3.3), свързвайки входния извод към системата on-column, а изходния — към детектора. Извършете основните проверки на апаратурата за газова хроматография (здравина на газовите контури, ефективност на детектора и на записващата система и т. н.).

Ако колонката се използва за първи път, се препоръчва да пристъпите към кондиционирането ѝ. Прокарайте през колонката малко газ, след което включете апаратурата за газова хроматография. Нагрейте постепенно до достигане, след около 4 часа, на температура 350 °C. Поддържайте тази температура в продължение на минимум 2 часа, след което пристъпете към настройката на апаратурата към условията на работа (настройка на газовия поток, запалване на пламъка, включване към електронното записващо устройство (3.3.4), настройка на температурата на камерата за колонката, на детектора и т. н.) и настройте сигнала на чувствителност поне 2 пъти по-висока от предвидената за провеждане на анализа. Ходът на основната линия трябва да бъде линеен, без пикове от каквото и да е естество, и не трябва да показва отклонения.

Отрицателното праволинейно отклонение е показател за неизправни връзки на колонката; положителното отклонение е показател за недостатъчно кондициониране на колонката.

5.2.2. Избор на работните условия

Общо взето, работните условия, които следва да се спазват, са следните:

— температура на колонката: —



20 °C/минута 5 °C/минута 20 °C/минута в началото 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′),

— температура на детектора: 350 °C,

— количество инжектирано вещество: 1 μl от разтвора (2—4 ml) n-хептан,

— газ носител: хелий или водород с оптимална линейна скорост за съответния газ (виж допълнението),

— инструментална чувствителност: в състояние да удовлетвори посочените по-долу условия:

Тези условия могат да варират в зависимост от характеристиките на колонката и на газовия хроматограф по такъв начин, че да се постигне анализиране на всички парафини, задоволителна разделителна способност на пиковете (виж фигурата); времето на задържане на вътрешния стандарт C32 следва да бъде 18 ± 3 минути. Най-изразеният пик на парафините следва да се намира на минимум 60 % височина от основата на скалата.

Параметрите на интегриране на пиковете следва да се определят по начин, който позволява правилно изчисление на лицата на пиковете, взети под внимание.

Бележка. Като се има предвид високата крайна температура, се допуска положително отклонение, което не бива да надвишава 10 % височина от основата на скалата.

5.3. Провеждане на анализа

С помощта на микроспринцовка с вместимост 10 μl вземете 1 μl от разтвора; издърпайте буталото на спринцовката, така че иглата да остане празна. Вкарайте иглата в инжекционния прибор и след 1—2 секунди бързо инжектирайте разтвора; след около 5 секунди бавно извадете иглата.

Проведете запис на анализа до пълното елуиране на парафините.

Основната линия следва винаги да отговаря на необходимите условия.

5.4. Идентифициране на пиковете

Идентифицирането на различните пикове следва да се извършва въз основа на времената на задържане и в сравнение със смеси от парафини с познати времена на задържане, анализирани при същите условия.

Фигурата представя хроматограма на парафините в необработено маслиново масло.

5.5. Количествено изчисление

С помощта на интегратора пристъпете към изчислението на лицата на пиковете на вътрешния стандарт и на алифатните естери от C40 до C46.

Изчислете съдържанието на парафин във всеки един от естерите, в mg/kg мастно вещество, по формулата:

където:

Ax = лице на пика на всеки естер, в квадратни милиметри;

As = лице на пика на вътрешния стандарт, в квадратни милиметри;

ms = добавена маса на вътрешния стандарт, в милиграми;

m = маса на пробата, взета за анализ, в грамове.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Отбележете сумата на съдържанията на отделните парафини от C40 до C46, в mg/kg мастно вещество (ppm).

Забележка. Компонентите, които трябва да се определят, се отнасят до пиковете с четно въглеродно число между естерите C40 и C46, съгласно примера на хроматограмата на парафините в маслиновото масло, посочена на фигурата по-долу. Ако естерът C46 се появи двойно, се препоръчва за идентифицирането му да се анализира фракцията на парафините в маслиново масло от остатъчен материал, където пикът C46 се идентифицира лесно, тъй като е най-изразеният.

Резултатите се дават с точност до една десета.

Фигура

Хроматограма на парафините в маслиново масло ( 9 )

Легенда:

I.S. = лауринов арахидат;

1 = дитерпенови естери;

2 + 2′ = естери C40;

3 + 3′ = естери C42;

4 + 4′ = естери C44;

5 = естери C46;

6 = стеролови естери и тритерпенови алкохоли.









Допълнение

Определяне на линейната скорост на газа

Инжектирайте от 1 до 3 μl метан (или пропан) в газовия хроматограф след настройката му към нормални условия на работа. Засечете с хронометър времето, необходимо на газа да премине през колонката, от момента на инжектирането му до момента, в който пикът се очертае (tM).

Линейната скорост, в cm/s, се изчислява по формулата L/tM, където L е дължината на колонката в сантиметри, а tM е засеченото време в секунди.

▼M26









ПРИЛОЖЕНИЕ V

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КОМПОНЕНТНИЯ СЪСТАВ И СЪДЪРЖАНИЕТО НА СТЕРОЛИ И НА ТРИТЕРПЕНОВИ ДИАЛКОХОЛИ ЧРЕЗ КАПИЛЯРНА ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1. ОБХВАТ

Методът описва процедура за определяне на отделното и общото съдържание на стероли и тритерпенови диалкохоли в маслиновите масла и маслиновите масла от остатъчен материал.

2. ПРИНЦИП

Маслото, към което е добавен α-холестанол като вътрешен стандарт, се осапунява с етанолов разтвор на калиев хидроксид, след което неосапуняемите съставки се екстрахират с помощта на етилов етер.

Фракцията на стеролите и на тритерпеновите диалкохоли се отделя от неосапуняемите съставки чрез тънкослойна хроматография на основна плака със силикагел. Фракциите, възстановени от силикагела, се преобразуват в триметилсилилови етери, след което се анализират чрез капилярна газова хроматография.

3. ОБОРУДВАНЕ

Стандартно лабораторно оборудване, включващо по-конкретно следното:

3.1. Колба с вместимост 250 ml с обратен хладник със стъклен шлиф.

3.2. Делителна фуния с вместимост 500 ml.

3.3. Колби с вместимост 250 ml.

3.4. Пълен набор за анализ чрез тънкослойна хроматография с използване на стъклени плаки с размер 20 × 20 cm.

3.5. Ултравиолетова лампа с дължина на вълната 254 или 366 nm.

3.6. Микроспринцовки с вместимост 100 μl и 500 μl.

3.7. Цилиндрична фуния за филтруване, подходяща за филтруване под вакуум, с порьозна преграда G3 (порьозност 15—40 μm), диаметър приблизително 2 cm, височина 5 cm и мъжка муфа с шлиф.

3.8. Конусовидна колба с вместимост 50 ml и женска муфа с шлиф, която може да се монтира към фунията за филтруване (точка 3.7).

3.9. Епруветка с вместимост 10 ml с конично дъно и стъклена тапа.

3.10. Газов хроматограф, подходящ за използване с капилярна колона, снабдена с инжекционна система за разделяне, който се състои от:

3.10.1. Термостатична камера за колони с възможност за поддържане на желаната температура с точност до ± 1 °С;

3.10.2. Инжектор с възможност за настройка на температурата с изпарителен елемент от персиланизирано стъкло и със система за разделяне.

3.10.3. Пламъчно-йонизационен детектор (ПЙД).

