А)

Блокиращият или конкурентният ELISA тест се извършват в съответствие със следния протокол: С конкурентния ELISA тест с използване на моноклонално антитяло 3-17-A3 е възможно да се идентифицират антителата срещу всички известни серотипове на вируса на болестта син език. Принципът на теста е прекъсването на реакцията между антигена на син език и груповото специфично моноклонално антитяло (3-17-A3) чрез добавянe на тест-серум. Антителата на болестта син език, налични в тест-серума, блокират реактивността на моноклоналното антитяло и водят до намаляване на очакваното проявяване на оцветяването след добавяне на маркирано с ензим антимише антитяло и на хромоген/субстрат. Серумите могат да бъдат изпитвани при разреждане 1:5 (метод на точковия тест — допълнение 1) или могат да бъдат титрувани (метод на титруване на серума — допълнение 2) за достигане до крайната точка на разреждане. Стойности на инхибиране над 50 % могат да бъдат смятани за положителни. Материали и реактиви: 1. Подходящи микротитърни плаки за ELISA. 2. Антиген: доставен като екстрахиран клетъчен концентрат, приготвен, както е описано по-долу, и съхраняван при температура – 20 °C или – 70 °C. 3. Блокиращ буфер: фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), съдържащ 0,3 % отрицателен по отношение на син език серум от възрастни говеда, 0,1 % (v/v) Tween-20 (доставен като сироп на полиоксиетилен сорбитон монолаурат) в PBS. 4. Моноклонално антитяло: 3-17-A3 (доставено като супернатант от хибридомна тъканна култура), насочено срещу групово специфичния полипептид VP7, съхраняван при температура– 20 °C или лиофилизиран и разреден в пропорция 1/100 с блокиращ буфер преди употреба. 5. Конюгат: заешки антимиши глобулин (адсорбиран и елюиран), конюгиран с пероксидаза от хрян и съхраняван на тъмно при температура 4 °C. 6. Хромоген и субстрат: Ортофенилен диамин (ОФД-хромоген) при крайна концентрация от 0,4 mg/ml в стерилна дестилирана вода. Водороден пероксид (30 % w/v-субстрат) 0,05 % v/v, добавени непосредствено преди употреба (5μl H2 O2 на 10 ml ОФД). (да се борави внимателно с ОФД — да се носят гумени ръкавици — предполагаем мутаген). 7. Едномоларна сярна киселина: 26,6 ml киселина, добавена към 473,4 ml дестилирана вода. (Важно! Винаги се прибавя киселината към водата и никога — водата към киселината). 8. Орбитален шейкър. 9. Четец за плаки ELISA (тестът може да бъде отчитан визуално). Схема на теста Cc: Контролна проба с конюгат (без серум / без моноклонално антитяло); C++: силно положителна серумна контролна проба; C+: слабо положителна серумна контролна проба; C-: отрицателна серумна контролна проба; Cm: контролна проба с моноклонално антитяло (без серум).



ДОПЪЛНЕНИЕ 1: Точково разреждане(1:5) формат (40 серумни проби/плака) Контролни проби Тест-серуми 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Б Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 В C++ C++ Г C++ C++ Д C+ C+ Е C+ C+ Ж Cm Cm 40 З Cm Cm 40



ДОПЪЛНЕНИЕ 2: Формат на титруване на серума(10 серумни проби/плака) Контролни проби Тест-серуми 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 Б Cc C- 1:10 1:10 В C++ C++ 1:20 1:20 Г C++ C++ 1:40 1:40 Д C+ C+ 1:80 1:80 Е C+ C+ 1:160 1:160 Ж Cm Cm 1:320 1:320 З Cm Cm 1:640 1:640 Протокол на изследването: Контролна проба с конюгат (Сс) : ямки 1A и 1B съдържат празна проба, състояща се от антиген на син език и конюгат. Тя може да бъде използвана за калибриране на четеца на плаки ELISA. Контролна проба с моноклонално антитяло (Cm) : Графи 1 и 2, редове Ж и З представляват контролната проба с моноклонално антитяло, съдържаща антиген на син език, моноклонално антитяло и конюгат. В тези ямки се появява максималното оцветяване. Средната отчетена оптическа плътност от тази контролна проба е 0 % от стойността на инхибиране. Положителна проба (C++, C+) : Графи 1 и 2, редове В-Г-Д-Е. В тези ямки има антиген на син език, съответно силно и слабо положителен антисерум, моноклонално антитяло и конюгат. Отрицателна контролна проба (C–) : Ямки 2A и 2Б са отрицателните проби, които съдържат антиген на син език, негативен по отношение на син език антисерум, моноклонално антитяло и конюгат. Тест-серуми : За обширни серологични изследвания и бърз