3.10.4. Система за добив на данни, подходяща за употреба с ПЙД (точка 3.10.3.), с възможност за ръчно въвеждане.

3.11. Капилярна колона от стопен кварц с дължина 20—30 m и вътрешен диаметър 0,25—0,32 mm, покрита с 5 % дифенил — 95 % диметилполисилоксан (неподвижна фаза с SE-52 или SE-54 или еквивалентна) до постигането на еднородна дебелина между 0,10 и 0,30 μm.

3.12. Микроспринцовка за газова хроматография с вместимост 10 μl и циментирана игла, подходяща за инжектиране с разделяне.

3.13. Десикатор за калциев дихлорид.

4. РЕАГЕНТИ

4.1. Калиев хидроксид с минимален титър 85 %.

4.2. Етанолов разтвор на калиев хидроксид — приблизително 2 N.

130 g калиев хидроксид (точка 4.1) се разтваря с охлаждане в 200 ml дестилирана вода и се долива до един литър с етанол (точка 4.10). Разтворът се съхранява в плътно затворени бутилки от тъмно стъкло за не повече от два дни.

4.3. Етилов етер с чистота за анализ.

4.4. Етанолов разтвор на калиев хидроксид — приблизително 0,2 N.

13 g калиев хидроксид (точка 4.1) се разтваря в 20 ml дестилирана вода и се долива до един литър с етанол (точка 4.10).

4.5. Безводен натриев сулфат с чистота за анализ.

4.6. Стъклени плаки (20 × 20 cm), покрити със силикагел, без флуоресцентен индикатор и с дебелина 0,25 mm (могат да се доставят от търговската мрежа готови за употреба).

4.7. Толуен с чистота за хроматографски анализ.

4.8. Ацетон с чистота за хроматографски анализ.

4.9. n-Хексан с чистота за хроматографски анализ.

4.10. Етилов етер с чистота за хроматографски анализ.

4.11. Етанол с чистота за анализ.

4.12. Етилацетат с чистота за анализ.

4.13. Референтен разтвор за тънкослойна хроматография: холестерол или фитостероли плюс 5 % разтвор на еритродиол в етилацетат (точка 4.11).

4.14. 0,2 % разтвор на 2,7-дихлорофлуоресцеин в етанол. Той се подлага на слаба алкализация чрез добавяне на няколко капки 2 N алкохолен разтвор на калиев хидроксид (точка 4.2).

4.15. Безводен пиридин с чистота за хроматографски анализ (вж. бележка 5).

4.16. Хексаметилдисилазан с чистота за анализ.

4.17. Триметилхлоросилан с чистота за анализ.

4.18. Разтвори на проби от триметилсилилови етери.

Те се приготвят в момента на употреба от стероли и еритродиол, получени от масла, в които се съдържат.

4.19. α-Холестанол с чистота над 99 % (чистотата трябва да бъде проверена чрез газова хроматография).

4.20. Вътрешен стандартен разтвор на α-холестанол, 0,2 % разтвор (m/V) в етилацетат (точка 4.11).

4.21. Разтвор на фенолфталеин, 10 g/l в етанол (точка 4.10).

4.22. Газ носител: водород или хелий, пречистени за газова хроматография.

4.23. Помощни газове: водород, хелий, азот и въздух, пречистени за газова хроматография.

4.24. Смес от n-хексан (точка 4.9)/етилов етер (точка 4.10) в съотношение 65:35 (V/V).

4.25. Реагент за силилиране, състоящ се от смес от пиридин/ хексаметилдисилазан/ триметилхлоросилан в съотношение 9:3:1 (V/V/V).

5. ПРОЦЕДУРА

5.1. Приготвяне на неосапуняемите съставки. 5.1.1. С помощта на микроспринцовка с вместимост 500 μl (точка 3.6) в колба с вместимост 250 ml (точка 3.1) се въвежда обем вътрешен стандартен разтвор на α-холестанол (точка 4.20), чието съдържание на холестанол съответства на приблизително 10 % от съдържанието на стероли в пробата. Така например за мостра маслиново масло с маса 5 g се прибавят 500 μl разтвор на α-холестанол (точка 4.20) и 1 500 μl, ако маслиновото масло е от остатъчен материал. Мострата се подлага на изпарение до изсъхване на топла водна баня със слаба струя азот; след охлаждане на колбата в нея се претеглят 5 ± 0,01 g от сухата филтрувана проба. Бележка 1: Животинските или растителните масла, съдържащи значителни количества холестерол, могат да отбележат пик с време на задържане, подобно на това при холестанола. В този случай стероловата фракция се подлага на двукратен анализ — с вътрешен стандарт и без него. 5.1.2. Добавят се 50 ml 2 N етанолов разтвор на калиев хидроксид (точка 4.2) и малко пемза, поставя се обратният хладник и се нагрява до слабо кипене, докато се извърши осапуняването (разтворът се избистря). Нагряването продължава още 20 минути, след което през върха на хладника се прибавят 50 ml дестилирана вода, хладникът се отделя и колбата се охлажда до приблизително 30 °C. 5.1.3. Съдържанието на колбата се прехвърля количествено в делителна фуния с вместимост 500 ml (точка 3.2), като се използват няколко части дестилирана вода (50 ml). Добавят се приблизително 80 ml етилов етер (точка 4.10) и делителната фуния се разклаща енергично в продължение на около 60 секунди, като налягането се освобождава периодично чрез нейното обръщане и отваряне на спирателния кран. Изчаква се до получаването на пълно разделяне на две фази (бележка 2). След това сапуненият разтвор се отлива възможно най-изчерпателно в отделна делителна фуния. По същия начин се извършват още две екстракции на фазата на водно-алкохолна смес, като всеки път се използват 60 до 70 ml етилов етер (точка 4.10). Бележка 2: Всяка емулсия може да бъде разрушена с прибавяне на малки количества етанол (точка 4.11). 5.1.4. Трите етерни екстракта се смесват в делителна фуния, съдържаща 50 ml вода. Промиването с вода (50 ml) продължава, докато промивната вода престане да се оцветява в розово при добавянето на капка разтвор на фенолфталеин (точка 4.21). След отстраняване на промивната вода се филтрува безводен натриев сулфат (точка 4.5) в предварително претеглена колба с вместимост 250 ml, като фунията и филтърът се промиват с малки количества етилов етер (точка 4.10). 5.1.5. Разтворителят се изпарява под вакуум чрез дестилация в ротационен изпарител при температура 30 °C. Добавят се 5 ml ацетон и летливият разтворител се отстранява напълно посредством лека въздушна струя. Остатъкът се изсушава в пещ при температура 103 ± 2 °C в продължение на 15 минути. След това се охлажда в десикатори и се претегля с точност до 0,1 mg.

5.2. Отделяне на фракцията на стеролите и тритерпеновите диалкохоли (еритродиол + уваол) 5.2.1. Подготовка на основните плаки за тънкослойна хроматография. Плаките със силикагел (точка 4.6) се потапят на 4 cm в 0,2 N етанолов разтвор на калиев хидроксид (точка 4.5) за 10 секунди, след което се оставят да изсъхнат в лабораторна камина за два часа и накрая се поставят в пещ при 100 °C за един час. Изваждат се от пещта и се съхраняват в десикатор за калциев хлорид (точка 3.13) до момента на употреба (така обработените плаки трябва да се използват в рамките на 15 дни). Бележка 3: Когато за отделяне на стероловата фракция се използват основни плаки със силикагел, не е необходимо неосапуняемата фракция да се обработва с диалуминиев триоксид. По този начин всички съединения с киселинни свойства (мастни киселини и други) се задържат в точката на накапване и ивицата на стеролите се отделя ясно от ивицата на алифатните и тритерпеновите алкохоли. 5.2.2. В проявителната камера се налива до дълбочина около 1 cm смес от хексан и етилов етер (точка 4.24) (бележка 4). Камерата се затваря с подходящ капак и се оставя най-малко за половин час на хладно, така че да се установи равновесие между течността и парите. Към вътрешните повърхности на камерата могат да се прикрепят ивици от филтърна хартия, потопени в елуента. Това намалява времето за проявяване с приблизително една трета и осигурява по-равномерно и правилно елуиране на съставките. Бележка 4: Необходимо е проявителната смес да се подменя за всяко изпитване, за да се получат напълно възпроизводими условия за елуиране; допуска се употребата на алтернативен разтворител 50:50 (V/V) n-хексан/етилов етер. 5.2.3. Приготвя се приблизително 5 % разтвор на неосапуняемите съставки (точка 5.1.5) в етилацетат (точка 4.12) и с помощта на микроспринцовка с вместимост 100 μl 0,3 ml от разтвора се нанасят на тънка и равномерна ивица върху долния край (2 cm) на хроматографската плака (точка 5.2.1). На същото равнище като ивицата се накапват 2 до 3 μl от референтния разтвор (точка 4.13.), така че ивицата на стеролите и тритерпеновите диалкохоли да може да бъде разпозната след проявяването. 5.2.4. Плаката се поставя в проявителната камера, приготвена съгласно изискванията в точка 5.2.2. Околната температура се поддържа между 15 и 20 °C (бележка 5). Камерата се затваря веднага с капака и се оставя за елуиране, докато фронтът на разтворителя достигне приблизително 1 cm от горния ръб на плаката. След това плаката се изважда от проявителната камера и разтворителят се изпарява под струя горещ въздух или като плаката се остави за кратко време под камина. Бележка 5: По-високата температура може да влоши разделянето. 5.2.5. Плаката се напръсква леко и равномерно с разтвора на 2,7-дихлорофлуоресцеин (точка 4.14), след което се оставя да изсъхне. Когато плаката се наблюдава под ултравиолетова светлина, ивиците на стеролите и тритерпеновите диалкохоли могат да се разпознаят, като се изравнят с петната, получени от референтния разтвор (точка 4.13). Границите на ивиците се очертават с черен молив по краищата на флуоресценцията (вж. фигура 3 относно плаките за тънкослойна хроматография). 5.2.6. Силикагелът в очертаните участъци се изтърква с помощта на метална шпатула. Отделеният надробен материал от силикагел се поставя във фунията за филтруване (точка 3.7). Прибавят се 10 ml горещ етилов ацетат (точка 4.12), разбърква се добре с металната шпатула и се филтрува под вакуум, като филтратът се събира в конусовидната колба (точка 3.8.), свързана с фунията за филтруване. Утайката от фунията се промива три пъти с етилов етер (точка 4.3) (приблизително 10 ml всеки път) и филтратът се събира в същата колба, свързана с фунията; филтратът се изпарява до обем 4—5 ml и остатъчният разтвор се прехвърля в епруветка с вместимост 10 ml (точка 3.9.), която е била претеглена предварително; изпарява се до изсъхване чрез слабо подгряване под слаба струя азот; утайката се разтваря отново с няколко капки ацетон (точка 4.8), след което отново се изпарява до изсъхване. Остатъкът в епруветката трябва да се състои от фракциите на стеролите и на тритерпеновите диалкохоли.

5.3. Приготвяне на триметилсилиловите етери. 5.3.1. В епруветката, съдържаща фракцията на стеролите и тритерпена, се добавя реагентът за силилиране (точка 4.25) (бележка 6) в съотношение 50 μl за всеки милиграм стероли и тритерпенови диалкохоли, като се избягва проникването на влага (бележка 7). Бележка 6: Готови за употреба разтвори могат да се доставят от търговската мрежа. Могат да се доставят и други реагенти за силилиране, като например бистриметилсилилтрифлуороацетамид + 1 % триметилхлоросилан, който трябва да се разреди със същия обем безводен пиридин. Пиридинът може да се замени със същото количество ацетонитрил. 5.3.2. Епруветката се затваря и внимателно се разклаща (без да се преобръща) до пълно разтваряне на съставките. Оставя се за да престои най-малко 15 минути при стайна температура, след което се центрофугира в продължение на няколко минути. Бистрият разтвор е готов за анализ чрез газова хроматография. Бележка 7: Слабата опалесценция, която може да се получи, е нормална и не причинява аномалии. Формирането на бял флокулат или появата на розово оцветяване е знак за наличието на влага или за увреждането на реагента. Ако това се случи, анализът трябва да бъде повторен (само ако се използва хексаметилдисилазан/ триметилхлоросилан).