скрининг серумите могат да се изследват при единично разреждане от 1:5 (допълнение 1). Като алтернатива, могат да бъдат изследвани 10 серума при разреждане, вариращо от 1:5 до 1:640 (допълнение 2). Това ще даде определени индикации за титъра на антитела в изследваните серуми. Процедура: 1. Антиген на син език се разрежда до предварително титруваната концентрация в PBS, разбърква се за кратко с ултразвукова бъркалка, за да се диспергират вирусните агрегати (ако не е наличен ултразвуков апарат, се бърка енергично с пипета) и се прибавят по 50 μl към всички ямки на плаката за ELISA. За диспергиране на антигена се почукват страните на плаката. 2. Инкубира се на 37 °C в продължение на 60 минути в орбитален шейкър. Плаките се измиват три пъти чрез напълване и изпразване на ямките с нестерилен PBS и се изсушават с помощта на попивателна хартия. 3. Контролни ямки: Прибавят се 100 μl блокиращ буфер към ямките с контролна проба конюгат (Cc). Прибавят се по 50 μl положителни и отрицателни контролни серумни проби при разреждане 1:5 (10 μl серумни проби + 40 μl блокиращ буфер), към съответните ямки C–, C + и C++. Прибавят се 50 μl блокиращ буфер към контролните ямки с моноклонално антитяло. Метод на точковото титруване: добавя се от всеки тест-серум, разреден в съотношение 1:5 с блокиращ буфер, за да се дублират ямките на графи 3—12 (10 μl серум + 40 μl блокиращ буфер), или Метод за титруване на серума: приготвят се серии двукратни разреждания на всяка от пробите за анализ (от 1:5 до 1:640) в блокиращ буфер в осем ямки на единични графи 3—12. 4. Веднага след прибавянето на тест-серумите се разрежда моноклоналното антитяло в съотношение 1:100 в блокиращ буфер и се добавят 50 μl към всички ямки на плаката, освен в тази за празната проба. 5. Инкубира се на 37 °C в продължение на 60 минути в орбитален шейкър. Плаката се измива три пъти с PBS и се изсушава с попивателна хартия. 6. Разрежда се заешки антимиши концентрат до съотношение 1/5 000 в блокиращ буфер и се добавят 50 μl към всички ямки на плаката. 7. Инкубира се на 37 °C в продължение на 60 минути в орбитален шейкър. Плаката се измива три пъти с PBS и се изсушава с попивателна хартия. 8. Разтопява се О-фенилендиамин дихидрохлорид (ОФД) и непосредствено преди употреба се добавят 5 μl водороден пероксид с концентрация 30 % за всеки 10 ml ОФД. Добавят се 50 μl към всички ямки на плаката. Изчаква се в продължение на приблизително 10 минути оцветяването да се прояви и реакцията се спира с едномоларна сярна киселина (50 μl на ямка). Оцветяване следва да се появи в контролните ямки, съдържащи моноклонално антитяло и в онези ямки, които съдържат серуми без антитела на син език. 9. Плаките се преглеждат и описват визуално или с използване на спектрофотометричен четец. Анализ на резултатите: Като се използва софтуерният пакет се отпечатват стойностите на оптичната плътност (ОП) и изразеното в проценти инхибиране (ПИ) за тест-серумите и контролните серуми въз основа на средната регистрирана стойност от контролните ямки с антиген. Данните, изразени като стойности на ОП или ПИ, се използват за определяне дали изследването е осъществено в рамките на приемливи граници. Стойностите на горните контролни граници (ГКГ) и долните контролни граници (ДКГ) на ОП за контролната проба с моноклонално антитяло (антиген с добавено моноклонално антитяло, но без добавяне на тест-серум) са между 0,4 и 1,4. Всяка плака, която не отговаря на горните критерии, трябва да се отхвърли. Ако не е налице компютърен софтуерен пакет, стойностите на ОП се отпечатват, като се използва принтерът на ELISA. Изчислява се средната стойност на ОП за контролните ямки с антиген, която се приравнява на 100 % от стойността. Определят се 50 % от стойността на ОП и се пресмята за всяка проба дали е положителна или отрицателна. Процентна стойност на инхибиране (ПИ) = 100 – (ОП на всяка тестова проба/средно ОП на Cm) × 100. Стойностите на ПИ съответно за дублираните отрицателни контролни ямки със серум и дублираните празни ямки трябва да бъдат съответно между + 25 %и – 25 % и + 95 % и + 105 %. Ако плаката не попадне в тези граници, това не я прави невалидна, но подсказва развиването на оцветяване на заден план. При силните и при слабите