5.4. Анализ чрез газова хроматография 5.4.1. Предварителни операции, кондициониране на капилярната колона. 5.4.1.1. Колоната (точка 3.11) се монтира в газовия хроматограф чрез свързване на входния край с инжектора с разделяне и на изходния край — с детектора. Извършва се обща проверка на газовохроматографския агрегат (течове от газовите вериги, ефикасност на детектора, ефикасност на разделителната система и на записващата система и т.н.). 5.4.1.2. Ако колоната се използва за първи път, се препоръчва тя да бъде кондиционирана: през нея се прокарва слаба струя газ, след което се включва газовохроматографският агрегат и се започва постепенно нагряване до достигането на температура от поне 20 °C над температурата за експлоатация (бележка 8). Тази температура се поддържа в продължение на най-малко два часа, след което целият агрегат се привежда в работен режим (настройка на газовата струя и разделяне, възпламеняване на пламъка, свързване с изчислителната система, настройване на температурата на колоната, детектора и инжектора и т.н.) и след това се записва сигналът с поне два пъти по-висока чувствителност от тази, която ще се използва при анализа. Ходът на базовата линия трябва да е прав, без пикове от какъвто и да било вид и без измествания. Отрицателното праволинейно изместване е показател за изтичане от свръзките на колоната, а положителното изместване — за нейното неподходящо кондициониране. Бележка 8: Температурата на кондициониране трябва винаги да е поне с 20 °C по-ниска от максималната температура, определена за използваната неподвижна фаза. 5.4.2. Избор на условия за работа 5.4.2.1. Условията за работа са следните: — температура на колоната: 260 ± 5 °C, — температура на инжектора: 280—300 °C, — температура на детектора: 280—300 °C, — линейна скорост на газа носител: хелий — 20 до 30 cm/s, водород — 30 до 50 cm/s, — коефициент на разделяне: 1:50 до 1:100, — чувствителност на инструмента: 4 до 16 пъти минималното намаляване, — чувствителност на записване: 1 до 2 mV от пълната скала, — количество на инжектираното вещество: 0,5 до 1 μl от разтвора на триметилсилилови етери. Тези условия могат да се изменят в зависимост от характеристиките на колоната и на газовия хроматограф с цел да се получат хроматограми, отговарящи на следните изисквания: — времето на задържане на β-ситостерола трябва да е 20 ± 5 минути, — пикът на кампестерола трябва да е, както следва: за маслиновото масло (средно съдържание 3 %) — 20 ± 5 % от пълната скала, за соевото масло (средно съдържание 20 %) — 80 ± 10 % от пълната скала, — всички налични стероли трябва да са разделени. В добавка към изискването за разделяне на пиковете те трябва да бъдат напълно отделени един от друг, т.е. следата на всеки пик трябва да се върне напълно до основата, преди да се издигне за следващия пик. Допуска се обаче непълно отделяне, при условие че пикът при RRT 1,02 (ситостанол) може да се изрази количествено чрез използването на перпендикуляр. 5.4.3. Провеждане на анализа 5.4.3.1. С помощта на микроспринцовката с вместимост 10 μl се изтегля 1 μl хексан, въвежда се 0,5 μl въздух и впоследствие — 0,5 до 1 μl от разтвора на пробата. Буталото на спринцовката се изтегля, за да се изпразни иглата. Иглата се въвежда през мембраната на инжектора и след една до две секунди разтворът се инжектира бързо, като иглата се изважда бавно след приблизително пет секунди. Също така може да се използва автоматичен инжектор. 5.4.3.2. Записването продължава до пълното елуиране на триметилсилиловите етери на наличните тритерпенови диалкохоли. Базовата линия трябва да продължи да отговаря на изискванията (точка 5.4.1.2). 5.4.4. Идентифициране на пиковете Идентифицирането на отделните пикове се извършва съгласно времената на задържане и чрез сравнение със сместа от стероли и триметилсилилови етери на тритерпеновите диалкохоли, анализирани при същите условия (вж. допълнението). Стеролите и тритерпеновите диалкохоли се елуират в следния ред: холестерол, брасикастерол, ергостерол, 24-метиленхолестерол, кампестерол, кампестанол, стигмастерол, Δ7-кампестерол, Δ5,23-стигмастадиенол, клеростерол, β-ситостерол, ситостанол, Δ5-авенастерол, Δ5,24-стигмастадиенол, Δ7-стигмастенол, Δ7-авенастерол, еритродиол и уваол. Времената на задържане за ß-ситостерол за колони SE-52 и SE-54 са посочени в таблица 1. Типичните хроматограми за някои масла са показани на фигури 1 и 2. 5.4.5. Количествена оценка. 5.4.5.1. С помощта на изчислителната система се намира площта на пиковете на α-холестанола и на стеролите и тритерпеновите диалкохоли. Пиковете за всички съединения, които не са включени (ергостеролът не трябва да се изчислява) в таблица 1, не се вземат под внимание. Корекционният фактор за α-холестанола се приема за равен на 1. 5.4.5.2. Концентрацията на всеки отделен стерол, изразена в mg/kg мастно вещество, се изчислява по следния начин: където: Ax = площта на пика на стерол x в единиците, използвани от изчислителната система, As = площта на пика на α-холестанола в единиците, използвани от изчислителната система, ms = масата на добавения α-холестанол в милиграми, m = масата на използваната за определянето проба в грамове.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1. Индивидуалните концентрации на стеролите се докладват в mg/kg мастно вещество, а сборът им — като общо количество на стеролите.

Компонентният състав на всеки отделен стерол, както и на еритродиола и уваола, се изразяват до един знак след десетичната запетая.

Общият компонентен състав на стеролите трябва да бъде изразен без десетична запетая.

▼M28

6.2. Изчислява се процентното съдържание на всеки отделен стерол чрез съотношението на площта на относимия пик спрямо общата площ на пиковете на стеролите:

където:

Ax = площта на пика на х;

ΣА = общата площ на пиковете на стеролите.

▼M26

6.3. Привиден β-ситостерол: Δ5,23-стигмастадиенол + клеростерол + β-ситостерол + ситостанол + Δ5-авенастерол + Δ5,24-стигмастадиенол.

6.4. Изчислява се процентът на еритродиола и уваола:

където:

ΣА = общата площ на пиковете на стеролите в единиците, използвани от изчислителната система,

ER = площта на пика на еритродиола в единиците, използвани от изчислителната система,

Uv = площта на пика на уваола в единиците, използвани от изчислителната система.









Допълнение

Определяне на линейната скорост на газа

В газовия хроматограф, настроен на нормални условия за работа, се инжектират 1 до 3 μl метан (или пропан) и се измерва времето, необходимо за преминаване на метана (или пропана) през колоната от момента на инжектиране до появата на пика (tM).

Линейната скорост на газа в cm/s е представена чрез L/tM, където L е дължината на колоната в сантиметри, а tM е измереното време в секунди.







Таблица 1 Относително време на задържане на стеролите Пик Идентификация Относително време на задържане SE 54 колона SE 52 колона 1 холестерол Δ5-холестен-3ß-ол 0,67 0,63 2 холестанол 5α-холестан-3ß-ол 0,68 0,64 3 брасикастерол [24S]-24-метил-Δ5,22-холестадиен-3ß-ол 0,73 0,71 * ергостерол [24S]-24 метил-D5,7,22-холестатриен-3β-ол 0,78 0,76 4 24-метиленхолестерол 24-метилен-Δ5,24-холестадиен-3ß-ол 0,82 0,80 5 кампестерол (24R)-24-метил-Δ5-холестен-3ß-ол 0,83 0,81 6 кампестанол (24R)-24-метилхолестан-3ß-ол 0,85 0,82 7 Стигмастерол (24S)-24-етил-Δ5,22-холестадиен-3ß-ол 0,88 0,87 8 Δ7-кампестерол (24R)-24-метил-Δ7-холестен-3ß-ол 0,93 0,92 9 Δ5,23-стигмастадиенол (24R,S)-24-етил-Δ5,23-холестадиен-3ß-ол 0,95 0,95 10 клеростерол (24S)-24-етил-Δ5,25-холестадиен-3ß-ол 0,96 0,96 11 ß-ситостерол (24R)-24-етил-Δ5-холестен-3ß-ол 1,00 1,00 12 ситостанол 24-етилхолестан-3ß-ол 1,02 1,02 13 Δ5-авенастерол (24Z)-24-етилиден-Δ-холестен-3ß-ол 1,03 1,03 14 Δ5,24-стигмастадиенол (24R,S)-24-етил-Δ5,24-холестадиен-3ß-ол 1,08 1,08 15 Δ7-стигмастенол (24R,S)-24-етил-Δ7-холестен-3ß-ол 1,12 1,12 16 Δ7-авенастерол (24Z)-24-етилиден-Δ7-холестен-3ß-ол 1,16 1,16 17 еритродиол 5α-олеан-12-ен-3β28-диол 1,41 1,41 18 уваол Δ12-урсен-3β28-диол 1,52 1,52

Фигура 1

Газова хроматограма на фракцията на стеролите и тритерпеновите диалкохоли на маслиново масло за осветление (с добавен вътрешен стандарт)

Фигура 2

Газова хроматограма на фракцията на стеролите и тритерпеновите диалкохоли на рафинирано маслиново масло (с добавен вътрешен стандарт)

Фигура 3

Плака за тънкослойна хроматография на маслиново масло от остатъчен материал с участъка, който трябва да бъде изтъркан с оглед определянето на стеролите и тритерпеновите диалкохоли

1 – сквален

2 – тритерпенови и алифатни алкохоли

3 – стероли и тритерпенови диалкохоли

4 – начало и свободни мастни киселини.

▼M26 —————

▼M21









ПРИЛОЖЕНИЕ VII

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПРОЦЕНТНОТО СЪДЪРЖАНИЕ НА 2-ГЛИЦЕРИЛ МОНОПАЛМИТАТ

1. ПРЕДМЕТ И СФЕРА НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Този метод описва аналитичната процедура за определяне на процентното съдържание на палмитинова киселина в позиция 2 на триглицеридите посредством анализа на 2-глицерил монопалмитат.

Методът е приложим за течни растителни масла при стайна температура (20 °C).

2. ПРИНЦИП

След подготовката ѝ маслената проба се подлага на въздействието на панкреатична липаза: частична хидролиза, специфична за позиции 1 и 3 на молекулата на триглицерида, води до появата на моноглицериди в позиция 2. Процентното съдържание на 2-глицерил монопалмитат в моноглицеридната фракция се определя, след силилация, посредством капилярна газова хроматография.

3. АПАРАТУРА И ЛАБОРАТОРНО ОБОРУДВАНЕ

3.1. Ерленмайерова колба от 25 ml.

3.2. Бехерови чаши от 100, 250 и 300 ml.

3.3. Стъклена колонка за хроматография, с вътрешен диаметър 21—23 mm, дължина 400 mm, оборудвана с диск с поресто дъно и кранче.

3.4. Градуирани епруветки от 10, 50, 100 и 200 ml.

3.5. Колби с вместимост 100 и 250 ml.

3.6. Ротационен изпарител.

3.7. Центрофужни епруветки с конично дъно, с вместимост 10 ml, с шлифована запушалка.

3.8. Центрофуга за епруветки от 10 и 100 ml.

3.9. Термостат, който позволява поддържане на постоянна температура от 40 °C ± 0,5 °C.

3.10. Калибровани пипети от 1 и 2 ml.

3.11. Хиподермична спринцовка от 1 ml.

3.12. Микроспринцовка от 100 μl.

3.13. Фуния от 1 000 ml.

3.14. Газов хроматограф за капилярни колонки, оборудван със система за студено инжектиране „on column“, за директно вкарване на пробата в колонката и с пещ, която е в състояние да поддържа желаната температура с точност до 1 °C.

3.15. Инжектор за студено пускане „on column“ за директно вкарване на пробата в колонката.

3.16. Пламъчно-йонизационен детектор и електрометър.

3.17. Записващ интегратор, адаптиран към електрометъра, с време на отговор под 1 секунда и променлива скорост на подаване на хартията.

3.18. Капилярна колонка от стъкло или кварц, с дължина 8—12 метра, с вътрешен диаметър от 0,25 до 0,32 mm, с покритие от метилполисилоксан или фенил метилполисилоксан 5 %, с дебелина 0,10—0,30 μm, която може да се използва при 370 °C.

3.19. Микроспринцовка с вместимост 10 μl, снабдена със закалена игла, с минимална дължина 7,5 cm, за директно инжектиране върху колонката.

4. РЕАКТИВИ

4.1. Силикагел с гранулометричен състав между 0,063 и 0,200 mm (70/280 mesh), приготвен по следния начин: поставете силикагела в порцеланова капсула, изсушете в пещ при 160 °C в продължение на 4 часа, след което оставете да се охлади на стайна температура в ексикатор. Добавете обем вода, равен на 5 % от теглото на силикагела, като процедирате по следния начин: в ерленмайерова колба от 500 ml претеглете 152 g силикагел и добавете 8 g дестилирана вода, запушете с тапа и разклатете внимателно до равномерно разпределяне на водата. Оставете да престои минимум 12 часа преди употреба.

4.2. n-хексан (за хроматография).

4.3. Изопропанол.

4.4. Воден разтвор на изопропанол, в обемно съотношение 1/1.

4.5. Панкреатична липаза. Използваната липаза трябва да има активност между 2,0 и 10 липазни единици/mg. (В търговската мрежа се предлагат панкреатични липази с активност между 2 и 10 единици на милиграм ензим.)

4.6. Буферен разтвор: 1 M воден разтвор на трисхидрокси-метиламинометан, доведен до pH 8 (проверява се с потенциометър), чрез добавяне на концентрирана солна киселина (1/1 v/v).

4.7. Натриев холат с ензимно качество — воден разтвор 0,1 % (разтворът трябва да се използва до 15 дни след приготвянето му).

4.8. Калциев хлорид, воден разтвор 22 %.

4.9. Диетилов етер за хроматография.

4.10. Проявяващ разтворител: смес n-хексан/диетилов етер (87/13) (v/v).

4.11. Натриев хидроокис, разтвор 12 тегловни процента.

4.12. Разтвор в етилов алкохол на 1 % фенолфталеин.

4.13. Газ носител: водород или хелий, за газова хроматография.

4.14. Спомагателни газове: водород, минимум 99 %, свободен от влага и органични примеси, и въздух, за газова хроматография, със същата чистота.

4.15. Реактив за силанизация: смес пиридин(хексаметилдисилазан) триметилхлоросилан 9/3/1 (v/v/v). (В търговската мрежа се предлагат готови за употреба разтвори. Могат да се използват други реактиви за силилация като бис-триметилсилил трифлуорацетамид + 1 % триметилхлоросилан, разреден със същия обем безводен пиридин.)

4.16. Сравнителни проби: чисти моноглицериди или смеси от моноглицериди с известен състав на процентното съдържание, подобен на този на пробата.

5. ПРОЦЕДУРА

5.1. Подготовка на пробата

5.1.1. Маслото със свободна киселинност под 3 % не се нуждае от неутрализация преди хроматографията върху колонката със силикагел. Маслото със свободна киселинност над 3 % трябва да се подложи на неутрализация, както е описано в точка 5.1.1.1. 5.1.1.1. Във фунията с вместимост 1 000 ml (3.13) налейте 50 g масло и 200 ml n-хексан. Добавете 100 ml изопропанол и такова количество от разтвора на натриевия хидроокис 12 % (4.11), което съответства на свободната киселинност на маслото плюс добавка от 5 %. Разклатете енергично в продължение на една минута. Добавете 100 ml дестилирана вода, разбъркайте отново и оставете в покой. След декантирането отстранете долния слой от сапуни. Отстранете евентуалните междинни слоеве (клей и неразтворими вещества). Промийте хексановия разтвор от неутрализираната киселина с последователни дози от по 50—60 ml от разтвора изопропанол/вода 1/1 (v/v) (4.4) до изчезване на розовото оцветяване на фенолфталеина. Отстранете по-голямата част от хексана чрез дестилация под вакуум (използвайте например ротационен изпарител) и прехвърлете маслото в колба от 100 ml (3.5). Изсушете маслото под вакуум до пълното отстраняване на разтворителя. В края на тази операция киселинността на маслото трябва да бъде под 0,5 %.

5.1.2. Поставете 1,0 g масло, приготвено по горепосочения начин, в ерленмайерова колба от 25 ml (3.1) и разтворете в 10 ml проявяваща смес (4.10). Оставете разтвора да престои в продължение на минимум 15 минути преди хроматографията върху колонка със силикагел. Ако разтворът е мътен, го центрофугирайте, за да гарантирате оптимални условия за хроматография. (Могат да се използват готови за употреба патрони силикагел SPE от 500 mg.)

5.1.3. Подготовка на хроматографската колонка Сипете в колонката (3.3) около 30 ml от проявяващия разтвор (4.10), поставете парче памук в долната част на колонката с помощта на стъклена пръчица; натиснете, за да отстраните въздуха. В бехерова чаша пригответе суспензия от 25 g силикагел (4.1) в около 80 ml проявяващ разтвор и я сипете в колонката с помощта на фуния. Проверете дали цялото количество силикагел е постъпило в колонката; промийте с проявяващия разтвор (4.10), отворете кранчето и оставете нивото на течността да стигне до около 2 mm над горното ниво на силикагела.