положителни контролни серуми трябва да се отчитат стойности на ПИ съответно между + 81 % и + 100 %, и между + 51 % и + + 80 %. Диагностичният праг за тест-серумите е 50 % (50 % за ПИ или 50 % за ОП). Проби, при които се отчитат по-ниски от 50 % стойности на ПИ се считат за отрицателни. Проби, при които се отчитат стойности на ПИ над и под прага за дублиращите ямки, се считат за съмнителни; такива проби могат да се изследват повторно по метода точковия тест и/или чрез титруване. Положителните проби могат също да се титруват, за да се получи представа доколко положителна е пробата. Визуално отчитане: Положителните и отрицателните проби се различават лесно с просто око; слабо положителните или силно отрицателните проби могат да бъдат по-трудни за интерпретиране без използване на апаратура. Приготвяне на антиген на син език за ELISA: 1. 40-60 плоски шишета (колби на Ру) със сливащи се бъбречни клетки на новородени хамстери BHK-21 се изплакват три пъти със среда на Eagle, която не съдържа серум, и се инфектират с вирус на син език от серотип 1 в среда на Eagle, несъдържаща серум. 2. Инкубират се при 37 °C и се изследват ежедневно за цитопатичен ефект (ЦПЕ). 3. Когато ЦПЕ обхване 90 до 100 % от слоя от клетки във всяко шише, вирусът се събира чрез разклащане на шишето, за да се отделят залепналите за стъклото клетки. 4. Шишетата се подлагат на центрофугиране при 2 000 до 3 000 об./мин., за да се раздробят клетките. 5. Супернатантът се отстранява и клетките се поставят отново в суспензия от приблизително 30 ml PBS, съдържащ 1 % „Sarkosyl“ и 2 ml фенилметилсулфонил флуорид (лизиращ буфер). Това може да бъде причина клетките да образуват гел, като за намаляване на този ефект може да бъде добавен повече лизиращ буфер. (NB: фенилметилсулфонил флуоридът е опасен — с него трябва да се борави с изключителна предпазливост.) 6. Чрез използване на ултразвукова сонда в продължение на 60 секунди при амплитуда 30 микрона клетките се разрушават. 7. Центрофугира се при 10 000 об./мин. в продължение на 10 минути. 8. Супернатантът се съхранява при температура + 4 °C, а останалата маса от клетки се поставя в 10 до 20 ml лизиращ буфер за получаване на нова суспензия. 9. Въздейства се с ултразвук и се избистря общо три пъти, като при всеки етап супернатантът се съхранява. 10. Супернатантите се обединяват и центрофугират при 24 000 об./мин. (100,000 g) в продължение на 120 минути при + 4 °C върху подложка от 5 ml 40 % захароза (w/v в PBS), като се използват епруветки за центрофугиране Beckmann от 30 ml и ротор SW 28. 11. Супернатантът се отстранява, епруветките се изплакват старателно и клетъчната маса отново се поставя в PBS, като чрез въздействие с ултразвук се получава суспензия. Антигенът се съхранява като аликвотни части при температура – 20 °C. Титруване на антиген на син език за ELISA: Антиген на син език за ELISA се титрува чрез индиректен метод ELISA. Двукратно разреденият антиген се титрува при константно разреждане (1/100) на моноклоналното антитяло 3-17-A3. Следва се посоченият по-долу протокол: 1. Разреден в PBS в съотношение 1:20 антиген на син език се титрува на микротитърна плака в серии от двукратно разредени проби (50 μl/ямка), като се използва многоканална пипета. 2. Пробите се инкубират в продължение на един час на 37 °C върху орбитален шейкър. 3. Плаките се измиват три пъти с PBS. 4. Добавят се 50 μl моноклонално антитяло 3-17-A3 (разредено 1/100) към всяка ямка на микротитърната плака. 5. Пробите се инкубират в продължение на един час на 37 °C върху орбитален шейкър. 6. Плаките се измиват три пъти с PBS. 7. Към всяка ямка на микротитърна плака се добавят 50 μl заешки антимиши глобулин, конюгиран с пероксидаза от хрян, разредена до предварително титрувана оптимална концентрация. 8. Пробите се инкубират в продължение на един час на 37 °C върху орбитален шейкър. 9. Добавят се субстрат и хромоген, както е описано по-горе. Реакцията се спира след 10 минути чрез добавяне на едномоларна сярна киселина (50 μl/ямка). При конкурентния анализ моноклоналното антитяло трябва да е в излишък, поради това се избира разреждане на антиген, което попада в титърната крива (не в областта на платото), която дава приблизително 0,8 ОП след 10 минути.