5.1.4. Хроматография върху колонка В ерленмайерова колба от 25 ml (3.1) претеглете точно 1,0 g от пробата, приготвена по описания в точка 5.1 начин. Разтворете пробата в 10 ml проявяващ разтвор (4.10). Сипете разтвора, приготвен по указанията в точка 5.1.3, в хроматографската колонка. Избягвайте движението на повърхността на колонката. Отворете кранчето и оставете разтвора на пробата да изтече, докато достигне нивото на силикагела. Проявете със 150 ml проявяващ разтвор. Регулирайте дебита на 2 ml/min (така че 150 ml да изтекат в колонката за около 60—70 минути). Съберете елуата в предварително претеглена колба с вместимост 250 ml. Изпарете разтворителя под вакуум и отстранете последните следи от него под азотен поток. Претеглете колбата и изчислете събрания екстракт. (В случай че използвате готови за употреба SPE патрони от силикагел, процедирайте по следния начин: поставете 1 ml разтвор (5.1.2) в предварително приготвените с 3 ml n-хексан патрони.) След перколация на разтвора проявете с 4 ml n-хексан/диетилов етер 9/1 (v/v). Съберете елуата в епруветка от 10 ml и го подложете на изпарение под азотен поток до изсъхване. Подложете сухия остатък на въздействие на панкреатична липаза (5.2). От основно значение е да проверите съдържанието на мастни киселини преди и след преминаването върху SPE патрона).

5.2. Хидролиза с панкреатична липаза

5.2.1. В центрофужна епруветка претеглете 0,1 g масло, приготвено съгласно точка 5.1. Добавете 2 ml буферен разтвор (4.6), 0,5 ml разтвор на натриев холат (4.7) и 0,2 ml разтвор на калциев хлорид, като разклащате добре след всяко добавяне. Затворете епруветката с шлифованата запушалка и я поставете в термостата при 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Добавете 20 mg липаза, разклатете старателно (като внимавате да не намокрите запушалката) и поставете епруветката в термостата за точно 2 минути, след което я извадете, разклатете енергично в продължение точно на 1 минута и оставете да се охлади.

5.2.3. Добавете 1 ml диетилов етер, запушете с тапата и разклатете енергично, след което центрофугирайте и прехвърлете етеровия разтвор в чиста и суха епруветка с помощта на микроспринцовка.

5.3. Подготовка на силанизираните деривати и на газовата хроматография

5.3.1. С помощта на микроспринцовка поставете 100 μl разтвор (5.2.3) в епруветка с конично дъно от 10 ml.

5.3.2. Отстранете разтворителя под слаб азотен поток, добавете 200 μl реактив за силанизация (4.15), запушете епруветката и оставете да престои 20 минути.

5.3.3. След 20 минути добавете от 1 до 5 ml n-хексан (в зависимост от хроматографските условия): полученият разтвор е готов за газова хроматография.

5.4. Газова хроматография

Условията на работа са следните:

— температура на инжектора (инжектор „on column“): под температурата на кипене на разтворителя (68 °C);

— температура на детектора: 350 °C;

— температура на колонката: програмиране на температурата на пещта: 60 °C в продължение на 1 минута, увеличавайки с 15 °C на минута до 180 °C, след това с 5 °C на минута до 340 °C, после се поддържа температура от 340 °C в продължение на 13 минути;

— газ носител: водород или хелий, настроен на адекватната линейна скорост с оглед постигане на разделителната способност, отразена във фигура 1. Времето на задържане на триглицерид C54 трябва да бъде 40 + 5 минути (виж фигура 2) (Условията на работа, посочени по-горе, се дават с указателна цел. Всеки оператор следва да ги оптимизира до постигане на желаната разделителна способност. Височината на пика, съответстващ на 2-глицерил монопалмитат, трябва да има минимална величина, равна на 10 % от скалата на записващото устройство.);

— количество инжектирано вещество: 0,5—1 μl от разтвора (5 ml) n-хексан (5.3.3).

5.4.1. Идентифициране на пиковете

Идентифицирането на индивидуалните моноглицериди се извършва в съответствие с получените времена на задържане и в сравнение със стандартните смеси моноглицериди, анализирани при същите условия.

5.4.2. Количествена преценка

Лицето на всеки пик се изчислява с помощта на електронен интегратор.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Процентното съдържание на глицерил монопалмитат се изчислява от съотношението между лицето на съответния пик и сбора от лицата на пиковете на всички моноглицериди (виж фигура 2) по формулата:

Глицерил монопалмитат (%):

,

където:

Ax = лицето на пика, съответстващ на глицерил монопалмитат;

ΣА = сборът от лицата на всички пикове на моноглицеридите.

Резултатът се дава с точност до една десета.

7. ПРОТОКОЛ ОТ АНАЛИЗА

Протоколът от анализа следва да посочва:

— позоваването на този метод,

— всяка информация, необходима за пълното идентифициране на пробата,

— резултата от анализа,

— всяко отклонение от този метод, било то по решение на заинтересованите страни или по друга причина,

— идентификационните данни на лабораторията, датата на анализа и подписа на отговорните лица по неговото провеждане.

Фигура 1

Хроматограма на продуктите от реакцията на силанизация, получени чрез действието на липазата върху рафинирано маслиново масло, към което е добавено 20 % естерифицирано масло (100 %)

Легенда: „acides gras libres“ = свободни мастни киселини; „Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée“ = рафинирано маслиново масло + 20 % естерифицирано масло; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 монопалмитолеин; „1-2 mono C18 insat.“ = 1-2 моно C18 ненаситени; „squalene“ = скуален

Фигура 2

Хроматограма на:

A) неестерифицирано маслиново масло, след липаза; след силанизация; в тези условия (капилярна колонка 8—12 m) парафиновата фракция се елуира едновременно с диглицеридната фракция или малко след това. След липаза съдържанието на триглицериди не би следвало да надвишава 15 %. Легенда: 1 = Свободни мастни киселини 2 = Моноглицериди 3 = Диглицериди 4 = Триглицериди * = 2-монопалмитин ** = Триглицерид C54

Хроматограма на:

Б) естерифицирано масло след липаза; след силанизация; в тези условия (капилярна колонка 8—12 m), парафиновата фракция се елуира едновременно с диглицеридната фракция или малко след това. След липаза съдържанието на триглицериди не би следвало да надвишава 15 %. Легенда: 1 = Свободни мастни киселини 2 = Моноглицериди 3 = Диглицериди 4 = Триглицериди * = 2-монопалмитин ** = Триглицерид C54

8. БЕЛЕЖКИ

ПРИГОТВЯНЕ НА ЛИПАЗАТА

В търговската мрежа се предлагат липази със задоволителна липазна активност. Възможно е и да бъдат приготвени лабораторно по следния начин:

Охладете до 0 °C 5 kg пресен свински панкреас. Отстранете околните твърда мазнина и съединителна тъкан и раздробете добре в ножова мелница до получаване на гладка кремообразна смес. Разбъркайте в продължение на 4 до 6 часа с 2,5 литра безводен ацетон, след което центрофугирайте. Екстрахирайте утайката още три пъти със същото количество безводен ацетон, след това два пъти със смес от равни части ацетон и диетилов етер и два пъти с диетилов етер.

Изсушете остатъка под вакуум за 48 часа до получаването на устойчив прах, който трябва да се съхранява в хладилник и на сухо.

ПРОВЕРЯВАНЕ НА АКТИВНОСТТА НА ЛИПАЗАТА

Пригответе емулсия от маслиново масло, както следва:

Разбъркайте в смесител в продължение на 10 минути смес от 165 ml от разтвор на гуми арабика при 100 g/l, 15 g натрошен лед и 20 ml предварително неутрализирано маслиново масло.

Сипете последователно в бехерова чаша с вместимост 50 ml 10 ml от тази емулсия, а след това 0,3 ml разтвор на натриев холат при 0,2 g/ml и 20 ml дестилирана вода.

Поставете бехеровата чаша в термостат, настроен на 37 °C; потопете електродите на pH метъра и спиралната бъркалка.

Прибавете, капка по капка, с помощта на бюрета, разтвор на натриев хидроокис (0,1 N), докато pH достигне 8,3.

Добавете един обем водна суспензия на липазен прах (0,1 g/ml липаза). Веднага щом pH метърът покаже pH 8,3, включете хронометъра и добавете разтвора на натриевия хидроокис, капка по капка, така че да се поддържа pH от 8,3. Отчитайте всяка минута обема на консумирания разтвор.

Нанесете данните в координатна система, чиято абсциса съответства на времето, а ординатата ѝ — на милилитрите алкален разтвор (0,1 N), нужни за поддържането на постоянно pH. Трябва да се получи линейна графика.

Активността на липазата, измерена в липазни единици/mg, се изчислява по следната формула:

където:

A — е активността в липазни единици/mg;

V — използваният обем на разтвор на натриев хидроокис — 0,1 N за минута, в милилитри (изчислен по графиката);

N — нормалността на разтвора на натриев хидроокис;

m — масата в mg на опитната липаза.

Единица липаза се дефинира като количеството ензим, което отделя 10 микроеквивалента киселина в минута.

▼M20 —————

▼M28









ПРИЛОЖЕНИЕ IХ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ В УЛТРАВИОЛЕТОВИЯ СПЕКТЪР

ПРЕДИСЛОВИЕ

Спектрофотометричното изследване в ултравиолетовия спектър може да осигури информация за качеството на дадена мазнина, състоянието ѝ на запазеност и промените, настъпили в нея при технологичните процеси. Абсорбцията при дължините на вълните, упоменати в метода, е вследствие на системи от конюгирани диени и триени, проявяващи се в резултат на процеси на окисляване и/или практики на рафиниране. Тези абсорбции са изразени като специфични екстинкции

(екстинкцията на 1 % разтвор (w/v) на мазнината в упоменатия разтворител, в кювета 10 mm), обикновено обозначавани като К (наричан още „коефициент на екстинкция“).

1. ОБХВАТ

Настоящото приложение описва процедурата за извършване на спектрофотометрично изследване на маслиново масло в ултравиолетовия спектър.

2. ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Проба се разтваря в нужния разтворител и абсорбцията на разтвора се определя при определени дължини на вълната срещу чистия разтворител.

Изчисляват се специфичните екстинкции при 232 nm и 268 nm в изооктан или при 232 nm и 270 nm в циклохексан за концентрация от 1 % w/v в кювета 10 mm.

3. ОБОРУДВАНЕ

3.1. Спектрофотометър, подходящ за извършване на измервания при ултравиолетови дължини на вълната (от 220 nm до 360 nm), с възможност за отчитане на отделните нанометрични единици. Препоръчва се редовна проверка на точността и възпроизводимостта на абсорбцията и скалите за дължина на вълната, както и за разсеяна светлина. 3.1.1. Скала за дължина на вълната: Тя може да се провери с помощта на референтен материал, състоящ се от филтър от оптично стъкло, съдържащ холмиев оксид или разтвор на холмиев оксид (запечатан или не), който има ясно разграничени абсорбционни ивици. Референтните материали са предназначени за проверка и калибриране на скалите за дължина на вълната на спектрофотометри във видимата и ултравиолетовата област с номинални ширини на спектралната ивица 5 nm или по-малко. Измерванията се извършват спрямо празна проба въздух в диапазона от дължини на вълната от 640 до 240 nm, според указанията, приложени към референтните материали. Извършва се корекция на базисната линия с празна траектория на лъча при всяка промяна на ширината на процепа. Дължините на вълната на стандарта са изброени в сертификата на референтния материал. 3.1.2. Скала за абсорбция: Тя може да се провери, като се използват налични в търговската мрежа запечатани референтни материали, състоящи се от подкислени разтвори на калиев дихромат, при някои концентрации и сертифицирани стойности на абсорбция при неговото λmax (от 4 разтвора на калиев дихромат в перхлорна киселина, запечатани в четири ултравиолетови кварцови кювети за измерване на линейността и референтната фотометрична точност в ултравиолетовата област). Разтворите на калиев дихромат се измерват спрямо празна проба на използваната киселина, след корекция на базисната линия, съгласно указанията, приложени към референтния материал. Стойностите на абсорбция са изброени в сертификата на референтния материал. С оглед на проверката на отклика на фотоклетката и фотоумножителя може да се постъпи и по следния начин: претеглят се 0,2000 g чист калиев хромат за спектрофотометрия и се разтварят в 0,05 N разтвор на калиев хидроксид в 1 000 ml градуирана колба като се долива до резката. Вземат се точно 25 ml от получения разтвор, пренасят се в 500 ml градуирана колба и се разреждат до резката като се използва същият разтвор на калиев хидроксид. Измерва се екстинкцията на така получения разтвор при 275 nm, като се използва разтворът на калиев хидроксид като референтен. Измерената екстинкция при използването на 1 cm кювета трябва да е 0,200 ± 0,005.

3.2. Кварцови кювети с правоъгълно сечение, с капачки, подходящи за измервания на дължини на вълната в ултравиолетовия спектър (220 до 360 nm), с оптичен път от 10 mm. Когато се напълнят с вода или друг подходящ разтворител, кюветите не трябва да показват помежду си разлики по-големи от 0,01 екстинкционни единици.

3.3. Мерителни колби с резка с обем 25 ml, клас А.

3.4. Аналитична везна, която позволява отчитане с точност до 0,0001 g.

4. РЕАКТИВИ

По време на анализа, освен ако е посочено друго, се използват само реактиви, признати като „чисти за анализ“, и дестилирана или деминерализирана вода, или вода с еквивалентна степен на чистота.

Разтворител: изооктан (2,2,4-триметилпентан) за измерването при 232 nm и 268 nm и циклохексан за измерването при 232 nm и 270 nm, с абсорбция по-малка от 0,12 при 232 nm и по-малка от 0,05 при 270 nm спрямо дестилирана вода, измерена в кювета 10 mm.

5. ПРОЦЕДУРА

5.1. Пробата трябва да е напълно хомогенна и без суспендирани онечиствания. В противен случай тя трябва да се филтрува през хартия при температура приблизително 30 °С.

5.2. Измерват се прецизно приблизително 0,25 g (с точност до 1 mg) от така подготвената проба в 25-милилитрова градуирана колба, долива се от определения разтворител до резката и се хомогенизира. Полученият разтвор трябва да е напълно бистър. Ако има наличност на опалесценция или мътност, бързо се филтрува през хартия. БЕЛЕЖКА: По принцип маса от 0,25—0,30 g е достатъчна за измерване на абсорбция на необработено маслиново масло и необработено маслиново масло екстра качество при 268 nm и 270 nm. За измерване при 232 nm, обикновено се изисква проба от 0,05 g, поради което обикновено се приготвят два отделни разтвора. За измервания на абсорбция на маслинови масла от остатъчен материал, рафинирани маслинови масла и маслинови масла с примеси обикновено е необходима по-малка проба, напр. 0,1 g, поради тяхната по-висока абсорбция.

5.3. Ако е необходимо, се коригира базисната линия (220—290 nm) с разтворител в двете кварцови кювети (с проба и референтна), след това кварцовата кювета с пробата се напълва с изпитвания разтвор и се измерва екстинкцията при 232, 268 или 270 nm спрямо референтния разтворител. Записаните стойности на екстинкцията трябва да са в рамките от 0,1 до 0,8 или в рамките на интервала на линейност на спектрофотометъра, който следва да бъде проверен. В противен случай измерванията трябва да се повторят, като според нуждата се използват по-концентрирани или по-разредени разтвори.

5.4. След измерване на абсорбцията при 268 или 270 nm се измерва абсорбцията при λmax, λmax + 4 и λmax – 4. Тези стойности на абсорбцията се използват за определяне на вариацията на специфичната екстинкция (ΔΚ). БЕЛЕЖКА: λmax се приема за 268 nm за изооктан, използван като разтворител, и 270 nm за циклохексан.

6. ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1. Записват се специфичните екстинкции (коефициенти на екстинкция) при различните дължини на вълната, изчислени по следния начин: където: Kλ = специфичната екстинкция при дължина на вълната λ; Eλ = екстинкцията, измерена при дължина на вълната λ; c = концентрация на разтвора в g/100 ml; s = дължина на пътя на кварцовата кювета, в cm; с точност до два знака след десетичната запетая.

6.2. Вариация на специфичната екстинкция (ΔΚ) Вариацията на абсолютната стойност на екстинкцията (ΔΚ) се изчислява по следния начин: където Km е специфичната екстинкция при дължина на вълната за максимална абсорбция при 270 nm и 268 nm в зависимост от използвания разтворител. Резултатите се изразяват с точност до два знака след десетичната запетая.









ПРИЛОЖЕНИЕ Х

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА МЕТИЛОВИ ЕСТЕРИ НА МАСТНИ КИСЕЛИНИ ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1. ОБХВАТ

В настоящото приложение са дадени указания за определяне чрез газова хроматография на свободни и свързани мастни киселини в растителни мазнини и масла след тяхното превръщане в метилови естери на мастни киселини (МЕМК).

Свързаните мастни киселини на триацилглицеролите (TAG) и, в зависимост от метода на естерификация, свободните мастни киселини (FFA) се превръщат в метилови естери на мастни киселини (МЕМК)), които се определят чрез капилярна газова хроматография.

Методът, описан в настоящото приложение, позволява определянето на метиловите естери на мастни киселини от C12 до C24, включително метилови естери на наситени, цис- и транс-мононенаситени и цис- и транс-полиненаситени мастни киселини.

2. ПРИНЦИП

Газовата хроматография се използва за количествен анализ на метилови естери на мастни киселини. Метиловите естери на мастни киселини се подготвят в съответствие с част A. След това те се инжектират в инжектора и се изпаряват в него. Разделянето на метиловите естери на мастни киселини се извършва в аналитични колони със специфична полярност и дължина. Пламъчно-йонизационен детектор (FID) се използва за откриване на метилови естери на мастни киселини. Условията на анализ са представени в част Б.

Може да се използва водород или хелий като газ носител (подвижна фаза) в газовата хроматография на метиловите естери на мастни киселини с пламъчно-йонизационен детектор. Водородът ускорява разделянето и дава по-резки пикове. Неподвижната фаза е микроскопичен слой на тънко течно покритие върху инертна твърда повърхност от кварц.

При преминаването си през капилярната колонка анализираните изпарени съединения взаимодействат с неподвижната фаза, която покрива вътрешната повърхност на колоната. Поради това различно взаимодействие на различни съединения, те елуират по различно време, което се нарича време на задържане на съединението за даден набор от параметри на анализа. Сравнението на времената на задържане се използва за идентификация на отделните съединения.

ЧАСТ A

ПРИГОТВЯНЕ НА МЕТИЛОВИТЕ ЕСТЕРИ НА МАСТНИТЕ КИСЕЛИНИ ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО И МАСЛИНОВО МАСЛО ОТ ОСТАТЪЧЕН МАТЕРИАЛ

1. ОБХВАТ

В настоящата част се определя приготвянето на метиловите естери на мастните киселини. Тя включва методи за приготвянето на метилови естери на мастните киселини от маслиново масло и маслиново масло от остатъчен материал.

2. ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Приготвянето на метилови естери на мастни киселини от маслинови масла и маслинови масла от остатъчен материал се извършва чрез транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид при стайна температура. Необходимостта от пречистване на пробата преди транс-естерификацията зависи от съдържанието на свободни мастни киселини в пробата и аналитичния параметър, който следва да бъде определен, той може да се избира в съответствие със следната таблица:







Категория масло Метод Необработено маслиново масло с киселинност ≤ 2,0 % 1. Мастни киселини 2. Транс-мастни киселини 3. ΔΕСΝ 42 (след пречистване със силикагел чрез ТФЕ) Рафинирано маслиново масло Маслиново масло, съставено от рафинирано масло и необработени маслинови масла Рафинирано маслиново масло от остатъчен материал Маслиново масло от остатъчен материал Необработено маслиново масло с киселинност > 2,0 % Сурово маслиново масло от остатъчен материал 1. Мастни киселини (след пречистване със силикагел чрез ТФЕ) 2. Транс-мастни киселини (след пречистване със силикагел чрез ТФЕ) 3. ΔΕСΝ42 (след пречистване със силикагел чрез ТФЕ)

3. МЕТОДОЛОГИЯ

3.1. Транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид при стайна температура

3.1.1. Принцип

Метиловите естери се образуват чрез транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид като междинен етап преди да се извърши осапуняването.

3.1.2. Реактиви

3.1.2.1. Метанол със съдържание на не повече от 0,5 % (m/m) вода.

3.1.2.2. Хексан с качество за хроматография.

3.1.2.3. Хептан с качество за хроматография.

3.1.2.4. Диетилов етер, стабилизиран за анализ.

3.1.2.5. Ацетон с качество за хроматография.

3.1.2.6. Разтворител за елуиране, за пречистване на маслото чрез колонна хроматография/ТФЕ, смес от хексан/диетилов етер в съотношение 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Калиев хидроксид, приблизително 2М метанолов разтвор: разтварят се 11,2 g калиев хидроксид в 100 ml метанол.

3.1.2.8. Патрони силикагел — 1 g (6 ml) за твърдофазна екстракция.

3.1.3. Апаратура

3.1.3.1. Епруветки с отвор на винт (с вместимост 5 ml ) с капачка със снадка от политетрафлуороетилен.

3.1.3.2. Градуирани или автоматични пипети, 2 ml и 0,2 ml.

3.1.4. Пречистване на пробите масло

При необходимост пробите се пречистват чрез преминаване на маслото през патрон силикагел за твърдофазна екстракция. Патрон силикагел (3.1.2.8) се поставя в апарат за вакуумно елуиране и се промива с 6 ml хексан (3.1.2.2); промиването се извършва без вакуум. След това разтвор на маслото (приблизително 0,12 g) в 0,5 ml хексан (3.1.2.2) се зарежда в колоната. Разтворът се прекарва през колоната и след това се елуира с 10 ml хексан/диетилов етер (87:13 v/v) (3.1.2.6). Комбинираните елуати се хомогенизират и се разделят на две еднакви по обем час